TW201834688A - 藥學組成物、抗原結合分子、治療方法以及篩選方法 - Google Patents

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Abstract

本發明是關於一種藥學組成物，含有第1抗原結合分子及第2抗原結合分子的組合，前述第1抗原結合分子及前述第2抗原結合分子未利用共價鍵而鍵結，並且於液中混合時，比起形成同型二聚體更易形成異二聚體。進而本發明是關於與該組合相關連的抗原結合分子、治療方法、及篩選方法。

Description

藥學組成物、抗原結合分子、治療方法以及篩選方法
本發明是關於藥學組成物、抗原結合分子、治療方法、及篩選方法。
抗體在血漿中的安定性高，副作用也少，故作為醫藥品而受重視。其中IgG型之抗體醫藥已有多數上市，現在也正在開發數量眾多的抗體醫藥(非專利文獻1、及非專利文獻2)。對於治療用抗體要求的功能，有藉由抗體結合於目標以阻斷特定分子間之交互作用、利用抗體之效應子機能即抗體依賴性細胞毒性(以下也稱為ADCC。)活性、補體依賴性細胞毒性(以下也稱為CDC。)活性之目標細胞之除去等。
天然的抗體及免疫球蛋白(以下也稱為IgG)是由通常2條相同的輕(L)鏈及2條相同的重(H)鏈構成。L鏈與H鏈以雙硫鍵連結，此L鏈H鏈之複合體彼此也在H鏈間形成雙硫鍵，形成分子量約150,000道爾吞之該複合體之同型二聚體。L鏈由L鏈可變區及L鏈恆定區(以下也稱為CL)構成，H鏈包括H鏈可變區及CH1、CH2、CH3及由鉸鏈區構成的H鏈恆定區。H鏈之CH1與CH2利用涉及H鏈間之雙硫鍵之鉸鏈區分隔。帶有如此的結構的IgG具有二個抗原結合部位 (二價抗體)。
Fc區在結構方面，藉由鉸鏈區、CH3界面而貢獻於二聚體形成。所以，有報告指出藉由在CH3界面導入變異而促進異二聚體之形成之例(非專利文獻3、4、5)、將鉸鏈區之半胱胺酸殘基置換為其他胺基酸，導入妨礙CH3二聚體形成的改變，製作一價抗體之例(非專利文獻6)。
又，在機能方面，利用與胎兒性Fc受體(以下也稱為FcRn)之交互作用以貢獻於血中滯留性之延長(非專利文獻7)、涉及經由Fc受體之ADCC、CDC、抗體依賴性細胞經由性吞噬作用(ADCP)這類效應子機能之表現。近年來，也有報告使效應子機能增進的改變技術(非專利文獻8)，活用在增強抗體醫藥的藥效。
抗體分子結合於在癌細胞表現的抗原，並利用ADCC等對於癌細胞發揮傷害活性。如此的由於ADCC等所為的細胞毒性活性，已知依存於在治療用抗體之目標細胞所表現之抗原之數目(非專利文獻9)，因此，考量治療用抗體之效果之觀點，以成為目標之抗原之表現量高的話較為理想。但是即使抗原之表現量高，若是在正常組織表現抗原，則會對於正常細胞發揮ADCC等傷害活性，故副作用會成為重大問題。因此，就癌治療藥而言，作為治療用抗體之目標的抗原，宜在癌細胞專一性地表現較佳。例如，已知作為癌抗原之針對EpCAM抗原之抗體分子，被認為是有前景的癌治療藥，但已知EpCAM抗原也會在胰臟表現，實際上，臨床試驗中，已有報告藉由投予抗EpCAM抗體，會觀察到起因於對胰臟之細胞毒性活性導致胰臟炎的副作用(非專利文獻10)。
發揮利用ADCC活性所致之細胞毒殺活性之抗體醫藥已獲致成功，有報告指出藉由將天然型人類IgG1之Fc區之N型糖鏈之海藻糖除去，而增強ADCC活性(非專利文獻11)、利用天然型人類IgG1之Fc區之胺基酸取代而增強對於FcγRIIIa之結合所獲致之ADCC活性之增強(非專利文獻12)等，而發揮強力的細胞毒殺活性的第二代之改良抗體分子。就利用上述由NK細胞中介之ADCC活性以外之機轉，而對於癌細胞發揮毒殺活性的抗體醫藥而言，也有報告將有強力的細胞毒殺活性的藥物與抗體接合而得的Antibody Drug Conjugate(ADC)(非專利文獻13)、及藉由將T細胞增援(recruit)到癌細胞而對於癌細胞發揮毒殺活性的低分子抗體(非專利文獻14)等發揮更強力的細胞毒殺活性的改良抗體分子。
如此的發揮更強力的細胞毒殺活性的抗體分子，即使是對於抗原的表現不多的癌細胞亦能發揮細胞毒殺活性，另一方面，對於抗原的表現少的正常組織也會同樣地發揮細胞毒殺活性。實際上，相較於針對EGFR抗原之天然型人類IgG1西妥昔單抗(Cetuximab)，針對CD3與EGFR之雙特異性抗體EGFR-BiTE藉由將T細胞增援到癌細胞，而對於癌細胞發揮強力的細胞毒殺活性，並發揮抗腫瘤效果。另一方面，EGFR在正常組織亦會表現，故已知道當EGFR-BiTE投予至食蟹獼猴時會出現嚴重的副作用(非專利文獻15)。又，在針對於癌細胞高表現的CD44v6的抗體結合了mertansine而得的ADC，即bivatuzumab mertansine，因為CD44v6在正常組織也會表現，因此臨床上觀察到有嚴重的皮膚毒性及肝毒性(非專利文獻16)。
如上，當使用即使對於抗原的表現少的癌細胞仍可發揮強力的細胞毒殺活性的抗體時，目標抗原需在癌極專一地表現，但是，如賀癌平(herceptin)之目標抗原即HER2、西妥昔單抗(Cetuximab)之目標抗原即EGFR在正常組織亦會表現般，據認為在癌中極專一性地表現的癌抗原的數目有限。所以，雖然能強化對於癌的細胞毒殺活性，對於正常組織之細胞毒性作用導致的副作用仍可能成為問題。
又，最近，有揭示藉由抑制有助於癌之免疫抑制的CTLA4來增強腫瘤免疫的Ipilimumab，會延長對於轉移性黑色素瘤的總生存率(Overall survival)(非專利文獻17)。但是，Ipilimumab會將CTLA4予以全身性地抑制，故腫瘤免疫增強，但另一方面，因為免疫全身性地活化，導致會有顯示類似自體免疫病症的嚴重副作用，成為問題(非專利文獻18)。
就可應用於第二代之抗體醫藥之技術而言，已開發了各式各樣的技術，據報告有效應子機能、抗原結合能力、藥物動態、安定性更好、或減低免疫原性風險的技術等(非專利文獻19)，但為了解決如上述副作用之能使抗體醫藥對於目標組織以高度專一性地作用的技術並沒有很多報告。
就以賦予高度選擇性為目標的技術而言，有報告同時著眼於二種目標的策略(非專利文獻20、21、22、23)。 在使用了CD4及CD70雙重陽性細胞、HER2及EGFR雙重陽性細胞的雙特異性抗體的研究中，相較於單陽性細胞，達成約10倍程度的毒殺活性提高(非專利文獻24，25)。 在這樣的情形下，近年已有開發出關於雙特異性抗體之製作方法的各式各樣的技術(專利文獻1~6)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第96/027011號 [專利文獻2]國際公開第2006/106905號 [專利文獻3]國際公開第2009/089004號 [專利文獻4]國際公開第2010/129304號 [專利文獻5]國際公開第2011/143545號 [專利文獻6]國際公開第2014/084607號 [非專利文獻]
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(發明欲解決之課題)
如上所述，在日益期待提高雙特異性抗體之有用性的狀況，希望有相較於正常細胞，對於涉及病症之細胞的效應子機能更高程度地專一，且其結果副作用更高程度地減低的抗體。 (解決課題之方式)
本案發明人等創造了在血漿中以抗原非結合狀態存在時不會交互作用，以抗體半分子的形式分別存在，在目標之細胞表面上形成雙特異性抗體的抗原結合分子的組合，乃完成本發明。本發明之態樣可列舉下列[1]~[15]。
[1]一種藥學組成物，含有第1抗原結合分子及第2抗原結合分子， 該第1抗原結合分子具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區、及含有第1 CH2及第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽;該第2抗原結合分子具有會結合於第2抗原之第2抗原結合區、及含有第2 CH2及第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽； 該第1抗原結合分子及該第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結，且於液中混合時，比起形成同型二聚體，更易形成異二聚體。 [2] 如[1]之藥學組成物，其中， 當在表面電漿子共振使用每1 mm2 固定有50 pg之該第1抗原結合分子之感測晶片及含有2.5 mg/mL之該第2抗原結合分子之測定液來測定兩抗原結合分子之親和性時，該第2抗原結合分子對於該第1抗原結合分子之結合量，按莫耳比計，為1:0.1~1:0.9之範圍內。
[3] 如[1]或[2]之藥學組成物，其中，於表現該第1抗原及該第2抗原之細胞存在之條件下之該異二聚體之形成量，比起該細胞不存在之條件下多。 [4] 如[1]至[3]中任一項之藥學組成物，其中， 形成該異二聚體時，該異二聚體對於FcγR之結合活性，比起該第1抗原結合分子之單體或該第2抗原結合分子之單體對於FcγR之結合活性、或形成該同型二聚體時該同型二聚體對於FcγR之結合活性高。
[5] 如[1]至[4]中任一項之藥學組成物，其中， 該第1多肽含有該第1 CH3，該第2多肽含有該第2 CH3，該第1 CH3及該第2 CH3於液中混合時，作為相較於形成該同型二聚體更易形成該異二聚體之改變，具有以下之(i)至(iii)中之至少一種之改變: (i)該第1 CH3及該第2 CH3中之任一者具正電荷之區，另一者具負電荷之區，且該異二聚體形成時，該正電荷之區對該負電荷之區進行交互作用的改變 (ii)該第1 CH3及該第2 CH3中之任一者具凸部，另一者具凹部，該異二聚體形成時，該凸部嵌合於該凹部並進行交互作用之改變 (iii)該第1 CH3及該第2 CH3為經改變之IgG之CH3，該經改變之IgG之CH3的一部分被置換為IgA之CH3之一部分，該異二聚體形成時，已置換該第1 CH3之該IgA之CH3之一部分與已置換該第2 CH3之該IgA之CH3之一部分進行交互作用之改變。 [6]如[1]至[5]中任一項之藥學組成物，其中， 該第1 CH3及該第2 CH3中之任一者或兩者，更具有按EU編號系統之357位、397位及409位之胺基酸殘基中之至少一者被置換為其他胺基酸殘基。
[7] 如[1]至[6]中任一項之藥學組成物，其中，該第1多肽及該第2多肽中之任一者或兩者更含有抗體半分子中之鉸鏈區部分。 [8] 如[7]之藥學組成物，其中， 該第1多肽及該第2多肽中之任一者或兩者中之該鉸鏈區部分，具有按EU編號系統之226位及229位中之任一者或兩者之半胱胺酸殘基改變為其他胺基酸殘基。
[9] 如[1]至[8]中任一項之藥學組成物，其中， 該第1多肽及該第2多肽各含有抗體半分子中之恆定區部分。 [10] 如[1]至[9]中任一項之藥學組成物，其中， 於存在表現該第1抗原及該第2抗原之細胞之條件下之效應子機能，比起存在不表現該第2抗原且表現該第1抗原之細胞或不表現該第1抗原且表現該第2抗原之細胞之條件下高。
[11] 一種藥學組成物，含有第1抗原結合分子及第2抗原結合分子，該第1抗原結合分子具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區、及含有第1 CH3之第1多肽;該第2抗原結合分子具有會結合於第2抗原之第2抗原結合區、及含有第2 CH3之第2多肽; 該第1抗原結合分子及該第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結， 該第1 CH3及該第2 CH3具有以下之(iv)至(vi)中之至少一種改變: (iv)該第1 CH3及該第2 CH3中之任一者具正電荷之區，另一者具負電荷之區，該異二聚體形成時，該正電荷之區對於該負電荷之區進行交互作用的改變; (v)該第1 CH3及該第2 CH3中之任一者具凸部，另一者具凹部，該異二聚體形成時，該凸部嵌合於該凹部並進行交互作用之改變; (vi) 該第1 CH3及該第2 CH3為經改變之IgG之CH3，該經改變之IgG之CH3的一部分被置換為IgA之CH3之一部分，該異二聚體形成時，已置換該第1 CH3之該IgA之CH3之一部分與已置換該第2 CH3之該IgA之CH3之一部分進行交互作用之改變。
[12] 一種第1抗原結合分子，具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區、及含有第1 CH2及第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽; 當與具會結合於第2抗原之第2抗原結合區及含有第2 CH2及第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽之第2抗原結合分子於液中混合時，比起形成該第1抗原結合分子間之同型二聚體，更易形成與該第2抗原結合分子之異二聚體，該異二聚體中，該第1抗原結合分子與該第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結。 [13] 一種第2抗原結合分子，具有會結合於第2抗原之第2抗原結合區、及含有第2 CH2及第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽; 當與具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區及含有第1 CH2及第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽之第1抗原結合分子在液中混合時，比起形成該第2抗原結合分子間之同型二聚體更易形成與該第1抗原結合分子之異二聚體， 該異二聚體中，該第1抗原結合分子與該第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結。
[14] 一種方法，將第1抗原結合分子及第2抗原結合分子對於具表現第1抗原及第2抗原之病原細胞之對象同時投予或逐次投予，以治療該對象之因該病原細胞所引起的病症; 該第1抗原結合分子具有會和該第1抗原結合之第1抗原結合區及含有第1 CH2及第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽， 該第2抗原結合分子具有會結合於該第2抗原之第2抗原結合區、及含有第2 CH2及第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽; 該第1抗原結合分子及該第2抗原結合分子在投予前及投予後未以共價鍵鍵結，在該病原細胞之表面形成異二聚體而發揮效應子機能。
