BR112020024235A2 - proteínas de ligação multiespecíficas e aprimoramento das mesmas - Google Patents

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Bianka Prinz
Ann F. Cheung
Jinyan DU
Daniel Fallon
Asya Grinberg
William Haney
Steven O'Neil
Ronnie Wei
Bradley M. LUNDE
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Abstract

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO MULTIESPECÍFICAS E APRIMORAMENTO DAS MESMAS. A invenção fornece aprimoramentos em anticorpos de fragmento variável de cadeia única (scFv), proteínas de ligação multiespecíficas, composições farmacêuticas que compreendem tais proteínas, e métodos terapêuticos que utilizam tais proteínas e composições farmacêuticas, incluindo para o tratamento de câncer.

Description

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO MULTIESPECÍFICAS E APRIMORAMENTO DAS MESMAS REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório Série Nº 62/677,137 depositado em 28 de maio de 2018, cuja divulgação é por este meio incorporada a adendo por referência na íntegra para todos os efeitos.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada por meio deste a título de referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 28 de maio de 2019, é denominada DFY-049WO_SL_ST25.txt e tem 340,101 bytes.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A invenção fornece aprimoramentos em anticorpos de fragmento variável de cadeia única (scFv) e uma proteína de ligação multiespecífica, composições farmacêuticas que compreendem tais proteínas, e métodos terapêuticos que utilizam tais proteínas e composições farmacêuticas, incluindo para o tratamento de câncer.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0004] O câncer continua sendo um problema de saúde significativo, apesar dos esforços substanciais de pesquisa e dos avanços científicos relatados na literatura para o tratamento desta doença. Alguns dos cânceres diagnosticados com mais frequência incluem câncer de próstata, câncer de mama e câncer de pulmão. O câncer de próstata é a forma mais comum de câncer nos homens. O câncer de mama continua sendo a principal causa de morte nas mulheres. As opções de tratamento atuais para esses cânceres não são eficazes para todos os pacientes e/ou podem ter efeitos colaterais adversos substanciais. Outros tipos de câncer também permanecem difíceis de tratar usando as opções terapêuticas existentes.
[0005] As imunoterapias do câncer são desejáveis porque são altamente específicas e podem facilitar a destruição de células cancerígenas usando o próprio sistema imunológico do paciente. As proteínas de fusão, como os agentes biespecíficos de células T, são imunoterapias de câncer descritas na literatura que se ligam a células tumorais e células T para facilitar a destruição de células tumorais. Anticorpos que se ligam a certos antígenos associados a tumores e a certas células imunes foram descritos na literatura. Ver, por exemplo, WO 2016/134371 e WO 2015/095412.
[0006] As células natural killer (NK) são um componente do sistema imunológico inato e constituem aproximadamente 15% dos linfócitos circulantes. As células NK se infiltram em praticamente todos os tecidos e foram originalmente caracterizadas por sua capacidade de eliminar células tumorais efetivamente sem a necessidade de sensibilização prévia. As células NK ativadas eliminam as células alvo por meios semelhantes às células T citotóxicas - ou seja, por grânulos citolíticos que contêm perforina e granzimas, bem como pelas vias dos receptores de morte. As células NK ativadas também secretam citocinas inflamatórias, como IFN-γ e quimiocinas, que promovem o recrutamento de outros leucócitos para o tecido alvo.
[0007] As células NK respondem aos sinais através de uma variedade de receptores ativadores e inibitórios em sua superfície. Por exemplo, quando as células NK encontram células autóctones saudáveis, sua atividade é inibida pela ativação dos receptores do tipo imunoglobulina (KIRs). Como alternativa, quando as células NK encontram células estranhas ou células cancerígenas, elas são ativadas por meio de seus receptores ativadores (por exemplo, NKG2D, NCRs, DNAM1). As células NK também são ativadas pela região constante de algumas imunoglobulinas através dos receptores CD16 em sua superfície. A sensibilidade geral das células NK à ativação depende da soma dos sinais estimuladores e inibitórios. NKG2D é uma proteína transmembranar tipo II que é expressa por essencialmente todas as células natural killer em que NKG2D serve como um receptor ativador. NKG2D também pode ser encontrado nas células T, onde atua como um receptor coestimulador. A capacidade de modular a função das células NK via NKG2D é útil em vários contextos terapêuticos, incluindo malignidade.
SUMÁRIO
[0008] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma melhoria em um fragmento variável de cadeia única (scFv) que está ligado a um domínio constante de anticorpo por meio de uma sequência de dobradiça. Em algumas modalidades, a dobradiça compreende os aminoácidos Ala-Ser. Em algumas outras modalidades, a dobradiça compreende os aminoácidos Ala-Ser e Thr-Lys-Gly. O scFv pode incluir um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, o scFv se liga a NKG2D ou a um antígeno associado a tumor. A sequência de dobradiça fornece flexibilidade de ligação ao antígeno alvo.
[0009] Em algumas modalidades do scFv, o domínio variável da cadeia pesada forma uma ponte dissulfeto com o domínio variável da cadeia leve. Por exemplo, uma ponte dissulfeto pode ser formada entre o resíduo C44 do domínio variável da cadeia pesada e o resíduo C100 do domínio variável da cadeia leve. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada está ligado ao domínio variável da cadeia leve por meio de um ligante flexível, como (G4S)4 (SEQ ID NO:427). Em algumas modalidades do scFv, o domínio variável da cadeia pesada está posicionado no terminal N do domínio variável da cadeia leve. Em algumas modalidades do scFv, o domínio variável da cadeia pesada está posicionado no terminal C do domínio variável da cadeia leve.
[0010] Em algumas modalidades, o domínio constante do anticorpo ligado ao scFv é capaz de se ligar ao CD16. Em algumas modalidades, o domínio constante do anticorpo compreende um domínio CH2 e um domínio CH3 de um anticorpo IgG, por exemplo, um anticorpo IgG1 humano. Em algumas modalidades, as mutações são introduzidas no domínio constante do anticorpo para permitir a heterodimerização com outro domínio constante do anticorpo. Por exemplo, se o domínio constante do anticorpo é derivado do domínio constante de uma IgG1 humana, o domínio constante do anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humana e difere em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411, e K439. Em algumas modalidades, o domínio constante do anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano e difere por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D, e K439E.
[0011] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína que contém o scFv ligado a uma região constante de anticorpo descrita acima. Em algumas modalidades, a proteína inclui um primeiro sítio de ligação ao antígeno, que compreende o scFv ligado a um domínio constante de anticorpo; um segundo sítio de ligação ao antígeno que pode assumir o formato Fab ou scFv descrito neste documento; e um segundo domínio constante de anticorpo ligado ao segundo sítio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a proteína é multiespecífica, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno se liga a NKG2D, o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno associado ao tumor e as regiões constantes do anticorpo se ligam ao CD16.
[0012] Em algumas outras modalidades, a proteína é multiespecífica, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno associado ao tumor, o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga a NKG2D e as regiões constantes do anticorpo se ligam a CD16. A região constante do anticorpo ligada ao scFv pode heterodimerizar com uma segunda região constante do anticorpo. As proteínas de ligação multiespecíficas nessas modalidades se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 em células natural killer e a um antígeno associado a tumor em células cancerosas. Essas proteínas podem envolver mais de um tipo de receptor de ativação de NK e podem bloquear a ligação de ligantes naturais a NKG2D. Em certas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em humanos. Em algumas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em humanos e/ou em outras espécies, como roedores e/ou macacos cynomolgus.
[0013] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação multiespecífica e a proteína contém um primeiro sítio de ligação ao antígeno que liga um antígeno associado ao tumor; um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo antígeno associado ao tumor que o primeiro sítio de ligação ao antígeno; um terceiro sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D; e uma região constante de anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para ligar CD16, ou um quarto sítio de ligação a antígeno que liga CD16. Qualquer um dos sítios de ligação ao antígeno pode tomar a forma de um Fab ou um scFv, como aqueles descritos acima. A proteína de ligação multiespecífica fornecida neste documento fornece engajamento bivalente do antígeno associado ao tumor, estabilizando assim o antígeno associado ao tumor na superfície da célula cancerosa e aumenta a citotoxicidade para as células cancerosas por células NK.
[0014] Em algumas modalidades, o engajamento bivalente de antígenos associados a tumor pelas proteínas de ligação multiespecíficas conferem uma ligação mais forte das proteínas de ligação multiespecíficas às células cancerosas, facilitando assim uma resposta citotóxica mais forte de células NK para as células cancerosas, especialmente para células cancerosas expressando um baixo nível de antígeno associado ao tumor.
[0015] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação multiespecíficas incorporam uma porção de um domínio Fc de anticorpo suficiente para ligar CD16, em que o domínio Fc de anticorpo compreende uma dobradiça e um domínio CH2 e/ou sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas à sequência de aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG humano. As mutações podem ser introduzidas no domínio constante do anticorpo para permitir a heterodimerização com outro domínio constante do anticorpo. Por exemplo, se o domínio constante do anticorpo é derivado do domínio constante de uma IgG1 humana, o domínio constante do anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humana e difere em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411, e K439.
[0016] Em algumas modalidades, o domínio constante do anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano e difere por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D, e K439E.
[0017] O sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor descrito acima pode ser um sítio que liga qualquer antígeno associado ao tumor, por exemplo, ANO1, BCMA, EpCAM, CAIX, CEA, CCR4, CD2, CD123, CD133, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CLAUDIN-18.2, DLL3, EGFR/ERBB1, GD2, IGF1R, HER2, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSMA, mesotelina, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, TROP2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4, PD1, 5T4, GPNMB, FR-alfa, PAPP-A, FLT3, GPC3, CXCR4, ROR1, ROR2, HLA-E, PD-L1, VLA4, CD44, CD13, CD15, CD47, CLL1, CD81, CD23, CD79a, CD79b, CD80, CRLF2, SLAMF7, CD138, CA125, NaPi2b, Nectin4, ADAM8, ADAM9, SLC44A4, CA19-9, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, ULRA 1, LILRA2, LILRA3, ULRA4, LILRA5, e ULRA6, CCR8, CD7, CTLA4, CX3CR1, ENTPD1, HAVCR2, IL-1R2, PDCD1LG2, TIGIT, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, GEM, NT5E, TNFRSF18, MUC1, P-caderina, Plexina-A1, TNFRSF10B, STEAP1, CDCP1, PTK7, Axl, erbB-3, EDNRB, Tyrp1, CD14, CD163, CSF3R, Siglec-9, ITGAM, VISTA, B7-H4 (VTCN1), CCR1, LRRC25, PTAFR, SIRPB1, TLR2, TLR4, CD300LB, ATP1A3, CCR5, MUC1 (ou MUC1-C), Plexin-A1, TNFRSF10B, STEAP1, CDCP1, PTK7, AXL, EDNRB, OLR1, eTYRP1.
[0018] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína que compreende: (a) um sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D; (b) um fragmento de receptor de célula T de ligação a antígeno (TCR); e (c) uma região constante de anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para ligar CD16, ou um sítio de ligação a antígeno adicional que liga CD16. Em certas modalidades, a proteína é uma proteína de ligação multiespecífica compreendendo um fragmento de TCR de ligação ao antígeno que liga um antígeno associado ao tumor (TAA).
[0019] Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é um fragmento Fab, e o fragmento TCR de ligação ao antígeno é um fragmento TCR de cadeia única (scTCR). Em certas modalidades, o fragmento scTCR está ligado a uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo por meio de uma dobradiça que compreende Ala-Ser. Em certas modalidades, a dobradiça compreende ainda a sequência de aminoácidos Thr-Lys-Gly.
[0020] Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é um scFv e o fragmento de TCR de ligação ao antígeno é um fragmento de TCR extracelular. Em certas modalidades, o scFv está ligado a uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo por meio de uma dobradiça que compreende Ala-Ser. Em certas modalidades, a dobradiça compreende ainda a sequência de aminoácidos Thr-Lys-Gly.
[0021] Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é um fragmento Fab e o fragmento de TCR de ligação ao antígeno é um fragmento de TCR extracelular.
[0022] Em certas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica compreende ainda um fragmento de TCR de ligação ao antígeno adicional que se liga ao mesmo antígeno que o fragmento de TCR de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é um scFv, e o fragmento de TCR de ligação ao antígeno e o fragmento de TCR de ligação ao antígeno adicional são fragmentos de TCR extracelulares. Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é um scFv, e o fragmento de TCR de ligação ao antígeno e o fragmento de TCR de ligação ao antígeno adicional são fragmentos de scTCR.
[0023] Em certas modalidades da proteína de ligação multiespecífica que contém um scFv, o scFv compreende um domínio variável de cadeia pesada ligado a um domínio variável de cadeia leve por meio de um ligante flexível. Em certas modalidades, o ligante flexível compreende (G4S)4. Em certas modalidades, o scFv compreende um domínio variável de cadeia pesada posicionado no terminal N ou terminal C de um domínio variável de cadeia leve.
[0024] Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, e em que o domínio variável da cadeia pesada forma uma ponte dissulfeto com o domínio variável da cadeia leve. Em certas modalidades, a ponte dissulfeto é formada entre Cys na posição 44 no domínio variável da cadeia pesada e Cys na posição 100 no domínio variável da cadeia leve, as posições definidas sob a numeração de Kabat. Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que contém tal ponte dissulfeto é um scFv.
[0025] Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno se liga a NKG2D em humanos.
[0026] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo de um antígeno associado a tumor apresentado por um complexo principal de histocompatibilidade (MHC).
[0027] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo ELAVL4 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 425 apresentada por HLA-A *02:01:48. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 351 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 352. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 351 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 353) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 352 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 354) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 349 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 350.
[0028] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo Insulina possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 426 apresentada por HLA-A *02:01:48. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 357 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 358. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 357 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 359) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 358 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 360) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 355 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 356.
[0029] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo TERT possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 340 apresentada por HLA-A *02:01:48. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 363 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 364. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 363 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 365) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 364 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 366) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 361 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 362.
[0030] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo ERBB2 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 341 apresentada por HLA-A *02. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 430 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 431. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 430 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 367) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 431 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 368) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 428 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 429.
[0031] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo WT1 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 342 apresentada por HLA-A *02. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 434 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 435. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 434 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 369) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 435 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 370) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 432 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 433.
[0032] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo WT1 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 342 apresentada por HLA-A *02. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 438 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 439. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 438 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 371) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 439 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 372) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 436 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 437.
[0033] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo MAGE-A3 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NO: 343 apresentada por HLA-A1. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 375 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 376. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 375 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 377) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 376 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 378) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 373 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 374.
[0034] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo MART1 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 344 apresentada por HLA-A2. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 381 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 382. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 381 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 383) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 382 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 384) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 379 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 380.
[0035] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo BIRC5 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 346 apresentada por HLA-A2. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 442 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 443. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 442 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 389) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 443 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 390) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 440 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 441.
[0036] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo BIRC5 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 346 apresentada por HLA-A2. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 444 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 445. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 444 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 391) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 445 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 392) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 385 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 386.
[0037] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo PRAME possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 347 apresentada por HLA-A2. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 395 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 396. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 395 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 397) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 396 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 398) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 393 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 394.
[0038] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo PRAME possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 347 apresentada por HLA-A2. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 401 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 402. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 401 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 403) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 402 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 404) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 399 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 400.
[0039] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo PRAME possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 347 apresentada por HLA-A2. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 407 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 408. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 407 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 409) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 408 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 410) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 405 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 406.
[0040] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo NY-ESO-1 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 348 apresentada por HLA-A2. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 413 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 414. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 413 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 415) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 414 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 416) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 411 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 412.
[0041] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo NY-ESO-1 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 348 apresentada por HLA-A2. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 418 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 414. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 418 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 415) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 414 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 416) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 417 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 412.
[0042] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo NY-ESO-1 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 348 apresentada por HLA-A2. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia alfa relacionado à SEQ ID NO: 421 e um domínio variável da cadeia beta relacionado à SEQ ID NO: 422. Por exemplo, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 421 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3α (SEQ ID NO: 423) do domínio variável da cadeia alfa. Da mesma forma, em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 422 e/ou incorporar uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência CDR3β (SEQ ID NO: 424) do domínio variável da cadeia beta. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa estabelecida em SEQ ID NO: 419 e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta estabelecida em SEQ ID NO: 420.
[0043] Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo SSX2 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 345 apresentada por HLA-A2. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa incorporando uma sequência CDR3α estabelecida na SEQ ID NO: 387. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia beta incorporando uma sequência CDR3β estabelecida na SEQ ID NO: 388.
[0044] Em certas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica compreende uma região constante de anticorpo ou uma porção desta suficiente para ligar CD16, em que a região constante de anticorpo ou a porção desta suficiente para ligar CD16 compreende dobradiça e domínio CH2 de um anticorpo IgG1 humano. Em certas modalidades, a região constante do anticorpo ou sua porção suficiente para ligar CD16 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano. As mutações podem ser introduzidas no domínio constante do anticorpo para permitir a heterodimerização com outro domínio constante do anticorpo. Por exemplo, se o domínio constante do anticorpo é derivado do domínio constante de uma IgG1 humana, o domínio constante do anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humana e difere em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411, e K439. Em algumas modalidades, o domínio constante do anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano e difere por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D, e K439E.
[0045] Em certas modalidades de qualquer um dos polipeptídeos ou proteínas anteriores que contêm um sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D (também chamado de "sítio de ligação NKG2D"), o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 1, tal como por ter uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 1, e/ou incorporando sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 307), CDR2 (SEQ ID NO: 4) e CDR3 (SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 308) sequências de SEQ ID NO: 1. O domínio variável da cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 1 pode ser acoplado a uma variedade de domínios variáveis da cadeia leve para formar um sítio de ligação NKG2D. Por exemplo, o sítio de ligação NKG2D que incorpora um domínio variável de cadeia pesada relacionado a SEQ ID NO: 1 pode ainda incorporar um domínio variável de cadeia leve selecionado de qualquer uma das sequências relacionadas a SEQ ID NOs: 2, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 e 43. Por exemplo, o sítio de ligação NKG2D incorpora um domínio variável de cadeia pesada com sequências de aminoácidos de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 1 e um domínio variável de cadeia leve com sequências de aminoácidos de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica a qualquer uma das sequências selecionadas de SEQ ID NOs: 2, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 e
43.
[0046] Alternativamente, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 44 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 48. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 44, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 309), CDR2 (SEQ ID NO: 46)e CDR3 (SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 310) sequências da SEQ ID NO: 44. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 48, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas ao CDR1 (SEQ ID NO: 49), CDR2 (SEQ ID
NO: 50)e CDR3 (SEQ ID NO: 51) sequências de SEQ ID NO: 48.
[0047] Em outras modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 52 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 56. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 52, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 311), CDR2 (SEQ ID NO: 54)e CDR3 (SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 312) sequências de SEQ ID NO: 52. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 56, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 57), CDR2 (SEQ ID NO: 58)e CDR3 (SEQ ID NO: 59) sequências de SEQ ID NO: 56.
[0048] Alternativamente, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado a SEQ ID NO: 60 e um domínio variável de cadeia leve relacionado a SEQ ID NO: 61, tal como por ter sequências de aminoácidos de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticos à SEQ ID NO: 60 e pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticos à SEQ ID NO: 61 respectivamente.
[0049] Em outra modalidade, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado a SEQ ID NO: 62 e um domínio variável de cadeia leve relacionado a SEQ ID NO: 66, por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 62, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 63), CDR2 (SEQ ID NO: 64)e CDR3 (SEQ ID NO: 65) de SEQ ID NO: 62. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 66, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID
NO: 67), CDR2 (SEQ ID NO: 68)e CDR3 (SEQ ID NO: 69) sequências de SEQ ID NO: 66.
[0050] O sítio de ligação NKG2D, em algumas modalidades, pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado a SEQ ID NO: 70 e um domínio variável de cadeia leve relacionado a SEQ ID NO: 74. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 70, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 71 ou SEQ ID NO: 313), CDR2 (SEQ ID NO: 72)e CDR3 (SEQ ID NO: 73 ou SEQ ID NO: 314) sequências da SEQ ID NO: 70. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 74, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 75), CDR2 (SEQ ID NO: 76)e CDR3 (SEQ ID NO: 77) sequências de SEQ ID NO: 74.
[0051] Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 78 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 82. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 78, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 79 ou SEQ ID NO: 315), CDR2 (SEQ ID NO: 80)e CDR3 (SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 316) sequências da SEQ ID NO: 78. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 82, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 83), CDR2 (SEQ ID NO: 84)e CDR3 (SEQ ID NO: 85) sequências de SEQ ID NO: 82.
[0052] Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 86 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 90. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 86 e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 317), CDR2 (SEQ ID NO: 88)e CDR3 (SEQ ID NO: 89 ou SEQ ID NO: 318) sequências da SEQ ID NO: 86. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 90, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 91), CDR2 (SEQ ID NO: 92)e CDR3 (SEQ ID NO: 93) sequências de SEQ ID NO: 90.
[0053] Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 94 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 98. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 94, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 319), CDR2 (SEQ ID NO: 96)e CDR3 (SEQ ID NO: 97 ou SEQ ID NO: 320) sequências da SEQ ID NO: 94. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 98, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 99), CDR2 (SEQ ID NO: 100)e CDR3 (SEQ ID NO: 101) sequências da SEQ ID NO: 98.
[0054] Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 102 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 106. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 102, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 103 ou SEQ ID NO: 313), CDR2 (SEQ ID NO: 104)e CDR3 (SEQ ID NO: 105 ou SEQ ID NO: 321) sequências da SEQ ID NO: 102. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 106, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 107), CDR2 (SEQ ID NO: 108)e CDR3 (SEQ ID NO: 109) sequências da SEQ ID NO:
106.
[0055] Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 322 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 98. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 322, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 319), CDR2 (SEQ ID NO: 96)e CDR3 (SEQ ID NO: 323 ou SEQ ID NO: 324) sequências da SEQ ID NO: 322. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 98, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO:99), CDR2 (SEQ ID NO:100), e CDR3 (SEQ ID NO:101) sequências da SEQ ID NO: 98.
[0056] Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 325 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 98. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 325, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO:95 ou SEQ ID NO:319), CDR2 (SEQ ID NO:96), e CDR3 (SEQ ID NO:326 ou SEQ ID NO:327)sequências da SEQ ID NO: 325. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 98, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO:99), CDR2 (SEQ ID NO:100), e CDR3 (SEQ ID NO:101) sequências da SEQ ID NO: 98.
[0057] Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 328 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 98. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 328, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO:95 ou SEQ ID NO:319), CDR2 (SEQ ID NO:96), e CDR3 (SEQ ID NO:329 ou SEQ ID NO:330) sequências da SEQ ID NO: 328. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 98, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO:99), CDR2 (SEQ ID NO:100), e CDR3 (SEQ ID NO:101) sequências da SEQ ID NO: 98.
[0058] Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 331 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 98. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 331, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO:95 ou SEQ ID NO:319), CDR2 (SEQ ID NO:96), e CDR3 (SEQ ID NO:332 ou SEQ ID NO:333) sequências da SEQ ID NO: 331. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 98, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO:99), CDR2 (SEQ ID NO:100), e CDR3 (SEQ ID NO:101) sequências da SEQ ID NO: 98.
[0059] Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 334 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 98. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 334, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO:95 ou SEQ ID NO:319), CDR2 (SEQ ID NO:96), e CDR3 (SEQ ID NO:335 ou SEQ ID NO:336) sequências da SEQ ID
NO: 334. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 98, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO:99), CDR2 (SEQ ID NO:100), e CDR3 (SEQ ID NO:101) sequências da SEQ ID NO: 98.
[0060] Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 337 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 98. Por exemplo, o domínio variável da cadeia pesada do sítio de ligação NKG2D pode ser pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 337, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO:95 ou SEQ ID NO:319), CDR2 (SEQ ID NO:96), e CDR3 (SEQ ID NO:338 ou SEQ ID NO:339) sequências da SEQ ID NO: 337. Da mesma forma, o domínio variável da cadeia leve do sítio de ligação NKG2D pode ser de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) idêntico à SEQ ID NO: 98, e/ou incorporar sequências de aminoácidos idênticas à CDR1 (SEQ ID NO:99), CDR2 (SEQ ID NO:100), e CDR3 (SEQ ID NO:101) sequências da SEQ ID NO: 98.
[0061] Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado a SEQ ID NO: 110 e um domínio variável de cadeia leve relacionado a SEQ ID NO: 111, tal como por ter sequências de aminoácidos de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas à SEQ ID NO: 110 e pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas à SEQ ID NO: 111 respectivamente. Em algumas modalidades, o sítio de ligação NKG2D pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado a SEQ ID NO: 112 e um domínio variável de cadeia leve relacionado a SEQ ID NO: 113, tal como por ter sequências de aminoácidos de pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticos à SEQ ID NO: 112 e pelo menos 90% (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticos à SEQ ID NO: 113, respectivamente.
[0062] Formulações contendo qualquer uma das proteínas aqui descritas; células contendo um ou mais ácidos nucleicos que expressam as proteínas, e métodos para aumentar a morte de células tumorais usando as proteínas também são fornecidos.
[0063] Outro aspecto da invenção fornece um método de tratamento de câncer em um paciente. O método compreende a administração a um paciente em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz das proteínas de ligação multiespecíficas descritas neste documento. Os cânceres a serem tratados podem incluir leucemia mieloide aguda, leucemia mielomonocítica aguda, linfoma de células B, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, linfoma difuso de grandes células B, câncer esofágico, sarcoma de Ewing, linfoma folicular, câncer gástrico, câncer gastrointestinal, tumores estromais gastrointestinais, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, carcinoma de células renais, neuroblastoma, câncer de pulmão de células não pequenas, tumores neuroendócrinos, câncer de ovário e câncer pancreático, câncer de próstata, sarcomas, câncer de pulmão de células pequenas, linfoma de células T, câncer de testículo, carcinoma tímico, câncer de tireoide, câncer urotelial, cânceres infiltrados por células supressoras derivadas de mieloides, cânceres infiltrados por células T reguladoras, cânceres com deposição de matriz extracelular, cânceres com altos níveis de estroma reativo e cânceres com neoangiogênese.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0064] A FIG.1A-1C ilustram três formatos exemplares de uma proteína de ligação multiespecífica que inclui o scFv ligado a uma região/domínio constante de anticorpo por meio de uma dobradiça. A FIG. 1A representa um anticorpo triespecífico (TriNKET) que contém um scFv direcionado a tumor ou fragmento de TCR de cadeia única (scTCR), um Fab direcionado a NKG2D e uma região/domínio constante de anticorpo heterodimerizado ("domínio CD") que liga CD16. O formato do anticorpo é referido neste documento como F3'-TriNKET. FIG. 1B representa um anticorpo que contém um scFv direcionado a NKG2D, um Fab direcionado a tumor ou um fragmento TCR extracelular e uma região constante de anticorpo heterodimerizado. O formato do anticorpo é referido neste documento como F3-TriNKET. FIG. 1C representa um anticorpo que contém um scFv de direcionamento a NKG2D, um scFv de direcionamento a tumor ou fragmento de scTCR e uma região constante de anticorpo heterodimerizado. Em certos TriNKETs exemplares, mutações de heterodimerização no domínio CD ligado ao sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D incluem K360E e K409W; mutações de heterodimerização no CD oposto incluem Q347R, D399V e F405T.
