BR112019017277A2 - proteínas de ligação a cd33, nkg2d e cd16 - Google Patents

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P Chang Gregory
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Abstract

proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a cd33, ao receptor nkg2d e a cd16 são descritas, bem como composições farmacêuticas e métodos terapêuticos úteis para o tratamento de câncer.

Description

PROTEÍNAS QUE SE LIGAM AO CD33, NKG2D E CD16
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício de e prioridade ao Pedido de Patente Provisório US N2 62/461.145, depositado em 20 de fevereiro de 2017, cujos conteúdos inteiros são incorporados por referência aqui para todos os propósitos.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é por meio deste incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia de ASCII, criada em 19 de fevereiro de 2018, é denominada DFY-007PC_SL.txt e é de 98.304 bytes em tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO [003] A invenção refere-se a proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao CD33, ao receptor NKG2D e CD16.
FUNDAMENTOS [004] O câncer continua sendo um problema de saúde significativo, não obstante dos esforços de pesquisa substanciais e avanços científicos relatados na literatura para tratar esta doença. Alguns dos cânceres mais frequentemente diagnosticados em adultos incluem câncer de próstata, câncer de mama e câncer de pulmão. Malignidades hematológicas, ainda que menos frequentes do que cânceres sólidos, têm baixas taxas de sobrevivência. As atuais opções de tratamento para estes cânceres não são eficazes para todos os pacientes e/ou podem ter efeitos colaterais adversos substanciais. Outros tipos de câncer também permanecem desafiadores para tratar usando opções terapêuticas existentes.
[005] Imunoterapias contra o câncer são desejáveis porque elas são
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2/85 altamente específicas e podem facilitar a destruição de células cancerígenas usando o sistema imune do próprio paciente. Proteínas de fusão tais como aclopadores de célula T biespecíficos são imunoterapias contra o câncer descritas na literatura que se ligam a células tumorais e células T para facilitar a destruição de células tumorais. Anticorpos que se ligam a certos antígenos associados ao tumor e a certas células imunes foram descritos na literatura. Ver, por exemplo, WO 2016/134371 e WO 2015/095412.
[006] Células natural killer (NK) são um componente do sistema imune inato e compõem aproximadamente 15 % de linfócitos circulantes. Células NK infiltram virtualmente todos os tecidos e foram originalmente caracterizadas por sua capacidade de matar células tumorais eficazmente sem a necessidade de sensibilização prévia. Células NK ativadas matam células alvos por meios similares às células T citolíticas - isto é, por intermédio de grânulos citotóxicos que contêm perforina e granzimas bem como por intermédio de vias de receptor de morte. Células NK ativadas também secretam citocinas inflamatórias tais como IFN-gama e quimiocinas que promovem o recrutamento de outros leucócitos ao tecido alvo.
[007] Células NK respondem aos sinais através de uma variedade de receptores ativadores e inibitórios em sua superfície. Por exemplo, quando células NK encontram auto-células saudáveis, sua atividade é inibida através da ativação dos receptores semelhantes à imunoglobulina de célula killer (KIRs). Alternativamente, quando células NK encontram células estranhas ou células cancerígenas, elas são ativadas por intermédio de seus receptores ativadores (por exemplo, NKG2D, NCRs, DNAM1). Células NK também são ativadas pela região constante de algumas imunoglobulinas através de receptores CD16 em sua superfície. A sensibilidade global de células NK à ativação depende da soma de sinais estimuladores e inibitórios.
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3/85 [008] CD33 é um membro das lectinas semelhantes à imunoglobina de ligação a ácido siálico. Como um receptor de transmembrana principalmente expresso em células de linhagem mielóide, CD33 modula respostas inflamatórias e imunes através de um efeito atenuante sobre as vias de sinalização acionadas por tirosina cinase. Por exemplo, CD33 mostrou suprimir constitutivamente a produção de citocinas pró-inflamatórias tais como IL-Ιβ, TNF-α e IL-8 por monócitos humanos.
[009] CD33 é associado com cânceres hematopoiéticos. Ele é amplamente expresso em blastos de quase toda leucemia mielóide aguda (AML). Além disso, células-tronco e/ou células progenitoras de câncer hematopoiético são descobertas serem CD33+, implicando que a terapia conduzida por CD33 pode potencialmente erradicar células-tronco e/ou células progenitoras malignas em tais casos enquanto poupando células-tronco hematopoiéticas normais. Além de sua expressão em AML, CD33 é encontrado em outros neoplasmas mieloides (por exemplo, síndromes mielodisplásicas e neoplasmas mieloproliferativos) e em subconjuntos de leucemias linfoblásticas agudas (ALL)/linfomas linfoblásticos de célula B e célula T. Este padrão de expressão tem levado ao uso de produtos terapêuticos conduzidos por CD33 em pacientes com malignidades incluindo AML, síndromes mielodisplásicas, leucemia mielomonocítica crônica, crise blástica mielóide de leucemia mielóide crônica e ALLs.
SUMÁRIO [010] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao CD33 em uma célula cancerígena e ao receptor NKG2D e receptor CD16 em células natural killer. Tais proteínas podem acoplar mais do que um tipo de receptor ativador de NK e podem bloquear a ligação de ligantes naturais ao NKG2D. Em certas modalidades, as proteínas podem agonizar células NK em seres humanos e em outras espécies tais como roedores e macacos cinomolgos.
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Vários aspectos e modalidades da invenção são descritos em mais detalhe abaixo.
[011] Consequentemente, um aspecto da invenção fornece uma proteína que incorpora um primeiro sítio de ligação a antigeno que se liga ao NKG2D; um segundo sítio de ligação a antigeno que se liga ao CD33; e um domínio Fc de anticorpo, uma porção do mesmo suficiente para se ligar ao CD16 ou um terceiro sítio de ligação a antigeno que se liga ao CD16. Cada um dos sítios de ligação a antigeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo, por exemplo, arranjados como em um anticorpo ou fundidos entre si para formar um scFv ou um ou mais dos sítios de ligação a antigeno podem ser um anticorpo de domínio único, tal como um anticorpo VhH como um anticorpo de camelídeo ou um anticorpo Vnar como aqueles encontrados em peixes cartilaginosos.
[012] O primeiro sítio de ligação a antigeno, que se liga ao NKG2D, em uma modalidade, pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 1, tal como tendo-se uma sequência de aminoácido pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntica à SEQ ID NO: 1 e/ou incorporando-se sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 54), CDR2 (SEQ ID NO: 55) e CDR3 (SEQ ID NO: 56) da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, o primeiro sítio de ligação a antigeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 42. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação a antigeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 41 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 57), CDR2 (SEQ ID NO: 58) e CDR3 (SEQ ID NO: 59) da SEQ ID NO: 41.
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Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antigeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 42 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 60), CDR2 (SEQ ID NO: 61) e CDR3 (SEQ ID NO: 62) da SEQ ID NO: 42. Em outras modalidades, o primeiro sítio de ligação a antigeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 43 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 44. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação a antigeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 43 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 63), CDR2 (SEQ ID NO: 64) e CDR3 (SEQ ID NO: 65) da SEQ ID NO: 43. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antigeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 44 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 66), CDR2 (SEQ ID NO: 67) e CDR3 (SEQ ID NO: 68) da SEQ ID NO: 44.
[013] Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação a antigeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 45 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 46, tal como tendose sequências de aminoácido pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas à SEQ ID NO: 45 e pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas à SEQ ID NO: 46 respectivamente. Em uma outra modalidade, o primeiro sítio de ligação a antigeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 47 e um domínio variável de
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6/85 cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 48, tal como tendo-se sequências de aminoácido pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas à SEQ ID NO: 47 e pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idênticas à SEQ ID NO: 48 respectivamente.
[014] Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação a antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 70. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 69 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 71), CDR2 (SEQ ID NO: 72) e CDR3 (SEQ ID NO: 73) da SEQ ID NO: 69. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 70 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 74), CDR2 (SEQ ID NO: 75) e CDR3 (SEQ ID NO: 76) da SEQ ID NO: 70. Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação a antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 77 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 78. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 77 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 69), CDR2 (SEQ ID NO: 80) e CDR3 (SEQ ID NO: 81) da SEQ ID NO: 77. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %,
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7/85 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 78 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 82), CDR2 (SEQ ID NO: 83) e CDR3 (SEQ ID NO: 84) da SEQ ID NO: 78.
[015] Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação a antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 85 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 86. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 85 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 87), CDR2 (SEQ ID NO: 88) e CDR3 (SEQ ID NO: 89) da SEQ ID NO: 85. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 86 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 90), CDR2 (SEQ ID NO: 91) e CDR3 (SEQ ID NO: 92) da SEQ ID NO: 86.
[016] Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação a antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 133 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 134. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do primeiro sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 133 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 135), CDR2 (SEQ ID NO: 136) e CDR3 (SEQ ID NO: 137) da SEQ ID NO: 133. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 134 e/ou incorporar sequências de
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8/85 aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 138), CDR2 (SEQ ID NO: 139) e CDR3 (SEQ ID NO: 140) da SEQ ID NO: 134.
[017] O segundo sítio de ligação a antígeno pode, opcionalmente, incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 93 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 94. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 93 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 95), CDR2 (SEQ ID NO: 96) e CDR3 (SEQ ID NO: 97) da SEQ ID NO: 93. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 94 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 98), CDR2 (SEQ ID NO: 99) e CDR3 (SEQ ID NO: 100) da SEQ ID NO: 94.
[018] Alternativamente, o segundo sítio de ligação a antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 101 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 102. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 101 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 103), CDR2 (SEQ ID NO: 104) e CDR3 (SEQ ID NO: 105) da SEQ ID NO: 101. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 58 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 106), CDR2 (SEQ ID NO:
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107) e CDR3 (SEQ. ID NO: 108) da SEQ ID NO: 102.
[019] Em uma outra modalidade, o segundo sítio de ligação a antigeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 109 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 110. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação a antigeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 59 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 111), CDR2 (SEQ ID NO: 112) e CDR3 (SEQ ID NO: 113) da SEQ ID NO: 109. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antigeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 110 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 114), CDR2 (SEQ ID NO: 115) e CDR3 (SEQ ID NO: 116) da SEQ ID NO: 110.
[020] Em uma outra modalidade, o segundo sítio de ligação a antigeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 117 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 118. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação a antigeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 117 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 119), CDR2 (SEQ ID NO: 120) e CDR3 (SEQ ID NO: 121) da SEQ ID NO: 117. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antigeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 118 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 122), CDR2 (SEQ ID NO: 123) e CDR3 (SEQ ID NO: 124) da SEQ ID NO: 118.
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10/85 [021] Em uma outra modalidade, o segundo sítio de ligação a antígeno pode incorporar um domínio variável de cadeia pesada relacionado à SEQ ID NO: 125 e um domínio variável de cadeia leve relacionado à SEQ ID NO: 126. Por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 125 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 127), CDR2 (SEQ ID NO: 128) e CDR3 (SEQ ID NO: 129) da SEQ ID NO: 125. Similarmente, o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno pode ser pelo menos 90 % (por exemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %) idêntico à SEQ ID NO: 126 e/ou incorporar sequências de aminoácido idênticas às sequências de CDR1 (SEQ ID NO: 130), CDR2 (SEQ ID NO: 131) e CDR3 (SEQ ID NO: 132) da SEQ ID NO: 126.
[022] Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação a antígeno incorpora um domínio variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido do domínio variável de cadeia leve presente no primeiro sítio de ligação a antígeno.
[023] Em algumas modalidades, a proteína incorpora uma porção de um domínio Fc de anticorpo suficiente para se ligar ao CD16, em que o domínio Fc de anticorpo compreende domínios de dobradiça e CH2 e/ou sequências de aminoácido pelo menos 90 % idênticas à sequência de aminoácido 234 a 332 de um anticorpo de IgG humano.
[024] Formulações contendo uma destas proteínas; células contendo um ou mais ácidos nucleicos que expressam estas proteínas e métodos de realçar a morte de célula tumoral usando estas proteínas também são fornecidos.
[025] Um outro aspecto da invenção fornece um método de tratar câncer em um paciente. O método compreende administrar a um paciente em
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11/85 necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação multiespecífica descrita na presente invenção. Canceres exemplares para tratamento usando as proteínas de ligação multiespecíficas incluem, por exemplo, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em AML, síndromes mielodisplásicas, leucemia mielomonocítica crônica, crise blástica mielóide de leucemia mielóide crônica e ALLs.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [026] A FIG. 1 é uma representação de um anticorpo multiespecífico, heterodimérico. Cada braço pode representar o domínio de ligação ao NKG2D ou domínio de ligação ao CD33. Em algumas modalidades, os domínios de ligação ao NKG2D e CD33s podem compartilhar uma cadeia leve comum.
[027] A FIG. 2 é uma representação de um anticorpo multiespecífico, heterodimérico. O domínio de ligação ao NKG2D ou CD33 pode tomar o formato de scFv (braço direito).
[028] A FIG. 3 são gráficos de linhas demonstrando a afinidade de ligação de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2D recombinante humano em um ensaio ELISA.
[029] A FIG. 4 são gráficos de linhas demonstrando a afinidade de ligação de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2D recombinante de cinomolgo em um ensaio ELISA.
[030] A FIG. 5 são gráficos de linhas demonstrando a afinidade de ligação de domínios de ligação ao NKG2D (listado como clones) ao NKG2D recombinante de camundongo em um ensaio ELISA.
[031] A FIG. 6 são gráficos de barras demonstrando a ligação de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) a células EL4 que expressam NKG2D humano por citometria de fluxo mostrando intensidade de fluorescência média (MFI) sobre o fundo.
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12/85 [032] A FIG. 7 são gráficos de barras demonstrando a ligação de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) a células EL4 que expressam NKG2D de camundongo por citometria de fluxo mostrando intensidade de fluorescência média (MFI) sobre o fundo.
[033] A FIG. 8 são gráficos de linhas demonstrando afinidade de ligação específica de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2DFc humano recombinante por competição com o ligante natural ULBP-6.
[034] A FIG. 9 são gráficos de linhas demonstrando afinidade de ligação específica de domínios de ligação aoo NKG2D (listados como clones) a NKG2DFc humano recombinante por competição com o ligante natural MICA.
[035] A FIG. 10 são gráficos de linhas demonstrando afinidade de ligação específica de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) ao NKG2D-Fc de camundongo recombinante por competição com o ligante natural Rae-1 delta.
[036] FIG. 11 são gráficos de barras mostrando a ativação de NKG2D humano por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) quantificando-se a porcentagem de células positivas para TNF-alfa, que expressam proteínas de fusão de NKG2D-CD3 zeta humano.
[037] A FIG. 12 são gráficos de barras mostrando a ativação de NKG2D de camundongo por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) quantificando-se a porcentagem de células positivas para TNF-alfa, que expressam proteínas de fusão de NKG2D-CD3 zeta de camundongo.
[038] A FIG. 13 são gráficos de barras mostrando a ativação de células NK humanas por domínios de ligação aoo NKG2D (listados como clones).
[039] A FIG. 14 são gráficos de barras mostrando a ativação de células NK humanas por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones).
[040] A FIG. 15 são gráficos de barras mostrando a ativação de células NK
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13/85 de camundongo por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones).
[041] A FIG. 16 são gráficos de barras mostrando a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones).
[042] A FIG. 17 são gráficos de barras mostrando o efeito citotóxico de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) sobre células tumorais.
[043] A FIG. 18 são gráficos de barras mostrando a temperatura de fusão de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) medida por fluorimetria diferencial de varredura.
[044] As FIGs. 19A a 19C são gráficos de barras da ativação sinérgica de células NK usando ligação ao CD16 e NKG2D. A FIG. 19A demonstra níveis de CD107a; a FIG. 19B demonstra níveis de IFNy; a FIG. 19C demonstra níveis de CD107a e IFNy. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± SD. Os dados são representativos de cinco experimentos independentes usando cinco doadores saudáveis diferentes.
[045] A FIG. 20 é uma representação de uma TriNKET na forma de Triomab, que é um anticorpo biespecífico, trifuncional que mantém uma forma semelhante à IgG. Esta quimera consiste em duas metades de anticorpos, cada um com uma cadeia leve e uma cadeia pesada, que originam-se de dois anticorpos precursores. A forma de Triomab pode ser um constructo heterodimérico contendo de anticorpo de rato e de anticorpo de camundongo.
[046] A FIG. 21 é uma representação de uma TriNKET na forma de cadeia leve (LC) comum de KiH, que envolve a tecnologia de knobs-into-holes (KIHs). KiH é um heterodímero contendo 2 Fabs que se ligam ao alvo 1 e 2 e um Fc estabilizado por mutações com heterodimerização. TriNKET no formato de KiH pode ser um constructo heterodimérico com 2 fabs que se ligam ao alvo 1 e alvo 2, contendo duas cadeias pesadas diferentes e uma cadeia leve comum que
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14/85 emparelha com ambas as cadeias pesadas.
