JP2024023438A - 多重特異性結合タンパク質及びその改善 - Google Patents

多重特異性結合タンパク質及びその改善 Download PDF

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Abstract

【課題】多重特異性結合タンパク質及びその改善の提供。【解決手段】本発明は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体、多重特異性結合タンパク質、そのようなタンパク質を含む医薬組成物、ならびにがんの治療を含むそのようなタンパク質及び医薬組成物を使用する治療方法の改善を提供する。一態様では、本発明は、ヒンジ配列を介して抗体定常ドメインに連結されている一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の改善を提供する。いくつかの実施形態では、このヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－Ｓｅｒを含む。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／６７７，１３７号の利益及び優先権を主張し、その開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年５月２８日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、ＤＦＹ－０４９ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前で、サイズは３４０，１０１バイトである。
発明の分野
本発明は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体及び多重特異性結合タンパク質、そのようなタンパク質を含む医薬組成物、ならびにがんの治療を含む、そのようなタンパク質及び医薬組成物を使用する治療方法の改善を提供する。
がんは、この疾患を治療するために文献で報告されている相当な研究努力及び科学的進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんの一部としては、前立腺癌、乳癌、及び肺癌が挙げられる。前立腺癌は、男性において最も一般的ながんの形態である。乳癌は、依然として女性における死亡の最多の原因である。これらのがんに対する現在の治療オプションは、全ての患者にとって有効なわけではないか、及び／または実質的な有害な副作用を有する場合がある。他の種類のがんもまた、既存の治療オプションを使用して治療することは課題のままである。
がん免疫療法は、特異性が高く、かつ患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進し得るので望ましい。二重特異的Ｔ細胞係合剤などの融合タンパク質は、腫瘍細胞及びＴ細胞に結合して腫瘍細胞の破壊を促進する、文献に記載されているがん免疫療法である。特定の腫瘍関連抗原及び特定の免疫細胞に結合する抗体が文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１及びＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の構成要素であり、循環リンパ球のおよそ１５％を占める。ＮＫ細胞は、事実上全ての組織に浸潤し、事前の感作を必要とせずに腫瘍細胞を効率的に殺滅するそれらの能力によって元々特徴付けられた。活性化したＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の手段によって、すなわち、パーフォリン及びグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒を介して及び死受容体経路を介して標的細胞を殺滅する。活性化したＮＫ細胞はまた、標的組織への他の白血球の動員を促進するＩＦＮ－γ及びケモカインなどの炎症性サイトカインを分泌する。
ＮＫ細胞は、それらの表面上の様々な活性化及び阻害受容体を介してシグナルに反応する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇した場合、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化を介して阻害される。代替的に、ＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇した場合、それらの細胞は、それらの活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、それらの表面上のＣＤ１６受容体を介していくつかの免疫グロブリンの定常領域によって活性化される。ＮＫ細胞の活性化に対する全体的な感受性は、刺激性及び阻害性シグナルの合計に依存する。ＮＫＧ２Ｄは、本質的に全てのナチュラルキラー細胞によって発現されるＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＮＫＧ２Ｄは活性化受容体として機能する。ＮＫＧ２Ｄは、共刺激受容体として機能するＴ細胞にも見られる。ＮＫＧ２Ｄを介してＮＫ細胞機能を調節する能力は、悪性腫瘍を含むさまざまな治療状況で有用である。
国際公開第２０１６／１３４３７１号 国際公開第２０１５／０９５４１２号
一態様では、本発明は、ヒンジ配列を介して抗体定常ドメインに連結されている一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の改善を提供する。いくつかの実施形態では、このヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－Ｓｅｒを含む。いくつかの他の実施形態では、このヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－Ｓｅｒ及びＴｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙを含む。このｓｃＦｖは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このｓｃＦｖは、ＮＫＧ２Ｄまたは腫瘍関連抗原に結合する。このヒンジ配列は、標的抗原への結合の可塑性を提供する。
ｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と軽鎖可変ドメインのＣ１００残基との間に形成され得る。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号４２７）などの可塑性リンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結されている。ｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＮ末端に配置されている。ｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＣ末端に配置されている。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖに連結された抗体定常ドメインは、ＣＤ１６に結合し得る。いくつかの実施形態では、抗体定常ドメインは、ＩｇＧ抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、突然変異が抗体定常ドメインに導入されて、別の抗体定常ドメインとのヘテロ二量体化が可能になる。例えば、抗体定常ドメインがヒトＩｇＧ１の定常ドメインに由来する場合、その抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得、かつＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択された１つ以上の位置で異なる。いくつかの実施形態では、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得、かつＱ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅからなる群より選択される１つ以上の置換によって異なる。
別の態様では、本発明は、上記の抗体定常領域に連結されたｓｃＦｖを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、このタンパク質は、抗体定常ドメインに連結されたｓｃＦｖを含む第１の抗原結合部位と、ここに記載されるＦａｂまたはｓｃＦｖフォーマットをとり得る第２の抗原結合部位と、この第２の抗原結合部位に連結された第２の抗体定常ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、このタンパク質は多重特異性であり、第１の抗原結合部位はＮＫＧ２Ｄに結合し、第２の抗原結合部位は腫瘍関連抗原に結合し、そして抗体定常領域はＣＤ１６に結合する。
いくつかの他の実施形態では、このタンパク質は多重特異性であり、この第１の抗原結合部位は腫瘍関連抗原に結合し、この第２の抗原結合部位はＮＫＧ２Ｄに結合し、かつ抗体定常領域はＣＤ１６に結合する。ｓｃＦｖに連結された抗体定常領域は、二次抗体定常領域とヘテロ二量体化し得る。これらの実施形態における多重特異性結合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に対して、ならびにがん細胞上の腫瘍関連抗原に対して結合する。そのようなタンパク質は、複数の種類のＮＫ活性化受容体と係合し得、かつＮＫＧ２Ｄに対する天然リガンドの結合を阻害し得る。所定の実施形態では、このタンパク質は、ヒトのＮＫ細胞を作動し得る。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、ヒトにおいて、ならびに／またはげっ歯類及び／またはカニクイザルなどの他の種において、ＮＫ細胞を作動し得る。
別の態様において、本発明は、多重特異性結合タンパク質を提供し、そしてこのタンパク質は、腫瘍関連抗原に結合する第１の抗原結合部位と、第１の抗原結合部位と同じ腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部位と、ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域もしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第４の抗原結合部位を含む。この抗原結合部位のいずれか１つは、上記のようなＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかの形態をとり得る。ここで提供される多重特異性結合タンパク質は、腫瘍関連抗原の二価の係合を提供し、それによってがん細胞表面上の腫瘍関連抗原を安定化し、ＮＫ細胞によるがん細胞に対する細胞毒性を増強する。
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質による腫瘍関連抗原の二価係合は、がん細胞への多重特異性結合タンパク質のより強い結合を付与し、それにより、がん細胞に対する、特に低レベルの腫瘍関連抗原を発現するがん細胞に対する、ＮＫ細胞のより強い細胞毒性応答を促進する。
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部を組み込み、この抗体Ｆｃドメインは、ヒンジ及びＣＨ２ドメイン及び／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４－３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。変異をこの抗体定常ドメインに導入して、別の抗体定常ドメインとのヘテロ二量体化を可能にしてもよい。例えば、抗体定常ドメインがヒトＩｇＧ１の定常ドメインに由来する場合、その抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得、かつＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択される１つ以上の位置で異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得、かつＱ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅからなる群より選択される１つ以上の置換によって異なる。
上記の腫瘍関連抗原結合部位は、任意の腫瘍関連抗原、例えば、ＡＮＯ１、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＣＲ４、ＣＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＬＡＵＤＩＮ－１８．２、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＧＤ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＭＡ、メソセリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＯＰ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、５Ｔ４、ＧＰＮＭＢ、ＦＲ－アルファ、ＰＡＰＰ－Ａ、ＦＬＴ３、ＧＰＣ３、ＣＸＣＲ４、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ１、ＶＬＡ４、ＣＤ４４、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ４７、ＣＬＬ１、ＣＤ８１、ＣＤ２３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＲＬＦ２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ１３８、ＣＡ１２５、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＳＬＣ４４Ａ４、ＣＡ１９－９、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４、ＬＩＬＲＢ５、ＬＩＬＲＡ１、ＬＩＬＲＡ２、ＬＩＬＲＡ３、ＬＩＬＲＡ４、ＬＩＬＲＡ５、及びＬＩＬＲＡ６、ＣＣＲ８、ＣＤ７、ＣＴＬＡ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＥＮＴＰＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＩＬ－１Ｒ２、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＮＴ５Ｅ、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＭＵＣ１、Ｐ－カドヘリン、プレキシン－Ａ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤＣＰ１、ＰＴＫ７、Ａｘｌ、ｅｒｂＢ－３、ＥＤＮＲＢ、Ｔｙｒｐ１、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＳＦ３Ｒ、Ｓｉｇｌｅｃ－９、ＩＴＧＡＭ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＣＣＲ１、ＬＲＲＣ２５、ＰＴＡＦＲ、ＳＩＲＰＢ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＣＤ３００ＬＢ、ＡＴＰ１Ａ３、ＣＣＲ５、ＭＵＣ１（またはＭＵＣ１－Ｃ）、プレキシン－Ａ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＳＴＥＲＡＰ１、ＣＤＣＰ１、ＰＴＫ７、ＡＸＬ、ＥＤＮＲＢ、ＯＬＲ１、及びＴＹＲＰ１に結合する部位であり得る。
別の態様において、本発明は、以下を含むタンパク質を提供する：（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位、（ｂ）抗原結合Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）フラグメント、及び（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域もしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する追加の抗原結合部位。所定の実施形態では、このタンパク質は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する抗原結合ＴＣＲフラグメントを含む多重特異性結合タンパク質である。
所定の実施形態では、抗原結合部位はＦａｂフラグメントであり、この抗原結合ＴＣＲフラグメントは一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）フラグメントである。所定の実施形態では、ｓｃＴＣＲフラグメントは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して抗体定常領域のポリペプチド鎖に連結されている。所定の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む。
所定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖであり、抗原結合ＴＣＲフラグメントは細胞外ＴＣＲフラグメントである。所定の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して抗体定常領域のポリペプチド鎖に連結されている。所定の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む。
所定の実施形態では、抗原結合部位はＦａｂフラグメントであり、かつ抗原結合ＴＣＲフラグメントは細胞外ＴＣＲフラグメントである。
所定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原結合ＴＣＲフラグメントと同じ抗原に結合する追加の抗原結合ＴＣＲフラグメントをさらに含む。所定の実施形態では、抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、抗原結合ＴＣＲフラグメント及び追加の抗原結合ＴＣＲフラグメントは、細胞外ＴＣＲフラグメントである。所定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖであり、抗原結合ＴＣＲフラグメント及び追加の抗原結合ＴＣＲフラグメントはｓｃＴＣＲフラグメントである。
ｓｃＦｖを含む多重特異性結合タンパク質の所定の実施形態では、ｓｃＦｖは、可塑性リンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結された重鎖可変ドメインを含む。所定の実施形態では、可塑性リンカーは、（Ｇ４Ｓ）４を含む。所定の実施形態では、ｓｃＦｖは、軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に配置された重鎖可変ドメインを含む。
所定の実施形態では、抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、ここで、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。所定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインの位置４４のＣｙｓと軽鎖可変ドメインの位置１００のＣｙｓとの間に形成され、これらの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けの下で定義される。所定の実施形態では、そのようなジスルフィド架橋を含む抗原結合部位は、ｓｃＦｖである。
所定の実施形態では、抗原結合部位は、ヒトにおいてＮＫＧ２Ｄに結合する。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示される腫瘍関連抗原由来のペプチドに結合する。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：４８によって提示される配列番号４２５のアミノ酸配列を有するＥＬＡＶＬ４ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３５１に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号３５２に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３５１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号３５３）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３５２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β配列（配列番号３５４）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３４９に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号３５０に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：４８によって提示される配列番号４２６のアミノ酸配列を有するインスリンペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３５７に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号３５８に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３５７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号３５９）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３５８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β配列（配列番号３６０）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３５５に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号３５６に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：４８によって提示される配列番号３４０のアミノ酸配列を有するＴＥＲＴペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３６３に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号３６４に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３６３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号３６５）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３６４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β（配列番号３６６）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３６１に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号３６２に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ＊０２によって提示される配列番号３４１のアミノ酸配列を有するＥＲＢＢ２ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４３０に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号４３１に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４３０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号３６７）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４３１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β（配列番号３６８）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４２８に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号４２９に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ＊０２によって提示される配列番号３４２のアミノ酸配列を有するＷＴ１ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４３４に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号４３５に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４３４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号３６９）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４３５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β（配列番号３７０）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４３２に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号４３３に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ＊０２によって提示される配列番号３４２のアミノ酸配列を有するＷＴ１ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４３８に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号４３９に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４３８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号３７１）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４３９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β（配列番号３７２）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４３６に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号４３７に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ１によって提示される配列番号３４３のアミノ酸配列を有するＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３７５に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号３７６に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３７５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号３７７）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３７６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β（配列番号３７８）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３７３に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号３７４に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４４のアミノ酸配列を有するＭＡＲＴ１ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３８１に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号３８２に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３８１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号３８３）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３８２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β配列（配列番号３８４）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３７９に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号３８０に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４６のアミノ酸配列を有するＢＩＲＣ５ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４４２に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号４４３に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号３８９）