JP2023052214A - Cd33、nkg2d及びcd16と結合するタンパク質 - Google Patents

Cd33、nkg2d及びcd16と結合するタンパク質 Download PDF

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Abstract

【課題】CD33、NKG2D受容体、及びCD16と結合する多重特異性結合性タンパク質、ならびにがんの治療に有用な医薬組成物及び治療方法を提供する。【解決手段】以下のもの:(a)NKG2Dに結合する第一の抗原結合部位;(b)CD33に結合する第二の抗原結合部位;及び、(c)抗体FcドメインもしくはCD16に結合するのに十分なその部分、又はCD16に結合する第三の抗原結合部位を含むタンパク質を提供する。【選択図】図1

Description

(関連出願の相互参照)
この出願は、2017年2月20日に出願された米国仮出願第62/461,145号からの優先権の恩
典を主張するものであり、その内容の全体が、あらゆる目的のために本明細書中に参照に
より組み込まれる。
(配列表)
この出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されている、その全体が参照により本
明細書中に組み込まれる配列表を含有する。該ASCIIコピーは、2018年2月19日に作成され
、DFY-007PC_SL.txtと名付けられ、かつ98,304バイトのサイズである。
(本発明の分野)
本発明は、CD33、NKG2D受容体、及びCD16に結合する多重特異性結合性タンパク質に関
する。
(背景)
がんは、この疾患を治療するための文献に報告された多大な研究努力及び科学の前進に
もかかわらず、重要な健康問題であり続けている。成人において最も頻繁に診断されるが
んのいくつかは、前立腺がん、乳がん、及び肺がんを含む。血液学的悪性腫瘍は、固形が
んより低頻度であるが、生存率が低い。これらのがんのための現在の治療選択肢は、全て
の患者について有効ではないか、又は実質的な不利な副作用を有し得るか、あるいはその
両方である。他のタイプのがんもまた、既存の治療選択肢を使用して治療するのが困難な
ままである。
がん免疫療法は、高度に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を
促進することができるので、望ましい。二重特異性T細胞エンゲージャー(engagers)の
ような融合タンパク質は、腫瘍細胞及びT細胞に結合して腫瘍細胞の破壊を促進する、文
献に記載されたがん免疫療法である。ある腫瘍関連抗原及びある免疫細胞に結合する抗体
は、文献に記載されている。たとえば国際公開番号WO 2016/134371及びWO 2015/095412を
参照されたい。
ナチュラルキラー(NK)細胞は、自然免疫系のコンポーネントであり、循環するリンパ球
のおよそ15%を構成する。NK細胞は、事実上全ての組織に浸潤し、当初は、事前の感作を
必要とせずに腫瘍細胞を有効に殺す能力によって特徴付けされた。活性化されたNK細胞は
、細胞傷害性T細胞と同様の手段によって、すなわち、パーフォリン及びグランザイムを
含有する細胞溶解性顆粒を介して、ならびにデス受容体経路を介して、標的細胞を殺す。
活性化されたNK細胞はまた、標的組織への他の白血球の動員を増進するIFN-γのような炎
症性サイトカイン及びケモカインを分泌する。
NK細胞は、その表面の多様な活性化及び阻害性受容体を通じたシグナルに応答する。た
とえば、NK細胞が健康な自己細胞に遭遇すると、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブ
リン様受容体(KIR)の活性化を通じて阻害される。あるいは、NK細胞が外来細胞又はがん
細胞に遭遇すると、それらは、活性化受容体(たとえば、NKG2D、NCR、DNAM1)を通じて活
性化される。NK細胞は、その表面のCD16受容体を通じていくつかの免疫グロブリンの定常
領域によっても活性化される。活性化に対するNK細胞の全体的な感受性は、刺激性シグナ
ル及び阻害性シグナルの総和に依存する。
CD33は、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチンのメンバーである。骨髄系列の細胞上
に主に発現される膜貫通受容体として、CD33は、チロシンキナーゼ駆動性シグナル伝達経
路を弱める効果を通じて炎症及び免疫反応を調節する。たとえば、CD33は、ヒト単球によ
る、IL-1β、TNF-α、及びIL-8のような炎症促進性サイトカインの産生を構成的に抑制す
ることが示されている。
CD33は、造血性がんと関連する。CD33は、ほとんど全ての急性骨髄性白血病(AML)の芽
球において広範に発現される。さらに、造血性がん幹細胞及び/又は前駆細胞は、CD33+
であることが見出されており、CD33指向性療法はそのような症例で正常造血幹細胞を温存
しながら悪性幹細胞及び/又は前駆細胞を潜在的に根絶し得ることが示されている。AML
におけるその発現に加えて、CD33は、他の骨髄性新生物(たとえば、骨髄異形成症候群及
び骨髄増殖性新生物)、及びB細胞及びT細胞の急性リンパ芽球性白血病(ALL)/リンパ
芽球性リンパ腫のサブセットでも見出されている。この発現パターンは、AML、骨髄異形
成症候群、慢性骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病の骨髄性急性転化、及びALLを含む
悪性腫瘍の患者におけるCD33指向性治療薬の使用に導いてきた。
(概要)
本発明は、がん細胞上のCD33、及びナチュラルキラー細胞上のNKG2D受容体及びCD16受
容体に結合する多重特異性結合性タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、2種
類以上のNK活性化受容体をエンゲージすることができ、NKG2Dへの天然リガンドの結合を
遮断し得る。ある実施態様において、このタンパク質は、ヒトにおいて、及びげっ歯類及
びカニクイザルのような他の種において、NK細胞を刺激することができる。本発明の種々
の態様及び実施態様は、以下においてさらに詳細に記載される。
したがって、本発明の一つの態様は、NKG2Dと結合する第一の抗原結合部位;CD33に結
合する第二の抗原結合部位;及び抗体Fcドメイン、CD16を結合するのに十分なその部分、
又はCD16と結合する第三の抗原結合部位、を組み込んだタンパク質を提供する。これらの
抗原結合部位は、各々、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメイン(たとえば抗体
内におけるとおりにアレンジされているか、又は一緒にscFvになるよう融合されている)
を組み込んでいてもよく、又は、1以上の抗原結合部位は、ラクダ科の抗体のようなVHH抗
体、もしくは軟骨魚類に見られるもののようなVNAR抗体などの単一ドメイン抗体であって
もよい。
第一の抗原結合部位は、NKG2Dに結合し、一つの実施態様において、たとえば、配列番
号1と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98
%、99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を有することによって、及び/又は配列番
号1のCDR1(配列番号54)、CDR2(配列番号55)、及びCDR3(配列番号56)配列と同一であるア
ミノ酸配列を組み込むことによって、配列番号1に関連する重鎖可変ドメインを組み込む
ことができる。あるいは、第一の抗原結合部位には、配列番号41に関連する重鎖可変ドメ
イン、及び配列番号42に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえば、
第一の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号41と少なくとも90%(たとえば、90
%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であるこ
とができ、及び/又は配列番号41のCDR1(配列番号57)、CDR2(配列番号58)、及びCDR3(配
列番号59)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗原結合
部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号42と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、92%
、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であることができ、及び
/又は配列番号42のCDR1(配列番号60)、CDR2(配列番号61)、及びCDR3(配列番号62)配列と
同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。他の実施態様において、第一の抗原結合部
位には、配列番号43に関連する重鎖可変ドメイン、及び配列番号44に関連する軽鎖可変ド
メインを組み込むことができる。たとえば、第一の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、
配列番号43と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、9
7%、98%、99%、又は100%)同一であることができ、及び/又は配列番号43のCDR1(配列
番号63)、CDR2(配列番号64)、及びCDR3(配列番号65)配列と同一のアミノ酸配列を組み込
むことができる。同様に、第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号44と少な
くとも90%(たとえば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%
、又は100%)同一であることができ、及び/又は配列番号44のCDR1(配列番号66)、CDR2(
配列番号67)、及びCDR3(配列番号68)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる
いくつかの実施態様において、第一の抗原結合部位は、たとえば、配列番号45と少なく
とも90%(たとえば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、
又は100%)同一のアミノ酸配列、及び配列番号46と少なくとも90%(たとえば、90%、91
%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一のアミノ酸配列
をそれぞれ有することによって、配列番号45に関連する重鎖可変ドメイン、及び配列番号
46に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。別の実施態様において、第一の
抗原結合部位は、たとえば、配列番号47と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、92%
、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一のアミノ酸配列、及び配
列番号48と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97
%、98%、99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列をそれぞれ有することによって、配
列番号47に関連する重鎖可変ドメイン、及び配列番号48に関連する軽鎖可変ドメインを組
み込むことができる。
いくつかの実施態様において、第一の抗原結合部位には、配列番号69に関連する重鎖可
変ドメイン、及び配列番号70に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たと
えば、第一の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号69と少なくとも90%(たとえ
ば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一で
あることができ、及び/又は配列番号69のCDR1(配列番号71)、CDR2(配列番号72)、及びCD
R3(配列番号73)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗原
結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号70と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であることができ、
及び/又は配列番号70のCDR1(配列番号74)、CDR2(配列番号75)、及びCDR3(配列番号76)配
列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。いくつかの実施態様において、第一の
抗原結合部位には、配列番号77に関連する重鎖可変ドメイン、及び配列番号78に関連する
軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえば、第一の抗原結合部位の重鎖可変ド
メインは、配列番号77と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であることができ、及び/又は配列番号77
のCDR1(配列番号69)、CDR2(配列番号80)、及びCDR3(配列番号81)配列と同一のアミノ酸配
列を組み込むことができる。同様に、第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番
号78と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%、又は100%)同一であることができ、及び/又は配列番号78のCDR1(配列番号82
)、CDR2(配列番号83)、及びCDR3(配列番号84)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むこと
ができる。
いくつかの実施態様において、第一の抗原結合部位には、配列番号85に関連する重鎖可
変ドメイン、及び配列番号86に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たと
えば、第一の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号85と少なくとも90%(たとえ
ば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一で
あることができ、及び/又は配列番号85のCDR1(配列番号87)、CDR2(配列番号88)、及びCD
R3(配列番号89)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗原
結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号86と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、9
2%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であることができ、
及び/又は配列番号86のCDR1(配列番号90)、CDR2(配列番号91)、及びCDR3(配列番号92)配
列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。
いくつかの実施態様において、第一の抗原結合部位には、配列番号133に関連する重鎖
可変ドメイン、及び配列番号134に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。
たとえば、第一の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号133と少なくとも90%(た
とえば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同
一であることができ、及び/又は配列番号133のCDR1(配列番号135)、CDR2(配列番号136)
、及びCDR3(配列番号137)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、
第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号134と少なくとも90%(たとえば、90
%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であるこ
とができ、及び/又は配列番号134のCDR1(配列番号138)、CDR2(配列番号139)、及びCDR3(
配列番号140)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。
第二の抗原結合部位には、場合によっては、配列番号93に関連する重鎖可変ドメイン及
び配列番号94に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえば、第二の抗
原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号93と少なくとも90%(たとえば、90%、91%
、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であることができ
、及び/又は配列番号93のCDR1(配列番号95)、CDR2(配列番号96)、及びCDR3(配列番号97)
配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗原結合部位の軽鎖
可変ドメインは、配列番号94と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、92%、93%、94
%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であることができ、及び/又は配列
番号94のCDR1(配列番号98)、CDR2(配列番号99)、及びCDR3(配列番号100)配列と同一のア
ミノ酸配列を組み込むことができる。
あるいは、第二の抗原結合部位には、配列番号101に関連する重鎖可変ドメイン及び配
列番号102に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえば、第二の抗原
結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号101と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、
92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であることができ、
及び/又は配列番号101のCDR1(配列番号103)、CDR2(配列番号104)、及びCDR3(配列番号10
5)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗原結合部位の軽
鎖可変ドメインは、配列番号58と少なくとも90%(たとえば、90%、91%、92%、93%、9
4%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であることができ、及び/又は配
列番号102のCDR1(配列番号106)、CDR2(配列番号107)、及びCDR3(配列番号108)配列と同一
のアミノ酸配列を組み込むことができる。
別の実施態様において、第二の抗原結合部位には、配列番号109に関連する重鎖可変ド
メイン、及び配列番号110に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえ
ば、第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号59と少なくとも90%(たとえば
、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であ
ることができ、及び/又は配列番号109のCDR1(配列番号111)、CDR2(配列番号112)、及びC
DR3(配列番号113)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗
原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号110と少なくとも90%(たとえば、90%、91%
、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であることができ
、及び/又は配列番号110のCDR1(配列番号114)、CDR2(配列番号115)、及びCDR3(配列番号
116)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。
別の実施態様において、第二の抗原結合部位には、配列番号117に関連する重鎖可変ド
メイン、及び配列番号118に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえ
ば、第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号117と少なくとも90%(たとえば
、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であ
ることができ、及び/又は配列番号117のCDR1(配列番号119)、CDR2(配列番号120)、及びC
DR3(配列番号121)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗
原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号118と少なくとも90%(たとえば、90%、91%
、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であることができ
