CN113286607A - 用于用抗cd19/cd22免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了包含CD19/CD22或CD22/CD19抗原结合结构域的嵌合抗原受体。还公开了涉及嵌合抗原受体的核酸、重组表达载体、宿主细胞、抗原结合片段和药物组合物。还公开了在对象中治疗或预防癌症的方法、以及制备嵌合抗原受体T细胞的方法。

Description

用于用抗CD19/CD22免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.Section 119(e)要求于2018年9月26日提交的美国临时专利申请No.62/736,955的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交并且在此通过引用整体并入的序列表。创建于2019年9月25日的所述ASCII拷贝被命名为Sequence_Listing.txt并且大小为197千字节。
技术领域
本申请涉及癌症领域，特别地涉及通过CD19/CD22抗原靶向结构域来同时靶向B细胞抗原CD19和CD22的CAR以及包含这样的CD19/CD22抗原靶向结构域的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)及其使用方法。
背景技术
癌症是对人健康最致命的威胁之一。仅在美国，癌症每年影响接近130万例新患者，并且其是继心血管疾病之后第二位的主要死亡原因，引起大约四分之一的死亡。实体瘤是大多数这些死亡的原因。尽管在某些癌症的医学治疗方面已取得显著进展，但是在过去的20年中所有癌症的总体5年存活率仅提高约10％。癌症或恶性肿瘤转移并且以不受控制的方式迅速生长，使得治疗极其困难。
CD19是85至95kDa跨膜细胞表面糖蛋白受体。CD19是蛋白质的免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，并且包含两个胞外Ig样结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(TedderTF，Isaacs，CM，1989，J Immunol 143：712-171)。CD19修饰B细胞受体信号传导，降低B细胞受体对抗原的触发阈值(Carter，RH，and Fearon，DT，1992，Science，256：105-107)，并与CD81和CD21协调以调节这种必需的B细胞信号传导复合物(Bradbury，LE，Kansas GS，LevyS，Evans RL，Tedder TF，1992，J Immunol，149：2841-50)。在B细胞个体发育期间，CD19能够独立于抗原受体在祖B细胞(pro-B)、前-前-B细胞(pre-pre-B cell)、前-B细胞(pre-B)、早期B细胞(early B cell)阶段发出信号，并且与Src家族蛋白酪氨酸激酶相关，是酪氨酸磷酸化的，诱导胞内钙动员和肌醇磷脂信号传导二者(Uckun FM，Burkhardt AL，Jarvis L，Jun X，Stealy B，Dibirdik I，Myers DE，Tuel-Ahlgren L，Bolen JB，1983，J Biol Chem268：21172-84)。与B细胞恶性肿瘤的治疗相关的关键点是：CD19在正常B细胞上以严格受调节的方式表达，受限于处于IgH基因重排阶段的早期B细胞前体、成熟B细胞，但在造血干细胞或成熟浆细胞上不表达(Anderson，KC，Bates，MP，Slaughenhout BL，Pinkus GS，Schlossman SF，Nadler LM，1984，Blood 63：1424-1433)。
CD22，也称为SIGLEC-2(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素2)，是95kDa跨膜表面糖蛋白，并且包含6个Ig样C2型结构域和1个Ig样V型结构域(uniprot.org/uniprot/P20273#structure，于2017年7月12日访问)。在B细胞个体发育期间，CD22从前B细胞阶段开始在B细胞表面表达，在成熟B细胞上持续，并且在浆细胞上丢失(Nitschke L，2009，ImmunologicalReviews，230：128-143)。CD22包含胞内ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)结构域，其在针对抗原的B细胞受体的接合之后用于下调细胞活化。CD22的抗体结合诱导与SHP-1和胞内磷酸酶的共定位，胞内磷酸酶也用于下调基于磷酸化的信号转导(Lumb S，FleishcerSJ，Wiedemann A，Daridon C，Maloney A，Shock A，Dorner T，2016，Journal of CellCommunication and Signaling，10：143-151)。与B细胞恶性肿瘤的治疗相关的关键点是：CD22在正常B细胞上以严格受调节的方式表达，但在造血干细胞或成熟浆细胞上不表达，这使得CD22成为B细胞白血病的合适靶抗原。CD22在成人和儿童(前B-ALL)B细胞恶性肿瘤二者上的表达已导致利用该靶标进行基于抗体和基于嵌合抗原受体(CAR)-T细胞二者的治疗(Haso W，Lee DW，Shah NN，Stetler-Stevenson M，Yuan CM，Pastan IH，Dimitrov DS，Morgan RA，FitzGerlad DJ，Barrett DM，Wayne AS，Mackall CL，Orentas RJ，2013，Blood，121：1165-1174)(Wayne AS，Kreitman RJ，Findley HW，Lew G，Delbrook C，Steinberg SM，Stetler-Stevenson M，FitzGerald DJ，Pastan I，2010，Clinical Cancer Research，16：1894-1903)。
已开发出许多新的治疗B细胞白血病和淋巴瘤的方法，包括与细菌毒素或化学治疗剂连接的抗CD22抗体(Wayne AS，FitzGerald DJ，Kreitman RJ，Pastan I，2014，Immunotoxins for leukemia，Blood，123：2470-2477)。奥英妥珠单抗(InotuzumabOzogamicin)(CMC-544，鼠单克隆抗体的一种人源化形式G5/44)是一种抗体药物缀合物，并且其作为单一药剂或与化学治疗组合给予，目前正在临床试验中被评价(NCT01664910，主办者：M.D.Anderson Cancer Center)(DiJoseph JF，et al.，2004，Blood，103：1807-1814)。作为单一药剂，结局胜过在标准治疗情况下所观察到的结局，但是注意到了显著的肝毒性(Kantarjian H，et al.，2016，Inotuzumb ozogamicin versus standard therapyfor acute lymphoblastic leukemia，New England Journal of Medicine，375：740-753)。未经修饰的CD22治疗性抗体依帕珠单抗(Epratuzumab)也正在与化学治疗组合进行测试(NCT01219816，主办者：Nantes University Hospital)。依帕珠单抗是一种嵌合蛋白，其由接枝到人抗体框架上的鼠CDR构成。尽管在一些白血病中有效，但Mosetumomabpasudotox由于与该抗体融合的细菌毒素的免疫原性以及与其他药剂的活性水平适度或相当的这两个问题而并不在广泛的临床开发中(参见NCT01829711，主办者：MedImmune，LLC)。迄今为止，CAR构建体中使用的许多CD22结合部分都利用了来自于这些鼠抗体的结构域，并且不能有效地活化靶向该CD22结构域的T细胞(例如用作Moxetumomab pasudotox基础的HA22抗CD22结合剂，参见James SE，Greenberg PD，Jensen MC，Lin Y，Wang J，Till BG，Raubitschek AA，Forman SJ，Press OW，2008，Jounral of Immunology 180：7028-7038)。在国家卫生研究院(NIH)，目前正在对一种作为抗CD22 CAR有效的抗CD22结合剂进行临床试验，但结果尚未公布(临床试验政府标识符：NCT02315612，Anti-CD22 ChimericReceptor T Cells in Pediatric and Young Adults with Recurrent or RefractoryCD22-expressing B Cell Malignancies，主办者：NCI)。该结合剂基于在本申请发明人之一Dimiter Dimitrov博士的实验室中开发的m971完全人抗体(Xiao X，Ho M，Zhu Z，PastanI，Dimitrov D，2009，Identification and characterization of fully human anti-CD22 monoclonal antibodies，MABS，1：297-303)。在由本申请的另一位发明人RimasOrentas博士监管的工作中，证明了m971结构域作为CAR是有效的(Haso W，et al.，2013，Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B-cell precursor acutelymphoblastic leukemia，Blood，121：1165-1174)。
B谱系白血病和淋巴瘤的传统治疗方法可包括化学治疗、放射治疗和干细胞移植(参见万维网mayclinic.org)。与这些治疗相关的高毒性以及并发症(例如复发、继发性恶性肿瘤或GVHD)的风险促使寻求更好的治疗选择。CD19在成人和儿童(前B-ALL)B细胞恶性肿瘤二者上的表达已导致利用该靶标进行基于抗体和基于嵌合抗原受体(CAR)-T细胞二者的治疗(Kochenderfer JN，Wilson WH，Janik JE，Dudley ME，Stetler-Stevenson M，Feldman SA，Marie I，Raffeld M，Nathan DA，Lanier BJ，Morgan RA，Rosenberg SA，2010，Blood 116：4099-102；Lee DW，Kochenderfer JN，Stetler-Stevenson M，Cui YK，DelbrookC，Feldman SA，Orentas R，Sabatino M，Shah NN，Steinberg SM，Stroncek D，TscherniaN，Yuan C，Zhang H，Zhang L，Rosenberg SA，Wayne AS，Mackall CL，2015，Lancet 385：517-28)。此外，淋巴瘤(DLBCL，FL)和白血病(CLL)上CD22抗原的存在使它成为有效肿瘤清除和预防肿瘤抗原逃逸的有吸引力的另外的靶标。
B谱系白血病的当前护理标准可由通过高剂量化学治疗或辐射进行的缓解诱导治疗随后是巩固组成，并且可以以干细胞移植和根据需要进行的另外的化学治疗过程为特征(参见万维网cancer.gov)。与这些治疗相关的高毒性以及并发症(例如复发、继发性恶性肿瘤或GVHD)的风险促使寻求更好的治疗选择。CD19在成人和儿童(前B-ALL)B细胞恶性肿瘤二者上的表达已导致利用该靶标进行基于抗体和基于嵌合抗原受体(CAR)-T细胞二者的治疗(Kochenderfer JN，Wilson WH，Janik JE，Dudley ME，Stetler-Stevenson M，FeldmanSA，Maric I，Raffeld M，Nathan DA，Lanier BJ，Morgan RA，Rosenberg SA，2010，Blood116：4099-102；Lee DW，Kochenderfer JN，Stetler-Stevenson M，Cui YK，Delbrook C，Feldman SA，Orentas R，Sabatino M，Shah NN，Steinberg SM，Stroncek D，Tschemia N，Yuan C，Zhang H，Zhang L，Rosenberg SA，Wayne AS，Mackall CL，2015，Lancet 385：517-28)。
已开发出许多治疗B细胞白血病和淋巴瘤的新方法，包括将抗CD19或抗CD22结合基序与T细胞结合基序连接的双特异性抗体(即旨在用于治疗费城染色体阴性复发性或难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的博纳吐单抗(Blinatumomab)，
Figure BPA0000304990170000041
)。迄今为止，CAR构建体中所使用的许多CD19或CD22的结合部分都利用了来自于鼠抗体的结构域。目前正在考虑批准这些产品中的许多，包括由Novartis和Kite Pharmaceuticals开发的那些。在2017年4月，Novartis宣布CTL019(tisagenlecleucel)获得了FDA突破性认定，用于治疗患有难治性或复发性(r/r)DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma))的两次或更多次既往治疗失败的成人患者，将该认定添加至针对r/r B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)的认定。这些适应证分别基于II期JULIET研究(NCT02445248)和ELIANA研究(NCT02435849)。JULIET试验示出总响应率(overall response rate，ORR)为45％，其中在三个月时具有37％完全响应(complete response，CR)和8％部分响应(partial response，PR)。在ELIANA研究中，输注该产品的患者中82％达到CR或计数恢复不完全的CR，并且在6个月时无复发存活率为60％。来自Kite Pharmaceuticals的CAR-T产品(KTE-C19，axicabtagene ciloleucel)针对弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBLC)、转化滤泡性淋巴瘤(transformed follicular lymphoma，TFL)和原发性纵隔B细胞淋巴瘤(primary mediastinal B-cell lymphoma，PMBCL)被授予突破性认定。在KTE-C19在r/r ALL中的Kite ZUMA-3 II期试验中，报告了73％的CR(在2个月或更长时间时)。无论是否利用了CAR-T治疗的抗体，仍有显著数量的患者无法通过这些治疗获得帮助，并且有可观的空间用于改善治疗方法。
嵌合抗原受体(CAR)是包含以下三个基本单元的杂合分子：(1)胞外抗原结合基序、(2)连接/跨膜基序，以及(3)胞内T细胞信号传导基序(Long AH，Haso WM，OrentasRJ.Lessons learned from a highly-active CD22-specific chimeric antigenreceptor.Oncoimmunology.2013；2(4)：e23621)。CAR的抗原结合基序通常仿照单链可变片段(single chain Fragment variable，ScFv)，其是免疫球蛋白(Ig)分子的最小结合结构域。还已改造了替选的抗原结合基序，例如受体配体(即，已将IL-13改造成结合肿瘤表达的IL-13受体)、完整免疫受体、文库来源肽和先天免疫系统效应分子(例如NKG2D)。用于CAR表达的替选细胞靶标(例如NK或γ-δT细胞)也在开发之中(Brown CE et al Clin CancerRes.2012；18(8)：2199-209；Lehner M et al.PLoS One.2012；7(2)：e31210)。关于限定最活跃的T细胞群以用CAR载体进行转导、确定最佳的培养和扩增技术，以及限定CAR蛋白结构本身的分子细节，仍然是需要完成的重要的工作。
CAR的连接基序可以是相对稳定的结构域(例如IgG的恒定结构域)或被设计成是延伸的柔性接头。结构基序(例如来自于IgG恒定结构域的那些)可用于将ScFv结合结构域延伸远离T细胞质膜表面。这对于一些其中结合结构域与肿瘤细胞表面膜特别接近的肿瘤靶标而言可以是重要的(例如对于二唾液酸神经节苷脂GD2而言；Orentas et al.，未发表的观察结果)。迄今为止，用于CAR的信号传导基序通常包含CD3-ζ链，因为该核心基序是T细胞活化的关键信号。报道的首个二代CAR以CD28信号传导结构域和CD28跨膜序列为特征。该基序还用于包含CD137(4-1BB)信号传导基序的三代CAR(Zhao Y et al J Immunol.2009；183(9)：5563-74)。随着新技术：用与抗CD3和抗CD28抗体连接的珠活化T细胞的出现，来自CD28的典型“信号2”的存在不再需要由CAR自身编码。通过使用珠激活，发现在体外测定中三代载体并不优于二代载体，并且在白血病的小鼠模型中三代载体相对于二代载体并未提供明显的益处(Haso W，Lee DW，Shah NN，Stetler-Stevenson M，Yuan CM，Pastan IH，Dimitrov DS，Morgan RA，FitzGerald DJ，Barrett DM，Wayne AS，Mackall CL，OrentasRJ.Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B cell precursor acutelymphoblastic leukemia，Blood.2013；121(7)：1165-74；Kochenderfer JN etal.Blood.2012；119(12)：2709-20)。这通过以二代CD28/CD3-ζ(Lee DW et al.AmericanSociety of Hematology Annual Meeting.New Orleans，LA；December 7-10，2013)和CD137/CD3-ζ信号传导格式(Porter DL et al.N Engl J Med.2011；365(8)：725-33)的CD19特异性CAR的临床成功被证明。除CD137之外，其他肿瘤坏死因子受体超家族成员(例如OX40)也能够在CAR转导的T细胞中提供重要的持续信号(Yvon E et al.Clin CancerRes.2009；15(18)：5852-60)。同样重要的是培养CAR T细胞群的培养条件，例如细胞因子IL-2、IL-7和/或IL-15的包含(KaiserAD et al.Cancer Gene Ther.2015；22(2)：72-78)。
用于癌症的CAR治疗的更广泛且有效的适应中的目前的挑战与有力靶标的缺乏相关。建立细胞表面抗原的结合剂现今是可容易实现的，但是发现对肿瘤具有特异性同时不伤害正常组织的细胞表面抗原仍然是艰巨的挑战。赋予表达CAR的T细胞以更大靶细胞特异性的一种潜在方式是使用组合的CAR方法。在一种系统中，将CD3-ζ和CD28信号单元分离于在同一细胞内表达的两种不同CAR构建体中；在另一种系统中，在同一T细胞中表达两种CAR，但是一种具有较低的亲和力并且因此需要可替选的CAR首先进行接合以使另一者具有完全活性(Lanitis E et al.Cancer Immunol Res.2013；1(1)：43-53；Kloss CC etal.Nat Biotechnol.2013；31(1)：71-5)。产生基于单scFv的CAR作为免疫治疗剂的另一挑战是肿瘤细胞异质性。至少一个团队已经开发了用于胶质母细胞瘤的CAR策略，其中效应细胞群同时靶向多种抗原(HER2、IL-13Ra、EphA2)，希望避免靶抗原阴性群体的生长(Hegde Met al.Mol Ther.2013；21(11)：2087-101)。
基于T细胞的免疫治疗已经成为合成生物学中的新前沿；预见多种启动子和基因产物将这些高度有效的细胞引导到肿瘤微环境，在此T细胞可避开负调节信号并且可介导有效的肿瘤杀伤。通过用基于化学的二聚化剂(例如AP1903)进行诱导型胱天蛋白酶9构建体的药物诱导二聚化来消除不期望的T细胞表明其中可在药理学上开启可控制T细胞群的强大开关的一种方式(Di Stasi A et al.N Engl J Med.2011；365(18)：1673-83)。通过诱饵受体的表达而对转化生长因子β的负调节效应具有免疫的效应T细胞群的产生进一步表明针对最佳抗肿瘤活性可对效应T细胞进行改造的程度(Foster AE et al.JImmunother.2008；31(5)：500-5)。因此，虽然显示CAR可以以类似于内源性T细胞受体的方式触发T细胞活化，但是该技术的临床应用的主要障碍迄今为止受限于CAR+T细胞的体内扩增、输注之后细胞的迅速消失和令人失望的临床活性。这可部分归因于所采用的一些CAR序列的鼠源。
使用博纳吐单抗(双特异性抗CD19和抗CD3抗体)已对于接受该治疗的重症患者显示出令人印象深刻的结果。然而，持久缓解率小于40％，并且造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplant，HSCT)最多仅能挽救50％的响应者(参见Gore etal.，2014，NCT01471782和Von Stackelberg，et al.，2014，NCT01471782，总结于Benjamin，JE，Stein AS，2016，Therapeutic Advances in Hematology 7：142-156)。已接受双特异性抗体或CAR-T治疗的患者随后进行HSCT以维持持久应答的要求仍是积极争论的领域。尽管报道了CD19 CAR-T试验的高度响应，一些甚至大于90％，但如果将试验重塑为“意图治疗”试验，则该数字可更接近70％(Davis KL，Mackall CL，2016，Blood Advances 1：265-268)。在宾夕法尼亚大学，报道的CAR19治疗之后12个月的最佳结果显示，能够接受T细胞产品的患者中RFS为55％且OS为79％(Maude SL，Teachey DT，Rheingold SR，Shaw PA，Aplenc R，Barrett DM，Barker CS，Callahan C，Frey NV，Farzana N，Lacey SF，Zheng A，Levine B，Melenhorst JJ，Motley L，Prter DL，June CH，Grupp SA，2016，J Clin Oncol 34，no15_suppl(May 2016)3011-3011)。
因此，在本领域中迫切且长期地需要发现用于使用可表现出特异性且有效抗肿瘤作用而没有前述缺点的方法来治疗B-ALL和其他表达CD19和/或CD22的B细胞恶性肿瘤的新的组合物和方法。
本发明通过提供可用于治疗癌症和其他疾病和/或病症的CAR组合物和治疗方法而解决了这些需求。特别地，如本文中所公开和描述的本发明提供了这样的CAR：其可用于治疗与CD19和/或CD22表达失调相关的疾病、障碍或病症，并且所述CAR包含在转导T细胞上表现出高表面表达的串联CD19/CD22抗原结合结构域，表现出表达CD19的细胞的高度细胞溶解，并且其中转导的T细胞表现出体内扩增和持续性。
发明内容
本文中提供了新的串联CD19和CD22靶向抗体或其抗原结合结构域，其中在氨基酸序列中CD19靶向部分位于CD22靶向部分之前或之后(下文中称为CD19/CD22)；和包含这样的CD19和/或CD22抗原结合结构域的嵌合抗原受体(串联CAR)；以及表达所述受体的宿主细胞(例如，T细胞)和编码所述受体的核酸分子。CAR在转导的T细胞上表现出高表面表达，具有高度的细胞溶解，并且在体内具有转导的T细胞扩增和持续性。还提供了使用所公开的CAR、宿主细胞和核酸分子的方法，例如以在对象中治疗癌症。
在一个方面中，提供了编码串联CD19/CD22嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，所述串联CD19/CD22嵌合抗原受体(CAR)从N端到C端包含至少一个CD19/CD22抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，其中串联CD19/CD22 CAR包含选自SEQ ID NO：1、3、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和82的核酸序列。
在一个方面中，提供了编码串联CD19/CD22嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，所述串联CD19/CD22嵌合抗原受体(CAR)从N端到C端包含至少一个CD19/CD22抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，其中由选自SEQ ID NO.1、3、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和82的核酸序列编码的串联CD19/CD22CAR编码包含选自SEQ ID NO.2、4、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83的氨基酸序列的串联CD19/CD22 CAR。
在一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD19/CD22抗原结合结构域包含与CD19/CD20结合的抗体的至少一个单链可变片段。
在另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD19/CD22抗原结合结构域包含与CD19/CD22结合的抗体的至少一个重链可变区。
在另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中所编码的CAR胞外CD19/CD22抗原结合结构域还包含至少一个与CD19/CD22结合的基于脂质运载蛋白(lipocalin)的抗原结合抗原(抗运载蛋白(anticalin))。
在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的胞外CD19/CD22抗原结合结构域通过接头结构域与跨膜结构域连接。
在另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中在所编码的CD19/CD22胞外抗原结合结构域之前是编码前导肽或信号肽的序列。
在另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，所述CAR包含至少一个由包含CD19/CD22核苷酸序列的核苷酸序列编码的CD19/CD22抗原结合结构域，所述CD19/CD22核苷酸序列分别包含在SEQ ID NO.1、3、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和82内，并且其中所述CAR另外编码靶向包括但不限于以下的抗原的胞外抗原结合结构域：CD22、ROR1、间皮素、CD33、CD38、CD123(IL3RA)、CD138、BCMA(CD269)、GPC2、GPC3、FGFR4、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、TSLPR、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR，或其任意组合。
在一个实施方案中，CAR构建体由通过2A核糖体跳跃元件在同一细胞中共表达的两条CAR链构成：一条CAR链包含针对CD19抗原的靶向结构域，并且另一条CAR链包含针对CD22抗原的CAR靶向结构域。在框内与靶向结构域融合，每条链都包含铰链/接头/间隔区结构域、跨膜结构域和CD3z激活结构域。在每条CAR链中可框内包含零个、一个或更多个共刺激结构域。
在一个实施方案中，CAR链包含顺序连接的两个共刺激结构域(三代CAR)。
在某些实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中另外编码的胞外抗原结合结构域包含抗CD22 ScFv抗原结合结构域、抗ROR1ScFv抗原结合结构域、抗间皮素ScFv抗原结合结构域、抗CD33 ScFv抗原结合结构域、抗CD38 ScFv抗原结合结构域、抗CD123(IL3RA)ScFv抗原结合结构域、抗CD138 ScFv抗原结合结构域、抗BCMA(CD269)ScFv抗原结合结构域、抗GPC2 ScFv抗原结合结构域、抗GPC3 ScFv抗原结合结构域、抗FGFR4 ScFv抗原结合结构域、抗TSLPR ScFv抗原结合结构域、抗c-Met ScFv抗原结合结构域、抗PMSA ScFv抗原结合结构域、抗糖脂F77 ScFv抗原结合结构域、抗EGFRvIII ScFv抗原结合结构域、抗GD-2 ScFv抗原结合结构域、抗NY-ESO-1 TCR ScFv抗原结合结构域、抗MAGE A3 TCR ScFv抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
在一个方面中，本文中提供的CAR还包含接头或间隔区结构域。
在一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中胞外CD19/CD22抗原结合结构域、胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与跨膜结构域连接。
在一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中所编码的接头结构域来自于CD8或CD28的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
在另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中所编码的CAR还包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD83、CD86、CD134、CD137和CD154，或其组合。
在另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中所编码的胞内信号传导结构域还包含CD3ζ胞内结构域。
在一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中所编码的胞内信号传导结构域相对于CD3ζ细胞内结构域布置在C端侧。
在另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、初级信号传导结构域，或其组合。
在另一些实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个共刺激结构域包含以下的功能性信号传导结构域：OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)，或其组合。
在一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，所述CAR还包含前导序列或信号肽，其中前导或信号肽核苷酸序列包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中所编码的前导序列包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
在一个方面中，本文中提供了嵌合抗原受体(CAR)，其从N端到C端包含至少一个CD19/CD22抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域。
在一个实施方案中，提供了CAR，其中胞外CD19/CD22抗原结合结构域包含与抗原结合的抗体的至少一个单链可变片段、或与抗原结合的抗体的至少一个重链可变区，或其组合。
在另一个实施方案中，提供了CAR，其中至少一个跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TNFRSF19，或其组合。
在一些实施方案中，提供了CAR，其中CAR另外编码包含以下的胞外抗原结合结构域：CD22、ROR1、间皮素、CD33、CD38、CD123(IL3RA)、CD138、BCMA(CD269)、GPC2、GPC3、FGFR4、TSLPR、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、TSLPR、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