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４４３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β配列（配列番号３９０）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４４０に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号４４１に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４６のアミノ酸配列を有するＢＩＲＣ５ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４４４に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号４４５に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４４４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号３９１）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４４５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β配列（配列番号３９２）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３８５に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号３８６に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４７のアミノ酸配列を有するＰＲＡＭＥペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３９５に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号３９６に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３９５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号３９７）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３９６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β（配列番号３９８）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３９３に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号３９４に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４７のアミノ酸配列を有するＰＲＡＭＥペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４０１に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号４０２に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４０１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメイン及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号４０３）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４０２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β（配列番号４０４）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３９９に示されるアルファ鎖アミノ酸配列、及び配列番号４００に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４７のアミノ酸配列を有するＰＲＡＭＥペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４０７に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号４０８に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４０７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号４０９）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４０８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β（配列番号４１０）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４０５に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号４０６に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４８のアミノ酸配列を有するＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４１３に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号４１４に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４１３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号４１５）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４１４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β（配列番号４１６）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４１１に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号４１２に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４８のアミノ酸配列を有するＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４１８に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号４１４に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４１８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号４１５）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４１４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β（配列番号４１６）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４１７に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号４１２に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４８のアミノ酸配列を有するＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４２１に関連するアルファ鎖可変ドメイン及び配列番号４２２に関連するベータ鎖可変ドメインを含む。例えば、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４２１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアルファ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのアルファ鎖可変ドメインのＣＤＲ３α配列（配列番号４２３）と同一のアミノ酸配列を組み込む。同様に、所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４２２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるベータ鎖可変ドメインを含むか、及び／またはこのベータ鎖可変ドメインのＣＤＲ３β（配列番号４２４）と同一のアミノ酸配列を組み込む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号４１９に示されるアルファ鎖アミノ酸配列及び配列番号４２０に示されるベータ鎖アミノ酸配列を含む。
所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４５のアミノ酸配列を有するＳＸＸ２ペプチドに結合する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３８７に示されるＣＤＲ３α配列を組み込んだアルファ鎖可変ドメインを含む。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、配列番号３８８に示されるＣＤＲ３β配列を組み込んだベータ鎖可変ドメインを含む。
所定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域またはその一部を含み、ここで、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域またはその部分は、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む。所定の実施形態では、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域またはその部分は、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。変異をこの抗体定常ドメインに導入して、別の抗体定常ドメインとのヘテロ二量体化を可能にしてもよい。例えば、抗体定常ドメインがヒトＩｇＧ１の定常ドメインに由来する場合、その抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得、かつＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択された１つ以上の位置で異なる。いくつかの実施形態では、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得、かつＱ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅからなる群より選択される１つ以上の置換によって異なる。
ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位（「ＮＫＧ２Ｄ結合部位」とも呼ばれる）を含む前述のポリペプチドまたはタンパク質のいずれか１つの所定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有すること、及び／または配列番号１のＣＤＲ１（配列番号３または配列番号３０７）、ＣＤＲ２（配列番号４）、及びＣＤＲ３（配列番号５または配列番号３０８）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことなどによって、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込み得る。配列番号１に関連する重鎖可変ドメインは、様々な軽鎖可変ドメインと結合して、ＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成し得る。例えば、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込むＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、及び４３に関連する配列のいずれか１つから選択される軽鎖可変ドメインをさらに組み込んでもよい。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、及び４３から選択される配列のいずれか１つと少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込む。
あるいは、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号４４に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号４８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでもよい。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号４４のＣＤＲ１（配列番号４５または配列番号３０９）、ＣＤＲ２（配列番号４６）、及びＣＤＲ３（配列番号４７または配列番号３１０）の配列と同一であるアミノ酸配列を組み込んでもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号４８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号４８のＣＤＲ１（配列番号４９）、ＣＤＲ２（配列番号５０）、及びＣＤＲ３（配列番号５１）の配列と同一であるアミノ酸配列を組み込んでもよい。
他の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号５２に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号５６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでもよい。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号５２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号５２のＣＤＲ１（配列番号５３または配列番号３１１）、ＣＤＲ２（配列番号５４）、及びＣＤＲ３（配列番号５５または配列番号３１２）の配列と同一のアミノ酸配列を組みんでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号５６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号５６のＣＤＲ１（配列番号５７）、ＣＤＲ２（配列番号５８）、及びＣＤＲ３（配列番号５９）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
あるいは、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、それぞれ、配列番号６０に対して、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有すること、及び配列番号６１に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有することなどによって、配列番号６０に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号６１に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでもよい。
別の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号６２に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号６６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでもよく、例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号６２のＣＤＲ１（配列番号６３）、ＣＤＲ２（配列番号６４）、及びＣＤＲ３（配列番号６５）配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号６６のＣＤＲ１（配列番号６７）、ＣＤＲ２（配列番号６８）、及びＣＤＲ３（配列番号６９）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、いくつかの実施形態では、配列番号７０に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号７４に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号７０のＣＤＲ１（配列番号７１または配列番号３１３）、ＣＤＲ２（配列番号７２）、及びＣＤＲ３（配列番号７３または配列番号３１４）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号７４のＣＤＲ１（配列番号７５）、ＣＤＲ２（配列番号７６）、及びＣＤＲ３（配列番号７７）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号７８に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号８２に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号７８のＣＤＲ１（配列番号７９または配列番号３１５）、ＣＤＲ２（配列番号８０）、及びＣＤＲ３（配列番号８１または配列番号３１６）の配列と同一のアミノ酸配列を組みんでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号８２のＣＤＲ１（配列番号８３）、ＣＤＲ２（配列番号８４）、及びＣＤＲ３（配列番号８５）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号８６に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号９０に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番８６のＣＤＲ１（配列番号８７または配列番号３１７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）、及びＣＤＲ３（配列番号８９または配列番号３１８）の配列と同一のアミノ酸配列を組みんでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号９０のＣＤＲ１（配列番号９１）、ＣＤＲ２（配列番号９２）、及びＣＤＲ３（配列番号９３）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号９４に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号９４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番９４のＣＤＲ１（配列番号９５または配列番号３１９）、ＣＤＲ２（配列番号９６）、及びＣＤＲ３（配列番号９７または配列番号３２０）の配列と同一のアミノ酸配列を組みんでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）、及びＣＤＲ３（配列番号１０１）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号１０２に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１０６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１０２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号１０２のＣＤＲ１（配列番号１０３または配列番号３１３）、ＣＤＲ２（配列番号１０４）、及びＣＤＲ３（配列番号１０５または配列番号３２１）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１０６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号１０６のＣＤＲ１（配列番号１０７）、ＣＤＲ２（配列番号１０８）、及びＣＤＲ３（配列番号１０９）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号３２２に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３２２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番３２２のＣＤＲ１（配列番号９５または配列番号３１９）、ＣＤＲ２（配列番号９６）、及びＣＤＲ３（配列番号３２３または配列番号３２４）の配列と同一のアミノ酸配列を組みんでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）、及びＣＤＲ３（配列番号１０１）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号３２５に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３２５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番３２５のＣＤＲ１（配列番号９５または配列番号３１９）、ＣＤＲ２（配列番号９６）、及びＣＤＲ３（配列番号３２６または配列番号３２７）の配列と同一のアミノ酸配列を組みんでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）、及びＣＤＲ３（配列番号１０１）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号３２８に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３２８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番３２８のＣＤＲ１（配列番号９５または配列番号３１９）、ＣＤＲ２（配列番号９６）、及びＣＤＲ３（配列番号３２９または配列番号３３０）の配列と同一のアミノ酸配列を組みんでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）、及びＣＤＲ３（配列番号１０１）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号３３１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３３１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号３３１のＣＤＲ１（配列番号９５または配列番号３１９）、ＣＤＲ２（配列番号９６）、及びＣＤＲ３（配列番号３３２または配列番号３３３）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）、及びＣＤＲ３（配列番号１０１）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号３３４に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３３４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号３３４のＣＤＲ１（配列番号９５または配列番号３１９）、ＣＤＲ２（配列番号９６）、及びＣＤＲ３（配列番号３３５または配列番号３３６）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）、及びＣＤＲ３（配列番号１０１）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号３３７に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３３７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号３３７のＣＤＲ１（配列番号９５または配列番号３１９）、ＣＤＲ２（配列番号９６）、及びＣＤＲ３（配列番号３３８または配列番号３３９）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。同様に、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってもよいし、及び／または配列番号９８のＣＤＲ１（配列番号９９）、ＣＤＲ２（配列番号１００）、及びＣＤＲ３（配列番号１０１）の配列と同一のアミノ酸配列を組み込んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、それぞれ、配列番号１１０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一及び配列番号１１１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有することなどにより、配列番号１１０に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１１１に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、それぞれ、配列番号１１２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一及び配列番号１１３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有することなどにより、配列番号１１２に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号１１３に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。
本明細書に記載のタンパク質のいずれか１つを含む製剤、そのタンパク質を発現する１つ以上の核酸を含む細胞、及びそのタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も提供される。
本発明の別の態様は、患者におけるがんを治療する方法を提供する。この方法は、それを必要とする患者に、治療的有効量の本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を投与することを含む。治療すべきがんとしては、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、乳癌、大腸癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃癌、消化管癌、消化管間質性腫瘍、膠芽腫、頭頸部癌、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、腎細胞癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、及び膵臓癌、前立腺癌、肉腫、小細胞肺癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、骨髄由来のサプレッサー細胞によって浸潤されたがん、Ｔ調節性細胞に浸潤されたがん、細胞外マトリックス沈着を伴うがん、高レベルの反応性間質を伴うがん、及び血管新生を伴うがんが挙げられ得る。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して抗体定常ドメインに連結された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むポリペプチドであって、前記ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む前記ポリペプチド。
（項目２）
