BR112013032630B1 - Polipeptídeo heterodimerizado compreendendo região fc de igg - Google Patents

Abstract

polipeptídeo heterodimerizado, composição farmacêutica compreendendo o mesmo, e método de produção de polipeptídeo compreendendo região fc. os presentes inventores produziram um polipeptídeo heterodimerizado tendo uma região fc formada a partir d e dois polipeptídeos com diferentes sequências de aminoácidos (um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo), e conseguiram produzir um polipeptídeo heterodimerizado contendo uma região fc com a melhora da função de região fc comparada com a de um homodímero em que a região fc é composta de apenas o primeiro polipeptídeo ou apenas o segundo polipeptídeo por tecnologia convencional.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção fornece regiões constantes de anticor pos cuja sequência de aminoácidos é alterada a partir de uma região constante de anticorpo de ocorrência natural, os anticorpos que compreendem tais regiões constantes, as composições farmacêuticas que compreendem tais anticorpos, e métodos para produzi-las.

Técnica de Fundamentos

[002] Anticorpos estão chamando a atenção como medicamen tos, uma vez que são altamente estáveis no sangue e têm poucos efeitos colaterais (Documentos sem patente 1 e 2). Quase todos os produtos farmacêuticos de anticorpos existentes no mercado são os anticorpos da subclasse IgG1 humana. Até agora, muitos estudos foram realizados sobre citotoxicidade celular dependente de anticorpo (doravante, referido como ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (daqui em diante, referido como CDC) que são as funções efetoras dos anticorpos da classe IgG, e classe IgG humana, anticorpos da subclasse IgG1 foram relatados como tendo a mais elevada atividade de ADCC e atividade CDC (Documento sem Patente 3). Além disso, a fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP), que é a fagocitose de células alvo mediada por anticorpos da classe IgG, também é mostrada como uma das funções efetoras do anticorpo (Documentos sem patente 4 e 5).

[003] Para um anticorpo IgG exibir ADCC, CDC, ou ADCP, a re gião Fc de anticorpo deve ligar-se a um receptor de anticorpo que está presente na superfície das células efetoras, tais como as células assassinas, as células assassinas naturais, e macrófagos ativados (daqui em diante designados por FCYR) e os vários componentes do com- plemento. Nos seres humanos, as isoformas FcYRIa, FCYRIIA, FcYRIIb, FcYRIIIa e FcYRIIIb foram relatadas como a família de proteínas FCYR, e os respectivos alótipos também foram relatados (Documento sem patente 6).

[004] Melhora das funções efetoras citotóxicas, tais como ADCC, ADCP, e CDC chamam a atenção como um meio promissor para aumentar os efeitos antitumorais de anticorpos. A importância das funções efetoras mediadas por FCYR de anticorpos para os seus efeitos antitumorais tem sido relatada por meio de modelos de camundongo (Documentos sem patente 7 e 8). Além disso, foi observada correlação entre os efeitos clínicos em seres humanos e de alótipo polimórficos alta afinidade (V158) e o alótipo polimórfico de baixa afinidade (F158) do FcyRIIIa (Documento sem patente 9). Estes relatórios mostraram que os anticorpos que têm uma região Fc que foi otimizada para ligação de FcyR específico mediam uma função efetora mais forte, como resultado demonstram efeitos antitumorais mais eficazes.

[005] O equilíbrio entre as atividades de ligação de um anticorpo a um receptor de ativação consistido em FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIIa e FcyRIIIb, e um receptor inibitório consistido em FcyRIIb é um elemento importante na otimização da função efetora de anticorpos. Utilização de uma região Fc que aumenta a atividade de ligação de receptores de ativação e diminui a atividade de ligação a receptores inibitórios pode ser capaz de conferir anticorpos com funções efetoras ideais (Documento sem Patente 10). Por outro lado, a utilização de uma região Fc que tenha sofrido ou diminuído a atividade de ligação de receptores de ativação e aumento da atividade de ligação a receptores inibitórios pode ser capaz de conferir um efeito imunossupressor de anticorpos (Documento sem Patente 11). Para a ligação entre uma região Fc e FcyR, vários resíduos de aminoácidos na região de dobradiça do anticorpo e o domínio CH2, e a cadeia de açúcar adicionada a Asn na posição 297 (numeração EU) que é ligada ao domínio CH2 demonstraram ser importantes para a ligação entre a região Fc e FCYR (Documentos sem patente 12, 13, e 14). Houve uma pesquisa sobre variantes de região Fc que possuem várias propriedades de ligação FcyR principalmente neste sítio de ligação, e as variantes de região Fc que têm atividades de ligação superiores a FcyR de ativação foram obtidas (Documentos de Patente 1 e 2). Por exemplo, Lazar et al. aumentou com êxito ligação de FcyRIIIa humana (V158) de aproximadamente 370 vezes por substituição de Ser na posição 239, Ala na posição 330, e Ile na posição 332 (numeração EU) de IgG1 humana por Asp, Leu, Glu e, respectivamente (Documento sem patente 15 e Documento de patente 2). A proporção de ligação de FcyRIIIa a ligação de FcyIIb (razão A/I) desta variante é aumentada de cerca de 9 vezes mais quando comparada com a do tipo selvagem. Além disso, Lazar et al. melhorou de forma bem sucedida a ligação a FcyIIb aproximadamente 430 vezes (Documento sem patente 16). Shinkawa et al. teve sucesso no aumento da ligação RcyIIIa cerca de 100 vezes removendo fucose da cadeia de açúcar adicionada a Asn na posição 297 (numeração EU) (Documento sem patente 17).

[006] No entanto, as alterações funcionais de regiões Fc de anti corpos relatados até agora têm limitações, e não existe uma demanda por melhores modificações funcionais de regiões Fc.

Documentos da Técnica Anterior

[007] [Documentos de patentes] [Documento de Patente 1] WO 2000/ 042072 [Documento de Patente 2] WO 2006/ 019447 [Documento de patente 3] WO 2009/ 041062 [Documento de patente 4] WO 2006/106905

[008] [Documentos sem Patente]

[009] [Documento sem Patente 1] Nature Biotechnology, 23, 1073-1078 (2005)

[0010] [Documento sem Patente 2] Eur. J. Pharm. Biopharm, 59(3), 389-96 (2005)

[0011] [Documento sem Patente 3] Chemical Immunology, 65, 88 (1997)

[0012] [Documento sem Patente 4] Cancer Res., 68, 8049-8057 (2008)

[0013] [Documento sem Patente 5] Blood, 113, 3735-3743 (2009)

[0014] [Documento sem Patente 6] Immunol. Lett. 82, 57-65 (2002)

[0015] [Documento sem Patente 7] Pro. Nat. Acad. Sci. 95: 652 656 (1998)

[0016] [Documento sem Patente 8] Nature Medicine, 6: 443-446 (2000)

[0017] [Documento sem Patente 9] Blood 99:754-758 (2002)

[0018] [Documento sem Patente 10] Science, 310, 1510-1512 (2005)

[0019] [Documento sem Patente 11] Science, 291, 484-486 (2001)

[0020] [Documento sem Patente 12] Chemical Immunology, 65, 88 (1997)

[0021] [Documento sem Patente 13] Eur. J. Immunol. 23, 1098 (1993)

[0022] [Documento sem Patente 14] Immunology, 86, 319 (1995)

[0023] [Documento sem Patente 15] Pro. Nat. Acad. Sci., 103, 4005-4010 (2006)

[0024] [Documento sem Patente 16] Mol. Immun. 45, 3926-3933 (2008)

[0025] [Documento sem Patente 17] J. Biol. Chem., 278, 3466 3473 (2003)

Sumário da Invenção Problema a ser Resolvido pela Invenção

[0026] A presente invenção foi conseguida tendo em vista as cir cunstâncias anteriores. Um objetivo da presente invenção é proporcionar polipeptídeos com a melhora da função da região Fc sobre poli- peptídeos homodimerizados convencionais tendo uma região Fc; composições farmacêuticas compreendendo os polipeptídeos; agentes terapêuticos ou agentes de prevenção de doenças imunoinflamatórias compreendendo as composições farmacêuticas, agentes terapêuticos ou agentes de prevenção de vários tipos de cânceres, e os métodos para produzi-los. Além disso, um objetivo da presente invenção é proporcionar métodos para melhorar a função da região Fc sobre polipep- tídeos homodimerizados convencionais que têm uma região Fc.

Meios para Resolver os Problemas

[0027] Os presentes inventores realizaram pesquisa dedicada a resolver os problemas acima mencionados. Como resultado, os presentes inventores produziram polipeptídeos heterodimerizados tendo uma região Fc que consiste em dois polipeptídeos com diferentes sequências de aminoácidos (um primeiro polipeptídeo e um segundo po- lipeptídeo), e, assim, produziram com êxito um polipeptídeo heterodi- merizado compreendendo uma região Fc com a melhora da função da região Fc sobre homodímeros convencionais nos quais a região Fc é composta de apenas o primeiro polipeptídeo ou apenas o segundo po- lipeptídeo.

[0028] Mais especificamente, a presente invenção proporciona [1] a [78] a seguir: [1] um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, em que o polipeptídeo é caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um heterodímero compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, e em que o polipeptídeo é caracterizado pelo fato de que uma função da região Fc é alterada comparada com a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homodímero que compreende apenas o primeiro polipeptídeo e comparada com a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homodímero que compreende apenas o segundo polipeptídeo; [2] o polipeptídeo de [1], em que pelo menos uma ou mais mutação de aminoácido é introduzida na região Fc; [3] o polipeptídeo de [1] ou [2], em que a mutação do ami- noácido inclui pelo menos uma mutação de aminoácidos que melhora a função da região Fc, quando a mutação é introduzida em apenas uma das regiões Fc comparada a quando a mutação é introduzida nas regiões Fc em ambos o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo e em que a mutação não é introduzida; [4] o polipeptídeo de [2] ou [3], em que pelo menos uma ou mais mutação de aminoácido é introduzida em um domínio CH2 da região Fc; [5] o polipeptídeo de [4], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas em um sítio de aminoáci- dos selecionado a partir do grupo que consiste em

[0029] Ala na posição 231 (numeração EU);

[0030] Pro na posição 232 (numeração EU);

[0031] Glu na posição 233 (numeração EU);

[0032] Leu na posição 234 (numeração EU);

[0033] Leu na posição 235 (numeração EU);

[0034] Gly na posição 236 (numeração EU);

[0035] Gly na posição 237 (numeração EU);

[0036] Pro na posição 238 (numeração EU);

[0037] Ser na posição 239 (numeração EU);

[0038] Val na posição 240 (numeração EU);

[0039] Asp na posição 265 (numeração EU);

[0040] Val na posição 266 (numeração EU);

[0041] Ser na posição 267 (numeração EU);

[0042] His na posição 268 (numeração EU);

[0043] Glu na posição 269 (numeração EU);

[0044] Asp na posição 270 (numeração EU);

[0045] Pro na posição 271 (numeração EU);

[0046] Gln na posição 295 (numeração EU);

[0047] Tyr na posição 296 (numeração EU);

[0048] Ser na posição 298 (numeração EU);

[0049] Tyr na posição 300 (numeração EU);

[0050] Ser na posição 324 (numeração EU);

[0051] Asn na posição 325 (numeração EU);

[0052] Lys na posição 326 (numeração EU);

[0053] Ala na posição 327 (numeração EU);

[0054] Leu na posição 328 (numeração EU);

[0055] Pro na posição 329 (numeração EU);

[0056] Ala na posição 330 (numeração EU);

[0057] Pro na posição 331 (numeração EU);

[0058] Ile na posição 332 (numeração EU);

[0059] Glu na posição 333 (numeração EU);

[0060] Lys na posição 334 (numeração EU);

[0061] Thr na posição 335 (numeração EU);

[0062] Ile na posição 336 (numeração EU) e

[0063] Ser na posição 337 (numeração EU) no domínio CH2 da região Fc; [6] o polipeptídeo de qualquer uma das [1] a [5], em que a alteração da função da região Fc é, pelo menos, uma ou mais alterações selecionadas a partir do grupo consistindo em melhora da atividade de ligação e melhora a seletividade de ligação a uma receptor FCY; [7] o polipeptídeo de [6], em que a alteração da função da região Fc é o aumento da atividade de ligação a um receptor de FCY; [8] o polipeptídeo de [7], em que o receptor de FCY é, pelo menos, um ou mais receptores selecionados a partir do grupo que consiste em FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIa H, FcyRIIb e FcyRIIIa; [9] o polipeptídeo de [8], em que o receptor de Fcy é FcyRIa; [10] o polipeptídeo de [9], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região i das Tabelas 2-1 e 2-2 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoáci- do do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [11] o polipeptídeo de [9], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região ii das Tabelas 2-1, 2-2, e 2-3 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [12] o polipeptídeo de [8], em que o receptor de Fcy é FcyRIIa R; [13] o polipeptídeo de [12], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região i das Tabelas 3-1 e 3-2 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoácido do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [14] o polipeptídeo de [12], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região ii das Tabelas 3-1 e 3-2 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoácido do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [15] o polipeptídeo de [8], em que o receptor de FCY é FcYRIIa H; [16] o polipeptídeo de [15], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região i da Tabela 4 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoáci- dos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [17] o polipeptídeo de [15], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região ii da Tabela 4 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoá- cidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [18] o polipeptídeo de [8], em que o receptor de FCY é FcYRIIb; [19] o polipeptídeo de [18], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região i da Tabela 5 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoáci- dos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [20] o polipeptídeo de [18], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região ii da Tabela 5 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoá- cidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [21] o polipeptídeo de [8], em que o receptor de FCY é FcYRIIIa; [22] o polipeptídeo de [21], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região i da Tabela 6 da presente especificação são introduzidas nas sequências de ami- noácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [23] o polipeptídeo de [21], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região ii da Tabela 6 da presente especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [24] o polipeptídeo de [6], em que a alteração da função da região Fc é a melhora da seletividade da atividade de ligação a um receptor de FCY; [25] o polipeptídeo de [24], em que a melhora da seletividade da atividade de ligação a um receptor de Fcy refere-se a seletividade entre um receptor de Fcy ativo e um receptor de Fcy inibidor; [26] o polipeptídeo de [25], em que entre os receptores de Fcy, o receptor de Fcy de ativação é, pelo menos, um ou mais receptores selecionados a partir do grupo que consiste em FcyRIa, FcyRIIa R, FcyRIIa H, e FcyRIIIa, e o receptor de Fcy inibidor é FcyRIIb; [27] o polipeptídeo de [26], em que o Receptor de Fcy de ativação é FcyRIa, e o receptor de Fcy inibidor é FcyRIIb, o qual é caracterizado pelo fato da atividade de ligação de FcyRIa ser seletivamente aumentada em comparação com o Atividade de ligação FcyRIIb; [28] o polipeptídeo de [27], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região b das Tabelas 19-1, 19-2, 19-3 e 19-4 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [29] o polipeptídeo de [27], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região b de Tabelas 19-1, 19-2, 19-3, 19-4, e 19-5 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [30] o polipeptídeo de [26], em que a ativação do receptor de FCY é FcYRIa, e o receptor de FCY inibidor é FcYRIIb, que é caracterizado pelo fato de que a atividade de ligação a FcYRIa é diminuída seletivamente em comparação com a atividade de ligação FcyRIIb; [31] o polipeptídeo de [30], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região c da Tabelas 23-1 e 23-2 da presente especificação são introduzidas nas sequências de aminoácido do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo po- lipeptídeo que constitui a região Fc; [32] o polipeptídeo de [30], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na região d de Tabelas 23-1 e 23-2 da presente especificação são introduzidas nas sequências de aminoácido do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo po- lipeptídeo que constitui a região Fc; [33] o polipeptídeo de [26], em que o Receptor de Fcy de ativação é FcyRIIa R, e do receptor de Fcy inibidor é FcyRIIb, que é caracterizado pelo fato de que a atividade de ligação a FcyRIIa R é seletivamente aumentada em comparação à atividade de ligação FcYRIIb ; [34] o polipeptídeo de [33], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região a da Tabela 20-1 desta especificação são introduzidas nas sequências de ami- noácidos do presente primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptí- deo que constitui a região Fc; [35] o polipeptídeo de [33], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região b de Tabelas 20-1, 20-2, e 20-3 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [36] o polipeptídeo de [26], em que o Receptor de FCY de ativação é FcYRIIa R, e do receptor de FCY inibidor é FcYRIIb, que é caracterizado pelo fato de que a atividade de ligação de de FcyRIIa R é diminuída seletivamente em comparação à atividade de ligação FcyRIIb ; [37] o polipeptídeo de [36], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região c da Tabela 24-1 desta especificação são introduzidas nas sequências de ami- noácidos do presente primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptí- deo que constitui a região Fc; [38] o polipeptídeo de [36], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na região d de Tabelas 24-1 e 24-2 da presente especificação são introduzidas nas sequências de aminoácido do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo po- lipeptídeo que constitui a região Fc; [39] o polipeptídeo de [26], em que o Receptor de FCY de ativação é FcYRIIa H, e o receptor de FCY inibidor é FcYRIIb, que é caracterizado pelo fato de que a atividade de ligação FcyRIIa H é seletivamente aumentada em comparação à atividade de ligação FcyRIIb ; [40] o polipeptídeo de [39], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região a da Tabela 21-1 desta especificação são introduzidas nas sequências de ami- noácidos do presente primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptí- deo que constitui a região Fc; [41] o polipeptídeo de [39], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região b de Tabelas 21-1, 21-2, e 21-3 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [42] o polipeptídeo de [26], em que o Receptor de Fcy de ativação é FcyRIIa H, e o receptor de Fcy inibidor é FcyRIIb, que é caracterizado pelo fato de que a atividade de ligação FcyRIIa H é diminuída seletivamente em comparação à atividade de ligação FcyRIIb ; [43] o polipeptídeo de [42], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região c da Tabelas 25-1 e 25-2 da presente especificação são introduzidas nas sequências de aminoácido do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo po- lipeptídeo que constitui a região Fc; [44] o polipeptídeo de [42], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região d de Tabe- las 25-1, 25-2, e 25-3 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [45] o polipeptídeo de [26], em que o receptor de FCY de ativação é FcYRIIIa, e o receptor de FCY inibidor é FcYRIIb, que é caracterizado pelo fato de que a atividade de ligação FcyRIIIa é seletivamente aumentada em comparação com a atividade de ligação FcyRIIb; [46] o polipeptídeo de [45], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região a da Tabela 22-1 desta especificação são introduzidas nas sequências de ami- noácidos do presente primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptí- deo que constitui a região Fc; [47] o polipeptídeo de [45], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região b de Tabelas 22-1, 22-2, e 22-3 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [48] o polipeptídeo de [26], em que o receptor de Fcy de ativação é FcyRIIIa, e o receptor de Fcy inibidor é FcyRIIb, que é caracterizado pelo fato de que a atividade de ligação de FcyRIIIa é diminuída seletivamente em comparação com a atividade de ligação FcyRIIb; [49] o polipeptídeo de [48], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região c da Tabelas 26-1 e 26-2 da presente especificação são introduzidas nas sequências de aminoácido do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo po- lipeptídeo que constitui a região Fc; [50] o polipeptídeo de [48], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região d de Tabelas 26-1, 26-2, 26-3 e 26-4 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [51] o polipeptídeo de [1], [21] ou [45], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em

[0064] substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[0065] substituição EU) com Y ou Q; de aminoácido L na posição 235 (numeração

[0066] substituição EU) com W; de aminoácido G na posição 236 (numeração

[0067] substituição EU) com M; de aminoácido S na posição 239 (numeração

[0068] substituição EU) com D; de aminoácido na posição 268 H (numeração

[0069] substituição EU) com E; de aminoácido D na posição 270 (numeração

[0070] substituição EU) com A; de aminoácido S na posição 298 (numeração

[0071] substituição EU) com D; de aminoácido K na posição 326 (numeração

[0072] substituição EU) com D; de aminoácido A na posição 327 (numeração

[0073] substituição EU) com W; de aminoácido L na posição 328 (numeração

[0074] substituição de aminoácido A na posição 330 (numeração EU) com M ou K; e

[0075] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com E ou G é introduzida nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [52] o polipeptídeo de [1], [21] ou [45], em que a mutação é introduzida em pelo menos um aminoácido selecionado de Leu na posição 234, Leu na posição 235, Gly na posição 236, Ser na posição 239, His na posição 268, na posição 270 Asp, Ser na posição 298, Lys na posição 326 de Ala na posição 327, Leu na posição 328 de Ala na posição 330 e Lys na posição 334 (numeração EU) nas sequências de aminoácido do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [53] o polipeptídeo de [1], [21] ou [45], em que a mutação é introduzida em pelo menos um aminoácido selecionado de Leu na posição 234, Leu na posição 235, Gly na posição 236, Ser na posição 239, His na posição 268, na posição 270 Asp, Ser na posição 298, Ala na posição 327, Leu na posição 328 e Lys na posição 334 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do polipeptídeo ou do primeiro poli- peptídeo e o segundo polipeptídeo que constitui a região Fc, e uma mutação é introduzida em pelo menos um aminoácido selecionado a partir de Asp na posição 270, Lys na posição 326 de Ala na posição 330 e Lys na posição 334 (numeração EU) na sequência de aminoáci- dos do outro polipeptídeo; [54] o polipeptídeo de [1], [21] ou [45], em que pelo menos uma mutação de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em

[0076] substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[0077] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y ou Q;

[0078] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[0079] substituição de aminoácido S na posição 239 (numeração EU) com M;

[0080] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[0081] substituição de aminoácido D na posição 270 (numeração EU) com E;

[0082] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A;

[0083] substituição de aminoácido A na posição 327 (numeração EU) com D;

[0084] substituição de aminoácido L na posição 328 (numeração EU) com W; e

[0085] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com L

[0086] Introduz-se a sequência de aminoácidos do polipeptídeo ou do primeiro polipeptídeo e segundo polipeptídeo que constitui a região Fc, e pelo menos uma mutação de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em

[0087] substituição de aminoácido D na posição 270 (numeração EU) com E;

[0088] substituição de aminoácido K na posição 326 (numeração EU) com D;

[0089] substituição de aminoácido A na posição 330 (numeração EU) com M ou K; e

[0090] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com E

[0091] é introduzido na sequência de aminoácidos de outro poli- peptídeo; [55] o polipeptídeo de [1], [21] ou [45], em que qualquer um conjunto de mutações de (i) a (vi) é introduzido na sequência de ami- noácidos do polipeptídeo ou do primeiro polipeptídeo e o segundo po- lipeptídeo que constitui a região Fc, e qualquer um conjunto de mutações de (vii) a (ix) é introduzido na sequência de aminoácidos do outro polipeptídeo: (i) substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[0092] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y;

[0093] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[0094] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D, e

[0095] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A; (ii) substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[0096] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y;

[0097] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[0098] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[0099] substituição de aminoácido D na posição 270 (numeração EU) com E, e

[00100] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A; (iii) a substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[00101] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Q;

[00102] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[00103] substituição de aminoácido S na posição 239 (numeração EU) com M;

[00104] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[00105] substituição de aminoácido D na posição 270 (numeração EU) com E, e

[00106] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A; (iv) substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[00107] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y;

[00108] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[00109] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[00110] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A, e

[00111] substituição de aminoácido A na posição 327 (numeração EU) com D; (v) substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[00112] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y;

[00113] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[00114] substituição de aminoácido S na posição 239 (numeração EU) com M;

[00115] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[00116] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A, e

[00117] substituição de aminoácido A na posição 327 (numeração EU) com D; (vi) a substituição de aminoácido L na posição 234 (nume- ração EU) com Y;

[00118] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y;

[00119] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[00120] substituição de aminoácido S na posição 239 (numeração EU) com M;

[00121] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[00122] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A;

[00123] substituição de aminoácido A na posição 327 (numeração EU) com D;

[00124] substituição de aminoácido L na posição 328 (numeração EU) com W; e

[00125] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com L; (vii) substituição de aminoácido K na posição 326 (numeração EU) com D;

[00126] substituição de aminoácido A na posição 330 (numeração EU) com M; e

[00127] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com E; (viii) substituição de aminoácido D na posição 270 (nume- ração EU) com E;

[00128] substituição de aminoácido K na posição 326 (numeração EU) com D;

[00129] substituição de aminoácido A na posição 330 (numeração EU) com M; e

[00130] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com E; (ix) substituição de aminoácido D na posição 270 (numera- ção EU) com E;

[00131] substituição de aminoácido K na posição 326 (numeração EU) com D;

[00132] substituição de aminoácido A na posição 330 (numeração EU) com K; e

[00133] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com E; [56] um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, em que o polipeptídeo é caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um heterodímero compreendendo um primeiro polipeptí- deo e um segundo polipeptídeo, e em que o polipeptídeo é caracterizado pelo fato de que uma função da região Fc é alterada comparada com a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homodímero que compreende apenas o primeiro po- lipeptídeo ou em comparação com a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homodímero que compreende apenas o segundo polipeptídeo; [57] o polipeptídeo de [56], em que a alteração da função da região Fc é, pelo menos, uma ou mais alterações selecionadas a partir do grupo consistindo em melhora da atividade de ligação, redução da ligação e melhora da seletividade de ligação do polipeptídeo a um receptor FCY; [58] o polipeptídeo de [57], em que a alteração da função da região Fc é, adicionalmente, uma alteração que melhora a estabilidade físico-química; [59] o polipeptídeo de [58], em que a alteração que melhora a estabilidade físico-química significa que um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um heterodímero compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo que tem uma Tm mais elevada do que a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta por um homodímero que compreende apenas o primeiro polipeptídeo ou que um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homo- dímero que compreende apenas o segundo polipeptídeo; [60] o polipeptídeo de qualquer um de [57] a [59], em que a alteração da função da região Fc é a melhora da atividade de ligação a um receptor de Fcy, e o receptor de Fcy é, pelo menos, um ou mais receptores selecionados do grupo que consiste em FcyRIa, FcyRIIa R, FcyRIIa H, FcyRIIb e FcyRIIIa; [61] o polipeptídeo de [60], em que o receptor de Fcy é FcyRIa; [62] o polipeptídeo de [61], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas nas Tabelas 31-1, 312, e 31-3 desta especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [63] o polipeptídeo de [60], em que o receptor de FCY é FcYRIIa R; [64] o polipeptídeo de [63], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas nas Tabelas 32-1 e 32-2 da presente especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos de o primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [65] o polipeptídeo de [60], em que o receptor de Fcy é FcyRIIa H; [66] o polipeptídeo de [65], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas nas Tabelas 33-1 e 33-2 da presente especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos de o primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [67] o polipeptídeo de [60], em que o receptor de Fcy é FcyRIIb; [68] o polipeptídeo de [67], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas nas Tabelas 34-1 e 34-2 da presente especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos de o primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [69] o polipeptídeo de [60], em que o receptor de Fcy é FcyRIIIa; [70] o polipeptídeo de [69], em que pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas nas Tabelas 35-1 e 35-2 da presente especificação são introduzidas nas sequências de aminoácidos de o primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; [71] o polipeptídeo de qualquer uma das [1] a [70], em que uma alteração de aminoácidos é introduzida adicionalmente para transmitir diferença em pontos isoelétricos entre o primeiro polipeptí- deo e o segundo polipeptídeo; [72] o polipeptídeo de [71], em que a alteração de aminoá- cido para conferir diferença em pontos isoelétricos é caracterizada pela introdução de pelo menos uma mutação de aminoácidos num local de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Gly na posição 137, Gly na posição 138, Thr na posição 139, Lys na posição 147, Ser na posição 192, Leu na posição 193, Gln na posição 196, Tyr na posição 198, Ile na posição 199, Asn na posição 203, Lys na posição 214, Val na posição 263, Glu na posição 272, Lys na posição 274, Tyr na posição 278, Lys na posição 288, Lys na posição 290, Gly na posição 316, Lys na posição 317, Lys na posição 320, Lys na posição 324, Tre na posição 335, Ser na posição 337, Lys na posição 340, Leu na posição 358, Lys na posição 360, Gln na posição 362, Ser na posição 364, Ser na posição 383, Asn na posição 384, Gly na posição 385, Gln na posição 386, Pro na posição 387, Asn na posição 390, Val na posição 397, e Val na posição 422 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo; [73] o polipeptídeo de [71], em que a alteração de aminoá- cido para conferir diferença em pontos isoelétricos é caracterizada pela introdução de uma mutação de pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em Gln na posição 196, na posição 199 Ile, Val na posição 263, Glu na posição 272, Gly na posição 316, Leu na posição 358, Ser na posição 364, Ser na posição 383, Pro na posição 387, e Val na posição 397 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de qualquer polipeptídeo de o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo, e introdução de uma mutação de pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Gly na posição 137, Gly na posição 138, Thr na posição 139, Lys na posição 147, Ser. na posição 192, Leu na posição 193, Tyr na posição 198, Ile na posição 199, Asn na posição 203, Lys na posição 214, Lys na posição 274, Tyr na posição 278, Lys na posição 288, Lys na posição 290, Gly na posição 316, Lys na posição 317, Lys na posição 320, Lys na posição 324, Thr na posição 335, Ser na posição 337, Lys na posição 340, Leu na posição 358, Lys na posição 360, Gln na posição 362, Ser. na posição 383, Asn na posição 384, Gly na posição 385, Gln na posição 386, Asn na posição 390, e Val na posição 422 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do outro polipeptídeo; [74] o polipeptídeo de qualquer uma das [1] a [73], em que o polipeptídeo é uma molécula de ligação ao antígeno; [75] o polipeptídeo de [74], em que a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo, um anticorpo biespecífico, ou uma molécula de fusão de Fc tal como uma proteína de fusão de Fc de peptídeo ou proteína de fusão de Fc de scaffold; [76] uma composição farmacêutica compreendendo o poli- peptídeo de [74] ou [75] e um veículo medicamente aceitável; [77] um processo para alterar a função de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, que compreende as etapas de hete- rodimerizar a região Fc, introduzindo uma mutação de aminoácidos no primeiro polipeptídeo e/ou no segundo polipeptídeo que constitui a região Fc, e introduzindo uma mutação de aminoácidos que altera a função da região Fc comparada a quando a região Fc forma um homodí- mero e [78] um processo para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, que compreende as etapas de heterodimerizar a região Fc, introduzindo uma mutação de aminoácidos no primeiro poli- peptídeo e/ou no segundo polipeptídeo que constitui a região Fc, e in-troduzindo uma mutação de aminoácidos para alterar a função da região Fc comparada a quando a região Fc forma um homodímero. Efeitos da Invenção

[00134] A presente invenção proporciona polipeptídeos que são adequados como fármacos, em que as suas atividades de ligação e as propriedades físicas (por exemplo, a estabilidade e homogeneidade) foram melhoradas através da alteração da sequência de aminoácidos da região constante do anticorpo. Breve Descrição dos Desenhos

[00135] Figura 1 mostra a estrutura de um complexo de região Fc e FcRn. FcRn liga-se a CH2 e CH3 de cada cadeia H de anticorpo, e está ligada a todo o anticorpo de um modo simétrico.

[00136] Figura 2 mostra a estrutura de um complexo de IgA e FcαR, que é um receptor de IgA. FcαR liga-se a Cα2 e Cα3 de cada uma das cadeias H IgA, e está ligado a todo o anticorpo de um modo simétrico.

[00137] Figura 3 mostra a estrutura de um complexo de região Fc e FcyRIII. Para a cadeia H, CH2 e CH3, aqueles no lado esquerdo da figura são referidas como a cadeia de HA, CHA2, e CHA3, e aqueles no lado direito são referidas como a cadeia de HB, CHB2, e CHB3, respectivamente.

[00138] Figura 4 mostra as interações detalhadas entre A327 em cada cadeia H e FCYRIII. (A) mostra a interação entre A327 em CHA2 e FCYRIII. (B) mostra a interação entre a A327 em CHB2HB e FCYRIII. Em FcyRIII, as cores preto, cinza e branca indicam a parte básica, parte neutra, e parte ácida, respectivamente.

[00139] Figura 5 mostra a comparação de Atividades de ligação FcyR de anticorpos em que D356K, H435R, e/ou K439E foram introduzidas. A atividade de ligação de GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5) para cada FcyR foi definida como 100. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), e GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 3 e 5).

[00140] Figura 6 mostra a comparação das atividades de ligação de FCYR de anticorpos em que G237A foi introduzido. A atividade de ligação de GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5) para cada FCYR foi definida como 100. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5), GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3 e 5), GpH7- A26/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 6, 4, e 5), e GpH7-A26/GpL16- k0 (SEQ ID N°s: 6 e 5).

[00141] Figura 7 mostra a comparação das atividades de ligação de FcyR de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimerizados em que G237L foi introduzido. A atividade de ligação de GpH7- G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5) para cada FCYR foi definida como 100. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5), GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 3 e 5), GpH7-A29/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 7, 4, e 5), e GpH7-A29/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 7 e 5).

[00142] Figura 8 mostra a comparação de atividades de ligação de FcyR de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimerizados em que L328E foi introduzido. A atividade de ligação de GpH7- G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5) para cada FCYR foi definida como 100. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5), GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 3 e 5), GpH7-A42/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 8, 4, e 5), e GpH7-A42/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 8 e 5).

[00143] Figura 9 mostra a comparação de atividades de ligação de FCYR de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimerizados em que L328D foi introduzido. A atividade de ligação de GpH7- G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5) para cada FCYR foi definida como 100. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5), GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 3 e 5), GpH7-A43/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 9, 4 e 5), e GpH7-A43/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 9 e 5).

[00144] Figura 10 mostra a comparação das atividades de ligação de FcyR de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimeriza- dos em que L234E foi introduzido. A atividade de ligação de GpH7- G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5) para cada FCYR foi definida como 100. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5), GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 3 e 5), GpH7-A5/GpH7- B16/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 10, e 5), e GpH7-B16/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 10 e 5).

[00145] Figura 11 mostra a comparação das atividades de ligação de FcyR de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimeriza- dos em que L234D foi introduzido. A atividade de ligação de GpH7- G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5) para cada FCYR foi definida como 100. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5), GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 3 e 5), GpH7-A5/GpH7- B17/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 11, e 5), e GpH7-B17/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 11 e 5).

[00146] Figura 12 mostra interações de P329 na região Fc com FCYRIII. Para a cadeia H, CH2 e CH3, aqueles no lado esquerdo da figura são referidos como a cadeia de HA, CHA2, e CHA3, e aqueles no lado direito são referidas como a cadeia de HB, CHB2, e CHB3, respectivamente. Esta figura mostra que a Pro na posição 329 (numeração EU) na região Fc interage com FcyRIII principalmente através de CHA2 que é um domínio CH2. Para a cadeia H, CH2 e CH3, aqueles no lado esquerdo da figura são referidos como a cadeia de HA, CHA2, e CHA3, e aqueles no lado direito são referidas como a cadeia de HB, CHB2, e CHB3, respectivamente.

[00147] Figura 13 mostra a comparação dos efeitos sobre as ativi dades de ligação de FcyR de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimerizados em que P329R, P329K, P329D, ou P329E foram introduzidos. A atividade de ligação de GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5) para cada FCYR foi definida como 100. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4 e 5), GpH7- A5/GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 12, e 5), GpH7-A5/GpH7- B13/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 13, e 5), GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 14, e 5), GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 15, e 5), GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 12 e 5), GpH7- B13/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 13 e 5), GpH7-B14/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 14 e 5), e GpH7-B15/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 15 e 5).

[00148] Figura 14 mostra a comparação das atividades de ligação para cada FcyR de um anticorpo heterodimerizado com G237A introduzida em uma das cadeias H, quando P329R é introduzido na mesma cadeia H ou em outra cadeia H. A atividade de ligação de GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5) para cada FCYR foi definida como 100. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4 e 5), GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 12, e 5), GpH7- A48/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 16, 4, e 5), GpH7-A26/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 6, 4 e 5), GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 6, 12, e 5), e GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 17, 4, e 5).

[00149] Figura 15 mostra a comparação das atividades de ligação para cada FcyR de um anticorpo heterodimerizado com L234D introduzido em uma das cadeias H, quando P329R é introduzido na mesma cadeia H ou em outra cadeia H. A atividade de ligação de GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5) para cada FCYR foi definida como 100. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4 e 5), GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 12, e 5), GpH7- A48/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 16, 4, e 5), GpH7-A5/GpH7- B17/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 11, e 5), GpH7-A48/GpH7-B17/GpL16- k0 (SEQ ID N°s: 16, 11, e 5), e GpH7-A5/GpH7-B41/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 18, e 5).

[00150] Figura 16 mostra a comparação das atividades FcyRIa de ligação de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimeriza- dos em que alterações idênticas foram introduzidas. O eixo horizontal mostra os valores de Ho/Con, e o eixo vertical mostra os valores de He/Co. He/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcyRIa do anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/variante GpH7- B3/GpL16-k0, que usa uma variante GpH7-B3 mutada para uma das cadeias H, pela atividade de ligação de FcyRIa de GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 de anticorpo heterodimerizado(SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), o qual utiliza o GpH7-B3 não mutado, e multiplicando o resultado por 100. Ho/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcYRIa do anticorpo homodimerizado variante GpH7-B3/GpL16-k0, que usa uma variante GpH7-B3 mutada para ambas as cadeias H, pela atividade de ligação de FcYRIa de anticorpo homodimerizado GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), que utiliza o GpH7-B3 não mutado, e multiplicando o resultado por 100.

[00151] Figura 17 mostra a comparação de Atividade de ligação de FcYRIIa R de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimeri- zados em que alterações idênticas foram introduzidas. O eixo horizontal mostra os valores de Ho/Con, e o eixo vertical mostra os valores de He/Co. He/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcYRIIa R do GpH7-A5/variante GpH7-B3/GpL16-k0 do anticorpo hete- rodimerizado, que usa uma variante GpH7-B3 mutada para uma das cadeias H, pela Atividade de ligação de FcYRIIa R do anticorpo hete- rodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4 e 5), que utiliza o GpH7-B3 não mutado. Ho/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcYRIIa R do anticorpo homodimerizado variante GpH7-B3/GpL16-k0, que usa uma variante GpH7-B3 mutada para ambas as cadeias H, pela atividade de ligação FcYRIIa R do Anticorpo homodimerizado GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), que utiliza o GpH7-B3 não mutado, e multiplica o resultado por 100.

[00152] Figura 18 mostra a comparação de atividade de ligação de FcYRIIa R dos anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimeri- zados em que alterações idênticas foram introduzidas. O eixo horizontal mostra os valores de Ho/Con, e o eixo vertical mostra os valores de He/Co. He/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcYRIIa H do anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/variante GpH7- B3/GpL16-k0, que usa uma variante GpH7-B3 mutada para uma das cadeias H, pela atividade de ligação de FcYRIIa H do anticorpo hetero- dimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4 e 5), que utiliza o GpH7-B3 não mutado. Ho/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcYRIIa H do anticorpo homodimerizado variante GpH7-B3/GpL16-k0, que usa uma variante GpH7-B3 mutada para ambas as cadeias H, pela Atividade de ligação de FcYRIIa H do anticorpo homodimerizado GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), que utiliza o GpH7-B3 não mutado, e multiplicando o resultado por 100.

[00153] Figura 19 mostra a comparação das atividades FcYRIIb de ligação de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimeriza- dos em que alterações idênticas foram introduzidas. O eixo horizontal mostra os valores de Ho/Con, e o eixo vertical mostra os valores de He/Co. He/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcYRIIb do anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/variante GpH7- B3/GpL16-k0, que usa uma variante GpH7-B3 mutada para uma das cadeias H, pela atividade de ligação de FcYRIIb do anticorpo hetero- dimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), que utiliza o GpH7-B3 não mutado. Ho/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcYRIIb do anticorpo homodimerizado variante GpH7-B3/GpL16-k0, que usa uma variante GpH7-B3 mutada para ambas as cadeias H, pela atividade de ligação de FcYRIIb de Anticorpo homodimerizado GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), que utiliza o GpH7-B3 não mutado, e multiplicando o resultado por 100.

[00154] Figura 20 mostra a comparação das atividades De ligação de FcYRIIIa de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodime- rizados em que alterações idênticas foram introduzidas. O eixo horizontal mostra os valores de Ho/Con, e o eixo vertical mostra os valores de He/Co. O eixo horizontal mostra os valores de Ho/Con, e o eixo vertical mostra os valores de He/Co. He/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcYRIIIa do anticorpo heterodimerizado GpH7- A5/variante GpH7-B3/GpL16-k0, que usa uma variante GpH7-B3 mu- tada para uma das cadeias H, pela atividade de ligação de FcYRIIIa do anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), que utiliza o GpH7-B3 não mutado. Ho/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcYRIIIa do anticorpo homo- dimerizado variante GpH7-B3/GpL16-k0, que usa uma variante GpH7- B3 mutada para ambas as cadeias H, pela atividade de ligação de FcYRIIIa do anticorpo homodimerizado GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5), que utiliza o GpH7-B3 não mutado, e multiplicando o resultado por 100.

[00155] Figura 21 mostra um diagrama conceitual comparando ligação de FCYR de cada um dos anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimerizados que utilizam cadeias H em que alterações foram introduzidas. Quando um ponto representado é contido dentro da Região i, significa que a alteração introduzida na região Fc tem o efeito de produzir He/Con > 100, Ho/Con < 100, He/Con > Ho/Con. Quando um ponto representado é contido dentro da Região ii, isto significa que a alteração introduzida na região Fc tem o efeito de produzir He/Con > 100, Ho/Con > 100, He/Con > Ho/Con. Quando um ponto representado é contido dentro da Região iii, significa que a alteração introduzida na região Fc tem o efeito de produzir He/Con > 100, Ho/Con > 100, He/Con < Ho/Con.

[00156] Figura 22 mostra o número de combinações produzidas quando os três tipos de alterações são introduzidas em qualquer das cadeias H de um anticorpo heterodimerizado. Cada um de círculo preenchido (•), triângulo (▲), e quadrado preenchido (■) refere-se a uma alteração diferente.

[00157] Figura 23 mostra a interação entre a FcyRIII e cada um dos resíduos de S239, A330 e I332 da região Fc de anticorpo. Citado em Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 103, 4005-4010, 2006.

[00158] Figura 24 mostra a comparação das atividades de ligação para FcyR de ativação e FcyR inibidor. Ela é um diagrama conceitual comparando as atividades de ligação de cada variante de FCYR de ativação e FCYR inibidor. O eixo vertical mostra a atividade de cada variante para FcyR de ativação (Receptor de Ativação), e o eixo horizontal mostra a atividade de ligação de cada variante de FcyR inibidor (Receptor Inibidor). As atividades de ligação do anticorpo natural a FcyR de ativação e FcyR inibidor eram cada uma ajustada para 100. Quando uma variante aumentou a atividade de ligação para FcyR de ativação sobre o anticorpo de ocorrência natural e diminuiu a atividade de ligação a FcyR inibidor, o anticorpo é esquematizado na Região b (área de sombra). Quando uma variante melhorou a atividade de ligação a FcyR inibidor sobre o anticorpo de ocorrência natural, e diminuiu a atividade de ligação a FcyR de ativação, o anticorpo é esquematizado na Região c (área sombreada).

[00159] Figura 25 mostra a comparação das atividades de ligação para FcyR de ativação e FcyR inibidor. Ela é um diagrama conceitual comparando as atividades de ligação de cada variante de FcyR de ativação e FcyR inibidor. O eixo vertical mostra a atividade de ligação de um anticorpo de ocorrência natural, para para FcyR de ativação (Receptor de Ativação), e o eixo horizontal mostra a atividade de ligação a FcyR inibidor (Receptor Inibidor). As atividades de ligação do anticorpo natural a FcyR de ativação e FcyR inibidor eram cada uma definida para 100. Quando o valor obtido dividindo a atividade de ligação de uma variante de FcyR de ativação pela atividade de ligação a FcyR inibidor é de 1,2 ou superior, o anticorpo é esquematizado na Região b (área de sombra). Quando o valor obtido dividindo a atividade de ligação de uma variante de FcyR de ativação pela atividade de ligação a FcyR inibidor é 0,8 ou menor, o anticorpo é esquematizado na Região d (área sombreada).

[00160] Figura 26 mostra a comparação das atividades de ligação de um anticorpo heterodimerizado a FcyRIa e FcyRIIb. Ela é um dia- grama que compara as atividades de ligação de um anticorpo hetero- dimerizado alterado para FcYRIa que é um FCYR de ativação e para FcYRIIb que é um FCYR inibidor. O eixo horizontal mostra os valores de Ho/Con para FcyR inibidor, e o eixo vertical mostra os valores de He/Con para FcyR de ativação. He/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcyR do anticorpo heterodimerizado GpH7- A5/variante GpH7-B3/GpL16-k0 que tem um Fc mutado, pela atividade de ligação de FcyR do anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4 e 5), que não tem nenhuma introdução de alterações, e multiplicando o resultado por 100.

[00161] Figura 27 mostra a comparação das atividades de ligação de um anticorpo heterodimerizado para FcyRIIa e FcyRIIb. Ela é um diagrama que compara as atividades de ligação de um anticorpo hete- rodimerizado alterado para FcyRIIa R que é um FcyR de ativação e FcyRIIb, que é um FcyR inibidor. O eixo horizontal mostra os valores de He/Con para FcyR inibidor, e o eixo vertical mostra os valores de He/Con para FcyR de ativação. He/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcyR do anticorpo heterodimerizado GpH7- A5/variante GpH7-B3/GpL16-k0, que tem um Fc mutado, pela atividade de ligação de FcyR do anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4 e 5), que não tem nenhuma introdução de alterações, e multiplicando o resultado por 100.

[00162] Figura 28 mostra a comparação das atividades de ligação de um anticorpo heterodimerizado para FcyRIIa H e FcyRIIb. Ela é um diagrama que compara as atividades de ligação de um anticorpo hete- rodimerizado alterado para FcyRIIa H, que é um FcyR de ativação, e FcyRIIb, que é um FcyR inibidor. O eixo horizontal mostra os valores de He/Con para FcyR inibidor, e o eixo vertical mostra os valores de He/Con para FcyR de ativação. He/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcyR do anticorpo heterodimerizado GpH7- A5/variante GpH7-B3/GpL16-k0, que tem um Fc mutado, pela atividade de ligação de FCYR do anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4 e 5), que não tem nenhuma introdução de alterações, e multiplicando o resultado por 100.

[00163] Figura 29 mostra a comparação das atividades de ligação de um anticorpo heterodimerizado para FcyRIIIa e FcyRIIb. Ela é um diagrama que compara as atividades de ligação de um anticorpo hete- rodimerizado alterado para FcyRIIIa que é um FcyR de ativação e FcyRIIb que é um FcyR inibidor. O eixo horizontal mostra os valores de He/Con para FcyR inibidor, e o eixo vertical mostra os valores de He/Con para FcyR de ativação. He/Con é um valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcyR do anticorpo heterodimerizado GpH7- A5/variante GpH7-B3/GpL16-k0 que tem um Fc mutado, pela atividade de ligação de FcyR do anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4 e 5), que não tem nenhuma introdução de alterações, e multiplicando o resultado por 100.

[00164] Figura 30 mostra a comparação dos efeitos de combinações de L234Y, G236W e S298A, com S239D, A330L e I332E sobre a estabilidade térmica de anticorpos. Ela é um gráfico que compara as alterações no conteúdo de monômero após um estudo de estabilidade acelerada por calor (40 °C durante duas semanas ou quatro semanas), foi realizada pesquisa de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimerizados com L234Y, G236W e S298A, anticorpos homodi- merizados e anticorpos heterodimerizados com S239D, A330L e I332E, e anticorpos heterodimerizados em que L234Y, G236W e S298A são introduzidos em uma das cadeias H e S239D, A330L, e I332E são introduzidos na outra cadeia H. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 31, 4, e 5), GpH7- A5/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 3, 41, e 5), GpH7-TA7/GpH7- TA45/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 31, 32, e 5), GpH7-A57/GpH7- B78/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 40, 41, e 5), e GpH7-TA7/GpH7- B78/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 31,41, e 5).

[00165] Figura 31 mostra o resultado da análise das atividades de ADCC de anticorpos heterodimerizados. A linhagem celular utilizada para a avaliação foi SK-pca13a, e a razão E/T foi de 50. PBMCs humanas foram usadas como células efetoras. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5), GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 3, 41, e 5), GpH7- TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 31, 4, e 5), GpH7-A57/GpH7- B78/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 40, 41, e 5), GpH7-TA7/GpH7- TA45/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 31, 32, e 5), e GpH7-TA7/GpH7- B78/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 31, 41, e 5). O eixo vertical mostra a atividade citotóxica do anticorpo, e o eixo horizontal mostra a concentração de anticorpos (μg/mL).

[00166] Figura 32 mostra os resíduos de aminoácidos que constituem as regiões Fc de IgG1 (SEQ ID N°: 76), IgG2 (SEQ ID N°: 77), IgG3 (SEQ ID N°: 78), e IgG4 (SEQ ID N°: 79), e sua relação à numeração EU de Kabat (aqui, também referida como o índice de EU).

[00167] Figura 33 mostra um resultado da análise das atividades de ADCC dos anticorpos heterodimerizados Fc descritos no Exemplo 12. A linhagem celular utilizada para a avaliação foi SK-pca13a, e a razão E/T foi de 50. PBMCs humanas foram usadas como células efetoras. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID HI033/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: HI032/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: HI048/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: N°s: 2 e 5), GpH7-Kn033/GpH7- 51, 56, e 5), GpH7-Kn032/GpH7- 53, 58, e 5), GpH7-Kn045/GpH7- 54, 59, e 5), GpH7-Kn056/GpH7- HI055/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 55, 60, e 5), e GpH7-Kn037/GpH7- HI036/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 52, 57, e 5). O eixo vertical mostra a ati-vidade citotóxica do anticorpo, e o eixo horizontal mostra a concentração de anticorpos (μg/mL).

[00168] Figura 34 mostra um resultado de exame da atividade de ADCC do Anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73- k0. A linhagem celular utilizada para a avaliação foi SKE18, e a razão E/T foi de 50. PBMCs humanas foram usadas como células efetoras. As amostras utilizadas para a avaliação e suas sequências foram H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0 (SEQ ID N°: 84, 85, e 106), H240- Kn032/H240-Hl032/L73-k0 (SEQ ID N°: 86, 87, e 106), H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 (SEQ ID N°s: 81, 82, e 106), e H240- afucosyl_G1d (a sequência de aminoácidos de H240-afucosyl_G1d é a mesma que a de H240-G1D (SEQ ID N°: 83), mas a fucose é removi- da)/L73-k0 (SEQ ID N°s: 83 e 106). O eixo vertical mostra a atividade citotóxica do anticorpo, e o eixo horizontal mostra a concentração de anticorpos (μg/mL).

[00169] Figura 35 mostra a atividade de ligação a FcgRI de um mutante de ponto que utiliza o anticorpo heterodimerizado H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 como molde. KD relativa n o eixo vertical indica o valor obtido dividindo a KD (mol/L) de H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0 para FcgRI pela KD de cada variante. Os números no eixo horizontal mostram as fileiras quando as KDs relativas são dispostas em ordem crescente.

[00170] Figura 36 mostra a atividade de ligação de FcgRIIa R de um mutante de ponto que utiliza o anticorpo heterodimerizado H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 como modelo. KD relativa sobre o eixo vertical indica o valor obtido dividindo a KD (mol/L) de H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0 para FcgRIIA R pela KD de cada variante. Os números no eixo horizontal mostram as fileiras quando as KDs relativas são dispostas em ordem crescente.

[00171] Figura 37 mostra a atividade de ligação de FcgRIIa H de um mutante de ponto que utiliza o anticorpo heterodimerizado H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 como molde. KD relativa sobre o eixo vertical indica o valor obtido dividindo a KD (mol/L) de H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0 para FcgRIIA H pela KD de cada variante. Os números no eixo horizontal mostram as fileiras quando as KDs relativas são dispostas em ordem crescente.

[00172] Figura 38 mostra a atividade de ligação de FcgRIIb de um mutante de ponto que utiliza o anticorpo heterodimerizado H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 como molde. KD relativa sobre o eixo vertical indica o valor obtido dividindo a KD (mol/L) de H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0 para FcgRIIb pela KD de cada variante. Os números no eixo horizontal mostram as fileiras quando as KDs relativas são dispostas em ordem crescente.

[00173] Figura 39 apresenta a atividade de ligação de FcgRIIIa F de um mutante de ponto que utiliza o anticorpo heterodimerizado H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 como molde. KD relativa sobre o eixo vertical indica o valor obtido dividindo a KD (mol/L) de H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0 para FcgRIIIa F de KD de cada variante. Os números no eixo horizontal mostram as fileiras quando as KDs relativas são dispostas em ordem crescente.

[00174] Figura 40 mostra a de ligação de FcgRIIIa V de um mutante de ponto que utiliza o anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0 como molde. KD relativa sobre o eixo vertical indica o valor obtido dividindo a KD (mol/L) de H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 para FcgRIIIa V pela KD de cada variante. Os números no eixo horizontal mostram as fileiras quando as KDs relativas são dispostas em ordem crescente.

[00175] Figura 41 mostra um resultado da análise da atividade de ADCC de um anticorpo heterodimerizado, H240-Kn072/H240- Hl076/L73-k0. A linhagem celular utilizada para a avaliação foi MIA- PaCa-2, e a razão E/T foi de 25. PBMCs humanas foram usadas como células efetoras. As amostras utilizadas para a avaliação e suas sequências foram H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0 (SEQ ID N°: 84, 85, e 106), H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 (SEQ ID N°: 81, 82, e 106), H240-afucosyl_G1d/L73-k0 (SEQ ID N°s: 83 e 106), e H240- Kn072/H240-Hl076/L73-k0 (SEQ ID N°s: 90, 91, e 106). O eixo vertical mostra a atividade citotóxica do anticorpo, e o eixo horizontal mostra a concentração de anticorpo (μg/mL).

[00176] Figura 42 mostra um resultado da análise da atividade de ADCC de um anticorpo melhorado derivado do anticorpo heterodimeri- zado H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0. A linhagem celular utilizada para a avaliação foi DLD-1, e a razão E/T foi de 50. PBMCs humanas foram usadas como células efetoras. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram H240-Kn033/H240-Hl033/L73- k0 (SEQ ID N°s: 84, 85, e 106), H240-afucosyl_G1d/L73-k0 (SEQ ID N°s: 83 e 106), H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0 (SEQ ID N°s: 92, 91, e 106), H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0 (SEQ ID N°s: 93, 91, e 106), e H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 (SEQ ID N°s: 94, 91, e 106). O eixo vertical mostra a atividade citotóxica do anticorpo, e o eixo horizontal mostra a concentração de anticorpo (μg/mL).

[00177] Figura 43 mostra um resultado da análise da atividade de ADCC de um anticorpo heterodimerizado, H240-Kn067/H240- Hl068/L73-k0, e tal. A linhagem celular utilizada para a avaliação foi DLD-1, e a razão E/T foi de 50. PBMCs humanas foram usadas como células efetoras. As amostras utilizadas para a avaliação e as suas sequências foram H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0 (SEQ ID N°s: 84, 85, e 106), H240-afucosyl_G1d/L73-k0 (SEQ ID N°s: 83 e 106), H240- Kn067/H240-Hl068/L73-k0 (SEQ ID N°s: 95, 96, e 106), H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0 (SEQ ID N°s: 99, 96, e 106), e H240- Kn126/H240-Hl068/L73-k0 (SEQ ID N°s: 100, 96, e 106). O eixo vertical mostra a atividade citotóxica do anticorpo, e o eixo horizontal mostra a concentração de anticorpo (μg/mL).

[00178] Figura 44 mostra uma estrutura de cristal de Fc (WT)/FcgR2a tipo R (PDB ID = 3RY6, J. Imunol., 2011 187, 3208-321). A figura ilustra cadeias laterais de Gln 127, Leu132 e Phe160, que são três resíduos que diferem entre o FcgRIIA tipo R e FcgRIIb na região próxima à interface de interação entre o FcgRIIA tipo R e Fc nesta estrutura. Os resíduos de aminoácidos correspondentes na FcgRIIb são mostrados usando um códigos de letras em parênteses.

[00179] Figura 45 mostra um complexo domínio extracelular Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb cuja estrutura foi determinada por análise da estrutura de cristal de raio X para o domínio CH2 e o domínio CH3, os da esquerda são chamados de domínio A e os da direita são chamados de domínio B, respectivamente.

[00180] Figura 46 mostra uma estrutura em torno de Lys127 (Gln de FcgRIIA tipo R) da região extracelular FcgRIIb no Fc (Kn120/Hl068)/complexo de região extracelular FcgRIIb cuja estrutura foi determinada por análise da estrutura de cristal de raio X. Uma vez que a densidade de elétrons da cadeia lateral não foi observada para Tyr296 da Fc (Kn120/Hl068), os modelos não foram construídos para a cadeia lateral além do átomo Cα.

[00181] Figura 47 mostra uma estrutura em torno de Ser132 (Leu em FcgRIIA tipo R) da região extracelular FcgRIIb na Fc (Kn120/Hl068)/complexo de domínio extracelular FcgRIIb cuja estrutura foi determinada por análise da estrutura de cristal de raio X. Uma vez que a densidade de elétrons da cadeia lateral não foi observada para D327 da Fc (Kn120/Hl068), os modelos não foram construídos para a cadeia lateral além do átomo Cα.

[00182] Figura 48 mostra uma estrutura em torno de Tyr160 (Phe em FcgRIIA tipo R) da região extracelular FcgRIIb na Fc (Kn120/Hl068)/complexo região extracelular FcgRIIb cuja estrutura foi determinada por análise da estrutura de cristal de raio X.

[00183] Figura 49 mostra um complexo de região extracelular de Fc (BP208)/FcgRIIb cuja estrutura foi determinada por análise da estrutura de cristal de raio X. Para o domínio CH2 e o domínio CH3, aqueles no lado esquerdo são referidos como o domínio A e aqueles no lado direito são referidos como domínio B, respectivamente.

[00184] Figura 50 mostra uma comparação dos domínios CH2 A entre a estrutura da Fc (BP208)/Complexo de região extracelular FcgRIIb determinada por análise da estrutura de cristal de raio X e a estrutura deo Fc (WT)/complexo região extracelular FcgRIIA (código PDB: 3RY6) determinada por análise da estrutura de cristal de raio X. Na figura, a estrutura da Fc (BP208)/complexo região extracelular FcgRIIb é representada por uma linha grossa, e a estrutura da Fc (WT)/complexo região extracelular FcgRIIA é representada por uma linha fina. Domínio A CH2 sozinho é ilustrado na estrutura da Fc (WT)/complexo região extracelular FcgRIIA.

[00185] Figura 51 mostra uma estrutura em torno de Ser239 de Fc (BP208) domínio B CH2 na Fc (BP208)/complexo região extracelular FcgRIIb, a qual foi determinada por análise da estrutura de cristal de raio X.

[00186] Figura 52 mostra uma estrutura em torno de Ser239 de Fc (BP208) domínio A CH2 de Fc (BP208)/complexo região extracelular FcgRIIb, a qual foi determinada por análise da estrutura de cristal de raio X.

[00187] Figura 53 mostra os resultados de cromatografia de troca catiônica analítica para um anticorpo alterado representativo, H240- AK072/H240-BH076/L73-k0. A: H240-AK072/H240-BH076/L73-k0; B: H240-FA021/H240-FB084/L73-k0.

[00188] Figura 54 mostra os resultados de cromatografia de troca catiônica para fracionamento (A) e recromatografia de troca catiônica analítica das frações recolhidas (B) de H240-FA021/H240-FB084/L73- k0 que é um anticorpo modificado representativo, H240-AK072/H240- BH076/L73-k0.

Modo de Realização da Invenção

[00189] As definições seguintes são fornecidas para facilitar a com-preensão da presente invenção aqui descrita.

[00190] A presente invenção proporciona polipeptídeos que compreendem uma região Fc, em que o polipeptídeo é caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um heterodímero compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o polipeptídeo é caracterizado pelo fato de que uma função da região Fc é alterada quando comparada com a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homodímero que compreende apenas o primeiro polipeptídeo, e quando comparada com a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homodímero que compreende apenas o segundo polipep- tídeo. Além disso, a presente invenção fornece métodos para a produção do polipeptídeo, e métodos para alterar as funções de um polipep- tídeo contendo uma região Fc.

[00191] Na presente invenção, o "polipeptídeo que compreende uma região Fc, em que o polipeptídeo é caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um heterodímero compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo" pode ser um complexo de polipeptídeo composto por um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, bem como outros múltiplos polipeptídeos.

[00192] Aqui, "primeiro polipeptídeo" e "segundo polipeptídeo" significa polipeptídeos que constituem uma região Fc de anticorpos. Os termos "primeiro polipeptídeo" e "segundo polipeptídeo" significam que as sequências são diferentes umas das outras, e, de preferência, pelo menos, as sequências de domínio CH2 são diferentes. Os polipeptí- deos podem ser, por exemplo, polipeptídeos que constituem a região Fc de uma IgG de ocorrência natural, ou polipeptídeos produzidos por alteração dos polipeptídeos que constituem a região Fc de uma IgG de ocorrência natural.

[00193] "IgGs de ocorrência natural" refere-se a polipeptídeos que pertencem a uma classe de anticorpos praticamente codificados por genes de imunoglobulina gama e que compreendem uma sequência de aminoácidos idêntica à de IgG encontrada na natureza. Por exemplo, uma IgG humana de ocorrência natural refere-se a uma IgG1 humana de ocorrência natural, IgG2 humana IgG3 humana de ocorrência natural de ocorrência natural, IgG4 humana de ocorrência natural, ou tal. IgGs de ocorrência natural incluem os mutantes produzidos espontaneamente a partir delas.

[00194] "Polipeptídeos" da presente invenção geralmente referem- se a peptídeos ou proteínas de cerca de dez ou mais aminoácidos de comprimento. Além disso, eles são geralmente polipeptídeos derivados de organismos, mas não são particularmente limitados, e, por exemplo, eles podem ser polipeptídeos que compreendem uma sequência concebida artificialmente. Além disso, eles podem ser qualquer um dos polipeptídeos de ocorrência natural, polipeptídeos sintéticos, polipeptídeos recombinantes, ou semelhante. As moléculas de proteína da presente invenção referem-se a moléculas que compreendem o polipeptídeo.

[00195] Os exemplos preferidos de polipeptídeos da presente invenção incluem anticorpos. Exemplos mais preferidos incluem IgGs de ocorrência natural, particularmente IgGs humanas de ocorrência natural. "IgG de ocorrência natural" refere-se a polipeptídeos que perten- cem a uma classe de anticorpos praticamente codificados por genes de imunoglobulina gama e que compreendem uma sequência de ami- noácidos idêntica à da IgG encontrada na natureza. Por exemplo, uma IgG humana de ocorrência natural, uma IgG1 humana de ocorrência natural, IgG2 humana de ocorrência natural,, IgG3 humana de ocorrência natural, IgG4 humana de ocorrência natural, ou tal. IgGs de ocorrência natural incluem os mutantes produzidos espontaneamente a partir delas.

[00196] Enquanto uma região constante tipo IgK (Kappa, □ □cadeia), IgL1, IgL2, IgL3, IgL6, e IgL7 (Lambda, cadeia □) está presente na região constante de cadeia leve de um anticorpo, ela pode ser qualquer região constante de cadeia leve. Para a região constante de IgK humano (Kappa) e região constante de IgL7 (Lambda) humana, uma pluralidade de sequências de alótipo devido a polimorfismo genético estão descritas em Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication No. 91-3242, e qualquer um deles pode ser utilizado na presente invenção. Além disso, na presente invenção, uma região constante de cadeia leve pode ser uma região constante de cadeia leve que tenha sido modificada com substituições de aminoáci- dos, adições, deleções, inserções e/ou modificações ou tal. Para a região Fc de anticorpo, por exemplo, regiões Fc dos tipos IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, e IgM existem. Por exemplo, uma região Fc de anticorpo IgG humano pode ser usado como a região Fc de anticorpo da presente invenção, e são preferidas as regiões Fc do anticorpo IgG1 humana. Regiões Fc que podem ser utilizadas como uma região Fc da presente invenção são, por exemplo, aquelas derivadas a partir de regiões constantes IgG de ocorrência natural, ou mais especificamente, uma região constante derivada de IgG1 humana de ocorrência natural (SEQ ID N°: 76), uma região constante deri-vada de IgG2 humana de ocorrência natural(SEQ ID N°: 77), uma re gião constante derivada de IgG3 humana de ocorrência natural (SEQ ID N°: 78), e uma região constante derivada de IgG4 humana de ocorrência natural (SEQ ID N°: 79). Figura 32 mostra as sequências da região constante de IgG1 IgG2, IgG3, e IgG4 de ocorrência natural,. Regiões constantes de IgG que ocorrem naturalmente incluem os mutan- tes produzidos espontaneamente a partir delas. Para as regiões constantes de anticorpos IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, e de IgG4 humanos, uma pluralidade de sequências de alótipo devido a polimorfismo genético estão descritas em "Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication No. 91-3242, e qualquer um deles pode ser utilizado na presente invenção. Em particular, para a sequência de IgG1 humana, a sequência de aminoácidos nas posições 356-358 (numeração EU) pode ser DEL ou EEM.

