KR20190070977A - 폴리펩티드 변이체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본원에는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 항체가 기재된다. 변이체 Fc 영역은 폴리펩티드(들), 항체 또는 항체들이 세포 표면 상에 있는 그의 표적, 항원 또는 항원들에 결합할 때 안정화된 Fc-Fc 상호작용을 제공하는 반면에, 동시에 감소된 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또한 가지며, Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 변형으로부터 초래되는 다른 이펙터 기능의 감소된 활성화를 또한 가질 수 있다.

Description

폴리펩티드 변이체 및 그의 용도
본 발명은 감소된 Fc 이펙터 기능, 예컨대 C1q와의 감소된 결합, 감소된 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 가지며, Fc-영역에서의 하나 이상의 아미노산 변형으로부터 초래되는 다른 이펙터 기능의 감소된 활성화를 또한 가질 수 있는 Fc 영역-함유 폴리펩티드, 예컨대 항체에 관한 것이다.
모노클로날 항체의 Fc-매개된 이펙터 기능, 예컨대 보체-의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및 항체-의존성 세포-매개된 식균작용 (ADCP)은 효능 및 독성에 의해 정의되는 치료 범위에 기여한다. CDC는 C1q가 항체의 Fc 영역에 결합함으로써 개시된다. C1q는 줄기에 부착된 6개의 구형 결합 헤드로 이루어진 다합체성 단백질이다. 개별 구형 결합 헤드는 IgG에 대해 낮은 친화도를 갖고; 전형적인 보체 경로를 촉발시키기 위해서는 C1q가 세포 표면 상의 다중 IgG1 분자와 결합함으로써 결합력을 획득해야 한다. ADCC 및 ADCP는 이펙터 세포 상의 Fcγ 수용체 (FcγR)에의 IgG Fc 영역의 결합에 의해 개시된다.
세포 표면 상에서의 표적 결합 시 IgG 육합체화는 강력한 C1q 결합을 지지하는 것으로 제시되어 있다. 육합체화는 분자간 비공유 Fc-Fc 상호작용을 통해 매개되고, Fc-Fc 상호작용은 CH3 도메인에서의 점 돌연변이, 예컨대 E345R 및 E430G에 의해 증진될 수 있다.
WO2013/004842는 변형된 이펙터 기능, 예컨대 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 초래하는 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드를 개시한다.
WO2014/108198은 증가된 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 초래하는 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 항체를 개시한다.
WO2012/130831은 폴리펩티드의 Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환의 결과로서 변경된 이펙터 기능을 갖는 Fc 영역-함유 폴리펩티드에 관한 것이다. 이들 폴리펩티드는 야생형 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교 시 인간 FcyRIIIa 및/또는 FcyRIIa 및/또는 FcyRI에 대해 감소된 친화도를 나타내고, 상기 폴리펩티드에 의해 유도된 ADCC를 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 의해 유도된 ADCC의 적어도 20%로 감소시킨다. WO2012/130831은 증진된 Fc-Fc 상호작용 및/또는 증진된 육합체 형성 능력을 갖는 Fc 영역-함유 폴리펩티드를 개시하지 않는다.
상기 기재된 바와 같이, 폴리펩티드 및/또는 항체 사이의 Fc-Fc 상호작용을 증진시키려는 이전의 노력은 이펙터 기능을 증진시키는 효과, 예컨대 증진된 CDC 및 또는 ADCC를 가지며, 이는 항체 또는 폴리펩티드가 결합하는 표적 세포의 세포 사멸을 유도한다.
항체 사이의 증진된 Fc-Fc 상호작용을 이용하여 세포 표면 상에 있는 그의 표적으로 항체 결합의 효과를 증폭시킬 수 있지만, 표적 세포가 이펙터 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포, 또는 이펙터 세포의 결합을 수반하는 것인 작용 메카니즘을 갖는 다른 이펙터 세포 (예를 들어, 이중특이적 항체에서)인 경우에는, C1q 또는 Fc-감마R과의 상호작용 및/또는 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC 및/또는 ADCC의 활성화가 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖지만, C1q 결합에 관여하지 않고/거나 Fc-감마R 상호작용을 갖지 않고, 이로써 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC 및/또는 ADCC를 활성화시키지 않는 항체가 요구된다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 IgG의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 변이체 폴리펩티드 또는 항체를 제공하는 것이며, 상기 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 비교 시 증가된 Fc-Fc 상호작용 및 감소된 이펙터 기능, 예컨대 CDC 및/또는 ADCC를 가지며, 여기서 모 폴리펩티드는 동일한 이소타입을 갖고, 동일한 항원 결합 영역을 가지며, 인간 IgG1에서의 E345, E430 또는 S440에 상응하는 아미노산 위치에서 Fc-Fc 증진 돌연변이인 제1 돌연변이를 가지며, 단, 위치 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W인 인간 IgG이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이펙터 기능, 예컨대 CDC를 유도하지 않고 증진된 Fc-Fc 상호작용 성질을 갖는 폴리펩티드 또는 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 이펙터 기능, 예컨대 ADCC를 유도하지 않고 증진된 Fc-Fc 상호작용 성질을 갖는 폴리펩티드 또는 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 이펙터 기능, 예컨대 CDC 및 ADCC를 유도하지 않고 증진된 Fc-Fc 상호작용 성질을 갖는 폴리펩티드 또는 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 증진된 Fc-Fc 상호작용을 초래하는 제1 돌연변이만을 갖는 모 폴리펩티드와 비교 시 감소된 Fc 이펙터 기능, 예컨대 감소된 CDC 및/또는 ADCC를 가지면서 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 폴리펩티드 또는 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 여전히 또 다른 목적은 폴리펩티드 또는 항체의 항원 결합 영역이 상응하는 항원에 결합하였을 때, Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC 및/또는 ADCC를 활성화시키지 않고, 신호전달을 활성화시키고, 임의적으로 증진된 신호전달을 유도하는 폴리펩티드 또는 항체를 제공하는 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 갖는 폴리펩티드 또는 항체로서, 여기서 Fc 영역은 Fc-Fc 증진 돌연변이인 제1 돌연변이, 및 C1q 결합 및/또는 Fc감마R 결합 및/또는 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC 및/또는 ADCC 활성을 감소시키는 제2 돌연변이를 갖는 것인 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 인간 IgG의 Fc 영역에서의 아미노산 위치 E322 또는 P329에 상응하는 Fc 영역에 제2 돌연변이를 도입함으로써, 이펙터 기능, 예컨대 CDC 및/또는 ADCC 활성은 감소되면서 제1 돌연변이의 올리고머화 능력이 유지될 수 있음을 발견하였다.
이론에 제한되지는 않지만, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체가 세포 표면 상의 표적에 결합할 때 두 폴리펩티드 또는 항체 분자의 Fc 영역 사이에 더욱 안정한 결합 상호작용이 있을 수 있으며, 이는 Fc 매개된 이펙터 기능을 증진시키지 않으면서 증진된 올리고머화, 예컨대 육합체 형성을 유도하는 것으로 믿어진다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 제1 돌연변이를 포함하지만 제2 돌연변이는 포함하지 않는 그들의 모 폴리펩티드 또는 모 항체와 비교 시 감소된 C1q 결합 및/또는 감소된 Fc감마R 결합을 추가로 갖는다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 제1 돌연변이를 포함하지만 제2 돌연변이는 포함하지 않는 그들의 모 폴리펩티드 또는 모 항체와 비교 시 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는다. 본 발명의 일부 폴리펩티드 또는 항체는 모 폴리펩티드 또는 모 항체와 비교 시 감소된 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC를 갖는다. 본 발명의 일부 폴리펩티드 또는 항체는 모 폴리펩티드 또는 모 항체와 비교 시 감소된 Fc 이펙터 기능, 예컨대 ADCC를 갖는다. 본 발명의 일부 폴리펩티드 또는 항체는 모 폴리펩티드 또는 모 항체와 비교 시 감소된 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC 및 ADCC를 갖는다. 본 발명의 일부 폴리펩티드 또는 항체는 제1 및 제2 돌연변이를 포함하지 않는 동일한 폴리펩티드 또는 항체, 즉, 야생형 Fc 영역과 비교 시 감소된 Fc 이펙터 반응을 추가로 갖는다. 본 발명의 일부 폴리펩티드는 감소된 C1q 결합 및/또는 감소된 Fc감마R 결합을 갖는다. 본 발명의 일부 폴리펩티드 또는 항체는 감소된 CDC 반응을 갖는다. 본 발명의 일부 폴리펩티드 또는 항체는 감소된 ADCC 반응을 갖는다. 본 발명의 일부 폴리펩티드 또는 항체는 감소된 ADCC 및 CDC 반응 둘 다, 및/또는 다른 감소된 이펙터 반응을 갖는 것을 특징으로 한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 IgG의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체로서, 여기서 Fc 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응하는 (i) 제1 돌연변이 및 (ii) 제2 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다 (Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242):
i. E430, E345 또는 S440에서의 제1 돌연변이, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임; 및
ii. K322 또는 P329에서의 제2 돌연변이.
즉, 본 발명의 제1 측면에서, 본 발명의 발명자들은 제1 돌연변이를 갖는 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 영역에서의 K322 또는 P329에 상응하는 아미노산 위치 중 하나에 제2 돌연변이를 도입하면, 제1 돌연변이가 표적 결합 시 Fc-Fc 상호작용을 증진시켜 올리고머화를 증진시켰으며, 제2 돌연변이가 Fc 이펙터 기능을 감소시킬 수 있었음을 발견하였다. 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 영역에서의 아미노산 위치 K322 또는 P329에 상응하는 돌연변이는 동일한 제1 돌연변이를 갖지만 제2 돌연변이는 갖지 않는 모 폴리펩티드 또는 모 항체와 비교 시 감소된 수준으로 하나 이상의 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 위치 E430, E345 또는 S440 중 하나로부터 선택될 수 있는 적어도 하나의 제1 돌연변이를 가지며, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이고, 폴리펩티드 또는 항체는 위치 K322 또는 P329 중 하나로부터 선택될 수 있는 적어도 하나의 제2 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W 및 S440Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G 또는 E345K로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 K322E, K322D, K322N, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W, P329A 및 P329Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 아미노산 위치 P329에 있으며, 단, 제2 돌연변이는 P329A가 아니다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 아미노산 위치 P329에 있으며, 단, 제2 돌연변이는 P329A 또는 P329G가 아니다.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 L234 및 L235에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 포함하지 않는다. 즉, 본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1에서의 L234 및 L235에 상응하는 위치에서 야생형 아미노산 L 및 L을 포함하며, 여기서 위치는 EU 넘버링에 따른 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 인간 IgG의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체로서, 여기서 Fc 영역은 (i) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 아미노산 위치: E430, E345 또는 S440에 상응하는 제1 돌연변이를 갖는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W인 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 방법이며, (ii) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 아미노산 위치: K322 또는 P329에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명의 발명자들은 아미노산 위치 E430, E345 또는 S440 중 하나에 상응하는 제1 돌연변이를 가지며, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W인 (이는 세포 표면 상에서의 표적 결합 시 올리고머화를 증진시키고 Fc 이펙터 기능을 증진시킴) 폴리펩티드 또는 항체의 K322 또는 P329에 상응하는 아미노산 위치 중 하나에 제2 돌연변이를 도입함으로써, 상기 이펙터 기능 중 하나 이상이 감소될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 제2 돌연변이는 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 이펙터 기능을 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서의 제1 돌연변이를 가지며, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W인 모 폴리펩티드의 수준에 필적하는 또는 그보다 낮은 수준으로 감소시킬 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 항체 또는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 항체 또는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 항체 또는 조성물의 유효량을 질환을 가진 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 측면, 특히 폴리펩티드 또는 항체의 다양한 용도 및 치료적 적용이 하기에 더욱 상세하게 기재된다.
도 1은 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 돌연변이(들) (E430G는 G로 지칭되고; E345R은 R로 지칭되고, E345R/E430G/S440Y는 RGY로 지칭됨)을 갖는 및 갖지 않는 IgG-005 변이체의 CDC 효능에 대한 IgG1의 Fc 도메인에서 C1q 결합 억제 돌연변이 (D270A/K322A는 AA로 지칭됨)의 효과를 제시한다. CD38-양성 Daudi 세포를 20% 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에 CD38 (돌연변이체) 항체의 농도 시리즈와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 프로피듐 아이오다이드 (PI)-양성 세포 백분율에 의해 결정되는 용해 백분율로 제시된다. HIV gp120에 대한 IgG1-b12 mAb 및 그의 돌연변이체를 비-결합 이소타입 대조군 mAb로서 사용하였다. 대표적인 예를 제시한다.
도 2는 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 E430G 돌연변이를 갖는 IgG-005 변이체의 CDC 효능에 대한 인간 IgG1 C1q 결합 부위에서의 단일 아미노산 치환의 효과를 제시한다. (A) CDC 검정의 경우, Daudi 세포를 20% 풀링된 NHS의 존재 하에 D270R, K322E, P329D 또는 P329R 돌연변이를 갖는 IgG1-005-E430G의 농도 시리즈와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 프로피듐 아이오다이드 (PI)-양성 세포 백분율에 의해 결정되는 용해 백분율로서 제시된다. 항체가 없는 샘플을 CDC 효능에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다. 2회 실험에 대한 대표적인 예를 제시한다. (B) K322E, P329D 또는 P329R 돌연변이를 갖는 세포-결합된 IgG1-005-E430G 항체에 대한 C1q의 결합을 FACS 상에서 유동세포 분석에 의해 분석하였고, FITC-표지된 토끼-항-HuC1q 항체의 평균 형광 강도 (MFI)로 나타내었다.
도 3은 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG-005-E430G의 CDC 효능에 대한 아미노산 K322 치환의 효과를 제시한다. Daudi 세포를 20% 풀링된 NHS의 존재 하에 CD38 항체 변이체의 농도 시리즈와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 프로피듐 아이오다이드 (PI)-양성 세포 백분율에 의해 결정되는 용해 백분율로서 제시된다. HIV gp120에 대한 항체 IgG1-b12-E430G를 Fc-Fc 증진 돌연변이를 갖는 비-결합 이소타입 대조군으로서 사용하였다.
도 4는 (A)에서는 모세관 전기영동 나트륨 도데실 술페이트 (CE-SDS)에 의해 및 (B)에서는 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의해 추가적인 돌연변이 K322D, K322E 또는 K322N을 갖는 IgG1-005-E430G 항체 변이체의 생물물리학 특징분석을 도시한다. (A) 좌측 패널: 비-환원 조건; 우측 패널: 환원 조건. (B) 개별 항체의 HP-SEC 프로파일을 0.1 A280 단위의 Y-오프셋에 의해 시차적으로 플롯팅하였다.
도 5는 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG-005-E430G의 CDC 효능에 대한 아미노산 P329 치환의 효과를 제시한다. Daudi 세포를 20% 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에 CD38 항체의 농도 시리즈와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 프로피듐 아이오다이드 (PI)-양성 세포 백분율에 의해 결정되는 용해 백분율로서 제시된다. HIV gp120에 대한 항체 IgG1-b12-E430G를 Fc-Fc 증진 돌연변이를 갖는 비-결합 이소타입 대조군으로서 사용하였다.
도 6은 생체발광 ADCC 리포터 생물검정으로 결정되는 바와 같이 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG-005-E430G에 의한 FcγRIIIa 활성화에 대한 아미노산 P329 치환의 효과를 제시한다. Daudi 세포에 결합된 항체에 의한 FcγRIIIa 활성화를 FcγRIIIa 결합 시 루시페라제를 발현하는 FcγRIIIa-발현 Jurkat 리포터 세포를 이용하여 정량화하였다. 루시페라제의 생성은 상대 발광 단위 (RLU)에 의해 제시된다. 각각의 데이터 포인트에 대해, 2개의 복제 샘플의 평균 및 표준 편차가 제시된다. 2회 실험의 대표적인 예가 제시된다.
도 7은 IgG1-005-E430G에 의한 ADCC-매개된 사멸에 대한 돌연변이 K322E, P329A, P329D, P329K 및 P329R의 효과를 제시한다. Daudi 세포의 ADCC는 E:T 비 100:1에서 건강한 인간 공여자로부터 새로 단리된 PBMC를 이용하는 시험관내 51Cr-방출 검정으로 결정하였다. HIV gp120에 대한 항체 IgG1-b12를 비-결합 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 각각의 데이터 포인트에 대해, 5개의 복제 샘플의 평균 및 표준 편차가 제시된다. 한 공여자의 PBMC를 이용하는 대표적인 예가 제시된다.
도 8은 증진된 Fc-Fc 상호작용 (E345K, E345R 및 E345R/E430G/S440Y는 RGY로 지칭됨)을 갖는 IgG-005의 상이한 변이체의 C1q 결합 또는 CDC 효능에 대한 P329D 돌연변이 도입의 효과를 제시한다. (A) 세포-결합된 항체에 대한 C1q 결합을 FACS 상에서 유동세포 분석에 의해 분석하고, FITC-표지된 토끼-항-HuC1q 항체의 평균 형광 강도 (MFI)로 나타내었다. (B) Daudi 세포에 대한 시험관내 CDC 검정을 20% 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에 수행하였다. CDC 효능은 프로피듐 아이오다이드 (PI)-양성 세포 백분율에 의해 결정되는 용해 백분율로서 제시된다. HIV gp120에 대한 항체 IgG1-b12를 비-결합 이소타입 대조군으로서 사용하였다.
도 9는 (A)에서는 HP-SEC에 의해, (B)에서는 CE-SDS에 의해 및 (C)에서는 네이티브 MS에 의해 추가적인 돌연변이 K322E 또는 P329D를 갖는 IgG1-005-RGY 항체 변이체의 생물물리학 특징분석을 제시한다.
도 10은 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 E430G 돌연변이를 갖는 포화 농도의 효능제 DR5 항체의 Fc-Fc 상호작용 및 클러스터링에 대한 P329D 및 K322E 돌연변이의 효과를 제시한다. (A) E430G 돌연변이를 갖는 효능제 DR5 항체에 의한 아폽토시스의 유도에서의 Fc-Fc 상호작용의 수반이, Fc-결합 펩티드 DCAWHLGELVWCT의 존재 하에 사멸 억제를 이용하여 BxPC-3 인간 암 세포에 대한 3 일 생존력 검정으로 제시된다. 5 μg/mL (B) 및 10 μg/mL (C)의 포화 항체 농도에서 BxPC-3 인간 암 세포에 대한 3 일 생존력 검정에서 제시된 바와 같이, P329D (B) 또는 K322E (C) 돌연변이의 도입이 E430G 돌연변이를 갖는 효능제 DR5 항체에 의한 사멸에 대한 IC50을 감소시켰지만, 최대 사멸은 여전히 달성되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 11은 SCID 마우스에서 500 μg의 i.v. 투여된 항체의 클리어런스율을 제시한다. (A) 혈청 샘플 내 총 인간 IgG를 ELISA에 의해 결정하고, 농도 대 시간 곡선으로 플롯팅하였다. 각각의 데이터 포인트는 3개의 복제 샘플의 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. (B) 항체 투여후 21 일까지의 클리어런스율을 식 D*1.000/AUC (D는 주사된 용량이고, AUC는 농도-시간 곡선의 곡선하 면적임)에 따라 결정하였다. 독립적인 2회 ELISA 실험의 대표적인 예가 제시된다.
도 12는 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG1-005-E430G의 CDC 효능에 대한 아미노산 P329 치환의 효과를 제시한다. Daudi 세포를 20% 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에 CD38 항체의 농도 시리즈와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 프로피듐 아이오다이드 (PI)-양성 세포 백분율에 의해 결정되는 용해 백분율로서 제시된다. HIV gp120에 대한 항체 IgG1-b12를 비-결합 이소타입 대조군으로서 사용하였다.
도 13은 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 캄파트(Campath)-E430G의 상이한 IgG 이소타입 변이체의 CDC 효능에 대한 아미노산 P329 치환의 효과를 제시한다. Wien 133 세포를 20% 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에 CD52 항체의 농도 시리즈와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 용량-반응 곡선하 면적으로 제시되고, 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 IgG1-캄파트 (100%)에 대해 정규화된다.
도 14는 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 캄파트-E430G의 IgG 이소타입 변이체의 CDC 효능에 대한 아미노산 K322 치환의 효과를 제시한다. Wien 133 세포를 20% 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에 CD52 항체의 농도 시리즈와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 용량-반응 곡선하 면적으로 제시되고, 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 IgG1-캄파트 (100%)에 대해 정규화된다.
도 15는 상이한 Fc-Fc 상호작용 증진 돌연변이를 갖는 IgG1-캄파트 변이체의 CDC 효능에 대한 아미노산 P329 (상단) 또는 K322 (하단) 치환의 효과를 제시한다. Wien 133 세포를 20% 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에 CD52 항체의 농도 시리즈와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 용량-반응 곡선하 면적으로 제시되고, 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 IgG1-캄파트 (100%)에 대해 정규화된다.
도 16은 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 항-CD20 항체의 CDC 효능에 대한 아미노산 K322 또는 P329 치환의 효과를 제시한다. Wien 133 세포를 20% 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에 CD20 항체의 농도 시리즈와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 프로피듐 아이오다이드 (PI)-양성 세포 백분율에 의해 결정되는 용해 백분율로서 제시된다. 항체 IgG1-b12를 비-결합 이소타입 대조군으로서 사용하였다.
도 17은 ELISA에 의해 측정되는 E430G-증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 항-CD38 IgG1-005 항체의 FcγR 결합에 대한 아미노산 K322 또는 P329 치환의 효과를 제시한다. 지정된 항체의 농도 시리즈를 미세적정 플레이트의 웰에 포획시키고, 고정된 농도의 FcγRIIA, FcγRIIB 또는 FcγRIII과 함께 인큐베이션하거나, 또는 FcγRI로 코팅된 웰에 첨가하였다. 변이체 P329D-E430G, P329K-E430G 및 P329R-E430G는 FcγRI 결합을 백그라운드 수준으로 감소시켰고, K322E-E430G는 시험한 모든 FcγR 변이체에의 결합을 야생형 (WT) IgG1-005와 유사하게 보유하였다. 변이체 L234A/L235A/P329G/E430G (AAGG) 및 L234F/L235E/P329D/E430G (FEDG)는 시험한 모든 FcγR 변이체에의 결합을 백그라운드 수준으로 감소시켰다.
도 18은 Fc-Fc 상호작용 증진 돌연변이를 갖는 IgG1-캄파트 또는 IgG1-11B8 변이체의 CDC 효능에 대한 아미노산 P329 치환의 효과를 제시한다. Wien 133 세포 를 20% 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에 CD20 및 CD52 항체의 혼합물의 농도 시리즈와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 (상부 패널) 프로피듐 아이오다이드 (PI)-양성 세포 백분율에 의해 결정된 용해 백분율 및 (하부 패널) 용량 반응-반응 곡선하 면적으로 제시되고, 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12 (0%), 및 IgG1-캄파트-E430G + IgG1-11B8-E430G의 혼합물 (100%)에 대해 정규화된다.
도 19는 Fc-Fc 상호작용 증진 돌연변이를 갖는 IgG1-캄파트 또는 IgG1-11B8 변이체의 CDC 효능에 대한 아미노산 K322 치환의 효과를 도시한다. Wien 133 세포를 20% 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에 CD20 및 CD52 항체의 혼합물의 농도 시리즈와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 (상부 패널) 프로피듐 아이오다이드 (PI)-양성 세포 백분율에 의해 결정된 용해 백분율 및 (하부 패널) 용량 반응-반응 곡선하 면적으로 제시되고, 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12 (0%), 및 IgG1-캄파트-E430G + IgG1-11B8-E430G의 혼합물 (100%)에 대해 정규화된다.
도 20은 Fc-Fc 상호작용 증진 돌연변이를 갖는 IgG1-캄파트 또는 IgG1-11B8 변이체에 의한 CDC 효능에 대한 아미노산 K322, K439 및 S440 치환의 효과를 제시한다. Daudi, Raji, Ramos, REH, U266B1, U-698-M, 및 Wien 133 세포를 20% 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에 단일 작용제 또는 혼합물로서 30.0 μg/mL의 CD20 및 CD52 항체와 함께 인큐베이션하였다. CDC 효능은 프로피듐 아이오다이드 (PI)-양성 세포 백분율에 의해 결정된 용해 백분율로 제시되고, 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12 (0%), 및 최고 용해를 유도한 항체에 따라 IgG1-캄파트-E430G (100%, REH, U266B1 및 Wien 133 세포의 경우) 또는 IgG1-11B8-E430G (100%, Daudi, Raji, Ramos 및 U-698-M 세포의 경우)에 대해 정규화된다. EGE = K322E/E430G/K439E; EGK = K322E/E430G/S440K.
도 21은 Fc-Fc-증진 돌연변이 E345R을 갖는 IgG1-SF2 변이체의 상대적 OX40 반응에 대한 아미노산 K322 또는 P329 치환의 효과를 제시한다. 해동-사용 글로리스판스(Thaw-and-Use GloResponse) NFκB-luc2/OX40 Jurkat 세포를 상이한 공급원으로부터의 5% 혈청 (최종)의 존재 하에 2.5 μg/mL 항체와 함께 5 시간 동안 인큐베이션하였다. OX40 검정 반응은 루시페라제 리포터 유전자의 발현을 유도하는 항-OX40 항체 또는 1.5 μg/mL OX40 리간드에 의한 OX40의 자극 이후에 검출된 발광으로 기록하였다. 발광 신호는 항체 없이 (0%) 및 OX40 리간드와 함께 (100%) 대조군 인큐베이션에 대해 측정된 반응에 대해 정규화된다. FBS: 태아 소 혈청; NHS: 정상 인간 혈청; WT: 야생형 IgG1-SF2 참조 항체.
도 22: 카바트(Kabat)에 제시된 EU 넘버링에 따라 넘버링된 바와 같이, 클러스탈(Clustal) 2.1 소프트웨어를 이용하여, IgG1 중쇄에서 잔기 P247 내지 K447에 상응하는 인간 IgG1, IgG1f, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 및 IgM Fc 세그먼트의 서열 정렬. 제시된 서열은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 (서열식별번호(SEQ ID NO):1; 유니프롯(UniProt) 수탁 번호 P01857)의 및 알로타입 변이체 IgG1m(f)의 잔기 130 내지 330; IgG2 중쇄 불변 영역 (서열식별번호:2; 유니프롯 수탁 번호 P01859)의 잔기 126 내지 326; 및 IgG3 중쇄 불변 영역 (서열식별번호:2; 유니프롯 수탁 번호 P01860)의 잔기 177 내지 377; 및 IgG4 중쇄 불변 영역 (서열식별번호:4; 유니프롯 수탁 번호 P01861)의 잔기 127 내지 327; 및 IgE 불변 영역 (유니프롯 수탁 번호 P01854)의 잔기 225-428; 및 IgA1 불변 영역 (유니프롯 수탁 번호 P01876)의 잔기 133-353; 및 IgA2 불변 영역 (유니프롯 수탁 번호 P01877)의 잔기 120-340; 및 IgM 불변 영역 (유니프롯 수탁 번호 P01871)의 잔기 230-452; 및 IgD 불변 영역 (유니프롯 수탁 번호 P01880)의 잔기 176-384를 나타낸다.
본 발명의 실시양태를 기재하는데 있어서, 명확성을 위해 특정한 용어가 사용될 것이다. 그러나, 본 발명은 그렇게 선택된 특정한 용어에 제한되는 것으로 의도되지 않고, 각각의 특정한 용어가 유사한 목적을 달성하기 위해 유사한 방식으로 작동하는 모든 기술적 등가물을 포함하는 것으로 이해한다.
정의
용어 "모 폴리펩티드" 또는 "모 항체"는, 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 항체와 동일한 폴리펩티드 또는 항체이지만, 모 폴리펩티드 또는 모 항체는 예를 들어 위치 E345, E430 또는 S440에서 Fc-Fc 증진 돌연변이인 제1 돌연변이를 가져, 그 결과 증가된 Fc-Fc-매개된 올리고머화, 증가된 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC를 갖고, 다른 증진된 이펙터 기능을 또한 가질 수 있는 것으로 이해한다.
용어 "이뮤노글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드"는 본 발명의 문맥상 이뮤노글로불린의 Fc-영역, 및 예를 들어 세포, 박테리아 또는 비리온 상에 존재하는 임의의 분자, 예컨대 폴리펩티드에 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이뮤노글로불린의 Fc-영역은 이뮤노글로불린의 2개의 CH2-CH3 영역 및 연결 영역, 예를 들어 힌지 영역을 포함하는, 전형적으로 항체를 파파인 (관련 기술분야의 기술자에게 공지됨)으로 소화시킨 후에 생성되는 항체의 단편으로 정의된다. 항체 중쇄의 불변 도메인은 항체 이소타입, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 또는 IgE를 정의한다. Fc-영역은 Fc 수용체로 불리는 세포 표면 수용체 및 보체계의 단백질에 의해 항체의 이펙터 기능을 매개한다. 결합 영역은 세포, 박테리아 또는 비리온에 결합할 수 있는 폴리펩티드 서열, 예컨대 단백질, 단백질 리간드, 수용체, 항원-결합 영역, 또는 리간드-결합 영역일 수 있다. 결합 영역이 예를 들어 수용체인 경우에는, "이뮤노글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드"가 이뮤노글로불린의 Fc-영역 및 상기 결합 영역의 융합 단백질로서 제조될 수 있었다. 결합 영역이 항원-결합 영역인 경우에는, "이뮤노글로불린의 Fc-도메인 및 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드"가 항체, 예컨대 키메라, 인간화 또는 인간 항체 또는 중쇄 단독 항체 또는 ScFv-Fc-융합체일 수 있다. 이뮤노글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드는 전형적으로 연결 영역, 예를 들어 힌지 영역, 및 이뮤노글로불린의 중쇄의 2개의 CH2-CH3 영역을 포함할 수 있고, 따라서 "이뮤노글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드"는 "적어도 이뮤노글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드"일 수 있다. 용어 "이뮤노글로불린의 Fc-영역"은 본 발명의 문맥상, 연결 영역, 예를 들어 항체의 아형에 따라 힌지, 및 이뮤노글로불린의 CH2 및 CH3 영역이 존재하는 것을 의미하며, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2, IgM 또는 IgE이다. 폴리펩티드는 인간 기원에 제한되지는 않으나, 임의의 기원, 예컨대 마우스 또는 시노몰구스 기원일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fc-영역", "Fc 영역", "Fc-도메인" 및 "Fc 도메인"은 항체의 단편 결정화가능한 영역을 지칭하는 것으로 의도된다. 상이한 용어들이 상호교환적으로 사용될 수 있고, 본 발명의 임의의 측면 또는 실시양태와 관련하여 동일한 의미 및 목적을 구성한다. 용어 "모 폴리펩티드" 또는 "모 항체"는 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 항체와 동일한 폴리펩티드 또는 항체이지만, 모 폴리펩티드 또는 모 항체는 제2 돌연변이를 수반하지 않지만, 예를 들어 위치 E345, E430 또는 S440에서 Fc-Fc 증진 돌연변이인 제1 돌연변이를 가져, 그 결과 모 폴리펩티드 또는 모 항체가 증가된 Fc-Fc-매개된 올리고머화, 증가된 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC를 갖고, 다른 증진된 이펙터 기능을 또한 가질 수 있는 것으로 이해한다. 상기 나타낸 바와 같이, 달리 명시하지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는다면, 용어 "모 폴리펩티드" 또는 "모 항체"는 제1 Fc-Fc 증진 돌연변이를 갖지만, Fc 이펙터 기능(들)을 감소시키는 제2 돌연변이는 갖지 않는 폴리펩티드 또는 항체를 지칭한다. 따라서, 폴리펩티드 또는 항체는 "모 폴리펩티드" 또는 "모 항체"와 비교 시 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 힌지 영역을 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 EU 넘버링에 따른 아미노산 216-230에 상응한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CH2 영역" 또는 "CH2 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH2 영역을 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH2 영역은 EU 넘버링에 따른 아미노산 231-340에 상응한다. 그러나, CH2 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 다른 아형 중 임의의 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CH3 영역" 또는 "CH3 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH3 영역을 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH3 영역은 EU 넘버링에 따른 아미노산 341-447에 상응한다. 그러나, CH3 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 다른 아형 중 임의의 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이뮤노글로불린"은, 1개 쌍의 저분자량 경쇄 (L) 및 1개 쌍의 중쇄 (H)의 2개 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어지며, 모든 4개는 디술피드 결합에 의해 잠재적으로 상호-연결된 것인, 구조상 관련된 당단백질의 부류를 지칭한다. 이뮤노글로불린의 구조는 널리 특징분석되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다. 간략히, 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 중쇄는 소위 "힌지 영역"에서 디술피드 결합을 통해 상호 연결된다. 각각의 경쇄는 전형적으로 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로도 지칭되는 더욱 보존된 영역 사이에 삽입된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 지칭되는 초가변성인 영역 (또는 구조적으로 정의된 루프의 서열 및/또는 형태에서 초가변성일 수 있는 초가변 영역)으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서부터 카르복시-말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)] 또한 참조). 달리 명시되지 않거나 문맥상 모순되지 않는 한, 본 발명에서 불변 영역에서의 아미노산 위치에 대한 지칭은 EU-넘버링에 따른다 (Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - 1991 NIH Publication No. 91-3242).
