JP2017043608A - ヘテロ二量化ポリペプチド - Google Patents

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Abstract

【課題】ＦｃγＲに対する結合を最適化した、Ｆｃ領域のより優れた機能改変方法の提供。
【解決手段】アミノ酸配列の異なる２つのポリペプチド（第一のポリペプチド及び第二のポリペプチド）から成るＦｃ領域を有するヘテロ二量化ポリペプチドを作製することにより、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみからなるホモ二量化体又は第二のポリペプチドから成るホモ二量化体と比べて、Ｆｃ領域の機能が改善されたＦｃ領域を含むヘテロ二量化ポリペプチド。
【選択図】なし

Description

本発明は、天然由来の抗体定常領域からアミノ酸配列が改変された抗体定常領域、該定常領域を含む抗体、該抗体を含む医薬組成物、ならびに、それらの製造方法を提供する。
抗体は血中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている（非特許文献１、非特許文献２）。現在上市されている抗体医薬のほとんどがヒトIgG1サブクラスの抗体である。IgGクラスの抗体のエフェクター機能である抗体依存性細胞障害活性（以下、ADCCと表記する）、補体依存性細胞障害活性（以下、CDCと表記する）については、これまでに多数の研究が行われ、ヒトIgGクラスでは、IgG1サブクラスの抗体が最も高いADCC活性、CDC活性を有することが報告されている（非特許文献３）。また、IgGクラスの抗体を介した標的細胞のファゴサイトーシスである抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシス（ADCP）も抗体のエフェクター機能の一つとして示されている（非特許文献４、非特許文献５）。
IgG抗体のADCC、CDC、ADCPの発現には、抗体Fc領域と、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等のエフェクター細胞表面上に存在する抗体レセプター（以下、FcγRと表記する）及び各種補体成分との結合が必要である。ヒトでは、FcγRのタンパク質ファミリーには、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIbのアイソフォームが報告されており、それぞれのアロタイプも報告されている（非特許文献６）。
ADCC、ADCPおよびCDCなどの細胞傷害性エフェクター機能の増強は、抗体の抗腫瘍効果を増強するための有望な手段として注目されている。抗体の抗腫瘍効果のためのFcγRを介したエフェクター機能の重要性は、マウスモデルを使って報告されている（非特許文献７、非特許文献８）。また、ヒトにおける臨床効果と、FcγRIIIaの高親和性多型アロタイプ（V158）と低親和性多型アロタイプ（F158）との間には相関が観察された（非特許文献９）。これらの報告から、特定のFcγRに対する結合を最適化したFc領域を有する抗体は、より強力なエフェクター機能を媒介し、それにより効果的な抗腫瘍効果を発揮することが示される。
FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIbからなる活性化受容体、FcγRIIbからなる阻害性受容体のそれぞれに対する抗体の結合活性のバランスは、抗体のエフェクター機能を最適化する上で重要な要素である。活性化受容体に対する結合活性を増強し、阻害性受容体に対しては結合活性を低減したFc領域を用いることで、最適なエフェクター機能を抗体に付与できる可能性がある（非特許文献１０）。また、逆に、活性化受容体に対する結合活性を維持あるいは低減し、阻害性受容体に対しては結合活性を増強したFc領域を用いることで、免疫抑制作用を抗体に付与できる可能性がある（非特許文献 １１）。Fc領域とFcγRの結合については、抗体のヒンジ領域及びCH2ドメイン内のいくつかのアミノ酸残基およびCH2ドメインに結合しているEUナンバリング297番目のAsnに付加される糖鎖が重要であることが示されている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４）。この結合箇所を中心に、これまでに様々なFcγR結合特性を持つFc領域の変異体がこれまでに研究され、より高い活性化FcγR結合活性を有するFc領域変異体が得られている（特許文献１、特許文献２）。例えば、Lazarらは、ヒトIgG1のEUナンバリング239番目のSer、330のAla、332のIleをそれぞれAsp、Leu、Gluに置換することで、ヒトFcγRIIIa(V158)への結合を約370倍まで増加させることに成功している（非特許文献１５、特許文献２）。この改変体は野生型と比べて、FcγRIIIaとFcγIIbに対する結合の比 (A/I比)が約9倍になっている。また、LazarらはFcγIIbに対する結合を約430倍増強させることにも成功している（非特許文献１６）。ShinkawaらはEUナンバリング297番目のAsnに付加される糖鎖のフコースを欠損させることで、FcγRIIIaに対する結合を約100倍まで増加させることに成功している（非特許文献１７）。
しかしながら、これまでに報告されている抗体のFc領域の機能改変には限界があり、より優れたFc領域の機能改変が求められていた。
WO 2000/042072 WO 2006/019447 WO 2009/041062 WO 2006/106905
Nature Biotechnology, 23, 1073 - 1078 (2005) Eur. J. Pharm. Biopharm, 59(3), 389-96 (2005) Chemical Immunology, 65, 88 (1997) Cancer Res., 68, 8049-8057 (2008) Blood, 113,3735-3743 (2009) Immunol. Lett. 82, 57-65 (2002) Pro. Nat. Acad. Sci. 95:652-656 (1998) Nature Medicine, 6: 443-446 (2000) Blood 99:754-758 (2002) Science, 310, 1510-1512 (2005) Science, 291, 484-486 (2001) Chemical Immunology, 65, 88 (1997) Eur. J. Immunol. 23, 1098 (1993) Immunology, 86, 319 (1995) Pro. Nat. Acad. Sci., 103, 4005-4010 (2006) Mol. Immun. 45, 3926-3933 (2008) J. Biol. Chem., 278, 3466-3473(2003)
本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その課題は従来のホモ二量化体であって、Fc領域を有するポリペプチドと比較して、該Fc領域の機能が改善したポリペプチド、該ポリペプチドを含有する医薬組成物、該医薬組成物を含有する免疫炎症性疾患の治療剤又は予防剤、各種の癌の治療剤又は予防剤、及びこれらの製造方法を提供することにある。さらに、本発明の課題は従来のホモ二量化体であって、Fc領域を有するポリペプチドと比較して、該Fc領域の機能を改善する方法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、アミノ酸配列の異なる２つのポリペプチド（第一のポリペプチド及び第二のポリペプチド）から成るＦｃ領域を有するヘテロ二量化ポリペプチドを作製することにより、従来技術である該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみからなるホモ二量化体又は第二のポリペプチドから成るホモ二量化体と比べて、Ｆｃ領域の機能が改善されたＦｃ領域を含むヘテロ二量化ポリペプチドを作製することに成功した。
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔７８〕を提供するものである。
〔１〕Ｆｃ領域を含み、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドであって、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチド及び該Ｆｃ領域が第二のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドと比べて、該Ｆｃ領域の機能が改変されていることを特徴とするポリペプチド。
〔２〕前記Ｆｃ領域において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔１〕に記載のポリペプチド。
〔３〕前記アミノ酸変異が、変異を導入しない場合及び第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドの両方のFc領域に変異が導入された場合と比較して、一方のFc領域にのみに変異が導入された場合の方が、該Fc領域の機能が向上するアミノ酸変異を少なくとも１つ含む、〔１〕又は〔２〕に記載のポリペプチド。
〔４〕前記Ｆｃ領域のＣＨ２領域において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔２〕又は〔３〕に記載のポリペプチド。
〔５〕前記Ｆｃ領域のＣＨ２領域において、EUナンバリング23１番目のAla、EUナンバリング232番目のPro、EUナンバリング233番目のGlu、EUナンバリング234番目のLeu、EUナンバリング235番目のLeu、EUナンバリング236番目のGly、EUナンバリング237番目のGly、EUナンバリング238番目のPro、EUナンバリング239番目のSer、EUナンバリング240番目のVal、EUナンバリング265番目のAsp、EUナンバリング266番目のVal、EUナンバリング267番目のSer、EUナンバリング268番目のHis、EUナンバリング269番目のGlu、EUナンバリング270番目のAsp、EUナンバリング271番目のPro、EUナンバリング295番目のGln、EUナンバリング296番目のTyr、EUナンバリング298番目のSer、EUナンバリング300番目のTyr、EUナンバリング324番目のSer、EUナンバリング325番目のAsn、EUナンバリング326番目のLys、EUナンバリング327番目のAla、EUナンバリング328番目のLeu、EUナンバリング329番目のPro、EUナンバリング330番目のAla、EUナンバリング331番目のPro、EUナンバリング332番目のIle、EUナンバリング333番目のGlu、EUナンバリング334番目のLys、EUナンバリング335番目のThr、EUナンバリング336番目のIle、及びEUナンバリング337番目のSerからなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔４〕に記載のポリペプチド。
〔６〕前記Ｆｃ領域の機能の改変がFcγレセプターに対する結合活性の増強、及び、結合の選択性の向上からなる群より選択される少なくとも一つ以上の改変であることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔７〕前記Ｆｃ領域の機能の改変がFcγレセプターに対する結合活性の増強であることを特徴とする、〔６〕に記載のポリペプチド。
〔８〕前記FcγレセプターがFcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIb 、及びFcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも１つ以上のレセプターであることを特徴とする、〔７〕に記載のポリペプチド。
〔９〕前記Fcγレセプターが、FcγRIaであることを特徴とする、〔８〕に記載のポリペプチド。
〔１０〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２−１及び表２−２の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔９〕に記載のポリペプチド。
〔１１〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２−１、表２−２及び表２−３の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔９〕に記載のポリペプチド。
〔１２〕前記Fcγレセプターが、FcγRIIa Rであることを特徴とする、〔８〕に記載のポリペプチド。
〔１３〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３−１及び表３−２の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔１２〕に記載のポリペプチド。
〔１４〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３−１及び表３−２の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔１２〕に記載のポリペプチド。
〔１５〕前記Fcγレセプターが、FcγRIIa Hであることを特徴とする、〔８〕に記載のポリペプチド。
〔１６〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表４の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔１５〕に記載のポリペプチド。
〔１７〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表４の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔１５〕に記載のポリペプチド。
〔１８〕前記Fcγレセプターが、FcγRIIbであることを特徴とする、〔８〕に記載のポリペプチド。
〔１９〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表５の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔１８〕に記載のポリペプチド。
〔２０〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表５の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔１８〕に記載のポリペプチド。
〔２１〕前記Fcγレセプターが、FcγRIIIaであることを特徴とする、〔８〕に記載のポリペプチド。
〔２２〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表６の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔２１〕に記載のポリペプチド。
〔２３〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表６の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔２１〕に記載のポリペプチド。
〔２４〕前記Ｆｃ領域の機能の改変がFcγレセプターに対する結合活性の選択性の向上であることを特徴とする、〔６〕に記載のポリペプチド。
〔２５〕前記Fcγレセプターに対する結合活性の選択性の向上が、活性型Ｆｃγレセプターと阻害型Ｆｃγレセプターとの間の選択性であることを特徴とする、〔２４〕に記載のポリペプチド。
〔２６〕前記Ｆｃγレセプターにおいて、活性型ＦｃγレセプターがFcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、及びFcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも１つ以上のレセプターであり、阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであることを特徴とする、〔２５〕に記載のポリペプチド。
〔２７〕前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIaであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、FcγRIIbに比べてFcγRIaに対する結合活性が選択的に増強されたことを特徴とする、〔２６〕に記載のポリペプチド。
〔２８〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表１９−１、表１９−２、表１９−３及び表１９−４の領域aに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔２７〕に記載のポリペプチド。
〔２９〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表１９−１、表１９−２、表１９−３、表１９−４及び表１９−５の領域bに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔２７〕に記載のポリペプチド。
〔３０〕前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIaであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、FcγRIIbに比べてFcγRIaに対する結合活性が選択的に減弱されたことを特徴とする、〔２６〕に記載のポリペプチド。
〔３１〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２３−１及び表２３−２の領域cに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔３０〕に記載のポリペプチド。
〔３２〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２３−１及び表２３−２の領域dに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔３０〕に記載のポリペプチド。
〔３３〕前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIa Rであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、FcγRIIbに比べてFcγRIIa Rに対する結合活性が選択的に増強されたことを特徴とする、〔２６〕に記載のポリペプチド。
〔３４〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２０−１の領域aに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔３３〕に記載のポリペプチド。
〔３５〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２０−１、表２０−２及び表２０−３の領域bに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔３３〕に記載のポリペプチド。
〔３６〕前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIa Rであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、FcγRIIbに比べてFcγRIIa Rに対する結合活性が選択的に減弱されたことを特徴とする、〔２６〕に記載のポリペプチド。
〔３７〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２４−１の領域cに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔３６〕に記載のポリペプチド。
〔３８〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２４−１及び表２４−２の領域dに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔３６〕に記載のポリペプチド。
〔３９〕前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIa Hであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、FcγRIIbに比べてFcγRIIa Hに対する結合活性が選択的に増強されたことを特徴とする、〔２６〕に記載のポリペプチド。
〔４０〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２１−１の領域aに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔３９〕に記載のポリペプチド。
〔４１〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２１−１、表２１−２及び表２１−３の領域bに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔３９〕に記載のポリペプチド。
〔４２〕前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIa Hであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、FcγRIIbに比べてFcγRIIa Hに対する結合活性が選択的に減弱されたことを特徴とする、〔２６〕に記載のポリペプチド。
〔４３〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２５−１及び表２５−２の領域cに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔４２〕に記載のポリペプチド。
〔４４〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２５−１、表２５−２及び表２５−３の領域dに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔４２〕に記載のポリペプチド。
〔４５〕前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIIaであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、FcγRIIbに比べてFcγRIIIaに対する結合活性が選択的に増強されたことを特徴とする、〔２６〕に記載のポリペプチド。
〔４６〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２２−１の領域aに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔４５〕に記載のポリペプチド。
〔４７〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２２−１、表２２−２及び表２２−３の領域bに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔４５〕に記載のポリペプチド。
〔４８〕前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIIaであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、FcγRIIbに比べてFcγRIIIaに対する結合活性が選択的に減弱されたことを特徴とする、〔２６〕に記載のポリペプチド。
〔４９〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２６−１及び表２６−２の領域cに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔４８〕に記載のポリペプチド。
〔５０〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２６−１、表２６−２、表２６−３及び表２６−４の領域dに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔４８〕に記載のポリペプチド。
〔５１〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのY又はQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換、EUナンバリング328番目のアミノ酸LからWへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからM又はKへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからE又はLへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔１〕、〔２１〕又は〔４５〕に記載のポリペプチド。
〔５２〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング234番目のLeu、235番目のLeu、236番目のGly、239番目のSer、268番目のHis、270番目のAsp、298番目のSer、EUナンバリング326番目のLys、327番目のAla、328番目のLeu、330番目のAla及び334番目のLysから選択される、少なくとも一つのアミノ酸に変異が導入されていることを特徴とする、〔１〕、〔２１〕又は〔４５〕に記載のポリペプチド。
〔５３〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング234番目のLeu、235番目のLeu、236番目のGly、239番目のSer、268番目のHis、270番目のAsp、298番目のSer、327番目のAla、328番目のLeu及び334番目のLysから選択される、少なくとも一つのアミノ酸に変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング270番目のAsp、EUナンバリング326番目のLys、330番目のAla及び334番目のLysから選択される、少なくとも一つのアミノ酸に変異が導入されていることを特徴とする、〔１〕、〔２１〕又は〔４５〕に記載のポリペプチド。
〔５４〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからY又はQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換及びEUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換、EUナンバリング328番目のアミノ酸LからWへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからLへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからM又はKへの置換、EUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔１〕、〔２１〕又は〔４５〕に記載のポリペプチド。
〔５５〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、(i)から(vi)のいずれかの変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、(vii)から(ix)のいずれかの変異が導入されている、〔１〕、〔２１〕又は〔４５〕に記載のポリペプチド：
(i) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
（ｉｉ） EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
(iii) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからＱへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
(iv) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換及びEUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換
(v) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換及びEUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換
(vi) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換、EUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換、EUナンバリング328番目のアミノ酸LからWへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからLへの置換
(vii) EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからMへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換
(viii) EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからMへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換
(ix) EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからKへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換。
〔５６〕Ｆｃ領域を含み、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドであって、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチド又は該Ｆｃ領域が第二のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドと比べて、該Ｆｃ領域の機能が改変されていることを特徴とするポリペプチド。
〔５７〕前記Ｆｃ領域の機能の改変が、ポリペプチドのFcγレセプターに対する結合活性の増強、結合の減弱、及び、結合の選択性の向上からなる群より選択される少なくとも一つ以上の改変であることを特徴とする、〔５６〕に記載のポリペプチド。
〔５８〕前記Ｆｃ領域の機能の改変が、さらに物理化学的安定性が向上するという改変であることを特徴とする、〔５７〕に記載のポリペプチド。
〔５９〕前記物理化学的安定性が向上するという改変は、Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドが、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチド又は該Ｆｃ領域が第二のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドと比べて、高いＴｍを有することを特徴とする〔５８〕に記載のポリペプチド。
〔６０〕前記Ｆｃ領域の機能の改変がFcγレセプターに対する結合活性の増強であり、該Fcγレセプターが、FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIb 、及びFcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも１つ以上のレセプターであることを特徴とする、〔５７〕〜〔５９〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔６１〕前記Fcγレセプターが、FcγRIaであることを特徴とする、〔６０〕に記載のポリペプチド。
〔６２〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３１−１、表３１−２及び表３１−３に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔６１〕に記載のポリペプチド。
〔６３〕前記Fcγレセプターが、FcγRIIa Rであることを特徴とする、〔６０〕に記載のポリペプチド。
〔６４〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３２−１及び表３２−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔６３〕に記載のポリペプチド。
〔６５〕前記Fcγレセプターが、FcγRIIa Hであることを特徴とする、〔６０〕に記載のポリペプチド。
〔６６〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３３−１及び表３３−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔６５〕に記載のポリペプチド。
〔６７〕前記Fcγレセプターが、FcγRIIbであることを特徴とする、〔６０〕に記載のポリペプチド。
〔６８〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３４−１及び表３４−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔６７〕に記載のポリペプチド。
〔６９〕前記Fcγレセプターが、FcγRIIIaであることを特徴とする、〔６０〕に記載のポリペプチド。
〔７０〕前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３５−１及び表３５−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔６９〕に記載のポリペプチド。
〔７１〕更に第一のポリペプチドと第二のポリペプチドの等電点に差を付与させるためのアミノ酸改変が導入されている、〔１〕から〔７０〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔７２〕等電点の差を付与するためのアミノ酸改変が、第一のポリペプチド及び/又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１３７番目のGly、１３８番目のGly、１３９番目のThr、１４７番目のLys、１９２番目のSer、１９３番目のLeu、１９６番目のGln、１９８番目のTyr、１９９番目のIle、２０３番目のAsn、２１４番目のLys、２６３番目のVal、２７２番目のGlu、２７４番目のLys、２７８番目のTyr、２８８番目のLys、２９０番目のLys、３１６番目のGly、３１７番目のLys、３２０番目のLys、３２４番目のLys、３３５番目のThr、３３７番目のSer、３４０番目のLys、３５８番目のLeu、３６０番目のLys、３６２番目のGln、３６４番目のSer、３８３番目のSer、３８４番目のAsn、３８５番目のGly、３８６番目のGln、３８７番目のPro、３９０番目のAsn、３９７番目のVal及び４２２番目のValからなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔７１〕に記載のポリペプチド。
〔７３〕等電点の差を付与するためのアミノ酸改変が、第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１９６番目のGln、１９９番目のIle、２６３番目のVal、２７２番目のGlu、３１６番目のGly、３５８番目のLeu、３６４番目のSer、３８３番目のSer、３８７番目のPro及び３９７番目のValからなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１３７番目のGly、１３８番目のGly、１３９番目のThr、１４７番目のLys、１９２番目のSer、１９３番目のLeu、１９８番目のTyr、１９９番目のIle、２０３番目のAsn、２１４番目のLys、２７４番目のLys、２７８番目のTyr、２８８番目のLys、２９０番目のLys、３１６番目のGly、３１７番目のLys、３２０番目のLys、３２４番目のLys、３３５番目のThr、３３７番目のSer、３４０番目のLys、３５８番目のLeu、３６０番目のLys、３６２番目のGln、３８３番目のSer、３８４番目のAsn、３８５番目のGly、３８６番目のGln、３９０番目のAsn及び４２２番目のValからなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、〔７１〕に記載のポリペプチド。
〔７４〕前記ポリペプチドが、抗原結合分子であることを特徴とする、〔１〕〜〔７３〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔７５〕前記抗原結合分子が、抗体、二重特異性抗体、ペプチドFc融合タンパク質、又はスキャッフォールドFc融合タンパク質などのFc融合分子であることを特徴とする、〔７４〕に記載のポリペプチド。
〔７６〕〔７４〕又は〔７５〕に記載のポリペプチド及び医学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
〔７７〕Ｆｃ領域を含むポリペプチドの機能を改変する方法であって、該Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドにアミノ酸変異を導入することにより該Ｆｃ領域をヘテロ二量体とし、アミノ酸変異の導入により該Ｆｃ領域がホモ二量体となった場合に比べてＦｃ領域の機能を改変する工程を含む、ポリペプチドの機能を改変する方法。
〔７８〕Ｆｃ領域を含むポリペプチドを製造する方法であって、該Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドにアミノ酸変異を導入することにより該Ｆｃ領域をヘテロ二量体とし、アミノ酸変異の導入により該Ｆｃ領域がホモ二量体となった場合に比べてＦｃ領域の機能を改変する工程を含む、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを製造する方法。
本発明により、抗体の定常領域のアミノ酸配列を改変することで結合活性が改変され、及び物性（例えば、安定性、均一性）が改善された、医薬品として適したポリペプチドが提供される。
Fc領域とFcRnとの複合体の構造を示す図である。FcRnは抗体の各H鎖のCH2およびCH3に結合し、抗体全体に対しては対称的に結合している。 IgAとIgA receptorであるFcαRとの複合体の構造を示す図である。FcαRはIgAの各H鎖のCα2およびCα3に結合し、抗体全体に対しては対称的に結合している。 Fc領域とFcγRIIIとの複合体の構造を示す図である。H鎖、CH2、CH3のそれぞれについて、図の向かって左側をHA鎖、CHA2、CHA3、右側をHB鎖、CHB2、CHB3と呼ぶ。 各H鎖におけるA327のFcγRIIIとの相互作用の詳細を示す図である。(A)はCHA2におけるA327とFcγRIIIとの相互作用を示す。（B）はCHB2HBにおけるA327とFcγRIIIとの相互作用を示す。FcγRIII上の色は、それぞれ、黒色：塩基性部位、灰色：中性部位、白：酸性部位を示す。 D356K、H435R、K439Eを導入した抗体のFcγRに対する結合活性の比較を示す図である。GpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）の各FcγRに対する結合活性を100とした。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）、GpH7-A5/GpL16-k0（配列番号：３、５）である。 G237Aを導入した抗体のFcγRに対する結合活性の比較を示す図である。GpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）の各FcγRに対する結合活性を100とした。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）、GpH7-A5/GpL16-k0（配列番号：３、５）、GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：６、４、５）、GpH7-A26/GpL16-k0（配列番号：６、５）である。 G237Lを導入したヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体のFcγRに対する結合活性の比較を示す図である。GpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）の各FcγRに対する結合活性を100とした。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）、GpH7-A5/GpL16-k0（配列番号：３、５）、GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：７、４、５）、GpH7-A29/GpL16-k0（配列番号：７、５）である。 L328Eを導入したヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体のFcγRに対する結合活性の比較を示す図である。GpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）の各FcγRに対する結合活性を100とした。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）、GpH7-A5/GpL16-k0（配列番号：３、５）、GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：８、４、５）、GpH7-A42/GpL16-k0（配列番号：８、５）、である。 L328Dを導入したヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体のFcγRに対する結合活性の比較を示す図である。GpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）の各FcγRに対する結合活性を100とした。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）、GpH7-A5/GpL16-k0（配列番号：３、５）、GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：９、４、５）、GpH7-A43/GpL16-k0（配列番号：９、５）、である。 L234Eを導入したヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体のFcγRに対する結合活性の比較を示す図である。GpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）の各FcγRに対する結合活性を100とした。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）、GpH7-A5/GpL16-k0（配列番号：３、５）、GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0（配列番号：３、１０、５）、GpH7-B16/GpL16-k0（配列番号：１０、５）である。 L234Dを導入したヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体のFcγRに対する結合活性の比較を示す図である。GpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）の各FcγRに対する結合活性を100とした。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）、GpH7-A5/GpL16-k0（配列番号：３、５）、GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0（配列番号：３、１１、５）、GpH7-B17/GpL16-k0（配列番号：１１、５）である。 Fc領域におけるP329とFcγRIIIとの相互作用を示す図である。H鎖、CH2、CH3のそれぞれについて、図の向かって左側をHA鎖、CHA2、CHA3、右側をHB鎖、CHB2、CHB3と呼ぶ。Fc領域におけるEUナンバリング329番目のProがFcγRIIIとの主に一方のCH2ドメインであるCHA2で相互作用していることを示した図である。H鎖、CH2、CH3のそれぞれについて、図の向かって左側をHA鎖、CHA2、CHA3、右側をHB鎖、CHB2、CHB3と呼ぶ。 P329R、P329K、P329D、P329Eを導入したヘテロ二量化抗体およびホモ二量化抗体のFcγRに対する結合活性に与える効果の比較を示す図である。GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）の各FcγRに対する結合活性を100とした。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0（配列番号：３、１２、５）、GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0（配列番号：３、１３、５）、GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0（配列番号：３、１４、５）、GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0（配列番号：３、１５、５）、GpH7-B12/GpL16-k0（配列番号：１２、５）、GpH7-B13/GpL16-k0（配列番号：１３、５）、GpH7-B14/GpL16-k0（配列番号：１４、５）、GpH7-B15/GpL16-k0（配列番号：１５、５）である。 G237Aが一方のH鎖に導入されたヘテロ二量化抗体に対して、P329Rを同じH鎖または異なるH鎖に導入した際の各FcγRに対する結合活性を比較した図である。GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）の各FcγRに対する結合活性を100とした。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0（配列番号：３、１２、５）、GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：１６、４、５）、GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：６、４、５）、GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0（配列番号：６、１２、５）、GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：１７、４、５）である。 L234Dが一方のH鎖に導入されたヘテロ二量化抗体に対して、P329Rを同じH鎖または異なるH鎖に導入した際の各FcγRに対する結合活性を比較した図である。GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）の各FcγRに対する結合活性を100とした。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0（配列番号：３、１２、５）、GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：１６、４、５）、GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0（配列番号：３、１１、５）、GpH7-A48/GpH7-B17/GpL16-k0（配列番号：１６、１１、５）、GpH7-A5/GpH7-B41/GpL16-k0（配列番号：３、１８、５）である。 同一の改変を導入したヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体のFcγRIaに対する結合活性を比較した図である。横軸にHo/Con、縦軸にHe/Coの値を示した。He/Conは変異を導入したGpH7-B3 variantを一方のH鎖に用いたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRIaに対する結合活性を、変異を導入していないGpH7-B3を用いたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）のFcγRIaに対する結合活性で割った値に100を乗じた値である。Ho/Conは変異を導入したGpH7-B3 variantを両方のH鎖に用いたホモ二量化抗体GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRIaに対する結合活性の値を、変異を導入していないGpH7-B3を用いたホモ二量化抗体GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）のFcγRIaに対する結合活性の値で割った値に100を乗じた値である。 同一の改変を導入したヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体のFcγRIIa Rに対する結合活性を比較した図である。横軸にHo/Con、縦軸にHe/Coの値を示した。He/Conは変異を導入したGpH7-B3 variantを一方のH鎖に用いたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRIIa Rに対する結合活性を、変異を導入していないGpH7-B3を用いたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）のFcγRIIa Rに対する結合活性で割った値である。Ho/Conは変異を導入したGpH7-B3 variantを両方のH鎖に用いたホモ二量化抗体GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRIIa Rに対する結合活性の値を、変異を導入していないGpH7-B3を用いたホモ二量化抗体GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）のFcγRIIa Rに対する結合活性の値で割った値に100を乗じた値である。 同一の改変を導入したヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体のFcγRIIa Hに対する結合活性を比較した図である。横軸にHo/Con、縦軸にHe/Coの値を示した。He/Conは変異を導入したGpH7-B3 variantを一方のH鎖に用いたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRIIa Hに対する結合活性を、変異を導入していないGpH7-B3を用いたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）のFcγRIIa Hに対する結合活性で割った値である。Ho/Conは変異を導入したGpH7-B3 variantを両方のH鎖に用いたホモ二量化抗体GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRIIa Hに対する結合活性の値を、変異を導入していないGpH7-B3を用いたホモ二量化抗体GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）のFcγRIIa Hに対する結合活性の値で割った値に100を乗じた値である。 同一の改変を導入したヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体のFcγRIIbに対する結合活性を比較した図である。横軸にHo/Con、縦軸にHe/Coの値を示した。He/Conは変異を導入したGpH7-B3 variantを一方のH鎖に用いたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRIIbに対する結合活性を、変異を導入していないGpH7-B3を用いたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）のFcγRIIbに対する結合活性で割った値である。Ho/Conは変異を導入したGpH7-B3 variantを両方のH鎖に用いたホモ二量化抗体GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRIIbに対する結合活性の値を、変異を導入していないGpH7-B3を用いたホモ二量化抗体GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）のFcγRIIbに対する結合活性の値で割った値に100を乗じた値である。 同一の改変を導入したヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体のFcγRIIIaに対する結合活性を比較した図である。横軸にHo/Con、縦軸にHe/Coの値を示した。横軸にHo/Con、縦軸にHe/Coの値を示した。He/Conは変異を導入したGpH7-B3 variantを一方のH鎖に用いたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRIIIaに対する結合活性を、変異を導入していないGpH7-B3を用いたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）のFcγRIIIaに対する結合活性で割った値である。Ho/Conは変異を導入したGpH7-B3 variantを両方のH鎖に用いたホモ二量化抗体GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRIIIaに対する結合活性の値を、変異を導入していないGpH7-B3を用いたホモ二量化抗体GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）のFcγRIIIaに対する結合活性の値で割った値に100を乗じた値である。 改変を導入したH鎖を用いたヘテロ二量化抗体、ホモ二量化抗体のそれぞれにおけるFcγR結合を比較した概念図である。プロットした点がiの領域に含まれた場合、Fc領域に導入した改変がHe/Con > 100、 Ho/Con <100、He/Con > Ho/Conとなる効果を有することを意味する。プロットした点がiiの領域に含まれた場合、Fc領域に導入した改変がHe/Con > 100、 Ho/Con >100、He/Con > Ho/Conとなる効果を有することを意味する。プロットした点がiiiの領域に含まれた場合、Fc領域に導入した改変改変がHe/Con > 100、 Ho/Con >100、He/Con < Ho/Conとなる効果を有することを意味する。 三種類の改変をヘテロ二量化抗体のいずれかのH鎖に導入する場合の組み合わせの数を示した図である。●（黒丸）、▲（黒三角）、■（黒四角）のそれぞれは異なる改変であることを意味する。 抗体のFc領域におけるS239、A330、I332の各残基とFcγRIIIとの相互作用を示す図である。Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 4005-4010, 2006より引用。 活性型FcγRと抑制型FcγRに対する結合活性の比較を示す図である。各改変体の活性型FcγRと抑制型FcγRに対する結合活性を比較した概念図である。各改変体の活性型FcγR (Activating Receptor)に対する活性を縦軸、抑制型FcγR (Inhibitory Receptor)に対する結合活性を横軸にとり、天然型抗体の活性型FcγRと抑制型FcγRに対する結合活性をそれぞれ100とした。改変体の活性型FcγRに対する結合活性が天然型抗体より増強し、抑制型FcγRに対する結合活性が低下した抗体はaの領域（網かけ部分）にプロットされる。改変体の抑制型FcγRに対する結合活性が天然型抗体より増強し、活性型FcγRに対する結合活性が低下した抗体はcの領域（斜線部分）にプロットされる。 活性型FcγRと抑制型FcγRに対する結合活性の比較を示す図である。各改変体の活性型FcγRと抑制型FcγRに対する結合活性を比較した概念図である。活性型FcγR (Activating Receptor)に対する天然型抗体の結合活性を縦軸、抑制型FcγR (Inhibitory Receptor)に対する結合活性を横軸にとり、天然型抗体の活性型FcγRと抑制型FcγRに対する結合活性をそれぞれ100とした。改変体の活性型FcγRに対する結合活性を抑制型FcγRに対する結合活性で割った値が1.2以上である抗体は、bの領域（網かけ部分）にプロットされる。改変体の活性型FcγRに対する結合活性を抑制型FcγRに対する結合活性で割った値が0.8以下である抗体はdの領域（斜線部分）にプロットされる。 ヘテロ二量化抗体のFcγRIaとFcγRIIbに対する結合活性の比較を示す図である。改変を導入したヘテロ二量化抗体の活性型FcγRであるFcγRIaと抑制型FcγRであるFcγRIIbに対する結合活性を比較した図である。横軸に抑制型FcγRに対するHe/Conの値、縦軸に活性型FcγRに対するHe/Conの値を示した。He/ConはFcに変異を導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRに対する結合活性を、改変を導入していないヘテロ二量抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）のFcγRに対する結合活性で割った値に100を乗じた値である。 ヘテロ二量化抗体のFcγRIIa RとFcγRIIbに対する結合活性の比較を示す図である。改変を導入したヘテロ二量化抗体の活性型FcγRであるFcγRIIa Rと抑制型FcγRであるFcγRIIbに対する結合活性を比較した図である。横軸に抑制型FcγRに対するHe/Conの値、縦軸に活性型FcγRに対するHe/Conの値を示した。He/ConはFcに変異を導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRに対する結合活性を、改変を導入していないヘテロ二量抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）のFcγRに対する結合活性で割った値に100を乗じた値である。 ヘテロ二量化抗体のFcγRIIa HとFcγRIIbに対する結合活性の比較を示す図である。改変を導入したヘテロ二量化抗体の活性型FcγRであるFcγRIIa Hと抑制型FcγRであるFcγRIIbに対する結合活性を比較した図である。横軸に抑制型FcγRに対するHe/Conの値、縦軸に活性型FcγRに対するHe/Conの値を示した。He/ConはFcに変異を導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRに対する結合活性を、改変を導入していないヘテロ二量抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）のFcγRに対する結合活性で割った値に100を乗じた値である。 ヘテロ二量化抗体のFcγRIIIaとFcγRIIbに対する結合活性の比較を示す図である。改変を導入したヘテロ二量化抗体の活性型FcγRであるFcγRIIIaと抑制型FcγRであるFcγRIIbに対する結合活性を比較した図である。横軸に抑制型FcγRに対するHe/Conの値、縦軸に活性型FcγRに対するHe/Conの値を示した。He/ConはFcに変異を導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0のFcγRに対する結合活性を、改変を導入していないヘテロ二量抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）のFcγRに対する結合活性で割った値に100を乗じた値である。 L234Y、G236W、S298AとS239D、A330L、I332Eの組み合わせが抗体の熱安定性に与える影響の比較を示す図である。L234Y、G236W、S298Aのヘテロ二量化抗体及びホモ二量化抗体、S239D、A330L、I332Eのヘテロ二量化抗体およびホモ二量化抗体、L234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に導入し、S239D、A330L、I332Eをもう一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体の熱加速試験（40℃ 2週間または4週間）後の単量体比率の変化を比較した図である。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３１、４、５）、GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0（配列番号：３、４１、５）、GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0（配列番号：３１、３２、５）、GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0（配列番号：４０、４１、５）、GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0（配列番号：３１、４１、５）である。 ヘテロ二量化抗体のADCC活性の検討結果を示す図である。評価に用いた細胞株はSK-pca13aであり、E/T ratio=50である。エフェクター細胞はヒトPBMCであった。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）、GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0（配列番号：３、４１、５）、GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３１、４、５）、GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0（配列番号：４０、４１、５）、GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0（配列番号：３１、３２、５）、GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0（配列番号：３１、４１、５）である。縦軸は抗体の細胞傷害活性を表し、横軸は抗体の濃度(μg/mL)を表す。 IgG1（配列番号：７６）、IgG2（配列番号：７７）、IgG3（配列番号：７８）及びIgG4（配列番号：７９）のFc領域を構成するアミノ酸残基と、kabatのEUナンバリング（本明細書においてEU INDEXとも呼ばれる）との関係を表す図である。 実施例12に記載のFcヘテロ二量化抗体のADCC活性の検討結果を示す図である。評価に用いた細胞株はSK-pca13aであり、E/T ratio=50である。エフェクター細胞はヒトPBMCであった。評価に用いたサンプルとその配列はGpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）、GpH7-Kn033 /GpH7-Hl033/GpL16-k0（配列番号：５１、５６、５）、GpH7-Kn032 /GpH7-Hl032/GpL16-k0（配列番号：５３、５８、５）、GpH7-Kn045 /GpH7-Hl048/GpL16-k0（配列番号：５４、５９、５）、GpH7-Kn056 /GpH7-Hl055/GpL16-k0（配列番号：５５、６０、５）、GpH7-Kn037 /GpH7-Hl036/GpL16-k0（配列番号：５２、５７、５）、である。縦軸は抗体の細胞傷害活性を表し、横軸は抗体の濃度(μg/mL)を表す。 ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のADCC活性の検討結果を示す図である。評価に用いた細胞株はSKE18であり、E/T ratio=50であった。エフェクター細胞はヒトPBMCであった。評価に用いたサンプルとその配列はH240-Kn033 /H240-Hl033/L73-k0（配列番号：８４、８５、１０６）、H240-Kn032 /H240-Hl032/L73-k0（配列番号：８６、８７、１０６）、H240-Kn061 /H240-Hl071/L73-k0（配列番号：８１、８２、１０６）、H240-afucosyl_G1d（H240-afucosyl_G1dはそのアミノ酸配列はH240-G1d (配列番号：83)と同じで、そのフコースが取れたものである）/L73-k0（配列番号：８３、１０６）である。縦軸は抗体の細胞傷害活性を表し、横軸は抗体の濃度 (μg/mL)を表す。 ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0をテンプレートにした点変異体のFcgRIに対する結合活性を示す図である。縦軸のRelative KDはFcgRIに対するH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のKD (mol/L) を各改変体のKDで割った値を表す。横軸の数字はRelative KDが小さい順に並べた際の順位を表す。 ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0をテンプレートにした点変異体のFcgRIIa Rに対する結合活性を示す図である。縦軸のRelative KDはFcgRIIa Rに対するH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のKD (mol/L) を各改変体のKDで割った値を表す。横軸の数字はRelative KDが小さい順に並べた際の順位を表す。 ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0をテンプレートにした点変異体のFcgRIIa Hに対する結合活性を示す図である。縦軸のRelative KDはFcgRIIa Hに対するH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のKD (mol/L) を各改変体のKDで割った値を表す。横軸の数字はRelative KDが小さい順に並べた際の順位を表す。 ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0をテンプレートにした点変異体のFcgRIIbに対する結合活性を示す図である。縦軸のRelative KDはFcgRIIbに対するH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のKD (mol/L) を各改変体のKDで割った値を表す。横軸の数字はRelative KDが小さい順に並べた際の順位を表す。 ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0をテンプレートにした点変異体のFcgRIIIa Fに対する結合活性を示す図である。縦軸のRelative KDはFcgRIIIa Fに対するH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のKD (mol/L) を各改変体のKDで割った値を表す。横軸の数字はRelative KDが小さい順に並べた際の順位を表す。 ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0をテンプレートにした点変異体のFcgRIIIa Vに対する結合活性を示す図である。縦軸のRelative KDはFcgRIIIa Vに対するH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のKD (mol/L) を各改変体のKDで割った値を表す。横軸の数字はRelative KDが小さい順に並べた際の順位を表す。 ヘテロ二量化抗体H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0のADCC活性の検討結果を示す図である。評価に用いた細胞株はMIAPaCa-2であり、E/T ratio=25であった。エフェクター細胞はヒトPBMCであった。評価に用いたサンプルとその配列はH240-Kn033 /H240-Hl033/L73-k0（配列番号：８４、８５、１０６）、H240-Kn061 /H240-Hl071/L73-k0（配列番号：８１、８２、１０６）、H240-afucosyl_G1d/L73-k0（配列番号：８３、１０６）、H240-Kn072 /H240-Hl076/L73-k0（配列番号：９０、９１、１０６）である。縦軸は抗体の細胞傷害活性を表し、横軸は抗体の濃度 (μg/mL)を表す。 ヘテロ二量化抗体H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0改良抗体のADCC活性の検討結果を示す図である。評価に用いた細胞株はDLD-1であり、E/T ratio=50であった。エフェクター細胞はヒトPBMCであった。評価に用いたサンプルとその配列はH240-Kn033 /H240-Hl033/L73-k0（配列番号：８４、８５、１０６）、H240-afucosyl_G1d/L73-k0（配列番号：８３、１０６）、H240-Kn113 /H240-Hl076/L73-k0（配列番号：９２、９１、１０６）、H240-Kn115 /H240-Hl076/L73-k0（配列番号：９３、９１、１０６）、H240-Kn125 /H240-Hl076/L73-k0（配列番号：９４、９１、１０６）である。縦軸は抗体の細胞傷害活性を表し、横軸は抗体の濃度(μg/mL)を表す。 ヘテロ二量化抗体H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0等のADCC活性の検討結果を示す図である。評価に用いた細胞株はDLD-1であり、E/T ratio=50であった。エフェクター細胞はヒトPBMCであった。評価に用いたサンプルとその配列はH240-Kn033 /H240-Hl033/L73-k0（配列番号：８４、８５、１０６）、H240-afucosyl_G1d/L73-k0（配列番号：８３、１０６）、H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0（配列番号：９５、９６、１０６）、H240-Kn120 /H240-Hl068/L73-k0（配列番号：９９、９６、１０６）、H240-Kn126 /H240-Hl068/L73-k0（配列番号：１００、９６、１０６）である。縦軸は抗体の細胞傷害活性を表し、横軸は抗体の濃度(μg/mL)を表す。 Fc(WT) / FcgR2a R型結晶構造（PDB ID=3RY6, J. Imunol. 2011, 187, 3208-321）の図である。同構造のFcとFcgRIIa R型の相互作用界面付近においてFcgRIIa R型とFcgRIIbとで異なる3残基Gln127, Leu132, Phe160の側鎖を図示した。なお()内はFcgRIIb中での対応するアミノ酸残基を一文字表記で表したものである。 X線結晶構造解析によって決定されたFcKn (120Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体の図である。CH2ドメイン、CH3ドメインのそれぞれについて、向かって左側をドメインA、右側をドメインBとした。 X線結晶構造解析によって決定されたFc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体のうち、FcgRIIb細胞外領域のLys127（FcgRIIa R型においてはGln）周辺の構造を示した図である。なおFc (Kn120/Hl068)のTyr296については側鎖の電子密度が観測されなかっため、Cα原子以外の側鎖のモデル構築はおこなわなかった。 X線結晶構造解析によって決定されたFc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体のうち、FcgRIIb細胞外領域のSer132（FcgRIIa R型においてはLeu）周辺の構造を示した図である。なおFc (Kn120/Hl068)のD327については側鎖の電子密度が観測されなかっため、Cα原子以外の側鎖のモデル構築はおこなわなかった。 X線結晶構造解析によって決定されたFc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体のうち、FcgRIIb細胞外領域のTyr160（FcgRIIa R型においてはPhe）周辺の構造を示した図である。 X線結晶構造解析によって決定されたFc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体の図である。CH2ドメイン、CH3ドメインのそれぞれについて、向かって左側をドメインA、右側をドメインBとした。 X線結晶構造解析によって決定されたFc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体の構造とFc (WT) / FcgRIIa細胞外領域複合体の構造（PDB code:3RY6）をCH2ドメインAにおいて比較したものである。図中太線で描画されたものがFc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体であり、細線で描画されたものがFc (WT) / FcgRIIa細胞外領域複合体の構造である。なお、Fc (WT) / FcgRIIa細胞外領域複合体の構造においては、CH2ドメインAのみを描画してある。 X線結晶構造解析によって決定されたFc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体のうち、Fc (BP208) CH2ドメインBのSer239周辺の構造を示した図である。 X線結晶構造解析によって決定されたFc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体のうち、Fc (BP208) CH2ドメインAのSer239周辺の構造を示した図である。 代表的なH240-AK072/H240-BH076/L73-k0改変抗体の分析用陽イオン交換クロマトグラフィーの結果を図示したものである。A: H240-AK072/H240-BH076/L73-k0、B: H240-FA021/H240-FB084/L73-k0 代表的なH240-AK072/H240-BH076/L73-k0改変抗体であるH240- FA021/H240- FB084/L73-k0の分取用陽イオン交換クロマトグラフィー(A)および分取画分の分析用陽イオン交換リクロマトグラフィー(B)の結果を図示したものである。