在一个实施方案中，提供了CAR，其中胞外抗原结合结构域包含抗CD22 ScFv抗原结合结构域、抗ROR1 ScFv抗原结合结构域、抗间皮素ScFv抗原结合结构域、抗CD33 ScFv抗原结合结构域、抗CD38 ScFv抗原结合结构域、抗CD123(IL3RA)ScFv抗原结合结构域、抗CD138 ScFv抗原结合结构域、抗BCMA(CD269)ScFv抗原结合结构域、抗GPC2 ScFv抗原结合结构域、抗GPC3 ScFv抗原结合结构域、抗FGFR4 ScFv抗原结合结构域、抗TSLPR ScFv抗原结合结构域、抗c-Met ScFv抗原结合结构域、抗PMSA ScFv抗原结合结构域、抗糖脂F77ScFv抗原结合结构域、抗EGFRvIII ScFv抗原结合结构域、抗GD-2 ScFv抗原结合结构域、抗NY-ESO-1 TCR ScFv抗原结合结构域、抗MAGE A3 TCR ScFv抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了CAR，其中至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域和初级信号传导结构域。
在另一个实施方案中，提供了CAR，其中至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)，或其组合。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：1的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CAR。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：3的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：60的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：62的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：64的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：66的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：68的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：70的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：72的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：74的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：76的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：78的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：80的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：82的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列编码包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的CAR。
在一个方面中，本文中所公开的CAR被修饰以表达或包含可检测标记以用于诊断、监测和/或预测治疗结局(例如癌症患者的无进展存活)或用于监测这样的治疗的进展。
在一个实施方案中，编码所公开CAR的核酸分子可包含在载体，例如病毒载体中。载体是DNA载体、RNA载体、质粒载体、黏粒载体、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体，或其组合。
在某些实施方案中，载体还包含启动子，其中所述启动子是诱导型启动子、组织特异性启动子、组成型启动子、自杀型启动子(suicide promoter)，或其任意组合。
在另一个实施方案中，表达CAR的载体还可被修饰以包含一个或更多个控制CAR T细胞表达或借助自杀开关来消除CAR-T细胞的操纵元件。自杀开关可包括例如凋亡诱导性信号传导级联反应或诱导细胞死亡的药物。在一个优选实施方案中，表达CAR的载体还可被修饰以表达酶，例如胸苷激酶(thymidine kinase，TK)或胞嘧啶脱氨酶(cytosinedeaminase，CD)。
在另一方面中，还提供了包含编码CAR的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是T细胞，例如从对象获得的原代T细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是CD8+T细胞。
在另一方面中，提供了包含抗肿瘤有效量的人T细胞群的药物组合物，其中所述T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，所述嵌合抗原受体(CAR)包含SEQ ID NO.2、4、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83的氨基酸序列，其中所述CAR包含至少一个包含CD19/CD22抗原结合结构域的胞外抗原结合结构域、至少一个接头结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，其中所述T细胞是患有癌症的人的T细胞。所述癌症尤其包括血液学癌症(hematological cancer)，例如白血病(例如，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)或慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML))、淋巴瘤(例如，套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)或霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma))、或多发性骨髓瘤，或其组合。
在一个实施方案中，提供了药物组合物，其中CAR的至少一个跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、间皮素、CD33、CD37、CD64、CD80、CD83、CD86、CD134、CD137、CD154、TNFRSF19，或其组合。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其中人癌症包括成人上皮癌(adultcarcinoma)，其包括：口腔和咽癌(舌、口、咽、头和颈)、消化系统癌症(食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、肝内胆管、胆囊、胰腺)、呼吸系统癌症(喉、肺和支气管)、骨和关节癌、软组织癌、皮肤癌(黑素瘤、基底和鳞状细胞癌)、儿童肿瘤(神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma))、中枢神经系统的肿瘤(脑、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤)，以及乳腺、生殖系统(子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸、阴茎、子宫内膜)、泌尿系统(膀胱、肾和肾盂、输尿管)、眼和眶、内分泌系统(甲状腺)以及脑和其他神经系统的癌症，或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了包含抗肿瘤有效量的患有癌症之人的人T细胞群的药物组合物，其中所述癌症是对一种或更多种化学治疗剂不具有响应性的难治性癌症。所述癌症包括造血性癌症(hematopoietic cancer)、骨髓增生异常综合征、胰腺癌、头颈癌、皮肤肿瘤、以下中的微小残留病(minimal residual disease，MRD)：急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)；成人B细胞恶性肿瘤，包括CLL(慢性淋巴细胞白血病)、CML(慢性髓细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)；儿童B细胞恶性肿瘤(包括B谱系ALL(急性淋巴细胞白血病))；多发性骨髓瘤；肺癌；乳腺癌；卵巢癌；前列腺癌；结肠癌；黑素瘤或其他血液学癌症和实体瘤，或其任意组合。
另一方面中，提供了制备包含CAR的T细胞(下文中的“CAR-T细胞”)的方法。所述方法包括用编码特异性结合CD19和/或CD22的所公开CAR的载体或核酸分子转导T细胞，从而制备CAR-T细胞。
在另一方面中，提供了产生经RNA改造细胞群的方法，其包括将编码所公开CAR的核酸分子的体外转录RNA或合成RNA引入对象的细胞中，从而产生CAR细胞。
在一个实施方案中，与CD19表达相关的疾病、障碍或病症是癌症，其包括造血性癌症、骨髓增生异常综合征、胰腺癌、头颈癌、皮肤肿瘤、以下中的微小残留病(MRD)：急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；成人B细胞恶性肿瘤，包括CLL(慢性淋巴细胞白血病)、CML(慢性髓细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)；儿童B细胞恶性肿瘤(包括B谱系ALL(急性淋巴细胞白血病))；多发性骨髓瘤；肺癌；乳腺癌；卵巢癌；前列腺癌；结肠癌；黑素瘤或其他血液学癌症和实体瘤，或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物中阻断由表达CD19和/或CD22的细胞介导的T细胞抑制并改变肿瘤微环境以抑制肿瘤生长的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的包含CAR的组合物，所述CAR包含选自SEQ ID NO.2、4、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述细胞选自表达CD19和/或CD22的肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞，及其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物中抑制、阻抑或防止抗肿瘤或抗癌免疫应答的免疫抑制的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的包含CAR的组合物，所述CAR选自SEQ ID NO.2、4、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83。在一个实施方案中，所述CAR抑制第一细胞与T细胞之间的相互作用，其中所述第一细胞选自CD19和/或CD22表达肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞，及其任意组合。
在另一方面中，提供了用于在哺乳动物中诱导抗肿瘤免疫的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的经编码所公开CAR的载体或核酸分子转导的T细胞。
在另一个实施方案中，提供了在哺乳动物中治疗或预防癌症的方法，其包括以在所述哺乳动物中有效治疗或预防癌症的量向所述哺乳动物施用一种或更多种所公开的CAR。所述方法包括在以下条件下向对象施用治疗有效量的表达特异性结合CD19和/或CD22和/或一种或更多种前述抗原的所公开CAR的宿主细胞，所述条件足以在所述对象中形成CAR上抗原结合结构域与CD19和/或CD22和/或一种或更多种前述抗原的胞外结构域的免疫复合物。
在另一个实施方案中，提供了用于治疗患有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述对象施用包含抗肿瘤有效量的T细胞群的药物组合物，其中所述T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含至少一个胞外CD19和/或CD22抗原结合结构域或其任意组合、至少一个接头或间隔区结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个胞内信号传导结构域，并且其中所述T细胞是患有癌症的对象的T细胞。
在另一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中治疗癌症的方法，其包括向所述对象施用包含抗肿瘤有效量的T细胞群的药物组合物，其中所述T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含SEQ ID NO.2、4、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83的氨基酸序列或其任意组合，其中所述T细胞是患有癌症的对象的T细胞。在前述方法的一些实施方案中，至少一个跨膜结构域包含以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD19、CD22、间皮素、CD33、CD37、CD64、CD80、CD83、CD86、CD134、CD137、CD154、TNFRSF16、TNFRSF19，或其组合。
在另一个实施方案中，提供了用于在被诊断患有癌症的人中产生持续性经遗传改造T细胞群的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向人施用被遗传改造成表达CAR的T细胞，其中所述CAR包含SEQ ID NO.2、4、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83的氨基酸序列或其任意组合、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，其中在施用之后，所述持续性经遗传改造T细胞群或所述T细胞的后代的群体在人中持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、2年或3年。
在一个实施方案中，人中的后代T细胞包含记忆T细胞。在另一个实施方案中，所述T细胞是自体T细胞。
在本文中所述的方法的所有方面和实施方案中，与肿瘤抗原表达升高相关的任一种前述癌症、疾病、障碍或病症都可使用本文中公开的一种或更多种CAR来治疗或预防或改善。
在另一方面中，提供了用于制备如上所述的嵌合抗原受体T细胞或用于如上所述在对象中预防、治疗或改善与肿瘤抗原表达升高相关的任一种癌症、疾病、障碍或病症的药盒(kit)，其包含容器和用于使用所述药盒的说明书，所述容器包含上文公开的任一种核酸分子、载体、宿主细胞或组合物，或其任意组合。
应理解，CAR、宿主细胞、核酸和方法在本文中详细描述的特定方面和实施方案之外也是可用的。本公开内容的前述特征和优点将通过以下详细描述变得更明显，该详细描述通过参照附图来进行。
附图说明
图1A和1B描绘了靶向CD22和CD19的串联CAR的结构。图1A：通过将靶向CD22抗原的单链可变片段序列(膜远端结构域)与靶向CD19抗原的单链可变片段序列(膜近端)通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头连接来产生抗CD22和抗CD19双重靶向CAR构建体(CAR22-19)。然后将所得CD22-CD19双重靶向结构域在框内连接至CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB(CD137)信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。图1B：以相似的方式产生串联靶向构建体CAR19-22，不同之处在于CD19的单链可变片段区(细胞膜的远端)通过甘氨酸丝氨酸柔性接头连接至CD22靶向序列的单链可变区(膜近端)，随后是CD8、4-1BB和CD3ζ结构域。每个CAR T构建体均能够通过与CD19或CD20肿瘤抗原或这二者结合而活化。
图2描绘了在人原代T细胞中串联CAR T构建体LTG 2681(CAR22-19)和LTG2791(CAR19-22)的表面表达。通过流式细胞术确定CAR T表达。如材料和方法中所述，T细胞在IL-2存在下用Miltenyi Biotec TransActTM CD3 CD28试剂活化并用LV转导。在培养第8天，使用三种染色方法之一测定活的经转导T细胞(7-AAD阴性)的CAR表面表达：CD19 Fc随后是抗Fc-AF647(上图)，或CD22-his试剂随后是抗-his-PE染色(下图)。转导中使用的LV列在每列的顶部。每个直方图上方都示出了相对于未经转导T细胞对照(UTD)的CAR T阳性群的百分比。示出了三个独立供体的代表性数据。
图3描绘了CAR T的体外细胞毒性。使用用萤光素酶稳定转导的Raji CD19+CD22+、REH CD19+CD22+或CD19-CD22-细胞系293T进行了基于萤光素酶的细胞毒性测定。CAR 22-19(LTG2681)与CAR 19-22(LTG2719)之间的比较，其区别仅在于抗原靶向结构域的顺序。包括比较性单靶向CAR19(pLTG1538)和CAR22(pLTG2200)以及阴性对照未经转导的T细胞。将CAR T细胞和靶肿瘤细胞在列出的效应物与靶标(E∶T)之比(x轴)下共孵育过夜。误差条代表来自三个技术重复的平均值。示出了一个实验，其代表来自三个供体的T细胞中的三个独立实验。
图4A和4B描绘了针对经转导以仅过度表达一种靶抗原的肿瘤系A431或293T的体外CAR T细胞毒性，以确认靶向CD22 CD19的CAR T细胞的每个结合剂结构域的特异性。使用用萤光素酶稳定转导的293T细胞、293T CD19+、293T CD20+或293T CD22+细胞系(图4A)或A431、A431 CD19+、A431 CD22+、A431 CD20+细胞系(图4B)进行基于萤光素酶的细胞毒性测定。数据点代表来自一项实验的一式三份测定的平均值，该实验代表用来自三个独立供体的CAR T细胞进行的三个独立实验。
图5.响应于白血病细胞系的CAR T细胞因子释放。使用ELISA测量了列于x轴的CAR-T在与Raji白血病系以10∶1的E∶T比共培养过夜之后的细胞因子产生。条表示三个重复样品的平均值+SD。数据代表用来自三个不同供体的CAR T细胞进行的三个独立实验。
图6描绘了具有不同共刺激结构域的多种抗CD22-19 CAR设计的示意图。示出了二代CAR(A)、三代CAR(B)、或将在同一细胞中共表达的一个靶向CD19抗原的二代CAR链与另一个靶向CD22抗原的一代CAR链(C)、或两个二代CAR链(D)组合的双顺反子CAR。缩写：识别CD19抗原的scFv CAR靶向结构域；a-CD22：识别CD22抗原的scFv CAR靶向结构域；H：铰链/接头结构域；TM：跨膜结构域：Co-stim：共刺激结构域；CD3z：CD3ζ来源的CAR激活结构域；2A：用于双顺反子CAR表达的核糖体跳跃元件。
图7描绘了通过流式细胞术检测的具有不同跨膜结构域和共刺激结构域的抗CD22-19 CAR的表达。对CAR T细胞同时进行CD19 scFv和CD22 scFv表达的染色。在每个流程图上方示出了构建体数量以及跨膜和共刺激结构域结构。数据代表了在来自不同健康供体的T细胞中进行的三个转导实验。
图8描绘了将Raji靶细胞与CAR T细胞以10、5和2.5的效应物与靶标(ET)比共孵育18小时之后，并入不同共刺激结构域的抗CD22-19 CAR的细胞溶解功能。y轴上示出了特异性靶标裂解的百分比，并且x轴上提供了CAR构建体名称。N＝3个技术重复±SEM。数据来自一项实验，其代表来自不同健康供体的T细胞中的三个实验。
图9A至9D描绘了具有不同共刺激结构域构造的每个抗CD22-19 CAR对Raji靶标的细胞因子应答。将效应物与靶细胞以10的E∶T比共培养18小时，并通过ELISA分析上清液的IL-2、TNFα和IFNγ。N＝3个技术重复±SEM。数据来自一项实验，其代表来自不同健康供体的T细胞中的三个实验。
具体实施方式
定义
除非上下文明确另外指出，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词是指一个/种或更多个/种。例如，术语“抗原”包括一种或更多种抗原，并且可被认为等同于短语“至少一种抗原”。本文中使用的术语“包含”意指“包括”。由此，“包含抗原”意指“包括抗原”而不排除另外的要素。短语“和/或”意指“和”或者“或”。还应理解，除非另外指出，否则针对核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有的分子重量或分子质量值都是近似的，并且是为了描述性目的而提供的。虽然可使用许多与本文中所述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但是具体的合适方法和材料在下文进行描述。在冲突的情况下，将以本说明书(包括术语的解释)为准。另外，材料、方法和实例仅是举例说明性的并且不旨在进行限制。为便于多种实施方案的综述，提供了以下术语解释：
术语“约”当指可测量值(例如量、持续时间等)时意指涵盖与特定值的.+-.20％、或在一些情况下.+-.10％、或在一些情况下.+-.5％、或在一些情况下.+-.1％、或在一些情况下.+-.0.1％的变化，因为这样的变化适合于进行所公开的方法。
除非另外指出，否则本文中的技术术语是根据常规用法使用的。分子生物学中常用术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes VII，Oxford University Press出版，1999；Kendrew et al.(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell ScienceLtd.出版，1994；和Robert A.Meyers(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology：aComprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995；以及其他类似参考文献。
本公开内容提供了CD19/CD22抗体或其片段以及具有这样的CD19/CD22抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。CAR的功能活性的增强与表达CAR的T细胞的功能活性的增强直接相关。作为这些修饰中一种或更多种的结果，CAR表现出高度的细胞因子诱导的细胞溶解和转导T细胞上的细胞表面表达二者，以及提高的体内T细胞扩增水平和转导CAR表达T细胞的持续性。本公开内容的CAR的优点在于一种CART慢病毒产品可用于治疗多种患者群体(即，CD19+、CD22+或双重CD19+CD22+癌症患者)，这在资源有限的情况下提供了灵活性。
将来自于不同蛋白质结构域的功能性部分组合的独特能力是嵌合抗原受体(CAR)的关键创新特征。这些蛋白质结构域中每一个的选择是关键设计特征，其特异性组合的方式也如此。每个设计结构域都是可在不同CAR平台之间使用以改造淋巴细胞的功能的必需组分。例如，胞外结合结构域的选择可使在其他情况下无效的CAR变得有效。
用于建立CAR的胞外抗原结合结构域的免疫球蛋白来源蛋白质序列的恒定框架组分可以是完全中性的或其可自缔合并驱使T细胞达到代谢衰竭的状态，由此使表达该CAR的治疗性T细胞的效果远远更低。这独立于该CAR结构域的抗原结合功能而发生。此外，胞内信号传导结构域的选择也可控制用于免疫治疗的治疗性淋巴细胞群的活性和持久性。尽管分别通过这些胞外和胞内结构域结合靶抗原的能力和向T细胞传递激活信号的能力是重要的CAR设计方面，但是还变得明显的是，胞外抗原结合片段来源的选择可对CAR的效力具有显著影响，并且从而对CAR的功能和临床效用具有限定作用。
本文中所公开的CAR在细胞中以高水平表达。表达CAR的细胞具有高体内增殖速率，产生大量细胞因子，并且针对表面上具有与CAR结合的CD19/CD22抗原的细胞具有高细胞毒活性。胞外CD19/CD22抗原结合结构域的使用导致产生在体内更好地起作用的CAR，同时避免在宿主免疫应答中诱导抗CAR免疫和杀伤CAR T细胞群。表达胞外CD19/CD22 ScFv抗原结合结构域的CAR表现出优异的活性/特性，包括i)防止如在小鼠来源结合序列的情况下所见的差的CAR T持久性和功能；ii)使CAR的区域性(即胸膜内)递送的缺乏有效；和iii)能够基于对CD19/CD22具有高亲和力和低亲和力的结合剂二者产生CAR T细胞设计。后一种特性允许研究者更好地调节CAR T产品的效力与毒性，和/或组织特异性，因为由于肿瘤上CD19/CD22的表达高于正常组织，与正常组织相比，较低亲和力的结合剂可对肿瘤具有更高的特异性，这可防止脱靶肿瘤毒性和旁观者细胞杀伤。
以下是对本发明CAR的详细描述，包括对其胞外CD19/CD22抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域的描述，以及对CAR、抗体及其抗原结合片段、缀合物、核苷酸、表达、载体以及宿主细胞、治疗方法、组合物和使用所公开CAR的药盒的另外的描述。
A.嵌合抗原受体(CAR)
本文中所公开的CAR包含至少一个能够与CD19/CD22结合的CD19/CD22抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内结构域。
嵌合抗原受体(CAR)是包含经由跨膜结构域与T细胞信号传导结构域连接的抗体之抗原结合结构域(例如单链可变片段(scFv))的人工构建杂合蛋白或多肽。CAR的特征包括其能够以非MHC限制性方式并且利用单克隆抗体的抗原结合特性将T细胞特异性和反应性朝向所选靶标重定向。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞以独立于抗原加工识别抗原的能力，由此绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。
如本文中所公开的，CAR的胞内T细胞信号传导结构域可包含例如T细胞受体信号传导结构域、T细胞共刺激信号传导结构域或这二者。T细胞受体信号传导结构域是指CAR中包含T细胞受体的胞内结构域的部分，例如但不限于CD3ζ蛋白的胞内部分。共刺激信号传导结构域是指CAR中包含共刺激分子的胞内结构域的部分，所述共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效响应所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。
1.胞外结构域
在一个实施方案中，CAR包含靶标特异性结合元件，其还被称为抗原结合结构域或部分。结构域的选择取决于限定靶细胞的表面的配体的类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域以识别充当靶细胞上与特定疾病状态相关的细胞表面标志物的配体。因此，可充当CAR中抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的一些实例包括与病毒性、细菌性和寄生物感染、自身免疫病和癌细胞相关的那些。
在一个实施方案中，可通过改造与肿瘤细胞上抗原特异性结合的期望抗原结合结构域来将CAR改造成靶向目的肿瘤抗原。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的引发免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答的蛋白质。抗原结合结构域的选择将取决于待治疗癌症的特定类型。肿瘤抗原包括例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(prostate-carcinoma tumor antigen-1，PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(insulin growth factor，IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和CD19/CD22。本文中所公开的肿瘤抗原仅仅通过示例的方式包括在内。该列表并不旨在是排他性的并且另一些实例对本领域技术人员而言将是明显的。
在一个实施方案中，肿瘤抗原包含一个或更多个与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达多种可作为用于免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，例如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP 100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。另一些靶分子属于转化相关分子组，例如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌-胚胎抗原，例如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成个体肿瘤特有的真正肿瘤特异性的免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原(例如CD19、CD22、CD22、BCMA、ROR1和CD37)是B细胞淋巴瘤中靶抗原的另一些候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD22、独特型)已经用作用单克隆抗体进行的被动免疫治疗的靶标，但成功有限。
在一个优选实施方案中，肿瘤抗原是CD19/CD22，并且与CD19/CD22表达相关的肿瘤包括表达高水平的胞外蛋白CD19/CD22的肺间皮瘤、卵巢癌和胰腺癌，或其任意组合。
肿瘤抗原的类型还可以是肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen，TSA)或肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)。TSA对肿瘤细胞而言是独特的并且不会出现在体内的其他细胞上。TAA对肿瘤细胞而言不是独特的并且作为替代还在不能诱导针对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可在使免疫系统能够对抗原作出响应的条件下发生。TAA可以是在胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原，此时免疫系统是未成熟的并且不能作出响应，或者TAA可以是在正常情况下以极低水平存在于正常细胞上但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA的一些非限制性实例包括以下：分化抗原，例如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2，以及肿瘤特异性多谱系抗原，例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚性抗原例如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，例如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原，例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，例如EB病毒(Epstein Barrvirus)抗原EBVA以及人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、C0-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在一个实施方案中，CAR的抗原结合结构域部分靶向包括但不限于以下的抗原：CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33、CD38、CD123、CD138、BCMA、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、FGFR4、TSLPR、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR等。
在一个优选实施方案中，CAR的抗原结合结构域部分靶向胞外CD19/CD22抗原。
