CN115197330B - 同时靶向cll1和cd33的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种同时靶向CLL1和CD33的嵌合抗原受体及其应用。该嵌合抗原受体具有A)抗原识别结构域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区。本发明同时靶向CLL1和CD33抗原制备的双特异性CAR‑T，既能杀灭白血病干细胞，又能清除绝大部分AML肿瘤细胞，降低肿瘤复发的风险。

Description

同时靶向CLL1和CD33的嵌合抗原受体及其应用
本申请要求于2021年04月14日提交中国专利局、申请号为2021103988944发明名称为“同时靶向CLL1和CD33的嵌合抗原受体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种同时靶向CLL1和CD33的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
CAR-T免疫疗法是近年发展起来的一项恶性肿瘤治疗新技术。尤其是CD19CAR-T治疗R/R B淋巴细胞白血病的临床试验，已经取得了显著的进展。近年来，越来越多的研究者将目光投注到采用CAR-T治疗AML中。
不幸的是，CAR-T细胞在治疗B-ALL方面的成功尚未转化为治疗急性髓系白血病(AML)，由于缺乏合适的靶向表面抗原，迟迟未能突破。在B-ALL和其他B细胞恶性肿瘤中，恶性B细胞的清除与正常B细胞/B细胞祖细胞的清除同时发生。由于随之而来的低丙种球蛋白血症很容易纠正，B细胞耗竭在临床上可被接收。与此形成鲜明对比的是，清除正常髓系细胞/祖细胞不太可能长时间耐受，因为靶向的AML抗原经常在健康的造血干细胞/祖细胞(HSPC)上共同表达，导致所有髓系后代细胞的缺失。人们正在寻求创造性的解决方案来克服这些障碍，从而使CART疗法成为AML患者的可行选择。
在AML中，两个有吸引力的靶向靶向是CD33和CD123。这两种抗原几乎在AML细胞上普遍存在，尽管它们也存在于正常的HSPC上。然而针对这两个靶点的CAR-T在临床上的疗效迟迟未见突破。
急性髓性白血病CART治疗缺乏理想抗原，促使人们寻找新的抗原。由于AML细胞的异质性，对于AML的治疗仍然是目前面临的挑战，这使得靶向单一抗原的CAR-T疗法欠佳。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
T细胞表达双特异性CAR，相比于单靶点的CAR-T，其杀伤AML肿瘤细胞的效力增加。因此，组合CAR-T的设计必须包括在恶性细胞中特异性共表达的两种靶抗原。本发明设计同时识别CLL1和CD33的新型CAR-T，采用双靶点，同时靶向AML细胞表面高度表达的CLL-1和CD33受体。原理为：(1)CLL-1受体靶向白血病干细胞(这类细胞是一小部分生长缓慢的白血病细胞亚群，可以抵抗常规药物治疗，同时可以稳定增殖为新的白血病细胞分支)。CLL1与白血病干细胞和疾病复发有关；(2)CD33受体靶向大部分的AML细胞。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明的第一方面涉及一种嵌合抗原受体，具有A)抗原识别结构域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区；
所述抗原识别结构域从N端到C端依次包括VH1-VL1-VL2-VH2；
其中，所述“-”为连接肽，且所述VH1、VL1、VL2、VH2均沿所述抗原识别结构域的中的N端到C端方向依次排列CDR1、CDR2、CDR3：
Figure BDA0003391185250000021
本发明的第二方面涉及分离的核酸，其表达得到如上所述的嵌合抗原受体。
本发明的第三方面涉及含有如上所述核酸的载体。
本发明的第四方面涉及T细胞，其含有如上所述的核酸或如上所述的载体，或细胞膜表面表达有如上所述的嵌合抗原受体。
本发明的第五方面涉及组合物，其包含在药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及如上所述的T细胞。
本发明的第六方面涉及如上所述的T细胞或如上所述的组合物在制备用于预防和/或治疗白血病的药物中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明同时靶向CLL1和CD33抗原制备的双特异性CAR-T，既能杀灭白血病干细胞，又能清除绝大部分AML肿瘤细胞，降低肿瘤复发的风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中CLL1-CD33双特异性CAR的结构示意图；
图2为本发明一个实施例中流式检测靶细胞的抗原表达情况；
图3为本发明一个实施例中pCDH-EF1-E3327载体图谱；
图4为本发明一个实施例中pCDH-EF1-G3327的载体图谱；
图5为本发明一个实施例中流式检测双特异性CAR结合CLL1和CD33蛋白情况；
图6为本发明一个实施例中E3327-CAR-T表达阳性率检测；
图7为本发明一个实施例中CAR-T杀伤靶细胞分泌细胞因子IFN-γ情况。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及一种嵌合抗原受体，具有A)抗原识别结构域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区；
所述抗原识别结构域从N端到C端依次包括VH1-VL1-VL2-VH2；
其中，所述“-”为连接肽，且所述VH1、VL1、VL2、VH2均沿所述抗原识别结构域的中的N端到C端方向依次排列CDR1、CDR2、CDR3：
Figure BDA0003391185250000041
本发明同时靶向CLL1和CD33抗原制备的双特异性CAR-T，既能杀灭白血病干细胞，又能清除绝大部分AML肿瘤细胞，降低肿瘤复发的风险。
术语“互补性决定区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，如Kabat等人所定义(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest,5thEd"US Department of Health and Human Services,NIH,1991,和后来的版本)。本申请采用Kabat编号系统对CDR进行定义。有三种重链CDR和三种轻链CDR。此处，取决于情况，术语“CDR”和“CDRs”用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在另一具体实施方式中，CDR区或CDR是指IMGT定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。
本发明还包含骨架区(FR)，骨架区可以为任何种属来源，例如牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人
在一些具体的示例中，所述VH1、VL1、VL2、VH2各自对应的骨架区序列如下所示：
Figure BDA0003391185250000042
在本发明中，可变区的序列均按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序进行连接组装。
在一些具体的示例中，所述VL1和所述VL2之间的连接肽序列如SEQ ID NO：31或32所示；
所述VH1和所述VL1之间的连接肽序列如SEQ ID NO：29所示，所述VL2和所述VH2之间的连接肽序列如SEQ ID NO：30所示。
在一些具体的示例中，所述铰链区选自CD8α的hinge区；优选其氨基酸序列如SEQID NO:33所示。
在一些实施方式中，所述跨膜域选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C中的一种；优选为CD8α跨膜区，其氨基酸序列为SEQ ID NO：34所示。