본 발명의 문맥에서 용어 "항체" (Ab)는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 단편, 또는 이들의 유도체를 지칭한다. 본 발명의 항체는 이뮤노글로불린의 Fc-도메인 및 항원-결합 영역을 포함한다. 항체는 일반적으로 2개의 CH2-CH3 영역 및 연결 영역, 예를 들어 힌지 영역, 예를 들어 적어도 Fc-도메인을 함유한다. 따라서, 본 발명의 항체는 Fc 영역 및 항원-결합 영역을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 또는 "Fc" 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예컨대 면역계의 다양한 세포 (예컨대, 이펙터 세포) 및 보체계의 보체, 예컨대 보체 활성화의 전형적인 경로에서의 제1 성분인 C1q에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 또한 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체 또는 유사한 분자일 수 있다. 용어 "이중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한, 전형적으로 중복되지 않는 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 에피토프는 동일한 또는 상이한 표적 상에 있을 수 있다. 에피토프가 상이한 표적 상에 있는 경우, 이러한 표적은 동일한 세포 또는 상이한 세포 또는 세포 유형 상에 있을 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 달리 명시하지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는다면, 본원에서 용어 항체에는 적어도 Fc-영역의 일부분을 포함하고 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 항체의 단편이 포함된다. 이러한 단편은 임의의 공지된 기술, 예컨대 효소적 절단, 펩티드 합성 및 재조합 발현 기술에 의해 제공될 수 있다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 제시되어 있다. 용어 "Ab" 또는 "항체" 내에 포함되는 결합 단편의 예에는 비제한적으로 일가 항체 (젠맵(Genmab)에 의한 WO2007059782에 기재됨); 2개의 중쇄만으로 이루어지며, 예를 들어 낙타에서 천연 발생되는 중쇄 항체 (예를 들어, Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446); 티오맙(ThioMabs) (로쉐(Roche), WO2011069104), 비대칭의 이중특이적 항체-유사 분자인 가닥-교환 조작된 도메인 (SEED 또는 시드-바디(Seed-body)) (머크(Merck), WO2007110205); 트리오맙(Triomab) (파마(Pharma)/프레세니우스 바이오테크(Fresenius Biotech), Lindhofer et al. 1995 J Immunol 155:219; WO2002020039); FcΔAdp (리제너론(Regeneron), WO2010151792), 아지메트릭(Azymetric) 스캐폴드 (자임웍스(Zymeworks)/머크, WO2012/058768), mAb-Fv (제노코어(Xencor), WO2011/028952), Xmab (제노코어), 이중 가변 도메인 이뮤노글로불린 (애보트(Abbott), DVD-Ig, 미국 특허 번호 7,612,181); 이중 도메인 더블 헤드 항체 (유니레버(Unilever); 사노피 아벤티스(Sanofi Aventis), WO20100226923), 디-디아바디(Di-diabody) (임클론(ImClone)/일라이 릴리(Eli Lilly)), 놉-인투-홀(Knobs-into-holes) 항체 포맷 (제넨테크(Genentech), WO9850431); 듀오바디(DuoBody) (젠맵, WO 2011/131746); 이중특이적 IgG1 및 IgG2 (화이자(Pfizer)/ 리나트(Rinat), WO11143545), 듀오맙(DuetMab) (메드이뮨(MedImmune), US2014/0348839), 정전기적 스티어링 항체 포맷 (암젠(Amgen), EP1870459 및 WO 2009089004; 쥬가이(Chugai), US201000155133; 온코메드(Oncomed), WO2010129304A2); 이중특이적 IgG1 및 IgG2 (리나트 뉴로사이언시스 코퍼레이션(Rinat neurosciences Corporation), WO11143545), 크로스맙(CrossMAbs) (로쉐, WO2011117329), LUZ-Y (제넨테크), 바이클로닉(Biclonic) (메루스(Merus), WO2013157953), 이중 표적화 도메인 항체 (GSK/도만티스(Domantis)), 2개의 표적을 인식하는 투인원(Two-in-one) 항체 또는 이중 작용 Fab (제넨테크, 노브이뮨(NovImmune), 아디맙(Adimab)), 교차-연결된 Mabs (카르마노스 캔서 센터(Karmanos Cancer Center)), 공유적으로 융합된 mAbs (AIMM), 코브엑스-바디(CovX-body) (코브엑스/화이자), 피노맙(FynomAbs) (코바겐(Covagen)/얀센 아이래그(Janssen ilag)), 듀타맙(DutaMab) (듀탈리스(Dutalys)/로쉐), iMab (메드이뮨), IgG-유사 이중특이적 (임클론/일라이 릴리, Shen, J., et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 65-74), TIG-바디, DIG-바디 및 PIG-바디 (파맙신(Pharmabcine)), 이중-친화도 재표적화 분자 (Fc-DART 또는 Ig-DART, 마크로제닉스(Macrogenics), WO/2008/157379, WO/2010/080538), BEAT (글렌마크(Glenmark)), 자이바디스(Zybodies) (자인제니아(Zyngenia)), 공통된 경쇄를 이용하는 접근법 (크루셀(Crucell)/메루스, US7262028) 또는 공통된 중쇄를 이용하는 접근법 (카파람다바디스(κλBodies), 노브이뮨, WO2012023053), 뿐만 아니라 Fc-도메인을 함유하는 항체 단편에 융합된 폴리펩티드 서열을 함유하는 융합 단백질, 예컨대 scFv-융합체, 예컨대 BsAb (자이모제네틱스(ZymoGenetics)/BMS), 허큘레스(HERCULES) (바이오젠 아이덱(Biogen Idec)) (US007951918), 스콜피온스(SCORPIONS) (이머전트 바이오솔루션즈(Emergent BioSolutions)/트루비온(Trubion) 및 자이모제네틱스/BMS), Ts2Ab (메드이뮨/AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p. 672-92), scFv 융합체 (제넨테크(Genetech)/로쉐), scFv 융합체 (노바티스(Novartis)), scFv 융합체 (이뮤노메딕스(Immunomedics)), scFv 융합체 (창저우 아담 바이오텍 인크(Changzhou Adam Biotech Inc)) (CN 102250246), TvAb (로쉐) (WO 2012025525, WO 2012025530), mAb2 (에프-스타(f-Star)) (WO2008/003116), 및 이중 scFv-융합체가 포함된다. 또한, 달리 명시되지 않는다면, 용어 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (예컨대, 인간 모노클로날 항체), 항체 혼합물 (재조합 폴리클로날), 예를 들어 심포젠(Symphogen) 및 메루스 (올리고클로닉스(Oligoclonics))에 의해 개발된 기술에 의해 생성된 것, WO2015/158867에 기재된 다합체성 Fc 단백질, WO2014/031646에 기재된 융합 단백질, 및 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체를 또한 포함하는 것으로 이해해야 한다. 생성된 항체는 잠재적으로 임의의 이소타입을 가질 수 있다.
본원에 사용될 때 용어 "전장 항체"는 해당 이소타입의 야생형 항체에서 정상적으로 발견되는 것들에 상응하는 모든 중쇄 및 경쇄 불변 및 가변 도메인을 함유하는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 삽입 또는 결실). 그러나, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 배선로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그라프팅된 항체는 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 쇄 유형 둘 다가 항체 조작의 결과로서 키메라인 항체를 지칭한다. 키메라 쇄는 인간 기원의 불변 영역에 연결된 외인성 가변 도메인 (비-인간 종으로부터 기원하거나, 또는 인간을 비롯한 임의의 종으로부터 합성되거나 조작됨)을 함유하는 쇄이다. 키메라 쇄의 가변 도메인은 전체적으로 분석할 때 인간보다는 비-인간 종에 더 가까운 V 영역 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 쇄 유형 둘 다가 항체 조작의 결과로서 인간화된 것인 항체를 지칭한다. 인간화 쇄는 전형적으로 가변 도메인의 상보성 결정 영역 (CDR)이 외인성 (인간 이외의 한 종으로부터 기원하거나, 또는 합성됨)인 반면에, 나머지 쇄는 인간 기원인 것인 쇄이다. 인간화 평가는 이용된 그라프팅 이외의 프로토콜을 허용하는 방법 자체가 아니라 생성된 아미노산 서열을 기준으로 한다. 인간화 쇄의 가변 도메인은 전체적으로 분석할 때 다른 종보다는 인간 종에 더 가까운 V 영역 아미노산 서열을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체", "모노클로날 Ab", "모노클로날 항체 조성물", "mAb" 등은 단일 분자 조성을 갖는 Ab 분자의 제조물을 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 제시한다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 제시하는 Ab를 지칭한다. 인간 mAb는 기능적 인간 항체를 생성하도록 재배열되고 불멸화 세포에 융합된, 인간 중쇄 트랜스진 레파토리 및 경쇄 트랜스진 레파토리를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 비-인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 이뮤노글로불린 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2, IgE 또는 IgM 또는 그의 임의의 알로타입, 예컨대 IgG1m(za) 및 IgG1m(f))를 지칭한다. 추가로, 각각의 중쇄 이소타입을 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 경쇄와 조합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혼합된 이소타입"은 한 이소타입과 또 다른 이소타입의 유사한 영역의 구조적 특징을 조합하여 하이브리드 이소타입을 생성함으로써 생성된 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 지칭한다. 혼합된 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2, IgE 또는 IgM으로부터 선택된 2가지 이상의 이소타입으로 구성된 서열을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있고, 이로써 예를 들어 IgG1/IgG3, IgG1/IgG4, IgG2/IgG3, IgG2/IgG4 또는 IgG1/IgA와 같은 조합을 생성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원-결합 영역", "항원 결합 영역", "결합 영역" 또는 항원 결합 도메인은 항원에 결합할 수 있는 항체의 영역을 지칭한다. 이 결합 영역은 전형적으로 프레임워크 영역 (FR)으로도 지칭되는 더욱 보존된 영역 사이에 삽입된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 지칭되는 초가변성인 영역 (또는 구조적으로 정의된 루프의 서열 및/또는 형태에서 초가변성일 수 있는 초가변 영역)로 추가로 세분될 수 있는 항체의 VH 및 VL 도메인에 의해 정의된다. 항원은 예를 들어 세포, 박테리아 또는 비리온 상에 존재하는 임의의 분자, 예컨대 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적"은 항체의 항원 결합 영역이 결합하는 분자를 지칭한다. 표적은 상승된 항체가 향하는 임의의 항원을 포함한다. 용어 "항원" 및 "표적"은 항체와 관련하여 상호교환적으로 사용될 수 있고, 본 발명의 임의의 측면 또는 실시양태와 관련하여 동일한 의미 및 목적을 구성할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체 가변 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 보통 분자, 예컨대 아미노산, 당 측쇄 또는 이들의 조합물의 표면 그룹으로 구성되며, 보통 특이적인 3차원의 구조적 특징, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. 구조적 및 비-구조적 에피토프는, 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합은 손실되지만 후자에 대한 결합은 손실되지 않는다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 수반되는 아미노산 잔기 (에피토프의 면역우세 성분으로도 지칭됨) 및 결합에 직접 수반되지 않는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
용어 본 발명의 "항체 변이체" 또는 "모 항체의 변이체"는 "모 항체"와 비교 시 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 항체 분자이다. 상기 상이한 용어들이 상호교환적으로 사용될 수 있고, 본 발명의 임의의 측면 또는 실시양태와 관련하여 동일한 의미 및 목적을 구성할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 "이뮤노글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변이체" 또는 "이뮤노글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역을 포함하는 모 폴리펩티드의 변이체"는 "이뮤노글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역을 포함하는 모 폴리펩티드"와 비교 시 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 "이뮤노글로불린의 Fc-영역 및 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드"이다. 상기 상이한 용어들이 상호교환적으로 사용될 수 있고, 본 발명의 임의의 측면 또는 실시양태와 관련하여 동일한 의미 및 목적을 구성할 수 있다. 예시적인 돌연변이에는 모 아미노산 서열에서 아미노산의 아미노산 결실, 삽입 및 치환이 포함된다. 아미노산 치환은 본래의 아미노산을 또 다른 천연 발생 아미노산 또는 비-천연 발생 아미노산 유도체로 교체할 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 또는 비-보존적일 수 있다. 본 발명의 문맥상, 보존적 치환은 하기 3개의 표 중 하나 이상에 반영된 아미노산의 부류 내에 있는 치환으로 정의될 수 있다:
보존적 치환을 위한 아미노산 잔기 부류
Figure pct00001
대안적인 보존적 아미노산 잔기 치환 부류
Figure pct00002
아미노산 잔기의 대안적인 물리적 및 기능적 분류
Figure pct00003
본 발명의 문맥에서, 변이체에서의 치환은 하기와 같이 나타낸다:
원래의 아미노산 - 위치 - 치환된 아미노산;
아미노산 잔기를 나타내기 위해 코드 Xaa 및 X를 비롯한 3개 문자 코드 또는 1개 문자 코드가 사용된다. 따라서, 표기 "E345R" 또는 "Glu345Arg"는, 변이체가 모 항체의 위치 345 아미노산에 상응하는 변이체 아미노산 위치에서 글루탐산의 아르기닌으로의 치환을 포함함을 의미한다.
이러한 위치가 항체에 존재하지 않지만, 변이체가 아미노산의 삽입을 포함하는 경우에는, 예를 들어 위치 - 치환된 아미노산으로 나타내고, 예를 들어 표기 "448E"가 사용된다.
이러한 표기는 일련의 상동성 폴리펩티드 또는 항체에서의 변형(들)과 특별한 관련이 있다.
유사하게, 치환 아미노산 잔기(들)의 실체가 없는 경우에는, 원래의 아미노산 - 위치; 또는 "E345"로 나타낸다.
원래의 아미노산(들) 및/또는 치환된 아미노산(들)이 모두는 아니지만 1개 초과의 아미노산(들)을 포함할 수 있는 변형의 경우, 위치 345에서 글루탐산의 아르기닌, 리신 또는 트립토판으로의 치환: "Glu345Arg,Lys,Trp" 또는 "E345R,K,W" 또는 "E345R/K/W" 또는 "E345에서 R, K 또는 W"는 본 발명의 문맥에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
추가로, 용어 "치환"은 다른 19개의 천연 아미노산 중 임의의 하나로의 치환 또는 비천연 아미노산과 같은 다른 아미노산으로의 치환을 포괄한다. 예를 들어, 위치 345에서 아미노산 E의 치환은 하기 각각의 치환을 포함한다: 345A, 345C, 345D, 345G, 345H, 345F, 345I, 345K, 345L, 345M, 345N, 345P, 345Q, 345R, 345S, 345T, 345V, 345W 및 345Y. 이는 표기 345X와 동등하며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타낸다. 이들 치환은 또한 E345A, E345C 등, 또는 E345A,C 등, 또는 E345A/C/등으로 표기될 수 있다. 이러한 치환 중 임의의 하나를 본원에 구체적으로 포함시키기 위해, 본원에 언급된 각각의 모든 위치에 동일하게 적용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이펙터 세포"는 면역 반응의 인식 및 활성화 단계와는 대조적으로 면역 반응의 이펙터 단계에 수반되는 면역 세포를 지칭한다. 예시적인 면역 세포에는 골수성 또는 림프구성 기원의 세포, 예를 들어 림프구 (예컨대, B 세포 및 T 세포, 예컨대 세포용해성 T 세포 (CTL)), 킬러 세포, 천연 킬러 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 다형핵 세포, 예컨대 호중구, 과립구, 비만 세포, 및 호염기구가 포함된다. 일부 이펙터 세포는 Fc 수용체 (FcR) 또는 보체 수용체를 발현하고, 특이적인 면역 기능을 수행한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포, 예를 들어 천연 킬러 세포는 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현하는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포 및 쿠퍼(Kupffer) 세포는 표적 세포의 특이적인 사멸, 및 면역계의 다른 성분에 대한 항원 제시, 또는 항원을 제시하는 세포로의 결합에 수바된다. 일부 실시양태에서, ADCC는 표적 세포 상에서 활성화된 C3 단편의 침착을 초래하는, 항체 유도된 전형적인 보체 활성화에 의해 추가로 증진될 수 있다. C3 절단 생성물은 골수 세포 상에서 발현되는 보체 수용체 (CR), 예컨대 CR3에 대한 리간드이다. 이펙터 세포 상에서 CR에 의한 보체 단편의 인식은 증진된 Fc 수용체-매개된 ADCC를 촉진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 유도된 전형적인 보체 활성화는 표적 세포 상에서 C3 단편을 유도한다. 이들 C3 절단 생성물은 직접적인 보체-의존성 세포성 세포독성 (CDCC)을 촉진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 입자 또는 표적 세포를 식균할 수 있다. 이펙터 세포 상에서의 특정한 FcR 또는 보체 수용체의 발현은 체액성 인자, 예컨대 시토카인에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FcγRI의 발현은 인터페론 γ (IFN γ) 및/또는 G-CSF에 의해 상향조절되는 것으로 확인되었다. 이 증진된 발현은 표적에 대한 FcγRI-보유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원을 식균할 수 있거나, 또는 표적 세포를 식균하거나 용해시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 유도된 전형적인 보체 활성화는 표적 세포 상에서 C3 단편을 유도한다. 이들 C3 절단 생성물은 이펙터 세포에 의한 직접적인 식균작용을 촉진시키거나 또는 항체 매개된 식균작용을 증진시킴으로써 간접적으로 촉진시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 이펙터 기능"은 세포 막 상에서의 폴리펩티드 또는 항체와 그의 표적, 예컨대 항원의 결합의 결과인 기능을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기서 Fc 이펙터 기능은 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 영역에서 기인한다. Fc 이펙터 기능의 예에는 (i) C1q-결합, (ii) 보체 활성화, (iii) 보체-의존성 세포독성 (CDC), (iv) 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC), (v) Fc-감마 수용체-결합, (vi) 항체-의존성 세포성 식균작용 (ADCP), (vii) 보체-의존성 세포성 세포독성 (CDCC), (viii) 보체-증진된 세포독성, (ix) 항체에 의해 매개된 옵소닌화 항체의 보체 수용체로의 결합, (x) 옵소닌화, 및 (xi) (i) 내지 (x)의 임의의 조합이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "감소된 Fc 이펙터 기능(들)"은 동일한 검정에서 모 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 이펙터 기능과 직접적으로 비교 시 폴리펩티드 또는 항체에 대해 감소된 Fc 이펙터 기능을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "클러스터링-의존성 기능"은 그들의 항원에 결합된 폴리펩티드 또는 항체의 올리고머화 이후에, 임의적으로 세포 상에서, 세포 막 상에서, 비리온 상에서, 또는 또 다른 입자 상에서, 항원 복합체 형성의 결과인 기능을 지칭하는 것으로 의도된다. 클러스터링-의존성 이펙터 기능의 예에는 (i) 항체 올리고머 형성, (ii) 항체 올리고머 안정성, (iii) 항원 올리고머 형성, (iv) 항원 올리고머 안정성, (v) 아폽토시스 유도, (vi) 증식 조정, 예컨대 증식 감소, 억제 또는 자극, (vii) 신호전달의 조정, 예컨대 단백질 인산화 감소, 억제 또는 자극, 및 (viii) (i) 내지 (vii)의 임의의 조합이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 벡터에 라이게이션된 핵산 세그먼트의 전사를 유도할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 원형 이중 가닥 DNA 루프의 형태를 갖는다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터이며, 여기서 핵산 세그먼트는 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 특정한 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터, 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터 (예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈을 따라 복제된다. 더욱이, 특정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용성을 갖는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태를 갖는다. 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터의 형태이기 때문에, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 것으로 의도되며, 이들은 동등한 기능으로 작용한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 용어가 특정한 대상체 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도됨을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정한 변형이 후세대에서 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손이 모세포와 실제로 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"의 범위 내에는 여전히 포함된다. 재조합 숙주 세포에는 예를 들어 트랜스펙토마, 예컨대 CHO 세포, HEK-293 세포, PER.C6, NS0 세포, 및 림프구 세포, 및 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 진핵 숙주, 예컨대 식물 세포 및 진균이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스펙토마"에는 Ab 또는 표적 항원을 발현하는 재조합 진핵 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포, PER.C6, NS0 세포, HEK-293 세포, 식물 세포, 또는 진균, 예컨대 효모 세포가 포함된다.
용어 "제제"는 세포와 회합된 항원 (예를 들어, 세포의 표면 상에서 발현된 항원), 세포 막, 비리온 또는 다른 구조체와 상호작용할 때 올리고머를 형성하는 능력을 증가시켜, 항원에 의한 증진된 신호전달 및/또는 활성화를 초래할 수 있는 항체 변이체 및 상이한 항체 변이체 혼합물의 제제를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "친화도"는 단일 부위에서, 예컨대 항체의 개별 항원 결합 부위와 항원의 1가 결합에서, 한 분자, 예를 들어 항체와 또 다른 것, 예를 들어 표적 또는 항원의 결합 강도를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결합력"은 표적과 동시에 상호작용하는 2개의 구조체 사이에서, 예컨대 항체의 다중 항원 결합 부위 사이에서, 또는 예를 들어 항체와 C1q 사이에서 다중 결합 부위들의 합한 강도를 지칭한다. 하나 초과의 결합 상호작용이 존재하는 경우, 2개의 구조체는 모든 결합 부위가 해리될 때에만 해리될 것이고, 따라서 해리 속도는 개별 결합 부위에 대한 것보다 느릴 것이고, 이로써 개별 결합 부위의 결합 강도 (친화도)와 비교 시 더 큰 효과적인 총 결합 강도 (결합력)가 제공될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고머"는 적어도 원칙적으로 개수에 제한이 없는 단량체로 구성된 중합체와는 대조적으로 1개 초과이지만 개수가 제한된 단량체 단위 (예를 들어, 항체)로 구성된 분자를 지칭한다. 예시적인 올리고머는 이합체, 삼합체, 사합체, 오합체 및 육합체이다. 올리고머에서 단량체 단위의 개수를 표기하기 위해 그리스어 접두사가 종종 사용되며, 예를 들어 사합체는 4개의 단위로 구성되고, 육합체는 6개의 단위로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고머화"는 단량체를 한정된 중합 정도로 전환시키는 과정을 지칭하는 것으로 의도된다. 여기서 본 발명에 따른 표적-결합 영역을 포함하는 폴리펩티드, 항체 및/또는 다른 이합체성 단백질은 예를 들어 세포 표면에서 표적 결합 후에 Fc-영역의 비공유 회합을 통해 올리고머, 예컨대 육합체를 형성할 수 있다. 항체의 올리고머화는 예를 들어 Fc-Fc 증진 돌연변이, 예컨대 E430G 또는 E345R을 함유하는 항-DR5 항체를 사용하는 세포 생존력 검정으로 평가될 수 있다 (실시예 13에 기재됨). 폴리펩티드 또는 항체의 Fc-Fc-매개된 올리고머화는 이웃 폴리펩티드 또는 항체 사이의 Fc-영역의 분자간 회합을 통해 (세포) 표면 상에서 표적 결합 후에 발생하고, E430, E345 또는 S440에 상응하는 아미노산에서의 제1 돌연변이의 도입에 의해 증가되나, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이다. 따라서, (세포) 표면 상에서의 표적 결합 시 Fc-Fc-매개된 올리고머화의 형성은 Fc-Fc 상호작용을 차단하는 펩티드 DCAWHLGELVWCT를 사용하는 검정으로 결정될 수 있다. 올리고머화의 유도는 검정에서 하기 그룹들의 반응을 비교함으로써 평가할 수 있다; 그룹 I) 야생형 Fc-영역을 갖는 항체, 그룹 II) 본 발명에 따른 제1 돌연변이, 예를 들어 E430G를 포함하는 것을 제외하고는 그룹 I)의 항체와 동일한 항체, 그룹 III) 본 발명에 따른 제1 돌연변이, 예를 들어 E430G를 포함하는 것을 제외하고는 그룹 I)의 항체와 동일한 항체와 조합된 DCAWHLGELVWCT 펩티드, 그룹 IV) 본 발명에 따른 제1 돌연변이, 예를 들어 E430G 및 본 발명에 따른 제2 돌연변이, 예를 들어 P329D를 포함하는 것을 제외하고는 그룹 I)의 항체와 동일한 항체. 그룹 I 및 그룹 II의 반응을 비교함으로써, 증진된 올리고머화의 반응을 평가할 수 있다. 그룹 II 및 III의 반응을 비교함으로써, 증진된 올리고머화를 차단하는 반응을 평가할 수 있다. 그룹 II 및 IV의 반응을 비교함으로써, 증진된 올리고머화가 유지되었는지 여부를 평가할 수 있다. 올리고머화에 의존성인 반응의 평가에 사용하기에 적합한 검정은 항체가 결합하는 표적 항원에 따라 좌우되며, 이는 관련 기술분야의 기술자에게 명백하다. 따라서, 프로그래밍된 세포 사멸 (PCD)을 유도하는 표적 항원, 예컨대 세포내 사멸 도메인을 갖는 TNFR-SF, 예를 들어 DR5, FAS, DR4 및 TNFR1에 결합하는 항체의 경우, 올리고머화를 결정하는데 적합한 검정은 실시예 13에 기재된 바와 같은 생존력 검정일 수 있다. 생존력 검정은 상기 기재된 검정 그룹, 즉, 그룹 I, 그룹 II, 그룹 III 및/또는 그룹 IV에 따른 항체의 존재 하에 BxPC-3 세포 상에서 수행될 수 있다. BxPC-3 세포를 상기 기재된 검정 그룹에 따른 항체 5 μg/mL 또는 10 μg/mL와 함께 37℃에서 3 일 동안 인큐베이션한다. 생존가능한 세포의 백분율은 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 발광 세포 생존력 검정 (프로메가(Promega), 카탈로그 번호 G7571)에서 결정할 수 있다. 공동-자극성 면역 수용체, 예컨대 사멸 도메인이 없는 TNFR-SF, 예를 들어 OX40, CD40, CD30, CD27, 4-1BB, RANK 및 GITR에 결합하는 항체의 경우, 올리고머화를 결정하는데 적합한 검정은 NFAT 리포터 생물검정일 수 있다. NFAT 리포터 생물검정은, 관련 기술분야의 기술자에게 명백한 표적 항원을 안정하게 발현하는 Jurkat NFAT 리포터 세포, 예컨대 NFAT 반응 요소의 조절 하에 루시페라제 리포터 유전자를 발현하고 상기 기재된 검정 그룹, 즉, 그룹 I, 그룹 II 그룹 III 및 그룹 IV의 존재 하에 OX40의 막 발현을 갖는 NFκB-luc2/OX40 Jurkat 세포를 이용하여 수행될 수 있다. NFκB-luc2/OX40 Jurkat 세포를 상기 기재된 검정 그룹에 따른 항체 1.5 또는 5 μg/mL와 함께 37℃에서 1 일 동안 인큐베이션한다. OX40의 활성화에 의해 유도된 루시페라제 발현은 발광 신호를 측정함으로써 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "클러스터링"은 비공유 상호작용을 통한 항체, 폴리펩티드, 항원 또는 다른 단백질의 올리고머화를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fc-Fc 증진"은 폴리펩티드가 표적 결합 시 올리고머를 형성하도록, 2개의 Fc-영역 함유 항체 또는 폴리펩티드의 Fc 영역들의 결합 강도를 증가시키거나 또는 이들 사이의 상호작용을 안정화시키는 것을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C1q 결합"은 C1q와 그의 항원에 결합된 항체의 결합의 측면에서 C1q의 결합을 지칭하는 것으로 의도된다. 그의 항원에 결합된 항체는 본원에 기재된 문맥상 생체내 및 시험관내 둘 다에서 일어나는 것으로 이해되어야 한다. C1q 결합은 예를 들어 인공적인 표면 상에 고정된 항체를 이용함으로써 또는 세포성 또는 비리온 표면 상에서 미리 결정된 항원에 결합된 항체를 이용함으로써 평가될 수 있다 (실시예 3 및 11에 기재됨). C1q와 항체 올리고머의 결합은 높은 결합력 결합을 초래하는 다가 상호작용인 것으로 본원에서 이해되어야 한다. 예를 들어 폴리펩티드 또는 항체에서의 제2 돌연변이의 도입으로부터 초래되는 C1q 결합의 감소는, 실시예 3에 예시된 바와 같이 동일한 검정 내에서 C1q와 폴리펩티드 또는 항체의 결합을 C1q와 제2 돌연변이가 없는 그의 모 폴리펩티드 또는 항체의 결합과 비교함으로써 측정될 수 있다. 간략히, 항체의 항원-결합 영역에 결합하는 표적 항원을 발현하는 적합한 기원의 세포가 이 검정에서 사용될 수 있고, 이러한 세포주 또는 세포 유형은 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 암 세포 상의 표적 항원, 예를 들어 DR5에 결합하는 항체의 경우에는, 암 세포, 예를 들어 BxPC-3 인간 췌장암 세포 (ATCC CRL-1687)가 상기 검정에서 적합할 수 있다. 반면에, T 세포 상에서 발현되는 OX-40에 결합하는 항체의 경우에는, T 세포, 예를 들어 Jurkat 인간 T 세포 (ATCC TIB-152)가 상기 검정에서 적합할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 감소된 C1q 결합은 폴리스티렌 둥근-바닥 96-웰 플레이트에서 1x106 mL 농도의 적절한 세포를 i) 20% C4-고갈된 혈청의 존재 하에 본 발명에 따른 제1 및 제2 돌연변이를 포함하는 항체에 대한 농도 시리즈 (0.0003-100 μg/mL); 및 ii) 20% C4-고갈된 혈청의 존재 하에 제1 돌연변이를 포함하지만 제2 돌연변이는 포함하지 않는 모 항체에 대한 농도 시리즈 (0.0003-100 μg/mL)와 함께 인큐베이션함으로써 평가될 수 있으며, 여기서 i) 및 ii)에서의 항체를 적절한 세포와 함께 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, 표지된 항-인간 C1q 항체, 예를 들어 FITC-표지된 토끼 항-HuC1q와 함께 인큐베이션하고, 유동세포 분석에 의해 C1q 결합을 결정한다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체의 감소된 C1q 결합은, 100 μL PBS 중에서 96-웰 마이크롤론(Microlon) ELISA 플레이트 (그라이너(Greiner), 카탈로그 번호 655092)를 i) 본 발명에 따른 제1 및 제2 돌연변이를 포함하는 항체의 희석 시리즈 (0.001 - 20 μg/mL); 및 ii) 제1 돌연변이를 포함하지만 제2 돌연변이는 포함하지 않는 항체의 희석 시리즈 (0.001 - 20 μg/mL)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 후속적으로 인큐베이션 사이에 세척하면서 검출 항체로서 0.025% 트윈(Tween) 20 및 0.1% 젤라틴으로 보충된 200 μL/웰 0.5x PBS와 함께 RT에서 1 시간 동안 (차단), 100 μL의 3% NHS (산퀸(Sanquin), 참조 M0008AC)와 함께 37℃에서 1 시간 동안, 100 μL의 토끼 항-인간 C1q (다코(DAKO), 카탈로그 번호 A0136, 1/4.000)와 함께 RT에서 1 시간 동안, 및 100 μL의 돼지 항-토끼 IgG-서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) (다코, 카탈로그 번호 P0399, 1/10.000)와 함께 RT에서 1 시간 동안; 및 최종적으로 1 mg/mL의 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)을 갖는 100 μL의 기질 (ABTS; 로쉐, 카탈로그 번호 11112 597001)과 함께 RT에서 약 15 분 동안 인큐베이션하고, 100 μL의 2% 옥살산을 첨가하여 반응을 중단시키고, 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써, C1q 결합 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에서 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보체 활성화"는 표면 상에서 항체-항원 복합체에 결합하는 C1로 불리는 큰 거대분자 복합체에 의해 개시되는 전형적인 보체 경로의 활성화를 지칭한다. C1은 6개 인식 단백질 C1q, 및 세린 프로테아제의 이종-사합체, C1r2C1s2로 이루어진 복합체이다. C1은 C4에서 C4a 및 C4b로의 절단 및 C2에서 C2a 및 C2b로의 절단을 시작하는 일련의 절단 반응을 수반하는 전형적인 보체 캐스케이드의 초기 사건에 있는 제1 단백질 복합체이다. C4b가 침착하여 C2a와 함께 C3 전환효소로 불리는 효소 활성 전환효소를 형성하며, 이는 보체 성분 C3을 C3b 및 C3a로 절단하여, C5 전환효소를 형성한다. 이 C5 전환효소는 C5를 C5a 및 C5b로 분할하고, 마지막 성분이 막 상에 침착하여, 말단 보체 성분 C5b, C6, C7, C8 및 C9가 막 공격 복합체 (MAC)로 조립되는 보체 활성화의 후기 사건을 촉발시킨다. 보체 캐스케이드는 보체-의존성 세포독성 (CDC)으로도 공지된 세포 용해를 초래하기 때문에 공극을 생성한다. 보체 활성화는 C1q 효능, CDC 반응속도론 CDC 검정 (WO2013/004842, WO2014/108198에 기재됨)을 이용함으로써 또는 Beurskens et al. April 1, 2012 vol. 188 no. 7 3532-3541에 기재된 C3b 및 C4b의 세포 침착 방법에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보체-의존성 세포독성" ("CDC")은, MAC 조립체에 의해 생성된 막에 있는 공극으로 인해 세포 또는 비리온 상의 그의 표적에 결합한 항체의 용해를 유도하는 항체-매개된 보체 활성화의 과정을 지칭하는 것으로 의도된다. CDC는 시험관내 검정, 예컨대 실시예 2, 3, 4 및 6에 기재된 바와 같이 또는 C1q 농도 시리즈에서 정상 인간 혈청이 보체 공급원으로 사용되는 CDC 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드 또는 항체에서의 제2 돌연변이의 도입으로부터 초래되는 CDC 활성의 감소는 실시예 3 및 4에 예시된 바와 같이 동일한 검정 내에서 폴리펩티드 또는 항체의 CDC 활성을 제2 돌연변이가 없는 그의 모 폴리펩티드 또는 항체의 CDC 활성과 비교함으로써 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체-의존성 세포-매개된 세포독성" ("ADCC")은 결합된 항체의 불변 영역을 인식하는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 의해 항체-코팅된 표적 세포 또는 비리온을 사멸시키는 메카니즘을 지칭하는 것으로 의도된다. ADCC는 실시예 10에 기재된 ADCC 검정 또는 실시예 9에 기재된 발광 ADCC 리포터 생물검정과 같은 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드 또는 항체에서의 제2 돌연변이의 도입으로부터 초래되는 ADCC 활성의 감소는 실시예 10 및 9에 예시된 바와 같이 동일한 검정 내에서 폴리펩티드 또는 항체의 ADCC 활성을 제2 돌연변이가 없는 그의 모 폴리펩티드 또는 항체의 ADCC 활성과 비교함으로써 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체-의존성 세포성 식균작용" ("ADCP")은 식균세포에 의한 내재화에 의해 항체-코팅된 표적 세포 또는 비리온을 제거하는 메카니즘을 지칭하는 것으로 의도된다. 내재화된 항체-코팅된 표적 세포 또는 비리온은 파고솜으로 불리는 소낭에 함유된 다음, 하나 이상의 리소솜과 융합되어, 파고리소솜을 형성한다. ADCP는 문헌 [van Bij et al. in Journal of Hepatology Volume 53, Issue 4, October 2010, Pages 677-685]에 기재된 바와 같이 이펙터 세포로서 대식세포 및 비디오 현미경을 사용하는 시험관내 세포독성 검정을 이용함으로써 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보체-의존성 세포성 세포독성" ("CDCC")은 항체-매개된 보체 활성화로 인해 표적 세포 또는 비리온에 공유 결합된 보체 3 (C3) 절단 생성물을 인식하는 보체 수용체를 발현하는 세포에 의해 표적 세포 또는 비리온을 사멸시키는 메카니즘을 지칭하는 것으로 의도된다. CDCC는 ADCC에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈장 반감기"는 제거하는 동안 (분포 단계 이후에) 혈액 혈장에서 폴리펩티드의 농도를 그의 초기 농도의 절반으로 감소시키는데 걸리는 시간을 나타낸다. 항체의 경우, 분포 단계는 전형적으로 1 - 3 일일 것이고, 이 단계 동안에 혈장과 조직 사이의 재분포로 인해 혈액 혈장 농도에서의 약 50% 감소가 일어난다. 혈장 반감기는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈장 클리어런스율"은 살아있는 유기체에 투여 시 폴리펩티드가 혈액으로부터 제거되는 속도의 정량적인 척도이다. 혈장 클리어런스율은 용량/AUC (mL/일/kg)로 계산될 수 있으며, 여기서 AUC 값 (곡선하 면적)은 농도-시간 곡선으로부터 측정된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체-약물 접합체"는 적어도 하나의 유형의 악성 세포, 약물, 및 약물을 예를 들어 항체에 커플링시키는 링커에 대해 특이성을 갖는 항체 또는 Fc-함유 폴리펩티드를 지칭한다. 링커는 악성 세포의 존재 하에 절단가능하거나 또는 비-절단가능할 수 있으며, 여기서 항체-약물 접합체는 악성 세포를 사멸시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체-약물 접합체 흡수"는 항체-약물 접합체가 세포 상에서 표적에 결합한 후, 세포 막에 의해 흡수/탐식되고, 이로써 세포로 들어가는 과정을 지칭한다. 항체-약물 접합체 흡수는 WO 2011/157741에 기재된 바와 같이 "시험관내 사멸 검정에서 항-TF ADC에 의한 항체-매개된 내재화 및 세포 사멸"로서 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아폽토시스"는 세포에서 일어날 수 있는 프로그래밍된 세포 사멸 (PCD) 과정을 지칭한다. 생화학적 사건은 특징적인 세포 변화 (형태) 및 사멸을 유도한다. 이들 변화에는 수포 형성, 세포 수축, 핵 단편화, 염색질 응축 및 염색체 DNA 단편화가 포함된다. 항체와 특정한 수용체의 결합은 아폽토시스를 유도할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로그래밍된 세포-사멸" 또는 "PCD"는 세포내 프로그램에 의해 매개된 임의의 형태의 세포 사멸을 지칭한다. 상이한 형태의 PCD가 존재하고, 다양한 유형의 PCD는, 세포내 신호전달을 방해함으로써 차단될 수 있는 활성 세포 과정에 의해 실행된다는 점에서 공통적이다. 특정한 실시양태에서, 세포 또는 조직에서 임의의 형태의 PCD의 발생은 세포 또는 조직을 접합된 아넥신 V로 염색하고, 포스파티딜세린 노출과 연관시킴으로써 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아넥신 V"는 세포 표면 상에서 포스파티딜세린 (PS)에 결합하는 아넥신 그룹의 단백질을 지칭한다.