[00197] Além disso, a força da interação entre a região Fc de anticorpo e FCYR tem sido relatada como dependendo da concentração de íon Zn2+ (Immunology Letters 143 (2012) 60-69). O anticorpo mostra uma interação forte entre a região Fc e FcgR quando a concentração de íon Zn2+ da região Fc é maior. A quelação de Zn2+ por His310 His435 e presente em CH3 da região Fc de anticorpo abre cada domínio CH2 na região Fc de uma posição distal. Isso facilita a interação entre o domínio CH2 e FcgR, e a interação entre a região Fc e FcgR é reforçada. Uma modalidade não limitativa da região Fc da presente invenção inclui uma região Fc, em que His na posição 310, His na posição 435, His na posição 433, e/ou Asn na posição 434 (numeração EU) é quelado com o Zn2+.

[00198] Na presente invenção, "região Fc" refere-se a uma região composta de uma região de dobradiça ou uma parte dela, um domínio CH2 e um domínio CH3 de uma molécula de anticorpo. De acordo com a numeração EU (aqui, também chamada índice EU), uma região Fc da classe de IgG refere-se a, por exemplo, uma região de cisteína na posição 226 do terminal C, ou a partir de prolina na posição 230 para o terminal C, mas não está limitada a elas.

[00199] A região Fc pode ser obtida de preferência por frações de re-eluição adsorvidas em uma coluna de proteína A ou coluna de proteína G após digestão parcial de anticorpos monoclonais IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ou tal utilizando uma protease, tal como pepsina. A protease não é particularmente limitada desde que ele possa digerir um anticorpo de comprimento completo, de modo a produzir fragmentos Fab e F(ab')2 de uma forma restritiva, configurando adequadamente as condições de reação enzimática, tais como o pH, e os exemplos incluem pepsina e papaína.

[00200] Aqui, "heterodimerização" significa constituir um único poli- peptídeo a partir de dois polipeptídeos com diferentes sequências de aminoácidos, e "heterodímero" significa um polipeptídeo composto por dois polipeptídeos com diferentes sequências de aminoácidos. Além disso, "homodimerização" significa constituir um único polipeptídeo a partir de dois polipeptídeos que têm as mesmas sequências de amino- ácidos, e "homodímero" significa um polipeptídeo composto por dois polipeptídeos que têm as mesmas sequências de aminoácidos, ou um polipeptídeo composto de polipeptídeos tendo as mesmas sequências de aminoácidos excluindo alterações feitas com a finalidade de hete- rodimerização eficiente ou alterações feitas com o propósito de purificação eficiente de heterodímeros, ou um polipeptídeo composto de polipeptídeos compreendendo os mesmos aminoácidos, excluindo alterações que não foram feitas com o propósito de melhorar a função de Fc. Na presente invenção, "heterodímero" ou "homodimérico" significa, de preferência "heterodimerização" ou "homodimerização" para a região Fc, ou de preferência, significa "heterodimerização" ou "homo- dimerização" para CH2 na região Fc. Além disso, "polipeptídeo progenitor" significa um polipeptídeo antes da introdução de alterações, tais como mutações de aminoácidos.

[00201] A mutação de aminoácidos da presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com múltiplas mutações de amino- ácidos.

[00202] Quando múltiplas mutações de aminoácidos são usadas em combinação, o número de mutações combinadas não é particularmente limitado, e pode ser ajustado de forma adequada dentro de uma gama que pode atingir os objetivos da invenção, e os exemplos incluem dois ou mais e 30 ou menos, e de preferência dois ou mais e 15 ou menos.

[00203] Quando múltiplas mutações de aminoácidos são combinadas, as mutações de aminoácidos podem ser introduzidas em apenas um dos dois polipeptídeos que constituem a região Fc, ou elas podem ser adequadamente distribuídas para ambos os dois polipeptídeos.

[00204] Além disso, na presente invenção, para conseguir um maior efeito de modificação da função na região Fc, é preferível introduzir pelo menos uma mutação de aminoácidos que melhora a função da região Fc, quando a mutação é introduzida em apenas um dos poli- peptídeos, comparado quando nenhuma mutação é introduzida e, quando a mutação é introduzida em ambas as regiões Fc dos dois po- lipeptídeos.

[00205] O local a ser alterado não é particularmente limitado, desde que seja em uma região Fc, e pode ser adequadamente ajustado dentro de uma gama que pode atingir os objetivos da presente invenção, e os exemplos incluem a região de dobradiça, a região CH2 e a região CH3.

[00206] Mais preferivelmente, o local a ser modificado é um domínio CH2. Domínio CH2 refere-se às posições 231-340 (numeração EU) e o domínio CH3 refere-se às posições 341-447 (numeração EU). Por exemplo, quando da introdução de mutações na sequência de amino- ácidos de uma região constante derivada a partir de IgG1 humana, re-síduos de aminoácidos em uma ou mais posições selecionadas de entre 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, e 447 (numeração EU) podem ser alterados.

[00207] Mais especificamente, quando da introdução de alterações na sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 humana, resíduos de aminoácidos em uma ou mais posições seleciona- das de entre 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, e 447 (numeração EU) podem ser alterados.

[00208] Mais especificamente, quando da introdução de alterações na sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 humana, resíduos de aminoácidos em uma ou mais posições selecionadas de entre 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, e 340 (numeração EU) podem ser alterados.

[00209] Mais especificamente, quando da introdução de alterações na sequência de aminoácidos de uma região constante de IgG1 humana, resíduos de aminoácidos em uma ou mais posições selecionadas de entre 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 295, 296, 298, 300, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 e 337 (numeração EU) podem ser alterados.

[00210] Na presente invenção, a alteração de aminoácidos significa qualquer substituição, deleção, adição, inserção e alteração, ou uma combinação das mesmas. Na presente invenção, alteração de amino- ácidos pode ser reformulada como mutação de aminoácidos, e elas são usadas como sinônimos. Substituição

[00211] Ao substituir resíduos de aminoácidos, substituição de um resíduo de aminoácido diferente é realizada com o objetivo de alterar aspectos, tais como: (a)-(c), descrito a seguir: (a) estrutura principal do polipeptídeo na região de estrutura em folha ou estrutura helicoidal; (b) carga elétrica ou hidrofobicidade no local alvo, ou (c) o tamanho da cadeia lateral.

[00212] Os resíduos de aminoácidos são classificados nos seguintes grupos, com base nas suas propriedades de cadeia lateral geral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile e; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr, asn, gln e; (3) ácidos: asp e glu; (4) básicos: his, lys, e Arg; (5) Os resíduos que afetam a orientação da cadeia: Gly e Pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe e.

[00213] Substituição entre os resíduos de aminoácidos dentro de cada um desses grupos de aminoácido é referida como substituição conservadora, e substituição de resíduos de aminoácidos entre diferentes grupos é referida como uma substituição não conservadora.

[00214] Substituições na presente invenção podem ser substituições conservadoras ou substituições não conservadoras, ou uma combinação de substituições conservadoras e substituições não conservadoras.

[00215] Em adição às mutações de aminoácidos introduzidas com base na presente invenção, os polipeptídeos da presente invenção podem adicionalmente ainda alterações adicionais. Por exemplo, as alterações adicionais podem ser selecionadas a partir de qualquer uma das substituições de aminoácidos, deleções, e modificações, ou suas combinações.

[00216] Por exemplo, os polipeptídeos da presente invenção podem ser alterados arbitrariamente dentro de uma gama que não praticamente altera a função pretendida para o polipeptídeo. Quando o poli- peptídeo da presente invenção é um anticorpo, a sua cadeia leve e cadeia pesada podem ser alteradas. Por exemplo, essas mutações podem ser realizadas por meio de substituição conservadora de resíduos de aminoácidos. Além disso, mesmo se uma alteração muda a função pretendida de um polipeptídeo da presente invenção, a alteração pode também ser realizada desde que a alteração na função esteja em uma gama dentro dos objetivos da presente invenção.

[00217] Alteração de sequência de aminoácido da presente invenção inclui a modificação pós-translacional. Uma modificação pós- tradução específica pode ser a adição ou supressão de uma cadeia de açúcar. Por exemplo, na região constante de IgG1, o resíduo de ami- noácido na posição 297 (numeração EU) pode ser modificado por cadeia de açúcar. A estrutura da cadeia de açúcar para a modificação não é limitada. Geralmente, os anticorpos expressos em células euca- rióticas compreendem glicosilação na região constante. Portanto, os anticorpos expressos em células, tais como os que estão abaixo são normalmente modificados por algum tipo de cadeia de açúcar: -células produtoras de anticorpos dos mamíferos -células eucariotas transformadas com um vetor de expressão compreendendo um DNA que codifica um anticorpo

[00218] As células eucarióticas mostradas aqui incluem células de leveduras e de animais. Por exemplo, as células CHO e células HEK293H são representativas de células de animais utilizadas na transformação com um vetor de expressão compreendendo um DNA que codifica o anticorpo. Por outro lado, aquelas sem a glicosilação nesse local também estão incluídas no anticorpo da presente invenção. Os anticorpos cuja região constante não é glicosilada podem ser obtidos através da expressão de um gene que codifica o anticorpo em células procarióticas, tais como Escherichia coli.

[00219] Na presente invenção, as alterações adicionais incluem es-pecificamente, por exemplo, a adição de ácido siálico na cadeia de açúcar de uma região Fc (MAbs. 2010 Set-Out; 2 (5): 519-27).

[00220] Quando o polipeptídeo da presente invenção é um anticorpo, por exemplo, as substituições de aminoácidos que melhoram a atividade de ligação de FcRn (J. Immunol. 2006 Jan 1; 176(1): 346-56; J Biol Chem. 2006 Aug 18; 281(33): 23514-24; Int. Immunol. 2006 Dec; 18(12): 1759-69; Nat Biotechnol. 2010 Feb; 28(2): 157-9; WO/2006/019447; WO/2006/053301; e WO/2009/086320), e substituições de aminoácidos para melhorar a heterogeneidade do anticorpo ou a sua estabilidade (WO/2009/041613) podem ser introduzidas em uma porção da região constante de anticorpo.

[00221] Para produzir um polipeptídeo heterodimerizado da presente invenção, é necessário que polipeptídeos tendo aminoácidos que diferem uns dos outros estejam associados, ou um polipeptídeo hete- rodimerizado de interesse é separado de outros polipeptídeos homo- dimerizados.

[00222] Para associação de polipeptídeos tendo aminoácidos diferentes uns dos outros e que compreendem uma região Fc, uma técnica de supressão de associação não intencional entre as cadeias H introduzindo repulsão eletrostática na interface da segunda região constante de cadeia H do anticorpo (CH2) ou na terceira região constante da cadeia H (CH3) (WO 2006/106905) pode ser aplicada.

[00223] Na tecnologia de suprimir a associação não intencional entre as cadeias H, introduzindo repulsão eletrostática na interface de CH2 ou CH3, exemplos de resíduos de aminoácidos em contato na interface de outras regiões constantes da cadeia H incluem o resíduo na posição 356 (numeração EU), o resíduo na posição 439 (numeração EU), a região de frente para o resíduo na posição 357 (numeração EU), o resíduo na posição 370 (numeração EU), o resíduo na posição 399 (numeração EU), e o resíduo na posição 409 (numeração EU) no domínio CH3.

[00224] Mais especificamente, por exemplo, em um anticorpo que contém dois tipos de domínios CH3 da cadeia H, o anticorpo, em que 1-3 pares de resíduos de aminoácidos escolhidos entre os resíduos de aminoácidos mostrados abaixo em (1) a (3) no primeiro domínio CH3 de cadeia H que têm o mesmo tipo de carga pode ser produzido: (1) resíduos de aminoácidos nas posições 356 e 439 (nu-meração EU), que são resíduos de aminoácidos contidos no domínio CH3 de cadeia H; (2) resíduos de aminoácidos nas posições 357 e 370 (nu-meração EU), que são resíduos de aminoácidos contidos no domínio CH3 de cadeia H e; (3) resíduos de aminoácidos nas posições 399 e 409 (nu-meração EU), que são resíduos de aminoácidos contidos no domínio CH3 de cadeia H.

[00225] Além disso, um anticorpo pode ser produzido em que 1-3 pares de resíduos de aminoácidos que correspondem aos pares de resíduos de aminoácidos acima indicados em (1) a (3) que tem o mesmo tipo de carga do primeiro domínio CH3 de cadeia H têm cargas opostas aos resíduos de aminoácidos correspondentes ao primeiro domínio CH3 de cadeia H acima mencionado, em que os pares de resíduos de aminoácidos são selecionados de entre os pares de resíduos de aminoácidos acima indicados em (1) a (3) no segundo domínio CH3 de cadeia H, que é diferente do primeiro domínio CH3 de cadeia H.

[00226] Os respectivos resíduos de aminoácidos de (1) a (3) acima mencionados são posicionados perto uns dos outros, quando associados. Os versados na técnica podem encontrar os locais que correspondem aos resíduos de aminoácidos acima mencionadas de (1) a (3), através da modelação de homologia e usando o software comercialmente disponível para o domínio CH3 de cadeia H pretendido ou região constante de cadeia H, e resíduos de aminoácidos destes locais podem ser alterados quando necessário.

[00227] Nos anticorpos acima mencionados, por exemplo, "resíduos de aminoácidos carregados" são preferivelmente selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos incluídos em qualquer um dos grupos (X) ou (Y) a seguir: (X) ácido glutâmico (E) e ácido aspártico (D); e (Y) lisina (K), arginina (R) e histidina (H).

[00228] Nos anticorpos acima mencionados, a frase "tendo o mesmo tipo de carga" significa que, por exemplo, todos os dois ou mais resíduos de aminoácidos são resíduos de aminoácidos incluídos em qualquer dos grupos acima mencionados (X) e (Y). A frase "tendo a carga oposta" significa que, por exemplo, quando pelo menos um dos dois ou mais resíduos de aminoácidos é um resíduo de aminoácido incluído em qualquer um dos grupos acima mencionados (X) e (Y), os resíduos de aminoácidos restantes são resíduos de aminoácidos incluídos no outro grupo.

[00229] Em uma modalidade preferida do anticorpo acima mencionado, o primeiro domínio CH3 de cadeia H e o segundo domínio CH3 de cadeia H podem ser reticulados por ligações de dissulfito.

[00230] Na presente invenção, os resíduos de aminoácidos a ser alterados não estão limitados aos resíduos de aminoácidos da região constante de anticorpo ou região variável do anticorpo descritas acima. Os versados na técnica podem encontrar os resíduos de aminoácidos que formam a interface em mutantes de polipeptídeos ou heteromultí- meros através da modelação de homologia e utilizando tal software comercialmente disponível, e podem alterar os resíduos de aminoáci- dos nesses locais para regular a associação.

[00231] Outras tecnologias conhecidas podem também ser usadas para a associação de polipeptídeos da presente invenção, possuindo diferentes aminoácidos e compreendendo uma região Fc. Polipeptí- deos tendo diferentes aminoácidos e que compreendem uma região Fc podem ser eficientemente associados uns com os outros através da substituição de um aminoácido de cadeia lateral presente em uma das regiões variáveis de cadeia H do anticorpo com uma cadeia lateral maior (saliência), e substituindo um aminoácido de cadeia lateral presente na região variável oposta da outra cadeia H com uma cadeia lateral menor (orifício), para permitir a colocação do knob dentro do furo WO 1996/027011; and Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677681).

[00232] Além disso, outras tecnologias conhecidas podem também ser usadas para a associação de polipeptídeos tendo diferentes ami- noácidos e que compreendem uma região Fc. Associação de polipep- tídeos tendo sequências diferentes pode ser induzida eficientemente pelo associação complementar de CH3, usando um domínio CH3 construído por troca de filamento produzido alterando parte do CH3 em uma das cadeias H de um anticorpo em uma sequência derivada de IgA correspondente a essa parte, e introduzindo uma sequência derivada de IgA correspondente na parte complementar do CH3 em outra cadeia H (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). Esta tecnologia conhecida, também pode ser utilizada para induzir de forma eficiente associação de polipeptídeos tendo diferentes aminoácidos e que compreendem uma região Fc.

[00233] Além disso, também se pode usar as tecnologias para a produção de anticorpos heterodimerizados usando associação de CH1 e CL de anticorpo, e associação de VH e VL, que são descritos no documento WO 2011/ 028952.

[00234] Além disso, mesmo nos casos em que os polipeptídeos he- terodimerizados não podem ser formados de forma eficiente, os poli- peptídeos heterodimerizados podem ser obtidos por separação e puri-ficação de polipeptídeos homodimerizados. Ao produzir um polipeptí- deo heterodimerizado consistindo em um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo que têm diferentes sequências de polipeptídeos, polipeptídeos homodimerizados consistindo em apenas dois primeiros polipeptídeos e polipeptídeo homodimerizado consistindo em apenas dois segundos polipeptídeos são misturados na forma de impurezas. Tecnologias conhecidas podem ser utilizadas como um método para remover eficazmente estes dois tipos de polipeptídeos homodimeriza- dos. Um método tem sido referido como sendo capaz de purificar dois tipos de homodímeros e o anticorpo heterodimerizado de interesse por cromatografia de troca iônica, criando uma diferença em pontos isoelé- tricos através da introdução de substituições de aminoácidos nas regiões variáveis dos dois tipos de cadeias H (WO 2007114325). Até hoje, como um método para a purificação de anticorpos heterodimerizados, um método utilizando a proteína A foi reportado para purificar um anticorpo heterodimerizado que compreende uma cadeia H IgG2a de camundongo, que se liga à Proteína A e uma cadeia H de IgG2b de camundongo, que não se liga à Proteína A (WO 98050431 e 95033844 WO).

[00235] Além disso, um anticorpo heterodimerizado sozinho pode ser purificado de forma eficiente utilizando cadeias H em que os resíduos de aminoácidos no sítio de ligação proteína A-IgG, as posições 435 e 436 (numeração EU) são substituídos por aminoácidos dando origem a diferentes afinidades de Proteína A tal como Tyr ou His para alterar a interação de cada um das cadeias H com Proteína A, e usando uma coluna de proteína.

[00236] Uma pluralidade destas substituições e tecnologias, por exemplo, duas ou mais delas podem ser utilizadas em combinação. Além disso, estas alterações podem ser feitas separadamente para o primeiro polipeptídeo e segundo polipeptídeo, quando necessário. Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser aqueles produzidos com base nos produtos das alterações acima mencionadas.

[00237] A sequência de aminoácidos pode ser alterada por vários métodos conhecidos dos versados na técnica. Tais métodos incluem o método de mutagênese dirigida sítio (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, e Nakagawa, M. (1995). Um método de âmbar duplo direcionado a oligodesoxirribonucleotídeo para mutagênese dirigida a local. Gene 152: 271-275; Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Oligonucle- otide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100: 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligo nucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; and Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 82: 488-492), o método de mutação de PCR, e o método de mutação de cassete, mas não se limitam a estes.

[00238] Na presente invenção, a expressão "função de região Fc" refere-se a, por exemplo, atividade de ligação de receptor de FCY de uma região Fc (ou aumento da atividade de ligação ou redução da atividade de ligação), seletividade de uma região Fc para isoforma de receptor Fcy (melhora de seletividade de ligação), estabilidade físico- química de uma região Fc, atividade de ADCC e atividade de ADCP. Aqui, seletividade de isoforma de receptor de Fcy de uma região Fc significa ligação seletiva a isoformas específicas de receptor Fcy. A estabilidade físico-química de uma região Fc significa, por exemplo, a estabilidade térmica de uma região Fc, a estabilidade de protease, a estabilidade a tratamento químico, a estabilidade de congelamento descongelamento, a estabilidade de armazenamento, a estabilidade sob condições ácidas, fotoestabilidade, estabilidade à agitação ou estresse associado à concentração, ou a manutenção de solubilidade em uma vasta gama de condições de solução. Além disso, uma função de região Fc pode referir-se a uma função de combinação de duas ou mais funções de atividade de ligação de receptor de Fcy de uma região Fc, seletividade de isoforma de receptor Fcy de uma região Fc, e estabilidade físico-química de uma região Fc, e isto significa que, por exemplo, uma função que combina a atividade de ligação de receptor de Fcy a uma região Fc e a seletividade de isoforma de receptor Fcy de uma região Fc, uma função combinando a atividade ligação de re-ceptor de Fcy a uma região Fc e a estabilidade físico-química de uma região Fc, uma função combinando seletividade de isorforma de receptor de Fcy de uma região Fc e a estabilidade físico-química da região Fc, e uma função combinando a atividade de ligação de receptor de FCY de uma região Fc, seletividade de isoforma de receptor de FCY de uma região Fc, e a estabilidade físico-química de uma região Fc.

[00239] Na presente invenção, "alteração da função de região Fc" significa, por exemplo, melhora, redução, ou tal de atividade de ligação de receptor de Fcy de uma região Fc, quando a função de região Fc refere-se à atividade de ligação de receptor de Fcy da região de ligação de recptor Fc. Melhora da seletividade significa, por exemplo, aumentar a atividade de ligação a um receptor de Fcy e ao mesmo tempo manter ou baixar as atividades de ligação a outros receptores de Fcy. Alternativamente, melhora da seletividade significa, por exemplo, reduzir a atividade de ligação a certos receptores de Fcy, manter ou melhorar as atividades de ligação a outros receptores de Fcy. Além disso, por exemplo, quando a função de região Fc refere-se a seletividade de subtipo de receptor Fcy de uma região Fc, "alteração da função de região Fc" significa melhorar ou baixar a seletividade de subtipo de receptor Fcy da região Fc. Alternativamente, por exemplo, quando a função de região Fc refere-se a estabilidade físico-química de uma região Fc, "alteração da função de região Fc" significa melhorar ou diminuir a estabilidade físico-química da região Fc, suprimindo uma diminuição na estabilidade, ou tal; e mais especificamente significa, por exemplo, a melhora ou a redução do valor Tm do domínio CH2, suprimindo uma diminuição no valor de Tm, ou tal.

[00240] Por exemplo, a melhora das funções combinadas de atividade de ligação de receptor Fcy de uma região Fc, seletividade de isoforma de receptor de Fcy de uma região Fc, e a estabilidade físico- química de uma região Fc, não têm necessariamente de ser melhorada em cada uma de Atividade de ligação de receptor Fcy de uma região Fc, seletividade de isoforma de receptor de Fcy de uma região Fc, e a estabilidade físico-química de uma região Fc, quando comparada com um controle, e o aperfeiçoamento é aceitável, desde que a função da região Fc seja melhorada como um todo. Por outro lado, por exemplo, a redução das funções combinadas da atividade de ligação de receptor FCY de uma região Fc, seletividade de isoforma de receptor de FCY de uma região Fc, e a estabilidade físico-química de uma região Fc não tem necessariamente de ser diminuída em todos de uma da atividade de ligação de receptor Fcy de uma região Fc, seletividade de isoforma de receptor de Fcy de uma região Fc, e a estabilidade físico- química de uma região Fc, quando comparada com um controle, e a diminuição é aceitável, desde que a função de região Fc seja reduzida como um todo.

[00241] Na presente invenção, "receptores Fcy" (aqui, referidos como receptores de Fc, FcyR, ou FcgR) refere-se a receptores que se podem se ligar com a região Fc de IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, e praticamente significa qualquer membro da família de proteínas codificadas por genes de receptores de Fcy. Nos seres humanos, essa família inclui FcyRI (CD64), incluindo isoformas FcyRIa, FcyRIb, e FcyRIC; FcyRII (CD32), incluindo isoformas FcyRIIA (incluindo alótipos H131 (tipo H) e R131 (tipo R)), FcyRIIb (incluindo FcyRIIb e FcyRIIb2), e FcyRIIC, e FcyRIII (CD16), incluindo isoformas FcyRIIIa (incluindo os alótipos V158 e F158), e FcyRIIIb (incluindo alótipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb-NA2), e quaisquer FcyRs humanos, isoformas ou alótipos FcyR ainda a ser descobertos, mas não se limita a isso. O FcyRs incluem FcyRs derivados de humano, camundongo, rato, coelho, e macaco, mas não está limitado a eles, e podem ser derivados de qualquer organismo. FcyRs de camundongo incluem FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16), e FcyRIII-2 (CD16-2 ou FcyRIV), e nenhum FcyRs de camundongo, ou isoformas ou alótipos de FcyR ainda a ser descobertos, mas não se limitam aos mesmos. Exemplos favoráveis de receptores Fcy, incluem FcyRI humano (CD64), FcyRIIa (CD32), FcYRIIb (CD32), FcYRIIIa (CD16), e/ou FcYRIIIb (CD16).

[00242] Para FCYRS, existem receptores de ativação que portam o motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM) e o receptor inibitório que porta o motivo inibitório baseado em tirosina imunoreceptora (ITIM). FCYRS são classificados em FCYRS de ativação: FcyRI, FcYRIIa R, FCYRII H, FcYRIIIa e FcYRIIIb e FCYR inibitório: FcyRIIb.

[00243] A sequência de polinucleotídeo e sequência de aminoáci- dode FcyRI são apresentadas na NM_000566.3 e NP_000557.1, res-pectivamente; a sequência de polinucleotídeo e sequência de aminoá- cido de FcyRIIa são apresentadas na BC020823.1 e AAH20823.1, respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e sequência de ami- noácido de FcyRIIb são apresentadas na BC146678.1 e AAI46679.1, respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e sequência de ami- noácido de FcyRIIIa são apresentadas na BC033678.1 e AAH33678.1, respectivamente; e a sequência de polinucleotídeo e sequência de aminoácido de FcyRIIIb são apresentadas na BC128562.1 e AAI28563.1, respectivamente (o número de registro RefSeq).

[00244] Em FcyRIIa, existem dois alótipos, um onde o aminoácido na posição 131 de FcyRIIa é a histidina (tipo H) e o outro onde este aminoácido é substituído por arginina (tipo I) (J. Exp. Med. 172: 19-25, 1990). Em FcyRIIb, existem dois alótipos, um em que o aminoácido na posição 232 de FcyRIIb é isoleucina (tipo I) e o outro em que este aminoácido é substituído por treonina (tipo T) (Arthritis. Rheum 46: 1242-1254 (2002)). Em FcyRIIIa, existem dois alótipos, um em que o aminoácido na posição 158 de FcyRIIIa é valina (tipo V) e o outro em que este aminoácido é substituído por fenilalanina (tipo F) (J. Clin. Invest. 100 (5): 1059-1070 (1997)). Além disso, em FcyRIIIb, existem dois alótipos, o tipo NA1 e o tipo NA2 (85 J. Clin Invest: 1287-1295 (1990)).

[00245] Uma das substâncias (o ligante) na observação de uma interação é imobilizada sobre uma camada fina de ouro sobre um sensor de chip, e por um raio de luz do lado reverso do chip do sensor de modo que reflexão total ocorre na interface entre a película de ouro fina e o vidro, uma porção de intensidade de reflexão reduzida é formada na parte da luz refletida (sinal de SPR). Quando a outra das substâncias (o analito) na observação de uma interação é feita fluir sobre a superfície do chip sensor e o ligando se liga ao analito, a massa da molécula do ligando imobilizado aumenta e o índice de refração do solvente sobre a superfície do chip sensor muda. A posição do sinal de SPR se desloca como um resultado desta alteração do índice de refração (por outro lado, a posição de sinal retorna quando esta ligação se dissocia). O sistema Biacore indica a quantidade de deslocamento acima mencionado, ou, mais especificamente, o tempo variável de massa através da representação gráfica da variação da massa na superfície do chip sensor na ordenada como os dados de medição (diagrama de sensor). A quantidade de analito ligado ao ligando capturado na superfície do chip sensor é determinada a partir do diagrama de sensor (quantidade de alteração na resposta do diagrama de sensor antes e depois de uma interação com o analito). No entanto, uma vez que a quantidade de ligação depende também da quantidade de ligando, que é necessário para fazer a comparação em condições em que a quantidade de ligando é considerada como sendo praticamente a mesma. Os parâ-metros cinéticos, tais como as constantes de velocidade de associação (ka) e constantes de velocidade de dissociação (kd) são determinados a partir da curva do diagrama de sensor, e as afinidades (KD) são determinadas a partir da razão das constantes. No método BIA- CORE, um método para a medição da inibição é de preferência usado. Um exemplo do método para a medição da inibição é descrito em Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (2006) 103 (11), 4005-4010.

[00246] Na presente invenção, se ou não a atividade de ligação em relação a cada tipo de receptor de FCY é aumentada ou diminuída em um polipeptídeo ou em uma região Fc da presente invenção pode ser determinada, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare), que é um analisador de interação, que utiliza fenômenos de ressonância de plasmon de superfície (SPR), como mostrado nos Exemplos. Biacore inclui quaisquer modelos, tais como Biacore T100, T200, X100, A100, 4000, 3000, 2000, 1000, e C. Para o chip sensor, quaisquer chips sensores de Biacore, como CM7, CM5, a CM4, CM3, C1, SA, NTA, L1, HPA, e chip Au podem ser utilizados. Para o tampão de execução, além de HBE-PE+, um tampão produzido usando HEPES, ácido fosfórico, ACES, Tris, ácido cítrico, e tal para ajustar o pH para um pH quase neutro, tal como de 7,4 pode ser utilizado. As medições podem ser efetuadas na gama de 4 °C a 37 °C. Uma proteína para a captura de anticorpos, tais como Proteína A, Proteína G, ou proteína L, que captura um anticorpo, o anticorpo IgG anti-humana, o IgG-Fab anti-humana, anticorpos de cadeia L anti-humana, anticorpo Fc anti-humano, proteína de antígeno, ou peptídeo de antígeno é imobilizado em um chip sensor através de métodos de acoplamento, tais como acoplamento de amina, acoplamento de dissulfito, ou acoplamento de aldeído. Vários tipos de receptores de Fcy tais como receptor Fcy I, tipo IIa R, tipo IIa H, IIb, tipo IIIa F, tipo V, e IIIb são aplicados como analitos e interações foram medidas para obter diagrama de sensores. Neste ponto, as medições podem ser realizadas pelo ajuste de concentração de receptor Fcy para um nível na gama de vários uM a vários pM de acordo com a força da interação tal como KD da amostra a ser medida. A constante de dissociação (KD) é obtida a partir da medição, e observando se o valor de KD é diminuído ou aumentado, pode-se determinar se a atividade de ligação de uma região Fc ou um polipeptídeo da presente invenção a vários receptores de Fcy é aumentada ou diminu- ída. Quando a captura é realizada pela proteína de captura de anticorpo imobilizada em um chip sensor, o nível de variação nos valores do diagrama de sensor antes e após a aplicação de diferentes receptores de FCY como analitos para os anticorpos no chip sensor é usado como um indicador, e de acordo com o grau do aumento de valor, pode-se determinar se a atividade de ligação do polipeptídeo ou uma região Fc da presente invenção a vários receptores de Fcy é aumentada ou diminuída. Em alternativa, também é possível imobilizar vários receptores Fcy, em vez de anticorpos, nos chips de sensor, e fazê-los interagir com uma amostra de anticorpo a ser avaliada. Se a atividade de ligação da região Fc ou o polipeptídeo da presente invenção aos vários receptores de Fcy é aumentada ou diminuída pode ser determinada a partir da diminuição ou aumento nos valores de KD calculados a partir dos diagramas de sensores de interação, ou a partir do grau de aumento do diagrama de sensores antes e depois de permitir que a amostra de anticorpos reaja.

[00247] Especificamente, a atividade de ligação de uma região Fc a um receptor Fcy pode ser medida pela triagem do Ensaio Homogêneo De Proximidade com Luminescência Amplificada (ALFA), o método BIACORE que utiliza fenômeno de ressonância de plasmon de superfície (SPR), ou tais, em adição a ELISA ou classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (2006) 103 (11): 4005-4010).

[00248] Seleção ALFA é realizada por tecnologia ALFA, que utiliza duas esferas, um doador e um aceitador, com base nos seguintes princípios. Sinais luminosos são detectados apenas quando moléculas ligadas às esferas doadoras interagem fisicamente com moléculas ligadas às esferas aceitadoras, e as duas esferas estão em estreita proximidade uma da outra. Fotossensibilizador excitado por Laser nas esferas doadoras converte oxigênio ambiente para oxigênio singleto em estado excitado. O oxigênio singleto é dispersado em torno das esferas doadoras e, quando atinge as esferas aceitadoras adjacentes, a reação quimioluminescente é induzida na esferas, e é finalmente, a luz é emitida. Quando as moléculas ligadas às esferas doadoras não interagem com as moléculas ligadas às esferas aceitadoras, a reação quimioluminescente não ocorre porque o oxigênio singleto produzido pelas esferas doadoras não atinge as esferas aceitadoras.

[00249] Por exemplo, um polipeptídeo de teste biotinilado é ligado a estreptavidina nas esferas doadoras e receptor FCY etiquetados com glutationa S-transferase (GST) está ligado às esferas aceitadoras. Na ausência de um polipeptídeo concorrente, o polipeptídeo de teste interage com o receptor Fcy e produz sinais de 520-620 nm. Um polipeptí- deo não rotulado compete com o polipeptídeo de teste pela interação com o receptor Fcy. Atividades de ligação relativas podem ser determinadas pela quantificação da diminuição na fluorescência observada como resultado da competição. Biotinilação de polipeptídeo utilizando Sulfo-NHS-biotina e tal é bem conhecida. O método de expressão do receptor Fcy e GST em uma célula portadora de um gene de fusão produzido por fusão de um polinucleotídeo que codifica o receptor de Fcy em moldura com um polinucleotídeo que codifica GST em um vetor exprimível, e realiza a purificação utilizando uma coluna de glutati- ona é adequadamente adotado como um método para etiquetar um receptor Fcy com GST. Os sinais obtidos são de preferência analisados, por exemplo, ajustando-os a um modelo de competição de um local, que utiliza uma análise de regressão não linear utilizando um software como o GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).

[00250] O marcador não está limitado ao uso de GST, e qualquer marcador tais como histidina, MBP, CBP, marcador Flag, um marcador de HA, marcador V5, e marcador c-myc, pode ser utilizado. Além disso, a ligação de um polipeptídeo de teste a esferas doadoras não se limita a ligação utilizando a reação da estreptavidina-biotina. Em particular, quando um polipeptídeo de teste é um anticorpo ou peptí- deo portador de Fc, tal como um polipeptídeo de fusão de Fc, um método de ligação de um polipeptídeo de teste através de uma proteína de reconhecimento de Fc, tal como Proteína A ou Proteína G sobre as esferas de doadores pode ser considerado.

[00251] Redução de ligação a atividade de ligação FCYR ou FCYR refere-se a ligação a FCYR com uma atividade de ligação substancialmente mais fraca do que a do polipeptídeo progenitor quando os ensaios são realizados utilizando praticamente a mesma quantidade de polipeptídeos a serem comparados.

[00252] Polipeptídeos heterodimerizados com ligação atenuada, reduzida ou reduzido a FcyR ou atividade de ligação FcyR refere-se aqueles que se ligam a FcyR com uma atividade de ligação substancialmente mais fraca do que a dos polipeptídeos homodimerizados quando os ensaios são realizados utilizando praticamente a mesma quantidade dos polipeptídeos a serem comparados.

[00253] Por exemplo, nos valores de KD medidos pelos métodos de medição acima mencionados, a relação de valor KD (valor de KD do polipeptídeo progenitor/valor de KD do polipeptídeo mutado) é, de pre-ferência 0,99 ou menos, 0,95 ou menos, de 0,9 ou menos, 0,8 ou menos, de 0,7 ou menos, de 0,5 ou menos, de 0,3 ou menos, e de 0,1 ou menos, e mais preferivelmente, 0,08 ou menos, 0,05 ou menos, 0,02 ou menos, 0,01 ou menos, e 0,001 ou menos. Aqui, a relação de valor KD é também chamada a relação de KD.

[00254] Os valores de KD medidos pelos métodos de medição acima mencionados são, de preferência um aumento de 1 pM ou mais, e mais de preferência um aumento de 10 pM, 100 pM, 1 nM ou mais, 2 nM, ou mais, 3 nM ou mais, 5 nM ou mais, 10 nM ou mais, 20 nM ou mais, 50 nM ou mais, 100 nM ou mais, ou um 1 μM ou mais. Os valo- res de KD medidos pelos métodos de medição acima mencionados são, de preferência 1 pM ou mais, e preferência, 2 pM ou mais, 100 pM ou menos, 1 nM ou mais, 10 nM ou mais, 100 nM ou mais, 500 nM ou mais, 1 μM ou mais, 3 μM ou mais, ou 5 μM ou mais.

[00255] Aperfeiçoamento, aumento ou melhora de ligação a FCYR ou atividade de ligação FCYR refere-se a ligação a FCYR com uma atividade de ligação substancialmente mais forte do que a do polipeptí- deo progenitor quando os ensaios são realizados utilizando praticamente a mesma quantidade de polipeptídeos para ser comparados.

[00256] Polipeptídeos heterodimerizados com ligação reforçada, aumentada, ou melhor a FcyR ou atividade de ligação FcyR refere-se aqueles que se ligam a FcyR com uma atividade de ligação substanci-almente mais forte do que a de polipeptídeos homodimerizados quando os ensaios são realizados utilizando praticamente a mesma quantidade dos polipeptídeos a serem comparados.

[00257] Por exemplo, nos valores de KD medidos pelos métodos de medição acima mencionados, a relação de valor KD (valor de KD do polipeptídeo progenitor/valor de KD do polipeptídeo mutado) é de pre-ferência 1,1 ou mais, 1,2 ou mais, 1,3 ou mais, 1,5 ou mais, 1,8 ou mais, dois ou mais, ou 3 ou mais, e mais de preferência, 5 ou mais, 10 ou mais, 100 ou mais, 250 ou mais, ou 1000 ou mais. Aqui, a relação de valor KD é também denominada razão KD.

[00258] Os valores de KD medidos pelos métodos de medição acima mencionados são, de preferência diminuído em 1 pM ou mais, e mais preferivelmente diminuídos em 10 pM, 100 pM, 1 nM ou mais, 2 nM ou mais, 3 nM ou mais, 5 nM ou mais, 10 nM ou mais, 20 nM ou mais, 50 nM ou mais, 100 nM ou mais, ou 1 μM ou mais.

[00259] Os valores de KD medidos pelos métodos de medição acima mencionados são, de preferência 5 μM ou menos, e mais preferivelmente, 3 μM ou menos, 1 μM ou menos, 0,5 μM ou menos, 0,1 μM ou menos, 0,01 μM ou menos, 1 nM ou menos, 0,1 nM ou menos, 0.001 nM ou menos, ou 1 pM ou menos.

[00260] Na presente invenção, quando a alteração da função de região Fc do polipeptídeo tem um aumento da atividade de ligação a um receptor de FCY, mutações de aminoácidos podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc acima. O tipo e amplitude da mutação de aminoácidos a ser introduzida não são particularmente limitados.

[00261] A força da interação entre a região Fc de um anticorpo e FcyR tem sido relatada como dependendo da concentração de íon Zn2+ (Immunology Letters 143 (2012) 60-69). O anticorpo mostra uma interação forte entre a região Fc e FcgR quando a concentração de íon Zn2+ da região Fc é maior. A quelação de Zn2+ por His310 His435 e presente em CH3 da região Fc de anticorpo abre cada domínio CH2 na região Fc de uma posição distal. Isso facilita a interação entre o domínio CH2 e FcgR, e a interação entre a região Fc e FcgR é reforçada. Uma modalidade não limitativa do anticorpo da presente invenção inclui uma região Fc, em que His na posição 310, His na posição 435, His na posição 433, e/ou Asn na posição 434 (numeração EU) é quelado com o Zn2+.

[00262] Quando o receptor de Fcy é FcyRIa, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região i das Tabelas 2-1 e 2-2 aqui podem ser introduzidas nas sequências de ami- noácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando o receptor Fcy é FcyRIa, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região ii das Tabelas 2-1, 2-2, e 2-3 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00263] Quando o receptor de FCY é FcYRIIa R, pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região i das Tabelas 3-1 e 3-2 são aqui descritos pode ser introduzida nas sequências de aminoácido do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando o receptor Fcy é FcyRIIa R, pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região ii das Tabelas 3-1 e 3-2 aqui pode ser ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00264] Quando o receptor de Fcy é FcyRIIa H, pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região i da Tabela 4 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando o receptor Fcy é FcyRIIa H, pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região ii da Tabela 4 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00265] Quando o receptor de Fcy é FcyRIIb, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região i da Tabela 5 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando o receptor Fcy é FcyRIIb, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região ii da Tabela 5 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00266] Quando o receptor de FCY é FcyRIIIa, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região i da Tabela 6 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando o receptor Fcy é FcyRIIIa, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região ii da Tabela 6 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando o receptor Fcy é FcyRIIIa, mais especificamente, pelo menos, um ou mais (por exemplo, duas ou três) mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y; substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y ou Q; substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W; substituição de aminoácido S na posição 239 (numeração EU) com M; substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D; substituição de aminoácido D na posição 270 (numeração EU) com E; substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A; substituição de aminoácido K na posição 326 (numeração EU) com D; substituição de aminoácido a na posição 327 (numeração EU) com D; substituição de aminoácido L na posição 328 (numeração EU) com W; substituição de aminoácido a na posição 330 (numeração EU) com M ou K, e substituição de aminoácido K na posição 334 (numera- ção EU) com E ou L podem ser introduzidas nas sequências de ami- noácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Ainda mais especificamente, quando o receptor FCY é FcyRIIIa, pelo menos, um ou mais (por exemplo, duas ou três) mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em substituição de aminoácido S na posição 239 (numeração EU) com D; substituição de aminoácido a na posição 330 (numeração EU) com L, e substituição de aminoácido que na posição 332 (numeração EU) com E, podem ser introduzidas na sequência de aminoácidos de qualquer um dos polipeptídeos que constituem a região Fc, o primeiro poli- peptídeo ou o segundo polipeptídeo, e pelo menos um ou mais (por exemplo, duas ou três) mutações de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y; substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W; e substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A, podem ser introduzidas na sequência de aminoácidos do outro polipeptídeo.

[00267] Ainda mais especificamente, quando o receptor Fcy é FcyRIIIa, uma mutação pode ser introduzida em, pelo menos, um ou mais (por exemplo, dois ou três) aminoácidos selecionados de entre Leu na posição 234, Leu na posição 235, Gly em posição 236, Ser na posição 239 de His na posição 268, na posição 270 Asp, Ser na posição 298, Ala na posição 327, Leu na posição 328 e Lys na posição 334 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de um ou dos poli- peptídeos que constituem a região Fc, o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo, e uma mutação pode ser introduzida em, pelo menos, um ou mais (por exemplo, dois ou três) aminoácidos selecionados de entre Asp na posição 270, Lys na posição 326, Ala na posição 330 e Lys na posição 334 (numeração EU) na sequência de ami- noácidos do outro polipeptídeo.

[00268] O aminoácido a ser alterado pode ser selecionado de forma adequada, e de preferência pelo menos uma ou mais (por exemplo, duas ou três) mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00269] substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[00270] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y ou Q;

[00271] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[00272] substituição de aminoácido S na posição 239 (numeração EU) com M;

[00273] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[00274] substituição de aminoácido D na posição 270 (numeração EU) com E;

[00275] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A;

[00276] substituição de aminoácido A na posição 327 (numeração EU) com D;

[00277] substituição de aminoácido L na posição 328 (numeração EU) com W; e

[00278] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com G pode ser introduzida na sequência de aminoácidos de qualquer um dos polipeptídeos que constituem a região Fc, o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo, e, pelo menos, uma ou mais (por exemplo, duas ou três) mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em:

[00279] substituição de aminoácido D na posição 270 (numeração EU) com E;

[00280] substituição de aminoácido K na posição 326 (numeração EU) com D;

[00281] substituição de aminoácido A na posição 330 (numeração EU) com M ou K; e

[00282] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com E pode ser introduzida na sequência de aminoácidos do outro polipeptídeo.

[00283] Mais preferivelmente, qualquer um conjunto de mutações de (i) a (vi) podem ser introduzidas na sequência de aminoácidos de qualquer um dos polipeptídeos que constituem a região Fc, o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo, e qualquer um conjunto de mutações (vii) a (ix) podem ser introduzidas na sequência de aminoá- cidos do outro polipeptídeo: (i) substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[00284] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y;

[00285] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[00286] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D, e

[00287] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A; (ii) substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[00288] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y;

[00289] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[00290] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[00291] substituição de aminoácido D na posição 270 (numeração EU) com E, e

[00292] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A; (iii) substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[00293] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Q;

[00294] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[00295] substituição de aminoácido S na posição 239 (numeração EU) com M;

[00296] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[00297] substituição de aminoácido D na posição 270 (numeração EU) com E, e

[00298] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A; (iv) substituição de aminoácido L na posição 234 (numera- ção EU) com Y;

[00299] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y;

[00300] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[00301] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[00302] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A, e

[00303] substituição de aminoácido A na posição 327 (numeração EU) com D; (v) substituição de aminoácido L na posição 234 (numeração EU) com Y;

[00304] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y;

[00305] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[00306] substituição de aminoácido S na posição 239 (numeração EU) com M;

[00307] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[00308] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A, e

[00309] substituição de aminoácido A na posição 327 (numeração EU) com D; (vi) substituição de aminoácido L na posição 234 (numera- ção EU) com Y;

[00310] substituição de aminoácido L na posição 235 (numeração EU) com Y;

[00311] substituição de aminoácido G na posição 236 (numeração EU) com W;

[00312] substituição de aminoácido S na posição 239 (numeração EU) com M;

[00313] substituição de aminoácido na posição 268 H (numeração EU) com D;

[00314] substituição de aminoácido S na posição 298 (numeração EU) com A;

[00315] substituição de aminoácido A na posição 327 (numeração EU) com D;

[00316] substituição de aminoácido L na posição 328 (numeração EU) com W; e

[00317] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com L; (vii) substituição de aminoácido K na posição 326 (numeração EU) com D;

[00318] substituição de aminoácido A na posição 330 (numeração EU) com M; e

[00319] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com E; (viii) substituição de aminoácido D na posição 270 (nume- ração EU) com E;

[00320] substituição de aminoácido K na posição 326 (numeração EU) com D;

[00321] substituição de aminoácido A na posição 330 (numeração EU) com M; e

[00322] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com E; (ix) substituição de aminoácido D na posição 270 (numeração EU) com E;

[00323] substituição de aminoácido K na posição 326 (numeração EU) com D;

[00324] substituição de aminoácido A na posição 330 (numeração EU) com K; e

[00325] substituição de aminoácido K na posição 334 (numeração EU) com E.

[00326] Seletividade de atividade de ligação pode ser determinada medindo a atividade de ligação do polipeptídeo para as respectivas isoformas de receptor FCY, e, em seguida, determinando as suas proporções. Por exemplo, a quantidade de ligação e o valor KD para uma FcyR pode ser usado como um indicador da atividade de ligação.

[00327] Aqui, "melhora da seletividade da atividade de ligação" significa que, por exemplo, a proporção de atividade de ligação de um poli- peptídeo de teste a isoformas de receptor FCY (atividade de ligação do polipeptídeo de teste para uma primeira isoforma de receptor Fcy/atividade de ligação do polipeptídeo de teste para a segunda isoforma de receptor Fcy) é aumentada em 0,1 ou mais, ou, de preferência 0,2 ou mais, 0,5 ou mais, 1 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, 5 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais, 50 ou mais, 70 ou mais, 100 ou mais, 150 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, ou 1000 ou mais, quando comparada com a proporção de atividades de ligação do polipeptídeo progenitor do polipeptídeo de teste para as isoformas de receptor Fcy (atividade de ligação do po- lipeptídeo progenitor do polipeptídeo de teste a primeira isoforma de receptor Fcy/atividade de ligação do polipeptídeo progenitor do polipep- tídeo de teste a segunda isoforma de receptor Fcy) determinada com base no método de medição acima mencionado. Além disso, a diminuição da seletividade de isoforma de receptor de Fcy significa que, por exemplo, a proporção de atividade de ligação de um polipeptídeo de teste a isoformas de receptor Fcy é reduzida em 0,1 ou mais, ou, de preferência 0,2 ou mais, 0,5 ou mais, 1 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, 5 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais, 50 ou mais, 70 ou mais, 100 ou mais, 150 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, ou 1000 ou mais, quando comparada com a proporção de atividades de ligação do peptídeo progenitor do polipeptí- deo de teste para as isoformas de receptor de Fcy determinadas com base no método de medição acima mencionado.

[00328] Aqui, como um indicador de seletividade, por exemplo, a razão A/I, que mostra a relação entre as atividades de ligação em relação a FcyR de ativação e FcyR inibidor também pode ser usada. Os valores obtidos dividindo-se a KD do polipeptídeo de teste para FcYRIIb pela KD do polipeptídeo de teste para FcYRIIa tipo H ou Tipo I foram utilizados como as respectivas razões A/I. A razão A/I é preferi-velmente 1,1 ou mais, 1,5 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, ou 5 ou mais, e mais preferivelmente 6 ou mais, 8 ou mais, ou 9 ou mais.

[00329] Aqui, como um indicador de seletividade, por exemplo, a razão FcYRIIIa F/FcYRIIb, que é um valor obtido dividindo a KD para FcYRIIb pela KD para FcYRIIIa F pode ser usada. Os valores obtidos dividindo a KD do polipeptídeo de teste para FcYRIIb pela KD do poli- peptídeo de teste para FcYRIIIa foram definidos como as respectivas razões FcYRIIIa F/FcYRIIB. A razão FcYRIIIA F/FcYRIIb é preferivelmente 1,1 ou mais, 1,5 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, ou 5 ou mais, e mais de preferência 10 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, 80 ou mais, 90 ou mais, 100 ou mais, 110 ou mais, 120 ou mais, 130 ou mais, 140 ou mais, 150 ou mais, 200 ou mais, 210 ou mais, 220 ou mais, 230 ou mais, ou 240 ou mais.

[00330] Na presente invenção, quando a alteração da função de região Fc do polipeptídeo é a melhora da seletividade da atividade de ligação a um receptor de FcY, uma mutação de aminoácidos pode ser introduzida na sequência de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. O tipo e amplitude da mutação de aminoácidos a ser introduzida não é particularmente limitado.

[00331] Em um caso em que a ativação dos receptores de FcY é FcYRIa, o receptor FcY inibidor é FcYRIIb, e a melhora da seletividade é reforço seletivo da atividade de ligação ao FcYRIa do que a FcYRIIb, pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região b a das Tabelas 19-1, 19-2, 19-3, e 19-4 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando a melhora da seletividade é reforço seletivo de atividade de ligação a FcYRIa do que a FcYRIIb, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região b de Tabelas 19-1, 192, 19-3, 19-4, e 19-5 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00332] Em um caso em que a ativação dos receptores de FCY é FcYRIa, o receptor FCY inibidor é FcYRIIb, e a melhora da seletividade é a redução seletiva da atividade de ligação a FcyRIa do que a FcyRIIb, pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região c da Tabelas 23-1 e 23-2 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando a melhora da seletividade é a redução seletiva da atividade de ligação a FcyRIa do que a FcyRIIb, pelo menos, uma ou mais mutações de ami- noácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região d de Tabelas 23-1 e 23-2 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro poli- peptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00333] Em um caso em que a ativação dos receptores de Fcy é FcyRIIa R, o receptor de Fcy inibidor é FcyRIIb, e a melhora da seletividade é reforço seletivo da atividade de ligação a FcyRIIa do que a FcyRIIb, pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região b de Tabela 20-1 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando a melhora da seletividade é reforço seletivo de atividade de ligação a FcYRIIa R do que a FcYRIIb, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoá- cidos descritas na Região b das tabelas 20-1, 20-2, e 20-3 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptí- deo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00334] Em um caso em que a ativação dos receptores de FcY é FcYRIIa R, o receptor FcY inibidor é FcYRIIb, e a melhora da seletividade é a redução seletiva da atividade de ligação a FcYRIIa do que a FcYRIIb, pelo menos uma mutação de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região c da Tabela 24-1 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando a melhora da seletividade é a redução seletiva da atividade de ligação a FcYRIIa R do que a FcYRIIb, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região d das Tabelas 24-1 e 24-2 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00335] Em um caso em que a ativação dos receptores de FcY é FcYRIIa H, o receptor FcY inibidor é FcYRIIb, e a melhora da seletividade é reforço seletivo da atividade de ligação a FcYRIIa H do que a FcYRIIb, pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região a da Tabela 21-1 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando a melhora da seletividade é reforço seletivo de atividade de ligação a FcYRIIa H do que a FcYRIIb, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoá- cidos descritas na Região b de Tabelas 21-1, 21-2, e 21-3 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptí- deo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00336] Em um caso em que a ativação dos receptores de FCY é FcYRIIa H, o receptor FCY inibidor é FcYRIIb, e a melhora da seletividade é a redução seletiva da atividade de ligação a FcyRIIa H do que a FcyRIIb, pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região c da Tabelas 25-1 e 25-2 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando a melhora da seletividade é a redução seletiva da atividade de ligação a FcyRIIa H que a FcyRIIb, pelo menos, uma ou mais mutações de ami- noácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região d das Tabelas 25-1, 25-2, e 25-3 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro po- lipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00337] Em um caso em que a ativação dos receptores de Fcy é FcyRIIIa, o receptor Fcy inibidor é FcyRIIb, e a melhora da seletividade é reforço seletivo da atividade de ligação a FcyRIIIa do que a FcyRIIb, pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região a da Tabela 22-1 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo poli- peptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando a melhora da seletividade é reforço seletivo de atividade de ligação a FcyRIIIa que a FcyRIIb, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região b de Tabelas 22-1, 22-2, e 22-3 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00338] Em um caso em que a ativação dos receptores de FCY é FcYRIIIa, o receptor FCY inibidor é FcYRIIb, e a melhora da seletividade é a redução seletiva da atividade de ligação a FcyRIIIa do que a FcyRIIb, pelo menos uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região c da Tabelas 26-1 e 26-2 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc. Além disso, quando a melhora da seletividade é a redução seletiva da atividade de ligação a FcyRIIIa que a FcyRIIb, pelo menos, uma ou mais mutações de amino- ácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas na Região d de Tabelas 26-1, 26-2, 26-3, 26-4 e aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00339] Aqui, o reforço seletivo de atividade de ligação a um receptor de Fcy desejado significa qualquer um dos seguintes casos: (i) atividade de ligação a um receptor de Fcy desejado é aumentada, e as atividades de ligação a outros receptores diferentes do receptor de Fcy desejado são inalteradas ou diminuídas; (ii) atividade de ligação a um receptor de Fcy desejado é aumentada, e as atividades de ligação a outros receptores diferentes do receptor de Fcy desejado são também reforçadas, mas o grau de aumento de atividade de ligação a outros receptores diferentes do receptor de Fcy desejado é menor do que o grau de aumento de atividade de ligação ao receptor Fcy desejado, ou (iii) atividade de ligação a um receptor de Fcy desejado é reduzida, mas o grau de redução da atividade de ligação é menor do que o grau de redução da atividade de ligação a outros receptores Fcy diferentes do receptor de FCY desejado.

[00340] Além disso, a redução seletiva da atividade de ligação a um receptor de Fcy desejado significa qualquer um dos seguintes casos: (i) atividade de ligação a um receptor de Fcy desejado é diminuída, e as atividades de ligação a outros receptores diferentes do receptor de Fcy desejado são inalteradas ou melhoradas; (ii) atividade de ligação a um receptor de Fcy desejado é diminuída, e as atividades de ligação a outros receptores diferentes do receptor de Fcy desejado são também diminuídas, mas o grau de redução da atividade de ligação a outros receptores diferentes do receptor Fcy desejado é menor do que o grau de redução da atividade de ligação ao receptor Fcy desejado, ou (iii) atividade de ligação a um receptor de Fcy desejado é aumentada, mas o grau de aumento de atividade de ligação é menor do que o grau de aumento de atividade de ligação a receptores Fcy diferentes do receptor Fcy desejado.

[00341] Aqui, a estabilidade físico-química de um meio de polipeptí- deos, por exemplo, a estabilidade termodinâmica de um polipeptídeo, que pode ser determinada utilizando, por exemplo, o valor de Tm do domínio CH2 como um indicador. Os valores de Tm podem ser medidos por dicroísmo circular (CD), calorimetria de varredura diferencial (DSC), ou fluorimetria de varredura diferencial (DSF).

[00342] A mudança na elipticidade molar residual média (θ), que acompanha um aumento em temperatura é medida por CD para calcular o valor de Tm. O instrumento de medição inclui, por exemplo, um medidor de dispersão dicroísmo circular (JASCO Corporation). Quando os espectros de CD são medidos a um comprimento de onda adequado (por exemplo, 208 nm ou 222 nm), enquanto se aumenta a temperatura, θ aumenta a uma determinada temperatura, e torna-se um valor constante a temperaturas mais elevadas. A temperatura a que um valor médio entre θ de baixa temperatura e θ de alta temperatura é tomada como Tm. Para a medição, é possível utilizar, por exemplo, uma solução de proteínas preparada usando ácido cítrico, tris, solução de fosfato, ou tal, a uma concentração de várias centenas de ug/ml.

[00343] DSC mede a variação de calorias, que acompanha um aumento em temperatura para calcular o valor de Tm. O instrumento de medição inclui MicroCal VP-DSC e Micro Cal Capilary DSC (ambos da DKSH Japan). A solução de proteína e um tampão são preenchidos nas células de medição, e em que as diferenças de temperatura entre as células são medidas ao mesmo tempo aumentando a temperatura, uma mudança de reação endotérmica é observada a partir de uma determinada temperatura. Esta temperatura é tomada para ser Tm. Para a medição, é possível utilizar, por exemplo, uma solução de proteína preparada utilizando tampão de citrato, TBS, PBS, tampão de histidi- na, ou tal a uma concentração de várias dezenas ug/ml a várias centenas de ug/ml.

[00344] DSF detecta a exposição dos resíduos hidrofóbicos que acompanha um aumento em temperatura por meio de um reagente fluorescente (por exemplo, SYPRO Orange) que se liga especificamente a resíduos hidrófobos para calcular o valor de Tm. A solução de proteína e um reagente de fluorescência são misturados em proporções adequadas, e quando as intensidades de fluorescência são medidas ao mesmo tempo aumentando a temperatura utilizando um instrumento de RT-PCR, o aumento da intensidade de fluorescência é observado a uma determinada temperatura. Esta temperatura é tomada para ser Tm. Exemplos do instrumento de medição incluem RotorGene Q (QIAGEN), e sistema de análise de PCR em tempo real CFX96 (Bio-Rad). Para a medição, é possível utilizar, por exemplo, uma solução de proteínas preparada utilizando PBS, tampão de histi- dina, ou tal a uma concentração de várias dezenas ug/ml a várias cen-tenas de ug/ml.

[00345] Aqui, a melhora da estabilidade físico-química de um poli- peptídeo significa que, por exemplo, o valor de Tm do domínio CH2 na região Fc de um polipeptídeo de teste determinado com base no método de medição acima mencionado é aumentada em 0,1 graus ou mais, de preferência 0,2 ou graus mais, 0,3 ou mais graus, 0,4 graus ou mais, de 0,5 graus, ou mais, 1 grau ou mais, dois graus ou mais, 3 ou mais graus, 4 ou mais graus, 5 graus ou mais, ou 10 graus ou mais em comparação com o valor tm do domínio CH2 na região Fc de um polipeptídeo de controle. Além disso, a melhora da estabilidade física de um polipeptídeo refere-se a redução suprimida da estabilidade física de um polipeptídeo, e por exemplo, a redução do valor Tm do domínio CH2 na região Fc de um polipeptídeo de teste é suprimida em relação ao valor Tm do CH2 domínio da região Fc de um polipeptídeo de controle por 0,1 graus ou mais, de preferência 0,2 ou mais graus, 0,3 graus ou mais, 0,4 ou mais graus, 0,5 graus ou mais, 1 grau ou mais, 2 graus ou mais, 3 graus ou mais, 4 graus ou mais, 5 graus ou mais, ou 10 graus ou mais, tal como determinado com base no método de medição acima mencionado.

[00346] Aqui, "a redução da estabilidade física de um polipeptídeo" significa que o valor de Tm do domínio CH2 na região Fc de um poli- peptídeo de teste determinado com base no método de medição acima mencionado é diminuída de 0,1 graus ou mais, de preferência 0,2 ou mais graus, 0,3 graus ou mais, 0,4 ou mais graus, 0,5 graus ou mais, 1 grau ou mais, 2 graus ou mais, 3 graus ou mais, 4 graus ou mais, 5 graus ou mais, ou 10 graus ou mais, em comparação com o valor Tm do domínio CH2 na região Fc de um peptídeo de controle.

[00347] A presente invenção também compreende um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, em que o polipeptídeo é caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um heterodímero compre-endendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, e em que a função da região Fc é alterada em comparação com a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homodímero que compreende apenas o primeiro polipeptídeo ou quando comparada com a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homodímero que compreende apenas o segundo polipeptídeo.

[00348] No polipeptídeo, a alteração da função de região Fc pode ser uma alteração que melhora ainda mais a estabilidade físico- química, além de, pelo menos, uma ou mais alterações selecionadas a partir do grupo consistindo em melhora da atividade de ligação, redução da ligação, e melhora da seletividade de atividade de ligação do polipeptídeo a um receptor de FCY, e contanto que qualquer uma dessas funções seja alterada, pode-se dizer que a função da região Fc da presente invenção é alterada.

[00349] Na presente invenção, a frase "quando mutações de ami- noácido são introduzidas na região Fc, tanto no primeiro polipeptídeo e no segundo polipeptídeo, a função da região Fc não é alterada" significa que, quando as mesmas mutações de aminoácidos são introduzidas em ambos o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo, a função desejada não é melhorada. Por exemplo, isso significa que, quando se pretende aumentar a atividade de ligação de um polipeptí- deo a um receptor Fcy, a atividade de ligação não se altera ou diminui, quando se pretende reduzir a atividade de ligação, a atividade de ligação não se altera ou é aumentada, quando se pretende melhorar a seletividade da atividade de ligação, a seletividade não é melhorada, e quando se pretende melhorar a estabilidade físico-química do polipep- tídeo, a estabilidade não é alterada ou é diminuída. Em relação à mutação de aminoácidos, a frase "quando ela introduzida em apenas uma das regiões Fe, a função da região Fc é alterada" significa que a função desejada é melhorada quando a mutação de aminoácidos é introduzida apenas em um ou outro dentre o primeiro polipeptídeo ou o segundo polipeptídeo. Por exemplo, isso significa que, quando se pretende aumentar a atividade de ligação de um polipeptídeo a um receptor de FCY, a atividade de ligação é aumentada, quando se pretende reduzir a atividade de ligação, a atividade de ligação é reduzida, quando se pretende melhorar a seletividade de atividade de ligação, a seletividade é melhorada, e quando se pretende melhorar a estabilidade físico-química de um polipeptídeo, a estabilidade é melhorada.

[00350] A presente invenção também inclui um polipeptídeo que é caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um hetero- dímero compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo poli- peptídeo, e que é caracterizado por ter uma Tm mais alta do que a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta por um homodímero que compreende apenas o primeiro polipeptídeo ou aquele de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homodímero que compreende apenas o segundo polipeptídeo. Juntamente com uma alteração que melhora a estabilidade físico-química, ou seja, possuindo uma Tm elevada, o polipeptí- deo também pode ter alterações adicionais à função de região Fc.

[00351] Em um caso em que a alteração da função adicional da região Fc é a melhora da atividade de ligação FcyRIa, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas nas Tabelas 31-1, 312, e 31-3 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00352] Em um caso em que a alteração da função adicional da região Fc é a melhora da atividade de Ligação FcyRIIa R, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas nas Tabelas 32-1 e 32-2 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00353] Em um caso em que a alteração da função adicional da região Fc é a melhora da atividade de ligação FcYRIIa H, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas nas Tabelas 33-1 e 33-2 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00354] Em um caso em que a alteração da função adicional da região Fc é a melhora da atividade de ligação de FcYRIIb, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas nas Tabelas 34-1 e 34-2 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00355] Em um caso em que a alteração da função adicional da região Fc é a melhora da atividade de ligação FcYRIIIa, pelo menos, uma ou mais mutações de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações de aminoácidos descritas nas Tabelas 35-1 e 35-2 aqui podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc.