[047] A FIG. 22 é uma representação de uma TriNKET na forma de imunoglobulina variável de domínio duplo (DVD-lg™), que combina os domínios de ligação ao alvo de dois anticorpos monoclonais por intermédio de ligantes que ocorrem naturalmente flexíveis e produz uma molécula semelhante à IgG tetravalente. DVD-lg™ é um constructo homodimérico onde o antigeno 2 direcionado a domínio variável é fundido ao N-terminal do domínio variável de antigeno 1 direcionado a Fab. O constructo contém Fc normal.
[048] A FIG. 23 é uma representação de uma TriNKET na forma de interface de Fab Ortogonal (Orto-Fab), que é um constructo heterodimérico que contém 2 Fabs que se ligam ao alvo 1 e alvo 2 fundidos a Fc. O pareamento de LC-HC é garantido pela interface ortogonal. A heterodimerização é garantida por mutações no Fc.
[049] A FIG. 24 é uma representação de um TrinKET no formato de Ig 2-em1.
[050] A FIG. 25 é uma representação de uma TriNKET na forma de ES, que é um constructo heterodimérico contendo dois Fabs diferentes que se ligam ao alvo 1 e alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é garantida por mutações direcionais eletrostáticas no Fc.
[051] A FIG. 26 é uma representação de uma TriNKET na forma de Permuta de Braço Fab: anticorpos que permutam braços Fab trocando-se uma cadeia pesada e cadeia leve ligada (semi-molécula) com um par de cadeia pesada-leve de uma outra molécula, resultando em anticorpos biespecíficos. A forma de Permuta de Braço Fab (cFae) é um heterodímero contendo 2 Fabs que se ligam ao alvo 1 e 2 e um Fc estabilizado por mutações com heterodimerização.
[052] A FIG. 27 é uma representação de uma TriNKET na forma de corpo SEED, que é um heterodímero contendo 2 Fabs que se ligam ao alvo 1 e 2 e um
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Fc estabilizado por mutações com heterodimerização.
[053] A FIG. 28 é uma representação de uma TriNKET na forma de LuZ-Y, em que zíper de leucina é usado para induzir a heterodimerização de duas HCs diferentes. A forma de LuZ-Y é um heterodímero contendo dois scFabs diferentes que se ligam ao alvo 1 e 2, fundidos a Fc. A heterodimerização é garantida através de motivos de zíper de leucina fundidos ao C-terminal de Fc.
[054] A FIG. 29 é uma representação de uma TriNKET na forma de corpo Cov-X.
[055] As FIGs. 30A a 30B são representações de TriNKETs nas formas de corpo κλ, que são um constructo heterodimérico com dois Fabs diferentes fundidos a Fc estabilizado por mutações com heterodimerização: antígeno 1 direcionado a Fabl contém kappa LC, enquanto o segundo antígeno 2 direcionado a Fab contém lambda LC. A FIG. 30A é uma representação exemplar de uma forma de um corpo κλ; a FIG. 30B é uma representação exemplar de um outro corpo κλ.
[056] A FIG. 31 é um constructo heterodimérica de Oasc-Fab que inclui Fab que se liga ao alvo 1 e scFab que se liga ao alvo 2 fundido a Fc. A heterodimerização é garantida por mutações no Fc.
[057] A FIG. 32 é um DuetMab, que é um constructo heterodimérico contendo dois Fabs diferentes que se ligam aos antígenos 1 e 2 e Fc estabilizado por mutações com heterodimerização. Fab 1 e 2 contêm pontes de S-S diferenciais que garantem pareamento de cadeia leve (LC) e cadeia pesada (HC) correto.
[058] A FIG. 33 é um CrossmAb, que é um constructo heterodimérico com dois Fabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2 fundidos a Fc estabilizado por heterodimerização. Domínios CL e CHI e domínios VH e VL são comutados, por exemplo, CHI é fundido em linha com VL, enquanto CL é fundido em linha com
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VH.
[059] A FIG. 34 é um Fit-lg, que é um constructo homodimérico onde Fab que se liga ao antigeno 2 é fundido ao N-terminal de HC de Fab que se liga ao antigeno 1. O constructo contém Fc do tipo selvagem.
[060] As FIG. 35A a 35B são perfis de ligação de TriNKETs direcionados ao CD33 ao NKG2D expresso em células EL4. A FIG. 35A mostra a ligação das TriNKETs em comparação com os anticorpos monoclonais que contêm o domínio de ligação ao NKG2D correspondente. A FIG. 35B mostra o perfil de ligação de TriNKETs direcionados ao CD33 que incluem 6 domínios de ligação ao NKG2D diferentes.
[061] As FIGs. 36A e 36B são perfis de ligação de TriNKETs direcionado ao CD33 ao CD33 expressos em células de AML humanas MV4-11. A FIG. 36C é um perfil de ligação de TriNKETs direcionado a CD33 e anticorpo monoclonal de CD33 ao CD33 expresso em células de AML humanas Molm-13. A FIG. 36D é o perfil de ligação de TriNKETs direcionado ao CD33 e anticorpo monoclonal de CD33 ao CD33 expresso em linhagem celular de AML humana MV4-11.
[062] As FIGs. 37A a 37B são gráficos de linhas demonstrando a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas em repouso ou ativadas por IL-2 em co-cultura com a linhagem celular de AML humana que expressa CD33 MV411. A FIG. 37A mostra a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas em repouso. A FIG. 37B mostra a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas ativadas por IL-2 do mesmo doador. Células NK sozinhas, células NK cocultivadas com células MV4-11 mas sem TriNKETs e uma TriNKET direcionado a CD20 foram usadas como controles.
[063] As FIGs. 38A a 38C são histogramas mostrando que a expressão do FcRyl de afinidade alta (CD64) em três linhagens celulares de AML humanas, linhagem celular Molm-13 (FIG. 38A), linhagem celular MV4-11 (FIG. 38B) e
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17/85 linhagem celular THP-1 (FIG. 38C).
[064] As FIGs. 39A a 39B são gráficos de linhas de ativação mediada por anticorpo monoclonal de CD33 ou TriNKETs de células NK humanas em cocultura com células Molm-13 (FIG. 39B) ou THP-1 (FIG. 39A). A FIG. 39C mostra a ativação de células NK humanas por TriNKETs em co-cultura com linhagem celular de AML humana MV4-11. HER2-TriNKET foi usado como um controle.
[065] FIGs. 40A a 40C são gráficos de linhas de citotoxicidade de NK humana para três linhagens celulares de AML humanas mediadas por TriNKETs direcionados ao CD33 e o anticorpo monoclonal de CD33 correspondente. A FIG. 40A mostra que o anticorpo monoclonal de CD33 mostrou eficácia reduzida para células MV4-11, que expressam CD64, mas em um nível mais baixo do que THP1. A FIG. 40B demonstra que o anticorpo monoclonal de CD33 mostrou boa eficácia para células Molm-13, que não expressam CD64. A FIG. 40C demonstra que o anticorpo monoclonal de CD33 não mostrou nenhum efeito sobre células THP-1.
[066] A FIG. 41 mostra a citotoxicidade mediada por TriNKETs de células NK humanas em repouso para células Molm-13.
[067] A FIG. 42A é um gráfico de barras mostrando que células B de um doador saudável são protegidas de lise mediada por TriNKET direcionado ao CD33. A FIG. 42B é um gráfico de barras mostrando que células de mielócitos CD33+ autólogos foram protegidos de repostas de célula NK mediadas por TriNKET direcionado ao CD33, e, portanto, foram resistentes à lise mediada por TriNKET.
DESCRIÇÃO DETALHADA [068] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao CD33 em uma célula cancerígena e ao receptor NKG2D e receptor CD16 em células natural killer para ativar as células natural killer, composições
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18/85 farmacêuticas compreendendo tais proteínas de ligação multiespecíficas e métodos terapêuticos usando tais proteínas multiespecíficas e composições farmacêuticas, incluindo para o tratamento de câncer. Vários aspectos da invenção são apresentados abaixo nas seções; entretanto, aspectos da invenção descritos em uma seção particular não devem ser limitados a qualquer seção particular.
[069] Para facilitar uma compreensão da presente invenção, vários termos e frases são definidos abaixo.
[070] Os termos um e uma como usados na presente invenção significam um ou mais e incluem o plural a menos que o contexto seja inapropriado.
[071] Como usado na presente invenção, o termo sítio de ligação a antígeno refere-se à parte da molécula de imunoglobulina que participa na ligação ao antígeno. Em anticorpos humanos, o sítio de ligação a antígeno é formado por resíduos de aminoácido das regiões variáveis (V) N-terminais das cadeias pesadas (H) e leves (L). Três trechos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesadas e leves são referidos como regiões hipervariáveis que são interpostas entre trechos de flanqueamento mais conservados conhecidos como regiões de estrutura ou FR. Assim o termo FR refere-se às sequências de aminoácido que são naturalmente encontradas entre regiões hipervariáveis e adjacentes às mesmas em imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo humana, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada são dispostas em relação uma à outra em espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação a antígeno. A superfície de ligação a antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesadas e leves são referidas como regiões
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19/85 determinantes de complementaridade ou CDRs. Em certos animais, tais como camelos e peixes cartilaginosos, o sítio de ligação a antígeno é formado por uma única cadeia de anticorpo fornecendo um anticorpo de domínio único. Sítios de ligação a antígeno podem existir em um anticorpo intacto, em um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que mantém a superfície de ligação a antígeno ou em um polipeptideo recombinante tal como um scFv, usando um ligante peptídico para conectar o domínio variável de cadeia pesada ao domínio variável de cadeia leve em um único polipeptideo.
[072] O termo antígeno associado ao tumor como usado na presente invenção significa qualquer antígeno incluindo, mas não limitado a, uma proteína, glicoproteína, gangliosídeo, carboidrato, lipídeo que é associado com câncer. Tal antígeno pode ser expresso em células malignas ou no microambiente tumoral tal como em vasos sanguíneos associados ao tumor, matriz extracelular, estroma mesenquimal ou infiltrados imunes.
[073] Como usado na presente invenção, os termos indivíduo e paciente referem-se a um organismo a ser tratado pelos métodos e composições descritos na presente invenção. Tais organismos preferivelmente incluem, mas não são limitados a, mamíferos (por exemplo, murinos, símios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos e semelhantes) e mais preferivelmente incluem seres humanos.
[074] Como usado na presente invenção, o termo quantidade eficaz refere-se à quantidade de um composto (por exemplo, um composto da presente invenção) suficiente para produzir resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não é intencionada a ser limitada a uma formulação ou via de administração particular. Como usado na presente invenção, o termo tratar inclui qualquer efeito, por exemplo, diminuição, redução, modulação,
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20/85 melhora ou eliminação, que resulta na melhoria da condição, doença, transtorno e semelhantes ou melhora de um sintoma destes.
[075] Como usado na presente invenção, o termo composição farmacêutica refere-se à combinação de um agente ativo com um veículo, inerte ou ativo, tornando a composição especialmente adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vivo ou ex vivo.
[076] Como usado na presente invenção, o termo veículo farmaceuticamente aceitável refere-se a qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão, tal como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões (por exemplo, tais como emulsões óleo/água ou água/óleo) e vários tipos de agentes umectantes. As composições também podem incluir estabilizantes e conservantes. Para exemplos de veículos, estabilizantes e adjuvantes, ver, por exemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15â Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].
[077] Como usado na presente invenção, o termo sal farmaceuticamente aceitável refere-se a qualquer sal farmaceuticamente aceitável (por exemplo, ácido ou base) de um composto da presente invenção que, durante a administração a um indivíduo, é capaz de fornecer um composto desta invenção ou um metabólito ativo ou resíduo do mesmo. Como é conhecido ao técnicos no assunto, sais dos compostos da presente invenção podem ser derivados de ácidos e bases inorgânicos ou orgânicos. Ácidos exemplares incluem, mas não são limitados a, ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, lático, salicílico, succínico, tolueno-psulfônico, tartárico, acético, cítrico, metanossulfônico, etanossulfônico, fórmico, benzoico, malônico, naftaleno-2-sulfônico, benzenossulfônico e semelhantes. Outros ácidos, tais como oxálico, embora não sejam por si só farmaceuticamente aceitáveis, podem ser utilizados na preparação de sais úteis como intermediários
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21/85 em obter os compostos da invenção e seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis.
[078] Bases exemplares incluem, mas não são limitadas a, hidróxidos de metal alcalino (por exemplo, sódio), hidróxidos de metal alcalino terroso (por exemplo, magnésio), amônia e compostos da fórmula NWzT, em que W é alquila Ci-4 e semelhantes.
[079] Sais exemplares incluem, mas não são limitados a: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digliconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, flucoeptanoato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, bromidrato, iodidrato, 2hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartarato, tiocianato, tosilato, undecanoato e semelhantes. Outros exemplos de sais incluem ânions dos compostos da presente invenção compostos com um cátion adequado tal como Na+, NH4+ e NW4+ (em que W é um grupo alquila C1-4) e semelhantes.
[080] Para uso terapêutico, sais dos compostos da presente invenção são considerados como sendo farmaceuticamente aceitáveis. Entretanto, sais de ácidos e bases que são não farmaceuticamente aceitáveis também podem encontrar uso, por exemplo, na preparação ou purificação de um composto farmaceuticamente aceitável.
[081] Por toda a descrição, onde composições são descritas como tendo, incluindo ou compreendendo componentes específicos ou onde processos e métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas, é considerado que, adicionalmente, existem composições da presente invenção que consistem essencialmente ou consistem nos
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22/85 componentes relatados e que existem processos e métodos de acordo com a presente invenção que consistem essencialmente ou consistem nas etapas de processamento relatadas.
[082] Em geral, as composições que especificam uma porcentagem são em peso a menos que de outro modo especificado. Além disso, se uma variável não for acompanhada por uma definição, então a definição prévia das variáveis controla.
I. Proteínas [083] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam ao CD33 em uma célula cancerígena e ao receptor NKG2D e receptor CD16 em células natural killer para ativar a célula natural killer. As proteínas de ligação multiespecíficas são úteis nas composições farmacêuticas e métodos terapêuticos descritos na presente invenção. A ligação da proteína de ligação multiespecífica ao receptor NKG2D e receptor CD16 na célula natural killer realça a atividade da célula natural killer para a destruição de uma célula cancerígena. A ligação da proteína de ligação multiespecífica ao CD33 em uma célula cancerígena traz a célula cancerígena em proximidade à célula natural killer, o que facilita a destruição direta e indireta da célula cancerígena pela célula natural killer. Outra descrição de proteínas de ligação multiespecíficas exemplares é fornecida abaixo.
[084] O primeiro componente das proteínas de ligação multiespecíficas se liga às células que expressam receptor NKG2D, que podem incluir, mas não são limitadas a, células NK, células T γδ e células T αβ CD8+. Durante a ligação de NKG2D, as proteínas de ligação multiespecíficas podem bloquear ligantes naturais, tais como ULBP6 e MICA, de se ligarem aos receptores de NKG2D e de ativadores de NKG2D.
[085] O segundo componente das proteínas de ligação multiespecíficas se
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23/85 liga a células que expressam CD33, que podem incluir, mas não são limitadas a, AML, síndromes mielodisplásicas, leucemia mielomonocítica crônica, crise blástica mielóide de leucemia mielóide crônica e ALLs.
[086] O terceiro componente para as proteínas de ligação multiespecíficas se liga a células que expressam CD16, um receptor de Fc na superfície de leucócitos incluindo células natural killer, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos e células dendríticas foliculares.
[087] As proteínas de ligação multiespecíficas descritas na presente invenção podem tomar vários formatos. Por exemplo, um formato é um anticorpo multiespecífico, heterodimérico incluindo uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma primeira cadeia leve de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma segunda cadeia leve de imunoglobulina (FIG. 1). A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um primeiro domínio variável de cadeia pesada e opcionalmente um primeiro domínio de cadeia pesada de CHI. A primeira cadeia leve de imunoglobulina inclui um primeiro domínio variável de cadeia leve e um primeiro domínio constante de cadeia leve. A primeira cadeia leve de imunoglobulina, junto com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina, formam um sítio de ligação a antígeno que se liga ao NKG2D. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um segundo domínio variável de cadeia pesada e opcionalmente um segundo domínio de cadeia pesada de CHI. A segunda cadeia leve de imunoglobulina inclui um segundo domínio variável de cadeia leve e um segundo domínio constante de cadeia leve. A segunda cadeia leve de imunoglobulina, junto com a segunda cadeia pesada de imunoglobulina, formam um sítio de ligação a antígeno que se liga ao CD33. O primeiro domínio Fc e segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligar ao CD16 (FIG. 1). Em algumas modalidades, a primeira
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24/85 cadeia leve de imunoglobulina pode ser idêntica à segunda cadeia leve de imunoglobulina.