Fc-수용체 결합은 실시예 9에 기재된 바와 같이 간접적으로 측정될 수 있다. Fc-수용체 결합은 실시예 21에 기재된 바와 같이 간접적으로 측정될 수 있다. 예를 들어 시험 항체 또는 폴리펩티드에서의 제2 돌연변이의 도입으로부터 초래되는 Fc-수용체 결합의 감소는 실시예 21에 예시된 바와 같이 동일한 검정 내에서 폴리펩티드 또는 항체의 ADCC 활성을 추가적인 돌연변이가 없는 그의 모 폴리펩티드 또는 항체의 ADCC 활성과 비교함으로써 측정될 수 있다.
용어 "Fc-감마 수용체", "Fc-감마R", "Fcγ 수용체", "FcγR"은 Fc-감마 수용체의 부류를 기재하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이 부류의 수용체에는 몇몇 패밀리 구성원, FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b)가 포함되고, 이들의 상이한 분자 구조로 인한 그들의 항체 친화도에서 차이가 있다. FcγRI은 FcγRII 또는 FcγRIII에 비해 IgG에 더 강력하게 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "FcRn"은 Fc 수용체인 신생아 Fc 수용체를 지칭하는 것으로 의도된다. 이는 모유로부터 신생아 설치류의 소화관의 상피를 거쳐 신생아 혈류로 IgG를 수송할 수 있는 독특한 수용체로서 설치류에서 처음 발견되었다. 추가의 연구를 통해 인간에서 유사한 수용체가 밝혀졌다. 그러나, 이는 인간에서는 태반에서 모체의 IgG를 성장중인 태아에게 수송하는 것을 용이하게 하는데 도움이 되는 것으로 발견되었고, 이는 또한 IgG 전환을 모니터링하는 역할을 하는 것으로 제시되어 있다. FcRn은 6.0-6.5의 산성 pH에서 IgG에 결합하지만, 중성 또는 더 높은 pH에서는 결합하지 않는다. 따라서, FcRn은 약간 산성인 pH에서 장관 (소화관의 내부)으로부터의 IgG에 결합하며, 여기서 pH는 중성 내지 염기성인 (pH 7.0-7.5) 기저측 (신체 내부)으로의 효율적인 단일방향 수송을 보장한다. 이 수용체는 또한 내피 세포에서 엔도시토시스 경로에서 그의 발생을 통해 IgG의 성인 샐비지에서 소정의 역할을 한다. 산성 엔도솜에서 FcRn 수용체는 음세포작용을 통해 내재화된 IgG에 결합하여, 이를 세포 표면으로 재순환시키고, 혈액의 염기성 pH에서 이를 방출시켜, 리소솜성 분해를 겪는 것을 방지한다. 이 메카니즘은 다른 이소타입과 비교 시 혈액에서의 IgG의 더 큰 반감기에 대한 설명을 제공할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 A"는 박테리아 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포 벽에서 원래 발견되는 56 kDa MSCRAMM 표면 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다. 이는 spa 유전자에 의해 코딩되고, 그의 조절은 DNA 위상 배치, 세포 삼투성, 및 ArlS-ArlR로 불리는 2-성분 시스템에 의해 제어된다. 이는 이뮤노글로불린에 결합하는 그의 능력 때문에 생화학 연구에서 사용되었다. 이는 3개의 헬릭스 번들로 폴딩된 5개의 상동성 Ig-결합 도메인으로 구성된다. 각각의 도메인은 여러 포유류 종으로부터의 단백질, 가장 주목할만하게는 IgG에 결합할 수 있다. 이는 대부분의 이뮤노글로불린의 중쇄 Fc 영역 (FcRn 수용체의 보존된 결합 부위와 중복됨)에 결합하고, 또한 인간 VH3 패밀리의 Fab 영역과 상호작용한다. 혈청에서 이들 상호작용을 통해, IgG 분자는 오직 그들의 Fab 영역만을 통해서가 아니라 그들의 Fc 영역을 통해 박테리아에 결합하고, 이로써 박테리아는 옵소닌화, 보체 활성화 및 식균작용을 방해한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 G"는 단백질 A와 매우 유사하지만 상이한 특이성을 갖는, 그룹 C 및 G 연쇄상구균 박테리아에서 발현되는 이뮤노글로불린-결합 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다. 이는 Fc 영역으로의 결합을 통해 항체를 정제하는데 사용되었던 65-kDa (G148 단백질 G) 및 58 kDa (C40 단백질 G) 세포 표면 단백질이다.
발명의 구체적 실시양태
본 발명은 표적 세포의 표면 상에 있는 상응하는 항원에 결합할 때 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖고, 따라서 항원에 결합 시 올리고머를 형성하지만, 결합 시 올리고머, 예컨대 육합체를 형성하는 폴리펩티드 및 항체에서 정상적으로 발견되는 증진된 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC 및/또는 ADCC는 갖지 않는 폴리펩티드 및 항체 치료제에 대한 요구의 발견에 기초한다. 놀랍게도, 발명자들은 아미노산 위치 E430, E345 또는 S440 중 하나에 상응하는 제1 돌연변이를 갖는 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 영역에서의 아미노산 위치 K322 또는 P329에 상응하는 제2 돌연변이를 도입함으로써, 제1 돌연변이만을 갖고 제2 돌연변이는 갖지 않는 동일한 모 폴리펩티드 또는 항체와 비교 시 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC 및/또는 ADCC는 감소되면서 증진된 Fc-Fc 상호작용을 유지시킬 수 있음을 발견하였다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 이펙터 기능이 심지어 야생형 폴리펩티드 또는 항체, 즉, 제1 및 제2 돌연변이를 갖지 않지만 그 외에는 동일한 폴리펩티드 또는 항체에서 발견되는 것보다 낮은 수준으로 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 돌연변이의 도입은 Fc 이펙터 기능을 야생형 폴리펩티드 또는 항체에서 발견되는 수준에 필적하는 또는 그보다 낮은 수준으로 감소시켰다. 일부 실시양태에서, 제2 돌연변이의 도입은 Fc 이펙터 기능을 제1 돌연변이만을 갖는 동일한 항체 또는 폴리펩티드, 즉, 모 폴리펩티드 또는 항체에서 발견되는 수준에 필적하는 또는 그보다 낮은 수준으로 감소시켰다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 IgG의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체로서, 여기서 Fc 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응하는 (i) 제1 돌연변이 및 (ii) 제2 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다:
i. E430, E345 또는 S440에서의 제1 돌연변이, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임; 및
ii. K322 또는 P329에서의 제2 돌연변이.
아미노산 위치 E430, E345 또는 S440 중 하나에 있는 본 발명에 따른 제1 돌연변이는 폴리펩티드 또는 항체에서 증진된 Fc-Fc 상호작용 및 올리고머화의 효과를 도입한다. 추가로, 폴리펩티드 또는 항체의 항원 결합 영역이 상응하는 표적 항원에 결합할 때, 증진된 올리고머화가 일어난다. 증진된 올리고머화는 올리고머, 예컨대 육합체를 생성한다. 올리고머 구조체, 예컨대 육합체의 생성은 폴리펩티드 또는 항체의 C1q 결합 결합력을 증가시킴으로써 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC 및/또는 ADCC를 증가시키는 효과를 갖는다. 아미노산 위치 K322 또는 P329 중 하나에 있는 본 발명에 따른 제2 돌연변이는 폴리펩티드 또는 항체에서 감소된 Fc 이펙터 기능의 효과를 도입한다. 이러한 감소된 Fc 이펙터 기능은 예를 들어 감소된 C1q 결합 또는 CDC 활성일 수 있다. 따라서, 제2 돌연변이는 제1 돌연변이에 의해 도입된 증진된 Fc 이펙터 기능을 중화시키고, 이로써 증진된 Fc-Fc 상호작용 및 올리고머화를 갖지만 증가된 Fc 이펙터 기능은 갖지 않는 폴리펩티드 또는 항체를 생성할 수 있다. 즉, Fc 이펙터 기능이 제1 돌연변이를 갖지만 제2 돌연변이는 갖지 않는 폴리펩티드 또는 항체와 비교 시 감소된다. 야생형 폴리펩티드 또는 항체가 증가된 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC를 갖는 일부 예에서, 제1 및 제2 돌연변이의 도입은 올리고머화 수준을 증가시킬 수 있는 반면에, CDC 수준은 야생형 폴리펩티드 또는 항체에서 발견되는 것보다 낮은 수준으로 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 항체는 Fc 이펙터 기능이 바람직하지 않을 때, 예를 들어 이펙터 세포를 활성화시킬 때 특별한 이점을 갖는다.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 L234 및 L235에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 포함하지 않는다. 즉, 본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1에서의 L234 및 L235에 상응하는 위치에서 야생형 아미노산 L 및 L을 포함하며, 여기서 위치는 EU 넘버링에 따른 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 제1 및 제2 돌연변이를 포함하며, 단, Fc 영역은 L234 및 L235에 상응하는 위치에서의 L 및 L을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W 및 S440Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G 또는 E345K로부터 선택된다. 본원에서 세포 표면 항원 결합 시 폴리펩티드 또는 항체의 증진된 올리고머화를 가능하게 하는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 Fc-Fc 증진 돌연변이인 적어도 하나의 돌연변이 및 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 즉, 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 i) E430, E345 또는 S440에 상응하는 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임, 및 적어도 하나의 ii) K322 또는 P329에 상응하는 아미노산 위치에서의 제2 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 상기 언급된 제1 돌연변이 중 하나는 제1 및/또는 제2 중쇄 중 하나에 존재할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 제1 돌연변이는 제1 및 제2 중쇄 둘 다에 존재한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 제1 돌연변이 및 제2 돌연변이는 제1 및 제2 중쇄 둘 다에 존재한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 제1 돌연변이는 제1 및 제2 중쇄에 존재하고, 제2 돌연변이는 제1 및 제2 중쇄 둘 다에 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 K322E, K322D, K322N, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 K322E이다. 본원에는 하나 이상의 Fc 이펙터 기능(들)을 억제할 수 있는 실시양태가 제공된다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 제1 돌연변이에 의해 증가된 Fc 이펙터 기능을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 제1 돌연변이에 의해 증가된 Fc 이펙터 기능을 부분적으로 감소시킨다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체에서의 제2 돌연변이는 제1 돌연변이를 갖지만 제2 돌연변이는 갖지 않는 폴리펩티드 또는 항체, 즉, 모 폴리펩티드 또는 모 항체에서 발견되는 것보다 낮은 수준으로 Fc 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체에서의 제2 돌연변이는 제1 및 제2 돌연변이를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 항체, 즉, 야생형 폴리펩티드 또는 항체에서 발견되는 것에 필적하는 또는 그보다 낮은 수준으로 Fc 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 상기 언급된 제2 돌연변이 중 하나는 제1 및/또는 제2 중쇄에 존재한다.
한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 K322E, K322D 및 K322N의 군으로부터 선택되고, CDC, CDCC, 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 K322E, K322D 및 K322N의 군으로부터 선택되고, C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 K322E이고, CDC, CDCC, 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 K322E이고, C1q 결합을 감소시킨다.
한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y의 군으로부터 선택되고, ADCC, ADCP, FcγR 결합, CDC, CDCC, 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y의 군으로부터 선택되고, ADCC, FcγR 결합, CDC, 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329R, P329K, P329D, P329E 및 P329G의 군으로부터 선택되고, ADCC, ADCP, FcγR 결합, CDC, CDCC 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329R이고, ADCC, ADCP, FcγR 결합, CDC, CDCC, 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329R이고, ADCC, ADCP, FcγR 결합, CDC, CDCC, 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329R이고, ADCC, FcγR 결합, CDC, 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329K이고, ADCC, FcγR 결합, CDC, 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329D이고, ADCC, FcγR 결합, CDC, 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329E이고, ADCC, FcγR 결합, CDC, 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329G이고, ADCC, FcγR 결합, CDC, 및/또는 C1q 결합을 감소시킨다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329A이다. 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329A이며, 이는 ADCC를 감소시키지만, CDC를 감소시키지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 위치 P329에 있으며, 단, 제2 돌연변이는 P329A가 아니다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 아미노산 위치 P329에 있으며, 단, 제2 돌연변이는 P329A 또는 P329G가 아니다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 P329R인 제2 돌연변이를 포함하며, 단, 폴리펩티드 또는 항체는 인간 IgG1에서의 L234 및 L235에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제2 돌연변이는 P329R, P329K 및 P329D의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430에 상응하는 아미노산 위치에 있고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
(i) K322E, K322D 및 K322N, 또는;
(ii) P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 E430에 상응하는 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이를 포함하고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
(i) K322E, K322D 및 K322N, 또는;
(ii) P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y; 단, Fc 영역은 L234 및 L235에 상응하는 위치에서의 L 및 L을 포함함.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430에 상응하는 아미노산 위치에 있고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
i. K322E, K322D 및 K322N, 또는;
ii. P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430에 상응하는 아미노산 위치에 있고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
(i) K322E, K322D 및 K322N, 또는;
(ii) P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G, E430S, E430F 및 E430T로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
(i) K322E, K322D 및 K322N, 또는;
(ii) P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 E430G인 제1 돌연변이, 및 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 돌연변이를 포함하며, 여기서 Fc 영역은 L234 및 L235에 상응하는 위치에서의 아미노산 L 및 L을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 K322E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 K322D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 K322N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329H이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329K이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329R이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329M이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329F이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329G이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329I이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329L이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329Q이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329S이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329T이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329V이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329W이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329Y이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G이고, 제2 돌연변이는 P329A이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345에 상응하는 아미노산 위치에 있고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
(i) K322E, K322D 및 K322N, 또는;
(ii) P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 E345에 상응하는 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이를 포함하고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
(i) K322E, K322D 및 K322N, 또는;
(ii) P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y; 단, Fc 영역은 L234 및 L235에 상응하는 위치에서의 L 및 L을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345에 상응하는 아미노산 위치에 있고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
i. K322E, K322D 및 K322N, 또는;
ii. P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345에 상응하는 아미노산 위치에 있고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
(i) K322E, K322D 및 K322N, 또는;
(ii) P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K, E345R 및 E345Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
(i) K322E, K322D 및 K322N, 또는;
(ii) P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 K322E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 K322D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 K322N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329H이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329K이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329R이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329M이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329F이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329G이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329I이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329L이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329Q이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329S이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329T이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329V이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329W이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329Y이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345K이고, 제2 돌연변이는 P329A이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 K322E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 K322D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 K322N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329H이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329K이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329R이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329M이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329F이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329G이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329I이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329L이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329Q이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329S이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329T이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329V이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329W이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329Y이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430S이고, 제2 돌연변이는 P329A이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 K322E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 K322D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 K322N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329H이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329K이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329R이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329M이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329F이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329G이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329I이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329L이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329Q이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329S이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329T이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329V이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329W이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329Y이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430F이고, 제2 돌연변이는 P329A이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 K322E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 K322D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 K322N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329H이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329K이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329R이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329M이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329F이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329G이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329I이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329L이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329Q이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329S이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329T이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329V이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329W이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329Y이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430T이고, 제2 돌연변이는 P329A이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 K322E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 K322D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 K322N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329H이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329K이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329R이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329M이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329F이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329G이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329I이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329L이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329Q이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329S이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329T이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329V이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329W이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329Y이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Q이고, 제2 돌연변이는 P329A이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 K322E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 K322D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 K322N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329H이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329K이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329R이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329M이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329F이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329G이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329I이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329L이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329Q이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329S이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329T이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329V이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329W이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329Y이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345R이고, 제2 돌연변이는 P329A이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 K322E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 K322D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 K322N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329H이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329K이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329R이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329M이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329F이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329G이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329I이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329L이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329Q이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329S이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329T이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329V이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329W이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329Y이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E345Y이고, 제2 돌연변이는 P329A이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y 및 S440W로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
(i) K322E, K322D 및 K322N, 또는;
(ii) P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y 및 S440W로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
(i) K322E, K322D 및 K322N, 또는;
(ii) P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y; 단, Fc 영역은 234 및 235에 상응하는 위치에서의 L 및 L을 포함함.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y 및 S440W로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
i. K322E, K322D 및 K322N, 또는;
ii. P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y 및 S440W로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 돌연변이는 하기로 이루어진 군 중 하나로부터 선택된다:
(i) K322E, K322D 및 K322N, 또는;
(ii) P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 K322E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 K322D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 K322N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329H이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329K이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329R이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329M이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329F이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329G이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329I이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329L이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329Q이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329S이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329T이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329V이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329W이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329Y이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440W이고, 제2 돌연변이는 P329A이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 K322E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 K322D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 K322N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329H이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329K이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329R이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329D이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329M이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329F이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329G이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329I이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329L이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329N이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329Q이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329S이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329T이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329V이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329W이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329Y이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 S440Y이고, 제2 돌연변이는 P329A이다.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함한다. Fc 영역은 CH2 도메인, CH3 도메인 및 임의적으로 힌지 영역을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 CH2 또는 CH3 도메인에서의 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 돌연변이는 CH2 도메인에 있다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 돌연변이는 CH3 도메인에 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 하기를 포함한다:
(i) Fc-Fc 증진 돌연변이인 제1 돌연변이;
(ii) Fc 이펙터 기능(들)을 억제하는 제2 돌연변이;
(iii) 동일한 추가의 돌연변이를 갖는 Fc 영역 사이의 올리고머화를 방지하는 추가의 돌연변이.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 K439에 상응하는 CH3 도메인에서의 추가의 돌연변이를 포함하거나, 또는 제1 돌연변이가 위치 S440에 있지 않은 경우에는 추가의 돌연변이가 위치 S440에 있을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 위치 S440 또는 K439 중 하나에 상응하는 CH3 도메인에서의 추가의 돌연변이를 포함하며, 단, 제1 돌연변이는 S440에 있지 않다. 본 발명에 따른 제1 및 제2 돌연변이, 및 위치 S440에서의 추가의 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체는 위치 S440에서의 추가의 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체와 올리고머를 형성하지 않는다. 본 발명에 따른 제1 및 제2 돌연변이 및 위치 K439에서의 추가의 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체는 위치 K439에서의 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체와 올리고머를 형성하지 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 추가의 돌연변이는 S440K 또는 K439E로부터 선택된다. K439E 또는 S440K인 추가의 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체는 동일한 돌연변이를 갖는 폴리펩티드와 올리고머를 형성하지 않는다. 이론에 구애되지 않고, K439E 및 S440K는 상보성 돌연변이로 보일 수 있으며, 따라서 K439E 돌연변이를 포함하는 Fc 영역은 K439E 돌연변이를 포함하는 또 다른 Fc 영역과 Fc-Fc 상호작용을 형성하지 않을 것이다. 그러나, K439E 돌연변이를 포함하는 Fc 영역은 S440K 돌연변이를 포함하는 또 다른 Fc 영역과 Fc-Fc 상호작용을 형성한다. 동일한 상황이 S440K 돌연변이를 포함하는 Fc 영역에서 발견되며, 이는 S440K 돌연변이를 포함하는 또 다른 Fc 영역과 Fc-Fc 상호작용을 형성하지 않을 것이다. 따라서, K439E 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체는 대안적인 방식으로 S440K 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체와 올리고머를 형성할 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 (i) 제1 돌연변이, (ii) 제2 돌연변이, (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응한다:
(i) 제1 돌연변이 E430, E345 또는 S440, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임;
(ii) E322 또는 P329에서의 제2 돌연변이;
(iii) K439 또는 S440에서의 추가의 돌연변이, 단, 추가의 돌연변이가 S440에 있는 경우에는 제1 돌연변이는 S440이 아님.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 (i) 제1 돌연변이, (ii) 제2 돌연변이, (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응하고:
(i) 제1 돌연변이 E430, E345 또는 S440, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임;
(ii) E322 또는 P329에서의 제2 돌연변이;
(iii) 추가의 K439E 또는 S440K 돌연변이, 단, 추가의 돌연변이가 S440K인 경우에는 제1 돌연변이는 S440에 있지 않음;
여기서 Fc 영역은 L234 및 L235에 상응하는 위치에서 야생형 아미노산 L 및 L을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 (i) E430에 상응하는 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이, 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(ii) K322E, K322D, K322N, P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y;
(iii) K439E 및 S440K.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 (i) E430에 상응하는 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이, 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(ii) K322E, K322D, K322N, P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y;
(iii) K439E 및 S440K;
여기서 Fc 영역은 L234 및 L235에 상응하는 위치에서 야생형 아미노산 L 및 L을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 (i) 제1 돌연변이, 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (ii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) E430G, E430S, E430F 및 E430T;
(ii) K322E, K322D, K322N, P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y;
(iii) K439E 및 S440K.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 (i) E345에 상응하는 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(ii) K322E, K322D, K322N, P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y;
(iii) K439E 및 S440K;
여기서 Fc 영역은 L234 및 L235에 상응하는 위치에서 야생형 아미노산 L 및 L을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 (i) 제1 돌연변이, 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제1, 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) E345K, E345R 및 E345Y;
(ii) K322E, K322D, K322N, P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y;
(iii) K439E 및 S440K.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 (i) 제1 돌연변이, 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제1, 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) S440W 및 S440Y;
(ii) K322E, K322D, K322N, P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y;
(iii) K439E.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 K439E 또는 S440K에 상응하는 육합체화-억제 돌연변이인 추가의 돌연변이를 포함한다. 즉, 본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 육합체화 증진 돌연변이, 예컨대 E430G, 및 육합체화-억제 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 육합체화 증진 돌연변이, 예컨대 E345K, 및 육합체화-억제 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 육합체화 증진 돌연변이, 예컨대 E430G, 및 육합체화-억제 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 육합체화 증진 돌연변이, 예컨대 E345K, 및 육합체화-억제 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함한다. 본원에는 K439E 돌연변이를 포함하는 항체와 S440K 돌연변이를 포함하는 항체의 조합 사이에서만 독점적인 육합체화를 허용하는 실시양태가 제공된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 항체는 적어도 제1 및 제2 돌연변이를 갖지만, 상기 기재된 바와 같이 폴리펩티드 또는 항체에 추가적인 기능을 도입하기 위해 추가적인 돌연변이를 또한 가질 수 있다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 최대 10개의 돌연변이, 예컨대 9개의 돌연변이, 예컨대 8개의 돌연변이, 예컨대 7개의 돌연변이, 예컨대 6개의 돌연변이, 예컨대 5개의 돌연변이, 예컨대 4개의 돌연변이, 예컨대 3개의 돌연변이 또는 예컨대 2개의 돌연변이를 포함한다.
본원에는 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체가 폴리펩티드 또는 항체에 추가적인 특징을 도입하는 추가적인 돌연변이를 갖는 것을 허용하는 실시양태가 제공된다. 추가로, 추가적인 돌연변이는 또한 Fc-Fc 상호작용에 수반되지 않는 위치에서, 뿐만 아니라 Fc 이펙터 기능에 수반되지 않는 위치에서 Fc 영역의 변화를 허용한다. 추가로, 추가적인 돌연변이는 대립유전자 변화로 인한 것일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 제2 돌연변이를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 항체와 동일한 모 폴리펩티드 또는 항체와 비교 시 적어도 20% 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는다. 이는 제1 및 제2 돌연변이를 갖는 폴리펩티드 또는 항체이이며, 여기서 제2 돌연변이는 제1 돌연변이만을 갖는 모 폴리펩티드 또는 항체와 비교 시 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 적어도 20% 감소시키는 효과를 갖는다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 제1 돌연변이만을 갖는 모 폴리펩티드 또는 항체와 비교 시 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 Fc 이펙터 기능을 유도하지 않는다.
본 발명에 따른 한 실시양태에서, 제1 및 제2 돌연변이를 갖는 폴리펩티드의 Fc 이펙터 기능 또는 활성에서의 감소는 상기 폴리펩티드를 동일한 항원 결합 영역, 및 Fc 영역에서의 동일한 제1 돌연변이를 갖지만 제2 돌연변이가 결여된 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드와 비교할 때임을 이해해야 한다.
본 발명에 따른 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 돌연변이를 갖는 폴리펩티드의 Fc 이펙터 기능 또는 활성에서의 감소는 상기 폴리펩티드를 동일한 항원 결합 영역 및 Fc 영역을 갖지만 Fc 영역에서의 제1 및 제2 돌연변이를 갖지 않는 모 폴리펩티드, 즉, 야생형 항체와 비교할 때임을 이해해야 한다.