在一些实施方式中，所述胞内信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、PKCθ、FcεRIγ、ZAP70、和CD3ζ中的任一种，或其任意组合，优选为4-1BB以及CD3ζ；更优选所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示；所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示。
在一些实施方式中，所述VH1的N端还连接有信号肽；优选所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示。
本发明还涉及分离的核酸，其表达得到如上所述的嵌合抗原受体。
核酸可为DNA或RNA。
本发明还涉及含有如上所述核酸的载体。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
载体也可以为组合物，例如，可以将不同区段的不同核酸位于不同载体上。
在本公开的一些具体的实施方式中，所述载体选自逆转录病毒载体、腺病毒、腺病毒相关病毒或CRISPR/CAS质粒；
在本公开的一些具体的实施方式中，所述逆转录病毒载体为慢病毒载体；
在本公开的一些具体的实施方式中，所述CRISPR/CAS质粒选自CRISPR/CAS-1、CRISPR/CAS-5、CRISPR/CAS-7、CRISPR/CAS-9、CRISPR/CAS-2、CRISPR/CAS-3、CRISPR/CAS-10中的任一种。
本发明还涉及T细胞，其含有如上所述的核酸或如上所述的载体，或细胞膜表面表达有如上所述的嵌合抗原受体。
在本公开的一些具体的实施方式中，所述T细胞为辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、γδT细胞中的任意一种。
本发明还涉及组合物，其包含在药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及如上所述的T细胞。
术语“药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的赋形剂、稀释剂或载体，其是本领域公知的，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
本发明还涉及如上所述的T细胞或如上所述的组合物在制备用于预防和/或治疗白血病的药物中的应用。
在一些实施方式中，白血病选自急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、B细胞慢性淋巴性白血病与慢性骨髓性白血病。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1抗体的来源
抗CD33的抗体来自clone huMy9-6:
33VL
EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR
33VH
QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS
抗CLL1的抗体(克隆号27H4)序列来自《抗CLL1抗体及其应用(202011458917.8)》及靶向CLL1嵌合抗原受体及其应用(202011461194.7)抗体27H4的氨基酸序列：
>27H4Hv
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYHMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNGAASHNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCARGWDYDGGYYAMDYWGQGTSVTVSS
>27H4Lv
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSDNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYTYPYTFGGGTKLEIK
实施例2检测肿瘤细胞CLL1和CD33表达情况
用FITC anti-human CD371(CLL1)抗体(biolegend品牌)和PE anti-CD33抗体(biolegend品牌)与靶细胞共孵育后，流式检测U937、Raji、细胞的CLL-1和CD33的表达。结果显示，U937和HL60为CLL-1和CD33双阳性细胞，Raji为CLL-1和CD33双阴性细胞。我们查找CLL1和CD33的基因序列，构建稳转慢病毒载体，感染Raji细胞，然后用嘌呤霉素(5μg/mL)筛选，得到分别表达CLL1和CD33的稳转细胞系Raji-CLL1和Raji-CD33。流式检测结果显示：稳转细胞系Raji-CLL1表达CLL1，Raji-CD33稳定表达CD33抗原，U937和HL60表达两种抗原(图2)。
实施例3嵌合抗原受体的设计
本实施例构建了抗CLL1的嵌合抗原受体(CLL1单靶点的CAR)和双特异性嵌合抗原受体(CLL1-CD33双特异性CAR)，结构示意图见图1，嵌合抗原受体包括一段CD8α的信号肽序列(Leader)，与CLL1抗原特异性结合的单链抗体序列(Anti-CLL1 scFv)或者CLL1-CD33双特异性scFv，CD8α的铰链区(Hinge)和跨膜区序列(Transmembrane)，4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域序列，具体各部分序列如下：
CD8α信号肽(leader)的氨基酸序列：MALPVTALLLPLALLLHAARP；
CD8α信号肽(leader)的核苷酸序列：ATGGCACTGCCAGTGACAGCCCTGCTGCTGCCACTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCACGCCCT；
CD8α铰链区(hinge)的氨基酸序列(SEQ ID NO.33)：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；
CD8α铰链区(hinge)的核苷酸序列：ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT；
CD8α跨膜区(TM)的氨基酸序列(SEQ ID NO.34)：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；
CD8α跨膜区(TM)的核苷酸序列：ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC；
4-1BB胞内共刺激域(ICD)的氨基酸序列(SEQ ID NO.35)：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；
4-1BB胞内共刺激域(ICD)的核苷酸序列：AAGAGAGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACAACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGTCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAGGGAGGATGTGAGCTG；
CD3ζ信号传导域的氨基酸序列(SEQ ID NO.36)：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；
CD3ζ信号传导域的核苷酸序列：AGGGTGAAGTTTTCTCGGAGCGCCGATGCACCAGCATATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCCAAGGAGGAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGAGAAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCACTGCACATGCAGGCCCTGCCACCTAGG。