[0065] A FIG. 2A ilustram um anticorpo triespecífico (TriNKET), em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno ou fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um antígeno associado ao tumor (tal como BCMA mostrado neste documento) ou um peptídeo deste apresentado por um complexo principal de histocompatibilidade (MHC); o segundo sítio de ligação ao antígeno se liga a NKG2D; e uma região constante de anticorpo heterodimerizado se liga a CD16. Em certos TriNKETs exemplares, mutações de heterodimerização no domínio CD ligado ao sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D incluem K360E e K409W; mutações de heterodimerização no CD oposto incluem Q347R, D399V e F405T.
[0066] As FIGs. 2B-2C ilustram um anticorpo triespecífico (TriNKET), em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno e o segundo sítio de ligação ao antígeno, ou o primeiro fragmento de TCR de ligação ao antígeno e o segundo fragmento de TCR de ligação ao antígeno, ligam o mesmo antígeno associado ao tumor (tal como BCMA mostrado neste documento) ou o mesmo peptídeo de um antígeno associado a tumor apresentado pelo mesmo MHC; o terceiro sítio de ligação ao antígeno se liga a NKG2D; e uma região constante de anticorpo heterodimerizado se liga a CD16. Estes formatos de anticorpos são referidos neste documento como F4-TriNKET. Em certos TriNKETs exemplares, mutações de heterodimerização no domínio CD ligado ao sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D incluem K360E e K409W; mutações de heterodimerização no CD oposto incluem Q347R, D399V e F405T. FIG. 2B ilustra que os primeiros dois sítios de ligação ao antígeno no formato Fab. FIG. 2C ilustra que os primeiros dois sítios de ligação ao antígeno no formato scFv.
[0067] As FIGs. 3A-3C mostram resultados de um estudo de estabilidade acelerado realizado a 37°C, no qual F3'-TriNKET foi considerado estável ao longo de 4 semanas.
[0068] A FIG. 4 mostra que o F3'-TriNKET purificado era estável durante a manutenção de pH baixo.
[0069] A FIG. 5A e FIG. 5B mostra que o F3'-TriNKET purificado era estável após 5 ciclos de congelamento-descongelamento, independentemente do pH (FIG. 5A mostra ciclos de congelamento-descongelamento em PBS, e FIG. 5B mostra ciclos de congelamento-descongelamento em citrato a pH 5,5).
[0070] A FIG. 6 mostra gráficos de barras das condições de degradação forçada nas quais o F3'-TriNKET permaneceu estável.
[0071] A FIG. 7 mostra a ligação de F3'-TriNKET-HER2 ou Trastuzumab a células HER2+ Colo-201.
[0072] A FIG. 8 mostra a ligação do anticorpo monoclonal F3'-TriNKET- CD33 ou CD33 ao CD33 expresso em células Molm-13.
[0073] As FIG. 9 e FIG. 10 mostram citotoxicidade mediada por F3'- TriNKET-HER2 contra a linhagem de células HER2-low 786-O e a linhagem de células HER2-high SkBr-3, respectivamente.
[0074] As FIG. 11 e FIG. 12 mostram citotoxicidade mediada por F3'- TriNKET-CD33 para duas linhagens de células humanas positivas para CD33, EOL-1 e THP-1, respectivamente.
[0075] A FIG. 13A mostra que a ligação de F3'-TriNKET-HER2 a FcγRIa é semelhante a Herceptina.
[0076] A FIG. 13B mostra que a ligação de F3'-TriNKET-HER2 a FcγRIIa é semelhante a Herceptina. A FIG. 13C mostra que a ligação de F3'-TriNKET-HER2 a FcγRIIIa 158V é semelhante a Herceptina.
[0077] A FIG. 14A mostra que F3'-TriNKET-HER2, onde o ligante HER2 é um scFv, a ligação a HER2 humano é semelhante a Herceptina em que os ligantes HER2 são Fabs. A FIG 14B mostra que F3'TriNKET-CD33, em que o ligante CD33 é um scFv, a ligação ao CD33 humano é semelhante ao anticorpo monoclonal CD33 em que os ligantes CD33 são Fabs.
[0078] A FIG. 15 mostra que a purificação em duas etapas de F3-TriNKET- BCMA atinge 99% de pureza.
[0079] A FIG. 16 mostra o envolvimento simultâneo de alvos NKG2D e CD33 com alta potência por F3-TriNKET-CD33.
[0080] A FIG. 17 mostra o engajamento simultâneo de alvos NKG2D e BCMA com alta potência por F3-TriNKET-BCMA.
[0081] A FIG. 18A mostra que o formato F3-TriNKET é estável por pelo menos até 14 dias. A FIG. 18B mostra que o formato F3-TriNKET é estável após uma retenção de pH baixo. AFIG. 18C mostra que o formato F3-TriNKET é estável após pelo menos 5 ciclos de congelamento-descongelamento.
[0082] As FIG. 19 são gráficos de linha que mostram que BCMA direcionado a F4-TriNKETs com diferentes domínios de ligação a NKG2D aumenta a lise de células NK humanas de células de mieloma KMS12-PE.
[0083] As FIG. 20 são gráficos de linha que mostram que BCMA direcionado a F4-TriNKETs com diferentes domínios de ligação a NKG2D aumenta a lise de células NK humanas de células de mieloma MM.1R.
[0084] As FIG. 21 são gráficos de linha que mostram a ligação de F4- TriNKET, duobody-TriNKET e anticorpo monoclonal BCMA a células de mieloma MM.1R.
[0085] As FIG. 22 são FACS mostra que a incubação com F4-TriNKET aumenta a expressão de BCMA de superfície ao longo do tempo.
[0086] As FIG. 23 são gráficos de linha que mostram que F4-TriNKET estabiliza BCMA de superfície.
[0087] As FIG. 24 são gráficos de barras que mostram que F4-TriNKET direcionado a BCMA com ligante A49 medeia a morte mais potente de células de mieloma KMS12-PE em diferentes concentrações ao longo de 30 horas do que o Duobody-TriNKET
[0088] As FIG. 25 são gráficos de barras que mostram que F4-TriNKET direcionado a BCMA com ligante A49 medeia a morte mais potente de células de mieloma MM.1S em diferentes concentrações ao longo de 30 horas do que o Duobody-TriNKET.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0089] A invenção fornece uma melhoria em um fragmento variável de cadeia única (scFv) que está ligado a um domínio constante de anticorpo por meio de uma sequência de dobradiça. A sequência de dobradiça fornece flexibilidade da ligação de scFv a um antígeno. Esta invenção também fornece proteínas de ligação multiespecíficas que incluem um ou mais dos scFv, em que as proteínas de ligação multiespecíficas se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 em células killer naturais e um antígeno associado a tumor. Esta invenção também fornece proteínas de ligação multiespecíficas que contêm dois sítios de ligação ao antígeno associado ao tumor que se ligam ao mesmo antígeno associado ao tumor e se ligam ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 em células killer naturais. A invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo tais proteínas de ligação multiespecíficas e métodos terapêuticos usando tais proteínas de ligação multiespecíficas e composições farmacêuticas, para fins como o tratamento de câncer também são fornecidos. Vários aspectos da invenção são apresentados abaixo nas seções; no entanto, aspectos da invenção descrita em um ponto particular não devem ser limitados a qualquer determinada seção.
[0090] Para facilitar a compreensão da presente invenção, uma série de termos e frases é definida abaixo.
[0091] Os termos “um”, “uma”, “o” e "a", conforme usados neste documento, significam “um ou mais” e incluem o plural, a menos que o contexto seja inadequado.
[0092] Conforme usados neste documento, os termos "sujeito" e "paciente" se referem a um organismo a ser tratado pelos métodos e composições descritos neste documento. Tais organismos incluem, preferencialmente, mas não se limitam a, mamíferos (por exemplo, murinos, símios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos e semelhantes) e, preferencialmente, incluem seres humanos.
[0093] Conforme usado neste documento, o termo "sítio de ligação ao antígeno" refere-se à parte da molécula de imunoglobulina que participa da ligação ao antígeno. Em anticorpos humanos, o local de ligação do antígeno é formado por resíduos de aminoácidos das regiões variáveis N-terminal ("V") das cadeias pesadas ("H") e leves ("L"). Três trechos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesada e leve são referidos como "regiões hipervariáveis", que são interpostas entre trechos flanqueadores mais conservados conhecidos como "regiões framework" ou "FRs". Assim, o termo "FR" se refere a sequências de aminoácidos que são encontradas naturalmente entre e adjacentes a regiões hipervariáveis em imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo humano, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada são dispostas relativas entre si no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação a antígeno. A superfície de ligação a antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado, e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesada e leve são referenciadas como "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs". Em certos animais, como camelos e peixes cartilaginosos, o sítio de ligação ao antígeno é formado por uma única cadeia de anticorpos, fornecendo um "anticorpo de domínio único." Os sítio de ligação ao antígeno podem existir em um anticorpo intacto, em um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que retém a superfície de ligação ao antígeno ou em um polipeptídeo recombinante, como um scFv, usando um peptídeo de ligação para conectar o domínio variável da cadeia pesada a o domínio variável da cadeia leve em um único polipeptídeo.
[0094] Tal como utilizado neste documento, os termos "fragmento de receptor de célula T de ligação a antígeno" e "fragmento de TCR de ligação a antígeno" são usados indistintamente e se referem a uma porção de um receptor de célula T (TCR) que liga um antígeno cognato. Em TCRs humanos αβ, um fragmento de TCR de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia alfa (Vα) e um domínio variável de cadeia beta (Vβ), cada um compreendendo três regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Os loops hipervariáveis denominados CDR3α e CDR3β ocupam uma posição central para se ligar a um peptídeo antígeno; as alças de CDR1α, CDR2α, CDR1β e CDR2β codificadas pela linhagem germinativa fazem mais contato com um MHC que apresenta o peptídeo antígeno. Em TCRs γδ humanos, um fragmento de TCR de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia gama
(Vγ) e um domínio variável de cadeia delta (Vδ), cada um compreendendo três CDRs. Os TCRs γδ humanos reconhecem antígenos (por exemplo, peptídeo ou lipídio) apresentados por MHC ou moléculas relacionadas ao MHC (por exemplo, CD1, receptor de proteína C endotelial (EPCR) ou sequência relacionada ao polipeptídeo classe I do MHC (MICA)). Entende-se que outras proteínas, como F1-ATPase, também podem apresentar antígenos para γδ TCRs. Os fragmentos de TCR de ligação ao antígeno podem existir em um TCR intacto, em um TCR angulado com cadeias de TCR ligadas por uma ligação dissulfeto, em um fragmento de ligação ao antígeno de um TCR intacto ou projetado que retém a superfície de ligação ao antígeno ou em um polipeptídeo recombinante tendo domínios variáveis de um TCR (por exemplo, Vα e Vβ) conectado por um ligante de peptídeo em um único polipeptídeo. Exemplos não limitativos de um fragmento de TCR de ligação ao antígeno incluem um fragmento de TCR compreendendo os domínios variáveis (por exemplo, Vα e Vβ) e domínios constantes (por exemplo, Cα e Cβ), mas sem as regiões de conexão, regiões transmembranares e regiões citoplasmáticas do TCR, referido neste documento como um "fragmento de TCR extracelular" e regiões variáveis de um TCR (por exemplo, Vα e Vβ) conectadas por um ligante de peptídeo, referido neste documento como um "fragmento de TCR de cadeia única (scTCR)."
[0095] Conforme usado neste documento, o termo "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de um composto (por exemplo, um composto da presente invenção) suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não está destinada a se limitar a uma formulação ou via de administração específica. Conforme usado neste documento, o termo "tratamento" inclui todo efeito, por exemplo, diminuir, reduzir, modular, melhorar ou eliminar, que resulte na melhoria da patologia, doença, distúrbio e semelhantes ou na melhoria de um sintoma destes.
[0096] Conforme usado neste documento, o termo "composição farmacêutica" refere-se à combinação de um agente ativo com um carreador, inerte ou ativo, tornando a composição especialmente adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vivo ou ex vivo.
[0097] Conforme usado neste documento, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquer um dos carreadores farmacêuticos padrão, tal como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões (por exemplo, tal como emulsões óleo/água ou água/óleo), e vários tipos de agentes umidificantes. As composições podem incluir também estabilizantes e conservantes. Para exemplos de carreadores, estabilizadores e adjuvantes, ver, por exemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].
[0098] Ao longo da descrição, quando as composições são descritas como possuindo, incluindo, ou compreendendo componentes específicos, ou em que os processos e os métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo passos específicos, é contemplado que, além disso, há composições da presente invenção que consistem essencialmente de, ou consistem de, os componentes recitados, e que existem processos e métodos de acordo com a presente invenção que consistem essencialmente em, ou consistem em, as etapas de processamento referidos.
[0099] Como um assunto geral, as composições que especificam uma percentagem estão em peso, salvo indicação em contrário. Além disso, se uma variável não é acompanhada por uma definição, então a definição anterior da variável controla. I. PROTEÍNAS
[0100] A invenção atual fornece uma melhoria em um fragmento variável de cadeia única (scFv) que está ligado a um domínio constante de anticorpo por meio de uma sequência de dobradiça. Em algumas modalidades, a dobradiça compreende os aminoácidos Ala-Ser. Em algumas outras modalidades, a dobradiça compreende os aminoácidos Ala-Ser e Thr-Lys-Gly. O scFv pode incluir um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, o scFv se liga a NKG2D ou a um antígeno associado a tumor. A sequência de dobradiça fornece flexibilidade de ligação scFv ao antígeno alvo.
[0101] Em algumas modalidades do scFv, o domínio variável da cadeia pesada forma uma ponte dissulfeto com o domínio variável da cadeia leve para aumentar a estabilidade do scFv. Por exemplo, uma ponte dissulfeto pode ser formada entre o resíduo C44 do domínio variável da cadeia pesada e o resíduo C100 do domínio variável da cadeia leve. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada está ligado ao domínio variável da cadeia leve por meio de um ligante flexível. Qualquer ligante adequado pode ser usado, por exemplo, o ligante (G4S)4. Em algumas modalidades do scFv, o domínio variável da cadeia pesada está posicionado no terminal N do domínio variável da cadeia leve. Em algumas modalidades do scFv, o domínio variável da cadeia pesada está posicionado no terminal C do domínio variável da cadeia leve.
[0102] Em algumas modalidades, o domínio constante do anticorpo ligado ao scFv pode derivar de uma região constante de um anticorpo de qualquer espécie que se liga ao CD16. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo humano, como uma região constante da IgG1 humana, uma região constante de IgG2, uma região constante de IgG3 ou uma região constante de IgG4. Em algumas outras modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo de outro mamífero, como coelho, cachorro, gato, camundongo ou cavalo. Em algumas modalidades, a região constante de anticorpo inclui uma dobradiça, um domínio CH2, um domínio CH3 e, opcionalmente, um domínio CH1. Em algumas modalidades, a região constante de anticorpo que inclui uma dobradiça, um domínio CH2, um domínio CH3 e, opcionalmente, um domínio CH1 é derivada de um anticorpo IgG1 humano. Em algumas modalidades, a região constante do anticorpo inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano.
[0103] Dentro do domínio Fc, a ligação a CD16 é mediada pela região de dobradiça e pelo domínio CH2. Por exemplo, na IgG1 humana, a interação com CD16 é focada principalmente nos resíduos de aminoácidos Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 e resíduo de carboidrato N-acetil-D-glucosamina no domínio CH2 (ver Sondermann et al., Nature, 406(6793):267-273). Com base nos domínios conhecidos, as mutações podem ser selecionadas para aprimorar ou reduzir a afinidade de ligação ao CD16, como o uso de bibliotecas exibidas em fagos ou bibliotecas de cDNA exibidas na superfície de leveduras ou podem ser projetadas com base na estrutura tridimensional conhecida da interação.
[0104] Em algumas modalidades, o domínio constante do anticorpo compreende um domínio CH2 e um domínio CH3 de um anticorpo IgG, por exemplo, um anticorpo IgG1 humano. Em algumas modalidades, as mutações são introduzidas no domínio constante do anticorpo para permitir a heterodimerização com outro domínio constante do anticorpo. Por exemplo, se o domínio constante do anticorpo é derivado do domínio constante de uma IgG1 humana, o domínio constante do anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humana e difere em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411, e K439. Em algumas modalidades, o domínio constante do anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano e difere por uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D, e K439E.
[0105] Listados abaixo estão exemplos de scFv ligado a uma região constante de anticorpo que também inclui mutações que permitem a heterodimerização de duas cadeias polipeptídicas. O scFv contendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) de Trastuzumabe é usado como exemplo. Cada sequência representa VL-(G4S)4-VH- dobradiça (AS)-Fc contendo mutações de heterodimerização (sublinhado). V L e VH contêm ponte 44VH -100VL S-S (sublinhado) e podem ser de qualquer tumor direcionado ou anticorpo de ligação a NKG2D. O Ala-Ser (AS, sublinhado) é incluído na sequência da região da dobradiça do cotovelo para equilibrar a flexibilidade e a geometria ideal. Em certas modalidades, uma sequência adicional Thr-Lys-Gly pode ser adicionada à sequência AS na dobradiça. O ligante (G 4S)4 está sublinhado nas sequências listadas no parágrafo abaixo.
[0106] Trastuzumabe –scFv-Fc A1 e Trastuzumabe –scFv-Fc B1 podem preferencialmente emparelhar e formar um heterodímero. Trastuzumabe –scFv-Fc A2 e Trastuzumabe –scFv-Fc B2 podem preferencialmente emparelhar e formar um heterodímero. Trastuzumabe –scFv-Fc A1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLY SGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPT NGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAM DYWGQGTLVTVSS AS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPG (SEQ ID NO:303) Trastuzumabe –scFv-Fc B1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLY SGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPT NGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAM DYWGQGTLVTVSS AS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPG (SEQ ID NO:304) Trastuzumabe –scFv-Fc A2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLY SGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPT NGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAM DYWGQGTLVTVSS AS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:305) Trastuzumabe –scFv-Fc B2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLY SGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPT NGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAM DYWGQGTLVTVSS AS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPG (SEQ ID NO:306)
[0107] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína que contém o scFv ligado a uma região constante de anticorpo descrita acima. Em algumas modalidades, a proteína inclui um primeiro sítio de ligação ao antígeno, que compreende o scFv ligado a um domínio constante de anticorpo; um segundo sítio de ligação ao antígeno que pode assumir o formato Fab ou scFv; e um segundo domínio constante de anticorpo ligado ao segundo sítio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a proteína é multiespecífica, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno se liga a NKG2D, o segundo sítio de ligação ao antígeno, na forma de um Fab, se liga a um antígeno associado ao tumor e as regiões constantes do anticorpo se ligam a CD16 (referido neste documento como o F3-TriNKET, como mostrado na FIG. 1B). Em algumas outras modalidades, a proteína é multiespecífica, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno associado ao tumor, o segundo sítio de ligação ao antígeno, na forma de um Fab, se liga a NKG2D e as regiões constantes do anticorpo se ligam a CD16 (referido neste documento como o F3'-TriNKET, como mostrado na FIG. 1A). A região constante do anticorpo ligada ao scFv heterodimeriza com a região constante do anticorpo do segundo sítio de ligação ao antígeno das proteínas descritas neste documento. As proteínas de ligação multiespecíficas incluindo o scFv descrito neste documento podem assumir vários formatos, como mostrado na FIG. 1A-1C.
[0108] As proteínas de ligação multiespecíficas podem se ligar às células que expressam o receptor NKG2D, que podem incluir, mas não estão limitadas a, células NK, células γδ T e CD8+ células αβ T . Após a ligação de NKG2D, as proteínas de ligação multiespecíficas podem bloquear ligantes naturais, como ULBP6 e MICA, de se ligarem a NKG2D e ativar os receptores NKG2D.
[0109] As proteínas de ligação multiespecíficas liga-se a células que expressam CD16, um receptor Fc na superfície dos leucócitos, incluindo células killer naturais, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos e células dendríticas foliculares.
[0110] Após a ligação ao receptor NKG2D e receptor CD16 em células killer naturais, e um antígeno associado a tumor em células cancerosas, as proteínas de proteínas de ligação multiespecíficas podem envolver mais de um tipo de receptor de ativação NK e podem bloquear a ligação de proteínas naturais ligantes para NKG2D. Em certas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em humanos. Em algumas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em humanos e em outras espécies, como roedores e macacos cynomolgus.
[0111] Em certas modalidades da presente invenção, uma proteína de ligação multiespecífica compreende um primeiro sítio de ligação ao antígeno que liga um antígeno associado ao tumor; um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo antígeno associado ao tumor que o primeiro sítio de ligação ao antígeno; um terceiro sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D; e uma região constante de anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para ligar CD16, ou um quarto sítio de ligação a antígeno que liga CD16. Qualquer um dos sítios de ligação ao antígeno pode assumir a forma de Fab ou scFv. Formatos exemplares são ilustrados na FIG. 2B-2C. Ambas as orientações VH-VL e a VL-VH do scFv são modalidades da presente divulgação.
[0112] Em certas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno ou o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo antígeno associado ao tumor é um scFv e o terceiro sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D é um scFv. Em certas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno e o segundo sítio de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo antígeno associado ao tumor são cada um scFv, e o terceiro sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D é um scFv. Em certas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno ou o segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo antígeno associado ao tumor é um Fab e o terceiro sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D é um scFv. Em certas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno e o segundo sítio de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo antígeno associado ao tumor são cada um Fab, e o terceiro sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D é um scFv. Em certas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno e o segundo sítio de ligação ao antígeno de um F4-TriNKET da presente divulgação têm sequências de aminoácidos idênticas.
[0113] Em outras modalidades, uma proteína de ligação multiespecífica divulgada neste documento compreende um primeiro sítio de ligação ao antígeno que liga um antígeno associado ao tumor; um segundo sítio de ligação ao antígeno que liga um antígeno diferente; um terceiro sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D; e uma região constante de anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para ligar CD16, ou um quarto sítio de ligação ao antígeno que liga
CD16. Qualquer um dos sítios de ligação ao antígeno pode assumir a forma de Fab ou scFv (na orientação VH-VL ou VL-VH). Em certas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno ou o segundo sítio de ligação ao antígeno que liga dois antígenos diferentes é um scFv e o terceiro sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D é um scFv. Em certas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno e o segundo sítio de ligação ao antígeno que liga m dois antígenos diferentes são cada um scFv, e o terceiro sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D é um scFv. Em certas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno ou o segundo sítio de ligação ao antígeno que liga dois antígenos diferentes é um Fab e o terceiro sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D é um scFv. Em certas modalidades, o primeiro sítio de ligação ao antígeno e o segundo sítio de ligação ao antígeno que se ligam a dois antígenos diferentes são cada um Fab, e o terceiro sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D é um scFv.
[0114] Em certas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica (referida neste documento como F4-TriNKETs) fornecida neste documento fornece engajamento bivalente de antígeno associado ao tumor, estabilizando e mantendo o antígeno associado ao tumor na superfície da célula cancerosa e aumentando a citotoxicidade em relação às células de câncer por células NK. Em algumas modalidades, o engajamento bivalente de antígenos associados a tumor pelas proteínas de ligação multiespecíficas conferem maior avidez das proteínas de ligação multiespecíficas às células cancerosas, facilitando assim uma resposta citotóxica mais forte das células NK em relação às células cancerosas, especialmente em relação ao células cancerosas que expressam um baixo nível de antígeno associado ao tumor.
[0115] A presente invenção também fornece uma proteína de ligação multiespecífica compreendendo (a) um sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D; (b) um fragmento de TCR de ligação ao antígeno; e (c) uma região constante de anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para ligar CD16, ou um sítio de ligação ao antígeno adicional que liga CD16. Em certas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno se liga a um peptídeo de um antígeno associado ao tumor (TAA) apresentado por um MHC, por exemplo, um peptídeo de um antígeno associado a tumor humano apresentado por um antígeno leucocitário humano (HLA). O elemento (b) pode existir em vários formatos (por exemplo, formatos solúveis), como um fragmento TCR extracelular ou um fragmento scTCR. Os elementos (a) e (c) podem existir em vários formatos e/ou compreender várias mutações divulgadas acima. Por exemplo, em certas modalidades, o elemento (c) é uma região constante do anticorpo ou uma porção dela suficiente para ligar CD16, a região constante do anticorpo ou porção da mesma compreendendo (i) um primeiro domínio constante do anticorpo ligado ao sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D, e (ii) um segundo domínio constante de anticorpo ligado ao fragmento de TCR de ligação ao antígeno, em que o primeiro e o segundo domínios constantes de anticorpo podem heterodimerizar.
[0116] Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é um fragmento Fab e o fragmento de TCR de ligação ao antígeno é um fragmento de scTCR. Dado que sua porção de ligação a NKG2D é um Fab e sua porção de ligação ao TAA compreende domínios variáveis ligados por um ligante de peptídeo em uma única cadeia (semelhante à proteína de ligação multiespecífica compreendendo um primeiro sítio de ligação ao antígeno, que compreende um scFv ligado a um domínio constante de anticorpo; um segundo sítio de ligação ao antígeno, que assume a forma de Fab; e um segundo domínio constante de anticorpo ligado ao segundo sítio de ligação ao antígeno, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno associado ao tumor, o segundo sítio de ligação ao antígeno liga NKG2D e as regiões constantes do anticorpo ligam CD16), o formato desta proteína de ligação multiespecífica também é referido neste documento como F3'-TriNKET, conforme ilustrado na FIG. 1A.
