CN116547306A

CN116547306A - 抗cd28和/或抗b7h3组合物

Info

Publication number: CN116547306A
Application number: CN202180071090.1A
Authority: CN
Inventors: J·R·德斯加尔莱斯; G·莫尔; M·海德瓦特; J·迪亚兹; V·古斯提曾
Original assignee: Xencor Inc
Current assignee: Xencor Inc
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2021-08-19
Publication date: 2023-08-04

Abstract

本文提供了新的抗CD28x抗B7H3(也称为“aCD28x αB7H3”)异源二聚双特异性抗体以及使用此类抗体治疗癌症的方法。主题αCD28x αB7H3抗体能够激动性地结合T细胞上的CD28共刺激分子并靶向肿瘤细胞上的B7H3。因此，此类抗体选择性地增强肿瘤部位处的抗肿瘤活性，同时最小化外周毒性。当与其它抗癌疗法联合使用时，本文提供的主题抗体对于增强抗肿瘤活性特别有用。

Description

抗CD28和/或抗B7H3组合物

优先权

本申请要求2020年8月19日提交的美国临时专利申请第63/067,834号和2020年10月15日提交的美国临时专利申请第63/092,272号的权益，其全部内容通过引用结合于此。

序列表并入段落

本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式以电子方式提交，并且特此以全文引用的方式并入。在2021年8月19日创建的所述ASCII拷贝命名为067461-5272-WO_SL.txt，并且大小为1,130,417字节。

背景技术

针对肿瘤的天然免疫反应派遣免疫效应细胞(如自然杀伤(NK)细胞和T细胞)来攻击和破坏肿瘤细胞。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)通常表达多种免疫检查点受体(例如，PD-1、CTLA-4)和共刺激受体(例如，ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD28)。随着时间的推移，由于抑制性免疫检查点的上调，TIL失去其细胞毒性能力。虽然检查点阻断已经证明相对于其它治疗方案增加了临床反应率，但是许多患者仍然不能实现对检查点阻断的反应。TIL上的共刺激受体的接合可以提供能够克服免疫检查点的负信号的正信号。激动性共刺激受体抗体的临床前和临床研究确实证明了共刺激受体的激动作用可以产生令人印象深刻的抗肿瘤反应，从而活化T细胞以攻击肿瘤细胞。

通过特异性破坏肿瘤细胞同时最小化外周毒性来增强抗肿瘤活性对于癌症治疗也是重要的。在这种情形中，至关重要的是，只有存在靶肿瘤细胞的T细胞才被提供共刺激信号。然而，对于TIL、外周T细胞和导致自身免疫毒性的自身抗原反应性T细胞，单一特异性全长抗体对共刺激受体的激动作用可能是非歧视性的。例如，乌瑞芦单抗(urelumab)(一种单特异性、非歧视性的泛4-1BB激动剂抗体)在早期临床试验中表现出显著的肝毒性(Segal等人，2016)。因此，仍然需要用于治疗癌症的新型免疫反应增强组合物。

发明内容

本文提供了新的抗CD28组合物，包含抗CD28 x抗TAA(例如，αCD28 x αB7H3)抗体，以及使用此类抗体治疗癌症的方法。主题抗CD28 x抗TAA抗体能够激动性地结合T细胞上的CD28共刺激分子和肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原(例如，B7H3)。因此，此类抗体选择性地增强肿瘤部位处的抗肿瘤活性，同时最小化外周毒性。本文提供的主题抗体特别适用于与其它抗癌疗法组合，包括例如检查点抑制剂。本文还提供了新的αCD28和αB7H3结合结构域。

在第一方面，本文提供一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-接头-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1各自是第一可变重结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)共同轻链，所述共同轻链从N末端到C末端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，并且CL是恒定轻结构域，其中所述共同轻链分别与所述第一单体中的每个VH1-CH1和所述第二单体中的VH2-CH1配对，其中所述VH1和所述VL一起形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且所述VH2和所述VL一起形成第二ABD，其中所述第一ABD和所述第二ABD中的一个结合人CD28，并且所述第一ABD和所述第二ABD中的另一个结合人B7H3。

在一些实施方案中，所述第一ABD结合人CD28，并且所述第二结合人B7H3。在某些实施方案中，所述第一ABD结合人B7H3，并且所述第二结合人CD28。

在一些实施方案中，所述VH1结构域的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO：518、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ IDNO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ IDNO：517、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ IDNO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ IDNO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：546、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：550、SEQ IDNO：551、SEQ ID NO：552、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：554、SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：556、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：560、SEQ ID NO：561、SEQ IDNO：562、SEQ ID NO：563、SEQ ID NO：564、SEQ ID NO：565、SEQ ID NO：566、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：571、SEQ ID NO：572、SEQ IDNO：573、SEQ ID NO：574、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：581、SEQ ID NO：582、SEQ ID NO：583和SEQ IDNO：584；并且其中所述VL结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：874。

在一些实施方案中，所述VH2结构域的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO：585、SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ IDNO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ IDNO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ IDNO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650和SEQ ID NO：651。

在某些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。

在异源二聚抗体的一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下异源二聚化变体的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。在示例性实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

在一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。在一些实施方案中，所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，所述第一单体或所述第二单体中的一者进一步包含pI变体。在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且所述第一Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在示例性实施方案中，所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体428L/434S。

在一些实施方案中，所述第二单体包含SEQ ID NO：1019的氨基酸序列，所述第一单体包含SEQ ID NO：1020的氨基酸序列，并且所述轻链具有SEQ ID NO：1021的氨基酸序列。

另一方面，本文提供一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)共同轻链，所述共同轻链从N末端到C末端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，并且CL是恒定轻结构域，其中所述第一VH结构域和所述VL结构域一起形成第一ABD，并且所述第二VH结构域和所述VL结构域一起形成第二ABD，并且其中所述第一ABD和所述第二ABD中的一个结合人CD28，并且所述第一ABD和所述第二ABD中的另一个结合人B7H3。

在某些实施方案中，所述VH1结构域的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO：518、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ IDNO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ IDNO：517、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ IDNO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ IDNO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：546、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：550、SEQ IDNO：551、SEQ ID NO：552、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：554、SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：556、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：560、SEQ ID NO：561、SEQ IDNO：562、SEQ ID NO：563、SEQ ID NO：564、SEQ ID NO：565、SEQ ID NO：566、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：571、SEQ ID NO：572、SEQ IDNO：573、SEQ ID NO：574、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：581、SEQ ID NO：582、SEQ ID NO：583和SEQ IDNO：584；并且其中所述VL结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：874。

在一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下异源二聚化变体的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。在某些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

在一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。在某些实施方案中，所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在某些实施方案中，所述第一单体或所述第二单体中的一者进一步包含pI变体。在示例性实施方案中，所述第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，所述第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且所述第二Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体428L/434S。

在另一方面，本文提供一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-第一结构域接头-scFv-第二结构域接头-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重结构域，scFv是抗CD28scFv，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)轻链，所述轻链从N末端到C末端包含VL1-CL，其中VL1是可变轻结构域，并且CL是恒定轻结构域，其中所述VH1结构域和所述第一VL1结构域中的每一个一起形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二VL结构域(VL2)，并且所述VH2和所述VL2形成第二ABD，其中所述第一ABD和所述第二ABD中的一个结合人CD28，并且所述第一ABD和所述第二ABD中的另一个结合肿瘤靶抗原(TTA)。

在某些实施方案中，所述第一ABD结合人CD28，并且所述第二ABD结合TTA。在一些实施方案中，所述第一ABD结合TTA，并且所述第二ABD结合人CD28。

在一些实施方案中，所述scFv从N末端到C末端包含VL2-scFv接头-VH2。在一些实施方案中，所述scFv从N末端到C末端包含VH2-scFv接头-VL2。

在一些实施方案中，所述VH2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ IDNO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ IDNO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ IDNO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ IDNO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650和SEQ ID NO：651；并且其中所述VL2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：874、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：665、SEQID NO：666、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：673、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQID NO：677、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：684、SEQ ID NO：685、SEQ ID NO：686、SEQ ID NO：687、SEQID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQ ID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQID NO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQ ID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：740、SEQ ID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQID NO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQ ID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ ID NO：750、SEQ ID NO：751、SEQ ID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQID NO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ ID NO：756。

在某些实施方案中，TTA是人B7H3。

在一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。

在示例性实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下异源二聚化变体的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。在一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

在一些实施方案中，所述第一单体或所述第二单体中的一者进一步包含pI变体。在示例性实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

在示例性实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且所述第一Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在某些实施方案中，所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体428L/434S。

在一方面，本文提供一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含：i)scFv，所述scFv包含第一可变重结构域、scFv接头和第一可变轻结构域；和ii)第一Fc结构域，其中使用结构域接头将scFv共价附接至第一Fc结构域的N末端；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是第一可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)轻链，所述轻链从N末端到C末端包含VL1-CL，其中VL1是可变轻结构域，并且CL是恒定轻结构域，其中所述VH1和所述VL1一起形成第一ABD，并且其中所述scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二VL结构域(VL2)，其中所述VH2和所述VL2一起形成第二ABD，并且其中所述第一ABD和所述第二ABD中的一个结合CD28，并且所述第一ABD和所述第二ABD中的另一个结合TTA。

在一些实施方案中，所述scFv从N末端到C末端包含VL2-scFv接头-VH2。在某些实施方案中，所述scFv从N末端到C末端包含VH2-scFv接头-VL2。

在某些实施方案中，所述第二ABD结合人CD28，其中所述VH2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ IDNO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ IDNO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ IDNO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ IDNO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ IDNO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ IDNO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650和SEQ ID NO：651；并且其中所述VL2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：874、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO：666、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：673、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：684、SEQ ID NO：685、SEQ ID NO：686、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQ ID NO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：740、SEQ ID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ ID NO：750、SEQ ID NO：751、SEQ ID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQ ID NO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ ID NO：756。

在某些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下异源二聚化变体的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。在示例性实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

在某些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。在一些实施方案中，所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在某些实施方案中，所述第一单体或所述第二单体中的一者进一步包含pI变体。在示例性实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

在另一方面，本文提供一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-scFv，其中VH1是第一可变重结构域，scFv是抗CD28 scFv，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)轻链，所述轻链从N末端到C末端包含VL1-CL，其中VL1是可变轻结构域，并且CL是恒定轻结构域，其中所述VH1结构域和所述第一VL1结构域中的每一个一起形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二VL结构域(VL2)，并且所述VH2和所述VL2一起形成第二ABD，其中所述第一ABD和所述第二ABD中的一个结合人CD28，并且所述第一ABD和所述第二ABD中的另一个结合肿瘤靶抗原(TTA)。

在某些实施方案中，所述scFv从N末端到C末端包含VL2-scFv接头-VH2。在一些实施方案中，所述scFv从N末端到C末端包含VH2-scFv接头-VL2。

在某些实施方案中，所述VH2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ IDNO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ IDNO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ IDNO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ IDNO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650和SEQ ID NO：651；并且其中所述VL2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：874、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：665、SEQID NO：666、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ ID N0：673、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQID NO：677、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：684、SEQ ID NO：685、SEQ ID NO：686、SEQ ID NO：687、SEQID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQ ID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQID NO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQ ID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：740、SEQ ID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQID NO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQ ID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ ID NO：750、SEQ ID NO：751、SEQ ID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQID NO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ ID NO：756。

在一些实施方案中，所述TTA是人B7H3。

在一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。在一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下异源二聚化变体的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。在某些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