以下の定義は、本明細書において説明する本発明の理解を容易にするために提供される。
本発明は、Ｆｃ領域を含み、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドであって、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチド及び該Ｆｃ領域が第二のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドと比べて、該Ｆｃ領域の機能が改変されていることを特徴とするポリペプチドを提供する。さらに、当該ポリペプチドの製造方法及びＦｃ領域を含むポリペプチドの機能を改変する方法なども提供する。
本発明において、「Ｆｃ領域を含み、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチド」とは、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチド、並びに他の複数のポリペプチドから構成されるポリペプチド複合体であってもよい。
本明細書で「第一のポリペプチド」及び「第二のポリペプチド」とは、抗体のFc領域を構成するポリペプチドを意味する。「第一のポリペプチド」及び「第二のポリペプチド」は互いに配列が異なっていることを意味し、好ましくは少なくともＣＨ２領域の配列が異なることを意味する。当該ポリペプチドとしては、例えば、天然型IgGのFc領域を構成するポリペプチドであってもよく、また天然型IgGのFc領域を構成するポリペプチドに改変が加えられたポリペプチドであってもよい。
天然型IgGとは天然に見出されるIgGと同一のアミノ酸配列を包含し、免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。例えば天然型ヒトIgGとは天然型ヒトIgG1、天然型ヒトIgG2、天然型ヒトIgG3、天然型ヒトIgG4などを意味する。天然型IgGにはそれから自然に生じる変異体等も含まれる。
本発明における「ポリペプチド」とは、通常、１０アミノ酸程度以上の長さを有するペプチド、およびタンパク質を指す。また、通常、生物由来のポリペプチドであるが、特に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。尚、本発明におけるタンパク質分子とは当該ポリペプチドを含む分子を指す。
本発明のポリペプチドの好ましい例として、抗体を挙げることができる。更に好ましい例として、天然型IgG、特に天然型ヒトIgGを挙げることができる。天然型IgGとは、天然に見出されるIgGと同一のアミノ酸配列を包含し、免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。例えば天然型ヒトIgGとは天然型ヒトIgG1、天然型ヒトIgG2、天然型ヒトIgG3、天然型ヒトIgG4などを意味する。天然型IgGにはそれから自然に生じる変異体等も含まれる。
抗体の軽鎖定常領域にはIgK(Kappa、κ鎖)、IgL1、IgL2、IgL3、IgL6、IgL7 (Lambda、λ鎖)タイプの定常領域が存在しているが、いずれの軽鎖定常領域であってもよい。ヒトIgK(Kappa)定常領域とヒトIgL7 (Lambda)定常領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。さらに、本発明において軽鎖定常領域は、アミノ酸の置換、付加、欠損、挿入および／または修飾などの改変が行われた軽鎖定常領域であってもよい。抗体のFc領域としては、例えばIgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgMタイプのFc領域が存在している。本発明の抗体のFc領域は、例えばヒトIgG抗体のFc領域を用いることができ、好ましくはヒトIgG1抗体のFc領域である。本発明のFc領域として、例えば、天然型IgGの定常領域、具体的には、天然型ヒトIgG1を起源とする定常領域（配列番号：７６）、天然型ヒトIgG2を起源とする定常領域（配列番号：７７）、天然型ヒトIgG3を起源とする定常領域（配列番号：７８）、天然型ヒトIgG4を起源とする定常領域（配列番号：７９）由来のFc領域を用いることができる。図32には天然型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4の定常領域の配列を示す。天然型IgGの定常領域にはそれから自然に生じる変異体等も含まれる。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4抗体の定常領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。特にヒトIgG1の配列としては、EUナンバリング３５６−３５８番目のアミノ酸配列がDELであってもEEMであってもよい。
また、抗体のFc領域とFcγRとの相互作用の強さはZn2+イオン濃度依存的であることが報告されている（Immunology Letters 143 (2012) 60-69）。抗体はFc領域のZn2+イオン濃度が高いほど、Fc領域とFcgRとの相互作用は増強される。抗体のFc領域のCH3に存在するHis310、His435がZn2+をキレートすることにより、遠位にあるFc領域の各CH2ドメインが開く。これにより、CH2ドメインとFcgRと相互作用しやすくなり、Fc領域とFcgRの相互作用が増強される。本発明のFc領域の非限定な一態様として、EUナンバリングで表される310位のHis、435位のHis、433位のHisおよび/または434位のAsnにZn2+がキレートされたFc領域が挙げられる。
本発明において、「Fc領域」は、抗体分子中の、ヒンジ部若しくはその一部、CH2、CH3ドメインからなる領域のことをいう。IgGクラスのFc領域は、EU ナンバリング（本明細書ではEU INDEXとも呼ばれる）で、例えば226番目のシステインからC末端、あるいは230番目のプロリンからC末端までを意味するが、これに限定されない。
Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体等をペプシン等の蛋白質分解酵素にて部分消化した後に、プロテインAカラムまたはプロテインGカラムに吸着された画分を再溶出することによって好適に取得され得る。かかる蛋白分解酵素としてはpH等の酵素の反応条件を適切に設定することにより制限的にFabやF(ab')2を生じるように全長抗体を消化し得るものであれば特段の限定はされず、例えば、ペプシンやパパイン等が例示できる。
本明細書において、「ヘテロ二量化」とはアミノ酸配列の異なる二つのポリペプチドから一つのポリペプチドを構成することを意味し、「ヘテロ二量化体」とは、アミノ酸配列の異なる二つのポリペプチドから構成されるポリペプチドのことを意味する。また、「ホモ二量化」とは同一のアミノ酸配列を有する二つのポリペプチドから一つのポリペプチドを構成することを意味し、「ホモ二量化体」とは、２つの同じアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはヘテロ二量化形成を効率的にすることを目的とした改変や、ヘテロ二量化体を効率的に精製することを目的とした改変を除いて同じアミノ酸配列から成るポリペプチド、あるいはFcの機能を改善することを目的としない改変を除いて同じアミノ酸から成るポリペプチドから構成されるポリペプチドのことを意味する。本発明において、「ヘテロ二量化体」又は「ホモ二量化体」とは、好ましくは、Fc領域について「ヘテロ二量化」または「ホモ二量化」を意味し、より好ましくは、Fc領域中のCH2について「ヘテロ二量化」または「ホモ二量化」を意味する。また「親ポリペプチド」とはアミノ酸変異等の改変を導入する前のポリペプチドを意味する。
本発明のアミノ酸変異は、単独で用いてもよく複数組み合わせて使用してもよい。
複数組み合わせて使用する場合、組み合わせる数は特に限定されず、発明の目的を達成できる範囲内で適宜設定することができ、例えば、２個以上３０個以下、好ましくは２個以上１５個以下である。
複数組み合わせる場合、Fc領域を構成する２つのポリペプチドの一方にのみ当該アミノ酸変異を加えてもよく、また２つのポリペプチドの双方に適宜振り分けて加えてもよい。
また、本発明においては、Fc領域のより高い機能の改変効果を得るために、変異を導入しない場合及び２つのポリペプチドの両方のFc領域に変異が導入された場合と比較して、一方にのみ変異が導入された場合の方が、該Fc領域の機能が向上するアミノ酸変異が少なくとも１つ導入されていることが好ましい。
改変される部位は、Fc領域であれば特に限定されず、本発明の目的を達成できる範囲内で適宜設定することができ、例えばヒンジ領域、CH2領域、CH3領域などである。
より好ましくは、改変される部位はCH2領域である。なお、CH2領域とはEUナンバリング231番目から340番目、CH3領域とはEUナンバリング341番目から447番目を意味する。例えば、ヒトIgG1を起源とする定常領域のアミノ酸配列に対して変異を導入する場合、EUナンバリング118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447から選択される1以上の位置におけるアミノ酸残基に改変を加えることができる。
より具体的には、ヒトIgG1定常領域のアミノ酸配列に対して改変を導入する場合、EUナンバリング226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447から選択される1以上の位置におけるアミノ酸残基に改変を加えることができる。
より具体的には、ヒトIgG1定常領域のアミノ酸配列に対して改変を導入する場合、EUナンバリング226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340から選択される1以上の位置におけるアミノ酸残基に改変を加えることができる。
より具体的には、ヒトIgG1定常領域のアミノ酸配列に対して変異を導入する場合、EUナンバリング231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、265、266、267、268、269、270、271、295、296、298、300、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337から選択される1以上の位置におけるアミノ酸残基に改変を加えることができる。
本発明においてアミノ酸の改変とは、置換、欠損、付加、挿入あるいは修飾のいずれか、又はそれらの組み合わせを意味する。本発明においては、アミノ酸の改変はアミノ酸の変異と言い換えることが可能であり、同じ意味で使用される。
置換
アミノ酸残基を置換する場合には、別のアミノ酸残基に置換することで、例えば次の(a)〜(c)のような点について改変する事を目的とする。
(a) シート構造、若しくは、らせん構造の領域におけるポリペプチドの背骨構造；(b) 標的部位における電荷若しくは疎水性、または(c)側鎖の大きさ。
アミノ酸残基は一般の側鎖の特性に基づいて以下のグループに分類される：
(1) 疎水性： ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(2) 中性親水性： cys、ser、thr、asn、gln；
(3) 酸性： asp、glu；
(4) 塩基性： his、lys、arg；
(5) 鎖の配向に影響する残基： gly、pro；及び
(6) 芳香族性： trp、tyr、phe。
これらの各グループ内でのアミノ酸残基の置換は保存的置換と呼ばれ、一方、他グループ間同士でのアミノ酸残基の置換は非保存的置換と呼ばれる。
本発明における置換は、保存的置換であってもよく、非保存的置換であってもよく、また保存的置換と非保存的置換の組合せであってもよい。
また本発明のポリペプチドには、本発明に基づいて導入されたアミノ酸変異に加え、更に付加的な改変を含むことができる。付加的な改変は、たとえば、アミノ酸の置換、欠損、あるいは修飾のいずれか、あるいはそれらの組み合わせから選択することができる。
例えば、本発明のポリペプチドには、さらに当該ポリペプチドの目的とする機能に実質的な変化を与えない範囲で、任意に改変を加えることができる。本発明のポリペプチドが抗体の場合、重鎖や軽鎖に改変を加えることができる。例えばこのような変異はアミノ酸残基の保存的置換によって行うことができる。また、本発明のポリペプチドの目的とする機能に変化を与えるような改変であっても、当該機能の変化が本発明の目的の範囲内であれば、そのような改変も行うことができる。
本発明におけるアミノ酸配列の改変には、翻訳後修飾が含まれる。具体的な翻訳後修飾として、糖鎖の付加あるいは欠損を示すことができる。たとえば、IgG1定常領域において、EUナンバリングの297番目のアミノ酸残基は、糖鎖で修飾されたものであることができる。修飾される糖鎖構造は限定されない。一般的に、真核細胞で発現される抗体は、定常領域に糖鎖修飾を含む。したがって、以下のような細胞で発現される抗体は、通常、何らかの糖鎖で修飾される。
・哺乳動物の抗体産生細胞
・抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換された真核細胞
ここに示した真核細胞には、酵母や動物細胞が含まれる。たとえばCHO細胞やHEK293H細胞は、抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換するための代表的な動物細胞である。他方、当該位置に糖鎖修飾が無いものも本発明の抗体に含まれる。定常領域が糖鎖で修飾されていない抗体は、抗体をコードする遺伝子を大腸菌などの原核細胞で発現させて得ることができる。
本発明において付加的な改変としては、より具体的には、例えばFc領域の糖鎖にシアル酸を付加したものであってもよい（MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27.）。
本発明のポリペプチドが抗体である場合、抗体定常領域部分に、例えばFcRnに対する結合活性を向上させるアミノ酸置換（J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56、J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24.、Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69.、Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2):157-9.、WO/2006/019447、WO/2006/053301、WO/2009/086320）、抗体のヘテロジェニティーや安定性を向上させるためのアミノ酸置換（(WO/2009/041613)）を加えてもよい。
本発明のヘテロ二量化ポリペプチドを作製するには互いに異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士を会合化させる、あるいは目的のヘテロ二量化ポリペプチドを他のホモ二量化ポリペプチドから分離する必要がある。
Fc領域を有する異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士の会合化には、抗体H鎖の第二の定常領域（CH2）又はH鎖の第三の定常領域（CH3）の界面に電荷的な反発を導入して目的としないH鎖同士の会合を抑制する技術を適用することができる（WO2006/106905）。
CH2又はCH3の界面に電荷的な反発を導入して意図しないH鎖同士の会合を抑制させる技術において、H鎖の他の定常領域の界面で接触するアミノ酸残基としては、例えばCH3領域におけるEUナンバリング356番目の残基、EUナンバリング439番目の残基、EUナンバリング357番目の残基、EUナンバリング370番目の残基、EUナンバリング399番目の残基、EUナンバリング409番目の残基に相対する領域を挙げることができる。
より具体的には、例えば、２種のH鎖CH3領域を含む抗体においては、第１のH鎖CH3領域における以下の（１）〜（３）に示すアミノ酸残基の組から選択される１組ないし３組のアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体とすることができる；
（１）H鎖CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング356位および439位のアミノ酸残基、
（２）H鎖CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング357位および370位のアミノ酸残基、
（３）H鎖CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング399位および409位のアミノ酸残基。
更に、上記第１のH鎖CH3領域とは異なる第２のH鎖CH3領域における前記（１）〜（３）に示すアミノ酸残基の組から選択されるアミノ酸残基の組であって、前記第１のH鎖CH3領域において同種の電荷を有する前記（１）〜（３）に示すアミノ酸残基の組に対応する１組ないし３組のアミノ酸残基が、前記第１のH鎖CH3領域における対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する抗体とすることができる。
上記（１）〜（３）に記載のそれぞれのアミノ酸残基は、会合した際に互いに接近している。当業者であれば、所望のH鎖CH3領域またはH鎖定常領域について、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、上記（１）〜（３）に記載のアミノ酸残基に対応する部位を見出すことができ、適宜、該部位のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
上記抗体において、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の（X）または（Y）のいずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい；
（X）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）、
（Y）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）。
上記抗体において、「同種の電荷を有する」とは、例えば、２つ以上のアミノ酸残基のいずれもが、上記（X）または（Y）のいずれか１の群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。「反対の電荷を有する」とは、例えば、２つ以上のアミノ酸残基のなかの少なくとも１つのアミノ酸残基が、上記（X）または（Y）のいずれか１の群に含まれるアミノ酸残基を有する場合に、残りのアミノ酸残基が異なる群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。
好ましい態様において上記抗体は、第１のH鎖CH3領域と第２のH鎖CH3領域がジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
本発明において改変に供するアミノ酸残基としては、上述した抗体の可変領域または抗体の定常領域のアミノ酸残基に限られない。当業者であれば、ポリペプチド変異体または異種多量体について、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、界面を形成するアミノ酸残基を見出すことができ、会合を制御するように、該部位のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
本発明のFc領域を有する異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士の会合化には更に他の公知技術を用いることもできる。抗体の一方のH鎖の可変領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(knob; 突起)に置換し、もう一方のH鎖の相対する可変領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(hole; 空隙)に置換することによって、突起が空隙に配置され得るようにすることで効率的にFc領域を有する異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士の会合化を起こすことができる（WO1996/027011、Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）。
これに加えて、Fc領域を有する異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士の会合化には更に他の公知技術を用いることもできる。抗体の一方のH鎖のCH3の一部をその部分に対応するIgA由来の配列にし、もう一方のH鎖のCH3の相補的な部分にその部分に対応するIgA由来の配列を導入したstrand-exchange engineered domain CH3を用いることで、異なる配列を有するポリペプチドの会合化をCH3の相補的な会合化によって効率的に引き起こすことができる (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。この公知技術を使っても効率的にFc領域を有する異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士の会合化を起こすことができる。
他にもWO2011/028952に記載の抗体のCH1とCLの会合化、VH、VLの会合化を利用したヘテロ二量化抗体作製技術も用いることができる。
また、効率的にヘテロ二量化ポリペプチドを効率的に形成することができない場合であっても、ヘテロ二量化ポリペプチドをホモ二量化ポリペプチドと分離、精製することによってもヘテロ二量化ポリペプチドを得ることが可能である。互いに配列の異なる第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドから成るヘテロ二量化ポリペプチドを作製する際には、2つの第一のポリペプチドのみからなるホモ二量化ポリペプチド、2つの第二のポリペプチドのみからなるホモ二量化ポリペプチドが不純物として混入する。これら2種類のホモ二量化ポリペプチドを効率的に除去する方法として、公知技術を使うことができる。2種類のH鎖の可変領域にアミノ酸置換を導入し等電点の差を付与することで、2種類のホモ体と目的のヘテロ二量化抗体をイオン交換クロマトグラフィーで精製可能にする方法が報告されている（WO2007114325）。ヘテロ二量化抗体を精製する方法として、これまでに、プロテインAに結合するマウスIgG2aのH鎖とプロテインAに結合しないラットIgG2bのH鎖からなるヘテロ二量化抗体をプロテインAを用いて精製する方法が報告されている(WO98050431, WO95033844)。
また、IgGとProteinAの結合部位であるEUナンバリング435番目および436番目のアミノ酸残基を、Tyr、HisなどのProteinAへの結合力の異なるアミノ酸に置換したH鎖を用いることで、各H鎖とProtein Aとの相互作用を変化させ、Protein Aカラムを用いることで、ヘテロ二量化抗体のみを効率的に精製することもできる。
これらの置換、技術を複数、例えば2個以上組合せて用いることができる。またこれらの改変は、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドに適宜別々に加えることができる。なお、本発明のポリペプチドは、上記改変が加えられたものをベースにして作製したものであってもよい。
アミノ酸配列の改変は、当分野において公知の種々の方法により行うことができる。これらの方法には、次のものに限定されるわけではないが、部位特異的変異誘導法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）、PCR変異法、カセット変異法等の方法により行うことができる。
本発明において、「Fc領域の機能」とは、例えば、Fc領域のFcγレセプターに対する結合活性（結合活性の増強、又は、結合活性の減弱）、Fc領域のFcγレセプターアイソフォーム間の選択性（結合の選択性の向上）、Fc領域の物理化学的安定性、ADCC活性、ADCP活性などをいう。ここでFc領域のFcγレセプターアイソフォーム間の選択性とは、Fcγレセプターの特定のアイソフォームに対して選択的に結合することを意味する。Fc領域の物理化学的安定性とは、例えばFc領域の熱力学的な安定性、プロテアーゼに対する安定性、化学処理に対する安定性、凍結融解に対する安定性、保存安定性、酸性条件下の安定性、光安定性、振とうや濃縮にともなうストレスに対する安定性、幅広い溶液条件における溶解性の維持を意味する。また、Fc領域の機能とは、Fc領域のFcγレセプターに対する結合活性、Fc領域のFcγレセプターアイソフォーム間の選択性、Fc領域の物理化学的安定性などから2つ以上を組み合わせた機能であってもく、例えばFc領域のFcγレセプターに対する結合活性とFc領域のFcγレセプターアイソフォーム間の選択性を合わせた機能、Fc領域のFcγレセプターに対する結合活性とFc領域の物理化学的安定性を合わせた機能、Fc領域のFcγレセプターアイソフォーム間の選択性とFc領域の物理化学的安定性を合わせた機能、Fc領域のFcγレセプターに対する結合活性、Fc領域のFcγレセプターアイソフォーム間の選択性及びFc領域の物理化学的安定性を合わせた機能を意味する。
本発明において、「Fc領域の機能を改変」とは、例えばFc領域の機能がFc領域のFcγレセプターに対する結合活性を示す場合はFc領域のFcγレセプターに対する結合活性の増強や減弱などを意味する。選択性の向上とは、例えばあるFcγレセプターに対する結合活性を増強する一方で、他のFcγレセプターに対する結合活性を維持あるいは低減することを意味する。あるいは、選択性の向上とは、例えばあるFcγレセプターに対する結合活性を低減する一方で、他のFcγレセプターに対する結合活性を維持あるいは増強することを意味する。また、例えばFc領域の機能がFc領域のFcγレセプターサブタイプ間の選択性を示す場合はFc領域のFcγレセプターサブタイプ間の選択性の向上や低下などを意味する。また、例えばFc領域の機能がFc領域の物理化学的安定性を示す場合は、Fc領域の物理化学的安定性の向上や低下、安定性の低下の抑制などを意味し、より具体的には、例えばCH2領域のTm値の向上や低下、Tm値の低下の抑制などを意味する。
また、例えばFc領域のFcγレセプターに対する結合活性、Fc領域のFcγレセプターアイソフォーム間の選択性及びFc領域の物理化学的安定性を合わせた機能の向上とは、対照に比べて、Fc領域のFcγレセプターに対する結合活性、Fc領域のFcγレセプターアイソフォーム間の選択性及びFc領域の物理化学的安定性の全てが向上している必要は必ずしもなく、全体としてFc領域の機能が向上していればよい。また逆に、例えばFc領域のFcγレセプターに対する結合活性、Fc領域のFcγレセプターアイソフォーム間の選択性及びFc領域の物理化学的安定性を合わせた機能の低下とは、対照に比べて、Fc領域のFcγレセプターに対する結合活性、Fc領域のFcγレセプターアイソフォーム間の選択性及びFc領域の物理化学的安定性の全てが低下している必要は必ずしもなく、全体としてFc領域の機能が低下していればよい。
本発明において、Fcγレセプター（本明細書ではFcγ受容体、FcγRまたはFcgRと記載することがある）とは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4のFc領域に結合し得る受容体をいい、実質的にFcγレセプター遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかなるメンバーをも意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131（H型）およびR131（R型）を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；およびアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）、並びにいかなる未発見のヒトFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されるものではない。FcγRは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル由来のものが含まれるが、これらに限定されず、いかなる生物由来でもよい。マウスFcγR類には、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）およびFcγRIII-2（CD16-2あるいはFcγRIV）、並びにいかなる未発見のマウスFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されない。こうしたFcγ受容体の好適な例としてはヒトFcγRI（CD64）、FcγRIIa（CD32）、FcγRIIb（CD32）、FcγRIIIa（CD16）及び／又はFcγRIIIb（CD16）が挙げられる。
FcγRには、ITAM(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)をもつ活性型レセプターとITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)をもつ抑制型レセプターが存在する。FcγRはFcγRI、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa、FcγRIIIbの活性型FcγRと、FcγRIIbの抑制型FcγRに分類される。
FcγRIのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれNM_000566.3及びNP_000557.1に、
FcγRIIaのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC020823.1及びAAH20823.1に、
FcγRIIbのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC146678.1及びAAI46679.1に、
FcγRIIIaのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC033678.1及びAAH33678.1に、及び
FcγRIIIbのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC128562.1及びAAI28563.1に記載されている（RefSeq登録番号）。
尚、FcγRIIaには、FcγRIIaの131番目のアミノ酸がヒスチジン（H型）あるいはアルギニン（R型）に置換された2種類の遺伝子多型が存在する（J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990）。また、FcγRIIbには、FcγRIIbの232番目のアミノ酸がイソロイシン（I型）あるいはスレオニン (T型)に置換された2種類の遺伝子多型が存在する（Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254 (2002)）。また、FcγRIIIaには、FcγRIIIaの158番目のアミノ酸がバリン（V型）あるいはフェニルアラニン（F型）に置換された2種類の遺伝子多型が存在する（J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070 (1997)）。また、FcγRIIIbには、NA1型、NA2型の2種類の遺伝子多型が存在する（J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990)）。
相互作用を観察する物質の一方（リガンド）をセンサーチップの金薄膜上に固定し、センサーチップの裏側から金薄膜とガラスの境界面で全反射するように光を当てると、反射光の一部に反射強度が低下した部分（SPRシグナル）が形成される。相互作用を観察する物質の他方（アナライト）をセンサーチップの表面に流しリガンドとアナライトが結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加し、センサーチップ表面の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に結合が解離するとシグナルの位置は戻る）。Biacoreシステムは上記のシフトする量、すなわちセンサーチップ表面での質量変化を縦軸にとり、質量の時間変化を測定データとして表示する（センサーグラム）。センサーグラムからセンサーチップ表面に補足したリガンドに対するアナライトの結合量（アナライトを相互作用させた前後でのセンサーグラム上でのレスポンスの変化量）が求められる。ただし、結合量はリガンドの量にも依存するため、比較する際にはリガンドの量を本質的に同じ量にしたとみなせる条件下で比較する必要がある。また、センサーグラムのカーブからカイネティクス：結合速度定数（ka）と解離速度定数(kd）が、当該定数の比からアフィニティー（KD）が求められる。BIACORE法では阻害測定法も好適に用いられる。阻害測定法の例はProc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010において記載されている。
本発明において、本発明のポリペプチド又はFc領域が各種Fcγレセプターに対する結合活性が増強した、あるいは、結合活性が減少したかどうかは、例えば本実施例に示されるように、表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用した相互作用解析機器であるBiacore (GE Healthcare) を用いて測定することができる。BiacoreはBiacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、Cなどいずれの機種も含まれる。センサーチップにはCM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA，Auチップ等のBiacore用のセンサーチップのいずれも用いることができる。ランニングバッファーにはHBE-EP+に加えて、HEPES、リン酸、ACES、Tris、クエン酸などでpH7.4等の中性付近のpHに調整したバッファーを用いることができる。測定温度は4-37℃の範囲で測定可能である。センサーチップ上にアミンカップリング、ジスルフィドカップリング、アルデヒドカップリング等のカップリング方法で抗体を補足するProteinA、ProteinG、ProteinL、抗ヒトIgG抗体、抗ヒトIgG-Fab、抗ヒトL鎖抗体、抗ヒトFc抗体、抗原タンパク質、抗原ペプチド等の抗体補足用のタンパク質を固定化する。そこへFcγレセプターI、IIa R型、IIa H型、IIb、IIIa F型、V型、IIIbなどの各種Fcγレセプターをアナライトとして流し、相互作用を測定し、センサーグラムを取得する。このときのFcγレセプターの濃度は測定するサンプルのKD等の相互作用の強さに合わせて、数uMから数pMの範囲で実施することができる。測定によってはその解離定数（KD）を取得し、KDの値が低下したか、あるいは増加したかどうかで本発明のポリペプチド又はFc領域が各種Fcγレセプターに対する結合活性が増強したか、あるいは、結合活性が減少したかどうかを判断することができる。また、センサーチップ上に固定化した抗体補足用タンパク質でキャプチャーした場合、センサーチップ上の抗体に対して各種Fcγレセプターをアナライトとして流した前後でのセンサーグラムの値の変化量を指標にその値が増加した程度で本発明のポリペプチド又はFc領域が各種Fcγレセプターに対する結合活性が増強したか、あるいは、結合活性が減少したかどうかを判断することができる。また、抗体ではなく、各種Fcγレセプターをセンサーチップ上に固定化し、そこへ評価したい抗体サンプルを相互作用させることも可能である。相互作用のセンサーグラムから算出したKD値の低下または増加、あるいは抗体サンプルを作用させる前後のセンサーグラムの増加の程度から本発明のポリペプチド又はFc領域が各種Fcγレセプターに対する結合活性が増強したか、あるいは、結合活性が減少したかどうかを判断することができる。
具体的には、Fc領域のFcγレセプターに対する結合活性はELISAやFACS（fluorescence activated cell sorting）の他、ALPHAスクリーン（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）や表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用したBIACORE法等によって測定することができる（Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
ALPHAスクリーンは、ドナーとアクセプターの2つのビーズを使用するALPHAテクノロジーによって下記の原理に基づいて実施される。ドナービーズに結合した分子が、アクセプタービーズに結合した分子と生物学的に相互作用し、2つのビーズが近接した状態の時にのみ、発光シグナルを検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ内のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素はドナービーズ周辺に拡散し、近接しているアクセプタービーズに到達するとビーズ内の化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子が相互作用しないときは、ドナービーズの産生する一重項酸素がアクセプタービーズに到達しないため、化学発光反応は起きない。
例えば、ドナービーズにビオチン標識された被検ポリペプチドがドナービーズ上のストレプトアビジンに結合され、アクセプタービーズにはグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ化されたFcγレセプターが結合される。競合するポリペプチドの非存在下では、被検ポリペプチドとFcγレセプターとは相互作用し520-620 nmのシグナルを生ずる。タグ化されていないポリペプチドは、被検ポリペプチドとFcγレセプター間の相互作用と競合する。競合の結果表れる蛍光の減少を定量することによって相対的な結合活性が決定され得る。ポリペプチドをSulfo-NHS-ビオチン等を用いてビオチン化することは公知である。FcγレセプターをGSTでタグ化する方法としては、FcγレセプターをコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドをインフレームで融合した融合遺伝子を発現可能なベクターに保持した細胞等において発現し、グルタチオンカラムを用いて精製する方法等が適宜採用され得る。得られたシグナルは例えばGRAPHPAD PRISM（GraphPad社、San Diego）等のソフトウエアを用いて非線形回帰解析を利用する一部位競合（one-site competition）モデルに適合させることにより好適に解析される。
なお、タグ化はGSTに限らず、ヒスチジンタグ、MBP、CBP、Flagタグ、HAタグ、V5タグ、c-mycタグなどのどのようなタグででよく、限定されない。また、被検ポリペプチドのドナービーズへの結合については、ビオチンーストレプトアビジン反応を利用した結合に限らればい。特に、被検ポリペプチドが抗体、Fc融合ポリペプチドなどのFcを含む場合は、ドナービーズ上のProtein A、Protein GなどのFc認識タンパク質を介して被検ポリぺプチドを結合させる方法が考えられる。
FcγRに対する結合またはFcγRに対する結合活性の減弱とは、比較するポリペプチドの量を本質的に同じにしてアッセイを行った時に、親ポリペプチドよりも本質的により弱い結合活性でFcγRと結合することをいう。
FcγRに対する結合またはFcγRに対する結合活性が減弱、減少又は低下したヘテロ二量化ポリペプチドとは、比較するポリペプチドの量を本質的に同じにしてアッセイを行った時に、ホモ二量化ポリペプチドよりも本質的により弱い結合活性でFcγRと結合するものをいう。
例えば、上記の測定法で測定したKD値において、KD値比（親ポリペプチドのKD値／変異を導入したポリペプチドのKD値）は、好ましくは0.99以下、0.95以下、0.9以下、0.8以下、0.7以下、0.5以下、0.3以下、0.1以下である。さらに好ましくは、0.08以下、0.05以下、0.02以下、0.01以下、0.001以下である。尚、本明細書においてKD値比はKD ratioともいう。
また、上記の測定法で測定したKD値において、KD値が1pM以上上昇していることが好ましく、10 pM、100 pM、1 nM以上、2 nM以上、3 nM以上、5 nM以上、10 nM以上、20 nM以上、50 nM以上、100 nM以上、1μM以上上昇していることがさらに好ましい。また、上記の測定法で測定したKD値において、KD値が1 pM以上であることが好ましく、10 pM以上、100 pM以上、1 nM以上、10 nM以上、100 nM以上、500 nM以上、1μM以上、3μM以上、5μM以上であることが好ましい。
FcγRに対する結合またはFcγRに対する結合活性の増強、上昇又は向上とは、比較するポリペプチドの量を本質的に同じにしてアッセイを行った時に、親ポリペプチドよりも本質的により強い結合活性でFcγRと結合することをいう。
FcγRに対する結合またはFcγRに対する結合活性が増強、上昇又は向上したヘテロ二量化ポリペプチドとは、比較するポリペプチドの量を本質的に同じにしてアッセイを行った時に、ホモ二量化ポリペプチドよりも本質的により強い結合活性でFcγRと結合するものをいう。
例えば、上記の測定法で測定したKD値において、KD値比（親ポリペプチドのKD値／変異を導入したポリペプチドのKD値）は、好ましくは1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.5以上、1．8以上、2以上、3以上である。さらに好ましくは、5以上、10以上、100以上、250以上、1000以上である。尚、本明細書においてKD値比はKD ratioともいう。
また、上記の測定法で測定したKD値において、KD値が1 pM以上低下していることが好ましく、10 pM、100 pM、1 nM以上、2 nM以上、3 nM以上、5 nM以上、10 nM以上、20 nM以上、50 nM以上、100 nM以上、1μM以上低下していることがさらに好ましい。
また、上記の測定法で測定したKD値において、KD値が5μM以下であることが好ましく、3μM以下、1μM以下、0.5μM以下、0.1μM以下、0.01μM以下、1 nM以下、0.1 nM以下、0.001 nM以下、1 pM以下であることが更に好ましい。
本発明において、当該ポリペプチドのＦｃ領域の機能の改変が、Fcγレセプターとの結合活性の増強である場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、アミノ酸変異が導入されていてもよい。導入される当該アミノ酸変異の種類や範囲は特に限定されるものではない。
また、抗体のFc領域とFcγRとの相互作用の強さはZn2+イオン濃度依存的であることが報告されている（Immunology Letters 143 (2012) 60-69）。抗体はFc領域のZn2+イオン濃度が高いほど、Fc領域とFcgRとの相互作用は増強される。抗体のFc領域のCH3に存在するHis310、His435がZn2+をキレートすることにより、遠位にあるFc領域の各CH2ドメインが開く。これにより、CH2ドメインとFcgRと相互作用しやすくなり、Fc領域とFcgRの相互作用が増強される。本発明の抗体の非限定な一態様として、EUナンバリングで表される310位のHis、435位のHis、433位のHisおよび/または434位のAsnにZn2+がキレートされたFc領域が挙げられる。
該Fcγレセプターが、FcγRIaである場合には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２−１及び表２−２の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、該Fcγレセプターが、FcγRIaである場合には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２−１、表２−２及び表２−３の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
また、該Fcγレセプターが、FcγRIIa Rである場合には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３−１及び表３−２の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、該Fcγレセプターが、FcγRIIa Rである場合には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３−１及び表３−２の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
また、該Fcγレセプターが、FcγRIIa Hである場合には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表４の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、該Fcγレセプターが、FcγRIIa Hである場合には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表４の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
また、該Fcγレセプターが、FcγRIIbである場合には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表５の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、該Fcγレセプターが、FcγRIIbである場合には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表５の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
また、該Fcγレセプターが、FcγRIIIaである場合には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表６の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、該Fcγレセプターが、FcγRIIIaである場合には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表６の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、該Fcγレセプターが、FcγRIIIaである場合には、より具体的には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのY又はQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換、EUナンバリング328番目のアミノ酸LからWへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからM又はKへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからE又はLへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上（例えば２つ又は３つ）のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、該Fcγレセプターが、FcγRIIIaである場合には、さらに具体的には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、
EUナンバリング239番目のアミノ酸SのDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AのLへの置換、及びEUナンバリング332番目のアミノ酸IのEへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上（例えば２つ又は３つ）のアミノ酸変異が導入されており、
もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、
EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上（例えば２つ又は３つ）のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
また、該Fcγレセプターが、FcγRIIIaである場合には、さらに具体的には、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング234番目のLeu、235番目のLeu、236番目のGly、239番目のSer、268番目のHis、270番目のAsp、298番目のSer、327番目のAla、328番目のLeu及び334番目のLysから選択される、少なくとも一つ以上（例えば２つ又は３つ）のアミノ酸に変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング270番目のAsp、326番目のLys、330番目のAla及び334番目のLysから選択される、少なくとも一つ以上（例えば２つ又は３つ）のアミノ酸に変異が導入されていてもよい。
改変されるアミノ酸は適宜選択され得るが、好ましくは、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからY又はQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換及びEUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換、EUナンバリング328番目のアミノ酸LからWへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからLへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上（例えば２つ又は３つ）のアミノ酸変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからM又はKへの置換、EUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上（例えば２つ又は３つ）のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
より好ましくは、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、(i)から(vi)のいずれかの変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、(vii)から(ix)のいずれかの変異が導入されていてもよい。
(i) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
(ii) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
(iii) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからＱへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
(iv) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換及びEUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換
(v) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換及びEUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換
(vi) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換、EUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換、EUナンバリング328番目のアミノ酸LからWへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからLへの置換
(vii) EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからMへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換
(viii) EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからMへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換
(ix) EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからKへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換。
結合活性の選択性は、ポリペプチドのFcγレセプターアイソフォームそれぞれに対する結合活性を測定した後、それらの比を求めることで測定することができる。結合活性の指標として、例えばFcγRに対する結合量、KD値を用いることができる。
本明細書において、結合活性の選択性が向上しているとは、例えば、上記の測定方法に基づいて求めた被検ポリペプチドのFcγレセプターアイソフォームへの結合活性の比（被検ポリペプチドの親ポリペプチドの第一のFcγレセプターアイソフォームへの結合活性／被検ポリペプチドの親ポリペプチドの第二のFcγレセプターアイソフォームへの結合活性）に比較して、被検ポリペプチドのFcγレセプターアイソフォームへの結合活性の比（被検ポリペプチドの親ポリペプチドの第一のFcγレセプターアイソフォームへの結合活性／被検ポリペプチドの第二のFcγレセプターアイソフォームへの結合活性）の比が0.1以上、好ましくは0.2以上、0.5以上、1以上、2以上、3以上、5以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、30以上、50以上、70以上、100以上、150以上、200以上、500以上、1000以上向上していることをいう。また、Fcγレセプターアイソフォームに対する選択性が低下しているとは、例えば、上記の測定方法に基づいて求めた被検ポリペプチドの親ポリペプチドのFcγレセプターアイソフォームへの結合活性の比に比較して被検ポリペプチドのFcγレセプターアイソフォームへの結合活性の比が0.1以上、好ましくは0.2以上、0.5以上、1以上、2以上、3以上、5以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、30以上、50以上、70以上、100以上、150以上、200以上、500以上、1000以上低下することをいう。
また、本明細書において、選択性の指標として、例えば、活性型FcγRと抑制型FcγRに対する結合活性の比率を示すA/I ratioを用いることができる。被検ポリペプチドのFcγRIIbに対するKDを被検ポリペプチドのFcγRIIa H型又はR型のKDで割った値をそれぞれのA/I ratioとした。A/I ratioは、好ましくは、1.1以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上が好ましく、より好ましくは6以上、8以上、9以上である。
また、本明細書において、選択性の指標として、例えば、FcγRIIbに対するKDをFcγRIIIa Fに対するKDで割った値であるFcγRIIIa F/FcγRIIb ratioを用いることができる。被検ポリペプチドのFcγRIIbに対するKDを被検ポリペプチドのFcγRIIIaに対するKDで割った値をそれぞれのFcγRIIIa F/FcγRIIb ratioとした。FcγRIIIa F/FcγRIIb ratioは、好ましくは、1.1以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上が好ましく、より好ましくは10以上、20以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上、110以上、120以上、130以上、140以上、150以上、200以上、210以上、220以上、230以上、240以上である。
本発明において、当該ポリペプチドのＦｃ領域の機能の改変が、Fcγレセプターとの結合活性の選択性の向上である場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、アミノ酸変異が導入されていてもよい。導入される当該アミノ酸変異の種類や範囲は特に限定されるものではない。
前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIaであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIaに対する結合活性が選択的に増強されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表１９−１、表１９−２、表１９−３及び表１９−４の領域ａに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIaに対する結合活性が選択的に増強されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表１９−１、表１９−２、表１９−３、表１９−４及び表１９−５の領域bに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIaであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIaに対する結合活性が選択的に減弱されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２３−１及び表２３−２の領域cに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIaに対する結合活性が選択的に減弱されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２３−１及び表２３−２の領域dに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIa Rであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIa Rに対する結合活性が選択的に増強されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２０−１の領域aに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIa Rに対する結合活性が選択的に増強されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２０−１、表２０−２及び表２０−３の領域bに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIa Rであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIa Rに対する結合活性が選択的に減弱されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２４−１の領域cに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIa Rに対する結合活性が選択的に減弱されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２４−１及び表２４−２の領域dに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIa Hであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIa Hに対する結合活性が選択的に増強されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２１−１の領域aに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIa Hに対する結合活性が選択的に増強されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２１−１、表２１−２及び表２１−３の領域bに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIa Hであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIa Hに対する結合活性が選択的に減弱されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２５−１及び表２５−２の領域cに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIa Hに対する結合活性が選択的に減弱されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２５−１、表２５−２及び表２５−３の領域dに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIIaであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIIaに対する結合活性が選択的に増強されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２２−１の領域aに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIIaに対する結合活性が選択的に増強されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２２−１、表２２−２及び表２２−３の領域bに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
前記活性型ＦｃγレセプターがFcγRIIIaであり、前記阻害型ＦｃγレセプターがFcγRIIbであり、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIIaに対する結合活性が選択的に減弱されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２６−１及び表２６−２の領域cに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。また、当該選択性の向上がFcγRIIbに比べてFcγRIIIaに対する結合活性が選択的に減弱されたことである場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２６−１、表２６−２、表２６−３及び表２６−４の領域dに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
ここで、所望のFcγレセプターに対する結合活性が選択的に増強するとは、以下のいずれかの場合を意味する。
(i)所望のFcγレセプターに対する結合活性が増強し、所望のFcγレセプター以外のレセプターに対する結合活性は変わらない又は減弱する、
(ii) 所望のFcγレセプターに対する結合活性が増強し、所望のFcγレセプター以外のレセプターに対する結合活性も増強するが、所望のFcγレセプター以外のレセプターに対する結合活性の増強の程度が所望のFcγレセプターに対する結合活性の増強の程度よりも低い、あるいは、
(iii)所望のFcγレセプターに対する結合活性は減弱しているが、当該結合活性の減弱の程度が所望のFcγレセプター以外のFcγレセプターに対する結合活性の減弱の程度よりも低い。
また、所望のFcγレセプターに対する結合活性が選択的に減弱するとは、以下のいずれかの場合を意味する。
(i)所望のFcγレセプターに対する結合活性が減弱し、所望のFcγレセプター以外のレセプターに対する結合活性は変わらない又は増強する、
(ii) 所望のFcγレセプターに対する結合活性が減弱し、所望のFcγレセプター以外のレセプターに対する結合活性も減弱するが、所望のFcγレセプター以外のレセプターに対する結合活性の減弱の程度が所望のFcγレセプターに対する結合活性の減弱の程度よりも低い、あるいは、
(iii) 所望のFcγレセプターに対する結合活性は増強しているが、当該結合活性の増強の程度が所望のFcγレセプター以外のFcγレセプターに対する結合活性の増強の程度よりも低い。
本明細書において、ポリペプチドの物理化学的安定性は、例えばポリペプチドの熱力学的な安定性を意味し、ポリペプチドの熱力学的な安定性は、例えばCH2領域のTm値などを指標として判断することができる。Tm値はCD（円二色性）、DSC（示査走査型熱量計）、DSF（示査走査型蛍光定量法）により測定することが可能である。
CDは昇温にともなう平均残基モル楕円率（θ）の変化を観測することにより、Tm値を算出する。測定機器としては、例えば円二色性分散計（日本分光）があげられる。適当な一波長（例えば208 nmや222 nm）において温度を上昇させながらCDスペクトルを測定すると、ある温度でθが上昇し、それ以降の温度では一定の値となる。このとき、低温時のθと高温時のθの中点の値をとる温度をTmとする。測定には、例えば、クエン酸、トリス、リン酸溶液などで調製されたタンパク質溶液を用いることが可能であり、数百ug/mLの濃度で測定に用いることができる。
DSCは昇温にともなう熱量変化を観測することにより、Tm値を算出する。測定機器としては、MicroCal VP-DSC、Micro Cal Capillary DSC（いずれもDKSHジャパン）があげられる。測定セルにタンパク質溶液ならびに緩衝液を封入し、温度を上昇させながらセル間の温度差を測定すると、ある温度を境に吸熱反応へと変化する。このときの温度をTmとする。測定には、例えば、クエン酸緩衝液、TBS、PBS、ヒスチジン緩衝液などで調製されたタンパク質溶液を用いることが可能であり、数十ug/mLから数百ug/mLの濃度で測定に用いることができる。
DSFは疎水性残基に特異的に結合する蛍光試薬（例えばSYPRO Orange）を用いて、昇温にともなう疎水性残基の露出を観測することにより、Tm値を算出する。タンパク質溶液と蛍光試薬を適当な割合で混合し、RT-PCR装置により温度を上昇させながら蛍光強度を測定すると、ある温度で蛍光強度の上昇が観測される。このときの温度をTmとする。測定機器としては、例えばRotor-Gene Q（QIAGEN）、CFX96リアルタイムPCR解析システム（Bio-Rad）があげられる。測定には、例えば、PBS、ヒスチジン緩衝液などで調製されたタンパク質溶液を用いることが可能であり、数十ug/mLから数百ug/mLの濃度で測定に用いることができる。
本明細書において、ポリペプチドの物理学的安定性が向上しているとは、例えば上記の測定方法に基づいて求めた対照ポリペプチドのFｃ領域中のCH2領域のTm値に比較して被検ポリペプチドのFc領域中のCH2領域のTm値が0.1度以上、好ましくは0.2度以上、0.3度以上、0.4度以上、0.5度以上、1度以上、2度以上、3度以上、4度以上、5度以上、10度以上向上していることをいう。また、ポリペプチドの物理学的安定性が向上しているとは、ポリペプチドの物理学的安定性の低下が抑制されていることをいい、例えば上記の測定方法に基づいて求めた対照ポリペプチドのFｃ領域中のCH2領域のTm値に対して被検ポリペプチドのFc領域中のCH2領域のTm値が低下するのを、0.1度以上、好ましくは0.2度以上、0.3度以上、0.4度以上、0.5度以上、1度以上、2度以上、3度以上、4度以上、5度以上、10度以上抑制していることをいう。
また、本明細書において、ポリペプチドの物理学的安定性が低下しているとは、例えば上記の測定方法に基づいて求めた対照ポリペプチドのFｃ領域中のCH2領域のTm値に比較して被検ポリペプチドのFc領域中のCH2領域のTm値が0.1度以上、好ましくは0.2度以上、0.3度以上、0.4度以上、0.5度以上、1度以上、2度以上、3度以上、4度以上、5度以上、10度以上低下していることをいう。
また、本発明には、Ｆｃ領域を含み、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドであって、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチド又は該Ｆｃ領域が第二のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドと比べて、該Ｆｃ領域の機能が改変されていることを特徴とするポリペプチドも含まれる。
当該ポリペプチドにおいては、前記Ｆｃ領域の機能の改変が、ポリペプチドのFcγレセプターとの結合活性の増強、結合活性の減弱、及び、結合活性の選択性の向上からなる群より選択される少なくとも一つ以上の改変に加えて、さらに物理化学的安定性が向上するという改変であってもよく、これらいずれかの機能が改変されていれば、本発明のFc領域の機能が改変されているということができる。
本発明において、「アミノ酸変異が、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドの両方のFc領域に導入された場合、該Fc領域の機能が改変しない」とは、同じアミノ酸変異を第一のポリペプチドと第二のポリペプチド両方に導入した場合に、所望の機能が向上しないことを意味し、例えば、ポリペプチドのFcγレセプターとの結合活性を増強させたい場合には、当該結合活性が変化しない又は減弱する、結合活性を減弱させたい場合には、当該結合活性が変化しない又は増強する、結合活性の選択性を向上させたい場合には、当該選択性が向上しない、ポリペプチドの物理化学的安定性を向上させたい場合には、当該安定性が変化しない又は低下することを意味する。アミノ酸変異が「一方のFc領域にのみ導入された場合、該Fc領域の機能が改変する」とは、アミノ酸変異を第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのいずれか一方のみに導入した場合に、所望の機能が向上することを意味し、例えば、ポリペプチドのFcγレセプターとの結合活性を増強させたい場合には、当該結合活性が増強する、結合活性を減弱させたい場合には、当該結合活性が減弱する、結合活性の選択性を向上させたい場合には、当該選択性が向上する、ポリペプチドの物理化学的安定性を向上させたい場合には、当該安定性が向上することを意味する。