[0117] Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é um scFv e o fragmento de TCR de ligação ao antígeno é um fragmento de TCR extracelular. Dado que sua porção de ligação a NKG2D é um scFv e sua porção de ligação ao TAA compreende domínios variáveis e domínios constantes (semelhante à proteína de ligação multiespecífica compreendendo um primeiro sítio de ligação ao antígeno, que compreende um scFv ligado a um domínio constante de anticorpo; um segundo sítio de ligação ao antígeno, que assume a forma de Fab; e um segundo domínio constante de anticorpo ligado ao segundo sítio de ligação ao antígeno, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno liga NKG2D, o segundo sítio de ligação ao antígeno liga um antígeno associado ao tumor, e as regiões constantes do anticorpo ligam-se a CD16), o formato desta proteína de ligação multiespecífica também é referido neste documento como F3-TriNKET, conforme ilustrado na FIG. 1B.
[0118] Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é um fragmento scFv e o fragmento de TCR de ligação ao antígeno é um fragmento de scTCR. Tal formato é ilustrado na FIG. 1C. Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é um Fab e o fragmento de TCR de ligação ao antígeno é um fragmento de TCR extracelular. Tal formato é ilustrado na FIG. 2A.
[0119] Em certas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica compreende um primeiro fragmento de TCR de ligação a antígeno que liga um antígeno (por exemplo, um peptídeo TAA apresentado por um MHC); um segundo fragmento de TCR de ligação ao antígeno que liga o mesmo antígeno ao primeiro fragmento de TCR de ligação ao antígeno; um sítio de ligação ao antígeno que liga NKG2D; e uma região constante de anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para ligar CD16, ou um quarto sítio de ligação a antígeno que se liga CD16. Alternativamente, é contemplado que o primeiro fragmento de TCR de ligação a antígeno e o segundo fragmento de TCR de ligação a antígeno podem ligar dois peptídeos TAA diferentes apresentados pelo mesmo ou por MHCs diferentes. Qualquer um dos sítios de ligação ao antígeno pode assumir a forma de Fab ou scFv. O primeiro e o segundo fragmentos de TCR de ligação ao antígeno podem assumir a forma de fragmento de TCR extracelular ou fragmento de scTCR. Formatos exemplares, que fornecem acoplamento bivalente de um antígeno (por exemplo, um peptídeo TAA apresentado por um MHC), são referidos neste documento como F4-TriNKETs e ilustrados na FIG. 2B-2C.
[0120] Em certas modalidades, o primeiro fragmento de TCR de ligação ao antígeno e o segundo fragmento de TCR de ligação ao antígeno de um F4- TriNKET da presente divulgação se ligam ao mesmo peptídeo TAA apresentado pelo mesmo MHC. Em certas modalidades, o primeiro fragmento de TCR de ligação ao antígeno ou o segundo fragmento de TCR de ligação ao antígeno é um scFv. Em certas modalidades, o primeiro fragmento de TCR de ligação ao antígeno e o segundo fragmento de TCR de ligação ao antígeno são cada um scFv. Em certas modalidades, o primeiro fragmento de TCR de ligação ao antígeno ou o segundo fragmento de TCR de ligação ao antígeno é um Fab. Em certas modalidades, o primeiro fragmento de TCR de ligação e antígeno e o segundo fragmento de TCR de ligação ao antígeno são cada um Fab.
[0121] Os F4-TriNKETs com fragmentos de TCR de ligação ao antígeno fornecidos neste documento fornecem engajamento bivalente de antígenos (por exemplo, peptídeos TAA apresentados por MHCs), estabilizando e mantendo o peptídeo TAA na superfície da célula cancerosa e aumentando a citotoxicidade para as células cancerosas pelas células NK. Em algumas modalidades, o engajamento bivalente de peptídeos TAA pelas proteínas de ligação multiespecíficas conferem maior avidez das proteínas de ligação multiespecíficas às células cancerosas, facilitando assim uma resposta citotóxica mais forte das células NK para as células cancerosas, especialmente para as células cancerosas apresentando um baixo nível do peptídeo TAA.
[0122] Entende-se que, onde a proteína da presente invenção compreende um scFv, o VH pode ser posicionado no terminal C ou no terminal N de V L. Da mesma forma, quando a proteína da presente invenção compreende um fragmento de scTCR, o Vα pode ser posicionado no terminal C ou no terminal N de Vβ.
[0123] Sequências exemplares de um sítio de ligação de NKG2D e um sítio de ligação de antígeno associado a tumor ou fragmentos de TCR de ligação a antígeno, que podem ser incorporados em F3/F3' e F4-TriNKETs, são listadas neste documento. Sítio de ligação NKG2D
[0124] A Tabela 1 lista sequências peptídicas de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a NKG2D. Salvo indicação em contrário, as sequências CDR fornecidas na Tabela 1 são determinadas sob Kabat. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve são arranjados no formato Fab. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve são fundidos em conjunto a partir de um scFv.
[0125] Os domínios de ligação NKG2D podem variar em sua afinidade de ligação para NKG2D, no entanto, todos eles ativam células NKG2D e NK humanas. Tabela 1 Clones Sequência de aminoácidos da região Sequência de aminoácidos variável da cadeia pesada da região variável da cadeia leve ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV DIQMTQSPSTLSASVGDRV 27705 YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI TITCRASQSISSWLAWYQQ
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RGPWSFDPWGQGTLVTVSS QPDDFATYYCQQYNSYPIT (SEQ ID NO:1) FGGGTKVEIK CDR1: GSFSGYYWS (não Kabat) (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:3) ou GYYWS (SEQ ID NO: 307) CDR2: EIDHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO:4) CDR3: ARARGPWSFDP (não Kabat) (SEQ ID NO: 5) ou ARGPWSFDP (SEQ ID NO: 308) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV EIVLTQSPGTLSLSPGERAT 27724 YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI LSCRASQSVSSSYLAWYQ
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GEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDT KPGKAPKLLIYKASSLESGV SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA PSRFSGSGSGTEFTLTISSL
RGPWSFDPWGQGTLVTVSS QPDDFATYYCQQYQSFPT (SEQ ID NO:28) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:29) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV DIQMTQSPSTLSASVGDRV 29419 YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI TITCRASQSISSWLAWYQQ
GEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDT KPGKAPKLLIYKASSLESGV SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA PSRFSGSGSGTEFTLTISSL
RGPWSFDPWGQGTLVTVSS QPDDFATYYCQQYSSFSTF (SEQ ID NO:30) GGGTKVEIK (SEQ ID NO:31) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV DIQMTQSPSTLSASVGDRV 29421 YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI TITCRASQSISSWLAWYQQ
GEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDT KPGKAPKLLIYKASSLESGV SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA PSRFSGSGSGTEFTLTISSL
RGPWSFDPWGQGTLVTVSS QPDDFATYYCQQYESYSTF (SEQ ID NO:32) GGGTKVEIK (SEQ ID NO:33) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV DIQMTQSPSTLSASVGDRV 29424 YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI TITCRASQSISSWLAWYQQ
GEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDT KPGKAPKLLIYKASSLESGV SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA PSRFSGSGSGTEFTLTISSL
RGPWSFDPWGQGTLVTVSS QPDDFATYYCQQYDSFITF (SEQ ID NO:34) GGGTKVEIK (SEQ ID NO:35) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV DIQMTQSPSTLSASVGDRV 29425 YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI TITCRASQSISSWLAWYQQ
GEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDT KPGKAPKLLIYKASSLESGV SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA PSRFSGSGSGTEFTLTISSL
RGPWSFDPWGQGTLVTVSS QPDDFATYYCQQYQSYPT (SEQ ID NO:36) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:37) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV DIQMTQSPSTLSASVGDRV 29426 YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI TITCRASQSIGSWLAWYQQ
GEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDT KPGKAPKLLIYKASSLESGV SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA PSRFSGSGSGTEFTLTISSL
RGPWSFDPWGQGTLVTVSS QPDDFATYYCQQYHSFPTF (SEQ ID NO:38) GGGTKVEIK (SEQ ID NO:39) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV DIQMTQSPSTLSASVGDRV 29429 YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI TITCRASQSIGSWLAWYQQ
GEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDT KPGKAPKLLIYKASSLESGV SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA PSRFSGSGSGTEFTLTISSL
RGPWSFDPWGQGTLVTVSS QPDDFATYYCQQYELYSYT (SEQ ID NO: 40) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:41) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV DIQMTQSPSTLSASVGDRV 29447 YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI TITCRASQSISSWLAWYQQ (F47) GEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDT KPGKAPKLLIYKASSLESGV
SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA PSRFSGSGSGTEFTLTISSL
RGPWSFDPWGQGTLVTVSS QPDDFATYYCQQYDTFITF (SEQ ID NO:42) GGGTKVEIK (SEQ ID NO:43) ADI- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKA DIVMTQSPDSLAVSLGERA 27727 SGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEW TINCKSSQSVLYSSNNKNY
MGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITAD LAWYQQKPGQPPKLLIYWA ESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR STRESGVPDRFSGSGSGT GDSSIRHAYYYYGMDVWGQGTTVT DFTLTISSLQAEDVAVYYCQ
VSS QYYSTPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:44) (SEQ ID NO:48)
CDR1: GTFSSYAIS (não Kabat) CDR1: (SEQ ID NO: 45) ou SYAIS (SEQ ID KSSQSVLYSSNNKNYLA NO: 309) (SEQ ID NO:49) CDR2: GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ CDR2: WASTRES (SEQ ID ID NO:46) NO:50) CDR3: ARGDSSIRHAYYYYGMDV CDR3: QQYYSTPIT (SEQ (não-Kabat) (SEQ ID NO:47) ou ID NO:51)
GDSSIRHAYYYYGMDV (SEQ ID NO:310) ADI- QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS EIVLTQSPATLSLSPGERAT 29443 GGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEW LSCRASQSVSRYLAWYQQ (F43) IGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDT KPGQAPRLLIYDASNRATGI
SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR PARFSGSGSGTDFTLTISSL
GSDRFHPYFDYWGQGTLVTVSS EPEDFAVYYCQQFDTWPP (SEQ ID NO:52) TFGGGTKVEIK CDR1: GSISSSSYYWG (não Kabat) (SEQ ID NO:56) (SEQ ID NO: 53) ou SSSYYWG CDR1: RASQSVSRYLA (SEQ ID NO: 311) (SEQ ID NO: 57) CDR2: SIYYSGSTYYNPSLKS (SEQ CDR2: DASNRAT (SEQ ID ID NO:54) NO: 58) CDR3: ARGSDRFHPYFDY (não CDR3: QQFDTWPPT (SEQ Kabat) (SEQ ID NO: 55) ou ID NO: 59) GSDRFHPYFDY (SEQ ID NO: 312) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAV DIQMTQSPSTLSASVGDRV 29404 YGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI TITCRASQSISSWLAWYQQ (F04) GEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDT KPGKAPKLLIYKASSLESGV
SKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARA PSRFSGSGSGTEFTLTISSL
RGPWSFDPWGQGTLVTVSS QPDDFATYYCEQYDSYPTF (SEQ ID NO: 60) GGGTKVEIK (SEQ ID NO:61) ADI- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKA DIVMTQSPDSLAVSLGERA 28200 SGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEW TINCESSQSLLNSGNQKNY
MGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITAD LTWYQQKPGQPPKPLIYW ESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR ASTRESGVPDRFSGSGSG RGRKASGSFYYYYGMDVWGQGTT TDFTLTISSLQAEDVAVYYC
VTVSS QNDYSYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:62) (SEQ ID NO:66) CDR1: GTFSSYAIS (não Kabat) CDR1: (SEQ ID NO: 63) ESSQSLLNSGNQKNYLT CDR2: GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ (SEQ ID NO:67) ID NO:64) CDR2: WASTRES (SEQ ID CDR3: ARRGRKASGSFYYYYGMDV NO:68) (não Kabat) (SEQ ID NO:65) CDR3: QNDYSYPYT (SEQ ID NO:69) ADI- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA EIVMTQSPATLSVSPGERA 29379 SGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW TLSCRASQSVSSNLAWYQ (E79) MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMT QKPGQAPRLLIYGASTRAT
RDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYC GIPARFSGSGSGTEFTLTIS ARGAPNYGDTTHDYYYMDVWGKG SLQSEDFAVYYCQQYDDW
TTVTVSS PFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:70) (SEQ ID NO:74) CDR1: YTFTSYYMH (não Kabat) CDR1: RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 71) ou SYYMH (SEQ (SEQ ID NO:75) ID NO: 313) CDR2: GASTRAT (SEQ ID CDR2: IINPSGGSTSYAQKFQG NO:76) (SEQ ID NO: 72) CDR3: QQYDDWPFT (SEQ CDR3: ARGAPNYGDTTHDYYYMDV ID NO:77) (não Kabat) (SEQ ID NO: 73) ou GAPNYGDTTHDYYYMDV (SEQ ID NO: 314) ADI- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA EIVLTQSPGTLSLSPGERAT 29463 SGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEW LSCRASQSVSSNLAWYQQ (F63) MGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTM KPGQAPRLLIYGASTRATGI
TRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYY PARFSGSGSGTEFTLTISSL CARDTGEYYDTDDHGMDVWGQGT QSEDFAVYYCQQDDYWPP
TVTVSS TFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:78) (SEQ ID NO:82) CDR1: YTFTGYYMH (não Kabat) CDR1: RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 79) ou GYYMH (SEQ (SEQ ID NO:83) ID NO: 315) CDR2: GASTRAT (SEQ ID CDR2: WINPNSGGTNYAQKFQG NO:84) (SEQ ID NO: 80) CDR3: QQDDYWPPT (SEQ CDR3: ARDTGEYYDTDDHGMDV ID NO: 85) (não Kabat) (SEQ ID NO: 81) ou DTGEYYDTDDHGMDV (SEQ ID NO: 316) ADI- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAA DIQMTQSPSSVSASVGDRV 27744 SGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW TITCRASQGIDSWLAWYQQ (A44) VSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISR KPGKAPKLLIYAASSLQSGV
DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC PSRFSGSGSGTDFTLTISSL AKDGGYYDSGAGDYWGQGTLVTV QPEDFATYYCQQGVSYPR
SS TFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:86) (SEQ ID NO:90) CDR1: FTFSSYAMS (não-Kabat) CDR1: RASQGIDSWLA (SEQ ID NO:87) ou SYAMS (SEQ ID NO: 91) (SEQ ID NO:317) CDR2: AASSLQS (SEQ ID CDR2: AISGSGGSTYYADSVKG NO: 92) (SEQ ID NO: 88) CDR3: QQGVSYPRT (SEQ CDR3: AKDGGYYDSGAGDY (não- ID NO: 93) Kabat) (SEQ ID NO:89) ou DGGYYDSGAGDY (SEQ ID NO:318) ADI- EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA DIQMTQSPSSVSASVGDRV 27749 SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEW TITCRASQGISSWLAWYQQ (A49) VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRD KPGKAPKLLIYAASSLQSGV
NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA PSRFSGSGSGTDFTLTISSL RGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTV QPEDFATYYCQQGVSFPR
SS TFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:94) (SEQ ID NO:98) CDR1: FTFSSYSMN (não Kabat) CDR1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 95) ou SYSMN (SEQ (SEQ ID NO: 99) ID NO: 319) CDR2: AASSLQS (SEQ ID CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG NO: 100) (SEQ ID NO: 96) CDR3: QQGVSFPRT (SEQ CDR3: ARGAPMGAAAGWFDP (não ID NO:101) Kabat) (SEQ ID NO: 97) ou GAPMGAAAGWFDP (SEQ ID NO: 320) ADI- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA EIVLTQSPATLSLSPGERAT 29378 SGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW LSCRASQSVSSYLAWYQQ (E78) MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMT KPGQAPRLLIYDASNRATGI
RDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYC PARFSGSGSGTDFTLTISSL AREGAGFAYGMDYYYMDVWGKGT EPEDFAVYYCQQSDNWPF
TVTVSS TFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:102) (SEQ ID NO:106) CDR1: YTFTSYYMH (não-Kabat) CDR1 (SEQ ID NO: 107) - (SEQ ID NO:103) ou SYYMH RASQSVSSYLA (SEQ ID NO:313) CDR2 (SEQ ID NO:108) - CDR2: IINPSGGSTSYAQKFQG DASNRAT (SEQ ID NO: 104) CDR3 (SEQ ID NO:109) - CDR3: AREGAGFAYGMDYYYMDV QQSDNWPFT (não-Kabat) (SEQ ID NO:105) ou
EGAGFAYGMDYYYMDV (SEQ ID NO:321) A49MI EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA DIQMTQSPSSVSASVGDRV
SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEW TITCRASQGISSWLAWYQQ VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRD KPGKAPKLLIYAASSLQSGV NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA PSRFSGSGSGTDFTLTISSL RGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVS QPEDFATYYCQQGVSFPR
S (SEQ ID NO:322) TFGGGTKVEIK CDR1: FTFSSYSMN (não-Kabat) (SEQ ID NO:98) (SEQ ID NO:95) ou SYSMN CDR1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO:319) (SEQ ID NO:99) CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG CDR2: AASSLQS (SEQ ID (SEQ ID NO:96) NO:100) CDR3: ARGAPIGAAAGWFDP (não- CDR3: QQGVSFPRT (SEQ Kabat) (SEQ ID NO:323) ou ID NO:101)
GAPIGAAAGWFDP (SEQ ID NO:324) A49MQ EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA DIQMTQSPSSVSASVGDRV
SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEW TITCRASQGISSWLAWYQQ VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRD KPGKAPKLLIYAASSLQSGV NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA PSRFSGSGSGTDFTLTISSL
RGAPQGAAAGWFDPWGQGTLVTV QPEDFATYYCQQGVSFPR SS (SEQ ID NO:325) TFGGGTKVEIK CDR1: FTFSSYSMN (não-Kabat) (SEQ ID NO:98) (SEQ ID NO:95) ou SYSMN CDR1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO:319) (SEQ ID NO:99) CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG CDR2: AASSLQS (SEQ ID (SEQ ID NO:96) NO:100) CDR3: ARGAPQGAAAGWFDP (não- CDR3: QQGVSFPRT (SEQ Kabat) (SEQ ID NO:326) ou ID NO:101)
GAPQGAAAGWFDP (SEQ ID NO:327) A49ML EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA DIQMTQSPSSVSASVGDRV
SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEW TITCRASQGISSWLAWYQQ VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRD KPGKAPKLLIYAASSLQSGV NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA PSRFSGSGSGTDFTLTISSL
RGAPLGAAAGWFDPWGQGTLVTV QPEDFATYYCQQGVSFPR SS (SEQ ID NO:328) TFGGGTKVEIK CDR1: FTFSSYSMN (não-Kabat) (SEQ ID NO:98)
(SEQ ID NO:95) ou SYSMN CDR1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO:319) (SEQ ID NO:99) CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG CDR2: AASSLQS (SEQ ID (SEQ ID NO:96) NO:100) CDR3: ARGAPLGAAAGWFDP (não- CDR3: QQGVSFPRT (SEQ Kabat) (SEQ ID NO:329) ou ID NO:101)
GAPLGAAAGWFDP (SEQ ID NO:330) A49MF EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA DIQMTQSPSSVSASVGDRV
SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEW TITCRASQGISSWLAWYQQ VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRD KPGKAPKLLIYAASSLQSGV NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA PSRFSGSGSGTDFTLTISSL
RGAPFGAAAGWFDPWGQGTLVTV QPEDFATYYCQQGVSFPR SS (SEQ ID NO:331) TFGGGTKVEIK CDR1: FTFSSYSMN (não-Kabat) (SEQ ID NO:98) (SEQ ID NO:95) ou SYSMN CDR1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO:319) (SEQ ID NO:99) CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG CDR2: AASSLQS (SEQ ID (SEQ ID NO:96) NO:100) CDR3: ARGAPFGAAAGWFDP (não CDR3: QQGVSFPRT (SEQ Kabat) (SEQ ID NO: 332) ou ID NO:101) GAPFGAAAGWFDP (SEQ ID NO: 333) A49MV EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA DIQMTQSPSSVSASVGDRV
SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEW TITCRASQGISSWLAWYQQ VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRD KPGKAPKLLIYAASSLQSGV NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA PSRFSGSGSGTDFTLTISSL
RGAPVGAAAGWFDPWGQGTLVTV QPEDFATYYCQQGVSFPR SS (SEQ ID NO:334) TFGGGTKVEIK CDR1: FTFSSYSMN (não-Kabat) (SEQ ID NO:98) (SEQ ID NO:95) ou SYSMN CDR1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO:319) (SEQ ID NO:99)
CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG CDR2: AASSLQS (SEQ ID (SEQ ID NO:96) NO:100) CDR3: ARGAPVGAAAGWFDP (não CDR3: QQGVSFPRT (SEQ Kabat) (SEQ ID NO: 335) ou ID NO:101) GAPVGAAAGWFDP (SEQ ID NO: 336) A49- EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAA DIQMTQSPSSVSASVGDRV consenso SGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEW TITCRASQGISSWLAWYQQ
VSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRD KPGKAPKLLIYAASSLQSGV NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA PSRFSGSGSGTDFTLTISSL
RGAPXGAAAGWFDPWGQGTLVTV QPEDFATYYCQQGVSFPR SS, em que X é M, L, I, V, Q, ou F TFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:337) (SEQ ID NO:98) CDR1: FTFSSYSMN (não-Kabat) CDR1: RASQGISSWLA (SEQ ID NO:95) ou SYSMN (SEQ ID NO:99) (SEQ ID NO:319) CDR2: AASSLQS (SEQ ID CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG NO:100) (SEQ ID NO:96) CDR3: QQGVSFPRT (SEQ CDR3: ARGAPXGAAAGWFDP, em ID NO:101) que X é M, L, I, V, Q, ou F (não- Kabat) (SEQ ID NO:338) ou GAPXGAAAGWFDP, em que X é M, L, I, V, Q, ou F (SEQ ID NO:339)
[0126] Alternativamente, um domínio variável de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 110 pode ser emparelhado com um domínio variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 111 para formar um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a NKG2D, conforme ilustrado em US
9.273.136. SEQ ID NO:110
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRY DGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTY
FDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:111
QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLL PSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTV L
[0127] Alternativamente, um domínio variável de cadeia pesada representado por SEQ ID NO: 112 pode ser emparelhado com um domínio variável de cadeia leve representado por SEQ ID NO: 113 para formar um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a NKG2D, conforme ilustrado em US 7,879,985. SEQ ID NO:112
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSG SANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGT
MVTVSS SEQ ID NO:113
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSR
ATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK Sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor
[0128] Antígeno associado ao tumor conforme usado neste documento, significa qualquer antígeno que inclui, mas não se limita a, uma proteína, glicoproteína, gangliosídeo, carboidrato, lipídio que está associado ao câncer. Esse antígeno pode ser expresso em células malignas ou no microambiente tumoral, como vasos sanguíneos associados a tumores, matriz extracelular, estroma mesenquimal ou infiltrados imunes. Por exemplo, o antígeno associado ao tumor pode incluir ANO1, BCMA, EpCAM, CAIX, CEA, CCR4, CD2, CD123, CD133, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CLAUDIN-18.2, DLL3, EGFR/ERBB1, GD2, IGF1R, HER2, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSMA, mesotelina, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, TROP2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4, PD1, 5T4, GPNMB, FR-alfa, PAPP-A, FLT3, GPC3, CXCR4, ROR1, ROR2, HLA-E, PD-L1, VLA4, CD44, CD13, CD15, CD47, CLL1, CD81, CD23, CD79a, CD79b, CD80, CRLF2, SLAMF7, CD138, CA125, NaPi2b, Nectin4, ADAM8, ADAM9, SLC44A4, CA19-9,
LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, ULRA 1, LILRA2, LILRA3, ULRA4, LILRA5, e ULRA6, CCR8, CD7, CTLA4, CX3CR1, ENTPD1, HAVCR2, IL-1R2, PDCD1LG2, TIGIT, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, GEM, NT5E, TNFRSF18, MUC1, P-caderina, Plexina-A1, TNFRSF10B, STEAP1, CDCP1, PTK7, Axl, erbB- 3, EDNRB, Tyrp1, CD14, CD163, CSF3R, Siglec-9, ITGAM, VISTA, B7-H4 (VTCN1), CCR1, LRRC25, PTAFR, SIRPB1, TLR2, TLR4, CD300LB, ATP1A3, CCR5, MUC1 (ou MUC1-C), Plexin-A1, TNFRSF10B, STEAP1, CDCP1, PTK7, AXL, EDNRB, OLR1, e TYRP1 expressa em células cancerosas.
[0129] Um sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor pode ser desenvolvido para se ligar a qualquer antígeno associado ao tumor. Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor inclui um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, que pode emparelhar para se ligar a um antígeno associado ao tumor. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve são arranjados no formato Fab. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve são fundidos em conjunto a partir de um scFv. Sítios de ligação a antígeno associados a tumor exemplares são listados abaixo.
