WO2013187495A1 - 改変されたFc領域を含む抗原結合分子 - Google Patents
改変されたFc領域を含む抗原結合分子 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2013187495A1 WO2013187495A1 PCT/JP2013/066428 JP2013066428W WO2013187495A1 WO 2013187495 A1 WO2013187495 A1 WO 2013187495A1 JP 2013066428 W JP2013066428 W JP 2013066428W WO 2013187495 A1 WO2013187495 A1 WO 2013187495A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- amino acid
- numbering
- region
- substitution
- antibody
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Abstract
Description
〔1〕抗原結合部位及びFcγR結合部位を有し、抗原及びFcγRと同時には結合しない、 Fc領域二量体。
〔2〕前記抗体のFc領域が、IgG型のFc領域である、〔1〕に記載のFc領域二量体。
〔3〕前記Fc領域二量体が、異なるアミノ酸配列を有する2つのFc領域(第1のFc領域及び第2のFc領域)からなるヘテロ二量体である、〔1〕又は〔2〕に記載のFc領域二量体。
〔4〕前記抗原結合部位が、Fc領域の少なくとも1つのアミノ酸を改変することにより導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有する部位である、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載のFc領域二量体。
〔5〕前記改変されるアミノ酸が、Fc領域のCH2ドメインのアミノ酸である、〔4〕に記載のFc領域二量体。
〔6〕前記改変されるアミノ酸が、ループ領域のアミノ酸である、〔4〕又は〔5〕に記載のFc領域二量体。
〔7〕前記改変されるアミノ酸が、EUナンバリング231~239、EUナンバリング265~271、EUナンバリング295~300およびEUナンバリング324~337から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸である、〔6〕に記載のFc領域二量体。
〔8〕前記ヘテロ二量体の改変されるアミノ酸が、第1のFc領域のEUナンバリング265~271およびEUナンバリング295~300、並びに第2のFc領域のEUナンバリング265~271およびEUナンバリング324~332から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸である、〔4〕に記載のFc領域二量体。
〔9〕前記抗原結合部位の改変が、少なくとも1つのアミノ酸の挿入である、〔4〕に記載のFc領域二量体。
〔10〕挿入されるアミノ酸の数が9以下である、〔9〕に記載のFc領域二量体。
〔11〕挿入される少なくとも1つのアミノ酸が、抗原に対する結合活性を有するペプチドである、〔9〕又は〔10〕に記載のFc領域二量体。
〔12〕前記FcγR結合部位が、Fc領域の少なくとも1つのアミノ酸が改変された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有する部位である、〔1〕~〔11〕のいずれかに記載のFc領域二量体。
〔13〕前記改変されるアミノ酸が、Fc領域のCH2ドメインのアミノ酸である、〔12〕に記載のFc領域二量体。
〔14〕前記改変されるアミノ酸が、EUナンバリング234番目のLeu、EUナンバリング235番目のLeu、EUナンバリング236番目のGly、EUナンバリング239番目のSer、EUナンバリング268番目のHis、EUナンバリング270番目のAsp、EUナンバリング298番目のSer、EUナンバリング326番目のLys、EUナンバリング330番目のAla、EUナンバリング332番目のIle、EUナンバリング334番目のLysからなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸改変が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有する、〔12〕又は〔13〕に記載のFc領域二量体。
〔15〕前記改変されるアミノ酸が、EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのY又はQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SのD又はMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HのDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのL又はMへの置換、EUナンバリング332番目のアミノ酸IのEへの置換、及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KのEへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸改変が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有する、〔12〕又は〔13〕に記載のFc領域二量体。
〔16〕前記Fc領域二量体のどちらか一方のFc領域のアミノ酸配列において、
EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのY又はQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SのMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HのDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸改変が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有しており、
もう一方のFc領域のアミノ酸配列において、
EUナンバリング239番目のアミノ酸SのDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのL又はMへの置換、EUナンバリング332番目のアミノ酸IのEへの置換、及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KのEへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸改変が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有する、〔12〕又は〔13〕に記載のFc領域二量体。
〔17〕前記Fc領域二量体のどちらか一方のFc領域が、(i)~(iii)いずれかのアミノ酸配列を有し、もう一方のFc領域が、(iv)~(vi)いずれかのアミノ酸配列を有する、〔12〕又は〔13〕に記載のFc領域二量体:
(i)EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列、
(ii) EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HのDへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列、及び、
(iii)EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SのMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HのDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列、
(iv) EUナンバリング239番目のアミノ酸SのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのLへの置換、及びEUナンバリング332番目のアミノ酸IのEへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列
(v) EUナンバリング326番目のアミノ酸KのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのMへの置換、及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KのEへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列
(vi) EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのMへの置換、及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KのEへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列。
〔18〕前記FcγR結合部位が天然型IgG1より高いFcγR結合活性を有する、〔12〕~〔17〕のいずれかに記載のFc領域二量体。
〔19〕前記FcγRが、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaおよびFcγRIIIbからなる群から選択される少なくとも1つ以上のレセプターである、〔1〕~〔18〕に記載のFc領域二量体。
〔20〕前記FcγRが、FcγRIIIaである、〔19〕に記載のFc領域二量体。
〔21〕前記改変されるアミノ酸が、表2-1~表2-3に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸が改変された又はそれと同一のアミノ酸配列を有する、〔19〕に記載のFc領域二量体。
〔22〕〔1〕~〔21〕のいずれかに記載のFc領域二量体を含む、ポリペプチド。
〔23〕ポリペプチドが抗体、多重特異性抗体、ペプチドFc融合タンパク質、又はスキャフォールドFc融合タンパク質である、〔22〕に記載のポリペプチド。
〔24〕ポリペプチドが抗体の可変領域を含み、第1の抗原が当該可変領域と結合し、第1の抗原とは異なる第2の抗原がFc領域と結合する、〔22〕又は〔23〕に記載のポリペプチド。
〔25〕第1の抗原が腫瘍細胞に特異的な抗原である、〔22〕~〔24〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔26〕第2の抗原が免疫細胞の表面で発現している分子、又は、腫瘍細胞と正常細胞で発現している分子である、〔22〕~〔25〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔27〕〔22〕~〔26〕のいずれかに記載のポリペプチド及び医学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
〔28〕〔22〕~〔26〕のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、工程(i)~(iv)を含む方法:
(i)アミノ酸配列が多様なCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドからなるペプチドライブラリーを作製する工程、
(ii)作製されたライブラリーの中から、CH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドが抗原及びFcγRに対する結合活性を有するが、当該抗原及びFcγRと同時には結合しない、CH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドを選択する工程、
(iii)工程(ii)で選択されたペプチド又はポリペプチドと同一のCH2ドメインを有するFc領域二量体を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養して、当該Fc領域二量体を含むポリペプチドを発現させる工程、並びに
(iv)前記宿主細胞培養物からFc領域二量体を含むポリペプチドを回収する工程。
〔29〕工程(i)のCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する2つのCH2ドメイン(第1のCH2ドメイン及び第2のCH2ドメイン)からなるヘテロ二量体である、〔28〕に記載の方法。
〔30〕工程(i)及び(ii)のCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドが、Fc領域二量体又はFc領域二量体を含むポリペプチドである、〔28〕又は〔29〕に記載の方法。
〔31〕工程(ii)において、CH2ドメインの熱変性温度が50℃以上のCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドを選択する工程を更に含む、〔28〕~〔30〕のいずれかに記載の方法。
〔32〕工程(i)のCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドがIgG型である、〔28〕~〔31〕のいずれかに記載の方法。
〔33〕工程(i)のCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドが、FcγRに対する結合活性を増強するための、〔14〕~〔17〕および〔21〕に記載のいずれかの改変配列と同一の配列を有する、〔28〕~〔32〕のいずれかに記載の方法。
〔34〕工程(i)のライブラリーが、CH2ドメインのアミノ酸配列が多様化されたライブラリーである、〔28〕~〔33〕のいずれかに記載の方法。
〔35〕工程(i)のライブラリーが、ループ領域のアミノ酸配列が多様化されたライブラリーである、〔28〕~〔34〕のいずれかに記載の方法。
〔36〕多様化されるループ領域のアミノ酸配列が、EUナンバリング231~239、EUナンバリング265~271、EUナンバリング295~300およびEUナンバリング324~337から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含む、〔28〕~〔35〕のいずれかに記載の方法。
〔37〕多様化されるループ領域のアミノ酸配列が、第1のFc領域のEUナンバリング265~271およびEUナンバリング295~300、並びに第2のFc領域のEUナンバリング265~271およびEUナンバリング324~332から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含む、〔29〕~〔36〕のいずれかに記載の方法。
〔38〕多様化が、抗原に対する結合活性を有するペプチドをランダムに挿入することによる多様化である、〔28〕~〔37〕のいずれかに記載の方法。
また、抗体のFc領域とFcγRとの相互作用の強さはZn2+イオン濃度依存的であることが報告されている(Immunology Letters 143 (2012) 60-69)。Fc領域のZn2+イオン濃度が高いほど、Fc領域とFcgRとの相互作用は増強される。抗体のFc領域のCH3に存在するHis310、His435がZn2+をキレートすることにより、遠位にあるFc領域の各CH2ドメインが開く。これにより、CH2ドメインとFcgRとが相互作用しやすくなり、Fc領域とFcgRの相互作用が増強される。本発明のFc領域の非限定な一態様として、EUナンバリングで表される310位のHis、435位のHis、433位のHisおよび/または434位のAsnにZn2+がキレートされたFc領域が挙げられる。
複数組み合わせて使用する場合、組み合わせる数は特に限定されず、発明の目的を達成できる範囲内で適宜設定することができ、例えば、2個以上30個以下、好ましくは2個以上15個以下である。
複数組み合わせる場合、Fc領域二量体を構成する2つのFc領域の一方にのみ当該アミノ酸変異を加えてもよく、また2つのFc領域の双方に適宜振り分けて加えてもよい。
より好ましくは、改変される部位はCH2領域である。なお、CH2領域とはEUナンバリング231番目から340番目、CH3領域とはEUナンバリング341番目から447番目を意味する。
なお、本発明において「ループ領域」とは、イムノグロブリンのβバレル構造の維持に関与しない残基が存在する領域を意味する。また、アミノ酸残基に改変を加えることには、予め所望の抗原に対して結合活性を有していることが知られているぺプチドを上述の領域に挿入する改変も含まれる。
これらの各グループ内でのアミノ酸残基の置換は保存的置換と呼ばれ、一方、他グループ間同士でのアミノ酸残基の置換は非保存的置換と呼ばれる。
本発明における置換は、保存的置換であってもよく、非保存的置換であってもよく、また保存的置換と非保存的置換の組合せであってもよい。
本発明のポリペプチドは、好ましくはヒトIgG1であり、ヒトIgG1のFc領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。特にヒトIgG1の配列としては、EUナンバリング356-358番目のアミノ酸配列がDELであってもEEMであってもよい。
例えば、本発明のFc領域二量体を含むポリペプチドには、さらに当該Fc領域二量体の目的とする機能に実質的な変化を与えない範囲で、任意に改変を加えることができる。本発明のポリペプチドが抗体の場合、重鎖や軽鎖に改変を加えることができる。例えばこのような変異はアミノ酸残基の保存的置換によって行うことができる。また、本発明のポリペプチドの目的とする機能に変化を与えるような改変であっても、当該機能の変化が本発明の目的の範囲内であれば、そのような改変も行うことができる。
ここに示した真核細胞には、酵母や動物細胞が含まれる。たとえばCHO細胞やHEK293H細胞は、抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換するための代表的な動物細胞である。他方、当該位置に糖鎖修飾が無いものも本発明の抗体に含まれる。定常領域が糖鎖で修飾されていない抗体は、抗体をコードする遺伝子を大腸菌などの原核細胞で発現させて得ることができる。
他にもFc領域へテロ二量体を含むポリペプチドには、WO2011/028952に記載の抗体のCH1とCLの会合化、VH、VLの会合化を利用したヘテロ二量化抗体作製技術を用いることもできる。
アミノ酸配列の改変は、当分野において公知の種々の方法により行うことができる。これらの方法には、次のものに限定されるわけではないが、部位特異的変異誘導法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492)、PCR変異法、カセット変異法等の方法により行うことができる。
FcγRIのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれNM_000566.3及びNP_000557.1に、 FcγRIIaのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC020823.1及びAAH20823.1に、 FcγRIIbのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC146678.1及びAAI46679.1に、 FcγRIIIaのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC033678.1及びAAH33678.1に、及び FcγRIIIbのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC128562.1及びAAI28563.1に記載されている(RefSeq登録番号)。 尚、FcγRIIaには、FcγRIIaの131番目のアミノ酸がヒスチジン(H型)あるいはアルギニン(R型)に置換された2種類の遺伝子多型が存在する(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990)。また、FcγRIIbには、FcγRIIbの232番目のアミノ酸がイソロイシン(I型)あるいはスレオニン (T型)に置換された2種類の遺伝子多型が存在する(Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254 (2002))。また、FcγRIIIaには、FcγRIIIaの158番目のアミノ酸がバリン(V型)あるいはフェニルアラニン(F型)に置換された2種類の遺伝子多型が存在する(J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070 (1997))。また、FcγRIIIbには、NA1型、NA2型の2種類の遺伝子多型が存在する(J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990))。