在本文中所公开的CD19/CD22特异性CAR的多个实施方案中，一般性方案在图1A和1B中示出，并且从N端到C端包括信号或前导肽、抗CD19/CD22 ScFv(其中CD19结合剂在T细胞膜的远端而CD22结合剂在T细胞膜的近端，或者其中CD22结合剂在T细胞膜的远端而CD19结合剂在T细胞膜的近端)、CD8胞外接头、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ激活结构域。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：1的核酸序列(前导-CD22VH-(GGGGS)-3 CD22 VL(GGGGS)-5 CD19 VH(GGGGS)-3 CD19 VL CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(构建体2219))，并且编码包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(前导-CD22 VH-(GGGGS)-3CD22 VL(GGGGS)-5 CD19 VH(GGGGS)-3 CD19 VL CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(构建体2219)的CAR。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：1的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列[前导-CD22VH-(GGGGS)-3 CD22 VL(GGGGS)-5 CD19 VH(GGGGS)-3 CD19 VL CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(构建体2219)]的CAR。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：3的核酸序列(前导-CD19 VH(GGGGS)3-CD19 VL-(GGGGS)5 -CD22 VL-(GGGGS)3-CD22 VH CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(构建体1922)(图2))，并且编码包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列[前导-CD19 VH(GGGGS)3-CD19 VL-(GGGGS)5-CD22 VL-(GGGGS)3-CD22 VH CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(构建体1922)]的CAR。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：3的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列[前导-CD19 VH(GGAGGS)3-CD19 VL-(GGGGS)5-CD22 VL-(GGGGS)3-CD22 VH CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(构建体1922)]的CAR。
并入与CD19/CD22抗原反应的单链可变片段(ScFv)序列的抗CD19/CD22 CAR的表面表达在下文的实施例2中示出。使用两种检测方法之一，通过流式细胞术分析来自健康供体的经LV转导的T细胞来确定每种含ScFv的CAR的表达水平：i)CD22-his，随后是抗his-FL；ii)CD19 Fc重组蛋白，随后是抗Fc-FL。与未经转导的T细胞对照相比，在人原代T细胞中，基于ScFv的抗CD19/CD22 CAR构建体CAR22-19和CAR19-22高度表达。
如实施例2和图3中所示，表明了CD19/CD22 CAR的高细胞溶解活性。图3：将人原代T细胞用编码CAR构建体(CAR 22-19(LTG2681，D0023)、CAR 19-22(D0024)、CAR19(LTG1538)或CAR22(LTG2200)；参见方法)的LV转导，然后与用萤火虫萤光素酶稳定转导的Raji、REH、K562或293T细胞系一起孵育18小时，用于基于发光的体外杀伤测定。Raji和Reh白血病系在其表面上表达CD19和CD22，而阴性对照293T则不如此。Raji和REH细胞被串联CAR 22-19(LTG2681)、串联CAR 19-22(LTG2719)以及单靶向CAR19(LTG1538)和CAR22(LTG2200)有效裂解。这些结果表明了单CAR对照和串联CD19靶向CD22靶向CAR的靶抗原限制性杀伤。
作为另外的特异性对照，创建了表达CD19或CD20或CD22的293T-luc系和A431-luc系(图4A和4B)。293T-19+被CAR 19(LTG1538)和串联CAR 22-19(LTG 2681)裂解，但不被CAR22 LTG 2200或未转导的T细胞对照裂解(图3)。293T-CD22+被串联CAR 22-19(LTG2681)和单CAR20 LTG2200裂解，但不被单CAR19(LTG 1538)或未转导的对照裂解，表明了串联CAR的抗原特异性。最后，没有CAR构建体裂解293T luc CD20细胞，因为该抗原不被靶向(图4A)。类似地，A431-luc 19系被串联CAR LTG2681或单CAR19 LTG1538裂解，但不被CAR22LTG2200或UTD对照裂解。反之亦然，A431 luc CD22细胞被串联CAR 1TG2681或单CAR22LTG2200裂解，但不被CD19 CAR LTG1538或UTD对照裂解。值得注意的是，没有CAR构建体裂解表达无关抗原的A431-luc CD20系，因为CD20抗原不被靶向。(图4B)。该结果强调了串联CAR22-19的每个靶向结构域的独立功能和特异性(图4)。此外，该实验表明，即使两种抗原(CD19 CD22)之一被下调并且不再表达，串联CAR 22-19仍将有效针对肿瘤细胞。因此，与单CAR相比，串联CAR可减轻肿瘤抗原逃逸。
然后评价了抗CD19/CD22 CAR T细胞关于细胞因子分泌的能力(图5)。将CD19+CD22+Raji肿瘤细胞与串联22-19 CAR T细胞(LTG2681)或阳性对照CAR19(LTG1538)、阳性对照CAR22(LTG2200)或阴性对照未经转导的T细胞(UTD)以10∶1的效应物与靶标之比共孵育过夜，并通过ELISA分析培养物上清液中的IFNγ、TNFα和IL-2。串联CAR 22-19(LTG2681)响应于肿瘤细胞强诱导细胞因子，而阴性对照(未经转导的，UTD)则未产生明显的细胞因子诱导。值得注意的是，串联CAR T表达细胞LTG2681显示出与CAR22对照(LTG2200)相似的IFNγ、TNFα、IL-2水平，以及稍高于单CAR19(LTG1538)对照的细胞因子应答，表明了串联CAR的高效力。重要地，在不存在肿瘤细胞(仅CART的组)的情况下，CAR 22-19不产生细胞因子分泌，这进一步证实了CAR的特异性，并表明串联CAR缺乏紧张性信号传导(tonicsignaling)。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：60的核酸序列[CD22-19 CD8 BBz(构建体LTG2737)(分别为图6、7、8和9)]，并且编码包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列[CD22-19 CD8 BBz(构建体LTG2737)]的CAR。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID N0：60的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列(CD22-19 CD8 BBz(构建体LTG2737))的CAR。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：64的核酸序列[CD22-19 CD8 ICOSz DNA(构建体D0136)(分别为图6、7、8和9)]，并且编码包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列[CD22-19 CD8 ICOSz DNA(构建体D0136)]的CAR。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：64的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列(CD22-19 CD8 ICOSz DNA(构建体D0136))的CAR。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：70的核酸序列[CD22-19 CD28 CD28z(构建体D0139)(分别为图6、7、8和9)]，并且编码包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列[CD22-19 CD28 CD28z(构建体D0139)]的CAR。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：70的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列(CD22-19 CD28 CD28z(构建体D0139))的CAR。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：76的核酸序列[CD19CD8H&TM ICOS z_CD22 CD8H&TM 3z(构建体D0146)(分别为图6、7、8和9)]，并且编码包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列[CD19 CD8H&TM ICOS z_CD22 CD8H&TM 3z(构建体D0146)]的CAR。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：76的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列(CD19 CD8H&TM ICOS z_CD22 CD8H&TM 3z(构建体D0146))的CAR。
在另一个实施方案中，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO：62、66、68、72、74、78、80和82的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且编码包含SEQ ID NO：63、67、69、73、75、79、81和83所示的氨基酸序列或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的CAR。
并入与CD22/CD19抗原反应的单链可变片段(ScFv)序列的抗CD22/CD19 CAR的表面表达在下文的实施例3中示出。
在一个实施方案中，设计了包含不同共刺激结构域的双重靶向CAR构建体。下文的实施例3的表1中列出了CAR构建体。在图6A至D中提供了CAR设计构造的示意图。在一些实施方案中，包含抗CD22 ScFv和抗CD19 scFv序列的串联CAR抗原结合结构域按以下顺序以串联连接：抗CD22 scFv-抗CD19-scFv-铰链-跨膜结构域-胞内结构域(图6A、6B)。在所有情况下，靶向串联结构域构造均基于CAR 22-19(LTG2681)。抗CD 22-19 CAR构建体LTG2737与抗CD 22-19 CAR构建体LTG2681包含相同的CAR序列，但在其构建期间未使用土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus，WHP)转录后调控元件(WPRE)。
在另一个实施方案中，如下文实施例3所述，通过将CAR抗原结合结构域与CD8a铰链和跨膜结构域在框内连接产生数种CAR T构建体(构建体LTG2737、D0135、D0136、D0137、D0145、D0146、D0147、D0148和D0149)。在另一些构建体中，利用了与共刺激结构域匹配的跨膜结构域序列：CD28用于D139、D140，OX40用于D0137、D0147、D0148。将跨膜结构域与来自于4-1BB(LTG2737)、CD28(D0135、D0139、D0140)、ICOS(D0136、D0146、D0148、D0149)、OX40(D0137、D0145、D0147、D0148)或CD27(D0138、D0149)的共刺激结构域在框内连接。所有CAR分子均包含CD3ζ信号传导结构域(CD247，第52至163位aa，参考序列ID：NP_000725.1)。
在另一个实施方案中，CAR的胞内结构域包含以串联连接的两个共刺激结构域CD28和4-1BB(D0140，图6B)。在一些实施方案中，使用用于双顺反子表达的2A核糖体跳跃元件在同一T细胞中共表达两种不同的CAR分子(D146、D147、D148、D149，图6C、6D)。在该构造中，每个CAR链仅包含一个靶向CD19或CD22抗原的scFv，并且两条链通过用编码双顺反子序列的单个慢病毒载体进行转导而在每个转导的T细胞中共表达。
在另一些实施方案中，在至少一条CAR链上，未使用共刺激结构域，使得将CD3ζ激活结构域直接与在同一细胞中同时表达的CAR链中一条的跨膜结构域在框内连接(D0146、D0147，图6C)。将CAR构建体序列克隆到三代慢病毒质粒骨架中在人EF-1α启动子控制下(Lentigen Technology Inc.，Gaithersburg，MD)。
图7中示出了并入不同共刺激结构域的抗CD22-19 CAR的表面表达。每种含ScFv的CAR的表达水平使用对两个scFv CAR靶向结构域同时染色通过对来自健康供体的经LV转导T细胞进行流式细胞术分析来确定：i)CD22-his，随后是抗his-PE；ii)CD19 Fc重组蛋白，随后是抗Fc-A647。与未经转导的T细胞对照相比，在人原代T细胞中，所有抗CD22-19 CAR都高度表达。CAR表达水平在71％至90％的范围内(图7)。
如图9A至9D所示，表明了抗CD22-19 CAR的高细胞溶解活性：将人原代T细胞用编码CAR构建体(LTG2737、D0135、D0136、D0137、D0138、D0139、D0140、D0145、D0146)的LV转导，然后与用萤火虫萤光素酶稳定转导的Raji、293T、293TCD19或293TCD22细胞系一起孵育18小时，用于基于发光的体外杀伤测定。如每个图右侧的图例所示，使用的效应物与靶标(ET)之比为2.5∶1、5∶1或10∶1。Raji细胞在其表面上表达CD19和CD22，而阴性对照293T则不如此。产生293TCD19和293TCD22靶系以分别稳定表达CD19或CD22靶抗原，并用于评价具有不同共刺激结构域的双重靶向CAR构建体在独立于其他抗原被每种单靶抗原CD19或CD22触发时实现靶标裂解的能力。
Raji细胞被所有双重靶向CAR有效裂解，但不被未经转导的T细胞UTD(阴性对照)裂解(图9A)。相比之下，所有双重靶向CAR构建体裂解单抗原系293TCD19和293TCD22，表明了这些CAR构建体当被单独CD19抗原或被单独CD22抗原激活时触发其抗肿瘤溶解功能的能力(分别为图9B和9D)。相比之下，双重靶向抗CD22-19-CAR均不裂解抗原阴性细胞系293T(图9C)。因此，在共表达CD19和CD22抗原的肿瘤Raji系中以及还在表达CD19或CD22单一抗原的293TCD19和293TCD22系中，所有抗CD22-19 CAR均具有功能，并且针对CD19-CD22-细胞系293T没有自发的杀伤活性，强调了这些构建体的靶标特异性。
然后评价具有不同共刺激结构域的抗CD22-19 CAR关于细胞因子分泌的能力(图8)。将CD19+CD22+Raji肿瘤细胞与表达构建体LTG2737、D0135、D0136、D0137、D0138、D0139、D0140、D0145、D0146的串联抗CD22-19 CAR T细胞或阴性对照未经转导的T细胞(UTD)以10∶1的效应物与靶标之比共孵育过夜，并通过ELISA分析培养物上清液中的IFNγ、TNFα和IL-2(图8)。所有双重靶向CAR均响应于肿瘤细胞强诱导IL-2和TNFα，而阴性对照(未经转导的，UTD)则未产生明显的细胞因子诱导(图8)。值得注意的是，示出的IFNγ水平在所有CAR 22-19中都被强诱导，但对于CAR构建体D0146、D0139、D0136尤其高，表明抗CD22-19 CAR的细胞因子应答的强度可通过在CAR设计中使用的共刺激结构域的组成来调节。总之，IFNγ、TNFα和IL-2的诱导分泌谱表明了所有CAR 22-19构建体的高效力。重要地，在不存在肿瘤细胞(仅CART的组)的情况下，抗CD22-19 CAR产生很少至不产生细胞因子分泌，这进一步证实了CAR的特异性，并表明具有不同共刺激结构域的串联抗CD22-19 CAR缺乏紧张性信号传导。
在不旨在限制于任何特定的作用机制的情况下，认为与本发明的示例性串联CD22和CD19靶向CAR相关的增强的治疗性功能的可能原因包括例如但不限于：a)改善了在质膜内的横向运动从而允许更有效的信号转导，b)在质膜微结构域(例如脂筏)内的定位优异，以及与与T细胞活化相关的跨膜信号传导级联相互作用的能力更大，c)通过优先移动远离抑制性(dampening)或下调性相互作用(例如与磷酸酶(例如CD45)的接近性或相互作用较低)而在质膜内的定位优异，以及d)优异组装成T细胞受体信号传导复合物(即免疫突触)，或e)由于每个CAR分子中存在两个不同靶向结构域而与肿瘤抗原接合的能力优异，或其任意组合。
虽然已经用示例性的仅胞外CD19/CD22可变重链和ScFv抗原结合结构域举例说明了本公开内容，但是可使用仅CD19/CD22可变重链和ScFv抗原结合结构域中的其他核苷酸和/或氨基酸变体以得到用于本文中所述的CAR中的CD19/CD22抗原结合结构域。
根据待靶向的期望抗原，CAR可被另外改造成包含对期望的抗原靶标具有特异性的合适抗原结合结构域。例如，如果CD19/CD22是待靶向的期望抗原，则可将针对CD19/CD22的抗体用作并入CAR中的抗原结合结构域。
在一个示例性的实施方案中，CAR的抗原结合结构域部分另外靶向CD33。优选地，CAR中的抗原结合结构域是抗CD33 ScFv，其中抗CD33 ScFv的核酸序列包含SEQ ID NO：46所示的序列。在一个实施方案中，抗CD33 ScFv包含编码SEQ ID NO：46的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CAR的抗CD19/CD22 ScFv部分包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列。
在一个示例性的实施方案中，CAR的抗原结合结构域部分另外靶向间皮素。优选地，CAR中的抗原结合结构域是抗间皮素ScFv，其中抗间皮素ScFv的核酸序列包含SEQ IDNO：48所示的序列。在一个实施方案中，抗间皮素ScFv包含编码SEQ ID NO：48的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CAR的抗间皮素ScFv部分包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列。
在本发明的一个方面中，提供了能够与非TSA或非TAA结合的CAR，所述非TSA或非TAA包括例如但不限于来自于以下的抗原：逆转录病毒科(例如人免疫缺陷病毒例如HIV-1和HIV-LP)、小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒和艾柯病毒)、风疹病毒、冠状病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、细小病毒、腺病毒科、疱疹病毒科[例如1型和2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和疱疹病毒]、痘病毒科(例如天花病毒、痘苗病毒和痘病毒)或丙型肝炎病毒，或其任意组合。
在本发明的另一方面中，提供了能够与来自于以下的细菌菌株的抗原结合的CAR：葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)或沙门氏菌属(Salmonella)。特别地，提供了能够与来自于例如以下感染性细菌的抗原结合的CAR：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属(Mycobacteria sp.)的细菌菌株(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)或戈登分枝杆菌(M.gordonea))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、A组链球菌(Group A Streptococcus)、B组链球菌(GroupB Streptococcus)(无乳链球菌(Streptococcus agalactiae))、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或破伤风梭菌(Clostridium tetani)，或其组合。
2.跨膜结构域
关于跨膜结构域，CAR包含一个或更多个与CAR的胞外CD19/CD22抗原结合结构域融合的跨膜结构域。
跨膜结构域可来自于天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可来自于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。
在本文中所述的CAR中特别使用的跨膜区可来自于以下(即至少包含以下的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、间皮素、CD33、CD37、CD64、CD80、CD83、CD86、CD134、CD137、CD154、TNFRSF16或TNFRSF19。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将存在于合成跨膜结构域的每个末端。任选地，短的寡肽接头或多肽接头(优选地长度为2至10个氨基酸)可在CAR的跨膜结构域和胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供特别合适的接头。
在一个实施方案中，除了上述跨膜结构域之外，还使用天然与CAR中结构域之一缔合的跨膜结构域。
在一些情况下，可对跨膜结构域进行选择或通过氨基酸替换以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合从而使与受体复合物中其他成员的相互作用最小化。
在一个实施方案中，本发明的CAR中的跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO：35的核酸序列。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含编码SEQ ID NO：36的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所编码的跨膜结构域包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的具有至少一个、两个或三个修饰(例如，替换)但不超过20、10或5个修饰(例如，替换)的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有95％至99％同一性的序列。
在一些情况下，CAR的跨膜结构域包含CD8.α.铰链结构域。在一个实施方案中，CD8铰链结构域包含SEQ ID NO：37的核酸序列。在一个实施方案中，CD8铰链结构域包含编码SEQ ID NO：38的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8铰链结构域包含SEQ IDNO：38的氨基酸序列，或与其具有95％至99％同一性的序列。
在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的接头结构域来自于CD8的胞外结构域，并且与跨膜CD8结构域、跨膜CD28结构域、或其组合连接。
3.间隔区结构域
在CAR中，间隔区结构域可布置在胞外结构域和跨膜结构域之间，或布置在胞内结构域和跨膜结构域之间。间隔区结构域意指用于将跨膜结构域与胞外结构域连接和/或将跨膜结构域与胞内结构域连接的任何寡肽或多肽。间隔区结构域包含多至300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，并且最优选25至50个氨基酸。
在一些实施方案中，接头可包含间隔区元件，其当存在时增大接头的尺寸使得效应分子或可检测标记与抗体或抗原结合片段之间的距离增大。示例性的间隔区是普通技术人员已知的，并且包括以下中列举的那些：美国专利No.7,964,566、7,498,298、6,884,869、6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5,138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444和4,486,414，以及美国专利公开No.20110212088和20110070248，其各自通过引用整体并入本文。
间隔区结构域优选具有促进CAR与抗原结合并增强信号传导到细胞内的序列。预期促进结合的氨基酸的一些实例包括半胱氨酸、带电荷氨基酸以及在潜在糖基化位点中的丝氨酸和苏氨酸，并且这些氨基酸可被用作构成间隔区结构域的氨基酸。
作为间隔区结构域，可使用为CD8.α.之铰链区的第137至206号氨基酸(SEQ IDNO：39)(NCBI RefSeq：NP.sub.--001759.3)、CD8.β.的第135至195号氨基酸(GenBank：AAA35664.1)、CD4的第315至396号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--000607.1)或CD28的第137至152号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--006130.1)的全部或部分。另外，作为间隔区结构域，可使用抗体H链或L链的恒定区的一部分。另外，间隔区结构域可以是人工合成序列。
另外，在CAR中，信号肽序列可与N端连接。信号肽序列存在于许多分泌蛋白和膜蛋白的N端，并且长度为15至30个氨基酸。由于上文作为胞内结构域提及的很多蛋白质分子都具有信号肽序列，因此这些信号肽可用作用于CAR的信号肽。在一个实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列。
4.胞内结构域
CAR的胞质结构域或在其他情况下胞内信号传导结构域负责激活其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应功能信号并指导细胞进行特化功能的蛋白质部分。虽然通常可使用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下不需要使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，这样的截短部分可用于代替完整链，只要其转导效应功能信号即可。术语胞内信号传导结构域因此意味着包括胞内信号传导结构域的足以转导效应功能信号的任何截短部分。
用于CAR中的胞内信号传导结构域的一些优选实例包括T细胞受体(TCR)和协同作用以在抗原受体接合之后起始信号转导的共受体的胞质序列，以及具有相同功能能力的这些序列的任何衍生物或变体和任何合成序列。
已知通过单独TCR产生的信号不足以完全激活T细胞并且还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可被认为由两种不同种类的胞质信号传导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)和以抗原独立性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。
初级胞质信号传导序列以刺激性方式或以抑制性方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激性方式起作用的初级胞质信号传导序列可包含被称为免疫受体酪氨酸基激活基序或ITAM的信号传导基序。
特别用于本文中所公开CAR的包含ITAM的初级胞质信号传导序列的一些实例包括来自于TCRζ(CD3ζ)、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。ITAM的具体非限制性实例包括具有以下序列的肽：CD3ζ的第51至164号氨基酸(NCBIRefSeq：NP.sub.--932170.1)、FcεRIγ的第45至86号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--004097.1)、FcεRIβ的第201至244号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--000130.1)、CD3γ的第139至182号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--000064.1)、CD3δ的第128至171号氨基酸(NCBIRefSeq：NP.sub.--000723.1)、CD3ε的第153至207号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--000724.1)、CD5的第402至495号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--055022.2)、0022的第707至847号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--001762.2)、CD79a的第166至226号氨基酸(NCBIRefSeq：NP.sub.--001774.1)、CD79b的第182至229号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--000617.1)和CD66d的第177至252号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--001806.2)，以及其与这些肽具有相同功能的变体。本文中所述的基于NCBI RefSeq ID或GenBank的氨基酸序列信息的氨基酸编号是基于每种蛋白质的前体(包含信号肽序列等)的全长进行编号的。在一个实施方案中，CAR中的胞质信号传导分子包含来自于CD3ζ的胞质信号传导序列。
在一个优选实施方案中，CAR的胞内结构域可被设计成包含单独或与任何其他可用于CAR背景的期望胞质结构域组合的CD3-ζ信号传导结构域。例如，CAR的胞内结构域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指CAR中包含共刺激分子的胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效响应所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。这样的共刺激分子的一些实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体等。这样的共刺激分子的一些具体非限制性实例包括具有以下序列的肽：CD2的第236至351号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--001758.2)、CD4的第421至458号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--000607.1)、CD5的第402至495号氨基酸(NCBIRefSeq：NP.sub.--055022.2)、CD8α的第207至235号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--001759.3)、CD83的第196至210号氨基酸(GenBank：AAA35664.1)、CD28的第181至220号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--006130.1)、CD137的第214至255号氨基酸(4-1BB，NCBIRefSeq：NP.sub.--001552.2)、CD134的第241至277号氨基酸(OX40，NCBI RefSeq：NP.sub.--003318.1)和ICOS的第166至199号氨基酸(NCBI RefSeq：NP.sub.--036224.1)，以及其与这些肽具有相同功能的变体。因此，尽管本文中的公开内容主要用4-1BB作为共刺激信号传导元件来举例说明，但是其他共刺激元件也在本公开内容的范围内。
CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或特定顺序彼此连接。任选地，短的寡肽接头或多肽接头(优选长度为2至10个氨基酸)可形成连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供特别合适的接头。
在一个实施方案中，胞内结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方案中，胞内结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在另一个实施方案中，胞内结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域以及CD28和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含SEQ ID NO：40所示的核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO：42所示的核酸序列。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含编码SEQ ID NO：41的氨基酸序列的核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含编码SEQ ID NO：43的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。
5.CAR的另外的描述
还明确地包括在本发明的范围内的是本文中所公开的CAR的功能性部分。当参考CAR使用时，术语“功能性部分”是指本文中所公开的一种或更多种CAR的以下任何部分或片段，所述部分或片段保留CAR(所述部分或片段为其一部分)(亲本CAR)的生物活性。功能性部分涵盖例如CAR的以下那些部分，其与亲本CAR相比在类似程度上、在相同程度上或在更高程度上保留识别靶细胞或者检测、治疗或预防疾病的能力。参考亲本CAR，功能性部分可包含例如亲本CAR的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。
功能性部分可在该部分的氨基或羧基端或在这两端包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸在亲本CAR的氨基酸序列中不存在。期望地，另外的氨基酸不干扰功能性部分的生物功能，例如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更期望地，与亲本CAR的生物活性相比，另外的氨基酸增强生物活性。
包括在本公开内容的范围内的是本文中所公开CAR的功能性变体。本文中使用的术语“功能性变体”是指与亲本CAR具有明显或显著序列同一性或相似性的CAR、多肽或蛋白质，所述功能性变体保留CAR(所述功能性变体为其变体)的生物活性。功能性变体涵盖例如本文中所述CAR(亲本CAR)的以下那些变体，其与亲本CAR相比在类似程度上、在相同程度上或在更高程度上保留识别靶细胞的能力。参考亲本CAR，功能性变体可例如与亲本CAR在氨基酸序列方面具有至少约30％、50％、75％、80％、90％、98％或更高同一性。
功能性变体可例如包含具有至少一个保守性氨基酸替换的亲本CAR的氨基酸序列。作为替选或补充，功能性变体可包含具有至少一个非保守性氨基酸替换的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，非保守性氨基酸替换优选不干扰或抑制功能性变体的生物活性。非保守性氨基酸替换可增强功能性变体的生物活性，使得与亲本CAR相比，功能性变体的生物活性提高。
CAR的氨基酸替换优选是保守性氨基酸替换。保守性氨基酸替换是本领域已知的，并且包括其中将一个具有特定物理和/或化学特性的氨基酸交换为另一个具有相同或相似化学或物理特性的氨基酸的氨基酸替换。例如，保守性氨基酸替换可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸替换另一个酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸替换另一个具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、He、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)、碱性/带正电荷的极性氨基酸替换另一个碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如，Lys、His、Arg等)、具有极性侧链的不带电荷氨基酸替换另一个具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如，Asn、Gin、Ser、Thr、Tyr等)、具有β支化侧链的氨基酸替换另一个具有β支化侧链的氨基酸(例如，He、Thr和Val)、具有芳香族侧链的氨基酸替换另一个具有芳香族侧链的氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)，等。
CAR可基本上由本文中所述的一个或更多个特定氨基酸序列组成，使得其他组分(例如，其他氨基酸)不会实质上改变功能性变体的生物活性。
CAR(包括功能性部分和功能性变体)可具有任意长度，即可包含任意数目的氨基酸，只要CAR(或其功能性部分或功能性变体)保留其生物活性，例如与抗原特异性结合、在哺乳动物中检测患病细胞或在哺乳动物中治疗或预防疾病等的能力即可。例如，CAR可为约50至约5000个氨基酸长，例如长度为50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸。
CAR(包括本发明的功能性部分和功能性变体)可包含替换一个或更多个天然存在氨基酸的合成氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域已知的，并且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羟脯氨酸和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、a-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸一酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’，N’-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、-氨基环戊烷羧酸、a-氨基环己烷羧酸、a-氨基环庚烷羧酸、a-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸、γ-二氨基丁酸、β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和a-叔丁基甘氨酸。
CAR(包括功能性部分和功能性变体)可被糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、环化(通过例如二硫桥)或转化成酸加成盐和/或任选地二聚或多聚的，或缀合的。
CAR(包括其功能性部分和功能性变体)可通过本领域已知的方法获得。CAR可通过制备多肽或蛋白质的任何合适方法来制备。从头合成多肽和蛋白质的合适方法在例如以下的参考文献中描述：Chan et al.，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，OxfordUniversity Press，Oxford，United Kingdom，2000；Peptide and Protein DrugAnalysis，ed.Reid，R.，Marcel Dekker，Inc.，2000；Epitope Mapping，ed.Westwood etal.，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2001；以及美国专利5,449,752。另外，可使用本文中所述的核酸使用标准重组方法重组产生多肽和蛋白质。参见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY 2001；和Ausubel et al.，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons，NY，1994。另外，一些CAR(包括其功能性部分和功能性变体)可从例如植物、细菌、昆虫、哺乳动物(例如，大鼠、人)等的来源分离和/或纯化。分离和纯化的方法是本领域公知的。或者，本文中所述的CAR(包括其功能性部分和功能性变体)可由公司商业化合成。在这方面，CAR可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
B.抗体和抗原结合片段
一个实施方案还提供了与本文中所公开的一种或更多种抗原特异性结合的CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合结构域或部分。本文中使用的“表达CAR的T细胞”或“CAR T细胞”意指表达CAR的T细胞，并且具有由例如CAR的抗体来源靶向结构域决定的抗原特异性。
本文中使用的“抗原结合结构域”可包括抗体及其抗原结合片段。术语“抗体”在本文中以最广义含义使用并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，及其抗原结合片段，只要其表现出所期望的抗原结合活性即可。抗体的一些非限制性实例包括例如完整的免疫球蛋白及其本领域已知的保留对抗原的结合亲和力的变体和片段。
“单克隆抗体”是从基本上均一的抗体的群体中获得的抗体，即除可能少量存在的可能天然存在的突变之外，构成该群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体是高特异性的，定向针对单一抗原表位。修饰语“单克隆的”表示抗体从基本上均一的抗体群体获得的特征，并且不被解释为要求通过任何特定方法产生抗体。在一些实例中，单克隆抗体是由B淋巴细胞的单克隆或由其中已转染编码单一抗体的抗体轻链可变区和重链可变区(或其抗原结合片段)的核酸的细胞或其后代产生的抗体。在一些实例中，单克隆抗体从对象分离。单克隆抗体可具有基本上对抗原结合或其他免疫球蛋白功能没有影响的保守性氨基酸替换。产生单克隆抗体的示例性方法是已知的，例如参见Harlow&Lane，Antibodies，A LaboratoryManual，2nd ed.Cold Spring Harbor Publications，New York(2013)。
通常来说，免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重(H)链和轻(L)链。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变结构域基因。存在两种轻链类型：lambda(λ)和kappa(κ)。存在五种主要的决定抗体分子的功能活性的重链种类(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每条重链和轻链都包含恒定区(或恒定结构域)和可变区(或可变结构域；参见例如Kindt et al.Kuby Immunology，6thed.，W.H.Freeman and Co.，page 91(2007))。在一些实施方案中，重链和轻链可变区组合以特异性结合抗原。在另一些实施方案中，仅需要重链可变区。例如，由仅重链组成的天然存在的骆驼科抗体在不存在轻链的情况下具有功能性且稳定(参见例如Hamers-Casterman et al.，Nature，363：446-448，1993；Sheriff etal.，Nat.Struct.Biol.，3：733-736，1996)。对“VH”的提及或“VH”是指抗体重链的可变区，包括例如Fv、ScFv、dsFv或Fab的抗原结合片段的抗体重链的可变区。对“VL”的提及或“VL”是指抗体轻链的可变结构域，包括Fv、ScFv、dsFv或Fab的抗体轻链的可变结构域。
轻链和重链可变区包含被三个还称作“互补性决定区”或“CDR”的高变区中断的“框架”区(参见例如Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，U.S.Department of Health and Human Services，1991)。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区(即组成轻链和重链的组合框架区)用于在三维空间中定位和排列CDR。
CDR主要负责与抗原表位的结合。给定CDR的氨基酸序列边界可使用许多公知方案中的任一种来容易地确定，所述方案包括由以下描述的那些：Kabat et al.(“Sequencesof Proteins of Immunological Interest，”5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1991；“Kabat”编号方案)，Al-Lazikani et al.，(JMB 273，927-948，1997；“Chothia”编号方案)和Lefranc et al.(“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains，”Dev.Comp.Immunol.，27：55-77，2003；“IMGT”编号方案)。每条链的CDR通常是指CDR1、CDR2和CDR3(从N端到C端)，并且还通常由特定CDR所在的链标识。因此，VH CDR3是来自发现其的抗体的重链可变结构域的CDR3，而VL CDR1是来自发现其的抗体的轻链可变结构域的CDR1。轻链CDR有时被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。重链CDR有时被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
“抗原结合片段”是全长抗体中保留特异性识别同源抗原的能力的部分，以及这样的部分的多种组合。抗原结合片段的一些非限制性实例包括Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段包括通过整个抗体的修饰产生的抗原结合片段或使用重组DNA方法从头合成的那些(参见例如Kontermann and Dubel(Ed)，Antibody Engineering，Vols.1-2，2nd Ed.，Springer Press，2010)。
单链抗体(scFv)是包含通过合适多肽接头连接为经遗传融合单链分子的一种或更多种抗体的VH和VL结构域的经遗传改造分子(参见例如Bird et al.，Science，242：423426，1988；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，85：5879 5883，1988；Ahmad et al.，Clin.Dev.Immunol.，2012，doi：10.1155/2012/980250；Marbry，IDrugs，13：543-549，2010)。scFv中VH结构域和VL结构域的分子内定向对于scFv通常不是决定性的。因此，可使用具有两种可能布置的scFv(VH结构域-接头结构域-VL结构域；VL结构域-接头结构域-VH结构域)。
在dsFv中，重链和轻链可变链已经被突变以引入二硫键从而使链的缔合稳定。还包括双抗体，其是这样的二价双特异性抗体：在其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短以致不能允许在同一链上的两个结构域之间进行配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，90：6444 6448，1993；Poljak et al.，Structure，2：11211123，1994)。
抗体还包括经遗传改造形式例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异缀合抗体(例如双特异性抗体)。还参见Pierce Catalog and Handbook，1994-1995(Pierce ChemicalCo.，Rockford，IL)；Kuby，J.，Immunology，3rd Ed.，W.H.Freeman&Co.，New York，1997。
非天然存在抗体可使用固相肽合成来构建，可重组产生，或者可例如通过筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库来获得，如Huse et al.，Science 246：1275-1281(1989)所述，其通过引用并入本文。这些和其他制备例如嵌合抗体、人源化抗体、CDR接枝抗体、单链抗体和双功能性抗体的方法是本领域技术人员公知的(Winter and Harris，Immunol.Today 14：243-246(1993)；Ward et al.，Nature 341：544-546(1989)；Harlowand Lane，同上，1988；Hilyard et al.，Protein Engineering：A practical approach(IRL Press 1992)；Borrabeck，Antibody Engineering，2d ed.(Oxford UniversityPress 1995)；其各自通过引用并入本文)。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中使参考抗体与其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，反之亦然，参考抗体在竞争测定中使该抗体与其抗原的结合阻断50％或更多。抗体竞争测定是已知的，并且本文中提供了示例性的竞争测定。
“人源化”抗体或抗原结合片段包含人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)抗体或抗原结合片段的一个或更多个CDR。提供CDR的非人抗体或抗原结合片段被称作“供体”，并且提供框架的人抗体或抗原结合片段被称作“接受者”。在一个实施方案中，在人源化免疫球蛋白中所有CDR都来自供体免疫球蛋白。恒定区不需要存在，但如果其存在的话，其可基本上与人免疫球蛋白恒定区相同，例如同一性为至少约85％至90％，例如约95％或更高。因此，人源化抗体或抗原结合片段的所有部分(除可能地CDR之外)都基本上与天然人抗体序列的对应部分相同。
“嵌合抗体”是包含来自于两种不同抗体的序列的抗体，所述两种不同抗体通常是不同物种的。在一些实例中，嵌合抗体包含一个或更多个来自一种人抗体的CDR和/或框架区和来自另一种人抗体的CDR和/或框架区。
“完全人抗体”或“人抗体”是包含来自(或来自于)人基因组的序列而不包含来自另一物种的序列的抗体。在一些实施方案中，人抗体包含来自(或来自于)人基因组的CDR、框架区，以及(如果存在的话)Fc区。人抗体可使用基于来自于人基因组的序列产生抗体的技术，例如通过噬菌体展示或使用转基因动物来鉴定和分离(参见例如Barbas etal.Phage display：A Laboratory Manuel.1st Ed.New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，2004.Print.；Lonberg，Nat.Biotech.，23：1117-1125，2005；Lonenberg，Curr.Opin.Immunol.，20：450-459，2008)。
抗体可具有一个或更多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，则结合位点可彼此相同或可以是不同的。例如，天然存在的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，而双特异性或双功能性抗体具有两个不同的结合位点。
测试抗体与CAR的任何功能性部分结合的能力的方法是本领域已知的并且包括任何抗体-抗原结合测定，例如放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、ELISA、Western印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定(参见例如，Janeway et al.，同下，美国专利申请公开No.2002/0197266 A1和美国专利No.7,338,929)。
另外，CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分可被修饰以包含可检测标记，例如放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸萤光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)。
C.缀合物
对本文中所公开的一种或更多种抗原具有特异性的CAR、表达CAR的T细胞、或单克隆抗体、或其抗原结合片段可使用本领域技术人员已知的任意数量方法与例如效应分子或可检测标记的试剂缀合。共价和非共价连接方法二者都可使用。缀合物包括但不限于其中效应分子或可检测标记与抗体或抗原结合片段共价连接的分子，所述抗体或抗原结合片段与本文中所公开的一种或更多种抗原特异性结合。本领域技术人员将理解，可使用多种效应分子和可检测标记，包括(但不限于)化学治疗剂、抗血管生成剂、毒素、放射性试剂(例如125I、32P、14C、3H和35S)以及其他标记、靶部分和配体等。
特定效应分子或可检测标记的选择取决于特定靶分子或细胞，以及期望的生物作用。因此，例如，效应分子可以是用于致使特定靶细胞(例如肿瘤细胞)死亡的细胞毒素。
用于使效应分子或可检测标记与抗体或抗原结合片段连接的操作根据效应物的化学结构而改变。多肽通常包含多种可用于与抗体上的合适官能团反应以使效应分子或可检测标记结合的官能团，例如羧酸基团(COOH)、游离胺基(-NH2)或巯基(-SH)。或者，抗体或抗原结合片段是衍生化的以暴露或连接另外的反应性官能团。衍生化可涉及连接多种已知接头分子(例如可从Pierce Chemical Company，Rockford，IL获得的那些)中的任一种。接头可以是用于将抗体或抗原结合片段与效应分子或可检测标记连接的任何分子。接头能够与抗体或抗原结合片段并且与效应分子或可检测标记形成共价键。合适的接头是本领域技术人员公知的并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。当抗体或抗原结合片段和效应分子或可检测标记是多肽时，接头可通过其侧基(例如通过与半胱氨酸的二硫键)与组成型氨基酸连接或者与末端氨基酸的α碳氨基和羧基基团连接。
在数个实施方案中，接头可包含间隔区元件，其当存在时增大接头的尺寸使得效应分子或可检测标记与抗体或抗原结合片段之间的距离增大。示例性的间隔区是普通技术人员已知的，并且包括以下中列举的那些：美国专利No.7,964,566、7,498,298、6,884,869、6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5，138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444和4,486,414，以及美国专利公开No.20110212088和20110070248，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，接头在胞内条件下是可切割的，使得在胞内环境中接头的切割从抗体或抗原结合片段释放效应分子或可检测标记。在另一些实施方案中，接头是不可切割的并且效应分子或可检测标记例如通过抗体降解来释放。在一些实施方案中，接头可被存在于胞内环境(例如在溶酶体或内体或小窝(caveolea)内)的切割剂切割。接头可以是例如被胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶)切割的肽接头。在一些实施方案中，肽接头为至少2个氨基酸长或至少3个氨基酸长。然而，接头可以为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸长，例如1至2、1至3、2至5、3至10、3至15、1至5、1至10、1至15个氨基酸长。蛋白酶可包括组织蛋白酶B和组织蛋白酶D以及纤溶酶，已知其所有都水解二肽药物衍生物，使得活性药物在靶细胞内释放(参见例如Dubowchik and Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83：67-123)。例如，可使用可被巯基依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B切割的肽接头(例如，苯丙氨酸-亮氨酸或甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸接头)。这样的接头的另一些实例在例如美国专利No.6,214,345中描述，其通过引用并入本文。在一个具体的实施方案中，可被胞内蛋白酶切割的肽接头是缬氨酸-瓜氨酸接头或苯丙氨酸-赖氨酸接头(参见例如美国专利No.6,214,345，其描述了使用缬氨酸-瓜氨酸接头的多柔比星合成)。
在另一些实施方案中，可切割接头是pH敏感性的，即在特定pH值下对水解敏感。通常来说，pH敏感性接头在酸性条件下是可水解的。例如，可使用在溶酶体中可水解的酸不稳定性接头(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)。(参见例如美国专利No.5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik and Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83：67-123；Neville et al.，1989，Biol.Chem.264：14653-14661.)这样的接头在中性pH条件(例如血液中的那些)下是相对稳定的，但在低于pH 5.5或pH 5.0(溶酶体的近似pH)下不稳定。在某些实施方案中，可水解的接头是硫醚接头(例如经由酰腙键与治疗剂连接的硫醚)(参见例如美国专利No.5,622,929)。
在另一些实施方案中，接头在还原条件下是可切割的(例如二硫化物接头)。多种二硫化物接头是本领域已知的，其包括例如可使用以下形成的那些：SATA(N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)-、SPDB和SMPT。(参见例如，Thorpe et al.，1987，Cancer Res.47：5924-5931；Wawrzynczak et al.，In Immunoconjugates：Antibody Conjugates inRadioimagery and Therapy of Cancer(C.W Vogel ed.，Oxford U.Press，1987)；Phillips et al.，Cancer Res.68：92809290，2008)。还参见美国专利No.4,880,935)。
在另一些具体的实施方案中，接头是丙二酸酯接头(Johnson et al.，1995，Anticancer Res.15：1387-93)、马来酰亚胺基苯甲酰基接头(Lau et al.，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3’-N-酰胺类似物(Lau et al.，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。
在另一些实施方案中，接头是不可切割的并且效应分子或可检测标记通过抗体降解而释放。(参见美国公开No.2005/0238649，其通过引用整体并入本文)。
在数个实施方案中，接头在胞外环境中对切割具有抗性。例如，当缀合物存在于胞外环境中(例如在血浆中)时，缀合物样品中不多于约20％、不多于约15％、不多于约10％、不多于约5％、不多于约3％、或不多于约1％的接头被切割。接头在胞外环境中是否对切割具有抗性可例如通过以下确定：将包含目的接头的缀合物与血浆一起孵育预定时间段(例如，2小时、4小时、8小时、16小时或24小时)，然后量化存在于血浆中的游离效应分子或可检测标记的量。可用于缀合物的不同示例性接头在WO 2004-010957、美国公开No.2006/0074008、美国公开No.20050238649和美国公开No.2006/0024317中描述，其各自通过引用整体并入本文。
在数个实施方案中，提供了CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分与一种或更多种小分子毒素的缀合物，所述小分子毒素例如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱、多拉司他汀类、奥瑞斯他汀类、单端孢霉烯和CC1065，以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。
适合用作美登木素生物碱毒素部分的美登素化合物是本领域公知的，并且可根据已知方法从天然来源分离，可使用遗传工程技术产生(参见Yu et al(2002)PNAS 99：7968-7973)，或者可以是根据已知方法合成制备的美登醇和美登醇类似物。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合来起作用的有丝分裂抑制剂。美登素首次从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离(美国专利No.3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生美登木素生物碱，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物在例如以下中公开：美国专利No.4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663和4,371,533，其各自通过引用并入本文。包含美登木素生物碱的缀合物、其制备方法以及其治疗用途在例如美国专利No.5,208,020；5,416,064；6,441,163和欧洲专利EP 0425 235 B1中公开，其公开内容在此明确地通过引用并入。
另外的毒素可与CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分一起使用。示例性毒素包括假单胞菌外毒素(PE)、蓖麻毒蛋白、相思豆毒素、白喉毒素及其亚基、核毒素(ribotoxin)、核糖核酸酶、皂草毒蛋白和加利车霉素，以及肉毒杆菌毒素A至F。这些毒素是本领域公知的并且许多可容易地从商业来源获得(例如，Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)。预期的毒素还包括毒素的变体(参见例如参见美国专利No.5,079,163和4,689,401)。
皂草毒蛋白是来自于肥皂草(Saponaria officinalis)的毒素，其通过使核糖体复合物的60S部分失活来破坏蛋白质合成(Stirpe et al.，Bio/Technology，10：405-412，1992)。然而，该毒素不具有特异性进入细胞内的机理，并且因此需要与被内化的识别细胞表面蛋白的抗体或抗原结合片段缀合以被细胞有效地摄取。
白喉毒素从白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)分离。通常来说，用于免疫毒素的白喉毒素是突变的以降低或消除非特异性毒性。具有完全酶活性但显著降低的非特异性毒性的被称为CRM107的突变体自20世纪70年代以来就为人所知(Laird andGroman，J.Virol.19：220，1976)，并且一直用于人临床试验。参见美国专利No.5,792,458和美国专利No.5,208,021。