[0130] A Tabela 2 lista sequências peptídicas de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a BCMA. Tabela 2 Clones Sequência de peptídeo de Sequência de peptídeo de domínio variável de cadeia domínio variável de cadeia leve pesada 1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC DIVMTQTPLSLSVTPGEPASIS (US14/77 KASGYSFPDYYINWVRQAPGQ CKSSQSLVHSNGNTYLHWYL 6,649) GLEWMGWIYFASGNSEYNQKF QKPGQSPQLLIYKVSNRFSGV
TGRVTMTRDTSSSTAYMELSSL PDRFSGSGSGADFTLKISRVE
RSEDTAVYFCASLYDYDWYFDV AEDVGVYYCAETSHVPWTFG WGQGTMVTVSS QGTKLEIK (SEQ ID NO: 118) (SEQ ID NO:114) ou
CDR1 (SEQ ID NO: 115) - DYYIN DIVMTQTPLSLSVTPGQPASIS CDR2 (SEQ ID NO: 116) - CKSSQSLVHSNGNTYLHWYL
WIYFASGNSEYNQKFTG QKPGQSPQLLIYKVSNRFSGV CDR3 (SEQ ID NO: 117) - PDRFSGSGSGTDFTLKISRVE
LYDYDWYFDV AEDVGIYYCSQSSIYPWTFGQ
GTKLEIK (SEQ ID NO: 119) CDR1(SEQ ID NO:120) -
KSSQSLVHSNGNTYLH CDR2 (SEQ ID NO:121) -
KVSNRFS CDR3 - AETSHVPWT (SEQ ID NO: 122) ou SQSSIYPWT (SEQ ID NO: 123) 2 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCK DIVLTQSPPSLAMSLGKRATIS (PCT/US1 ASGYTFTDYSINWVKRAPGKGL CRASESVTILGSHLIHWYQQK 5/64269) KWMGWINTETREPAYAYDFRG PGQPPTLLIQLASNVQTGVPA
RFAFSLETSASTAYLQINNLKYE RFSGSGSRTDFTLTIDPVEED DTATYFCALDYSYAMDYWGQG DVAVYYCLQSRTIPRTFGGGT
TSVTVSS KLEIK (SEQ ID NO:124) (SEQ ID NO: 128) CDR1 (SEQ ID NO:125) - DYSIN CDR1 (SEQ ID NO:129) - CDR2 (SEQ ID NO:126) - RASESVTILGSHLIH WINTETREPAYAYDFR CDR2 (SEQ ID NO:130) - CDR3 (SEQ ID NO:127) - LASNVQT DYSYAMDY CDR3 (SEQ ID NO:131) -
LQSRTIPRT 3 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI (US14/12 KASGGTFSNYWMHWVRQAPG TCSASQDISNYLNWYQQKPG 2,391) QGLEWMGATYRGHSDTYYNQK KAPKLLIYYTSNLHSGVPSRF
FKGRVTITADKSTSTAYMELSSL SGSGSGTDFTLTISSLQPEDF RSEDTAVYYCARGAIYNGYDVL ATYYCQQYRKLPWTFGQGTK
DNWGQGTLVTVSS LEIKR (SEQ ID NO: 132) (SEQ ID NO: 136) CDR1 (SEQ ID NO:133) - CDR1 (SEQ ID NO:137) -
NYWMH SASQDISNYLN CDR2 (SEQ ID NO:134) - CDR2 (SEQ ID NO:138) -
ATYRGHSDTYYNQKFKG YTSNLHS CDR3 (SEQ ID NO:135) - CDR3 (SEQ ID NO:139) -
GAIYNGYDVLDN QQYRKLPWT 4 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTC SYVLTQPPSVSVAPGQTARIT (US20170 TVSGGSISSSSYFWGWIRQPPG CGGNNIGSKSVHWYQQPPG 051068) KGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKS QAPVVVVYDDSDRPSGIPER
RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAA FSGSNSGNTA
DTAVYYCARHDGATAGLFDYW TLTISRVEAGDEAVYYCQVW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 140) DSSSDHVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 144) CDR1: SSSYFWG (SEQ ID NO: 141) CDR1: GGNNIGSKSVH (SEQ CDR2: SIYYSGITYYNPSLKS ID NO: 145) (SEQ ID NO: 142) CDR2: DDSDRPS (SEQ ID CDR3: HDGATAGLFDY (SEQ ID NO: 146) NO: 143) CDR3: QVWDSSSDHVV (SEQ ID NO: 147) 5 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC EIVLTQSPGTLSLSPGERATLS (WO2017 AASGFTFSDNAMGWVRQAPGK CRASQSVSDEYLSWYQQKP 021450) GLEWVSAISGPGSSTYYADSVK GQAPRLLIHSASTRATGIPDR
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA FSGSGSGTDFTLAISRLEPED
EDTAVYYCAKVLGWFDYWGQG FAVYYCQQYGYPPDFTFGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 148) TKVEIK (SEQ ID NO: 152) CDR1: RASQSVSDEYLS (SEQ CDR1: RASQSVSDEYLS ID NO: 149) (SEQ ID NO:153) CDR2: SASTRAT (SEQ ID NO: CDR2: SASTRAT (SEQ ID 150) NO:154)
CDR3: QQYGYPPDFT (SEQ ID CDR3: QQYGYPPDFT (SEQ NO: 151) ID NO:155)
[0131] Alternativamente, um domínio de ligação a BCMA pode incluir um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve conforme listado abaixo em EM-801 e EM-901. Domínio variável de cadeia pesada EM-801 (SEQ ID NO:157):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISG
SGG CDR1 CDR2
STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQG TL CDR3
VTVSS Domínio variável de cadeia leve EM-801 (SEQ ID NO:158):
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSR
ATGI CDR1 CDR2
PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGYPPDFTFGQGTKVEIK CDR3 Domínio variável de cadeia pesada EM-901 (SEQ ID NO:159)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNAMGWVRQAPGKGLEWVSAISG PGS CDR1 CDR2
STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQG TL CDR3
VTVSS Domínio variável de cadeia leve EM-901 (SEQ ID NO:160)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSDEYLSWYQQKPGQAPRLLIHSASTR ATGI CDR1 CDR2
PDRFSGSGSGTDFTLAISRLEPEDFAVYYCQQYGYPPDFTFGQGTKVEIK CDR3
[0132] Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a BCMA podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 156. SEQ ID NO:156
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTN AILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTG DEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCK SLPAALSATEIEKSISAR
[0133] A Tabela 3 lista sequências peptídicas de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a CD33. Os domínios de ligação a CD33 podem variar em sua afinidade de ligação a CD33. Tabela 3 Sequência de peptídeo de domínio Sequência de peptídeo de domínio variável de cadeia pesada variável de cadeia leve ADI- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR 10159 AASGFTFSSYGMSWVRQAPGKG ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI [Ab1] LEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGR YDASSLESGVPSRFSGSGSGTEF (G59) FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED TLTISSLQPDDFATYYCQQYESFP TAVYYCAREGGPYYDSSGYFVY TFGGGTKVEIK [SEQ ID NO165] YGMDVWGQGTTVTVSS [SEQ ID CDR1: RASQSISSWLA [SEQ ID NO:161] NO:166] CDR1: FTFSSYGMS [SEQ ID NO: CDR2: DASSLES [SEQ ID NO:167] 162] CDR3: QQYESFPT [SEQ ID CDR2: NIKQDGSEKYYVDSVKG NO:168] [SEQ ID NO: 163] CDR3:
AREGGPYYDSSGYFVYYGMDV [SEQ ID NO: 164] ADI- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR 10177 AASGFTFSSYWMSWVRQAPGK ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI [Ab2] GLEWVANIKQDGSEKYYVDSVK YEASSLESGVPSRFSGSGSGTEF
GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRA TLTISSLQPDDFATYYCQQLESYP EDTAVYYCARPLNAGELDVWGQ LTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:173] GTMVTVSS [SEQ ID NO:169] CDR1: RASQSISSWLA [SEQ ID CDR1: FTFSSYWMS [SEQ ID NO:174] NO:170] CDR2: EASSLES [SEQ ID NO:175] CDR2: NIKQDGSEKYYVDSVKG CDR3: QQLESYPLT [SEQ ID [SEQ ID NO:171] NO:176] CDR3: ARPLNAGELDV [SEQ ID NO:172] ADI- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR 11776 ASGFTFSKYTMSWVRQAPGKGL ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI [Ab3] EWVSAIVGSGESTYFADSVKGRF YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEF (H76) TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT TLTISSLQPDDFATYYCQQYDDLP AVYYCAREGGPYYDSSGYFVYY TFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:181] GMDVWGQGTTVTVSS [SEQ ID CDR1: RASQSISSWLA [SEQ ID NO:177] NO:182] CDR1: FTFSKYTMS [SEQ ID CDR2: KASSLES [SEQ ID NO:183] NO:178] CDR3: QQYDDLPT [SEQ ID CDR2: AIVGSGESTYFADSVKG NO:184] [SEQ ID NO:179] CDR3:
AREGGPYYDSSGYFVYYGMDV [SEQ ID NO:180] ADI- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCR 11801 KASGYTFSDYYMHWVRQAPGQ SSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQ [Ab4] GLEWMGMINPSWGSTSYAQKFQ SPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSG
GRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQ EDTAVYYCAREAADGFVGERYF DVALPITFGGGTKVEIK [SEQ ID DLWGRGTLVTVSS [SEQ ID NO:189] NO:185] CDR1: RSSQSLLYSNGYNYLD CDR1: YTFSDYYMH [SEQ ID [SEQ ID NO:190] NO:186] CDR2: LGSNRAS [SEQ ID NO:191]
CDR2: MINPSWGSTSYAQKFQG CDR3: MQDVALPIT [SEQ ID [SEQ ID NO:187] NO:192] CDR3: AREAADGFVGERYFDL [SEQ ID NO:188] ADI- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR 11807 AASGFTFGSYWMSWVRQAPGK ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI [Ab5] GLEWVATIKQDGSEKSYVDSVKG YEASSLESGVPSRFSGSGSGTEF (I07) RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE TLTISSLQPDDFATYYCQQSQSYP DTAVYYCARPLNAGELDVWGQG PITFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:197] TMVTVSS [SEQ ID NO:193] CDR1: RASQSISSWLA [SEQ ID CDR1: FTFGSYWMS [SEQ ID NO: NO:198] 194] CDR2: EASSLES [SEQ ID NO:199] CDR2: TIKQDGSEKSYVDSVKG CDR3: QQSQSYPPIT [SEQ ID [SEQ ID NO:195] NO:200] CDR3: ARPLNAGELDV [SEQ ID NO:196] ADI- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR 11809 AASGFTFPSYWMSWVRQAPGK ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI [Ab6] GLEWVATIKRDGSEKGYVDSVKG YEASSLESGVPSRFSGSGSGTEF
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE TLTISSLQPDDFATYYCQQSQSYP DTAVYYCARPLNAGELDVWGQG PITFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:205] TMVTVSS [SEQ ID NO:201] CDR1: RASQSISSWLA [SEQ ID CDR1: FTFPSYWMS [SEQ ID NO:206] NO:202] CDR2: EASSLES [SEQ ID NO:207] CDR2: TIKRDGSEKGYVDSVKG CDR3: QQSQSYPPIT [SEQ ID [SEQ ID NO:203] NO:208] CDR3: ARPLNAGELDV [SEQ ID NO:204] ADI- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCR 11815 KASGYTFGTYYMHWVRQAPGQ ASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLI [Ab7] GLEWMGIINPSRGSTVYAQKFQG YAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDF
RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSE TLTISSLQPEDFATYYCQQAHSYP
DTAVYYCARGAGYDDEDMDVW LTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:213] GKGTTVTVSS [SEQ ID NO:209] CDR1: RASQGIDSWLA [SEQ ID CDR1: YTFGTYYMH [SEQ ID NO:214] NO:210] CDR2: AASSLQS [SEQ ID NO:215] CDR2: IINPSRGSTVYAQKFQG CDR3: QQAHSYPLT [SEQ ID [SEQ ID NO:211] NO:216] CDR3: ARGAGYDDEDMDV [SEQ ID NO:212] ADI- EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR 11819 ASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL ASNSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI [Ab8] EWVSSISSSSEGIYYADSVKGRF YEASSTKSGVPSRFSGSGSGTEF
TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT TLTISSLQPDDFATYYCQQYDDLP AVYYCAREGGPYYDSSGYFVYY TFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:221] GMDVWGQGTTVTVSS [SEQ ID CDR1: RASNSISSWLA [SEQ ID NO:217] NO:222] CDR1: FTFSSYAMS [SEQ ID CDR2: EASSTKS [SEQ ID NO:223] NO:218] CDR3: QQYDDLPT [SEQ ID CDR2: SISSSSEGIYYADSVKG NO:224] [SEQ ID NO:219] CDR3:
AREGGPYYDSSGYFVYYGMDV [SEQ ID NO:220] ADI- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCR 11830 AASGFTFSSYWMSWVRQAPGK ASQVIYSYLNWYQQKPGKAPKLLI [Ab9] GLEWVANINTDGSEVYYVDSVKG YAASSLKSGVPSRFSGSGSGTDF
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE TLTISSLQPEDFATYYCQQVYDTP DTAVYYCARDVGPGIAYQGHFDY LTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:229] WGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:225] CDR1: RASQVIYSYLN [SEQ ID CDR1: FTFSSYWMS [SEQ ID NO:230] NO:226] CDR2: AASSLKS [SEQ ID NO:231] CDR2: NINTDGSEVYYVDSVKG CDR3: QQVYDTPLT [SEQ ID [SEQ ID NO:227] NO:232]
CDR3: ARDVGPGIAYQGHFDY [SEQ ID NO:228] ADI- QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCT EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRA 11835 VSGGSISSTDYYWGWIRQPPGK SHSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLI [Ab10] GLEWIGSIGYSGTYYNPSLKSRV YDASNRATGIPARFSGSGSGTDFT (I35) TISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTA LTISSLEPEDFAVYYCQQYDNLPT VYYCARETAHDVHGMDVWGQG FGGGTKVEIK [SEQ ID NO:237] TTVTVSS [SEQ ID NO: 233] CDR1: RASHSVYSYLA [SEQ ID CDR1: GSISSTDYYWG [SEQ ID NO:238] NO: 234] CDR2: DASNRAT [SEQ ID NO:239] CDR2: SIGYSGTYYNPSLKS [SEQ CDR3: QQYDNLPT [SEQ ID NO: ID NO:235] 240] CDR3: ARETAHDVHGMDV [SEQ ID NO:236] Lintuzuma QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCR b KASGYTFTDYNMHWVRQAPGQ ASESVDNYGISFMNWFQQKPGKA
GLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKS PKLLIYAASNQGSGVPSRFSGSGS KATITADESTNTAYMELSSLRSED GTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQS
TAVYYCARGRPAMDYWGQGTLV KEVPWTFGQGTKVEIK TVSS (SEQ ID NO:245) (SEQ ID NO:241) CDR1(SEQ ID NO:246) - CDR1 (SEQ ID NO:242) - ESVDNYGISFMN GYTFTDY CDR2 (SEQ ID NO:247) - CDR2 (SEQ ID NO:243) - AASNQGS YIYPYNGGTG CDR3 (SEQ ID NO: 248) - CDR3 (SEQ ID NO:244) - QQSKEVPWT
GRPAMDY Gemtuzu EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRA mab KASGYTITDSNIHWVRQAPGQSL SESLDNYGIRFLTWFQQKPGKAP
EWIGYIYPYNGGTDYNQKFKNRA KLLMYAASNQGSGVPSRFSGSGS TLTVDNPTNTAYMELSSLRSEDT GTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQT AFYYCVNGNPWLAYWGQGTLVT KEVPWSFGQGTKVEVK
VSS (SEQ ID NO:249) (SEQ ID NO:253) CDR1 (SEQ ID NO:250) - CDR1 (SEQ ID NO:254) -
GYTITDS ESLDNYGIRFLT CDR2 (SEQ ID NO:251) - CDR2 (SEQ ID NO:255) -
YIYPYNGGTD AASNQGS CDR3 (SEQ ID NO:252) - CDR3 (SEQ ID NO:256) -
GNPWLAY QQTKEVPWS anti-CD33 QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSC EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCK (US KASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGL SSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPG 7,557,189 EWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKA QSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGS ) TLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDS GSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCH
AVYYCAREVRLRYFDVWGQGTT QYLSSRTFGQGTKLEIKR VTVSS (SEQ ID NO:261) (SEQ ID NO:257) CDR1 (SEQ ID NO:262) - CDR1 (SEQ ID NO:258) - QSVFFSSSQKNYLA GYTFTSY CDR2 (SEQ ID NO:263) - CDR2 (SEQ ID NO:259) - WASTRES YPGNDD CDR3 (SEQ ID NO:264) - CDR3 (SEQ ID NO:260) - HQYLSSRT
EVRLRYFDV vadastuxi QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCK mab KASGYTFTNYDINWVRQAPGQG ASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLI (US LEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKAK YRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDY 13/804,22 ATLTADTSTSTAYMELRSLRSDD TLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPL 7) TAVYYCASGYEDAMDYWGQGTT TFGGGTKVEIKR VTVSSA (SEQ ID NO:269) (SEQ ID NO:265) CDR1 (SEQ ID NO:270): CDR1 (SEQ ID NO:266): QDINSYLS GYTFTNY CDR2 (SEQ ID NO:271): CDR2 (SEQ ID NO:267): YPGDGS RANRLVD CDR3 (SEQ ID NO:268): CDR3 (SEQ ID NO:272):
GYEDAMDY LQYDEFPLT
[0134] Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a CD33 podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 273. SEQ ID NO:273
MPLLLLLPLLWAGALAMDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSP VHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDAR RRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCS VSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGA GVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALC LCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAA PTVEMDEELHYASLNFHGMNPSKDTSTEYSEVRTQ
[0135] A Tabela 4 lista sequências peptídicas de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a HER2. Tabela 4 Clones Sequência de aminoácidos de Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia domínio variável de cadeia pesada leve Trastuzu EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC DIQMTQSPSSLSASVGDRVT mab AASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGL ITCRASQDVNTAVAWYQQK
EWVARIYPTNGYTRYADSVKGR PGKAPKLLIYSASFLYSGVPS FTISADTSKNTAYLQMNSLRAED RFSGSRSGTDFTLTISSLQP TAVYYCSRWGGDGFYAMDYWG EDFATYYCQQHYTTPPTFG
QGTLVTVSS QGTKVEIK (SEQ ID NO:274) (SEQ ID NO:278) CDR1(SEQ ID NO:275) - CDR1(SEQ ID NO:279) -
GFNIKDT QDVNTAVA CDR2 (SEQ ID NO:276) - CDR2 (SEQ ID NO:280) -
YPTNGY SASFLYS CDR3 (SEQ ID NO:277) - CDR3 (SEQ ID NO:281) -
WGGDGFYAMDY QQHYTTPPT Pertuzum EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC DIQMTQSPSSLSASVGDRVT ab AASGFTFTDYTMDWVRQAPGK ITCKASQDVSIGVAWYQQKP
GLEWVADVNPNSGGSIYNQRFK GKAPKLLIYSASYRYTGVPS GRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLR RFSGSGSGTDFTLTISSLQP AEDTAVYYCARNLGPSFYFDYW EDFATYYCQQYYIYPYTFGQ
GQGTLVTVSSA GTKVEIKR (SEQ ID NO:282) (SEQ ID NO:286) CDR1 (SEQ ID NO:283) - CDR1 (SEQ ID NO:287) -
GFTFTDY QDVSIGVA CDR2 (SEQ ID NO:284) - CDR2 (SEQ ID NO:288) -
NPNSGG SASYRYT CDR3 (SEQ ID NO:285) - CDR3 (SEQ ID NO:289) -
NLGPSFYFDY QQYYIYPYT MGAH22 QVQLQQSGPELVKPGASLKLSC DIVMTQSHKFMSTSVGDRVS (US TASGFNIKDTYIHWVKQRPEQGL ITCKASQDVNTAVAWYQQK 8,802,09 EWIGRIYPTNGYTRYDPKFQDKA PGHSPKLLIYSASFRYTGVP 3) TITADTSSNTAYLQVSRLTSEDTA DRFTGSRSGTDFTFTISSVQ
VYYCSRWGGDGFYAMDYWGQ AEDLAVYYCQQHYTTPPTFG
GASVTVSSA GGTKVEIKR (SEQ ID NO:290) (SEQ ID NO:294) CDR1 (SEQ ID NO:291) - CDR1 (SEQ ID NO:295) -
GFNIKDT QDVNTAVA CDR2 (SEQ ID NO:292) - CDR2 (SEQ ID NO:296) -
YPTNGY SASFRYT CDR3 (SEQ ID NO:293) - CDR3 (SEQ ID NO:297) -
WGGDGFYAMDY QQHYTTPPT
[0136] Alternativamente, novos sítios de ligação ao antígeno que podem se ligar a HER2 podem ser identificados por triagem para ligação à sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 298.
MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQ VVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFE DNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQ DTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRT VCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPAL VTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAE DGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPE SFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRI LHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPH QALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVE ECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPF CVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRA SPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAM PNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPK ANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRL GSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDI DETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGI PAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMAR DPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDP APGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDG DLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQ PDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPE
YLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEY LGLDVPV (SEQ ID NO:298).
[0137] Um fragmento de ligação a antígeno de TCR pode ser desenvolvido para se ligar a um peptídeo antígeno associado a tumor apresentado por um MHC. Em algumas modalidades, o fragmento de TCR de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia alfa e um domínio variável de cadeia beta, que pode emparelhar para se ligar a um peptídeo TAA apresentado por um MHC. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia alfa e o domínio variável da cadeia beta são arranjados no formato de fragmento extracelular do TCR. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia alfa e o domínio variável da cadeia beta são fundidos a partir de um fragmento scTCR.
[0138] Exemplos não limitantes de proteínas que podem ser processadas em peptídeos TAA direcionáveis para TCR incluem antígenos de diferenciação de tecidos (por exemplo, MART-1, gp100, CEA, CD19 e tirosinase), antígenos de linhagem germinativa tumoral (por exemplo, NY-ESO-1, MAGE -A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A12, MAGE-C2, BAGE1, GAGE1, CTAG1, CTAG2, XAGE-1B e SSX2), proteínas normais superexpressas por células cancerígenas (por exemplo, hTERT, EGFR, ERBB2, WT1, MUC1 e mesotelina), proteínas virais (por exemplo, HPV, EBV e MCC) e antígenos mutados específicos de tumor. Sítios de ligação a antígeno associados a tumor exemplares são listados abaixo.