[15] 一種選擇第1抗原結合分子及第2抗原結合分子的組合的方法， 是從具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區及含有第1 CH2及第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽之第1抗原結合分子之改變體群、以及具有會結合於第2抗原之第2抗原結合區、及含有第2 CH2及第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽之第2抗原結合分子之改變體群中，從下列(a)~(c)選擇第1抗原結合分子及第2抗原結合分子的組合: (a)第1抗原結合分子與第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結、 (b)第1抗原結合分子及第2抗原結合分子相較於形成第1抗原結合分子間或第2抗原結合分子間之同型二聚體，更易形成第1抗原結合分子及第2抗原結合分子之間之異二聚體、 (c)當於表面電漿子共振使用每1 mm2 固定有50 pg之第1抗原結合分子之感測晶片及含有2.5　mg/mL之第2抗原結合分子之測定液、測定兩抗原結合分子之親和性時，該第2抗原結合分子對於該第1抗原結合分子之結合量，按莫耳比為1:0.1~1:0.9之範圍內。 (發明之效果)
依照本發明，可提供副作用減低的抗原結合分子的組合。
A.定義 本說明書中，「多肽」包括複數胺基酸以胜肽鍵結合成的胜肽全部。本說明書中，多肽有時稱為「胜肽」或「蛋白質」。 本說明書中，「抗原結合區」是指具有結合於抗原之活性之化合物。抗原結合區可為胜肽性也可為非胜肽性。
本說明書中，「CH1」是指抗體之CH1之1鏈之多肽。具體而言，CH1，是按EU編號系統之H鏈118~215位之胺基酸殘基表示之區，本說明書中，除了野生型以外，也包括於野生型有胺基酸殘基之取代、加成、或缺失而得的改變體。 本說明書中，「CH2」，是指抗體之CH2之1鏈之多肽。具體而言，CH2，是按EU編號系統之H鏈231~340位之胺基酸殘基表示之區，本說明書中，除了野生型以外，也包括於野生型有胺基酸殘基之取代、加成、或缺失而得的改變體。 本說明書中，「CH3」，是指抗體之CH3之1鏈之多肽。具體而言，CH3，是按EU編號系統之H鏈341位至C末端之胺基酸殘基表示之區，本說明書中，除了野生型以外，也包括於野生型有胺基酸殘基之取代、加成、或缺失而得的改變體。 本說明書中，「CL」，是指抗體之CL之1鏈之多肽。具體而言，CL，是指按EU編號系統之L鏈108位至C末端之胺基酸殘基表示之區，本說明書中，除了野生型以外，也包括於野生型有胺基酸殘基之取代、加成、或缺失而得的改變體。
本說明書中，「抗體半分子」，是指抗體中之H鏈間之結合解離時的一分子，一般有時稱為一價抗體。抗體為IgG時之抗體半分子，例如:由H鏈1鏈與L鏈1鏈構成之複合體。抗體半分子，包括駱駝科等的抗體觀察到的由2條H鏈構成之抗體，即所謂重鏈抗體(heavy-chain antibody)(也稱為VHH(VH 是源自重鏈抗體)抗體。)之使H鏈間之結合解離成的由H鏈1鏈構成的分子。 於一態樣中，抗體半分子也包括嵌合抗體、來自人源化抗體者。 一態樣中，抗體半分子包括來自IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等各種構造同型(isotype)者。抗體半分子較佳為來自IgG者。IgG中存在IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。抗體半分子也可來自其中任一者的次型。考量易發揮效應子機能之觀點，抗體半分子較佳為來自IgG1或IgG2。
本說明書中，「鉸鏈區」是抗體中之位在CH1與CH2之間之區。具體而言，鉸鏈區，是按EU編號系統之216~230位之胺基酸殘基表示之區，本說明書中，除了野生型以外，也包括於野生型有胺基酸殘基之取代、加成、或缺失而得的改變體。本說明書中，「抗體半分子中之鉸鏈區部分」，是指H鏈1鏈中之鉸鏈區部分，是指由1鏈之多肽構成者。
本說明書中，「恆定區」，是指抗體中之包括CH1、CH2、CH3、CL及鉸鏈區之區。本說明書中，「抗體半分子中之恆定區部分」，是指抗體半分子中之恆定區部分。
本說明書中，用語「Fc區」是為了定義至少包含恆定區之一部分之免疫球蛋白H鏈之C末端區而使用的。此用語包括天然型序列Fc區及變異體Fc區。於一態樣中，人類IgG之H鏈Fc區是從Cys226、或從Pro230延伸到H鏈之羧基末端。惟Fc區之C末端之離胺酸 (Lys447) 或甘胺酸‐離胺酸(Gly446-Lys447)可存在亦可不存在。本說明書中，若未特別指明，Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號賦予，是依據Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 記載之EU編號系統(也稱為EU索引)。
「效應子機能」，是指起因於抗體之Fc區之依據抗體之構造同型而不同的生物學的活性。抗體之效應子機能，例如包括以下者：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity:CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞經由性細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如:B細胞受體)之向下調控；及B細胞活化。
「Fc受體」或「FcR」，是指結合於抗體之Fc區的受體。於一些態樣中，FcR是天然型人類FcR。一些態樣中，FcR是結合於IgG抗體(gamma受體)，包括FcγRI、FcγRII、及FcγRIII次類之受體，以該等受體之對偶基因變異體及選擇的編接(splicing)所獲致的形態。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，它們主要在其細胞質域(domain)有不同的類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA，在其細胞質域含有免疫受體酪胺酸活化模體 (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) 。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域含有免疫受體酪胺酸阻害模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM)。(例如參照Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)。)FcR例如在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；及de Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)有綜論。本說明書之用語「FcR」亦包括未來會鑑定出的其他FcR。
本說明書中，「共價鍵」包括一般所已知的全部。共價鍵例如:雙硫鍵及碳-碳鍵。
本說明書中，用語「細胞毒性劑」是指抑制或妨礙細胞機能、及/或成為細胞死亡或破壞之原因的物質。細胞毒性劑不限於此等，但可包括放射性同位素(例如:211 At、131 I、125 I、90 Y、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi、32 P、212 Pb及Lu之放射性同位素)；化學療法劑或化學療法藥(例如: 胺甲蝶呤(Methotrexate)、阿黴素(adriamycin)、長春花生物鹼類（長春花新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、依妥普賽(etoposide)）、小紅莓(doxorubicin)、氮芥苯丙胺酸(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、氮芥苯丁酸 (chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑(intercalating agent)；增殖抑制劑；核酸分解酵素等酵素及其斷片；抗生素；例如:低分子毒素或細菌、真菌、植物、或動物起源之有酵素活性的毒素(包括其斷片及/或變異體)等、毒素；及以下揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
B.藥學組成物 於一態樣中，本發明提供一種藥學組成物，含有第1抗原結合分子及第2抗原結合分子中之任一者或兩者。
1.第1抗原結合分子 第1抗原結合分子具有第1抗原結合區與第1多肽。
a.第1抗原結合區 第1抗原結合區是結合於第1抗原之區。較佳為第1抗原結合區含有抗體半分子之可變區部分或其第1抗原結合性斷片。第1抗原結合性斷片，是指保持了對於第1抗原之結合性之抗體半分子之可變區部分之斷片。
第1抗原，可列舉例如，於目標細胞表現之蛋白質。該蛋白質較佳為在成為對象病症之原因之異常細胞表現的抗原。在異常細胞表現的該抗原，較佳為膜蛋白質。該膜蛋白質，較佳為其細胞外區。
第1抗原可以和後述第2抗原相同也可不同。較佳為第1抗原不同於第2抗原。藉由第1抗原與第2抗原不同，第1抗原結合分子及第2抗原結合分子之組合提升對於異常細胞之目標專一性。 較佳為第1抗原及第2抗原中之任一者或兩者在異常細胞表現，但在正常細胞不表現，更佳為第1抗原及第2抗原兩者在異常細胞表現，但在正常細胞不表現。
抗原之種類不特別限定，可為任意種抗原。抗原之例，可列舉例如，受體或其斷片、癌抗原、MHC抗原、分化抗原等，但無特殊限制。
又，該受體之例，可例舉例如:造血因子受體家族、細胞介素受體家族、酪胺酸激酶型受體家族、絲胺酸/蘇胺酸激酶型受體家族、TNF受體家族、G蛋白質共軛型受體家族、GPI錨定型受體家族、酪胺酸磷酸酶型受體家族、接著因子家族、荷爾蒙受體家族等屬於受體家族的受體等。關於這些屬於受體家族的受體、及其特徵，有多數文獻存在，例如:Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New ComprehesiveBiochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., New York, USA、Patthy L. (1990) Cell, 61: 13-14.、Ullrich A., et al. (1990) Cell, 61: 203-212.、Massagul J. (1992) Cell, 69: 1067-1070.、Miyajima A., et al. (1992) Annu. Rev. Immunol., 10: 295-331.、Taga T. and Kishimoto T. (1992) FASEB J., 7: 3387-3396.、Fantl WI., et al. (1993) Annu. Rev. Biochem., 62: 453-481.、Smith CA., et al. (1994) Cell, 76: 959-962.、Flower DR. (1999) Biochim. Biophys. Acta, 1422: 207-234.、宮坂昌之監修, 細胞工程別冊手冊系列「接著因子手冊」(1994) (秀潤社, 東京, 日本)等。上述屬於受體家族之具體受體，可列舉例如:人類或小鼠紅血球生成素(EPO)受體、人類或小鼠顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)受體、人類或小鼠血小板生成素(TPO)受體、人類或小鼠胰島素受體、人類或小鼠Flt-3配體受體、人類或小鼠血小板衍生生長因子(PDGF)受體、人類或小鼠干擾素(IFN)-α、β受體、人類或小鼠瘦素受體、人類或小鼠成長荷爾蒙(GH)受體、人類或小鼠介白素(IL)-10受體、人類或小鼠類胰島素增殖因子(IGF)-I受體、人類或小鼠白血病抑制因子(LIF)受體、人類或小鼠毛狀體神經營養因子(CNTF)受體等 (hEPOR: Simon, S. et al. (1990) Blood 76, 31-35.; mEPOR: D'Andrea, AD. Et al. (1989) Cell 57, 277-285.; hG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8702-8706.; mG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Cell 61, 341-350.; hTPOR: Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644.; mTPOR: Skoda, RC. Et al. (1993) 12, 2645-2653.; hInsR: Ullrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756-761.; hFlt-3: Small, D. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 459-463.; hPDGFR: Gronwald, RGK. Et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3435-3439.; hIFNα/βR: Uze, G. et al. (1990) Cell 60, 225-234.及Novick, D. et al. (1994) Cell 77, 391-400.)。
癌抗原，是伴隨細胞之惡性化而表現的抗原，也稱為腫瘤專一性抗原。又，細胞癌化時在細胞表面、蛋白質分子上出現的異常的醣鏈也會成為癌抗原，特別稱為癌醣鏈抗原。癌抗原，例如可列舉:CA19-9、CA15-3、sialyl SSEA-1(SLX)等。
MHC抗原大致分成MHC class I抗原與MHC class II抗原，MHC class I抗原包括HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，MHC class II抗原包括HLA-DR、-DQ、-DP。
分化抗原包括CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、 CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130等。