具体的には、FcγR結合部位のFcγレセプターに対する結合活性はELISAやFACS(fluorescence activated cell sorting)の他、ALPHAスクリーン(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)や表面プラズモン共鳴(SPR)現象を利用したBIACORE法等によって測定することができる(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
例えば、ドナービーズにビオチン標識された被検ポリペプチドがドナービーズ上のストレプトアビジンに結合され、アクセプタービーズにはグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)でタグ化されたFcγレセプターが結合される。競合するポリペプチドの非存在下では、被検ポリペプチドとFcγレセプターとは相互作用し520-620 nmのシグナルを生ずる。タグ化されていないポリペプチドは、被検ポリペプチドとFcγレセプター間の相互作用と競合する。競合の結果表れる蛍光の減少を定量することによって相対的な結合活性が決定され得る。ポリペプチドをSulfo-NHS-ビオチン等を用いてビオチン化することは公知である。FcγレセプターをGSTでタグ化する方法としては、FcγレセプターをコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドをインフレームで融合した融合遺伝子を発現可能なベクターに保持した細胞等において発現し、グルタチオンカラムを用いて精製する方法等が適宜採用され得る。得られたシグナルは例えばGRAPHPAD PRISM(GraphPad社、San Diego)等のソフトウエアを用いて非線形回帰解析を利用する一部位競合(one-site competition)モデルに適合させることにより好適に解析される。
また、ELISAプレートあるいはセンサーチップに固定した抗原若しくはFcγRのいずれか一方への結合が、他方を溶液中に添加することで阻害されるかどうかを測定することによって確認することができる。
例えば、上記の測定法で測定したKD値において、KD値比(天然型IgG1のKD値/Fc領域二量体あるいは当該二量体を含むポリペプチドのKD値)は、好ましくは1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.5以上、1.8以上、2以上、3以上である。さらに好ましくは、5以上、10以上、100以上、250以上、1000以上である。尚、本明細書においてKD値比はKD ratioともいう。 また、上記の測定法で測定したKD値において、KD値が1 pM以上低下していることが好ましく、10 pM、100 pM、1 nM以上、2 nM以上、3 nM以上、5 nM以上、10 nM以上、20 nM以上、50 nM以上、100 nM以上、1μM以上低下していることがさらに好ましい。 また、上記の測定法で測定したKD値において、KD値が5μM以下であることが好ましく、3μM以下、1μM以下、0.5μM以下、0.1μM以下、0.01μM以下、1 nM以下、0.1 nM以下、0.001 nM以下、1 pM以下であることが更に好ましい。
(i)EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換
(ii) EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HのDへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換、及び、
(iii)EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SのMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HのDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換、
(iv) EUナンバリング239番目のアミノ酸SのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのLへの置換、及びEUナンバリング332番目のアミノ酸IのEへの置換
(v) EUナンバリング326番目のアミノ酸KのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのMへの置換、及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KのEへの置換
(vi) EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのMへの置換、及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KのEへの置換。
F、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受容体、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盤増殖因子、胎盤アルカリホスファターゼ(PLAP)、胎盤ラクトゲン、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子-1、血小板増殖因子(platelet-growth factor)、plgR、PLP、異なるサイズのポリグリコール鎖(poly glycol chain)(例えば、PEG-20、PEG-30、PEG40)、PP14、プレカリクレイン、プリオンタンパク質、プロカルシトニン、プログラム細胞死タンパク質1、プロインスリン、プロラクチン、プロタンパク質転換酵素PC9、プロリラキシン(prorelaxin)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、プロテインA、プロテインC、プロテインD、プロテインS、プロテインZ、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、リラキシン、リラキシンA鎖、リラキシンB鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス(RSV) F、Ret、レチキュロン(reticulon)4、リウマチ因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、スクレロスチン(Sclerostin)、SDF-1、SDF1 α、SDF1 β、セリン(SERINE)、血清アミロイドP、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、志賀様毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、スフィンゴシン一リン酸受容体1、ブドウ球菌のリポテイコ酸、Stat、STEAP、STEAP-II、幹細胞因子(SCF)、ストレプトキナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、シンデカン-1、TACE、TACI、TAG-72 (腫瘍関連糖タンパク質-72)、TARC、TB、TCA-3、T細胞受容体α/β、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、テネイシン、TERT、精巣PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β汎特異的(TGF-β Pan Specific)、TGF-β RII、TGF-β RIIb、TGF-β RIII、TGF-β Rl (ALK-5)、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TGF-I、トロンビン、トロンボポエチン(TPO)、胸腺間質性リンホプロテイン(Thymic stromal lymphoprotein)受容体、胸腺Ck-1、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、チロキシン、チロキシン結合グロブリン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、組織因子プロテアーゼインヒビター、組織因子タンパク質、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受容体I、TNF受容体II、TNF-α、TNF-β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2/DR4)、TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B)、TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID)、TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD)、TNFRSF11A (RANK ODF R/TRANCE R)、TNFRSF11B (OPG OCIF/TR1)、TNFRSF12 (TWEAK R FN14)、TNFRSF12A、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSF1A (TNF Rl CD120a/p55-60)、TNFRSF1B (TNF RII CD120b/p75-80)、TNFRSF21 (DR6)、TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRSF25 (DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFC R)、TNFRSF4 (OX40 ACT35/TXGP1 R)、TNFRSF5 (CD40 p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-1/APT1/CD95)、TNFRSF6B (DcR3 M68/TR6)、TNFRSF7 (CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA)、TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2リガンド/TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANKリガンドODF/OPGリガンド)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3リガンド/DR3リガンド)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEMリガンド/LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITRリガンド AITRリガンド/TL6)、TNFSF1A (TNF-a コネクチン(Conectin)/DIF/TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa/TNFSF1)、TNFSF3 (LTb TNFC/p33)、TNFSF4 (OX40リガンドgp34/TXGP1)、TNFSF5 (CD40リガンドCD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP)、TNFSF6 (Fasリガンド Apo-1リガンド/APT1リガンド)、TNFSF7 (CD27リガンドCD70)、TNFSF8 (CD30リガンドCD153)、TNFSF9 (4-1 BBリガンド CD137リガンド)、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒性代謝産物(toxic metabolite)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、TGF-αおよびTGF-β等のトランスフォーミング増殖因子(TGF)、膜貫通型糖タンパク質NMB、トランスサイレチン、TRF、Trk、TROP-2、トロホブラスト糖タンパク質、TSG、TSLP、腫瘍壊死因子(TNF)、腫瘍関連抗原CA 125、Lewis Y関連糖を示す腫瘍関連抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VAP-1、血管内皮増殖因子(VEGF)、バスピン(vaspin)、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-カドヘリン、VE-カドヘリン-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEFGR-2、VEGF受容体 (VEGFR)、VEGFR-3 (flt-4)、VEGI、VIM、ウイルス抗原、ビタミンB12受容体、ビトロネクチン受容体、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ヴィルブランド因子(vWF)、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-l-β、XCLl/リンホタクチン、XCR1、XEDAR、XIAP、XPDなどがあげられる。好ましくは、第1の抗原としては、例えば、腫瘍細胞に特異的な抗原が好ましく、具体的には、例えば、EpCAM、EREG、GPC3等が挙げられる。第2の抗原としては、例えば、免疫細胞表面分子(T細胞表面分子、NK細胞表面分子、抗原提示細胞表面分子(CD3, TCR、NKG2D、CD137、OX40、GITR、CD40、TLR1~10、C type lectin、等)、腫瘍細胞、腫瘍の血管、ストローマ細胞等に発現するが、正常組織においても発現している抗原(インテグリン、Tissue factor、VEGFR、PDGFR、EGFR、IGFR、METケモカインレセプター、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、CD44、フィブロネクチン、DR5、TNFRSF等)が好ましく、具体的には、例えば、CD3、インテグリンが挙げられる。
例えば、可変領域のN末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者によく知られた修飾である。したがって、本発明の抗体は、その重鎖のN末端がグルタミンの場合には、それがピログルタミン酸に修飾された可変領域を含む。
他のタンパク質、生理活性ペプチドとしては、例えば受容体、接着分子、リガンド、酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など (3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
(i)アミノ酸配列が多様なCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドからなるペプチドライブラリーを作製する工程、
(ii)作製されたライブラリーの中から、CH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドがFcγR及び抗原に対する結合活性を有するが、FcγR及び当該抗原と同時には結合しない、CH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドを選択する工程、
(iii)工程(ii)で選択されたペプチド又はポリペプチドと同一のCH2ドメインを有するFc領域二量体を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養して、当該Fc領域二量体を含むポリペプチドを発現させる工程、及び
(iv)前記宿主細胞培養物からFc領域二量体を含むポリペプチドを回収する工程。
(v)CH2ドメインの熱変性温度が50℃以上のCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドを選択する工程。
本方法によって導入されるアミノ酸変異の種類や範囲は特に限定されるものではない。
天然型の免疫グロブリンは、可変領域で抗原と結合し、定常領域でFcγR、FcRn、FcαR、FcεRといったレセプターや補体と結合する。IgGのFc領域で相互作用する結合分子のひとつであるFcRnは、抗体の重鎖それぞれに1分子ずつ結合するため、IgG型の抗体1分子に対して2分子のFcRnが結合することが報告されている。しかし、FcRn等とは異なり、図1に示すように、FcγRは抗体のヒンジ領域およびCH2ドメインで相互作用し、IgG型の抗体1分子に対して1分子のみ結合する(J. Bio. Chem., (20001) 276, 16469-16477)。
1.X側で強いFcγRに対する結合活性を有する
2.Y側で目的の抗原(第2の抗原)に対する結合活性を有する
3.FcγR及びY側で結合する抗原に同時には結合しない
実施例1に記載したように、Dual binding Fcとは、X側でFcγRに結合し、Y側で第二の抗原に結合するが、FcγR及び第二の抗原に同時には結合しない分子である。第二の抗原と結合するためにFc領域にアミノ酸改変を導入する場合、通常二つのH鎖の両方にアミノ酸改変が導入される。しかし、両方のH鎖に改変を導入されると、目的とするY側だけでなくX側のアミノ酸も改変されてしまう。X側にも改変が導入された結果、X側ではFcγRとの相互作用が低下してしまう可能性がある。したがって、Dual Binding Fcは、X側ではFcγRと相互作用を増強するための改変が導入され、Y側では抗原と相互作用するための改変を導入することが必要である。
(3-1)ヘテロ二量体化抗体によるX側からのFcγRに対する結合活性増強のコンセプト証明
ヘテロ二量体化抗体を利用することでX側からのFcγRに対する結合活性を増強(最適化)できるか検討した。
従来は、抗体の各H鎖に同じ改変を導入したホモ二量化抗体を用いることで、FcγRに対する結合活性が増強する改変を探索していた。しかし、実施例2で言及したように抗体とFcγRとが非対称に相互作用することから、両H鎖に同じ改変を導入した場合、その改変が一方のH鎖ではFcγRに対する結合活性を増強するが、もう一方のH鎖では結合を阻害している可能性がある。このような改変を両H鎖に導入したホモ二量化抗体では、FcγRに対する結合活性を必ずしも増強しないが、一方のH鎖にのみ改変を導入したヘテロ二量化抗体ではFcγRに対する結合活性を増強する可能性がある。言い換えれば、その改変はX側でのFcγRとの相互作用を増強できるが、Y側でのFcγRとの相互作用を必ずしも増強しないことを示しており、このような改変はX側の結合活性を増強する改変であるといえる。
従来技術を用いたホモ二量化抗体について、各改変の効果を検証した。S239D、A330L、I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0ではGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が約260倍増強していたが、反対にL234Y、G236W、S298Aを両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0では0.49倍に減弱していた。この結果から、ホモ二量化抗体においてはS239D、A330L、I332Eの改変群にのみFcγRIIIaに対する結合活性増強効果があることが明らかとなった。
前項で考察したように、ヘテロ二量化抗体を用いることで、X側でのFcγRとの相互作用を増強することができ、さらに従来のホモ二量化抗体技術によって創製された改変体よりもFcγRIIIaに対する結合活性を増強することに成功した。抗体はFcγRIIIaを介してNK細胞を誘導し、標的抗原を発現する細胞に対する抗体依存的細胞障害活性を発揮する。ヘテロ二量化抗体においてFcγRIIIaに対する結合活性だけでなく、ADCC活性も同様に増強していることを確認するために、表5に記載したFcγRIIIaに対する結合活性が上昇したヘテロ二量化抗体、ホモ二量化抗体、および天然型IgG1について、参考実施例3の方法に従ってADCC活性を測定した。その結果を図10に示す。
