CN113527518A

CN113527518A - 靶向cd22和cd19的双特异性嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN113527518A
Application number: CN202110814481.XA
Authority: CN
Inventors: 罗敏; 李光超; 王学俊; 丁雯
Original assignee: Guangzhou Bio Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Bio Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2021-07-19
Publication date: 2021-10-22

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种靶向CD22和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用。该嵌合抗原受体具有A)抗原识别结构域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区；所述抗原识别结构域从N端到C端依次包括CD22scFv‑CD19scFv。本发明所提供的双特异性嵌合抗原受体靶向CD19和CD22抗原的双特异性CAR‑T，可以清除绝大部分肿瘤细胞，降低肿瘤复发的风险。

Description

靶向CD22和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种靶向CD22和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(CD19 CAR T细胞)产品已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗B淋巴细胞白血病，并显示出巨大成功。尽管在B淋巴细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者中CD19 CAR-T细胞疗法引起令人印象深刻的完全缓解(CR)，但完全缓解的高发生率有时会因CD19阴性白血病细胞的出现而受到限制。使用CD19 CAR-T细胞疗法后复发的病人中，约有60％显示CD19抗原丢失，这涉及几个不同的机制。因此，针对靶向抗原丢失的改进的CAR设计成为迫切的需求。克服CAR-T细胞治疗后抗原丢失的一种方法是同时靶向癌细胞上的两个或多个抗原，鉴于抗CD22 CAR-T细胞也已证明具有临床疗效，靶向CD19和CD22的双特异性CAR修饰的T细胞可以克服单阴性复发的局限性。

CD22是在细胞分化的成熟阶段在B细胞表面表达的135kDa的唾液酸糖蛋白(Dorken等，J.Immunol.136：4470-4479，1986)。CD22在B细胞活化中起作用并且作为粘附分子，介导与活化的血细胞和辅助细胞的相互作用(Hanasaki等，J.Biol.Chem.270(13)：7533-7542，1995)。在发育的早期阶段，在B细胞的表面上未发现CD22，也未在干细胞中表达CD22。但是，所有B细胞淋巴瘤和白血病中有60-70％表达CD22。

连接子或间隔子(Linker)是自然界中产生的用于分离单个蛋白质多个结构域的短氨基酸序列。没有连接子的功能区域直接融合可能会导致许多不良的结果，包括融合蛋白的错误折叠，蛋白质生产的低产量，或生物活性受损。这些连接体采用卷曲结构，并表现出对Gln、Arg、Glu、Ser和Pro氨基酸的偏好。用于结构研究的合成嵌合蛋白的人工连接物大多含有丰富的甘氨酸残基。有趣的是，在许多蛋白质中发现的自然发生的柔性连接物也富含甘氨酸残基。聚甘油酸和富甘油酸连接物可以被认为是独立的单元，并不影响它们所附着的单个蛋白质的功能。富含甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)的多肽具有特殊的优势:(i)多肽主链的旋转自由，使相邻的结构域可以自由地相互移动；(ii)增强了溶解度；(iii)抗蛋白质水解。一个合适的连接剂可能包括小侧链氨基酸的组合，如甘氨酸和丝氨酸，具有更高的甘氨酸的整体百分比。

最常见的柔性Linker就是G(Gly)甘氨酸和S(Ser)丝氨酸的GS组合，最常用的GS组合就是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，通过改变n的大小，研究者可以将结构域之间的距离放大和减小，实现结构域分离(n≥2)或连接结构域，研究其相互作用。其他一些常见的蛋白Linker具有一些特定的用途，例如单链可变片段(single chain variable fragment，scFv)中，连接重链可变区(VH)和轻链可变区。(Lys)提高水溶性。更简单粗暴一些的柔性Linker就是纯甘氨酸(Gly)组成的(Gly)8，或短一点点的(Gly)6，它们的优点是在酵母表达纯化过程中，能够抵抗蛋白酶的水解，同时保护两端蛋白结构域的功能活性。