b.第1多肽 第1多肽包括第1 CH2及第1 CH3中之任一者或兩者。第1多肽較佳為包括第1 CH3。 一態樣中，第1多肽也可更含有抗體半分子中之鉸鏈區部分。本態樣中，第1多肽也可含有抗體半分子中之Fc區部分。
於其他態樣中，第1多肽也可更含有抗體半分子中之CH1。本態樣中，第1多肽也可更含有抗體半分子中之CL。本態樣中，第1多肽也可含有抗體半分子中之恆定區部分。恆定區部分含有Fc區部分。
第1多肽含有抗體半分子中之Fc區部分或恆定區部分時，亦可對於該Fc區部分或該恆定區部分進一步施加使它們原本具有之效應子機能增進或降低的改變。具體而言，可列舉使對於FcγR、FcRn、C1q等之結合力增強或降低之改變，但不限定於此。
c.其他部分 第1抗原結合分子也可具有上述第1抗原結合區及第1多肽以外之化合物。「第1抗原結合區與第1多肽以外之化合物」，可列舉例如，胜肽性或非胜肽性之連結子、及其他化合物等。其他化合物可列舉胜肽性或非胜肽性之細胞毒性劑等。
2.第2抗原結合分子 第2抗原結合分子具有第2抗原結合區與第2多肽。
a.第2抗原結合區 第2抗原結合區是結合於第2抗原之區。較佳為第2抗原結合區含有抗體半分子之可變區部分或其第2抗原結合性斷片。第2抗原結合性斷片，是指保持了對於第2抗原之結合性之抗體半分子之可變區部分之斷片。
第2抗原為例如可列舉在目標細胞表現的蛋白質。該蛋白質較佳為在成為對象病症之原因之異常細胞表現的抗原。在異常細胞表現的該抗原，較佳為膜蛋白質。該膜蛋白質，較佳為其細胞外區。
第2抗原可和上述第1抗原相同也可不同。較佳為第1抗原不同於第2抗原。藉由第1抗原與第2抗原不同，由於第1抗原結合分子及第2抗原結合分子之組合而提升對於異常細胞之目標專一性。 較佳為第1抗原及第2抗原中之任一者或兩者在異常細胞表現，但在正常細胞不表現，更佳為第1抗原及第2抗原兩者在異常細胞表現，但在正常細胞不表現。
b.第2多肽 第2多肽含有第2 CH2及第2 CH3中之任一者或兩者。第2多肽較佳為含有第2 CH3。 一態樣中，第2多肽亦可進一步含有抗體半分子中之鉸鏈區部分。本態樣中，第2多肽也可含有抗體半分子中之Fc區部分。
於其他態樣，第2多肽也可進一步含有抗體半分子中之CH1。本態樣中，第2多肽也可進一步含有抗體半分子中之CL。本態樣中，第2多肽也可含有抗體半分子中之恆定區部分。恆定區部分包括Fc區部分。
第2多肽含有抗體半分子中之Fc區部分或恆定區部分時，也可對於該Fc區部分或該恆定區部分進一步施加使此等原本具有之效應子機能升高或降低的改變。具體而言，可列舉使對於FcγR、FcRn、C1q等之結合力增強或降低的改變，但不限定於此。
c.其他部分 第2抗原結合分子也可含有上述第2抗原結合區及第2多肽以外之化合物。「第2抗原結合區與第2多肽以外之化合物」，例如可列舉:胜肽性或非胜肽性之連結子、及其他化合物等。其他化合物可以列舉胜肽性或非胜肽性之細胞毒性劑等。
3.第1抗原結合分子與第2抗原結合分子的關係 第1抗原結合分子及第2抗原結合分子並未利用共價鍵鍵結。藥學組成物中中，第1抗原結合分子及第2抗原結合分子只要未利用共價鍵鍵結即可，也可以交互作用。未以共價鍵之該交互作用可列舉氫鍵及分子間鍵結等。該交互作用之量宜少。該量越少，副作用越減低。
一態樣中，於表面電漿子共振測得的第1抗原結合分子與第2抗原結合分子之結合量之莫耳比，可使用作為該交互作用之指標。例如，於表面電漿子共振使用每1 mm2 固定有50 pg之第1抗原結合分子的感測晶片與含有2.5 mg/mL之第2抗原結合分子之測定液、測定兩抗原結合分子之親和性時，該第2抗原結合分子對於該第1抗原結合分子之結合量，按莫耳比計，為1:0.1~1:0.9之範圍內。 該莫耳比，就第2抗原結合分子之結合量之上限値而言，為1:0.9以下即可，較佳為1:0.8以下，更佳為1:0.7以下，更佳為1:0.65以下，最佳為1:0.5以下。該上限値若越低，在不存在表現第1抗原及第2抗原之細胞之條件下，越不易形成異二聚體，副作用越減低。 另一方面，該莫耳比，就第2抗原結合分子之結合量之下限値而言為1：0.1以上即可，較佳為1：0.14以上，更佳為1：0.17以上，更佳為1：0.2以上、最佳為1：0.23以上。該下限値越高，在表現第1抗原及第2抗原之細胞之表面、越易形成第1抗原結合分子及第2抗原結合分子之異二聚體，效應子機能變得越高。
表面電漿子共振中使用的裝置，可列舉例如:Biacore(註冊商標) T200(GE Healthcare)等。 在藉由表面電漿子共振測定中使用的測定液，例如使用HBS-EP+10X(GE Healthcare)。HBS-EP+10X為製成10倍濃度的測定液，故使用時稀釋成10分之1後使用。使用時之測定液之具體組成，為0.01M之HEPES、0.15M之NaCl、3mM之EDTA、0.05% (v/v)之SurfactantP20、pH 7.4。測定時之測定液之理想溫度為25℃。
一態樣中，第1抗原結合分子及第2抗原結合分子，於液中混合時，比起形成同型二聚體更易形成異二聚體。該態樣中，「同型二聚體」，是第1抗原結合分子與第1抗原結合分子之利用不以共價鍵的交互作用形成的二聚體、或第2抗原結合分子與第2抗原結合分子之利用不以共價鍵的交互作用形成的二聚體。又，「異二聚體」，是第1抗原結合分子與第2抗原結合分子之利用不以共價鍵之交互作用形成之二聚體。交互作用可列舉氫鍵、分子間鍵結等。 　考量減低副作用的觀點，第1抗原結合分子及第2抗原結合分子較佳為在液中不易交互作用。但是第1抗原結合分子及第2抗原結合分子間之該交互作用處於平衡狀態，所以提高液中之第1抗原結合分子及第2抗原結合分子之濃度到藥學組成物中適合對於對象投予之濃度以上時，有可能發生該交互作用。於此情形，第1抗原結合分子及第2抗原結合分子的濃度越高，交互作用的第1抗原結合分子及第2抗原結合分子的量越增加。
在液中混合的情形，作為比起形成同型二聚體更易形成異二聚體之第1抗原結合分子及第2抗原結合分子之具體態樣，第1多肽含有第1 CH3，第2多肽含有第2 CH3，第1 CH3及第2 CH3於液中混合時，就比起形成同型二聚體更易形成異二聚體之改變而言，可列舉下列(i)至(iii)中之至少一種改變。 (i)前述第1 CH3及前述第2 CH3中之任一者具有正電荷之區，另一者具有負電荷之區，形成前述異二聚體時，前述正電荷之區與前述負電荷之區進行交互作用之改變 (ii)前述第1 CH3及前述第2 CH3中之任一者具凸部，另一者具凹部，形成前述異二聚體時，前述凸部嵌合於前述凹部並進行交互作用之改變 (iii)前述第1 CH3及前述第2 CH3為經改變之IgG之CH3，前述經改變之IgG之CH3其一部分被取代為IgA之CH3之一部分，形成前述異二聚體時，置換前述第1 CH3之前述IgA之CH3之一部分與置換前述第2 CH3之前述IgA之CH3之一部分進行交互作用之改變
作為該(i)之改變，可列舉例如:國際公開第2006/106905號、國際公開第2009/089004號、國際公開第2010/129304號、國際公開第2014/084607號揭示者。具體方法之一例，可列舉例如，具有第1抗原結合活性之多肽重鏈恆定區之胺基酸序列中之按EU編號系統之356位與439位、357位與370位、及399位與409位之組合中之至少1個組合改變為有相同電荷之胺基酸，具第2抗原結合活性之或不具抗原結合活性之多肽重鏈恆定區之按EU編號系統之356位與439位、357位與370位、及399位與409位之組合中之至少1個組合改變為和具第1抗原結合活性之多肽有相反電荷之胺基酸。更具體而言，例如:對於具第1抗原結合活性之多肽與具第2抗原結合活性之多肽之重鏈恆定區之胺基酸序列中，其中任一者之多肽導入按EU編號系統之356位之Glu被取代為Lys之變異，另一者之多肽導入按EU編號系統之439位之Lys被取代為Glu之變異。
該(ii)之改變，可列舉例如:國際公開第96/027011號、Margaret Merchant et al., Nature Biotechnology 1998, 16, 677-681揭示者。具體方法之一例，可列舉於CH3導入T366Y、於另一CH3導入Y407A之組合，或於其中一CH3導入T366W、於另一CH3導入Y407A之組合，或於其中一CH3導入F405A、於另一CH3導入T394W之組合、或於其中一CH3導入Y407T、於另一CH3導入T366Y之組合、或於其中一CH3導入T366Y/F405A、於另一CH3導入T394W/Y407T之組合、或於其中一CH3導入T366W/F405W、於另一CH3導入T394S/Y407A之組合、或於其中一CH3導入F405W/Y407A、於另一CH3導入T366W/T394S之組合、或於其中一CH3導入F405W、於另一CH3導入T394S之組合、或於其中一CH3導入T366W、於另一CH3導入T366S/L368A/Y407V之組合。該(ii)之改變也可以和該(i)之改變組合。如此的組合，可列舉例如，國際公開第2012/058768號揭示者。
該(iii)之改變，使用將抗體之其中一H鏈之CH3之一部分設為對應此部分之IgA來源的序列，並於另一H鏈之CH3之互補部分導入對應此部分之IgA來源的序列的strand-exchange engineered domain CH3，藉由利用CH3的互補的交互作用來有效率地引發具有不同序列之多肽之交互作用的技術 (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。使用此公知技術也能有效率地容易形成異二聚體。作為(iii)之改變，可列舉例如，國際公開第2007/110205號揭示之改變技術。
作為在液中混合時比起形成同型二聚體更易形成異二聚體之第1抗原結合分子及第2抗原結合分子之其他具體態樣，也可採用對於鉸鏈區部分施加的改變。如此的改變，可列舉例如，國際公開第2011/143545號揭示之改變技術。
第1 CH3及第2 CH3中之任一者或兩者較佳為有按EU編號系統之357位、397位及409位之胺基酸殘基中之至少一者被取代為其他胺基酸殘基之取代。藉由施加如此的改變，當於上述表面電漿子共振使用每1 mm2 固定有50 pg之第1抗原結合分子之感測晶片與含有2.5 mg/mL之第2抗原結合分子之測定液來測定兩抗原結合分子之親和性時，該第2抗原結合分子對於該第1抗原結合分子之結合量，容易設定為上述莫耳比之範圍內。
一態樣中，於表現第1抗原及第2抗原之細胞存在之條件下的異二聚體之形成量以多於該細胞不存在之條件下為佳。 該細胞不存在之條件下是指，不存在表現第1抗原及第2抗原之細胞，但是也包括存在不表現第2抗原但表現第1抗原之細胞或是不表現第1抗原但表現第2抗原之細胞的條件下。亦即，「於表現第1抗原及第2抗原之細胞存在之條件下的異二聚體之形成量多於細胞不存在的條件下」，包括當藥學組成物投予至生物體內時，表現第1抗原及第2抗原之細胞之表面的異二聚體之形成量多於不表現第2抗原但表現第1抗原之細胞或是不表現第1抗原但表現第2抗原之細胞之表面的異二聚體之形成量。
一態樣中，在表現第1抗原及第2抗原之細胞表面形成異二聚體時，該異二聚體對於FcγR之結合活性，高於第1抗原結合分子之單體或第2抗原結合分子之單體對於FcγR之結合活性、或形成同型二聚體時同型二聚體對於FcγR之結合活性。此現象意指例如，將藥學組成物投予至具有表現第1抗原及第2抗原之細胞之對象時，藉由到達該細胞表面之第1抗原結合分子與第2抗原結合分子而形成的異二聚體，比起在該細胞表面單純結合的單體或在該細胞表面形成之同型二聚體，可誘導更高程度的FcγR活化，發揮效應子機能。藉此，副作用更減低。 本態樣中，FcγR可列舉囓齒類及靈長類之FcγR，可為該等中之任一FcγR。本態樣中，FcγR較佳為囓齒類及靈長類之FcγR。囓齒類較佳為小鼠及大鼠。靈長類較佳為食蟹獼猴及人類。本態樣中，FcγR可列舉人類FcγR、及與其在結構上有相同性且有同樣的機能的囓齒類及人類以外之靈長類的同系物。 本態樣中，FcγR的次類可列舉人類FcγRI、人類FcγRII及人類FcγRIII、以及該等囓齒類及人類以外之靈長類之同系物。該等之中，FcγR較佳為人類FcγRII或人類FcγRIII、或該等囓齒類及人類以外之靈長類之同系物，更佳為人類FcγRIII或此囓齒類及人類以外之靈長類之同系物。人類FcγR較佳為人類FcγRII或人類FcγRIII，更佳為人類FcγRIII。 本態樣中，人類FcγRII進一步分成人類FcγRIIA、人類FcγRIIB及人類FcγRIIC。該等之中，人類FcγRII較佳為人類FcγRIIB。人類FcγRIII進一步分成人類FcγRIIIA及人類FcγRIIIB。該等之中，人類FcγRIII較佳為人類FcγRIIIA。
一態樣中，在存在表現第1抗原及第2抗原之細胞之條件下之效應子機能，高於存在不表現第2抗原但表現第1抗原之細胞或是不表現第1抗原但表現第2抗原之細胞之條件下。藉此，副作用更減低。 效應子機能較佳為ADCC及CDC，更佳為ADCC。
一態樣中，第1多肽及第2多肽中之任一者或兩者含有抗體半分子中之鉸鏈區部分時，第1多肽及第2多肽中之任一者或兩者之鉸鏈區部分，具有按EU編號系統之226位及229位中之任一者或兩者之半胱胺酸殘基被取代為其他胺基酸殘基之取代。該態樣中，較佳為第1多肽及第2多肽兩者的鉸鏈區部分，具有按EU編號系統之226位及229位中之任一者或兩者之半胱胺酸殘基被取代為其他胺基酸殘基之取代，或第1多肽及第2多肽中之任一者或兩者之鉸鏈區部分，按EU編號系統之226位及229位之兩者的半胱胺酸殘基被取代為其他胺基酸殘基之取代。更佳為第1多肽及第2多肽兩者的鉸鏈區部分，具有按EU編號系統之226位及229位兩者的半胱胺酸殘基被取代為其他胺基酸殘基之取代。利用該取代能抑制H鏈間之雙硫鍵，故第1抗原結合分子及第2抗原結合分子容易變成不以共價鍵鍵結者。 該態樣中，更佳為按EU編號系統之226位及229位中之任一者或兩者之半胱胺酸殘基被取代為其他胺基酸殘基之取代，與上述第1 CH3及第2 CH3中之任一者或兩者之按EU編號系統之357位、397位及409位之胺基酸殘基中之至少一者取代為其他胺基酸殘基之取代加以組合。藉由該等改變的組合，第1抗原結合分子及第2抗原結合分子不會依共價鍵鍵結，進而於液中混合時，比起形成同型二聚體更易形成異二聚體。
4.其他成分 藥學組成物除了含有第1抗原結合分子及第2抗原結合分子以外亦可含有其他成分。 其他成分，可列舉例如，藥學上可容許之擔體。