抗体を医薬品として開発する際には、生物の体内での安定性および保存安定性が求められるため、高度な物理化学的安定性を有することも期待される。例えば、上記で言及したS239D、A330L、I332Eを抗体の両鎖に導入した改変の場合、この改変を導入すると、抗体のFc領域が熱力学的に不安定になることが報告されており、熱安定性の低下は医薬品としての開発を困難にさせる(Molecular Immunol.(2008) 45, 1872-1882)。抗体の医薬品としての有用性および開発の容易さを高めるためには、FcγRに対する結合活性を増強する一方で、物理化学的な安定性を維持することも重要である。ホモ二量化抗体では改変を両H鎖に導入するために、1種類の改変を導入すると抗体1分子あたり2箇所改変を導入することになる。しかし、ヘテロ二量化抗体では各H鎖に対して改変を導入するか否か選択できるために、1種類の改変を導入するとしても抗体1分子あたりに1箇所改変を導入するのに留めることが可能である。前項で考察したように、改変の種類によってはFcγRIIIaに対する結合活性の増強効果に関しては一方のH鎖に導入すれば十分な場合がある。仮にその改変が抗体の物理化学的な安定性を減じる効果を持っていた場合には、一方のH鎖にのみその改変を導入することでFcγRIIIaに対する結合活性増強効果を付与する一方で、抗体の物理化学的な不安定化を最小限にとどめることが可能であると考えられる。
前項でヘテロ二量体化抗体が従来技術であるホモ二量体抗体よりもFcγRとの相互作用を強める(もしくは最適化する)だけでなく、熱安定性の面からも優れていることが示された。さらにFcγRIIIaに対する結合活性を増強した改変体では、ADCC活性が増強されることが示された。そこで、さらにFcγRとの相互作用を最適化した抗体を創出した。
FcγRIIIaに対する結合活性を増強する(Glycobiol. (2006) Vol.17 no.1 pp. 104-118など)と報告のあるアフコシル化抗体を比較のために作製した。相同染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞ではフコーストランスポーターの機能が阻害される。この細胞を用いることでフコースが欠損した抗体を得ることが可能である(WO2006/067913等)。また、beta 1, 4-N-acetylglucosaminyltransferase IIIとGolgi alpha-mannosidase IIが強制発現される細胞で抗体を産生させてもフコースが欠損した抗体を得ることが可能である(Ferrara ら、 Biotechnol. Bioeng. (2006) 93 (5), 851-861)。これら同業者公知の手法により、H240-G1d(配列番号:12)およびL73-k0(配列番号:11)を組み合わせて発現させ、H240-G1d/L73-k0をアフコシル化した抗体H240-afucosyl_G1d/L73-k0を得た。
FcγRとの相互作用を増強させた抗体を作製した。具体的には、H240-Kn033(配列番号:13)にL234Y、L235Y、G236W、H268D、S298Aを導入し、H240-Kn061(配列番号:17)を参考実施例1の方法にしたがって作製し、H240-Hl033(配列番号:14)にK326D、A330M、K334Eを導入し、H240-Hl071(配列番号:18)を参考実施例1の方法にしたがって作製した。
これらについて、参考実施例2の方法にしたがって、各FcγRに対する結合活性を評価した。
H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0がヘテロ二量化抗体の特徴を有するか考察した。表7の結果から、L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298Aを一方のH鎖に有し、K326D/A330M/K334Eをもう一方のH鎖に有するヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の方が、L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298Aを両H鎖に有するようなホモ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl134/L73-k0および、K326D/A330M/K334Eを両H鎖に有するようなホモ二量化抗体H240-Kn132/H240-Hl071/L73-k0のいずれよりも、FcγRIIIa FおよびFcγRIIIa Vに対する強い結合活性を有することが確認された。すなわち、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0はその各H鎖から成るホモ二量化抗体よりもFcγRに対する結合活性を増強するというヘテロ二量化抗体の特徴を有することが明らかとなった。つまり、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0は一方向(X側)でのFcγRに対する結合活性が増強されていることが示され、Y側を第二の抗原との結合部位に利用したDual binding Fc分子となりうる。
更なるFcγRとの相互作用の最適化を目指して、参考実施例1の方法にしたがって、H240-Kn061にY235Q、S239M、D270Eを導入したH240-Kn125(配列番号:21)およびH240-Hl071にD270Eを導入したH240-Hl076(配列番号:22)を作製した。参考実施例1の方法にしたがって、一方のH鎖としてH240-Hl076、L鎖としてL73-k0を、もう一方のH鎖としてH240-Kn125をそれぞれ組み合わせ、H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0を調製した。調製された抗体を参考実施例2の方法にしたがって、各FcγRに対する結合活性を天然型IgG1であるH240-G1d/L73-k0、それにKnobs-into-Holesを加えたH240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0、既存のADCC活性増強技術であるアフコシル化抗体H240-afucosyl_G1d/L73-k0およびADCC活性増強改変であるS239D/A330L/I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0とともに評価した結果を表8にまとめた。
X側からのFcγRに対する結合活性を維持しながら、Y側からの目的の抗原と結合するFc領域を取得する方法として、Fc領域のアミノ酸に多様性を持たせた分子集団(ライブラリーと呼ぶ)からスクリーニングする方法が挙げられる。Y側からの抗原に対する結合活性を付与するためにライブラリー化する箇所として、図12に示したループAL2, AL3, BL2およびBL4が考えられた。具体的には、図11および12に示したように、HA鎖のEUナンバリング265~271のループAL2、EUナンバリング295~300のループAL3、および、HB鎖のEUナンバリング265~271のループBL2、EUナンバリング324~332のループBL4がライブラリー化するループとして考えられた。これらの箇所はX側からのFcγRとの結合への関与は小さいが、これらのループをさまざまなアミノ酸が出現するように完全にライブラリー化した場合、X側からのFcγRとの結合を保持することは極めて困難であると考えられる。すなわち、これらのループにランダムにアミノ酸が出現するライブラリーにおいて、X側からのFcγRに対する結合活性を少なくとも天然型IgGと同程度に維持し、医薬品として使用に耐える熱安定性を有し、且つ、Y側から目的の抗原に対して結合活性を有する分子を取得することは非常に困難である。
実施例4に示されたように、図12に示したループAL2(HA鎖Loop2), AL3(HA鎖Loop3), BL2(HB鎖Loop2)およびBL4(HB鎖Loop4)において、許容されるアミノ酸が出現するライブラリーが設計された。スキャフォールドタンパク質において、任意の抗原に対する結合分子を取得しようとする場合、スキャフォールドに用いている天然タンパク質のループを長く改変した(延長した)ループを用いて、ライブラリー化する方法が知られている(Peds(2010), 23(4), 289-297)。ループを長くすることのメリットとして、アミノ酸配列の多様性を増大させること、および、抗体の重鎖CDR3のように長いループによって多様なコンフォーメーションが取れること、によって、任意の抗原に対する結合分子が取得されるやすくなる点である。既存のスキャフォールドタンパク質において、ループを延長した際に考慮すべき点は、熱安定性が保たれているかどうかという点のみである。しかしながら、dual binding Fcにおいては、熱安定性に加えて、X側からのFcγRに対する結合活性が維持できているかどうかという点が極めて重要である。通常行われるように両H鎖にループの延長を導入したホモ二量体化抗体である場合、延長されたループ領域がY側の抗原との結合に寄与しないにもかかわらず、熱安定性およびFcγRとの相互作用を低下させてしまうと考えられる。したがって、ループの延長は両鎖に導入するのではなく、片方の鎖にのみ導入する必要がある。
接着分子として知られているIntegrin αvβ3は、多くの癌細胞および腫瘍の周りの血管に発現していることから、腫瘍をターゲッティングする標的分子として有用であるが、一方でさまざまな正常細胞にも発現してことが知られている(Thromb Haemost. 1998 Nov;80(5):726-34.)。したがって、FcγRとIntegrin αvβ3が同時に結合してしまうと正常細胞がNK細胞などによる強力なADCC活性によって障害されてしまう可能性が考えられた。そこでFcγRとIntegrin αvβ3が同時には結合しない分子が作製できれば、正常細胞に障害を与えることなく、Integrin αvβ3を発現する腫瘍細胞に抗EREG抗体分子をターゲットすることができると考えられた。すなわち、可変領域(Fab)で第1の抗原であるEpiregulin(EREG)に結合し、Fc領域のX側からFcγR、Y側から第2の抗原であるIntegrin αvβ3に結合し、且つ、FcγR及びIntegrin αvβ3に同時には結合しないdual binding Fc分子の取得を検討した。
Dual binding Fc分子を取得する方法は、前述のようにライブラリーを利用する方法とタンパク質に対して結合活性を有することが知られているペプチドを挿入する方法がある。Integrin αvβ3に対して結合活性を有するペプチドとして、RGD(Arg-Gly-Asp)ペプチドが知られている。実施例4および5でFcγRとの相互作用および熱安定性の観点から抗原結合に利用できると考えられたH240-Kn125/H240-Hl076/L73のループ領域にRGD(Arg-Gly-Asp)ペプチドが挿入された分子(H240-Kn125/H240-Hl076-ma1/L73;配列番号21/45/11、H240-Kn125-ma1/H240-Hl076/L73;配列番号46/22/11)を参考実施例1に従って作製した。また、対照として定常領域がヒト天然IgG1であるH240-G1dE/H240-G1dE/L73;配列番号44/44/11)、J. Biotech, 155, 193-202, 2011に報告されている抗体のCH3領域にRGD(Arg-Gly-Asp)ペプチドが挿入された抗体(H240-Kn125-CD/H240-Hl076/L73;配列番号47/22/11)および(H240-G1d-CD/H240-G1d-CD/L73;配列番号48/48/11)を参考実施例1に従って作製した。CH3領域を介してIntegrin αvβ3と結合するこの分子は、FcγRとIntegrin αvβ3に同時に結合することが出来ると考えられる。
Fc領域にRGD(Arg-Gly-Asp)ペプチドが挿入された分子がIntegrin αvβ3と結合するか、ELISA法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)で判定した。具体的には、1μg/mLとなるようにCoating Buffer(0.1M NaHCO3、pH9.6)で希釈したIntegrin αvβ3(R&D Systems)をNunc-Immuno(tm) MicroWell(tm) 96 well solid plates(Nunc)の各ウェル100μLずつ添加し、Integrin αvβ3をプレートに固相化した。抗原(Integrin αvβ3)が固相化されたプレートを0.1g/L塩化カルシウムおよび0.1g/L塩化マグネシウムを含むTBS溶液(TBS(+)溶液と表記する)250μLで3回洗浄した。5%BSAおよび0.1g/L塩化カルシウム、0.1g/L塩化マグネシウムを含むTBS溶液(ブロッキング溶液と表記する)250μLを加えて室温1時間インキュベートした。
ブロッキング溶液を除いた後、TBS(+)溶液で3回洗浄した。TBS(+)溶液を用いて1、10、100μg/mLとなるように調製された抗体溶液を100μLずつ各ウェルに添加し、室温1時間インキュベートして抗体をIntegrin αvβ3に結合させた。
抗体溶液を除いた後、TBS(+)溶液で3回洗浄し、ブロッキング溶液で50000倍に希釈された抗ヒトIgGを認識するHRP標識抗体を加えて、室温1時間インキュベートした。
HRP標識抗体溶液を除いた後、TBS(+)溶液で3回洗浄し、ウェルに残った溶液を十分除いてからTMB溶液を加えて室温20分間インキュベートして発色させ、50μLの1M硫酸溶液を加えて反応を停止させた。反応が停止した溶液の450nm波長の吸光度を測定した。
次に、前項で作製したIntegrin αvβ3とFc領域で結合する抗体が、FcγRに対する結合活性を保持しているかSPR法(surface plasmon resonance)で確認した。具体的には、Biacore T100 (GE Healthcare) を用いて、FcγRIIIaとの相互作用解析を行った。ランニングバッファーには前項で用いたTBS(+)溶液を用い、測定温度は25℃とした。Series S Sencor Chip CM4(GEヘルスケア)に、アミンカップリング法によりProteinLを固定化したチップを用いた。ProteinLを固定化したチップへ目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したFcγRIIIaを相互作用させた。10 mM glycine-HCl、pH1.5を反応させることで、チップにキャプチャーした抗体を洗浄し、チップを再生して繰り返し用いた。
各抗体のFcγRIIIaに対する結合活性は主にFcγRIIIaに対する結合活性およびFcγRIIIaに対する解離定数を指標として評価した。各抗体のFcγRIIIaに対する解離定数は、Biacoreの測定結果に対して速度論的解析を実施することで算出した。具体的には、Biacore Evaluation Softwareにより測定して得られたセンサーグラムを1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ka (L/mol/s)、解離速度定数kd(1/s)を算出し、その値から解離定数KD (mol/L) を算出した。
前項までの結果から、Integrin αvβ3に対して結合活性を有し、かつ、FcγRIIIaに対して天然型IgG1よりも強い結合活性を有する分子が得られた。次に、前項までに作製されたFc領域がFcγRIIIaとIntegrin αvβ3と同時に結合するか判定した。
ブロッキング溶液を除いた後、TBS(+)溶液で3回洗浄した。あらかじめTBS(+)溶液を用いて希釈された2μg/mL抗体溶液55μLと0、2、20、200μg/mL FcγRIIIa溶液55μLを混ぜて抗体・FcγR混合溶液を調製し、室温1時間インキュベートした。抗体・FcγR混合溶液を100μLウェルに添加し、室温1時間インキュベートして抗体をIntegrin αvβ3に結合させた。
抗体・FcγR混合溶液を除いた後、TBS(+)溶液で3回洗浄し、ブロッキング溶液で50000倍に希釈された抗ヒトIgGを認識するHRP標識抗体を加えて、室温1時間インキュベートした。
HRP標識抗体溶液を除いた後、TBS(+)溶液で3回洗浄し、ウェルに残った溶液を十分除いてからTMB溶液を加えて室温20分間インキュベートして発色させ、50μLの1M硫酸溶液を加えることで反応を停止させた。反応が停止した溶液の450nm波長の吸光度を測定した。
FcγRに結合している抗体がIntegrin αvβ3と結合するか、SPR法を用いて判定した。具体的には、Biacore T200 (GE Healthcare) を用いて、FcγRIIIaに結合させた抗体とIntegrin αvβ3の結合を確認した。ランニングバッファーには前項で用いたTBS(+)溶液を用い、測定温度は15℃とした。Series S Sencor Chip CM5(GEヘルスケア)に、アミンカップリング法により抗His抗体(anti-penta-His antibody、QIAGEN)を固定化したチップを用いた。抗His抗体を固定化したチップへFcγRIIIaをキャプチャーした。次に、ランニングバッファーで希釈した抗体を相互作用させた。このとき、チップ上には、FcγRIIIaに結合した抗体のみが存在する。抗体がキャプチャーされているチップに、ランニングバッファーで260nMに希釈したIntegrin αvβ3を相互作用させた。10 mM glycine-HCl、pH2.5を反応させることで、チップにキャプチャーした抗体を洗浄し、チップを再生して繰り返し用いた。
FcγRIIIaに結合した各抗体のIntegrin αvβ3に対する結合活性は、センサーグラムの形状を以って判断した。
以上の結果から、X側からFcγRIIIaに結合し、Y側からIntegrin αvβ3に結合し、かつ、FcγRIIIa及びIntegrin αvβ3に同時には結合しないdual binding Fc分子の特性を有する抗EREG抗体を創製することができた。本実施例では、第1の抗原であるEREGに結合する可変領域を有する抗体に対して、第2の抗原であるIntegrin αvβ3に結合するRGDペプチドをY側のループに挿入することで、第2の抗原に対する結合活性を付与し、且つ、FcγRと第2の抗原に同時には結合しない分子を取得することが出来た。同様の方法で、WO2006036834に例示されているようなタンパク質に対して結合活性を有するペプチドを実施例4や実施例5で選定されたループに挿入することで、任意の第二の抗原に対して結合活性を有する、抗EREG抗体を取得することができる。さらに、実施例4および実施例5で設計されたライブラリーを用いることで、任意の第2の抗原に対して結合活性を有する抗EREG抗体を創製することが可能であると考えられる。第1の抗原に対する可変領域は、当業者公知の様々な方法で取得することが可能であることから、このようなライブラリーを用いることで、任意の第1の抗原と任意の第2の抗原とFcγRに対して結合活性を有し、第2の抗原及びFcγRに同時には結合することができない、抗体分子を創製することが可能であると言える。
実施例3でヘテロ二量体化抗体を用いることで従来のホモ二量体化抗体を用いるよりも、Fc領域とFcγRとの非対称な相互作用をより最適化できることが示された。実施例3では、最適化されていることを示す一例として、片方のH鎖にS239D, A330L, I332E 、もう片方のH鎖にL234Y、G236W、S298A の改変が導入されたヘテロ二量体化抗体が用いられた。導入されたアミノ酸改変が実施例3で考察したように実際にFcγRとの相互作用に関与しているかをヘテロ二量体化抗体とFcγRIIIa(FcγRIIIa細胞外領域)との複合体の結晶構造解析から考察した。
片方のH鎖にS239D, A330L, I332E 、もう片方のH鎖にL234Y、G236W、S298A の改変が導入されたヘテロ二量体化抗体のFc領域をFc (YWA-DLE)と呼ぶ。Fc(YWA-DLE)はFc(DLE)とFc(YWA)で構成される。Fc(YWA-DLE) の調製は以下のように行った。H240-Kn033(配列番号13)にS239D, A330L, I332Eを、H240-Hl033 (配列番号14)にはL234Y、G236W、S298Aを導入した。さらにEUナンバリング220番目のCysをSerに置換し、EUナンバリング236番目のGluからそのC末端をFc(DLE) (配列番号53)およびFc(YWA)(配列番号54)とした。Fc (DLE)および Fc (YWA)をコードする塩基配列を動物細胞発現用のベクターに組み込んだ。参考実施例1に記載の方法にしたがって、作製した上記ベクターを動物細胞に導入し、Fc(YWA-DLE)の発現および精製を行った。なお、EUナンバリング220番目のCysは通常のIgG1においては、L鎖のCysとdisulfide bondを形成しているが、Fcのみを調製する場合、L鎖を共発現させないため、不要なdisulfide bond形成を回避するためにSerに置換された。