本発明には、前記Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドが、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチド又は該Ｆｃ領域が第二のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドと比べて、高いＴｍを有することを特徴とするポリペプチドも含まれる。当該ポリペプチドは高いＴｍを有するという物理化学的安定性が向上した改変とともに、さらにＦｃ領域の機能の改変が加わっていてもよい。
さらに付加されるＦｃ領域の機能の改変が、FcγRIaに対する結合活性の増強である場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３１−１、表３１−２及び表３１−３に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
また、さらに付加されるＦｃ領域の機能の改変が、FcγRIIa Rに対する結合活性の増強である場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３２−１及び表３２−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
また、さらに付加されるＦｃ領域の機能の改変が、FcγRIIa Hに対する結合活性の増強である場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３３−１及び表３３−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
また、さらに付加されるＦｃ領域の機能の改変が、FcγRIIbに対する結合活性の増強である場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３４−１及び表３４−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
また、さらに付加されるＦｃ領域の機能の改変が、FcγRIIIaに対する結合活性の増強である場合、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３５−１及び表３５−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていてもよい。
本発明において、アミノ酸変異が導入された第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドの組み合わせは特に限定されるものではないが、配列番号：２〜４及び６〜６０に記載されたポリペプチドから選択された、異なる種類／又は同一の種類のポリペプチドの組み合わせを例示することができる。又、本願の実施例に記載された、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むポリペプチドの組み合わせ（２つの抗体のＨ鎖及び１つの抗体のＬ鎖の組み合わせ）を好ましい例として挙げることができる。
本発明のポリペプチドは、抗原結合分子であってもよい。本発明において、抗体結合分子の種類は特に特定されるものではないが、好ましい例としては、抗体、二重特異性抗体、ペプチドFc融合タンパク質、又はスキャッフォールドFc融合タンパク質などのFc融合分子を例示することができる。
<抗体>
さらに、本発明のポリペプチドとして抗体を提供する。
本発明における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体変異体、抗体断片、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体等、如何なる抗体も含まれる。
本発明の抗体は、抗原の種類、抗体の由来などは限定されず、いかなる抗体でもよい。抗体の由来としては、特に限定されないが、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体などを挙げることができる。
抗体を作製する方法は当業者によく知られているが、例えばモノクローナル抗体の場合ハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)）、組換え方法（米国特許第4,816,567号）により製造してもよい。また、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) ; Marks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991)）。また、単一のB細胞クローンから単離してもよい (N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011))。
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCRが公知である。
３つのCDRと４つのFRが連結された抗体可変領域をコードするDNAとヒト抗体定常領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト化抗体発現用ベクターが作成できる。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP 239400、国際公開WO1996/002576参照）。
必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。
ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物（国際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735参照）を免疫動物とし、DNA免疫により所望のヒト抗体が取得され得る。
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のV領域が一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現される。抗原に結合するscFvを発現するファージが選択され得る。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製され得る。当該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより当該ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知である（国際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388参照）。
本発明の抗体を構成する可変領域は、任意の抗原を認識する可変領域であることが出来る。
本明細書において抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよい。抗原の例としては、17-IA, 4-1 BB, 4Dc, 6-keto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, A1 Adenosine Receptor, A33, ACE, ACE-2, Activin, Activin A, Activin AB, Activin B, Activin C, Activin RIA, Activin RIA ALK-2, Activin RIB ALK-4, Activin RIIA, Activin RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Addressins, adiponectin, ADP ribosyl cyclase-1, aFGF, AGE, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, allergen, alpha1-antichemotrypsin, alpha1-antitrypsin, alpha-synuclein, alpha-V/beta-1 antagonist, aminin, amylin, amyloid beta, amyloid immunoglobulin heavy chain variable region. amyloid immunoglobulin light chain variable region, Androgen, ANG, angiotensinogen, Angiopoietin ligand-2, anti-Id, antithrombinIII, Anthrax, APAF-1, APE, APJ, apo A1, apo serum amyloid A, Apo-SAA, APP, APRIL, AR, ARC, ART, Artemin, ASPARTIC, Atrial natriuretic factor, Atrial natriuretic peptide, atrial natriuretic peptides A, atrial natriuretic peptides B, atrial natriuretic peptides C, av/b3 integrin, Axl, B7-1, B7-2, B7-H, BACE, BACE-1, Bacillus anthracis protective antigen, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, BcI, BCMA, BDNF, b-ECGF, beta-2-microglobulin, betalactamase, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, B-lymphocyte Stimulator (BIyS), BMP, BMP-2 (BMP-2a), BMP-3 (Osteogenin), BMP-4 (BMP-2b), BMP-5, BMP-6 (Vgr-1), BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BMPR-II (BRK-3), BMPs, BOK, Bombesin, Bone-derived neurotrophic factor, bovine growth hormone, BPDE, BPDE-DNA, BRK-2, BTC, B-lymphocyte cell adhesion molecule, C10, C1-inhibitor, C1q, C3, C3a, C4, C5, C5a(complement 5a), CA125, CAD-8, Cadherin-3, Calcitonin, cAMP, Carbonic anhydrase-IX, carcinoembryonic antigen (CEA), carcinoma-associated antigen, Cardiotrophin-1, Cathepsin A, Cathepsin B, Cathepsin C/DPPI, Cathepsin D, Cathepsin E, Cathepsin H, Cathepsin L, Cathepsin O, Cathepsin S, Cathepsin V, Cathepsin X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1/I-309, CCL11/Eotaxin, CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL16/HCC-4, CCL17/TARC, CCL18/PARC, CCL19/ELC, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3-alpha, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF-1, CCL24/Eotaxin-2, CCL25/TECK, CCL26/Eotaxin-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CCL3/M1P-1-alpha, CCL3Ll/LD-78-beta, CCL4/MIP-l-beta, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/10/MTP-1-gamma, CCR, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD10, CD105, CD11a, CD11b, CD11c, CD123, CD13, CD137, CD138, CD14, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD15, CD152, CD16, CD164, CD18, CD19, CD2, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27L, CD28, CD29, CD3, CD30, CD30L, CD32, CD33 (p67 proteins), CD34, CD37, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD49b, CD5, CD51, CD52, CD54, CD55, CD56, CD6, CD61, CD64, CD66e, CD7, CD70, CD74, CD8, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD105, CD158a, CEA, CEACAM5, CFTR, cGMP, CGRP receptor, CINC, CKb8-1, Claudin18, CLC, Clostridium botulinum toxin, Clostridium difficile toxin, Clostridium perfringens toxin, c-Met, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, complement factor 3 (C3), complement factor D, corticosteroid-binding globulin, Colony stimulating factor-1 receptor, COX, C-Ret, CRG-2, CRTH2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1/Fractalkine, CX3CR1, CXCL, CXCL1/Gro-alpha, CXCL10, CXCL11/I-TAC, CXCL12/SDF-l-alpha/beta, CXCL13/BCA-1, CXCL14/BRAK, CXCL15/Lungkine. CXCL16, CXCL16, CXCL2/Gro-beta CXCL3/Gro-gamma, CXCL3, CXCL4/PF4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8, CXCL9/Mig, CXCLlO/IP-10, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, cystatin C, cytokeratin tumor-associated antigen, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, Decay accelerating factor, Delta-like protein ligand 4, des(1-3)-IGF-1 (brain IGF-1), Dhh, DHICA oxidase, Dickkopf-1, digoxin, Dipeptidyl peptidase IV, DKl, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EGF like domain containing protein 7, Elastase, elastin, EMA, EMMPRIN, ENA, ENA-78, Endosialin, endothelin receptor, endotoxin, Enkephalinase, eNOS, Eot, Eotaxin, Eotaxin-2, eotaxini, EpCAM, Ephrin B2/EphB4, Epha2 tyrosine kinase receptor, epidermal growth factor receptor (EGFR), ErbB2 receptor, ErbB3 tyrosine kinase receptor, ERCC, EREG, erythropoietin (EPO), Erythropoietin receptor, E-selectin, ET-1, Exodus-2, F protein of RSV, F10, F11, F12, F13, F5, F9, Factor Ia, Factor IX, Factor Xa, Factor VII, factor VIII, Factor VIIIc, Fas, FcalphaR, FcepsilonRI, FcgammaIIb, FcgammaRI, FcgammaRIIa, FcgammaRIIIa, FcgammaRIIIb, FcRn, FEN-1, Ferritin, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF-2 receptor, FGF-3, FGF-8, FGF-acidic, FGF-basic, FGFR, FGFR-3, Fibrin, fibroblast activation protein (FAP), fibroblast growth factor, fibroblast growth factor-10, fibronectin, FL, FLIP, Flt-3, FLT3 ligand, Folate receptor, follicle stimulating hormone (FSH), Fractalkine (CX3C), free heavy chain, free light chain, FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, G-CSF, G-CSF receptor, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-15 (MIC-1), GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14/CDMP-1), GDF-6 (BMP-13/CDMP-2), GDF-7 (BMP-12/CDMP-3), GDF-8 (Myostatin), GDF-9, GDNF, Gelsolin, GFAP, GF-CSF, GFR-alpha1, GFR-alpha2, GFR-alpha3, GF-β1, gH envelope glycoprotein, GITR, Glucagon, Glucagon receptor, Glucagon-like peptide 1 receptor, Glut 4, Glutamate carboxypeptidase II, glycoprotein hormone receptors, glycoprotein IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), Glypican-3, GM-CSF, GM-CSF receptor, gp130, gp140, gp72, granulocyte-CSF (G-CSF), GRO/MGSA, Growth hormone releasing factor, GRO-β, GRO-γ, H. pylori, Hapten (NP-cap or NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCC 1, HCMV gB envelope glycoprotein, HCMV UL, Hemopoietic growth factor (HGF), Hep B gp120, heparanase, heparin cofactor II, hepatic growth factor, Bacillus anthracis protective antigen, Hepatitis C virus E2 glycoprotein, Hepatitis E, Hepcidin, Her1, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), herpes simplex virus (HSV) gB glycoprotein, HGF, HGFA, High molecular weight melanoma-associated antigen (HMW-MAA), HIV envelope proteins such as GP120, HIV MIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HMGB-1, HRG, Hrk, HSP47, Hsp90, HSV gD glycoprotein, human cardiac myosin, human cytomegalovirus (HCMV), human growth hormone (hGH), human serum albumin, human tissue-type plasminogen activator (t-PA), Huntingtin, HVEM, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, IgA, IgA receptor, IgE, IGF, IGF binding proteins, IGF-1, IGF-1 R, IGF-2, IGFBP, IGFR, IL, IL-1, IL-10, IL-10 receptors, IL-11, IL-11 receptors, IL-12, IL-12 receptors, IL-13, IL-13 receptors, IL-15, IL-15 receptors, IL-16, IL-16 receptors, IL-17, IL-17 receptors, IL-18 (IGIF), IL-18 receptors, IL-1alpha, IL-1beta, IL-1 receptors, IL-2, IL-2 receptors, IL-20, IL-20 receptors, IL-21, IL-21 receptors, IL-23, IL-23 receptors, IL-2 receptors, IL-3, IL-3 receptors, IL-31, IL-31 receptors, IL-3 receptors, IL-4, IL-4 receptors IL-5, IL-5 receptors, IL-6, IL-6 receptors, IL-7, IL-7 receptors, IL-8, IL-8 receptors, IL-9, IL-9 receptors, immunoglobulin immune complex, immunoglobulins, INF-alpha, INF-alpha receptors, INF-beta, INF-beta receptors, INF-gamma, INF-gamma receptors, IFN type-I , IFN type-I receptor, influenza, inhibin, Inhibin α, Inhibin β, iNOS, insulin, Insulin A-chain, Insulin B-chain, Insulin-like growth factor 1, insulin-like growth factor 2, insulin-like growth factor binding proteins, integrin, integrin alpha2, integrin alpha3, integrin alpha4, integrin alpha4/beta1, integrin alpha-V/beta-3, integrin alpha-V/beta-6, integrin alpha4/beta7, integrin alpha5/beta1, integrin alpha5/beta3, integrin alpha5/beta6, integrin alphaσ (alphaV), integrin alphaθ, integrin beta1, integrin beta2, integrin beta3(GPIIb-IIIa), IP-10, I-TAC, JE, kalliklein, Kallikrein 11, Kallikrein 12, Kallikrein 14, Kallikrein 15, Kallikrein 2, Kallikrein 5, Kallikrein 6, Kallikrein L1, Kallikrein L2, Kallikrein L3, Kallikrein L4, kallistatin, KC, KDR, Keratinocyte Growth Factor (KGF), Keratinocyte Growth Factor-2 (KGF-2), KGF, killer immunoglobulin-like receptor, kit ligand (KL), Kit tyrosine kinase, laminin 5, LAMP, LAPP (Amylin, islet-amyloid polypeptide), LAP (TGF- 1), latency associated peptide, Latent TGF-1, Latent TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LDL, LDL receptor, LECT2, Lefty, Leptin, leutinizing hormone (LH), Lewis-Y antigen, Lewis-Y related antigen, LFA-1, LFA-3, LFA-3 receptors, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteins, LIX, LKN, Lptn, L-Selectin, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, Lung surfactant, Luteinizing hormone, Lymphotactin, Lymphotoxin Beta Receptor, Lysosphingolipid receptor, Mac-1, macrophage-CSF (M-CSF), MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, maspin, MCAM, MCK-2, MCP, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-I (MCAF), M-CSF, MDC, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), megsin, Mer, MET tyrosine kinase receptor family, METALLOPROTEASES, Membrane glycoprotein OX2, Mesothelin, MGDF receptor, MGMT, MHC (HLA-DR), microbial protein, MIF, MIG, MIP, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, monocyte attractant protein, monocyte colony inhibitory factor, mouse gonadotropin-associated peptide, MPIF, Mpo, MSK, MSP, MUC-16, MUC18, mucin (Mud), Muellerian-inhibiting substance, Mug, MuSK, Myelin associated glycoprotein, myeloid progenitor inhibitor factor-1 (MPIF-I), NAIP, Nanobody, NAP, NAP-2, NCA 90, NCAD, N-Cadherin, NCAM, Neprilysin, Neural cell adhesion molecule, neroserpin, Neuronal growth factor (NGF), Neurotrophin-3, Neurotrophin-4, Neurotrophin-6, Neuropilin 1, Neurturin, NGF-beta, NGFR, NKG20, N-methionyl human growth hormone, nNOS, NO, Nogo-A, Nogo receptor, non-structural protein type 3 (NS3) from the hepatitis C virus, NOS, Npn, NRG-3, NT, NT-3, NT-4, NTN, OB, OGG1, Oncostatin M, OP-2, OPG, OPN, OSM, OSM receptors, osteoinductive factors, osteopontin, OX40L, OX40R, oxidized LDL, p150, p95, PADPr, parathyroid hormone, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-Cadherin, PCNA, PCSK9, PDGF, PDGF receptor, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-D, PDK-1, PECAM, PEDF, PEM, PF-4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIGF, PIN, PLA2, Placenta growth factor, placental alkaline phosphatase (PLAP), placental lactogen, plasmi
nogen activator inhibitor-1, platelet-growth factor, plgR, PLP, poly glycol chains of different size(e.g. PEG-20, PEG-30, PEG40), PP14, prekallikrein, prion protein, procalcitonin, Programmed cell death protein 1, proinsulin, prolactin, Proprotein convertase PC9, prorelaxin, prostate specific membrane antigen (PSMA), Protein A, Protein C, Protein D, Protein S, Protein Z, PS, PSA, PSCA, PsmAr, PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, P-selectin glycoprotein ligand-1, R51, RAGE, RANK, RANKL, RANTES, relaxin, Relaxin A-chain, Relaxin B-chain, renin, respiratory syncytial virus (RSV) F, Ret, reticulon 4, Rheumatoid factors, RLI P76, RPA2, RPK-1, RSK, RSV Fgp, S100, RON-8, SCF/KL, SCGF, Sclerostin, SDF-1, SDF1α, SDF1β, SERINE, Serum Amyloid P, Serum albumin, sFRP-3, Shh, Shiga like toxin II, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, sphingosine 1-phosphate receptor 1, Staphylococcal lipoteichoic acid, Stat, STEAP, STEAP-II, stem cell factor (SCF), streptokinase, superoxide dismutase, syndecan-1, TACE, TACI, TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72), TARC, TB, TCA-3, T-cell receptor alpha/beta, TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, Tenascin, TERT, testicular PLAP-like alkaline phosphatase, TfR, TGF, TGF-alpha, TGF-beta, TGF-beta Pan Specific, TGF-beta RII, TGF-beta RIIb, TGF-beta RIII, TGF-beta Rl (ALK-5), TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, TGF-I, Thrombin, thrombopoietin (TPO), Thymic stromal lymphoprotein receptor, Thymus Ck-1, thyroid stimulating hormone (TSH), thyroxine, thyroxine-binding globulin, Tie, TIMP, TIQ, Tissue Factor, tissue factor protease inhibitor, tissue factor protein, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF receptor I, TNF receptor II, TNF-alpha, TNF-beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2/DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R/TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF/TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF12A, TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF Rl CD120a/p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b/p75-80), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRSF25 (DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35/TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1/APT1/CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68/TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2 Ligand/TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK Ligand ODF/OPG Ligand), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 Ligand/DR3 Ligand), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM Ligand/LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR Ligand AITR Ligand/TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectin/DIF/TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa/TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC/p33), TNFSF4 (OX40 Ligand gp34/TXGP1), TNFSF5 (CD40 Ligand CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP), TNFSF6 (Fas Ligand Apo-1 Ligand/APT1 Ligand), TNFSF7 (CD27 Ligand CD70), TNFSF8 (CD30 Ligand CD153), TNFSF9 (4-1 BB Ligand CD137 Ligand), TNF-α, TNF-β, TNIL-I, toxic metabolite, TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, transferrin receptor, transforming growth factors (TGF) such as TGF-alpha and TGF-beta, Transmembrane glycoprotein NMB, Transthyretin, TRF, Trk, TROP-2, Trophoblast glycoprotein, TSG, TSLP, Tumor Necrosis Factor (TNF), tumor-associated antigen CA 125, tumor-associated antigen expressing Lewis Y related carbohydrate, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, Urokinase, VAP-1, vascular endothelial growth factor (VEGF), vaspin, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherin, VE-Cadherin-2, VEFGR-1 (flt-1), VEFGR-2, VEGF receptor (VEGFR), VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, Viral antigens, VitB12 receptor, Vitronectin receptor, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integrin, von Willebrand Factor (vWF), WIF-1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, XCL2/SCM-l-beta, XCLl/Lymphotactin, XCR1, XEDAR, XIAP, XPDなどがあげられる。
可変領域を構成するアミノ酸配列は、その抗原結合活性が維持される限り、１または複数のアミノ酸残基の改変が許容される。可変領域のアミノ酸配列を改変する場合、改変される部位や改変されるアミノ酸の数は特に限定されない。例えば、CDRおよび／またはFRに存在するアミノ酸を適宜、改変することができる。可変領域のアミノ酸を改変する場合、特に限定されないが、結合活性が維持されていることが好ましく、例えば、改変前と比較して50%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは100%以上の結合活性を有していることが好ましい。又、アミノ酸改変により結合活性が上昇していてもよく、例えば結合活性が改変前と比較して2倍、5倍、10倍等になっていてもよい。本発明の抗体において、アミノ酸配列の改変とは、アミノ酸残基の置換、付加、欠損、挿入および修飾の少なくとも１つであることができる。
例えば、可変領域のN末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者によく知られた修飾である。したがって、本発明の抗体は、その重鎖のN末端がグルタミンの場合には、それがピログルタミン酸に修飾された可変領域を含む。
本発明の抗体の可変領域は、任意の配列であってよく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体、および、これらの非ヒト抗体をヒト化したヒト化抗体、および、ヒト抗体など、どのような由来の抗体の可変領域でもよい。「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region）をヒト抗体のCDRへ移植したものである。CDRを同定するための方法は公知である（Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877）。また、その一般的な遺伝子組換え手法も公知である（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。また、これらの抗体の可変領域に対して、抗原への結合、薬物動態、安定性、抗原性を改善するために、様々なアミノ酸置換を導入したものであってもよい。本発明の抗体の可変領域は抗原に対する結合にpH依存性を有することで、抗原に対して繰り返し結合することができてもよい（WO/2009/125825）。
抗体の軽鎖定常領域にはκ鎖とλ鎖タイプの定常領域が存在しているが、いずれの軽鎖定常領域であってもよい。さらに、本発明において軽鎖定常領域は、アミノ酸の置換、付加、欠損、挿入および／または修飾などの改変が行われた軽鎖定常領域であってもよい。
本発明の抗体の重鎖定常領域としては、例えばヒトIgG抗体の重鎖定常領域を用いることができ、好ましくはヒトIgG1抗体の重鎖定常領域である。
本発明の抗体を構成する可変領域は、任意の抗原を認識する可変領域であることが出来る。重鎖可変領域を構成するアミノ酸配列は、その抗原結合活性が維持される限り、１または複数のアミノ酸残基の改変が許容される。
また、可変領域の改変は結合活性の上昇、特異性の改善、pIの低下、抗原に対する結合にpH依存的な性質の付与、結合熱安定性の改善、溶解性の改善、化学修飾に対する安定性、糖鎖に由来するヘテロジェナイエティの改善、免疫原性を低下させることをin silico予測を使って同定した、あるいはin vitroのT細胞を使ったアッセイによって同定したT細胞エピトープの回避、あるいはレギュラトリーT細胞を活性化するT細胞エピトープの導入等を目的として実施される（mAbs 3:243-247, 2011）
また、本発明のポリペプチドは、Fc領域と他のタンパク質、生理活性ペプチドなどとを結合させたFc融合タンパク質分子（ペプチドFc融合タンパク質）又は、コラーゲンやポリ乳酸などの高分子によって構成される細胞外マトリックスなどを結合させたFc融合タンパク質分子（スキャッフォールドFc融合タンパク質）であってもよい。
他のタンパク質、生理活性ペプチドとしては、例えば受容体、接着分子、リガンド、酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明のFc融合タンパク質分子の好ましい例として、標的に結合するレセプタータンパク質にFcドメインを融合したタンパク質が挙げられ、例えば、TNFR-Fc融合タンパク、IL1R-Fc融合タンパク、VEGFR-Fc融合タンパク、CTLA4-Fc融合タンパク等（Nat Med. 2003 Jan;9(1):47-52、BioDrugs. 2006;20(3):151-60.）が挙げられる。また、本発明のポリペプチドに融合させるタンパク質は標的分子に結合する限り如何なる分子であってもよく、例えばscFv分子（WO2005/037989）、単ドメイン抗体分子（WO2004/058821, WO2003/002609）、抗体様分子（Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658、Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10、Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469、Protein Science 2006, 15:14-27）、例えば、DARPins（WO2002/020565）、Affibody（WO1995/001937）、Avimer（WO2004/044011, WO2005/040229）、Adnectin（WO2002/032925）等が挙げられる。また、抗体およびFc融合タンパク質分子は、複数種類の標的分子あるいはエピトープに結合する二重特異性抗体などの多重特異性抗体であってもよい。
また本発明の抗体には、抗体の修飾物も含まれる。抗体の修飾物の例としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）や細胞障害性物質等の各種分子と結合させた抗体を挙げることができる。このような抗体修飾物は、本発明の抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいうが、当該エピトープは異なる分子中に存在していてもよいし、同一の分子中に存在していてもよい。
本発明のポリペプチドは当業者に公知の方法により製造することができる。例えば、抗体は以下の方法で作製することができるが、これに限定されるものではない。
単離されたポリペプチドをコードする遺伝子を適当な宿主に導入することによって抗体を作製するための宿主細胞と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明の抗原結合分子を単離するのに応用され得る。真核細胞が宿主細胞として使用される場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が適宜使用され得る。具体的には、動物細胞としては、次のような細胞が例示され得る。
（１）哺乳類細胞、：CHO（Chinese hamster ovary cell line）、COS（Monkey kidney cell line）、ミエローマ（Sp2/O、NS0等）、BHK （baby hamster kidney cell line）、HEK293（human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus (Ad)5 DNA）、PER.C6 cell (human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes)、Hela、Vero、など（Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1)）
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など
抗体の重鎖をコードするDNAであって、Fc領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換された重鎖をコードするDNA、および抗体の軽鎖をコードするDNAを発現させる。Fc領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換された重鎖をコードするDNAは、例えば、天然型の重鎖をコードするDNAのFc領域部分を取得し、該Fc領域中の特定のアミノ酸をコードするコドンが目的の他のアミノ酸をコードするよう、適宜置換を導入することによって得ることが出来る。
また、あらかじめ、天然型重鎖のFc領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたタンパク質をコードするDNAを設計し、該DNAを化学的に合成することによって、Fc領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換された重鎖をコードするDNAを得ることも可能である。アミノ酸の置換部位、置換の種類としては、特に限定されるものではない。また置換に限られず、欠損、付加、挿入、又は修飾のいずれか、又はそれらの組み合わせであってもよい。
また、Fc領域中において1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換された重鎖をコードするDNAは、部分DNAに分けて製造することができる。部分DNAの組み合わせとしては、例えば、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNA、あるいはFab領域をコードするDNAとFc領域をコードするDNAなどが挙げられるが、これら組み合わせに限定されるものではない。軽鎖をコードするDNAもまた、同様に部分DNAに分けて製造することができる。
上記DNAを発現させる方法としては、以下の方法が挙げられる。例えば、重鎖可変領域をコードするDNAを、重鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込み重鎖発現ベクターを構築する。同様に、軽鎖可変領域をコードするDNAを、軽鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込み軽鎖発現ベクターを構築する。これらの重鎖、軽鎖の遺伝子を単一のベクターに組み込むことも出来る。
目的とする抗体をコードするDNAを発現ベクターへ組み込む際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などを用いることができる。
本発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（QIAGEN社製）、pEGFP、またはpET（この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えばリポフェクチン法、リン酸カルシウム法、DEAE-Dextran法を用いて行うことができる。
大腸菌発現ベクターの他、例えば、本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovirus expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞、HEK293細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、CAGプロモーター（Gene. (1991) 108, 193、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、形質転換細胞を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。さらに遺伝子のコピー数を増やす目的でEBNA1タンパク質を共発現させる場合もあるが、この場合、複製開始点OriPを有するベクターを用いる。（Biotechnol Bioeng. 2001 Oct 20;75(2):197-203.、Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20;91(6):670-7.）
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
抗体の回収は、例えば、形質転換した細胞を培養した後、分子形質転換した細胞の細胞内又は培養液より分離することによって行うことが出来る。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、１ｑ、ＦｃＲｎ、プロテインA、プロテインGカラム、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
二重特異性抗体の効率的な作製方法として、Knobs-into-holes技術を用いることができる。具体的には、本発明のヘテロ二量化ポリペプチドを作製するには互いに異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士を会合化させる、あるいは目的のヘテロ二量化ポリペプチドを他のホモ二量化ポリペプチドから分離する必要がある。
Fc領域を有する異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士の会合化には、抗体H鎖の第二の定常領域（CH2）又はH鎖の第三の定常領域（CH3）の界面に電荷的な反発を導入して目的としないH鎖同士の会合を抑制する技術を適用することができる（WO2006/106905）。
CH2又はCH3の界面に電荷的な反発を導入して意図しないH鎖同士の会合を抑制させる技術において、H鎖の他の定常領域の界面で接触するアミノ酸残基としては、例えばCH3領域におけるEUナンバリング356番目の残基、EUナンバリング439番目の残基、EUナンバリング357番目の残基、EUナンバリング370番目の残基、EUナンバリング399番目の残基、EUナンバリング409番目の残基に相対する領域を挙げることができる。
より具体的には、例えば、２種のH鎖CH3領域を含む抗体においては、第１のH鎖CH3領域における以下の（１）〜（３）に示すアミノ酸残基の組から選択される１組ないし３組のアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体とすることができる；
（１）H鎖CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング356位および439位のアミノ酸残基、
（２）H鎖CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング357位および370位のアミノ酸残基、
（３）H鎖CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、EUナンバリング399位および409位のアミノ酸残基。
更に、上記第１のH鎖CH3領域とは異なる第２のH鎖CH3領域における前記（１）〜（３）に示すアミノ酸残基の組から選択されるアミノ酸残基の組であって、前記第１のH鎖CH3領域において同種の電荷を有する前記（１）〜（３）に示すアミノ酸残基の組に対応する１組ないし３組のアミノ酸残基が、前記第１のH鎖CH3領域における対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する抗体とすることができる。
上記（１）〜（３）に記載のそれぞれのアミノ酸残基は、会合した際に互いに接近している。当業者であれば、所望のH鎖CH3領域またはH鎖定常領域について、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、上記（１）〜（３）に記載のアミノ酸残基に対応する部位を見出すことができ、適宜、該部位のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
上記抗体において、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の（X）または（Y）のいずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい；
（X）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）、
（Y）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）。
上記抗体において、「同種の電荷を有する」とは、例えば、２つ以上のアミノ酸残基のいずれもが、上記（X）または（Y）のいずれか１の群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。「反対の電荷を有する」とは、例えば、２つ以上のアミノ酸残基のなかの少なくとも１つのアミノ酸残基が、上記（X）または（Y）のいずれか１の群に含まれるアミノ酸残基を有する場合に、残りのアミノ酸残基が異なる群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。
好ましい態様において上記抗体は、第１のH鎖CH3領域と第２のH鎖CH3領域がジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
本発明において改変に供するアミノ酸残基としては、上述した抗体の可変領域または抗体の定常領域のアミノ酸残基に限られない。当業者であれば、ポリペプチド変異体または異種多量体について、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、界面を形成するアミノ酸残基を見出すことができ、会合を制御するように、該部位のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
本発明のFc領域を有する異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士の会合化には更に他の公知技術を用いることもできる。抗体の一方のH鎖の可変領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(knob; 突起)に置換し、もう一方のH鎖の相対する可変領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(hole; 空隙)に置換することによって、突起が空隙に配置され得るようにすることで効率的にFc領域を有する異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士の会合化を起こすことができる（WO1996/027011、Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）。
これに加えて、Fc領域を有する異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士の会合化には更に他の公知技術を用いることもできる。抗体の一方のH鎖のCH3の一部をその部分に対応するIgA由来の配列にし、もう一方のH鎖のCH3の相補的な部分にその部分に対応するIgA由来の配列を導入したstrand-exchange engineered domain CH3を用いることで、異なる配列を有するポリペプチドの会合化をCH3の相補的な会合化によって効率的に引き起こすことができる (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。この公知技術を使っても効率的にFc領域を有する異なるアミノ酸を有するポリペプチド同士の会合化を起こすことができる。
他にもWO2011/028952に記載の抗体のCH1とCLの会合化、VH、VLの会合化を利用したヘテロ二量化抗体作製技術も用いることができる。
また、ヘテロ二量化ポリペプチドを効率的に形成することができない場合であっても、ヘテロ二量化ポリペプチドをホモ二量化ポリペプチドと分離、精製することによってもヘテロ二量化ポリペプチドを得ることが可能である。互いに配列の異なる第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドから成るヘテロ二量化ポリペプチドを作製する際には、2つの第一のポリペプチドのみからなるホモ二量化ポリペプチド、2つの第二のポリペプチドのみからなるホモ二量化ポリペプチドが不純物として混入する。これら2種類のホモ二量化ポリペプチドを効率的に除去する方法として、公知技術を使うことができる。2種類のH鎖の可変領域にアミノ酸置換を導入し等電点の差を付与することで、2種類のホモ体と目的のヘテロ二量化抗体をイオン交換クロマトグラフィーで精製可能にする方法が報告されている（WO2007114325）。
等電点の差を付与するためのアミノ酸改変は、会合する２つのポリペプチドの等電点に差が生じているかぎり、導入されるアミノ酸改変は特に限定されず、免疫原性の低下等、他の目的のアミノ酸改変が含まれていても良い。改変されるアミノ酸は、Fcγレセプターへの結合活性に影響の少ない位置のアミノ酸であることが好ましい。また、所望のFcγレセプターへの結合活性を高めるアミノ酸改変であってもよい。そのような改変のためのアミノ酸の位置としては、具体的には、例えば、第一のポリペプチド及び/又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１３７番目のGly、１３８番目のGly、１３９番目のThr、１４７番目のLys、１９２番目のSer、１９３番目のLeu、１９６番目のGln、１９８番目のTyr、１９９番目のIle、２０３番目のAsn、２１４番目のLys、２６３番目のVal、２７２番目のGlu、２７４番目のLys、２７８番目のTyr、２８８番目のLys、２９０番目のLys、３１６番目のGly、３１７番目のLys、３２０番目のLys、３２４番目のLys、３３５番目のThr、３３７番目のSer、３４０番目のLys、３５８番目のLeu、３６０番目のLys、３６２番目のGln、３６４番目のSer、３８３番目のSer、３８４番目のAsn、３８５番目のGly、３８６番目のGln、３８７番目のPro、３９０番目のAsn、３９７番目のVal及び４２２番目のValからなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることが好ましい。更に、EUナンバリング１３７番目のGly、１３８番目のGly、１３９番目のThr、１４７番目のLys、１９２番目のSer、１９３番目のLeu、１９６番目のGln、１９９番目のIle、２０３番目のAsn、２１４番目のLys、２７２番目のGlu、２７４番目のLys、２８８番目のLys、２９０番目のLys、３５８番目のLeu、３６０番目のLys、３６２番目のGln、３８３番目のSer、３８４番目のAsn、３８５番目のGly、３８６番目のGln、３９０番目のAsn、３９７番目のVal及び４２２番目のValからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることが好ましく、更に、EUナンバリング１３７番目のGly、１３８番目のGly、１４７番目のLys、１９２番目のSer、１９３番目のLeu、１９６番目のGln、１９９番目のIle、２０３番目のAsn、２１４番目のLys、２７４番目のLys、２８８番目のLys、３５８番目のLeu、３８４番目のAsn及び３９７番目のValからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることがより好ましい。
より具体的には、第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１９６番目のGln、１９９番目のIle、２６３番目のVal、２７２番目のGlu、３１６番目のGly、３５８番目のLeu、３６４番目のSer、３８３番目のSer、３８７番目のPro及び３９７番目のValからなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１３７番目のGly、１３８番目のGly、１３９番目のThr、１４７番目のLys、１９２番目のSer、１９３番目のLeu、１９８番目のTyr、１９９番目のIle、２０３番目のAsn、２１４番目のLys、２７４番目のLys、２７８番目のTyr、２８８番目のLys、２９０番目のLys、３１６番目のGly、３１７番目のLys、３２０番目のLys、３２４番目のLys、３３５番目のThr、３３７番目のSer、３４０番目のLys、３５８番目のLeu、３６０番目のLys、３６２番目のGln、３８３番目のSer、３８４番目のAsn、３８５番目のGly、３８６番目のGln、３９０番目のAsn及び４２２番目のValからなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることが好ましい。更に、一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１９６番目のGln、１９９番目のIle、２７２番目のGlu、３５８番目のLeu、３８３番目のSer及び３９７番目のValからなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１３７番目のGly、１３８番目のGly、１３９番目のThr、１４７番目のLys、１９２番目のSer、１９３番目のLeu、１９９番目のIle、２０３番目のAsn、２１４番目のLys、２７４番目のLys、２８８番目のLys、２９０番目のLys、３５８番目のLeu、３６０番目のLys、３６２番目のGln、３８３番目のSer、３８４番目のAsn、３８５番目のGly、３８６番目のGln、３９０番目のAsn及び４２２番目のValからなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることが好ましい。更に、一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１９６番目のGln、１９９番目のIle、３５８番目のLeu及び３９７番目のValからなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１３７番目のGly、１３８番目のGly、１４７番目のLys、１９２番目のSer、１９３番目のLeu、１９９番目のIle、２０３番目のAsn、２１４番目のLys、２７４番目のLys、２８８番目のLys及び３８４番目のAsnからなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることがより好ましい。
アミノ酸の改変は、改変後に、会合する２つのポリペプチドの等電点に差が生じるように改変されていれば、特に限定されない。
等電点を高くするための好ましい改変としては、例えば、EUナンバリング１９６番目のアミノ酸のLysへの置換、２６３番目のアミノ酸のLysへの置換、２７２番目のアミノ酸のLysへの置換、３１６番目のアミノ酸のLysへの置換、３６４番目のアミノ酸のLysへの置換、３５８番目のアミノ酸のLysへの置換、３８３番目のアミノ酸のLysへの置換、３８７番目のアミノ酸のLysへの置換、３９７番目のアミノ酸のLysへの置換が挙げられる。また、等電点を低くするための好ましい改変としては、例えば、EUナンバリング１３７番目のアミノ酸のGluへの置換、１３８番目のアミノ酸のGluへの置換、１３９番目のアミノ酸のGluへの置換、１４７番目のアミノ酸のGluへの置換、１９８番目のアミノ酸のGluへの置換、２０３番目のアミノ酸のAspへの置換、２１４番目のアミノ酸のThrへの置換、２７４番目のアミノ酸のGlnへの置換、２７８番目のアミノ酸のGluへの置換、２８８番目のアミノ酸のGluへの置換、２９０番目のアミノ酸のGluへの置換、３１６番目のアミノ酸のGluへの置換、３１７番目のアミノ酸のGluへの置換、３２０番目のアミノ酸のGluへの置換、３２４番目のアミノ酸のGluへの置換、３３５番目のアミノ酸のGluへの置換、３３７番目のアミノ酸のAspへの置換、３４０番目のアミノ酸のGluへの置換、３５８番目のアミノ酸のGluへの置換、３６０番目のアミノ酸のGluへの置換、３６２番目のアミノ酸のGluへの置換、３８３番目のアミノ酸のGluへの置換、３８４番目のアミノ酸のGluへの置換、３８５番目のアミノ酸のGluへの置換、３８６番目のアミノ酸のGluへの置換、３９０番目のアミノ酸のGluへの置換、４２２番目のアミノ酸のGluへの置換が挙げられる。
等電点に差が生じさせる目的以外のアミノ酸改変を組み合わせる場合、例えば、免疫原性を低下させる場合には、EUナンバリング１３８番目のアミノ酸のSerへの置換、１９２番目のアミノ酸のAsnへの置換、１９３番目のアミノ酸のPheへの置換及び１９９番目のアミノ酸のThrへの置換を組み合わせてもよい。
また、ヘテロ二量化抗体を精製する方法として、これまでに、プロテインAに結合するマウスIgG2aのH鎖とプロテインAに結合しないラットIgG2bのH鎖からなるヘテロ二量化抗体をプロテインAを用いて精製する方法が報告されている(WO98050431, WO95033844)。
また、IgGとProteinAの結合部位であるEUナンバリング435番目および436番目のアミノ酸残基を、Tyr、HisなどのProteinAへの結合力の異なるアミノ酸に置換したH鎖を用いることで、各H鎖とProtein Aとの相互作用を変化させ、Protein Aカラムを用いることで、ヘテロ二量化抗体のみを効率的に精製することもできる。 これらの置換、技術を複数、例えば2個以上組合せて用いることができる。またこれらの改変は、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドに適宜別々に加えることができる。なお、本発明のポリペプチドは、上記改変が加えられたものをベースにして作製したものであってもよい。
さらに本発明は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを製造する方法であって、該Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドにアミノ酸変異を導入することにより該Ｆｃ領域をヘテロ二量体とし、アミノ酸変異の導入により該Ｆｃ領域がホモ二量体となった場合に比べてＦｃ領域の機能を改変する工程を含む、Ｆｃ領域を含むポリペプチドを製造する方法を提供する。
例えば以下の工程を含む製造方法を挙げることができる；
（ａ）Fc領域を含むポリペプチドにおいて、該Fc領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドにアミノ酸変異を導入する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で変異が導入された第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドからなるヘテロ二量体の、Fc領域の機能を測定する工程、および
（ｃ）親ポリペプチド又はアミノ酸変異の導入により該Ｆｃ領域がホモ二量体となった場合と比較して、Fc領域の機能が改変されたポリペプチドを選択する工程。
なお、本製造方法において、以下の工程を（ａ）の工程の後に行ってもよい。
（ｄ）Fc領域を有する第一のポリペプチドと第二のポリペプチドから成るヘテロ二量化ポリペプチドを、提示したリボソーム、ファージ、イーストにディスプレイさせる工程
好ましい態様としては、Ｆｃ領域を含むポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）親ポリペプチド又はアミノ酸変異の導入により該Ｆｃ領域がホモ二量体となった場合と比較して、Fc領域の機能が改変されるように、当該ポリペプチドをコードする核酸を改変する工程、
（ｂ）宿主細胞に当該核酸を導入し発現するように培養する工程、
（ｃ）宿主細胞培養物から当該ポリペプチドを回収する工程、を含む方法である。
さらに当該製造方法によって製造される抗体及びFc融合タンパク質分子も本発明に含まれる。
本方法によって導入されるアミノ酸変異の種類や範囲は特に限定されるものではないが、明細書に記載された各Fc領域の機能の改変に関与するアミノ酸変異（より具体的には、実施例の表に具体的に開示されたアミノ酸変異）を例示することができる。
また本発明は、Ｆｃ領域を含むポリペプチドの機能を改変する方法であって、該Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドにアミノ酸変異を導入することにより該Ｆｃ領域をヘテロ二量体とし、アミノ酸変異の導入により該Ｆｃ領域がホモ二量体となった場合に比べてＦｃ領域の機能を改変する工程を含む、ポリペプチドの機能を改変する方法を提供する。
例えば以下の工程を含む改変方法を挙げることができる；
（ａ）Fc領域を含むポリペプチドにおいて、該Fc領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドにアミノ酸変異を導入する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で変異が導入された第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドからなるヘテロ二量体の、Fc領域の機能を測定する工程、および