[088] Um outro formato exemplar envolve um anticorpo multiespecífico, heterodimérico incluindo uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina (FIG. 2). A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3) fundido por intermédio de um ligante ou uma dobradiça de anticorpo a um fragmento variável de cadeia única (scFv) composto de um domínio variável de cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve que emparelham e se ligam ao NKG2D ou CD33. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina inclui um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um segundo domínio variável de cadeia pesada e opcionalmente um domínio de cadeia pesada de CHI. A cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina emparelha com a cadeia leve de imunoglobulina e se liga ao NKG2D ou CD33. O primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligar ao CD16 (FIG. 2).
[089] Um ou mais motivos de ligação adicionais podem ser fundidos ao Cterminal do domínio CH3 de região constante, opcionalmente por intermédio de uma sequência de ligante. Em certas modalidades, o sítio de ligação a antigeno pode ser uma região variável de cadeia única ou estabilizada por dissulfeto (scFv) ou pode formar uma molécula tetravalente ou trivalente.
[090] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Triomab, que é um anticorpo biespecífico, trifuncional que mantém uma forma semelhante a IgG. Esta quimera consiste em duas metades de anticorpos, cada com uma cadeia leve e uma cadeia pesada, que originam-se de dois anticorpos precursores.
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25/85 [091] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica é a forma de cadeia leve (LC) comum de KiH, que envolve a tecnologia de knobsinto-holes (KIHs). A KIH envolve desenvolver domínios Ch3 para criar um knob ou um hole em cada cadeia pesada para promover a heterodimerização. O conceito por trás da tecnologia de Fc Knobs-into-Holes (KiH) foi introduzir um knob em um domínio CH3 (CH3A) por substituição de um pequeno resíduo com um volumoso (por exemplo, T366Wch3a em numeração EU). Para acomodar o knob, uma superfície hole complementar foi criada no outro domínio CH3 (CH3B) substituindo-se os resíduos vizinhos mais próximos ao knob com os menores (por exemplo, T366S/L368A/Y407Vch3b). A mutação hole foi otimizada por triagem da biblioteca de fago guiada por estrutura (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library, J. Mol. Biol. (1997) 270(1):26-35). Estruturas de cristal de X-ray de variantes Fc KiH (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, etal., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947-57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs. Mol. Immunol. (2014) 58(1):132-8) demonstraram que a heterodimerização é termodinamicamente favorecida por interações hidrofóbicas conduzidas por complementaridade estérica na interface do núcleo inter-domínio CH3, ao passo que as interfaces knob-knob e hole-hole não favorecem a homodimerização devido ao impedimento estérico e rompimento das interações favoráveis, respectivamente.
[092] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de imunoglobulina de domínio variável duplo (DVD-lg™), que combina
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26/85 os domínios de ligação alvo de dois anticorpos monoclonais através de ligantes naturais flexíveis e produz uma molécula semelhante a IgG tetravalente.
[093] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de interface Fab Ortogonal (Orto-Fab). No método de IgG orto-Fab (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al., Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32(2):191-8), o projeto regional com base na estrutura introduz mutações complementares na interface LC e HCvh-chi em apenas um Fab, sem nenhuma mudança sendo feita ao outro Fab.
[094] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está no formato de Ig 2-em-l. Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de ES, que é um constructo heterodimérico contendo dois Fabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é garantida por mutações direcionais eletrostáticas no Fc. Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de κλ-Body, que é um constructo heterodimérico com dois Fabs diferentes fundidos ao Fc estabilizado por mutações com heterodimerização: Fabl alvejando um antígeno 1 contém kappa LC, enquanto o segundo Fab alvejando o antígeno 2 contém lambda LC. A FIG. 30A é uma representação exemplar de uma forma de um κλ-Body, a FIG. 30B é uma representação exemplar de um outro κλ-Body.
[095] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de permuta do braço Fab (anticorpos que permutam braços Fab trocando-se uma cadeia pesada e cadeia leve ligada (semi-molécula) com um par de cadeia pesada-leve de uma outra molécula, que resulta em anticorpos biespecíficos). Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de SEED Body. A plataforma de domínio desenvolvido de permuta de filamento (SEED) foi designada para gerar moléculas semelhantes a anticorpo
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27/85 biespecífico e assimétrico, uma capacidade que expande as aplicações terapêuticas de anticorpos naturais. Esta plataforma de proteína desenvolvida é fundamentada em trocar sequências estruturalmente relacionadas de imunoglobulina dentro dos domínios CH3 conservados. O projeto SEED permite a geração eficiente de heterodímeros AG/GA, enquanto desfavorecendo a homodimerização de domínios CH3 AG e GA SEED. (Muda M. et a!., Protein Eng. Des. Sei. (2011, 24(5):447 - 54)). Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma LuZ-Y, em que um zíper de leucina é usado para induzir a heterodimerização de duas HCs diferentes. (Wranik, BJ. et al., J. Biol. Chem. (2012), 287:43331 - 9).
[096] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Cov-X-6oc/y. Em CovX-Bodies biespecíficos, dois peptídeos diferentes são unidos usando um ligante de azetidinona ramificado e fundidos ao anticorpo andaime sob condições suaves em uma maneira específica do sítio. Ao passo que os farmacóforos são responsáveis pelas atividades funcionais, o andaime de anticorpo transmite meia-vida longa e distribuição semelhante a Ig. Os farmacóforos podem ser quimicamente otimizados ou substituídos com outros farmacóforos para gerar anticorpos biespecíficos otimizados ou únicos. (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52);22611 - 22616).
[097] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma heterodimérica Oasc-Fab que inclui Fab que se liga ao alvo 1 e scFab que se liga ao alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é garantida por mutações no Fc.
[098] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma de DuetMab, que é um constructo heterodimérico contendo dois Fabs diferentes que se ligam aos antígenos 1 e 2 e Fc estabilizado por mutações com heterodimerização. Fab 1 e 2 contêm pontes de S-S diferenciais que
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28/85 garantem pareamento de LC e HC correto.
[099] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma de CrossmAb, que é um constructo heterodimérico com dois Fabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2, fundidos a Fc estabilizado por heterodimerização. Os domínios CL e CHI e domínios VH e VL são comutados, por exemplo, CHI é fundido em linha com VL, enquanto CL é fundido em linha com VH.
[0100] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma de Fit-lg, que é um constructo homodimérico onde o Fab que se liga ao antígeno 2 é fundido ao N-terminal do HC do Fab que se liga ao antígeno 1. O constructo contém Fc do tipo selvagem.
[0101] A Tabela 1 lista sequências de peptídeo de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar ao NKG2D. Os domínios de ligação ao NKG2D podem variar em sua afinidade de ligação ao NKG2D, não obstante, eles todos ativam NKG2D humano e células NK.
Tabela 1
Clones Sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada Sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve
ADI-27705 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) CDR1 (SEQ ID NO:54)- GSFSGYYWS CDR2 (SEQ ID NO:55)- D1QMTQSPSTLSASVG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYNSYPITFGGGTKVEI K (SEQ ID NO:2)
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EIDHSGSTNYNPSLKS CDR3 (SEQ ID NO:56)- ARARGPWSFDP
ADI-27724 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:3) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLS CRASQSVSSSYLAWYQQKPG QAPRLLIYGASSRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV YYCQQYGSSPITFGGGTKVEI K (SEQ ID NO:4)
ADI-27740 (A40) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:5) D1QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSIGSWLAWYQQKP GKAPKLLIYKASSLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYHSFYTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO:6)
ADI-27741 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7) D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSIGSWLAWYQQKP GKAPKLLIYKASSLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQSNSYYTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO:8)
ADI-27743 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9) D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYNSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NQ:10)
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ADI-28153 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWGFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:11) E LQMTQS PSS LS AS VG D R VTI TCRTSQSISSYLNWYQQKPG QPPKLLIYWASTRESGVPDRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDSA TYYCQQSYDIPYTFGQGTKLEI K (SEQ ID NO:12)
ADI-28226 (C26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:13) D1QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYGSFPITFGGGTKVEI K (SEQ ID NO:14)
ADI-28154 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:15) D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPDDFA TYYCQQSKEVPWTFGQGTK VEIK (SEQ ID NO:16)
ADI-29399 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17) D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYNSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:18)
ADI-29401 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSIGSWLAWYQQKP GKAPKLLIYKASSLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFA
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KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:19) TYYCQQYDIYPTFGGGTKVEI K (SEQ ID NQ:20)
ADI-29403 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21) D1QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYDSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:22)
ADI-29405 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23) D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYGSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:24)
ADI-29407 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:25) D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYQSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:26)
ADI-29419 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:27) D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYSSFSTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:28)
ADI-29421 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS
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KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:29) GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYESYSTFGGGTKVEIK (SEQ ID NQ:30)
ADI-29424 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:31) D1QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYDSFITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:32)
ADI-29425 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:33) D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYQSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:34)
ADI-29426 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:35) D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSIGSWLAWYQQKP GKAPKLLIYKASSLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYHSFPTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO:36)
ADI-29429 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:37) D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSIGSWLAWYQQKP GKAPKLLIYKASSLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFA TYYCQQYELYSYTFGGGTKVE IK (SEQ ID NO:38)
ADI-29447 (F47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID D1 QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG
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HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:39) KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCQQYDTFITFGGGTKVEIK (SEQ ID NQ:40)
ADI-27727 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG GTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGII PIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTA YMELSSLRSEDTAVYYCARGDSSIRHA YYYYG M D V WG QGTTVTVSS (SEQ ID NO:41) CDR1 (SEQ ID NO:57)- GTFSSYAIS CDR2 (SEQ ID NO:58)- GIIPIFGTANYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:59)- ARGDSSIRHAYYYYGMDV DIVMTQSPDSLAVSLGERATI NCKSSQSVLYSSNNKNYLAW YQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QAEDVAVYYCQQYYSTPITFG GGTKVEIK (SEQ ID NO:42) CDR1 (SEQ ID NQ:60)- KSSQSVLYSSNNKNYLA CDR2 (SEQ ID NO:61) - WASTRES CDR3 (SEQ ID NO:62)- QQYYSTPIT
ADI-29443 (F43) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGG SISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIY YSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARGSDRFHPYFD YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:43) CDR1 (SEQ ID NO:63)- GSISSSSYYWG CDR2 (SEQ ID NO:64)- SIYYSGSTYYNPSLKS CDR3 (SEQ ID NO:65)- ARGSDRFHPYFDY EIVLTQSPATLSLSPGERATLS CRASQSVSRYLAWYQQKPG QAPRLLIYDASNRATGIPARF SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFA VYYCQQFDTWPPTFGGGTK VEIK (SEQ ID NO:44) CDR1 (SEQ ID NO:66) - RASQSVSRYLA CDR2 (SEQ ID NO:67) - DASNRAT CDR3 (SEQ ID NO:68)- QQFDTWPPT
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ADI-29404 (F04) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYG GSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEID HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDP WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:45) D1QMTQS PSTLS AS VG D RVTI TCRASQSISSWLAWYQQKPG KAPKLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFAT YYCEQYDSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:46)
ADI-28200 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASG GTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGII PIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTA YMELSSLRSEDTAVYYCARRGRKASGS FYYYYG M D V WG QGTTVTVSS (SEQ ID NO:47) DIVMTQSPDSLAVSLGERATI NCESSQSLLNSGNQKNYLTW YQQKPGQPPKPLIYWASTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISS LQAEDVAVYYCQNDYSYPYT FGQGTKLEIK (SEQ ID NO:48)
ADI-27744 (A44) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGGYYDS GAG DYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:69) CDR1 (SEQ ID NO:71) - FTFSSYAMS CDR2 (SEQ ID NO:72)- AISGSGGSTYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO:73) - AKDGGYYDSGAGDY D1 QMTQS PSS VS ASVG D RVTI TCRASQGIDSWLAWYQQKP GKAPKLLIYAASSLQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQGVSYPRTFGGGTKV EIK (SEQ ID NQ:70) CDR1 (SEQ ID NO:74) - RASQGIDSWLA CDR2 (SEQ ID NO:75) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:76) - QQGVSYPRT
ADI-27749 (A49) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGF TFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISS SSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTAVYYCARGAPMGAA AGWFDPWGQGTLVTVSS D1 QMTQS PSS VS ASVG D RVTI TCRASQGISSWLAWYQQKP GKAPKLLIYAASSLQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
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(SEQ ID NO:77) CDR1 (SEQ ID NO:79) - FTFSSYSMN CDR2 (SEQ ID NQ:80)- SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO:81)- ARGAPMGAAAGWFDP TYYCQQGVSFPRTFGGGTKV EIK (SEQ ID NO:78) CDR1 (SEQ ID NO:82) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:83) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:84) - QQGVSFPRT
ADI-29463 (F63) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMG WINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDT S1 STAY MELSRLRSD DTA VY YC A R DTG EYYDTD D H G M D V WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:85) CDR1 (SEQ ID NO:87) - YTFTGYYMH CDR2 (SEQ ID NO:88)- WINPNSGGTNYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:89)- ARDTGEYYDTDDHGMDV EIVLTQSPGTLSLSPGERATLS CRASQSVSSNLAWYQQKPG QAPRLLIYGASTRATGIPARFS GSGSGTEFTLTISSLQSEDFAV YYCQQDDYWPPTFGGGTKV EIK (SEQ ID NO:86) CDR1 (SEQ ID NQ:90) - RASQSVSSNLA CDR2 (SEQ ID NO:91) - GASTRAT CDR3 (SEQ ID NO:92) - QQDDYWPPT
ADI-29379 (E79) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGII NPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCARGAPNY GDTTHDYYYMDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:133) CDR1 (SEQ ID NO:135) - YTFTSYYMH EIVMTQSPATLSVSPGERATL SCRASQSVSSNLAWYQQKP GQAPRLLIYGASTRATGIPAR FSGSGSGTEFTLTISSLQSEDF AVYYCQQYDDWPFTFGGGT KVEIK (SEQ ID NO:134)
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CDR2 (SEQ ID NO:136) - IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:137) - ARGAPNYGDTTHDYYYMDV CDR1 (SEQ ID NO:138) - RASQSVSSNLA CDR2 (SEQ ID NO:139) - GASTRAT CDR3 (SEQ ID NQ:140) - QQYDDWPFT
[0102] Alternativamente, um domínio variável de cadeia pesada definido pela SEQ ID NO: 49 pode ser pareado com um domínio variável de cadeia leve definido pela SEQ ID NO: 50 para formar um sítio de ligação ao antigeno que pode se ligar ao NKG2D, como ilustrado em US 9,273,136.
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYD GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQ GTTVTVSS (SEQ ID NO:49)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPS GVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL (SEQ ID NQ:50) [0103] Alternativamente, um domínio variável de cadeia pesada definido pela SEQ ID NO: 51 pode ser pareado com um domínio variável de cadeia leve definido pela SEQ ID NO: 52 para formar um sítio de ligação ao antigeno que pode se ligar ao NKG2D, como ilustrado em US 7,879,985.
QVH LQESGPG LVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPG KG LEWIG HISYSGSA NYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:51)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATG IPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:52) [0104] A Tabela 2 lista sequências de peptídeo dos domínios variáveis de cadeia pesada e dos domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação,
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37/85 podem se ligar ao CD33.