結晶構造解析に用いるFcγRIIIa(FcγRIIIa細胞外領域)は、参考実施例5の方法で発現、簡易精製された。得られたFcγRIIIa細胞外領域サンプル4mgに対し、glutathione S-transferaseとの融合蛋白として大腸菌により発現精製した糖鎖切断酵素Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622)を0.4mg加え、0.1M Bis-Tris pH6.5のBuffer条件で、室温にて数日間静置することにより、N型糖鎖をAsnに直接結合したN-acetylglucosamineを残して切断した。次にこの糖鎖切断処理を施したFcγRIIIa細胞外領域サンプルを、5000MWCOの限外ろ過膜により濃縮し、0.02M HEPS pH7.5, 0.05M NaClで平衡化したゲルろ過カラムクロマトグラフィー(Superdex200 10/300)により精製した。
上記の方法によって得られた糖鎖切断FcγRIIIa細胞外領域画分にFc(YWA-DLE)をモル比でFcγRIIIa細胞外領域のほうが過剰となるよう加え、10000MWCOの限外ろ過膜により濃縮後、0.02M HEPS pH7.5, 0.05M NaClで平衡化したゲルろ過カラムクロマトグラフィー(Superdex200 10/300)により精製することで、Fc(YWA-DLE) / FcγRIIIa細胞外領域複合体の画分を得た。さらにこの画分を0.02M HEPES pH7.5で平衡化した陰イオン交換カラム(MonoQ 5/50 GL)にアプライし、NaClのグラジェントにより溶出、結果得られたクロマトグラフィーは複数のピークに分かれており、そのうちの主要な3つのピークを別々に分取し、それぞれを結晶化用Fc(YWA-DLE) / FcγRIIIa細胞外領域複合体のサンプルとした。
上記の方法で精製した結晶化用Fc(YWA-DLE) / FcγRIIIa細胞外領域複合体のサンプルを10000MWCOの限外ろ過膜 により、0.05M イミダゾール pH8へとBuffer置換をおこないながら、約10mg/mlまで濃縮し、シッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化をおこなった。結晶化にはHydra II Plus One (MATRIX)を用い、0.1M MES pH7、15% PEG3350, 0.2M 酢酸アンモニウム, 0.01M スペルミンのリザーバー溶液に対し、リザーバー溶液:結晶化サンプル=0.2μl:0.2μlで混合して結晶化ドロップを作成、シール後、20℃に静置したところ、細い柱状の結晶を得ることに成功した。
得られたFc(YWA-DLE) / FcγRIIIa細胞外領域複合体の単結晶一つを0.1M MES pH7、18% PEG3350, 0.2M酢酸アンモニウム, 0.01Mスペルミン, エチレングリコール20%(v/v) の溶液に浸した後、微小なナイロンループ付きのピンで溶液ごとすくいとり、液体窒素中で凍結させ、Spring-8のBL32XUにてX線回折データの測定をおこなった。なお、測定中は常に-178℃の窒素気流中に置くことで凍結状態を維持し、ビームライン備え付けのCCDディテクタMX-225HE(RAYONIX) により、結晶を1°ずつ回転させながらトータル180枚のX線回折画像を収集した。得られた回折画像からの格子定数の決定、回折斑点の指数付け、ならびに回折データの処理には、プログラムXia2(J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190)、XDS Package(Acta Cryst. (2010) D66, 125-132)およびScala(Acta Cryst. (2006) D62, 72-82)を用い、最終的に分解能2.97Åまでの回折強度データを得ることに成功した。本結晶は、空間群P212121に属し、格子定数a=71.80Å、b=100.91Å、c=123.54Å、α=90°、β=90°、γ=90°であった。
Fc(YWA-DLE)/FcγRIIIa細胞外領域複合体の構造決定のため、プログラムPhaser(J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674)を用いて分子置換法を実施した。得られた結晶格子の大きさとFc(YWA-DLE)/FcγRIIIa細胞外領域複合体の分子量から非対称単位中の複合体の数は一個と予想され、既知のIgG1-Fc / FcγRIIIa細胞外領域複合体の結晶構造であるPDB code:3SGJの構造座標を探索用モデルとして用いて、当該結晶の格子内での向きと位置を回転関数および並進関数から決定した。さらに得られた初期構造モデルに対し、Fc領域の2つのCH2ドメインと2つのCH3ドメインならびに、FcγRIIIa細胞外領域を独立に動かす剛体精密化をおこなったところ、25-3.0Åの回折強度データに対する結晶学的信頼度因子R値は43.9%、Free R値は43.4%となった。さらにプログラムREFMAC5(Acta Cryst. (2011) D67, 355-367)を用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcならびにモデルから計算された位相をもとに算出された2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップに基づく当該構造モデルの修正をプログラムCoot(Acta Cryst. (2010) D66, 486-501)を用いて実施、これらの作業を繰り返すことで構造モデルの精密化をおこなった。最終的には、分解能25-2.97Åの18126個の回折強度データを用いて、4891個の非水素原子を含む構造モデルの結晶学的信頼度因子R値は21.7%、Free R値は26.9%となった。
Fc(YWA-DLE)と FcγRIIIa細胞外領域複合体についてX線結晶構造解析により分解能2.97Åで立体構造を決定、その解析結果である構造を図19に示した。2つのFc CH2ドメインの間にFcγRIIIa細胞外領域が挟まれるように結合しており、これまで解析されたIgG1-FcとFcγRIIIa(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2011, 108, 12669-126674)、ならびにFcγRIIIb(Nature, 2000, 400, 267-273; J.Biol.Chem. 2011, 276, 16469-16477)の細胞外領域との複合体の立体構造(立体配置)とほぼ同じであった。以下ではFcγRIIIaのアミノ酸位置はStandard NCBI numberingに従った(Mol Immunol. 2008 Apr;45(7):1872-82)。
〔参考実施例1〕抗体の発現ベクターの作製および抗体の発現と精製
アミノ酸置換の導入はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCRまたはIn fusion Advantage PCR cloning kit (TAKARA)等を用いて当業者公知の方法で行い、発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株(Invitrogen)、またはFreeStyle293細胞(Invitrogen社)に、一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GEヘルスケア)を用いて当業者公知の方法で、抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
Biacore T100、Biacore A100またはBiacore 4000(GE Healthcare) を用いて、目的の抗体とFcγRとの相互作用解析を行った。ランニングバッファーにはHBS-EP+ (GE Healthcare)を用い、測定温度は25℃とした。センサーチップにはSeries S Sencor Chip CM5(GEヘルスケア)にアミンカップリング法により抗原ペプチドを固定化したチップ、Series S Sensor Chip SA(certified)(GEヘルスケア)に対して予めビオチン化しておいた抗原ペプチドを相互作用させ、固定化したチップ、Series S Sencor Chip CM5(GEヘルスケア)にProtein L (ACTIGEN, BioVision) を固定化したチップ、あるいはSeries S Sencor Chip CM5(GEヘルスケア)にProtein A/G (Thermo Scientific) を固定化したチップを用いた。これらのチップへ目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈した各FcγRを相互作用させた。10 mM glycine-HCl、pH1.5を反応させることで、チップにキャプチャーした抗体を洗浄し、チップを再生して繰り返し用いた。
各抗体のFcγRに対する結合活性は主にFcγRに対する結合活性およびFcγRに対する解離定数を指標として評価した。
抗体の片側のH鎖にのみ入れることでFcγRに対する結合活性が増強した改変体について、以下の方法に従ってADCC活性を測定した。
ヒト末梢血単核球(以下、ヒトPBMCと指称する。)をエフェクター細胞として用いて各被験抗体のADCC活性を以下のように測定した。
1000単位/mlのヘパリン溶液(ノボ・ヘパリン注5千単位,ノボ・ノルディスク)が予め200μl注入された注射器を用い、中外製薬株式会社所属の健常人ボランティア(成人男性)より末梢血50 mlを採取した。PBS(-)を用いて2倍に希釈された当該末梢血を4等分し、15 mlのFicoll-Paque PLUSが予め注入されて遠心操作が行なわれたLeucosepリンパ球分離管(Greiner bio-one)に加えた。当該末梢血が分注された分離管が2150 rpmの速度によって10分間室温にて遠心分離の操作をした後、単核球画分層を分取した。10%FBSを含むDulbecco's Modified Eagle's Medium(SIGMA)(以下10%FBS/D-MEMと称する。)によって1回当該各分層に含まれる細胞を洗浄した後、当該細胞が10%FBS/D-MEM中にその細胞密度が5x106 細胞/ mlとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液をヒトPBMC溶液として以後の実験に供した。
SK-Hep-1にヒトグリピカン3を強制発現させたSK-pca13aをディッシュから剥離し、3x106細胞に1.85MBqのCr-51を加えた。Cr-51を加えた細胞を5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で1時間インキュベートした後、10%FBS/D-MEMで1回細胞を洗浄し、当該細胞が10%FBS/D-MEM中にその細胞密度が2x105 細胞/ mlとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液を標的細胞として以後の実験に供した。
ADCC活性をクロムリリース法による特異的クロム遊離率にて評価した。まず、各濃度(0、0.004、0.04、0.4、4、40 μg/ml)に調製した抗体溶液を96ウェルU底プレートの各ウェル中に50μlずつ添加した。次に、(2)で調製した標的細胞を50μlずつ播種し(1x104細胞/ウェル)室温にて15分間静置した。各ウェル中に(1)で調製したヒトPBMC溶液各100μl(5x105細胞/ウェル)を加えた当該プレートを、5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で4時間静置した後に、遠心操作した。当該プレートの各ウェル中の100μlの培養上清の放射活性をガンマカウンターを用いて測定した。下式:
特異的クロム遊離率(%)=(A-C)×100/(B-C)
に基づいて特異的クロム遊離率を求めた。
上式において、Aは各ウェル中の100μlの培養上清の放射活性(cpm)の平均値を表す。また、Bは標的細胞に100μlの2% NP-40水溶液(Nonidet P-40、ナカライテスク)および50μlの10% FBS/D-MEM培地を添加したウェル中の100μlの培養上清の放射活性(cpm)の平均値を表す。さらに、Cは標的細胞に10% FBS/D-MEM培地を150 μl添加したウェル中の100μlの培養上清の放射活性(cpm)の平均値を表す。試験はtriplicateにて実施し、各被験抗体のADCC活性が反映される前記試験における特異的クロム遊離率(%)の平均値および標準偏差を算出した。
本検討では、Rotor-Gene Q(QIAGEN)を用いた示査走査型蛍光定量法を用いて改変抗体のTm(熱変性温度)を評価した。なお、本手法は、抗体の熱安定性評価法として広く知られている示唆走査型熱量計を用いたTm評価と良好な相関を示すことが既に報告されている(Journal of Pharmaceutical Science 2010 ; 4 : 1707-1720)。
データはRotor-Gene Q Series Software(QIAGEN)を用いて蛍光遷移が認められた温度を算出し、この値をTm値とした。
FcγRの細胞外ドメインを以下の方法で調製した。まずFcγRの細胞外ドメインの遺伝子の合成を当業者公知の方法で実施した。その際、各FcγRの配列はNCBIに登録されている情報に基づき作製した。具体的には、FcγRIについてはNCBIのaccession # NM_000566.3の配列、FcγRIIaについてはNCBIのaccession # NM_001136219.1の配列、FcγRIIbについてはNCBIのaccession # NM_004001.3の配列、FcγRIIIaについてはNCBIのaccession # NM_001127593.1の配列、FcγRIIIbについてはNCBIのaccession # NM_000570.3の配列に基づいて作製し、C末端にHisタグ(HHHHHH)配列を付加した。またFcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIbについては多型が知られているが、多型部位についてはFcγRIIaについてはJ. Exp. Med., 1990, 172: 19-25、FcγRIIIaについてはJ. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070, FcγRIIIbについてはJ. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691を参考にして作製した。
Claims (38)
- 抗原結合部位及びFcγR結合部位を有し、抗原及びFcγRと同時には結合しない、Fc領域二量体。
- 前記抗体のFc領域が、IgG型のFc領域である、請求項1に記載のFc領域二量体。
- 前記Fc領域二量体が、異なるアミノ酸配列を有する2つのFc領域(第1のFc領域及び第2のFc領域)からなるヘテロ二量体である、請求項1又は2に記載のFc領域二量体。
- 前記抗原結合部位が、Fc領域の少なくとも1つのアミノ酸を改変することにより導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有する部位である、請求項1~3のいずれかに記載のFc領域二量体。
- 前記改変されるアミノ酸が、Fc領域のCH2ドメインのアミノ酸である、請求項4に記載のFc領域二量体。
- 前記改変されるアミノ酸が、ループ領域のアミノ酸である、請求項4又は5に記載のFc領域二量体。
- 前記改変されるアミノ酸が、EUナンバリング231~239、EUナンバリング265~271、EUナンバリング295~300およびEUナンバリング324~337から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸である、請求項6に記載のFc領域二量体。
- 前記ヘテロ二量体の改変されるアミノ酸が、第1のFc領域のEUナンバリング265~271およびEUナンバリング295~300、並びに第2のFc領域のEUナンバリング265~271およびEUナンバリング324~332から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸である、請求項4に記載のFc領域二量体。
- 前記抗原結合部位の改変が、少なくとも1つのアミノ酸の挿入である、請求項4に記載のFc領域二量体。
- 挿入されるアミノ酸の数が9以下である、請求項9に記載のFc領域二量体。
- 挿入される少なくとも1つのアミノ酸が、抗原に対する結合活性を有するペプチドである、請求項9又は10に記載のFc領域二量体。
- 前記FcγR結合部位が、Fc領域の少なくとも1つのアミノ酸が改変された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有する部位である、請求項1~11のいずれかに記載のFc領域二量体。
- 前記改変されるアミノ酸が、Fc領域のCH2ドメインのアミノ酸である、請求項12に記載のFc領域二量体。
- 前記改変されるアミノ酸が、EUナンバリング234番目のLeu、EUナンバリング235番目のLeu、EUナンバリング236番目のGly、EUナンバリング239番目のSer、EUナンバリング268番目のHis、EUナンバリング270番目のAsp、EUナンバリング298番目のSer、EUナンバリング326番目のLys、EUナンバリング330番目のAla、EUナンバリング332番目のIle、EUナンバリング334番目のLysからなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸改変が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有する、請求項12又は13に記載のFc領域二量体。
- 前記改変されるアミノ酸が、EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのY又はQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SのD又はMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HのDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのL又はMへの置換、EUナンバリング332番目のアミノ酸IのEへの置換、及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KのEへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸改変が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有する、請求項12又は13に記載のFc領域二量体。
- 前記Fc領域二量体のどちらか一方のFc領域のアミノ酸配列において、
EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのY又はQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SのMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HのDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸改変が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有しており、
もう一方のFc領域のアミノ酸配列において、
EUナンバリング239番目のアミノ酸SのDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのL又はMへの置換、EUナンバリング332番目のアミノ酸IのEへの置換、及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KのEへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸改変が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列を有する、請求項12又は13に記載のFc領域二量体。 - 前記Fc領域二量体のどちらか一方のFc領域が、(i)~(iii)いずれかのアミノ酸配列を有し、もう一方のFc領域が、(iv)~(vi)いずれかのアミノ酸配列を有する、請求項12又は13に記載のFc領域二量体:
(i)EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列、
(ii) EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HのDへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列、及び、