（ｃ）親ポリペプチド又はアミノ酸変異の導入により該Ｆｃ領域がホモ二量体となった場合と比較して、Fc領域の機能が改変されたポリペプチドを選択する工程。
なお、本改変方法において、以下の工程を（ａ）の工程の後に行ってもい。
（ｄ）Fc領域を有する第一のポリペプチドと第二のポリペプチドから成るヘテロ二量化ポリペプチドを、提示したリボソーム、ファージ、イーストにディスプレイさせる工程
好ましい態様としては、Ｆｃ領域を含むポリペプチドの改変方法であって、
（ａ）親ポリペプチド又はアミノ酸変異の導入により該Ｆｃ領域がホモ二量体となった場合と比較して、Fc領域の機能が改変されるように、当該ポリペプチドをコードする核酸を改変する工程、
（ｂ）宿主細胞に当該核酸を導入し発現するように培養する工程、
（ｃ）宿主細胞培養物から当該ポリペプチドを回収する工程、を含む方法である。
さらに当該改変方法によって改変される抗体及びFc融合タンパク質分子も本発明に含まれる。
本方法によって導入されるアミノ酸変異の種類や範囲は、特に限定されるものではないが、明細書に記載された各Fc領域の機能の改変に関与するアミノ酸変異（より具体的には、実施例の表に具体的に開示されたアミノ酸変異）を例示することができる。
さらに本発明は、Ｆｃ領域を含み、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドであって、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチド及び／又は該Ｆｃ領域が第二のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドと比べて、該Ｆｃ領域の機能が改変されていることを特徴とするポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明の該核酸はDNA、RNAなど、如何なる形態でもよい。
さらに本発明は、上記本発明の核酸を含むベクターを提供する。ベクターの種類はベクターが導入される宿主細胞に応じて当業者が適宜選択することができ、例えば上述のベクターを用いることができる。
さらに本発明は、上記本発明のベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。宿主細胞は当業者が適宜選択することができ、例えば上述の宿主細胞を用いることができる。
<医薬組成物>
本発明は、本発明のポリペプチドを含有する医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドである抗体又はFc融合タンパク質分子に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る溶液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。ポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明においては、上記本発明のポリペプチドを含有する医薬組成物は、癌、免疫炎症性疾患などの治療剤又は予防剤の有効成分として有用である。
なお本明細書で用いられているアミノ酸の3文字表記と1文字表記の対応は以下の通りである。
アラニン：Ala：A
アルギニン：Arg：R
アスパラギン：Asn：N
アスパラギン酸：Asp：D
システイン：Cys：C
グルタミン：Gln：Q
グルタミン酸：Glu：E
グリシン：Gly：G
ヒスチジン：His：H
イソロイシン：Ile：I
ロイシン：Leu：L
リジン：Lys：K
メチオニン：Met：M
フェニルアラニン：Phe：F
プロリン：Pro：P
セリン：Ser：S
スレオニン：Thr：T
トリプトファン：Trp：W
チロシン：Tyr：Y
バリン：Val：V
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕ヘテロ二量化抗体によるFcγR認識能向上のコンセプトの説明
抗体はFc領域を介してFcRn、FcγR、補体など、様々な分子と相互作用している。FcのリガンドのひとつであるFcRnは抗体の各H鎖（重鎖）に対してそれぞれ1分子が結合しているため、1分子の抗体に対して2分子のFcRnが結合する（図１）。生体内においてFcRnは細胞膜上に発現しているため、生体内において抗体は各H鎖の同じ部分を介して対照的に2分子のFcRnを認識している（Nature, 372: 379-383, 1994）。また、IgGと同じ免疫グロブリンファミリーに属するIgAも、IgGとFcRnの関係と同様に、1分子のIgAが対称的に2分子のIgAレセプターであるFcαRを認識している（図２）（Nature, 423:614 - 620, 2003）。
しかし、FcRn等と異なり、FcγRは抗体 1分子に対して1分子しか結合しない（図３）（JBC, 276: 16469-16477, 2001）。IgGは両H鎖のCH2ドメインを介してFcγRを認識しているが、FcγRと相互作用している部位は各H鎖において異なる。例えば、図３の左側のH鎖をHA鎖、右側をHB鎖とすると、EUナンバリング327番目のAlaはHA鎖、HB鎖の各鎖でFcγRと相互作用しているが、各H鎖において相互作用する相手側の残基の性質が異なる（図４）。HA鎖においてはFcγRIIIのEUナンバリング87番目とEUナンバリング110番目のTrpと疎水的に相互作用しているが、HB鎖においてはEUナンバリング131番目のHisと相互作用している。そのため、EUナンバリング327番目のAlaをTrp等の疎水性の高いアミノ酸と置換した場合、HA鎖ではFcγRとの結合活性を向上させる効果があっても、HB鎖ではFcγRとの結合活性を低減させる可能性がある。このことから、アミノ酸改変によってIgGのFc領域のFcγRに対する相互作用を最適化するためには、各H鎖におけるFcγRに対する非対称的な効果を考慮する必要があると考えられる。それにも関わらず、従来技術ではIgGのFc領域のFcγRに対する相互作用を最適化する際には両H鎖に同じ改変を導入していた（WO2006/019447、WO2000/042072）。しかし、IgGのFc領域がFcγRと非対称に相互作用することを考慮すると、各H鎖に異なる改変を導入した方がIgGとFcγRとの相互作用をより精密に最適化することができると考えられる。すなわち、Fc領域のFcγRに対する相互作用を最適化するために各H鎖に異なる改変を加えた抗体であるヘテロ二量化抗体を使うことで、従来技術で実施されてきた各H鎖に同じ改変を加えた抗体であるホモ二量化抗体と比べて、FcγRとの相互作用を一層最適化できる可能性がある。
〔実施例２〕ヘテロ二量化抗体によるFcγR認識能向上のコンセプトの証明
抗体の各H鎖に異なる改変を導入したヘテロ二量化抗体を用いることにより、従来技術であるホモ二量化抗体と比べて、抗体とFcγRに対する結合活性をより最適化できるか検討した。
従来は、抗体の各H鎖に同じ改変を導入したホモ二量化抗体を用いることで、FcγRに対する結合が増強する改変を探索していた。しかし、実施例1で言及したように抗体とFcγRとが非対称に相互作用することから、両H鎖に同じ改変を導入した場合、その改変が一方のH鎖ではFcγRに対する結合活性を増強するが、もう一方のH鎖では結合を阻害している可能性がある。このような改変を両H鎖に導入したホモ二量化抗体では、FcγRに対する結合活性を必ずしも増強しないが、一方のH鎖にのみ改変を導入したヘテロ二量化抗体ではFcγRに対する結合活性を増強する可能性がある。
この仮説を検証するために、FcγRに対する結合活性を改変すると考えられる改変を一方のH鎖にのみ導入した第一のポリペプチドと、その改変を加えていない第二のポリペプチドから成るヘテロ二量化抗体と、FcγRに対する結合活性を改変すると考えられる改変を一方のH鎖にのみ導入した第一のポリペプチドから成るホモ二量化抗体のFcγRに対する結合を比較した。従来の考えに基づくと、その改変がFcγRに対する結合活性を増強するのであれば、必ずホモ二量化抗体の方がヘテロ二量化抗体よりも優れているはずである。しかし、仮に抗体のFcがFcγRを非対称に認識しているのであれば、改変の種類によっては、ヘテロ二量化抗体の方がホモ二量化抗体よりもFcγRに対して強い結合活性を示すはずである。
抗体のH鎖の可変領域としては、WO2009/041062に開示される血漿中動態が改善した抗グリピカン３抗体のpH7のCDRを含むグリピカン３抗体の可変領域を使用し、GpH7（配列番号：１）と呼ぶ。抗体H鎖定常領域として、以下のものを使用し、それをGpH7と組み合わせて使用した。なお、抗体H鎖定常領域の名称をH1とした場合、可変領域にGpH7を持つ抗体のH鎖に対応する配列はGpH7-H1と呼ぶ。なお、アミノ酸の改変を示す場合には、D356Kのように示す。最初のアルファベット（D356KのDに該当）は、改変前のアミノ酸残基を一文字表記で示した場合のアルファベットを意味し、それに続く数字（D356Kの356に該当）はその改変箇所のEUナンバリングを意味し、最後のアルファベット（D356KのKに該当）は改変後のアミノ酸残基を一文字表記で示した場合のアルファベットを意味する。GpH7を可変領域に持つIgG1のC末端のGlyおよびLysを除去したGpH7-G1d（配列番号：２）、GpH7-G1dにD356K及びH435Rの変異を導入したGpH7-A5（配列番号：３）、GpH7-G1dにK439Eの変異を導入したGpH7-B3（配列番号：４）を参考実施例１の方法にしたがって調製した。それぞれのH鎖に導入したD356KおよびK439Eの変異は、2つのH鎖からなるヘテロ二量化抗体を産生する際に、各H鎖のヘテロ体を効率的に形成させるために導入した（WO2006/106905）。H435RはProtein Aへの結合を妨げる改変であり、ヘテロ体とホモ体を効率よく分離するために導入した（参考実施例３、４、５を参照）。同様に、抗体のL鎖にはWO2009/041062に開示される血漿中動態が改善したグリピカン３抗体のL鎖であるGpL16-k0（配列番号：５）を使用した。
GpH7-A5、GpH7-B3を親ポリペプチドとして、ヘテロ二量化抗体のコンセプトを証明するための変異を導入し、改変体を調製し、評価した。作製した発現ベクターは、参考実施例1の方法に従い、FreeStyle293細胞（invitrogen）へのトランスフェクションに用いた。発現した抗体は参考実施例1の方法に従い、精製した。ホモ二量化抗体を発現させる際には、抗体L鎖であるGpL16-k0が挿入された発現ベクターと一種類の抗体H鎖配列が挿入された発現ベクターを用いた。ヘテロ二量化抗体を発現させる際には抗体L鎖としてはホモ二量化抗体と同様にGpL16-k0が挿入された発現ベクターを用い、抗体H鎖の1つとしてD356Kの改変を導入したGpH7-A5に更に改変を加えた配列を挿入した発現ベクターを用い、抗体H鎖のもう1つとしてK439Eの改変を導入したGpH7-B3に更に改変を導入した配列を挿入した発現ベクターを用い、ヘテロ二量化抗体が効率的に発現するようにした。発現後に精製して得られた抗体は、例えばヘテロ二量化抗体の発現に用いた抗体H鎖に対応する発現ベクターの一つがGpH7-H1、もう一つの抗体H鎖がGpH7-H2、抗体L鎖に対応する発現ベクターがGpL16-k0である場合、GpH7-H1/GpH7-H2/GpL16-k0と表記する。この際にD356K、H435Rの改変が導入されている配列をH1、K439Eの改変が導入されている配列をH2に対応させた。例えば、ホモ二量化抗体の発現に用いた抗体H鎖に対応する発現ベクターがGpH7-H1、抗体L鎖に対応する発現ベクターがGpL16-k0であるホモ二量化抗体の場合、GpH7-H1/GpL16-k0と表記する。調製した抗体を用いて、FcγRに対する結合活性を参考実施例２に記した方法で測定した。
まずはじめに、ヘテロ二量化体を形成、精製するためにGpH7-A5に導入されたD356KおよびH435R、および、GpH7-B3に導入されたK439Eの改変が、天然型IgGと比較して、FcγRに対する結合活性に影響を及ぼすか否かを評価した。コントロールとして、抗体H鎖としてGpH7-G1d、抗体L鎖としてGpL16-k0を挿入したプラスミドを用いて、参考実施例1の方法にしたがって、GpH7-G1d/GpL16-k0（配列番号：２、５）を発現、精製した。同様にしてD356KおよびH435Rが両H鎖に導入されたホモ二量化抗体GpH7-A5/GpL16-k0（配列番号：３、５）を、K439Eが両H鎖に導入されたホモ二量化抗体GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：４、５）を、D356KおよびH435Rが一方のH鎖に導入され、K439Eがもう一方のH鎖に導入されたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）を調製した。参考実施例２の方法にしたがって、これらの抗体と各FcγRに対する結合活性を比較した結果を図５にまとめた。
測定の結果、GpH7-G1d/GpL16-k0とGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0を比較すると、両者で各FcγRに対する結合活性に大きな変化は観察されなかった。また、GpH7-A5/GpL16-k0およびGpH7-B3/GpL16-k0はGpH7-G1d/GpL16-k0と比べていずれのFcγRに対しても少なくとも８割程度の結合活性を維持していた。これらの結果から、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0、GpH7-A5/GpL16-k0、GpH7-B3/GpL16-k0はGpH7-G1d/GpL16-k0と比較してFcγRに対する結合が著しく損なわれておらず、これらの抗体の各H鎖に対して変異を導入した改変体の各FcγRに対する結合活性を比較することが可能であると判断した。
次に、GpH7-A5にG237Aの変異を導入したGpH7-A26（配列番号：６）を参考実施例１の方法にしたがって作製した。H鎖としてGpH7-A26、GpH7-B3、L鎖としてGpL16-k0を用いて、G237Aが一方のH鎖のみに導入されたヘテロ二量化抗体GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：６、４、５）を参考実施例１の方法にしたがって発現させた。同様にして、H鎖としてGpH7-A26、L鎖としてGpL16-k0を用いて、G237Aが両H鎖に導入されたホモ二量化抗体GpH7-A26/GpL16-k0（配列番号：６、５）を参考実施例１の方法にしたがって発現させた。これらを参考実施例２の方法にしたがって、各FcγRに対する結合活性を評価した（図６）。その結果、ヘテロ二量化抗体GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0では、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性が増強した。それにも関わらず、同じ改変を両H鎖に加えたホモ二量化抗体GpH7-A26/GpL16-k0はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性が減弱していた。このことから、G237Aは両H鎖に導入すると FcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性を減弱させるにも関わらず、片方のH鎖のみに導入するとFcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性を増強させる改変であることが明らかとなった。
次に、GpH7-A5にG237Lの変異を導入したGpH7-A29（配列番号：７）を参考実施例１の方法にしたがって作製した。H鎖としてGpH7-A29、GpH7-B3、L鎖としてGpL16-k0を用いて、G237Lが一方のH鎖のみに導入されたヘテロ二量化抗体GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：７、４、５）を参考実施例１の方法にしたがって発現させた。同様にして、H鎖としてGpH7-A29、L鎖としてGpL16-k0を用いて、G237Lが両H鎖に導入されたホモ二量化抗体GpH7-A29/GpL16-k0（配列番号：７、５）を参考実施例１の方法にしたがって発現させた。参考実施例２の方法にしたがって、これらの抗体と各FcγRに対する結合活性を評価した（図７）。ヘテロ二量化抗体GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0では、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性が増強した。それにも関わらず、同じ改変を両H鎖に加えたホモ二量化抗体GpH7-A29/GpL16-k0はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性が減弱していた。このことから、G237Lは両H鎖に導入すると FcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性を減弱させるにも関わらず、一方のH鎖のみに導入するとFcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性を増強させる効果のある改変であることが明らかとなった。
次に、GpH7-A5にL328Eの変異を導入したGpH7-A42（配列番号：８）を参考実施例１の方法にしたがって作製した。H鎖としてGpH7-A42、GpH7-B3、L鎖としてGpL16-k0を用いて、L328Eが一方のH鎖のみに導入されたヘテロ二量化抗体GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：８、４、５）を参考実施例１の方法にしたがって発現させた。同様にして、H鎖としてGpH7-A42、L鎖としてGpL16-k0を用いて、L328Eが両H鎖に導入されたホモ二量化抗体GpH7-A42/GpL16-k0（配列番号：８、５）を参考実施例１の方法にしたがって発現させた。これらを参考実施例２の方法にしたがって、各FcγRに対する結合活性を評価した（図８）。ヘテロ二量化抗体GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0では、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性が増強した。一方で、同じ改変を両H鎖に加えたホモ二量化抗体GpH7-A42/GpL16-k0では、FcγRIIa Rに対する結合活性はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりも減弱しており、FcγRIIbに対する結合活性は増強していたが、その増強の程度はL328Eを一方のH鎖にのみ導入したGpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0の方が大きかった。このことから、L328Eは両H鎖に導入するよりも一方のH鎖のみに導入した方が、FcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性を増強させる効果が高い改変であることが明らかとなった。
次に、GpH7-A5にL328Dの変異を導入したGpH7-A43（配列番号：９）を参考実施例１の方法にしたがって作製した。H鎖としてGpH7-A43、GpH7-B3、L鎖としてGpL16-k0を用いて、L328Dが一方のH鎖のみに導入されたヘテロ二量化抗体GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：９、４、５）を参考実施例1の方法にしたがって発現させた。同様にして、H鎖としてGpH7-A43、L鎖としてGpL16-k0を用いて、L328Dが両H鎖に導入されたホモ二量化抗体GpH7-A43/GpL16-k0（配列番号：９、５）を参考実施例１の方法にしたがって発現させた。これらを参考実施例２の方法にしたがって、各FcγRに対する結合活性を評価した（図９）。ヘテロ二量化抗体GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0では、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性が増強した。一方で、同じ改変を両H鎖に加えたホモ二量化抗体GpH7-A43/GpL16-k0では、FcγRIIa Rに対する結合活性はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりも減弱しており、FcγRIIbに対する結合活性は増強していたが、その増強の程度はL328Dを一方のH鎖にのみ導入したGpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0の方が大きかった。このことから、L328Dは両H鎖に導入するよりも一方のH鎖のみに導入した方が、FcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性を増強させる効果のある改変であることが明らかとなった。
次に、GpH7-B3にL234Eの変異を導入したGpH7-B16（配列番号：１０）を参考実施例１の方法にしたがって作製した。H鎖としてGpH7-A5、GpH7-B16、L鎖としてGpL16-k0を用いて、L234Eが一方のH鎖のみに導入されたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0（配列番号：３、１０、５）を参考実施例１の方法にしたがって発現させた。同様にして、H鎖としてGpH7-B16、L鎖としてGpL16-k0を用いて、L234Eが両H鎖に導入されたホモ二量化抗体GpH7-B16/GpL16-k0（配列番号：１０、５）を参考実施例１の方法にしたがって発現させた。これらを参考実施例２の方法にしたがって、各FcγRに対する結合活性を評価した（図１０）。ヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0では、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIIa F、FcγRIIbに対する結合活性が増強した。それにも関わらず、同じ改変を両H鎖に加えたホモ二量化抗体GpH7-B16/GpL16-k0はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIIa F、FcγRIIbに対する結合活性が減弱していた。このことから、L234Eは両H鎖に導入すると FcγRIIIa F、FcγRIIbに対する結合を減弱させるが、一方のH鎖のみに導入するとFcγRIIIa F、FcγRIIbに対する結合活性を増強させる効果のある改変であることが明らかとなった。
次に、GpH7-B3にL234Dの変異を導入したGpH7-B17（配列番号：１１）を参考実施例１の方法にしたがって作製した。H鎖としてGpH7-A5、GpH7-B17、L鎖としてGpL16-k0を用いて、L234Dが一方のH鎖のみに導入されたヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0（配列番号：３、１１、５）を参考実施例1の方法にしたがって発現させた。同様にして、H鎖としてGpH7-B17、L鎖としてGpL16-k0を用いて、L234Dが両H鎖に導入されたホモ二量化抗体GpH7-B17/GpL16-k0（配列番号：１１、５）を参考実施例１の方法にしたがって発現させた。これらを参考実施例２の方法にしたがって、各FcγRに対する結合活性を評価した（図１１）。ヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0では、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性が増強した。それにも関わらず、同じ改変を両H鎖に加えたホモ二量化抗体GpH7-B17/GpL16-k0はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性が減弱していた。このことから、L234Dは両H鎖に導入すると FcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性を減弱させるが、一方のH鎖のみに導入するとFcγRIIa R、FcγRIIbに対する結合活性を増強させる効果のある改変であることが明らかとなった。
これらの結果から、2つのH鎖に同じ改変を導入したホモ二量化抗体ではFcγRに対する結合活性が減弱する場合であっても、抗体の一方のH鎖にのみにその改変を導入したヘテロ二量化抗体を作製することにより、FcγRに対する結合活性を増強させることが可能であることが明らかとなった。
すなわち、これらの結果から、抗体の各H鎖に異なる改変を加えたヘテロ二量化抗体を用いることで、従来の方法であった2つのH鎖に同じ改変を導入するホモ二量化抗体と比較して、より優れた抗体のFc領域のFcγRに対する結合特性を付与することが可能であることが明らかとなった。
〔実施例３〕ヘテロ二量化抗体によるFcγR認識方向の確認
実施例２で示した通り、ヘテロ二量化抗体を用いることで、ホモ二量化抗体よりもFcγRに対する結合活性を増強させられることが明らかとなった。実施例２の改変を抗体の両H鎖に導入した場合には、むしろ天然型抗体よりもFcγRに対する結合活性が減少していた。この結果からは、ヘテロ二量化抗体に導入した改変が、一方のH鎖に導入されたときはFcγRに対する結合活性を増強するが、両鎖に導入した場合には、FcγRが結合した状態で、一方の鎖では改変後の残基が結合を増強するものの、もう一方の鎖ではFcγRとの相互作用を阻害していると考えられた。すなわち、図３のFcγRが図の奥側から結合している状態を「X方向からの結合」と呼び、それとは反対に図の表側からの結合を「Y方向からの結合」と呼ぶと、ホモ二量化抗体はX方向、Y方向の両方向からのFcγRに対する結合活性を等しく変化させるが、ヘテロ二量化抗体はX方向、Y方向のいずれか一方向からの結合に偏ってFcγRに対する結合活性を変化させていると考えられた。
この仮説を実験によって検証するために、FcγRとの結合を主にX方向、Y方向のいずれか一方向からのみ阻害する改変を見出し、H鎖のいずれか一方ににここで見出した改変を導入し、同じH鎖、あるいは異なるもう一方のH鎖にFcγRに対する結合活性を増強する改変を導入することで、FcγRに対する結合活性がどのように阻害されるかを検証した。この改変と組み合わせる方法を検討した。抗体とFcγRとの結合に関与しているが、一方のH鎖でのみ結合に関与している改変を立体構造情報から探索し、P329をその候補として見出した。HA鎖のP329はFcγRIIIの87番目と110番目のTrpと疎水コアを形成しているが、HB鎖のP329はFcγRIIIとは直接相互作用していない（Nature, 372:379 - 383, 1994） (図１２)。例えば、HA鎖のP329を電荷を有する残基に置換すると、この疎水コアが崩壊し、図１２に表示されているX方向からの結合は阻害されると考えられるが、反対のY方向からの結合に関与していないHB鎖のP329は置換されず、そのままであるため、Y方向からの結合には大きな影響を与えないと予想した。
GpH7-B3のP329に電荷を有するR、K、D、Eの変異をそれぞれ導入した配列GpH7-B12、GpH7-B13、GpH7-B14、GpH7-B15（配列番号：１２〜１５）を挿入した発現ベクターを参考実施例１に記した方法で作製した。作製した発現ベクターは、それぞれGpH7-A5、GpL16-k0と組み合わせてヘテロ二量化抗体として発現するか、他のH鎖とは組み合わせずにGpL16-k0のみと合わせてホモ二量化抗体として、参考実施例１の方法にしたがって発現させ、精製した。精製して得られた抗体はヘテロ二量化抗体としてはGpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0であり、ホモ二量化抗体としてはGpH7-B12/GpL16-k0、GpH7-B13/GpL16-k0、GpH7-B14/GpL16-k0、GpH7-B15/GpL16-k0であった。調製した抗体を用いて、各FcγRに対する結合を参考実施例２に記した方法で測定し、その結果を図１３に示した。
P329R、P329Kを導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0のFcγRに対する結合活性はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0の各FcγRに対する結合活性の1/5から1/4程度になり、ホモ二量化抗体GpH7-B12/GpL16-k0、GpH7-B13/GpL16-k0ではFcγRとの結合が観察されなかった。また、P329D、P329Eを導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0、 GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0のFcγRに対する結合活性はFcγRIaについてはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0の各FcγRに対する結合活性の1/5から1/4程度になり、FcγRIa 以外は1/2以上の結合活性を維持していた。ホモ二量化抗体GpH7-B14/GpL16-k0、GpH7-B15/GpL16-k0ではFcγRIaに対する結合活性のみ残存していたが、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0のFcγRIaに対する結合活性の1/5以下であった。GpH7-B12、GpH7-B13には塩基性残基を、GpH7-B14、GpH7-B15には酸性残基を導入していることから、P329はArg、Lysなどの塩基性残基に置換した方がFcγRに対する結合活性をより強力に阻害すると考えられた。今回、一方のH鎖にのみ改変を導入した場合にはFcγRに対する結合活性が残存しているが、両鎖に同じ改変を導入するとほぼ結合が観察されなくなったという結果は、一方のH鎖のP329を親水性の残基に置換すれば一方向からの結合は阻害されるが、もう一方向からの結合は維持されるという仮説を支持するものと考えられた。
次に、実施例２で見出したヘテロ二量化することでFcγRに対する結合活性を増強する改変G237A、L234DがFcγRとの相互作用を一方向に偏って増強しているかを、各改変とP329Rの改変とを組み合わせた改変体を作製し、各改変体の各Fcに対する結合活性を比較することで検証した。K439Eと同じH鎖にP329Rの変異が導入されるようにGpH7-B3にP329Rの変異を導入したGpH7-B12（配列番号：１２）、D356K、H435Rと同じH鎖にP329Rの変異を導入されるようにGpH7-A5にP329Rを導入したGpH7-A48（配列番号：１６）、GpH7-A5にG237AとP329Rの変異を導入した配列GpH7-A45（配列番号：１７）、GpH7-B5にL234DとP329Rの変異を導入したGpH7-B41（配列番号：１８）を挿入した発現ベクターを参考実施例１に記した方法で作製した。参考実施例１の方法にしたがって、これらの発現ベクターと抗体L鎖に対応する発現ベクターであるGpL16-k0とを用いてG237AまたはL234DとP329Rとがいずれか一方のH鎖に導入されるように発現させた（表１）。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
G237AとP329Rの組み合わせの評価には、改変を導入するポリペプチドとしてGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0、P329Rを一方のH鎖に導入した改変体としてGpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0およびGpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0、P329Rと同じH鎖にG237Aを導入した改変体としてGpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0、P329Rと異なるH鎖にG237Aを導入した改変体としてGpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0を用い、参考実施例２の方法にしたがって各FcγRへの結合活性を比較した（図１４）。
P329Rを片方のH鎖に導入したGpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0とGpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0を比較すると、FcγRに対する結合パターンに大きな違いは観察されなかった。このことから、P329RはD356K、H435Rが導入されたH鎖に導入されても、K439Eが導入されたH鎖に導入されても、FcγRに対する結合には影響を及ぼさないと考えられた。
次に、G237Aを一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体であるGpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIa R、IIbに対する結合が増強していた。しかし、P329Rを一方のH鎖のみに導入したGpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0と比べて、G237Aをもう一方のH鎖に導入したGpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0ではFcγRに対する結合が減弱し、G237AのFcγRIIa R、IIbに対する結合増強の効果が観察されなかった。その一方で、P329Rを一方のH鎖のみに導入したGpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0と比べて、G237AをP329Rと同じH鎖に導入したGpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0ではFcγRIIa R、IIbに対する結合が増強しており、G237AのFcγRIIa R、IIbに対する増強効果が観察された。この結果から、G237AはP329Rを導入した鎖と異なる鎖に導入すると、抗体とFcγRとの結合が強力に阻害されたため、GpH7-A5に導入したG237AとGpH7-B3に導入したP329Rとを組み合わせると、抗体とFcγRとの結合を同じ方向で認識することが示された。
L234Dの改変についても同様の評価を実施した（図１５）。L234Dを一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体であるGpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIa R、IIbに対する結合が増強していた。しかし、P329Rのみを一方のH鎖に導入したGpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0と比べて、L234Dをもう一方のH鎖に導入したGpH7-A48/GpH7-B17/GpL16-k0ではFcγR Ia以外のFcγRに対する結合が減弱し、L234DのFcγRIIa R、IIbに対する結合増強の効果が観察されなかった。その一方で、P329Rのみを一方のH鎖に導入したGpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0と比べて、L234DをP329Rと同じH鎖に導入したGpH7-A5/GpH7-B41/GpL16-k0ではFcγRIIa R、IIbに対する結合が増強しており、L234DのFcγRIIa R、IIbに対する増強効果が観察された。この結果から、L234DはP329Rを導入した鎖と異なる鎖に導入すると、抗体とFcγRとの結合が強力に阻害されたため、GpH7-B3に導入したL234DとGpH7-A5に導入したP329Rとを組み合わせると、抗体とFcγRとの結合を同じ方向で認識することが示された。
つまり、G237AおよびL234Dのいずれも、P329Rとは抗体とFcγRに対する結合活性を強める（／弱める）方向が同じであった。
このように、ヘテロ改変はFcγRに対する結合をX方向、Y方向のいずれか一方に偏って強めていた。この結果から、ヘテロ二量化抗体はFcγRとの相互作用を非対称に増強していることが示された。
〔実施例４〕ヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体のFcγRに対する結合比較
実施例２より、抗体の2つのH鎖に異なる改変を加えることにより、2つのH鎖に同じ改変を加えるよりも、抗体のFc領域を介したFcγRに対する結合を増強することが可能であることを見出した。そこで、このような性質を持つ改変を見出すために、以下の実験を行った。
実施例２で作製したGpH7-B3(配列番号：４)において、FcγRとの結合に関与すると考えられるアミノ酸とその周辺のアミノ酸、具体的にはEUナンバリング234番目のLeu、EUナンバリング235番目のLeu、EUナンバリング236番目のGly、EUナンバリング237番目のGly、EUナンバリング238番目のPro、EUナンバリング329番目のSer、EUナンバリング265番目のAsp、EUナンバリング266番目のVal、EUナンバリング267番目のSer、EUナンバリング268番目のHis、EUナンバリング269番目のGlu、EUナンバリング270番目のAsp、EUナンバリング271番目のPro、EUナンバリング295番目のGln、EUナンバリング296番目のTyr、EUナンバリング298番目のSer、EUナンバリング300番目のTyr、EUナンバリング324番目のSer、EUナンバリング325番目のAsn、EUナンバリング326番目のLys、EUナンバリング327番目のAla、EUナンバリング328番目のLeu、EUナンバリング329番目のPro、EUナンバリング330番目のAla、EUナンバリング331番目のPro、EUナンバリング番目の、EUナンバリング332番目のIle、EUナンバリング333番目のGlu、EUナンバリング334番目のLys、EUナンバリング335番目のThr、EUナンバリング336番目のIle、EUナンバリング337番目のSerの部分を、元のアミノ酸とシステインを除く18種類のアミノ酸にそれぞれ置換したGpH7-B3 variantを作製した。各GpH7-B3 variantの名称は、A_Bと表現し、Aには改変する残基のEUナンバリング、アミノ酸の種類の情報を一文字表記で記載し、Bには置換後のアミノ酸の情報を示した。例えばEUナンバリング234番目のLeuをGlyにしたB3_variantはL234_01Gと命名される。なお、置換後のアミノ酸の情報に関しては一文字表記の前にそのアミノ酸特有の数値を便宜上記載した。具体的には、Glyの場合は01G、Alaの場合は02A、Valの場合は03V、Pheの場合は04F、Proの場合は05P、Metの場合は06M、Ileの場合は07I、Leuの場合は08L、Aspの場合は09D、Gluの場合は10E、Lysの場合は11K、Argの場合は12R、Serの場合は13S、Thrの場合は14T、Tyrの場合は15Y、Hisの場合は16H、Asnの場合は18N、Glnの場合は19Q、Trpの場合は20Wという記号を用いた。
2本のH鎖に変異を導入したホモ二量化抗体は以下の手順で調製した。抗体の発現にはH鎖としてGpH7-B3 variant、L鎖としてGpL16-k0（配列番号：５）を用い、参考実施例１の方法に従って抗体を調製した。このようにして調製した両H鎖に変異を導入したホモ二量化抗体をHo Abと呼ぶ。
一方のH鎖のみに変異を導入したヘテロ二量化抗体は以下の手順で調製した。抗体の発現にはH鎖としてGpH7-B3 variant、GpH7-A5（配列番号：３）、L鎖としてGpL16-k0（配列番号：５）を用い、参考実施例１の方法に従って抗体を調製した。このようにして調製した一方のH鎖にのみ変異を導入したヘテロ二量化抗体をHe Abと呼ぶ。
ホモ二量化抗体のコントロールとして、H鎖にGpH7-B3（配列番号：４）、L鎖にGpL16-k0（配列番号：５）を用いて調製した抗体GpH7-B3/GpL16-k0を、参考実施例１の方法に従って調製した。このホモ二量化抗体のコントロールとなる抗体をHoCon Abと呼ぶ。実施例２で検討したように、HoCon Abは天然型IgG1と比べて各FcγRに対する結合活性は大きく変化していない。
ヘテロ二量化抗体のコントロールとして、H鎖にGpH7-A5（配列番号：３）、GpH7-B3（配列番号：４）、L鎖にGpL16-k0（配列番号：５）を用いて調製した抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0を、参考実施例１の方法に従って調製した。このヘテロ二量化抗体のコントロールとなる抗体をHeCon Abと呼ぶ。HeCon Abは実施例２で検討したように、天然型IgG1と比べて各FcγRに対する結合は大きく変化していない。
調製したHo Ab、He Ab、HeCon AbおよびHoCon Abを用いて、FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIaに対する結合活性を参考実施例２の方法に従って測定した。それぞれのFcγRの測定結果について、以下の方法に従って図を作製した。He Abの各FcγRに対する結合活性を、HeCon Abの各FcγRに対する結合活性で割り、100をかけた値をHe/Conとした。Ho Abの各FcγRに対する結合活性を、HoCon Abの各FcγRに対する結合活性で割り、100をかけた値をHo/Conとした。目的の改変を含むGpH7-B3variantを用いて作製したホモ二量化抗体、ヘテロ二量化抗体について、横軸にHo/Con、縦軸にHe/Conの値をとった。FcγRIa, FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H), FcγRIIb、FcγRIIIaのそれぞれのFcγRについての結果を図１６、図１７、図１８、図１９、図２０にまとめた。各改変について、He/ConおよびHo/Conの値によって次のように解釈できる。
1. He/ConおよびHo/Conの値が100である場合：その変異を導入したGpH7-B3 variantを含むヘテロ二量化抗体He Ab、ホモ二量化抗体Ho AbのFcγRに対する結合活性が、それぞれヘテロ二量化抗体のコントロール、ホモ二量化抗体のコントロールのFcγRに対する結合活性と同等であることを示す。
2. He/Con、Ho/Conの値が100以下である場合：その変異を導入したGpH7-B3 variantを含むヘテロ二量化抗体He Ab、ホモ二量化抗体Ho AbのFcγRに対する結合活性が、それぞれヘテロ二量化抗体のコントロール、ホモ二量化抗体のコントロールのFcγRに対する結合活性より弱いことを示す。
3. He/Con、Ho/Conの値が100以上を示す場合：その変異を導入したGpH7-B3 variantを含むヘテロ二量化抗体He Ab、ホモ二量化抗体Ho AbのFcγRに対する結合活性が、それぞれヘテロ二量化抗体のコントロール、ホモ二量化抗体のコントロールのFcγRに対する結合活性より強いことを示す。
4. He/Conの値がHo/Conの値より大きい場合：その変異を導入したGpH7-B3 variantを含むヘテロ二量化抗体He AbのFcγRに対する結合活性が、ホモ二量化抗体Ho AbのFcγRに対する結合活性より強いことを示す。
5. He/Conの値がHo/Conの値より小さい場合：変異を導入したGpH7-B3 variantを含むヘテロ二量化抗体He AbのFcγRに対する結合活性が、変異を導入したGpH7-B3 variantを含むホモ二量化抗体Ho AbのFcγRに対する結合活性より弱いことを示す。
この1から5の解釈に基づき、図１６から図２０の各図の点を図２１のように分類することができる。
その改変が、図２１のiの領域に存在した場合は、その改変は2つのH鎖に導入されたホモ二量化抗体においてはFcγRに対する結合を減弱するが、同じ改変が一方のH鎖にのみ導入されたヘテロ二量化抗体においてはFcγRに対する結合を増強する効果があることを意味する。すなわち、その改変はヘテロ二量化抗体でのみFcγRに対する結合を増強する改変である。iの領域に含まれる改変を各FcγRについて表２（表２−１〜２−３）、表３（表３−１及び３−２）、表４、表５、表６にまとめた。
その改変が、図２１のiiの領域に存在した場合は、その点に対応する改変は両H鎖に導入されたホモ二量化抗体、同じ改変が一方のH鎖にのみ導入されたヘテロ二量化抗体のいずれにおいてもFcγRに対する結合を増強するが、その結合増強効果はヘテロ二量化抗体においての方が大きいことを意味する。すなわち、この領域内の改変はホモ二量化抗体よりも、ヘテロ二量化抗体においての方が、FcγRに対する結合増強効果の高い改変である。iiの領域に含まれる改変を各FcγRについて表２（表２−１〜２−３）、表３（表３−１及び３−２）、表４、表５、表６にまとめた。
なお、各表において、FcγRIa、FcγRIＩa H、FcγRIIa R、FcγRIIb、FcγRIIIaに対する結合活性に関わるHe/ConをそれぞれHe/Con _1a、He/Con _2aH、He/Con _2aR、He/Con _2b、He/Con_3aとし、FcγRIa、FcγRIＩa H、FcγRIIa R、FcγRIIb、FcγRIIIaに対する結合活性に関わるHo/ConをそれぞれHo/Con _1a、Ho/Con _2aH、Ho/Con _2aR、Ho/Con _2b、Ho/Con_3aとした。
その改変が、図２１のiiiの領域に存在した場合は、その点に対応する改変は両H鎖に導入されたホモ二量化抗体、同じ改変が一方のH鎖にのみ導入されたヘテロ二量化抗体のいずれにおいてもFcγRに対する結合を増強するが、その結合増強効果がホモ二量化抗体においての方が大きいことを意味する。すなわち、この領域内の改変はヘテロ二量化抗体よりも、ホモ二量化抗体においての方が、FcγRに対する結合増強効果の高い改変である。
尚、以下の表において、アミノ酸の改変を示す場合には、A327_03Vのように示す。最初のアルファベット（A327_03VのAに該当）は、改変前のアミノ酸残基を一文字表記で示した場合のアルファベットを意味する。それに続く数字（A327_03Vの327に該当）はその改変箇所のEUナンバリングを意味する。最後の数字＋アルファベット（A327_03Vの03Vに該当）は、改変後のアミノ酸残基を一文字表記で示した場合のアルファベット（アミノ酸の種類を示す数字＋アルファベット）を意味する。それぞれ、01G(Gly)、02A(Ala)、03V(Val)、04F(Phe)、05P(Pro)、06M(Met)、07I(Ile)、08L(Leu)、09D(Asp)、10E(Glu)、11K(Lys)、12R(Arg)、13S(Ser)、14T(Thr)、15Y(Tyr)、16H(His)、17C(Cys)、18N(Asn)、19Q(Gln)、20W(Trp)で表される。以上のことから、例えば、「A327_03V」は「EUナンバリング327番目のアミノ酸AのVへの置換」を意味する。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
Figure 2017043608
 FcγRIaについて i,iiの領域（図２１）に含まれる改変を示す。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
 FcγRIIa R について i,iiの領域 (図２１) に含まれる改変を示す。
Figure 2017043608
 FcγRIIa Hについて i,iiの領域（図２１）に含まれる改変を示す。
Figure 2017043608
 FcγRIIbについて i,iiの領域（図２１）に含まれる改変を示す。
Figure 2017043608
 FcγRIIIaについて i,iiの領域（図２１）に含まれる改変を示す。
本実施例で見出された改変は実施例２に加えて、実施例１に示したヘテロ二量化抗体によるFcγR認識能向上のコンセプトを支持すると考えられた。図２１のiの領域にある改変は従来のように２つのH鎖の双方に導入した際にはFcγRに対する結合活性を減弱させる改変として考えられ、結合を増強する改変としては認識されてこなかった。しかし、２つのH鎖の一方にのみ導入することで、このような改変についてもFcγRに対する結合活性を向上させる改変として見出すことに成功した。
〔実施例５〕ヘテロ二量化抗体の改変の組み合わせの決定方法
実施例３で示したように、ヘテロ二量化抗体において、ある改変がFcγRに対する結合に及ぼす効果は、改変によって方向が異なる。そのため、ヘテロ二量化抗体において複数の改変を組み合わせてFcγRに対する結合を一層増強あるいは減弱させようとする場合には、各改変のFcγRとの結合に及ぼす効果の方向をそろえる必要がある。仮に二つの改変が抗体のFcγRに対する結合に及ぼす増強効果の方向が異なる状態で各改変を導入した場合、各改変の効果が互いに打ち消しあい、FcγRに対する結合増強改変を組み合わせたにもかかわらず、結合増強効果が観察されないと考えられる。しかし、通常は各改変をどちらのH鎖に導入すべきかを事前に見分ける方法がないため、適切な組み合わせ方法を見出すためには、目的の改変を同じH鎖あるいは異なるH鎖に導入した抗体を調製し、FcγRに対する結合活性を比較しなければならない。例えば、ホモ二量化抗体の場合、３種類の異なる改変を全て導入する際には、両H鎖に各改変を導入した抗体を一種類作製すればよい。しかし、ヘテロ二量化抗体の場合、各改変をいずれかのH鎖に導入するかを判断する必要がある。その場合、図２２に示した通り、最大で４通りの組み合わせを試す必要がある。すなわち、改変の組み合わせの検討をする際に作製すべき改変体の数が多大になり、非効率的である。そこで抗体とFcγRの結合を一方向からのみ阻害するP329Rを、導入を検討する改変と組み合わせることでその改変が抗体とFcγRとの結合に影響を及ぼす方向を見出す方法を検討した。
実施例４で見出されたヘテロ二量化抗体においてFcγRIIIaに対する結合を増強する改変であるL234Y、G236W、S298AをそれぞれP329Rが導入されたのと同じH鎖、あるいは異なるH鎖に導入した場合に、FcγRIIIaに対する結合がどのように変化するかを評価した。まず、H鎖としてP329R改変を導入したGpH7-B12に、L234Y、G236W、S298Aをそれぞれ導入したGpH7-HA5（配列番号：１９）、GpH7-HA6（配列番号：２０）、GpH7-HA11（配列番号：２１）、もう一つのH鎖としてGpH7-A5、L鎖としてGpL16-k0を用いて参考実施例１の方法に従って、目的の改変体を発現、調製した。また、H鎖としてL234Y、G236W、S298AをそれぞれGpH7-B3に導入したGpH7-B3-01-15Y（配列番号：２２）、GpH7-B3-03-20W（配列番号：２３）、GpH7-B3-15-02A（配列番号：２４）、もう一つのH鎖としてGpH7-A5にP329Rを導入したGpH7-A48（配列番号：１６）、L鎖としてGpL16-k0を用いて、参考実施例１の方法に従って、目的の抗体を発現、調製した。ここで得られた抗体をそれぞれGpH7-A5/GpH7-HA5/GpL16-k0（配列番号：３、１９、５）、GpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0（配列番号：３、２０、５）、GpH7-A5/GpH7-HA11/GpL16-k0（配列番号：３、２１、５）、GpH7-A48/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0（配列番号：１６、２２、５）、GpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0（配列番号：１６、２３、５）、GpH7-A48/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0（配列番号：１６、２４、５）とした。参考実施例２の方法に従って各改変体のFcγRIIIaに対する結合活性を比較し、L234Y、G236W、S298AのP329Rとの組み合わせの効果を表７にまとめた。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）、FcγRIIIaに対する結合活性はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0（配列番号：３、４、５）の FcγRIIIaに対する結合を100としたときの相対的な結合活性を表記した。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
この結果から、各改変について、各改変をP329Rと同じH鎖に導入した場合、異なるH鎖に導入した場合について、FcγRIIIaに対する結合活性を比較した。L234Yの場合、前者に対応するGpH7-A5/GpH7-HA5/GpL16-k0の結合活性は60、後者に対応するGpH7-A48/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0の結合活性は11であり、P329Rと異なるH鎖に改変が導入された場合の方がFcγRに対する結合が阻害されていた。G236Wの場合、前者に対応するGpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0の結合活性は56、後者に対応するGpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0の結合活性は13であり、P329Rと異なるH鎖に改変が導入された場合の方がFcγRに対する結合が阻害されていた。S298Aの場合、前者に対応するGpH7-A5/GpH7-HA11/GpL16-k0の結合活性は84、後者に対応するGpH7-A48/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0の結合活性は47であり、P329Rと異なるH鎖に改変が導入された場合の方がFcγRに対する結合活性が阻害されていた。いずれの改変についても後者のP329Rと異なるH鎖に導入した場合の方がFcγRIIIaに対する結合が阻害されていた。P329Rを導入したH鎖が図３のHA鎖に対応すると仮定すると、P329RはX方向からの結合を阻害すると考えられる。結合が顕著に阻害された組み合わせは、L234Y、G236W、S298AをP329Rと異なるH鎖に導入したときであったので、この場合これらの改変をHB鎖に導入したことになる。L234Y、G236W、S298Aのいずれの改変も、P329Rと異なるH鎖に導入したときにFcγRIIIa に対する結合増強効果が顕著に阻害されたことから、HB鎖に導入した場合にはいずれの改変もP329RがFcγRIIIaの結合を阻害するX方向からの結合を強めていたと考えられる。よって、これらの改変を同じH鎖に導入することで、FcγRIIIaに対する結合をさらに増強することができると考えられた。
L234Y、G236W、S298Aのうち2つをそれぞれ同じH鎖あるいは異なるH鎖に導入することでFcγRに対する結合が増強するのかを評価し、上記の仮説を検証した。L234Y、G236W、S298AのそれぞれをGpH7-A5に導入したGpH7-TA1（配列番号：２５）、GpH7-TA2（配列番号：２６）、GpH7-TA3（配列番号：２７）と、L234Y、G236W、S298AのそれぞれをGpH7-B3に導入したGpH7-B3-01-15Y（配列番号：２２）、GpH7-B3-03-20W（配列番号：２３）、GpH7-B3-15-02A（配列番号：２４）を挿入した発現ベクターを参考実施例１の方法にしたがい作製した。また、L234YとG236WをGpH7-A5に導入したGpH7-TA4（配列番号：２８）、L234YとS298AをGpH7-A5に導入したGpH7-TA5（配列番号：２９）、G236WとS298AをGpH7-A5に導入したGpH7-TA6（配列番号：３０）を挿入した発現ベクターを作製した。これらを表８のように組み合わせ、それぞれの組み合わせに対してGpL16-k0をL鎖として加えて、参考実施例１の方法に従って目的の抗体の発現、調製を実施した。発現したサンプルのH鎖、変異箇所に関する情報、抗体のFcγRIIIaに対する結合を測定した結果を表８にまとめた。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）、FcγRIIIaに対する結合活性はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0の FcγRIIIaに対する結合を100としたときの相対的な結合活性を表記した。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
表８の結果から、L234YとG236Wの組み合わせ効果について検証した。L234YとG236Wを異なるH鎖に導入したGpH7-TA2/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0はFcγRIIIaに対する結合活性が130であり、L234Yのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0の結合活性131と比べて増加しておらず、G236Wのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0の結合活性140と比べて減少していた。しかし、L234YとG236Wを同じH鎖に導入したGpH7-TA4/GpH7-B3/GpL16-k0は結合活性が168であり、L234Yのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0、G236Wのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0と比べて結合活性が増加していた。この結果から、L234YとG236Wは予測した通り、同じH鎖に導入することでFcγRIIIaに対する結合活性をより増強することが明らかとなった。
次に、表８より、L234YとS298Aの組み合わせ効果について検証した。L234YとS298Aを異なるH鎖に導入したGpH7-TA1/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0はFcγRIIIaに対する結合活性が142であり、L234Yのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0の結合活性131と比べて増加していたが、S298Aのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0の結合活性である163より減少していた。つまり、GpH7-TA1/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0はS298Aのみを導入した場合よりも結合活性が増強していないことからS298AとL234Yとを異なるH鎖に導入しては、FcγRIIIaに対する結合活性をより増強する効果を付与できなかったと言える。しかし、L234YとS298Aを同じH鎖に導入したGpH7-TA5/GpH7-B3/GpL16-k0は結合活性が208であり、L234Yのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0、S298Aのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0のいずれと比べてもFcγRIIIaへの結合活性が増加していた。この結果から、L234YとS298Aとは予測した通り、同じH鎖に導入することでFcγRIIIaに対する結合活性をより増強することが明らかとなった。
次に、表８より、G236WとS298Aの組み合わせ効果について検証した。G236WとS298Aを異なるH鎖に導入したGpH7-TA3/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0はFcγRIIIaに対する結合活性が70であり、G236Wのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0の結合活性である140と比べて減少しており、S298Aのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0の結合活性である163よりも減少していた。しかし、G236WとS298Aを同じH鎖に導入したGpH7-TA6/GpH7-B3/GpL16-k0は結合活性が228であり、G236Wのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0、S298Aのみを導入したGpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0のいずれと比べても結合活性が増加していた。この結果から、G236WとS298Aとは予測した通り、同じH鎖に導入することでFcγRIIIaに対する結合活性をより増強することが明らかとなった。
これらの結果から、最初に予測した通り、L234Y、G236W、S298A はそれぞれ同じH鎖に導入されたときにのみ、結合が増強することが示された。これはL234Y、G236W、S298A が同じ鎖に存在する場合には、FcγRとの結合を同じ方向から増強していることを支持するデータである。つまり、各改変とP329Rとを組み合わせ、FcγRIIIaに対する結合活性を比較した結果から予測された結果に従うことで、2つの改変を適切に組み合わせる方法を決定できることを示している。すなわち、P329Rとの組み合わせはヘテロ二量化抗体における改変の組み合わせ方法を予測する有用な方法であり、この方法を用いることで、その他の有用な改変の組み合わせを明らかにすることが可能である。
各改変とP329Rとを組み合わせ、FcγRIIIaに対する結合活性を比較した結果から、2つ以上の改変の組み合わせを考えた場合、L234YとG236W、G236WとS298A、S298AとL234Yは同じH鎖に導入した場合、それぞれ同じ方向からFcγRIIIaとの相互作用を増強していることが明らかとなった。すなわち、この結果からL234Y、G236W、S298Aは全て同じ方向からFcγRIIIaに対する結合活性を増強していると考えられるため、これらの改変は同じH鎖に導入した場合に、FcγRIIIaに対する結合活性が最も強くなると予想された。この仮説を検証するために、L234YとG236W、L234YとS298A、G236WとS298Aのそれぞれの改変群をGpH7-A5に導入したGpH7-TA4、GpH7-TA5、GpH7-TA6とL234Y、G236W、S298AをそれぞれGpH7-B3に導入したGpH7-B3-01-15Y、GpH7-B3-03-20W、GpH7-B3-15-02Aを挿入した発現ベクターを参考実施例1にしたがって調製し、L234Y、G236W、S298Aの３つの改変がいずれかのH鎖には導入されるように組み合わせ、L鎖としてGpL16-k0を加えて、参考実施例１の方法に従って目的の抗体を発現、精製した。また、L234Y、G236W、S298Aの３つの改変をGpH7-A5に導入したGpH7-TA7（配列番号：３１）を作製し、GpH7-B3、GpL16-k0と合わせて、参考実施例1の方法に従って目的の抗体を発現、精製した。ここで調製した抗体のリストと、それぞれの抗体のFcγRIIIaに対する結合活性を比較した結果を表９にまとめた。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）、FcγRIIIaに対する結合活性はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0の FcγRIIIaに対する結合活性を100としたときの相対的な結合活性を表記した。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
その結果、各改変とP329Rとを組み合わせ、FcγRIIIaに対する結合活性を比較した結果から予測した通り、L234Y、G236W、S298Aが同じH鎖に導入されたGpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0が最もFcγRIIIaに対する結合が増強していた。すなわち、この結果から各改変とP329Rとを組み合わせ、FcγRIIIaに対する結合活性を比較することで、2つ以上の改変の適切な組み合わせ方法を予想することができることが明らかとなった。
〔実施例６〕ヘテロ二量化抗体における従来のホモ二量化抗体と新規ヘテロ二量化抗体の比較
実施例５の表７、表８、表９の結果から、単独でFcγRIIIaに対する結合活性を増強するヘテロ改変は、適切に組み合わせることで、FcγRIIIaへの結合をさらに増強することが可能であることが示された。具体的には、L234Y、G236W、S298Aは同じH鎖に改変を加えることで、FcγRに対する結合活性がより増強することが示された。
次に、複数の改変を組み合わせても、対応する複数の改変を導入した場合にヘテロ二量化抗体の方がホモ二量化抗体よりもFcγRに対する結合が増強しているというヘテロ二量化抗体の性質が維持されているかを確認した。具体的には、GpH7-A5、GpH7-B3のそれぞれにL234Y、G236W、S298Aを導入したGpH7-TA7およびGpH7-TA45（配列番号：３２）を参考実施例１の方法にしたがって作製し、表１０に示すようにL234Y、G236W、S298Aが一方のH鎖にのみ導入されたヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0およびGpH7-A5/GpH7-TA45/GpL16-k0、L234Y、G236W、S298Aが両H鎖に導入されたホモ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0を参考実施例1の方法にしたがって発現、精製した。これらを参考実施例２の方法にしたがって、そのFcγRIIIaに対する結合を比較した（表１０）。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）、FcγRIIIaに対する結合活性はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0の FcγRIIIaに対する結合活性を100としたときの相対的な結合活性を表記した。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
表１０の結果から、L234Y、G236W、S298Aが一方のH鎖にのみ導入されたヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0およびGpH7-A5/GpH7-TA45/GpL16-k0のいずれと比べても、L234Y、G236W、S298Aが両H鎖に導入されたホモ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0は、FcγRIIIaに対する結合が減少していた。このことから、ヘテロ二量化抗体においてはFcγRに対する結合活性を増強するが、ホモ二量化抗体においてはFcγRに対する結合活性を減弱するという、L234Y、G236W、S298Aの各改変の性質が、複数の改変を組み合わせた場合であっても維持されることが明らかとなった。
次に、L234Y、G236W、S298A が一方のH鎖にのみ導入されたヘテロ二量化抗体において、実施例３で考察したようなFcγRIIIaとの結合の方向性が維持されているか否かを検証した。
GpH7-TA7、GpH7-B3のそれぞれにP329Rを導入したGpH7-TA8（配列番号：３３）、GpH7-B12（配列番号：１２）を参考実施例１の方法にしたがって作製し、表１１に示すようにL234Y、G236W、S298A とP329Rを同じH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0、異なる鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0を参考実施例１の方法にしたがって調製した。これらの抗体とL234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0のFcγRIIIに対する結合活性を参考実施例２の方法にしたがって比較した（表１１）。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）、FcγRIIIaに対する結合活性はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0の FcγRIIIaに対する結合を100としたときの相対的な結合活性を表記した。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
表１１の結果、L234Y、G236W、S298Aの改変群をP329Rと同じH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0とL234Y、G236W、S298Aの改変群をP329Rと異なるH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0のいずれも、GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0に比べてFcγRIIIaに対する結合活性が減弱していたが、GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0ではFcγRIIIaに対する結合活性が11であり、GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0の150に比べて顕著に減弱していた。この結果から、L234Y、G236W、S298Aの改変を複数H鎖に導入しても、P329Rと異なるH鎖に導入した場合には著しくFcγRに対する結合活性が著しく減弱されるという、実施例３においてL234Y、G236W、S298Aの各改変の場合に観察された性質と同様の性質が観察された。
これらの結果から、FcγRに対する結合を増強する改変を適切に組み合わせることによって、ヘテロ二量化抗体の性質を維持したまま、FcγRに対する結合活性を一層増強することが可能であることが明らかとなった。
〔実施例７〕従来技術との比較：FcγRIIIa結合増強アミノ酸改変抗体とヘテロ改変体の比較
これまでにもFcγRIIIaに対する結合を増強することでADCC活性を増強する改変が知られている。例えば、S239D、I332E、A330Lの改変は両抗体のH鎖に導入した場合に、最もFcγRIIIaに対する結合を増強する改変であることが知られている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 4005-4010, 2006）。抗体依存的細胞障害（ADCC）活性が増強することで、抗体の抗腫瘍活性が増強することが示されており、抗体のFcγRIIIaに対する結合を増強することは抗体の医薬品としての有用性を高めるために有効な手段である。しかしながら、これまでの実施例で示されている通り、ホモ二量化抗体を用いたFcγRに対する結合活性の増強には限界があると考えられ、ヘテロ改変により、更なる増強が可能と考えられた。
実施例１で述べたように、抗体のFc領域とFcγRとは非対称的に相互作用している。S239D、I332E、A330Lの改変を導入した抗体の場合、その立体構造からHA鎖においてはS239D、I332E、A330Lの改変された全ての残基がFcγRとの相互作用の増強に関与しているが、HB鎖においてS239D以外はFcγRと接しておらず、FcγRに対する結合活性増強に寄与していないと考えられた（図２３）。すなわち、Fc領域とFcγRとの相互作用の非対称性を考慮すると、従来の抗体改変技術で導入した各改変はFcγRと十分に相互作用できず、抗体とFcγRとの相互作用を最適化するのには不十分と考えられる。例えば、上記のS239D、I332E、A330Lの改変の場合、HB鎖にこれらの改変の代わりにFcγRIIIaとの相互作用をHB鎖側から増強する改変を導入することで、FcγRIIIaに対する結合を更に増強することが可能になると考えられる。すなわち、抗体の各H鎖に異なる改変を加える本発明のヘテロ二量化抗体を作製する技術（以下、本明細書において「ヘテロ二量化抗体技術」という）を用いることで、抗体の各H鎖に同じ改変を加える技術（以下、本明細書において、「従来技術」または「ホモ二量化抗体技術」という）よりもさらにFcγRに対する結合を増強させられる可能性がある。
FcとFcγRIIIaの複合体の立体構造から、S239D、I332E、A330L とは反対に、S298はFcγRとは図２３のHB鎖でしか相互作用していないと考えられる（JBC, 276: 16469-16477, 2001）。このことから、S298に改変を導入した場合、置換された変異もHB鎖側でFcγRIIIaと相互作用すると考えられる。実施例５で見たように、L234Y、G236WはS298Aと同じ方向からFcγRとの相互作用を増強していると考えられた。つまり、S239D、A330L、I332E を同じH鎖に導入し、L234Y、G236W、S298Aを反対のH鎖に導入すれば、導入した全ての改変がFcγRと同時に相互作用することが可能になり、その結果としてFcγRとの相互作用を一層増強することができると考えられる。