Tabela 2
Clones Sequência de peptídeos do domínio variável de cadeia pesada Sequência de peptídeos do domínio variável de cadeia leve
Lintuzumabe QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTF TDYNMHWVRQAPGQGLEWIGYIYPYNG GTGYNQKFKSKATITADESTNTAYMELSSL RSEDTAVYYCARGRPAMDYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO:93) CDR1 (SEQ ID NO:95) - GYTFTDY CDR2 (SEQ ID NO:96) - YIYPYNGGTG CDR3 (SEQ ID NO:97) - GRPAMDY DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASESVDNYGISFMNWFQQ KPGKAPKLLIYAASNQGSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPDD FATYYCQQSKEVPWTFGQGT KVEIK (SEQ ID NO:94) CDR1(SEQID NO:98) - ESVDNYGISFMN CDR2 (SEQ ID NO:99)- AASNQGS CDR3 (SEQ ID NQ:100) - QQSKEVPWT
Gemtuzumabe EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTIT DSNIHWVRQAPGQSLEWIGYIYPYNGGTD YNQKFKNRATLTVDNPTNTAYMELSSLRSE DTAFYYCVNGNPWLAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NQ:101) CDR1 (SEQ ID NQ:103) - GYTITDS CDR2 (SEQ ID NQ:104) - YIYPYNGGTD CDR3 (SEQ ID NQ:105) - GNPWLAY D1QLTQS PSTLS AS VG D R VTIT CRASESLDNYGIRFLTWFQQK PGKAPKLLMYAASNQGSGVP SRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDD FATYYCQQTKEVPWSFGQGT KVEVK (SEQ ID NQ:102) CDR1 (SEQ ID NQ:106) - ESLDNYGIRFLT CDR2 (SEQ ID NQ:107) - AASNQGS CDR3 (SEQ ID NQ:108) - QQTKEVPWS
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anti-CD33 (US 7,557,189) QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYT FTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDI SYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTS EDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVS S (SEQ ID NO:109) CDR1 (SEQ ID NO:111) - GYTFTSY CDR2 (SEQ ID NO:112) - YPGNDD CDR3 (SEQ ID NO:113) - EVRLRYFDV E1VLTQS PG S LAVS PG E R VTM S CKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQ QI PGQSPRLLIYWASTRESG VP DRFTGSGSGTDFTLTISSVQPE DLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKL EIKR (SEQ ID NQ:110) CDR1 (SEQ ID NO:114) - QSVFFSSSQKNYLA CDR2 (SEQ ID NO:115) - WASTRES CDR3 (SEQ ID NO:116) - HQYLSSRT
vadastuximabe (US 13/804,227) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TNYDINWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGS TKYN E KF KAKATLTADTSTSTAY MELRSLRS DDTAVYYCASGYEDAMDYWGQGTTVTVS SA (SEQ ID NO:117) CDR1 (SEQ ID NO:119): GYTFTNY CDR2 (SEQ ID NQ:120): YPGDGS CDR3 (SEQ ID NO:121): GYEDAMDY D1QMTQS PSS LS ASVG D R VTI NCKASQDINSYLSWFQQKPG KAPKTLIYRANRLVDGVPSRFS GSGSGQDYTLTISSLQPEDFAT YYCLQYDEFPLTFGGGTKVEIK R (SEQ ID NO:118) CDR1 (SEQ ID NO:122): QDINSYLS CDR2 (SEQ ID NO:123): RANRLVD CDR3 (SEQ ID NO:124): LQYDEFPLT
[0105] Alternativamente, novos sítios de ligação ao antigeno que podem se ligar ao CD33 podem ser identificados realizando uma triagem quanto à ligação à sequência de aminoácido definida pela SEQ ID NO: 53.
SEQ ID NO: 53
MPLLLLLPLLWAGALAMDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPV
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HGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSY FFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFS WLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPT TGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDT HPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNFHGMNPSKDTSTEYS EVRTQ [0106] Dentro do domínio Fc, a ligação ao CD16 é mediada pela região da dobradiça e pelo domínio CH2. Por exemplo, dentro de IgGl humana, a interação com CD16 é principalmente focada em resíduos de aminoácido Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - He 332, Leu 234 - Ser 239 e resíduo do carboidrato N-acetil-D-glicosamina no domínio CH2 (ver, Sondermann et al, Nature, 406 (6793):267 - 273). Com base nos domínios conhecidos, mutações podem ser selecionadas para aumentar ou reduzir a afinidade de ligação ao CD16, tal como usando bibliotecas de exibição de fago ou bibliotecas de cDNA de exibição de superfície de levedura ou podem ser designadas com base na estrutura tridimensional conhecida da interação.
[0107] A montagem das cadeias pesadas do anticorpo heterodimérico pode ser realizada expressando duas sequências de cadeia pesada de anticorpo diferentes na mesma célula, que pode levar à montagem de homodímeros de cada cadeia pesada do anticorpo bem como à montagem de heterodímeros. Promover a montagem preferencial de heterodímeros pode ser realizada incorporando diferentes mutações no domínio CH3 de cada região constante de cadeia pesada do anticorpo como mostrado em US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207, US13/866756, US14/647480 e US14/830336. Por exemplo, mutações podem ser feitas no domínio CH3 com base na IgGl humana e incorporando pares distintos de substituições de aminoácido dentro de um primeiro polipeptídeo e um
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40/85 segundo polipeptideo que permite que estas duas cadeias heteromerizem seletivamente entre si. As posições de substituições de aminoácido ilustradas abaixo são todas numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat.
[0108] Em um cenário, uma substituição de aminoácido no primeiro polipeptideo substitui o aminoácido original com um aminoácido maior, selecionado a partir de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) ou triptofano (W) e pelo menos uma substituição de aminoácido no segundo polipeptideo substitui o(s) aminoácido(s) original (is) com um aminoácido menor, escolhido a partir de alanina (A), serina (S), treonina (T) ou valina (V), tal que a maior substituição de aminoácido (uma protuberância) encaixe na superfície das menores substituições de aminoácido (uma cavidade). Por exemplo, um polipeptideo pode incorporar uma substituição de T366W e o outro pode incorporar três substituições incluindo T366S, L368A e Y407V.
[0109] Um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo da invenção pode ser opcionalmente ligado a uma sequência de aminoácido pelo menos 90 % idêntica a uma região constante do anticorpo, tal como uma região constante de IgG incluindo domínios da dobradiça, CH2 e CH3 com ou sem domínio CHI. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido da região constante é pelo menos 90 % idêntica a uma região constante de anticorpo humano, tal como uma região constante de IgGl humana, uma região constante de lgG2, região constante de lgG3 ou região constante de lgG4. Em algumas modalidades adicionais, a sequência de aminoácido da região constante é pelo menos 90 % idêntica a uma região constante de anticorpo de um outro mamífero, tal como coelho, cão, gato, camundongo ou cavalo. Uma ou mais mutações podem ser incorporadas na região constante quando comparado à região constante de IgGl humana, por exemplo em Q347, Y349, L351, 5354, E356, E357, K360, Q362, 5364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, 5400, D401, F405, Y407, K409,
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T411 e/ou K439. Substituições exemplares incluem, por exemplo, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E,
S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E,
L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D,
K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A,
F405T, Y407A, Y407I , Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D, e K439E.
[0110] Em certas modalidades, mutações que podem ser incorporadas no CHI de uma região constante de IgG 1 humana podem estar no aminoácido V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 e/ou V173. Em certas modalidades, mutações que podem ser incorporadas no Ck de uma região constante de IgG 1 humana pode estar no aminoácido E123, F116, S176, V163, S174 e/ou T164.
[0111] Substituições de aminoácido podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostradas na tabela 3.
Tabela 3
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
Conjunto 1 S364E/F405A Y349K/T394F
Conjunto 2 S364H/D401K Y349T/T411E
Conjunto 3 S364H/T394F Y349T/F405A
Conjunto 4 S364E/T394F Y349K/F405A
Conjunto 5 S364E/T411E Y349K/D401K
Conjunto 6 S364D/T394F Y349K/F405A
Conjunto 7 S364H/F405A Y349T/T394F
Conjunto 8 S364K/E357Q L368D/K370S
Conjunto 9 L368D/K370S S364K
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Conjunto 10 L368E/K370S S364K
Conjunto 11 K360E/Q362E D401K
Conjunto 12 L368D/K370S S364K/E357L
Conjunto 13 K370S S364K/E357Q
Conjunto 14 F405L K409R
Conjunto 15 K409R F405L
[0112] Alternativamente, substituições de aminoácido podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostradas na tabela 4.
Tabela 4
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
Conjunto 1 K409W D399V/F405T
Conjunto 2 Y349S E357W
Conjunto 3 K360E Q347R
Conjunto 4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
Conjunto 5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
Conjunto 6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
[0113] Alternativamente, substituições de aminoácido podem ser selecionadas a partir do seguinte conjunto de substituições mostradas na tabela 5.
Tabela 5
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
Conjunto 1 T366K/L351K L351D/L368E
Conjunto 2 T366K/L351K L351D/Y349E
Conjunto 3 T366K/L351K L351D/Y349D
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Conjunto 4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
Conjunto 5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
Conjunto 6 E356K/D399K K392D/K409D
[0114] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácido em cada cadeia de polipeptídeo pode ser selecionada a partir da Tabela 6.
Tabela 6
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
L351Y, D399R, D399K, S400K, S400R, Y407A, Y407I, Y407V T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F K392D, K392E, K409F, K409W, T411D e T411E
[0115] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácido pode ser selecionada a partir do seguinte conjunto de substituições na tabela 7, onde a(s) posição(ões) indicada(s) na coluna Primeiro polipeptídeo é(são) substituída(s) por qualquer aminoácido negativamente carregado conhecido e a posição(ões) indicada(s) na coluna Segundo polipeptídeo é(são) substituída(s) por qualquer aminoácido positivamente carregado conhecido.
Tabela 7
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
K392, K370, K409, ou K439 D399, E356, ou E357
[0116] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácido pode ser selecionada a partir do seguinte conjunto de na tabela 8, onde a(s) posição(ões) indicada(s) na coluna Primeiro polipeptídeo é(são) substituída(s) por qualquer aminoácido positivamente carregado conhecido e a(s) posição(ões) indicada(s) na coluna Segundo polipeptídeo é(são) substituída(s) por qualquer aminoácido negativamente carregado conhecido.
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Tabela 8
Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo
D399, E356, ou E357 K409, K439, K370, ou K392
[0117] Alternativamente, substituições de aminoácido podem ser selecionadas a partir do seguinte conjunto na tabela 9.
Tabela 9
Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo
T350V, L351Y, F405A, e Y407V T350V, T366L, K392L, e T394W
[0118] Alternativamente ou além disso, a estabilidade estrutural de uma proteína heteromultimérica pode ser aumentada introduzindo S354C em qualquer uma da primeira ou segunda cadeia de polipeptídeo e Y349C na cadeia de polipeptídeo oposta, que forma uma ponte dissulfeto artificial dentro da interface dos dois polipeptídeos.
[0119] As proteínas multiespecíficas descritas acima podem ser fabricadas usando tecnologia de DNA recombinante bem conhecida a um técnico no assunto. Por exemplo, uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica a primeira cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um primeiro vetor de expressão; uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica a segunda cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um segundo vetor de expressão; uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve de imunoglobulina pode ser clonada em um terceiro vetor de expressão; o primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser estavelmente transfectados juntos em células hospedeiras para produzir as proteínas multiméricas.
[0120] Para obter o rendimento mais alto da proteína multiespecífica, razões diferentes do primeiro, segundo e terceiro vetor de expressão podem ser
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45/85 exploradas para determinar a razão ideal para transfecção nas células hospedeiras. Depois da transfecção, clones únicos podem ser isolados para geração de banco de células usando métodos conhecidos na técnica, tais como diluição limitada, ELISA, FACS, microscopia ou Clonepix.
[0121] Clones podem ser cultivados sob condições adequadas para um aumento de escala em biorreator e mantiveram a expressão da proteína multiespecífica. As proteínas multiespecíficas podem ser isoladas e purificadas usando métodos conhecidos na técnica incluindo centrifugação, filtração em profundidade, lise celular, homogeneização, congelamento-descongelamento, purificação por afinidade, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca por interação hidrofóbica e cromatografia em modo misto.
II. Características das proteínas multiespecíficas [0122] Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para CD33, se ligam a células que expressam NKG2D humano. Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas se ligam ao antígeno associado ao tumor CD33 em um nível compatível àquele de um anticorpo monoclonal tendo o mesmo domínio de ligação ao CD33. Entretanto, as proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção podem ser mais eficazes em reduzir o crescimento tumoral e matar células cancerígenas que expressam CD33 do que os anticorpos monoclonais de CD33 correspondentes.
[0123] Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para CD33, podem ativar células NK humanas primárias quando do cultivo com células tumorais que expressam o antígeno CD33. A ativação de célula NK é marcada pelo aumento na desgranulação de CD107a e produção de
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IFNy e citocina. Além disso, comparado a um anticorpo monoclonal que inclui o mesmo domínio de ligação ao CD33, as proteínas multiespecíficas mostram ativação superior de células NK humanas na presença de células tumorais que expressam o antígeno CD33.
[0124] Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para CD33, podem aumentar a atividade de células NK humanas em repouso e ativadas por IL-2 na presença de células tumorais que expressam o antígeno CD33.
[0125] Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para um antígeno associado ao tumor CD33, podem aumentar a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso e ativadas por IL-2 na presença de células tumorais que expressam o antígeno CD33. Em certas modalidades, comparado aos anticorpos monoclonais correspondentes, as proteínas multiespecíficas podem oferecer uma vantagem contra células tumorais que expressam CD33 médio e baixo.
[0126] Em certas modalidades, as proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção podem ser vantajosas em tratar cânceres com alta expressão de receptor Fc (FcR) ou cânceres residentes em um microambiente tumoral com níveis altos de FcR, comparado aos anticorpos monoclonais de CD33 correspondentes. Anticorpos monoclonais exercem seus efeitos sobre o crescimento tumoral através de múltiplos mecanismos incluindo ADCC, CDC, fagocitose e obstrução de sinal entre outros. Entre FcyRs, CD16 tem a afinidade mais baixa por Fc de IgG; FcyRI (CD64) é o FcR de alta afinidade, que liga cerca de 1000 vezes mais fortemente ao Fc de IgG do que CD16. CD64 é normalmente expresso em muitas linhagens hematopoiéticas tais como a linhagem mieloide e
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47/85 pode ser expresso em tumores derivados destes tipos de células, tal como leucemia mielóide aguda (AML). Células imunes que se infiltram no tumor, tais como MDSCs e monócitos, também expressam CD64 e são conhecidas por infiltrarem no microambiente tumoral. A expressão de CD64 pelo tumor ou no microambiente tumoral pode ter um efeito prejudicial sobre a terapia com anticorpo monoclonal. A expressão de CD64 no microambiente tumoral torna difícil para estes anticorpos atacarem CD16 na superfície de células NK, visto que os anticorpos preferem se ligar ao receptor de afinidade alta. As proteínas multiespecíficas, através do alvejamento de dois receptores ativadores na superfície de células NK, podem superar o efeito prejudicial da expressão de CD64 (no tumor ou microambiente tumoral) sobre a terapia com anticorpo monoclonal. Não obstante da expressão de CD64 nas células tumorais, as proteínas multiespecíficas são capazes de mediar respostas de célula NK humana contra todas as células tumorais, porque o alvejamento duplo de dois receptores ativadores em células NK fornece ligação específica mais forte às células NK.
[0127] Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção podem fornecer um melhor perfil de segurança através de efeitos colaterais no alvo fora do tumor. Células natural killer e células T CD8 são ambas capazes de lisar diretamente células tumorais, embora os mecanismos através dos quais as células NK e célula T CD8 reconhecem auto-células normais de células tumorais difiram. A atividade de células NK é regulada pelo equilíbrio de sinais de receptores ativadores (NCRs, NKG2D, CD16, etc.) e inibitórios (KIRs, NKG2A, etc.). O equilíbrio destes sinais ativadores e inibitórios permite que células NK determinem auto-células saudáveis de auto-células estressadas, viralmente infectadas ou transformadas. Este mecanismo embutido de autotolerância ajudará a proteger o tecido saudável normal de respostas de célula NK. Para ampliar este princípio, a auto-tolerância de células NK permitirá que
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TriNKETs alvejem antígenos expressos tanto em auto-células quanto em células tumorais sem efeitos colaterais fora do tumor ou com uma janela terapêutica aumentada. Diferente de células natural killer, células T requerem reconhecimento de um peptídeo específico apresentado por moléculas de MHC para ativação e funções efetoras. Células T foram o alvo primário de imunoterapia e muitas estratégias foram desenvolvidas para redirecionar respostas da célula T contra o tumor. Biespecificações de célula T, inibidores de ponto de controle e células CAR-T foram todos aprovados pelo FDA, mas frequentemente sofrem de toxicidades limitantes de dose. Biespecificações de célula T e células CAR-T trabalham em torno do sistema de reconhecimento de TCR-MHC usando domínios de ligação para alvejar antígenos na superfície de células tumorais e usando domínios de sinalização desenvolvidos para transduzir os sinais de ativação na célula efetora. Embora eficazes em evocar uma resposta imune antitumoral estas terapias são frequentemente ligadas com a síndrome de liberação de citocina (CRS) e efeitos colaterais no alvo fora do tumor. As proteínas multiespecíficas são únicas neste contexto visto que elas não anularão os sistemas naturais de ativação e inibição de célula NK. Ao contrário, as proteínas multiespecíficas são designadas para oscilar o equilíbrio e fornecem sinais de ativação adicionais às células NK, enquanto mantendo a tolerância de NK às auto-células saudáveis.
[0128] Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção podem retardar a progressão do tumor mais eficazmente do que os anticorpos monoclonais de CD33 correspondentes que incluem o mesmo domínio de ligação a CD33. Em algumas modalidades, as proteínas multiespecíficas descritas na presente invenção podem ser mais eficazes contra metástases de câncer do que os anticorpos monoclonais de CD33 correspondentes que incluem o mesmo domínio de ligação ao CD33.