刚性Linker具有(EAAAK)n序列的α-螺旋形成的Linker具有内部氢键和密切联系肽链骨干，刚性且稳定。因此，刚性α-螺旋Linker可作为蛋白质结构域之间的刚性间隔。通过将蓝色荧光蛋白(EBFP)和绿色荧光蛋白(EGFP)连接在一起，评估荧光共振能量转移(FRET)之间的效率，可以发现(EAAAK)n序列连接两个荧光蛋白时，荧光共振能量转移效率比(GGGGS)n序列低，说明α-螺旋Linker能够有效的隔离两个不同的蛋白结构域。另一种类型的刚性Linker具有Pro-rich序列(XP)n，其中X可指定任何氨基酸，推荐选择丙氨酸(Ala)，赖氨酸(Lys)或谷氨酸(Glu)。(XP)n序列没有螺旋结构，Linker中存在的脯氨酸(Pro)可以增加骨架硬度，并且有效分离结构域。富含脯氨酸序列的结构在机体中广泛的存在，例如骨骼肌蛋白的N端就存在(Ala-Pro)7的结构。刚性Linker表现出相对坚硬的结构，能够有效的将两端的蛋白结构域分开，通过改变n的大小，就能够轻易调整结构域之间的最佳距离，从而保证两端蛋白的活性与生物功能。

γδT细胞是外周血细胞毒性T细胞，其不需要由MHC分子的抗原呈现用于识别和功能并且不会引起移植物抗宿主病。此外，在临床前研究和早期临床试验中，已使用扩增的Vγ9Vδ2T细胞证明了抗肿瘤活性。γδT细胞的另一个潜在优势是，与αβT细胞不同，它们不限于MHC，几乎不会产生GVHD，因此，利用表达CAR转基因的工程异体供体来源的γδT细胞，理论上可以用作现成的通用产品。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种双特异性嵌合抗原受体，其具有A)抗原识别结构域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区；

所述抗原识别结构域从N端到C端依次包括CD22 scFv-CD19 scFv；

其中，所述CD22 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述CD19 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述“-”为氨基酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的连接肽。

本发明的第二目的在于提供一种分离的核酸，其表达得到如上所述的双特异性嵌合抗原受体。

本发明的第三目的在于提供一种含有如上所述核酸的载体。

本发明的第四目的在于提供一种宿主细胞，其含有如上所述的核酸或如上所述的载体，或细胞膜表面表达有如上所述的双特异性嵌合抗原受体。

本发明的第五目的在于提供一种药用组合物，其包含如上所述的宿主细胞。

本发明的第六目的在于提供一种如上所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗白血病的药物中的应用。

本发明所提供的双特异性嵌合抗原受体靶向CD19和CD22抗原的双特异性CAR-T，可以清除绝大部分肿瘤细胞，降低肿瘤复发的风险。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中流式检测靶细胞的抗原表达情况；

图2为本发明一个实施例中CD19-CD22双特异性CAR的结构；

图3A为本发明一个实施例中pBG-G22-CAR载体图谱；

图3B为本发明一个实施例中pBG-CD19-CAR载体图谱；

图3C为本发明一个实施例中pBG-G22BE载体图谱；

图3D为本发明一个实施例中pBG-E22BE的载体图谱；

图4为本发明一个实施例中流式检测双特异性CAR结合CD19和CD22蛋白情况；

图5A为本发明一个实施例中E22BE CAR-γδT表达阳性率检测结果；

图5B为本发明一个实施例中G22BE CAR-γδT表达阳性率检测结果；

图6为本发明一个实施例中CAR-γδΤ杀伤对比实验的实验结果。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明涉及一种双特异性嵌合抗原受体，其具有A)抗原识别结构域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区；

所述抗原识别结构域从N端到C端依次包括CD22 scFv-CD19 scFv；

在一些实施方式中，所述铰链区为CD8α的hinge区；在一些实施方式中，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在一些实施方式中，所述跨膜域选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C中的一种；优选所述跨膜域为CD8α跨膜区；进一步优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在一些实施方式中，所述胞内信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、PKCθ、FcεRIγ、ZAP70和CD3ζ中的任一种，或其任意组合，优选为4-1BB以及CD3ζ；更优选所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

在一些实施方式中，所述抗原识别结构域的N端还连接有信号肽；优选所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

应当理解，本发明所涉及的“区”或者“域”，可以选自与它们各自所对应的示例序列，例如SEQ ID NO：1～9中的任一项的氨基酸序列，或与之具有至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或至少约99％同一性的序列，且保留相应所需功能的实质上相似的序列。

实质上相似的序列亦保留多肽的所需活性。通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。进一步的，实质上相似的序列还包括与所需功能差异不大的经过修饰的序列，这些修饰例如磷酸化、糖基化、泛素化等。