(iii)EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SのMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HのDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列、
(iv) EUナンバリング239番目のアミノ酸SのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのLへの置換、及びEUナンバリング332番目のアミノ酸IのEへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列
(v) EUナンバリング326番目のアミノ酸KのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのMへの置換、及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KのEへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列
(vi) EUナンバリング270番目のアミノ酸DのEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのMへの置換、及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KのEへの置換が導入された、又はそれと同一のアミノ酸配列。 - 前記FcγR結合部位が天然型IgG1より高いFcγR結合活性を有する、請求項12~17のいずれかに記載のFc領域二量体。
- 前記FcγRが、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaおよびFcγRIIIbからなる群から選択される少なくとも1つ以上のレセプターである、請求項1~18に記載のFc領域二量体。
- 前記FcγRが、FcγRIIIaである、請求項19に記載のFc領域二量体。
- 前記改変されるアミノ酸が、表2-1~表2-3に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸が改変された又はそれと同一のアミノ酸配列を有する、請求項19に記載のFc領域二量体。
- 請求項1~21のいずれかに記載のFc領域二量体を含む、ポリペプチド。
- ポリペプチドが、抗体、多重特異性抗体、ペプチドFc融合タンパク質、又はスキャフォールドFc融合タンパク質である、請求項22に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが抗体の可変領域を含み、第1の抗原が当該可変領域と結合し、第1の抗原とは異なる第2の抗原がFc領域と結合する、請求項22又は23に記載のポリペプチド。
- 第1の抗原が腫瘍細胞に特異的な抗原である、請求項22~24のいずれかに記載のポリペプチド。
- 第2の抗原が免疫細胞の表面で発現している分子、又は、腫瘍細胞と正常細胞で発現している分子である、請求項22~25のいずれかに記載のポリペプチド。
- 請求項22~26のいずれかに記載のポリペプチド及び医学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
- 請求項22~26のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、工程(i)~(iv)を含む方法:
(i)アミノ酸配列が多様なCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドからなるペプチドライブラリーを作製する工程、
(ii)作製されたライブラリーの中から、CH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドが抗原及びFcγRに対する結合活性を有するが、当該抗原及びFcγRと同時には結合しない、CH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドを選択する工程、
(iii)工程(ii)で選択されたペプチド又はポリペプチドと同一のCH2ドメインを有するFc領域二量体を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養して、当該Fc領域二量体を含むポリペプチドを発現させる工程、並びに
(iv)前記宿主細胞培養物からFc領域二量体を含むポリペプチドを回収する工程。 - 工程(i)のCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する2つのCH2ドメイン(第1のCH2ドメイン及び第2のCH2ドメイン)からなるヘテロ二量体である、請求項28に記載の方法。
- 工程(i)及び(ii)のCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドが、Fc領域二量体又はFc領域二量体を含むポリペプチドである、請求項28又は29に記載の方法。
- 工程(ii)において、CH2ドメインの熱変性温度が50℃以上のCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドを選択する工程を更に含む、請求項28~30のいずれかに記載の方法。
- 工程(i)のCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドがIgG型である、請求項28~31のいずれかに記載の方法。
- 工程(i)のCH2ドメインを含むペプチド又はポリペプチドが、FcγRに対する結合活性を増強するための、請求項14~17および21に記載のいずれかの改変配列と同一の配列を有する、請求項28~32のいずれかに記載の方法。
- 工程(i)のライブラリーが、CH2ドメインのアミノ酸配列が多様化されたライブラリーである、請求項28~33のいずれかに記載の方法。
- 工程(i)のライブラリーが、ループ領域のアミノ酸配列が多様化されたライブラリーである、請求項28~34のいずれかに記載の方法。
- 多様化されるループ領域のアミノ酸配列が、EUナンバリング231~239、EUナンバリング265~271、EUナンバリング295~300およびEUナンバリング324~337から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含む、請求項28~35のいずれかに記載の方法。
- 多様化されるループ領域のアミノ酸配列が、第1のFc領域のEUナンバリング265~271およびEUナンバリング295~300、並びに第2のFc領域のEUナンバリング265~271およびEUナンバリング324~332から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸を含む、請求項29~36のいずれかに記載の方法。
- 多様化が、抗原に対する結合活性を有するペプチドをランダムに挿入することによる多様化である、請求項28~37のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP23195290.4A EP4310191A2 (en) | 2012-06-14 | 2013-06-14 | Antigen-binding molecule containing modified fc region |
US14/406,232 US11142563B2 (en) | 2012-06-14 | 2013-06-14 | Antigen-binding molecule containing modified Fc region |
EP13803763.5A EP2862875B1 (en) | 2012-06-14 | 2013-06-14 | ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING MODIFIED Fc REGION |
JP2014521419A JP6628966B2 (ja) | 2012-06-14 | 2013-06-14 | 改変されたFc領域を含む抗原結合分子 |
US17/484,003 US20220242934A1 (en) | 2012-06-14 | 2021-09-24 | Antigen-binding molecule containing modified fc region |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012-134908 | 2012-06-14 | ||
JP2012134908 | 2012-06-14 |
Related Child Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
US14/406,232 A-371-Of-International US11142563B2 (en) | 2012-06-14 | 2013-06-14 | Antigen-binding molecule containing modified Fc region |
US17/484,003 Division US20220242934A1 (en) | 2012-06-14 | 2021-09-24 | Antigen-binding molecule containing modified fc region |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2013187495A1 true WO2013187495A1 (ja) | 2013-12-19 |
Family
ID=49758313
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2013/066428 WO2013187495A1 (ja) | 2012-06-14 | 2013-06-14 | 改変されたFc領域を含む抗原結合分子 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11142563B2 (ja) |
EP (2) | EP2862875B1 (ja) |
JP (3) | JP6628966B2 (ja) |
WO (1) | WO2013187495A1 (ja) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015068847A1 (ja) * | 2013-11-11 | 2015-05-14 | 中外製薬株式会社 | 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子 |
US9890218B2 (en) | 2011-06-30 | 2018-02-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Heterodimerized polypeptide |
US10766960B2 (en) | 2012-12-27 | 2020-09-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Heterodimerized polypeptide |
JPWO2020027224A1 (ja) * | 2018-07-31 | 2021-08-02 | 国立大学法人 東京大学 | 新たな結合特異性を抗体に付与する超汎用法 |
US11142563B2 (en) | 2012-06-14 | 2021-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule containing modified Fc region |
US11154615B2 (en) | 2014-11-11 | 2021-10-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region |
US11274151B2 (en) | 2020-03-31 | 2022-03-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | CD3-targeting and DLL3-targeting multispecific antigen-binding molecules and uses thereof |
WO2022270612A1 (ja) * | 2021-06-25 | 2022-12-29 | 中外製薬株式会社 | 抗ctla-4抗体の使用 |
US11952422B2 (en) | 2017-12-05 | 2024-04-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137 |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX352889B (es) | 2011-02-25 | 2017-12-13 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo de fc especifico para fcyriib. |
SG10201709559PA (en) | 2012-08-24 | 2017-12-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Fcγriib-specific fc region variant |
EP3597747B1 (en) * | 2012-08-24 | 2023-03-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Mouse fcgammarii-specific fc antibody |
US11267868B2 (en) | 2013-04-02 | 2022-03-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc region variant |
BR112016006197B1 (pt) | 2013-09-27 | 2023-04-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Método para produzir um anticorpo biespecífico de polipeptídeos |
PE20221834A1 (es) | 2014-12-19 | 2022-11-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpos antimiostatina |
KR20170110129A (ko) | 2015-02-05 | 2017-10-10 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용 |
US11359009B2 (en) | 2015-12-25 | 2022-06-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-myostatin antibodies and methods of use |
WO2017214321A1 (en) | 2016-06-07 | 2017-12-14 | Gliknik Inc. | Cysteine-optimized stradomers |
MX2019000887A (es) * | 2016-07-22 | 2019-09-04 | Gliknik Inc | Proteínas de fusión de fragmentos de proteínas humanas para crear composiciones de fc de inmunoglobina multimerizadas en un orden con unión mejorada al receptor de fc. |
CN116251182A (zh) | 2016-08-05 | 2023-06-13 | 中外制药株式会社 | 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物 |
EP3579848A4 (en) | 2017-02-08 | 2021-03-03 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR ACTIVATING NATURAL KILLER CELLS AND THEIR THERAPEUTIC USES FOR TREATING CANCER |
AU2018221731C1 (en) | 2017-02-17 | 2021-11-18 | Denali Therapeutics Inc. | Engineered transferrin receptor binding polypeptides |
AU2018220736A1 (en) | 2017-02-20 | 2019-09-05 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Proteins binding HER2, NKG2D and CD16 |
AU2018224319B2 (en) * | 2017-02-27 | 2024-04-04 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Multispecific binding proteins targeting CEA |
EP3661554A4 (en) * | 2017-07-31 | 2021-04-21 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | PROTEINS BINDING TO NKG2D, CD16 AND FLT3 |
CN112368012A (zh) | 2018-02-08 | 2021-02-12 | 蜻蜓疗法股份有限公司 | 靶向nkg2d受体的抗体可变结构域 |
EP3825333A4 (en) * | 2018-07-06 | 2022-04-06 | Abmax Biopharmaceuticals | LOW FUNCTIONALITY ADCC/CDC MONOCLONAL ANTIBODY, METHOD FOR PREPARATION AND USE |
TW202140553A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商威特拉公司 | C5ar1抗體分子及其用途 |
KR20230142831A (ko) | 2021-01-13 | 2023-10-11 | 비스테라, 인크. | 인간화된 보체 5a 수용체 1 항체 및 이의 사용 방법 |
Citations (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0125023A1 (en) | 1983-04-08 | 1984-11-14 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobulin preparations, methods for their preparation, DNA sequences, expression vectors and recombinant host cells therefor |
EP0239400A2 (en) | 1986-03-27 | 1987-09-30 | Medical Research Council | Recombinant antibodies and methods for their production |
WO1992001047A1 (en) | 1990-07-10 | 1992-01-23 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
WO1992003918A1 (en) | 1990-08-29 | 1992-03-19 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
WO1992020791A1 (en) | 1990-07-10 | 1992-11-26 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
WO1993006213A1 (en) | 1991-09-23 | 1993-04-01 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
WO1993011236A1 (en) | 1991-12-02 | 1993-06-10 | Medical Research Council | Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage |
WO1993012227A1 (en) | 1991-12-17 | 1993-06-24 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