表1 CLL1-CD33双特异性CAR的scFv序列组成
Figure BDA0003391185250000101
E3327(33VH-33VL-(EAAAK)3-27H4VL-27H4VH)(氨基酸序列)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKREAAAKEAAAKEAAAKDIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSDNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYTYPYTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYHMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNGAASHNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCARGWDYDGGYYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
G3327(33VH-33VL-(G4S)5-27H4VL-27H4VH)(氨基酸序列)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGEIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSDNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYTYPYTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYHMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNGAASHNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCARGWDYDGGYYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
实施例4构建的嵌合抗原受体表达载体
(1)根据CAR基因的蛋白理论序列，优化CAR基因，使其能够在人细胞中高效表达，通过密码子优化及全基因合成方法制备CAR基因，在广州艾基生物技术有限公司进行全基因合成；
(2)用EcoRI和BamHI双酶切全基因合成的CAR基因和空载体pCDH-EF1-MCS,于37℃水浴中酶切30min后，使用1.5％的琼脂糖凝胶进行DNA电泳，然后使用天根的琼脂糖凝胶试剂盒纯化回收处理；
(3)pCDH-EF1-MCS载体与CAR基因片段的连接：
连接体系如表2所示：
表2
组件 添加量(μl)
pCDH-EF1-MCS载体 2(50ng)
CAR基因 10(150ng)
T4 DNA连接缓冲液 2
T4 DNA连接酶(NEB) 1
<![CDATA[dd H<sub>2</sub>O]]> 5
总共 20
于22℃连接1h，连接产物直接转化Stbl3大肠杆菌感受态细胞，取200μl转化产物涂布氨苄抗性的LB平板，LB平板于37℃的培养箱中倒置培养过夜。次日早晨随机挑选3个单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送样测序。
其中，双特异性抗CLL1和CD33的嵌合抗原受体慢病毒表达载体pCDH-EF1-E3327及pCDH-EF1-G3327的载体图谱见图3和图4。
实施例5流式检测双特异性CAR结合CLL1和CD33蛋白情况
为了评估两种CAR结构是否能有效结合抗原，我们进一步将pCDH-EF1-E3327和pCDH-EF1-G3327质粒瞬转293T细胞，用流式检测两种CAR分别结合CD33和CLL1抗原蛋白情况。将处于对数生长期的293T细胞消化重悬后，3×105/孔铺板12孔板；培养过夜后，将质粒pBG-H2733-CAR和pBG-E3327-CAR以1ug/孔，PEI为3ug/孔，转染293T细胞；转染后48小时收获细胞进行流式检测。所用的检测抗原蛋白：Human CLL-1Protein,His Tag(Acrobiosystem，CLA-H5245，终浓度0.5ug/ml)；Human Siglec-3/CD33 Protein,Fc Tag(Acro biosystem，CD3-H5257，终浓度0.5ug/ml)；protein L-FITC(Acrobiosystem,RP L-PF141，1：40)，室温标记30min。对应的二抗：anti-his tag(终浓度5ul/test)；anti-humanFc(终浓度1：100)。
结果如图5所示：用protein L检测两种CAR结构，转染效率接近，分别为20.37％和22.07％；pBG-E3327-CAR和pBG-G3327-CAR二者同CLL1抗原的结合分别为22.08％和17.72％，E3327略优；而结合CD33结合率无较大差异，分别为25.78％和25.41％。因此，两种CAR都能有效结合CD33和CLL1两种抗原蛋白，E3327结合两种抗原略优。
实施例6慢病毒包装
分别对实施例中的慢病毒表达载体进行慢病毒包装，采用四质粒系统，具体步骤如下：
(1)四质粒系统分别表达慢病毒载体包装所需的gag/pol、Rev、VSV-G及本发明构建的CAR表达载体：将四质粒进行瞬时转染293T细胞，DNA含量为2μg/mL；
(2)将上述质粒与PEI转染试剂混合，加入至一定体积的无血清的DME M中，混匀后放置15分钟，将上述混合液加入至铺有293T细胞的细胞的T75培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养6h；
(3)6h后更换新鲜培养基，继续进行培养，并且加入10mM的丁酸钠溶液，72小时后收集慢病毒的培养上清进行纯化检测。
实施例7慢病毒感染T细胞
每位志愿者采10ml的全血，将外周血与生理盐水1:1进行稀释，在离心管内加入Ficoll，缓缓加入稀释后的外周血，1500rpm离心30min轻轻吸取PBMC层移入另一离心管内；用生理盐水洗涤PBMC多次，转入X-VIVO培养基(含50ng/mL的OKT3，300IU/mL的IL-2)中进行培养，PBMC分离后，需要用含50ng/mL的OKT3，300IU/ml的IL-2的X-VIVO进行激活，2日后将培养基更换成含300IU/mL的X-VIVO进行扩大培养；
利用RetroNectin提高慢病毒对T细胞的感染效率，将30μg的RetroNectin，包被于6孔板内，放于37℃细胞培养箱2h；吸取RetroNectin，利用含2.5％BS A的Hank’s溶液封闭包被后的6孔板，放于37℃细胞培养箱0.5h；吸取封闭液，利用含2％Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板，加入X-VIVO培养基，加入适量的慢病毒溶液，2000g，离心2h；弃上清，加入1×106的T细胞(CD3阳性>90％)，1000g，离心10min，于37℃、5％CO2和一定湿度的细胞培养箱内培养，第二日重复上述过程。第7天去除磁珠。每两天进行一次计数并更换含300IU/mL的X-VIVO，并且将细胞浓度维持0.5×106-1×106/mL，连续培养8天。用美国Cou ntstar IC1000自动细胞计数仪计数，评估CAR-T细胞的扩增情况。结果发现，各CAR-T组扩增良好，没有显著区别。
实施例8 CAR的表达及其功能评估
我们制备了E3327的CAR-T。采用流式细胞仪检测T细胞表面CAR分子的表达，利用APC-anti-CD3抗体标记T细胞群，然后用FITC-Protein L(AC ROBiosystems公司)检测CAR表达阳性率。结果如图6所示：E3327-CAR-T细胞CAR表达率为71.37％。进一步检测CAR-T识别CD33和CLL1抗原蛋白的能力，其阳性率分别为21.31％和66.32％。说明表达E3327的CAR-T能有效识别两种抗原。