[00356] Na presente invenção, a combinação do primeiro polipeptí- deo e o segundo polipeptídeo em que as mutações de aminoácidos são introduzidas não é particularmente limitada, e exemplos incluem combi-nações de diferentes tipos/ou o mesmo tipo de polipeptídeos selecionados entre os polipeptídeos descritos em SEQ ID N°s de 2 a 4 e 6 a 60. Além disso, os exemplos preferidos incluem uma combinação de poli- peptídeos compreendendo o primeiro polipeptídeo e segundo polipeptí- deo descritos nos Exemplos aqui apresentados (uma combinação das cadeias H de dois anticorpos e da cadeia L de um anticorpo).

[00357] O polipeptídeo da presente invenção pode ser uma molécula de ligação ao antígeno. Na presente invenção, enquanto que a molécula de ligação ao anticorpo não está particularmente limitada no tipo, os exemplos preferidos incluem um anticorpo, um anticorpo bies- pecífico, ou uma molécula de fusão de Fc tal como uma proteína de fusão de Fc de peptídeo ou uma proteína de fusão de Fc scaffold. Anticorpo

[00358] Além disso, um anticorpo é fornecido como um polipeptídeo da presente invenção.

[00359] O termo "anticorpo/anticorpos" na presente invenção é utilizado na direção mais lato, e, desde que a atividade biológica desejada seja mostrada, compreende qualquer anticorpo, tais como anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos variantes, fragmentos de anticorpos, anticorpos poliespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecífi- cos), anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados.

[00360] Em relação aos anticorpos da presente invenção, o tipo de antígeno e origem do anticorpo não é limitada, e eles podem ser de qualquer tipo de anticorpos. A origem dos anticorpos não é particularmente limitada, mas exemplos incluem anticorpos humanos, anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, e anticorpos de coelho.

[00361] Os métodos para produzir os anticorpos são bem conhecidos dos versados na técnica, e, por exemplo, os anticorpos monoclo- nais podem ser produzidos pelo método do hibridoma (Kohler e Mils- tein, Nature 256: 495 (1975)), ou o método de recombinação (Patente U.S. No.. 4816567). Alternativamente, eles podem ser isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos de fago (Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)). Alternativamente, eles podem ser isolados a partir de um único clone de células B (N. Biotechnol. 28 (5): 253-457 (2011)).

[00362] Um anticorpo humanizado é também chamado de anticorpo humano remodelado. Especificamente, os anticorpos humanizados preparados por enxerto de CDRs de um anticorpo animal não humano, tal como um anticorpo de camundongo em um anticorpo humano e assim são conhecidos. Tecnologias comuns de engenharia genética para a obtenção de anticorpos humanizados também são conhecidas. Especificamente, por exemplo, PCR de extensão por sobreposição é conhecido como um método para o enxerto de CDR de anticorpos de camundongo em FRs humanas.

[00363] Um vetor para a expressão de um anticorpo humanizado pode ser produzido através da inserção de um DNA que codifica para uma região variável de anticorpo, no qual três CDRs e quatro FRs, são ligados e um DNA que codifica uma região constante de anticorpo humano em um vetor de expressão de modo que estes DNAs são fundidos em Tabela. Após este vetor de integração ser transfectado para um hospedeiro para estabelecer células recombinantes, estas células são cultivadas, e o DNA que codifica o anticorpo humanizado é expresso para produzir o anticorpo humanizado, na cultura de células (vide, Publicação de Patente Europeia No. EP 239.400, e Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 1996/ 002576).

[00364] Quando necessário, um resíduo de aminoácido em uma FR pode ser substituído de modo que as CDRs de um anticorpo humano remodelado formam um sítio de ligação ao antígeno adequado. Por exemplo, uma mutação pode ser introduzida na sequência de aminoá- cidos de uma FR através da aplicação do método de PCR utilizado para o enxerto de CDRs de camundongo em FRs humanas.

[00365] Um anticorpo humano desejado pode ser obtido através de imunização de DNA, utilizando um animal transgênico com o repertório completo de genes de anticorpo humano (vide Publicação Internacio- nal Nos. WO 1993/ 012227, WO 1992/ 003918, WO 1994/ 002602, WO 1994/ 025585, WO 1996/034096, e WO 1996/ 033735) como um animal para a imunização.

[00366] Além disso, as tecnologias para a obtenção de um anticorpo humano por filtração usando uma biblioteca de anticorpos humanos são conhecidas. Por exemplo, uma região V de anticorpo humano é expressa na superfície de um fago como um anticorpo de cadeia simples (scFv), pelo método de exposição em fagos. O fago expressando scFv que se liga ao antígeno pode ser selecionado. A sequência de DNA que codifica para a região V do anticorpo humano ligado a antí- geno pode ser determinada através da análise dos genes do fago selecionado. Após a determinação da sequência de DNA de scFv que se liga ao antígeno, um vetor de expressão pode ser preparado por fusão da sequência de região V em Tabela com a sequência de uma região C de anticorpo humano desejada, e, em seguida, a inserção deste em um vetor de expressão adequado. O vetor de expressão é introduzido em células de expressão adequadas, tais como as descritas acima, e o anticorpo humano pode ser obtido através da expressão do gene que codifica o anticorpo humano. Estes métodos são já é conhecido (vide, Publicação Internacional Nos. WO 1992/ 001047, WO 1992/ 020791, WO 1993/ 006213, WO 1993/ 011236, WO 1993/ 019172, WO 1995/ 001438, e WO 1995/15388).

[00367] As regiões variáveis que constituem os anticorpos da presente invenção podem ser regiões variáveis que reconhecem qualquer antígeno.

[00368] Aqui, não há nenhuma limitação particular no antígeno, e ele pode ser quaisquer antígenos. Exemplos de antígenos incluem 17- IA, 4-1 BB, 4DC, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2, 8-oxo-dG, A1 de adeno- sina, A33, ACE, ACE-2, Ativina, Ativina A, Ativin AB, Ativin B, Ativin C, Ativin RIA, Ativin RIA ALK-2, Ativin RIB ALK-4, Ativin RIIA, Ativin RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adressinas, adiponectina, ribosil ADP ciclase-1, aFGF, AGE, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alér- geno, alfa1-antiquimiotripsina, alfa1-antitripsina, alfa-sinucleína, antagonista alfa-V/beta-1, aminin, amilina, amilóide beta, região variável de cadeia pesada da imunoglobulina amilóide. região variável de cadeia leve da imunoglobulina amilóide, andrógeno, ANG, angiotensinogênio, angiopoietina ligante-2, anti-Id, antithrombinIII, Anthrax, APAF-1, APE, APJ, apo A1, apo soro amilóide A, Apo-SAA, APP, abril, AR, ARC, ART, artemina, aspártico, atrial fator natriurético, peptídeo natriurético atrial, peptídeos natriuréticos atriais A, peptídeos natriuréticos atriais B, peptídeos natriuréticos atriais C, integrina av/b3, Axl, B7-1, B7-2, B7-H, BACE, BACE-1, antígeno protetor Bacillus anthracis, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, o BCI, BCMA, BDNF, b- ECGF, beta-2-microglobulina, betalactamase, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, B-linfócito Estimulador (biys), BMP, BMP-2 (BMP- 2-A), BMP-3 (osteogenina), BMP-4 (BMP-2b), BMP-5, BMP-6 (Vgr-1), BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BMPR-II (BRK-3), BMPs, Bok, bombesina, fator neurotrófico derivado do osso, hormônio de crescimento bovino, BPDE, BPDE- DNA, BRK-2, BTC, de linfócitos B da molécula de adesão celular, C10, C1-inibidor, C1q, C3, C3a, C4, C5, C5a (complemento 5a), CA125, caderina-3, calcitonina, acampamento, anidrase carbônica-IX, antíge- no carcinoembrionário (CEA), antígeno associado a carcinoma CAD-8, Cardiotrofina-1, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1/I-309, CCL11/Eotaxin, CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL16/HCC-4, CCL17/TARC, CCL18/PARC, CCL19/ELC, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3-alfa, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF-1, CCL24/Eotaxin-2, CCL25/TECK, CCL26/Eotaxin-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CCL3/M1P-1-alfa, CCL3Ll/LD-78-beta, CCL4/MIP-1-beta, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/10/MTP-1-gama, CCR, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD10, CD105, CD11a, CD11b, CD11c, CD123, CD13, CD137, CD138, CD14, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD15, CD152, CD16, CD164, CD18, CD19, CD2, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27L, CD28, CD29, CD3, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteínas P67), CD34, CD37, CD38, CD3e, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD49b, CD5, CD51, CD52, CD54, CD55, CD56, CD6, CD61, CD64, CD66e, CD7, CD70, CD74, CD8, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD105, CD158a, CEA, CEACAM5, CFTR, cGMP, receptor de CGRP, CINC, CKb8-1, Claudin18, CLC, toxina Clostridium botulinum, toxina Clostridium difficile, toxina Clostridium perfringens, c-Met, CMV, CMV UL, CNTF, Cntn-1, fator de complemento 3 (C3), fator de complemento D, globulina de ligação a corticosteróides, receptor de fator-1 estimulante de colônia, COX, C-Ret, CRG-2, CRTH2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1/Fractalkine, CX3CR1, CXCL, CXCL1/Gro-alfa, CXCL10, CXCL11/I-TAC, CXCL12/SDF-1-alfa/beta, CXCL13/BCA-1, CXCL14/BRAK, CXCL15/Lungkine. CXCL16, CXCL16, CXCL2/Gro-beta CXCL3/Gro-gama, CXCL3, CXCL4/PF4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8, CXCL9/Mig, CXCLlO/IP-10, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, cistatina C antígeno associado a tumor, citoquerati- na, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, Decay fator de aceleração, proteína ligante tipo Delta 4, des (1-3)-IGF-1 (IGF-1 cerebral), Dhh, DHICA oxidase, Dickkopf-1, digoxina, inibidores da dipeptidil-peptidase IV, DKL, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, Ecad, EDA, EDA-A1, EDA- A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), domínio tipo EGF contendo proteína 7, elastase, elastina, EMA, EMMPRIN, ENA, ENA-78, endossialina, receptor de endotelina, endotoxina, encefalinase, eNOS, Eot, Eotaxi- na, Eotaxina-2, eotaxini, EpCAM, Efrina B2/EphB4, receptor tirosina- cinase EphA2, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), o receptor ErbB2, receptor de tirosina-quinase ErbB3, ERCC, EREG, eritropoietina (EPO), eritropoietina receptor, E-selectina, ET-1, Êxodo- 2, proteína F de RSV, F10, F11, F12, F13, F5, F9, o Fator Ia, fator IX, fator Xa, fator VII, fator VIII, fator VIIIc, Fas, FcalfaR, FcepsilonRI, FcgammaIIb, FcgammaRI, FcgammaRIIa, FcgammaRIIIA, Fcgamma- RIIIB, FcRn, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, receptor FGF-2, FGF-3, FGF-8, FGF-ácido, FGFR, fibrina, proteína de ativação de fi- broblastos (FAP), fator de crescimento de fibroblastos, fator de crescimento de fibroblastos-10, fibronectina, FL, FLIP, Flt-3, ligando FLT3, receptor de folato, hormônio estimulante do folículo do FGFR-3-FGF básico (FSH), fractalcina (CX3C), cadeia pesada livre, cadeia leve livre, FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, G250, Gás 6, GCP-2, GCSF, G-CSF, receptor de G-CSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-15 (MIC-1), GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP- 14/CDMP-1), GDF-6 (BMP-13/CDMP-2), GDF-7 (BMP-12/CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDNF, gelsolina, GFAP, GF-CSF, TFG- alfa1, alfa2-GFR TFG-alfa3, GF-1β, glicoproteína gH envelope, GITR, glucagon, receptor do glucagon, receptor de peptídeo 1 tipo glucagon, Glut 4, glutamato carboxipeptidase II, receptores de hormônio da gli- coproteína, glicoproteína IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), glipicano-3, GM-CSF, receptor de GM-CSF, gp130, gp140, GP72, granulócito-CSF (G-CSF), GRO/MGSA, fator de libertação da hormônio do crescimento, GRO-D, GRO-Y, H. pylori, hapteno (NP-cap ou NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCC 1, glicoproteínas HCMV gB envelopes, HCMV UL, fator de crescimento hamatopoético (HGF), Hep B gp120, heparanase, cofator II de hepari- na, fator de crescimento hepático, antígeno protetor de Bacillus an- thracis, glicoproteína E2 do vírus da Hepatite C, Hepatite E, hepcidina, Her1, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), vírus da herpes simplex (HSV), glicoproteína gB, HGF, HGFA, antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), proteínas de envelope de VIH, tais como GP120, HIV MIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA- DR, HM1.24, HMFG PEM, HMGB-1, HRG, HRK, Hsp47, Hsp90, glico- proteína gD de HSV, miosina cardíaca humana, citomegalovírus humano (HCMV), hormônio de crescimento humano (hGH), albumina do soro humano, ativador de plasminogênio tipo tecido humano (t-PA), Huntingtina, HVEM, PIA, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, a ICE, ICOS, IFN- alfa, IFN-beta, IFN-gama, IgA, receptor de IgA, IgE, IGF, proteínas de ligação a IGF, IGF-1, IGF-1R, o IGF-2, IGFBP, IGFR, IL, IL-1, IL-10, receptores IL-10, IL-11, receptores, IL-11, IL-12, receptores IL-12, IL- 13, receptores IL-13, IL-15, receptores IL-15, IL-16, receptores IL-16, IL-17, receptores IL-17, IL-18 (IGIF), receptores IL-18, IL-1alfa, IL- 1beta, receptores IL-1, IL-2, IL-2, receptores IL-20, IL-20, receptores IL-21, receptores IL-21, IL-23, receptores IL-23, IL-2, receptores IL-3, receptores IL-3, IL-31, receptores IL-31, IL-3, receptores IL-4, receptores IL-4, IL-5, receptores IL-5, IL-6, receptores IL-6, IL-7, receptores IL- 7, IL-8, receptores IL-8, IL-9, receptores IL-9, complexo de imunoglo- bulina imune, imunoglobulinas, INF-alfa, receptores INF- alfa, INF- beta, receptores de IFN-beta, IFN-gama, receptores de IFN-gama, o IFN tipo-I, receptor IFN tipo I, gripe, inibina, inibina α, inibina β, iNOS, insulina, cadeia A da insulina, cadeia B da insulina, fator de crescimento -1 tipo insulina, fator de crescimento 2 tipo a insulina, proteínas de ligação do fator de crescimento tipo insulina, integrina, integrina alfa 2, integrina alfa3, integrina alfa 4, integrina alfa4/beta1, integrina alfa- V/beta-3, integrina alfa-V/beta-6, integrina alfa4/beta7, integrina al- fa5/beta1, integrina alfa5/beta3, integrina alfa5/beta6, integrina alfa □ (alfaV), integrina alfa θ, integrina betal, beta2 integrina, integrina be ta3 (GPIIb-IIIa), IP-10, I-TAC, JE, kalliklein, Calicreína 11, 12 Calicreí- na, Calicreína 14, Calicreína15, Calicreína 2, Calicreína 5, calicreína 6, Calicreína L1, calicreína L2, Calicreína L3, calicreína L4, kallistatin, KC, KDR, fator de crescimento de queratinócitos (KGF), fator de crescimento de queratinócitos-2 (KGF-2), KGF, receptor tipo imunoglobuli- na assassina, kit ligando (KL), Kit de tirosina quinase, laminina 5, LAMP, LAPP (amilina, polipeptídeo ilha-amilóide), LAP (TGF-1), peptí- deo associado a latência, TGF-1 latente, TGF-1 latente, antígeno BP1, LBP, LDGF, LDL, receptor LDL, LECT2, Lefty, leptina, hormônio lutei- nizante (LH), antígeno de Lewis-Y, antígeno relacionado a Lewis-Y, receptores LFA-1, LFA-3, A-3FL, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteínas, LIX, LKN, LPTn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, surfactante pulmonar, hormônio luteinizante, linfotactina, Linfotoxina Beta receptor, receptor Lisosfingolipídeo, Mac-1, macrófago-CSF (M-CSF), MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, maspina, MCAM, MCK-2, MCP, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-I (MCAF), M-CSF, MDC, MDC (67 aa), MDC (69 aa), megsin, família receptor tirosina quinase Mer, MET, metaloproteases, Membrana glicoproteína OX2, Mesothelin, receptor MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), proteína microbiana, MIF, MIG, MIP, MIP-1 α, MIP-1 β, MIP-3 α, MIP-3 β, MIP-4, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP- 10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, proteína de atração de monócitos, fator inibidor de colônia de monócitos, peptídeo associado à gonado- trofina de camundongo, MPIF, Mpo, MSK, MSP, MUC-16, MUC18, mucina (Mud), substância inibidora de Muellerian, Mug, MuSK, glico- proteína associada a mielina, fator 1 de inibidor progenitor de mielóide (MPIF-I), NAIP, Nanocorpo, NAP, NAP-2, NCA 90, NCAD, N-caderina, NCAM, neprilisina, molécula de adesão de células neurais, neroserpi- na, fator de crescimento neuronal (NGF), neurotrofina-3, neurotrofina- 4, neurotrofina-6, neuropilina 1, neurturina, NGF-beta, NGFR, NKG20, hormônio de crescimento humano N-metionila, nNOS, NO, Nogo-a, receptor Nogo, proteína não estrutural tipo 3 (NS3) do vírus da hepatite C, NOS, Nnp, NRG-3, NT, NT-3, NT-4, NTN, OB, OGG1, oncostati- na M, OP-2, OPG, OPN, OSM, receptores OSM, fatores osteoinduti- vos, osteopontina, OX40L, OX40R, LDL oxidada, p150, p95, PADPr, hormônio da paratireóide, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P- caderina, PCNA, PCSK9, PDGF, receptor PDGF, PDGF-AA, PDGF- AB, PDGF-BB, PDGF-D, PDK-1, PECAM, PEDF, PEM, PF-4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIGF, PIN, PLA2, fator de crescimento da placenta, fosfatase alcalina placentária (PLAP), lactogênio placentário, inibidor-1 do do ativador do plasminogênio, fator de crescimento das plaquetas, PLGR, PLP, cadeias de poli glicol de tamanho diferente (por exemplo, PEG40 PEG-30 PEG-20), PP14, pré-calicreína, proteína príon, procal- citonina, proteína de morte celular programada 1, pró-insulina, prolac- tina, Proproteína PC9 convertase, prorelaxina, membrana específico da próstata antígeno (PSMA), proteína A, proteína C, proteína D, proteína S, proteína Z, PS, PSA, PSCA, PsmAr, PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, P-selectina glicoproteína ligando-1, R51, RAGE, RANK, RANKL, RANTES, relaxina, relaxina A-chain, cadeia B da relaxina, renina, vírus sincicial respiratório (RSV) F, Ret, Reticulon 4, fator reumatóide, RLI P76, RPA2, RPK-1, RSK, RSV FGP, S100, RON-8, SCF/KL, SCGF, sclerostin, SDF-1, SDF1 α, β SDF1, serina, soro amilóide P, albumina sérica, sFRP-3, Shh, Shiga como toxina II, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, receptor 1 de esfingosina 1-fosfato, ácido lipoteicóico estafilocócica, Stat, STEAP, STEAP-II, fator de células estaminais (SCF), estreptoquinase, superóxido dismutase, sindecam-1, TACE, TACI, TAG-72 ( glicoproteína-72 associada ao tumor), TARC, TB, TC-3, receptor de células T alfa/beta, TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, tenascina, TERC, fosfatase alcalina tipo PLAP testicular, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan específico, TGF-beta RII, TGF-beta RIIb, TGF-beta RIII, TGF-beta Rl (ALK-5), TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, TGF-I, trombina, trombopoietina (TPO), receptor de linfoproteína es- tromal tímico, Thymus Ck-1, hormônio de estimulação da tiróide (TSH), tiroxina, globulina de ligação à tiroxina, Tie, TIMP, TIQ, fator Tecidual, inibidor de protease do fator tecidual, fator de proteína tecidual, TMEFF2, TMPO, TMPRSS2, receptor de TNF I, receptor de TNF II, TNF-alfa, TNF-beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2/DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK- 2A/TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R/TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF/TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF12A, TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF Rl CD120a/p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b/p75-80), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRSF25 (DR3 Apo- 3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35/TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1/APT1/CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68/TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2 Ligando/TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK Ligando ODF/OPG Ligando), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 Ligando/DR3 Ligando), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM Ligan- do/LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR Ligando AITR Li- gando/TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectin/DIF/TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa/TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC/p33), TNFSF4 (OX40 Li- gando gp34/TXGP1), TNFSF5 (CD40 Ligando CD154/gp39/HIG- M1/IMD3/TRAP), TNFSF6 (Fas Ligando Apo-1 Ligando/APT1 Ligando), TNFSF7 (CD27 Ligando CD70), TNFSF8 (CD30 Ligando CD153), TNFSF9 (4-1 BB Ligando CD137 Ligando), TNF-, TNF-, TNIL-I, tmetabólito tóxico, TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRA- IL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, fatores de crescimento de transformação (TGF) tais como TGF-alfa e TGF-beta, glicoproteína de transmembrana NMB, Transtiretina, TRF, Trk, TROP-2, glicoproteína de trophoblasto, TSG, TSLP, Fator de Necrose Tumoral (TNF), antíge- no associado a tumor CA 125, carboidratos relacionados a Lewis Y expressando antígeno associado a tumor, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, uroquinase, proteína VAP-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), vaspin, VCAM, VCAM-1, VeCAD, VE-caderina, VE- caderina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEFGR-2, receptor VEGF (VEGFR), VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígenos virais, receptor VITB12, o receptor de vitronectina, VLA, VLA-1, VLA-4, integrina VNR, fator de von Willebrand (vWF), WIF-1, Wnt1, WNT10A, Wnt10b, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, Wnt7a, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, XCL2/SCM-l-beta, XCLl/linfotactina, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD.

[00369] Uma ou mais alterações de resíduos de aminoácidos são permitidas nas sequências de aminoácidos que constituem as regiões variáveis desde que a sua atividade de ligação ao antígeno sejam mantidas. Quando se altera a sequência de aminoácidos da região va-riável, não há nenhuma limitação particularmente no sítio de modificação e o número de aminoácidos alterado. Por exemplo, os aminoáci- dos presentes em CDR e/ou FR podem ser alterados de forma adequada. Ao alterar os aminoácidos de uma região variável, a atividade de ligação é de preferência mantida em particular, sem limitação, e por exemplo, em comparação com antes da modificação, a atividade de ligação é de 50 % ou mais, de preferência 80 % ou mais, e mais prefe-rivelmente 100 % ou mais. Além disso, a atividade de ligação pode ser aumentada por alterações de aminoácidos. Por exemplo, a atividade de ligação podem ser 2-, 5-, 10 vezes maior do que ou tal que antes da modificação. Nos anticorpos da presente invenção, a alteração da sequência de aminoácidos pode ser, pelo menos, uma substituição, adição, eliminação, inserção e alteração de resíduo de aminoácido.

[00370] Por exemplo, a modificação da glutamina N-terminal de uma região variável em ácido piroglutâmico por piroglutamilação é uma modificação bem conhecida dos versados na técnica. Assim, quando o N-terminal da cadeia pesada é glutamina, os anticorpos da presente invenção compreendem as regiões variáveis nas quais a glu- tamina é modificada para ácido piroglutâmico.

[00371] As regiões variáveis de anticorpos da presente invenção podem ter quaisquer sequências, e elas podem ser regiões variáveis de anticorpos de qualquer origem, tais como anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, anticorpos de coelho, anticorpos de cabra, anticorpos de camelo, anticorpos humanizados produzidos por humanização destes anticorpos não humanos e anticorpos humanos. "Anticorpos humanizados", também referidos como "anticorpos reformulados humanos" são os anticorpos em que a regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo derivado de um mamífero não humano, por exemplo, um anticorpo de rato, são transplantadas para as CDRs de um anticorpo humano. Métodos para a identificação de CDRs são conhecidos (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). As tecnologias de recombina- ção genéticas comuns são também conhecidas (vide, Pedido de Patente Europeia No. EP 125023 e WO 96/02576). Além disso, estes anticorpos podem ter várias substituições de aminoácidos introduzidas em suas regiões variáveis para melhorar a sua ligação ao antígeno, farmacocinética, estabilidade, e antigenicidade. As regiões variáveis dos anticorpos da presente invenção podem ser capazes de ligar antí- genos repetidamente, devido à sua fiabilidade do pH na ligação ao an- tígeno (WO/2009/125825).

[00372] Regiões constantes tipo □ cadeia e □ cadeia estão presentes no anticorpo de regiões constantes de cadeia leve, mas qualquer uma das regiões constantes de cadeia leve é aceitável. Além disso, regiões constantes de cadeia leve da presente invenção podem ser as regiões constantes de cadeia leve, com alterações de aminoácidos tais como substituições, adições, deleções, inserções e/ou modificações.

[00373] Por exemplo, para as cadeias pesadas, as regiões constantes de um anticorpo da presente invenção, regiões constantes de cadeia pesada de anticorpos humanos IgG podem ser utilizadas e são preferidas as regiões constantes de cadeia pesada de IgG1 humanos.

[00374] As regiões variáveis que constituem um anticorpo da presente invenção podem ser regiões variáveis que reconhecem qualquer antíge- no. Um ou vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos que constitui uma região variável de cadeia pesada pode ser alterado, desde que a atividade de ligação ao antígeno seja mantida.

[00375] Além disso, a alteração das regiões variáveis é efetuada com o objetivo de aumentar a atividade de ligação, melhorar a especificidade, a redução de pI, o que confere uma propriedade dependente do pH para a ligação ao antígeno, melhora da estabilidade térmica de ligação, melhora da solubilidade, proporcionar estabilidade à modificação química, melhorar heterogeneidade derivada de cadeia de açúcar, evitando epítopo de célula T que reduz a imunogenicidade identificada através de previsão in silico, ou por um ensaio in vitro, utilizando células T, introduzindo epítopo de célula T que ativa as células T reguladoras, ou tais mAbs (3: 243-247, 2011).

[00376] Além disso, um polipeptídeo da presente invenção pode ser uma molécula de proteína de fusão de Fc produzida por ligação de uma região Fc com uma outra proteína, um peptídeo biologicamente ativo, ou tal (proteína de fusão de Fc de peptídeo), ou uma molécula de proteína de fusão de Fc produzida ligando uma região Fc a uma matriz extracelular composta por polímeros, tais como o colágeno ou ácido poliláctico (proteína de fusão de Fc scaffold).

[00377] Exemplos de outra proteína ou peptídeo biologicamente ativa incluem receptores, moléculas de adesão, enzimas e ligandos, mas não se limitam a estes.

[00378] Os exemplos preferidos de moléculas de proteína de fusão de Fc da presente invenção incluem proteínas com um domínio Fc fundido a uma proteína do receptor que se liga a um alvo, e tais exemplos incluem a proteína de fusão TNFR-Fc, a proteína de fusão Fc IL1R, proteína de fusão de VEGFR-Fc, e proteína de fusão CTLA4-Fc (Nat. Med. Janeiro de 2003; 9 (1): 47-52; BioDrugs 2006, 20 (3): 15160). Além disso, uma proteína a ser fundida a um polipeptídeo da presente invenção pode ser qualquer molécula, desde que ela se ligue a uma molécula alvo, e exemplos incluem moléculas de scFv (WO 2005/ 037989), as moléculas de anticorpos de domínio único (WO 2004/ 058821, WO 2003/ 002609), moléculas tipo anticorpos (Current Opinion in Biotechnology 2006, 17: 653-658; Current Opinion in Biotechnology 2007, 18: 1-10; Current Opinion in Structural Biology 1997, 7: 463469; e Protein Science 2006, 15: 14-27) tal como DARPins (WO 2002/020565), Affibody (WO 1995/001937), Avimer (WO 2004/044011; WO 2005/040229), e Adnectin (WO 2002/032925). Além disso, os anticorpos e as moléculas de proteína de fusão de Fc podem ser anticorpos multiespecíficos que se ligam a vários tipos de moléculas alvo ou epítopos, tais como os anticorpos biespecíficos.

[00379] Além disso, os anticorpos da presente invenção incluem os produtos de modificação de anticorpos. Tais produtos de modificação de anticorpos incluem, por exemplo, os anticorpos ligados a várias moléculas, tais como o polietilenoglicol (PEG) e substâncias citotóxicas. Tais produtos de modificação de anticorpos podem ser obtidos modificando quimicamente os anticorpos da presente invenção. Métodos para modificar anticorpos já estão estabelecidos neste campo.

[00380] Os anticorpos da presente invenção podem também ser anticorpos biespecíficos. "Anticorpo biespecífico" refere-se a um anticorpo que tem um único anticorpo em regiões variáveis de moléculas que reconhecem diferentes epítopos. Os epítopos podem estar presentes numa única molécula ou em moléculas diferentes.

[00381] Os polipeptídeos da presente invenção podem ser preparados pelos métodos conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser preparados pelos métodos descritos a seguir, mas os métodos não se limitam a estes.

[00382] Há várias combinações de hospedeiro de células/vetor de expressão conhecidos para a preparação de anticorpos através da in-trodução de genes isolados que codificam o polipeptídeo em hospedeiros apropriados. Todos estes sistemas de expressão são aplicáveis para o isolamento das moléculas de ligação de antígeno da presente invenção. As células eucarióticas adequadas utilizadas como células hospedeiras incluem células de animais, células vegetais e células fúngicas. Especificamente, as células de animais incluem, por exemplo, as seguintes células. (1) células de mamíferos: CHO (linhagem celular de ovário de hamster chinês), COS (linhagem celular de rim de macaco), mielo- ma (SP2/O, NS0 e tal), BHK (linhagem celular de rim de baby hamster), HEK293 (linhagem celular de rim de embrião humano com ade- novírus cortado (Ad) 5 DNA), célula PER.C6 (linhagem celular de retina de embrião humano transformado com o adenovírus tipo 5 (Ad5) E1A e genes E1B), Hela, Vero, ou tal (Current Protocols in Protein Science (maio, 2001, Unidade 5.9, Tabela 5.9.1)); (2) As células de anfíbios: oócitos de Xenopus, ou tais, e (3) células de inseto: sf9, Sf21, Tn5, ou semelhante.

[00383] Um DNA que codifica uma cadeia pesada de anticorpo em que um ou mais resíduos de aminoácidos na região Fc têm sido substituídos por outros aminoácidos de interesse e DNA que codifica uma cadeia leve de anticorpo, são expressos. Um DNA que codifica uma cadeia pesada, em que um ou mais resíduos de aminoácidos na região Fc são substituídos por outros aminoácidos de interesse podem ser preparados, por exemplo, através da obtenção de um DNA que codifica para a região Fc de uma cadeia pesada natural e a introdução de uma substituição apropriada de modo que um codão que codifica um aminoácido particular na região Fc codifica outro aminoácido de interesse.

[00384] Alternativamente, um DNA que codifica uma cadeia pesada, em que um ou mais resíduos de aminoácidos na região Fc são substituídos por outros aminoácidos de interesse também podem ser preparados através da concepção e depois sintetizar quimicamente um DNA que codifica para uma proteína em que um ou mais aminoá- cidos resíduos na região Fc da cadeia pesada natural são substituídos por outros aminoácidos de interesse. A posição e o tipo de substituição de aminoácidos não são particularmente limitados. Além disso, a alteração não é limitada à substituição, e a alteração pode ser qualquer um de deleção, adição ou inserção, ou combinação dos mesmos.

[00385] Alternativamente, um DNA que codifica uma cadeia pesada, em que um ou mais resíduos de aminoácidos na região Fc são substituídos por outros aminoácidos de interesse pode ser preparado como uma combinação de DNA parcial. Tais combinações de DNA parcial incluem, por exemplo, a combinação de um DNA que codifica uma região variável e um DNA que codifica para uma região constan- te, e a combinação de um DNA que codifica uma região de Fab e de um DNA que codifica uma região Fc, mas não se limitam a estes. Além disso, um DNA que codifica uma cadeia leve pode ser preparada de forma semelhante como uma combinação de DNA parcial.

[00386] Os métodos para expressar os DNA acima descritos incluem os métodos descritos abaixo. Por exemplo, um vetor de expressão da cadeia pesada é construído através da inserção de um DNA que codifica uma região variável da cadeia pesada em um vetor de expressão, juntamente com um DNA que codifica uma região constante de cadeia pesada. Do mesmo modo, um vetor de expressão da cadeia leve é construída através da inserção de um DNA que codifica uma região variável da cadeia leve para um vetor de expressão, juntamente com um DNA que codifica uma região constante de cadeia leve. Alternativamente, estes genes de cadeias pesadas e leves, podem ser inseridos em um único vetor.

[00387] Quando da inserção de um DNA que codifica o anticorpo de interesse para um vetor de expressão, o DNA é inserido, de modo que o anticorpo é expresso sob o controle de uma região de regulação da expressão, tais como um intensificador ou promotor. Em seguida, as células hospedeiras são transformadas com este vetor de expressão para expressar o anticorpo. Em tais casos, pode ser utilizada uma combinação adequada de anfitrião e vetor de expressão.

[00388] Exemplos de vetores incluem vetores M13, vetores PUC, pBR322, pBluescript, e PCR-Script. Alternativamente, quando se aponta para o subclone de cDNA e consumo, para além dos vetores descritos acima, pGEM-T, pDIRECT, pT7, e tal pode ser utilizado.

[00389] Os vetores de expressão são particularmente úteis quando se utiliza vetores para produzir os anticorpos da presente invenção. Por exemplo, quando uma célula hospedeira é E. coli, tais como JM109, DH5 α, HB101, e XL1-Blue, os vetores de expressão devem possuir um promotor que permite a expressão eficiente em E. coli, por exemplo, lacZ promotor (Ward et al., Nature (1989) 341: 544-546; FA- SEB J. (1992) 6:, (Better et al., Science (1988) 2422-2427 sua totalidade são aqui incorporados por referência), o promotor araB 240: 1041-1043; sua totalidade são aqui incorporados por referência), o promotor de T7, ou tal. Tais vetores incluem pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (QIAGEN), pEGFP, ou pET (neste caso, o hospedeiro é de preferência BL21 que expressa a polimerase de ARN T7), além dos vetores descritos acima.

[00390] Os vetores podem conter as sequências de sinal para a secreção de polipeptídeo. Como uma sequência de sinal para a secreção de polipeptídeo, uma sequência de sinal pelB (Lei, SP et al., J. Bacte- riol (1987) 169: 4379; sua totalidade são aqui incorporados por referência) pode ser utilizado quando um polipeptídeo é segregado para o E. coli periplasma. O vetor pode ser introduzido nas células hospedeiras através do método da lipofectina, método de fosfato de cálcio, e o método de DEAE-dextrano, por exemplo.

[00391] Em adição a vetores de expressão de E. coli, os vetores para a produção dos polipeptídeos da presente invenção incluem vetores de expressão de mamíferos (por exemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids Res. 1990, 18 (17): p5322, sua totalidade são aqui incor-porados por referência), pEF e pCDM8), vetores de expressão derivados de células de insetos (por exemplo, o "sistema Bac-to-BAC de expressão de baculovírus" (GIBCO BRL) e pBacPAK8), vetores de expressão deri-vados de plantas (por exemplo, e pMH1 pMH2), vetores de expressão derivados de vírus de animal (por exemplo, pHSV, pMV, e pAdexLcw), vetores de expressão retrovirais (por exemplo, pZIPneo), vetores de ex-pressão de levedura (por exemplo, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, e SP-Q01), e vetores de expressão de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608 e pKTH50), por exemplo.

[00392] Quando se pretende para a expressão em células de animais, tais como células CHO, COS, NIH3T3 e HEK293, os vetores têm de ter um promotor essencial para a expressão em células, por exemplo, o promotor de SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277: 108; sua totalidade são aqui incorporados por referência), MMTV-LTR, o promotor EF1 α (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990..) 18: 5322; sua totalidade são aqui incorporados por referência), o promotor CAG (Gene. (1990) 18: 5322; sua totalidade são aqui incorporados por referência), e promotor de CMV, e mais de preferência, têm um gene para a seleção de células transformadas (por exemplo, um gene de resistência a droga que permite a avaliação usando um agente (neomicina, G418 ou tal)). Vetores com tais características incluem pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, e pOP13, por exemplo. Além disso, em alguns casos, a proteína EBNA1 pode ser ainda co-expressa com a finalidade de aumentar o número de cópias do gene, e, neste caso, um vetor com um ponto de iniciação da replicação OriP é usado. (Bio- technol. Bioeng 20 de outubro de 2001, 75 (2): 197-203, e Biotechnol Bioeng 2005 Set 20; 91 (6): 670-7)

[00393] Além disso, o método seguinte pode ser usado para a expressão de genes estáveis e número de cópias do gene de amplificação em células: células de CHO deficiente em uma via de síntese de ácido nucleico são introduzidas em um vetor que transporta um gene DHFR, que compensa a deficiência (por exemplo, pCHOI), e o vetor é amplificado usando metotrexato (MTX). Alternativamente, o método seguinte pode ser usado para a expressão do gene transitório: células COS com um gene que expressa o antígeno T de SV40 no seu cromossoma são transformadas com um vetor com uma origem de repli- cação de SV40 (pcD e tal). Origens de replicação derivadas de vírus polioma, adenovírus, vírus do papiloma bovino (BPV), e como também pode ser usado. Para amplificar o número de cópias do gene em célu- las hospedeiras, os vetores de expressão podem conter ainda os mar-cadores de seleção tais como gene aminoglicosídeo transferase (APH), gene da timidina-quinase (TK), gene xantina-guanina fosforri- bosiltransferase E. coli (Ecogpt), e gene di-hidrofolato redutase (dhfr).

[00394] Os anticorpos podem ser recolhidos, por exemplo, por cultura de células transformadas, e, em seguida, a separação dos anticorpos a partir do interior das células transformadas ou a partir do meio de cultura. Os anticorpos podem ser separados e purificados utilizando uma combinação adequada de métodos tais como centrifugação, fracionamento com sulfato de amônio, salificação, ultrafiltração, 1q, FcRn, proteína A, coluna de proteína G, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica e cromatografia de filtração em gel.

[00395] Como um método eficiente para a produção de anticorpos biespecíficos, a tecnologia Knobs-into-holes pode ser usado. Especificamente, para a produção de um polipeptídeo heterodimerizado da presente invenção, é necessário dispor de associação entre os poli- peptídeos que têm aminoácidos que diferem umas das outras, ou para separar o polipeptídeo heterodimerizado de interesse de outros poli- peptídeos homodimerizados.

[00396] Por associação de polipeptídeos com aminoácidos diferentes uns dos outros e que compreende uma região Fc, uma tecnologia de suprimir a associação não intencional entre as cadeias H, introduzindo repulsão eletrostática na interface da segunda região constante de cadeia H do anticorpo (CH2) ou a terceira região constante da cadeia H (CH 3) (WO 2006/106905) podem ser aplicados.

[00397] Na tecnologia de suprimir a associação não intencional entre as cadeias H, introduzindo repulsão eletrostática na interface de CH2 ou CH3, exemplos de resíduos de aminoácidos de contacto na interface de outras regiões constantes da cadeia H incluem o resíduo na posição 356 (numeração EU), o resíduo na posição 439 (numera- ção EU), a região de frente para o resíduo na posição 357 (numeração EU), o resíduo na posição 370 (numeração EU), o resíduo na posição 399 (numeração EU), e o resíduo na posição 409 (numeração EU) no domínio CH3.

[00398] Mais especificamente, por exemplo, em um anticorpo que contém dois tipos de domínios CH3 da cadeia H, o anticorpo, em que 1-3 pares de resíduos de aminoácidos escolhidos entre os resíduos de aminoácidos mostradas abaixo em (1) a (3) no primeiro H domínio CH3 de cadeia têm o mesmo tipo de carga pode ser produzida: (1) os resíduos de aminoácidos nas posições 356 e 439 (numeração EU), que são resíduos de aminoácidos contidos no domínio CH3 de cadeia H; (2) os resíduos de aminoácidos nas posições 357 e 370 (numeração EU), que são resíduos de aminoácidos contidos no domínio da cadeia H e CH3; (3) os resíduos de aminoácidos nas posições 399 e 409 (numeração EU), que são resíduos de aminoácidos contidos no domínio CH3 de cadeia H.

[00399] Além disso, um anticorpo pode ser produzido em que 1-3 pares de resíduos de aminoácidos que correspondem aos pares de resíduos de aminoácidos acima indicadas em (1) a (3) que tem o mesmo tipo de carga do primeiro domínio CH3 de cadeia H têm cargas opostas para os resíduos de aminoácidos correspondentes na acima mencionada primeiro domínio CH3 de cadeia H , em que os pares de resíduos de aminoácidos são selecionados de entre os pares de resíduos de amino- ácidos acima indicadas em (1) a (3) no segundo domínio CH3 de cadeia H, que é diferente do primeiro domínio CH3 de cadeia H .

[00400] Os respectivos resíduos de aminoácidos de (1) a (3) acima mencionado são posicionados perto uns dos outros, quando associado. Os versados na técnica podem encontrar os locais que correspon- dem aos resíduos de aminoácidos acima mencionadas de (1) a (3), através da modelação de homologia e usando o software comercialmente disponível como para o domínio CH3 de cadeia H pretendido ou uma região constante de cadeia H, e os resíduos de aminoácidos destes sites podem ser alterados quando necessário.

[00401] Nos anticorpos acima mencionados, por exemplo, resíduos de aminoácidos "carregados" são preferivelmente selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos incluídos em qualquer um dos grupos (X) ou (Y) a seguir: (X) ácido glutâmico (E) e ácido aspártico (D); e (Y) lisina (K), arginina (R) e histidina (H).

[00402] Nos anticorpos acima mencionados, a frase "tendo o mesmo tipo de carga" significa que, por exemplo, todos os dois ou mais resíduos de aminoácidos são resíduos de aminoácidos incluídos em qualquer dos grupos acima mencionado (X) e (Y). A frase "tendo a carga oposta" significa que, por exemplo, quando pelo menos um dos dois ou mais resíduos de aminoácidos é um resíduo de aminoácido incluído em qualquer um dos grupos acima mencionados (X) e (Y), os resíduos de aminoácidos restante são resíduos de aminoácidos incluídos no outro grupo.

[00403] Em uma modalidade preferida do anticorpo acima mencionado, o primeiro domínio CH3 de cadeia H e o segundo domínio CH3 de cadeia H pode ser reticulado por ligações de dissulfito.

[00404] Na presente invenção, os resíduos de aminoácidos a ser alterado não estão limitados aos resíduos de aminoácidos da região constante de anticorpo ou região variável do anticorpo descrito acima. Os versados na técnica podem encontrar os resíduos de aminoácidos que formam a interface, em mutantes de polipeptídeos ou heteromul- tímeros através da modelação de homologia e utilizando software como comercialmente disponível, e podem alterar os resíduos de amino- ácidos nesses locais para regular a associação.

[00405] Outras tecnologias conhecidas podem também ser usadas para a associação de polipeptídeos da presente invenção, possuindo diferentes aminoácidos e que compreende uma região Fc. Polipeptí- deos tendo diferentes aminoácidos e que compreendem uma região Fc podem ser eficientemente associados uns com os outros através da substituição de um aminoácido de cadeia lateral presente em uma das regiões variáveis da cadeia H do anticorpo com uma cadeia lateral maior (saliência), e substituindo um aminoácido de cadeia lateral presente na região variável oposta da outra cadeia H com uma cadeia lateral menor (orifício), para permitir a colocação do botão dentro do furo WO 1996/027011; e Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617621; Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).

[00406] Além disso, outras tecnologias conhecidas podem também ser usadas para a associação de polipeptídeos tendo diferentes ami- noácidos e que compreende uma região Fc. Associação de polipeptí- deos tendo sequências diferentes pode ser induzida eficientemente pela associação complementar de CH3, usando um domínio CH3 construído por troca de cadeia produzido alterando parte do CH3 de uma das cadeias H de um anticorpo em uma sequência de IgA derivada correspondente a esse parte, e introduzindo uma correspondente sequência IgA-derivado para a parte complementar do CH3 em outra cadeia H (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). Esta tecnologia conhecida também pode ser utilizada para induzir de forma eficiente associação de polipeptídeos tendo diferentes aminoá- cidos e que compreende uma região Fc.

[00407] Além disso, também se pode usar as tecnologias para a produção de anticorpos heterodimerizados usando associação de CH1 e CL de anticorpo, e associação de VH e VL, que são descritos no documento WO 2011/ 028952.

[00408] Além disso, mesmo nos casos em que os polipeptídeos he- terodimerizados não podem ser formados de forma eficiente, os poli- peptídeos heterodimerizados pode ser obtido por separação e purificação de polipeptídeos homodimerizados los. Quando a produção de um polipeptídeo heterodimerizado consistindo em um primeiro polipeptí- deo e um segundo polipeptídeo que têm diferentes sequências de po- lipeptídeos uns aos outros, homodimerizado consistindo em apenas dois primeiros polipeptídeos e polipeptídeo homodimerizado consistindo em apenas dois segundo polipeptídeo são misturados na forma de impurezas. Tecnologias conhecidas podem ser utilizadas como um método para remover eficazmente estes dois tipos de polipeptídeos homodimerizados. Um método tem sido referido como sendo capaz de purificar dois tipos de homodímeros e o anticorpo heterodimerizado de interesse por cromatografia de troca iônica, pela criação de uma diferença em pontos isoelétricos através da introdução de substituições de aminoácidos nas regiões variáveis dos dois tipos de cadeias H (WO 2007114325).

[00409] Quanto alteração de aminoácidos para conferir diferença em pontos isoelétricos, a alteração de aminoácidos a ser introduzida não é particularmente limitado, desde que a diferença é produzida entre os pontos isoelétricos de dois polipeptídeos que associem e que também podem incluir alterações de aminoácidos feitas para a outra fins tais como a redução da imunogenicidade. Os aminoácidos alterados são de preferência ácidos aminados em posições com pouca influência sobre a atividade de ligação para um receptor de FCY. Além disso, pode ser uma alteração de aminoácidos que aumenta a atividade de ligação a um receptor de Fcy desejado. Para essas alterações, é preferível introduzir pelo menos uma mutação do aminoácido na posição de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo especificamente de Gly na posição 137, Gly na posição 138, Thr na posição 139, Lys na posição 147, Ser na posição 192, Leu na posição 193, Gln na posição 196, Tyr na posição 198, Ile na posição 199, Asn na posição 203, Lys na posição 214, Val na posição 263, Glu na posição 272, Lys na posição 274, Tyr na posição 278, Lys na posição 288, Lys na posição 290, Gly na posição 316, Lys na posição 317, Lys na posição 320, Lys na posição 324, Thr na posição 335, Ser na posição 337, Lys na posição 340, Leu na posição 358, Lys na posição 360, Gln na posição 362, Ser na posição 364, Ser na posição 383, Asn na posição 384, Gly na posição 385, Gln na posição 386, Pro na posição 387, Asn na posição 390, Val na posição 397, e Val na posição 422 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo. Além disso, é preferível introduzir uma mutação em pelo menos um aminoácido selecionado de entre o grupo constituído por Gly na posição 137, Gly na posição 138, Thr na posição 139, Lys na posição 147, Ser na posição 192, Leu na posição 193, Gln na posição 196, Ile na posição 199, Asn na posição 203, Lys na posição 214, Glu na posição 272, Lys na posição 274, Lys na posição 288, Lys na posição 290, Leu na posição 358, Lys na posição 360, Gln na posição 362, Ser na posição 383, Asn na posição 384, Gly na posição 385, Gln na posição 386, Asn na posição 390, Val na posição 397, e Val na posição 422 (numeração EU). Além disso, é mais preferível introduzir uma mutação em pelo menos um aminoácido selecionado de entre o grupo constituído por Gly na posição 137, Gly na posição 138, Lys na posição 147, Ser na posição 192, Leu na posição 193, Gln na posição 196, Ile na posição 199, Asn na posição 203, Lys na posição 214, Lys na posição 274, Lys na posição 288, Leu na posição 358, Asn na posição 384, e Val na posição 397 (numeração EU).

[00410] Mais especificamente, é preferível que uma mutação seja introduzida em pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em Gln na posição 196, na posição 199 Ile, Val na posição 263, Glu na posição 272, Gly na posição 316, Leu na posição 358, Ser na posição 364, Ser na posição 383, Pro na posição 387, e Val na posição 397 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do polipeptídeo ou do primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo, e de preferência, uma mutação é introduzida em pelo menos um amino- ácido selecionado de entre o grupo constituído por Gly na posição 137, Gly na posição 138, Thr na posição 139, Lys na posição 147, Ser na posição 192, Leu na posição 193, Tyr na posição 198, Ile na posição 199, Asn na posição 203, Lys na posição 214, Lys na posição 274, Tyr na posição 278, Lys na posição 288, Lys na posição 290, Gly na posição 316, Lys na posição 317, Lys na posição 320, Lys na posição 324, Thr na posição 335, Ser na posição 337, Lys na posição 340, Leu na posição 358, Lys na posição 360, Gln na posição 362, Ser na posição 383, Asn na posição 384, Gly na posição 385, Gln na posição 386, Asn na posição 390, e Val na posição 422 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do outro polipeptídeo. Além disso, é preferível que uma mutação é introduzida em pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em Gln na posição 196, Ile na posição 199, Glu na posição 272, Leu na posição 358, Ser na posição 383, e Val na posição 397 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos, e de preferência, uma mutação é introduzida em pelo menos um aminoácido selecionado de entre o grupo constituído por Gly na posição 137, Gly na posição 138, Thr na posição 139, Lys na posição 147, Ser na posição 192, Leu na posição 193, Ile na posição 199, Asn na posição 203, Lys na posição 214, Lys na posição 274, Lys na posição 288, Lys na posição 290, Leu na posição 358, Lys na posição 360, Gln na posição 362, Ser na posição 383, Asn na posição 384, Gly na posição 385, Gln na posição 386, Asn na posição 390, e Val na posição 422 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do outro polipeptídeo. Além disso, é mais preferível que a mutação é in- troduzida em pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em Gln na posição 196, Ile na posição 199, Leu na posição 358, e Val na posição 397 (numeração EU) no amino sequência de ácido de um dos polipepeptídeos e que uma mutação é introduzida em pelo menos um aminoácido selecionado de entre o grupo constituído por Gly na posição 137, Gly na posição 138, Lys na posição 147, Ser na posição 192, Leu na posição 193, Ile na posição 199, Asn na posição 203, Lys na posição 214, Lys na posição 274, Lys na posição 288, e Asn na posição 384 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do outro polipeptídeo.

[00411] A alteração de aminoácidos não está particularmente limitada, desde que a alteração é feita para produzir uma diferença em pontos isoelétricos entre os dois polipeptídeos, associando depois a alteração.

[00412] Exemplos de uma alteração preferida para aumentar o ponto isoelétrico incluem a substituição do aminoácido na posição 196 com Lys, a substituição do aminoácido na posição 263 com Lys, a substituição do aminoácido na posição 272 com Lys, a substituição do aminoá- cido na posição 316 com Lys, a substituição do aminoácido na posição 364 com Lys, a substituição do aminoácido na posição 358 com Lys, a substituição do aminoácido na posição 383 com Lys, a substituição do aminoácido na posição 387 com Lys, e a substituição do aminoácido na posição 397 com Lys (numeração EU). Exemplos de uma alteração preferido para diminuir o ponto isoelétrico incluem a substituição do amino- ácido na posição 137 com Glu, substituição do aminoácido na posição 138 com Glu, substituição do aminoácido na posição 139 com Glu, substituição do aminoácido na posição 147 com Glu, substituição do aminoácido na posição 198 com Glu, substituição do aminoácido na posição 203 com Asp, a substituição do aminoácido na posição 214 com Thr, a substituição do aminoácido na posição 274 por Gln, substituição do aminoácido na posição 278 com Glu, substituição do aminoácido na posição 288 com Glu, substituição do aminoácido na posição 290 com Glu, substituição do aminoácido na posição 316 com Glu, substituição do aminoácido na posição 317 com Glu, substituição do aminoácido na posição 320 com Glu, substituição do aminoácido na posição 324 com Glu, substituição do aminoácido na posição 335 com Glu, substituição do aminoácido na posição 337 com Asp, substituição de o aminoácido na posição 340 com Glu, substituição do aminoácido na posição 358 com Glu, substituição do aminoácido na posição 360 com Glu, substituição do aminoácido na posição 362 com Glu, substituição do aminoácido na posição 383 com Glu, substituição do aminoácido na posição 384 com Glu, substituição do aminoácido na posição 385 com Glu, substituição do aminoácido na posição 386 com Glu, substituição do aminoácido na posição 390 por Glu, e substituição de o aminoácido na posição 422 por Glu (numeração EU).

[00413] Ao combinar alterações de aminoácidos que são feitas para uma finalidade diferente do que produzir uma diferença em pontos iso- elétricos, por exemplo, para reduzir a antigenicidade, a substituição do aminoácido na posição 138 com Ser, a substituição do aminoácido na posição 192 com Asn, substituição do aminoácido na posição 193 com Phe, e a substituição do aminoácido na posição 199 com Tre (numeração EU) podem ser combinados.

[00414] Até agora, como um método para a purificação de um anticorpo heterodimerizado, um método que utiliza a proteína A, para a purificação de um anticorpo compreendendo uma heterodimerizado IgG2a cadeia H do rato, que se liga à proteína A e uma cadeia H de IgG2b de rato, que não se liga à proteína A foi avaliado (WO 98050431 e WO 95033844).

[00415] Além disso, um anticorpo heterodimerizado sozinho pode ser purificado de forma eficiente utilizando cadeias H em que os resí- duos de aminoácidos nas posições 435 e 436 (numeração EU), que constituem o sítio de ligação entre a IgG e proteína A, são substituídos com aminoácidos tais como Tyr e His que têm afinidade diferente para a proteína A a alterar a interação entre cada uma das cadeias H e proteína A, e usando uma coluna de proteína. Uma pluralidade, por exemplo, dois ou mais, dessas substituições e técnicas podem ser usadas em combinação. Além disso, quando for necessário, estas alterações podem ser aplicadas separadamente para o primeiro polipep- tídeo e o segundo polipeptídeo. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser aqueles produzidos com base nos polipeptídeos de que as alterações acima mencionadas foram aplicadas.

[00416] A presente invenção também fornece um método para a produção de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, que compreende as etapas de heterodimerizar a região Fc, introduzindo uma mutação de aminoácidos no primeiro polipeptídeo e/ou no segundo polipeptídeo que constitui a região Fc, e introduzindo uma mutação de aminoácido para alterar a função da região Fc comparada a quando a região Fc forma um homodímero.

[00417] Exemplos incluem um método de produção que compreende as seguintes etapas de: (a) em um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, in-troduzindo uma mutação de aminoácidos no primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; (b) determinar a função da região Fc do heterodímero que consiste do primeiro polipeptídeo e segundo polipeptídeo em que uma mutação é introduzida na etapa (a); (c) selecionar um polipeptídeo com a função de região Fc alterada em comparação com o polipeptídeo progenitor ou comparada a quando a região Fc é homodimerizada por introdução da mutação de aminoácidos.

[00418] Neste método de produção, a etapa seguinte pode ser realizada após a etapa (a): (d) exibir o polipeptídeo heterodimerizado contendo a região Fc que consiste do primeiro polipeptídeo e segundo polipeptídeo sobre os ribossomas apresentados, fagos, ou levedura.

[00419] Uma modalidade preferida é um método para a produção de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, que compreende as etapas de: (a) alterar um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de modo a que a função da região Fc é alterada em comparação com o polipeptídeo progenitor ou comparada a quando a região Fc forma um homodímero através da introdução de mutações de aminoácidos; (b) introduzir o ácido nucleico numa célula hospedeira e cul-tivar a célula para expressar o polipeptídeo; e (c) coletar o polipeptídeo a partir de uma cultura de células hospedeiras.

[00420] Os anticorpos e as moléculas de proteína de fusão de Fc produzidas pelo método de produção também estão incluídas na presente invenção.

[00421] O tipo e a variedade de mutações de aminoácidos introduzidos pelo presente método não está particularmente limitado, mas exemplos incluem mutações de aminoácidos envolvidos na alteração da função de cada região Fc aqui descrita (mais especificamente, as mutações de aminoácidos revelado especificamente nas tabelas nos Exemplos).

[00422] A presente invenção também fornece um método para modificar a função de um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, que compreende as etapas de heterodimerizar a região Fc, introduzindo uma mutação de aminoácidos no primeiro polipeptídeo e/ou no segundo polipeptídeo que constitui a região Fc de alterar a função da re- gião Fc comparada a quando a região Fc forma um homodímero por introdução da mutação de aminoácidos.

[00423] Exemplos incluem métodos de alteração, compreendendo as seguintes etapas de: (a) em um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, in-troduzindo uma mutação de aminoácidos no primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo que constitui a região Fc; (b) determinar a função da região Fc do heterodímero que consiste do primeiro polipeptídeo e segundo polipeptídeo em que uma mutação é introduzida na etapa (a); (c) selecionar um polipeptídeo com a função de região Fc alterada em comparação com o polipeptídeo progenitor ou comparada a quando a região Fc está homodimerizado por introdução da mutação de aminoácidos.

[00424] Neste método de alteração, a etapa seguinte pode ser realizada após a etapa (a): (d) exibir o polipeptídeo heterodimerizado contendo a região Fc que consiste do primeiro polipeptídeo e segundo polipeptídeo apresentado em ribossomas, fagos, ou levedura.

[00425] Uma modalidade preferida é um método para modificar um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, que compreende as etapas de: (a) alterar um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de modo a que a função da região Fc é alterada em comparação com o polipeptídeo progenitor ou comparada a quando a região Fc forma um homodímero por introdução da mutação de aminoácidos; (b) introduzir o ácido nucleico numa célula hospedeira e cul-tivar a célula para expressar o polipeptídeo; e (c) coletar o polipeptídeo a partir de uma cultura de células hospedeiras.

[00426] Os anticorpos e as moléculas de proteína de fusão de Fc alteradas pelo método de alteração, também estão incluídos na presente invenção.

[00427] O tipo e a variedade de mutações de aminoácidos introduzidos pelo presente método não está particularmente limitado, mas exemplos incluem mutações de aminoácidos envolvidos na alteração da função de cada região Fc aqui descrita (mais especificamente, as mutações de aminoácidos revelado especificamente nas tabelas nos Exemplos).

[00428] Além disso, a presente invenção proporciona um ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma região Fc, em que o polipeptídeo é caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um heterodímero compreendendo um primeiro polipeptí- deo e um segundo polipeptídeo, e em que o polipeptídeo é caracterizado pelo fato de um função de região Fc é alterada em comparação com a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homodímero que compreende apenas o primeiro po- lipeptídeo e/ou comparada com a de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que a região Fc é composta de um homodímero que compreende apenas o segundo polipeptídeo. O ácido nucleico da presente invenção pode estar em qualquer forma, tais como DNA ou ARN.

[00429] A presente invenção também proporciona vetores que transportam os ácidos nucleicos acima descritos da presente invenção. O tipo de vetor pode ser adequadamente selecionado pelos versados na técnica, dependendo das células hospedeiras a serem introduzidas com o vetor. Os vetores incluem, por exemplo, aqueles descritos acima.

[00430] Além disso, a presente invenção refere-se a células hospedeiras transformadas com os vetores acima descritos da presente invenção. As células hospedeiras adequadas podem ser selecionadas pelos versados na técnica. As células hospedeiras incluem, por exemplo, aqueles descritos acima. Composições Farmacêuticas

[00431] A presente invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem o polipeptídeo da presente invenção.

[00432] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formulados, para além dos anticorpos ou moléculas de proteína de fusão de Fc , que são os polipeptídeos da presente invenção, com transportadores farmaceuticamente aceitáveis, por métodos conhecidos. Por exemplo, as composições podem ser usadas parenteri- camente, quando os anticorpos ou moléculas de proteína de fusão de Fc são formulados em uma solução ou suspensão estéril para injeção utilizando água ou qualquer outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, as composições podem ser formuladas de forma adequada por combinação dos anticorpos ou moléculas de proteína de fusão de Fc com veículos farmacologicamente aceitáveis, ou suportes, especificamente, de água esterilizada ou soro fisiológico, óleos vegetais, agentes emulsionantes, agentes de suspensão, surfactantes, estabilizadores, agentes aromatizantes, excipientes, veículos, conservantes, agentes de ligação, e tal, misturando-as a uma dose unitária e na forma requerida por implementações farmacêuticas geralmente aceitas. Os exemplos específicos de veículos incluem o ácido silícico anidro leve, lactose, celulose cristalina, manitol, amido, carmelose de cálcio, carmelose de sódio, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulo- se, dietilaminoacetato de polivinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicéridos de cadeia média, óleo de rícino endurecido com polioxieti- leno 60, sacarose, carboximetil celulose, amido de milho, sal inorgânico, e tal. O conteúdo do ingrediente ativo em tal formulação é ajustado de modo que uma dose adequada dentro do intervalo necessário possa ser obtida.

[00433] As composições estéreis para injeção podem ser formuladas utilizando veículos, tais como água destilada para injeção, de acordo com protocolos padrão.

[00434] As soluções aquosas utilizadas para injeção incluem, por exemplo, solução salina fisiológica e soluções isotônicas contendo glicose ou outros adjuvantes, tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio. Estes podem ser usados em conjunto com solubili- zantes adequados, tais como álcool, especialmente etanol, poliálcoois tais como propileno glicol e polietileno glicol, e surfactantes não iônicos tais como polissorbato 80TM e HCO-50.

[00435] Óleos incluem óleos de gergelim e óleo de soja, e podem ser combinados com agentes de solubilização, tais como benzoato de benzila ou álcool benzílico. Estes também podem ser formulados com tampões, por exemplo, tampões de fosfato ou tampões acetato de sódio; analgésicos, por exemplo, cloridrato de procaína; estabilizadores, por exemplo, álcool benzílico ou fenol, ou antioxidantes. As injeções são preparadas tipicamente aliquotas em ampolas adequadas.

[00436] A administração é preferivelmente realizada parenterica- mente, e inclui especificamente a injeção, administração intranasal, administração intrapulmonar e administração percutânea. Por exemplo, as injeções podem ser administradas sistemicamente ou localmente, por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal ou injeção subcutânea.

[00437] Além disso, o método de administração pode ser adequadamente selecionada de acordo com a idade e os sintomas do paciente. Uma dose única da composição farmacêutica contendo um polipep- tídeo ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo pode ser selecionado, por exemplo, a partir da faixa de 0,0001 a 1,000 mg por kg de peso corporal. Alternativamente, a dosagem pode ser, por exemplo, na faixa de 0.001 a 100.000 mg/paciente. Contudo, a dose não está limitada a estes valores. A dosagem e método de administração variam dependendo do peso do corpo do paciente, a idade e os sintomas, e pode ser adequadamente selecionado pelos versados na técnica.

[00438] Na presente invenção, as composições farmacêuticas que compreendem os polipeptídeos da presente invenção descritos acima, são úteis como ingredientes ativos para agentes terapêuticos ou agentes de prevenção de câncer, doenças inflamatórias autoimunes e tal.

[00439] Tal como aqui utilizado, os códigos de três letras e de uma só letra para os respectivos aminoácidos são como se segue:

[00440] Alanina: Ala (A)

[00441] Arginina: Arg (R)

[00442] Asparagina: Asn (N)

[00443] Ácido aspártico: Asp (D)

[00444] Cisteína: Cys (C)

[00445] Glutamina: Gln (Q)

[00446] Ácido glutâmico Glu (E)

[00447] Glicina: Gly (G)

[00448] Histidina: His (H)

[00449] Isoleucina: Ile (I)

[00450] Leucina: Leu (L)

[00451] Lisina: Lys (K)

[00452] Metionina: Met (M)

[00453] Fenilalanina: Phe (F)

[00454] Proline: Pro (P)

[00455] Serina: Ser (S)

[00456] Treonina: Thr (T)

[00457] Triptofano: Trp (W)

[00458] Tirosina: Tyr (Y)

[00459] Valina: Val (V)

[00460] Todos os documentos da técnica anterior aqui citados são incorporados para referência na sua totalidade.

Exemplos

[00461] Aqui abaixo, a presente invenção será descrita mais especi-ficamente com referência aos exemplos, mas não é para ser interpretada como estando limitada aos mesmos.