[0139] A Tabela 5 lista as sequências peptídicas de alvos de TCR e as sequências de cadeia alfa e beta de TCR correspondentes. Tabela 5 Proteína alvo e Fragmento extracelular do Fragmento extracelular do peptídeo TCRα TCR-beta apresentado domínio variável de cadeia α Domínio variável de cadeia β por um MHC (Vα) (Vβ) CDR3 de cadeia α (CDR3α) CDR de cadeia β (CDR3β) ELAVL4 KEVEQNSGPLSVPEGAIASL NAGVTQTPKFQVLKTGQSM (UniProt ID NCTYSDRGSQSFFWYRQY TLQCAQDMNHEYMSWYRQ P26378) SGKSPELIMSIYSNGDKEDG DPGMGLRLIHYSVGAGITDQ
LGYGFVNYI RFTAQLNKASQYVSLLIRDS GEVPNGYNVSRSTTEDFPL (SEQ ID QPSDSATYLCAVTTDSWGK RLLSAAPSQTSVYFCASRP NO:425) LQFGAGTQVVVTPDIQNPD GLAGGRPEQYFGPGTRLTV apresentado PAVYQLRDSKSSDKSVCLFT TEDLKNVFPPEVAVFEPSEA por HLA- DFDSQTNVSQSKDSDVYITD EISHTQKATLVCLATGFYPD A*02:01:48 KTVLDMRSMDFKSNSAVAW HVELSWWVNGKEVHSGVS
SNKSDFACANAFNNSIIPED TDPQPLKEQPALNDSRYAL TFFPS (SEQ ID NO:349) SSRLRVSATFWQDPRNHFR Vα: CQVQFYGLSENDEWTQDR
KEVEQNSGPLSVPEGAIASL AKPVTQIVSAEAWGRAD
NCTYSDRGSQSFFWYRQY (SEQ ID NO:350) SGKSPELIMSIYSNGDKEDG Vβ:
RFTAQLNKASQYVSLLIRDS NAGVTQTPKFQVLKTGQSM QPSDSATYLCAVTTDSWGK TLQCAQDMNHEYMSWYRQ
LQFGAGTQVVVTPDIQNP DPGMGLRLIHYSVGAGITDQ (SEQ ID NO:351) GEVPNGYNVSRSTTEDFPL CDR3α: CAVTTDSWGKLQF RLLSAAPSQTSVYFCASRP (SEQ ID NO:353) GLAGGRPEQYFGPGTRLTV TEDLKNVF (SEQ ID NO:352) CDR3β:
CASRPGLAGGRPEQYF (SEQ ID NO:354) Insulina EVEQDPGPLSVPEGAIVSLN AGVIQSPRHEVTEMGQQVT (UniProt ID CTYSNSAFQYFMWYRQYS LRCKPISGHDYLFWYRQTM P01308) RKGPELLMYTYSSGNKEDG MRGLELLIYFNNNVPIDDSG
ALWGPDPAA RFTAQVDKSSKYISLFIRDS MPEDRFSAKMPNASFSTLKI A (SEQ ID QPSDSATYLCAMRGDSSYK QPSEPRDSAVYFCASSLWE NO:426) LIFGSGTRLLVRPDIQNPDP KLAKNIQYFGAGTRLSVLED apresentado AVYQLRDSKSSDKSVCLFT LKNVFPPEVAVFEPSEAEIS por HLA- DFDSQTNVSQSKDSDVYITD HTQKATLVCLATGFYPDHVE A*02:01:48 KCVLDMRSMDFKSNSAVA LSWWVNGKEVHSGVCTDP
WSNKSDFACANAFNNSIIPE QPLKEQPALNDSRYALSSRL DTFFPS (SEQ ID NO:355) RVSATFWQDPRNHFRCQV Vα: QFYGLSENDEWTQDRAKPV
EVEQDPGPLSVPEGAIVSLN TQIVSAEAWGRAD CTYSNSAFQYFMWYRQYS (SEQ ID NO:356) RKGPELLMYTYSSGNKEDG Vβ:
RFTAQVDKSSKYISLFIRDS AGVIQSPRHEVTEMGQQVT QPSDSATYLCAMRGDSSYK LRCKPISGHDYLFWYRQTM
LIFGSGTRLLVRPDIQNP MRGLELLIYFNNNVPIDDSG (SEQ ID NO:357) MPEDRFSAKMPNASFSTLKI CDR3α: CAMRGDSSYKLIF QPSEPRDSAVYFCASSLWE
(SEQ ID NO:359) KLAKNIQYFGAGTRLSVLED LKNVF (SEQ ID NO:358) CDR3β:
CASSLWEKLAKNIQYF (SEQ ID NO:360)
TERT IQVEQSPPDLILQEGANSTL AGVTQTPKFQVLKTGQSMT (UniProt ID RCNFSDSVNNLWWFHQNP LQCAQDMNHEYMSWYRQD O14746) WGQLINLFYIPSGTKQNGRL PGMGLRLIHYSIHPEYTDQG
ILAKFLHWL SATTVATERYSLLYISSSQTT EVPNGYNVSRSTTEDFPLRL (SEQ ID DSGVYFCAVDSATALPYGYI LSAAPSQTSVYFCASSYQG NO:340) FGTGTRLKVLANIQNPDPAV TEAFFGQGTRLTVVEDLNKV apresentado YQLRDSKSSDKSVCLFTDF FPPEVAVFEPSEAEISHTQK por HLA- DSQTNVSQSKDSDVYITDK ATLVCLATGFYPDHVELSW A*02:01:48 CVLDMRSMDFKSNSAVAW WVNGKEVHSGVCTDPQPLK
SNKSDFACANAFNNSIIPED EQPALNDSRYALSSRLRVS TFFPS (SEQ ID NO:361) ATFWQDPRNHFRCQVQFY Vα: GLSENDEWTQDRAKPVTQI
IQVEQSPPDLILQEGANSTL VSAEAWGRAD RCNFSDSVNNLWWFHQNP (SEQ ID NO:362) WGQLINLFYIPSGTKQNGRL Vβ:
SATTVATERYSLLYISSSQTT AGVTQTPKFQVLKTGQSMT DSGVYFCAVDSATALPYGYI LQCAQDMNHEYMSWYRQD
FGTGTRLKVLANIQNP PGMGLRLIHYSIHPEYTDQG (SEQ ID NO:363) EVPNGYNVSRSTTEDFPLRL CDR3α: LSAAPSQTSVYFCASSYQG
CAVDSATALPYGYIF TEAFFGQGTRLTVVEDLNKV (SEQ ID NO:365) F (SEQ ID NO:364) CDR3β: CASSYQGTEAFF (SEQ ID NO:366) ERBB2 EVEQDPGPLSVPEGAIVSLN AGVAQSPRYKIIEKRQSVAF (UniProt ID CTYSNSAFQYFMWYRQYS WCNPISGHATLYWYQQILG P04626) RKGPELLMYTYSSGNKEDG QGPKLLIQFQNNGVVDDSQ
KIFGSLAFL RFTAQVDKSSKYISLFIRDS LPKDRFSAERLKGVDSTLKI (SEQ ID QPSDSATYLCAMSLYYGGS QPAKLEDSAVYLCASSLEIF NO:341) QGNLIFGKGTKLSVKPDPAV GGIADTDTQYFGPGTRLTVL apresentado YQLRDSKSSDKSVCLFTDF EDLKNVFPPEVAVFEPSEAE por HLA-A*02 DSQTNVSQSKDSDVYITDK ISHTQKATLVCLATGFYPDH
CVLDMRSMDFKSNSAVAW VELSWWVNGKEVHSGVCT
SNKSDFACANAFNNSIIPED DPQPLKEQPALNDSRYALS TFFPS (SEQ ID NO:428) SRLRVSATFWQDPRNHFRC Vα: QVQFYGLSENDEWTQDRA
EVEQDPGPLSVPEGAIVSLN KPVTQIVSAEAWGRAD CTYSNSAFQYFMWYRQYS (SEQ ID NO:429) RKGPELLMYTYSSGNKEDG Vβ:
RFTAQVDKSSKYISLFIRDS AGVAQSPRYKIIEKRQSVAF QPSDSATYLCAMSLYYGGS WCNPISGHATLYWYQQILG
QGNLIFGKGTKLSVKP QGPKLLIQFQNNGVVDDSQ (SEQ ID NO:430) LPKDRFSAERLKGVDSTLKI CDR3α: QPAKLEDSAVYLCASSLEIF
CAMSLYYGGSQGNLIF GGIADTDTQYF (SEQ ID NO:367) GPGTRLTVLEDLKNVF (SEQ ID NO:431) CDR3β:
CASSLEIFGGIADTDTQYF (SEQ ID NO:368) WT1 EVEQNSGPLSVPEGAIASLN NAGVTQTPKFRVLKTGQSM (UniProt ID CTYSDRGSQSFFWYRQYS TLLCAQDMNHEYMYWYRQ P19544) GKSPELIMFIYSNGDKEDGR DPGMGLRLIHYSVGEGTTA
RMFPNAPYL FTAQLNKASQYVSLLIRDSQ KGEVPDGYNVSRLKKQNFL (SEQ ID PSDSATYLCAVNDQGGGAD LGLESAAPSQTSVYFCASS NO:342) GLTFGKGTHLIIQPDPAVYQ WWDTGELFFGEGSRLTVLE apresentado LRDSKSSDKSVCLFTDFDS DLKNVFPPEVAVFEPSEAEI por HLA-A*02 QTNVSQSKDSDVYITDKCVL SHTQKATLVCLATGFYPDHV
DMRSMDFKSNSAVAWSNK ELSWWVNGKEVHSGVCTD
SDFACANAFNNSIIPEDTFFP PQPLKEQPALNDSRYALSS S (SEQ ID NO:432) RLRVSATFWQDPRNHFRCQ Vα: VQFYGLSENDEWTQDRAKP
EVEQNSGPLSVPEGAIASLN VTQIVSAEAWGRAD CTYSDRGSQSFFWYRQYS (SEQ ID NO:433) GKSPELIMFIYSNGDKEDGR Vβ:
FTAQLNKASQYVSLLIRDSQ NAGVTQTPKFRVLKTGQSM PSDSATYLCAVNDQGGGAD TLLCAQDMNHEYMYWYRQ
GLTFGKGTHLIIQP DPGMGLRLIHYSVGEGTTA (SEQ ID NO:434) KGEVPDGYNVSRLKKQNFL CDR3α: LGLESAAPSQTSVYFCASS
CAVNDQGGGADGLTF WWDTGELFFGEGSRLTVLE (SEQ ID NO:369) DLKNVF (SEQ ID NO:435) CDR3β: CASSWWDTGELFF (SEQ ID NO:370) WT1 AQSVTQLGSHVSVSEGALV DVKVTQSSRYLVKRTGEKV (UniProt ID LLRCNYSSSVPPYLFWYVQ FLECVQDMDHENMFWYRQ P19544) YPQGLQLLLKYTSAATLVKG DPGLGLRLIYFSYDVKMKEK
RMFPNAPYL INGFEAEFKKSETSFHLTKP GDIPEGYSVSREKKERFSLIL (SEQ ID SAHMSDAAEYFCAVSEGGD ESASTNQTSMYLCAWGTLA NO:342) YKLSFGAGTTVTVRADPAVY TEQYFGPGTRLTVTEDLKNV apresentado QLRDSKSSDKSVCLFTDFD FPPEVAVFEPSEAEISHTQK por HLA-A*02 SQTNVSQSKDSDVYITDKCV ATLVCLATGFYPDHVELSW
LDMRSMDFKSNSAVAWSN WVNGKEVHSGVCTDPQPLK
KSDFACANAFNNSIIPEDTFF EQPALNDSRYALSSRLRVS PS (SEQ ID NO:436) ATFWQDPRNHFRCQVQFY Vα: GLSENDEWTQDRAKPVTQI
AQSVTQLGSHVSVSEGALV VSAEAWGRAD LLRCNYSSSVPPYLFWYVQ (SEQ ID NO:437) YPQGLQLLLKYTSAATLVKG Vβ:
INGFEAEFKKSETSFHLTKP DVKVTQSSRYLVKRTGEKV SAHMSDAAEYFCAVSEGGD FLECVQDMDHENMFWYRQ
YKLSFGAGTTVTVRA DPGLGLRLIYFSYDVKMKEK (SEQ ID NO:438) GDIPEGYSVSREKKERFSLIL CDR3α: CAVSEGGDYKLSF ESASTNQTSMYLCAWGTLA (SEQ ID NO:371) TEQYFGPGTRLTVTEDLKNV F (SEQ ID NO:439) CDR3β: CAWGTLATEQYF (SEQ ID NO:372) MAGE-A3 AQEVTQIPAALSVPEGENLV AGVTQTPRYLIKTRGQQVTL (UniProt ID LNCSFTDSAIYNLQWFRQD SCSPISGHRSVSWYQQTPG P43357) PGKGLTSLLYVRPYQREQT QGLQFLFEYFSETQRNKGN
CASSFNMATG SGRLNASLDKSSGRSTLYIA FPGRFSGRQFSNSRSEMNV QYF (SEQ ID ASQPGDSATYLCAVRPGGA STLELGDSALYLCASSFNMA NO:343) GPFFVVFGKGTKLSVIPNIQ TGQYFGPGTRLTVTEDLKN apresentado NPDPAVYQLRDSKSSDKSV VFPPEVAVFEPSEAEISHTQ por HLA-A1 CLFTDFDSQTNVSQSKDSD KATLVCLATGFYPDHVELS
VYITDKCVLDMRSMDFKSN WWVNGKEVHSGVCTDPQP
SAVAWSNKSDFACANAFNN LKEQPALNDSRYALSSRLRV SIIP (SEQ ID NO:373) SATFWQDPRNHFRCQVQF Vα: YGLSENDEWTQDRAKPVTQ
AQEVTQIPAALSVPEGENLV IVSAEAWGRAD LNCSFTDSAIYNLQWFRQD (SEQ ID NO:374) PGKGLTSLLYVRPYQREQT Vβ:
SGRLNASLDKSSGRSTLYIA AGVTQTPRYLIKTRGQQVTL ASQPGDSATYLCAVRPGGA SCSPISGHRSVSWYQQTPG
GPFFVVFGKGTKLSVIPNIQ QGLQFLFEYFSETQRNKGN NP (SEQ ID NO:375) FPGRFSGRQFSNSRSEMNV CDR3α: CAVRPGGAGPFF STLELGDSALYLCASSFNMA (SEQ ID NO:377) TGQYFGPGTRLTVTEDLKN VF (SEQ ID NO:376) CDR3β: CASSFNMATGQYF (SEQ ID NO:378) MART1 EVEQDPGPLSVPEGAIVSLN EAQVTQNPRYLITVTGKKLT
(UniProt ID CTYSNSAFQYFMWYRQYS VTCSQNMNHEYMSWYRQD Q16655) RKGPELLMYTYSSGNKEDG PGLGLRQIYYSMNVEVTDK
EAAGIGILTV RFTAQVDKSSKYISLFIRDS GDVPEGYKVSRKEKRNFPLI (SEQ ID QPSDSATYLCAMSETGGFK LESPSPNQTSLYFCASSLVG NO:344) TIFGAGTRLFVKANIQNPDP TAGSPLHFGNGTRLTVTEDL apresentado AVYQLRDSKSSDKSVCLFT NKVFPPEVAVFEPSEAEISH por HLA-A2 DFDSQTNVSQSKDSDVYITD TQKATLVCLATGFFPDHVEL
KTVLDMRSMDFKSNSAVAW SWWVNGKEVHSGVSTDPQ
SNKSDFACANAFNNSIIPED PLKEQPALNDSRYCLSSRLR TFFPS (SEQ ID NO:379) VSATFWQNPRNHFRCQVQ Vα: FYGLSENDEWTQDRAKPVT
EVEQDPGPLSVPEGAIVSLN QIVSAEAWGRAD CTYSNSAFQYFMWYRQYS (SEQ ID NO:380) RKGPELLMYTYSSGNKEDG Vβ:
RFTAQVDKSSKYISLFIRDS EAQVTQNPRYLITVTGKKLT QPSDSATYLCAMSETGGFK VTCSQNMNHEYMSWYRQD
TIFGAGTRLFVKANIQNP PGLGLRQIYYSMNVEVTDK (SEQ ID NO:381) GDVPEGYKVSRKEKRNFPLI CDR3α: CAMSETGGFKTIF LESPSPNQTSLYFCASSLVG (SEQ ID NO:383) TAGSPLHFGNGTRLTVTEDL NKVF (SEQ ID NO:382) CDR3β:
CASSLVGTAGSPLHF (SEQ ID NO:384) SSX2 CDR3α: CDR3β: (UniProt ID CAMTSGFGNEKLTF CATSRGQGGQPQHF Q16385) (SEQ ID NO:387) (SEQ ID NO:388)
KASEKIFYV (SEQ ID NO:345) apresentado por HLA-A2
BIRC5, GESVGLHLPTLSVQEGDNSI DAMVIQNPRYQVTQFGKPV também INCAYSNSASDYFIWYKQES TLSCSQTLNHNVMYWYQQK chamado de GKGPQFIIDIRSNMDKRQGQ SSQAPKLLFHYYDKDFNNE survivina RVTVLLNKTVKHLSLQIAAT ADTPDNFQSRRPNTSFCFL (UniProt ID QPGDSAVYFCAENCAETVT DIRSPGLGDAAMYLCATSR O15392) DSWGKLQFGAGTQVVVTPD GDSTAEPQHFGDGTRLSILE
ELTLGEFLKL PAVYQLRDSKSSDKSVCLFT DLNKVFPPEVAVFEPSEAEI (SEQ ID DFDSQTNVSQSKDSDVYITD SHTQKATLVCLATGFYPDHV NO:346) KTVLDMRSMDFKSNSAVAW ELSWWVNGKEVHSGVCTD apresentado SNKSDFACANAFNNSIIPED PQPLKEQPALNDSRYALSS por HLA-A2 TFFPS (SEQ ID NO:440) RLRVSATFWQDPRNHFRCQ Vα: VQFYGLSENDEWTQDRAKP
GESVGLHLPTLSVQEGDNSI VTQIVSAEAWGRAD INCAYSNSASDYFIWYKQES (SEQ ID NO:441) GKGPQFIIDIRSNMDKRQGQ Vβ:
RVTVLLNKTVKHLSLQIAAT DAMVIQNPRYQVTQFGKPV QPGDSAVYFCAENCAETVT TLSCSQTLNHNVMYWYQQK
DSWGKLQFGAGTQVVVTP SSQAPKLLFHYYDKDFNNE (SEQ ID NO:442) ADTPDNFQSRRPNTSFCFL CDR3α: DIRSPGLGDAAMYLCATSR
CAETVTDSWGKLQF GDSTAEPQHFGDGTRLSILE (SEQ ID NO:389) DLNKVF (SEQ ID NO:443) CDR3β:
CATSRGDSTAEPQHF (SEQ ID NO:390) BIRC5, AQKITQTQPGMFVQEKEAV SQTIHQWPATLVQPVGSPL também TLDCTYDTSDQSYGLFWYK SLECTVEGTSNPNLYWYRQ chamado de QPSSGEMIFLIYQGSYDEQN AAGRGLQLLFYSVGIGQISS survivina ATEGRYSLNFQKARKSANL EVPQNLSASRPQDRQFILSS (UniProt ID VISASQLGDSAMYFCAMRE KKLLLSDSGFYLCAGQDLNT O15392) GGGYNKLIFGAGTRLAVHP EAFFGQGTRLTVVEDLNKVF
ELTLGEFLKL DPAVYQLRDSKSSDKSVCL PPEVAVFEPSEAEISHTQKA
(SEQ ID FTDFDSQTNVSQSKDSDVYI TLVCLATGFYPDHVELSWW NO:346) TDKTVLDMRSMDFKSNSAV VNGKEVHSGVCTDPQPLKE apresentado AWSNKSDFACANAFNNSIIP QPALNDSRYALSSRLRVSAT por HLA-A2 EDTFFPS (SEQ ID NO:385) FWQDPRNHFRCQVQFYGL Vα: SENDEWTQDRAKPVTQIVS
AQKITQTQPGMFVQEKEAV AEAWGRAD TLDCTYDTSDQSYGLFWYK (SEQ ID NO:386) QPSSGEMIFLIYQGSYDEQN Vβ:
ATEGRYSLNFQKARKSANL SQTIHQWPATLVQPVGSPL VISASQLGDSAMYFCAMRE SLECTVEGTSNPNLYWYRQ
GGGYNKLIFGAGTRLAVHP AAGRGLQLLFYSVGIGQISS (SEQ ID NO:444) EVPQNLSASRPQDRQFILSS CDR3α: CAMREGGGYNKLIF KKLLLSDSGFYLCAGQDLNT (SEQ ID NO:391) EAFFGQGTRLTVVEDLNKVF (SEQ ID NO:445) CDR3β: CAGQDLNTEAFF (SEQ ID NO:392)
PRAME AQSVTQLGSHVSVSERALV DSGVTQTPKHLITATGQRVT (UniProt ID LLRCNYSSSVPPYLFWYVQ LRCSPRSGDLSVYWYQQSL P78395) YPNQGLQLLLKYTSAATLVK DQGLQFLIQYYNGEERAKG
QLLALLPSL GINGFEAEFKKSETSFHLTK NILERFSAQQFPDLHSELNL (SEQ ID NO: PSAHMSDAAEYFCAVSGQT SSLELGDSALYFCASARWD 347) GANNLFFGTGTRLTVIPYIQ RGGEQYFGPGTRLTVTEDL apresentado NPDPAVYQLRDSKSSDKSV KNVFPPEVAVFEPSEAEISH por HLA-A2 CLFTDFDSQTNVSQSKDSD TQKATLVCLATGFYPDHVEL
VYITDKTVLDMRSMDFKSNS SWWVNGKEVHSGVSTDPQ AVAWSNKSDFACANAFNNS PLKEQPALNDSRYCLSSRLR
IIPEDTFFPS VSATFWQNPRNHFRCQVQ (SEQ ID NO:393) FYGLSENDEWTQDRAKPVT Vα: QIVSAEAWGRAD AQSVTQLGSHVSVSERALV (SEQ ID NO:394) LLRCNYSSSVPPYLFWYVQ Vβ:
YPNQGLQLLLKYTSAATLVK DSGVTQTPKHLITATGQRVT GINGFEAEFKKSETSFHLTK LRCSPRSGDLSVYWYQQSL PSAHMSDAAEYFCAVSGQT DQGLQFLIQYYNGEERAKG
GANNLFFGTGTRLTVIPYIQ NILERFSAQQFPDLHSELNL NP (SEQ ID NO:395) SSLELGDSALYFCASARWD CDR3α: CAVSGQTGANNLF RGGEQYFGPGTRLTVTEDL (SEQ ID NO:397) KNVF (SEQ ID NO:396) CDR3β:
CASARWDRGGEQYF (SEQ ID NO:398)
PRAME GQQLNQSPQSMFIQEGEDV DVKVTQSSRYLVKRTGEKV (UniProt ID SMNCTSSSIFNTWLWYKQD FLECVQDMDHENMFWYRQ P78395) PGEGPVLLIALYKAGELTSN DPGLGLRLIYFSYDVKMKEK
QLLALLPSL GRLTAQFGITRKDSFLNISAS GDIPEGYSVSREKKERFSLIL (SEQ ID NO: IPSDVGIYFCAGIPRDNYGQ ESASTNQTSMYLCASTPWL 347) NFVFGPGTRLSVLPYIQNPD AGGNEQFFGPGTRLTVLED apresentado PAVYQLRDSKSSDKSVCLFT LKNVFPPEVAVFEPSEAEIS por HLA-A2 DFDSQTNVSQSKDSDVYITD HTQKATLVCLATGFYPDHVE
KTVLDMRSMDFKSNSAVAW LSWWVNGKEVHSGVSTDP
SNKSDFACANAFNNSIIPED QPLKEQPALNDSRYCLSSR TFFPS (SEQ ID NO:399) LRVSATFWQNPRNHFRCQV Vα: QFYGLSENDEWTQDRAKPV
GQQLNQSPQSMFIQEGEDV TQIVSAEAWGRAD SMNCTSSSIFNTWLWYKQD (SEQ ID NO:400) PGEGPVLLIALYKAGELTSN Vβ:
GRLTAQFGITRKDSFLNISAS DVKVTQSSRYLVKRTGEKV IPSDVGIYFCAGIPRDNYGQ FLECVQDMDHENMFWYRQ
NFVFGPGTRLSVLPYIQNP DPGLGLRLIYFSYDVKMKEK (SEQ ID NO:401) GDIPEGYSVSREKKERFSLIL CDR3α: ESASTNQTSMYLCASTPWL
CAGIPRDNYGQNFVF AGGNEQFFGPGTRLTVLED (SEQ ID NO:403) LKNVF (SEQ ID NO:402)
CDR3β:
CASTPWLAGGNEQFF (SEQ ID NO:404)
PRAME QKEVEQNSGPLSVPEGAIAS DSGVTQTPKHLITATGQRVT (UniProt ID LNCTYSDRGSQSFFWYRQY LRCSPRSGDLSVYWYQQSL P78395) SGKSPELIMFIYSNGDKEDG DQGLQFLIQYYNGEERAKG
QLLALLPSL RFTAQLNKASQYVSLLIRDS NILERFSAQQFPDLHSELNL (SEQ ID NO: QPSDSATYLCAVKDNAGNM SSLELGDSALYFCASSDGG 347) LTFGGGTRLMVKPHIQNPD GVYEQYFGPGTRLTVTEDL apresentado PAVYQLRDSKSSDKSVCLFT KNVFPPEVAVFEPSEAEISH por HLA-A2 DFDSQTNVSQSKDSDVYITD TQKATLVCLATGFYPDHVEL
KTVLDMRSMDFKSNSAVAW SWWVNGKEVHSGVSTDPQ
SNKSDFACANAFNNSIIPED PLKEQPALNDSRYCLSSRLR TFFPS (SEQ ID NO:405) VSATFWQNPRNHFRCQVQ Vα: FYGLSENDEWTQDRAKPVT QKEVEQNSGPLSVPEGAIAS QIVSAEAWGRAD (SEQ ID LNCTYSDRGSQSFFWYRQY NO: 406) SGKSPELIMFIYSNGDKEDG Vβ:
RFTAQLNKASQYVSLLIRDS DSGVTQTPKHLITATGQRVT QPSDSATYLCAVKDNAGNM LRCSPRSGDLSVYWYQQSL
LTFGGGTRLMVKPHIQNP DQGLQFLIQYYNGEERAKG (SEQ ID NO:407) NILERFSAQQFPDLHSELNL CDR3α: CAVKDNAGNMLTF SSLELGDSALYFCASSDGG (SEQ ID NO:409) GVYEQYFGPGTRLTVTEDL KNVF (SEQ ID NO:408) CDR3β:
CASSDGGGVYEQYF (SEQ ID NO:410) NY-ESO-1 QEVTQIPAALSVPEGENLVL GVTQTPKFQVLKTGQSMTL (UniProt ID NCSFTDSAIYNLQWFRQDP QCAQDMNHEYMSWYRQDP P78358) GKGLTSLLLIQSSQREQTSG GMGLRLIHYSVGAGITDQGE
SLLMWITQC RLNASLDKSSGRSTLYIAAS VPNGYNVSRSTTEDFPLRLL
(SEQ ID QPGDSATYLCAVRPTSGGS SAAPSQTSVYFCASSYVGN NO:348) YIPTFGRGTSLIVHPYIQNPD TGELFFGEGSRLTVLEDLKN apresentado PAVYQLRDSKSSDKSVCLFT VFPPEVAVFEPSEAEISHTQ por HLA- DFDSQTNVSQSKDSDVYITD KATLVCLATGFYPDHVELS A*02:01:48 KCVLDMRSMDFKSNSAVA WWVNGKEVHSGVCTDPQP
WSNKSDFACANAFNNSIIPE LKEQPALNDSRYALSSRLRV DTFFPS (SEQ ID NO:411) SATFWQDPRNHFRCQVQF Vα: YGLSENDEWTQDRAKPVTQ
QEVTQIPAALSVPEGENLVL IVSAEAWGRAD NCSFTDSAIYNLQWFRQDP (SEQ ID NO:412) GKGLTSLLLIQSSQREQTSG Vβ:
RLNASLDKSSGRSTLYIAAS GVTQTPKFQVLKTGQSMTL QPGDSATYLCAVRPTSGGS QCAQDMNHEYMSWYRQDP
YIPTFGRGTSLIVHPYIQNP GMGLRLIHYSVGAGITDQGE (SEQ ID NO:413) VPNGYNVSRSTTEDFPLRLL CDR3α: SAAPSQTSVYFCASSYVGN
CAVRPTSGGSYIPTF TGELFFGEGSRLTVLEDLKN (SEQ ID NO:415) VF (SEQ ID NO:414) CDR3β: CASSYVGNTGELFF (SEQ ID NO:416) NY-ESO-1 KQQVTQIPAALSVPEGENLV GVTQTPKFQVLKTGQSMTL (UniProt ID LNCSFTDSAIYNLQWFRQD QCAQDMNHEYMSWYRQDP P78358) PGGKLTSLLLIQSSQREQTS GMGLRLIHYSVGAGITDQGE
SLLMWITQC GRLNASLDKSAGSSTLYIAA VPNGYNVSRSTTEDFPLRLL (SEQ ID SQPGDSATYLCAVRPTSGG SAAPSQTSVYFCASSYVGN NO:348) SYIPTFGRGTSLIVHPYIQNP TGELFFGEGSRLTVLEDLKN apresentado DPAVYQLRDSKSSDKSVCL VFPPEVAVFEPSEAEISHTQ por HLA- FTDFDSQTNVSQSKDSDVYI KATLVCLATGFYPDHVELS A*02:01:48 TDKCVLDMRSMDFKSNSAV WWVNGKEVHSGVCTDPQP
AWSNKSDFACANAFNNSIIP LKEQPALNDSRYALSSRLRV
EDTFFPSPE SATFWQDPRNHFRCQVQF (SEQ ID NO:417) YGLSENDEWTQDRAKPVTQ
Vα: IVSAEAWGRAD KQQVTQIPAALSVPEGENLV (SEQ ID NO:412) LNCSFTDSAIYNLQWFRQD Vβ:
PGGKLTSLLLIQSSQREQTS GVTQTPKFQVLKTGQSMTL GRLNASLDKSAGSSTLYIAA QCAQDMNHEYMSWYRQDP SQPGDSATYLCAVRPTSGG GMGLRLIHYSVGAGITDQGE
SYIPTFGRGTSLIVHPYIQNP VPNGYNVSRSTTEDFPLRLL (SEQ ID NO:418) SAAPSQTSVYFCASSYVGN CDR3α: TGELFFGEGSRLTVLEDLKN CAVRPTSGGSYIPTF VF (SEQ ID NO:414) (SEQ ID NO:415) CDR3β: CASSYVGNTGELFF (SEQ ID NO:416) NY-ESO-1 KQEVTQIPAALSVPEGENLV GVTQTPKFQVLKTGQSMTL (UniProt ID LNCSFTDSAIYNLQWFRQD QCAQDMNHEYMSWYRQDP P78358) PGKGLTSLLLIQSSQREQTS GMGLRLIHYSVGAGTTDQG
SLLMWITQC GRLNASLDKSSGSSTLYIAA EVPNGYNVSRSTIEDFPLRL (SEQ ID SQPGDSATYLCAVRPLLDG LSAAPSQTSVYFCASSYLGN NO:348) TYIPTFGRGTSLIVHPYIQNP TGELFFGEGSRLTVLEDLKN apresentado DPAVYQLRDSKSSDKSVCL VFPPEVAVFEPSEAEISHTQ por HLA- FTDFDSQTNVSQSKDSDVYI KATLVCLATGFYPDHVELS A*02:01:48 TDKCVLDMRSMDFKSNSAV WWVNGKEVHSGVCTDPQP
AWSNKSDFACANAFNNS LKEQPALNDSRYALSSRLRV (SEQ ID NO:419) SATFWQDPRNHFRCQVQF Vα: YGLSENDEWTQDRAKPVTQ
KQEVTQIPAALSVPEGENLV IVSAEAWGRAD LNCSFTDSAIYNLQWFRQD (SEQ ID NO:420) PGKGLTSLLLIQSSQREQTS Vβ:
GRLNASLDKSSGSSTLYIAA GVTQTPKFQVLKTGQSMTL SQPGDSATYLCAVRPLLDG QCAQDMNHEYMSWYRQDP
TYIPTFGRGTSLIVHPYIQNP GMGLRLIHYSVGAGTTDQG (SEQ ID NO:421) EVPNGYNVSRSTIEDFPLRL CDR3α: LSAAPSQTSVYFCASSYLGN
CAVRPLLDGTYIPTF TGELFFGEGSRLTVLEDLKN (SEQ ID NO:423) VF (SEQ ID NO:422) CDR3β: CASSYLGNTGELFF (SEQ ID NO:424) Região constante de anticorpo e heterodimerização
[0140] A região constante de anticorpo (domínio Fc) descrita na presente invenção pode derivar de uma região constante de um anticorpo de qualquer espécie que se liga ao CD16. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo humano, como uma região constante da IgG1 humana, uma região constante de IgG2, uma região constante de IgG3 ou uma região constante de IgG4. Em algumas outras modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo de outro mamífero, como coelho, cachorro, gato, camundongo ou cavalo. Em algumas modalidades, a região constante de anticorpo inclui uma dobradiça, um domínio CH2, um domínio CH3 e, opcionalmente, um domínio CH1. Em algumas modalidades, a região constante de anticorpo que inclui uma dobradiça, um domínio CH2, um domínio CH3 e, opcionalmente, um domínio CH1 é derivada de um anticorpo IgG1 humano. Em algumas modalidades, a região constante do anticorpo inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano.