前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記ジスルフィド架橋が、前記重鎖可変ドメイン由来のＣ４４と前記軽鎖可変ドメイン由来のＣ１００との間に形成される、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記重鎖可変ドメインが、可塑性リンカーを介して前記軽鎖可変ドメインに連結されている、項目１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記可塑性リンカーが（Ｇ４Ｓ）４を含む、項目４に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置する、項目１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記ヒンジがアミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む、項目１～６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記抗体定常ドメインが、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインまたはその一部を含む、項目１～７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記抗体定常ドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記抗体定常ドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目９に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記抗体定常ドメインが、前記ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択される１つ以上の位置で異なる、項目１０に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記抗体定常ドメインが、前記ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＱ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅからなる群より選択される１つ以上の置換によって異なる、項目１１に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記ｓｃＦｖがＮＫＧ２Ｄまたは腫瘍関連抗原に結合する、項目１～１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記ｓｃＦｖがＮＫＧ２Ｄに結合し、かつ前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、配列番号９４、配列番号１、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７８、配列番号８６、配列番号１０２、配列番号３２２、配列番号３２５、配列番号３２８、配列番号３３１、配列番号３３４、及び配列番号３３７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記重鎖可変ドメインが配列番号９４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記重鎖可変ドメインが配列番号３２２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記重鎖可変ドメインが配列番号３２５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記重鎖可変ドメインが配列番号３２８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記重鎖可変ドメインが配列番号３３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記重鎖可変ドメインが配列番号３３４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記重鎖可変ドメインが配列番号３３７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記重鎖可変ドメインが配列番号４４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号４８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２３）
前記重鎖可変ドメインが配列番号５２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号５６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２４）
前記重鎖可変ドメインが配列番号６０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号６１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２５）
前記重鎖可変ドメインが配列番号６２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２６）
前記重鎖可変ドメインが配列番号７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号７４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２７）
前記重鎖可変ドメインが配列番号７８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号８２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２８）
前記重鎖可変ドメインが配列番号８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２９）
前記重鎖可変ドメインが配列番号１０２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号１０６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目３０）
前記ｓｃＦｖがＮＫＧ２Ｄに結合し、かつ前記重鎖可変ドメインが配列番号１１０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号１１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目３１）
前記ｓｃＦｖがＮＫＧ２Ｄに結合し、かつ前記重鎖可変ドメインが配列番号１１２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変ドメインが配列番号１１３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目３２）
項目１３に記載のポリペプチドであって、前記ｓｃＦｖが腫瘍関連抗原に結合し、前記腫瘍関連抗原が、ＡＮＯ１、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＣＲ４、ＣＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＬＡＵＤＩＮ－１８．２、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＧＤ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＭＡ、メソセリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＯＰ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、５Ｔ４、ＧＰＮＭＢ、ＦＲ－アルファ、ＰＡＰＰ－Ａ、ＦＬＴ３、ＧＰＣ３、ＣＸＣＲ４、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ１、ＶＬＡ４、ＣＤ４４、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ４７、ＣＬＬ１、ＣＤ８１、ＣＤ２３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＲＬＦ２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ１３８、ＣＡ１２５、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＳＬＣ４４Ａ４、ＣＡ１９－９、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４、ＬＩＬＲＢ５、ＬＩＬＲＡ１、ＬＩＬＲＡ２、ＬＩＬＲＡ３、ＬＩＬＲＡ４、ＬＩＬＲＡ５、及びＬＩＬＲＡ６、ＣＣＲ８、ＣＤ７、ＣＴＬＡ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＥＮＴＰＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＩＬ－１Ｒ２、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＧＥＭ、ＮＴ５Ｅ、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＭＵＣ１、Ｐ－カドヘリン、プレキシン－Ａ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤＣＰ１、ＰＴＫ７、Ａｘｌ、ｅｒｂＢ－３、ＥＤＮＲＢ、Ｔｙｒｐ１、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＳＦ３ Ｒ、Ｓｉｇｌｅｃ－９、ＩＴＧＡＭ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＣＣＲ１、ＬＲＲＣ２５、ＰＴＡＦＲ、ＳＩＲＰＢ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＣＤ３００ＬＢ、ＡＴＰ１Ａ３、ＣＣＲ５、ＭＵＣ１（またはＭＵＣ１－Ｃ）、プレキシン－Ａ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤＣＰ１、ＰＴＫ７、ＡＸＬ、ＥＤＮＲＢ、ＯＬＲ１、及びＴＹＲＰ１からなる群より選択される、前記ポリペプチド。
（項目３３）
先行項目のいずれか１つに記載のｓｃＦｖを含むタンパク質。
（項目３４）
以下を含むタンパク質であって：
（ａ）項目１～３２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、第１の抗原結合部位と；
（ｂ）第２の抗原結合部位と；
（ｃ）第２の抗体定常ドメインと、を含む前記タンパク質。
（項目３５）
前記第１の抗原結合部位がＮＫＧ２Ｄに結合し、かつ前記第２の抗原結合部位が腫瘍関連抗原に結合する、項目３４に記載のタンパク質。
（項目３６）
前記第１の抗原結合部位が腫瘍関連抗原に結合し、かつ前記第２の抗原結合部位がＮＫＧ２Ｄに結合する、項目３４に記載のタンパク質。
（項目３７）
前記第２の抗原結合部位がｓｃＦｖまたはＦａｂを含む、項目３４～３６のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目３８）
前記第２の抗体定常ドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む、項目３４～３７のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目３９）
前記第２の抗体定常ドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目３４～３８のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４０）
前記第２の抗体定常ドメインが、前記ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択される１つ以上の位置で異なる、項目３９に記載のタンパク質。
（項目４１）
以下を含むタンパク質であって：
（ａ） 腫瘍関連抗原と結合する第１の抗原結合部位と；
（ｂ） 前記第１の抗原結合部位と同じ腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部位と；
（ｃ） ＮＫＧ２Ｄと結合する第３の抗原結合部位と；
（ｄ） ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体定常領域もしくはその一部、またはＣＤ１６
に結合する第４の抗原結合部位と、を含む前記タンパク質。
（項目４２）
前記第１の抗原結合部位が、ｓｃＦｖまたはＦａｂを含む、項目４１に記載のタンパク質。
（項目４３）
前記第２の抗原結合部位がｓｃＦｖまたはＦａｂを含む、項目４１または４２に記載のタンパク質。
（項目４４）
前記第３の抗原結合部位がｓｃＦｖまたはＦａｂを含む、項目４１～４３のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４５）
前記腫瘍関連抗原が、ＡＮＯ１、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＣＲ４、ＣＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＬＡＵＤＩＮ－１８．２、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＧＤ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＭＡ、メソセリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＯＰ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、５Ｔ４、ＧＰＮＭＢ、ＦＲ－アルファ、ＰＡＰＰ－Ａ、ＦＬＴ３、ＧＰＣ３、ＣＸＣＲ４、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ１、ＶＬＡ４、ＣＤ４４、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ４７、ＣＬＬ１、ＣＤ８１、ＣＤ２３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＲＬＦ２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ１３８、ＣＡ１２５、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＳＬＣ４４Ａ４、ＣＡ１９－９、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４、ＬＩＬＲＢ５、ＬＩＬＲＡ１、ＬＩＬＲＡ２、ＬＩＬＲＡ３、ＬＩＬＲＡ４、ＬＩＬＲＡ５、及びＬＩＬＲＡ６、ＣＣＲ８、ＣＤ７、ＣＴＬＡ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＥＮＴＰＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＩＬ－１Ｒ２、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＧＥＭ、ＮＴ５Ｅ、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＭＵＣ１、Ｐ－カドヘリン、プレキシン－Ａ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤＣＰ１、ＰＴＫ７、Ａｘｌ、ｅｒｂＢ－３、ＥＤＮＲＢ、Ｔｙｒｐ１、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＳＦ３Ｒ、Ｓｉｇｌｅｃ－９、ＩＴＧＡＭ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＣＣＲ１、ＬＲＲＣ２５、ＰＴＡＦＲ、ＳＩＲＰＢ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＣＤ３００ＬＢ、ＡＴＰ１Ａ３、ＣＣＲ５、ＭＵＣ１（またはＭＵＣ１－Ｃ）、プレキシン－Ａ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＳＴＥＲＡＰ１、ＣＤＣＰ１、ＰＴＫ７、ＡＸＬ、ＥＤＮＲＢ、ＯＬＲ１、及びＴＹＲＰ１からなる群より選択される、項目４１～４４のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４６）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号９４、配列番号１、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７８、配列番号８６、配列番号１０２、配列番号３２２、配列番号３２５、配列番号３２８、配列番号３３１、配列番号３３４、及び配列番号３３７から選択される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、項目４１～４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目４７）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号９４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目４８）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号３２２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目４９）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号３２５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目５０）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号３２８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目５１）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号３３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目５２）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号３３４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目５３）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号３３７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目５４）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号４４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号４８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目５５）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号５２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号５６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目５６）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号６０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号６１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目５７）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号６２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目５８）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号７４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目５９）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号７８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号８２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目６０）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目６１）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号１０２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１０６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４６に記載のタンパク質。
（項目６２）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号１１０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４１～４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目６３）
前記第３の抗原結合部位が、配列番号１１２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１１３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目４１～４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目６４）
ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域またはその部分が、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む、項目４１～６３のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目６５）
ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体定常領域またはその部分が、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目６４に記載のタンパク質。
（項目６６）
ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体定常領域またはその部分が、前記ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択される１つ以上の位置で異なる、項目６５に記載のタンパク質。
（項目６７）
以下を含むタンパク質であって：
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位と、
（ｂ）抗原結合Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）フラグメントと、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域もしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する追加の抗原結合部位と、を含む前記タンパク質。
（項目６８）
前記抗原結合部位がＦａｂフラグメントであり、かつ前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）フラグメントである、項目６７に記載のタンパク質。
（項目６９）
前記ｓｃＴＣＲフラグメントが、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して前記抗体定常領域のポリペプチド鎖に連結されている、項目６８に記載のタンパク質。
（項目７０）
前記抗原結合部位がｓｃＦｖであり、かつ前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが細胞外ＴＣＲフラグメントである、項目６７に記載のタンパク質。
（項目７１）
前記ｓｃＦｖが、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して前記抗体定常領域のポリペプチド鎖に連結されている、項目７０に記載のタンパク質。
（項目７２）
前記ヒンジがアミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む、項目６９または７１に記載のタンパク質。
（項目７３）
前記抗原結合部位がＦａｂフラグメントであり、かつ前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが細胞外ＴＣＲフラグメントである、項目６７に記載のタンパク質。
（項目７４）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントと同じ抗原に結合する追加の抗原結合ＴＣＲフラグメントをさらに含む、項目６７に記載のタンパク質。
（項目７５）
前記抗原結合部位がｓｃＦｖであり、かつ前記抗原結合ＴＣＲフラグメント及び前記追加の抗原結合ＴＣＲフラグメントが細胞外ＴＣＲフラグメントである、項目７４に記載のタンパク質。
（項目７６）
前記抗原結合部位がｓｃＦｖであり、かつ前記抗原結合ＴＣＲフラグメント及び前記追加の抗原結合ＴＣＲフラグメントがｓｃＴＣＲフラグメントである、項目７４に記載のタンパク質。
（項目７７）
前記ｓｃＦｖが、可塑性リンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結された重鎖可変ドメインを含む、項目７０～７２及び７５～７６のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目７８）
前記可塑性リンカーが（Ｇ４Ｓ）４を含む、項目７７に記載のタンパク質。
（項目７９）
前記ｓｃＦｖが、軽鎖可変ドメインの前記Ｎ末端または前記Ｃ末端に位置する重鎖可変ドメインを含む、項目７０～７２及び７５～７８のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目８０）
前記抗原結合部位が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、項目６７～７９のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目８１）
前記ジスルフィド架橋が、Ｋａｂａｔ番号付けの下で定義される位置で、前記重鎖可変ドメインの位置４４のＣｙｓと前記軽鎖可変ドメインの位置１００のＣｙｓとの間に形成される、項目８０に記載のタンパク質。
（項目８２）
前記抗原結合部位がヒトのＮＫＧ２Ｄに結合する、項目６７～８１のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目８３）
前記抗原結合部位が、配列番号９４、配列番号１、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７８、配列番号８６、配列番号１０２、配列番号３２２、配列番号３２５、配列番号３２８、配列番号３３１、配列番号３３４、及び配列番号３３７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメインを含む、項目６７～８２のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目８４）
前記抗原結合部位が、配列番号９４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目８５）
前記抗原結合部位が、配列番号３２２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目８６）
前記抗原結合部位が、配列番号３２５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目８７）
前記抗原結合部位が、配列番号３２８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目８８）
前記抗原結合部位が、配列番号３３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目８９）
前記抗原結合部位が、配列番号３３４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目９０）
前記抗原結合部位が、配列番号３３７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目９１）
前記抗原結合部位が、配列番号４４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号４８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目９２）
前記抗原結合部位が、配列番号５２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号５６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目９３）
前記抗原結合部位が、配列番号６０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号６１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目９４）
前記抗原結合部位が、配列番号６２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目９５）
前記抗原結合部位が、配列番号７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号７４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目９６）
前記抗原結合部位が、配列番号７８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号８２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目９７）
前記抗原結合部位が、配列番号８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目９８）
前記抗原結合部位が、配列番号１０２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１０６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目８３に記載のタンパク質。
（項目９９）
前記抗原結合部位が、配列番号１１０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目６７～８２のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１００）