进一步分析IFN-γ的分泌量。本发明使用Human IFN-γELISA试剂盒(欣博盛)来检测CAR-T细胞释放IFN-γ细胞因子的浓度。我们用Raji,Raji-CLL1,Raji-CD33,HL60作为靶细胞，进行杀伤试验。CAR-T细胞与各种靶细胞，按1:1的效靶比共孵育16小时后取上清用酶联免疫法(ELISA)检测培养液上清中IFN-γ的分泌量。
其原理是采用双抗体夹心ELISA法，用抗人IFN-γ抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人IFN-γ会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人IFN-γ抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗人IFN-γ抗体与结合在包被抗体上的人IFN-γ结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，IFN-γ浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中IFN-γ的浓度，结果如图7所示。
结果显示：表达E3327的CAR-T细胞与Raji-CLL1(稳转CLL1的Raji细胞),Raji-CD33(稳转CD33的Raji细胞)和HL60(CLL1表达阳性)共孵育后释放大量IFN-γ，而与Raji(CD33和CLL1表达阴性)共培养后，未见大量IFN-γ释放。说明表达E3327的CAR-T细胞的杀伤具有特异性，CAR-T细胞对CLL1和CD33单一阳性或双阳性肿瘤细胞，都有显著的杀伤效果。
表3
靶细胞 CLL1 CD33
Raji 阴性(-) 阴性(-)
HL60 阳性(+) 阳性(+)
Raji-CD33 阴性(-) 阳性(+)
Raji-CLL1 阳性(+) 阴性(-)
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州百暨基因科技有限公司
<120> 同时靶向CLL1和CD33的嵌合抗原受体及其应用
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Ser Tyr Tyr Ile His
1               5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 2
Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 3
Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val
1               5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 4
Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 5
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 6
His Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr
1               5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 7
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 8
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 9
Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro
1               5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 10
Gly Tyr His Met His
1               5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 11
Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Ala Ser His Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Asp
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 12
Gly Trp Asp Tyr Asp Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
            20                  25                  30
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 14
Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly
1               5                   10
<210> 15
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 15
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 16
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 17
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys
            20
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 18
Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 19
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 20
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1               5                   10
<210> 21
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 21
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
            20
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 22
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210> 23
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 23
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 24
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 25
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
            20                  25                  30
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 26
Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10
<210> 27
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 27
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 28
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 29
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1               5                   10                  15
Lys Gly
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 31
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1               5                   10                  15
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
            20                  25
<210> 33
<211> 45
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 33
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1               5                   10                  15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
            20                  25                  30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
        35                  40                  45
<210> 34
<211> 24
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 34
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
            20
<210> 35
<211> 42
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 35
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1               5                   10                  15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
            20                  25                  30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
        35                  40
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 36
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
            20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
        35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
    50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
                85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
            100                 105                 110
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 37
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro
            20

Claims (13)

1.嵌合抗原受体，其特征在于，具有A)抗原识别结构域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区；
所述抗原识别结构域从N端到C端依次包括VH1-VL1-VL2-VH2；
其中，所述“-”为连接肽，且所述VH1、VL1、VL2、VH2均沿所述抗原识别结构域中的N端到C端方向依次排列CDR1、CDR2、CDR3：
Figure FDA0004155746260000011
所述VH1、VL1、VL2、VH2各自对应的骨架区序列如下所示：
Figure FDA0004155746260000012
所述VL1和所述VL2之间的连接肽序列如SEQ ID NO：31所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述VH1和所述VL1之间的连接肽序列如SEQ ID NO：29所示，所述VL2和所述VH2之间的连接肽序列如SEQ ID NO：30所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区选自CD8α的hinge区。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8α的hinge区的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示。
5.根据权利要求1～2任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜域选自T细胞受体的CD8α跨膜区，其氨基酸序列为SEQ ID NO：34所示。
6.根据权利要求1～2任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导区为4-1BB以及CD3ζ。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQID NO：35所示；所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示。
8.根据权利要求1～2任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述VH1的N端还连接有信号肽；所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示。
9.分离的核酸，其特征在于，表达得到权利要求1～8任一项所述的嵌合抗原受体。
10.含有权利要求9所述核酸的载体。
11.T细胞，其含有权利要求9所述的核酸或权利要求10所述的载体，或细胞膜表面表达有权利要求1～8任一项所述的嵌合抗原受体。
12.药物组合物，其包含在药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及权利要求11所述的T细胞。
13.权利要求11所述的T细胞或权利要求12所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗白血病的药物中的应用。
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