[0141] Dentro do domínio Fc, a ligação a CD16 é mediada pela região de dobradiça e pelo domínio CH2. Por exemplo, na IgG1 humana, a interação com CD16 é focada principalmente nos resíduos de aminoácidos Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 e resíduo de carboidrato N-acetil-D-glucosamina no domínio CH2 (ver Sondermann et al., Nature, 406(6793):267-273). Com base nos domínios conhecidos, as mutações podem ser selecionadas para aprimorar ou reduzir a afinidade de ligação ao CD16, como o uso de bibliotecas exibidas em fagos ou bibliotecas de cDNA exibidas na superfície de leveduras ou podem ser projetadas com base na estrutura tridimensional conhecida da interação.
[0142] Em certas modalidades, mutações que podem ser incorporadas no
CH1 de uma região constante da IgG1 humana podem estar no aminoácido V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 e/ou V173. Em certas modalidades, mutações que podem ser incorporadas no Cκ de uma região constante da IgG1 humana podem estar no aminoácido E123, F116, S176, V163, S174 e/ou T164.
[0143] A montagem de cadeias pesadas de anticorpos heterodiméricos pode ser realizada expressando duas sequências diferentes de cadeias pesadas de anticorpos na mesma célula, o que pode levar à montagem de homodímeros de cada cadeia pesada de anticorpos, bem como à montagem de heterodímeros. A promoção da montagem preferencial de heterodímeros pode ser realizada incorporando diferentes mutações no domínio CH3 de cada região constante de anticorpos, como mostrado nas US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207, US13/866756, US14/647480 e US14/830336. Por exemplo, mutações podem ser feitas no domínio CH3 com base na IgG1 humana e incorporando pares distintos de substituições de aminoácidos dentro de um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo que permite que essas duas cadeias se heterodimerizem seletivamente uma com a outra. As posições das substituições de aminoácidos ilustradas abaixo são numeradas de acordo com o índice da UE como em Kabat.
[0144] Em um cenário, uma substituição de aminoácidos no primeiro polipeptídeo substitui o aminoácido original por um aminoácido maior, selecionado entre arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) ou triptofano (W) e pelo menos um amino a substituição de ácido no segundo polipeptídeo substitui o (s) aminoácido (s) original (s) por um (s) aminoácido (s) menor (s), escolhido (s) de alanina (A), serina (S), treonina (T) ou valina (V), de modo que a maior substituição de aminoácidos (uma protuberância) se encaixa na superfície das substituições menores de aminoácidos (uma cavidade). Por exemplo, um polipeptídeo pode incorporar uma substituição T366W e o outro pode incorporar três substituições, incluindo T366S, L368A e Y407V.
[0145] Uma ou mais mutações podem ser incorporadas na região constante em comparação com a região constante da IgG1 humana, por exemplo em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e/ou K439.
Substituições exemplificativas incluem, por exemplo, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D e K439E.
[0146] Alternativamente, as substituições de aminoácidos podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na Tabela 6. Tabela 6 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo Conjunto 1 S364E/F405A Y349K/T394F Conjunto 2 S364H/D401K Y349T/T411E Conjunto 3 S364H/T394F Y349T/F405A Conjunto 4 S364E/T394F Y349K/F405A Conjunto 5 S364E/T411E Y349K/D401K Conjunto 6 S364D/T394F Y349K/F405A Conjunto 7 S364H/F405A Y349T/T394F Conjunto 8 S364K/E357Q L368D/K370S Conjunto 9 L368D/K370S S364K Conjunto L368E/K370S S364K 10 Conjunto K360E/Q362E D401K 11 Conjunto L368D/K370S S364K/E357L 12 Conjunto K370S S364K/E357Q 13 Conjunto F405L K409R
Conjunto K409R F405L 15
[0147] Alternativamente, as substituições de aminoácidos podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na Tabela 7. Tabela 7 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo Conjunto 1 K409W D399V/F405T Conjunto 2 Y349S E357W Conjunto 3 K360E Q347R Conjunto 4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T Conjunto 5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T Conjunto 6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
[0148] Alternativamente, as substituições de aminoácidos podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na Tabela 8. Tabela 8 Primeiro Segundo Polipeptídeo Polipeptídeo Conjunto 1 T366K/L351K L351D/L368E Conjunto 2 T366K/L351K L351D/Y349E Conjunto 3 T366K/L351K L351D/Y349D Conjunto 4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E Conjunto 5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E Conjunto 6 E356K/D399K K392D/K409D
[0149] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos em cada cadeia polipeptídica pode ser selecionada a partir da Tabela 9.
Tabela 9 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo L351Y, D399R, D399K, T366V, T366I, T366L, S400K, S400R, Y407A, Y407I, T366M, N390D, N390E, Y407V K392L, K392M, K392V, K392F K392D, K392E, K409F, K409W, T411D e T411E
[0150] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácido pode ser selecionada a partir do seguinte conjunto de substituições na Tabela 10, onde a(s) posição(ões) indicada(s) na coluna do Primeiro Polipeptídeo são substituídas por qualquer aminoácido carregado negativamente conhecido e a(s) posição(ões) indicado na segunda coluna polipeptídica é substituído por qualquer aminoácido carregado positivamente conhecido. Tabela 10 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo K392, K370, K409 ou K439 D399, E356 ou E357
[0151] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos pode ser selecionada a partir do seguinte conjunto de substituições na Tabela 11, em que as posições indicadas na coluna Primeiro Polipeptídeo são substituídas por qualquer aminoácido carregado positivamente conhecido e as posições indicadas na coluna Segunda Polipeptídeo são substituídas por qualquer aminoácido carregado negativamente conhecido. Tabela 11 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo D399, E356 ou E357 K409, K439, K370 ou K392
[0152] Alternativamente, as substituições de aminoácidos podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos na Tabela 12. Tabela 12
Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo T350V, L351Y, F405A e Y407V T350V, T366L, K392L, e T394W
[0153] Alternativamente, ou além disso, a estabilidade estrutural de uma proteína hetero-multimérica pode ser aumentada pela introdução de S354C em qualquer uma da primeira ou segunda cadeia polipeptídica e Y349C na cadeia polipeptídica oposta, que forma uma ponte dissulfeto artificial dentro da interface dos dois polipeptídeos.
[0154] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 na posição T366, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere de a sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em T366, L368 e Y407.
[0155] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em T366, L368 e Y407, e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 na posição T366.
[0156] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405 e T411 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Y349, E357, S364, L368, K370, T394, D401, F405 e T411.
[0157] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Y349, E357, S364, L368, K370, T394, D401, F405 e T411 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405 e T411.
[0158] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em L351, D399, S400 e Y407 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em T366, N390, K392, K409 e T411.
[0159] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em T366, N390, K392, K409 e T411 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em L351, D399, S400 e Y407.
[0160] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Q347, Y349, K360 e K409 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Q347, E357, D399 e F405.
[0161] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Q347, E357, D399 e F405 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Y349, K360, Q347 e K409.
[0162] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em K370, K392, K409 e K439 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em D356, E357 e D399.
[0163] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em D356, E357 e D399 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em K370, K392, K409 e K439.
[0164] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em L351, E356, T366 e D399 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Y349, L351, L368, K392 e K409.
[0165] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em Y349, L351, L368, K392 e K409 e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em L351, E356, T366 e D399.
[0166] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 por uma substituição S354C e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 por uma substituição Y349C.
[0167] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 por uma substituição Y349C e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 por uma substituição S354C.
[0168] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 por substituições K360E e K409W e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 pelas substituições O347R, D399V e F405T.
[0169] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 pelas substituições O347R, D399V e F405T e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 pelas substituições K360E e K409W.
[0170] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 por substituições T366W e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 pelas substituições T366S, T368A e Y407V.
[0171] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 pelas substituições T366S, T368A e Y407V e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 por uma substituição T366W.
[0172] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 pelas substituições T350V, L351Y, F405A e Y407V e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 pelas substituições T350V, T366L, K392L e T394W.
[0173] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 pelas substituições T350V, T366L, K392L e T394W e em que a sequência de aminoácidos da outra cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo difere da sequência de aminoácidos de uma região constante da IgG1 pelas substituições T350V, L351Y, F405A e Y407V.
[0174] Listados abaixo estão exemplos de mutações nas regiões constantes que permitem a heterodimerização de duas cadeias polipeptídicas. As cadeias pesadas de trastuzumab A1, A2, B1 e B2 incluem, cada uma , um domínio variável de cadeia pesada de trastuzumab (sequência em negrito) e uma região constante derivada da IgG1 humana com mutações em aminoácidos sublinhados. A cadeia pesada de trastuzumab A1 e a cadeia pesada de trastuzumab B1 podem preferencialmente se emparelhar e formar um heterodímero. A cadeia pesada de trastuzumab A2 e a cadeia pesada de trastuzumab B2 podem preferencialmente se emparelhar e formar um heterodímero. Cadeia pesada de trastuzumab A
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYP TNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSD
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:299). Cadeia pesada de trastuzumab B
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYP TNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:300). Cadeia pesada de trastuzumab A1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYP TNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYP
SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG* (SEQ ID NO:301). Cadeia pesada de trastuzumab B1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYP TNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYA MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYP
SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG* (SEQ ID NO:302).
[0175] As proteínas descritas acima podem ser feitas usando tecnologia de DNA recombinante bastante conhecida pelos versados na técnica. Por exemplo, uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica a primeira cadeia de imunoglobulina compreendendo um scFv, dobradiça e uma região constante de anticorpo pode ser clonada em um primeiro vetor de expressão; uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica a segunda cadeia de imunoglobulina, por exemplo, compreendendo outro scFv, dobradiça e uma região constante de anticorpo ou compreendendo uma cadeia pesada de anticorpo pode ser clonada em um segundo vetor de expressão; e uma terceira sequência de ácidos nucleicos que codifica uma cadeia leve de anticorpo pode ser clonada em um terceiro vetor de expressão. O primeiro, o segundo e, opcionalmente, o terceiro vetores de expressão podem ser transfectados de forma estável em células hospedeiras para produzir as proteínas multiméricas descritas neste documento.
[0176] Para atingir o maior rendimento da proteína de ligação multiespecífica, diferentes proporções do primeiro, segundo e terceiro vetor de expressão podem ser exploradas para determinar a proporção ideal para a transfecção nas células hospedeiras. Após a transfecção, os clones únicos podem ser isolados para geração de banco de células usando métodos conhecidos na técnica, como diluição limitada, ELISA, FACS, microscopia ou Clonepix.
[0177] Os clones podem ser cultivados em condições adequadas para a ampliação do biorreator e a expressão mantida da proteína de ligação multiespecífica. As proteínas de ligação multiespecíficas podem ser isoladas e purificadas usando métodos conhecidos na técnica, incluindo centrifugação, filtração em profundidade, lise celular, homogeneização, congelamento- descongelamento, purificação por afinidade, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca de interação hidrofóbica e cromatografia de modo misto. II. APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS
[0178] A invenção fornece métodos para o tratamento de câncer usando uma proteína de ligação multiespecífica descrita neste documento e/ou uma composição farmacêutica descrita neste documento. Os métodos podem ser usados para tratar uma variedade de cânceres, incluindo um tumor sólido, um linfoma e uma leucemia. O tipo de câncer a ser tratado é desejavelmente compatível com o tipo de célula cancerígena à qual a proteína se liga. Por exemplo, o tratamento de um câncer que expressa HER2, tal como um câncer de mama que expressa HER2, é desejavelmente tratado usando uma proteína descrita neste documento que se liga à proteína. Em certas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de uma variedade de cânceres que expressam BCMA pela administração a um paciente em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica descrita neste documento. Em certas modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de uma variedade de cânceres que expressam CD33 pela administração a um paciente em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica descrita neste documento.
[0179] Consequentemente, um aspecto da invenção fornece um método de tratamento de câncer em um paciente, em que o método compreende a administração a um paciente em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína descrita neste documento para tratar o câncer. Aspectos e modalidades adicionais dos métodos terapêuticos são descritos abaixo.
[0180] O método terapêutico pode ser caracterizado de acordo com o câncer a ser tratado.
Por exemplo, em certas modalidades, o câncer é um tumor sólido.
Em certas outras modalidades, o câncer é câncer cerebral, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de colo do útero, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de endométrio, câncer de esôfago, leucemia, câncer de pulmão, câncer de fígado, melanoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal, câncer de estômago, câncer de testículo ou câncer uterino.
Em ainda outras modalidades, o câncer é um tumor vascularizado, carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, carcinoma de células pequenas, melanoma, neuroblastoma, sarcoma (por exemplo, um angiossarcoma ou condrossarcoma), câncer de laringe, câncer de parotídeo, câncer do trato biliar, câncer da tireoide, melanoma lentiginoso acral, queratoses actínicas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenoide cístico, adenomas, adenossarcoma, carcinoma adenoescamoso, câncer do canal anal, câncer anal, câncer anorretal, tumor astrocítico, carcinoma de glândulas bartolinas, carcinoma de célula basal, câncer biliar, câncer nos ossos, câncer da medula óssea, câncer brônquico, carcinoma de glândula brônquica, carcinoide, colangiocarcinoma, condossarcoma, papiloma/carcinoma do plexo coroide, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, carcinoma de células claras, câncer de tecido conjuntivo, cistoadenoma, câncer do sistema digestório, câncer do duodeno, câncer do sistema endócrino, tumor do seio endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma estromal do endométrio, adenocarcinoma endometrioide, câncer das células endoteliais, câncer ependimário, câncer das células epiteliais, sarcoma de Ewing, câncer de olhos e órbita, câncer genital feminino, hiperplasia nodular focal, câncer de vesícula biliar, câncer de antro gástrico, câncer de fundo gástrico, gastrinoma, glioblastoma, glucagonoma, câncer de coração, hemangioblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatose hepática, câncer hepatobiliar, carcinoma hepatocelular, doença de Hodgkin, câncer de íleo, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia de célula escamosa interepitelial, câncer do ducto biliar intra-hepático, carcinoma de célula escamosa invasiva, câncer do jejuno, câncer das juntas, sarcoma de Kaposi, câncer pélvico, carcinoma de células grandes, câncer do intestino grosso, leiomiossarcoma, melanomas de lentigo maligno,
linfoma, câncer genital masculino, melanoma maligno, tumores mesoteliais malignos, meduloblastoma, meduloepitelioma, câncer meníngeo, câncer mesotelial, carcinoma metastático, câncer de boca, carcinoma mucoepidermoide, mieloma múltiplo, câncer muscular, câncer do trato nasal, câncer do sistema nervoso, adenocarcinoma neuroepitelial melanoma nodular, câncer de pele não epitelial, carcinoma de células tipo grão de aveia ("oat cells"), câncer oligodendroglial, câncer de cavidade oral, osteossarcoma, adenocarcinoma seroso papilar, câncer de pênis, câncer de faringe, tumores da hipófise, plasmocitoma, pseudossarcoma, blastoma pulmonar, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer do sistema respiratório, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, câncer dos seios paranasais, câncer de pele, carcinoma de células pequenas, câncer do intestino delgado, câncer de músculo liso, câncer de tecido mole, tumor secretor de somatostatina, câncer de coluna, carcinoma de células escamosas, câncer de músculo estriado, câncer submesotelial, melanoma disseminativo superficial, leucemia de células T, câncer de língua, carcinoma indiferenciado, câncer de ureter, câncer de uretra, câncer de bexiga urinária, câncer do sistema urinário, câncer de colo uterino, câncer de corpo uterino, melanoma uveal, câncer vaginal, carcinoma verrucoso, VIPoma, câncer de vulva, carcinoma bem diferenciado ou tumor de Wilms.
[0181] Em certas outras modalidades, o câncer a ser tratado é um linfoma não-Hodgkin, como um linfoma de células B ou um linfoma de células T. Em certas modalidades, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de células B, como um linfoma de células B grandes difuso, linfoma de células B primário do mediastino, linfoma folicular, linfoma linfocítico de células pequenas, linfoma das células do manto, linfoma de células B da zona marginal, linfoma de células B da zona marginal extranodal, linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma de células B da zona marginal esplênica, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocítico, leucemia de células pilosas ou linfoma do sistema nervoso central (SNC). Em certas outras modalidades, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de células T, como um linfoma linfoblástico T precursor, linfoma de células T periférico, linfoma de células T cutâneo, linfoma de células T angioimunoblástico, linfoma de células T/natural killer extranodal, linfoma de células T do tipo enteropatia, linfoma de células T do tipo paniculite subcutânea, linfoma anaplásico de células grandes ou linfoma de células T periférico.
[0182] Em certas modalidades, os cânceres são AML, síndromes mielodisplásicas, leucemia mielomonocítica crônica, crise blástica mieloide de leucemia mieloide crônica e ALLs.
[0183] Em certas modalidades, o câncer a ser tratado pode ser caracterizado de acordo com a presença de um antígeno específico expresso na superfície da célula cancerígena. Em certas modalidades, a célula cancerígena pode expressar um ou mais dos seguintes além de BCMA: CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 e PD1.
[0184] Em certas modalidades, a célula cancerígena pode expressar um ou mais dos seguintes além de CD33: CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, TROP2, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 e PD1.
[0185] Em certas modalidades, a célula cancerígena pode expressar um ou mais dos seguintes além de HER2: CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 e PD1.
[0186] Em certas modalidades, o câncer a ser tratado pode ser caracterizado de acordo com a apresentação de um determinado peptídeo TAA por um MHC na superfície da célula cancerígena. Exemplos não limitantes de proteínas que podem ser processadas em peptídeos TAA direcionáveis para TCR incluem antígenos de diferenciação de tecidos (por exemplo, MART-1, gp100, CEA, CD19 e tirosinase), antígenos de linhagem germinativa tumoral (por exemplo, NY-ESO-1, MAGE -A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A12, MAGE-C2, BAGE1, GAGE1, CTAG1, CTAG2, XAGE-1B e SSX2), proteínas normais superexpressas por células cancerígenas (por exemplo, hTERT, EGFR, ERBB2, WT1, MUC1 e mesotelina), proteínas virais (por exemplo, HPV, EBV e MCC) e antígenos mutados específicos de tumor. Em certas modalidades, a célula cancerígena contém um peptídeo ELAVL4 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 425 apresentado por HLA-A*02:01:48. Em certas modalidades, a célula cancerígena contém um peptídeo de insulina com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 426 apresentado por HLA-A*02:01:48. Em certas modalidades, a célula cancerígena contém um peptídeo hTERT com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 340 apresentado por HLA-A*02:01:48. Em certas modalidades, a célula cancerígena contém um peptídeo ERBB2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 341 apresentado por HLA-A*02. Em certas modalidades, a célula cancerígena contém um peptídeo WT1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 342 apresentado por HLA-A*02. Em certas modalidades, a célula cancerígena contém um peptídeo MAGE-A3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 343 apresentado por HLA-A1. Em certas modalidades, a célula cancerígena contém um peptídeo MART1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 344 apresentado por HLA-A2. Em certas modalidades, a célula cancerígena contém um peptídeo BIRC5 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 346 apresentado por HLA-A2. Em certas modalidades, a célula cancerígena contém um peptídeo PRAME com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 347 apresentado por HLA-A2. Em certas modalidades, a célula cancerígena contém um peptídeo NY-ESO-1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 348 apresentado por HLA-A2. Em certas modalidades, a célula cancerígena contém um peptídeo SSX2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 345 apresentado por HLA-A2. III. TERAPIA COMBINADA
[0187] Outro aspecto da invenção fornece terapia combinada. Uma proteína de ligação multiespecífica descrita neste documento pode ser usada em combinação com agentes terapêuticos adicionais para tratar o câncer.
[0188] Agentes terapêuticos exemplificativos que podem ser usados como parte de uma terapia combinada no tratamento de câncer incluem, por exemplo, radiação, mitomicina, tretinoína, ribomustina, gemcitabina, vincristina, etoposídeo, cladribina, mitobronitol, metotrexato, doxorrubicina, carboquona, pentostatina, nitracrina, zinostatina, cetrorelix, letrozol, raltitrexed, daunorubicina, fadrozol,
fotemustina, timalfasina, sobuzoxano, nedaplatina, citarabina, bicalutamida, vinorelbina, vesnarinona, aminoglutetimida, amsacrina, proglumida, acetato eliptínio, ketanserina, doxifluridina, etretinato, isotretinoina, estreptozocina, nimustina, vindesina, flutamida, drogenil, butocina, carmofur, razoxano, sizofilan, carboplatina, mitolactol, tegafur, ifosfamida, prednimustina, picibanil, levamisol, teniposídeo, improsulfan, enocitabina, lisurida, oximetolona, tamoxifeno, progesterona, mepitiostano, epitiostanol, formestano, interferon-alfa, interferon-2 alfa, interon-beta, interferon-gama, fator 1 estimulador de colônias, fator 2 estimulador de colônias, denileucina diftitox, interleucina-2, fator de liberação do hormônio luteinizante e variações dos agentes acima mencionados que podem exibir ligação diferencial ao seu receptor cognato e meia-vida sérica aumentada ou diminuída.
[0189] Uma classe adicional de agentes que podem ser usados como parte de uma terapia combinada no tratamento do câncer são os inibidores de checkpoint imunológicos. Inibidores de checkpoint imunológicos exemplificativos incluem agentes que inibem um ou mais dos (i) antígeno 4 associado a linfócitos T‑citotóxicos (CTLA4), (ii) proteína de morte celular programada 1 (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7-H3, (vi) B7-H4 e (vii) TIM3. O inibidor do CTLA4 ipilimumab foi aprovado pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para o tratamento de melanoma.
[0190] Ainda, outros agentes que podem ser usados como parte de uma terapia combinada no tratamento do câncer são agentes de anticorpos monoclonais que têm como alvo alvos não-checkpoint (por exemplo, herceptina) e agentes não citotóxicos (por exemplo, inibidores de tirosina-quinase).
[0191] Ainda outras categorias de agentes anticâncer incluem, por exemplo: (i) um inibidor selecionado de um inibidor de ALK, um inibidor de ATR, um antagonista A2A, um inibidor de reparo de excisão de base, um inibidor de tirosina quinase Bcr-Abl, um tirosina quinase de Bruton Inibidor, um inibidor de CDC7, um inibidor de CHK1, um inibidor de quinase dependente de ciclina, um inibidor de DNA-PK, um inibidor de DNA-PK e mTOR, um inibidor de DNMT1, um inibidor de DNMT1 mais 2-cloro-desoxiadenosina, um inibidor de HDAC, um inibidor da via de sinalização Hedgehog, um inibidor de IDO, um inibidor de JAK,
um inibidor de mTOR, um inibidor de MEK, um inibidor de MELK, um inibidor de MTH1, um inibidor de PARP, um inibidor de 3-quinase de fosfoinositídeo, um inibidor de PARP1 e DHODH um inibidor de proteassoma, um inibidor de Topoisomerase II, um inibidor de tirosina quinase, um inibidor de VEGFR e um inibidor WEE1; (ii) um agonista de OX40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 ou ICOS; e (iii) uma citocina selecionada a partir de IL-12, IL-15, GM- CSF e G-CSF.
[0192] As proteínas da invenção também podem ser usadas como um complemento para a remoção cirúrgica da lesão primária.
[0193] A quantidade de proteína de ligação multiespecífica e agente terapêutico adicional e o tempo relativo de administração podem ser selecionados a fim de atingir um efeito terapêutico combinado desejado. Por exemplo, ao administrar uma terapia combinada a um paciente em necessidade de tal administração, os agentes terapêuticos na combinação, ou uma composição ou composições farmacêuticas compreendendo os agentes terapêuticos, podem ser administrados em qualquer ordem como, por exemplo, sequencialmente, concomitantemente, juntos, simultaneamente e similares. Além disso, por exemplo, uma proteína de ligação multiespecífica pode ser administrada durante um tempo em que o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(ais) exerce(m) seu efeito profilático ou terapêutico, ou vice-versa. IV. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[0194] A presente divulgação também apresenta composições/formulações farmacêuticas que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica descrita neste documento.
