JP7187518B2 - Ｃａｉｘ、ａｎｏ１、メソテリン、ｔｒｏｐ２またはクローディン－１８．２を標的にする多重特異性結合タンパク質 - Google Patents

Ｃａｉｘ、ａｎｏ１、メソテリン、ｔｒｏｐ２またはクローディン－１８．２を標的にする多重特異性結合タンパク質 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年２月２７日に出願された米国出願番号第６２／４６４，３４１号、２０１７年２月２７日に出願された米国出願番号第６２／４６４，３４４号、２０１７年２月２７日に出願された米国出願番号第６２／４６４，３４７号、２０１７年３月６日に出願された米国出願番号第６２／４６７，５５７号、２０１７年３月２０日に出願された米国出願番号第６２／４７３，６５２号、および２０１７年３月２０日に出願された米国出願番号第６２／４７３，６５９号に基づく利益および優先権を主張しており、これら出願の各々の全体の内容は、すべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書によって援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、その全体は、参照により本明細書に組み込まれている。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１８年２月２７日に作成され、ＤＦＹ－０１２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、２１２，４８０バイトのサイズである。
発明の分野
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６、ならびに炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸ）、アノクタミン－１（ＡＮＯ１）、メソテリン、トロホブラスト細胞表面抗原（ＴＲＯＰ２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびクローディン－１８．２から選択される腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。
背景
がんは、この疾患を処置するための文献に報告されている十分な研究努力および科学進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんの中には、前立腺がん、乳がん、および肺がんが含まれる。前立腺がんは、男性におけるがんの最も一般的な形態である。乳がんは依然として女性における主要な死因である。小細胞肺がんは、依然として最も致死的な悪性腫瘍の一つである。これらのがんに対する現在の処置選択肢は、すべての患者に効果的というわけではなく、および／または実質的な有害副作用を有する可能性がある。他の種類のがんも、既存の治療選択肢を使用して処置することが依然として困難である。
がん免疫療法は、それらが非常に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進することができるので望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、腫瘍細胞の破壊を促進するために腫瘍細胞およびＴ細胞に結合する、文献に記載されているがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原およびある特定の免疫細胞に結合する抗体は文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１およびＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の構成要素であり、循環リンパ球の約１５％を構成する。ＮＫ細胞は実質的にすべての組織に浸潤し、最初は、事前感作を必要とせずに腫瘍細胞を効果的に殺傷するそれらの能力によって特徴付けられた。活性化されたＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の手段によって、すなわち、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒を介して、ならびに死受容体経路を介して、標的
細胞を殺傷する。活性化されたＮＫ細胞はまた、標的組織への他の白血球の動員を促進するＩＦＮ－γおよびケモカインなどの炎症性サイトカインを分泌する。
ＮＫ細胞は、それらの表面における様々な活性化受容体および阻害受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇すると、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化によって阻害される。あるいはＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇すると、それらは、それらの活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、それらの表面におけるＣＤ１６受容体を介していくつかの免疫グロブリンの定常領域によって活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感受性は、刺激シグナルおよび阻害シグナルの合計に依存する。
炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸ）は、亜鉛金属酵素であり、炭酸水素イオンおよび水素イオンを形成する二酸化炭素の可逆的水和に関与する酵素のファミリーに属する。ＣＡＩＸは、正常組織では発現が限定されているが、多種多様な固形腫瘍において過剰発現されており、腫瘍発達において重要な役割を演じている。ＣＡＩＸは、低酸素腫瘍微小環境によって誘導されて、細胞内ｐＨを腫瘍細胞増殖および生存に好都合であるように維持し、同時に腫瘍細胞侵襲を容易にする酸性の細胞外間隙を生成することによって、腫瘍細胞における高速の解糖系代謝の有害作用に対抗するように機能する。これまでに、ＣＡＩＸの過剰発現は、腎細胞癌、乳がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、卵巣がん、ならびに食道、肺、結腸、腎臓、子宮頸部などの癌および非小細胞肺癌などの一般的な上皮がんにおいて検出されている。
メソテリンは、細胞表面タンパク質にアンカーされたグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）であり、胸膜、腹膜、および心膜の中皮細胞において発現されている。メソテリンは、その正常な発現に加えて、中皮腫、卵巣がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、胆管細胞癌、胃がん、子宮漿液性癌、胸腺癌、および急性骨髄性白血病を含む種々のがんにおいて過剰発現されている。メソテリンは、細胞接着、細胞生存／増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および化学療法抵抗性を含む腫瘍進行において重要な役割を演じ得ることが示唆されている。
アノクタミン－１（ＡＮＯ１）は、電位感受性カルシウム活性化クロライドチャネルである。アノクタミン－１（ＡＮＯ１）は、ＴＭＥＭ１６、ＴＡＯＳ２、ＯＲＡＯＶ２、およびＤＯＧ－１などの他の名前でも公知である。カルシウム活性化クロライドチャネルは、経皮分泌、心臓性およびニューロン励起、感覚伝達、平滑筋収縮、ならびに受精を含む多数の生理学的プロセスにおいて機能している。ＡＮＯ１は、上皮液分泌、嗅覚および光伝達、ニューロンおよび心臓興奮性、ならびに腸運動を含む血管緊張の制御に関与している可能性がある。ＡＮＯ１は、一部のがんにおいて、例えば食道扁平上皮がん（ＥＳＣＣ）、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、膵がん、乳がん、前立腺がんおよび肉腫においても高度に発現されており、そこで、細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、細胞遊走および転移を増大させると考えられている。ＨＮＳＣＣ腫瘍の約８５％は、ＡＮＯ１陽性であることが見出され、ＡＮＯ１の高レベル腫瘍発現を有するＨＮＳＣＣ患者は、全生存率が低下しており；ＡＮＯ１の過剰発現は、前立腺がんの悪性度および乳がんの予後不良と密接に関連することも見出されている。
ＴＲＯＰ２は、膜貫通糖タンパク質およびＣａ２＋シグナル伝達因子である。ＴＲＯＰ２は、特定の正常組織における発現に加えて、乳がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、上咽頭癌、および卵巣癌を含む種々のがんにおいて過剰発現されている。それは、がん細胞に増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、浸潤および生存についてのシグナルを送る。
ＣＤ６６ｅまたはＣＥＡＣＡＭ５としても公知の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、大きな細胞表面糖タンパク質であり、細胞間接触を媒介する細胞接着分子として主に作用している。ＣＥＡは、細胞接着および遊走における作用に加えて、胃腸管、結腸直腸および膵がんの９０％、非小細胞肺がん細胞の７０％ならびに乳がんの５０％を含む高パーセンテージのヒトがんにおいて過剰発現されていることが見出されている。ＣＥＡの過剰発現は、腫瘍形成能、および腫瘍侵襲性の増強と関連することが示されている。
クローディン－１８．２は、クローディン－１８の２つのアイソフォームのうちの１つであり、上皮層の透過性、バリア機能および極性を制御するタイトジャンクションの主な構成成分である。クローディン－１８．２は、健康な組織では胃粘膜の短命な分化細胞においてのみ発現されている。しかし、胃腸管腺癌の８０％および膵臓腫瘍の６０％に至るまでにおいて過剰発現されている。さらに、その発現は、食道がん、非小細胞肺癌、卵巣がん、結腸がん、およびいくつかの形態の胆道癌（ｂｉｌｉａｒｙ ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を有する個体の異なるサブセットにおいて観察されている。
国際公開第２０１６／１３４３７１号 国際公開第２０１５／０９５４１２号
要旨
本発明は、がん細胞におけるＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２およびナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。かかるタンパク質は、２種類以上のＮＫ活性化受容体と会合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を阻止し得る。ある特定の実施形態では、本タンパク質は、ヒトならびにげっ歯動物およびカニクイザルなどの他の種のＮＫ細胞を刺激し得る。本発明の様々な態様および実施形態を以下にさらに記載する。
したがって、本発明の一態様は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２に結合する第２の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメイン、その一部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを組み込んだタンパク質を提供する。抗原結合部位はそれぞれ、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメイン（例えば、１つの抗体中に配置されているか、または互いに融合してｓｃＦｖを形成する）を組み込んでいてもよく、あるいは抗原結合部位のうちの１つまたは複数が、ラクダ科抗体のようなＶＨＨ抗体、または軟骨魚類に見られるもののようなＶＮＡＲ抗体などの単一ドメイン抗体であってもよい。
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、一実施形態では、例えば配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有すること、および／または、配列番号１のＣＤＲ１配列（配列番号５１）、ＣＤＲ２配列（配列番号５２）、およびＣＤＲ３配列（配列番号５３）と同一のアミノ酸配列を組み込むことにより、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込んでいる。配列番号１に関連する重鎖可変ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成するように様々な軽鎖可変ドメインとカップリングしてよい。例えば、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込んだ第１の抗原結合
部位は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および４０に関連する配列のいずれか１つから選択される軽鎖可変ドメインをさらに組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および４０から選択される配列のいずれか１つと少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。代替的に、第１の抗原結合部位は、配列番号４１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号４２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号４１のＣＤＲ１配列（配列番号５４）、ＣＤＲ２配列（配列番号５５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号５６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号４２のＣＤＲ１配列（配列番号５７）、ＣＤＲ２配列（配列番号５８）、およびＣＤＲ３配列（配列番号５９）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。他の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号４３に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号４４に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号４３のＣＤＲ１配列（配列番号６０）、ＣＤＲ２配列（配列番号６１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号６２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号４４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号４４のＣＤＲ１配列（配列番号６３）、ＣＤＲ２配列（配列番号６４）、およびＣＤＲ３配列（配列番号６５）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号４５に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号４６に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号４５のＣＤＲ１配列（配列番号６６）、ＣＤＲ２配列（配列番号６７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号６８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号４６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号４６のＣＤＲ１配列（配列番号６９）、ＣＤＲ２配列（配列番号７０）、およびＣＤＲ３配列（配列番号７１）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、第１の抗原結合部位は、例えば配列番号４７および配列番号４８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有することにより、それぞれ、配列番号４７に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号４８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。別の実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば配列番号４９および配列番号５０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ
酸配列を有することにより、それぞれ、配列番号４９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号５０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１３２に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１３３に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１３２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１３２のＣＤＲ１配列（配列番号１３４）、ＣＤＲ２配列（配列番号１３５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１３６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１３３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１３３のＣＤＲ１配列（配列番号１３７）、ＣＤＲ２配列（配列番号１３８）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１３９）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１４０に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１４１に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１４０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１４０のＣＤＲ１配列（配列番号１４２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１４３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１４４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１４１のＣＤＲ１配列（配列番号１４５）、ＣＤＲ２配列（配列番号１４６）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１４７）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１４８に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１４９に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１４８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１４８のＣＤＲ１配列（配列番号１５０）、ＣＤＲ２配列（配列番号１５１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１５２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１４９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１４９のＣＤＲ１配列（配列番号１５３）、ＣＤＲ２配列（配列番号１５４）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１５５）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１５６に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１５７に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１５６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１５６のＣＤＲ１配列（配列番号１５８）、ＣＤＲ２配列（配列番号１５９）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１６０）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１５７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１５７のＣＤＲ１配列（配列番号１６１）、ＣＤＲ２配列（配列番号１６２）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１６３）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号１６４に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１６５に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１６４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１６４のＣＤＲ１配列（配列番号１６６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１６７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１６８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１６５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１６５のＣＤＲ１配列（配列番号１６９）、ＣＤＲ２配列（配列番号１７０）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１７１）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
第２の抗原結合部位は、ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２に結合できる。一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＡＩＸに結合し、ＣＡＩＸ結合部位を形成するようにカップリングできる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。例えば、第２の抗原結合部位は、配列番号７２に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号７３に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号７２のＣＤＲ１配列（配列番号７４）、ＣＤＲ２配列（配列番号７５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号７６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号７３のＣＤＲ１配列（配列番号７７）、ＣＤＲ２配列（配列番号７８）、およびＣＤＲ３配列（配列番号７９）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、第２の抗原結合部位は、配列番号８０に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号８１に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号８０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号８０のＣＤＲ１配列（配列番号８２）、ＣＤＲ２配列（配列番号８３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号８４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号８１のＣＤＲ１配列（配列番号８５）、ＣＤＲ２配列（配列番号８６）、およびＣＤＲ３配列（配列番号８７）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
代替的に、第２の抗原結合部位は、配列番号８８に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号８９に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号８８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００