蓖麻毒蛋白是来自蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻子(Castor bean))的凝集素RCA60。对于蓖麻毒蛋白的一些实例，参见美国专利No.5,079,163和美国专利No.4,689,401。蓖麻凝集素(Ricinus communis agglutinin，RCA)以两种形式存在，其根据其大约65kD和120kD的分子量分别表示为RCA60和RCA120(Nicholson&Blaustein，J.Biochim.Biophys.Acta 266：543，1972)。A链负责使蛋白质合成失活和杀伤细胞。B链使蓖麻毒蛋白与细胞表面半乳糖残基结合和促进A链转运到溶质溶胶内(Olsnes et al.，Nature 249：627-631，1974和美国专利No.3,060,165)。
还曾使核糖核酸酶与靶向分子缀合以用作免疫毒素(参见Suzuki et al.，Nat.Biotech.17：265-70，1999)。示例性的核毒素例如α-帚曲毒素(α-sarcin)和局限曲菌素在例如Rathore et al.，Gene 190：31-5，1997；和Goyal and Batra，Biochem.345 Pt 2：247-54，2000中讨论。加利车霉素首次从棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)分离并且是导致凋亡的引起DNA中双链断裂的烯二炔抗肿瘤抗生素家族的成员(参见，例如Lee et al.，J.Antibiot.42：1070-87，1989)。该药物是临床试验中免疫毒素的毒性部分(参见例如，Gillespie et al.，Ann.Oncol.11：735-41，2000)。
相思豆毒素包括来自相思子(Abrus precatorius)的毒性凝集素。毒性成分相思豆毒素a、b、c和d的分子量为约63kD至67kD并且由两条二硫化物连接的多肽链A和B构成。A链抑制蛋白质合成；B链(相思豆毒素-b)与D-半乳糖残基结合(参见，Funatsu et al.，Agr.Biol.Chem.52：1095，1988；和Olsnes，Methods Enzymol.50：330-335，1978)。
对本文中所公开的一种或更多种抗原具有特异性的CAR、表达CAR的T细胞、单克隆抗体、其抗原结合片段还可与可检测标记缀合；例如，能够通过以下进行检测的可检测标记：ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微术或诊断成像技术(例如计算机断层摄影术(computed tomography，CT)、计算机轴向断层摄影术(computed axial tomography，CAT)扫描、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、核磁共振成像(nuclear magneticresonance imaging，NMRI)、磁共振断层摄影术(magnetic resonance tomography，MTR)、超声、纤维光学检查和腹腔镜检查)。可检测标记的具体非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶连接物、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于通过MRI检测的超顺磁性铁氧化物纳米晶体)。例如，可用的可检测标记包括荧光化合物，包括萤光素、异硫氰酸萤光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系元素磷光体等。还使用生物发光标记，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)、黄色荧光蛋白(Yellowfluorescent protein，YFP)。CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分还可与可用于检测的酶缀合，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶等。当CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分与可检测酶缀合时，其可通过添加被该酶用于产生可辨别的反应产物的另外的试剂来检测。例如，当存在试剂辣根过氧化物酶时，过氧化氢和二氨基联苯胺的添加产生在视觉上可检测的有色反应产物。CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分还可与生物素缀合，并且通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合来检测。应注意的是，抗生物素蛋白本身可与酶或荧光标记缀合。
CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分可与顺磁性试剂(例如钆)缀合。顺磁性试剂(例如超顺磁性铁氧化物)也用作标记。抗体还可与镧系元素(例如铕和镝)和锰缀合。抗体或抗原结合片段还可用被第二报道子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)标记。
CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分还可与放射性标记的氨基酸缀合。放射性标记可用于诊断性和治疗性目的二者，例如，放射性标记可用于通过x射线、发射谱或其他诊断技术来检测本文中所公开的一种或更多种抗原和抗原表达细胞。另外，放射性标记可在治疗上用作用于在对象中治疗肿瘤，例如用于治疗神经母细胞瘤的毒素。用于多肽的标记的一些实例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：3H、14C、15N、35S、90y、99Tc、111In、125I和131I。
检测这样的可检测标记的方法是本领域技术人员公知的。因此，例如，放射性标记可使用胶片或闪烁计数器来检测，荧光标记可使用光检测器检测发射的光照进行检测。酶标记通常通过向酶提供底物并检测通过酶对底物的作用而产生的反应产物来检测，并且比色标记通过简单地可视化着色标记来检测。
D.核苷酸、表达、载体和宿主细胞
本发明的一个实施方案还提供了包含编码本文中所述的任一种CAR、抗体或其抗原结合部分(包括其功能性部分和功能性变体)的核苷酸序列的核酸。本发明的核酸可包含编码本文中所述的任一种前导序列、抗原结合结构域、跨膜结构域和/或胞内T细胞信号传导结构域的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核苷酸序列可以是经密码子修饰的。不受特定理论束缚，认为核苷酸序列的密码子优化提高mRNA转录物的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可涉及用另一个密码子替代天然密码子，所述另一个密码子编码相同的氨基酸但可被更容易在细胞内获得的tRNA翻译，由此提高翻译效率。核苷酸序列的优化还可减少可能干扰翻译的次级mRNA结构，由此提高翻译效率。
在本发明的一个实施方案中，核酸可包含编码本发明CAR的抗原结合结构域的经密码子修饰的核苷酸序列。在本发明的另一个实施方案中，核酸可包含编码本文中所述的任一种CAR(包括其功能性部分和功能性变体)的经密码子修饰的核苷酸序列。
本文中使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指DNA或RNA聚合物，其可以是单链的或双链的、合成的或从天然来源获得的(例如分离的和/或纯化的)；其可包含天然的、非天然的或被改变的核苷酸；并且其可包含天然的、非天然的或被改变的核苷酸间连接，例如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接，代替在未经修饰寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或替换。然而，如本文中所讨论的，在一些情况下对核酸而言，包含一个或更多个插入、缺失、倒位和/或替换可以是合适的。
重组核酸可以是具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个在其他情况下分离的序列片段制备的序列的核酸。这种人工组合通常通过化学合成或更常见地通过人工操作分离的核酸片段，例如通过遗传工程技术，例如Sambrook et al.(同上)中所述的那些来实现。核酸可使用本领域已知的操作基于化学合成和/或酶促连接反应来构建。参见例如Sambrook et al.(同上)和Ausubel et al.(同上)。例如，核酸可使用天然存在的核苷酸或被设计成提高分子的生物稳定性或提高在杂交后形成的二联体的物理稳定性的经多种修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)来化学合成。可用于产生核酸的经修饰核苷酸的一些实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。或者，本发明的一种或更多种核酸可从公司，例如Integrated DNA Technologies(Coralville，IA，USA)购买。
核酸可包含编码任一种CAR或其功能性部分或功能性变体的任何分离或纯化的核苷酸序列。或者，核苷酸序列可包含任一种序列的简并核苷酸序列或简并序列的组合。
一个实施方案还提供了分离或纯化的核酸，其包含与本文中所述的任一种核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文中所述的任一种核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列可在高严格性条件下杂交。“高严格性条件”意指核苷酸序列以可检测地强于非特异性杂交的量与靶序列(本文中所述的任一种核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严格性条件包括可使具有精确互补序列的多核苷酸或仅包含少数分散错配的多核苷酸与偶然具有一些与该核苷酸序列匹配的小区域(例如3至10个碱基)的随机序列区分开的条件。与具有14至17个碱基或更多碱基的全长互补物相比，这样的小互补性区域更容易解链，并且高严格性杂交使其容易可区分。相对高严格性条件可包括例如低盐和/或高温条件，例如由在约50℃至70℃的温度下约0.02M至0.1M NaCl或等同物提供的。这样的高严格性条件容许核苷酸序列与模板链或靶标链之间的错配很少(如果有的话)，并且特别地适合于检测任一种本发明CAR的表达。通常可理解的是，通过添加递增量的甲酰胺可使条件更加严格。
还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与本文中所述的任一种核酸具有至少约70％或更高，例如约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的同一性。
在一个实施方案中，核酸可并入到重组表达载体中。在这点上，一个实施方案提供了包含任一种核酸的重组表达载体。出于本文中的目的，术语“重组表达载体”意指以下经遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，其当该构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列并且使载体与细胞在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下接触时允许宿主细胞表达该mRNA、蛋白质、多肽或肽。载体整体上不是天然存在的。
然而，载体的部分可以是天然存在的。重组表达载体可包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链的或双链的、合成的或部分从天然来源获得的，并且其可包含天然的、非天然的或被改变的核苷酸。重组表达载体可包含天然存在或非天然存在的核苷酸间连接，或这两种类型的连接。优选地，非天然存在或被改变的核苷酸或核苷酸间连接不阻碍载体的转录或复制。
在一个实施方案中，重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括针对增殖和扩增或针对表达或这二者而设计的那些，例如质粒和病毒。载体可选自pUC系列(Fermentas Life Sciences，GlenBumie，MD)、pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，CA)、pET系列(Novagen，Madison，WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，CA)。
还可使用噬菌体载体例如
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λZapII(Stratagene)、EMBL4和λNMI149。植物表达载体的一些实例包括pBIO1、pBI101.2、pBHO1.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的一些实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。慢病毒载体是来自于慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括自我失活慢病毒载体，如Milone et al.，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中提供的。可用于临床的慢病毒载体的另一些实例包括例如但不限于来自Oxford BioMedica plc的LENTIVECTOR.RTM.基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAX.TM.载体系统等。慢病毒载体的非临床类型也是可用的并且是本领域技术人员已知的。
多种转染技术是本领域公知的(参见例如，Graham et al.，Virology，52：456-467(1973)；Sambrook et al.(同上)；Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier(1986)；以及Chu et al.，Gene，13：97(1981))。
转染方法包括磷酸钙共沉淀(参见例如，Graham et al.，同上)、直接微注射到培养的细胞内(参见例如，Capecchi，Cell，22：479-488(1980))、电穿孔(参见例如，Shigekawaet al.，BioTechniques，6：742-751(1988))、脂质体介导的基因转移(参见例如，Manninoet al.，BioTechniques，6：682-690(1988))、脂质介导的转导(参见例如，Feigner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：7413-7417(1987))和使用高速微型射弹的核酸递送(参见例如，Klein et al.，Nature，327：70-73(1987))。
在一个实施方案中，重组表达载体可使用例如Sambrook et al.(同上)和Ausubelet al.(同上)中描述的标准重组DNA技术来制备。环形或线性的表达载体构建体可制备成包含在原核或真核宿主细胞中具有功能性的复制系统。复制系统可来自于例如ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
重组表达载体可包含调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，所述调节序列对需向其中引入载体的宿主细胞的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，这视情况而定并且考虑载体是基于DNA还是基于RNA。重组表达载体可包含限制性位点以有利于克隆。
重组表达载体可包含一个或更多个允许选择转化或转染的宿主细胞的标记基因。标记基因包括杀生物剂抗性(例如针对抗生素、重金属等的抗性)；营养缺陷型宿主中提供原养型的互补，等等。用于本发明表达载体的合适的标记基因包括例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
重组表达载体可包含与编码CAR(包括其功能性部分和功能性变体)的核苷酸序列或与与编码CAR之核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列可操作连接的天然或非天然启动子。启动子的选择(例如，强的、弱的、诱导型的、组织特异性的和发育特异性的)在技术人员的普通技术之内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的技术之内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子，或在鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。
重组表达载体可被设计用于瞬时表达、用于稳定表达或用于二者。另外，重组表达载体可被制成用于组成型表达或用于诱导型表达。
另外，重组表达载体可被制备成包含自杀基因。本文中使用的术语“自杀基因”是指引起表达该自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是以下基因：其赋予其中表达该基因的细胞以针对试剂(例如药物)的敏感性，并且当使该细胞与该试剂接触或暴露于该试剂时引起该细胞死亡。自杀基因是本领域已知的(参见例如，Suicide Gene Therapy：Methods and Reviews，Springer，Caroline J.(Cancer Research UK Centre for CancerTherapeutics at the Institute of Cancer Research，Sutton，Surrey，UK)，HumanaPress，2004)并且包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
一个实施方案还提供了包含本文中所述的任一种重组表达载体的宿主细胞。本文中使用的术语“宿主细胞”是指可包含本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体(例如人)分离。宿主细胞可以是黏附细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的并且包括例如DH5a大肠杆菌(E.coli)细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。出于扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞可以是原核细胞，例如DH5αt细胞。出于产生重组CAR的目的，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。当宿主细胞可以是任何细胞类型，可以来源于任何类型的组织，并且可以在任何发育阶段时，宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)或外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。宿主细胞可以是T细胞。
出于本文中的目的，T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或从哺乳动物获得的T细胞。如果从哺乳动物获得，则T细胞可以从许多来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或流体。T细胞还可以是富集的或纯化的。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是从人分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以在任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助性T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、记忆干细胞(即Tscm)、幼稚T细胞等。T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
在一个实施方案中，本文中所述的CAR可用于合适的非T细胞。这样的细胞是具有免疫效应功能的那些，例如NK细胞和由多能干细胞产生的T样细胞。
一个实施方案还提供了包含至少一种本文中所述的宿主细胞的细胞群。细胞群可以是异质的群体，其包含含有所述任一种重组表达载体的宿主细胞以及至少一种其他细胞，例如不包含任一种重组表达载体的宿主细胞(例如T细胞)或不同于T细胞的细胞，例如B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等。或者，细胞群可以是基本上同质的群体，其中该群体主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(例如基本上由其组成)。该群体还可以是克隆细胞群，其中该群体中的所有细胞都是包含重组表达载体的单宿主细胞的克隆，使得该群体中的所有细胞都包含该重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群是包含含有如本文中所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群。
CAR(包括其功能性部分和变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)可以是分离和/或纯化的。例如，纯化的(或分离的)宿主细胞制备物是其中宿主细胞比在其体内天然环境中的细胞纯度更高的宿主细胞制备物。这样的宿主细胞可例如通过标准纯化技术来产生。在一些实施方案中，宿主细胞的制备物被纯化使得宿主细胞代表制备物的总细胞含量的至少约50％，例如至少约70％。例如，纯度可以为至少约50％，可大于约60％、约70％或约80％，或者可以为约100％。
E.治疗方法
预期本文中所公开的CAR可用于在哺乳动物中治疗或预防疾病的方法。在这点上，一个实施方案提供了在哺乳动物中治疗或预防癌症的方法，其包括以有效地在该哺乳动物中治疗或预防癌症的量向该哺乳动物施用CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体和/或其抗原结合部分，和/或药物组合物。
一个实施方案还包括在施用本文中所公开的CAR之前对哺乳动物进行淋巴细胞清除(lymphodeplete)。淋巴细胞清除的一些实例包括但可不限于非清髓性淋巴细胞清除化学治疗、清髓性淋巴细胞清除化学治疗、全身照射等。
出于其中施用宿主细胞或细胞群的方法的目的，细胞可以是哺乳动物同种异体或自体的细胞。优选地，细胞是哺乳动物自体的。如本文中使用的，同种异体意指以下任何材料，其与该材料被引入的个体来自于相同物种的不同动物。当一个或更多个基因座的基因不相同时，两个或更多个个体被认为彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可在遗传上充分不相似以在抗原性上相互作用。本文中使用的“自体的”意指以下任何材料，其来自于与该材料稍后被重新引入到的个体中的同一个体。
本文中提及的哺乳动物可以是任何哺乳动物。本文中使用的术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，例如小鼠和仓鼠；和兔形目的哺乳动物，例如兔。哺乳动物可来自食肉目，包括猫科(猫)和犬科(犬)。哺乳动物可来自偶蹄目，包括牛科(牛)和猪科(猪)；或者是奇蹄目，包括马科(马)。哺乳动物可以是灵长目、Ceboid目或Simoid目(猴)；或者是类人猿目(人和猿)。优选地，哺乳动物是人。
关于方法，癌症可以是任何癌症，包括以下中的任一种：急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌症(例如，膀胱癌)、骨癌、脑癌(例如，髓母细胞瘤)、乳腺癌，肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌，眼癌、肝内胆管癌、关节癌，颈癌、胆囊癌或胸膜癌，鼻癌、鼻腔癌或中耳癌，口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠类癌肿瘤、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌和肺腺癌)、淋巴瘤、间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、B-慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)和伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、卵巢癌、胰腺癌，腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌，咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、滑膜肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和输尿管癌。
本文中使用的术语“治疗”和“预防”以及从其来源的词语并不一定意指100％或完全的治疗或预防。相反，存在本领域普通技术人员视为具有潜在益处或治疗效果的不同程度的治疗或预防。在这一方面，所述方法可在哺乳动物中提供任意量或任意水平的癌症治疗或预防。
此外，由所述方法提供的治疗或预防可包括治疗或预防被治疗或预防的疾病(例如，癌症)的一种或更多种状况或症状。另外，出于本文中的目的，“预防”可涵盖延迟疾病或其症状或状况的发作。
另一个实施方案提供了在哺乳动物中检测癌症的存在的方法，其包括：(a)使包含来自哺乳动物的一种或更多种细胞的样品与CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体和/或其抗原结合部分、或药物组合物接触，从而形成复合物；(b)以及检测复合物，其中复合物的检出指示哺乳动物中存在癌症。
样品可通过任何合适的方法(例如，活检或尸体剖检)获得。活检是从个体中移出组织和/或细胞。这样的移出可以是为了从个体中收集组织和/或细胞以对所移出的组织和/或细胞进行实验。该实验可包括确定个体是否患有和/或正遭受特定病症或疾病状态的实验。该病症或疾病可以是例如癌症。
对于在哺乳动物中检测增生性病症(例如，癌症)的存在的方法的一个实施方案，包含哺乳动物的细胞的样品可以是包含全细胞、全细胞裂解物或全细胞裂解物的级分(例如细胞核或细胞质级分、全蛋白质级分或核酸级分)的样品。如果样品包含全细胞，则细胞可以是哺乳动物的任何细胞，例如任何器官或组织的细胞，包括血细胞或内皮细胞。
对于哺乳动物，接触可发生在体外或体内。优选地，接触是在体外。
另外，复合物的检测可通过本领域已知的任意数量的方式进行。例如，本文中所述的本文中所公开CAR、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群，或者抗体或其抗原结合部分可用可检测标记进行标记，所述可检测标记例如如上文所公开的放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸萤光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)。
测试CAR识别靶细胞的能力和抗原特异性的方法是本领域已知的。例如，Clay etal.，J.Immunol，163：507-513(1999)教导了测量细胞因子(例如干扰素-γ、粒细胞/单核细胞集落刺激因子(granulocyte/monocyte colony stimulating factor，GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-αt)或白介素2(interleukin 2，IL-2))的释放的方法。另外，CAR功能可通过测量细胞的细胞毒性来评价，如Zhao et al，J.Immunol，174：4415-4423(2005)中所述。
另一个实施方案提供了本发明的CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体或其抗原结合部分、和/或药物组合物用于在哺乳动物中治疗或预防增生性病症(例如，癌症)的用途。癌症可以是本文中所述的任一种癌症。
任何施用方法都可用于所公开的治疗剂，包括局部和系统施用。例如，可使用表面、经口、血管内(例如静脉内)、肌内、腹膜内、鼻内、皮内、鞘内和皮下施用。具体的施用模式和剂量方案将由主治临床医师考虑病例的具体情况(例如对象、疾病、涉及的疾病状态和治疗是否是预防性的)来选择。在其中施用多于一种药剂或组合物的情况下，可使用一种或更多种施用途径；例如化学治疗剂可经口施用并且抗体或抗原结合片段或缀合物或组合物可静脉内施用。施用方法包括注射，在此情况下，在例如以下的无毒可药用载体中提供CAR、CAR T细胞、缀合物、抗体、抗原结合片段或组合物：水、盐水、林格液、右旋糖溶液、5％人血清白蛋白、不挥发油(fixed oil)、油酸乙酯或脂质体。在一些实施方案中，可使用所公开化合物的局部施用，例如通过将抗体或抗原结合片段施加到已从中除去肿瘤的组织区域，或被怀疑倾向于肿瘤发生的区域。在一些实施方案中，包含治疗有效量抗体或抗原结合片段的药物制剂的持续瘤内(或肿瘤附近)释放可以是有益的。在另一些实例中，缀合物作为滴眼剂表面施加到角膜，或玻璃体内施加到眼中。
所公开的治疗剂可被配制成适合于精确剂量的单个施用的单位剂量形式。另外，所公开的治疗剂可以以单剂量或以多剂量方案来施用。多剂量方案是以下方案：其中初级治疗过程可具有多于一个单独剂量，例如1至10个剂量，然后以后续时间间隔根据需要给予其他剂量以维持或加强组合物作用。治疗可涉及在数天至数月或甚至数年的时期内的化合物的日剂量或多个日剂量。因此，剂量方案还将至少部分地基于待治疗对象的特定需求来确定并且将取决于施用医师的判断。
抗体或缀合物的通常剂量可以为约0.01mg/kg至约30mg/kg，例如约0.1mg/kg至约10mg/kg。
在一些具体实例中，基于多次每日给药方案(例如至少连续2天、连续10天等)向对象施用包含一种或更多种缀合物、抗体、组合物、CAR、CAR T细胞或另外的药剂的治疗性组合物例如数周、数月或数年的时间。在一个实例中，向对象施用缀合物、抗体、组合物或另外的药剂至少30天，例如至少2个月、至少4个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月的时间。
在一些实施方案中，所公开的方法包括与所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR或表达CAR的T细胞组合(例如依次地、基本上同时或同时)向对象提供外科手术、放射治疗和/或化学治疗。这样的药剂和治疗的方法和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可由熟练的临床医师来确定。用于另外的药剂的制剂和给药方案可根据制造商的说明来使用或如由技术人员凭经验确定的。用于这样的化学治疗的制剂和给药方案还在ChemotherapyService，(1992)Ed.，M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，Md中描述。
在一些实施方案中，组合治疗可包括向对象施用治疗有效量的另外的癌症抑制剂。可用于组合治疗的另外的治疗剂的一些非限制性实例包括微管结合剂、DNA嵌入剂或交联剂、DNA合成抑制剂、DNA和RNA转录抑制剂、抗体、酶、酶抑制剂、基因调节剂和血管生成抑制剂。这些药剂(其以治疗有效量施用)和治疗可单独或组合使用。例如，任何合适的抗癌剂或抗血管生成剂都可与本文中所公开的CAR、CAR-T细胞、抗体、抗原结合片段或缀合物组合施用。这样的药剂的方法和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可由熟练的临床医师来确定。