本发明还涉及分离的核酸，其表达得到如上所述的双特异性嵌合抗原受体。

本发明还涉及含有如上所述核酸的载体。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

载体也可以为组合物，例如，可以将不同区段的不同核酸位于不同载体上。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体或CRISPR/CAS质粒。

本发明还涉及宿主细胞，其含有如上所述的核酸或如上所述的载体，或细胞膜表面表达有如上所述的双特异性嵌合抗原受体。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述宿主细胞为T细胞，进一步的，所述T细胞为辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、γδT细胞中的任意一种；最优选为γδT细胞。

本发明还涉及药用组合物，其包含如上所述的宿主细胞。

所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载剂。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括当与活性组分组合时允许所述组分保持生物学活性并且与受试者的免疫系统不发生反应的任何材料。实例包括但不限于标准药物载剂(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液))和各种类型的润湿剂中的任一者。用于气雾剂或肠胃外施用的示例性稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包含此类载剂的组合物通过熟知的常规方法来配制(参见例如，Remi ngton's Pharmaceutical Sciences,第18版，A.Gennaro编,Mack PublishingCo.,Eas ton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice ofPharmacy，第21版，Mack Publishing,2005)。

根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗白血病的药物中的应用。

根据本发明的再一方面，还涉及一种治疗有需要的患者的白血病的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的如上所述的宿主细胞或药用组合物，从而治疗白血病。

“患者”是哺乳动物，哺乳动物包括但不限于人、猴子、猪和其他农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、啮齿动物(包括小鼠、大鼠、豚鼠)等。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1检测肿瘤细胞CD19和CD22表达情况

用APC anti-human CD19 Antibody抗体(biolegend品牌)和FITC anti-humanCD22 Antibody抗体(biolegend品牌)与靶细胞共孵育后，流式检测Raji、K562、293T、A549和PC9细胞的CD19和CD22的表达。如图1结果显示，Raji为CD19和CD22双阳性细胞，293T、A549和PC9为CD19和CD22双阴性细胞。

实施例2嵌合抗原受体的设计

本实施例构建了抗CD19的嵌合抗原受体(CD19单靶点的CAR)、抗CD22的嵌合抗原受体(CD22单靶点的CAR)和两个双特异性嵌合抗原受体(CD19-CD22双特异性CAR)，结构示意图见图2，嵌合抗原受体包括一段CD8α的信号肽序列(Leader)，与CD19抗原特异性结合的单链抗体序列(Anti-CD19 scFv)或者CD19-CD22双特异性scFv，CD8α的铰链区(Hinge)和跨膜区序列(Transmembrane)，4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域序列。CD19抗体序列来自FMC63抗体克隆；CD22抗体序列来自m971抗体克隆(专利WO/2009/124109)；

具体各部分序列如下：

CD8α信号肽(leader)的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)：

MALPVTALLLPLALLLHAARP；

CD8α信号肽(leader)的核苷酸序列：

ATGGCACTGCCAGTGACAGCCCTGCTGCTGCCACTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCACGCCCT；

CD8α铰链区(hinge)的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；

CD8α铰链区(hinge)的核苷酸序列：

ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT；

CD8α跨膜区(TM)的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)：

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；

CD8α跨膜区(TM)的核苷酸序列：

ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC；

4-1BB胞内共刺激域(ICD)的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；

4-1BB胞内共刺激域(ICD)的核苷酸序列：

AAGAGAGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACAACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGTCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAGGGAGGATGTGAGCTG；

CD3ζ信号传导域的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；

CD3ζ信号传导域的核苷酸序列：

AGGGTGAAGTTTTCTCGGAGCGCCGATGCACCAGCATATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCCAAGGAGGAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGAGAAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCACTGCACATGCAGGCCCTGCCACCTAGG

表1：CD19-CD22双特异性CAR的scFv序列组成

实施例3构建的嵌合抗原受体表达载体

(1)根据CAR基因的蛋白理论序列，优化CAR基因，使其能够在人细胞中高效表达，通过密码子优化及全基因合成方法在广州艾基生物技术有限公司进行全基因合成；

(2)用EcoRI和BamHI双酶切全基因合成的CAR基因和空载体pBG,于37℃水浴中酶切30min后，使用1.5％的琼脂糖凝胶进行DNA电泳，然后使用天根的琼脂糖凝胶试剂盒纯化回收处理；