％）同一であり、かつ／または配列番号８８のＣＤＲ１配列（配列番号９０）、ＣＤＲ２配列（配列番号９１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号９２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号８９のＣＤＲ１配列（配列番号９３）、ＣＤＲ２配列（配列番号９４）、およびＣＤＲ３配列（配列番号９５）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＡＮＯ１に結合し、ＡＮＯ１結合部位を形成するようにカップリングできる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。例えば、第２の抗原結合部位は、配列番号９７に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号９８に関連する軽鎖可変ドメインとを様々に組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号９７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号９７のＣＤＲ１配列（配列番号９９）、ＣＤＲ２配列（配列番号１００）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１０１）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号９８のＣＤＲ１配列（配列番号１０２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１０３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１０４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、メソテリンに結合し、メソテリン結合部位を形成するようにカップリングできる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。例えば、第２の抗原結合部位は、配列番号１０６に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１０７に関連する軽鎖可変ドメインとを様々に組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１０６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１０６のＣＤＲ１配列（配列番号１０８）、ＣＤＲ２配列（配列番号１０９）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１０）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１０７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１０７のＣＤＲ１配列（配列番号１１１）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１２）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１３）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。代替的に、第２の抗原結合部位は、配列番号１１４に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１１５に関連する軽鎖可変ドメインとを様々に組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１１４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１１５のＣＤＲ１配列（配列番号１１６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１１５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１１５のＣＤＲ１配列（配列番号１１９）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２０）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１２１）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。代替的に、第２の抗原結合部位は、配列番号１２２に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１２３に関連する軽鎖可変ドメインとを様々に組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１２２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１２２のＣＤＲ１配列（配列番号１２４）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１２６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１２３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１２３のＣＤＲ１配列（配列番号１２７）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２８）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１２９）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＴＲＯＰ２に結合し、ＴＲＯＰ２結合部位を形成するようにカップリングできる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。例えば、第２の抗原結合部位は、配列番号１７２に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１７３に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１７２のＣＤＲ１配列（配列番号１７４）、ＣＤＲ２配列（配列番号１７５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１７６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１７３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１７３のＣＤＲ１配列（配列番号１７７）、ＣＤＲ２配列（配列番号１７８）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１７９）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。代替的に、第２の抗原結合部位は、配列番号１８０に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１８１に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１８０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１８０のＣＤＲ１配列（配列番号１８２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１８３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１８４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１８１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１８１のＣＤＲ１配列（配列番号１８５）、ＣＤＲ２配列（配列番号１８６）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１８７）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。代替的に、第２の抗原結合部位は、配列番号１８８に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１８９に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１８９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１８９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよい。代替的に、第２の抗原結合部位は、配列番号１９０に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１９１に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよい。代替的に、第２の抗原結合部位は、配列番号１９２に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１９３に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％
、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよい。
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＥＡに結合し、ＣＥＡ結合部位を形成するようにカップリングできる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。例えば、第２の抗原結合部位は、配列番号１９５に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１９６に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１９５のＣＤＲ１配列（配列番号１９７）、ＣＤＲ２配列（配列番号１９８）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１９９）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号１９６のＣＤＲ１配列（配列番号２００）、ＣＤＲ２配列（配列番号２０１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号２０２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。代替的に、第２の抗原結合部位は、配列番号２０３に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２０４に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２０３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２０３のＣＤＲ１配列（配列番号２０５）、ＣＤＲ２配列（配列番号２０６）、およびＣＤＲ３配列（配列番号２０７）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２０４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２０４のＣＤＲ１配列（配列番号２０８）、ＣＤＲ２配列（配列番号２０９）、およびＣＤＲ３配列（配列番号２１０）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。代替的に、第２の抗原結合部位は、配列番号２１１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２１２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２１１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２１２のＣＤＲ１配列（配列番号２１３）、ＣＤＲ２配列（配列番号２１４）、およびＣＤＲ３配列（配列番号２１５）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２１２のＣＤＲ１配列（配列番号２１６）、ＣＤＲ２配列（配列番号２１７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号２１８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、クローディン－１８．２に結合し、クローディン－１８．２結合部位を形成するようにカップリングできる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。例えば、第２の抗原結合部位は、配列番号２２０に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２２１に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２２０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２２０のＣＤＲ１配列（配列番号２２２）、ＣＤＲ２配列（配列番号２２３）、およびＣＤＲ３
配列（配列番号２２４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２２１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２２１のＣＤＲ１配列（配列番号２２５）、ＣＤＲ２配列（配列番号２２６）、およびＣＤＲ３配列（配列番号２２７）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位は、配列番号２２８に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号２２９に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２２８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２２８のＣＤＲ１配列（配列番号２３０）、ＣＤＲ２配列（配列番号２３１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号２３２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２２９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、かつ／または配列番号２２９のＣＤＲ１配列（配列番号２３３）、ＣＤＲ２配列（配列番号２３４）、およびＣＤＲ３配列（配列番号２３５）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。
一部の実施形態では、本タンパク質は、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメインの一部分を組み込んでおり、ここで抗体Ｆｃドメインは、ヒンジおよびＣＨ２ドメイン、および／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
これらのタンパク質のうちの１つを含有する製剤、これらのタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含有する細胞、およびこれらのタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も提供される。
本発明の別の態様は、患者のがんを処置する方法を提供する。本方法は、それを必要とする患者に、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を治療有効量で投与することを含む。ＣＡＩＸ標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、腎細胞癌、乳がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、卵巣がん、食道、肺、結腸、腎臓、子宮頸部の腫瘍および非小細胞肺癌が挙げられる。メソテリン標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、中皮腫、卵巣がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、胆管細胞癌、胃がん、子宮漿液性癌、胸腺癌、および急性骨髄性白血病が挙げられる。ＡＮＯ１標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、食道扁平上皮がん（ＥＳＣＣ）、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、膵がん、乳がん、前立腺がんおよび肉腫が挙げられる。ＴＲＯＰ２標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、上咽頭癌および卵巣癌が挙げられる。ＣＥＡ標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、胃腸がん、結腸直腸がん、膵がん、非小細胞肺がんおよび乳がんが挙げられる。クローディン－１８．２標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、食道がん、非小細胞肺癌、卵巣がん、結腸がんおよびいくつかの形態の胆道癌が挙げられる。
図１は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体の図である。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡおよびクローディン－１８．２結合ドメインから選択される腫瘍関連抗原結合ドメインの１つのいずれかを表し得る。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび腫瘍関連抗原結合ドメインは、共通の軽鎖をもつ場合がある。
図２は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体の図である。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡおよびクローディン－１８．２結合ドメインから選択される腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかは、ｓｃＦｖフォーマット（右アーム）をとることができる。
図３は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。
図４は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。
図５は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるマウス組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。
図６は、フローサイトメトリーによる、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフであり、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍率を示している。
図７は、フローサイトメトリーによる、マウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフであり、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍率を示している。
図８は、天然リガンドのＵＬＢＰ－６と競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
図９は、天然リガンドのＭＩＣＡと競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
図１０は、天然リガンドのＲａｅ－１デルタと競合することによる、組換えマウスＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
図１１は、ヒトＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ－アルファ陽性細胞のパーセンテージを定量化することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。
図１２は、マウスＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ－アルファ陽性細胞のパーセンテージを定量化することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。
図１３は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
図１４は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
図１５は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
図１６は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
図１７は、腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の細胞傷害作用を示す棒グラフである。
図１８は、示差走査型蛍光定量法によって測定された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の融解温度を示す棒グラフである。
図１９Ａ～１９Ｃは、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄの結合を使用したＮＫ細胞の相乗的活性化の棒グラフである。図１９ＡはＣＤ１０７ａのレベルを示し、図１９ＢはＩＦＮγのレベルを示し、図１９ＣはＣＤ１０７ａおよびＩＦＮγのレベルを示す。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。データは、５名の異なった健康なドナーを使用した、５つの独立した実験を代表するものである。
図２０は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体であるＴｒｉｏｍａｂ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。Ｔｒｉｏｍａｂ形態は、ラット抗体の１／２およびマウス抗体の１／２を含有するヘテロ二量体構築物であり得る。
図２１は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ：ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）技術を用いるＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＫｉＨは、標的１および２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨフォーマットにおけるＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖と、両方の重鎖と対合する共通の軽鎖とを含有する、標的１および標的２に結合する２つのＦａｂを含むヘテロ二量体構築物であり得る。
図２２は、自然起源の可動性リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）とは、抗原２を標的とする可変ドメインが、抗原１を標的とするＦａｂの可変ドメインのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である。構築物は通常のＦｃを含有する。
図２３は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つのＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、直交性Ｆａｂ界面（オルト－Ｆａｂ）形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＬＣ－ＨＣの対合は、直交界面によって確実になっている。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける突然変異によって確実になっている。
図２４は、２－ｉｎ－１ ＩｇフォーマットにおけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。
図２５は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリング突然変異によって確実になっている。
図２６は、Ｆａｂアーム交換形態におけるＴｒｉＮＫＥＴ、すなわち、重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重鎖－軽鎖対とスワップすることによりＦａｂアームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体の図である。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。
図２７は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である、ＳＥＥＤ Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。
図２８は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ－Ｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＬｕＺ－Ｙ形態は、Ｆｃに融合した標的１および２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフによって確実になっている。
図２９は、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。