前記抗原結合部位が、配列番号１１２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１１３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、項目６７～８２のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１０１）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示される腫瘍関連抗原由来のペプチドに結合する、項目６７～１００のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１０２）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：４８によって提示される配列番号４２５のアミノ酸配列を有するＥＬＡＶＬ４ペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号３５１と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメイン、及び配列番号３５２と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１０３）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：４８によって提示される配列番号４２６のアミノ酸配列を有するインスリンペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号３５７と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号３５８と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１０４）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：４８によって提示される配列番号３４０のアミノ酸配列を有するＴＥＲＴペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号３６３と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号３６４と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１０５）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ＊０２によって提示される配列番号３４１のアミノ酸配列を有するＥＲＢＢ２ペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号４３０と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号４３１と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１０６）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ＊０２によって提示される配列番号３４２のアミノ酸配列を有するＷＴ１ペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号４３４と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号４３５と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１０７）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ＊０２によって提示される配列番号３４２のアミノ酸配列を有するＷＴ１ペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号４３８と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号４３９と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１０８）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ１によって提示される配列番号３４３のアミノ酸配列を有するＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号３７５と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号３７６と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１０９）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４４のアミノ酸配列を有するＭＡＲＴ１ペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号３８１と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号３８２と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１１０）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４６のアミノ酸配列を有するＢＩＲＣ５ペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号４４２と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号４４３と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１１１）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４６のアミノ酸配列を有するＢＩＲＣ５ペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号４４４と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号４４５と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１１２）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４７のアミノ酸配列を有するＰＲＡＭＥペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号３９５と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号３９６と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１１３）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４７のアミノ酸配列を有するＰＲＡＭＥペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号４０１と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号４０２と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１１４）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４７のアミノ酸配列を有するＰＲＡＭＥペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号４０７と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号４０８と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１１５）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４８のアミノ酸配列を有するＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号４１３と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号４１４と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１１６）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４８のアミノ酸配列を有するＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号４１８と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号４１４と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１１７）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４８のアミノ酸配列を有するＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドに結合し、前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、配列番号４２１と少なくとも９０％同一であるアルファ鎖可変ドメインと、配列番号４２２と少なくとも９０％同一であるベータ鎖可変ドメインとを含む、項目１０１に記載のタンパク質。
（項目１１８）
前記抗原結合ＴＣＲフラグメントが、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４５のアミノ酸配列を有するＳＳＸ２ペプチドに結合する、項目１０１に記載のタンパク質。（項目１１９）
ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体定常領域またはその部分が、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む、項目６７～１１８のいずれか１項に記載のタンパク質。
（項目１２０）
ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体定常領域またはその部分が、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１１９に記載のタンパク質。
（項目１２１）
ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体定常領域またはその部分が、前記ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択される１つ以上の位置で異なる、項目１２０に記載のタンパク質。
（項目１２２）
項目３３～１２１のいずれか１項によるタンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、製剤。
（項目１２３）
項目３３～１２１のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む細胞。
（項目１２４）
腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を項目３３～１２１のいずれか１項に記載のタンパク質に曝すことを含む、方法。
（項目１２５）
項目３３～１２１のいずれか１項に記載のタンパク質または項目１２２に記載の製剤を患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
（項目１２６）
前記がんが、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、乳癌、大腸癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃癌、消化管癌、消化管間質性腫瘍、膠芽腫、頭頸部癌、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、腎細胞癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、及び膵臓癌、前立腺癌、肉腫、小細胞肺癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、骨髄由来のサプレッサー細胞によって浸潤されたがん、細胞外マトリックス沈着を伴うがん、高レベルの反応性間質を伴うがん、及び血管新生を伴うがんからなる群より選択される、項目１２５に記載の方法。
Ａ～Ｃは、ヒンジを介して抗体定常領域／ドメインに連結されたｓｃＦｖを含む多重特異性結合タンパク質の３つの例示的なフォーマットを示す。Ａは、腫瘍を標的とするｓｃＦｖまたは一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）フラグメント、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂ、及びＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）を含む三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を表す。この抗体フォーマットは、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ標的化ｓｃＦｖ、腫瘍標的化Ｆａｂまたは細胞外ＴＣＲフラグメント、及びヘテロ二量体化抗体定常領域を含む抗体を表す。この抗体フォーマットは、本明細書ではＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。Ｃは、ＮＫＧ２Ｄを標的とするｓｃＦｖ、腫瘍を標的とするｓｃＦｖまたはｓｃＴＣＲフラグメント、及びヘテロ二量体化された抗体定常領域を含む抗体を表す。特定の例示的なＴｒｉＮＫＥＴにおいて、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位に連結されたＣＤドメイン上のヘテロ二量体化変異には、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗが含まれる。反対側のＣＤ上のヘテロ二量体化変異には、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔが含まれる。 第１の抗原結合部位または抗原結合ＴＣＲフラグメントが腫瘍関連抗原（ここに示されるＢＣＭＡなど）または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示されるそのペプチドに結合する三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を示す。第２の抗原結合部位は、ＮＫＧ２Ｄに結合する。ヘテロ二量体化された抗体定常領域はＣＤ１６に結合する。特定の例示的なＴｒｉＮＫＥＴにおいて、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位に連結されたＣＤドメイン上のヘテロ二量体化変異には、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗが含まれる。反対側のＣＤ上のヘテロ二量体化変異には、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔが含まれる。 第１の抗原結合部位及び第２の抗原結合部位、または第１の抗原結合ＴＣＲフラグメント及び第２の抗原結合ＴＣＲフラグメントが、同じ腫瘍関連抗原（ここに示されているＢＣＭＡなど）または同じＭＨＣによって提示された腫瘍関連抗原由来の同じペプチドに結合する三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を示す。第３の抗原結合部位はＮＫＧ２Ｄに結合する。そして、ヘテロ二量体化された抗体定常領域はＣＤ１６に結合する。これらの抗体フォーマットは、本明細書ではＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。特定の例示的なＴｒｉＮＫＥＴにおいて、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位に連結されたＣＤドメイン上のヘテロ二量体化変異には、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗが含まれる。反対側のＣＤ上のヘテロ二量体化変異には、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔが含まれる。Ｂは、Ｆａｂフォーマットの最初の２つの抗原結合部位を示している。 第１の抗原結合部位及び第２の抗原結合部位、または第１の抗原結合ＴＣＲフラグメント及び第２の抗原結合ＴＣＲフラグメントが、同じ腫瘍関連抗原（ここに示されているＢＣＭＡなど）または同じＭＨＣによって提示された腫瘍関連抗原由来の同じペプチドに結合する三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を示す。第３の抗原結合部位はＮＫＧ２Ｄに結合する。そして、ヘテロ二量体化された抗体定常領域はＣＤ１６に結合する。これらの抗体フォーマットは、本明細書ではＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。特定の例示的なＴｒｉＮＫＥＴにおいて、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位に連結されたＣＤドメイン上のヘテロ二量体化変異には、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗが含まれる。反対側のＣＤ上のヘテロ二量体化変異には、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔが含まれる。Ｃは、ｓｃＦｖフォーマットの最初の２つの抗原結合部位を示している。 ３７℃で実施された加速安定性研究の結果を示しており、この研究では、Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴが４週間にわたって安定していることが判明した。 ３７℃で実施された加速安定性研究の結果を示しており、この研究では、Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴが４週間にわたって安定していることが判明した。 ３７℃で実施された加速安定性研究の結果を示しており、この研究では、Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴが４週間にわたって安定していることが判明した。 精製されたＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴが低ｐＨ保持の間、安定していたことを示している。 Ａ及びＢは、精製されたＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴが、ｐＨに関係なく、５サイクルの冷凍解凍後に安定であったことを示す（Ａは、ＰＢＳでの冷凍解凍サイクルを示し、図５Ｂは、ｐＨ５．５でのクエン酸塩での冷凍解凍サイクルを示す）。 Ｆ３’－ＴｒｉｎＫＥＴが安定したままであった強制分解条件の棒グラフを示している。 ＨＥＲ２＋Ｃｏｌｏ－２０１細胞へのＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＨＥＲ２またはトラスツズマブの結合を示している。 Ｍｏｌｍ－１３細胞上で発現されたＣＤ３３へのＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＣＤ３３またはＣＤ３３モノクローナル抗体の結合を示している。 ＨＥＲ２低細胞株７８６－Ｏに対するＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＨＥＲ２媒介細胞毒性を示している。 ＨＥＲ２高細胞株ＳｋＢｒ－３に対するＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＨＥＲ２媒介細胞毒性を示している。 ２つのＣＤ３３陽性ヒト細胞株、ＥＯＬ－１に対するＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＣＤ３３媒介細胞毒性を示している。 ２つのＣＤ３３陽性ヒト細胞株、ＴＨＰ－１に対するＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＣＤ３３媒介細胞毒性を示している。 ＦｃγＲＩａに結合するＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＨＥＲ２がハーセプチンに類似していることを示している。 ＦｃγＲＩＩａに結合するＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＨＥＲ２がハーセプチンに類似していることを示している。 ＦｃγＲＩＩＩａ １５８Ｖに結合するＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＨＥＲ２がハーセプチンに類似していることを示している。 ＡはＨＥＲ２結合剤がｓｃＦｖであるＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＨＥＲ２が、ヒトＨＥＲ２に結合することは、ＨＥＲ２結合剤がＦａｂであるハーセプチンに類似していることを示している。ＢはＣＤ３３結合剤がｓｃＦｖであるＦ３’ＴｒｉｎＫＥＴ－ＣＤ３３が、ヒトＣＤ３３に結合することは、ＣＤ３３結合剤がＦａｂであるＣＤ３３モノクローナル抗体に類似していることを示す。 ＡはＨＥＲ２結合剤がｓｃＦｖであるＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＨＥＲ２が、ヒトＨＥＲ２に結合することは、ＨＥＲ２結合剤がＦａｂであるハーセプチンに類似していることを示している。ＢはＣＤ３３結合剤がｓｃＦｖであるＦ３’ＴｒｉｎＫＥＴ－ＣＤ３３が、ヒトＣＤ３３に結合することは、ＣＤ３３結合剤がＦａｂであるＣＤ３３モノクローナル抗体に類似していることを示す。 Ｆ３－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＢＣＭＡの２段階精製が９９％の純度を達成することを示している。 Ｆ３－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＤ３３による高い力価を有するＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ３３標的の同時係合を示している。 Ｆ３－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＢＣＭＡによる高い力価を有するＮＫＧ２Ｄ及びＢＣＭＡ標的の同時係合を示している。 Ｆ３－ＴｒｉＮＫＥＴフォーマットが少なくとも１４日間まで安定していることを示している。 Ｆ３－ＴｒｉＮＫＥＴフォーマットが低ｐＨ保持後に安定していることを示している。 Ｆ３－ＴｒｉＮＫＥＴフォーマットが、少なくとも５サイクルまでの冷凍解凍後に安定していることを示している。 異なるＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを有するＢＣＭＡ標的化Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴが、ＫＭＳ１２－ＰＥ骨髄腫細胞のヒトＮＫ細胞溶解を増強することを示す折れ線グラフである。 異なるＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを有するＢＣＭＡ標的化Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴが、ＭＭ．１Ｒ骨髄腫細胞のヒトＮＫ細胞溶解を増強することを示す折れ線グラフである。 ＭＭ．１Ｒ骨髄腫細胞へのＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴ、デュオボディ－ＴｒｉＮＫＥＴ、及びＢＣＭＡモノクローナル抗体の結合を示す折れ線グラフである。 ＦＡＣＳが、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴとのインキュベーションが、経時的に表面ＢＣＭＡ発現を増大させることを示している。 Ｆ４－ＴｒｉｎＫＥＴが表面ＢＣＭＡを安定化することを示す折れ線グラフである。 Ａ４９結合剤を用いたＢＣＭＡ標的化Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴが、デュオボディ－ＴｒｉＮＫＥＴよりも３０時間にわたって異なる濃度でＫＭＳ１２－ＰＥ骨髄腫細胞のより強力な殺滅を媒介することを示す棒グラフである。 Ａ４９結合剤を用いたＢＣＭＡ標的化Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴが、デュオボディ－ＴｒｉＮＫＥＴよりも３０時間にわたって異なる濃度でＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞のより強力な殺滅を媒介することを示す棒グラフである。
本発明は、ヒンジ配列を介して抗体定常ドメインに連結されている一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の改善を提供する。このヒンジ配列は、抗原に結合するｓｃＦｖの可塑性を提供する。本発明はまた、１つ以上のｓｃＦｖを含む多重特異性結合タンパク質を提供し、ここで、この多重特異性結合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびに腫瘍関連抗原に結合する。本発明はまた、同じ腫瘍関連抗原に結合する２つの腫瘍関連抗原結合部位を含み、かつナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体に結合する、多重特異性結合タンパク質も提供する。そのような多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにがんの治療などの目的のための、そのような多重特異性結合タンパク質及び医薬組成物を使用する治療方法も提供される。本発明の様々な態様を以下のセクションにおいて記載するが、１つの特定のセクションに記載された本発明の態様は、任意の特定のセクションに限定されるものではない。
本発明の理解を容易にするために、多数の用語及び語句を以下に定義する。
本明細書で使用される用語「ある、１つの（ａ）」及び「ある、１つの（ａｎ）」は、文脈が不適切でない限り、「１つ以上」を意味し、複数を含む。
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書に記載の方法及び組成物によって治療される生物体を指す。そのような生物体としては好ましくは、哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれるがこれらに限定されず、より好ましくは、ヒトが含まれる。
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）及び軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に相違するストレッチは、「超可変領域」と称され、これは「フレームワーク領域」、または「ＦＲ」として知られているより保存された隣接のストレッチの間に挟まれている。よって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンにおける超可変領域の間にそれらに隣接して天然に見られるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間で互いに相対的に配置されて抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に対して相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」、または「ＣＤＲ」と称される。ラクダ及び軟骨魚類などの所定の動物では、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクトな抗体において、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合フラグメントにおいて、またはｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドにおいて、単一ポリペプチド中で重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに連結するためのペプチドリンカーを使用して、存在し得る。