[0195] A composição pode ser formulada para uso em uma variedade de sistemas de distribuição de drogas. Um ou mais excipientes ou carreadores fisiologicamente aceitáveis também podem ser incluídos na composição para formulação adequada. As formulações adequadas para uso na presente divulgação são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadélfia, Pa., 17ª ed., 1985. Para uma breve revisão dos métodos para administração de drogas, ver, por exemplo, Langer (Science 249: 1527-1533 1990).
[0196] A formulação de distribuição de drogas intravenosas da presente divulgação pode estar contida em uma bolsa, uma caneta ou uma seringa. Em certas modalidades, a bolsa pode ser conectada a um canal que compreende um tubo e/ou uma agulha. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liofilizada ou uma formulação líquida. Em certas modalidades, a formulação pode ser seca por congelamento (liofilizada) e contida em cerca de 12 a 60 frascos. Em certas modalidades, a formulação pode ser liofilizada e 45 mg da formulação liofilizada podem estar contidos em um frasco. Em certas modalidades, a formulação liofilizada de cerca de 40 mg – cerca de 100 mg pode estar contida em um frasco. Em certas modalidades, a formulação liofilizada de 12, 27 ou 45 frascos é combinada para obter uma dose terapêutica da proteína na formulação da droga intravenosa. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco a cerca de 1000 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 600 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco.
[0197] As proteínas da presente divulgação podem existir em uma formulação farmacêutica aquosa líquida incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína em uma solução tamponada que forma uma formulação.
[0198] Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais, ou podem ser filtradas até a esterilização. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso na forma em que se encontram ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada com um carreador aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações será tipicamente entre 3 e 11, preferivelmente entre 5 e 9 ou entre 6 e 8, e ainda preferivelmente entre 7 e 8, tal como 7 a 7,5. As composições resultantes na forma sólida podem ser embaladas em várias unidades de dose única, cada uma contendo uma quantidade fixa do(s) agente(s) mencionado(s) acima. A composição na forma sólida também pode ser embalada em um recipiente para uma quantidade flexível.
[0199] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece uma formulação com uma vida útil prolongada incluindo a proteína da presente divulgação, em combinação com manitol, ácido cítrico monohidratado, citrato de sódio, fosfato dissódico di-hidratado, di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado, cloreto de sódio, polissorbato 80, água e hidróxido de sódio.
[0200] Em certas modalidades, uma formulação aquosa é preparada incluindo a proteína da presente divulgação em uma solução tamponada com pH. O tampão desta invenção pode ter um pH que varia de cerca de 4 a cerca de 8, por exemplo, de cerca de 4,5 a cerca de 6,0, ou de cerca de 4,8 a cerca de 5,5, ou pode ter um pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Faixas intermediárias aos pHs citados acima também se destinam a fazer parte desta divulgação. Por exemplo, faixas de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores citados acima como limites superior e/ou inferior devem ser incluídos. Exemplos de tampões que controlarão o pH dentro dessa faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (como succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões de ácidos orgânicos.
[0201] Em certas modalidades, a formulação inclui um sistema tampão que contém citrato e fosfato para manter o pH em uma faixa de cerca de 4 a cerca de
8. Em certas modalidades, a faixa de pH pode ser de cerca de 4,5 a cerca de 6,0 ou de cerca de pH 4,8 a cerca de 5,5 ou em uma faixa de pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Em certas modalidades, o sistema tampão inclui ácido cítrico monohidratado, citrato de sódio, fosfato dissódico di-hidratado e/ou di- hidrogenofosfato de sódio di-hidratado. Em certas modalidades, o sistema tampão inclui cerca de 1,3 mg/ml de ácido cítrico (por exemplo, 1,305 mg/ml), cerca de 0,3 mg/ml de citrato de sódio (por exemplo, 0,305 mg/ml), cerca de 1,5 mg/ml de fosfato dissódico di-hidratado (por exemplo, 1,53 mg/ml), cerca de 0,9 mg/ml de di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado (por exemplo, 0,86) e cerca de 6,2 mg/ml de cloreto de sódio (por exemplo, 6,165 mg/ml). Em certas modalidades, o sistema tampão inclui 1-1,5 mg/ml de ácido cítrico, 0,25 a 0,5 mg/ml de citrato de sódio, 1,25 a 1,75 mg/ml de fosfato dissódico di-hidratado, 0,7 a 1,1 mg/ml de di- hidrogenofosfato de sódio di-hidratado e 6,0 a 6,4 mg/ml de cloreto de sódio. Em certas modalidades, o pH da formulação é ajustado com hidróxido de sódio.
[0202] Um poliol, que atua como um tonificante e pode estabilizar o anticorpo, também pode ser incluído na formulação. O poliol é adicionado à formulação numa quantidade que pode variar em relação à isotonicidade desejada da formulação. Em certas modalidades, a formulação aquosa pode ser isotônica. A quantidade de poliol adicionado também pode ser alterada em relação ao peso molecular do poliol. Por exemplo, uma quantidade mais baixa de um monossacarídeo (por exemplo, manitol) pode ser adicionada, em comparação com um dissacarídeo (como a trealose). Em certas modalidades, o poliol que pode ser usado na formulação como um agente de tonicidade é manitol. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 5 a cerca de 20 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 7,5 a 15 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 10-14 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 12 mg/ml. Em certas modalidades, o poliol sorbitol pode ser incluído na formulação.
[0203] Um detergente ou surfactante também pode ser adicionado à formulação. Detergentes exemplificativos incluem detergentes não iônicos, como polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20, 80 etc.) ou poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188). A quantidade de detergente adicionada é tal que reduz a agregação do anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de partículas na formulação e/ou reduz a adsorção. Em certas modalidades, a formulação pode incluir um surfactante que é um polissorbato. Em certas modalidades, a formulação pode conter o polissorbato detergente 80 ou Tween 80. Tween 80 é um termo usado para descrever o acetato de sorbitano e polioxietileno (20) (ver Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4ª ed., 1996). Em certas modalidades, a formulação pode conter entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL de polissorbato 80, ou entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL. Em certas modalidades, cerca de 0,1% de polissorbato 80 pode ser adicionado à formulação.
[0204] Nas modalidades, o produto proteico da presente divulgação é formulado como uma formulação líquida. A formulação líquida pode estar presente em uma concentração de 10 mg/mL em um frasco USP/Ph Eur tipo I
50R fechado com uma rolha de borracha e selado com um fecho de alumínio crimpado. A rolha pode ser feita de elastômero em conformidade com USP e Ph Eur. Em certas modalidades, os frascos podem ser cheios com 61,2 mL da solução do produto proteico, a fim de permitir um volume extraível de 60 mL. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser diluída com solução salina a 0,9%.
[0205] Em certas modalidades, a formulação líquida das proteínas da divulgação pode ser preparada como uma solução de concentração de 10 mg/mL em combinação com um açúcar em níveis de estabilização. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser preparada em um carreador aquoso. Em certas modalidades, um estabilizador pode ser adicionado em uma quantidade não superior à que pode resultar em uma viscosidade indesejável ou inadequada para administração intravenosa. Em certas modalidades, o açúcar pode ser um dissacarídeo, por exemplo, sacarose. Em certas modalidades, a formulação líquida também pode incluir um ou mais de um agente tampão, um surfactante e um conservante.
[0206] Em certas modalidades, o pH da formulação líquida pode ser definido por adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base pode ser hidróxido de sódio.
[0207] Além da agregação, a desamidação é uma variação comum de produto de peptídeos e proteínas que pode ocorrer durante a fermentação, clarificação da colheita/célula, purificação, armazenamento de substância de droga/produto de droga e durante a análise da amostra. Desamidação é a perda de NH3 de uma proteína que forma um intermediário succinimida que pode sofrer hidrólise. O intermediário da succinimida resulta em uma diminuição de massa de 17 daltons a partir do peptídeo de origem. A hidrólise subsequente resulta em um aumento de massa de 18 daltons. O isolamento do intermediário da succinimida é difícil devido à instabilidade sob condições aquosas. Como tal, a desamidação é tipicamente detectável como um aumento de massa de 1 dalton. A desamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou isoaspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de desamidação incluem pH, temperatura, constante dielétrica do solvente, força iônica, sequência primária, conformação polipeptídica local e estrutura terciária. Os resíduos de aminoácidos adjacentes a Asn na cadeia peptídica afetam as taxas de desamidação. Gly e Ser após um Asn em sequências de proteínas resultam em uma maior suscetibilidade à desamidação.
[0208] Em certas modalidades, a formulação líquida das proteínas da presente divulgação pode ser preservada sob condições de pH e umidade para impedir a desaminação do produto proteico.
[0209] O carreador de interesse neste documento é um que seja farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Carreadores ilustrativos podem incluir água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0210] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações deste documento para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).
[0211] As formulações intravenosas (IV) podem ser a via de administração preferencial em casos particulares, como quando um paciente está no hospital após o transplante recebendo todas as drogas pela via IV. Em certas modalidades, a formulação líquida é diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9% antes da administração. Em certas modalidades, o produto farmacêutico diluído para injeção é isotônico e adequado para administração por infusão intravenosa.
[0212] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM - 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas "formadoras de bases". Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões de glicinato, carbonato, citrato, nesse caso, íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íon.
[0213] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações deste documento para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).
[0214] O carreador de interesse neste documento é um que seja farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Carreadores ilustrativos podem incluir água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0215] As proteínas da presente divulgação podem existir em uma formulação liofilizada incluindo as proteínas e um lioprotetor. O lioprotetor pode ser açúcar, por exemplo, dissacarídeos. Em certas modalidades, o lioprotetor pode ser sacarose ou maltose. A formulação liofilizada também pode incluir um ou mais de um agente tampão, um surfactante, um agente de volume e/ou um conservante.
[0216] A quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização do produto de droga liofilizado pode estar em uma razão em peso de pelo menos 1:2 de proteína para sacarose ou maltose. Em certas modalidades, a razão em peso de proteína para sacarose ou maltose pode ser de 1:2 a 1:5.
[0217] Em certas modalidades, o pH da formulação, antes da liofilização, pode ser definido por adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base farmaceuticamente aceitável pode ser hidróxido de sódio.
[0218] Antes da liofilização, o pH da solução que contém a proteína da presente divulgação pode ser ajustado entre 6 e 8. Em certas modalidades, a faixa de pH para o produto de droga liofilizado pode ser de 7 a 8.
[0219] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM - 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos
(inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas "formadoras de bases". Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões de glicinato, carbonato, citrato, nesse caso, íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íon.
[0220] Em certas modalidades, um "agente de volume" pode ser adicionado. Um "agente de volume" é um composto que adiciona massa a uma mistura liofilizada e contribui para a estrutura física do bolo liofilizado (por exemplo, facilita a produção de um bolo liofilizado essencialmente uniforme que mantém uma estrutura de poros abertos). Os agentes de volume ilustrativos incluem manitol, glicina, polietileno glicol e sorbitol. As formulações liofilizadas da presente invenção podem conter tais agentes de volume.
[0221] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações deste documento para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).
[0222] Em certas modalidades, o produto farmacêutico liofilizado pode ser constituído por um carreador aquoso. O carreador aquoso de interesse neste documento é um que seja farmaceuticamente aceitável (por exemplo, seguro e não tóxico para administração a um humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida, após liofilização. Diluentes ilustrativos podem incluir água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0223] Em certas modalidades, o produto farmacêutico liofilizado da presente divulgação é reconstituído com Água Estéril para Injeção, USP (SWFI) ou Injeção de Cloreto de Sódio a 0,9%, USP. Durante a reconstituição, o pó liofilizado se dissolve em uma solução.
[0224] Em certas modalidades, o produto proteico liofilizado da presente divulgação é constituído para cerca de 4,5 mL de água para injeção e diluído com solução salina a 0,9% (solução de cloreto de sódio).
[0225] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para obter a resposta terapêutica desejada em um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente.
[0226] A dose específica pode ser uma dose uniforme para cada paciente, por exemplo, 50-5000 mg de proteína. Alternativamente, a dose de um paciente pode ser adaptada ao peso corporal aproximado ou à área de superfície do paciente. Outros fatores na determinação da dosagem apropriada podem incluir a doença ou condição a ser tratada ou evitada, a gravidade da doença, a via de administração e a idade, sexo e condição médica do paciente. Um refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para o tratamento é feito rotineiramente por aqueles versados na técnica, especialmente diante das informações de dosagem e ensaios divulgados neste documento. A dosagem também pode ser determinada através do uso de ensaios conhecidos para determinar as dosagens usadas em conjunto com dados de resposta à dose apropriados. A dosagem de um paciente individual pode ser ajustada conforme o progresso da doença é monitorado. Os níveis sanguíneos da construção ou complexo alvo em um paciente podem ser medidos para ver se a dosagem precisa ser ajustada para atingir ou manter uma concentração eficaz. A farmacogenômica pode ser usada para determinar quais construções e/ou complexos alvo e dosagens destes tem maior probabilidade de serem eficazes para um determinado indivíduo (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).
[0227] No geral, dosagens por peso corporal são de cerca de 0,01 μg a cerca de 100 mg por kg de peso corporal, como cerca de 0,01 μg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 100 μg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 50 μg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 10 μg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 1 μg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 0,1 μg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 μg acerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal,
cerca de 0,1 μg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 100 μg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 10 μg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 1 μg/kg de peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 100 μg/kg de peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 50 μg/kg de peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 10 μg/kg de peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 100 μg/kg de peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 50 μg/kg de peso corporal, cerca de 50 μg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 50μg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 μg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 μg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 μg a cerca de 100 μg/kg de peso corporal, cerca de 100 μg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 100 μg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 100 μg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 100 μg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 mg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 1 mg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 mg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 50 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
[0228] As doses podem ser administradas uma ou mais vezes ao dia, semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou mesmo uma vez a cada 2 a 20 anos. As pessoas versadas na técnica podem facilmente estimar as taxas de repetição para a dosagem com base nos tempos de permanência medidos e nas concentrações da construção ou complexo alvo nos fluidos corporais ou tecidos. A administração da presente invenção pode ser intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, intracavitária, por perfusão através de um cateter ou por injeção intralesional direta. Isso pode ser administrado uma ou mais vezes por dia, uma ou mais vezes por semana, uma ou mais vezes por mês e uma ou mais vezes por ano.
[0229] A descrição acima descreve vários aspectos e modalidades da invenção. O pedido de patente contempla especificamente todas as combinações e permutações dos aspectos e das modalidades.
EXEMPLOS
[0230] A invenção agora, sendo descrita de forma geral, será mais facilmente compreendida pela referência aos exemplos seguintes, que estão incluídos apenas para fins de ilustração de determinados aspectos e modalidades da presente invenção e não se destinam a limitar a invenção. Exemplo 1 - Purificação de F3-TriNKET e F3'-TriNKET
[0231] Ambas as proteínas F3-TriNKET e F3'-TriNKET foram purificadas seguindo as etapas que são usadas para purificar anticorpos monoclonais terapêuticos. Resumidamente, o método de purificação incluiu uma purificação da Proteína A (obteve cerca de 80-90% de monômero) seguida por etapa de eluição de sal de Poros HS CIEX (obteve cerca de 97-99% de monômero). Para o processo de fabricação clínica, uma etapa de purificação adicional com Q Cepharose ou Q Mustang (modo de fluxo contínuo) (para obter cerca de 99% de monômero) pode ser adicionada para reduzir ainda mais a proteína de célula inteira (WCP) e o DNA de CHO.
[0232] A F3'-TriNKET purificada tem alta estabilidade térmica (DSC), semelhante aos anticorpos monoclonais terapêuticos. E a estabilidade do Fc mutante contendo F3'-TrinKETs é próxima ao Fc da IgG1. Ver a Tabela 13 abaixo. Tabela 13 Molécula Tm₁ (°C) Tm₂ (°C) Tm₃ (°C) Herceptina 72,4 83,6 F3‘-TriNKET 73,2 79,0 86,7 Exemplo 2 - F3'-TriNKET é estável por pelo menos 4 semanas
[0233] Em um estudo de estabilidade acelerado realizado a 37 °C, descobriu-se que a F3'-TriNKET fica estável por 4 semanas. Ver as Figuras 3A- 3C.
[0234] A F3'-TriNKET purificada ficou estável durante a manutenção de pH baixo. 20 mg/mL da proteína purificada foram incubados durante 2 horas em glicina a pH 3,0. A Figura 4 mostra que a F3'-TriNKET purificada ficou estável durante a manutenção de pH baixo.
[0235] A F3'-TriNKET purificada ficou estável após 5 ciclos de congelamento-descongelamento. As Figuras 5A e 5B mostram que a F3'-TriNKET purificada ficou estável após 5 ciclos de congelamento-descongelamento, independentemente do pH (A Figura 5A mostra ciclos de congelamento- descongelamento em PBS, e a Figura 5B mostra ciclos de congelamento- descongelamento em citrato a pH 5,5).
[0236] A F3'-TriNKET purificada ficou estável em estudos de degradação forçada. A Figura 6 mostra gráficos de barras das condições de degradação forçada nas quais a F3'-TriNKET permaneceu estável. Exemplo 3 - Avaliação da ligação da TriNKET aos antígenos de câncer humano expresso em células
[0237] Linhagens celulares de câncer humano que expressam um antígeno de câncer de interesse foram usadas para avaliar a ligação do antígeno tumoral das TriNKETs. A linhagem celular AML humana Molm-13 foi usada para avaliar a ligação da F3'-TriNKET-CD33 a células que expressam CD33. A linhagem celular HER2+ Colo-201 foi usada para avaliar a ligação da F3'-TriNKET-HER2 a células que expressam HER2. F3'-TriNKET-HER2 e F3'-TriNKET-CD33 foram diluídas e incubadas com as respectivas células. A ligação da F3'-TriNKET-HER2 e F3'- TriNKET-CD33 às células que expressam HER2 e CD33, respectivamente, foi detectada usando um anticorpo secundário IgG anti-humano conjugado com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, a ligação de MFI a células que expressam HER2 e CD33, respectivamente, foi normalizada para controles de anticorpos secundários para obter valores de "fold over background". Exemplo 4 - Ensaio de citotoxicidade em células NK humanas primárias
[0238] Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de leucócitos de sangue periférico humano usando centrifugação de gradiente de densidade. PBMCs isoladas foram lavadas e preparadas para isolamento de células NK. As células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com grânulos magnéticos, a pureza das células NK isoladas era tipicamente >90% CD3-CD56+. As células NK isoladas foram mantidas em repouso durante a noite e utilizadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade. Ensaio de citotoxicidade DELFIA:
[0239] As linhagens celulares de câncer humano que expressam um alvo de interesse foram colhidas da cultura, as células foram lavadas com PBS e ressuspensas em meios de crescimento a 106/mL para marcação com reagente BATDA (Perkin Elmer AD0116). As instruções do fabricante foram seguidas para a marcação das células alvo. Após a marcação, as células foram lavadas 3x com PBS e ressuspensas em 0,5 - 1,0x105/mL em meio de cultura. Para preparar os poços de fundo, uma alíquota das células marcadas foi deixada de lado e as células foram removidas dos meios. 100 µl dos meios foram cuidadosamente adicionados aos poços em triplicado para evitar perturbar as células sedimentadas. Foram adicionados 100 µL de células marcadas com BATDA a cada poço da placa de 96 poços. Os poços foram reservados para liberação espontânea das células alvo e os poços foram preparados para lise máxima das células alvo por adição de Triton-X a 1%. Os anticorpos monoclonais ou TriNKETs contra o alvo tumoral de interesse foram diluídos no meio de cultura, 50 µl de mAb diluído ou TriNKET foram adicionados a cada poço. As células NK em repouso e/ou ativadas foram colhidas da cultura, as células foram lavadas e ressuspensas a 105- 2,0x106/mL em meio de cultura, dependendo da razão E:T desejada. Foram adicionados 50 µL de células NK a cada poço da placa para produzir um total de 200 µL de volume de cultura. A placa foi incubada a 37 °C com CO2 a 5% por 2-3 horas antes de desenvolver o ensaio.
[0240] Após a cultura durante 2-3 horas, a placa foi removida da incubadora e as células foram sedimentadas por centrifugação a 200 g por 5 minutos. 20 µl de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa fornecida pelo fabricante, 200 µl de solução de európio em temperatura ambiente foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada em um agitador de placas a 250 rpm por 15 minutos. A placa foi lida usando os instrumentos Victor 3 ou SpectraMax i3X. A % de Lise específica foi calculada da seguinte forma: % de Lise específica = ((Liberação experimental – Liberação espontânea) / (Liberação máxima – Liberação espontânea)) * 100%. Ensaio de citotoxicidade por citometria de fluxo
[0241] Linhagens celulares de câncer humano que expressam BCMA e transduzidas para expressar de forma estável NucLight Green (Essen BioScience 4475) após a seleção com puromicina foram colhidas da cultura, centrifugadas e ressuspensas a 105/mL em meio de cultura. 100 µl de células alvo foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços. TriNKETs contra BCMA foram diluídas em meio de cultura e 50 µl de cada foram adicionados aos poços duplicados. NKs humanos purificados em repouso durante a noite foram colhidos da cultura, lavados e ressuspensos a 4x105/mL em meio de cultura. Para uma razão E:T de 2: 1, 50 µl de células NK foram adicionados a todos os poços, com exceção dos controles somente alvo, que receberam 100 µl de meio de cultura. A placa foi incubada a 37 °C com CO2 a 5% durante 30 horas.
[0242] Após a co-cultura, as células foram coradas, fixadas e analisadas por citometria de fluxo. As células alvo restantes foram detectadas com fortes deslocamentos no canal FITC, com células mortas excluídas com coloração de viabilidade. O número de eventos verdes foi exportado e a % de morte foi calculada por comparação com as amostras de controle somente alvo. Esferas de contagem foram incluídas para garantir que os volumes registrados fossem comparáveis. Exemplo 5 - F3 'TriNKETs se ligam a antígenos tumorais expressos em células
[0243] A Figura 7 mostra a ligação de F3'-TriNKET-HER2 ou Trastuzumab a células HER2+ Colo-201. F3'-TriNKET-HER2 ligou as células Colo-201 em um valor máximo mais alto de "fold over background", mas teve um valor de ligação EC50 ligeiramente reduzido.
[0244] A Figura 8 mostra a ligação do anticorpo monoclonal F3'-TriNKET- CD33 ou CD33 ao CD33 expresso em células Molm-13. F3'-TriNKET ligou células Molm-13 em um valor de ligação máximo de "fold over background" e EC50 em comparação com mAb CD33. Exemplo 6 - F3'-TriNKETs fazem a mediação da citotoxicidade NK contra células alvo HER2+ e CD33+:
[0245] As Figuras 9 e 10 apresentam citotoxicidade mediada por F3'- TriNKET-HER2 contra a linhagem celular HER2-low 786-O e a linhagem celular HER2-high SkBr-3, respectivamente. A F3'-TriNKET-HER2 forneceu potentes valores de EC50 para indução de citotoxicidade mediada por NK contra as linhagens celulares HER2-low e HER2-high. Comparada ao trastuzumab, a F3'- TriNKET-HER2 forneceu uma maior lise específica máxima e valores de EC 50 mais potentes em células de alta e baixa expressão de HER2.
[0246] As Figuras 11 e 12 apresentam citotoxicidade mediada por F3'- TriNKET-CD33 para duas linhagens celulares humanas positivas para CD33, EOL-1 e THP-1, respectivamente. O anticorpo monoclonal CD33 foi capaz de aumentar a lise de células NK de células alvo EOL-1 (Figura 11), mas foi considerado ineficaz contra a linhagem celular FcR-high THP-1 (Figura 12). A F3'- TriNKET-CD33 forneceu valores subnanomolares de EC50 para indução de citotoxicidade mediada por NK contra células alvo THP-1 e EOL-1. Exemplo 7 - F4-TriNKETs fazem a mediação da citotoxicidade de NK
[0247] Este exemplo descreve a potência do aumento mediado por TriNKET no formato F4 bivalente da morte de células NK de células cancerígenas alvo. Este exemplo descreve a ligação da TriNKET de formato F4 bivalente às células alvo. Este exemplo descreve os efeitos da TriNKET de formato F4 bivalente na estabilização e manutenção da alta expressão de BCMA nas superfícies celulares. Este exemplo descreve que a avidez de uma TriNKET de formato F4 bivalente com seu alvo melhora a afinidade com a qual a TriNKET se liga ao antígeno alvo, o que de fato estabiliza a expressão e manutenção de altos níveis do antígeno alvo na superfície celular. Estabilização de superfície de BCMA por F4-TriNKETs
[0248] Células de mieloma KMS12-PE BCMA positivas foram incubadas com 10 µg/mL de F4-TriNKET ou anticorpo monoclonal (EM-901), as amostras foram divididas em terços, para cada amostra as alíquotas foram colocadas em gelo por 20 minutos, a 37 °C durante 2 horas ou 37 °C durante 24 horas. Após o período de incubação, as células foram lavadas e a F4-TriNKET ligada foi detectada usando um anticorpo secundário IgG anti-humano. Após a coloração,
as células foram fixadas e armazenadas a 4 °C, todas as amostras foram analisadas no final do estudo. Avaliação da ligação da F4-TriNKET aos antígenos de câncer humano expresso em células
[0249] Linhagens celulares de câncer humano que expressam BCMA foram usadas para avaliar a ligação do antígeno tumoral da F4-TriNKETs (por exemplo, A49-F4-TriNKET-BCMA, um domínio de ligação a NKG2D do clone ADI-27749 e um domínio de ligação a BCMA derivado de EM-901). A linhagem celular de mieloma múltiplo humano MM.1R, que expressa BCMA em um nível mais alto do que as células de mieloma KMS12-PE, foi usada para avaliar a ligação da TriNKETs a células que expressam níveis altos de BCMA. F4-TriNKETs foram diluídas e incubadas com células MM.1R. A ligação da F4-TriNKET foi detectada usando um anticorpo secundário IgG anti-humano conjugado com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, o MFI de ligação ao BCMA expresso em células foi normalizado para controles secundários de anticorpos para obter valores de "fold over background". Ensaio de citotoxicidade em células NK humanas primárias
[0250] Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de leucócitos de sangue periférico humano usando centrifugação de gradiente de densidade. PBMCs isoladas foram lavadas e preparadas para isolamento de células NK. As células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com grânulos magnéticos, a pureza das células NK isoladas era tipicamente >90% CD3-CD56+. As células NK isoladas foram mantidas em repouso durante a noite e utilizadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade.