藥學組成物可利用該技術領域中有通常知識者公知之方法製劑化。例如能以水或其他在藥學上可容許之液體的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑之形式，以非經口地使用。例如:藥理學上容許之擔體或介質，具體而言，可考慮將滅菌水、生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、載運劑、防腐劑、黏結劑等適當組合，以一般認可的製藥實務要求的單位用量形態混合以製劑化。此製劑中，有效成分量是設定為能獲得指示範圍之適當容量。
用於注射之無菌組成物，可使用如注射用蒸餾水之載運劑，依通常之製劑實務進行配方。
注射用之水溶液，例如含有生理食鹽水、葡萄糖、其他輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張溶液。也可以併用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(Polysorbate 80(TM)、HCO-50等)。
油性液可列舉麻油、大豆油，溶解輔助劑也可使用苯甲酸苄酯及/或苯甲醇。又，也可摻合緩衝劑(例如:磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、止痛劑(例如:鹽酸普卡因)、安定劑(例如:苯甲醇及苯酚)、抗氧化劑。製備的注射液通常填充在適當的安瓿瓶內。
就一態樣而言，藥學組成物之對象病症是細胞增殖性病症中的惡性腫瘤時，較佳為第1抗原及第2抗原皆為癌抗原，藥學組成物含有細胞毒性劑作為其他成分。細胞毒性劑除了上述例示者以外也包括免疫檢查點抑制劑等。
5.劑型 藥學組成物較佳為利用非經口投予來投予。例如可製成注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型之組成物。例如可利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等來進行全身或局部投予。 第1抗原結合分子及第2抗原結合分子可調劑為同一劑，也可調劑為不同藥劑。藥學組成物含有細胞毒性劑作為其他成分時，細胞毒性劑可以和第1抗原結合分子或第2抗原結合分子調劑為同一劑，也可調劑為不同藥劑。調劑為不同藥劑時，投予的時間點可就含有成分各別決定。
6.對象病症 藥學組成物之對象病症不特別限定，較佳為由表現第1抗原及第2抗原之病原細胞引起的病症。亦即，該病症宜為第1抗原結合分子與第2抗原結合分子在細胞表面形成異二聚體並使效應子機能發揮的病症。 具體的對象病症，可列舉例如:細胞增殖性病症、免疫亢進性病症、感染性病症等。細胞增殖性病症，可列舉例如腫瘤。免疫亢進性病症可列舉自體免疫病症。感染性病症可列舉細菌感染及病毒感染。
7.製造方法 第1抗原結合分子及第2抗原結合分子，可利用用於獲得蛋白質的一般的方法製造。抗原結合分子，通常使用編碼此等抗原結合分子之核酸，於寄主細胞表現而獲得。於寄主細胞表現的抗原結合分子，通常從寄主細胞回收、精製。第1抗原結合分子與第2抗原結合分子，可於寄主細胞共同表現，也可於不同的寄主細胞表現而得。以下針對具體的製造方法記載。
核酸，通常是載持(插入)於適當載體，並導入到寄主細胞。該載體只要能使插入的核酸安定保持者即無特殊限制，例如寄主使用大腸菌的話，則宜使用pBluescript載體(Stratagene公司製)等作為選殖(clonong)用載體較佳，但可使用市售的各種載體。為了生產抗原結合分子而使用載體時，特別以表現載體為有用。表現載體只要是在試管內、大腸菌內、培養細胞內、生物個體內表現多肽的載體即可，無特殊限制，例如，若在試管內表現，則使用pBEST載體(PROMEGA公司製)，若為大腸菌則使用pET載體(Invitrogen公司製)，若為培養細胞則使用pME18S-FL3載體(GenBank Accession No. AB009864)，若為生物個體則使用pME18S載體(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))等較佳。於載體插入本發明之DNA時，可依常法，例如藉由使用了限制酵素位點之接合酶反應而進行(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 11.4-11.11)。
上述寄主細胞無特殊限制，可因應目的而使用各種寄主細胞。用以使抗原結合分子表現之細胞，可列舉例如:細菌細胞(例：鏈球菌、葡萄球菌、大腸菌、鏈黴菌、枯草桿菌)、真菌細胞(例：酵母、麴菌)、昆蟲細胞(例：Drosophila S2、Spodoptera SF9)、動物細胞(例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes 黑色素瘤細胞)及植物細胞。對於寄主細胞之載體導入，例如能夠以磷酸鈣沉澱法、電氣脈衝穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9)、Lipofectamine法(GIBCOBRL公司製)、微注射法等公知之方法進行。
為了使在寄主細胞表現的抗原結合分子分泌到小胞體的內腔、細胞周邊腔、或細胞外之環境，可將適當的分泌信號納入到目標之抗原結合分子內。該等信號對於目標之抗原結合分子可以為內源性也可為異種信號。
上述製造方法中，於抗原結合分子分泌到培養基的情形，抗原結合分子之回收是回收培養基。於抗原結合分子是在細胞內產生的情形，首先將該細胞溶解，之後回收抗原結合分子。
為了從重組細胞培養物將抗原結合分子回收並精製，可使用包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性交互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析及凝集素層析之公知之方法。
於H鏈間以雙硫鍵等共價鍵鍵結之雙特異性抗體之製造中，大多數的場合，需要進行為了排除不希望之H鏈及L鏈組合成的抗原結合分子的精製步驟。另一方面，於本發明之第1抗原結合分子及第2抗原結合分子之製造中，第1抗原結合分子及第2抗原結合分子間未形成共價鍵，故可省略如此的精製步驟。例如，使第1抗原結合分子及第2抗原結合分子在寄主細胞共同表現時，可以利用各種層析從培養基或細胞溶解物、僅需收集有第1抗原結合分子及第2抗原結合分子存在之區分(fraction)即可。使第1抗原結合分子及第2抗原結合分子於各別的寄主細胞表現時，可以將培養基、細胞溶解物混合後將抗原結合分子予以精製，也可以從培養基或細胞溶解物將第1抗原結合分子及第2抗原結合分子各別精製後再進行混合。考量減少為了排除不希望之H鏈及L鏈組合成之抗原結合分子之精製步驟之手續及該步驟中排除之抗原結合分子之浪費之觀點，宜使第1抗原結合分子及第2抗原結合分子於各別的寄主細胞表現較佳。
在即將將藥學組成物投予至對象前，才將第1抗原結合分子及第2抗原結合分子混合並製備的情況，或將含有後述第1抗原結合分子但不含第2抗原結合分子之第1藥學組成物及含有第2抗原結合分子但不含第1抗原結合分子之第3藥學組成物逐次投予時，宜使第1抗原結合分子與第2抗原結合分子於各別的細胞表現並精製，並製造分別含有第1抗原結合分子與第2抗原結合分子之藥學組成物。
C.抗原結合分子及藥學組成物之其他態樣 1.第1抗原結合分子之其他態樣 第1抗原結合分子之其他具體態樣，例如可列舉一種第1抗原結合分子，是具有會與第1抗原結合之第1抗原結合區以及含有第1 CH2與第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽，而且當與具有會與第2抗原結合之第2抗原結合區及含有第2 CH2與第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽之2抗原結合分子在液中混合時，比起形成前述第1抗原結合分子間之同型二聚體，較易形成與前述第2抗原結合分子之異二聚體，前述異二聚體中，前述第1抗原結合分子與前述第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結。 本態樣中，第1抗原結合區、第1多肽、及此等以外之其他部分，與在「1.第1抗原結合分子」記載者相同。第2抗原結合區、第2多肽、及此等以外之其他部分，與在「2.第2抗原結合分子」記載者相同。第1抗原結合分子與第2抗原結合分子間之關係，與在「3.第1抗原結合分子與第2抗原結合分子之關係」記載者相同。
本態樣中，第1抗原結合分子，可製成含有第1抗原結合分子但不含第2抗原結合分子之第1藥學組成物的形式。於此情形，是另外製造含有第2抗原結合分子之第2藥學組成物。第2藥學組成物可以含有也可不含第1抗原結合分子。第2藥學組成物亦在亦可不在同一事業所內製造。此等第1藥學組成物與第2藥學組成物可對於對象組合使用。 本態樣中，第1藥學組成物，除了不含有第2抗原結合分子以外，皆和上述「1.第1抗原結合分子」、「2.第2抗原結合分子」、「3.第1抗原結合分子與第2抗原結合分子之關係」、「4.其他成分」、「5.劑型」、「6.對象病症」及「7.製造方法」相同。
2.第2抗原結合分子之其他態樣 第2抗原結合分子之其他具體態樣，例如可列舉一種第2抗原結合分子，具有會和第2抗原結合之第2抗原結合區及含有第2 CH2與第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽，且當與具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區及含有第1 CH2與第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽之第1抗原結合分子在液中混合時，比起形成前述第2抗原結合分子間之同型二聚體，更易形成與前述第1抗原結合分子之異二聚體，前述異二聚體中，前述第1抗原結合分子與前述第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結。 本態樣中，第1抗原結合區、第1多肽、及此等以外之其他部分，和「1.第1抗原結合分子」記載者相同。第2抗原結合區、第2多肽、及此等以外之其他部分，和「2.第2抗原結合分子」記載者相同。第1抗原結合分子與第2抗原結合分子間之關係，和「3.第1抗原結合分子與第2抗原結合分子之關係」記載者相同。
本態樣中，第2抗原結合分子，可製造成含有第2抗原結合分子但不含第1抗原結合分子之第3藥學組成物的形式。於此情形，是另外製造含有第1抗原結合分子之第4藥學組成物。第4藥學組成物可含有也可不含第1抗原結合分子。此等第3藥學組成物可和第4藥學組成物組合使用。 本態樣中，第3藥學組成物，除了不含第1抗原結合分子以外，與上述「1.第1抗原結合分子」、「2.第2抗原結合分子」、「3.第1抗原結合分子與第2抗原結合分子之關係」、「4.其他成分」、「5.劑型」、「6.對象病症」及「7.製造方法」相同。
3.藥學組成物之其他態樣 藥學組成物之其他具體態樣，例如可列舉含有具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區及含有第1 CH3之第1多肽之第1抗原結合分子;及具有會與第2抗原結合之第2抗原結合區、及含有第2 CH3之第2多肽之第2抗原結合分子;且前述第1抗原結合分子及前述第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結，前述第1 CH3及前述第2 CH3具有下列(iv)至(vi)中之至少一改變之藥學組成物。 (iv)前述第1 CH3及前述第2 CH3中之任一者具有正電荷之區，另一者具有負電荷之區，且形成前述異二聚體時，前述正電荷之區與前述負電荷之區進行交互作用的改變 (v)前述第1 CH3及前述第2 CH3中之任一者具有凸部，另一者具有凹部，且前述異二聚體形成時，前述凸部嵌合於前述凹部並進行交互作用的改變 (vi)前述第1 CH3及前述第2 CH3為經改變之IgG之CH3，前述經改變之IgG之CH3，其一部分被置換為IgA之CH3之一部分，前述異二聚體形成時，已置換前述第1 CH3之前述IgA之CH3之一部分與已置換前述第2 CH3之前述IgA之CH3之一部進行交互作用的改變
本態樣中，第1抗原結合分子與第2抗原結合分子，和上述「1.第1抗原結合分子」及「2.第2抗原結合分子」相同。本態樣之藥學組成物之詳情，和上述「4.其他成分」、「5.劑型」、「6.對象病症」及「7.製造方法」相同。
上述(iv)之改變，例如可列舉:國際公開第2006/106905號、國際公開第2009/089004號、國際公開第2010/129304號、國際公開第2014/084607號揭示者。具體方法之一例，例如具有第1抗原結合活性之多肽之重鏈恆定區之胺基酸序列中之按EU編號系統之356位與439位、357位與370位、及399位與409位之組合當中，至少1個組合改變為有相同電荷之胺基酸；具有第2抗原結合活性或不具抗原結合活性之多肽之重鏈恆定區之按EU編號系統之356位與439位、357位與370位、及399位與409位之組合當中，至少1個組合改變為與具有第1抗原結合活性之多肽有相反電荷之胺基酸。更具體而言，例如，具有第1抗原結合活性之多肽與具有第2抗原結合活性之多肽之重鏈恆定區之胺基酸序列中，於任一者的多肽導入按EU編號系統之356位之Glu被取代為Lys之變異，並於另一者之多肽導入按EU編號系統之439位之Lys被取代為Glu之變異。
該(v)之改變，例如，國際公開第96/027011號、Margaret Merchant et al., Nature Biotechnology 1998, 16, 677-681揭示者。具體方法之一例，可列舉在CH3導入T366Y,於另一CH3導入Y407A的組合，或於其中一CH3導入T366W、於另一CH3導入Y407A之組合，或於其中一CH3導入F405A、於另一CH3導入T394W的組合，或於其中一CH3導入Y407T、於另一CH3導入T366Y的組合，或於其中一CH3導入T366Y/F405A、於另一CH3導入T394W/Y407T的組合，或於其中一CH3導入T366W/F405W、於另一CH3導入T394S/Y407A的組合，或於其中一CH3導入F405W/Y407A、於另一CH3T導入366W/T394S的組合，或於其中一CH3導入F405W、於另一CH3導入T394S的組合，或於其中一CH3導入T366W、於另一CH3導入T366S/L368A/Y407V的組合。該(v)之改變，也能夠以與該(iv)之改變組合。如此的組合，例如，國際公開第2012/058768號揭示者。