、及び/又は配列番号118のCDR1(配列番号122)、CDR2(配列番号123)、及びCDR3(配列番号
124)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。
別の実施態様において、第二の抗原結合部位には、配列番号125に関連する重鎖可変ド
メイン、及び配列番号126に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえ
ば、第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号125と少なくとも90%(たとえば
、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であ
ることができ、及び/又は配列番号125のCDR1(配列番号127)、CDR2(配列番号128)、及びC
DR3(配列番号129)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗
原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号126と少なくとも90%(たとえば、90%、91%
、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%)同一であることができ
、及び/又は配列番号126のCDR1(配列番号130)、CDR2(配列番号131)、及びCDR3(配列番号
132)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。
いくつかの実施態様において、第二の抗原結合部位には、第一の抗原結合部位に存在す
る軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組
み込む。
いくつかの実施態様において、タンパク質は、CD16を結合するのに十分な抗体Fcドメイ
ンの部分を組み込まれ、ここで、この抗体Fcドメインは、ヒンジ及びCH2ドメイン、及び
/又はヒトIgG抗体のアミノ酸配列234~332と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む
これらのタンパク質のうちの1つを含有する製剤;これらのタンパク質を発現する1以上
の核酸を含有する細胞、及びこれらのタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も
また提供される。
本発明の別の態様は、患者においてがんを治療する方法を提供する。この方法は、本明
細書において記載される多重特異性結合性タンパク質の治療的有効量を、それを必要とす
る患者に投与することを含む。多重特異性結合性タンパク質を使用する治療のための例示
的ながんとしては、たとえば、がんが、AML、骨髄異形成症候群、慢性骨髄単球性白血病
、慢性骨髄性白血病の骨髄急性転化、及びALLからなる群から選択されるものが挙げられ
る。
(図面の簡単な説明)
図1は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体の表現である。各アームは、NKG2D結合ドメイン又はCD33結合ドメインのいずれかを表すことができる。いくつかの実施態様において、NKG2D及びCD33結合ドメインは、共通の軽鎖を共有することができる。
図2は、ヘテロ二量体多重特異性抗体の表現である。NKG2D又はCD33結合ドメインは、scFvフォーマットを採ることができる(右腕)。
図3は、ELISAアッセイにおけるヒト組換えNKG2Dに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の結合親和性を実証する折れ線グラフである。
図4は、ELISAアッセイにおけるカニクイザル組換えNKG2Dに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の結合親和性を実証する折れ線グラフである。
図5は、ELISAアッセイにおけるマウス組換えNKG2Dに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の結合親和性を実証する折れ線グラフである。
図6は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度(MFI)の倍数を示すフローサイトメトリーによる、ヒトNKG2Dを発現するEL4細胞に対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の結合を実証する棒グラフである。
図7は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度(MFI)の倍数を示すフローサイトメトリーによる、マウスNKG2Dを発現するEL4細胞に対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の結合を実証する棒グラフである。
図8は、天然リガンドULBP-6との競合による組換えヒトNKG2D-Fcに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の特異的結合親和性を実証する折れ線グラフである。
図9は、天然リガンドMICAとの競合による組換えヒトNKG2D-Fcに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の特異的結合親和性を実証する折れ線グラフである。
図10は、天然リガンドRae-1デルタとの競合による組換えマウスNKG2D-Fcに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の特異的結合親和性を実証する折れ線グラフである。
図11は、ヒトNKG2D-CD3ゼータ融合タンパク質を発現するTNF-α陽性細胞のパーセンテージを定量することによる、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるヒトNKG2Dの活性化を示す棒グラフである。
図12は、マウスNKG2D-CD3ゼータ融合タンパク質を発現するTNF-α陽性細胞のパーセンテージを定量することによる、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるマウスNKG2Dの活性化を示す棒グラフである。
図13は、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるヒトNK細胞の活性化を示す棒グラフである。
図14は、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるヒトNK細胞の活性化を示す棒グラフである。
図15は、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるマウスNK細胞の活性化を示す棒グラフである。
図16は、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるマウスNK細胞の活性化を示す棒グラフである。
図17は、腫瘍細胞に対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の細胞傷害性効果を示す棒グラフである。
図18は、示差走査型蛍光定量法によって測定されたNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の融解温度を示す棒グラフである。
図19A~19Cは、CD16及びNKG2D結合を使用するNK細胞の相乗的活性化の棒グラフである。図19Aは、CD107aのレベルを実証する;図19Bは、IFNγのレベルを実証する;図19Cは、CD107a及びIFNγのレベルを実証する。グラフは、平均(n=2)±SDを示す。データは、5人の異なる健常ドナーを使用する5回の独立した実験の代表である。
図20は、IgG様の形を維持する三機能性の二重特異性抗体である、Triomab形態のTriNKETの表現である。このキメラは、二つの親抗体から由来する、各々が一つの軽鎖及び一つの重鎖を有する二つの半抗体からなる。Triomab形態は、ラット抗体の1/2及びマウス抗体の1/2を含有するヘテロ二量体の構築物であってもよい。
図21は、ノブ・イントゥー・ホール(knobs-into-holes)(KIH)技術を包含する、KiH共通軽鎖(Common Light Chain)(LC)形態のTriNKETの表現である。KiHは、標的1及び2に結合する二つのFab、及びヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたFcを含有するヘテロ二量体である。KiHフォーマットのTriNKETは、二つの異なる重鎖及び両重鎖と対形成する共通の軽鎖を含有する、標的1及び標的2に結合する二つのfabを有するヘテロ二量体の構築物であってもよい。
図22は、可動性の天然リンカーを介して二つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価IgG様分子を生じる、デュアル可変ドメイン免疫グロブリン(DVD-Ig(商標))形態のTriNKETの表現である。DVD-Ig(商標)は、ホモ二量体の構築物であり、ここで、抗原2を標的とする可変ドメインが抗原1を標的とするFabの可変ドメインのN末端に融合されている。構築物は通常のFcを含有する。
図23は、Fcに融合された標的1及び標的2に結合する二つのFabを含有するヘテロ二量体の構築物である、直交性Fabインターフェイス(Ortho-Fab)形態のTriNKETの表現である。LC-HC対形成は、直交性インターフェイスによって確保される。ヘテロ二量体化は、Fc内の突然変異によって確保される。
図24は、2-イン-1 IgフォーマットのTrinKETの表現である。
図25は、Fcに融合された標的1及び標的2に結合する二つの異なるFabを含有するヘテロ二量体の構築物である、ES形態のTriNKETの表現である。ヘテロ二量体化は、Fc内の静電ステアリング突然変異によって確保される。
図26は、Fabアーム交換形態のTriNKET:重鎖及び付属する軽鎖(半分子)を別の分子由来の重鎖-軽鎖対と取り換えることによってFabアームを交換し、二重特異性抗体をもたらす抗体の表現である。Fabアーム交換形態(cFae)は、標的1及び2に結合する二つのFab、及びヘテロ二量体化突然変異によって安定化されるFcを含有するヘテロ二量体である。
図27は、標的1及び2に結合する二つのFab、及びヘテロ二量体化突然変異によって安定化されるFcを含有するヘテロ二量体である、SEED Body形態のTriNKETの表現である。
図28は、ロイシンジッパーが二つの異なるHCのヘテロ二量体化を誘導するために使用される、LuZ-Y形態のTriNKETの表現である。LuZ-Y形態は、Fcに融合された標的1及び2に結合する二つの異なるscFabを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、FcのC末端に融合されたロイシンジッパーモチーフを通じて確保される。
図29は、Cov-X-Body形態のTriNKETの表現である。
図30A~30Bは、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されるFcに融合された二つの異なるFabを有するヘテロ二量体の構築物である、κλ-Body形態のTriNKETの表現である:抗原1を標的とするFab1はカッパLCを含有し、一方、抗原2を標的とする第二のFabはラムダLCを含有する。図30Aは、κλ-Bodyの一つの形態の例示的表現であり;図30Bは、別のκλ-Bodyの例示的表現である。
図31は、標的1に結合するFab及びFcに融合された標的2に結合するscFabを含むOasc-Fabヘテロ二量体の構築物である。ヘテロ二量体化は、Fc内の突然変異によって確保される。
図32は、DuetMabであり、これは抗原1及び2に結合する二つの異なるFab、及びヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたFcを含有するヘテロ二量体の構築物である。Fab1及び2は、正しい軽鎖(LC)及び重鎖(HC)対形成を確保する差次的S-S架橋を含有する。
図33は、CrossmAbであり、これはヘテロ二量体化によって安定化されたFcに融合された標的1及び2に結合する二つの異なるFabを有するヘテロ二量体の構築物である。CL及びCH1ドメイン、及びVH及びVLドメインが切り替えられる、たとえばCH1が直列にVLと融合され、一方、CLが直列にVHと融合される。
図34は、Fit-Igであり、これは抗原2に結合するFabが抗原1に結合するFabのHCのN末端に融合されているホモ二量体の構築物である。この構築物は、野生型Fcを含有する。
図35A~35Bは、EL4細胞上で発現されたNKG2Dに対する、CD33を標的とするTriNKETの結合プロフィールである。図35Aは、対応するNKG2D結合ドメインを含有するモノクローナル抗体と比較したTriNKETの結合を示す。図35Bは、6個の異なるNKG2D結合ドメインを含むCD33を標的とするTriNKETの結合プロフィールを示す。
図36A及び36Bは、MV4-11ヒトAML細胞上で発現されたCD33に対する、CD33を標的とするTriNKETの結合プロフィールである。図36Cは、Molm-13ヒトAML細胞上で発現されたCD33に対する、CD33を標的とするTriNKET及びCD33モノクローナル抗体の結合プロフィールである。図36Dは、ヒトAML細胞株MV4-11上で発現されたCD33に対する、CD33を標的とするTriNKET及びCD33モノクローナル抗体の結合プロフィールである。
図37A~37Bは、CD33発現ヒトAML細胞株MV4-11との共培養における休止又はIL-2活性化ヒトNK細胞のTriNKET媒介性活性化を実証する、折れ線グラフである。図37Aは、休止ヒトNK細胞のTriNKET媒介性活性化を示す。図37Bは、同じドナーからのIL-2活性化されたヒトNK細胞のTriNKET媒介性活性化を示す。NK細胞単独、TriNKETを用いないMV4-11細胞との共培養でのNK細胞、及びCD20を標的とするTriNKETを、コントロールとして使用した。
図38A~38Cは、三種のヒトAML細胞株、Molm-13細胞株(図38A)、MV4-11細胞株(図38B)、及びTHP-1細胞株(図38C)での高親和性FcRγI(CD64)の発現を示すヒストグラムである。
図39A~39Bは、Molm-13(図39B)又はTHP-1(図39A)細胞のいずれかとの共培養におけるヒトNK細胞のCD33モノクローナル抗体又はTriNKET媒介性活性化の折れ線グラフである。図39Cは、MV4-11ヒトAML細胞株との共培養におけるTriNKETによるヒトNK細胞の活性化を示す。HER2-TriNKETをコントロールとして使用した。
図40A~40Cは、CD33を標的とするTriNKET及び対応するCD33モノクローナル抗体によって媒介された三種のヒトAML細胞株に対するヒトNK細胞傷害性の折れ線グラフである。図40Aは、CD33モノクローナル抗体が、CD64をTHP-1よりも低レベルで発現するMV4-11細胞に対し低減した効力を示したことを示す。図40Bは、CD33モノクローナル抗体が、CD64を発現しないMolm-13細胞に対し良好な効力を示したことを実証する。図40Cは、CD33モノクローナル抗体がTHP-1細胞に効果を示さなかったことを実証する。
図41は、Molm-13細胞に対する休止ヒトNK細胞のTriNKET媒介性細胞傷害性を示す。
図42Aは、健常ドナー由来のB細胞はCD33を標的とするTriNKET媒介性溶解から保護されることを示す棒グラフである。図42Bは、自家CD33+骨髄細胞はCD33を標的とするTriNKET媒介性NK細胞応答から保護され、したがって、TriNKET媒介性溶解に抵抗性であったことを示す棒グラフである。
(詳細な説明)
本発明は、がん細胞上のCD33とナチュラルキラー細胞上のNKG2D受容体及びCD16受容体
とに結合してナチュラルキラー細胞を活性化する多重特異性結合性タンパク質、そのよう
な多重特異性結合性タンパク質を含む医薬組成物、及び、がんの治療のためのものを含む
、そのような多重特異性タンパク質及び医薬組成物を使用する治療方法を提供する。本発
明の種々の態様は、以下において章に分けて説明される;しかし、一つの特定の章におい
て記載される本発明の態様は、いかなる特定の章にも限定されるべきではない。
本発明の理解を促進するために、多数の用語及び語句を以下において定義する。
本明細書において使用される「一つの」(「a」及び「an」)という用語は、「1以上」
(「one or more」)を意味し、文脈上不適切でない限り複数を含む。
本明細書において使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、免疫グロブリン分
子の抗原結合に参加する部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重(「H」)鎖
及び軽(「L」)鎖のN末端可変(「V」)領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖及び
軽鎖のV領域内の三つの高度に多岐にわたるストレッチは、「超可変領域」と呼ばれ、「
フレームワーク領域」又は「FR」として知られる、より保存された隣接ストレッチ間に挟
まれている。そのため、「FR」という用語は、免疫グロブリンにおいて超可変領域の間及
び隣に天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の三つの超可
変領域及び重鎖の三つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するように三次元空間で互い
に関して配置される。この抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に相補的であり、
重鎖及び軽鎖の各々の三つの超可変領域は、「相補性決定領域」又は「CDR」と呼ばれる
。ラクダ及び軟骨魚類のような、ある動物において、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗
体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクト抗体、抗原
結合表面を保持する抗体の抗原結合フラグメント、又は、単一ポリペプチドにおいて軽鎖
可変ドメインに重鎖可変ドメインを接続するためのペプチドリンカーを使用する、scFvの
ような組換えポリペプチドの中に存在することができる。
本明細書において使用される「腫瘍関連抗原」という用語は、タンパク質、糖タンパク
質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない、がんと関連する任
意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞上で、あるいは腫瘍関連血管、細胞外
マトリックス、間葉系間質、又は免疫浸潤のような腫瘍微小環境において、発現されるこ
とができる。
本明細書において使用される場合、「被験者」及び「患者」という用語は、本明細書に
おいて記載される方法及び組成物によって治療されるべき生物を指す。このような生物は
、好ましくは哺乳類(たとえばマウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、など)を含
み、より好ましくはヒトを含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「有効量」という用語は、有益な又は所望の結果を
もたらすのに十分な、化合物(たとえば本発明の化合物)の量を指す。有効量は、1回以上
の投与、適用、又は投薬で投与することができ、特定の製剤又は投与経路に限定されるこ
とを意図しない。本明細書において使用される場合、「治療する」(treating)という用
語は、状態、疾患、障害などの改善、又はその症状の寛解をもたらす、たとえば緩和、低
減、調節、寛解、又は排除のような、任意の効果を含む。
本明細書において使用される場合、「医薬組成物」という用語は、インビボ又はエクス
ビボでの診断又は治療用途のためにその組成物を特に好適にする不活性又は活性の担体と
、活性剤との組み合わせを指す。
本明細書において使用される場合、「医薬として許容し得る担体」という用語は、リン
酸緩衝生理食塩溶液、水、乳濁液(たとえば油/水、又は水/油乳濁液など)、及び種々の
タイプの湿潤剤のような、任意の標準的製薬担体を指す。この組成物はまた、安定剤及び
保存料をも含むことができる。担体、安定剤及びアジュバントの例については、たとえば
Martinの「レミントンの製剤科学」(Remington's Pharmaceutical Sciences)、15版、M
ack Publ. Co., Easton, PA(1975)を参照されたい。
本明細書において使用される場合、「医薬として許容し得る塩」という用語は、被験者
への投与の際、本発明の化合物、又はその活性代謝産物もしくは残基を提供することがで
きる、本発明の化合物の任意の医薬として許容し得る塩(たとえば酸又は塩基)を指す。当
業者には公知のように、本発明の化合物の「塩」は、無機又は有機酸、及び塩基から誘導
されてもよい。例示的な酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル
酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-ス
ルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息
香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられるが、
これらに限定されない。シュウ酸のような他の酸は、それら自体は医薬として許容し得る
ものではないものの、本発明の化合物及びその医薬として許容し得る酸付加塩を入手する
ことにおける中間体として有用な塩の調製において利用してもよい。
例示的な塩基としては、アルカリ金属(たとえばナトリウム)水酸化物、アルカリ土類金