[0251] Ensaio de citotoxicidade DELFIA: as linhagens celulares de câncer humano que expressam um alvo de interesse foram colhidas da cultura, as células foram lavadas com PBS e ressuspensas em meios de crescimento a 106/mL para marcação com reagente BATDA (Perkin Elmer AD0116). As instruções do fabricante foram seguidas para a marcação das células alvo. Após a marcação, as células foram lavadas 3x com PBS e ressuspensas em 0,5 - 1,0x105/mL em meio de cultura. Para preparar os poços de fundo, uma alíquota das células marcadas foi deixada de lado e as células foram removidas dos meios. 100 µl dos meios foram cuidadosamente adicionados aos poços em triplicado para evitar perturbar as células sedimentadas. Foram adicionados 100 µL de células marcadas com BATDA a cada poço da placa de 96 poços. Os poços foram reservados para liberação espontânea das células alvo e os poços foram preparados para lise máxima das células alvo por adição de Triton-X a 1%. Os anticorpos monoclonais ou TriNKETs contra o alvo tumoral de interesse foram diluídos no meio de cultura, 50 µl de mAb diluído ou TriNKET foram adicionados a cada poço. As células NK em repouso e/ou ativadas foram colhidas da cultura, as células foram lavadas e ressuspensas a 105- 2,0x106/mL em meio de cultura, dependendo da razão E:T desejada. Foram adicionados 50 µL de células NK a cada poço da placa para produzir um total de 200 µL de volume de cultura. A placa foi incubada a 37 °C com CO2 a 5% por 2-3 horas antes de desenvolver o ensaio. Após a cultura durante 2-3 horas, a placa foi removida da incubadora e as células foram sedimentadas por centrifugação a 200 g por 5 minutos. 20 µl de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa fornecida pelo fabricante, 200 µl de solução de európio em temperatura ambiente foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada em um agitador de placas a 250 rpm por 15 minutos. A placa foi lida usando os instrumentos Victor 3 ou SpectraMax i3X. A % de Lise específica foi calculada da seguinte forma: % de Lise específica = ((Liberação experimental – Liberação espontânea) / (Liberação máxima – Liberação espontânea)) * 100%. Citotoxicidade de NK mediada por F4-TriNKET
[0252] A lise mediada por F4-TriNKET de células de mieloma BCMA positivo foi testada. A Figura 19 mostra a lise mediada por F4-TriNKET de células de mieloma KMS12-PE BCMA positivo por células efetoras NK humanas em repouso. A Figura 20 mostra a lise mediada por F4-TriNKET de células de mieloma MM.1R BCMA positivo por células efetoras NK humanas em repouso. O anticorpo monoclonal EM-901 foi usado como controle em ambas as experiências. Na Figura 19, células KMS12-PE (baixa expressão de BCMA) foram utilizadas como células alvo; na Figura 20 MM.1R (alta expressão de BCMA) foram usados como células alvo. Contra células de alta e baixa expressão de BCMA, MM.1R e KMS12-PE, respectivamente, o F4-TriNKET teve valores subnanomolares de EC50. Comparado com um anticorpo monoclonal BCMA EM- 901, a F4-TriNKET forneceu maior lise específica máxima e potência contra ambas as linhagens celulares.
[0253] A Figura 21 mostra a ligação de F4-TriNKET (A49-F4-TriNKET- BCMA), duobody-TriNKET (A49-DB-TriNKET-BCMA) ou anticorpo monoclonal BCMA (EM-901) a células de mieloma MM.1R. Todas as três proteínas foram capazes de se ligar ao BCMA expresso nas células MM.1R de uma forma responsiva à dose. Os ligantes ávidos foram capazes de se ligar com um valor máximo de "fold over background" levemente reduzido em comparação com os ligantes monovalentes, mas a ligação ávida proporcionou um valor de ligação EC50 melhorado. F4-TriNKETs estabilizam BCMA de superfície
[0254] A Figura 22 mostra a coloração de BCMA de superfície com F4- TriNKET ou anticorpo monoclonal BCMA (EM-901) após incubação pelo tempo indicado. Tanto o mAb BCMA (EM-901) quanto a F4-TriNKET foram capazes de estabilizar o BCMA de superfície rapidamente após a incubação. O mAb BCMA (EM-901) e a F4-TriNKET foram capazes de sustentar o aumento da expressão de BCMA de superfície por um período de 24 horas.
[0255] A Figura 23 mostra a estabilização de BCMA de superfície em células KMS12-PE após incubação com F4-TriNKET ou anticorpo monoclonal BCMA (EM-901). A estabilização inicial de BCMA na superfície celular aconteceu rapidamente após a exposição a F4-TriNKET ou mAb (EM-901). A ligação ávida fornecida por F4-TriNKET e o anticorpo monoclonal (EM-901) sustentou alto BCMA de superfície por mais tempo do que a ligação de BCMA monovalente, conforme indicado pela queda na expressão de BCMA de superfície em 24 horas com a duobody-TriNKET. F4-TriNKETs fazem a mediação da citotoxicidade substancial de longo prazo
[0256] Ensaio de citotoxicidade de citometria de fluxo: linhagens celulares de câncer humano que expressam BCMA e transduzidas para expressar de forma estável NucLight Green (Essen BioScience 4475) após a seleção com puromicina foram colhidas da cultura, centrifugadas e ressuspensas a 10 5/mL em meio de cultura. 100 µl de células alvo foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços. TriNKETs contra BCMA foram diluídas em meio de cultura e 50 µl de cada foram adicionados aos poços duplicados. NKs humanos purificados em repouso durante a noite foram colhidos da cultura, lavados e ressuspensos a 4x10 5/mL em meio de cultura. Para uma razão E:T de 2: 1, 50 µl de células NK foram adicionados a todos os poços, com exceção dos controles somente alvo, que receberam 100 µl de meio de cultura. A placa foi incubada a 37 °C com CO 2 a 5% durante 30 horas.
[0257] Após a co-cultura, as células foram coradas, fixadas e analisadas por citometria de fluxo. As células alvo restantes foram detectadas com fortes deslocamentos no canal FITC, com células mortas excluídas com coloração de viabilidade. O número de eventos verdes foi exportado e a % de morte foi calculada por comparação com as amostras de controle somente alvo. Esferas de contagem foram incluídas para garantir que os volumes registrados fossem comparáveis. F4-TriNKETs fazem a mediação da citotoxicidade substancial de longo prazo
[0258] As Figuras 24 e 25 mostram a lise de células NK humanas de linhagens celulares alvo BCMA positivas com razão E:T de 2:1 na presença de F4 ou DB-TriNKETs após 30 horas. A Figura 24 mostra a morte de células KMS12- PE (baixa expressão de BCMA) acima de nenhuma morte de controle de proteína, enquanto na Figura 25 células MM.1S (maior expressão de BCMA) foram usadas como células alvo. Em comparação com o duobody-TriNKET monovalente, a F4- TriNKET demonstrou morte elevada de linhagens celulares com alta e baixa expressão de BCMA em todas as concentrações testadas.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0259] A divulgação completa de cada um dos documentos de patentes e artigos científicos referidos neste documento são incorporados por referência para todos os fins.
EQUIVALENTES
[0260] A invenção pode ser incorporada de outras formas específicas sem se afastar do espírito ou das características essenciais desta. As modalidades precedentes devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos ilustrativos ao invés de limitantes da invenção descrita neste documento.
O escopo da invenção, portanto, é indicado pelas reivindicações anexadas em vez de sê-lo pela descrição acima, e todas as alterações que vêm dentro do significado e alcance de equivalência das reivindicações destinam-se a serem abrangidas nestas.

Claims (126)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento variável de cadeia única (scFv) ligado a um domínio constante de anticorpo através de uma dobradiça compreendendo Ala-Ser, em que o scFv compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve.
2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada forma uma ponte dissulfeto com o domínio variável da cadeia leve.
3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a ponte dissulfeto é formada entre C44 do domínio variável de cadeia pesada e C100 do domínio variável de cadeia leve.
4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada está ligado ao domínio variável de cadeia leve através de um ligante peptídico flexível.
5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico flexível compreende (G4S)4.
6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada está posicionado no terminal N ou no terminal C do domínio variável de cadeia leve.
7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que a dobradiça compreende ainda a sequência de aminoácidos Thr-Lys-Gly.
8. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de que o domínio constante do anticorpo compreende um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar ao CD16.
9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o domínio constante do anticorpo compreende um domínio CH2 e um CH3 de um anticorpo IgG1 humano.
10. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o domínio constante do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano.
11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o domínio constante do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao domínio Fc da IgG1 humana e difere em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e K439.
12. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o domínio constante do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao domínio Fc da IgG1 humana e difere em um ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo em Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D e K439E.
13. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, caracterizado pelo fato de que o scFv se liga a NKG2D ou a um antígeno associado a tumor.
14. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o scFv se liga a NKG2D, e o domínio variável de cadeia pesada do scFv compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:334 e SEQ ID NO:337.
15. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:94 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
16. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:322 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
17. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:325 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
18. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:328 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
19. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:331 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
20. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:334 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
21. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:337 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
22. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:44 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:48.
23. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:52 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:56.
24. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:60 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:61.
25. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:62 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:66.
26. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:70 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:74.
27. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:78 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:82.
28. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:86 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:90.
29. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:102 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:106.
30. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o scFv se liga a NKG2D, e em que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:110 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:111.
31. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o scFv se liga a NKG2D, e em que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:112 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:113.
32. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o scFv se liga a um antígeno associado a tumor, com o antígeno associado a tumor sendo selecionado do grupo consistindo em ANO1, BCMA, EpCAM, CAIX, CEA, CCR4, CD2, CD123, CD133, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CLAUDINA-18.2, DLL3, EGFR/ERBB1, GD2, IGF1R, HER2, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSMA, mesotelina, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, TROP2, MAGE- A3, B7.1, B7.2, CTLA4, PD1, 5T4, GPNMB, FR-alfa, PAPP-A, FLT3, GPC3, CXCR4, ROR1, ROR2, HLA-E, PD-L1, VLA4, CD44, CD13, CD15, CD47, CLL1, CD81, CD23, CD79a, CD79b, CD80, CRLF2, SLAMF7, CD138, CA125, NaPi2b, Nectina4, ADAM8, ADAM9, SLC44A4, CA19-9, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, ULRA 1, LILRA2, LILRA3, ULRA4, LILRA5 e ULRA6, CCR8, CD7, CTLA4, CX3CR1, ENTPD1, HAVCR2, IL-1R2, PDCD1LG2, TIGIT, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, GEM, NT5E, TNFRSF18, MUC1, P-caderina, Plexina-A1, TNFRSF10B, STEAP1, CDCP1, PTK7, Axl, erbB-3, EDNRB, Tyrp1, CD14, CD163, CSF3R, Siglec-9, ITGAM, VISTA, B7-H4 (VTCN1), CCR1, LRRC25, PTAFR, SIRPB1, TLR2, TLR4, CD300LB, ATP1A3, CCR5, MUC1 (ou MUC1-C), Plexina-A1, TNFRSF10B, STEAP1, CDCP1, PTK7, AXL, EDNRB, OLR1 e TYRP1.
33. Proteína caracterizada pelo fato de que compreende o scFv de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
34. Proteína caracterizada pelo fato de que compreende:
(a) um primeiro sítio de ligação a antígeno, em que o primeiro sítio de ligação a antígeno compreende um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32; (b) um segundo sítio de ligação a antígeno; e (c) um segundo domínio constante de anticorpo.
35. Proteína, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno se liga a NKG2D e o segundo sítio de ligação a antígeno se liga a um antígeno associado a tumor.
36. Proteína, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno se liga a um antígeno associado a tumor e o segundo sítio de ligação a antígeno se liga a NKG2D.
37. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-36, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação a antígeno compreende um scFv ou Fab.
38. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-37, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio constante de anticorpo compreende uma dobradiça e um domínio CH2 de um anticorpo IgG1 humano.
39. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-38, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio constante de anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano.
40. Proteína, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio constante do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao domínio Fc da IgG1 humana e difere em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e K439.
41. Proteína caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação a antígeno que se liga a um antígeno associado a tumor; (b) um segundo sítio de ligação a antígeno que se liga ao mesmo antígeno associado a tumor que o primeiro sítio de ligação a antígeno; (c) um terceiro sítio de ligação a antígeno que se liga a NKG2D; e
(d) uma região constante de anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para se ligar ao CD16, ou um quarto sítio de ligação a antígeno que se liga ao CD16.
42. Proteína, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno compreende um scFv ou Fab.
43. Proteína, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação a antígeno compreende um scFv ou Fab.
44. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-43, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um scFv ou Fab.
45. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-44, caracterizada pelo fato de que o antígeno associado a tumor é selecionado do grupo consistindo em ANO1, BCMA, EpCAM, CAIX, CEA, CCR4, CD2, CD123, CD133, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CLAUDINA-18.2, DLL3, EGFR/ERBB1, GD2, IGF1R, HER2, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSMA, mesotelina, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, TROP2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4, PD1, 5T4, GPNMB, FR-alfa, PAPP-A, FLT3, GPC3, CXCR4, ROR1, ROR2, HLA-E, PD-L1, VLA4, CD44, CD13, CD15, CD47, CLL1, CD81, CD23, CD79a, CD79b, CD80, CRLF2, SLAMF7, CD138, CA125, NaPi2b, Nectina4, ADAM8, ADAM9, SLC44A4, CA19-9, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, ULRA 1, LILRA2, LILRA3, ULRA4, LILRA5 e ULRA6, CCR8, CD7, CTLA4, CX3CR1, ENTPD1, HAVCR2, IL-1R2, PDCD1LG2, TIGIT, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, GEM, NT5E, TNFRSF18, MUC1, P- caderina, Plexina-A1, TNFRSF10B, STEAP1, CDCP1, PTK7, Axl, erbB-3, EDNRB, Tyrp1, CD14, CD163, CSF3R, Siglec-9, ITGAM, VISTA, B7-H4 (VTCN1), CCR1, LRRC25, PTAFR, SIRPB1, TLR2, TLR4, CD300LB, ATP1A3, CCR5, MUC1 (ou MUC1-C), Plexina-A1, TNFRSF10B, STEAP1, CDCP1, PTK7, AXL, EDNRB, OLR1 e TYRP1.
46. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-45, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:60, SEQ ID
NO:62, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:334 e SEQ ID NO:337.
47. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:94 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
48. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:322 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
49. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:325 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
50. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:328 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
51. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:331 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
52. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:334 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
53. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:337 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
54. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:44 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:48.
55. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:52 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:56.
56. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:60 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:61.
57. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:62 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:66.
58. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:70 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:74.
59. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%
idêntica à SEQ ID NO:78 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:82.
60. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:86 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:90.
61. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:102 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:106.
62. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-45, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:110 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:111.
63. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-45, caracterizada pelo fato de que o terceiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:112 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:113.
64. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-63, caracterizada pelo fato de que a região constante do anticorpo ou a porção da mesma suficiente para se ligar ao CD16 compreende uma dobradiça e um domínio CH2 de um anticorpo IgG1 humano.
65. Proteína, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a região constante do anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para se ligar ao CD16 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano.
66. Proteína, de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que a região constante do anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para se ligar ao CD16 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao domínio Fc da IgG1 humana e difere em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e K439.
67. Proteína caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um sítio de ligação a antígeno que se liga a NKG2D; (b) um fragmento de ligação a antígeno do receptor de células T (TCR); e (c) uma região constante de anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para se ligar ao CD16, ou um sítio de ligação a antígeno adicional que se liga ao CD16.
68. Proteína, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno é um fragmento Fab, e o fragmento de ligação a antígeno de TCR é um fragmento de cadeia única do TCR (scTCR).
69. Proteína, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que o fragmento scTCR está ligado a uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo através de uma dobradiça compreendendo Ala-Ser.
70. Proteína, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno é um scFv, e o fragmento de ligação a antígeno de TCR é um fragmento extracelular do TCR.
71. Proteína, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que o scFv está ligado a uma cadeia polipeptídica da região constante do anticorpo através de uma dobradiça compreendendo Ala-Ser.
72. Proteína, de acordo com a reivindicação 69 ou 71, caracterizada pelo fato de que a dobradiça compreende ainda a sequência de aminoácidos Thr-Lys- Gly.
73. Proteína, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno é um fragmento Fab, e o fragmento de ligação a antígeno de TCR é um fragmento extracelular do TCR.
74. Proteína, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um fragmento de ligação a antígeno de TCR adicional que se liga ao mesmo antígeno que o fragmento de ligação a antígeno de TCR.
75. Proteína, de acordo com a reivindicação 74, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno é um scFv, e o fragmento de ligação a antígeno de TCR e o fragmento de ligação a antígeno de TCR adicional são fragmentos extracelulares do TCR.
76. Proteína, de acordo com a reivindicação 74, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno é um scFv, e o fragmento de ligação a antígeno de TCR e o fragmento de ligação a antígeno de TCR adicional são fragmentos scTCR.
77. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70-72 e 75-76, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende um domínio variável de cadeia pesada ligado a um domínio variável de cadeia leve através de um ligante peptídico flexível.
78. Proteína, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que o ligante peptídico flexível compreende (G4S)4.
79. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70-72 e 75-78, caracterizada pelo fato de que o scFv compreende um domínio variável de cadeia pesada posicionado no terminal N ou no terminal C de um domínio variável de cadeia leve.
80. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67-79, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, e em que o domínio variável da cadeia pesada forma uma ponte dissulfeto com o domínio variável da cadeia leve.
81. Proteína, de acordo com a reivindicação 80, caracterizada pelo fato de que a ponte dissulfeto é formada entre Cys na posição 44 no domínio variável da cadeia pesada e Cys na posição 100 no domínio variável da cadeia leve, com as posições definidas sob a numeração de Kabat.
82. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67-81, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno se liga a NKG2D em humanos.
83. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67-82, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre: SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:334 e SEQ ID NO:337.
84. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:94 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
85. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:322 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
86. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:325 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
87. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:328 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
88. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:331 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
89. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:334 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
90. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:337 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:98.
91. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:44 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:48.
92. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:52 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:56.
93. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:60 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:61.
94. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:62 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:66.
95. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:70 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:74.
96. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:78 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:82.
97. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:86 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:90.
98. Proteína, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:102 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:106.
99. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67-82, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:110 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:111.
100. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67-82, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:112 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:113.
101. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67-100, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo de um antígeno associado a tumor apresentado por um complexo principal de histocompatibilidade (MHC).
102. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo ELAVL4 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:425 apresentado por HLA-
A*02:01:48, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:351 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:352.
103. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo de insulina com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:426 apresentado por HLA- A*02:01:48, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:357 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:358.
104. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo TERT com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:340 apresentado por HLA-A*02:01:48, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:363 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:364.
105. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo ERBB2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:341 apresentado por HLA-A*02, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:430 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:431.
106. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo WT1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:342 apresentado por HLA-A*02, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:434 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:435.
107. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo WT1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:342 apresentado por HLA-A*02, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:438 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:439.
108. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo MAGE-A3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:343 apresentado por HLA-A1, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:375 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:376.
109. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo MART1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:344 apresentado por HLA-A2, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:381 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:382.
110. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo BIRC5 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:346 apresentado por HLA-A2, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:442 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:443.
111. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo BIRC5 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:346 apresentado por HLA-A2, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:444 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:445.
112. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo PRAME com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:347 apresentado por HLA-A2, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:395 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:396.
113. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo PRAME com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:347 apresentado por HLA-A2, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:401 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:402.
114. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo PRAME com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:347 apresentado por HLA-A2, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:407 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:408.
115. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo NY-ESO- 1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:348 apresentado por HLA-A2, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:413 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:414.
116. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo NY-ESO- 1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:348 apresentado por HLA-A2, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:418 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:414.
117. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo NY-ESO- 1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:348 apresentado por HLA-A2, e em que o fragmento de ligação a antígeno de TCR compreende um domínio variável de cadeia alfa pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:421 e um domínio variável de cadeia beta pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO:422.
118. Proteína, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno de TCR se liga a um peptídeo SSX2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:345 apresentada por HLA-A2.
119. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67-118, caracterizada pelo fato de que a região constante do anticorpo ou a porção da mesma suficiente para se ligar ao CD16 compreende uma dobradiça e um domínio
CH2 de um anticorpo IgG1 humano.
120. Proteína, de acordo com a reivindicação 119, caracterizada pelo fato de que a região constante do anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para se ligar ao CD16 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano.
121. Proteína, de acordo com a reivindicação 120, caracterizada pelo fato de que a região constante do anticorpo ou uma porção da mesma suficiente para se ligar ao CD16 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao domínio Fc da IgG1 humana e difere em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e K439.
122. Formulação caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-121, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
123. Célula caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-121.
124. Método para potencializar a morte de células tumorais, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende a exposição de um tumor e de células natural killer à proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-
121.
125. Método para tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração da proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-121, ou da formulação de acordo com a reivindicação 122, a um paciente.
126. Método, de acordo com a reivindicação 125, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo em leucemia mieloide aguda, leucemia mielomonocítica aguda, linfoma de células B, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, linfoma difuso de grandes células B, câncer esofágico, sarcoma de Ewing, linfoma folicular, câncer gástrico, câncer gastrointestinal, tumores estromais gastrointestinais, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, carcinoma de células renais, neuroblastoma, câncer pulmonar de não pequenas células, tumores neuroendócrinos, câncer de ovário e câncer de pâncreas, câncer de próstata, sarcomas, câncer pulmonar de pequenas células, linfoma de células T, câncer de testículo, carcinoma tímico, câncer de tireoide, câncer urotelial, cânceres infiltrados por células supressoras derivadas da linhagem mieloide, cânceres com deposição de matriz extracelular, cânceres com altos níveis de estroma reativo e cânceres com neoangiogênese.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102375218B1 (ko) 2016-12-08 2022-03-17 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 T 세포 수용체 및 이를 사용하는 면역 요법
CN110944651A (zh) 2017-02-08 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
CR20200013A (es) 2017-07-14 2020-03-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Molécula de polipéptido con especificidad dual mejorada
US11884733B2 (en) 2018-02-08 2024-01-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the NKG2D receptor
JP7353576B2 (ja) * 2018-02-20 2023-10-02 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｄ３３、ｎｋｇ２ｄ、及びｃｄ１６に結合する多重特異性結合タンパク質、ならびにその使用方法
DE202019005887U1 (de) 2018-07-03 2023-06-14 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon
EA202091888A1 (ru) 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
BR112021002278A2 (pt) * 2018-08-08 2021-07-20 Dragonfly Therapeutics, Inc. proteínas que ligam nkg2d, cd16 e um antígeno associado a tumor
KR20220016083A (ko) 2019-04-30 2022-02-08 센티 바이오사이언시스, 인코포레이티드 키메라 수용체 및 이의 사용 방법
EP4143236A1 (en) * 2020-05-01 2023-03-08 Novartis AG Engineered immunoglobulins
KR20230005952A (ko) * 2020-05-04 2023-01-10 임뮤노라이즌 엘티디. 전구체 삼중-특이적 항체 구조체 및 그의 이용 방법
WO2022074206A1 (en) * 2020-10-08 2022-04-14 Affimed Gmbh Trispecific binders
EP4273161A1 (en) * 2020-12-31 2023-11-08 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Protein containing heterodimer antibody fc, and preparation method therefor
TW202309071A (zh) 2021-05-05 2023-03-01 德商英麥提克生物技術股份有限公司 特異性結合ｐｒａｍｅ之抗原結合蛋白
US20230116446A1 (en) * 2021-09-21 2023-04-13 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation HETERODIMERIC Fc FOR MAKING FUSION PROTEINS AND BISPECIFIC ANTIBODIES
WO2023148494A1 (en) * 2022-02-03 2023-08-10 University College Cardiff Consultants Limited Novel t-cell receptor

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10156482A1 (de) * 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
AU2005291039A1 (en) * 2004-10-01 2006-04-13 Avidex Ltd. T-cell receptors containing a non-native disulfide interchain bond linked to therapeutic agents
GB0614780D0 (en) * 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
SI2794658T1 (sl) * 2011-12-19 2017-05-31 Synimmune Gmbh Bispecifična molekula protitelesa
EP2922874A4 (en) * 2012-11-21 2016-10-19 Wuhan Yzy Biopharma Co Ltd BISPECIFIC ANTIBODIES
KR101522954B1 (ko) * 2012-11-27 2015-05-27 아주대학교산학협력단 항체 중쇄불변부위의 이종이중체 고효율 형성을 유도하는 ch3 도메인 변이체 쌍, 이의 제조방법, 및 용도
AU2014232501C1 (en) * 2013-03-15 2021-04-22 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
JP6721590B2 (ja) * 2014-12-03 2020-07-15 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性抗体
EP3233122A4 (en) * 2014-12-17 2018-09-19 Intrexon Corporation Intercalated single-chain variable fragments
EP3095792A1 (en) * 2015-05-19 2016-11-23 Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München T cell receptor with specificity for myeloperoxidase peptide and uses thereof
US20180327499A1 (en) * 2015-11-13 2018-11-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti- nkg2d single domain antibodies and uses thereof
US20200048345A1 (en) * 2015-12-28 2020-02-13 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
WO2017165464A1 (en) * 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
CN110944651A (zh) * 2017-02-08 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途
MX2019009566A (es) * 2017-02-10 2020-01-20 Dragonfly Therapeutics Inc Proteinas de union a bcma, nkg2d y cd16.
CA3235295A1 (en) * 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
JP2020510646A (ja) * 2017-02-20 2020-04-09 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｄ３３、ｎｋｇ２ｄ及びｃｄ１６と結合するタンパク質
JP2020531438A (ja) * 2017-08-16 2020-11-05 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、およびｅｇｆｒ、ｈｌａ−ｅ、ｃｃｒ４、またはｐｄ−ｌ１に結合するタンパク質

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