Exemplo 1 Explicação do conceito de melhora de reconhe-cimento FCYR por anticorpos heterodimerizados

[00462] Um anticorpo interage através da sua região Fc com várias moléculas, tais como o FcRn, FcyR, e complementos. Uma única molécula de FcRn, que é um ligando de Fc, liga-se a cada uma das cadeias pesadas (cadeias H) de um anticorpo. Assim, duas moléculas de FcRn ligam-se a uma única molécula de anticorpo (Figura 1). In vivo, a FcRn é expressa na membrana celular. Assim, um anticorpo reconhece duas moléculas de FcRn de forma simétrica por meio dos sítios idênticos nas suas respectivas cadeias H in vivo (Nature, 372: 379383, 1994). Além disso, de uma maneira semelhante à relação entre a IgG e FcRn, uma única molécula de imunoglobulina, que pertence à mesma família de imunoglobulina como IgG, reconhece de um modo simétrico duas moléculas de FcαR, que é um receptor de IgA (Figura 2) (Nature, 423: 614-620, 2003).

[00463] No entanto, ao contrário de FcRn e outros, apenas uma molécula de FcyR liga-se a uma molécula de um anticorpo (Figura 3) (JBC, 276: 16469-16477, 2001). IgG reconhece FcyR via os domínios CH2 das duas cadeias H, no entanto, os sítios de interação FcyR são diferentes entre as duas cadeias H. Por exemplo, quando a cadeia H mostrado no lado esquerdo da Figura 3 é definido como cadeia de HA, e o outro no lado direito como cadeia HB, Ala na posição 327 (numeração EU) em cada uma das cadeias de HA e HB interage com FcyR. No entanto, existe uma diferença entre as propriedades dos resíduos de parceiros com que as respectivas interações das cadeias H (Figura 4). A cadeia de HA interage com FCYRIII de forma hidrófoba em Trp das posições 87 e 110 (numeração EU), enquanto a etapa que a cadeia HB interage com FCYRIII na sua posição de 131 (numeração EU). Assim, quando Ala na posição 327 (numeração EU) é substituído com um aminoácido altamente hidrofóbico, tal como Trp, que pode reduzir a atividade de ligação de FcyR de cadeia HB mesmo se ela tem o efeito de melhorar a FcyR-atividade da cadeia HA vinculativo. Assim, o efeito assimétrica das duas cadeias H de FcyR deve ser considerado para otimizar a interação da região Fc de IgG com FcyR por alteração de aminoácidos. No entanto, na técnica anterior, a mesma alteração foi introduzida nas duas cadeias H para otimizar a interação da região Fc de IgG com FcyR (WO 2006/ 019447 e WO 2000/ 042072). No entanto, quando se considera a interação assimétrica a região Fc de IgG com FcyR, a interação entre a IgG e FcyR pode ser otimizada através da introdução de mais finamente diferentes alterações nas cadeias H. Isto é, a interação com FcyR pode ser mais finamente otimizado por meio de um anticorpo heterodimerizado resultante da introdução de alterações diferentes em que as duas cadeias H para otimizar a interação da região Fc com FcyR, em comparação com um anticorpo homo- dimerizado resultante a partir da introdução da mesma alteração para as cadeias H, o que tem sido realizado na técnica anterior.

Exemplo 2 Prova do conceito de melhora de reconhecimento FcyR por anticorpos heterodimerizados

[00464] Foi avaliado se a atividade de ligação FcyR de um anticorpo pode ser otimizada mais finamente por meio de um anticorpo heterodi- merizado introduzido com diferentes alterações nas duas cadeias H, em comparação com um anticorpo homodimerizado da técnica anterior.

[00465] Convencionalmente, as alterações que melhoram a ligação de FcyR têm sido procuradas utilizando um anticorpo homodimerizado resultante da introdução da mesma alteração em ambas as cadeias H de um anticorpo. No entanto, tal como descrito no Exemplo 1, um anticorpo interage com FCYR de uma forma assimétrica, e quando a mesma alteração é introduzida nas duas cadeias H, a alteração de uma cadeia H pode aumentar a atividade de ligação a FcyR enquanto a alteração na outra cadeia H pode inibir a ligação, em vez disso. A atividade de ligação de FcyR não é, necessariamente, um aumento em um anticorpo homodimerizado resultante da introdução de uma tal alteração em ambas as cadeias H. No entanto, um anticorpo heterodimeri- zado resultante da introdução da alteração em apenas uma das duas cadeias H pode ter a atividade de ligação a FcyR aumentada.

[00466] A fim de testar esta hipótese, no que diz respeito à ligação de FcyR, um anticorpo heterodimerizado compreendendo um primeiro polipeptídeo, em que apenas uma cadeia H foi introduzida com uma modificação que é pensada alterar a atividade de ligação de FcyR e um segundo polipeptídeo sem a alteração acima foi comparada com um anticorpo homodimerizado compreendendo o primeiro polipeptí- deo, em que apenas uma cadeia H foi introduzida com a alteração de que é pensado para alterar a atividade de ligação de FcyR. Com base no conceito anterior, quando a atividade de ligação a FcyR é aumentada pela alteração, o anticorpo homodimerizado é sempre superior ao anticorpo heterodimerizado. No entanto, se um anticorpo Fc reconhece FcyR de uma forma assimétrica, o anticorpo heterodimerizado é esperado apresentar atividade de ligação a FcyR maior do que o anticorpo homodimerizado dependendo do tipo de alteração.

[00467] A região variável da cadeia H de um anticorpo utilizado foi a região variável de um anticorpo antiglipicano-3, que contém o CDR de pH 7 do anticorpo antiglipicano-3 com as cinéticas melhoradas em plasma é descrita em WO 2009/ 041062. A região variável é denominada GpH7 (SEQ ID N°: 1). As regiões constantes de cadeias H de anticorpo a seguir descritas foram utilizadas em combinação com GpH7. Quando a região constante de cadeia H de um anticorpo é chamada H1, a sequência da cadeia H do anticorpo tendo a região variável GpH7 é referida como GpH7-H1. Alterações de aminoácido são indicadas de uma maneira tal como D356K. A primeira letra do alfabeto (por exemplo, "D" de D356K) é um código de uma letra representando o resíduo de aminoácido antes da alteração, e a seguir o número (por exemplo, "356" de D356K) indica a posição de alteração (numeração EU). A última letra do alfabeto (por exemplo, "K" de D356K) é um código de uma letra representando o resíduo de aminoácido após a alteração. GpH7-G1D (SEQ ID N°: 2) resultante da remoção do Gly e Lys do terminal C de uma IgG1 possuindo a região variável GpH7; GpH7-A5 (SEQ ID N°: 3) resultante da introdução de mutações D356K e H435R em GpH7-G1D e GpH7-B3 (SEQ ID N°: 4) resultante da introdução de K439E em GpH7-G1D foram preparadas de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. As mutações D356K e K439E foram introduzidas em cada cadeia H para permitir a formação eficaz de heterodímero das respectivas cadeias H quando a produção de um anticorpo heterodimerizado compreendendo dois tipos de cadeias H (WO 2006/106905). H435R, que é uma alteração que inibe a ligação de proteína A, foi introduzida para permitir uma separação eficiente das formas heterodimerizadas e homodimerizadas (vide Exemplos de referência 3, 4, e 5). Entretanto, a cadeia L de anticorpo utilizado foi GpL16-k0 (SEQ ID N°: 5), que é a cadeia L de anticorpo de glipicano-3 com cinética melhorada em plasma é descrita em WO 2009/ 041062.

[00468] As mutações para provar o conceito de que o anticorpo he- terodimerizado foi introduzido em polipeptídeos progenitores GpH7-A5 e GpH7-B3 para construir variantes modificadas, e as variantes foram avaliadas. Os vetores de expressão construídos foram usados para transfectar células FreeStyle293 (Invitrogen) de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos expressos foram purificados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Quando se expressa um anticorpo homodimerizado, um vetor de expressão inserido com a cadeia L de anticorpo GpL16-k0 foi utilizado em conjunto com um vetor de expressão introduzido com um tipo de sequência da cadeia H do anticorpo. Quando um anticorpo heterodi- merizado foi expresso, inserido em um vetor de expressão com a cadeia L de anticorpo GpL16-k0, como usado para o anticorpo homodi- merizado acima, e inserido em um vetor de expressão com uma sequência resultante da introdução de uma alteração adicional em GpH7-A5 tendo o alteração D356K como uma cadeia H de anticorpo, e um vetor de expressão introduzido com uma sequência resultante da introdução de uma alteração adicional em GpH7-B3 tendo a alteração K439E coma outra cadeia H de anticorpo, foram utilizadas para conseguir a expressão eficiente do anticorpo heterodimerizado. O anticorpo expresso e purificado é referido, por exemplo, como GpH7- H1/GpH7-H2/GpL16-k0, quando o vetor de expressão utilizado para expressar uma cadeia H de anticorpo do anticorpo heterodimerizado é GpH7-H1, o vetor de expressão para a outra cadeia H de anticorpo é GpH7-H2, e o vetor de expressão para a cadeia L de anticorpo é GpL16-k0. Neste sistema, uma sequência introduzida com as alterações D356K e H435R corresponde a H1, e uma sequência introduzida com o K439E alteração corresponde a H2. Por exemplo, quando os vetores de expressão utilizados para expressar a cadeia H de anticorpo e a cadeia L de anticorpo homodimerizado são respectivamente GpH7-H1 e GpL16-k0, o anticorpo homodimerizado é referido como GpH7-H1/GpL16-k0. Anticorpos preparados foram usados para medir a atividade de ligação de FCYR pelo método descrito no Exemplo de Referência 2.

[00469] Primeiro, avaliou-se se as alterações D356K e H435R in- troduzidas em GpH7-A5, e a alteração K439E introduzida em GpH7- B3 para formar heterodímeros e purificar tinham um efeito sobre a atividade de ligação de FCYR, em comparação com IgG nativa. Como um controle, GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 2 e 5, respectivamente) foi expresso utilizando plasmídeos inseridos com GpH7-G1D e GpL16- k0 como a cadeia H de anticorpo e cadeia L, respectivamente, e purificada de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Da mesma forma, o anticorpo homodimerizado GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3 e 5, respectivamente), cujas duas cadeias H foram introduzidas com D356K e H435R, o anticorpo homodimerizado GpH7-B3/GpL16- k0 (SEQ ID N°s: 4 e 5, respectivamente), cujas duas cadeias H foram introduzidas com K439E, e o anticorpo heterodimerizado GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 4, e 5, respectivamente) na qual uma das cadeias H foi introduzida com D356K e H435R e a outra foi introduzida com K439E, estavam preparadas. Estes anticorpos e a sua atividade de ligação para cada FcyR foram comparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2, e o resultado está resumido na figura. 5.

[00470] O resultado da medição mostrou que não houve diferença significativa na atividade de ligação a cada FcyR entre GpH7- G1d/GpL16-k0 e GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Além disso, com respeito a cada um de FcyR, GpH7-A5/GpL16-k0 e GpH7-B3/GpL16-k0 manteve pelo menos cerca de 80 % da atividade de ligação de GpH7- G1d/GpL16-k0. Baseado no resultado do acima, determinou-se que a ligação Fcy de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, GpH7-A5/GpL16-k0, e GpH7-B3/GpL16-k0 R não foi significativamente reduzida quando comparada com GpH7-G1d/GpL16-k0, e assim, as variantes resultantes da introdução de mutações em cada cadeia H destes anticorpos podem ser comparadas com a atividade de ligação a cada FcyR.

[00471] Em seguida, GpH7-A26 (SEQ ID N°: 6) resultante da intro dução da mutação G237A em GpH7-A5 foi construído de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Usando GpL16-k0 como a cadeia L, e GpH7-A26 e GpH7-B3 como a cadeia H, o anticorpo heterodimerizado GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 6, 4, e 5, respectivamente) no qual apenas uma das cadeias de H foi introduzida com G237A foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Da mesma forma, usando GpH7-A26 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L, o anticorpo homodimerizado GpH7-A26/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 6 e 5, respectivamente), cujas duas cadeias H foram introduzidas com G237A foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Estes anticorpos foram avaliados para a atividade de ligação a cada FCYR de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Figura 6). O resultado mostrou que o anticorpo heterodimerizado GpH7-A26/GpH7- B3/GpL16-k0 tinha aumentado atividades de ligação para FcyRIIa e FcyRIIb em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Enquanto isso, o anticorpo homodimerizado GpH7-A26/GpL16-k0 em que a mesma alteração foi introduzida em ambas as cadeias H tinha reduzido as atividades de ligação a FcyRIIa e FcyRIIb, em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Estes resultados demonstram que, G237A é uma alteração que aumenta as atividades de ligação a FcyRIIa e FcyRIIb quando introduzido em apenas uma cadeia H, ao mesmo tempo reduz as atividades de ligação a FcyRIIa e FcyRIIb quando introduzido em ambas Cadeias H.

[00472] Em seguida, GpH7-A29 (SEQ ID N°: 7), resultante da introdução da mutação em G237L GpH7-A5 foi construído de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Usando GpL16-k0 como a cadeia L, e GpH7-A29 e GpH7-B3 como a cadeia H, o anticorpo heterodimerizado GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 7, 4, e 5, respectivamente) no qual apenas uma das cadeias de H foi intro- duzida com G237L foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Da mesma forma, usando GpH7-A29 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L, o anticorpo homodimerizado GpH7-A29/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 7 e 5, respectivamente), cujas duas cadeias H foram introduzidas com G237L foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Estes anticorpos e as suas atividades de ligação para cada FCYR foram avaliados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Figura 7). O anticorpo heterodimerizado GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0 tinha aumentado Atividades de ligação FcyRIIa R e ligação FcyRIIb em relação a GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Enquanto isso, o anticorpo homodime- rizado GpH7-A29/GpL16-k0 cujas duas cadeias H tinham a mesma alteração reduziu a atividade de ligação a FcyRIIa e FcyRIIb em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Estes resultados demonstram que, G237L é uma alteração que tem um efeito de aumentar as atividades de ligação a FcyRIIa e FcyRIIb quando introduzido em apenas uma cadeia H, ao mesmo tempo reduz as atividades de ligação a FcyRIIa e FcyRIIb quando introduzido em ambas as cadeias H.

[00473] Em seguida, GpH7-A42 (SEQ ID N°: 8), resultante da introdução da mutação L328E em GpH7-A5 foi construído de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Usando GpL16-k0 como a cadeia L, e GpH7-A42 e GpH7-B3 como a cadeia H, o anticorpo he- terodimerizado GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 8, 4, e 5, respectivamente) no qual apenas uma das cadeias de H foi introduzida com L328E foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Da mesma forma, usando GpH7-A42 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L, o anticorpo homodimerizado GpH7- A42/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 8 e 5, respectivamente), cujas duas cadeias H foram introduzidas com L328E foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Estes anticorpos foram avaliados para a atividade de ligação a cada FCYR de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Figura 8). O anticorpo heterodimerizado GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0 apresentaram aumento da atividade de ligação a FcyRIIa e FcyRIIb em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Enquanto isso, o anticorpo homo- dimerizado GpH7-A42/GpL16-k0 cujas duas cadeias H foram introduzidas com a mesma alteração tinha reduzido Atividade de ligação FcyRIIa e aumento da atividade de ligação FcyRIIb em relação aos GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, no entanto, o grau de crescimento foi maior no GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com L328E. Estes resultados demonstram que L328E é uma alteração que é mais eficaz para aumentar as atividades de ligação a FcyRIIa e FcyRIIb quando introduzido em apenas uma cadeia H do que quando introduzido ambas as cadeias H.

[00474] Em seguida, GpH7-A43 (SEQ ID N°: 9), resultante da introdução da mutação em L328D GpH7-A5 foi construído de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Usando GpL16-k0 como a cadeia L, e GpH7-A43 e GpH7-B3 como a cadeia H, o anticorpo he- terodimerizado GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 9, 4, e 5, respectivamente) no qual apenas uma das cadeias de H foi introduzida com L328D foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Da mesma forma, usando GpH7-A43 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L, o anticorpo homodimerizado GpH7- A43/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 9 e 5, respectivamente), cujas duas cadeias H foram introduzidas com L328D foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Estes anticorpos foram avaliados para a atividade de ligação a cada FcyR de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Figura 9). O anticorpo heterodimerizado GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0 apresentaram aumento da atividade de ligação a FcyRIIa e FcyRIIb em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Enquanto isso, o anticorpo homo- dimerizado GpH7-A43/GpL16-k0 cujas duas cadeias H foram introduzidas com a mesma alteração tinha reduzido atividade de ligação FcYRIIa e aumento da atividade de ligação FcYRIIb em relação a GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, no entanto, o grau de crescimento foi maior em GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com L328D. Estes resultados demonstram que L328D é uma alteração que é mais eficaz para aumentar as atividades de ligação a FcYRIIa e FcYRIIb quando introduzida em apenas uma cadeia H do que quando introduzida em ambas as cadeias H.

[00475] Em seguida, GpH7-B16 (SEQ ID N°: 10), resultante da introdução da mutação L234E na GpH7-B3 foi construído de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Usando GpL16-k0 como a cadeia L, e GpH7-A5 e GpH7-B16 como a cadeia H, o anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 10 e 5, respectivamente) no qual apenas uma das cadeias de H foi introduzida com L234E foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Da mesma forma, usando GpH7-B16 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L, o anticorpo homodime- rizado GpH7-B16/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 10 e 5, respectivamente), cujas duas cadeias H foram introduzidas com L234E foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Estes anticorpos foram avaliados para a atividade de ligação a cada FcYR de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Figura 10). O anticorpo GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0 heterodimerizado tinha aumentado atividades de ligação para FcYRIIIa F e FcYRIIb em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Enquanto isso, o an-ticorpo GpH7-B16/GpL16-k0 homodimerizado cujas duas cadeias H foram introduzidas com a mesma alteração tinha reduzido as atividades de ligação para FcYRIIIa F e FcYRIIb em comparação com GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Estes resultados demonstram que L234E é uma alteração que é eficaz para aumentar as atividades de ligação a FcYRIIIa F e FcYRIIb quando introduzida em apenas uma cadeia H, ao mesmo tempo que reduz as atividades de ligação a FcYRIIIa F e FcYRIIb quando introduzida em ambas as cadeias H.

[00476] Em seguida, GpH7-B17 (SEQ ID N°: 11), resultante da introdução da mutação em L234D GpH7-B3 foi construído de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Usando GGpL16- k0 como a cadeia L, e GpH7-A5 e GpH7-B17 como a cadeia H, o anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 11 e 5, respectivamente), cujas duas cadeias H foram introduzidas com L234D foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Da mesma forma, usando GpH7-B17 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L, o anticorpo homodimerizado GpH7- B17/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 11 e 5, respectivamente), cujas duas cadeias H foram introduzidas com L234D foi expresso de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Estes anticorpos foram avaliados para a atividade de ligação a cada FcYR de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Figura 11). O anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0 apresentaram aumento da atividade de ligação a FcYRIIa e FcYRIIb em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Enquanto isso, o anticorpo GpH7- B17/GpL16-k0 homodimerizado cujas duas cadeias H foram introduzidas com a mesma alteração tinha reduzido as atividades de ligação para FcYRIIa e FcYRIIb em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0. Estes resultados demonstram que L234D é uma alteração que é eficaz para aumentar as atividades de ligação a FcYRIIa e FcYRIIb quando introduzida em apenas uma cadeia H, ao mesmo tempo que reduz as atividades de ligação a FcYRIIa e FcYRIIb quando introduzida em ambas as cadeias H.

[00477] Os resultados acima demonstram que, mesmo se um anticorpo homodimerizado cujas duas cadeias H foram introduzidas com as mesmas exposições alteração reduzida atividade de ligação FCYR, é possível aumentar a atividade de ligação de FCYR construindo um anticorpo heterodimerizado em que apenas uma das cadeias H foi introduzida com a alteração.

[00478] Assim, os resultados acima demonstram que uma propriedade de ligação FcyR superior de um domínio Fc de anticorpo pode ser fornecida usando um anticorpo heterodimerizado cujas duas cadeias H foram introduzidas com diferentes alterações, em comparação com um anticorpo homodimerizado feito por um método convencional para introduzir a mesma alteração em ambas as cadeias H.

Exemplo 3 Confirmação da direção de reconhecimento FcyR de anticorpos heterodimerizados

[00479] Como mostrado no Exemplo 2, foi demonstrado que, utilizando anticorpos heterodimerizados, atividade de ligação FcyR mais alta comparada com anticorpos homodimerizados pode ser alcançada. Quando as alterações descritas no Exemplo 2 foram introduzidas em ambas as cadeias H de um anticorpo, a atividade de ligação de FcyR foi bastante reduzida, em comparação com o anticorpo de ocorrência natural. Esta constatação sugere que tais alterações resultem em um aumento na atividade de ligação de FcyR quando introduzida uma cadeia H de um anticorpo heterodimerizado, no entanto, quando a mutação é introduzida em ambas as cadeias H, após ligação a FcyR, o resíduo após alteração aumenta a ligação de uma cadeia, ao passo que inibe a interação com FcyR na outra cadeia. Aqui, o estado onde FcyR está ligado na direção do lado da profundidade da figura 3 é definido como "ligação de direção X", ao mesmo tempo de um modo oposto, a ligação a partir do lado da frente é definida como "ligação de dirção Y". Especulou-se que no anticorpo heterodimerizado apenas uma das di- reções X e direção Y de atividades de ligação FCYR é alterada, enquanto que o anticorpo homodimerizado as atividades de ligação FCYR na direção X e Y são alteradas da mesma maneira.

[00480] Para provar a hipótese experimentalmente, os presentes inventores encontraram alterações que principalmente inibem a ligação de FcyR, em apenas uma ou outra da direção X e da direção Y, e introduziram essa alteração em qualquer uma das cadeias H e introduziram na mesma ou na outra cadeia H de uma alteração que aumenta a atividade de ligação de FcyR, para verificar a inibição da atividade de ligação de FcyR. Os inventores da presente invenção queriam encontrar um método para ser utilizado em combinação com a modificação acima. Informações conformacionais foram buscadas para alterações que estão envolvidas na ligação FcyR de um anticorpo, mas apenas estão envolvidas na ligação de apenas qualquer um das cadeias H. Como resultado, foi encontrada P329 como candidato. P329 na de cadeia HA forma um núcleo hidrofóbico com Trp nas posições 87 e 110 em FcyRIII, enquanto P329 na cadeia HB não interage diretamente com FcyRIII (Nature, 372: 379-383, 1994) (Figura 12). Por exemplo, pensou-se que a substituição de P329 da cadeia de HA por um resíduo carregado eletricamente provoca o colapso do núcleo hi- drofóbico, e resulta em inibição da ligação na direção X mostrada na Figura 12, no entanto, a previsão era de que não existisse qualquer impacto significativo sobre a ligação na direção Y, porque P329 da cadeia HB, que não está envolvido na ligação na direção Y do outro lado, permanece não substituído.

[00481] Mutações de R, K, D e E carregados eletricamente foram introduzidas em GpH7-B3 em P329 para produzir, respectivamente, as sequências de GpH7-B12,-B13 GpH7, GpH7-B14, e GpH7-B15 (SEQ ID N°s: 12 a 15), e vetores de expressão inseridos com estas sequências foram construídos utilizando o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os vetores de expressão construídos foram cada um deles combinados com GpH7-A5 e GpL16-k0 para expressar anticorpos heterodimerizados, ou eles foram combinados com GpL16-k0 sozinho, mas não com outras cadeias H para expressar anticorpos ho- modimerizados. Estes anticorpos foram expressos e purificados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos purificados resultantes são os seguintes: os anticorpos hetero- dimerizados GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0, GpH7-A5/GpH7- B13/GpL16-k0, GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0, e-GpH7 A5/GpH7- B15/GpL16-k0 e anticorpos homodimerizados GpH7-B12/GpL16-k0, GpH7-B13/GpL16-k0, GpH7-B14/GpL16-k0, e GpH7-B15/GpL16-k0. Os anticorpos preparados foram usados para avaliar a atividade de ligação de cada FCYR pelo método descrito no Exemplo de Referência 2. O resultado é mostrado na Figura 13.

[00482] A atividade de ligação FcyR de GpH7-A5/GpH7- B12/GpL16-k0 e GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0, que são anticorpos heterodimerizado introduzidos com P329R e P329K, respectivamente, foi de cerca de 1/5 a 1/4 da atividade de ligação de cada FcyR de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Enquanto isso, a ligação FcyR não foi observada para os anticorpos homodimerizados GpH7-B12/GpL16-k0 e GpH7-B13/GpL16-k0. Por outro lado, como para FcyRIa, atividade de ligação FcyR de GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0 e GpH7-A5/GpH7- B15/GpL16-k0, que são os anticorpos heterodimerizados introduzidos com P329D e P329E, respectivamente, foi de cerca de 1/5 a 1/4 da atividade de ligação para cada FcyR de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0; como para FcyR diferente de FcyRIa, eles retiveram 50 % ou mais da atividade de ligação. Os anticorpos homodimerizados GpH7- B14/GpL16-k0 e GpH7-B15/GpL16-k0 só manteveram a atividade ligação FcyRIa, e a atividade foi 1/ 5 ou menos da atividade de ligação FcyRIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. GpH7-B12 e B13-GpH7 são introduzidos com resíduos básicos, enquanto GpH7-B14 e B15-GpH7 são introduzidos com resíduos ácidos. Assim, pensou-se que a atividade de ligação a FCYR é mais fortemente inibida pela substituição de P329 com um resíduo básico tal como Arg e Lys. O resultado mostra que a atividade de ligação de FcyR foi mantida quando uma alteração foi introduzida em apenas uma cadeia H, ao passo que a ligação era quase indetectável quando a mesma alteração foi introduzida em ambas as cadeias H, suporta a hipótese de que a substituição de um resíduo hidrofílico em P329 em uma cadeia H inibe a ligação em uma direção, embora a ligação em outra direção seja mantida.

[00483] Então, se as mutações G237A e L234D que aumentam a atividade de ligação a FcyR por heterodimerização, que se verificou, tal como descritas no Exemplo 2, melhoram a interação com FcyR exclusivamente em uma direção foram avaliadas por comparação da atividade de ligação de cada FcyR de cada variante, que foi preparada para ter a alteração P329R em combinação com as alterações acima. Os vetores de expressão inseridos com GpH7-B12 (SEQ ID N°: 12), resultando da introdução da mutação P329R em GpH7-B3 tal que P329R é introduzido na mesma cadeia H como K439E; GpH7-A48 (SEQ ID N°: 16) resultando da introdução da mutação P329R em GpH7-A5 tal que P329R é introduzido na mesma cadeia H como D356K e H435R; GpH7-A45 (SEQ ID N°: 17), resultante da introdução de mutações G237A e P329R em GpH7-A5 e GpH7-B41 (SEQ ID N°: 18), resultante da introdução de mutações L234D e P329R em GpH7- B5, foram construídos utilizando o método descrito no Exemplo de Referência 1. Usando estes vetores de expressão e o vetor de expressão GpL16-k0 correspondente a uma cadeia L de anticorpo, os anticorpos foram expressos de modo a que P329R e G237A ou L234D fossem introduzidos apenas em uma das cadeias H de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1 (Tabela 1). Tabela 1

[00484] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes de regiões constantes de cadeia H de anticorpos respectivos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em relação a GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação particular). As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoáci- dos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00485] A combinação de G237A e P329R foi avaliada usando GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como um polipeptídeo para a introdução de alterações; GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 e GpH7-A48/GpH7- B3/GpL16-k0 como variantes em que uma das cadeias H foi introduzida com P329R; GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0 como uma variante em que G237A foi introduzido na mesma cadeia P329R e GpH7- A26/GpH7-B12/GpL16-k0 como uma variante em que G237A foi introduzido na outra cadeia de P329R. Eles foram comparados quanto à atividade de ligação a cada FCYR de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Figura 14).

[00486] Quando GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com P329R foi comparado com GpH7- A48/GpH7-B3/GpL16-k0, não foi observada diferença significativa no padrão de Ligação FcyR. Assim, pensou-se que P329R não tem influência sobre a ligação FcyR mesmo quando introduzido numa cadeia H introduzida com D356K e H435R ou quando introduzido numa cadeia H introduzida com K439E.

[00487] Por outro lado, GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0, que é um anticorpo heterodimerizado em que apenas uma das cadeias H foi introduzida com G237A, mostrou ligação aumentada para FcyRIIa R e IIb, em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. No entanto, em comparação com GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com P329R, GpH7-A26/GpH7- B12/GpL16-k0 em que a outra cadeia H foi introduzida com G237A exibiu uma ligação FcyR reduzida, e, assim, o efeito de G237A para aumentar a ligação a FcyRIIa R e IIb não foi observado. Enquanto isso, em comparação com GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias de H foi introduzida com P329R, GpH7- A45/GpH7-B3/GpL16-k0 em que G237A foi introduzido com a mesma cadeia H como P329R mostrou uma ligação aumentada para FcyRIIa R e IIb, e, assim, o efeito de G237A para aumentar a ligação a FcyRIIa R e IIb foi observado. Uma vez que a ligação entre o anticorpo e FcyR foi fortemente inibida quando G237A foi introduzido na cadeia diferente do que introduzida com P329R, os resultados acima mostram que, quando introduzido em G237A GpH7-A5 é combinado com P329R in- troduzido em GpH7-B3, reconhecem a ligação entre o anticorpo e FCYR na mesma direção.

[00488] A alteração L234D também foi avaliada da mesma maneira (Figura 15). GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0, que é um anticorpo hete- rodimerizado em que apenas uma das cadeias H foi introduzida com L234D, mostrou um aumento da ligação a FcyRIIa R e IIb, em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. No entanto, em comparação com GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com P329R, GpH7-A48/GpH7-B17/GpL16-k0 em que L234D foi introduzido na outra cadeia H apresentaram uma reduzida ligação a FcyR diferente de FcyRIa, e, assim, o efeito de L234D para melhorar a ligação a FcyRIIa e IIb não foi observado. Enquanto isso, em comparação com GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias de H foi introduzida com P329R, GpH7-A5/GpH7- B41/GpL16-k0 em que L234D foi introduzido na mesma cadeia H como P329R mostrou um aumento da ligação de FcyRIIa e IIb, e, assim, o efeito de L234D para melhorar a ligação a FcyRIIa e IIb foi observado. Uma vez que a ligação entre o anticorpo e FcyR foi fortemente inibida quando L234D foi introduzido na cadeia diferente do que introduzida com P329R, os resultados acima mostram que, quando introduzido na L234D GpH7-B3 é combinado com P329R introduzido em GpH7-A5, reconhecem a ligação entre o anticorpo e FcyR na mesma direção.

[00489] Ou seja, ambos G237A e L234D aumentaram (/ reduziram) a atividade de ligação FcyR de um anticorpo na mesma direção como P329R.

[00490] Desta forma, a heteroalteração melhorou a ligação a FcyR exclusivamente em uma da Direção X e da Direção Y. Esta constatação demonstra que a interação com FcyR é reforçada de forma assimétrica nos anticorpos heterodimerizados.

[00491] Exemplo 4 Comparação da ligação FCYR do anticorpo hete- rodimerizado com a do anticorpo homodimerizado

[00492] Como descrito no Exemplo 2, os presentes inventores revelaram que a ligação FcyR de um anticorpo através do seu domínio Fc pode ser melhorada através da introdução de alterações diferentes para as duas cadeias H de um anticorpo, em vez de introduzir a mesma alteração em ambas as cadeias H. Assim, para descobrir alterações com tal propriedade, os presentes inventores realizaram o experimento descrito abaixo.

[00493] Para construir variantes GpH7-B3, pensou-se que aminoá- cidos seriam envolvidos na ligação a FcyR e aminoácidos em torno deles em GpH7-B3 (SEQ ID N°: 4), construídos tal como descrito no Exemplo 2, especificamente, Leu na posição 234 (UE numeração), Leu na posição 235 (numeração EU), Gly na posição 236 (numeração EU), Gly na posição 237 (numeração EU), Pro na posição 238 (numeração EU), Ser na posição 329 (numeração EU), Asp na posição 265 (numeração EU), Val na posição 266 (numeração EU), Ser na posição 267 (numeração EU), Sua na posição 268 (numeração EU), Glu na posição 269 (numeração EU), Asp na posição 270 (numeração EU), Pro na posição 271 (numeração EU), Gln na posição 295 (numeração EU), Tyr na posição 296 (numeração EU), Ser na posição 298 (numeração EU), Tyr na posição 300 (numeração EU), Ser na posição 324 (numeração EU), Asn na posição 325 (numeração EU), Lys na posição 326 (numeração EU), Ala na posição 327 (numeração EU), Leu na posição 328 (numeração EU), Pro na posição 329 (numeração EU), Ala na posição 330 (numeração EU), Pro na posição 331 (numeração EU), Ile na posição 332 (numeração EU), Glu na posição 333 (numeração EU), Lys na posição 334 (numeração EU), Thr na posição 335 (numeração EU), Ile na posição 336 (numeração EU), e Ser na posição 337 (numeração EU) foram cada um deles substituídos com 18 tipos de aminoácidos exceto o aminoácido original e cisteína. Cada variante GpH7-B3 foi nomeada "A_B", onde A representa a informação sobre o tipo de aminoácido indicado pelo código de uma letra e a numeração EU do resíduo alterado, e B indica a informação sobre o aminoácido após a substituição. Por exemplo, quando Gly for substituída por Leu na posição 234 (numeração EU), a B3_variant é chamada L234_01G. Para fins de descrição, na informação sobre o aminoácido após a substituição, um número específico para o aminoácido é adicionado antes de cada código de uma letra. Especificamente, os símbolos utilizados são os seguintes: 01G para Gly; 02A para Ala; 03V para Val, 04F para Phe; 05P para Pro; 06M para Met; 07I para Ile; 08L para Leu; 09D para Asp; 10E por Glu; 11K por Lys; 12R para Arg; 13S para Ser; 14T para Thr; 15Y para Tyr; 16H para a Sua; 18N para Asn; 19q para Gln, e 20W para Trp.

[00494] Anticorpos homodimerizados em que ambas as cadeias H foram introduzidas com uma mutação foram preparados pelo seguinte procedimento. Os anticorpos foram expressos utilizando uma variante GpH7-B3 como a cadeia H e GpL16-k0 (SEQ ID N°: 5) como a cadeia L. Os anticorpos foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos homodimerizados em que ambas as cadeias H foram introduzidas com uma mutação assim preparada são referidos como Ho Ab.

[00495] Anticorpos heterodimerizados em que apenas uma das cadeias H foi introduzida com uma mutação foram preparados pelo seguinte procedimento. Os anticorpos foram expressos utilizando uma variante GpH7-B3 e GpH7-A5 (SEQ ID N°: 3) como a cadeia H e GpL16-k0 (SEQ ID N°: 5) como a cadeia L. Os anticorpos foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos hete- rodimerizados no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com uma mutação assim preparada são referidos como He Ab.

[00496] Como anticorpo homodimerizado de controle, GpH7- B3/GpL16-k0 que foi preparado utilizando GpH7-B3 (SEQ ID N°: 4) como a cadeia H e GpL16-k0 (SEQ ID N°: 5) como a cadeia L foi preparada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Este anticorpo homodimerizado de controle é referido como HoCon Ab. Tal como avaliado no Exemplo 2, a atividade de ligação de HoCon Ab para cada FCYR não é significativamente alterada quando comparada com a IgG1 nativa.

[00497] Como anticorpo heterodimerizado de controle, GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 que foi preparado utilizando GpH7-A5 (SEQ ID N°: 3) e GpH7-B3 (SEQ ID N°: 4) como a cadeia H e GpL16-k0 (SEQ ID N°: 5) como a cadeia L foi preparada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Este anticorpo heterodimerizado controle é referido como HeCon Ab. Tal como avaliado no Exemplo 2, a atividade de ligação de HeCon Ab para cada FcyR não foi significativamente alterada em comparação com a IgG1 nativa.

[00498] Ho Ab, He Ab, HeCon Ab, Ab e HoCon Ab preparados foram ensaiados para a atividade de ligação a FcyRIa, FcyRIIa (R), FcyRIIa (H), FcyRIIb e FcyRIIIa de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2. Como para o resultado do ensaio para cada FcyR, um gráfico foi desenhado através do seguinte procedimento. A atividade de ligação de He Ab para cada FcyR foi dividida pela HeCon Ab, e depois multiplicada por 100, o que é referido como He/Con. A atividade de ligação de Ho Ab para cada FcyR é dividida pela HoCon Ab, e depois multiplicada por 100, o que é referido como Ho/Con. Quanto aos anticorpos homodimerizados e heterodimerizado preparados usando uma variante GpH7-B3 compreendendo uma alteração de interesse, valores Ho/Con e He/Con foram plotados nos eixos horizontal e vertical, respectivamente. Os resultados para a respectiva FcyRs, ou seja, FcyRIa, FcyRIIa (R), FcyRIIa (H), FcyRIIb e FcyRIIIa, encon- tram-se resumidos nas Figs. 16 a 20. Com base em valores He/Con e Ho/Con, cada alteração pode ser interpretada da seguinte forma. 1. Quando os valores He/Con e Ho/Con são 100: isso significa que a atividade de ligação de FCYR do anticorpo heterodimerizado He Ab e anticorpo homodimerizado Ho Ab, os quais compreendem uma variante GpH7-B3 introduzida com uma mutação de interesse, é equivalente à atividade de ligação de FcyR do anticorpo heterodimerizado de controle e anticorpo de controle homodimerizado, respectivamente. 2. Quando os valores He/Con e Ho/Con são de 100 ou menos: isso significa que a atividade de ligação de FcyR do anticorpo he- terodimerizado He Ab e anticorpo homodimerizado Ho Ab, os quais compreendem uma variante GpH7-B3 introduzida com uma mutação de interesse, é mais fraca do que a atividade de ligação FcyR do anticorpo heterodimerizado de controle e anticorpo homodimerizado de controle, respectivamente. 3. Quando os valores He/Con e Ho/Con são de 100 ou mais: isso significa que a atividade de ligação de FcyR do anticorpo heterodimerizado He Ab e anticorpo homodimerizado Ho Ab, os quais compreendem uma variante GpH7-B3 introduzida com uma mutação de interesse, é mais forte do que a atividade de ligação FcyR do anticorpo heterodimerizado de controle e anticorpo homodimerizado de controle, respectivamente. 4. Quando o/valor Con Ele é maior do que o valor Ho/Con: isso significa que a atividade de ligação de FcyR do anticorpo hetero- dimerizado He Ab compreendendo uma variante GpH7-B3 introduzida com uma mutação de interesse é mais forte do que a atividade do anticorpo homodimerizado Ho Ab. 5. Quando o valor He/Con é menor do que o valor Ho/Con: isso significa que a atividade de ligação a FcyR do anticorpo heterodi- merizado He Ab compreendendo uma variante GpH7-B3 introduzida com uma mutação de interesse é mais fraca do que a atividade do an-ticorpo homodimerizado Ho Ab.

[00499] Com base na interpretação dos itens 1 a 5 acima, os apon-tamentos de dados nas Figura 16 a 20 podem ser classificados como mostrados na Figura 21.

[00500] Quando uma alteração está presente na Região i na Figura 21, isto significa que a alteração, quando introduzida em ambas as cadeias H de um anticorpo homodimerizado, reduz a sua ligação a FCYR, ao passo que a mesma alteração, quando introduzida em apenas uma cadeia H de um anticorpo heterodimerizado, tem o efeito de aumentar a sua ligação ao FcyR. Isto é, a alteração aumenta a ligação a FcyR de apenas o anticorpo heterodimerizado. Como para cada FcyR, alterações que compreendidas na Região i estão resumidas na Tabela 2 (Tabelas 2-1 a 2-3), Tabela 3 (Tabelas 3-1 e 3-2), Tabela 4, Tabela 5 e Tabela 6.

[00501] Quando uma alteração está presente na Região ii da Figura 21, isto significa que a alteração correspondente do ponto que melhora a ligação de FcyR, quando introduzida em ambas as cadeias H de um anticorpo homodimerizado, ou quando introduzida apenas em uma cadeia H de um anticorpo heterodimerizado, e o efeito de reforçar a ligação é mais forte no o anticorpo heterodimerizado. Especificamente, as alterações nesta região têm um maior efeito de reforço da ligação de FcyR no anticorpo heterodimerizado que no anticorpo homodimeriza- do. Como para cada FcyR, alterações que se enquadram na Região ii estão resumidas na Tabela 2 (Tabelas 2-1 a 2-3), Tabela 3 (Tabelas 31 e 3-2), Tabela 4, Tabela 5 e Tabela 6.

[00502] Em cada tabela, He/Con relacionado com a atividade de ligação a FcyRIa FcyRIIa H, FcyRIIa R, FcyRIIb e FcyRIIIa é conhecido como He/Con_1a, He/Con_2aH, He/Con_2aR, He/Con_2b e He/Con_3a, respectivamente; Ho/Con relacionado com a atividade de ligação a FcYRIa FcYRIIa H, FcYRIIa R, FcYRIIb e FcYRIIIa é referido como Ho/Con_1a, Ho/Con_2aH, Ho/Con_2aR, Ho/Con_2b e Ho/Con_3a, respectivamente.

[00503] Quando uma alteração está presente na Região iii na Figura 21, isto significa que a alteração correspondente ao ponto, quando introduzida em ambas as cadeias H de um anticorpo homo- dimerizado, ou quando introduzida apenas em uma cadeia H de um anticorpo heterodimerizado, aumenta a ligação a FcYR, e o efeito de aumento de ligação é mais forte no anticorpo homodimerizado. Especificamente, as alterações nesta região têm um maior efeito de reforço da ligação do FcYR no anticorpo homodimerizado que no anticorpo heterodimerizado.

[00504] Nas tabelas abaixo, as alterações de aminoácido são indicadas de uma maneira tal como A327_03V. A primeira letra do alfabeto (por exemplo, "A" do A327_03V) é um código de uma letra representando o resíduo de aminoácido antes da alteração, e a seguir o número (por exemplo, "327" de A327_03V) indica a posição de alteração (numeração EU). O último algarismo e uma letra do alfabeto (por exemplo, "03V" de A327_03V) indica uma letra alfabética em que o resíduo de aminoácido após alteração é representado por um código de uma letra (número que representa o tipo de aminoáci- do + letra alfabética). Tais são indicadas da seguinte forma: 01G (Gly), 02A (Ala), 03V (Val), 04F (Phe), 05P (Pro), 06M (Met), 07I (Ile), 08L (Leu), 09D (Asp), 10E (Glu), 11K (Lys), 12R (Arg), 13S (SER), 14T (THR), 15Y (Tyr), 16H (His), 17C (Cis), 18N (ASN), 19q (Gln) e 20W (Trp). Assim, por exemplo, "A327_03V" significa "uma substituição de V para A na posição de aminoácido 327 (numeração EU)". Tabela 2-3

região/nome

[00505] Com relação a FcRIa, alterações compreendidas nas Regiões i e ii (Figura 21) são mostradas.

REGION i REGION ii região/nome/

[00506] Com relação a FcRIIa R, alterações compreendidas nas Re-giões i e ii (Figura 21) são mostradas. Tabela 4

região/nome/

[00507] Com relação a FcRIIa H, alterações compreendidas nas Re-giões i e ii (Figura 21) são mostradas. Tabela 5

região/nome/

[00508] Com relação a FcRIIb, alterações compreendidas nas Regiões i e ii (Figura 21) são mostradas. Tabela 6

região/nome/

[00509] Com relação a FcRIIIa, alterações compreendidas nas Regiões i e ii (Figura 21) são mostradas.

[00510] As alterações divulgadas neste Exemplo, juntamente com o Exemplo 2, são pensadas para suportar o conceito de melhora da ca-pacidade de reconhecimento de FCYR pelo anticorpo heterodimerizado descrito no Exemplo 1. Alterações na Região i na figura. 21 pensa-se que reduzem a atividade de ligação de FcyR quando introduzidas em ambas as cadeias H de uma maneira convencional, e que não tenham sido reconhecidas como alterações que aumentam a ligação. Os in- ventores da presente invenção, no entanto, conseguiram demonstrar que tais alterações também melhoram a atividade de ligação a FCYR, introduzindo-as em apenas uma das duas cadeias H.

[00511] Exemplo 5 Método para a determinação de combinações de alterações de anticorpos heterodimerizados

[00512] Tal como descrito no Exemplo 3, o efeito de uma alteração na ligação Fcy de um anticorpo heterodimerizado R difere na direção dependendo da alteração. Por esta razão, quando várias alterações são combinadas para adicionalmente aumentar ou reduzir a ligação de FcyR de um anticorpo heterodimerizado, ele é necessário para unificar a direção do efeito de cada modificação sobre a ligação de FcyR. Se duas alterações foram introduzidas de um modo que os seus efeitos melhorem a ligação a FcyR de um anticorpo sejam diferentes na direção, os efeitos das alterações aniquilam uns aos outros e o efeito de aumentar a ligação não seria observado apesar da combinação de alterações para aumentar a ligação de FcyR. No entanto, não existe um método para prever de antemão quais cadeia H devem ser introduzidas com uma alteração. Assim, a fim de encontrar um método adequado para a combinação, em geral, os anticorpos em que as alterações de interesse são introduzidos na mesma cadeia ou cadeias H diferentes precisam de ser preparados, e eles são comparados uns com os outros para a atividade de ligação de FcyR. Por exemplo, quando todos os três tipos diferentes de alterações são introduzidas em um anticorpo homodimerizado, um único tipo de anticorpo, em que cada alteração foi introduzida em ambas as cadeias H, pode ser preparado. No caso de um anticorpo heterodimerizado, no entanto, que é necessário para determinar quais cadeia H devem ser introduzidas, com cada alteração. Neste caso, como mostrado na Figura 22, existe um máximo de quatro combinações a ser julgado, ou seja, o número de variantes que devem ser preparadas para avaliação de combinações de alteração é muito grande, e isto é ineficiente. Assim, os presentes in-ventores testaram um método para identificar a direção em que uma alteração de interesse tem um efeito sobre a ligação FCYR de um anti-corpo combinando a alteração com P329R que inibe a ligação do FCYR de um anticorpo a partir de uma única direção.

[00513] Os presentes inventores examinaram como a ligação e FcyRIIIa foi alterada quando alterações L234Y, G236W, e S298A que aumentam a ligação a FcyRIIIa foram cada uma introduzidas na mesma cadeia H como P329R ou outra cadeia H de um anticorpo hetero- dimerizado encontrado no Exemplo 4. Em primeiro lugar, as variantes de interesse foram expressas e preparadas de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1, utilizando GpH7-A5 como uma cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L e como a outra cadeia H, GpH7-HA5 (SEQ ID N°: 19), GpH7-HA6 (SEQ ID N°: 20), e GpH7- HA11 (SEQ ID N°: 21), resultante da introdução de L234Y, G236W, S298A e, respectivamente, em GpH7-B12 introduzido com a alteração P329R. Além disso, os anticorpos de interesse foram expressos e preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1, utilizando-se como uma cadeia H, GpH7-A48 (SEQ ID N°: 16), resultante da introdução de P329R em GpH7-A5, e GpL16-k0 como a cadeia L e a outra cadeia H, GpH7-B3-01-15Y (SEQ ID N°: 22), GpH7- B3-03-20W (SEQ ID N°: 23), e GpH7-B3-15-02A (SEQ ID N°: 24), resultante da introdução de L234Y, G236W, S298A e, respectivamente, em GpH7-B3. Os anticorpos assim obtidos foram denominados GpH7- A5/GpH7-HA5/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 19 e 5, respectivamente), GpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 20 e 5, respectivamente), GpH7-A5/GpH7-HA11/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 3, 21 e 5, respectivamente), GpH7-A48/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 16, 22 e 5, respectivamente), GpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 (SEQ ID N°s: 16, 23 e 5, respectivamente), e GpH7-A48/GpH7-B3-15- 02A/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 16, 24 e 5, respectivamente). As variantes foram comparadas umas com as outras para a atividade de ligação de FcYRIIIa de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2. Os efeitos da combinação de L234Y, G236W, e S298A com P329R estão resumidos na Tabela 7. Tabela 7

[00514] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de respectivos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). A atividade de ligação de FcYRIIIa é indicada como uma atividade de ligação relativamente ao definir a ligação FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID N°: 3, 4, e 5, respectivamente) como 100. As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00515] Com base no resultado, as alterações foram comparadas para a atividade de ligação de FcYRIIIa quando cada alteração foi introduzida na mesma cadeia H como P329R ou na cadeia H diferente da introduzida com P329R. No caso de L234Y, a atividade de ligação de GpH7-A5/GpH7-HA5/GpL16-k0 correspondente à anterior era de 60, enquanto que a atividade de ligação de GpH7-A48/GpH7- B3-01-15Y/GpL16-k0 correspondente a última foi de 11, sendo assim, a ligação FCYR foi inibida quando a alter ação foi introduzida na cadeia H diferente da que foi introduzida com P329R. No caso de G236W, a atividade de ligação de GpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0 correspondente à anterior era de 56, enquanto que a atividade de ligação de GpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 correspondente a última foi de 13, sendo assim, a ligação FcyR foi inibida quando a alteração foi introduzida na cadeia H diferente da que foi introduzida com P329R. No caso de S298A, a atividade de ligação de GpH7- A5/GpH7-HA11/GpL16-k0 correspondente à anterior era de 84, enquanto que a atividade de ligação de GpH7-A48/GpH7-B3-15- 02A/GpL16-k0 correspondente a última foi de 47, assim, a atividade de ligação de FcyR foi inibida quando a alteração foi introduzida na cadeia H diferente da que foi introduzida com P329R. Para todas as alterações, a ligação FcyRIIIa foi inibida quando uma alteração foi introduzida na cadeia H diferente da que foi introduzida com P329R, como descrito em último caso. Se a cadeia H introduzida com P329R correspondia à cadeia HA da Figura 3, P329R é pensado para inibir a ligação na direção X. Uma vez que as combinações que resultaram em uma inibição significativa da ligação são aquelas em que L234Y, G236W, ou S298A foram introduzidos na cadeia H diferente da que foi introduzida com P329R, neste caso, as alterações que foram introduzidas na cadeia HB. Uma vez que o efeito de melhorar a ligação FcyRIIIa foi marcadamente inibido quando qualquer uma das alterações L234Y, G236W, e S298A foram introduzidas na cadeia H diferente da que foi introduzida com P329R, todas as alterações, quando introduzidas na cadeia HB, reforçaram a ligação FcYRIIIa da direção X, que é inibida por P329R. Assim, pensou-se que a ligação FcYRIIIa pode ser adicionalmente melhorada através da introdução destas alterações na mesma cadeia H.

[00516] A hipótese acima descrita foi testada avaliando se a ligação FcY R é aumentada através da introdução de dois L234Y, G236W, e S298A na mesma cadeia H ou em diferentes cadeias H. Os vetores de expressão inseridos com GpH7-TA1 (SEQ ID N°: 25), GpH7-TA2 (SEQ ID N°: 26), e GpH7-TA3 (SEQ ID N°: 27), resultantes da introdução de L234Y, G236W, e em S298A GpH7-A5, respectivamente, e vetores de expressão inseridos com GpH7-B3-01-15Y (SEQ ID N°: 22), GpH7-B3-03-20W (SEQ ID N°: 23), e GpH7-B3-15- 02A (SEQ ID N°: 24), resultantes da introdução de L234Y, G236W, e S298A em GpH7-B3, respectivamente, foram construídos de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Além disso, os vetores de expressão inseridos com o seguinte foram construídos: GpH7-TA4 (SEQ ID N°: 28), resultante da introdução de L234Y e G236W em GpH7-A5; GpH7-TA5 (SEQ ID N°: 29), resultante da introdução de L234Y e S298A em GpH7-A5, e GpH7-AT6 (SEQ ID N°: 30), resultante da introdução de G236W e S298A em GpH7-A5. Estes foram combinados de uma maneira como se mostra na Tabela 8, e GpL16-k0 foi adicionado como a cadeia L para cada combinação. Os anticorpos de interesse foram expressos e preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Em relação às amostras expressas, informações sobre as cadeias H e sítios de mutação, e os resultados do ensaio sobre a ligação FcYRIIIa do anticorpo estão resumidos na Tabela 8. Tabela 8

[00517] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de respectivos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). A ati-vidade de ligação FcYRIIIa é indicada como uma atividade de ligação relativa ao definir a ligação FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como 100. As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00518] O efeito da combinação de L234Y e G236W foi avaliado com base no resultado apresentado na Tabela 8. A atividade de ligação de FcYRIIIa de GpH7-TA2/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0 em que L234Y e G236W foram introduzidos em diferentes cadeias H era de 130, e não foi aumentada em comparação com a atividade de ligação de 131 de GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0 introduzido com L234Y isoladamente, enquanto que foi diminuída em comparação com a atividade de ligação de 140 de GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16- k0 introduzido com G236W sozinho. Enquanto isso, a atividade de ligação de GpH7-TA4/GpH7-B3/GpL16-k0 em que L234Y e G236W foram introduzidos na mesma cadeia H foi de 168, e foi aumentada em comparação com a atividade de ligação de GpH7-A5/GpH7-B3-01- 15Y/GpL16-k0 introduzido com L234Y sozinho e GpH7-A5/GpH7-B3- 03-20W/GpL16-k0 introduzido com G236W sozinho. Como previsto, este resultado demonstra que L234Y e G236W, quando introduzidos na mesma cadeia H, adicionalmente aumentam a atividade de ligação de FcYRIIIa.

[00519] Em seguida, o efeito da combinação de L234Y e S298A foi avaliada com base na Tabela 8. A atividade de ligação de FcYRIIIa de GpH7-TA1/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 em que L234Y e S298A foram introduzidos em diferentes cadeias H foi de 142, e foi aumentada em comparação com a atividade de ligação de 131 de GpH7-A5/GpH7-B3- 01-15Y/GpL16-k0 introduzido com L234Y isoladamente, enquanto que foi diminuída em comparação com a atividade de ligação de 163 de GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 introduzido com S298A sozinho. Isto é, uma vez que a atividade de ligação de GpH7-TA1/GpH7-B3-15- 02A/GpL16-k0 não aumentou, em comparação com quando sozinho S298A foi introduzido, pode-se dizer que o efeito de aumentar ainda mais a atividade de ligação FcYRIIIa não foi fornecida quando e S298A L234Y foram introduzidos em diferentes cadeias H. Enquanto isso, a atividade de ligação de FcYRIIIa de GpH7-TA5/GpH7-B3/GpL16-k0 em que L234Y e S298A foram introduzidos na mesma cadeia H foi de 208, e foi aumentada em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3-01- 15Y/GpL16-k0 introduzido com L234Y sozinho e GpH7-A5/GpH7-B3- 15-02A/GpL16-k0 introduzido com S298A sozinho. Como previsto, este resultado demonstra que L234Y e S298A, quando introduzidos na mesma cadeia H, pode adicionalmente aumentam a atividade de ligação de FcYRIIIa.

[00520] Em seguida, o efeito da combinação de G236W e S298A foi avaliada com base na Tabela 8. A atividade de ligação de FcYRIIIa de GpH7-TA3/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 em que G236W e S298A foram introduzidos em diferentes cadeias H foi de 70, e foi reduzida em comparação com a atividade de ligação de 140 de GpH7-A5/GpH7-B3- 03-20W/GpL16-k0 introduzido com G236W sozinho, e a atividade de ligação de 163 ° GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 introduzido com S298A sozinho. Enquanto isso, a atividade de ligação de GpH7- TA6/GpH7-B3/GpL16-k0 em que G236W e S298A foram introduzidos na mesma cadeia H era 228, e foi aumentada em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 introduzido com G236W sozinho e GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 introduzido com S298A sozinho. Como previsto, este resultado demonstra que G236W e S298A, quando introduzidos na mesma cadeia H, adicionalmente aumentam a atividade de ligação de FcYRIIIa.

[00521] Tal como foi inicialmente previsto, estes resultados demonstram que L234Y, G236W, e S298A, apenas quando cada um é introduzido na mesma cadeia H, aumentam a ligação. Estes dados suportam que L234Y, G236W e S298A, quando estando presentes na mesma cadeia, melhoram a ligação de FcYR da mesma direção. Isto é, esta mostra que se pode estabelecer um método para a combinação de duas alterações de forma apropriada com base na sequência prevista a partir do resultado da comparação da atividade de ligação de FcYRIIIa, combinando P329R com cada uma das alterações. Em outras palavras, a combinação com P329R é um método útil para prever um método de combinação de alterações no nível de anticorpos hete- rodimerizados. Este método pode ser usado para revelar outras com-binações úteis de alterações.

[00522] As combinações de duas ou mais alterações foram consideradas com base no resultado da comparação da atividade de ligação de FcYRIIIa combinando P329R com cada uma das alterações. Foi demonstrado que L234Y e G236W, G236W e S298A S298A e L234Y, quando introduzidos na mesma cadeia H, respectivamente, melhoram a interação com FcYRIIIa a partir da mesma direção. Isto é, a partir deste resultado, foi pensado que L234Y, G236W, e S298A todos aumentam a atividade de ligação de FcYRIIIa na mesma direção, e, portanto, essas alterações, quando introduzidas na mesma cadeia H, eram esperadas para aumentar ao máximo a atividade de ligação FcYRIIIa. Para avaliar esta hipótese, GpH7-TA4, GpH7-TA5, e GpH7- AT6 foram construídos através da introdução em GpH7-A5 cada um dos grupos de alteração de L234Y e G236W, L234Y e S298A, e G236W e S298A; GpH7-B3-01-15Y, GpH7-B3-03-20W, e GpH7-B3- 15-02A foram construídos através da introdução de L234Y, G236W, e S298A , respectivamente, em GpH7-B3; vetores de expressão inseridos com as construções acima foram preparados de acordo com o Exemplo de Referência 1. Os vetores foram combinados de uma maneira que as três alterações, L234Y, G236W, e S298A, foram introduzidas na cadeia H e GpL16-k0 foi adicionado como a cadeia L, e os anticorpos de interesse foram expressos e preparados de acordo com o método descrito Exemplo de Referência 1. Além disso, GpH7-TA7 (SEQ ID N°: 31), resultante da introdução de três alterações, L234Y, G236W, e S298A em GpH7-A5 foi construído, e combinado com GpH7-B3 e GpL16-k0 para expressar e purificar um anticorpo de interesse de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. A lista dos anticorpos preparados tal como aqui descrito e o resultado da comparação da atividade de ligação de FcYRIIIa entre anticorpos é apresentada na Tabela 9. Tabela 9

[00523] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de respectivos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). A atividade de ligação FcYRIIIa é indicada como uma atividade de ligação relativa ao definir a atividade de ligação FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como 100. As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00524] Tal como foi previsto a partir do resultado da comparação da atividade de ligação de FcYRIIIa combinando P329R com cada alteração, GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 em que L234Y, G236W, e S298A foram introduzidos na mesma cadeia H exibiu ligação FcYRIIIa mais fortemente reforçada. Isto é, o resultado demonstra que é possível prever um método para combinar adequadamente duas ou mais alterações por comparação da atividade de ligação de FcYRIIIa combinando P329R com cada alteração.

[00525] Exemplo 6 Comparação de anticorpo homodimerizado convencional e novo anticorpo heterodimerizado baseado em anticorpo heterodimerizado

[00526] Os resultados apresentados nas Tabelas 7, 8 e 9 do Exemplo 5 demonstram que as heteroalterações que cada um sozinho aumenta a atividade de ligação FcYRIIIa, quando adequadamente combinadas, podem aumentar ainda mais a ligação de FcYRIIIa. Especificamente, demonstrou-se que as alterações L234Y, G236W, e S298A, quando introduzidas na mesma cadeia H, adicionalmente aumentam a atividade de ligação de FcYR.

[00527] Em seguida, os presentes inventores examinaram se, mesmo várias alterações forem combinadas, o anticorpo heterodi- merizado resultante ainda teria a característica do anticorpo hetero- dimerizado que o anticorpo heterodimerizado introduzido com múltiplas alterações exibe ligação FcYR mais fortemente reforçada do que o anticorpo homodimerizado introduzido com as correspondente múltiplas alterações. Especificamente, GpH7-TA7 e GpH7-TA45 (SEQ ID N°: 32), resultante da introdução de L234Y, G236W, e S298A em GpH7-A5 e GpH7-B3, respectivamente, foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Como mostrado na Tabela 10, os anticorpos heterodimerizados GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 e GpH7-A5/GpH7-TA45/GpL16-k0 em que L234Y, G236W, e S298A foram introduzidos em apenas uma cadeia H, e a anticorpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7- TA45/GpL16-k0 em que L234Y, G236W, e S298A foram introduzidos em ambas as cadeias H foram expressos e purificados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Estes anticorpos foram comparados quanto à ligação a FcYRIIIa de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Tabela 10). Tabela 10

[00528] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de respectivos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação). A atividade de ligação FcYRIIIa é indicada como uma atividade de ligação relativa ao definir a ligação FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como 100. As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de amino- ácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00529] O resultado mostrado na Tabela 10 demonstra que o anticorpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com L234Y, G236W, e S298A apresentou redução ligação de FcYRIIIa em comparação com os anticorpos heterodimerizados GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 e GpH7- A5/GpH7-TA45/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A. Isto mostra que a característica das alterações L234Y, G236W, e S298A que eles aumentam a atividade de ligação de FcYR de um anticorpo heterodimerizado mas reduz a atividade de ligação de FcYR de um anticorpo homodimerizado, é mantida mesmo quando várias alterações são combinadas juntas.

[00530] Em seguida, os presentes inventores examinaram se um anticorpo heterodimerizado em que apenas uma das cadeias H foi in- troduzida com L234Y, G236W, e S298A retém a direcionalidade da ligação FcYRIIIa discutida no Exemplo 3.

[00531] GpH7-TA8 (SEQ ID N°: 33) e GpH7-B12 (SEQ ID N°: 12), resultante da introdução de P329R em GpH7-TA7 e GpH7-B3, res-pectivamente, foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Como mostrado na Tabela 11, o anticorpo heterodimerizado GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0 em que L234Y, G236W, e S298A foram introduzidos na mesma cadeia H como P329R, e o anticorpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7- B12/GpL16-k0 em que L234Y, G236W, e S298A foram introduzidos na cadeia H diferente da que foi introduzida com P329R foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Quanto à atividade de ligação a FcYRIII, estes anticorpos foram comparados com o anticorpo heterodimerizado GpH7- TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Tabela 11). Tabela 11

[00532] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de respectivos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). A atividade de ligação FcYRIIIa é indicada como uma atividade de ligação relativa ao definir a ligação FcYRIIIa de GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como 100. As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00533] O resultado apresentado na Tabela 11 demonstra que o anticorpo heterodimerizado GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0 em que o grupo de alterações L234Y, G236W, e S298A foi introduzido na mesma cadeia H como P329R, e o anticorpo heterodimerizado GpH7 TA7/GpH7-B12/GpL16-k0 em que o grupo de alterações L234Y, G236W, e S298A foi introduzido na cadeia H diferente da que foi introduzida com P329R ambos exibindo reduzida atividades de ligação FcYRIIIa em comparação com GpH7-TA7/GpH7- B3/GpL16-k0. A atividade de ligação de FcYRIIIa de GpH7- TA7/GpH7-B12/GpL16-k0 foi de 11, e foi significativamente reduzida quando comparada com a atividade de 150 de GpH7-TA8/GpH7- B3/GpL16-k0. Este resultado demonstra a característica de que a atividade de ligação de FcYR é acentuadamente reduzida se múltiplas das alterações L234Y, G236W, e S298A forem introduzidas em uma cadeia H, quando eles são introduzidos na cadeia H diferente da que foi introduzida com P329R, que foi observado no Exemplo 3 para as alterações L234Y, G236W, e S298A.

[00534] Os resultados acima demonstram que uma combinação apropriada de alterações que melhoram a ligação FcYR pode aumentar ainda mais a atividade de ligação de FcYR mantendo a característica de um anticorpo heterodimerizado.

[00535] Exemplo 7 Comparação com técnica anterior: comparação entre variantes heterodimerizadas e anticorpos alterados por aminoácidos que melhoram a ligação de FcYRIIIa

[00536] Alterações que aumentem a atividade de ADCC melhorando a ligação FcYRIIIa já são conhecidos. Por exemplo, as alter ações S239D, I332E, e A330L são conhecidas como mutações que aumentam a ligação a FcYRIIIa mais quando introduzidos em ambas as cadeias H de um anticorpo (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1 03, 4005-4010, 2006). A atividade antitumoral de um anticorpo foi demonstrada para ser aumentada pelo aumento da atividade citotóxica celular dependente de anticorpo (ADCC). Reforçar a ligação de FcYRIIIa de um anticorpo é um meio eficaz para melhorar a utilidade de anticorpos como produtos farmacêuticos. No entanto, como mostram os exemplos acima, não são consideradas limitações sobre o aumento da atividade de ligação FcYR utilizando anticorpos homo- dimerizados. Assim, pensou-se que a atividade de ligação a FcYR pode ser ainda aumentada em heteroalteração.