属(たとえばマグネシウム)水酸化物、アンモニア、及び式NW4 +(式中、WはC1~4アルキル
である)の化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な塩としては、以下のもの:酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギ
ン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩
、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩
、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸(flucoheptanoate)、グリセロ
リン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素
酸塩(hydroiodide)、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタ
ンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩(
palmoate)、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバレ
ート、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレート、ウンデカ
ン酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。塩の他の例としては、Na+、NH4 +
及びNW4 +(式中、WはC1~4アルキル基である)のような好適なカチオンと複合した本発明の
化合物のアニオンなどが挙げられる。
治療用途のためには、本発明の化合物の塩は、医薬として許容し得るように企図される
。しかし、医薬として許容し得ない酸及び塩基の塩もまた、たとえば、医薬として許容し
得る化合物の調製又は精製において、用途を見出し得る。
記載全体を通じて、組成物が具体的コンポーネントを有する、含有する、又は含むとし
て記載されている場合、又はプロセス及び方法が具体的工程を有する、含有する、又は含
むとして記載されている場合、付加的に、指定されたそのコンポーネントから本質的にな
る、又は指定されたそのコンポーネントからなる、本発明の組成物があること、及び指定
されたそのプロセス工程から本質的になる、又は指定されたそのプロセス工程からなる、
本発明のプロセス及び方法があることが企図される。
一般的な問題として、パーセンテージを特定する組成物は、別途特記しない限り、重量
による。さらに、変数が定義を伴っていない場合は、その変数の先の定義が支配する。
I. タンパク質
本発明は、がん細胞上のCD33と、ナチュラルキラー細胞上のNKG2D受容体及びCD16受容
体とに結合して、ナチュラルキラー細胞を活性化する多重特異性結合性タンパク質を提供
する。この多重特異性結合性タンパク質は、本明細書において記載される医薬組成物及び
治療方法において有用である。ナチュラルキラー細胞上のNKG2D受容体及びCD16受容体に
対する多重特異性結合性タンパク質の結合は、がん細胞の破壊に向けてナチュラルキラー
細胞の活性を増強する。がん細胞上のCD33に対する多重特異性結合性タンパク質の結合は
、がん細胞をナチュラルキラー細胞の近傍に運び、それがナチュラルキラー細胞によるが
ん細胞の直接又は間接の破壊を促進する。さらに、例示的な多重特異性結合性タンパク質
の説明を以下に提供する。
多重特異性結合性タンパク質の第一のコンポーネントは、NK細胞、γδT細胞及びCD8+
αβT細胞を含むことができるがこれらに限定されない、NKG2D受容体を発現する細胞に結
合する。NKG2D結合に際して、多重特異性結合性タンパク質は、ULBP6及びMICAのような天
然リガンドを、NKG2Dへの結合及びNKG2D受容体の活性化から遮断し得る。
多重特異性結合性タンパク質の第二のコンポーネントは、AML、骨髄異形成症候群、慢
性骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病の骨髄急性転化、及びALLを含むことができるが
これらに限定されない、CD33を発現する細胞に結合する。
多重特異性結合性タンパク質の第三のコンポーネントは、ナチュラルキラー細胞、マク
ロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、及び濾胞性樹状細胞を含む白血球の表面上の
Fc受容体であるCD16を発現する細胞に結合する。
本明細書において記載される多重特異性結合性タンパク質は、種々のフォーマットをと
ることができる。たとえば、一つのフォーマットは、第一の免疫グロブリン重鎖、第一の
免疫グロブリン軽鎖、第二の免疫グロブリン重鎖、及び第二の免疫グロブリン軽鎖を含む
ヘテロ二量体の多重特異性抗体である(図1)。第一の免疫グロブリン重鎖は、第一のFc(
ヒンジ-CH2-CH3)ドメイン、第一の重鎖可変ドメイン、及び場合によっては第一のCH1重鎖
ドメインを含む。第一の免疫グロブリン軽鎖は、第一の軽鎖可変ドメイン及び第一の軽鎖
定常ドメインを含む。第一の免疫グロブリン軽鎖は、第一の免疫グロブリン重鎖と共に、
NKG2Dと結合する抗原結合部位を形成する。第二の免疫グロブリン重鎖は、第二のFc(ヒン
ジ-CH2-CH3)ドメイン、第二の重鎖可変ドメイン、及び場合によっては第二のCH1重鎖ドメ
インを含む。第二の免疫グロブリン軽鎖は、第二の軽鎖可変ドメイン及び第二の軽鎖定常
ドメインを含む。第二の免疫グロブリン軽鎖は、第二の免疫グロブリン重鎖と共に、CD33
と結合する抗原結合部位を形成する。第一のFcドメイン及び第二のFcドメインは、一緒に
、CD16に結合することができる(図1)。いくつかの実施態様において、第一の免疫グロ
ブリン軽鎖は、第二の免疫グロブリン軽鎖と同一であることができる。
別の例示的フォーマットは、第一の免疫グロブリン重鎖、第二の免疫グロブリン重鎖、
及び免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体の多重特異性抗体を包含する(図2)。第一
の免疫グロブリン重鎖は、リンカー又は抗体ヒンジを介して、対形成しNKG2D又はCD33と
結合する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成される単鎖可変フラグメント(s
cFv)に融合された第一のFc(ヒンジ-CH2-CH3)ドメインを含む。第二の免疫グロブリン重鎖
は、第二のFc(ヒンジ-CH2-CH3)ドメイン、第二の重鎖可変ドメイン、及び場合によっては
CH1重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び定常軽鎖ドメイ
ンを含む。第二の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対形成し、NKG2D又はCD3
3に結合する。第一のFcドメイン及び第二のFcドメインは、一緒にCD16に結合することが
できる(図2)。
一つ以上の付加的な結合モチーフは、場合によってはリンカー配列を介して、定常領域
CH3ドメインのC末端に融合されてもよい。ある実施態様において、抗原結合部位は、単鎖
又はジスルフィド安定化可変領域(scFv)であり得、又は四価もしくは三価分子を形成し得
る。
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、Triomab形態であり、
これはIgG様の形を維持する三機能性の二重特異性抗体である。このキメラは、二つの親
抗体から由来する、各々が一つの軽鎖及び一つの重鎖を有する二つの半抗体からなる。
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、KiH共通軽鎖(Common
Light Chain)(LC)形態であり、これはノブ・イントゥー・ホール(knobs-into-holes)(
KIH)技術を包含する。KIHは、ヘテロ二量体化を増進するためにCH3ドメインを改造して「
ノブ」又は「ホール」のいずれかを各重鎖に創出することを包含する。「ノブ・イントゥ
ー・ホール(KiH)」Fc技術の背景コンセプトは、小さい残基を嵩高い残基で置換すること
により(たとえば、EU付番におけるT366WCH3A)、一つのCH3ドメイン(CH3A)中に「ノブ」を
導入することであった。この「ノブ」を収容するために、ノブの最も近くに隣接する残基
をより小さい残基で置き換えることにより(たとえば、T366S/L368A/Y407VCH3B)、他のCH3
ドメイン(CH3B)上に相補的な「ホール」表面が創出された。「ホール」突然変異は、構造
先導型(structured-guided)ファージライブラリースクリーニング(Atwell S, Ridgway
JB,Wells JA, Carter P.の文献、「ファージディスプレイライブラリーを使用するホモ二
量体のドメインインターフェイスのリモデリングからの安定なヘテロ二量体」(Stable he
terodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage dis
play library)、J. Mol. Biol. (1997) 270(1):26-35))によって最適化された。KiH Fc変
異体のX線結晶構造(Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess Cらの文
献、「ノブ・アンド・ホールアグリコシル化半抗体ホモ二量体の逆平行コンフォメーショ
ンはCH2-CH3疎水性相互作用によって媒介される」(Antiparallel conformation of knob
and hole aglycosylated half antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrop
hobic interaction)、J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947-57; Mimoto F, Kadono S, K
atada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori Kの文献、「FcγRsに対して改良された親和性
を有する非対称に改造された新規なFc変異体の結晶構造」(Crystal structure of a nov
el asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for Fc gamma Rs)
、Mol. Immunol. (2014) 58(1):132-8))により、ヘテロ二量体化がCH3ドメイン間のコア
インターフェイスでの立体的相補性によって駆動された疎水性相互作用によって熱力学的
に好まれるのに対し、ノブ-ノブ及びホール-ホールのインターフェイスはそれぞれ立体
障害及び好ましい相互作用の崩壊のためにホモ二量体化を好まないことが、実証された。
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、デュアル可変ドメイン
免疫グロブリン(DVD-Ig(商標))形態にあり、これは、可動性の天然リンカーを介して二
つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせて、四価のIgG様分子を生じる
ものである。
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、直交性Fabインターフ
ェイス(Ortho-Fab)形態にある。ortho-Fab IgGアプローチ(Lewis SM, Wu X, Pustilnik A
, Sereno A, Huang F, Rick HLらの文献、「直交性Fabインターフェイスの構造ベースの
設計による二重特異性IgG抗体の生成」(Generation of bispecific IgG antibodies by
structure-based design of an orthogonal Fab interface)、Nat. Biotechnol. (2014)
32(2):191-8)において、構造ベースの領域設計は、一方のFabのみのLC及びHCVH-CH1イン
ターフェイスで、他方のFabに何らの変化も起こさずに相補的突然変異を導入する。
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、2-イン-1 Igフォーマ
ットにある。いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、ES形態にあ
り、これは、Fcに融合された標的1及び標的2に結合する二つの異なるFabを含有するヘテ
ロ二量体の構築物である。ヘテロ二量体化は、Fcにおける静電ステアリング突然変異によ
って確保される。いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、κλ-B
ody形態にあり、これは、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたFcに融合された
二つの異なるFabを有するヘテロ二量体の構築物である:抗原1を標的とするFab1はカッパ
LCを含有し、一方、抗原2を標的とする第二のFabはラムダLCを含有する。図30Aは、κλ-
Bodyの一形態の例示的表現であり;図30Bは別のκλ-Bodyの例示的表現である。
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、Fabアーム交換(Fab Ar
m Exchange)形態(重鎖及び付属する軽鎖(半分子)を別の分子由来の重鎖-軽鎖対と取り換
えることによってFabアームを交換し、それが二重特異性抗体をもたらす抗体)にある。い
くつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、SEED Body形態にある。ス
トランド交換改造ドメイン(SEED)プラットフォームは、非対称の二重特異性抗体様分子、
天然抗体の治療的適用を拡張する能力を生成するために設計された。このタンパク質改造
プラットフォームは、保存されたCH3ドメイン内で免疫グロブリンの構造的に関連する配
列を交換することに基づいている。SEED設計は、AG/GAヘテロ二量体の効率的生成を可能
にし、一方、AG及びGA SEED CH3ドメインのホモ二量体化を避ける(Muda M.らの文献、Pro
tein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54))。いくつかの実施態様において、多重特異
性結合性タンパク質は、LuZ-Y形態にあり、この中では、二つの異なるHCのヘテロ二量体
化を誘導するためにロイシンジッパーが使用される(Wranik, BJ.らの文献、J. Biol. Che
m. (2012), 287:43331-9)。
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、Cov-X-Body形態にある
。二重特異性CovX-Bodyにおいて、二つの異なるペプチドは、分岐型アゼチジノンリンカ
ーを使用して一緒にされ、穏やかな条件下で部位特異的な方式で足場抗体に融合される。
ファルマコフォアは機能的活性の原因であり、一方、抗体足場は、長い半減期及びIg様分
布を授ける。ファルマコフォアは、化学的に最適化することができ、又は他のファルマコ
フォアと置き換えて、最適化された又は独自の二重特異性抗体を生成することができる(D
oppalapudi VRらの文献、PNAS (2010), 107(52);22611-22616)。
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、Fcに融合された標的1
に結合するFab及び標的2に結合するscFabを含むOasc-Fabヘテロ二量体の形態にある。ヘ
テロ二量体化は、Fcにおける突然変異によって確保される。
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、DuetMab形態にあり、
これは抗原1及び2に結合する二つの異なるFab、及びヘテロ二量体化突然変異によって安
定化されたFcを含有するヘテロ二量体の構築物である。Fab 1及び2は、正しいLC及びHCの
対形成を確保する差次的S-S架橋を含有する。
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、CrossmAb形態にあり、
これは、ヘテロ二量体化によって安定化されるFcに融合された、標的1及び2に結合する二
つの異なるFabを有するヘテロ二量体の構築物である。CL及びCH1ドメイン、及びVH及びVL
ドメインは、切り替えられ、たとえばCH1は直列にVLと融合される一方、CLは直列にVHと
融合される。
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、Fit-Ig形態にあり、こ
れは、抗原2に結合するFabが抗原1に結合するFabのHCのN末端に融合されたホモ二量体の
構築物である。この構築物は、野生型Fcを含有する。
表1は、組み合わせでNKG2Dに結合することができる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメ
インのペプチド配列を掲載する。NKG2D結合ドメインは、NKG2Dに対するその結合親和性が
変化し得るが、それにもかかわらず、それらは全てヒトNKG2D及びNK細胞を活性化する。
Figure 2023052214000002
Figure 2023052214000003
Figure 2023052214000004
Figure 2023052214000005
Figure 2023052214000006
Figure 2023052214000007
Figure 2023052214000008
あるいは、米国第9,273,136号に説明されているように、配列番号49によって定義され
る重鎖可変ドメインは、配列番号50によって定義される軽鎖可変ドメインと対形成させ、
NKG2Dに結合することができる抗原結合部位を形成することができる。
Figure 2023052214000009
あるいは、米国第7,879,985号に説明されているように、配列番号51によって定義さ
れる重鎖可変ドメインは、配列番号52によって定義される軽鎖可変ドメインと対形成させ
、NKG2Dに結合することができる抗原結合部位を形成することができる。
Figure 2023052214000010
表2は、組み合わせでCD33に結合することができる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメ
インのペプチド配列を掲載する。
Figure 2023052214000011
Figure 2023052214000012
あるいは、CD33に結合することができる新規な抗原結合部位は、配列番号53によって定
義されるアミノ酸配列に対する結合についてスクリーニングすることによって同定するこ
とができる。
Figure 2023052214000013
Fcドメイン内において、CD16結合は、ヒンジ領域及びCH2ドメインによって媒介される
。たとえば、ヒトIgG1内において、CD16との相互作用は、CH2ドメイン中のアミノ酸残基A
sp 265 - Glu 269、Asn 297 - Thr 299、Ala 327 - Ile 332、Leu 234 - Ser 239、及び
炭水化物残基N-アセチル-D-グルコサミンに第一義的にフォーカスされる(Sondermannらの
文献、Nature, 406 (6793):267-273を参照されたい)。公知のドメインに基づいて、突然
変異は、ファージディスプレイライブラリー又は酵母表面ディスプレイcDNAライブラリー
を使用することなどによって、CD16に対する結合親和性を増強又は低減するように選択す
ることができ、又は、相互作用の公知の三次元構造に基づいて設計することができる。
ヘテロ二量体の抗体重鎖のアセンブリーは、同じ細胞において二つの異なる抗体重鎖配
列を発現させることによって達成することができ、それは各抗体重鎖のホモ二量体のアセ
ンブリーを、ヘテロ二量体のアセンブリーと同様にもたらし得る。ヘテロ二量体の優先的
なアセンブリーを増進することは、米国第13/494870号、米国第16/028850号、米国第11/5
33709号、米国第12/875015号、米国第13/289934号、米国第14/773418号、米国第12/81120
7号、米国第13/866756号、米国第14/647480号、及び米国第14/830336号に示されるように
、各抗体重鎖定常領域のCH3ドメインに異なる突然変異を組み込むことによって達成する
ことができる。たとえば、突然変異は、ヒトIgG1に基づいて、第一のポリペプチド及び第
二のポリペプチド内にこれらの二つの鎖が相互に選択的にヘテロ二量体化することを可能
にする別個の対のアミノ酸置換を組み込むことによって、CH3ドメインに作製することが
できる。以下において説明されるアミノ酸置換の位置は、全てKabatにおけるようにEUイ
ンデックスに従って付番されている。
一つのシナリオにおいて、第一のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、元のアミノ酸
を、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)又はトリプトファン(W)から選択
される、より大きいアミノ酸で置き換え、かつ、第二のポリペプチドにおける少なくとも
一つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、又
はバリン(V)から選ばれる、より小さいアミノ酸で置き換え、このより大きいアミノ酸置
換(突起物)がこのより小さいアミノ酸置換の表面(空洞)の中にフィットするようにする。
たとえば、一つのポリペプチドにはT366W置換を組み込むことができ、他方にはT366S、L3