この仮説を検証するために以下の実験を行った。L234Y、G236W、S298A、S239D、A330L、I332Eの改変をそれぞれ導入したH鎖と、P329Rを同じH鎖、あるいは異なるH鎖に導入した抗体を利用して、実施例５の方法にしたがって各改変がFcγRを認識する方向を決定した。参考実施例１の方法にしたがって、GpH7-A5、GpH7-A5にP329Rを導入したGpH7-A48（配列番号：１６）、GpH7-B3にS239DおよびP329Rを導入したGpH7-HA7（配列番号：３４）、GpH7-B3にA330LおよびP329Rを導入したGpH7-HA15（配列番号：３５）、GpH7-B3にI332EおよびP329Rを導入したGpH7-HA18（配列番号：３６）、GpH7-B3にL234YおよびP329Rを導入したGpH7-HA5（配列番号：１９）、GpH7-B3にG236WおよびP329Rを導入したGpH7-HA6（配列番号：２０）、GpH7-B3にS298AおよびP329Rを導入したGpH7-HA11（配列番号：２１）、GpH7-B3にS239Dを導入したGpH7-B3-06-09D（配列番号：３７）、GpH7-B3にA330Lを導入したGpH7-B3-20-08L（配列番号：３８）、GpH7-B3にI332Eを導入したGpH7-B3-22-10E（配列番号：３９）、GpH7-B3にL234Yを導入したGpH7-B3-01-15Y（配列番号：２２）、GpH7-B3にG236Wを導入したGpH7-B3-03-20W（配列番号：２３）、GpH7-B3にS298Aを導入したGpH7-B3-15-02A（配列番号：２４）を挿入した発現ベクターを作製した。L234Y、G236W、S298A、S239D、A330L、I332Eの各改変とP329Rとが同じH鎖あるいは異なるH鎖に存在するように、各H鎖に対応する発現ベクターを組み合わせ、L鎖に対応する発現ベクターのGpL16-k0と合わせて、参考実施例1の方法に従って目的の抗体を発現、調製した。調製した抗体を使ってFcγRIIIaに対する結合活性を測定し、P329Rを用いたL234Y、G236W、S298A，S239D、A330L、I332EのFcγRIIIa認識方向を検討した結果を表１２にまとめた。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）、FcγRIIIaに対する結合活性はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0の FcγRIIIaに対する結合活性を100としたときの相対的な結合活性を表記した。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
その結果から、各改変について、各改変をP329Rと同じH鎖に導入した場合、異なるH鎖に導入した場合で、FcγRIIIaに対する結合活性を比較した。S239Dの場合、前者に対応するGpH7-A5/GpH7-HA7/GpL16-k0の結合活性は3、後者に対応するGpH7-A48/GpH7-B3-06-09D/GpL16-k0の結合活性は123であり、P329Rと同じH鎖に改変が導入された場合の方がFcγRIIIaに対する結合が阻害されていた。A330Lの場合、前者に対応するGpH7-A5/GpH7-HA15/GpL16-k0の結合活性は32、後者に対応するGpH7-A48/GpH7-B3-20-08L/GpL16-k0の結合活性は60であり、P329Rと同じH鎖に改変が導入された場合の方がFcγRIIIaに対する結合が阻害されていた。I332Eの場合、前者に対応するGpH7-A5/GpH7-HA18/GpL16-k0の結合活性は35、後者に対応するGpH7-A48/GpH7-B3-22-10E/GpL16-k0の結合活性は189であり、P329Rと同じH鎖に改変が導入された場合の方がFcγRIIIaに対する結合が阻害されていた。いずれの改変についても前者のP329Rが同じH鎖に導入されていた場合の方がFcγRIIIaに対する結合が阻害されていた。P329Rを導入したH鎖が図２３のHA鎖に対応すると仮定すると、P329RはX方向からの結合を阻害すると考えられる。結合が顕著に阻害された組み合わせは、S239D、A330L、I332EをP329Rと同じH鎖に導入したときであったので、この場合これらの改変をHA鎖に導入したことになる。S239D、A330L、I332Eのいずれの改変も、P329Rと同じH鎖に導入したときにFcγRIIIa に対する結合増強効果が顕著に阻害されたことから、HA鎖に導入した場合にはいずれの改変もP329RがFcγRIIIaの結合を阻害するX方向からの結合を強めていたと考えられる。よって、これらの改変を同じH鎖に導入することで、FcγRIIIaに対する結合をさらに増強することができると考えられる。実施例５より、L234Y、G236W、S298AはいずれもHB鎖に導入した場合にX方向からの結合を強めていると考察された。実施例5、実施例6で考察したように、P329Rと組み合わせることで各改変を適切に組み合わせる方法を見出すことが可能である。今回の結果から、図３のX方向からのFcγRIIIaに対する結合を増強するためにはS239D、A330L、I332EはHA鎖、L234Y、G236W、S298AはHB鎖に導入する必要があり、それぞれの改変群を異なるH鎖に導入することで、X方向からのFcγRIIIaに対する結合をより増強することが可能であると考えられた。
この仮説を検証するために、参考実施例１の方法にしたがってS239D、A330L、I332Eを全てGpH7-A5に導入したGpH7-A57（配列番号：４０）、GpH7-B3に導入したGpH7-B78（配列番号：４１）およびL234Y、G236W、S298Aを全てGpH7-A5に導入したGpH7-TA7（配列番号：３１）、GpH7-B3に導入したGpH7-TA45（配列番号：３２）を挿入した発現ベクターを調製した。これらの発現ベクターとGpH7-A5、GpH7-B3、GpL16-k0を使って、一方のH鎖にL234Y、G236W、S298Aを、もう一方のH鎖にS239D、A330L、I332Eを導入したヘテロGpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0、L234Y、G236W、S298Aのみを一方のH鎖に導入したGpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0、L234Y、G236W、S298Aを両方のH鎖に導入したGpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0、S239D、A330L、I332Eのみを一方のH鎖に導入したGpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0、S239D、A330L、I332Eを両方のH鎖に導入したGpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0を参考実施例１の方法に従って発現、調製した。調製した抗体は参考実施例２の方法に従って測定したFcγRIIIaに対するKDを指標に、FcγRIIIaに対する結合活性を比較し、L234Y、G236W、S298AとS239D、A330L、I332Eの組み合わせの効果の検証結果を表１３にまとめた。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。GpH7-G1d/GpL16-k0のFcγRIIIaに対するKDを各抗体のKDで割った値をKD ratio 1とし、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0のFcγRIIIaに対するKDを各抗体のKDで割った値をKD ratio 2とした。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
表１３の結果から、天然型IgG1であるGpH7-G1d/GpL16-k0と、D356K、H435RおよびK439Eをそれぞれ一方のH鎖に導入したGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0とを比較すると、そのFcγRIIIaに対する結合活性の変化は0.75倍であり、大きな差異は観察されなかった。このことから、D356K、H435RおよびK439Eの改変はFcγRIIIaに対する結合活性に対して影響を与えないと考えられた。
従来技術を用いたホモ二量化抗体について、各改変の効果を検証した。S239D、A330L、I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0ではGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が約260倍増強していたが、反対にL234Y、G236W、S298Aを両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0では0.49倍に減弱していた。この結果から、ホモ二量化抗体においてはS239D、A330L、I332Eの改変群にのみFcγRIIIaに対する結合活性増強効果があることが明らかとなった。
各改変群を一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体について、各改変群の効果を検証した。S239D、A330L、I332Eを一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0ではGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が30倍増強し、L234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0では5.1倍増強した。この結果から、S239D、A330L、I332Eの改変群の方がFcγRIIIaに対する結合活性増強効果が高いことが明らかとなった。
各改変群のホモ二量化抗体とヘテロ二量化抗体における効果の違いを検証した。S239D、A330L、I332Eについては、そのヘテロ二量化抗体においてはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が30倍増強し、ホモ二量化抗体では約260倍増強しており、ホモ二量化抗体に導入したほうがFcγRIIIaに対する結合活性の増強を一層高められることが明らかとなった。一方で、L234Y、G236W、S298Aについては、そのヘテロ二量化抗体においてはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が5.1倍増強したにも関わらず、ホモ二量化抗体では0.49倍に減弱していた。この結果は実施例5で考察したのと同様に、L234Y、G236W、S298Aの改変群はヘテロ二量化抗体においてのみ、FcγRIIIaに対する結合活性増強効果が見出されることを示している。
ホモ二量化抗体においてはS239D、A330L、I332Eの改変群のみがFcγRIIIaに対する結合増強効果を示し、ヘテロ二量化抗体においてもS239D、A330L、I332Eの改変群のほうFcγRIIIaに対する結合増強が高いことが示されてきた。これらの結果から、S239D、A330L、I332Eの改変群とL234Y、G236W、S298Aの改変群を組み合わせを考えた場合、従来の考えに基づいて考えれば、ヘテロ二量化抗体、ホモ二量化抗体のいずれにおいてもFcγRIIIaに対する結合増強が高いS239D、A330L、I332Eの改変群のみを両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0がFcγRIIIaに対する結合増強効果が最も高いと予測される。しかし、S239D、A330L、I332Eを一方のH鎖に導入し、L234Y、G236W、S298Aをもう一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が約350倍増強し、S239D、A330L、I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体よりも高い結合増強効果を示していた。これはS239D、A330L、I332Eの改変群とL234Y、G236W、S298Aの改変群を異なるH鎖に導入することで、導入された全ての改変がHA鎖、HB鎖の両方からFcγRIIIaに対する結合活性を増強させ、S239D、A330L、I332Eの改変群を両H鎖に導入した場合よりも高い効果を発揮するという仮説を裏付ける結果であると考えられた。
すなわち、ヘテロ二量化抗体を用いることで、従来のホモ二量化抗体を用いるよりも、Fc領域とFcγRIIIaとの非対称な相互作用をより最適化することができ、より高い結合活性を有するFc領域をデザインすることができることが示された。
図２３よりA330L、I332EはHA鎖でしかFcγRと相互作用していないが、S239DはHA鎖、HB鎖の両方においてFcγRと相互作用していると考えられた。実際、S239D、A330L、I332Eを一方のH鎖のみに導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0ではFcγRIIIaに対するKDは5.4E-8であるが、ホモ二量化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0ではKDが6.2E-9であり、FcγRIIIaに対する結合活性が8.7倍増強していた。この結合活性の差はS239Dが両H鎖から結合増強に関与していることに起因すると考えると、S239Dを両H鎖に導入することでこの差が解消すると考えられた。この仮説を検証するために、GpH7-A5にS239Dを導入したGpH7-A53（配列番号：４２）を作製し、S239D、A330L、I332Eを導入したGpH7-B78と組み合わせて参考実施例１の方法に従って発現、調製をし、参考実施例２の方法に従ってS239D、A330L、I332Eのヘテロ二量化抗体およびホモ二量化抗体とFcγRIIIaに対する結合を比較し、S239DとS239D、A330L、I332Eの組み合わせの効果の検証を行った（表１４）。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0のFcγRIIIaに対するKDを各抗体のKDで割った値をKD ratioとした。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
表１４から、S239D、A330L、I332Eを一方のH鎖に、S239Dをもう一方のH鎖に導入したGpH7-A53/GpH7-B78/GpL16-k0ではS239D、A330L、I332Eを一方のH鎖のみに導入したGpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が4.9倍増強し、S239D、A330L、I332Eを両H鎖に導入したGpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性は1.8倍しか減弱していなかった。この結果から、上記の仮説の通り、S239Dは両H鎖においてFcγRIIIaと相互作用し、この改変を導入することでFcγRIIIaと相互作用を一層増強することができると考えられた。
一方のH鎖にL234Y、G236W、S298Aを、もう一方のH鎖にS239D、A330L、I332Eを導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0にS239Dを導入することで、更なるFcγRIIIaに対する結合活性の増強が可能か検証した。参考実施例1の方法にしたがって、GpH7-TA7に対してS239Dを導入したGpH7-TA22（配列番号：４３）を挿入した発現ベクターを調製し、GpH7-B3にS239D、A330L、I332Eを導入したGpH7-B78、GpL16-k0と合わせて、目的の抗体を発現、調整した。さらに、一方のH鎖にL234Y、G236W、S239D、S298Aを、もう一方のH鎖にS239D、A330L、I332Eを導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0を調製した。参考実施例２の方法に従ってFcγR IIIa に対する結合活性を比較し、S239DとS239D、A330L、I332Eの組み合わせの効果の検証を行った（表１５）。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0のFcγRIIIaに対するKDを各抗体のKDで割った値をKD ratioとした。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
表１５より、一方のH鎖にL234Y、G236W、S298Aを、もう一方のH鎖にS239D、A330L、I332Eを導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0において、S239Dを含まない側の鎖にS239Dを導入したGpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0ではGpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0よりも3.2倍結合活性が増強していた。この結果、S239Dを用いることで、FcγRIIIaに対する結合の更なる増強が可能であることが示された。
次に、実施例４で見出したFcγRIIIaに対する結合増強改変の一つであるY296W、K334Gを更に加えること検討を実施した。
まず、Y296WをいずれのH鎖に導入するかを検討した。GpH7-TA7にY296Wの変異を導入したGpH7-TA52（配列番号：４４）を作製し、GpH7-B78と組み合わせて参考実施例1の方法に従って、発現、調製した。また、GpH7-B78にY296Wを導入したGpH7-TA58（配列番号：４５）を作製し、GpH7-TA22と組み合わせて参考実施例１の方法に従って発現、調製した。調製した抗体について参考実施例２の方法に従って、FcγRIIIaに対する結合活性を比較し、Y296Wの組み合わせの効果の検証を行った（表１６）。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0のFcγRIIIaに対するKDを各抗体のKDで割った値をKD ratioとした。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
この結果から、Y296WはL234Y、G236W、S298Aと異なるH鎖に導入した場合、導入前後でFcγRIIIaに対する結合活性が1.2倍しか増強しないが、同じH鎖に導入した場合、GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が1.8倍増強した。この結果から、Y296WはL234Y、G236W、S298Aと同じH鎖に導入することで、FcγRIIIaに対する結合増強効果があると考えられる。
次に、GpH7-TA22にY296Wを導入したGpH7-TA54（配列番号：４６）を作製し、GpH7-B78と組み合わせて参考実施例1の方法に従って、発現、調製した。また、GpH7-B78にY296Wを導入したGpH7-TA58（配列番号：４５）を作製し、GpH7-TA22と組み合わせて参考実施例１の方法に従って発現、調製した。調製した抗体について参考実施例２の方法に従って、FcγRIIIaに対する結合活性を比較し、Y296Wの組み合わせの効果の検証を行った（表１７）。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0のFcγRIIIaに対するKDを各抗体のKDで割った値をKD ratioとした。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
表１７の結果から、Y296WはL234Y、G236W、S298Aと異なるH鎖に導入した場合、導入前後でFcγRIIIaに対する結合活性が変化しないが、同じH鎖に導入した場合、GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が1.3倍増強した。この結果から、Y296WはL234Y、G236W、S298Aと同じH鎖に導入することで、FcγRIIIaに対する結合活性増強効果があると考えられる。
次に、K334Gについても同様の検討を行った。GpH7-TA7にK334Gを導入したGpH7-TA40（配列番号：４７）を作製し、GpH7-B78と組み合わせて参考実施例１の方法に従って、発現、調製した。また、GpH7-B78にK334Gを導入したGpH7-TA50（配列番号：４８）を作製し、GpH7-TA7と組み合わせて参考実施例１の方法に従って発現、調製した。調製した抗体について参考実施例２の方法に従って、FcγRIIIaに対する結合を比較し、K334Gの組み合わせの効果の検証を行った（表１８）。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0のFcγRIIIaに対するKDを各抗体のKDで割った値をKD ratioとした。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
表１８の結果から、K334GはL234Y、G236W、S298Aと同じH鎖に導入した場合、導入前後でFcγRIIIaに対する結合活性が半分に低下してしまうが、異なるH鎖に導入した場合、GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が1.2倍増強した。この結果から、K334GはL234Y、G236W、S298Aと異なるH鎖に導入することで、FcγRIIIaに対する結合活性増強効果があると考えられた。
〔実施例８〕活性型FcγRおよび抑制型FcγRに対する選択性の向上
FcγRは、ITAMをもつ活性型とITIMをもつ抑制型が存在する。代表的な活性型FcγR (Activating receptor)としてFcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIaが挙げられ、また代表的な抑制型FcγR(Inhibitory receptor)としてFcγRIIbが挙げられる。がんを標的にした抗体において、ADCC活性や抗体依存的細胞貪食（ADCP）活性を作用機序にもつ活性型FcγRに対する結合活性と抑制型FcγRに対する結合活性の比率が重要な役割を果たすと考えられている（Nature Medicine, 6: 443-446, 2000）。
がんを標的にした抗体は、活性型FcγRに対する結合活性を増強させ、抑制型FcγRに対する結合活性を減弱させることが望ましいと考えられる。具体的には、図２４に示したaの領域に含まれる改変のように、活性型FcγRに対し天然型抗体より強く結合し、かつ抑制型FcγRに対して天然型抗体より弱く結合する、すなわち活性型FcγRに選択的に結合増強する改変であることが望ましい。また、図２５に示したbの領域にある改変のように、活性型FcγRと抑制型FcγRに対する結合活性の比率を、天然型抗体と比較して大きくなる改変であることが望ましい。このような改変は抑制型FcγRと比べて活性型FcγRに対して選択的に結合活性を増強した改変と言える。
改変を一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体He Abのそれぞれの活性型FcγRおよび抑制型FcγRに対する結合活性を実施例4の方法に準じて測定した。それぞれのヘテロ二量化抗体のそれぞれの活性型FcγRおよび抑制型FcγRに対する結合活性の比率を評価するために、その結果を図２６、図２７、図２８、図２９にまとめた。図２６の活性型FcγRはFcγRIa、図２７の活性型FcγRはFcγRIIa (R)、図２８の活性型FcγRはFcγRIIa (H)、図２９の活性型FcγRはFcγRIIIaである。
図２６の中で図２４、図２５のaおよびbに対応する領域に存在する改変を表１９（表１９−１〜１９−５）にまとめた。同様にして、FcγRIIa (R)（図２７）、FcγRIIa (H) （図２８）、FcγRIIIa（図２９）についてもaおよびbに対応する領域に存在する改変のリストをそれぞれ表２０（表２０−１〜２０−３）、表２１（表２１−１〜２１−３）、表２２（表２２−１〜２２−３）にまとめた。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
Figure 2017043608
Figure 2017043608
Figure 2017043608
 FcγRIIbと比べてFcγRIaに対する結合を選択的に増強する改変のリストを示す。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
Figure 2017043608
 FcγRIIbと比べてFcγRIIa (R)に対する結合を選択的に増強する改変のリストを示す。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
Figure 2017043608
 FcγRIIbと比べてFcγRIIa (H)に対する結合を選択的に増強する改変のリストを示す。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
Figure 2017043608
 FcγRIIbと比べてFcγRIIIaに対する結合を選択的に増強する改変のリストを示す。
一方、唯一の抑制型FcγRであるFcγRIIbは、自己免疫疾患や炎症性疾患において重要な役割を果たしている（J.Exp.Med., 203, 2157-2164, 2006、J.immunol., 178, 3272-3280, 2007）。FcγRIIbに対する結合活性を増強させたFc領域を有する抗体がB細胞が病因となっている自己免疫疾患の治療に有効である可能性も示されている（Mol. Immunology 45, 3926-3933, 2008）。自己免疫疾患や炎症性疾患の治療を目的にした抗体の場合、活性型FcγRを介したADCC活性やADCP活性が病態を悪化させる可能性があるため、活性型FcγRに対する結合活性は可能な限り減弱させ、抑制型FcγRに対する結合活性を増強させることが望ましい。具体的には、図２４のcの領域に存在する改変のように、抑制型FcγRに対する結合活性を天然型抗体と比較して増強させ、活性型FcγRに対する結合活性を減弱させる効果があることが望ましい。このような改変は抑制型FcγRに選択的に結合増強する効果があると言える。また、図２５のdの領域に存在する改変のように、抑制型FcγRに対する結合活性と活性型FcγRに対する結合活性の比率が天然型抗体と比較して大きくする効果があることが望ましい。このような改変は活性型FcγRと比べて抑制型FcγRに対して選択的に結合活性を増強した改変と言える。
そこで上述した各ヘテロ二量化抗体の抑制型FcγRおよび活性型FcγRに対する結合活性の比率を評価した図２６、図２７、図２８、図２９を用い、各図中の改変について図２４、図２５のcおよびdに対応する領域に存在する改変のリストをそれぞれ表２３（表２３−１及び２３−２）、表２４（表２４−１及び２４−２）、表２５（表２５−１〜２５−３）、表２６（表２６−１〜２６−４）にまとめた。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
 FcγRIaと比べてFcγRIIbに対して選択的に結合増強した改変のリストを示す。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
 FcγRIIa(R)と比べてFcγRIIbに対して選択的に結合増強した改変のリストを示す。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
Figure 2017043608
 FcγRIIa(H)と比べてFcγRIIbに対して選択的に結合増強した改変のリストを示す。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
Figure 2017043608
Figure 2017043608
 FcγRIIIaと比べてFcγRIIbに対して選択的に結合増強した改変のリストを示す。
〔実施例９〕ヘテロ二量化抗体の物理化学的安定性の評価
抗体を医薬品として開発する際には、高度な物理化学的安定性を有することも期待される。例えば、上記で言及したS239D、A330L、I332Eを抗体の両鎖に導入した改変の場合、この改変を導入すると、抗体のFc領域が熱力学的に不安定になることが報告されており、熱安定性の低下は医薬品としての開発を困難にさせる（Molecular Immunology, 45, 1872-1882, 2008）。抗体の医薬品としての有用性および開発の容易さを高めるためには、FcγRに対する結合活性を増強する一方で、物理化学的な安定性を維持することも重要である。ホモ二量化抗体では改変を両H鎖に導入するために、1種類の改変を導入すると抗体1分子あたり2箇所改変を導入することになる。しかし、ヘテロ二量化抗体では各H鎖に対して改変を導入するか否か選択できるために、1種類の改変を導入するとしても抗体1分子あたりに1箇所改変を導入するのに留めることが可能である。実施例7で考察したように、改変の種類によってはFcγRIIIaに対する結合活性の増強効果に関しては一方のH鎖に導入すれば十分な場合がある。仮にその改変が抗体の物理化学的な安定性を減じる効果を持っていた場合には、一方のH鎖にのみその改変を導入することでFcγRIIIaに対する結合活性増強効果を付与する一方で、抗体の物理化学的な不安定化を最小限にとどめることが可能であると考えられる。
この仮説を検証するために、S239D、A330L、I332Eのどの残基が実際にCH2領域の不安定化に寄与しているかを検討した。S239D、A330L、I332Eの改変をそれぞれGpH7-B3に導入したGpH7-B3-06-09D（配列番号：３７）、GpH7-B3-20-08L（配列番号：３８）、GpH7-B3-22-10E（配列番号：３９）を挿入した発現ベクターを参考実施例１の方法にしたがって作製し、L鎖としてGpL16-k0を用いて参考実施例１の方法で目的の抗体を発現、調製した。またコントロールとして改変を加えていないGpH7-B3とGpL16-k0を用いて目的の抗体を発現、調製した。各抗体のCH2領域のTmを参考実施例５の方法にしたがってThermal shift assayによって比較した（表２７）。なお、以下では特別に断らない限り、TmとはCH2領域のTmを指す。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、Hの欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）、Tmの欄には各抗体のTm、△Tmの欄には各抗体のTmとGpH7-B3/GpL16-k0のTmとの差を表記した。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
S239Dを導入したホモ二量化抗体GpH7-B3-06-09D/GpL16-k0、A330Lを導入したホモ二量化抗体GpH7-B3-20-08L/GpL16-k0、I332Eを導入したホモ二量化抗体GpH7-B3-22-10E/GpL16-k0とGpH7-B3/GpL16-k0を比較すると、それぞれTmが3℃、1℃、8℃減少していた。この結果から、これら3つの改変の中でI332EがCH2のTmを減少させる効果が最も高く、I332EがS239D、A330L、I332Eの改変群を導入した抗体においてもTmの減少に最も寄与していると考えられた。
I332Eは側鎖の周囲をV240、V323、L328などの疎水的なアミノ酸に囲まれている。I332Eを導入した抗体では、疎水性の高いIleから親水性の高いGluへ置換しているため、周辺の残基との疎水的な相互作用が消失し、Fc領域の不安定化に寄与していると考えられた。一方で、実施例７で考察したように、I332Eは一方のH鎖でしかFcγRIIIaと相互作用していない。そのため、FcγRIIIaとの相互作用に関与していないもう一方のH鎖のI332についてはIleのままにすることで、FcγRIIIaに対する結合の増強効果を付与しつつも、熱力学的な安定性を維持することが可能であると考えられた。そこで、I332Eを一方のH鎖にしか導入しないことで、両鎖に導入した場合に比べてTmが上昇するかを検証した。I332EをGpH7-A5に導入したGpH7-A44（配列番号：４９）、GpH7-B3に導入したGpH7-B80（配列番号：５０）を挿入した発現ベクターを作製し、GpH7-B3、GpH7-A5、GpL16-k0と合わせて、I332Eを一方のH鎖のみに導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0、GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0、I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0を参考実施例1の方法に従ってそれぞれ発現、調製した。コントロールとして、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0を調製した。 各抗体のFcγRIIIaに対する結合活性を参考実施例2の方法にしたがって評価した。また各抗体のCH2領域のTmを参考実施例5の方法にしたがってThermal shift assayによって比較した（表２８及び表２９）。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0のFcγRIIIaに対するKDを各抗体のKDで割った値をKD ratioとした。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
Figure 2017043608
 I332Eを一方のH鎖に置換した抗体および両鎖に置換した抗体のCH2のTmを示す。
Sampleの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）、Tmの欄には各抗体のTm、△Tmの欄には各抗体のTmとGpH7-B3/GpL16-k0のTmとの差を表記した。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
表２８の結果から、I332Eを一方のH鎖のみに導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0ではGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が約3倍、および GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0では約4倍増強していた。このことから、GpH7-A5あるいはGpH7-B3のいずれにI332Eを導入してもI332EのFcγRIIIa結合活性増強効果は大きく変わらないと考えられた。また、I332Eを両H鎖に導入したGpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0ではGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べてFcγRIIIaに対する結合活性が約7倍増強していた。これらの結果からI332Eはその立体構造から考察した通り、両H鎖に導入せずとも、一方のH鎖にのみ導入しただけでも、十分にFcγRIIIaに対する結合活性増強効果を有することが明らかとなった。
次に、表２９の結果から、I332Eを一方のH鎖のみに導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0と GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0ではいずれもその親Fc分子であるGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0からTmが4℃減少していたことから、GpH7-A5あるいはGpH7-B3のいずれにI332Eを導入してもI332Eの抗体のTmに与える影響は変わらないと考えられた。一方でI332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0ではGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0からTmが10℃減少していた。I332Eを一方のH鎖のみに導入したヘテロ二量化抗体はI332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体よりもTmが6℃高く維持されていた。この結果から、I332Eを両H鎖ではなく、一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体を用いることで、Tmの低下抑制が可能であることが明らかとなった。ヘテロ二量化抗体は抗体の物理化学的な安定性を維持するためにも有用な技術であることを示している。
I332Eの改変はFcγRIIIaに対する結合増強効果については優れているものの、従来のホモ二量化抗体を使った場合には熱力学的な安定性を著しく損ねてしまい、抗体を医薬品として用いる場合に問題になると考えられた。しかし、表２８及び表２９の結果からヘテロ二量化抗体を用いることで、I332EのFcγRIIIaに対する結合増強活性を利用しつつも、抗体の物理化学的な安定性を維持することが可能となることが示された。この結果から、ヘテロ二量化抗体は抗体のFcγR結合活性と抗体の物理化学的な安定性をより精緻に調整するのに優れた技術であると考えられる。
GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0はS239D、A330L、I332Eを一方のH鎖にしか持たないため、S239D、A330L、I332Eを両方のH鎖に有するGpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0と比べてTmを高く維持している可能性がある。そこで、実施例７に示したL234Y、G236W、S298Aの改変群とS239D、A330L、I332Eの改変群をそれぞれ組み合わせたヘテロ二量化抗体、ホモ二量化抗体のTmの測定を参考実施例５に記載の方法に従って実施した。
これを検証するために、一方のH鎖にL234Y、G236W、S298Aの改変群を、もう一方のH鎖にS239D、A330L、I332Eの改変群を導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0、L234Y、G236W、S298Aの改変群のみを一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0、両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0、S239D、A330L、I332Eのみを一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0、両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0を参考実施例1の方法に従って調製した。各抗体のCH2領域のTmを参考実施例５の方法にしたがってThermal shift assayによって比較し、L234Y、G236W、S298AとS239D、A330L、I332Eの組み合わせのTmに与える影響を検討した（表３０）。
Figure 2017043608
 サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-G1d/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）、Tmの欄には各抗体のTm、△Tmの欄には各抗体のTmとGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0のTmとの差を表記した。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
ヘテロ二量化抗体形成効率を高める改変D356K/H435RおよびK439Eを導入したGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0を天然型IgG1であるGpH7-G1d/GpL16-k0と比較すると、CH2のTmの低下は1℃であった。
従来技術であるホモ二量化抗体について、各改変群の効果を検証した。S239D、A330L、I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0ではGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べてTmが20℃低下し、L234Y、G236W、S298Aの改変群を両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0ではTmの低下が観察されなかったことから、ホモ二量化抗体においてはL234Y、G236W、S298Aの改変群自体にはTmを低減する効果がないと考えられた。
各改変群を一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体について、各改変群の効果を検証した。S239D、A330L、I332Eを一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0ではGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べてTmが8℃低下し、L234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0ではTmの低下は観察されなかった。この結果から、ヘテロ二量化抗体においてもL234Y、G236W、S298Aの改変群自体にはTmを低減する効果がないと考えられた。
S239D、A330L、I332Eを両H鎖に導入したGpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0では天然型IgG1と比べてTmが21℃減少していたが、一方のH鎖にのみS239D、A330L、I332Eの改変を有するGpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0ではTmは60℃であり、ホモ二量化抗体よりも10℃以上高いTmを維持していた。実施例７の表１３より、S239D、A330L、I332Eのホモ二量化抗体の方が、ヘテロ二量化抗体よりも約9倍FcγRIIIaに対する結合が増強していた。S239D、A330L、I332Eは両H鎖に導入することで、FcγRIIIaに対する結合を大きく増強するが、Tmも著しく低下させてしまう。
次に、L234Y、G236W、S298Aを両H鎖に導入したGpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0では天然型抗体と比べてTmが1℃のみ減少しており、これはL234Y、G236W、S298AによるTmの減少ではなく、先に考察した通りヘテロ二量化抗体を作るために利用したD356K/H435RおよびK439Eの影響であると考えられた。これは、L234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に導入したGpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0でも同様にTmが1℃しか減少していないことからも示される。
最後に、L234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に、S239D、A330L、I332Eをもう一方のH鎖に持つGpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0のTmは天然型抗体から10℃低下しており、S239D、A330L、I332Eを一方のH鎖に導入したGpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0とほぼ同一である。しかし、実施例7の表１３よりGpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0はGpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0よりもFcγRIIIaに対する結合が10倍以上増強している。
すなわち、L234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に、S239D、A330L、I332Eをもう一方のH鎖にしたヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0を用いることで、S239D、A330L、I332Eのホモ二量化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0と比べて、FcγRIIIaに対する結合を増強させることができる上に、Tmも10℃以上向上させることが可能であることが明らかとなった。
次に、上記のTmの測定をしたサンプルについて、更に熱力学的な安定性を参考実施例６に記載の熱加速試験（40℃ 2週間または4週間） によって評価した（図３０）。
GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と天然型抗体GpH7-G1d/GpH7-G1d/GpL16-k0を比較すると、4週間後に前者は1.27 %、後者は1.86 %と単量体比率が減少しており、大きな差異は認められなかった。つまり、ヘテロ二量化抗体を調製するのに用いている改変D356K/H435RおよびK439Eが熱加速試験における単量体比率の変化に与える影響はほとんどないと考えられた。
S239D、A330L、I332Eを両H鎖に導入したGpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0では四週間後には約16%単量体比率が減少していたのに対して、一方のH鎖にのみS239D、A330L、I332Eの改変を有するGpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0では4週間後には9.63 %単量体比率が減少していた。すなわち、S239D、A330L、I332Eを一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体を用いることで、より安定して単量体比率を維持する効果があることが明らかとなった。
次に、L234Y、G236W、S298Aを両H鎖に導入したGpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0および一方のH鎖に導入したGpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0ではは4週間後に1.78 %、1.42 %単量体比率が減少するのみで、いずれも天然型抗体と比べて単量体比率の変化に明確な差異を見出すことはできなかった。すなわち、L234Y、G236W、S298Aは一方のH鎖に導入しようとも、両鎖に導入しようとも熱加速試験における単量体比率には影響を及ぼさないと考えられた。
最後に、L234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に、S239D、A330L、I332Eをもう一方のH鎖に持つGpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0では4週間後に2.47 %単量体比率が減少しており、天然型抗体の1.86 %よりもわずかに単量体比率が減少するのみであった。すなわち、L234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に、S239D、A330L、I332Eをもう一方のH鎖にしたヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0を用いることで、S239D、A330L、I332Eのホモ二量化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0と比べて、FcγRIIIaに対する結合を増強させることができる上に、熱加速試験においても単量体比率を高く維持する効果をもたらすことが可能であることが明らかとなった。
すなわち、ヘテロ二量化抗体は通常のホモ二量化抗体と比較して、FcγRに対する結合を増強できるだけでなく、安定性も改善することで、抗体の医薬品としての価値をホモ二量化抗体よりもさらに高めることのできる技術であることが示された。
〔実施例１０〕FcγRに対する結合が向上し、安定性を低下させない改変の探索
実施例９に記載したように、H鎖に改変を導入するとFcγRに対する結合活性を増強するが、CH2の物理化学的な安定性、すなわちTmを低下させる可能性がある。しかしながら、実施例９で述べたように、特に抗体を医薬品として用いる場合にはそのような性質は好ましくない。実施例９で述べたように、FcγRに対する結合活性を増強する一方で、CH2の不安定化を抑制するためには一方のH鎖のみに改変を導入するヘテロ二量化抗体を用いることが有用である。すなわち、図21のiiおよびiiiの領域に該当するような従来のホモ二量化抗体においてもFcγRに対する結合活性の増強が観察されていたにもかかわらず、ホモ二量化抗体においてはTmが低下してしまっている改変については、ヘテロ二量化することで天然型抗体と比べてFcγRに対する結合活性は増強した上に、ホモ二量化抗体よりもTmを向上させることが可能である。
このような改変を見出すために、図２１のii、iiiにある領域のホモ二量化抗体のTmを参考実施例５の方法に従って測定し、Tmが天然型抗体と比較して低下した改変のリストを表３１〜３５にまとめた。
表３１（表３１−１〜３１−３）に領域ii,iiiでTmが68℃以下のIaのデータ、表３２（表３２−１及び３２−２）に領域ii,iiiでTmが68℃以下のIIaRのデータ、表３３（表３３−１及び３３−２）に領域ii,iiiでTmが68℃以下のIIaHのデータ、表３４（表３４−１及び表３４−２）に領域ii,iiiでTmが68℃以下のIIbのデータ、表３５（表３５−１及び３５−２）に領域ii,iiiでTmが68℃以下のIIIaのデータを示す。
これらの改変を一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体を用いることによって、天然型抗体と比較して、FcγRに対する結合が向上し、かつ安定性が大きく低下しない抗体を作製できる可能性がある。
Figure 2017043608
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〔実施例１１〕FcγRIIIaに対する認識能を向上したヘテロ二量化抗体のADCC活性の測定
実施例７で考察したように、ヘテロ二量化抗体を用いることで、従来のホモ二量化抗体技術によって創製された改変体よりもFcγRIIIaに対する結合活性を増強することに成功した。抗体はFcγRIIIaを介してNK細胞を誘導し、標的抗原を発現する細胞に対する抗体依存的細胞障害活性を発揮する。ヘテロ二量化抗体においてFcγRIIIaに対する結合活性だけでなく、ADCC活性も同様に増強していることを確認するために、実施例７の表１３に記載したFcγRIIIaに対する結合活性が上昇したヘテロ二量化抗体、ホモ二量化抗体、および天然型IgG1について、参考実施例７の方法に従ってADCC活性を測定した。その結果を図３１に示す。
図３１の結果より、天然型IgG1であるGpH7-G1d/GpL16-k0と、D356K、H435RおよびK439Eをそれぞれ一方のH鎖に導入したGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0とを比較すると、そのADCC活性には大きな差異は観察されなかった。このことから、D356K、H435RおよびK439Eの改変はADCC活性に対して影響を与えないと考えられた。
次に、従来通りFcγRIIIaに対する結合活性を増強する改変を抗体の両H鎖に同じく導入したホモ二量化抗体について、その結合増強効果がADCC活性においても同様の傾向が観察されるかを検証した。L234Y、G236W、S298Aを両H鎖に導入したGpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0と、S239D、A330L、I332Eを両H鎖に導入したGpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0を比較した。FcγRIIIaに対する結合活性に関しては、GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0ではGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べて顕著に結合が増強していたが、GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0では結合が低下していた。ADCC活性においてもGpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりも活性が上昇していたが、GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0はGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりも活性が減少していた。このようにホモ二量化抗体については、FcγRIIIaに対する結合活性の強さとADCC活性の強さとに相関が観察された。
次に、抗体の一方のH鎖にのみFcγRIIIaに対する結合活性を増強する改変を導入したヘテロ二量化抗体について、その結合増強効果がADCC活性においても同様の傾向が観察されるかを検証した。L234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に導入したGpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0と、S239D、A330L、I332Eを一方のH鎖に導入したGpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0を比較した。FcγRIIIaに対する結合活性に関しては、GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0とGpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0のいずれも、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べて増強しており、ADCC活性においても同様の傾向が観察された。加えて、GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0の方がGpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0よりもFcγRIIIaに対する結合活性が増強しているが、ADCC活性においても同様の傾向が保たれており、ホモ二量化抗体と同様にヘテロ二量化抗体においてもFcγRIIIaに対する結合活性の強さとADCC活性の強さとが相関することが示された。
次に、L234Y、G236W、S298AおよびS239D、A330L、I332Eの各改変群について、それぞれのヘテロ二量化抗体、ホモ二量化抗体におけるFcγRIIIaに対する結合活性とADCC活性増強効果に相関が観察されるか検証した。まずS239D、A330L、I332Eの改変群を一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体であるGpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0と両H鎖に導入したホモ二量化抗体であるGpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0とを比較すると、FcγRIIIaに対する結合活性に関してはヘテロ二量化抗体よりもホモ二量化抗体の方が結合を増強する効果は高かったが、ADCC活性に関して差は認められなかった。次に、L234Y、G236W、S298Aの改変群を一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体であるGpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0と両H鎖に導入したホモ二量化抗体であるGpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0とを比較すると、FcγRIIIaに対する結合活性に関してはヘテロ二量化抗体の方がGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0よりも結合を増強しているのに対して、ホモ二量化抗体では結合が減弱していた。ADCC活性についても、同様の傾向が観察された。このことから、L234Y、G236W、S298Aの改変群が有するFcγRIIIaに対する結合活性を一方向のみから増強するという効果がADCC活性にも反映されたと考えられた。これらの結果から、ある改変群を一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体と、両H鎖に導入したホモ二量化抗体とのFcγRIIIaに対する結合活性の強さとADCC活性の強さとが相関すると考えられた。
次に、L234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に、S239D、A330L、I332Eをもう一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体であるGpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0とS239D、A330L、I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体であるGpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0とを比較した。FcγRIIIaに対する結合活性に関しては、いずれもGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べて顕著に増強しており、ADCC活性においても同様の傾向が観察された。加えて、GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0の方がGpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0よりもFcγRIIIaに対する結合活性が増強しており、ADCC活性においてもGpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0の方が強いADCC活性を示していた。
前述の通り、L234Y、G236W、S298AとS239D、A330L、I332Eの各改変群については、それぞれを一方のH鎖に導入した場合にも、両H鎖に導入した場合にも、後者のS239D、A330L、I332Eの改変群の方がADCC活性をより増強する効果が観察されていた。しかし、L234Y、G236W、S298AとS239D、A330L、I332Eの各改変群を異なるH鎖に導入することにより、ヘテロ二量化抗体およびホモ二量化抗体のそれぞれにおいてADCC活性増強効果の高いS239D、A330L、I332Eを両H鎖に加えるよりも、ADCC活性増強効果を示すことが明らかとなった。
すなわち、従来技術であるホモ二量化抗体で観察されてきたようなFcγRIIIaに対する結合活性の強さとADCC活性の強さとの相関は、ヘテロ二量化抗体同士の比較、ヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体との比較のいずれにおいても同様に観察されることが明らかとなった。このことから、ヘテロ二量化抗体技術を利用することで、従来技術よりも優れたADCC活性を有する抗体を創製することが可能であることが明らかとなった。
〔実施例１２〕FcγRIIaにおける従来のホモ二量化抗体と新規ヘテロ二量化抗体の比較
実施例1で述べたように、FcγRIIIaは抗体医薬の薬効に置いて重要な役割を果たしていると考えられている。更に、FcγRIIIaに加えて、IgG1由来の抗体医薬の薬効において、FcγRIIaの果たす役割も注目されている。
FcγRIIaには131番目のアミノ酸がArgまたはHisであるR型、H型とそれぞれ呼ばれるアロタイプが存在し、それぞれヒトIgG2に対する結合活性が異なることが知られている（Tissue Antigens 2003: 61: 189-202）。このFcγRIIaのアロタイプの違いによって、感染症への罹患のしやすさが異なることが知られている（Tissue Antigens 2003: 61: 189-202）。これはアロタイプの違いによってFcγRIIaとIgG2に対する結合活性が異なる結果、IgG2を介した病原体に対する抵抗機構が異なることに起因するためと考えられる（Infection and Immunitiy 1995: 63: 73-81）。また、マウスFcγRIVはヒトFcγRIIaと発現細胞が対応することが知られているが、このFcγRIVが抗CD20抗体のマウスモデルにおける薬効に重要な役割を果たすことが報告されている。このことから、ヒトにおいてはFcγRIIaが同様の役割を果たしているのではないかと推察される（The Journal of Experimental Medicine 2004: 199: 1659-1669、 The Journal of Experimental Medicine 2006: 203: 743-753、 Immunity 2005: 23: 41-51）。実際に、抗体のFc領域のFcγRIIaに対する結合活性をIgG1より増強した抗体はIgG1に比べて、macrophageを介した抗体依存的細胞貪食活性（ADCP活性）が増強することが報告されている（Molecular Cancer Therapeutics 2008: 7: 2517-2527）。また、ADCPが増強したFc領域を有する抗CD19抗体はmouse xenograft modelにおいてもIgG1より強い抗腫瘍効果を示している（Nature Medicine 2000: 6: 443-446）。この抗体のFc領域はサルのFcγRIIaに対する結合活性も増強している。CD19はB細胞表面に発現しているが、この抗体をサルに投与すると、IgG1のFc領域を有する抗CD19抗体と比べて、B細胞の消失が増強することが報告されている（Science 2005: 310: 1510-1512）。
これらの報告から、FcγRIIIaに対する結合活性を増強させることに加えて、FcγRIIaに対する結合活性も増強させることで、抗体医薬の薬効、特に抗腫瘍効果の更なる向上が期待される。このような特徴を持つ抗体は従来技術を用いて過去に作製されていた（Molecular Cancer Therapeutics 2008: 7: 2517-2527）。しかし、FcγRIIaも抗体のFc領域とは非対称に結合すると考えられるため、実施例11で考察したこと同様にヘテロ二量化抗体技術を用いることでFcγRIIaに対する結合活性をより一層増強することが可能であると考えられる。これを検証するために、実施例4の結果から天然型IgGと比べてFcγRIIIaおよびFcgRIIa R型、H型のいずれにも結合活性が増強するような改変を選択し、それらを組み合わせてFcγRIIIaおよびFcgRIIa R型、H型のいずれにも結合活性が増強した変異を導入し、FcγRに対する結合が異なるH鎖を組み合わせたヘテロ二量化抗体を作製し、その各FcγRに対する結合活性を評価した。
また、これらの活性型FcγRと対照的に、抑制型FcγRであるFcγRIIbは免疫反応を抑制する細胞内シグナルを誘発する。FcγRIIbをノックアウトしたマウスにおいては、抗体の抗腫瘍効果が亢進する（Nature Medicine 2000: 6: 443-446）、あるいは抗体を介したB細胞の消失が促進する（The Journal of Experimental Medicine 2006: 203: 743-753）という報告がされていることから、FcγRIIbの抗体の生体内における薬効に重要な役割を果たしていることが示されている。また、マウスIgGサブクラスの抗腫瘍効果と各IgGサブクラスの活性型FcγRと抑制型FcγRに対する結合の比率（A/I ratio）との間には相関が観察されている（Science 2005: 310: 1510-1512）。これらの報告から、A/I ratioが抗体の免疫を介したエフェクター機能に重要であると考えられる。すなわち、A/I ratioの高い抗体を創製すれば、そのエフェクター機能が増強し、有用であると考えられる。しかし、活性型FcγRであるFcγRIIaと抑制型FcγRであるFcγRIIbとはその細胞外ドメインにおいて93%の配列相同性があり、極めて配列相同性が高いため、FcγRIIaに対する結合活性を増強しつつも、FcγIIbに対する結合活性を増強させずに、A/I ratioを高くすることは極めて困難であると予想された。FcγRIIbと抗体のFc領域とはFcγRIIIa、FcγRIIaと同様に非対称に結合すると考えられる。従来技術であると、抗体の両H鎖に同じ改変を導入することでしか、FcγRとの相互作用を制御できなかったが、ヘテロ二量化抗体技術を使えば、より精緻な制御が可能となり、ひいては極めて配列が類似している、FcγRIIaとFcγRIIbとのA/I ratioも向上させることができると考えられた。そこで、この点についてもヘテロ二量化抗体技術が従来技術と比較して優れているかを検証した。
ここでの検討ではヘテロ二量化抗体を効率的に形成させるために、抗体H鎖定常領域にKnobs-into-Holes技術を用いた。Knobs-into-Holes技術は一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（knob; 突起）に置換し、もう一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（hole; 空隙）に置換することにより、突起が空隙内に配置されるようにして、H鎖のヘテロ二量化を促進し、目的のヘテロ二量化抗体を効率的に取得できる技術である（Nature, 372: 379-383 (1994)）。CH3領域にあるアミノ酸側鎖をより大きくすることを目的にしたY349C、T366Wの改変を定常領域に導入したH鎖をKnob鎖と呼び、これに更に改変を導入した定常領域については、そのH鎖定常領域の名称はKnという記号で始め、その後に三桁の数字を付けてKn001のように呼ぶ。CH3領域にあるアミノ酸側鎖をより小さくすることを目的にしたD356C、T336S、L368A、Y407VのHole改変を定常領域に導入したH鎖をHole鎖と呼び、これに更に改変を導入したものについては、そのH鎖定常領域の名称はHlという記号で始め、その後に三桁の数字を付けて、Hl001のように呼ぶ。また、抗体H鎖定常領域の名称をそれぞれKn001、Hl001とした場合、可変領域にGpH7を持つ抗体のH鎖に対応する配列はGpH7-Kn001、GpH7-Hl001と呼ぶ。発現後に精製して得られた抗体は、例えばヘテロ二量化抗体の発現に用いた抗体H鎖に対応する配列がGpH7-Kn001、もう一つの抗体H鎖に対応する配列がGpH7-Hl001、抗体L鎖に対応する配列がGpL16-k0である場合、GpH7-Kn001/GpH7-Hl001/GpL16-k0と表記した。
まず、GpH7-G1dに対してY349C、T336Wの改変を定常領域に導入したGpH7-Kn033（配列番号：５１）、GpH7-G1dに対してD356C、T336S、L368A、Y407Vの改変を定常領域に導入したGpH7-Hl033（配列番号：５６）を参考実施例1の方法にしたがって調製した。ヘテロ二量化抗体を発現させる際には抗体L鎖としてはGpL16-k0が挿入された発現ベクターを用い、抗体H鎖の1つとしてY349C、T336Wの改変を導入したGpH7-Kn033（配列番号：５１）に更に改変を加えた配列を挿入した発現ベクターを用い、もう一方の抗体H鎖としてD356C、T336S、L368A、Y407Vの改変を導入したGpH7-Hl033（配列番号：５６）に更に改変を導入した配列を挿入した発現ベクターを用い、ヘテロ二量化抗体が効率的に発現するようにした。
実施例4で得られた各改変が抗体と各FcγRに対する結合に与える影響に関する情報に基づいて、FcγRIIIa、FcγRIIa R型、H型のいずれに対しても結合が増強するように意図した抗体を以下のように作製した。抗体の各H鎖の定常領域に異なる改変を導入する際には、GpH7-Kn033、GpH7-Hl033を親ポリペプチドとして用いた。GpH7-Kn033にL234Y、L235Y、G236A、H268D、S298Aを導入したGpH7-Kn045（配列番号：５４）、L234Y、L235Y、G236A、H268D、Q295L、S298Aを導入したGpH7-Kn056（配列番号：５５）、GpH7-Hl033にG236A、S239D、A330K、I332Eを導入したGpH7-Hl048（配列番号：５９）、G236A、S239D、Q295L、A330M、I332Eを導入したGpH7-Hl055（配列番号：６０）を参考実施例1の方法にしたがって作製した。
次に、以下のように各H鎖を組み合わせて、参考実施例1にしたがって抗体を発現させた。H鎖としてGpH7-Kn033、GpH7-Hl033、L鎖としてGpL16-k0を用いて、G1dに対してKnobs-into-Holes技術のみを適用したGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0を発現させた。H鎖としてGpH7-Kn045、GpH7-Hl048、L鎖としてGpL16-k0を用いて、ヘテロ二量化抗体であるGpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0を発現させた。H鎖としてGpH7-Kn045、GpH7-Hl055、L鎖としてGpL16-k0を用いて、ヘテロ二量化抗体であるGpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0を発現させた。H鎖としてGpH7-Kn056、GpH7-Hl055、L鎖としてGpL16-k0を用いて、ヘテロ二量化抗体であるGpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0を発現させた。
比較対象となる既存技術を用いた抗体を（Pro. Nat. Acad. Sci., 103, 4005-4010 (2006)）を参考にして、以下のように調製した。FcγRIIIa、FcγRIIa R型、H型のいずれに対しても結合が増強すると報告されている改変G236A/S239D/I332EをGpH7-Kn033、GpH7-Hl033のそれぞれに導入し、GpH7-Kn037（配列番号：５２）、GpH7-Hl036（配列番号：５７）を作製した。また、FcγRIIIaに対して結合が増強すると報告されている改変S239D/A330L/I332EをGpH7-Kn033、GpH7-Hl033のそれぞれに導入し、GpH7-Kn032（配列番号：５３）、GpH7-Hl032（配列番号：５８）を作製した。これらのH鎖を組み合わせて、参考実施例1にしたがって抗体を発現させた。H鎖としてGpH7-Kn037、GpH7-Hl036、L鎖としてGpL16-k0を用いて、G1dに対してKnobs-into-Holes技術のみを適用した分子であるGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0の両H鎖にG236A/S239D/I332Eを導入したホモ二量化抗体GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0を発現させた。H鎖としてGpH7-Kn032、GpH7-Hl032、L鎖としてGpL16-k0を用いて、G1dに対してKnobs-into-Holes技術のみを適用した分子であるGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0の両H鎖にS239D/A330L/I332Eを導入したホモ二量化抗体GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0を発現させた。
これらの抗体について参考実施例2の方法にしたがって、各FcγRに対する結合活性を評価し、その結果を表３６にまとめた。また、各抗体のKD ratioを表３７にFcγRIIIaに対するKDの比率であるA/I ratioを表３８にまとめた。