図３０Ａおよび３０Ｂは、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、κλ－Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。抗原１を標的とするＦａｂ１はカッパＬＣを含有し、一方、抗原２を標的とする第２のＦａｂはラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κλ－Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ－Ｂｏｄｙの例示的な図である。
図３１は、Ｆｃに融合した、標的１に結合するＦａｂと、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含む、Ｏａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける突然変異によって確実になっている。
図３２は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂである。Ｆａｂ１および２は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）の正確な対合を確実にする特異な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）Ｓ－Ｓ架橋を含有する。
図３３は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂである。ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインラインで融合しており、一方、ＣＬは、ＶＨとインラインで融合している。
図３４は、抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ－Ｉｇである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
図３５は、ＥＬ４細胞において発現されるＮＫＧ２Ｄに対するＣＡＩＸ結合ドメインおよびＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含むＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す。
図３６は、ヒト腎細胞癌細胞Ａ４９８において発現されるＣＡＩＸに対するＣＡＩＸ結合ドメインおよびＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含むＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す。
図３７Ａは、ＣＡＩＸ陽性腎細胞癌Ａ４９８細胞に対するＫＨＹＧ－１エフェクター細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介細胞傷害性を示す。点線は、ＴｒｉＮＫＥＴを添加することなく休止ＫＨＹＧ－１細胞と同時培養した際のＡ４９８細胞のバックグラウンド殺傷を示す。図３７Ｂは、ＣＡＩＸ陽性腎細胞癌Ａ４９８細胞に対する休止ＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介細胞傷害性を示す。
本発明は、がん細胞におけるＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２およびナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化させる多重特異性結合タンパク質、かかる多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに、がんの処置のためが挙げられる、かかる多重特異性タンパク質および医薬組成物を使用する治療方法を提供する。本発明の様々な態様は、以下のセクションに記載されるが；ある特定のセクションに記載される本発明の態様は、いかなる特定のセクションにも限定されない。
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および句を以下に定義する。
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、「１つまたは複数」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数を含む。
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知である、より保存された隣接するストレッチの間に介在している「超可変領域」と称される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンにおける超可変領域の間におよびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するように三次元空間において互いに対して配置される。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定の動物において、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクトな抗体中、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片中、またはｓｃＦｖなどの組換えポリペプチド中に存在し、ペプチドリンカーを使用して単一ポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに連結することができる。
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」という用語は、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない、任
意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞において、または腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉系間質、もしくは免疫浸潤物におけるような腫瘍微小環境中で発現され得る。
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載の方法および組成物によって処置される生物を指す。かかる生物には、好ましくは、限定されないが、哺乳動物（例えば、ネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、より好ましくはヒトが含まれる。
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬量で投与されてもよく、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。本明細書中で使用される場合、「処置する」という用語は、何らかの効果、例えば、状態、疾患、障害などの好転をもたらす、減少、低減、モジュレート、改善もしくは除去、またはそれらの症状の改善を含む。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、組成物を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断的使用または治療的使用に特に適切にする、活性剤と、不活性または活性な担体との組合せを指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水または水／油エマルションなど）、および種々の種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤およびアジュバントの例に関しては、例えば、Martin、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１５版、Mack Publ.Co.、Easton、PA［１９７５年］を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与すると、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残留物を提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に公知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から誘導され得る。例示的な酸には、限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが含まれる。シュウ酸などの他の酸は、それら自体では薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に利用され得る。
例示的な塩基には、限定されないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニアおよび式ＮＷ４ ＋（式中、ＷはＣ１～４アルキルである）の化合物などが含まれる。
例示的な塩には、限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫
酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが含まれる。塩の他の例には、Ｎａ＋、ＮＨ４ ＋およびＮＷ４ ＋（式中、ＷはＣ１～４アルキル基である）などの適切なカチオンと配合された本発明の化合物のアニオンが含まれる。
治療的使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されると意図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において使用することができる。
組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されているか、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている説明全体にわたって、さらに、列挙された成分から本質的になる、またはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびに列挙されたプロセスステップから本質的になる、またはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが意図される。
一般的事項として、パーセンテージを特定する組成物は、特に明記しない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の以前の定義が優先する。
Ｉ．タンパク質
本発明は、がん細胞におけるＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２およびナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化させる多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載の医薬組成物および治療方法において有用である。ナチュラルキラー細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に多重特異性結合タンパク質が結合すると、がん細胞の破壊を目的としたナチュラルキラー細胞の活性が増強される。がん細胞のＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡ、またはクローディン－１８．２に多重特異性結合タンパク質が結合すると、がん細胞がナチュラルキラー細胞に近接するため、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的な破壊が容易になる。例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる説明を以下に提供する。
多重特異性結合タンパク質の第１の構成要素は、ＮＫ細胞、γδＴ細胞、およびＣＤ８＋αβＴ細胞を含み得るがこれらに限定されない、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する。多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合すると、ＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合し、ＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化させることを阻止し得る。
多重特異性結合タンパク質の第２の構成要素は、ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡ、またはクローディン－１８．２発現細胞に結合する。ＣＡＩＸ発現細胞としては、腎細胞癌、乳がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、卵巣がん、食道、肺、結腸、腎臓、子宮頸部の腫瘍および非小細胞肺癌が挙げられるがこれらに限定されない。メソテリン発現細胞としては、中皮腫、卵巣がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、胆管細胞癌、胃がん、子宮漿液性癌、胸腺癌、および急性骨髄性白血病が挙げられるがこれらに限定されない。ＡＮＯ１発現細胞としては、食道扁平上皮がん（ＥＳＣＣ）、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、膵がん、乳がん、前立腺がんおよび肉腫が挙げられるがこれらに限定されない。ＴＲＯＰ２発現細胞としては、乳がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、上咽頭癌、および卵巣癌が挙げられるがこれらに限定されない。ＣＥＡ発現細胞としては、胃腸がん、結腸直腸がん、膵がん、非小細胞肺がんおよび乳がんが挙げられ
るがこれらに限定されない。クローディン－１８．２発現細胞としては、食道がん、非小細胞肺癌、卵巣がん、結腸がんおよびいくつかの形態の胆道癌が挙げられるがこれらに限定されない。
多重特異性結合タンパク質の第３の構成要素は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、および濾胞性樹状細胞を含む白血球の表面にあるＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。
本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、様々なフォーマットをとることができる。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、および第２の免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（図１）である。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインと、第１の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第１のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第２のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２に結合する抗原結合部位を形成する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒にＣＤ１６に結合することができる（図１）。一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン軽鎖と同一である。
別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、および免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（図２）に関する。第１の免疫グロブリン重鎖は、対合し、ＮＫＧ２ＤまたはＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡおよびクローディン－１８．２から選択される腫瘍関連抗原の１つに結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して融合している、第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じてＣＨ１重鎖ドメインとを含む。この免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対合し、ＮＫＧ２ＤまたはＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡおよびクローディン－１８．２から選択される腫瘍関連抗原の１つに結合する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒にＣＤ１６に結合することができる（図２）。
１つまたは複数のさらなる結合モチーフが、必要に応じてリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合され得る。ある特定の実施形態では、抗原結合部位は、一本鎖もしくはジスルフィド安定化可変領域（ＳｃＦｖ）であり得るか、または四価もしくは三価の分子を形成し得る。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ形態である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）技術を用いるＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態である。ＫＩＨは、ヘテロ二量体化を促進するために、ＣＨ３ドメインを工学操作して各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれか
を作出することを伴う。「ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の背後にある概念は、小さな残基を嵩高の残基で置換することにより、１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に「ノブ」（すなわち、ＥＵ付番でＴ３６６ＷＣＨ３Ａ）を導入することであった。この「ノブ」に適応するように、他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）において、ノブに最も近い隣接残基をより小さな残基に置き換えること（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶＣＨ３Ｂ）により、相補的な「ホール」表面が作出された。「ホール」突然変異は、構造情報に基づくファージライブラリスクリーニング（Atwell S、Ridgway JB、Wells JA、Carter P.、Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library、J Mol Biol（１９９７年）２７０巻（１号）：２６～３５頁）によって最適化された。ＫｉＨ Ｆｃ変異体のＸ線結晶構造（Elliott JM、Ultsch M、Lee J、Tong R、Takeda K、Spiess Cら、Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J Mol Biol（
２０１４年）４２６巻（９号）：１９４７～５７頁、Mimoto F、Kadono S、Katada H
、Igawa T、Kamikawa T、Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs. Mol
Immunol（２０１４年）５８巻（１号）：１３２～８頁）は、ＣＨ３ドメイン間のコア
界面では、立体的相補性によって推進される疎水性相互作用がヘテロ二量体化に熱力学的に有利に働くが、ノブ－ノブおよびホール－ホールの界面は、それぞれ立体障害および好ましい相互作用の妨害が原因でホモ二量体化に有利に働かないことを示した。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、自然起源の可動性リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））形態におけるものである。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交性Ｆａｂ界面（オルト－Ｆａｂ）形態におけるものである。オルト－Ｆａｂ ＩｇＧアプローチ（Lewis SM、Wu X、Pustilnik A、Sereno A、Huang F、Rick HLら、Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol.（２０１４年）３２巻（２号）：１９１～８頁）では、構造に基づく領
域デザインにより、一方のＦａｂにおけるＬＣおよびＨＣＶＨ－ＣＨ１の界面にのみ相補的突然変異が導入され、他方のＦａｂが変化することはない。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２ｉｎ１ Ｉｇフォーマットにおけるものである。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリング突然変異によって確実になっている。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、κλ－Ｂｏｄｙ形態におけるものである。抗原１を標的とするＦａｂ１はカッパＬＣを含有し、一方、抗原２を標的とする第２のＦａｂはラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κλ－Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ－Ｂｏｄｙの例示的な図である。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換形態（重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重鎖－軽鎖対とスワップすることによりＦａｂアームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体）である。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＳＥＥＤ Ｂｏｄｙ形態におけるものである。ＳＥＥＤ（ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ）プラットフォームは、天然抗体の治療用途を広げる可能性がある非対称かつ二重特異性抗体様の分子を生成するためにデザインされた。このタンパク質工学操作プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメインにおける免疫グロブリンの構造的に関連した配列の交換に基づく。ＳＥＥＤデザインは、ＡＧおよびＧＡ ＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避しつつ、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効果的な生成を可能にする（Muda
M.ら、Protein Eng. Des. Sel.（２０１１年、２４巻（５号）：４４７～５４頁）
）。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ－Ｙ形態におけるものである（Wranik, BJ.ら、J. Biol. Chem.（２０１２年）、２８７巻：４３３３１～９頁）。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ形態におけるものである。二重特異性ＣｏｖＸ－Ｂｏｄｙでは、分枝状のアゼチジノンリンカーを使用して２つの異なるペプチドをひとつに結合させ、温和な条件下にてスキャフォールド抗体に部位特異的様式で融合させる。機能的活性に関与するのはファルマコフォアだが、抗体スキャフォールドは長い半減期およびＩｇ様の分布をもたらす。最適化された、または独特の二重特異性抗体を生成するために、ファルマコフォアは化学的に最適化するか、または他のファルマコフォアに置き換えることができる（Doppalapudi VRら、PNAS（２０
１０年）、１０７巻（５２号）；２２６１１～２２６１６頁）。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した、標的１に結合するＦａｂと、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含む、Ｏａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける突然変異によって確実になっている。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂ形態におけるものである。Ｆａｂ１および２は、ＬＣおよびＨＣの正確な対合を確実にする特異なＳ－Ｓ架橋を含有する。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態におけるものである。ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインラインで融合しており、ＣＬは、ＶＨとインラインで融合している。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ－Ｉｇ形態におけるものである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
表１は、組み合わせてＮＫＧ２Ｄと結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を記載している。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄへのそれらの結合親和性について変動し得るが、それにも関わらず、それらはすべてヒトＮＫＧ２ＤおよびＮＫ細胞を活性化する。
Figure 0007187518000001
Figure 0007187518000002
Figure 0007187518000003
Figure 0007187518000004
Figure 0007187518000005