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III. Aplicações terapêuticas [0129] A invenção fornece métodos para tratar câncer usando uma proteína de ligação multiespecífica descrita aqui e/ou uma composição farmacêutica descrita aqui. Os métodos podem ser usados para tratar uma variedade de canceres que expressam CD33 administrando-se a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica descrita na presente invenção.
[0130] O método terapêutico pode ser caracterizado de acordo com o câncer a ser tratado. Por exemplo, em certas modalidades, o câncer é AML, síndromes mielodisplásicas, leucemia mielomonocítica crônica, crise blástica mieloide de leucemia mieloide crônica e ALLs.
[0131] Em certas modalidades adicionais, o câncer é câncer cerebral, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer do endométrio, câncer esofágico, leucemia, câncer de pulmão, câncer de fígado, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de reto, câncer renal, câncer de estômago, câncer testicular ou câncer uterino. Ainda em outras modalidades, o câncer é um carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de células pequenas, melanoma, neuroblastoma, sarcoma (por exemplo, um angiossarcoma ou condrossarcoma), câncer de laringe, câncer da parótida, câncer do trato biliar, câncer da tireoide, melanoma lentiginoso acral, queratose actínica, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma cístico adenoide, adenomas, adenosarcoma, carcinoma adenoescamoso, câncer do canal anal, câncer anal, câncer anorretal, tumor astrocítico, carcinoma da glândula de bartholin, carcinoma de células basais, câncer biliar, câncer ósseo, câncer da medula óssea, câncer brônquico, carcinoma glandular brônquico, carcinoide, colangiocarcinoma, condossarcoma, papiloma/carcinoma do plexo coroide, leucemia linfocítica crônica, leucemia
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50/85 mielóide crônica, carcinoma de células claras, câncer do tecido conjuntivo, cistadenoma, câncer do sistema digestivo, câncer do duodeno, câncer do sistema endócrino, tumor do seio endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma estromal endometrial, adenocarcinoma endometrioide, câncer de célula endotelial, câncer ependimal, câncer de célula epitelial, sarcoma de Ewing, câncer do olho e órbita, câncer genital feminino, hiperplasia nodular focal, câncer da vesícula biliar, câncer do antro gástrico, câncer do fundo gástrico, gastrinoma, glioblastoma, glucagonoma, câncer do coração, hemangiblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatose hepática, câncer hepatobiliar, carcinoma hepatocelular, doença de Hodgkin, câncer do íleo, insulinoma, neoplasia intra-epitelial, neoplasia de célula escamosa inter-epitelial, câncer das vias biliares intra-hepáticas, carcinoma invasivo de células escamosas, câncer do jejuno, câncer das articulações, sarcoma de Kaposi, câncer pélvico, carcinoma de células grandes, câncer do intestino grosso, leiomiossarcoma, melanomas por lentigo maligno, linfoma, câncer genital masculino, melanoma maligno, tumores mesoteliais malignos, meduloblastoma, meduloepitelioma, câncer menígeo, câncer mesotelial, carcinoma metastático, câncer de boca, carcinoma mucoepidermoide, mieloma múltiplo, câncer muscular, câncer do trato nasal, câncer do sistema nervoso, melanoma nodular com adenocarcinoma neuroepitelial, câncer de pele não epitelial, linfoma não-Hodgkin, carcinoma de células pequenas, câncer oligodendroglial, câncer da cavidade oral, osteossarcoma, adenocarcinoma seroso papilar, câncer de pênis, câncer da faringe, tumores pituitários, plasmacitoma, pseudossarcoma, blastoma pulmonar, câncer de reto, carcinoma de células renais, câncer do sistema respiratório, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, câncer sinusal, câncer de pele, carcinoma de células pequenas, câncer de
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51/85 intestino delgado, câncer do músculo liso, câncer do tecido mole, tumor secretante de somatostatina, câncer da espinha dorsal, carcinoma de células escamosas, câncer de músculo estriado, câncer submesotelial, melanoma de expansão superficial, leucemia de célula T, câncer da língua, carcinoma não diferenciado, câncer do ureter, câncer da uretra, câncer da bexiga urinária, câncer do sistema urinário, câncer do colo uterino, câncer do corpo uterino, melanoma uveal, câncer vaginal, carcinoma verrucoso, VIPoma, câncer de vulva, carcinoma bem diferenciado ou tumor de Wilms.
[0132] Em certas modalidades adicionais, o câncer é linfoma não-Hodgkin, tal como um linfoma de célula B ou um linfoma de célula T. Em certas modalidades, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de célula B, tal como um linfoma de célula B grande difuso, linfoma de célula B mediastinal primário, linfoma folicular, linfoma linfocítico pequeno, linfoma da célula do manto, linfoma de célula B da zona marginal, linfoma de célula B da zona marginal extranodal, linfoma de célula B zona marginal nodal, linfoma de célula B da zona marginal esplênica, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico, leucemia de células pilosas ou linfoma do sistema nervoso central (CNS) primário. Em certas modalidades adicionais, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de célula T, tal como um linfoma de T-linfoblástico precursor, linfoma de célula T periférico, linfoma de célula T cutâneo, linfoma de célula T angioimunoblástico, linfoma de célula natural killer/cé\u\a T extranodal, linfoma de célula T do tipo enteropático, linfoma de célula T semelhante à paniculite subcutânea, linfoma anaplásico de células grandes ou linfoma de célula T periférico.
[0133] O câncer a ser tratado pode ser caracterizado de acordo com a presença de um antigeno particular expresso na superfície da célula cancerígena. Em certas modalidades, a célula cancerígena pode expressar um ou mais dos seguintes além de CD33: CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70,
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EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7,l, B7,2, CTLA4 e PD1.
IV. Terapia de combinação [0134] Um outro aspecto da invenção leva em consideração a terapia de combinação. Proteínas de ligação multiespecíficas descritas na presente invenção podem ser usadas em combinação com agentes terapêuticos adicionais para tratar o câncer.
[0135] Agentes terapêuticos exemplares que podem ser usados como parte de uma terapia de combinação no tratamento de câncer, incluem, por exemplo, radiação, mitomicina, tretinoina, ribomustina, gencitabina, vincristina, etoposido, cladribina, mitobronitol, metotrexato, doxorrubicina, carboquona, pentostatina, nitracrina, zinostatina, cetrorrelix, letrozol, raltitrexed, daunorrubicina, fadrozol, fotemustina, timalfasina, sobuzoxano, nedaplatina, citarabine, bicalutamida, vinorelbina, vesnarinona, aminoglutetimida, ansacrina, proglumida, acetato de eliptínio, cetanserina, doxifluridina, etretinato, isotretinoína, estreptozocina, nimustina, vindesina, flutamida, drogenil, butocina, carmofur, razoxano, sizofilano, carboplatina, mitolactol, tegafur, ifosfamida, prednimustina, picibanil, levamisol, teniposido, improssulfano, enocitabina, lisurida, oximetolona, tamoxifeno, progesterona, mepitiostano, epitiostanol, formestano, interferon-alfa, interferon-2 alfa, interferon-beta, interferon-gama, fator-1 estimulante de colônia, fator-2 estimulante de colônia, denileucina diftitox, interleucina-2, fator de liberação de hormônio luteinizante e variações dos agentes anteriormente mencionados que podem exibir diferencial de se ligar ao seu receptor cognato e meia-vida do soro aumentada ou diminuída.
[0136] Uma classe adicional de agentes que podem ser usados como parte de uma terapia de combinação no tratamento de câncer são os inibidores de
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53/85 ponto de controle imunes. Inibidores de checkpoint imunes exemplares incluem agentes que inibem um ou mais de (i) antigeno 4 associado a linfócito T citotóxico (CTLA4), (ii) proteína 1 de morte celular programada (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7-H3, (vi) B7-H4 e (vii) TIM3. O inibidor de CTLA4 ipilimumabe foi aprovado pela United States Food and Drug Administration para tratar melanoma.
[0137] Ainda outros agentes que podem ser usados como parte de uma terapia de combinação no tratamento de câncer são agentes de anticorpo monoclonal que alvejam alvos não-checkpoint (por exemplo, herceptina) e agentes não citotóxicos (por exemplo, inibidores de tirosina-cinase).
[0138] Ainda outras categorias de agentes anticâncer incluem, por exemplo: (i) um inibidor selecionado de um Inibidor de ALK, um Inibidor de ATR, um Antagonista de A2A, um Inibidor de Reparo por Excisão de Base, um Inibidor de Tirosina Cinase de Bcr-Abl, um Inibidor de Tirosina Cinase de Bruton, um Inibidor de CDC7, um Inibidor de CHK1, um Inibidor de Cinase Dependente de Ciclina, um Inibidor de DNA-PK, um Inibidor tanto de DNA-PK quanto de mTOR, um Inibidor de DNMT1, um Inibidor de DNMT1 mais 2-cloro-desoxiadenosina, um Inibidor de HDAC, um Inibidor da Via de Sinalização de Hedgehog, um Inibidor de IDO, um Inibidor de JAK, um Inibidor de mTOR, um Inibidor de MEK, um Inibidor de MELK, um Inibidor de MTH1, um Inibidor de PARP, um Inibidor de Fosfoinositida 3-Cinase, um Inibidor tanto de PARP1 quanto de DHODH, um Inibidor de Proteassoma, um Inibidor de Topoisomerase-ll, um Inibidor de Tirosina Cinase, um Inibidor de VEGFR e um Inibidor de WEE1; (ii) um agonista de 0X40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 ou ICOS; e (iii) uma citocina selecionada de IL-12, IL-15, GM-CSF e G-CSF.
[0139] Proteínas da invenção também podem ser usadas como um adjunto à remoção cirúrgica da lesão primária.
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54/85 [0140] A quantidade de proteína de ligação multiespecífica e agente terapêutico adicional e o cronograma relativo de administração podem ser selecionados de modo a obter um efeito terapêutico combinado desejado. Por exemplo, quando da administração de uma terapia de combinação a um paciente em necessidade de tal administração, os agentes terapêuticos na combinação ou uma composição farmacêutica ou composições compreendendo os agentes terapêuticos, podem ser administrados em qualquer ordem tal como, por exemplo, sequencialmente, concorrentemente, juntamente, simultaneamente e semelhantes. Além disso, por exemplo, uma proteína de ligação multiespecífica pode ser administrada durante um tempo quando o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(is) exercem seu efeito profilático ou terapêutico ou vice versa.
V. Composições farmacêuticas [0141] A presente invenção também caracteriza composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína descrita na presente invenção. A composição pode ser formulada para o uso em uma variedade de sistemas de liberação de fármaco. Um ou mais excipientes ou veículos fisiologicamente aceitáveis também podem ser incluídos na composição para formulação apropriada. Formulações adequadas para o uso na presente invenção são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17â ed., 1985. Para uma breve revisão dos métodos para liberação de fármaco, ver, por exemplo, Langer (Science 249:1527 - 1533, 1990).
[0142] A formulação de liberação de fármaco intravenosa da presente invenção pode ser contida em uma bolsa, uma caneta ou uma seringa. Em certas modalidades, a bolsa pode ser conectada a um canal compreendendo um tubo e/ou uma agulha. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma
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55/85 formulação liofilizada ou uma formulação líquida. Em certas modalidades, a formulação pode ser seca por congelamento (liofilizada) e contida em cerca de 12 a 60 frascos. Em certas modalidades, a formulação pode ser liofilizada e 45 mg da formulação liofilizada podem ser contidos em um frasco. Em certas modalidades, cerca de 40 mg a cerca de 100 mg de formulação liofilizada podem ser contidos em um frasco. Em certas modalidades, a formulação seca por congelamento de 12, 27 ou 45 frascos são combinadas para obter uma dose terapêutica da proteína na formulação intravenosa de fármaco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco a cerca de 1000 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 600 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco.
[0143] Esta presente invenção pode existir em uma formulação farmacêutica líquida aquosa incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína em uma solução tamponada formando uma formulação.
[0144] Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais ou podem ser filtradas estéreis. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para o uso como são ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada com um veículo aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações tipicamente será entre 3 e 11, mais preferivelmente entre 5 e 9 ou entre 6 e 8 e o mais preferivelmente entre 7 e 8, tal como 7 a 7,5. As composições resultantes na forma sólida podem ser embaladas em múltiplas unidades de dose única, cada uma contendo uma quantidade fixa do agente ou agentes mencionados acima. A composição na forma sólida também pode ser embalada em um recipiente para uma quantidade flexível.
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56/85 [0145] Em certas modalidades, a presente invenção fornece uma formulação com uma vida de prateleira prolongada incluindo a proteína da presente invenção, em combinação com manitol, ácido cítrico monoidratado, citrato de sódio, fosfato de dissódio dihidratado, dihidrogeno fosfato de sódio dihidratado, cloreto de sódio, polisorbato 80, água e hidróxido de sódio.
[0146] Em certas modalidades, uma formulação aquosa é preparada incluindo a proteína da presente invenção em uma solução tamponada. O tampão desta invenção pode ter um pH variando de cerca de 4 a cerca de 8, por exemplo, de cerca de 4,5 a cerca de 6,0 ou de cerca de 4,8 a cerca de 5,5 ou pode ter um pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Faixas intermediárias aos pH's relatados acima também são intencionadas a serem parte desta invenção. Por exemplo, faixas de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores relatados acima como limites superiores e/ou inferiores são intencionadas a serem incluídas. Exemplos de tampões que controlarão o pH dentro desta faixa incluem tampões de acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (tal como succinato de sódio), gliconato, histidina, citrato e outro ácido orgânico.
[0147] Em certas modalidades, a formulação inclui um sistema tampão que contém citrato e fosfato para manter o pH em uma faixa de cerca de 4 a cerca de 8. Em certas modalidades a faixa de pH pode ser de cerca de 4,5 a cerca de 6,0 ou de cerca de pH 4,8 a cerca de 5,5 ou em uma faixa de pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Em certas modalidades, o sistema tampão inclui ácido cítrico monoidratado, citrato de sódio, fosfato dissódico dihidratado e/ou dihidrogenofosfato de sódio dihidratado. Em certas modalidades, o sistema tampão inclui cerca de 1,3 mg/mL de ácido cítrico (por exemplo, 1,305 mg/mL), cerca de 0,3 mg/mL de citrato de sódio (por exemplo, 0,305 mg/mL), cerca de 1,5 mg/mL de fosfato dissódio dihidratado (por exemplo, 1,53 mg/mL), cerca de 0,9 mg/mL de dihidrogeno fosfato de sódio dihidratado (por exemplo, 0,86) e
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57/85 cerca de 6,2 mg/mL de cloreto de sódio (por exemplo, 6,165 mg/mL). Em certas modalidades, o sistema tampão inclui 1 a 1,5 mg/mL de ácido cítrico, 0,25 a 0,5 mg/mL de citrato de sódio, 1,25 a 1,75 mg/mL de fosfato dissódico dihidratado, 0,7 a 1,1 mg/mL de dihidrogenofosfato de sódio dihidratado e 6,0 a 6,4 mg/mL de cloreto de sódio. Em certas modalidades, o pH da formulação é ajustado com hidróxido de sódio.
[0148] Um poliol, que age como um tônico e pode estabilizar o anticorpo, também pode ser incluído na formulação. O poliol é adicionado à formulação em uma quantidade que pode variar a respeito da isotonicidade desejada da formulação. Em certas modalidades, a formulação aquosa pode ser isotônica. A quantidade de poliol adicionado também pode ser alterada a respeito do peso molecular do poliol. Por exemplo, uma quantidade inferior de um monossacarídeo (por exemplo, manitol) pode ser adicionada, comparado a um dissacarídeo (tal como trealose). Em certas modalidades, o poliol que pode ser usado na formulação como um agente de tonicidade é manitol. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 5 a cerca de 20 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 7,5 a 15 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 10 -14 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 12 mg/mL. Em certas modalidades, o poliol sorbitol pode ser incluído na formulação.
[0149] Um detergente ou tensoativo também pode ser adicionado à formulação. Detergentes exemplares incluem detergentes não iônicos tais como polisorbatos (por exemplo, polisorbatos 20, 80 etc.) ou poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188). A quantidade de detergente adicionado é tal que ela reduz a agregação do anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de particulados na formulação e/ou reduz a adsorção. Em certas modalidades, a
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58/85 formulação pode incluir um tensoativo que é um polisorbato. Em certas modalidades, a formulação pode conter o detergente polisorbato 80 ou Tween 80. Tween 80 é um termo usado para descrever sorbitanmonooleato de polioxietileno (20) (ver Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4â edi., 1996). Em certas modalidades, a formulação pode conter entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL de polisorbato 80 ou entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL. Em certas modalidades, cerca de 0,1 % de polisorbato 80 pode ser adicionado na formulação.