Figure 2017043608
 FcγRIIa、IIIaに対する結合増強ヘテロ二量化抗体の各FcγRに対する結合活性を示す。
サンプルの欄には抗体の名称、Kn、Hlの欄にはそれぞれ各抗体のKnob鎖、Hole鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。
Figure 2017043608
 FcγRIIa、IIIaに対する結合増強ヘテロ二量化抗体の各FcγRに対する結合活性を示す。
サンプルの欄には抗体の名称、Kn、Hlの欄にはそれぞれ各抗体のKnob鎖、Hole鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0のFcγRに対するKDを各抗体のKDで割った値をKD ratioとした。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
Figure 2017043608
 活性型FcγRと抑制型FcγRに対する結合活性の比率を示す。
サンプルの欄には抗体の名称、Kn、Hlの欄にはそれぞれ各抗体のKnob鎖、Hole鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0のFcγRIIbに対するKDを各抗体のFcγRIIa H型、R型のKDで割った値をそれぞれのA/I ratioとした。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
表３６及び３７の結果から、G1dに対してKnobs-into-Holes技術のみを適用した分子であるGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0と比較して、G236A/S239D/I332Eを両H鎖に導入したGpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0はFcγRIIa H型に対する結合が22倍、FcγRIIa R型に対する結合が43倍、FcγRIIIa Fに対する結合が161倍に増強していた。また、表３８の結果から、GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0のA/I ratioはFcγRIIa H型に対して8.6、FcγRIIa R型に対して13であり、GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0の6.2、4.9と比較して向上していた。
表３６及び３７の結果から、G1dに対してKnobs-into-Holes技術のみを適用した分子であるGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0と比較して、S239D/A330L/I332Eを両H鎖に導入したGpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0はFcγRIIa H型に対する結合が1.2倍、FcγRIIa R型に対する結合が3.0倍、FcγRIIIa Fに対する結合が381倍に増強していた。また、表３８の結果から、GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0のA/I ratioはFcγRIIa H型に対して0.93、FcγRIIa R型に対して1.8であり、GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0と比較して低下していた。
表３６及び３７の結果から、G1dに対してKnobs-into-Holes技術のみを適用した分子であるGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0と比較して、L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298Aを一方のH鎖に、G236A/S239D/A330K/I332Eをもう一方のH鎖に導入したGpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0はFcγRIIa H型に対する結合が52倍、FcγRIIa R型に対する結合が154倍、FcγRIIIa Fに対する結合が419倍に増強していた。また、この結果から、FcγRIIaに対する結合活性は、H型、R型のいずれについてもG236A/S239D/I332Eを両H鎖に導入した従来技術であるホモ二量化抗体GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0と比べて増強していた。加えて、FcγRIIIa Fに対する結合活性も、S239D/A330L/I332Eを両H鎖に導入した従来技術であるホモ二量化抗体GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0と比べてもわずかに増強していた。表３８の結果からGpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0のA/I ratioはFcγRIIa H型に対して9.5、FcγRIIa R型に対して22であり、GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0、GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0のいずれと比較しても向上していた。この結果から、ヘテロ二量化抗体技術を用いることで、GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0は従来技術と比べて、FcγRIIa、FcγRIIIa Fに対する結合活性を増強するとともに、より選択的に活性型FcγRに対して結合することが示された。
表３６及び３７の結果から、G1dに対してKnobs-into-Holes技術のみを適用した分子であるGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0と比較して、L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298Aを一方のH鎖に、G236A/S239D/Q295L/A330M/I332Eをもう一方のH鎖に導入したGpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0はFcγRIIa H型に対する結合が21倍、FcγRIIa R型に対する結合が56倍、FcγRIIIa Fに対する結合が985倍に増強していた。また、この結果から、FcγRIIaに対する結合増活性は、H型、R型のいずれについてもG236A/S239D/I332Eを両H鎖に導入した従来技術であるホモ二量化抗体GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0と比べてほぼ同等であった。FcγRIIIa Fに対する結合活性は、S239D/A330L/I332Eを両H鎖に導入した従来技術であるホモ二量化抗体GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0と比べて増強していた。表３８の結果からGpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0のA/I ratioはFcγRIIa H型に対して8.3、FcγRIIa R型に対して18であり、GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0より向上し、GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0と比較してFcγRIIa H型についてはほぼ同等であり、FcγRIIa R型については向上していた。この結果から、ヘテロ二量化抗体技術を用いることで、GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0は従来技術と比べて、FcγRIIaに対する結合活性を同程度に向上させつつ、FcγRIIIaに対する結合活性をより増強するとともに、より選択的に活性型FcγRに対して結合することが示された。
表３６及び３７の結果から、G1dに対してKnobs-into-Holes技術のみを適用した分子であるGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0と比較して、L234Y/L235Y/G236A/H268D/Q295L/S298Aを一方のH鎖に、G236A/S239D/Q295L/A330M/I332Eをもう一方のH鎖に導入したGpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0はFcγRIIa H型に対する結合が20倍、FcγRIIa R型に対する結合が44倍、FcγRIIIa Fに対する結合が1114倍に増強していた。また、この結果から、FcγRIIaに対する結合増活性は、H型、R型のいずれについてもG236A/S239D/I332Eを両H鎖に導入した従来技術であるホモ二量化抗体GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0と比べてほぼ同等であった。FcγRIIIa Fに対する結合活性は、S239D/A330L/I332Eを両H鎖に導入した従来技術であるホモ二量化抗体GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0と比べて増強していた。表３８の結果からGpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0のA/I ratioはFcγRIIa H型に対して8.7、FcγRIIa R型に対して16であり、GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0より向上し、GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0と比較してFcγRIIa H型についてはほぼ同等であり、FcγRIIa R型については向上していた。この結果から、ヘテロ二量化抗体技術を用いることで、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0は従来技術と比べて、FcγRIIaに対する結合活性を同程度に向上させつつ、FcγRIIIaに対する結合活性をより増強するとともに、より選択的に活性型FcγRに対して結合することが示された。
〔実施例１３〕従来技術との比較：FcγRIIa、FcγRIIIaに対する結合活性が増強したヘテロ二量化抗体の熱安定性の評価
実施例９にあるように、従来技術で得られたホモ二量化抗体はFcγRへの結合活性が増強しているものの、物理化学的に不安定であるため、医薬品としての価値を損ねていた。しかし、ヘテロ二量化抗体技術は各改変のFcγRに対する結合活性の増強効果と物理化学的な面での影響とを制御しやすく、FcγRに対する結合活性を増強しつつも物理化学的な安定性を損なわないことが可能であることが明らかとなった。この実施例では活性型FcγRであるFcγRIIaとFcγRIIIaに対する結合活性が増強した抗体についても同様に物理化学的な安定性、特に熱力学的安定性が減じていないか検証した。実施例11でFcγRに対する結合活性を評価した抗体について、参考実施例5の方法にしたがって各抗体のCH2領域のTmを測定し、その結果をに表３９まとめた。
Figure 2017043608
 FcγRIIa、FcγRIIIaに対する結合活性を増強した抗体のTmを示す。
表３９の結果から、ヘテロ二量化抗体であるGpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0のいずれも、従来技術であるホモ二量化抗体GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0と比べて高いTmを維持していた。実施例11で述べたように、これらのヘテロ二量化抗体は従来のホモ二量化抗体と比べて、FcγRを介したエフェクター機能を発揮するのにより適した性質を有している。すなわち、この結果からヘテロ二量化抗体技術を用いることで、抗体の物理化学的な安定性を損ねることなく、FcγRに対する結合を精緻に制御することが可能であることが明らかとなった。
〔実施例１４〕活性型FcγRであるFcγRIIIa Fに対する選択性を向上した改変の組み合わせの効果
実施例８で述べたように、活性型FcγRおよび抑制型FcγRに対する選択性を向上させる技術は有用である。ここでは実施例8で見出した活性型FcγであるFcγRIIIa Fに対する結合と抑制型FcγRであるFcγRIIbに対する結合の比率を向上させるのに、すなわち選択性の向上にヘテロ二量化が有効であるか検証した。具体的には活性型FcγであるFcγRIIIa Fに対する結合と抑制型FcγRであるFcγRIIbに対する結合の比率を向上させる改変であるL234Y、G236W、S298A（表22-1領域a）と実施例7で検討したS239D、A330L、I332Eと組み合わせて、ヘテロ二量化抗体でホモ二量化抗体と比べて、選択性の向上の効果が得られるのかを検証した。
この検証のために、参考実施例１の方法にしたがってS239D、A330L、I332Eを全てGpH7-A5に導入したGpH7-A57（配列番号：４０）、GpH7-B3に導入したGpH7-B78（配列番号：４１）およびL234Y、G236W、S298Aを全てGpH7-A5に導入したGpH7-TA7（配列番号：３１）、GpH7-B3に導入したGpH7-TA45（配列番号：３２）を挿入した発現ベクターを調製した。これらの発現ベクターとGpH7-A5、GpH7-B3、GpL16-k0を使って、一方のH鎖にL234Y、G236W、S298Aを、もう一方のH鎖にS239D、A330L、I332Eを導入したヘテロGpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0、L234Y、G236W、S298Aのみを一方のH鎖に導入したGpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0、L234Y、G236W、S298Aを両方のH鎖に導入したGpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0、S239D、A330L、I332Eのみを一方のH鎖に導入したGpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0、S239D、A330L、I332Eを両方のH鎖に導入したGpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0を参考実施例１の方法に従って発現、調製した。調製した抗体は参考実施例２の方法に従ってFcγRIIIaに対するKDおよびFcγRIIbに対するKDを測定した。各抗体のFcγRIIbに対するKDをFcγRIIIaに対するKDで割った値であるFcγRIIIa/FcγRIIb ratioを指標に、各抗体のFcγRIIIaに対する結合の選択性が向上したか否かを検証した。検証結果を表４０にまとめた。
Figure 2017043608
サンプルの欄には抗体の名称、H1、H2の欄には各抗体のH鎖定常領域の名称、変異箇所の欄にはGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比較して異なる変異（特に変異がない場合には「-」）を表記した。各抗体のFcγRIIbに対するKDをFcγRIIIa Fに対するKDで割った値をFcγRIIIa F/FcγRIIb ratioとした。各抗体のH鎖、L鎖に対応するアミノ酸配列の配列番号を併記した。
表４０の結果から、天然型IgG1であるGpH7-G1d/GpL16-k0と、D356K、H435RおよびK439Eをそれぞれ一方のH鎖に導入したGpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0とを比較すると、FcγRIIIa/FcγRIIb ratioはそれぞれ2.5、1.9であり、大きな差異は観察されなかった。このことから、D356K、H435RおよびK439Eの改変はFcγRIIIaに対する結合の選択性に対して影響を与えないと考えられた。
従来技術を用いたホモ二量化抗体について、各改変の効果を検証した。S239D、A330L、I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0ではFcγRIIIa/FcγRIIb ratioが100であり、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べて向上していた。一方で、L234Y、G236W、S298Aを両H鎖に導入したホモ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0では5.3であり、ホモ二量化抗体においてはS239D、A330L、I332Eの組み合わせの方がFcγRIIIaに対する結合の選択性を向上させる効果が高いことが明らかとなった。
次に、各改変群を一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体について、各改変群の効果を検証した。S239D、A330L、I332Eを一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0ではFcγRIIIa/FcγRIIb ratioが7.9であり、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0と比べて向上していた。一方で、L234Y、G236W、S298Aを一方のH鎖に導入したヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0では14であった。この結果から、ヘテロ二量化抗体においてはL234Y、G236W、S298Aの改変群の方がFcγRIIIaに対する結合の選択性を向上させる効果が高いことが明らかとなった。
各改変群のホモ二量化抗体とヘテロ二量化抗体における効果の違いを検証した。S239D、A330L、I332Eについては、そのヘテロ二量化抗体においてはFcγRIIIa/FcγRIIb ratioが7.9であり、ホモ二量化抗体では100であった。この結果から、S239D、A330L、I332Eについてはヘテロ二量化すると、FcγRIIIaに対する結合の選択性を向上させる効果があるが、ホモ二量化すると、その効果が更に増強されることが明らかとなった。反対に、L234Y、G236A、S298Aについては、そのヘテロ二量化抗体においてはFcγRIIIa/FcγRIIb ratioが14であり、ホモ二量化抗体では5.3であった。この結果から、L234Y、G236A、S298Aについてはヘテロ二量化すると、FcγRIIIaに対する結合の選択性を向上させる効果があるが、ホモ二量化すると、その効果が減弱することが明らかとなった。これらの結果から、ホモ二量化抗体においてはS239D、A330L、I332Eの改変群の方がL234Y、G236A、S298Aの改変群よりもFcγRIIIaに対する結合の選択性を向上させる効果が高いが、ヘテロ二量化抗体においてはL234Y、G236A、S298Aの改変群の方がS239D、A330L、I332Eの改変群よりもFcγRIIIaに対する結合の選択性を向上させる効果が高いことが明らかとなった。
L234Y、G236A、S298Aの改変群とS239D、A330L、I332Eの改変群とを組み合わせたヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0ではFcγRIIIa/FcγRIIb ratioが244と、L234Y、G236A、S298Aの改変群を一方のH鎖にのみ有するヘテロ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0、両H鎖に有するホモ二量化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0、S239D、A330L、I332Eの改変群を一方のH鎖にのみ有するヘテロ二量化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0、両H鎖に有するホモ二量化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0のいずれと比べてFcγRIIIaに対する結合の選択性を向上させる効果が高いことが明らかとなった。この結果はL234Y、G236A、S298Aの改変群のヘテロ二量化抗体でのFcγRIIIaに対する結合の選択性の向上効果と、S239D、A330L、I332Eの改変群のヘテロ二量化抗体での効果とを合わせたものと考えられる。すなわち、ヘテロ二量化抗体では、ホモ二量化抗体と比べて、優れたFcγRIIIaに対する結合の選択性の向上効果が観察されることが明らかとなった。
すなわち、ヘテロ二量化抗体を用いることで、従来のホモ二量化抗体を用いるよりも、Fc領域とFcγRIIIaとの非対称な相互作用をより最適化することができ、より高いFcγRIIIaに対する結合の選択性を有するFc領域をデザインすることが可能であることが示された。
〔実施例１５〕FcgRIIa結合増強ヘテロ二量化抗体のADCC活性の測定
実施例12で調製したGpH7-G1d/GpL16-k0、GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0、GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0、GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0について、参考実施例7の方法にしたがってADCC活性を評価し、その結果を図３３にまとめた。
図３３においてGpH7-G1d/GpL16-k0とGpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0のADCC活性の比較をすると、両者はほぼ同等の活性を有していた。この結果から、Knobs-into-Holesを抗体のFc領域に導入してもFcgRに対する結合に加えてADCC活性においても影響がないことが明らかとなった。
実施例12に記載したヘテロ二量化抗体GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0はいずれも改変導入前の抗体GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0と比較してより強いADCC活性を示した。また、ヘテロ二量化抗体GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0はFcgRIIa RおよびFcgRIIa Hに対する結合を増強し、ADCP活性を増強したと報告のあるG236A/S239D/I332Eの改変を両H鎖に有するホモ二量化抗体GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0および、既存のADCC活性増強を適用した抗体であるGpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0と同程度のADCC活性を示した。
すなわち、GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0は実施例12で示したようにFcgRIIa RおよびFcgRIIa Hに対する結合が既存技術と比較して一層増強していることに加えて、既存のADCC活性増強技術と比較して同等のADCC活性増強効果を有している。すなわち、ここで評価したヘテロ二量化抗体はADCC活性増強効果については既存技術と同程度の効果を有する上にFcgRIIa HおよびFcgRIIa Rに対する結合の増強があるという点で、既存技術と比較して優れていると考えられる。
〔実施例１６〕FcgRIIIaに対する結合を増強したヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の創出
また、実施例11で示したように、FcγRIIIaに対する結合活性を増強したヘテロ二量化抗体はADCC活性も増強していることが明らかとなった。実施例11では、GPC3に対する抗体において効果が確認されたが、他の抗原においても同様の効果が観察されるか確認するため、抗Epiregulin (EREG) 抗体を用いて同様の実験を行った。ここで、EREGに対する抗体のH鎖可変領域の配列をH240（配列番号：８０）、可変領域、定常領域を含むL鎖の配列をL73-k0(配列番号：１０６)とする。
実施例4の結果をもとにH鎖に新たにFcgRIIIaに対して結合を増強した改変体を作製した。ここではヘテロ二量化技術としては実施例12に記載のKnobs-into-Holes技術を用いた。具体的には、H240-G1d （配列番号：８３）に対してY349C、T336Wの改変を定常領域に導入したH240-Kn033（配列番号：８４）、H240-G1dに対してD356C、T336S、L368A、Y407Vの改変を定常領域に導入したH240-Hl033（配列番号：８５）を参考実施例1の方法にしたがって調製した。次に、H240-Kn033（配列番号：８４）にL234Y、L235Y、G236W、H268D、S298Aを導入し、H240-Kn061（配列番号：８１）を参考実施例1の方法にしたがって作製し、H240-Hl033（配列番号：８５）にK326D、A330M、K334Eを導入し、H240-Hl071（配列番号：８２）を参考実施例1の方法にしたがって作製した。H240-Kn061、H240-Hl071、L73-k0を組み合わせて、参考実施例1の方法にしたがってヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0を発現させた。
実施例12と同様に、FcgRIIIaに対する結合を増強すると報告のあるS239D、A330L、I332Eを導入した改変体を比較対象として用いるために作製した。具体的には参考実施例1の方法にしたがってS239D、A330L、I332EをH240-Kn033（配列番号：８４）、H240-Hl033（配列番号：８５）のそれぞれに導入した、H240-Kn032（配列番号：８６）、H240-Hl032（配列番号：８７）を作製した。H240-Kn032、H240-Hl032、L73-k0を組み合わせて、参考実施例1の方法にしたがってホモ二量化抗体H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0を発現させた。
次に、FcgRIIIaに対する結合を増強する(Glycobiol. Vol.17 no.1 pp. 104-118 (2006)など)と報告のあるアフコシル化抗体を比較のために作製した。相同染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞ではフコーストランスポーターの機能が阻害される。この細胞を用いることでフコースが欠損した抗体を得ることが可能である（WO2006/067913等）。また、beta 1, 4-N-acetylglucosaminyltransferase IIIとGolgi alpha-mannosidase IIが強制発現される細胞で抗体を産生させてもフコースが欠損した抗体を得ることが可能である（Ferrara ら、 Biotechnol. Bioeng. (2006) 93 (5), 851-861）。これら同業者公知の手法により、H240-G1d（配列番号：８３）およびL73-k0（配列番号：１０６）を組み合わせて発現させ、H240-G1d/L73-k0をアフコシル化した抗体H240-afucosyl_G1d/L73-k0(配列番号：８３、１０６)を得た。
また、参考実施例1の方法にしたがって、コントロールとしてH240-Kn033（配列番号：８４）、H240-Hl033（配列番号：８５）、L73-k0（配列番号：１０６）を組み合わせてH240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0を発現させた。
これらについて、参考実施例8の方法にしたがって、各FcgRに対する結合活性を評価し、その結果を表４１にまとめた。
Figure 2017043608
表４１の結果から、ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0はH240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0と比較して、特にFcgRIIIa F、FcgRIIIa Vに対する結合が増強していた。ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0はH240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0にL234Y/L235Y/G236W/H268D/S298AおよびK326D/A330M/K334Eを導入した改変体であることから、これらの導入された改変のFcgRに対する結合が増強されたと言える。
表４１の結果から、ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0は既存のADCC活性増強技術を適用したH240-afucosyl_G1d/L73-k0およびH240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0と比較してFcgRIIIa F、FcgRIIIa Vに対する結合が増強していた。この結果から、ヘテロ二量化抗体は従来のホモ二量化抗体によるADCC活性増強技術およびアフコシル化によるADCC活性増強技術と比較して、FcgRIIIaに対する結合増強効果が高いことが明らかとなった。
加えて、ヘテロ二量化抗体ではADCP活性増強に重要と考えられるFcgRIIaに対する結合も、FcgRIIa Hについては両抗体よりも増強しており、FcgRIIa RについてはH240-afucosyl_G1d/L73-k0よりも結合が増強し、H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0と同程度であった。
次にヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0がその各H鎖から成るホモ二量化抗体よりもFcgRに対する結合活性を増強するというヘテロ二量化抗体の特徴を有するかを確認した。ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の一方のH鎖であるH240-Kn061にはL234Y/L235Y/G236W/H268D/S298Aが、もう一方のH鎖であるH240-Hl071にはK326D/A330M/K334Eが導入されている。このヘテロ二量化抗体が、各H鎖からなるホモ二量化抗体と比較して、各FcgRに対してより強い結合活性を有することを確認した。具体的には、L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298AをH240-Hl033に導入したH240-Hl134（配列番号：８８）、およびK326D/A330M/K334EをH240-Kn033に導入したH240-Kn132（配列番号：８９）を参考実施例1の方法にしたがって作製した。この発現ベクターを用いて、参考実施例1の方法にしたがい、L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298Aを両H鎖に有するようなホモ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl134/L73-k0を発現させ、K326D/A330M/K334Eを両H鎖に有するようなホモ二量化抗体H240-Kn132/H240-Hl071/L73-k0を発現させた。これらのホモ二量化抗体と、L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A、K326D/A330M/K334Eを各H鎖に有するヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のFcgRIIIaFおよびFcgRIIIa Vに対する結合を参考実施例8の方法にしたがって測定した。その結果を表４２にまとめた。
Figure 2017043608
表４２の結果から、L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298Aを一方のH鎖に有し、K326D/A330M/K334Eをもう一方のH鎖に有するヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の方が、L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298Aを両H鎖に有するようなホモ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl134/L73-k0および、K326D/A330M/K334Eを両H鎖に有するようなホモ二量化抗体H240-Kn132/H240-Hl071/L73-k0のいずれよりも、FcgRIIIa FおよびFcgRIIIa Vに対する強い結合活性を有することが確認された。すなわち、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0はその各H鎖から成るホモ二量化抗体よりもFcgRに対する結合活性を増強するというヘテロ二量化抗体の特徴を有することが明らかとなった。
次に、参考実施例9の方法にしたがって、H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0、H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0、H240-afucosyl_G1d/L73-k0、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のADCC活性を比較し、その結果を図３４にまとめた。
図３４の結果から、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0はH240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0と比べて著しく強いADCC活性を示した。それに加えて、既存のADCC活性増強技術を適用したH240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0およびH240-afucosyl_G1d/L73-k0よりも強いADCC活性を示した。すなわち、ADCC活性においてもH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0は既存のADCC活性増強技術より強いADCC活性を示すことが明らかとなった。
〔実施例１７〕ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0をテンプレートにした更なる改変体の作製と評価
先の実施例16において、優れたADCC活性を示すH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0を見出した。更に優れた活性を有する改変体を見出すため、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0をテンプレートとして、参考実施例1の方法にしたがって、H240-Kn061およびH240-Hl071の各H鎖のEUナンバリング231番目から242番目をそれぞれCysおよび元のアミノ酸以外の異なる18種類のアミノ酸に置換した改変体を合計約420種類調製し、各FcgRに対する結合を評価した。具体的には、参考実施例8に記載の方法にしたがって各改変体のFcgRI、FcgRIIa R、FcgRIIa H、FcgRIIb、FcgRIIIa F、FcgRIIIa Vに対するKD値をそれぞれ算出し、そのKD値でH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の FcgRI、FcgRIIa R、FcgRIIa H、FcgRIIb、FcgRIIIa F、FcgRIIIa Vに対するKD値を割った値をRelative KDとし、評価の指標とした。すなわち、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のKD値を1とした場合に、各改変体の各FcgRに対するKD値が何倍変動したかを評価の指標とした。Relative KDが大きいほど、その改変体がH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0と比べて各FcgRに対する結合がより増強していることを示している。
各改変体のFcgRI、FcgRIIa R、FcgRIIa H、FcgRIIb、FcgRIIIa F、FcgRIIIa Vに対するRalative KDを縦軸に、Relative KDが小さい順になるようにした際の順位を横軸にした図をそれぞれ図３５、図３６、図３７、図３８、図３９、図４０に示した。
これらの結果の解析から、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0よりもFcgRIIbへの結合を増強することなく、FcgRIIa R、FcgRIIIa F、FcgRIIIa Vのいずれか、あるいはいくつかに対する結合を増強した改変体を見出した。その改変を導入したH鎖およびその改変を表４３（FcgRIIbへの結合を増強することなく、FcgRIIa RおよびFcgRIIIaに対する結合を増強する改変）にまとめた。FcgRIIbに対するRelative KDが1以下となり、FcgRIIa R、FcgRIIIa F、FcgRIIIa Vのいずれか、あるいはいくつかに対するRelative KDが1.3以上となる改変を選択した。
Figure 2017043608
上記表４３中の数値は、各改変体の各FcgRに対するRelative KDを表す。
これらの改変は抑制型FcgRであるFcgRIIbに対する結合を増強せず、ADCP活性に重要な役割を果たすFcgRIIaやADCC活性に重要な役割を果たすFcgRIIIaに対する結合を増強する効果がある。そのため、これらの改変を導入することで、抗体の免疫抑制的な作用を増強することなく、ADCC活性やADCP活性を増強させ、より強い抗腫瘍活性を発揮することが期待される。
次に、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0よりもFcgRIIIaへの結合を減弱することなく、FcgRIIa HおよびFcgRIIa Rに対する結合を増強する改変体を見出した。その改変を導入したH鎖およびその改変を表４４（FcgRIIIaへの結合を減弱することなく、FcgRIIaへの結合を増強する改変）にまとめた。FcgRIIIa FおよびFcgRIIIa Vに対するRelative KDが0.7以上であり、FcgRIIa HおよびFcgRIIa Rに対するRelative KDが1.5以上となる改変を選択した。
Figure 2017043608
上記表４４中の数値は、各改変体の各FcgRに対するRelative KDを表す。
これらの改変はADCC活性に重要な役割を果たすFcgRIIIaに対する結合を減弱することなく、改変によってはFcgRIIIaに対する結合を増強し、ADCP活性に重要な役割を果たすFcgRIIaに対する結合を増強する改変である。そのため、この改変を導入することで、ADCC活性およびADCP活性、ADCC活性またはADCP活性を増強させ、より強い抗腫瘍活性を発揮することが期待される。
次に、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0よりもFcgRIIIaへの結合を減弱することなく、FcgRIIbに対する結合を減弱する改変体を見出した。その改変を導入したH鎖およびその改変を表４５（FcgRIIIaへの結合を維持したまま、FcgRIIbへの結合を減弱させる改変）にまとめた。FcgRIIIa FおよびFcgRIIIa Vに対するRelative KDが1以上であり、FcgRIIbに対するRelative KDが0.5以下となる改変を選択した。
Figure 2017043608
上記表４５中の数値は、各改変体の各FcgRに対するRelative KDを表す。
これらの改変はADCC活性に重要な役割を果たすFcgRIIIaに対する結合を減弱することなく、抑制型FcgRであるFcgRIIbに対する結合を減弱させている。そのため、この改変を導入することで、ADCC活性を低減することなく、抗体の免疫抑制的な作用が低減されているため、より強い抗腫瘍活性を発揮することが期待される。
また、ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0が各H鎖からなるホモ二量化抗体よりもFcgRに対して強く結合するというヘテロ二量化抗体の性質を有することから、これらの改変をH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0に導入して得られる改変体も同様のヘテロ二量化抗体の性質を有すると考えられる。
〔実施例１８〕ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0に導入した改変と置き換え可能な改変
実施例17で得られた図３５、図３６、図３７、図３８、図３９、図４０の結果から、ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のこれらの改変箇所をその他の改変に置き換えることが可能かを検証した。ここで、置換可能な改変とは、その改変を導入することで、導入前と比較して、FcgRIIIa FおよびFcgRIIIa Vに対する結合が0.7倍以上であり、FcgRIIbに対する結合が1.3倍以下であるような改変を指す。
実施例17で調製した改変体は抗体のEUナンバリング231番目から242番目のアミノ酸に改変を導入している。ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の、H240-Kn061のH鎖にはL234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A、H240-Hl071のH鎖にはK326D/A330M/K334Eを導入しているため、実施例17の結果からH240-Kn061のH鎖に導入された改変のうちL234Y、L235Y、G236Wが他のアミノ酸に置換可能かを検証することができる。
H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の一方のH鎖であるH240-Hl071に導入した改変箇所は含まれず、もう一方のH鎖であるH240-Kn061のH鎖のEUナンバリング234番目、235番目、236番目が含まれる。今回調製した改変体の中で、H240-Kn061のH鎖のEUナンバリング234番目、235番目、236番目に改変を導入したもので、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0と比較して、FcgRIIIa FおよびFcgRIIIa Vに対する結合が0.7倍以上であり、FcgRIIbに対する結合が1.3倍以下であるような改変体はH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0と同等かより優れた活性を有すると考えられるため、ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の優れた性質を損なうことなく置き換えることが可能であると考えられた。このような条件を満たす改変について、導入したH鎖およびその改変を表４６（H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0と同等の活性を維持する、あるいはより優れた性質を付与する改変）にまとめた。
Figure 2017043608
上記表４６中の「改変を導入したH鎖」とは、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のH鎖のうち、いずれのH鎖に置換可能であるかを表し、「改変」は数字がEUナンバリングで表したときの残基番号、最初のアルファベットがH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のその残基番号に対応するアミノ酸、最後のアルファベットが置換可能なアミノ酸を表す。
この結果から、H240-Kn061のH鎖定常領域に導入した改変のうち、置換可能な部位、および置換可能なアミノ酸は表４７（H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0と同等の活性を維持したまま置換可能なH240-Kn061の改変部位と、置換可能なアミノ酸）のようにまとめられる。
Figure 2017043608
上記表４７中の「改変部位」とは、H240-Kn061のEUナンバリングで表したときの残基番号EUナンバリングで表したときの残基番号、置換可能なアミノ酸とはその部位を表中のアミノ酸に置換しても、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0と同等の活性を持つような、すなわち置換可能なアミノ酸を表す。
H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0に導入した改変のうち、H240-Kn061のH268D、S298A、およびH240-Hl071のK326D、A330M、K334Eについては実施例17では対応する部位について改変を導入していない。以下では、これらの部位についても置き換え可能な改変の有無を実施例4の結果から考察した。具体的には、実施例4の結果のうち、H鎖の一方のみに改変を導入したヘテロ二量化抗体において、FcgRIIIa Fに対する結合の指標であるHe/Con_3aFが改変導入前に比べて1.3倍以上増強、すなわちHe/Con_3aFの値が130以上であり、かつその部位で最も強い効果を示す3つの改変を選択した。その結果をまとめると、表４８（H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の改変H268D、S298A、K326D、A330M、K334Eと置換可能な改変の改変部位、置換可能なアミノ酸、およびそのFcgRIIIa Fに対する結合活性）のようになる。
Figure 2017043608
上記表４８中の「改変部位」とは、EUナンバリングで表したときの残基番号を表す。「置換可能なアミノ酸」とは実施例4においてH鎖の一方のみに改変を導入したヘテロ二量化抗体において、FcgRIIIa Fに対する結合の指標であるHe/Con_3aFが改変導入前に比べて1.3倍以上増強しており、かつその部位で最も強い効果を示す3つの改変を表す。「He/Con_3aF」は実施例4で定義される値である。
表４８の結果を改変部位ごとに、置換可能なアミノ酸でまとめると表４９（H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の改変H268D、S298A、K326D、A330M、K334Eの置換可能な改変部位と、置換可能なアミノ酸）のようになる。
Figure 2017043608
表４９から、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0のH268DはDの代わりにEまたはAに置換しても、同等の活性を発揮すると考えられる。同様にして、K326DはDの代わりにTまたはIであっても、A330MはMの代わりにPまたはFであっても、K334DはDの代わりに、EまたはIであっても同等の活性を発揮すると考えられる。一方で、S298Aについては改変しても、同等の活性を発揮すると考えられる改変は見出すことができなかった。
また、ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0がその各H鎖から成るホモ二量化抗体よりもFcgRに対する結合活性を増強するというヘテロ二量化抗体の特徴を有することから、これらの改変をH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0に導入して得られる改変体も同様にヘテロ二量化抗体の性質を有すると考えられる。
〔実施例１９〕ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0へのD270Eの導入とその評価
次に、H240-Kn061/H240-Hl071を更に改良するために、ADCC活性を増強すると考えられるFcgRIIIaに対する結合を更に増強し、免疫抑制的なシグナルを通じて抗体の抗腫瘍活性を低減すると考えられるFcgRIIbに対する結合を更に減弱することを試みた。具体的には、実施例4で見出されたFcgRIIIaに対する結合を増強し、かつFcgRIIbに対する結合を減弱する改変であるD270EをH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の両H鎖に導入した。H240-Kn061、H240-Hl071のそれぞれにD270Eを導入した配列をそれぞれH240-Kn072 (配列番号：９０)、H240-Hl076 (配列番号：９１)とし、実施例1の方法にしたがい、L73-k0と組み合わせヘテロ二量化抗体H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0を発現、調製した。この抗体と、H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0、H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0、H240-afucosyl_G1d/L73-k0、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0とを、参考実施例8の方法にしたがって、各FcgRに対する結合活性を評価し、その結果を表５０にまとめた。
Figure 2017043608
表５０から、H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0はH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0と同様に既存のADCC活性増強技術を適用したH240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0およびH240-afucosyl_G1d/L73-k0よりもFcgRIIIa FおよびFcgRIIIa Vに強く結合し、加えてH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0よりも強く結合した。FcgRIIbに対して、H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0は既存のADCC活性増強技術により作製したH240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0およびH240-afucosyl_G1d/L73-k0よりも結合が減弱し、更にH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0よりも減弱していた。
すなわち、D270Eを導入することで、ADCC活性を増強するFcgRIIIaに対する結合が増強されていることからより強いADCC活性を有することが期待され、免疫抑制的なシグナルを伝達するFcgRIIbに対する結合が減弱されていることから抗体の免疫抑制的な作用を低減することが期待されるため、H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0はH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0よりも優れた抗腫瘍効果を発揮すると考えられる。
次に、H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0のADCC活性をH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0、H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0およびH240-afucosyl_G1d/L73-k0と比較した。その結果を図４１に示す。
図４１の結果からH240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0はH240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0よりも著しく強いADCC活性を示した。また、H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0は既存のADCC活性増強技術を適用したアフコシル化抗体H240-afucosyl_G1d/L73-k0よりも強いADCC活性を示し、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0とは同程度のADCC活性を示した。
この結果から、ヘテロ二量化抗体H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0は既存のADCC活性増強技術よりも強いADCC活性を有することに加えて、FcgRIIbに対する結合も減弱した既存技術よりも優れた抗体である。
また、ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0が各H鎖からなるホモ二量化抗体よりもFcgRに対して強く結合するというヘテロ二量化抗体の性質を有することから、D270EをH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の両H鎖に導入して得られたH240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0も同様にヘテロ二量化抗体の性質を有すると考えられる。
〔実施例２０〕ヘテロ二量化抗体H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0の更なる改良
実施例19において見出されたH240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0の更なる改良を試みた。具体的には、実施例18において見出されたH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0に更に優れた性質をH240-Kn061に導入することで付与する改変Y234E、Y235N、Y235Q、S239Mを、H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0と組み合わせた。
参考実施例1の方法にしたがって、H240-Kn072にY234E、Y235Nを導入したH240-Kn113（配列番号：９２）、H240-Kn072にS239Mを導入したH240-Kn115（配列番号：９３）、H240-Kn072にY235Q、S239Mを導入したH240-Kn125（配列番号：９４）を作製した。参考実施例1の方法にしたがって、一方のH鎖としてH240-Hl076、L鎖としてL73-k0を、もう一方のH鎖としてH240-Kn113、H240-Kn115、H240-Kn125をそれぞれ組み合わせ、H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0、H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0、H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0を調製した。これらについて、参考実施例8の方法にしたがって、各FcgRに対する結合を、天然型IgG1であるH240-G1d/L73-k0、それにKnobs-into-Holesを加えたH240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0、既存のADCC活性増強技術であるアフコシル化抗体H240-afucosyl_G1d/L73-k0およびADCC活性増強改変であるS239D/A330L/I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0とともに評価した結果を表５１にまとめた。
Figure 2017043608
H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0は、H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0と比較して、抑制型FcgRであるFcgRIIbに対する結合は同程度を維持し、かつADCC活性に重要な役割を果たすFcgRIIIa FおよびFcgRIIIa Vに対する結合が増強していた。抑制型FcgRであるFcgRIIbに対する結合については、天然型抗体であるIgG1と比較しても結合が同程度であった。FcgRIIIaについてはFcgRIIIa FおよびFcgRIIIa Vに対する結合が既存のADCC活性増強技術であるアフコシル化抗体H240-afucosyl_G1d/L73-k0およびADCC活性増強改変であるS239D/A330L/I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0よりも増強していた。このことから、H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0は天然型のIgG1と比べて免疫抑制的な作用が増強されることなく、かつ既存のADCC活性増強改変を適用したアフコシル化抗体、ホモ二量化抗体以上に強い抗腫瘍効果を有する可能性がある。
H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0は、H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0と比較してADCC活性に重要な役割を果たすFcgRIIIa FおよびFcgRIIIa Vに対する結合が更に増強していた。加えて、ADCP活性に重要なFcgRIIa RおよびFcgRIIa Hに対する結合も、天然型IgG1であるH240-G1d/L73-k0、それにKnobs-into-Holesを加えたH240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0、既存のADCC活性増強技術であるアフコシル化抗体H240-afucosyl_G1d/L73-k0およびADCC活性増強改変であるS239D/A330L/I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0よりも増強していた。
H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0は、H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0と同様に、抑制型FcgRであるFcgRIIbに対する結合がIgG1と同程度に維持されたまま、ADCC活性に重要な役割を果たすFcgRIIIa FおよびFcgRIIIa Vに対する結合がH240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0以上に増強していた。既存のADCC活性増強技術であるアフコシル化抗体H240-afucosyl_G1d/L73-k0およびADCC活性増強改変であるS239D/A330L/I332Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0と比べた場合、FcgRIIaのアロタイプの一つであるFcgRIIa Hに対する結合がより増強し、FcgRIIbに対する結合が減弱し、FcgRIIIaについては両アロタイプに対する結合が増強していることから、H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0は既存のADCC活性増強改変を適用したアフコシル化抗体、ホモ二量化抗体以上にADCP活性増強、ADCC活性増強が期待され、加えて免疫抑制的な作用の減弱が期待できる。
次に、H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0、H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0、H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0のADCC活性をH240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0、既存のADCC活性増強技術であるアフコシル化抗体H240-afucosyl_G1d/L73-k0と比較した。その結果を図４２に示す。
図４２から、いずれのヘテロ二量化抗体も既存のADCC活性増強技術であるアフコシル化抗体よりも優れたADCC活性を示すことが明らかとなった。
各FcgRに対する結合プロファイル、および既存技術と比較したADCC活性の結果から、今回H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0のH240-Kn072に導入したY234E、Y235N、Y235Q、S239MはH240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0により優れた性質を付与する改変であることが明らかとなった。
ヘテロ二量化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0が各H鎖からなるホモ二量化抗体よりもFcgRに対して強く結合するというヘテロ二量化抗体の性質を有することから、D270EをH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0の両H鎖に導入して得られたH240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0も同様にヘテロ二量化抗体の性質を有し、そこに更に改変を導入したH240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0、H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0、H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0も同様にヘテロ二量化抗体の性質を有すると考えられた。
〔実施例２１〕FcgRIIa、FcgRIIIaに対する結合を増強したヘテロ二量化抗体の作製
実施例4の結果をもとにH鎖にFcgRIIIaおよびFcgRIIaに対して結合を増強した改変体を作製した。具体的には、参考実施例1の方法にしたがってH240-Kn033（配列番号：８４）にL234Y、L235Y、G236W、H268D、S298A、A327Dを導入し、H240-Kn067（配列番号：９５）を作製し、H240-Hl033（配列番号：８５）にD270E、K326D、A330K、K334Eを導入し、H240-Hl068（配列番号：９６）を作製した。H240-Kn067、H240-Hl068、L73-k0を組み合わせて、参考実施例1の方法にしたがってヘテロ二量化抗体H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0を発現させた。
まず、このヘテロ二量化抗体H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0がその各H鎖から成るホモ二量化抗体よりもFcgRに対する結合活性を増強するというヘテロ二量化抗体の特徴を有するかを確認した。ヘテロ二量化抗体H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0の一方のH鎖であるH240-Kn067にはL234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327Dが、もう一方のH鎖であるH240-Hl068にはD270E/K326D/A330K/K334Eが導入されている。そこで、L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327DをH240-Hl033に導入したH240-Hl136（配列番号：９７）、およびD270E/K326D/A330K/K334EをH240-Kn033に導入したH240-Kn133（配列番号：９８）を参考実施例1の方法にしたがって作製した。この発現ベクターを用いて、参考実施例1の方法にしたがい、L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327Dを両H鎖に有するようなホモ二量化抗体H240-Kn067/H240-Hl136/L73-k0、D270E/K326D/A330K/K334Eを両H鎖に有するようなホモ二量化抗体H240-Kn113/H240-Hl068/L73-k0を発現させた。これらのホモ二量化抗体と、L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327Dを一方のH鎖に有し、D270E/K326D/A330K/K334Eをもう一方のH鎖に有するヘテロ二量化抗体H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0のFcgRIIa H、FcgRIIa R、FcgRIIIaFおよびFcgRIIIa Vに対する結合を参考実施例8の方法にしたがって測定した。その結果を表５２にまとめた。
Figure 2017043608
更にこの改変体に対して、実施例18において見出されたH240-Kn061に導入することでH240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0に更に優れた性質を付与する改変Y235Q、S239Mを、H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0と組み合わせた。具体的には、参考実施例1の方法にしたがって、H240-Kn067にS239Mを導入したH240-Kn120（配列番号：９９）、H240-Kn120にY235Qを導入したH240-Kn126（配列番号：１００）、を作製した。参考実施例1の方法にしたがって、一方のH鎖としてH240-Hl068、L鎖としてL73-k0を、もう一方のH鎖としてH240-Kn067、H240-Kn120、H240-Kn126をそれぞれ組み合わせ、H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0を調製した。これらについて、参考実施例8の方法にしたがって、各FcgRに対する結合を評価した結果を表５３にまとめた。
Figure 2017043608
この結果から、H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0のいずれも既存のADCC活性増強抗体であるH240-afucosyl_G1d/L73-k0およびH240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0と比較してFcgRIIIaに対する結合を同等か、それ以上に増強していた。また、いずれの既存技術と比較しても、ADCP活性に重要な役割を果たすFcgRIIa RおよびFcgRIIa Hに対する結合が増強していた。このことから、今回作製したH240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0のいずれのヘテロ二量化抗体も既存技術と同等かそれ以上のADCC活性を有し、かつそれらよりも優れたADCP活性を有する可能性が示唆された。
特に、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0はFcgRIIa RおよびFcgRIIa Hに対する結合を増強し、ADCP活性を増強したと報告のあるG236A/S239D/I332Eの改変を両H鎖に有するホモ二量化抗体H240-Kn037/H240-Hl036/L73-k0と比較しても、FcgRIIa HおよびFcgRIIa Rに対する結合がより増強している。すなわち、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0は既存のADCC活性増強技術を使った抗体よりもFcgRIIIa FおよびFcgRIIIa Vに対する結合を増強し、かつ既存のADCP活性増強技術を使った抗体よりもFcgRIIa RおよびFcgRIIa Hに対する結合が増強している。そのため、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0は既存技術を使った抗体以上に強いADCC活性およびADCP活性を有する可能性のある優れた抗体である。
次に、参考実施例9にしたがって各改変体のADCC活性を既存のADCC活性増強技術であるアフコシル化抗体H240-afucosyl_G1d/L73-k0と比較した。その結果を図４３に示す。
図４３の結果から、今回作製したいずれのヘテロ二量化抗体も既存のADCC活性増強技術であるアフコシル化抗体と同等かそれ以上に優れたADCC活性を示すことが明らかとなった。
各FcgRに対する結合プロファイル、および既存技術と比較したADCC活性の結果から、今回調製したH240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0のいずれも既存のADCC活性増強技術と同程度かそれ以上のADCC活性を有しつつも、FcgRIIa結合を介したADCP活性も増強する可能性の高いヘテロ二量化抗体であることが明らかとなった。
〔実施例２２〕ヘテロ二量化抗体H240-AK072/H240-BH076/L73-k0の各FcgRに対する結合活性、ADCC活性の評価
これまでKnobs-into-Holesを利用したヘテロ二量化抗体としてH240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0の各FcgRに対する結合、ADCC活性を評価してきた。ここで、別のヘテロ二量化抗体作製技術であるD356K、H435RおよびK439Eを使った場合にも、異なる二つのH鎖から成るヘテロ二量化抗体がその各H鎖から成るホモ二量化抗体よりもFcgRに対する結合活性を増強するというヘテロ二量化抗体の特徴が同様に観察されるかを確認した。
まず、H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0の片方のH鎖であるH240-Kn072に導入されている改変であるL234Y/L235Y/G236W/H268D/D270E/S298Aを、H240-G1d(配列番号：８３)のアロタイプであるH240-G1dE(配列番号：１０１)にD356K、H435Rを導入したH240-A5E (配列番号：１０２)に導入しH240-AK072(配列番号：１０４)を作製した。次に、もう片方のH鎖であるH240-Hl076に導入されているD270E/K326D/A330M/K334Eを、H240-G1DEにK439Eを導入したH240-B3E(配列番号：１０３)に導入し、H240-BH076 (配列番号：１０５)を作製した。実施例1の方法にしたがって、H240-AK072、H240-BH076、L73-k0を組み合わせて、ヘテロ二量化抗体H240-AK072/H240-BH076/L73-k0を発現、調製した。同様にして、H240-AK072とL73-k0、H240-BH076とL73-k0をそれぞれ組み合わせて、ホモ二量化抗体H240-AK072/L73-k0、H240-BH076/L73-k0を発現、調製した。これらの抗体の各FcgRに対する結合活性を参考実施例8の方法にしたがって比較した結果を表５４にまとめた。
Figure 2017043608
この結果より、ヘテロ二量化抗体H240-AK072/H240-BH076/L73-k0はその各H鎖からなるホモ二量化抗体H240-AK072 /L73-k0、H240-BH076/L73-k0のいずれよりも強くFcgRに結合するというヘテロ二量化抗体の特徴を有することが確認された。
次に、参考実施例1の方法にしたがって、H240-A5E、H240-B3E、L73-k0を組み合わせて発現し、H240-A5E/H240-B3E/L73-k0を調製した。参考実施例8の方法にしたがって、H240-G1d/L73-k0、H240-A5E/H240-B3E/L73-k0、H240-afucosyl_G1d/L73-k0、ヘテロ二量化抗体H240-AK072/H240-BH076/L73-k0の各FcgRに対する結合を評価し、その結果を表５５にまとめた。
Figure 2017043608