본 발명에 따른 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 적어도 하나의 이펙터 기능을 감소시킨다. 본 발명에 따른 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 하나 초과의 이펙터 기능을 감소시킨다. 본 발명에 따른 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 CDC 활성을 감소시킨다. 본 발명에 따른 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 ADCC 활성을 감소시킨다. 또 다른 실시양태에서, 제2 돌연변이는 CDC 및 ADCC 활성을 감소시킨다. 본 발명에 따른 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 FcγRIIIa 신호전달을 감소시킨다. 본 발명에 따른 추가의 실시양태에서, 제2 돌연변이는 CDC 활성을 감소시키지만, ADCC 활성 또는 FcγRIIIa 신호전달은 감소시키지 않는다. 즉, 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 제2 돌연변이는 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키는 반면에, 다른 이펙터 기능에 대해서는 감소시키는 효과를 갖지 않는다. 본 발명에 따른 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 CDC 활성을 감소시키지만, 상당한 ADCC 활성을 여전히 보유한다.
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 이펙터 기능은 하기 군으로부터 선택된다; 보체-의존성 세포독성 (CDC), 보체-의존성 세포-매개된 세포독성, 보체 활성화, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포-매개된 식균작용, C1q 결합 및 FcγR 결합. 한 실시양태에서, Fc 이펙터 기능은 FcγRIIIa 신호전달이다. 즉, 본 발명에 따른 제2 돌연변이는 적어도 하나의 Fc 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다.
일부 제2 돌연변이는 하나 초과의 이펙터 기능에서의 감소를 제시한다. CDC 활성을 감소시키는 특정한 돌연변이는 또한 감소된 ADCC 활성 및 감소된 FcγRIIIa 결합을 특징으로 하였고, 이러한 돌연변이에는 P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y를 포함하는 군으로부터 선택된 돌연변이가 포함된다. 반면에 다른 돌연변이는 CDC 활성을 보유하지만 FcγRIIIa 결합을 감소시키고 ADCC 활성을 감소시키는 것으로 확인되었으며, 이러한 돌연변이에는 P329A를 포함하는 군으로부터의 것들이 포함된다. 일부 제2 돌연변이는 FcγRIa 결합을 제시하지 않았고, 예컨대 P329R 및 P329K이다. 일부 제2 돌연변이는 FcγRIa 결합에 대한 일부 감소를 제시하였고, 예컨대 P329G 및 P329A이다.
본원은 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 신규한 폴리펩티드 또는 항체-기반 치료제를 제공한다. 본 발명은 또한 Fc-Fc 증진된 폴리펩티드 또는 항체의 더욱 선택적인 Fc 이펙터 기능 능력을 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체, 단일특이적 항체, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 단일특이적 폴리펩티드, 이중특이적 폴리펩티드 또는 다중특이적 폴리펩티드이다.
본 발명의 폴리펩티드는 천연, 예를 들어 인간 Fc 도메인을 갖는 항체에 제한되지는 않으나, 이는 또한 본 발명의 돌연변이 이외의 다른 돌연변이, 예컨대 글리코실화에 영향을 미치거나 또는 항체를 이중특이적 항체로 만드는 돌연변이를 갖는 항체일 수 있다. 용어 "천연 항체"는 임의의 유전적으로 도입된 돌연변이를 포함하지 않는 임의의 항체를 의미한다. 따라서, 천연 발생 변형, 예를 들어 상이한 알로타입을 포함하는 항체는 본 발명의 관점에서 "천연 항체"로 이해되어야 하고, 따라서 모 항체로 이해될 수 있다. 이러한 항체는 본 발명에 따른 하나 이상의 돌연변이에 대한 주형으로서 작용할 수 있고, 이로써 본 발명의 변이체 항체를 제공할 수 있다. 본 발명의 돌연변이 이외의 다른 돌연변이를 포함하는 모 항체의 예는 IgG4-유사 CH3 영역을 포함하는 두 항체의 절반-분자 교환을 촉진시키기 위해 환원 조건을 이용하여, 응집물 형성을 수반하지 않고 이중특이적 항체를 형성하는 WO2011/131746 (젠맵)에 기재된 이중특이적 항체이다. 모 항체의 다른 예에는 이중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 이종이합체: 트리오맙 (프레세니우스); 이중특이적 IgG1 및 IgG2 (리나트 뉴로사이언시스 코퍼레이션); FcΔAdp (리제너론); 놉-인투-홀 (제넨테크); 정전기적 스티어링 (암젠, 쥬가이, 온코메드); 시드바디즈 (SEEDbodies, 머크); 아지메트릭 스캐폴드 (자임웍스); mAb-Fv (제노코어); 및 LUZ-Y (제넨테크)가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 다른 예시적인 모 항체 포맷에는 비제한적으로 야생형 항체, 전장 항체 또는 Fc-함유 항체 단편, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
폴리펩티드 또는 항체는 임의의 이소타입, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM 또는 IgA를 갖는 임의의 인간 항체, 임의적으로 인간 전장 항체, 예컨대 인간 전장 IgG1 항체일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 도 22에 제시된 Fc 세그먼트를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 세그먼트는 본원에 개시된 바와 같이 제1 돌연변이, 제2 돌연변이 및/또는 추가의 돌연변이 또는 제3 돌연변이를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 서열식별번호: 1에서 Fc 세그먼트를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 세그먼트는 본원에 개시된 바와 같이 제1 돌연변이, 제2 돌연변이 및/또는 추가의 돌연변이 또는 제3 돌연변이를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 서열식별번호: 2에서 Fc 세그먼트를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 세그먼트는 본원에 개시된 바와 같이 제1 돌연변이, 제2 돌연변이 및/또는 추가의 돌연변이 또는 제3 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 서열식별번호: 3에서 Fc 세그먼트를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 세그먼트는 본원에 개시된 바와 같이 제1 돌연변이, 제2 돌연변이 및/또는 추가의 돌연변이 또는 제3 돌연변이를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 서열식별번호: 4에서 Fc 세그먼트를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, Fc 세그먼트는 본원에 개시된 바와 같이 제1 돌연변이, 제2 돌연변이 및/또는 추가의 돌연변이 또는 제3 돌연변이를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 서열식별번호: 5에서 Fc 세그먼트를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 세그먼트는 본원에 개시된 바와 같이 제1 돌연변이, 제2 돌연변이 및/또는 추가의 돌연변이 또는 제3 돌연변이를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 서열식별번호: 6에서 Fc 세그먼트를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 세그먼트는 본원에 개시된 바와 같이 제1 돌연변이, 제2 돌연변이 및/또는 추가의 돌연변이 또는 제3 돌연변이를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 서열식별번호: 7에서 Fc 세그먼트를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 세그먼트는 본원에 개시된 바와 같이 제1 돌연변이, 제2 돌연변이 및/또는 추가의 돌연변이 또는 제3 돌연변이를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 서열식별번호: 8에서 Fc 세그먼트를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 세그먼트는 본원에 개시된 바와 같이 제1 돌연변이, 제2 돌연변이 및/또는 추가의 돌연변이 또는 제3 돌연변이를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 서열식별번호: 9에서 Fc 세그먼트를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 세그먼트는 본원에 개시된 바와 같이 제1 돌연변이, 제2 돌연변이 및/또는 추가의 돌연변이 또는 제3 돌연변이를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 서열식별번호: 10에서 Fc 세그먼트를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 세그먼트는 본원에 개시된 바와 같이 제1 돌연변이, 제2 돌연변이 및/또는 추가의 돌연변이 또는 제3 돌연변이를 추가로 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 인간 IgG1 항체, 예를 들어 IgG1m(za) 또는 IgG1m(f) 알로타입이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM, IgA 이소타입 또는 혼합된 이소타입인 Fc 영역을 갖는다. 즉, 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 영역은 적어도 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM, IgA 이소타입 또는 혼합된 이소타입에 상응하는 Fc 영역에 도입된 제1 및 제2 돌연변이를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 하기 군으로부터 선택된 혼합된 이소타입이다: IgG1/IgG2, IgG1/IgG3, IgG1/IgG4, IgG2/IgG3, IgG2/IgG4 및 IgG3/IgG4. 혼합된 이소타입에서, Fc 영역은 하나 초과의 이소타입으로부터의 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 Fc 영역을 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 인간 IgG1 이소타입인 Fc 영역을 갖는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 IgG1m(f), IgG1m(a), IgG1m(z), IgG1m(x) 알로타입 또는 혼합된 알로타입인 Fc 영역을 갖는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체은 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체이다.
종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 (TNFRSF)는 세포외 시스테인-풍부 도메인을 통해 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 (TNFSF)의 리간드에 결합하는 능력을 특징으로 하는 시토카인 수용체의 그룹이다. TNF 수용체는 원형질 막에서 삼합체성 복합체를 형성한다. TNFRSF에는 하기 29가지 단백질 목록이 포함된다; TNFR1 (유니프롯 P19438), FAS (유니프롯 P25445), DR3 (유니프롯 Q93038), DR4 (유니프롯 O00220), DR5 (유니프롯 O14763), DR6 (유니프롯 O75509), NGFR (유니프롯 P08138), EDAR (유니프롯 Q9UNE0), DcR1 (유니프롯 Q14798), DcR2 (유니프롯 Q9UBN6), DcR3 (유니프롯 O95407), OPG (유니프롯 O00300), TROY (유니프롯 Q92956), XEDAR (유니프롯 Q9HAV5), LTbR (유니프롯 P36941), HVEM (유니프롯 Q92956), TWEAKR (유니프롯 Q9NP84), CD120b (유니프롯 P20333), OX40 (유니프롯 P43489), CD40 (유니프롯 P25942), CD27 (유니프롯 P26842), CD30 (유니프롯 P28908), 4-1BB (유니프롯 Q07011), RANK (유니프롯 Q9Y6Q6), TACI (유니프롯 O14836), BLySR (유니프롯 Q96RJ3), BCMA (유니프롯 Q02223), GITR (유니프롯 Q9Y5U5), RELT (유니프롯 Q969Z4).
일부 TNFRSF는 아폽토시스에 수반되고, 세포내 사멸 도메인을 함유하며, 예컨대 FAS, DR4, DR5, TNFR1, DR6, DR3, EDAR 및 NGFR이다. 다른 TNFRSF는 다른 신호 변환 경로, 예컨대 증식, 생존 및 분화에 수반되며, 예컨대 DcR1, DcR2, DcR3, OPG, TROY, XEDAR, LTbR, HVEM, TWEAKR, CD120b, OX40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR, RELT이다. TNF 수용체는 포유류의 광범위한 조직에서, 특히 백혈구에서 발현된다.
한 실시양태에서, 항원 결합 영역은 TNFR-SF의 구성원에 결합한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 영역은 세포내 사멸 도메인을 포함하지 않는 TNFR-SF의 구성원에 결합한다. 한 실시양태에서, TNFR-SF는 OX40, CD40, CD30, CD27, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, RELT 및 GITR의 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, TNFR-SF는 FAS, DR4, DR4, TNFR1, DR6, DR3, EDAR 및 NGFR의 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 항체는 임의의 표적에 결합할 수 있고, 이러한 본 발명에 따른 표적 또는 항원의 예는 TNFR1, FAS, DR3, DR4, DR5, DR6, NGFR, EDAR, DcR1, DcR2, DcR3, OPG, TROY, XEDAR, LTbR, HVEM, TWEAKR, CD120b, OX40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR, RELT에 대한 것일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
다중특이적 항체
한 측면에서, 본 발명은 인간 IgG 및 제1 항원 결합 영역의 제1 Fc 영역, 인간 IgG 및 제2 항원 결합 영역의 제2 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체를 제공하며, 여기서 상기 제1 및 제2 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 위치에 상응하는 (i) 제1 돌연변이 및 (ii) 제2 돌연변이 및 (iii) 제3 돌연변이를 포함하며:
(i) E430, E345 또는 S440에서의 제1 돌연변이;
(ii) K322 또는 P329에서의 제2 돌연변이;
(iii) F405 또는 K409에서의 제3 돌연변이;
여기서 제3 돌연변이는, 제1 Fc 영역이 위치 F405에서 돌연변이를 갖는 경우에 제2 Fc 영역이 K409에서 돌연변이를 갖고 또한 그 반대로 갖도록, 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역과 상이하다.
본원은 (iii) 제3 돌연변이가 제1 및 제2 Fc 영역에서의 동일한 위치에 위치하지 않기 때문에, 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역이 동일하지 않은 실시양태를 제공한다.
본원에 기재된 본 발명의 임의의 실시양태가 하기 기재된 다중특이적 항체 측면에서 사용될 수 있는 것으로 이해해야 한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 변이체는 단일특이적 항체, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체로부터 선택된 항체이다.
특정한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 WO 2011/131746에 기재된 포맷을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제1 항원-결합 영역, 제2 항원-결합 영역, 및 이뮤노글로불린의 제1 CH2-CH3 중쇄 및 이뮤노글로불린의 제2 CH2-CH3 중쇄를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 또는 항체인 폴리펩티드 또는 항체에 관한 것으로서, 여기서 제1 및 제2 항원-결합 영역은 동일한 항원 상의 또는 상이한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하고, 여기서 제1 및/또는 제2 CH2-CH3 중쇄는 하기를 포함하며:
(i) 인간 IgG1 중쇄의 Fc 영역에서의 E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y 및 S440W에 상응하는 군으로부터 선택된 제1 돌연변이,
(ii) E322E, P329R, P329K, P329D에 상응하는 군으로부터 선택된 제2 돌연변이,
여기서 제1 CH2-CH3 중쇄는 인간 IgG1의 Fc 영역에서의 K409, T366, L368, K370, D399, F405 및 Y407에 상응하는 것들로부터 선택된 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고;
제2 CH2-CH3 중쇄는 인간 IgG1의 Fc 영역에서의 F405, T366, L368, K370, D399, Y407 및 K409에 상응하는 것들로부터 선택된 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드에서의 제3 돌연변이는 제2 폴리펩티드에서의 추가의 돌연변이와 상이하다.
본 발명의 이중특이적 항체는 특정한 포맷에 제한되지는 않고, 본원에 기재된 임의의 것들일 수 있다.
본 발명의 한 특정한 실시양태에서, (i) 제1 CH2-CH3 중쇄는 K409에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이, 예컨대 K409R을 포함하고; (ii) 제2 CH2-CH3 중쇄는 F405에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이, 예컨대 F405L을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 CH2-CH3 중쇄는 하기를 포함하며:
(i) E430G에 상응하는 제1 돌연변이,
(ii) E322E, K322D, K322N, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329f, P329G, P329I, P329L, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W, P329Y로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 돌연변이,
여기서 제1 CH2-CH3 중쇄는 K409R에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고;
제2 CH2-CH3 중쇄는 F405L에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 CH2-CH3 중쇄는 하기를 포함하며:
(iii) E430G에 상응하는 제1 돌연변이,
(iv) E322E에 상응하는 제2 돌연변이,
여기서 제1 CH2-CH3 중쇄는 K409R에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고; 제2 CH2-CH3 중쇄는 F405L에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 CH2-CH3 중쇄는 하기를 포함하며:
(i) E430G에 상응하는 제1 돌연변이,
(ii) P329R에 상응하는 제2 돌연변이,
여기서 제1 CH2-CH3 중쇄는 K409R에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고; 제2 CH2-CH3 중쇄는 F405L에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 CH2-CH3 중쇄는 하기를 포함하며:
(i) E430G에 상응하는 제1 돌연변이,
(ii) P329K에 상응하는 제2 돌연변이,
여기서 제1 CH2-CH3 중쇄는 K409R에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고;
제2 CH2-CH3 중쇄는 F405L에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 CH2-CH3 중쇄는 하기를 포함하며:
(i) E430G에 상응하는 제1 돌연변이,
(ii) P329D에 상응하는 제2 돌연변이,
여기서 제1 CH2-CH3 중쇄는 K409R에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고;
제2 Fc 영역은 F405L에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 CH2-CH3 중쇄는 하기를 포함하며:
(i) E345K에 상응하는 제1 돌연변이,
(ii) E322E, K322D, K322N, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329f, P329G, P329I, P329L, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W, P329Y로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 돌연변이,
여기서 제1 CH2-CH3 중쇄는 K409R에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고;
제2 CH2-CH3 중쇄는 F405L에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 CH2-CH3 중쇄는 하기를 포함하며:
(iii) E345K에 상응하는 제1 돌연변이,
(iv) E322E에 상응하는 제2 돌연변이,
여기서 제1 CH2-CH3 중쇄는 K409R에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고; 제2 CH2-CH3 중쇄는 F405L에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 CH2-CH3 중쇄는 하기를 포함하며:
(iii) E345K에 상응하는 제1 돌연변이,
(iv) P329R에 상응하는 제2 돌연변이,
여기서 제1 CH2-CH3 중쇄는 K409R에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고;
제2 CH2-CH3 중쇄는 F405L에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 CH2-CH3 중쇄는 하기를 포함하며:
(iii) E345K에 상응하는 군으로부터 선택된 제1 돌연변이,
(iv) P329K에 상응하는 군으로부터 선택된 제2 돌연변이,
여기서 제1 CH2-CH3 중쇄는 K409R에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고;
제2 CH2-CH3 중쇄는 F405L에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 CH2-CH3 중쇄는 하기를 포함하며:
(iii) E345K에 상응하는 군으로부터 선택된 제1 돌연변이,
(iv) P329D에 상응하는 군으로부터 선택된 제2 돌연변이,
여기서 제1 CH2-CH3 중쇄는 K409R에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함하고;
제2 CH2-CH3 중쇄는 F405L에 상응하는 아미노산 잔기에서의 제3 돌연변이를 포함한다.
폴리펩티드 또는 항체의 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 방법
폴리펩티드 또는 항체와 관련하여 하기 기재된 실시양태가 이뮤노글로불린의 CH2-CH3 영역을 갖는 Fc 영역 및 항원-결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체에 관한 것으로서, 폴리펩티드 또는 항체는 또한 이뮤노글로불린의 제1 CH2-CH3 영역 및 제1 항원-결합 영역을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 또는 항체, 및 이뮤노글로불린의 제2 CH2-CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 영역 및 제2 항원-결합 영역을 갖는 제2 폴리펩티드 또는 항체일 수 있음을 이해해야 한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 이뮤노글로불린의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체로서, 여기서 Fc 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 Fc 영역은 (i) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 위치: E430, E345 또는 S440에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 방법이며, (ii) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 위치: K322 또는 P329에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 위치 E430, E345 또는 S440 중 하나에 있는 본 발명에 따른 제1 돌연변이는 폴리펩티드 또는 항체의 증진된 Fc-Fc 상호작용의 효과를 도입한다. 위치 K322 또는 P329 중 하나에 있는 본 발명에 따른 제2 돌연변이는 또한 상기 기재된 바와 같이 폴리펩티드 또는 항체에서 감소된 Fc 이펙터 기능의 효과를 도입한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W 및 S440Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원은 제1 돌연변이가 Fc-Fc 상호작용을 증진시키는 실시양태를 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제1 돌연변이는 E430G 또는 E345K로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 제2 돌연변이를 도입함으로써 제1 Fc-Fc 증진 돌연변이를 갖는 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 이펙터 기능 또는 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이다. Fc 이펙터 기능을 감소시키는 방법은 폴리펩티드 또는 항체를 동일한 항원 결합 영역, 및 Fc 영역에서의 동일한 제1 돌연변이를 갖지만 Fc 영역에서의 제2 돌연변이가 결여된 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드 또는 항체와 비교하였을 때에 결정된 것임을 이해해야 한다. 일부 실시양태에서, Fc 이펙터 기능 또는 활성을 감소시키는 방법은 동일한 항원 결합 영역, 및 Fc 영역에서의 제1 및 제2 돌연변이를 갖지 않는 Fc 영역을 갖는 모 폴리펩티드 또는 항체의 수준보다 낮거나 또는 그에 필적하는 수준으로 이펙터 기능을 감소시킨다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 K322E, K322D, K322N, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 방법은 Fc 이펙터 기능, 예컨대 CDC, CDCC 및/또는 C1q 결합을 감소시키는 것에 관한 것으로서, 여기서 상기 방법은 K322E, K322D 및 K322N의 군으로부터 선택된 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 방법은 Fc 이펙터 기능, 예컨대 ADCC, ADCP, FcγR 결합, CDC CDCC 및/또는 C1q 결합을 감소시키는 것에 관한 것으로서, 여기서 P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y의 군으로부터 선택된 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 K322E, P329R, P329K 및 P329D의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 돌연변이는 위치 P329에 있으며, 단, 제2 돌연변이는 P329A가 아니다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 E322E에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 E322D에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 E322N에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329H에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329K에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329R에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 상기 방법은 P329D에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329E에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329M에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329F에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329G에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329I에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329L에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329N에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329Q에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329S에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329T에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329V에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329W에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329Y에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E430G에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 E322E에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 E322D에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 E322N에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329H에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329K에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329R에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329D에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 상기 방법은 P329E에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329M에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329F에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329G에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329I에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329L에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329N에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329Q에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329S에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329T에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329V에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329W에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 P329Y에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항체의 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 E345K에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 방법은 K322E, P329R, P329K 및 P329D로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 CH3 도메인에서의 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 위치: S440 또는 K439 중 하나에 상응하는 CH3 도메인에서의 추가의 돌연변이를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 위치 S440 또는 K439 중 하나에 상응하는 CH3 도메인에서의 추가의 돌연변이를 포함하며, 단, 제1 돌연변이가 S440에 있는 경우에는 추가의 돌연변이는 위치 S440에 있지 않다. 본 발명에 따른 제1 및 제2 돌연변이 및 위치 S440에서의 추가의 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체는 위치 S440에서의 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체와 올리고머를 형성하지 않는다. 본 발명에 따른 제1 및 제2 돌연변이 및 위치 K439에서의 추가의 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체는 위치 K439에서의 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체와 올리고머를 형성하지 않는다. 본원은 제1 폴리펩티드 또는 항체가 K439E 돌연변이를 포함하고 제2 폴리펩티드 또는 항체가 S440K 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체 사이의 올리고머 형성을 허용하는 방법을 제공한다. 이러한 방식으로, 올리고머, 예컨대 육합체가 특정한 패턴의 제1 및 제2 폴리펩티드로 형성되게 할 수 있다. 이는 폴리펩티드가 상이한 표적 또는 에피토프에 결합하고, 올리고머가 이들 상이한 표적 또는 에피토프의 조합으로 형성되어야 하는 방법에서 관심의 대상이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가의 돌연변이가 S440K 또는 K439E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 이펙터 기능은 상기 폴리펩티드와 동일하거나 또는 동일한 제1 돌연변이를 갖지만 제2 돌연변이는 갖지 않는 모 폴리펩티드 또는 모 항체와 비교 시 적어도 20% 감소된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 제1 돌연변이만을 갖는 모 폴리펩티드 또는 항체와 비교 시 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc 이펙터 기능은 하기 군으로부터 선택된다; 보체 의존성 세포독성 (CDC), 보체 의존성 세포-매개된 세포독성 (CDCC), 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포-매개된 식균작용 (ADCP), C1q 결합 및 FcγR 결합.
한 실시양태에서, 본 발명은 ADCC를 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 ADCC는 제2 돌연변이를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 항체와 동일한 비교 항체와 비교 시 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 감소된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CDC를 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 CDC는 제2 돌연변이를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 항체와 동일한 비교 항체와 비교 시 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 감소된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 C1q 결합을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 C1q 결합은 제2 돌연변이를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 항체와 동일한 비교 항체와 비교 시 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 감소된다.
한 실시양태에서, 본 발명 Fc-감마 수용체 결합을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc-감마 수용체 결합은 제2 돌연변이를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 항체와 동일한 비교 항체와 비교 시 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 감소된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 Fc-감마 수용체 결합을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc-감마 수용체 결합은 제1 및 제2 돌연변이를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 항체와 동일한 비교 항체와 비교 시 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 감소된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 Fc-감마 수용체 I 결합을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc-감마 수용체 I 결합은 제2 돌연변이를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 항체와 동일한 비교 항체와 비교 시 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 감소된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 Fc-감마 수용체 I 결합을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc-감마 수용체 I 결합은 제1 및 제2 돌연변이를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 항체와 동일한 비교 항체와 비교 시 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 감소된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 Fc-감마 수용체 I 결합을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc-감마 수용체 I 결합은 제2 돌연변이를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 항체와 동일한 비교 항체와 비교 시 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 또는 적어도 100% 감소된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 Fc-감마 수용체 I 결합을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 여기서 Fc-감마 수용체 I 결합은 제1 및 제2 돌연변이를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 항체와 동일한 비교 항체와 비교 시 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 또는 적어도 100% 감소된다. 따라서, 상기 방법은 Fc-감마 수용체 I 결합을 야생형 Fc 영역과 비교 시 감소된 수준으로 감소시키는 것을 포함한다.
조성물
폴리펩티드 또는 항체와 관련하여 하기 기재된 실시양태가 이뮤노글로불린의 CH2-CH3 영역을 갖는 Fc 영역 및 항원-결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체에 관한 것으로서, 폴리펩티드 또는 항체는 또한 제1 항원-결합 영역, 제2 항원-결합 영역, 및 이뮤노글로불린의 제1 CH2-CH3 중쇄 및 이뮤노글로불린의 제2 CH2-CH3 중쇄를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 다중특이적 폴리펩티드 또는 항체일 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 항체 및 그의 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 구체적 측면 및 실시양태는 하기에 기재될 것이다. 추가로, 이러한 폴리펩티드 또는 항체는 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 수득될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 본원에서 임의의 측면 또는 실시양태에 기재된 제1 폴리펩티드 또는 항체 및 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 항체는 하기를 포함하는 Fc 영역을 포함하며:
(i) Fc-Fc 증진 돌연변이인 제1 돌연변이;
(ii) Fc 이펙터 기능(들)을 억제하는 제2 돌연변이;
(iii) 동일한 추가의 돌연변이를 갖는 Fc 영역 사이의 올리고머화를 방지하는 추가의 돌연변이,
여기서 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 항체는 동일한 추가의 돌연변이를 갖지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 폴리펩티드 또는 항체 및 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 항체는 i) 제1 돌연변이, ii) 제2 돌연변이 및 iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 항체는 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다. 따라서, 조성물은 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 (i) 제1 돌연변이, (ii) 제2 돌연변이, (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응한다:
(i) 제1 돌연변이 E430, E345 또는 S440, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임;
(ii) E322 또는 P329에서의 제2 돌연변이;
(iii) K439 또는 S440에서의 추가의 돌연변이, 단, 추가의 돌연변이가 S440에 있는 경우에는 제1 돌연변이는 S440에 있지 않고, 단, 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 아미노산 위치에서의 추가의 돌연변이를 포함하지 않음.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 (i) 제1 돌연변이, (ii) 제2 돌연변이, (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응한다:
(i) 제1 돌연변이 E430, E345 또는 S440, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임;
(ii) E322 또는 P329에서의 제2 돌연변이;
(iii) 제1 Fc 영역에서의 K439에서의 추가의 돌연변이 및 제2 Fc 영역에서의 S440에서의 추가의 돌연변이, 단, 추가의 돌연변이가 S440에 있는 경우에는 제1 돌연변이는 S440에 있지 않음.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 (i) 제1 돌연변이, (ii) 제2 돌연변이, (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응한다:
(i) 제1 돌연변이 E430, E345 또는 S440, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임;
(ii) E322 또는 P329에서의 제2 돌연변이;
(iii) 제2 Fc 영역에서의 K439에서의 추가의 돌연변이 및 제1 Fc 영역에서의 S440에서의 추가의 돌연변이, 단, 추가의 돌연변이가 S440에 있는 경우에는 제1 돌연변이는 S440에 있지 않음.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 (i) 제1 돌연변이, (ii) 제2 돌연변이, (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응한다:
(i) 제1 돌연변이 E430, E345 또는 S440, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임;
(ii) E322 또는 P329에서의 제2 돌연변이;
(iii) 제1 Fc 영역에서의 추가의 K439E 돌연변이 및 제2 Fc 영역에서의 추가의 S440K 돌연변이.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 (i) 제1 돌연변이, (ii) 제2 돌연변이, (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응한다:
(i) 제1 돌연변이 E430, E345 또는 S440, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임;
(ii) E322 또는 P329에서의 제2 돌연변이;
(iii) 제1 Fc 영역에서의 추가의 S440K 돌연변이 및 제2 Fc 영역에서의 추가의 E439E 돌연변이.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하고, 제1 및 제2 Fc-영역은 (i) 제1 돌연변이, (iii) 추가의 돌연변이를 포함하고, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 (ii) 제2 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응한다:
(i) 제1 돌연변이 E430, E345 또는 S440, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임;
(ii) E322 또는 P329에서의 제2 돌연변이;
(iii) 제1 Fc 영역에서의 추가의 K439E 돌연변이 및 제2 Fc 영역에서의 추가의 S440K 돌연변이.