WO1993019172A1 (en) | 1992-03-24 | 1993-09-30 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
WO1994002602A1 (en) | 1992-07-24 | 1994-02-03 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
WO1994025585A1 (en) | 1993-04-26 | 1994-11-10 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
WO1995001438A1 (en) | 1993-06-30 | 1995-01-12 | Medical Research Council | Sbp members with a chemical moiety covalently bound within the binding site; production and selection thereof |
WO1995001937A1 (fr) | 1993-07-09 | 1995-01-19 | Association Gradient | Procede de traitement de residus de combustion et installation de mise en ×uvre dudit procede |
WO1995015388A1 (en) | 1993-12-03 | 1995-06-08 | Medical Research Council | Recombinant binding proteins and peptides |
WO1995033844A1 (de) | 1994-06-03 | 1995-12-14 | GSF - Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Verfahren zur herstellung von heterologen bispezifischen antikörpern |
WO1996002576A1 (fr) | 1994-07-13 | 1996-02-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine |
WO1996027011A1 (en) | 1995-03-01 | 1996-09-06 | Genentech, Inc. | A method for making heteromultimeric polypeptides |
WO1996034096A1 (en) | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
WO1996033735A1 (en) | 1995-04-27 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
WO1998050431A2 (en) | 1997-05-02 | 1998-11-12 | Genentech, Inc. | A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
WO2000042072A2 (en) | 1999-01-15 | 2000-07-20 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
WO2002020565A2 (en) | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Universität Zürich | Collections of repeat proteins comprising repeat modules |
WO2002032925A2 (en) | 2000-10-16 | 2002-04-25 | Phylos, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
WO2003002609A2 (en) | 2001-06-28 | 2003-01-09 | Domantis Limited | Dual-specific ligand and its use |
WO2004044011A2 (en) | 2002-11-06 | 2004-05-27 | Avidia Research Institute | Combinatorial libraries of monomer domains |
WO2004058821A2 (en) | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand |
WO2005037989A2 (en) | 2001-01-17 | 2005-04-28 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
WO2005040229A2 (en) | 2003-10-24 | 2005-05-06 | Avidia, Inc. | Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers |
WO2006019447A1 (en) | 2004-07-15 | 2006-02-23 | Xencor, Inc. | Optimized fc variants |
WO2006036834A2 (en) | 2004-09-24 | 2006-04-06 | Amgen Inc. | MODIFIED Fc MOLECULES |
WO2006053301A2 (en) | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to fcrn |
WO2006067913A1 (ja) | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 |
WO2006106905A1 (ja) | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
WO2007114325A1 (ja) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法 |
WO2009041062A1 (ja) | 2007-09-28 | 2009-04-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 血漿中動態が改善されたグリピカン3抗体 |
WO2009041613A1 (ja) | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 抗体定常領域改変体 |
WO2009086320A1 (en) | 2007-12-26 | 2009-07-09 | Xencor, Inc | Fc variants with altered binding to fcrn |
WO2009125825A1 (ja) | 2008-04-11 | 2009-10-15 | 中外製薬株式会社 | 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子 |
WO2011028952A1 (en) | 2009-09-02 | 2011-03-10 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
WO2011078332A1 (ja) | 2009-12-25 | 2011-06-30 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法 |
Family Cites Families (89)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5932411U (ja) | 1982-08-24 | 1984-02-29 | エヌオーケー株式会社 | 離型装置 |
JPH0328966Y2 (ja) | 1987-10-16 | 1991-06-20 | ||
DE69214709T2 (de) | 1991-04-26 | 1997-02-20 | Surface Active Ltd | Neue Antikörper und Verfahren zu ihrer Verwendung |
AU6235294A (en) | 1993-02-02 | 1994-08-29 | Scripps Research Institute, The | Methods for producing polypeptide binding sites |
US5981478A (en) | 1993-11-24 | 1999-11-09 | La Jolla Cancer Research Foundation | Integrin-binding peptides |
US7951917B1 (en) | 1997-05-02 | 2011-05-31 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
BR9907964A (pt) | 1998-02-06 | 2000-10-17 | Ilexus Pty Limited | Estruturas tridimensionais e modelos de receptores fc e usos dos mesmos |
GB9809951D0 (en) | 1998-05-08 | 1998-07-08 | Univ Cambridge Tech | Binding molecules |
US6344443B1 (en) | 1998-07-08 | 2002-02-05 | University Of South Florida | Peptide antagonists of tumor necrosis factor alpha |
CN1189166C (zh) | 1998-09-11 | 2005-02-16 | 伊来克萨斯独资有限公司 | Fc受体调节剂及其应用 |
RU2236222C2 (ru) | 1998-09-11 | 2004-09-20 | Айлексус Пти Лимитед | Модуляторы fc-рецептора и их применение |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
ES2276735T3 (es) | 2001-09-14 | 2007-07-01 | Affimed Therapeutics Ag | Anticuerpos fv multimericos de cadena sencilla en tandem. |
WO2003074679A2 (en) | 2002-03-01 | 2003-09-12 | Xencor | Antibody optimization |
US7317091B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US7662925B2 (en) | 2002-03-01 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US8193318B2 (en) | 2002-08-14 | 2012-06-05 | Macrogenics, Inc. | FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof |
BRPI0314814C1 (pt) | 2002-09-27 | 2021-07-27 | Xencor Inc | anticorpo compreendendo uma variante de fc |
RU2325186C2 (ru) | 2002-09-27 | 2008-05-27 | Ксенкор, Инк. | АНТИТЕЛО, СОДЕРЖАЩЕЕ Fc-ВАРИАНТНУЮ ЧАСТЬ (ВАРИАНТЫ), ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АНТИТЕЛО, И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО |
EP2368578A1 (en) | 2003-01-09 | 2011-09-28 | Macrogenics, Inc. | Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same |
US7960512B2 (en) | 2003-01-09 | 2011-06-14 | Macrogenics, Inc. | Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same |
US20090010920A1 (en) | 2003-03-03 | 2009-01-08 | Xencor, Inc. | Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb |
US8388955B2 (en) | 2003-03-03 | 2013-03-05 | Xencor, Inc. | Fc variants |
US9051373B2 (en) | 2003-05-02 | 2015-06-09 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
WO2005063815A2 (en) | 2003-11-12 | 2005-07-14 | Biogen Idec Ma Inc. | Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto |
EP1701979A2 (en) | 2003-12-03 | 2006-09-20 | Xencor, Inc. | Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor |
CA2546054C (en) | 2003-12-10 | 2014-05-13 | Medarex, Inc. | Interferon alpha antibodies and their uses |
AU2005206536B2 (en) | 2004-01-16 | 2010-09-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion polypeptides capable of activating receptors |
MXPA06011796A (es) | 2004-04-16 | 2007-05-07 | Macrogenics Inc | Anticuerpos especificos de fc(riib y metodos para el uso de los mismos. |
RU2006142852A (ru) | 2004-05-05 | 2008-06-10 | Ксенкор, Инк. (Us) | Оптимизированные fc-варианты |
US20070048785A1 (en) | 2004-06-09 | 2007-03-01 | Lin Laura L | Anti-IL-13 antibodies and complexes |
EA016357B1 (ru) | 2004-07-30 | 2012-04-30 | Ринат Ньюросайенс Корп. | Антитела, направленные против бета-амилоидного пептида, и способы их применения |
SI1773885T1 (sl) | 2004-08-05 | 2010-08-31 | Genentech Inc | Humanizirani anti-CMET antagonisti |
AU2005277567A1 (en) | 2004-08-16 | 2006-03-02 | Medimmune, Llc | Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity |
CN101123983A (zh) | 2004-10-27 | 2008-02-13 | 米迪缪尼股份有限公司 | 特定修饰对相关抗原的亲和力来调节抗体的特异性 |
CA2585717A1 (en) | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Medimmune Inc. | Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens |
US7632497B2 (en) | 2004-11-10 | 2009-12-15 | Macrogenics, Inc. | Engineering Fc Antibody regions to confer effector function |
ATE425186T1 (de) | 2005-01-05 | 2009-03-15 | F Star Biotech Forsch & Entw | Synthetische immunoglobulindomänen mit in regionen des moleküls, die sich von den die komplementarität bestimmenden bereichen unterscheiden, modifizierten bindeeigenschaften |
WO2006076594A2 (en) | 2005-01-12 | 2006-07-20 | Xencor, Inc. | Antibodies and fc fusion proteins with altered immunogenicity |
CA2596248A1 (en) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Vaxinnate Corporation | Method to identify polypeptide toll-like receptor (tlr) ligands |
WO2006133486A1 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-21 | The Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Limited | CRYSTAL STRUCTURES AND MODELS FOR Fc RECEPTOR:Fc COMPLEXES AND USES THEREOF |
US20070190063A1 (en) | 2005-08-19 | 2007-08-16 | Bahjat Keith S | Antibody-mediated enhancement of immune response |
KR20080073293A (ko) | 2005-10-14 | 2008-08-08 | 메디뮨 엘엘씨 | 항체 라이브러리의 세포 디스플레이 |
US20070087005A1 (en) | 2005-10-14 | 2007-04-19 | Lazar Gregory A | Anti-glypican-3 antibody |
JP2009538273A (ja) | 2006-04-14 | 2009-11-05 | トルビオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 改造されたFCエフェクター機能を持つ、免疫グロブリン・ヒンジ領域とFc領域とを備える結合タンパク質 |
AU2007249160B2 (en) | 2006-05-15 | 2013-09-12 | I2 Pharmaceuticals, Inc. | Neutralizing antibodies to influenza viruses |
AT503889B1 (de) | 2006-07-05 | 2011-12-15 | Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F | Multivalente immunglobuline |
DK2383297T5 (da) | 2006-08-14 | 2022-07-04 | Xencor Inc | Optimerede antistoffer rettet mod CD19 |
LT2520590T (lt) | 2007-04-03 | 2018-09-10 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Susijusioms rūšims specifinis rišantis domenas |