另外的化学治疗剂包括但不限于：烷化剂，例如氮芥(nitrogen mustard)(例如，苯丁酸氮芥、氯甲胺(chlormethine)、环磷酰胺、异环磷酰胺和美法仑)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀和链佐星)、含铂化合物(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂和BBR3464)、白消安、达卡巴嗪、二氯甲二乙胺、丙卡巴肼、替莫唑胺、噻替派和尿嘧啶氮芥；抗代谢物，例如叶酸(例如，氨甲蝶呤、培美曲塞和雷替曲塞)、嘌呤(例如克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯基嘌呤和硫鸟嘌呤(tioguanine))、嘧啶(例如，卡培他滨)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和吉西他滨；植物生物碱，例如鬼臼(podophyllum)(例如，依托泊苷和替尼泊苷)、紫杉烷类(例如，多西他赛和紫杉醇)、长春花类(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)；细胞毒性/抗肿瘤抗生素，例如蒽环类家族成员(例如，柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌和戊柔比星)、博来霉素、利福平、羟基脲(hydroxyurea)和丝裂霉素；拓扑异构酶抑制剂，例如拓扑替康和伊立替康；单克隆抗体，例如阿仑单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、吉姆单抗、利妥昔单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗和曲妥珠单抗；光敏剂，例如氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、卟吩姆钠和维替泊芬；以及其他药剂，例如阿利维A酸、六甲蜜胺、安吖啶、阿那格雷、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿西替尼、贝沙罗汀、贝伐珠单抗、硼替佐米、塞来昔布、地尼白介素(denileukin diftitox)、厄洛替尼、雌莫司汀、吉非替尼、羟基尿素(hydroxycarbamide)、伊马替尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、喷司他丁、马索丙考、米托坦、培门冬酶、他莫昔芬、索拉非尼、舒尼替尼、维罗非尼(vemurafinib)、凡德他尼和维甲酸(tretinoin)。这样的药剂的选择和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可由熟练的临床医师来确定。
组合治疗可提供协同作用并且证明具有协同性，即当活性成分一起使用时达到的效果大于由单独使用化合物产生的效果的总和。当活性成分：(1)在组合的单位剂量制剂中共配制并同时施用或递送；(2)以单独制剂交替或并行递送；或(3)通过另一些方案进行时，可获得协同作用。当交替递送时，当化合物依次施用或递送，例如在单独的注射器中通过不同的注射剂依次施用或递送时，可获得协同作用。通常来说，在交替期间，每种活性成分的有效剂量依次施用，即先后施用，然而在组合治疗中，两种或更多种活性成分的有效剂量一起施用。
在一个实施方案中，在抗癌治疗之后向患有肿瘤的对象施用有效量的与本文中所公开的一种或更多种抗原特异性结合的抗体或抗原结合片段或其缀合物。在已经过足够时间量以允许施用的抗体或抗原结合片段或缀合物与在对应癌细胞上表达的抗原形成免疫复合物之后，检测免疫复合物。免疫复合物的存在(或不存在)指示治疗的有效性。例如，与在治疗之前获取的对照相比免疫复合物增加指示该治疗是无效的，然而与在治疗之前获取的对照相比免疫复合物减少指示该治疗是有效的。
F.生物药物组合物
本文中提供了用于基因治疗、免疫治疗和/或细胞治疗的生物药物组合物或生物制剂组合物(下文中的“组合物”)，其包含在载体(例如可药用载体)中的与本文中所公开的一种或更多种抗原特异性结合的一种或更多种所公开CAR、或表达CAR的T细胞、抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR、或表达CAR的T细胞。组合物可以以单位剂量形式制备用于向对象施用。施用的量和时机由治疗临床医师决定以达到期望结局。组合物可被配制成用于系统(例如静脉内)或局部(例如瘤内)施用。在一个实例中，所公开的CAR、或表达CAR的T细胞、抗体、抗原结合片段、缀合物被配制用于肠胃外施用，例如静脉内施用。包含本文中所公开的CAR、或表达CAR的T细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的组合物用于例如肿瘤的治疗和检测，所述肿瘤例如但不限于神经母细胞瘤。在一些实例中，组合物可用于癌的治疗或检测。包含如本文中所公开的CAR、或表达CAR的T细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的组合物还用于例如病理性血管生成的检测。
用于施用的组合物可包含溶解在可药用载体(例如水性载体)中的CAR、或表达CAR的T细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的溶液。可使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不期望的物质。这些组合物可通过常规的公知灭菌技术来灭菌。这些组合物可根据需要包含可药用的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、辅助剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中CAR、或表达CAR的T细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物的浓度可广泛地变化，并且根据所选的具体施用模式和对象的需求将主要基于流体体积、黏度、体重等来选择。制备这样的剂型用于基因治疗、免疫治疗和/或细胞治疗的实际方法对于本领域技术人员是已知的或将是明显的。
用于静脉内施用的典型组合物包含约0.01mg/kg至约30mg/kg的抗体或抗原结合片段或缀合物/对象/天(或对应剂量的包含抗体或抗原结合片段的CAR、或表达CAR的T细胞、缀合物)。用于制备可施用组合物的实际方法对本领域技术人员将是已知或明显的并且在例如Remington’s Pharmaceutical Science，19th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA(1995)的出版物中更详细地描述。
CAR、或表达CAR的T细胞、抗体、抗原结合片段或缀合物可以以冻干形式提供并且在施用之前用无菌水再水化，但是其也以已知浓度的无菌溶液提供。然后将CAR、或表达CAR的T细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物溶液添加到包含0.9％氯化钠(USP)的输注袋中，并且在一些情况下以0.5mg/kg体重至15mg/kg体重的剂量施用。本领域中在抗体或抗原结合片段和缀合物药物的施用方面有相当多的经验可供使用；例如自1997年
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获批以来，抗体药物一直在美国销售。CAR、或表达CAR的T细胞、抗体、抗原结合片段及其缀合物可通过缓慢输注而不是以静脉内推送(push)或推注(bolus)来施用。在一个实例中，施用较高的负荷剂量，随后以较低水平施用维持剂量。例如，可在大约90分钟的时间内输注4mg/kg抗体或抗原结合片段的初始负荷剂量(或包含抗体或抗原结合片段的缀合物的对应剂量)，随后如果在前剂量耐受良好，则在30分钟时间内输注2mg/kg的每周维持剂量进行4至8周。
受控释放肠胃外制剂可被制备成植入物、油性注射剂，或制备成颗粒系统。对于蛋白质递送系统的概述，参见Banga，A.J.，Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation，Processing，and Delivery Systems，Technomic Publishing Company，Inc.，Lancaster，PA，(1995)。颗粒系统包括微球体、微粒、微胶囊剂、纳米胶囊剂、纳米球体和纳米粒。微胶囊剂包含治疗性蛋白质(例如细胞毒素或药物)作为中心核。在微球体中，治疗剂分散在整个颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球体和微胶囊剂通常分别是指纳米粒、纳米球体和纳米胶囊剂。毛细管的直径为约5μm使得只有纳米粒静脉内施用。微粒的直径通常为约100μm并且皮下或肌内施用。参见例如，Kreuter，J.，Colloidal Drug DeliverySystems，J.Kreuter，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY，pp.219-342(1994)；和Tice&Tabibi，Treatise on Controlled Drug Delivery，A.Kydonieus，ed.，Marcel Dekker，Inc.New York，NY，pp.315-339，(1992)。
聚合物可用于本文中所公开的CAR、或表达CAR的T细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物组合物的离子控制释放。用于受控药物递送的多种可降解和不可降解的聚合物基质是本领域已知的(Langer，Accounts Chem.Res.26：537-542，1993)。例如，嵌段共聚物泊洛沙姆407在低温下作为黏性但是可活动的液体存在，但在体温下形成半固体凝胶。已经表明，其是用于重组白介素-2和脲酶的配制和持续递送的有效载剂(Johnston et al.，Pharm.Res.9：425-434，1992；和Pec et al.，J.Parent.Sci.Tech.44(2)：58-65，1990)。或者，羟基磷灰石已经作为微载体用于蛋白质的受控释放(Ijntema et al.，Int.J.Pharm.112：215-224，1994)。在另一方面中，脂质体被用于脂质包封的药物的受控释放以及药物靶向(Betageri et al.，Liposome Drug Delivery Systems，TechnomicPublishing Co.，Inc.，Lancaster，PA(1993))。用于治疗性蛋白质的受控递送的许多另外的系统是已知的(参见美国专利No.5,055,303；美国专利No.5,188,837；美国专利No.4,235,871；美国专利No.4,501,728；美国专利No.4,837,028；美国专利No.4,957,735；美国专利No.5,019,369；美国专利No.5,055,303；美国专利No.5,514,670；美国专利No.5,413,797；美国专利No.5,268,164；美国专利No.5,004,697；美国专利No.4,902,505；美国专利No.5,506,206；美国专利No.5,271,961；美国专利No.5,254,342和美国专利No.5,534,496)。
G.药盒
在一个方面中，还提供了使用本文中所公开的CAR的药盒。例如，药盒用于在对象中治疗肿瘤，或用于制备表达本文中所公开的一种或更多种CAR的CAR T细胞。如本文中所公开的，药盒将通常包含所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、CAR或表达CAR的T细胞。药盒中可包含多于一种所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、CAR或表达CAR的T细胞。
药盒可包含容器和在容器上或附于容器的标记或包装插入物。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。容器通常容纳包含一种或更多种所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、CAR或表达CAR的T细胞的组合物。在一些实施方案中，容器可具有无菌入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标记或包装插入物指示该组合物用于治疗特定病症。
标记或包装插入物通常还包含例如在治疗或预防肿瘤或制备CAR T细胞的方法中使用所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、CAR或表达CAR的T细胞的说明书。包装插入物通常包含在治疗性产品的商业包装中通常包含的说明书，其包含关于与使用这样的治疗性产品相关的适应证、用法、剂量、施用、禁忌和/或警告的信息。说明性材料可以以电子形式(例如计算机磁盘或压缩光盘)书写或可以是可视化的(例如视频文件)。药盒还可包含有利于该药盒被设计用于的特定应用的另外的组分。因此，例如，药盒可另外地包含检测标记的工具(例如用于酶标记的酶底物、检测荧光标记的滤光器装置、合适的第二标记(例如第二抗体)等)。药盒可另外地包含缓冲剂和通常用于特定方法的实践的其他试剂。这样的药盒和合适的内容物是本领域技术人员公知的。
实施例
通过以下实施例对本发明进行进一步举例说明，这些实施例不应以任何方式解释为对本发明范围施加限制。相反，应清楚地理解，可寻求多个其他实施方案、其修改方案和等同方案，其在本领域技术人员阅读本文中的说明之后可以是明显的而不脱离本发明的精神和/或所附权利要求书的范围。
实施例1A
从完全人噬菌体和酵母展示的scFv文库分离CD19特异性抗体
材料和方法：
a)人ScFv和CD19特异性抗体的产生
由50名健康捐赠者的外周血B细胞构建的初始人scFv(免疫球蛋白的重组单链可变片段)噬菌体展示文库(近似多样性，1010独特特异性)(Z.Y Zhu和D.S.Dimitrov，未公布的数据)用于选择针对重组人CD19蛋白的ScFv(Miltenyi Biotec，未公布的)。将1012个噬菌体展示scFv的扩增文库与5、3和1μg包被的CD19以5×100-μl体积孵育，分别在第一轮、第二轮和第三轮生物淘选期间在室温下均匀分布在96孔板的5个孔中2小时。在每轮孵育之后，用包含0.05％吐温20的磷酸缓冲盐水(PBST)洗涤孔(对于第一轮洗涤5次，后几轮洗涤10次)以除去非特异性结合的噬菌体，在37℃下将结合的噬菌体与TG1感受态细胞混合1小时，从感染的细胞扩增噬菌体并用于下一轮生物淘选。在第三轮生物淘选之后，通过使用自动化BioRobotics BioPick菌落挑选系统(Genomic Solutions，Ann Arbor，MI)从感染的TGI细胞随机挑选380个克隆，并且各自接种到96孔板中含有100μg/ml羧苄青霉素和0.2％葡萄糖的150μl 2YT培养基中。在细菌培养物在600nm处的光密度(OD600)达到0.5之后，将感染复数(multiplicity of infection，MOI)为10的辅助噬菌体M13K07和50μg/ml(终浓度)的卡那霉素添加到培养基中，并进一步将板在30℃下在摇床中以250rpm孵育过夜。将噬菌体上清液与PBS中3％的脱脂乳以4∶1的体积比混合，并且用于酶联免疫吸附测定(ELISA)，以鉴定展示具有高CD19结合亲和力的ScFv或VH的噬菌体克隆。将上清液用在96孔板中以50ng/孔包被的重组人CD19在室温下孵育2小时，并用PBST洗涤5次(在于4℃下孵育过夜之后，将其用PBS中3％的脱脂乳封闭并用包含0.05％吐温20的PBS洗涤三次)。使用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-M13抗体检测CD19结合的噬菌体。在用抗体孵育之后，通过洗涤孔除去非特异性结合的抗体，并添加3，3，’5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物，并测量在450nm下的溶液吸光度(A450)。选择A450＞1.0的与CD19结合的克隆用于进一步表征。
b)所选的可溶性scFv的表达和纯化
对所选的克隆的VH和VL进行DNA测序，并如下所述表达和纯化由具有独特序列的克隆编码的scFv。将从这些克隆中提取的质粒用于HB2151细胞的转化。从含有新鲜转化的细胞的板中挑出单个菌落，接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和0.2％葡萄糖的200ml 2YT培养基中，并在37℃下以250rpm摇动孵育。当培养物在600nm处的OD达到0.90时，添加终浓度为0.5mM的异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷，并将培养物进一步在30℃下孵育过夜。在8,000×g下离心20分钟之后收集细菌沉淀物，并将其重悬于含有0.5mU多黏菌素B(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的PBS缓冲液中。在室温下以50rpm旋转孵育30分钟之后，将重悬的沉淀物在4℃下以25,000×g离心25分钟，并使用Ni-NTA树脂根据供应商方案(Qiagen)将上清液用于ScFv纯化。
c)ELISA结合测定
ELISA结合测定：将50μl的2μg/ml在PBS中的经稀释重组人CD19在4℃下包被在96孔板中过夜。将具有His和Flag标签的经纯化的scFv系列稀释并添加至包被有靶蛋白的孔中。洗涤之后，在室温下添加1∶3000稀释的HRP缀合的抗-Flag抗体持续1小时。洗涤之后，添加3，3，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物，在室温下孵育10分钟之后，添加1N H2SO4以终止反应，并在450nm处读取O.D.以量化相对的ScFv与CD19结合的能力。
d)scFv文库的酵母展示
用于噬菌体展示的相同ScFv起始材料也被并入到酵母ScFv展示系统中。为了补充基于噬菌体的scFv分析，还筛选了表达人scFv文库的酵母文库。为了富集表达与重组CD19-Fc和在CHOK1细胞的细胞表面上表达的CD19二者结合的scFv的酵母，对用CD19转染的CHOK1细胞进行细胞淘选。对于细胞表面上的第一轮淘选，在淘选之前两天，将CHOK1-CD19细胞接种到6孔板中，并在F12K培养基中生长至50％汇合。然后将5×107个酵母细胞用PBSA缓冲液洗涤2次，并重悬于3mL F12 K培养基中，然后轻轻滴加至CHOK1-CD19细胞。在冰上轻轻摇动2小时之后，然后将CHOK1-CD19细胞用冰冷的PBSA洗涤3次，以除去不与CHOK1-CD19结合的酵母细胞，并随后使用0.05％的胰蛋白酶-EDTA(Gibco)将CHOK1-CD19细胞和结合的酵母细胞从板上解离。然后将包含酵母和CHOK1细胞的细胞混合物接种到10mL SDCAA培养基中，在30℃下扩增过夜，并随后在30℃下在SGCAA培养基中诱导16小时。对于第二轮细胞淘选，进行与上述类似的方案，但是使用更严格的洗涤条件。这种淘选方法产生了m19217结合剂。该结合剂以及来自噬菌体展示的其他结合剂的进一步表征表明，需要进行亲和力成熟，因为由该命中物(hit)产生的CAR的生物学特性仍然不是最佳的。
为了提高m19217的亲和力，通过使用易错PCR在scFv基因序列中产生随机点突变产生酵母展示m19217突变scFv文库。在电穿孔之后，随后将所得突变体文库在SDCAA培养基中在30℃下生长过夜，持续16小时，然后转入SGCAA培养基中在30℃下再持续16小时。随后将突变体文库通过MACS(免疫磁柱，Miltenyi Biotec)用CD19-Fc进行分选，CD19-Fc作为捕获抗原以缩小文库的大小并提高可与CD19-Fc结合的突变体群。然后通过用抗c-Myc-Alexa488和CD19-Fc/抗-Hu-Fc对库进行双重染色并选择具有最高结合亲和力以及c-Myc表达水平的结合剂选择最强的结合剂。然后，将该过程再重复两次，直到用经荧光标记抗原对酵母颗粒进行的流式细胞术产生突变体库的相对于起始构建体提高的平均结合亲和力。使用递减量的经标记CD19，通过酵母库的流式细胞术评估结合亲和力。此过程导致0.5μg/ml的M19217的EC50(对于展示ScFv的酵母上经标记CD19的50％结合的有效浓度)提高至亲和力成熟结合剂(M19217-1、19217-2、M19217-7、M19217-23、M19217-29、M19217-38、M19217-40)的亲和力＜0.01μg/ml。
结果：
由于CD19结构的独特挑战，噬菌体展示候选者未产生生物功能性CAR构建体，并且因此，通过酵母展示产生了产生生物活性结合剂的ScFv鉴定。基于酵母展示ScFv的流式细胞术分析，鉴定了8种对重组人CD19具有特异性的ScFv克隆并分别将其标记为人抗CD19ScFv结合剂M19217(LTG2050，首建者克隆，EC50为0.5μg/ml)和以下亲和力成熟结合剂(EC50＜0.01μg/ml)：M19217-1(LTG2065)、M19217-2(LTG2066)、M19217-7(LTG2067)、M19217-23(LTG2068)、M19217-29(LTG2069)、M19217-38(LTG2070)、和M19217-40(LTG2071)。下文实施例2中概述了并入抗CD19 scFv M19217-1序列的串联CAR的产生。
实施例1B
从完全人噬菌体和酵母展示的scFv文库分离CD22特异性抗体
材料和方法：
a)人ScFv和CD22特异性抗体的产生
由50名健康捐赠者的外周血B细胞构建的初始人scFv(免疫球蛋白的重组单链可变片段)噬菌体展示文库(近似多样性，1010独特特异性)(Z.Y Zhu和D.S.Dimitrov，未公布的数据)用于选择针对重组人CD19蛋白的ScFv(Miltenyi Biotec，未公布的)。将1012个噬菌体展示scFv的扩增文库与5、3和1μg包被的CD22以5×100-μl体积孵育，分别在第一轮、第二轮和第三轮生物淘选期间在室温下均匀分布在96孔板的5个孔中2小时。在每轮孵育之后，用包含0.05％吐温20的磷酸缓冲盐水(PBST)洗涤孔(对于第一轮洗涤5次，后几轮洗涤10次)以除去非特异性结合的噬菌体，在37℃下将结合的噬菌体与TG1感受态细胞混合1小时，从感染的细胞扩增噬菌体并用于下一轮生物淘选。在第三轮生物淘选之后，通过使用自动化BioRobotics BioPick菌落挑选系统(Genomic Solutions，Ann Arbor，MI)从感染的TG1细胞随机挑选380个克隆，并且各自接种到96孔板中含有100μg/ml羧苄青霉素和0.2％葡萄糖的150μl 2YT培养基中。在细菌培养物在600nm处的光密度(OD600)达到0.5之后，将感染复数(MOI)为10的辅助噬菌体M13K07和50μg/ml(终浓度)的卡那霉素添加到培养基中，并进一步将板在30℃下在摇床中以250rpm孵育过夜。将噬菌体上清液与PBS中3％的脱脂乳以4∶1的体积比混合，并且用于酶联免疫吸附测定(ELISA)，以鉴定展示具有高CD22结合亲和力的ScFv或VH的噬菌体克隆。将上清液用在96孔板中以50ng/孔包被的重组人CD22在室温下孵育2小时，并用PBST洗涤5次(在于4℃下孵育过夜之后，将其用PBS中3％的脱脂乳封闭并用包含0.05％吐温20的PBS洗涤三次)。使用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-M13抗体检测CD22结合的噬菌体。在用抗体孵育之后，通过洗涤孔除去非特异性结合的抗体，并添加3，3，’5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物，并测量在450nm下的溶液吸光度(A450)。选择A450＞1.0的与CD22结合的克隆用于进一步表征。b)所选的可溶性scFv的表达和纯化
对所选的克隆的VH和VL进行DNA测序，并如下所述表达和纯化由具有独特序列的克隆编码的scFv。将从这些克隆中提取的质粒用于HB2151细胞的转化。从含有新鲜转化的细胞的板中挑出单个菌落，接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和0.2％葡萄糖的200ml 2YT培养基中，并在37℃下以250rpm摇动孵育。当培养物在600nm处的OD达到0.90时，添加终浓度为0.5mM的异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷，并将培养物进一步在30℃下孵育过夜。在8,000×g下离心20分钟之后收集细菌沉淀物，并将其重悬于含有0.5mU多黏菌素B(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的PBS缓冲液中。在室温下以50rpm旋转孵育30分钟之后，将重悬的沉淀物在4℃下以25,000×g离心25分钟，并使用Ni-NTA树脂根据供应商方案(Qiagen)将上清液用于ScFv纯化。
c)ELISA结合测定
对于ELISA分析，将50μl的2μg/ml在PBS中的经稀释重组人CD22在4℃下包被在96孔板中过夜。将具有His和Flag标签的经纯化的scFv系列稀释并添加至包被有靶蛋白的孔中。洗涤之后，在室温下添加1∶3000稀释的HRP缀合的抗-Flag抗体持续1小时。洗涤之后，添加3，3，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物，在室温下孵育10分钟之后，添加1N H2SO4以终止反应，并在450nm处读取O.D.以量化相对的ScFv与CD22结合的能力。
d)scFv文库的酵母展示
用于噬菌体展示的相同ScFv起始材料也被并入到酵母ScFv展示系统中。为了补充基于噬菌体的scFv分析，还筛选了表达人scFv文库的酵母文库。为了富集表达与重组CD22-Fc和在CHOK1细胞的细胞表面上表达的CD19二者结合的scFv的酵母，对用CD22转染的CHOK1细胞进行细胞淘选。对于细胞表面上的第一轮淘选，在淘选之前两天，将CHOK1-CD22细胞接种到6孔板中，并在F12K培养基中生长至50％汇合。然后将5×107个酵母细胞用PBSA缓冲液洗涤2次，并重悬于3mL F12 K培养基中，然后轻轻滴加至CHOK1-CD22细胞。在冰上轻轻摇动2小时之后，然后将CHOK1-CD22细胞用冰冷的PBSA洗涤3次，以除去不与CHOK1-CD22结合的酵母细胞，并随后使用0.05％的胰蛋白酶-EDTA(Gibco)将CHOK1-CD22细胞和结合的酵母细胞从板上解离。然后将包含酵母和CHOK1细胞的细胞混合物接种到10mL SDCAA培养基中，在30℃下扩增过夜，并随后在30℃下在SGCAA培养基中诱导16小时。对于第二轮细胞淘选，进行与上述类似的方案，但是使用更严格的洗涤条件。这种淘选方法产生了16P、24P、25P、11S和12S结合剂。如下文实施例2中所述，在一系列体外CART功能性测定中，将结合剂序列并入到CART构建体中。CART格式的来自噬菌体展示的这些结合剂的表征揭示，仅16P结合剂在体外具有特异性的肿瘤裂解活性，但其与CAR阳性对照相比较低。此外，当在体内异种移植模型中测试基于16P的CART细胞时，其抗肿瘤功能非常弱(下文实施例2)。综述，这些结果表明，需要对抗CD22 ScFv结合剂进行亲和力成熟，因为由该结合剂组产生的CAR的生物学特性仍然不是最佳的。
为了提高16P的亲和力，通过使用易错PCR在scFv基因序列中产生随机点突变产生酵母展示突变scFv文库。在电穿孔之后，随后将所得突变体文库在SDCAA培养基中在30℃下生长过夜，持续16小时，然后转入SGCAA培养基中在30℃下再持续16小时。随后将突变体文库通过MACS(免疫磁柱，Miltenyi Biotec)用CD22-Fc进行分选，CD22-Fc作为捕获抗原以缩小文库的大小并提高可与CD22-Fc结合的突变体群。然后通过用抗c-Myc-Alexa 488和CD19-Fc/抗-Hu-Fc对库进行双重染色并选择具有最高结合亲和力以及c-Myc表达水平的结合剂选择最强的结合剂。然后，将该过程再重复两次，直到用经荧光标记抗原对酵母颗粒进行的流式细胞术产生突变体库的相对于起始构建体提高的平均结合亲和力。使用递减量的经标记CD22，通过酵母库的流式细胞术评估结合亲和力。此过程导致0.5μg/ml的16P的EC50(对于展示ScFv的酵母上经标记CD19的50％结合的有效浓度)提高至亲和力成熟结合剂(16P1、16P2、16P3、16P3v2、16P6、16P8、16P10、16P13、16P15、16P16、16P17、16P20、16P20v2)的亲和力＜0.01μg/ml。
结果：
由于CD22结构的独特挑战，噬菌体展示候选者未产生足够的具有高生物活性和特异性的功能性CAR构建体。因此，通过酵母展示产生了具有生物活性和高特异性的结合剂的ScFv。基于酵母展示ScFv的流式细胞术分析，鉴定了13种对重组人CD22具有特异性的ScFv克隆并分别将其标记为人抗CD22 ScFv结合剂16P(LTG2202，首建者克隆，EC50为0.5μg/ml)和以下亲和力成熟结合剂(EC50＜0.01μg/ml)：16P1、16P2、16P3、16P3v2、16P6、16P8、16P10、16P13、16P15、16P17、16P20和16P20v2。下文实施例2中概述了并入抗CD22 scFv16P17序列的串联CAR的产生。
实施例2
表达完全人抗CD22和抗CD19 scFv结合序列的双重靶向串联CAR
本实施例讨论了同时靶向肿瘤抗原CD19和CD22的双重靶向CAR的产生。已假定该方法有助于减轻肿瘤抗原逃逸，肿瘤抗原逃逸是导致使用单CAR方法(即抗CD19 CAR治疗或抗CD22 CAR治疗)的CAR治疗失败的重要部分(Sotillo，Elena，et al.″Convergence ofacquired mutations and alternative splicing of CD19enables resistance toCART-19 immunotherapy.″Cancer discovery(2015).Gardner，Rebecca，et al.″Acquisition of a CD19 negative myeloid phenotype allows immune escape of MLL-rearranged B-ALL from CD19 CAR-T cell therapy.″Blood(2016)：blood-2015.，Fry，Terry J.，et al.″CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that isnaive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy.″Nature medicine 24.1(2018)：20.)。
已表明使用小鼠scFv序列作为CAR组分引起患者中的免疫排斥或变应性过敏反应，从而限制了CAR T治疗的持久性和实用性，并提高了毒性的风险。因此，在CAR设计中使用完全人scFv结合剂序列对于未来CAR开发是高度优先的。
CD19是85kDa至95kDa跨膜细胞表面糖蛋白受体。CD19是蛋白质的免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，并且包含两个胞外Ig样结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(TedderTF，Isaacs，CM，1989，J Immunol 143：712-171)。CD19修饰B细胞受体信号传导，降低B细胞受体对抗原的触发阈值(Carter，RH，and Fearon，DT，1992，Science，256：105-107)，并与CD81和CD21协调以调节这种必需的B细胞信号传导复合物(Bradbury，LE，Kansas GS，LevyS，Evans RL，Tedder TF，1992，J Immunol，149：2841-50)。在B细胞个体发育期间，CD19能够独立于抗原受体在祖B细胞、前-前-B细胞、前-B细胞、早期B细胞阶段发出信号，并且与Src家族蛋白酪氨酸激酶相关，是酪氨酸磷酸化的，诱导胞内钙动员和肌醇磷脂信号传导二者(Uckun FM，Burkhardt AL，Jarvis L，Jun X，Stealy B，Dibirdik I，Myers DE，Tuel-Ahlgren L，Bolen JB，1983，J Biol Chem 268：21172-84)。与B细胞恶性肿瘤的治疗相关的关键点是：CD19在正常B细胞上以严格受调控的方式表达，受限于处于IgH基因重排阶段的早期B细胞前体、成熟B细胞，但在造血干细胞或成熟浆细胞上不表达(Anderson，KC，Bates，MP，Slaughenhout BL，Pinkus GS，Schlossman SF，Nadler LM，1984，Blood 63：1424-1433)。