その結果、H240-AK072/H240-BH076/L73-k0ではH240-G1d/L73-k0および既存のADCC活性増強技術であるアフコシル抗体H240-afucosyl_G1d/L73-k0と比較してFcgRIIIa F、FcgRIIIa Vに対する結合が増強していた。また、H240-G1d/L73-k0とH240-A5E/H240-B3E/L73-k0のFcgRに対する結合活性は同等であることから、H240-AK072/H240-BH076/L73-k0の結合活性の増強は各H鎖に導入したL234Y/L235Y/G236W/H268D/D270E/S298AおよびD270E/K326D/A330M/K334Eの改変に由来すると考えられる。
〔実施例２３〕Fc (Kn120/Hl068)とFcgRIIb細胞外領域との複合体のX線結晶構造解析
実施例２１で作製したH240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0では、FcgRIIIaならびにFcgRIIa H型にくわえ、アロタイプであるFcgRIIa R型に対する結合活性の増強を果たしたが、抑制型レセプターであるFcgRIIbに対する結合活性の増強も同時に観察された。FcgRIIbに対する結合増強は、免疫抑制的な効果をもたらすと考えられるため、このFcgRIIbとの結合を低減させることで、本発明の目的であるADCC活性を一層増強させることができる可能性がある。
しかしながら、FcgRIIaとFcgRIIbは細胞外領域のアミノ酸配列の93%が一致し、非常に高い相同性を有している。さらに天然型IgG1のFc (以下Fc (WT))とFcgRIIa R型の細胞外領域複合体の結晶構造（J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217）から分析すると、両者の相互作用界面付近においては、FcgRIIa R型はFcgRIIbと比べてわずか３アミノ酸（Gln127, Leu132, Phe160）にしか違いが見いだせなかった（図４４）。このためFcgRIIa R型に対する結合活性を維持しつつ、FcgRIIbに対する結合活性のみを減弱させることは、非常に困難であると予想された。そのため、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0のFc部分 (Fc (Kn120/Hl068) )とFcgRIIb細胞外領域との複合体の結晶構造情報を取得し、より詳細に導入するアミノ酸変異を検討することで、FcgRIIbに対する結合活性を選択的に低減する改変を見出せる可能性がより高まると考え、Fc (Kn120/Hl068)とFcgRIIb細胞外領域との複合体のX線結晶構造解析をおこなった。
その結果、Fc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体についてX線結晶構造解析により分解能2.78Åで立体構造を決定することに成功した。その解析の結果取得された構造を図４５に示す。2つのFc CH2ドメインの間にFcgRIIb細胞外領域が挟まれるように結合しており、これまで解析されたFc (WT)とFcgRIIIa（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2011, 108, 12669-126674）、FcgRIIIb（Nature, 2000, 400, 267-273; J.Biol.Chem. 2011, 276, 16469-16477）、FcgRIIaの各細胞外領域との複合体の立体構造と類似していることが明らかとなった。
次に、Fcとの結合面近くにあり、FcgRIIa R型とFcgRIIbとで異なる３つのアミノ酸残基周辺の構造を示す。図４６ではLys127（FcgRIIa R型においてはGln）周辺の構造を示した。もっとも近いFcgRIIbの残基は、図４６に示したFcのCH2ドメインBにあるEUナンバリング２９８番目のAlaであるが、この残基は結合の境界面においてFcgRIIbと直接接しているため、Lys127と相互作用可能な大きな残基の導入は困難であると考えられた。その他の周囲のアミノ酸残基も、このLys127からは距離が遠く、直接的に相互作用できる変異を見出すことはできなかった。図４７にはSer132（FcgRIIa R型においてはLeu）周辺の構造を示した。やはり、この残基もFcからの距離が遠く、このSerと直接相互作用が可能となる変異を見出すことはできなかった。最後に図４８にはTyr160（FcgRIIa R型においてはPhe）周辺の構造を示した。このTyrは、FcのCH2ドメインAにあるEUナンバリング２３６番目のGlyの主鎖カルボニル酸素と水素結合を形成している。そこでEUナンバリング２３６番目のGly236に変異を導入し、ループ構造を変化させることで、その結果としてこの水素結合を消失することができれば、FcgRIIbに対する結合活性のみを低減できる可能性がある。また、EUナンバリング２３６番目のGlyの位置に、側鎖の大きな変異を導入した場合、その側鎖がFcgRIIaおよびFcgRIIbの160番の側鎖と直接相互作用することが予想され、FcgR2a R型のPhe160とFcgRIIbのTyr160との違いを利用して、FcgRIIbに対して選択的に結合活性を低減することができる可能性も考えられた。
実験方法
［Fc (Kn0120/Hl068) の発現精製］
Fc (Kn0120/Hl068) の調製は以下のように行った。まず、H240-Kn120(配列番号９９)およびH240-Hl068 (配列番号９６)のEUナンバリング220番目のCysをSerに置換し、EUナンバリング236番目のGluからそのC末端をPCRによってクローニングした遺伝子配列Fc (Kn0120)および Fc (Hl068)を参考例1に記載の方法にしたがって発現ベクターの作製、発現、精製を行った。なお、EUナンバリング220番目のCysは通常のIgG1においては、L鎖のCysとdisulfide bondを形成しているが、Fcのみを調製する場合、L鎖を共発現させないため、不要なdisulfide bond形成を回避するためにSerに置換した。
［FcgRIIb細胞外領域の発現精製］
参考例8の方法にしたがって調製した。
［Fc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体の精製］
結晶化用に得られたFcgRIIb細胞外領域サンプル 1.5mgに対し、glutathione S-transferaseとの融合蛋白として大腸菌により発現精製したEndo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622) 0.15mgを加え、0.1M Bis-Tris pH6.5のBuffer条件で、室温にて３日間静置することにより、N型糖鎖をAsnに直接結合したN-acetylglucosamineを残して切断した。次にこの糖鎖切断処理を施したFcgRIIb細胞外領域サンプルを10000MWCOの限外ろ過膜により濃縮し、20mM HEPES pH7.5, 0.1M NaClで平衡化したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Superdex200 10/300）により精製した。さらに得られた糖鎖切断FcgRIIb細胞外領域画分にFc (Kn0120/Hl068) をモル比でFcgRIIb細胞外領域のほうが若干過剰となるよう加え、10000MWCOの限外ろ過膜により濃縮後、25mM HEPES pH7.5, 0.1M NaClで平衡化したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Superdex200 10/300）により精製し、Fc (Kn0120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体のサンプルを得た。
［Fc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb複合体細胞外領域複合体の結晶化］
Fc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体のサンプルを10000MWCOの限外ろ過膜により約10mg/mlまで濃縮し、ハンギングドロップ蒸気拡散法にてSeeding法を併用しつつ結晶化をおこなった。結晶化にはVDXmプレート(Hampton Research)を用い、0.1M Bis-Tris pH6.0, 14.4% PEG3350, 0.2M Ammonium Sulfatecのリザーバー溶液に対し、リザーバー溶液：結晶化サンプル＝0.85μl：0.85μlで混合して結晶化ドロップを作成、さらに同様な条件で得られた同複合体の結晶からSeeding Tool(Hampton Research)を用いて種結晶を移植するStreak Seedingをおこない、20℃に静置したところ、柱状の結晶を得ることに成功した。
［Fc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体結晶からのＸ線回折データの測定］
得られたFc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体の単結晶一つを0.1M Bis-Tris pH6.0, 17.5% PEG3350, 0.2M Ammonium Sulfate, Glycerol 16%(v/v) の溶液に浸した後、微小なナイロンループ付きのピンで溶液ごとすくいとり、液体窒素中で凍結させ、高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーBL-17AにてX線回折データの測定をおこなった。なお、測定中は常に-178℃の窒素気流中に置くことで凍結状態を維持し、ビームライン備え付けのCCDディテクタQuantum 315r (ADSC)により、結晶を0.5°ずつ回転させながらトータル360枚のX線回折画像を収集した。得られた回折画像からの格子定数の決定、回折斑点の指数付け、ならびに回折データの処理には、プログラムXia2（J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190）、XDS Package（Acta Cryst. 2010, D66, 125-132）ならびにScala（Acta Cryst. 2006, D62, 72-82）を用い、最終的に分解能2.78Åまでの回折強度データを得た。本結晶は、空間群P41212に属し、格子定数ａ＝152.94Å、ｂ＝152.94Å、ｃ＝82.24Å、α＝90°、β＝90°、γ＝90°であった。
［Fc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体のX線結晶構造解析］
構造決定は、プログラムPhaser（J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674）を用いた分子置換法によりおこなった。得られた結晶格子の大きさとFc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体の分子量から非対称単位中の複合体の数は一個と予想された。Fc(WT) / FcgRIIIa細胞外領域複合体の結晶構造であるPDB code:3SGJの構造座標から、A鎖239-340番ならびにB鎖239-340番のアミノ酸残基部分を別座標として取り出し、それぞれをFc CH2ドメインの探索用モデルとした。同じくPDB code:3SGJの構造座標から、A鎖341-444番とB鎖341-443番のアミノ酸残基部分を一つの座標として取り出し、Fc CH3ドメインの探索用モデルとした。最後にFcgRIIb細胞外領域の結晶構造であるPDB code:2FCB の構造座標からA鎖6-178番のアミノ酸残基部分を取り出しFcgRIIbの探索用モデルとした。Fc CH3ドメイン、FcgRIIb細胞外領域、Fc CH2ドメインの各探索用モデルの結晶格子内での向きと位置を、回転関数および並進関数から決定し、Fc (Kn120/Hl068) / FcgRIIb細胞外領域複合体結晶構造の初期モデルを得た。得られた初期モデルに対し2つのFcのCH2ドメイン、2つのFcのCH3ドメインならびにFcgRIIb細胞外領域を動かす剛体精密化をおこなったところ、この時点で25-3.0Åの回折強度データに対し、結晶学的信頼度因子Ｒ値は41.4%、Free R値は42.6%となった。さらにプログラムREFMAC5（Acta Cryst. 2011, D67, 355-367）を用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcならびにモデルから計算された位相をもとに算出した２Ｆｏ−Ｆｃ、Ｆｏ−Ｆｃを係数とする電子密度マップを見ながらのモデル修正をプログラムCoot（Acta Cryst. 2010, D66, 486-501）でおこない、これらを繰り返すことでモデルの精密化をおこなった。最後に2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをもとに水分子をモデルに組み込み、精密化をおこなうことで、最終的に分解能25-2.78Åの24274個の回折強度データを用い、4964個の非水素原子を含むモデルに対し、結晶学的信頼度因子Ｒ値は22.8%、Free R値は27.7%となった。
〔実施例２４〕FcgRIIaRに対する結合活性を維持または増強し、FcgRIIbに対する結合活性を低減した抗体の作製
実施例２１で見出された改変体H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0はADCP活性に重要なFcgRIIaR, FcgRIIaHに対する結合活性が増強されると共に、抑制型のFcgRIIbに対する結合活性も天然型IgG1と比較して約50倍増強されていた。高いADCP活性を示すためには、抑制型FcgRIIbに対する結合活性を可能な限り低減できることが好ましい。そこで、活性型FcgRIIaR, FcgRIIaHへの結合活性を維持したままFcgRIIbへの結合活性を低減できる改変を探索した。実施例23に示したように、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0のFcとFcgRIIb細胞外領域の複合体の結晶構造解析結果から、FcgRIIbのTyr160とFc(Kn120/Hl068)のCH2ドメインAに存在するGly236の主鎖カルボニル酸素との間で水素結合が形成されていることが示された。FcgRIIaR, FcgRIIaHにおいてはこの部位がPhe160となっており、上述の相互作用は存在しないと考えられるため、Gly236に改変を導入し、FcgRIIbのTyr160との相互作用を消失させることができれば、FcgRIIa R型に対する結合活性は維持しつつも、FcgRIIbに対する結合活性を低下させる、すなわちFcgRIIbに対して選択的に結合活性を低減できる可能性がある。具体的には、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0とFcgRIIbとの結合においてFcgRIIbのY160と相互作用しているH240-Hl068に由来するH鎖存在するG236を、Ser, Val, Ile, Thrに置換することで、G236を反転させ、ループ構造を変化させ、Y160との相互作用を消失させることができないかと考えた。また、FcgRIIbのLys127とFc(Kn120/Hl068)のCH2ドメインＡのE294とは、遠位ながらも静電相互作用している可能性がある。従って、E294を正電荷をもつLys、Argに置換することで、静電反発を誘起し、FcgRIIbとの相互作用を減弱できる可能性があると考えた。
参考実施例1の方法に従ってH240-Kn120(配列番号９９)に対し、それぞれE294R、E294Kを導入したH240-Kn179(配列番号１０７)、H240-Kn180(配列番号１０８)を、H240-Hl068（配列番号９６）にそれぞれG236S, G236V, G236I, G236Tを導入したH240-Hl073(配列番号１０９)、H240-Hl085（配列番号１１０）、H240-Hl086（配列番号１１１）、H240-Hl089（配列番号１１２）を作製した。参考実施例1の方法に従って、一方のH鎖としてH240-Kn120、H240-Kn180を、L鎖としてL73-k0を、もう一方のH鎖としてH240-Hl073、H240-Hl085、H240-Hl086、H240-Hl089をそれぞれ組み合わせ、H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl085/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl086/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl089/L73-k0、H240-Kn179/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn180/H240-Hl068/L73-k0を調製した。これらの改変体のFcgRに対する結合を参考実施例8の方法に従って評価した結果を表５６に示す。なお、表中に灰色で網掛けしたH240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0のKDは、このときのFcgRIaに対するkdが本測定で使用したBiacore4000の解離定数(kd)の測定可能範囲5x10-5s-1から1s-1の範囲測定限界である5x10-5s-1よりも小さい値を示していたため、kdを5x10-5s-1以下として算出したKDである。
Figure 2017043608
また、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0のFcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIbに対する各KDを各改変体のKDで割った値、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0のFcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIbに対するKDを1としたときの、相対的なKDであるrelative KDを表５７に示した。
Figure 2017043608
これらの結果から、本検討で作製した6種類の改変はいずれもH240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 と比較して、FcgRIIaR, FcgRIIaHに対する結合活性を維持または増強し、FcgRIIbに対する結合活性を減弱させることが示された。
次に、表57で検討した改変を組み合わせることでさらにFcgRIIbに対する結合活性を減弱させることを試みた。ここでは、H240-Kn120へのE294KあるいはE294Rの導入、および、H240-Hl068へのG236Tの導入を併用することでさらなるFcgRIIbに対する結合活性の抑制を試みた。表57に示した通り、これらの改変はいずれもFcgRIIIaF, FcgRIIIaVに対する結合活性を減弱させる。そこで、これらの改変に加えて、FcgRIIIaに対する結合活性を増強されることが報告されているI332Eおよび、実施例18で示したFcgRIIIaに対する結合活性を増強させる改変であるY235Nを導入し、さらなるFcgRIIbに対する結合活性の抑制、およびFcgRIIIaに対する結合活性の増強を試みた。
参考実施例1の方法に従ってH240-Kn120(配列番号９９)に対し、Y235NとE294Kを導入したH240-Kn192(配列番号１１３)、Y235NとE294Rを導入したH240-Kn193(配列番号１１４)を、H240-Hl068（配列番号９６）にG236TとI332Eを導入したH240-Hl204(配列番号１１５)を作製した。参考実施例1の方法に従って、一方のH鎖としてH240-Kn192、H240-Kn193を、L鎖としてL73-k0を、もう一方のH鎖としてH240-Hl089、H240-Hl204をそれぞれ組み合わせ、H240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0、H240-Kn180/H240-Hl089/L73-k0、H240-Kn192/H240-Hl204/L73-k0、H240-Kn193/H240-Hl204/L73-k0を調製した。これらの改変体のFcgRに対する結合活性を参考実施例8の方法に従って評価した結果を表５８に示す。なお、表中に灰色で網掛けしたH240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0のKDは、このときのFcgRIaに対するkdが本測定で使用したBiacore4000の解離定数(kd)の測定可能範囲5x10-5s-1から1s-1の範囲測定限界である5x10-5s-1よりも小さい値を示していたため、kdを5x10-5s-1以下として算出したKDである。
Figure 2017043608
また、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0のFcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIbに対する各KDを各改変体のKDで割った値、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0のFcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIbに対するKDを1としたときの、相対的なKDであるrelative KDを表５９に示した。
Figure 2017043608
H240-Kn120にE294KもしくはE294Rを導入し、H240-Hl068にG236Tを導入したH240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0、およびH240-Kn180/H240-Hl089/L73-k0はいずれもH240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIaR, FcgRIIaHへの結合を増強しつつFcgRIIbへの結合を0.4倍に低減していた。またそれぞれの改変をどちらか片方の鎖にしか持たないH240-Kn120/H240-Hl089/L73-k0、H240-Kn179/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn180/H240-Hl068/L73-k0と比較して1.5倍から2倍のFcgRIIbへの結合低減効果を示した。
これらの改変体に対してさらに、I332EおよびY235Nを導入したH240-Kn192/H240-Hl204/L73-k0、およびH240-Kn193/H240-Hl204/L73-k0はいずれも改変導入前のH240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0、およびH240-Kn180/H240-Hl089/L73-k0と比較してFcgRIIaR, FcgRIIaH、FcgRIIbへの結合を維持したままFcgRIIIaFへの結合を2倍に、またFcgRIIIaVへの結合を約8倍向上させることができた。
〔実施例２５〕ヘテロ二量化抗体H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の活性型FcgRに対する結合活性の増強
実施例24においてH240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0に対して改変を導入することで、FcgRIIaR, FcgRIIaHに対する結合を維持または増強し、抑制型FcgRIIbに対する結合活性を低減した改変体を作製した。本検討では、活性型のFcgRであるFcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIIaF, FcgRIIIaVに対する結合活性の増強を試みた。
参考実施例1の方法に従ってH240-Kn120にL328Wを導入したH240-Kn138（配列番号１１６）、I332Qを導入したH240-Kn173（配列番号１１７）、K334Yを導入したH240-Kn178（配列番号１１８）、L328Aを導入したH240-Kn166（配列番号１１９）、I332Mを導入したH240-Kn172（配列番号１２０）、L328WとK334Lを導入したH240-Kn149（配列番号１２１）を作製した。またもう一方のH鎖として、H240-Hl068にL328Wを導入したH240-Hl147（配列番号１２２）、L328Aを導入したH240-Hl170（配列番号１２３）、I332Eを導入したH240-Hl174（配列番号１２４）、I332Tを導入したH240-Hl150（配列番号１２５）、A231Hを導入したH240-Hl182（配列番号１２６）、I332Qを導入したH240-Hl177（配列番号１２７）を作製した。参考実施例1の方法に従い、片方のH鎖としてH240-Kn138（配列番号１１６）、H240-Kn173（配列番号１１７）、H240-Kn178（配列番号１１８）H240-Kn149（配列番号１２１）、H240-Kn166（配列番号１１９）、H240-Kn172（配列番号１２０）を、またもう一方のH鎖としてH240-Hl170（配列番号１２３）、H240-Hl150（配列番号１２５）、H240-Hl174（配列番号１２４）、H240-Hl182（配列番号１２６）、H240-Hl147（配列番号１２２）、H240-Hl177（配列番号１２７）を、L鎖としてL73-k0（配列番号１０６）を用いてH240-Kn120/H240-Hl170/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl150/L73-k0、H240-Kn138/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl174/L73-k0、H240-Kn173/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn178/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl182/L73-k0、H240-Kn138/H240-Hl147/L73-k0、H240-Kn166/H240-Hl170/L73-k0、H240-Kn172/H240-Hl177/L73-k0、H240-Kn149/H240-Hl068/L73-k0を調製した。これらの改変体のFcgRに対する結合を参考実施例8の方法に従って評価した結果を表６０に示す。
Figure 2017043608
また、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0のFcgRIa FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIa F, FcgRIIIa Vに対する各KDを各改変体のKDで割った値、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0のFcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIbに対する各KDを1としたときの相対的なKDであるrelative KDを表６１に示した。
Figure 2017043608
ここに示した改変体は、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIIaF, FcgRIIIaVのうち少なくとも一つのFcgRに対する結合が増強されている改変体である。
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の一方のH鎖であるH240-Hl068に対してL328Aを導入したH240-Kn120/H240-Hl170/L73-k0はH240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIaR, FcgRIIaHに対する結合活性が2.3倍向上した。
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の一方のH鎖であるH240-Hl068に対してI332Tを導入したH240-Kn120/H240-Hl150/L73-k0はH240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIaRに対する結合活性を維持したままFcgRIIaHに対する結合活性が1.2倍向上した。
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の一方のH鎖であるH240-Kn120にL328Wを導入したH240-Kn138/H240-Hl068/L73-k0はH240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIaRに対する結合活性を維持したまま、FcgRIIaHに対する結合活性が1.6倍に向上した。
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の一方のH鎖であるH240-Hl068に対してI332Eを導入したH240-Kn120/H240-Hl174/L73-k0は、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIIaFに対する結合活性が4.3倍、FcgRIIIaVに対する結合活性が10倍向上した。
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の一方のH鎖であるH240-Kn120に対してI332Qを導入したH240-Kn173/H240-Hl068/L73-k0は、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIIaVに対する結合活性を維持したままFcgRIIIaFに対する結合活性を1.2倍向上した。
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の一方のH鎖であるH240-Kn120に対してK334Yを導入したH240-Kn178/H240-Hl068/L73-k0はH240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIIaFに対する結合活性が1.6倍に、FcgRIIIaVに対する結合活性が1.9倍に向上した。
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の一方のH鎖であるH240-Hl068に対してA231Hを導入したH240-Kn120/H240-Hl182/L73-k0は、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIIaVに対する結合活性が1.2倍に向上した。
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の両方のH鎖にL328Wを導入したH240-Kn138/H240-Hl147/L73-k0は、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIaRに対する結合活性が1.8倍に向上した。
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の両方のH鎖にL328Aを導入したH240-Kn166/H240-Hl170/L73-k0は、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIaHに対する結合活性が1.9倍に向上した。
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の片方のH鎖であるH240-Kn120にI332Mを、もう一方のH鎖であるH240-Hl068に対してI332Qを導入したH240-Kn172/H240-Hl177/L73-k0は、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIIaFに対する結合活性を維持したままFcgRIIIaVに対する結合活性が1.6倍向上した。
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0の一方のH鎖であるH240-Kn120にL328W, K334Lを導入したH240-Kn149/H240-Hl068/L73-k0は、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較してFcgRIIaR, FcgRIIIaVに対する結合活性を維持したまま、FcgRIIaHに対する結合活性が1.6倍向上した。
以上の結果からこれらの改変体はH240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0と比較して高いADCP活性もしくはADCC活性を有すると考えられた。
〔実施例２６〕FcgRIIbに対する結合活性を増強したヘテロ二量化抗体の創出
ヒトでは、FcγRのタンパク質ファミリーには、FcγRIa (CD64A)、FcγRIIa (CD32A)、FcγRIIb (CD32B)、FcγRIIIa (CD16A)、FcγRIIIb (CD16B)のアイソフォームが報告されており、それぞれのアロタイプも報告されている（Immunol Lett, 82(1-2), 57-65, 2002）。FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIaは免疫活性的な機能を有するため活性型FcγRと呼ばれ、FcγRIIbは免疫抑制的な機能を有し、抑制型FcγRと呼ばれる（Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010）。
FcγRIIbはB細胞に発現している唯一のFcγRである（Eur J Immunol 19, 1379-1385, 1989）。FcγRIIbに対して抗体のFc領域が相互作用することで、B細胞の初回免疫が抑制されることが報告されている（J Exp Med 129, 1183-1201, 1969）。また、B細胞上のFcγRIIbとB細胞受容体（B cell receptor：BCR）とが血中の免疫複合体を介して架橋されると、B細胞の活性化が抑制され、B細胞の抗体産生が抑制されることが報告されている（Immunol Lett 88, 157-161, 2003）。このBCRとFcγRIIbを介した免疫抑制的なシグナルの伝達にはFcγRIIbの細胞内ドメインに含まれるimmunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif（ITIM）が必要である（Science, 256, 1808-1812, 1992、Nature, 368, 70-73, 1994）。シグナルが入り、ITIMがリン酸化されると、SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase（SHIP）がリクルートされ、他の活性型FcγRのシグナルカスケードの伝達を阻害し、炎症性免疫反応を抑制する（Science, 290, 84-89, 2000）。また、FcgRIIbのみを会合化することによっても、BCR非依存的にIgM産生B細胞をアポトーシスすることなく、B細胞の増殖とBCRの架橋によるカルシウム流入を一過的に抑制することが報告されている (J Imunol, 181, 5350-5359, 2008)
また、FcγRIIbは樹状細胞、マクロファージ、活性化された好中球、マスト細胞、好塩基球でも発現している。これらの細胞においても、FcγRIIbはphagocytosisや炎症性サイトカインの放出等の活性型FcγRの機能を阻害し、炎症性免疫反応を抑制する（Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010）。
FcγRIIbの免疫抑制的な機能の重要性については、これまでにFcγRIIbノックアウトマウスを用いた研究により明らかにされてきた。FcγRIIbノックアウトマウスでは、液性免疫が適切に制御されず（J Immunol, 163, 618-622, 1999）、コラーゲン誘導関節炎（CIA）に対する感受性が増加したり（J Exp Med, 189, 187-194, 1999）、ループス（lupus）様の症状を呈したり、グッドパスチャー（Goodpasture）シンドローム様の症状を呈したりする（J Exp Med, 191, 899-906, 2000）ことが報告されている。
また、FcγRIIbの調節不全はヒトの自己免疫疾患との関連も報告されている。例えば、FcγRIIbのプロモーター領域や細胞膜貫通領域における遺伝子多型と、全身性エリテマトーデス（SLE）の発症頻度との関連（Hum, Genet, 117, 220-227, 2005、J Biol Chem, 282, 1738-1746, 2007、Arthritis Rheum, 54, 3908-3917, 2006、Nat Med, 11, 1056-1058, 2005、J Immunol, 176, 5321-5328, 2006）や、SLE患者のB細胞表面におけるFcγRIIbの発現低下が報告されている（J Exp Med, 203, 2157-2164, 2006、J Immunol. 178, 3272-3280, 2007）。
このようにマウスモデルおよび臨床上の知見から、FcγRIIbはB細胞との関与を中心に、自己免疫疾患、炎症性疾患を制御する役割を果たしていると考えられ、自己免疫疾患、炎症性疾患を制御するための有望な標的分子である。
市販の抗体医薬として主に用いられているIgG1はFcγRIIbだけでなく、活性型FcγRにも強く結合することが知られている（Blood, 113, 3716-3725, 2009）。FcγRIIbに対する結合を増強した、あるいは活性型FcγRと比較してFcγRIIbに対する結合活性の選択性を向上させたFc領域を利用することで、IgG1と比べて免疫抑制的な性質を有した抗体医薬の開発可能性が考えられる。例えば、BCRに結合する可変領域と、FcγRIIbに対する結合を増強したFcを有する抗体を利用することで、B細胞の活性化を阻害する可能性が示唆されている（Mol Immunol, 45, 3926-3933, 2008）。B細胞上のFcγRIIbとＢ-cell receptorに結合したIgEとが架橋されることで、B細胞のプラズマ細胞への分化、その結果として起こるIgE産生が抑制され、ヒトPBMCを移植したマウスにおいてヒトIgGやIgM濃度は維持されているが、ヒトIgE濃度は減少することが報告されている（Acad News, doi: 10.1016, jaci.2011.11.029）。IgEだけではなく、B-cell receptor複合体を形成するCD79bとFcgRIIBとを抗体で架橋した場合にはin vitroにおいてB細胞の増殖が抑制され、コラーゲン関節炎モデルにおいて症状を緩和したことが報告されている (Arthritis Rheum, 62, 1933-1943, 2010)。
B細胞以外にも、IgEの受容体であるFcεRIと結合するIgEのFc部分とFcgRIIbに対する結合を増強したIgGのFc部分とを融合させた分子を使って、マスト細胞上のFcεRIとFcgRIIbとを架橋することで、FcgRIIbのリン酸化を引き起こし、FcεRI依存的なカルシウムの流入を抑制することが報告されており、これはFcgRIIbに対する結合を増強することでFcgRIIbの刺激を介した脱顆粒の阻害が可能であることを示唆している (Immunol let, doi: 10.1016/j.imlet.2012.01.008)。
これらのことから、FcγRIIbに対する結合活性を向上させたFcを持つ抗体が自己免疫疾患等の炎症性疾患の治療薬として有望であることが示唆される。
また、FcgRIIbに対する結合を増強した変異体は、自己免疫疾患等の炎症性疾患の治療薬に加えてがん治療薬としても有望であることが示唆されている。これまでに、FcgRIIbは 抗TNFレセプターファミリーに対するアゴニスト抗体のアゴニスト活性においても重要な役割を果たすことが明らかにされて いる。具体的にはTNFレセプターファミリーに含まれるCD40、DR4、DR5、CD30、CD137に対する抗体のアゴニスト活性にはFcgRIIbとの相互作用が必要であることが示唆されている （Science, 333, 1030-1034, 2011、Cancer Cell 19, 101-1113, 2011、J Clin Invest 2012; doi:10.1172/JCI61226、J Immunol 171, 562-, 2003、Blood, 108, 705-, 2006、J Immunol 166, 4891, 2001）。非特許文献（Science, 333, 1030-1034, 2011）においては、FcgRIIbに対する結合を増強した抗体を用いることで、抗CD40抗体の抗腫瘍効果が増強することが示されている。このことから、FcgRIIbに対する結合を増強した抗体は抗TNFレセプターファミリーに対する抗体を始めとするアゴニスト抗体のアゴニスト作用を増強する効果があると期待される。
これまでにFcγRIIbに対する結合活性を向上させたFcを持つ抗体についての報告はなされている（Mol Immunol, 45, 3926-3933, 2008）。この文献中では、抗体のFc領域にS267E/L328F、G236D/S267E、S239D/S267E等の改変を加えることで、FcγRIIbに対する結合活性を向上させていた。この文献の中で、S267E/L328Fの変異を導入した抗体が最も強くFcγRIIbに対して結合していた。このFcγRIIbに対する結合を一層増強することで、上述のFcγRIIbを介した作用を更に増強することが期待できる。
また、S267E/L328Fの変異を導入した抗体はFcγRIaおよびFcγRIIaのH型に対する結合は天然型IgG1と同程度に維持していた。しかし、別の報告によると、この改変はFcγRIIaのR型に対する結合がFcγRIIbに対する結合と同程度に数百倍増強しており、FcγRIIa R型と比較した場合、FcγRIIbに対する結合の選択性が向上していない（Eur J Immunol 23, 1098-1104, 1993）。
FcγRIIbに対する結合がIgG1と比べて増強していたとしても、FcγRIIbを発現せずFcγRIIaを発現している血小板のような細胞（Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010）に関しては、FcγRIIbに対する結合の増強ではなく、FcγRIIaに対する結合の増強の効果のみが影響すると考えられる。例えば、VEGFに対する抗体であるbevacizumabを投与された患者群では血栓塞栓症のリスクが上昇することが知られている（J Natl Cancer Inst, 99, 1232-1239, 2007）。また、CD40 ligandに対する抗体の臨床開発試験においても同様に血栓塞栓症が観察され、臨床試験が中止された（Arthritis Rheum, 48, 719-727, 2003）。これらのいずれの抗体の場合も、動物モデルなどを使ったその後の研究により、投与した抗体が血小板上のFcgRIIaに対する結合を介して血小板を凝集し、血栓を形成することが示唆されている（J Thromb Haemost, 7, 171-181, 2008, J Immunol, 185, 1577-1583, 2010）。自己免疫疾患の一つである全身性エリテマトーデスにおいてはFcγRIIa依存的な機構によって血小板が活性化し、血小板の活性化が重症度と相関するという報告がある（Sci Transl Med, vol 2, issue 47, 47-63, 2010）。このような血栓塞栓症を発症するリスクが元々高い患者に対して、FcgRIIaに対する結合を増強させた抗体を投与することは、仮にFcgRIIbに対する結合が増強されていたとしても、血栓塞栓症の発症リスクを一層高めることになり、極めて危険である。
また、FcgRIIaに対する結合を増強させた抗体はマクロファージを介した抗体依存的貪食活性 (ADCP)が増強することが報告されている（Mol Cancer Ther 7, 2517-2527, 2008）。抗体の抗原がマクロファージによって貪食されると同時に抗体自身も貪食されることになるが、その場合その抗体由来のペプチド断片も抗原提示され、抗原性が高くなると考えられ、抗体に対する抗体（抗抗体）の産生リスクを上昇させると考えられる。すなわち、FcgRIIaに対する結合を増強すると、抗体に対する抗体の産生リスクを高め、医薬品としての価値を著しく減じてしまう。
すなわち、FcgRIIaに対する結合を増強すると、血小板凝集を介した血栓形成のリスクを上昇させてしまい、また抗原性が高くなり、抗抗体産生のリスクを高めてしまうという点で、医薬品としての価値を著しく減じてしまう。
このような観点から先のFcgRIIbに対する結合を増強したFcについてみると、FcgRIIa R型に対する結合は天然型IgG1と比較して著しく増強されているため、FcgRIIa R型を保有する患者への医薬品としては価値を著しく減じている。FcγRIIaのH型とR型とはCaucasianやAfrican-Americanでほぼ同程度の頻度で観察される（J Clin Invest, 97, 1348-1354, 1996、Arthritis Rheum, 41, 1181-1189, 1998）。このことから、このFcを自己免疫疾患の治療に用いる場合に、医薬品としての効果を享受しつつ、安全に利用できる患者の数は限定的である。
また、FcgRIIbを欠損した樹状細胞、あるいは抗FcgRIIb抗体によりFcgRIIbと抗体のFc部分との相互作用が阻害された樹状細胞においては、樹状細胞の成熟が自発的に起こることが報告されている（J Clin Invest 115, 2914-2923, 2005，Proc Natl Acad Sci USA, 102, 2910-2915, 2005）。この報告から、FcgRIIbは炎症などが生じていない定常状態において、積極的に樹状細胞の成熟を抑制していることが示唆される。樹状細胞表面にはFcgRIＩbに加えて、FcgRIIaも発現していることから、例え抑制型のFcgRIIbに対する結合を増強したとしても、活性型のFcgRIIa等に対する結合も増強されていれば、結果として樹状細胞の成熟を促してしまうと考えられる。すなわち、FcgRIIbに対する結合活性だけではなく、FcgRIIaに対する結合活性に対してFcgRIIbに対する結合活性の比率を改善することが、抗体に免疫抑制的な作用をもたらす上では重要であると考えられる。
このことから、FcgRIIbの結合を介した免疫抑制的な作用を利用した医薬品の創出を考えた場合、FcgRIIbに対する結合活性を増強するのみならず、FcgRIIa H型、R型いずれの遺伝子多型に対しても結合を天然型IgG1と同程度に維持するか、それ以下に減弱したFcが求められている。
これに対して、これまでにFc領域にアミノ酸改変を導入することで、FcγRIIbに対する結合の選択性を上昇させた例が報告されている（Mol Immunol, 40, 585-593, 2003）。しかし、この文献中で報告されているFcγRIIbに対する選択性が改善したとされるいずれの変異体においても、天然型IgG1と比べてFcγRIIbに対する結合が減少していた。そのため、これらの変異体が実際にFcγRIIbを介した免疫抑制的な反応をIgG1以上に引き起こすことは困難であると考えられる。
また先に述べたアゴニスト抗体においてもFcgRIIbは重要な役割を果たしているため、その結合活性の増強をすることで、アゴニスト活性の増強も期待される。しかしながら、FcgRIIaに対する結合も同様にして増強してしまうと、目的としないADCC活性やADCP活性などを発揮してしまい、副作用が出てしまう恐れがある。そのような観点からも、FcgRIIbに対して選択的に結合活性を増強できることが好ましい。
これらの結果から、FcγRIIbを利用した自己免疫疾患治療やがんの治療を目的とした抗体医薬を創製するにあたっては、天然型IgGと比較して、FcγRIIaのいずれの遺伝子多型に対しても結合活性が維持あるいは減少し、かつFcγRIIbに対する結合活性が増強していることが重要である。しかし、FcγRIIbは活性型FcγRの1つであるFcγRIIaと、細胞外領域の配列が93%一致し、極めて構造が類似し、さらにFcγRIIaには遺伝子多型として131番目のアミノ酸がHisであるH type（H型）とArgであるR type（R型）とが存在し、それぞれで抗体との相互作用が異なる（J Exp Med, 172, 19-25, 1990）。そのため、FcγRIIbに対して選択的に結合するFc領域を創製するには、これらの類似する配列を区別し、FcγRIIaの各遺伝子多型に対する結合活性を増加させない、あるいは減少させる一方で、FcγRIIbに対する結合活性を増加させるという、FcγRIIbに対する結合活性を選択的に向上させた性質を抗体のFc領域に付与することが、最も困難な課題であると考えられ、これまでにFcgRIIbに対する十分な選択性を有する変異体は得られてこなかった。US2009/0136485には、FcγRIIbに対する結合活性が増強した変異体も報告されているが、その程度は弱く、上記のような性質を持つ変異体の開発が求められていた。
本検討では、ヘテロ二量化抗体を用いてFcgRIIb選択的に結合活性を増強した改変体の作製を検討した。抗体H鎖可変領域としては、WO2009/125825に開示されているヒトインターロイキン６レセプターに対する抗体の可変領域であるIL6Rの可変領域IL6R（配列番号：１２８）を用いた。また、ヒトIgG1のC末端のGlyおよびLysを除去したG1dを有するIL6R-G1d(配列番号：１２９)を作製した。次に、IL6R-G1dに対してK439Eを導入したIL6R-B3(配列番号：１３０)を作製した。さらにIL6R-B3に対してE233D、G237D、P238D、H268D、P271G、A330Rを導入したIL6R-BP208（配列番号：１３１）を作製した。またIL6R-B3に対してS267E、L328Fを導入し、既存のFcgRIIb結合活性増強Fcを有するIL6R-BP253(配列番号：１３２)を作製した。抗体L鎖としてはtocilizumabのL鎖であるIL6R-L(配列番号：１３３)を共通に用い、それぞれのH鎖と共に参考実施例１の方法に従ってホモ二量体IL6R-B3/IL6R-L、IL6R-BP208/IL6R-L、IL6R-BP253/IL6R-Lを作製した。参考実施例8に記載の方法に従い、これらの改変体のFcgR Ia, FcgR IIaR, FcgR IIaH, FcgR IIb, FcgR IIIaVに対する結合活性を評価した結果を表６２に示す。なお、表６２中灰色で塗りつぶしたセルはFcgRのIgGに対する結合が微弱であり、速度論的な解析では正しく解析できないと判断された。このように、各改変抗体とFcgRとの相互作用が微弱で、上記の速度論的な解析では正しく解析できないと判断された場合、その相互作用についてはBiacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AEに記載の以下の1:1結合モデル式を利用してKDを算出した。
1:1 binding modelで相互作用する分子のBiacore上での挙動は以下の式１によって表わすことができる。
〔式１〕
Figure 2017043608
Req:a plot of steady state binding levels against analyte concentration
C: concentration
RI:bulk refractive index contribution in the sample
Rmax:analyte binding capacity of the surface
この式を変形すると、KDは以下の式２のように表わすことができる。
〔式２〕
Figure 2017043608
この式にRmax、RI、Cの値を代入することで、KDを算出することが可能である。RI、Cについては測定結果のセンサーグラム、測定条件から値を求めることができる。Rmaxの算出については、以下の方法にしたがった。その測定回に同時に評価した比較対象となる相互作用が十分強い抗体について、上記の1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせた際に得られたRmaxの値を、比較対象となる抗体のセンサーチップへのキャプチャー量で除し、評価したい改変抗体のキャプチャー量で乗じて得られた値をRmaxとした。
Figure 2017043608
また、IL6R-B3/IL6R-LのFcgRIa FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIbに対する各KDを各改変体の対応するKDで割った値、IL6R-B3/IL6R-LのFcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIbに対する各KDを1としたときの相対的なKDであるrelative KDを表６３に示す。
Figure 2017043608
表６３に示すように、既存のFcgRIIb結合活性増強抗体であるIL6R-BP253/IL6R-Lは、改変導入前のヒトIgG1型の抗体(IL6R-B3/IL6R-L)と比較してFcgRIIbに対する結合活性を約350倍増強すると共に、FcgRIIaRに対する結合活性も約500倍増強されている。一方、IL6R-BP208/IL6R-LはFcgRIIbに対する結合活性は約100倍と既存のFcgRIIb結合活性増強抗体に及ばないが、FcgRIIaRに対する結合活性はIgG1型と比較して1.3倍と、同程度の結合活性を保っており、FcgRIIbへの選択性に優れた抗体である。
次に、FcgR2bに対する活性増強と選択性の向上を図るために、IL6R-BP208/IL6R-L のFcであるFc (BP208) とFcgRIIb細胞外領域との複合体の結晶構造情報を取得し、より詳細に導入するアミノ酸変異を検討が必要と考え、以下の実験方法にしたがってFc (BP208)とFcgRIIb細胞外領域との複合体のX線結晶構造解析をおこなった。
［Fc (BP208) の発現精製］
Fc (BP208)の調製は以下のように行った。まず、IL6R-BP208のEUナンバリング220番目のCysをSerに置換し、EUナンバリング236番目のGluからそのC末端をPCRによってクローニングした遺伝子配列Fc(BP208)を参考例1に記載の方法にしたがって発現ベクターの作製、発現、精製を行った。なお、EUナンバリング220番目のCysは通常のIgG1においては、L鎖のCysとdisulfide bondを形成しているが、Fcのみを調製する場合、L鎖を共発現させないため、不要なdisulfide bond形成を回避するためにSerに置換した。
［FcgRIIb細胞外領域の発現精製］
参考例8の方法にしたがって調製した。
［Fc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体の精製］
結晶化用に得られたFcgRIIb細胞外領域サンプル 1.5mgに対し、glutathione S-transferaseとの融合蛋白として大腸菌により発現精製したEndo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622) 0.15mgを加え、0.1M Bis-Tris pH6.5のBuffer条件で、室温にて３日間静置することにより、N型糖鎖をAsnに直接結合したN-acetylglucosamineを残して切断した。次にこの糖鎖切断処理を施したFcgRIIb細胞外領域サンプルを5000MWCOの限外ろ過膜により濃縮し、20mM HEPES pH7.5, 0.1M NaClで平衡化したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Superdex200 10/300）により精製した。さらに得られた糖鎖切断FcgRIIb細胞外領域画分にFc (BP208) をモル比でFcgRIIb細胞外領域のほうが若干過剰となるよう加え、10000MWCOの限外ろ過膜の限外ろ過膜により濃縮後、25mM HEPES pH7.5, 0.1M NaClで平衡化したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Superdex200 10/300）により精製し、Fc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体のサンプルを得た。
［Fc (BP208) / FcgRIIb複合体細胞外領域複合体の結晶化］
Fc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体のサンプルを10000MWCOの限外ろ過膜 により約10mg/mlまで濃縮し、ハンギングドロップ蒸気拡散法にてSeeding法を併用しつつ結晶化をおこなった。結晶化にはVDXmプレート(Hampton Research)を用い、0.1M Bis-Tris pH6.5、19% PEG3350, 0.2M Potassium Phosphate dibasicのリザーバー溶液に対し、リザーバー溶液：結晶化サンプル＝0.85μl：0.85μlで混合して結晶化ドロップを作成、そこに同様な条件で得られた同複合体の結晶をSeed Bead(Hampton Research)を用いて砕いた種結晶溶液から作成した希釈溶液0.15ulを添加し、リザーバーの入ったウェルに密閉、20℃に静置したところ、板状の結晶を得ることに成功した。
［Fc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体結晶からのＸ線回折データの測定］
得られたFc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体の単結晶一つを0.1M Bis-Tris pH6.5, 24% PEG3350, 0.2M Potassium Phosphate dibasic, Ethlene glycol 20%(v/v) の溶液に浸した後、微小なナイロンループ付きのピンで溶液ごとすくいとり、液体窒素中で凍結させ、Spring-8のBL32XUにてX線回折データの測定をおこなった。なお、測定中は常に-178℃の窒素気流中に置くことで凍結状態を維持し、ビームライン備え付けのCCDディテクタMX-225HE(RAYONIX) により、結晶を0.6°ずつ回転させながらトータル300枚のX線回折画像を収集した。得られた回折画像からの格子定数の決定、回折斑点の指数付け、ならびに回折データの処理には、プログラムXia2（J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190）、XDS Package（Acta Cryst. 2010, D66, 125-132）ならびにScala（Acta Cryst. 2006, D62, 72-82）を用い、最終的に分解能2.81Åまでの回折強度データを得た。本結晶は、空間群C2221に属し、格子定数ａ＝156.69Å、ｂ＝260.17Å、ｃ＝56.85Å、α＝90°、β＝90°、γ＝90°であった。
［Fc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体のX線結晶構造解析］
構造決定は、プログラムPhaser（J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674）を用いた分子置換法によりおこなった。得られた結晶格子の大きさとFc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体の分子量から非対称単位中の複合体の数は一個と予想された。Fc(WT) / FcgRIIIa細胞外領域複合体の結晶構造であるPDB code:3SGJの構造座標から、A鎖239-340番ならびにB鎖239-340番のアミノ酸残基部分を別座標として取り出し、それぞれをFcのCH2ドメインの探索用モデルとした。同じくPDB code:3SGJの構造座標から、A鎖341-444番とB鎖341-443番のアミノ酸残基部分を一つの座標として取り出し、Fc CH3ドメインの探索用モデルとした。最後にFcgRIIb細胞外領域の結晶構造であるPDB code:2FCB の構造座標からA鎖6-178番のアミノ酸残基部分を取り出しFc (BP208) の探索用モデルとした。Fc CH3ドメイン、FcgRIIb細胞外領域、Fc CH2ドメインの各探索用モデルの結晶格子内での向きと位置を、回転関数および並進関数から決定しようとしたところ、CH2ドメインのひとつについてはその位置決定がうまくいかなかった。そこで残りの３つの部分から計算された位相をもとに計算した電子密度マップに対し、Fc(WT) / FcgRIIIa細胞外領域複合体の結晶構造構造を参考にしながら最後のCH2ドメインAの位置を決定、Fc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体結晶構造の初期モデルを得た。得られた初期モデルに対し2つのFcのCH2ドメイン、2つのFcのCH3ドメインならびにFcgRIIb細胞外領域を動かす剛体精密化をおこなったところ、この時点で25-3.0Åの回折強度データに対し、結晶学的信頼度因子Ｒ値は42.6%、Free R値は43.7%となった。さらにプログラムREFMAC5（Acta Cryst. 2011, D67, 355-367）を用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcならびにモデルから計算された位相をもとに算出した２Ｆｏ−Ｆｃ、Ｆｏ−Ｆｃを係数とする電子密度マップを見ながらのモデル修正をプログラムCoot（Acta Cryst. 2010, D66, 486-501）でおこない、これらを繰り返すことでモデルの精密化をおこなった。最後に2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをもとに水分子をモデルに組み込み、精密化をおこなうことで、最終的に分解能25-2.81Åの27259個の回折強度データを用い、4794個の非水素原子を含むモデルに対し、結晶学的信頼度因子Ｒ値は24.4%、Free R値は27.9%となった。
構造解析の結果、Fc (BP208) / FcgRIIb細胞外領域複合体の立体構造を分解能2.81Åで決定、その解析の結果取得された構造を図４９に示す。2つのFc CH2ドメインの間にFcgRIIb細胞外領域が挟まれるように結合しており、これまで解析された天然型IgGのFcであるFc (WT)とFcgRIIIa（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2011, 108, 12669-126674）、FcgRIIIb（Nature, 2000, 400, 267-273; J.Biol.Chem. 2011, 276, 16469-16477）、FcgRIIaの各細胞外領域との複合体の立体構造と類似していた。
しかし細部を見ると、Fc(BP208)はG237DならびにP238Dの変異の導入の影響により、FcgRIIaと結合したFc(WT)と比較してCH2ドメインAにおいてヒンジ領域から続く233-239のループ構造が変化していた（図５０）。この結果、Fc(BP208) のG237主鎖のアミドとFcgRIIｂのTyr160側鎖との間に強固な水素結合の形成が認められた。このTyr160はFcgRIIaにおいてはPheであり、水素結合の形成は不可能なことから、この水素結合はFcgRIIbに対する結合活性の向上ならびにFcgRIIaに対する結合の低減という選択性の獲得に重要な寄与をしていると考えられた。
本構造解析結果をもとにさらなる活性向上を目指した改変の可能性を精査したところ、改変導入部位の候補のひとつとしてS239を見出した。図５１に示す通り、FcgRIIbのLys117が構造的に見てもっとも自然な形で伸びる方向にこのCH2ドメインBのSer239は位置している。ただ、今回の解析ではFcgRIIbのLys117の電子密度は観察されていないことから、一定の構造はとっておらず、現状ではFc (BP208)との相互作用へのこのLys117の関与は限定的であると考えられるが、このCH2ドメインBのS239を負電荷を有するDまたはEへと改変した場合、正電荷をもつFcgRIIbのLys117との間に静電相互作用が期待でき、その結果としてFcgRIIへの結合活性の向上が期待された。
一方、CH2ドメインAにおけるS239の構造を見てみると、本アミノ酸側鎖は、G236の主鎖と水素結合を形成、ヒンジ領域から続き、FcgRIIｂ Tyr160側鎖と水素結合を形成するD237を含む233番目から239番にかけてのループ構造を安定化させていると考えられた（図５２）。ループ構造を結合時のコンフォメーションに安定化させることは、結合にともなうエントロピーの低下を抑制し、結果として結合自由エネルギーの増加つまり結合活性の向上につながる。一方、このCH2ドメインAのS239をDまたはEへと改変した場合、G236主鎖との水素結合が失われ、ループ構造の不安定化につながる。さらにすぐ近くに存在するD265と静電反発をも招く可能性があり、さらなるループ構造の不安定化が起きると考えられた。この不安定化された分のエネルギーは、FcgRIIbとの相互作用エネルギーの減少に働くため、結果として結合活性の低下を招くことになる。つまり、S239DまたはS239Eを両H鎖に導入したホモ二量化抗体ではCH2 ドメインBにおけるFcgRIIbのLys117との静電相互作用による結合活性を増強する効果が、CH2 ドメインAにおけるループ構造の不安定化による結合活性を減弱する効果により相殺され、結合活性の増強にはつながらない可能性があるが、S239DまたはS239Eを一方のH鎖にのみ導入したヘテロ二量化抗体であれば、CH2ドメインAのS239によるループ構造の安定化が維持されたままなので、CH2ドメインBに導入されたS239DまたはS239Eにより新たに形成されたFcgRIIbのLys117との静電相互作用の分だけ、結合活性が増強する可能性が考えられた。
この仮説を検証するために、次にIL6R-BP208/IL6R-Lを鋳型とし、一方のH鎖のFc領域にだけS239D又はS239Eの改変を導入することで、FcgRIIbに対する結合活性をさらに増強した抗体の作製を検討した。抗体H鎖として、IL6R-BP208に対してS239Dを導入したIL6R-BP256(配列番号：１３４)および、S239Eを導入したIL6R-BP257(配列番号：１３５)を作製した。またもう一方のH鎖として、IL6R-G1dにD356K及びH435Rの変異を導入したIL6R-A5(配列番号：１３６)を作製し、これに対してさらにE233D、G237D、P238D、H268D、P271G、A330Rを導入したIL6R-AP002(配列番号：１３７)を作製した。抗体L鎖としてはtocilizumabのL鎖であるIL6R-L(配列番号：１３３)を共通に用い、それぞれのH鎖と共に参考実施例１の方法に従ってホモ二量化抗体IL6R-B3/IL6R-L、IL6R-BP208/IL6R-L、IL6R-BP253/IL6R-L、IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-BP257/IL6R-Lおよびヘテロ二量化抗体IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-Lを作製した。参考実施例8に記載の方法に従い、これらの改変体のFcgR Ia, FcgR IIaR, FcgR IIaH, FcgR IIbに対する結合活性を評価した結果を表６４に示す。
Figure 2017043608
なお、表６４中灰色で塗りつぶしたセルはFcgRのIgGに対する結合が微弱であり、速度論的な解析では正しく解析できないと判断された。このように、各改変抗体とFcgRとの相互作用が微弱で、上記の速度論的な解析では正しく解析できないと判断された場合、その相互作用についてはBiacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AEに記載の以下の1:1結合モデル式を利用してKDを算出した。
1:1 binding modelで相互作用する分子のBiacore上での挙動は以下の式１によって表わすことができる。
〔式１〕
Figure 2017043608
Req:a plot of steady state binding levels against analyte concentration
C: concentration
RI:bulk refractive index contribution in the sample
Rmax:analyte binding capacity of the surface
この式を変形すると、KDは以下の式２のように表わすことができる。
〔式２〕
Figure 2017043608
この式にRmax、RI、Cの値を代入することで、KDを算出することが可能である。RI、Cについては測定結果のセンサーグラム、測定条件から値を求めることができる。Rmaxの算出については、以下の方法にしたがった。その測定回に同時に評価した比較対象となる相互作用が十分強い抗体について、上記の1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせた際に得られたRmaxの値を、比較対象となる抗体のセンサーチップへのキャプチャー量で除し、評価したい改変抗体のキャプチャー量で乗じて得られた値をRmaxとした。
また、IL6R-B3/IL6R-LのFcgRIa FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIbに対する各KDを各改変体のKDで割った値、IL6R-B3/IL6R-LのFcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIbに対する各KDを1としたときの相対的なKDであるrelative KDおよび、各改変体のFcgRIIaRに対するKDをFcgRIIbに対するKDで割った値を表６５に示す。
Figure 2017043608
表６５に示すように、IL6R-BP208/IL6R-Lの両H鎖に対してS239DもしくはS239Eを導入したIL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-BP257/IL6R-Lでは、導入前の改変体IL6R-BP208/IL6R-Lと比較してFcgRIIbに対する結合活性、FcgRIIaRに対する結合活性がともに減弱していた。一方、IL6R-BP208/IL6R-Lの片方のH鎖に対してS239D、もしくはS239Eを導入したIL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-Lでは、FcgRIIbへの結合がそれぞれ752倍、657倍に向上し、既存技術よりも高いFcgRIIbに対する結合活性を示した。またFcgRIIaRに対する結合活性も、IL6R-BP208/IL6R-Lの1.3倍からそれぞれ7.7倍、8.3倍に増加した。ここで、表中のKD(IIaR)/KD(IIb)は、各改変体のFcgRIIaRに対するKDをFcgRIIbに対するKDで割った値であり、この値が大きいほどFcgRIIbに対する選択性が高いことを示す。既存のFcgRIIb結合活性増強抗体であるIL6R-BP253/IL6R-Lはこの値が0.3と、IgG1型と比較して選択性が改善していないのに対して、IL6R-BP208/IL6R-Lは26.3と高いFcgRIIb選択性を有する。今回、IL6R-BP208/IL6R-Lの片方のH鎖に対してS239D、もしくはS239Eを導入したIL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-LではKD(IIaR)/KD(IIb)の値がそれぞれ34.3および27.7と、IL6R-BP208/IL6R-Lよりも改善していた。
ここで、実施例４で行ったIgG1型(GpH7-B3/GpL16-k0)を鋳型にした網羅的改変体の評価結果において、S239D, S239Eの効果は表６６に示したようであった。表中のHo/Con_2aRおよびHo/Con_2bは、ホモ二量化抗体のコントロールを100とした時のFcgRIIaRおよびFcgRIIbに対する結合活性の強さの程度を示す。また、He/Con_2aRおよびHe/Con_2bは、ヘテロ二量化抗体のコントロールを100とした時のFcgRIIaRおよびFcgRIIbに対する結合の強さの程度を示す。
Figure 2017043608
表６６からは、今回導入したS239DおよびS239Eは、天然型IgG1に対して導入した際には、両鎖に導入するか、片方の鎖に導入するかに関わらずFcgRIIaRおよびFcgRIIbに対する結合を増強する改変であった。しかしながら、これらの改変をIL6R-BP208/IL6R-Lの両H鎖に導入すると、FcgRIIaR, FcgRIIbに対する結合活性が減弱し、片方のH鎖に導入した場合にのみFcgRIIaR, FcgRIIbに対する結合活性が増強した。この結果はIgG1型を鋳型にした際に得られた改変の効果とは異なるものであり、これらの改変はIL6R-BP208/IL6R-Lに導入して初めて上記の効果を有することが明らかとなった。