Figure 0007187518000006
Figure 0007187518000007
Figure 0007187518000008
代替的に、ＵＳ９，２７３，１３６において説明されているように、配列番号４７によって定義される重鎖可変ドメインを、配列番号４８によって定義される軽鎖可変ドメインと対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。
Figure 0007187518000009
代替的に、ＵＳ７，８７９，９８５において説明されているように、配列番号４９によって定義される重鎖可変ドメインを、配列番号５０によって定義される軽鎖可変ドメインと対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。
Figure 0007187518000010
表２は、組み合わさってＣＡＩＸに結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。
Figure 0007187518000011
Figure 0007187518000012
代替的に、ＣＡＩＸに結合する新規の抗原結合部位は、配列番号９６によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
Figure 0007187518000013
表３は、組み合わさってＡＮＯ１に結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。
Figure 0007187518000014
Figure 0007187518000015
代替的に、ＡＮＯ１に結合する新規の抗原結合部位は、配列番号１０５によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
Figure 0007187518000016
表４は、組み合わさってメソテリンに結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。
Figure 0007187518000017
Figure 0007187518000018
代替的に、メソテリンに結合する新規の抗原結合部位は、配列番号１３０によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
Figure 0007187518000019
表５は、組み合わさってＴＲＯＰ２に結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。
Figure 0007187518000020
Figure 0007187518000021
Figure 0007187518000022
代替的に、ＴＲＯＰ２に結合する新規の抗原結合部位は、配列番号１９４によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
Figure 0007187518000023
表６は、組み合わさってＣＥＡに結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。
Figure 0007187518000024
Figure 0007187518000025
代替的に、ＣＥＡに結合する新規の抗原結合部位は、配列番号２１９によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
Figure 0007187518000026
Figure 0007187518000027
表７は、組み合わさってクローディン－１８．２に結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。
Figure 0007187518000028
Figure 0007187518000029
代替的に、クローディン－１８．２に結合する新規の抗原結合部位は、配列番号２３６によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって特定することができる。
Figure 0007187518000030
Ｆｃドメイン内で、ＣＤ１６結合はヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内で、ＣＤ１６との相互作用は主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５～Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７～Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７～Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４～Ｓｅｒ２３９、およびＣＨ２ドメインにおける炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに焦点が当てられている（Sondermannら、Nature、４０６巻（６７９３号）：２６７～２７３頁を参照されたい）。既知のドメインに基づいて、突然変異は、ファージディスプレイライブラリもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリを使用することなどによって、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強もしくは低減させるように選択され得るか、または相互作用の既知の三次元構造に基づいてデザインされ得る。
ヘテロ二量体抗体重鎖の構築は、同じ細胞内で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成することができ、これにより、各抗体重鎖のホモ二量体の構築およびヘテロ二量体の構築をもたらすことができる。ヘテロ二量体の選択的構築の促進は、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０およびＵＳ１４／８３０３３６に示されているように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン内に異なる突然変異を組み込むことによって達成することができる。例えば、突然変異は、ヒトＩｇＧ１に基づき、これらの２つの鎖が互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にする第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド内にアミノ酸置換の異なる対を組み込んでいるＣＨ３ドメイン内で作製され得る。以下に例示したアミノ酸置換の位置は、Ｋａｂａｔにおけるように、すべてＥＵインデックスに従って番号付けしている。
１つの状況では、第１のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択される、より大きなアミノ酸で置換し、第２のポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、より大きなアミノ酸置換（突出）が、より小さな
アミノ酸置換（空洞）の表面に適合するように、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選択される、より小さなアミノ酸で置換する。例えば、一方のポリペプチドはＴ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる。
本発明の抗体重鎖可変ドメインは、必要に応じて、ＣＨ１ドメインを有するまたは有さないヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの、抗体定常領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と連結され得る。一部の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などの、ヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。一部の他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物由来の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。１つまたは複数の突然変異が、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９において定常領域に組み込まれ得る。例示的な置換には、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅが含まれる。
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込まれ得る突然変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、および／またはＶ１７３であり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込まれ得る突然変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、および／またはＴ１６４であり得る。
代替的に、アミノ酸置換は、以下の表８に示される置換のセットから選択してもよい。
Figure 0007187518000031
代替的に、アミノ酸置換は、以下の表９に示される置換のセットから選択してもよい。
Figure 0007187518000032
代替的に、アミノ酸置換は、以下の表１０に示される置換のセットから選択してもよい。
Figure 0007187518000033
代替的に、各ポリペプチド鎖における少なくとも１つのアミノ酸置換を表１１から選択してもよい。
Figure 0007187518000034
代替的に、以下の表１２における置換のセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択してもよく、ここで「第１のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、「第２のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の正に帯電したアミノ酸に置き換えられる。
Figure 0007187518000035
代替的に、以下の表１３におけるセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択してもよく、ここで「第１のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、「第２のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられる。
Figure 0007187518000036
代替的に、アミノ酸置換は、以下の表１４のセットから選択してもよい。
Figure 0007187518000037
代替的にまたは付加的に、ヘテロ多量体タンパク質の構造安定性は、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃを導入し、反対のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入することによって増加させることができ、これにより、２つのポリペプチドの界面内で人工ジスルフィド架橋が形成する。
上記の多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベク
ターにクローニングすることができ、第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ、免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ、第１、第２および第３の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定にトランスフェクトして多量体タンパク質を産生することができる。
多重特異性タンパク質の最も高い収率を達成するために、第１、第２および第３の発現ベクターの異なる比率を調べて宿主細胞へのトランスフェクションのための最適比率を決定することができる。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当技術分野において公知の方法を使用して、細胞バンク生成のために単一クローンを単離することができる。
クローンは、バイオリアクタスケールアップに適した条件下で培養することができ、多重特異性タンパク質の発現を維持することができる。多重特異性タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、均質化、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、およびミックスモードクロマトグラフィーを含む、当技術分野において公知の方法を使用して単離され、精製され得る。
ＩＩ．多重特異性タンパク質の特徴
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよびＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２の結合ドメインを含む本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する。ある特定の実施形態では、多重特異性タンパク質は、それぞれ同じＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２結合ドメインを有するモノクローナル抗体のものと比較可能なレベルで腫瘍関連抗原ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２に結合する。しかしながら、本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、対応するＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２モノクローナル抗体よりも、腫瘍増殖を低減させ、ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２を発現するがん細胞を殺傷するのに効果的であり得る。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよびＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２の結合ドメインを含む本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、抗原ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２を発現する腫瘍細胞と共に培養すると初代ヒトＮＫ細胞を活性化させることができる。ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ１０７ａの脱顆粒およびＩＦＮγサイトカイン産生量の増加によって示される。さらに、同じＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２結合ドメインを含むモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、抗原ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２を発現する腫瘍細胞の存在下において、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示す。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよびＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２の結合ドメインを含む本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、抗原ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２を発現する腫瘍細胞の存在下で、ヒト休止ＮＫ細胞およびヒトＩＬ－２活性化ＮＫ細胞の活性を増強することができる。
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび腫瘍関連抗原ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２の結合ドメインを
含む本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、抗原ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２を発現する腫瘍細胞の存在下で、ヒト休止ＮＫ細胞およびヒトＩＬ－２活性化ＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するモノクローナル抗体と比較して、中程度および低度のＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２を発現する腫瘍細胞に対する利点を提示し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、対応するＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２モノクローナル抗体と比較して、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を高発現するがん、またはＦｃＲのレベルが高い腫瘍微小環境に存在するがんを処置するのに有利であり得る。モノクローナル抗体は、とりわけＡＤＣＣ、ＣＤＣ、食作用、およびシグナル遮断を含む複数の機構により、腫瘍成長に対するそれらの効果を発揮する。ＦｃγＲの中でも、ＣＤ１６がＩｇＧ Ｆｃに対して最も低い親和性を有し、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、ＣＤ１６の約１０００倍強くＩｇＧ Ｆｃに結合する高親和性ＦｃＲである。ＣＤ６４は通常、骨髄系列などの多くの造血系列で発現し、これらの細胞型に由来する腫瘍、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で発現する場合がある。ＭＤＳＣおよび単球などの腫瘍に浸潤する免疫細胞もＣＤ６４を発現し、腫瘍微小環境に浸潤することが公知である。腫瘍による、または腫瘍微小環境におけるＣＤ６４の発現は、モノクローナル抗体療法に有害作用を及ぼし得る。抗体は高親和性受容体に優先的に結合するため、腫瘍微小環境でＣＤ６４が発現すると、これらの抗体がＮＫ細胞表面上のＣＤ１６と会合することが困難になる。多重特異性タンパク質は、ＮＫ細胞の表面にある２つの活性化受容体を標的とすることにより、ＣＤ６４発現（腫瘍におけるものか腫瘍微小環境におけるものかを問わない）がモノクローナル抗体療法に及ぼす有害作用を克服することができる。ＮＫ細胞にある２つの活性化受容体の二重標的化により、ＮＫ細胞に対するより強い特異的結合がもたらされるため、腫瘍細胞におけるＣＤ６４発現にかかわらず、多重特異性タンパク質は、あらゆる腫瘍細胞に対するヒトＮＫ細胞応答を媒介することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、オンターゲット・オフ腫瘍（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ）副作用の低減によって、より良好な安全性プロファイルをもたらし得る。ナチュラルキラー細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞が腫瘍細胞から正常な自己を認識する機構は異なるが、ＮＫ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞はいずれも、腫瘍細胞を直接的に溶解させることができる。ＮＫ細胞の活性は、活性化受容体（ＮＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６など）および阻害性受容体（ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａなど）からのシグナルのバランスによって調節される。これらの活性化シグナルおよび阻害性シグナルのバランスにより、ＮＫ細胞が、ストレスを受けた自己細胞、ウイルスに感染した自己細胞、または形質転換した自己細胞から健康な自己細胞を判定することが可能になる。この「内蔵された」自己寛容機構は、正常で健康な組織をＮＫ細胞応答から保護するのに役立つ。この原理を拡大適用すると、ＮＫ細胞の自己寛容により、ＴｒｉＮＫＥＴが、腫瘍外の副作用を伴わず、または治療域の増加を伴って、自己および腫瘍の両方で発現する抗原を標的とすることが可能になる。ナチュラルキラー細胞とは異なり、Ｔ細胞は、活性化およびエフェクター機能のために、ＭＨＣ分子によって提示される特定のペプチドの認識を必要とする。Ｔ細胞は免疫療法の主要な標的であり、腫瘍に対するＴ細胞応答を再指向するために多くの方策が立てられてきた。Ｔ細胞二重特異性薬、チェックポイント阻害剤、およびＣＡＲ－Ｔ細胞はすべてＦＤＡに承認されているが、用量制限毒性を有することが多い。Ｔ細胞二重特異性薬およびＣＡＲ－Ｔ細胞は、結合ドメインを使用して腫瘍細胞の表面にある抗原を標的とすること、および工学操作されたシグナル伝達ドメインを使用して活性化シグナルをエフェクター細胞に伝達することにより、ＴＣＲ－ＭＨＣ認識システムを回避する。これらの療法は、抗腫瘍免疫応答を誘発するのに効果的ではあるが、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）およびオンターゲット・オフ腫瘍副作用を伴うことが多
い。これに関連して、多重特異性タンパク質が独特であるのは、ＮＫ細胞の活性化および阻害の天然のシステムを「無効化」しないからである。むしろ多重特異性タンパク質は、このバランスを傾け、ＮＫの健康な自己に対する寛容性を維持しながら、さらなる活性化シグナルをＮＫ細胞にもたらすようにデザインされている。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、同じ抗原結合ドメインを含む対応するＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２モノクローナル抗体よりも効果的に腫瘍の進行を遅延させ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、同じ抗原結合ドメインを含む対応するＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２モノクローナル抗体よりも、がん転移に対して効果的であり得る。
ＩＩＩ．治療用途
本発明は、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質および／または本明細書に記載の医薬組成物を使用してがんを処置するための方法を提供する。本方法は、それを必要とする患者に、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を治療有効量で投与することにより、ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２を発現する種々のがんを処置するために使用され得る。
この治療方法は、処置されるがんによって特徴付けられ得る。ＣＡＩＸ標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、腎細胞癌、乳がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、卵巣がん、食道、肺、結腸、腎臓、子宮頸部の腫瘍および非小細胞肺癌が挙げられる。メソテリン標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、中皮腫、卵巣がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、胆管細胞癌、胃がん、子宮漿液性癌、胸腺癌、および急性骨髄性白血病が挙げられる。ＡＮＯ１標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、食道扁平上皮がん（ＥＳＣＣ）、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、膵がん、乳がん、前立腺がんおよび肉腫が挙げられる。ＴＲＯＰ２標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、上咽頭癌、および卵巣癌が挙げられる。ＣＥＡ標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、胃腸がん、結腸直腸がん、膵がん、非小細胞肺がんおよび乳がんが挙げられる。クローディン－１８．２標的化多重特異性結合タンパク質を使用して処置されるがんとしては、例えば、食道がん、非小細胞肺癌、卵巣がん、結腸がん、およびいくつかの形態の胆道癌が挙げられる。
ある特定の他の実施形態では、がんは、脳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、白血病、肺がん、肝がん、黒色腫、卵巣がん、膵がん、直腸がん、腎がん、胃がん、精巣がん、または子宮がんである。さらに他の実施形態では、がんは、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん（bilary tract cancer）、甲状腺
がん、末端黒子型黒色腫、日光角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌（adenoid cycstic carcinoma）、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛
門がん、肛門直腸がん、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管がん、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノイド、胆管細胞癌、軟骨肉腫（chondosarcoma）、脈絡叢乳頭腫（choriod plexus papilloma）／細胞腫、慢性リンパ性白血病