68A、及びY407Vを含む三つの置換を組み込むことができる。
本発明の抗体重鎖可変ドメインは、場合によっては、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインを含
む、CH1ドメインを有する又は有さないIgG定常領域のような、抗体定常領域と少なくとも
90%同一のアミノ酸配列にカップリングすることができる。いくつかの実施態様において
、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトIgG1定常領域、IgG2定常領域、IgG3定常領域、又はIg
G4定常領域のような、ヒト抗体定常領域と少なくとも90%同一である。いくつかの他の実
施態様において、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、又はウマの
ような別の哺乳類由来の抗体定常領域と少なくとも90%同一である。1以上の突然変異は
、ヒトIgG1定常領域と比較して定常領域の中に、たとえばQ347、Y349、L351、S354、E356
、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、
F405、Y407、K409、T411及び/又はK439に、組み込むことができる。例示的な置換として
は、たとえば、Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L35
1K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K
、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L
368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394
F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、
Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D、及びK439Eが挙げられる。
ある実施態様において、ヒトIgG1定常領域のCH1に組み込むことができる突然変異は、
アミノ酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171、及び/又はV173にあっても
よい。ある実施態様において、ヒトIgG1定常領域のCκに組み込むことができる突然変異
は、アミノ酸E123、F116、S176、V163、S174、及び/又はT164にあってもよい。
アミノ酸置換は、表3に示される以下の置換のセットから選択し得る。
Figure 2023052214000014
あるいは、アミノ酸置換は、表4に示される以下の置換のセットから選択し得る。
Figure 2023052214000015
あるいは、アミノ酸置換は、表5に示される以下の置換のセットから選択し得る。
Figure 2023052214000016
あるいは、各ポリペプチド鎖における少なくとも一つのアミノ酸置換は、表6から選択
し得る。
Figure 2023052214000017
あるいは、少なくとも一つのアミノ酸置換は、表7における以下の置換のセットから選
択し得、ここで、第一のポリペプチドの縦列に示される位置は、任意の公知の負に荷電し
たアミノ酸で置き換えられ、第二のポリペプチドの縦列に示される位置は、任意の公知の
正に荷電したアミノ酸で置き換えられる。
Figure 2023052214000018
あるいは、少なくとも一つのアミノ酸置換は、表8における以下のセットから選択し得
、ここで、第一のポリペプチドの縦列に示される位置は、任意の公知の正に荷電したアミ
ノ酸で置き換えられ、第二のポリペプチドの縦列に示される位置は、任意の公知の負に荷
電したアミノ酸で置き換えられる。
Figure 2023052214000019
あるいは、アミノ酸置換は、表9に示される以下の置換のセットから選択し得る。
Figure 2023052214000020
あるいは、又はそれに加えて、ヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性は、第一の又は
第二のポリペプチド鎖のいずれかにS354Cを、かつ、反対側のポリペプチド鎖にY349Cを、
導入することによって増大してもよく、これは二つのポリペプチドのインターフェイス内
に人為的なジスルフィド架橋を形成する。
上で記載した多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えDNA技術を使用して作製
することができる。たとえば、第一の免疫グロブリン重鎖をコードする第一の核酸配列は
、第一の発現ベクター中にクローニングすることができる;第二の免疫グロブリン重鎖を
コードする第二の核酸配列は、第二の発現ベクター中にクローニングすることができる;
免疫グロブリン軽鎖をコードする第三の核酸配列は、第三の発現ベクター中にクローニン
グすることができる;第一、第二、及び第三の発現ベクターは、宿主細胞中に一緒に安定
にトランスフェクトして、多量体タンパク質を産生させることができる。
多重特異性タンパク質の最大の収率を達成するために、第一、第二、及び第三の発現ベ
クターの異なる比を探求して、宿主細胞中へのトランスフェクションのための最適比を決
定することができる。トランスフェクション後、単一のクローンは、限界希釈法、ELISA
、FACS、顕微鏡法、又はClonepixのような、当該分野において公知の方法を使用して、細
胞バンク生成のために単離することができる。
クローンは、バイオリアクターのスケールアップに好適な条件下で培養し、多重特異性
タンパク質の発現を維持することができる。多重特異性タンパク質は、遠心分離、深層ろ
過、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結融解、親和性精製、ゲルろ過、イオン交換ク
ロマトグラフィ、疎水性相互作用交換クロマトグラフィ、及び混合モードクロマトグラフ
ィを含む、当該分野において公知の方法を使用して、単離及び精製することができる。
II. 多重特異性タンパク質の特徴
ある実施態様において、NKG2D結合ドメイン及びCD33のための結合ドメインを含む、本
明細書において記載される多重特異性タンパク質は、ヒトNKG2Dを発現する細胞に結合す
る。ある実施態様において、多重特異性タンパク質は、同じCD33結合ドメインを有するモ
ノクローナル抗体のレベルと匹敵するレベルで腫瘍関連抗原CD33に結合する。しかし、本
明細書において記載される多重特異性タンパク質は、腫瘍成長の低減及びCD33を発現する
癌細胞の殺傷において、対応するCD33モノクローナル抗体よりも有効となり得る。
ある実施態様において、NKG2D結合ドメイン及びCD33のための結合ドメインを含む、本
明細書において記載される多重特異性タンパク質は、抗原CD33を発現する腫瘍細胞と共に
培養する場合、初代ヒトNK細胞を活性化することができる。NK細胞活性化は、CD107a脱顆
粒及びIFNγサイトカイン産生の増大を特徴とする。さらに、同じCD33結合ドメインを含
むモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、抗原CD33を発現する腫瘍細
胞の存在下でヒトNK細胞の優れた活性化を示す。
ある実施態様において、NKG2D結合ドメイン及びCD33のための結合ドメインを含む、本
明細書において記載される多重特異性タンパク質は、抗原CD33を発現する腫瘍細胞の存在
下で休止及びIL-2活性化されたヒトNK細胞の活性を増強することができる。
ある実施態様において、NKG2D結合ドメイン及び腫瘍関連抗原CD33のための結合ドメイ
ンを含む、本明細書において記載される多重特異性タンパク質は、抗原CD33を発現する腫
瘍細胞の存在下で、休止及びIL-2活性化されたヒトNK細胞の細胞傷害活性を増強すること
ができる。ある実施態様において、多重特異性タンパク質は、対応するモノクローナル抗
体と比較して、中程度及び低度のCD33を発現する腫瘍細胞に対して利点を与えることがで
きる。
ある実施態様において、対応するCD33モノクローナル抗体と比較して、本明細書におい
て記載される多重特異性タンパク質は、高発現のFc受容体(FcR)を有するがん、又は高レ
ベルのFcRを有する腫瘍微小環境にあるがんを治療することにおいて、有利となり得る。
モノクローナル抗体は、腫瘍成長に対するその効果を、中でも特にADCC、CDC、食作用、
及びシグナル遮断を含む複数のメカニズムを通して発揮する。FcγRの中で、CD16は、IgG
Fcに対して最も低い親和性を有する;FcγRI(CD64)は、高親和性FcRであり、これはCD16
よりも約1000倍より強くIgG Fcと結合する。CD64は、通常、骨髄性分化系列のような多く
の造血分化系列で発現され、急性骨髄性白血病(AML)のようなこれらの細胞タイプから由
来する腫瘍上で発現されることができる。MDSC及び単球のような、腫瘍に浸潤する免疫細
胞もまた、CD64を発現し、腫瘍微小環境に浸潤することが知られている。腫瘍による又は
腫瘍微小環境におけるCD64の発現は、モノクローナル抗体療法に対して不利な影響を有す
ることができる。抗体は高親和性受容体に好んで結合するので、腫瘍微小環境におけるCD
64の発現は、これらの抗体がNK細胞の表面上のCD16にエンゲージすることを困難にする。
多重特異性タンパク質は、NK細胞の表面の二つの活性化受容体を標的とすることを通じて
、モノクローナル抗体療法に対する(腫瘍上又は腫瘍微小環境における)CD64発現の不利な
影響を克服することができる。腫瘍細胞上でのCD64発現にかかわらず、NK細胞上の二つの
活性化受容体をデュアル標的化することはNK細胞へのより強い特異的結合を提供するので
、多重特異性タンパク質は、全ての腫瘍細胞に対するヒトNK細胞応答を媒介することがで
きる。
いくつかの実施態様において、本明細書において記載される多重特異性タンパク質は、
低減されたオン標的オフ腫瘍副作用を通じてより良い安全性プロフィールを提供し得る。
ナチュラルキラー細胞及びCD8 T細胞は、共に腫瘍細胞を直接的に溶解することができる
が、NK細胞及びCD8 T細胞が腫瘍細胞から正常自己を認識するメカニズムは相違する。NK
細胞の活性は、活性化(NCR、NKG2D、CD16、など)受容体及び阻害性(KIR、NKG2A、など)受
容体からのシグナルのバランスによって調節される。これらの活性化シグナル及び阻害性
シグナルのバランスは、NK細胞が、ストレスを受けた、ウイルス感染した又はトランスフ
ォームした自己細胞から健康な自己細胞を判別することを可能にする。この自己寛容性の
「ビルトイン」メカニズムは、正常健康組織をNK細胞応答から保護することを助けること
になる。この原理を拡張するために、NK細胞の自己寛容性は、TriNKETが、オフ腫瘍副作
用なしに、又はより増大した治療的ウィンドウを有して、自己及び腫瘍の両方に発現され
る抗原を標的とすることを可能にすることになる。ナチュラルキラー細胞とは異なって、
T細胞は、活性化及びエフェクター機能のためにMHC分子によって提示される特異的ペプチ
ドの認識を必要とする。T細胞は、免疫療法の一次標的であり、腫瘍に対してT細胞応答を
再方向付けするために多くの戦略が開発されてきた。T細胞二重特異性体(bispecifics)
、チェックポイント阻害剤、及びCAR-T細胞は、全てFDAによって承認されているが、しば
しば用量規制毒性が問題となる。T細胞二重特異性体及びCAR-T細胞は、腫瘍細胞の表面上
の抗原を標的とするために結合ドメインを使用することにより、及びエフェクター細胞に
活性化シグナルを伝達するために改造されたシグナリングドメインを使用することにより
、TCR-MHC認識系の周辺で作用する。抗腫瘍免疫応答を誘起するのに有効であるが、これ
らの療法は、しばしばサイトカイン放出症候群(CRS)、及びオン標的オフ腫瘍副作用と結
びつけられる。多重特異性タンパク質は、NK細胞活性化及び阻害の天然系を「無視する」
ことがないので、この文脈において独特である。その代わりに、多重特異性タンパク質は
、バランスを左右し、健康な自己に対するNKの寛容性を維持しながら、NK細胞に対する付
加的な活性化シグナルを提供するように設計されている。
いくつかの実施態様において、本明細書において記載される多重特異性タンパク質は、
同じCD33結合ドメインを含む対応するCD33モノクローナル抗体よりも有効に、腫瘍の進行
を遅延させることができる。いくつかの実施態様において、本明細書において記載される
多重特異性タンパク質は、がん転移に対して、同じCD33結合ドメインを含む対応するCD33
モノクローナル抗体よりも有効であることができる。
III. 治療的適用
本発明は、本明細書に記載される多重特異性結合性タンパク質及び/又は本明細書に記
載される医薬組成物を使用してがんを治療する方法を提供する。この方法は、治療的有効
量の本明細書に記載される多重特異性結合性タンパク質を、それを必要とする患者に投与
することにより、CD33を発現する多種多様ながんを治療するために使用し得る。
この治療方法は、治療すべきがんにしたがって特徴付けすることができる。たとえば、
ある実施態様において、がんは、AML、骨髄異形成症候群、慢性骨髄単球性白血病、慢性
骨髄性白血病の骨髄急性転化、及びALLである。
ある他の実施態様において、がんは、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直
腸がん、子宮内膜がん、食道がん、白血病、肺がん、肝臓がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓
がん、直腸がん、腎がん、胃がん、精巣がん、又は子宮がんである。さらに別の実施態様
において、がんは、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経芽腫、肉腫(たとえば血
管肉腫又は軟骨肉腫)、喉頭がん、耳下腺がん、胆道系がん、甲状腺がん、末端部黒質黒
色腫、光線角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、アデノイド嚢胞癌、腺腫、
腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星状細胞腫瘍、バルトリ
ン腺癌、基底細胞癌、胆道がん、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノ
イド、胆管細胞癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫/癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血
病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器がん、十二指腸がん、内分泌系がん、内
胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん
、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼窩がん、女性生殖器がん、限局性結節性過形成、胆
嚢がん、胃幽門がん、胃底がん、胃腺腫、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓がん、血管芽腫
、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸が
ん、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平上皮新生物、肝内胆管がん、浸潤性扁平
上皮癌、空腸がん、関節がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫
、悪性黒子黒色腫、リンパ腫、男性生殖器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽腫、髄
上皮腫、髄膜がん、中皮がん、転移癌、口がん、粘膜表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉がん、
鼻道がん、神経系がん、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、非上皮性皮膚がん、非ホジキンリ
ンパ腫、燕麦細胞癌、オリゴデンドログリアがん、口腔がん、骨肉腫、乳頭漿液性腺癌、
陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸がん、腎細胞癌、
呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔がん、皮膚がん、小
細胞癌、小腸がん、平滑筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁
平上皮癌、横紋筋がん、中皮下がん、表在性悪性黒色腫、T細胞白血病、舌がん、未分化
癌、尿管がん、尿道がん、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸がん、子宮体がん、ブドウ膜
黒色腫、膣がん、疣状癌、ビポーマ、外陰がん、高分化癌、又はウィルムス腫瘍である。
ある他の実施態様において、がんは、B細胞リンパ腫、又はT細胞リンパ腫のような非ホ
ジキンリンパ腫である。ある実施態様において、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞
型B細胞リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、
マントル細胞リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、節外辺縁帯B細胞リンパ腫、節辺縁帯B細
胞リンパ腫、脾辺縁帯B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫
、有毛細胞白血病、又は原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫などのB細胞リンパ腫である。
ある他の実施態様において、非ホジキンリンパ腫は、前駆Tリンパ芽球性リンパ腫、末梢T
細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、節外ナチュラルキラ
ー/T細胞リンパ腫、腸症型T細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様T細胞リンパ腫、未分化大細
胞リンパ腫、又は末梢T細胞リンパ腫などのT細胞リンパ腫である。
治療すべきがんは、がん細胞の表面上に発現される特定の抗原の存在に従って特徴付け
することができる。ある実施態様において、がん細胞は、CD33に加えて、以下のもの:CD
2、CD19、CD20、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4
/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B
7.2、CTLA4、及びPD1の一つ以上を発現することができる。
IV. 組み合わせ療法
本発明の別の態様は、組み合わせ療法を提供する。本明細書において記載される多重特
異性結合性タンパク質は、がんを治療するために付加的な治療剤と組み合わせて使用する
ことができる。
がんの治療において組み合わせ療法の一部として使用してもよい例示的な治療剤として
は、たとえば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、
ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ド
キソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリ
クス、レトロゾール、ラルキトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムス
チン、サイマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビ
ノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エ
リプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、
ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カル
モフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、
イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプ
ロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステ
ロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン-α、イ
ンターフェロン-2α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、コロニー刺激因子-1
、コロニー刺激因子-2、デニロイキンジフチトクス、インターロイキン-2、黄体ホルモン
放出因子、及びその同族受容体への差次的結合及び増大したもしくは低減した血清半減期
を呈し得る前述の剤のバリエーションが挙げられる。
がんの治療において組み合わせ療法の一部として使用してもよいさらなるクラスの剤は
、免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、
(i)細胞傷害性T‐リンパ球関連抗原4(CTLA4)、(ii)プログラムド細胞死タンパク質1(PD1)
、(iii)PDL1、(iv)LAG3、(v)B7-H3、(vi)B7-H4、及び(vii)TIM3の、一つ以上を阻害する
剤が挙げられる。CTLA4阻害剤イピリムマブは、黒色腫を治療するために米国食品医薬品
局によって承認されている。
がんの治療において組み合わせ療法の一部として使用してもよいさらに他の剤としては