(3)pBG载体与CAR基因片段的连接：

连接体系如表2所示：

表2

组件	添加量(μl)
		pBG载体	2(50ng)
CAR基因	10(150ng)
		T4 DNA连接缓冲液	2
T4 DNA连接酶(NEB)	1
		dd H<sub>2</sub>O	5
总共	20

于22℃连接1h，连接产物直接转化Stbl3大肠杆菌感受态细胞，取200μl转化产物涂布氨苄抗性的LB平板，LB平板于37℃的培养箱中倒置培养过夜。次日早晨随机挑选3个单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送样测序。

其中，特异性抗CD19和CD22的嵌合抗原受体慢病毒表达载体pBG-CD22-CAR、pBG-CD19-CAR、pBG-E22BE及pBG-G22BE的载体图谱见图3A～图3D。

实施例4流式检测双特异性CAR结合CD19和CD22蛋白情况

为了评估两种双特异性CAR结构是否能有效结合抗原，我们进一步将pBG-E22BE和pBG-G22BE质粒瞬转293T细胞，用流式检测两种CAR分别结合CD19和CD22抗原蛋白情况。将处于对数生长期的293T细胞消化重悬后，3×10⁵/孔铺板12孔板；培养过夜后，将质粒pBG-E22BE和pBG-G22BE分别以1μg/孔，PEI为3μg/孔，转染293T细胞；转染后48小时收获细胞进行流式检测。所用的检测抗原蛋白：FITC-Labeled Human CD22 Protein,His Tag(Acrobiosystem，SI2-HF2H6)；FITC-Labeled Human CD19 Protein,Fc Tag(Acrobiosystem，CD9-HF251)；Protein L-FITC(Acrobiosystem,RPL-PF141)，室温标记30min。对应的二抗：His tag Alexa Fluor@647-conjugated antibody(R&D systems，IC0501R-100UG)；APC anti-human IgG Fc Antibody(biolegend，409306)。

结果显示：用Protein L-FITC检测两种CAR结构转染效率，E22BE和G22BE阳性率分别为43.90％和24.90％；二者同CD19抗原的结合分别为18.42％和12.85％；而结合CD22结合率分别为8.60％和16.18％，G3327更平衡地同时结合CD19和CD22靶点抗原。结果见图4。

实施例5 CAR-γδT细胞的制备

(1)分离PBMC

采集50mL外周血；在超净工作台中向2支50mL灭菌离心管中分别加入15mL淋巴细胞分离液，将25～30mL外周血缓慢注入含有淋巴细胞分离液的离心管中，按照淋巴细胞分离液的使用说明，将离心管在700g下室温离心20min，升速1，降速2，若血液储存超过2小时，将离心时间增至30min；

离心后，血液分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第2层)、分离液(第3层)和红细胞(底层)构成，用吸管将第2层单个核细胞收集至新的离心管中，加入20mL PBS稀释细胞悬液，500g离心10min；移除上清液，加入20mL PBS稀释细胞悬液，混匀，取20μL细胞悬液计数，余下悬液500g离心10min备用。

(2)γδT细胞激活

加入10mLγδT激活培养基重悬PBMC，γδT激活培养基包含GT-T551 H3培养基、2mL灭活自体血浆、适宜浓度IL-2、唑来膦酸等；取20μL细胞悬液计数；将上述细胞悬液转入细胞培养瓶中，用γδT激活培养基调整细胞密度至(2～3)×10⁶个/mL，37℃、5％CO₂培养箱中培养3～4天。

(3)慢病毒感染和扩大培养

Day4，使用RetroNectin包被非组织培养处理的24孔板，将RetroNectin母液用PBS液稀释至40ug/mL，添加1mL至24孔板中；用封口膜封闭，4℃过夜孵育。

Day5，吸弃RetroNectin，用2％人血清白蛋白室温封闭30min，然后用PBS洗一遍；将逆转录病毒加至包被的孔中，培养板于32℃，1500g离心2h；然后吸弃病毒，用PBS洗一遍孔。将离心收集的γδT细胞，用新鲜的完全培养基重悬至1×10⁶cells/mL；前后左右晃匀细胞，将孔板于32℃1500g离心30min-2h，然后在37℃培养箱中继续过夜培养。