、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器系がん、十二指腸がん、内分泌系がん、卵黄嚢腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼および眼窩のがん、女性性器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、胃噴門がん、胃底部がん、ガストリン産生腫瘍、神経
膠芽腫、グルカゴン産生腫瘍、心臓がん、血管芽腫（hemangiblastoma）、血管内皮腫、
血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸がん、インスリノーマ、上皮内新生物（intaepithelial neoplasia）、上皮間扁平細胞新生物（interepithelial squamous cell neoplasia）、肝内胆管がん、浸潤性扁平上皮癌、空腸がん、
関節がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子由来黒色腫、リンパ腫、男性生殖器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄上皮腫、髄膜がん、中皮がん、転移性癌、口がん、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉がん、鼻腔がん、神経系がん、神経上皮腺癌結節性黒色腫、非上皮性皮膚がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞がん、口腔がん、骨肉腫、漿液性乳頭腺がん、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸がん、腎細胞癌、呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性細胞腫、副鼻腔がん、皮膚がん、小細胞癌、小腸がん、平滑筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁平上皮癌、横紋筋がん、中皮下がん、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌がん、未分化癌、尿管がん、尿道がん、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸部がん、子宮体がん、ぶどう膜黒色腫、膣がん、疣状癌、ＶＩＰ産生腫瘍、外陰部がん、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。
ある特定の他の実施形態では、がんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リンパ腫である。
処置されるがんは、がん細胞の表面で発現する特定の抗原の存在によって特徴付けられ得る。ある特定の実施形態では、がん細胞は、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１のうちの１つまたは複数を発現し得る。
ＩＶ．併用療法
本発明の別の態様は併用療法を提供する。本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、がんを処置するためにさらなる治療剤と組み合わせて使用される。
がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤には、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エ
ノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－２アルファ、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ、コロニー刺激因子－１、コロニー刺激因子－２、デニロイキンディフティトックス、インターロイキン－２、黄体形成ホルモン放出因子、ならびにその同種受容体に対して特異な結合、および増加したまたは減少した血清半減期を示し得る上述の薬剤の変形型が含まれる。
がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る薬剤のさらなるクラスは免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７－Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７－Ｈ４、および（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つまたは複数を阻害する薬剤が含まれる。ＣＴＬＡ４阻害剤であるイピリムマブは、黒色腫を処置するために米国食品医薬品局によって承認されている。
がんを処置する際に併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体薬剤（例えば、ハーセプチン）および非細胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。
抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫおよびｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２－クロロ－デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１およびＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ－ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ならびにＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＧ－ＣＳＦから選択されるサイトカインが含まれる。
本発明のタンパク質はまた、原発病巣の外科的除去の補助として使用され得る。
多重特異性結合タンパク質およびさらなる治療剤の量ならびに投与の相対的タイミングは、所望の併用療法効果を達成するために選択され得る。例えば、このような投与を必要とする患者に併用療法を投与する場合、組み合わせる治療剤、または治療剤を含む１つもしくは複数の医薬組成物は、例えば、連続的に、併せて、一緒に、同時になどの任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、さらなる治療剤がその予防効果または治療効果を発揮する時間の間投与されてもよく、またはその逆であってもよい。
Ｖ．医薬組成物
本開示は、本明細書に記載のタンパク質を治療有効量で含有する医薬組成物も特色とする。組成物は、種々の薬物送達系で使用されるように製剤化することができる。適切な製剤を作るために、１種または複数の生理学的に許容される賦形剤または担体を組成物に含めることもできる。本開示で使用される好適な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Philadelphia、Pa.、第１７版、１９８５年に見
出される。薬物送達のための方法に関する簡潔な概説については、例えば、Langer（Scie
nce、２４９巻：１５２７～１５３３頁、１９９０年）を参照されたい。
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、または注射器に含有されてもよい。ある特定の実施形態では、バッグはチューブおよび／または針を含むチャネルに接続されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は凍結乾燥製剤または液体製剤であってもよい。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライ（凍結乾燥）されてもよく、約１２～６０個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライされてもよく、４５ｍｇのフリーズドライされた製剤が１個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ～約１００ｍｇのフリーズドライされた製剤が１個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、１２、２７、または４５個のバイアルからのフリーズドライされた製剤は、静脈内薬物製剤中に治療用量のタンパク質を得るために組み合わされてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアル～約１０００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約６００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。
本開示は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療有効量のタンパク質を含む液体水性医薬製剤中に存在することができる。
これらの組成物は従来の滅菌技術によって滅菌されてもよく、または濾過滅菌されてもよい。得られた水溶液はそのままで使用するためにパッケージ化されてもよく、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的に、３から１１の間、より好ましくは５から９の間または６から８の間、最も好ましくは７から８の間、例えば７～７．５である。得られた固形の組成物は複数の単回用量単位でパッケージ化されてもよく、各々は一定量の上述の１つまたは複数の薬剤を含有する。固形の組成物はまた、柔軟な量のための容器にパッケージ化されてもよい。
ある特定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、および酸化ナトリウムと組み合わせて本開示のタンパク質を含む、延長された貯蔵寿命を有する製剤を提供する。
ある特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本発明の緩衝液は、約４～約８、例えば、約４．５～約６．０、もしくは約４．８～約５．５の範囲のｐＨを有してもよく、または約５．０～約５．２のｐＨを有してもよい。上記に列挙したｐＨの中間の範囲も、本開示の一部であることが意図される。例えば、上限および／または下限として上記に列挙した値のいずれかの組合せを使用する値の範囲が含まれることが意図される。ｐＨをこの範囲内に制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が含まれる。
ある特定の実施形態では、製剤は、ｐＨを約４～約８の範囲に維持するためにクエン酸塩およびリン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨの範囲は、約４．５～約６．０、または約ｐＨ４．８～約５．５、または約５．０～約５．２のｐＨ範囲であってもよい。ある特定の実施形態では、緩衝系には、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、および／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物が含まれる。ある特定の実施形態では、緩衝系は、約１．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約０．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム（例えば、
０．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約１．５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍｌ）、約０．９ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６）、および約６．２ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍｌ）を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系は、１～１．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸、０．２５～０．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム、１．２５～１．７５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７～１．１ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物、および６．０～６．４ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは水酸化ナトリウムを用いて調整される。
トニシファイヤー（tonicifier）として作用し、抗体を安定化させることができるポリオールも、製剤に含めることができる。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化し得る量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は等張性であってもよい。添加されるポリオールの量も、ポリオールの分子量に関して変化し得る。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、少量の単糖（例えば、マンニトール）が添加されてもよい。ある特定の実施形態では、等張化剤として製剤に使用され得るポリオールはマンニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトール濃度は約５～約２０ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約７．５～１５ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１０～１４ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１２ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、ポリオールソルビトールを製剤に含めることができる。
洗剤または界面活性剤もまた、製剤に添加してもよい。例示的な洗剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロクサマー（例えば、ポロクサマー１８８）などの非イオン性洗剤が挙げられる。添加される洗剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減させ、かつ／または製剤中の微粒子の形成を最低限に抑え、かつ／または吸着を低減させるようなものである。ある特定の実施形態では、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は、洗剤のポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを表すために使用される用語である（Fiedler、Lexikon der Hifsstoffe、Editio Cantor Verlag Aulendorf、第４版、１９９６年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート８０、または約０．５ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬの間を含有し得る。ある特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加され得る。
実施形態では、本開示のタンパク質産物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉じ、アルミニウムクリンプシールクロージャで密封した、ＵＳＰ／Ｐｈ ＥｕｒいずれかのタイプＩ ５０Ｒバイアルにおいて、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され得る。栓は、ＵＳＰおよびＰｈ Ｅｕｒに準拠したエラストマーで作られていてもよい。ある特定の実施形態では、６０ｍＬの採取容量を可能にするために、バイアルに６１．２ｍＬのタンパク質産物溶液が充填され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、０．９％の生理食塩水で希釈され得る。
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定化レベルで糖と組み合わせた１０ｍｇ／ｍＬ濃度溶液として調製され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は水性担体中で調製され得る。ある特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくないまたは不適切な粘度をもたらし得る量以下の量で添加され得る。ある特定の実施形態では、糖は、二糖、例えば、スクロースであり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、および保存剤のうちの１つまたは複数を含み得る。
ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
凝集に加えて、脱アミドは、発酵、採取／細胞清澄化、精製、薬物物質／薬物製品貯蔵の間および試料分析の間に発生し得るペプチドおよびタンパク質の一般的な産物のバリアントである。脱アミドは、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成するタンパク質からのＮＨ３の喪失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解は、１８ダルトンの質量増加をもたらす。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性に起因して困難である。したがって、脱アミドは、典型的に１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミドは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかを生じる。脱アミドの速度に影響を及ぼすパラメータには、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポリペプチド立体配座および三次構造が含まれる。ペプチド鎖におけるＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響を及ぼす。タンパク質配列におけるＡｓｎに続くＧｌｙおよびＳｅｒは、脱アミドに対してより高い感受性を生じる。
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミノを阻止するためのｐＨおよび湿度の条件下で保存され得る。
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。
静脈内（ＩＶ）製剤は、患者が、移植後に入院しており、ＩＶ経路を介してすべての薬物を受けている場合などの特定の場合に好ましい投与経路であり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％の塩化ナトリウム溶液により希釈される。ある特定の実施形態では、注射のための希釈された薬物製品は等張であり、静脈内注入による投与に適している。
ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加することができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
保存剤は、必要に応じて、細菌作用を低減するために本明細書の製剤に加えられてよい。保存剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回投与）製剤の産生を容易にし得る。
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
本開示は、タンパク質およびリオプロテクタントを含む凍結乾燥製剤として存在することもできる。リオプロテクタントは糖、例えば二糖であり得る。ある特定の実施形態では、リオプロテクタント（lycoprotectant）は、スクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤は、緩衝剤、界面活性剤、増量剤、および／または保存剤のうちの１つまたは複数を含んでもよい。
凍結乾燥された薬物製品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比は１：２～１：５であり得る。
ある特定の実施形態では、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは６から８の間に調整され得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥した薬物製品についてのｐＨ範囲は７～８であり得る。
ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ～２００ｍＭの量で添加することができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
ある特定の実施形態では、「増量剤」を添加することができる。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放気孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤はこのような増量剤を含有し得る。
保存剤は、必要に応じて、細菌作用を低減するために本明細書の製剤に添加されてよい。保存剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回投与）製剤の産生を容易にし得る。
ある特定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品は水性担体で構成され得る。本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、凍結乾燥後、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な希釈剤には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥薬物製品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％の塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成の間、凍結乾燥粉末は溶液に溶解する。
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、約４．５ｍＬの注射用水に構成され、０．９％の生理食塩水溶液（塩化ナトリウム溶液）により希釈される。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性を生じず、特定の患者、組成物、および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように変化し得る。
特定の用量は、各患者に対して均一な用量、例えば、５０～５０００ｍｇのタンパク質であってもよい。代替的に、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に合わせられ得る。適切な投薬量を決定する際の他の要因には、処置または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および医学的状態が含まれ得る。処置のための適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、特に、本明細書に開示される投薬量情報およびアッセイを考慮して当業者によって慣用的になされる。投薬量はまた、適切な用量応答データと併せて使用される投薬量を決定するための公知のアッセイの使用によって決定することができる。個々の患者の投薬量は、疾患の進行がモニターされるにつれて調節されてもよい。患者における標的化可能な構築物または複合物の血中レベルは、有効濃度に達するか、または有効濃度を維持するように投薬量が調節される必要があるかどうかを調べるために測定され得る。どの標的化可能な構築物および／または複合物、ならびにそれらの投薬量が、所与の個体に対して効果的である可能性が高いかを決定するために薬理ゲノム学が使用され得る（Schmitzら、Clinica Chimica
Acta ３０８巻：４３～５３頁、２００１年；Steimerら、Clinica Chimica Acta
３０８巻：３３～４１頁、２００１年）。
一般に、体重に基づく投薬量は、約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
用量は、１日に１回もしくは複数回、１週間に１回もしくは複数回、１ヶ月に１回もしくは複数回または１年に１回もしくは複数回、またはさらに２～２０年に１回与えられ得る。当業者は、体液または組織中の標的化可能な構築物または複合体の測定された滞留時間および濃度に基づいて投薬のための反復率を容易に推定することができる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内であってもよく、カテーテルを介する潅流によってでもよく、または直接的な病巣内注射によってでもよい。これは、１日に１回または複数回、１週間に１回または複数回、１ヶ月に１回または複
数回、および１年に１回または複数回、投与され得る。
上記の説明は本発明の複数の態様および実施形態を記載している。本出願は特に、態様および実施形態のすべての組合せおよび置換を意図する。