、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体剤(たとえばハーセプチン)及
び非細胞傷害性剤(たとえばチロシンキナーゼ阻害剤)が挙げられる。
さらに他の抗がん剤のカテゴリーとしては、たとえば:(i)ALK阻害剤、ATR阻害剤、A2A
アンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Bcr-Ablチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトンチロ
シンキナーゼ阻害剤、CDC7阻害剤、CHK1阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、DNA-
PK阻害剤、DNA-PK及びmTORの両方の阻害剤、DNMT1阻害剤、DNMT1阻害剤プラス2-クロロデ
オキシアデノシン、HDAC阻害剤、ハリネズミシグナル伝達経路阻害剤、IDO阻害剤、JAK阻
害剤、mTOR阻害剤、MEK阻害剤、MELK阻害剤、MTH1阻害剤、PARP阻害剤、ホスホイノシチ
ド3キナーゼ阻害剤、PARP1及びDHODHの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソ
メラーゼII阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、VEGFR阻害剤、及びWEE1阻害剤から選択さ
れる阻害剤;(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25、又はICOSのアゴニ
スト;及び(iii)IL-12、IL-15、GM-CSF、及びG-CSFから選択されるサイトカインが挙げら
れる。
本発明のタンパク質は、一次病変の外科的除去の補助としても使用することができる。
多重特異性結合性タンパク質及び付加的な治療剤の量、及び投与の相対的なタイミング
は、所望の組み合わされた治療効果を達成するために選択してもよい。たとえば、そのよ
うな投与を必要とする患者に組み合わせ療法を投与する場合、組み合わせの治療剤、又は
これらの治療剤を含む医薬組成物もしくは組成物は、たとえば、順次、同時期に、一緒に
、同時に、などの任意の順序で投与してもよい。さらに、たとえば、多重特異性結合性タ
ンパク質は、付加的な治療剤がその予防的又は治療的効果を発揮する間に投与してもよく
、又はその逆であってもよい。
V. 医薬組成物
本開示は、治療的有効量の本明細書において記載されるタンパク質を含有する医薬組成
物をも特徴とする。この組成物は、多様な薬物送達系における使用のために製剤化するこ
とができる。一つ以上の生理学的に許容し得る賦形剤又は担体もまた、適正な製剤化のた
めに組成物に含ませることができる。本開示における使用のために好適な製剤は、「レミ
ントンの製剤科学」(Remington's Pharmaceutical Sciences)、Mack Publishing Compa
ny, Philadelphia, Pa., 第17版, 1985に見い出される。薬物送達の方法の手短な総説に
ついては、たとえば Langerの文献(Science 249:1527-1533, 1990)を参照されたい。
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、又はシリンジに含有させてもよい。あ
る実施態様において、このバッグは、チューブ及び/又は針を含むチャンネルに繋げても
よい。ある実施態様において、製剤は、凍結乾燥製剤又は液体製剤であってもよい。ある
実施態様において、製剤は、フリーズドライ(凍結乾燥)し、約12~60本のバイアルに封
入してもよい。ある実施態様において、製剤は、フリーズドライしてもよく、45 mgのフ
リーズドライ製剤を1本のバイアルに封入してもよい。ある実施態様において、約40 mg
~約100 mgのフリーズドライ製剤を、1本のバイアルに封入してもよい。ある実施態様に
おいて、12、27、又は45本のバイアルからのフリーズドライ製剤を一緒にして、静脈内薬
物製剤における治療的用量のタンパク質を得る。ある実施態様において、製剤は、液体製
剤であってもよく、約250 mg/バイアル~約1000 mg/バイアルとして貯蔵してもよい。あ
る実施態様において、製剤は、液体製剤であってもよく、約600 mg/バイアルとして貯蔵
してもよい。ある実施態様において、製剤は、液体製剤であってもよく、約250 mg/バイ
アルとして貯蔵してもよい。
この本開示は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療的有効量のタンパク質を含む液体水性
医薬製剤で存在し得る。
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌してもよく、又は滅菌ろ過してもよい
。得られる水性溶液は、そのまま使用するために包装してもよく、又は凍結乾燥してもよ
く、凍結乾燥された調製物は、投与に先立って滅菌水性担体と一緒にする。調製物のpHは
、典型的には3及び11の間になり、より好ましくは5及び9の間又は6及び8の間であり、最
も好ましくは7及び8の間であり、たとえば7~7.5である。得られる固体形態の組成物は、
各々が固定された量の上記の剤(単数又は複数)を含有する複数の単回用量単位に包装し
てもよい。固体形態の組成物は、可動的な量のために容器中に包装することもできる。
ある実施態様において、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリ
ウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム
、ポリソルベート80、水、及び水酸化ナトリウムとの組み合わせで本開示のタンパク質を
含む、延長された貯蔵寿命を有する製剤を提供する。
ある実施態様において、水性製剤は、pH緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含めて調製
される。本発明の緩衝液は、約4~約8、たとえば約4.5~約6.0、又は約4.8~約5.5の範囲
のpHを有していてもよく、又は約5.0~約5.2のpHを有していてもよい。上記のpHの中間の
範囲もまた、本開示の一部であることが意図される。たとえば、上限及び/又は下限とし
て上記される値の任意の組み合わせを使用する値の範囲は、含まれることが意図されてい
る。この範囲内にpHをコントロールする緩衝液の例としては、酢酸塩(たとえば酢酸ナト
リウム)、コハク酸塩(コハク酸ナトリウムなど)、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン
酸塩、及びその他の有機酸緩衝液が挙げられる。
ある実施態様において、製剤は、pHを約4~約8の範囲に維持するためのクエン酸塩及び
リン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある実施態様において、pH範囲は、約4.5~約6.0、又
は約pH4.8~約5.5であってもよく、又は約5.0~約5.2のpH範囲にあってもよい。ある実施
態様において、緩衝系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム
二水和物、及び/又はリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある実施態様において、
緩衝系は、約1.3 mg/mlのクエン酸(たとえば1.305 mg/ml)、約0.3 mg/mlのクエン酸ナト
リウム(たとえば0.305 mg/ml)、約1.5 mg/mlのリン酸二ナトリウム二水和物(たとえば1.5
3 mg/ml)、約0.9 mg/mlのリン酸二水素ナトリウム二水和物(たとえば0.86)、及び約6.2 m
g/mlの塩化ナトリウム(たとえば6.165 mg/ml)を含む。ある実施態様において、緩衝系は
、1~1.5 mg/mlのクエン酸、0.25~0.5 mg/mlのクエン酸ナトリウム、1.25~1.75 mg/ml
のリン酸二ナトリウム二水和物、0.7~1.1 mg/mlのリン酸二水素ナトリウム二水和物、及
び6.0~6.4 mg/mlの塩化ナトリウムを含む。ある実施態様において、製剤のpHは、水酸化
ナトリウムで調整される。
等張剤として作用し、抗体を安定化し得るポリオールも、製剤に含まれていてもよい。
ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化させてもよい量で製剤に添加される。あ
る実施態様において、水性製剤は等張であってもよい。添加されるポリオールの量は、ポ
リオールの分子量に関して変えてもよい。たとえば、(トレハロースのような)二糖と比較
してより少ない量の単糖(たとえばマンニトール)を添加してもよい。ある実施態様におい
て、等張化剤として製剤において使用してもよいポリオールは、マンニトールである。あ
る実施態様において、マンニトール濃度は、約5~約20 mg/mlであってもよい。ある実施
態様において、マンニトールの濃度は、約7.5~15 mg/mlであってもよい。ある実施態様
において、マンニトールの濃度は、約10~14 mg/mlであってもよい。ある実施態様におい
て、マンニトールの濃度は、約12 mg/mlであってもよい。ある実施態様において、ポリオ
ール、ソルビトールを製剤に含ませてもよい。
洗剤又は界面活性剤もまた、製剤に添加してもよい。例示的な洗剤としては、ポリソル
ベート類(たとえばポリソルベート20、80など)又はポロクサマー類(たとえばポロクサマ
ー188)のような非イオン性洗剤が挙げられる。添加される洗剤の量は、製剤化された抗体
の凝集を低減する、及び/又は製剤中の粒子の形成を最小限にする、及び/又は吸着を低
減するような量である。ある実施態様において、製剤は、ポリソルベートである界面活性
剤を含んでいてもよい。ある実施態様において、製剤は、洗剤、ポリソルベート80又はTw
een 80を含有してもよい。Tween 80は、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエー
トを記載するために使用される用語である(Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio C
antor Verlag Aulendorfの文献、第4版、1996を参照されたい)。ある実施態様において、
製剤は、約0.1 mg/mL及び約10 mg/mLの間、又は約0.5 mg/mL及び約5 mg/mLの間のポリソ
ルベート80を含有してもよい。ある実施態様において、約0.1%ポリソルベート80を製剤
に添加してもよい。
(複数の)実施態様において、本開示のタンパク質生成物は、液体製剤として製剤化さ
れる。液体製剤は、ゴム栓で閉じ、アルミ製のクリンプシールクロージャーで密閉された
USP / Ph Eur type I 50R バイアル中の10 mg/mL濃度で提示してもよい。この栓は、USP
及びPh Eurに準拠したエラストマーで製造してもよい。ある実施態様において、バイアル
には、抽出可能容量を60 mLとするために、61.2 mLのタンパク質生成物溶液を充填しても
よい。ある実施態様において、液体製剤は、0.9%生理食塩水溶液で希釈してもよい。
ある実施態様において、本開示の液体製剤は、安定化レベルの糖との組み合わせで10 m
g/mL濃度の溶液として調製してもよい。ある実施態様において、液体製剤は、水性担体中
に調製してもよい。ある実施態様において、静脈内投与に望ましくない又は適さない粘度
をもたらし得る量を超えない量で安定剤を添加してもよい。ある実施態様において、糖は
、二糖類、たとえばスクロースであってもよい。ある実施態様において、液体製剤は、一
つ以上の緩衝剤、界面活性剤、及び保存料をも含んでいてもよい。
ある実施態様において、液体製剤のpHは、医薬として許容し得る酸及び/又は塩基の添
加によって設定してもよい。ある実施態様において、医薬として許容し得る酸は、塩酸で
あってもよい。ある実施態様において、塩基は、水酸化ナトリウムであってもよい。
凝集に加えて、脱アミド化は、発酵、採取/細胞清澄化、精製、薬物質/薬物生成物貯蔵
の間、及びサンプル分析の間に起こり得るペプチド及びタンパク質の一般的な生成物変異
体である。脱アミド化は、加水分解を行うことができるコハク酸イミド中間体を形成する
タンパク質からのNH3の喪失である。コハク酸イミド中間体は、親ペプチドの17ダルトン
の質量低減をもたらす。後続する加水分解は、18ダルトンの質量増大をもたらす。コハク
酸イミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性のために困難である。それ自体、脱ア
ミド化は、典型的には1ダルトンの質量増大として検出可能である。アスパラギンの脱ア
ミド化は、アスパラギン酸又はイソアスパラギン酸のいずれかをもたらす。脱アミド化の
速度に影響するパラメーターとしては、pH、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、
局所ポリペプチドコンフォメーション及び三次構造が挙げられる。ペプチド鎖においてAs
nに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響する。タンパク質配列においてAsnに
続くGly及びSerは、脱アミド化に対してより高い感受性をもたらす。
ある実施態様において、本開示の液体製剤は、タンパク質生成物の脱アミノ化を防ぐた
めのpH及び湿度条件下で保存されてもよい。
本明細書における目的の水性担体は、医薬として許容し得る(ヒトに対する投与につい
て安全かつ非毒性の)ものであり、液体製剤の調製に有用なものである。実例となる担体
としては、注射用の滅菌水(SWFI)、注射用の静菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(たとえばリン酸
緩衝生理食塩水)、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル溶液、又はデキストロース溶液が挙げ
られる。
保存料は、細菌の作用を低減するために、場合によっては、本明細書における製剤に添
加してもよい。保存料の添加は、たとえば、多回使用(複数回投与)製剤の製造を促進し得
る。
静脈内(IV)製剤は、患者が移植後に病院にいてIV経路を介して全ての薬剤を受けている
場合のように、特定の場合において好ましい投与経路であり得る。ある実施態様において
、液体製剤は、投与前に0.9%塩化ナトリウム溶液で希釈される。ある実施態様において
、注射用の希釈された薬剤生成物は等張であり、静脈内注入による投与に好適である。
ある実施態様において、塩又は緩衝剤コンポーネントは、10 mM~200 mMの量で添加し
てもよい。塩類及び/又は緩衝剤は、医薬として許容し得るものであり、「塩基形成性」
金属又はアミンを用いて種々の公知の酸(無機及び有機)から誘導される。ある実施態様に
おいて、緩衝剤は、リン酸緩衝剤であってもよい。ある実施態様において、緩衝剤は、グ
リシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝剤であってもよく、その場合、ナトリウム、カリウ
ム又はアンモニウムイオンは、対イオンとして役立つ。
保存料は、細菌の作用を低減するために、場合によっては、本明細書における製剤に添
加してもよい。保存料の添加は、たとえば、多回使用(複数回投与)製剤の製造を促進し得
る。
本明細書における目的の水性担体は、医薬として許容し得る(ヒトに対する投与につい
て安全かつ非毒性の)ものであり、液体製剤の調製に有用なものである。実例となる担体
としては、注射用の滅菌水(SWFI)、注射用の静菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(たとえばリン酸
緩衝生理食塩水)、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル溶液、又はデキストロース溶液が挙げ
られる。
この本開示は、タンパク質及び凍結乾燥保護剤を含む凍結乾燥製剤で存在し得る。凍結
乾燥保護剤は、糖、たとえば二糖類であってもよい。ある実施態様において、凍結乾燥保
護剤は、スクロース又はマルトースであってもよい。凍結乾燥製剤は、緩衝剤、界面活性
剤、増量剤、及び/又は保存料の一つ以上をも含んでいてもよい。
凍結乾燥薬剤生成物の安定化に有用なスクロース又はマルトースの量は、少なくとも1:
2のタンパク質対スクロース又はマルトースの重量比であってもよい。ある実施態様にお
いて、タンパク質対スクロース又はマルトース重量比は、1:2~1:5であってもよい。
ある実施態様において、製剤のpHは、凍結乾燥前に、医薬として許容し得る酸及び/又
は塩基の添加によって設定してもよい。ある実施態様において、医薬として許容し得る酸
は塩酸であってもよい。ある実施態様において、医薬として許容し得る塩基は水酸化ナト
リウムであってもよい。
凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のpHは、6~8に調整してもよい。あ
る実施態様において、凍結乾燥薬剤生成物のpH範囲は、7~8であってもよい。
ある実施態様において、塩又は緩衝剤コンポーネントは、10 mM~200 mMの量で添加し
てもよい。塩類及び/又は緩衝剤は、医薬として許容し得るものであり、「塩基形成性」
金属又はアミンを用いて種々の公知の酸(無機及び有機)から誘導される。ある実施態様に
おいて、緩衝剤は、リン酸緩衝剤であってもよい。ある実施態様において、緩衝剤は、グ
リシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝剤であってもよく、その場合、ナトリウム、カリウ
ム又はアンモニウムイオンは、対イオンとして役立つ。
ある実施態様において、「増量剤」を添加してもよい。「増量剤」は、凍結乾燥混合物
に質量を加え、凍結乾燥ケーキの物理的構造に貢献する(たとえば開放孔(open pore)構
造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの産生を促進する)化合物である。実例とな
る増量剤としては、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール及びソルビトール
が挙げられる。本発明の凍結乾燥製剤は、このような増量剤を含有してもよい。
保存料は、細菌の作用を低減するために、場合によっては、本明細書における製剤に添
加してもよい。保存料の添加は、たとえば、多回使用(複数回投与)製剤の製造を促進し得
る。
ある実施態様において、凍結乾燥薬剤生成物は、水性担体を用いて構成されていてもよ
い。本明細書における目的の水性担体は、医薬として許容し得る(ヒトに対する投与につ
いて安全かつ非毒性の)ものであり、凍結乾燥後に、液体製剤の調製に有用なものである
。実例となる希釈剤としては、注射用の滅菌水(SWFI)、注射用の静菌水(BWFI)、pH緩衝溶
液(たとえばリン酸緩衝生理食塩水)、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル溶液、又はデキスト
ロース溶液が挙げられる。
ある実施態様において、現開示の凍結乾燥薬剤生成物は、注射用の滅菌水、USP(SWFI)
、又は0.9%塩化ナトリウム注射、USPのいずれかを用いて再構成される。再構成の間に、
凍結乾燥粉末は溶液に溶解する。
ある実施態様において、本開示の凍結乾燥タンパク質生成物は、約4.5 mLの注射用水に
構成され、0.9%生理食塩水溶液(塩化ナトリウム溶液)で希釈される。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、特定の患者、組成物、及び投
与モードについて所望の治療応答を患者に毒性なしに達成するのに有効な活性成分の量を
得るように、変化させてもよい。
具体的用量は、各患者について均一な用量、たとえば、50~5000 mgのタンパク質であ
ることができる。あるいは、患者の用量は、その患者のおよその体重又は表面積に適合さ
せることができる。適切な投薬を決定することにおける他の要因は、治療又は防止すべき
疾患又は状態、疾患の重症度、投与の経路、及び患者の年齢、性別及び医学的状態を含む
ことができる。さらに、治療のための適切な投薬を決定するために必要な計算の改善は、
特に本明細書において開示される投薬情報及びアッセイに照らして、当業者によってルー
チンに行われる。投薬は、適切な用量反応データと一緒に使用される投薬を決定するため
の公知のアッセイの使用を通じて決定することもできる。個別の患者の投薬は、疾患の進
行の監視につれて調整することができる。患者における標的可能な構築物又は複合体の血
液レベルは、有効濃度に到達する又はそれを維持するために投薬を調整する必要があるか
どうかを調べるために測定することができる。ファーマコゲノミクスは、所定の個体につ
いてどのような標的可能な構築物及び/又は複合体、及びその投薬が、最も有効である可
能性が高いかを決定するために使用してもよい(Schmitzらの文献、Clinica Chimica Acta
308: 43-53, 2001; Steimerらの文献、Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001)。
一般に、体重に基づく投薬は、体重1kg当たり約0.01 μg~約100 mgであり、たとえば
、約0.01 μg~約100 mg/kg体重、約0.01 μg~約50 mg/kg体重、約0.01 μg~約10 mg/k
g体重、約0.01 μg~約1 mg/kg体重、約0.01 μg~約100 μg/kg体重、約0.01 μg~約50
μg/kg体重、約0.01 μg~約10 μg/kg体重、約0.01 μg~約1 μg/kg体重、約0.01 μg
~約0.1 μg/kg体重、約0.1 μg~約100 mg/kg体重、約0.1 μg~約50 mg/kg体重、約0.1
μg~約10 mg/kg体重、約0.1 μg~約1 mg/kg体重、約0.1 μg~約100 μg/kg体重、約0
.1 μg~約10 μg/kg体重、約0.1 μg~約1 μg/kg体重、約1 μg~約100 mg/kg体重、約
1 μg~約50 mg/kg体重、約1 μg~約10 mg/kg体重、約1 μg~約1 mg/kg体重、約1 μg