[0150] Em modalidades, o produto proteico da presente invenção é formulado como uma formulação líquida. A formulação líquida pode ser apresentada em uma concentração de 10 mg/mL em um frasco USP/Ph Eur tipo I 50R fechado com uma tampa de borracha e selado com um fechamento de selo de alumínio. A tampa pode ser fabricada de elastômero correspondendo a USP e Ph Eur. Em certas modalidades, frascos podem ser cheios com 61,2 mL da solução de produto proteico de modo a permitir um volume extraível de 60 mL. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser diluída com solução salina a 0,9 %.
[0151] Em certas modalidades, a formulação líquida da invenção pode ser preparada como uma solução de concentração a 10 mg/mL em combinação com um açúcar em níveis estabilizantes. Em certas modalidades a formulação líquida pode ser preparada em um veículo aquoso. Em certas modalidades, um estabilizante pode ser adicionado em uma quantidade não maior do que aquela que pode resultar em uma viscosidade indesejável ou inadequada para administração intravenosa. Em certas modalidades, o açúcar pode ser dissacarídeos, por exemplo, sacarose. Em certas modalidades, a formulação líquida também pode incluir um ou mais de um agente tamponante, um tensoativo e um conservante.
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59/85 [0152] Em certas modalidades, o pH da formulação líquida pode ser ajustado por adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitáveis. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base pode ser hidróxido de sódio.
[0153] Além da agregação, desamidação é uma variante de produto comum de peptídeos e proteínas que podem ocorrer durante a fermentação, colheita/clarificação celular, purificação, armazenamento de substância do fármaco/produto do fármaco e durante a análise de amostra. Desamidação é a perda de NH3 de uma proteína formando um intermediário de succinimida que pode passar por hidrólise. O intermediário de succinimida resulta em uma diminuição de massa de 17 dalton do peptídeo precursor. A hidrólise subsequente resulta em um aumento de massa de 18 dalton. O isolamento do intermediário de succinimida é difícil devido à instabilidade sob condições aquosas. Como tal, a desamidação é tipicamente detectável como aumento de massa de 1 dalton. A desamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou isoaspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de desamidação incluem pH, temperatura, constante dielétrica do solvente, concentração iônica, sequência primária, conformação de polipeptideo local e estrutura terciária. Os resíduos de aminoácido adjacentes a Asn na cadeia de peptídeo afetam as taxas de desamidação. Gly e Ser a seguir de um Asn em sequências de proteína resultam em uma suscetibilidade mais alta à desamidação.
[0154] Em certas modalidades, a formulação líquida da presente invenção pode ser conservada sob condições de pH e umidade para impedir a desaminação do produto proteico.
[0155] O veículo aquoso de interesse aqui é um que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Veículos ilustrativos incluem água
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60/85 estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0156] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações da presente invenção para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação de multiuso (dose múltipla).
[0157] Formulações intravenosas (IV) podem ser a via de administração preferida em exemplos particulares, tal como quando um paciente está no hospital depois do transplante recebendo todos os fármacos por intermédio da via IV. Em certas modalidades, a formulação líquida é diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9 % antes da administração. Em certas modalidades, o produto do fármaco diluído para injeção é isotônico e adequado para administração por infusão intravenosa.
[0158] Em certas modalidades, um sal ou componentes tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM a 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais formadores de base ou aminas. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões de glicinato, carbonato, citrato, caso este em que, íons sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íon.
[0159] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação de multiuso (dose múltipla).
[0160] O veículo aquoso de interesse aqui é um que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para
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61/85 a preparação de uma formulação líquida. Veículos ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0161] Esta presente invenção pode existir em uma formulação liofilizada incluindo as proteínas e um lioprotetor. O lioprotetor pode ser açúcar, por exemplo, dissacarídeos. Em certas modalidades, o lioprotetor pode ser sacarose ou maltose. A formulação liofilizada também pode incluir um ou mais de um agente tamponante, um tensoativo, um agente de volume e/ou um conservante.
[0162] A quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização do produto do fármaco liofilizado pode estar em uma razão em peso de pelo menos 1:2 de proteína para sacarose ou maltose. Em certas modalidades, a razão em peso de proteína para sacarose ou maltose pode ser de 1:2 a 1:5.
[0163] Em certas modalidades, o pH da formulação, antes da liofilização, pode ser ajustado por adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitáveis. Em certas modalidades o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base farmaceuticamente aceitável pode ser hidróxido de sódio.
[0164] Antes da liofilização, o pH da solução contendo a proteína da presente invenção pode ser ajustado entre 6 a 8. Em certas modalidades, a faixa de pH para o produto do fármaco liofilizado pode ser de 7 a 8.
[0165] Em certas modalidades, um sal ou componentes tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM a 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais formadores de base ou aminas. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões de glicinato, carbonato, citrato, caso
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62/85 este em que, íons sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íon.
[0166] Em certas modalidades, um agente de volume pode ser adicionado. Um agente de volume é um composto que adiciona massa a uma mistura liofilizada e contribui para a estrutura física da torta liofilizada (por exemplo, facilita a produção de uma torta liofilizada essencialmente uniforme que mantém uma estrutura de poro aberto). Agentes de volumes ilustrativos incluem manitol, glicina, polietilenoglicol e sorbitol. As formulações liofilizadas da presente invenção podem conter tais agentes de volume.
[0167] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação de multiuso (dose múltipla).
[0168] Em certas modalidades, o produto do fármaco liofilizado pode ser constituído com um veículo aquoso. O veículo aquoso de interesse na presente invenção é um que é farmaceuticamente aceitável (por exemplo, seguro e não tóxico para administração a um ser humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida, depois da liofilização. Diluentes ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0169] Em certas modalidades, o produto do fármaco liofilizado da presente invenção é reconstituído com água estéril para injeção, USP (SWFI) ou injeção de cloreto de sódio a 0,9 %, USP. Durante a reconstituição, o pó liofilizado dissolve em uma solução.
[0170] Em certas modalidades, o produto proteico liofilizado da presente invenção é constituído a cerca de 4,5 mL de água para injeção e diluído com solução salina a 0,9 % (solução de cloreto de sódio).
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63/85 [0171] Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particulares, sem serem tóxicos ao paciente.
[0172] A dose específica pode ser uma dose uniforme para cada paciente, por exemplo, 50 a 5000 mg de proteína. Alternativamente, a dose de um paciente pode ser adaptada ao peso corpóreo aproximado ou área de superfície do paciente. Outros fatores em determinar a dosagem apropriada podem incluir a doença ou condição a ser tratada ou prevenida, a severidade da doença, a via de administração e a idade, sexo e condição médica do paciente. Outro refinamento dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para o tratamento é rotineiramente feito por técnicos no assunto, especialmente à luz da informação de dosagem e ensaios divulgados na presente invenção. A dosagem também pode ser determinada através do uso de ensaios conhecidos para determinar as dosagens usadas em combinação com dados de dose-resposta apropriados. A dosagem de um paciente individual pode ser ajustada conforme o progresso da doença for monitorado. Níveis sanguíneos do constructo ou complexo alvejável em um paciente podem ser medidos para ver se a dosagem precisa ser ajustada para atingir ou manter uma concentração eficaz. Farmacogenômica pode ser usada para determinar que constructos e/ou complexos alvejáveis e dosagens destes, devem ser mais prováveis a serem eficazes para um dado indivíduo (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43 53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33 - 41, 2001).
[0173] Em geral, dosagens com base em peso corpóreo são de cerca de 0,01 pg a cerca de 100 mg por kg de peso corpóreo, tal como cerca de 0,01 pg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 pg a cerca de 50 mg/kg de peso
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64/85 corpóreo, cerca de 0,01 pg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 pg a cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 pg a cerca de 100 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 pg a cerca de 50 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 pg a cerca de 10 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 pg a cerca de 1 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,01 pg a cerca de 0,1 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 pg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 pg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 pg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 pg a cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 pg a cerca de 100 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 pg a cerca de 10 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 0,1 pg a cerca de 1 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 pg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 pg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 pg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 pg a cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 pg a cerca de 100 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 pg a cerca de 50 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 pg a cerca de 10 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 pg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 pg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 pg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 pg a cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 pg a cerca de 100 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 pg a cerca de 50 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 50 pg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 50pg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 50 pg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 50 pg a cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 50 pg a cerca de 100 pg/kg de peso corpóreo, cerca de 100 pg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 100 pg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 100 pg a cerca de 10 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 100 pg a cerca de 1 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 mg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 1 mg a cerca de 10 mg/kg de peso
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65/85 corpóreo, cerca de 10 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 10 mg a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo, cerca de 50 mg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo.
[0174] Doses podem ser fornecidas uma vez ou mais vezes diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente ou ainda uma vez a cada 2 a 20 anos. Técnicos no assunto podem estimar facilmente as taxas de repetição para dosagem com base nos tempos de residência e concentrações medidos do constructo ou complexo alvejáveis em fluidos ou tecidos corpóreos. A administração da presente invenção pode ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, intracavitária, por perfusão através de um cateter ou por injeção intralesional direta. Esta pode ser administrada uma vez ou mais vezes diariamente, uma vez ou mais vezes semanalmente, uma vez ou mais vezes mensalmente e uma vez ou mais vezes anualmente.
[0175] A descrição acima descreve aspectos e modalidades múltiplos da invenção. O pedido de patente especificamente considera todas as combinações e permutações dos aspectos e modalidades.
EXEMPLOS [0176] A invenção agora sendo de maneira geral descrita, será mais facilmente entendida por referência aos exemplos seguintes, que são incluídos meramente para propósitos de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção e não é intencionada a limitar a invenção.
Exemplo 1 - domínios de ligação a NKG2D se ligam a NKG2D
Domínios de ligação a NKG2D se ligam a NKG2D recombinante purificado [0177] As sequências de ácido nucleico de ectodomínios de NKG2D humanos, de camundongo ou cinomolgo foram fundidas com as sequências de ácido nucleico que codificam domínios Fc de IgGl humana e introduzidas em
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66/85 células mamíferas a serem expressas. Depois da purificação, proteínas de fusão de NKG2D-Fc foram adsorvidas aos poços das microplacas. Depois de bloquear os poços com albumina sérica bovina para impedir a ligação não específica, domínios de ligação a NKG2D foram titulados e adicionados aos poços préadsorvidos com proteínas de fusão de NKG2D-Fc. A ligação do anticorpo primário foi detectada usando um anticorpo secundário que foi conjugado à peroxidase de raiz forte e especificamente reconhece uma cadeia leve capa humana para evitar a reatividade cruzada de Fc. 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB), um substrato para peroxidase de raiz forte, foi adicionado aos poços para visualizar o sinal de ligação, cuja Absorbância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Um clone de domínio de ligação a NKG2D, um controle de isótipo ou um controle positivo (selecionado a partir das SEQ ID NOs: 45 - 48 ou clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) foi adicionado a cada poço.
[0178] O controle de isótipo mostrou ligação mínima às Proteínas de NKG2D-Fc recombinantes, enquanto o controle positivo ligou mais fortemente aos antígenos recombinantes. Domínios de ligação a NKG2D produzidos por todos os clones demonstraram ligação através de proteínas de NKG2D-Fc recombinante humanas, de camundongo e cinomolgo, embora com afinidades variadas de clone a clone. Geralmente, cada clone anti-NKG2D ligou-se a NKG2DFc recombinante humano (FIG. 3) e de cinomolgo (FIG. 4) com afinidade similar, mas com afinidade mais baixa a NKG2D-Fc recombinante de camundongo (FIG. 5).
Domínios de ligação a NKG2D se ligam a células que expressam NKG2D [0179] Linhagens celulares de linfoma de camundongo EL4 foram manipuladas para expressar receptores de antígeno quimérico de NKG2D domínio de sinalização CD3 zeta humanos ou de camundongo. Um clone de
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67/85 ligação a NKG2D, um controle de isótipo ou um controle positivo foi usado em uma concentração de 100 nM para manchar NKG2D extracelular expresso nas células EL4. A ligação do anticorpo foi detectada usando anticorpos secundários anti-lgG humana conjugados a fluoróforo. Células foram analisadas por citometria de fluxo e fold-over-background (FOB) foi calculado usando a intensidade de fluorescência média (MFI) de células que expressão NKG2D comparado às células EL4 precursoras.
[0180] Domínios de ligação a NKG2D produzidos por todos os clones se ligaram às células EL4 que expressam NKG2D humano e de camundongo. Anticorpos de controle positivo (selecionados a partir da SEQ ID NO: 45 a 48 ou clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) forneceram o melhor sinal de ligação de FOB. A afinidade de ligação a NKG2D para cada clone foi similar entre as células que expressam NKG2D humano (FIG. 6) e NKG2D de camundongo (FIG. 7).
Exemplo 2 - domínios de ligação a NKG2D bloqueiam a ligação do ligante natural ao NKG2D
Competição com ULBP-6 [0181] Proteínas de NKG2D-Fc humano recombinante foram adsorvidas aos poços de uma microplaca e os poços que foram bloqueados com albumina sérica bovina reduzem a ligação não específica. Uma concentração saturada de ULBP-6-His-biotina foi adicionada aos poços, seguido por adição dos clones de domínio de ligação a NKG2D. Depois de uma incubação de 2 horas, poços foram lavados e ULBP-6-His-biotina que permaneceu ligado aos poços revestidos com NKG2D-Fc foi detectado por conjugado de estreptavidina à peroxidase de raiz forte e substrato de TMB. A absorbância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Depois de subtrair o fundo, a ligação específica dos domínios de ligação a NKG2D às proteínas de NKG2D-Fcfoi calculada a partir da porcentagem de ULBP
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6-His-biotina que foi bloqueada de se ligar às proteínas de NKG2D-Fc nos poços. O anticorpo de controle positivo (selecionado a partir das SEQ ID NOs: 45 a 48) e vários domínios de ligação a NKG2D bloquearam a ligação de ULBP-6 ao NKG2D, enquanto o controle de isótipo mostrou pouca competição com ULBP-6 (FIG. 8).
Competição com MICA [0182] Proteínas de MICA-Fc humano recombinante foram adsorvidas aos poços de uma microplaca e os poços foram bloqueados com albumina sérica bovina para reduzir a ligação não específica. NKG2D-Fc-biotina foi adicionado aos poços seguido por domínios de ligação a NKG2D. Depois da incubação e lavagem, NKG2D-Fc-biotina que permaneceu ligado aos poços revestidos com MICA-Fc foi detectado usando estreptavidina-HRP e substrato de TMB. A Absorbância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Depois de subtrair o fundo, a ligação específica de domínios de ligação a NKG2D às proteínas de NKG2D-Fc foi calculada a partir da porcentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi bloqueada de se ligar aos poços revestidos com MICA-Fc. O anticorpo de controle positivo (selecionado a partir das SEQ ID NOs: 45 a 48) e vários domínios de ligação a NKG2D bloquearam a ligação de MICA ao NKG2D, enquanto o controle de isótipo mostrou pouca competição com MICA (FIG. 9).
Competição com Rae-1 delta [0183] Rae-ldelta-Fc de camundongo recombinante (adquirido da R&D Systems) foi adsorvido aos poços de uma microplaca e os poços foram bloqueados com albumina sérica bovina para reduzir a ligação não específica. NKG2D-Fc-biotina de camundongo foi adicionado aos poços seguido por domínios de ligação a NKG2D. Depois da incubação e lavagem, NKG2D-Fc-biotina que permaneceu ligado aos poços revestidos com Rae-ldelta-Fc foi detectado usando estreptavidina-HRP e substrato de TMB. A absorbância foi medida a 450
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69/85 nM e corrigida a 540 nM. Depois de subtrair o fundo, a ligação específica de domínios de ligação a NKG2D às proteínas de NKG2D-Fc foi calculada a partir da porcentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi bloqueada de se ligar aos poços revestidos com Rae-ldelta-Fc. O controle positivo (selecionado a partir das SEQ ID NOs: 45 a 48 ou clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) e vários clones de domínio de ligação a NKG2D bloquearam a ligação de Rae-ldelta ao NKG2D de camundongo, enquanto o anticorpo de controle de isótipo mostrou pouca competição com Rae-ldelta (FIG. 10).
Exemplo 3 - clones de domínio de ligação a NKG2D ativam NKG2D [0184] Sequências de ácido nucleico de NKG2D humano e de camundongo foram fundidas às sequências de ácido nucleico que codificam um domínio de sinalização CD3 zeta para obter constructos de receptor de antígeno quimérico (CAR). Os constructes de NKG2D-CAR depois foram clonadas em um vetor retroviral usando montagem de Gibson e transfectadas em células expi293 para produção do retrovirus. Células EL4 foram infectadas com vírus contendo NKG2D-CAR junto com 8 pg/mL de polibreno. 24 horas depois da infecção, os níveis de expressão de NKG2D-CAR nas células EL4 foram analisados por citometria de fluxo e clones que expressam níveis altos do NKG2D-CAR na superfície celular foram selecionados.