本明細書で使用される場合、「抗原結合Ｔ細胞受容体フラグメント」及び「抗原結合ＴＣＲフラグメント」という用語は、交換可能に使用され、同族抗原に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部を指す。ヒトαβＴＣＲでは、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、アルファ鎖可変ドメイン（Ｖα）及びベータ鎖可変ドメイン（Ｖβ）を含み、それぞれが３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲ３α及びＣＤＲ３βという名前の超可変ループは、抗原ペプチドを結合するための中心的な位置を占める。生殖細胞系列にコードされたＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ１β、及びＣＤＲ２βループは、抗原ペプチドを提示するＭＨＣと最も接触する。ヒトγδＴＣＲでは、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ガンマ鎖可変ドメイン（Ｖγ）及びデルタ鎖可変ドメイン（Ｖδ）を含み、それぞれが３つのＣＤＲを含む。ヒトγδＴＣＲは、ＭＨＣ又はＭＨＣ関連分子（例えば、ＣＤ１、内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、またはＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ））によって提示された抗原（例えば、ペプチドまたは脂質）を認識する。Ｆ１－ＡＴＰａｓｅなどの他のタンパク質もγδＴＣＲに抗原を提示し得ることが理解されている。抗原結合ＴＣＲフラグメントは、インタクトなＴＣＲに、ジスルフィド結合によって連結されたＴＣＲ鎖を有する操作されたＴＣＲに、抗原結合表面を保持するインタクトであるか、もしくは操作されたＴＣＲの抗原結合フラグメントに、または単一のポリペプチド内のペプチドリンカーによって接続されたＴＣＲの可変ドメイン（例えば、Ｖα及びＶβ）を有する組換えポリペプチドに存在し得る。抗原結合ＴＣＲフラグメントの非限定的な例としては、可変ドメイン（例えば、Ｖα及びＶβ）及び定常ドメイン（例えば、Ｃα及びＣβ）を含むが、ＴＣＲの接続領域、膜貫通領域、及び細胞質領域を欠く、本明細書で「細胞外ＴＣＲフラグメント」と呼ばれる，ＴＣＲフラグメント、ならびに本明細書で「一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）フラグメント」と呼ばれる、ペプチドリンカーによって接続されたＴＣＲの可変領域（例えば、Ｖα及びＶβ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量の化合物（例えば、本発明の化合物）を指す。有効量とは、１回以上の投与、適用または投薬量で投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されるものであるとは意図されていない。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、任意の効果、例えば、病態、疾患、障害などの改善をもたらす、軽減、減少、調節、改良もしくは除去、またはそれらの症状の改良を含む。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性剤と不活性または活性の担体との組み合わせであって、組成物をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断的または治療的使用に特に好適なものとするものを指す。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョンなど）、及び様々な種類の湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤及び防腐剤を含み得る。担体、安定剤及びアジュバントの例については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ［１９７５］を参照されたい。
本明細書を通して、組成物が、特定の成分を有するか、含むか、もしくはそれらから構成されるものとして記載されている場合、またはプロセス及び方法が、特定の工程を有するか、含むか、もしくはそれらから構成されるものとして記載されている場合、追加的に、記述された成分から本質的になるか、またはそれらからなる本発明の化合物があること、及び記述された処理工程から本質的になるか、またはそれらからなる本発明によるプロセス及び方法があることが企図されている。
一般事項として、パーセンテージを明記している組成物は、別段に明記しない限り、重量による。さらに、可変要素に定義が伴っていないのであれば、その可変要素の以前の定義が優先する。
Ｉ．タンパク質
本発明は、ヒンジ配列を介して抗体定常ドメインに連結されている一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の改良を提供する。いくつかの実施形態では、このヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－Ｓｅｒを含む。いくつかの他の実施形態では、このヒンジは、アミノ酸Ａｌａ－Ｓｅｒ及びＴｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙを含む。このｓｃＦｖは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、このｓｃＦｖは、ＮＫＧ２Ｄまたは腫瘍関連抗原に結合する。ヒンジ配列は、標的抗原に結合するｓｃＦｖの可塑性を提供する。
ｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成して、ｓｃＦｖの安定性を増強する。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と軽鎖可変ドメインのＣ１００残基との間に形成され得る。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、可塑性リンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結されている。任意の適切なリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）４リンカーを使用してもよい。ｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＮ末端に配置されている。ｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインのＣ末端に配置されている。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖに連結された抗体定常ドメインは、ＣＤ１６に結合する任意の種の抗体の定常領域に由来し得る。いくつかの実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。いくつかの他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物に由来する抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、抗体定常領域は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及び任意選択でＣＨ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及び任意選択でＣＨ１ドメインを含む抗体定常領域は、ヒトＩｇＧ１抗体に由来する。いくつかの実施形態では、抗体定常領域は、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６の結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用は、主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５～Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７～Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７～Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４～Ｓｅｒ２３９、及びＣＨ２ドメイン内の炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに焦点が当てられている（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４０６（６７９３）：２６７－２７３を参照されたい）。公知のドメインに基づいて、変異は、ファージ提示ライブラリーもしくは酵母表面提示ｃＤＮＡライブラリーなどを使用することによってＣＤ１６に対する結合親和性を増進または低減するように選択されてもよいし、または相互作用の公知の三次元構造に基づいて設計され得る。
いくつかの実施形態では、抗体定常ドメインは、ＩｇＧ抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、変異を抗体定常ドメインに導入して、別の抗体定常ドメインとのヘテロ二量体化を可能にする。例えば、抗体定常ドメインがヒトＩｇＧ１の定常ドメインに由来する場合、その抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得、かつＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群より選択された１つ以上の位置で異なる。いくつかの実施形態では、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得、かつＱ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅからなる群より選択される１つ以上の置換によって異なる。
以下に列挙されているのは、２つのポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を可能にする変異も含む抗体定常領域に連結されたｓｃＦｖの例である。例として、トラスツズマブの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むｓｃＦｖを使用する。各配列は、ヘテロ二量体化変異を含むＶＬ－（Ｇ４Ｓ）４－ＶＨ－ヒンジ（ＡＳ）－Ｆｃを表す（下線付き）。ＶＬ及びＶＨには、４４ＶＨ－１００ＶＬ ＳＳ架橋（下線付き）が含まれており、任意の腫瘍標的化抗体またはＮＫＧ２Ｄ結合抗体に由来し得る。Ａｌａ－Ｓｅｒ（ＡＳ、下線付き）は、可塑性と最適な形状とのバランスをとるために、エルボーヒンジ領域の配列に含まれている。所定の実施形態では、追加の配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙは、ヒンジでＡＳ配列に追加され得る。（Ｇ４Ｓ）４リンカーは、以下の段落に列挙されている配列で下線が引かれている。
トラスツズマブ－ｓｃＦｖ－ＦｃＡ１及びトラスツズマブ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｂ１は、優先的に対になり、ヘテロダイマーを形成する。トラスツズマブ－ｓｃＦｖ－ＦｃＡ２及びトラスツズマブ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｂ２は、優先的に対になり、ヘテロダイマーを形成し得る。
トラスツズマブ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ａ１
（配列番号３０３）
トラスツズマブ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｂ１
（配列番号３０４）
トラスツズマブ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ａ２
（配列番号３０５）
トラスツズマブ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ Ｂ２
（配列番号３０６）
別の態様では、本発明は、上記の抗体定常領域に連結されたｓｃＦｖを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、このタンパク質は、抗体定常ドメインに連結されたｓｃＦｖを含む第１の抗原結合部位、ＦａｂまたはｓｃＦｖフォーマットをとり得る第２の抗原結合部位、及び第２の抗原結合部位に連結された第２の抗体定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、このタンパク質は多重特異性であり、第１の抗原結合部位はＮＫＧ２Ｄに結合し、Ｆａｂの形態の第２の抗原結合部位は腫瘍関連抗原に結合し、そして抗体定常領域は、ＣＤ１６に結合する（図１Ｂに示すように、本明細書でＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる）。いくつかの他の実施形態では、タンパク質は多重特異性であり、ここで第１の抗原結合部位は腫瘍関連抗原に結合し、第２の抗原結合部位はＦａｂの形態でＮＫＧ２Ｄに結合し、抗体定常領域はＣＤ１６に結合する（図１Ａに示すように、本明細書でＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる）。ｓｃＦｖに連結された抗体定常領域は、本明細書に記載のタンパク質の第２の抗原結合部位の抗体定常領域とヘテロ二量体化する。本明細書に記載のｓｃＦｖを含む多重特異性結合タンパク質は、図１Ａ～図１Ｃに示すように様々なフォーマットをとり得る。
多重特異性結合タンパク質は、ＮＫ細胞、γδ Ｔ細胞及びＣＤ８＋αβ Ｔ細胞を含み得るがこれらに限定されないＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合し得る。ＮＫＧ２Ｄ結合時に、多重特異性結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６及びＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化することを阻止し得る。
多重特異性結合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、及び濾胞樹状細胞を含む白血球の表面上のＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。
ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびにがん細胞上の腫瘍関連抗原に対する結合の際、多重特異性結合タンパク質のタンパク質は、複数の種類のＮＫ活性化受容体と結合し得、ナチュラルリガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合をブロックし得る。所定の実施形態では、このタンパク質は、ヒトのＮＫ細胞を作動し得る。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、ヒトにおいて、ならびにげっ歯類及びカニクイザルなどの他の種において、ＮＫ細胞を作動し得る。
本発明の所定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、腫瘍関連抗原に結合する第１の抗原結合部位と、第１の抗原結合部位と同じ腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部位と、ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域もしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第４の抗原結合部位を含む。抗原結合部位のいずれか１つは、ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかの形態をとり得る。例示的なフォーマットが図２Ｂ～図２Ｃに示されている。ｓｃＦｖのＶＨ－ＶＬ及びＶＬ－ＶＨ配向の両方が、本開示の実施形態である。
所定の実施形態では、同じ腫瘍関連抗原に結合する第１の抗原結合部位または第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位は、ｓｃＦｖである。所定の実施形態では、同じ腫瘍関連抗原に結合する第１の抗原結合部位及び第２の抗原結合部位は、それぞれｓｃＦｖであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位はｓｃＦｖである。所定の実施形態では、同じ腫瘍関連抗原に結合する第１の抗原結合部位または第２の抗原結合部位はＦａｂであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位はｓｃＦｖである。所定の実施形態では、同じ腫瘍関連抗原に結合する第１の抗原結合部位及び第２の抗原結合部位はそれぞれＦａｂであり、かつＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位はｓｃＦｖである。所定の実施形態では、本開示のＦ４－ＴｒｉｎＫＥＴの第１の抗原結合部位及び第２の抗原結合部位は、同一のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、本明細書に開示の多重特異性結合タンパク質は、腫瘍関連抗原に結合する第１の抗原結合部位と、異なる抗原に結合する第２の抗原結合部位と、ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域もしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第４の抗原結合部位とを含む。抗原結合部位のいずれか１つは、ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかの形をとり得る（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ配向のいずれかで）。所定の実施形態では、２つの異なる抗原に結合する第１の抗原結合部位または第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位は、ｓｃＦｖである。所定の実施形態では、２つの異なる抗原に結合する第１の抗原結合部位及び第２の抗原結合部位はそれぞれｓｃＦｖであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位はｓｃＦｖである。所定の実施形態では、２つの異なる抗原に結合する第１の抗原結合部位または第２の抗原結合部位はＦａｂであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位はｓｃＦｖである。所定の実施形態では、２つの異なる抗原に結合する第１の抗原結合部位及び第２の抗原結合部位はそれぞれＦａｂであり、ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位はｓｃＦｖである。
所定の実施形態では、本明細書で提供される多重特異性結合タンパク質（本明細書ではＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる）は、腫瘍関連抗原の二価係合を提供し、それにより、がん細胞表面上の腫瘍関連抗原を安定化及び維持し、ＮＫ細胞によるがん細胞に対する細胞毒性を増強する。いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質による腫瘍関連抗原の二価係合は、がん細胞への多重特異性結合タンパク質のより高い結合力を付与し、それにより、ＮＫ細胞からがん細胞へ、特に低レベルの腫瘍関連抗原を発現するがん細胞へのより強い細胞毒性応答を促進する。
本発明はまた、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位、（ｂ）抗原結合ＴＣＲフラグメント、及び（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域もしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する追加の抗原結合部位を含む多重特異性結合タンパク質も提供する。所定の実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＭＨＣによって提示される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のペプチド、例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）によって提示されるヒト腫瘍関連抗原由来のペプチドに結合する。エレメント（ｂ）は、細胞外ＴＣＲフラグメントまたはｓｃＴＣＲフラグメントなどの様々なフォーマット（例えば、可溶性フォーマット）で存在し得る。エレメント（ａ）及び（ｃ）は、様々なフォーマットで存在してもよく、及び／または上記に開示される様々な突然変異を含んでもよい。例えば、所定の実施形態では、エレメント（ｃ）は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域またはその一部であり、この抗体定常領域またはその一部は、（ｉ）ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位に連結された第１の抗体定常ドメイン、及び（ｉｉ）抗原結合ＴＣＲフラグメントに連結された第２の抗体定常ドメインを含んでおり、ここで、この第１及び第２の抗体定常ドメインはヘテロ二量体化し得る。
所定の実施形態では、抗原結合部位はＦａｂフラグメントであり、抗原結合ＴＣＲフラグメントはｓｃＴＣＲフラグメントである。そのＮＫＧ２Ｄ結合部分がＦａｂであり、そのＴＡＡ結合部分が一本鎖のペプチドリンカーによって連結された可変ドメインを含むとすると（抗体定常ドメインと連結されたｓｃＦｖを含む第１の抗原結合部位を含む多重特異性結合タンパク質；Ｆａｂの形態をとる第２の抗原結合部位；及び第２の抗原結合部位に連結された第２の抗体定常ドメイン（第１の抗原結合部位が腫瘍関連抗原に結合し、第２の抗原結合部位がＮＫＧ２Ｄに結合し、抗体定常領域はＣＤ１６に結合する）と同様に）、この多重特異性結合タンパク質のフォーマットは、図１Ａに示すように、本明細書ではＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴとも呼ばれる。
所定の実施形態では、抗原結合部位はｓｃＦｖであり、抗原結合ＴＣＲフラグメントは細胞外ＴＣＲフラグメントである。そのＮＫＧ２Ｄ結合部分がｓｃＦｖであり、そのＴＡＡ結合部分が可変ドメインと定常ドメインを含むとすると（抗体定常ドメインに結合したｓｃＦｖを含む第１の抗原結合部位を含む多重特異性結合タンパク質；Ｆａｂの形態をとる第２の抗原結合部位；ならびに第２の抗原結合部位に連結された第２の抗体定常ドメイン（第１の抗原結合部位がＮＫＧ２Ｄに結合し、第２の抗原結合部位が腫瘍関連抗原に結合し、及びこの抗体定常領域はＣＤ１６に結合する）と同様）、この多重特異性結合タンパク質のフォーマットは、図１Ｂに示すように、本明細書ではＦ３－ＴｒｉＮＫＥＴとも呼ばれる。
所定の実施形態では、この抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、この抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ｓｃＴＣＲフラグメントである。そのようなフォーマットが図１Ｃに示されている。所定の実施形態では、この抗原結合部位はＦａｂであり、この抗原結合ＴＣＲフラグメントは細胞外ＴＣＲフラグメントである。そのようなフォーマットが図２Ａに示されている。
所定の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原（例えば、ＭＨＣによって提示されるＴＡＡペプチド）に結合する第１の抗原結合ＴＣＲフラグメント；第１の抗原結合ＴＣＲフラグメントと同じ抗原に結合する第２の抗原結合ＴＣＲフラグメント；ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位；ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域もしくはその一部、またはＣＤ１６に結合する第４の抗原結合部位、を含む。あるいは、第１の抗原結合ＴＣＲフラグメント及び第２の抗原結合ＴＣＲフラグメントは、同じまたは異なるＭＨＣによって提示される２つの異なるＴＡＡペプチドに結合し得ると考えられる。この抗原結合部位のいずれか１つは、ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれの形態をとってもよい。第１及び第２の抗原結合ＴＣＲフラグメントは、細胞外ＴＣＲフラグメントまたはｓｃＴＣＲフラグメントのいずれの形態をとってもよい。抗原（例えば、ＭＨＣによって提示されるＴＡＡペプチド）の二価の係合を提供する例示的なフォーマットは、本明細書ではＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれ、図２Ｂ～図２Ｃに示されている。
所定の実施形態では、本開示のＦ４－ＴｒｉｎＫＥＴの第１の抗原結合ＴＣＲフラグメント及び第２の抗原結合ＴＣＲフラグメントは、同じＭＨＣによって提示される同じＴＡＡペプチドに結合する。所定の実施形態では、この第１の抗原結合ＴＣＲフラグメントまたは第２の抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ｓｃＦｖである。所定の実施形態では、この第１の抗原結合ＴＣＲフラグメント及び第２の抗原結合ＴＣＲフラグメントは、それぞれ、ｓｃＦｖである。所定の実施形態では、この第１の抗原結合ＴＣＲフラグメントまたは第２の抗原結合ＴＣＲフラグメントは、Ｆａｂである。所定の実施形態では、この第１の抗原結合ＴＣＲフラグメント及び第２の抗原結合ＴＣＲフラグメントは、それぞれＦａｂである。
ここに示す抗原結合性ＴＣＲフラグメントを有するＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴは、抗原（例えば、ＭＨＣによって提示されるＴＡＡペプチド）の二価の係合を提供し、それによりがん細胞の表面上のＴＡＡペプチドを安定化し、維持し、かつＮＫ細胞によるがん細胞に対する細胞傷害性を増強する。いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質によるＴＡＡペプチドの二価係合は、がん細胞への多重特異性結合タンパク質のより高い結合力を付与し、それにより、ＮＫ細胞からがん細胞、特に低レベルのＴＡＡペプチドを提示するがん細胞へのより強い細胞毒性応答を促進する。
本発明のタンパク質がｓｃＦｖを含む場合、ＶＨは、ＶＬのＣ末端またはＮ末端のいずれかに配置され得ることが理解される。同様に、本発明のタンパク質がｓｃＴＣＲフラグメントを含む場合、Ｖαは、ＶβのＣ末端またはＮ末端のいずれに配置されてもよい。
Ｆ３／Ｆ３’及びＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴに組み込み得るＮＫＧ２Ｄ結合部位及び腫瘍関連抗原結合部位または抗原結合ＴＣＲフラグメントの例示的な配列を本明細書に列挙する。
ＮＫＧ２Ｄ結合部位
表１は、ＮＫＧ２Ｄに組み合わさって結合し得る、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙している。別段示されない限り、表１に提供されるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔの下で決定されている。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、Ｆａｂフォーマットで配置される。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは一緒に融合され、ｓｃＦｖを形成する。
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄへの結合親和性が異なり得るが、それでも、それらは全てがヒトＮＫＧ２Ｄ及びＮＫ細胞を活性化する。
代替的に、配列番号１１０によって示される重鎖可変ドメインは、米国特許第９，２７３，１３６号に示されるように、ＮＫＧ２Ｄに結合し得る抗原結合部位を形成するために配列番号１１１によって示される軽鎖可変ドメインと対を形成し得る。
配列番号１１０
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS
配列番号１１１
QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL
代替的に、配列番号１１２に示される重鎖可変ドメインは、米国特許第７，８７９，９８５号に示されるように、ＮＫＧ２Ｄに結合し得る抗原結合部位を形成するために配列番号１１３に示される軽鎖可変ドメインと対を形成し得る。
配列番号１１２
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS
配列番号１１３
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
腫瘍関連抗原結合部位：
本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」とは、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない任意の抗原を意味する。そのような抗原は、悪性細胞上、または腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉間質、もしくは免疫浸潤物上などの腫瘍微小環境において発現され得る。例えば、腫瘍関連抗原としては、がん細胞で発現されるＡＮＯ１、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＣＲ４、ＣＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＬＡＵＤＩＮ－１８．２、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＧＤ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＭＡ、メソセリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＯＰ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、５Ｔ４、ＧＰＮＭＢ、ＦＲ－アルファ、ＰＡＰＰ－Ａ、ＦＬＴ３、ＧＰＣ３、ＣＸＣＲ４、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ１、ＶＬＡ４、ＣＤ４４、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ４７、ＣＬＬ１、ＣＤ８１、ＣＤ２３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＲＬＦ２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ１３８、ＣＡ１２５、ＮａＰｉ２ｂ、Ｎｅｃｔｉｎ４、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＳＬＣ４４Ａ４、ＣＡ１９－９、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４、ＬＩＬＲＢ５、ＬＩＬＲＡ１、ＬＩＬＲＡ２、ＬＩＬＲＡ３、ＬＩＬＲＡ４、ＬＩＬＲＡ５、及びＬＩＬＲＡ６、ＣＣＲ８、ＣＤ７、ＣＴＬＡ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＥＮＴＰＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＩＬ－１Ｒ２、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＧＥＭ、ＮＴ５Ｅ、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＭＵＣ１、Ｐ－カドヘリン、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤＣＰ１、ＰＴＫ７、Ａｘｌ、ｅｒｂＢ－３、ＥＤＮＲＢ、Ｔｙｒｐ１、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＳＦ３Ｒ、Ｓｉｇｌｅｃ－９、ＩＴＧＡＭ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＣＣＲ１、ＬＲＲＣ２５、ＰＴＡＦＲ、ＳＩＲＰＢ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＣＤ３００ＬＢ、ＡＴＰ１Ａ３、ＣＣＲ５、ＭＵＣ１（またはＭＵＣ１－Ｃ）、Ｐｌｅｘｉｎ－Ａ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤＣＰ１、ＰＴＫ７、ＡＸＬ、ＥＤＮＲＢ、ＯＬＲ１、及びＴＹＲＰ１が挙げられる。