~約100 μg/kg体重、約1 μg~約50 μg/kg体重、約1 μg~約10 μg/kg体重、約10 μg
~約100 mg/kg体重、約10 μg~約50 mg/kg体重、約10 μg~約10 mg/kg体重、約10 μg
~約1 mg/kg体重、約10 μg~約100 μg/kg体重、約10 μg~約50 μg/kg体重、約50 μg
~約100 mg/kg体重、約50μg~約50 mg/kg体重、約50 μg~約10 mg/kg体重、約50 μg~
約1 mg/kg体重、約50 μg~約100 μg/kg体重、約100 μg~約100 mg/kg体重、約100 μg
~約50 mg/kg体重、約100 μg~約10 mg/kg体重、約100 μg~約1 mg/kg体重、約1 mg~
約100 mg/kg体重、約1 mg~約50 mg/kg体重、約1 mg~約10 mg/kg体重、約10 mg~約100
mg/kg体重、約10 mg~約50 mg/kg体重、約50 mg~約100 mg/kg体重である。
用量は、1回以上を、毎日、毎週、毎月、又は毎年、あるいは2~20年ごとに1回、与え
られてもよい。当業者は、測定された体液又は組織における標的可能な構築物又は複合体
の滞留時間及び濃度に基づいて投薬の反復率を容易に見積もることができる。本発明の投
与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内、カテーテルを介
した灌流によるもの、又は直接病巣内注射によるものであり得る。これは、毎日1回以上
、毎週1回以上、毎月1回以上、及び毎年1回以上、投与してもよい。
上記の説明は、本発明の複数の態様及び実施態様を記載する。本特許明細書は、これら
の態様及び実施態様の全ての組み合わせ及び並べ替えを具体的に企図する。
(実施例)
ここで一般的に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによりさらに容
易に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明のある態様及び実施態様の実例の目的
のみのために含まれており、本発明を限定することを意図していない。
実施例1: NKG2D結合ドメインはNKG2Dに結合する
NKG2D結合ドメインは精製された組換えNKG2Dに結合する
ヒト、マウス又はカニクイザルNKG2D外部ドメインの核酸配列を、ヒトIgG1 Fcドメイン
をコードする核酸配列と融合させ、発現されるべき哺乳類細胞中に導入した。精製後、NK
G2D-Fc融合タンパク質を、マイクロプレートのウェルに吸着させた。非特異的結合を防ぐ
ためにウシ血清アルブミンを用いてウェルをブロッキングした後、NKG2D結合ドメインを
滴定し、NKG2D-Fc 融合タンパク質を予め吸着させたウェルに添加した。一次抗体結合は
、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲート化されヒトカッパ軽鎖を特異的
に認識してFc交差反応性を回避する二次抗体を使用して検出した。ホースラディッシュペ
ルオキシダーゼの基質である3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)をウェルに添加し
て、結合シグナルを可視化し、その吸光度を、450 nMで測定し、540 nMで修正した。NKG2
D結合ドメインクローン、アイソタイプコントロール又は陽性コントロール(配列番号45~
48、又はeBioscienceで入手可能な抗マウスNKG2DクローンMI-6及びCX-5)を各ウェルに添
加した。
アイソタイプコントロールは、組換えNKG2D-Fcタンパク質に最小限の結合を示したが、
一方、陽性コントロールは、組換え抗原に最も強力に結合した。全てのクローンによって
産生されたNKG2D結合ドメインは、ヒト、マウス、及びカニクイザル組換えNKG2D-Fcタン
パク質を横断的に結合することを実証したが、クローンごとの親和性の変化を伴っていた
。一般に、各抗NKG2Dクローンは、ヒト(図3)及びカニクイザル(図4)組換えNKG2D-Fcに同
様の親和性で結合したが、マウス(図5)組換えNKG2D-Fcに対してはより低い親和性で結合
した。
NKG2D結合ドメインはNKG2Dを発現する細胞に結合する
EL4マウスリンパ腫細胞株を、ヒト又はマウスNKG2D-CD3ゼータシグナリングドメインキ
メラ抗原受容体を発現するように改造した。NKG2D結合クローン、アイソタイプコントロ
ール又は陽性コントロールを100 nM濃度で使用して、EL4細胞上で発現された細胞外NKG2D
を染色した。抗体結合は、フルオロフォアをコンジュゲート化した抗ヒトIgG二次抗体を
使用して検出した。細胞は、フローサイトメトリーで解析し、バックグラウンドに対する
倍数(FOB)を、親EL4細胞と比較してのNKG2D発現細胞の平均蛍光強度(MFI)を使用して算出
した。
全てのクローンによって産生されたNKG2D結合ドメインは、ヒト及びマウスNKG2Dを発現
するEL4細胞に結合した。陽性コントロール抗体(配列番号45~48、又はeBioscienceで入
手可能な抗マウスNKG2DクローンMI-6及びCX-5から選択される)は、最良のFOB結合シグナ
ルを与えた。各クローンについてのNKG2D結合親和性は、ヒトNKG2D(図6)及びマウスNKG2D
(図7)を発現する細胞間で同様であった。
実施例2: NKG2D結合ドメインはNKG2Dへの天然リガンド結合を遮断する
ULBP-6との競合
組換えヒトNKG2D-Fcタンパク質を、マイクロプレートのウェルに吸着させ、これらのウ
ェルを、ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングして、非特異的結合を低減させた。飽
和濃度のULBP-6-His-ビオチンをウェルに添加し、続いて、NKG2D結合ドメインクローンを
添加した。2時間のインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、NKG2D-Fcでコーティング
したウェルに結合した残存するULBP-6-His-ビオチンを、ストレプトアビジンをコンジュ
ゲート化したホースラディッシュペルオキシダーゼ及びTMB基質によって検出した。吸光
度を、450 nMで測定し、540 nMで修正した。バックグラウンドを差し引いた後、NKG2D-Fc
タンパク質に対するNKG2D結合ドメインの特異的結合を、ウェル中のNKG2D-Fcタンパク質
への結合から遮断されたULBP-6-His-ビオチンのパーセンテージから算出した。陽性コン
トロール抗体(配列番号45~48から選択される)及び種々のNKG2D結合ドメインは、NKG2Dへ
のULBP-6結合を遮断したが、一方、アイソタイプコントロールは、ULBP-6との競合をほと
んど示さなかった(図8)。
MICAとの競合
組換えヒトMICA-Fcタンパク質を、マイクロプレートのウェルに吸着させ、これらのウ
ェルを、ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングして、非特異的結合を低減させた。NK
G2D-Fc-ビオチンをウェルに添加し、続いて、NKG2D結合ドメインを添加した。インキュベ
ーション及び洗浄後、MICA-Fcでコーティングしたウェルに結合した残存するNKG2D-Fc-ビ
オチンを、ストレプトアビジン-HRP及びTMB基質を使用して検出した。吸光度は、450 nM
で測定し、540 nMで修正した。バックグラウンドを差し引いた後、NKG2D-Fcタンパク質へ
のNKG2D結合ドメインの特異的結合を、MICA-Fcでコーティングされたウェルへの結合から
遮断されたNKG2D-Fc-ビオチンのパーセンテージから算出した。陽性コントロール抗体(配
列番号45~48から選択される)及び種々のNKG2D結合ドメインは、NKG2DへのMICA結合を遮
断したが、一方、アイソタイプコントロールは、MICAとの競合をほとんど示さなかった(
図9)。
Rae-1デルタとの競合
組換えマウスRae-1デルタ-Fc(R&D Systemsから購入した)を、マイクロプレートのウェ
ルに吸着させ、これらのウェルを、ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングして、非特
異的結合を低減させた。マウスNKG2D-Fc-ビオチンをウェルに添加し、続いて、NKG2D結合
ドメインを添加した。インキュベーション及び洗浄後、Rae-1デルタ-Fcでコーティングし
たウェルに結合した残存するNKG2D-Fc-ビオチンを、ストレプトアビジン-HRP及びTMB基質
を使用して検出した。吸光度は、450 nM で測定し、540 nMで修正した。バックグラウン
ドを差し引いた後、NKG2D-Fcタンパク質へのNKG2D結合ドメインの特異的結合を、Rae-1デ
ルタ-Fcでコーティングしたウェルへの結合から遮断されたNKG2D-Fc-ビオチンのパーセン
テージから算出した。陽性コントロール(配列番号45~48、又はeBioscienceで入手可能な
抗マウスNKG2DクローンMI-6及びCX-5から選択される)及び種々のNKG2D結合ドメインクロ
ーンは、マウスNKG2DへのRae-1デルタ結合を遮断したが、一方、アイソタイプコントロー
ル抗体は、Rae-1デルタとの競合をほとんど示さなかった(図10)。
実施例3: NKG2D結合ドメインクローンはNKG2Dを活性化する
ヒト及びマウスNKG2Dの核酸配列を、CD3ゼータシグナリングドメインをコードする核酸
配列に融合して、キメラ抗原受容体(CAR)構築物を得た。NKG2D-CAR構築物を、次に、Gibs
onアセンブリーを使用してレトロウイルスベクター中にクローニングし、レトロウイルス
産生のためにexpi293細胞にトランスフェクトした。EL4細胞は、8μg/mLポリブレンと一
緒にNKG2D-CARを含有するウイルスで感染させた。感染24時間後、EL4細胞中のNKG2D-CAR
の発現レベルをフローサイトメトリーで解析し、細胞表面上に高レベルのNKG2D-CARを発
現するクローンを選択した。
NKG2D結合ドメインがNKG2Dを活性化するか否かを決定するために、それらをマイクロプ
レートのウェルに吸着させ、NKG2D-CAR EL4細胞を、ブレフェルジン-A及びモネンシンの
存在下で、抗体フラグメントでコーティングしたウェルで4時間、培養した。細胞内TNF-
α産生、NKG2D活性化についてのインジケーターを、フローサイトメトリーによってアッ
セイした。TNF-α陽性細胞のパーセンテージを、陽性コントロールで処理した細胞に対し
て正規化した。全てのNKG2D結合ドメインは、ヒトNKG2D(図11)及びマウスNKG2D(図12)の
両方を活性化した。
実施例4: NKG2D結合ドメインはNK細胞を活性化する
初代ヒトNK細胞
末梢血単核細胞(PBMC)は、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから
単離した。NK細胞(CD3- CD56+)は、磁性ビーズを用いる陰性選択を使用してPBMCから単離
し、単離されたNK細胞の純度は、典型的には>95%であった。単離されたNK細胞を、次に
、100 ng/mL IL-2を含有する培地中で24~48時間培養し、その後、NKG2D結合ドメインを
吸着させたマイクロプレートのウェルに移して、フルオロフォアをコンジュゲート化した
抗CD107a抗体、ブレフェルジン-A、及びモネンシンを含有する培地中で培養した。培養に
続いて、NK細胞を、フルオロフォアをコンジュゲート化したCD3、CD56及びIFN-γに対す
る抗体を使用して、フローサイトメトリーによってアッセイした。CD107a及びIFN-γ染色
を、CD3- CD56+細胞において解析し、NK細胞活性化を評価した。CD107a/IFN-γ二重陽性
細胞の増大は、一つの受容体よりも二つの活性化受容体のエンゲージメントを通じた、よ
り良いNK細胞活性化の指標である。NKG2D結合ドメイン及び陽性コントロール(配列番号45
~48から選択される)は、アイソタイプコントロールよりも、より高いパーセンテージのN
K細胞がCD107a+及びIFN-γ+になることを示した(図13及び図14は、それぞれがNK細胞調製
のために異なるドナーのPBMCを使用した、2回の独立した実験からのデータを表す)。
初代マウスNK細胞
脾臓は、C57Bl/6マウスから入手し、70μm細胞ストレーナーを通して壊して、単一細胞
懸濁液を得た。細胞は、ペレット化し、ACK溶解緩衝液(Thermo Fisher Scientific #A10
49201から購入した;155 mM塩化アンモニウム、10 mM炭酸水素カリウム、0.01 mM EDTA)
中に再懸濁して、赤血球を除去した。残りの細胞は、100 ng/mL hIL-2と共に72時間培養
してから回収し、NK細胞単離のために調製した。NK細胞(CD3-NK1.1+)は、次に、磁性ビー
ズを用いる陰性除去技術を使用して脾臓細胞から単離し、典型的には>90%の純度であっ
た。精製されたNK細胞を、100 ng/mL mIL-15を含有する培地中で48時間培養してから、NK
G2D結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移して、フルオロフォアをコ
ンジュゲート化した抗CD107a抗体、ブレフェルジン-A、及びモネンシンを含有する培地中
で培養した。NKG2D結合ドメインでコーティングしたウェル中での培養の後、NK細胞を、
フルオロフォアをコンジュゲート化したCD3、NK1.1及びIFN-γに対する抗体を使用して、
フローサイトメトリーによりアッセイした。CD107a及びIFN-γ染色を、CD3- NK1.1+細胞
において解析し、NK細胞活性化を評価した。CD107a/IFN-γ二重陽性細胞の増大は、一つ
の受容体よりも二つの活性化受容体のエンゲージメントを通じた、より良いNK細胞活性化
の指標である。NKG2D結合ドメイン及び陽性コントロール(eBioscienceで入手可能な抗マ
ウスNKG2DクローンMI-6及びCX-5から選択される)は、アイソタイプコントロールよりも、
より高いパーセンテージのNK細胞がCD107a+及びIFN-γ+になることを示した(図15及び図1
6は、それぞれがNK細胞調製のために異なるマウスを使用した、2回の独立した実験からの
データを表す)。
実施例5: NKG2D結合ドメインは標的腫瘍細胞の細胞傷害性を可能にする
ヒト及びマウス初代NK細胞活性化アッセイは、NKG2D結合ドメインとのインキュベーシ
ョン後のNK細胞上の増大した細胞傷害性マーカーを実証する。このことが、増大した腫瘍
細胞溶解につながるか否かを調べるために、各NKG2D結合ドメインが単一特異性抗体に開
発された細胞ベースのアッセイを利用した。Fc領域は、一つの標的化アームとして使用さ
れ、一方、Fab領域(NKG2D結合ドメイン)は、NK細胞を活性化するための別の標的化アーム
として作用した。ヒト起源であり、高レベルのFc受容体を発現するTHP-1細胞を腫瘍標的
として使用し、Perkin Elmer DELFIA Cytotoxicity Kitを使用した。THP-1細胞は、BATDA
試薬で標識し、培地中に105/mLで再懸濁した。標識されたTHP-1細胞を、次に、マイクロ
タイタープレートのウェル中で、37℃で3時間、NKG2D抗体及び単離されたマウスNK細胞と
一緒にした。インキュベーション後、20μlの培養上清を採取し、200μlのユウロピウム
溶液と混合し、振とうしながら15分間、遮光してインキュベートした。蛍光を、時間分解
蛍光モジュールを備えたPheraStarプレートリーダー(励起337nm、発光620nm)によって
経時的に測定し、キットの指示書に従って特異的溶解を算出した。
陽性コントロール、NKG2Dの天然リガンドULBP-6は、マウスNK細胞によるTHP-1標的細胞
の増大した特異的溶解を示した。NKG2D抗体も、THP-1標的細胞の特異的溶解を増大したが
、一方、アイソタイプコントロール抗体は、低減した特異的溶解を示した。点線は、添加
した抗体なしでのマウスNK細胞によるTHP-1細胞の特異的溶解を示す(図17)。
実施例6: NKG2D抗体は高い熱安定性を示す
NKG2D結合ドメインの融解温度を、示差走査型蛍光定量法を使用してアッセイした。外
挿された見かけの融解温度は、典型的なIgG1抗体に関して相対的に高い(図18)。
実施例7: NKG2D及びCD16を架橋することによるヒトNK細胞の相乗的活性化
初代ヒトNK細胞活性化アッセイ
末梢血単核細胞(PBMC)は、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから
単離した。NK細胞は、陰性磁性ビーズ(StemCell # 17955)を使用してPBMCから精製した
。NK細胞は、フローサイトメトリーにより決定したところ、>90% CD3-CD56+であった。
細胞を、次に100 ng/mL hIL-2(Peprotech #200-02)を含有する培地中で48時間拡大させ
た後、活性化アッセイに使用した。抗体を、100 μl滅菌PBS中、2 μg/ml(抗CD16、Biole
gend # 302013)及び5 μg/mL(抗NKG2D、R&D #MAB139)の濃度で、4℃で一晩、96ウェル
平底プレート上にコーティングし、続いて、過剰な抗体を除去するためにウェルを十分に
洗浄した。脱顆粒の評価のために、IL-2活性化されたNK細胞を、5×105細胞/mlで、100 n
g/mL hIL2及び1 μg/mL APCコンジュゲート化抗CD107a mAb(Biolegend # 328619)を補充
した培地中に再懸濁した。1×105細胞/ウェルを、次に、抗体でコーティングしたプレー
トに添加した。タンパク質輸送阻害剤であるブレフェルジンA(BFA, Biolegend # 420601
)及びモネンシン(Biolegend # 420701)を、それぞれ最終希釈1:1000及び1:270で添加し
た。プレーティングした細胞は、5% CO2中、37℃で4時間、インキュベートした。IFN-γ
の細胞内染色のために、NK細胞を、抗CD3(Biolegend #300452)及び抗CD56 mAb(Biolegen
d # 318328)で標識し、その後、固定し、透過性にし、抗IFN-γ mAb(Biolegend # 5065
07)で標識した。NK細胞を、生CD56+CD3-細胞上でゲーティングした後、フローサイトメト
リーによって、CD107a及びIFN-γの発現について解析した。
受容体組み合わせの相対的効力を調べるために、プレート結合刺激によるNKG2D又はCD1
6の架橋、及び両受容体の共架橋を実施した。図19(図19A~19C)に示すように、CD16及びN
KG2Dの組み合わせた刺激は、高く上昇したレベルのCD107a(脱顆粒)(図19A)及び/又はIFN
-γ産生(図19B)をもたらした。点線は、各受容体の個別の刺激の相加的効果を表す。
IL-2活性化されたNK細胞のCD107aレベル及び細胞内IFN-γ産生は、抗CD16、抗NKG2D、
又は両モノクローナル抗体の組み合わせを用いる4時間のプレート結合刺激の後に解析し
た。グラフは、平均(n=2)±SDを示す。図19Aは、CD107aのレベルを実証する;図19Bは、
IFNγのレベルを実証する;図19Cは、CD107a及びIFNγのレベルを実証する。図19A~19C
に示されるデータは、5人の異なる健常ドナーを使用する5回の独立した実験の代表である
実施例8: 多重特異性結合性タンパク質はNKG2Dに結合する
EL4マウスリンパ腫細胞株を、ヒトNKG2Dを発現するように改造した。各々がNKG2D結合
ドメイン、腫瘍関連抗原結合ドメイン(CD33結合ドメイン)、及び図1に示すようにCD16に
結合するFcドメインを含有する三重特異性結合性タンパク質(TriNKET)を、EL4細胞上に発
現された細胞外NKG2Dに対するそれらの親和性について試験した。NKG2Dへの多重特異性結
合性タンパク質の結合は、フルオロフォアをコンジュゲート化した抗ヒトIgG二次抗体を
使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって解析し、バックグラウンドに対
する倍数(FOB)を、親EL4細胞と比較したNKG2D発現細胞の平均蛍光強度(MFI)を使用して算
出した。
試験したTriNKETは、CD33-TriNKET-C26(ADI-28226及びCD33結合ドメイン)、CD33-TriNK
ET-F04(ADI-29404及びCD33結合ドメイン)、CD33-TriNKET-A44(ADI-27744及びCD33結合ド
メイン)、CD33-TriNKET-F47(ADI-29447及びCD33結合ドメイン)、CD33-TriNKET-A49(ADI-2
7749及びCD33結合ドメイン)及びCD33-TriNKET-F63(ADI-27463及びCD33結合ドメイン)を含
む。試験した分子に使用したCD33結合ドメインは、以下に掲載する重鎖可変ドメイン及び
軽鎖可変ドメインから構成されていた。
CD33重鎖可変ドメイン(配列番号:125):
Figure 2023052214000021
CD33軽鎖可変ドメイン(配列番号:126):
Figure 2023052214000022
データは、CD33結合ドメイン及びNKG2D結合ドメインを含むTriNKETがNKG2Dに結合する
ことを示す(図35A~35B)。図35Aは、TriNKETの結合を、対応するNKG2D結合ドメインを含
有するモノクローナル抗体との比較で示す。図35Bは、6個の異なるNKG2D結合ドメインを
含むCD33を標的とするTriNKETの結合プロフィールを示す。
実施例9: 多重特異性結合性タンパク質はヒト腫瘍抗原に結合する
三重特異性結合性タンパク質はCD33に結合する
CD33を発現するヒトAML細胞株MV4-11及びMolm-13を使用して、腫瘍関連抗原CD33に対す
るTriNKETの結合をアッセイした。TriNKET、及び場合によっては親の抗CD33モノクローナ
ル抗体を細胞と共にインキュベートし、結合を、フルオロフォアをコンジュゲート化した
抗ヒトIgG二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって解析し、
バックグラウンドに対する倍数(FOB)を、二次抗体コントロールに対して正規化したTriNK