該(vi)之改變，是藉由使用將抗體之其中一H鏈之CH3之一部分設為對應此部分之IgA來源的序列，並於另一H鏈之CH3之互補部分導入對應此部分之IgA來源的序列的strand-exchange engineered domain CH3，而利用CH3的互補的交互作用來有效率地引發有不同序列之多肽之交互作用的技術 (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。使用此公知技術也能有效率地容易形成異二聚體。(vi)之改變，例如，國際公開第2007/110205號揭示之改變技術。
在液中混合時，相較於形成同型二聚體更易形成異二聚體之第1抗原結合分子及第2抗原結合分子其他具體態樣，也可採用對於鉸鏈區部分施加的改變。如此的改變，例如，國際公開第2011/143545號揭示之改變技術。
第1 CH3及第2 CH3中之任一者或兩者，較佳為按具有EU編號系統之357位、397位及409位之胺基酸殘基中之至少一者被取代為其他胺基酸殘基之取代。藉由施加如此的改變，當於上述表面電漿子共振使用每1 mm2 固定有50 pg之第1抗原結合分子之感測晶片與含有2.5 mg/mL之第2抗原結合分子之測定液來測定兩抗原結合分子之親和性時，該第2抗原結合分子對於該第1抗原結合分子之結合量，容易設定為上述莫耳比之範圍內。
D.治療方法 一態樣中，本發明提供一種治療方法，包括將第1抗原結合分子及第2抗原結合分子同時投予或逐次投予至對象。適合該治療方法的對象，具有起因於表現第1抗原及第2抗原的病原細胞的病症。 第1抗原結合分子，和上述「B.藥學組成物」之「1.第1抗原結合分子」、或「C.抗原結合分子及藥學組成物之其他態樣」之「1.第1抗原結合分子之其他態樣」者相同。 第2抗原結合分子，和上述「B.藥學組成物」之「2.第2抗原結合分子」、或「C.抗原結合分子及藥學組成物之其他態樣」之「2.第2抗原結合分子之其他態樣」者相同。 第1抗原結合分子及第2抗原結合分子，在投予前及投予後未以共價鍵鍵結合，但第1抗原結合分子與第2抗原結合分子在病原細胞之表面形成異二聚體而發揮效應子機能。
同時投予，包括含有第1抗原結合分子及第2抗原結合分子之藥學組成物之投予，以及含有第1抗原結合分子但不含第2抗原結合分子之第1藥學組成物及含有第2抗原結合分子但不含第1抗原結合分子之第3藥學組成物之同時投予。 逐次投予，是將含有第1抗原結合分子但不含有第2抗原結合分子之第1藥學組成物，以及含有第2抗原結合分子但不含第1抗原結合分子之第3藥學組成物，時間錯開進行投予。第1藥學組成物與第2藥學組成物之投予間隔，是設定在投予後第1抗原結合分子與第2抗原結合分子於病原細胞之表面形成異二聚體並發揮效應子機能的範圍內。 「同時投予或逐次投予」，包括同時投予與逐次投予的組合。
投予方法，可依患者的年齡、症狀適當選擇。含有抗體或編碼為抗體的聚核苷酸的醫藥組成物的投予量，例如可設定為每一次體重每1kg投予0.0001mg至1000mg之範圍內。或例如:可設為每位患者0.001~100000mg的投予量，但本發明不一定要限於該等數値。投予量及投予方法，會依患者的體重、年齡、症狀等變動，但若為該技術領域中有通常知識者，可考慮此等條件並設定適當的投予量及投予方法。
E.篩選方法 一態樣中，本發明提供選擇第1抗原結合分子及第2抗原結合分子的組合的篩選方法。該篩選方法，是選擇第1抗原結合分子及第2抗原結合分子的組合的方法。 該組合，是由第1抗原結合分子之改變體群及第2抗原結合分子之改變體群中選擇。
第1抗原結合分子之改變體群，是具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區，以及含有第1 CH2與第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽的抗原結合分子之改變體之集合體。 第1抗原結合分子之改變體群，是具有會結合於第2抗原之第2抗原結合區，及含有第2 CH2與第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽的抗原結合分子之改變體之集合體。
第1抗原結合分子及第2抗原結合分子的組合，可從此等集合體選擇符合下列(a)至(c)中皆符合者。 (a)第1抗原結合分子與第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結。 (b)第1抗原結合分子及第2抗原結合分子，比起形成第1抗原結合分子間或第2抗原結合分子間之同型二聚體更易形成第1抗原結合分子及第2抗原結合分子之間之異二聚體。 (c)表面電漿子共振，使用每1 mm2 固定有50 pg之第1抗原結合分子之感測晶片與含有2.5 mg/mL之第2抗原結合分子之測定液來測定兩抗原結合分子之親和性時，該第2抗原結合分子對於該第1抗原結合分子之結合量，按莫耳比計，為1:0.1~1:0.9之範圍內。
(a)(b)之選擇方法，例如可採用依據分子尺寸之分級方法。具體方法，可列舉粒徑篩析層析法。 (c)之選擇方法，例如藉由由使用表面電漿子共振之結果算出的上述莫耳比是否為上述範圍內以進行。 [實施例]
[試驗例1]抗體半分子之表現載體之製作及抗體半分子之表現與精製 胺基酸取代之導入，是使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCR或In fusion Advantage PCR cloning kit (TAKARA)等，以該技術領域中有通常知識者公知之方法進行，建構表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域中有通常知識者公知之方法決定。將製作的質體暫時性導入到來自人類胎兒腎癌細胞之HEK293H株(Invitrogen)、或FreeStyle293細胞(Invitrogen社)，實施抗體半分子之表現。從獲得之培養上清使用rProtein A Sepharose(註冊商標) Fast Flow(GE Healthcare)依該技術領域中有通常知識者公知之方法將抗體半分子進行精製。對於精製的抗體半分子濃度，使用分光光度計測定於280 nm之吸光度，從獲得之値使用依PACE法算出的吸光係數，算出抗體半分子濃度(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
[試驗例2]抗體半分子之分子量之分析 針對獲得之抗體半分子之分子量，使用HPLC Agilent 1260 Infinity(註冊商標)(Agilent Technologies)，管柱使用G3000SWXL (TOSOH)，依該技術領域中有通常知識者公知之方法分析。抗體半分子蛋白質濃度設為0.25mg/mL，實施80 μL之注射。
[試驗例3]FcγR之製備與對於FcγR之結合活性之評價 FcγR之細胞外域依下列方法製備。首先，依該技術領域中有通常知識者公知之方法實施FcγR之細胞外域之基因之合成。此時，針對FcγRIIIa已知有多型，多型部位參考J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070製作。
將獲得之基因斷片插入到動物細胞表現載體，製作表現載體。將製作的表現載體暫時性導入到來自人類胎兒腎癌細胞的FreeStyle293細胞(Invitrogen社)，使目標蛋白質表現。培養並回收獲得之培養上清後，通過0.22μm過濾器獲得培養上清。獲得之培養上清，原則上以下列4個步驟精製。第1步驟實施陽離子交換管柱層析(SP Sepharose(註冊商標) FF)，第2步驟實施對於His標籤之親和管柱層析(HisTrap HP)，第3步驟實施凝膠過濾管柱層析(Superdex(註冊商標)200)，第4步驟實施無菌過濾。針對精製的蛋白質，使用分光光度計測定於280 nm之吸光度，使用從獲得之値利用PACE等方法算出的吸光係數，算出精製蛋白質的濃度(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。 使用Biacore(註冊商標) T200，實施目標之抗體半分子與FcγR之交互作用解析。測定使用Biotin CAPture Kit, Series S(GE Healthcare)，電泳緩衝液(running buffer)是將HBS-EP+10X (GE Healthcare)稀釋成10分之1後使用，測定溫度定為25℃。感測晶片使用已在Series S Sencor Chip CAP(GE Healthcare)預先使生物素化之抗原胜肽交互作用並固定化的晶片。使目標抗體半分子捕捉於該等晶片，與經電泳緩衝液稀釋的FcγR交互作用。將已捕捉在晶片的抗原與抗體半分子依套組附帶的説明書洗淨，將晶片再生並重複使用。
抗體半分子對於FcγR的結合活性，主要是以針對FcγR之結合活性及針對FcγR之解離常數作為指標進行評價。
各抗體半分子針對FcγR之解離常數，是對於Biacore(註冊商標)之測定結果實施動力學分析以算出。具體而言，將利用Biacore(註冊商標) Evaluation Software測定而獲得之感測圖以1:1 Langmuir binding model進行global fitting，以算出結合速度常數ka (L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s)，由此値算出解離常數KD (mol/L)。
[試驗例4]使用FcγRIIIa-V158 Jurkat cells(Promega)作為效應子細胞之各待驗抗體半分子之ADCC活性之測定 使用FcγRIIIa-V158 Jurkat cells(以下稱為Jurkat cells)作為效應子細胞，依下列方式測定各待驗抗體半分子之ADCC活性。
Jurkat cells之製備 從培養瓶(flask)回收Jurkat cells ，以含有4%FBS的RPMI 1640培養基(Gibco)(以下稱為Assay Buffer)將細胞洗淨1次後，將該細胞懸浮於Assay Buffer中，使其細胞密度成為3x106 細胞/ mL。該細胞懸浮液作為Jurkat cells溶液，供以後之實驗用。
(1)目標細胞之製備 將使SK-Hep-1強制表現人類Glypican3之SK-pca60、表現人類Epiregulin之SKE-4B2、或表現人類Glypican3與人類Epiregulin兩者的EREG_SK-pca60_#2從培養皿剝離，以Assay Buffer將細胞洗淨1次後，將該細胞懸浮於Assay Buffer中，使其細胞密度成為1x106 細胞/ mL。將該細胞懸浮液作為目標細胞溶液，供以後之實驗用。
(2)發光試藥之製備 將Bio-Glo Luciferase Assay Buffer 100mL(Promega)加到Bio-Glo Luciferase Assay Substrate(Promega)的瓶中，倒轉混合。將瓶子遮光，於-20℃冷凍。該發光試藥供以後之實驗用。
(3)ADCC報告子試驗(ADCC活性) 利用螢光素酶發光之倍性變化(Fold change)來評價ADCC活性。首先，將(2)製備的目標細胞以25μl(2.5 x 104 cells/孔)逐一添加在96孔平底白色盤的各孔中。然後將製備成各濃度(0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30μg/mL)的抗體半分子溶液各25μl逐一添加到各孔中。將於各孔中已添加(1)製備之Jurkat cells溶液各25μl(7.5 x 104 cells/孔)的該盤，在5%二氧化碳培養箱中於37℃靜置24小時。將(3)製備的發光試藥融化，於各孔各逐一添加75μl，於室溫靜置10分鐘。使用螢光儀測定該盤之各孔中之150μl之培養上清之螢光素酶之發光。依據下式1，求ADCC活性。
(式1) Fold change＝A/B
上式1中，A代表各孔中之150μl之培養上清之螢光素酶發光之平均値。又，B代表將(3)之實驗中的抗體半分子溶液替換為添加25μl之Assay Buffer時，150μl之培養上清之螢光素酶發光之平均値。試驗是實施三重複，算出反映各待驗抗體半分子之ADCC活性的前述試驗中的ADCC活性(Fold change)之平均値。
[試驗例5]抗體半分子間之交互作用之測定 使用Biacore(註冊商標) T200分析獲得之抗體半分子間之交互作用。測定使用Biotin CAPture Kit, Series S(GE Healthcare)，電泳緩衝液是將HBS-EP+10X (GE Healthcare)稀釋成10分之1後使用，測定溫度定為25℃。感測晶片，使用使預先生物素化的抗原胜肽交互作用於Series S Sencor Chip CAP(GE Healthcare)並固定化的晶片。使該等晶片捕捉約50 RU之目標之抗體半分子A，使經電泳緩衝液稀釋的目標抗體半分子B成為2.5 mg/mL，以30μL/min之流速使其進行180秒交互作用，並實施測定。依據以下之式2，計算莫耳結合比例。將捕捉在晶片的抗體半分子A依套組附帶的説明書洗淨，將晶片再生並重複使用。
(式2) 莫耳結合比例＝(作為分析物之結合的抗體半分子B之結合量(RU、最大値)/抗體半分子B的分子量)/(被捕捉的抗體半分子A之結合量(RU)/抗體半分子A的分子量)
[試驗例6]1D3-Kn125/Hl076、1D3-DA303v2、1D3-DB220v2的血中濃度測定 利用電化學免疫測定法(ECLIA)進行測定。於固定了Human IgG-heavy and light chain Antibody (Bethyl)的MULTI-ARRAY 96孔盤(MSD)添加血漿樣本，使其於室溫反應。然後，將抗人類IgG (Jackson Immuno Research)反應後，加入SULFO-TAG streptavidin (MSD)並使其反應。測定以SECTOR S 600 (MSD)實施。
[試驗例7]1D3-DA303v2/DB220v2之血中濃度測定 利用LC-MS進行測定。將Ab-Capcher Mag (ProteNova)與血漿樣本混合後，添加含有溶菌酶、DTT、尿素的混合溶液，使其反應。再者，使其與碘代乙醯胺(Iodoacetamid)溶液 (Sigma Aldrich)反應後，加入胰蛋白酶(Trypsin)溶液。之後回收上清，添加三氟乙酸(wako)後，注入到Acquity UPLC (Waters)，以Xevo TQ-S (Waters)進行測定。