在另一方面，本文提供一种核酸组合物，所述核酸组合物分别包含：a)第一核酸，所述第一核酸编码本文所述的异源二聚抗体中的任一种的第一单体；b)第二核酸，所述第二核酸编码异源二聚抗体的第二单体；和c)第三核酸，所述第三核酸编码异源二聚抗体的轻链。本文还提供包含含有一种或多种第一核酸、第二核酸和第三核酸的表达载体的表达载体组合物；包含此类表达载体组合物的宿主细胞；以及制备本文所述的异源二聚抗体的方法。

在另一方面，本文提供一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用本文提供的异源二聚抗体。

在另一方面，本文提供一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用：a)本文所述的异源二聚抗体，其中TTA是人B7H3；和b)结合CD3和B7H3的双特异性抗体。

在另一方面，本文提供一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用：a)本文所述的异源二聚抗体，其中TTA是人B7H3；和b)选自由抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体组成的组的检查点抑制剂。

在另一方面，本文提供一种组合物，所述组合物包含抗CD28 ABD，所述抗CD28 ABD包含：a)可变重结构域，所述可变重结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ IDNO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ IDNO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ IDNO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQID NO：659、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671和SEQ ID NO：672；和b)可变轻结构域，所述可变轻结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：874、SEQ ID NO：652、SEQID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQID NO：664、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO：666、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：673、SEQ ID NO：674、SEQID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：684、SEQ ID NO：685、SEQID NO：686、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718、SEQID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQ ID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：729、SEQID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQ ID NO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQ ID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：740、SEQID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQ ID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ ID NO：750、SEQ ID NO：751、SEQID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQ ID NO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ IDNO：756。在一些实施方案中，所述组合物是抗体，所述抗体包含：a)包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链；和b)包含VL-CL的轻链。

在另一方面，本文提供一种组合物，所述组合物包含抗B7H3 ABD，所述B7H3 ABD包含：a)可变重结构域，所述可变重结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：518、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ IDNO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ IDNO：517、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ IDNO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ IDNO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：546、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：550、SEQ IDNO：551、SEQ ID NO：552、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：554、SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：556、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：560、SEQ ID NO：561、SEQ IDNO：562、SEQ ID NO：563、SEQ ID NO：564、SEQ ID NO：565、SEQ ID NO：566、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：571、SEQ ID NO：572、SEQ IDNO：573、SEQ ID NO：574、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：581、SEQ ID NO：582、SEQ ID NO：583和SEQ IDNO：584；和b)可变轻结构域，所述可变轻结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：874和SEQ ID NO：932。

在一方面，本文提供包含抗B7H3 ABD的组合物，所述抗B7H3 ABD包含：a)具有SEQID NO：946的氨基酸序列的可变重结构域；和b)具有SEQ ID NO：950的氨基酸序列的可变轻结构域。

在另一方面，本文提供包含抗B7H3 ABD的组合物，所述抗B7H3 ABD包含：a)具有SEQ ID NO：956的氨基酸序列的可变重结构域；和b)具有SEQ ID NO：960的氨基酸序列的可变轻结构域。

在一方面，本文提供一种包含抗B7H3 ABD的组合物，所述抗B7H3 ABD包含：a)具有SEQ ID NO：964的氨基酸序列的可变重结构域；和b)具有SEQ ID NO：968的氨基酸序列的可变轻结构域。

在另一方面，本文提供包含抗B7H3 ABD的组合物，所述抗B7H3 ABD包含：a)具有SEQ ID NO：972的氨基酸序列的可变重结构域；和b)具有SEQ ID NO：976的氨基酸序列的可变轻结构域。

在一些实施方案中，所述组合物是抗体，所述抗体包含：a)包含连接至-CH1-铰链-CH2-CH3的VH的重链；和b)包含连接至-CL的VL的轻链。

在另一方面，本文提供一种核酸组合物，所述核酸组合物分别包含：a)第一核酸，所述第一核酸编码本文所述的抗CD28 ABD或抗B7H3 ABD中的任一个的VH；和b)第二核酸，所述第二核酸编码抗CD28或抗B7H3 ABD的VL。本文还提供包含含有一种或多种第一核酸和第二核酸的表达载体的表达载体组合物；包含此类核酸组合物或表达载体组合物的宿主细胞；以及制备本文所述的抗CD28 ABD或抗B7H3 ABD组合物的方法。

在一方面，本文提供一种包含CD28抗原结合结构域(ABD)的组合物。CD28 ABD包含以下CD28结合结构域中的任一个的可变重互补决定区1-3(vhCDR1-3)和可变轻互补决定区(v1CDR1-3)：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1。

在一些实施方案中，CD28 ABD包含以下CD28结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1。在示例性实施方案中，CD28抗原结合结构域选自以下CD28抗原结合结构域：CD28结合结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1。

在另一方面，本文提供包含CD28抗原结合结构域(ABD)的抗CD28抗体。CD28抗原结合结构域包含以下CD28结合结构域中的任一个的可变重互补决定区1-3(vhCDR1-3)和可变轻互补决定区(vlCDR1-3)：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1。在一些实施方案中，CD28 ABD包含以下CD28结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1。在示例性实施方案中，CD28抗原结合结构域选自以下CD28抗原结合结构域：CD28结合结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1._L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_HIL1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1。

在一些实施方案中，所述抗CD28抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含第一抗原结合结构域和第一恒定结构域；以及b)第二单体，所述第二单体包含第二抗原结合结构域和第二恒定结构域，其中所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域中的任一个是CD28抗原结合结构域。

在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合不同的抗原。

在某些实施方案中，所述CD28抗原结合结构域是抗CD28单链片段(scFv)。在示例性实施方案中，所述scFv包含带电荷的scFv接头。

在一些实施方案中，所述第一恒定结构域和所述第二恒定结构域各自包含CH2-CH3。在示例性实施方案中，所述第一恒定结构域和所述第二恒定结构域各自是变体恒定结构域。在某些实施方案中，所述第一恒定结构域和所述第二恒定结构域包含选自由以下组成的组的一组异源二聚化变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V。在某些实施方案中，所述第一单体和所述第二单体各自还包含一种或多种消融变体。在示例性实施方案中，所述消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，所述第一单体或所述第二单体中的至少一种进一步包含一种或多种pI变体。在特定实施方案中，所述pI变体是N208D/Q295E/N3 84D/Q418E/N421D。

在另一方面，本文提供一种包含B7H3抗原结合结构域(ABD)的组合物。B7H3结合结构域包括以下B7H3结合结构域中的任一个的可变重互补决定区1-3(vhCDR1-3)和可变轻互补决定区(vlCDR1-3)：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗(omburtamab)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、BRCA84D、BRCA69D、PRCA 157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-IA、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在一些实施方案中，B7H3 ABD包括以下B7H3结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在示例性实施方案中，B7H3 ABD选自以下B7H3抗原结合结构域：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在又一方面，本文提供了包含B7H3抗原结合结构域的抗B7H3抗体，B7H3抗原结合结构域包含以下B7H3抗原结合结构域中的任一个的可变重互补决定区1-3(vhCDR1-3)和可变轻互补决定区(vlCDR1-3)：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在一些实施方案中，所述抗B7H3抗体包含B7H3抗原结合结构域。B7H3抗原结合结构域包括以下B7H3抗原结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-14、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。在示例性实施方案中，B7H3抗原结合结构域选自以下B7H3抗原结合结构域中的任一个：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在一些实施方案中，所述抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含第一抗原结合结构域和第一恒定结构域；以及b)第二单体，所述第二单体包含第二抗原结合结构域和第二恒定结构域，其中所述第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的任一个是B7H3抗原结合结构域。在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合不同的抗原。

在示例性实施方案中，所述第一抗原结合结构域是B7H3抗原结合结构域，并且所述第二抗原结合结构域是CD28结合结构域。在一些实施方案中，CD28结合结构域包括以下CD28结合结构域中的任一个的vhCDR1-3和vlCDR1-3：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1。在一些实施方案中，CD28结合结构域包括以下CD28结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1。在某些实施方案中，所述CD28结合结构域是抗CD28scFv。在示例性实施方案中，所述scFv包含带电荷的scFv接头。

在一些实施方案中，所述第一恒定结构域和所述第二恒定结构域各自包含CH2-CH3。在示例性实施方案中，所述第一恒定结构域和所述第二恒定结构域各自是变体恒定结构域。

在特定实施方案中，所述第一结构域和所述第二恒定结构域包含选自由以下的一组异源二聚化变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V。在某些实施方案中，所述第一单体和所述第二单体各自包含一种或多种消融变体。在某些实施方案中，所述消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，所述第一单体或所述第二单体中的至少一种进一步包含一种或多种pI变体。在特定实施方案中，所述pI变体是N208D/Q295E/N3 84D/Q418E/N421D。

在另一方面，本文提供抗CD28 x抗TAA 1+1Fab-scFv-Fc异源二聚抗体。在一个实施方案中，所述异源二聚抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包括：i)抗CD28 scFv，其包含第一可变重结构域、scFv接头和第一可变轻结构域；和ii)第一Fc结构域，其中使用结构域接头将scFv共价附接至第一Fc结构域的N末端；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)第三单体，所述第三单体包含第二可变轻结构域，其中所述第二可变重结构域和所述第二可变轻结构域形成肿瘤相关抗原(TAA)结合结构域。

在一些实施方案中，所述抗CD28 scFv包含以下CD28抗原结合结构域中的任一个的vhCDR1-3和vlCDR1-3：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1。

在某些实施方案中，所述抗CD28 scFv的第一可变重结构域和第一可变轻结构域分别是以下CD28抗原结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1。

在特定实施方案中，所述TAA结合结构域是B7H3结合结构域。在一些实施方案中，所述B7H3结合结构域包含以下B7H3抗原结合结构域中的任一个的vhCDR1-3和v1CDR1-3：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2F4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在示例性实施方案中，所述第二可变重结构域和所述第二可变轻结构域分别是以下B7H3抗原结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在示例性实施方案中，所述抗CD28 scFv从N末端到C末端取向为第一可变轻结构域-scFv接头-第一可变重结构域。在其它实施方案中，所述抗CD28 scFv从N末端到C末端取向为第一可变重结构域-scFv接头-第一可变轻结构域。在许多实施方案中，所述scFv接头是带电荷的scFv接头。

在某些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域是变体Fc结构域。在一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下组成的组的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。在示例性实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

在某些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。在示例性实施方案中，所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，所述第一单体或所述第二单体中的一者包含一种或多种pI变体。在示例性实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

在示例性实施方案中，所述第一Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且其中编号是根据EU编号进行的。

在某些实施方案中，所述scFv接头是具有氨基酸序列(GKPGS)₄的带电荷的scFv接头。

在特定实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自进一步包含氨基酸变体428/434S。

在一些实施方案中，抗CD28 x抗TAA 1+1Fab-scFv-Fc异源二聚抗体包含：a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含抗CD28 scFv-接头-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)第三单体，所述第三单体包含VL-CL；其中第一变体Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q，其中第二变体Fc结构域包含氨基酸变体L368D/K370S，其中第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中VH和VL形成肿瘤相关抗原(TAA)结合结构域，并且其中抗CD28 scFv包含以下CD28抗原结合结构域中的一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1，并且其中编号是根据EU编号进行的。