ET及び親モノクローナル抗CD33抗体からの平均蛍光強度(MFI)を使用して算出した。CD33
を標的とするTriNKETは、親抗CD33抗体と比較して、匹敵するレベルのCD33に対する結合
を示す(図36)。TriNKETは、MV4-11(図36A、36B、及び36D)及びMolm-13細胞(図36C)上の細
胞表面CD33に対する結合を示す。全体的な結合シグナルは、同じCD33結合ドメインを含有
するので、TriNKET間で匹敵する。
実施例10: 多重特異性結合性タンパク質はNK細胞を活性化する
末梢血単核細胞(PBMC)は、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから
単離した。NK細胞(CD3- CD56+)は、磁性ビーズを用いる陰性選択を使用してPBMCから単離
し、単離されたNK細胞の純度は、典型的には>90%であった。単離されたNK細胞を、活性
化のために100 ng/mL IL-2を含有する培地中で培養するか、又はサイトカインなしで一晩
休止させた。IL-2活性化したNK細胞は、活性化後、24~48時間以内に使用した。
CD33を発現するMV4-11細胞を採取し、培地中に2×106/mLで再懸濁した。CD33モノクロ
ーナル抗体又はCD33を標的とするTriNKETを培地中に希釈した。活性化されたNK細胞を採
取し、洗浄し、培地中に2×106/mLで再懸濁した。がん細胞を、次に、IL-2の存在下でモ
ノクローナル抗体/TriNKET及び活性化されたNK細胞と混合した。細胞内サイトカイン染
色のために細胞の外へのタンパク質輸送を遮断するために、ブレフェルジン-A及びモネン
シンも混合培養に添加した。フルオロフォアをコンジュゲート化した抗CD107aを混合培養
に添加し、この培養物を4時間インキュベートしてから、フルオロフォアをコンジュゲー
ト化したCD3、CD56及びIFN-γに対する抗体を使用するFACS解析のためにサンプルを調製
した。CD107a及びIFN-γ染色を、CD3- CD56+細胞において解析し、NK細胞活性化を評価し
た。CD107a/IFN-γ二重陽性細胞の増大は、一つの受容体ではなく二つの活性化受容体の
エンゲージメントを通じた、より良いNK細胞活性化の指標である。
CD33陽性MV4-11細胞との初代ヒトNK細胞の共培養は、初代ヒトNK細胞のTriNKET媒介性
活性化をもたらした。CD33を標的とするTriNKETは、CD107a脱顆粒及びIFNγサイトカイン
産生の増大によって示されるように、MV4-11細胞と共培養されたヒトNK細胞の活性化を媒
介した(図37A及び37B)。NK細胞単独、TriNKETなしでMV4-11細胞と共培養されたNK細胞、C
D20を標的とするTriNKETを、コントロールとして使用した。C33モノクローナル抗体と比
較して、CD33を標的とするTriNKETは、増大したNK細胞活性を示した(図37A及び37B)。
実施例11: 三重特異性結合性タンパク質は標的がん細胞の細胞傷害性を可能にする
末梢血単核細胞(PBMC)は、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから
単離した。NK細胞(CD3- CD56+)は、磁性ビーズを用いる陰性選択を使用してPBMCから単離
し、単離されたNK細胞の純度は、典型的には>90%であった。単離されたNK細胞を、活性
化のために100 ng/mL IL-2を含有する培地中で培養するか、又はサイトカインなしで一晩
休止させた。IL-2活性化した又は休止させたNK細胞は、翌日、細胞傷害性アッセイに使用
した。
DELFIA細胞傷害性アッセイ:
CD33を発現するヒトがん細胞株は、培養から採取し、細胞をPBSで洗浄し、BATDA試薬(P
erkin Elmer AD0116)で標識するために106/mLで成長培地に再懸濁した。標的細胞の標識
については、製造業者の指示に従った。標識した後、細胞をPBSで3回洗浄し、0.5~1.0×
105/mLで培地中に再懸濁した。バックグラウンドウェルを調製するために、標識細胞のア
リコートを取り分け、細胞を培地から遠心分離した。100 μlの培地を、ペレット化した
細胞を崩さないように注意深く3連のウェルに添加した。100 μlのBATDA標識細胞を、96
ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルは、標的細胞からの偶発的放出のために保
存し、ウェルは、1% Triton-Xの添加により、標的細胞の最大溶解のために調製した。目
的の腫瘍標的に対するモノクローナル抗体又はTriNKETを培地で希釈して、50 μlの希釈
されたmAb又はTriNKETを各ウェルに添加した。休止させた及び/又は活性化したNK細胞を
、培養から採取し、細胞を洗浄し、所望のエフェクター対標的細胞(E:T)比に応じて培
地中に105~2.0×106/mLで再懸濁した。50 μlのNK細胞をプレートの各ウェルに添加し、
培地容量を合計で200 μlとした。プレートは、37℃で5%CO2と共に2~3時間インキュベ
ートしてから、アッセイを発色させた。
2~3時間の培養の後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を、200gで5分
間の遠心分離によりペレット化した。20 μlの培養上清を製造業者から提供された清潔な
マイクロプレートに移し、200 μlの室温のユウロピウム溶液を各ウェルに添加した。プ
レートは、遮光して、250rpmのプレートシェーカー上で15分間インキュベートした。プレ
ートを、Victor 3又はSpectraMax i3X機器のいずれかを使用して読み取った。%特異的溶
解は、以下のようにして算出した:%特異的溶解=((実験的放出-偶発的放出)/(最大放
出-偶発的放出)) * 100%。
TriNKETは、CD33陽性ヒトがん細胞株に対するヒトNK細胞の細胞傷害性を媒介した。休
止ヒトNK細胞をMV4-11がん細胞と混合し(図40A)、休止ヒトNK細胞をMolm-13がん細胞と混
合し(図40B)、そして休止ヒトNK細胞をTHP-1がん細胞と混合した(図40C)。TriNKET(たと
えば、CD33-TriNKET-C26及びCD33-TriNKET-F04)は、これらのがん細胞に対して用量反応
的に休止ヒトNK細胞の細胞傷害活性を増強することができる。点線は、TriNKETなしでの
休止NK細胞の細胞傷害活性を示す。CD33モノクローナル抗体は、CD64を発現するがTHP-1
細胞よりも低いレベルであるMV4-11細胞に対して低減した効力を示した。CD33モノクロー
ナル抗体は、CD64を発現しないMolm-13細胞に対して良好な効力を示した。CD33モノクロ
ーナル抗体は、高いCD64レベルを有するTHP-1細胞に対して何ら効果を示さなかった。
CD33陽性ヒトがん細胞Molm-13のTriNKET媒介性溶解をアッセイした。休止ヒトNK細胞を
、5:1の比でMolm-13がん細胞と混合し(図41)、及びTriNKET(たとえば、CD33-TriNKET-A49
、CD33-TriNKET-A44、CD33-TriNKET-C26、及びCD33-TriNKET-E79)は、これらのがん細胞
に対して用量反応的に休止ヒトNK細胞の細胞傷害活性を増強することができた。点線は、
TriNKETなしでの休止NK細胞の細胞傷害活性を示す。
実施例12: FcRの高発現を有するがんの治療における、又は高レベルのFcRを有する腫
瘍微小環境におけるTriNKETの利点
モノクローナル抗体療法は、血液学的腫瘍及び固形腫瘍の両方を含む多くのがんタイプ
の治療について承認されてきた。がん治療におけるモノクローナル抗体の使用は患者の結
果を改善してきた一方、未だに限界がある。機構的な研究により、モノクローナル抗体は
、腫瘍成長に対するその効果を、中でも特にADCC、CDC、食作用、及びシグナル遮断を含
む複数のメカニズムを通して発揮することが実証されている。
最も顕著なことに、ADCCは、モノクローナル抗体がその効果を発揮する主要なメカニズ
ムであると考えられている。ADCCは、ナチュラルキラー細胞の表面の低親和性FcγRIII (
CD16)の抗体Fcエンゲージメントに依存し、これが腫瘍細胞の直接的溶解を媒介する。Fc
γRの中で、CD16は、IgG Fcに対して最も低い親和性を有し、FcγRI(CD64)は、高親和性F
cRであり、CD16よりも約1000倍強くIgG Fcに結合する。
CD64は、通常、骨髄性分化系列のような多くの造血分化系列で発現され、急性骨髄性白
血病(AML)のようなこれらの細胞タイプから由来する腫瘍上で発現されることができる。M
DSC及び単球のような、腫瘍に浸潤する免疫細胞もまた、CD64を発現し、腫瘍微小環境に
浸潤することが知られている。腫瘍による又は腫瘍微小環境におけるCD64の発現は、モノ
クローナル抗体療法に対して不利な影響を有することができる。抗体は高親和性受容体に
好んで結合するので、腫瘍微小環境におけるCD64の発現は、これらの抗体がNK細胞の表面
上のCD16にエンゲージすることを困難にする。TriNKETは、NK細胞の表面の二つの活性化
受容体を標的とすることを通じて、モノクローナル抗体療法に対するCD64発現の不利な影
響を克服することができる可能性がある。
三種のAML細胞株でのFcRγI (CD64)発現
高レベル及び低レベルのCD64表面発現を有する腫瘍に対するTriNKET及びモノクローナ
ル抗体の活性を試験するために、インビトロ培養系が開発された。Molm-13及びTHP-1は、
同様の発現の表面CD33を有する二種のヒトAML細胞株であるが、Molm-13細胞はCD64を発現
せず、一方、THP-1細胞はその表面にCD64を発現する(図38A~38C)。CD33を標的とするよ
う指向するモノクローナル抗体又はTriNKETを使用して、モノクローナル抗体又はTriNKET
療法に対する、腫瘍によるCD64発現の効果を試験した。図38A~38Cは、三種のヒトAML細
胞株、Molm-13細胞株(図38A)、MV4-11細胞株(図38B)、及びTHP-1細胞株(図38C)上での高
親和性FcRγI (CD64)の発現を示した。Molm-13細胞はCD64を発現せず、一方、MV4-11細胞
は低レベル、THP-1は高レベルの細胞表面CD64を有する。
TriNKETはFcRの高い表面発現を有する腫瘍細胞を標的とすることにおいて利点を有する
図39A~39Bは、Molm-13(図39B)又はTHP-1(図39A)細胞のいずれかとの共培養におけるヒ
トNK細胞のモノクローナル抗体又はTriNKET媒介性活性化を示す。ヒトCD33に対するモノ
クローナル抗体は、増大したCD107a脱顆粒及びIFNγ産生によって証明されるように、Mol
m-13共培養系においてヒトNK細胞の良好な活性化を実証した。このモノクローナル抗体は
、がん細胞上に高レベルのCD64が存在するTHP-1共培養系に対して効果を有さない。興味
深いことに、TriNKETは、Molm-13(図39B)及びTHP-1(図39A)細胞の両方に対して有効であ
り、TriNKETは腫瘍上のCD64への結合を克服し、活性化のために有効にNK細胞を標的とす
ることができることを示している。NK細胞上の二つの活性化受容体のデュアル標的化は、
NK細胞に対するより強い特異的結合を提供した。NK細胞上のCD16のみを標的とするモノク
ローナル抗体は、他の高親和性FcRによって結合されることができ、NK細胞上のCD16のエ
ンゲージメントを防止する。図39Cに示されるように、TriNKETは、MV4-11ヒトAML細胞と
の共培養において休止ヒトNK細胞の活性化も有効に媒介した。
TriNKETはFcγRI発現にかかわらずAML細胞株に対する効力を実証する
図40A~40Cは、標的として三種のヒトAML細胞株を使用するヒトNK細胞傷害性アッセイ
を示す。CD33に対するモノクローナル抗体は、CD64を発現しないMolm-13細胞に対して良
好な効力を示した(図40B)。CD64を発現するがTHP-1より低レベルであるMV4-11細胞(図40A
)は、モノクローナル抗CD33について低減した効力を示した。THP-1細胞(図40C)は、モノ
クローナル抗CD33単独について効果を示さなかった。腫瘍細胞上のCD64発現にかかわらず
、TriNKETは、ここで試験した全ての腫瘍細胞に対するヒトNK細胞応答を媒介することが
できた。
図40A~40Cは、THP-1細胞が、その表面での高レベルの高親和性FcR発現のためにモノク
ローナル抗体療法に対して保護されたことを示す。TriNKETは、NK細胞の表面上の二つの
活性化受容体を標的とすることによって、この保護を回避した。細胞傷害性データは、共
培養活性化実験において見られたことと直接的に相関した。TriNKETは、THP-1細胞につい
て見られたmAb療法からの保護を回避し、高レベルのFcRにもかかわらずNK細胞媒介性溶解
を誘導することができた。
実施例13: PBMC培養における正常骨髄細胞及び正常B細胞の殺傷: TriNKETはより少
ないオン標的オフ腫瘍副作用を通じてより良い安全性プロフィールを提供する
ナチュラルキラー細胞及びCD8 T細胞は、共に腫瘍細胞を直接的に溶解することができ
るが、NK細胞及びCD8 T細胞が腫瘍細胞から正常自己を認識するメカニズムは相違する。N
K細胞の活性は、活性化(NCR、NKG2D、CD16、など)受容体及び阻害性(KIR、NKG2A、など)
受容体からのシグナルのバランスによって調節される。これらの活性化シグナル及び阻害
性シグナルのバランスは、NK細胞が、ストレスを受けた、ウイルス感染した又はトランス
フォームした自己細胞から健康な自己細胞を決定することを可能にする。この自己寛容性
の「ビルトイン」メカニズムは、正常健康組織をNK細胞応答から保護することを助けるこ
とになる。この原理を拡張するために、NK細胞の自己寛容性は、TriNKETが、オフ腫瘍副
作用なしに、又は増大した治療的ウィンドウを有して、自己及び腫瘍の両方に発現される
抗原を標的とすることを可能にすることになる。
ナチュラルキラー細胞とは異なって、T細胞は、活性化及びエフェクター機能のためにM
HC分子によって提示される特異的ペプチドの認識を必要とする。T細胞は、免疫療法の一
次標的であり、腫瘍に対してT細胞応答を再方向付けするために多くの戦略が開発されて
きた。T細胞二重特異性体(bispecifics)、チェックポイント阻害剤、及びCAR-T細胞は
、全てFDAによって承認されているが、しばしば用量規制毒性が問題となる。T細胞二重特
異性体及びCAR-T細胞は、腫瘍細胞の表面上の抗原を標的とするために結合ドメインを使
用することにより、及びエフェクター細胞に活性化シグナルを伝達するために改造された
シグナリングドメインを使用することにより、TCR-MHC認識系の周辺で作用する。抗腫瘍
免疫応答を誘起するのに有効であるが、これらの療法は、しばしばサイトカイン放出症候
群(CRS)、及びオン標的オフ腫瘍副作用とカップリングされる。TriNKETは、NK細胞活性化
及び阻害の天然の系を「無視する」ことがないので、この文脈において独特である。その
代わりに、TriNKETは、バランスを左右し、健康な自己に対するNKの寛容性を維持しなが
ら、NK細胞に対して付加的な活性化シグナルを提供するように設計されている。
PBMCは、密度勾配遠心分離によって全血から単離した。夾雑する赤血球は全て、ACK溶
解バッファー中でのインキュベーションによって溶解させた。PBMCをPBS中で3回洗浄し、
総PBMCをカウントした。PBMCを、初代細胞培養培地中で106/mLに調整した。1mLのPBMCを
、24ウェルプレートのウェルに播種し、示されたTriNKET又はmAbをこれらのPBMC培養物に
10 μg/mLで添加した。細胞は、5% CO2と共に 37℃で一晩培養した。翌日(24時間後)、
PBMCを培養から採取し、FACS解析のために調製した。CD45+;CD19+ B細胞及びCD45+;CD3
3+;CD11b+ 骨髄細胞のパーセンテージを、異なる処理群にわたって解析した。
図42Aは、健常ドナー由来のB細胞(CD33陰性)はCD33を標的とするTriNKETによって影響
を受けなかったことを示す。CD33を標的とするTriNKETで処理されたPBMCは、CD45+、CD3-
、CD56- リンパ球集団に対して効果を示さなかった。図42Bは、自家CD33+ 骨髄細胞はCD3
3を標的とするTriNKET媒介性NK細胞応答から保護され、したがってTriNKET媒介性溶解に
抵抗性であったことを示す。これらの培養において、CD45+、CD33+、CD11b+ 骨髄細胞の
頻度は、CD33を標的とするTriNKETとのインキュベーションに際して変化しなかった。
参照による組み込み
本明細書において引用される特許書類及び科学的記事の各々の開示全体は、あらゆる目
的のために参照により組み込まれる。
等価物
本発明は、その精神又は本質的な特徴から逸脱することなしに、他の具体的な形態に具
体化されてもよい。前述の実施態様は、それゆえ全ての観点において本明細書において記
載される本発明を限定するものではなく実例となるものとして考慮されるべきである。し
たがって、本発明の範囲は、前述の記載によってよりもむしろ添付の請求項によって示さ
れるのであり、請求項の等価物の意味及び範囲内にある全ての変更は、その中に含まれる
ことが意図されている。
等価物
本発明は、その精神又は本質的な特徴から逸脱することなしに、他の具体的な形態に具
体化されてもよい。前述の実施態様は、それゆえ全ての観点において本明細書において記
載される本発明を限定するものではなく実例となるものとして考慮されるべきである。し
たがって、本発明の範囲は、前述の記載によってよりもむしろ添付の請求項によって示さ
れるのであり、請求項の等価物の意味及び範囲内にある全ての変更は、その中に含まれる
ことが意図されている。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
(態様1)
以下のもの:
(a) NKG2Dに結合する第一の抗原結合部位;
(b) CD33に結合する第二の抗原結合部位;及び
(c) 抗体FcドメインもしくはCD16に結合するのに十分なその部分、又はCD16に結合する
第三の抗原結合部位
を含むタンパク質。
(態様2)
前記第一の抗原結合部位が、ヒト、非ヒト霊長類、及びげっ歯類のNKG2Dに結合する、
態様1記載のタンパク質。
(態様3)
前記第一の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、態様1又
は2記載のタンパク質。
(態様4)
前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチドに存在する、態
様3記載のタンパク質。
(態様5)
前記第二の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、態様3~4
のいずれか1項記載のタンパク質。
(態様6)
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチ
ドに存在する、態様5記載のタンパク質。
(態様7)
前記第一の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ド
メインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、態様5又は6記載のタンパク質。
(態様8)
前記第一の抗原結合部位が、配列番号1と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメインを含
む、態様1~7のいずれか1項記載のタンパク質。
(態様9)
前記第一の抗原結合部位が、配列番号41と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
配列番号42と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、態様1~7のいずれか1項記
載のタンパク質。
(態様10)
前記第一の抗原結合部位が、配列番号43と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
配列番号44と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、態様1~7のいずれか1項記
載のタンパク質。
(態様11)
前記第一の抗原結合部位が、配列番号45と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
配列番号46と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、態様1~7のいずれか1項記
載のタンパク質。
(態様12)
前記第一の抗原結合部位が、配列番号47と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
配列番号48と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、態様1~7のいずれか1項記
載のタンパク質。
(態様13)
前記第一の抗原結合部位が、配列番号69と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
配列番号70と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、態様1~7のいずれか1項記
載のタンパク質。
(態様14)
前記第一の抗原結合部位が、配列番号77と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
配列番号78と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、態様1~7のいずれか1項記
載のタンパク質。
(態様15)
前記第一の抗原結合部位が、配列番号85と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
配列番号86と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、態様1~7のいずれか1項記
載のタンパク質。
(態様16)