[0185] Para determinar se os domínios de ligação a NKG2D ativam NKG2D, eles foram adsorvidos aos poços de uma microplaca e células EL4 de NKG2D-CAR foram cultivadas nos poços revestidos com fragmento de anticorpo por 4 horas na presença de brefeldina-A e monensina. A produção de TNF-alfa intracelular, um indicador para a ativação de NKG2D, foi avaliada por citometria de fluxo. A porcentagem de células positivas para TNF-alfa foi normalizada às células tratadas com o controle positivo. Todos os domínios de ligação a NKG2D ativaram tanto NKG2D humano (FIG. 11) quanto NKG2D de camundongo (FIG.
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12).
Exemplo 4 - domínios de ligação a NKG2D ativam células NK
Células NK humanas primárias [0186] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias humanas do sangue periférico usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3‘ CD56+) foram isoladas usando seleção negativa com microesferas magnéticas de PBMCs e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente > 95 %. Células NK isoladas depois foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 por 24 a 48 horas antes que elas fossem transferidas aos poços de uma microplaca à qual os domínios de ligação a NKG2D foram adsorvidos e cultivados no meio contendo anticorpo anti-CD107a conjugado a fluoróforo, brefeldina-A e monensina. A seguir da cultura, células NK foram avaliadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-gama. Coloração com CD107a e IFN-gama foi analisada em células CD3 CD56+ para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplo-positivas de CD107a/IFN-gama é indicativo de melhor ativação de célula NK através do compromisso de dois receptores ativadores ao invés de um receptor. Domínios de ligação a NKG2D e o controle positivo (selecionado a partir das SEQ ID NOs: 45 a 48) mostraram uma porcentagem mais alta de células NK tornando-se CD107a+ e IFN-gama+ do que o controle de isótipo (FIG. 13 & FIG. 14 representam dados de dois experimentos independentes, cada um usando uma PBMC de doador diferente para preparação de célula NK).
Células NK de camundongo primárias [0187] Baços foram obtidos de camundongos C57BI/6 e triturados através de um filtro de célula de 70 pm para obter suspensão de célula única. As células foram peletizadas e ressuspensas em tampão de lise de ACK (adquirido da
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Thermo Fisher Scientific #A1049201; cloreto de amônio a 155 mM, bicarbonato de potássio a 10 mM, EDTA a 0,01 mM) para remover os eritrócitos. As células remanescentes foram cultivadas com 100 ng/mL de hlL-2 por 72 horas antes de serem colhidas e preparadas para isolamento de célula NK. Células NK (CD3‘ NK1,1+) depois foram isoladas de células do baço usando uma técnica de supressão negativa com microesferas magnéticas com tipicamente > 90 % de pureza. Células NK purificadas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de mlL-15 por 48 horas antes que elas fossem transferidas para os poços de uma microplaca aos quais os domínios de ligação a NKG2D foram adsorvidos e cultivados no meio contendo anticorpo anti-CD107a conjugado a fluoróforo, brefeldina-A e monensina. A seguir da cultura nos poços revestidos com domínio de ligação a NKG2D, células NK foram avaliadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, NK1.1 e IFN-gama. Coloração com CD107a e IFN-gama foi analisado em células CD3‘ NK1.1+ para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplo-positivas para CD107a/IFNgama é indicativo da melhor ativação de célula NK através do compromisso de dois receptores ativadores ao invés de um receptor. Domínios de ligação a NKG2D e o controle positivo (selecionado de clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) mostraram uma porcentagem mais alta de células NK tornando-se CD107a+ e IFN-gama+ do que o controle de isótipo (FIG. 15 & FIG. 16 representam dados de dois experimentos independentes, cada um usando um camundongo diferente para a preparação de célula NK).
Exemplo 5 - domínios de ligação a NKG2D permitem a citotoxicidade de células tumorais alvos [0188] Ensaios de ativação de célula NK primária humana e de camundongo demonstram marcadores de citotoxicidade aumentados em células NK depois da incubação com domínios de ligação a NKG2D. Para resolver se isto se traduz
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72/85 em lise de célula tumoral aumentada, um ensaio de base celular foi utilizado onde cada domínio de ligação a NKG2D foi desenvolvido em um anticorpo monoespecífico. A região Fc foi usada como um braço de alvejamento, enquanto a região Fab (domínio de ligação a NKG2D) agiu como um outro braço de alvejamento para ativar células NK. Células THP-1, que são de origem humana e expressam níveis altos de receptores Fc, foram usadas como um alvo tumoral e um kit de Citotoxicidade DELFIA Perkin Elmer foi usado. Células THP-1 foram rotuladas com reagente BATDA e ressuspensas em 105/mL em meio de cultura. Células THP-1 rotuladas depois foram combinadas com anticorpos NKG2D e células NK isoladas de camundongo em poços de uma placa microtituladora a 37 °C por 3 horas. Depois da incubação, 20 μΙ_ do sobrenadante de cultura foram removidos, misturados com 200 μΙ_ de solução de Európio e incubados com agitação por 15 minutos no escuro. A fluorescência foi medida com o passar do tempo por um leitor de placa PheraStar equipado com um módulo de fluorescência resolvida no tempo (Excitação de 337 nm, Emissão de 620 nm) e a lise específica foi calculada de acordo com as instruções do kit.
[0189] O controle positivo, ULBP-6 - um ligante natural para NKG2D, mostrou lise específica aumentada de células alvos THP-1 por células NK de camundongo. Anticorpos NKG2D também aumentaram a lise específica de células alvos THP-1, enquanto o anticorpo de controle de isótipo mostrou lise específica reduzida. A linha pontilhada indica a lise específica de células THP-1 por células NK de camundongo sem anticorpo adicionado (FIG. 17).
Exemplo 6 - anticorpos NKG2D mostram termoestabilidade alta [0190] Temperaturas de fusão de domínios de ligação a NKG2D foram avaliadas usando fluorimetria diferencial de varredura. As temperaturas de fusão aparentes extrapoladas são altas em relação a anticorpos de IgGl típicos (FIG. 18).
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Exemplo 7 - Ativação sinérgica de células NK humanas por reticulação de NKG2D e CD16
Ensaio de ativação de célula NK humana primária [0191] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK foram purificadas a partir de PBMCs usando microesferas magnéticas negativas (StemCell n° 17955). Células NK foram > 90 % de CD3 CD56+ como determinado por citometria de fluxo. As células depois foram expandidas 48 horas em meio contendo 100 ng/mL de hlL-2 (Peprotech n° 200-02) antes do uso nos ensaios de ativação. Anticorpos foram revestidos sobre uma placa de fundo plano de 96 poços em uma concentração de 2 pg/mL (anti-CD16, Biolegend n° 302013) e 5 pg/mL (antiNKG2D, R&D #MAB139) em 100 pL de PBS estéril durante a noite a 4 °C seguido por lavagem dos poços completamente para remover anticorpo em excesso. Para a avaliação da desgranulação de células NK ativadas por IL-2 foram ressuspensas em 5xl05 células/mL em meio de cultura suplementado com 100 ng/mL de hlL2 e 1 pg/mL de mAb anti-CD107a conjugado a APC (Biolegend n° 328619). IxlO5 células/poço depois foram adicionadas sobre placas revestidas com anticorpo. Os inibidores de transporte de proteína Brefeldina A (BFA, Biolegend n° 420601) e Monensina (Biolegend n° 420701) foram adicionados em uma diluição final de 1:1000 e 1:270 respectivamente. As células plaqueadas foram incubadas por 4 horas a 37 °C em CO2 a 5 %. Para o Coloração intracelular de IFN-γ células NK foram rotuladas com mAb anti-CD3 (Biolegend n° 300452) e anti-CD56 (Biolegend n° 318328) e subsequentemente fixadas e permeabilizadas e rotuladas com mAb anti-IFN-γ (Biolegend n° 506507). Células NK foram analisadas quanto à expressão de CD107a e IFN-γ por citometria de fluxo depois da supressão em células CD56+CD3‘vivas.
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74/85 [0192] Para investigar a potência relativa de combinação de receptor, reticulação de NKG2D ou CD16 e co-reticulação de ambos os receptores por estimulação ligada à placa foram realizadas. Como mostrado na Figura 19 (FIGs. 19A a 19C), a estimulação combinada de CD16 e NKG2D resultou em níveis altamente elevados de CD107a (desgranulação) (FIG. 19A) e/ou produção de IFN-γ (FIG. 19B). Linhas pontilhadas representam um efeito aditivo de estimulações individuais de cada receptor.
[0193] Níveis de CD107a e produção de IFN-γ intracelular de células NK ativadas por IL-2 foram analisados depois de 4 horas de estimulação ligada à placa com anti-CD16, anti-NKG2D ou uma combinação de ambos os anticorpos monoclonais. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± SD. A FIG. 19A demonstra níveis de CD107a; a FIG. 19B demonstra níveis de IFNy; a FIG. 19C demonstra níveis de CD107a e IFNy. Os dados mostrados nas FIGs. 19A a 19C são representativos de cinco experimentos independentes usando cinco doadores saudáveis diferentes.
Exemplo 8 - Proteínas de ligação multiespecíficas se ligam a NKG2D [0194] Linhagens celulares de linfoma de camundongo EL4 foram manipuladas para expressar NKG2D humano. Proteínas de ligação triespecíficas (TriNKETs) de modo que todas contenham um domínio de ligação a NKG2D, um domínio de ligação a antígeno associado ao tumor (domínio de ligação a CD33) e um domínio Fc que se liga a CD16 como mostrado na FIG. 1, foram testadas quanto à sua afinidade a NKG2D extracelular expresso em células EL4. A ligação das proteínas de ligação multiespecíficas a NKG2D foi detectada usando anticorpos secundários anti-lgG humana conjugados a fluoróforo. Células foram analisadas por citometria de fluxo e vezes sobre o fundo (FOB) foi calculado usando a intensidade de fluorescência média (MFI) de células que expressam NKG2D comparado a células EL4 precursoras.
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75/85 [0195] TriNKETs testadas incluem CD33-TriNKET-C26 (ADI-28226 e um domínio de ligação a CD33), CD33-TriNKET-F04 (ADI-29404 e um domínio de ligação a CD33), CD33-TriNKET-A44 (ADI-27744 e um domínio de ligação a CD33), CD33-TriNKET-F47 (ADI-29447 e um domínio de ligação a CD33), CD33-TriNKETA49 (ADI-27749 e um domínio de ligação a CD33) e CD33-TriNKET-F63 (ADI27463 e um domínio de ligação a CD33). O domínio de ligação a CD33 usado nas moléculas testadas foi composto de um domínio variável de cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve como listado abaixo.
Domínio variável de cadeia pesada de CD33 (SEQ ID NO: 125):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYVVHWVRQAPGQGLEWIVIGYINPY
CDR1 (SEQ ID NO: 127) CDR2 NDGTKYNEKFKG R VTMTR DTSISTAYM E LS R LRS D DTAVYYCAR DYRYEVYGMDY (SEQ ID NO: 128) CDR3 (SEQ ID NO: 129)
WGQGTLVTVSS
Domínio variável de cadeia leve de CD33 (SEQ ID NO: 126):
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCTASSSVNYIHWYQQKPGQPPKLLIYDTSKVASGVP
CDR1(SEQ ID NO: 130) CDR2 (SEQ ID NO: 131) ARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQQWRSYPLTFGQGTKLEIK CDR3 (SEQ ID NO: 132) [0196] Os dados mostram queTriNKETs que incluem um domínio de ligação a CD33 e um domínio de ligação a NKG2D se ligam a NKG2D (FIGs. 35A a 35B). A FIG. 35A mostra a ligação das TriNKETs em comparação com os anticorpos monoclonais que contêm o domínio de ligação de NKG2D correspondente. A FIG. 35B mostra o perfil de ligação de TriNKETs direcionado a CD33 que incluem 6 domínios de ligação de NKG2D diferentes.
Exemplo 9 - Proteínas de ligação multiespecíficas se ligam a antígenos tumorais humanos
Proteínas de ligação triespecíficas se ligam a CD33
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76/85 [0197] Linhagens celulares de AML humana MV4-11 e Molm-13 que expressam CD33 foram usadas para avaliar a ligação de TriNKETs ao antigeno associado ao tumor CD33. TriNKETs e opcionalmente o anticorpo monoclonal anti-CD33 precursor foram incubadas com as células e a ligação foi detectada usando anticorpos secundários anti-lgG humana conjugados a fluoróforo. Células foram analisadas por citometria de fluxo e fold-over-background (FOB) foi calculado usando a intensidade de fluorescência média (MFI) das TriNKETs e o anticorpo anti-CD33 monoclonal precursor normalizado aos controles de anticorpo secundário. TriNKETs direcionado a CD33 mostram níveis comparáveis de ligação a CD33 quando comparado com o anticorpo anti-CD33 precursor (FIG. 36). ATriNKETs mostra que a ligação à superfície de célula CD33 em células MV411 (FIG. 36A, 36B e 36D) e Molm-13 (FIG. 36C). O sinal de ligação global é comparável entre TriNKETs visto que elas contêm o mesmo domínio de ligação a CD33.
Exemplo 10 - Proteínas de ligação multiespecíficas ativam células NK [0198] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias humanas do sangue periférico usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3‘ CD56+) foram isoladas usando seleção negativa com microesferas magnéticas de PBMCs e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente > 90 %. Células NK isoladas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 para ativação ou em repouso durante a noite sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 foram usadas dentro de 24 a 48 horas depois da ativação.
[0199] Células MV4-11 que expressam CD33 foram colhidas e ressuspensas em meio de cultura em 2xlO6/mL. Anticorpos monoclonais de CD33 ou TriNKETs alvejantes de CD33 foram diluídos em meio de cultura. Células NK ativadas foram colhidas, lavadas e ressuspensas em 2xlO6/mL em meio de cultura. Células
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77/85 cancerígenas depois foram misturadas com anticorpos monoclonais/TriNKETs e células NK ativadas na presença de IL-2. Brefeldina-A e monensina também foram adicionadas à cultura misturada para bloquear o transporte de proteína fora da célula para coloração de citocina intracelular. Anti-CD107a conjugado a fluoróforo foi adicionado à cultura misturada e a cultura foi incubada por 4 horas antes que as amostras fossem preparadas para análise de FACS usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-gama. A coloração com CD107a e IFN-gama foi analisada em células CD3‘ CD56+ para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplo-positivas para CD107a/IFNgama é indicativo da melhor ativação de célula NK através do compromisso de dois receptores ativadores ao invés de um receptor.
[0200] A co-cultura de células NK humanas primárias com células MV4-11 positivas para CD33 resultou em ativação mediada por TriNKET das células NK humanas primárias. Uma ativação mediada por TriNKET direcionado a CD33 de células NK humanas co-cultivadas com células MV4-11, como indicado por um aumento na desgranulação de CD107a e produção de IFNy e citocina (FIG. 37A e 37B). Células NKsozinhas, células NK co-cultivando com células MV4-11 mas sem TriNKETs, TriNKETdirecionado a CD20foram usadas como controles. Comparado ao anticorpo monoclonal de C33, a TriNKET direcionado a CD33 mostrou atividade de célula NK aumentada (FIG. 37A e 37B).
Exemplo 11 - Proteínas de ligação triespecíficas permitem a citotoxicidade de células cancerígenas alvos [0201] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias humanas do sangue periférico usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3‘ CD56+) foram isoladas usando seleção negativa com microesferas magnéticas de PBMCs e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente > 90 %. Células NK isoladas foram
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78/85 cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 para ativação ou em repouso durante a noite sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 ou em repouso foram usadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade.
Ensaio de citotoxicidade de DELFIA:
[0202] Linhagens celulares cancerígenas humanas que expressam CD33 foram colhidas da cultura, as células foram lavadas com PBS e foram ressuspensas em meio de crescimento em 106/mL para rotulagem com reagente BATDA (Perkin Elmer AD0116). As instruções do fabricante foram seguidas para a rotulagem das células alvos. Depois da rotulagem as células foram lavadas 3x com PBS e foram ressuspensas em 0,5 a l,0xl05/mL em meio de cultura. Para preparar os poços de fundo uma alíquota das células rotuladas foi deixada de lado e as células foram giradas fora do meio. 100 pL do meio foram cuidadosamente adicionados aos poços em triplicata para evitar romper as células peletizadas. 100 pL de células rotuladas com BATDA foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços. Poços foram preservados quanto à liberação espontânea de células alvos e poços foram preparados para a lise max de células alvos por adição de 1 % de Triton-X. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs contra o alvo tumoral de interesse foram diluídos em meio de cultura, 50 pL de mAb ou TriNKET diluído foram adicionados a cada poço. Células NK em repouso e/ou ativadas foram colhidas das culturas, as células foram lavadas e foram ressuspensas em 105 a 2,0xl06/mL em meio de cultura dependendo da razão de célula efetora para alvo desejada (E:T). 50 pL de células NK foram adicionados a cada poço da placa para compor um total de 200 pL de volume de cultura. A placa foi incubada a 37 °C com CO2 a 5 % por 2 a 3 horas antes do desenvolvimento do ensaio.