腫瘍関連抗原結合部位は、任意の腫瘍関連抗原に結合するように開発され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原結合部位は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、これらは、対になって腫瘍関連抗原に結合し得る。いくつかの実施形態では、この重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、Ｆａｂフォーマットで配置される。いくつかの実施形態では、この重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは一緒に融合され、ｓｃＦｖを形成する。例示的な腫瘍関連抗原結合部位を以下に列挙する。
表２は、ＢＣＭＡに組み合わさって結合し得る重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙している。
あるいは、ＢＣＭＡ結合ドメインは、以下のＥＭ－８０１及びＥＭ－９０１に列挙されているように、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含んでもよい。
ＥＭ－８０１重鎖可変ドメイン（配列番号１５７）：
ＥＭ－８０１軽鎖可変ドメイン（配列番号１５８）：
ＥＭ－９０１重鎖可変ドメイン（配列番号１５９）
ＥＭ－９０１軽鎖可変ドメイン（配列番号１６０）
あるいは、ＢＣＭＡに結合し得る新規の抗原結合部位は、配列番号１５６によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定され得る。
配列番号１５６
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR
表３は、ＣＤ３３に組み合わさって結合し得る重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙している。ＣＤ３３結合ドメインは、ＣＤ３３への結合親和性が異なってもよい。
あるいは、ＣＤ３３に結合し得る新規の抗原結合部位は、配列番号２７３によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定され得る。
配列番号２７３
MPLLLLLPLLWAGALAMDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNFHGMNPSKDTSTEYSEVRTQ
表４は、ＨＥＲ２に組み合わさって結合し得る重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙している。
あるいは、ＨＥＲ２に結合し得る新規な抗原結合部位は、配列番号２９８によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定され得る。
MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV（配列番号２９８）。
抗原結合ＴＣＲフラグメントは、ＭＨＣによって提示される腫瘍関連抗原ペプチドに結合するように開発され得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ＴＣＲフラグメントは、アルファ鎖可変ドメイン及びベータ鎖可変ドメインを含み、これらは、ＭＨＣによって提示されるＴＡＡペプチドに結合するために対になり得る。いくつかの実施形態では、アルファ鎖可変ドメイン及びベータ鎖可変ドメインは、細胞外ＴＣＲフラグメントフォーマットで配置される。いくつかの実施形態では、アルファ鎖可変ドメイン及びベータ鎖可変ドメインは一緒に融合され、ｓｃＴＣＲフラグメントを形成する。
ＴＣＲ標的化可能なＴＡＡペプチドにプロセシングされ得るタンパク質の非限定的な例としては、組織分化抗原（例えば、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＣＤ１９、及びチロシナーゼ）、腫瘍生殖系列抗原（例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＢＡＧＥ１、ＧＡＧＥ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、ＸＡＧＥ－１Ｂ、及びＳＳＸ２）、がん細胞によって過剰発現される正常なタンパク質（例えば、ｈＴＥＲＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＷＴ１、ＭＵＣ１、及びメソテリン）、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＰＶ、ＥＢＶ、及びＭＣＣ）、及び腫瘍特異的に変異した抗原が挙げられる。例示的な腫瘍関連抗原結合部位を以下に列挙する。
表５には、ＴＣＲ標的のペプチド配列ならびに対応するＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖配列を列挙する。
抗体定常領域及びヘテロ二量体化
本発明に記載の抗体定常領域（Ｆｃドメイン）は、ＣＤ１６に結合する任意の種の抗体の定常領域に由来し得る。いくつかの実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。いくつかの他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物に由来する抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、抗体定常領域は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及び任意選択でＣＨ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及び任意選択でＣＨ１ドメインを含む抗体定常領域は、ヒトＩｇＧ１抗体に由来する。いくつかの実施形態では、抗体定常領域は、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６の結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用は、主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５～Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７～Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７～Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４～Ｓｅｒ２３９、及びＣＨ２ドメイン内の炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに焦点が当てられている（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４０６（６７９３）：２６７－２７３を参照されたい）。公知のドメインに基づいて、変異は、ファージ提示ライブラリーまたは酵母表面提示ｃＤＮＡライブラリーを使用することなどによって、ＣＤ１６に対する結合親和性を増進または低減するように選択されてもよいし、または相互作用の公知の三次元構造に基づいて設計されてもよい。
所定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、及び／またはＶ１７３にあり得る。所定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、及び／またはＴ１６４にあり得る。
ヘテロ二量体抗体重鎖のアセンブリは、同一細胞内で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成され得、これはヘテロ二量体のアセンブリだけでなく、各抗体重鎖のホモ二量体のアセンブリをもたらし得る。ヘテロ二量体の優先的なアセンブリを促進することは、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０、及びＵＳ１４／８３０３３６に示されるように、各抗体定常領域のＣＨ３ドメインにおいて異なる変異を組み込むことによって達成され得る。例えば、ヒトＩｇＧ１に基づいて、ならびに、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド内のアミノ酸置換の異なる対（これらの２つの鎖が、互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にする）を組み込んでＣＨ３ドメインに変異がなされ得る。以下に示されるアミノ酸置換の位置は全て、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従って番号付けされている。
１つのシナリオでは、第１のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、元のアミノ酸をアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるより大きなアミノ酸に置き換え、第２のポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸（複数可）をアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選ばれるより小さなアミノ酸（複数可）に置き換えることで、より大きなアミノ酸置換（突起）がより小さなアミノ酸置換（空洞）の表面にフィットする。例えば、一方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を組み込んでいてもよく、他方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込んでいてもよい。
ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及び／またはＫ４３９において１つ以上の変異が定常領域に組み込まれ得る。例示的な置換としては、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅが挙げられる。
代替的に、アミノ酸置換は、表６に示される以下の置換のセットから選択され得る。
代替的に、アミノ酸置換は、表７に示される以下の置換のセットから選択され得る。
代替的に、アミノ酸置換は、表８に示される以下の置換のセットから選択され得る。
代替的に、各ポリペプチド鎖における少なくとも１つのアミノ酸置換は、表９から選択され得る。
代替的に、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表１０における以下の置換のセットから選択され得、ここで、第１ポリペプチドの列に示される位置（複数可）は、任意の公知の負に荷電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）は、任意の既知の正に荷電したアミノ酸によって置き換えられる。
代替的に、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表１１における以下のセットから選択され得、ここで、第１ポリペプチドの列に示される位置（複数可）は、任意の既知の正に荷電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）は、任意の既知の負に荷電したアミノ酸によって置き換えられる。
代替的に、アミノ酸置換は、表１２に示される以下のセットから選択され得る。
代替的に、または加えて、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃを導入し、対向するポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入して、２つのポリペプチドの界面内に人工的なジスルフィド架橋を形成することによって、ヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性が増大され得る。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、位置Ｔ３６６でのＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８及びＹ４０７からなる群より選択される１つ以上の位置にあるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８及びＹ４０７からなる群より選択される１つ以上の位置において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６位のＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００及びＹ４０７からなる群より選択される１つ以上の位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＴ４１１からなる群より選択される１つ以上の位置において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００及びＹ４０７からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０、及びＫ４０９からなる群より選択される１つ以上の位置において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９及びＦ４０５からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９及びＦ４０５からなる群より選択される１つ以上の位置において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７及びＫ４０９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＫ４３９からなる群より選択される１つ以上の位置において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７及びＤ３９９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７及びＤ３９９からなる群より選択される１つ以上の位置において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＫ４３９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６及びＤ３９９からなる群より選択される１つ以上の位置において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２及びＫ４０９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２及びＫ４０９からなる群より選択される１つ以上の位置において、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６及びＤ３９９からなる群より選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、ここで抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、ここで抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体の定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗの置換により、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの置換により、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、ここで、抗体の定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗの置換によりＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、ここで、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗの置換により、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗの置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、ここで、抗体定常領域の他のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖの置換により、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
以下に列挙されているのは、２つのポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を可能にする定常領域の変異の例である。トラスツズマブ重鎖Ａ１、Ａ２、Ｂ１、及びＢ２にはそれぞれ、トラスツズマブの重鎖可変ドメイン（太字の配列）と、下線が引かれたアミノ酸に変異があるヒトＩｇＧ１に由来する定常領域が含まれている。トラスツズマブ重鎖Ａ１とトラスツズマブ重鎖Ｂ１とは、優先的に対になり、ヘテロダイマーを形成し得る。トラスツズマブ重鎖Ａ２とトラスツズマブ重鎖Ｂ２とは、優先的に対になってヘテロダイマーを形成し得る。
トラスツズマブ重鎖Ａ
（配列番号２９９）。
トラスツズマブ重鎖Ｂ
（配列番号３００）。
トラスツズマブ重鎖Ａ１
Figure 2024023438000049
 トラスツズマブ重鎖Ｂ１
Figure 2024023438000050
上述のタンパク質は、当業者に周知である組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、ｓｃＦｖ、ヒンジ及び抗体定常領域を含む第１の免疫グロブリン鎖をコードする第１の核酸配列は、第１の発現ベクターにクローニングされ得；例えば、別のｓｃＦｖ、ヒンジ及び抗体定常領域を含むか、または抗体重鎖を含む第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列は、第２の発現ベクターにクローニングされ得；抗体軽鎖をコードする第３の核酸配列は、第３の発現ベクターにクローニングされ得る。第１、第２、及び任意選択で第３の発現ベクターは、宿主細胞に一緒に安定的にトランスフェクトされて、本明細書に記載の多量体タンパク質を生成し得る。
多重特異性結合タンパク質の最も高い収率を達成するため、第１、第２、及び第３の発現ベクターの異なる比を探索して、宿主細胞へのトランスフェクションのための最適な比を決定してもよい。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当該技術分野で公知の方法を使用して細胞バンク生成のために単一クローンを単離してもよい。
クローンを、バイオリアクターのスケールアップに好適な条件下で培養し、多重特異性タンパク質の発現を維持してもよい。多重特異性結合タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイズ、冷凍解凍、アフィニティ精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーを含む当該技術分野で公知の方法を使用して単離及び精製してもよい。
ＩＩ．治療への適用
本発明は、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質及び／または本明細書に記載の医薬組成物を使用してがんを治療するための方法を提供する。この方法は、固形腫瘍、リンパ腫、及び白血病を含む様々ながんを治療するために使用され得る。治療されるがんの種類は望ましくは、このタンパク質が結合するがん細胞の種類と一致する。例えば、ＨＥＲ２を発現する乳癌などのＨＥＲ２を発現するがんの治療は、望ましくは、タンパク質に結合する、本明細書に記載のタンパク質を使用して治療される。所定の実施形態では、この方法は、それを必要とする患者に、治療的有効量の本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を投与することによって、ＢＣＭＡを発現する種々のがんを治療するための方法を提供する。所定の実施形態では、この方法は、それを必要とする患者に、治療的有効量の本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を投与することによって、ＣＤ３３を発現する種々のがんを治療するための方法を提供する。
従って、本発明の一態様は、がんを治療するための、治療的有効量の本明細書に記載のタンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者のがんを治療する方法を提供する。この治療方法の追加的態様及び実施形態を以下に記載する。
この治療方法は、治療されるがんに応じて特徴付けされ得る。例えば、所定の実施形態では、このがんは固形腫瘍である。所定の他の実施形態では、このがんは、脳癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、または子宮癌である。さらに他の実施形態では、このがんは、血管新生性腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、末端性黒子性黒色腫、光線性角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞性癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星状腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢絨乳頭腫／癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織癌、嚢胞腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞癌、上衣癌、上皮細胞癌、ユーイング肉腫、眼及び眼窩癌、女性生殖器癌、限局性結節性過形成症、胆嚢癌、胃前庭部癌、胃底癌、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮間扁平上皮新生物、肝内胆管癌、浸潤性扁平上皮癌、空腸癌、関節癌、カポジ肉腫、骨盤癌、大細胞癌、大腸癌、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、リンパ腫、男性生殖器癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄様上皮腫、髄膜癌、中皮癌、転移性癌、口腔癌、粘膜表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻道癌、神経系癌、神経上皮性腺癌結節性黒色腫、非上皮性皮膚癌、燕麦細胞癌、希突起神経膠細胞癌、口腔癌、骨肉腫、乳頭漿液性腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、直腸癌、腎細胞癌、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋癌、軟部組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎癌、扁平上皮癌、横紋筋癌、中皮下癌、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌癌、未分化癌、尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿器系癌、子宮頸癌、子宮体癌、ぶどう膜黒色腫、膣癌、いぼ状癌、ビポーマ、外陰癌、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。
所定の他の実施形態では、治療されるがんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。所定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫である。所定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｔ細胞リンパ腫、例えば、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢Ｔ細胞リンパ腫である。
所定の実施形態では、このがんは、ＡＭＬ、骨髄異形成症候群、慢性骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病の骨髄性急性転化症、及びＡＬＬである。
所定の実施形態では、治療されるがんは、がん細胞の表面に発現した特定の抗原の存在に応じて特徴付けられ得る。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＢＣＭＡに加えて、次のうちの１つ以上を発現し得る：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０，ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、及びＰＤ－Ｌ１。
所定の実施形態では、このがん細胞は、ＣＤ３３に加えて、次のうちの１つ以上を発現し得る：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ＴＲＯＰ２、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、及びＰＤ－Ｌ１。
所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＥＲ２に加えて、次のうちの１つ以上を発現する：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、及びＰＤ－Ｌ１。
所定の実施形態では、治療されるがんは、がん細胞の表面上のＭＨＣによる特定のＴＡＡペプチドの存在に応じて特徴付けられ得る。ＴＣＲ標的化可能なＴＡＡペプチドにプロセシングされ得るタンパク質の非限定的な例としては、組織分化抗原（例えば、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＣＤ１９、及びチロシナーゼ）、腫瘍生殖系列抗原（例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＢＡＧＥ１、ＧＡＧＥ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、ＸＡＧＥ－１Ｂ、及びＳＳＸ２）、がん細胞によって過剰発現される正常なタンパク質（例えば、ｈＴＥＲＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＷＴ１、ＭＵＣ１、及びメソテリン）、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＰＶ、ＥＢＶ、及びＭＣＣ）、及び腫瘍特異的に変異した抗原が挙げられる。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：４８によって提示される配列番号４２５のアミノ酸配列を有するＥＬＡＶＬ４ペプチドを含む。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：４８によって提示される配列番号４２６のアミノ酸配列を有するインスリンペプチドを含む。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：４８によって提示される配列番号３４０のアミノ酸配列を有するｈＴＥＲＴペプチドを含む。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２によって提示される配列番号３４１のアミノ酸配列を有するＥＲＢＢ２ペプチドを含む。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２によって提示される配列番号３４２のアミノ酸配列を有するＷＴ１ペプチドを含む。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ１によって提示される配列番号３４３のアミノ酸配列を有するＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドを含む。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４４のアミノ酸配列を有するＭＡＲＴ１ペプチドを含む。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４６のアミノ酸配列を有するＢＩＲＣ５ペプチドを含む。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４７のアミノ酸配列を有するＰＲＡＭＥペプチドを含む。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４８のアミノ酸配列を有するＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドを含む。所定の実施形態では、このがん細胞は、ＨＬＡ－Ａ２によって提示される配列番号３４５のアミノ酸配列を有するＳＳＸ２ペプチドを含む。