본원은 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 항체 둘 다 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖거나, 또는 제1 또는 제2 폴리펩티드만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태를 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 (i) E430에 상응하는 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이, 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(ii) K322E, K322D, K322N, P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y;
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 (i) E345에 상응하는 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이, 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(ii) K322E, K322D, K322N, P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y;
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc 영역은 (i) 제1 E430G 돌연변이 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(ii) K322E, K322D, K322N, P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y;
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc 영역은 (i) 제1 E430G 돌연변이 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(ii) K322E, P329K, P329R, P329D;
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 돌연변이 및 (ii) 제2 K322E 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 돌연변이 및 (ii) 제2 P329K 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 돌연변이 및 (ii) 제2 P329R 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 돌연변이 및 (ii) 제2 P329D 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc 영역은 (i) 제1 E345K 돌연변이 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(ii) K322E, K322D, K322N, P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y;
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc 영역은 (i) 제1 E345K 돌연변이 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(ii) K322E, P329K, P329R, P329D;
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 돌연변이 및 (ii) 제2 K322E 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 돌연변이 및 (ii) 제2 P329K 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 돌연변이 및 (ii) 제2 P329R 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 돌연변이 및 (ii) 제2 P329D 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc 영역은 (i) 제1 E345R 돌연변이 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(ii) K322E, K322D, K322N, P329A, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W 및 P329Y;
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc 영역은 (i) 제1 E345R 돌연변이 및 (ii) 제2 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 제2 및 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(ii) K322E, P329K, P329R, P329D;
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345R 돌연변이 및 (ii) 제2 K322E 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345R 돌연변이 및 (ii) 제2 P329K 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345R 돌연변이 및 (ii) 제2 P329R 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345R 돌연변이 및 (ii) 제2 P329D 돌연변이, 및 (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 추가의 돌연변이는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(iii) K439E 및 S440K, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 항체는 하기를 포함하는 Fc 영역을 포함하며:
(i) Fc-Fc 증진 돌연변이인 제1 돌연변이;
(ii) 동일한 추가의 돌연변이를 갖는 Fc 영역 사이의 올리고머화를 방지하는 추가의 돌연변이, 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 항체는 동일한 추가의 돌연변이를 갖지 않음,
(iii) 제1 또는 제2 Fc 영역은 제2 돌연변이를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 폴리펩티드 또는 항체만이 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 제2 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 (i) E430, E345 또는 S440으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임, (ii) 제2 돌연변이, (iii) 추가의 돌연변이 E를 포함하며, 여기서 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응하며:
(iii) 추가의 K439E 또는 S440K 돌연변이, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 추가의 돌연변이를 포함하지 않고, 여기서 제1 돌연변이가 S440Y 또는 S440W인 경우에는 추가의 돌연변이는 S440K가 아님;
(ii) 제1 또는 제2 Fc 영역은 E322 또는 P329에서 (둘 다에서는 아님) 제2 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) E430, E345 또는 S440으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임, 및 ii) E322 및 P329의 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 제2 돌연변이, 및 iii) 추가의 K439E 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) E430 및 E345로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이, 및 추가의 S440K 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) E430 또는 E345로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이, 및 ii) E322 및 P329의 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 제2 돌연변이, 및 iii) 추가의 S440K 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) E430, E345 또는 S440으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치에서의 제1 돌연변이 (단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임), 및 추가의 K439E 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 및 ii) 제2 E322E 돌연변이, 및 iii) 추가의 K439E 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E430G 돌연변이, 및 추가의 S440K 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 및 ii) 제2 E322E 돌연변이, 및 iii) 추가의 S440K 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E430G 돌연변이, 및 추가의 K322E 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 및 ii) 제2 P329R 돌연변이, 및 iii) 추가의 K439E 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E430G 돌연변이, 및 추가의 S440K 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 및 ii) 제2 P329R 돌연변이, 및 iii) 추가의 S440K 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E430G 돌연변이, 및 추가의 K322E 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 및 ii) 제2 P329K 돌연변이, 및 iii) 추가의 K439E 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E430G 돌연변이, 및 추가의 S440K 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 및 ii) 제2 P329K 돌연변이, 및 iii) 추가의 S440K 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E430G 돌연변이, 및 추가의 K322E 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 및 ii) 제2 P329D 돌연변이, 및 iii) 추가의 K439E 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E430G 돌연변이, 및 추가의 S440K 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E430G 및 ii) 제2 P329D 돌연변이, 및 iii) 추가의 S440K 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E430G 돌연변이, 및 추가의 K322E 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 및 ii) 제2 E322E 돌연변이, 및 iii) 추가의 K439E 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E345K 돌연변이, 및 추가의 S440K 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 및 ii) 제2 E322E 돌연변이, 및 iii) 추가의 S440K 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E345K 돌연변이, 및 추가의 K322E 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 및 ii) 제2 P329R 돌연변이, 및 iii) 추가의 K439E 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E345K 돌연변이, 및 추가의 S440K 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 및 ii) 제2 P329R 돌연변이, 및 iii) 추가의 S440K 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E345K 돌연변이, 및 추가의 K322E 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 및 ii) 제2 P329K 돌연변이, 및 iii) 추가의 K439E 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E345K 돌연변이, 및 추가의 S440K 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 및 ii) 제2 P329K 돌연변이, 및 iii) 추가의 S440K 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E345K 돌연변이, 및 추가의 K322E 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 및 ii) 제2 P329D 돌연변이, 및 iii) 추가의 K439E 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E345K 돌연변이, 및 추가의 S440K 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc-영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 항체, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc-영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 Fc-영역은 (i) 제1 E345K 및 ii) 제2 P329D 돌연변이, 및 iii) 추가의 S440K 돌연변이를 포함하고; 제2 Fc-영역은 i) 제1 E345K 돌연변이, 및 추가의 K322E 돌연변이를 포함한다. 이로써, 제1 폴리펩티드 또는 항체만이 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 (TNFR-SF)의 구성원에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은, TNFR1, FAS, DR3, DR4, DR5, DR6, NGFR 및 EDAR로 이루어진 군으로부터 선택된, 세포내 사멸 도메인을 갖는 TNFR-SF의 구성원에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은, DcR1, DcR2, DcR3, OPG, TROY, XEDAR, LTbR, HVEM, TWEAKR, CD120b, OX40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR, RELT로 이루어진 군으로부터 선택된, 세포내 사멸 도메인을 갖지 않는 TNFR-SF의 구성원에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 OX40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR 및 RELT로 이루어진 면역 활성화제의 군에 속하는 TNFR-SF의 구성원에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는, OX40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR 및 RELT로 이루어진 군으로부터 선택된, 세포내 사멸 도메인을 갖지 않는 TNFR-SF의 하나 이상의 구성원 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 OX40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR 및 RELT로 이루어진 군으로부터 선택된, 세포내 사멸 도메인을 갖지 않는 TNFR-SF의 하나의 구성원에 결합하는 제1 폴리펩티드는, OX40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR 및 RELT로 이루어진 군으로부터 선택된, 세포내 사멸 도메인을 갖지 않는 TNFR-SF의 하나의 구성원에 결합하는 제2 항체의 결합을 차단하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 항체 및 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물은 조성물 중에 1:49 내지 49:1 몰비, 예컨대 1:1 몰비, 1:2 몰비, 1:3 몰비, 1:4 몰비, 1:5 몰비, 1:6 몰비, 1:7 몰비, 1:8 몰비, 1:9 몰비, 1:10 몰비, 1:15 몰비, 1:20 몰비, 1:25 몰비, 1:30 몰비, 1:35 몰비, 1:40 몰비, 1:45 몰비, 1:50 몰비, 50:1 몰비, 45:1 몰비, 40:1 몰비, 35:1 몰비, 30:1 몰비, 25:1 몰비, 20:1 몰비, 15:1 몰비, 10:1 몰비, 9:1 몰비, 8:1 몰비, 7:1 몰비, 6:1 몰비, 5:1 몰비, 4:1 몰비, 3:1 몰비, 2:1 몰비로 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 및/또는 임의의 추가적인 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 조성물 중에 등몰비로 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 조성물은 제약 조성물이다.
치료적 적용
본 발명의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 폴리펩티드, 항체, 이중특이적 항체 또는 조성물은 의약으로서, 즉, 치료적 적용을 위해 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 개시된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 폴리펩티드, 항체 또는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료에서 사용하기 위한 본원에 개시된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 폴리펩티드, 항체 또는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 폴리펩티드, 항체 또는 조성물의 유효량을 질환을 가진 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 질환은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 및 감염성 질환의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 방법은 추가적인 치료제를 추가로 투여하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 추가적인 치료제는 화학요법제 (비제한적으로 파클리탁셀, 테모졸로미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 독소루비신, 겜시타빈, 5-플루오로우라실, 페메트렉세드 포함), 키나제 억제제 (비제한적으로 소라페닙, 수니티닙 또는 에베롤리무스 포함), 아폽토시스-조정제 (비제한적으로 재조합 인간 TRAIL 또는 비리나판트 포함), RAS 억제제, 프로테아솜 억제제 (비제한적으로 보르테조밉 포함), 히스톤 데아세틸라제 억제제 (비제한적으로 보리노스타트 포함), 기능식품, 시토카인 (비제한적으로 IFN-γ 포함), 항체 또는 항체 모방체 (비제한적으로 항-EGFR, 항-IGF-1R, 항-VEGF, 항-CD20, 항-CD38, 항-HER2, 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA4, 항-CD40, 항-CD137, 항-GITR 항체 및 항체 모방체 포함), 항체-약물 접합체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항암제(들)이다.
부분들의 키트
폴리펩티드 또는 항체와 관련하여 하기 기재된 실시양태가 이뮤노글로불린의 CH2-CH3 영역을 갖는 Fc 영역 및 항원-결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체에 관한 것으로서, 폴리펩티드 또는 항체는 또한 이뮤노글로불린의 제1 CH2-CH3 영역 및 제1 항원-결합 영역을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 또는 항체, 및 이뮤노글로불린의 제2 CH2-CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 영역 및 제2 항원-결합 영역을 갖는 제2 폴리펩티드 또는 항체일 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 요법에서의 동시적, 개별적 또는 순차적 사용을 위한 부분들의 키트에 관한 것이다. 추가로, 이러한 변이체는 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 수득될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 폴리펩티드, 항체 또는 조성물을 포함하는 부분들의 키트에 관한 것으로서, 여기서 상기 폴리펩티드, 항체 또는 조성물은 하나 이상의 용기, 예컨대 바이알 내에 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 부분들의 키트는 요법에서의 동시적, 개별적 또는 순차적 사용을 위한 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 폴리펩티드, 항체 또는 조성물을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 진단 방법에서 사용하기 위한 본원에 기재된 임의의 실시양태에 따른 폴리펩티드, 항체, 조성물 또는 부분들의 키트의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 또는 다른 포유류의 신체의 적어도 일부분에 본원에 기재된 임의의 실시양태에 따른 폴리펩티드, 항체, 조성물 또는 부분들의 키트를 투여하는 것을 포함하는, 진단 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 또는 다른 포유류의 신체의 적어도 일부분을 영상화하는데 있어서 본원에 기재된 임의의 실시양태에 따른 폴리펩티드, 항체, 조성물 또는 부분들의 키트의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 실시양태에 따른 변이체, 조성물 또는 부분들의 키트를 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 다른 포유류의 신체의 적어도 일부분을 영상화하는 방법에 관한 것이다.
조성물
추가적으로, 본 발명은 상기 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 임의의 폴리펩티드 또는 항체의 제제, 즉, 폴리펩티드 또는 항체의 다중 카피를 포함하는 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 의약으로서의 이러한 임의의 폴리펩티드 또는 항체, 제제 또는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 하나의 폴리펩티드 또는 항체는 적어도 본 발명에 따른 제1 및 제2 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드 또는 항체의 조합물, 뿐만 아니라 이러한 변이체 조합물의 제제 및 제약 조성물, 및 의약으로서의 이들의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 2가지 폴리펩티드 또는 항체가 전형적으로 동일한 세포, 세포 막, 비리온 및/또는 다른 입자의 표면 상에서 전형적으로 발현되는 동일한 항원 또는 상이한 항원에 결합한다.
접합체
폴리펩티드 또는 항체와 관련하여 하기 기재된 실시양태가 이뮤노글로불린의 CH2-CH3 영역을 갖는 Fc 영역 및 항원-결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체에 관한 것으로서, 폴리펩티드 또는 항체는 또한 이뮤노글로불린의 제1 CH2-CH3 영역 및 제1 항원-결합 영역을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 또는 항체, 및 이뮤노글로불린의 제2 CH2-CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 영역 및 제2 항원-결합 영역을 갖는 제2 폴리펩티드 또는 항체일 수 있음을 이해해야 한다.
한 측면에서, 본 발명은 변이체가 약물, 독소 또는 방사성 표지에 접합된 것인, 예컨대 상기 변이체가 링커를 통해 독소에 접합된 것인 폴리펩티드 또는 항체에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 상기 변이체는 융합 단백질의 일부분이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 C-말단에서 또 다른 분자, 예컨대 독소 또는 표지에 접합되지 않는다. 한 실시양태에서, 변이체는 또 다른 부위에서, 전형적으로 올리고머 형성을 방해하지 않는 부위에서 또 다른 분자에 접합된다. 예를 들어, 항체 변이체는 다른 부위에서 독소 (예컨대, 방사성 동위원소) 전구약물 또는 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물에 연결될 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들어 암 요법에서 표적 세포의 사멸을 더욱 효과적이게 만들 수 있다. 따라서, 생성된 변이체는 면역접합체이다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 치료적 모이어티, 예컨대 세포독소, 화학요법제 약물, 시토카인, 면역저해제, 및/또는 방사성 동위원소에 연결된 또는 접합된 항체를 제공한다. 이러한 접합체는 본원에서 "면역접합체" 또는 "약물 접합체"로서 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다.
세포독소 또는 세포독성제에는 세포에 유해한 (예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의의 작용제가 포함된다. 본 발명의 면역접합체를 형성하는데 적합한 치료제에는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 메이탄신 또는 그의 유사체 또는 유도체, 엔디인 항종양 항생제, 예컨대 네오카르지노스타틴, 칼리케아마이신, 에스페라미신, 디네미신, 리다마이신, 케다르시딘 또는 그의 유사체 또는 유도체, 안트라시클린, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신, 항대사물 (예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나제, 겜시타빈, 클라드리빈), 알킬화제 (예컨대, 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴 및 다른 백금 유도체, 예컨대 카르보플라틴; 뿐만 아니라 두오카르마이신 A, 두오카르마이신 SA, CC-1065 (라켈마이신으로도 공지됨), 또는 CC-1065의 유사체 또는 유도체, 돌라스타틴, 피롤로[2,1-c][1,4] 벤조디아제핀 (PDB) 또는 그의 유사체, 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신), 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 안트라마이신 (AMC)), 유사분열 저해제 (예를 들어, 튜불린-억제제), 예컨대 모노메틸 오리스타틴 E, 모노메틸 오리스타틴 F, 또는 돌라스타틴 10의 다른 유사체 또는 유도체; 히스톤 데아세틸라제 억제제, 예컨대 히드록삼산 트리코스타틴 A, 보리노스타트 (SAHA), 벨리노스타트, LAQ824, 및 파노비노스타트, 뿐만 아니라 벤즈아미드, 엔티노스타트, CI994, 모세티노스타트 및 지방족산 화합물, 예컨대 페닐부티레이트 및 발프로산, 프로테아솜 억제제, 예컨대 다노프레비르, 보르테조밉, 아마톡신, 예컨대 α-아만틴, 디프테리아 독소 및 관련 분자 (예컨대, 디프테리아 A 쇄 및 그의 활성 단편 및 하이브리드 분자); 리신 독소 (예컨대, 리신 A 또는 탈글리코실화 리신 A 쇄 독소), 콜레라 독소, 시가-유사 독소 (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 바우만-버크(Bowman-Birk) 프로테아제 억제제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모데씬, 젤라닌, 아브린 A 쇄, 모데씬 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에모마이신 독소가 포함된다. 다른 적합한 접합된 분자에는 항미생물성/용해성 펩티드, 예컨대 CLIP, 마가이닌 2, 멜리틴, 세크로핀, 및 P18; 리보뉴클레아제 (RNase), DNase I, 포도상구균성 장독소-A, 미국자리공 항바이러스성 단백질, 디프테린 독소, 및 슈도모나스 내독소가 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) 및 Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994)]을 참조한다. 본원에 기재된 본 발명의 항체와 조합되어 투여될 수 있는 치료제, 예컨대 항암 시토카인 또는 케모카인이 또한 본 발명의 항체와의 접합에 유용한 치료적 모이어티에 대한 후보이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 약물 접합체는 오리스타틴 또는 오리스타틴 펩티드 유사체 및 유도체에 접합된 본원에 개시된 항체를 포함한다 (US5635483; US5780588). 오리스타틴은 미세관 역학, GTP 가수분해 및 핵 및 세포 분열을 방해하지 않고 (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584), 항암 (US5663149) 및 항진균 활성 (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965)을 갖는 것으로 제시되어 있다. 오리스타틴 약물 모이어티는 링커를 통해, 펩티드 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (말단)를 통해 항체에 부착될 수 있다.
예시적인 오리스타틴 실시양태에는 문헌 [Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research. Volume 45, abstract number 623, presented March 28, 2004]에 개시되고 US 2005/0238649에 기재된 N-말단-연결된 모노메틸 오리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF가 포함된다.
예시적인 오리스타틴 실시양태는 MMAE (모노메틸 오리스타틴 E)이다. 또 다른 예시적인 오리스타틴 실시양태는 MMAF (모노메틸 오리스타틴 F)이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 접합된 핵산 또는 핵산-연관 분자를 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 접합된 핵산은 세포독성 리보뉴클레아제, 안티센스 핵산, 억제성 RNA 분자 (예를 들어, siRNA 분자) 또는 면역자극성 핵산 (예를 들어, 면역자극성 CpG 모티프-함유 DNA 분자)이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 압타머 또는 리보자임에 접합된다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 방사성 표지된 아미노산을 포함하는 항체가 제공된다. 방사성 표지된 변이체는 진단적 및 치료적 목적 둘 다를 위해 사용될 수 있다 (방사성 표지된 분자로의 접합은 또 다른 가능한 특징임). 폴리펩티드에 대한 표지의 비제한적인 예에는 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 및 125I, 131I, 및 186Re가 포함된다. 방사성 표지된 아미노산 및 관련 펩티드 유도체의 제조 방법은 관련 기술분야 (예를 들어, 문헌 [Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2nd Ed., Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)] 참조) 및 U.S. 4,681,581, U.S. 4,735,210, U.S. 5,101,827, U.S. 5,102,990 (US RE35,500), U.S. 5,648,471 및 U.S. 5,697,902에 공지되어 있다. 예를 들어, 방사성 동위원소는 클로르아민-T 방법에 의해 접합될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 방사성 동위원소 또는 방사성 동위원소-함유 킬레이트에 접합된다. 예를 들어, 변이체는 킬레이터 링커, 예를 들어 DOTA, DTPA 또는 티툭세탄에 접합될 수 있으며, 이는 항체가 방사성 동위원소와 복합체화될 수 있게 한다. 변이체는 또한 또는 대안적으로 하나 이상의 방사성 표지된 아미노산 또는 다른 방사성 표지된 분자를 포함할 수 있거나 또는 그에 접합될 수 있다. 방사성 표지된 변이체는 진단적 및 치료적 목적 둘 다를 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 변이체는 알파-방사체에 접합된다. 방사성 동위원소의 비제한적인 예에는 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, 111In, 131I, 186Re, 213Bs, 225Ac 및 227Th가 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα, IFNβ, IFNγ, GM-CSF, CD40L, Flt3 리간드, 줄기 세포 인자, 안세스팀, 및 TNFα로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인에 접합될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 또한 예를 들어 그들의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 공유 접합시킴으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 예시적인 중합체, 및 이들을 펩티드에 접합시키기 위한 방법은 예를 들어 US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 및 US 4,609,546에 예시되어 있다. 추가적인 중합체에는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (예를 들어, 약 1,000 내지 약 40,000, 예컨대 약 2,000 내지 약 20,000의 분자량을 갖는 PEG)이 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 접합된 분자(들), 예컨대 상기 기재된 것들에 접합시키는 것에 대해 관련 기술분야에 공지됨 임의의 방법, 예컨대 문헌 [Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982)]에 기재된 방법을 이용할 수 있다. 이러한 변이체는 다른 모이어티를 변이체 또는 그의 단편 (예를 들어, 항체 H 또는 L 쇄)의 N-말단측 또는 C-말단측에 화학적으로 접합시킴으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)] 참조). 이러한 접합된 변이체 유도체는 또한 적절한 경우 내부 잔기 또는 당에서 접합에 의해 생성될 수 있다.
작용제는 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 제2 작용제의 간접적인 커플링의 한 예는 스페이서 또는 링커 모이어티를 통해 이중특이적 항체의 시스테인 또는 리신 잔기에 커플링되는 것이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 스페이서 또는 링커를 통해 생체 내에서 치료 약물로 활성화될 수 있는 전구약물 분자에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 세포내 조건 하에 절단될 수 있으며, 이로써 링커의 절단은 세포내 환경에서 항체로부터 약물 단위를 방출시킨다. 일부 실시양태에서, 링커는 세포내 환경에서 (예를 들어, 리소솜 또는 엔도솜 또는 포낭 내에서) 존재하는 절단가능한 작용제에 의해 절단될 수 있다. 예를 들어, 스페이서 또는 링커는 종양-세포 연관된 효소 또는 다른 종양-특이적 조건에 의해 절단될 수 있으며, 이로써 활성 약물이 형성된다. 이러한 전구약물 기술 및 링커의 예는 WO02083180, WO2004043493, WO2007018431, WO2007089149, WO2009017394 및 WO201062171 (Syntarga BV, et al.)에 기재되어 있다. 적합한 항체-전구약물 기술 및 두오카르마이신 유사체가 또한 미국 특허 번호 6,989,452 (메다렉스(Medarex))에서 확인될 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 링커는 또한 또는 대안적으로 예를 들어 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소, 예컨대 비제한적으로 리소솜성 또는 엔도솜성 프로테아제에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이를 갖는다. 절단제에는 카텝신 B 및 D 및 플라스민이 포함될 수 있으며, 이들 모두는 디펩티드 약물 유도체를 가수분해시켜 표적 세포 내에서 활성 약물의 방출을 초래하는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123] 참조). 구체적 실시양태에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit (발린-시트룰린) 링커 또는 Phe-Lys (페닐알라닌-리신) 링커이다 (예를 들어, US6214345를 참조하며, 여기에는 Val-Cit 링커 및 상이한 예의 Phe-Lys 링커에 의한 독소루비신의 합성이 기재되어 있음). Val-Cit 및 Phe-Lys 링커 구조의 예에는 하기 기재된 MC-vc-PAB, MC-vc-GABA, MC-Phe-Lys-PAB 또는 MC-Phe-Lys-GABA (여기서 MC는 말레이미도 카프로일의 약어이고, vc는 Val-Cit의 약어이고, PAB는 p-아미노벤질카르바메이트의 약어이고, GABA는 γ-아미노부티르산의 약어임)가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 치료제의 세포내 단백질 분해성 방출을 이용하는 것의 이점은, 작용제가 전형적으로 접합될 때 약화되고, 접합체의 혈청 안정성이 전형적으로 높다는 것이다.
여전히 또 다른 실시양태에서, 링커 단위는 절단될 수 없고, 약물은 항체 분해에 의해 방출된다 (US 2005/0238649 참조). 전형적으로, 이러한 링커는 실질적으로 세포외 환경에 대해 민감하지 않다. 본원에 사용된 바와 같이, 링커와 관련하여 "실질적으로 세포외 환경에 대해 민감하지 않은"은, 변이체 항체 약물 접합체 화합물이 세포외 환경 (예를 들어, 혈장)에 존재할 때, 변이체 항체 약물 접합체 화합물의 샘플에서 20% 이하, 전형적으로 약 15% 이하, 더욱 전형적으로 약 10% 이하, 훨씬 더 전형적으로 약 5% 이하, 약 3% 이하, 또는 약 1% 이하의 링커가 절단됨을 의미한다. 링커가 실질적으로 세포외 환경에 대해 민감하지 않은지 여부는 예를 들어 변이체 항체 약물 접합체 화합물을 혈장과 함께 미리 결정된 시간 기간 동안 (예를 들어, 2, 4, 8, 16 또는 24 시간) 인큐베이션한 다음, 혈장에 존재하는 유리 약물의 양을 정량화함으로써 결정될 수 있다. MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 예시적 실시양태는 하기 구조를 갖는다 (여기서 Ab는 항체를 의미하고, p는 약물-로딩 (또는 항체 분자당 세포정지 또는 세포독성 약물의 평균 개수)을 나타내며 1 내지 약 8이고, 예를 들어 p는 4-6, 예컨대 3-5일 수 있거나 또는 p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 수 있음).
절단가능한 링커가 오리스타틴과 조합된 예에는 MC-vc-PAB-MMAF (vcMMAF로도 지정됨) 및 MC-vc-PAB-MMAF (vcMMAE로도 지정됨) (여기서 MC는 말레이미도 카프로일에 대한 약어이고, vc는 Val-Cit (발린-시트룰린) 기재 링커의 약어이고, PAB는 p-아미노벤질카르바메이트에 대한 약어임)가 포함된다.
다른 예에는 비-절단가능한 링커, 예컨대 mcMMAF (mc (MC는 문맥상 mc와 동일함)는 말레이미도 카프로일의 약어임)와 조합된 오리스타틴이 포함된다.
한 실시양태에서, 약물 링커 모이어티는 vcMMAE이다. vcMMAE 약물 링커 모이어티 및 접합 방법은 WO2004010957, US7659241, US7829531, US7851437 및 US 11/833,028 (시애틀 제네틱스, 인크.(Seattle Genetics, Inc.)), (본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있고, vcMMAE 약물 링커 모이어티는 거기에 개시된 것과 유사한 방법을 이용하여 시스테인에서 항체에 결합된다.
한 실시양태에서, 약물 링커 모이어티는 mcMMAF이다. mcMMAF 약물 링커 모이어티 및 접합 방법은 US7498298, US 11/833,954, 및 WO2005081711 (시애틀 제네틱스, 인크.), (본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있고, mcMMAF 약물 링커 모이어티는 거기에 개시된 것과 유사한 방법을 이용하여 시스테인에서 변이체에 결합된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 킬레이터 링커, 예를 들어 티툭세탄에 부착되며, 이는 이중특이적 항체가 방사성 동위원소에 접합되게 한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체의 각각의 아암 (또는 Fab-아암)은 동일한 하나 이상의 치료적 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된다.
한 실시양태에서, 항체의 하나의 아암만이 하나 이상의 치료적 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된다.
한 실시양태에서, 항체의 각각의 아암은 상이한 치료적 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된다. 예를 들어, 변이체가 이중특이적 항체이고, 본원에 기재된 바와 같은 2개의 상이한 단일특이적 항체, 예를 들어 제1 및 제2 항체의 제어된 Fab-아암 교환에 의해 제조되는 실시양태에서, 이러한 이중특이적 항체는 상이한 치료적 모이어티에 접합되거나 또는 그와 회합된 단일특이적 항체를 이용함으로써 수득될 수 있다.
추가의 용도
폴리펩티드 또는 항체와 관련하여 하기 기재된 실시양태가 이뮤노글로불린의 CH2-CH3 영역을 갖는 Fc 영역 및 항원-결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체에 관한 것으로서, 폴리펩티드 또는 항체는 또한 이뮤노글로불린의 제1 CH2-CH3 영역 및 제1 항원-결합 영역을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 또는 항체, 및 이뮤노글로불린의 제2 CH2-CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 영역 및 제2 항원-결합 영역을 갖는 제2 폴리펩티드 또는 항체일 수 있음을 이해해야 한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 특히 질환 또는 장애의 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 상기 기재된 본 발명의 폴리펩티드, 항체에 관한 것이다. 이러한 질환 및 장애의 예에는 비제한적으로 암 및 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염이 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암의 치료를 위한 본원에 기재된 폴리펩티드, 항체, 이중특이적 항체, 조성물 및 부분들의 키트에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 변이체, 조성물 또는 부분들의 키트를 투여하는 것을 포함하는, 인간 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 변이체, 조성물 또는 부분들의 키트를 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
"치료"는 증상 또는 질환 상태를 용이하게 하거나, 개선시키거나, 정지시키거나 또는 근절하는 (치유하는) 목적으로 본 발명의 치료 활성 화합물의 유효량을 투여하는 것에 관한 것이다.
"유효량" 또는 "치료 유효량"은 필요한 투여량에서 및 시간의 기간 동안 원하는 치료 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 항체의 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 항체가 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한, 치료적으로 유익한 효과가 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 더 큰 것이다.
투여량
폴리펩티드 또는 항체와 관련하여 하기 기재된 실시양태가 이뮤노글로불린의 CH2-CH3 영역을 갖는 Fc 영역 및 항원-결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체에 관한 것으로서, 폴리펩티드 또는 항체는 또한 이뮤노글로불린의 제1 CH2-CH3 영역 및 제1 항원-결합 영역을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 또는 항체, 및 이뮤노글로불린의 제2 CH2-CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 영역 및 제2 항원-결합 영역을 갖는 제2 폴리펩티드 또는 항체일 수 있음을 이해해야 한다.
항체에 대해 효율적인 투여량 및 투여량 레지멘은 치료될 질환 또는 상태에 따라 좌우되며, 관련 기술분야의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 항체의 치료 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 약 0.1 내지 100 mg/kg, 예컨대 약 0.1 내지 50 mg/kg, 예를 들어 약 0.1 내지 20 mg/kg, 예컨대 약 0.1 내지 10 mg/kg, 예를 들어 약 0.5, 약 예컨대 0.3, 약 1, 약 3, 약 5 또는 약 8 mg/kg이다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 또한 조합 요법으로 투여될 수 있고, 즉, 치료될 질환 또는 상태와 관련된 다른 치료제와 조합될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 항체-함유 의약은 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 세포독성제, 화학요법제 또는 혈관신생 억제제와의 조합물이다. 이러한 조합된 투여는 동시적, 개별적 또는 순차적일 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 방사선 요법 및/또는 수술과 조합하여 본 발명의 변이체 또는 제약 조성물의 치료 유효량을 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환, 예컨대 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
제조 방법
폴리펩티드 또는 항체와 관련하여 하기 기재된 실시양태가 이뮤노글로불린의 CH2-CH3 영역을 갖는 Fc 영역 및 항원-결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체에 관한 것으로서, 폴리펩티드 또는 항체는 또한 이뮤노글로불린의 제1 CH2-CH3 영역 및 제1 항원-결합 영역을 갖는 다중특이적 폴리펩티드 또는 항체, 및 이뮤노글로불린의 제2 CH2-CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 영역 및 제2 항원-결합 영역을 갖는 제2 폴리펩티드 또는 항체일 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 측면 중 어느 하나에 따른 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 및 벡터, 뿐만 아니라 상기 변이체를 코딩하는 벡터 및 발현계를 제공한다. 항체 및 그의 변이체에 대해 적합한 핵산 구축물, 벡터 및 발현계는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 실시예에 기재되어 있다. 변이체가 중쇄 (또는 그의 Fc-함유 단편)뿐 아니라 경쇄를 포함하는 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 또는 상이한 핵산 또는 벡터 상에 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 측면 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 항체를 숙주 세포에서 생성하는 방법이며, 여기서 상기 폴리펩티드 또는 항체는 적어도 중쇄의 Fc 영역을 포함하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다:
a) 변이체의 Fc 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 구축물을 제공하는 단계,
b) 숙주 세포에서 상기 뉴클레오티드 구축물을 발현하는 단계, 및
c) 상기 숙주 세포의 세포 배양물로부터 상기 항체 변이체를 회수하는 단계.
일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 항체이다. 그러나, 대부분의 실시양태에서, 항체는 경쇄를 또한 함유할 것이고, 따라서 상기 숙주 세포는 동일한 또는 상이한 벡터 상에서 경쇄-코딩 구축물을 추가로 발현한다.
항체의 재조합 발현에 적합한 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, CHO, HEK-293, Expi293T, PER-C6, NS/0 및 Sp2/0 세포가 포함된다. 한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 단백질의 Asn-연결된 글리코실화가 가능한 세포, 예를 들어 진핵생물 세포, 예컨대 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포이다. 추가의 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 인간-유사 또는 인간 글리코실화를 갖는 당단백질을 생성하도록 유전자 조작된 비-인간 세포이다. 이러한 세포의 예는 유전자-변형된 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (Hamilton et al., Science 301 (2003) 1244-1246; Potgieter et al., J. Biotechnology 139 (2009) 318-325) 및 유전자-변형된 렘나 미노르(Lemna minor) (Cox et al., Nature Biotechnology 12 (2006) 1591-1597)이다.
한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 항체 중쇄로부터 C-말단 리신 K447 잔기를 효율적으로 제거할 수 없는 숙주 세포이다. 예를 들어, Liu et al. (2008) J Pharm Sci 97: 2426 (본원에 참조로 포함됨)의 표 2는 이러한 수많은 항체 생성 시스템, 예를 들어 Sp2/0, NS/0 또는 트랜스제닉 유선 (염소)을 열거하며, 여기서 C-말단 리신의 일부분만이 제거된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 변경된 글리코실화 기구를 가진 숙주 세포이다. 이러한 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있으며, 본 발명의 변이체를 발현하여 변경된 글리코실화를 가진 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, 뿐만 아니라 EP1176195; WO03/035835; 및 WO99/54342를 참조한다. 조작된 글리코 형태를 생성하는 추가적인 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있으며, Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473), US6602684, WO00/61739A1; WO01/292246A1; WO02/311140A1; WO 02/30954A1; 포텔리전트(Potelligent™) 기술 (바이오와, 인크.(Biowa, Inc.) 뉴저지주 프린스턴); 글리코맙(GlycoMAb™) 글리코실화 조작 기술 (글리카트 바이오테크놀로지 아게(GLYCART biotechnology AG), 스위스 취리히); US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49에 기재된 것들이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 상기 기재된 본 발명의 방법에 의해 수득된 또는 수득가능한 항체에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 생성할 수 있는 숙주 세포에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 뉴클레오티드 구축물에 의해 형질전환되거나 형질감염되었다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 예시되며, 이는 추가의 제한으로 파악되어서는 안된다.
서열 표
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예
실시예 1:
항체 생성, 제조 및 정제
항체를 위한 발현 구축물
항체 발현을 위해, 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 서열을 유전자 합성 (진아트(GeneArt) 유전자 합성; 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 독일)에 의해 제조하고, IgG1 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 불변 영역을 함유하는 pcDNA3.3 발현 벡터 (써모피셔 사이언티픽, 미국)에 클로닝하였다. 원하는 돌연변이를 유전자 합성 또는 부위 지정 돌연변이 발생에 의해 도입하였다. 본 출원에서 언급된 항체는 이전에 기재된 CD38 항체 HuMAB 005 (WO2006/099875), DR5 항체 hDR5-01, hDR5-05 (WO2014/009358), CD52 항체 IgG1-캄파트 (알렘투주맙, Crowe et al., Clin Exp Immunol. 1992, 87(1):105-110), 및 CD20 항체 IgG1-7D8 및 IgG1-11B8 (WO2004/035607)로부터 유래된 VH 및 VL 서열을 갖는다. 일부 예에서, 인간 IgG1 항체 b12, gp120-특이적 항체를 음성 대조군으로 사용하였다 (Barbas et al., J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-23).