在某些实施方案中，所述TAA结合结构域是B7H3结合结构域。在一些实施方案中，VH和VL分别是以下B7H3抗原结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在示例性实施方案中，所述scFv包含具有氨基酸序列(GKPGS)₄的带电荷的scFv接头。在一些实施方案中，所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自进一步包含氨基酸变体428/434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在另一方面，本文提供了抗CD28 x抗TAA 2+1 Fab₂-scFv-Fc抗体，其包含：a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-接头1-抗CD28 scFv-接头2-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重结构域，接头1和接头2分别是第一结构域接头和第二结构域接头，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；和c)共同轻链，所述共同轻链包含可变轻结构域；其中第一可变重结构域和可变轻结构域形成第一肿瘤相关抗原(TAA)结合结构域，并且第二可变重结构域和可变轻结构域形成第二TAA结合结构域。

在示例性实施方案中，所述第一TAA结合结构域和所述第二TAA结合结构域各自是B7H3结合结构域。在示例性实施方案中，所述第一B7H3结合结构域和所述第二B7H3结合结构域各自包含以下B7H3抗原结合结构域中的任一个的vhCDR1-3和v1CDR1-3：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。在一些实施方案中，所述第一可变重结构域和所述第二可变重结构域各自包含B7H3结合结构域的可变重结构域，并且所述可变轻结构域包含B7H3结合结构域的可变轻结构域，其中所述B7H3结合结构域是以下B7H3抗原结合结构域中的任一个：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-14、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在抗CD28 x抗TAA 2+1Fab₂-scFv-Fc抗体的几个实施方案中，所述抗CD28scFv包含scFv可变重结构域、scFv可变轻结构域以及连接scFv可变重结构域和scFv可变轻结构域的scFv接头。在某些实施方案中，所述抗CD28 scFv包含以下CD28抗原结合结构域中的任一个的vhCDR1-3和vlCDR1-3：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1。在某些实施方案中，所述抗CD28 scFv的scFv可变重结构域和scFv可变轻结构域分别包含以下CD28抗原结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.1IA1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1。

在一些实施方案中，所述scFv可变重结构域使用所述第一结构域接头附接至所述第一单体的所述CH1的C末端，并且所述scFv可变轻结构域使用所述第二结构域接头共价附接至所述第一Fc结构域的N末端。在其它实施方案中，所述scFv可变轻结构域使用所述第一结构域接头附接至所述第一单体的所述CH1的C末端，并且所述scFv可变重结构域使用所述第二结构域接头共价附接至所述第一Fc结构域的N末端。在一些实施方案中，所述scFv接头是带电荷的scFv接头。

在某些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域是变体恒定结构域。所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域中包含选自以下异源二聚化偏斜变体的一组异源二聚化变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。在一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

在一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。在示例性实施方案中，所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，所述第一单体或所述第二单体中的一者包含一种或多种pI变体。在特定实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

在示例性实施方案中，所述第一单体的第一Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体N208D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/Q295E/L368D/K370S/N384D/Q418E/N421D，并且其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，所述抗CD28 scFv包含具有氨基酸序列(GKPGS)₄的带电荷的scFv接头。在某些实施方案中，所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自进一步包含氨基酸变体428/434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，抗CD28 x抗TAA 2+1Fab₂-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-接头1-抗CD28 scFv-接头2-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；和c)共同轻链，所述共同轻链包含VL-CL；其中所述第一变体Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q，其中所述第二变体Fc结构域包含氨基酸变体L368D/K370S，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中VH1和VL各自形成肿瘤相关抗原(TAA)结合结构域，其中所述抗CD28 scFv包含以下CD28抗原结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1，并且其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，VH1和VL形成B7H3结合结构域。在示例性实施方案中，VH1和VL是以下B7H3抗原结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在一些实施方案中，所述scFv包含具有氨基酸序列(GKPGS)₄的带电荷的scFv接头。在某些实施方案中，所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自进一步包含氨基酸变体428/434S。

在另一方面，本文提供抗CD28 x抗TAA 1+1CLC异源二聚抗体，其包含：a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重结构域，并且CH2-C3是第二Fc结构域；和c)共同轻链，所述共同轻链从N末端到C末端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，并且CL是恒定轻结构域，其中第一可变重结构域和可变轻结构域形成第一抗原结合结构域，并且第二可变重结构域和可变轻结构域形成第二抗原结合结构域。

在一些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。在某些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下异源二聚化变体的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。在示例性实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

在某些实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。在示例性实施方案中，所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，所述第一单体或所述第二单体中的一者进一步包含pI变体。在特定实施方案中，所述第一单体的CHI-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

在某些实施方案中，所述第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体428/434S。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域结合CD28，并且另一抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)。

在某些实施方案中，所述第二抗原结合结构域结合CD28和VH2，并且VL分别包含以下CD28结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1。

在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域结合TTA。在示例性实施方案中，TAA是B7H3。在示例性实施方案中，VH1和VL分别包含以下B7H3结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在示例性实施方案中，所述第一抗原结合结构域结合B7H3，并且所述第二抗原结合结构域结合CD28，VH1是可变重结构域2E4A3.189[B7H3]_H1.22，VH2是可变重结构域1A7[CD28]_H1.14，并且VL是可变轻结构域1A7[CD28]_L1。

在一方面，本文提供抗CD28 x抗TAA 2+1CLC异源二聚抗体，其包含：a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-接头-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1各自是第一可变重结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重结构域，并且CH2-C3是第二Fc结构域；和c)共同轻链，所述共同轻链从N末端到C末端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，并且CL是恒定轻结构域，其中第一可变重结构域和可变轻结构域各自形成第一抗原结合结构域，并且第二可变重结构域和可变轻结构域形成第二抗原结合结构域。

在几个实施方案中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。在示例性实施方案中，所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在特定实施方案中，所述第一单体或所述第二单体中的一者进一步包含pI变体。在示例性实施方案中，所述第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

在抗CD28 x抗TAA 2+1CLC异源二聚抗体的一些实施方案中，所述第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，所述第二Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且其中编号是根据EU编号进行的。

在某些实施方案中，所述第一抗原结合结构域结合CD28，并且所述第二抗原结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)。在示例性实施方案中，VH1和VL分别包含以下CD28结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1。

在一些实施方案中，TAA是B7H3。在示例性实施方案中，VH2和VL分别包含以下B7H3结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704。

在一些实施方案中，VH1是可变重结构域1A7[CD28]_H1.14，VH2是可变重结构域2E4A3.189[B7H3]_H1.22，并且VL是可变轻结构域1A7[CD28]_L1。

在另一方面，本文提供选自以下异源二聚抗体的异源二聚抗体：XENP34730、XENP34389、XENP34728、XENP34717和XENP34339。

本文还提供编码本文提供的组合物和抗体的核酸组合物、包含此类核酸的表达载体和包含表达载体的宿主细胞。

在另一方面，本文提供治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本文提供的抗体(例如，抗CD28 x抗TAA抗体)。在一些实施方案中，还向患者施用癌症治疗剂。在特定实施方案中，所述治疗剂是检查点抑制剂(例如，抗PD1抗体)或抗CD3 x抗TAA双特异性抗体。

附图说明

图1描绘了人、小鼠和食蟹猴CD28的序列。这种CD28可用于开发交叉反应性CD28抗原结合结构域，以易于临床开发。

图2A和B描绘了人、小鼠和食蟹猴B7H3的序列。这种B7H3可用于开发交叉反应性B7H3抗原结合结构域，以易于临床开发。

图3A-3F描绘了异源二聚化变体组的有用对(包含偏斜变体和pI变体)。在图3F中，存在并无对应“单体2”变体的变体。此类变体是可以单独用于αB7H3 x αCD28 bsAb的任一单体上或例如包含在利用scFv作为组分的格式的非scFv侧上的pI变体，并且合适的带电荷的scFv接头可以用在将scFv用作CD28结合结构域的第二单体上。适合的带电荷的接头展示于图6中。

图4描绘了同配变体抗体恒定区和其相应取代的列表。pI_(-)指示较低pI变体，而pI_(+)指示较高pI变体。这些变体可以任选地并且独立地与本文概述的其它变体(包含异源二聚化变体)组合。

图5描绘了消融FcγR结合的有用消融变体(也称为“敲除”或“KO”变体)。在一些实施方案中，此类消融变体包含在本文描述的主题抗体的两个单体的Fc结构域中。在其它实施方案中，所述消融变体仅包含在仅一个变体Fc结构域上。

图6描绘了用于增大或减小利用一个或多个scFv作为组分的主题异源二聚αB7H3x αCD28 bsAb的pI的如本文所述的多个带电荷的scFv接头。(+H)阳性接头在本文中特别适用，尤其是与本文所示的抗CD28 V_L和V_H序列一起使用。根据Whitlow等人，《蛋白质工程(Protein Engineering)》6(8)：989-995(1993)，具有单个电荷的单个现有技术scFv接头被称为“Whitlow”。应注意的是，这种接头用于减少scFv中的聚集和增强scFv中的蛋白水解稳定性。此类带电荷的scFv接头可以用于本文公开的主题抗体格式中的任一种中，所述主题抗体格式包含scFv(例如，1+1Fab-scFv-Fc格式和2+1Fab₂-scFv-Fc格式)。

图7描绘了许多示例性结构域接头。在一些实施方案中，这些接头用于将单链Fv连接至Fc链。在一些实施方案中，这些接头可以任何取向组合。例如，GGGGS接头可以在N末端或C末端处与“下半铰链”接头结合。在一些实施方案中，图7中描绘的两个或多个结构域接头可以组合形成更长的结构域接头，用于本文所述的异源二聚抗体。

图8显示了本发明的αB7H3 x αCD28 bsAb的异源二聚Fc结构域(即本实施方案中的CH2-CH3)的特别有用的实施方案。

图9描绘了可以与本文所述的异源二聚抗体一起使用的各种异源二聚偏斜变体氨基酸取代。

图10A-10C显示了基于人IgG1的几种有用的异源二聚αB7-H3 x αCD28 bsAb主链的序列，没有细胞因子序列。异源二聚Fc主链1基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、处于第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体，以及处于两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。异源二聚Fc主链2基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、处于第二异源二聚Fc链上的S364K偏斜变体，以及处于两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。异源二聚Fc主链3基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的L368E/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、处于第二异源二聚Fc链上的S364K偏斜变体，以及处于两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。异源二聚Fc主链4基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的K360E/Q362E/T411E偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、处于第二异源二聚Fc链上的D401K偏斜变体，以及处于两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。异源二聚Fc主链5基于人IgG1(356D/358L同种异型)，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、处于第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体，以及处于两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。异源二聚Fc主链6基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、处于第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体，以及处于两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体和去除糖基化的N297A变体。异源二聚Fc主链7基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、处于第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体，以及处于两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体和去除糖基化的N297S变体。异源二聚Fc主链8基于人IgG4，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、处于第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体，以及处于两条链上的消融了Fab臂交换(如本领域所已知)的S228P(根据EU编号，在Kabat中为S241P)变体。异源二聚Fc主链9基于人IgG2，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、处于第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体。异源二聚Fc主链10基于人IgG2，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、处于第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体，以及处于两条链上的S267K消融变体。异源二聚Fc主链11基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、处于第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体，以及处于两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体和M428L/N434S Xtend变体。异源二聚Fc主链12基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括处于第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体、处于第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体和P217R/P229R/N276K pI变体，以及处于两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。

在这些主链的每一条主链内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与附图的“亲本”相比，如本领域技术人员将理解，与亲本人IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比，已经含有多个氨基酸修饰)。也就是说，除了此图的主链中所含的偏斜变体、pI变体和消融变体之外或作为其替代方案，所列举的骨架可含有另外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。此外，本文描绘的主链可以包括C末端甘氨酸(K446_)和/或赖氨酸(K447_)的缺失。C末端甘氨酸和/或赖氨酸的缺失可以被有意地工程化以减少异质性或在某些双特异性格式(例如mAb-scFv格式)的情形中。此外，C末端甘氨酸和/或赖氨酸缺失可以天然发生，例如在生产和储存期间。