Day 6，再次进行一遍上述操作：包被，负载，感染。

实施例6双特异性CAR-γδT表达

采用流式细胞仪检测制备的E22BE和G22BE的CAR-γδT表面CAR分子的表达，利用APC-anti-CD3抗体标记T细胞群，然后用FITC-Protein L(AcroBiosystems公司)检测CAR表达阳性率。结果显示：E22BE CAR-γδT细胞CAR表达率为77.00％，G22BE CAR-γδT细胞CAR表达率为61.30％。进一步检测CAR-γδT识别CD19和CD22抗原蛋白的能力，E22BE CAR-γδT细胞CD19和CD22阳性率分别为23.20％和61.90％；G22BE CAR-γδT细胞CD19和CD22阳性率分别为39.80％和40.80％。说明表达G22BE的CAR-γδT能更有效识别两种抗原。

实施例7 CAR-γδT细胞功能评估

我们查找CD19和CD22的基因序列，构建携带荧光素酶的慢病毒载体，感染K562细胞，然后用嘌呤霉素(5μg/mL)筛选，得到分别表达CD19和CD22的稳转细胞系K562-CD19-luc和K562-CD22-luc。分别将对照γδT细胞、G22BE CAR-γδT细胞、CD19 CAR-γδT细胞CD22CAR-γδT细胞与靶细胞Raji-luc和K562-CD19-luc、K562-CD22-luc、K562-luc共孵育，效靶比(E：T)为1：1，接种至黑色96孔板，共孵育4-6h后，加入荧光素酶底物(Promega，Bright-Glo^TMLuciferase Assay System)，于多功能酶标仪上检测荧光值，荧光值代表相应的杀伤率，越高代表细胞杀伤越强。

结果如图6显示：相较于CD19 CAR-γδT或CD22 CAR-γδT，表达G22BE的CAR-γδT细胞与双阳性(Raji-luc)或单阳性细胞(K562-CD19-luc、K562-CD22-luc)共培养后，都可见明显较强荧光信号，说明表达G22BE CAR-γδT能杀伤表达任意CD19或CD22的肿瘤细胞，表现出更广谱的杀伤活性。而CD19 CAR-γδT或CD22 CAR-γδT仅杀伤单一阳性的肿瘤细胞。同时，G22BE的CAR-γδT细胞却不明显杀伤K562细胞，说明表达G22BE的CAR-γδT细胞的杀伤具有较好特异性。

表3

细胞名称	CD19	CD22
			K562	阴性(-)	阴性(-)
K562-CD19	阳性(+)	阴性(-)
			K562-CD22	阴性(-)	阳性(+)
Raji	阳性(+)	阳性(+)

综上所述，CD19和CD22双特异性CAR-γδT细胞能同时结合CD19和CD22两个抗原靶点，并能有效杀伤任一抗原阳性的肿瘤细胞，具有比单一靶点的CAR-γδT更广谱的杀伤活性，能有效降低肿瘤复发的几率，也能应用于单一靶点CAR-T治疗后的肿瘤复发的患者。基于γδT细胞制备的双特异性通用型CAR-γδT，以非MHC限制性的方式识别抗原，异体回输几乎不会引起GVHD，可作为天然的“off the shelf(现货)”细胞。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州百暨基因科技有限公司

<120> 靶向CD22和CD19的双特异性嵌合抗原受体及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 236

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

130 135 140

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser

145 150 155 160

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu

165 170 175

Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

195 200 205

Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro

210 215 220

Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 2

<211> 245

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 3

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 5

<211> 45

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 5

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 6

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 7

<211> 42

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 7

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 8

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 9

<211> 21

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 9

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

Claims

1.双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，具有A)抗原识别结构域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区；

所述抗原识别结构域从N端到C端依次包括CD22 scFv-CD19 scFv；

2.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区为CD8α的hinge区；优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

3.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜域选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C中的一种；优选所述跨膜域为CD8α跨膜区；优选其氨基酸序列如SEQID NO:6所示。

4.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、PKCθ、FcεRIγ、ZAP70和CD3ζ中的任一种，或其任意组合，优选为4-1BB以及CD3ζ；更优选所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

5.根据权利要求1～4任一项所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原识别结构域的N端还连接有信号肽；优选所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

6.分离的核酸，其特征在于，表达得到权利要求1～5任一项所述的双特异性嵌合抗原受体。

7.含有权利要求6所述核酸的载体。

8.宿主细胞，其特征在于，含有权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的载体，或细胞膜表面表达有权利要求1～5任一项所述的双特异性嵌合抗原受体。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、γδT细胞中的任一种。

10.药用组合物，其特征在于，包含权利要求8或9所述的宿主细胞。

11.权利要求8或9所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗白血病的药物中的应用。