[0203] Depois de cultivar por 2 a 3 horas, a placa foi removida da incubadora e as células foram peletizadas por centrifugação em 200 g por 5
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79/85 minutos. 20 μ!_ de sobrenadante de cultura foram transferidos para uma microplaca limpa fornecida do fabricante e 200 μΙ_ de solução de európio na temperatura ambiente foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada em um agitador de placa em 250 rpm por 15 minutos. A placa foi lida usando os instrumentos Victor 3 ou SpectraMax i3X. A % de lise específica foi calculada como segue: % de Lise específica = ((Liberação experimental Liberação espontânea)/(Liberação máxima - Liberação espontânea)) * 100 %.
[0204] TriNKETs mediaram a citotoxicidade de células NK humanas para as linhagens celulares cancerígenas humana positivas para CD33. Células NK humanas em repouso foram misturadas com células MV4-11 cancerígenas (FIG. 40A), células NK humanas em repouso foram misturadas com células cancerígenas Molm-13 (FIG. 40B) e células NK humanas em repouso foram misturadas com células cancerígenas THP-1 (FIG. 40C). TriNKETs (por exemplo, CD33-TriNKET-C26 e CD33-TriNKET-F04) são capazes de realçar a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso em uma maneira responsiva de dose para as células cancerígenas. A linha pontilhada indica a atividade citotóxica de células NK em repouso sem as TriNKETs. O anticorpo monoclonal de CD33 mostrou eficácia reduzida em células MV4-11, que expressam CD64, mas em um nível mais baixo do que as células THP-1. O anticorpo monoclonal de CD33 mostrou boa eficácia em células Molm-13, que não expressam CD64. O anticorpo monoclonal de CD33 não mostrou nenhum efeito sobre células THP1, que têm um nível de CD64 alto.
[0205] A lise mediada por TriNKET de células cancerígenas humanas positivas para CD33 Molm-13 foi avaliada. Células NK humanas em repouso foram misturadas com células cancerígenas Molm-13 em razão de 5:1 (FIG. 41) e TriNKETs (por exemplo, CD33-TriNKET-A49, CD33-TriNKET-A44, CD33-TriNKETC26 e CD33-TriNKET-E79) foram capazes de realçar a atividade citotóxica de
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80/85 células NK humanas em repouso em uma maneira responsiva de dose para as células cancerígenas. A linha pontilhada indica a atividade citotóxica de células NK em repouso sem TriNKETs.
Exemplo 12 - A vantagem de TriNKETs no tratamento de cânceres com expressão alta de FcR ou em microambientes tumorais com níveis altos de FcR [0206] Terapia com anticorpo monoclonal foi aprovada para o tratamento de muitos tipos de câncer, incluindo tanto tumores hematológicos quanto sólidos. Embora o uso de anticorpos monoclonais no tratamento do câncer tenha melhorado os efeitos no paciente, ainda existem limitações. Estudos mecanísticos demonstraram que anticorpos monoclonais exercem seus efeitos sobre o crescimento tumoral através de mecanismos múltiplos incluindo ADCC, CDC, fagocitose e obstrução de sinal entre outros.
[0207] O mais notavelmente, ADCC é considerado como sendo um principal mecanismo através do qual os anticorpos monoclonais exercem seu efeito. ADCC conta com o compromisso do anticorpo Fc do FcyRIII (CD16) de afinidade baixa sobre a superfície de células natural killer, que medeiam a lise direta da célula tumoral. Entre FcyR, CD16 tem a afinidade mais baixa para Fc de IgG, FcyRI (CD64) é o FcR de afinidade alta e liga cerca de 1000 vezes mais fortemente ao Fc de IgG do que CD16.
[0208] CD64 é normalmente expresso em muitas linhagens hematopoiéticas tais como a linhagem mielóide e pode ser expresso em tumores derivados destes tipos de células, tal como leucemia mielóide aguda (AML). Células imunes que infiltram no tumor, tais como MDSCs e monócitos, também expressam CD64 e são conhecidas infiltrarem no microambiente tumoral. A expressão de CD64 pelo tumor ou no microambiente tumoral pode ter um efeito prejudicial sobre a terapia com anticorpo monoclonal. A expressão de CD64 no microambiente tumoral torna difícil para estes anticorpos comprometerem
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CD16 na superfície de células NK, visto que os anticorpos preferem se ligar ao receptor de afinidade alta. Através do alvejamento de dois receptores ativadores na superfície de células NK, TriNKETs podem ser capazes de superar o efeito prejudicial da expressão de CD64 sobre a terapia com anticorpo monoclonal.
Expressão de FcRyl (CD64) em três linhagens celulares de AML [0209] Um sistema de cultura in vitro foi desenvolvido para testar a atividade de TriNKETs e anticorpos monoclonais contra tumores com níveis altos e baixos de expressão na superfície de CD64. Molm-13 e THP-1 são duas linhagens celulares AML humana que têm expressão similar de CD33 superficial, mas células Molm-13 não expressam CD64, enquanto células THP-1 expressam CD64 em sua superfície (FIGs. 38A a 38C). Usando anticorpos monoclonais ou TriNKETs dirigidos para alvejar CD33, o efeito da expressão de CD64 pelo tumor sobre a terapia com anticorpo monoclonal ou TriNKET foi testado. As FIGs. 38A a 38C mostram a expressão do FcRyl de afinidade alta (CD64) sobre três linhagens celulares de AML humana, linhagem celular Molm-13 (FIG. 38A), linhagem celular MV4-11 (FIG. 38B) e linhagem celular THP-1 (FIG. 38C). Células Molm-13 não expressam CD64, enquanto células MV4-11 têm um nível baixo e THP-1 têm um nível alto de CD64 de superfície celular.
TriNKETs têm uma vantagem em alvejar células tumorais com alta expressão superficial de FcRs [0210] As FIGs. 39A a 39B mostram a ativação mediada por anticorpo monoclonal ou TriNKET de células NK humanas em co-cultura com células Molm13 (FIG. 39B) ou THP-1 (FIG. 39A). Um anticorpo monoclonal contra CD33 humano demonstrou boa ativação de células NK humanas, no sistema de cocultura Molm-13 como evidenciado por desgranulação de CD107a e produção de IFNy aumentadas. O anticorpo monoclonal não tem nenhum efeito sobre o sistema de co-cultura de THP-1, onde níveis altos de CD64 estão presentes nas
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82/85 células cancerígenas. Interessantemente, TriNKETs são eficazes tanto contra células Molm-13 (FIG. 39B) quanto THP-1 (FIG. 39A), indicando que TriNKETs são capazes de superar a ligação ao CD64 no tumor e eficazmente alvejar células NK para ativação. O alvejamento duplo de dois receptores ativadores em células NK forneceu ligação específica mais forte às células NK. Anticorpos monoclonais, que apenas alvejam CD16 em células NK, podem ser ligados por outros FcRs de afinidade alta e impedem o engajamento de CD16 em células NK. Como mostrado na FIG. 39C, TriNKETs também medeiam eficientemente a ativação de células NK humanas em repouso em co-cultura com células de AML humanas MV4-11.
TriNKETs demonstram eficácia sobre linhagens celulares de AML não obstante da expressão de FcyRI [0211] As FIGs. 40A a 40C mostram ensaios de citotoxicidade de NK humana usando as três linhagens celulares de AML humana como alvos. Um anticorpo monoclonal contra CD33 mostrou boa eficácia contra células Molm-13 (FIG. 40B), que não expressam CD64. Células MV4-11 (FIG. 40A), que expressam CD64, mas em um nível mais baixo do que THP-1, mostraram eficácia reduzida com o anti-CD33 monoclonal. Células THP-1 (FIG. 40C) não mostraram nenhum efeito com anti-CD33 monoclonal sozinho. Não obstante da expressão de CD64 sobre as células tumorais, TriNKETs foram capazes de mediar respostas de célula NK humana contra todas as células tumorais testadas aqui.
[0212] As FIGs. 40A a 40C mostram que células THP-1 foram protegidas contra terapia com anticorpo monoclonal, devido aos níveis altos de expressão de FcR de afinidade alta sobre sua superfície. TriNKETs burlaram esta proteção alvejando-se dois receptores ativadores na superfície de células NK. Dados de citotoxicidade correlacionaram diretamente ao que foi observado nos experimentos de ativação de co-cultura. TriNKETs foram capazes de burlar a
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83/85 proteção de terapia com mAb observada com células THP-1 e induzir a lise mediada por célula NK não obstante de níveis altos de FcR.
Exemplo 13 - Extermínio de células mieloides normais e B normais em culturas de PBMC: TriNKETs fornecem melhor perfil de segurança através de menos efeitos colaterais dentro do alvo fora do tumor [0213] Células natural killer e células T CD8 são ambas capazes de lisar diretamente células tumorais, embora os mecanismos através dos quais células NK e células T CD8 reconhecem auto-células normais de células tumorais difiram. A atividade de células NK é regulada pelo equilíbrio de sinais de receptores ativadores (NCRs, NKG2D, CD16, etc.) e inibitórios (KIRs, NKG2A, etc.). O equilíbrio destes sinais ativadores e inibitórios permite que células NK determinem as auto-células saudáveis de auto-células estressadas, viralmente infectadas ou transformadas. Este mecanismo embutido de auto-tolerância, ajudará a proteger o tecido normal de respostas de célula NK. Para estender este princípio, a auto-tolerância de células NK permitirá que TriNKETs alvejem antígenos expressos tanto em próprias quanto tumorais sem efeitos colaterais fora de tumor ou com uma janela terapêutica aumentada.
[0214] Diferente de células natural killer, células T requerem reconhecimento de um peptídeo específico apresentado por moléculas de MHC para funções ativadoras e efetoras. Células T foram o alvo primário de imunoterapia e muitas estratégias foram desenvolvidas para redirecionar respostas de célula T contra o tumor. Biespecificações de célula T, inibidores de checkpoint e células CAR-T foram todos aprovados pelo FDA, mas frequentemente sofrem de toxicidades limitantes de dose. Biespecificações de célula T e células CAR-T trabalham em torno do sistema de reconhecimento de TCR-MHC usando-se domínios de ligação para alvejar antígenos na superfície de células tumorais e usando domínios de sinalização manipulados para transduzir
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84/85 os sinais de ativação na célula efetora. Embora eficazes em evocar uma resposta imune antitumoral estas terapias são frequentemente ligadas com a síndrome de liberação de citocina (CRS) e efeitos colaterais dentro do alvo fora do tumor. TriNKETs são únicas neste contexto visto que elas não anularão os sistemas naturais de ativação e inibição de célula NK. Ao contrário, TriNKETs são designadas para oscilar o equilíbrio e fornecer sinais de ativação adicionais às células NK, enquanto mantendo tolerância de NK às próprias saudáveis.
[0215] PBMCs foram isoladas do sangue total por centrifugação por gradiente de densidade. Quaisquer eritrócitos contaminantes foram lisados por incubação em tampão de lise de ACK. PBMCs foram lavadas 3x em PBS e PBMCs totais foram contadas. PBMCs foram ajustadas a 106/mL em meio de cultura de célula primária. 1 mL de PBMCs foi semeado em poços de uma placa de 24 poços, as TriNKETs ou mAbs indicados foram adicionados às culturas de PBMC a 10 pg/mL. Células foram cultivadas durante a noite a 37 °C com CO2 a 5 %. No dia seguinte (24 horas mais tarde) PBMCs foram colhidas da cultura e preparadas para análise de FACS. A porcentagem de células B CD45+; CD19+ e mielócitos CD45+; CD33+; CDllb+ foi analisada sobre os diferentes grupos de tratamento.
[0216] A FIG. 42A mostra que células B (negativas para CD33) de um doador saudável foram não afetadas por TriNKET direcionado a CD33. PBMCs tratadas com TriNKETs direcionado a CD33 não mostraram nenhum efeito sobre a população de linfócito CD45+, CD3-, CD56-. A FIG. 42B mostra que mielócitos de CD33+ autólogos foram protegidos de respostas de célula NK mediadas por TriNKET direcionado a CD33, e, portanto, foram resistentes à lise mediada por TriNKET. Nestas culturas, a frequência de mielócitos CD45+, CD33+, CDllb+ foi inalterada durante a incubação com TriNKETs direcionado a CD33.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA [0217] A invenção inteira de cada um dos documentos de patente e artigos
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85/85 científicos referidos aqui é incorporada por referência para todos os propósitos.
EQUIVALENTES [0218] A invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem divergir do espírito ou características essenciais deste. As modalidades precedentes, portanto, devem ser consideradas em todos os respeitos como ilustrativas ao invés de limitantes da invenção descrita aqui. O escopo da invenção é assim indicado pelas reivindicações anexas ao invés de pela descrição precedente e todas as mudanças que entram dentro do significado e faixa de equivalência das reivindicações são intencionadas a serem incluídas nesta.

Claims (36)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende:
    (a) um primeiro sítio de ligação a antígeno que se liga ao NKG2D;
    (b) um segundo sítio de ligação a antígeno que se liga ao CD33; e (c) um domínio Fc de anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação a antígeno que se liga ao CD16.
  2. 2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno se liga ao NKG2D em humanos, primatas não humanos, e roedores.
  3. 3. Proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve.
  4. 4. Proteína de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve estão presentes no mesmo polipeptídeo.
  5. 5. Proteína de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve.
  6. 6. Proteína de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno estão presentes no mesmo polipeptídeo.
  7. 7. Proteína de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia leve do primeiro sítio de ligação a antígeno tem uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno.
  8. 8. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno
    Petição 870190101434, de 09/10/2019, pág. 98/105 vs compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 1.
  9. 9. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antigeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 41 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 42.
  10. 10. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antigeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 43 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 44.
  11. 11. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antigeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 45 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 46.
  12. 12. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antigeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 47 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 48.
  13. 13. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antigeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 69 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 70.
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  14. 14. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 77 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 78.
  15. 15. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 85 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 86.
  16. 16. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 133 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à SEQ ID NO: 134.
  17. 17. Proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno é um anticorpo de domínio único.
  18. 18. Proteína de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de domínio único é um fragmento VhH ou um fragmento Vnar.
  19. 19. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve.
  20. 20. Proteína de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno estão presentes no mesmo polipeptídeo.
  21. 21. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada do segundo
    Petição 870190101434, de 09/10/2019, pág. 100/105
    A/Ç>
    sítio de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 93 e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 94.
  22. 22. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 101 e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 102.
  23. 23. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 109 e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 110.
  24. 24. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 117 e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 118.
  25. 25. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada do segundo sítio de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 125 e o domínio variável de cadeia leve do segundo sítio de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos
    Petição 870190101434, de 09/10/2019, pág. 101/105
    5/6 pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 126.
  26. 26. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 8 a 16, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação a antígeno é um anticorpo de domínio único.
  27. 27. Proteína de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação a antígeno é um fragmento VhH ou um fragmento Vnar.
  28. 28. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que compreende uma porção de um domínio Fc de anticorpo suficiente para se ligar a CD16, em que o domínio Fc de anticorpo compreende domínios de dobradiça e CH2.
  29. 29. Proteína de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc de anticorpo compreende os domínios de dobradiça e CH2 de um anticorpo IgGl humano.
  30. 30. Proteína de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234 a 332 de um anticorpo IgGl humano.
  31. 31. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizada pelo fato de que o domínio Fc compreende a sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica ao domínio Fc da IgGl humana e difere em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo consistindo em Q347, Y349, T350, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411, K439.
  32. 32. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  33. 33. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais ácidos
    Petição 870190101434, de 09/10/2019, pág. 102/105
    6/6 nucleicos que expressam uma proteína definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.
  34. 34. Método para melhorar diretamente e/ou indiretamente a morte de células tumorais, caracterizado pelo fato de que compreende a exposição de um tumor e células natural killer a uma proteína definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.
  35. 35. Método para tratar câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma proteína definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou uma formulação definida na reivindicação 32 a um paciente.
  36. 36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em AML, síndromes mielodisplásicas, leucemia mielomonocítica crônica, crise blástica mieloide de leucemia mieloide crônica, e ALLs.
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