ＩＩＩ．併用療法
本発明の別の態様は、併用療法を提供する。本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、がんを治療するための追加の治療剤と組み合わせて使用され得る。
がんの治療における併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤として、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボクオン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリックス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフル、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフル、イフォスファミド、プレドニムスチン、ピシバニル、レバミソール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、フォルメスタン、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－２アルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、コロニー刺激因子－１、コロニー刺激因子－２、デニロイキン・ディフチトックス、インターロイキン－２、黄体形成ホルモン放出因子、及び同族受容体への異なる結合を示し、かつ血清半減期の増加または減少を示し得る前述の薬剤のバリエーションが挙げられる。
がんの治療における併用療法の一部として使用され得る追加のクラスの薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７－Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７－Ｈ４、及び（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つ以上を阻害する剤が挙げられる。ＣＴＬＡ４阻害剤であるイピリムマブは、黒色腫の治療について米国食品医薬品局（ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認されている。
がんの治療における併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的（例えば、ハーセプチン）及び非細胞毒性剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）を標的とするモノクローナル抗体薬剤である。
抗癌剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基切除修復阻害剤、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルートンのチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫとｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤と２－クロロ－デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１及びＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、及びＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳの作動薬；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦから選択されるサイトカインが挙げられる。
本発明のタンパク質はまた、原発病変の外科的除去に対する補助として使用されてもよい。
多重特異性結合タンパク質及び追加の治療剤の量、ならびに投与の相対的なタイミングは、所望の併用された治療効果を達成するために選択され得る。例えば、併用療法の投与を、そのような投与を必要とする患者に行う場合、併用における治療剤、または治療剤を含む医薬組成物（複数可）は、例えば、順次に、共に、一緒に、同時になどの任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、追加の治療剤（複数可）がその予防的または治療的効果を発揮する時期に投与されてもよいし、またはその逆もあり得る。
ＩＶ．医薬組成物
本開示はまた、治療有効量の本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物／製剤を特徴とする。
この組成物は、様々な薬物送達システムでの使用のために製剤化され得る。適切な製剤化のために、１つ以上の生理学的に許容可能な賦形剤または担体も組成物に含まれてもよい。本開示で使用するための好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見出される。薬物送達のための方法の簡易なレビューについては、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、またはシリンジに含有されてもよい。所定の実施形態では、バッグは、チューブ及び／または針を含むチャンネルに接続されてもよい。所定の実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤であっても、または液体製剤であってもよい。所定の実施形態では、製剤は、冷凍乾燥（凍結乾燥）され、約１２～６０個のバイアル中に含有され得る。所定の実施形態では、製剤は、冷凍乾燥され得、４５ｍｇの冷凍乾燥製剤が１つのバイアルに含有され得る。所定の実施形態では、約４０ｍｇ～約１００ｍｇの冷凍乾燥製剤が１つのバイアルに含有され得る。所定の実施形態では、静脈内薬物製剤中のタンパク質の治療用量を得るために、１２個、２７個、または４５個のバイアルからの冷凍乾燥製剤が組み合わされる。所定の実施形態では、製剤は、液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアル～約１０００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。所定の実施形態では、製剤は、液体製剤であってもよく、約６００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。所定の実施形態では、製剤は、液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。
本開示のタンパク質は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療的有効量のタンパク質を含む液体水性薬学的製剤中に存在してもよい。
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されてもよいし、または滅菌濾過されてもよい。得られる水溶液は、そのまま使用するために包装されてもよいし、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは典型的には、３～１１、より好ましくは５～９または６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５である。得られる固体形態の組成物は、固定量の前述の薬剤（複数可）をそれぞれ含有する複数の単回用量単位で包装され得る。固体形態の組成物はまた、変動する量のための容器に包装され得る。
所定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、及び水酸化ナトリウムと組み合わせて、本開示のタンパク質を含む、保存期間が延長された製剤を提供する。
所定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本発明の緩衝液は、約４～約８、例えば、約４．５～約６．０、または約４．８～約５．５の範囲のｐＨを有してもよいし、または約５．０～約５．２のｐＨを有してもよい。上記のｐＨに対して中間的な範囲もまた、本開示の一部であることが意図されている。例えば、上記の値のいずれかの組み合わせを上限値及び／または下限値として使用した値の範囲が含まれることが意図されている。この範囲内でｐＨを制御する緩衝剤の例としては、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸緩衝液が挙げられる。
所定の実施形態では、この製剤は、約４～約８の範囲のｐＨを維持するためにクエン酸塩及びリン酸塩を含有する緩衝系を含む。所定の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５～約６．０、または約４．８～約５．５、または約５．０～約５．２のｐＨ範囲であり得る。所定の実施形態では、緩衝系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、及び／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。所定の実施形態では、緩衝系は、約１．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約０．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約１．５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍｌ）、約０．９ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６）、及び約６．２ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍｌ）を含む。所定の実施形態では、緩衝系は、１～１．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸、０．２５～０．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム、１．２５～１．７５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７～１．１ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び６．０～６．４ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを含む。所定の実施形態では、製剤のｐＨは、水酸化ナトリウムで調整される。
等張化剤として作用し、かつ抗体を安定化させ得るポリオールも製剤に含まれ得る。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化し得る量で製剤に添加される。所定の実施形態では、水性製剤は、等張性であり得る。添加されるポリオールの量はまた、ポリオールの分子量に関して変化され得る。例えば、二糖類（トレハロースなど）と比較して、より少ない量の単糖類（例えば、マンニトール）を添加してもよい。所定の実施形態では、等張化剤として製剤中で使用され得るポリオールは、マンニトールである。所定の実施形態では、マンニトール濃度は、約５～約２０ｍｇ／ｍｌであり得る。所定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約７．５～１５ｍｇ／ｍｌであり得る。所定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１０～１４ｍｇ／ｍｌであり得る。所定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１２ｍｇ／ｍｌであり得る。所定の実施形態では、ポリオールソルビトールが製剤に含まれ得る。
洗浄剤または界面活性剤も製剤に添加され得る。例示的な洗浄剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性の洗浄剤が挙げられる。添加される洗浄剤の量とは、製剤化された抗体の凝集を低減するか、及び／または製剤中の微粒子の形成を最小化するか、及び／または吸着を低減するような量である。所定の実施形態では、この製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含み得る。所定の実施形態では、製剤は、洗浄剤のポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを説明するために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ，Ｅｄｉｔｉｏ Ｃａｎｔｏｒ Ｖｅｒｌａｇ Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，４ｔｈ ｅｄｉ．，１９９６年を参照されたい）。所定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含有し得る。所定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加されてもよい。
実施形態では、本開示のタンパク質生成物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉鎖され、かつアルミニウムクリンプシール閉鎖材で密封されたＵＳＰ／Ｐｈ ＥｕｒタイプＩ ５０Ｒバイアルのいずれかの中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され得る。この栓は、ＵＳＰ及びＰｈ Ｅｕｒに準拠したエラストマーから作製され得る。所定の実施形態では、バイアルは、６０ｍＬの抽出可能な体積を可能にするために、６１．２ｍＬのタンパク質生成物溶液で満たされ得る。所定の実施形態では、液体製剤は、０．９％の生理食塩水で希釈され得る。
所定の実施形態では、本開示のタンパク質の液体製剤は、安定化レベルで糖と組み合わせて１０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液として調製され得る。所定の実施形態では、この液体製剤は、水性担体中で調製され得る。所定の実施形態では、安定化剤は、静脈内投与に望ましくないか、または好適ではない粘度をもたらし得る量を超えない量で添加され得る。所定の実施形態では、糖は、二糖類、例えば、スクロースであってもよい。所定の実施形態では、液体製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、及び防腐剤のうちの１つ以上を含んでもよい。
所定の実施形態では、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容可能な酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。所定の実施形態では、薬学的に許容可能な酸は、塩酸であり得る。所定の実施形態では、塩基は、水酸化ナトリウムであってもよい。
凝集に加えて、脱アミド化は、発酵、採取／細胞浄化、精製、薬物物質／薬物製品貯蔵中、及び試料分析中に起こり得るペプチド及びタンパク質の一般的な生成物の変化である。脱アミド化は、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成するタンパク質からのＮＨ３の喪失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解は、１８ダルトンの質量増加をもたらす。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下では不安定なため困難である。このように、脱アミド化は典型的には、１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミド化は、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかをもたらす。脱アミド化の速度に影響を与えるパラメータとしては、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所的ポリペプチド高次構造及び三次構造が挙げられる。ペプチド鎖におけるＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響を与える。タンパク質配列におけるＡｓｎに続くＧｌｙ及びＳｅｒは、脱アミド化に対してより高い感受性をもたらす。
所定の実施形態では、本開示由来のタンパク質の液体製剤は、タンパク質生成物の脱アミノ化を防止するためにｐＨ及び湿度の条件下で保存され得る。
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容可能であり（ヒトへの投与に安全であり、非毒性である）、かつ液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体としては、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。
細菌作用を減少させるために、防腐剤が本明細書の製剤に任意選択で添加され得る。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。
静脈内（ＩＶ）製剤は、特定の場合、例えば、患者が病院において移植後に全ての薬物をＩＶ経路で受けている場合に好ましい投与経路であり得る。所定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈される。所定の実施形態では、注射用に希釈された薬物製品は、等張性であり、静脈内注入による投与に好適である。
所定の実施形態では、塩または緩衝成分は、１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加され得る。塩及び／または緩衝液は、薬学的に許容可能であり、「塩基形成」金属またはアミンを有する様々な既知の酸（無機及び有機）に由来する。所定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液であり得る。所定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝液であり得、この場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
細菌作用を減少させるために、防腐剤が本明細書の製剤に任意選択で添加され得る。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容可能であり（ヒトへの投与に安全であり、非毒性である）、かつ液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体としては、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。
本開示のタンパク質は、タンパク質及び凍結保護剤を含む凍結乾燥製剤中に存在し得る。凍結保護剤は、糖類、例えば、二糖類であってもよい。所定の実施形態では、凍結保護剤は、スクロースであっても、またはマルトースであってもよい。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、増量剤及び／または防腐剤のうちの１つ以上を含み得る。
凍結乾燥薬物製品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２というタンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比であり得る。所定の実施形態では、タンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比は、１：２～１：５であり得る。
所定の実施形態では、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容可能な酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。所定の実施形態では、薬学的に許容可能な酸は、塩酸であってもよい。所定の実施形態では、薬学的に許容可能な塩基は、水酸化ナトリウムであってもよい。
凍結乾燥の前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは、６～８で調整され得る。所定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品のｐＨ範囲は、７～８であり得る。
所定の実施形態では、塩または緩衝成分は、１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加され得る。塩及び／または緩衝液は、薬学的に許容可能であり、「塩基形成」金属またはアミンを有する様々な既知の酸（無機及び有機）に由来する。所定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液であってもよい。所定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝液であってもよく、この場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
所定の実施形態では、「増量剤」が添加されてもよい。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を加え、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放細孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール及びソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤は、そのような増量剤を含有し得る。
細菌作用を減少させるために、防腐剤が本明細書の製剤に任意選択で添加され得る。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。
所定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品は、水性担体中で構成され得る。本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容可能であり（例えば、ヒトへの投与に安全であり、非毒性である）、かつ凍結乾燥後に、液体製剤の調製に有用なものである。例示的な希釈剤としては、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。
所定の実施形態では、本開示の凍結乾燥薬物製品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％塩化ナトリウム注射剤（ＵＳＰ）のいずれかで再構成される。再構成中に、凍結乾燥粉末が溶液に溶解する。
所定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、注射用の約４．５ｍＬの水に構成され、０．９％生理食塩水（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対する毒性を伴わずに、特定の患者、組成物、及び投与様式について所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変更されてもよい。
具体的な用量は、各々の患者にとって均一な用量、例えば、５０～５０００ｍｇのタンパク質であってもよい。代替的に、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に対して調整され得る。適切な投薬量を決定する際の他の要因には、治療または予防すべき疾患または病態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別及び医学的状態が含まれ得る。治療のための適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる微調整は、特に本明細書に開示される投薬量情報及びアッセイに照らして、当業者によって慣習的になされ得る。投薬量はまた、適切な用量－反応データと併せて使用される投薬量を決定するための既知のアッセイの使用により決定され得る。個々の患者の投薬量は、疾患の進行をモニターしながら調整され得る。有効濃度に到達するか、またはそれを維持するために投薬量を調整する必要があるかどうかを確認するために患者における標的となり得る構築物または複合体の血中濃度が測定され得る。どの標的となり得る構築物及び／または複合体、ならびにそれらの投薬量が、所与の個体に対して最も有効である可能性が高いかを決定するために、ファーマコゲノミクスを使用してもよい（Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ３０８：４３－５３，２００１；Ｓｔｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ３０８：３３－４１，２００１）。
一般に、体重を基準とする投薬量は、体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ～約１００ｍｇ、例えば、約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
用量は、１日、１週、１か月もしくは１年ごとに１回以上、またはさらに２～２０年ごとに１回で与えられてもよい。当業者は、測定された滞留時間及び体液または組織中の標的となり得る構造物または複合体の濃度に基づいて、投薬のための反復率を容易に推定し得る。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、硬膜内、髄腔内、腔内であるか、カテーテルを介した灌流によるか、または直接病巣内注射による場合がある。これは、１日に１回以上、１週に１回以上、１か月に１回以上、及び毎年１回以上投与され得る。
上記の記載は、本発明の複数の態様及び実施形態を記載している。本特許出願は特に、その態様及び実施形態の全ての組み合わせ及び変更を企図している。
ここで一般的に記載されている本発明は、単に本発明の所定の態様及び実施形態を例示する目的のためにのみ含まれる以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、本発明を限定することは意図されていない。
実施例１－Ｆ３－ＴｒｉＮＫＥＴ及びＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴの精製
Ｆ３－ＴｒｉＮＫＥＴ及びＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴタンパク質の両方とも、治療用モノクローナル抗体の精製に使用されるステップに従って精製した。簡単に説明すると、精製方法には、プロテインＡ精製（約８０～９０％のモノマーを達成）とそれに続くＰｏｒｏｓ ＨＳ ＣＩＥＸ塩ステップ溶出（約９７～９９％のモノマーを達成）が含まれていた。臨床製造プロセスでは、ＱセファロースまたはＱマスタング（フロースルーモード）（約９９％のモノマーを達成するため）を使用した追加の精製ステップを追加して、全細胞タンパク質（ＷＣＰ）及びＣＨＯ ＤＮＡをさらに減らしてもよい。
精製されたＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴは、治療用モノクローナル抗体と同様に、高い熱安定性（ＤＳＣ）を有する。また、Ｆ３’－ＴｒｉｎＫＥＴを含む変異体Ｆｃの安定性はＩｇＧ１Ｆｃに近い。下の表１３を参照のこと。
実施例２－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴは少なくとも４週間安定である
３７℃で実施された加速安定性研究では、Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴは４週間にわたって安定であることが見出された。図３Ａ～３Ｃを参照のこと。
精製されたＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴは、低ｐＨ保持中も安定であった。２０ｍｇ／ｍＬの精製タンパク質をｐＨ３．０のグリシン中で２時間インキュベートした。図４では、精製されたＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴが低ｐＨ保持の間、安定していたことが示される。
精製されたＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴは、５サイクルの冷凍解凍後も安定であった。図５Ａ及び図５Ｂでは、精製されたＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴが、ｐＨに関係なく、５サイクルの冷凍解凍後に安定であったことが示される（図５Ａは、ＰＢＳでの冷凍解凍サイクルを示し、図５Ｂは、ｐＨ５．５でのクエン酸塩での冷凍解凍サイクルを示す）。
精製されたＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴは強制分解研究で安定であった。図６は、Ｆ３’－ＴｒｉｎＫＥＴが安定したままであった強制分解条件の棒グラフを示している。
実施例３－細胞に発現したヒトがん抗原に対するＴｒｉＮＫＥＴの結合の評価
目的のがん抗原を発現するヒトがん細胞株を使用して、ＴｒｉＮＫＥＴの腫瘍抗原結合を評価した。ヒトＡＭＬ細胞株Ｍｏｌｍ－１３を使用して、ＣＤ３３発現細胞に対するＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＤ３３の結合を評価した。ＨＥＲ２＋Ｃｏｌｏ－２０１細胞株を使用して、ＨＥＲ２発現細胞に対するＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＨＥＲ２の結合を評価した。Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＨＥＲ２及びＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＤ３３を希釈し、それぞれの細胞とインキュベートした。Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＨＥＲ２及びＦ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＤ３３のＨＥＲ２発現細胞及びＣＤ３３発現細胞への結合は、それぞれ、フルオロフォア複合体化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出された。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、それぞれＨＥＲ２発現細胞及びＣＤ３３発現細胞に対する結合ＭＦＩを、二次抗体対照に対して正規化し、バックグラウンド値に対する倍数を得た。