일시적인 발현
항체를 IgG1,κ로서 발현하였다. 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 플라스미드 DNA 혼합물을 본질적으로 Vink 등 (Vink et al., Methods, 65 (1), 5-10 2014)에 의해 기재된 바와 같이 293펙틴(293fectin) (인비트로젠(Invitrogen), 미국)을 사용하여 Expi293T 세포 (라이프(Life)/써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국)에서 일시적으로 발현하였다.
단백질의 정제 및 분석
항체를 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 배양물 상청액을 0.20 μM의 끝이 막힌 여과기 상에서 여과하고, 5 mL 맙셀렉트 수레(MabSelect SuRe) 컬럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 로딩하고, 0.02 M 시트르산나트륨-NaOH, pH 3으로 세척하고 용리시켰다. 정제한 직후에 용리액을 하이프렙(HiPrep) 탈염 컬럼 (지이 헬스케어) 상에 로딩하고, 항체에 대해 12.6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 완충제 (비.브라운(B.Braun) 또는 써모 피셔(Thermo Fisher))로 완충제 교환하였다. 완충제 교환 후에, 샘플을 0.2 μm의 끝이 막힌 여과기 상에서 멸균 여과하였다. 정제된 단백질을 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 (CE-SDS) 상에서의 모세관 전기영동 및 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)를 비롯한 수많은 생물분석 검정에 의해 분석하였다. 농도를 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 정제된 항체를 2-8℃에서 보관하였다.
실시예 2:
증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG-005 변이체의 시험관내 CDC 효능에 대한 야생형 항체에서 C1q 결합 및 CDC를 억제하는 것으로 이전에 제시된 돌연변이의 효과의 분석
인간 IgG1의 CH2 도메인에서 C1q 결합 중심을 잔기 D270, K322, P329 및 P331로의 알라닌 치환에 의해 맵핑하였다 (Idusogie et al., 2000 J. Immunol.). 돌연변이체 D270A, K322A 및 P329A는 보체 농도-의존성 방식으로 리툭시맙에 의한 C1q 결합 및 보체 활성화를 효율적으로 감소시킬 수 있었다 (Idusogie et al., 2000 J. Immunol).
세포 표면 상에서의 표적 결합 시 IgG 육합체화는 강력한 C1q 결합을 초래하는 C1q의 육합체 구조의 효율적인 결합을 지지하는 것으로 제시되어 있다 (Diebolder et al., Science 2014). 세포 표면 상에서 IgG 육합체화는 분자간 비공유 Fc-Fc 상호작용을 통해 매개되고, CH2 도메인에서의 점 돌연변이, 예컨대 E345R 및 E430G에 의해 증진될 수 있다 (Diebolder et al., 2014 Science; De Jong et al., 2015 PloS Biology). Fc-Fc 증진 돌연변이는 세포 표면 상에서 육합체 항체 구조에 대한 C1q 결합 결합력을 증가시키는 반면에, C1q 결합 친화도에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, C1q 결합 친화도를 감소시키는 것으로 기재된 돌연변이가 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 돌연변이를 갖는 IgG1 항체 변이체에 의해 CDC를 차단시킬 수 있는지 여부는 예측할 수 없다.
여기서 본 발명자들은 보체 활성화를 증진시키는 것으로 공지된 안정화된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG1-005 변이체: IgG1-005-E430G 및 IgG1-005-E345R (WO2013/004842, WO2014/108198) 및 IgG1-005-E345R/E430G/S440Y (WO2014/006217)에서 D270A/K322A (AA) 이중 돌연변이 도입의 효과를 분석하였다.
CDC 검정의 경우, 0.1 x 106 Daudi 세포 (ATCC # CCL-213™)를 폴리스티렌 둥근-바닥 96-웰 플레이트 (그라이너 바이오-원(bio-one) 카탈로그 번호 650101)에서 정제된 항체의 농도 시리즈와 함께 80 μL의 총 부피에서 15 분 동안 진탕기 상에서 RT에서 사전 인큐베이션하였다. 다음으로, 20 μL의 정상 인간 혈청 (NHS; 카탈로그 번호 M0008 산퀸, 네덜란드 암스테르담)을 보체 공급원으로서 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에서 45 분 동안 인큐베이션하였다 (20% 최종 NHS 농도; 3배 희석으로 0.001-10.0 μg/mL 최종 항체 농도). 플레이트를 얼음 상에 두어 반응을 중단시킨 후에, 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하고, 상청액을 2 μg/mL 프로피듐 아이오다이드 용액 (PI; 시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 네덜란드 즈비나르데) 20 μL로 교체하였다. PI-양성 세포의 개수를 인텔리시트 아이큐(Intellicyt iQue™) 스크리너 (베스트부르크(Westburg)) 상에서 FACS 분석에 의해 결정하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad PRISM) 5에서 로그-변환된 농도를 이용하는 비선형 용량-반응 대입의 최적-적합 값을 이용하여 데이터를 분석하였다. 용해 백분율은 (PI-양성 세포의 개수 / 세포의 총 개수) x 100%로 계산하였다.
야생형 (WT) IgG1-005에서 D270A/K322A (AA) 이중 돌연변이의 도입은 Daudi 세포에 대한 CDC의 완전한 억제를 초래하였다 (도 1). 대조적으로, Fc-Fc 상호작용 증진 돌연변이 E430G 또는 E345R의 존재 하에서는, D270A/K322A의 도입이 CDC 효능에 대해 작은 효과만을 가졌으며 (도 1): IgG1-005-E430G 및 IgG1-005-AA-E430G에 대해 각각 EC50 0.01 ± 0.01 (μg/mL ± SD) 및 0.06 ± 0.02 μg/mL를 가지면서 100%의 동일한 최대 사멸을 나타내고; IgG1-005-E345R 및 IgG1-005-AA-E345R에 대해 각각 EC50 0.01 μg/mL 및 0.14 μg/mL를 가지면서 100% 및 74.3%의 최대 사멸을 초래하였다. 용액 중에서 항체 육합체화를 초래하는 삼중 돌연변이 E345R/E430G/S440Y의 존재 하에서는 (Diebolder et al., 2014 Science; Wang et al., 2016 Mol. Cell), D270A/K322A는 CDC에 대해 어떠한 효과도 갖지 않았다 (도 1).
이들 데이터는 WT IgG1 항체의 CDC 활성을 억제한 돌연변이가 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 돌연변이를 갖는 항체 변이체의 CDC 활성을 차단할 수 없었음을 제시한다.
실시예 3:
증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG1-005 변이체의 시험관내 CDC 효능에 대한 C1q 결합 코어의 위치 D270, K322 및 P329에서 돌연변이 선택의 효과의 분석
인간 IgG1 C1q 결합 부위의 위치 D270, K322 및 P329에서의 돌연변이는 C1q가 IgG1에 결합할 때 수립되는 단백질-단백질 상호작용을 방해하기 위한 목적으로 고안되었다. 따라서, WT 아미노산을 새로운 또는 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산으로 치환시켰다: D270R, K322E, P329D 및 P329R. 이들 추가적인 돌연변이체를 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 E430G 돌연변이를 갖는 IgG1-005 변이체의 CDC 효능에 대한 그들의 효과에 대해 시험하였다. 정제된 항체의 농도 시리즈 (3배 희석으로 0.001-10.0 μg/mL 최종 항체 농도)를 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 이용하여 Daudi 세포에 대한 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다.
Figure pct00006
K322E, P329D 또는 P329R 돌연변이의 도입은 IgG1-005-E430G에 의한 Daudi 세포의 CDC-매개된 사멸을 강력하게 억제하였다 (도 2A). 대조적으로, D270R의 도입은 효능에서의 감소 및 EC50 값에서의 증가를 초래하였지만 (IgG1-005-E430G 및 IgG1-005-D270R/E430G에 대해 각각 0.005 μg/mL 및 0.15 μg/mL), IgG1-005-E430G에 의한 Daudi 세포의 최대 사멸은 감소시키지 못했다. D270A/K322A에 대한 데이터는 실시예 2에 기재된 바와 같이 IgG1-005-E430G에 의한 CDC 효능에 대해 작은 효과만을 가짐을 제시하기 위한 참조로서 포함되었다.
IgG1-005-E430G의 CDC 효능을 억제하는 K322E, P329D 및 P329R 돌연변이의 경우, Daudi 세포에 결합된 항체로의 C1q 결합에 대한 효과를 FACS 분석에 의해 측정하였다. 0.1 x 106 Daudi 세포를 폴리스티렌 둥근-바닥 96-웰 플레이트에서 정제된 항체의 농도 시리즈 (3.33배 희석으로 0.0003-100.0 μg/mL 최종 항체 농도) 및 C1q 공급원으로서 20% C4-고갈된 혈청과 함께 4℃에서 30 분 동안 100 μL 반응으로 인큐베이션하였다. 100 μL의 FACS 완충제 (PBS/0.1% BSA/0.01% Na-아지드)를 첨가하고, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 세포를 150 μL의 FACS 완충제로 세척하고, 50 μL의 FITC-표지된 토끼 항-HuC1q 항체 (다코, 카탈로그 번호 F0254; 20 μg/mL 최종 농도)와 함께 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하고, 30 μL의 FACS 완충제에 재현탁시켜, 인텔리시트 아이큐™ 스크리너 상에서 평균 형광 강도를 결정하였다.
K322E, P329D 또는 P329R 돌연변이의 도입은 Daudi 세포에 결합된 IgG1-005-E430G로의 C1q 결합을 억제하였다 (도 2B).
종합하면, 이들 데이터는 IgG1-005-E430G에서 K322E, P329D 또는 P329R 돌연변이의 도입이 C1q 결합의 억제 및 동시에 Daudi 세포의 CDC-매개된 사멸을 초래하였음을 제시한다.
실시예 4: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG1-005 변이체의 시험관내 CDC 효능에 대한 K322X 돌연변이의 효과
실시예 1에 기재된 바와 같이 일시적인 형질감염의 상청액을 취함으로써 항체를 수집하였다. 항체 농도 시리즈 (3배 희석으로 0.001-30.0 μg/mL 최종 농도)를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 Daudi 세포에 대해 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다. E430G 돌연변이와 함께 위치 322의 리신 (K)의 알라닌 (A), 페닐알라닌 (F), 글리신 (G), 히스티딘 (H), 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V), 트립토판 (W), 티로신 (Y), 아스파르테이트 (D), 글루타메이트 (E) 또는 아스파라긴 (N)으로의 치환을 시험하였다 (도 3).
이 실험에서, 특이적인 돌연변이 K322D, K322E 및 K322N은 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG1-005-E430G에 의한 보체 활성화 및 CDC를 차단할 수 있었다.
실시예 5: 돌연변이 K322D, K322E 또는 K322N을 함유하는 IgG1-005-E430G 변이체의 생물물리학 특징분석
K322E, K322D 또는 K322N 돌연변이를 갖는 IgG1-005-E430G 변이체의 정제된 항체 배치를 CE-SDS 및 HP-SEC에 의해 분석하였다.
CE-SDS를 환원 및 비-환원 조건 하에 수행하였다. 샘플의 순도 및 단편화를 랩칩(Labchip) GXII (고감도 프로토콜) 상에서 CE-SDS (캘리퍼 랩칩(Caliper Labchip) GXII, 퍼킨엘머(PerkinElmer))를 일부 변형하여 이용함으로써 분석하였다. 비-환원된 및 환원된 샘플 (DTT의 첨가) 둘 다를 HT 단백질 발현 시약 키트 (CLS960008)를 이용하여 제조하고, 70℃에서 10 분 동안 인큐베이션에 의해 변형시켰다. 샘플을 HT 항체 분석 200 고감도 설정에서 작동시켰다. 데이터를 랩칩 GXII 소프트웨어를 이용하여 분자량 및 순도 (총 분획)에 대해 분석하였다. 도 4A는 IgG1-005-K322E/E430G가 디술피드-가교된 중쇄 및 경쇄를 갖는 야생형 IgG1 검정 대조군에 필적하는 거동을 나타내었음을 제시한다. 대략 150 kDa의 겉보기 MW를 갖는 단일 분자 종은 비-환원 조건 하에 가시적인 반면에, 환원 조건 하에서는 50 kDa의 겉보기 MW를 갖는 중쇄 및 26 kDa의 경쇄가 가시적이었다. 항체 변이체 IgG1-005-K322D/E430G 및 IgG1-005-K322N/E430G는 비-환원 조건 하에 보다 고분자량 응집물을 함유하였으며, 이는 환원 후에는 분해되는 것으로 보였다.
HP-SEC 분별화는 TSK HP-SEC 컬럼 (G3000SWxl; 토소 바이오사이언시스(Toso Biosciences), 옴니라보(Omnilabo)를 통해, 네덜란드 브레다) 및 워터스(Waters) 2487 이중 λ 흡광도 검출기 (워터스)에 연결된 워터스 알리안스(Waters Alliance) 2975 분리 장치 (워터스, 네덜란드 에텐-루어)를 이용하여 수행하였다. 1.25 μg/mL의 단백질을 함유하는 50 μL의 샘플을 pH 6.8에서 완충된 0.1 M Na2SO4 /0.1 M 인산나트륨 중에서 1 mL/min으로 분리하였다. 결과는 엠파워(Empower) 소프트웨어 버젼 3을 이용하여 가공하고, 총 피크 면적의 백분율로서 피크마다 나타내었다. 도 4B는 항체 IgG1-005-K322E/E430G가 단량체 종에 대해 예상되는 용리 시간에서 우세하게 용리된 반면에 (98% 단량체), 변이체 IgG1-005-K322D/E430G (70% 응집됨) 및 IgG1-005-K322N/E430G (43% 응집됨)는 보다 고분자량 종을 상당량 나타내었음을 제시한다. 따라서, HP-SEC 분석은 이중 돌연변이체 K322E/E430G가 이중 돌연변이체 K322D/E430G 및 K322N/E430G에 비해 용액 중에서 더욱 균질하였음을 시사한다.
실시예 6: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG1-005 변이체의 시험관내 CDC 효능에 대한 P329X 돌연변이의 효과
본 실시예에서 시험관내 CDC 효능에 대한 P329X 돌연변이의 효과를 증진된 CDC를 갖는 항체 IgG1-005-E430G에 대해 시험하였다. 상이한 농도의 정제된 항체 (0.001-30.0 μg/mL 최종 농도 범위)를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 Daudi 세포에 대해 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다.
Daudi 세포에 대한 IgG1-005-E430G의 CDC 효능은 위치 P329의 프롤린을 아스파르테이트 (D), 글루타메이트 (E), 페닐알라닌 (F), 글리신 (G), 히스티딘 (H), 이소류신 (I), 리신 (K), 류신 (L), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V), 트립토판 (W) 또는 티로신 (Y)으로 치환시킴으로써 완전히 억제되었다 (도 5). 대조적으로, 위치 329의 프롤린에서 알라닌 (A)으로의 치환은 IgG1-005-E430G에 대해 0.01 μg/mL에서 IgG1-005-P329A/E430G에 대해 0.11 μg/mL로 EC50을 이동시키면서 CDC 효능을 단지 부분적으로 감소시켰지만, 최대 사멸에 대한 효과는 없었다. 이들 데이터는 위치 329의 프롤린에서 또 다른 아미노산으로의 치환이 IgG1-005-E430G에 의한 CDC 효능의 억제 (P329D/E/F/G/H/I/K/L/N/Q/R/S/T/V/W/Y의 경우) 또는 억제 없음 (P329A의 경우)을 초래하였음을 예시한다.
실시예 7: 위치 P329에서 돌연변이를 함유하는 IgG1-005-E430G 변이체의 생물물리학 특징분석.
위치 329의 프롤린이 시스테인을 제외한 임의의 다른 아미노산으로 치환된 IgG1-005-E430G 변이체의 정제된 항체 배치를 CE-SDS 및 HP-SEC에 의해 분석하였다.
CE-SDS를 실시예 5에 기재된 바와 같이 환원 및 비-환원 조건 하에 수행하였다. 아미노산 P329의 추가적인 돌연변이를 함유하는 모든 시험한 IgG1-005-E430G 항체 변이체는 디술피드-가교된 중쇄 및 경쇄를 갖는 야생형 IgG1 검정 대조군 항체와 유사한 거동을 나타내었고, 대략 150 kDa의 겉보기 MW를 갖는 단일 분자 종은 비-환원 조건 하에 가시적인 반면에, 환원 조건 하에서는 50 kDa의 겉보기 MW를 갖는 중쇄 및 26 kDa의 경쇄가 가시적이었다 (표 1에 요약됨). 이들 데이터는 변성 조건 하에 야생형 IgG1 항체의 전형적인 거동을 나타내는 단량체 분자가 형성됨을 시사한다.
HP-SEC 분별화를 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다. 아미노산 P329에서 추가적으로 돌연변이된 시험한 IgG1-005-E430G 항체 변이체는 가변량의 보다 고분자량 종을 함유하였다 (표 1). 변이체 IgG1-005-P329R/E430G, IgG1-005-P329D/E430G, 및 IgG1-005-P329T/E430G는 용액 중에서 본질적으로 균질하였다.
표 1. IgG1-005-P329X/E430G 항체 변이체 (여기서 X는 P 또는 C 이외의 임의의 아미노산을 나타냄)의 CE-SDS 및 HP-SEC에 의한 생물물리학 특징분석.
Figure pct00007
실시예 8: 위치 P329에서 돌연변이를 함유하는 IgG1-005-E430G 변이체의 열 안정성의 분석
위치 329의 프롤린이 시스테인 이외의 임의의 다른 아미노산으로 치환된 IgG1-005-E430G 변이체의 정제된 항체 배치를 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 분석하였다.
DSF를 외인성 염료 스피로-오렌지(Sypro-Orange) (써모피셔 사이언티픽, S6651)가 변성된 IgG에 의해 노출된 소수성 영역에 결합함으로써 초래되는 형광 강도에서의 변화를 검출할 수 있는 iQ5 96-웰 RT-PCR 기계 (바이오-라드(Bio-Rad))에서 수행하였다. 열 용융 곡선은 분석된 IgG의 제어된 단계적인 열 변성 동안에 증가하는 형광을 측정함으로써 도출될 수 있다. 따라서, PBS pH 7.4 (비. 브라운, 네덜란드) 또는 30 mM NaAc pH 4 중에서 20 μL의 75 mM 스피로-오렌지와 혼합된 5 μL의 0.6 mg/mL IgG 단백질의 샘플을 2개 제조하였다. 형광을 증분당 0.5℃의 단계적인 증분으로 25℃ 내지 95℃의 온도에서 및 15 초의 지속시간 + 모든 웰의 형광을 기록하는데 필요한 시간에서 기록하였다.
각각의 분석된 항체의 경우, 온도 증가 시 형광 강도에서의 급격한 증가로서 관찰되는 제1 열 전이 (Tm)의 중간점을 2개의 복제 샘플 둘 다에 대해 평균하여 표 2에 요약하였다. IgG1-005 및 IgG1-005-E430G에서 P329R 또는 P329K의 도입은 항체의 Tm 온도에서의 적당한 증가를 초래한 반면에, P329D의 도입은 WT IgG1-005 및 IgG1-005-E430G 둘 다의 Tm 온도를 감소시켰다. 이들 데이터는 P329R 또는 P329GK의 도입이 IgG1-005 및 IgG1-005-E430G의 열 안정성을 증가시킨 반면에, P329D는 이들 항체의 열 안정성을 감소시켰음을 시사한다.
표 2: IgG1-005-P329X/E430G 항체 변이체의 DSF 분석.
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1 IgG1-005 항체 변이체는 감소하는 Tm에 따라 등급이 매겨졌음.
2 온도 증가 시에 관찰된 제1 열 전이의 중간점. 각각의 값은 2개 측정치의 평균을 나타냄.
실시예 9: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG1-005 변이체에 의한 FcγRIIIa 활성화에 대한 위치 P329에서의 돌연변이의 효과
ADCC의 유도에 대한 효과를 위치 329의 프롤린이 시스테인, 아스파르테이트, 메티오닌 또는 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산으로 치환된 IgG1-005-E430G 변이체에 대해 시험하였다. 위치 P329에서의 돌연변이 (P329A/E/F/G/H/I/K/L/N/Q/S/T/V/W/Y)를 함유하는 IgG1-005-E430G 변이체에 의한 FcγRIIIa-매개된 신호전달의 활성화는 제조자의 지침에 따라 (프로메가, #TM383) Daudi 세포에 대해 발광 ADCC 리포터 생물검정 (프로메가, 카탈로그 번호 G7015)을 이용하여 정량화하였다. 이펙터 세포로서, 키트는 고친화도 FcγRIIIa (V158)를 안정하게 발현하도록 조작된 Jurkat 인간 T 세포, 및 반딧불이 루시페라제의 발현을 유도하는 활성화된 T 세포의 핵 인자 (NFAT)-반응 요소를 함유한다. 간략히, Daudi 세포 (5.000 세포/웰)를 ADCC 검정 완충제 (3.5% 저 IgG 혈청으로 보충된 RPMI-1640 배지 (론자(Lonza), 카탈로그 번호 BE12-115F)) 중에서 384-웰 화이트 옵티플레이트(OptiPlate) (퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6007290)에 시딩하고, 항체 농도 시리즈 (5배 희석으로 0.128-2.000 ng/mL 최종 농도) 및 해동된 ADCC 생물검정 이펙터 세포를 함유하는 총 30 μL 부피로 37℃/5% CO2에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 실온 (RT)에서 15 분 동안 인큐베이션한 후, 30 μL 바이오 글로(Bio Glo) 검정 루시페라제 시약을 첨가하고, RT에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 루시페라제 생성을 엔비젼 멀티라벨 판독기(EnVision Multilabel Reader) (퍼킨 엘머) 상에서 발광 판독치에 의해 정량화하였다. 발광 신호는 배지-단독 샘플 (Daudi 세포 없음, 항체 없음, 이펙터 세포 없음)로부터 결정된 백그라운드 발광 신호를 차감함으로써 정규화하였다.
IgG1-005-E430G에 의한 용량-반응성 FcγRIIIa 활성화는 항체 농도 시리즈 3.2 ng/nL - 16 ng/mL - 80 ng/mL에 대해 도 6에 예시된 바와 같이 모든 시험한 농도의 모든 P329X 변이체 (제시되지 않음)에 의해 완전히 억제되었다. 이들 데이터는 위치 329에서 프롤린이 FcγRIIIa의 결합 및 활성화에 필수적임을 예시한다.
실시예 10: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG1-005 변이체의 ADCC 효능에 대한 위치 K322 및 P329에서의 돌연변이 효과의 분석
유리한 생물물리학 특징 (실시예 5, 실시예 7 및 실시예 8에 기재됨)을 제시하는 IgG1-005-E430G의 CDC-억제 돌연변이체 (실시예 4 및 실시예 6에 기재됨)를 그들의 ADCC 효능에 대해 시험하였다. K322E, P329A, P329D, P329K 또는 P329R 돌연변이를 함유하는 IgG1-005-E430G 변이체를 이펙터 세포로서 3명의 상이한 건강한 공여자로부터 새로 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 이용하여 Daudi 세포에 대해 시험관내 ADCC 검정에 적용하였다. 제조자의 지침에 따라 표준 피콜(Ficoll) 밀도 원심분리를 위해 림프구 분리 배지 (론자, 카탈로그 번호 17-829E)를 사용하여 연막(buffy coats) (산퀸, 네덜란드 암스테르담)으로부터 PBMC를 단리하였다. 철 함유 10% 공여자 소 혈청 (DBSI, 써모피셔, 카탈로그 번호 10371029) 및 Pen/Strep (론자, 카탈로그 번호 DE17-603E)으로 보충된 RPMI-1640 배지 (론자, 카탈로그 번호 BE12-115F)에서 세포를 재현탁시킨 후, 세포를 트립판 블루 배제에 의해 카운트하고, 1x107 세포/mL로 농축시켰다.
Daudi 세포를 수확하고 (5x106 세포/mL), 세척하고 (PBS로 2회, 1200 rpm, 5 분), 10% DBSI 및 Pen/Strep으로 보충된 1 mL RPMI-1640 배지에서 수집하고, 여기에 100 μCi 51Cr (크로뮴-51; 퍼킨엘머, 카탈로그 번호 NEZ030002MC)을 첨가하였다. 혼합물을 진탕 수조에서 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척한 후 (50 mL PBS로 2회, 1200 rpm, 5 분), 세포를 10% DBSI 및 Pen/Strep으로 보충된 RPMI-1640 배지에 재현탁시키고, 트립판 블루 배제에 의해 카운트하고, 1x105 세포/mL의 농도로 희석하였다.
ADCC 실험의 경우, 50 μL의 51Cr-표지된 Daudi 세포 (5.000 세포/웰)를 96-웰 둥근-바닥 미세적정 플레이트 (그라이너 바이오-원; 카탈로그 번호 650101)에서 10% DBSI 및 Pen/Strep으로 보충된 총 100 μL 부피의 RPMI-1640 배지에서 IgG1-005-E430G 항체 변이체의 농도 시리즈 (3배 희석으로 0.3-1.000 ng/mL 최종 농도)와 함께 사전 인큐베이션하였다. RT에서 20 분 후에, 50 μL의 PBMC (500.000 세포)를 첨가하여 100:1의 이펙터 대 표적 비를 초래하고, 37℃/5% CO2에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해의 최대량을 결정하기 위해, 50 μL의 51Cr-표지된 Daudi 세포 (5.000 세포)를 100 μL의 5% 트리톤-X100과 함께 인큐베이션하였다. 자발적인 용해의 양을 결정하기 위해, 5.000 51Cr-표지된 Daudi 세포를 임의의 항체 또는 이펙터 세포 없이 150 μL 배지에서 인큐베이션하였다. 항체-비의존성 세포 용해의 수준은 5.000 Daudi 세포를 항체 없이 500.000 PBMC와 인큐베이션함으로써 결정하였다. 방출된 51Cr의 양을 카운트하기 위해, 플레이트를 원심분리하고 (1200 rpm, 10 분), 25 μL의 상청액을 96-웰 플레이트에서 100 μL 마이크로신트(Microscint)-40 용액 (팩커드(Packard), 카탈로그 번호 6013641)으로 옮겼다. 플레이트를 밀봉하고, 800 rpm에서 15 분 동안 진탕시키고, 방출된 51Cr을 감마 카운터를 이용하여 카운트하였다. 측정된 분당 카운트 (cpm)를 이용하여 하기와 같이 항체-매개된 용해의 백분율을 계산하였다: (cpm 샘플 - cpm Ab-비의존성 용해)/(cpm 최대 용해 - cpm 자발적인 용해) x 100%.
IgG1-005-E430G에 의한 Daudi 세포의 용량-반응성 ADCC-매개된 사멸은 도 7에서 항체 농도 시리즈 0.3 ng/mL - 3 ng/mL - 30 ng/mL - 300 ng/mL에 대해 예시된 바와 같이 P329D, P329K 또는 P329R 돌연변이를 도입함으로써 완전히 억제되었다. 대조적으로, K322E 또는 P329A 돌연변이를 갖는 IgG1-005-E430G 변이체는 Daudi 세포에 대해 상당한 ADCC 효능을 보유하였다.
실시예 4 및 실시예 6에 기재된 CDC 데이터, 실시예 9에 기재된 ADCC 리포터 데이터 및 본 실시예에 기재된 시험관내 ADCC 데이터를 요약하면, 세포 표면 상에서의 표적 결합 시 Fc-Fc 상호작용 및 육합체화에 대한 E430G 돌연변이의 증진 효과에도 불구하고, P329D, P329K 또는 P329R 돌연변이의 도입이 IgG1-005-E430G의 CDC 및 ADCC 활성 둘 다를 억제하였다. 대조적으로, K322E 및 P329A 돌연변이는 IgG1-005-E430G에 의해 CDC 억제를 초래한 반면에, ADCC 효능을 보유하였다.
실시예 11: P329D 돌연변이는 일반적으로 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 돌연변이를 갖는 IgG1 항체에 의한 보체 활성화 및 CDC를 억제하기 위해 적용가능하다
실시예 3 및 실시예 6은 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 E430G 돌연변이를 함유하는 항-CD38 mAb IgG1-005 변이체에서 P329D 돌연변이의 도입이 Daudi 세포에 대한 CDC 활성의 완전한 억제를 초래하였음을 기재한다. 다음으로, P329D 돌연변이의 도입이 다른 Fc-Fc-증진 돌연변이를 함유하는 IgG1-005 변이체에 대해 동일한 효과를 갖는지를 시험하였다. 따라서, P329D 돌연변이를 E345R, E345K 또는 E345R/E430G/S440Y (RGY) 돌연변이(들)을 갖는 IgG1-005 변이체에 도입하고, Daudi 세포에 대해 C1q 결합 및 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다.
Daudi 세포에 결합된 항체에 대한 C1q 결합은 실시예 3에 기재된 바와 같이 FACS 분석에 의해 측정하였다. CDC 검정의 경우, 항체 농도 시리즈 (3.33배 희석으로 0.0003-100.0 μg/mL 최종 농도)를 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 Daudi 세포에 대해 시험하였다.
P329D 돌연변이의 도입은 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 E345K, E345R 또는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 갖는 IgG1-005 변이체에 의해 Daudi 세포에 대한 C1q 결합 (도 8A) 및 CDC 효능 (도 8B)의 완전한 억제를 초래하였다.
실시예 3에 기재된 E430G 데이터와 함께 본 실시예에 나타낸 E345K, E345R 및 RGY 돌연변이에 의한 데이터는 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 돌연변이를 갖는 IgG1-005 항체에 의한 C1q 결합 및 CDC 효능이 일반적으로 P329D 돌연변이의 도입에 의해 억제될 수 있음을 예시한다.
실시예 12: K322E 또는 P329D 돌연변이를 함유하는 육합체성 IgG1-005-E345R/E430G/S440Y 변이체의 생물물리학 특징분석
IgG1 육합체화에 대한 K322E 및 P329D의 효과를 연구하기 위해, 본 발명자들은 삼중 돌연변이체 IgG1-005-E345R/E430G/S440Y를 사용하였으며, 이는 3개의 Fc-Fc 상호작용-증진 돌연변이 E345R, E430G 및 S440Y (RGY)가 조합된 것이고, 용액 중에서 항체 육합체를 형성하는 것으로 제시하였다 (Diebolder et al., Science 2014). K322E 또는 P329D를 IgG1-005-RGY에 도입하여 IgG1-005-K322E/E345R/E430G/S440Y (IgG1-005-ERGY) 및 IgG1-005-P329D/E345R/E430G/S440Y (IgG1-005-DRGY)를 생성하였고, 항체 육합체화에 대한 효과를 CE-SDS, HP-SEC 및 네이티브 질량 분광분석법에 의해 분석하였다.
HP-SEC 분별화를 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다. IgG1-005-RGY에 대해 관찰된 거동과 일치하게 (Diebolder et al., Science 2014), IgG1-005-ERGY 및 IgG1-005-DRGY 둘 다 용액 중에서 올리고머화하는 그들의 능력을 보유하였다 (도 9A). 올리고머 (용리 시간 ~6.3 분) 및 단량체 (용리 시간 ~9-9.3 분)에 상응하는 2개의 피크가 관찰되었고, 중간체 강도는 아마도 올리고머와 단량체 상태 사이의 동적 교환에 의해 초래되었다. IgG1-005-ERGY에서 올리고머 분획은 58.4%로 결정된 반면에, 31.4%는 단량체이었고; 10.2%는 중간체 종으로서 용리되었다. IgG1-005-DRGY에서 올리고머 분획은 78.8%로 결정된 반면에, 단량체 분획은 12.5%이었고; 중간체 종은 8.7%로 관찰되었다.
CE-SDS를 환원 및 비-환원 조건 하에 수행하였다. IgG1-005-RGY에 대해 관찰된 결과에 따라 (Diebolder et al., Science 2014), IgG1-005-ERGY 및 IgG1-005-DRGY 둘 다 비-환원 조건 하에 대략 150 kDa의 겉보기 MW를 갖는 단일 분자 종을 나타낸 반면에, 환원 조건 하에서는 50 kDa의 겉보기 MW 및 26 kDa의 경쇄를 갖는 중쇄가 가시적이었다 (도 9B). 이들 데이터는 IgG1-005-ERGY 및 IgG1-005-DRGY가 WT 단량체 IgG1 검정 대조군 항체와 유사하게 거동하였음을 제시하고, 비공유 Fc-Fc 상호작용과 일치하게 변성 CE-SDS 조건 하에 육합체화가 방해되었음을 나타낸다.