CN109456410B (zh) | 2007-04-03 | 2022-01-28 | 安进研发(慕尼黑)股份有限公司 | 跨物种特异性CD3-ε结合结构域 |
LT2176298T (lt) | 2007-05-30 | 2018-04-10 | Xencor, Inc. | Būdai ir kompozicijos, skirti cd32b ekspresuojančių ląstelių slopinimui |
KR100888133B1 (ko) | 2007-10-02 | 2009-03-13 | 에스케이에너지 주식회사 | 4종의 금속성분으로 구성된 다성분계 비스무스몰리브데이트 촉매 제조방법 및 상기촉매를 이용하여1,3-부타디엔을 제조하는 방법 |
US20120039871A1 (en) | 2007-11-08 | 2012-02-16 | Pikamab, Inc. | Methods and compositions for antibody therapy |
PT2235064E (pt) | 2008-01-07 | 2016-03-01 | Amgen Inc | Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática |
AU2009206506B2 (en) | 2008-01-23 | 2013-01-10 | Xencor, Inc. | Optimized CD40 antibodies and methods of using the same |
AU2009212747B2 (en) * | 2008-01-31 | 2013-11-07 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Engineered antibody constant domain molecules |
KR101705911B1 (ko) | 2008-09-03 | 2017-02-10 | 제넨테크, 인크. | 다중특이적 항체 |
AU2010265933B2 (en) | 2009-06-26 | 2015-05-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format |
JP2013511281A (ja) | 2009-11-23 | 2013-04-04 | アムジェン インコーポレイテッド | 単量体抗体Fc |
WO2011107989A1 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-09 | Lostam Biopharmaceuticals Ltd | Improved therapeutic antibodies against flagellated pseudomonas aeruginosa |
US10435458B2 (en) | 2010-03-04 | 2019-10-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding |
ES2617777T5 (es) | 2010-04-23 | 2022-10-13 | Hoffmann La Roche | Producción de proteínas heteromultiméricas |
AU2011325833C1 (en) | 2010-11-05 | 2017-07-13 | Zymeworks Bc Inc. | Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain |
AR084053A1 (es) | 2010-11-30 | 2013-04-17 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agente terapeutico que induce citotoxicidad |
AU2012205663B2 (en) | 2011-01-10 | 2017-02-02 | Emory University | Antibodies directed against influenza |
MX352889B (es) | 2011-02-25 | 2017-12-13 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo de fc especifico para fcyriib. |
JP5972915B2 (ja) * | 2011-03-16 | 2016-08-17 | アムジエン・インコーポレーテツド | Fc変異体 |
CN103796677B (zh) | 2011-04-20 | 2019-08-16 | 健玛保 | 针对her2和cd3的双特异性抗体 |
SG195072A1 (en) | 2011-05-21 | 2013-12-30 | Macrogenics Inc | Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3 |
BR112013032630B1 (pt) | 2011-06-30 | 2022-06-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Polipeptídeo heterodimerizado compreendendo região fc de igg |
CN103748114B (zh) | 2011-08-23 | 2017-07-21 | 罗切格利卡特公司 | T细胞活化性双特异性抗原结合分子 |
WO2013047752A1 (ja) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | 中外製薬株式会社 | 抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
CA2851795C (en) | 2011-10-20 | 2018-11-13 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-cd22 chimeric antigen receptors |
WO2013063702A1 (en) | 2011-11-04 | 2013-05-10 | Zymeworks Inc. | Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain |
EP2813568A4 (en) | 2012-02-09 | 2016-04-06 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | MODIFIED FC REGION OF ANTIBODY |
DK2857420T3 (da) | 2012-05-30 | 2020-11-23 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Målvævsspecifikt antigenbindende molekyle |
US11142563B2 (en) | 2012-06-14 | 2021-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule containing modified Fc region |
EP3597747B1 (en) | 2012-08-24 | 2023-03-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Mouse fcgammarii-specific fc antibody |
DK2940135T5 (da) | 2012-12-27 | 2021-09-20 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Heterodimeriseret polypeptid |
EP2948475A2 (en) | 2013-01-23 | 2015-12-02 | AbbVie Inc. | Methods and compositions for modulating an immune response |
US11267868B2 (en) | 2013-04-02 | 2022-03-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc region variant |
BR112016006197B1 (pt) | 2013-09-27 | 2023-04-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Método para produzir um anticorpo biespecífico de polipeptídeos |
TWI652279B (zh) | 2013-11-11 | 2019-03-01 | 中外製藥股份有限公司 | 含改變的抗體可變區之抗原結合分子 |
ES2900898T3 (es) | 2014-04-07 | 2022-03-18 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpos biespecíficos inmunoactivadores |
TW202313697A (zh) | 2014-11-11 | 2023-04-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 包含經改變之抗體可變區之抗原結合分子的資料庫 |
PE20221834A1 (es) | 2014-12-19 | 2022-11-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpos antimiostatina |
US11952422B2 (en) | 2017-12-05 | 2024-04-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137 |
MA53742A (fr) | 2018-09-28 | 2022-01-05 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molécules de liaison à l'antigène capables de se lier à cd3 et cd137 mais pas simultanément |
-
2013
- 2013-06-14 US US14/406,232 patent/US11142563B2/en active Active
- 2013-06-14 EP EP13803763.5A patent/EP2862875B1/en active Active
- 2013-06-14 WO PCT/JP2013/066428 patent/WO2013187495A1/ja active Application Filing
- 2013-06-14 JP JP2014521419A patent/JP6628966B2/ja active Active
- 2013-06-14 EP EP23195290.4A patent/EP4310191A2/en active Pending
-
2017
- 2017-10-30 JP JP2017209084A patent/JP6815969B2/ja active Active
-
2020
- 2020-12-23 JP JP2020213215A patent/JP7245815B2/ja active Active
-
2021
- 2021-09-24 US US17/484,003 patent/US20220242934A1/en active Pending
Patent Citations (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0125023A1 (en) | 1983-04-08 | 1984-11-14 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobulin preparations, methods for their preparation, DNA sequences, expression vectors and recombinant host cells therefor |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
EP0239400A2 (en) | 1986-03-27 | 1987-09-30 | Medical Research Council | Recombinant antibodies and methods for their production |
WO1992001047A1 (en) | 1990-07-10 | 1992-01-23 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
WO1992020791A1 (en) | 1990-07-10 | 1992-11-26 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
WO1992003918A1 (en) | 1990-08-29 | 1992-03-19 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
WO1993006213A1 (en) | 1991-09-23 | 1993-04-01 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
WO1993011236A1 (en) | 1991-12-02 | 1993-06-10 | Medical Research Council | Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage |
WO1993012227A1 (en) | 1991-12-17 | 1993-06-24 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
WO1993019172A1 (en) | 1992-03-24 | 1993-09-30 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
WO1994002602A1 (en) | 1992-07-24 | 1994-02-03 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
WO1994025585A1 (en) | 1993-04-26 | 1994-11-10 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
WO1995001438A1 (en) | 1993-06-30 | 1995-01-12 | Medical Research Council | Sbp members with a chemical moiety covalently bound within the binding site; production and selection thereof |
WO1995001937A1 (fr) | 1993-07-09 | 1995-01-19 | Association Gradient | Procede de traitement de residus de combustion et installation de mise en ×uvre dudit procede |
WO1995015388A1 (en) | 1993-12-03 | 1995-06-08 | Medical Research Council | Recombinant binding proteins and peptides |
WO1995033844A1 (de) | 1994-06-03 | 1995-12-14 | GSF - Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Verfahren zur herstellung von heterologen bispezifischen antikörpern |
WO1996002576A1 (fr) | 1994-07-13 | 1996-02-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine |
WO1996027011A1 (en) | 1995-03-01 | 1996-09-06 | Genentech, Inc. | A method for making heteromultimeric polypeptides |
WO1996033735A1 (en) | 1995-04-27 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
WO1996034096A1 (en) | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
WO1998050431A2 (en) | 1997-05-02 | 1998-11-12 | Genentech, Inc. | A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
WO2000042072A2 (en) | 1999-01-15 | 2000-07-20 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
WO2002020565A2 (en) | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Universität Zürich | Collections of repeat proteins comprising repeat modules |
WO2002032925A2 (en) | 2000-10-16 | 2002-04-25 | Phylos, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
WO2005037989A2 (en) | 2001-01-17 | 2005-04-28 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
WO2003002609A2 (en) | 2001-06-28 | 2003-01-09 | Domantis Limited | Dual-specific ligand and its use |
WO2004044011A2 (en) | 2002-11-06 | 2004-05-27 | Avidia Research Institute | Combinatorial libraries of monomer domains |
WO2004058821A2 (en) | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand |
WO2005040229A2 (en) | 2003-10-24 | 2005-05-06 | Avidia, Inc. | Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers |
WO2006019447A1 (en) | 2004-07-15 | 2006-02-23 | Xencor, Inc. | Optimized fc variants |
WO2006036834A2 (en) | 2004-09-24 | 2006-04-06 | Amgen Inc. | MODIFIED Fc MOLECULES |
WO2006053301A2 (en) | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to fcrn |
WO2006067913A1 (ja) | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 |
WO2006106905A1 (ja) | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
WO2007114325A1 (ja) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法 |
WO2009041613A1 (ja) | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 抗体定常領域改変体 |