ここで概して記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、これらの実施例は本発明のある特定の態様および実施形態の例示の目的のためにのみ含まれ、本発明を限定することを意図していない。
（実施例１）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄに結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは精製した組換えＮＫＧ２Ｄに結合する
ヒト、マウスまたはカニクイザルＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの核酸配列を、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインをコードする核酸配列と融合させ、発現させる哺乳動物細胞に導入した。精製後、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ融合タンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させた。非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミンでウェルを阻止した後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを滴定し、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ融合タンパク質を予め吸着させたウェルに添加した。一次抗体結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートし、Ｆｃ交差反応を回避するためにヒトカッパ軽鎖を特異的に認識する二次抗体を使用して検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼに対する基質である３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェルに添加して結合シグナルを可視化し、その吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローン、アイソタイプ対照または陽性対照（配列番号４７～５０、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ－６およびＣＸ－５から選択した）を各ウェルに添加した。
アイソタイプ対照は組換えＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質に対してわずかな結合を示したが、陽性対照が組換え抗原に対して最も強く結合した。クローン毎に親和性は異なったが、すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒト、マウス、およびカニクイザルの組換えＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質のすべてで結合を示した。概して、各抗ＮＫＧ２Ｄクローンは、ヒト（図３）およびカニクイザル（図４）の組換えＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに同様の親和性で結合したが、マウス（図５）の組換えＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃに対する親和性は比較的低かった。
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を、ヒトまたはマウスのＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現するように工学操作した。ＮＫＧ２Ｄ結合クローン、アイソタイプ対照または陽性対照を１００ｎＭ濃度にて使用して、ＥＬ４細胞において発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色した。フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して抗体結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、親ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を計算した。
すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒトおよびマウスのＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に結合した。陽性対照抗体（配列番号４５～４８、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ－６およびＣＸ－５から選択される）が最も良好なＦＯＢ結合シグナルをもたらした。各クローンのＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図６）とマウスＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図７）との間で同様であった。
（実施例２）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄへの天然リガンドの結合を阻止する
ＵＬＢＰ－６との競合
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルを阻止した。飽和濃度のＵＬＢＰ－６－Ｈｉｓ－ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンを添加した。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＵＬＢＰ－６－Ｈｉｓ－ビオチンを、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびＴＭＢ基質とコンジュゲートしたストレプトアビジンによって検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ウェル中のＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質への結合を阻止されたＵＬＢＰ－６－Ｈｉｓ－ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号４７～５０から選択される）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２ＤへのＵＬＢＰ－６結合を阻止したが、アイソタイプ対照はＵＬＢＰ－６との競合をほとんど示さなかった（図８）。
ＵＬＢＰ－６配列は、配列番号１３１によって示される。
Figure 0007187518000038
Figure 0007187518000039
ＭＩＣＡとの競合
組換えヒトＭＩＣＡ－Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルを阻止した。ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、ＭＩＣＡ－Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンを、ストレプトアビジン－ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ＭＩＣＡ－Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を阻止されたＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号４７～５０から選択される）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２ＤへのＭＩＣＡ結合を阻止したが、アイソタイプ対照はＭＩＣＡとの競合をほとんど示さなかった（図９）。
Ｒａｅ－１デルタとの競合
組換えマウスＲａｅ－１デルタ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した）をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウェルをウシ血清アルブミンで阻止した。マウスＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、Ｒａｅ－１デルタ－Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンを、ストレプトアビジン－ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ
－Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、Ｒａｅ－１デルタ－Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を阻止されたＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ－ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号４７～５０、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ－６およびＣＸ－５から選択される）および種々のＮＫＧ２Ｄ－結合ドメインクローンはマウスＮＫＧ２ＤへのＲａｅ－１デルタ結合を阻止したが、アイソタイプ対照抗体はＲａｅ－１デルタとの競合をほとんど示さなかった（図１０）。
（実施例３）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンはＮＫＧ２Ｄを活性化させる
ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に、ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄの核酸配列を融合させて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を得た。次に、ギブソンアセンブリを使用してＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ構築物をレトロウイルスベクターにクローニングし、レトロウイルス産生のためにｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。８μｇ／ｍＬのポリブレンと共にＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを含有するウイルスにＥＬ４細胞を感染させた。感染の２４時間後、ＥＬ４細胞中のＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、細胞表面で高レベルのＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを発現するクローンを選択した。
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化させるかどうかを判定するために、それらをマイクロプレートのウェルに吸着させ、抗体断片でコーティングされたウェルにおいてＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ ＥＬ４細胞をブレフェルジン－Ａおよびモネンシンの存在下で４時間にわたって培養した。ＮＫＧ２Ｄ活性化の指標である細胞内ＴＮＦ－アルファ産生をフローサイトメトリーによってアッセイした。陽性対照で処置した細胞に対してＴＮＦ－アルファ陽性細胞のパーセンテージを正規化した。すべてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがヒトＮＫＧ２Ｄ（図１１）およびマウスＮＫＧ２Ｄ（図１２）の両方を活性化させた。
（実施例４）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫ細胞を活性化させる
初代ヒトＮＫ細胞
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９５％であった。次に、単離されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含有する培地中で２４～４８時間にわたって培養した後、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン－Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。培養後、ＣＤ３、ＣＤ５６、およびＩＦＮ－γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ－γの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ－γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（配列番号４７～５０から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮ－γ＋になることを示した（図１３および図１４は、ＮＫ細胞の調製のために異なるドナーのＰＢＭＣをそれぞれ使用した、２つの独立した実験を表す）。
初代マウスＮＫ細胞
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから脾臓を得、７０μｍのセルストレイナーを通して押しつぶして、単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆ
ｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した、＃Ａ１０４９２０１；１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ炭酸水素カリウム、０．０１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁して赤血球を除去した。残りの細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－２と共に７２時間にわたって培養し、その後採取し、ＮＫ細胞単離の準備をした。次に、磁気ビーズを用いたネガティブディプリーション技術を使用し、典型的には＞９０％の純度で脾臓細胞からＮＫ細胞（ＣＤ３－ＮＫ１．１＋）を単離した。精製されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ－１５を含有する培地中で４８時間にわたって培養した後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン－Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインでコーティングされたウェルにおいて培養した後、ＣＤ３、ＮＫ１．１、およびＩＦＮ－γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３－ＮＫ１．１＋細胞におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ－γの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ－γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ－６およびＣＸ－５から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮ－γ＋になることを示した（図１５および図１６は、ＮＫ細胞の調製のために異なるマウスをそれぞれ使用した、２つの独立した実験のデータを表す）。
（実施例５）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは標的腫瘍細胞の細胞傷害性を可能にする
ヒトおよびマウス初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとのインキュベーション後、ＮＫ細胞にある増加した細胞傷害性マーカーを示す。これが腫瘍細胞溶解の増加につながるかどうかに対処するために、各ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが単一特異的抗体になる細胞ベースのアッセイを利用した。Ｆｃ領域を１つの標的化アームとして使用し、一方、Ｆａｂ領域（ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン）はＮＫ細胞を活性化するための別の標的化アームとして作用した。ヒト起源であり、高レベルのＦｃ受容体を発現するＴＨＰ－１細胞を腫瘍標的として使用し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性キットを使用した。ＴＨＰ－１細胞をＢＡＴＤＡ試薬で標識化し、１０５／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。次に標識ＴＨＰ－１細胞をＮＫＧ２Ｄ抗体および単離されたマウスＮＫ細胞とマイクロタイタープレートのウエル中で３７℃、３時間、合わせた。インキュベーション後、２０μｌの培養上清を除き、２００μｌのユーロピウム溶液と混合し、暗所、１５分間振とうしながらインキュベートした。蛍光を時間分解蛍光モジュール（励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を備えたＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダーによって経時的に測定し、特異的溶解をキット説明書に従って算出した。
陽性対照、ＵＬＢＰ－６－、ＮＫＧ２Ｄについての天然リガンドは、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ－１標的細胞の特異的溶解の増加を示した。ＮＫＧ２Ｄ抗体もＴＨＰ－１標的細胞の特異的溶解を増加させた一方で、アイソタイプ対照抗体は、特異的溶解の低減を示した。点線は、抗体を添加していないマウスＮＫ細胞によるＴＨＰ－１細胞の特異的溶解を示している（図１７）。
（実施例６）
ＮＫＧ２Ｄ抗体は、高い熱安定性を示す
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの融解温度を示差走査型蛍光定量法を使用してアッセイした。推定した見かけの融解温度は、典型的ＩｇＧ１抗体と比べて高い（図１８）。
（実施例７）
ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６の架橋によるヒトＮＫ細胞の相乗的活性化
初代ヒトＮＫ細胞活性化アッセイ
密度勾配遠心分離を使用し、末梢ヒト血液軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ネガティブ磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＃１７９５５）を使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞を精製した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定して＞９０％のＣＤ３－ＣＤ５６＋であった。次に、細胞を、活性化アッセイに使用する前に１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００－０２）を含有する培地中で４８時間増殖させた。抗体を、１００μｌの滅菌ＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌ（抗ＣＤ１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３０２０１３）および５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ ＃ＭＡＢ１３９）の濃度にて４℃で一晩、９６ウェル平底プレート上にコーティングし、続いてウェルを十分に洗浄して過剰の抗体を除去した。脱顆粒の評価のために、ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ２および１μｇ／ｍＬのＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３２８６１９）を補充した培養培地に５×１０５個の細胞／ｍＬにて再懸濁した。次に、１×１０５個の細胞／ウェルを、抗体でコーティングされたプレート上に添加した。タンパク質輸送阻害剤であるブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２０６０１）およびモネンシン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２０７０１）を、それぞれ１：１０００および１：２７０の最終希釈にて添加した。播いた細胞を、３７℃にて４時間にわたって５％ＣＯ２においてインキュベートした。ＩＦＮ－γの細胞内染色のために、ＮＫ細胞を、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３００４５２）および抗ＣＤ５６ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１８３２８）で標識化し、続いて固定し、透過処理し、抗ＩＦＮ－γ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃５０６５０７）で標識化した。ＮＫ細胞を、生ＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞においてゲーティングした後、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ－γの発現について分析した。
受容体の組合せの相対的効力を調査するため、プレート結合刺激により、ＮＫＧ２ＤまたはＣＤ１６の架橋および両受容体の共架橋を行った。図１９（図１９Ａ～１９Ｃ）に示したように、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄの組み合わせた刺激は、ＣＤ１０７ａ（脱顆粒）レベル（図１９Ａ）および／またはＩＦＮ－γ産生レベル（図１９Ｂ）の大きな上昇をもたらした。点線は、各受容体の個々の刺激の相加効果を表す。
抗ＣＤ１６、抗ＮＫＧ２Ｄまたは両方のモノクローナル抗体の組合せを用いた４時間のプレート結合刺激の後、ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａレベルおよび細胞内ＩＦＮ－γを分析した。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。図１９ＡはＣＤ１０７ａのレベルを示し、図１９ＢはＩＦＮγのレベルを示し、図１９ＣはＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ－γ産生のレベルを示す。図１９Ａ～１９Ｃに示したデータは、５名の異なる健康なドナーを使用した、５つの独立した実験を代表するものである。
（実施例８）
多重特異性結合タンパク質はＮＫＧ２Ｄに結合する
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株をヒトＮＫＧ２Ｄを発現するように操作した。図１に示す、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、腫瘍関連抗原結合ドメイン（ＣＡＩＸ結合ドメイン）、およびＣＤ１６に結合するＦｃドメインをそれぞれ含有する三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）をＥＬ４細胞に発現される細胞外ＮＫＧ２Ｄへのそれらの親和性について検査した。ＮＫＧ２Ｄへの多重特異性結合タンパク質の結合をフルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を親ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して算出した。
検査したＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＡＩＸ（ＡＤＩ－２７７４４およびＣＡＩＸ結合ドメイン）、Ｆ６３－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＡＩＸ（ＡＤＩ－２９４０
４およびＣＤ３３結合ドメイン）、Ｅ７９－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＡＩＸ（ＡＤＩ－２９３７９およびＣＡＩＸ結合ドメイン）、Ｆ４７－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＡＩＸ（ＡＤＩ－２９４４７およびＣＡＩＸ結合ドメイン）、およびＡ４９－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＡＩＸ（ＡＤＩ－２７７４９およびＣＡＩＸ結合ドメイン）を含む。ＣＡＩＸ結合ドメインは、配列番号８０の重鎖可変ドメイン、および配列番号８１の軽鎖可変ドメインから構成された。
図３５は、ＣＡＩＸ結合ドメインおよび異なるＮＫＧ２Ｄ結合ドメインをそれぞれ含むＴｒｉＮＫＥＴが、ＥＬ４細胞に発現されるＮＫＧ２Ｄに結合することを示している。
（実施例９）
多重特異性結合タンパク質は、ヒト腫瘍抗原に結合する
三重特異性結合タンパク質は、ＣＡＩＸに結合する
ＣＡＩＸを発現するヒト腎細胞癌株Ａ４９８を腫瘍関連抗原ＣＡＩＸへのＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイするために使用した。ＴｒｉＮＫＥＴおよび必要に応じて親抗ＣＡＩＸモノクローナル抗体を細胞と共にインキュベートし、結合をフルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を、二次抗体対照に標準化してＴｒｉＮＫＥＴおよび親モノクローナル抗ＣＡＩＸ抗体由来の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して算出した。ＣＡＩＸ－標的化ＴｒｉＮＫＥＴは、親抗ＣＡＩＸ抗体と比較して、Ａ４９８細胞のＣＡＩＸに比較可能なレベルの結合を示す（図３６）。全体的な結合シグナルは、それらが同じＣＡＩＸ結合ドメインを含むことから、ＴｒｉＮＫＥＴにおいて比較可能である。