图11描绘了以2+1mAb-scFv格式使用的异源二聚B7H3 x CD28 bsAb主链的示例性序列。此处描绘的格式基于图X中描绘的异源二聚Fc主链1，除了进一步包括单体1(-)上的G446_和单体2(+)上的G446_/K447_。应注意，图X中描绘的任何额外主链可以适用于2+1mAb-scFv格式，在一条或两条链上包括或不包括K447_。应注意，这些序列可以进一步包括M428L/N434S变体。

图12描绘了在利用Fab a结合结构域的αB7H3 x αCD28 bsAb的实施方案中使用的“CH1+铰链”的序列。“CH1+铰链”序列用于将可变重结构域(V_H)连接至Fc主链(如图39中所描绘)。对于Fab在(+)侧上的特定实施方案，可使用“CH1(+)+铰链”序列。对于Fab在(-)侧上的特定实施方案，可使用“CH1(-)+铰链”序列。

图13描绘了在呈2+1Fab₂-scFv-Fc格式或2+1CLC格式的αB7H3 x αCD28 bsAb的实施方案中使用的“CH1+半铰链”结构域接头的序列。在2+1Fab₂-scFv-Fc格式中，“CH1+半铰链”序列用于将可变重结构域(V_H)连接至双特异性抗体的Fab-scFv-Fc侧上的scFv结构域。在2+1CLC格式中，“CH1+半铰链”序列用于将第一可变重结构域(V_H)连接至双特异性抗体的Fab-Fab-Fc侧上的第二V_H结构域。应注意，可以使用其它接头代替“CH1+半铰链”。还应注意，尽管此处的序列是基于IgG1序列，但可基于IgG2或IgG4序列构建等同物。

图14描绘了在αB7H3 x αCD28 bsAb的实施方案中使用的“CH1”的序列。

图15描绘了在αB7H3 x αCD28 bsAb的实施方案中使用的“铰链”的序列。

图16描绘了在利用Fab结合结构域的主题αB7H3 x αCD28 bsAb中使用的同源轻链的恒定结构域。

图17描绘了XENP16432的序列，XENP16432为基于纳武单抗(nivolumab)和具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的IgG1主链的抗PD-1mAb。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。

图18描绘了1A7的可变重链序列和可变轻链序列，1A7是示例性的噬菌体衍生的CD28结合结构域，以及XENP28428的序列，XENP28428是基于1A7和具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的IgG1主链的抗CD28 mAb。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的V_H和V_L结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些V_H和V_L序列可以以scFv格式或Fab格式使用。

图19描绘了示例性亲和力优化的1A7 VH变体的序列。应注意，本文描绘的VH可以与本文描绘的任何其它可变轻结构域配对。

图20描绘了示例性亲和力优化的1A7衍生的可变轻结构域的序列。应注意，此VL可以与本文描绘的任何其它可变重结构域配对。

图21A和21B描绘了示例性亲和力优化的1A7 VH/VH对的序列。应注意，这些对可以被格式化为fab或scFv。

图22描绘了在A)scFv(在1+1Fab-scFv-Fc bsAb格式的情形中)和B)Fab(在2+1CLCbsAb格式的情形中)的示例性亲和力工程化1A7 VH/VL和及其结合亲和力。

图23描绘了XENP27181的序列，XENP27181是基于HuTN228结合结构域和具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的IgG1主链的二价抗CD28 mAb；和XENP27656的序列，XENP27656是基于HuTN228结合结构域(格式化为scFv)和具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的IgG1主链的单价抗CD28 mAb。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的V_H和V_L结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些V_a和V_L序列可以以scFv格式或Fab格式使用。

图24描绘了通过Octet测定的人CD28的各种CD28结合噬菌体克隆(格式化为二价mAb)的K_Dapp(K_D表观，由于二价结合)。前60秒的解离用于数据拟合。

图25描绘了基于噬菌体衍生的克隆的示例性二价抗CD28 mAb在人PBMC上的结合。数据显示噬菌体活动产生的CD28结合结构域具有比现有技术HuTN228更弱的最大结合(这与实施例1A中描述的人源化CD28结合结构域相关)。

图26描绘了2E4A3.189的可变重链序列和可变轻链序列，2E4A3.189是示例性噬菌体衍生的B7H3结合结构域，以及XENP32637的序列，XENP32637是基于2E4A3.189和具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的IgG1主链的抗B7H3 mAb。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的V_H和V_L结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些V_H和V_L序列可以以scFv格式或Fab格式使用。

图27描绘了亲和力优化可变重2E4A3.189_H1.22的序列。应注意，此VH可以与本文描绘的任何其它可变轻结构域(VL)配对。

图28描绘了人源化6A1的可变重链序列和可变轻链序列，人源化6A1是示例性大鼠杂交瘤衍生的B7H3结合结构域，以及XENP33383的序列，XENP33383是基于6A1和具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的IgG1主链的抗B7H3 mAb。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的V_H和V_L结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些V_H和V_L序列可以以scFv格式或Fab格式使用。

图29描绘了人源化3C4的可变重链序列和可变轻链序列，人源化3C4是示例性大鼠杂交瘤衍生的B7H3结合结构域。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的V_H和V_L结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些V_H和V_L序列可以以scFv格式或Fab格式使用。

图30描绘了人源化4F12的可变重链序列和可变轻链序列，人源化4F12是示例性兔杂交瘤衍生的B7H3结合结构域。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的V_H和V_L结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些V_H和V_L序列可以以scFv格式或Fab格式使用。

图31描绘了人源化38E2的可变重链序列和可变轻链序列，人源化38E2是示例性兔杂交瘤衍生的B7H3结合结构域。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的V_H和V_L结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些V_H和V_L序列可以以scFv格式或Fab格式使用。

图32描绘了在1+1双特异性格式的情形中，各种B7H3结合结构域的单价结合亲和力(K_D)。应注意，2E4A3_H1.22_1A7_L1和2E4A3_H1.3_1A7_L1利用抗CD28克隆1A7的VL。

图33A-33E描绘了本发明的示例性格式。图33A描绘了具有结合第一抗原的第一Fab臂和结合第二抗原的第二scFv臂的“1+1Fab-scFv-Fc”格式。1+1Fab-scFv-Fc格式包含：第一单体，所述第一单体包含(任选地通过接头)共价附接至第一异源二聚Fc主链的N末端的第一重链可变区(VH1)；第二单体，所述第二单体包含(任选地通过接头)共价附接至第二相应异源二聚Fc主链的N末端的单链Fv；和第三单体，所述第三单体包含共价附接至轻链恒定结构域的轻链可变区，其中轻链可变区与VH1互补。图33B描绘了具有第一Fab臂和第二Fab-scFv臂的“2+1Fab₂-scFv-Fc”格式，其中Fab结合第一抗原，并且scFv结合第二抗原。2+1Fab₂-scFv-Fc格式包含：第一单体，所述第一单体包含(任选地通过接头)共价附接至第一异源二聚Fc主链的N末端的第一重链可变区(VH1)；第二单体，所述第二单体包含(任选地通过接头)共价附接至(任选地通过接头)共价附接至第二相应异源二聚Fc主链的N末端的单链Fv的VH1；以及第三单体，所述第三单体包含共价附接至轻链恒定结构域的轻链可变区，其中轻链可变区与VH1互补。图33C描绘了具有包含结合第一抗原的第一Fab臂的第一Fc和包含结合第二抗原的第二Fab臂的第二Fc的“1+1共同轻链”或“1+1CLC”格式。1+1CLC格式包括含有VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的第一单体、含有VH2-CH1-铰链-CH2-CH3的第二单体和含有VL-CL的第三单体。VL与VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性的结合结构域；VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的结合结构域。图33D描绘了具有包含2个各自结合第一抗原的Fab臂的第一Fc和包含1个结合第二抗原的Fab臂的第二Fc的“2+1共同轻链”或“2+1CLC”格式。2+1CLC格式包括含有VH1-CH1-铰链-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的第一单体、含有VH2-CH1-铰链-CH2-CH3的第二单体和含有VL-CL的第三单体。VL与第一VH1和第二VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性的结合结构域；VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的结合结构域。图33E描绘了具有包含结合第一抗原的N末端Fab臂的第一Fc和包含结合第一抗原的N末端Fab臂和结合第二抗原的C末端scFv的第二Fc的“2+1mAb-scFv”格式。2+1mAb-scFv格式包括含有VH1-CHI-铰链-CH2-CH3的第一单体、含有VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-scFv的第二单体和含有VL-CL的第三单体。VL与第一VH1和第二VH1配对以形成对第一抗原具有结合特异性的结合结构域。

图34A-34E描绘了用于CD28双特异性抗体的本发明的示例性格式。图34A描绘了具有结合肿瘤相关抗原的第一Fab臂和结合CD28的第二scFv臂的“1+1Fab-scFv-Fc”格式。1+1Fab-scFv-Fc格式包含：第一单体，所述第一单体包含(任选地通过接头)共价附接至第一异源二聚Fc主链的N末端的第一重链可变区(VH1)；第二单体，所述第二单体包含(任选地通过接头)共价附接至第二相应异源二聚Fc主链的N末端的单链Fv；和第三单体，所述第三单体包含共价附接至轻链恒定结构域的轻链可变区，其中轻链可变区与VH1互补。图34B描绘了具有第一Fab臂和第二Fab-scFv臂的“2+1Fab₂-scFv-Fc”格式，其中Fab结合肿瘤相关抗原，并且scFv结合CD28。2+1Fab₂-scFv-Fc格式包含：第一单体，所述第一单体包含(任选地通过接头)共价附接至第一异源二聚Fc主链的N末端的第一重链可变区(VH1)；第二单体，所述第二单体包含(任选地通过接头)共价附接至(任选地通过接头)共价附接至第二相应异源二聚Fc主链的N末端的单链Fv的VH1；以及第三单体，所述第三单体包含共价附接至轻链恒定结构域的轻链可变区，其中轻链可变区与VH1互补。图34C描绘了具有包含结合肿瘤相关抗原的第一Fab臂的第一Fc和包含结合CD28的第二Fab臂的第二Fc的“1+1共同轻链”或“1+1CLC”格式。1+1CLC格式包括含有VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的第一单体、含有VH2-CH1-铰链-CH2-CH3的第二单体和含有VL-CL的第三单体。VL与VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性的结合结构域；VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的结合结构域。图34D描绘了具有包含2个各自结合肿瘤相关抗原的Fab臂的第一Fc和包含1个结合CD28的Fab臂的第二Fc的“2+1共同轻链”或“2+1CLC”格式。2+1CLC格式包括含有VH1-CH1-铰链-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的第一单体、含有VH2-CH1-铰链-CH2-CH3的第二单体和含有VL-CL的第三单体。VL与第一VH1和第二VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性的结合结构域；VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的结合结构域。图34E描绘了具有包含结合肿瘤相关抗原的N末端Fab臂的第一Fc和包含结合肿瘤相关抗原的N末端Fab臂和结合CD28的C末端scFv的第二Fc的“2+1mAb-scFv”格式。2+1mAb-scFv格式包括含有VH1-CHI-铰链-CH2-CH3的第一单体、含有VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-scFv的第二单体和含有VL-CL的第三单体。VL与第一VH1和第二VH1配对以形成对肿瘤相关抗原具有结合特异性的结合结构域。