[試驗例8]血中之B細胞測定 使用血比毛細管 (TERUMO (股)公司)從C57BL/6NCr Slc小鼠 (♂、7週大、日本SLC(股)公司) 的背中足靜脈實施採血。將採取的血液以15 μL逐一地加到 2 mL的ACK Lyncing Buffer (gibco)，於暗處在室溫溫育5分鐘後，以500×g進行5分鐘離心分離，去除上清。將其再度重複。製備於MACS 緩衝液(Miltenyi Biotec) 1450 mL添加了BSA 原液(Miltenyi Biotec) 75 mL而得的緩衝液(FACS buffer)，將FcR 阻斷藥劑(Miltenyi Biotec) 稀釋10倍後，以20 μL/Tube將細胞懸浮。於室溫溫育10分鐘後，添加BUV395 anti-CD45R/B220(BD) 0.5 μL、PE-CF594 anti-IgM (BD) 0.5 μL及Zombie NIR Fixable Viability Kit 0.4 μL，於4℃溫育20分鐘後，加入2 mL的FACS 緩衝液，以500×g進行5分鐘離心，去除上清。以400 μL的FACS 緩衝液再懸浮，以BD FACS LSR Fortessa X-20 (BD)進行解析。
[試驗例9]活細胞中之B細胞之比例解析 使用Flowjo ver7.6 (TOMY Digital Biology) 實施解析。分閘(gate)出活細胞後，將成為解析對象之CD45R/B220+ IgM+之區分作為B細胞。按各樣本算出活細胞中之B細胞之比例。
[實施例1]抗體半分子之製作 以下揭示為了製作有雙重陽性細胞選擇性毒殺活性之抗體半分子的具體胺基酸取代之程序。製作、評價的抗體半分子的簡稱及名稱、CH3改變、以及抗體半分子的序列編號示於表1。又，抗體半分子H鏈可變區部分的名稱命為VH時，恆定區部分帶有CH的抗體半分子的H鏈所對應的序列稱為VH-CH，抗體半分子L鏈可變區部分的名稱命為VL時，恆定區部分帶有CL的抗體半分子的L鏈所對應的序列稱為VL-CL。表現後精製所獲得之抗體半分子，例如同型二聚體化抗體之表現所使用之抗體半分子H鏈所對應的表現載體為VH1-CH1、抗體半分子L鏈所對應的表現載體為VL1-CL1之同型二聚體化抗體時，記載為VH1-CH1/VL1-CL1。帶有4條鏈之異二聚體化抗體之表現所使用之抗半分子體H鏈所對應之表現載體之一為VH1-CH1、另一抗體半分子H鏈為VH2-CH2、抗體半分子L鏈所對應之表現載體之一為VL1-CL1、另一抗體半分子L鏈為VL2-CL2時，記載為VH1-CH1/VL1-CL1//VH2-CH2/VL2-CL2。又，各抗體半分子是等量混合時，抗體半分子A命為VH1-CH1/VL1-CL1、抗體半分子B命為VH2-CH2/VL2-CL2時，記載為VH1-CH1/VL1-CL1+VH2-CH2/VL2-CL2。為了簡便，有時僅使用恆定區的簡稱，而表示記載為A1、B1、或A1+B1。要表達胺基酸之改變時，以如D356K的方式表示。最初的字母(D356K之D)，是指改變前之胺基酸殘基以單字母表示時的字母，接續的數字(D356K的356)，是指其改變處的EU編號，最後之字母(D356K之K)，是指改變後之胺基酸殘基以單字母表達時的字母。又，進行改變的模盤，使用對於天然型IgG1，末端的GK有缺損的序列。
首先，使用國際公開第2013/002362號記載之改變，以使異二聚體化時ADCC活性增強。將CH2中，L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、S298A置換到抗體半分子A，D270E、K326D、A330M、K334E置換到抗體半分子B。為了使抗體之鉸鏈區間之雙硫鍵不形成，分別對抗體半分子A、B設為C226S、C229S。除了該等變異，更使用國際公開第2006/106905號記載之改變以作為抑制同型二聚體之形成且促進異二聚體之形成的改變。具體而言，抗半分子A進行D356K取代、抗體半分子B進行K439E取代。但是，CH3界面的交互作用強，僅以此變異無法取得抗體半分子。故為了減弱CH3界面的交互作用，使用國際公開第2015/046467號記載之改變。 對於抗體半分子A、B 各導入CH3界面的胺基酸殘基E357、V397、K409的改變。將此等ADCC增強改變、鉸鏈區之改變、異二聚體化改變及CH3界面不安定化改變予以組合，以取得目標抗體半分子A及抗體半分子B。亦即，抗體半分子A及抗體半分子B在血中、各抗原單獨表現的細胞上，不引起同型二聚體化，而是同時結合於存在二種抗原的細胞時，抗體半分子彼此才異二聚體化，並能結合於FcγRIIIa。
[表1]
[實施例2]抗體半分子的分子量之評價 利用粒徑篩析層析法實施製作之抗體半分子A、B的分子量之評價。此時，就完整抗體之對照(第1圖a之W之峰部)而言，使用國際公開第2009/125825號揭示之針對人類介白素6受體的抗體。H鏈可變區使用MRAH(序列編號：11)，H鏈恆定區使用天然型IgG1的序列(序列編號：12)。L鏈可變區使用MRAL(序列編號：13)，L鏈恆定區使用天然型κ鏈k0(序列編號：14)的序列。就抗體半分子狀態之對照(第1圖b的H的峰部)而言，H鏈可變區使用國際公開第2013/100120號記載之抗人類Epiregulin抗體之H鏈可變區部分EGLVH(序列編號：15)，H鏈恆定區部分使用有Lu等人的報告(Shan L, Colazet M, Rosenthal KL, Yu XQ, Bee JS, Ferguson A, Damschroder MM, Wu H, Dall'Acqua WF, Tsui P, Oganesyan V. (2016) Generation and Characterization of an IgG4 Monomeric Fc Platform. PLoS One. 2016 Aug 1;11(8))記載之具有改變的wtIgG4C4(序列編號：16)。L鏈可變區，使用國際公開第2013/100120號記載之抗人類Epiregulin抗體之L鏈可變區部分EGLVL(序列編號：17)，L鏈恆定區使用天然型κ鏈k0的序列。又，測定依試驗例2記載的方法實施。又，此時的H鏈可變區分別使用MRAH，針對L鏈，皆使用MRAL-k0實施測定。 測定之結果，如第1圖所示，僅抗體半分子A1、A3、A4、A5的情況，可獲得抗體半分子(H峰部)與完整抗體(W峰部)之混合物(第1圖c、e-g)，A2可獲得抗體半分子(W峰部)與推測處於抗體半分子與完整抗體之平衡狀態之分子(E峰部)(第1圖d)，僅抗體半分子B1、B2、B3、B4、B5的情況，以抗體半分子(H峰部)的形式存在(第1圖h-l)。又，即使將抗體半分子A1與B1(第1圖m)、A2與B2(第1圖n)、A3與B3(第1圖o)、A4與B4(第1圖p)、A5與B5(第1圖q)混合，完整抗體之形成(W峰部)比起僅抗體半分子A1、A2、A3、A4、A5個別時或僅抗體半分子B1、B2、B3、B4、B5時並未更增加。又，針對混合了A1-B1(第1圖m)、A3-B3(第1圖o)的情形，觀察到推測處於抗體半分子與完整抗體之平衡的狀態之分子(E峰部)的形成。
[實施例3]抗體半分子對於FcγRIIIa之結合能力之評價 然後，依試驗例3記載的方法測定該等抗體半分子是否在溶液中為抗體半分子的狀態，對於FcγRIIIa不顯示結合能力，但伴隨抗原結合而局部濃縮藉此異二聚體化，並回復對於FcγRIIIa的結合。又，此時，H鏈可變區部分使用MRAH，L鏈可變區部分使用MRAL，L鏈恆定區部分使用k0，實施測定。天然型IgG1之値，是使用Mimoto等人的報告(Mimoto F, Igawa T, Kuramochi T, Katada H, Kadono S, Kamikawa T, Shida-Kawazoe M, Hattori K.(2013) Novel asymmetrically engineered antibody Fc variant with superior FcγR binding affinity and specificity compared with afucosylated Fc variant. MAbs 5(2), 229-236)記載之値。 測定之結果，如表2所示，抗體半分子A之系列A1-A5、抗體半分子B之系列B1-B5，單獨各不對於FcγRIIIa顯示結合能力，但抗體半分子A1與B1、A2與B2、A3與B3、A4與B4、A5與B5各自混合時，才對於FcγRIIIa顯示結合能力。
[表2]＊n. d.為未檢出的簡稱，代表低於測定下限，無法測定。
[實施例4]抗體半分子之ADCC活性之評價 依試驗例4記載的方法測定該等恆定區之抗體半分子相較於現有的雙特異性抗體是否具有優良的雙重陽性細胞選擇性毒殺活性。就抗原表現細胞而言，使用使SK-Hep-1強制表現Glypican3的國際公開第2016/182064號記載之SK-pca60、強制表現Epiregulin之國際公開第2014/208482號記載之SKE-4B2。就Glypican3、Epiregulin雙重陽性細胞而言，使用使SK-pca60強制表現Epiregulin的EREG_SK-pca60_#2。此時，針對實施例3使用之抗體半分子A之系列，其H鏈可變區部分使用國際公開第2009/041062號記載之抗GPC3抗體GH0(序列編號：18)，其L鏈可變區部分使用國際公開第2009/041062號記載之抗GPC3抗體GL0(序列編號：19)，L鏈恆定區部分使用k0。針對抗體半分子B使用EGLVH，L鏈可變區使用EGLVL，L鏈恆定區使用k0。又，就現有的雙特異性抗體而言，使用GH0-Kn125P17/GL0-k0//EGLVH-Hl076N17/EGLVL-k0(GH0/EGLVH-BiAb)。雙特異性抗體之恆定區，為了使異二聚體化時ADCC活性增強，分別進行國際公開第2013/002362號記載之CH2，L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、S298A取代到Kn125P17(序列編號：20)，D270E、K326D、A330M、K334E取代到Hl076N17(序列編號：21)。又，為了利用電荷的差異製作雙特異性抗體，將國際公開第2015/046467號記載之D356K、V397Y置換到Kn125P17，V397Y、K439E置換到Hl076N17。又，針對356-358位的序列，使用天然型IgG1的異(allotype) EEM的序列。將依此方式製作的GH0-Kn125P17/GL0-k0、EGLVH-Hl076N17/EGLVL-k0，依利用恆定區之電荷之差異的該技術領域中有通常知識者公知之方法(Proc. Natl. Acad. Sci., 110, 5145-5150, 2013)混合，並製成目標的雙特異性抗體。
測定是將抗體半分子A1與B1、A2與B2、A3與B3、A4與B4、A5與B5混合並添加。A1 + B1、A4 + B4、A5 + B5的情形，對於SK-pca60、SKE-4B2，ADCC活性低，對於EREG_SK-pca60_#2，顯示強ADCC活性。A2 + B2、A3 + B3的情形，對於SKE-4B2，ADCC活性低，對於SK-pca60、EREG_SK-pca60_#2，顯示強ADCC活性。使用現有的雙特異性抗體時，對於SK-pca60、SKE-4B2、EREG_SK-pca60_#2全部細胞皆顯示強ADCC活性。由以上可知，本次製作的抗體半分子A1、A4、A5及B1、B4、B5對於上列每一細胞皆比現有雙特異性抗體有更優良的雙重陽性細胞選擇性毒殺活性，關於抗體半分子A2、A3及B2、B3，亦為比起現有雙特異性抗體，對於一種類細胞有更優良的雙重陽性細胞選擇性毒殺活性。
[實施例5]抗體半分子間之交互作用之評價 使用Biacore(註冊商標)，依試驗例5記載的方法測定此等抗體半分子A1與B1、A2與B2、A3與B3、A4與B4、A5與B5間的交互作用。此時，被捕捉的抗體半分子的H鏈可變區部分使用國際公開第2009/041621號記載之抗人類IL6受體抗體的H鏈可變區部分PF1H(序列編號：22)，L鏈可變區部分使用國際公開第2009/041621號記載之抗人類IL6受體抗體的L鏈可變區部分PF1L(序列編號：23)，L鏈恆定區部分使用k0。又，作為分析物使用之抗體半分子的H鏈可變區，使用國際公開第2015/174439號記載之抗KLH抗體IC17H(序列編號：24)，針對L鏈可變區使用國際公開第2015/174439號記載之抗KLH抗體IC17L(序列編號：25)，L鏈恆定區使用k0。 其結果，如表3所示，抗體半分子A1-A5有約50RU被捕捉時，各抗體半分子B1-B5之莫耳結合比例為0.18-0.63時，顯示發揮雙重陽性細胞選擇性ADCC活性。
[表3]
[實施例6]抗體半分子之體內(in vivo)評價 針對抗體半分子DA303v2及DB220v2在小鼠生物體內和抗原結合時是否僅形成二聚體並顯示細胞毒殺活性，使用具有抗小鼠CD19抗體之可變區部分之抗體半分子進行評價。
6-1. 抗小鼠CD19抗體半分子之製作 抗小鼠CD19抗體(Clone: 1D3)是從ATCC購買細胞株HB-305，並依該技術領域中有通常知識者公知之方法進行抗體基因的選殖。就抗體半分子H鏈恆定區部分而言，製作對於天然型人類IgG1之C末端之Gly及Lys已除去之G1d(序列編號：26)之CH2具有導入ADCC增強改變之L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A，CH3導入為了促進抗體半分子形成與異二聚體化促進之改變D356K/V397Y/K409D的恆定區部分DA303v2(序列編號：27)，且具抗小鼠CD19抗體的H鏈可變區部分之抗體半分子H鏈之基因。同樣地，就抗體H鏈恆定區部分而言，製作具有於G1d之CH2導入作為ADCC增強改變之D270E/K326D/A330M/K334E，於CH3導入為了促進抗體半分子形成與異二聚體化促進之改變V397Y/K409D/K439E的恆定區部分DB220v2(序列編號：28)，且有抗小鼠CD19抗體的H鏈可變區部分之抗體半分子H鏈之基因。又，為了製作有和此等抗體半分子相同之ADCC增強改變之完整抗體，製作就抗體H鏈恆定區而言，具有在G1d之CH2導入作為ADCC增強改變之L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A，於CH3導入作為異二聚體化改變之Y349C/T366W之Kn125(序列編號：29)，且具抗小鼠CD19抗體的H鏈可變區的抗體H鏈的基因，及就抗體H鏈恆定區而言，具有於G1d之CH2導入作為ADCC增強改變之D270E/K326D/A330M/K334E，於CH3導入作為異二聚體化改變之D356C/T366S/L368A/Y407V之Hl076(序列編號：30)，且有抗小鼠CD19抗體的H鏈可變區之抗體H鏈之基因。Kn125與Hl076導入了Knobs-into-holes技術(Margaret Merchant et al., Nature Biotechnology 1998, 16, 677-681)，藉由此等2個H鏈基因和抗小鼠CD19抗體的L鏈基因共同表現，生成異二聚體化的完整抗體。又，同樣製作帶有對於G1d導入了國際公開第2013/047748號記載之用以減弱對於小鼠FcγR之結合之改變(L235R/S239K)而得的恆定區F760(序列編號：31)作為H鏈恆定區，帶有具抗小鼠CD19抗體H鏈可變區之抗體H鏈之基因、及國際公開第2015/174439號記載之ADCC活性增強之小鼠IgG2a恆定區(mFa55: 序列編號：32)作為H鏈恆定區，且有抗小鼠CD19抗體H鏈可變區之抗體H鏈之基因。就不結合於小鼠CD19之抗體而言，分別製作具有國際公開第2015/174439號記載之抗KLH抗體的H鏈可變區IC17H(序列編號：24)，且具有對於FcγR之結合減弱的恆定區F760nN17(序列編號：33)的抗體H鏈基因。就抗體L鏈而言，製作具天然型人類kappa恆定區(k0：序列編號：14)，且具帶有抗小鼠CD19抗體L鏈可變區之抗體L鏈之基因、及同樣有天然型小鼠kappa恆定區(mk0: 序列編號：34)，且帶有抗小鼠CD19抗體L鏈可變區之抗體L鏈之基因。又，製作帶有抗KLH抗體L鏈可變區IC17L(序列編號：25)，且具天然型人類kappa恆定區(k0)之抗體L鏈基因。將在此製作的各基因依表4所示之組合表現，並依試驗例1記載的方法獲得目標抗體。