（実施例１０）
三重特異性結合タンパク質は、標的がん細胞の細胞傷害性を可能にする
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）を単離し、単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には９０％を超えた。単離されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２を含有する培地中で活性化のために培養した、またはサイトカインなしで一晩休止させた。ＩＬ－２活性化または休止ＮＫ細胞を翌日、細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
ＮＫ／ＮＫ Ｔ細胞株ＫＨＹＧ－１細胞を１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２を含む１０％ＨＩ－ＦＢＳ－ＲＰＭＩ－１６４０中で維持した。エフェクター細胞としての使用前日に、ＫＨＹＧ－１細胞を培養物から採取し、細胞をＩＬ－２含有培地から洗浄した。洗浄後、ＫＨＹＧ－１細胞を１０％ＨＩ－ＦＢＳ－ＲＰＭＩ－１６４０中に再懸濁し、サイトカインなしで一晩休止させた。
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ：
ＣＡＩＸを発現するヒトＡ４９８がん細胞を培養物から採取した；細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＤ０１１６）を用いた標識化のために増殖培地に１０６個／ｍＬで再懸濁した。製造業者の説明書に従って標的細胞を標識化した。標識化後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．５～１．０×１０５／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。バックグラウンドウェルを準備するために、標識化した細胞のアリコートを取っておき、細胞を培地からスピンアウトした。１００μｌの培地を、ペレット化した細胞を乱さないように３連でウェルに注意深く添加した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識化細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルを標的細胞からの自然放出のために保存し、ウェルを１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘの添加による標的細胞の最大溶解のために準備した。目的の腫瘍標的に対するＴｒｉＮＫＥＴを培養培地に希釈し、５０μｌの希釈ＴｒｉＮＫＥＴを各ウエルに加えた。休止ＮＫ細胞、活性化ＮＫ細胞またはＫＨ
ＹＧ－１細胞を培養物から採取し、洗浄し、エフェクターの標的細胞に対する望ましい比（Ｅ：Ｔ）に応じて１０５～２．０×１０６個／ｍＬで培養培地に再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞を合計培養物体積２００μｌになるようにプレートの各ウエルに加えた。アッセイを展開する前にプレートを３７℃、５％ＣＯ２、２～３時間インキュベートした。
２～３時間培養後、プレートをインキュベーターから出し、細胞を２００ｇ、５分間の遠心分離によって沈殿させた。２０μｌの培養上清を製造者から供給されたきれいなマイクロプレートに移し、２００μｌの室温ユーロピウム溶液を各ウエルに加えた。プレートを光から保護し、プレート振とう機上、２５０ｒｐｍ、１５分間インキュベートした。プレートをＶｉｃｔｏｒ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ装置を使用して読み取った。特異的溶解率％を次のとおり算出した：特異的溶解率％＝（（実験上の放出－自然放出）／（最大放出－自然放出））＊１００％。
ＣＡＩＸ陽性ヒトがん細胞に対するヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介細胞傷害性。休止ＫＨＹＧ－１細胞とＡ４９８標的細胞との同時培養は、約３８％の特異的溶解腫瘍溶解をもたらした（図３７Ａにおいて点線により示されている）。３種の異なるＴｒｉＮＫＥＴ標的化ＣＡＩＸ（Ａ４９－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＡＩＸ；Ｅ７９－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＡＩＸ；およびＡ４４－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＡＩＸ）の同時培養物への添加は、３種すべてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインについて腫瘍細胞の特異的溶解を約２０％増強した（図３７Ａ）。
休止ヒトＮＫ細胞をＡ４９８がん細胞と混合した。休止ヒトＮＫ細胞は、ＣＡＩＸ ｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを加えなければＡ４９８細胞に対する細胞傷害活性を有さなかった。ＣＡＩＸに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ（ホモ二量体）としてｈＩｇＧ１を含むＢＡＹ７９－４６２０可変ドメインは、特異的溶解を約９％に増加させることができた。ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４９－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＡＩＸ、Ｅ７９－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＡＩＸおよびＡ４４－ＴｒｉＮＫＥＴ－ＣＡＩＸ）は、モノクローナル抗体と比較してがん細胞に対する休止ヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強した（図３７Ｂ）。
参照による組み込み
本明細書で参照される特許文献および科学論文の各々の開示全体は、すべての目的のために参照により組み込まれる。
等価物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに他の特定の形態で実現されてもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書で記載している本発明を限定するのではなく、すべての点で例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に入るすべての変更はその中に包含されることが意図される。
本発明は、以下の態様を提供しうる。
[１]
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ＣＡＩＸ、ＡＮＯ１、メソテリン、ＴＲＯＰ２、ＣＥＡまたはクローディン－１８．２に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメイン、もしくはその一部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
[２]
前記第１の抗原結合部位が、ヒト、非ヒト霊長類、およびげっ歯動物のＮＫＧ２Ｄに結合する、上記[１]に記載のタンパク質。
[３]
前記第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、上記[１]または[２]に記載のタンパク質。
[４]
前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、上記[３]に記載のタンパク質。
[５]
前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、上記[３]または[４]に記載のタンパク質。
[６]
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、上記[５]に記載のタンパク質。
[７]
前記第１の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、上記[５]または[６]に記載のタンパク質。
[８]
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、先行するいずれかの項に記載のタンパク質。
[９]
前記第１の抗原結合部位が、配列番号４１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号４２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、上記[１]から[７]のいずれかに記載のタンパク質。
[１０]
前記第１の抗原結合部位が、配列番号４３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号４４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、上記[１]から[７]のいずれかに記載のタンパク質。
[１１]
前記第１の抗原結合部位が、配列番号４５と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号４６と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、上記[１]から[７]のいずれかに記載のタンパク質。
[１２]
前記第１の抗原結合部位が、配列番号４７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号４８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、上記[１]から[７]のいずれかに記載のタンパク質。
[１３]
前記第１の抗原結合部位が、配列番号４９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号５０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、上記[１]から[７]のいずれかに記載のタンパク質。
[１４]
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１３２と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１３３と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、上記[１]から[７]のいずれかに記載のタンパク質。
[１５]
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１４０と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１４１と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、上記[１]から[７]のいずれかに記載のタンパク質。
[１６]
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１４８と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１４９と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、上記[１]から[７]のいずれかに記載のタンパク質。
[１７]
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１５６と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１５７と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、上記[１]から[７]のいずれかに記載のタンパク質。
[１８]
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１６４と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１６５と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、上記[１]から[７]のいずれかに記載のタンパク質。
[１９]
前記第１の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、上記[１]または[２]に記載のタンパク質。
[２０]
前記単一ドメイン抗体が、Ｖ Ｈ Ｈ断片またはＶ ＮＡＲ 断片である、上記[１９]に記載のタンパク質。
[２１]
前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、上記[１]、[２]、[１９]または[２０]のいずれかに記載のタンパク質。
[２２]
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、上記[２１]に記載のタンパク質。
[２３]
前記第２の抗原結合部位がＣＡＩＸに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号７２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号７３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、先行するいずれかの項に記載のタンパク質。
[２４]
前記第２の抗原結合部位がＣＡＩＸに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
配列番号７４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号７６のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、先行するいずれかの項に記載のタンパク質。
[２５]
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
配列番号７７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号７８のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号７９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、上記[２４]に記載のタンパク質。
[２６]
前記第２の抗原結合部位がＣＡＩＸに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号８０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号８１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[２７]
前記第２の抗原結合部位がＣＡＩＸに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
配列番号８２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号８３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号８４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]または[２６]のいずれかに記載のタンパク質。
[２８]
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
配列番号８５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号８６のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号８７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、上記[２７]に記載のタンパク質。
[２９]
前記第２の抗原結合部位がＣＡＩＸに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号８９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[３０]
前記第２の抗原結合部位がＣＡＩＸに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
配列番号９０のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号９１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号９２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]または[２９]のいずれかに記載のタンパク質。
[３１]
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
配列番号９３のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号９４のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号９５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、上記[３０]に記載のタンパク質。
[３２]
前記第２の抗原結合部位がＡＮＯ１に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号９７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[３３]
前記第２の抗原結合部位がメソテリンに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１０６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１０７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[３４]
前記第２の抗原結合部位がメソテリンに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可
変ドメインが、配列番号１１４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１１５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[３５]
前記第２の抗原結合部位がメソテリンに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１２２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１２３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[３６]
前記第２の抗原結合部位がＴＲＯＰ２に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１７２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１７３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[３７]
前記第２の抗原結合部位がＴＲＯＰ２に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１８０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１８１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[３８]
前記第２の抗原結合部位がＴＲＯＰ２に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１８９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[３９]
前記第２の抗原結合部位がＴＲＯＰ２に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[４０]
前記第２の抗原結合部位がＴＲＯＰ２に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１９２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１９３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[４１]
前記第２の抗原結合部位がＣＥＡに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１９６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[４２]
前記第２の抗原結合部位がＣＥＡに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２０３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２０４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[４３]
前記第２の抗原結合部位がＣＥＡに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２１２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[４４]
前記第２の抗原結合部位がクローディン－１８．２に結合し、前記第２の抗原結合部位
の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２２０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２２１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[４５]
前記第２の抗原結合部位がクローディン－１８．２に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２２８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２２９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[１]から[２２]のいずれかに記載のタンパク質。
[４６]
前記第２の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、上記[１]から[４]または[８]から[２０]のいずれかに記載のタンパク質。
[４７]
前記第２の抗原結合部位が、Ｖ Ｈ Ｈ断片またはＶ ＮＡＲ 断片である、上記[４６]に記載のタンパク質。
[４８]
前記タンパク質が、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメインの一部分を含み、前記抗体Ｆｃドメインが、ヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、先行するいずれかの項に記載のタンパク質。
[４９]
前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、上記[４８]に記載のタンパク質。
[５０]
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、上記[４８]または[４９]に記載のタンパク質。
[５１]
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、Ｋ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる、上記[４８]から[５０]のいずれかに記載のタンパク質。
[５２]
先行するいずれかの項に記載のタンパク質および薬学的に許容される担体を含む製剤。
[５３]
上記[１]から[５１]のいずれかに記載のタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含む細胞。
[５４]
上記[１]から[５１]のいずれかに記載のタンパク質に腫瘍およびナチュラルキラー細胞を曝露することを含む、腫瘍細胞死を直接的および／または間接的に増強する方法。
[５５]
上記[１]から[５１]のいずれかに記載のタンパク質または上記[５２]に記載の製剤を患者に投与することを含む、がんを処置する方法。
[５６]
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＣＡＩＸに結合し、処置されるがんが、腎細胞癌、乳がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、卵巣がん、食道、肺、結腸、腎臓、子宮頸部の腫瘍および非小細胞肺癌からなる群から選択される、上記[５５]に記載の方法。
[５７]
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がメソテリンに結合し、処置されるがんが、
中皮腫、卵巣がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、胆管細胞癌、胃がん、子宮漿液性癌、胸腺癌、および急性骨髄性白血病からなる群から選択される、上記[５５]に記載の方法。
[５８]
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＡＮＯ１に結合し、処置されるがんが、食道扁平上皮がん（ＥＳＣＣ）、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、膵がん、乳がん、前立腺がんおよび肉腫からなる群から選択される、上記[５５]に記載の方法。