前記第一の抗原結合部位が、配列番号133と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及
び配列番号134と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、態様1~7のいずれか1項
記載のタンパク質。
(態様17)
前記第一の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、態様1又は2記載のタンパク質。
(態様18)
前記単一ドメイン抗体が、V H Hフラグメント又はV NAR フラグメントである、態様17記載
のタンパク質。
(態様19)
前記第二の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、態様1~2
又は17~18のいずれか1項記載のタンパク質。
(態様20)
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチ
ドに存在する、態様19記載のタンパク質。
(態様21)
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号93と少なくとも90%同一のア
ミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号94と少なく
とも90%同一のアミノ酸配列を含む、態様1~20のいずれか1項記載のタンパク質。
(態様22)
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号101と少なくとも90%同一の
アミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号102と少
なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、態様1~20のいずれか1項記載のタンパク質。
(態様23)
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号109と少なくとも90%同一の
アミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号110と少
なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、態様1~20のいずれか1項記載のタンパク質。
(態様24)
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号117と少なくとも90%同一の
アミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号118と少
なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、態様1~20のいずれか1項記載のタンパク質。
(態様25)
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号125と少なくとも90%同一の
アミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号126と少
なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、態様1~20のいずれか1項記載のタンパク質。
(態様26)
前記第二の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、態様1~4又は8~16のいずれか1
項記載のタンパク質。
(態様27)
前記第二の抗原結合部位が、V H Hフラグメント又はV NAR フラグメントである、態様26記
載のタンパク質。
(態様28)
前記タンパク質が、CD16に結合するのに十分な抗体Fcドメインの部分を含み、前記抗体
Fcドメインが、ヒンジ及びCH2ドメインを含む、態様1~27のいずれか1項記載のタンパク
質。
(態様29)
前記抗体Fcドメインが、ヒトIgG1抗体のヒンジ及びCH2ドメインを含む、態様28記載の
タンパク質。
(態様30)
前記Fcドメインが、ヒトIgG1抗体のアミノ酸234~332と少なくとも90%同一のアミノ酸
配列を含む、態様28又は29記載のタンパク質。
(態様31)
前記Fcドメインが、ヒトIgG1のFcドメインと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含み
、Q347、Y349、T350、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、
N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、K439からなる群から選
択される1以上の位置で相違する、態様28~30のいずれか1項記載のタンパク質。
(態様32)
態様1~31のいずれか1項記載のタンパク質及び医薬として許容し得る担体を含む、製剤

(態様33)
態様1~31のいずれか1項記載のタンパク質を発現する1以上の核酸を含む、細胞。
(態様34)
直接的に及び/又は間接的に腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍及びナチュラル
キラー細胞を、態様1~31のいずれか1項記載のタンパク質に曝露することを含む、方法。
(態様35)
がんを治療する方法であって、態様1~31のいずれか1項記載のタンパク質又は態様32記
載の製剤を患者に投与することを含む、方法。
(態様36)
前記がんが、AML、骨髄異形成症候群、慢性骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病の骨
髄急性転化、及びALLからなる群から選択される、態様35記載の方法。

Claims (36)

  1. 以下のもの:
    (a) NKG2Dに結合する第一の抗原結合部位;
    (b) CD33に結合する第二の抗原結合部位;及び
    (c) 抗体FcドメインもしくはCD16に結合するのに十分なその部分、又はCD16に結合する
    第三の抗原結合部位
    を含むタンパク質。
  2. 前記第一の抗原結合部位が、ヒト、非ヒト霊長類、及びげっ歯類のNKG2Dに結合する、
    請求項1記載のタンパク質。
  3. 前記第一の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項1
    又は2記載のタンパク質。
  4. 前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチドに存在する、請
    求項3記載のタンパク質。
  5. 前記第二の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項3
    ~4のいずれか1項記載のタンパク質。
  6. 前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチ
    ドに存在する、請求項5記載のタンパク質。
  7. 前記第一の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ド
    メインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項5又は6記載のタンパク質。
  8. 前記第一の抗原結合部位が、配列番号1と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメインを含
    む、請求項1~7のいずれか1項記載のタンパク質。
  9. 前記第一の抗原結合部位が、配列番号41と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
    配列番号42と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1~7のいずれか1項
    記載のタンパク質。
  10. 前記第一の抗原結合部位が、配列番号43と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
    配列番号44と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1~7のいずれか1項
    記載のタンパク質。
  11. 前記第一の抗原結合部位が、配列番号45と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
    配列番号46と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1~7のいずれか1項
    記載のタンパク質。
  12. 前記第一の抗原結合部位が、配列番号47と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
    配列番号48と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1~7のいずれか1項
    記載のタンパク質。
  13. 前記第一の抗原結合部位が、配列番号69と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
    配列番号70と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1~7のいずれか1項
    記載のタンパク質。
  14. 前記第一の抗原結合部位が、配列番号77と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
    配列番号78と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1~7のいずれか1項
    記載のタンパク質。
  15. 前記第一の抗原結合部位が、配列番号85と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及び
    配列番号86と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1~7のいずれか1項
    記載のタンパク質。
  16. 前記第一の抗原結合部位が、配列番号133と少なくとも90%同一の重鎖可変ドメイン及
    び配列番号134と少なくとも90%同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1~7のいずれか1
    項記載のタンパク質。
  17. 前記第一の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項1又は2記載のタンパク質
  18. 前記単一ドメイン抗体が、VHHフラグメント又はVNARフラグメントである、請求項17記
    載のタンパク質。
  19. 前記第二の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項1
    ~2又は17~18のいずれか1項記載のタンパク質。
  20. 前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチ
    ドに存在する、請求項19記載のタンパク質。
  21. 前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号93と少なくとも90%同一のア
    ミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号94と少なく
    とも90%同一のアミノ酸配列を含む、請求項1~20のいずれか1項記載のタンパク質。
  22. 前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号101と少なくとも90%同一の
    アミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号102と少
    なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、請求項1~20のいずれか1項記載のタンパク質。
  23. 前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号109と少なくとも90%同一の
    アミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号110と少
    なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、請求項1~20のいずれか1項記載のタンパク質。
  24. 前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号117と少なくとも90%同一の
    アミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号118と少
    なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、請求項1~20のいずれか1項記載のタンパク質。
  25. 前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号125と少なくとも90%同一の
    アミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号126と少
    なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、請求項1~20のいずれか1項記載のタンパク質。
  26. 前記第二の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項1~4又は8~16のいずれ
    か1項記載のタンパク質。
  27. 前記第二の抗原結合部位が、VHHフラグメント又はVNARフラグメントである、請求項26
    記載のタンパク質。
  28. 前記タンパク質が、CD16に結合するのに十分な抗体Fcドメインの部分を含み、前記抗体
    Fcドメインが、ヒンジ及びCH2ドメインを含む、請求項1~27のいずれか1項記載のタンパ
    ク質。
  29. 前記抗体Fcドメインが、ヒトIgG1抗体のヒンジ及びCH2ドメインを含む、請求項28記載
    のタンパク質。
  30. 前記Fcドメインが、ヒトIgG1抗体のアミノ酸234~332と少なくとも90%同一のアミノ酸
    配列を含む、請求項28又は29記載のタンパク質。
  31. 前記Fcドメインが、ヒトIgG1のFcドメインと少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含み
    、Q347、Y349、T350、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、
    N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、K439からなる群から選
    択される1以上の位置で相違する、請求項28~30のいずれか1項記載のタンパク質。
  32. 請求項1~31のいずれか1項記載のタンパク質及び医薬として許容し得る担体を含む、製
    剤。
  33. 請求項1~31のいずれか1項記載のタンパク質を発現する1以上の核酸を含む、細胞。
  34. 直接的に及び/又は間接的に腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍及びナチュラル
    キラー細胞を、請求項1~31のいずれか1項記載のタンパク質に曝露することを含む、方法
  35. がんを治療する方法であって、請求項1~31のいずれか1項記載のタンパク質又は請求項
    32記載の製剤を患者に投与することを含む、方法。
  36. 前記がんが、AML、骨髄異形成症候群、慢性骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病の骨
    髄急性転化、及びALLからなる群から選択される、請求項35記載の方法。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110944651A (zh) 2017-02-08 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途
CA3054079A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
EA202091977A1 (ru) * 2018-05-28 2021-02-09 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Мультиспецифические связывающие белки, которые связывают cd33, nkg2d и cd16, и способы применения
CN113121697B (zh) * 2019-12-31 2023-06-09 周易 Ch3结构域改造诱导形成的异源二聚体及其制备方法和应用
CN115197330B (zh) * 2021-04-14 2023-04-28 广州百暨基因科技有限公司 同时靶向cll1和cd33的嵌合抗原受体及其应用
CN116948029A (zh) * 2022-04-20 2023-10-27 南京融捷康生物科技有限公司 一种包含IgG类Fc区变体的抗体及其用途
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001071005A2 (en) * 2000-03-24 2001-09-27 Micromet Ag Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
CL2007002668A1 (es) * 2006-09-20 2008-05-09 Amgen Inc Proteina de union a antigeno que se une al receptor de glucagon humano; acido nucleico que la codifica; metodo de produccion; composicion farmaceutica que la comprende; y su uso para tratar o prevenir la diabetes tipo 2.
PL2222706T5 (pl) * 2007-12-14 2017-09-29 Novo Nordisk As Przeciwciała przeciwko ludzkiemu NKG2D i ich zastosowania
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
EP2332994A1 (en) * 2009-12-09 2011-06-15 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Trispecific therapeutics against acute myeloid leukaemia
EP3936521A1 (en) * 2013-03-15 2022-01-12 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10174117B2 (en) * 2013-06-11 2019-01-08 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Anti-HER2 single domain antibodies, polypeptides comprising thereof and their use for treating cancer
EP2985294A1 (en) * 2014-08-14 2016-02-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted T cell activation
AU2015301460B2 (en) * 2014-08-14 2021-04-08 Novartis Ag Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor
ES2688035T3 (es) * 2014-08-29 2018-10-30 Gemoab Monoclonals Gmbh Receptor de antígeno universal que expresa células inmunes para direccionamiento de antígenos múltiples diversos, procedimiento para fabricación del mismo y utilización del mismo para tratamiento de cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes
DK3029137T3 (en) * 2014-12-06 2019-04-08 Gemoab Monoclonals Gmbh GENETICALLY MODIFIED PLURI OR MULTIPOTENT STEM CELLS AND USE THEREOF
AU2016275030B2 (en) * 2015-06-10 2021-12-09 Nantkwest, Inc. Modified NK-92 cells for treating cancer
JP7082604B2 (ja) * 2016-03-21 2022-06-08 マレンゴ・セラピューティクス,インコーポレーテッド 多重特異性および多機能性分子ならびにその使用
CN110944651A (zh) * 2017-02-08 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途

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