[表4]
6-2. 抗小鼠CD19抗體半分子或其二聚體對於小鼠FcγR之結合評價 實施對實施例6-1製備之抗體半分子當中，1D3-mFa55、1D3-Kn125/Hl076、1D3-DA303v2、1D3-DB220v2及1D3-DA303v2與1D3-DB220v2之等量混合物的對於小鼠FcγRI、II、III、IV之結合測定。又，製作作為比較對象之具有從天然型人類IgG1的序列去除了C末端之Gly及Lys的G1d作為H鏈恆定區，具抗小鼠CD19抗體的H鏈可變區部分之抗體半分子H鏈之基因，及具天然型人類kappa恆定區k0且帶有抗小鼠CD19抗體L鏈可變區之抗體L鏈之基因，依試驗例1的方法，獲得抗小鼠CD19抗體半分子、1D3-G1d。小鼠FcγRI、II、III、IV依國際公開第2014/030750號記載的方法製備。使用Biacore(註冊商標) T200 (GE Healthcare)，實施各抗體半分子或其二聚體與FcγR之交互作用解析。電泳緩衝液是將HBS-EP+10X (GE Healthcare)稀釋成10分之1後使用，測定溫度設為25℃。Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare)，使用以胺偶聯法固定了Protein A/G (PIERCE)的晶片。使此感測晶片捕捉目標抗體半分子，使其與經電泳緩衝液稀釋之FcγR交互作用而進行測定。又，藉由使其與25 mM NaOH及10 mM Glycine-HCl (pH1.5)反應，將已捕捉在感測晶片的抗體半分子洗淨，將感測晶片再生並重複使用。為了算出各抗體半分子或其二聚體之對於FcγR之KD値之動力學分析，依下列方法實施。首先，使上述感測晶片捕捉目標抗體半分子，使其與經電泳緩衝液稀釋之mFcγR交互作用，針對獲得之感測圖，以Biacore(註冊商標) Evaluation Software將測定結果以1:1 Langmuir binding model進行global fitting，來算出結合速度常數ka (L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s)，由此値算出解離常數KD (mol/L)。又，抗體半分子或其二聚體與FcγR之交互作用微弱且判斷無法以上述動力學分析正確解析時，則對其交互作用，利用Biacore(註冊商標) T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE記載之以下之1:1結合模型式來算出KD。
以1:1 binding model交互作用的分子在Biacore(註冊商標)上之行為能夠以下列式3表達。
(式3) Req = C・Rmax /(KD+C) + RI Req : 相對於分析物濃度之穩定態結合水平圖(a plot of steady state binding levels against analyte concentration) C: 濃度(concentration) RI: 樣本中之容積折射係數貢獻(bulk refractive index contribution in the sample) Rmax : 表面分析物結合能力(analyte binding capacity of the surface)
若將此式變形，KD能以下列式4表達。
(式4) KD = C・Rmax /(Req -RI)-C
藉由於此式中代入Rmax 、RI、C之値，可算出KD。針對RI、C，可從測定結果之感測圖、測定條件求値。針對Rmax 之算出，依以下之方法。針對此測定中同時評價之成為比較對象之交互作用充分強的抗體，將以上述1:1 Langmuir binding model進行global fitting時獲得之Rmax 之値除以成為比較對象之抗體在感測晶片的捕捉量，並乘以欲評價之改變抗體之捕捉量，獲得之値定義為Rmax 。在本次測定條件中，RI = 0、C= 500 nM (FcγRI、FcγRIV)或4000 nM (FcγRII、FcγRIII)。對於針對各FcγR之G1d之交互作用解析結果獲得之感應圖以1:1 Langmuir binding model進行global fitting時獲得之Rmax 之値除以G1d的捕捉量，再乘以各抗體之捕捉量，獲得之値作為Rmax。此是假定任一抗體半分子或其二聚體相較於G1d，各FcγR能結合之極限量無變化，測定時之Rmax 和此測定時結合在晶片上之抗體之量成比例的計算。Req ，定義為測定時觀察到的各FcγR對於感測晶片上之抗體半分子或其二聚體之結合量。
如此獲得之各抗體針對小鼠FcγR之KD値示於表5。表中之灰色塗滿的値，是因判斷FcγR對於抗體半分子或其二聚體之結合微弱，無法以動力學分析來正確解析，故利用上式4算出之値。又，「針對小鼠FcγRs 之KD 倍數」之値，是將針對各FcγR之G1d之KD除以各抗體之KD而得的値，代表各抗體針對各FcγR之親和性相較於G1d是否有增強或減弱了多少。又，N.D.代表在感測圖上未確認結合。
[表5]
由表5之結果，FcγR結合增強型小鼠IgG2a抗體mFa55，相較於G1d，對於FcγRI增加44.7倍、對於FcγRII增加3.4倍、對於FcγRIII增加11.7倍、對於FcγRIV增加57.5倍結合。人類IgG1型之異二聚體化ADCC增強抗體Kn125/Hl076，相較於G1d，對於FcγRI結合減弱、是0.4倍，對於FcγRII增加、是5.7倍、對於FcγRIII增加、是13.2倍、對於FcγRIV增加、是253.3倍。抗體半分子DA303v2對任一小鼠FcγR皆未結合。抗體半分子DB220v2亦對任一小鼠FcγR皆為結合減弱，其親和性相較於G1d，對FcγRI為0.05倍、對FcγRII為0.03倍、對FcγRIII為0.04倍。又，對FcγRIV未結合。二種抗體半分子DA303v2與DB220v2等量混合而測定的1D3-DA303v2/1D3-DB220v2，相較於G1d，對FcγRI結合減弱、是0.03倍、對FcγRII減弱、是0.08倍、對FcγRIII減弱、是0.4倍，但針對FcγRIV，結合增加、是11.5倍。由以上之結果，可知任何抗體半分子單獨時對於FcγR之結合活性幾乎無損失，反觀將二種抗體半分子混合並形成異二聚體時，對於FcγRIV之結合增強，因此可期待效應子活性。
6-3. 小鼠中之抗體半分子之單體投予、及混合投予時之藥物動態評價 評價實施例6-1記載的方法製作之1D3-Kn125/Hl076、1D3-DA303v2、1D3-DB220v2、1D3-DA303v2/DB220v2的小鼠血中藥物動態。投予是以10 mg/kg從小鼠尾靜脈進行，從頸靜脈經時地採血。血漿中濃度，對1D3-Kn125/Hl076、1D3-DA303v2、1D3-DB220v2以電化學免疫測定法 (ECLIA: 試驗例6)，針對1D3-DA303v2/DB220v2將各抗體半分子以LC-MS (試驗例7)測定。其結果，相較於完整抗體1D3-Kn125/Hl076，1D3-DA303v2、1D3-DB220v2、1D3-DA303v2/DB220v2從血中非常快速消失，投予後3日相對於剛投予時之濃度減少至1/100左右(第3圖)。又，分別關於1D3-DA303v2、及1D3-DB220v2，針對單獨投予與混合投予血漿中濃度變化未顯示顯著差異。此顯示即使是混合投予，抗體半分子未進行異二聚體化而以單體存在，於可變區結合於抗原時才進行異二聚體化。
6-4. 小鼠生物體內中之B細胞耗竭(B cell depletion)之評價 藉由將實施例6-1記載的方法精製、製備之抗小鼠CD19抗體半分子 (表4記載) 對於小鼠進行靜脈內投予，驗證是否顯示細胞毒殺活性。又，體內B細胞耗竭(in vivo B cell depletion)試驗的投予量的設定，是從實施例6-3所示之完整抗體及抗體半分子之消失濃度變化，設定各檢體槽(trough)濃度為同程度。具體而言，為了維持C57BL/6NCr Slc小鼠的必要血中濃度，以表6所示之投予條件，將各種抗體或抗體半分子進行靜脈內投予(各群n=3)。投予後第3日實施背中足靜脈採血，依試驗例8記載的方法將血中之B細胞染色後，以FACS檢測活細胞中之B細胞。依試驗例9記載的方法算出血中之B細胞之比例，結果，相較於KLH-F760nN17，1D3-F760未顯示細胞毒殺活性，陽性對照1D3-mFa55及1D3- Kn125/Hl076顯示顯著細胞毒殺活性。於本條件下，抗體半分子1D3-DA303v2及1D3-DB220v2分別單獨投予未顯示細胞毒殺活性，但將它們等量混合並投予時，相較於KLH-F760nN17，顯示顯著細胞毒殺活性 (第4圖)。如實施例6-3所示，據認為抗體半分子以混合狀態投予，若可變區未結合於抗原，則仍會以抗體半分子的形式存在，因此此處獲得之B細胞耗竭活性推測是各抗體半分子在可變區結合於抗原才形成異二聚體並顯示ADCC活性的結果。
[表6]
[試驗例10]抗體半分子之表現載體之製作及抗體半分子之表現與精製 胺基酸取代之導入，使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)、PCR或In fusion Advantage PCR cloning kit (TAKARA)等，依該技術領域中有通常知識者公知之方法進行，建構表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域中有通常知識者公知之方法決定。將製作的質體對於Expi293細胞(Invitrogen)暫時性導入，實施抗體半分子之表現。從獲得之培養上清，使用MonoSpin ProA 96孔盤型(商標註冊)(GL Science)，依該技術領域中有通常知識者公知之方法將抗體半分子精製。精製抗體半分子濃度，使用分光光度計測定於280 nm之吸光度，從獲得之値依PACE法算出吸光係數，使用吸光係數算出抗體半分子濃度(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
[試驗例11]抗體半分子的分子量的分析 獲得之抗體半分子的分子量使用HPLC ACQUITY UPLC H-Class(註冊商標)(Waters)、管柱使用SuperSW3000(TOSOH)，依該技術領域中有通常知識者公知之方法分析。抗體半分子蛋白質濃度設為0.10 mg/mL，進行10 μL之注射。
[實施例7]抗體半分子之製作 為了驗證不使用在實施例1使用之異二聚體化改變，能不能夠抑制同型二聚體之形成，不使用異二聚體化改變、或使用Ha等人類之報告(Ha JH, Kim JE, Kim YS (2016) Immunoglobulin Fc Heterodimer Platform Technology: From Design to Applications in Therapeutic Antibodies and Proteins. Front Immunol. 2016 Oct 6;7:394.)記載之改變。具體而言，僅ADCC增強改變、鉸鏈區之改變、CH3界面不安定化改變之半分子抗體A、B，及除此以外尚對於抗體半分子A施加Y349T、T394F 取代、對於抗體半分子B施加S364H、F405A取代。製作、評價之抗體半分子之簡稱及名稱、CH3改變、及抗體半分子的序列編號，示於表7。
[表7]
[實施例8]抗體半分子的分子量之評價 製作之抗體半分子A、B的分子量之評價以粒徑篩析層析法實施。此時，作為完整抗體之對照(第5-1圖a之W之峰部)，使用國際公開第2009/125825號揭示之針對人類介白素6受體之抗體。H鏈可變區使用MRAH(序列編號：11)，H鏈恆定區使用天然型IgG1的序列(序列編號：12)。L鏈可變區使用MRAL(序列編號：13)，L鏈恆定區使用天然型κ鏈k0(序列編號：14)的序列。就抗體半分子狀態之對照(第5圖b的H之峰部)而言，H鏈可變區使用國際公開第2013/100120號記載之抗人類Epiregulin抗體的H鏈可變區部分EGLVH(序列編號：15)，H鏈恆定區部分使用有Lu等人之報告(Shan L, Colazet M, Rosenthal KL, Yu XQ, Bee JS, Ferguson A, Damschroder MM, Wu H, Dall'Acqua WF, Tsui P, Oganesyan V. (2016) Generation and Characterization of an IgG4 Monomeric Fc Platform. PLoS One. 2016 Aug 1;11(8))記載之具有改變之wtIgG4C4(序列編號：16)。L鏈可變區使用國際公開第2013/100120號記載之抗人類Epiregulin抗體的L鏈可變區部分EGLVL(序列編號：17)，L鏈恆定區使用天然型κ鏈k0的序列。又，測定依試驗例11記載之方法實施。又，此時的H鏈可變區各使用MRAH，針對L鏈皆使用MRAL-k0實施測定。 測定之結果，如第5圖所示，僅抗體半分子A1、A6的情形，可獲得抗體半分子(H峰部)與完整抗體(W峰部)之混合物(第5圖c、d)，僅抗體半分子A7、B1、B6、B7的情形，以抗體半分子(H峰部)的形式存在(第5圖e-h)。又，抗體半分子A1與B1(第5圖i)、A6與B6(第5圖j)、A7與B7(第5圖k)即使混合，完整抗體之形成(W峰部)分別相較於僅抗體半分子A1、A6、A7的情形或僅抗體半分子B1、B6、B7的情形，並無增加。