智人(Homo sapiens)CD22(SIGLEC-2，Leu14)是在B细胞白血病和淋巴瘤上表达的经充分研究的细胞表面糖蛋白。至少两种抗CD22抗体药物(奥英妥珠单抗)或免疫毒素缀合物(Moxetumomab Pasudotox)已成为临床试验(NCT02981628，NCT00659425)的对象。这些方法已经取得了一些成功，并且仍在研究中，例如与其他化学治疗剂组合(Muller F，StookeyS，Cunningham T，Pastan I，2017，Paclitaxel synergizes with exposure tumeadjusted CD22-targeted immunotoxins against B-cell malignancies，Oncotarget 8：30644-30655)。然而，考虑到用CD19 CAR进行的基于T细胞的治疗的最新进展，靶向表达CD22的恶性肿瘤的最佳方法可能是基于细胞的免疫治疗。特征在于基于m971的抗CD22 CAR的治疗目前正在在国家癌症研究所进行临床试验(NCT02315612，P.I.：Terry Fry，M.D.)。在此提出的靶向CD22 CD19的串联CAR构建体是一种创新的新方法：在一个构建体中产生和实施新的完全人CD19和CD22结合部分，以实现完全的持久缓解并防止肿瘤抗原逃逸。
在该实施例中已采用了单CAR对照作为与靶向CD19和CD22的串联CAR的比较。利用小鼠杂交瘤FMC63来源的scFv的CAR构建体LTG1538是活性对照。该小鼠来源的序列是目前在商业开发中使用的结合剂(参见KTE-C19，Kite Pharma和CTL019，Novartis)。m971CARLTG2200等同于在NCI评价的CAR，并且用作抗CD22 CAR对照。
材料和方法：
(a)细胞系
伯基特淋巴瘤细胞系Raji和慢性髓细胞性白血病系K562购自美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)(ATCC，Manassass，VA)。REH白血病系购自DSMZ(Leibniz Institute DSMZ，Braunschwieg，Germany)。将细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(fetal bovine serum)(FBS，Hyclone，Logan，UT)和2mM L-Glutamax(ThermoFisher Scientific，Grand Island，NY)的RPMI-1640培养基中培养。人胚肾系293T购自ATCC(Gibco/Thermo Fisher Scientific，Grand Island，NY)。通过用编码萤火虫萤光素酶的慢病毒载体(Lentigen Technology，Inc.，Gaithersburg，MD)稳定转导野生型肿瘤系，然后克隆和选择萤光素酶阳性克隆产生表达萤光素酶的细胞系的单细胞克隆。Raji克隆是通过在小鼠中对经萤光素酶转导的Raji细胞进行传代而产生的，并根据其增殖能力进行选择。在捐赠者的书面同意下，从Oklahoma血液研究所(Oklahoma Blood Institute，OBI)的健康志愿者中收集全血。经处理的血沉棕黄层购自OBI(Oklahoma City，OK)。使用CD4-和CD8-微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)的1∶1混合物根据制造商的方案通过阳性选择从血沉棕黄层纯化CD4阳性和CD8阳性人T细胞。
(b)嵌合抗原受体(CAR)-表达载体的产生
CAR抗原结合结构域ScFv序列来自于人抗CD22 ScFv或重链可变片段。通过将结合剂序列与CD8a连接和跨膜结构域(第123至191位aa，参考序列ID NP_001759.3)，然后与4-1BB(CD137，第214至255位aa，UniProt序列ID Q07011)信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域(CD247，第52至163位aa，参考序列ID：NP_000725.1)在框内连接产生CAR T构建体。将CAR构建体序列克隆到三代慢病毒质粒骨架(Lentigen Technology Inc.，Gaithersburg，MD)中。通过HEK 293T细胞的瞬时转染产生包含慢病毒载体(LV)的上清液，并通过离心包含慢病毒载体的上清液使载体沉淀，并储存在-80℃下。
(c)原代T细胞的纯化和转导
使用CD4+和CD8+细胞的免疫磁珠选择根据制造商的方案(Miltenyi Biotec，Bergisch-Gladbach，Germany)从全血或血沉棕黄层(在捐赠者的书面同意下购自商业供应商)中纯化来自健康志愿者的人原代T细胞。在补充有200IU/ml IL-2的TexMACS培养基中以0.3×106至2×106细胞/ml的密度培养T细胞，用CD3/CD28
Figure BPA0000304990170000711
GMP T细胞TransAct试剂(Miltenyi Biotec)活化并在第2天在存在10μg/ml硫酸精蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的情况下用编码CAR构建体的慢病毒载体转导过夜，并在第3天更换培养基。将培养物在补充有200IU/ml IL-2的TexMACS培养基中增殖，直到在第8至13天收获。
(d)免疫效应物测定(CTL和细胞因子)
为了确定细胞介导的细胞毒性(CTL测定)，将用萤火虫萤光素酶稳定转导的5,000个靶细胞与CAR T细胞以多种效应物与靶标之比合并，并孵育过夜。向每个孔添加SteadyGlo试剂(Promega，Madison WI)并将所得的发光量化为每秒的计数(样品CPS)。仅靶标的孔(最大CPS)和仅靶标的孔加1％吐温-20(最小CPS)用于确定测定范围。比裂解百分比(percent specific lysis)计算为：(1-(样品CPS-最小CPS)/(最大CPS-最小CPS))。移出E∶T比例为10∶1的共培养物的上清液并通过ELISA(eBioscience，San Diego，CA)分析IFNγ、TNFα和IL-2的浓度。
(e)流式细胞术分析
对于细胞染色，从培养物中收获了五十万个CAR T转导细胞，在补充有0.5％牛血清白蛋白(Miltenyi Biotec)的冷AutoMACS缓冲液中清洗两次，并通过用CD22-Fc肽随后用抗Fc-PE缀合物(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)染色检测CAR表面表达。在指定的情况下，根据供应商的方案使用与VioBlue荧光团(Miltenyi Biotec)缀合的抗CD4抗体。未经转导的细胞用作阴性对照。通过7AAD染色(BD Biosciences，San Jose，CA)排除所有研究中的死细胞。将细胞清洗两次并重悬于200μl染色缓冲液中，然后通过流式细胞术进行定量分析。在
Figure BPA0000304990170000721
分析仪(Miltenyi Biotec)上进行流式细胞术分析，并使用FlowJo软件(Ashland，OR)生成数据图。
结果：
为了克服肿瘤抗原逃逸，开发了用于双重靶向CD22和CD19肿瘤抗原的串联CAR构建体。图1A和1B中示出了串联CAR设计的方案。通过柔性接头将靶向CD19和CD22的完全人scFv结合剂以22-19或19-22方向(以从膜远端到近端标注)串联连接。然后，将所得CAR结合区段与CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ激活结构域在框内连接以产生CAR 22-19(LTG2681，图1A)或CAR19-22(LTG2719，图1B)。将CAR序列并入三代慢病毒载体中，并应用于原代人T细胞用于转导。
在该实施例中已采用了单CAR对照作为与靶向CD19和CD22的串联CAR的比较。利用小鼠杂交瘤FMC63来源的scFv的CAR构建体LTG1538是活性对照。该小鼠来源的序列是目前在商业开发中使用的结合剂(参见KTE-C19，Kite Pharma和CTL019，Novartis)。m971 CARLTG2200等同于在NCI评价的CAR，并且用作抗CD22 CAR对照。
图2中示出了并入与CD19/CD22抗原反应的单链可变片段(ScFv)序列的抗CD19/CD22 CAR的表面表达。使用两种检测方法之一，通过流式细胞术分析来自健康供体的经LV转导的T细胞确定每种含ScFv的CAR的表达水平：i)CD22-his，随后是抗his-PE；ii)CD19 Fc重组蛋白，随后是抗Fc-A647。与未经转导的T细胞对照相比，在人原代T细胞中，基于ScFv的抗CD19/CD22 CAR构建体CAR22-19 LTG 2681和CAR19-22 LTG2719高度表达。
如图3中所示，表明了CD19/CD22 CAR的高细胞溶解活性。将人原代T细胞用编码CAR构建体(CAR 22-19(LTG2681，D0023)、CAR 19-22(LTG 2791，D0024)、CAR19(LTG1538)或CAR22(LTG2200)；参见方法)的LV转导，然后与用萤火虫萤光素酶稳定转导的Raji、REH或293T细胞系一起孵育18小时，用于基于发光的体外杀伤测定。Raji和Reh白血病系在其表面上表达CD19和CD22，而阴性对照293T则不如此。Raji和REH细胞被串联CAR 22-19(LTG2681)、串联CAR 19-22(LTG27190)和单靶向对照CAR19(LTG1538)和CAR22(LTG2200)有效裂解(图3)。因此，串联CAR22-19和CAR19-22二者在共表达CD19和CD22抗原的肿瘤系中均具有功能，并且针对CD19-CD22-细胞系293T没有自发的杀伤活性，强调了这些构建体的靶标特异性。
接下来，通过使用经改造以仅表达单一靶抗原(CD19或CD22，或无关抗原CD20)的肿瘤系A431或293T来测试串联CAR中每个scFv的独立的功能和特异性。创建了表达CD19的293T-luc系(293T luc CD-19+)或表达CD22的293T-luc系(293T luc-20+)，并将CD20+(293T luc CD20)系用作无关的靶对照(图4A)。293T-19+被CAR 19(LTG1538)和串联CAR22-19(LTG 2681)裂解，但不被CAR22 LTG 2200或未经转导的T细胞对照裂解(图3)。293T-CD22+被串联CAR 22-19(LTG 2681)和单CAR20 LTG2200裂解，但不被单CAR19(LTG 1538)或未经转导的对照裂解，表明了串联CAR的抗原特异性。最后，没有CAR构建体裂解293T lucCD20细胞，因为该抗原不被靶向(图4A)。类似地，在针对仅表达CD19抗原的A431克隆(A431luc CD19)、或仅表达CD22抗原的A431克隆(A431 luc-CD22)或表达抗原CD20的无关靶对照系A431 luc-CD20(其不旨在被串联CAR 19-22和22-19识别)的过夜杀伤测定中，测试了串联CAR T细胞(图4B)。同样，A431 luc CD19系仅被CAR 19(LTG1538)和串联CAR 22-19(LTG2681)裂解，但不被CAR22 LTG 2200或未经转导的T细胞对照裂解，而A431 luc CD22系被串联CAR 22-19(LTG 2681)和单CAR20 LTG2200裂解，但不被单CAR19(LTG 1538)或未经转导的对照裂解，表明了串联CAR的抗原特异性。此外，没有CAR构建体裂解A431 luc CD20细胞，因为该抗原不被靶向(图4B)。该结果强调了串联CAR22-19的每个靶向结构域的独立功能和特异性(图4A至4B)，以及靶向CD19和CD22抗原的串联CAR减轻肿瘤抗原逃逸的潜力。
然后评价了抗CD19/CD22 CAR T细胞关于细胞因子分泌的能力(图5)。将CD19+CD22+Raji肿瘤细胞与串联22-19 CAR T细胞(LTG2681)或阳性对照CAR19(LTG1538)、阳性对照CAR22(LTG2200)或阴性对照未经转导的T细胞(UTD)以10∶1的效应物与靶标之比共孵育过夜，并通过ELISA分析培养物上清液中的IFNγ、TNFα和IL-2。串联CAR 22-19(LTG2681)响应于肿瘤细胞强诱导细胞因子，而阴性对照(未经转导的，UTD)则未产生明显的细胞因子诱导。值得注意的是，串联CAR T表达细胞LTG2681显示出与CAR22对照(LTG2200)相似的IFNγ、TNFα、IL-2水平，以及稍高于单CAR19(LTG1538)对照的细胞因子应答，表明了串联CAR的高效力。重要地，在不存在肿瘤细胞(仅CART的组)的情况下，CAR 22-19不产生细胞因子分泌，这进一步证实了CAR的特异性，并表明串联CAR缺乏紧张性信号传导。
实施例3
并入不同共刺激结构域的双重靶向CAR 22-19构建体显示出稳健的抗肿瘤功能
本实施例讨论了并入不同共刺激结构域的串联CD22-和CD19-双重靶向CAR构建体。在本实施例中，用于CAR 22-19设计的共刺激结构域包括ICOS、OX40、CD27、CD137/4-1BB和CD28。这些共刺激结构域序列来自于已知参与T细胞功能(包括T细胞活化、扩增、持久性、表型分化、记忆形成和抗肿瘤应答)正调节的T细胞表面分子(Zhao Z，Condomines M，vander Stegen SJ，et al：Structural design of engineered costimulation determinestumor rejection kinetics and persistence of CAR T cells.Cancer cell 28：415-428，2015，Guedan S，Posey AD，Jr.，Shaw C，et al：Enhancing CAR T cell persistencethrough ICOS and 4-1BB costimulation.JCI Insight 3，2018，Song D-G，Ye Q，PoussinM，et al：CD27 costimulation augments the survival and antitumor activity ofredirected human T cells in vivo.Blood 119：696-706，2012，Hombach AA，Heiders J，Foppe M，et al：OX40 costimulation by a chimeric antigen receptor abrogatesCD28 and IL-2 induced IL-10 secretion by redirected CD4+Tcells.Oncoimmunology 1：458-466，2012，Yoshinaga SK，Whoriskey JS，Khare SD，et al：T-cell co-stimulation through B7RP-1 and ICOS.Nature 402：827-832，1999)。在一些情况下，CAR接头/铰链区也来自于所使用的共刺激结构域。
设计同时双重靶向CD19和CD22抗原来减轻肿瘤抗原逃逸，肿瘤抗原逃逸已阻碍了接受靶向CD19或CD22的单CAR治疗的患者亚群的治疗益处(Sotillo，Elena，et al.″Convergence of acquired mutations and alternative splicing of CD19 enablesresistance to CART-19 immunotherapy.″Cancer discovery(2015).Gardner，Rebecca，et al.″Acquisition of a CD19 negative myeloid phenotype allows immune escapeof MLL-rearranged B-ALL from CD19 CAR-T cell therapy.″Blood(2016)：blood-2015.，Fry，Terry J.，et al.″CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALLthat is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy.″Naturemedicine 24.1(2018)：20.)。
在CAR设计中，避免可触发宿主抗“外源”免疫应答的非人来源的序列被认为有助于改善CAR T细胞的持久性，并且是优选的。用于本实施例中的所有CAR组分都是人来源的。由与靶向CD19的T细胞膜近端人scFv在框内连接的靶向CD22的T细胞膜远端人scFv构成的基于抗CD 22-19 CAR(LTG2737)的CAR结合剂构造用于实施例3中的所有CAR构建体。
材料和方法：
(a)细胞系
伯基特淋巴瘤细胞系Raji购自美国组织培养物保藏中心(ATCC，Manassass，VA)。将细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，UT)和2mM L-Glutamax(ThermoFisher Scientific，Grand Island，NY)的RPMI-1640培养基中培养。人胚肾系293T购自ATCC(Gibco/Thermo Fisher Scientific，Grand Island，NY)。通过用编码萤火虫萤光素酶的慢病毒载体(Lentigen Technology，Inc.，Gaithersburg，MD)稳定转导野生型肿瘤系，然后克隆和选择萤光素酶阳性克隆产生表达萤光素酶的细胞系的单细胞克隆。通过将人CD19蛋白和人CD22蛋白慢病毒转导到亲本293T-萤光素酶表达克隆中，然后单细胞克隆、选择和扩增CD19或CD22阳性靶细胞克隆(视情况而定)，产生表达CD19和CD22的293T细胞系克隆，分别命名为293TCD19和293TCD22。稳定的表达萤光素酶的Raji克隆是通过在小鼠中对经萤光素酶转导的Raii细胞进行传代而产生的，并根据其增殖能力进行选择。在捐赠者的书面同意下，从Oklahoma血液研究所(OBI)的健康志愿者中收集全血。经处理的血沉棕黄层购自OBI(Oklahoma City，OK)。使用CD4-和CD8-微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)的1∶1混合物根据制造商的方案通过阳性选择从血沉棕黄层纯化CD4阳性和CD8阳性人T细胞。
(b)嵌合抗原受体(CAR)-表达载体的产生
串联CAR抗原结合结构域来自于以抗CD22 scFv-抗CD19-scFv-铰链-跨膜结构域-胞内结构域的构造串联连接的人抗CD22 ScFv序列和人抗CD19 scFv序列。一些CAR T构建体通过将CAR抗原结合结构域与CD8a铰链和跨膜结构域(第123至191位aa，参考序列ID NP_001759.3)并随后与4-1BB(CD137，第214至255位aa，UniProt序列ID Q07011)信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域(CD247，第52至163位aa，参考序列ID：NP_000725.1)在框内连接来产生。在另一些构建体中，将4-1BB共刺激结构域替换为人ICOS、CD27、CD28、OX-40共刺激结构域，使用每个分子的完整信号传导结构域序列。在一些实施方案中，用与共刺激结构域来自于相同的蛋白质的跨膜序列替换CD8跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR的胞内结构域由以串联连接的两个共刺激结构域构成。在一些实施方案中，不使用共刺激结构域，并且将CD3ζ激活结构域直接与跨膜结构域在框内连接。在一些实施方案中，两条CAR链在同一双顺反子表达盒中编码，被2A核糖体跳跃元件隔开，从而使得这两条CAR链能够在用编码双顺反子CAR的慢病毒构建体转导的每个T细胞中共表达。将CAR构建体序列克隆到三代慢病毒质粒骨架中在人EF-1α启动子控制下(Lentigen Technology Inc.，Gaithersburg，MD)。通过HEK 293T细胞的瞬时转染产生包含慢病毒载体(LV)的上清液，并通过离心包含慢病毒载体的上清液使载体沉淀，并储存在-80℃下。
(c)原代T细胞的纯化和转导
使用CD4+和CD8+细胞的免疫磁珠选择根据制造商的方案(Miltenyi Biotec，Bergisch-Gladbach，Germany)从全血或血沉棕黄层(在捐赠者的书面同意下购自商业供应商)中纯化来自健康志愿者的人原代T细胞。在补充有200IU/ml IL-2的TexMACS培养基中以0.3×106至2×106细胞/ml的密度培养T细胞，用CD3/CD28
Figure BPA0000304990170000761
GMP T细胞TransAct试剂(Miltenyi Biotec)活化并在第2天在存在10μg/ml硫酸精蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的情况下用编码CAR构建体的慢病毒载体转导过夜，并在第3天更换培养基。将培养物在补充有200IU/ml IL-2的TexMACS培养基中增殖，直到在第8至13天收获。
(d)免疫效应物测定(CTL和细胞因子)
为了确定细胞介导的细胞毒性(CTL测定)，将用萤火虫萤光素酶稳定转导的5,000个靶细胞与CAR T细胞以多种效应物与靶标之比合并，并孵育过夜。向每个孔添加SteadyGlo试剂(Promega，Madison WI)并将所得的发光量化为每秒的计数(样品CPS)。仅靶标的孔(最大CPS)和仅靶标的孔加1％吐温-20(最小CPS)用于确定测定范围。比裂解百分比计算为：(1-(样品CPS-最小CPS)/(最大CPS-最小CPS))。移出E∶T比例为10∶1的共培养物的上清液并通过ELISA(eBioscience，San Diego，CA)分析IFNγ、TNFα和IL-2的浓度。
(e)流式细胞术分析
对于细胞染色，从培养物中收获了五十万个CAR T转导细胞，在补充有0.5％牛血清白蛋白(Miltenyi Biotec)的冷AutoMACS缓冲液中清洗两次，并通过用CD22-His肽随后用抗His第二检测试剂，同时用CD19 Fc肽随后用抗Fc缀合物(第二检测试剂购自JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)染色检测CAR表面表达。在指定的情况下，根据供应商的方案使用与VioBlue荧光团(Miltenyi Biotec)缀合的抗CD4抗体。未经转导的细胞用作阴性对照。通过7AAD染色(BD Biosciences，San Jose，CA)排除所有研究中的死细胞。将细胞清洗两次并重悬于200μl染色缓冲液中，然后通过流式细胞术进行定量分析。在
Figure BPA0000304990170000771
分析仪(Miltenyi Biotec)上进行流式细胞术分析，并使用FlowJo软件(Ashland，OR)生成数据图。
结果
设计了包含不同共刺激结构域的双重靶向CAR构建体。表1中列出了CAR构建体。图6提供了CAR设计构造的示意图。在一些实施方案中，包含抗CD22 ScFv和抗CD19 scFv序列的串联CAR抗原结合结构域按以下顺序以串联连接：抗CD22 scFv-抗CD19-scFv-铰链-跨膜结构域-胞内结构域(图6A和6B)。在所有情况下，靶向串联结构域构造均基于CAR 22-19(LTG2681)。抗CD 22-19 CAR构建体LTG2737与抗CD 22-19 CAR构建体LTG2681包含相同的CAR序列，但在其构建期间未使用土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)。
数种CAR T构建体通过将CAR抗原结合结构域与CD8a铰链和跨膜结构域在框内连接产生(构建体LTG2737、D0135、D0136、D0137、D0145、D0146、D0147、D0148和D0149)。在另一些构建体中，利用了与共刺激结构域匹配的跨膜结构域序列：CD28用于D139、D140，OX40用于D0137、D0147、D0148。将跨膜结构域与来自于4-1BB(LTG2737)、CD28(D0135、D0139、D0140)、ICOS(D136、D146、D148、D149)、OX40(D0137、D0145、D0147、D0148)或CD27(D0138、D0149)的共刺激结构域在框内连接。所有CAR分子均包含CD3ζ信号传导结构域(CD247，第52至163位aa，参考序列ID：NP_000725.1)。在一个实施方案中，CAR的胞内结构域由以串联连接的两个共刺激结构域CD28和4-1BB构成(D0140，图6B)。在一些实施方案中，使用用于双顺反子表达的2A核糖体跳跃元件在同一T细胞中共表达两种不同的CAR分子(D146、D147、D148、D149，图6C、6D)。在该构造中，每个CAR链仅包含一个靶向CD19或CD22抗原的scFv，并且两条链均通过用编码双顺反子序列的单个慢病毒载体进行转导而在每个被转导的T细胞中共表达。在一些实施方案中，在至少一条CAR链上，未使用共刺激结构域，使得将CD3ζ激活结构域直接与在同一细胞中同时表达的CAR链中一条的跨膜结构域在框内连接(D0146、D0147，图6C)。将CAR构建体序列克隆到三代慢病毒质粒骨架中在人EF-1α启动子控制下(Lentigen Technology Inc.，Gaithersburg，MD)。
表1.CD22和CD19 CAR T靶向构建体和对照
Figure BPA0000304990170000781
Figure BPA0000304990170000791
图7中示出了并入不同共刺激结构域的抗CD22-19 CAR的表面表达。每种含ScFv的CAR的表达水平通过使用如下对两个scFv CAR靶向结构域同时染色对来自健康供体的经LV转导T细胞进行流式细胞术分析确定：i)CD22-his，随后是抗his-PE；ii)CD19 Fc重组蛋白，随后是抗Fc-A647。与未经转导的T细胞对照相比，在人原代T细胞中，所有抗CD22-19 CAR都高度表达。CAR表达水平在71％至90％的范围内(图7)。
如图9所示，表明了抗CD22-19 CAR的高细胞溶解活性：将人原代T细胞用编码CAR构建体(LTG2737、D0135、D0136、D0137、D0138、D0139、D0140、D0145、D0146)的LV转导，然后与用萤火虫萤光素酶稳定转导的Raji、293T、293TCD19或293TCD22细胞系一起孵育18小时，用于基于发光的体外杀伤测定。如每个图右侧的图例所示，使用的效应物与靶标(ET)之比为2.5∶1、5∶1或10∶1。Raji细胞在其表面上表达CD19和CD22，而阴性对照293T则不如此。产生293TCD19和293TCD22靶系以分别稳定表达CD19或CD22靶抗原，并用于评价具有不同共刺激结构域的双重靶向CAR构建体在独立于其他抗原被每个单靶抗原CD19或CD22触发时实现靶标裂解的能力。
Raji细胞被所有双重靶向CAR有效裂解，但不被未经转导的T细胞UTD(阴性对照)裂解(图9A)。相比之下，所有双重靶向CAR构建体裂解单抗原系293TCD19和293TCD22，表明了这些CAR构建体当被单独CD19抗原或被单独CD22抗原激活时触发其抗肿瘤裂解功能的能力(分别为图9B和9D)。相比之下，双重靶向抗CD22-19-CAR均不裂解抗原阴性细胞系293T(图9C)。因此，在共表达CD19和CD22抗原的肿瘤系中以及还在表达CD19或CD22单抗原的293TCD19和293TCD22系中，所有抗CD22-19-CAR均具有功能，并且针对CD19-CD22-细胞系293T没有自发的杀伤活性，强调了这些构建体的靶标特异性。
然后评价了具有不同共刺激结构域的抗CD22-19 CAR关于细胞因子分泌的能力(图8)。将CD19+CD22+Raji肿瘤细胞与表达构建体LTG2737、D0135、D0136、D0137、D0138、D0139、D0140、D0145、D0146的串联抗CD22-19-CAR T细胞或阴性对照未经转导的T细胞(UTD)以10∶1的效应物与靶标之比共孵育过夜，并通过ELISA分析培养物上清液中的IFNγ、TNFα和IL-2(图8)。所有双重靶向CAR均响应于肿瘤细胞强诱导IL-2和TNFα，而阴性对照(未经转导的，UTD)则未产生明显的细胞因子诱导(图8)。值得注意的是，示出的IFNγ水平在所有CAR 22-19中都被强诱导，但对于CAR构建体D0146、D0139、D0136尤其高，表明抗CD22-19CAR的细胞因子应答的强度可通过在CAR设计中使用的共刺激结构域的组成来调节。总之，IFNγ、TNFα和IL-2的诱导分泌谱表明了所有CAR 22-19构建体的高效力。重要地，在不存在肿瘤细胞(仅CART的组)的情况下，抗CD22-19 CAR产生很少至不产生细胞因子分泌，这进一步证实了CAR的特异性，并表明具有不同共刺激结构域的串联抗CD22-19 CAR缺乏紧张性信号传导。
等同方案
在本文中引用的每一篇申请和专利，以及在每一篇所述申请和专利中引用的每一篇文献或参考文献(包括在每一篇授权专利的审查期间；“申请引用文献”)，以及与这些申请和专利中任一个相对应和/或要求其优先权的每一篇PCT和外国申请或专利，以及每一篇中请引用文献中引用或参考的每一篇文献均在此通过引用明确地并入本文，并且可用于实施本发明。更通常地，本文中引用了文献或参考文献，不管是在权利要求书之前的参考文献列表中还是在正文本身；并且，这些文献或参考文献(“本文引用参考文献”)中的每一篇以及在每一篇本文引用参考文献中引用的每一篇文献或参考文献(包括任何制造商说明书、指南等)均在此通过引用明确地并入本文。
对一些具体实施方案的前述描述提供了充分的信息使得其他人员可通过应用目前知识针对不同应用容易地对这样的具体实施方案进行修改或调整而不脱离一般概念，并且因此这样的调整和修改应当且旨在包含在所公开实施方案的等同方案的含义和范围内。应理解的是，本文所使用的短语或术语是出于描述而非限制的目的。在附图和说明书中已经公开了一些示例性实施方案，并且尽管可能已经使用特定的术语，但是除非另作声明，否则其仅以一般性和描述性含义使用，而非出于限制目的，权利要求书的范围因此并不局限于此。此外，本领域技术人员将理解，本文中所讨论方法的某些步骤可以以可替选顺序来排序或步骤可进行组合。因此，这意味着所附权利要求书并不限于本文所公开的具体实施方案。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验就确定本文中所述的本发明实施方案的许多等同方案。这样的等同方案涵盖在所附权利要求书中。
序列表
如37 C.F.R.1.822中所限定的，使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码来显示下文所列的核酸和氨基酸序列。仅显示每个核酸序列的一条链，但互补链被理解为通过对所示链的任何引用而包含在内。在所附序列表中：
SEQ ID NO：1 LTG2681 D0023前导-CD22 VH-(GGGGS)-3 CD22 VL-(GGGGS)-5CD19 VH(GGGGS)-3 CD19 VL CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(构建体CAR 2219)的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000821
Figure BPA0000304990170000831
SEQ ID NO：2 LTG2681 D0023前导-CD22 VH-(GGGGS)-3 CD22 VL(GGGGS)-5 CD19VH(GGGGS)-3 CD19 VL CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(构建体CAR 2219)的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000832
Figure BPA0000304990170000841
SEQ ID NO：3 LTG2791 D0024前导-CD19 VH(GGGGS)-3 CD19 VL-(GGGGS)-5-CD22VH(GGGGS)-3-CD22 VH CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(构建体CAR 1922)的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000842
Figure BPA0000304990170000851
SEQ ID NO：4 LTG2791 D0024前导-CD19 VH(GGGGS)-3-CD19 VL-(GGGGS)-5-CD22VH(GGGGS)-3-CD22 VH CD8铰链+TM-4-1BB-CD3z(构建体CAR 1922)的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000852
Figure BPA0000304990170000861