[00537] Tal como mencionado no Exemplo 1, o domínio Fc de um anticorpo interage com FcYR de uma forma assimétrica. No caso de um anticorpo com as alterações introduzidas S239D, I332E, e A330L, em vista da estrutura tridimensional, pensa-se que, na cadeia de HA, todos os resíduos alterados de S239D, I332E, e A330L estão envolvidos na melhora da interação com FcYR, enquanto na cadeia HB, resíduos diferentes de S239D estão fora de contato com FcYR e não contribuem para o aumento da atividade de ligação FcYR (Figura 23). Isto é, à luz da assimetria da interação entre o domínio Fc e FcYR, cada alteração introduzida pela tecnologia de alteração de anticorpos convencional não é suficientemente capaz de interação com FcYR e isto é pensado para ser suficiente para otimizar a interação anticorpo/FcYR. Por exemplo, no caso de alterações acima descritas S239D, I332E, e A330L, pensa-se que a ligação FcYRIIIa pode ser adicionalmente melhorada através da introdução de alterações que melhoram a interação com FcYRIIIa na cadeia lateral do HB, em vez de introduzir as alterações acima na cadeia HB. Isto é, a ligação de FCYR poderia ser melh orada através da utilização da tecnologia da presente invenção para a produção de anticorpos através da introdução de diferentes alterações heterodi- merizadas para cada cadeia H do anticorpo (daqui em diante referido como "tecnologia de anticorpos heterodimerizados") do que usando a tecnologia para introduzir a mesma alteração de ambas as cadeias H de anticorpo (daqui em diante referida como "técnica anterior" ou "tecnologia de anticorpos homodimerizados").

[00538] Em vista da estrutura tridimensional do complexo FcyRIIIa/ Fc, ao contrário de S239D, I332E, e A330L, pensa-se que S298 interage com FcyR apenas na cadeia HB, como mostrado na Figura 23 (JBC, 276: 16.469-16.477, 2001). Assim, pensa-se que, quando uma alteração é introduzida em S298, o resíduo após a mutação por substituição também interage com FcyRIIIa na cadeia lateral do HB. Como pode ser visto no Exemplo 5, L234Y e G236W são pensados para aumentar a interação com FcyR a partir da mesma direção que S298A. Isto é, acredita-se que, quando S239D, A330L, e I332E são introduzidos na mesma cadeia H, e L234Y, G236W, e S298A são introduzidos na outra cadeia H, todas as alterações introduzidas podem interagir com FcyR ao mesmo tempo, resultando na melhora da interação com FcyR.

[00539] Para avaliar a hipótese acima, os presentes inventores realizaram as experiências seguintes. A direção de reconhecimento FcyR por cada alteração foi determinada de acordo com o método descrito no Exemplo 5, utilizando-se anticorpos que possuem uma cadeia H introduzida com a alteração L234Y, G236W, S298A, S239D, A330L, ou I332E, e P329R introduzida na mesma cadeia H ou diferente. Os vetores de expressão inseridos, com o seguinte foram construídos de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1:

[00540] GpH7-A5; GpH7-A48 (SEQ ID N°: 16), resultante da introdução de P329R em GpH7-A5; GpH7-HA7 (SEQ ID N°: 34), resultante da introdução de S239D e P329R em GpH7-B3; GpH7-HA15 (SEQ ID N°: 35), resultante da introdução de A330L e P329R em GpH7-B3; GpH7-HA18 (SEQ ID N°: 36), resultante da introdução de I332E e P329R em GpH7-B3; GpH7-HA5 (SEQ ID N°: 19), resultante da introdução de L234Y e P329R em GpH7-B3; GpH7-HA6 (SEQ ID N°: 20), resultante da introdução de G236W e P329R em GpH7-B3; GpH7-HA11 (SEQ ID N°: 21) resultante da introdução de e S298A P329R em GpH7-B3; GpH7-B3-06-09D (SEQ ID N°: 37), resultante da introdução de S239D em GpH7-B3; GpH7-B3-20-08L (SEQ ID N°: 38), resultante da introdução de A330L em GpH7-B3; GpH7-B3- 22-10E (SEQ ID N°: 39), resultante da introdução de I332E em GpH7-B3; GpH7-B3-01-15Y (SEQ ID N°: 22), resultante da introdução de L234Y em GpH7-B3; GpH7-B3-03-20W (SEQ ID N°: 23), resultante da introdução de G236W em GpH7-B3, e GpH7-B3-15-02A (SEQ ID N°: 24), resultante da introdução de S298A em GpH7-B3. Os vetores de expressão para as respectivas cadeias H foram combinados de uma maneira que cada uma das alterações L234Y, G236W, S298A, S239D, A330L, e I332E está presente na mesma cadeia H como P329R ou na cadeia H diferente de P329R, e o vetor de expressão GpL16-k0 para a cadeia H foi combinado com eles. Os anticorpos de interesse foram expressos e preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos preparados foram utilizados para ensaiar a atividade de ligação de FcYRIIIa. O resultado da avaliação usando P329R na direção do reconhecimento de FcYRIIIa por L234Y, G236W, S298A, S239D, A330L, e I332E são resumidos na Tabela 12. Tabela 12

[00541] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de respectivos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mu-tações que são diferentes em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). A ativi-dade de ligação FcYRIIIa é indicada como uma atividade de ligação rela-tiva ao definir a ligação FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como 100. As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de ami- noácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00542] Com base no resultado, como para cada uma altercação, a atividade de ligação de FcYRIIIa é comparada entre o momento em cada alteração é introduzida na mesma cadeia H como P329R, e, quando in-troduzida na cadeia H diferente de P329R. No caso de S239D, a atividade de ligação de GpH7-A5/GpH7-HA7/GpL16-k0 correspondente à anterior é 3, enquanto que a atividade de ligação de GpH7-A48/GpH7-B3-06- 09D/GpL16-k0 correspondente a última foi de 123, sendo assim, a ligação FcYRIIIa foi inibida quando a alteração foi introduzida na mesma cadeia H como P329R. No caso de A330L, a atividade de ligação de GpH7- A5/GpH7-HA15/GpL16-k0 correspondente à anterior era de 32, enquanto que a atividade de ligação de GpH7-A48/GpH7-B3-20-08L/GpL16-k0 cor-respondente a última foi de 60, sendo assim, a ligação FcYRIIIa foi inibida quando a alteração foi introduzida na mesma cadeia H como P329R. No caso de I332E, a atividade de ligação de GpH7-A5/GpH7-HA18/GpL16- k0 correspondente à anterior era de 35, enquanto que a atividade de ligação de GpH7-A48/GpH7-B3-22-10E/GpL16-k0 correspondente a última foi de 189, sendo assim, a ligação FcYRIIIa foi inibida quando a alteração foi introduzida na mesma cadeia H como P329R. Como para todas as alterações, a ligação FcYRIIIa foi inibida quando a alteração foi introduzida na mesma cadeia H como P329R, isto é, no primeiro caso. Se a cadeia H introduzida com P329R correspondia à cadeia HA da Figura 23, P329R é pensado para inibir a ligação da Direção X. Uma vez que as combinações que inibem significativamente a ligação são aqueles em que S239D, A330L, ou I332E foi introduzido na mesma cadeia H como P329R, isto é, neste caso, as alterações foram introduzidas na cadeia de HA. Uma vez que o efeito de melhorar a ligação FcYRIIIa foi marcada- mente inibida quando qualquer uma das alterações S239D, A330L, e I332E foi introduzido na mesma cadeia H como P329R, todas as alterações, quando introduzido na corrente de HA, melhorar a ligação FcYRIIIa da direção X que é inibida pelo P329R. Assim, pensa-se que a ligação FcYRIIIa pode ser adicionalmente melhorada através da introdução des- tas alterações na mesma cadeia H. Com base no Exemplo 5, foi conside-rado que todos L234Y, G236W, e S298A, quando introduzido na cadeia HB, melhorar a ligação do sentido x. Como discutido nos exemplos 5 e 6, pode-se encontrar um método para combinar adequadamente respectivas alterações, combinando-as com P329R. Com base nos resultados acima, para melhorar a ligação de FCY direção X, como mostrado na Figura RIIIA. 3, S239D, A330L, e I332E devem ser introduzidas na cadeia HA, enquanto L234Y, G236W, e S298A necessitam de ser introduzidos na cadeia HB. Assim, pensava-se que a ligação FcyRIIIa da direção X pode ser melhorada através da introdução dos respectivos grupos de alteração em diferentes cadeias H.

[00543] Para avaliar a hipótese acima, os vetores de expressão inseridos com o seguinte foram construídos de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1:

[00544] GpH7-A57 (SEQ ID N°: 40), resultante da introdução de todos S239D, A330L, e I332E em GpH7-A5;

[00545] GpH7-B78 (SEQ ID N°: 41), resultante da introdução de todos S239D, A330L, e I332E em GpH7-B3;

[00546] GpH7-TA7 (SEQ ID N°: 31), resultante da introdução de todos L234Y, G236W, e S298A em GpH7-A5; e

[00547] GpH7-TA45 (SEQ ID N°: 32), resultante da introdução de todos L234Y, G236W, e S298A em GpH7-B3. Usando os vetores de expressão, e GpH7-A5, GpH7-B3, e GpL16-k0, os seguintes anticorpos foram expressos e preparado de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1:

[00548] hetero GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A, e o outro foi introduzida com S239D, A330L, e I332E;

[00549] GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A;

[00550] GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H, foram introduzidas com L234Y, G236W, e S298A;

[00551] GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 no qual apenas uma das ca deias H foi introduzida com S239D, A330L, e I332E; e

[00552] GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H, foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E. Os anticorpos prepa-rados foram comparados quanto à atividade de ligação de FcyRIIIa utili-zando, como um indicador, KD para FcYRIIIa que foi determinado de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2. O resultado da avaliação do efeito da combinação de L234Y, G236W, e S298A com S239D, A330L, e I332E são resumidos na Tabela 13. Tabela 13

[00553] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de respectivos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). Um valor obtido dividindo KD de GpH7-G1d/GpL16-k0 para FcYRIIIa pela KD de cada anticorpo é definida como " relação de KD 1 ", enquanto que um valor obtido dividindo KD de GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16 k0-FcYRIIIa pela KD de cada anticorpo foi definida como " relação de KD 2 ". As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00554] Em vista dos resultados da Tabela 13, em que quando GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 D356K, H435R, e K439E foram introduzidos em cada uma da cadeia H é comparado com GpH7- G1d/GpL16-k0 que é nativo IgG1, a diferença na atividade de ligação FcYRIIIa é de 0,75 vez, e não foi observada diferença significativa. Assim, pensava-se que as alterações D356K, H435R e K439E não afetam a atividade de ligação FcYRIIIa.

[00555] Cada alteração foi avaliada para o seu efeito sobre os anticorpos homodimerizados que utilizam a tecnologia anterior. A atividade de ligação de FcYRIIIa do anticorpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E foi aumentada em cerca de 260 vezes mais do que GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Em contraste, a atividade de ligação de FcYRIIIa do anticorpo homodimeri- zado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com L234Y, G236W, e S298A foi diminuída para 0,49 vezes. Isto demonstra que só o grupo das alterações S239D, A330L, e I332E tem o efeito de aumentar a atividade de ligação de FcYRIIIa de anticorpos homodimerizados.

[00556] Anticorpos heterodimerizados em que apenas uma das cadeias H foi introduzida com cada grupo de alteração foram avaliados para os efeitos de cada grupo de alteração. A atividade de ligação de FcYRIIIa do anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7- B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com S239D, A330L, e I332E foi aumentada em cerca de 30 vezes mais do que GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, enquanto que a atividade de ligação de FcYRIIIa do anticorpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7- B3/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A foi aumentada em 5,1 vezes. Este resultado demonstra que o grupo das alterações S239D, A330L, e I332E tem o efeito mais forte para aumentar a atividade de ligação de FcYRIIIa.

[00557] Cada grupo de alteração foi avaliado para a diferença no seu efeito entre o anticorpo homodimerizado e anticorpo heterodi- merizado. Quanto S239D, A330L, e I332E, a atividade de ligação de FcYRIIIa do anticorpo heterodimerizado foi aumentada em 30 vezes mais do que GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, enquanto a atividade do anticorpo homodimerizado foi aumentada em cerca de 260 vezes, o que demonstra que as alterações, quando introduzidos anticorpos homodimerizados, aumentam ainda mais a atividade de ligação de FcYRIIIa. Entretanto, no que se refere a L234Y, G236W, e S298A, a atividade de ligação FcYRIIIa do anticorpo heterodimerizado foi aumentada em 5,1 vezes mais do que GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, no entanto, a atividade do anticorpo homodimerizado foi reduzida a 0,49 vezes. Este resultado mostra que o grupo das alterações L234Y, G236W, e S298A , apenas em anticorpos heterodimeriza- dos, tem o efeito de aumentar a atividade de ligação de FcYRIIIa, como discutido no Exemplo 5.

[00558] Foi demonstrado que, em anticorpos homodimerizados, apenas o grupo das alterações S239D, A330L, e I332E tem o efeito de aumentar a ligação de FcYRIIIa, e também em anticorpos hetero- dimerizados, o grupo de alterações S239D, A330L, e I332E mais fortemente aumentou a ligação de FcYRIIIa. Com base no conceito convencional, se a combinação do grupo das alterações S239D, A330L, e I332E com o grupo das alterações L234Y, G236W é considerada, seria previsível que o efeito de aumentar a ligação de FcYRIIIa fosse o mais forte no anticorpo homodimerizado GpH7- A57/GpH7-B78/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H são introduzidas com apenas o grupo das alterações S239D, A330L, e I332E, que fortemente aumentam a ligação a FcYRIIIa de ambos anticorpo heterodimerizado e anticorpo homodimerizado. No entanto, a atividade de ligação de FcYRIIIa do anticorpo heterodimerizado GpH7- TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 em que S239D, A330L, e I332E foram introduzidos na cadeia H e L234Y, G236W, e S298A foram introduzidos na outra cadeia H foi aumentada em cerca de 350 vezes mais do que GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, o efeito de aumentar a ligação era mais forte do que para o anticorpo homodimerizado em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E. Isto suporta a hipótese de que, quando o grupo das alterações S239D, A330L, e I332E, e o grupo das alterações L234Y, G236W e S298A são introduzidos em diferentes cadeias H, todas as alterações introduzidas melhoram a atividade de ligação FcYRIIIa em ambas as cadeias HA e HB cadeia, e o efeito é maior do que no caso quando o grupo das alterações S239D, A330L, e I332E são introduzidos em ambas as cadeias H.

[00559] Isto é, foi demonstrado que o uso de anticorpos hetero- dimerizados, em vez de anticorpos homodimerizados convencionais, permite a otimização mais fina da interação assimétrica entre o domínio Fc e FcYRIIIa para conceber domínios Fc que têm uma ativi- dade de ligação forte.

[00560] Em vista da Figura 23, pensava-se que A330L e I332E interagissem com FCYR apenas na cadeia de HA, enquanto S239D interagisse com FCYR em ambas as cadeias H A e HB cadeia. Com efeito, KD para FcyRIIIa do anticorpo heterodimerizado GpH7- A5/GpH7-B78/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com S239D, A330L, e I332E foi 5.4E-8, enquanto que a KD do anticorpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 era 6.2E-9, assim, a atividade de ligação FcyRIIIa foi aumentada em 8,7 vezes. Se for considerado que a diferença na atividade de ligação é devida ao envolvimento de S239D no aumento da ligação de ambas as cadeias H, esta diferença é pensada para ser eliminada através da introdução de S239D em ambas as cadeias H. Para avaliar esta hipótese, GpH7-A53 (SEQ ID N°: 42), resultante da introdução de S239D em GpH7-A5 foi construído, e, isso é combinado com GpH7-B78 introduzido com S239D, A330L, e I332E, e a expressão e preparação foi realizada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. O efeito da combinação de S239D e S239D, A330L, e I332E foi avaliado comparando a ligação de FcyRIIIa entre os anticorpos heterodimerizados e homodimerizados com S239D, A330L, e I332E de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Tabela 14). Tabela 14

[00561] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de respectivos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). Um valor obtido dividindo KD de GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 para FcYRIIIa pela KD de cada anticorpo foi definida como " relação de KD ". As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de ami- noácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00562] A Tabela 14 mostra que a atividade de ligação de FcYRIIIa de GpH7-A53/GpH7-B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi in-troduzida com S239D, A330L, e I332E e a outra introduzida com S239D foi aumentada em 4,9 vezes que de GpH7-A5/GpH7- B78/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com S239D, A330L, e I332E, enquanto a atividade diminuiu apenas 1,8 vez mais do que GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E. Este resultado demonstra que S239D interage com FcYRIIIa em ambas as cadeias H, tal como mencionado acima para a hipótese. Pensou-se que a interação com FcYRIIIa pode ser melhorada com a introdução da alteração acima.

[00563] Os presentes inventores testaram se a atividade de ligação de FcYRIIIa pode ainda ser aumentada através da introdução de S239D no anticorpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A a outra foi introduzida com S239D, A330L, e I332E. GpH7- TA22 (SEQ ID N°: 43) foi construído através da introdução de S239D em GpH7-TA7, e, em seguida, inserido em um vetor de expressão, e o vetor de expressão resultante foi combinado com GpL16-k0, e GpH7- B78 obtido introduzindo S239D, A330L, e I332E em GpH7-B3, e o anticorpo de interesse foi expresso e preparado de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Além disso, o anticorpo hetero- dimerizado GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0 foi preparado introduzindo L234Y, G236W, S239D, e S298A em uma cadeia H, e S239D, A330L, e I332E na outra cadeia H. Para avaliar o efeito da combinação de S239D com S239D, A330L, e I332E, os anticorpos foram comparados quanto à atividade de ligação de FcYRIIIa de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Tabela 15). Tabela 15

[00564] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de respectivos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). Um valor obtido dividindo KD de GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 para FcYRIIIa pela KD de cada anticorpo foi definida como " relação de KD". As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de amino- ácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00565] A Tabela 15 mostra que a atividade de ligação de GpH7- TA22/GpH7-B78/GpL16-k0 resultante da introdução de S239D Na cadeia H, que não contém S239D NO anticorpo em heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A e a outra cadeia H com S239D, A330L, e I332E foi aumentada em 3,2 vezes mais do que GpH7- TA7/GpH7-B78/GpL16-k0. Este resultado demonstra que a ligação FcYRIIIa pode ser melhorada usando S239D.

[00566] Em seguida, os presentes inventores consideraram a introdução de mais alterações Y296W e K334G que aumentam a ligação de FcYRIIIa, que foram reveladas tal como descrito no Exemplo 4.

[00567] Primeiro, foi considerado que cadeia H deve ser introduzida com Y296W. GpH7-TA52 (SEQ ID N°: 44), resultante da introdução da mutação em Y296W GpH7-TA7 foi construído e expresso e preparado em combinação com GpH7-B78 de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Além disso, GpH7-TA58 (SEQ ID N°: 45), resultante da introdução de Y296W em GpH7-B78 foi construído e ex-presso e preparado em combinação com GpH7-TA22 de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Para avaliar os efeitos de combinações com Y296W, os anticorpos preparados foram comparados quanto à atividade de ligação de FcYRIIIa de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Tabela 16).

Tabela 16

[00568] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos, as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes de região constante de cadeia H de anticorpos respectivos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). Um valor obtido dividindo KD de GpH7-TA7/GpH7- B78/GpL16-k0 para FcYRIIIa pela KD de cada ant icorpo foi definida como " relação de KD ". As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00569] O resultado mostrou que Y296W, quando introduzido na cadeia H diferente da que foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A, aumentou a atividade de ligação de FcYRIIIa apenas 1,2 vez, após introdução em comparação com antes, enquanto Y296W, quando introduzido na mesma cadeia H, aumentou a atividade de ligação FcYRIIIa de 1,8 vez mais do que GpH7-TA7/GpH7- B78/GpL16-k0. A partir deste resultado, pensa-se que Y296W, quando introduzido na mesma cadeia H como L234Y, G236W, e S298A, tem o efeito de reforçar a ligação de FcYRIIIa.

[00570] Em seguida, GpH7-TA54 (SEQ ID N°: 46), resultante da introdução de Y296W em GpH7-TA22 foi construído e expresso e preparado em combinação com GpH7-B78 de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Além disso, GpH7-TA58 (SEQ ID N°: 45), resultante da introdução de Y296W em GpH7-B78 foi construído e expresso e preparado em combinação com GpH7-TA22 de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Para avaliar o efeito da combinação com Y296W, os anticorpos preparados foram comparados quanto à atividade de ligação de FcYRIIIa de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Tabela 17).

[00571] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos, as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de respectivos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). Um valor obtido dividindo KD de GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0 para FcYRIIIa pela KD de cada anticorpo foi definida como " relação de KD ". As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de ami- noácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00572] O resultado apresentado na Tabela 17 demonstra que, quando Y296W foi introduzido na cadeia H, que é diferente da que foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A, não houve diferença na atividade de ligação de FcYRIIIa após a introdução em comparação com antes. Quando Y296W foi introduzido na mesma cadeia H como L234Y, G236W, e S298A, a atividade de ligação de FcYRIIIa foi aumentada em 1,3 vezes mais do que GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0. A partir deste resultado, foi pensado que Y296W, quando introduzido na mesma cadeia H como L234Y, G236W, e S298A, tem o efeito de aumentar a atividade de ligação de FcYRIIIa.

[00573] Então, K334G também foi avaliada da mesma maneira. GpH7-TA40 (SEQ ID N°: 47), resultante da introdução de K334G em GpH7-TA7 foi construído e expresso e preparado em combinação com GpH7-B78 de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Além disso, GpH7-TA50 (SEQ ID N°: 48), resultante da introdução de K334G em GpH7-B78 foi construído e expresso e preparado em combinação com GpH7-TA7 de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Para avaliar o efeito de combinações com K334G, os anticorpos preparados foram comparados quanto à ligação a FcYRIIIa de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2 (Tabela 18). [Tabela 18]

[00574] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos, as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes das regiões constantes da cadeia H de cada anticorpo e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). Um valor obtido dividindo KD de GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 para FcYRIIIa pela KD de cada anticorpo foi definida como " relação de KD ". As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de ami- noácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00575] O resultado apresentado na Tabela 18 demonstra que, quando K334G foi introduzido na mesma cadeia H como L234Y, G236W, e S298A, a atividade de ligação de FcYRIIIa é diminuída a metade após a introdução em comparação com antes. Quando K334G foi introduzido na cadeia H diferente, a atividade de ligação de FcYRIIIa foi aumentada em 1,2 vez mais do que GpH7-TA7/GpH7- B78/GpL16-k0. A partir deste resultado, foi pensado que K334G, quando introduzido na cadeia H diferente da que foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A, tem o efeito de aumentar a atividade de ligação de FcYRIIIa. [Exemplo 8] Melhora da seletividade para FCYR de ativação ou FCYR inibidor

[00576] Existe FcYR de ativação que tem ITAM, e FcYR inibidor que tem ITIM. FcYRs de ativação representativos (receptor de ativação) incluem FcYRIa, FcYRIIa e FcYRIIIa, enquanto FcYRs inibidores representativos (Receptor Inibidor) incluem FcYRIIb. Quanto a anticorpos direcionados para o câncer, a proporção da atividade de ligação para FcYR de ativação cujo mecanismo de ação é baseado na atividade de ADCC ou atividade fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) contra a atividade de ligação a FcYR inibidor acredita-se desempenhar um papel importante (Nature Medicine, 6: 443-446, 2000).

[00577] Para os anticorpos orientados para o câncer, é desejável aumentar a sua atividade de ligação para FCYR de ativação enquanto reduz a sua atividade de ligação para FCYR inibidor. Especificamente, as alterações são desejáveis, tais como aquelas incluídas em uma região mostrada na Figura 24, modificações que permitem que um anticorpo se ligue a FcyR de ativação mais fortemente do que o anticorpo nativo, e ligue-se a FcyR inibidor mais fracamente do que o anticorpo nativo, isto é, as alterações que melhoram a ligação de uma ativação de FcyR de maneira seletiva. Além disso, as alterações são desejáveis, tais como aquelas na Região b mostrada na Figura 25, alterações que permitem que a razão entre a atividade de ligação para FcyR de ativação e a atividade de ligação para FcyR inibidor seja maior do que o anticorpo nativo. Pode dizer-se que tais alterações aumentam seletivamente a atividade de ligação para FcyR de ativação em comparação com FcyR inibidor.

[00578] Os anticorpos heterodimerizados He Abs, em que uma das cadeias H foi introduzida com uma alteração foram testados para as suas atividades de ligação para cada FcyR de ativação e FcyR inibidor de acordo com o método descrito no Exemplo 4. O resultado está resumido nas Figs. 26, 27, 28 e 29 para avaliar a relação entre a atividade de ligação a cada FcyR de ativação e FcyR inibidor para cada anticorpo heterodimerizado. O FcyRs de ativação nas figuras 26, 27, 28, e 29 são FcyRIa, FcyRIIa (R), FcyRIIa (H), e FcyRIIIa, respectivamente.

[00579] As alterações presentes na região na Figura 26 correspondentes a a e b na Figura 24 e 25 são listadas na Tabela 19 (Tabela 191 a 19-5). Da mesma forma, como para FcyRIIa (R) (Figura 27), FcyRIIa (H) (Figura 28), FcyRIIIa (Figura 29), alterações presentes na região correspondente a a e b são listadas na Tabela 20 (Tabela 20-1 a 20-3), Tabela 21 (Tabela 21-1 a 21-3), e na Tabela 22 (Tabela 22-1 a 22-3). [Tabela 19-5] REGION b

região/nome/ligação IIb, IIa,

[00580] A tabela mostra uma lista de alterações que melhoram sele-tivamente a ligação a FcYRIa em comparação com FcYRIIb.

[00581] A tabela mostra uma lista de alterações que seletivamente melhoram a ligação a FcYRIIa (R) quando comparada a FcYRIIb. [Tabela 21-1] NAME He/Con_2b

região/nome/ligação IIb, IIa, ....

[00582] A tabela mostra uma lista de alterações que seletivamente melhoram a ligação a FcYRIIa (H) quando comparada a FCYRII. [Tabela 22-1]

região/nome/ligação IIb, IIa,

[00583] A tabela mostra uma lista de alterações que melhoram seletivamente a ligação a FcYRIIIa em comparação com FcYRIIb.

[00584] Por outro lado, FcYRIIb, o único FCYR inibidor, desempenha um papel importante em doenças autoimunes e doenças inflamatórias (J. Exp. Med., 203, 2157-2164, 2006, J. Immunol, 178, 3272-3280, 2007). Também tem sido mostrado que os anticorpos possuindo um domínio Fc com o aumento da atividade de ligação a FcYRIIb pode ser eficaz no tratamento de doenças autoimunes causadas por células B (Mol. Immunology 45, 3926-3933, 2008). No caso de os anticorpos que visam o tratamento de doenças autoimu- nes e de doenças inflamatórias, a atividade de ADCC e atividade de ADCP através de FcYR de ativação pode agravar as condições patológicas. Assim, é desejável aumentar a atividade inibidora de ligação de FcYR enquanto reduz a atividade de ligação a FcYR de ativação tanto quanto possível. Especificamente, como as alterações presentes na Região c da Figura. 24, desejavelmente alterações têm o efeito de aumentar a atividade de ligação de FcYR inibidor, em comparação com o anticorpo nativo e para reduzir a atividade de ligação à FcYR de ativação. Tais alterações podem ser ditas pa ra serem alterações que aumentam seletivamente a atividade de ligação a FCYR inibidor em comparação com FCYR de ativação. Além disso, como as alterações presentes na Região d na Figura 25, alterações desejavelmente têm o efeito de aumentar a proporção entre a atividade de ligação a FcyR inibidor e a atividade de ligação a FcyR de ativação, em comparação com o anticorpo nativo. Tais alterações podem ser ditas para serem alterações que aumentam seletivamente a atividade de ligação a FcyR inibidor, em comparação com a FcyR de ativação.

[00585] Com base na Figura 26, 27, 28, e 29, na avaliação da relação entre a atividade de ligação a FcyR inibidor e FcyR de ativação para cada um dos anticorpos heterodimerizados acima, para alterações mostradas em cada figura, aquelas presentes nas regiões correspondentes a c e d nas Figs. 24 e 25 estão resumidas a uma lista na Tabela 23 (Tabelas 23-1 e 23-2), Tabela 24 (Tabelas 24-1 e 24-2), Tabela 25 (Tabelas 25-1 a 25-3), a Tabela 26 (Tabelas 26-1 a 26-4).

região/nome/ligação IIb, IIa,

[00586] A tabela mostra uma lista de alterações que seletivamente melhoram a ligação a FcγRIIb quando comparada a FcγRIa.

[00587] A tabela mostra uma lista de alterações que seletivamente melhoram a ligação a FcYRIIb quando comparada a FcYRIIa(R). [Tabela 25-3]

região/nome/ligação IIb, IIa,

[00588] A tabela mostra uma lista de alterações que seletivamente melhoram a ligação a FcYRIIb quando comparada a FcYRIIa(H).

região/nome/ligação IIb, IIa,

[00589] A tabela mostra uma lista de alterações que melhoram sele-tivamente a ligação a FcYRIIb em comparação com FcYRIIIa. [Exemplo 9] Avaliação de anticorpos heterodimerizados para a estabilidade físicoquímica

[00590] Quando os anticorpos são desenvolvidos como fármacos, os anticorpos devem ter elevada estabilidade físicoquímica. Por exemplo, a uma alteração de anticorpo onde o S239D acima descrito, A330L, e I332E são introduzidos em ambas as cadeias de anticorpo, tem sido relatado que o domínio Fc de anticorpo torna termodinami- camente instáveis devido à alteração introduzida (Molecular Immunology, 45, 1872-1882, 2008), e tal estabilidade térmica reduzida dificulta o desenvolvimento de anticorpos como produtos farmacêuticos. A fim de aumentar a utilidade de anticorpos, tal como os produtos farmacêu- ticos e para tornar o desenvolvimento mais simples, também é importante aumentar a atividade de ligação FCYR e manter a estabilidade físicoquímica. No caso de anticorpos homodimerizados, alterações são introduzidas em ambas as cadeias H, e isto significa que uma molécula de anticorpo introduzido com um único tipo de alteração tem a alteração em dois sítios. No caso de anticorpos heterodimerizados, por outro lado, é possível escolher se uma alteração é introduzida em qualquer cadeia H, e portanto, mesmo que a introdução de um único tipo de alteração, que é introduzida em um único sítio por uma molécula de anticorpo. Como discutido no Exemplo 7, dependendo do tipo de alteração, como com o efeito de aumentar a atividade de ligação FcyRIIIa, que é, por vezes, suficiente para introduzir uma alteração para uma cadeia H. Se uma alteração tem o efeito de reduzir a estabilidade físicoquímica de um anticorpo, pode-se conferir o anticorpo com o efeito de aumentar a atividade de ligação a FcyRIIIa, introduzindo a alteração em apenas em uma cadeia H e minimizando a desestabiliza- ção físicoquímico do anticorpo.

[00591] Para avaliar esta hipótese, os presentes inventores avaliaram que resíduo de S239D, A330L, e I332E realmente contribuíram para a desestabilização do domínio CH2. Os vetores de expressão inseridos com o seguinte foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1: GpH7-B3-06-09D (SEQ ID N°: 37), GpH7-B3-20-08L (SEQ ID N°: 38), e GpH7-B3-22-10E (SEQ ID N°: 39), resultante da introdução das alterações S239D, A330L, e I332E, respectivamente, em GpH7-B3. Usando GpL16-k0 como a cadeia L, os anticorpos de interesse foram expressos e preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Além disso, como controle, um anticorpo de interesse foi expresso e preparado usando GpL16-k0 e GpH7-B3, que não contém a alteração. Os respectivos anticorpos foram comparados quanto à Tm do domínio CH2 por teste de desvio térmico de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 5 (Tabela 27). Daqui em diante, a menos que especificado em contrário, Tm significa para a Tm de domínio CH2. [Tabela 27]

[00592] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos, a coluna " H " indica os nomes da região constante de cadeia H de cada anticorpo, a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica), a coluna "Tm" indica a Tm de cada anticorpo, e a coluna " □ Tm " indica a diferença de Tm entre cada um dos anticorpos e GpH7-B3/GpL16-k0. As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00593] Quando o anticorpo homodimerizado GpH7-B3-06- 09D/GpL16-k0 introduzido com S239D, o anticorpo homodimerizado GpH7-B3-20-08L/GpL16-k0 introduzido com A330L, e o anticorpo ho- modimerizado GpH7-B3-22-10E/GpL16 k0-introduzida com I332E foram comparados com GpH7-B3/GpL16-k0, a Tm foi diminuída em 3 °C, 1 °C e 8 °C, respectivamente. Este resultado demonstra que, das três alterações, I332E teve o maior efeito de reduzir a Tm em CH2, assim, I332E é pensado para contribuir também para a diminuição de Tm de um anticorpo introduzido com o grupo das alterações S239D, A330L, e I332E.

[00594] A cadeia lateral de I332E está rodeada por aminoácidos hidrofóbicos, tais como V240, V323, e L 328. Em um anticorpo introduzido com I332E, a interação hidrofóbica com os resíduos circundantes é suprimida devido à substituição de hidrofóbica Ile com Glu hidrofílico, e este é pensado para contribuir para a desestabilização do domínio Fc. Enquanto isso, como discutido no Exemplo 7, a interação de I332E com FcYRIIIa ocorre exclusivamente em qualquer cadeia H. Por esta razão, pensava-se que, quando I332 era mantida não substituída na outra cadeia H, que não está envolvida na interação com FcYRIIIa, a estabilidade termodinâmica pode ser mantida enquanto que confere o efeito de aumentar a ligação de FcYRIIIa. Em seguida, os presentes inventores introduziram I332E em apenas uma cadeia H, e avaliaram se a Tm é elevada, em comparação com quando é introduzida I332E em ambas as cadeias H. Os vetores de expressão inseridos com GpH7-A44 (SEQ ID N°: 49) e GpH7-B80 (SEQ ID N°: 50), resultante da introdução de I332E em GpH7-A5 e GpH7-B3, respectivamente, foram construídos. Eles foram combinados com GpH7-B3, GpH7-A5, e GpL16-k0 para expressar e preparar os seguintes anticorpos de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1: os anticorpos heterodimerizados GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0 e GpH7-A44/GpH7- B3/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com I332E, e o anticorpo homodimerizado GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com I332E. GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 foi preparado como um controle. Cada anticorpo foi avaliado para a atividade de ligçaão FcYRIIIa de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2. Além disso, os anticorpos foram comparados quanto a Tm do domínio CH2 por teste de desvio térmico de acordo com o método descrito no Exemplo de Referên- cia 5 (Tabelas 28 e 29). [Tabela 28]

[00595] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de cada anticorpo e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). Um valor obtido dividindo KD de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 para FcYRIIIa pela KD de cada anticorpo foi definida como " relação de KD ". As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de ami- noácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo. [Tabela 29]

[00596] A tabela mostra a Tm de CH2 de anticorpos com substituição I332E em uma cadeia H, e os anticorpos com substituição I332E em ambas as cadeias H.

[00597] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de cada anticorpo, a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica), a coluna "Tm" indica a Tm de cada anticorpo, e a coluna " □ Tm " indica a diferença de Tm entre cada um dos anticorpos e GpH7- B3/GpL16-k0. As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anti-corpo.

[00598] O resultado apresentado na Tabela 28 demonstra que a atividade de ligação FcYRIIIa do anticorpo heterodimerizado GpH7 - A5/GpH7-B80/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com I332E foi aumentada em cerca de 3 vezes mais do que GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, enquanto que a atividade de GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0 foi aumentada em cerca de 4 vezes mais do que GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. A partir desta, pensava- se que o efeito de I332E para aumentar a atividade de ligação a FcYRIIIa não é significativamente alterado, independentemente de quando é introduzido I332E GpH7-A5 ou é introduzido GpH7-B3. Enquanto isso, a atividade de ligação a FcYRIIIa de GpH7- A44/GpH7-B80/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com I332E foi aumentada em cerca de sete vezes a do GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Estes resultados revelaram que I332E tem um efeito de aumentar suficientemente a atividade de ligação a FcYRIIIa mesmo se for introduzida uma única cadeia H, se não forem introduzidos em ambas as cadeias H, como considerado com base na estrutura tridimensional.

[00599] Além disso, o resultado apresentado na Tabela 29 revela que a Tm dos anticorpos heterodimerizados GpH7-A5/GpH7- B80/GpL16-k0 e GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0 em que I332E foi introduzido em apenas uma cadeia H, foram ambos diminuiu 4 °C em comparação com a Tm do GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 que é a sua molécula Fc parental. Assim, pensou-se que não existe qualquer diferença na influência de I332E no anticorpo Tm, independentemente de quando é introduzido I332E GpH7-A5 ou GpH7-B3. Enquanto isso, a Tm do anticorpo homodimerizado GpH7-A44/GpH7- B80/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com I332E foi diminuída em 10 °C, em comparação com a de GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0. A Tm do anticorpo heterodimerizado no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com I332E foi mantida para ser de 6 °C maior do que a do anticorpo homodimerizado em que ambas as cadeias H foram introduzidas com I332E. Este resultado demonstra que a diminuição do Tm pode ser suprimida através da utilização de um anticorpo heterodimerizado nos quais apenas uma, mas não ambas, as cadeias H é introduzida com I332E. Isto mostra que a tecnologia de anticorpos heterodimerizados é útil para manter o anticorpo a estabilidade físicoquímica.

[00600] O I332E alteração é superior em termos de efeito de aumentar a ligação de FcYRIIIa, no entanto, se os anticorpos homodi- merizados convencionais são utilizadas com ele, a sua estabilidade termodinâmica é significativamente reduzida, e isto é problemático quando os anticorpos são usados como produtos farmacêuticos. No entanto, os resultados mostrados nas Tabelas 28 e 29 demonstram que a utilização de um anticorpo heterodimerizado permite explorar o efeito de I332E para aumentar o FcYRIIIa mantendo a estabilidade físicoquímica do anticorpo. A partir desta constatação, pensa-se que os anticorpos heterodimerizados são uma tecnologia excelente para mais finamente ajustar a atividade de ligação FcYR e a estabilidade físicoquímica de anticorpos.

[00601] GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 tem S239D, A330L, e I332E em apenas uma cadeia H, e, assim, possivelmente, mantém elevada Tm em comparação com GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H têm S239D, A330L, e I332E. Assim, os anticorpos heterodimerizado e homodimerizado resultantes da combinação do grupo das alterações L234Y, G236W, e S298A com o grupo das alterações S239D, A330L, e I332E descrito no Exemplo 7 foram ensaiados para Tm de acordo com o método descrito na referência exemplo 5.

[00602] Para avaliar isto, o anticorpo heterodimerizado GpH7- TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com o grupo do L234Y alterações, G236W, e S298A e a outra cadeia H foi introduzida com o grupo de as alterações S239D, A330L, e I332E, o anticorpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16- k0 no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com o grupo das alterações L234Y, G236W, e S298A; anticorpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com o grupo das alterações L234Y, G236W, e S298A; anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 em que apenas um do H cadeias foi introduzido com S239D, A330L, e I332E, e o anticorpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7- B78/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E, foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. A influência da combinação de L234Y, G236W, e S298A com S239D, A330L, e I332E na Tm foi avaliada comparando a Tm do domínio CH2 dos respectivos anticorpos por teste de desvio térmico de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 5 (Tabela 30). [Tabela 30]

[00603] GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 introduzido com alterações D356K/H435R e K439E para aumentar a eficiência da formação de anticorpos heterodimerizados foi comparado com GpH7-G1d/GpL16- k0 que é uma IgG1 nativa. A Tm de CH2 foi diminuída em 1 °C.

[00604] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos, as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H de cada anticorpo, a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-G1d/GpL16-k0 ("- ": quando não há nenhuma mutação específica), a coluna "Tm" indica a Tm de cada anticorpo, e a coluna "Tm" indica a diferença de Tm entre cada um dos anticorpos e GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00605] Anticorpos homodimerizados da tecnologia da técnica anterior, foram avaliados para os efeitos de cada grupo de alteração. A Tm do anticorpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E foi diminuída em 20 °C, em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0. Por outro lado, uma diminuição da Tm não foi observado para o anticorpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16- k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com o grupo do L234Y alterações, G236W, e S298A. Assim, pensou-se que o grupo das alterações L234Y, G236W, e S298A não tem o efeito de diminuir a Tm de anticorpos homodimerizados.

[00606] Anticorpo heterodimerizados em que apenas uma das cadeias H foi introduzida com cada grupo de alteração foram avaliadas para os efeitos de cada grupo de alteração. A Tm do anticorpo hetero- dimerizado GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com S239D, A330L, e I332E foi uma diminuição de 8 °C em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Por outro lado, uma diminuição da Tm não foi observado para o anticorpo heterodime- rizado GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A. A partir destes resultados, considerou-se que o grupo das alterações L234Y, G236W, e S298A não tem o efeito de diminuir a Tm de anticorpos heterodimerizados.

[00607] A Tm de GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E foi diminuída em 21°C, em comparação com a IgG1 nativa. A Tm de GpH7- A5/GpH7-B78/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H tem as alterações S239D, A330L, e I332E foi de 60°C, e é mantida Tm de 10°C ou mais elevada do que a do anticorpo homodimerizado. Como se mostra na Tabela 13 no Exemplo 7, a ligação FcYRIIIa do anticorpo homodimerizado com S239D, A330L, e I332E foi aumentada em cerca de 9 vezes superior a do anticorpo heterodimerizado com S239D, A330L, e I332E. S239D, A330L, e I332E, quando introduzido em ambas as cadeias H, fortemente melhora a ligação de FcYRIIIa, mas reduz significativamente a Tm.

[00608] Além disso, a Tm de GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com L234Y, G236W, e S298A foi apenas reduzido em 1°C, em comparação com o anticorpo nativo. A diminuição de Tm foi provavelmente devido à influência de D356K/H435R e K439E utilizado para construir o anticorpo heterodi- merizado como discutido acima, em vez de devida a L234Y, G236W, e S298A. Isto também é mostrado pelo fato que a Tm de GpH7- TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A foi também diminuiu apenas 1°C.

[00609] Finalmente, a Tm de GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H tem L234Y, G236W, e e S298A a outra cadeia H tem S239D, A330L, e I332E foi diminuída em 10°C em relação ao anticorpo nativo, e foi quase equivalente a de GpH7-A5/GpH7- B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com S239D, A330L, e I332E. No entanto, como se mostra na Tabela 13 no Exemplo 7, a ligação de GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 FcYRIIIa é aumentada em 10 vezes ou mais em comparação com a de GpH7-A5/GpH7- B78/GpL16-k0.

[00610] Isto é, foi demonstrado que, utilizando o anticorpo hetero- dimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e e S298A a outra foi introduzida com S239D, A330L, e I332E, a ligação FcYRIIIa pode ser melhorada, e também, a Tm pode ser aumentada em ou mais de 10°C, em comparação com o anticorpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7- B78/GpL16-k0 com S239D, A330L, e I332E.

[00611] Em seguida, as amostras acima descritas sujeitas à medição de Tm foram ainda avaliadas para a estabilidade termodinâmica do estudo de estabilidade acelerada de calor descrito no Exemplo de Referência 6 (a 40°C durante duas a quatro semanas) (Figura 30).

[00612] Quando GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 foi comparado com o anticorpo nativo GpH7-G1d/GpH7-G1d/GpL16-k0, o conteúdo de monômeros do primeiro e último diminuíram 1,27% e 1,86%, após quatro semanas,, respectivamente, e não houve diferença significativa. Assim, pensou-se que as alterações D356K/H435R e K439E utilizadas para construir o anticorpo heterodimerizado quase não têm influência sobre a variação do conteúdo de monômero em estudo de estabilidade acelerada por calor.

[00613] Quanto GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E, o conteúdo de monômero diminuiu em cerca de 16% depois de quatro semanas. Enquanto isso, o conteúdo de monômero de GpH7-A5/GpH7- B78/GpL16-k0 no qual apenas uma das cadeias H tem as alterações S239D, A330L, e I332E foi diminuído em 9,63% depois de quatro semanas. Assim, demonstrou-se que o efeito de manter o conteúdo de monômero de forma mais estável foi conseguido usando anticorpos heterodimerizados em que apenas uma das cadeias H foi introduzida com S239D, A330L, e I332E.

[00614] Além disso, o conteúdo de monômero de GpH7-TA7/GpH7- TA45/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com L234Y, G236W, eS298A e GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W e S298A foi apenas diminuído em 1,78% e 1,42%, após quatro semanas, respecti-vamente. Não havia diferença clara na mudança de conteúdo de mo- nômero, em comparação com o anticorpo nativo. Assim, pensava-se que L234Y, G236W e S298A não afetam o conteúdo de monômero no estudo de estabilidade acelerada por calor, mesmo quando eles são introduzidos em uma cadeia H ou ambas as cadeias H.

[00615] Finalmente, o conteúdo de monômero de GpH7-TA7/GpH7- B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H tem L234Y, G236W, e S298A e a outra cadeia H tem S239D, A330L, e I332E foi reduzida em 2,47% após quatro semanas. O conteúdo de monômero foi apenas ligeiramente reduzido em comparação com 1,86 % para o anticorpo nativo. Assim, demonstrou-se que, usando o anticorpo heterodimeri- zado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H tem L234Y, G236W, e e S298A a outra cadeia H tem S239D, A330L, e I332E, a ligação FcYRIIIa pode ser melhorada, e também, o efeito de manter o conteúdo de monômeros a um nível elevado em calor estudo de estabilidade acelerada pode ser conseguida em comparação com o anticorpo GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 homodimerizado com S239D, A330L, e I332E.

[00616] Assim, demonstrou-se que, quando comparada com os an-ticorpos homodimerizados convencionais, a tecnologia de anticorpos heterodimerizados não só é capaz de aumentar a ligação FcYR, mas também melhora a estabilidade, e, assim, aumenta o valor dos anti- corpos, tal como os produtos farmacêuticos mais do que os anticorpos homodimerizados.

[00617] [Exemplo 10] Buscar alterações que melhoram a ligação FCYR mas não reduzem a estabilidade

[00618] Como descrito no Exemplo 9, a atividade de ligação a FCYR é aumentada através da introdução de alterações na cadeia H. No entanto, estas alterações podem reduzir a estabilidade físicoquímica de CH2, isto é, reduzir a Tm. No entanto, tal como descrito no Exemplo 9, tais propriedades não são favoráveis, em particular, quando os anticorpos são usados como produtos farmacêuticos. Como descrito no Exemplo 9, ela é útil para usar o anticorpo heterodimerizado no qual apenas uma das cadeias de H foi introduzida com alterações para aumentar a atividade de ligação a FcyR enquanto suprime a desestabili- zação de CH2. Especificamente, no que diz respeito a alterações que diminuem a Tm de anticorpos homodimerizados, embora sejam observadas para melhorar a atividade de ligação FcyR de anticorpos homo- dimerizados convencionais, tais como aqueles que correspondem às regiões II e III, representados na figura. 21, elas permitem que a sua heterodimerização da Tm seja maior do que a dos anticorpos homodi- merizados enquanto aumentam a atividade de ligação FcyR em comparação com o anticorpo nativo.

[00619] Para encontrar tais alterações, anticorpos homodimerizados nas regiões II e III mostradas na Figura 21 foram ensaiados para a Tm de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 5. Uma lista de alterações que reduzem a Tm em comparação com o anticorpo nativo são apresentadas nas Tabelas de 31 a 35. Tabela 31 (Tabelas 31-1 a 31-3) mostra os dados para Ia, onde Tm é de 68 °C ou menos para a Região ii ou iii; Tabela 32 (Tabelas 32-1 e 32-2) mostra os dados para IIaR onde Tm é 68°C ou menos para a Região ii ou iii; Tabela 33 (Tabelas 33-1 e 33-2) mostra os da dos para IIaH onde Tm é de 68°C ou menos para a Região ii ou iii; Ta-bela 34 (Tabelas 34-1 e 34-2) mostra os dados para Ilb onde Tm é de 68°C ou menos para a Região ii ou iii; Tabela 35 (Tabelas 35-1 e 35-2) mostra os dados para IIIa onde Tm é de 68°C ou menos para a Região ii ou iii.

[00620] Anticorpos que melhoraram ligação FCYR em comparação com o anticorpo nativo e cuja estabilidade não é significativamente reduzida podem ser produzidos por meio de um anticorpo heterodimeri- zado em que apenas uma das cadeias H é introduzida com essas alterações. [Tabela 35-2]

nome [Exemplo 11] ensaio da atividade de anticorpos ADCC hete- rodimerizado com a melhora da capacidade de reconhecer FcYRIIIa

[00621] Como discutido no Exemplo 7, usando o anticorpo hetero- dimerizado, a atividade de ligação a FcYRIIIa foi aumentada com êxito mais do que a de variantes produzidas pela tecnologia de anticorpos homodimerizados convencional. Anticorpos induzem as células NK através de FcYRIIIa a exibir citotoxicidade celular dependente de anticorpos contra células que expressam o antígeno alvo. Para avaliar se os anticorpos heterodimerizados têm não apenas um aumento da atividade de ligação FcYRIIIa, mas também aumento na atividade de ADCC, os anticorpos heterodimerizados com um aumento da atividade de ligação a FcYRIIIa mostrado na Tabela 13 no Exemplo 7, os anticorpos homodimerizados e IgG1 nativo foram ensaiados para a atividade de ADCC de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 7. O resultado é mostrado na Figura 31.

[00622] Com base no resultado mostrado na Figura 31, quando GpH7-G1d/GpL16-k0 que é uma IgG1 nativa é comparado com GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 em que D356K, H435R, e K439E foi introduzido em cada uma da cadeia H, não há nenhuma diferença significativa na atividade de ADCC. Assim, pensava-se que as alterações D356K, H435R e K439E não afetariam a atividade ADCC.

[00623] Em seguida, os anticorpos homodimerizados em que uma alteração que aumenta a atividade de ligação FcYRIIIa foi introduzida em ambas as cadeias H de maneira convencional, foram examinados para avaliar se a mesma tendência como visto no efeito de aumento de ligação é também observada para a atividade de ADCC. GpH7- TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com L234Y, G236W, e S298A foi comparado com GpH7- A57/GpH7-B78/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E. Em relação à atividade de ligação FcYRIIIa, a ligação de GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 foi marcada- mente melhorada em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, enquanto a ligação de GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 foi reduzida. Do mesmo modo, a atividade de ADCC de GpH7-A57/GpH7- B78/GpL16-k0 foi aumentada mais do que a de GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0, enquanto que a atividade de GpH7-TA7/GpH7- TA45/GpL16-k0 foi reduzida em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0. Assim, como com os anticorpos homodimerizados, foi observada uma correlação entre o nível da atividade de ligação a FcYRIIIa e a atividade de ADCC.

[00624] Em seguida, os anticorpos heterodimerizados no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com uma alteração que aumenta a atividade de ligação a FcYRIIIa foram examinados para avaliar se a mesma tendência como visto no efeito de aumento de ligação foi observada para a atividade de ADCC. GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e S298A foi comparado com GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com S239D, A330L, e I332E. As atividades de ligação FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 e GpH7- TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 foram aumentadas em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. A mesma tendência foi observada para a atividade de ADCC. Além disso, a atividade de ligação a FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 foi aumentada mais do que a de GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0, no entanto, a mesma tendência foi obtida para a atividade de ADCC. Assim, não só os anticorpos homo- dimerizados mas também os anticorpos heterodimerizados tem uma correlação entre o nível de atividade de ligação FcYRIIIa e a atividade de ADCC.

[00625] Então, em relação a cada um dos grupos de alterações L234Y, G236W e S298A, e as alterações S239D, A330L, e I332E, foi avaliado se os anticorpos heterodimerizados e anticorpos homodimeri- zados têm uma correlação entre os efeitos para melhorar a atividade de ligação de FcYRIIIae a atividade de ADCC. Em primeiro lugar, quando GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 que é um anticorpo heterodi- merizado em que apenas uma das cadeias H foi introduzida com o grupo da alteração S239D, A330L, e I332E foi comparado com GpH7- A57/GpH7-B78/GpL16-k0 que é um anticorpo homodimerizado em que ambas as cadeias H foram introduzidas com o grupo, o efeito de aumentar a atividade de ligação a FcYRIIIa foi maior no anticorpo homo- dimerizado do que no anticorpo heterodimerizado, no entanto, não houve diferença para a atividade de ADCC. Além disso, quando GpH7- TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 que é um anticorpo heterodimerizado em que apenas uma das cadeias H foi introduzida com o grupo do L234Y alterações, G236W, e S298A foram comparadas com GpH7-TA7/GpH7- TA45/GpL16-k0 que é um anticorpo homodimerizado em que ambas as cadeias H foram introduzidas com o grupo, no que diz respeito à atividade de ligação FcYRIIIa, a ligação do anticorpo heterodimerizado foi realçada mais fortemente do que a de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16- k0, enquanto que a ligação do anticorpo homodimerizado foi reduzida. A mesma tendência foi observada para a atividade de ADCC. Assim, pensou-se que o efeito do grupo das alterações L234Y, G236W, e S298A para aumentar a atividade de ligação a FcYRIIIa apenas de uma direção reflete na atividade de ADCC. A partir destes resultados, considerou-se que no nível de anticorpos heterodimerizados no qual apenas uma das cadeias H foi introduzida com um grupo de alterações, e anticorpos, em que ambas as cadeias H foram introduzidas com o grupo homodimerizado, existe uma correlação entre o nível de atividade de ligação FcYRIIIa e a atividade de ADCC.

[00626] Em seguida, o anticorpo heterodimerizado GpH7- TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e e S298A a outra cadeia H foi introduzida com S239D, A330L, e I332E foi comparado com o anticorpo homodimeri- zado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E. Em relação à atividade de ligação FcYRIIIa, ambos tinham aumentado significativamente as atividades de ligação, em comparação com GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0. A mesma tendência foi observada para a atividade de ADCC. Além disso, a atividade de ligação a FcYRIIIa de GpH7- TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 foi aumentada mais do que a de GpH7- A57/GpH7-B78/GpL16-k0, e GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 também exibiu uma atividade de ADCC mais forte.

[00627] Tal como descrito acima, em relação aos grupos do L234Y alterações, G236W, e S298A, e as alterações S239D, A330L, e I332E, este último grupo de alteração, S239D, A330L, e I332E, foi observado um efeito mais forte para aumentar a ADCC atividade, independentemente de quando introduzido em uma cadeia H ou ambas as cadeias H. Por outro lado, demonstrou-se que, quando o grupo de alterações L234Y, G236W, e S298A, e o grupo das alterações S239D, A330L, e I332E são, respectivamente, introduzidos em diferentes cadeias de H, o efeito de aumentar a atividade de ADCC é mais forte do que quando S239D, A330L, e I332E, que tem um forte efeito de aumentar a atividade de ADCC de ambos os anticorpos heterodimerizado e homodi- merizado, são introduzidos em ambas as cadeias H.

[00628] Isto é, foi demonstrado que a correlação entre o nível da atividade de ligação a FcYRIIIa e o nível de ADCC, tal como a observado em anticorpos homodimerizados da tecnologia da técnica anterior, é também observado quando se compara anticorpos heterodimeri- zados um ao outro e, quando compara-se anticorpos heterodimeriza- dos e homodimerizados. Isto revela que o uso da tecnologia de anticorpos heterodimerizados permite a preparação de anticorpos com atividade de ADCC superiores às das tecnologias convencionais. [Exemplo 12] Comparação dos anticorpos homodimerizados con-vencionais e anticorpos heterodimerizados novos em conexão com FcYRIIa

[00629] Tal como descrito no Exemplo 1, FcYRIIIa provavelmente desempenha um papel importante na eficácia do fármaco de produtos farmacêuticos de anticorpos. Além disso, a atenção tem sido direico- nada para o papel de FcYRIIa que é executado na eficácia do fármaco de produtos farmacêuticos de anticorpos IgG1 derivados, além de FcYRIIIa.

[00630] Para FcYRIIa, existem alótipos chamados tipos R e H, que têm Arg e His na posição do aminoácido 131, respectivamente, e que são conhecidos por variar na atividade de ligação de IgG2 humana (Tissue Antigens 2003, 61, 189-202). A suscetibilidade à infecção é conhecida variar em função da diferença no alótipo FcYRIIa (Tissue Antigens 2003: 61: 189-202). Isto é pensado ser por causa da ativida- de de ligação de IgG2 FcYRIIa que varia de acordo com a diferença do alótipo, e como resultado, o mecanismo de resistência para patógenos via IgG2 difere (Infection and Immunity 1995, 63, 73-81). Enquanto isso, as células que expressam FCYRIV de camundongo são conhecidas corresponder a células que expressam FcYRIIa humano, e FCYRIV tem sido relatada desempenhar um papel importante na eficácia do fárma- co de um anticorpo anti-CD20 no modelo do camundongo. Estes resultados sugerem que, em humanos, FcYRIIa desempenha um papel semelhante (The Journal of Experimental Medicine 2004: 199: 1659-1669; The Journal of Experimental Medicine 2006, 203, 743-753; Immunity 2005, 23, 41-51). Na verdade, tem sido relatado que, um an-ticorpo em que a atividade de ligação FcYRIIa da região Fc é reforçada em comparação com a IgG1 melhora a atividade de fagocitose celular mediada por macrófagos dependente de anticorpos (ADCP) em com-paração com a IgG1 (Molecular Cancer Therapeutics 2008, 7, 25172527). Além disso, em um modelo de xenoenxerto de camundongo, um anticorpo anti-CD19 com um domínio Fc com ADCP reforçada exibe um efeito antitumoral mais forte do que a da IgG1 (Nature Medicine, 2000, 6, 443-446). O domínio Fc deste anticorpo aumentou a atividade de ligação a FcYRIIa de macaco. CD19 é expresso na superfície de células B. Tem sido relatado que este anticorpo, quando administrado a macacos, aumenta a eliminação de células B, em comparação com um anticorpo anti-CD19 que tem a região Fc da IgG1 (Ciência 2005, 310, 1510-1512).

[00631] A partir destes relatos, espera-se que a eficácia de produtos farmacêuticos de anticorpos, em particular, o efeito antitumoral possa ainda ser melhorada pelo aumento da atividade de ligação a FcYRIIa além de aumentar a atividade de ligação a FcYRIIIa. Os anticorpos com tais características foram produzidos através de tecnologias convencionais (Molecular Cancer Therapeutics 2008, 7, 2517- 2527). No entanto, uma vez que FcYRIIa é pensado para se ligar a um domínio Fc de anticorpo de uma forma assimétrica, considera-se que a atividade de ligação FcYRIIa pode ser ainda aumentada através da uti-lização da tecnologia de anticorpos heterodimerizados como descrito no Exemplo 11. Para avaliar isto, alterações que aumentem a atividade de ligação para todos FcYRIIIa, FcgRIIA tipo I, e FcgRIIA tipo H, em comparação com IgG nativa foram selecionadas com base no resultado mostrado no Exemplo 4, e combinadas para introduzir as mutações que o reforço da ligação de atividade para todos FcYRIIIa, FcgRIIA tipo R, e FcgRIIA tipo H, e os anticorpos heterodimerizados foram produzidos tendo uma combinação de cadeias H com ligação diferencial FcYR. Os anticorpos foram avaliados para a atividade de ligação de cada FcYR.

[00632] Por outro lado, em contraste com este FcYR de ativação, FcYRIIb que é um FcYR inibidor induz sinal intracelular que suprime a resposta imunológica. Tem sido relatado que, em camundongos knockout de FcYRIIb o efeito antitumoral de anticorpos é reforçado (Nature Medicine, 2000, 6, 443-446) e eliminação de células B mediada por anticorpos é promovida (The Journal of Experimental Medicine 2006, 203, 743-753), mostrando que FcYRIIb desempenha um papel importante na eficácia do fármaco de anticorpos in vivo. Por outro lado, foi observada uma correlação entre o efeito antitumoral de camundongo de subclasses de IgG e a razão entre a atividade de ligação a FcYR de ativação contra a atividade de ligação a FcYR inibidor (razão A/I) de cada uma das subclasses de IgG (Science 2005, 310, 1510-1512). Esses relatos sugerem que os índices A/I são importantes para a função de anticorpos efetores via imunidade. Especificamente, quando os anticorpos são produzidos tendo uma maior razão de A/I, a sua função efetora é reforçada, e tais anticorpos são úteis. Foi, no entanto, previsto ser extremamente difícil aumentar a razão A/I através do aumento da atividade de ligação a FcYRIIa sem aumentar a atividade de ligação FcYlIb, porque a homologia de sequência entre FcYRIIa que é um FcYR de ativação, e FcYRIIb que é um FcYR inibidor é de 93 %, o que é extremamente elevado, nos seus domínios extracelulares. Como FcYRIIIa e FcYRIIa, FcYRIIb é pensado ligar a um domínio Fc de anticorpos de forma assimétrica. Com as tecnologias convencionais, a interação com FcYR pode ser regulada apenas pela introdução da mesma alteração em ambas as cadeias H de um anticorpo. Em contraste, o uso da tecnologia de anticorpos heterodimerizados permite uma regulação mais exata, e, assim, permite a melhora da razão de A/I mesmo entre FcYRIIa e FcYRIIb cujas sequências são altamente semelhantes. Assim, os presentes inventores também avaliaram, a partir deste ponto de vista, se a tecnologia de anticorpos heterodimerizados é superior às tecnologias convencionais.

[00633] Nessa avaliação, para formar eficientemente anticorpos he- terodimerizados, a tecnologia de knobs em holes foi utilizada para a região constante de cadeia H do anticorpo. A tecnologia de knobs em holes é uma tecnologia que permite a promoção de heterodimerização das cadeias H e preparação eficiente de anticorpos heterodimerizado de interesse substituindo uma cadeia lateral de aminoácido por uma cadeia lateral maior (knob) no domínio CH3 de uma cadeia H e substituindo uma cadeia lateral de aminoácido por uma cadeia lateral menor (hole) no domínio CH3 da outra cadeia H de modo que o knob é colocado no hole (Nature, 372, 379-383 (1994)). Uma cadeia H cuja região constante foi introduzida com as alterações Y349C e T366W que pretende ter cadeias laterais de aminoácidos maiores no domínio CH3 é referida como "cadeia knob". Quando uma alteração adicional é introduzida nesta, o nome da região constante de cadeia H começa com o símbolo "kn", que é seguido de um número com três dígitos, como Kn001. Uma cadeia H cuja região constante foi introduzida com as al- terações D356C, T366S, L368A e Y407V que pretende ter cadeias laterais de aminoácidos menores no domínio CH3 é referida como "cadeia hole". Quando uma alteração adicional é introduzida nesta, o nome da região constante de cadeia H começa com o símbolo "Hl", que é seguido de um número com três dígitos e, assim, é referido a, tal como HL001. Além disso, quando as regiões constantes da cadeia H do anticorpo são Kn001 e HL001, as sequências das cadeias H de um anticorpo cuja regiões variáveis têm GpH7 são referidas como GpH7- Kn001 e GpH7-HL001, respectivamente. Um anticorpo purificado depois de expressão é referido, por exemplo, como GpH7-Kn001/GpH7- Hl001/GpL16-k0 quando a sequência correspondente a uma cadeia H de anticorpo utilizada para expressar o anticorpo heterodimerizado é GpH7-Kn001, e a sequência correspondente ao outro anticorpo da cadeia H é GpH7-HL001, e a sequência que corresponde à cadeia L de anticorpo é GpL16-k0.

[00634] Primeiro, GpH7-Kn033 (SEQ ID N°: 51), resultante da introdução das alterações Y349C e T366W na região constante para GpH7-G1D, e GpH7-Hl033 (SEQ ID N°: 56), resultante da introdução das alterações D356C, T366S, L368A e Y407V na região constante para GpH7-G1D foi construído de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Ao expressar anticorpos heterodimerizados, os seguintes vetores de expressão foram usados para a expressão eficiente deles: um vetor de expressão inserido com GpL16-k0 na cadeia L de anticorpo, por uma cadeia H de anticorpo, um vetor de expressão com uma sequência inserida introduzido com uma outra alteração para GpH7-Kn033 (SEQ ID N°: 51) introduzido com as alterações Y349C e T366W e, na outra cadeia H de anticorpo, um vetor de expressão com uma sequência inserida introduzido com uma outra alteração para GpH7-Hl033 (SEQ ID N°: 56) introduzido com as alterações D356C, T366S, L368A e Y407V.

[00635] Os anticorpos cuja ligação a todos FcYRIIIa, FcYRIIa tipo I, e FcYRIIa tipo H destinam-se a ser melhorados foram produzidos como descrito abaixo, com base na informação obtida no Exemplo 4 com a influência de cada alteração na ligação de um anticorpo para cada FcYR. Ao introduzir diversas alterações nas regiões constantes das respectivas cadeias H de um anticorpo, GpH7-Kn033 e GpH7-Hl033 foram usados como polipeptídeos progenitores. GpH7-Kn045 (SEQ ID N°: 54), resultante da introdução de L234Y, L235Y, G236A, H268D, e S298A em GpH7-Kn033; GpH7-Kn056 (SEQ ID N°: 55), resultante da introdução de L234Y, L235Y, G236A, H268D, Q295L e S298A em GpH7-Kn033; GpH7-Hl048 (SEQ ID N°: 59), resultante da introdução de G236A, S239D, A330K, e I332E em GpH7-Hl033 e GpH7-Hl055 (SEQ ID N°: 60) resultante da introdução de G236A, S239D, Q295L, A330M, e I332E em GpH7-Hl033, foram construídos de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1.

[00636] Em seguida, as respectivas cadeias H foram combinadas da maneira descrita abaixo, e os anticorpos foram expressos de acordo com o Exemplo de Referência 1. GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16- k0 resultante da aplicação da tecnologia de knobs em holes sozinha para G1D foi expresso utilizando GpH7-Kn033 e GpH7-Hl033 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L. O anticorpo heterodimerizado GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 foi expresso utilizando GpH7- Kn045 e GpH7-Hl048 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L. O anticorpo heterodimerizado GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0 foi expresso utilizando GpH7-Kn045 e GpH7-Hl055 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L. O anticorpo heterodimerizado GpH7- Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 foi expressa utilizando GpH7-Kn056 e GpH7-Hl055 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L.

[00637] Anticorpos baseados no uso de tecnologias convencionais para comparação foram preparados com referência a Pro. Nat. Acad. Sci., 103, 4.005-4.010 (2006), como descrito abaixo. A alteração G236A/S239D/I332E, que tem sido relatada para aumentar a ligação a todos FcYRIIIa, FcYRIIa tipo R e FcYRIIa tipo H, foi introduzida em GpH7-Kn033 e GpH7-Hl033 para construir GpH7-Kn037 (SEQ ID N°: 52) e GpH7-Hl036 (SEQ ID N°: 57), respectivamente. Além disso, a alteração S239D/A330L/I332E, que foi relatada para aumentar a ligação de FcYRIIIa, foi introduzida em GpH7-Kn033 e GpH7-Hl033 para construir GpH7-Kn032 (SEQ ID N°: 53) e GpH7-Hl032 (SEQ ID N°: 58), respectivamente. Estas cadeias H foram combinadas, e os anticorpos foram expressos de acordo com o Exemplo de Referência 1. O anticorpo homodimerizado GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, resultante da introdução de G236A/S239D/I332E em ambas as cadeias H de GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0, que é uma molécula que resulta da aplicação da tecnologia knobs em holes sozinha para G1D, foi expresso utilizando GpH7-Kn037 e GpH7-Hl036 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L. O anticorpo homodimerizado GpH7- Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0, resultante da introdução de S239D/A330L/I332E em ambas as cadeias H de GpH7-Kn033/GpH7- Hl033/GpL16-k0, que é uma molécula que resulta da aplicação da tecnologia knobs em holes sozinha para G1D, foi expresso utilizando GpH7-Kn032 e GpH7-Hl032 como a cadeia H e GpL16-k0 como a cadeia L.

[00638] Estes anticorpos foram avaliados para a atividade de ligação a cada FcYR de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2. O resultado está resumido no Tabela 36. Enquanto isso, a razão KD de cada anticorpo é mostrada na Tabela 37, e a razão A/I, que representa a razão KD/FcYRIIIa, está resumida na Tabela 38. [Tabela 36]

[00639] A tabela mostra a atividade de ligação para cada FCYR de anticorpos heterodimerizados com ligação melhorada a FcYRIIa e IIIa.

[00640] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "kn" e "Hl" indicam os nomes das regiões constantes da cadeia knob e cadeia hole de cada um dos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica).

[00641] A tabela mostra a atividade de ligação para cada FCYR de anticorpos heterodimerizados com ligação melhorada a FcYRIIa e IIIa.

[00642] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "kn" e "Hl" indicam os nomes das regiões constantes da cadeia knob e cadeia hole de cada um dos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). Um valor obtido dividindo KD de GpH7- Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0 para FCYR pela KD de cada anticorpo foi definido como "razão KD". As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo. [Tabela 38]

[00643] A tabela mostra a relação entre a atividade de ligação para FCYR de ativação e a atividade de ligação para FCYR inibidor.

[00644] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "kn" e "Hl" indicam os nomes das regiões constantes da ca- deia knob e cadeia hole de cada um dos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0 ("-": quando não há nenhuma mutação específica). Um valor obtido dividindo KD de GpH7- Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0 para FcYRIIb pela KD de cada um dos anticorpos para o FcYRIIa tipo H e tipo R foi definida como " relação de A/I " para cada tipo. As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00645] Os resultados mostrados nas Tabelas 36 e 37 demonstram que, em relação a GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com G236A/S239D/I332E, a sua ligação a FcYRIIa tipo H foi aumentada em 22 vezes, a sua ligação a FcYRIIa tipo R foi aumentada em 43 vezes, e a sua ligação a FcYRIIIa F foi aumenta-da, em 161 vezes, em comparação com GpH7-Kn033/GpH7- Hl033/GpL16-k0 que é uma molécula resultante da aplicação da tecnolo-gia knobs em holes sozinha para G1D. Enquanto isso, o resultado apre-sentado na Tabela 38 demonstra que a razão A/I de GpH7-Kn037/GpH7- Hl036/GpL16-k0 foi de 8,6 para o FcYRIIa tipo H e 13 para o FcYRIIa tipo R, que foram aumentadas, em comparação com, respectivamente, 6,2 e 4,9 de GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0.

[00646] Os resultados mostrados nas Tabelas 36 e 37 demonstram que, em relação a GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D/A330L/I332E, a sua ligação a FcYRIIa tipo H foi aumentada em 1,2 vez, a sua ligação a FcYRIIa tipo R foi aumentada em 3,0 vezes, sendo a sua ligação a FcYRIIIa F aumentada em 381 vezes, em comparação com GpH7- Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0 que é uma molécula resultante da aplicação dos tecnologia knobs em holes sozinha para G1D. Enquanto isso, o resultado apresentado na Tabela 38 demonstra que a razão A/I de GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 foi de 0,93 para o FcYRIIa tipo H e 1,8 para o FcYRIIa tipo R, que foram reduzidos em comparação com GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0.

[00647] Os resultados mostrados nas Tabelas 36 e 37 demonstram que, em relação a GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298A e a outra cadeia H com G236A/S239D/A330K/I332E, a sua ligação a FcYRIIa tipo H foi aumentada em 52 vezes, a sua ligação a FcYRIIa tipo R foi aumentada em 154 vezes, e a sua ligação a FcYRIIIa F foi aumentada em 419 vezes, em comparação com GpH7-Kn033/GpH7- Hl033/GpL16-k0 que é uma molécula que resulta da aplicação da tecnologia de knobs em holes sozinha para G1D. O resultado também demonstra que, para ambos os tipos de H e I, a atividade de ligação a FcYRIIa foi aumentado em comparação com o anticorpo homodimeriza- do GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com G236A/S239D/I332E da tecnologia da técnica anterior. Além disso, a atividade de ligação de FcYRIIIa F foi ligeiramente aumentada em comparação com o anticorpo homodimerizado GpH7- Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D/A330L/I332E da tecnologia da técnica anterior. O resultado apresentado na Tabela 38 demonstra que a razão A/I de GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 foi de 9,5 para o FcYRIIa tipo H e 22 para o FcYRIIa tipo R, que foram aumentados quando comparados com qualquer um de GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0, GpH7- Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, e GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0. O resultado demonstra que, utilizar a tecnologia de anticorpo heterodi- merizado, as atividades de ligação FcYRIIa-e F e FcYRIIIa de GpH7- Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 são aumentadas e o anticorpo liga-se de forma mais seletiva a FcYR de ativação, em comparação com quando se utiliza a tecnologia convencional.

[00648] Os resultados mostrados nas Tabelas 36 e 37 demonstram que, em relação a GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298A e a outra cadeia H foi introduzida com G236A/S239D/Q295L/A330M/I332E, a sua ligação a FcYRIIa tipo H foi aumentada em 21 vezes, a sua ligação a FcYRIIa tipo R foi aumentada em 56 vezes, e a sua ligação a FcYRIIIa F foi aumentada em 985 vezes, em comparação com-GpH7 Kn033/GpH7- Hl033/GpL16-k0 que é uma molécula que resulta da aplicação da tecno-logia de knobs em holes sozinha para G1D. O resultado também de-monstra que, para ambos os tipos de H e I, a atividade de ligação a FcYRIIa foi quase equivalente a do anticorpo homodimerizado GpH7- Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram intro-duzidas com G236A/S239D/I332E da tecnologia da técnica anterior. A atividade de ligação do F FcYRIIIa foi aumentado em comparação com o anticorpo homodimerizado GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D/A330L/I332E da tecnologia da técnica anterior. O resultado apresentado na Tabela 38 demonstra que a razão A/I de GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0 foi de 8,3 para o FcYRIIa tipo H e 18 para o FcYRIIa tipo R, o qual foi aumenta-do em comparação com GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0 e GpH7- Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0, e em comparação com GpH7- Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, foi quase equivalente para o FcYRIIa tipo H e aumentou para R. Este FcYRIIa tipo Resultado demonstra que, utili-zando a tecnologia de anticorpos heterodimerizados, em GpH7- Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0, a atividade de ligação FcYRIIIa é ainda aumentada, enquanto a sua atividade de ligação a FcYRIIa é aumentada para uma proporção comparável, e o anticorpo liga-se de forma mais se-letiva para FcYR de ativação, em comparação com quando se utiliza a tecnologia convencional.

[00649] Os resultados mostrados nas Tabelas 36 e 37 demonstram que, em relação a GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 em que uma das cadeias H foi introduzida com L234Y/L235Y/G23- 6A/H268D/Q295L/S298A e a outra cadeia H foi introduzida com G236A/S239D/Q295L/A330M/I332E, a sua ligação a FcYRIIa tipo H foi aumentada em 20 vezes, a sua ligação a FcYRIIa tipo R foi aumentada em 44 vezes, e a sua ligação a FcYRIIIa F foi aumentada em 1114 vezes, em comparação com GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0 que é uma molécula que resulta da aplicação da tecnologia de knobs em holes sozinho para G1D. Este resultado mostra também que, para os dois tipos de H e I, a atividade de ligação a FcYRIIa era equivalente a do anticorpo homodimerizado GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com G236A/S239D/I332E da tecnologia da técnica anterior. A atividade de ligação do F FcYRIIIa foi aumentado em comparação com o anticorpo homodimerizado GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 em que ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D/A330L/I332E da tecnologia da técnica anterior. O resultado apresentado na Tabela 38 demonstra que a razão A/I de GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 foi de 8,7 para o FcYRIIa tipo H e 16 para o FcYRIIa tipo R, o qual foi aumentado em comparação com GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0 e GpH7- Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0, e em comparação com GpH7- Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, foi quase equivalente para o FcYRIIa tipo H e aumentou para R. O FcYRIIa tipo Resultado demonstra que, utilizando a tecnologia de anticorpos heterodimerizados, em GpH7- Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0, a atividade de ligação FcYRIIIa é ainda aumentada, enquanto a sua atividade de ligação a FcYRIIa é aumentada para uma proporção comparável, e o anticorpo liga-se de forma mais seletiva para FcYR de ativação, em comparação com quando se utiliza a tecnologia convencional.

[Exemplo 13] A comparação com a tecnologia convencional: ava liação da estabilidade térmica de anticorpos heterodimerizados com o aumento da atividade de ligaçao FcYRIIa e FcYRIIIa.

[00650] Como descrito no Exemplo 9, os anticorpos homodimeriza- dos obtidos pela tecnologia convencional, apesar de ter um aumento da atividade de ligação a FCYR, são físicoquimicamente instáveis, e eles tem reduzido o seu valor como agentes farmacêuticos. Por outro lado, revelou-se que a tecnologia de anticorpos heterodimerizados era conveniente para a regulação do efeito de cada modificação para au-mentar a atividade de ligação FcyR e a influência do aspecto físico- químico, e que o aumento da atividade de ligação a FcyR sem reduzir a estabilidade físicoquímica era possível. Estes Exemplo testa se os anticorpos com atividades de ligação melhoradas a FcyRIIa e FcyRIIIa, que são FcyR de ativação, da mesma forma, não reduziram a estabili-dade físicoquímica, estabilidade termodinâmica em particular. Cada anticorpo avaliado quanto à sua atividade de ligação a FcyR no Exemplo 11 foi ensaiado para a Tm da região CH2 de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 5. O resultado está resumido no Tabela 39. [Tabela 39]

[00651] A tabela mostra Tm de anticorpos com o aumento das atividades de ligação para FcYRIIa e FcYRIIIa.

[00652] O resultado mostrado na Tabela 39 demonstra que todos os anticorpos heterodimerizados GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0, GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0, e GpH7-Kn056/GpH7- Hl055/GpL16-k0 retido alta tm em comparação com os anticorpos ho- modimerizados GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 e GpH7- Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 da técnica anterior. Conforme descrito no Exemplo 11, os anticorpos heterodimerizados têm propriedades mais adequadas para conseguir a função efetora mediada por FCYR, em comparação com os anticorpos homodimerizados convencionais. Especificamente, a descoberta descrita acima demonstra que a ligação a FcyR pode ser finamente regulada sem reduzir a estabilidade físicoquímica de anticorpos usando a tecnologia de anticorpos hetero- dimerizados.

[Exemplo 14] Efeito da combinação de alterações que melhoram a seletividade para FcYRIIIa F, um FCYR de ativação

[00653] Como descrito no Exemplo 8, as tecnologias para melhorar a seletividade para a FcyR de ativação e FcyR inibidor são úteis. Este exemplo testa se a heterodimerização é eficaz para aumentar a relação entre a ligação a FcyRIIIa F, um Fcy de ativação, e a ligação a FcyRIIb, um FcyR inibidor, isto é, eficaz para melhorar a seletividade, tal como descrito no Exemplo 8. Especificamente, L234Y, G236W, e S298A (Região a mostrada na Tabela 22-1), que são as alterações que aumentam a relação entre a ligação a FcyRIIIa F, um Fcy de ativação, e a ligação a FcyRIIb, um FcyR inibidor, foram combinadas com S239D, A330L, e I332E avaliados no Exemplo 7, para testar se a melhora da seletividade pode ser conseguida em anticorpos heterodi- merizados, em comparação com anticorpos homodimerizados.

[00654] Para avaliar isto, os vetores de expressão inseridos com GpH7-A57 (SEQ ID N°: 40), resultante da introdução de todos S239D, A330L, e I332E em GpH7-A5; GpH7-B78 (SEQ ID N°: 41), resultante da introdução de todos S239D, A330L, e I332E em GpH7-B3; GpH7- TA7 (SEQ ID N°: 31), resultante da introdução de todos L234Y, G236W, e S298A em GpH7-A5, e GpH7-TA45 (SEQ ID N°: 32), resultante da introdução de todos L234Y, G236W, e S298A em GpH7-B3 foram construídos de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Usando estes vetores de expressão e GpH7-A5, GpH7- B3, e GpL16-k0, hetero GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W, e e S298A a outra foi introduzida com S239D, A330L, e I332E;

[00655] GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 apenas uma das cadeias H foi introduzida com L234Y, G236W e S298A;

[00656] GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 ambas as cadeias H foram introduzidas com L234Y, G236W e S298A;

[00657] GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 apenas uma das cadeias H foi introduzida com S239D, A330L, e I332E; e

[00658] GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 ambas as cadeias H foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E

[00659] foram expressos e preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos preparados foram ensaiados quanto a KDs para FcYRIIIa e FcYRIIb de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2. Se ou não cada anticorpo foi melhorado para seletividade de ligação FcYRIIIa isso foi avaliado utilizando, como um indicador, razão FcYRIIIa/FcYRIIb que é obtida através da divisão de cada anticorpo KD para FcYRIIb por KD de cada anticorpo para FcYRIIIa. O resultado da avaliação está resumido na Tabela 40. [Tabela 40]

[00660] A coluna "AMOSTRA" indica os nomes de anticorpos; as colunas "H1" e "H2" indicam os nomes da região constante de cadeia H em cada um dos anticorpos, e a coluna "SÍTIO DE MUTAÇÃO" indica as mutações que são diferentes em comparação com GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": usado quando não há mutação particular). Os valores obtidos pela divisão da KD de cada anticorpo para FcYRIIb pela KD de cada anticorpo para FcYRIIIa F são indicadas em "razão FcYRIIIa F/FcYRIIb". As SEQ ID N°s também são mostradas para as sequências de aminoácidos da cadeia H e da cadeia L de cada anticorpo.

[00661] Quando, com base nos resultados apresentados na Tabela 40, um IgG1 GpH7-G1d/GpL16-k0 nativo é comparado com GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 em que D356K, H435R, e K439E cada um foi introduzido em uma cadeia H, a razão FcYRIIIa/FcYRIIb é de 2,5 e 1,9, respectivamente, e não havia grande diferença entre eles. Isto sugere que as alterações D356K, H435R e K439E não afetam a seletividade da ligação a FcYRIIIa.

[00662] Verificou-se o efeito de cada alteração em anticorpos ho- modimerizados da área da técnica anterior. A razão FcYRIIIa/FcYRIIb de anticorpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 ambos cujas cadeias H foram introduzidas com S239D, A330L, e I332E era 100, e foi aumentada em comparação com GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16- k0. Enquanto isso, a razão FcYRIIIa/FcYRIIb de anticorpo homodimeri- zado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 ambos cujas cadeias H foram introduzidas com L234Y, G236W e S298A foi de 5,3. Quanto anticorpos homodimerizados, foi demonstrada a combinação de S239D, A330L, e I332E tendo o maior efeito para melhorar a seletividade da ligação a FcYRIIIa.

[00663] Em seguida, os anticorpos heterodimerizados apenas uma das cadeias H tinham sido introduzidas em cada grupo de alteração foram avaliadas para os efeitos de cada grupo de alteração. A razão FcYRIIIa/FcYRIIb de anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7- B78/GpL16-k0 um de cuja cadeia H foi introduzida com S239D, A330L, e I332E foi de 7,9, e foi aumentada em comparação com GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Enquanto isso, a razão FcYRIIIa/FcYRIIb de anticorpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 um de cuja cadeia H foi introduzida com L234Y, G236W e S298A foi 14. Estes resultados demonstram que, em relação a anticorpos heterodimerizados, o grupo de alterações L234Y, G236W, e S298A tem o maior efeito de aumentar a seletividade da ligação a FcYRIIIa.

[00664] A diferença no efeito de cada grupo de alteração no nível de anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimerizados foi avaliada. Quanto S239D, A330L, e I332E, a razão FcYRIIIa/FcYRIIb do anticorpo heterodimerizado com eles foi de 7,9, enquanto que a do anticorpo homodimerizado com eles foi de 100. Estes resultados demonstram que S239D, A330L, e I332E tem o efeito de melhora da seletividade da ligação a FcYRIIIa sobre heterodimerização, e o efeito é ainda mais reforçado mediante a homodimerização. Por outro lado, em relação L234Y, G236A, e S298A, a razão FcYRIIIa/FcYRIIb do anticorpo hetero- dimerizado com eles foi de 14, enquanto que a do anticorpo homodime- rizado com eles foi de 5,3. Estes resultados demonstram que L234Y, G236A, e S298A têm o efeito de melhora da seletividade da ligação a FcYRIIIa sobre heterodimerização, mas o efeito é reduzido mediante a homodimerização. Os resultados demonstram que o grupo de alterações S239D, A330L, e I332E em anticorpos homodimerizados tem o maior efeito de melhora da seletividade da ligação a FcYRIIIa do que o grupo de alterações L234Y, G236A, e S298A, enquanto o grupo de alterações L234Y, G236A e S298A em anticorpos heterodimerizados tem o maior efeito para melhorar a seletividade da ligação a FcYRIIIa do que o grupo de alterações S239D, A330L, e I332E.

[00665] Demonstrou-se que a razão FcYRIIIa/FcYRIIb de anticorpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 com o grupo de alte-rações L234Y, G236A, e S298A em combinação com o grupo de altera-ções S239D, A330L, e I332E era 244, e, assim, seu efeito para melhorar a seletividade da ligação a FcYRIIIa foi maior em comparação com o an-ticorpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 apenas um de cujas cadeias H teve o grupo de alterações L234Y, G236A e S298A, an-ticorpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 ambos cujas cadeias H tem o grupo de alterações L234Y, G236A, e S298A, anticorpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 apenas um de cujas cadeias H tem o grupo de alterações S239D, A330L, e I332E, e anticorpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 ambos cujas cadeias H têm o grupo de alterações S239D, A330L, e I332E. Esses resultados são considerados como uma soma do efeito do grupo de alterações L234Y, G236A, e S298A em um anticorpo heterodimerizado para melhorar a seletividade da ligação a FcYRIIIa e o efeito do grupo de alterações S239D, A330L, e I332E em um anticorpo heterodimerizado. Especifica-mente, foi revelado que os anticorpos heterodimerizados mostram um efeito excelente para melhorar a seletividade da ligação a FcYRIIIa, em comparação com anticorpos homodimerizados.

[00666] Especificamente, demonstrou-se que a utilização de anticorpos heterodimerizados, em vez de anticorpos homodimerizados convencionais, permite a otimização mais fina da interação assimétrica entre a região Fc e FcYRIIIa e regiões Fc de criação com uma maior seletividade da ligação a FcYRIIIa.

[Exemplo 15] Medição da atividade de ADCC de anticorpos hete- rodimerizados que exibem uma melhor ligação FcgRIIA

[00667] A atividade de ADCC de GpH7-G1d/GpL16-k0, GpH7- Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0, GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0, GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16- k0, e GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 preparados no Exemplo 12, foi avaliada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 7. Os resultados são resumidos na Figura. 33.

[00668] Quando GpH7-G1d/GpL16-k0 GpH7-Kn033/GpH7- Hl033/GpL16-k0 e foram comparados quanto à atividade de ADCC com base na Figura 33, que tinham atividade de ADCC comparável. Este resultado demonstra que as knobs em holes, mesmo quando introduzidas em uma região Fc de anticorpos, não afetam a ligação de FCYR ou atividade ADCC.

[00669] Ambos os anticorpos heterodimerizados GpH7-Kn045/GpH7- Hl048/GpL16-k0 e GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 descritos no Exemplo 12 exibiram uma maior atividade de ADCC, em comparação com o anticorpo GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0 antes de introdução de alterações. Enquanto isso, os anticorpos heterodimerizados GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 e GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/Gp- L16-k0 mostraram atividade de ADCC comparável a do anticorpo homo- dimerizado GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 ambos cujas cadeias H tem a alteração G236A/S239D/I332E que tinha sido relatada para au-mentar a ligação FcgRIIA R e FcgRIIA H e atividade de ADCP e para aquele do anticorpo GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 resultante da aplicação do reforço da atividade de ADCC existente.

[00670] Especificamente, como mostrado no Exemplo 12, e GpH7- Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 não só exibem uma ligação reforçada a FcgRIIA R e FcgRIIA H, em comparação com a técnica existente, mas também têm efeito de aumento da atividade de ADCC comparável à técnica que aumenta a atividade de ADCC existente. Especificamente, os anticorpos heterodi- merizados aqui avaliados são superiores à técnica existente em que não só eles têm o efeito de aumento da atividade de ADCC comparável ao obtido pela técnica existente, mas também apresentam aumen- to da ligação a FcgRIIA H e FcgRIIA R.

[Exemplo 16] Preparação de Anticorpo heterodimerizado H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 que exibe ligação reforçada FcgRIIIa

[00671] Conforme descrito no Exemplo 11, os anticorpos heterodi- merizados com um aumento da atividade de ligação a FcYRIIIa foram demonstradas ter melhorado a atividade de ADCC. No Exemplo 11, o efeito foi demonstrado com anticorpos contra GPC3. Se o mesmo efeito pode ser observado para outros antígenos foi avaliado através da realização de uma experiência semelhante utilizando um anticorpo an- ti-epirregulina (EREG). Aqui, a sequência da região variável da cadeia H do anticorpo contra EREG é referido como H240 (SEQ ID N°: 80), e a sua sequência de cadeia L, incluindo as regiões constantes e variável é referido como L73-k0 (SEQ ID N°: 106).

[00672] Com base nos resultados do Exemplo 4, as novas variantes possuindo cadeias H que exibem reforçada ligação FcgRIIIa foram preparadas. Nisto, a técnica de knobs em holes descrita no Exemplo 12 foi usada como técnica de heterodimerização. Especificamente, H240-Kn033 (SEQ ID N°: 84), resultante da introdução de alterações Y349C e T366W para a região constante de H240-G1d (SEQ ID N°: 83) e H240-HI033 (SEQ ID N°: 85), resultante da introdução de alterações D356C, T366S, L368A e Y407V para a região constante de H240-G1D foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Em seguida, H240-Kn061 (SEQ ID N°: 81) foi preparado através da introdução de L234Y, L235Y, G236W, H268D, e S298A em H240-Kn033 (SEQ ID N°: 84) de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. H240-Hl071 (SEQ ID N°: 82) foi construído através da introdução de K326D, A330M, e K334E em H240-Hl033 (SEQ ID N°: 85) de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Anticorpo heterodimerizado H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 foi expressa pela combinação de H240- Kn061, H240-Hl071, e L73-k0 de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1.

[00673] Variantes introduzidas com S239D, A330L, e I332E, que têm sido relatados para aumentar a ligação a FcYRIIIa, foram construídos da mesma forma que descrito no Exemplo 12, a ser utilizado para comparação. Especificamente, H240-Kn032 (SEQ ID N°: 86) e H240- HI032 (SEQ ID N°: 87), resultante da introdução de S239D, A330L, e I332E em H240-Kn033 (SEQ ID N°: 84) e H240-HI033 (SEQ ID N°: 85), respectivamente, foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Anticorpo homodimerizado H240- Kn032/H240-Hl032/L73-k0 foi expresso pela combinação de H240- Kn032, H240-Hl032, e L73-k0 de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1.

[00674] Em seguida, um anticorpo afucosilado, que tem sido relatado para aumentar a ligação ao FcgRIIIa (Glycobiol. Vol.17 no.1 pp 104-118 (2006)), foi preparado para comparação. A função do transportador de fucose é inibida em células em que a expressão do gene do transportador de fucose foi artificialmente suprimida em ambos os cromossomas homólogos. Anticorpos com falta de fucose podem ser obtidos pelo uso de tais células (WO 2006/ 067913, etc.) Alternativamente, os anticorpos com falta de fucose também podem ser obtidos por produção de anticorpos em células com a expressão forçada de beta 1,4-N-acetilglucosaminiltransferase III e Golgi alfa-manosidase II (Ferrara et al. Biotechnol. Bioeng. (2006) 93 (5), 851-861). H240-G1D (SEQ ID N°: 83) e L73-k0 (SEQ ID N°: 106) foram expressos em combinação, e anticorpo H240-afucosyl_G1d/L73-k0 (SEQ ID N°s: 83 e 106) foi obtido afuciosilando H240 G1d/L73-k0 usando as tecnologias acima descritas conhecidas dos versados na técnica.

[00675] Além disso, H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0 foi expresso como um controle combinando H240-Kn033 (SEQ ID N°: 84), H240- HI033 (SEQ ID N°: 85), e L73-k0 (SEQ ID N°: 106) de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1.

[00676] A atividade de ligação dos anticorpos a cada FcgR foi avaliada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 8 e os resultados estão resumidos na Tabela 41. [Tabela 41]

[00677] Os resultados apresentados na Tabela 41 demonstram que a ligação do anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73- k0, em particular, para FcgRIIIa F e FcgRIIIa V foi melhorada em comparação com H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0. Uma vez que o anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 é uma variante resultante de introdução de L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A e K326D/A330M/K334E em H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0, pode-se dizer que a ligação das alterações introduzidas a FcgR foi reforçada.

[00678] Os resultados apresentados na Tabela 41 demonstram que a ligação FcgRIIIa F e FcgRIIIa V do anticorpo heterodimerizado H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 foi aumentada em comparação com H240- afucosyl_G1d/L73-k0 e H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 resultante da aplicação da técnica de reforço da atividade de ADCC existente. Este resultado demonstra que o anticorpo heterodimerizado exibe o efeito forte para aumentar a ligação ao FcgRIIIa, em comparação com a técnica de reforço da atividade de ADCC baseada em anticorpos homo- dimerizados convencionais e técnica de reforço da atividade de ADCC baseada em afucosilação.

[00679] Além disso, no que se refere a ligação FcgRIIA que se pensa ser importante para a atividade de reforço ADCP, ligação FcgRIIA H do anticorpo heterodimerizado foi melhorada em comparação com os dois anticorpos, e sua ligação FcgRIIA R foi aumentada em relação a H240-afucosyl_G1d/L73-k0 e comparável a de H240-Kn032/H240- Hl032/L73-k0.

[00680] Se anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0 tem a característica de um anticorpo heterodimerizado, que é o fato de reforçar a atividade de ligação FcgR em comparação com anticorpos homodimerizados que compõem cada cadeia H dela, foi avaliada. No anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0, L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A foi introduzido H240-Kn061, que é uma das cadeias H e K326D/A330M/K334E foi introduzido em H240-Hl071, que é a outra cadeia H. O anticorpo hete- rodimerizado foi comparado com os anticorpos homodimerizados compreendendo cada cadeia H da mesma para avaliar se o anticorpo heterodimerizado tem atividade de ligação mais forte para cada FcgR. Especificamente, H240-HI134 (SEQ ID N°: 88), resultante da introdução de L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A em H240 e H240-Hl033- Kn132 (SEQ ID N°: 89), resultante da introdução de K326D/A330M/K334E em H240-Kn033 foram construídos de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Usando estes vetores de expressão, anticorpos homodimerizados H240-Kn061/H240- Hl134/L73-k0 ambos cujas cadeias H e têm L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A e anticorpo homodimerizado H240-Kn132/H240-Hl071/L73-k0 ambos cujas cadeias H tem K326D/A330M/K334E foram expressos de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. A ligação a FcgRIIIaF e FcgRIIIa V de anticorpos homodimerizados e anticorpo heterodimerizado H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 cada uma cujas cadeias H tem L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A ou K326D/A330M/K334E foi medida de acordo com a método descrito no Exemplo de referência 8. Os resultados estão resumidos na Tabela 42. [Tabela 42]

[00681] Os resultados apresentados na Tabela 42 demonstram que a atividade de ligação de e FcgRIIIa F e FcgRIIIa V de anticorpo hete- rodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 um de cujas cadeias H tem L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A e a outra cadeia H tem K326D/A330M/K334E é mais forte do que a atividade de anticorpo homodimerizado H240-Kn061/H240-Hl134/L73-k0 ambos cujas cadeias H e têm L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A anticorpo homodime- rizado H240-Kn132/H240-Hl071/L73-k0 ambos cujas cadeias H tem K326D/A330M/K334E. Nomeadamente, H240-Kn061/H240-Hl071/L73- k0 foi demonstrada para ter a característica de um anticorpo heterodi- merizado, que é o fato de reforçar a atividade de ligação de FcgR em comparação com anticorpos homodimerizados compreendendo cada cadeia H da mesma.

[00682] Em seguida, a atividade de ADCC de H240-Kn033/H240- Hl033/L73-k0, H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0, H240- afucosyl_G1d/L73-k0, e H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 foram com-paradas de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 9. Os resultados são resumidos na Figura. 34.

[00683] Os resultados mostrados na figura 34 demonstram que a atividade de ADCC exibe H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 significativamente mais forte, em comparação com H240-Kn033/H240- Hl033/L73-k0. Além disso, a atividade de ADCC foi mais forte do que a de H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 e H240-afucosyl_G1d/L73-k0 resultante da aplicação da técnica de reforço da atividade de ADCC existente. Nomeadamente, H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 foi demonstrado exibir atividade de ADCC mais forte do que a conseguida com a técnica de reforço da atividade de ADCC existente. [Exemplo 17] Preparação de outras variantes usando anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 como um molde e avaliação dos mesmos

[00684] H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 exibindo atividade de ADCC superior foi descoberto no Exemplo 16 acima. Para revelar outras variantes com uma atividade superior, um total de cerca de 420 tipos de variantes em que aminos ácidos nas posições 231-242 (numeração EU) foram substituídas por 18 tipos de aminoácidos exceto Cys e aminoácidos originais, em cada uma das cadeias H de H240- H240 e Kn061-Hl071 foram preparados utilizando H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0 como um modelo de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos foram avaliados para a ligação a cada FcgR. Especificamente, o valor de KD de cada variante foi calculado para cada um de FcgRI, FcgRIIA R, FcgRIIA H, FcgRIIb, FcgRIIIa F, e FcgRIIIa V de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 8, e o valor de KD do H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 para cada um dos FcgRI, FcgRIIA R, FcgRIIA H, FcgRIIb, FcgRIIIa F, e FcgRIIIa V foi dividido pelo valor de Kd obtido acima. O valor resultante foi definido como KD relativa, e utilizado como um indicador de avaliação. Especificamente, o grau de dobras alteradas no valor de KD de cada variante para cada FcgR ao tirar o valor de KD do H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 como 1 foi utilizado como um indicador de avaliação. Quando a KD relativa é maior, isso significa que a ligação da variante para cada FcgR é mais fortemente aumentada, em compa-ração com H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0.

[00685] Gráficos em que KDs relativas das respectivas variantes para FcgRI, FcgRIIA R, FcgRIIA H, FcgRIIb, FcgRIIIa F, ou FcgRIIIa V são mostrados nos eixos verticais e números de classificação ao organizar KDs relativa em ordem crescente que são mostradas no eixo horizontal são exibidos nas Figs. 35, 36, 37, 38, 39 e 40, respectivamente.

[00686] A partir do resultado da análise, as variantes que melhoram a ligação de qualquer um de, ou de vários FcgRIIA R, FcgRIIIa F, e FcgRIIIa V sem aumentar a ligação FcgRIIb em relação a H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 foram descobertas. As alterações e as cadeias H introduzidas com as alterações estão resumidas na Tabela 43 (alterações que melhoram a ligação de FcgRIIA R e FcgRIIIa sem au-mentar a ligação a FcgRIIb). Foram selecionadas alterações em que a KD relativa é 1 ou menos para FcgRIIb e o valor de KD relativa é 1.3 ou mais para qualquer um dos, ou vários de FcgRIIA R, FcgRIIIa F, e FcgRIIIa V. [Tabela 43]

[00687] Os valores apresentados na Tabela 43 acima indicam KD relativa de cada variante para cada FcgR.

[00688] As alterações têm o efeito de aumentar a ligação a FcgRIIA que desempenha um papel importante na atividade de ADCP e a ligação a FcgRIIIa que desempenha um papel importante na atividade de ADCC, sem aumentar a ligação a FcgRIIb, um FcgR inibidor. Assim, a atividade antitumoral mais forte pode ser esperada, uma vez que a introdução destas alterações aumenta as atividades ADCC e ADCP, sem aumentar a ação imunossupressora do anticorpo.

[00689] Além disso, as variantes que aumentam a ligação a FcgRIIA H e FcgRIIA R sem reduzir a relação de ligação a FcgRIIIa H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 foram descobertas. As alterações e as cadeias H introduzidas com as alterações estão resumidas na Tabela 44 (alterações que melhoram a ligação de FcgRIIA sem reduzir a ligação para FcgRIIIa). Foram selecionadas alterações em que a KD realtiva é de 0,7 ou mais para FcgRIIIa F e V FcgRIIIa e a KD relativa é de 1,5 ou mais para FcgRIIA H e R FcgRIIA. [Tabela 44]

[00690] Os valores apresentados na Tabela 44 acima indicam KD relativa de cada variante para cada FcgR.

[00691] As alterações para aumentar a ligação FcgRIIA que desempenha um papel importante na atividade de ADCP sem reduzir a ligação para FcgRIIIa que desempenha um papel importante na atividade de ADCC, e algumas das alterações para aumentar a ligação FcgRIIIa. Assim, uma atividade antitumoral mais forte pode ser esperada, introduzindo as alterações e, assim, aumentar ADCC e ADCP atividades, isto é ADCC ou atividade de ADCP.

[00692] Além disso, as variantes que reduzem a ligação de FcgRIIb sem reduzir a ligação para FcgRIIIa relação ao H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0 foram descobertas. As alterações e as cadeias H introduzidas com as alterações estão resumidas na Tabela 45 (alterações que reduzem a ligação de FcgRIIb, mantendo a ligação à FcgRIIIa). Foram selecionadas alterações em que a relação é de 1 KD ou mais para FcgRIIIa F e FcgRIIIa V e KD relativa é de 0,5 ou menos para FcgRIIb. [Tabela 45]

[00693] Os valores apresentados na Tabela 45 acima indicam KD relativa de cada variante para cada FcgR.

[00694] As alterações reduzir a ligação para FcgRIIb, um FcgR inibidor, sem reduzir a ligação para FcgRIIIa que desempenha um papel importante na atividade de ADCC. Assim, uma atividade antitumoral mais forte pode ser esperada, uma vez que a introdução das alterações reduzir ação imunossupressiva do anticorpo, sem reduzir a atividade de ADCC.

[00695] Além disso, uma vez que o anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 tem a funcionalidade de um anticorpo heterodimerizado que é que ele se liga mais fortemente a FcgR de an-ticorpos homodimerizados compreendendo cada cadeia H daí, as vari-antes obtidas por introdução das alterações em H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0 são pensados para ter a mesma característica de um anticorpo heterodimerizado. [Exemplo 18] Alterações que podem substituir as alterações in-troduzidas no anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0

[00696] Com base nos resultados mostrados nas Figs. 35, 36, 37, 38, 39, e 40, obtido no Exemplo 17, se ou não as alterações no anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 eram substituíveis com outras alterações foi avaliada. Aqui, "alteração substituíveis" refere-se a uma alteração, quando introduzida, resulta na ligação a FcgRIIIa F e FcgRIIIa V de 0,7 vezes ou mais, e a ligação a FcgRIIb de 1,3 vezes ou menos, em comparação com antes da introdução da alteração.

[00697] Em relação às variantes preparadas no Exemplo 17, foram introduzidas alterações em anticorpos nas posições dos aminoácidos 231-242 (numeração EU). No anticorpo heterodimerizado H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0, L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A foi introduzido na cadeia H H240-Kn061 e K326D/A330M/K334E foi intro-duzido na cadeia H H240-Hl071. Entre as alterações introduzidas na cadeia H H240-Kn061, se L234Y, L235Y, G236W e são substituíveis com outros aminoácidos pode ser avaliado com base nos resultados apresentados no Exemplo 17.

[00698] Os sítios de alteração incluir posições 234, 235 e 236 (nu-meração EU) em cadeia H-H240 Kn061, que é uma das cadeias H de H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0, mas não incluem os sítios de alteração introduzidas em cadeia H H240-Hl071, que é a outra cadeia H. Das variantes preparadas neste experimento, as introduzidas com alterações nas posições 234, 235 e 236 (numeração EU) na cadeia H- H240 Kn061, aqueles que têm uma ligação a FcgRIIIa F e FcgRIIIa V é de 0,7 vezes ou mais e uma ligação a FcgRIIb é 1,3 vezes ou menos, em comparação com H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 são pensados para ter uma atividade comparável ou superior ao H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0. Assim, as substituições sem reduzir as excelentes propriedades de anticorpos heterodimerizados H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 foram pensadas ser possíveis. Quanto às alterações que satisfaçam as condições descritas acima, as modificações e as cadeias H introduzidas com eles encontram-se resumidos na Tabela 46 (alterações que permitem reter a atividade comparável ou que confiram a uma atividade superior à da H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0). [Tabela 46]

[00699] Na Tabela 46 acima, "ALTERAÇÃO INTRODUZIDA NA CADEIA H" significa que cadeia H de H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 é substituível, e em "ALTERAÇÃO", um numeral representa um número de resíduos de acordo com a numeração EU, a primeira letra do alfabeto representa um aminoácido que corresponde a um número de resíduo indicado em H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0, e a última letra alfabética representa um aminoácido substituíveis.

[00700] A partir dos resultados, entre as alterações introduzidas na região constante de cadeia H de H240-Kn061, locais substituíveis e aminoácidos são resumidos como se mostra na Tabela 47 (locais de alteração em H240-Kn061, em que uma alteração pode ser substituído, mantendo a atividade aminoácidos, comparável ao do H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0, e substituíveis). [Tabela 47]

[00701] Na Tabela 47 mostrado acima, "POSIÇÃO ALTERADA" refere-se a um número de resíduos de acordo com a numeração EU em H240-Kn061 e "AMINOÁCIDO SUBSTITUÍDO" refere-se a um aminoáci- do, mesmo quando substituído nesse local com um aminoácido mostrada nesta tabela, permite ter a atividade semelhante à de H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0, isto é, um aminoácido que pode ser substituído.

[00702] Das alterações introduzidas, em relação H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 H268D e S298A de H240-Kn061 e K326D, A330M, e K334E de H240-Hl071, as alterações não foram introduzidas nos locais correspondentes no experimento descrito no Exemplo 17. Assim, a presença ou ausência da alteração de substituição nos locais acima descritos, também é discutida a seguir com base nos resultados apresentados no Exemplo 4. Especificamente, com base nos resultados apresentados no Exemplo 4, três alterações, o que resultou num valor He/Con_3aF de 130 ou mais e que exibiu o efeito mais forte nos locais, isto é, aqueles que mostraram uma prega de 1,3 ou mais, em comparação com aumento antes da introdução de alterações na He/Con_3aF como um indicador para a ligação a FcgRIIIa F num anti-corpo heterodimerizado apenas uma das cadeias H foram introduzidos com uma alteração, foram selecionados. Os resultados estão resumidos na Tabela 48 (sítios de alteração de alterações substituíveis com a alteração H268D, S298A, K326D, A330M, ou K334E de H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0; aminoácido substituído, e atividade de ligação FcgRIIIa F resultante). [Tabela 48]

[00703] Na Tabela 48 mostrado acima, "POSIÇÃO ALTERADA" refere-se a um número de resíduos de acordo com a numeração EU. "AMINOÁCIDO SUBSTITUÍVEL" refere-se aos três alterações que re-sulta em um 1,3 vezes ou mais aumento em comparação com antes da introdução de alterações na He/Con_3aF como um indicador para a ligação a FcgRIIIa F ligação, num anticorpo heterodimerizado em que uma alteração tinha foi introduzido em apenas uma cadeia H como descrito no Exemplo 4, e o qual apresenta o efeito mais forte para os sítios. "He/Con_3aF" é um valor definido no Exemplo 4.

[00704] Com base nos resultados apresentados na Tabela 48, os aminoácidos de substituição em cada local de alteração estão resumidos na Tabela 49 (sítios de alteração de substituição de alteração H268D, S298A, K326D, A330M, ou K334E na H240-Kn061/e H240- Hl071/L73-k0 aminoácidos substituíveis). [Tabela 49]

[00705] Com base na Tabela 49, mesmo que D de H268D é substituído por E ou A, em H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0, atividade comparável é pensada para ser conseguida. Da mesma forma, mesmo no caso de D de K326D é T ou I, ou mesmo quando de A330M M é P ou F, ou mesmo quando D de K334D é E ou I, atividade comparável é pensada para ser conseguida. Entretanto, como a S298A, não há alterações que é pensado para alcançar uma atividade comparável pode ser encontrada.

[00706] Além disso, uma vez que o anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 tem a funcionalidade de um anticorpo heterodimerizado que é que ele melhora a atividade de ligação para anticorpos do que FcgR homodimerizado compreendendo cada cadeia H daí, as variantes obtidas por introdução das alterações em H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 são pensadas para ter a mesma característica de anticorpo heterodimerizado. [Exemplo 19] Introdução de D270E em anticorpo hetero- dimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 e avaliação do mesmo.

[00707] Em seguida, para melhorar ainda mais H240- Kn061/H240-Hl071, os presentes inventores tentaram melhorar ainda mais a ligação da FcgRIIIa que é pensada para aumentar a atividade de ADCC e para reduzir ainda mais a ligação da FcgRIIb que é pensado para reduzir a atividade anti-tumor de um anticorpo através de imunossupressor sinais. Especificamente, D270E, uma alteração encontrada no Exemplo 4, o que melhora a ligação FcgRIIIa e reduz o ligação FcgRIIb, foi introduzido em ambas as cadeias H de H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0. As sequências obtidas através da introdução de D270E em H240 e H240-Kn061-Hl071 foram nomeados H240-Kn072 (SEQ ID N°: 90) e H240-HI076 (SEQ ID N°: 91), e foram combinados com L73-k0 para expressar e preparar o anticorpo heterodimerizado H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Junto com este anticorpo, H240- Kn033/H240-Hl033/L73-k0, H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0, H240- afucosyl_G1d/L73-k0 e H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 foram ensaiados para a atividade de ligação de cada FcgR de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 8. Os resultados estão resumidos na Tabela 50. [Tabela 50]

[00708] A Tabela 50 mostra que, similarmente ao H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0, H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 mais for-temente ligados aos FcgRIIIa F e FcgRIIIa V que H240-Kn032/H240- Hl032/L73-k0 e H240-afucosyl_G1d/L73-k0 resultante da aplicação da técnica de atividade de reforço de ADCC existente, e, além disso, obrigado mais fortemente do que H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0. A ligação de FcgRIIb H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 foi reduzido em relação aos dos H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 e H240- afucosyl_G1d/L73-k0 produzida pelo que aumenta a atividade de ADCC da técnica existente, e, além disso, foi reduzida em relação à de H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0.

[00709] Especificamente, uma vez que a introdução de D270E aumenta a ligação FcgRIIIa que aumenta a atividade de ADCC, uma atividade de ADCC mais forte é esperado, e uma vez que a ligação a FcgRIIb que transduz sinais imunossupressores é diminuída, espera- se redução na ação imunossupressiva do anticorpo. Assim, pensa-se que H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 exibem efeito antitumor, que é superior à da H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0.

[00710] Em seguida, a atividade de ADCC de H240-Kn072/H240- Hl076/L73-k0 foi comparado com os de H240-Kn061/H240-Hl071/L73- k0, H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0, e H240-afucosyl_G1d/L73-k0. Os resultados são mostrados na figura. 41.

[00711] Os resultados mostrados na figura. 41 demonstram que H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 exibe atividade de ADCC que é signi-ficativamente mais forte do que a de H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0. Além disso, a atividade de ADCC de H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 era mais forte do que a do anticorpo H240-afucosyl_G1d/L73-k0 afu- cosilado resultante da aplicação da técnica de atividade de reforço de ADCC existente, e é comparável à de H240-Kn061/H240-Hl071/L73- k0.

[00712] Estes resultados demonstram que o anticorpo heterodime- rizado H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 não só tem uma atividade de ADCC mais forte do que a conseguida pela técnica de reforço da atividade de ADCC já existente, mas também exibe ligação reduzida para FcgRIIb e, portanto, é mais excelente do que os anticorpos obtido pela técnica existente.

[00713] Além disso, uma vez que o anticorpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 tem a funcionalidade de um anticorpo heterodimerizado que é que ele se liga mais fortemente a FcgR de an-ticorpos homodimerizados compreendendo cada cadeia H daí, H240- Kn072/H240-Hl076/L73-k0 obtida introduzindo D270E em ambas as cadeias H de H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 é pensado para ter a mesma característica de anticorpo heterodimerizado. [Exemplo 20] Melhora adicional de anticorpo heterodimeri- zado H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0

[00714] Os presentes inventores tentaram melhorar H240- Kn072/H240-Hl076/L73-k0, que foi descoberto no Exemplo 19. Especificamente, H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 foi combinado com alterações Y234E, Y235N, Y235Q, S239M e que, quando introduzidas em H240-Kn061, adicionalmente, conferem propriedades superiores a H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 descoberto no Exemplo 18.

[00715] H240-Kn113 (SEQ ID N°: 92), resultante da introdução de Y234E e Y235N em H240-Kn072, H240-Kn115 (SEQ ID N°: 93), resultante da introdução de S239M em H240-Kn072, e H240-Kn125 (SEQ ID N°: 94), resultante da introdução de Y235Q e S239M em H240- Kn072 foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240- Kn115/H240-Hl076/L73-k0, e H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 foram preparados através da combinação de H240-Hl076 como uma cadeia H, L73-k0 como a cadeia L, e H240-Kn113, H240-Kn115, e H240- Kn125 como a outra cadeia H de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Aqueles descritos acima foram avaliados para a ligação a cada FcgR de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 8, juntamente com a IgG1 nativa H240- G1d/L73-k0, H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0 modificado daí utilizando knobs em holes, o anticorpo afucosilado H240-afucosyl_G1d/L73- k0 obtido pelo que aumenta a atividade de ADCC técnica existente, e o anticorpo homodimerizado H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 ambos cujas cadeias H foram introduzidos com uma atividade de ADCC que aumentam a alteração S239D/A330L/I332E. Os resultados estão resumidos na Tabela 51. [Tabela 51]

[00716] Quando comparado com H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0 mostrou comparável à ligação FcgRIIb, um FcgR inibidor, e aumento da ligação para FcgRIIIa F e FcgRIIIa V, que desempenham um papel importante na atividade de ADCC. Em relação à ligação a FcgRIIb, um FcgR inibidor, o grau de ligação era comparável, mesmo quando comparados com a IgG1 de anticorpo nativa. No que diz respeito ao FcgRIIIa, a ligação a FcgRIIIa F e FcgRIIIa V era mais reforçada do que o anticorpo afucosilado H240-afucosyl_G1d/L73-k0 obtido pela técnica de atividade de reforço de ADCC existente e anticorpo homodimerizado H240-Kn032/H240- Hl032/L73-k0 ambos cujas cadeias H foram introduzidas com alterações ADCC que aumentam a atividade S239D/A330L/I332E. Os resultados descritos acima indicam a possibilidade de que H240- Kn113/H240-Hl076/L73-k0 não aumenta as ações imunossupressoras como comparado com IgG1 nativa e exibe efeito antitumoral mais forte do que a do anticorpo afucosilado resultante da aplicação de ADCC de reforço da atividade de alteração existente e do anticorpo homodimeri- zado.

[00717] Quando comparado com H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0 mostraram aumento da ligação para FcgRIIIa F e FcgRIIIa V, as quais desempenham um papel importante na atividade de ADCC. Além disso, a ligação de FcgRIIA R e FcgRIIA H, que são importantes para a atividade de ADCP, foi mais reforçada do que a da IgG1 nativa H240-G1d/L73-k0, H240-Kn033/H240- Hl033/L73-k0 resultante da aplicação de knobs-into-furos para o efeito, o anticorpo afucosilado H240-afucosyl_G1d/L73-k0 obtida pela técnica de reforço da atividade de ADCC já existente, e que o anticorpo ho- modimerizado H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 ambos cujas cadeias H foram introduzidas com alterações de reforço de atividade de ADCC S239D/A330L/I332E.

[00718] Tal como acontece com H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 mostrou mais aumento da ligação para FcgRIIIa F e FcgRIIIa V, as quais desempenham um papel importante na atividade de ADCC, de H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0, mantendo a ligação a FcgRIIb, um FcgR inibidor, a um nível comparável ao de IgG1. H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 exibiram ligação melhorada a FcgRIIA H, um alótipo FcgRIIA bem como reduziu a ligação FcgRIIb e ligação melhorada a ambos os alótipos FcgRIIIa, em comparação com o anticorpo afucosilado H240- afucosyl_G1d/L73-k0 obtido pela ADCC que aumenta a atividade e a técnica de anticorpo homodimerizado H240-Kn032/H240-Hl032/L73- k0 ambos cujas cadeias H foram introduzidas com um intensificador de atividade de ADCC alteração S239D/A330L/I332E existente. Assim, H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 pode ser esperado para aumentar as atividades ADCP e ADCC e também reduzir as ações imunossupressoras mais fortemente do que o anticorpo homodime- rizado e afucosilado anticorpo resultante da aplicação daalteração de reforço de atividade de ADCC existente.

[00719] Em seguida, as atividades de ADCC de H240- Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0, e H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 foram comparadas com aquelas de H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0, e H240-afucosyl_G1d/L73-k0 e anticorpo afucosilado obtido pela técnica de atividade de reforço de ADCC existente. Os resultados são mostrados na figura. 42.

[00720] Como mostrado na Figura 42, todos os anticorpos hete- rodimerizados exibiu uma atividade de ADCC mais excelente do que o anticorpo afucosilado obtido pela técnica de atividade de reforço de ADCC existente.

[00721] Os perfis de ligação para cada FcgR e o resultado de comparação de atividade de ADCC com as tecnologias existentes demonstram que Y234E, Y235N, Y235Q, e S239M, que foram intro-duzidas em H240-Kn072 de H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0, são alterações que conferem H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 com outras características superiores.

[00722] Uma vez que o anticorpo heterodimerizado H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 tem a característica de um anticorpo que é heterodimerizado que se liga mais fortemente a FcgR de anticorpos homodimerizados compreendendo cada cadeia H daí, H240- Kn072/H240-Hl076/L73-k0 obtido através da introdução de D270E em ambas as cadeias H de H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 deverá ter a mesma característica de anticorpo heterodimerizado. Da mesma forma, H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn115/H240- Hl076/L73-k0 e H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 obtida através da introdução de novas alterações em H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 também são pensadas para ter a mesma característica de anticorpo heterodimerizado.

[Exemplo 21] Preparação de anticorpos heterodimerizados que apresentam ligação aumentada para FcgRIIA e FcgRIIIa

[00723] Com base no resultado mostrado no Exemplo 4, as variantes com cadeias H que exibem uma ligação aumentada ao FcgRIIA e FcgRIIIa foram preparadas. Especificamente, H240- Kn067 (SEQ ID N°: 95) foi produzido através da introdução de L234Y, L235Y, G236W, H268D, S298A, um A327D em H240-Kn033 (SEQ ID N°: 84), e H240-HI068 (SEQ ID N°: 96) foi produzido através da introdução de D270E, K326D, A330K, e K334E em H240- HI033 (SEQ ID N°: 85), de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Anticorpo heterodimerizado H240-Kn067/H240- Hl068/L73-k0 foi expresso pela combinação de H240-Kn067, H240- Hl068, e L73-k0 de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1.

[00724] Em primeiro lugar, se o anticorpo heterodimerizado H240- Kn067/H240-Hl068/L73-k0 tem a característica de um anticorpo he- terodimerizado que é aquela que aumenta a atividade de ligação para FcgR do que os anticorpos homodimerizados que compõem cada cadeia H daí foi avaliada. No H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0 anticorpo heterodimerizado, L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D foi introduzido H240- Kn067 como para uma cadeia H e D270E/K326D/A330K/K334E foi introduzido H240-Hl068 como a outra cadeia H. Em seguida, H240- HI136 (SEQ ID N°: 97), resultante de introdução de L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D em H240 e H240- Hl033-Kn133 (SEQ ID N°: 98), resultante da introdução de D270E/K326D/A330K/K334E em H240-Kn033 foram construídos de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Usando estes vetores de expressão, anticorpos homodimerizados H240- Kn067/H240-Hl136/L73-k0 ambos cujas cadeias H e têm L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D anticorpo homodimeri- zado H240-Kn113/H240-Hl068/L73-k0 ambos cujas cadeias H têm D270E/K326D/A330K/K334E foram expressas de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos e os anticorpos homodimerizados heterodimerizado H240-Kn067/H240- Hl068/L73-k0 um de cuja cadeia H tem L234Y/L235Y/G2- 36W/H268D/S298A/A327D e o outro de cuja cadeia H tem D270E/K326D/A330K/K334E foram ensaiados para a ligação a FcgRIIA H, FcgRIIA R, FcgRIIIaF, e FcgRIIIa V de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 8. Os resultados estão resumidos na Tabela 52. [Tabela 52]

[00725] Além disso, com base nesta variante, H240-Kn067/H240- Hl068/L73-k0 foi combinado com alterações Y235Q e S239M que, quando introduzidos H240-Kn061, conferem ainda mais H240- Kn061/H240-Hl071/L73-k0 com características superiores como descoberto no Exemplo 18. Especificamente, H240-Kn120 (SEQ ID N°: 99), resultante da introdução de S239M em H240 e H240-Kn067- Kn126 (SEQ ID N°: 100) resultante da introdução de Y235Q em H240-Kn120 foram preparados de acordo com o método descrito na referência Exemplo 1. H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0, e H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0 foram preparadOs combinando H240-Hl068 como para uma cadeia H e L73-k0 como a cadeia L com H240-Kn067, H240-Kn120, e H240- Kn126 como a outra cadeia H de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Aqueles acima descrito foram testados quanto à ligação a cada FcgR de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 8. Os resultados estão resumidos na Tabela 53. [Tabela 53]

[00726] Este resultado demonstra que H240-Kn067/H240- Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0, e H240-Kn126/H240- Hl068/L73-k0 todos exibem FcgRIIIa comparável ou aumento da ligação, em comparação com os reforçada-atividade anticorpos ADCC já existentes: H240-afucosyl_G1d/L73-k0 e H240-Kn032/H240- Hl032/L73-k0. Além disso, a ligação de FcgRIIA R e FcgRIIA H, os quais desempenham um papel importante na atividade de ADCP, foi aumentada em relação a cada uma das tecnologias existentes. A descoberta acima descrita sugere que todos os anticorpos heterodimeri- zados H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73- k0, e H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0 produzido aqui têm atividade de ADCC comparável ou mais forte e a atividade de ADCP superior em relação as obtidas pelas tecnologias existentes.

[00727] Em particular, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 exibiu ligação aumentada para FcgRIIA R e FcgRIIA H, mesmo quando comparado com o anticorpo homodimerizado H240-Kn037/H240-Hl036/L73- k0 ambos cujas cadeias H têm alterações G236A/S239D/I332E relatado para aumentar a ligação ao FcgRIIA R e FcgRIIA H, bem como para aumentar a atividade de ADCP. Especificamente, H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0 exibe mais ligação aumentada para FcgRIIIa F e FcgRIIIa V do que os anticorpos obtidos pelo que aumenta a atividade de ADCC técnica existente, e exposições mais ligação aumentada para FcgRIIA R e FcgRIIA H do que os anticorpos obtidos por a técnica de reforço da atividade de ADCP existente. Assim, H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0 é um anticorpo que pode ter mais forte ADCC e ADCP atividade do que os anticorpos obtidos pelas tecnologias existentes.

[00728] Em seguida, de acordo com o Exemplo de Referência 9, a atividade de ADCC de cada variante foi comparada com a do anticorpo H240-afucosyl_G1d/L73-k0 afucosilado obtida pela técnica de atividade de reforço de ADCC existente. O resultado é mostrado na Fi- gura 43.

[00729] O resultado mostrado na Figura 43 demonstra que todos os anticorpos produzidos heterodimerizado este tempo têm atividade de ADCC comparável ou superior ao do anticorpo afucosilado obtido pela técnica de atividade de reforço de ADCC existente.

[00730] Os perfis de ligação para cada FcgR e o resultado de comparação de atividade de ADCC com as tecnologias existentes demonstram que todos H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0, e H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0 preparado desta vez são anticorpos heterodimerizados que são altamente provável ter atividade de ADCC comparável ou superior ao obtido com o de aumento de atividade técnica ADCC existente, bem como o aumento da atividade de ADCP via de ligação a FcgRIIA.

[Exemplo 22] Avaliação de anticorpos heterodimerizados H240- AK072/H240-BH076/L73-k0 para a atividade de ligação de cada FcgR e atividade de ADCC

[00731] Acima, H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0, que é um anticorpo heterodimerizado resultante da aplicação de knobs em holes, foi avaliado quanto à sua ligação a cada FcgR e a atividade de ADCC. Aqui, se a funcionalidade de um anticorpo heterodimerizado que é um anticorpo que heterodimerizado compreendendo duas cadeias diferentes de H tem maior atividade de ligação a FcgR do que os anticorpos homodimerizados compreendendo cada cadeia H daí também é observada, mesmo quando se utiliza D356K, H435R, e K439E como alternativa heterodimerizado técnica de produção de anticorpos, foi avaliada.

[00732] Primeiro, H240-AK072 (SEQ ID N°: 104) foi construído através da introdução de L234Y/L235Y/G236W/H268D/D270E/S298A, uma alteração introduzida na H240-Kn072 que é uma cadeia H de H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0, em H240-A5E (SEQ ID N°: 102) re- sultante da introdução de D356K e H435R em H240-G1dE (SEQ ID N°: 101), que é um alótipo de H240-G1D (SEQ ID N°: 83). Em seguida, H240-BH076 (SEQ ID N°: 105) foi construído através da introdução de D270E/K326D/A330M/K334E, que foi introduzido em H240-Hl076 como a outra cadeia H, em H240-B3E (SEQ ID N°: 103), resultante do introdução de K439E em H240-G1dE. O anticorpo heterodimerizado H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 foi expresso e preparado por combinação de H240-AK072, H240-BH076, e L73-k0 de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Da mesma forma, H240-AK072 e L73-k0 e H240-BH076 e L73-k0 foram cada um combinados para expressar e preparar os anticorpos homodimerizados H240-AK072/L73-k0 e H240-BH076/L73-k0. Os anticorpos foram comparados quanto à ligação a cada FcgR de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 8. Os resultados estão resumidos na Tabela 54. [Tabela 54]

[00733] Os resultados descritos acima confirmam que o anticorpo heterodimerizado H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 tem a funcionalidade de um anticorpo heterodimerizado que é que ele se liga a FcgR mais fortemente do que os anticorpos homodiméricos H240- AK072/L73-k0 e H240-BH076/L73-k0 cada um dos quais compreende uma das cadeias H dos mesmos.

[00734] Em seguida, H240-A5E, H240-B3E, e L73-k0 foram combinados e expressos para preparar H240-A5E/H240-B3E/L73-k0 de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. H240- G1d/L73-k0, H240-A5E/H240-B3E/L73-k0, H240-afucosyl_G1d/L73- k0, e o anticorpo heterodimerizado H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 foram avaliados para a ligação a cada FcgR de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 8. Os resultados estão resumidos na Tabela 55. [Tabela 55]

[00735] Os resultados mostram que a ligação de H240- AK072/H240-BH076/L73-k0 para FcgRIIIa F e FcgRIIIa V foi melhorada em comparação com H240-G1d/L73-k0 e anticorpo afucosil H240- afucosyl_G1d/L73-k0 obtido com o existente técnica de atividade de reforço de ADCC. Enquanto isso, já que a atividade de ligação FcgR foi comparável entre H240-G1d/L73-k0 e H240-A5E/H240-B3E/L73-k0, a atividade de ligação aumentada de H240-AK072/H240-BH076/L73- k0 foi pensada para ser devido a alterações L234Y/L235Y/G236- W/H268D/D270E/S298A e D270E/K326D/A330M/K334E introduzido em cada cadeia H. [Exemplo 23] Análise da estrutura de cristal de raio X de um complexo de Fc (Kn120/Hl068) e região extracelular FcgRIIb

[00736] H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 produzido como descrito no Exemplo 21, não apena teve atividade de ligação aumentada para FcgRIIA e FcgRIIIa tipo H quanto para alótipo FcgRIIA tipo R mas também teve atividade de ligação aumentada ao FcgRIIb, um receptor inibidor. A ligação reforçada FcgRIIb é pensada causar efeitos imu- nossupressores. Assim, a redução da ligação a FcgRIIb seria capaz de conseguir um maior aumento da atividade de ADCC, que é um dos objetivos da presente invenção.

[00737] No entanto, 93% da sequência de aminoácidos da região extracelular da FcgRIIA FcgRIIb e fósforo, e são altamente homólogos entre si. Além disso, de acordo com uma análise baseada na estrutura cristalográfica (J. Imunol. De 2011, 187, 3208-3217), do complexo entre a Fc da IgG1 nativa (a seguir abreviado como Fc (WT)) e a região extracelular de FcgRIIA tipo R, perto interagindo faz interface entre as proteínas de ambas, apenas três aminoácidos (Gln127, Leu132, Phe160 e) em FcgRIIA tipo I foram diferentes quando comparados com FcgRIIb (Figura 44). Por esta razão, a previsão era de que era extremamente difícil de reduzir a atividade de ligação de FcgRIIb sozi- nha, mantendo a atividade de ligação ao FcgRIIA tipo R. Em seguida, os presentes inventores concebido que, se obtido informação sobre a estrutura cristalográfica do complexo entre a parte Fc (Fc (Kn120/Hl068)) da região extracelular H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 e FcgRIIb e investigaram as mutações de aminoácidos para ser introduzidas em mais detalhe, a possibilidade de revelar uma alteração que reduz seletivamente o atividade FcgRIIb vinculante seria aumentado. Assim, o complexo entre o Fe (Kn120/Hl068) ea região extracelular FcgRIIb foi analisado por análise da estrutura cristalina por raios-X.

[00738] Como resultado, os presentes inventores conseguiram determinar a estrutura tridimensional do complexo de Fe (Kn120/Hl068) região extracelular/FcgRIlb em 2,78 Â de resolução por análise da estrutura cristalina por raios-X. A estrutura obtida como um resultado da análise é mostrado na Figura 45. Região extracelular FcgRIIb foi revelada para ser amarrada e imprensada entre dois domínios CH2Fc, que lembra as estruturas tridimensionais dos complexos previamente analisadas entre Fc (WT) e as respectivas regiões extracelulares de FcgRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 2011, 108, 12669-126674), FcgRIIIb (Nature, 2000, 400, 267-273;. J. Biol Chem 2011, 276, 16469-16477) e FcgRIIA.

[00739] Em seguida, as estruturas de cerca de três resíduos de aminoácidos, que estão perto da interface de ligação a Fc e são diferentes entre o FcgRIIA tipo R e FcgRIIb, são descritos. Figura 46 mostra a estrutura em torno da Lys127 (Gln em FcgRIIA tipo I). O resíduo mais próximo em FcgRIIb é Ala na posição 298 (numeração EU) localizado no domínio CH2 B de Fc representado na Figura 46. Este resíduo está em contato direto com FcgRIIb na interface de ligação. Portanto, pensou-se que a introdução de qualquer resíduo volumoso capaz de interagir com Lys127 foi difícil. Outros resíduos de aminoácidos ao redor são muito distante de Lys127 e sem mutações capazes de interação direta poderia ser encontrado. Figura 47 mostra a estrutura em torno de Ser132 (Leu em FcgRIIA tipo I). Este resíduo também é muito distante da Fc, e sem mutações capazes de interação direta com este Ser poderia ser encontrado. Finalmente, a Figura 48 mostra a estrutura em torno Tyr160 (Phe em FcgRIIA tipo R). Este Tyr forma uma ligação de hidrogênio com o oxigênio da cadeia principal carbonila de Gly na posição 236 (numeração EU) no domínio CH2 A da Fc. Neste caso, a atividade de ligação de FcgRIIb sozinho pode ser reduzida através da introdução de uma mutação em Gly236 na posição 236 (numeração EU), se a mutação faz com que uma mudança de estrutura de malha e, assim, elimina a ligação de hidrogênio. Além disso, quando uma mutação com qualquer cadeia lateral volumosa é introduzida na posição de Gly na posição 236 (numeração EU), a cadeia lateral está previsto para interagir diretamente com a cadeia lateral na posição 160 em FcgRIIA ou FcgRIIb, e a atividade de ligação a FcgRIIb pode ser reduzida seletivamente usando a diferença entre Phe160 em FcgR2a tipo R e Tyr160 em FcgRIIb. Método experimental [Expressão e Purificação de Fc (Kn0120/Hl068)]

[00740] Uma Fc (Kn0120/Hl068) foi preparada como se segue. Primeiro, Cys na posição 220 (numeração EU) de H240-Kn120 (SEQ ID N°: 99) e H240-HI068 (SEQ ID N°: 96) foi substituído com Sor. Em seguida, a sequência genética de Fc (Kn0120) e Fc (Hl068) a partir de Glu na posição 236 (numeração EU) para o seu terminal C, foi clonada por PCR. Utilizando esta sequência genética clonada, a produção de vetores de expressão, e expressão e purificação de Fc (Kn0120) e Fc (Hl068) foram realizadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Cys na posição 220 (numeração EU) forma uma ligação de dissulfureto com Cis da cadeia L em geral a IgG1. A cadeia L não é coexpressa sozinha quando Fc é preparada, e, por conseguinte, este resíduo foi substituído com Ser para evitar a formação de pontes de dissulfeto desnecessárias. [Expressão e purificação da região extracelular de FcgRIIb]

[00741] Isto foi preparado de acordo com o método do Exemplo de Referência 8. [A purificação do complexo região extracelular Fc (Kn120/Hl068)/FcgRIIb]

[00742] A 1,5 mg da amostra de região extracelular FcgRIIb obtida por cristalização, 0,15 mg de Endo F1 (Protein Science 1996, 5: 26172622) expressa e purificada a partir de Escherichia coli como uma glu- tationa S-transferase da proteína de fusão foi adicionado. Este foi deixado permanecer à temperatura ambiente durante três dias em 0,1 M de tampão de Bis-Tris a pH 6,5, e o oligossacarídeo N-ligado foi clivado, deixando N-acetilglucosamina ligado a Asn diretamente. Em seguida, esta amostra de região extracelular FcgRIIb submetida a tratamento com carboidrato por clivagem foi concentrada por ultrafiltração com 10000 MWCO, e purificada por cromatografia de filtração em gel (Superdex200 10/300), utilizando uma coluna equilibrada em HEPES 20 mM a pH 7,5 contendo 0,1 M de NaCl. Além disso, para a fração da região extracelular FcYRIIb clivada em carboidrato obtido, Fc (Kn0120/Hl068) foi adicionado de modo que a razão molar da região extracelular da FcgRIIb estaria presente em ligeiro excesso, e, depois de concentração por ultrafiltração, com 10.000 MWCO, um amostra da Fc (Kn0120/Hl068)/complexo região extracelular FcgRIIb foi obtido através de purificação por cromatografia de filtração em gel (Super- dex200 10/300), utilizando uma coluna equilibrada em HEPES 25 mM a pH 7,5 contendo 0,1 M de NaCl. [Cristalização do complexo da região extracelular do complexo FcgRIIb/Fc (Kn120/Hl068)] Uma amostra do complexo de região extracelular Fc (Kn120/Hl068)/FcgRIIb foi concentrada para aproximadamente 10 mg/ml por ultrafiltração com 10.000 MWCO, e a cristalização foi realizada pelo método de gota suspensa de difusão de vapor em combinação com o método de propagação. Placa VDXm (Hampton Research) foi utilizado para a cristalização. Usando uma solução reservatório contendo 0,1 M de Bis-Tris (pH 6,0), 14,4% PEG3350, e 0,2 M de sulfato de amônio, gotas de cristalização foram preparadas a uma razão de mistura de solução reservatório: amostra cristalização = 0,85 μl: 0,85 μl. Em seguida, raia sementeira foi realizada utilizando ferramenta Sementeira (Hampton Research) para transferir os cristais de semente a partir dos cristais do complexo obtido sob as mesmas condições. As gotas foram deixadas repousar a 20°C. Isto produziu sucesso cristais colunares. [Medição de dados de difração de raios X de um Cristal de complexo de região extracelular Fc (Kn120/Hl068)/FcgRIIb]

[00743] Um dos cristais individuais obtidos de Fc (Kn120/Hl068)/complexo região extracelular FcgRIIb foi embebida em uma solução de 0,1 M de Bis-Tris pH 6,0, 17,5% PEG3350, 0,2 M de sulfato de amônio, 16% de glicerol (v/v). O cristal foi retirado da solução usando um broche com laço nylon pequeno anexo, e congelados em nitrogênio líquido e, em seguida, os dados de difração de raios X foi medida nas instalações radiação síncrotron Photon Fábrica BL-17A na Organização de Pesquisa do Acelerador de Alta Energia. Durante a medição, o cristal foi constantemente colocado em uma fluxo de nitrogênio a -178°C para manter em um estado congelado, e um total de 360 imagens de difração de raios X foram coletadas por meio de detector Quantum 315r CCD (ADSC) ligado a uma linha de feixe com rotação de 0,5° do cristal de cada vez. Determinação de parâmetros celulares, indexação de pontos de difração, e processamento de dados de difração a partir das imagens de difração obtidas foram realizados utilizando o programa Xia2 (J. Appl. Cryst. 2010, 43: 186-190), Pacote XDS (Acta. Cryst. 2010, D66: 125-132) and Scala (Acta. Cryst. 2006, D62: 72-82e, finalmente, os dados de intensidade de difração de até 2,78 Â de resolução foram obtidos. O cristal pertence ao grupo espacial P41212 e tem os seguintes parâmetros celulares, a = 152,94 Â, b = 152.94 Â, c = 82,24 A, α = 90°, β = 90°, Y = 90°. [Análise cristalográfica de Raio X do complexo região extracelular Fc (Kn120/Hl068)/FcgRIIb]

[00744] Estrutura cristalina de Fc (Kn120/Hl068)/complexo região extracelular de FcyRIIb foi determinada pelo método de substituição molecular, utilizando o programa Phaser ((J. Appl Cryst 2007, 40: 658674) a partir do tamanho do estrutura de cristal obtido e o peso molecular da Fc (Kn120/Hl068)/complexo região extracelular FcgRIIb, o número de complexos na unidade assimétrica foi previsto para ser um a partir das coordenadas estruturais de código PDB: 3SGJ que é a estrutura do cristal do complexo da região extracelular FcgRIIIa/Fc (WT), as porções de resíduos de aminoácidos das posições de cadeia A 239-340 e as posições da cadeia B 239-340 foram retiradas como coordenadas separadas, e elas foram usadas, respectivamente, como modelos para a pesquisa do Domínios CH2 Fc. As porções de resíduos de aminoácidos da posições de cadeia A 341-444 e as posições da cadeia B 341-443 foram retiradas como um único conjunto de coordenadas das mesmas coordenadas estruturais de código PDB: 3SGJ, e este foi utilizado como um modelo para pesquisar os domínios CH3 Fc. Finalmente, a partir das coordenadas estruturais de código PDB: 2FCB que é uma estrutura de cristal da região extracelular da FcgRIIb, as porções de resíduos de aminoácidos da posições de cadeia A 6-178 foram retiradas e usadas como um modelo para a busca na FcgRIIb. A orientação e posição de cada modelo de busca na rede do cristal foi determinada para o domínio CH2 da Fc, da região extracelular FcgRIIb, e domínio CH2 da Fc, com base na função de rotação e função de conversão para se obter o modelo inicial para o cristal estrutura da Fc (Kn120/Hl068)/complexo da região extracelular FcgRIIb. Quando refinamento de corpo rígido que move os dois domínios CH2 de Fc, os dois domínios CH3 de Fc, e a região extracelular da FcgRIIb foi realizada no modelo inicial obtido, o fator de fiabilidade cristalográfica, o valor de R tornou-se 41,4%, e o valor de R gratuito tornou-se de 42,6% para difração de dados de intensidade de 25 Â a 3,0 Â neste momento. Além disso, refinamento estrutural usando o REFMAC5 programa (Acta Cryst. de 2011, D67, 355-367), e revisão do modelo de observar os mapas de densidade eletrônica cujo coeficiente tem 2Fo-Fc ou Fo-Fc, que são calculados com base no fator determinado experimentalmente estrutural Fo, o fator Fc estrutural calculado ea fase calculada usando o modelo, foi realizada pelo programa coot (Acta Cryst 2010, D66: 486-501), e o refinamento do modelo foi realizado por repetição destes passos Finalmente, como resultado da incorporação de moléculas de água para o modelo com base nos mapas de densidade de elétrons que utilizam 2Fo.-Fc ou Fo-Fc como o coeficiente e o seguinte refinamento, o fator de fiabilidade cristalográfi- ca, os valores de I e o valor livre de R do modelo contendo 4964 átomos que não sejam hidrogênio ficou 22,8% e 27,7% para os dados de intensidade de difração de 24.274 a partir de 25 Â de 2,78 Â de resolução, respectivamente.

[00745] [Exemplo 24] Preparação de anticorpos mantendo a atividade de ligação FcgRIIaR ou tendo atividade de ligação FcgRIIaR aumentada, e atividade de ligação FcgRIIb reduzida

[00746] Variante H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 descoberta no Exemplo 21 tinha um aumento da atividade de ligação ao FcgRIIaR e FcgRIIaH que são importantes para a atividade de ADCP, e, além disso, a sua atividade de ligação ao FcgRIIb inibidor foi aumentada para cerca de 50 vezes mais do que nativo IgG1. A fim de conseguir uma elevada atividade de ADCP, é preferível reduzir a atividade de ligação ao FcgRIIb inibidor tanto quanto possível. Assim, os inventores da presente invenção procurou alterações que permitem a redução da atividade de ligação ao FcgRIIb, mantendo a atividade de ligação para ativar FcgRIIa R e FcgRIIA H. Conforme descrito no Exemplo 23, o resultado da análise cristalográfica do complexo entre a Fc da região extra- celular H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 e FcgRIIb mostrou que Tyr160 em FcgRIIb formada uma ligação de hidrogênio com o oxigênio principal cadeia de carbonila de Gly236 presente em CH 2 domínio A da Fc (Kn120/Hl068). Em FcgRIIaFcgRIIA R eH, a posição correspondente é ocupada por Phe160, e da interação acima descrita é provável que esteja presente. Isto sugere a possibilidade de que, se a interação ao Tyr160 em FcgRIIb pode ser eliminado através da introdução de uma alteração no Gly236, a atividade de ligação FcgRIIb pode ser reduzido, mantendo a atividade de ligação de FcgRIIA tipo R, isto é, a atividade de ligação de FcgRIIb pode ser seletivamente reduzida. Especificamente, os presentes inventores concebido que a interação de Y160 pode ser eliminado se a reversão de G236 e alteração da estrutura de loop foi introduzida por substituição Ser, Vai, Lie, ou Thr para G236, da cadeia H derivado do H240-Hl068 que interage com Y160 de FcgRIIb na ligação entre FcgRIIb e H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0. Enquanto isso, apesar de distante, Lys127 de FcgRIIb pode estar em interação eletrostática com E294 de domínio CH2 A da Fc (Kn120/Hl068). Assim, os presentes inventores consideraram a possibilidade de que a interação com FcgRIIb pode ser reduzida através da indução de repulsão eletrostática substituindo E294 com carregado positivamente Lys ou Arg.

[00747] H240-Kn179 (SEQ ID N°: 107) e H240-Kn180 (SEQ ID N°: 108) resultante da introdução de cada uma das E294R e E294K em H240-Kn120 (SEQ ID N°: 99), e H240-HI073 (SEQ ID N°: 109), H240- HI085 (SEQ ID N°: 110), H240-HI086 (SEQ ID N°: 111), e H240-HI089 (SEQ ID N°: 112) resultante da introdução de cada uma das G236S, G236V, G236I, e G236T em H240-Hl068 (SEQ ID N°: 96), foram pre-parados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl085/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl086/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl089/L73-k0, H240-Kn179/H240-Hl068/L73-k0, e H240-Kn180/H240-Hl068/L73-k0 foram preparadas através da combinação de cada um dos H240-H240 e Kn120-Kn180 como uma cadeia H, L73-k0 como a cadeia L, e H240- Hl073, H240-Hl085, H240-Hl086, e H240-Hl089 como a outra cadeia H de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. As variantes descritas acima foram avaliadas quanto à sua ligação a FcgR de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 8. Os resultados são mostrados na Tabela 56. A KD cinza sombreada de H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0 na tabela foi calculada com base no pressuposto de que kd é de 5 x 10-5 s-1 ou menos, porque o valor de kd para FcgRIa foi menor do que o limite de medição de 5 x 10-5 s-1 para fora do intervalo de medição de 5 x 10-5 s-1 a 1 s-1 para a constante de dissociação (kd) em Biacore4000 usado no ensaio. [Tabela 56]

[00748] Além disso, os valores obtidos dividindo KD de H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para cada um dos FcgRIIaR, FcgRIIaH, e FcgRIIb por KD de cada variante, a KD relativa determinada quando tomada, como 1, a KD do H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para FcgRIIaR, FcgRIIaH, ou FcgRIIb são mostradas na Tabela 57. [Tabela 57]

[00749] Os resultados demonstram que todos os seis tipos de alterações produzidas por esta avaliação mantiveram ou aumentaram a atividade de ligação ao FcgRIIa R e FcgRIIA H e reduziu a atividade de ligação FcgRIIb em comparação com H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0.

[00750] Em seguida, as alterações examinadas na Tabela 57 foram combinadas para reduzir ainda mais a atividade de ligação ao FcgRIIb. Neste experimento, os presentes inventores teve como objetivo reprimir ainda mais a atividade de FcgRIIb com o uso combinado de introdução de E294K ou E294R em H240-Kn120 e introdução de G236T em H240-Hl068. Como mostrado na Tabela 57, todas as alterações de reduzir as atividades de ligação ao FcgRIIIa F e FcgRIIIa V. Em seguida, para além destas alterações, I332E que tem sido relatado para aumentar a atividade de ligação ao FcgRIIIa e o Y235N alteração que aumenta a atividade de ligação FcgRIIIa, tal como descrito no Exemplo 18 foram introduzidos, em um fim de suprimir ainda mais a atividade de ligação de FcgRIIb e aumentar a atividade de ligação ao FcgRIIIa.

[00751] H240-Kn192 (SEQ ID N°: 113) resultante da introdução de Y235N e E294K em H240-Kn120 (SEQ ID N°: 99), H240-Kn193 (SEQ ID N°: 114) resultante da introdução de Y235N e E294R em H240- Kn120 (SEQ ID N°: 99), e H240-HI204 (SEQ ID N°: 115) resultante da introdução de G236T e I332E em H240-HI068 (SEQ ID N°: 96) foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referên- cia 1. H240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0, H240-Kn180/H240-Hl089/L73- k0, H240-Kn192/H240-Hl204/L73-k0, e foram preparados H240- Kn193/H240-Hl204/L73-k0 combinando cada um dos H240-H240 e Kn192-Kn193 como uma cadeia H, L73-k0 como a cadeia L, e H240- H240 e Hl089-Hl204 como a outra cadeia H de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. As variantes descritas acima foram avaliadas quanto à sua ligação a FCYR de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 8. O resultado é apresentado na Tabela 58. A KD cinza sombreada de H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0 na tabela foi calculada com base no pressuposto de que kd é de 5 x 10-5 s-1 ou menos, porque o valor de kd para FcyRIa foi menor do que o limite de medição de 5 x 10-5 s-1 para fora do intervalo de medição de 5 x 10-5 s-1 a 1 s-1 para a constante de dissociação (kd) em Biaco- re4000 usado no ensaio. [Tabela 58]

[00752] Além disso, os valores obtidos dividindo KD de H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para cada um dos FcgRIIaR, FcgRIIaH, e FcgRIIb por KD de cada variante, a KD relativa determinada quando tomada, como 1, a KD do H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para FcgRIIaR, FcgRIIaH, ou FcgRIIb é mostrada na Tabela 59. [Tabela 59]

[00753] H240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0 e H240-Kn180/H240- Hl089/L73-k0, resultante da introdução de E294K ou E294R em H240- Kn120 e introdução de G236T em H240-Hl068, ambos exibiram aumento da ligação à FcgRIIa R e FcgRIIA H em comparação com H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0, enquanto a sua ligação FcgRIIb foi reduzida para 0,4 vezes mais do que H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0. Além disso, o efeito de reduzir a ligação FcgRIIb foi de 1,5 vezes para o dobro, quando comparado com H240-Kn120/H240-Hl089/L73-k0, H240-Kn179/H240-Hl068/L73-k0, e H240-Kn180/H240-Hl068/L73-k0, apenas uma de cujas cadeias tem cada alteração.

[00754] H240-Kn192/H240-Hl204/L73-k0 e H240-Kn193/H240- Hl204/L73-k0 resultante da introdução de I332E e Y235N no acima vari-antes ambos mantiveram a ligação a FcgRIIaR, FcgRIIaH e FcgRIIb e aumentou a ligação FcgRIIIaF e FcgRIIIaV em duas vezes e oito vezes, respectivamente, em comparação com H240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0 e H240-Kn180/H240-Hl089/L73-k0 antes da introdução das alterações.

[00755] [Exemplo 25] Aumento da atividade de ligação do anticorpo Heterodimerizado H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para ativar FcgR

[00756] No Exemplo 24, variantes tendo atividade de ligação reduzida para o FcgRIIb inibidor, mantendo ou melhorando a ligação para FcgRIIa R e FcgRIIA H foram produzidas através da introdução de al-terações em H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0. Neste exame, os presentes inventores tentaram aumentar a atividade de ligação para FcgRs ativando: FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIIaF e FcgRIIIaV.

[00757] H240-Kn138 (SEQ ID N°: 116) resultante da introdução de L328W em H240-Kn120; H240-Kn173 (SEQ ID N°: 117) resultante da introdução de I332Q em H240-Kn120; H240-Kn178 (SEQ ID N°: 118) resultante da introdução de K334Y em H240-Kn120; H240-Kn166 (SEQ ID N°: 119) resultante da introdução de L328A em H240-Kn120; H240-Kn172 (SEQ ID N°: 120) resultante da introdução de I332M em H240-Kn120; e H240-Kn149 (SEQ ID N°: 121) resultante da introdução de L328W e K334L em H240-Kn120 foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Além disso, H240- Hl147 (SEQ ID N°: 122) resultante da introdução de L328W em H240- Hl068; H240-Hl170 (SEQ ID N°: 123) resultante da introdução de L328A em H240-Hl068; H240-Hl174 (SEQ ID N°: 124) resultante da introdução de I332E em H240-Hl068; H240-Hl150 (SEQ ID N°: 125) resultante da introdução de I332T em H240-Hl068; H240-Hl182 (SEQ ID N°: 126) resultante da introdução de A231H em H240-Hl068 e H240-Hl177 (SEQ ID N°: 127) resultante da introdução de I332Q em H240-Hl068 foram preparadas como a outra cadeia H. H240- Kn120/H240-Hl170/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl150/L73-k0, H240- Kn138/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl174/L73-k0, H240- Kn173/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn178/H240-Hl068/L73-k0, H240- Kn120/H240-Hl182/L73-k0, H240-Kn138/H240-Hl147/L73-k0, H240- Kn166/H240-Hl170/L73-k0, H240-Kn172/H240-Hl177/L73-k0, e H240- Kn149/H240-Hl068/L73-k0 foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1, utilizando L73-k0 (SEQ ID N°: 106), como a cadeia L, H240-Kn138 (SEQ ID N°: 116), H240-Kn173 (SEQ ID N°: 117), H240-Kn178 (SEQ ID N°: 118), H240-Kn149 (SEQ ID N°: 121), H240-Kn166 (SEQ ID N°: 119), e H240-Kn172 (SEQ ID N°: 120) na forma de uma cadeia H, e H240-HI170 (SEQ ID N°: 123), H240-HI150 (SEQ ID N°: 125), H240-Hl174 (SEQ ID N°: 124), H240- HI182 (SEQ ID N°: 126), H240-HI147 (SEQ ID N°: 122), e H240-HI177 (SEQ ID N°: 127) como a outra cadeia H. Estas variantes foram analisadas quanto à Iigação a FcgR de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 8. Os resultados são mostrados na Tabela 60. [Tabela 60]

[00758] Além disso, os valores obtidos pela divisão de KD H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para cada um dos FcgRIa FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIA F, e FcgRIIIa V pela KD de cada variante, a KD relativa determinada quando tomada, como 1, KD de H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para cada um dos FcgRIIaR, FcgRIIaH, e

[00759] As variantes apresentadas nesta tabela exibem ligação aumentada para, pelo menos, um de FcgRs de FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIIaF, e FcgRIIIaV em comparação com H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0.

[00760] H240-Kn120/H240-Hl170/L73-k0 resultante da introdução de L328A em H240-Hl068 que é uma cadeia H de H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0 tem atividades FcgRIIaH vinculativos FcgRIIaR-e aumentou para 2,3 vezes como em comparação com H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0.

[00761] H240-Kn120/H240-Hl150/L73-k0 resultante da introdução de I332T em H240-Hl068 que é uma cadeia H de H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0 tem atividade FcgRIIaH de ligação aumentou em 1,2 vez a de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 mantendo a atividade de ligação FcgRIIaR.

[00762] H240-Kn138/H240-Hl068/L73-k0 resultante da introdução de L328W em H240-Kn120 que é uma cadeia H de H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tem atividade FcgRIIaH de ligação aumentou em 1,6 vezes a de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0, mantendo a atividade de ligação FcgRIIaR.

[00763] H240-Kn120/H240-Hl174/L73-k0 resultante da introdução de I332E em H240-Hl068 que é uma cadeia H de H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0 tem atividade FcgRIIIaF de ligação aumentou 4,3 vezes e FcgRIIIaV vinculativo atividade aumentada para 10 vezes, em comparação com H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0.

[00764] H240-Kn173/H240-Hl068/L73-k0 resultante da introdução de I332Q em H240-Kn120 que é uma cadeia H de H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0 tem atividade FcgRIIIaF de ligação aumentou em 1,2 vez a de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 mantendo a atividade FcgRIIIaV vinculativo.

[00765] H240-Kn178/H240-Hl068/L73-k0 resultante da introdução de K334Y em H240-Kn120 que é uma cadeia H de H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0 tem atividade FcgRIIIaF de ligação aumentou 1,6 vezes e FcgRIIIaV vinculativo atividade aumentada de 1,9 vezes em relação ao H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0.

[00766] H240-Kn120/H240-Hl182/L73-k0 resultante da introdução de A231H em H240-Hl068 que é uma cadeia H de H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0 tem atividade de ligação a FcgRIIIaV aumentou 1,2 vez quando comparado com H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0.

[00767] H240-Kn138/H240-Hl147/L73-k0 resultante da introdução de L328W em ambas as cadeias H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73- k0 tem atividade de ligação FcgRIIaR aumentou 1,8 vezes, em comparação com H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0.

[00768] H240-Kn166/H240-Hl170/L73-k0 resultante da introdução de L328A em ambas as cadeias H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tem atividade FcgRIIaH de ligação aumentou 1,9 vezes, em comparação com H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0.

[00769] H240-Kn172/H240-Hl177/L73-k0 resultante da introdução de I332M em H240-Kn120 que é uma cadeia H de H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0 e introdução de I332Q em H240-Hl068 que é o outro H cadeia tem atividade FcgRIIIaV de ligação aumentou 1,6 vezes mais do que H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 mantendo a atividade FcgRIIIaF vinculativo.

[00770] H240-Kn149/H240-Hl068/L73-k0 resultante da introdução de L328W e K334L em H240-Kn120 que é uma cadeia H de H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tem atividade FcgRIIaH de ligação aumentou para 1,6 vezes mais do que H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 mantendo as atividades de ligação para FcgRIIaR e FcgRIIIaV.

[00771] Os resultados descritos acima indicam que as variantes têm atividade de ADCP ou de ADCC forte em comparação com H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0.

[Exemplo 26] Preparação de anticorpo heterodimerizado com atividade de ligação de FcgRIIb aumentada

[00772] Nos seres humanos, FcYRIa (CD64A), FcYRIIa (CD32A), FcYRIIb (CD32B), FcYRIIIa (CD16A), e FcYRIIIb (CD16B) foram relatados como isoformas da proteína FcYR humano família, e as suas alóti- pos também têm sido relatados (Immunol Lett, 82 (1-2), 57-65, 2002). FcYRIa FcYRIIa e FcYRIIIa ter immunoativating funções, e são chamados de FcYR de ativação, enquanto FcYRIIb tem funções imunossu- pressores, e é chamado de inibição FcYR (Nat Rev Immunol, 10, 328343, 2010).

[00773] FcYRIIb é o único FcYR expressa nas células B (Eur J Immunol 19, 1379-1385, 1989). A interação da região Fc de anticorpo com FcYRIIb foi reportado para suprimir a resposta imune primária de células B (J. Exp. Med. 129, 1183-1201, 1969). Além disso, é relatado que quando FcYRIIb em células B e um receptor de células B (BCR) são reticulados por meio de um complexo imunológico, em sangue, a ativação da célula B é suprimida, e a produção de anticorpos pelas células B é suprimida (Immunol Lett 88, 157-161, 2003). Neste trans- dução de sinal mediada por imunossupressores BCR e FcYRIIb, o motivo de inibição à base de tirosina imunorreceptor (ITIM) contida no domínio intracelular de FcYRIIb é necessário (Science, 256, 1808 1812, 1992; Nature, 368, 70-73, 1994). Quando ITIM é fosforilada mediante sinalização, SH2 contendo polifosfato inositol 5-fosfatase (SHIP) é recrutado, transdução de outras cascatas de sinalização de FcYR de ativação é inibida, e a resposta imune inflamatória é suprimida (Science, 290, 84-89, 2000). Além disso, a agregação de FcgRIIb sozinho foi reportado para suprimir transitoriamente o influxo de cálcio devido à reticulação de BCR e proliferação de células B de um modo independente de BCR sem induzir a apoptose de células produtoras de IgM-B (J Imunol, 181, 5350-5359, 2008).

[00774] Além disso, FcYRIIb também é expresso em células dendrí- ticas, macrófagos, neutrófilos ativados, mastócitos e basófilos. FcYRIIb inibe as funções de FcYR de ativação tais como fagocitose e liberação de citocinas inflamatórias nestas células, e suprime a resposta imune inflamatória (Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010).

[00775] A importância das funções de imunossupressores da FcYRIIb foi elucidado até o momento através de estudos utilizando camundongos knockout FcYRIIb. Há relatos de que em camundongos knockout FcYRIIb, a imunidade humoral não é adequadamente regulada (J Immunol, 163, 618-622, 1999), a sensibilidade para com artrite induzida por colágeno (CIA) é aumentada (J Exp. Med., 189, 187-194, 1999), sintomas de lúpus semelhantes são apresentados, e os sintomas tipo síndrome de Goodpasture são apresentados (J. Exp. Med., 191, 899-906, 2000).

[00776] Além disso, insuficiência regulamentar de FcYRIIb tem sido relatado como sendo relacionado a doenças autoimune humana. Por exemplo, a relação entre o polimorfismo genético na região transmem- branar e a Região do promotor de FcYRIIb, e a frequência de desen-volvimento de lúpus sistêmico eritematoso (LES) (Hum, Genet, 117, 220-227, 2005; J Biol Chem, 282, 1738-1746, 2007; Arthritis Rheum, 54, 3908-3917, 2006; Nat. Med., 11, 1056-1058, 2005, J Immunol, 176, 5321-5328, 2006), e redução da expressão de FcYRIIb na superfície de células B em pacientes com LES (J Exp. Med., 203, 2157-2164, 2006;. J Immunol 178, 3272-3280, 2007) têm sido relatados.

[00777] A partir de modelos de camundongo e os resultados clínicos, tais como, FcYRIIb é considerado desempenhar o papel de controlar as doenças autoimunes e de doenças inflamatórias, principalmente por meio do envolvimento com as células B, e é uma molécula alvo promissora para o controle de doenças autoimunes e doenças inflamatórias.

[00778] IgG1, utilizado principalmente como um produto farmacêutico de anticorpo disponível comercialmente, é conhecido por se ligar não só a FcYRIIb, mas também para ativar fortemente FCYR (Blood, 113, 3716-3725, 2009). Pode ser possível desenvolver fármacos que têm maiores propriedades de anticorpos imunossupressores em comparação com os da IgG1, por utilização de uma região Fc com ligação FcYRIIb melhorada, ou seletividade de ligação FcYRIIb melhorada em comparação com a atividade de ativação de FcYR. Por exemplo, tem sido sugerido que a utilização de um anticorpo possuindo uma região variável que se liga a BCR e uma Fc com ligação FcYRIIb melhorada pode inibir a ativação das células B (Mol. Immunol, 45, 3926-3933, 2008). Tem sido relatado que a reticulação de FcYRIIb em células B e de IgE ligadas a um receptor de células B suprime a diferenciação das células B em células de plasma, que, como resultado determina supressão da produção de IgE, e em camundongos transplantados com CMSP humanos, IgG humana e concentração de IgM são mantidos enquanto a concentração de IgE humana é reduzida (Acad Notícias, doi: 10,1016, jaci.2011.11.029). Além de IgE, tem sido relatado que, quando FcgRIIB e CD79b formando um complexo do receptor de células B são reticulados por um anticorpo, proliferação de células B é suprimida in vitro, e os sintomas são aliviados em modelo de artrite de colágeno (Arthritis Rheum, 62, 1933-1943, 2010).

[00779] Além de células B, tem sido relatado que a reticulação de FcεRI e FcgRIIb em mastócitos utilizando moléculas, em que a porção Fc de uma IgG com ligação FcgRIIb melhorada é fundida com a porção Fc de IgE que se liga a um receptor IgE de IgEεRI, provoca fosfori- lação de FcgRIIb, suprimindo assim influxo de cálcio dependente de FcεRI. Isto sugere que a inibição da degranulação via estimulação FcgRIIb é possível através de ligação FcgRIIb melhorada (Immunol let, doi: 10.1016/j.imlet.2012.01.008).

[00780] Por conseguinte, um anticorpo possuindo uma Fc com atividade de ligação FcYRIIb melhorada é sugerido para ser promissor como um agente terapêutico para as doenças inflamatórias, tais como doenças autoimunes.

[00781] Além disso, os mutantes com ligação FcgRIIb melhorada têm sido sugeridos para ser promissores agentes terapêuticos para o câncer, bem como agentes terapêuticos para doenças inflamatórias, tais como doenças autoimunes. Até agora, FcgRIIb foi encontrado para desempenhar um papel importante na atividade agonista de anticorpos agonistas contra a família do receptor anti-TNF. Especificamente, foi sugerido que a interação com FcgRIIb é necessária para a atividade agonista de anticorpos contra CD40, DR4, DR5, CD30, CD137 e, os quais estão incluídos na família de receptores de TNF (Science, 333, 1030-1034, 2011; Cancer Cell 19, 101-1113, 2011, J Clin Invest 2012, doi: 10.1172/JCI61226, J Immunol 171, 562-, 2003; Blood, 108, 705-, 2006, J Immunol 166, 4891, 2001). Documento sem patente (Science, 333, 1030-1034, 2011) mostra que a utilização de anticorpos com ligação FcgRIIb melhorada aumenta o efeito antitumoral dos anticorpos anti-CD40. Deste modo, espera-se que os anticorpos com FcgRIIb melhorada tenham um efeito de atividade agonista melhorada de anticorpos agonistas, incluindo anticorpos contra a família de receptores de anti-TNF.

[00782] Anticorpos com uma Fc com atividade ligação FcYRIIb melhorada foram relatados (Mol Immunol, 45, 3926-3933, 2008). Neste documento, atividade de ligação FcYRIIb foi melhorada com a adição de alterações como S267E/L328F, G236D/S267E e S239D/S267E a uma região Fc de anticorpos. No documento, o anticorpo introduzido com a mutação S267E/L328F se liga mais fortemente a FcYRIIb. Por conseguinte, através do reforço de FcYRIIb de ligação, esperava-se que a função acima descrita mediada por FcYRIIb pode ser melhorada.

[00783] Além disso, os anticorpos apresentando mutação S267E/L328E mantém o mesmo nível de ligação a FcYRIa e FcYRIIa tipo H como o de uma IgG1 que ocorrem naturalmente. No entanto, um outro relatório mostra que esta alteração aumenta a para FcYRIIa tipo R várias centenas de vezes a ligação para o mesmo nível de ligação FcYRIIb, o que significa que a seletividade de ligação FcY RIIb não é melhorada em comparação com o FcYRIIa tipo R (Eur J Immunol 23, 1098-1104, 1993).

[00784] Mesmo se ligação FcYRIIb foi aumentada em comparação com a de IgG1, apenas o efeito de aumentar a ligação de FcYRIIa e não o acessório de ligação FcYRIIb é considerado como tendo influência sobre as células, tais como as plaquetas que expressam FcYRIIa mas fazer não expressam FcYRIIb (Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010). Por exemplo, o grupo de pacientes que foram administradas bevacizumab, um anticorpo contra VEGF, é conhecido por ter um risco aumentado de tromboembolismo (J Natl Cancer Inst, 99, 1232-1239, 2007). Além disso, o tromboembolismo tem sido observado de um modo semelhante em testes clínicos de desenvolvimento de anticorpos contra o ligando de CD40, e o estudo clínico foi descontinuado (Arthritis Rheum, 48, 719-727, 2003). Em ambos os casos destes anticorpos, estudos posteriores com modelos animais e tal sugeriram que os anticorpos administrados agregam plaquetas via ligações FcgRIIA nas plaquetas e formam de coágulos de sangue (J Thromb Haemost, 7, 171-181, 2008, J Immunol, 185, 1577-1583, 2010). No lúpus erite- matoso sistêmico que é uma doença autoimune, as plaquetas são ativadas através de um mecanismo dependente de FcYRIIa e ativação plaquetária tem sido relatada para correlacionar com a gravidade dos sintomas (Sci Transl Med, Vol. 2, Edição 47, 47-63, 2010). Mesmo que a ligação FcgRIIb seja melhorada, a administração de um anticorpo com a ligação FcgRIIA melhorada para esses pacientes que já têm um alto risco de desenvolvimento de tromboembolismo irá aumentar o risco de desenvolvimento de tromboembolismo, assim, é extremamente perigoso.

[00785] Além disso, os anticorpos com ligação FcgRIIA melhorada têm sido relatados para aumentar fagocitose celular mediada por ma- crófagos dependente de anticorpo (ADCP) (Mol. Câncer Ther 7, 25172527, 2008). Quando os antígenos do anticorpo são fagocitados pelos macrófagos, os anticorpos são eles próprios também fagocitados ao mesmo tempo. Nesse caso, os fragmentos peptídicos derivados desses anticorpos são também apresentados como um antígeno e a anti- genicidade pode tornar-se mais elevada, aumentando assim o risco de produção de anticorpos contra os anticorpos (anti-anticorpos). Mais especificamente, aumentando a ligação FcgRIIA irá aumentar o risco de produção de anticorpos contra os anticorpos, e isto irá diminuir notavelmente o seu valor como agentes farmacêuticos.

[00786] Mais especificamente, o valor como produtos farmacêuticos serão consideravelmente reduzida quando FcgRIIA ligação é aumentada, o que conduz a um aumento do risco de formação de trombos através da agregação de plaquetas, antigenicidade mais elevada, e um risco aumentado da produção de anti-anticorpo.

[00787] A partir de um tal ponto de vista, a Fc acima mencionada com ligação FcgRIIb melhorada mostra FcgRIIA tipo R notavelmente aumentada comparada com aquele de uma IgG1 de ocorrência natural. Portanto, o seu valor como um produto farmacêutico para pacientes portadores de FcgRIIA tipo R é consideravelmente reduzido. FcYRIIa tipos H e R são observados em caucasianos e afro- americanos, com aproximadamente a mesma frequência (J Clin Invest, 97, 1348-1354, 1996; Arthritis Rheum, 41, 1181-1189, 1998). Portanto, quando essa Fc foi utilizada para o tratamento de doenças autoimu- nes, o número de pacientes que podem utilizá-la com segurança, en- quanto se desfruta de seus efeitos como um produto farmacêutico será limitado.

[00788] Além disso, em células dendríticas deficientes em FcgRIIb ou células dendríticas em que a interação entre FcgRIIb e a porção Fc de anticorpo é inibida por um anticorpo anti-FcgRIIb, as células dendrí- ticas foram relatadas para amadurecer espontaneamente (J Clin Invest 115, 2914-2923, 2005; Proc Natl. Acad. Sci. EUA, 102, 2910-2915, 2005). Este relatório sugere que FcgRIIb está suprimindo ativamente maturação das células dendríticas em um estado de equilíbrio em que a inflamação e tal, não estão ocorrendo. FcgRIIA é expressa na superfície de células dendríticas, para além FcgRIIb e, portanto, mesmo que a ligação FcgRIIb inibidor é melhorada e se a ligação para ativação FcgR como FcgRIIA também é aumentada, a maturação das células dendríticas pode ser promovido como um resultado. Mais especificamente, não só melhorar a atividade de ligação FcgRIIb, mas também a relação de FcgRIIb-atividade de ligação em relação à atividade de ligação ao FcgRIIA é considerado importante no fornecimento de anticorpos com uma ação imunossupressora.

[00789] Portanto, quando se considera a produção de produtos farmacêuticos, que utilizam a ligação mediada pelo FcgRIIb-ação imu- nossupressora, existe uma necessidade para um Fc que não só tem uma atividade melhorada ligação FcgRIIb, mas também a ligação a ambos FcgRIIA, tipos H e alótipos R, que é mantida a um nível semelhante ou é enfraquecido a um nível mais baixo do que o de uma IgG1 de ocorrência natural.

[00790] Enquanto isso, os casos em que as alterações de aminoá- cidos foram introduzidas na região Fc para aumentar a seletividade de ligação de FcYRIIb foram relatados até agora (Mol. Immunol, 40, 585593, 2003). No entanto, todas as variantes de dito ter melhorado FcYRIIb seletividade como relatado no presente documento demons- traram diminuição FcYRIIb de ligação em comparação com a de uma IgG1 de ocorrência natural. Portanto, considera-se ser difícil para essas variantes para realmente induzir uma reação imunossupressora FcYRIIb mediada mais fortemente do que IgG1.

[00791] Além disso, uma vez que FcgRIIb desempenha um papel importante nos anticorpos agonistas mencionados acima, aumentando a sua atividade de ligação está prevista para aumentar a atividade agonista. No entanto, quando a ligação FcgRIIA é similarmente melhorada, atividades indesejadas, tais como a atividade de ADCC e ADCP atividade serão expostos, e isto pode causar efeitos secundários. Também a partir de tal ponto de vista, é preferível ser capaz de aumentar seletivamente a atividade de ligação ao FcgRIIb.

[00792] A partir destes resultados, na produção de produtos farmacêuticos de anticorpos a serem utilizados para o tratamento de doenças autoimunes e câncer utilizam FcYRIIb, é importante que, em comparação com os de uma IgG de ocorrência natural, as atividades de ligação para ambos os alótipos FcYRIIa são mantidos ou diminuída vinculativo, e FcYRIIb é reforçada. No entanto, FcYRIIb compartilha 93% de identidade de sequência, na região extracelular de com aquela de FcYRIIa, que é um dos FcYRs de ativaçao, e eles são muito semelhantes estruturalmente. Há alótipos de FcYRIIa, tipo H e tipo R, em que o aminoácido na posição 131 é Sua (tipo H) ou Arg (tipo R), e mesmo assim cada um deles reage de forma diferente com os anticorpos (J Exp Med, 172, 19-25, 1990). Por conseguinte, para produzir uma região Fc que se liga seletivamente a FcYRIIb, o problema mais difícil pode ser a região que confere o anticorpo Fc com a propriedade de melhorar a seletivamente a atividade de ligação de FcYRIIb que envolve a distinguir estas sequências homólogas, e diminuindo ou não aumentar a atividade de ligação para cada alótipo de FcYRIIa, enquanto o aumento da atividade de ligação para FcYRIIb. Até agora, as vari- antes tendo seletividade FcgRIIb suficiente não foram obtidos. US 2009/0136485 relatórios variantes com atividade aumentada de ligação FcYRIIb, no entanto, o grau de melhora é reduzido, e há uma procura de desenvolvimento de variantes tendo propriedades similares às descritas acima.

[00793] Nesta avaliação, os presentes inventores investigaram a preparação de variantes cuja atividade de ligação foi aumentada de forma FcgRIIb seletivo utilizando anticorpos heterodimerizados. IL6R região variável (SEQ ID N°: 128), que é a região variável de um anticorpo humano contra o receptor da interleucina 6, descrito no documento WO 2009/125825, foi utilizado como a região variável de cadeia H do anticorpo. Além disso, IL6R-G1D (SEQ ID N°: 129) contendo G1D que carece o C-terminal de Gly e Lys da IgG1 humana foi produzido, e, em seguida, K439E foi introduzido IL6R-G1D construir IL6R-B3 (SEQ ID N°: 130). Enquanto isso, E233D, G237D, P238D, H268D, P271G, e A330R foram introduzidos IL6R-B3 para construir IL6R- BP208 (SEQ ID N°: 131). Além disso, S267E e L328F foram introduzidos IL6R-B3 para construir IL6R-BP253 (SEQ ID N°: 132) que tem uma Fc existente com o aumento da atividade de ligação ao FcgRIIb. A cadeia L de tocilizumab, IL6R-L (SEQ ID N°: 133), foi utilizada como a cadeia L de anticorpo comuns, e foram usadas em combinação com cada cadeia H de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1 para produzir homodímeros IL6R-B3/IL6R-L, IL6R- BP208/IL6R-L, e IL6R-BP253/IL6R-L. Estas variantes foram avaliadas para a atividade de ligação a FcgR Ia, FcgR mentiroso, FcgR IIaH, FcgR IIb, e FcgR IIIaV de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 8. Os resultados são mostrados na Tabela 62. Quando uma célula é cheia com cinza na Tabela 62, isso significa que a ligação de IgG a FcgR concluiu-se demasiado fraco para analisar adequadamente por análise cinética. Assim, quando a interação entre ca- da um dos anticorpos modificados e FcgR foi fraca, e análise correcta foi determinada como sendo impossível pela análise cinética acima mencionado, a KD para estas interações foram calculados usando o modelo de ligação 01:01 equação seguinte descrito em o Biacore T100 Software Manual BR1006-48 Edição AE.

[00794] O comportamento de moléculas que interagem de acordo com o modelo de ligação 1:01 em Biacore pode ser descrito pela equação 1 mostrado abaixo. [Equação 1]

Req: o esquema dos níveis estáveis de ligação contra con-centração do analito C: concentração RI: contribuição de índice de refração de massa na amostra Rmax: capacidade de ligação do analito da superfície Quando esta equação é rearranjada, KD pode ser expressa como a Equação 2 mostrada abaixo. [Equação 2]

[00795] KD pode ser calculada por substituição dos valores de Rmax, RI, e C para esta equação. Os valores de RI e C podem ser determinados a partir do diagrama de sensor dos resultados de medição e condições de medição. Rmax foi calculado de acordo com o seguinte método. Como o objetivo de comparação, para anticorpos que tinham interações suficientemente fortes como avaliadas simultaneamente no mesmo ciclo de medição, o valor Rmax foi obtido através do ajuste global usando o modelo de ligação de Langmuir 1:01, e, em seguida, foi dividido pela quantidade do anticorpo de comparação capturado no chip sensor, e multiplicado pela quantidade capturada de um anticorpo alterado a ser avaliado. [Tabela 62]

[00796] Os valores obtidos pela divisão de KD IL6R-B3/IL6R-L para cada um dos FcgRIa FcgRIIaR, FcgRIIaH e FcgRIIb pela KD correspondente de cada variante modificada, a KD relativa determinada quando tomada, como 1, KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcgRIIaR, FcgRIIaH, ou FcgRIIb são mostrados na Tabela 63. [Tabela 63]

[00797] Atividade como mostrada na Tabela 63, IL6R-BP253/IL6R- L, que é um anticorpo existente com o aumento da atividade de ligação ao FcgRIIb, tem ligação FcgRIIb aumentada em cerca de 350 vezes e a atividade de ligação a FcgRIIaR aumentou para cerca de 500 vezes, em comparação com anticorpo IgG1 humana (IL6R-B3/IL6R-L) sem introdução da alteração. Enquanto isso, a atividade de ligação de FcgRIIb de IL6R-BP208/IL6R-L é cerca de 100 vezes e, portanto, inferior a do anticorpo existente com o aumento da atividade de ligação FcgRIIb, no entanto, a sua atividade de ligação ao FcgRIIaR é 1,3 vezes e comparável ao da tipo IgG1. Assim, IL6R-BP208/IL6R-L é um excelente anticorpo na seletividade para FcgRIIb.

[00798] Em seguida, os presentes inventores consideraram que, com a finalidade de melhorar a atividade de ligação FcgR2b e a seletividade, é necessário obter informações sobre a estrutura cristalográfica do complexo entre a região extracelular FcgRIIb e Fc (BP208), que é a Fc de IL6R-BP208/IL6R-L, e para avaliar mais precisamente as mutações de aminoácidos a ser introduzido. Assim, o complexo entre o Fe (BP208) e a região extracelular FcgRIIb foi analisada por cristalografia de raios X de acordo com o método experimental descrito a seguir. [Expressão e Purificação de Fc (BP208)]

[00799] Uma Fc (BP208) foi preparada como se segue. Primeiro, Cys na posição 220 (numeração EU) de IL6R-BP208 foi substituído com Sor. Em seguida, a sequência genética de Fc (BP208) a partir de Glu na posição 236 (numeração EU) para o seu terminal C, foi clonado por PCR. Utilizando esta sequência clonada genética, a produção de vetores de expressão, e expressão e purificação de Fc (BP208) foram realizadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Cys na posição 220 (numeração EU) forma uma ligação de dissulfureto com Cis da cadeia L em geral a IgG1. A cadeia L não é coexpressa sozinha quando Fc é preparado, e, por conseguinte, este resíduo foi substituído com Ser a evitar a formação de pontes de dissulfeto desnecessários.

[Expressão e purificação da região extracelular da FcgRIIb]

[00800] Este foi preparado de acordo com o método do Exemplo de Referência 8. [Purificação de Fc (BP208)/complexo região extracelular FcgRIIb]

[00801] Para 1,5 mg da amostra da região extracelular FcgRIIb obtida por cristalização, 0,15 mg de Endo F1 (Protein Science 1996, 5: 2617-2622) expressa e purificada a partir de Escherichia coli como uma glutationa S-transferase da proteína de fusão foi adicionado. Esta foi deixada a permanecer à temperatura ambiente durante três dias em 0,1 M de tampão de Bis-Tris a pH 6,5, e o oligossacarídeo N-ligado foi clivada, deixando de N-acetilglucosamina ligado a Asn diretamente. Em seguida, esta amostra da região extracelular FcgRIIb submetido a tratamento carboidrato clivagem foi concentrada por ultrafiltração com 5000 MWCO, e purificado por cromatografia de filtração em gel (Su- perdex200 10/300), utilizando uma coluna equilibrada em HEPES 20 mM a pH 7,5 contendo 0,1 M de NaCl. Além disso, a fração FcgRIIb região extracelular clivada por carboidrato obtido, Fc (BP208) foi adicionado de modo que a razão molar da região extracelular da FcgRIIb estaria presente em ligeiro excesso, e, depois de concentração por ultrafiltração, com 10.000 MWCO, uma amostra do complexo de região extracelular Fc (BP208)/FcgRIIb foi obtido através de purificação por cromatografia de filtração em gel (Superdex200 10/300), utilizando uma coluna equilibrada em HEPES 25 mM a pH 7,5 contendo 0,1 M de NaCl. [Cristalização de Fc/complexo da região extracelular FcgRIIb (BP208)]

[00802] Uma amostra de Fc (BP208)/complexo região extracelular FcgRIIb foi concentrada a cerca de 10 mg/ml usando 10000MWCO filtro de ultrafiltração, e cristalizou-se utilizando o método de difusão de vapor de gotas de suspensão em conjunto com o método de propagação. Placa VDXm (Hampton Research) foi utilizado para a cristalização. Usando uma solução reservatório contendo 0,1 M de Bis-Tris (pH 6,5), 19% PEG3350, e 0,2 M de fosfato de potássio dibásico, gotas de cristalização foram preparados a uma razão de mistura de solução reservatório: amostra cristalização = 0,85 μl: 0,85 μl. Cristais do complexo obtidos nas mesmas condições foram esmagados com Semente Bead (Hampton Research) para preparar uma solução de cristal semente. 0,15 ul de uma solução diluída produzido a partir da solução de cristais de semente foi adicionada às gotas de cristalização, os quais foram selados nos poços contendo reservatórios, e deixada repousar a 20°C, foram produzidos com êxito os cristais em forma de placa. [Medição de dados de difração de raios X de um Fc (BP208)/FcgRIIb complexo de região extracelular cristal]

[00803] Um dos cristais individuais obtidos de Fc (BP208)/complexo região extracelular FcgRIIb foi embebida em uma solução de 0,1 M de Bis-Tris pH 6,5, 24% de PEG3350, 0,2 M de fosfato de potássio dibá- sico, ethlene glicol 20% (v/v). O cristal foi retirado da solução usando um broche com laço de nylon pequeno anexo, e congelado em nitrogênio líquido e, em seguida, os dados de difração de raios X foram medidos por BL32XUin Spring-8. Durante a medição, o cristal foi constantemente colocado em um fluxo de nitrogênio a -178°C para manter em um estado congelado, e um total de 300 imagens de difração de raios X foram coletadas por meio de detector CCD MX-225HE (RA- YONIX) ligado a uma linha de feixe com rotação a 0,6° de cada vez. Determinação de parâmetros celulares, indexação de pontos de difra- ção, e processamento de dados de difração a partir das imagens de difração obtidas foram realizados utilizando o programa Xia2 (J. Appl. Cryst. 2010, 43: 186-190)., XDS Package (Acta. Cryst 2010, D66: 125132) e Scala (Acta. Cryst 2006, D62: 72-82) e, finalmente, os dados de intensidade de difração de até 2,81 Â de resolução foram obtidos. O cristal pertence ao grupo de espaço C2221, e tem os seguintes parâmetros celulares, a = 156,69 A, b = 260,17 A, c = 56,85 A, α = 90°, β = 90°, Y = 90°. [Análise cristalográfica de Raio X do complexo Fc (BP208)/região extracelular FcgRIIb]

[00804] Estrutura cristalina do complexo Fc (BP208)/região extrace- lular de FcYRIIb foi determinada pelo método de substituição molecular, utilizando o programa Phaser ((J. Appl Cryst 2007, 40: 658-674). A partir do tamanho da estrutura de cristal obtida e o peso molecular do complexo Fc (BP208)/região extracelular FcgRIIb, o número de complexos na unidade assimétrica foi previsto para ser um a partir das coordenadas estruturais de código PDB: 3SGJ que é a estrutura cristalina de complexo Fc (WT)/região extracelular FcgRIIIa, as porções de resíduos de aminoácidos da posições de cadeia A 239-340 e as posições da cadeia B 239-340 foram retiradas como coordenadas separadas, e elas foram usadas, respectivamente, como modelos para pesquisar os domínios CH2 Fc. O porções de resíduos de aminoácidos da posições de cadeia A 341-444 e as posições da cadeia B 341-443 foram retiradas como um único conjunto de coordenadas das mesmas coordenadas estruturais de código PDB: 3SGJ, e este foi utilizado como um modelo para a pesquisa de domínios CH3 Fc. Finalmente, a partir das coordenadas estruturais de código PDB: 2FCB que é uma estrutura cristalina da região extracelular de FcgRIIb, as porções de resíduos de aminoácidos da posições de cadeia A 6-178 foram retiradas e utilizadas como um modelo para a pesquisa de Fc (BP208). Os presentes inventores tentaram determinar as orientações e posições de cada modelo de busca de domínios CH3 Fc, região extracelular FcgRIIb e domínio CH2 da Fc nas redes cristalinas usando função de rotação e função de tradução, mas não conseguiram determinar a posição do um dos domínios CH2. Em seguida, com referência à estrutu-ra de cristal do complexo de Fe (WT)/região extracelular FcgRIIIa, a posição do último domínio CH2 A foi determinada a partir de um mapa de densidade de elétrons que foi calculado com base na fase determinada a partir das restantes três partes. Assim, os presentes inventores obtiveram um modelo inicial para a estrutura cristalina de Fc (BP208)/complexo região extracelular FcgRIIb. Quando refinamento de corpo rígido que move os dois domínios CH2 de Fc, os dois domínios CH3 de Fc, e região extracelular da FcgRIIb foi realizada no modelo inicial obtido, fiabilidade de fator cristalográfico, o valor de R tornou-se 42,6%, e o valor livre de R tornou-se de 43,7% para os dados de difra- ção de intensidade de 25 Â a 3,0 Â, neste ponto. Além disso, o refinamento estrutural usando o programa REFMAC5 (Acta Cryst. de 2011, D67, 355-367), e revisão do modelo para observar os mapas de densidade eletrônica cujo coeficiente tem 2Fo-Fc ou Fo-Fc, que são calculados com base no fator estrutural determinado experimentalmente Fo, fator estrutural Fc calculado e a fase calculada utilizando o modelo, foi efetuada pelo programa coot (Acta Cryst 2010, D66: 486-501), e o refinamento do modelo foi realizado por repetição destes passos Finalmente, como resultado da incorporação de moléculas de água no modelo com base nos mapas de densidade eletrônica que usam 2Fo-Fc ou Fo-Fc como o coeficiente, e o seguinte refinamento, o fator de confiabilidade cristalográfica, valores de R e o valor de R livre do modelo contendo 4.794 de átomos não hidrogênio se tornou 24,4% e 27,9%, para 27.259 dados de intensidade de difração de 25 Â a 2,81 Â de resolução, respectivamente.

[00805] A estrutura tridimensional do complexo de/Fc (BP208) região extracelular FcgRIIb foi determinada em 2,81 Â de resolução pela análise de estrutura. A estrutura obtida como um resultado da análise é mostrada na Figura 49. Região extracelular FcgRIIb foi revelada para ser amarrada e imprensada entre dois domínios CH2 de Fc, que lembra as estruturas tridimensionais dos complexos previamente analisados entre Fc (WT), que é Fc de IgG nativa, e as respectivas regiões extracelulares de FcgRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 2011, 108, 12669-126674), FcgRIIIb (Nature, 2000, 400, 267-273;. J. Biol Chem 2011, 276, 16.469-16.477) e FcgRIIA.

[00806] No entanto, uma observação detalhada da Fc (BP208) revelou uma alteração na estrutura de loop de 233-239 na sequência da região de dobradiça de domínio CH2 A, devido à influência das muta ções introduzidas e G237D P238D, em comparação com Fc (WT) ligado ao FcgRIIA (Figura 50). O resultado mostrou que a amida cadeia principal de G237 na Fc (BP208) formou uma forte ligação de hidrogênio com a cadeia lateral de Tyr160 em FcgRIIb. Em FcgRIIA, Phe está presente, em vez deste Tyr160, e é incapaz de formar uma tal ligação de hidrogênio. Isso sugere que a ligação de hidrogênio acima descrita tem importante contribuição para a aquisição da seletividade, isto é, a melhora da atividade de FcgRIIb e redução da ligação FcgRIIA.

[00807] Com base nos resultados da análise estrutural, os presentes inventores avaliaram precisamente possíveis alterações para aumentar ainda mais a atividade, e encontraram S239 como um candidato para o local da introdução da alteração. Como mostrado na Figura 51, Ser239 de domínio CH2 B está localizada em uma posição para a qual Lys117 de FcgRIIb sobressai de uma forma estruturalmente natural. No entanto, uma vez que a densidade de elétrons não foi observada para Lys117 de FcgRIIb pela análise descrita acima, pensa-se que Lys117 não tem uma estrutura definida e tem apenas um efeito limitado sobre a interação com Fc (BP208), na situação atual. Quando S239 do domínio CH2 B é alterado para D ou E carregado negativamente, uma interação eletrostática com Lys117 carregado positivamente de FcgRIIb pode ser esperada, resultando assim na melhora da atividade de ligação a FcgRII.

[00808] Por outro lado, a observação da estrutura de S239 no domínio CH2 A sugere que a cadeia lateral desse aminoácido, através da formação de uma ligação de hidrogênio com a cadeia principal de G236, estabiliza a estrutura em loop nas posições 233-239, incluindo D237 que forma uma ligação de hidrogênio com a cadeia lateral de FcgRIIb Tyr160, seguinte a região de dobradiça (Figura 52). A estabilização da estrutura de loop na conformação de ligação suprime a redução de entropia por ligação, e resulta em um aumento na energia livre de ligação, levando a uma melhora da atividade de ligação. Entretanto, quando S239 de domínio CH2 A é alterado para D ou E, a estrutura de loop se torna instável devido à perda da ligação de hidrogênio com a cadeia principal de G236. Além disso, a repulsão eletrostática para D265 na proximidade pode ser causada, conduzindo a uma maior de- sestabilização da estrutura de loop. A energia para a desestabilização funciona para diminuir a energia de interação FcgRIIb, resultando em atividade de ligação reduzida. Especificamente, no caso de um anticorpo homodimerizado ambos cujas cadeias H foram introduzidas com S239D ou S239E, o efeito de aumento da atividade de ligação, devido à interação eletrostática de domínio CH2 B para Lys117 de FcgRIIb é contrabalançado pelo efeito de redução da atividade de ligação devido a desestabilização da estrutura em loop no domínio CH2 A e, assim, pode não resultar na melhora da atividade de ligação. Por outro lado, no caso de um anticorpo heterodimerizado apenas um de cujas cadeias H foi introduzida com S239D ou S239E, uma vez que a estabilização da estrutura de loop por S239 de domínio CH2 A é mantida, a atividade de ligação foi pensada para aumentar à interação eletrostática correspondente recém-formada com Lys117 de FcgRIIb devido a S239D ou S239E introduzida no domínio CH2 B.

[00809] A fim de avaliar a hipótese acima descrita, os presentes inventores tentaram produzir anticorpos com aumento adicional da atividade de ligação de FcgRIIb através da introdução de mutações S239D ou S239E na região Fc de uma cadeia H sozinha usando IL6R- BP208/IL6R-L como modelo. IL6R-BP256 (SEQ ID N°: 134) resultante da introdução de S239D em IL6R-BP208, e IL6R-BP257 (SEQ ID N°: 135) resultante da introdução de S239E em IL6R-BP208 foram produzidos como uma cadeia de anticorpo H. Além disso, IL6R-A5 (SEQ ID N°: 136) resultante da introdução de mutações D356K e H435R em IL6R-G1D, e IL6R-AP002 (SEQ ID N°: 137) resultante da introdução de E233D, G237D, P238D, H268D, P271G, e A330R em IL6R-A5 (SEQ ID N°: 136) foram produzidos como o outro cadeia H. IL6R-L (SEQ ID N°: 133), que é a cadeia L de tocilizumab foi usado como a cadeia L comum de anticorpo, e os anticorpos homodimerizados IL6R- B3/IL6R-L, IL6R-BP208/IL6R-L, IL6R-BP253/IL6R-L, IL6R- BP256/IL6R-L, e IL6R-BP257/IL6R-L, e os anticorpos heterodimeriza- dos IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L, e foram IL6R-AP002/IL6R- BP257/IL6R-L preparado em conjunto com as respectivas cadeias H de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. As variantes foram avaliadas para a atividade de ligação a FcgR Ia, FcgR IIaR, FcgR IIaH, e FcgRIIb de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 8. Os resultados são mostrados na Tabela 64. [Tabela 64]

[00810] Quando uma célula é preenchida com cinza na Tabela 64, isso significa que a ligação de IgG a FcgR foi concluída para ser muito fraca para analisar adequadamente por análise cinética. Assim, quando a interação entre cada um dos anticorpos modificados e FcgR foi fraca, e análise correta foi determinada como sendo impossível pela análise cinética acima mencionada, a KD para estas interações foi calculada usando a seguinte equação de modelo de ligação 1:1 descrita em Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edição AE.

[00811] O comportamento de moléculas que interagem de acordo com o modelo de ligação 1:1 em Biacore pode ser descrito pela equa ção 1 mostrada abaixo. [Equação 1]

Req: esquema dos níveis de ligação estáveis em relação à concentração do analito C: concentração RI: contribuição do índice de refração de massa na amostra Rmax: capacidade de ligação do analito da superfície Quando esta equação é rearranjada, KD pode ser expressa como a Equação 2 mostrada abaixo. [Equação 2]

KD pode ser calculada por substituição dos valores de Rmax, RI, e C para esta equação. Os valores de RI e C podem ser de-terminadas a partir do diagrama sensor dos resultados de medição e condições de medição. Rmax foi calculado de acordo com o seguinte método. Como o objetivo de comparação, para anticorpos que tinham interações suficientemente fortes como avaliadas simultaneamente no mesmo ciclo de medição, o valor Rmax foi obtido através do ajuste global usando o modelo de ligação de Langmuir 1:01, e, em seguida, foi dividida pela quantidade do anticorpo comparação capturado para o chip sensor, e multiplicado pela quantidade capturada de um anticorpo alterado a ser avaliada.

[00812] Enquanto isso, os valores obtidos pela divisão de KD IL6R- B3/IL6R-L para cada um dos FcgRIa FcgRIIaR, FcgRIIaH e FcgRIIb por KD de cada variante, o parente KD determinado quando se toma, como 1, KD de IL6R-B3/IL6R-L para cada um dos FcgRIIaR, FcgRIIaH, e FcgRIIb, e os valores obtidos dividindo KD de cada variante para FcgRIIaR por KD para FcgRIIb são mostrados na Tabela 65. [Tabela 65]

[00813] Como mostrado na Tabela 65, e IL6R-BP256/IL6R-L IL6R- BP257/IL6R-L resultante da introdução de S239D S239E ou em ambas as cadeias H de IL6R-BP208/IL6R-L apresentou diminuição da atividade de ligação FcgRIIb, bem como reduzida atividade de ligação FcgRII- aR em comparação com o IL6R-BP208/IL6R-L variante antes da introdução. Enquanto isso, a ligação para FcgRIIb de IL6R-AP002/IL6R- BP256/IL6R-L e IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L resultante da introdução de S239D ou S239E em uma cadeia H de IL6R-BP208/IL6R-L foi aumentado 752 vezes e 657 vezes, respectivamente, e, assim, as suas atividades de ligação FcgRIIb foram maiores do que a conseguida com a técnica existente. Além disso, as atividades de ligação estavam FcgRIIaR aumentou para 7,7 vezes e 8,3 vezes, respectivamente, enquanto que a dos IL6R-BP208/IL6R-L foi aumentado para 1,3 vezes. Na tabela, KD (mentiroso)/KD (IIb) representa um valor obtido dividindo KD de cada variante para FcgRIIaR por KD para FcgRIIb. Quando o valor é maior, isso significa que a seletividade para FcgRIIb é maior. O valor para IL6R-BP253/IL6R-L que é um anticorpo existente com o aumento da atividade de ligação FcgRIIb é de 0,3, o que sugere que a seletividade não foi melhorada em comparação com o tipo IgG1, ao passo que o valor para IL6R-BP208/IL6R-L é 26,3, o que implica que tem elevada seletividade FcgRIIb. Nesta experiência, e IL6R-AP002/IL6R- BP256/IL6R-L IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L, resultante da introdu- ção de S239D ou S239E em uma cadeia H de IL6R-BP208/IL6R-L, mostrou valores de KD(IIaR)/KD(Ilb) de 34,3 e 27,7, respectivamente, e foram melhorados mais de IL6R-BP208/IL6R-L.

[00814] O resultado da avaliação global das variantes usando tipo IgG1 (GpH7-B3/GpL16-k0) como um modelo, o qual foi realizado conforme descrito no Exemplo 4, mostra que S239D e S239E tem efeitos como mostrado na Tabela 66. Na tabela, Ho/Con_2aR e Ho/Con_2b representam os níveis de atividade de ligação FcgRIIaR e FcgRIIb quando tomando como 100 daqueles do anticorpo homodimerizado de controle. Enquanto isso, He/Con_2aR e He/Con_2b representam os níveis de ligação FcgRIIaR e FcgRIIbs quando tomando como 100 aqueles do anticorpo heterodimerizado de controle. [Tabela 66]

[00815] Tabela 66 mostra que as alterações S239D e S239E introduzidas neste experimento, quando introduzido na IgG1 nativa, independentemente de uma ou ambas as correntes, reforçada a ligação para FcRIIaR e FcgRIIb. No entanto, as alterações, quando introduzidos em ambas as cadeias H de IL6R-BP208/IL6R-L, reduziu as atividades de ligação para FcgRIIaR e FcgRIIb, e só quando introduzidos em uma cadeia H, o aumento das atividades de ligação para FcgRIIaR e FcgRIIb. O resultado demonstra que o efeito das alterações é diferente do obtido usando o tipo IgG1 como um modelo. Assim, estas alterações foram demonstrados para alcançar o efeito acima descrito apenas quando introduzido IL6R-BP208/IL6R-L.

[Exemplo 27] Design da sequência de aminoácidos da região constante de melhorar a capacidade para separar e purificar os homodímeros e heterodímeros [Seleção do local de substituição de resíduos]

[00816] A coexpressão de dois tipos de cadeias H (referidas como cadeia A e cadeia B) no fabrico anticorpo heterodimerizados resulta na formação de: anticorpo homodimerizado resultante da dimerização de cadeias H ambas as quais são cadeias A, anticorpo homodimerizado resultante da dimerização de H ambas as cadeias dos quais são cadeias B e anticorpo heterodimerizado resultantes da dimerização de cadeias H dos quais um é uma cadeia e a outra é a cadeia B. Um método conhecido para a eficiência de separação e purificação de anticorpos heterodimerizados de interesse é o de controlar o ponto isoelé- trico de um anticorpo e a capacidade de retenção e separação numa coluna de troca iônica pela substituição de resíduos de aminoácidos em cada região variável (WO 2007/114325). No entanto, uma vez que cada anticorpo tem uma sequência diferente nas suas regiões variáveis, em particular na região CDR, o método descrito acima tem a versatilidade limitada. Em seguida, como um método mais versátil para substituição de resíduos em anticorpos para purificar anticorpos hete- rodimerizados, os presentes inventores investigaram um método para controlar o ponto isoelétrico e na capacidade de retenção e separação numa coluna de troca iônica pela substituição de resíduos apenas na região constante de um anticorpo.

[00817] Em geral, a separação de uma coluna de troca iônica é pro-vavelmente depender de cargas elétricas na superfície das moléculas, e em muitos casos, a condição de separação é examinada por considerar o ponto isoelétrico de uma molécula alvo. Assim, neste Exemplo, também se esperava que a separação numa coluna de troca iônica a ser melhorado através da substituição de resíduos de aminoácidos que constituem a região constante de anticorpos de uma forma que provoca uma diferença de ponto eléctrico entre anticorpos homodimerizados e anticorpos heterodimerizados a ser separadas.

[00818] Enquanto isso, tem sido sugerida não só um modo de troca iônica pura, mas também a interação hidrofóbica a ser envolvido na separação por cromatografia de troca iônica (Peng Liu et al., J Chromatogr A. 2009 Out 30; 1216 (44): 7,497-504). Por esta razão, na separação e purificação com base no método descrito acima, é possível utilizar cro- matografia hidrofóbica, para além de troca iônica cromatografia.

[00819] Métodos de substituição de resíduo para alterar o ponto isoelétrico incluem métodos para a substituição de um resíduo com um resíduo neutro e métodos para a substituição de um resíduo básico ou ácido, com um resíduo neutro de base ou ácido. Abordagens mais eficazes incluem métodos para a substituição de um resíduo carregado positivamente por um resíduo e métodos para a substituição de um resíduo carregado negativamente por um resíduo carregado positivamente carregado negativamente.

[00820] Nos métodos descritos acima, todas as partes de uma sequência de anticorpo pode ser um candidato para o sítio de substituição de um resíduo que resulta em uma alteração de ponto isoelétrico. No entanto, a substituição aleatória que dá origem a uma sequência não-nativa pode aumentar o risco de imunogenicidade, e não é um método adequado a partir do ponto de vista de utilização farmacêutica.

[00821] Os resíduos podem ser substituídos de forma a minimizar o número de epítopos de células T envolvidas na imunogenicidade, de modo a minimizar o aumento no risco de imunogenicidade. Um meio possível inclui a utilização de sequências de subclasses de IgG. Subclasses de IgG humanas incluem IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Ao substituir porções de uma sequência de anticorpo, com as sequências de diferentes subclasses de acordo com um método descrito no documento WO 2007/114325, o ponto isoelétrico pode ser alterada, enquanto suprime o aumento do número de epítopos de células T.

[00822] Os métodos alternativos disponíveis incluem em células T ferramentas de previsão epítopo silico tais como Epibase.

[00823] Epibase Light (Lonza) é uma ferramenta de silício para calcular a capacidade de ligação entre o peptídeo 9-mero e grande alelo DRB1 usando algarismo mais RÁPIDO (Expert Opin Biol Ther 2007 Mar, 7 (3): 405-18). Esta ferramenta permite a identificação de epíto- pos de células T que se ligam fortemente ou moderadamente ao MHC de classe II.

[00824] O cálculo reflete a taxa de abundância de alótipos DRB1. Para este propósito, é possível utilizar a seguinte proporção abundância em populações caucasianas.

[00825] DRB1 * 1501 (24,5%), DRB1 * 0301 (23,7%), DRB1 * 0701 (23,3%), DRB1 * 0101 (15,0%), DRB1 * 1101 (11,6%), DRB1 * 1302 (8,2%), DRB1 * 1401/1454 (4,9%), DRB1 * 0901 (2,3%), DRB1 * 1502 (0,5%), DRB1 * 1202 (0,1%)

[00826] Todos os epítopos em cada sequência de anticorpos modificados que apresentam forte ou moderada de ligação são identificados por FASTER algorism e epítopos críticos são exibidos após a exclusão de sequências germinativas humanas e sequência da junção da região variável e região constante. O número de epítopos de células T aumentou em substituição de qualquer resíduo de aminoácido, para cada resíduo de qualquer sequência é calculada utilizando a função de randomização desta ferramenta. Isto permite a seleção de pocilgas de substituição resíduo que resulta numa alteração de ponto isoelétrico, sem aumentar o número de epítopos de células T.

[00827] H240-AK072 (SEQ ID N°: 104) e H240-BH076 (SEQ ID N°: 105) foram analisadas por Epibase. A Tabela 67 mostra que a H240- AK072 o número de epítopos de células T que podem ser alterados por substituição de qualquer resíduo, enquanto que a Tabela 68 mostra o número de H240-BH076. Com base nos resultados, pode-se se- lecionar a substituição de resíduos que resulta numa alteração de pon- to isoelétrico, sem aumentar os epítopos de células-T. [Tabela 67-1]

Legendas: Numeração. EU/ sequência

[00828] Através dos métodos acima descritos e uma combinação dos mesmos, as variantes de H240-H240 e AK072-BH076 descritas abaixo foram projetadas (Tabelas 69 e 70), relativamente aos sítios de substituição de resíduos para alterar o ponto isoelétrico. [Tabela 69]

[Construção de vetor de expressão para anticorpos altera- dos H240-AK072/H240-BH076/L73-k0]

[00829] Em primeiro lugar, a fim de construir cDNAs para anticorpo modificado H240-AK072/H240-BH076/L73-k0, oligo DNA sintéticos foram construídos utilizando H240-AK072ou H240-BH076 como um molde, de tal maneira que eles resultam em uma mutação em cada um dos resíduos de aminoácidos selecionado. Em seguida, os vetores de expressão de células de animais portadoras de genes de interesse fo- ram construídos usando cada oligo DNA sintético de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. [Expressão e purificação de anticorpo alterado H240-AK072/H240- BH076/L73-k0]

[00830] Para avaliar os anticorpos alterados de H240-AK072/H240- BH076/L73-k0, anticorpos modificados foram preparados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1 por coexpressão em determinadas combinações de uma cadeia L (L73-k0, SEQ ID N°: 106) e cada uma das cadeias H resultantes da introdução de uma alteração em H240-H240 ou AK072-BH076 (cadeia H resultante da introdução de uma alteração em H240-AK072 é referido como a cadeia A, enquanto que a cadeia H, resultante da introdução de um alteração em H240-BH076 é referido como a cadeia B), de modo que cada um dos anticorpos resultantes tem uma cadeia e da cadeia B em qualquer uma das combinações. SEQ ID N°s de representante cadeias A e cadeias B são apresentados na Tabela 71. [Tabela 71]

[Exemplo 28] Avaliação físicoquímica de variantes H240- AK072/H240-BH076/L73-k0 [Medida de diferença de tempo de retenção por cromatografia de troca catiônica]

[00831] Cada anticorpo foi testado sob as seguintes condições.

[00832] Fase móvel A: 20 mM de MES-NaOH, pH 6,0

[00833] Fase móvel B: 20 mM de MES-NaOH, 200 mM de NaCl, pH 6,0

[00834] Coluna: Bio Pro-SP F (YMC)

[00835] Taxa de fluxo: 0,5 ml/min:

[00836] Gradiente: 10 % de B (0-5 min), 10-60 % de B (5-55 min)

[00837] Detecção: Abs. 280 nm

[00838] Figura 53 mostra um cromatograma representativo. O pico em uma posição inicial de eluição corresponde ao anticorpo ho- modimerizado de cadeia B da cadeia B, enquanto que o pico principal corresponde a um anticorpo heterodimerizado de cadeia de cadeia B. Uma cadeia é introduzida com uma substituição de resíduo (H435R) para reduzir a ligação à Proteína A. Os anticorpos utilizados nesta experiência são removidos na etapa de purificação com a rProtein A SepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare), durante o processo de preparação, pelo método descrito Exemplo de Referência 1. Assim, anticorpo homodimerizado de cadeia A de cadeia A é dificilmente detectado sob a condição descrita acima. Os presentes inventores calcularam: diferença de tempo de retenção Δ RT (min) = (tempo de retenção para o pico de anticorpo heteromérico)-(tempo de retenção para a cadeia B de pico anticorpo homomérico), como um indicador para avaliar a separação dos anticorpos heterodimeri- zados e homodimerizado. A Tabela 72 mostra os resultados da avaliação de vários variantes. Os resultados demonstram que a diferen-ça de tempo de retenção entre o anticorpo heteromérico e anticorpo homomérico tornam-se maiores, dependendo da introdução de substituições de resíduos concebidos e suas combinações. [Análise do conteúdo de agregado por um método de cromato- grafia de filtração em gel]

[00839] Anticorpos purificados foram avaliados pelo conteúdo de agregado por análise SEC usando ACQUITY UPLC sistema H-Class (Waters). 50 mM de tampão fosfato, pH 7,0, contendo cloreto de sódio 300 mM (Isekyu) foi usada como fase móvel e BEH200 SEC (águas) foi usado como coluna analítica. As medições foram realizadas a um comprimento de onda de 215 nm. Os dados foram analisados utilizando Empower2 (Waters). Os componentes eluídos no lado de maior peso molecular, em relação aos monômeros eram consideradas coletivamente como o agregado, e o conteúdo foi calculada. Tabela 72 mostra os resultados da avaliação para as várias variantes. Os resultados sugerem que as respectivas variantes reter a estabilidade relativa de polimerização, uma vez que o conteúdo de agregado não foi drasticamente aumentada em relação a H240- AK072/H240-BH076/L73-k0 antes da modificação. [Avaliação de anticorpos alterados para o ponto médio da temperatura de desnaturação térmica (Tm) por fluorometria varredura diferencial]

[00840] A estabilidade térmica dos anticorpos foi avaliada por meio da determinação da sua temperatura de ponto médio de desnaturação térmica (Tm) por fluorometria de varredura diferencial utilizando Rotor Gene-Q (QIAGEN). Este processo tem sido indicado para mostrar uma correlação excelente com a avaliação Tm usando calorimetria de varredura diferencial, que é um método conhecido para a avaliação da estabilidade térmica de anticorpos (Journal of Pharmaceutical Science 2010, 4:1707-1720).

[00841] Depois de 5000 vezes concentrada SYPRO laranja (Mo lecular Probes) foi diluída com PBS (Sigma), as soluções de anticorpos foram misturadas com ele para preparar amostras de medição. 20 μl de cada uma das amostras foram colocadas em tubos de medição e a temperatura foi aumentada de 30 °C até 99 °C. A temperatura foi aumentada em 0,4 °C e deixou-se repousar durante cerca de 6 segundos, e a intensidade de fluorescência foi determinada a 470 nm (comprimento de onda de excitação)/555 nm (comprimento de onda fluorescente).

[00842] A partir dos dados, a temperatura à qual foi observada transição fluorescência foi calculada como Tm utilizando Rotor Gene Q Series Software (QIAGEN). Da mesma maneira, como relatado em Molecular Immunology 37 (2000) 697-706 e tal, Tm do domínio CH2 foi definida como Tm1 correspondente à primeira transição. Enquanto isso, os valores de Tm foram próximos entre CH3 e Fab dos anticorpos testados, e julgou-se difícil compará-los separadamente. Assim, os valores de Tm utilizados nesta avaliação são valores Tm1. Tabela 72 mostra os resultados da avaliação para várias variantes. Os resultados sugerem que as respectivas variantes reter a estabilidade estrutural, porque os valores de Tm não foram drasticamente reduzidos em comparação com H240-AK072/H240- BH076/L73-k0 antes da modificação. [Tabela 72]

[Avaliação da separação de troca iônica purificação cromatografia]

[00843] Cada amostra foi avaliada para a separação em um método de purificação de cromatografia de troca iônica usando avant25 AKTA (GE Healthcare). A fase móvel utilizada foi de tampão MES 20 mM, pH 6,0, e o tampão 20 mM de MES, pH 6,0, contendo cloreto de sódio 500 mM. A coluna utilizada foi Hi Armadilha SP HP 1 ml (GE Healthcare). A purificação foi realizada por um método de gradiente utilizando uma mis-tura de duas soluções. Os dados de purificação foi recolhido em um comprimento de onda de 280 nm. O resultado da eluição foi avaliado usando Unicorn6.1 (GE Healthcare). Figura 54 mostra um resultado da avaliação para a variante H240-FA021/H240-BF084/L73-k0. O resultado demonstra que, através da introdução das substituições de resíduos re-centemente identificados nesta experiência, os anticorpos homodimeri- zados e heterodimerizado podem ser separados e purificados por meio de purificação que utilizam coluna utilizada em grande escala. [Exemplo 29] Avaliação imunológica de variantes H240- AK072/H240-BH076/L73-k0 [Avaliação da atividade de ligação FCYR pelo método de ressonância de plasma de superfície]

[00844] Os anticorpos de interesse foram analisadas para a interação de FcgR de acordo com o método descrito no Exemplo de referência 8.

[00845] Os resultados da avaliação de vários variantes estão apre-sentados na Tabela 73. Os resultados demonstram que a capacidade de ligação FCYR da variante H240-FA021/H240-BF084/L73-k0, que foi confirmada para ser separada na Figura 54, era comparável à de H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 antes da modificação. [Tabela 73]

[00846] A utilidade e eficácia clínica de fármacos de anticorpos são limitadas por anticorpos antifármaco (ADAs). ADAs afetam a eficácia e de fármacos e a cinética de produtos farmacêuticos de anticorpos e, por vezes, causam efeitos colaterais graves. Muitos fatores que influenciam a imunogenicidade foram relatados, e em particular, acredita- se ser importante que os epítopos de células T estejam contidos em antígenos. As ferramentas in silico disponíveis para prever estes epí- topos de células T incluem Epibase (Lonza), iTope/TCED (Antitope), e EpiMatrix (EpiVax). Tem sido relatado que as sequências que contêm epítopos de células T presentes nas proteínas de interesse poderiam ser previstas utilizando as ferramentas mencionadas acima (Expert Opin Biol Ther Mar 2007, 7 (3): 405-18).

[00847] Epibase Light (Lonza) é uma ferramenta in silico para o cálculo da capacidade de ligação entre peptídeo 9-mer e alelo DRB1 maior usando algorismo FASTER (Expert Opin Biol Ther 2007 Mar; 7 (3): 40518). Esta ferramenta permite a identificação de epítopos de células T que se ligam fortemente ou moderadamente a MHC de classe II.

[00848] Uma pontuação de imunogenicidade in silico pode ser determinada para cada anticorpo modificado de acordo com a seguinte equação (Equação 4) no sistema de Epibase Light (Lonza). [Equação 4]

[00849] Pontuação de imunogenicidade = Soma (cada número X de frequência de população de alótipo DRB1 de epítopos críticos)

[00850] O cálculo reflete a taxa de abundância de alótipos DRB1. Para este propósito, é possível utilizar a seguinte razão de abundância em caucasianos.

[00851] DRB1 * 1501 (24,5%), DRB1 * 0301 (23,7%), DRB1 * 0701 (23,3%), DRB1 * 0101 (15,0%), DRB1 * 1101 (11,6%), DRB1 * 1302 (8,2%), DRB1 * 1401/1454 (4,9%), DRB1 * 0901 (2,3%), DRB1 * 1502 (0,5%), DRB1 * 1202 (0,1%)

[00852] Todos os epítopos contidos em cada sequência de anticorpos modificados que apresentam forte ou moderada ligação são identificados por algorismo FASTER, em seguida, epítopos após a exclusão de sequências germinativas humanas e sequências de junção entre a região variável e região constante são usados como epítopos críticos no cálculo de pontuação de imunogenicidade. Quando a pontuação é menor, isso significa que uma sequência tem risco de imunogenicida- de inferior. Tabela 74 mostra as pontuações de risco calculados para H240-AK072 e H240-BH076, e variantes obtidas. Assim, as variantes que resultam em uma melhor capacidade de separação e purificação para homodímero e heterodímero e cujo risco de imunogenicidade não é significativamente alterado em relação a H240-AK072/H240- BH076/L73-k0 podem ser produzidas por seleção de qualquer combinação de cadeia A cadeia e B. [Tabela 74]

[Exemplo de Referência 1] Construção de vetores de expressão de anticorpos e expressão e purificação de anticorpos

[00853] As substituições de aminoácidos foram introduzidas por meio de métodos conhecidos pelos versados na técnica utilizando Kit QuikChange Site-Direted Mutagenesis (Stratagene), PCR, ou em proveito de fusão kit de clonagem de PCR (TAKARA), e vetores de expressão foram construídos. A sequência de nucleotídeos do vetor de expressão obtida foi determinada através de métodos conhecidos dos versados na técnica. Os plasmídeos produzidos foram introduzidos de forma transiente na linhagem celular HEK293H derivada de células do câncer do rim embrionárias humanas (Invitrogen) ou em células Fre- eStyle293 (Invitrogen) para expressão do anticorpo. Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido por métodos conhecidos para aqueles versados na técnica usando rProtein A SepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare). Para a concentração dos anticorpos purificados, a sua absorvância a 280 nm foi medida utilizando um espectrofotômetro. A partir do valor obtido, o coeficiente de extinção calculado pelo método de PACE foi usado para calcular a concentração de anticorpo (Protein Science 1995, 4 : 2411-2423). [Exemplo de Referência 2] Preparação de FCYR e avaliação da ati-vidade de ligação a FCYR

[00854] Domínios extracelulares de FcgRs foram preparados pelo método seguinte. Primeiro, o gene do domínio extracelular de FcgR foi sintetizado por um método bem conhecido dos versados na técnica. Naquele momento, a sequência de cada FcgR foi produzida com base nas informações registradas no NCBI. Especificamente, FcgRI foi produzido com base na sequência de NCBI Adesão # NM_000566.3, FcgRIIA foi produzido com base na sequência de NCBI Adesão # NM_001136219.1, FcgRIIb foi produzido com base na sequência de NCBI Adesão # NM_004001.3, FcgRIIIa foi produzido com base na sequência de NCBI Adesão # NM_001127593.1, e FcgRIIIb foi produ- zido com base na sequência de NCBI Adesão # NM_000570.3, e um marcador de His foi ligado ao terminal C. Além disso, o polimorfismo é conhecido por FcgRIIA, FcgRIIIa, e FcgRIIIb, e os sítios polimórficos foram produzidos por referência a J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25 para FcgRIIA, J. Clin.. Invest, 1997, 100 (5): 1059-1070 para FcgRIIIa, e J. Clin.. Invista., 1989, 84, 1688-1691 para FcgRIIIb.

[00855] Os fragmentos de gene obtidos foram inseridos em um vetor de expressão de células de animais, e os vetores de expressão foram produzidos. Os vetores de expressão produzidos foram introduzidos transientemente em células FreeStyle293 derivadas de linhagem celular de câncer do rim embrionárias humanas (Invitrogen) para expressar as proteínas de interesse. Quanto FcgRIIb utilizado para análise cristalográfica, a proteína de interesse foi expressa na presença de Kifunesine a uma concentração final de 10 ug/ml, de modo que a cadeia de açúcar adicionada a FcgRIIb será do tipo de alta-manose. As células foram cultivadas, e após a coleta do sobrenadante de cultura obtido, este foi passado através de um filtro de 0,22 μM para obter o sobrenadante da cultura. Em princípio, os sobrenadantes da cultura obtidos foram purificados nas quatro etapas seguintes. As etapas foram realizadas, por cromatografia em coluna de troca de cátions (SP Sepharose FF) na etapa 1, cromatografia de coluna de afinidade (His- Trap HP) para His na etapa 2, cromatografia em coluna de filtração em gel (Superdex200) na etapa 3, e cromatografia asséptica na etapa 4. No entanto, para a FcgRI, cromatografia de coluna de troca aniônica usando Q-Sepharose FF foi realizada como na etapa 1. As proteínas purificadas foram submetidas a medições de absorvância a 280 nm usando um espectrofotômetro, e a partir dos valores obtidos, as concentrações das proteínas purificadas, foram calculadas usando o coeficiente de absorção calculado usando métodos tais como PACE (Protein Science 1995, 4: 2411-2423).

[00856] Análise da interação entre anticorpos objetivo e o FCYR foi realizada utilizando Biacore T100 (GE Healthcare). HBS-EP + (GE Healthcare), foi utilizado como tampão de execução, e a temperatura de medida foi ajustada para 25°C. Chips produzidos pela imobilização do peptídeo de antígeno pelo método de acoplamento de amina para um Serie S Sencor Chip CM5 (GE Healthcare), ou, alternativamente, os chips produzidos, permitindo que os peptídeos do antígeno biotini- lado preliminarmente interajam com e imobilizem em uma Série S Sensor Chip SA (certificada) (GE Healthcare) foram usadas. Os anticorpos de interesse foram capturados sobre um chip imobilizado por peptídeo antígeno, e deixado interagir com cada FcyR diluído com tampão de execução. Para regenerar repetidamente e usar o chip, os anticorpos capturados sobre o chip foram lavados por meio de reação de 10 mM de glicina-HCI, pH 1,5.

[00857] A atividade de ligação FcyR de cada anticorpo foi avaliada usando principalmente como um indicador a atividade de ligação FcyR e constante de dissociação para FcyR.

[00858] A atividade de ligação FcyR refere-se à atividade de ligação em relação a FcyR. No que diz respeito a atividade de ligação FcyR relativa, em cada uma das medições da atividade de ligação de uma amostra de controle foi tomada como 100 (%) para calcular as atividades de ligação de outros anticorpos. A atividade de ligação descrita acima foi definida como um valor obtido através da divisão do nível da mudança no diagrama sensor, antes e depois de uma interação de FcyR para o anticorpo capturado, o que reflecte a atividade de ligação de FcyR, por a quantidade de cada anticorpo capturado. A razão é que a atividade de ligação de FcyR depende da quantidade de anticorpo capturado.

[00859] A constante de dissociação de cada um dos anticorpos de FcyR foi calculada através da realização de análise cinética de o resul- tado da medição da Biacore. Especificamente, para calcular a taxa de associação constante ka (L/mol/s) e taxa de dissociação kd constante (1/s), diagrama de sensores obtido por medição foram processados para a montagem global em Software de Avaliação Biacore usando 1:1 modelo de ligação de Langmuir e dissociação KD constante (mol/L) foi calculada a partir dos valores resultantes. [Exemplo de Referência 3] Produção de vetores de expressão para genes de anticorpos heterodimerizados e expressão de cada um dos anticorpos

[00860] Como a região variável da cadeia H do anticorpo, os descritos a seguir, foram utilizados:

[00861] Q153 (a cadeia H da região variável do anticorpo anti- humano F.IX; SEQ ID N°: 61);

[00862] Q407 (a cadeia H da região variável do anticorpo anti- humano F.IX; SEQ ID N°: 62);

[00863] J142 (a região variável da cadeia H do anticorpo humano anti-FX; SEQ ID N°: 63);

[00864] J300 (a região variável da cadeia H do anticorpo humano anti-FX; SEQ ID N°: 64); e

[00865] MRA-VH (região variável da cadeia H de uma interleucina-6 do anticorpo humano antirreceptor; SEQ ID N°: 65).

[00866] Como a cadeia L de anticorpo, os descritos a seguir, foram utilizados:

[00867] L180-k (cadeia L comum de anticorpo F.IX anti- humano/anticorpo anti-humano de FX; SEQ ID N°: 66);

[00868] L210-k (cadeia L comum de anticorpo F.IX anti- humano/anticorpo anti-humano de FX; SEQ ID N°: 67); e

[00869] MRA-k (cadeia L de uma interleucina-6 do anticorpo humano antirreceptor; SEQ ID N°: 68).

[00870] Como a região constante de cadeia H do anticorpo, os des- critos a seguir, foram utilizados:

[00871] G4D (SEQ ID N°: 69), o qual foi construído a partir de IgG4 através da introdução de uma mutação de substituição de Ser para Pro na posição 228 (numeração EU) e excluindo o C-terminal de Gly e Lys;

[00872] Z72 (SEQ ID N°: 70), o qual foi construído a partir de G4D através da introdução de uma mutação de substituição de His para Arg na posição 435 (numeração EU), uma mutação por substituição de Tyr para Phe na posição 436 (numeração EU), e uma mutação de substituição de Leu para Pro na posição 445 (numeração EU);

[00873] Z7 (SEQ ID N°: 71), o qual foi construído a partir de G4D através da introdução de uma mutação de substituição de Glu para Lys na posição 356 (numeração EU);

[00874] Z73 (SEQ ID N°: 72), o qual foi construído a partir de Z72 através da introdução de uma mutação de substituição de Lys para Glu na posição 439 (numeração EU);

[00875] z106 (SEQ ID N°: 73), o qual foi construído a partir de Z7 através da introdução de uma mutação de substituição de Lys para Gln na posição 196 (numeração EU), uma mutação por substituição de Tyr para Phe na posição 296 (numeração EU), e uma mutação de substituição de Arg para Lys na posição 409 (numeração EU);

[00876] Z107 (SEQ ID N°: 74), o qual foi construído a partir de Z73 através da introdução de uma mutação de substituição de Lys para Gln na posição 196 (numeração EU), uma mutação por substituição de Tyr para Phe na posição 296 (numeração EU), a partir de uma mutação de substituição Arg em Lys na posição 409 (numeração EU), e uma mutação de substituição de Tyr para Phe na posição 436 (numeração EU); e

[00877] G1D (SEQ ID N°: 75), o qual foi construído por exclusão do C-terminal de Gly e Lys de IgG1. A mutação de substituição de Glu para Lys na posição 356 (numeração EU) e a mutação por substituição de Lys para Glu na posição 439 (numeração EU) foram introduzidos para a formação eficiente de moléculas heteroméricos das respectivas cadeias H na produção de anticorpos (heteroméricos (WO 2006/106905) PROCESSO DE PRODUÇÃO DE POLIPEPTÍDEO PELO REGULAMENTO DE MONTAGEM).

[00878] Os genes da cadeia H de anticorpo anti-humano F.IX Q153 e Q153 G4D-Z7 foram construídos ligando respectivamente G4D e Z7 a jusante do Q153. Gene de cadeia H de anticorpo F.X anti-humano Q407-z106 foi construído ligando z106 a jusante do Q407. Genes de cadeia H de anticorpo F.X anti-humano H-J142 G4D, J142-Z72, Z73 e J142 foram construídos, ligando respectivamente G4D, Z72, e Z73 a jusante do J142. Gene de cadeia H de anticorpo F.X anti-humano J300-Z107 foi construído ligando Z107 a jusante de J300. Genes de cadeia H de anticorpo de receptor de interleucina-6 anti-humana MRA- G1D, MRA-z106, e MRA-Z107 foram construídos ligando respectivamente G1D, z106, e Z107 a jusante de MRA-VH.

[00879] Os respectivos genes de anticorpos (Q153-G4D, Q153-Z7, Q407-z106, J142-G4D, J142-Z72, Z73-J142, J300-z106, MRA-G1D, MRA-z106, MRA-Z107, L180-k, L210-k, e MRA-k) foram inseridos em vetores de expressão de células de animais.

[00880] Os anticorpos seguintes foram expressos transitoriamente em células FreeStyle293 (Invitrogen) por transfecção utilizando os vetores de expressão construídos. Como pode ser visto abaixo, vários genes de anticorpos a serem transfectados foram dispostos e usados como nomes de anticorpos.

[00881] MRA-G1d/MRA-k

[00882] MRA-z106/MRA-z107/MRA-k

[00883] Q153-G4d/J142-G4d/L180-k

[00884] Q153-G4d/J142-z72/L180-k

[00885] Q153-z7/J142-z73/L180-k

[00886] Q407-z106/J300-z107/L210-k

[00887] [Exemplo de Referência 4] Avaliação das condições de eluição para o anticorpo heterodimerizado em cromatografia de afinidade de Proteína A, e separação e purificação

[00888] Um meio de cultura celular FreeStyle293 (daqui em diante abreviado como MC), obtido por expressão transitória de Q153- G4d/J142-G4d/L180-k e Q153-G4d/J142-z72/L180-k foi utilizado como uma amostra para avaliar o estado de eluição em proteína A cromatografia de afinidade. CM filtrada através de filtro de □ 0,22 μM foi carregado numa coluna de rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), equilibrada com STP-D. Lavagens 1 e 2, e eluições de 1 a 5 apresentadas na Tabela 75 foram realizadas de uma forma gradual. A quantidade de CM a ser carregado foi ajustado de forma que a quantidade de anticorpo carregada na coluna é de 20 mg/ml de resina. As frações eluídas sob cada condição foram recolhidas e os componentes em cada uma das frações de eluição foram identificados por análise de cromatografia de troca catiônica. Para preparar os controles, cada CM foi carregado numa resina de rProtein G- Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). As amostras purificadas por eluição de batelada em batelada foram usadas como controles. Uma vez que Proteína G liga-se ao domínio de Fab de um anticorpo, todas as espécies de anticorpos (anticorpo biespecífico de interesse, em que dois tipos de cadeias H são associados de uma forma hete- romérica (anticorpo heteromérico) e como anticorpos monoespecífi- cos homoméricos de impureza em que cadeias de um único tipo H são homomericamente associadas) em CM pode ser purificado utilizando proteína G, independentemente de a sua atividade de ligação à proteína A. [Tabela 75]

[00889] CM em que Q153-G4d/J142-G4d/L180-k ou Q153- G4d/J142-z72/L180-k tinha sido expresso foi eluída a partir de uma coluna de proteína (eluições 1 a 5), e as respectivas frações eluídas foram analisadas por cromatografia de troca catiônica. Como para Q153-G4d/J142-G4d/L180-k, a análise revelou que, como a condição de eluição foi alterada de 1 a 5, isto é, medida que o pH do tampão de eluição foi reduzida, a composição de anticorpos das frações eluídas mudou gradualmente no fim do J142-G4d/L180-k anticorpo homoméri- co ao Q153-G4d/J142-G4d/L180-k anticorpo heteromérico, e, em seguida, para o anticorpo Q153-G4d/L180-k homomérico. A ordem de eluição é entendido como sendo, de acordo com a força de ligação à Proteína A. Isto significa que a proteína de ligação de uma força de homomérico Q153-G4d/L180-k anticorpo, que se manteve ligado até um pH mais baixo, é maior do que espécies homomérico J142- G4d/L180-k (anticorpo homomérico contra FX), que eluiu a um pH elevado. Região variável J142 é conhecido por ser uma sequência que não se liga à proteína A. Especificamente, espécies homoméricas J142-G4d/L180-k (anticorpo homomérico contra FX) tem sítios de compulsão A duas proteínas; anticorpo heteromérico Q153-G4d/J142- G4d/L180-k tem três sítios de compulsão uma proteína, e Q153- G4d/L180-k anticorpo homomérico (anticorpo homomérico contra FIX) tem dois sítios de ligação de proteína A. Foi assim demonstrado que, mais sítios de ligação de proteína A resultou em ligação de Proteína A mais forte e, portanto, um pH mais baixo foi necessário para eluição.

[00890] Enquanto isso, como por Q153-G4d/J142-z72/L180-k, revelou-se que como a condição de eluição foi alterada de 1 a 5, a composição de anticorpos na fração eluída foi alterada do anticorpo hetero- mérico Q153-G4d/J142-z72/L180-K para o anticorpo homomérico Q153-G4d/L180-k. O anticorpo homomérico J142-z72/L180-k (anticorpo homomérico contra FX) foi quase indetectável em cada fração de eluição, e isso indica que ele não tem nenhuma capacidade de ligação de proteína A. Pensa-se que a ausência de capacidade de ligação de proteína A de J142-Z72 pode ser devido à mutação de substituição introduzida de Arg para His na posição 435 (numeração EU). Anticorpo homomérico J142-z72/L180-k (anticorpo homomérico contra FX) não tem nenhum sítio de ligação a proteína A; anticorpo heteromérico Q153-G4d/J142-z72/L180-k tem dois sítios de ligação de proteína A, e anticorpo homomérico Q153-G4D/L180-k (anticorpo homomérico contra FIX) tem quatro sítios de ligação de proteína A. Uma vez que o anticorpo homomérico J142-z72/L180-k (anticorpo homomérico contra FX) fluiu sem ligação à Proteína A e não foi detectado em cada fração de eluição. Além disso, em ambos os casos de Q153-G4d/J142- G4d/L180-k e Q153-G4d/J142-z72/L180-k, sugeriu-se que o anticorpo heteromérico e anticorpo homomérico Q153-G4d/L180-k (um anticorpo homomérico contra o FIX) fossem separados um do outro, a pH 3,6 ou um pH mais baixo.

[00891] Anticorpos heterodimerizados foram purificados por croma- tografia em coluna de Proteína A de acordo com as condições de puri-ficação avaliadas como descrito acima.

[00892] CM dos anticorpos a seguir indicados foram utilizados como amostra.

[00893] Q153-G4d/J142-G4d/L180-k

[00894] Q153-G4d/J142-z72/L180-k

[00895] Q153-z7/J142-z73/L180-k

[00896] Q407-z106/J300-z107/L210-k

[00897] CM filtrado através filtro de □□0,22 μM foi carregado em uma coluna de rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), equi-librado com STP-D. Lavagens 1 e 2 e eluições 1 e 2 mostradas na Tabela 76 foram realizadas (eluição 1 sozinha foi realizada para Q407- z106/J300-z107/L210-k). A condição de eluição foi com base no resultado descrito acima. A quantidade de CM a ser carregado foi ajustada de forma que a quantidade de anticorpo carregado é de 20 mg/ml de resina. As frações eluídas sob cada condição foram coletadas e os componentes contidos em cada fração de eluição foram identificados por análise de cromatografia de troca catiônica. Da mesma maneira, como mostrado na sequência descrita acima, cada CM foi carregado em uma resina de rProtein G Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) para preparar os controles. As amostras purificadas por eluição de batelada em batelada foram usadas como controles. [Tabela 76]

[00898] Os resultados da análise de cromatografia de troca catiôni- ca para cada fração eluída são mostrados nas Tabelas 77 a 80 abaixo. Os valores representam a área de pico de eluição expressa em per-centagem. No que diz respeito a outros anticorpos diferentes de Q153- G4d/J142-G4d/L180-k, o anticorpo homomérico contra FX era quase indetectável em qualquer fração de eluição. Revelou-se que, não só o anticorpo homomérico J142-Z72 (anticorpo homomérico contra FX), mas também anticorpos homoméricos J142-Z73 e J300-Z107 (anticorpos homoméricos contra FX) não se ligam à Proteína A. Pensa-se que a ausência da capacidade de ligação de proteína A em que o anticorpo homomérico contra FX era devido à mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU), que foi introduzida na região constante de cadeia H do anticorpo contra o FX. O anticorpo hetero- mérico, que é um anticorpo biespecífico de interesse, foi principalmente detectado na fração de eluição 1, enquanto que, embora eles também foram detectados a um nível muito baixo na fração de eluição 1, o anticorpo homomérico contra FIX foi eluído principalmente pela eluição 2. Em comparação com Q153-G4d/J142-z72/L180-k, nos casos de Q153-z7/J142-z73/L180-k e Q407-z106/J300-z107/L210-k, a proporção do anticorpo heteromérico (anticorpo biespecífico de interesse) foi aumentada consideravelmente na fração eluída a pH 3,6. Demonstrouse que, quando uma mutação de substituição de Glu para Lys na posição 356 (numeração EU) e uma mutação de substituição de Lys para Glu na posição 439 (numeração EU) para a finalidade de formação eficiente de moléculas heteroméricas para respectivas cadeias H foram introduzidas em adição à mutação de substituição de His para Arg na posição 435 (numeração EU), o anticorpo heteromérico, que é um anticorpo biespecífico de interesse, pode ser purificado até uma pureza de 98 % ou superior através de uma etapa de purificação sozinha baseada em Proteína A.

[00899] A descoberta descrita acima mostra que, com base na diferença entre o número de sítios de ligação de proteína A entre anticor- po homomérico e anticorpo heteromérico, o anticorpo heteromérico pode ser eficientemente separado e purificado para elevada pureza usando a etapa de cromatografia de proteína A sozinha.

[Exemplo de Referência 5] Avaliação de anticorpos alterados para Tm por fluorometria DE varredura diferencial

[00900] Nesta avaliação, a Tm de anticorpos alterados foi avaliada por fluorometria de varredura diferencial utilizando Rotor Gene-Q (QI AGEN). Este processo tem sido indicado para mostrar uma correlação excelente com a avaliação Tm usando calorimetria de varredura dife-rencial, que é um método conhecido para a avaliação da estabilidade térmica de anticorpos (Journal of Pharmaceutical Science 2010, 4: 1707-1720).

[00901] Depois de 5000 vezes concentrada SYPRO laranja (Molecular Probes) foi diluída com PBS (Sigma), as soluções de anticorpos foram misturadas com ele para preparar amostras de medição. 20 μl de cada uma das amostras foram colocadas em tubos de medição e a temperatura foi aumentada a uma taxa de aumento da temperatura de 240°C/hora desde 30°C até 99°C. A alteração de fluorescência com o aumento da temperatura foi detectado a 470 nm (comprimento de onda de excitação)/555 nm (comprimento de onda fluorescente).

[00902] A partir dos dados, a temperatura à qual foi observada transição fluorescência foi calculada como Tm utilizando Rotor Gene Q Series Software (QIAGEN). [Exemplo de Referência 6] Teste de aceleração de anticorpos he- teroméricos modificados

[00903] Testes de aceleração foram realizados em relação aos anticorpos descritos neste Exemplo e a estabilidade de armazenamento foi comparada.

[00904] Após purificação com proteína A, os anticorpos foram preparados em 1,0 mg/ml, usando PBS contendo ácido clorídrico a 0,2 mM, e armazenada numa incubadora a 40°C. No início de armazenamento, depois de duas semanas de armazenagem, e depois de quatro semanas de armazenamento, cada anticorpo foi avaliado para o conteúdo de monômero por meio de cromatografia de exclusão de tamanho utilizando uma coluna G3000 SWXL. [Exemplo de Referência 7] Atividade de ADCC de cada anticorpo de teste utilizando células mononucleares periféricas humanas como células efetoras

[00905] As variantes com a atividade de ligação a FCYR aumentada através da introdução de uma alteração em apenas uma cadeia H de um anticorpo foram ensaiadas para a atividade de ADCC de acordo com o método descrito abaixo.

[00906] ADCC de cada anticorpo de teste foi analisado utilizando células mononucleares do sangue periférico humano (daqui em diante referidos como "CMSP humanas "), como células efetoras, pelo procedimento descrito abaixo. (1) Preparação de soluções de PBMC humanos

[00907] Usando seringas pré-cheias com 200 μl de 1.000 unida- des/ml solução de heparina (Novo-Heparina 5.000 unidades para injeção; Novo Nordisk), 50 ml de sangue periférico foi coletado de voluntários saudáveis (adulto masculino) filiados à Chugai Pharmaceutical Co. Ltd. O sangue periférico foi diluído duas vezes com PBS (-), e dividido em quatro partes iguais, cada uma das quais foi transferida para um tubo de separação de leucócitos pré-centrifugado Leucosep (Greiner Bio-One), contendo 15 ml de Ficoll-Paque PLUS. Os tubos de separação contendo uma alíquota do sangue periférico foram centrifugados a 2150 rpm e temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, as frações de células mononucleares resultantes foram coletadas. As células em cada fração foram lavadas uma vez com Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (Sigma) contendo 10% de FBS (a seguir referido como "10% de FBS/D-MEM"), e, em seguida, suspensas a uma densidade de 5 x 106 células/ml em FBS a 10%/D-MEM. As suspensões de células foram utilizadas como soluções de PBMC humanos nas experiências subsequentes. (2) Preparação de células alvo

[00908] SK-pca13a resultante da expressão forçada de glipicano-3 humana em SK-Hep-1 foi isolada a partir da placa, e 1.85 MBq de Cr- 51 foi adicionado a 3 x 106 células. Células adicionadas com Cr-51 foram incubadas numa incubadora sob 5% de gás de dióxido de carbono a 37°C durante uma hora. Em seguida, as células foram lavadas uma vez com 10 % de FBS/D-MEM, e suspensas a uma densidade de células de 2 x 105 células/ml em 10% de FBS/D-MEM. A suspensão de células foi usada como células alvo nas experiências subsequentes. (3) teste de liberação de crômio (atividade ADCC)

[00909] Atividade CCDA foi avaliada com base na taxa de liberação de crômio específica, determinada pelo ensaio de liberação de crômio. Em primeiro lugar, as soluções de anticorpos preparadas para cada concentração (0, 0,004, 0,04, 0,4, 4, e 40 μg/mL) foram adicionadas em 50 μl de respectivas poços de uma placa de 96 poços de fundo U. Em seguida, 50 μl de alíquotas das células alvo preparadas como descrito em (2) foram semeadas (1 x 104 células/poço) e deixadas repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos. 100 μl de solução de PBMC humano preparado como descrito em (1) foi adicionado a cada poço (5 x 105 células/poço). As placas foram incubadas em 5% de gás de dióxido de carbono em um incubador de CO2 a 37°C durante quatro horas, e, em seguida, centrifugadas. 100 μl de sobrenadante de cultura em cada poço das placas foi medido para radioatividade usando um contador gama. A taxa de liberação de cromo específica foi determinada pela seguinte fórmula: [Taxa específica de liberação de cromo (%)] = (AC) x 100/(BC).

[00910] Nesta fórmula, "A" representa radioatividade média (cpm) de 100 μl de sobrenadante de cultura em cada poço. "B" representa radioatividade média (cpm) de 100 μl de sobrenadante de cultura em um poço contendo as células alvo, 100 μl de 2% de solução aquosa NP-40 (Nonidet P-40; Nacalai Tesques), e 50 μl de 10% de FBS/D- MEM. Além disso, "C" representa radioatividade média (cpm) de 100 μl de sobrenadante de cultura em um poço contendo as células alvo e 150 μl de FBS a 10%/D-MEM. O teste foi realizado em triplicado. A média e desvio padrão da taxa de liberação de crômio específica (%), que reflete a ADCC de cada anticorpo de teste foram calculadas com base no ensaio descrito acima. [Exemplo de Referência 8] Preparação de FCYR e avaliação da ati-vidade de ligação a FCYR

[00911] Domínios extracelulares de FcgRs foram preparados pelo método seguinte. Primeiro, o gene do domínio extracelular de FcgR foi sintetizado por um método bem conhecido dos versados na técnica. Naquela época, a sequência de cada FcgR foi produzida com base nas informações registradas no NCBI. Especificamente, FcgRI foi produzido com base na sequência de NCBI Adesão # NM_000566.3, FcgRIIA foi produzido com base na sequência de NCBI Adesão # NM_001136219.1, FcgRIIb foi produzido com base na sequência de NCBI Adesão # NM_004001.3, FcgRIIIa foi produzido com base na sequência de NCBI Adesão # NM_001127593.1, e FcgRIIIb foi produzido com base na sequência de NCBI Adesão # NM_000570.3, e um marcador de His foi ligado ao terminal C. Além disso, o polimorfismo é conhecido por FcgRIIA, FcgRIIIa, e FcgRIIIb, e os sítios polimórficos foram produzidos por referência a J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25 para FcgRIIA, J. Clin.. Invest, 1997, 100 (5): 1059-1070 para FcgRIIIa, e J. Clin. Invista., 1989, 84, 1688-1691 para FcgRIIIb.

[00912] Os fragmentos de gene obtidos foram inseridos em um vetor de expressão de células de animais, e os vetores de expressão foram produzidos. Os vetores de expressão produzidos foram introduzido transientemente em células FreeStyle293 derivadas de linhagem de células de câncer do rim humanas embrionárias (Invitrogen) para ex-pressar as proteínas de interesse. Quanto a FcgRIIb utilizado para análise cristalográfica, a proteína de interesse foi expressa na presença de Kifunesine a uma concentração final de 10 ug/ml, de modo que a cadeia de açúcar adicionada a FcgRIIb será do tipo de alta-manose. As células foram cultivadas, e após a coleta do sobrenadante de cultura obtido, este foi passado através de um filtro de 0,22 μM para obter o sobrenadante da cultura. Em princípio, os sobrenadantes da cultura purificados foram obtidos nas quatro etapas seguintes. As etapas rea-lizadas foram, cromatografia em coluna de troca de cátions (SP Sepharose FF) na etapa 1, cromatografia de coluna de afinidade (His- Trap HP) para His na etapa 2, cromatografia em coluna de filtração em gel (Superdex200) na etapa 3, e cromatografia asséptica na etapa 4. No entanto, para FcgRI, cromatografia de coluna de troca aniônica usando Q-Sepharose FF foi realizada como na etapa 1. As proteínas purificadas foram submetidas a medições de absorvância a 280 nm usando um espectrofotômetro, e a partir dos valores obtidos, as concentrações das proteínas purificadas, foram calculadas usando o coeficiente de absorção calculado usando métodos tais como o de PACE (Protein Science 1995, 4 : 2411-2423).

[00913] Análise da interação entre anticorpos objetivo e o FCYR foi realizada utilizando Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200, Bia- core A100 e Biacore 4000. HBS-EP + (GE Healthcare), foi utilizado como tampão de execução, e a temperatura de medida foi ajustada para 25 °C. Chips produzidos para imobilizar o peptídeo de antígeno pelo método de acoplamento de amina para um Serie S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare), os chips produzidos permitindo que peptídeos de antígeno biotinilados preliminarmente interajam e imobilizem em um Serie S Sensor Chip SA (certificado) (GE Healthcare), foram utilizados chips produzidos para imobilizar proteína L (ACTIGEN, BioVision) para Serie S Sencor Chip CM5 (GE Healthcare), ou chips produzidos para imobilizar a proteína A/G (Thermo Scientific) para Serie S Sencor Chip CM5 (GE Healthcare). Os anticorpos de interesse foram capturados sobre estes chips, e deixados interagir com cada FcyR diluído com tampão de execução. Para regenerar repetidamente e usar o chip, os anticorpos capturados sobre o chip foram lavados por meio de reação de 10 mM de glicina-HCI, pH 1,5.

[00914] A atividade de ligação FCYR de cada anticorpo foi avaliada usando principalmente como um indicador da atividade de ligação FcyR e dissociação constante para FcyR.

[00915] A atividade de ligação a FcyR refere-se à atividade de ligação relativa a FcyR. No que diz respeito a atividade de ligação FcyR relativa, em cada uma das medições da atividade de ligação de uma amostra de controle foi tomada como 100 (%) para calcular as atividades de ligação de outros anticorpos. A atividade de ligação descrita acima foi definida como um valor obtido através da divisão do nível da mudança no diagrama de sensor, antes e depois de uma interação de FcyR com o anticorpo capturado, o que reflete a atividade de ligação de FcyR, pela quantidade de cada anticorpo capturado. A razão é que a atividade de ligação de FcyR depende da quantidade de anticorpo capturado.

[00916] A constante de dissociação de cada anticorpo para FcyR foi calculada através da realização de análise cinética do resultado da medição da Biacore. Especificamente, para calcular a taxa de associação constante ka (L/mol/s) e taxa de dissociação kd constante (1/s), diagramas de sensor obtido por medição foram processados para a montagem global em Software de Avaliação Biacore usando modelo de ligação de Langmuir 1:1. A dissociação KD constante (mol/L) foi calculada a partir dos valores resultantes. [Exemplo de Referência 9] Atividade de ADCC de cada anticorpo de teste utilizando células mononucleares do sangue humano periférico como células efetoras

[00917] Cada uma das variantes de Fc com alteração é ensaiada para a sua atividade de ADCC de acordo com o método descrito abaixo.

[00918] A atividade de ADCC de cada anticorpo de teste foi analisada utilizando células mononucleares do sangue periférico humano (daqui em diante referidas como "CMSP humanas"), como células efe- toras, pelo procedimento descrito abaixo. (1) Preparação de soluções de PBMC humanos

[00919] Usando seringas pré-cheias com 200 μl de 1.000 unida- des/ml solução de heparina (Novo-Heparina 5.000 unidades para injeção; Novo Nordisk), 50 ml de sangue periférico foi coletado de voluntários saudáveis (adulto masculino) filiados à Chugai Pharmaceutical Co. Ltd. O sangue periférico foi diluído duas vezes com PBS (-), e dividido em quatro partes iguais, cada uma das quais foi transferida para um tubo de separação de leucócitos pré-centrifugados Leucosep (Greiner Bio-One), contendo 15 ml de Ficoll-Paque PLUS. Os tubos de separação contendo uma alíquota do sangue periférico foram centrifugados a 2150 rpm e temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, as frações de células mononucleares resultantes foram coletadas. As células em cada fração foi lavada uma vez com Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (Sigma) contendo 10% de FBS (a seguir referido como "10% de FBS/D-MEM"), e, em seguida, suspensas a uma densidade de 5 x 106 células/ml ou 2,5 x 106 células/ml em 10% de FBS/D-MEM. As suspensões de células foram utilizadas como soluções de PBMC humano nas experiências subsequentes. (2) Preparação de células alvo

[00920] SK-pca13a resultante da expressão forçada de epirregulina humano em SK-Hep-1, SKE18, linhagem celular de câncer do cólon humano DLD-1, ou linhagem celular de pâncreas humano MIAPaCa-2 foram descoladas da placa, e 200 μl de 0,2 mg/mL de solução de Cal- ceina foi adicionado a 1 x 106 células ou 1,85 MBq de Cr-51 foi adicionado a 3 x 106 células. Células adicionados com Calcein ou Cr-51 foram incubadas em uma incubadora sob 5% de gás de dióxido de car- bono a 37 °C durante uma ou duas horas. Em seguida, as células foram lavadas uma vez com 10% de FBS/D-MEM, e suspensas a uma densidade de células de 2 x 105 células/ml em 10% de FBS/D-MEM. A suspensão de células foi usada como células alvo nas experiências subsequentes. (3-1) Calcein ou ensaio de liberação de crômio (atividade ADCC)

[00921] Atividade de ADCC foi avaliada com base em Calcein específico ou a taxa de liberação de crômio determinada pelo Calcein ou ensaio de liberação de crômio. Em primeiro lugar, as soluções de anticorpos preparadas para cada concentração (0, 0,004, 0,04, 0,4, 4, e 40 μg/mL) foram adicionadas em 50 μl de respectivos poços de uma placa de 96 poços de fundo U. Em seguida, 50 μl de alíquotas das células alvo preparadas como descrito em (2) foram semeadas (1 x 104 células/poço) e deixadas repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos. 100 μl de solução de PBMC humano preparado como descrito em (1) foi adicionado a cada poço (5 x 105 células/poço, ou 2,5 x 105 células/poço). As placas foram incubadas em 5 % de gás de dióxido de carbono em um incubador de CO2 a 37°C durante quatro horas, e, em seguida, centrifugadas. 100 μl de sobrenadante de cultura em cada poço das placas foi medido por fluorescência de Calceina e a radioatividade utilizando um contador gama e absorptiômetro. A taxa de liberação de crômio específica foi determinada pela seguinte fórmula: [Calceina específica ou taxa de liberação de cromo (%)] = (AC) x 100/(BC).

[00922] Nesta fórmula, "A" representa a fluorescência média de Calceina (comprimento de onda de excitação: 485 nm; comprimento de onda de fluorescência: 535 nm) ou radioatividade média (cpm) de 100 μl de sobrenadante de cultura em cada poço. "B" representa fluorescência de Calceina média (comprimento de onda de excitação: 485 nm; comprimento de onda de fluorescência: 535 nm) ou radioatividade média (cpm) de 100 μl de sobrenadante de cultura em um poço contendo as células alvo, 100 μl de 2% de solução aquosa NP-40 (Nonidet P-40; Nacalai Tesques), e 50 μl de FBS a 10%/D-MEM. Além disso, "C" representa a média de fluorescência de Calceina (comprimento de onda de excitação: 485 nm; comprimento de onda de fluorescência: 535 nm) ou radioatividade média (cpm) de 100 μl de sobrenadante de cultura em um poço contendo as células alvo e 150 μl de FBS a 10%/D-MEM. O teste foi realizado em triplicado. A média e desvio padrão da Calceina específica ou a taxa de liberação de crômio (%), que reflete ADCC de cada anticorpo de teste foram calculadas com base no ensaio descrito acima.

Claims (5)

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fc de IgG, em que a região Fc de IgG é composta por um heterodímero compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, e em que uma função da região Fc de IgG é alterada em comparação com a de um polipeptídeo em que a região Fc de IgG é composta por um homodímero compreendendo apenas o primeiro polipeptídeo, e em comparação com a de um polipeptídeo em que a região Fc de IgG é composta por um homodímero compreendendo apenas o segundo polipeptídeo, em que a alteração da função da região Fc é a melhora da seletividade da atividade de ligação a um receptor(es) FCY, em que a melhora da seletividade da atividade de ligação a um receptor FCY se refere à seletividade entre um receptor Fcy de ativação e um receptor Fcy inibitório, e em que o(s) receptor(es) Fcy de ativação é/são FcyRIIa R e FcyRIIa H ou FcyRIIIa, e o receptor Fcy inibitório é FcyRIIb, em que qualquer um conjunto de mutações de (i) a (vi) é introduzido na sequência de aminoácidos de qualquer polipeptídeo do primeiro polipeptídeo ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc do IgG1 humano, e qualquer um conjunto de mutações de (vii) a (ix) é introduzido na sequência de aminoácidos do outro polipeptídeo: (i) substituição de aminoácido L na posição 234 de acordo com a numeração EU com Y; substituição de aminoácido L na posição 235 de acordo com a de acordo com a numeração EU com Y; substituição de aminoácido G na posição 236 de acordo com a numeração EU com W; substituição de aminoácido H na posição 268 de acordo com a numeração EU com D, e substituição de aminoácido S na posição 298 de acordo com a numeração EU com A; (ii) substituição de aminoácido L na posição 234 de acordo com a numeração EU com Y; substituição de aminoácido L na posição 235 de acordo com a numeração EU com Y; substituição de aminoácido G na posição 236 de acordo com a numeração EU com W; substituição de aminoácido H na posição 268 de acordo com a numeração EU com D; substituição de aminoácido D na posição 270 de acordo com a numeração EU com E, e substituição de aminoácido S na posição 298 de acordo com a numeração EU com A; (iii) substituição de aminoácido L na posição 234 de acordo com a numeração EU com Y; substituição de aminoácido L na posição 235 de acordo com a numeração EU com Q; substituição de aminoácido G na posição 236 de acordo com a numeração EU com W; substituição de aminoácido S na posição 239 de acordo com a numeração EU com M; substituição de aminoácido H na posição 268 de acordo com a numeração EU com D; substituição de aminoácido D na posição 270 de acordo com a numeração EU com E, e substituição de aminoácido S na posição 298 de acordo com a numeração EU com A; (iv) substituição de aminoácido L na posição 234 de acordo com a numeração EU com Y; substituição de aminoácido L na posição 235 de acordo com a numeração EU com Y; substituição de aminoácido G na posição 236 de acordo com a numeração EU com W; substituição de aminoácido H na posição 268 de acordo com a numeração EU com D; substituição de aminoácido S na posição 298 de acordo com a numeração EU com A, e substituição de aminoácido A na posição 327 de acordo com a numeração EU com D; (v) substituição de aminoácido L na posição 234 de acordo com a numeração EU com Y; substituição de aminoácido L na posição 235 de acordo com a numeração EU com Y; substituição de aminoácido G na posição 236 de acordo com a numeração EU com W; substituição de aminoácido S na posição 239 de acordo com a numeração EU com M; substituição de aminoácido H na posição 268 de acordo com a numeração EU com D; substituição de aminoácido S na posição 298 de acordo com a numeração EU com A, e substituição de aminoácido A na posição 327 de acordo com a numeração EU com D; (vi) substituição de aminoácido L na posição 234 de acordo com a numeração EU com Y; substituição de aminoácido L na posição 235 de acordo com a numeração EU com Y; substituição de aminoácido G na posição 236 de acordo com a numeração EU com W; substituição de aminoácido S na posição 239 de acordo com a numeração EU com M; substituição de aminoácido H na posição 268 de acordo com a numeração EU com D; substituição de aminoácido S na posição 298 de acordo com a numeração EU com A; substituição de aminoácido A na posição 327 de acordo com a numeração EU com D; substituição de aminoácido L na posição 328 de acordo com a numeração EU com W; e substituição de aminoácido K na posição 334 de acordo com a numeração EU com L; (vii) substituição de aminoácido K na posição 326 de acordo com a numeração EU com D; substituição de aminoácido A na posição 330 de acordo com a numeração EU com M; e substituição de aminoácido K na posição 334 de acordo com a numeração EU com E; (viii) a substituição de aminoácido D na posição 270 de acordo com a numeração EU com E; substituição de aminoácido K na posição 326 de acordo com a numeração EU com D; substituição de aminoácido A na posição 330 de acordo com a numeração EU com M; e substituição de aminoácido K na posição 334 de acordo com a numeração EU com E; (ix) substituição de aminoácido D na posição 270 de acordo com a numeração EU com E; substituição de aminoácido K na posição 326 de acordo com a numeração EU com D; substituição de aminoácido A na posição 330 de acordo com a numeração EU com K; e substituição de aminoácido K na posição 334 de acordo com a numeração EU com E.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o conjunto de mutações introduzido no primeiro polipeptídeo e no segundo polipeptídeo é selecionado do grupo consistindo nos seguintes (a) a (f): (a) as mutações de (iii) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácidos de qualquer polipeptídeo do primeiro polipeptídeo ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc de IgG e as mutações de (viii) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo; (b) as mutações de (i) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácidos de qualquer polipeptídeo do primeiro polipeptídeo ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc de IgG e as mutações de (vii) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo; (c) as mutações de (ii) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácidos de qualquer polipeptídeo do primeiro polipeptídeo ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc de IgG e as mutações de (viii) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo; (d) as mutações de (iv) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácidos de qualquer polipeptídeo do primeiro polipeptídeo ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc de IgG e as mutações de (ix) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo; (e) as mutações de (v) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácidos de qualquer polipeptídeo do primeiro polipeptídeo ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc de IgG e as mutações de (ix) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo; e (f) mutações de (vi) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácidos de qualquer polipeptídeo do primeiro polipeptídeo ou do segundo polipeptídeo que constitui a região Fc de IgG e as mutações de (ix) definidas na reivindicação 1 são introduzidas na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que uma alteração de aminoácidos é introduzida adicionalmente para transmitir diferença em pontos isoelétricos entre o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo; e em que a alteração de aminoácido para conferir diferença em pontos isoelétricos é definida pela: (1) introdução de uma mutação de aminoácidos num local de aminoácido selecionado do grupo consistindo em Gly na posição 137, Gly na posição 138, Thr na posição 139, Lys na posição 147, Ser na posição 192, Leu na posição 193, Gln na posição 196, Tyr na posição 198, Ile na posição 199, Asn na posição 203, Lys na posição 214, Val na posição 263, Glu na posição 272, Lys na posição 274, Tyr na posição 278, Lys na posição 288, Lys na posição 290, Gly na posição 316, Lis na posição 317, Lys na posição 320, Lys na posição 324, Thr na posição 335, Ser na posição 337, Lys na posição 340, Leu na posição 358, Lys na posição 360, Gln na posição 362, Ser na posição 364, Ser na posição 383, Asn na posição 384, Gly na posição 385, Gln na posição 386, Pro na posição 387, Asn na posição 390, Val na posição 397, e Val na posição 422 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácidos do primeiro polipeptídeo e/ou do segundo polipeptídeo; ou (ii) a introdução de uma mutação de um aminoácido selecionado do grupo consistindo em Gln na posição 196, Ile na posição 199, Val na posição 263, Glu na posição 272, Gly na posição 316, Leu na posição 358, Ser na posição 364, Ser na posição 383, Pro na posição 387, e Val na posição 397 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácidos de qualquer polipeptídeo do primeiro polipeptídeo ou do segundo polipeptídeo, e introdução de uma mutação de um aminoácido selecionado do grupo constituído por Gly na posição 137, Gly na posição 138, Thr na posição 139, Lys na posição 147, Ser na posição 192, Leu na posição 193, Tyr na posição 198, Ile na posição 199, Asn na posição 203, Lys na posição 214, Lys na posição 274, Tyr na posição 278, Lys na posição 288, Lys na posição 290, Gly na posição 316, Lys na posição 317, Lys na posição 320, Lys na posição 324, Thr na posição 335, Ser na posição 337, Lys na posição 340, Leu na posição 358, Lys na posição 360, Gln na posição 362, Ser na posição 383, Asn na posição 384, Gly na posição 385, Gln na posição 386, Asn na posição 390, e Val na posição 422 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácidos do outro polipeptídeo.

4. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma molécula de ligação ao antígeno.

5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo, um anticorpo biespecífico, ou uma molécula de fusão de Fc tal como uma proteína de fusão de Fc de peptídeo ou proteína de fusão de Fc scaffold.

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