〔実施例２７〕ホモ二量体とヘテロ二量体の分離精製能向上を目指した定常領域アミノ酸配列のデザイン
[残基置換部位の選択]
ヘテロ二量化抗体の製造において二種類のH鎖（それぞれをA鎖およびB鎖とする）を共発現させた場合、各H鎖であるA鎖が二量体化したホモ二量化抗体およびB鎖が二量化したホモ二量化抗体と、異なる二つのH鎖であるA鎖、B鎖が二量化したヘテロ二量化抗体が生成する。目的とするヘテロ二量化抗体を効率的に分離精製する手法として、各々の可変領域についてアミノ酸残基を置換し、抗体の等電点およびイオン交換カラムでの保持能と分離能を制御する方法が知られている（WO2007/114325）。しかしながら、可変領域、特にCDR領域は抗体毎に配列が異なることから、該当技術の汎用性には限界があると考えられる。そこで、ヘテロ二量化抗体精製のためのより汎用的な抗体残基置換手法として、抗体の定常領域のみの残基置換により、等電点およびイオン交換カラムでの保持能と分離能を制御する方法が検討された。
一般的に、イオン交換カラムでの分離は、分子表面の電荷に依存すると考えられており、多くの場合、目的分子の等電点を考慮した分離条件が検討される。よって、本実施例においても、分離したいホモ二量化抗体とヘテロ二量化抗体の等電点に差が生じるように抗体定常領域を構成するアミノ酸残基を置換することで、イオン交換カラムでの分離が改善すると期待された。
なお、イオン交換クロマトグラフィーでの分離は純粋なイオン交換モードのみならず、疎水性相互作用も関与することが示唆されている（Peng Liu et al., J Chromatogr A. 2009 Oct 30;1216(44):7497-504）。このため、上記手法による分離精製には、イオン交換クロマトグラフィーに加え、疎水クロマトグラフィーも利用可能である。
等電点を変化させる残基置換としては、中性残基を塩基性残基あるいは酸性残基に置換する、および、塩基性残基あるいは酸性残基を中性残基に置換する、という方法がある。より効果的な対応として、正電荷を持つ残基を負電荷を持つ残基に置換する、および、負電荷を持つ残基を正電荷を持つ残基に置換する、という方法がある。
上記方法によれば、抗体配列の全ての部分が等電点を変化させうる残基置換部位の候補となる。しかしながら、非天然配列へのランダムな置換は免疫原性のリスクを高める危険性があり、医薬品としての使用を考えた場合に適切な方法ではない。
免疫原性リスクをできるだけ増大させないようにするため、免疫原性に関与するT-cell epitopeの数ができるだけ少なくなるように残基置換を行う方法が考えられる。一つの手段として、IgGサブクラス配列の利用が挙げられる。ヒトIgGのサブクラスにはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4が存在する。WO2007/114325で開示されている方法に基づき、抗体配列の一部を異なるサブクラスの配列に置換することで、T-cell epitopeの増加を抑制しながら等電点を変化させることが可能である。
別な手段として、Epibase等のT-cell epitopeを予測するin silicoツールが利用できる。
Epibase Light (Lonza)はFASTER algorism (Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.)を用いて、9-merペプチドとmajor DRB1アレルとの結合能を計算するin silicoツールである。本ツールはMHC classIIに対する強い結合および中程度の結合となるT-cell epitopeを同定することができる。
計算にはDRB1アロタイプの存在比が反映され、これには以下に示すCaucasianにおける存在比が使用できる。
DRB1*1501（24.5%）、DRB1*0301（23.7%）、DRB1*0701（23.3%）、DRB1*0101（15.0%）、DRB1*1101（11.6%）、DRB1*1302（8.2%）、DRB1*1401/1454（4.9%）、DRB1*0901（2.3%）、DRB1*1502（0.5%）、DRB1*1202（0.1%）
各改変抗体配列中に含まれる強い結合と中程度の結合の全てのエピトープをFASTER algorismにより求めた後、ヒトジャームライン配列及び可変領域と定常領域の境界配列を除外したものがcritical epitopeとして提示される。本ツールのrandomized機能を用いることで、任意の配列に含まれる残基一つずつについて、それぞれ任意のアミノ酸残基に置換した場合のT-cell epitope増加数が算出される。これにより、等電点変化をもたらすがT-cell epitopeは増加しない残基置換部位を選択することが可能である。
H240-AK072（配列番号：１０４）、およびH240-BH076（配列番号：１０５）について、Epibaseによる解析が実施された。表67はH240-AK072について、表68はH240-BH076について、任意の残基の置換により変化しうるT-cell epitopeの数が示されている。この結果を基に、T-cell epitopeを増加させず、かつ、等電点を変化させる残基置換を選択することが可能である。
Figure 2017043608
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Figure 2017043608
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Figure 2017043608
以上の方法およびその組み合わせにより、等電点改変のための残基置換部位として、以下に示されるH240-AK072、およびH240-BH076改変体がデザインされた（表６９、７０）。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
[H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改変抗体発現用ベクターの構築]
初めに、H240-AK072/H240-BH076/L73-k0の改変抗体のcDNAを作製するため、H240-AK072またはH240-BH076を鋳型として、選択された各アミノ酸残基が変異するようデザインされた合成オリゴDNAがそれぞれ設計された。次に、各合成オリゴDNAを使って、参考実施例1の方法にしたがい、目的の遺伝子を含む動物細胞発現ベクターを作製した。
[H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改変抗体の発現、精製]
H240-AK072/H240-BH076/L73-k0の改変抗体を評価するため、H240-AK072またはH240-BH076に改変を導入した各H鎖（H240-AK072に改変を導入したH鎖をA鎖、H240-BH076に改変を導入したH鎖をB鎖と呼ぶ）およびL鎖（L73-k0、配列番号：１０６）を任意の組み合わせで共発現させることによって、参考実施例1の方法にしたがい、A鎖およびB鎖が任意の組み合わせとなるような改変抗体が得られた。代表的なA鎖およびB鎖の配列番号を表７１に示した。
Figure 2017043608
〔実施例２８〕H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改変体の物理化学的評価
[陽イオン交換クロマトグラフィーによる保持時間差の測定]
各抗体について、下記の条件で測定が実施された。
Mobile phase A: 20 mM MES-NaOH, pH6.0
Mobile phase B: 20 mM MES-NaOH, 200 mM NaCl, pH6.0
Column: Bio Pro SP-F (YMC)
Flow rate: 0.5 mL/min
Gradient: 10%B(0-5 min), 10-60%B(5-55 min)
Detection: Abs. 280 nm
図５３は代表的なクロマトグラムを示す。溶出時間が早い位置に出現するピークはB鎖-B鎖のホモ二量化抗体、主要なピークはA鎖-B鎖のヘテロ二量化抗体由来である。A鎖にはProteinAとの結合を減弱させる残基置換（H435R）が導入されており、ここで用いた抗体は参考実施例1の方法で調製される過程でrProtein A SepharoseTM Fast Flow (GEヘルスケア)による精製過程で除去されてしまうため、A鎖-A鎖ホモ二量化抗体は本条件ではほとんど検出されない。ヘテロ二量化抗体とホモ二量化抗体の分離を評価する指標として、保持時間差ΔRT（分）＝（ヘテロ抗体ピークの保持時間）−（B鎖ホモ抗体ピークの保持時間）、が算出された。表７２は各種改変体の評価結果を示す。以上より、デザインした残基置換の導入、およびその組み合わせによってヘテロ抗体とホモ抗体の保持時間差が拡大することが示された。
[ゲルろ過クロマトグラフ法による会合体含有量の評価]
ACQUITY UPLC H-Class system（Waters）を用いたSEC分析により、精製抗体中の会合体含有量が評価された。移動相には300 mMの塩化ナトリウムを含む50 mMリン酸緩衝液, pH7.0（伊勢久）を、分析カラムにはBEH200 SEC（waters）を用い、215 nmの波長で測定が行われた。Empower2（Waters）を用いてデータ解析を実施し、単量体よりも高分子量側に溶出した成分を一括して会合体としてその含有量が算出された。表７２は各種改変体の評価結果を示す。これより、各種改変体は改変前のH240-AK072/H240-BH076/L73-k0に比べ、大幅に会合体量が増加しているものはなく、会合化に関する安定性が確保されていると考えられた。
[示査走査型蛍光定量法による改変抗体の熱変性中点（Tm）評価]
Rotor-Gene Q（QIAGEN）を用いた示査走査型蛍光定量法を用いて抗体の熱変性中点（Tm）を測定することにより熱安定性が評価された。なお、本手法は、抗体の熱安定性評価法として広く知られている示査走査型熱量計を用いたTm評価と良好な相関を示すことが既に報告されている（Journal of Pharmaceutical Science 2010 ; 4 : 1707-1720）。
5000倍濃度のSYPRO orange（Molecular Probes）をPBS（Sigma）により希釈後、抗体溶液と混和することにより測定サンプルが調製された。各サンプルを20 μLずつ測定用チューブにセットし、30℃から99℃まで温度を上昇させた。0.4℃昇温して約6秒静止後に蛍光強度が470 nm（励起波長）/ 555 nm（蛍光波長）において検出された。
データはRotor-Gene Q Series Software（QIAGEN）を用いて蛍光遷移が認められた温度を算出し、この値がTm値とされた。Molecular Immunology 37 (2000) 697-706等で報告されているように、CH2ドメインのTm値はFirst transition に該当するTm1とした。一方、検討した抗体ではCH3とFabのTm値が近く、これらを分離した比較をすることが困難であると判断し、本評価に用いるTm値はTm1の値を採用した。表７２は各種改変体の評価結果を示す。これより、各種改変体は改変前のH240-AK072/H240-BH076/L73-k0に比べ、大幅にTm値が低下しているものはなく、構造的な安定性が維持されていると考えられた。
Figure 2017043608
[イオン交換クロマトグラフィー精製における分離の評価]
AKTA avant25 (GE healthcare)を用いたイオン交換クロマトグラフィー精製法において、各検体の分離が評価された。移動相には20 mM MES緩衝液, pH6.0ならびに500 mMの塩化ナトリウムを含む20 mM MES緩衝液, pH6.0を、カラムはHi Trap SP HP 1mL (GE healthcare)を用い、2液混合グラジエント法により精製が実施された。精製データの取得は280 nmの波長で実施し、Unicorn6.1 (GE healthcare)を用いて溶出結果が評価された。図５４はH240-FA021/H240-BF084/L73-k0改変体の評価結果を示す。これより、ラージスケールで使用されるカラム担体を用いた精製により、本検討において新規に見出された残基置換を導入することで、ホモ二量化抗体とヘテロ二量化抗体が分離精製可能であることが示された。
〔実施例２９〕H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改変体の免疫学的評価
[表面プラズモン散乱法によるFcγRに対する結合活性の評価]
参考実施例8の方法にしたがって、目的の抗体とFcgRとの相互作用解析が行われた。
各種改変体の評価結果を表７３に示した。これより、図５４で分離が確認されたH240-FA021/H240-BF084/L73-k0改変体のFcγRへの結合能は改変前のH240-AK072/H240-BH076/L73-k0と同等であることが示された。
Figure 2017043608
[in silico免疫原性予測ツールEpibaseを用いた免疫原性リスク評価]
臨床における抗体医薬品の有用性と薬効は抗医薬品抗体（ADAs）により制限される。ADAsは抗体医薬品の薬効および動態に影響を及ぼし、時に重篤な副作用をもたらすことがある。免疫原性に影響する因子は多数報告されているが、特にT cell epitopeが抗原に含まれることが重要であるとされる。このT cell epitopeを予測するin silicoツールとしてはEpibase（Lonza）、iTope/TCED（Antitope）およびEpiMatrix（EpiVax）等が利用可能である。これらのツールを用いることで目的とするタンパク質に存在するT CELL EPITOPEを含む配列を予測できることが報告されている（Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.）。
Epibase Light (Lonza)はFASTER algorism (Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.)を用いて、9-merペプチドとmajor DRB1アレルとの結合能を計算するin silicoツールである。本ツールはMHC classIIに対する強い結合および中程度の結合となるT cell epitopeを同定することができる。
各改変抗体のin silico免疫原性スコアはEpibase Light (Lonza)システム内の以下の計算式（式４）により求められる。
（式４）
免疫原性スコア = Sum (each DRB1 allotype population frequency X number of critical epitopes)
計算にはDRB1アロタイプの存在比が反映され、これには以下に示すCaucasianにおける存在比が使用できる。
DRB1*1501（24.5%）、DRB1*0301（23.7%）、DRB1*0701（23.3%）、DRB1*0101（15.0%）、DRB1*1101（11.6%）、DRB1*1302（8.2%）、DRB1*1401/1454（4.9%）、DRB1*0901（2.3%）、DRB1*1502（0.5%）、DRB1*1202（0.1%）
各改変抗体配列中に含まれる強い結合と中程度の結合の全てのエピトープをFASTER algorismにより求めた後、ヒトジャームライン配列及び可変領域と定常領域の境界配列を除外したものがcritical epitopeとして免疫原性スコア計算に使用される。スコアが低いほど、免疫原性リスクが小さい配列と考えられる。表７４にH240-AK072およびH240-BH076、さらにそれらの改変体について計算されたリスクスコアを示す。これより、A鎖およびB鎖の任意の組み合わせを選択することで、H240-AK072/H240-BH076/L73-k0に比べてホモ二量体とヘテロ二量体の分離精製能を向上させ、さらに、免疫原性のリスクが大きく変化しない改変体を作製することが可能である。
Figure 2017043608
〔参考実施例１〕抗体の発現ベクターの作製および抗体の発現と精製
アミノ酸置換の導入はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）、PCRまたはIn fusion Advantage PCR cloning kit (TAKARA)等を用いて当業者公知の方法で行い、発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen）、またはFreeStyle293細胞(Invitrogen社)に、一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow（GEヘルスケア）を用いて当業者公知の方法で、抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
〔参考実施例２〕FcγRの調製とFcγRに対する結合活性の評価
FcgRの細胞外ドメインを以下の方法で調製した。まずFcgRの細胞外ドメインの遺伝子の合成を当業者公知の方法で実施した。その際、各FcgRの配列はNCBIに登録されている情報に基づき作製した。具体的には、FcgRIについてはNCBIのaccession # NM_000566.3の配列、FcgRIIaについてはNCBIのaccession # NM_001136219.1の配列、FcgRIIbについてはNCBIのaccession # NM_004001.3の配列、FcgRIIIaについてはNCBIのaccession # NM_001127593.1の配列、FcgRIIIbについてはNCBIのaccession # NM_000570.3の配列に基づいて作製し、C末端にHisタグを付加した。またFcgRIIa、FcgRIIIa、FcgRIIIbについては多型が知られているが、多型部位についてはFcgRIIaについてはJ. Exp. Med., 1990, 172: 19-25、FcgRIIIaについてはJ. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070, FcgRIIIbについてはJ. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691を参考にして作製した。
得られた遺伝子断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターをヒト胎児腎癌細胞由来FreeStyle293細胞（Invitrogen社）に、一過性に導入し、目的タンパク質を発現させた。なお、結晶構造解析用に用いたFcgRIIbについては、終濃度10 ug/mLのKifunesine存在下で目的タンパク質を発現させ、FcgRIIbに付加される糖鎖が高マンノース型になるようにした。培養し、得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターを通して培養上清を得た。得られた培養上清は原則として次の4ステップで精製した。第1ステップは陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（SP Sepharose FF）、第2ステップはHisタグに対するアフィニティカラムクロマトグラフィー（HisTrap HP）、第3ステップはゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Superdex200）、第4ステップは無菌ろ過、を実施した。ただし、FcgRIについては、第1ステップにQ sepharose FFを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを実施した。精製したタンパク質については分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いて精製タンパク質の濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
Biacore T100 (GE Healthcare) を用いて、目的の抗体とFcγRとの相互作用解析を行った。ランニングバッファーにはHBS-EP+ (GE Healthcare)を用い、測定温度は25℃とした。Series S Sencor Chip CM5（GEヘルスケア）に、アミンカップリング法により抗原ペプチドを固定化したチップ、あるいはSeries S Sensor Chip SA（certified）（GEヘルスケア）に対して予めビオチン化しておいた抗原ペプチドを相互作用させ、固定化したチップを用いた。抗原ペプチドを固定化したチップへ目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈した各FcγRを相互作用させた。10 mM glycine-HCl、pH1.5を反応させることで、チップにキャプチャーした抗体を洗浄し、チップを再生して繰り返し用いた。
各抗体のFcγRに対する結合活性は主にFcγRに対する結合活性およびFcγRに対する解離定数を指標として評価した。
FcγRに対する結合活性はFcγRに対する相対的な結合活性を意味する。FcγRに対する相対的な結合活性は各測定時におけるコントロールとなるサンプルの結合活性を100 (%)として、他の抗体の結合活性を算出した。ここでいう結合活性には、キャプチャーさせた抗体にFcγRを相互作用させた前後でのセンサーグラムの変化量をFcγRの結合活性を各抗体のキャプチャー量で割った値を用いた。FcγRの結合活性はキャプチャーした抗体の量に依存するためである。
各抗体のFcγRに対する解離定数は、Biacoreの測定結果に対して速度論的解析を実施することで算出した。具体的には、Biacore Evaluation Softwareにより測定して得られたセンサーグラムを1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ka (L/mol/s)、解離速度定数kd(1/s)を算出し、その値から解離定数KD (mol/L) を算出した。
〔参考実施例３〕ヘテロ二量化抗体遺伝子発現ベクターの作製と各抗体の発現
抗体H鎖可変領域として、次のものが使用された。Q153（抗ヒトF.IX抗体のH鎖可変領域、配列番号：６１）、Q407（抗ヒトF.IX抗体のH鎖可変領域、配列番号：６２）、J142（抗ヒトF.X抗体のH鎖可変領域、配列番号：６３）、J300（抗ヒトF.X抗体のH鎖可変領域、配列番号：６４）、MRA-VH（抗ヒトインターロイキン-6受容体抗体のH鎖可変領域、配列番号：６５）。
抗体L鎖として、次のものが使用された。L180-k（抗ヒトF.IX抗体/抗ヒトF.X抗体共通L鎖、配列番号：６６）、L210-k（抗ヒトF.IX抗体/抗ヒトF.X抗体共通L鎖、配列番号：６７）、MRA-k（抗ヒトインターロイキン-6受容体抗体のL鎖、配列番号：６８）。
抗体H鎖定常領域として、次のものが使用された。IgG4にEUナンバリング228番目のSerをProに置換する変異を導入してC末端のGly及びLysを除去したG4d（配列番号：６９）、G4dにEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異、EUナンバリング436番目のTyrをPheに置換する変異及びEUナンバリング445番目のLeuをProに置換する変異を導入したz72（配列番号：７０）、G4dにEUナンバリング356番目のGluをLysに置換する変異を導入したz7（配列番号：７１）、z72にEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異を導入したz73（配列番号：７２）、z7にEUナンバリング196番目のLysをGlnに置換する変異、EUナンバリング296番目のPheをTyrに置換する変異及びEUナンバリング409番目のArgをLysに置換する変異を導入したz106（配列番号：７３）、z73にEUナンバリング196番目のLysをGlnに置換する変異、EUナンバリング296番目のPheをTyrに置換する変異、EUナンバリング409番目のArgをLysに置換する変異およびEUナンバリング436番目のPheをTyrに置換する変異を導入したz107（配列番号：７４）、IgG1のC末端のGly及びLysを除去したG1d（配列番号：７５）。EUナンバリング356番目のGluをLysに置換する変異及びEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異は、ヘテロ抗体を産生する際に、各H鎖のヘテロ分子を効率的に形成させるためである（(WO 2006/106905) PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY）。
Q153の下流にG4dあるいはz7を連結することで、抗ヒトF.IX抗体H鎖遺伝子Q153-G4dあるいはQ153-z7が作製された。Q407の下流にz106を連結することで、抗ヒトF.IX抗体H鎖遺伝子Q407-z106が作製された。J142の下流にG4d、z72あるいはz73を連結することで、抗ヒトF. X抗体H鎖遺伝子J142-G4d、J142-z72あるいはJ142-z73が作製された。J300の下流にz107を連結することで、抗ヒトF. X抗体H鎖遺伝子J300-z107が作製された。MRA-VHの下流にG1d、z106あるいはz107を連結することで、抗ヒトインターロイキン-6受容体抗体H鎖遺伝子MRA-G1d、MRA-z106あるいはMRA-z107が作製された。
各抗体遺伝子（Q153-G4d、Q153-z7、Q407-z106、J142-G4d、J142-z72、J142-z73、J300-z106、MRA-G1d、MRA-z106、MRA-z107、L180-k、L210-k、MRA-k）は、動物細胞発現ベクターに組み込まれた。
作製した発現ベクターを用いて、以下の抗体をFreeStyle293細胞（invitrogen）へのトランスフェクションにより、一過性に発現させた。以下の通り、トランスフェクションする複数の抗体遺伝子を並べたものを抗体名として表記した。
MRA-G1d/MRA-k
MRA-z106/MRA-z107/MRA-k
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k
Q153-G4d/J142-z72/L180-k
Q153-z7/J142-z73/L180-k
Q407-z106/J300-z107/L210-k
〔参考実施例４〕ヘテロ二量化抗体のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーの溶出条件の検討と分離精製
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k及びQ153-G4d/J142-z72/L180-kを一過性に発現させ得られたFreeStyle293細胞培養液（以下CMと略す）を試料として、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーの溶出条件を検討した。D-PBSで平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flowカラム（GE Healthcare）に、φ0.22μmフィルターで濾過したCMを負荷し、表７５に示す洗浄1、2、溶出1〜5を段階的に実施した。カラムに負荷する抗体量が20 mg/mL resineになるようにCMの負荷量を調節した。各条件の溶出画分を分取し、陽イオン交換クロマトグラフィー分析により、各溶出画分に含まれている成分を同定した。コントロールには各CMをrProtein G Sepharose Fast Flow樹脂 (GE Healthcare)に負荷し、バッチで溶出することにより精製した試料を用いた。プロテインGは抗体のFab部分に結合するため、プロテインGを用いることで、プロテインAへの結合活性とは無関係に、CM中に存在する全ての抗体（目的の2種類のH鎖がヘテロ会合化した二重特異性抗体（ヘテロ抗体）、及び、不純物の1種類のH鎖がホモ会合化した単特異性のホモ抗体）を精製することが可能である。
Figure 2017043608
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k及びQ153-G4d/J142-z72/L180-kを発現させたCMのプロテインAカラムの各溶出画分（溶出１〜５）の陽イオン交換クロマトグラフィー分析を行った。 Q153-G4d/J142-G4d/L180-kは、溶出1画分から溶出5画分になるにつれて、つまり溶出に用いた溶媒のpHが下がるにつれて、各画分に含まれる抗体成分が、ホモ抗体J142-G4d/L180-kからヘテロ抗体Q153-G4d/J142-G4d/L180-k、そしてホモ抗体Q153-G4d/L180-kの順に変化していることが判明した。溶出の順番はプロテインＡへの結合力の強さに準じていると考えられる。つまり、高pHで溶出したホモ体J142-G4d/L180-k（FXに対するホモ抗体）よりも低pHになるまで結合したままだったホモ抗体Q153-G4d/L180-kの方がプロテインＡに対する結合力が強いということになる。可変領域J142はプロテインＡに結合しない配列であることが分かっている。つまり、ホモ体J142-G4d/L180-k（FXに対するホモ抗体）はプロテインＡへの結合部位が2ヶ所、ヘテロ抗体Q153-G4d/J142-G4d/L180-kは3ヶ所、ホモ抗体Q153-G4d/L180-k（FIXに対するホモ抗体）は4ヶ所となっている。よって、プロテインＡへの結合部位数が多いほど、プロテインＡに強く結合し、溶出させるために必要なpHが低くなるということが判明した。
一方Q153-G4d/J142-z72/L180-kでは、溶出1画分から溶出5画分になるにつれて、各画分に含まれる抗体成分が、ヘテロ抗体Q153-G4d/J142-z72/L180-k次いでホモ抗体Q153-G4d/L180-kの順に変化していることが判明した。ホモ抗体J142-z72/L180-k（FXに対するホモ抗体）は各溶出画分においてほとんど検出されなかったため、プロテインＡに対する結合が欠失していることが示された。J142-z72に導入されているEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異により、プロテインＡに結合しなくなると考えられる。ホモ抗体J142-z72/L180-k（FXに対するホモ抗体）はプロテインＡへの結合部位がなく、ヘテロ抗体Q153-G4d/J142-z72/L180-kは2ヶ所、ホモ抗体Q153-G4d/L180-k（FIXに対するホモ抗体）は4ヶ所となる。ホモ抗体J142-z72/L180-k（FXに対するホモ抗体）はプロテインＡに結合せず素通りするため、各溶出画分で検出されなかった。また、Q153-G4d/J142-G4d/L180-k及びQ153-G4d/J142-z72/L180-kともに、pH3.6とそれ以下のpHでヘテロ抗体とホモ抗体Q153-G4d /L180-k（FIXに対するホモ抗体）を分離できる可能性が示された。
上記で検討した精製条件を使って、プロテインAカラムクロマトグラフィーを使ってヘテロ二量化抗体の精製を実施した。
下記に示す抗体のCMを試料として用いた。
・Q153-G4d/J142-G4d/L180-k
・Q153-G4d/J142-z72/L180-k
・Q153-z7/J142-z73/L180-k
・Q407-z106/J300-z107/L210-k
D-PBSで平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flowカラム (GE Healthcare)にφ0.22μmフィルターで濾過したCMを負荷し、表７６に示す洗浄1、2、溶出1、2を実施した（Q407-z106/J300-z107/L210-k は溶出1のみの実施）。溶出条件は上述の結果を参考にした。負荷する抗体量が20 mg/mL resineになるようにCMの負荷量を調節した。各条件の溶出画分を分取し、陽イオン交換クロマトグラフィー分析により、各溶出画分に含まれている成分を同定した。コントロールには上述の結果と同様に、各CMをrProtein G Sepharose Fast Flow樹脂 (GE Healthcare)に負荷し、バッチで溶出することにより精製した試料を用いた。
Figure 2017043608
各溶出画分の陽イオン交換クロマトグラフィー分析の結果を以下の表７７〜８０に示した。値は溶出ピークの面積をパーセントで表記した。Q153-G4d/J142-G4d/L180-k以外の抗体ではFXに対するホモ抗体がいずれの溶出画分にもほとんど検出されなかった。ホモ抗体J142-z72（FXに対するホモ抗体）だけでなく、ホモ抗体J142-z73及びJ300-z107（FXに対するホモ抗体）もプロテインＡに結合しなくなっているということが判明した。これは、FXに対する抗体のH鎖定常領域に導入されているEUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異によりFXに対するホモ抗体においてプロテインＡに対する結合性が失われているためと考えられた。目的の二重特異性抗体であるヘテロ抗体は大部分が溶出１画分で検出され、FIXに対するホモ抗体は溶出１画分にもわずかに検出されたが、大部分が溶出２で溶出していた。Q153-G4d/J142-z72/L180-kと比較して、Q153-z7/J142-z73/L180-k及びQ407-z106/J300-z107/L210-kにおいて、pH3.6溶出画分の目的の二重特異性抗体であるヘテロ抗体の割合が大幅に向上した。EUナンバリング435番目のHisをArgに置換する変異に加えて、各H鎖のヘテロ分子を効率的に形成させるためのEUナンバリング356番目のGluをLysに置換する変異およびEUナンバリング439番目のLysをGluに置換する変異を導入することで、プロテインＡ精製工程のみにより、目的の二重特異性抗体であるヘテロ抗体を98%以上の純度で精製可能であることが明らかになった。
以上より、ホモ抗体とヘテロ抗体のプロテインA結合部位の数の差を利用し、プロテインＡクロマトグラフィー工程のみを用いることで、ヘテロ抗体を高純度にかつ効率的に分離精製することが可能であることを見出した。
Figure 2017043608
Figure 2017043608
Figure 2017043608
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〔参考実施例５〕示査走査型蛍光定量法による改変抗体のTm評価
本検討では、Rotor-Gene Q（QIAGEN）を用いた示査走査型蛍光定量法を用いて改変抗体のTmを評価した。なお、本手法は、抗体の熱安定性評価法として広く知られている示唆走査型熱量計を用いたTm評価と良好な相関を示すことが既に報告されている（Journal of Pharmaceutical Science 2010 ; 4 : 1707-1720）。
5000倍濃度のSYPRO orange（Molecular Probes）をPBS（Sigma）により希釈後、抗体溶液と混和することにより測定サンプルを調製した。各サンプルを20 μLずつ測定用チューブにセットし、240℃ /hrの昇温速度で30℃から99℃まで温度を上昇させた。昇温度に伴う蛍光変化を470 nm（励起波長）/ 555 nm（蛍光波長）において検出を行った。
データはRotor-Gene Q Series Software（QIAGEN）を用いて蛍光遷移が認められた温度を算出し、この値をTm値とした。
〔参考実施例６〕ヘテロ改変抗体の加速試験
本実施例中の抗体に関して加速試験を実施し、保存安定性の比較をおこなった。
プロテインA精製後の各抗体を0.2 mM塩酸を含むPBSを用いて1.0 mg/mLに調製し、40℃の恒温槽において保存を行った。各抗体とも、保存開始時、2週間保存後、4週間保存後にG3000 SWXLカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを実施し、単量体含有率を観察した。
〔参考実施例７〕ヒト末梢血単核球をエフェクター細胞として用いた各被験抗体のADCC活性
抗体の片側のH鎖にのみ入れることでFcγRに対する結合活性が増強した改変体について、以下の方法に従ってADCC活性を測定した。
ヒト末梢血単核球（以下、ヒトPBMCと指称する。）をエフェクター細胞として用いて各被験抗体のADCC活性を以下のように測定した。
（１）ヒトPBMC溶液の調製
1000単位／mlのヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注5千単位，ノボ・ノルディスク）が予め200μl注入された注射器を用い、中外製薬株式会社所属の健常人ボランティア（成人男性）より末梢血50 mlを採取した。PBS（-）を用いて2倍に希釈された当該末梢血を4等分し、15 mlのFicoll-Paque PLUSが予め注入されて遠心操作が行なわれたLeucosepリンパ球分離管（Greiner bio-one）に加えた。当該末梢血が分注された分離管が2150 rpmの速度によって10分間室温にて遠心分離の操作をした後、単核球画分層を分取した。10%FBSを含むDulbecco's Modified Eagle's Medium（SIGMA）（以下10%FBS/D-MEMと称する。）によって1回当該各分層に含まれる細胞を洗浄した後、当該細胞が10%FBS/D-MEM中にその細胞密度が5x106 細胞/ mlとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液をヒトPBMC溶液として以後の実験に供した。
（２）標的細胞の調製
SK-Hep-1にヒトグリピカン3を強制発現させたSK-pca13aをディッシュから剥離し、3x106cellsに1.85MBqのCr-51を加えたた。Cr-51を加えた細胞を5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で1時間インキュベートした後、10%FBS/D-MEMで1回細胞を洗浄し、当該細胞が10%FBS/D-MEM中にその細胞密度が2x105 細胞/ mlとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液を標的細胞として以後の実験に供した。
（３）クロム遊離試験（ADCC活性）
ADCC活性をクロムリリース法による特異的クロム遊離率にて評価した。まず、各濃度（0、0.004、0.04、0.4、4、40 μg/ml）に調製した抗体溶液を96ウェルU底プレートの各ウェル中に50μlずつ添加した。次に、（２）で調製した標的細胞を50μlずつ播種し（1x104 cells/ウェル）室温にて15分間静置した。各ウェル中に（１）で調製したヒトPBMC溶液各100μl（5x105 cells/ウェル）を加えた当該プレートを、5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で4時間静置した後に、遠心操作した。当該プレートの各ウェル中の100μlの培養上清の放射活性をガンマカウンターを用いて測定した。下式：
特異的クロム遊離率(%)＝(A-C)×100/(B-C)
に基づいて特異的クロム遊離率を求めた。
上式において、Aは各ウェル中の100μlの培養上清の放射活性（cpm）の平均値を表す。また、Bは標的細胞に100μlの2% NP-40水溶液（Nonidet P-40、ナカライテスク）および50μlの10% FBS/D-MEM培地を添加したウェル中の100μlの培養上清の放射活性（cpm）の平均値を表す。さらに、Cは標的細胞に10% FBS/D-MEM培地を150 μl添加したウェル中の100μlの培養上清の放射活性（cpm）の平均値を表す。試験はtriplicateにて実施し、各被験抗体のADCC活性が反映される前記試験における特異的クロム遊離率（%）の平均値および標準偏差を算出した。
〔参考実施例８〕FcγRの調製とFcγRに対する結合活性の評価
FcgRの細胞外ドメインを以下の方法で調製した。まずFcgRの細胞外ドメインの遺伝子の合成を当業者公知の方法で実施した。その際、各FcgRの配列はNCBIに登録されている情報に基づき作製した。具体的には、FcgRIについてはNCBIのaccession # NM_000566.3の配列、FcgRIIaについてはNCBIのaccession # NM_001136219.1の配列、FcgRIIbについてはNCBIのaccession # NM_004001.3の配列、FcgRIIIaについてはNCBIのaccession # NM_001127593.1の配列、FcgRIIIbについてはNCBIのaccession # NM_000570.3の配列に基づいて作製し、C末端にHisタグを付加した。またFcgRIIa、FcgRIIIa、FcgRIIIbについては多型が知られているが、多型部位についてはFcgRIIaについてはJ. Exp. Med., 1990, 172: 19-25、FcgRIIIaについてはJ. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070, FcgRIIIbについてはJ. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691を参考にして作製した。
得られた遺伝子断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターをヒト胎児腎癌細胞由来FreeStyle293細胞（Invitrogen社）に、一過性に導入し、目的タンパク質を発現させた。なお、結晶構造解析用に用いたFcgRIIbについては、終濃度10 ug/mLのKifunesine存在下で目的タンパク質を発現させ、FcgRIIbに付加される糖鎖が高マンノース型になるようにした。培養し、得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターを通して培養上清を得た。得られた培養上清は原則として次の4ステップで精製した。第1ステップは陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（SP Sepharose FF）、第2ステップはHisタグに対するアフィニティカラムクロマトグラフィー（HisTrap HP）、第3ステップはゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Superdex200）、第4ステップは無菌ろ過、を実施した。ただし、FcgRIについては、第1ステップにQ sepharose FFを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを実施した。精製したタンパク質については分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いて精製タンパク質の濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
Biacore T100、Biacore T200、Biacore A100またはBiacore 4000(GE Healthcare) を用いて、目的の抗体とFcγRとの相互作用解析を行った。ランニングバッファーにはHBS-EP+ (GE Healthcare)を用い、測定温度は25℃とした。センサーチップにはSeries S Sencor Chip CM5（GEヘルスケア）にアミンカップリング法により抗原ペプチドを固定化したチップ、Series S Sensor Chip SA（certified）（GEヘルスケア）に対して予めビオチン化しておいた抗原ペプチドを相互作用させ、固定化したチップ、Series S Sencor Chip CM5（GEヘルスケア）にProtein L (ACTIGEN, BioVision) を固定化したチップ、あるいはSeries S Sencor Chip CM5（GEヘルスケア）にProtein A/G (Thermo Scientific) を固定化したチップを用いた。これらのチップへ目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈した各FcγRを相互作用させた。10 mM glycine-HCl、pH1.5を反応させることで、チップにキャプチャーした抗体を洗浄し、チップを再生して繰り返し用いた。
各抗体のFcγRに対する結合活性は主にFcγRに対する結合活性およびFcγRに対する解離定数を指標として評価した。
FcγRに対する結合活性はFcγRに対する相対的な結合活性を意味する。FcγRに対する相対的な結合活性は各測定時におけるコントロールとなるサンプルの結合活性を100 (%)として、他の抗体の結合活性を算出した。ここでいう結合活性には、キャプチャーさせた抗体にFcγRを相互作用させた前後でのセンサーグラムの変化量をFcγRの結合活性を各抗体のキャプチャー量で割った値を用いた。FcγRの結合活性はキャプチャーした抗体の量に依存するためである。
各抗体のFcγRに対する解離定数は、Biacoreの測定結果に対して速度論的解析を実施することで算出した。具体的には、Biacore Evaluation Softwareにより測定して得られたセンサーグラムを1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ka (L/mol/s)、解離速度定数kd(1/s)を算出し、その値から解離定数KD (mol/L) を算出した。
〔参考実施例９〕ヒト末梢血単核球をエフェクター細胞として用いた各被験抗体のADCC活性
Fc改変を適用した各改変体について、以下の方法に従ってADCC活性を測定した。
ヒト末梢血単核球（以下、ヒトPBMCと指称する。）をエフェクター細胞として用いて各被験抗体のADCC活性を以下のように測定した。
（１）ヒトPBMC溶液の調製
1000単位／mlのヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注5千単位，ノボ・ノルディスク）が予め200μl注入された注射器を用い、中外製薬株式会社所属の健常人ボランティア（成人男性）より末梢血50 mlを採取した。PBS（-）を用いて2倍に希釈された当該末梢血を4等分し、15 mlのFicoll-Paque PLUSが予め注入されて遠心操作が行なわれたLeucosepリンパ球分離管（Greiner bio-one）に加えた。当該末梢血が分注された分離管が2150 rpmの速度によって10分間室温にて遠心分離の操作をした後、単核球画分層を分取した。10%FBSを含むDulbecco's Modified Eagle's Medium（SIGMA）（以下10%FBS/D-MEMと称する。）によって1回当該各分層に含まれる細胞を洗浄した後、当該細胞が10%FBS/D-MEM中にその細胞密度が5 x 106 細胞/ml又は2.5 x 106 細胞/mlとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液をヒトPBMC溶液として以後の実験に供した。
（２）標的細胞の調製
SK-Hep-1にヒトEpiregulinを強制発現させたSK-pca13a又はSKE18又はヒト大腸癌株DLD-1又はヒト膵癌細胞株MIAPaCa-2をディッシュから剥離し、1 x 106cellsあたり0.2 mg/mLのCalcein溶液200μL又は3 x 106cellsに1.85 MBqのCr-51を加えた。Calcein溶液又はCr-51を加えた細胞を5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で1-2時間インキュベートした後、10%FBS/D-MEMで1回細胞を洗浄し、当該細胞が10%FBS/D-MEM中にその細胞密度が2 x 105 細胞/mlとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液を標的細胞として以後の実験に供した。
（３−１）カルセイン又はクロム遊離試験（ADCC活性）
ADCC活性をカルセイン又はクロムリリース法による特異的カルセイン又はクロム遊離率にて評価した。まず、各濃度（0、0.004、0.04、0.4、4、40μg/ml）に調製した抗体溶液を96ウェルU底プレートの各ウェル中に50μlずつ添加した。次に、（２）で調製した標的細胞を50μlずつ播種し（1 x 104 cells/ウェル）室温にて15分間静置した。各ウェル中に（１）で調製したヒトPBMC溶液各100μl（5 x 105 cells/ウェル又は2.5 x 105 cells/ウェル）を加えた当該プレートを、5%炭酸ガスインキュベータ中において37℃で4時間静置した後に、遠心操作した。当該プレートの各ウェル中の100μlの培養上清のカルセイン蛍光又は放射活性を吸光光度計又はガンマカウンターを用いて測定した。下式：
特異的カルセイン又はクロム遊離率(%)＝(A-C)×100/(B-C)
に基づいて特異的カルセイン又はクロム遊離率を求めた。
上式において、Aは各ウェル中の100μlの培養上清のカルセイン蛍光（励起波長485 nm、蛍光波長535 nm）又は放射活性（cpm）の平均値を表す。また、Bは標的細胞に100μlの2% NP-40水溶液（Nonidet P-40、ナカライテスク）および50μlの10% FBS/D-MEM培地を添加したウェル中の100μlの培養上清のカルセイン蛍光（励起波長485 nm、蛍光波長535 nm）又は放射活性（cpm）の平均値を表す。さらに、Cは標的細胞に10% FBS/D-MEM培地を150μl添加したウェル中の100μlの培養上清のカルセイン蛍光（励起波長485 nm、蛍光波長535 nm）又は放射活性（cpm）の平均値を表す。試験はtriplicateにて実施し、各被験抗体のADCC活性が反映される前記試験における特異的カルセイン又はクロム遊離率（%）の平均値および標準偏差を算出した。

Claims (42)

  1. IgGのＦｃ領域を含み、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドであって、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチド及び該Ｆｃ領域が第二のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドと比べて、該Ｆｃ領域の機能が改変されていることを特徴とするポリペプチドであり、
    ここで、該Ｆｃ領域の機能の改変がFcγレセプターに対する結合活性の増強であり、さらにここで、前記Ｆｃ領域のＣＨ２領域において、EUナンバリング23１番目のAla、EUナンバリング232番目のPro、EUナンバリング233番目のGlu、EUナンバリング234番目のLeu、EUナンバリング235番目のLeu、EUナンバリング236番目のGly、EUナンバリング237番目のGly、EUナンバリング238番目のPro、EUナンバリング239番目のSer、EUナンバリング240番目のVal、EUナンバリング265番目のAsp、EUナンバリング266番目のVal、EUナンバリング267番目のSer、EUナンバリング268番目のHis、EUナンバリング269番目のGlu、EUナンバリング270番目のAsp、EUナンバリング271番目のPro、EUナンバリング295番目のGln、EUナンバリング296番目のTyr、EUナンバリング298番目のSer、EUナンバリング300番目のTyr、EUナンバリング324番目のSer、EUナンバリング325番目のAsn、EUナンバリング326番目のLys、EUナンバリング327番目のAla、EUナンバリング328番目のLeu、EUナンバリング329番目のPro、EUナンバリング330番目のAla、EUナンバリング331番目のPro、EUナンバリング332番目のIle、EUナンバリング333番目のGlu、EUナンバリング334番目のLys、EUナンバリング335番目のThr、EUナンバリング336番目のIle、及びEUナンバリング337番目のSerからなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、ポリペプチド。
  2. 前記FcγレセプターがFcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIb 、及びFcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも１つ以上のレセプターであることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記Fcγレセプターが、FcγRIaであることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２−１及び表２−２の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表２−１、表２−２及び表２−３の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。
  6. 前記Fcγレセプターが、FcγRIIa Rであることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
  7. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３−１及び表３−２の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３−１及び表３−２の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項６に記載のポリペプチド。
  9. 前記Fcγレセプターが、FcγRIIa Hであることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
  10. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表４の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項９に記載のポリペプチド。
  11. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表４の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項９に記載のポリペプチド。
  12. 前記Fcγレセプターが、FcγRIIbであることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
  13. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表５の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項１２に記載のポリペプチド。
  14. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表５の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項１２に記載のポリペプチド。
  15. 前記Fcγレセプターが、FcγRIIIaであることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
  16. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表６の領域iに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項１５に記載のポリペプチド。
  17. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表６の領域iiに記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項１５に記載のポリペプチド。
  18. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング234番目のアミノ酸LのYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LのY又はQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GのWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SのAへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換、EUナンバリング328番目のアミノ酸LからWへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからM又はKへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからE又はLへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載のポリペプチド。
  19. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング234番目のLeu、235番目のLeu、236番目のGly、239番目のSer、268番目のHis、270番目のAsp、298番目のSer、EUナンバリング326番目のLys、327番目のAla、328番目のLeu、330番目のAla及び334番目のLysから選択される、少なくとも一つのアミノ酸に変異が導入されていることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載のポリペプチド。
  20. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング234番目のLeu、235番目のLeu、236番目のGly、239番目のSer、268番目のHis、270番目のAsp、298番目のSer、327番目のAla、328番目のLeu及び334番目のLysから選択される、少なくとも一つのアミノ酸に変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング270番目のAsp、EUナンバリング326番目のLys、330番目のAla及び334番目のLysから選択される、少なくとも一つのアミノ酸に変異が導入されていることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載のポリペプチド。
  21. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからY又はQへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換及びEUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換、EUナンバリング328番目のアミノ酸LからWへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからLへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからM又はKへの置換、EUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載のポリペプチド。
  22. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、(i)から(vi)のいずれかの変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、(vii)から(ix)のいずれかの変異が導入されている、請求項１〜２１のいずれかに記載のポリペプチド：
    (i) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
    (ii) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
    (iii) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからＱへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
    (iv) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換及びEUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換
    (v) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換及びEUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換
    (vi) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換、EUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換、EUナンバリング328番目のアミノ酸LからWへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからLへの置換
    (vii) EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからMへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換
    (viii) EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからMへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換
    (ix) EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからKへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換。
  23. IgGのＦｃ領域を含み、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドであって、
    ここで、前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、(i)から(vi)のいずれかの変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、(vii)から(ix)のいずれかの変異が導入されている、ポリペプチド：
    (i) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
    (ii) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
    (iii) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからＱへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換及びEUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換
    (iv) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換及びEUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換
    (v) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換及びEUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換
    (vi) EUナンバリング234番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸LからYへの置換、EUナンバリング236番目のアミノ酸GからWへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸SからMへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸HからDへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸SからAへの置換、EUナンバリング327番目のアミノ酸AからDへの置換、EUナンバリング328番目のアミノ酸LからWへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからLへの置換
    (vii) EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからMへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換
    (viii) EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからMへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換
    (ix) EUナンバリング270番目のアミノ酸DからEへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸KからDへの置換、EUナンバリング330番目のアミノ酸AからKへの置換及びEUナンバリング334番目のアミノ酸KからEへの置換。
  24. Ｆｃ領域を含み、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドであって、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチド又は該Ｆｃ領域が第二のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドと比べて、該Ｆｃ領域の機能が改変されていることを特徴とするポリペプチドであり、ここでＦｃ領域の機能の改変が、ポリペプチドのFcγレセプターに対する結合活性の増強及び物理化学的安定性が向上するという改変である前記ポリペプチド。
  25. 前記物理化学的安定性が向上するという改変は、Ｆｃ領域が第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドが、該Ｆｃ領域が第一のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチド又は該Ｆｃ領域が第二のポリペプチドのみを含むホモ二量化体により構成されていることを特徴とするポリペプチドと比べて、高いＴｍを有することを特徴とする請求項２４に記載のポリペプチド。
  26. 前記Ｆｃ領域の機能の改変がFcγレセプターに対する結合活性の増強であり、該Fcγレセプターが、FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIb 、及びFcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも１つ以上のレセプターであることを特徴とする、請求項２４又は２５に記載のポリペプチド。
  27. 前記Fcγレセプターが、FcγRIaであることを特徴とする、請求項２６に記載のポリペプチド。
  28. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３１−１、表３１−２及び表３１−３に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項２７に記載のポリペプチド。
  29. 前記Fcγレセプターが、FcγRIIa Rであることを特徴とする、請求項２６に記載のポリペプチド。
  30. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３２−１及び表３２−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項２９に記載のポリペプチド。
  31. 前記Fcγレセプターが、FcγRIIa Hであることを特徴とする、請求項２６に記載のポリペプチド。
  32. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３３−１及び表３３−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項３１に記載のポリペプチド。
  33. 前記Fcγレセプターが、FcγRIIbであることを特徴とする、請求項２６に記載のポリペプチド。
  34. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３４−１及び表３４−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項３３に記載のポリペプチド。
  35. 前記Fcγレセプターが、FcγRIIIaであることを特徴とする、請求項２６に記載のポリペプチド。
  36. 前記Ｆｃ領域を構成する第一のポリペプチド及び／又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、明細書表３５−１及び表３５−２に記載されたアミノ酸変異からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項３５に記載のポリペプチド。
  37. 更に第一のポリペプチドと第二のポリペプチドの等電点に差を付与させるためのアミノ酸改変が導入されている、請求項１〜３６のいずれかに記載のポリペプチド。
  38. 等電点の差を付与するためのアミノ酸改変が、第一のポリペプチド及び/又は第二のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１３７番目のGly、１３８番目のGly、１３９番目のThr、１４７番目のLys、１９２番目のSer、１９３番目のLeu、１９６番目のGln、１９８番目のTyr、１９９番目のIle、２０３番目のAsn、２１４番目のLys、２６３番目のVal、２７２番目のGlu、２７４番目のLys、２７８番目のTyr、２８８番目のLys、２９０番目のLys、３１６番目のGly、３１７番目のLys、３２０番目のLys、３２４番目のLys、３３５番目のThr、３３７番目のSer、３４０番目のLys、３５８番目のLeu、３６０番目のLys、３６２番目のGln、３６４番目のSer、３８３番目のSer、３８４番目のAsn、３８５番目のGly、３８６番目のGln、３８７番目のPro、３９０番目のAsn、３９７番目のVal及び４２２番目のValからなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項３７に記載のポリペプチド。
  39. 等電点の差を付与するためのアミノ酸改変が、第一のポリペプチド又は第二のポリペプチドのどちらか一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１９６番目のGln、１９９番目のIle、２６３番目のVal、２７２番目のGlu、３１６番目のGly、３５８番目のLeu、３６４番目のSer、３８３番目のSer、３８７番目のPro及び３９７番目のValからなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されており、もう一方のポリペプチドのアミノ酸配列において、EUナンバリング１３７番目のGly、１３８番目のGly、１３９番目のThr、１４７番目のLys、１９２番目のSer、１９３番目のLeu、１９８番目のTyr、１９９番目のIle、２０３番目のAsn、２１４番目のLys、２７４番目のLys、２７８番目のTyr、２８８番目のLys、２９０番目のLys、３１６番目のGly、３１７番目のLys、３２０番目のLys、３２４番目のLys、３３５番目のThr、３３７番目のSer、３４０番目のLys、３５８番目のLeu、３６０番目のLys、３６２番目のGln、３８３番目のSer、３８４番目のAsn、３８５番目のGly、３８６番目のGln、３９０番目のAsn及び４２２番目のValからなる群より選択される、少なくとも一つのアミノ酸変異が導入されていることを特徴とする、請求項３７に記載のポリペプチド。
  40. 前記ポリペプチドが、抗原結合分子であることを特徴とする、請求項１〜３９のいずれかに記載のポリペプチド。
  41. 前記抗原結合分子が、抗体、二重特異性抗体、ペプチドFc融合タンパク質、又はスキャッフォールドFc融合タンパク質などのFc融合分子であることを特徴とする、請求項４０に記載のポリペプチド。
  42. 請求項４０又は４１に記載のポリペプチド及び医学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
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