実施例４－初代ヒトＮＫ細胞細胞傷害性アッセイ
密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。単離したＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞の単離のために調製した。ＮＫ細胞を、磁気ビーズを用いた陰性選択技術を使用して単離し、単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には、＞９０％のＣＤ３－ＣＤ５６＋であった。単離されたＮＫ細胞を一晩休息させ、翌日に細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ：
目的の標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＤ０１１６）で標識するために１０６／ｍＬで成長培地に再懸濁した。標的細胞の標識については製造者の指示に従った。標識後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．５～１．０×１０５細胞／ｍＬで培養培地に再懸濁した。バックグラウンドのウェルを調製するために、標識された細胞のアリコートを別に取り、細胞を培地から回転除去した。１００μｌの培地を、ペレット化された細胞が乱されるのを避けるように慎重にウェルに三重に添加した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルを標的細胞からの自然放出のために保存し、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘの添加によって、標的細胞の最大溶解のためにウェルを準備した。目的の腫瘍標的に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地に希釈し、５０μｌの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを、各ウェルに添加した。休息したか、及び／または活性化したＮＫ細胞を、培養物から採取し、細胞を洗浄し、所望のＥ：Ｔ比に応じて１０５～２．０×１０６／ｍＬで培養培地に再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞を、プレートの各ウェルに添加し、合計２００μｌの培養容積とした。プレートを３７℃で５％ＣＯ２を用いて２～３時間インキュベートした後、アッセイを展開した。
２～３時間培養した後、インキュベーターからプレートを取り出し、２００ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。２０μｌの培養上清を、製造者から提供された清浄なマイクロプレートに移し、２００μｌの室温ユーロピウム溶液を、各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカー上で、２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。Ｖｉｃｔｏｒ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ装置のいずれかを使用してプレートを読み取った。特異的溶解％を次のように計算した：特異的溶解％＝（（実験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出））＊１００％。
フローサイトメトリー細胞毒性アッセイ
ピューロマイシン選択後にＢＣＭＡを発現し、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｇｒｅｅｎ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ ４４７５）を安定して発現するように形質導入されたヒトがん細胞株を、培養物から回収し、スピンダウンし、培養培地に１０５／ｍＬで再懸濁した。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌの標的細胞を加えた。ＢＣＭＡに対するＴｒｉＮＫＥＴを培養培地で希釈し、それぞれ５０μｌを複製ウェルに添加した。一晩休ませた精製ヒトＮＫを培養物から回収し、洗浄し、培養培地に４×１０５／ｍＬで再懸濁した。２：１のＥ：Ｔ比では、１００μｌの培養培地を受け取った標的のみの対照を除いて、５０μｌのＮＫ細胞を全てのウェルに添加した。このプレートを３７℃で５％ＣＯ２を用いて３０時間インキュベートした。
共培養後、細胞を染色し、固定し、フローサイトメトリーで分析した。残りの標的細胞は、ＦＩＴＣチャネルの強いシフトで検出され、死んだ細胞を生存性染色で除外した。グリーンイベントの数を出力し、標的のみの対照試料との比較によって殺滅％を計算した。記録された量が同等であることを保証するために、カウントビーズを含んでいた。
実施例５－Ｆ３’ＴｒｉＮＫＥＴは細胞に発現した腫瘍抗原に結合する
図７は、ＨＥＲ２＋Ｃｏｌｏ－２０１細胞へのＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＨＥＲ２またはトラスツズマブの結合を示している。Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＨＥＲ２は、バックグラウンドを超える高い最大倍数までＣｏｌｏ－２０１細胞に結合するが、わずかにＥＣ５０結合値を低下させた。
図８は、Ｍｏｌｍ－１３細胞上で発現されたＣＤ３３へのＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＣＤ３３またはＣＤ３３モノクローナル抗体の結合を示す。Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴは、ＣＤ３３ ｍＡｂと比較してバックグラウンド及びＥＣ５０結合値を超え同様の最大倍数までＭｏｌｍ－１３細胞に結合した。
実施例６－Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴは、ＨＥＲ２＋及びＣＤ３３＋標的細胞に対するＮＫ細胞毒性を媒介する。
図９及び図１０は、それぞれ、ＨＥＲ２低細胞株７８６－Ｏ及びＨＥＲ２高細胞株ＳｋＢｒ－３に対する、Ｆ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＨＥＲ２媒介細胞毒性を示している。Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２低細胞株及びＨＥＲ２高細胞株の両方に対するＮＫ媒介性細胞傷害の誘導のための強力なＥＣ５０値を得た。トラスツズマブと比較して、Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＨＥＲ２は、高ＨＥＲ２発現細胞及び低ＨＥＲ２発現細胞の両方で大きな最大特異的溶解及びより強力なＥＣ５０値を得た。
図１１及び図１２は、２つのＣＤ３３陽性ヒト細胞株、それぞれＥＯＬ－１及びＴＨＰ－１に対するＦ３’－ＴｒｉｎＫＥＴ－ＣＤ３３媒介細胞毒性を示している。ＣＤ３３モノクローナル抗体は、ＥＯＬ－１標的細胞のＮＫ細胞溶解を増大し得るが（図１１）、ＦｃＲ－高ＴＨＰ－１細胞株に対しては効果がないことが見出された（図１２）。Ｆ３’－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＤ３３では、ＴＨＰ－１及びＥＯＬ－１の両方の標的細胞に対するＮＫ媒介性細胞傷害の誘導に関してナノモル以下のＥＣ５０値が得られた。
実施例７－Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫ細胞毒性を媒介する
この実施例では、標的がん細胞のＮＫ細胞殺滅の二価Ｆ４フォーマットＴｒｉＮＫＥＴ媒介性の増強の効力について説明する。この実施例では、標的細胞への２価のＦ４フォーマットＴｒｉＮＫＥＴの結合について説明する。この実施例では、細胞表面でのＢＣＭＡの高い細胞表面発現の安定化及び維持における二価Ｆ４フォーマットＴｒｉＮＫＥＴの効果について説明する。この実施例は、二価のＦ４フォーマットＴｒｉＮＫＥＴのその標的への結合力が、ＴｒｉＮＫＥＴが標的抗原に結合する親和性を改善し、細胞表面での高レベルの標的抗原の発現及び維持を効果的に安定させることを説明する。
Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴによるＢＣＭＡ表面安定化
ＢＣＭＡ陽性ＫＭＳ１２－ＰＥ骨髄腫細胞を、１０μｇ／ｍＬのＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴまたはモノクローナル抗体（ＥＭ－９０１）とインキュベートし、試料を３分の１に分割し、各試料のアリコートを氷上に２０分間、３７℃で２時間または３７℃で２４時間、置いた。インキュベーション期間後、細胞を洗浄し、結合したＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴを、抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。染色後、細胞を固定して４℃で保存し、研究の最後に全ての試料を分析した。
細胞に発現したヒトがん抗原に対するＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴの結合の評価
ＢＣＭＡを発現するヒトがん細胞株を使用して、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴの腫瘍抗原結合を評価した（例えば、Ａ４９－Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＢＣＭＡ、クローンＡＤＩ－２７７４９に由来するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン及びＥＭ－９０１に由来するＢＣＭＡ結合ドメイン）。ＫＭＳ１２－ＰＥ骨髄腫細胞よりも高レベルでＢＣＭＡを発現するヒト多発性骨髄腫細胞株ＭＭ．１Ｒを使用して、高レベルのＢＣＭＡを発現する細胞へのＴｒｉＮＫＥＴの結合を評価した。Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴを希釈し、ＭＭ．１Ｒ細胞とインキュベートした。Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴの結合は、フルオロフォア複合体化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、細胞に発現したＢＣＭＡに対する結合ＭＦＩを二次抗体対照に対して正規化し、バックグラウンド値に対する倍数を得た。
初代ヒトＮＫ細胞細胞傷害性アッセイ
密度勾配遠心分離を使用して、ヒト末梢血バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。単離したＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞の単離のために調製した。ＮＫ細胞を、磁気ビーズを用いた陰性選択技術を使用して単離し、単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には、＞９０％のＣＤ３－ＣＤ５６＋であった。単離されたＮＫ細胞を、一晩休ませて、翌日に細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ：目的の標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＤ０１１６）で標識するために１０６／ｍＬで増殖培地に再懸濁した。標的細胞の標識のために製造者の指示に従った。標識後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．５～１．０×１０５／ｍＬで培養培地に再懸濁した。バックグラウンドウェルを調製するために、標識された細胞のアリコートを別に取り、その細胞を培地から回転除去した。１００μｌの培地を、ペレット化された細胞が乱されるのを避けるように慎重にウェルに三重に添加した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルを標的細胞からの自然放出のために保存し、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘの添加によって標的細胞の最大溶解のためにウェルを準備した。目的の腫瘍標的に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地に希釈し、５０μｌの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。休息させるか及び／または活性化したＮＫ細胞を、培養物から採取し、細胞を洗浄し、所望のＥ：Ｔ比に応じて１０５～２．０×１０６／ｍＬで培養培地に再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加し、合計２００μｌの培養容積とした。そのプレートを３７℃で５％ＣＯ２を用いて２～３時間インキュベートした後、アッセイを展開した。２～３時間培養した後、そのプレートをインキュベーターから取り出し、２００ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。２０μｌの培養上清を製造者から提供された清浄なマイクロプレートに移し、２００μｌの室温ユーロピウム溶液を各ウェルに添加した。このプレートを光から保護し、プレートシェーカー上で、２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。Ｖｉｃｔｏｒ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ装置のいずれかを使用してそのプレートを読み取った。特異的溶解％を次のように計算した：特異的溶解％＝（（実験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出））＊１００％。
Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ媒介性のＮＫ細胞毒性
ＢＣＭＡ陽性骨髄腫細胞のＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴ媒介性の溶解をアッセイした。図１９は、休息したヒトＮＫエフェクター細胞によるＢＣＭＡ陽性ＫＭＳ１２－ＰＥ骨髄腫細胞のＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解を示している。図２０は、休息したヒトＮＫエフェクター細胞によるＢＣＭＡ陽性ＭＭ．１Ｒ骨髄腫細胞のＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解を示している。ＥＭ－９０１モノクローナル抗体を両方の実験の対照として使用した。図１９では、ＫＭＳ１２－ＰＥ細胞（低ＢＣＭＡ発現）を標的細胞として使用した。図２０では、ＭＭ．１Ｒ（高ＢＣＭＡ発現）を標的細胞として使用した。高度および低度の両方のＢＣＭＡ発現細胞、それぞれ、ＭＭ．１Ｒ及びＫＭＳ１２－ＰＥに対して、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴはナノモル以下のＥＣ５０値を有していた。ＢＣＭＡモノクローナル抗体ＥＭ－９０１と比較して、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴは、両方の細胞株に対してより大きな最大特異的溶解及び効力を提供した。
図２１は、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９－Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＢＣＭＡ）、デュオボディ－ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９－ＤＢ－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＢＣＭＡ）、またはＢＣＭＡモノクローナル抗体（ＥＭ－９０１）のＭＭ．１Ｒ骨髄腫細胞への結合を示す。３つのタンパク質は全て、ＭＭ．１Ｒ細胞で発現したＢＣＭＡに対して用量反応方式で結合し得た。強烈な結合剤は、一価の結合剤に比べ、バックグラウンドよりもわずかに減少した最大倍数で結合し得たが、強烈な結合は、ＥＣ５０結合値の改善をもたらした。
Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴは表面のＢＣＭＡを安定化する
図２２は、示された時間のインキュベーション後のＦ４－ＴｒｉｎＫＥＴまたはＢＣＭＡモノクローナル抗体（ＥＭ－９０１）による表面ＢＣＭＡの染色を示す。ＢＣＭＡ ｍＡｂ（ＥＭ－９０１）及びＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴは両方とも、インキュベーション後に表面ＢＣＭＡを迅速に安定化し得た。ＢＣＭＡ ｍＡｂ（ＥＭ－９０１）及びＦ４－ＴｒｉＮＫＥＴは、２４時間にわたってＢＣＭＡ表面発現の増大を維持し得た。
図２３は、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴまたはＢＣＭＡモノクローナル抗体（ＥＭ－９０１）とのインキュベーション後のＫＭＳ１２－ＰＥ細胞上の表面ＢＣＭＡの安定化を示す。細胞表面でのＢＣＭＡの初期安定化は、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂ（ＥＭ－９０１）への曝露後に急速に起こった。Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴ及びモノクローナル抗体（ＥＭ－９０１）によって提供される強烈な結合は、デュオボディ－ＴｒｉＮＫＥＴによる２４時間での表面ＢＣＭＡ発現の低下によって示されるように、一価ＢＣＭＡ結合よりも長く、高表面ＢＣＭＡを維持した。
Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴは、実質的な長期細胞毒性を媒介する
フローサイトメトリー細胞毒性アッセイ：ピューロマイシン選択後にＢＣＭＡを発現し、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｇｒｅｅｎ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ ４４７５）を安定して発現するように形質導入されたヒトがん細胞株を培養液から回収し、スピンダウンし、培養培地に１０５／ｍＬで再懸濁した。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌの標的細胞を加えた。ＢＣＭＡに対するＴｒｉＮＫＥＴを、培養培地で希釈し、それぞれ５０μｌを複製ウェルに添加した。一晩休ませた精製ヒトＮＫを培養物から回収し、洗浄し、培養培地に４×１０５／ｍＬで再懸濁した。２：１のＥ：Ｔ比では、１００μｌの培養培地を受け取った標的のみの対照を除いて、５０μｌのＮＫ細胞を全てのウェルに添加した。プレートを３７℃で５％ＣＯ２を用いて３０時間インキュベートした。
共培養後、細胞を染色し、固定し、フローサイトメトリーで分析した。残りの標的細胞を、ＦＩＴＣチャネルの強いシフトで検出し、死んだ細胞を生存性染色で除外した。グリーンイベントの数をエクスポートし、標的のみの対照試料と比較して殺滅％を計算した。記録された量が同等であることを保証するために、カウントビーズを含んでいた。
Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴは、実質的な長期細胞毒性を媒介する
図２４及び図２５は、３０時間後のＦ４またはＤＢ－ＴｒｉｎＫＥＴの存在下での２：１のＥ：Ｔ比でのＢＣＭＡ陽性標的細胞株のヒトＮＫ細胞溶解を示している。図２４は、タンパク質対照の殺滅がない場合を超えるＫＭＳ１２－ＰＥ細胞の殺滅（低ＢＣＭＡ発現）を示しているが、図２５では、ＭＭ．１Ｓ細胞（より高いＢＣＭＡ発現）を標的細胞として使用した。一価のデュオボディ－ＴｒｉＮＫＥＴと比較して、Ｆ４－ＴｒｉＮＫＥＴは、試験した全ての濃度で、高及び低ＢＣＭＡ発現細胞株の両方の殺滅の上昇を実証した。
参照による組み込み
本明細書で言及されている特許文献及び科学論文の各々の開示全体は、全ての目的のために参照により組み込まれる。
等価物
本発明は、その趣旨または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。そのため、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、あらゆる点で例示的であるとみなされるべきである。よって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び均等の範囲内におさまる全ての変更は、そこに含まれることが意図されている。

Claims (19)

  1. タンパク質であって、
    （ａ）腫瘍関連抗原に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であって、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、ｓｃＦｖと、
    （ｂ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂであって、
    （ｉ）配列番号３１９の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号９６の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）アミノ酸配列、および配列番号３３９の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン；並びに
    （ｉｉ）配列番号９９のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１００のＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１０１のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン
    を含む、Ｆａｂと、
    （ｃ）ＣＤ１６に結合するヘテロ二量体を形成する第１の抗体定常ドメインおよび第２の抗体定常ドメインであって、ヘテロ二量体化変異を含む、第１の抗体定常ドメインおよび第２の抗体定常ドメインと
    を含み、前記ｓｃＦｖは前記第１の抗体定常ドメインのＮ末端に連結され、前記Ｆａｂは前記第２の抗体定常ドメインのＮ末端に連結される、タンパク質。
  2. 前記ｓｃＦｖは、Ａｌａ－Ｓｅｒを含むヒンジを介して前記第１の抗体定常ドメインのＮ末端に連結される、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 前記ヒンジがアミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙをさらに含む、請求項２に記載のタンパク質。
  4. 前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、必要に応じて前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメイン由来のＣ４４と前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメイン由来のＣ１００との間に、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質。
  5. 前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、可塑性リンカーを介して前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインに連結されており、必要に応じて前記可塑性リンカーが（Ｇ ４ Ｓ） ４ を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質。
  6. 前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質。
  7. 前記第１の抗体定常ドメインおよび前記第２の抗体定常ドメインが、それぞれ、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質。
  8. 前記第１の抗体定常ドメインおよび前記第２の抗体定常ドメインが、それぞれ、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のタンパク質。
  9. 前記ヘテロ二量体化変異が、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、およびＫ４３９からなる群より選択される１つ以上の位置に存在する、請求項７または８に記載のタンパク質。
  10. 前記ヘテロ二量体化変異が、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅからなる群より選択される１つ以上の置換を含む、請求項９に記載のタンパク質。
  11. 前記ヘテロ二量体化変異が、前記第１の抗体定常ドメインにおいてＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔ置換を含み、かつ前記第２の抗体定常ドメインにおいてＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換を含む、請求項１０に記載のタンパク質。
  12. 前記Ｆａｂの前記抗体重鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号３１９、９６、および３２０；または９５、９６、および９７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、かつ
    前記Ｆａｂの前記抗体軽鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号９９、１００、および１０１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
    必要に応じて前記Ｆａｂの前記重鎖可変ドメインが配列番号９４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記Ｆａｂの前記軽鎖可変ドメインが配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
  13. 前記Ｆａｂの前記抗体重鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号３１９、９６、および３２４；または９５、９６、および３２３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、かつ
    前記Ｆａｂの前記抗体軽鎖可変ドメインは、それぞれ、配列番号９９、１００、および１０１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
    必要に応じて前記Ｆａｂの前記重鎖可変ドメインが配列番号３２２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ前記Ｆａｂの前記軽鎖可変ドメインが配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、製剤。
  15. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む細胞。
  16. 療法における使用のための、請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組成物、または請求項１４に記載の製剤。
  17. 腫瘍細胞死の増強に使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組成物であって、前記使用は、腫瘍およびナチュラルキラー細胞を前記タンパク質に曝すことを含む、組成物。
  18. がんの治療に使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組成物または請求項１４に記載の製剤であって、前記使用は、前記タンパク質または前記製剤を患者に投与することを含む、組成物または製剤。
  19. 前記がんが、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、乳癌、大腸癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道癌、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃癌、消化管癌、消化管間質性腫瘍、膠芽腫、頭頸部癌、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、腎細胞癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、及び膵臓癌、前立腺癌、肉腫、小細胞肺癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、骨髄由来のサプレッサー細胞によって浸潤されたがん、細胞外マトリックス沈着を伴うがん、高レベルの反応性間質を伴うがん、及び血管新生を伴うがんからなる群より選択される、請求項１８に記載の使用のための組成物または製剤。
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