과량의 C1q의 부재 또는 존재 하에 150 mM 아세트산암모늄 pH 7.5 중에서 완충된 2 μM IgG1-005-DRGY에 대한 네이티브 질량 분광분석법 분석을 고 질량 검출에서 최적의 성능을 위해 조정된 변형 LCT 비행 시간 (워터스, 영국) 질량 분광분석기를 이용하여 수행하였다. 표준 정적 나노스프레이 공급원에 탑재된 붕규산염 유리 모세관으로부터 샘플을 분무하였다. 데이터 분석은 매스링스(MassLynx) (워터스, 영국) 및 오리진 프로(Origin Pro) (오리진 랩(Origin Lab), 미국) 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. IgG1-005-RGY에 대해 관찰된 바와 같이, IgG1-005-DRGY는 육합체를 형성하였다 (도 9). IgG1-005-DRGY 육합체에 C1q의 첨가는 검출가능한 C1q 결합을 나타내지 않은 반면에, IgG1-005-RGY는 동등한 조건 하에 C1q에 용이하게 결합하였다 (도 9C).
요약하면, 이 실시예에 기재된 생물물리학 분석은, 돌연변이 P329D 또는 K322E를 억제하는 C1q 결합의 도입이 용액 중에서 IgG1-005-RGY의 육합체화를 차단하지 않았지만 (HP-SEC, 네이티브 MS), C1q 결합을 완전히 제거하였음을 나타낸다 (네이티브 MS). 더욱이, 용액 중에서 항체 변이체 IgG1-005-ERGY 및 IgG1-005-DRGY에 의해 형성된 올리고머는 IgG1-005-RGY에 대해 기재된 Fc-Fc 상호작용과 일치하게 비공유 상호작용 (CE-SDS)에 의해 형성되었다 (Diebolder et al., Science 2014).
실시예 13: P329D 돌연변이의 존재 하에 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 효능제 DR5 항체에 의한 사멸을 유도하는 효능의 분석
효능제 사멸 수용체 5 (DR5) 항체는 DR5 하이퍼클러스터링을 통한 외인성 아폽토시스 경로의 활성화에 의해 DR5-양성 종양 세포의 사멸을 유도할 수 있고, 아답터 단백질인 사멸 도메인을 갖는 Fas-연관 단백질 (FADD)을 세포내 DR5 사멸 도메인으로 동원시키며, 이는 카스파제-8의 결합 및 활성화를 유도하고, 아폽토시스를 개시하는 DISC (사멸-유도 신호전달 복합체)의 형성을 유도한다. Fc-Fc 상호작용이 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 E430G 돌연변이를 함유하는 DR5 항체의 조합물 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G)에 의한 사멸에 수반됨을 제시하기 위해, 본 발명자들은 Fc-Fc 상호작용에 수반되는 소수성 패치에 있는 코어 아미노산을 함유하는 영역에서 Fc에 결합하는 13-잔기 펩티드 DCAWHLGELVWCT (DeLano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83)를 사용하였다 (Diebolder et al., Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3). BxPC-3 세포에 대한 생존력 검정을 DCAWHLGELVWCT 펩티드의 존재 또는 부재 하에 수행하였다. 부착성 BxPC-3 (ATCC, CRL-1687) 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 세포 스트레이너에 통과시켰다. 세포를 1,200 rpm에서 5 분 동안 원심분리에 의해 펠렛화하고, 0.5x105 세포/mL의 농도를 갖는 배양물 배지 (25mM Hepes 및 L-글루타민 (론자 카탈로그 번호 BE12-115F) + 10% DBSI (라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 카탈로그 번호 10371-029) + Pen/Strep (론자 카탈로그 번호 DE17-603E)을 갖는 RPMI 1640)에 재현탁시켰다. 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 편평-바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, 카탈로그 번호 655182)에 시딩하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 배양물 배지를 제거하고, 100 μg/mL의 Fc-결합 DCAWHLGELVWCT 펩티드를 함유하거나, 비-특이적인 대조군 펩티드 GWTVFQKRLDGSV를 함유하거나, 또는 펩티드를 함유하지 않는 100 μL의 배양물 배지로 교체하였다. 다음으로, 50 μL의 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G (833 ng/mL 최종 농도)을 첨가하고, 37℃에서 3 일 동안 인큐베이션하였다. 최대 사멸을 결정하기 위해, 샘플을 5 μM 스타우로스포린 (시그마 알드리치, 카탈로그 번호 S6942)과 함께 인큐베이션하였다. 대사 활성 세포의 지표인 존재하는 ATP를 정량화하는 셀타이터-글로 발광 세포 생존력 검정 (프로메가, 카탈로그 번호 G7571)으로 생존가능한 세포 백분율을 결정하였다. 키트로부터, 20 μL의 루시페린 용액 시약을 웰마다 첨가하고, 플레이트를 500 rpm에서 2 분 동안 진탕시킴으로써 혼합하였다. 다음으로, 플레이트를 37℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 100 uL의 상청액을 화이트 옵티플레이트-96 (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6005299)으로 옮기고, 엔비젼 멀티라벨 판독기 (퍼킨엘머) 상에서 발광을 측정하였다. 데이터를 분석하고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하는 비선형 회귀법 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)을 이용하여 플롯팅하였다. 생존가능한 세포 백분율을 하기 식을 이용하여 계산하였다: % 생존가능한 세포 = [(발광 항체 샘플 - 발광 스타우로스포린 샘플)/(발광 항체 무함유 샘플 - 발광 스타우로스포린 샘플)]*100.
BxPC-3 세포의 사멸을 유도하는 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 능력이 100 μg/mL의 Fc-결합 DCAWHLGELVWCT 펩티드에 의해 강력하게 억제되었다 (도 10A). 이들 데이터는 암 세포의 세포 표면 상에서 DR5 클러스터링을 유도하고 아폽토시스를 유도하기 위해서는 Fc-Fc-증진 돌연변이를 갖는 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G에 대해 Fc-Fc 상호작용이 필요하였음을 나타낸다.
다음으로, 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 E430G 돌연변이를 갖는 효능제 DR5 항체에 의한 DR5 클러스터링 및 아폽토시스 유도에 대한 돌연변이 P329D 도입의 효과를 연구하기 위해 생존력 검정을 수행하였다. 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 BxPC-3 세포에 대한 생존력 검정을 수행하였다. 간략히, 밤새 부착시킨 BxPC-3 세포 (5,000 세포/웰)를 37℃에서 3 일 동안 5 μg/mL 또는 10 μg/mL의 최종 항체 농도에서 총 150 μL 부피로 인큐베이션하였다. 생존가능한 세포 백분율을 셀타이터-글로 발광 세포 생존력 검정으로 결정하였다.
P329D (도 10B) 또는 K322E (도 10C) 돌연변이를 도입한 후에, 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 E430G 돌연변이를 갖는 조합물 IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 포화 항체 농도는 여전히 BxPC-3 세포의 사멸을 유도할 수 있었다.
종합하면, 이들 데이터는 P329D 및 K322E 돌연변이가 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 E430G 돌연변이를 갖는 효능제 DR5 항체의 포화 농도에 의해 표적 세포 상에서의 DR5 결합 시 클러스터링 및 아폽토시스 유도를 위해 필요한 Fc-Fc 상호작용을 차단하지 않았음을 예시한다.
실시예 14: K322E, P329D 또는 P329R 돌연변이를 함유하는 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG1-005 변이체의 글리코실화 프로파일링
정제된 항체 IgG1-005-K322E/E430G, IgG1-005-P329D/E430G 및 IgG1-005-P329R/E430G의 N-연결된 글리칸을 질량 분광분석법에 의해 분석하였다.
IgG 샘플을 DTT와 함께 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 60℃에서 밀리큐(MilliQ) 물 (용리액 A) 및 LC-MS 등급 아세토니트릴 (용리액 B) (이들 둘 다 0.05% 포름산 (플루카(Fluka))을 함유함)을 사용하는 프로스위프트(Proswift) RP-4H 1 x 250 mm 컬럼 (써모 사이언티픽) 상에서 10 분 차단 구배를 이용함으로써 얼티메이트(Ultimate) 3000 UPLC 시스템 (디오넥스(Dionex)) 상에서 샘플을 탈염시켰다. UPLC 시스템을 전자분무 이온화 HESI 공급원을 구비한 큐-이그제큐티브 플러스 오르비트랩 MS 시스템(Q-Exactive Plus Orbitrap MS system) (써모 사이언티픽)에 커플링시켰다. 분석하기 전에, 800-3000 m/z 규모를 LTQ 벨로스(Velos) ESI 양성 보정 믹스를 이용하여 보정하였다. 기록된 질량 스펙트럼을 단백질 디콘볼루션(Deconvolution) 소프트웨어 (써모 사이언티픽)를 이용하여 디콘볼루션시키고, 개별 N-연결된 글리칸의 상대적 존재비를 정량화하기 위해 사용하였다.
항체 변이체 IgG1-005-K322E/E430G, IgG1-005-P329D/E430G 및 IgG1-005-P329R/E430G는 모두 낮은 수준의 만노스-5 또는 하전된 종, 높은 수준의 푸코실화, 및 10% 내지 30%의 갈락토실화 종을 가지면서 EXPI293 세포에서 발현되는 IgG1 항체에 대해 일반적으로 관찰되는 것과 유사한 글리코실화 프로파일을 나타내었다 (표 3). 이들 데이터는 돌연변이 K322E, P329D 및 P329R이 IgG1-005-E430G의 글리코실화 프로파일에 실질적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
표 3: IgG1-005-E430G 변이체의 N-연결된 글리칸 분포
Figure pct00009
실시예 15: K322E, P329D 또는 P329R 돌연변이를 함유하는 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG-005 변이체의 약동학적 (PK) 분석
IgG1-005-E430G의 클리어런스율에 대한 K322E, P329D 및 P329R 돌연변이의 효과를 SCID 마우스에서 PK 실험으로 연구하였다. IgG1-005-K322E/E430G, IgG1-005-P329D/E430G 및 IgG1-005-P329R/E430G의 클리어런스율을 CDC-억제 돌연변이를 갖지 않는 IgG1-005-E430G 및 증진된 Fc-Fc 상호작용에 대한 E430G 돌연변이를 갖지 않는 WT IgG1-005와 비교하였다.
이 연구에서 마우스를 중심 실험실 동물 시설(Central Laboratory Animal Facility) (네덜란드 우트레흐트)에 하우징하고, AAALAC 및 ISO 9001:2000 승인된 동물 시설 (GDL)에서 FELASA에 의해 정의된 바와 같은 우수한 동물 실무에 따라 취급하였다. 모든 실험을 지침 (2010/63/EU)으로부터 번역되고 우트레흐트 대학 동물 윤리 위원회에 의해 승인된 네덜란드 동물 보호법 (WoD)을 준수하여 수행하였다. 11-12 주령의 암컷 SCID (C.B-17/IcrHan@Hsd-Prkdc<scid, 엔비고(Envigo)) 마우스 (그룹당 3 마리의 마우스)에게 500 μg 항체 (25 mg/kg)를 210 μL (IgG1-005-K322E/E430G의 경우) 또는 200 μL (다른 배치의 경우) 주사 부피로 정맥내 주사하였다. 항체를 투여한지 10 분, 4 시간, 1 일, 2 일, 7 일, 14 일 및 21 일 후에 복재 정맥으로부터 50-100 μL의 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액을 헤파린-함유 바이알에 수집하고, 14,000 g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 20 μL의 혈장 샘플을 0.2% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 보충된 980 μL의 PBST (0.05% 트윈 20으로 보충된 PBS)로 희석하고, 항체 농도를 결정할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 총 인간 IgG 농도를 샌드위치 ELISA를 이용하여 결정하였다. 마우스 항-인간 IgG-카파 mAb 클론 MH16 (CLB 산퀸, 카탈로그 번호 M1268)을 포획 항체로서 사용하였고, 100 μL 중에서 4℃에서 밤새 96-웰 마이크롤론 ELISA 플레이트 (그라이너, 독일)에 2 μg/mL의 PBS 농도에서 코팅하였다. 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 1 시간 동안 0.2% BSA로 보충된 PBS와 함께 인큐베이션함으로써 플레이트를 차단하였다. 세척한 후, 100 μL의 희석된 혈장 샘플을 첨가하고, 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 μL의 PBST로 3회 세척하고, 후속적으로 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 1 시간 동안 100 μL의 퍼옥시다제-표지된 염소 항-인간 IgG 이뮤노글로불린 (#109-035-098, 잭슨(Jackson), 펜실베니아주 웨스트 그레이스; 0.2% BSA로 보충된 PBST 중에서 1:10.000)과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 μL의 PBST로 다시 3회 세척한 후에, RT에서 15 분 동안 빛으로부터 보호하면서 100 μL의 기질 2,2'-아지노-비스 (3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산) [ABTS; 로쉐, 카탈로그 번호 11112 422001; 50 mL ABTS 완충제 중의 1 정제 (로쉐, 카탈로그 번호 11112 597001)]과 함께 인큐베이션하였다. 100 μL의 2% 옥살산을 첨가하여 반응을 중단시키고, RT에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트 판독기 (바이오텍(Biotek), 버몬트주 위누스키)에서 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도는 참조 곡선으로서 주사된 물질을 이용하여 계산하였다. IgG를 함유하는 플레이트 대조군 인간 골수종 단백질 (더 본딩 사이트(The binding site), 영국)이 포함되었다. 인간 IgG 농도 (μg/mL)를 플롯팅하고 (도 11A), 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 6.0을 이용하여 계산하였다. 혈액 샘플링 마지막 날 (21 일째)까지의 클리어런스율을 식 D*1.000/AUC (여기서 D는 주사 용량임 (25 mg/kg))에 의해 결정하였다 (도 11B).
CDC-억제된 돌연변이체 IgG1-005-K322E/E430G, IgG1-005-P329D/E430G 및 IgG1-005-P329R/E430G는 모두 IgG1-005-E430G 및 WT IgG1-005와 동일한 범위의 클리어런스율을 제시하였다 (도 11). 이들 데이터는 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG1-005-E430G 항체의 클리어런스율이 K322E (CDC를 억제하지만 ADCC 효능은 보유함) 또는 P329D 및 P329R (CDC 및 ADCC 효능 둘 다를 억제함)에 의해 영향을 받지 않았음을 나타낸다.
실시예 16: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 IgG1-005 변이체의 시험관내 CDC 효능에 대한 P329X 돌연변이의 효과
본 실시예에서 시험관내 CDC 효능에 대한 P329X 돌연변이의 효과를 IgG1-005와 비교 시 증진된 CDC를 갖는 항체 IgG1-005-E430G에 대해 시험하였다. 상이한 농도의 정제된 항체 (0.001-30.0 μg/mL 최종 농도 범위)를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 Daudi 세포에 대해 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다.
Daudi 세포에 대한 IgG1-005-E430G의 CDC 효능은 위치 P329의 프롤린을 메티오닌 (M), 아스파르테이트 (D), 또는 아르기닌 (R)으로 치환시킴으로써 완전히 억제되었다 (도 12). 대조적으로, 위치 329의 프롤린에서 알라닌 (A)으로의 치환은 IgG1-005-E430G에 대해 0.01 μg/mL에서 IgG1-005-P329A/E430G에 대해 0.10 μg/mL로 EC50을 이동시키면서 CDC 효능을 단지 부분적으로 감소시켰지만, 최대 사멸에 대한 효과는 없었다. 이들 데이터는 위치 329의 프롤린에서 또 다른 아미노산으로의 치환이 IgG1-005-E430G에 의한 CDC 효능의 억제 (P329M/D/R의 경우) 또는 억제 없음 (P329A의 경우)을 초래하였음을 예시한다.
실시예 17: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 캄파트 IgG 이소타입 변이체의 시험관내 CDC 효능에 대한 P329R 및 P329D 돌연변이의 효과
시험관내 CDC 효능에 대한 P329R 및 P329D 돌연변이의 효과를 IgG1-캄파트와 비교 시 증진된 CDC를 갖는 항체 IgG1-캄파트-E430G의 상이한 IgG 이소타입 변이체를 이용하여 시험하였다 (도 13). 상이한 농도의 정제된 항체 (0.001-30.0 μg/mL 최종 농도 범위)를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 Wien 133 세포에 대해 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다. 3회 실험 반복의 용량-반응 곡선하 면적을 그래프패드 프리즘 7.02를 사용하여 로그 변환된 농도 축을 이용하여 계산하고, 이소타입 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 IgG1-캄파트 (100%)에 대해 측정된 세포 용해에 대해 정규화하였다.
IgG1-캄파트-E430G의 Wien 133 세포에 대한 CDC 용량 반응 곡선하 면적은 WT와 비교 시 대략 3배 증가한 반면에, 위치 329의 프롤린을 아르기닌 (R) 또는 아스파르트산 (D)으로 치환시킴으로써 CDC 활성이 백그라운드 수준으로 감소하였다 (도 13). 유사하게, IgG2-캄파트-E430G에 의한 CDC는 돌연변이 P329R 또는 P329D의 도입 시 백그라운드 수준으로 감소하였다. 또한, P329R 또는 P329D 중 하나와 E430G 돌연변이를 둘 다 함유하는 IgG3 및 IgG4 이소타입 변이체는 백그라운드 수준보다 높은 CDC 용해를 제시하는데 실패하였다.
이들 데이터는 위치 329의 프롤린에서 아르기닌 또는 아스파르트산으로의 치환이 IgG1-캄파트-E430G의 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 이소타입 변이체에 의한 CDC 효능의 효율적 억제를 초래하였음을 예시한다.
실시예 18: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 캄파트 IgG 이소타입 변이체의 시험관내 CDC 효능에 대한 돌연변이 K322E의 효과
시험관내 CDC 효능에 대한 돌연변이 K322E의 효과를 IgG1-캄파트와 비교 시 증진된 CDC를 갖는 항체 IgG1-캄파트-E430G의 상이한 IgG 이소타입 변이체를 이용하여 시험하였다 (도 14). 상이한 농도의 정제된 항체 (0.001-30.0 μg/mL 최종 농도 범위)를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 Wien 133 세포에 대해 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다. 3회 실험 반복의 용량-반응 곡선하 면적을 그래프패드 프리즘 7.02를 사용하여 로그 변환된 농도 축을 이용하여 계산하고, 이소타입 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 IgG1-캄파트 (100%)에 대해 측정된 세포 용해에 대해 정규화하였다.
IgG1-캄파트-E430G의 Wien 133 세포에 대한 CDC 용량 반응 곡선하 면적은 WT와 비교 시 대략 3배 증가한 반면에, 이는 위치 322의 리신을 글루탐산 (E)으로 치환시킴으로써 ~18%로 감소하였다 (도 14). 유사하게, IgG2-캄파트-E430G에 의한 CDC는 돌연변이 K322E의 도입 시 백그라운드 수준으로 감소하였다. 또한, E430G 및 K322E 돌연변이 둘 다를 함유하는 IgG3 및 IgG4 이소타입 변이체는 백그라운드 수준보다 높은 CDC 용해를 제시하는데 실패하였다.
이들 데이터는 위치 322의 리신에서 글루탐산으로의 치환이 IgG1-캄파트-E430G의 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 이소타입 변이체에 의한 CDC 효능의 효율적 억제를 초래하였음을 예시한다.
실시예 19: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 유도하는 상이한 돌연변이를 갖는 캄파트 변이체의 시험관내 CDC 효능에 대한 돌연변이 P329R 및 K322E의 효과
시험관내 CDC 효능에 대한 돌연변이 P329R 및 K322E의 효과를 항체 IgG1-캄파트의 상이한 Fc-Fc 상호작용 촉진 변이체를 사용하여 시험하였다. 상이한 농도의 정제된 항체 (0.001-30.0 μg/mL 최종 농도 범위)를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 Wien 133 세포에 대해 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다. 3회 실험 반복의 용량-반응 곡선하 면적을 그래프패드 프리즘 7.02를 사용하여 로그 변환된 농도 축을 이용하여 계산하고, 이소타입 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 IgG1-캄파트 (100%)에 대해 측정된 세포 용해에 대해 정규화하였다.
Fc-Fc 상호작용 촉진 돌연변이 E345K를 함유하는 IgG1-캄파트-E345K의 Wien 133 세포에 대한 CDC 용량 반응 곡선하 면적은 WT와 비교 시 대략 2.4배 증가하였다. 위치 329의 프롤린에서 아르기닌 (R)으로의 치환은 CDC를 대략 8%로 제한하였다. 추가로, 증가된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 2개의 다른 변이체 E345R 및 E345R/E430G/S440Y (RGY)에 P329R의 도입은 CDC 활성을 모 IgG1-캄파트 항체에 대해 관찰된 것보다 낮은 수준으로 제한하였다 (도 15).
항체 IgG1-캄파트-E345K에서 위치 322의 리신에서 글루탐산 (E)으로의 치환은 CDC 용량 반응 곡선하 면적을 모 IgG1-캄파트 항체의 대략 240% 내지 24%로 감소시켰다. 증가된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 변이체 E345R로 K322E의 도입은 이 변이체의 CDC 활성을 모 IgG1-캄파트 항체에 대해 관찰된 것의 60%로 제한하였다 (도 15). 그러나, 돌연변이 P329R과는 대조적으로, K322E는 변이체 RGY의 CDC를 IgG1-캄파트보다 낮은 수준으로 제한할 수 없었다.
이들 데이터는 C1q 결합 부위에서의 돌연변이 P329R 또는 K322E를 통한 직접적인 C1q 결합의 억제가 증진된 Fc-Fc 상호작용 촉진 돌연변이, 예컨대 E345R 및 RGY에 의해 부분적으로 보완되어 세포 표면에서 IgG 육합체의 다가 C1q 결합 부위의 형성을 촉진시킬 수 있음을 시사한다. IgG1-캄파트-P329R-RGY가 IgG1-캄파트-K322E-RGY보다 낮은 CDC 활성을 제시하기 때문에, P329R은 K322E에 비해 직접적인 C1q 결합의 더욱 강력한 억제제인 것으로 여겨진다.
요약하면, 이들 데이터는 위치 329의 프롤린에서 아르기닌으로의 치환, 또는 위치 322의 리신에서 글루탐산으로의 치환은 상이한 Fc-Fc 상호작용 강도를 갖는 IgG1-캄파트 변이체의 CDC 효능을 감소시킬 수 있음을 예시한다.
실시예 20: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 항-CD20 항체의 시험관내 CDC 효능에 대한 돌연변이 P329R, P329D 및 K322E의 효과
시험관내 CDC 효능에 대한 돌연변이 P329R, P329D 및 K322E의 효과를 항-CD20 항체 IgG1-11B8 (유형 II) 및 IgG1-7D8 (유형 I) (WO2004/035607)의 변이체를 사용하여 시험하였다. 상이한 농도의 정제된 항체 (0.001-30.0 μg/mL 최종 농도 범위)를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 Wien 133 세포에 대해 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다.
IgG1-11B8은 검출가능한 CDC를 제시하지 않은 반면에, 증진된 Fc-Fc 상호작용을 유도하는 돌연변이 E430G의 도입은 효율적인 세포 용해를 촉진시켰다 (IgG1-11B8-E430G, 도 16). 돌연변이 P329R 및 K322E 둘 다 IgG1-11B8-E430G의 CDC 활성을 비-결합 이소타입 대조군 항체 IgG1 b12에 대해 관찰된 백그라운드 용해 수준으로 제한하였다.
IgG1-7D8은 Wien 133 세포의 CDC를 유도할 수 있었지만, CDC 효능은 Fc-Fc 상호작용 증진 돌연변이 E430G의 도입에 의해 자극되었다. 돌연변이 P329R 또는 P329D의 도입은 CDC 활성을 야생형 모 항체 IgG1-7D8보다 낮은 수준으로 저해하였다. 이론에 제한되지는 않으면서, B-세포 수용체 회합을 통해 매개된 Fc-영역 비의존성의 부수적인 CDC는 CD20에 대한 유형 I 항체에 대해 전형적인 IgG1-7D8-P329R-E430G 및 IgG1-7D8-P329D-E430G에서 검출된 잔류 CDC에 기여할 수 있다.
이들 데이터는 위치 322의 리신에서 글루탐산으로의 치환, 또는 위치 329의 프롤린에서 아르기닌 또는 아스파르트산으로의 치환이 2가지 상이한 항-CD20 항체의 CDC 효능의 억제를 초래하였음을 예시한다.
실시예 21: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 항-CD38 항체의 시험관내 FcγR 결합에 대한 K322E 또는 P329X 돌연변이의 효과
IgG1-005 항체 변이체와 FcγRI의 단량체 세포외 도메인 (ECD)의 결합 및 FcγRIIA 알로타입 131H, FcγRIIA 알로타입 131R, FcγRIIB, FcγRIIIA 알로타입 158F, 및 FcγRIIIA 알로타입 158V의 ECD의 이합체성 변이체의 결합을 정제된 항체를 이용하여 ELISA 검정으로 시험하였다.
FcγRI에의 결합을 검출하기 위해, 96-웰 마이크롤론 ELISA 플레이트 (그라이너, 독일)를 PBS 중에서 밤새 4℃에서 His-태그 부착된 FcγRI ECD (1 μg/ml)로 코팅하고, 세척하고, 200 μL/웰 PBS/0.2% BSA로 실온 (RT)에서 1 시간 동안 차단시켰다. 인큐베이션 사이에 세척을 하면서, 플레이트를 검출 항체로서 PBST/0.2% BSA 중에서 100 μL/웰의 IgG1-005 항체 변이체의 희석 시리즈 (5배 희석으로 0.0013-20 μg/mL)와 함께 RT에서 1 시간 동안 및 PBST/0.2% BSA 중에서 100 μL/웰의 항-인간-카파LC-HRP (시그마-알드리치, A-7164, 1:5.000)와 함께 RT에서 30 분 동안 RT에서 30 분 동안 순차적으로 인큐베이션하였다. 1 mg/mL의 2,2'-아지노-비스 (3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) (ABTS; 로쉐, 독일 만하임)을 사용하여 대략 15 분 동안 발달시켰다. 100 μL의 2% 옥살산을 첨가하여 반응을 중단시켰다.
이합체성 FcγR 변이체에의 결합을 검출하기 위해, 96-웰 마이크롤론 ELISA 플레이트 (그라이너, 독일)를 PBS 중에서 밤새 4℃에서 염소 F(ab')2-항-인간-IgG-F(ab')2 (잭슨 래버러토리, 109-006-097, 1 μg/ml)로 코팅하고, 세척하고, 200 μL/웰의 PBS/0.2% BSA를 사용하여 실온 (RT)에서 1 시간 동안 차단시켰다. 인큐베이션 사이에 세척을 하면서, 플레이트를 검출 항체로서 PBST/0.2% BSA 중에서 100 μL/웰의 IgG1-005 항체 변이체의 희석 시리즈 (5배 단계로 0.0013-20 μg/mL)와 함께 RT에서 1 시간 동안, PBST/0.2% BSA 중에서 100 μL/웰의 이합체성, His-태그 부착된, C-말단 비오틴화된 FcγR ECD 변이체 (1 μg/mL)와 함께 RT에서 1 시간 동안, 및 PBST/0.2% BSA 중에서 100 μL/웰 스트렙타비딘-폴리HRP (CLB, M2032, 1:10.000)와 함께 RT에서 30 분 동안 순차적으로 인큐베이션하였다. 1 mg/mL의 ABTS (로쉐, 독일 만하임)를 사용하여 대략 10 분 (IIA-131H, IIA-131R, IIIA-158V), 20 분 (IIIA-158F), 또는 30 분 (IIB) 동안 발달시켰다. 100 μL의 2% 옥살산을 첨가하여 반응을 중단시켰다.
흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (바이오텍, 버몬트주 위누스키)에서 405 nm에서 측정하였다. 그래프패드 프리즘 7.02 소프트웨어를 사용하여 가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응 곡선을 대입함으로써 로그 변환된 데이터를 분석하였다. 용량-반응 곡선하 면적을 로그 변환된 농도 축을 이용하여 계산하였다.
K322E는 Fc-Fc 증진 돌연변이를 함유하는 항-CD38 항체에 의한 CDC를 강력하게 억제한 반면에 (실시예 3 및 4), 이 돌연변이는 실시예 10에서 관찰된 ADCC 활성의 보존과 일치하게 상이한 FcγR 변이체와의 항체 결합에 대해 제한된 효과를 가졌다 (도 17). 대조적으로, Fc-Fc 증진된 항체 변이체에서 P329의 돌연변이 (P329A/G/D/K/R)의 도입은 L234A/L235A/P329G/E430G (AAGG) 및 L234F/L235E/P329D/E430G (PEDG)에 필적하게 FcγRIIA-131H (도 17C), FcγRIIA-131R (도 17D), FcγRIIB (도 17B), FcγRIIIA-158F (도 17E), 및 FcγRIIIA-158V (도 17F)에의 결합을 본질적으로 백그라운드 수준으로 감소시켰다. 흥미롭게도, P329의 상이한 치환을 함유하는 항체는 FcγRI에의 결합에서 차이가 있었다 (도 17A). 돌연변이 P329A 및 P329G가 FcγRI와의 상당한 결합을 보유한 반면에, 치환 P329D, P329K 및 P329R은 또한 L234A/L235A/P329G/E430G (AAGG) 및 L234F/L235E/P329D/E430G (PEDG)에 필적하게 FcγRI를 본질적으로 백그라운드 수준으로 감소시켰다.
결론적으로, 변이체 K322E는 CDC를 강력하게 저해할 수 있지만 (실시예 3, 4), 모든 시험한 FcγR 변이체에의 결합은 보유하였다. 치환 P329D, P329K 및 P329R은 CDC를 강력하게 억제하였지만 (실시예 3, 6, 11), Fc-Fc 증진된 항체의 모든 시험한 FcγR의 결합을 또한 차단하였다 (도 17). 대조적으로, 돌연변이 P329A 또는 P329G를 함유하는 Fc-Fc 증진된 항체는 FcγRI와의 상당한 결합을 보유하였다.
실시예 22 : 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 항-CD20+항-CD52 항체 혼합물의 시험관내 CDC 효능에 대한 돌연변이 P329R의 효과
시험관내 CDC 효능에 대한 돌연변이 P329R의 효과를 항-CD20 항체 IgG1-11B8 및 항-CD52 항체 IgG1-캄파트의 변이체의 혼합물을 사용하여 시험하였다. 상이한 농도의 정제된 항체 (0.001-60.0 μg/mL 최종 농도 범위)를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 Wien 133 세포에 대해 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다. 상이한 돌연변이를 항체 IgG1-11B8 및 IgG1-캄파트에 도입하였으며: E430G는 증진된 Fc-Fc 상호작용을 유도하고; P329R은 항체와의 직접적인 C1q 결합을 억제하고; 돌연변이 K439E 또는 S440K는 자체 Fc-Fc 상호작용을 억제하고 교차-상보성 Fc-Fc 상호작용을 통해 이종-육합체성 항체 복합체의 형성을 촉진시킨다. 대조군으로서, 단일 항체를 또한 비-결합 이소타입 대조군 항체 IgG1-b12 또는 IgG1-b12-E430G와 1:1로 혼합하여, 개별 성분 및 그로 구성된 혼합물의 농도를 직접적으로 비교하도록 하였다. 3회 실험 반복의 용량-반응 곡선하 면적을 그래프패드 프리즘 7.02를 사용하여 로그 변환된 농도 축을 이용하여 계산하고, 이소타입 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 IgG1-캄파트-E430G + IgG1-11B8-E430G의 혼합물 (100%)에 대해 측정된 세포 용해에 대해 정규화하였다.
IgG1-캄파트-E430G 및 IgG1-11B8-E430G의 1:1 혼합물은 효율적인 세포 용해를 촉진시켰다 (도 18). 돌연변이 K439E의 도입은 IgG1-캄파트-E430G의 CDC 효능을 감소시킨 반면에, IgG1-캄파트-P329R-E430G-K439E를 생성하기 위한 추가적인 돌연변이 P329R의 도입은 이소타입 대조군 IgG1-b12 및 IgG1-b12-E430G에 대해 관찰된 용해에 의해 정의된 바와 같이 CDC 활성을 백그라운드 수준으로 감소시켰다 (도 18). 단일 돌연변이 S440K 및 이중 돌연변이 S440K-P329R 둘 다 IgG1-11B8-E430G의 CDC 효능을 백그라운드 수준으로 제한하였다.