[實施例9]抗體半分子之ADCC活性之評價 依試驗例4記載之方法測定具該等恆定區之抗體半分子相較於現有之雙特異性抗體是否有優良的雙重陽性細胞選擇性毒殺活性。作為抗原表現細胞，使用使SK-Hep-1強制表現Glypican3之國際公開第2016/182064號記載之SK-pca60、強制表現Epiregulin之國際公開第2014/208482號記載之SKE-4B2。作為Glypican3、Epiregulin雙重陽性細胞，使用使SK-pca60強制表現Epiregulin之EREG_SK-pca60_#2。此時，針對抗體半分子A之系列，其H鏈可變區部分使用國際公開第2009/041062號記載之抗GPC3抗體GH0(序列編號：18)，其L鏈可變區部分使用國際公開第2009/041062號記載之抗GPC3抗體GL0(序列編號：19)，L鏈恆定區部分使用k0。針對抗體半分子B使用EGLVH，L鏈可變區使用EGLVL，L鏈恆定區使用k0。又，就現有之雙特異性抗體而言，使用GH0-Kn125P17/GL0-k0//EGLVH-Hl076N17/EGLVL-k0(GH0/EGLVH-BiAb)。雙特異性抗體之恆定區，以使異二聚體化時ADCC活性增強之方式，國際公開第2013/002362號記載之CH2，將L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、S298A置換到Kn125P17(序列編號：20)，D270E、K326D、A330M、K334E置換到Hl076N17(序列編號：21)。又，為了利用電荷的差異製作雙特異性抗體，將國際公開第2015/046467號記載之D356K、V397Y取代到Kn125P17，V397Y、K439E取代到Hl076N17。又，針對356-358位的序列，使用天然型IgG1的異EEM的序列。將依此方式製作之GH0-Kn125P17/GL0-k0、EGLVH-Hl076N17/EGLVL-k0，依利用恆定區之電荷差異之該技術領域中有通常知識者公知之方法(Proc. Natl. Acad. Sci., 110, 5145-5150, 2013)混合，製成目標之雙特異性抗體。 測定是將抗體半分子A1與B1、A6與B6、A7與B7混合並添加。測定結果示於第6圖。與A1 + B1的情形同樣，A6 + B6、A7 + B7的情形對於SK-pca60、SKE-4B2，ADCC活性較低，對於EREG_SK-pca60_#2顯示較強的ADCC活性。使用現有的雙特異性抗體時，對於SK-pca60、SKE-4B2、EREG_SK-pca60_#2的細胞皆顯示強ADCC活性。由以上可知，本次製作的抗體半分子A6、A7及B6、B7亦對於任一細胞皆比起現有的雙特異性抗體，有更優良的雙重陽性細胞選擇性毒殺活性。
[實施例10]抗體半分子間之交互作用之評價 使用Biacore(註冊商標)依試驗例5記載的方法測定此等抗體半分子A1與B1、A6與B6、A7與B7間之交互作用。此時被捕捉的抗體半分子的H鏈可變區部分使用國際公開第2009/041621號記載之抗人類IL6受體抗體的H鏈可變區部分PF1H(序列編號：22)，L鏈可變區部分使用國際公開第2009/041621號記載之抗人類IL6受體抗體的L鏈可變區部分PF1L(序列編號：23)，L鏈恆定區部分使用k0。又，作為分析物使用的抗體半分子的H鏈可變區，使用國際公開第2015/174439號記載之抗KLH抗體IC17H(序列編號：24)，針對L鏈可變區，使用國際公開第2015/174439號記載之抗KLH抗體IC17L(序列編號：25)，並使用為L鏈恆定區之k0。 其結果，如表8，當抗體半分子A6、A7約50RU被捕捉時，各抗體半分子B6、B7之莫耳結合比例成為0.18-0.63之範圍內，顯示發揮雙重陽性細胞選擇的ADCC活性。抗體半分子B之利用電泳緩衝液所為之稀釋，於實施例5稀釋成18.6-28.0倍，在本實施例稀釋成5.7-9.0倍。
[表8]
無。
第1-1圖顯示利用粒徑篩析層析法，確認抗體半分子是否形成二聚體化(完整抗體)的結果。W代表完整抗體之溶出位置，H代表抗體半分子之溶出位置，E代表推測處於完整抗體與抗體半分子之平衡狀態之分子狀態之溶出位置。 第1-2圖接續第1-1圖。 第1-3圖接續第1-2圖。 第2圖顯示利用ADCC報告子試驗，檢驗於表現2種抗原之細胞存在下(EREG_SK-pca60_#2)或表現1種抗原之細胞存在下(SK-pca60或SKE-4B2)，由於抗體半分子之組合所致之ADCC活性之結果。 第3圖顯示具有針對小鼠CD19之可變區之抗體半分子、或完整抗體在正常小鼠之血中濃度變化。 第4圖顯示以FACS定量已投予具有針對小鼠CD19之可變區之抗體半分子、或完整抗體之正常小鼠的血中的B細胞之比例之圖。 第5-1圖顯示利用粒徑篩析層析法，確認抗體半分子是否形成二聚體化(完整抗體)的結果。W代表完整抗體之溶出位置，H代表抗體半分子之溶出位置。 第5-2圖接續第5-1圖。 第6圖顯示利用ADCC報告子試驗，檢驗於表現2種抗原之細胞存在下(EREG_SK-pca60_#2)或表現1種抗原之細胞存在下(SK-pca60或SKE-4B2)，由於抗體半分子之組合所致之ADCC活性之結果。

Claims (15)

  1. 一種藥學組成物，含有第1抗原結合分子及第2抗原結合分子， 該第1抗原結合分子具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區、及含有第1 CH2與第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽；該第2抗原結合分子具有會結合於第2抗原之第2抗原結合區、及含有第2 CH2與第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽；其中 該第1抗原結合分子及該第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結，且於液中混合時，比起形成同型二聚體，更易形成異二聚體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之藥學組成物，其中， 當在表面電漿子共振使用每1 mm2 固定有50 pg之該第1抗原結合分子之感測晶片及含有2.5　mg/mL之該第2抗原結合分子之測定液、測定兩抗原結合分子之親和性時，該第2抗原結合分子對於該第1抗原結合分子之結合量，按莫耳比計，為1:0.1~1:0.9之範圍內。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之藥學組成物，其中，於表現該第1抗原及該第2抗原之細胞存在之條件下之該異二聚體之形成量，比起該細胞不存在之條件下多。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之藥學組成物，其中， 形成該異二聚體時，該異二聚體對於FcγR之結合活性，比起該第1抗原結合分子之單體或該第2抗原結合分子之單體對於FcγR之結合活性、或形成該同型二聚體時該同型二聚體對於FcγR之結合活性高。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之藥學組成物，其中， 該第1多肽含有該第1 CH3，該第2多肽含有該第2 CH3，該第1 CH3及該第2 CH3於液中混合時，作為相較於形成該同型二聚體更易形成該異二聚體之改變，具有以下之(i)至(iii)中之至少一種之改變: (i)該第1 CH3及該第2 CH3中之任一者具正電荷之區，另一者具負電荷之區，且該異二聚體形成時，該正電荷之區對該負電荷之區進行交互作用之改變； (ii)該第1 CH3及該第2 CH3中之任一者具凸部，另一者具凹部，該異二聚體形成時，該凸部嵌合於該凹部並進行交互作用之改變； (iii)該第1 CH3及該第2 CH3為經改變之IgG之CH3，該經改變之IgG之CH3的一部分被置換為IgA之CH3之一部分，該異二聚體形成時，已置換該第1 CH3之該IgA之CH3之一部分與已置換該第2 CH3之該IgA之CH3之一部分進行交互作用之改變。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之藥學組成物，其中， 該第1 CH3及該第2 CH3中之任一者或兩者，更具有按EU編號系統之357位、397位及409位之胺基酸殘基中之至少一者被置換為其他胺基酸殘基。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之藥學組成物，其中，該第1多肽及該第2多肽中之任一者或兩者更含有抗體半分子中之鉸鏈區部分。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之藥學組成物，其中， 該第1多肽及該第2多肽中之任一者或兩者中之該鉸鏈區部分，具有按EU編號系統之226位及229位中之任一者或兩者之半胱胺酸殘基改變為其他胺基酸殘基。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之藥學組成物，其中， 該第1多肽及該第2多肽各含有抗體半分子中之恆定區部分。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之藥學組成物，其中， 於存在表現該第1抗原及該第2抗原之細胞之條件下之效應子機能，比起存在不表現該第2抗原且表現該第1抗原之細胞或不表現該第1抗原且表現該第2抗原之細胞之條件下高。
  11. 一種藥學組成物，含有第1抗原結合分子及第2抗原結合分子，該第1抗原結合分子具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區、及含有第1 CH3之第1多肽；該第2抗原結合分子具有會結合於第2抗原之第2抗原結合區、及含有第2 CH3之第2多肽；其中 該第1抗原結合分子及該第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結， 該第1 CH3及該第2 CH3具有以下之(iv)至(vi)中之至少一種改變: (iv)該第1 CH3及該第2 CH3中之任一者具正電荷之區，另一者具負電荷之區，該異二聚體形成時，該正電荷之區對於該負電荷之區進行交互作用之改變； (v)該第1 CH3及該第2 CH3中之任一者具凸部，另一者具凹部，該異二聚體形成時，該凸部嵌合於該凹部並進行交互作用之改變； (vi) 該第1 CH3及該第2 CH3為經改變之IgG之CH3，該經改變之IgG之CH3的一部分被置換為IgA之CH3之一部分，該異二聚體形成時，已置換該第1 CH3之該IgA之CH3之一部分與已置換該第2 CH3之該IgA之CH3之一部分進行交互作用之改變。
  12. 一種第1抗原結合分子，具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區、及含有第1 CH2及第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽； 當與具會結合於第2抗原之第2抗原結合區及含有第2 CH2及第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽之第2抗原結合分子於液中混合時，比起形成該第1抗原結合分子間之同型二聚體，更易形成與該第2抗原結合分子之異二聚體，該異二聚體中，該第1抗原結合分子與該第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結。
  13. 一種第2抗原結合分子，具有會結合於第2抗原之第2抗原結合區、及含有第2 CH2及第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽； 當與具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區及含有第1 CH2及第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽之第1抗原結合分子在液中混合時，比起形成該第2抗原結合分子間之同型二聚體更易形成與該第1抗原結合分子之異二聚體， 該異二聚體中，該第1抗原結合分子與該第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結。
  14. 一種方法，係將第1抗原結合分子及第2抗原結合分子對於具表現第1抗原及第2抗原之病原細胞之對象同時投予或逐次投予，以治療該對象之該病原細胞引起的病症； 該第1抗原結合分子具有會和該第1抗原結合之第1抗原結合區及含有第1 CH2與第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽， 該第2抗原結合分子具有會結合於該第2抗原之第2抗原結合區、及含有第2 CH2與第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽； 該第1抗原結合分子及該第2抗原結合分子在投予前及投予後未以共價鍵鍵結，在該病原細胞之表面形成異二聚體而發揮效應子機能。
  15. 一種選擇第1抗原結合分子及第2抗原結合分子的組合的方法， 係從具有會和第1抗原結合之第1抗原結合區及含有第1 CH2與第1 CH3中之任一者或兩者之第1多肽之第1抗原結合分子之改變體群、以及具有會結合於第2抗原之第2抗原結合區、及含有第2 CH2與第2 CH3中之任一者或兩者之第2多肽之第2抗原結合分子之改變體群中，從下列(a)~(c)選擇第1抗原結合分子及第2抗原結合分子的組合: (a) 第1抗原結合分子與第2抗原結合分子未以共價鍵鍵結； (b) 第1抗原結合分子及第2抗原結合分子相較於形成第1抗原結合分子間或第2抗原結合分子間之同型二聚體，更易形成第1抗原結合分子及第2抗原結合分子之間之異二聚體； (c) 當於表面電漿子共振使用每1 mm2 固定有50 pg之第1抗原結合分子之感測晶片及含有2.5　mg/mL之第2抗原結合分子之測定液、測定兩抗原結合分子之親和性時，該第2抗原結合分子對於該第1抗原結合分子之結合量，按莫耳比為1:0.1~1:0.9之範圍內。
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