[５９]
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＴＲＯＰ２に結合し、処置されるがんが、乳がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、上咽頭癌および卵巣癌からなる群から選択される、上記[５５]に記載の方法。
[６０]
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＣＥＡに結合し、処置されるがんが、胃腸がん、結腸直腸がん、膵がん、非小細胞肺がんおよび乳がんからなる群から選択される、上記[５５]に記載の方法。
[６１]
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がクローディン－１８．２に結合し、処置されるがんが、食道がん、非小細胞肺癌、卵巣がん、結腸がんおよびいくつかの形態の胆道癌からなる群から選択される、上記[５５]に記載の方法。

Claims (24)

  1. （ａ）抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第１の抗原結合部位と、
    （ｂ）抗ＣＡＩＸ抗体、抗ＡＮＯ１抗体、抗メソテリン抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体または抗クローディン－１８．２抗体のＶＨおよびＶＬを含む第２の抗原結合部位と、
    （ｃ）抗体Ｆｃドメイン、もしくはその一部分の第１のポリペプチドと、
    （ｄ）抗体Ｆｃドメイン、もしくはその一部分の第２のポリペプチドと、
    を含むタンパク質であって、
    前記抗体Ｆｃドメイン、もしくはその一部分の第１のポリペプチドおよび前記抗体Ｆｃドメイン、もしくはその一部分の第２のポリペプチドは一緒にＣＤ１６に結合し、
    前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＶＨまたはＶＬは、抗体Ｆｃドメイン、もしくはその一部分の第１のポリペプチドのＮ末端に融合しており、前記抗ＣＡＩＸ抗体、抗ＡＮＯ１抗体、抗メソテリン抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体または抗クローディン－１８．２抗体のＶＨまたはＶＬは、抗体Ｆｃドメイン、もしくはその一部分の第２のポリペプチドのＮ末端に融合している、タンパク質。
  2. 前記第１の抗原結合部位が、ヒトおよび非ヒト霊長類のＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＶＨおよびＶＬが、同じポリペプチド上に存在する、請求項１に記載のタンパク質。
  4. 前記抗ＣＡＩＸ抗体、抗ＡＮＯ１抗体、抗メソテリン抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体または抗クローディン－１８．２抗体のＶＨおよびＶＬが、同じポリペプチド上に存在する、請求項１に記載のタンパク質。
  5. 前記第１の抗原結合部位が、
    （ａ）配列番号５４の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号５５の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号５６の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号５８の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号５９の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号６０の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号６１の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号６２の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号６３の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号６４の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号６５の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列；または
    （ｃ）配列番号６６の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号６７の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号６８の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号６９の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号７０の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号７１の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列
    を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質。
  6. （ａ）前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＶＨが配列番号４１と少なくとも９０％同一であり、前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＶＬが配列番号４２と少なくとも９０％同一であり；
    （ｂ）前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＶＨが配列番号４３と少なくとも９０％同一であり、前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＶＬが配列番号４４と少なくとも９０％同一であり；または
    （ｃ）前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＶＨが配列番号４５と少なくとも９０％同一であり、前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のＶＬが配列番号４６と少なくとも９０％同一である、
    請求項５に記載のタンパク質。
  7. 前記第２の抗原結合部位が、抗ＣＡＩＸ抗体のＶＨおよびＶＬを含み、且つ、
    （ａ）配列番号７４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号７５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号７６のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号７７のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号７８のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号７９のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号８２のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号８３のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号８４のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号８５のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号８６のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号８７のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
    または
    （ｃ）配列番号９０のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号９１のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号９２のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号９３のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号９４のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号９５のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列
    を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質。
  8. （ａ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号７２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号７３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
    （ｂ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号８０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号８１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
    または
    （ｃ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号８９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む
    請求項７に記載のタンパク質。
  9. 前記第２の抗原結合部位が、抗ＡＮＯ１抗体のＶＨおよびＶＬを含み、且つ、
    配列番号９９のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１００のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号１０１のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号１０２のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１０３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号１０４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列
    を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質。
  10. 前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号９７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項９に記載のタンパク質。
  11. 前記第２の抗原結合部位が、抗メソテリン抗体のＶＨおよびＶＬを含み、且つ、
    （ａ）配列番号１０８のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１０９のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号１１０のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号１１１のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１１２のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号１１３のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号１１６のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１１７のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号１１８のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号１１９のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１２０のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号１２１のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
    または
    （ｃ）配列番号１２４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１２５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号１２６のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号１２７のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１２８のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号１２９のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列
    を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質。
  12. （ａ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号１０６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号１０７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
    （ｂ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号１１４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号１１５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
    または
    （ｃ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号１２２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号１２３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む
    請求項１１に記載のタンパク質。
  13. 前記第２の抗原結合部位が、抗ＴＲＯＰ２抗体のＶＨおよびＶＬを含み、且つ、
    （ａ）配列番号１７４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１７５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号１７６のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号１７７のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１７８のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号１７９のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
    または
    （ｂ）配列番号１８２のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１８３のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号１８４のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号１８５のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号１８６のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号１８７のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列
    を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質。
  14. （ａ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号１７２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号１７３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
    （ｂ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号１８０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号１８１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
    （ｃ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号１８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号１８９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
    （ｄ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号１９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号１９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；または
    （ｅ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号１９２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号１９３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む
    請求項１３に記載のタンパク質。
  15. 前記第２の抗原結合部位が、抗クローディン－１８．２抗体のＶＨおよびＶＬを含み、且つ、
    （ａ）配列番号２２２のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号２２３のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号２２４のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号２２５のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号２２６のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号２２７のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
    または
    （ｂ）配列番号２３０のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号２３１のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；
    配列番号２３２のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；
    配列番号２３３のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；
    配列番号２３４のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および
    配列番号２３５のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列
    を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質。
  16. （ａ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号２２０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号２２１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；または
    （ｂ）前記第２の抗原結合部位のＶＨが配列番号２２８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位のＶＬが配列番号２２９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む
    請求項１５に記載のタンパク質。
  17. 前記抗体Ｆｃドメインが、ヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
  18. 前記抗体Ｆｃドメインが、
    （ａ）ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメイン；
    （ｂ）ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列；および
    （ｃ）ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列
    の少なくとも１つを含み、
    前記（ｃ）の場合、前記抗体Ｆｃドメインは、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる、請求項１７に記載のタンパク質。
  19. 請求項１から１８のいずれか一項に記載のタンパク質および薬学的に許容される担体を含む製剤。
  20. 請求項１から１８のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞。
  21. 腫瘍細胞死を直接的および／または間接的に増強する方法に使用するための、請求項１から１８のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組成物であって、
    前記方法が、前記腫瘍細胞およびナチュラルキラー細胞を前記組成物に曝露することを含む、組成物。
  22. 治療に使用するための、請求項１から１８のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項１９に記載の製剤を含む組成物。
  23. がんを処置する方法に使用するための、請求項１から１８のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項１９に記載の製剤を含む組成物。
  24. （ａ）前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位が、抗ＣＡＩＸ抗体のＶＨおよびＶＬを含み、且つ、処置されるがんが、腎細胞癌、乳がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、胃がん、膀胱がん、卵巣がん、食道腫瘍、肺がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頸がんおよび非小細胞肺癌からなる群から選択される；
    （ｂ）前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位が、抗メソテリン抗体のＶＨおよびＶＬを含み、且つ、処置されるがんが、中皮腫、卵巣がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、胆管細胞癌、胃がん、子宮漿液性癌、胸腺癌、および急性骨髄性白血病からなる群から選択される；
    （ｃ）前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位が、抗ＡＮＯ１抗体のＶＨおよびＶＬを含み、且つ、処置されるがんが、食道扁平上皮がん（ＥＳＣＣ）、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、膵がん、乳がん、前立腺がんおよび肉腫からなる群から選択される；
    （ｄ）前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位が、抗ＴＲＯＰ２抗体のＶＨおよびＶＬを含み、且つ、処置されるがんが、乳がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵がん、前立腺がん、子宮頸がん、頭頸部がん、上咽頭癌および卵巣癌からなる群から選択される；
    または
    （ｅ）前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位が、抗クローディン－１８．２抗体のＶＨおよびＶＬを含み、且つ、処置されるがんが、食道がん、非小細胞肺癌、卵巣がん、結腸がんおよびいくつかの形態の胆道癌からなる群から選択される、請求項２３に記載の使用するための組成物。
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