SEQ ID NO：5完全人CAR19 LTG2065(M19217-1-CD8 TM-4-1BBζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000862
Figure BPA0000304990170000871
SEQ ID NO：6完全人CAR19 LTG2065(M19217-1-CD8 TM-4-1BBζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000872
SEQ ID NO：7小鼠scFv CAR19 LTG1538的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000873
Figure BPA0000304990170000881
SEQ ID NO：8小鼠scFv CAR19 LTG1538的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000882
SEQ ID NO：9 CAR22 LTG2209的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000883
Figure BPA0000304990170000891
SEQ ID NO：10 CD22A 1495(CAR 20A)的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000892
SEQ ID NO：11前导/信号肽序列(LP)的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000901
SEQ ID NO：12前导/信号肽序列(LP)的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000902
SEQ ID NO：35 CD8跨膜结构域的DNA核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000903
SEQ ID NO：36 CD8跨膜结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000904
SEQ ID NO：37 CD8铰链结构域的DNA核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000905
SEQ ID NO：38 CD8铰链结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000906
SEQ ID NO：39 CD8.α.的第137至206号氨基酸铰链和跨膜区的氨基酸序列(NCBIRefSeq：NP.sub.--001759.3)
Figure BPA0000304990170000907
SEQ ID NO：40 4-1BB的信号传导结构域的DNA核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000908
SEQ ID NO：41 4-1BB的信号传导结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000911
SEQ ID NO：42 CD3-ζ的信号传导结构域的DNA核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000912
SEQ ID NO：43 CD3ζ的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000913
SEQ ID NO：44 ScFv CD19(FMC63)的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000921
SEQ ID NO：45 ScFv CD19(FMC63)的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000922
SEQ ID NO：46抗CD33 CAR(LTG1936)的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000931
SEQ ID NO：47抗CD33 CAR(LTG1936)的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000941
SEQ ID NO：48抗间皮素CAR(LTG1904)的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000942
Figure BPA0000304990170000951
SEQ ID NO：49抗间皮素CAR(LTG1904)的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000952
SEQ ID NO：50重链scFv 16P17的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000953
SEQ ID NO：51重链scFv 16P17的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000954
SEQ ID NO：52轻链scFv 16P17的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000961
SEQ ID NO：53轻链scFv 16P17的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000962
SEQ ID NO：54重链scFv M19217-1的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000963
SEQ ID NO：55重链scFv M19217-1的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000964
SEQ ID NO：56轻链scFv M19217-1的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000965
SEQ ID NO：57轻链scFv M19217-1的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000971
SEQ ID NO：58 CAR22 LTG2200(M971-CD8TM-4-1BB-ζ)的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000972
SEQ ID NO：59 CAR22 LTG2200(M971-CD8TM-4-1BB-ζ)的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000981
SEQ ID NO：60 CAR LTG2737(CD22-19 CD8 BBz)的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170000982
Figure BPA0000304990170000991
SEQ ID NO：61 CAR LTG2737 CD22-19 CD8 BBz的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170000992
Figure BPA0000304990170001001
SEQ ID NO：62 CAR D0135 CD22-19 CD8 CD28z的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170001002
Figure BPA0000304990170001011
SEQ ID NO：63 CAR D0135 CD22-19 CD8 CD28z的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170001012
SEQ ID NO：64 CAR D0136 CD22-19 CD8 ICOSz DNA的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170001021
Figure BPA0000304990170001031
SEQ ID NO：65 CAR D0136 CD22-19 CD8 ICOSz的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170001032
SEQ ID NO：66 CAR D0137 CD22-19 CD8 OX40TM OX40z的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170001033
Figure BPA0000304990170001041
Figure BPA0000304990170001051
SEQ ID NO：67 CAR D0137 CD22-19 CD8 OX40TM OX40z的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170001052
SEQ ID NO：68 CAR D0138 CD22-19 CD8 CD27z的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170001053
Figure BPA0000304990170001061
SEQ ID NO：69 CAR D0138 CD22-19 CD8 CD27z的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170001071
SEQ ID NO：70 CAR D0139 CD22-19 CD28 CD28z的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170001072
Figure BPA0000304990170001081
SEQ ID NO：71 CAR D0139 CD22-19 CD28 CD28z的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170001091
SEQ ID NO：72 CAR D0145 CD22-19 CD8 OX40z的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170001092
Figure BPA0000304990170001101
SEQ ID NO：73 CAR D0145 CD22-19 CD8 OX40z的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170001102
Figure BPA0000304990170001111
SEQ ID NO：74 CAR D0140 CD22-19 CD28 CD28 BBz的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170001112
Figure BPA0000304990170001121
SEQ ID NO：75 CAR D0140 CD22-19 CD28 CD28 BBz的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170001122
Figure BPA0000304990170001131
SEQ ID NO：76 CAR D0146 CD19 CD8H&TM ICOS z-_CD22 CD8H&TM 3z的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170001132
Figure BPA0000304990170001141
SEQ ID NO：77 CAR D0146 CD19 CD8H&TM ICOS z_CD22 CD8H&TMz的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170001151
SEQ ID NO：78 CAR D0147 CD19 CD8H OX40TM OX40 z_CD22 CD8H&TM z的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170001152
Figure BPA0000304990170001161
Figure BPA0000304990170001171
SEQ ID NO：79 CAR D0147 CD19 CD8H OX40TM OX40 z_CD22 CD8H&TM 3z的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170001172
SEQ ID NO：80 CAR D0148 CD19 CD8H OX40TM OX40 z_CD22 CD8H&TM ICOS z的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170001181
Figure BPA0000304990170001191
SEQ ID NO：81 CAR D0148 CD19 CD8H OX40TM OX40 z_CD22 CD8H&TM ICOS z的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170001192
Figure BPA0000304990170001201
SEQ ID NO：82 CAR D0149 CD19 CD8H&TM CD27 z_CD22 CD8H&TM ICOS3 z的核苷酸序列
Figure BPA0000304990170001202
Figure BPA0000304990170001211
Figure BPA0000304990170001221
SEQ ID NO：83 CAR D0149 CD19 CD8H&TM ICOS z CD22 CD8H&TM ICOS z的氨基酸序列
Figure BPA0000304990170001222
Figure IPA0000304990110000011
Figure IPA0000304990110000021
Figure IPA0000304990110000031
Figure IPA0000304990110000041
Figure IPA0000304990110000051
Figure IPA0000304990110000061
Figure IPA0000304990110000071
Figure IPA0000304990110000081
Figure IPA0000304990110000091
Figure IPA0000304990110000101
Figure IPA0000304990110000111
Figure IPA0000304990110000121
Figure IPA0000304990110000131
Figure IPA0000304990110000141
Figure IPA0000304990110000151
Figure IPA0000304990110000161
Figure IPA0000304990110000171
Figure IPA0000304990110000181
Figure IPA0000304990110000191
Figure IPA0000304990110000201
Figure IPA0000304990110000211
Figure IPA0000304990110000221
Figure IPA0000304990110000231
Figure IPA0000304990110000241
Figure IPA0000304990110000251
Figure IPA0000304990110000261
Figure IPA0000304990110000271
Figure IPA0000304990110000281
Figure IPA0000304990110000291
Figure IPA0000304990110000301
Figure IPA0000304990110000311
Figure IPA0000304990110000321
Figure IPA0000304990110000331
Figure IPA0000304990110000341
Figure IPA0000304990110000351
Figure IPA0000304990110000361
Figure IPA0000304990110000371
Figure IPA0000304990110000381
Figure IPA0000304990110000391
Figure IPA0000304990110000401
Figure IPA0000304990110000411
Figure IPA0000304990110000421
Figure IPA0000304990110000431
Figure IPA0000304990110000441
Figure IPA0000304990110000451
Figure IPA0000304990110000461
Figure IPA0000304990110000471
Figure IPA0000304990110000481
Figure IPA0000304990110000491
Figure IPA0000304990110000501
Figure IPA0000304990110000511
Figure IPA0000304990110000521
Figure IPA0000304990110000531
Figure IPA0000304990110000541
Figure IPA0000304990110000551
Figure IPA0000304990110000561
Figure IPA0000304990110000571
Figure IPA0000304990110000581
Figure IPA0000304990110000591
Figure IPA0000304990110000601
Figure IPA0000304990110000611
Figure IPA0000304990110000621
Figure IPA0000304990110000631
Figure IPA0000304990110000641
Figure IPA0000304990110000651
Figure IPA0000304990110000661
Figure IPA0000304990110000671
Figure IPA0000304990110000681
Figure IPA0000304990110000691
Figure IPA0000304990110000701
Figure IPA0000304990110000711
Figure IPA0000304990110000721
Figure IPA0000304990110000731
Figure IPA0000304990110000741
Figure IPA0000304990110000751
Figure IPA0000304990110000761
Figure IPA0000304990110000771
Figure IPA0000304990110000781
Figure IPA0000304990110000791
Figure IPA0000304990110000801
Figure IPA0000304990110000811
Figure IPA0000304990110000821
Figure IPA0000304990110000831
Figure IPA0000304990110000841

Claims (48)

1.编码CD19/CD22串联嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，所述CD19/CD22串联嵌合抗原受体(CAR)包含至少一个包含CD19/CD22抗原结合结构域的胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，其中所述CD19/CD22串联嵌合抗原受体(CAR)由包含SEQ ID NO.1、3、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80或82的核苷酸序列编码。
2.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个CD19/CD22抗原结合结构域包含与CD19/CD22结合的抗体的至少一个单链可变片段。
3.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个CD19/CD22抗原结合结构域包含与CD19/CD22结合的抗体的至少一个重链可变区。
4.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个CD19/CD22抗原结合结构域、所述至少一个胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。
5.权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所编码的接头或间隔区结构域来自于CD8或CD28的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
6.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中在所编码的胞外CD19/CD22抗原结合结构域之前是编码前导肽的前导核苷酸序列。
7.权利要求6所述的分离的核酸分子，其中所述前导核苷酸序列包含含有SEQ ID NO：11的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：12的前导氨基酸序列。
8.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD8、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD83、CD86、CD134、CD137、CD154和TNFRSF19，或其任意组合。
9.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中编码所述CD19/CD22串联嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列由包含SEQ ID NO.1、3、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80或82的核苷酸序列或者与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列编码。
10.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域还包含CD3ζ胞内结构域。
11.权利要求10所述的分离的核酸分子，其中所述所编码的至少一个胞内信号传导结构域相对于所述CD3ζ胞内结构域布置在C端侧。
12.权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、初级信号传导结构域，或其任意组合。
13.权利要求12所述的分离的核酸分子，其中所编码的至少一个共刺激结构域包含以下的功能性信号传导结构域：OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)，或其任意组合。
14.嵌合抗原受体(CAR)，其由权利要求1所述的分离的核酸分子编码。
15.权利要求14所述的CAR，其包含至少一个包含CD19/CD22抗原结合结构域的胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，其中所述CD19/CD22串联CAR包含含有SEQ ID NO.2、4、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81或83的氨基酸序列。
16.权利要求15所述的CAR，其中所述CD19/CD22抗原结合结构域包含与CD19/CD22结合的抗体的至少一个单链可变片段。
17.权利要求15所述的CAR，其中所述CD19/CD22抗原结合结构域包含与CD19/CD22结合的抗体的至少一个重链可变区。
18.权利要求15所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD8、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154和TNFRSF19，或其任意组合。
19.权利要求18所述的CAR，其中CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
20.权利要求15所述的CAR，其中胞外CD19/CD22抗原结合结构域、所述胞内信号传导结构域、或这二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。
21.权利要求20所述的CAR，其中所述接头或间隔区结构域来自于CD8或CD28的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
22.权利要求17所述的CAR，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域和初级信号传导结构域。
23.权利要求22所述的CAR，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)，或其组合。
24.载体，其包含权利要求1所述的核酸分子。
25.权利要求24所述的载体，其中所述载体选自：DNA载体、RNA载体、质粒载体、黏粒载体、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体，或其组合。
26.权利要求24所述的载体，其还包含启动子。
27.权利要求26所述的载体，其中所述启动子是诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、自杀型启动子，或其任意组合。
28.细胞，其包含权利要求24所述的载体。
29.权利要求28所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
30.权利要求28所述的细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
31.权利要求28所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
32.制备细胞的方法，其包括用权利要求24所述的载体转导T细胞。
33.产生经RNA改造细胞群的方法，其包括将体外转录的RNA或合成RNA引入到细胞中，其中所述RNA包含权利要求1所述的核酸分子。
34.在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求28所述的细胞。
35.在哺乳动物中治疗或预防癌症的方法，其包括以在所述哺乳动物中有效地治疗或预防癌症的量向所述哺乳动物施用权利要求15所述的CAR。
36.药物组合物，其包含抗肿瘤有效量的人T细胞群，其中所述T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含至少一个包含CD19/CD22抗原结合结构域的胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，其中CD19/CD22串联CAR包含含有SEQ ID NO.2、4、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81或83的氨基酸序列，并且其中所述T细胞是患有癌症的人的T细胞。
37.权利要求36所述的药物组合物，其中所述至少一个跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD8、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154和TNFRSF19，或其任意组合。
38.权利要求36所述的药物组合物，其中所述T细胞是患有血液学癌症的人的T细胞。
39.权利要求38所述的药物组合物，其中所述血液学癌症是白血病或淋巴瘤。
40.权利要求39所述的药物组合物，其中所述白血病是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)或慢性髓细胞性白血病(CML)。
41.权利要求39所述的药物组合物，其中所述淋巴瘤是套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。
42.权利要求38所述的药物组合物，其中所述血液学癌症是多发性骨髓瘤。
43.权利要求36所述的药物组合物，其中人癌症包括成人上皮癌，其包括口腔和咽癌(舌、口、咽、头和颈)、消化系统癌症(食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、肝内胆管、胆囊、胰腺)、呼吸系统癌症(喉、肺和支气管)、骨和关节癌、软组织癌、皮肤癌(黑素瘤、基底和鳞状细胞癌)、儿童肿瘤(神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤)、中枢神经系统的肿瘤(脑、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤)，以及乳腺、生殖系统(子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸、阴茎、子宫内膜)、泌尿系统(膀胱、肾和肾盂、输尿管)、眼和眶、内分泌系统(甲状腺)以及脑和其他神经系统的癌症，或其任意组合。
44.治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向该对象施用包含抗肿瘤有效量的T细胞群的药物组合物，其中所述T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，所述嵌合抗原受体(CAR)包含至少一个包含CD19/CD22抗原结合结构域的胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，其中CD19/CD22串联CAR包含含有SEQ ID NO.2、4、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81或83的氨基酸序列，其中所述T细胞是患有癌症的对象的T细胞。
45.在有此需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用包含抗肿瘤有效量的T细胞群的药物组合物，其中所述T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，所述嵌合抗原受体(CAR)包含至少一个包含CD19/CD22抗原结合结构域的胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域，其中CD19/CD22串联CAR包含含有SEQ ID NO.2、4、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81或83的氨基酸序列，其中所述T细胞是患有癌症的对象的T细胞。
46.权利要求44或45所述的方法，其中所述至少一个跨膜结构域包含含有以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD8、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154，或其任意组合。
47.用于产生表达嵌合抗原受体的细胞的方法，所述方法包括向细胞中引入权利要求1所述的分离的核酸。
48.根据权利要求47所述的用于产生表达嵌合抗原受体的细胞的方法，其中所述细胞是T细胞或包含T细胞的细胞群。
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