IgG1-11B8-E430G-S440K를 부분적으로 활성인 항체 IgG1-캄파트-E430G-K439E에 첨가하면 CDC 활성이 IgG1-캄파트-E430G+IgG1-11B8-E430G와 유사한 수준으로 복구된 반면에, IgG1-11B8-P329R-E430G-S440K를 IgG1-캄파트- E430G-K439E에 첨가하면 IgG1-캄파트-E430G-K439E와 비교할 때 CDC 활성의 부분적 복구를 초래하였다. IgG1-11B8-E430G-S440K를 IgG1-캄파트-P329R-E430G-K439E에 첨가하면, 검출가능한 CDC 활성을 제시하는데 실패하였던 이들 둘 다는 포화 표적 결합에서 대략 56% 세포 용해를 회복하였다. 대조적으로, IgG1-11B8-P329R-E430G-S440K를 IgG1-캄파트-P329R-E430G-K439E에 첨가하면 백그라운드 수준보다 높은 CDC 활성이 수득되지 않았다.
이들 데이터는 P329R 돌연변이가 두 성분 중 하나의 단일 작용제 활성을 저해함으로써 IgG-E430G-K439E+IgG-E430G-S440K 항체 혼합물의 선택성을 개선시켰음을 제시한다. 놀랍게도, 심지어 개별 성분 둘 다는 검출가능한 CDC 활성을 제시하지 않았음에도 불구하고, 두 항체 중 하나만이 P329R 돌연변이를 함유한 혼합물의 경우에는 CDC 활성이 여전히 부분적으로 복구되었다. 이론에 제한되지는 않으면서, 이종-육합체성 IgG 조립체에서 3개의 돌연변이되지 않은 P329R-비함유 결합 부위에 대한 C1q의 결합력은 부분적인 CDC 활성을 회복하는데 충분히 높을 수 있다. 대조적으로, 예를 들어 둘 다 P329R 돌연변이를 함유하는 Ab들의 혼합물에서 6개 모든 C1q 결합 부위의 상실은 CDC 활성을 백그라운드 수준으로 감소시켰다.
실시예 23: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 항-CD20+항-CD52 항체 혼합물의 시험관내 CDC 효능에 대한 돌연변이 K322E의 효과
시험관내 CDC 효능에 대한 돌연변이 K322E의 효과는 항-CD20 항체 IgG1-11B8 및 항-CD52 항체 IgG1-캄파트의 변이체의 혼합물을 사용하여 시험하였다. 상이한 농도의 정제된 항체 (0.001-30.0 μg/mL 최종 농도 범위)를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 Wien 133 세포에 대해 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다. 상이한 돌연변이를 항체 IgG1-11B8 및 IgG1-캄파트에 도입하였으며: E430G는 증진된 Fc-Fc 상호작용을 유도하고; K322E는 항체와의 직접적인 C1q 결합을 억제하고; 돌연변이 K439E 또는 S440K는 자체 Fc-Fc 상호작용을 억제하고 교차-상보성 Fc-Fc 상호작용을 통해 이종-육합체성 항체 복합체의 형성을 촉진시킨다. 3회 실험 반복의 용량-반응 곡선하 면적을 그래프패드 프리즘 7.02를 사용하여 로그 변환된 농도 축을 이용하여 계산하고, 이소타입 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 IgG1-캄파트-E430G + IgG1-11B8-E430G의 혼합물 (100%)에 대해 측정된 세포 용해에 대해 정규화하였다.
IgG1-캄파트-E430G 및 IgG1-11B8-E430G의 1:1 혼합물은 효율적인 세포 용해를 촉진시켰다 (도 19). 돌연변이 K439E의 도입은 IgG1-캄파트-E430G의 CDC 효능을 감소시킨 반면에, IgG1-캄파트-K322E-E430G-K439E를 생성하는 추가적인 돌연변이 K322E의 도입은 CDC 활성을 비-결합 대조군 IgG1-b12에 대해 관찰된 백그라운드 수준으로 감소시켰다 (도 19). 단일 돌연변이 S440K 및 이중 돌연변이 S440K-K322E 둘 다는 IgG1-11B8-E430G의 CDC 효능을 백그라운드 수준으로 제한하였다.
IgG1-11B8-E430G-S440K를 부분적으로 활성인 항체 IgG1-캄파트-E430G-K439E에 첨가하면 CDC 활성이 IgG1-캄파트-E430G+IgG1-11B8-E430G에 대해 관찰된 최대 수준과 유사한 수준으로 복구된 반면에, IgG1-11B8-K322E-E430G-S440K와 IgG1-캄파트-E430G-K439E의 조합물은 또한 대략 최대의 CDC 활성으로 회복시켰다. IgG1-11B8-E430G-S440K 및 IgG1-캄파트-K322E-E430G-K439E의 혼합물 (둘 다 단일 작용제로서는 검출가능한 CDC 활성을 제시하는데 실패하였음)은 세포 용해를 대략 90%로 회복시켰다. 대조적으로, IgG1-11B8-K322E-E430G-S440K를 IgG1-캄파트-K322E-E430G-K439E에 첨가하면 대략 31%의 최대 세포 용해가 수득되었다.
이들 데이터는 직접적인 C1q 결합을 억제하는 돌연변이 K322E의 도입이 K439E + S440K 항체 혼합물에서 개별 성분의 CDC 활성을 추가로 저해할 수 있음을 예시한다. 놀랍게도, 심지어 개별 성분 둘 다는 단일 작용제로서는 검출가능한 CDC 활성을 제시하는데 실패하였음에도 불구하고, 두 항체 중 하나만이 K322E 돌연변이를 함유한 혼합물의 경우 CDC에 의한 최대 근처의 세포 용해가 여전히 복구될 수 있었다.
실시예 24: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 항-CD20+항-CD52 항체 혼합물에 의한 상이한 세포주의 선택적인 사멸
실시예 23은 Fc-Fc 증진된 CD20- 및 CD52-관련 항체의 특이적인 조합물이 성분 둘 다가 동시에 존재하며, 단, 각각의 항체가 Fc-Fc 상호작용을 통한 자체-올리고머화를 차단하는 K439E 또는 S440K 돌연변이를 함유하는 경우에만 적절한 수준에서 Wien 133 표적 세포를 선택적으로 용해시킬 수 있음을 입증하였다. 항-CD52 항체의 직접적인 C1q 결합이 추가의 K322E 돌연변이 (실시예 23) 또는 P329R 돌연변이 (실시예 22)의 도입에 의해 저해된 경우에, 혼합물의 선택적인 활성은 그의 개별 성분과 비교 시 개선되었다. 그들의 개별 성분과 비교할 때 항-CD20 + 항-CD52 항체의 혼합물에 대한 선택적인 CDC-매개된 세포 용해는 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 시험관내 CDC 검정을 이용하여 7가지 상이한 세포주에 대해 시험하였다. 상이한 돌연변이를 항체 IgG1-11B8 및 IgG1-캄파트에 도입하였으며: E430G는 증진된 Fc-Fc 상호작용을 유도하고; K322E는 항체와의 직접적인 C1q 결합을 억제하고; 돌연변이 K439E 또는 S440K는 자체 Fc-Fc 상호작용을 억제하고 교차-상보성 Fc-Fc 상호작용을 통해 이종-육합체성 항체 복합체의 형성을 촉진시킨다.
시험관내 CDC 효능을 항-CD20 항체 IgG1-11B8 및 항-CD52 항체 IgG1-캄파트의 변이체의 혼합물을 이용하여 시험하였다. 30.0 μg/mL의 최종 농도의 정제된 항체를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 20% NHS를 사용하여 7가지 인간 암 세포주: Daudi (ATCC #CCL-213), Raji (ATCC #CCL-86), Ramos (ATCC #CRL-1596), REH (DSMZ #ACC22), U266B1 (ATCC #TIB-196), U-698-M (DSMZ #ACC4), 및 Wien 133 (Dr. Geoff Hale에 의해 친절하게 제공됨 (바이오아나랩 리미티드(BioAnaLab Limited), 영국 옥스포드)에 대해 시험관내 CDC 검정으로 시험하였다. 세포 용해를 3회 실험 반복에 대해 평균하고, 항체가 가장 높은 용해를 유도함에 따라 이소타입 대조군 항체 IgG1-b12 (0%) 및 IgG1-캄파트-E430G (100%, REH, U266B1, 및 Wien 133 세포의 경우) 또는 IgG1-11B8-E430G (100%, Daudi, Raji, Ramos, 및 U-698-M 세포의 경우)에 대해 측정된 세포 용해에 대해 세포주마다 정규화하였다.
7가지 세포주의 세포 표면에서 CD52 및 CD20 발현을 퀴피키트(QIFIKIT) (바이오사이텍스(Biocytex), 카탈로그 번호 CP010)를 이용하는 간접적인 면역형광에 의해 측정하였다. 100,000 세포/웰을 폴리스티렌 96-웰 둥근-바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, 카탈로그 번호 650101)에 시딩하였다. 다음 단계를 4℃에서 수행하였다. 세포를 300xg에서 3 분 동안 원심분리에 의해 펠렛화하고, 10 μg/mL 포화 농도의 인간 모노클로날 항-CD52 항체 IgG1-캄파트 또는 항-CD20 항체 IgG1-11B8을 함유하는 50 μL PBS에 재현탁시켰다. 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 300g에서 3 분 동안 원심분리에 의해 펠렛화하고, 150 μL의 FACS 완충제 (PBS + 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA) + 0.02% (w/v) 아지드화나트륨)에 재현탁시켰다. 설정 및 보정 비드를 제조자의 지침에 따라 플레이트에 첨가하였다. 세포 및 비드를 150 μL의 FACS 완충제로 2회 더 동시에 세척하고, 50 μL의 FITC-접합된 마우스-IgG 흡착된 염소 항-인간 IgG (바이오사이텍스)에 재현탁시켰다. 이차 항체를 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 세포 및 비드를 150 μL의 FACS 완충제로 2회 세척하고, 150 μL의 FACS 완충제에 재현탁시켰다. 세포를 고정제 (바이오사이텍스)에 재현탁시키고, 빛으로부터 보호하면서 4℃에서 5 내지 60 분 동안 인큐베이션하였다. FACS 칸토(Canto) ll (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)) 상에서 생존가능한 세포의 집단 내에서 10,000 사건을 기록함으로써 면역형광을 측정하였다. 보정 비드의 형광 강도의 기하 평균을 이용하여, 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어 7, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여 제로 강도 및 제로 농도를 통해 진행되도록 강제하는 보정 곡선을 계산하였다. 각각의 세포주에 대해, 원형질 막에서 발현되는 항원 분자의 개수에 대한 추정치인 항체 결합 용량 (ABC)은 보정 곡선의 방정식을 기준으로 하여 (그래프패드 소프트웨어를 이용하여 표준 곡선으로부터 미지수를 보간함) 인간 항체-염색된 세포의 기하 평균 형광 강도를 사용하여 계산한 후에, 일차 항체 없이 인큐베이션된 웰에 대해 결정된 백그라운드를 차감하였다. ABC로서 발현된 분자의 개수를 2회의 독립적인 실험에 대해 평균하고, CD52 발현에 의해 정렬하여 표 4에 요약하였다.
IgG1-캄파트-E430G 또는 IgG1-11B8-E430G에 의해 유도된 용해는 표적 발현에 따라 달라졌으며 (도 20): 낮은 CD20 발현 U-266B1 및 REH 세포는 항-CD20 Ab IgG1-11B8-E430G에 의한 용해에 대해 회복성이었던 반면에, 항-CD52 Ab IgG1-캄파트-E430G에 대해서는 민감성이었다. 대조적으로, 낮은 CD52 발현 Daudi 세포는 IgG1-캄파트-E430G에 대해 회복성이었던 반면에, IgG1-11B8-E430G에 대해서는 민감성이었다.
CD52 및 CD20 둘 다 세포 표면에 존재하는 경우에만 Ab 육합체의 선택적인 형성을 달성하기 위해, 추가적인 K439E, S440K 및/또는 K322E 돌연변이를 IgG1-캄파트-E430G 또는 IgG1-11B8 변이체에 도입하여, 단일 작용제 활성을 저해하였다. IgG1-캄파트-E430G-K439E가 IgG1-캄파트-E430G와 비교 시 비교적 낮은 CD52 발현 세포주 U-698-M 및 Raji에 대해 감소된 단일 작용제 활성을 제시하였지만, 높은 CD52 발현 세포주 U-266B1, Wien 133, Ramos 및 REH에 대해서는 IgG1-캄파트-E430G와 유사한 최대 용해 수준을 나타내었다. 추가적인 K322E 돌연변이 생성 IgG1-캄파트-K322E-E430G-K439E (캄파트-EGE)의 도입에 의해 C1q 결합이 감소되었을 때, 시험한 7가지 모든 세포주에서 단일 작용제 활성이 제거되었다. IgG1-11B8-E430G의 활성은 IgG1-11B8-E430G 매개된 용해에 대해 민감성인 모든 세포주에 대해 S440K 돌연변이만을 사용하여 이미 차단될 수 있었으며; K322E, E430G 및 S440K 돌연변이를 포함하는 IgG1-11B8-EGK는 또한 비-결합 IgG1-b12에 의해 정의되는 백그라운드에 필적하는 단일 작용제 활성을 나타내었다.
IgG1-캄파트-E430G-K439E를 IgG1-11B8-E430G-S440K와 혼합하였을 때, 7가지 모든 세포주가 용해되었으며, 이는 선택성을 부재를 예시한다. 매우 대조적으로, IgG1-캄파트-K322E-E430G-K439E (캄파트 EGE) 및 IgG1-11B8-E430G-S440K의 혼합물은 세포당 20,000 카피 초과의 수준으로 CD20 및 CD52 둘 다의 표면 발현을 제시하는 이들 세포주, 즉, Wien 133, Ramos, U-698-M 및 Raji만을 선택적으로 용해시켰다. IgG1-캄파트-EGE 활성은 세포 표면으로 동원되지 않는 IgG1-b12-E430G-S440K 대조군 항체를 사용하여서는 복구될 수 없었다. 대조적으로, U-266B1, REH 및 Daudi는 CD20 또는 CD52의 낮은 발현으로 인해 용해되지 않았다. 이는 IgG1-캄파트-EGE에 의한 C1q의 동원이 IgG1-11B8-E430G-S440K에 의한 이종-올리고머화에 의존적임을 시사한다. 실제로, C1q 결합을 감소시키는 K322E 돌연변이를 또한 함유하는 CD20 항체 IgG1-11B8-K322E-E430G-S440K (IgG1-11B8-EGK)는 IgG1-캄파트-EGE에 첨가되었을 때 효율적인 세포 용해를 복구시킬 수 없었다.
결론적으로, CD20 및 CD52 둘 다를 적절한 수준으로 발현하는 세포의 선택적인 사멸은 항체 IgG1-캄파트-K322E-E430G-K439E 및 IgG1-11B8-E430G-S440K의 혼합물을 사용하여 달성될 수 있으며; 대조적으로, 이 혼합물은 CD20 또는 CD52를 세포당 <20,000 카피의 수준으로 발현하는 세포주의 백그라운드 용해 수준을 나타내었다.
표 4는 퀴피키트를 이용하여 결정되며 세포당 특이적인 항체 결합 단위의 개수로서 표현되는, 상이한 세포주의 CD52 및 CD20의 세포 표면 발현을 요약한다.
Figure pct00010
실시예 25: 증진된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 항-OX40 항체에 의한 Jurkat 세포 상의 OX40의 활성화에 대한 K322E 또는 P329R 돌연변이의 효과
OX40 리간드에 의한 OX40/CD134 수용체의 가교는 OX40 수용체를 발현하는 T-세포의 증식을 유도할 수 있다 (Gramaglia, I., Weinberg, A. D., Lemon, M., and Croft, M. (1998) Ox-40 ligand: a potent costimulatory molecule for sustaining primary CD4 T cell responses. J. Immunol. 161, 6510-6517). OX40/CD134 신호전달에 대한 돌연변이 K322E 또는 P329R의 효과를 본질적으로 제조자에 의해 공급된 지침에 따라 OX40 생물검정 키트 (프로메가, #CS197704)를 사용하고 항-OX40 항체 IgG1-SF2의 상이한 변이체 (미국 특허 2014/0377284)를 사용하여 시험하였다. NFAT 반응 요소의 하류에 있는 인간 OX40 및 루시페라제 리포터 유전자를 안정하게 발현하는 해동-사용 글로리스판스 NFκB-luc2/OX40 Jurkat 세포 (프로메가, #CS197704)는 OX40 활성화 시 루시페라제를 발현한다. 25 μL의 새로 해동된 세포를 96-웰 화이트 F-바닥 옵티플레이트 (퍼킨 엘머, # 6005299)에서 25 μL의 RPMI 1640 배지 (프로메가, #G708A)에서 하기에 상세하게 기재된 상이한 공급원으로부터의 8% 혈청의 존재 하에 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 2.5 μg/mL (최종 농도)의 항체 또는 1.5 μg/mL (최종 농도)의 정제된 재조합 OX40 리간드 (바이오레전드(Biolegend), #555704)를 80 μL의 최종 부피로 배지 중의 세포에 첨가하였다. 세포를 추가 5 시간 동안 인큐베이션한 후, 바이오-글로 시약 (프로메가, #CS197704)을 첨가하였다. 주위 온도에서 5-10 분 동안 인큐베이션한 후에, 엔비젼 멀티라벨 플레이트 판독기를 이용하여 발광을 기록하였다. 비교되는 혈청 공급원은 태아 소 혈청 (FBS, 프로메가 Ref. J121A), 56℃에서 30 분 동안 열-불활성화된 FBS, 인간 C1q-고갈된 혈청 (퀴델(Quidel), #A509), 인간 재조합 C1q로 보충된 인간 C1q-고갈된 혈청 (1.0 μg/mL 최종 농도; 퀴델, #A400), 또는 정상 인간 혈청 (NHS, 산퀸, Ref. M0008AC)이었다.
OX40 반응 검정에서 양성 대조군으로서 사용된 재조합 OX40 리간드는 비-결합 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 명백한 반응 신호를 유도하였다 (도 21). 시험 화합물에 의해 유도된 OX40 반응을 항체 없이 인큐베이션 (0%) 및 OX40 리간드와 함께 인큐베이션 (100%)에 대해 정규화하였다. 야생형 항-OX40 항체 IgG1-SF2는 혈청 공급원과는 무관하게 음성 대조군 항체 IgG1-b12와 본질적으로 유사한 OX40 반응 수준을 유도하였다. 대조적으로, E345R 돌연변이만을 함유하고 세포 표면 결합 후에 항체 사이의 Fc-Fc 상호작용을 유도하는 IgG1-SF2 변이체는 다양한 OX40 반응을 유도하였으며, 이는 C1q가 불활성화되거나 또는 고갈되었을 때의 OX40 리간드의 수준을 능가하였다 (>100%) (도 21B/D).
IgG1-SF2-E345R에서 K322E 또는 P329R 돌연변이의 도입은 활성 보체의 부재 하에, 즉, 열-불활성화된 FBS (도 21B) 및 C1q-고갈된 혈청 (도 21D) 중에서 OX40 반응에 유의한 영향을 미치지 않았다. 놀랍게도, IgG1-SF2-E345R에서 K322E 또는 P329R 돌연변이의 도입은 활성 보체의 존재 하에, 즉, 열-불활성화되지 않은 FBS (도 21A), 1.0 μg/mL의 인간 재조합 C1q의 존재 하에 인간 C1q-고갈된 혈청 (도 21C) 및 NHS (도 21E) 중에서 증진된 OX40 활성화를 초래하였다.
본 실시예에 기재된 놀라운 관찰은, 이론에 제한되지는 않으면서, 가능하게는 C1q 결합 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)의 차이에 의해 설명될 수 있으며: 활성 C1q가 존재하지 않는 경우에는 (도 21B/D), IgG1-SF2-E345R이 이미 최적으로 클러스터링되어 OX40 활성화를 유도할 수 있고, 이 경우에 C1q 억제 돌연변이 K322E 또는 P329R의 도입은 효과가 없다. 대조적으로, IgG1-SF2-E345R에 의한 최적의 OX40 활성화는 활성 C1q가 존재할 때 방해되고 (도 21A/C/E), C1q 억제 돌연변이 K322E 또는 P329R의 도입은 활성 C1q의 부재 시의 활성에 필적하는 최적의 OX40 활성화의 복구를 초래하였다. C1q의 부재 시에 기록된 루시페라제 활성과 비교할 때 활성 C1q의 존재 하에 IgG1-SF2-E345R에 의해 관찰된 루시페라제 활성의 감소는 CDC 활성에 의해 설명될 수 있으며, 이는 Jurkat 리포터 세포주 상에서의 높은 OX40 발현이 E345R Fc-Fc 증진 돌연변이를 갖는 IgG1-SF2-E345R 항체에 의해 세포가 CDC에 민감해질 수 있기 때문이다. Fc-Fc-증진 돌연변이를 함유하는 항체의 C1q 결합 및 CDC 활성을 둘 다 강력하게 감소시킬 수 있는 추가적인 돌연변이 K322E 또는 P329R의 도입 (실시예 3에 기재됨; 도 2)은 이 CDC 활성을 효과적으로 차단할 수 있으며, 따라서 활성 보체의 존재 하에서도 최적의 OX40 반응 유도가 가능하다.
요약하면, 재조합 OX40 리간드에 의해 유도된 것을 능가하는 강력한 OX40 반응이 활성 보체의 존재 또는 부재 둘 다에서 Fc-Fc-증진 E345R 돌연변이, 및 C1q-결합 억제 돌연변이 K322E 또는 P329R을 둘 다 함유하는 항-OX40 항체에 대해 관찰되었다. 대조적으로, 야생형 항-OX40 항체 IgG1-SF2는 이들 검정 조건 하에 검출가능한 OX40 반응을 유도하는데 실패하였고, 항체 IgG1-SF2-E345R만이 보체가 불활성인 조건 하에서만 최대 OX40 반응이 가능하였다. 결론적으로, Fc-Fc-증진 돌연변이 및 C1q-억제 돌연변이 K322E 또는 P329R의 조합물은 놀랍게도 강력한 OX40-효능제 항체를 제공하였으며, 이는 생리학적으로 관련된 혈정 조건 하에 T-세포 증식을 최대화시킬 수 있다.
등가물
관련 기술분야의 기술자는 일상적인 실험만으로도 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태의 여러 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다. 종속항에 개시된 실시양태의 임의의 모든 조합물이 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
SEQUENCE LISTING <110> Genmab B.V. <120> POLYPEPTIDE VARIANTS AND USES THEREOF <130> P/0104-WO <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 201 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 1 5 10 15 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 20 25 30 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 35 40 45 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 50 55 60 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 65 70 75 80 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 85 90 95 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 115 120 125 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 130 135 140 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 145 150 155 160 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 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165 170 175 Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln 180 185 190 Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys 195 200 <210> 7 <211> 221 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 7 Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr 1 5 10 15 Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys 35 40 45 Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp 50 55 60 Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys 65 70 75 80 Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro 85 90 95 Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu 100 105 110 Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val 115 120 125 Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr 130 135 140 Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe 145 150 155 160 Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp 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Claims (53)

  1. 인간 IgG의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드로서, 여기서 Fc 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응하는 (i) 제1 돌연변이 및 (ii) 제2 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드:
    i. E430, E345 또는 S440에서의 제1 돌연변이, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임; 및
    ii. K322 또는 P329에서의 제2 돌연변이.
  2. 제1항에 있어서, 제1 돌연변이가 E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W 및 S440Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 제1 돌연변이가 E430G 또는 E345K로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 돌연변이가 K322E, K322D, K322N, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W, P329A 및 P329Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 돌연변이가 K322E인 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 돌연변이가 P329R, P329K 및 P329D의 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 CH2 또는 CH3 도메인에서의 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, Fc 영역이 위치 K439에 상응하는 CH3 도메인에서의 추가의 돌연변이를 포함하거나, 또는 제1 돌연변이가 위치 S440에 있지 않은 경우에는 추가의 돌연변이가 위치 S440에 있을 수 있는 것인 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 추가의 돌연변이가 S440K 또는 K439E로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 최대 10개의 돌연변이, 예컨대 9개의 돌연변이, 예컨대 8개의 돌연변이, 예컨대 7개의 돌연변이, 예컨대 6개의 돌연변이; 예컨대 5개의 돌연변이, 예컨대 4개의 돌연변이, 예컨대 3개의 돌연변이 또는 예컨대 2개의 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 동일한 제1 돌연변이를 갖지만 제2 돌연변이는 갖지 않는 폴리펩티드와 동일한 모 폴리펩티드와 비교 시 적어도 20%, 예컨대 적어도 30% 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖는 것인 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 Fc 이펙터 기능을 유도하지 않는 것인 폴리펩티드.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, Fc 이펙터 기능이 보체 의존성 세포독성 (CDC), 보체 의존성 세포-매개된 세포독성 (CDCC), 보체 활성화, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포-매개된 식균작용 (ADCP), C1q 결합 및 FcγR 결합의 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 항체, 단일특이적 항체, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체인 폴리펩티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM, IgA 이소타입 또는 혼합된 이소타입인 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 인간 IgG1 이소타입인 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체인 폴리펩티드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 영역이 TNFR-SF의 구성원에 결합하는 것인 폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, TNFR-SF가 세포내 사멸 도메인을 포함하지 않는 것인 폴리펩티드.
  21. 제19항에 있어서, TNFR-SF의 구성원이 FAS, DR4, DR5, TNFR1, DR6, DR3, EDAR 및 NGFR의 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  22. 제20항에 있어서, TNFR-SF가 OX40, CD40, CD30, CD27, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, RELT 및 GITR의 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  23. 인간 이뮤노글로불린의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드로서, 여기서 Fc 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 상기 Fc 영역은 (i) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 위치: E430, E345 또는 S440에 상응하는 제1 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드의 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 방법이며, (ii) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 위치: K322 또는 P329에 상응하는 제2 돌연변이를 도입하는 것을 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제1 돌연변이가 E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W 및 S440Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 제1 돌연변이가 E430G 또는 E345K로부터 선택되는 것인 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 돌연변이가 K322E, K322D, K322N, P329H, P329K, P329R, P329D, P329E, P329F, P329G, P329I, P329L, P329M, P329N, P329Q, P329S, P329T, P329V, P329W, P329A 및 P329Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 돌연변이가 K322E, P329R, P329K 및 P329D의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 CH3 도메인에서의 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, Fc 영역이 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 위치: S440 또는 K439 중 하나에 상응하는 CH3 도메인에서의 추가의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 추가의 돌연변이가 S440K 또는 K439E로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 이펙터 기능이 동일한 제1 돌연변이를 갖지만 제2 돌연변이는 갖지 않는 폴리펩티드와 동일한 모 폴리펩티드와 비교 시 적어도 20%, 예컨대 적어도 30% 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 감소된 것인 방법.
  32. 제23항 또는 제31항에 있어서, Fc 이펙터 기능이 보체 의존성 세포독성 (CDC), 보체 의존성 세포-매개된 세포독성 (CDCC), 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포-매개된 식균작용 (ADCP), C1q 결합 및 FcγR 결합의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, ADCC가 제2 돌연변이를 포함하지 않는 것을 제외하고는 상기 항체와 동일한 비교 항체와 비교 시 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 감소된 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 제1 항원-결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드, 제2 항원-결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 또는 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 (i) 제1 돌연변이, (ii) 제2 돌연변이, (iii) 추가의 돌연변이를 포함하며, 여기서 돌연변이는 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1에서의 하기 아미노산 위치에 상응하는 것인 조성물:
    (i) 제1 돌연변이 E430, E345 또는 S440, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임;
    (ii) E322 또는 P329에서의 제2 돌연변이;
    (iii) K439 또는 S440에서의 추가의 돌연변이, 단, 추가의 돌연변이가 S440에 있는 경우에는 제1 돌연변이는 S440에 있지 않고, 단, 제1 및 제2 Fc 영역은 동일한 아미노산 위치에서의 추가의 돌연변이를 포함하지 않음.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드가, TNFR1, FAS, DR3, DR4, DR5, DR6, NGFR 및 EDAR로 이루어진 군으로부터 선택된, 세포내 사멸 도메인을 갖는 TNFR-SF의 하나 이상의 구성원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 것인 조성물.
  39. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드가, 세포내 사멸 도메인을 갖지 않는 TNFR-SF의 하나 이상의 구성원, 예컨대 OX40, CD40, CD30, CD27, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, RELT 및 GITR 상의 상이한 에피토프에 결합하는 것인 조성물.
  40. 제36항 또는 제37항에 있어서, 세포내 사멸 도메인을 갖지 않는 TNFR-SF의 하나의 구성원, 예컨대 OX40, CD40, CD30, CD27, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, RELT 및 GITR에 결합하는 상기 제1 폴리펩티드가 세포내 사멸 도메인을 갖지 않는 TNFR-SF의 하나의 구성원, 예컨대 OX40, CD40, CD30, CD27, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, RELT 및 GITR에 결합하는 상기 제2 항체의 결합을 차단하지 않는 것인 조성물.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드가 조성물 중에 1:49 내지 49:1 몰비, 예컨대 1:1 몰비, 1:2 몰비, 1:3 몰비, 1:4 몰비, 1:5 몰비, 1:6 몰비, 1:7 몰비, 1:8 몰비, 1:9 몰비, 1:10 몰비, 1:15 몰비, 1:20 몰비, 1:25 몰비, 1:30 몰비, 1:35 몰비, 1:40 몰비, 1:45 몰비, 1:50 몰비, 50:1 몰비, 45:1 몰비, 40:1 몰비, 35:1 몰비, 30:1 몰비, 25:1 몰비, 20:1 몰비, 15:1 몰비, 10:1 몰비, 9:1 몰비, 8:1 몰비, 7:1 몰비, 6:1 몰비, 5:1 몰비, 4:1 몰비, 3:1 몰비, 2:1 몰비로 존재하는 것인 조성물.
  42. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드 및/또는 임의의 추가적인 폴리펩티드가 조성물 중에 등몰비로 존재하는 것인 조성물.
  43. 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 제약 조성물인 조성물.
  44. 제1항 내지 제22항 및 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 폴리펩티드 또는 조성물.
  45. 제1항 내지 제22항 및 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 폴리펩티드 또는 조성물.
  46. 제1항 내지 제22항 및 제34항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 조성물의 유효량을 질환을 가진 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 질환이 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 및 감염성 질환의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 추가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 추가적인 치료제가 화학요법제 (비제한적으로 파클리탁셀, 테모졸로미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 독소루비신, 겜시타빈, 5-플루오로우라실, 페메트렉세드 포함), 키나제 억제제 (비제한적으로 소라페닙, 수니티닙 또는 에베롤리무스 포함), 아폽토시스-조정제 (비제한적으로 재조합 인간 TRAIL 또는 비리나판트 포함), RAS 억제제, 프로테아솜 억제제 (비제한적으로 보르테조밉 포함), 히스톤 데아세틸라제 억제제 (비제한적으로 보리노스타트 포함), 기능식품, 시토카인 (비제한적으로 IFN-γ 포함), 항체 또는 항체 모방체 (비제한적으로 항-EGFR, 항-IGF-1R, 항-VEGF, 항-CD20, 항-CD38, 항-HER2, 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA4, 항-CD40, 항-CD137, 항-GITR 항체 및 항체 모방체 포함), 항체-약물 접합체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항암제(들)인 방법.
  50. 제1항 내지 제22항 및 제34항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 조성물을 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드 또는 조성물은 하나 이상의 용기, 예컨대 바이알 내에 있는 것인 부분들의 키트.
  51. 제50항에 있어서, 제1항 내지 제22항 및 제34항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 조성물이 요법에서의 동시적, 개별적 또는 순차적 사용을 위한 것인 부분들의 키트.
  52. 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 조성물의 용도.
  53. 제52항에 있어서, 질환이 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환인 용도.
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