WO2009041062A1 (ja) | 2007-09-28 | 2009-04-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 血漿中動態が改善されたグリピカン3抗体 |
WO2009086320A1 (en) | 2007-12-26 | 2009-07-09 | Xencor, Inc | Fc variants with altered binding to fcrn |
WO2009125825A1 (ja) | 2008-04-11 | 2009-10-15 | 中外製薬株式会社 | 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子 |
WO2011028952A1 (en) | 2009-09-02 | 2011-03-10 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
WO2011078332A1 (ja) | 2009-12-25 | 2011-06-30 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法 |
Non-Patent Citations (88)
Title |
---|
"Sequences of proteins of immunological interest", NIH PUBLICATION NO. 91-3242 |
ACTA CRYST., vol. D62, 2006, pages 72 - 82 |
ACTA CRYST., vol. D66, 2010, pages 125 - 132 |
ACTA CRYST., vol. D66, 2010, pages 486 - 501 |
ACTA CRYST., vol. D67, 2011, pages 355 - 367 |
ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, vol. 58, 2006, pages 1622 - 1654 |
ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, vol. 58, 2006, pages 640 - 656 |
ANN. REV. IMMUNOL., vol. 6, 1988, pages 251 - 81 |
ARTHRITIS. RHEUM., vol. 46, 2002, pages 1242 - 1254 |
BETTER ET AL., SCIENCE, vol. 240, 1988, pages 1041 - 1043 |
BIODRUGS., vol. 20, no. 3, 2006, pages 151 - 60 |
BIOTECHNOL BIOENG., vol. 75, no. 2, 20 October 2001 (2001-10-20), pages 197 - 203 |
BIOTECHNOL BIOENG., vol. 91, no. 6, 20 September 2005 (2005-09-20), pages 670 - 7 |
CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER., vol. 56, no. 9, September 2007 (2007-09-01), pages 1397 - 406 |
CANCER TREAT REV., vol. 36, no. 6, October 2010 (2010-10-01), pages 458 - 67 |
CANCER TREAT REV., vol. 6, no. 6, 3 October 2010 (2010-10-03), pages 458 - 67 |
CHEM. IMMUNOL., vol. 65, 1997, pages 88 - 110 |
CHOTHIA ET AL., NATURE, vol. 342, 1989, pages 877 |
CLACKSON ET AL., NATURE, vol. 352, 1991, pages 624 - 628 |
CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, vol. 17, 2006, pages 653 - 658 |
CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, vol. 18, 2007, pages 1 - 10 |
CURRENT OPINION IN STRUCTURAL BIOLOGY, vol. 7, 1997, pages 463 - 469 |
CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, May 2001 (2001-05-01) |
ENDOCR RELAT CANCER, vol. 13, 2006, pages 45 - 51 |
EUR J PHARM BIOPHARM., vol. 59, no. 3, 2005, pages 389 - 396 |
EUR. J. IMMUNOL., vol. 23, 1993, pages 1098 - 1104 |
FASEB J., vol. 6, 1992, pages 2422 - 2427 |
FERRARA ET AL., BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 93, no. 5, 2006, pages 851 - 861 |
FUTURE ONCOL., vol. 8, no. 1, January 2012 (2012-01-01), pages 73 - 85 |
GLYCOBIOL., vol. 17, no. 1, 2006, pages 104 - 118 |
HASHIMOTO-GOTOH, T; MIZUNO, T; OGASAHARA, Y; NAKAGAWA, M.: "An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis", GENE, vol. 152, 1995, pages 271 - 275, XP004042690, DOI: doi:10.1016/0378-1119(94)00750-M |
IMMUNOL. LETT., vol. 82, 2002, pages 57 - 65 |
IMMUNOL., vol. 86, 1995, pages 319 - 324 |
IMMUNOLOGY LETTERS, vol. 143, 2012, pages 60 - 69 |
INT IMMUNOL., vol. 18, no. 12, December 2006 (2006-12-01), pages 1759 - 69 |
J BIOL CHEM., vol. 281, no. 33, 18 August 2006 (2006-08-18), pages 23514 - 24 |
J IMMUNOL., vol. 176, no. 1, 1 January 2006 (2006-01-01), pages 346 - 56 |
J. APPL. CRYST., vol. 40, 2007, pages 658 - 674 |
J. APPL. CRYST., vol. 43, 2010, pages 186 - 190 |
J. BIO. CHEM., vol. 276, 2001, pages 16469 - 16477 |
J. BIOL. CHEM., vol. 276, 2011, pages 16469 - 16477 |
J. BIOL. CHEM., vol. 278, 2003, pages 3466 - 3473 |
J. BIOTECH, vol. 155, 2011, pages 193 - 202 |
J. CLIN. INVEST, vol. 100, no. 5, 1997, pages 1059 - 1070 |
J. CLIN. INVEST., vol. 100, no. 5, 1997, pages 1059 - 1070 |
J. CLIN. INVEST., vol. 84, 1989, pages 1688 - 1691 |
J. CLIN. INVEST., vol. 85, 1990, pages 1287 - 1295 |
J. EXP. MED, vol. 172, 1990, pages 19 - 25 |
J. EXP. MED., vol. 172, 1990, pages 19 - 25 |
J. IMMUNOL., vol. 163, no. 3, 1 August 1999 (1999-08-01), pages 1246 - 52 |
JBC, vol. 276, 2001, pages 16469 - 16477 |
JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCE, vol. 4, 2010, pages 1707 - 1720 |
KABAT ET AL.: "Sequence of Proteins of Immunological Interest", 1987, NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH |
KOHLER; MILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1975, pages 495 |
KRAMER W; FRITZ HJ: "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods", ENZYMOL., vol. 154, 1987, pages 350 - 367 |
KRAMER, W; DRUTSA, V; JANSEN, HW; KRAMER, B; PFLUGFELDER, M; FRITZ, HJ: "The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 12, 1984, pages 9441 - 9456, XP002026371 |
KUNKEL, TA: "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection", PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 82, 1985, pages 488 - 492, XP002052322, DOI: doi:10.1073/pnas.82.2.488 |
LEI, S. P. ET AL., J. BACTERIOL., vol. 169, 1987, pages 4397 |
MABS, vol. 2, no. 5, September 2010 (2010-09-01), pages 519 - 27 |
MABS, vol. 3, 2011, pages 243 - 247 |
MABS., vol. 4, no. 2, 1 March 2012 (2012-03-01) |
MARKS ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 222, 1991, pages 581 - 597 |
MERCHANT AM ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 16, 1998, pages 677 - 681 |
MOL IMMUNOL., vol. 45, no. 7, April 2008 (2008-04-01), pages 1872 - 82 |
MOLECULAR IMMUNOL., vol. 45, 2008, pages 1872 - 1882 |
N. BIOTECHNOL., vol. 28, no. 5, 2011, pages 253 - 457 |
NAT BIOTECHNOL., vol. 28, no. 2, February 2010 (2010-02-01), pages 157 - 9 |
NAT MED., vol. 9, no. 1, January 2003 (2003-01-01), pages 47 - 52 |
NAT. BIOTECH., vol. 28, 2011, pages 502 - 10 |
NAT. BIOTECHNOL., vol. 23, 2005, pages 1073 - 1078 |
NAT. REV. IMMUNOL., vol. 8, 2008, pages 34 - 47 |
NAT. REV., vol. 10, 2010, pages 301 - 316 |
NATURE, vol. 372, 1994, pages 379 - 383 |
NATURE, vol. 400, 2000, pages 267 - 273 |
NUCLEIC ACIDS. RES., vol. 18, no. 17, 1990, pages 5322 |
PEDS, vol. 23, no. 4, 2010, pages 289 - 297 |
PROC. NATL. ACAD. SCI. U. S. A., vol. 103, 2006, pages 4005 - 4010 |
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 103, no. 11, 2006, pages 4005 - 4010 |
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 108, 2011, pages 12669 - 126674 |
PROTEIN ENG., vol. 9, 1996, pages 617 - 621 |
PROTEIN ENGINEERING DESIGN & SELECTION, vol. 23, 2010, pages 195 - 202 |
PROTEIN SCIENCE, vol. 15, 2006, pages 14 - 27 |
PROTEIN SCIENCE, vol. 4, 1995, pages 2411 - 2423 |
RIDGWAY JB ET AL., PROTEIN ENGINEERING, vol. 9, 1996, pages 617 - 621 |
ROLAND E. KONTERMANN: "Dual targeting strategies with bispecific antibodies", MABS, vol. 4, no. 2, March 2012 (2012-03-01), pages 182 - 197, XP009160769 * |
THROMB HAEMOST., vol. 80, no. 5, November 1998 (1998-11-01), pages 726 - 34 |
WARD ET AL., NATURE, vol. 341, 1989, pages 544 - 546 |
ZOLLER, MJ; SMITH, M.: "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors", METHODS ENZYMOL., vol. 100, 1983, pages 468 - 500, XP001088749, DOI: doi:10.1016/0076-6879(83)00074-9 |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9890218B2 (en) | 2011-06-30 | 2018-02-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Heterodimerized polypeptide |
US11142563B2 (en) | 2012-06-14 | 2021-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule containing modified Fc region |
US10766960B2 (en) | 2012-12-27 | 2020-09-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Heterodimerized polypeptide |
WO2015068847A1 (ja) * | 2013-11-11 | 2015-05-14 | 中外製薬株式会社 | 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子 |
US11739149B2 (en) | 2013-11-11 | 2023-08-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule containing modified antibody variable region |
US11154615B2 (en) | 2014-11-11 | 2021-10-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region |
US11952422B2 (en) | 2017-12-05 | 2024-04-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137 |
JPWO2020027224A1 (ja) * | 2018-07-31 | 2021-08-02 | 国立大学法人 東京大学 | 新たな結合特異性を抗体に付与する超汎用法 |
JP7303527B2 (ja) | 2018-07-31 | 2023-07-05 | 国立大学法人 東京大学 | 新たな結合特異性を抗体に付与する超汎用法 |
US11274151B2 (en) | 2020-03-31 | 2022-03-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | CD3-targeting and DLL3-targeting multispecific antigen-binding molecules and uses thereof |
US11718672B2 (en) | 2020-03-31 | 2023-08-08 | Chugai Seiyaki Kabushiki Kaisha | CD137- and DLL3-targeting multispecific antigen-binding molecules |
WO2022270612A1 (ja) * | 2021-06-25 | 2022-12-29 | 中外製薬株式会社 | 抗ctla-4抗体の使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7245815B2 (ja) | 2023-03-24 |
US20150166636A1 (en) | 2015-06-18 |
JP2018076304A (ja) | 2018-05-17 |
EP2862875A1 (en) | 2015-04-22 |
JP6628966B2 (ja) | 2020-01-15 |
JPWO2013187495A1 (ja) | 2016-02-08 |
EP2862875B1 (en) | 2023-09-06 |
EP2862875C0 (en) | 2023-09-06 |
US20220242934A1 (en) | 2022-08-04 |
US11142563B2 (en) | 2021-10-12 |
JP2021059572A (ja) | 2021-04-15 |
EP4310191A2 (en) | 2024-01-24 |
EP2862875A4 (en) | 2016-01-13 |
JP6815969B2 (ja) | 2021-01-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7245815B2 (ja) | 改変されたFc領域を含む抗原結合分子 | |
JP6719507B2 (ja) | ヘテロ二量化ポリペプチド | |
JP6634066B2 (ja) | ヘテロ二量化ポリペプチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 13803763 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2014521419 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 14406232 Country of ref document: US |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2013803763 Country of ref document: EP |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |