TWI687439B - 異源二聚化多胜肽 - Google Patents

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Abstract

本案發明人等，藉由製作具有由胺基酸序列不同的2個多胜肽(第一多胜肽及第二多胜肽)構成之Fc區之異源二聚化多胜肽，成功地製作包含比起習知技術之該Fc區僅由第一多胜肽構成之同源二聚化體或由第二多胜肽構成之同源二聚化體，Fc區之機能有所改善之Fc區之異源二聚化多胜肽。

Description

異源二聚化多胜肽
本發明提供來自於天然來源的抗體不變區的胺基酸序列經過改變的抗體不變區、包含該不變區之抗體、包含該抗體之醫藥組合物、及此等的製造方法。
抗體由於在血液中之安定性高、副作用亦少，作為醫藥品受到重視(非專利文獻1、非專利文獻2)。現在上市的抗體醫藥幾乎都是人類IgG1次類的抗體。針對IgG類的抗體之效應子機能即抗體依存性細胞抑制活性(以下，表示記載為ADCC)、補體依存性細胞抑制活性(以下，表示記載為CDC)，至今為止已有多數研究進行，據報告，人類IgG類中以IgG1次類的抗體有最高的ADCC活性、CDC活性(非專利文獻3)。又，經由IgG類抗體之標的細胞之吞噬作用亦即抗體依存性細胞中介性吞噬作用(ADCP)，也顯示是抗體之效應子機能之一(非專利文獻4、非專利文獻5)。
IgG抗體之ADCC、CDC、ADCP之展現，需要抗體Fc區、與殺手細胞、天然殺手細胞、經活化之巨噬體等效應子細胞表面上所存在之抗體受體(以下，記載為Fc γ R)及各種補體成分結合。人類的Fc γ R蛋白質家族中據報告有Fc γ RIa、Fc γ RIIa、Fc γ RIIb、Fc γ RIIIa、Fc γ RIIIb之同功異形體(isoform)，也據報告有各自的異型(allotype)(非專利文獻6)。
ADCC、ADCP及CDC等細胞傷害性效應子機能之增強， 作為用於增強抗體之抗腫瘤效果之有希望的方法而受重視。為了抗體之抗腫瘤效果之經由Fc γ R之效應子機能之重要性，已有使用小鼠模型的報告(非專利文獻7、非專利文獻8)。又，在人類觀察到臨床效果、與Fc γ RIIIa之高親和性多型異型(V158)與低親和性多型異型(F158)之間有相關性(非專利文獻9)。從該等報告顯示，具有對於特定Fc γ R之結合經過最適化之Fc區的抗體，會媒介更強的效應子機能，並藉此發揮更為有效的抗腫瘤效果。
抗體對於由Fc γ RIa、Fc γ RIIa、Fc γ RIIIa、Fc γ RIIIb構成之活化受體、由Fc γ RIIb構成之抑制性受體各別之結合活性的均衡性，在最適化抗體之效應子機能方面為重要的要素。藉由使用對於活化受體之結合活性增強且對於抑制性受體之結合活性減低的Fc區，可能對於抗體賦予最適的效應子機能(非專利文獻10)。又，反之，藉由使用對於活化受體之結合活性予以維持或減低，且對於抑制性受體之結合活性經增強之Fc區，可能對於抗體賦予免疫抑制作用(非專利文獻11)。針對Fc區與Fc γ R之結合，據揭示：抗體之鉸鏈區及CH2分域內的數個胺基酸殘基及CH2分域所結合之EU編號297號的Asn上加成的糖鏈係為重要(非專利文獻12、非專利文獻13、非專利文獻14)。以該鍵結部位為中心，至今為止已有各種各樣具有Fc γ R結合特性之Fc區之變異體受到探討，已獲得了具有更高活化Fc γ R結合活性之Fc區變異體(專利文獻1、專利文獻2)。例如：Lazar等人，藉由將人類IgG1之EU編號239號的 Ser、330之Ala、332之Ile分別取代成Asp、Leu、Glu，成功地增加對於人類Fc γ RIIIa(V158)之結合達約370倍(非專利文獻15、專利文獻2)。該改變體相較於野生型，對於Fc γ RIIIa與Fc γ IIb之結合之比例(A/I比)成為約9倍。又，Lazar等人也成功地增強對於Fc γ IIb之結合約430倍(非專利文獻16)。Shinkawa等人藉由使在EU編號297號的Asn加成之糖鏈之岩藻糖缺損，成功地增強對於Fc γ RIIIa之結合達約100倍(非專利文獻17)。
但是至今為止，對於所報告的抗體之Fc區之機能改變有其極限，需要更優異的Fc區之機能改變。
【先前技術文獻】
【專利文獻】
【專利文獻1】WO 2000/042072
【專利文獻2】WO 2006/019447
【專利文獻3】WO 2009/041062
【專利文獻4】WO 2006/106905
【非專利文獻】
【非專利文獻1】Nature Biotechnology、23、1073-1078 (2005)
【非專利文獻2】Eur. J. Pharm. Biopharm、59 (3)、389-96 (2005)
【非專利文獻3】Chemical Immunology、65、88 (1997)
【非專利文獻4】Cancer Res.、68、8049-8057 (2008)
【非專利文獻5】Blood、113, 3735-3743 (2009)
【非專利文獻6】Immunol. Lett. 82、57-65 (2002)
【非專利文獻7】Pro. Nat. Acad. Sci. 95:652-656 (1998)
【非專利文獻8】Nature Medicine、6:443-446 (2000)
【非專利文獻9】Blood 99:754-758 (2002)
【非專利文獻10】Science、310、1510-1512 (2005)
【非專利文獻11】Science、291、484-486 (2001)
【非專利文獻12】Chemical Immunology、65、88 (1997)
【非專利文獻13】Eur. J. Immunol. 23、1098 (1993)
【非專利文獻14】Immunology、86、319 (1995)
【非專利文獻15】Pro. Nat. Acad. Sci.、103、4005-4010 (2006)
【非專利文獻16】Mol. Immun. 45、3926-3933 (2008)
【非專利文獻17】J. Biol. Chem.、278、3466-3473 (2003)
本發明係有鑑於如此的狀況而產生，其課題為提供相較於習知之同源二聚化體且為具有Fc區之多胜肽，該Fc區之機能有所改善之多胜肽、含有該多胜肽之醫藥組合物、含有該醫藥組合物之免疫發炎性疾病之治療劑或預防劑、各種癌症之治療劑或預防劑、及此等之製造方法。再者，本發明之課題在於提供相較於為習知之同源二聚化體且為具有Fc區之多胜肽，改善該Fc區之機能之方法。
本案發明人等為了解決上述課題努力研究。其結果，本案發明人等藉由製作具有由胺基酸序列不同的2種多胜肽(第一多胜肽及第二多胜肽)構成之Fc區之異源二聚化多胜肽，成功地製作了相較於為習知技術之該Fc區僅由第一多胜肽構成之同源二聚化體或由第二多胜肽構成的同源二聚化體，Fc區之機能有所改善之含Fc區之異源二聚化多胜肽。
本發明更具體而言提供以下[1]~[78]。
[1]一種多胜肽，包含Fc區且該Fc區係由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成，其特徵為：相較於由該Fc區僅包含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽及由該Fc區僅包含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，該Fc區之機能改變。
[2]如[1]之多胜肽，其中，前述Fc區中，導入至少1個以上的胺基酸變異。
[3]如[1]或[2]之多胜肽，其中，前述胺基酸變異包含至少以下至少1種變異：相較於未導入變異之情形及對於第一多胜肽及第二多胜肽之兩者之Fc區導入變異之情形，僅對於其中之一之Fc區導入變異之情形中之該Fc區之機能更為提高之胺基酸變異。
[4]如[2]或[3]之多胜肽，其中，於前述Fc區之CH2區導入至少一種以上之胺基酸變異。
[5]如[4]之多胜肽，其中，於前述Fc區之CH2區，在選自 於由EU編號231號的Ala、EU編號232號的Pro、EU編號233號的Glu、EU編號234號的Leu、EU編號235號的Leu、EU編號236號的Gly、EU編號237號的Gly、EU編號238號的Pro、EU編號239號的Ser、EU編號240號的Val、EU編號265號的Asp、EU編號266號的Val、EU編號267號的Ser、EU編號268號的His、EU編號269號的Glu、EU編號270號的Asp、EU編號271號的Pro、EU編號295號的Gln、EU編號296號的Tyr、EU編號298號的Ser、EU編號300號的Tyr、EU編號324號的Ser、EU編號325號的Asn、EU編號326號的Lys、EU編號327號的Ala、EU編號328號的Leu、EU編號329號的Pro、EU編號330號的Ala、EU編號331號的Pro、EU編號332號的Ile、EU編號333號的Glu、EU編號334號的Lys、EU編號335號的Thr、EU編號336號的Ile、及EU編號337號的Ser構成的群組中的胺基酸部位，導入至少一種以上的胺基酸變異。
[6]如[1]~[5]中任一項之多胜肽，其中，前述Fc區之機能之改變，係選自於由對於Fc γ受體之結合活性之增強、及結合之選擇性之提高構成的群組中之至少1個以上的改變。
[7]如[6]之多胜肽，其中，前述Fc區之機能之改變係對於Fc γ受體之結合活性之增強。
[8]如[7]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體係選自於由Fc γ RIa、Fc γ RIIa R、Fc γ RIIa H、Fc γ RIIb、及 Fc γ RIIIa構成之群組中之至少1個以上之受體。
[9]如[8]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體為Fc γ RIa。
[10]如[9]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表2-1及表2-2之i區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異。
[11]如[9]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表2-1、表2-2及表2-3之ii區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[12]如[8]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體為Fc γ RIIa R。
[13]如[12]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表3-1及表3-2之i區記載之胺基酸變異構成之群組中的至少1個以上的胺基酸變異。
[14]如[12]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表3-1及表3-2之ii區記載之胺基酸變異構成的群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[15]如[8]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體為Fc γ RIIa H。
[16]如[15]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於說明書表4之i區記載之胺基酸變異構成的群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[17]如[15]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表4之ii區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[18]如[8]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體為Fc γ RIIb。
[19]如[18]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表5之i區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[20]如[18]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於說明書表5之ii區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[21]如[8]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體為Fc γ RIIIa。
[22]如[21]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表6之i區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[23]如[21]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表6之ii區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[24]如[6]之多胜肽，其中，前述Fc區之機能之改變為對於Fc γ受體之結合活性之選擇性之提高。
[25]如[24]之多胜肽，其中，前述對於Fc γ受體之結合活性之選擇性之提高，係活性型Fc γ受體與抑制型Fc γ受體之間之選擇性。
[26]如[25]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體中，活性型Fc γ受體係選自於由Fc γ RIa、Fc γ RIIa R、Fc γ RIIa H、及Fc γ RIIIa構成之群組中之至少1個以上之受體，且抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb。
[27]如[26]之多胜肽，其中，前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIa，且前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於對於Fc γ RIIb，對於之Fc γ RIa之結合活性選擇性的增強。
[28]如[27]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表19-1、表19-2、表19-3及表19-4之a區記載之胺基酸變異構成之群組之至少1個以上之胺基酸變異。
[29]如[27]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表19-1、表19-2、表19-3、表19-4及表19-5之b區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[30]如[26]之多胜肽，前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIa、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於比起對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIa之結合活性選擇的被減弱。
[31]如[30]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表23-1及表23-2之c區記載之胺基酸變異構成之群組中之 至少1個以上之胺基酸變異。
[32]如[30]之多胜肽，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表23-1及表23-2之d區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[33]如[26]之多胜肽，前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa R、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa R之結合活性選擇性的被增強。
[34]如[33]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表20-1之a區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[35]如[33]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表20-1、表20-2及表20-3之b區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[36]如[26]之多胜肽，其中，前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa R、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa R之結合活性選擇性的被減弱。
[37]如[36]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表24-1之c區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[38]如[36]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表24-1及表24-2之d區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[39]如[26]之多胜肽，前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa H、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa H之選擇性的被增強。
[40]如[39]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表21-1之a區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[41]如[39]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表21-1、表21-2及表21-3之b區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[42]如[26]之多胜肽，其中，前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa H、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa H之結合活性選擇性的被減弱。
[43]如[42]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表25-1及表25-2之c區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[44]如[42]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽 及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表25-1、表25-2及表25-3之d區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[45]如[26]之多胜肽，其中，前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIIa、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIIa之選擇性的被增強。
[46]如[45]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表22-1之a區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[47]如[45]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表22-1、表22-2及表22-3之b區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[48]如[26]之多胜肽，其中，前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIIa、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIIa之結合活性選擇性的被減弱。
[49]如[48]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表26-1及表26-2之c區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[50]如[48]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表 26-1、表26-2、表26-3及表26-4之d區記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[51]如[1]、[21]或[45]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由以下構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異：EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y或Q、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號298號的胺基酸S取代為A、EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號327號的胺基酸A取代為D、EU編號328號的胺基酸L取代為W、EU編號330號的胺基酸A取代為M或K及EU編號334號的胺基酸K取代為E或L。
[52]如[1]、[21]或[45]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，對於選自於以下至少1個以上胺基酸導入變異：EU編號234號的Leu、235號的Leu、236號的Gly、239號的Ser、268號的His、270號的Asp、298號的Ser、EU編號326號的Lys、327號的Ala、328號的Leu、330號的Ala及334號的Lys。
[53]如[1]、[21]或[45]之多胜肽，其中，於構成前述Fc區之第一多胜肽或第二多胜肽其中之一之多胜肽之胺基酸序列中，對於選自於以下至少1個以上胺基酸導入變異：EU編號234號的Leu、235號的Leu、236號的Gly、239號的 Ser、268號的His、270號的Asp、298號的Ser、327號的Ala、328號的Leu及334號的Lys，且在其中另一多胜肽之胺基酸序列，對於選自於以下至少1個以上胺基酸導入變異：EU編號270號的Asp、EU編號326號的Lys、330號的Ala及334號的Lys。
[54]如[1]、[21]或[45]之多胜肽，其中，於構成前述Fc區之第一多胜肽或第二多胜肽中其中之一之多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由以下構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異：EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y或Q、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號298號的胺基酸S取代為A及EU編號327號的胺基酸A取代為D、EU編號328號的胺基酸L取代為W及EU編號334號的胺基酸K取代為L構成之群組，並於其中另一多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由以下構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異：EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為M或K、EU編號334號的胺基酸K取代為E。
[55]如[1]、[21]或[45]之多胜肽，其中，於構成前述Fc區之第一多胜肽或第二多胜肽中其中之一之多胜肽之胺基酸序列中，導入(i)至(vi)中任一變異，其中另一多胜肽之 胺基酸序列中，導入(vii)至(ix)中任一變異：
(i)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號268號的胺基酸H取代為D及EU編號298號的胺基酸S取代為A
(ii)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基酸D取代為E及EU編號298號的胺基酸S取代為A
(iii)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Q、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基酸D取代為E及EU編號298號的胺基酸S取代為A
(iv)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號298號的胺基酸S取代為A及EU編號327號的胺基酸A取代為D
(v)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號298號的胺基酸S取代為A及EU編號327號的胺基酸A取代為D
(vi)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號 的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號298號的胺基酸S取代為A、EU編號327號的胺基酸A取代為D、EU編號328號的胺基酸L取代為W及EU編號334號的胺基酸K取代為L
(vii)EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為M及EU編號334號的胺基酸K取代為E
(viii)EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為M及EU編號334號的胺基酸K取代為E
(ix)EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為K及EU編號334號的胺基酸K取代為E。
[56]一種多胜肽，其係包含Fc區且該Fc區由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成，其特徵為：相較於由該Fc區僅包含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽或由該Fc區僅包含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，該Fc區之機能有所改變。
[57]如[56]之多胜肽，其中，前述Fc區之機能之改變為選自於由以下構成之群組中之至少一種以上之改變：多胜肽對於Fc γ受體之結合活性之增強、結合之減弱、及結合之選擇性之提高。
[58]如[57]之多胜肽，其中，前述Fc區之機能之改變為物理化學的安定性更為提高。
[59]如[58]之多胜肽，其中，前述物理化學的安定性提高的改變，係指Fc區由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成之多胜肽，相較於該Fc區由僅含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽或該Fc區由僅含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，具有較高之Tm。
[60]如[57]至[59]中任一項之多胜肽，其中，前述Fc區之機能之改變係對於Fc γ受體之結合活性之增強，且該Fc γ受體係選自於由Fc γ RIa、Fc γ RIIa R、Fc γ RIIa H、Fc γ RIIb、及Fc γ RIIIa構成之群組中之至少1個以上之受體。
[61]如[60]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體為Fc γ RIa。
[62]如[61]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表31-1、表31-2及表31-3記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[63]如[60]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體為Fc γ RIIa R。
[64]如[63]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表32-1及表32-2記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[65]如[60]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體為Fc γ RIIa H。
[66]如[65]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表33-1及表33-2記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1 個以上之胺基酸變異。
[67]如[60]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體為Fc γ RIIb。
[68]如[67]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表34-1及表34-2記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[69]如[60]之多胜肽，其中，前述Fc γ受體為Fc γ RIIIa。
[70]如[69]之多胜肽，其中，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表35-1及表35-2記載之胺基酸變異構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異。
[71]如[1]至[70]中任一項之多胜肽，更導入用以對於第一多胜肽與第二多胜肽之等電點賦予差異的胺基酸改變。
[72]如[71]之多胜肽，其中，用於賦予等電點之差異之胺基酸改變，係在第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，於選自於由EU編號137號的Gly、138號的Gly、139號的Thr、147號的Lys、192號的Ser、193號的Leu、196號的Gln、198號的Tyr、199號的Ile、203號的Asn、214號的Lys、263號的Val、272號的Glu、274號的Lys、278號的Tyr、288號的Lys、290號的Lys、316號的Gly、317號的Lys、320號的Lys、324號的Lys、335號的Thr、337號的Ser、340號的Lys、358號的Leu、360號的Lys、362號的Gln、364號的Ser、383號的Ser、384號的Asn、385號的Gly、386號的Gln、387號的Pro、390號的Asn、397 號的Val及422號的Val構成之群組中之胺基酸部位中導入至少1種胺基酸變異。
[73]如[71]之多胜肽，其中，用於賦予等電點之差異之胺基酸改變，係於第一多胜肽或第二多胜肽之中任一者的多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由EU編號196號的Gln、199號的Ile、263號的Val、272號的Glu、316號的Gly、358號的Leu、364號的Ser、383號的Ser、387號的Pro及397號的Val構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異，並於其中另一多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由EU編號137號的Gly、138號的Gly、139號的Thr、147號的Lys、192號的Ser、193號的Leu、198號的Tyr、199號的Ile、203號的Asn、214號的Lys、274號的Lys、278號的Tyr、288號的Lys、290號的Lys、316號的Gly、317號的Lys、320號的Lys、324號的Lys、335號的Thr、337號的Ser、340號的Lys、358號的Leu、360號的Lys、362號的Gln、383號的Ser、384號的Asn、385號的Gly、386號的Gln、390號的Asn及422號的Val構成之群組中之至少1種胺基酸變異。
[74]如[1]至[73]中任一項之多胜肽，其中，前述多胜肽為抗原結合分子。
[75]如[74]之多胜肽，其中，前述抗原結合分子為抗體、雙專一性抗體、胜肽Fc融合蛋白質、或支架Fc融合蛋白質等Fc融合分子。
[76]一種醫藥組合物，其係包含如[74]或[75]之多胜肽及 醫學上可容許之載體。
[77]一種改變多胜肽之機能之方法，係改變包含Fc區之多胜肽之機能之方法，包含以下步驟：藉由對於構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽導入胺基酸變異使該Fc區成為異源二聚物，並藉由導入胺基酸變異，使比起該Fc區成為同源二聚物之情形，Fc區之機能有所改變。
[78]一種製造包含Fc區之多胜肽之方法，其係製造包含Fc區之多胜肽之方法，包含以下步驟：藉由對於構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽導入胺基酸變異使該Fc區成為異源二聚物，並藉由導入胺基酸變異，使相較於該Fc區成為同源二聚物之情形，Fc區之機能有所改變。
依本發明，藉由改變抗體之不變區之胺基酸序列，提供結合活性改變且及物性(例如：安定性、均勻性)有所改善之適於作為醫藥品之多胜肽。
【實施發明之形態】
以下定義係為了容易理解本說明書說明之本發明而提供。
本發明提供一種多胜肽，其係包含Fc區且該Fc區由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成，相較於該Fc區僅由含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜 肽及該Fc區僅由含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，該Fc區之機能經過改變。再者，也提供該多胜肽之製造方法及含Fc區之多胜肽之機能之改變方法等。
本發明中，「含Fc區且該Fc區由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成之多胜肽」，也可指由第一多胜肽及第二多胜肽、及其他多數多胜肽構成之多胜肽複合體。
本說明書中，「第一多胜肽」及「第二多胜肽」係指構成抗體之Fc區之多胜肽。「第一多胜肽」及「第二多胜肽」彼此序列不同，較佳為至少CH2區之序列係不同。該多胜肽，可為例如構成天然型IgG之Fc區之多胜肽，也可為對於構成天然型IgG之Fc區之多胜肽加以改變而得之多胜肽。
天然型IgG，包含與天然發現的IgG為相同之胺基酸序列，意指屬於由免疫球蛋白gamma基因實質上編碼的抗體之類的多胜肽。例如天然型人類IgG，係指天然型人類IgG1、天然型人類IgG2、天然型人類IgG3、天然型人類IgG4等。天然型IgG，也包括從其自然產生的變異體等。
本發明中「多胜肽」，通常係指具有約10個胺基酸以上之長度之胜肽、及蛋白質。又，通常為生物來源的多胜肽但不特別限定，也可為例如由人工設計之序列構成的多胜肽。又，也可為天然多胜肽、或合成多胜肽、重組多胜肽等任一者。又，本發明中蛋白質分子，指包含該多胜肽之分子。
本發明之多胜肽之理想例可列舉抗體。更理想之例，可列舉天然型IgG，尤其天然型人類IgG。天然型IgG，係包含與天然發現的IgG為相同之胺基酸序列，且意指屬於由免疫球蛋白gamma基因實質上編碼的抗體之類別的多胜肽。例如天然型人類IgG，意指天然型人類IgG1、天然型人類IgG2、天然型人類IgG3、天然型人類IgG4等。天然型IgG也包括從其中自然產生的變異體等。
抗體之輕鏈不變區存在IgK(Kappa、κ鏈)、IgL1、IgL2、IgL3、IgL6、IgL7(Lambda、λ鏈)型之不變區，但可為任一輕鏈不變區。人類IgK(Kappa)不變區與人類IgL7(Lambda)不變區，由於基因多型而有多數異型序列係已記載於Sequences of proteins of immunological interest、NIH Publication No.91-3242，但本發明中可為其中任一者。再者，本發明中輕鏈不變區，也可為經過胺基酸取代、加成、缺損、插入及/或修飾等改變之輕鏈不變區。抗體之Fc區，例如存在IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM型之Fc區。本發明之抗體之Fc區，可使用例如人類IgG抗體之Fc區，較佳為人類IgG1抗體之Fc區。本發明之Fc區，可使用例如：天然型IgG之不變區，具體而言，以天然型人類IgG1作為起源之不變區(序列編號：76)、以天然型人類IgG2作為起源之不變區(序列編號：77)、以天然型人類IgG3作為起源之不變區(序列編號：78)、以天然型人類IgG4作為起源之不變區(序列編號：79)之Fc區。圖32顯示天然型IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4之不變區之序列。天然型IgG之不變區也包括從其中自然產生之變異體等。人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4抗體之不變區，由於基因多型而有多數異型序列已記載於Sequences of proteins of immunological interest、NIH Publication No.91-3242，但本發明中可為其中任一者。尤其就人類IgG1之序列而言，可為EU編號356-358號的胺基酸序列為DEL者或為EEM者均可。
又，據報告抗體之Fc區與Fc γ R之交互作用之強度依存於Zn2+離子濃度(Immunology Letters 143(2012)60-69)。抗體的Fc區之Zn2+離子濃度愈高，則Fc區與FcgR之交互作用愈增強。抗體之Fc區之CH3存在之His310、His435藉由螯合Zn2+，將位於遠位的Fc區之各CH2分域打開。藉此，CH2分域與FcgR之交互作用變得容易，且Fc區與FcgR之交互作用增強。本發明之Fc區之一非限定態樣，可列舉EU編號表示之310位之His、435位之His、433位之His及/或434位之Asn有Zn2+螯合的Fc區。
本發明中，「Fc區」係指由抗體分子中之鉸鏈部或其一部分、CH2、CH3分域構成之區。IgG類之Fc區，為EU編號(本說明書也稱為EU INDEX)例如226號的半胱胺酸至C末端、或230號的脯胺酸至C末端，但不限於此。
Fc區，可藉由將IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體等利用胰蛋白酶等蛋白質分解酵素部分消化之後，將吸附於Protein A管柱或Protein G管柱之級分(fraction)予以再溶出而理想地獲得。該蛋白分解酵素，只要是可藉由 適當設定pH等酵素之反應條件而以限制地產生Fab或F(ab’)2之方式將全長抗體予以消化者即可，無特別限定，可列舉例如：胰蛋白酶或木瓜酶等。
本說明書中，「異源二聚化」，係指從胺基酸序列不同的二種多胜肽構成一個多胜肽，「異源二聚化體」，係指從胺基酸序列不同的二種多胜肽構成之多胜肽。又，「同源二聚化」，係指從具有相同胺基酸序列之二種多胜肽構成一個多胜肽，「同源二聚化體」，係指由2個相同胺基酸序列構成多胜肽，或為了有效率地形成異源二聚化而作之改變、或為了有效率地精製異源二聚化體而做的改變以外由相同胺基酸序列構成之多胜肽，或不是為了改善Fc之機能之改變以外由相同胺基酸構成之多胜肽所構成的多胜肽。本發明中，「異源二聚化體」或「同源二聚化體」，較佳為針對Fc區的「異源二聚化」或「同源二聚化」，更佳為針對Fc區中之CH2的「異源二聚化」或「同源二聚化」。又，「母多胜肽」，係指導入胺基酸變異等改變之前之多胜肽。
本發明之胺基酸變異，可單獨使用也可將多數組合使用。
將多數組合使用之情形，組合數不特別限定，可在能達成發明目的之範圍內適當設定，例如：2個以上30個以下，較佳為2個以上15個以下。
將多數組合時，可以僅對於構成Fc區之2個多胜肽之其中之一施加該胺基酸變異，也可對於2個多胜肽之兩者 適當分配施加胺基酸變異。
又，本發明中，為了獲得Fc區之更高機能之改變效果，相較於未導入變異之情形及對於2個多胜肽之兩個Fc區導入變異之情形，僅對於其中之一導入變異之情形，宜導入使該Fc區之機能提高之胺基酸變異至少1種較佳。
改變的部位，只要是Fc區即可，不特別限定，可在能達成本發明目的之範圍內適當設定，例如鉸鏈區、CH2區、CH3區等。
更佳為經改變之部位為CH2區。又，CH2區，係指從EU編號231號至340號、CH3區係指從EU編號341號至447號。例如：對於以人類IgG1為起源之不變區之胺基酸序列導入變異之情形，可在從EU編號118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、233、239、240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447選出的1個以上之位置對於胺基酸殘基施加改變。
更具體而言，當對於人類IgG1不變區之胺基酸序列導入改變之情形，可對於從EU編號226、227、228、229、 230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447選出之1個以上之位置的胺基酸殘基施加改變。
更具體而言，當對於人類IgG1不變區之胺基酸序列導 入改變之情形，可對於從EU編號226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340選出之1個以上之位置之胺基酸殘基施加改變。
更具體而言，當對於人類IgG1不變區之胺基酸序列導入變異的情形，可對於從EU編號231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、265、266、267、268、269、270、271、295、296、298、300、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337選出之1個以上之位置的胺基酸殘基施加改變。
本發明中胺基酸之改變，係指取代、缺損、加成、插入或修飾中之任一者，或此等的組合。本發明中，胺基酸之改變可替代稱為胺基酸之變異，以相同含意使用。
取代
取代胺基酸殘基之情形，係藉由取代為其他胺基酸殘 基，而達成針對例如以下(a)~(c)之點的改變。
(a)片結構、或螺旋結構之區之多胜肽之骨架結構；(b)標的部位之電荷或疏水性、或(c)側鏈之大小。
胺基酸殘基，依據一般的側鏈特性分類為以下群組：(1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)鹼性：his、lys、arg；(5)影響鏈之配向之殘基：gly、pro；及(6)芳香族性：trp、tyr、phe。
該等各群組內的胺基酸殘基之取代稱為保守性取代，另一方面，在與其他群組間彼此間的胺基酸殘基的取代稱為非保守性取代。
本發明中取代，可為保守性取代，也可為非保守性取代，且也可為保守性取代與非保守性取代之組合。
又，本發明之多胜肽，除了基於本發明所導入之胺基酸變異以外，也可更包含加成性的改變。加成性的改變，例如可從胺基酸之取代、缺損、或修飾中之任一者或此等的組合中選擇。
例如：可對於本發明之多胜肽，在對於該多胜肽欲達成目的之功能無造成實質變化的範圍內任意施以改變。本發明之多胜肽為抗體之情形，可以對於重鏈或輕鏈施加改變。例如如此的變異可以利用胺基酸殘基之保守性取代進行。又，即使是會對於本發明之多胜肽欲達成之功能造成 變化之改變，只要是該功能之變化在本發明之目的範圍內即可施行如此的改變。
本發明中，對於胺基酸序列之改變包括轉譯後修飾。具體的轉譯後修飾，可列舉糖鏈之加成或缺損。比如，IgG1不變區中，EU編號之297號的胺基酸殘基可為經糖鏈修飾者。修飾之糖鏈結構不限定。一般而言，於真核細胞表現之抗體，於不變區包含糖鏈修飾。因此於如以下之細胞表現之抗體，通常會以某個糖鏈修飾。
‧哺乳動物之抗體產生細胞
‧經過以包含編碼為抗體之DNA之表現載體進行轉形(transformation)之真核細胞
在此所示之真核細胞包括酵母或動物細胞。例如，CHO細胞或HEK293H細胞，係用於以包含編碼為抗體之DNA之表現載體進行轉形的代表的動物細胞。另一方面，該位置無糖鏈修飾者也包括在本發明之抗體。不變區未經糖鏈修飾之抗體，可藉由使編碼為抗體之基因於大腸菌等原核細胞表現而獲得。
本發明中，加成性改變更具體而言，可為例如對於Fc區之糖鏈加成有唾液酸者(MAbs.2010 Sep-Oct；2(5)：519-27.)。
本發明之多胜肽為抗體之情形，可對於抗體不變區部分，施行例如使對於FcRn之結合活性提高之胺基酸取代(J Immunol.2006 Jan 1；176(1)：346-56、J Biol Chem.2006 Aug 18；281(33)：23514-24.、Int Immunol.2006 Dec；18(12)：1759-69.、Nat Biotechnol.2010 Feb；28(2)：157-9.、WO/2006/019447、WO/2006/053301、WO/2009/086320)、使抗體之異質性(heterogeneity)或安定性提高的胺基酸取代((WO/2009/041613))。
製作本發明之異源二聚化多胜肽時，需將具有彼此相異之胺基酸之多胜肽彼此組合(assembly)化、或將目的之異源二聚化多胜肽從其他同源二聚化多胜肽分離。
為了將具有Fc區之具不同胺基酸之多胜肽彼此組合化，可以應用對於抗體H鏈之第二不變區(CH2)或H鏈之第三不變區(CH3)之界面導入電荷性排斥而抑制非目的之H鏈彼此組合的技術(WO2006/106905)。
於對於CH2或CH3之界面導入電荷性排斥而抑制不欲之H鏈彼此之組合的技術，與H鏈之其他不變區之界面接觸之胺基酸殘基，例如CH3區之EU編號356號的殘基、EU編號439號的殘基、EU編號357號的殘基、EU編號370號的殘基、EU編號399號的殘基、EU編號409號的殘基所相對之區。
更具體而言，例如：包含2種H鏈CH3區之抗體中，可為從第1H鏈CH3區之以下(1)~(3)所示之胺基酸殘基之群組選出之1組至3組胺基酸殘基具有同種電荷之抗體；(1)H鏈CH3區包含之胺基酸殘基且為EU編號356位及439位之胺基酸殘基、(2)H鏈CH3區包含之胺基酸殘基且為EU編號357位及370位之胺基酸殘基、 (3)H鏈CH3區包含之胺基酸殘基且為EU編號399位及409位之胺基酸殘基。
再者，與上述第1H鏈CH3區相異之第2H鏈CH3區中，從前述(1)~(3)所示之胺基酸殘基之群組選出之胺基酸殘基之群組，且前述第1H鏈CH3區具同種電荷之前述(1)~(3)所示之胺基酸殘基之群組所對應的1組至3組胺基酸殘基，可為具有與前述第1H鏈CH3區中之對應胺基酸殘基有相反電荷之抗體。
上述(1)~(3)記載之各胺基酸殘基，在組合時會彼此接近。若為該技術領域中具有通常知識者，可針對所望之H鏈CH3區或H鏈不變區，使用市售軟體進行同源性模式建立(homology modeling)等，而發現上述(1)~(3)記載之胺基酸殘基所對應的部位，並適當將該部位之胺基酸殘基改變。
上述抗體中，「具電荷之胺基酸殘基」，例如宜從以下(X)或(Y)中任一群組包含之胺基酸殘基選出較佳；(X)麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)、(Y)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
上述抗體中，「具同種電荷」，係指例如：2個以上之胺基酸殘基中之任一者具有上述(X)或(Y)之任一群組包含之胺基酸殘基。「具有相反電荷」，係指例如：2個以上之胺基酸殘基中之至少1種胺基酸殘基具有上述(X)或(Y)中之任一群組包含之胺基酸殘基的情形，其餘的胺基酸殘基具有不同之群組包含之胺基酸殘基。
理想態樣中，上述抗體可為以雙硫鍵將第1H鏈CH3區與第2H鏈CH3區交聯。
本發明中供改變之胺基酸殘基，不限於上述抗體之可變區或抗體之不變區之胺基酸殘基。若為該技術領域中具有通常知識者，可針對多胜肽變異體或異種多聚物，利用使用市售軟體之同源性模式建立等，找出形成界面之胺基酸殘基，並進行該部位胺基酸殘基改變以控制其組合。
本發明之具有具Fc區之不同胺基酸之多胜肽彼此之組合化，可更使用其他公知技術。藉由將抗體之其中之一H鏈之可變區存在之胺基酸側鏈取代成較大的側鏈(knob；突起)，並將另一H鏈之相對的可變區存在之胺基酸側鏈取代為較小的側鏈(hole；空隙)，可以藉由突起能配置於空隙的方式，有效率地實施具有具Fc區之不同胺基酸彼此的組合化(WO1996/027011、Ridgway JB et al.、Protein Engineering(1996)9、617-621、Merchant AM et al.Nature Biotechnology(1998)16、677-681)。
此外，具有具Fc區之不同胺基酸的多胜肽彼此之組合化，也可更採用其他公知技術。藉由使用導入使抗體之其中之一之H鏈之CH3之一部分為對應於該部分之IgA來源之序列，且其中另一H鏈之CH3之互補部分導入對應於該部分之IgA來源的序列而得的strand-exchange engineered domain CH3，可藉由CH3之互補性組合化，有效率地進行具有不同序列之多胜肽之組合化(Protein Engineering Design & Selection、23；195-202、2010)。 使用該公知技術也能有效率地進行具有具Fc區之不同胺基酸之多胜肽彼此之組合化。
此外，也可使用WO2011/028952記載之利用抗體之CH1與CL之組合化、VH、VL之組合化之異源二聚化抗體製作技術。
又，即使無法有效率的形成異源二聚化多胜肽的情形，也可藉由將異源二聚化多胜肽分離、精製成同源二聚化多胜肽，而獲得異源二聚化多胜肽。當製作由彼此序列相異之第一多胜肽及第二多胜肽構成之異源二聚化多胜肽時，會混入僅由2個第一多胜肽構成之同源二聚化多胜肽、僅由2個第二多胜肽構成同源二聚化多胜肽作為雜質。就有效率地去除此等2種同源二聚化多胜肽之方法而言，可以使用公知技術。有人報告：藉由對於2種H鏈之可變區導入胺基酸取代，而賦予等電點之差異，能將2種類之同源體與目的之異源二聚化抗體利用離子交換層析精製之方法(WO2007114325)。將異源二聚化抗體予以精製之方法，至今為止有人報告以下方法：將由會與Protein A結合之小鼠IgG2a之H鏈以及不會與Protein A結合之大鼠IgG2b之H鏈構成的異源二聚化抗體，利用Protein A精製之方法(WO98050431、WO95033844)。
又，使用將係IgG與ProteinA之結合部位的EU編號435號及436號的胺基酸殘基取代為Tyr、His等對於ProteinA之結合力不同之胺基酸的H鏈，使各H鏈與Protein A的交互作用改變，並使用Protein A管柱，可 藉此僅將異源二聚化抗體有效率的精製。
該等取代、技術可以組合多數，例如組合2種以上。又，該等改變可以對於第一多胜肽與第二多胜肽適當地分別實施。又，本發明之多胜肽，也可為以施加有上述改變者作為基礎而製作者。
胺基酸序列之改變，可利用該技術領域中公知之各方法進行。該等方法，不限於以下者，但可藉由以下方法實施：點專一性變異誘導法(Hashimoto-Gotoh、T、Mizuno、T、Ogasahara、Y、and Nakagawa、M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis.Gene 152、271-275、Zoller、MJ、and Smith、M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol.100、468-500、Kramer,W、Drutsa,V、Jansen,HW、Kramer,B、Pflugfelder,M、and Fritz,HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction.Nucleic Acids Res.12、9441-9456、Kramer W、and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods.Enzymol.154、350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection Proc Natl Acad Sci U S A.82、488-492)、PCR變異法、卡式變異法等方法。
本發明中，「Fc區之機能」係指例如：Fc區對於Fc γ受體之結合活性(結合活性之增強、或結合活性之減弱)、Fc區之Fc γ受體同功異形體間之選擇性(結合之選擇性之提高)、Fc區之物理化學的安定性、ADCC活性、ADCP活性等。在此，Fc區之Fc γ受體同功異形體間之選擇性，係指對於Fc γ受體之特定同功異形體選擇性結合之意。Fc區之物理化學的安定性，係指例如Fc區之熱力學安定性、對於蛋白酶之安定性、對於化學處理之安定性、對於冷凍熔解之安定性、保存安定性、酸性條件下之安定性、光安定性、振盪或濃縮伴隨之緊張的安定性、於廣溶液條件中維持溶解性。又，Fc區之機能，可為Fc區對於Fc γ受體之結合活性、Fc區對於為Fc γ受體之同功異形體間之選擇性、Fc區之物理化學安定性等組合2個以上之機能，例如意指Fc區對於Fc γ受體之結合活性與Fc區之Fc γ受體同功異形體間之選擇性合併之機能、Fc區對於Fc γ受體之結合活性與Fc區之物理化學的安定性合併之機能、Fc區對於Fc γ受體同功異形體間之選擇性與Fc區之物理化學的安定性合併的機能、Fc區對於Fc γ受體之結合活性、Fc區對於Fc γ受體同功異形體間之選擇性及Fc區之物理化學的安定性合併的機能。
本發明中「改變Fc區之機能」，於例如Fc區之機能係表示Fc區對於Fc γ受體之結合活性之情形，意指Fc區對於Fc γ受體之結合活性之增強或減弱等。選擇性之提高，係指例如對於某Fc γ受體之結合活性增強，另一方 面，對於其他之Fc γ受體之結合活性維持或減低。或，選擇性之提高係指例如對於某Fc γ受體之結合活性減低，另一方面，對於其他Fc γ受體之結合活性維持或增強。又，例如Fc區之機能係表示Fc區對於Fc γ受體次型間之選擇性之情形，係意指Fc區對於Fc γ受體次型間之選擇性之提高或下降等。又，於例如Fc區之機能表示Fc區之物理化學的安定性之情形，意指Fc區之物理化學的安定性之提高或下降，安定性之下降之抑制等，更具體而言，意指例如CH2區之Tm值之提高或下降，Tm值之下降之抑制等。
又，例如Fc區對於Fc γ受體之結合活性、Fc區對於Fc γ受體同功異形體間之選擇性及Fc區之物理化學的安定性合併之機能之提高，係指相對於對照組，不一定要Fc區對於Fc γ受體之結合活性、Fc區對Fc γ受體同功異形體間之選擇性及Fc區之物理化學的安定性全部提高，只要就全體而言，Fc區之機能有提高即可。又，反之，例如Fc區對於Fc γ受體之結合活性、Fc區之Fc γ受體同功異形體間之選擇性及Fc區之物理化學的安定性合併的機能下降，係指相較於對照組，不一定要Fc區對於Fc γ受體之結合活性、Fc區對Fc γ受體同功異形體間之選擇性及Fc區之物理化學的安定性之全部下降，只要就全體而言之Fc區之機能有下降即可。
本發明中，Fc γ受體(本說明書有時記載為Fc γ受體、Fc γ R或FcgR)，係指能結合於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之Fc區的受體，也意指實施上由Fc γ受體基因所編 碼的蛋白質家族的任一成員。人類的該家族中，包括同功異形體Fc γ RIa、Fc γ RIb及Fc γ RIc之Fc γ RI(CD64)；包括同功異形體Fc γ RIIa(包括異型H131(H型)及R131(R型))、Fc γ RIIb(包括Fc γ RIIb-1及Fc γ RIIb-2)及Fc γ RIIc之Fc γ RII(CD32)；及包括同功異形體Fc γ RIIIa(包括異型V158及F158)及Fc γ RIIIb(包括異型Fc γ RIIIb-NA1及Fc γ RIIIb-NA2)之Fc γ RIII(CD16)、及各種未發現的人類Fc γ R類或Fc γ R同功異形體或異型，但不限於此等。Fc γ R也包括來自於人類、小鼠、大鼠、兔及猴者，但不限於此等，可為各種生物來源者。小鼠Fc γ R類，包括Fc γ RI(CD64)、Fc γ RII(CD32)、Fc γ RIII(CD16)及Fc γ RIII-2(CD16-2或Fc γ RIV)、及各種未發現的小鼠Fc γ R類或Fc γ R同功異形體或異型，但不限於此等。如此的Fc γ受體之理想例，可列舉人類Fc γ RI(CD64)、Fc γ RIIa(CD32)、Fc γ RIIb(CD32)、Fc γ RIIIa(CD16)及/或Fc γ RIIIb(CD16)。
Fc γ R，存在有具有ITAM(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)之活性型受體及具有ITIM(immunoreceptor tyrosine-based抑制劑y motif)之抑制型受體。Fc γ R，分類為Fc γ RI、Fc γ RIIa R、Fc γ RIIa H、Fc γ RIIIa、Fc γ RIIIb之活性型Fc γ R、及Fc γ RIIb之抑制型Fc γ R。
Fc γ RI之聚核苷酸序列及胺基酸序列，各記載於NM_000566.3及NP_000557.1， Fc γ RIIa之聚核苷酸序列及胺基酸序列，各記載於BC020823.1及AAH20823.1，Fc γ RIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列，各記載於BC146678.1及AAI46679.1，Fc γ RIIIa之聚核苷酸序列及胺基酸序列，各記載於BC033678.1及AAH33678.1，Fc γ RIIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列，各記載於BC128562.1及AAI28563.1(RefSeq註冊編號)。
又，Fc γ RIIa，存在有Fc γ RIIa之131號的胺基酸取代成組胺酸(H型)或精胺酸(R型)之2種基因多型(J.Exp.Med、172、19-25、1990)。又，Fc γ RIIb，存在有Fc γ RIIb之232號的胺基酸取代成異白胺酸(I型)或蘇胺酸(T型)之2種基因多型(Arthritis.Rheum.46：1242-1254(2002))。又，Fc γ RIIIa，存在有Fc γ RIIIa之158號的胺基酸取代成纈胺酸(V型)或苯丙胺酸(F型)之2種基因多型(J.Clin.Invest.100(5)：1059-1070(1997))。又，Fc γ RIIIb，存在有NA1型、NA2型之2種基因多型(J.Clin.Invest.85：1287-1295(1990))。
若將觀察交互作用之物質的其中之一(配體)固定在感測晶片的金薄膜上，從感測晶片之背側照光使在金薄膜與玻璃之交界面發生全反射，則一部分反射光會形成反射強度下降的部分(SPR訊號)。若將觀察交互作用之物質其中另一者(分析物)流過感測晶片的表面且分析物結合，則受固定化之配體分子之質量增加，感測晶片表面之溶劑之折 射率會改變。藉由此折射率之改變，SPR訊號之位置會移位(反之，若結合發生解離，訊號之位置會返回)。Biacore系統，會採取上述移位量亦即感測晶片表面之質量變化作為縱軸，取質量之時間變化作為測常數據加以顯示(感測圖)。從感測圖可求取分析物對於在感測晶片表面所捕捉之配體之結合量(使分析物交互作用前後在感測圖上的回應的變化量)。惟，由於結合量也會依存於配體的量，所以比較時，需將配體量視為本質上為相同量的條件下進行比較。又，從感測圖曲線，可求取動力學(kinetics)：求取結合速度常數(ka)與解離速度常數(kd)，並由該常數之比求取親和性(KD)。BIACORE法也可適用於抑制測定法。抑制測定法例如記載於Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)、4005-4010。
本發明中，本發明之多胜肽或Fc區是否對於各種Fc γ受體之結合活性有所增強、或結合活性有所減少，例如可如本實施例所示，使用利用表面電漿子共振(SPR)現象之交互作用解析設備Biacore(GE Healthcare)進行測定。Biacore包括Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、C等任一機種。感測晶片可以使用CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA，Au晶片等Biacore用之感測晶片中之任一者。電泳緩衝液(running buffer)，除了可使用HBE-EP+，也可使用HEPES、磷酸、ACES、Tris、檸檬酸等調整為pH7.4等中性附近之pH的緩衝液。測定溫度可於4-37℃之範圍測定。在感測晶片上利 用胺偶聯、雙硫鍵偶聯、醛偶聯等偶聯方法固定捕捉抗體之ProteinA、ProteinG、ProteinL、抗人類IgG抗體、抗人類IgG-Fab、抗人類L鏈抗體、抗人類Fc抗體、抗原蛋白質、抗原胜肽等抗體捕捉用之蛋白質。對於其將Fc γ受體I、IIa R型、IIa H型、IIb、IIIa F型、V型、IIIb等各種Fc γ受體流過作為分析物，並測定交互作用，取得感測圖。此時Fc γ受體之濃度可以配合測定之樣本之KD等交互作用之強度，從數uM至數pM之範圍實施。藉由測定，可以取得其解離常數(KD)，並由KD之值是否下降或增加，可判斷本發明之多胜肽或Fc區對於各種Fc γ受體之結合活性是否增強或結合活性減少。又，由固定在感測晶片上之抗體捕捉用蛋白質所捕捉(capture)的情形，可以將各種Fc γ受體作為分析物對於感測晶片上之抗體流過前後之感測圖之值之變化量作為指標，以其值增加的程度判斷本發明之多胜肽或Fc區對於各種Fc γ受體之結合活性是否增強或結合活性是否減少。又，也可不將抗體，而是將各種Fc γ受體固定於感測晶片上，而使其與欲評價之抗體樣本交互作用。從交互作用之感測圖計算之KD值之下降或增加、或使抗體樣本作用前後之感測圖之增加程度，可判斷本發明之多胜肽或Fc區對於各種Fc γ受體之結合活性是否有增強、或結合活性是否有減少。
具體而言，Fc區對於Fc γ受體之結合活性，可以藉由ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)，除此以外可藉由利用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等測定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)、4005-4010)。
ALPHA篩選，係利用使用捐出體與受體之2個珠之ALPHA技術，依據下列原理實施。結合在捐出體珠之分子與結合在受體珠的分子，以生物學性交互作用，且僅於2個珠成為接近狀態時才會偵測到發光訊號。由雷射激發之捐出體珠內之光敏化劑，會將周邊的氧變換為激發狀態之單線態氧(singlet oxygen)。單線態氧往捐出體珠周邊擴散，於到達接近受體珠時，會引起珠內之化學發光反應，最終發光。接合於捐出體珠之分子與結合於受體珠之分子不交互作用時，捐出體珠產生之單線態氧不會到達受體珠，所以不起化學發光反應。
例如：於捐出體珠標記有生物素的受測多胜肽結合於捐出體珠上之鏈黴親合素(streptoavidin)，且受體珠有谷胱甘肽S轉移酶(GST)所標籤化的Fc γ受體結合。於不存在競爭的多胜肽時，受測多胜肽會與Fc γ受體交互作用並產生520-620 nm之訊號。未經標籤化之多胜肽，會和受測多胜肽與Fc γ受體間之交互作用競爭。可藉由將競爭結果表示的螢光減少予以定量，而決定相對的結合活性。多胜肽使用Sulfo-NHS-生物素等予以生物素化係為公知。Fc γ受體以GST標籤化之方法，可適當採用將編碼為Fc γ受體之聚核苷酸與編碼為GST之聚核苷酸於框架內(inframe)融合成的融合基因在保持有可表現之載體的細胞等中表 現，並使用谷胱甘肽管柱精製之方法等。將獲得之訊號，使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等軟體，擬合於利用非線形回歸解析之單部位競合(one-site competition)模型，而理想地解析。
又，標籤化不限於GST，也可為如組胺酸標籤、MBP、CBP、Flag標籤、HA標籤、V5標籤、c-myc標籤等標籤，不限定。又，針對受測多胜肽對於捐出體珠之結合，不限於利用生物素-鏈黴親合素反應之結合。尤其，當受測多胜肽為抗體、Fc融合多胜肽等含Fc之情形，可考慮經由捐出體珠上之Protein A、Protein G等Fc識別蛋白質使受測多胜肽結合之方法。
對於Fc γ R之結合或對於Fc γ R之結合活性之減弱，係指將比較之多胜肽之量定為本質上相同進行分析時，比起母多胜肽以本質上較弱之結合活性與Fc γ R結合。
對於Fc γ R之結合或對於Fc γ R之結合活性減弱、減少或下降的異源二聚化多胜肽，係指將比較之多胜肽之量定為本質上相同進行分析時，比起同源二聚化多胜肽以本質上較弱結合活性與Fc γ R結合。
例如：上述測定法所測定之KD值中，KD值比(母多胜肽之KD值/導入變異之多胜肽之KD值)，較佳為0.99以下，0.95以下，0.9以下，0.8以下，0.7以下，0.5以下，0.3以下，0.1以下。更佳為0.08以下，0.05以下，0.02以下，0.01以下，0.001以下。又，本說明書中，KD值比也稱為KD ratio。
又，上述測定法所測定之KD值中，KD值宜升高到1pM以上較佳，升高到10 pM、100 pM、1 nM以上，2 nM以上，3 nM以上，5 nM以上，10 nM以上，20 nM以上，50 nM以上，100 nM以上，1μM以上又更佳。又，上述測定法所測定之KD值中，KD值為1 pM以上較佳，10 pM以上，100 pM以上，1 nM以上，10 nM以上，100 nM以上，500 nM以上，1μM以上，3μM以上，5μM以上更佳。
對於Fc γ R之結合或對於Fc γ R之結合活性之增強、上升或提高，係指將比較之多胜肽之量定為本質上相同進行分析時，比起母多胜肽以本質上較強之結合活性與Fc γ R結合。
對於Fc γ R之結合或對於Fc γ R之結合活性增強、上升或提高之異源二聚化多胜肽，係指將比較之多胜肽之量定為本質上相同進行分析時，比起同源二聚化多胜肽以本質上較強結合活性與Fc γ R結合。
例如：上述測定法所測定之KD值中，KD值比(母多胜肽之KD值/導入變異之多胜肽之KD值)，較佳為1.1以上，1.2以上，1.3以上，1.5以上，1.8以上，2以上，3以上。更佳為5以上，10以上，100以上，250以上，1000以上。又，本說明書中，KD值比也稱為KD ratio。
又，上述測定法所測定之KD值中，KD值宜下降1 pM以上較佳，下降10 pM、100 pM、1 nM以上，2 nM以上，3 nM以上，5 nM以上，10 nM以上，20 nM以上，50 nM以上，100 nM以上，1μM以上又更佳。
又，上述測定法所測定之KD值中，KD值為5μM以下較佳，3μM以下，1μM以下，0.5μM以下，0.1μM以下，0.01μM以下，1 nM以下，0.1 nM以下，0.001 nM以下，1 pM以下更佳。
本發明中，該多胜肽之Fc區之機能之改變為與Fc γ受體之結合活性增強之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入胺基酸變異。導入之該胺基酸變異之種類或範圍不特別限定。
又，據報告抗體之Fc區與Fc γ R之交互作用之強度依存於Zn2+離子濃度(Immunology Letters 143(2012)60-69)。抗體於Fc區之Zn2+離子濃度愈高，Fc區與FcgR之交互作用愈增強。抗體之Fc區之CH3所存在之His310、His435將Zn2+螯合，而藉此將位於遠位之Fc區之各CH2分域打開。藉此，CH2分域與FcgR容易交互作用，Fc區與FcgR之交互作用增強。本發明之抗體之一非限定態樣中，可列舉EU編號表示之310位之His、435位之His、433位之His及/或434位之Asn螯合有Zn2+之Fc區。
該Fc γ受體為Fc γ RIa之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從說明書表2-1及表2-2之i區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該Fc γ受體為Fc γ RIa之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從說明書表2-1、表2-2及表2-3之ii區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少 1個以上之胺基酸變異。
又，該Fc γ受體為Fc γ RIIa R之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從說明書表3-1及表3-2之i區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該Fc γ受體為Fc γ RIIa R之情形。構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從說明書表3-1及表3-2之ii區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
又，該Fc γ受體為Fc γ RIIa H之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從說明書表4之i區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該Fc γ受體為Fc γ RIIa H之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從說明書表4之ii區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
又，該Fc γ受體為Fc γ RIIb之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從說明書表5之i區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該Fc γ受體為Fc γ RIIb之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從說明書表5之ii區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
又，該Fc γ受體為Fc γ RIIIa之情形，構成前述Fc 區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從說明書表6之i區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該Fc γ受體為Fc γ RIIIa之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從說明書表6之ii區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該Fc γ受體為Fc γ RIIIa之情形，更具體而言，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y或Q、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號298號的胺基酸S取代為A、EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號327號的胺基酸A取代為D、EU編號328號的胺基酸L取代為W、EU編號330號的胺基酸A取代為M或K及EU編號334號的胺基酸K取代為E或L構成之群組選出出至少一種以上(例如2個或3個)胺基酸變異。又，該Fc γ受體為Fc γ RIIIa之情形，更具體而言，在構成前述Fc區之第一多胜肽或第二多胜肽中其中之一之多胜肽之胺基酸序列，也可導入從EU編號239號的胺基酸S取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為L、及EU編號332號的胺基酸I取代為E構成之群組選出之至少一種以上(例如2個或3個)之胺基酸變異， 且其中另一多胜肽之胺基酸序列，也可導入從EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、及EU編號298號的胺基酸S取代為A構成之群組選出之至少一種以上(例如2個或3個)之胺基酸變異。
又，該Fc γ受體為Fc γ RIIIa之情形，更具體而言，可於構成前述Fc區之第一多胜肽或第二多胜肽中其中之一之多胜肽之胺基酸序列對於從EU編號234號的Leu、235號的Leu、236號的Gly、239號的Ser、268號的His、270號的Asp、298號的Ser、327號的Ala、328號的Leu及334號的Lys選出之至少一種以上(例如2個或3個)之胺基酸導入變異，並於其中另一多胜肽之胺基酸序列中，對於從EU編號270號的Asp、326號的Lys、330號的Ala及334號的Lys選出之至少一種以上(例如2個或3個)之胺基酸導入變異。
改變的胺基酸可以適當選擇，但較佳為構成前述Fc區之第一多胜肽或第二多胜肽中其中之一之多胜肽之胺基酸序列中，導入從由EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y或Q、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號298號的胺基酸S取代為A及EU編號327號的胺基酸A取代為D、EU編號328號的胺基酸L取代為W及EU編號334號的胺基酸K取代為L構成之群組選 出之至少一種以上(例如2個或3個)之胺基酸變異，並於其中另一多胜肽之胺基酸序列中，導入從由EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為M或K、EU編號334號的胺基酸K取代為E構成之群組選出之至少一種以上(例如2個或3個)之胺基酸變異。
更佳為構成前述Fc區之第一多胜肽或第二多胜肽中其中之一之多胜肽之胺基酸序列中，導入(i)至(vi)中任一者之變異，且其中另一多胜肽之胺基酸序列中，導入(vii)至(ix)中之任一者之變異。
(i)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號268號的胺基酸H取代為D及EU編號298號的胺基酸S取代為A
(ii)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基酸D取代為E及EU編號298號的胺基酸S取代為A
(iii)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Q、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基酸D取代為E及EU編號298號的胺基酸S取代為A
(iv)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號 的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號298號的胺基酸S取代為A及EU編號327號的胺基酸A取代為D
(v)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號298號的胺基酸S取代為A及EU編號327號的胺基酸A取代為D
(vi)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號298號的胺基酸S取代為A、EU編號327號的胺基酸A取代為D、EU編號328號的胺基酸L取代為W及EU編號334號的胺基酸K取代為L
(vii)EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為M及EU編號334號的胺基酸K取代為E
(viii)EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為M及EU編號334號的胺基酸K取代為E
(ix)EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為K及EU編號334號的胺基酸K取代為E。
結合活性之選擇性，可分別測定多胜肽對於各Fc γ受體同功異形體之結合活性後，藉由求取此等之比以測定。 結合活性之指標，可使用例如對於Fc γ R之結合量、KD值。
本說明書中，結合活性之選擇性提高，係指相較於例如基於上述測定方法求取之受測多胜肽之母多胜肽對於Fc γ受體同功異形體之結合活性之比(受測多胜肽之母多胜肽對於第一Fc γ受體同功異形體之結合活性/受測多胜肽之母多胜肽對於第二Fc γ受體同功異形體之結合活性)，受測多胜肽對於Fc γ受體同功異形體之結合活性之比(受測多胜肽對於第一Fc γ受體同功異形體之結合活性/受測多胜肽對於第二Fc γ受體同功異形體之結合活性)之比提高0.1以上，較佳為0.2以上，0.5以上，1以上，2以上，3以上，5以上，7以上，8以上，9以上，10以上，15以上，20以上，30以上，50以上，70以上，100以上，150以上，200以上，500以上，1000以上。又，對於Fc γ受體同功異形體之選擇性下降，係指例如相較於基於上述測定方法求得之受測多胜肽之母多胜肽對於Fc γ受體同功異形體之結合活性之比，受測多胜肽對於Fc γ受體同功異形體之結合活性之比下降了0.1以上，較佳為0.2以上，0.5以上，1以上，2以上，3以上，5以上，7以上，8以上，9以上，10以上，15以上，20以上，30以上，50以上，70以上，100以上，150以上，200以上，500以上，1000以上。
又，本說明書中，選擇性之指標，可使用代表例如：對於活性型Fc γ R與對於抑制型Fc γ R之結合活性之比率的A/I ratio。受測多胜肽對於Fc γ RIIb之KD除以受測 多胜肽對Fc γ RIIa H型或R型之KD得到之值，定為各自的A/I ratio。A/I ratio，較佳為1.1以上，1.5以上，2以上，3以上，5以上，更佳為6以上，8以上，9以上。
又，本說明書中，選擇性之指標，可使用例如：將對於Fc γ RIIb之KD除以對於Fc γ RIIIa F之KD而得之值，即Fc γ RIIIa F/Fc γ RIIb ratio。受測多胜肽對於Fc γ RIIb之KD除以受測多胜肽對於Fc γ RIIIa之KD而得之值，各定為Fc γ RIIIa F/Fc γ RIIb ratio。Fc γ RIIIa F/Fc γ RIIb ratio，較佳為1.1以上，1.5以上，2以上，3以上，5以上，更佳為10以上，20以上，30以上，40以上，50以上，60以上，70以上，80以上，90以上，100以上，110以上，120以上，130以上，140以上，150以上，200以上，210以上，220以上，230以上，240以上。
本發明中，該多胜肽之Fc區之機能之改變為與Fc γ受體之結合活性之選擇性提高之情形，可在構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中導入胺基酸變異。導入之該胺基酸變異之種類或範圍不特別限定。
前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIa，前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIa之選擇性增強之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表19-1、表19-2、表19-3及表19-4之a區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb， 對於Fc γ RIa之選擇性增強之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表19-1、表19-2、表19-3、表19-4及表19-5之b區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIa、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIa之結合活性選擇性地減弱的情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表23-1及表23-2之c區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIa之結合活性選擇性地減弱的情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表23-1及表23-2之d區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa R、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa R之選擇性的增強的情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表20-1之a區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa R之選擇性增強之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第 二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表20-1、表20-2及表20-3之b區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa R、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa R之結合活性選擇性減弱的情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表24-1之c區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa R之結合活性選擇性的減弱的情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表24-1及表24-2之d區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa H、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa H之選擇性增強的情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表21-1之a區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa H之選擇性增強之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表21-1、表21-2及表21-3之b區記載之胺基酸變異構成之群組選出 之至少1個以上之胺基酸變異。
前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa H、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa H之結合活性選擇性減弱之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表25-1及表25-2之c區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa H之結合活性選擇性的減弱的情形。構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表25-1、表25-2及表25-3之d區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIIa、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIIa之選擇性增強之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表22-1之a區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIIa之選擇性的增強之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表22-1、表22-2及表22-3之b區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
前述活性型Fc γ受體為Fc γ RIIIa、前述抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIIa之結合活性選擇性的被減弱的情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表26-1及表26-2之c區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。又，該選擇性之提高係相較於對於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIIa之結合活性選擇性的被減弱的情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表26-1、表26-2、表26-3及表26-4之d區記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
在此，對於所望之Fc γ受體的結合活性選擇性的增強，係指以下任一者的情況。
(i)對於所望的Fc γ受體的結合活性增強，且對於所望的Fc γ受體以外的受體的結合活性不變或減弱、(ii)對於所望的Fc γ受體的結合活性增強，且對於所望的Fc γ受體以外的受體的結合活性也增強，但對於所望的Fc γ受體以外的受體的結合活性之增強程度低於對於所望的Fc γ受體之結合活性之增強程度，或、(iii)對於所望的Fc γ受體的結合活性減弱，但是該結合活性之減弱程度低於對於所望的Fc γ受體以外的Fc γ受體的結合活性之減弱程度。
又，對於所望的Fc γ受體之結合活性選擇性的減弱， 係指以下任一者的情況。
(i)對於所望的Fc γ受體之結合活性減弱，且對於所望的Fc γ受體以外的受體的結合活性不變或增強、(ii)對於所望的Fc γ受體的結合活性減弱，且對於所望的Fc γ受體以外的受體的結合活性也減弱，但是對於所望的Fc γ受體以外的受體的結合活性之減弱程度低於對於所望的Fc γ受體的結合活性之減弱程度，或、(iii)對於所望的Fc γ受體的結合活性增強，但是該結合活性之增強的程度低於對於所望的Fc γ受體以外的Fc γ受體的結合活性之增強程度。
本說明書中，多胜肽之物理化學的安定性，意指例如多胜肽之熱力學的安定性，多胜肽之熱力學的安定性，可以將例如CH2區之Tm值等作為指標進行判斷。Tm值可利用CD(圓二色性)、DSC(示差掃描型熱量計)、DSF(示差掃描型螢光定量法)測定。
CD係觀測在伴隨升溫之平均殘基莫耳橢圓率(θ)的變化以計算Tm值。測定設備，例如圓二色性分散計(日本分光)。若於適當的單一波長(例如208 nm或222 nm)邊升高溫度邊測定CD光譜，在某個溫度θ會升高，之後溫度成為固定值。此時取低溫時之θ與高溫時之θ之中點值的溫度，作為Tm。測定可使用以例如：檸檬酸、Tris、磷酸溶液等製備的蛋白質溶液，可使用數百ug/mL之濃度進行測定。
DSC係觀測伴隨升溫之熱量變化以計算Tm值。測定設 備可列舉MicroCal VP-DSC、Micro Cal Capillary DSC(均為DKSH Japan)。在測定小室中封入蛋白質溶液及緩衝液，邊使溫度升高邊測定小室間的溫度差，在某個溫度為分界，會變化成吸熱反應。以此時的溫度作為Tm。測定可使用以例如：檸檬酸緩衝液、TBS、PBS、組胺酸緩衝液等製備的蛋白質溶液，可使用數十ug/mL至數百ug/mL之濃度進行測定。
DSF係使用對於疏水性殘基專一性結合的螢光試藥(例如SYPRO Orange)，觀測伴隨升溫之疏水性殘基之露出，以計算Tm值。若將蛋白質溶液與螢光試藥以適當比例混合，並以RT-PCR裝置邊使溫度升高邊測定螢光強度，會在某個溫度觀測到螢光強度的上升。以此時的溫度作為Tm。測定設備，例如Rotor-Gene Q(QIAGEN)、CFX96即時PCR解析系統(Bio-Rad)。測定可使用以例如：PBS、組胺酸緩衝液等製備的蛋白質溶液，可使用數十ug/mL至數百ug/mL的濃度進行測定。
本說明書中，多胜肽之物理學的安定性提高，係指相較於基於例如上述測定方法求得之對照多胜肽之Fc區中之CH2區之Tm值，受測多胜肽之Fc區中之CH2區之Tm值提高了0.1度以上，較佳為提高了0.2度以上，0.3度以上，0.4度以上，0.5度以上，1度以上，2度以上，3度以上，4度以上，5度以上，10度以上。又，多胜肽之物理學的安定性提高，係指多胜肽之物理學的安定性之下降受抑制，例如相對於基於上述測定方法求得之對照多胜肽 之Fc區中之CH2區之Tm值，受測多胜肽之Fc區中之CH2區之Tm值下降有0.1度以上，較佳為0.2度以上，0.3度以上，0.4度以上，0.5度以上，1度以上，2度以上，3度以上，4度以上，5度以上，10度以上受抑制。
又，本說明書中，多胜肽之物理學的安定性下降，係指相較於基於例如上述測定方法求得之對照多胜肽之Fc區中之CH2區之Tm值，受測多胜肽之Fc區中之CH2區之Tm值下降了0.1度以上，較佳為下降了0.2度以上，0.3度以上，0.4度以上，0.5度以上，1度以上，2度以上，3度以上，4度以上，5度以上，10度以上。
又，本發明，也包含：包含Fc區且該Fc區係由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成的多胜肽，且相較於由該Fc區僅含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽或由該Fc區僅含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，該Fc區之機能有所改變的多胜肽。
該多胜肽中，前述Fc區之機能之改變除了從選自於由多胜肽與Fc γ受體之結合活性之增強、結合活性之減弱、及結合活性之選擇性之提高構成之群組中之至少一種以上之改變以外，也可為物理化學的安定性更為提高的改變，若為該等任一機能改變，可稱為本發明之Fc區之機能有改變。
本發明中，「胺基酸變異係導入於第一多胜肽及第二多胜肽之兩者的Fc區的情形，該Fc區之機能未改變」，係指當將相同的胺基酸變異導入第一多胜肽與第二多胜肽 兩者的情形，所望的機能未提高，例如：欲使多胜肽與Fc γ受體之結合活性增強之情形，該結合活性未變化或減弱，欲使結合活性減弱之情形，該結合活性未變化或增強，欲使結合活性之選擇性提高之情形，該選擇性未提高，欲使多胜肽之物理化學的安定性提高之情形，該安定性未變化或下降。胺基酸變異為「僅導入其中之一之Fc區之情形，該Fc區之機能有改變」，係指僅將胺基酸變異導入第一多胜肽或第二多胜肽其中之一之情形，所望的機能提高，例如：欲使多胜肽與Fc γ受體之結合活性增強之情形，該結合活性增強，欲使結合活性減弱之情形，該結合活性減弱，欲使結合活性之選擇性提高之情形，該選擇性提高，欲使多胜肽之物理化學的安定性提高之情形，該安定性提高。
本發明中，也包含前述Fc區由含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成之多胜肽，相較於該Fc區由僅含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽或該Fc區由僅含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，具有較高Tm之多胜肽。對於該多胜肽實施具有高Tm之物理化學的安定性提高的改變的同時，也可進一步施加Fc區之機能之改變。
當進一步附加之Fc區之機能之改變，為對於Fc γ RIa之結合活性增強之情形，於構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表31-1、表31-2及表31-3記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
又，當進一步附加之Fc區之機能之改變，為對於Fc γ RIIa R之結合活性增強之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表32-1及表32-2記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
又，當進一步附加的Fc區之機能之改變，為對於Fc γ RIIa H之結合活性增強之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表33-1及表33-2記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
又，當進一步附加之Fc區之機能之改變，為對於Fc γ RIIb之結合活性增強之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表34-1及表34-2記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
又，當進一步附加之Fc區之機能之改變，為對於Fc γ RIIIa之結合活性增強之情形，構成前述Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，也可導入從由說明書表35-1及表35-2記載之胺基酸變異構成之群組選出之至少1個以上之胺基酸變異。
本發明中，導入胺基酸變異之第一多胜肽及第二多胜肽之組合不特別限定，可列舉從序列編號：2~4及6~60記載之多胜肽選出之不同種類/或同一種類之多胜肽之組合。又，可列舉本申請案實施例記載之包含第一多胜肽及 第二多胜肽之多胜肽之組合(2個抗體之H鏈及1個抗體之L鏈之組合)作為理想例。
本發明之多胜肽也可為抗原結合分子。本發明中，抗體結合分子之種類不特別特定，理想例可列舉抗體、雙專一性抗體、胜肽Fc融合蛋白質、或支架Fc融合蛋白質等Fc融合分子。
<抗體>
再者，提供抗體作為本發明之多胜肽。
本發明中「抗體」的用語，係以最廣的含意使用，只要顯示所望的生物學的活性，單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、抗體變異體、抗體片段、多專一性抗體(例如：二專一性抗體)、嵌合抗體、人類化抗體等各種抗體都包含在內。
本發明之抗體，不限定抗原種類、抗體來源等，可為各種抗體。抗體來源不特別限定，可列舉人類抗體、小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體等。
製作抗體之方法係該技術領域中具有通常知識者所熟知，例如為單株抗體之情形，可利用融合瘤法(Kohler and Milstein、Nature 256：495(1975))、重組方法(美國專利第4,816,567號)製造。又，也可從噬菌體抗體庫單離(Clackson et al.、Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.、J.Mol.Biol.222：581-597(1991))。又，也可從單一的B細胞選殖體(clone)單離(N.Biotechnol.28(5)：253-457(2011))。
人類化抗體，也稱為再構成(reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外的動物例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體之人類化抗體等為公知。用於獲得人類化抗體之一般的基因重組方法亦為已知。具體而言，就將小鼠抗體之CDR移植到人類的FR的方法，例如Overlap Extension PCR為公知。
藉由將編碼為3個CDR與4個FR連結成的抗體可變區的DNA與編碼為人類抗體不變區之DNA於框架內融合的方式插入於表現載體中，可製作人類化抗體表現用載體。將該重組載體導入寄主，並建立重組細胞後，培養該重組細胞，使該編碼為人類化抗體之DNA表現，可以在該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體(參照歐洲專利公開EP 239400、國際公開WO1996/002576)。
視需要，也可取代FR之胺基酸殘基，使得再構成人類抗體之CDR形成適當的抗原結合部位。例如，可應用將小鼠CDR移植到人類FR之PCR法，於FR導入胺基酸序列之變異。
可將具有人類抗體基因之所有曲目(repertory)的基因轉殖動物(參照國際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作為免疫動物，利用DNA免疫取得所望的人類抗體。
再者，使用人類抗體庫利用淘選取得人類抗體之技術亦為已知。例如：將人類抗體之V區以單鏈抗體(scFv)之形 式，利用噬菌體展示法表現在噬菌體的表面。可選出表現結合於抗原之scFv的噬菌體。藉由解析選擇的噬菌體的基因，可決定編碼為結合於抗原之人類抗體之V區的DNA序列。決定結合於抗原之scFv之DNA序列後，將該V區序列與所望的人類抗體C區之序列以框架內融合後，插入適當的表現載體，可製作表現載體。將該表現載體導入上述列舉之理想的表現細胞中，並表現編碼為該人類抗體之基因，可取得該人類抗體。該等方法已經公知(參照國際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
構成本發明之抗體之可變區，可為任意之識別抗原之可變區。
本說明書中，抗原不特別限定，可為任意抗原。抗原，可列舉：17-IA、4-1 BB、4Dc、6-keto-PGF1a、8-iso-PGF2a、8-oxo-dG、A1 Adenosine受體、A33、ACE、ACE-2、Activin、Activin A、Activin AB、Activin B、Activin C、Activin RIA、Activin RIA ALK-2、Activin RIB ALK-4、Activin RIIA、Activin RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、Addressins、adiponectin、ADP ribosyl cyclase-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、allergen、alpha1-antichemotrypsin、alpha1-antitrypsin、alpha-synuclein、alpha-V/beta-1 antagonist、aminin、 amylin、amyloid beta、amyloid免疫球蛋白重鏈可變區。amyloid免疫球蛋白輕鏈可變區、Androgen、ANG、angiotensinogen、Angiopoietin配體-2、anti-Id、antithrombinIII、Anthrax、APAF-1、APE、APJ、apo A1、apo serum amyloid A、Apo-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、ASPARTIC、Atrial natriuretic factor、Atrial natriuretic胜肽、atrial natriuretic胜肽A、atrial natriuretic胜肽B、atrial natriuretic胜肽C、av/b3 integrin、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、Bacillus anthracis保護抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、BcI、BCMA、BDNF、b-ECGF、beta-2-微球蛋白、betalactamase、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、B-lymphocyte Stimulator(BIyS)、BMP、BMP-2(BMP-2a)、BMP-3(Osteogenin)、BMP-4(BMP-2b)、BMP-5、BMP-6(Vgr-1)、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BMPR-II(BRK-3)、BMPs、BOK、Bombesin、Bone-derived neurotrophic factor、牛生長激素、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、B-淋巴細胞黏附分子、C10、C1-抑制劑、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a(complement 5a)、CA125、CAD-8、Cadherin-3、Calcitonin、cAMP、Carbonic anhydrase-IX、carcinoembryonic抗原(CEA)、carcinoma關連抗原、Cardiotrophin-1、Cathepsin A、Cathepsin B、Cathepsin C/DPPI、Cathepsin D、Cathepsin E、Cathepsin H、 Cathepsin L、Cathepsin O、Cathepsin S、Cathepsin V、Cathepsin X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/Eotaxin、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3-alpha、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/Eotaxin-2、CCL25/TECK、CCL26/Eotaxin-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-alpha、CCL3L1/LD-78-beta、CCL4/MIP-1-beta、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-gamma、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67 proteins)、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受體、CINC、CKb8-1、Claudin18、CLC、Clostridium botulinum毒素、Clostridium difficile毒素、Clostridium perfringens毒素、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、補體因子3(C3)、 補體因子D、corticosteroid-binding globulin、Colony stimulating factor-1受體、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/Fractalkine、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-alpha、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-1-alpha/beta、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/Lungkine.CXCL16、CXCL16、CXCL2/Gro-beta CXCL3/Gro-gamma、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、cystatin C、cytokeratin腫瘤關連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、Decay加速因子、Delta狀蛋白配體4、des(1-3)-IGF-1(brain IGF-1)、Dhh、DHICA oxidase、Dickkopf-1、digoxin、Dipeptidyl peptidase IV、DK1、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EGF類似分域，但含蛋白7、Elastase、elastin、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、Endosialin、endothelin受體、內毒素、Enkephalinase、eNOS、Eot、Eotaxin、Eotaxin-2、eotaxini、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、Epha2酪蛋白激酶受體、上皮生長因子受體(EGFR)、ErbB2受體、ErbB3酪蛋白激酶受體、ERCC、EREG、紅血球生成素(EPO)、紅血球生成素受體、E-selectin、ET-1、Exodus-2、F protein of RSV、F10、F11、F12、F13、F5、F9、Factor Ia、Factor IX、Factor Xa、Factor VII、factor VIII、Factor VIIIc、 Fas、FcalphaR、FcepsilonRI、FcgammaIIb、FcgammaRI、FcgammaRIIa、FcgammaRIIIa、FcgammaRIIIb、FcRn、FEN-1、Ferritin、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受體、FGF-3、FGF-8、FGF-acidic、FGF-basic、FGFR、FGFR-3、Fibrin、fibroblast activation protein(FAP)、成纖維細胞生長因子、成纖維細胞生長因子-10、fibronectin、FL、FLIP、Flt-3、FLT3配體、Folate受體、濾泡刺激激素(FSH)、Fractalkine(CX3C)、游離重鏈、游離輕鏈、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受體、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15(MIC-1)、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14/CDMP-1)、GDF-6(BMP-13/CDMP-2)、GDF-7(BMP-12/CDMP-3)、GDF-8(Myostatin)、GDF-9、GDNF、Gelsolin、GFAP、GF-CSF、GFR-alpha1、GFR-alpha2、GFR-alpha3、GF-β 1、gH外套糖蛋白、GITR、Glucagon、Glucagon受體、Glucagon狀胜肽1受體、Glut 4、Glutamate carboxypeptidase II、糖蛋白hormone受體、糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)、Glypican-3、GM-CSF、GM-CSF受體、gp130、gp140、gp72、granulocyte-CSF(G-CSF)、GRO/MGSA、生長激素釋放因子、GRO-β、GRO-γ、H.pylori、Hapten(NP-cap or NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMV gB envelope糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子(HGF)、Hep B gp120、heparanase、heparin cofactor II、肝細胞生長因子、Bacillus anthracis protective抗原、Hepatitis Cvirus E2糖蛋白、Hepatitis E、Hepcidin、Her1、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、herpes simplex virus(HSV)gB糖蛋白、HGF、HGFA、高分子量骨髓瘤關連抗原(HMW-MAA)、HIV外套蛋白，例如GP120、HIV MIB gp 120 V3 loop、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMGB-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖蛋白、人類心肌球蛋白、human cytomegalovirus(HCMV)、人類生長激素(hGH)、人類血清白蛋白、人類組織型血纖維蛋白溶酶原活化子(t-PA)、Huntingtin、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-alpha、IFN-beta、IFN-gamma、IgA、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白、IGF-1、IGF-1R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受體、IL-11、IL-11受體、IL-12、IL-12受體、IL-13、IL-13受體、IL-15、IL-15受體、IL-16、IL-16受體、IL-17、IL-17受體、IL-18(IGIF)、IL-18受體、IL-1alpha、IL-1beta、IL-1受體、IL-2、IL-2受體、IL-20、IL-20受體、IL-21、IL-21受體、IL-23、IL-23受體、IL-2受體、IL-3、IL-3受體、IL-31、IL-31受體、IL-3受體、IL-4、IL-4受體IL-5、IL-5受體、IL-6、IL-6受體、IL-7、IL-7受體、IL-8、IL-8受體、IL-9、IL-9受體、免疫球蛋白免疫複合體、免疫球蛋白、INF-alpha、INF-alpha受體、INF-beta、INF-beta受體、INF-gamma、INF-gamma受體、IFN type-I、IFN type-I受體、influenza、inhibin、Inhibin α、Inhibin β、iNOS、胰島素、InsulinA-chain、 Insulin B-chain、Insulin狀生長因子1、胰島素狀生長因子2、胰島素狀生長因子binding proteins、integrin、integrin alpha2、integrin alpha3、integrin alpha4、integrin alpha4/beta1、integrin alpha-V/beta-3、integrin alpha-V/beta-6、integrin alpha4/beta7、integrin alpha5/beta1、integrin alpha5/beta3、integrin alpha5/beta6、integrin alpha σ(alphaV)、integrin alpha θ、integrin beta1、integrin beta2、integrin beta3(GPIIb-IIIa)、IP-10、I-TAC、JE、kalliklein、Kallikrein 11、Kallikrein 12、Kallikrein 14、Kallikrein 15、Kallikrein 2、Kallikrein 5、Kallikrein 6、Kallikrein L1、Kallikrein L2、Kallikrein L3、Kallikrein L4、kallistatin、KC、KDR、Keratinocyte Growth Factor(KGF)、Keratinocyte Growth Factor-2(KGF-2)、KGF、killer免疫球蛋白狀受體、kit ligand(KL)、Kit酪蛋白激酶、laminin 5、LAMP、LAPP(Amylin、islet-amyloid polypeptide)、LAP(TGF-1)、latency associated胜肽、Latent TGF-1、Latent TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受體、LECT2、Lefty、Leptin、黃體化激素(leutinizing hormone)(LH)、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相關抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受體、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-Selectin、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺界面活性劑、黃體化激素(leutinizing hormone)、Lymphotactin、Lympho毒素Beta Receptor、 Lysosphingolipid受體、Mac-1、macrophage-CSF(M-CSF)、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、maspin、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I(MCAF)、M-CSF、MDC、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、megsin、Mer、MET酪蛋白激酶受體家族、METALLOPROTEASES、膜糖蛋白OX2、Mesothelin、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、microbial protein、MIF、MIG、MIP、MIP-1 α、MIP-1 β、MIP-3 α、MIP-3 β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、單核球吸引蛋白、單核球群落抑制因子、小鼠性腺激素關連胜肽、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、mucin(Mud)、Muellerian-inhibiting substance、Mug、MuSK、Myelin關連糖蛋白、myeloid progenitor抑制因子-1(MPIF-I)、NAIP、Nanobody、NAP、NAP-2、NCA 90、NCAD、N-Cadherin、NCAM、Neprilysin、神經細胞黏附分子、neroserpin、神經原生長因子(NGF)、Neurotrophin-3、Neurotrophin-4、Neurotrophin-6、Neuropilin 1、Neurturin、NGF-beta、NGFR、NKG20、N-甲硫醯胺基人類生長激素、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受體、C型肝炎病毒的非結構性蛋白3型(NS3)、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、Oncostatin M、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受體、osteoinductive factors、osteopontin、OX40L、OX40R、oxidized LDL、p150、p95、PADPr、副甲狀腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、 P-Cadherin、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受體、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、Placenta生長因子、胎盤鹼性磷解酶(PLAP)、placental lactogen、血纖維蛋白溶酶原活化子抑制劑-1、platelet-生長因子、plgR、PLP、不同大小的聚甘醇鏈(例如PEG-20、PEG-30、PEG40)、PP14、prekallikrein、prion protein、procalcitonin、程式化細胞死亡蛋白1、pro胰島素、prolactin、Proprotein convertase PC9、prorelaxin、前列腺專一性膜抗原(PSMA)、Protein A、Protein C、Protein D、Protein S、Protein Z、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-selectin糖蛋白配體-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、relaxin、Relaxin A鏈、Relaxin B鏈、renin、respiratory syncytial virus(RSV)F、Ret、reticulon 4、Rheumatoid factors、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、Sclerostin、SDF-1、SDF1 α、SDF1 β、SERINE、Serum Amyloid P、Serum albumin、sFRP-3、Shh、Shiga類毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、sphingosine 1-phosphate受體1、Staphylococcal lipoteichoic acid、Stat、STEAP、STEAP-II、幹細胞因子(SCF)、strepto激酶、superoxide dismutase、syndecan-1、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤關連糖蛋白-72)、TARC、TB、TCA-3、T-cell受體alpha/beta、 TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、Tenascin、TERT、睪丸PLAP狀鹼性磷解酶、TfR、TGF、TGF-alpha、TGF-beta、TGF-beta Pan Specific、TGF-beta RII、TGF-beta RIIb、TGF-beta RIII、TGF-beta R1(ALK-5)、TGF-beta1、TGF-beta2、TGF-beta3、TGF-beta4、TGF-beta5、TGF-I、凝血酶、thrombopoietin(TPO)、Thymic stromal lymphoprotein受體、Thymus Ck-1、甲狀腺刺激激素(TSH)、甲狀腺素、甲狀腺結合球蛋白、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、組織因子蛋白酶抑制劑、組織因子蛋白、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受體I、TNF受體II、TNF-alpha、TNF-beta、TNF-beta2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2/DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2/TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R/TRANCE R)TNFRSF11B(OPG OCIF/TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF12A、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ/TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF R1 CD120a/p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b/p75-80)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRSF25(DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII/TNFC R)、TNFRSF4 (OX40 ACT35/TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1/APT1/CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68/TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1 BB CD137/ILA)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2 Ligand/TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK Ligand ODF/OPG Ligand)、TNFSF12(TWEAK Apo-3 Ligand/DR3 Ligand)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM Ligand/LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR Ligand AITR Ligand/TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin/DIF/TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa/TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC/p33)、TNFSF4(OX40 Ligand gp34/TXGP1)、TNFSF5(CD40 Ligand CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP)、TNFSF6(Fas Ligand Apo-1 Ligand/APT1 Ligand)、TNFSF7(CD27 Ligand CD70)、TNFSF8(CD30 Ligand CD153)、TNFSF9(4-1 BB Ligand CD137 Ligand)、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒性代謝物、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、transferrin受體、轉形生長因子(TGF)，例如TGF-alpha及TGF-beta、穿膜糖蛋白NMB、Transthyretin、TRF、Trk、TROP-2、Trophoblast糖蛋白、TSG、TSLP、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤關連抗原CA 125、腫瘤關連抗原表現Lewis Y相關的碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、Uro激酶、VAP-1、血管內皮 生長因子(VEGF)、vaspin、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-Cadherin-2、VEFGR-1(flt-1)、VEFGR-2、VEGF受體(VEGFR)、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、Viral抗原、VitB12受體、Vitronectin受體、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR integrin、von Willebrand Factor(vWF)、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-1-beta、XCL1/Lymphotactin、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD等。
構成可變區之胺基酸序列，在能維持其抗原結合活性之限度內，可容許1或多數之胺基酸殘基之改變。改變可變區之胺基酸序列之情形，改變部位或改變之胺基酸之數目不特別限定。例如可適當改變CDR及/或FR存在之胺基酸。改變可變區之胺基酸之情形，不特別限定，以維持結合活性較佳，例如：相較於改變前，具有50%以上，較佳為80%以上，更佳為100%以上之結合活性較佳。又，也可藉由胺基酸改變使結合活性上升，例如結合活性相較於改變前，可成為2倍、5倍、10倍等。本發明之抗體中，胺基酸序列之改變，可為胺基酸殘基之取代、加成、缺損、插入及修飾中之至少1種。
例如：可變區之N末端之麩醯胺酸經過焦麩醯胺基化而修飾為焦麩胺酸，為該技術領域中之通常知識者熟知的修飾。因此，本發明之抗體於其重鏈之N末端為麩醯胺酸 之情形，包含其修飾成焦麩胺酸的可變區。
本發明之抗體之可變區可為任意序列，可為小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體、及該等非人類抗體予以人類化而得之人類化抗體、及人類抗體等任意來源的抗體之可變區。「人類化抗體」，也稱為再構成(reshaped)人類抗體，係將人類以外之哺乳動物來源抗體例如小鼠抗體之互補性決定區(CDR；complementarity determining region)移植到人類抗體之CDR者。用於鑑定CDR之方法為公知(Kabat et al.、Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987)、National Institute of Health、Bethesda、Md.；Chothia et al.、Nature(1989)342：877)。又，其一般的基因重組方法也為公知(參照歐洲專利申請案公開編號EP 125023號公報、WO 96/02576號公報)。又，為了改善對於抗原之結合、藥物動態、安定性、抗原性，也可對於該等抗體之可變區導入各種胺基酸取代。也可藉由使本發明之抗體之可變區對於抗原之結合具有pH依存性，以使對於抗原能夠反複結合(WO/2009/125825)。
抗體之輕鏈不變區存在κ鏈與λ鏈型之不變區，但是可為任一輕鏈不變區。再者，本發明中輕鏈不變區，也可為經過了胺基酸取代、加成、缺損、插入及/或修飾等改變之輕鏈不變區。
本發明之抗體之重鏈不變區，可使用例如人類IgG抗體之重鏈不變區，較佳為人類IgG1抗體之重鏈不變區。
構成本發明之抗體之可變區，可為任意之識別抗原之可變區。構成重鏈可變區之胺基酸序列，在維持其抗原結合活性之限度內，可容許1或多數之胺基酸殘基之改變。
又，可變區之改變會使結合活性上升、專一性改善、pI下降，對於抗原之結合賦予pH依存的性質、結合熱安定性改善、溶解性改善、對於化學修飾之安定性、來自於糖鏈之異質性(heterogeneity)之改善、免疫原性下降的現象，係使用經電腦模擬(in silico)預測鑑定，或利用使用體外(in vitro)的T細胞的分析鑑定之T細胞抗原決定部位的規避、或活化調節性T細胞之T細胞抗原決定部位之導入等作為目的而實施(mAbs 3：243-247、2011)
又，本發明之多胜肽，也可為Fc區與其他蛋白質、生理活性胜肽等結合成的Fc融合蛋白質分子(胜肽Fc融合蛋白質)或、使以膠原蛋白或聚乳酸等高分子構成之細胞外基質等結合成的Fc融合蛋白質分子(支架Fc融合蛋白質)。
其他蛋白質、生理活性胜肽，例如受體、黏著分子、配體、酵素，但不限於該等。
本發明之Fc融合蛋白質分子之理想例，可列舉結合於標的之受體蛋白質有Fc分域融合而得之蛋白質，例如：TNFR-Fc融合蛋白、IL1R-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc融合蛋白、CTLA4-Fc融合蛋白等(Nat Med.2003 Jan；9(1)：47-52、BioDrugs.2006；20(3)：151-60.)。又，使本發明之多胜肽融合之蛋白質，只要能結合於標的分子即可，可為任意分子，例如scFv分子(WO2005/037989)、 單分域抗體分子(WO2004/058821、WO2003/002609)、類抗體分子(Current Opinion in Biotechnology 2006、17：653-658、Current Opinion in Biotechnology 2007、18：1-10、Current Opinion in Structural Biology 1997、7：463-469、Protein Science 2006、15：14-27)，例如：DARPins(WO2002/020565)、Affibody(WO1995/001937)、Avimer(WO2004/044011、WO2005/040229)、Adnectin(WO2002/032925)等。又，抗體及Fc融合蛋白質分子，也可為結合於多數種類之標的分子或抗原決定部位之雙專一性抗體等多重專一性抗體。
又，本發明之抗體也包括抗體之修飾物。抗體之修飾物，例如：結合有聚乙二醇(PEG)或細胞抑制性物質等各種分子而得的抗體。如此的抗體修飾物，可藉由對於本發明之抗體實施化學性修飾而獲得。抗體之修飾方法在該技術領域已確立。
再者，本發明之抗體也可為雙專一性抗體(bispecific antibody)。雙專一性抗體，係指在同一抗體分子內具有識別不同抗原決定部位之可變區的抗體，但該抗原決定部位可存在不同分子中也可存在同一分子中。
本發明之多胜肽可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法製造。例如：抗體可利用以下方法製作，但不限於該等。
藉由將編碼為經單離之多胜肽的基因導入適當的寄主以製作抗體之寄主細胞與表現載體之許多組合為公知。該 等表現系均可應用在單離本發明之抗原結合分子。真核細胞用作為寄主細胞之情形，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言，動物細胞可列舉如下的細胞。(1)哺乳類細胞、：CHO(中國倉鼠卵巢細胞株(Chinese hamster ovary cell line))、COS(猴腎細胞株(Monkey kidney cell line))、骨髓瘤(Sp2/O、NS0等)、BHK(幼倉鼠腎細胞株(baby hamster kidney cell line))、HEK293(有受剪切之腺病毒的人類胚胎腎細胞株(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus)(Ad)5 DNA)、PER.C6細胞(經腺病毒型E1A及E1B基因轉形的人類胚胎網膜細胞株(human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5(Ad5)E1A and E1B genes))、Hela、Vero、等(Current Protocols in Protein Science(May、2001、Unit 5.9、Table 5.9.1))(2)兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等
使為編碼為抗體之重鏈之DNA且為編碼為將Fc區中之1或多數胺基酸殘基取代為目的之其他胺基酸而得之重鏈之DNA、及編碼為抗體之輕鏈之DNA表現。編碼為將Fc區中之1或多數胺基酸殘基取代為目的之其他胺基酸之重鏈之DNA，可藉由例如取代編碼為天然型之重鏈之DNA之Fc區部分，並適當導入取代，使得編碼為該Fc區中之特定之胺基酸之密碼子編碼為目的之其他胺基酸，以獲得。
又，也可事先設計編碼為將天然型重鏈之Fc區中之1 或多數胺基酸殘基取代為目的之其他胺基酸而得之蛋白質之DNA，並將該DNA進行化學合成，而獲得編碼為Fc區中之1或多數之胺基酸殘基取代為目的之其他胺基酸而得之重鏈的DNA。胺基酸之取代部位、取代之種類，不特別限定。又，取代不限，可為缺損、加成、插入、或修飾中之任一者，或此等的組合。
又，編碼為Fc區中之1或多數胺基酸殘基取代為目的之其他胺基酸而得之重鏈的DNA，可以區分為部分DNA進行製造。部分DNA之組合，例如：編碼為可變區之DNA與編碼為不變區之DNA、或編碼為Fab區之DNA與編碼為Fc區之DNA等，但不限於該等組合。編碼為輕鏈之DNA，也同樣可區分為部分DNA以進行製造。
使上述DNA表現之方法，可列舉以下方法。例如：將編碼為重鏈可變區之DNA以及編碼為重鏈不變區之DNA一起納入表現載體，構建重鏈表現載體。同樣，將編碼為輕鏈可變區之DNA以及編碼為輕鏈不變區之DNA一起納入表現載體，構建輕鏈表現載體。該等重鏈、輕鏈之基因可以納入單一載體。
將編碼為目的抗體之DNA納入表現載體時，係在受表現控制區例如：增強子、啟動子(promoter)之控制之下表現的方式，納入表現載體。其次，利用該表現載體將寄主細胞轉形，使抗體表現。此時，可使用適當的寄主與表現載體之組合。
載體，可列舉M13系載體、pUC系載體、pBR322、 pBluescript、pCR-Script等。又，當目的為cDNA之次選殖、切出時，除了上述載體以外，也可使用例如：pGEM-T、pDIRECT、pT7等。
在目的為生產本發明之抗體而使用載體之情形，尤以表現載體為有用。表現載體，例如：寄主為JM109、DH5 α、HB101、XL1-Blue等大腸菌之情形，必需帶有使能在大腸菌以良好效率表現之啟動子、例如：lacZ啟動子(Ward等人、Nature(1989)341、544-546；FASEB J.(1992)6、2422-2427，將其全體納入本說明書作為參照)、araB啟動子(Better等人、Science(1988)240、1041-1043、將其全體納入本說明書作為參照)、或T7啟動子等。如此的載體，除了上述載體以外，可列舉pGEX-5X-1(Pharmacia公司製)、「QIAexpress system」(QIAGEN公司製)、pEGFP、或pET(於此情形，寄主宜為表現T7 RNA聚合酶之BL21較佳)等。
又，載體也可含有用於分泌多胜肽之訊號序列。多胜肽分泌用的訊號序列，當產生於大腸菌之胞外質之情形，可使用pelB訊號序列(Lei、S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169、4397，其全體納如於本說明書作為參照)。載體對於寄主細胞之導入，可使用例如微脂體(lipofectin)法、磷酸鈣法、DEAE-Dextran法進行。
大腸菌表現載體以外，就製造本發明之多胜肽之載體而言，可列舉：哺乳動物來源的表現載體(例如：pcDNA3(Invitrogen公司製)、或pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990、18(17),p5322、其全體納入本說明書中作為參照)、pEF、pCDM8)、昆蟲細胞來源的表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO BRL公司製)、pBacPAK8)、植物來源的表現載體(例如pMH1、pMH2)、動物病毒來源的表現載體(例如：pHSV、pMV、pAdexLcw)、反轉錄病毒來源的表現載體(例如：pZIPneo)、酵母來源的表現載體(例如：「Pichia Expression Kit」(Invitrogen公司製)、pNV11、SP-Q01)、枯草菌來源的表現載體(例如：pPL608、pKTH50)。
當目的為在CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞、HEK293細胞等動物細胞表現之情形，必需帶有使在細胞內表現所必要之啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan等人、Nature(1979)277、108、其全體納入本說明書中作為參照)、MMTV-LTR啟動子、EF1 α啟動子(Mizushima等人、Nucleic Acids Res.(1990)18、5322、其全體納入本說明書中作為參照)、CAG啟動子(Gene.(1991)108、193、其全體納入本說明書中作為參照)、CMV啟動子等，若具有用於選拔轉形細胞之基因(例如：能以藥劑(新黴素、G418等)判別之藥劑耐性基因)為更佳。具有如此特性之載體，例如：pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。再者，有時為了增加基因之副本數，會使EBNA1蛋白質共同表現，於此情形，使用具有複製開始點OriP之載體。(Biotechnol Bioeng.2001 Oct 20；75(2)：197-203.、Biotechnol Bioeng.2005 Sep 20；91(6)：670-7.)
再者，當目的為使基因安定表現且使細胞內之基因副本數之放大之情形，可列舉在核酸合成路徑缺損的CHO細胞導入具有與其互補之DHFR基因之載體(例如：pCHOI等)，並利用甲氨蝶呤(MTX)使放大之方法，又，當目的為基因之暫時性表現之情形，可列舉使用在染色體上帶有表現SV40 T抗原之基因的COS細胞，以帶有SV40之複製起點之載體(pcD等)進行轉形之方法。複製開始點，也可使用多瘤病毒、腺病毒、牛乳突瘤病毒(BPV)等來源者。再者，為了於寄主細胞系將基因副本數放大，表現載體也可含有胺基糖苷轉移酶(APH)基因、胸腺嘧啶激酶(TK)基因、大腸菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酵素(dhfr)基因等作為選擇標記。
抗體之回收，可藉由例如培養經轉形之細胞後，將經過分子轉形之細胞之細胞內或培養液予以分離以進行。抗體之分離、精製，可適當組合離心分離、硫安截止、鹽析、超過濾、1q、FcRn、Protein A、Protein G管柱、親和性層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等方法。
雙專一性抗體之有效率的製作方法，可使用Knobs-into-holes技術。具體而言，為了製作本發明之異源二聚化多胜肽，必需將具有彼此不同的胺基酸的多胜肽彼此組合，或將目的之異源二聚化多胜肽從其他同源二聚化多胜肽分離。
具Fc區之具不同胺基酸之多胜肽彼此之組合化，可應 用在抗體H鏈之第二不變區(CH2)或H鏈之第三不變區(CH3)之界面導入電荷性排斥，以抑制非目的之H鏈彼此之組合的技術(WO2006/106905)。
於對於CH2或CH3之界面導入電荷性的排斥以抑制不欲之H鏈彼此之組合之技術中，與H鏈之另一不變區之界面接觸之胺基酸殘基，例如CH3區之EU編號356號的殘基、EU編號439號的殘基、EU編號357號的殘基、EU編號370號的殘基、EU編號399號的殘基、EU編號409號的殘基所相對之區。
更具體而言，例如：從包含2種H鏈CH3區之抗體中，第1H鏈CH3區中之以下(1)~(3)表示之胺基酸殘基之群組選出之1組至3組胺基酸殘基具有同種電荷之抗體；(1)為H鏈CH3區包含之胺基酸殘基且為EU編號356位及439位之胺基酸殘基、(2)為H鏈CH3區包含之胺基酸殘基且為EU編號357位及370位之胺基酸殘基、(3)為H鏈CH3區包含之胺基酸殘基且為EU編號399位及409位之胺基酸殘基。
再者，可製成以下抗體：為與上述第1H鏈CH3區相異之第2H鏈CH3區中之前述(1)~(3)表示之胺基酸殘基之群組中選出之胺基酸殘基之群組，且前述第1H鏈CH3區具同種電荷之前述(1)~(3)所示之胺基酸殘基之群組所對應的1組至3組之胺基酸殘基，與前述第1H鏈CH3區之對應的胺基酸殘基具有相反的電荷。
上述(1)~(3)記載之各胺基酸殘基，在組合時會彼此接近。若為該技術領域中具有通常知識者，可針對所望的H鏈CH3區或H鏈不變區，利用使用市售軟體之同源性模式建立等，而找出上述(1)~(3)記載之胺基酸殘基所對應的部位，並適當改變該部位之胺基酸殘基。
上述抗體中，「具有電荷之胺基酸殘基」，例如：從以下(X)或(Y)中之任一群組包含之胺基酸殘基選出較佳；(X)麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)、(Y)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。
上述抗體中，「具有同種電荷」，係指例如：2個以上之胺基酸殘基中之任一者具有上述(X)或(Y)中任一群組包含之胺基酸殘基。「具有相反電荷」，係指例如：2個以上之胺基酸殘基中之至少1種胺基酸殘基為具有上述(X)或(Y)中之任一群組包含之胺基酸殘基時，其餘的胺基酸殘基具有不同的群組包含之胺基酸殘基。
理想態樣中，上述抗體也可利用將第1H鏈CH3區與第2H鏈CH3區以雙硫鍵而交聯。
本發明中供改變之胺基酸殘基，不限於上述抗體之可變區或抗體之不變區之胺基酸殘基。若為該技術領域中具有通常知識者，可針對多胜肽變異體或異種多聚物，利用使用市售軟體之同源性模式建立等，找出形成界面之胺基酸殘基，並以控制組合之方式，改變該部位之胺基酸殘基。
本發明之具Fc區之具不同胺基酸之多胜肽彼此之組合化，可使用另外其他的公知技術。藉由將抗體之其中之 一之H鏈之可變區存在之胺基酸側鏈取代為較大的側鏈(knob；突起)，並將其中另一H鏈之相對之可變區存在之胺基酸側鏈取代為較小的側鏈(hole；空隙)，藉此使突起能配置於空隙，可有效率的將具Fc區之具不同胺基酸之多胜肽彼此組合(WO1996/027011、Ridgway JB et al.、Protein Engineering(1996)9、617-621、Merchant AM et al.Nature Biotechnology(1998)16、677-681)。
此外，將具Fc區之具不同胺基酸之多胜肽彼此組合，可使用另外其他的公知技術。藉由使用抗體其中之一之H鏈之CH3之一部分為該部分所對應之IgA來源的序列且在其中另一H鏈之CH3之互補的部分導入該部分所對應之IgA來源的序列的strand-exchange engineered domain CH3，可利用CH3的互補性組合化，而有效率地進行具有不同序列之多胜肽之組合化(Protein Engineering Design & Selection、23；195-202、2010)。使用該公知技術也可有效率的將具Fc區之具不同胺基酸之多胜肽彼此組合化。
此外，也可使用WO2011/028952記載抗體之CH1與CL之組合化、利用VH、VL之組合化之異源二聚化抗體製作技術。
又，即使未能有效率地形成異源二聚化多胜肽，也可藉由與異源二聚化多胜肽分離、同源二聚化多胜肽分離、精製，而獲得異源二聚化多胜肽。當製作由序列互不相同之第一多胜肽及第二多胜肽構成之異源二聚化多胜肽時，會混入僅由2個第一多胜肽構成之同源二聚化多胜肽、僅 由2個第二多胜肽構成之同源二聚化多胜肽作為雜質。就有效率地去除該等2種同源二聚化多胜肽之方法而言，可使用公知技術。已有人報告以下方法：藉由對於2種H鏈之可變區導入胺基酸取代，並賦予等電點之差異，能將2種同源體與目的之異源二聚化抗體利用離子交換層析進行精製(WO2007114325)。
用於賦予等電點之差異之胺基酸改變，只要能夠對於組合之2個多胜肽之等電點造成差異即可，導入之胺基酸改變不特別限定，也可包括免疫原性之下降等其他目的之胺基酸改變。改變之胺基酸，宜為對於Fc γ受體之結合活性影響少的位置的胺基酸較佳。又，也可為提高對於所望的Fc γ受體之結合活性之胺基酸改變。如此改變用之胺基酸之位置，具體而言，例如：第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入從由EU編號137號的Gly、138號的Gly、139號的Thr、147號的Lys、192號的Ser、193號的Leu、196號的Gln、198號的Tyr、199號的Ile、203號的Asn、214號的Lys、263號的Val、272號的Glu、274號的Lys、278號的Tyr、288號的Lys、290號的Lys、316號的Gly、317號的Lys、320號的Lys、324號的Lys、335號的Thr、337號的Ser、340號的Lys、358號的Leu、360號的Lys、362號的Gln、364號的Ser、383號的Ser、384號的Asn、385號的Gly、386號的Gln、387號的Pro、390號的Asn、397號的Val及422號的Val構成之群組選出之至少一種胺基酸變異較佳。再者，導入從由EU編號137號 的Gly、138號的Gly、139號的Thr、147號的Lys、192號的Ser、193號的Leu、196號的Gln、199號的Ile、203號的Asn、214號的Lys、272號的Glu、274號的Lys、288號的Lys、290號的Lys、358號的Leu、360號的Lys、362號的Gln、383號的Ser、384號的Asn、385號的Gly、386號的Gln、390號的Asn、397號的Val及422號的Val構成之群組選出之至少一種胺基酸變異較佳，更佳為導入從EU編號137號的Gly、138號的Gly、147號的Lys、192號的Ser、193號的Leu、196號的Gln、199號的Ile、203號的Asn、214號的Lys、274號的Lys、288號的Lys、358號的Leu、384號的Asn及397號的Val構成之群組選出之至少一種胺基酸變異。
更具體而言，第一多胜肽或第二多胜肽中任一者之多胜肽之胺基酸序列中，導入從由EU編號196號的Gln、199號的Ile、263號的Val、272號的Glu、316號的Gly、358號的Leu、364號的Ser、383號的Ser、387號的Pro及397號的Val構成之群組選出之至少一種胺基酸變異，且其中另一多胜肽之胺基酸序列中，導入從由EU編號137號的Gly、138號的Gly、139號的Thr、147號的Lys、192號的Ser、193號的Leu、198號的Tyr、199號的Ile、203號的Asn、214號的Lys、274號的Lys、278號的Tyr、288號的Lys、290號的Lys、316號的Gly、317號的Lys、320號的Lys、324號的Lys、335號的Thr、337號的Ser、340號的Lys、358號的Leu、360號的Lys、362號的Gln、383 號的Ser、384號的Asn、385號的Gly、386號的Gln、390號的Asn及422號的Val構成之群組選出之至少一種胺基酸變異較佳。更佳為，在其中之一之多胜肽之胺基酸序列中，導入從由EU編號196號的Gln、199號的Ile、272號的Glu、358號的Leu、383號的Ser及397號的Val構成之群組選出之至少1種胺基酸變異，並於其中另一多胜肽之胺基酸序列中，導入從由EU編號137號的Gly、138號的Gly、139號的Thr、147號的Lys、192號的Ser、193號的Leu、199號的Ile、203號的Asn、214號的Lys、274號的Lys、288號的Lys、290號的Lys、358號的Leu、360號的Lys、362號的Gln、383號的Ser、384號的Asn、385號的Gly、386號的Gln、390號的Asn及422號的Val構成之群組選出之至少一種胺基酸變異較佳。又更佳為在其中之一之多胜肽之胺基酸序列中，導入從由EU編號196號的Gln、199號的Ile、358號的Leu及397號的Val構成之群組選出之至少1種胺基酸變異，且於其中另一多胜肽之胺基酸序列中，導入從由EU編號137號的Gly、138號的Gly、147號的Lys、192號的Ser、193號的Leu、199號的Ile、203號的Asn、214號的Lys、274號的Lys、288號的Lys及384號的Asn構成之群組選出之至少一種胺基酸變異。
胺基酸之改變，只要是在改變後，組合之2個多胜肽之等電點發生差異的改變即可，不特別限定。
用以提高等電點之理想改變，例如：EU編號196號的 胺基酸取代為Lys、263號的胺基酸取代為Lys、272號的胺基酸取代為Lys、316號的胺基酸取代為Lys、364號的胺基酸取代為Lys、358號的胺基酸取代為Lys、383號的胺基酸取代為Lys、387號的胺基酸取代為Lys、397號的胺基酸取代為Lys。又，用以降低等電點之理想改變，例如：EU編號137號的胺基酸取代為Glu、138號的胺基酸取代為Glu、139號的胺基酸取代為Glu、147號的胺基酸取代為Glu、198號的胺基酸取代為Glu、203號的胺基酸取代為Asp、214號的胺基酸取代為Thr、274號的胺基酸取代為Gln、278號的胺基酸取代為Glu、288號的胺基酸取代為Glu、290號的胺基酸取代為Glu、316號的胺基酸取代為Glu、317號的胺基酸取代為Glu、320號的胺基酸取代為Glu、324號的胺基酸取代為Glu、335號的胺基酸取代為Glu、337號的胺基酸取代為Asp、340號的胺基酸取代為Glu、358號的胺基酸取代為Glu、360號的胺基酸取代為Glu、362號的胺基酸取代為Glu、383號的胺基酸取代為Glu、384號的胺基酸取代為Glu、385號的胺基酸取代為Glu、386號的胺基酸取代為Glu、390號的胺基酸取代為Glu、422號的胺基酸取代為Glu。
組合使等電點產生差異之目的以外之胺基酸改變之情形，例如於使免疫原性下降之情形，可組合EU編號138號的胺基酸取代為Ser、192號的胺基酸取代為Asn、193號的胺基酸取代為Phe及199號的胺基酸取代為Thr。
又，精製異源二聚化抗體之方法，至今為止已有人報 告：將由結合於Protein A之小鼠IgG2a之H鏈與未結合於Protein A之大鼠IgG2b之H鏈構成異源二聚化抗體，使用Protein A予以精製之方法(WO98050431、WO95033844)。
又，藉由使用將IgG與ProteinA之結合部位即EU編號435號及436號的胺基酸殘基，取代為Tyr、His等對於ProteinA之結合力不同的胺基酸而得的H鏈，使H鏈與Protein A之交互作用改變，並藉由使用Protein A管柱，可僅將異源二聚化抗體有效率的精製。該等取代、技術，可組合多數例如2個以上。又，該等改變可以對於第一多胜肽與第二多胜肽適當地分別進行。又，本發明之多胜肽，也可為以施有上述改變者為基礎製作者。
又，本發明提供一種製造含Fc區之多胜肽之方法，包含以下步驟：係藉由對於構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽導入胺基酸變異，使該Fc區成為異源二聚物，並藉由胺基酸變異之導入，使得相較於該Fc區成為同源二聚物之情形，Fc區之機能有所改變。
例如可列舉包含以下步驟之製造方法；(a)在含Fc區之多胜肽中，對於構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽導入胺基酸變異、(b)測定已於前述步驟(a)導入變異之由第一多胜肽及第二多胜肽構成之異源二聚物之Fc區之機能，及(c)比較母多胜肽或藉由胺基酸變異之導入使該Fc區成為同源二聚物之情形，選擇Fc區之機能經改變之多胜肽。
又，本製造方法中，可在(a)之步驟後進行以下步驟。
(d)使具Fc區之由第一多胜肽與第二多胜肽構成之異源二聚化多胜肽，展示於經提示之核糖體、噬菌體、酵母菌。
理想態樣為一種包含Fc區之多胜肽之製造方法，包含以下步驟：(a)比較母多胜肽或由於胺基酸變異之導入使該Fc區成為同源二聚物之情形，以Fc區之機能有所改變之方式改變編碼為該多胜肽之核酸，(b)對於寄主細胞導入該核酸，並培養使其表現該核酸，(c)從寄主細胞培養物回收該多胜肽。
再者，本發明也包括依該製造方法製造之抗體及Fc融合蛋白質分子。
依本方法導入之胺基酸變異之種類或範圍不特別限定，可列舉說明書記載之各Fc區之機能之改變涉及的胺基酸變異(更具體而言，實施例之表具體揭示之胺基酸變異)。
又，本發明提供一種改變多胜肽之機能之方法，係改變含Fc區之多胜肽之機能之方法，包含以下步驟：藉由對於構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽導入胺基酸變異，使該Fc區成為異源二聚物，並相較於藉由胺基酸變異之導入使該Fc區成為同源二聚物之情形，使Fc區之機能改變。
例如可列舉包含以下步驟之改變方法；(a)在含Fc區之多胜肽中，對於構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽導入胺基酸變異， (b)測定已於前述步驟(a)導入變異之由第一多胜肽及第二多胜肽構成之異源二聚物之Fc區之機能，及(c)比較母多胜肽或由於胺基酸變異之導入而使該Fc區成為同源二聚物之情形，選擇Fc區之機能有所改變之多胜肽。
又，本改變方法中，可在(a)之步驟後進行以下步驟。
(d)使具Fc區之由第一多胜肽與第二多胜肽構成之異源二聚化多胜肽，展示於經提示之核糖體、噬菌體、酵母菌。
理想態樣為一種包含Fc區之多胜肽之改變方法，包含以下步驟：(a)比較母多胜肽或由於胺基酸變異之導入使該Fc區成為同源二聚物之情形，以Fc區之機能有所改變之方式改變編碼為該多胜肽之核酸，(b)對於寄主細胞導入該核酸，並培養使其表現該核酸，(c)從寄主細胞培養物回收該多胜肽。
再者，本發明也包括依該改變方法改變之抗體及Fc融合蛋白質分子。
依本方法導入之胺基酸變異之種類或範圍不特別限定，可列舉說明書記載之各Fc區之機能之改變涉及的胺基酸變異(更具體而言，實施例之表具體揭示之胺基酸變異)。
又，本發明提供一種核酸，其係編碼為如下的多胜肽：包含Fc區且該Fc區由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成，相較於該Fc區僅由含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽及/或該Fc區僅由含第二多胜肽之 同源二聚化體構成之多胜肽，該Fc區之機能經過改變。本發明之該核酸可為DNA、RNA等任意形態。
又，本發明提供包含上述本發明之核酸之載體。載體之種類可因應導入載體之寄主細胞，由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，例如可使用上述載體。
再者，本發明，係關於由上述本發明之載體轉形之寄主細胞。寄主細胞可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，例如可使用上述寄主細胞。
<醫藥組合物>
本發明提供含有本發明之多胜肽之醫藥組合物。
本發明之醫藥組合物，除了本發明之多胜肽抗體或Fc融合蛋白質分子以外，也可導入醫藥上可容許之載體並以公知方法製劑化。例如：可以和水或除此以外的藥學上可容許之溶液之無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑之形式，以非經口的使用。例如據認為可以與藥理學上可容許之載體或介質，具體而言，與滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、載具(vehicle)、防腐劑、黏結劑等適當組合，以一般認可之製藥實務要求之單位用量形態混合而製劑化。具體而言，載體可列舉輕質矽酸酐、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯基縮醛二乙胺基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三酸甘油酯、聚氧乙烯硬化篦麻子油60、白糖、羧基甲基纖維素、玉米澱粉、 無機鹽類等。該等製劑中，有效成分量係可獲得指示之範圍之適當容量者。
注射用之無菌組成物，可使用如注射用蒸餾水之載具，依通常之製劑實務配方。
注射用水溶液，也可併用例如生理食鹽水、包含葡萄糖或其他輔助藥之等張液、例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉，適當的溶解輔助劑例如醇，具體而言乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非離子性界面活性劑、例如聚山梨糖醇酯80(TM)、HCO-50。
油性液可列舉麻油、黃豆油，也可併用苯甲酸苄酯、苯甲醇作為溶解輔助劑。又，也可摻合緩衝劑例如磷酸鹽緩衝液、乙酸鈉緩衝液、止痛劑例如：普羅卡因鹽酸鹽、安定劑例如苯甲醇、苯酚、抗氧化劑。製備之注射液通常填充在適當的安瓿。
投予較佳為非經口投予，具體而言，可列舉注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型等。注射劑型之例，例如：可利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等進行全身或局部投予。
又，可視患者的年齡、症狀選擇適當投予方法。含有多胜肽或編碼為多胜肽之聚核苷酸之醫藥組合物之投予量，例如可在每次體重每1kg為0.0001 mg至1000 mg之範圍選擇。或例如可於每名患者為0.001至100000 mg/body之範圍選擇投予量，但不限於該等數值。投予量、投予方法會視患者之體重或年齡、症狀等變動，若為該技術領域 中具有通常知識者可適當選擇。
本發明中，上述含本發明之多胜肽之醫藥組合物，作為癌症、免疫發炎性疾病等之治療劑或預防劑之有效成分為有用。
又，本說明書使用之胺基酸之3字母表示記載及1字母表示記載之對應如下。
丙胺酸：Ala：A
精胺酸：Arg：R
天冬醯胺酸：Asn：N
天冬胺酸：Asp：D
半胱胺酸：Cys：C
麩醯胺酸：Gln：Q
麩胺酸：Glu：E
甘胺酸：Gly：G
組胺酸：His：H
異白胺酸：Ile：I
白胺酸：Leu：L
離胺酸：Lys：K
甲硫胺酸：Met：M
苯基丙胺酸：Phe：F
脯胺酸：Pro：P
絲胺酸：Ser：S
蘇胺酸：Thr：T
色胺酸：Trp：W
酪胺酸：Tyr：Y
纈胺酸：Val：V
又，本說明書引用的全部先前技術文獻，作為參照納入於本說明書。
【實施例】
以下以實施例更具體說明本發明，但本發明不限於該等實施例。
[實施例1]利用異源二聚化抗體提高Fc γ R識別能力之概念之說明
抗體係經由Fc區而與FcRn、Fc γ R、補體等各式各樣的分子交互作用。為Fc之一種配體的FcRn，由於會對於抗體之各H鏈(重鏈)各結合1分子，所以對於1分子之抗體會結合2分子之FcRn(圖1)。在活體內，由於FcRn係表現在細胞膜上，所以活體內，抗體會藉由各H鏈之相同部分對照的識別2分子的FcRn(Nature、372：379-383、1994)。又，與IgG屬於相同免疫球蛋白家族之IgA，也如同IgG與FcRn之關係，1分子之IgA對稱的識別2分子之IgA受體Fc α R(圖2)(Nature、423：614-620、2003)。
但是Fc γ R與FcRn等不同，Fc γ R對於抗體1分子僅會有1分子結合(圖3)(JBC、276：16469-16477、2001)。IgG雖會經由兩H鏈之CH2分域而識別Fc γ R，但是與Fc γ R交互作用的部位於各H鏈不相同。例如：若以圖3之左側之H鏈為HA鏈、右側為HB鏈，EU編號327號的Ala於HA鏈、HB鏈之各鏈會與Fc γ R交互作用，但是於各H鏈中交互作 用之對象側之殘基之性質不同(圖4)。HA鏈中，Fc γ RIII之EU編號87號與EU編號110號的Trp會疏水性的交互作用，但是HB鏈中，會與EU編號131號的His交互作用。所以，當EU編號327號的Ala取代為Trp等疏水性高的胺基酸的情形，於HA鏈雖有提高與Fc γ R之結合活性的效果，但可能於HB鏈會使與Fc γ R之結合活性下降。因此，為了使藉由胺基酸改變將IgG之Fc區對於Fc γ R之交互作用最適化，據認為需考慮各H鏈中對於Fc γ R之非對稱的效果。儘管如此，在習知技術中，當IgG之Fc區對於Fc γ R之交互作用最適化時，係對於兩H鏈導入相同的改變(WO2006/019447、WO2000/042072)。但是若考慮IgG之Fc區與Fc γ R係非對稱的交互作用，則據認為對於各H鏈導入不同的改變可更為精密的將IgG與Fc γ R之交互作用最適化。亦即，為了將Fc區對於Fc γ R之交互作用最適化，使用對於各H鏈施加不同改變之抗體異源二聚化抗體，可以相較於以習知技術實施之對於各H鏈施加相同改變之抗體同源二聚化抗體，將與Fc γ R之交互作用更加最適化。
[實施例2]利用異源二聚化抗體提高Fc γ R識別能力之概念之證明
探討藉由使用對於抗體之各H鏈導入不同改變之異源二聚化抗體，是否相較於為習知技術之同源二聚化抗體，抗體與Fc γ R之結合活性更為最適化。
以往係使用對於抗體之各H鏈導入相同改變之同源二聚化抗體，探討對於Fc γ R之結合增強之改變。但是如實 施例1所言及，由於抗體與Fc γ R係非對稱的交互作用，所以當對於兩H鏈導入相同改變之情形，該改變在其中之一之H鏈會增強對於Fc γ R之結合活性，但於另一H鏈可能會抑制結合。將如此的改變對於兩H鏈導入而得之同源二聚化抗體，對於Fc γ R之結合活性不一定增強，但僅對於其中一H鏈導入改變而得之異源二聚化抗體，可能對於Fc γ R之結合活性會增強。
為了檢驗此假說，比較由將據認為會改變對於Fc γ R之結合活性之改變僅導入其中一H鏈而得之第一多胜肽、與未施加此改變之第二多胜肽構成之異源二聚化抗體，以及由將據認為會改變對於Fc γ R之結合活性之改變僅導入其中一H鏈而得之第一多胜肽構成的同源二聚化抗體對於Fc γ R之結合。依據以往的想法，若該改變增強對於Fc γ R之結合活性，則同源二聚化抗體應必定優於異源二聚化抗體。但是假定抗體之Fc係非對稱地識別Fc γ R，則會隨改變之種類，異源二聚化抗體應比起同源二聚化抗體，對於Fc γ R顯示較強結合活性。
抗體之H鏈之可變區，係使用含有WO2009/041062揭示之血漿中動態有改善之抗Glypican3抗體之pH7之CDR之Glypican3抗體之可變區，且稱為GpH7(序列編號：1)。抗體H鏈不變區係使用以下者，並將其與GpH7組合使用。又，抗體H鏈不變區之名稱命為H1之情形，可變區帶有GpH7之抗體之H鏈所對應之序列稱為GpH7-H1。又，顯示胺基酸之改變之情形，係如D356K。最初的字母(該當於 D356K之D)，係指改變前之胺基酸殘基以單字母表示記載時之字母，接續的數字(該當於D356K之356)，係指其改變位置之EU編號，最後的字母(該當於D356K之K)，係指改變後之胺基酸殘基以單字母表示記載之情形之字母。依參考實施例1之方法製備可變區帶有GpH7之IgG1之C末端之Gly及Lys除去而得之GpH7-G1d(序列編號：2)、對於GpH7-G1d導入D356K及H435R之變異之GpH7-A5(序列編號：3)、對於GpH7-G1d導入K439E之變異之GpH7-B3(序列編號：4)。對於各H鏈導入之D356K及K439E之變異，係為了生產由2個H鏈構成之異源二聚化抗體時，有效率地形成各H鏈之異源體而導入(WO2006/106905)。H435R係會妨礙對於Protein A之結合之改變，係為了將異源體與同源體以良好效率分離而導入(參照參考實施例3、4、5)。同樣，抗體之L鏈使用WO2009/041062揭示之血漿中動態有改善之Glypican3抗體之L鏈GpL16-k0(序列編號：5)。
以GpH7-A5、GpH7-B3作為母多胜肽，導入用於證明異源二聚化抗體之概念之變異，並製備改變體，進行評價。製作之表現載體，依照參考實施例1之方法，使用在對於FreeStyle293細胞(invitrogen)進行轉染。將表現的抗體依參考實施例1之方法精製。表現同源二聚化抗體時，使用插入有與插入抗體L鏈GpL16-k0之表現載體為同種類之抗體H鏈序列的表現載體。使異源二聚化抗體表現時，抗體L鏈使用與同源二聚化抗體同樣插入有GpL16-k0之表現 載體，並且就抗體H鏈之一，使用對於已導入D356K之改變之GpH7-A5插入進一步更施加改變之序列的表現載體，就抗體之另一H鏈而言，使用對於導入K439E之改變之GpH7-B3插入更進一步導入改變之序列之表現載體，以將異源二聚化抗體有效率的表現。表現後精製獲得之抗體，於例如異源二聚化抗體之表現使用之抗體H鏈所對應之表現載體之一為GpH7-H1、另一抗體H鏈為GpH7-H2、抗體L鏈所對應之表現載體為GpL16-k0之情形，表示記載為GpH7-H1/GpH7-H2/GpL16-k0。於此時，導入D356K、H435R之改變之序列對應於H1、導入K439E之改變之序列對應於H2。例如：當同源二聚化抗體之表現使用之抗體H鏈所對應之表現載體為GpH7-H1、抗體L鏈所對應之表現載體為GpL16-k0之同源二聚化抗體之情形，表示記載為GpH7-H1/GpL16-k0。使用製備之抗體，依參考實施例2記載之方法測定對於Fc γ R之結合活性。
首先，將為了形成、精製異源二聚化體而導入於GpH7-A5之D356K及H435R、及導入於GpH7-B3之K439E之改變，與天然型IgG比較，評價是否會影響對於Fc γ R之結合活性。作為對照，使用插入有作為抗體H鏈之GpH7G1d、作為抗體L鏈之GpL16-k0的質體，依參考實施例1之方法，表現、精製GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)。同樣，製備將D356K及H435R導入兩H鏈而得之同源二聚化抗體GpH7-A5/GpL16-k0(序列編號：3、5)、K439E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-B3/GpL16-k0(序列 編號：4、5)、D356K及H435R導入其中之一之H鏈，且K439E導入其中另一H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)。依參考實施例2之方法，比較該等抗體與對於各Fc γ R之結合活性，結果整理於圖5。
測定結果，比較GpH7-G1d/GpL16-k0與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，兩者未觀察到對於各Fc γ R的結合活性有大幅變化。又，GpH7-A5/GpL16-k0及GpH7-B3/GpL16-k0，相較於GpH7-G1d/GpL16-k0，對於任一Fc γ R都維持至少8成左右的結合活性。由該等結果判斷：GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0、GpH7-A5/GpL16-k0、GpH7-B3/GpL16-k0相較於GpH7-G1d/GpL16-k0，對於Fc γ R之結合無顯著減損，可以比較對於該等抗體之各H鏈導入變異之改變體對各Fc γ R之結合活性。
其次，依參考實施例1之方法製作對於GpH7-A5導入G237A之變異之GpH7-A26(序列編號：6)。H鏈使用GpH7-A26、GpH7-B3、L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法使G237A僅導入其中之一之H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：6、4、5)表現。同樣，H鏈使用GpH7-A26、L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法使將G237A對於兩H鏈導入而得之同源二聚化抗體GpH7-A26/GpL16-k0(序列編號：6、5)表現。將該等依參考實施例2之方法，評價各對於Fc γ R之結合活性(圖6)。其結果，異源二聚化抗體 GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0，比起GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性增強。儘管如此，將相同改變對於兩H鏈施加之同源二聚化抗體GpH7-A26/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性減弱。由此可知，若將G237A導入兩H鏈，對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性減弱，但即便如此，若僅對於其中之一之H鏈導入，係對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性之增強之改變。
其次，依參考實施例1之方法製作對於GpH7-A5導入G237L之變異之GpH7-A29(序列編號：7)。H鏈使用GpH7-A29、GpH7-B3、L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法使G237L僅導入於其中之一之H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：7、4、5)表現。同樣，H鏈使用GpH7-A29、L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法使G237L導入於兩H鏈而得之同源二聚化抗體GpH7-A29/GpL16-k0(序列編號：7、5)表現。依參考實施例2之方法，評價該等抗體對於各Fc γ R之結合活性(圖7)。異源二聚化抗體GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性增強。儘管如此，將相同改變對於兩H鏈施加之同源二聚化抗體GpH7-A29/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb 之結合活性減弱。由此可知，若將G237L對於兩H鏈導入，對Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性會減弱，儘管如此，若僅對於其中之一之H鏈導入，會是有使對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性增強之效果之改變。
其次依參考實施例1之方法製作對於GpH7-A5導入L328E之變異的GpH7-A42(序列編號：8)。H鏈使用GpH7-A42、GpH7-B3、L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法使L328E僅導入於其中之一之H鏈的異源二聚化抗體GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：8、4、5)表現。同樣，H鏈使用GpH7-A42、L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法使L328E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-A42/GpL16-k0(序列編號：8、5)表現。將該等依參考實施例2之方法，各評價對於Fc γ R之結合活性(圖8)。異源二聚化抗體GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性增強。另一方面，將相同改變對於兩H鏈施加之同源二聚化抗體GpH7-A42/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R之結合活性比起GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0減弱，對於Fc γ RIIb之結合活性增強，但其增強程度，以僅將L328E導入其中之一之H鏈的GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0為較大。由此可知，相較於將L328E導入兩H鏈，僅導入其中之一之H鏈者，為對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性增強之效果較高的改變。
其次，依參考實施例1之方法製作對於GpH7-A5導入 L328D之變異之GpH7-A43(序列編號：9)。H鏈使用GpH7-A43、GpH7-B3、L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法使L328D僅導入其中之一之H鏈之異源二聚化抗體GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：9、4、5)表現。同樣，H鏈使用GpH7-A43、L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法使L328D導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-A43/GpL16-k0(序列編號：9、5)表現。將該等依參考實施例2之方法評價對各Fc γ R之結合活性(圖9)。異源二聚化抗體GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性增強。另一方面，將相同改變對於兩H鏈施加之同源二聚化抗體GpH7-A43/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R之結合活性比起GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0減弱，對於Fc γ RIIb之結合活性雖增強，但其增強程度，以將L328D僅導入其中之一之H鏈之GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0較大。由此可知，相較於L328D導入兩H鏈，僅導入其中之一之H鏈者，為對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性增強較有效果的改變。
其次，依參考實施例1之方法製作對於GpH7-B3導入L234E之變異之GpH7-B16(序列編號：10)。H鏈使用GpH7-A5、GpH7-B16、L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法使L234E僅導入其中之一之H鏈之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0(序列編號：3、10、5)表現。同樣，H鏈使用GpH7-B16、L鏈使用GpL16-k0，依參考實 施例1之方法，將L234E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-B16/GpL16-k0(序列編號：10、5)表現。將該等依參考實施例2之方法評價對各Fc γ R之結合活性(圖10)。異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIIa F、Fc γ RIIb之結合活性增強。儘管如此，將相同改變對於兩H鏈施加之同源二聚化抗體GpH7-B16/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIIa F、Fc γ RIIb之結合活性減弱。由此可知，若將L234E對兩H鏈導入，對於Fc γ RIIIa F、Fc γ RIIb之結合會減弱，但若僅對其中之一之H鏈導入，是對於Fc γ RIIIa F、Fc γ RIIb之結合活性有增強效果之改變。
其次依參考實施例1之方法製作對於GpH7-B3導入L234D之變異之GpH7-B17(序列編號：11)。依參考實施例1之方法，將H鏈使用GpH7-A5、GpH7-B17、L鏈使用GpL16-k0，L234D僅導入其中之一之H鏈之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0(序列編號：3、11、5)表現。以同樣方式，依參考實施例1之方法，將H鏈使用GpH7-B17、L鏈使用GpL16-k0、L234D導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-B17/GpL16-k0(序列編號：11、5)表現。將該等依參考實施例2之方法評價對各Fc γ R之結合活性(圖11)。異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性增強。儘管如此，將相同改變對於兩 H鏈施加之同源二聚化抗體GpH7-B17/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性減弱。由此可知：L234D若導入兩H鏈，會使對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性減弱，但若僅導入其中之一之H鏈，會是有使對於Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb之結合活性增強之效果之改變。
從該等結果，可知：在對於2個H鏈導入相同改變之同源二聚化抗體，即使對於Fc γ R之結合活性減弱之情形，仍可藉由製作僅對於抗體之其中之一之H鏈導入該改變之異源二聚化抗體，而使對於Fc γ R之結合活性增強。
亦即，由該等結果可知：藉由使用對於抗體之各H鏈施加不同改變之異源二聚化抗體，相較於為習知方法之對於2個H鏈導入相同改變之同源二聚化抗體，可賦予更優異之抗體之Fc區對Fc γ R之結合特性。
[實施例3]異源二聚化抗體對於Fc γ R識別方向之確認
如實施例2所示，藉由使用異源二聚化抗體，相較於同源二聚化抗體，對於Fc γ R之結合活性增強。將實施例2之改變對於抗體之兩H鏈導入之情形，相較於天然型抗體，對於Fc γ R之結合活性更減少。從此結果可認為：對於異源二聚化抗體導入之改變，當對於其中之一之H鏈導入時，對於Fc γ R之結合活性增強，但對於兩鏈導入之情形，於有Fc γ R結合之狀態，其中之一之鏈雖增強改變後殘基之結合，但是其中另一鏈則抑制與Fc γ R之交互作用。亦即，若將圖3之Fc γ R從圖後側結合之狀態稱為「從X方 向結合」，並將與其相反地，從圖的前側的結合稱為「從Y方向之結合」，據認為同源二聚化抗體從X方向、Y方向之兩方向對於Fc γ R之結合活性係同等地變化，但是異源二聚化抗體從X方向、Y方向其中任一方向之結合係不均等地使對於Fc γ R之結合活性變化。
為了驗證該假說，進行實驗，找出與Fc γ R之結合主要僅從X方向、Y方向中任一方向抑制之改變，並且對於H鏈之其中任一者導入此處找出的改變，並對於相同H鏈、或不同之其中另一H鏈導入增強對於Fc γ R之結合活性之改變，藉以驗證對於Fc γ R之結合活性是以如何的方式受抑制。探討該改變與組合方法。從立體結構資訊探索涉及抗體與Fc γ R之結合但僅涉及其中之一之H鏈之結合的改變，找到P329為其候選者。HA鏈之P329會與Fc γ RIII之87號及110號的Trp形成疏水核，但HB鏈之P329不會與Fc γ RIII直接交互作用(Nature、372：379-383、1994)(圖12)。例如：若將HA鏈之P329取代為具有電荷之殘基，該疏水核會崩潰，據認為會抑制從圖12所示之X方向之結合，但是由於未涉及從相反的Y方向的結合的HB鏈之P329並未受取代而維持原狀，所以預測從Y方向之結合未受大影響。
依參考實施例1記載之方法製作插入有各對於GpH7-B3之P329導入電荷之R、K、D、E之變異的序列GpH7-B12、GpH7-B13、GpH7-B14、GpH7-B15(序列編號：12~15)的表現載體。依參考實施例1之方法表現，使製作之表現 載體，各與GpH7-A5、GpL16-k0組合而表現異源二聚化抗體，或是未與其他H鏈組合而僅與GpL16-k0一起成為同源二聚化抗體，並進行精製。精製而得之抗體，就異源二聚化抗體而言，為GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0，就同源二聚化抗體而言，為GpH7-B12/GpL16-k0、GpH7-B13/GpL16-k0、GpH7-B14/GpL16-k0、GpH7-B15/GpL16-k0。使用製備之抗體，依參考實施例2記載之方法測定對於各Fc γ R之結合，其結果如圖13所示。
導入P329R、P329K之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0對於Fc γ R之結合活性，為GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0對於各Fc γ R之結合活性之1/5至1/4左右，同源二聚化抗體GpH7-B12/GpL16-k0、GpH7-B13/GpL16-k0，未觀察到與Fc γ R之結合。又，導入P329D、P329E之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0對於Fc γ R之結合活性，針對Fc γ RIa，為GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0對於各Fc γ R之結合活性之1/5至1/4左右，對於Fc γ RIa以外，維持1/2以上之結合活性。同源二聚化抗體GpH7-B14/GpL16-k0、GpH7-B15/GpL16-k0，僅殘存對於 Fc γ RIa之結合活性，但為GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0對於Fc γ RIa之結合活性之1/5以下。由於GpH7-B12、GpH7-B13導入鹼性殘基，GpH7-B14、GpH7-B15導入酸性殘基，所以，據認為P329取代為Arg、Lys等鹼性殘基者，更強力地抑制對於Fc γ R之結合活性。本次，僅對於其中之一之H鏈導入改變之情形，會殘存對於Fc γ R之結合活性，但是若對於兩鏈導入相同改變，則幾乎未觀察到結合，此結果可認為係支持以下假說：其中之一之H鏈之P329若取代為親水性之殘基，會抑制從一方向之結合，但是從另一方向之結合會維持。
其次，製作各改變與P329R之改變組合之改變體，並比較各改變體對於各Fc γ R之結合活性，驗證：藉由於實施例2找到的異源二聚化對增強對Fc γ R之結合活性之改變G237A、L234D是否與Fc γ R之交互作用是偏在一方向增強。依參考實施例1記載之方法，製作插入有以下序列的表現載體：以對於與K439E為相同之H鏈導入P329R之變異之方式對於GpH7-B3導入P329R之變異而得之GpH7-B12(序列編號：12)、以對於與D356K、H435R為相同之H鏈導入P329R之變異之方式對於GpH7-A5導入P329R而得之GpH7-A48(序列編號：16)、對於GpH7-A5導入G237A與P329R之變異而得之序列GpH7-A45(序列編號：17)、對於GpH7-B3導入L234D與P329R之變異而得之GpH7-B41(序列編號：18)。依參考實施例1之方法，使用該等表現載體及對應於抗體L鏈之表現載體GpL16-k0，以將G237A或L234D與 P329R導入其中任一H鏈之方式表現(表1)。
Figure 101123397-A0202-02-0113-640
樣本欄，記載抗體名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄，記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為不同的變異(無特別的變異之情形，記載為「-」)。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
G237A與P329R之組合之評價中，就導入改變之多胜肽使用GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0、就將P329R導入其中之一之H鏈之改變體使用GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0及GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0、就與P329R為相同H鏈導入G237A之改變體使用GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0、就與 P329R為不同之H鏈導入G237A之改變體使用GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0，依照參考實施例2之方法，比較對於各Fc γ R之結合活性(圖14)。
比較將P329R導入其中之一之H鏈的GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0以及GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0，並未觀察到對於Fc γ R之結合樣式有大的差異。由此可認為：P329R即使對於已導入D356K、H435R之H鏈導入、對於已導入K439E之H鏈導入，也不會影響對於Fc γ R之結合。
其次，將G237A僅對於其中之一之H鏈導入而得之異源二聚化抗體GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R、IIb之結合有所增強。但是相較於將P329R僅導入其中之一之H鏈而得之GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0，將G237A對於其中另一之H鏈導入而得之GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0，對於Fc γ R之結合減弱，且未觀察到G237A對於Fc γ RIIa R、IIb之結合增強之效果。另一方面，相較於將P329R僅對於其中之一之H鏈導入而得之GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0，將G237A對於與P329R為相同之H鏈導入而得之GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R、IIb之結合增強，且觀察到G237A對於Fc γ RIIa R、IIb之增強效果。從此結果顯示：若將G237A導入與已導入P329R之鏈為不同之鏈，由於抗體與Fc γ R之結合受強力抑制，故若將導入於GpH7-A5之G237A與導 入於GpH7-B3之P329R加以組合，抗體與Fc γ R之結合會於相同方向識別。
針對L234D之改變，也實施同樣評價(圖15)。將L234D僅對其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R、IIb之結合增強。但是相較於將P329R僅對其中之一之H鏈導入而得之GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0，將L234D對於其中另一一H鏈導入而得之GpH7-A48/GpH7-B17/GpL16-k0，對於Fc γ R Ia以外之Fc γ R之結合減弱，且未觀察到L234D對於Fc γ RIIa R、IIb之結合增強之效果。另一方面，相較於將P329R僅對於其中之一之H鏈導入而得之GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0，將L234D導入與P329R為相同之H鏈而得之GpH7-A5/GpH7-B41/GpL16-k0，對於Fc γ RIIa R、IIb之結合增強，且觀察到L234D對於Fc γ RIIa R、IIb之增強效果。由此結果，顯示：若將L234D導入與已導入P329R之鏈為不同之鏈，由於抗體與Fc γ R之結合受強力抑制，故若組合導入GpH7-B3之L234D及導入GpH7-A5之P329R，則抗體與Fc γ R之結合會於相同方向識別。
亦即G237A及L234D均為，P329R增強(/減弱)抗體與Fc γ R之結合活性之方向相同。
以此方式，異源改變將對於Fc γ R之結合於X方向、Y方向任一方向不均地增強。從此結果顯示：異源二聚化抗體 將與Fc γ R之交互作用非對稱地增強。
[實施例4]異源二聚化抗體與同源二聚化抗體對於Fc γ R之結合比較
依實施例2，發現藉由對於抗體之2個H鏈施加相異之改變，能比起對於2個H鏈施加相同改變，增強經由抗體之Fc區對於Fc γ R之結合。而，為了找出具有如此性質之改變，進行以下實驗。
製作將於實施例2製作之GpH7-B3(序列編號：4)中，據認為涉及與Fc γ R結合之胺基酸及其周邊的胺基酸，具體而言，EU編號234號的Leu、EU編號235號的Leu、EU編號236號的Gly、EU編號237號的Gly、EU編號238號的Pro、EU編號329號的Ser、EU編號265號的Asp、EU編號266號的Val、EU編號267號的Ser、EU編號268號的His、EU編號269號的Glu、EU編號270號的Asp、EU編號271號的Pro、EU編號295號的Gln、EU編號296號的Tyr、EU編號298號的Ser、EU編號300號的Tyr、EU編號324號的Ser、EU編號325號的Asn、EU編號326號的Lys、EU編號327號的Ala、EU編號328號的Leu、EU編號329號的Pro、EU編號330號的Ala、EU編號331號的Pro、EU編號號的、EU編號332號的Ile、EU編號333號的Glu、EU編號334號的Lys、EU編號335號的Thr、EU編號336號的Ile、EU編號337號的Ser的部分，各取代為除了原本的胺基酸以及半胱胺酸以外的18種胺基酸而得的GpH7-B3 variant。各GpH7-B3 variant的名稱， 以A_B代表，A代表改變之殘基之EU編號、胺基酸之種類之資訊，以單字母表示記載，B代表取代後之胺基酸之資訊。例如EU編號234號的Leu取代為Gly之B3_variant，命名為L234_01G。又，關於取代後之胺基酸之資訊，在單字母表示記載之前，簡單記載該胺基酸特有的數值。具體而言、Gly的情形使用01G、Ala的情形使用02A、Val的情形使用03V、Phe的情形使用04F、Pro的情形使用05P、Met的情形使用06M、Ile的情形使用07I、Leu的情形使用08L、Asp的情形使用09D、Glu的情形使用10E、Lys的情形使用11K、Arg的情形使用12R、Ser的情形使用13S、Thr的情形使用14T、Tyr的情形使用15Y、His的情形使用16H、Asn的情形使用18N、Gln的情形使用19Q、Trp的情形使用20W的記號。
依以下程序製備對於2條H鏈導入變異之同源二聚化抗體。抗體之表現方面，H鏈使用GpH7-B3 variant、L鏈使用GpL16-k0(序列編號：5)，依參考實施例1之方法製備抗體。將以此方式製備之對於兩H鏈導入變異之同源二聚化抗體，稱為Ho Ab。
依以下程序製備僅於其中之一之H鏈導入變異之異源二聚化抗體。抗體之表現方面，H鏈使用GpH7-B3 variant、GpH7-A5(序列編號：3)、L鏈使用GpL16-k0(序列編號：5)，依參考實施例1之方法製備抗體。將以此方式製備之僅對其中之一之H鏈導入變異之異源二聚化抗體，稱為He Ab。
作為同源二聚化抗體之對照，將H鏈使用GpH7-B3(序 列編號：4)、L鏈使用GpL16-k0(序列編號：5)所製備之抗體GpH7-B3/GpL16-k0，依參考實施例1之方法製備。將該成為同源二聚化抗體之對照的抗體，稱為HoCon Ab。如實施例2的探討，HoCon Ab比起天然型IgG1，對於各Fc γ R之結合活性未有大幅變化。
作為異源二聚化抗體之對照，將H鏈使用GpH7-A5(序列編號：3)、GpH7-B3(序列編號：4)、L鏈使用GpL16-k0(序列編號：5)所製備之抗體GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，依參考實施例1之方法製備。將該成為異源二聚化抗體之對照之抗體，稱為HeCon Ab。HeCon Ab，如實施例2之探討，相較於天然型IgG1，對於各Fc γ R之結合無大變化。
使用製備之Ho Ab、He Ab、HeCon Ab及HoCon Ab，依參考實施例2之方法測定對於Fc γ RIa、Fc γ RIIa(R)、Fc γ RIIa(H)、Fc γ RIIb、Fc γ RIIIa之結合活性。針對各Fc γ R之測定結果，依以下之方法製圖。將He Ab對於各Fc γ R之結合活性除以HeCon Ab對於各Fc γ R之結合活性再乘以100得到的值，作為He/Con。將Ho Ab對於各Fc γ R之結合活性除以HoCon Ab對於各Fc γ R之結合活性再乘以100得到的值，作為Ho/Con。針對使用含目的改變之GpH7-B3variant而製作之同源二聚化抗體、異源二聚化抗體，橫軸取Ho/Con、縱軸取He/Con之值。Fc γ RIa、Fc γ RIIa(R)、Fc γ RIIa(H)、Fc γ RIIb、Fc γ RIIIa之各Fc γ R之結果，整理如圖16、圖17、圖18、圖19、圖20。針對各改變，可以如下方式解釋He/Con及Ho/Con之值。
1. He/Con及Ho/Con之值為100時：包含導入該變異之GpH7-B3 variant之異源二聚化抗體He Ab、同源二聚化抗體Ho Ab對於Fc γ R之結合活性，與各異源二聚化抗體之對照、同源二聚化抗體之對照對於Fc γ R之結合活性顯示為同等。
2. He/Con、Ho/Con之值為100以下之情形：包含導入該變異之GpH7-B3 variant之異源二聚化抗體He Ab、同源二聚化抗體Ho Ab對於Fc γ R之結合活性，相較於與各異源二聚化抗體之對照、同源二聚化抗體之對照對於Fc γ R之結合活性為較弱。
3. He/Con、Ho/Con之值為100以上之情形：包含導入該變異之GpH7-B3 variant之異源二聚化抗體He Ab、同源二聚化抗體Ho Ab對於Fc γ R之結合活性，相較於各異源二聚化抗體之對照、同源二聚化抗體之對照對於Fc γ R之結合活性顯示為較強。
4. He/Con之值大於Ho/Con之值之情形：包含導入該變異之GpH7-B3 variant之異源二聚化抗體He Ab對於Fc γ R之結合活性，相較於同源二聚化抗體Ho Ab對於Fc γ R之結合活性顯示為較強。
5. He/Con之值小於Ho/Con之值之情形：包含導入該變異之GpH7-B3 variant之異源二聚化抗體He Ab對於Fc γ R之結合活性，相較於包含有導入該變異之GpH7-B3 variant之同源二聚化抗體Ho Ab對於Fc γ R之結合活性，顯示為較弱。
基於該1至5之解釋，可將圖16至圖20之各圖之點分類如圖21。
當該改變存在於圖21之i區時，係指：會減弱該改變導入於2個H鏈而得之同源二聚化抗體對Fc γ R的結合，但相同改變僅導入其中之一之H鏈而得之異源二聚化抗體有增強對於Fc γ R之結合之效果。亦即，該改變為僅增強異源二聚化抗體對於Fc γ R之結合之改變。i區包含之改變針對各Fc γ R，整理於表2(表2-1~2-3)、表3(表3-1及3-2)、表4、表5、表6。
該改變存在於圖21之ii區時，係指：該點所對應之改變導入於兩H鏈而得之同源二聚化抗體、相同改變僅對其中之一之H鏈導入而得之異源二聚化抗體，對於Fc γ R之結合均有增強，但是結合增強效果以異源二聚化抗體較大。亦即，該區內之改變係相較於在同源二聚化抗體，在異源二聚化抗體中對於Fc γ R之結合增強效果較高之改變。ii區包含之改變針對各Fc γ R，整理於表2(表2-1~2-3)、表3(表3-1及3-2)、表4、表5、表6。
又，各表中，相對於Fc γ RIa、Fc γ RIIa H、Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb、Fc γ RIIIa之結合活性相關的He/Con各定為He/Con_1a、He/Con_2aH、He/Con_2aR、He/Con_2b、He/Con_3a，相對於Fc γ RIa、Fc γ RIIa H、Fc γ RIIa R、Fc γ RIIb、Fc γ RIIIa之結合活性相關的Ho/Con各定為Ho/Con_1a、Ho/Con_2aH、Ho/Con_2aR、Ho/Con_2b、Ho/Con_3a。
該改變存在於圖21之iii區時，係指：該點所對應之改變導入於兩H鏈而得之同源二聚化抗體、相同改變僅對其中之一之H鏈導入而得之異源二聚化抗體，對於Fc γ R之結合均有增強，但結合增強效果以同源二聚化抗體較大。亦即，該區內之改變係相較於在異源二聚化抗體，在同源二聚化抗體中對於Fc γ R之結合增強效果較高之改變。
又，下表中，代表胺基酸之改變之情形，係以A327_03V之方式表示。最前面的字母(該當於A327_03V之A)，係指改變前之胺基酸殘基以單字母表示記載代表時之字母。接續的數字(該當於A327_03V之327)，係指該改變位置之EU編號。最後之數字+字母(該當於A327_03V之03V)，係指改變後之胺基酸殘基以單字母表示記載時之字母(代表胺基酸之種類之數字+字母)。各以01G(Gly)、02A(Ala)、03V(Val)、04F(Phe)、05P(Pro)、06M(Met)、07I(Ile)、08L(Leu)、09D(Asp)、10E(Glu)、11K(Lys)、12R(Arg)、13S(Ser)、14T(Thr)、15Y(Tyr)、16H(His)、17C(Cys)、18N(Asn)、19Q(Gln)、20W(Trp)表示。由以上，例如：「A327_03V」係指「EU編號327號的胺基酸A取代為V」。
Figure 101123397-A0202-02-0122-641
Figure 101123397-A0202-02-0123-642
Figure 101123397-A0202-02-0124-643
 代表針對Fc γ RIa，i,ii之區(圖21)包含之改變。
Figure 101123397-A0202-02-0125-644
Figure 101123397-A0202-02-0126-645
代表針對Fc γ RIIa R，i,ii之區(圖21)包含之改變。
Figure 101123397-A0202-02-0127-646
代表針對Fc γ RIIa H，i,ii之區(圖21)包含之改變。
Figure 101123397-A0202-02-0128-647
代表針對Fc γ RIIb，i,ii之區(圖21)包含之改變。
Figure 101123397-A0202-02-0129-648
代表針對Fc γ RIIIa，i,ii之區(圖21)包含之改變。
本實施例發現的改變，除了實施例2，據認為也支持實施例1所示之異源二聚化抗體獲致之Fc γ R識別能力提高之概念。圖21之i區有的改變，當以習知方式導入於2個H鏈時是會減弱對於Fc γ R之合活性之改變，未識別是會增強結合的改變。但是成功地發現藉由僅對於2個H鏈之其中之一導入，針對如此的改變也是能提高對於Fc γ R之結合活性之改變。
[實施例5]異源二聚化抗體之改變之組合之決定方法
如實施例3所示，在異源二聚化抗體中，某個改變在對於Fc γ R之結合造成的效果，會由於改變而有不同方向。所以，當組合異源二聚化抗體中之多數改變而欲使對於Fc γ R之結合更為增強或減弱之情形，需使在各改變在對於Fc γ R之結合造成之效果之方向一致。假如二個之改變在對於抗體對Fc γ R之結合造成之增強效果之方向不同之狀態導入各改變的情形，據認為各改變的效果會彼此抵消，即使組合了對於Fc γ R之結合增強的改變，也會觀察不到結合增強效果。但是通常由於並沒有在事前分辨應將各改變對於哪一H鏈導入的方法，所以為了找出適當的組合方法，必需製備將目的之改變導入相同H鏈或相異之H鏈的抗體，並且比較對於Fc γ R的結合活性。例如：為同源二聚化抗體之情形，將3種不同的改變全部導入的情形，只要製備1種對於兩H鏈導入各改變之抗體即可。但是當異源二聚化抗體之情形，必需判斷各改變要導入哪一H鏈。於此情形，如圖22所示，最多要測試4組組合。亦即，當探討改變之組合時應製作之改變體之數目龐大，沒有效率。所以探討藉由將僅從一方向抑制抗體與Fc γ R之結合的P329R與探討導入之改變予以組合，而找出該改變對於抗體與Fc γ R之結合造成之影響之方向的方法。
評價將實施例4找出之異源二聚化抗體中對於Fc γ RIIIa之結合有增強之改變L234Y、G236W、S298A分別對於與已導入P329R者為相同H鏈、或相異H鏈導入之 情形，對於Fc γ RIIIa之結合是如何變化。首先，H鏈使用對於已導入P329R改變之GpH7-B12各導入L234Y、G236W、S298A之GpH7-HA5(序列編號：19)、GpH7-HA6(序列編號：20)、GpH7-HA11(序列編號：21)、其中另一H鏈使用GpH7-A5、L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法表現並製備目的之改變體。又，H鏈使用各將L234Y、G236W、S298A導入於GpH7-B3之GpH7-B3-01-15Y(序列編號：22)、GpH7-B3-03-20W(序列編號：23)、GpH7-B3-15-02A(序列編號：24)、其中另一H鏈使用對於GpH7-A5導入P329R之GpH7-A48(序列編號：16)、L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法表現、製備目的之抗體。將在此獲得之抗體各定為GpH7-A5/GpH7-HA5/GpL16-k0(序列編號：3、19、5)、GpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0(序列編號：3、20、5)、GpH7-A5/GpH7-HA11/GpL16-k0(序列編號：3、21、5)、GpH7-A48/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0(序列編號：16、22、5)、GpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0(序列編號：16、23、5)、GpH7-A48/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0(序列編號：16、24、5)。依參考實施例2之方法，比較各改變體對於Fc γ RIIIa之結合活性，並整理L234Y、G236W、S298A與P329R組合之效果於表7。
Figure 101123397-A0202-02-0132-649
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為不同之變異(無特變異之情形，為「-」)對於Fc γ RIIIa之結合活性於將GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對於Fc γ RIIIa之結合定為100時之相對的結合活性。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
由此結果，針對各改變，將當各改變導入與P329R為相同H鏈之情形，針對導入不同H鏈之情形對於Fc γ RIIIa之結合活性加以比較。L234Y的情形，前者所對應之GpH7-A5/GpH7-HA5/GpL16-k0之結合活性為60、後者所對應之GpH7-A48/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0之結合活性為11，改變係導入與P329R為不同之H鏈之情形，對於Fc γ R 之結合較受抑制。G236W的情形，前者所對應之GpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0之結合活性為56、後者所對應之GpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0之結合活性為13，改變導入與與P329R為不同H鏈之情形，對於Fc γ R之結合較受抑制。S298A的情形，前者所對應之GpH7-A5/GpH7-HA11/GpL16-k0之結合活性為84、後者所對應之GpH7-A48/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0之結合活性為47，改變導入與P329R為不同H鏈之情形，對於Fc γ R之結合活性較受抑制。針對任一改變均為後者之導入於與P329R為不同之H鏈之情形，對Fc γ RIIIa之結合較受抑制。若假設導入P329R之H鏈對應於圖3之HA鏈，則可認為P329R係抑制從X方向之結合。結合顯著受抑制之組合，由於係L234Y、G236W、S298A導入與P329R為不同之H鏈之情形，所以該情形該等改變係導入到HB鏈。L234Y、G236W、S298A任一之改變，由於當導入到與P329R為不同之H鏈時，對Fc γ RIIIa之結合之增強效果顯著受抑制，故據認為導入HB鏈之情形之任一改變都能增強抑制P329R對於Fc γ RIIIa之結合之從X方向之結合。是以，可認為，藉由將該等改變導入相同H鏈，能更增強對於Fc γ RIIIa之結合。
評價藉由對於L234Y、G236W、S298A中之2個各導入相同H鏈或相異H鏈是否會增強對於Fc γ R之結合，並且驗證上述假說。依參考實施例1之方法製作插入有將L234Y、G236W、S298A各導入於GpH7-A5之GpH7-TA1(序列 編號：25)、GpH7-TA2(序列編號：26)、GpH7-TA3(序列編號：27)、及將L234Y、G236W、S298A各導入於GpH7-B3之GpH7-B3-01-15Y(序列編號：22)、GpH7-B3-03-20W(序列編號：23)、GpH7-B3-15-02A(序列編號：24)之表現載體。又，製作插入有將L234Y與G236W導入於GpH7-A5之GpH7-TA4(序列編號：28)、L234Y與S298A導入於GpH7-A5之GpH7-TA5(序列編號：29)、G236W與S298A導入於GpH7-A5之GpH7-TA6(序列編號：30)的表現載體。將該等依表8之方式組合，並對於各組合，增加以GpL16-k0作為L鏈，依參考實施例1之方法實施目的抗體之表現、製備。表現之樣本之H鏈、變異位置相關資訊、抗體對於Fc γ RIIIa之結合之測定結果，整理如表8。
Figure 101123397-A0202-02-0135-650
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為不同之變異(無特別變異之情形為「-」)，對於Fc γ RIIIa之結合活性，當令GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0對於Fc γ RIIIa之結合為100時之相對的結合活性。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
從表8之結果，驗證L234Y與G236W之組合效果。將L234Y與G236W導入不同H鏈之GpH7-TA2/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0對於Fc γ RIIIa之結 合活性為130，相較於僅導入L234Y之GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0之結合活性131未有增加，相較於僅導入G236W之GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0之結合活性140有減少。但是將L234Y與G236W導入於相同H鏈之GpH7-TA4/GpH7-B3/GpL16-k0之結合活性為168，相較於僅導入L234Y之GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0、僅導入G236W之GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0，結合活性有增加。由此結果可知，L234Y與G236W如同預測，藉由導入相同H鏈，對於Fc γ RIIIa之結合活性更為增強。
其次依表8，驗證L234Y與S298A之組合效果。將L234Y與S298A導入不同H鏈之GpH7-TA1/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之結合活性為142，相較於僅導入L234Y之GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0之結合活性131有增加，但相較於僅導入S298A之GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0之結合活性163有減少。亦即，可說：相較於GpH7-TA1/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0僅導入S298A之情形，結合活性未有增強，因此將S298A與L234Y導入不同之H鏈，未能賦予使對於Fc γ RIIIa之結合活性更增強的效果。但是將L234Y與S298A導入相同H鏈之GpH7-TA5/GpH7-B3/GpL16-k0之結合活性為208，相較於僅導入L234Y之GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0、僅導 入S298A之GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0之任一者，對於Fc γ RIIIa之結合活性都有增加。由此結果可知：L234Y與S298A如同預測，藉由導入相同H鏈，會更增強對於Fc γ RIIIa之結合活性。
其次依表8驗證G236W與S298A之組合效果。將G236W與S298A導入於不同之H鏈之GpH7-TA3/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之結合活性為70，相較於僅導入G236W之GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0之結合活性140有減少，相較於僅導入S298A之GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0之結合活性163也減少。但是將G236W與S298A導入於相同H鏈之GpH7-TA6/GpH7-B3/GpL16-k0其結合活性為228，相較於僅導入G236W之GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0、僅導入S298A之GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0任一者，結合活性都有增加。由此結果可知：G236W與S298A如同預測，藉由導入相同H鏈，會更增強對於Fc γ RIIIa之結合活性。
由該等結果顯示：如同起初的預測，僅於將L234Y、G236W、S298A各導入相同H鏈時，結合會增強。其係支持於L234Y、G236W、S298A存在於相同鏈之情形，與Fc γ R之結合會從相同方向增強的數據。亦即，藉由依照從比較各改變與P329R組合、對於Fc γ RIIIa之結合活性之結果預測的結果，可決定將2個改變適當組合的方法。亦即， 與P329R之組合係預測在異源二聚化抗體中之改變之組合方法的有用方法，藉由使用該方法，可以明瞭其他有用的改變的組合。
從比較各改變與P329R組合、對於Fc γ RIIIa之結合活性之結果，可知：考慮2個以上之改變之組合的情形、將L234Y與G236W、G236W與S298A、S298A與L234Y導入相同H鏈之情形，各從相同方向使與Fc γ RIIIa之交互作用增強。亦即，由此結果，由於可認為L234Y、G236W、S298A均由相同方向增強對於Fc γ RIIIa之結合活性，所以當該等改變導入相同H鏈之情形，料想對於Fc γ RIIIa之結合活性會是最強。為了驗證該假說，依參考實施例1製備插入有將L234Y與G236W、L234Y與S298A、G236W與S298A各改變群組導入於GpH7-A5之GpH7-TA4、GpH7-TA5、GpH7-TA6與L234Y、G236W、S298A各導入於GpH7-B3之GpH7-B3-01-15Y、將GpH7-B3-03-20W、GpH7-B3-15-02A的表現載體，將L234Y、G236W、S298A之3個改變以導入其中任一之H鏈之方式加以組合、並增加L鏈作為GpL16-k0，依參考實施例1之方法將目的抗體表現、精製。又，製作將L234Y、G236W、S298A之3個改變導入於GpH7-A5之GpH7-TA7(序列編號：31)，與GpH7-B3、GpL16-k0合併，依參考實施例1之方法將目的抗體表現、精製。在此，整理製備之抗體之表、及比較各抗體對Fc γ RIIIa之結合活性之結果於表9。
Figure 101123397-A0202-02-0139-651
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為不同之變異(無特別變異之情形為「-」)，對於Fc γ RIIIa之結合活性記載於定GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之結合活性為100時之相對的結合活性。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
其結果，如同從各改變與P329R組合並比較對於Fc γ RIIIa之結合活性之結果所預測，將L234Y、G236W、S298A對於相同H鏈導入之GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0，最為增強對Fc γ RIIIa之結合。亦即，由此結果可知：藉由將將各改變與P329R組合並比較對於Fc γ RIIIa之結合活性，可料想2個以上之改變之適當組合方法。
[實施例6]異源二聚化抗體中之習知同源二聚化抗體及新穎異源二聚化抗體之比較
由實施例5之表7、表8、表9之結果，顯示單獨會增 強對Fc γ RIIIa之結合活性之異源改變予以適當組合，會更為增強對於Fc γ RIIIa之結合。具體而言，藉由將L234Y、G236W、S298A對於相同H鏈施加改變，會更增強對Fc γ R之結合活性。
其次，也確認了將多數之改變組合，於導入對應之多數之改變之情形，也會維持異源二聚化抗體較同源二聚化抗體對Fc γ R之結合更增強之異源二聚化抗體之性質。具體而言，依參考實施例1之方法製作將對於GpH7-A5、GpH7-B3各導入L234Y、G236W、S298A之GpH7-TA7及GpH7-TA45(序列編號：32)，依參考實施例1之方法表現如表10所示，將L234Y、G236W、S298A僅導入於其中之一之H鏈之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0及將GpH7-A5/GpH7-TA45/GpL16-k0、L234Y、G236W、S298A導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0並加以精製。依參考實施例2之方法比較該等對於Fc γ RIIIa之結合(表10)。
Figure 101123397-A0202-02-0140-652
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈 不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為不同之變異(無特別變異之情形為「-」)，對於Fc γ RIIIa之結合活性記載當定GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之結合活性為100時之相對的結合活性。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
從表10之結果，相較於將L234Y、G236W、S298A僅導入其中之一之H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0及GpH7-A5/GpH7-TA45/GpL16-k0任一者，將L234Y、G236W、S298A導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0，對於Fc γ RIIIa之結合有減少。由此可知：於異源二聚化抗體增強對Fc γ R之結合活性、但於同源二聚化抗體減弱對Fc γ R之結合活性此種L234Y、G236W、S298A之各改變之性質，即使在組合多數改變之情形仍會維持。
其次驗證將L234Y、G236W、S298A僅對於其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體中，是否會維持實施例3所考察到的與Fc γ RIIIa之結合之方向性。
依參考實施例1之方法製作對於GpH7-TA7、GpH7-B3各導入P329R之GpH7-TA8(序列編號：33)、GpH7-B12(序列編號：12)，並如表11所示，依參考實施例1之方法製備將L234Y、G236W、S298A與P329R導入相同H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0、導入於相 異鏈之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0。依參考實施例2之方法，比較該等抗體、與將L234Y、G236W、S298A導入其中之一之H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0對於Fc γ RIII之結合活性(表11)。
Figure 101123397-A0202-02-0142-653
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為不同之變異(無特別變異之情形為「-」)，對Fc γ RIIIa之結合活性記載於令GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0對於Fc γ RIIIa之結合為100時之相對的結合活性。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
表11之結果，將L234Y、G236W、S298A之改變群組與P329R導入於相同H鏈之異源二聚化抗體GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0與將L234Y、G236W、S298A之改變群組導入與已導入P329R為不同H鏈而得之異源二 聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0，均相較於GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性有所減弱，但GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之結合活性為11，相較於GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0之150顯著減弱。由此結果，觀察到：即使將L234Y、G236W、S298A之改變導入於多數H鏈，仍會觀察到導入於與P329R為不同H鏈之情形對Fc γ R之結合活性顯著減弱之這種與在實施例3之L234Y、G236W、S298A之各改變的情形所觀察到性質為同樣的性質。
由該等結果，可知：藉由將對於Fc γ R之結合增強之改變適當組合，能維持異源二聚化抗體之性質而更增強對於Fc γ R之結合活性。
[實施例7]與習知技術之比較：Fc γ RIIIa結合增強胺基酸改變抗體與異源改變體之比較
至今已知藉由增強對Fc γ RIIIa之結合會增強ADCC活性之改變。例如：將S239D、I332E、A330L之改變導入於兩抗體之H鏈時，已知是最會增強對Fc γ RIIIa之結合之改變(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103,4005-4010,2006)。藉由增強抗體依存性細胞抑制(ADCC)活性，顯示抗體之抗腫瘤活性增強，抗體對Fc γ RIIIa之結合增強係提高作為抗體之醫藥品之有用性的有效方式。但是到此為止之實施例所示，據認為使用同源二聚化抗體對於Fc γ R之結合活性之增強有極限，據認為藉由異源改變能更為增強。
如實施例1所述，抗體之Fc區與Fc γ R係非對稱的交 互作用。當為導入S239D、I332E、A330L之改變之抗體之情形，由其立體結構，HA鏈中之S239D、I332E、A330L之經改變的所有殘基會涉及與Fc γ R之交互作用之增強，但於HB鏈中之S239D以外未接觸Fc γ R，據認為不會有助於對於Fc γ R之結合活性增強(圖23)。亦即，若考慮Fc區與Fc γ R之交互作用之非對稱性，習知之抗體改變技術所導入之各改變據認為未與Fc γ R充分交互作用，對於使抗體與Fc γ R之交互作用最適化仍為不足。例如：上述S239D、I332E、A330L之改變的情形，藉由將對於HB鏈之該等改變替換為將與Fc γ RIIIa之交互作用從HB鏈側增強之改變，據認為能更增強對Fc γ RIIIa之結合。亦即，藉由使用對於抗體之各H鏈施加不同改變之製作本發明之異源二聚化抗體之技術(以下，本說明書稱為「異源二聚化抗體技術」)，比起對於抗體之各H鏈施加相同改變之技術(以下，本說明書中，稱為「習知技術」或「同源二聚化抗體技術」)，可能更增強對於Fc γ R之結合。
從Fc與Fc γ RIIIa之複合體之立體結構，據認為與S239D、I332E、A330L相反地，S298與Fc γ R僅在圖23之HB鏈交互作用(JBC,276：16469-16477,2001)。由此可認為：對於S298導入改變時，經取代之變異也在HB鏈側與Fc γ RIIIa交互作用。如實施例5，據認為L234Y、G236W係與S298A從同方向增強與Fc γ R之交互作用。亦即，若將S239D、A330L、I332E對於相同H鏈導入，並將L234Y、G236W、S298A從相對的H鏈導入，則導入的全部改變可與 Fc γ R同時交互作用，其結果據認為能更增強與Fc γ R之交互作用。
為了驗證此假說進行以下實驗。利用各別導入L234Y、G236W、S298A、S239D、A330L、I332E之改變而得之H鏈、及將P329R導入於相同H鏈、或相異H鏈而得之抗體，依實施例5之方法決定各改變識別Fc γ R之方向。依參考實施例1之方法，製作插入有於GpH7-A5、GpH7-A5導入P329R之GpH7-A48(序列編號：16)、於GpH7-B3導入S239D及P329R之GpH7-HA7(序列編號：34)、於GpH7-B3導入A330L及P329R之GpH7-HA15(序列編號：35)、於GpH7-B3導入I332E及P329R之GpH7-HA18(序列編號：36)、於GpH7-B3導入L234Y及P329R之GpH7-HA5(序列編號：19)、於GpH7-B3導入G236W及P329R之GpH7-HA6(序列編號：20)、於GpH7-B3導入S298A及P329R之GpH7-HA11(序列編號：21)、於GpH7-B3導入S239D之GpH7-B3-06-09D(序列編號：37)、於GpH7-B3導入A330L之GpH7-B3-20-08L(序列編號：38)、於GpH7-B3導入I332E之GpH7-B3-22-10E(序列編號：39)、於GpH7-B3導入L234Y之GpH7-B3-01-15Y(序列編號：22)、於GpH7-B3導入G236W之GpH7-B3-03-20W(序列編號：23)、於GpH7-B3導入S298A之GpH7-B3-15-02A(序列編號：24)的表現載體。以使L234Y、G236W、S298A、S239D、A330L、I332E之各改變與P329R存在於相同H鏈或相異H鏈之方式，將各H鏈所對應之表現載體組合、合併L鏈所對應之表現載體之GpL16-k0，依參考實施例1之方法將目的抗體 表現、製備。使用製備之抗體測定對Fc γ RIIIa之結合活性，並探討使用P329R之L234Y、G236W、S298A，S239D、A330L、I332E對於Fc γ RIIIa之識別方向，結果整理如表12。
Figure 101123397-A0202-02-0146-654
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)，對Fc γ RIIIa之結合活性記載當令 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之結合活性為100時之相對的結合活性。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
從其結果，比較針對各改變，各改變導入於與P329R為相同H鏈之情形、導入於相異H鏈之情形中，對Fc γ RIIIa之結合活性比較。S239D的情形，前者所對應之GpH7-A5/GpH7-HA7/GpL16-k0之結合活性為3、後者所對應之GpH7-A48/GpH7-B3-06-09D/GpL16-k0之結合活性為123，改變導入於與P329R為相同H鏈之情形對Fc γ RIIIa之結合較受抑制。A330L的情形，前者所對應之GpH7-A5/GpH7-HA15/GpL16-k0之結合活性為32、後者所對應之GpH7-A48/GpH7-B3-20-08L/GpL16-k0之結合活性為60，改變與P329R導入於相同H鏈之情形對Fc γ RIIIa之結合較受抑制。I332E的情形，前者所對應之GpH7-A5/GpH7-HA18/GpL16-k0之結合活性為35，後者所對應之GpH7-A48/GpH7-B3-22-10E/GpL16-k0之結合活性為189，改變導入於與P329R為相同H鏈之情形對Fc γ RIIIa之結合較受抑制。任一改變均為，前者之P329R導入於相同H鏈之情形對Fc γ RIIIa之結合較受抑制。若假定導入P329R之H鏈為圖23之HA鏈所對應者，可認為329R係抑制從X方向之結合。結合顯著受抑制之組合，係239D、A330L、I332E導入與P329R為相同H鏈之時，故此情形該等改變係導入於HA鏈。S239D、A330L、I332E之任一改變，亦為與329R導入相同H鏈時對於Fc γ RIIIa之結合增強效 果較顯著受抑制，故導入於HA鏈之情形之任一改變據認為亦為增強P329R抑制Fc γ RIIIa之結合從X方向之結合。是以，據認為：該等改變藉由導入相同H鏈，能更增強對Fc γ RIIIa之結合。由實施例5，可推察L234Y、G236W、S298A均導入於HB鏈時，會增強從X方向之結合。如實施例5、實施例6所推察，能藉由與P329R組合，能找出各改變適當組合之方法。從此次的結果，可知為了從圖3之X方向增強對Fc γ RIIIa之結合，需將S239D、A330L、I332E導入於HA鏈、L234Y、G236W、S298A導入於HB鏈，藉由各改變群組導入於相異H鏈，據認為會更增強從X方向對Fc γ RIIIa之結合。
為了驗證該假說，依參考實施例1之方法，製備插入有將S239D、A330L、I332E全部導入於GpH7-A5之GpH7-A57(序列編號：40)、對於GpH7-B3導入之GpH7-B78(序列編號：41)及將L234Y、G236W、S298A全部導入於GpH7-A5之GpH7-TA7(序列編號：31)、於GpH7-B3導入之GpH7-TA45(序列編號：32)的表現載體。使用該等表現載體及GpH7-A5、GpH7-B3、GpL16-k0，將於其中之一之H鏈導入L234Y、G236W、S298A、其中另一H鏈導入S239D、A330L、I332E之異源GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0、將L234Y、G236W、S298A僅導入其中之一之H鏈之GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0、將L234Y、G236W、S298A導入兩者之H鏈之GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0、將S239D、A330L、I332E 僅導入其中之一之H鏈之GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0、S239D、A330L、I332E導入兩者之H鏈之GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，依參考實施例1之方法表現、製備。以製備之抗體依參考實施例2之方法測定之對Fc γ RIIIa之KD作為指標，比較對Fc γ RIIIa之結合活性，將L234Y、G236W、S298A與S239D、A330L、I332E之組合之效果之驗證結果，整理於表13。
Figure 101123397-A0202-02-0150-655
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)。GpH7-G1d/GpL16-k0對於Fc γ RIII之 KD除以各抗體之KD而得之值定為KD ratio 1、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0對於Fc γ RIIIa之KD除以各抗體之KD而得之值定為KD ratio 2。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
從表13之結果，將天然型IgG1GpH7-G1d/GpL16-k0、與將D356K、H435R及K439E各導入其中之一之H鏈而得之GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0加以比較，其對Fc γ RIIIa之結合活性之變化為0.75倍，未觀察到大的差異。由此可認為：D356K、H435R及K439E之改變未對Fc γ RIIIa之結合活性造成影響。
針對使用習知技術之同源二聚化抗體驗證各改變之效果。將S239D、A330L、I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性增強約260倍，但相反地，將L234Y、G236W、S298A導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0，減弱0.49倍。從此結果，可知：於同源二聚化抗體，僅對於S239D、A330L、I332E之改變群組有對Fc γ RIIIa之結合活性增強效果。
針對各改變群僅對於其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體，驗證各改變群組之效果。S239D、A330L、I332E對於其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性增 強30倍，且L234Y、G236W、S298A對於其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0，增強5.1倍。從此結果可知：S239D、A330L、I332E之改變群組之對Fc γ RIIIa之結合活性增強效果較高。
驗證各改變群組於同源二聚化抗體與異源二聚化抗體之效果差異。針對S239D、A330L、I332E，於其異源二聚化抗體，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性增強30倍，於同源二聚化抗體增強約260倍，可知導入於同源二聚化抗體者之對Fc γ RIIIa之結合活性增強更為提高。另一方面，針對L234Y、G236W、S298A，於其異源二聚化抗體，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性增強5.1倍，儘管如此，於同源二聚化抗體減弱為0.49倍。此結果與實施例5所推察者相同，L234Y、G236W、S298A之改變群組僅於異源二聚化抗體，可發現到對Fc γ RIIIa之結合活性增強效果。
同源二聚化抗體中，僅有S239D、A330L、I332E之改變群組顯示對Fc γ RIIIa之結合增強效果，異源二聚化抗體中亦為S239D、A330L、I332E之改變群組之對Fc γ RIIIa之結合增強較高。從該等結果可知，若考量組合S239D、A330L、I332E之改變群組以及L234Y、G236W、S298A之改變群組之情形，依據以往的思考，可預測：異源二聚化抗體、同源二聚化抗體均為對Fc γ RIIIa之結合增強高之僅將S239D、A330L、I332E之改變群組導入於兩H鏈之同源 二聚化抗體GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之結合增強效果會最高。但是顯示為：將S239D、A330L、I332E導入於其中之一之H鏈且將L234Y、G236W、S298A導入於其中另一之H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性有約350倍增強，且比起將S239D、A330L、I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體有較高的結合增強效果。此可認為係支持以下假說的結果：藉由將S239D、A330L、I332E之改變群組與L234Y、G236W、S298A之改變群組導入於相異H鏈，所導入之全部改變會從HA鏈、HB鏈之兩者增強對Fc γ RIIIa之結合活性，發揮比起將S239D、A330L、I332E之改變群組導入於兩H鏈之情形更高之效果。
亦即，顯示：藉由使用異源二聚化抗體，比起使用習知之同源二聚化抗體，能使Fc區與Fc γ RIIIa之非對稱的交互作用更為最適化，能設計出具有更高結合活性之Fc區。
從圖23可認為：A330L、I332E僅在HA鏈與Fc γ R交互作用，但S239D於HA鏈、HB鏈之兩者會與Fc γ R交互作用。實際上，將S239D、A330L、I332E僅導入於其中之一之H鏈的異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之KD為5.4E-8，但同源二聚化抗體GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0之KD為6.2E-9，對Fc γ RIIIa之結合活性有8.7倍增強。若考量該結合活性之差係起因於S239D涉及從兩H鏈將結合增強，則可認為 藉由將S239D對於兩H鏈導入，能解除該差距。為驗證該假說，製作對於GpH7-A5導入S239D之GpH7-A53(序列編號：42)，並與導入S239D、A330L、I332E之GpH7-B78組合，依參考實施例1之方法表現、製備，依參考實施例2之方法，比較S239D、A330L、I332E之異源二聚化抗體及同源二聚化抗體對Fc γ RIIIa之結合，驗證S239D與S239D、A330L、I332E之組合之效果(表14)。
Figure 101123397-A0202-02-0155-656
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)。GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之KD除以各抗體之KD而得之值定為KD ratio。 各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
從表14，將S239D、A330L、I332E對於其中之一之H鏈導入、將S239D對於其中另一之H鏈導入而得之GpH7-A53/GpH7-B78/GpL16-k0，相較於S239D、A330L、I332E僅對於其中之一之H鏈導入之GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性有4.9倍增強，相較於S239D、A330L、I332E對於兩H鏈導入之GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性僅減弱1.8倍。從此結果可認為：如同上述假說，S239D在兩H鏈與Fc γ RIIIa交互作用，且藉由導入該改變，能夠更為增強與Fc γ RIIIa的交互作用。
驗證藉由於其中之一之H鏈導入L234Y、G236W、S298A、於其中另一之H鏈導入S239D、A330L、I332E之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0中導入S239D，是否能更增強對Fc γ RIIIa之結合活性。依參考實施例1之方法，製備插入有對GpH7-TA7導入S239D之GpH7-TA22(序列編號：43)的表現載體，與於GpH7-B3導入S239D、A330L、I332E之GpH7-B78、GpL16-k0合併，進行目的抗體之表現、製備。再者，製備於其中之一之H鏈導入L234Y、G236W、S239D、S298A、其中另一之H鏈導入S239D、A330L、I332E之異源二聚化抗體GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0。依參考實施例2之方法，比較對於Fc γ R IIIa之結合活性，驗證S239D與S239D、 A330L、I332E之組合之效果(表15)。
Figure 101123397-A0202-02-0157-657
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)。GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0對 Fc γ RIIIa之KD除以各抗體之KD而得之值定為KD ratio。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
從表15，對於其中之一之H鏈導入L234Y、G236W、S298A、其中另一之H鏈導入S239D、A330L、I332E之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0中，對於不含S239D之側之鏈導入S239D之GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0相較於GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0有3.2倍結合活性增強。此結果顯示：藉由使用S239D，能更增強對Fc γ RIIIa之結合。
其次，實施探討更施加實施例4發現之對Fc γ RIIIa之結合增強改變之一之Y296W、K334G。
首先，探討是否將Y296W導入任一H鏈。製作於GpH7-TA7導入Y296W之變異之GpH7-TA52(序列編號：44)，與GpH7-B78組合，依參考實施例1之方法表現、製備。又，製作於GpH7-B78導入Y296W之GpH7-TA58(序列編號：45)，與GpH7-TA22組合，依參考實施例1之方法表現、製備。針對製備之抗體，依參考實施例2之方法，比較對Fc γ RIIIa之結合活性，並驗證Y296W之組合之效果(表16)。
Figure 101123397-A0202-02-0159-658
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變 異之情形為「-」)。GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之KD除以各抗體之KD而得之值定為KD ratio。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
由此結果，Y296W導入於與L234Y、G236W、S298A為相異H鏈之情形，導入前後對Fc γ RIIIa之結合活性僅有1.2倍增強，但導入於相同H鏈之情形，相較於GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性有1.8倍增強。由此結果可認為：Y296W與L234Y、G236W、S298A藉由導入相同H鏈，有增強對Fc γ RIIIa之結合之效果。
其次製作對於GpH7-TA22導入Y296W之GpH7-TA54(序列編號：46)，與GpH7-B78組合，依參考實施例1之方法表現、製備。又，製作於GpH7-B78導入Y296W之GpH7-TA58(序列編號：45)，與GpH7-TA22組合，依參考實施例1之方法表現、製備。針對製備之抗體，依參考實施例2之方法，比較對Fc γ RIIIa之結合活性，驗證Y296W之組合之效果(表17)。
Figure 101123397-A0202-02-0161-659
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)。GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之KD除以各抗體之KD而得之值定為KD ratio。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
由表17之結果，Y296W導入於與L234Y、G236W、S298A為相異H鏈之情形，導入前後對Fc γ RIIIa之結合活性無變化，但導入於相同H鏈之情形，相較於GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性有1.3倍增強。從此結果可認為Y296W與L234Y、G236W、S298A藉由導入相同H鏈，有對Fc γ RIIIa之結合活性增強之效果。
其次針對K334G也進行同樣探討。製備於GpH7-TA7導入K334G之GpH7-TA40(序列編號：47)，與GpH7-B78組合，依參考實施例1之方法表現、製備。又，製作於GpH7-B78導入K334G之GpH7-TA50(序列編號：48)，與GpH7-TA7組合，依參考實施例1之方法表現、製備。針對製備之抗體，依參考實施例2之方法比較對Fc γ RIIIa之結合，並驗證K334G之組合之效果(表18)。
Figure 101123397-A0202-02-0163-660
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變 異之情形為「-」)。GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之KD除以各抗體之KD而得之值定為KD ratio。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
從表18之結果，K334G於與L234Y、G236W、S298A導入於相同H鏈之情形，導入前後對Fc γ RIIIa之結合活性下降為一半，但導入於相異H鏈之情形，相較於GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性有1.2倍增強。從此結果，可認為K334G藉由導入於與L234Y、G236W、S298A為相異H鏈，有對Fc γ RIIIa之結合活性增強之效果。
[實施例8]對於活性型Fc γ R及抑制型Fc γ R之選擇性之提高
Fc γ R，存在具ITAM之活性型及具ITIM之抑制型。代表的活性型Fc γ R(Activating receptor)可列舉Fc γ RIa、Fc γ RIIa、Fc γ RIIIa，代表的抑制型Fc γ R(Inhibitory receptor)可列舉Fc γ RIIb。以癌症為標的之抗體中，據認為對於作用機轉有ADCC活性或抗體依存性細胞吞噬(ADCP)活性的活性型Fc γ R的結合活性與對於抑制型Fc γ R之結合活性之比例，會發揮重要作用(Nature Medicine,6：443-446,2000)。
以癌症為標的之抗體，據認為增強對活性型Fc γ R之結合活性、減弱對抑制型Fc γ R之結合活性為理想。具體 而言，如圖24之a區包含之改變，對於活性型Fc γ R比起天然型抗體更強力結合，且對於抑制型Fc γ R比起天然型抗體更弱結合，亦即對於活性型Fc γ R選擇性地結合增強之改變為理想。又，如圖25之b區之改變，對於活性型Fc γ R與抑制型Fc γ R之結合活性之比例，相較於天然型抗體增大之改變較理想。如此的改變，可稱為相較於抑制型Fc γ R，對於活性型Fc γ R之選擇性地結合活性增強的改變。
依實施例4之方法測定將改變導入於其中之一之H鏈之異源二聚化抗體He Ab分別對於活性型Fc γ R及抑制型Fc γ R之結合活性。為了評價各異源二聚化抗體分別對於活性型Fc γ R及抑制型Fc γ R之結合活性之比例，將其結果整理於圖26、圖27、圖28、圖29。圖26之活性型Fc γ R為Fc γ RIa、圖27之活性型Fc γ R為Fc γ RIIa(R)、圖28之活性型Fc γ R為Fc γ RIIa(H)、圖29之活性型Fc γ R為Fc γ RIIIa。
圖26之中，圖24、圖25之a及b所對應之區存在之改變整理於表19(表19-1~19-5)。以同樣方式，針對Fc γ RIIa(R)(圖27)、Fc γ RIIa(H)(圖28)、Fc γ RIIIa(圖29)，亦將a及b所對應之區存在之改變之表整理於表20(表20-1~20-3)、表21(表21-1~21-3)、表22(表22-1~22-3)。
Figure 101123397-A0202-02-0166-661
Figure 101123397-A0202-02-0167-662
Figure 101123397-A0202-02-0168-663
Figure 101123397-A0202-02-0169-664
Figure 101123397-A0202-02-0170-665
顯示相較於對Fc γ RIIb，對Fc γ RIa之結合選擇性增強之改變之表。
Figure 101123397-A0202-02-0171-85
Figure 101123397-A0202-02-0172-86
Figure 101123397-A0202-02-0173-87
顯示相較於對Fc γ RIIb，對Fc γ RIIa(R)之結合選擇性增強之改變之表。
Figure 101123397-A0202-02-0174-88
Figure 101123397-A0202-02-0175-89
Figure 101123397-A0202-02-0176-90
顯示相較於對Fc γ RIIb，對Fc γ RIIa(H)之結合選擇性增強之改變之表。
Figure 101123397-A0202-02-0177-91
Figure 101123397-A0202-02-0178-92
Figure 101123397-A0202-02-0179-93
顯示相較於對Fc γ RIIb，對Fc γ RIIIa之結合選擇性增強之改變之表。
另一方面，唯一之抑制型Fc γ R即Fc γ RIIb，於自體免疫疾病或發炎性疾病具有重要作用(J.Exp.Med.,203,2157-2164,2006、J.immunol.,178,3272-3280,2007)。具有對Fc γ RIIb之結合活性增強之Fc區之抗體顯示對於治療B細胞成為病因之自體免疫疾病為有效之可能性(Mol.Immunology 45,3926-3933,2008)。於目的為治療自體免疫疾病或發炎性疾病之抗體之情形，由於經由活性型Fc γ R之ADCC活性或ADCP活性可能使病態惡化，故希望對活性型Fc γ R之結合活性儘可能減弱、對於抑制型Fc γ R之結合活性增強。具體而言，希望如圖24之c區存在之改變，使對抑制型Fc γ R之結合活性相較於天然型抗體增強、對活性型Fc γ R之結合活性有減弱的效果。如此的改變，可說有對於抑制型Fc γ R之選擇性結合增強之效果。又，如圖25之d區存在之改變，對抑制型Fc γ R之結 合活性與對活性型Fc γ R之結合活性之比例，希望相較於天然型抗體有增大的效果。如此的改變，可說是相較於活性型Fc γ R，對於抑制型Fc γ R之選擇性結合活性有所增強之改變。
而，使用評價上述各異源二聚化抗體之抑制型Fc γ R與對活性型Fc γ R之結合活性之比例的圖26、圖27、圖28、圖29，針對各圖中之改變，將圖24、圖25之c及d所對應之區所存在之改變之表，各整理於表23(表23-1及23-2)、表24(表24-1及24-2)、表25(表25-1~25-3)、表26(表26-1~26-4)。
Figure 101123397-A0202-02-0181-94
Figure 101123397-A0202-02-0182-95
顯示相較於對Fc γ RIa，對Fc γ RIIb選擇性地結合有增強之改變之表。
Figure 101123397-A0202-02-0183-96
Figure 101123397-A0202-02-0184-97
顯示相較於對Fc γ RIIa(R)，對Fc γ RIIb之選擇性結合增強之改變之表。
Figure 101123397-A0202-02-0185-99
Figure 101123397-A0202-02-0186-100
Figure 101123397-A0202-02-0187-101
顯示相較於對Fc γ RIIa(H)，對Fc γ RIIb選擇性的結合增強之改變之表。
Figure 101123397-A0202-02-0188-102
Figure 101123397-A0202-02-0189-103
Figure 101123397-A0202-02-0190-104
Figure 101123397-A0202-02-0191-105
顯示相較於對Fc γ RIIIa，對Fc γ RIIb選擇性結合增強之改變之表。
[實施例9]異源二聚化抗體之物理化學的安定性之評價
當開發抗體作為醫藥品時，也期待有高度的物理化學安定性。例如：將上述言及之S239D、A330L、I332E導入於抗體之兩鏈之改變的情形，據報告若導入該改變，抗體之Fc區會變得熱力學不安定，熱安定性之下降會使開發成醫藥品變得困難(Molecular Immunology,45,1872-1882,2008)。為了提高抗體作為醫藥品之有用性及開發容易性，增強對於Fc γ R之結合活性的另一方面，維持物理化學的安定性亦為重要。同源二聚化抗體中，為了將改變導入兩 H鏈，若導入1種改變，會在抗體每1分子於2個位置導入改變。但是，於異源二聚化抗體，由於能夠選擇對於各H鏈是否導入改變，故能於即使導入1種改變仍於抗體每1分子保留導入1個位置改變。如實施例7之推察，有時依改變種類，關於對Fc γ RIIIa之結合活性之增強效果僅於其中之一之H鏈導入即為足夠之情形。假設該改變係具有減低抗體之物理化學安定性之效果之情形，藉由僅對於其中之一之H鏈導入該改變，據認為能賦予對Fc γ RIIIa之結合活性增強效果，另一方面，可使得抗體之物理化學不安定化維持在最小限度。
為了驗證該假說，探討S239D、A330L、I332E哪個殘基實際上貢獻於CH2區之不安定化。依參考實施例1之方法製作插入有將S239D、A330L、I332E之改變各導入於GpH7-B3之GpH7-B3-06-09D(序列編號：37)、GpH7-B3-20-08L(序列編號：38)、GpH7-B3-22-10E(序列編號：39)的表現載體，並且L鏈使用GpL16-k0，依參考實施例1之方法將目的抗體表現、製備。又，作為對照，使用未施加改變之GpH7-B3與GpL16-k0，將目的抗體表現、製備。將各抗體之CH2區之Tm依參考實施例5之方法，利用Thermal shift assay加以比較(表27)。又，以下若無特別指明，Tm係指CH2區之Tm。
Figure 101123397-A0202-02-0193-106
樣本欄記載抗體之名稱、H欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-B3/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)、Tm欄記載各抗體之Tm、△Tm欄記載各抗體之Tm與GpH7-B3/GpL16-k0之Tm間之差。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
若比較導入S239D之同源二聚化抗體GpH7-B3-06-09D/GpL16-k0、導入A330L之同源二聚化抗體GpH7-B3-20-08L/GpL16-k0、導入I332E之同源二聚化抗體GpH7-B3-22-10E/GpL16-k0及GpH7-B3/GpL16-k0，Tm各減少3℃、1℃、8℃。由此結果可認為，該等3種改變之中，I332E使CH2之Tm減少的效果最高，I332E在導入S239D、A330L、I332E之改變群組之抗體中，對於Tm之減少最有貢獻。
I332E係側鏈之周圍以V240、V323、L328等疏水性胺基酸包圍。導入I332E之抗體，由於疏水性高之Ile取代 成親水性高之Glu，所以與周邊殘基的疏水性交互作用消失，據認為貢獻於Fc區之不安定化。另一方面，如實施例7所推察，I332E僅於其中之一之H鏈與Fc γ RIIIa交互作用。所以，針對未涉於與Fc γ RIIIa之交互作用的其中另一之H鏈之I332，維持Ile，藉此據認為對Fc γ RIIIa之結合賦予增強效果，同時維持熱力學安定性。而，藉由僅將I332E導入其中之一之H鏈，驗證相較於導入於兩鏈之情形，Tm是否有上升。製作插入有將I332E導入於GpH7-A5之GpH7-A44(序列編號：49)、導入於GpH7-B3之GpH7-B80(序列編號：50)的表現載體，與GpH7-B3、GpH7-A5、GpL16-k0合併，依參考實施例1之方法分別表現將I332E僅導入其中之一之H鏈之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0、GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0、將I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0並製備。作為對照，製備GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0。各抗體之對Fc γ RIIIa之結合活性，依參考實施例2之方法進行評價。又，依參考實施例5之方法，將各抗體之CH2區之Tm依Thermal shift assay加以比較(表28及表29)。
Figure 101123397-A0202-02-0195-107
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)。GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之KD除以各抗體之KD而得之值定為KD ratio。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
Figure 101123397-A0202-02-0196-108
顯示將I332E取代於其中之一之H鏈而得之抗體及取代於兩鏈之抗體之CH2之Tm。
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)、Tm欄記載各抗體之Tm、△Tm欄記載各抗體之Tm與GpH7-B3/GpL16-k0之Tm之差。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
從表28之結果，將I332E僅導入其中之一之H鏈之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性有約3倍增強，且於GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0有約4倍增強。由此可認為：對於GpH7-A5或GpH7-B3中任一者導入I332E，I332E對Fc γ RIIIa結合活性之增強效果也沒有大改變。又，將I332E導入於兩H鏈之GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0，比起GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合活性有 約7倍增強。由該等結果可知，I332E如同從其立體結構之推察，即使未導入兩H鏈，只要僅對其中之一之H鏈導入，即具有對Fc γ RIIIa之結合活性增強之充分效果。
其次，從表29之結果，將I332E僅對其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0與GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0，均比其母Fc分子GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0的Tm有4℃減少，故認為對於GpH7-A5或GpH7-B3任一者導入I332E也不會改變對於I332E之抗體之Tm的影響。另一方面，將I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0，比起GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0的Tm有10℃減少。將I332E僅導入於其中之一之H鏈之異源二聚化抗體，比起將I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體，Tm維持有6℃之高。由此結果可知：藉由使用I332E不是導入兩H鏈，而是僅導入其中之一之H鏈之異源二聚化抗體，能抑制Tm下降。異源二聚化抗體顯示為對於維持抗體之物理化學安定性亦為有用之技術。
I332E之改變針對對Fc γ RIIIa之結合增強效果為優異，但於使用習知同源二聚化抗體之情形，會顯著有損熱力學的安定性，據認為抗體作為醫藥品之情形會成為問題。但是，從表28及表29之結果，顯示藉由使用異源二聚化抗體，能夠利用I332E之對Fc γ RIIIa之結合增強活性也能同時維持抗體之物理化學安定性。從此結果可認為：異源二聚化抗體為將抗體之Fc γ R結合活性以及抗體之物 理化學安定性更精細調整的優異技術。
GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0由於僅在其中之一的H鏈具有S239D、A330L、I332E，故可比起在兩者之H鏈具有S239D、A330L、I332E之GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，維持Tm為高。而，依參考實施例5記載之方法，進行實施例7所示之L234Y、G236W、S298A之改變群組以及S239D、A330L、I332E之改變群組分別組合成的異源二聚化抗體、同源二聚化抗體之Tm之測定。
為了驗證，將於其中之一之H鏈導入L234Y、G236W、S298A之改變群組、其中另一之H鏈導入S239D、A330L、I332E之改變群組之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0、僅於其中之一之H鏈導入L234Y、G236W、S298A之改變群組之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0、於兩H鏈導入之同源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0、僅於其中之一之H鏈導入S239D、A330L、I332E之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0、導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，依參考實施例1之方法製備。各抗體之CH2區之Tm，依參考實施例5之方法利用Thermal shift assay加以比較，探討L234Y、G236W、S298A以及S239D、A330L、I332E之組合對於Tm造成的影響(表30)。
Figure 101123397-A0202-02-0199-109
樣本欄記載抗體之名稱、H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱、變異位置欄記載與GpH7-G1d/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)、Tm欄記載 各抗體之Tm、△Tm欄記載各抗體之Tm與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0之Tm之差。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
若將導入提高異源二聚化抗體形成效率之改變D356K/H435R及K439E之GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，與天然型IgG1GpH7-G1d/GpL16-k0加以比較，CH2之Tm下降1℃。
針對為習知技術之同源二聚化抗體，驗證各改變群組之效果。於將S239D、A330L、I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0之Tm有20℃下降，將L234Y、G236W、S298A之改變群組導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0，未觀察到Tm下降，故可認為於同源二聚化抗體，L234Y、G236W、S298A之改變群組本身無減低Tm之效果。
針對將各改變群組僅導入其中之一之H鏈之異源二聚化抗體，驗證各改變群組之效果。將S239D、A330L、I332E對於其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0，比起GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，Tm有8℃下降，將L234Y、G236W、S298A導入於其中之一之H鏈之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0，未觀察到Tm下降。從此結果可認為：於異源二聚化抗體，亦為L234Y、G236W、S298A之改變群組本身無減低Tm之效果。
將S239D、A330L、I332E導入於兩H鏈之GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，比起天然型IgG1，Tm有21℃減少，但僅於其中之一之H鏈具有S239D、A330L、I332E之改變的GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0，Tm為60℃，比起同源二聚化抗體維持高10℃以上之Tm。從實施例7之表13，S239D、A330L、I332E之同源二聚化抗體，相較於異源二聚化抗體，對Fc γ RIIIa之結合增強約9倍。S239D、A330L、I332E藉由對兩H鏈導入，能大幅增強對Fc γ RIIIa之結合，但Tm也會顯著下降。
其次，將L234Y、G236W、S298A導入於兩H鏈之GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0，比起天然型抗體，Tm僅減少1℃，此據認為並非由於L234Y、G236W、S298A導致之Tm減少，而是如前推察，由於製作異源二聚化抗體所利用之D356K/H435R及K439E之影響。其於將L234Y、G236W、S298A導入於其中之一之H鏈之GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0，也同樣Tm僅有1℃減少可顯示。
最後，將L234Y、G236W、S298A導入其中之一之H鏈、將S239D、A330L、I332E導入其中另一之H鏈之GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0之Tm，比起天然型抗體有10℃下降，與將S239D、A330L、I332E導入其中之一之H鏈之GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0大致相同。但是，從實施例7之表13，GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0，相較於GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0，對Fc γ RIIIa之結合增強有 10倍以上。
亦即，藉由使用將L234Y、G236W、S298A用於其中之一之H鏈、S239D、A330L、I332E用於其中另一之H鏈之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0，相較於S239D、A330L、I332E之同源二聚化抗體GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，能增強對Fc γ RIIIa之結合，且Tm也提高10℃以上。
其次針對進行了上述Tm之測定的樣本，再依參考實施例6記載之熱加速試驗(40℃ 2週或4週)，評價熱力學安定性(圖30)。
若比較GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0與天然型抗體GpH7-G1d/GpH7-G1d/GpL16-k0，4週後，前者有1.27%、後者有1.86%的單體比例減少，未認為有大的差異。亦即，用於製備異源二聚化抗體之改變D356K/H435R及K439E，可認為對於熱加速試驗之單體比例之變化幾乎不會造成影響。
將S239D、A330L、I332E導入於兩H鏈之GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，於四週後有約16%單體比例減少，相對於此，僅於其中之一之H鏈具有S239D、A330L、I332E之改變之GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0，於4週後有9.63%單體比例減少。亦即，藉由使用將S239D、A330L、I332E僅對於其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體，有更安定維持單體比例之效果。
其次，將L234Y、G236W、S298A導入於兩H鏈之 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0及導入於其中之一之H鏈之GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0，於4週後僅有1.78%、1.42%單體比例減少，但均比起天然型抗體，未見到單體比例之變化有明確差異。亦即可認為：即使欲將L234Y、G236W、S298A導入其中之一之H鏈，導入於兩鏈，在熱加速試驗對於單體比例也不會造成影響。
最後，將L234Y、G236W、S298A導入於其中之一之H鏈、S239D、A330L、I332E導入於其中另一之H鏈之GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0，在4週後有2.47%單體比例減少，比起天然型抗體之1.86%，單體比例只有些許減少。亦即，藉由使用將L234Y、G236W、S298A導入其中之一之H鏈、將S239D、A330L、I332E導入於其中另一之H鏈之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0，相較於S239D、A330L、I332E之同源二聚化抗體GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，能增強對Fc γ RIIIa之結合，且於熱加速試驗也能帶來維持單體比例為高的效果。
亦即，異源二聚化抗體相較於通常的同源二聚化抗體，不僅對於Fc γ R之結合能增強，安定性也有改善，所以顯示為能夠使抗體作為醫藥品之價值，比起同源二聚化抗體更為提高之技術。
[實施例10]提高對Fc γ R之結合且不使安定性下降之改變之探索
如實施例9之記載，若對於H鏈導入改變，對Fc γ R之結合活性會增強，但會有使CH2之物理化學安定性、亦 即Tm下降之可能。但是如實施例9所述，尤其抗體作為醫藥品使用之情形，如此之性質並不理想。如實施例9所述，為了增強對Fc γ R之結合活性並一方面抑制CH2之不安定化，使用僅對其中之一之H鏈導入改變之異源二聚化抗體係為有用。亦即，圖21之ii及iii區所該當之習知同源二聚化抗體，雖觀察到對Fc γ R之結合活性增強，但於同源二聚化抗體之Tm卻下降之改變，藉由進行異源二聚化，能比起天然型抗體使對Fc γ R之結合活性增強，且相較於同源二聚化抗體之Tm也提高。
為了找出如此的改變，將圖21之ii、iii區之同源二聚化抗體之Tm，依參考實施例5之方法測定，並將Tm與天然型抗體比較且下降之改變之表，整理於表31~35。
顯示表31(表31-1~31-3)於ii,iii區之Tm為68℃以下之Ia之數據、表32(表32-1及32-2)之ii,iii區之Tm為68℃以下之IIaR之數據、表33(表33-1及33-2)之ii,iii區之Tm為68℃以下之IIaH之數據、表34(表34-1及表34-2)之ii,iii區之Tm為68℃以下之IIb之數據、表35(表35-1及35-2)之ii,iii區之Tm為68℃以下之IIIa之數據。
藉由使用將該等改變僅對其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體，相較於天然型抗體，可製作對Fc γ R之結合提高且安定性不會大幅下降之抗體。
Figure 101123397-A0202-02-0205-110
Figure 101123397-A0202-02-0206-112
Figure 101123397-A0202-02-0207-113
Figure 101123397-A0202-02-0208-114
Figure 101123397-A0202-02-0209-115
Figure 101123397-A0202-02-0210-116
Figure 101123397-A0202-02-0211-117
Figure 101123397-A0202-02-0212-118
Figure 101123397-A0202-02-0213-119
Figure 101123397-A0202-02-0214-120
Figure 101123397-A0202-02-0215-121
[實施例11]測定對Fc γ RIIIa之識別能力提高之異源二聚化抗體之ADCC活性
如實施例7之推察，藉由使用異源二聚化抗體，成功地比起由習知之同源二聚化抗體技術創製之改變體增強對Fc γ RIIIa之結合活性。抗體經由Fc γ RIIIa誘導NK細胞，並且對於表現標的抗原之細胞發揮抗體依存的細胞抑制活性。為了確認於異源二聚化抗體，不僅對Fc γ RIIIa之結合活性，ADCC活性也同樣增強，針對實施例7之表13記載之對Fc γ RIIIa之結合活性上升之異源二聚化抗體、同源二聚化抗體、及天然型IgG1，依參考實施例7之方法測定ADCC活性。其結果如圖31。
由圖31之結果，若比較天然型IgG1GpH7-G1d/GpL16-k0、以及將D356K、H435R及K439E各對其中之一之H鏈導入之GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，未觀察到其ADCC活性有大的差異。由此，可認為D356K、H435R及K439E之改變對於ADCC活性未造成影響。
其次，針對如以往將對Fc γ RIIIa之結合活性增強之改變同樣對於抗體之兩H鏈導入之同源二聚化抗體，驗證其結合增強效果於ADCC活性是否會觀察到同樣傾向。比較將L234Y、G236W、S298A導入於兩H鏈之GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0、及將S239D、A330L、I332E導入於兩H鏈之GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0。關於對Fc γ RIIIa之結合活性，於GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0顯著地結合有增強，但於GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0的結合下降。於ADCC活性，亦為GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0的活性有上升，但是GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0的活性有減少。針對如此，同源二聚化抗體觀察到對Fc γ RIIIa之結合活性之強度與ADCC活性之強度有相關。
其次，針對僅對抗體之其中之一之H鏈導入增強對Fc γ RIIIa之結合活性之改變的異源二聚化抗體，驗證該結合增強效果是否於ADCC活性也會觀察到同樣的傾向。比較將L234Y、G236W、S298A導入於其中之一之H鏈之GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0、以及將S239D、A330L、I332E導入於其中之一之H鏈之GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0。關於對Fc γ RIIIa之結合活性GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0與GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0，均比起 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0有增強，於ADCC活性也觀察到同樣的傾向。此外，GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0比起GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0之對Fc γ RIIIa之結合活性更有增強，但ADCC活性保持同樣傾向，顯示與同源二聚化抗體同樣，於異源二聚化抗體亦為對Fc γ RIIIa之結合活性之強度與ADCC活性之強度有相關。
其次，針對L234Y、G236W、S298A及S239D、A330L、I332E之各改變群組，驗證各異源二聚化抗體、同源二聚化抗體中，對Fc γ RIIIa之結合活性與ADCC活性增強效果是否會觀察到相關。首先，比較將S239D、A330L、I332E之改變群組僅對其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0及對於兩H鏈導入之同源二聚化抗體GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，結果，關於對Fc γ RIIIa之結合活性，亦為相較於異源二聚化抗體，同源二聚化抗體增強結合之效果較高，但ADCC活性未認為有差異。其次，比較將L234Y、G236W、S298A之改變群組僅對其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0以及對於兩H鏈導入之同源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0，結果關於對Fc γ RIIIa之結合活性，異源二聚化抗體比起GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0增強結合較多，相對於此同源二聚化抗體中之結合減弱。針對ADCC活性也觀察到同樣傾向。由此可認為：L234Y、G236W、S298A之改變群組具有之對Fc γ RIIIa之結合活性僅從一方向增強的效果，也會反 映於ADCC活性。由該等結果，可認為：某改變群組僅對其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體、及對於兩H鏈導入之同源二聚化抗體之對Fc γ RIIIa之結合活性之強度與ADCC活性之強度有相關。
其次，比較將L234Y、G236W、S298A對於其中之一之H鏈導入、將S239D、A330L、I332E對其中另一之H鏈導入之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0，以及將S239D、A330L、I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0。關於對Fc γ RIIIa之結合活性，均相較於GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0有顯著增強，於ADCC活性也觀察到同樣的傾向。此外，GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0，相較於GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之結合活性更為增強，ADCC活性也以GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0顯示較強ADCC活性。
如前述，針對L234Y、G236W、S298A以及S239D、A330L、I332E之各改變群組，分別導入於其中之一之H鏈之情形，亦為對於兩H鏈導入之情形中，後者S239D、A330L、I332E之改變群組觀察到更增強ADCC活性之效果。但是可知，藉由將L234Y、G236W、S298A及S239D、A330L、I332E之各改變群組導入於相異H鏈，於異源二聚化抗體及同源二聚化抗體中，各為較將ADCC活性增強效果高之S239D、A330L、I332E對於兩H鏈施加，顯示較高ADCC活性增強效果。
亦即，如於習知技術同源二聚化抗體觀察到之對Fc γ RIIIa之結合活性之強度與ADCC活性之強度之相關，異源二聚化抗體彼此之比較、異源二聚化抗體與同源二聚化抗體之比較，均同樣可觀察到。由此可知，藉由利用異源二聚化抗體技術，可以創製比起習知技術具有更優異ADCC活性之抗體。
[實施例12]Fc γ RIIa之習知同源二聚化抗體與新穎異源二聚化抗體之比較
如實施例1所述，據認為Fc γ RIIIa在抗體醫藥之藥效具有重要作用。又，除了Fc γ RIIIa，IgG1來源的抗體醫藥之藥效中，Fc γ RIIa發揮的作用也受到重視。
Fc γ RIIa中，131號的胺基酸存在有Arg或His，各稱為R型、H型之異型，已知各對於人類IgG2之結合活性相異(Tissue Antigens 2003：61：189-202)。由於該Fc γ RIIa之異型之差異，已知對於感染症罹患之容易度相異(Tissue Antigens 2003：61：189-202)。由於該異型之差異，使Fc γ RIIa與IgG2之結合活性相異，結果據認為會造成經由IgG2之對病原體之抵抗機轉不同(Infection and Immunitiy 1995：63：73-81)。又，已知小鼠Fc γ RIV與人類Fc γ RIIa在表現細胞係為對應，據報告該Fc γ RIV在抗CD20抗體之小鼠模型的藥效有重要作用。由此可推察，於人類Fc γ RIIa可能也發揮同樣的作用(The Journal of Experimental Medicine 2004：199：1659-1669、The Journal of Experimental Medicine 2006： 203：743-753、Immunity 2005：23：41-51)。實際上，據報告：抗體之Fc區對於Fc γ RIIa之結合活性比起IgG1有所增強之抗體，比起IgG1，經由macrophage之抗體依存的細胞吞噬活性(ADCP活性)會增強(Molecular Cancer Therapeutics 2008：7：2517-2527)。又，具有ADCP增強之Fc區之抗CD19抗體，於mouse xenograft model也顯示較IgG1為強之抗腫瘤效果(Nature Medicine 2000：6：443-446)。該抗體之Fc區對於猴之Fc γ RIIa之結合活性也增強。CD19會表現於B細胞表面，但若將該抗體對於猴投予，比起具有IgG1之Fc區之抗CD19抗體，據報告B細胞之消失會增強(Science 2005：310：1510-1512)。
由該等報告，可期待：藉由增強對Fc γ RIIIa之結合活性，除此以外對Fc γ RIIa之結合活性也增強，更為提高抗體醫藥之藥效，尤其抗腫瘤效果。以往曾使用習知技術製作具有如此特徵之抗體(Molecular Cancer Therapeutics 2008：7：2517-2527)。但是據認為Fc γ RIIa也會與抗體之Fc區以非對稱結合，所以，據認為與實施例11所推察同樣使用異源二聚化抗體技術，藉此可更增強對Fc γ RIIa之結合活性。為加以驗證，從實施例4之結果選擇比起天然型IgG，對Fc γ RIIIa及FcgRIIa R型、H型均能使結合活性增強之改變，將該等組合，導入對於Fc γ RIIIa及FcgRIIa R型、H型之結合活性均增強之變異，並製作組合對Fc γ R之結合為相異之H鏈的異源二聚化抗體，評價其對於各Fc γ R之結合活性。
又，與該等活性型Fc γ R對照，抑制型Fc γ R即Fc γ RIIb會誘發將免疫反應抑制之細胞內訊號。於將Fc γ RIIb基因剔除的小鼠，據報告抗體之抗腫瘤效果亢進(Nature Medicine 2000：6：443-446)、或經由抗體之B細胞之消失促進(The Journal of Experimental Medicine 2006：203：743-753)，故顯示Fc γ RIIb在抗體於活體內之藥效有重要作用。又，小鼠IgG次類之抗腫瘤效果與各IgG次類之活性型Fc γ R與抑制型對Fc γ R之結合之比例(A/I ratio)之間，觀察到相關(Science 2005：310：1510-1512)。從該等報告，可認為A/I ratio對於經由抗體之免疫的效應子機能為重要。亦即，據認為若創制A/I ratio高之抗體，其效應子機能會增強且有用。但是活性型Fc γ R即Fc γ RIIa與抑制型Fc γ R即Fc γ RIIb，其細胞外分域有93%的序列相同性，序列相同性極高，故可想像要增強對Fc γ RIIa之結合活性且同時不增強對Fc γ IIb之結合活性而提高A/I ratio極困難。Fc γ RIIb與抗體之Fc區，據認為是與Fc γ RIIIa、Fc γ RIIa同樣以非對稱結合。若是習知技術，藉由對於抗體之兩H鏈導入相同改變僅能控制與Fc γ R之交互作用，但若使用異源二聚化抗體技術，可更精細控制，據認為連序列極類似之Fc γ RIIa與Fc γ RIIb之A/I ratio也能提高。是以，針對此點，也驗證異源二聚化抗體技術相較於習知技術是否較優異。
在此的探討，為了有效率地形成異源二聚化抗體，對於抗體H鏈不變區使用Knobs-into-Holes技術。 Knobs-into-Holes技術，係將其中之一之H鏈之CH3區存在之胺基酸側鏈取代為較大側鏈(knob；突起)，其中另一之H鏈之CH3區存在之胺基酸側鏈取代為較小側鏈(hole；空隙)，藉此將突起配置於空隙內，而促進H鏈之異源二聚化，有效率取得目的之異源二聚化抗體之技術(Nature,372：379-383(1994))。為了將位於CH3區之胺基酸側鏈增大而將Y349C、T366W之改變導入於不變區之H鏈，稱為Knob鏈，針對將其進一步導入改變後之不變區，其H鏈不變區之名稱以Kn之記號開始，之後加上三位數之數字，以如Kn001之方式稱呼。為了將位於CH3區之胺基酸側鏈減小而將D356C、T366S、L368A、Y407V之Hole改變導入於不變區之H鏈，稱為Hole鏈，針對將其進一步導入改變者，其H鏈不變區之名稱以Hl之記號為開始，之後加上三位數字，以Hl001之方式稱呼。又，抗體H鏈不變區之名稱各為Kn001、Hl001之情形、可變區帶有GpH7之抗體之H鏈所對應之序列，稱為pH7-Kn001、GpH7-Hl001。表現後精製得到之抗體，如異源二聚化抗體之表現使用之抗體H鏈所對應之序列記載為GpH7-Kn001、另一抗體H鏈所對應之序列為GpH7-Hl001、抗體L鏈所對應之序列為GpL16-k0之情形，記載為pH7-Kn001/GpH7-Hl001/GpL16-k0。
首先依參考實施例1之方法，製備對於GpH7-G1d將Y349C、T366W之改變導入不變區之GpH7-Kn033(序列編號：51)、對於GpH7-G1d將D356C、T366S、L368A、Y407V之改變導入於不變區之GpH7-Hl033(序列編號：56)。使異 源二聚化抗體表現時，抗體L鏈使用插入有GpL16-k0之表現載體，抗體H鏈之一使用對於插入有Y349C、T366W之改變之GpH7-Kn033(序列編號：51)再施加改變之序列的表現載體，並就其中另一抗體H鏈，使用插入有對於已導入D356C、T366S、L368A、Y407V之改變之GpH7-Hl033(序列編號：56)更導入改變之序列的表現載體，以有效地表現異源二聚化抗體。
基於實施例4獲得之各改變對於抗體對各Fc γ R之結合造成之影響相關之資訊，依以下方式製作欲使對於Fc γ RIIIa、Fc γ RIIa R型、H型之結合均增強之抗體。對於抗體之各H鏈之不變區導入相異改變時，使用GpH7-Kn033、GpH7-Hl033當作母多胜肽。依參考實施例1之方法製作對於GpH7-Kn033導入L234Y、L235Y、G236A、H268D、S298A之GpH7-Kn045(序列編號：54)、導入L234Y、L235Y、G236A、H268D、Q295L、S298A之GpH7-Kn056(序列編號：55)、於GpH7-Hl033導入G236A、S239D、A330K、I332E之GpH7-Hl048(序列編號：59)、導入G236A、S239D、Q295L、A330M、I332E之GpH7-Hl055(序列編號：60)。
其次，依以下方式，將各H鏈組合，依參考實施例1表現抗體。H鏈使用GpH7-Kn033、GpH7-Hl033、L鏈使用GpL16-k0，使對於G1d僅應用Knobs-into-Holes技術之GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0表現。H鏈使用GpH7-Kn045、GpH7-Hl048、L鏈使用GpL16-k0，使異源二聚化抗體GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0表現。H鏈使 用GpH7-Kn045、GpH7-Hl055、L鏈使用GpL16-k0，使異源二聚化抗體GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0表現。H鏈使用GpH7-Kn056、GpH7-Hl055、L鏈使用GpL16-k0，使異源二聚化抗體GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0表現。
將成為比較對象之使用既存技術之抗體(Pro.Nat.Acad.Sci.,103,4005-4010(2006))依以下方式製備作為參考。將據報告對於Fc γ RIIIa、Fc γ RIIa R型、H型任一者之結合均有增強之改變G236A/S239D/I332E分別對GpH7-Kn033、GpH7-Hl033導入，製作GpH7-Kn037(序列編號：52)、GpH7-Hl036(序列編號：57)。又，將據報告對於Fc γ RIIIa之結合有增強之改變S239D/A330L/I332E各導入GpH7-Kn033、GpH7-Hl033，製作GpH7-Kn032(序列編號：53)、GpH7-Hl032(序列編號：58)。將該等H鏈組合，依參考實施例1使抗體表現。H鏈使用GpH7-Kn037、GpH7-Hl036、L鏈使用GpL16-k0，使對於G1d僅應用Knobs-into-Holes技術之分子GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0之兩H鏈中導入G236A/S239D/I332E之同源二聚化抗體GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0表現。H鏈使用GpH7-Kn032、GpH7-Hl032、L鏈使用GpL16-k0，使對於G1d僅應用Knobs-into-Holes技術之分子GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0之兩H鏈導入S239D/A330L/I332E之同源二聚化抗體GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0表現。
針對該等抗體，依參考實施例2之方法各對Fc γ R之結合活性加以評價，其結果整理於表36。又，各抗體之KD ratio整理於表37，對Fc γ RIIIa之KD之比例A/I ratio整理於表38。
Figure 101123397-A0202-02-0226-122
顯示對Fc γ RIIa、IIIa之結合增強之異源二聚化抗體 各對Fc γ R之結合活性。
樣本欄記載抗體之名稱，Kn、H1欄各記載各抗體之Knob鏈、Hole鏈不變區之名稱，變異位置欄記載與GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)。
Figure 101123397-A0202-02-0228-123
顯示對Fc γ RIIa、IIIa之結合增強之異源二聚化抗體 對各Fc γ R之結合活性。
樣本欄記載抗體之名稱，Kn、H1欄記載各抗體之Knob鏈、Hole鏈不變區之名稱，變異位置欄記載GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)。GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0對Fc γ R之KD除以各抗體之KD所得之值，定為KD ratio。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
Figure 101123397-A0202-02-0230-124
顯示對活性型Fc γ R與對抑制型Fc γ R之結合活性之比例。
樣本欄記載抗體之名稱，Kn、H1之欄各記載各抗體之Knob鏈、Hole鏈不變區之名稱，變異位置欄記載於 GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變異之情形為「-」)。GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0對Fc γ RIIb之KD除以各抗體之Fc γ RIIa H型、R型之KD而得之值，各定為A/I ratio。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
從表36及37之結果，相較於對G1d僅應用Knobs-into-Holes技術之分子GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0，G236A/S239D/I332E導入於兩H鏈之GpH7-Kn037/GpH7-H1036/GpL16-k0對Fc γ RIIa H型之結合增強為22倍、對Fc γ RIIa R型之結合增強為43倍、對Fc γ RIIIa F之結合增強為161倍。又，從表38之結果可知：GpH7-Kn037/GpH7-H1036/GpL16-k0之A/I ratio對Fc γ RIIa H型為8.6、對Fc γ RIIa R型為13，相較於GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0之6.2、4.9有所提高。
從表36及37之結果，相較於對G1d僅應用Knobs-into-Holes技術之分子GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0，S239D/A330L/I332E導入於兩H鏈之GpH7-Kn032/GpH7-H1032/GpL16-k0對Fc γ RIIa H型之結合增強為1.2倍、對Fc γ RIIa R型之結合增強為3.0倍、對Fc γ RIIIa F之結合增強為381倍。又，從表38之結果，GpH7-Kn032/GpH7-H1032/GpL16-k0之A/I ratio對Fc γ RIIa H型為0.93、對Fc γ RIIa R型 為1.8，相較於GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0有所下降。
從表36及37之結果，相較於對於G1d僅應用Knobs-into-Holes技術之分子GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0，將L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298A導入其中之一之H鏈、將G236A/S239D/A330K/I332E導入其中另一之H鏈之GpH7-Kn045/GpH7-H1048/GpL16-k0，對Fc γ RIIa H型之結合增強為52倍、對Fc γ RIIa R型之結合增強為154倍、對Fc γ RIIIa F之結合增強為419倍。又，從該結果可知，對Fc γ RIIa之結合活性，H型、R型均相較於將G236A/S239D/I332E導入於兩H鏈之習知技術同源二聚化抗體GpH7-Kn037/GpH7-H1036/GpL16-k0，有所增強。此外，對Fc γ RIIIa F之結合活性，亦為相較於S239D/A330L/I332E導入於兩H鏈之習知技術同源二聚化抗體GpH7-Kn032/GpH7-H1032/GpL16-k0，有些微增強。從表38之結果可知，GpH7-Kn045/GpH7-H1048/GpL16-k0之A/I ratio對Fc γ RIIa H型為9.5、對Fc γ RIIa R型為22，相較於GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0、GpH7-Kn037/GpH7-H1036/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-H1032/GpL16-k0中之任一者均為提高。從此結果可知，藉由使用異源二聚化抗體技術，GpH7-Kn045/GpH7-H1048/GpL16-k0相較於習知技術，對Fc γ RIIa、Fc γ RIIIa F之結合活性增強，且同時，顯示 更有選擇的對活性型Fc γ R結合。
從表36及37之結果，相較於對於G1d僅應用Knobs-into-Holes技術之分子GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0，將L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298A導入其中之一之H鏈、G236A/S239D/Q295L/A330M/I332E導入其中另一之H鏈之GpH7-Kn045/GpH7-H1055/GpL16-k0，對Fc γ RIIa H型之結合增強為21倍、對Fc γ RIIa R型之結合增強為56倍、對Fc γ RIIIa F之結合增強為985倍。又，從此結果，對於Fc γ RIIa之結合增強活性，於H型、R型均為相較於G236A/S239D/I332E導入於兩H鏈之習知技術即同源二聚化抗體GpH7-Kn037/GpH7-H1036/GpL16-k0，大致為同等。對Fc γ RIIIa F之結合活性，相較於將S239D/A330L/I332E導入於兩H鏈之習知技術即同源二聚化抗體GpH7-Kn032/GpH7-H1032/GpL16-k0有所增強。從表38之結果，GpH7-Kn045/GpH7-H1055/GpL16-k0之A/I ratio對於Fc γ RIIa H型為8.3、對Fc γ RIIa R型為18，比起GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-H1032/GpL16-k0有提高，且相較於GpH7-Kn037/GpH7-H1036/GpL16-k0，針對Fc γ RIIa H型大致為同等，針對Fc γ RIIa R型有所提高。從此結果，藉由使用異源二聚化抗體技術，GpH7-Kn045/GpH7-H1055/GpL16-k0相較於習知技術，對Fc γ RIIa之結合活性有同程度提高，且同時對對 Fc γ RIIIa之結合活性更增強，顯示更有選擇的對活性型Fc γ R結合。
從表36及37之結果，相較於對G1d僅應用Knobs-into-Holes技術之分子GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0，將L234Y/L235Y/G236A/H268D/Q295L/S298A導入其中之一之H鏈、G236A/S239D/Q295L/A330M/I332E導入其中另一之H鏈之GpH7-Kn056/GpH7-H1055/GpL16-k0對Fc γ RIIa H型之結合增強為20倍、對Fc γ RIIa R型之結合增強為44倍、對Fc γ RIIIa F之結合增強為1114倍。又，從此結果，對Fc γ RIIa之結合增強活性，於H型、R型均比起G236A/S239D/I332E導入於兩H鏈之習知技術即同源二聚化抗體GpH7-Kn037/GpH7-H1036/GpL16-k0，大致為同等。對於Fc γ RIIIa F之結合活性，相較於將S239D/A330L/I332E導入於兩H鏈之習知技術即同源二聚化抗體GpH7-Kn032/GpH7-H1032/GpL16-k0有增強。從表38之結果，GpH7-Kn056/GpH7-H1055/GpL16-k0之A/I ratio對於Fc γ RIIa H型為8.7、對Fc γ RIIa R型為16，比起GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-H1032/GpL16-k0有提高，相較於GpH7-Kn037/GpH7-H1036/GpL16-k0，針對Fc γ RIIa H型大致同等，且針對Fc γ RIIa R型有提高。從此結果，藉由使用異源二聚化抗體技術，GpH7-Kn056/GpH7-H1055/GpL16-k0相較於習知技術，對 Fc γ RIIa之結合活性以同程度提高，且同時對Fc γ RIIIa之結合活性更為增強，顯示更有選擇的對活性型Fc γ R結合。
[實施例13]與習知技術之比較：對Fc γ RIIa、對Fc γ RIIIa之結合活性有增強之異源二聚化抗體之熱安定性之評價
如實施例9，習知技術獲得之同源二聚化抗體對Fc γ R之結合活性雖有增強，但由於物理化學方面不安定，有損作為醫藥品之價值。但是異源二聚化抗體技術容易將各改變對於Fc γ R之結合活性之增強效果於物理化學方面之影響加以控制，能增強對Fc γ R之結合活性且同時無損物理化學安定性。該實施例中，針對對活性型Fc γ RFc γ RIIa與對Fc γ RIIIa之結合活性有增強之抗體是否也同樣物理化學安定性、尤其熱力學的安定性未減損加以驗證。實施例11中，針對對Fc γ R之結合活性已評價之抗體，依參考實施例5之方法測定各抗體之CH2區之Tm，其結果整理於表39。
Figure 101123397-A0202-02-0236-125
顯示對Fc γ RIIa、對Fc γ RIIIa之結合活性增強之抗體之Tm。
從表39之結果，異源二聚化抗體GpH7-Kn045/GpH7-H1048/GpL16-k0、GpH7-Kn045/GpH7-H1055/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-H1055/GpL16-k0中任一者，均比起習知 技術同源二聚化抗體GpH7-Kn037/GpH7-H1036/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-H1032/GpL16-k0，維持高Tm。如實施例11所述，該等異源二聚化抗體相較於習知之同源二聚化抗體，具有更適於發揮經由Fc γ R之效應子機能的性質。亦即，從該結果可知，藉由使用異源二聚化抗體技術，能無損抗體之物理化學安定性，而精細控制對Fc γ R之結合。
[實施例14]對於為活性型Fc γ R之Fc γ RIIIa F之選擇性提高之改變之組合之效果
如實施例8所述，提高對活性型Fc γ R及抑制型Fc γ R之選擇性之技術係有用。在此，驗證對於為了提高實施例8找到的對活性型Fc γ Fc γ RIIIa F之結合及對抑制型Fc γ RFc γ RIIb之結合之比例，亦即選擇性之提高，異源二聚化是否有效。具體而言，將提高對活性型Fc γ Fc γ RIIIa F之結合以及對抑制型Fc γ RFc γ RIIb之結合之比例的改變L234Y、G236W、S298A(表22-1a區)，與實施例7探討之S239D、A330L、I332E加以組合，以異源二聚化抗體與同源二聚化抗體比較，驗證是否可得到選擇性提高之效果。
為了加以驗證，依參考實施例1之方法製備插入有將S239D、A330L、I332E全部導入於GpH7-A5之GpH7-A57(序列編號：40)、導入於GpH7-B3之GpH7-B78(序列編號：41)及將L234Y、G236W、S298A全部導入於GpH7-A5之GpH7-TA7(序列編號：31)、導入於GpH7-B3之GpH7-TA45(序列編號：32)的表現載體。使用該等表現載體以及GpH7-A5、 GpH7-B3、GpL16-k0，將對於其中之一之H鏈導入L234Y、G236W、S298A、其中另一之H鏈導入S239D、A330L、I332E之異源GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0、將L234Y、G236W、S298A僅導入於其中之一之H鏈之GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0、將L234Y、G236W、S298A導入於兩者之H鏈之GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0、將S239D、A330L、I332E僅導入於其中之一之H鏈之GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0、將S239D、A330L、I332E導入於兩者H鏈之GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，參考實施例1之方法表現、製備。將製備之抗體依參考實施例2之方法，測定對Fc γ RIIIa之KD及對Fc γ RIIb之KD。以各抗體對Fc γ RIIb之KD除以對Fc γ RIIIa之KD而得之值Fc γ RIIIa/Fc γ RIIb ratio作為指標，驗證各抗體對Fc γ RIIIa之結合之選擇性是否有提高。驗證結果整理於表40。
Figure 101123397-A0202-02-0239-126
樣本欄記載抗體之名稱，H1、H2欄記載各抗體之H鏈不變區之名稱，變異位置欄記載與GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0比較為相異之變異(無特別變 異之情形為「-」)。各抗體對Fc γ RIIb之KD除以對Fc γ RIIIa F之KD而得之值，定為Fc γ RIIIa F/Fc γ RIIb ratio。各抗體之H鏈、L鏈所對應之胺基酸序列之序列編號也一併記載。
從表40之結果，若比較天然型IgG1GpH7-G1d/GpL16-k0、以及將D356K、H435R及K439E各導入於其中之一之H鏈之GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，Fc γ RIIIa/Fc γ RIIb ratio各為2.5、1.9，未觀察到有大的差異。由此，可認為：D356K、H435R及K439E之改變對於對Fc γ RIIIa之結合之選擇性未造成影響。
針對使用習知技術之同源二聚化抗體，驗證各改變之效果。將S239D、A330L、I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0，Fc γ RIIIa/Fc γ RIIb ratio為100，比GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0有提高。另一方面，將L234Y、G236W、S298A導入於兩H鏈之同源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0為5.3，可知，同源二聚化抗體中S239D、A330L、I332E之組合之提高對Fc γ RIIIa之結合之選擇性之效果較高。
其次針對各改變群組僅對其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體，驗證各改變群組之效果。將S239D、A330L、I332E導入於其中之一之H鏈之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0，Fc γ RIIIa/Fc γ RIIb ratio為7.9，比起GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0有提高。另一方 面，將L234Y、G236W、S298A導入於其中之一之H鏈之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0，為14。從此結果，可知於異源二聚化抗體，L234Y、G236W、S298A之改變群組提高對Fc γ RIIIa之結合之選擇性之效果較高。
驗證各改變群組於同源二聚化抗體以及異源二聚化抗體之效果之不同。針對S239D、A330L、I332E，於其異源二聚化抗體，Fc γ RIIIa/Fc γ RIIb ratio為7.9，於同源二聚化抗體為100。從此結果可知，若針對S239D、A330L、I332E進行異源二聚化，有提高對Fc γ RIIIa之結合之選擇性的效果，但若進行同源二聚化，其效果會更增強。相反地，針對L234Y、G236A、S298A，其異源二聚化抗體的Fc γ RIIIa/Fc γ RIIb ratio為14，同源二聚化抗體為5.3。從此結果可知，針對L234Y、G236A、S298A若進行異源二聚化，會提高對Fc γ RIIIa之結合之選擇性之效果，但若進行同源二聚化，其效果會減弱。從該等結果可知，於同源二聚化抗體，S239D、A330L、I332E之改變群組比起L234Y、G236A、S298A之改變群組提高對Fc γ RIIIa之結合之選擇性之效果更高，但於異源二聚化抗體，L234Y、G236A、S298A之改變群組比起S239D、A330L、I332E之改變群組提高對Fc γ RIIIa之結合之選擇性之效果更高。
組合L234Y、G236A、S298A之改變群組以及S239D、A330L、I332E之改變群組的異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0中，Fc γ RIIIa/Fc γ RIIb ratio為244，且相較於L234Y、G236A、S298A之改變群組 僅於其中之一之H鏈具有之異源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0、於兩H鏈具有之同源二聚化抗體GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0、S239D、A330L、I332E之改變群組僅於其中之一之H鏈具有之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0、於兩H鏈具有之同源二聚化抗體GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0中之任一者，提高對Fc γ RIIIa之結合之選擇性之效果較高。該結果據認為係L234Y、G236A、S298A之改變群組於異源二聚化抗體提高對Fc γ RIIIa之結合之選擇性之效果、以及S239D、A330L、I332E之改變群組於異源二聚化抗體之效果合併者。亦即，可知：異源二聚化抗體相較於同源二聚化抗體，可觀察到較優異之對Fc γ RIIIa之結合之選擇性之提高效果。
亦即，藉由使用異源二聚化抗體，比起使用習知之同源二聚化抗體，能將Fc區與Fc γ RIIIa之非對稱交互作用更最適化，顯示能設計出具有更高之對Fc γ RIIIa之結合之選擇性的Fc區。
[實施例15]FcgRIIa結合增強異源二聚化抗體之ADCC活性之測定
針對實施例12製備之GpH7-G1d/GpL16-k0、GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0、GpH7-Kn037/GpH7-H1036/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-H1032/GpL16-k0、GpH7-Kn045/GpH7-H1048/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-H1055/GpL16-k0，依參考實施例7之方 法評價ADCC活性，結果整理於圖33。
圖33中，比較GpH7-G1d/GpL16-k0與GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0之ADCC活性，兩者大致有同等活性。從此結果可知，即使將Knobs-into-Holes導入抗體之Fc區，再加上對FcgR之結合，也對於ADCC活性沒有影響。
實施例12記載之異源二聚化抗體GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0，均相較於改變導入前之抗體GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0，顯示較強的ADCC活性。又，將據報告異源二聚化抗體GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0對FcgRIIa R及FcgRIIa H之結合增強且ADCP活性增強之G236A/S239D/I332E之改變於兩H鏈具有之同源二聚化抗體GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0及應用現有之ADCC活性增強之抗體GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0，顯示有同程度之ADCC活性。
亦即，GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0如實施例12所示，對FcgRIIa R及FcgRIIa H之結合相較於既存技術更增強，此外，相較於現有之ADCC活性增強技術，有同等的ADCC活性增強效果。亦即，在此評價之異源二聚化抗體，針對ADCC活性增強效果與現有技術有同程度的效果，且對於 FcgRIIa H及FcgRIIa R之結合有增強，從此等觀點，可認為比現有技術更為優異。
[實施例16]創出對於FcgRIIIa之結合有增強之異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0
又，如實施例11所示可知，對Fc γ RIIIa之結合活性增強之異源二聚化抗體，ADCC活性也增強。實施例11中，確認了對GPC3之抗體的效果，但為了確認於其他抗原是否也會觀察到同樣效果，使用抗Epiregulin(EREG)抗體進行同樣的實驗。在此，將對EREG之抗體之H鏈可變區之序列定為H240(序列編號：80)、含可變區、不變區之L鏈之序列定為L73-k0(序列編號：106)。
基於實施例4之結果，製作H鏈重新的對FcgRIIIa之結合有增強之改變體。在此，異源二聚化技術使用實施例12記載之Knobs-into-Holes技術。具體而言，依參考實施例1之方法製備對H240-G1d(序列編號：83)將Y349C、T366W之改變導入於不變區之H240-Kn033(序列編號：84)、對H240-G1d將D356C、T366S、L368A、Y407V之改變導入於不變區之H240-Hl033(序列編號：85)。其次，參考實施例1之方法製作於H240-Kn033(序列編號：84)導入L234Y、L235Y、G236W、H268D、S298A之H240-Kn061(序列編號：81)，於H240-Hl033(序列編號：85)導入K326D、A330M、K334E之H240-Hl071(序列編號：82)。將H240-Kn061、H240-Hl071、L73-k0組合，依參考實施例1之方法使異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 表現。
與實施例12同樣，為了將導入據報告增強對FcgRIIIa之結合之S239D、A330L、I332E之改變體作為比較對象進行製作。具體而言，依參考實施例1之方法，製作將S239D、A330L、I332E各導入於H240-Kn033(序列編號：84)、H240-H1033(序列編號：85)之H240-Kn032(序列編號：86)、H240-H1032(序列編號：87)。將H240-Kn032、H240-H1032、L73-k0組合，依參考實施例1之方法使同源二聚化抗體H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0表現。
其次，為了比較製作據報告增強對FcgRIIIa之結合之(Glycobiol.Vol.17 no.1 pp.104-118(2006)等)的去岩藻糖化(afucosylated)抗體。相同染色體上之兩者的岩藻糖轉運蛋白(transporter)基因之表現受人為抑制之細胞，岩藻糖轉運蛋白之機能受抑制。藉由使用該細胞，可獲得岩藻糖缺損的抗體(WO2006/067913等)。又，beta 1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III及Golgi alpha-mannosidaseII強制表現之細胞中，即使產生抗體也可能獲得岩藻糖有缺損的抗體(Ferrara等人，Biotechnol.Bioeng.(2006)93(5),851-861)。將該等依該技術領域中具有通常知識者公知之方法，組合表現H240-G1d(序列編號：83)及L73-k0(序列編號：106)，獲得將H240-G1d/L73-k0去岩藻糖化之抗體H240-afucosyl_G1d/L73-k0(序列編號：83、106)。
又，依參考實施例1之方法，使作為對照之 H240-Kn033(序列編號：84)、H240-H1033(序列編號：85)、L73-k0(序列編號：106)組合之H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0表現。
針對該等，依參考實施例8之方法，評價對各FcgR之結合活性，並整理其結果於表41。
Figure 101123397-A0202-02-0247-127
從表41之結果，異源二聚化抗體 H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0相較於H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0，尤其對FcgRIIIa F、FcgRIIIa V之結合有增強。異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0，係對於H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0導入L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A及K326D/A330M/K334E之改變體，故可說導入該等之改變對於FcgR之結合增強。
從表41之結果，異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0相較於應用現有之ADCC活性增強技術之H240-afucosyl_G1d/L73-k0及H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0，對FcgRIIIa F、FcgRIIIa V之結合有增強。從此結果，異源二聚化抗體相較於利用習知之同源二聚化抗體所為之ADCC活性增強技術及去岩藻糖化所為之ADCC活性增強技術，對FcgRIIIa之結合增強效果較高。此外，據認為異源二聚化抗體中，對ADCP活性增強為重要之對FcgRIIa之結合，針對FcgRIIa H相較於兩抗體也有增強，針對FcgRIIa R，相較於H240-afucosyl_G1d/L73-k0其結合有增強，與H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0為同程度。
其次，確認異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0是否有相對於由其之各H鏈構成之同源二聚化抗體對於FcgR之結合活性增強之異源二聚化抗體之特徵。異源二聚化抗體 H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之其中之一之H鏈H240-Kn061，導入L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A。其中另一之H鏈H240-H1071導入K326D/A330M/K334E有導入。將該異源二聚化抗體，與由各H鏈構成之同源二聚化抗體比較，確認對各FcgR有更強之結合活性。具體而言，將L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A導入於H240-H1033之H240-H1134(序列編號：88)、及K326D/A330M/K334E導入於H240-Kn033之H240-Kn132(序列編號：89)，依參考實施例1之方法製作。使用該表現載體，依參考實施例1之方法，使於兩H鏈具有L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A之同源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1134/L73-k0表現，並使兩H鏈具有K326D/A330M/K334E之同源二聚化抗體H240-Kn132/H240-H1071/L73-k0表現。依參考實施例8之方法測定：該等同源二聚化抗體、以及各H鏈具有L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A、K326D/A330M/K334E之異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0對FcgRIIIaF及FcgRIIIa V之結合。其結果整理於表42。
Figure 101123397-A0202-02-0250-128
從表42之結果，確認：於其中之一之H鏈具有L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A且於其中另一之H鏈具有K326D/A330M/K334E之異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0，相較於兩H鏈具有L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A之同源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1134/L73-k0及兩H鏈具有K326D/A330M/K334E之同源二聚化抗體H240-Kn132/H240-H1071/L73-k0中之任一者，對FcgRIIIa F及FcgRIIIa V有較強結合活性。亦即，可知：H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0具有較由其各H鏈構成之同源二聚化抗體，對FcgR之結合活性更增強之異源二聚化抗體之特徵。
其次依參考實施例9之方法，比較H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0、H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0、H240-afucosyl_G1d/L73-k0、 H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之ADCC活性，其結果整理於圖34。
從圖34之結果，H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0相較於H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0，顯示顯著較強的ADCC活性。此外，顯示較應用現有之ADCC活性增強技術之H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0及H240-afucosyl_G1d/L73-k0為更強之ADCC活性。亦即，可知：於ADCC活性，亦為H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0顯示較現有之ADCC活性增強技術更強之ADCC活性。
[實施例17]以異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0作為模板之進一步的改變體之製作以及評價
於前面的實施例16中，找到顯示優異之ADCC活性之H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0。為了找出具有更優異活性之改變體，以H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0作為模板，依參考實施例1之方法，製備將H240-Kn061及H240-H1071之各H鏈之EU編號231號至242號分別取代為Cys及原本之胺基酸以外之相異之18種胺基酸的改變體合計約420種類，並評價對各FcgR之結合。具體而言，依參考實施例8記載之方法，分別計算各改變體對FcgRI、FcgRIIa R、FcgRIIa H、FcgRIIb、FcgRIIIa F、FcgRIIIa V之KD值，以該KD值除以H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0對FcgRI、FcgRIIa R、FcgRIIa H、FcgRIIb、FcgRIIIa F、FcgRIIIa V之KD 值而得之值作為Relative KD，作為評價之指標。亦即，當H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之KD值定為1之情形，各改變體對於各FcgR之KD值會有幾倍變動作為評價之指標。Relative KD愈大，代表該改變體相較於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0，對各FcgR之結合更增強。
以各改變體對FcgRI、FcgRIIa R、FcgRIIa H、FcgRIIb、FcgRIIIa F、FcgRIIIa V之Ralative KD作為縱軸、以Relative KD從小往大之順序之順位為橫軸之圖，各如圖35、圖36、圖37、圖38、圖39、圖40。
從該等結果之解析，找出相較於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0，對於FcgRIIb之結合未有增強，且對FcgRIIa R、FcgRIIIa F、FcgRIIIa V中之任一者或幾個的結合有增強之改變體。導入該改變之H鏈及其改變，整理於表43(對於FcgRIIb之結合未增強，對FcgRIIa R及FcgRIIIa之結合有增強之改變)。選擇對FcgRIIb之Relative KD成為1以下，對FcgRIIa R、FcgRIIIa F、FcgRIIIa V中之任一者或數個的Relative KD成為1.3以上之改變。
Figure 101123397-A0202-02-0253-129
上述表43中之數值，代表各改變體對各FcgR之 Relative KD。
該等改變，有對抑制型FcgRFcgRIIb之結合不增強、對ADCP活性發揮重要作用之FcgRIIa或對ADCC活性具有重要作用之對FcgRIIIa之結合增強之效果。所以，藉由導入該等改變，有不增強抗體之免疫抑制性作用，而期待增強ADCC活性或ADCP活性，且發揮更強之抗腫瘤活性。
其次找出相較於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0，對FcgRIIIa之結合不減弱，對FcgRIIa H及FcgRIIa R之結合增強之改變體。將導入該改變之H鏈，並將其改變整理於表44(對於FcgRIIIa之結合不減弱，對FcgRIIa之結合增強之改變)。選擇對FcgRIIIa F及FcgRIIIa V之Relative KD為0.7以上，對FcgRIIa H及FcgRIIa R之Relative KD成為1.5以上之改變。
Figure 101123397-A0202-02-0255-130
上述表44中之數值，代表各改變體對各FcgR之 Relative KD。
該等改變係對ADCC活性發揮重要作用之對FcgRIIIa之結合不減弱，由於改變對FcgRIIIa之結合增強，且對ADCP活性發揮重要作用之FcgRIIa之結合增強之改變。所以，藉由導入該改變，可期待ADCC活性及ADCP活性、ADCC活性或ADCP活性增強，發揮更強抗腫瘤活性。
其次，找出相較於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0，對FcgRIIIa之結合不減弱，對FcgRIIb之結合減弱之改變體。導入該改變之H鏈及其改變整理於表45(維持對於FcgRIIIa之結合且使對FcgRIIb之結合減弱之改變)。選擇對FcgRIIIa F及FcgRIIIa V之Relative KD為1以上且對FcgRIIb之Relative KD成0.5以下之改變。
Figure 101123397-A0202-02-0257-131
上述表45中之數值代表各改變體對各FcgR之Relative KD。
該等改變，不會使對ADCC活性發揮重要作用之對FcgRIIIa之結合減弱，會使對抑制型FcgRFcgRIIb之結合減弱。所以，藉由導入該改變，不會減低ADCC活性、會減低抗體之免疫抑制性作用，可期待更強的抗腫瘤活性。
又，異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0由於具有較由各H鏈構成之同源二聚化抗體對FcgR更強力結合之異源二聚化抗體之性質，所以據認為將該等改變導入H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0而獲得之改變體也具有同樣之異源二聚化抗體之性質。
[實施例18]可以與導入於異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之改變替換的改變
從實施例17獲得之圖35、圖36、圖37、圖38、圖39、圖40之結果，驗證是否可將異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之該等改變位置替換為其他改變。在此，可替換之改變，係指藉由導入該改變，相較於導入前，對FcgRIIIa F及FcgRIIIa V之結合為0.7倍以上，且對FcgRIIb之結合成為1.3倍以下之改變。
實施例17製備之改變體，係對於抗體之EU編號231號至242號的胺基酸導入改變。異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之H240-Kn061之H鏈導入L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A、H240-H1071之H鏈導入K326D/A330M/K334E，所以可從實施例17之結果，驗證H240-Kn061之H鏈所導入之改變當中的L234Y、L235Y、G236W是否能替換為其他的胺基酸。
不包括對於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之其中之一之H鏈H240-H1071導入之改變位置，包括其中另一之H鏈H240-Kn061之H鏈之EU編號234號、235號、236號。本次製備之改變體之中，係對於H240-Kn061之H鏈之EU編號234號、235號、236號導入改變，相較於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0，對FcgRIIIa F及FcgRIIIa V之結合為0.7倍以上，對FcgRIIb之結合為1.3倍以下之改變體，據認為具有與H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0為同等或更優異之活性，所以，據認為可無損於異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之優異性質而可替換。針對滿足如此的條件的改變，將導入之H鏈及其改變整理於表46(維持與H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0為同等活性或賦予更優異之性質之改變)。
Figure 101123397-A0202-02-0260-132
上述表46中之「導入改變之H鏈」，係指是否可替換為H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之H鏈之中之任一H鏈，「改變」為以數字EU編號代表時之殘基編號，最開頭的字母代表為H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之該殘基編號所對應之胺基酸，最後的字母代表可替換之胺基酸。
從該結果，在對於H240-Kn061之H鏈不變區導入之改變之中，可取代之部位、及可替換之胺基酸整理如表47(維持與H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0為同等活性之可替換之H240-Kn061之改變部位、以及可替換之胺基酸)。
Figure 101123397-A0202-02-0261-133
上述表47中之「改變部位」，代表H240-Kn061以EU編號表示時之殘基編號EU編號表示之殘基編號，可替換之胺基酸係指即使將該部位替換為表中之胺基酸，仍能維持與H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0帶有同等活性之亦即可替換之胺基酸。
對於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0導入之改變之中，針對H240-Kn061之H268D、S298A、及H240-H1071之K326D、A330M、K334E，於實施例17未針對對應部位導入改變。以下針對該等部位，也從實施例4之結果推察是否有可替換的改變。具體而言，選擇實施例4之結果之中，僅於其中之一H鏈導入改變之異源二聚化抗體中，對FcgRIIIa F之結合之指標He/Con_3aF比起改變導入前有1.3倍以上增強，亦即He/Con_3aF之值為130以上且於其部位顯示最強效果之3種改變。整理其結果，如表48(H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之改變H268D、S298A、K326D、A330M、K334E及可替換之改變之改變部位、可替換之胺基酸、及其對FcgRIIIa F之結合活性)。
Figure 101123397-A0202-02-0262-134
上述表48中之「改變部位」，係指以EU編號表示時之殘基編號。「可替換之胺基酸」，係指於實施例4僅對其中之一H鏈導入改變之異源二聚化抗體中，對FcgRIIIa F之結合之指標He/Con_3aF比起改變導入前有1.3倍以上增強，且該部位顯示最強效果之3種改變。「He/Con_3aF」係於實施例4定義之值。
將表48之結果依各改變部位、可替換之胺基酸整理於表49(H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之改變H268D、S298A、K326D、A330M、K334E之可替換之改變部位、及可替換之胺基酸)。
Figure 101123397-A0202-02-0263-135
從表49，可認為即使將H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之H268D從D替換為E或A，也能發揮同等活性。以同樣方式，可認為即使K326D從D替換為T或I，A330M從M替換為P或F，334D從D替換為E或I，也能發揮同等活性。另一方面，針對S298A，未能找出即使改變也能發揮同等活性的改變。
又，異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0由於具有相較於由其各H鏈構成之同源二聚化抗體對FcgR之結合活性更增強之異源二聚化抗體之特徵，故將該等改變導入於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0而得之改變體據認為也同樣具有異源二聚化抗體之性質。
[實施例19]對於異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0導入D270E及其評價
其次為了將H240-Kn061/H240-H1071進一步改良，嘗試將據認為會增強ADCC活性的對FcgRIIIa之結合更增強且據認為會經由免疫抑制性訊號減低抗體之抗腫瘤活性之對FcgRIIb之結合更減弱。具體而言，將於實施例4找出 的對FcgRIIIa之結合增強且對FcgRIIb之結合減弱的改變D270E導入於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之兩H鏈。於H240-Kn061、H240-H1071分別導入D270E之序列，各定為H240-Kn072(序列編號：90)、H240-H1076(序列編號：91)，且依實施例1之方法，表現並製備與L73-k0組合之異源二聚化抗體H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0。將該抗體、及H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0、H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0、H240-afucosyl_G1d/L73-k0、H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0，依參考實施例8之方法評價對各FcgR之結合活性，將其結果整理如表50。
Figure 101123397-A0202-02-0265-136
從表50，H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0，相較於 H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0及同樣應用現有之ADCC活性增強技術之H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0及H240-afucosyl_G1d/L73-k0，會對FcgRIIIa F及FcgRIIIa V強力結合，此外，相較於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0更強力結合。對FcgRIIb，H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0相較於利用現有之ADCC活性增強技術製作之H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0及H240-afucosyl_G1d/L73-k0，結合較減弱，且較H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0為減弱。
亦即，藉由導入D270E，增強ADCC活性之對FcgRIIIa之結合增強，故可期待具有更強之ADCC活性，且傳達免疫抑制性訊號之對FcgRIIb之結合減弱，所以可期待抗體之免疫抑制性作用減低，故據認為H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0比起H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0可發揮更優異的抗腫瘤效果。
其次，將H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0之ADCC活性與H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0、H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0及H240-afucosyl_G1d/L73-k0比較。其結果如圖41。
從圖41之結果，H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0比起H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0顯示顯著較強的ADCC活性。又，H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0比起應用現有之ADCC活性增強技術之去岩藻糖化抗體 H240-afucosyl_G1d/L73-k0顯示更強之ADCC活性，且與H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0顯示同程度之ADCC活性。
從該結果，異源二聚化抗體H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0為比起現有之ADCC活性增強技術具有較強之ADCC活性，此外對FcgRIIb之結合也減弱的優於現有技術的抗體。
又，異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0由於具有較由各H鏈構成之同源二聚化抗體對FcgR更強力結合之異源二聚化抗體之性質，所以，D270E導入於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之兩H鏈而得之H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0據認為也同樣具有異源二聚化抗體之性質。
[實施例20]異源二聚化抗體H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0之進一步改良
嘗試將實施例19找到的H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0進一步改良。具體而言，藉由對於實施例18找到的H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0導入H240-Kn061於以賦予更優異性質之改變Y234E、Y235N、Y235Q、S239M，與H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0組合。
依參考實施例1之方法，製作對於H240-Kn072導入Y234E、Y235N之H240-Kn113(序列編號：92)、於H240-Kn072導入S239M之H240-Kn115(序列編號：93)、於H240-Kn072導入Y235Q、S239M之H240-Kn125(序列編號：94)。依參 考實施例1之方法，以H240-H1076作為其中之一之H鏈、L73-k0作為L鏈、其中H240-Kn113、H240-Kn115、H240-Kn125作為另一之H鏈，各自組合，製備H240-Kn113/H240-H1076/L73-k0、H240-Kn115/H240-H1076/L73-k0、H240-Kn125/H240-H1076/L73-k0。針對該等，依參考實施例8之方法，將對各FcgR之結合，以及天然型IgG1H240-G1d/L73-k0、對其施加Knobs-into-Holes之H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0、現有之ADCC活性增強技術去岩藻糖化抗體H240-afucosyl_G1d/L73-k0及ADCC活性增強改變S239D/A330L/I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0一起進行評價之結果，整理於表51。
Figure 101123397-A0202-02-0269-137
H240-Kn113/H240-H1076/L73-k0，相較於 H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0，對抑制型FcgR即FcgRIIb之結合維持為同程度，且對ADCC活性發揮重要作用之對FcgRIIIa F及FcgRIIIa V之結合有增強。針對對抑制型FcgR即FcgRIIb之結合，相較於天然型抗體IgG1，結合為同程度。針對FcgRIIIa，對FcgRIIIa F及FcgRIIIa V之結合，相較於現有之ADCC活性增強技術去岩藻糖化抗體H240-afucosyl_G1d/L73-k0及ADCC活性增強改變S239D/A330L/I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0有增強。由此，H240-Kn113/H240-H1076/L73-k0相較於天然型之IgG1，為免疫抑制性作用未增強，且可能有超越應用現有之ADCC活性增強改變之去岩藻糖化抗體、同源二聚化抗體之強抗腫瘤效果。
H240-Kn115/H240-H1076/L73-k0，相較於H240-Kn113/H240-H1076/L73-k0，ADCC活性發揮重要作用之對FcgRIIIa F及FcgRIIIa V之結合更增強。此外，對ADCP活性為重要之對FcgRIIa R及FcgRIIa H之結合，也較天然型IgG1H240-G1d/L73-k0、以及施加有Knobs-into-Holes之H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0、現有之ADCC活性增強技術去岩藻糖化抗體H240-afucosyl_G1d/L73-k0及ADCC活性增強改變S239D/A330L/I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0更有增強。
H240-Kn125/H240-H1076/L73-k0，與 H240-Kn113/H240-H1076/L73-k0同樣，對抑制型FcgRFcgRIIb之結合維持與IgG1為同程度，對ADCC活性發揮重要作用之對FcgRIIIa F及FcgRIIIa V之結合增強至超越H240-Kn115/H240-H1076/L73-k0。相較於現有之ADCC活性增強技術去岩藻糖化抗體H240-afucosyl_G1d/L73-k0及ADCC活性增強改變S239D/A330L/I332E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0之情形，對於為FcgRIIa之一異型之FcgRIIa H之結合更增強，對FcgRIIb之結合減弱，且針對FcgRIIIa對兩異型之結合增強，所以H240-Kn125/H240-H1076/L73-k0期待有超越應用現有之ADCC活性增強改變之去岩藻糖化抗體、同源二聚化抗體以上的ADCP活性增強、ADCC活性增強，此外，可期待免疫抑制性作用之減弱。
其次，將H240-Kn113/H240-H1076/L73-k0、H240-Kn115/H240-H1076/L73-k0、H240-Kn125/H240-H1076/L73-k0之ADCC活性與H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0、現有之ADCC活性增強技術去岩藻糖化抗體H240-afucosyl_G1d/L73-k0比較。其結果如圖42。
從圖42可知，任一異源二聚化抗體均較現有之ADCC活性增強技術去岩藻糖化抗體顯示更優異之ADCC活性。
從對各FcgR之結合概況、及現有技術加以比較之ADCC活性之結果，可知：本次H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0 之於H240-Kn072導入Y234E、Y235N、Y235Q、S239M，為對於H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0賦予更優異性質之改變。
異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0由於相較於由各H鏈構成之同源二聚化抗體對FcgR更強力結合之異源二聚化抗體之性質，所以據認為將D270E導入於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之兩H鏈獲得之H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0也同樣具異源二聚化抗體之性質，對於更導入改變之H240-Kn113/H240-H1076/L73-k0、H240-Kn115/H240-H1076/L73-k0、H240-Kn125/H240-H1076/L73-k0也同樣具有異源二聚化抗體之性質。
[實施例21]對FcgRIIa、FcgRIIIa之結合有增強之異源二聚化抗體之製作
依據實施例4之結果，製作H鏈對FcgRIIIa及FcgRIIa之結合有增強之改變體。具體而言，依參考實施例1之方法對於H240-Kn033(序列編號：84)導入L234Y、L235Y、G236W、H268D、S298A、A327D，並製作H240-Kn067(序列編號：95)，對於H240-H1033(序列編號：85)導入D270E、K326D、A330K、K334E並製作H240-H1068(序列編號：96)。將H240-Kn067、H240-H1068、L73-k0組合，依參考實施例1之方法使異源二聚化抗體H240-Kn067/H240-H1068/L73-k0表現。
首先，確認該異源二聚化抗體H240-Kn067/H240-H1068/L73-k0是否具有比起由其各H鏈構成之同源二聚化抗體對FcgR之結合活性更增強之異源二聚化抗體之特徵。於異源二聚化抗體H240-Kn067/H240-H1068/L73-k0之其中之一之H鏈H240-Kn067導入L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D，其中另一之H鏈H240-H1068導入D270E/K326D/A330K/K334E。並依參考實施例1之方法製作將L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D導入於H240-H1033之H240-H1136(序列編號：97)、及將D270E/K326D/A330K/K334E導入於H240-Kn033之H240-Kn133(序列編號：98)。使用該表現載體，依參考實施例1之方法，使兩H鏈具有L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D之同源二聚化抗體H240-Kn067/H240-H1136/L73-k0、兩H鏈具有D270E/K326D/A330K/K334E之同源二聚化抗體H240-Kn113/H240-H1068/L73-k0表現。依參考實施例8之方法測定該等同源二聚化抗體，以及其中之一之H鏈具有L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D、其中另一之H鏈具有D270E/K326D/A330K/K334E之異源二聚化抗體H240-Kn067/H240-H1068/L73-k0對FcgRIIa H、FcgRIIa R、FcgRIIIaF及FcgRIIIa V之結合。其結果整理於表52。
Figure 101123397-A0202-02-0274-138
再對於該改變體，藉由導入於實施例18找到的H240-Kn061，將對於H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0賦予 更優異之性質之改變Y235Q、S239M與H240-Kn067/H240-H1068/L73-k0組合。具體而言，依參考實施例1之方法，製作對於H240-Kn067導入S239M之H240-Kn120(序列編號：99)、對H240-Kn120導入Y235Q之H240-Kn126(序列編號：100)。依參考實施例1之方法，以H240-H1068作為其中之一之H鏈、以L73-k0作為L鏈、H240-Kn067、H240-Kn120、H240-Kn126作為其中另一之H鏈，各自組合，製備H240-Kn067/H240-H1068/L73-k0、H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0、H240-Kn126/H240-H1068/L73-k0。針對該等，依參考實施例8之方法，評價對各FcgR之結合，結果整理於表53。
Figure 101123397-A0202-02-0276-139
從該結果，H240-Kn067/H240-H1068/L73-k0、 H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0、H240-Kn126/H240-H1068/L73-k0比起現有之ADCC活性增強抗體H240-afucosyl_G1d/L73-k0及H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0，均對FcgRIIIa之結合為同等、或增強超越該等。又，相較於任一現有技術，對ADCP活性發揮重要作用之對FcgRIIa R及FcgRIIa H之結合都較增強。由此啟示，本次製作之H240-Kn067/H240-H1068/L73-k0、H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0、H240-Kn126/H240-H1068/L73-k0任一異源二聚化抗體，均顯示與現有技術有同等更超越之ADCC活性，且可能較此等有更優異的ADCP活性。
尤其，H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，相較於兩H鏈具有據報告會增強對FcgRIIa R及FcgRIIa H之結合且增強ADCP活性之G236A/S239D/I332E之改變的同源二聚化抗體H240-Kn037/H240-H1036/L73-k0，對FcgRIIa H及FcgRIIa R之結合更增強。亦即，H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，相較於使用現有之ADCC活性增強技術之抗體，對FcgRIIIa F及FcgRIIIa V之結合增強，且相較於使用現有之ADCP活性增強技術之抗體，對FcgRIIa R及FcgRIIa H之結合增強。所以，H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0係可能具有超越使用現有技術之抗體之強ADCC活性及ADCP活性的優異的抗體。
其次，依參考實施例9，將各改變體之ADCC活性與現 有之ADCC活性增強技術去岩藻糖化抗體H240-afucosyl_G1d/L73-k0加以比較。其結果如圖43。
從圖43之結果可知，本次製作之任一異源二聚化抗體均顯示比現有之ADCC活性增強技術即去岩藻糖化抗體有同等或優越之優異之ADCC活性。
從對各FcgR之結合概況、及現有技術加以比較之ADCC活性之結果可知，本次製備之H240-Kn067/H240-H1068/L73-k0、H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0、H240-Kn126/H240-H1068/L73-k0均有與現有之ADCC活性增強技術為同程度或超越之ADCC活性，且同時為經由FcgRIIa結合之ADCP活性也增強之可能性高之異源二聚化抗體。
[實施例22]異源二聚化抗體H240-AK072/H240-BH076/L73-k0之對各FcgR之結合活性、ADCC活性之評價
評價至此利用之作為Knobs-into-Holes之異源二聚化抗體的H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0之對各FcgR之結合、ADCC活性。在此，於使用其他異源二聚化抗體製作技術D356K、H435R及K439E之情形，亦確認是否同樣會觀察到由相異之二條H鏈構成之異源二聚化抗體比起由其各H鏈構成之同源二聚化抗體有對FcgR之結合活性增強之異源二聚化抗體之特徵。
首先，將於H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0之其中一 H鏈H240-Kn072導入之改變L234Y/L235Y/G236W/H268D/D270E/S298A，導入於在H240-G1d(序列編號：83)之異型H240-G1dE(序列編號：101)導入D356K、H435R之H240-A5E(序列編號：102)，製作H240-AK072(序列編號：104)。其次，將於其中另一H鏈H240-Hl076導入之D270E/K326D/A330M/K334E，導入在H240-G1dE導入K439E之H240-B3E(序列編號：103)，並製作H240-BH076(序列編號：105)。依實施例1之方法，組合H240-AK072、H240-BH076、L73-k0，表現並製備異源二聚化抗體H240-AK072/H240-BH076/L73-k0。以同樣方式，將H240-AK072與L73-k0、H240-BH076與L73-k0分別組合，表現並製備同源二聚化抗體H240-AK072/L73-k0、H240-BH076/L73-k0。依參考實施例8之方法，比較該等抗體之對各FcgR之結合活性，結果整理於表54。
Figure 101123397-A0305-02-0279-1
由該結果，確認異源二聚化抗體H240-AK072/H240-BH076/L73-k0，相較於由其各H鏈構成之同源二聚化抗體H240-AK072/L73-k0、H240-BH076/L73-k0中之任一者，均有對FcgR較強結合之 異源二聚化抗體之特徵。
其次依參考實施例1之方法，將H240-A5E、H240-B3E、L73-k0組合表現，製備H240-A5E/H240-B3E/L73-k0。依參考實施例8之方法，評價H240-G1d/L73-k0、H240-A5E/H240-B3E/L73-k0、H240-afucosyl_G1d/L73-k0、異源二聚化抗體H240-AK072/H240-BH076/L73-k0之對各FcgR之結合，其結果整理於表55。
Figure 101123397-A0202-02-0281-141
其結果，H240-AK072/H240-BH076/L73-k0中，相較於 H240-G1d/L73-k0及現有之ADCC活性增強技術即去岩藻糖化抗體H240-afucosyl_G1d/L73-k0，對FcgRIIIa F、FcgRIIIa V之結合有增強。又，H240-G1d/L73-k0與H240-A5E/H240-B3E/L73-k0之對FcgR之結合活性為同等，故可認為H240-AK072/H240-BH076/L73-k0之結合活性之增強係來自於對各H鏈所導入之L234Y/L235Y/G236W/H268D/D270E/S298A及D270E/K326D/A330M/K334E之改變。
[實施例23]Fc(Kn120/H1068)與FcgRIIb細胞外區之複合體之X射線結晶結構解析
實施例21製作之H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，除了對FcgRIIIa及FcgRIIa H型，對異型FcgRIIa R型也發揮結合活性之增強，但也同時觀察到對抑制型受體FcgRIIb之結合活性之增強。對FcgRIIb之結合增強，據認為會帶來免疫抑制性效果，故藉由減低其對FcgRIIb之結合，可能更增強本發明之目的ADCC活性。
但是FcgRIIa與FcgRIIb的細胞外區之胺基酸序列有93%為一致，有非常高的相同性。且若從天然型IgG1之Fc(以下Fc(WT))與FcgRIIa R型之細胞外區複合體之結晶結構(J.Imunol.2011,187,3208-3217)分析，在兩者之交互作用界面附近，FcgRIIa R型相較於FcgRIIb只能看出僅3個胺基酸(Gln127,Leu132,Phe160)不同(圖44)。所以，欲維持對FcgRIIa R型之結合活性且同時僅使對FcgRIIb之結合活性減弱，可料想是非常困難。所以，藉 由取得H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之Fc部分(Fc(Kn120/H1068))與FcgRIIb細胞外區之複合體之結晶結構資訊，更詳細探討導入之胺基酸變異，據認為可以找出對FcgRIIb之結合活性選擇性減低之改變，並進行Fc(Kn120/H1068)與FcgRIIb細胞外區之複合體之X射線結晶結構解析。
其結果，針對Fc(Kn120/H1068)/FcgRIIb細胞外區複合體，利用X射線結晶結構解析成功地以解析力2.78埃決定立體結構。該解析之結果取得之結構如圖45。可知，以在2個Fc CH2分域之間夾持FcgRIIb細胞外區之方式結合，且與至今為止所解析之Fc(WT)及FcgRIIIa(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011,108,12669-126674)、FcgRIIIb(Nature,2000,400,267-273；J.Biol.Chem.2011,276,16469-16477)、FcgRIIa之各細胞外區之複合體之立體結構類似。
其次顯示在與Fc之結合面附近，與FcgRIIa R型及FcgRIIb為相異之3個胺基酸殘基周邊之結構。圖46顯示Lys127(FcgRIIa R型為Gln)周邊之結構。最近的FcgRIIb的殘基，為圖46所示之位於Fc之CH2分域B之EU編號298號的Ala，但由於該殘基在結合之交界面直接相接於FcgRIIb，故據認為難以導入可能與Lys127交互作用之大的殘基。其他周圍的胺基酸殘基，距該Lys127之距離遠，未能發現能直接交互作用之變異。圖47顯示Ser132(FcgRIIa R型為Leu)周邊之結構。也是，該殘基距 Fc之距離遠，未能找出能與該Ser直接交互作用之變異。最後，於圖48顯示Tyr160(FcgRIIa R型中為Phe)周邊之結構。該Tyr與位於Fc之CH2分域A之EU編號236號的Gly之主鏈羰基氧形成氫鍵。而藉由對於EU編號236號的Gly236導入變異，使環圈(loop)結構變化，其結果若該氫鍵會消失，則可能僅減低對FcgRIIb之結合活性。又，當對於EU編號236號的Gly之位置導入側鏈大之變異之情形，該側鏈預測會與FcgRIIa及FcgRIIb之160號之側鏈直接交互作用，利用FcgR2a R型之Phe160及FcgRIIb之Tyr160的差異，據認為可對於FcgRIIb選擇性地減低結合活性。
實驗方法 [Fc(Kn0120/H1068)之表現精製]
以下列方式製備Fc(Kn0120/H1068)。首先，將H240-Kn120(序列編號99)及H240-H1068(序列編號96)之EU編號220號的Cys取代為Ser，依參考例1記載之方法，進行表現載體之製作、表現、精製EU編號236號的Glu至其C末端利用PCR選殖之基因序列Fc(Kn0120)及Fc(H1068)。又，EU編號220號的Cys於通常之IgG1中，係與L鏈之Cys形成雙硫鍵，但僅製備Fc之情形，由於不要使其與L鏈共表現，為了形成不需要的雙硫鍵，取代為Ser。
[FcgRIIb細胞外區之表現精製]
依參考例8之方法製備。
[Fc(Kn120/H1068)/FcgRIIb細胞外區複合體之精製]
對於結晶化用獲得之FcgRIIb細胞外區樣本1.5mg，添加作為與glutathione S-transferase之融合蛋白之從大腸菌表現精製之Endo F1(Protein Science 1996,5,2617-2622)0.15mg，於0.1M Bis-Tris pH6.5之緩衝液條件，於室溫靜置3日，藉此保留N型糖鏈直接鍵結於Asn之N-acetylglucosamine並切斷。其次，將施以該糖鏈切斷處理之FcgRIIb細胞外區樣本以10000MWCO之超過濾膜濃縮，並利用經以20mM HEPES pH7.5,0.1M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。再對於獲得之糖鏈切斷FcgRIIb細胞外區級分，添加Fc(Kn0120/H1068)使莫耳比，為FcgRIIb細胞外區有若干過量，以10000MWCO之超過濾膜濃縮後，利用經以25mM HEPES pH7.5,0.1M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製，獲得Fc(Kn0120/H1068)/FcgRIIb細胞外區複合體之樣本。
[Fc(Kn120/H1068)/FcgRIIb複合體細胞外區複合體之結晶化]
將Fc(Kn120/H1068)/FcgRIIb細胞外區複合體之樣本利用10000MWCO之超過濾膜濃縮成約10mg/ml，以懸滴(hanging-drop)蒸氣擴散法，併用Seeding法進行結晶化。結晶化，係使用VDXm板(Hampton Research)，製作對於0.1M Bis-Tris pH6.0,14.4% PEG3350,0.2M Ammonium Sulfatec之貯池溶液，貯池溶液：結晶化樣本=0.85μl：0.85μl混合並結晶化之滴劑(drop)，再從以同樣條件獲 得之同複合體之結晶使用Seeding Tool(Hampton Research)，進行移植種結晶之Streak Seeding，靜置20℃，成功獲得柱狀之結晶。
[從Fc(Kn120/H1068)/FcgRIIb細胞外區複合體結晶之X射線繞射數據之測定]
將獲得之Fc(Kn120/H1068)/FcgRIIb細胞外區複合體之一個單結晶浸於0.1M Bis-Tris pH6.0,17.5% PEG3350,0.2M Ammonium Sulfate,Glycerol 16%(v/v)之溶液後，以附有微小的尼龍環圈的針撈取溶液，使在液態氮中冷凍，於高能量加速器研究機構之放射光設施PHOTON FACTORY BL-17A進行X射線繞射數據之測定。又，測定中隨時置於-178℃之氮氣流中以維持冷凍狀態，以附有束線之CCD偵測器Quantum 315r(ADSC)，邊將結晶以級距0.5°旋轉邊收集總共360張的X射線繞射影像。從獲得之繞射影像決定晶格常數、賦予繞射斑點的指數，以及處理繞射數據，係使用Xia2程式(J.Appl.Cryst.2010,43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.2010,D66,125-132)及Scala(Acta Cryst.2006,D62,72-82)，最後獲得解析力達2.78埃的繞射強度數據。本結晶屬於空間群P41212，且晶格常數a=152.94埃、b=152.94埃、c=82.24埃、α=90°、β=90°、γ=90°。
[Fc(Kn120/H1068)/FcgRIIb細胞外區複合體之X射線結晶結構解析]
結構決定係使用利用Phaser程式之(J.Appl.Cryst.2007, 40,658-674)分子取代法實施。從獲得之結晶晶格之大小以及Fc(Kn120/H1068)/FcgRIIb細胞外區複合體之分子量，預想非對稱單位中之複合體之數目為一個。從Fc(WT)/FcgRIIIa細胞外區複合體之結晶結構PDB code：3SGJ之結構座標，取出A鏈239-340號及B鏈239-340號之胺基酸殘基部分作為另一座標，將該等各當作Fc CH2分域之探索用模型。同樣從PDB code：3SGJ之結構座標，取出A鏈341-444號與B鏈341-443號之胺基酸殘基部分作為一座標，當作Fc CH3分域之探索用模型。最後，從FcgRIIb細胞外區之結晶結構PDB code：2FCB之結構座標取出A鏈6-178號之胺基酸殘基部分，作為FcgRIIb之探索用模型。從旋轉函數及平移函數決定Fc CH3分域、FcgRIIb細胞外區、Fc CH2分域之各探索用模型之結晶晶格內的方向與位置，獲得Fc(Kn120/H1068)/FcgRIIb細胞外區複合體結晶結構之起始模型。對於獲得之起始模型，進行移動2個Fc之CH2分域、2個Fc之CH3分域及FcgRIIb細胞外區之剛體精密化，結果於此時點，相對於25-3.0埃之繞射強度數據，晶學的可靠度因子R值成為41.4%、Free R值成為42.6%。再使用REFMAC5程式，邊觀測依據使用Acta Cryst.2011,D67,355-367)之結構精密化、及從實驗決定之結構因子Fo與模型計算得之結構因子Fc及從模型計算之位相所計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc作為係數之電子密度輿圖，邊以Coot程式(Acta Cryst.2010,D66,486-501)實施模型修正，反複此等操作，進行模型之精密化。最後基於以 2Fo-Fc、Fo-Fc為係數之電子密度輿圖將水分子納入模型並進行精密化，最終使用解析力25-2.78埃之24274個繞射強度數據，對於含964個非氫原子的模型，結晶學的可靠度因子R值成為22.8%、Free R值成為27.7%。
[實施例24]維持或增強對FcgRIIaR之結合活性且對FcgRIIb之結合活性減低之抗體之製作
實施例21找到的改變體H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，對ADCP活性為重要之對FcgRIIaR,FcgRIIaH之結合活性增強且同時對抑制型之FcgRIIb之結合活性相較於天然型IgG1有約50倍增強。為了顯示高ADCP活性，對抑制型FcgRIIb之結合活性宜儘可能減低較佳。而，探索維持對活性型FcgRIIaR,FcgRIIaH之結合活性且同時能減低對FcgRIIb之結合活性之改變。如實施例23所示，從H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之Fc與FcgRIIb細胞外區之複合體之結晶結構解析結果，顯示FcgRIIb之Tyr160與Fc(Kn120/H1068)之CH2分域A所存在之Gly236之主鏈羰基氧之間形成氫鍵。FcgRIIaR,FcgRIIaH，該部位成為Phe160，據認為不存在上述交互作用，故若能對於Gly236導入改變，且使與FcgRIIb之Tyr160之交互作用消失，能維持對FcgRIIa R型之結合活性且同時使對FcgRIIb之結合活性下降，亦即能對於FcgRIIb選擇性地減低結合活性。具體而言，將在H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0與FcgRIIb之結合中從與FcgRIIb之Y160交互作用之H240-H1068而來之H鏈存在 的G236，取代成Ser,Val,Ile,Thr，據認為會使G236反轉，改變環圈結構，說不定與Y160之交互作用會消失。又，FcgRIIb之Lys127與Fc(Kn120/H1068)之CH2分域A之E294，雖是遠位但仍可能靜電交互作用。因此，藉由將E294取代為帶正電荷之Lys、Arg，據認為可能引起靜電排斥，並減弱與FcgRIIb之交互作用。
依參考實施例1之方法，製作將對H240-Kn120(序列編號99)各導入E294R、E294K而得之H240-Kn179(序列編號107)、H240-Kn180(序列編號108)，導入於在H240-H1068(序列編號96)各導入G236S,G236V,G236I,G236T之H240-H1073(序列編號109)、H240-H1085(序列編號110)、H240-H1086(序列編號111)、H240-H1089(序列編號112)。依參考實施例1之方法，以H240-Kn120、H240-Kn180作為其中之一之H鏈、L73-k0作為L鏈、H240-H1073、H240-H1085、H240-H1086、H240-H1089作為其中另一之H鏈，將此等分別組合，製備H240-Kn120/H240-H1073/L73-k0、H240-Kn120/H240-H1085/L73-k0、H240-Kn120/H240-H1086/L73-k0、H240-Kn120/H240-H1089/L73-k0、H240-Kn179/H240-H1068/L73-k0、H240-Kn180/H240-H1068/L73-k0。依參考實施例8之方法評價該等改變體對FcgR之結合之結果，如表56。又，表中以灰色加網點的H240-Kn120/H240-H1073/L73-k0之 KD，代表此時對FcgRIa之kd小於本測定使用之Biacore4000之解離常數(kd)之可測定範圍5x10-5s-1至1s-1之範圍測定極限5x10-5s-1之值，故為將kd定為5x10-5s-1以下計算得到之KD。
Figure 101123397-A0202-02-0290-142
 又，當將H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之對FcgRIIaR,FcgRIIaH,FcgRIIb之各KD除以各改變體之KD而得之值、H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之對FcgRIIaR,FcgRIIaH,FcgRIIb之KD為1時，相對的KD即relative KD，如表57。
Figure 101123397-A0202-02-0290-143
 從該等結果，顯示本探討製作之6種改變，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，均維持或增強對FcgRIIaR,FcgRIIaH之結合活性，且減弱對FcgRIIb之結合活性。
其次，藉由組合於表57探討之改變，進一步嘗試使對FcgRIIb之結合活性減弱。在此，藉由併用對H240-Kn120導入E294K或E294R、及對H240-H1068導入G236T，進一步抑制對FcgRIIb之結合活性。如表57，該等改變均使對FcgRIIIaF,FcgRIIIaV之結合活性減弱。而嘗試除了該等改變以外，將據報告會增強對FcgRIIIa之結合活性之I332E，及實施例18所示對FcgRIIIa之結合活性增強之改變Y235N導入，以更加抑制對FcgRIIb之結合活性、及增強對FcgRIIIa之結合活性。
依參考實施例1之方法，製作將對於H240-Kn120(序列編號99)導入Y235N與E294K之H240-Kn192(序列編號113)、導入Y235N與E294R之H240-Kn193(序列編號114)，對於H240-H1068(序列編號96)導入G236T與I332E之H240-H1204(序列編號115)。依參考實施例1之方法，以H240-Kn192、H240-Kn193作為其中之一之H鏈、L73-k0作為L鏈、H240-H1089、H240-H1204作為其中另一之H鏈，將該等組合，製備H240-Kn179/H240-H1089/L73-k0、H240-Kn180/H240-H1089/L73-k0、H240-Kn192/H240-H1204/L73-k0、H240-Kn193/H240-H1204/L73-k0。依參考實施例8之方法評價該等改變體對FcgR之結合活性之結果如表58。又，表中以灰色網點表示的H240-Kn120/H240-H1073/L73-k0之KD，代表此時對FcgRIa之kd小於本測定使用之Biacore4000之解離常數(kd)之可測定範圍5x10-5s-1至 1s-1之範圍測定極限5x10-5s-1之值，故為將kd定為5x10-5s-1以下計算得到之KD。
Figure 101123397-A0202-02-0292-144
 又，H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0對FcgRIIaR,FcgRIIaH,FcgRIIb之各KD除以各改變體之KD所得之值、H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0對FcgRIIaR,FcgRIIaH,FcgRIIb之KD定為1時，相對之KD即relative KD，如表59。
Figure 101123397-A0202-02-0292-145
 於H240-Kn120導入E294K或E294R並於H240-H1068導入G236T5 1H240-Kn179/H240-H1089/L73-k0、及 H240-Kn180/H240-H1089/L73-k0，均相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，對FcgRIIaR,FcgRIIaH之結合增強且同時對FcgRIIb之結合減少為0.4倍。又，將較於僅於其中之一鏈帶有該等各別之改變之H240-Kn120/H240-H1089/L73-k0、H240-Kn179/H240-H1068/L73-k0、H240-Kn180/H240-H1068/L73-k0，顯示有1.5倍至2倍之對FcgRIIb之結合減低效果。對該等改變體進一步導入I332E及Y235N之H240-Kn192/H240-H1204/L73-k0、及H240-Kn193/H240-H1204/L73-k0，均相較於改變導入前之H240-Kn179/H240-H1089/L73-k0、及H240-Kn180/H240-H1089/L73-k0，維持對FcgRIIaR,FcgRIIaH、FcgRIIb之結合且對FcgRIIIaF之結合提高為2倍、且對FcgRIIIaV之結合有約8倍提高。
[實施例25]異源二聚化抗體H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0對活性型FcgR之結合活性之增強
藉由於實施例24對於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0導入改變，製作對FcgRIIaR,FcgRIIaH之結合維持或增強且對抑制型FcgRIIb之結合活性減低之改變體。本探討中，嘗試增強對活性型之FcgRFcgRIIaR,FcgRIIaH,FcgRIIIaF,FcgRIIIaV之結合活性之增強。
依參考實施例1之方法，製作於H240-Kn120導入L328W 之H240-Kn138(序列編號116)、導入I332Q之H240-Kn173(序列編號117)、導入K334Y之H240-Kn178(序列編號118)、導入L328A之H240-Kn166(序列編號119)、導入I332M之H240-Kn172(序列編號120)、導入L328W與K334L之H240-Kn149(序列編號121)。又，製作作為其中另一之H鏈使用於H240-H1068導入L328W之H240-H1147(序列編號122)、導入L328A之H240-H1170(序列編號123)、導入I332E之H240-H1174(序列編號124)、導入I332T之H240-H1150(序列編號125)、導入A231H之H240-H1182(序列編號126)、導入I332Q之H240-H1177(序列編號127)。依參考實施例1之方法，使用H240-Kn138(序列編號116)、H240-Kn173(序列編號117)、H240-Kn178(序列編號118)H240-Kn149(序列編號121)、H240-Kn166(序列編號119)、H240-Kn172(序列編號120)作為其中之一之H鏈，並使用H240-H1170(序列編號123)、H240-H1150(序列編號125)、H240-H1174(序列編號124)、H240-H1182(序列編號126)、H240-H1147(序列編號122)、H240-H1177(序列編號127)作為其中另一之H鏈、使用L73-k0(序列編號106)作為L鏈，製備H240-Kn120/H240-H1170/L73-k0、H240-Kn120/H240-H1150/L73-k0、H240-Kn138/H240-H1068/L73-k0、H240-Kn120/H240-H1174/L73-k0、H240-Kn173/H240-H1068/L73-k0、H240-Kn178/H240-H1068/L73-k0、 H240-Kn120/H240-H1182/L73-k0、H240-Kn138/H240-H1147/L73-k0、H240-Kn166/H240-H1170/L73-k0、H240-Kn172/H240-H1177/L73-k0、H240-Kn149/H240-H1068/L73-k0。依參考實施例8之方法評價該等改變體對FcgR之結合，結果如表60。
Figure 101123397-A0202-02-0296-146
 又，H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0對FcgRIa FcgRIIaR, FcgRIIaH,FcgRIIb,FcgRIIa F,FcgRIIIa V之各KD除以各改變體之KD獲得之值、H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之對於FcgRIIaR,FcgRIIaH,FcgRIIb之各KD定為1時之相對的KD即relative KD，如表61。
Figure 101123397-A0202-02-0297-147
在此所示之改變體，係相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，對FcgRIIaR,FcgRIIaH,FcgRIIIaF,FcgRIIIaV中之至少一種FcgR之結合有增強之改變體。
對H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之其中之一之H鏈H240-H1068導入L328A之H240-Kn120/H240-H1170/L73-k0，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，對FcgRIIaR,FcgRIIaH之結合活性有2.3倍提高。
對H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之其中之一之H鏈H240-H1068導入I332T之H240-Kn120/H240-H1150/L73-k0，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，維持對FcgRIIaR之結合活性，對FcgRIIaH之結合活性有1.2倍提高。
對H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之其中之一之H鏈H240-Kn120導入L328W之H240-Kn138/H240-H1068/L73-k0，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，維持對FcgRIIaR之結合活性，對FcgRIIaH之結合活性提高為1.6倍。
對H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之其中之一之H鏈H240-H1068導入I332E之H240-Kn120/H240-H1174/L73-k0，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，對FcgRIIIaF之結合活性有4.3倍提高、對FcgRIIIaV之結合活性有10倍提高。
對H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之其中之一之H鏈H240-Kn120導入I332Q之H240-Kn173/H240-H1068/L73-k0，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，維持對FcgRIIIaV之結合活性，對對FcgRIIIaF之結合活性有1.2倍提高。
對H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之其中之一之H鏈H240-Kn120導入K334Y之H240-Kn178/H240-H1068/L73-k0，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，對FcgRIIIaF之結合活性提高為1.6倍，對FcgRIIIaV之結合活性提高為1.9倍。
對H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之其中之一之H鏈H240-H1068導入A231H之H240-Kn120/H240-H1182/L73-k0，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，對FcgRIIIaV之結合活性提高為1.2倍。
對H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之兩者之H鏈導入L328W之H240-Kn138/H240-H1147/L73-k0，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，對FcgRIIaR之結合活性提高為1.8倍。
H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之兩者之H鏈導入L328A之H240-Kn166/H240-H1170/L73-k0，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，對FcgRIIaH之結合活性提高為1.9倍。
對H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之其中一H鏈 H240-Kn120導入I332M、對其中另一之H鏈H240-H1068導入I332Q之H240-Kn172/H240-H1177/L73-k0，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，維持對FcgRIIIaF之結合活性，對FcgRIIIaV之結合活性提高為1.6倍。
對H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0之其中之一之H鏈H240-Kn120導入L328W,K334L之H240-Kn149/H240-H1068/L73-k0，相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，維持對FcgRIIaR,FcgRIIIaV之結合活性，對FcgRIIaH之結合活性有1.6倍提高。
從以上之結果可認為：該等改變體相較於H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0，具有較高的ADCP活性或ADCC活性。
[實施例26]創製對FcgRIIb之結合活性有增強之異源二聚化抗體
人類的Fc γ R的蛋白質家族，據報告有Fc γ RIa(CD64A)、Fc γ RIIa(CD32A)、Fc γ RIIb(CD32B)、Fc γ RIIIa(CD16A)、Fc γ RIIIb(CD16B)之同功異形體，各自之異型也有人報告(Immunol Lett,82(1-2),57-65,2002)。Fc γ RIa、Fc γ RIIa、Fc γ RIIIa由於具有免疫活化機能，故稱為活性型Fc γ R,Fc γ RIIb具有免疫抑制性機能，稱為抑制型Fc γ R(Nat Rev Immunol,10,328-343,2010)。
Fc γ RIIb係在B細胞表現之唯一之Fc γ R(Eur J Immunol 19,1379-1385,1989)。抗體之Fc區藉由對 Fc γ RIIb交互作用，據報告會抑制B細胞之初次免疫(J Exp Med 129,1183-1201,1969)。又，若B細胞上之Fc γ RIIb與B細胞受體(B cell receptor：BCR)經由血中之免疫複合體而交聯，據報告B細胞之活化會受抑制，且B細胞之抗體產生受抑制(Immunol Lett 88,157-161,2003)。該經由BCR與Fc γ RIIb之免疫抑制性訊號之傳遞，需要Fc γ RIIb之細胞內分域包含之immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif(ITIM)(Science,256,1808-1812,1992、Nature,368,70-73,1994)。若訊號傳來，ITIM被磷酸化，SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase(SHIP)會增援，抑制其他活性型Fc γ R之訊號串列的傳遞，並抑制發炎性免疫反應(Science,290,84-89,2000)。又，據報告僅是將FcgRIIb組合化，不會使BCR非依存的產生IgM的B細胞計畫性死亡(apoptosis)，而是由於B細胞之增殖與BCR之交聯導致暫時抑制鈣流入(J Imunol,181,5350-5359,2008)
又，Fc γ RIIb也會在樹狀細胞、巨噬細胞、經活化之嗜中性球、肥胖細胞、嗜鹼性球表現。該等細胞中，Fc γ RIIb會抑制phagocytosis或發炎性細胞激素釋出等活性型Fc γ R之機能，並抑制發炎性免疫反應(Nat Rev Immunol,10,328-343,2010)。
針對Fc γ RIIb之免疫抑制性機能之重要性，至今已利用使用Fc γ RIIb基因剔除小鼠之研究而明白。Fc γ RIIb基因剔除小鼠中，液性免疫未受適當控制(J Immunol,163, 618-622,1999)，據報告對於膠原蛋白誘導關節炎(CIA)之感受性增加(J Exp Med,189,187-194,1999)、或呈狼瘡(lupus)狀症狀、或呈Goodpasture(Goodpasture)症候群狀的症狀(J Exp Med,191,899-906,2000)。
又，據報告Fc γ RIIb之調節不全與人類之自體免疫疾病有關連。例如：據報告Fc γ RIIb之啟動子區或細胞膜貫通區之基因多型、與全身性紅斑性狼瘡(SLE)之發病頻度之關連(Hum,Genet,117,220-227,2005、J Biol Chem,282,1738-1746,2007、Arthritis Rheum,54,3908-3917,2006、Nat Med,11,1056-1058,2005、J Immunol,176,5321-5328,2006)、或SLE患者之B細胞表面的Fc γ RIIb之表現下降(J Exp Med,203,2157-2164,2006、J Immunol.178,3272-3280,2007)。
如上所述，從小鼠模型及臨床上之觀察見解，據認為Fc γ RIIb以與B細胞之相關為中心，具有控制自體免疫疾病、發炎性疾病之作用，為用於控制自體免疫疾病、發炎性疾病之有前景的標的分子。
市售的抗體醫藥主要使用之IgG1，已知不僅會結合於Fc γ RIIb，也會對活性型Fc γ R強力結合(Blood,113,3716-3725,2009)。藉由利用對Fc γ RIIb之結合增強，或相較於活性型Fc γ R，對Fc γ RIIb之結合活性之選擇性提高之Fc區，據認為可開發出比起IgG1更具有免疫抑制性性質之抗體醫藥。例如：藉由利用對BCR結合之可變區、及對Fc γ RIIb之結合有增強之Fc之抗體，啟示能抑制B細 胞之活化(Mol Immunol,45,3926-3933,2008)。藉由將B細胞上之Fc γ RIIb與B-cell receptor所結合之IgE交聯，會使B細胞分化為漿細胞，其結果IgE產生受抑制，據認為移植了人類PBMC之小鼠中的人類IgG或IgM濃度會維持，但人類IgE濃度減少(Acad News,doi：10.1016,jaci.2011.11.029)。不僅是IgE，於將形成B-cell receptor複合體之CD79b與FcgRIIB以抗體交聯之情形，據報告在體外(in vitro)的B細胞增殖受抑制，膠原蛋白關節炎模型中的症狀減輕(Arthritis Rheum,62,1933-1943,2010)。
B細胞以外，使用將與IgE之受體Fc ε RI結合之IgE之Fc部分及對FcgRIIb之結合有增強之IgG之Fc部分予以融合之分子，將肥胖細胞上之Fc ε RI與FcgRIIb予以交聯，據報告會引起FcgRIIb之磷酸化，並抑制Fc ε RI依存的鈣流入，此啟示藉由增強對FcgRIIb之結合，能抑制經由FcgRIIb之刺激之脫顆粒(Immunol let,doi：10.1016/j.imlet.2012.01.008)。由該等啟示：具有使對Fc γ RIIb之結合活性提高之Fc之抗體，作為自體免疫疾病等發炎性疾病之治療藥有前景。
又，對FcgRIIb之結合有增強之變異體，啟示不僅作為自體免疫疾病等發炎性疾病之治療藥，作為癌症治療藥亦有前景。至今為止，已明白FcgRIIb在對抗TNF受體家族之致效劑(agonist)抗體之致效劑活性也發揮重要作用。具體而言，對TNF受體家族包含之CD40、DR4、DR5、 CD30、CD137之抗體之致效劑活性，與FcgRIIb之交互作用啟示係為必要(Science,333,1030-1034,2011、Cancer Cell 19,101-1113,2011、J Clin Invest 2012；doi：10.1172/JCI61226、J Immunol 171,562-,2003、Blood,108,705-,2006、J Immunol 166,4891,2001)。非專利文獻(Science,333,1030-1034,2011)中，顯示藉由使用對FcgRIIb之結合有增強之抗體，抗CD40抗體之抗腫瘤效果會增強。由此可期待：對FcgRIIb之結合有增強之抗體，有增強包含對抗TNF受體家族之抗體之致效劑抗體之致效劑作用之效果。
至今已有具使對Fc γ RIIb之結合活性提高Fc之抗體的報告(Mol Immunol,45,3926-3933,2008)。該文獻中，藉由對於抗體之Fc區施以S267E/L328F、G236D/S267E、S239D/S267E等改變，提高了對Fc γ RIIb之結合活性。該文獻中，導入S267E/L328F之變異之抗體最強力結合於Fc γ RIIb。藉由更增強其對Fc γ RIIb之結合，可期待上述經由Fc γ RIIb之作用更增強。
又，導入S267E/L328F之變異之抗體對Fc γ RIa及Fc γ RIIa之H型之結合，與天然型IgG1維持為同程度。但是依其他報告，該改變，將對Fc γ RIIa之R型之結合與對Fc γ RIIb之結合以同程度地增強了數百倍，相較於Fc γ RIIa R型之情形，對Fc γ RIIb之結合之選擇性並未提高(Eur J Immunol 23,1098-1104,1993)。
即使對Fc γ RIIb之結合相較於IgG1有增強，關於未 表現Fc γ RIIb而表現Fc γ RIIa之如血小板之細胞(Nat Rev Immunol,10,328-343,2010)，據認為不會影響對Fc γ RIIb之結合之增強，而僅會影響對Fc γ RIIa之結合增強之效果。例如：已知投予對抗VEGF之抗體bevacizumab之患者群，血栓栓塞症之風險上昇(J Natl Cancer Inst,99,1232-1239,2007)。又，對於CD40配體之抗體之臨床開發試驗，也同樣觀察到血栓栓塞症，臨床試驗中止(Arthritis Rheum,48,719-727,2003)。該等任一抗體之情形，均由使用動物模型等之後之研究，啟示投予之抗體經由對血小板上之FcgRIIa之結合而使血小板凝集並形成血栓(J Thromb Haemost,7,171-181,2008,J Immunol,185,1577-1583,2010)。為一種自體免疫疾病之全身性紅斑性郎瘡，有以下報告：由於Fc γ RIIa依存性機轉使血小板活化，且血小板之活化與重症程度相關(Sci Transl Med,vol 2,issue 47,47-63,2010)。對於如此之血栓栓塞症發病風險原本就高的患者而言，投予使對FcgRIIa之結合增強之抗體，假設會增強對FcgRIIb之結合，會更提高血栓栓塞症之發病風險，極為危險。
又，對FcgRIIa之結合增強之抗體，據報告經由巨噬體之抗體依存的吞噬活性(ADCP)會增強(Mol Cancer Ther 7,2517-2527,2008)。抗體之抗原若被巨噬體吞噬，在此同時抗體自身也會被吞噬，但此情形其抗體來源的胜肽片段也會被抗原提示，據認為抗原性提高，產生對抗抗體之抗體(抗抗體)之風險升高。亦即，若對FcgRIIa之結 合增強，會提高產生對抗抗體之抗體之風險，作為醫藥品之價值顯著減損。
亦即，若對FcgRIIa之結合增強，經由血小板凝集之血栓形成之風險上升，且抗原性提高，產生抗抗體之風險提高，從此等觀點，作為醫藥品之價值顯著減損。
若從如此的觀點針對前面對FcgRIIb之結合有增強之Fc觀之，對FcgRIIa R型之結合，相較於天然型IgG1有顯著增強，所以作為對於保有FcgRIIa R型之患者之醫藥品的價值顯著減損。Fc γ RIIa之H型與R型，於高加索民族(Caucasian)或非洲美國人(African-American)以大致同程度的頻度觀察到(J Clin Invest,97,1348-1354,1996、Arthritis Rheum,41,1181-1189,1998)。由此，將該Fc作為自體免疫疾病之治療使用之情形，能享受作為醫藥品之效果且同時能安全地利用之患者之數有限。
又，於FcgRIIb有缺損之樹狀細胞、或由於抗FcgRIIb抗體使FcgRIIb與抗體之Fc部分的交互作用受抑制之樹狀細胞中，據報告樹狀細胞之成熟會自發性地發生(J Clin Invest 115,2914-2923,2005,Proc Natl Acad Sci USA,102,2910-2915,2005)。從該報告啟示：FcgRIIb於未發炎等的穩定狀態中，會積極的抑制樹狀細胞之成熟。樹狀細胞表面，除了FcgRIIb也會有FcgRIIa表現，所以即對抑制型之FcgRIIb之結合有增強，若對活性型之FcgRIIa等之結合也增強，結果據認為會促進樹狀細胞成熟。亦即，不僅是對FcgRIIb之結合活性，改善對FcgRIIb之結合活 性相對於對FcgRIIa之結合活性之比例，據認為在對於抗體賦予免疫抑制性作用方面為重要。
由此，於考慮創製利用經由FcgRIIb之結合之免疫抑制性作用之醫藥品之情形，需要不僅增強對FcgRIIb之結合活性，且對FcgRIIa H型、R型任一基因多型之結合也維持與天然型IgG1為同程度、或減弱至較其為弱之Fc。
相對於此，至今為止據報告：藉由對Fc區導入胺基酸改變，使對Fc γ RIIb之結合之選擇性上升之例(Mol Immunol,40,585-593,2003)。但是該文獻中報告之對Fc γ RIIb之選擇性有所改善之任一變異體，均為相較於天然型IgG1，對Fc γ RIIb之結合有減少。所以，據認為該等變異體實際上難以比IgG1更能引起經由Fc γ RIIb之免疫抑制性反應。又，於前述致效劑抗體亦為FcgRIIb發揮重要作用，所以藉由使其結合活性增強，也期待致效劑活性之增強。但是對FcgRIIa之結合若也以同樣方式增強，會發揮不是目的之ADCC活性或ADCP活性等，有出現副作用之虞。從如此的觀點，宜能將對FcgRIIb選擇的結合活性增強較佳。
從該等結果，當創製目的為利用Fc γ RIIb之自體免疫疾病治療或癌症治療之抗體醫藥時，相較於天然型IgG，使對Fc γ RIIa之任一基因多型之結合活性維持或減少且對Fc γ RIIb之結合活性增強係為重要。但是，Fc γ RIIb與為活性型Fc γ R之一的Fc γ RIIa，在細胞外區之序列有93%一致，結構極類似，而且Fc γ RIIa中，作為基因多型 之131號的胺基酸存在有HisH type(H型)與ArgR type(R型)，各自與抗體之交互作用相異(J Exp Med,172,19-25,1990)。所以，為了創制對於Fc γ RIIb為選擇性結合之Fc區，據認為區別該等類似之序列，且將不使對Fc γ RIIa之各基因多型之結合活性增加、或減少，且另一方面使對Fc γ RIIb之結合活性增加之所謂的對Fc γ RIIb之結合活性選擇性提高之性質對於抗體之Fc區賦予，是最為困難的課題，至今為止未獲得對FcgRIIb有足夠選擇性之變異體。US2009/0136485，也有報告對Fc γ RIIb之結合活性增強之變異體，但其程度弱，需要開發帶有如上述性質之變異體。
本探討中，探討使用異源二聚化抗體而增強FcgRIIb選擇性結合活性之改變體之製作。抗體H鏈可變區，使用WO2009/125825揭示之對抗人類介白素6受體之抗體之可變區IL6R之可變區IL6R(序列編號：128)。又，製作人類IgG1之C末端之Gly及Lys已除去之具有G1d之IL6R-G1d(序列編號：129)。其次，製作對於IL6R-G1d導入K439E之IL6R-B3(序列編號：130)。再製作對於IL6R-B3導入E233D、G237D、P238D、H268D、P271G、A330R之IL6R-BP208(序列編號：131)。又，對於IL6R-B3導入S267E、L328F，製作具有現有之FcgRIIb結合活性增強之Fc之IL6R-BP253(序列編號：132)。抗體L鏈共同使用tocilizumab之L鏈IL6R-L(序列編號：133)，與各自的H鏈一起依參考實施例1之方法製作同源二聚物 IL6R-B3/IL6R-L、IL6R-BP208/IL6R-L、IL6R-BP253/IL6R-L。依參考實施例8記載之方法，評價該等改變體對FcgR Ia,FcgR IIaR,FcgR IIaH,FcgR IIb,FcgR IIIaV之結合活性，結果如表62。又，表62中塗灰之小格，代表FcgR對IgG之結合微弱，判斷未能以動力理論解析正確解析。以此方式，當各改變抗體與FcgR之交互作用微弱，且判斷以上述動力理論解析無法正確解析之情形，針對其交互作用，使用Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE記載之以下之1：1結合模型式，計算KD。
以1：1 binding model交互作用之分子於Biacore上之行為，可以下列式1表達。
[式1]Req=C˙Rmax/(KD+C)+RI
Req：a plot of steady state binding levels against analyte concentration
C：concentration
RI：bulk refractive index contribution in the sample
Rmax：analyte binding capacity of the surface
若將該式變形，KD可以下列式2表達。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
藉由對該式代入Rmax、RI、C之值，可求算KD。針對RI、C，可從測定結果之感測圖、測定條件求值。Rmax之計 算依以下方法。針對其測定當次同時評價之成為比較對象之交互作用夠強之抗體，將於上述1：1 Langmuir binding model進行global fitting時獲得之Rmax之值除以成為比較對象之抗體在感測晶片的捕捉量，並乘上欲評價之改變抗體之捕捉量獲得之值，當作Rmax。
Figure 101123397-A0202-02-0310-633
 又，將IL6R-B3/IL6R-L對FcgRIa FcgRIIaR,FcgRIIaH,FcgRIIb之各KD除以各改變體之對應KD而得之值、將IL6R-B3/IL6R-L對FcgRIIaR,FcgRIIaH,FcgRIIb之各KD定為1時之相對的KD即relative KD，如表63。
Figure 101123397-A0202-02-0310-149
 如表63，現有之FcgRIIb結合活性增強抗體IL6R-BP253/IL6R-L，相較於改變導入前之人類IgG1型之抗體(IL6R-B3/IL6R-L)，對FcgRIIb之結合活性有約350倍增強，同時對FcgRIIaR之結合活性也有約500倍增強。另一方面，IL6R-BP208/IL6R-L對FcgRIIb之結合活性約 100倍，雖不及現有之FcgRIIb結合活性增強抗體，但對FcgRIIaR之結合活性相較於IgG1型為1.3倍，為保持同程度之結合活性，對FcgRIIb之選擇性優異之抗體。
其次，為了達成對FcgR2b之活性增強及選擇性之提高，取得IL6R-BP208/IL6R-L之FcFc(BP208)與FcgRIIb細胞外區之複合體之結晶結構資訊，並考慮必需更詳細探討導入之胺基酸變異，依以下之實驗方法，實施Fc(BP208)與FcgRIIb細胞外區之複合體之X射線結晶結構解析。
[Fc(BP208)之表現精製]
Fc(BP208)之製備依以下方式進行。首先，將IL6R-BP208之EU編號220號的Cys取代為Ser，將EU編號236號的Glu至其C末端依PCR選殖而得之基因序列Fc(BP208)，依參考例1記載之方法，製作、表現、精製表現載體。又，EU編號220號的Cys於通常之IgG1，係與L鏈之Cys形成雙硫鍵，但僅製備Fc之情形，為了不使L鏈共表現，為了避免形成不需要的雙硫鍵，取代為Ser。
[FcgRIIb細胞外區之表現精製]
依參考例8之方法製備。
[Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之精製]
對於結晶化用獲得之FcgRIIb細胞外區樣本1.5mg，添加作為與glutathione S-transferase之融合蛋白之從大腸菌表現精製之Endo Fl(Protein Science 1996,5,2617-2622)0.15mg，於0.1M Bis-Tris pH6.5之緩衝液條件，於室溫靜置3日，藉此保留N型糖鏈直接鍵結於Asn 之N-acetylglucosamine並切斷。其次，將施以該糖鏈切斷處理之FcgRIIb細胞外區樣本以5000MWCO之超過濾膜濃縮，並利用經以20mM HEPES pH7.5,0.1M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。再對於獲得之糖鏈切斷FcgRIIb細胞外區級分，添加Fc(BP208)使莫耳比為FcgRIIb細胞外區有若干過量，以10000MWCO之超過濾膜濃縮後，利用經以25mM HEPES pH7.5,0.1M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製，獲得Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之樣本。
[Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之結晶化]
將Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之樣本利用10000MWCO之超過濾膜濃縮成約10mg/ml，以懸滴(hanging-drop)蒸氣擴散法，併用Seeding法進行結晶化。結晶化，係使用VDXm板(Hampton Research)，製作對於0.1M Bis-Tris pH6.5、19% PEG3350,0.2M Potassium Phosphate dibasic之貯池溶液，貯池溶液：結晶化樣本=0.85μl：0.85μl混合並結晶化之滴劑(drop)，再從以同樣條件獲得之同複合體之結晶使用Seed Bead(Hampton Research)，添加從破碎的種結晶溶液製作之稀釋溶液0.15ul，密閉於裝有貯池之井，並於20℃靜置，成功獲得板狀之結晶。
[從Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體結晶之X射線繞射數據之測定]
將獲得之Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之一個單 結晶浸於0.1M Bis-Tris pH6.5,24% PEG3350,0.2M Potassium Phosphate dibasic,Ethlene glycol 20%(v/v)之溶液後，以附有微小的尼龍環圈的針撈取溶液，使在液態氮中冷凍，於Spring-8之BL32XU進行X射線繞射數據之測定。又，測定中隨時置於-178℃之氮氣流中以維持冷凍狀態，以附有束線之CCD偵測器MX-225HE(RAYONIX)，邊將結晶以級距0.6°旋轉邊收集總共300張的X射線繞射影像。從獲得之繞射影像決定晶格常數、賦予繞射斑點的指數，以及處理繞射數據，係使用Xia2程式(J.Appl.Cryst.2010,43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.2010,D66,125-132)及Scala(Acta Cryst.2006,D62,72-82)，最後獲得解析力達2.81埃的繞射強度數據。本結晶屬於空間群C2221，且晶格常數a=156.69埃、b=260.17埃、c=56.85埃、α=90°、β=90°、γ=90°。
[Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之X射線結晶結構解析]
結構決定係使用利用Phaser程式之(J.Appl.Cryst.2007,40,658-674)分子取代法實施。從獲得之結晶晶格之大小以及Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之分子量，預想非對稱單位中之複合體之數目為一個。從Fc(WT)/FcgRIIIa細胞外區複合體之結晶結構PDB code：3SGJ之結構座標，取出A鏈239-340號及B鏈239-340號之胺基酸殘基部分作為另一座標，將該等各當作Fc CH2分域之探索用模型。同樣從PDB code：3SGJ之結構座標，取出A鏈 341-444號與B鏈341-443號之胺基酸殘基部分作為一座標，當作Fc CH3分域之探索用模型。最後，從FcgRIIb細胞外區之結晶結構PDB code：2FCB之結構座標取出A鏈6-178號之胺基酸殘基部分，作為Fc(BP208)之探索用模型。從旋轉函數及平移函數決定Fc CH3分域、FcgRIIb細胞外區、Fc CH2分域之各探索用模型之結晶晶格內的方向與位置，結果未能順利針對CH2分域之一決定其位置。而從基於其餘的3個部分計算到的位相所計算之電子密度輿圖，邊參考Fc(WT)/FcgRIIIa細胞外區複合體之結晶結構結構邊決定最後之CH2分域A之位置，獲得Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體結晶結構之起始模型。對於獲得之起始模型，進行移動2個Fc之CH2分域、2個Fc之CH3分域及FcgRIIb細胞外區之剛體精密化，結果於此時點，相對於25-3.0埃之繞射強度數據，結晶學的可靠度因子R值成為42.6%、Free R值成為43.7%。再使用REFMAC5程式，邊觀測依據使用Acta Cryst.2011,D67,355-367)之結構精密化、及從實驗決定之結構因子Fo與模型計算得之結構因子Fc及從模型計算之位相所計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc作為係數之電子密度輿圖，邊以Coot程式(Acta Cryst.2010,D66,486-501)實施模型修正，反複此等操作，進行模型之精密化。最後基於以2Fo-Fc、Fo-Fc為係數之電子密度輿圖將水分子納入模型並進行精密化，最終使用解析力25-2.81埃之27259個繞射強度數據，對於含4794個非氫原子的模型，結晶學的可靠度因子R值成為 24.4%、Free R值成為27.9%。
結構解析之結果，以解析力2.81埃決定Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之立體結構，該解析之結果取得之結構如圖49。係於2個Fc CH2分域之間夾持FcgRIIb細胞外區之方式結合，與至今為止所解析之天然型IgG之FcFc(WT)與FcgRIIIa(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011,108,12669-126674)、FcgRIIIb(Nature,2000,400,267-273；J.Biol.Chem.2011,276,16469-16477)、FcgRIIa與各細胞外區之複合體之立體結構類似。
但若觀察細部，Fc(BP208)由於G237D及P238D之變異導入之影響，相較於與FcgRIIa結合之Fc(WT)，於CH2分域A接續於絞鏈區之233-239之環圈結構有改變(圖50)。其結果，據認為Fc(BP208)之G237主鏈之醯胺與FcgRIIb之Tyr160側鏈之間會形成強固的氫鍵。該Tyr160於FcgRIIa為Phe，不可能形成氫鍵，故該氫鍵據認為對FcgRIIb之結合活性之提高及對FcgRIIa之結合之減低之選擇性之獲得有重要貢獻。
基於本結構解析結果，進一步調查目的為更提更活性之改變之可能性，結果發現作為改變導入部位之候選者之一的S239。如圖51，FcgRIIb之Lys117在結構上觀之最自然形態伸展之方向，有該CH2分域B之Ser239。但，本次解析未觀察FcgRIIb之Lys117之電子密度，所以未採固定結構，現狀為據認為該Lys117對於涉及與Fc(BP208)之交互作用有限，但當該CH2分域B之S239改變為具負電荷 之D或E之情形，可期待帶正電荷之FcgRIIb與Lys117之間有靜電交互作用，其結果，能期待對FcgRII之結合活性提高。
另一方面，若觀察於CH2分域A之S239之結構，本胺基酸側鏈與G236之主鏈形成氫鍵，據認為會使接續於鉸鏈區，從與FcgRIIb Tyr160側鏈形成氫鍵之含D237之233號至239號的環圈結構安定化(圖52)。結合環圈結構時構形安定化，會抑制伴隨結合之熵下降，結果造成結合自由能量之增加，亦即結合活性提高。另一方面，該CH2分域A之S239改變為D或E之情形，與G236主鏈之氫鍵消失，造成環圈結構之不安定化。而且，也可能導致與緊鄰存在之D265靜電排斥，據認為會使環圈結構更不安定化。該不安定化的分量的能量，會作用於減少與FcgRIIb之交互作用能量，結果造成結合活性之下降。亦即，將S239D或S239E導入於兩H鏈之同源二聚化抗體中，由於CH2分域B中之FcgRIIb與Lys117之靜電交互作用而得之增強結合活性之效果，會與由於CH2分域A中之環圈結構之不安定化導致之結合活性減弱之效果抵消，而可能造成結合活性不增強，但若為將S239D或S239E僅對其中之一之H鏈導入之異源二聚化抗體，由於利用CH2分域A之S239可維持環圈結構之安定化，所以據認為能以導入於CH2分域B之S239D或S239E而新形成之FcgRIIb對Lys117之靜電交互作用之分量，增強結合活性。
為了驗證該假說，其次以IL6R-BP208/IL6R-L作為模 板，僅對其中之一之H鏈之Fc區導入S239D或S239E之改變，藉此探討製作對FcgRIIb之結合活性更增強之抗體。製作作為抗體H鏈之對IL6R-BP208導入S239D之IL6R-BP256(序列編號：134)及導入S239E之IL6R-BP257(序列編號：135)。又，製作作為其中另一之H鏈之於IL6R-G1d導入D356K及H435R之變異之IL6R-A5(序列編號：136)並對其進一步導入E233D、G237D、P238D、H268D、P271G、A330R之IL6R-AP002(序列編號：137)。抗體L鏈共同使用tocilizumab之L鏈IL6R-L(序列編號：133)，與各自之H鏈一起依參考實施例1之方法製作同源二聚化抗體IL6R-B3/IL6R-L、IL6R-BP208/IL6R-L、IL6R-BP253/IL6R-L、IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-BP257/IL6R-L及異源二聚化抗體IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L。依參考實施例8記載之方法，評價該等改變體對FcgR Ia,FcgR IIaR,FcgR IIaH,FcgR IIb之結合活性，結果如表64。
Figure 101123397-A0202-02-0317-150
又，表64中塗灰之小格，代表FcgR對IgG之結合微弱，判斷未能以動力理論解析正確解析。以此方式，當各改變抗體與FcgR之交互作用微弱，且判斷以上述動力理論解析無法正確解析之情形，針對其交互作用，使用Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE記載之以下之1：1結合模型式，計算KD。
以1：1 binding model交互作用之分子於Biacore上之行為，可以下列式1表達。
[式1]Req=C˙Rmax/(KD+C)+RI
Req：a plot of steady state binding levels against analyte concentration
C：concentration
RI：bulk refractive index contribution in the sample
Rmax：analyte binding capacity of the surface
若將該式變形，KD可以下列式2表達。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
藉由對該式代入Rmax、RI、C之值，可求算KD。針對RI、C，可從測定結果之感測圖、測定條件求值。Rmax之計算依以下方法。針對其測定當次同時評價之成為比較對象之交互作用夠強之抗體，將於上述1：1 Langmuir binding model進行global fitting時獲得之Rmax之值除以成為比較對象之抗體在感測晶片的捕捉量，並乘上欲評價之改變 抗體之捕捉量獲得之值，當作Rmax。又，將IL6R-B3/IL6R-L對FcgRIa FcgRIIaR,FcgRIIaH,FcgRIIb之各KD除以各改變體之對應KD而得之值、將IL6R-B3/IL6R-L對FcgRIIaR,FcgRIIaH,FcgRIIb之各KD定為1時之相對的KD、及各改變體對FcgRIIaR之KD除以對FcgRIIb之KD而得之值，表示於表65。
Figure 101123397-A0202-02-0319-151
 如表65，對於IL6R-BP208/IL6R-L之兩H鏈導入S239D或S239E之IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-BP257/IL6R-L，相較於導入前之改變體IL6R-BP208/IL6R-L，對FcgRIIb之結合活性、對FcgRIIaR之結合活性都減弱。另一方面，對IL6R-BP208/IL6R-L之其中一H鏈導入S239D、或S239E之IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L，對FcgRIIb之結合各提高為752倍、657倍，顯示比現有技術有較高之對FcgRIIb之結合活性。又，對FcgRIIaR之結合活性，也從IL6R-BP208/IL6R-L之1.3倍各增為7.7倍、8.3倍。在此，表中之KD(IIaR)/KD(IIb)，係將各改變體對FcgRIIaR之KD除以對FcgRIIb之KD而得之值，該值愈大，代表對 FcgRIIb之選擇性愈高。現有之FcgRIIb結合活性增強抗體IL6R-BP253/IL6R-L之該值為0.3，相較於IgG1型，選擇性未改善，相對於此，IL6R-BP208/IL6R-L為26.3之高，具FcgRIIb選擇性。本次，對於IL6R-BP208/IL6R-L之其中一H鏈導入S239D、或S239E之IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L，KD(IIaR)/KD(IIb)之值各為34.3及27.7，比起IL6R-BP208/IL6R-L有改善。
在此，於實施例4進行之以IgG1型(GpH7-B3/GpL16-k0)作為模板而網羅的改變體之評價結果中，S239D,S239E之效果如表66。表中之Ho/Con_2aR及Ho/Con_2b，代表同源二聚化抗體之對照定為100時，對FcgRIIaR及對FcgRIIb之結合活性之強度之程度。又，He/Con_2aR及He/Con_2b，代表異源二聚化抗體之對照定為100時，對FcgRIIaR及對FcgRIIb之結合之強度之程度。
Figure 101123397-A0202-02-0320-152
 從表66可知，本次導入之S239D及S239E，係對於天然型IgG1導入時，不管是對兩鏈導入還是對其中之一鏈導入，對FcgRIIaR及對FcgRIIb之結合增強之改變。但是若該等改變導入於IL6R-BP208/IL6R-L之兩H鏈，對FcgRIIaR，對FcgRIIb之結合活性減弱，僅有於導入其中之一H鏈之 情形，對FcgRIIaR，對FcgRIIb之結合活性為增強。此結果與以IgG1型作為模板時獲得之改變之效果相異，可知該等改變係於導入IL6R-BP208/IL6R-L才具上述效果。
[實施例27]目標為提高同源二聚物與異源二聚物之分離精製能力之不變區胺基酸序列之設計 [殘基取代部位之選擇]
於異源二聚化抗體之製造使二種H鏈(各定為A鏈及B鏈)共同表現之情形，會生成各H鏈A鏈二聚體化之同源二聚化抗體及B鏈二聚化之同源二聚化抗體、及相異二條H鏈A鏈、B鏈二聚化之異源二聚化抗體。作為有效率地將目的之異源二聚化抗體分離精製之方法，已知有針對各可變區將胺基酸殘基取代，並以抗體之等電點及離子交換管柱控制保持能力及分離能力之方法(WO2007/114325)。但是由於可變區，尤其CDR區在每個抗體的序列相異，故據認為該技術之泛用性有極限。而就用於精製異源二聚化抗體之更泛用的抗體殘基取代方法而言，有人探討僅將抗體之不變區之殘基取代，而控制等電點及於離子交換管柱之保持能力及分離能力之方法。
一般以離子交換管柱分離，據認為依存於分子表面之電荷，許多情形，探討考慮目的分子之等電點之分離條件。是以，本實施例，亦以使欲分離之同源二聚化抗體與異源二聚化抗體之等電點產生差異之方式，將構成抗體不變區之胺基酸殘基取代，藉此期待改善離子交換管柱之分離。
又，離子交換層析之分離不僅是純粹的離子交換模 式，據啟示也涉及疏水性交互作用(Peng Liu et al.,J Chromatogr A.2009 Oct 30；1216(44)：7497-504)。所以，利用上述方法之分離精製，除了可利用離子交換層析，也可利用疏水層析。
使等電點變化之殘基取代，有將中性殘基取代為鹼性殘基或酸性殘基、及將鹼性殘基或酸性殘基取代為中性殘基之方法。更有效果的對應，有將帶正電荷之殘基取代為帶負電荷之殘基、及將帶負電荷之殘基取代為帶正電荷之殘基之方法。
依上述方法，抗體序列的全部部分成為能使等電點變化之殘基取代部位之候選者。但是對於非天然序列之隨機取代有提高免疫原性之風險之危險性，並非適於考慮作為醫藥品之用途之情形的方法。
為了使免疫原性風險儘可能不增大，據考慮有以儘可能減少涉及免疫原性之T-cell epitope之數目的方式進行殘基取代之方法。其中之一之方法，可利用IgG次類序列。人類IgG之次類存在IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。依WO2007/114325揭示之方法，將抗體序列之一部分取代為相異次類之序列，可藉由在抑制T-cell epitope之增加之狀態，使等電點變化。
就其他方法而言，可利用Epibase等預測T-cell epitope之電腦模擬(in silico)工具。
Epibase Light(Lonza)，係使用FASTER演算法(Expert Opin Biol Ther.2007 Mar；7(3)：405-18.)，計 算9-mer胜肽與major DRB1對偶基因(allele)之結合能力之電腦模擬工具。本工具，可鑑別對MHC classII為強結合及中程度結合之T-cell epitope。
計算會反映出DRB1異型之存在比，其可使用以下所示之Caucasian中之存在比。
DRB1*1501(24.5%)、DRB1*0301(23.7%)、DRB1*0701(23.3%)、DRB1*0101(15.0%)、DRB1*1101(11.6%)、DRB1*1302(8.2%)、DRB1*1401/1454(4.9%)、DRB1*0901(2.3%)、DRB1*1502(0.5%)、DRB1*1202(0.1%)
依FASTER演算法求取各改變抗體序列中包含之強結合與中程度之結合之全部抗原決定部位後，將排除人類生殖細胞係序列及可變區與不變區之交界序列以外者，提示作為critical epitope。使用本工具之隨機化(randomized)機能，針對任意序列包含之殘基逐一各取代為任意胺基酸殘基之情形，計算T-cell epitope增加數。藉此，可選擇帶來等電點變化但不增加T-cell epitope之殘基取代部位。
針對H240-AK072(序列編號：104)、及H240-BH076(序列編號：105)，以Epibase實施解析。表67代表針對H240-AK072、表68代表針對H240-BH076，可能利用任意殘基之取代而變化之T-cell epitope之數目。依該結果，可選擇T-cell epitope不增加，且會使等電點變化之殘基取代。
Figure 101123397-A0202-02-0324-153
Figure 101123397-A0202-02-0325-154
Figure 101123397-A0202-02-0326-155
Figure 101123397-A0202-02-0327-156
Figure 101123397-A0202-02-0328-157
【表67-6】
Figure 101123397-A0202-02-0329-158
Figure 101123397-A0202-02-0330-159
Figure 101123397-A0202-02-0331-160
Figure 101123397-A0202-02-0332-161
Figure 101123397-A0202-02-0333-162
Figure 101123397-A0202-02-0334-163
Figure 101123397-A0202-02-0335-164
藉由以上之方法及其組合，就改變等電點之殘基取代部位，設計了以下所示之H240-AK072、及H240-BH076改變體(表69、70)。
Figure 101123397-A0202-02-0335-165
Figure 101123397-A0202-02-0336-166
[H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改變抗體表現用載體之構建]
首先，為了製作H240-AK072/H240-BH076/L73-k0之改變抗體之cDNA，以H240-AK072或H240-BH076作為模板，分別設計以設計成所選擇之各胺基酸殘基變異之合成寡DNA。其次使用各合成寡DNA，依參考實施例1之方法，製作含有目的基因之動物細胞表現載體。
[H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改變抗體之表現、精製]
為了評價H240-AK072/H240-BH076/L73-k0之改變抗體，藉由使對於H240-AK072或H240-BH076導入改變之各H鏈(對於H240-AK072導入改變之H鏈稱為A鏈、對於H240-BH076導入改變之H鏈稱為B鏈)及L鏈(L73-k0、序列編號：106)以任意組合使共表現，依參考實施例1之方法，獲得A鏈及B鏈成為任意組合之改變抗體。代表的A鏈及B鏈之序列編號，如表71所示。
Figure 101123397-A0202-02-0337-167
[實施例28]H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改變體之物理化學的評價 [利用陽離子交換層析測定滯留時間差]
針對各抗體依下列條件實施測定。
移動相A：20 mM MES-NaOH,pH6.0
移動相B：20 mM MES-NaOH,200 mM NaCl,pH6.0
管柱：Bio Pro SP-F(YMC)
流速：0.5 mL/min
梯度：10%B(0-5 min),10-60%B(5-55 min)
偵測：Abs.280 nm
圖53顯示代表的層析圖。出現於溶出時間快的位置的峰部為B鏈-B鏈之同源二聚化抗體，主要峰部係來自於A鏈-B鏈之異源二聚化抗體。A鏈導入使與ProteinA之結合減弱之殘基取代(H435R)，在此使用之抗體由於在以參考實施例1之方法製備的過程中以利用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare)之精製過程已被除去，所以A鏈-A鏈同源二聚化抗體於本條件幾乎不會檢測到。作為評價異源二聚化抗體與同源二聚化抗體之分離的指標，計算滯留時間差△RT(分)=(異源抗體峰部之滯留時間)-(B鏈同源抗體峰部之滯留時間)。表72顯示各種改變體之評價結果。由以上，顯示由於導入設計之殘基取代、及其組合，擴大了異源抗體與同源抗體之滯留時間差。
[利用凝膠過濾層析法評價組合體含量]
利用使用ACQUITY UPLC H-Class system(Waters)之SEC分析，評價精製抗體中之組合體含量。移動相使用含300 mM之氯化鈉之50 mM磷酸緩衝液，pH7.0(伊勢久)，分析管柱使用BEH200 SEC(waters)，於215 nm之波長實施測定。使用Empower2(Waters)實施數據解析，將溶出於比起單體更為高分子量側之成分一起作為組合體，計算其含量。表72顯示各種改變體之評價結果。由此，可認為：各種改變體相較於改變前之H240-AK072/H240-BH076/L73-k0，組合體量未大幅增加，關於組合化之安定性受到確保。
[利用示差掃描型螢光定量法評價改變抗體之熱改性中點(Tm)]
依使用Rotor-Gene Q(QIAGEN)之示差掃描型螢光定量法測定抗體之熱改性中點(Tm)，以評價熱安定性。又，本方法已有人報告與廣為人知作為抗體之熱安定性評價法的使用示差掃描型熱量計的Tm評價顯示良好的相關(Journal of Pharmaceutical Science 2010；4：1707-1720)。將5000倍濃度之SYPRO orange(Molecular Probes)以PBS(Sigma)稀釋後，與抗體溶液混合以製備測定樣本。將各樣本各20 μL移到測定用管，使溫度從30℃升高到99℃。升溫0.4℃並靜止約6秒後，於螢光強度為470 nm(激發波長)/555 nm(螢光波長)進行檢測。
數據使用Rotor-Gene Q Series Software(QIAGEN)計 算認為有螢光遷移的溫度，以該值作為Tm值。如Molecular Immunology 37(2000)697-706等所報告者，將CH2分域之Tm值定為該當於第1轉移區(First transition)之Tm1。另一方面，所探討之抗體的CH3與Fab之Tm值接近，據認為難以將其分離比較，本評價使用之Tm值採取Tm1之值。表72顯示各種改變體之評價結果。由此可認為：各種改變體相較於改變前之H240-AK072/H240-BH076/L73-k0，Tm值未有大幅下降，結構安定性維持。
Figure 101123397-A0202-02-0340-168
[離子交換層析精製之分離之評價]
於使用AKTA avant25(GE healthcare)之離子交換層析精製法中，評價各檢體之分離。移動相使用20 mM MES 緩衝液，pH6.0及含500 mM氯化鈉之20 mM MES緩衝液，pH6.0，管柱使用Hi Trap SP HP 1mL(GE healthcare)，依2液混合梯度法實施精製。精製數據之取得係於波長280 nm實施，並使用Unicorn6.1(GE healthcare)評價溶出結果。圖54顯示H240-FA021/H240-BF084/L73-k0改變體之評價結果。由此顯示：藉由使用大規模使用之管柱載體精製，本探討藉由導入新找到的殘基取代，顯示能將同源二聚化抗體與異源二聚化抗體分離精製。
[實施例29]H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改變體之免疫學的評價 [利用表面電漿子散射法評價對Fc γ R之結合活性]
依參考實施例8之方法，實施目的之抗體與FcgR之交互作用解析。各種改變體之評價結果如表73。由此顯示：於圖54已確認分離之H240-FA021/H240-BF084/L73-k0改變體對於Fc γ R之結合能力，與改變前之H240-AK072/H240-BH076/L73-k0為同等。
Figure 101123397-A0202-02-0342-169
[使用電腦模擬(in silico)免疫原性預測工具Epibase之免疫原性風險評價]
臨床上，抗體醫藥品之有用性以及藥效受限於抗醫藥品抗體(ADAs)。ADAs會影響抗體醫藥品之藥效及動態，有時會帶來嚴重的副作用。已有人報告許多影響免疫原性的因子，但尤其抗原包含T cell epitope被視為重要。預測該T cell epitope之電腦模擬工具，可利用Epibase(Lonza)、iTope/TCED(Antitope)及EpiMatrix(EpiVax)等。藉由使用該等工具，據報告能預測包含存在於目的蛋白質之T CELL EPITOPE之序列(Expert Opin Biol Ther.2007 Mar；7(3)：405-18.)。
Epibase Light(Lonza)，係使用FASTER演算法(Expert Opin Biol Ther.2007 Mar；7(3)：405-18.)，計算9-mer胜肽與major DRB1對偶基因之結合能力的電腦模擬工具。本工具能鑑別對於MHC classII為強結合及中程度結合之T cell epitope。
各改變抗體之電腦模擬免疫原性分數，係使用Epibase Light(Lonza)系統內的以下計算式(式4)求取。
(式4)免疫原性分數=Sum(each DRB1 allotype population frequency X number of critical epitopes)
計算會反映DRB1異型之存在比，可使用以下所示之在Caucasian之存在比。
DRB1*1501(24.5%)、DRB1*0301(23.7%)、DRB1*0701(23.3%)、DRB1*0101(15.0%)、DRB1*1101(11.6%)、DRB1*1302(8.2%)、DRB1*1401/1454(4.9%)、DRB1*0901(2.3%)、DRB1*1502(0.5%)、DRB1*1202(0.1%)
以FASTER演算法求取各改變抗體序列中包含之強結合與中程度之結合之所有抗原決定部位後，將排除人類生殖細胞系序列及可變區與不變區之交界序列以外者作為critical epitope使用在計算免疫原性分數。分數愈低，可認為是免疫原性風險愈小的序列。表74顯示H240-AK072及H240-BH076，及針對此等改變體計算的風險分數。由此， 藉由選擇A鏈及B鏈之任意之組合，能比起H240-AK072/H240-BH076/L73-k0，提高同源二聚物與異源二聚物之分離精製能力，再者，能製作免疫原性之風險未有大變化的改變體。
Figure 101123397-A0202-02-0344-170
[參考實施例1]抗體之表現載體之製作以及抗體之表現與精製
胺基酸取代之導入，使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCR或In fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA)等以該技術領域中具有通常知識者公知之方法進行，構建表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列，以該技術領域中具有通常知識者公知之方法決定。將製作之質體暫時導入人類胎兒腎癌細胞來源的HEK293H株(Invitrogen)、或FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)，進行抗體之表現。從獲得之培養上清，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare)，以該技術領域中具有通常知識者公知之方法，進行抗體精製。精製抗體濃度，使用分光光度計測定於280 nm之吸光度，並使用從獲得之值依PACE法計算之吸光係數，計算抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
[參考實施例2]Fc γ R之製備以及對Fc γ R之結合活性之評價
依以下之方法製備FcgR之細胞外分域。首先依該技術領域中具有通常知識者公知之方法實施FcgR之細胞外分域之基因之合成。此時，各FcgR之序列係依NCBI登錄的資訊製作。具體而言，針對FcgRI依NCBI之accession # NM_000566.3之序列、針對FcgRIIa依NCBI之accession # NM_001136219.1之序列、針對FcgRIIb依NCBI之accession # NM_004001.3之序列、針對FcgRIIIa依NCBI之accession # NM_001127593.1之序列、針對FcgRIIIb依NCBI之accession # NM_000570.3之序列製作，並於C末端附加His標籤。又，已知針對FcgRIIa、FcgRIIIa、FcgRIIIb有多型，針對多型部位，就FcgRIIa參考J.Exp.Med.,1990,172：19-25、就FcgRIIIa參考J.Clin.Invest.,1997,100(5)：1059-1070，就FcgRIIIb參考J.Clin.Invest.,1989,84,1688-1691製作。
將獲得之基因片段插入於動物細胞表現載體，並製作表現載體。將製作之表現載體暫時性導入於人類胎兒腎癌細胞來源的FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)，使目 的蛋白質表現。又，針對結晶結構解析用之FcgRIIb，於終濃度10 ug/mL之Kifunesine存在下使目的蛋白質表現，使加成於FcgRIIb之糖鏈成為高甘露糖型。進行培養，回收獲得之培養上清後，通過0.22μm濾器獲得培養上清。將獲得之培養上清原則而言依以下4步驟進行精製。第1步驟，為陽離子交換管柱層析(SP Sepharose FF)、第2步驟為對His標籤之親和性管柱層析(HisTrap HP)、第3步驟為凝膠過濾管柱層析(Superdex200)、第4步驟為無菌過濾。惟，針對FcgRI，第1步驟實施使用Q sepharose FF之陰離子交換管柱層析。針對精製之蛋白質，使用分光光度計測定於280 nm之吸光度，使用從獲得之值以PACE等方法計算出之吸光係數，計算精製蛋白質之濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
使用Biacore T100(GE Healthcare)，進行目的抗體與Fc γ R之交互作用解析。電泳緩衝液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，測定溫度定為25℃。使用：對於Series S Sencor Chip CM5(GE Healthcare)，使利用胺偶聯法固定化有抗原胜肽之晶片、或對Series S Sensor Chip SA(certified)(GE Healthcare)預先經生物素化之抗原胜肽交互作用並固定化之晶片。使目的抗體被捕捉於固定化有抗原胜肽之晶片，使與經電泳緩衝液稀釋之各Fc γ R交互作用。與10 mM glycine-HCl、pH1.5反應，洗滌捕捉於晶片之抗體，並將晶片再生反複使用。
各抗體對Fc γ R之結合活性，主要以對Fc γ R之結合 活性及對Fc γ R之解離常數作為指標進行評價。
對Fc γ R之結合活性，係指對Fc γ R之相對的結合活性。對Fc γ R之相對的結合活性，係以各測定時成為對照之樣本之結合活性作為100(%)，計算其他抗體之結合活性。在此所指之結合活性中，使Fc γ R與已捕捉之抗體交互作用前後之感測圖之變化量，係使用Fc γ R之結合活性除以各抗體之捕捉量而得之值。原因為Fc γ R之結合活性依存於所捕捉之抗體之量。
各抗體對Fc γ R之解離常數，係藉由對Biacore之測定結果實施動力理論解析以計算。具體而言，將以Biacore Evaluation Software測定而得之感測圖以1：1 Langmuir binding model，進行global fitting，計算結合速度常數ka(L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s)，並從其值計算解離常數KD(mol/L)。
[參考實施例3]異源二聚化抗體基因表現載體之製作以及各抗體之表現
抗體H鏈可變區，使用以下者。Q153(抗人類F.IX抗體之H鏈可變區、序列編號：61)、Q407(抗人類F.IX抗體之H鏈可變區、序列編號：62)、J142(抗人類F.X抗體之H鏈可變區、序列編號：63)、J300(抗人類F.X抗體之H鏈可變區、序列編號：64)、MRA-VH(抗人類介白素-6受體抗體之H鏈可變區、序列編號：65)。
抗體L鏈，使用以下者。L180-k(抗人類F.IX抗體/抗人類F.X抗體共通L鏈、序列編號：66)、L210-k(抗人 類F.IX抗體/抗人類F.X抗體共通L鏈、序列編號：67)、MRA-k(抗人類介白素-6受體抗體之L鏈、序列編號：68)。
抗體H鏈不變區，使用以下者。對IgG4導入將EU編號228號的Ser取代為Pro之變異並去除C末端之Gly及Lys而得之G4d(序列編號：69)、對G4d導入將EU編號435號的His取代為Arg之變異、EU編號436號的Tyr取代為Phe之變異及EU編號445號的Leu取代為Pro之變異而得之z72(序列編號：70)、對G4d導入將EU編號356號的Glu取代為Lys之變異而得之z7(序列編號：71)、對z72導入將EU編號439號的Lys取代為Glu之變異而得之z73(序列編號：72)、對z7導入將EU編號196號的Lys取代為Gln之變異、EU編號296號的Phe取代為Tyr之變異及EU編號409號的Arg取代為Lys之變異而得之z106(序列編號：73)、對z73導入將EU編號196號的Lys取代為Gln之變異、EU編號296號的Phe取代為Tyr之變異、EU編號409號的Arg取代為Lys之變異及EU編號436號的Phe取代為Tyr之變異而得之z107(序列編號：74)、除去了IgG1之C末端之Gly及Lys而得之G1d(序列編號：75)。原因為：EU編號356號的Glu取代為Lys之變異及EU編號439號的Lys取代為Glu之變異，於產生異源抗體時，會有效率地形成各H鏈之異源分子((WO 2006/106905)PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY)。
藉由在Q153之下游連結G4d或z7，製作抗人類F.IX 抗體H鏈基因Q153-G4d或Q153-z7。藉由於Q407之下游連結z106，製作抗人類F.IX抗體H鏈基因Q407-z106。藉由於J142之下游連結G4d、z72或z73，製作抗人類F.X抗體H鏈基因J142-G4d、J142-z72或J142-z73。藉由於J300之下游連結z107，製作抗人類F.X抗體H鏈基因J300-z107。藉由於MRA-VH之下游連結G1d、z106或z107,製作抗人類介白素-6受體抗體H鏈基因MRA-G1d、MRA-z106或MRA-z107。
將各抗體基因(Q153-G4d、Q153-z7、Q407-z106、J142-G4d、J142-z72、J142-z73、J300-z106、MRA-G1d、MRA-z106、MRA-z107、L180-k、L210-k、MRA-k)納入動物細胞表現載體。
使用製作之表現載體，將以下之抗體對於FreeStyle293細胞(invitrogen)轉染，使暫時性表現。如以下，將排列有轉染的多數抗體基因者加以記載作為抗體名。
MRA-G1d/MRA-k
MRA-z106/MRA-z107/MRA-k
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k
Q153-G4d/J142-z72/L180-k
Q153-z7/J142-z73/L180-k
Q407-z106/J300-z107/L210-k
[參考實施例4]異源二聚化抗體之Protein A親和性層析之溶出條件之探討以及分離精製
以將Q153-G4d/J142-G4d/L180-k及Q153-G4d/J142-z72/L180-k暫時性表現而得之FreeStyle293細胞培養液(以下簡稱為CM)作為試樣，探討Protein A親和性層析之溶出條件。於經以D-PBS平衡化之rProtein A Sepharose Fast Flow管柱(GE Healthcare)，載於經過以φ 0.22μm濾器過濾的CM，並分階段實施表75所示之洗滌1、2、溶出1~5。調整CM之負荷量使對於管柱載入之抗體量成為20 mg/mL樹脂。分取各條件之溶出級分，利用陽離子交換層析分析，鑑定各溶出級分所含之成分。對照，使用將各CM載入於rProtein G Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)，以批式溶出精製之試樣。Protein G由於會結合於抗體之Fab部分，故藉由使用Protein G，可無關於對Protein A之結合活性，將CM中存在的所有抗體(將目的之2種H鏈異源組合化而得之雙專一性抗體(異源抗體)、及將雜質之1種H鏈同源組合化而得之單專一性之同源抗體)加以精製。
Figure 101123397-A0202-02-0351-171
進行使Q153-G4d/J142-G4d/L180-k及Q153-G4d/J142-z72/L180-k表現之CM之Protein A管柱之各溶出級分(溶出1~5)的陽離子交換層析分析。解明：Q153-G4d/J142-G4d/L180-k，隨著從溶出1級分至溶出5級分，亦即隨著溶出使用之溶劑之pH下降，各級分包含之抗體成分會依序從同源抗體J142-G4d/L180-k變化為異源抗體Q153-G4d/J142-G4d/L180-k、及同源抗體Q153-G4d/L180-k。溶出之順序據認為係依據對Protein A之結合力之強度。亦即，比起於高pH溶出之同源體J142-G4d/L180-k(對FX之同源抗體)，直到低pH維持著結合狀態的同源抗體Q153-G4d/L180-k對於Protein A之結合力較強。可知：可變區J142係未結合於Protein A之序列。亦即，同源體J142-G4d/L180-k(對FX之同源抗體)對Protein A之結合部位為2處、異源抗體Q153-G4d/J142-G4d/L180-k為3處、同源抗體Q153-G4d/L180-k(對FIX之同源抗體)為4處。是以，可解明：對Protein A之結合部位數目愈多，對Protein A愈強 結合，為了使其溶出的必要pH愈降低。
另一方面，解明：於Q153-G4d/J142-z72/L180-k，隨著從溶出1級分到溶出5級分，各級分包含之抗體成分會依序從異源抗體Q153-G4d/J142-z72/L180-k變化到同源抗體Q153-G4d/L180-k。同源抗體J142-z72/L180-k(對FX之同源抗體)在各溶出級分幾乎未檢測到，顯示對Protein A之結合係缺失。藉由對於J142-z72導入之EU編號435號的His取代為Arg之變異，據認為會變得不與Protein A結合。同源抗體J142-z72/L180-k(對FX之同源抗體)，沒有對Protein A之結合部位，異源抗體Q153-G4d/J142-z72/L180-k有2處、同源抗體Q153-G4d/L180-k(對FIX之同源抗體)有4處。同源抗體J142-z72/L180-k(對FX之同源抗體)未結合於Protein A而是直接通過，故在各溶出級分未檢測到。又，Q153-G4d/J142-G4d/L180-k及Q153-G4d/J142-z72/L180-k，均顯示能於pH3.6及更低的pH分離異源抗體與同源抗體Q153-G4d/L180-k(對FIX之同源抗體)之可能性。
使用上述探討之精製條件，使用Protein A管柱層析實施異源二聚化抗體之精製。以下列抗體之CM作為試樣。
‧Q153-G4d/J142-G4d/L180-k
‧Q153-G4d/J142-z72/L180-k
‧Q153-z7/J142-z73/L180-k
‧Q407-z106/J300-z107/L210-k
對於經D-PBS平衡化之rProtein A Sepharose Fast Flow管柱(GE Healthcare)加載經φ 0.22μm濾器過濾的CM，實施表76所示之洗滌1、2、溶出1、2(Q407-z106/J300-z107/L210-k僅分取溶出1)。溶出條件參考上述結果。加載之抗體量係調整CM之加載量使成為20 mg/mL樹脂。分取各條件之溶出級分，利用陽離子交換層析分析，鑑定各溶出級分所含之成分。對照，使用將各CM載入於rProtein G Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)，以批式溶出精製之試樣。。
Figure 101123397-A0202-02-0353-172
各溶出級分之陽離子交換層析分析之結果記載於以下之表77~80。值係將溶出峰部之面積以百分比表示。Q153-G4d/J142-G4d/L180-k以外之抗體，在任一溶出級分均幾乎未檢測到對FX之同源抗體。解明：不僅是同源抗體J142-z72(對FX之司源抗體)，同源抗體J142-z73及J300-z107(對FX之同源抗體)也變得不結合於Protein A。此可認為原因在於：藉由將對於對FX之抗體之H鏈不變區所導入之EU編號435號的His取代為Arg之變異，在對FX之同源抗體喪失了對Protein A之結合性。目的之雙專 一性抗體異源抗體，大部分於溶出1的級分檢測到，對FIX之同源抗體也於溶出1級分檢測到少許，但是大部分溶出到溶出2。相較於Q153-G4d/J142-z72/L180-k，Q153-z7/J142-z73/L180-k及Q407-z106/J300-z107/L210-k中，pH3.6溶出級分之目的雙專一性抗體異源抗體之比例大幅提高。可知：除了將EU編號435號的His取代為Arg之變異，也導入用以有效率地形成各H鏈之異源分子之EU編號356號的Glu取代為Lys之變異及EU編號439號的Lys取代為Glu之變異，可僅利用Protein A精製步驟，便能以98%以上之純度精製目的之雙專一性抗體異源抗體。
由以上，發現：利用同源抗體與異源抗體之Protein A結合部位之數之差，藉由僅使用Protein A層析步驟，可以高純度且有效率地將異源抗體分離精製。
Figure 101123397-A0202-02-0354-173
Figure 101123397-A0202-02-0354-174
Figure 101123397-A0202-02-0355-175
Figure 101123397-A0202-02-0355-636
[參考實施例5]利用示差掃描型螢光定量法所為之改變抗體之Tm評價
本探討中，利用使用Rotor-Gene Q(QIAGEN)之示差掃描型螢光定量法評價改變抗體之Tm。又，本方法，已據報告與廣為人知作為抗體之熱安定性評價法的使用示差掃描型熱量計之Tm評價有良好相關(Journal of Pharmaceutical Science 2010；4：1707-1720)。將5000倍濃度之SYPRO orange(Molecular Probes)以PBS(Sigma)稀釋後，與抗體溶液混合以製備測定樣本。將各樣本各20 μL移到測定用管，以240℃/hr的升溫速度使溫度從30℃升高到99℃。於螢光強度為470 nm(激發波長)/555 nm(螢光波長)檢測伴隨升溫的螢光變化。
數據使用Rotor-Gene Q Series Software(QIAGEN)計算認為有螢光遷移的溫度，以該值作為Tm值。
[參考實施例6]異源改變抗體之加速試驗
關於本實施例中之抗體實施加速試驗，並實施保存安定性之比較。
將Protein A精製後之各抗體使用含0.2 mM鹽酸之PBS製備為1.0 mg/mL，並於40℃之恆溫槽保存。各抗體，均於保存開始時、保存2週後、保存4週後，使用G3000 SWXL管柱實施尺寸排除層析，並觀察單體含有率。
[參考實施例7]使用人類末梢血單核球作為效應子細胞之各受測抗體之ADCC活性
針對僅對於抗體之單側H鏈導入而增強對Fc γ R之結合活性的改變體，依以下方法測定ADCC活性。
使用人類末梢血單核球(以下，稱為人類PBMC)作為效應子細胞，依以下方式測定各受測抗體之ADCC活性。
(1)人類PBMC溶液之製備
使用預先注入1000單位/ml之肝素溶液(Novo‧肝素注5千單位，Novo Nordisk)200μl的注射器，抽取中外製藥(股)公司所屬之健康正常志願者(成人男性)的末梢血50 ml。將使用PBS(-)稀釋為2倍之該末梢血分成4等分，添加於預先注入15 ml之Ficoll-Paque PLUS並進行離心操作的Leucosep淋巴球分離管(Greiner bio-one)。將分注有該末梢血之分離管以2150 rpm的速度於室溫進行離心分離操作10分鐘後，分取單核球級分層。利用含10%FBS之Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(SIGMA)(以下稱為10%FBS/D-MEM。)，將該各分層包含之細胞洗滌1次後，將該細胞懸浮於10%FBS/D-MEM中，使其細胞密度成為5x106 細胞/ml。將該細胞懸浮液作為人類PBMC溶液，供以後實驗。
(2)標的細胞之製備
將使SK-Hep-1強制表現人類Glypican3之SK-pca13a從培養皿剝離，以每3x106cells添加1.85MBq之Cr-51。將加入有Cr-51之細胞於5%二氧化碳溫育器中於37℃進行1小時溫育後，以10%FBS/D-MEM洗滌細胞1次，並將該細胞懸浮於10%FBS/D-MEM中使其細胞密度成為2x105細胞/ml。將該細胞懸浮液作為標的細胞，供以後實驗。
(3)鉻游離試驗(ADCC活性)
ADCC活性以利用鉻釋出法之專一性鉻游離率評價。首先，將製備為各濃度(0、0.004、0.04、0.4、4、40 μg/ml)之抗體溶液，各以50μl添加到96井U底板之各井中。其次，接種(2)製備之標的細胞50μl(1x104 cells/井)，於室溫靜置15分鐘。於各井中，將添加有於(1)製備之人類PBMC溶液各100μl(5x105 cells/井)之該板，於5%二氧化碳溫育器中於37℃靜置4小時之後，進行離心操作。使用蓋氏計數器測定該板之各井中之100μl之培養上清之放射活性。依下式求取專一性鉻游離率：專一性鉻游離率(%)=(A-C)×100/(B-C)
上式中，A代表各井中之100μl之培養上清之放射活性(cpm)之平均值。又，B代表對於標的細胞添加了100μl之2% NP-40水溶液(Nonidet P-40、Nacalai)及50μl之 10% FBS/D-MEM培養基之井中之100μl之培養上清之放射活性(cpm)之平均值。再者，C代表對於標的細胞添加了10% FBS/D-MEM培養基150 μl之井中之100μl之培養上清之放射活性(cpm)之平均值。試驗實施三重複，計算反映受測抗體之ADCC活性之前述試驗之專一性鉻游離率(%)之平均值及標準偏差。
[參考實施例8]Fc γ R之製備以及對Fc γ R之結合活性之評價
依以下方法製備FcgR之細胞外分域。首先，依該技術領域中具有通常知識者公知之方法實施FcgR之細胞外分域之基因之合成。此時，各FcgR之序列係依據NCBI登錄的資訊製作。具體而言，針對FcgR依據NCBI之accession # NM_000566.3之序列、針對FcgRIIa依據NCBI之accession # NM_001136219.1之序列、針對FcgRIIb依據NCBI之accession # NM_004001.3之序列、針對FcgRIIIa依據NCBI之accession # NM_001127593.1之序列、針對FcgRIIIb依據NCBI之accession # NM_000570.3之序列製作，並於C末端附加His標籤。又，針對FcgRIIa、FcgRIIIa、FcgRIIIb已知有多型，針對多型部位，就FcgRIIa參考J.Exp.Med.,1990,172：19-25、就FcgRIIIa參考J.Clin.Invest.,1997,100(5)：1059-1070，就FcgRIIIb參考J.Clin.Invest.,1989,84,1688-1691製作。
將獲得之基因片段插入於動物細胞表現載體，並製作 表現載體。將製作之表現載體暫時性導入於人類胎兒腎癌細胞來源的FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)，使目的蛋白質表現。又，針對結晶結構解析用之FcgRIIb，於終濃度10 ug/mL之Kifunesine存在下使目的蛋白質表現，使加成於FcgRIIb之糖鏈成為高甘露糖型。進行培養，回收獲得之培養上清後，通過0.22μm濾器獲得培養上清。將獲得之培養上清原則而言依以下4步驟進行精製。第1步驟，為陽離子交換管柱層析(SP Sepharose FF)、第2步驟為對His標籤之親和性管柱層析(HisTrap HP)、第3步驟為凝膠過濾管柱層析(Superdex200)、第4步驟為無菌過濾。惟，針對FcgRI，第1步驟實施使用Q sepharose FF之陰離子交換管柱層析。針對精製之蛋白質，使用分光光度計測定於280 nm之吸光度，使用從獲得之值以PACE等方法計算出之吸光係數，計算精製蛋白質之濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
使用Biacore T100、Biacore T200、Biacore A100或Biacore 4000(GE Healthcare)，進行目的抗體與Fc γ R之交互作用解析。電泳緩衝液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，測定溫度定為25℃。感測晶片使用：對於Series S Sencor Chip CM5(GE Healthcare)，使利用胺偶聯法固定化有抗原胜肽之晶片、或對Series S Sensor Chip SA(certified)(GE Healthcare)預先經生物素化之抗原胜肽交互作用並固定化之晶片、於Series S Sencor Chip CM5(GE Healthcare)固定化有Protein L(ACTIGEN, BioVision)之晶片、或於Series S Sencor Chip CM5(GE Healthcare)固定化有Protein A/G(Thermo Scientific)之晶片。使目的抗體被捕捉於固定化有抗原胜肽之晶片，使與經電泳緩衝液稀釋之各Fc γ R交互作用。與10 mM glycine-HCl、pH1.5反應，洗滌捕捉於晶片之抗體，並將晶片再生反複使用。
各抗體對Fc γ R之結合活性，主要以對Fc γ R之結合活性及對Fc γ R之解離常數作為指標進行評價。
對Fc γ R之結合活性，係指對Fc γ R之相對的結合活性。對Fc γ R之相對的結合活性，係以各測定時成為對照之樣本之結合活性作為100(%)，計算其他抗體之結合活性。在此所指之結合活性中，使Fc γ R與已捕捉之抗體交互作用前後之感測圖之變化量，係使用Fc γ R之結合活性除以各抗體之捕捉量而得之值。原因為Fc γ R之結合活性依存於所捕捉之抗體之量。
各抗體對Fc γ R之解離常數，係藉由對Biacore之測定結果實施動力理論解析以計算。具體而言，將以Biacore Evaluation Software測定而得之感測圖以1：1 Langmuir binding model，進行global fitting，計算結合速度常數ka(L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s)，並從其值計算解離常數KD(mol/L)。
[參考實施例9]使用人類末梢血單核球作為效應子細胞之各受測抗體之ADCC活性
針對應用Fc改變之各改變體，依以下方法測定ADCC 活性。
依以下方式測定使用人類末梢血單核球(以下，稱為人類PBMC。)作為效應子細胞之各受測抗體之ADCC活性。
(1)人類PBMC溶液之製備
使用預先注入1000單位/ml之肝素溶液(Novo‧肝素注5千單位，Novo Nordisk)200μl的注射器，抽取中外製藥(股)公司所屬之健康正常志願者(成人男性)的末梢血50 ml。將使用PBS(-)稀釋為2倍之該末梢血分成4等分，添加於預先注入15 ml之Ficoll-Paque PLUS並進行離心操作的Leucosep淋巴球分離管(Greiner bio-one)。將分注有該末梢血之分離管以2150 rpm的速度於室溫進行離心分離操作10分鐘後，分取單核球級分層。利用含10%FBS之Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(SIGMA)(以下稱為10%FBS/D-MEM。)，將該各分層包含之細胞洗滌1次後，將該細胞懸浮於10%FBS/D-MEM中，使其細胞密度成為5x106細胞/ml或2.5 x 106細胞/ml。將該細胞懸浮液作為人類PBMC溶液，供以後實驗。
(2)標的細胞之製備
將使SK-Hep-1強制表現人類Epiregulin之SK-pca13a或SKE18或人類大腸癌株DLD-1或人類胰臟癌細胞株MIAPaCa-2從培養皿剝離，以每1 x 106cells添加0.2 mg/mL之Calcein溶液200μL或每3 x 106cells添加1.85 MBq之Cr-51。將加入有Calcein溶液或Cr-51之細胞於5%二氧化碳溫育器中於37℃進行1-2小時溫育後，以 10%FBS/D-MEM洗滌細胞1次，並將該細胞懸浮於10%FBS/D-MEM中使其細胞密度成為2x105細胞/ml。將該細胞懸浮液作為標的細胞，供以後實驗。
(3-1)Calcein或鉻游離試驗(ADCC活性)
ADCC活性利用Calcein或利用鉻釋出法之專一性Calcein或鉻游離率評價。首先將製備為各濃度(0、0.004、0.04、0.4、4、40μg/ml)之抗體溶液各添加50μl於96井U底板之各井中。其次各接種50μl(2)製備之標的細胞(1 x 104 cells/井)，於室溫靜置15分鐘。將各井中加入有(1)製備之人類PBMC溶液各100μl(5 x 105 cells/井或2.5 x 105 cells/井)之該板，於5%二氧化碳溫育器中於37℃靜置4小時後，進行離心操作。使用吸光光度計或蓋氏計數器測定該板之各井中之100μl之培養上清之Calcein螢光或放射活性。依下式求取專一性Calcein或鉻游離率：專一性Calcein或鉻游離率(%)=(A-C)×100/(B-C)
上式中，A代表各井中之100μl之培養上清之Calcein螢光(激發波長485 nm、螢光波長535 nm)或放射活性(cpm)之平均值。又，B代表對標的細胞添加了100μl之2% NP-40水溶液(Nonidet P-40、Nacalai)及50μl之10% FBS/D-MEM培養基之井中之100μl之培養上清之Calcein螢光(激發波長485 nm、螢光波長535 nm)或放射活性(cpm)之平均值。再者，C代表對於標的細胞添加了10% FBS/D-MEM培養基150μl之井中之100μl之培養上清之Calcein螢 光(激發波長485 nm、螢光波長535 nm)或放射活性(cpm)之平均值。試驗實施三重複，且計算反映各受測抗體之ADCC活性之前述試驗之專一性Calcein或鉻游離率(%)之平均值及標準偏差。
圖1顯示Fc區與FcRn之複合體之結構。FcRn結合於抗體之各H鏈之CH2及CH3，且對抗體全體為對稱的結合。
圖2顯示IgA與IgA receptorFc α R之複合體之結構。Fc α R結合於IgA之各H鏈之C α 2及C α 3，且對抗體全體為對稱的結合。
圖3顯示Fc區與Fc γ RIII之複合體之結構。針對H鏈、CH2、CH3，各為將朝向圖以左側稱為HA鏈、CHA2、CHA3、右側稱為HB鏈、CHB2、CHB3。
圖4顯示各H鏈中之A327與Fc γ RIII之交互作用之細節。(A)代表CHA2中之A327與Fc γ RIII之交互作用。(B)代表CHB2HB中之A327與Fc γ RIII之交互作用。Fc γ RIII上之顏色，各代表黑色：鹼性部位、灰色：中性部位、白：酸性部位。
圖5顯示導入D356K、H435R、K439E之抗體對Fc γ R之結合活性之比較。GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)對於各Fc γ R之結合活性定為100。評價使用之樣本及其序列，為GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0(序 列編號：3、5)。
圖6顯示導入G237A之抗體對Fc γ R之結合活性之比較。GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)對於各Fc γ R之結合活性定為100。評價使用之樣本及其序列為GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0(序列編號：3、5)、GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：6、4、5)、GpH7-A26/GpL16-k0(序列編號：6、5)。
圖7顯示導入G237L之異源二聚化抗體及同源二聚化抗體對Fc γ R之結合活性之比較。GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)對於各Fc γ R之結合活性定為100。評價使用之樣本及其序列為GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0(序列編號：3、5)、GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：7、4、5)、GpH7-A29/GpL16-k0(序列編號：7、5)。
圖8顯示導入L328E之異源二聚化抗體與同源二聚化抗體對Fc γ R之結合活性之比較。GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)對於各Fc γ R之結合活性定為100。評價使用之樣本及其序列為GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0(序列編號：3、5)、GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號： 8、4、5)、GpH7-A42/GpL16-k0(序列編號：8、5)、。
圖9顯示導入L328D之異源二聚化抗體與同源二聚化抗體對Fc γ R之結合活性之比較。GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)對於各Fc γ R之結合活性定為100。評價使用之樣本及其序列為GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0(序列編號：3、5)、GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：9、4、5)、GpH7-A43/GpL16-k0(序列編號：9、5)、。
圖10顯示導入L234E之異源二聚化抗體與同源二聚化抗體對Fc γ R之結合活性之比較。GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)對於各Fc γ R之結合活性定為100。評價使用之樣本及其序列為GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0(序列編號：3、5)、GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0(序列編號：3、10、5)、GpH7-B16/GpL16-k0(序列編號：10、5)。
圖11顯示導入L234D之異源二聚化抗體與同源二聚化抗體對Fc γ R之結合活性之比較。GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)對於各Fc γ R之結合活性定為100。評價使用之樣本及其序列為GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0(序列編號：3、5)、GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0(序列編號： 3、11、5)、GpH7-B17/GpL16-k0(序列編號：11、5)。
圖12顯示Fc區中之P329與Fc γ RIII之交互作用。針對H鏈、CH2、CH3，各以朝向圖將左側稱為HA鏈、CHA2、CHA3、右側稱為HB鏈、CHB2、CHB3。顯示Fc區中之EU編號329號的Pro與Fc γ RIII之主要其中之一之CH2分域CHA2交互作用之圖。針對H鏈、CH2、CH3各以朝向圖將左側稱為HA鏈、CHA2、CHA3、右側稱為HB鏈、CHB2、CHB3。
圖13顯示導入P329R、P329K、P329D、P329E之異源二聚化抗體及同源二聚化抗體對Fc γ R之結合活性帶來的效果之比較。GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對於各Fc γ R之結合活性定為100。評價使用之樣本及其序列為GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0(序列編號：3、12、5)、GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0(序列編號：3、13、5)、GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0(序列編號：3、14、5)、GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0(序列編號：3、15、5)、GpH7-B12/GpL16-k0(序列編號：12、5)、GpH7-B13/GpL16-k0(序列編號：13、5)、GpH7-B14/GpL16-k0(序列編號：14、5)、GpH7-B15/GpL16-k0(序列編號：15、5)。
圖14顯示相較於將G237A導入於其中之一之H鏈而得之異源二聚化抗體，將P329R導入於相同H鏈或相異H鏈時對於各Fc γ R之結合活性加以比較之圖。GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對於各 Fc γ R之結合活性定為100。評價使用之樣本及其序列為GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0(序列編號：3、12、5)、GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：16、4、5)、GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：6、4、5)、GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0(序列編號：6、12、5)、GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：17、4、5)。
圖15顯示相較於將L234D導入其中之一之H鏈之異源二聚化抗體，將P329R導入於相同H鏈或相異H鏈時對於各Fc γ R之結合活性加以比較之圖。GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對於各Fc γ R之結合活性定為100。評價使用之樣本及其序列為GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0(序列編號：3、12、5)、GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：16、4、5)、GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0(序列編號：3、11、5)、GpH7-A48/GpH7-B17/GpL16-k0(序列編號：16、11、5)、GpH7-A5/GpH7-B41/GpL16-k0(序列編號：3、18、5)。
圖16顯示導入同一改變之異源二聚化抗體與同源二聚化抗體，對Fc γ RIa之結合活性加以比較之圖。橫軸代表Ho/Con、縱軸代表He/Co之值。He/Con，係將導入變異之GpH7-B3 variant使用於其中之一之H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0對於Fc γ RIa之結合活性，除以使用未導入變異之GpH7-B3而 得之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對於Fc γ RIa之結合活性而得之值再乘以100之值。Ho/Con，係將導入變異之GpH7-B3 variant使用兩者之H鏈而得之同源二聚化抗體GpH7-B3 variant/GpL16-k0對於Fc γ RIa之結合活性之值，除以使用未導入變異之GpH7-B3之同源二聚化抗體GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)對於Fc γ RIa之結合活性之值而得之值再乘以100之值。
圖17顯示將導入同一改變之異源二聚化抗體與同源二聚化抗體對Fc γ RIIa R之結合活性加以比較之圖。橫軸代表Ho/Con、縱軸代表He/Co之值。He/Con，係將導入變異之GpH7-B3 variant使用於其中之一之H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0對Fc γ RIIa R之結合活性，除以使用未導入變異之GpH7-B3而得之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對Fc γ RIIa R之結合活性而得之值。Ho/Con，係將導入變異之GpH7-B3 variant使用於兩者之H鏈而得之同源二聚化抗體GpH7-B3 variant/GpL16-k0對Fc γ RIIa R之結合活性之值，除以使用未導入變異之GpH7-B3而得之同源二聚化抗體GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)對Fc γ RIIa R之結合活性之值而得之值再乘以100而得之值。
圖18顯示將導入同一改變之異源二聚化抗體與同源二聚化抗體對Fc γ RIIa H之結合活性加以比較之圖。橫軸代表Ho/Con、縱軸代表He/Co之值。He/Con，係將導入變 異之GpH7-B3 variant使用於其中之一之H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0對Fc γ RIIa H之結合活性，除以使用未導入變異之GpH7-B3而得之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對Fc γ RIIa H之結合活性而得之值。Ho/Con，係將導入變異之GpH7-B3 variant使用於兩者之H鏈而得之同源二聚化抗體GpH7-B3 variant/GpL16-k0對Fc γ RIIa H之結合活性之值，除以使用未導入變異之GpH7-B3而得之同源二聚化抗體GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)對Fc γ RIIa H之結合活性之值而得之值再乘以100而得之值。
圖19顯示將導入同一改變之異源二聚化抗體與同源二聚化抗體對Fc γ RIIb之結合活性加以比較之圖。橫軸代表Ho/Con、縱軸代表He/Con，係將導入變異之GpH7-B3 variant使用於其中之一之H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0對Fc γ RIIb之結合活性，除以使用未導入變異之GpH7-B3而得之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對Fc γ RIIb之結合活性而得之值。Ho/Con，係將導入變異之GpH7-B3 variant使用於兩者之H鏈而得之同源二聚化抗體GpH7-B3 variant/GpL16-k0對Fc γ RIIb之結合活性之值，除以使用未導入變異之GpH7-B3而得之同源二聚化抗體GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)對Fc γ RIIb之結合活性之值而得之值再乘以100而得之值。
圖20顯示將導入同一改變之異源二聚化抗體與同源 二聚化抗體對Fc γ RIIIa之結合活性加以比較之圖。橫軸代表Ho/Con、縱軸代表He/Con，係將導入變異之GpH7-B3 variant使用於其中之一之H鏈而得之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之結合活性，除以使用未導入變異之GpH7-B3而得之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對Fc γ RIIIa之結合活性而得之值。Ho/Con，係將導入變異之GpH7-B3 variant使用於兩者之H鏈而得之同源二聚化抗體GpH7-B3 variant/GpL16-k0對Fc γ RIIIa之結合活性之值，除以使用未導入變異之GpH7-B3而得之同源二聚化抗體GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：4、5)對Fc γ RIIIa之結合活性之值而得之值再乘以100而得之值。
圖21顯示將使用導入改變之H鏈之異源二聚化抗體、同源二聚化抗體分別之Fc γ R結合加以比較之概念圖。繪製之點包含於i區之情形，意指導入於Fc區之改變有成為He/Con>100、Ho/Con<100、He/Con>Ho/Con之效果。繪製之點包含於ii區之情形，意指導入於Fc區之改變有成為He/Con>100、Ho/Con>100、He/Con>Ho/Con之效果。繪製之點包含於iii區之情形，意指導入於Fc區改變改成為He/Con>100、Ho/Con>100、He/Con<Ho/Con之效果。
圖22顯示將三種改變對於異源二聚化抗體之任一H鏈導入之情形之組合之數目。●(黑圓)、▲(黑三角)、■(黑四角)各意指不同的改變。
圖23顯示抗體之Fc區中之S239、A330、I332之各殘基與Fc γ RIII之交互作用。由Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103,4005-4010,2006引用。
圖24顯示對活性型Fc γ R以及抑制型Fc γ R之結合活性之比較。為比較各改變體之活性型Fc γ R以及抑制型對Fc γ R之結合活性之概念圖。取各改變體對活性型Fc γ R(Activating Receptor)之活性為縱軸、對抑制型Fc γ R(Inhibitory Receptor)之結合活性為橫軸，並將天然型抗體對活性型Fc γ R與抑制型Fc γ R之結合活性各定為100。改變體之對活性型Fc γ R之結合活性比起天然型抗體為增強，且對抑制型Fc γ R之結合活性為下降的抗體，繪製於a區(網點部分)。改變體對抑制型Fc γ R之結合活性比起天然型抗體增強，且對活性型Fc γ R之結合活性為下降之抗體，繪製於c區(斜線部分)。
圖25顯示對活性型Fc γ R以及抑制型Fc γ R之結合活性之比較。為比較各改變體之活性型Fc γ R以及抑制型對Fc γ R之結合活性之概念圖。取天然型抗體對活性型Fc γ R(Activating Receptor)之活性為縱軸、對抑制型Fc γ R(Inhibitory Receptor)之結合活性為橫軸，並將天然型抗體對活性型Fc γ R與抑制型Fc γ R之結合活性各定為100。改變體之對活性型Fc γ R之結合活性除以對抑制型Fc γ R之結合活性而得之值為1.2以上的抗體，繪製於b區(網點部分)。改變體對活性型Fc γ R之結合活性除以對對抑制型Fc γ R之結合活性而得ㄅ值為0.8以下之抗體，繪製於d 區(斜線部分)。
圖26顯示將異源二聚化抗體對Fc γ RIa及對Fc γ RIIb之結合活性加以比較之圖。係比較導入改變之異源二聚化抗體對於為活性型Fc γ R之Fc γ RIa及對於為抑制型Fc γ R之Fc γ RIIb之結合活性之圖。橫軸代表對抑制型Fc γ R之He/Con之值、縱軸代表對活性型Fc γ R之He/Con之值。He/Con，係將對於Fc導入變異之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0對於Fc γ R之結合活性，除以未導入改變之異源二聚抗體GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對於Fc γ R之結合活性而得之值再乘以100而得之值。
圖27顯示異源二聚化抗體對Fc γ RIIa R及對Fc γ RIIb之結合活性之比較之圖。係比較導入改變之異源二聚化抗體對於為活性型Fc γ R之Fc γ RIIa R及對於為抑制型Fc γ R之Fc γ RIIb之結合活性之圖。橫軸代表對抑制型Fc γ R之He/Con之值、縱軸代表對活性型Fc γ R之He/Con之值。He/Con，係將對於Fc導入變異之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0對於Fc γ R之結合活性，除以未導入改變之異源二聚抗體GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對於Fc γ R之結合活性而得之值再乘以100而得之值。
圖28顯示異源二聚化抗體對Fc γ RIIa H及對Fc γ RIIb之結合活性之比較之圖。係比較導入改變之異源二聚化抗體對於為活性型Fc γ R之Fc γ RIIa H及對於為抑 制型Fc γ R之Fc γ RIIb之結合活性之圖。橫軸代表對抑制型Fc γ R之He/Con之值、縱軸代表對活性型Fc γ R之He/Con之值。He/Con，係將對於Fc導入變異之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0對於Fc γ R之結合活性，除以未導入改變之異源二聚抗體GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對於Fc γ R之結合活性而得之值再乘以100而得之值。
圖29顯示異源二聚化抗體對Fc γ RIIIa H及對Fc γ RIIb之結合活性之比較之圖。係比較導入改變之異源二聚化抗體對於為活性型Fc γ R之Fc γ RIIIa H及對於為抑制型Fc γ R之Fc γ RIIb之結合活性之圖。橫軸代表對抑制型Fc γ R之He/Con之值、縱軸代表對活性型Fc γ R之He/Con之值。He/Con，係將對於Fc導入變異之異源二聚化抗體GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0對於Fc γ R之結合活性，除以未導入改變之異源二聚抗體GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)對於Fc γ R之結合活性而得之值再乘以100而得之值。
圖30顯示比較L234Y、G236W、S298A與S239D、A330L、I332E之組合賦予抗體之熱安定性之影響之圖。係比較L234Y、G236W、S298A之異源二聚化抗體及同源二聚化抗體、S239D、A330L、I332E之異源二聚化抗體及同源二聚化抗體、將L234Y、G236W、S298A導入於其中之一之H鏈並將S239D、A330L、I332E導入於其中另一之H鏈之異源二聚化抗體之熱加速試驗(40℃2週或4週)後之單體比例 之變化之圖。評價使用之樣本及其序列為GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：31、4、5)、GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0(序列編號：3、41、5)、GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0(序列編號：31、32、5)、GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0(序列編號：40、41、5)、GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0(序列編號：31、41、5)。
圖31顯示異源二聚化抗體之ADCC活性之探討結果。評價使用之細胞株為SK-pca13a，E/T ratio=50。效應子細胞為人類PBMC。評價使用之樣本及其序列為GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：3、4、5)、GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0(序列編號：3、41、5)、GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0(序列編號：31、4、5)、GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0(序列編號：40、41、5)、GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0(序列編號：31、32、5)、GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0(序列編號：31、41、5)。縱軸代表抗體之細胞傷害活性，橫軸代表抗體之濃度(μg/mL)。
圖32顯示構成IgG1(序列編號：76)、IgG2(序列編號：77)、IgG3(序列編號：78)及IgG4(序列編號：79)之Fc區之胺基酸殘基、及kabat之EU編號(本說明書也稱為EU INDEX)間之關係。
圖33顯示實施例12記載之Fc異源二聚化抗體之ADCC活性之探討結果。評價使用之細胞株為SK-pca13a，E/T ratio=50。效應子細胞為人類PBMC。評價使用之樣本及其序列為GpH7-G1d/GpL16-k0(序列編號：2、5)、GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0(序列編號：51、56、5)、GpH7-Kn032/GpH7-H1032/GpL16-k0(序列編號：53、58、5)、GpH7-Kn045/GpH7-H1048/GpL16-k0(序列編號：54、59、5)、GpH7-Kn056/GpH7-H1055/GpL16-k0(序列編號：55、60、5)、GpH7-Kn037/GpH7-H1036/GpL16-k0(序列編號：52、57、5)。縱軸代表抗體之細胞傷害活性、橫軸代表抗體之濃度(μg/mL)。
圖34顯示異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0之ADCC活性之探討結果。評價使用之細胞株為SKE18，/T ratio=50。效應子細胞為人類PBMC。評價使用之樣本及其序列為H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0(序列編號：84、85、106)、H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0(序列編號：86、87、106)、H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0(序列編號：81、82、106)、H240-afucosyl_G1d(H240-afucosyl_G1d其胺基酸序列與H240-G1d(序列編號：83)相同，係去除其岩藻糖者)/L73-k0(序列編號：83、106)。縱軸代表抗體之細胞傷害活性、橫軸代表抗體之濃度(μg/mL)。
圖35顯示以異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0作為模板之點變異體對FcgRI之結合活性。縱軸之Relative KD，代表將 H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0對FcgRI之KD(mol/L)除以各改變體之KD而得之值。橫軸之數字，代表將Relative KD從小至大排序時的順位。
圖36顯示以異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0作為模板之點變異體對FcgRIIa R之結合活性。縱軸之Relative KD，代表將H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0對FcgRIIa R之KD(mol/L)除以各改變體之KD而得之值。橫軸之數字，代表將Relative KD從小至大排序時的順位。
圖37顯示以異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0作為模板之點變異體對FcgRIIa H之結合活性。縱軸之Relative KD，代表將H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0對FcgRIIa H之KD(mol/L)除以各改變體之KD而得之值。橫軸之數字，代表將Relative KD從小至大排序時的順位。
圖38顯示以異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0作為模板之點變異體對FcgRIIb之結合活性。縱軸之Relative KD，代表將H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0對FcgRIIb之KD(mol/L)除以各改變體之KD而得之值。橫軸之數字，代表將Relative KD從小至大排序時的順位。
圖39顯示以異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0作為模板之點變異體對FcgRIIIa F之結合活性。縱軸之Relative KD，代表將 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0對FcgRIIIa F之KD(mol/L)除以各改變體之KD而得之值。橫軸之數字，代表將Relative KD從小至大排序時的順位。
圖40顯示以異源二聚化抗體H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0作為模板之點變異體對FcgRIIIa V之結合活性。縱軸之Relative KD，代表將H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0對FcgRIIIa V之KD(mol/L)除以各改變體之KD而得之值。橫軸之數字，代表將Relative KD從小至大排序時的順位。
圖41顯示異源二聚化抗體H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0之ADCC活性之探討結果。評價使用之細胞株為MIAPaCa-2，E/T ratio=25。效應子細胞為人類PBMC。評價使用之樣本及其序列為H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0(序列編號：84、85、106)、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0(序列編號：81、82、106)、H240-afucosyl_G1d/L73-k0(序列編號：83、106)、H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0(序列編號：90、91、106)。縱軸代表抗體之細胞傷害活性、橫軸代表抗體之濃度(μg/mL)。
圖42顯示異源二聚化抗體H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0改良抗體之ADCC活性之探討結果。評價使用之細胞株為DLD-1，E/T ratio=50。效應子細胞為人類PBMC。評價使用之樣本及其序列為H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0(序列編號：84、85、 106)、H240-afucosyl_G1d/L73-k0(序列編號：83、106)、H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0(序列編號：92、91、106)、H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0(序列編號：93、91、106)、H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0(序列編號：94、91、106)。縱軸代表抗體之細胞傷害活性、橫軸代表抗體之濃度(μg/mL)。
圖43顯示異源二聚化抗體H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0等ADCC活性之探討結果。評價使用之細胞株為DLD-1，E/T ratio=50。效應子細胞為人類PBMC。評價使用之樣本及其序列為H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0(序列編號：84、85、106)、H240-afucosyl_G1d/L73-k0(序列編號：83、106)、H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0(序列編號：95、96、106)、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0(序列編號：99、96、106)、H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0(序列編號：100、96、106)。縱軸代表抗體之細胞傷害活性、橫軸代表抗體之濃度(μg/mL)。
圖44顯示Fc(WT)/FcgR2a R型結晶結構(PDB ID=3RY6,J.Imunol.2011,187,3208-321)。圖示在同結構之Fc與FcgRIIa R型之交互作用界面附近，FcgRIIa R型與FcgRIIb不同的3殘基Gln127,Leu132,Phe160的側鏈。又，( )內係將FcgRIIb中的對應胺基酸殘基以單字母代表者。
圖45顯示由X射線結晶結構解析決定之Fc (Kn120/Hl068)/FcgRIIb細胞外區複合體之圖。針對CH2分域、CH3分域，各以朝左側為分域A、右側為分域B。
圖46顯示由X射線結晶結構解析決定之Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb細胞外區複合體之中，FcgRIIb細胞外區之Lys127(FcgRIIa R型中為Gln)周邊之結構。又，針對Fc(Kn120/Hl068)之Tyr296，未觀測到側鏈之電子密度，故未實施Cα原子以外之側鏈之模型構建。
圖47顯示由X射線結晶結構解析決定之Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb細胞外區複合體之中，FcgRIIb細胞外區之Ser132(FcgRIIa R型為Leu)周邊之結構。又，針對Fc(Kn120/Hl068)之D327，未觀測到側鏈之電子密度，故未實施Cα原子以外之側鏈之模型構建。
圖48顯示由X射線結晶結構解析決定之Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb細胞外區複合體之中，FcgRIIb細胞外區之Tyr160(FcgRIIa R型為Phe)周邊之結構。
圖49顯示由X射線結晶結構解析決定之Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之圖。針對CH2分域、CH3分域，各以朝左側為分域A、右側為分域B。
圖50顯示由X射線結晶結構解析決定之Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之結構以及Fc(WT)/FcgRIIa細胞外區複合體之結構(PDB code：3RY6)，於CH2分域A加以比較者。圖中以粗線描繪者，為Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體，以細線描繪者為Fc(WT)/FcgRIIa細胞外區複合體之結構。又，Fc(WT)/FcgRIIa細胞外區 複合體之結構中，僅繪出CH2分域A。
圖51顯示由X射線結晶結構解析決定之Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之中，Fc(BP208)CH2分域B之Ser239周邊之結構。
圖52顯示由X射線結晶結構解析決定之Fc(BP208)/FcgRIIb細胞外區複合體之中，Fc(BP208)CH2分域A之Ser239周邊之結構。
圖53顯示圖示代表的H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改變抗體之分析用陽離子交換層析之結果。A：H240-AK072/H240-BH076/L73-k0、B：H240-FA021/H240-FB084/L73-k0
圖54顯示圖示代表的H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改變抗體H240-FA021/H240-FB084/L73-k0之分取用陽離子交換層析(A)及分取級分之分析用陽離子交換層析(B)之結果。
<110> 中外製藥股份有限公司
<120> 異源二聚化多胜肽
<130> C1-A1104Y1P
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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Figure 101123397-A0202-02-0381-177
Figure 101123397-A0202-02-0382-178
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<212> PRT
<213> 人造的
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<223> 人工合成的胜肽序列
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Figure 101123397-A0202-02-0383-180
Figure 101123397-A0202-02-0384-182
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<223> 人工合成的胜肽序列
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Figure 101123397-A0202-02-0385-184
Figure 101123397-A0202-02-0386-185
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<223> 人工合成的胜肽序列
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Figure 101123397-A0202-02-0386-186
Figure 101123397-A0202-02-0387-187
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<223> 人工合成的胜肽序列
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Figure 101123397-A0202-02-0388-189
Figure 101123397-A0202-02-0389-190
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<223> 人工合成的胜肽序列
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Figure 101123397-A0202-02-0389-191
Figure 101123397-A0202-02-0390-192
Figure 101123397-A0202-02-0391-193
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<223> 人工合成的胜肽序列
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Figure 101123397-A0202-02-0392-195
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<223> 人工合成的胜肽序列
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Figure 101123397-A0202-02-0393-197
Figure 101123397-A0202-02-0394-198
Figure 101123397-A0202-02-0395-199
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<223> 人工合成的胜肽序列
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Figure 101123397-A0202-02-0396-201
Figure 101123397-A0202-02-0397-202
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<223> 人工合成的胜肽序列
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Figure 101123397-A0202-02-0399-204
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Figure 101123397-A0202-02-0400-205
Figure 101123397-A0202-02-0401-206
Figure 101123397-A0202-02-0402-207
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Figure 101123397-A0202-02-0402-208
Figure 101123397-A0202-02-0403-209
Figure 101123397-A0202-02-0404-210
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<212> PRT
<213> 人造的
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<223> 人工合成的胜肽序列
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Figure 101123397-A0202-02-0404-211
Figure 101123397-A0202-02-0405-212
Figure 101123397-A0202-02-0406-213
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<212> PRT
<213> 人造的
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Figure 101123397-A0202-02-0406-214
Figure 101123397-A0202-02-0407-216
Figure 101123397-A0202-02-0408-217
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<212> PRT
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Figure 101123397-A0202-02-0408-218
Figure 101123397-A0202-02-0409-219
Figure 101123397-A0202-02-0410-221
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<212> PRT
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<400> 16
Figure 101123397-A0202-02-0410-222
Figure 101123397-A0202-02-0411-223
Figure 101123397-A0202-02-0412-224
<210> 17
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 17
Figure 101123397-A0202-02-0412-225
Figure 101123397-A0202-02-0413-226
Figure 101123397-A0202-02-0414-227
<210> 18
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 18
Figure 101123397-A0202-02-0414-228
Figure 101123397-A0202-02-0415-229
Figure 101123397-A0202-02-0416-230
<210> 19
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 19
Figure 101123397-A0202-02-0417-231
Figure 101123397-A0202-02-0418-232
<210> 20
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 20
Figure 101123397-A0202-02-0419-233
Figure 101123397-A0202-02-0420-234
Figure 101123397-A0202-02-0421-235
<210> 21
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 21
Figure 101123397-A0202-02-0421-237
Figure 101123397-A0202-02-0422-238
Figure 101123397-A0202-02-0423-239
<210> 22
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 22
Figure 101123397-A0202-02-0423-240
Figure 101123397-A0202-02-0424-241
Figure 101123397-A0202-02-0425-242
<210> 23
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 23
Figure 101123397-A0202-02-0425-243
Figure 101123397-A0202-02-0426-244
Figure 101123397-A0202-02-0427-245
<210> 24
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 24
Figure 101123397-A0202-02-0427-246
Figure 101123397-A0202-02-0428-247
Figure 101123397-A0202-02-0429-248
<210> 25
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 25
Figure 101123397-A0202-02-0429-249
Figure 101123397-A0202-02-0430-250
Figure 101123397-A0202-02-0431-251
<210> 26
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 26
Figure 101123397-A0202-02-0431-252
Figure 101123397-A0202-02-0432-253
Figure 101123397-A0202-02-0433-254
<210> 27
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 27
Figure 101123397-A0202-02-0433-255
Figure 101123397-A0202-02-0434-256
Figure 101123397-A0202-02-0435-257
<210> 28
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 28
Figure 101123397-A0202-02-0435-258
Figure 101123397-A0202-02-0436-259
Figure 101123397-A0202-02-0437-260
<210> 29
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 29
Figure 101123397-A0202-02-0438-261
Figure 101123397-A0202-02-0439-262
<210> 30
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 30
Figure 101123397-A0202-02-0440-263
Figure 101123397-A0202-02-0441-264
Figure 101123397-A0202-02-0442-265
<210> 31
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 31
Figure 101123397-A0202-02-0442-266
Figure 101123397-A0202-02-0443-267
Figure 101123397-A0202-02-0444-268
<210> 32
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 32
Figure 101123397-A0202-02-0444-269
Figure 101123397-A0202-02-0445-270
Figure 101123397-A0202-02-0446-271
<210> 33
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 33
Figure 101123397-A0202-02-0446-272
Figure 101123397-A0202-02-0447-273
Figure 101123397-A0202-02-0448-274
<210> 34
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 34
Figure 101123397-A0202-02-0448-275
Figure 101123397-A0202-02-0449-276
Figure 101123397-A0202-02-0450-277
<210> 35
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 35
Figure 101123397-A0202-02-0450-278
Figure 101123397-A0202-02-0451-279
Figure 101123397-A0202-02-0452-280
<210> 36
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 36
Figure 101123397-A0202-02-0452-281
Figure 101123397-A0202-02-0453-282
Figure 101123397-A0202-02-0454-283
<210> 37
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 37
Figure 101123397-A0202-02-0454-284
Figure 101123397-A0202-02-0455-285
Figure 101123397-A0202-02-0456-286
<210> 38
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 38
Figure 101123397-A0202-02-0456-287
Figure 101123397-A0202-02-0457-288
Figure 101123397-A0202-02-0458-289
<210> 39
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 39
Figure 101123397-A0202-02-0459-290
Figure 101123397-A0202-02-0460-291
<210> 40
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 40
Figure 101123397-A0202-02-0461-292
Figure 101123397-A0202-02-0462-293
Figure 101123397-A0202-02-0463-294
<210> 41
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 41
Figure 101123397-A0202-02-0463-295
Figure 101123397-A0202-02-0464-296
Figure 101123397-A0202-02-0465-297
<210> 42
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 42
Figure 101123397-A0202-02-0465-298
Figure 101123397-A0202-02-0466-299
Figure 101123397-A0202-02-0467-300
<210> 43
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 43
Figure 101123397-A0202-02-0467-301
Figure 101123397-A0202-02-0468-302
Figure 101123397-A0202-02-0469-303
<210> 44
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 44
Figure 101123397-A0202-02-0469-304
Figure 101123397-A0202-02-0470-305
Figure 101123397-A0202-02-0471-306
<210> 45
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 45
Figure 101123397-A0202-02-0471-308
Figure 101123397-A0202-02-0472-309
Figure 101123397-A0202-02-0473-310
<210> 46
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 46
Figure 101123397-A0202-02-0473-311
Figure 101123397-A0202-02-0474-312
Figure 101123397-A0202-02-0475-313
<210> 47
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 47
Figure 101123397-A0202-02-0475-314
Figure 101123397-A0202-02-0476-315
Figure 101123397-A0202-02-0477-316
<210> 48
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 48
Figure 101123397-A0202-02-0478-317
Figure 101123397-A0202-02-0479-318
<210> 49
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 49
Figure 101123397-A0202-02-0480-319
Figure 101123397-A0202-02-0481-320
Figure 101123397-A0202-02-0482-321
<210> 50
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 50
Figure 101123397-A0202-02-0482-322
Figure 101123397-A0202-02-0483-323
Figure 101123397-A0202-02-0484-324
<210> 51
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 51
Figure 101123397-A0202-02-0484-325
Figure 101123397-A0202-02-0485-326
Figure 101123397-A0202-02-0486-327
<210> 52
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 52
Figure 101123397-A0202-02-0486-328
Figure 101123397-A0202-02-0487-330
Figure 101123397-A0202-02-0488-331
<210> 53
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 53
Figure 101123397-A0202-02-0488-332
Figure 101123397-A0202-02-0489-333
Figure 101123397-A0202-02-0490-334
<210> 54
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 54
Figure 101123397-A0202-02-0490-335
Figure 101123397-A0202-02-0491-336
Figure 101123397-A0202-02-0492-337
<210> 55
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 55
Figure 101123397-A0202-02-0492-338
Figure 101123397-A0202-02-0493-339
Figure 101123397-A0202-02-0494-340
<210> 56
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 56
Figure 101123397-A0202-02-0494-341
Figure 101123397-A0202-02-0495-342
Figure 101123397-A0202-02-0496-343
<210> 57
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 57
Figure 101123397-A0202-02-0496-344
Figure 101123397-A0202-02-0497-345
Figure 101123397-A0202-02-0498-346
<210> 58
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 58
Figure 101123397-A0202-02-0499-347
Figure 101123397-A0202-02-0500-348
<210> 59
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 59
Figure 101123397-A0202-02-0501-349
Figure 101123397-A0202-02-0502-350
Figure 101123397-A0202-02-0503-351
<210> 60
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 60
Figure 101123397-A0202-02-0503-352
Figure 101123397-A0202-02-0504-353
Figure 101123397-A0202-02-0505-354
<210> 61
<211> 123
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 61
Figure 101123397-A0202-02-0505-355
<210> 62
<211> 123
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 62
Figure 101123397-A0202-02-0506-356
<210> 63
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 63
Figure 101123397-A0202-02-0506-357
Figure 101123397-A0202-02-0507-358
<210> 64
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 64
Figure 101123397-A0202-02-0507-359
Figure 101123397-A0202-02-0508-360
<210> 65
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 65
Figure 101123397-A0202-02-0508-361
<210> 66
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 66
Figure 101123397-A0202-02-0508-362
Figure 101123397-A0202-02-0509-363
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 67
Figure 101123397-A0202-02-0510-364
Figure 101123397-A0202-02-0511-365
<210> 68
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 68
Figure 101123397-A0202-02-0511-366
Figure 101123397-A0202-02-0512-367
<210> 69
<211> 325
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 69
Figure 101123397-A0202-02-0512-368
Figure 101123397-A0202-02-0513-369
<210> 70
<211> 325
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 70
Figure 101123397-A0202-02-0514-370
Figure 101123397-A0202-02-0515-371
<210> 71
<211> 325
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 71
Figure 101123397-A0202-02-0515-372
Figure 101123397-A0202-02-0516-373
Figure 101123397-A0202-02-0517-374
<210> 72
<211> 325
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 72
Figure 101123397-A0202-02-0517-375
Figure 101123397-A0202-02-0518-376
<210> 73
<211> 325
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 73
Figure 101123397-A0202-02-0518-377
Figure 101123397-A0202-02-0519-378
Figure 101123397-A0202-02-0520-379
<210> 74
<211> 325
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 74
Figure 101123397-A0202-02-0520-380
Figure 101123397-A0202-02-0521-381
<210> 75
<211> 328
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 75
Figure 101123397-A0202-02-0522-382
Figure 101123397-A0202-02-0523-386
<210> 76
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Figure 101123397-A0202-02-0523-385
Figure 101123397-A0202-02-0524-387
Figure 101123397-A0202-02-0525-388
<210> 77
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Figure 101123397-A0202-02-0525-389
Figure 101123397-A0202-02-0526-390
<210> 78
<211> 377
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Figure 101123397-A0202-02-0526-391
Figure 101123397-A0202-02-0527-392
Figure 101123397-A0202-02-0528-393
<210> 79
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Figure 101123397-A0202-02-0528-394
Figure 101123397-A0202-02-0529-395
Figure 101123397-A0202-02-0530-396
<210> 80
<211> 116
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 80
Figure 101123397-A0202-02-0530-398
<210> 81
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 81
Figure 101123397-A0202-02-0530-399
Figure 101123397-A0202-02-0531-400
Figure 101123397-A0202-02-0532-401
<210> 82
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 82
Figure 101123397-A0202-02-0533-402
Figure 101123397-A0202-02-0534-403
<210> 83
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 83
Figure 101123397-A0202-02-0535-404
Figure 101123397-A0202-02-0536-405
Figure 101123397-A0202-02-0537-406
<210> 84
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 84
Figure 101123397-A0202-02-0537-407
Figure 101123397-A0202-02-0538-408
Figure 101123397-A0202-02-0539-409
<210> 85
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 85
Figure 101123397-A0202-02-0539-410
Figure 101123397-A0202-02-0540-411
Figure 101123397-A0202-02-0541-412
<210> 86
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 86
Figure 101123397-A0202-02-0541-413
Figure 101123397-A0202-02-0542-414
Figure 101123397-A0202-02-0543-415
<210> 87
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 87
Figure 101123397-A0202-02-0543-416
Figure 101123397-A0202-02-0544-417
Figure 101123397-A0202-02-0545-418
<210> 88
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 88
Figure 101123397-A0202-02-0545-419
Figure 101123397-A0202-02-0546-420
Figure 101123397-A0202-02-0547-421
<210> 89
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 89
Figure 101123397-A0202-02-0547-422
Figure 101123397-A0202-02-0548-423
Figure 101123397-A0202-02-0549-424
<210> 90
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 90
Figure 101123397-A0202-02-0549-425
Figure 101123397-A0202-02-0550-426
Figure 101123397-A0202-02-0551-427
<210> 91
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 91
Figure 101123397-A0202-02-0551-428
Figure 101123397-A0202-02-0552-429
Figure 101123397-A0202-02-0553-430
<210> 92
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 92
Figure 101123397-A0202-02-0554-431
Figure 101123397-A0202-02-0555-432
<210> 93
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 93
Figure 101123397-A0202-02-0556-433
Figure 101123397-A0202-02-0557-434
Figure 101123397-A0202-02-0558-435
<210> 94
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 94
Figure 101123397-A0202-02-0558-436
Figure 101123397-A0202-02-0559-437
Figure 101123397-A0202-02-0560-438
<210> 95
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 95
Figure 101123397-A0202-02-0560-637
Figure 101123397-A0202-02-0561-440
Figure 101123397-A0202-02-0562-441
<210> 96
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 96
Figure 101123397-A0202-02-0562-442
Figure 101123397-A0202-02-0563-443
Figure 101123397-A0202-02-0564-444
<210> 97
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 97
Figure 101123397-A0202-02-0564-666
Figure 101123397-A0202-02-0565-446
Figure 101123397-A0202-02-0566-447
<210> 98
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 98
Figure 101123397-A0202-02-0566-448
Figure 101123397-A0202-02-0567-449
Figure 101123397-A0202-02-0568-450
<210> 99
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 99
Figure 101123397-A0202-02-0568-451
Figure 101123397-A0202-02-0569-452
Figure 101123397-A0202-02-0570-453
<210> 100
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 100
Figure 101123397-A0202-02-0570-454
Figure 101123397-A0202-02-0571-455
Figure 101123397-A0202-02-0572-456
<210> 101
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 101
Figure 101123397-A0202-02-0573-457
Figure 101123397-A0202-02-0574-458
<210> 102
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 102
Figure 101123397-A0202-02-0575-459
Figure 101123397-A0202-02-0576-460
Figure 101123397-A0202-02-0577-461
<210> 103
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 103
Figure 101123397-A0202-02-0577-462
Figure 101123397-A0202-02-0578-463
Figure 101123397-A0202-02-0579-465
<210> 104
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 104
Figure 101123397-A0202-02-0579-466
Figure 101123397-A0202-02-0580-467
Figure 101123397-A0202-02-0581-468
<210> 105
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 105
Figure 101123397-A0202-02-0581-469
Figure 101123397-A0202-02-0582-470
Figure 101123397-A0202-02-0583-471
<210> 106
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造的Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 106
Figure 101123397-A0202-02-0583-472
Figure 101123397-A0202-02-0584-473
<210> 107
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 107
Figure 101123397-A0202-02-0584-474
Figure 101123397-A0202-02-0585-475
Figure 101123397-A0202-02-0586-476
<210> 108
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 108
Figure 101123397-A0202-02-0586-477
Figure 101123397-A0202-02-0587-478
Figure 101123397-A0202-02-0588-479
<210> 109
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 109
Figure 101123397-A0202-02-0588-480
Figure 101123397-A0202-02-0589-481
Figure 101123397-A0202-02-0590-482
<210> 110
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 110
Figure 101123397-A0202-02-0590-483
Figure 101123397-A0202-02-0591-484
Figure 101123397-A0202-02-0592-485
<210> 111
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 111
Figure 101123397-A0202-02-0593-486
Figure 101123397-A0202-02-0594-487
<210> 112
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 112
Figure 101123397-A0202-02-0595-488
Figure 101123397-A0202-02-0596-489
Figure 101123397-A0202-02-0597-490
<210> 113
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 113
Figure 101123397-A0202-02-0597-491
Figure 101123397-A0202-02-0598-492
Figure 101123397-A0202-02-0599-493
<210> 114
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 114
Figure 101123397-A0202-02-0599-494
Figure 101123397-A0202-02-0600-495
Figure 101123397-A0202-02-0601-496
<210> 115
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 115
Figure 101123397-A0202-02-0601-497
Figure 101123397-A0202-02-0602-498
Figure 101123397-A0202-02-0603-499
<210> 116
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 116
Figure 101123397-A0202-02-0603-500
Figure 101123397-A0202-02-0604-501
Figure 101123397-A0202-02-0605-502
<210> 117
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 117
Figure 101123397-A0202-02-0605-503
Figure 101123397-A0202-02-0606-504
Figure 101123397-A0202-02-0607-505
<210> 118
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 118
Figure 101123397-A0202-02-0607-506
Figure 101123397-A0202-02-0608-507
Figure 101123397-A0202-02-0609-508
<210> 119
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 119
Figure 101123397-A0202-02-0609-509
Figure 101123397-A0202-02-0610-510
Figure 101123397-A0202-02-0611-511
<210> 120
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 120
Figure 101123397-A0202-02-0612-512
Figure 101123397-A0202-02-0613-513
<210> 121
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 121
Figure 101123397-A0202-02-0614-515
Figure 101123397-A0202-02-0615-516
Figure 101123397-A0202-02-0616-517
<210> 122
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 122
Figure 101123397-A0202-02-0616-518
Figure 101123397-A0202-02-0617-519
Figure 101123397-A0202-02-0618-521
<210> 123
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 123
Figure 101123397-A0202-02-0618-522
Figure 101123397-A0202-02-0619-523
Figure 101123397-A0202-02-0620-524
<210> 124
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 124
Figure 101123397-A0202-02-0620-525
Figure 101123397-A0202-02-0621-526
Figure 101123397-A0202-02-0622-527
<210> 125
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 125
Figure 101123397-A0202-02-0622-528
Figure 101123397-A0202-02-0623-529
Figure 101123397-A0202-02-0624-530
<210> 126
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 126
Figure 101123397-A0202-02-0624-531
Figure 101123397-A0202-02-0625-532
Figure 101123397-A0202-02-0626-533
<210> 127
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 127
Figure 101123397-A0202-02-0626-534
Figure 101123397-A0202-02-0627-535
Figure 101123397-A0202-02-0628-536
<210> 128
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 128
Figure 101123397-A0202-02-0628-537
Figure 101123397-A0202-02-0629-538
<210> 129
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 129
Figure 101123397-A0202-02-0629-539
Figure 101123397-A0202-02-0630-540
Figure 101123397-A0202-02-0631-541
<210> 130
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 130
Figure 101123397-A0202-02-0631-542
Figure 101123397-A0202-02-0632-543
Figure 101123397-A0202-02-0633-544
<210> 131
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 131
Figure 101123397-A0202-02-0633-545
Figure 101123397-A0202-02-0634-638
Figure 101123397-A0202-02-0635-547
<210> 132
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 132
Figure 101123397-A0202-02-0635-548
Figure 101123397-A0202-02-0636-549
Figure 101123397-A0202-02-0637-550
<210> 133
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 133
Figure 101123397-A0202-02-0637-551
Figure 101123397-A0202-02-0638-552
<210> 134
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 134
Figure 101123397-A0202-02-0639-553
Figure 101123397-A0202-02-0640-555
Figure 101123397-A0202-02-0641-556
<210> 135
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 135
Figure 101123397-A0202-02-0641-557
Figure 101123397-A0202-02-0642-558
Figure 101123397-A0202-02-0643-559
<210> 136
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 136
Figure 101123397-A0202-02-0643-560
Figure 101123397-A0202-02-0644-561
Figure 101123397-A0202-02-0645-562
<210> 137
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 137
Figure 101123397-A0202-02-0645-563
Figure 101123397-A0202-02-0646-564
Figure 101123397-A0202-02-0647-565
<210> 138
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 138
Figure 101123397-A0202-02-0647-566
Figure 101123397-A0202-02-0648-567
Figure 101123397-A0202-02-0649-568
<210> 139
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 139
Figure 101123397-A0202-02-0649-569
Figure 101123397-A0202-02-0650-570
Figure 101123397-A0202-02-0651-571
<210> 140
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 140
Figure 101123397-A0202-02-0651-572
Figure 101123397-A0202-02-0652-573
Figure 101123397-A0202-02-0653-574
<210> 141
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 141
Figure 101123397-A0202-02-0653-639
Figure 101123397-A0202-02-0654-576
Figure 101123397-A0202-02-0655-577
<210> 142
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 142
Figure 101123397-A0202-02-0655-578
Figure 101123397-A0202-02-0656-579
Figure 101123397-A0202-02-0657-580
<210> 143
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 143
Figure 101123397-A0202-02-0658-581
Figure 101123397-A0202-02-0659-582
<210> 144
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 144
Figure 101123397-A0202-02-0660-583
Figure 101123397-A0202-02-0661-584
Figure 101123397-A0202-02-0662-585
<210> 145
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 145
Figure 101123397-A0202-02-0662-586
Figure 101123397-A0202-02-0663-587
Figure 101123397-A0202-02-0664-589
<210> 146
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 146
Figure 101123397-A0202-02-0664-590
Figure 101123397-A0202-02-0665-591
Figure 101123397-A0202-02-0666-592
<210> 147
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 147
Figure 101123397-A0202-02-0666-593
Figure 101123397-A0202-02-0667-594
Figure 101123397-A0202-02-0668-595
<210> 148
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 148
Figure 101123397-A0202-02-0668-596
Figure 101123397-A0202-02-0669-597
Figure 101123397-A0202-02-0670-598
<210> 149
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 149
Figure 101123397-A0202-02-0670-599
Figure 101123397-A0202-02-0671-600
Figure 101123397-A0202-02-0672-601
<210> 150
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 150
Figure 101123397-A0202-02-0672-602
Figure 101123397-A0202-02-0673-603
Figure 101123397-A0202-02-0674-604
<210> 151
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 151
Figure 101123397-A0202-02-0674-605
Figure 101123397-A0202-02-0675-606
Figure 101123397-A0202-02-0676-607
<210> 152
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 152
Figure 101123397-A0202-02-0676-608
Figure 101123397-A0202-02-0677-609
Figure 101123397-A0202-02-0678-610
<210> 153
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 153
Figure 101123397-A0202-02-0679-612
Figure 101123397-A0202-02-0680-613
<210> 154
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 154
Figure 101123397-A0202-02-0681-614
Figure 101123397-A0202-02-0682-615
Figure 101123397-A0202-02-0683-616
<210> 155
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 155
Figure 101123397-A0202-02-0683-617
Figure 101123397-A0202-02-0684-618
Figure 101123397-A0202-02-0685-619
<210> 156
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 156
Figure 101123397-A0202-02-0685-620
Figure 101123397-A0202-02-0686-621
Figure 101123397-A0202-02-0687-622
<210> 157
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 157
Figure 101123397-A0202-02-0687-623
Figure 101123397-A0202-02-0688-624
Figure 101123397-A0202-02-0689-625
<210> 158
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 158
Figure 101123397-A0202-02-0689-627
Figure 101123397-A0202-02-0690-628
Figure 101123397-A0202-02-0691-629
<210> 159
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 159
Figure 101123397-A0202-02-0691-630
Figure 101123397-A0202-02-0692-631
Figure 101123397-A0202-02-0693-667

Claims (14)

  1. 一種多胜肽，包含Fc區且該Fc區係由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成，其特徵為：相較於由該Fc區僅包含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽及由該Fc區僅包含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，該Fc區的機能改變，其中，於該Fc區之CH2區，在選自於由EU編號231號的Ala、EU編號232號的Pro、EU編號233號的Glu、EU編號234號的Leu、EU編號235號的Leu、EU編號236號的Gly、EU編號237號的Gly、EU編號238號的Pro、EU編號239號的Ser、EU編號240號的Val、EU編號265號的Asp、EU編號266號的Val、EU編號267號的Ser、EU編號268號的His、EU編號269號的Glu、EU編號270號的Asp、EU編號271號的Pro、EU編號295號的Gln、EU編號296號的Tyr、EU編號298號的Ser、EU編號300號的Tyr、EU編號324號的Ser、EU編號325號的Asn、EU編號326號的Lys、EU編號327號的Ala、EU編號328號的Leu、EU編號329號的Pro、EU編號330號的Ala、EU編號331號的Pro、EU編號332號的Ile、EU編號333號的Glu、EU編號334號的Lys、EU編號335號的Thr、EU編號336號的Ile、及EU編號337號的Ser構成的群組中的胺基酸部位，導入至少一種以上的胺基酸變異，其中，該Fc區的機能的改變係對於Fc γ受體之結合活性增強，其中：(i)該Fc γ受體為Fc γ RIa，其中，構成該Fc區之第一 多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表2-1及表2-2之i區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於由說明書表2-1、表2-2及表2-3之ii區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異；(ii)該Fc γ受體為Fc γ RIIa R，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表3-1及表3-2之i區記載之胺基酸變異構成之群組中的至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於由說明書表3-1及表3-2之ii區記載之胺基酸變異所構成的群組中之至少1個以上的胺基酸變異；(iii)該Fc γ受體為Fc γ RIIa H，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於說明書表4之i區記載之胺基酸變異所構成的群組中之至少1個以上之胺基酸變異；或導入選自於由說明書表4之ii區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上之胺基酸變異；(iv)該Fc γ受體為Fc γ RIIb，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表5之i區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於說明書表5之ii區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或(v)該Fc γ受體為Fc γ RIIIa，其中，構成該Fc區之第 一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表6之i區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於由說明書表6之ii區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異。
  2. 一種多胜肽，包含Fc區且該Fc區係由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成，其特徵為：相較於由該Fc區僅包含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽及由該Fc區僅包含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，該Fc區的機能改變，其中，於該Fc區之CH2區，在選自於由EU編號231號的Ala、EU編號232號的Pro、EU編號233號的Glu、EU編號234號的Leu、EU編號235號的Leu、EU編號236號的Gly、EU編號237號的Gly、EU編號238號的Pro、EU編號239號的Ser、EU編號240號的Val、EU編號265號的Asp、EU編號266號的Val、EU編號267號的Ser、EU編號268號的His、EU編號269號的Glu、EU編號270號的Asp、EU編號271號的Pro、EU編號295號的Gln、EU編號296號的Tyr、EU編號298號的Ser、EU編號300號的Tyr、EU編號324號的Ser、EU編號325號的Asn、EU編號326號的Lys、EU編號327號的Ala、EU編號328號的Leu、EU編號329號的Pro、EU編號330號的Ala、EU編號331號的Pro、EU編號332號的Ile、EU編號333號的Glu、EU編號334號的Lys、EU編號335號的Thr、EU編號336號的Ile、及EU編號 337號的Ser構成的群組中的胺基酸部位，導入至少一種以上的胺基酸變異，其中，該Fc區的機能改變為對Fc γ受體之結合活性的選擇性提高，且該對於Fc γ受體之結合活性之選擇性的提高，係活性型Fc γ受體與抑制型Fc γ受體之間的選擇性，其中：(i)該活性型Fc γ受體為Fc γ RIa，且該抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIa之結合活性選擇性地增強，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表19-1、表19-2、表19-3及表19-4之a區記載之胺基酸變異所構成之群組之至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於由說明書表19-1、表19-2、表19-3、表19-4及表19-5之b區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；(ii)該活性型Fc γ受體為Fc γ RIa、該抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIa之結合活性選擇性地被減弱，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表23-1及表23-2之c區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於由說明書表23-1及表23-2之d區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；(iii)該活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa R、該抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於Fc γ RIIb，對於Fc γ RIIa R 之結合活性選擇性地被增強，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表20-1之a區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於由說明書表20-1、表20-2及表20-3之b區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；(iv)該活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa R、該抑制型Fc γ 受體為Fc γ RIIb，且相較於Fc γ RIIb，對Fc γ RIIa R之結合活性選擇性地被減弱，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表24-1之c區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於由說明書表24-1及表24-2之d區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；(v)該活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa H、該抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，相較於Fc γ RIIb，對Fc γ RIIa H之結合活性被選擇性地增強，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表21-1之a區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於由說明書表21-1、表21-2及表21-3之b區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；(vi)該活性型Fc γ受體為Fc γ RIIa H，該抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於Fc γ RIIb，對Fc γ RIIa H之 結合活性選擇性地被減弱，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表25-1及表25-2之c區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於由說明書表25-1、表25-2及表25-3之d區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；(vii)該活性型Fc γ受體為Fc γ RIIIa，該抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於Fc γ RIIb，對Fc γ RIIIa之結合活性被選擇性地增強，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表22-1之a區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於由說明書表22-1、表22-2及表22-3之b區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或(viii)該活性型Fc γ受體為Fc γ RIIIa，該抑制型Fc γ受體為Fc γ RIIb，且相較於Fc γ RIIb，對Fc γ RIIIa之結合活性選擇性地被減弱，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表26-1及表26-2之c區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或導入選自於由說明書表26-1、表26-2、表26-3及表26-4之d區記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異。
  3. 一種多胜肽，包含Fc區且該Fc區係由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成，其特徵為：相較於 由該Fc區僅包含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽及由該Fc區僅包含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，該Fc區的機能改變，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由以下構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異：EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y或Q、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號298號的胺基酸S取代為A、EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號327號的胺基酸A取代為D、EU編號328號的胺基酸L取代為W、EU編號330號的胺基酸A取代為M或K及EU編號334號的胺基酸K取代為E或L。
  4. 一種多胜肽，包含Fc區且該Fc區係由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成，其特徵為：相較於由該Fc區僅包含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽及由該Fc區僅包含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，該Fc區的機能改變，其中，於構成該Fc區之第一多胜肽或第二多胜肽中的一多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由以下構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異：EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y或Q、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的 胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號298號的胺基酸S取代為A及EU編號327號的胺基酸A取代為D、EU編號328號的胺基酸L取代為W及EU編號334號的胺基酸K取代為L構成之群組，另一多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由以下構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異：EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為M或K、EU編號334號的胺基酸K取代為E。
  5. 一種多胜肽，包含Fc區且該Fc區係由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體構成，其特徵為：相較於由該Fc區僅包含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽及由該Fc區僅包含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，該Fc區的機能改變，其中，於構成該Fc區之第一多胜肽或第二多胜肽中的一多胜肽之胺基酸序列中，導入(i)至(vi)中任一變異，另一多胜肽之胺基酸序列中，導入(vii)至(ix)中任一變異：(i)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號268號的胺基酸H取代為D及EU編號298號的胺基酸S取代為A；(ii)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基 酸D取代為E及EU編號298號的胺基酸S取代為A；(iii)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Q、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號270號的胺基酸D取代為E及EU編號298號的胺基酸S取代為A；(iv)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號298號的胺基酸S取代為A及EU編號327號的胺基酸A取代為D；(v)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號298號的胺基酸S取代為A及EU編號327號的胺基酸A取代為D；(vi)EU編號234號的胺基酸L取代為Y、EU編號235號的胺基酸L取代為Y、EU編號236號的胺基酸G取代為W、EU編號239號的胺基酸S取代為M、EU編號268號的胺基酸H取代為D、EU編號298號的胺基酸S取代為A、EU編號327號的胺基酸A取代為D、EU編號328號的胺基酸L取代為W及EU編號334號的胺基酸K取代為L；(vii)EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為M及EU編號334號的胺基酸K取代為E；(viii)EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號326 號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為M及EU編號334號的胺基酸K取代為E；或(ix)EU編號270號的胺基酸D取代為E、EU編號326號的胺基酸K取代為D、EU編號330號的胺基酸A取代為K及EU編號334號的胺基酸K取代為E。
  6. 一種多胜肽，其係包含Fc區且該Fc區由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體所構成，其特徵為：相較於由該Fc區僅包含第一多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽或由該Fc區僅包含第二多胜肽之同源二聚化體構成之多胜肽，該Fc區之機能改變，其中，該Fc區之機能改變係對於Fc γ受體的結合活性增強，其中：(i)該Fc γ受體為Fc γ RIa，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表31-1、表31-2及表31-3記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；(ii)該Fc γ受體為Fc γ RIIa R，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表32-1及表32-2記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；(iii)該Fc γ受體為Fc γ RIIa H，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表33-1及表33-2記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；(iv)該Fc γ受體為Fc γ RIIb，其中，構成該Fc區之第 一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表34-1及表34-2記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異；或(v)該Fc γ受體為Fc γ RIIIa，其中，構成該Fc區之第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由說明書表35-1及表35-2記載之胺基酸變異所構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異。
  7. 如申請專利範圍第6項之多胜肽，其中，該Fc區之機能改變更包含提高物理化學的安定性。
  8. 如申請專利範圍第7項之多胜肽，其中，該物理化學的安定性提高的改變，係指Fc區由包含第一多胜肽及第二多胜肽之異源二聚化體所構成之多胜肽，相較於該Fc區由僅含第一多胜肽之同源二聚化體所構成之多胜肽或該Fc區由僅含第二多胜肽之同源二聚化體所構成之多胜肽，具有較高之Tm。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之多胜肽，更導入用以對於第一多胜肽與第二多胜肽之等電點賦予差異的胺基酸改變。
  10. 如申請專利範圍第9項之多胜肽，其中，用於賦予等電點差異的胺基酸改變，係在第一多胜肽及/或第二多胜肽之胺基酸序列中，於選自於由EU編號137號的Gly、138號的Gly、139號的Thr、147號的Lys、192號的Ser、193號的Leu、196號的Gln、198號的Tyr、199號的Ile、203號的Asn、214號的Lys、263號的Val、272號的Glu、 274號的Lys、278號的Tyr、288號的Lys、290號的Lys、316號的Gly、317號的Lys、320號的Lys、324號的Lys、335號的Thr、337號的Ser、340號的Lys、358號的Leu、360號的Lys、362號的Gln、364號的Ser、383號的Ser、384號的Asn、385號的Gly、386號的Gln、387號的Pro、390號的Asn、397號的Val及422號的Val構成之群組中之胺基酸部位中導入至少1個胺基酸變異。
  11. 如申請專利範圍第9項之多胜肽，其中，用於賦予等電點差異之胺基酸改變，係於第一多胜肽或第二多胜肽中的一多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由EU編號196號的Gln、199號的Ile、263號的Val、272號的Glu、316號的Gly、358號的Leu、364號的Ser、383號的Ser、387號的Pro及397號的Val構成之群組中之至少1個以上的胺基酸變異，並於另一多胜肽之胺基酸序列中，導入選自於由EU編號137號的Gly、138號的Gly、139號的Thr、147號的Lys、192號的Ser、193號的Leu、198號的Tyr、199號的Ile、203號的Asn、214號的Lys、274號的Lys、278號的Tyr、288號的Lys、290號的Lys、316號的Gly、317號的Lys、320號的Lys、324號的Lys、335號的Thr、337號的Ser、340號的Lys、358號的Leu、360號的Lys、362號的Gln、383號的Ser、384號的Asn、385號的Gly、386號的Gln、390號的Asn及422號的Val構成之群組中之至少1個的胺基酸變異。
  12. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之多胜肽， 其中，該多胜肽為抗原結合分子。
  13. 如申請專利範圍第12項之多胜肽，其中，該抗原結合分子為抗體、雙專一性抗體、胜肽Fc融合蛋白質、或支架Fc融合蛋白質等Fc融合分子。
  14. 一種醫藥組合物，其係包含如申請專利範圍第12或13項之多胜肽及醫學的可容許之載體。
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