图35A和35B描绘了呈1+1Fab-scFv-Fc格式的示例性αB7H3 x αCD28 bsAb的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区、接头、Fc区和恒定结构域之间的边界。应注意，αB7H3x αCD28 bsAb可以利用90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的可变区、Fc区和恒定结构域序列。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。

图36A-36C描绘了呈2+1Fab₂-scFv-Fc格式的示例性αB7H3 x αCD28 bsAb的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区、接头、Fc区和恒定结构域之间的边界。scFv结构域具有V_H-scFv接头-V_L的取向(N末端到C末端)，但是这可以颠倒。应注意，scFv结构域序列包括作为可变重区和可变轻区之间的scFv接头的序列GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS(SEQ ID NO：796)；然而，此接头可以用图6中的任何scFv接头来替换。还应注意，链2序列包括作为scFv的C末端和CH2结构域的N末端之间的结构域接头的序列GGGGSGGGGSKTHTCPPCP(SEQ ID NO：818)，其是“柔性半铰链”结构域接头；然而，此接头可以用图7的任何“有用的结构域接头”来替换。应注意，αB7H3 x aCD28 bsAb可以利用90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的可变区、Fc区和恒定结构域序列。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。

图37描绘了呈1+1CLC格式的示例性αB7H3 x αCD28 bsAb的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区、接头、Fc区和恒定结构域之间的边界。应注意，αB7H3 x αCD28 bsAb可以利用90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的可变区、Fc区和恒定结构域序列。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。

图38A-38E描绘了呈2+1CLC格式的示例性aB7H3 x αCD28 bsAb的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区、接头、Fc区和恒定结构域之间的边界。scFv结构域具有V_H-scFv接头-V_L的取向(N末端到C末端)，但是这可以颠倒。应注意，链2序列包括作为结构域接头(加双下划线)的序列EPKSCGKPGSGKPGS(SEQ ID NO：1182)；然而，此接头可以用任何结构域接头来替换，包括图6的任何“有用的结构域接头”。应注意，αB7H3 x αCD28 bsAb可以利用90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的可变区、Fc区和恒定结构域序列。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。

图39A-39C描绘了呈2+1mAb-scFv格式的示例性αB7H3 x αCD28 bsAb的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区、接头、Fc区和恒定结构域之间的边界。scFv结构域具有V_H-scFv接头-V_L的取向(N末端到C末端)，但是这可以颠倒。应注意，链2序列包括作为结构域接头的序列GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS(SEQ ID NO：796)；然而，此接头可以用任何结构域接头替换，包括图6的任何“有用的结构域接头”。应注意，αB7H3 x αCD28 bsAb可以利用90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的可变区、Fc区和恒定结构域序列。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。

图40A和40B描绘了A)经典T细胞/APC相互作用和B)通过将CD3双特异性抗体与CD28双特异性抗体组合来复制经典T细胞/APC相互作用。在经典T细胞/APC相互作用中，存在由TCR与肽-MHC的反应性提供的第一信号(信号1)和由在APC上表达的CD80/CD86的CD28交联提供的第二信号(信号2)，其一起完全活化T细胞。相反，在使用CD3双特异性的治疗中，仅提供了第一信号。CD28信号可以由CD28双特异性提供，其想法是通过CD28共刺激来促进活化和增殖。

图41描绘了通过CD28双特异性抗体引入CD28信号传导，以及通过检查点阻断(例如PD-1阻断)减轻任何检查点介导的对所添加的CD28信号的抑制。

图42描绘了在存在用抗CD3 scFv(1∶1效应子∶靶比率)和B7H3 x CD3 bsAbXENP34339、XENP35612、XENP35611和XENP34336(分别具有77nM、270nM、610nM和440nM的CD28结合亲和力)转染的MCF7癌细胞的情况下，效应细胞对IL-2释放的诱导。数据显示，降低CD28结合亲和力降低了B7H3 x CD28双特异性抗体的效力。

图43A-44C描绘了在存在A)MDA-MB-231、B)LnCAP和C)DU145靶细胞(1∶1 E∶T比率)和恒定剂量的示例性B7H3 x CD3 bsAb的情况下，B7H3 x CD28 bsAb对来自T细胞的IL-2分泌的诱导。

图44描绘了抗CD28克隆1A7可变重结构域和可变轻结构域变体的共有框架区(FR)和互补决定区(CDR)(如在Kabat中)。

图45A-45D描绘了在食蟹猴研究中呈各种抗体格式的B7H3xCD28 bsAb的药代动力学。数据显示，在所研究的每个剂量水平下，2+1共同轻链格式具有最佳的半衰期和药代动力学。

图46A-46H描绘了被给予A)XENP34398、B)XENP37808、C)XENP37810、D)XENP34732、E)XENP35151、F)XENP351535、G)XENP37807和H)XENP37982的食蟹猴的血清浓度水平随时间的变化。相对剂量描绘如下：圆圈代表0.5X剂量；倒置三角形表示1.3X剂量；六边形表示1.8X剂量；正方形表示2X剂量；菱形表示3.25X剂量；星形表示4.5X剂量；并且三角形表示5X剂量。

图47总结了B7H3 x CD28 bsAb XENP34398、XENP37808、XENP34732和XENP35153的特性。应注意，此汇总表中描绘的数据中的一些可能与工作实施例中其它地方描绘的实验数据不同，因为那些数据中的一些说明了开发早期阶段的实验数据。

图48A和48B描绘了在将A)A549癌细胞和B)SKOV-3癌细胞与CD3⁺T细胞(10∶1效应子∶靶比率)与指定浓度的B7H3 x CD28双特异性抗体XENP34339或XENP34717一起孵育后的IFNγ释放。数据显示XENP34339和XENP34717均诱导T细胞释放细胞因子。具有二价B7H3结合的XENP34339比具有单价B7H3结合的XENP34717更有效地诱导细胞因子释放。

图49描绘了通过XENP34339在混合淋巴细胞反应中(在与1μg/mL CTLA-4-Fc一起孵育后)CD28信号传导的恢复。误差条代表以一式四份技术测试的一个MLR反应的培养上清液中的平均表达。

图50A和50B描绘了将负载NLV的MDA-MB-231癌细胞与从A)第一供体和B)第二供体纯化的CD3⁺T细胞以10∶1效应子∶靶比率以及所指示的XENP16432、XENP34339和XENP34389组合一起孵育后的IFNγ释放。数据显示，与单独XENP34339一起孵育诱导T细胞释放细胞因子，并且与PD-1阻断协同组合以增强细胞因子释放。

图51描绘了在将负载NLV的MCF7癌细胞与以10∶1的效应子∶靶比率纯化的纯化的CD3⁺T细胞以及所指示的XENP16432和XENP34339组合一起孵育后，NLV四聚体阳性细胞的扩增。数据显示XENP34339与PD-1阻断的组合增强了NLV四聚体阳性CD8⁺T细胞的扩增。

图52描绘了完整B7H3胞外V1C1-V2V2结构域或单个V1C1或V2C2结构域的抗B7H3克隆2E4A3.189和克隆6A1的解离常数(K_D；和相应的传感图)。

图53描绘了抗CD28克隆1A7亲和力变体H1.14_L1作为CD28抗原的呈2+1CLC格式的Fab或呈2+1Fab₂-scFv-Fc格式的scFv的解离常数(K_D；和相应的传感图)。

图54A和54B描绘了为2+1Fab₂-scFv-Fc格式并且包含H1.30_L1.47抗CD3 scFv(又称为CD3高[VHVL])的示例性αPSMA x αCD3 bsAb的序列。CDR加有下划线，并且斜线指示可变区与其它链组分(例如恒定区和结构域接头)之间的边界。应注意，αPSMA x αCD3 bsAb可以利用90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义)和/或包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代的可变区、Fc区和恒定结构域序列。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。

图55描绘了在将LNCaP癌细胞(PSMA⁺B7H3⁺)与CD3⁺T细胞以1∶1效应子∶靶比率以及单独的示例性CD3双特异性(αPSMA x αCD3 XENP31602)或与所指示浓度的XENPXENP34339组合一起孵育后，细胞杀伤随时间的变化。数据显示，与单独孵育癌症和T细胞相比，单独的XENP31602 αPSMA x αCD3最小程度地增强了细胞杀伤。添加XENP34339 αB7H3 x αCD28克服了癌细胞对CD3双特异性的抗性。

图56A-56I描绘了适用于可与本发明的CD28双特异性抗体组合的CD3双特异性抗体的示例性抗CD3结合结构域的序列。CDR加下划线，scFv接头加双下划线(在序列中，scFv接头是带正电荷的scFv(GKPGS)₄接头(SEQ ID NO：796)，但是如本领域的技术人员将理解的，这个接头可以被其它接头替换，包含不带电荷的接头或带负电荷的接头，其中一些描绘在图6中)，并且斜线指示可变结构域的一个或多个边界。另外，命名约定展示了scFv从N末端到C末端的取向。如本文中所指出并且对本文中含有CDR的每一序列而言确实如此，如表2中所示，取决于所使用的编号，CDR位置的精确标识可能略微不同，并且因此本文中不仅包括带下划线的CDR并且还包括使用其它编号系统的V_H和V_L结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些V_H和V_L序列可以以scFv格式或Fab格式使用。

图57A-57C描绘了在将LNCaP癌细胞(PSMA⁺B7H3⁺)与CD3⁺T细胞以1∶1效应子∶靶比率以及1μg/ml XENP34339与剂量渐增的示例性CD3双特异性(αPSMA x αCD3 XENP31602)组合一起孵育后，A)IFNγ释放，B)IL-2释放，和C)CD3⁺T细胞扩增。

图58A-58C描绘了在将22Rv1癌细胞(PSMA⁺B7H3⁺)与CD3⁺T细胞以1：1效应子：靶比率以及1μg/ml XENP34339与剂量渐增的示例性CD3双特异性(αPSMA x αCD3 XENP31602)组合一起孵育后，A)IFNγ释放，B)IL-2释放，和C)CD3⁺T细胞扩增。

图59A-59C描绘了在将SKOV-3癌细胞(PSMA^-B7H3⁺)与CD3⁺T细胞以1∶1效应子∶靶比率以及1μg/ml XENP34339与剂量渐增的示例性CD3双特异性(αPSMA x αCD3 XENP31602)组合一起孵育后，A)IFNγ释放，B)IL-2释放，和C)CD3⁺T细胞扩增。

图60A-60C描绘了在将OVCAR-8癌细胞(PSMA^-B7H3⁺)与CD3⁺T细胞以1∶1效应子∶靶比率以及1μg/ml XENP34339与剂量渐增的示例性CD3双特异性(αPSMA x aCD3 XENP31602)组合一起孵育后，A)IFNγ释放，B)IL-2释放，和C)CD3⁺T细胞扩增。

图61A-61E描绘了在被给予A)单独的第一示例性B7H3 x CD3双特异性抗体(CD3bsAb1)(0.5mg/kg)、B)单独的第二示例性B7H3 x CD3双特异性抗体(CD3bsAb2)(0.5mg/kg)、C)XENP34339(5.0mg/kg)与CD3bsAb1(0.5mg/kg)的组合、D)XENP34339(5.0mg/kg)与CD3bsAb2(0.5mg/kg)的组合或E)PBS的pp65-MDA-MB-231和huPBMC移植的NSG小鼠中，单个小鼠的肿瘤体积(由卡尺测量确定；基线已校正)随时间(以天计)的变化。F)描绘

图62描绘了在被给予单独的第一示例性B7H3 x CD3双特异性抗体(CD3bsAb1)(0.5mg/kg)、单独的第二示例性B7H3 x CD3双特异性抗体(CD3bsAb2)(0.5mg/kg)、XENP34339(5.0mg/kg)与CD3bsAb1(0.5mg/kg)的组合、XENP34339(5.0mg/kg)与CD3bsAb2(0.5mg/kg)的组合或PBS对照的pp65-MDA-MB-231和huPBMC移植的NSG小鼠中，肿瘤体积(由卡尺测量确定；基线已校正)随时间(以天计)的组中值变化。

图63描绘了在第一次剂量后第14天在被给予单独的第一示例性B7H3 x CD3双特异性抗体(CD3bsAb1)(0.5mg/kg)、单独的第二示例性B7H3 x CD3双特异性抗体(CD3bsAb2)(0.5mg/kg)、XENP34339(5.0mg/kg)与CD3bsAb1(0.5mg/kg)的组合、XENP34339(5.0mg/kg)与CD3bsAb2(0.5mg/kg)的组合或PBS对照的pp65-MDA-MB-231和huPBMC移植的NSG小鼠的血液中的CD45+细胞计数。

图64A-64E描绘了在被给予低浓度剂量或高浓度剂量的单独的示例性PSMA x CD3bsAb XENP32220或与XENP34339组合的22RV1和huPBMC移植的NSG-DKO小鼠的血液(如计数所指示)中的A)CD45+、B)CD4+(全部)、C)CD8+(全部)、D)CD4+(Ki67+)和E)CD8+(Ki67+)细胞的扩增。与用单独的CD3 bsAb处理相比，用CD3和CD28 bsAb处理增强了T细胞扩增。

图65A-65D描绘了在被给予低浓度剂量或高浓度剂量的单独的示例性PSMA x CD3bsAb XENP32220或与XENP34339组合的22RV1和huPBMC移植的NSG-DKO小鼠的血液(如计数所指示)中的A)CD4+细胞的活化(如CD25表达所指示)、B)CD4+细胞的活化(如PD1表达所指示)、C)CD8+细胞的活化(如CD25表达所指示)和D)CD8+细胞的活化(如PD1表达所指示)。与用单独CD3 bsAb处理相比，用CD3和CD28 bsAb处理增强了T细胞活化。

图66描绘了在被给予单独的示例性B7H3 x CD3双特异性抗体(0.5mg/kg)、单独的XENP35612(1mg/kg)、XENP34339(0.3mg/kg)与B7H3 x CD3 bsAb(0.5mg/kg)的组合、XENP35612(1mg/kg)与B7H3 x CD3 bsAb(0.5mg/kg)的组合或PBS对照的pp65-MDA-MB-231移植的CD34+Hu-NSG小鼠中，肿瘤体积(由卡尺测量确定；基线已校正)随时间(以天计)的组中值变化。

图67A和67B描绘了在被给予单独的示例性B7H3 x CD3双特异性抗体(0.5mg/kg)、单独的XENP35612(1mg/kg)、XENP34339(0.3mg/kg)与B7H3 x CD3 bsAb(0.5mg/kg)的组合、XENP35612(1mg/kg)与B7H3 x CD3 bsAb(0.5mg/kg)的组合或PBS对照的pp65-MDA-MB-231移植的CD34+Hu-NSG小鼠中，在A)第6天和B)第9天(给药后)的基线校正后的肿瘤体积。使用曼-惠特尼检验(Mann-Whimey test)对基线校正后的数据进行统计学分析。

图68A和68B描绘了在被给予单独的示例性B7H3 x CD3双特异性抗体(0.5mg/kg)、单独的XENP35612(1mg/kg)、XENP35612(1mg/kg)与B7H3 x CD3 bsAb(0.5mg/kg)的组合或PBS对照的pp65-MDA-MB-231移植的CD34+Hu-NSG小鼠的肿瘤中，A)CD45+和B)CD8+细胞的扩增。使用不成对的t检验对经过对数转换的数据进行统计学分析。

图69描绘了XENP29154的序列，其为内部产生的TGN1412。

图70A-70C描绘了A)IFNγ、B)IL-6和C)TNFα从用风干的XENP34339、TGN1412(XENP29154)或阴性对照PBS处理的人PBMC中的释放。

图71A-71C描绘了A)IFNγ、B)IL-2和C)TNFα从用风干的XENP37808、TGN1412(XENP29154)或阴性对照PBS处理的人PBMC中的释放。

图72A和72B描绘了在存在用αCD3 scFv转染的HEK细胞(有或没有B7H3敲除)的情况下，通过XENP37808，A)来自人供体的PBMC或B)来自食蟹猴供体的PBMC对IL-2释放的诱导。

图73A和73B描绘了RTCC对单独的A)22RV-NLR(具有约170K B7H3抗原密度)和B)DU145-NLR(具有约270K B7H3抗原密度)靶细胞B7H33 x CD3 mAb或与XENP34398或XENP37808组合的诱导。数据显示XENP34398和XENP37808(与B7H3 X CD3组合)诱导非常相似水平的RTCC。

图74A-74C描绘了在存在A)OVCAR8(具有约20K B7H3抗原密度)、B)22RV1-NLR(具有约170K B7H3抗原密度)和C)DU145-NLR(具有约270K B7H3抗原密度)和XENP34398或XENP37808与B7H3 x CD3 bsAb组合的情况下，T细胞对IL-2释放的诱导。

图75描绘了抗B7H3克隆2E4A3.189可变重结构域和可变轻结构域变体的共有框架区(FR)和互补决定区(CDR)(如在Kabat中)。

具体实施方式

I.概述

正广泛研究癌症治疗中的T细胞活化。T细胞需要多种信号进行完全活化和分化。如图40中所示，由T细胞受体(TCR)识别肽-MHC(pMHC)复合物所促进的信号1是T细胞活化所绝对需要的。与信号1协同并放大信号1的信号2通常由CD28配体CD80和CD86与CD28本身的相互作用提供。虽然单独的CD28接合通常是惰性的，但当与信号1活化组合时，其促进额外的活化、存活和增殖信号，包括IL2分泌。由于CD80和CD86仅由专职抗原呈递细胞(APC)天然表达，肿瘤环境中CD28共刺激的程度可能高度可变。因此，本发明涉及一类新的肿瘤靶向CD28双特异性抗体(包括本文更全面描述的B7H3 x CD28)，可以模拟CD28的CD80/CD86接合，从而提供信号2的人工来源。值得注意的是，信号可以由肿瘤细胞的天然TCR：pMHC识别提供，或其可以由CD28双特异性与CD3双特异性的组合来提供(其可以模拟信号1)。

因此，本文提供了新的抗CD28×抗B7H3(也称为“αCD28 x αB7H3”，并且有时称为“CD28 X B7H3”)双特异性抗体和使用这种抗体治疗癌症的方法。在许多情况下，这些双特异性抗体是异源二聚体。主题αCD28 x αB7H3抗体能够激动性地结合T细胞上的CD28共刺激分子并靶向肿瘤细胞上的B7H3。因此，此类抗体选择性地增强肿瘤部位处的抗肿瘤活性，同时最小化外周毒性。单独作为单一疗法或当与本文更全面描述的其它抗癌疗法联合使用时，本文提供的主题抗体对于增强抗肿瘤活性特别有用

因此，在一方面，本文提供了与两种不同抗原结合的异源二聚抗体，例如抗体是“双特异性的”，因为所述抗体与两种不同的靶抗原结合，通常是如下所述的CD28和B7H3。这些异源二聚抗体可以单价地(例如，存在单个抗原结合结构域，如可变重结构域对和可变轻结构域对)或二价地(存在各自独立地结合抗原的两个抗原结合结构域)结合靶抗原中每一个。在一些实施方案中，本文提供的异源二聚抗体包括一个CD28结合结构域和一个B7H3结合结构域(例如，本文描述的呈“1+1Fab-scFv-Fc”格式的异源二聚抗体，其因此是双特异性的和二价的)。在其它实施方案中，本文提供的异源二聚抗体包括一个CD28结合结构域和两个B7H3结合结构域(例如，本文描述的呈“2+1Fab₂-scFv-Fc”格式的异源二聚抗体，其因此是双特异性的但为三价的，因为其含有三个抗原结合结构域(ABD))。本文提供的异源二聚抗体是基于使用不同的含有氨基酸取代(即偏斜变体)的单体，所述氨基酸取代使异源二聚体的形成“偏斜”于同源二聚，这将在下文中更全面地描述。在一些实施方案中，异源二聚抗体也与“pI变体”偶联，所述“pI变体”允许从同源二聚中简单纯化异源二聚体，如下文类似地概述。所提供的异源二聚双特异性抗体通常依赖于使用可以在生产细胞中自组装以产生异源二聚蛋白的工程化或变体Fc结构域，以及产生和纯化此类异源二聚蛋白的方法。

II.命名法

本文提供的抗体以若干种不同的格式列出。在一些实例中，特定抗体中的每个单体被给予唯一的“XENP”编号，但是如本领域中将理解的，较长的序列可能含有较短的XENP编号。例如，1+1Fab-scFv-Fc格式抗体的“scFv-Fc”单体可以具有第一XENP编号，而scFv结构域本身将具有不同的XENP编号。一些分子具有三种多肽，因此具有组分的XENP编号被用作名称。因此，呈2+1Fab₂-scFv-Fc格式的分子XENP34389包括三个序列(参见图28A)：“Fab-Fc重链”单体；2)“Fab-scFv-Fc重链”单体；和3)“轻链”单体或等同物，但是本领域的技术人员将能够通过序列比对容易地鉴定这些序列。这些XENP编号在序列表以及标识符中，并且在附图中使用。另外，一个包含三种组分的分子产生多个序列标识符。例如，Fab的列表包括全重链序列、可变重结构域序列和可变重结构域序列的三个CDR、全轻链序列、可变轻结构域序列和可变轻结构域序列的三个CDR。Fab-scFv-Fc单体包括全长序列、可变重结构域序列、3个重链CDR序列和一个scFv序列(包括scFv可变重结构域序列、scFv可变轻结构域序列和scFv接头)。应注意，本文中具有scFv结构域的一些分子使用单个带电荷的scFv接头(+H)，但也可以使用其它的。另外，特定抗原结合结构域(例如，B7H3和CD28结合结构域)的术语命名法使用“Hx.xx_Ly.yy”类格式，其中编号作为特定可变链序列的唯一标识符。因此，B7H3结合结构域6A[B7H3]的Fab侧的可变结构域(例如，图28A)是“H1_L1”，这指示可变重结构域H1与轻结构域L1组合。在这些序列用作scFv的情况下，名称“H1_L1”指示可变重结构域，H1与轻结构域L1组合并且从N端到C端处于VH-接头-VL取向。具有重可变结构域和轻可变结构域的相同序列但是所述序列处于倒序(从N末端到C末端是VL-接头-VH取向)的这种分子将被命名为“L1_H1”。类似地，不同构建体可能“混合和匹配”重链和轻链，如从序列表和附图中将显而易见的。

此外，关于序列表，SEQ ID NO：1-88对应于先前在USSN 63/092,272的图17中显示的抗原结合结构域；SEQ ID NO：89-496对应于先前在USSN 63/092,272的图24中显示的抗原结合结构域。此外，SEQ ID NO：497至584都是2E4A3.189[B7H3]亲本抗体的变体可变重结构域，所有这些都用于本发明中，如下面更全面概述。SEQ ID NO：585至651都是1A7[CD28]亲本抗体的变体可变重结构域，其都用于本发明中。SEQ ID NO：652至756都是1A7[CD28]亲本抗体的变体可变轻结构域，其都用于本发明中。

III.定义

为了能更全面地了解本申请，下文阐述几种定义。此类定义意在涵盖语法等同物。

本文中的“CD28”、“分化簇28”和“Tp44”(例如，基因库登录号NP_001230006(人)、NP_001230007(人)、NP_006130(人)和NP_031668(小鼠))是指在T细胞上表达的B7受体，其提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号。除了T细胞受体(TCR)之外，通过CD28的T细胞刺激为各种白介素的产生提供了强有力的信号。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)蛋白的受体。CD28包括带有YMNM基序的细胞间结构域，所述基序对于募集含SH2结构域的蛋白质(特别是PI3K)至关重要。CD28还包括两个富含脯氨酸的基序，其能够结合含SH3的蛋白质。示例性CD28序列描绘于图1中。除非另有说明，否则提及CD28是指人CD28序列。

本文中的“B7H3”、“B7-H3”、“B7RP-2”、“CD276”、“分化簇276”(例如，基因库登录号NP_001019907(人)、NP_001316557(人)、NP_001316558(人)、NP_079516(人)和NP_598744(小鼠))是指1型跨膜蛋白，其是具有由单个IgV-IgC结构域对构成的胞外结构域的B7家族的成员。B7H3是免疫检查点分子并在许多类型的癌症中异常过表达。图2A和B描述了示例性B7H3序列。除非另有说明，否则提及B7H3是指人B7H3序列。

本文中通过“消融”意指活性的降低或消除。因此举例而言，“消融FcγR结合”意指与不含特定变体的Fc区相比，Fc区氨基酸变体具有小于50％起始结合，较佳具有大于70-80-90-95-98％活性损失，且一般而言，活性低于Biacore、SPR或BLI分析中的可侦测结合的水平。特别用于FcγR结合的消融的是图5所示的那些变体，所述变体通常添加到两个单体中。

如本文所用，“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”指其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞溶解的细胞介导反应。ADCC与结合FcγRIIIa相关；与FcγRIIIa结合的增加引起ADCC活性的增加。

如本文所用，“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬意指其中表达FcγR的非特异性吞噬细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞吞噬的细胞介导反应。

如本文所用，通常使用术语“抗体”。本文提供的抗体可以采取如本文所述的多种格式，包含本文所述的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。

传统的免疫球蛋白(Ig)抗体是“Y”形四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻链”单体(通常分子量为约25kDa)和一个“重链”单体(通常分子量为约50-70kDa)。

其它有用的抗体格式包括但不限于本文提供的“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”格式(参见，例如，图33)。其它有用的抗体格式包括但不限于“mAb-Fv”、“mAb-scFv”、“中心Fy”、“单臂scFv-mAb”、“scFv-mAb”、“双重scFv”和“三叉(trident)”格式抗体，如US20180127501A1中所公开，其通过引用并入本文，特别是在与抗体格式相关的相关部分中(参见例如US20180127501A1的图2)。

抗体重链通常包含可变重(VH)结构域，所述结构域包含vhCDR1-3；以及Fc结构域，所述Fc结构域包含CH2-CH3单体。在一些实施方案中，抗体重链包含铰链和CHI结构域。传统的抗体重链是从N末端到C末端如下组织的单体：VH-CH1-铰链-CH2-CH3。CH1-铰链-CH2-CH3统称为抗体的重链“恒定结构域”或“恒定区”，其中有五种不同的类别或“同种型”：IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。

在一些实施方案中，本文提供的抗体包括IgG同种型恒定结构域，所述IgG同种型恒定结构域具有若干亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在几个免疫球蛋白结构域。本文中通过“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指具有不同三级结构的免疫球蛋白的区域。本发明感兴趣的是重链结构域，包括恒定重(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的情形中，IgG同种型各自具有三个CH区。因此，在IgG的情形中，“CH”结构域如下：“CH1”指根据如Kabat中的EU索引的位置118-215。“铰链”指根据如Kabat中的EU索引的位置216-230。“CH2”指根据如Kabat中的EU索引的位置231-340，并且“CH3”指根据如Kabat中的EU索引的位置341-447。如表1所示，在不同的编号系统之间，重链结构域的确切编号和位置可以有所不同。如本文所示和下文所描述，pI变体可以处于CH区的一个或多个CH区以及铰链区中，如下文所讨论。

应注意，IgG1具有在356(D或E)和358(L或M)处具有多型性的不同同种异型。本文所描绘的序列使用356E/358M同种异型，然而在本文中包括其它同种异型。也就是说，本文所包括的包括IgG1 Fc结构域的任何序列可能具有356D/358L，替代356E/358M同种异型。应当理解，治疗性抗体还可以包含同种型和/或亚类的杂合体。例如，如以引用方式并入的美国公开2009/0163699中所示，本发明的抗体在一些实施方案中包含IgG1/G2杂交体。

如本文所用，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”指包含抗体的恒定区，在一些情况下不包含所有第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1)或其一部分，并且在一些情况下，任选地包括铰链的全部或一部分的多肽。对于IgG，Fc结构域包括免疫球蛋白结构域CH2和CH3(Cγ2和Cγ3)，以及任选地CH1(Cγ1)与CH2(Cγ2)之间的铰链区的全部或一部分。因此，在一些情况下，Fc结构域从N末端到C末端包括CH2-CH3和铰链-CH2-CH3。在一些实施方案中，Fc结构域是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域，其中IgG1铰链-CH2-CH3和IgG4铰链-CH2-CH3在许多实施方案中有特定用途。此外，在人IgG1 Fc结构域的情况下，铰链可以包括C220S氨基酸取代。此外，在人IgG4 Fc结构域的情况下，铰链可以包括S228P氨基酸取代。尽管Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常被定义成在其羧基末端包含残基E216、C226或A231，其中编号是根据如Kabat中的EU索引进行的。在一些实施方案中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如以改变与一种或多种FcγR或FcRn的结合。

本文中的“重链恒定区”意指抗体(或其片段)的CH1-铰链-CH2-CH3部分，排除可变重结构域；在人类IgG1的EU编号中，此为氨基酸118-447。本文中的“重链恒定区片段”意指含有较少来自N端和C端中任一个或两个的氨基酸但仍保留与另一重链恒定区形成二聚体的能力的重链恒定区。

重链的另一种类型的结构域是铰链区。本文的“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“铰链结构域”意指包括抗体的第一恒定结构域与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置215处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置231处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置216(IgG1中的E216)到230(IgG1中的P230)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引进行的。在一些情况下，使用“铰链片段”，其在铰链结构域的N末端和C末端的一个或两个处含有较少的氨基酸。如本文所提及，pI变体还可在铰链区中制成。在本文中许多抗体具有被被丝氨酸代替的在根据EU编码(铰链区)的位置220处的至少一个半胱氨酸。通常，这种修饰在本文所描绘的大多数序列的“scFv单体”侧(当使用1+1或2+1格式时)上，但是其也可以是在“Fab单体”侧上或在两者上以减少二硫化物形成。本文序列中特别包括这些半胱氨酸中的一个或两个被取代(C220S)。

如本领域技术人员所知，重链恒定区结构域(即CH1、铰链区、CH2和CH3结构域)的确切编号和位置在不同的编号系统中可以有所不同。根据EU和Kabat的重恒定区编号的有用比较如下，参见Edelman等人，1969，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》63：78-85，以及Kabat等人，1991，《免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)》，第5版，美国公共卫生署(United States Public HealthService)，国立卫生研究院(National Institute of Health)，贝塞斯达(Bethesda)，所述文献通过引用整体并入。

表1

	EU编号	Kabat编号
			CH1	118-215	114-223
铰链	216-230	226-243
			CH2	231-340	244-360
CH3	341-447	361-478

抗体轻链通常包含两个结构域：可变轻结构域(VL)，所述可变轻结构域包含轻链CDR vlCDR1-3，以及恒定轻链区(往往称为CL或Cκ)。抗体轻链通常从N末端到C末端如下组织：VL-CL。

本文中的“抗原结合结构域”或“ABD”意指一组六个互补决定区(CDR)在作为多肽序列的一部分存在时与如本文所讨论的靶抗原(例如，B7H3或CD28)特异性地结合。如本领域中已知，这些CDR通常作为第一组可变重CDR(vhCDR或VHCDR)和第二组可变轻CDR(vlCDR或VLCDR)存在，其各自包含三个CDR：vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3可变重CDR和vlCDR1、vlCDR2和v1CDR3 vhCDR3可变轻CDR。CDR存在于可变重结构域(vhCDR1-3)和可变轻结构域(vlCDR1-3)中。来自Fv区的可变重结构域和可变轻结构域。

本发明提供了大量不同的CDR集合。在这种情况下，“完整CDR组”包含三个可变轻CDR和三个可变重CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些可以分别是较大可变轻结构域或可变重结构域的一部分。另外，如本文中更全面地概述的，当使用重链和轻链时(例如当使用Fab时)，可变重结构域和可变轻结构域可以在单独的多肽链上，或在scFv序列的情况下在单个多肽链上。

如本领域技术人员将理解，CDR的确切编号和位置在不同编号系统中可以是不同的。然而，应理解，可变重序列和/或可变轻序列的公开包含相关(固有)CDR的公开。因此，每个可变重区的公开内容是vhCDR的公开内容(例如，vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)，并且每个可变轻区的公开内容是vlCDR的公开内容(例如，vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)。CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人，《发展与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27(1)：55-77(2003)：

表2

在整个本说明书中，当提及可变结构域(大致是轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)中的残基以及用于Fc区的EU编号系统时，通常使用Kabat编号系统(例如Kabat等人，见上文(1991))。

CDR有助于形成抗原结合结构域和抗体的抗原结合位点，或更具体来说，表位结合位点。“表位”是指与称为互补位的抗体分子可变区中的特定抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是诸如氨基酸或糖侧链的分子的组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可具有多于一个表位。

表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖面积内。

表位可以是构象的或线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生构象表位。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别可以在于在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。

在独特的空间构象中，表位典型地包含至少3个并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别同一表位的抗体可以用简单的免疫测定来验证，所述免疫测定示出了一个抗体阻断另一个抗体与靶抗原结合的能力，例如“分箱(binning)”。如下文概述的，本发明不仅包含本文所枚举的抗原结合结构域和抗体，还包含竞争与所枚举的抗原结合结构域结合的表位结合的抗原结合结构域和抗体。

在一些实施方案中，抗原结合结构域的六个CDR源自可变重结构域和可变轻结构域。在“Fab”格式中，一组6个CDR源自两个不同的多肽序列、可变重结构域(vh或VH；含有vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)和可变轻结构域(v1或VL；含有vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，vh结构域的C末端附接至重链的CH1结构域的N末端并且v1结构域的C末端附接至恒定轻结构域的N末端(并且因此形成轻链)。在scFv格式中，vh和v1结构域通常通过使用如本文所述的接头(或“scFv接头”)共价附接成单个多肽序列，其可以是(从N端开始)vh-接头-v1或v1-接头-vh，前者通常是优选的(包括每侧的可选结构域接头，这取决于使用的格式)。通常，scFv结构域的C末端附接至第二个单体中全部或部分铰链的N末端。

如本文所用，“可变区”或“可变结构域”意指包括基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因基因座的任何Vκ、Vλ和/或VH基因编码的一个或多个Ig结构域并且含有赋予抗原特异性的CDR的免疫球蛋白的区域。因此，“可变重结构域”与“可变轻结构域”配对以形成抗原结合结构域(“ABD”)。另外，每个可变结构域包括从氨基末端到羧基末端按以下顺序布置的三个高变区(“互补决定区”、“CDR”)(可变重结构域的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3和可变轻结构域的v1CDR1、v1CDR2和v1CDR3)和四个框架(FR)区：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

如本文所用，“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL以及CL免疫球蛋白结构域的抗体区，所述结构域通常位于两条不同的多肽链上(例如，VH-CH1位于一个链上而VL-CL位于另一个链上)。Fab可以指分离情况下的这个区或本发明的双特异性抗体的情形中的这个区。在Fab的情形中，除了CH1和CL结构域之外，Fab还包括Fv区。

如本文所用，“Fv”或“Fv片段”或“Fv区域”是指包含VL和VH结构域的抗体区域。Fv区可以形成fab(如上所述，通常是两种不同的多肽，也包括如上所述的恒定区)和单链Fv(scFv)，其中v1和vh结构域包含在单个肽中，通常用本文所述的接头附接。

本文中通过“单链Fv”或“scFv”意指通常使用如本文所讨论的scFv接头来共价附接至可变轻结构域以形成scFv或scFv结构域的可变重结构域。scFv结构域可以从N端到C端处于任一取向(vh-接头-v1或v1-接头-vh)。在序列表和附图所描绘的序列中，vh和v1结构域的顺序以名称指示，例如，H.X_L.Y意指N端到C端为vh-接头-vl，并且L.Y_H.X为v1-接头-vh。

本文提供的主题抗体的一些实施方案包括至少一个scFv结构域，所述至少一个scFv结构域虽然不是天然发生的但是通常包含通过scFv接头连接在一起的可变重结构域和可变轻结构域。如本文所概述，虽然scFv结构域通常由N末端到C末端定向为VH-scFv接头-VL，但是针对任一个scFv结构域(或使用Fab的vh和v1序列构建的那些)，这种定向可以逆向，成为VL-scFv接头-VH，其中取决于格式，任选的接头位于一个末端或两个末端。

本文中的“修饰”或“变体”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的更改。例如，修饰可以是与蛋白质连接的改变的碳水化合物或PEG结构。本文中通过“氨基酸修饰”指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另外说明，否则氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如具有DNA和RNA形式的密码子的20种氨基酸。

本文中通过“氨基酸取代”或“取代”指用不同的氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代是针对并非天然存在于特定位置、并非天然存在于生物体内或任何生物体内的氨基酸。例如，取代E272Y是指变体多肽，在这一情况下是指Fc变体，其中位置272处的谷氨酸用酪氨酸代替。为清楚起见，已经被工程化以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如，将CGG(编码精氨酸)换成CGA(仍然编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管产生对相同蛋白质进行编码的新基因，但是如果蛋白质在其开始的特定位置处具有相同氨基酸，则所述蛋白质不是氨基酸取代。

如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在位置233之后和位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后和位置234之前插入AlaAspGlu。

如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”是指去除亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸序列。例如，E233-或E233#、E233()或E233del表示在位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示从位置233开始的序列GluAspAla的缺失。

如本文所用，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，但并没有多得使得变体蛋白质使用如下所述比对程序将不与亲本蛋白质比对。通常，使用下文所述的比对程序(如BLAST)，变体蛋白质(如本文概述的变体Fc结构域等)与亲本蛋白质通常至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

如本文所用，“变体”还指赋予特定功能的特定氨基酸修饰(例如，“异源二聚化变体”、“pI变体”、“消融变体”等)。

如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽，例如Fc亲本多肽是人野生型序列，如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重恒定结构域或Fc区，但是具有变体的人序列还可以用作“亲本多肽”，例如可以包含美国公开2006/0134105的IgG1/2杂交体。本文中的蛋白质变体序列将与亲本蛋白质序列优选地拥有至少约80％同一性，并且最优选地至少约90％同一性，更优选地至少约95％到98％到99％同一性。因此，如本文所用，“抗体变体”或“变体抗体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本抗体不同的抗体，如本文所用，“IgG变体”或“变体IgG”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本IgG(再次，在许多情况下，来自人IgG序列)不同的抗体，并且如本文所用，“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。如本文所用，“Fc变体”或“变体Fc”意指包括如与人IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域相比，在Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。

如本文所用，“Fc变体”或“变体Fc”意指包括Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。修饰可以是添加、缺失或取代。Fc变体根据构成其的氨基酸修饰进行定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽具有位置434处的丝氨酸取代的Fc变体，其中编号是根据EU索引进行的。同样地，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。WT氨基酸的身份标识可以是非特定的，在此情况下前述变体称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，428L/434S是与434S/428L相同的Fc变体等。对于本文所讨论的涉及抗体或其衍生物和片段(例如，Fc结构域)的所有位置，除非另外指出，否则氨基酸位置编号是根据EU索引进行的。“EU索引”或“如Kabat编号或EU编号”方案中的“EU索引”指EU抗体的编号(Edelman等人，1969，《美国国家科学院院刊》63：78-85，所述文献在此通过引用整体并入)。修饰可以是添加、缺失或取代。

通常，变体Fc结构域与对应的亲本人IgG Fc结构域具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性(使用下文所讨论的同一性算法，其中一个实施方案利用如本领域已知的BLAST算法，使用默认参数)。可替代地，与亲本Fc结构域相比，变体Fc结构域可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸修饰。可替代地，与亲本Fc结构域相比，变体Fc结构域可以具有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸修饰。另外，如本文所讨论的，本文所述的变体Fc结构域仍然保持与另一个Fc结构域形成二聚体的能力，如使用本文所述已知技术如非变性凝胶电泳所测量。

如本文所用，“蛋白质”意指至少两个共价附接的氨基酸，其包含蛋白质、多肽、寡肽和肽。另外，构成本发明的抗体的多肽可以包含一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、循环变换、环化、其它分子的接头、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。

如本文所用，“残基”意指蛋白质中的位置以及其相关的氨基酸同一性。举例来说，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人类抗体IgG1中位置297处的残基。

如本文所用，“IgG子类修饰”或“同型修饰”意指将IgG同型的一个氨基酸转化成不同比对的IgG同型中的对应的氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为在EU位置296处IgG1包含酪氨酸并且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。

如本文所用，“非天然发生修饰”意指不是同种型的氨基酸修饰。例如，因为人IgG均不包括位置434处的丝氨酸，因此IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂交体)的取代434S被认为是非天然发生修饰。

如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指由DNA和RNA编码的20个天然发生的氨基酸中的一种。

如本文所用，“效应子功能”指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包含但不限于ADCC、ADCP和CDC。

如本文所用，“IgG Fc配体”意指来自与IgG抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体络合物的任何生物体的分子，优选地是多肽。Fc配体包含但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒性FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其为与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人，2002，《免疫学评论(Immunological Reviews)》190：123-136，其通过引用整体并入)。Fc配体可包括结合Fc的未发现的分子。特定的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。如本文所用，“Fc配体”意指来自与抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体络合物的任何生物体的分子，优选地是多肽。

如本文所用，“Fcγ受体”或“FcγR”或“FcgammaR”意指与IgG抗体Fc区结合并由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人中，这个家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人，2002，《免疫学快报(Immunol Lett)》82：57-65，其通过引用整体并入)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包含但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。

如本文所用，“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指与IgG抗体Fc区结合并且至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包含但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域中所已知，功能FcRn蛋白包括两种多肽，通常被称为重链和轻链。轻链是β-2微球蛋白并且重链由FcRn基因编码。除非本文另外指出，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的络合物。各种FcRn变体用于增加与FcRn受体的结合并且在一些情况下用于增加血清半衰期。“FcRn变体”是有助于增加与FcRn受体的结合的氨基酸修饰，并且下文中示出了适合的FcRn变体。

如本文所用，“亲本多肽”意指随后被修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽或天然存在的多肽的变体或工程化版本。因此，如本文所用，“亲本免疫球蛋白”意指被修饰以产生变体的未经修饰免疫球蛋白多肽，并且如本文所用，“亲本抗体”意指被修饰以产生变体抗体的未经修饰抗体。应注意，“亲本抗体”包含如下文概述的已知商业的重组产生抗体。在此情形中，“亲本Fc结构域”将是相对于所列举变体；因此，将“变体人IgG1 Fc结构域”与人IgG1的亲本Fc结构域相比较，将“变体人IgG4 Fc结构域”与亲本Fc结构域人IgG4相比较等。

如本文所用，“位置”指蛋白质序列中的位置。位置可以顺序地或根据已建立的格式进行编号，例如用于抗体结构域的编号的EU索引(例如，CH1、CH2、CH3或铰链结构域)。

如本文所用，“靶抗原”意指通过包括给定抗体的可变区的抗原结合结构域来特异性地结合的分子。

在本文中，在本发明的异源二聚抗体的单体的情形中，“链性(strandedness)”意指，类似于DNA的“相匹配”的两个链，异源二聚化变体并入每个单体中以便保持“相匹配”以形成异源二聚体的能力。例如，如果一些pI变体被工程化成单体A(例如，使pI更高)，则也可以利用的“电荷对”的空间变体不干扰pI变体，例如使pI更高的电荷变体被放在同一个“链”或“单体”上以保持两种功能。类似地，对于如以下更全面地概述的以成对的组出现的“偏斜”变体，技术人员将认为pI决定所述对中的一组将会进入哪个链或单体，从而使得还使用偏斜变体的pI使p1分离最大化。

如本文所用，“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。

在本文中，在产生根据本发明的双特异性抗体的情形中，“宿主细胞”意指含有对双特异性抗体的组分进行编码的外源性核酸并且能够在适合条件下表达双特异性抗体的细胞。下文中讨论了适合的宿主细胞。

在本文中，“野生型或WT”意指在自然界发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包含等位变异。WT蛋白质具有尚未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。

本文提供了与人抗体结构域具有序列同一性的多个抗体结构域(例如，Fc结构域)。两个类似序列之间的序列同一性(例如，抗体可变结构域)可以通过如以下的算法等算法测量：如Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)“生物序列的比较(Comparison OfBiosequences)”，《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2：482[局部同源算法]；Needleman，S.B.和Wunsch，CD.(1970)“可适用于搜索两种蛋白质的氨基酸序列中的类似性的一般方法(A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino AcidSequence Of Two Proteins)”，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48：443[同源比对算法]，Pearson，W.R.和Lipman，D.J.(1988)“用于生物序列比较的改进的工具(Improved ToolsFor Biological Sequence Comparison)”，《美国国家科学院(U.S.A.))》85：2444[类似性搜索方法]；或Altschul，S.F.等人，(1990)“基础局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool)”，《分子生物学杂志》215：403-10，即“BLAST”算法，参见https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。当使用前述算法中的任一种时，使用默认参数(用于窗口长度、空位罚分等)。在一个实施方案中，使用默认参数用BLAST算法来完成序列同一性。

本发明的抗体通常是分离的或重组的。在用于描述本文所公开的各种多肽时，“分离的”意指已经从表达多肽的细胞或细胞培养物中鉴定并且分离和/或回收的多肽。通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。“重组”意指在外源性宿主细胞中使用重组核酸技术产生抗体，并且也可以分离抗体。

“特异性结合”或“特异性地结合”或“特异于”特定抗原或表位意指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可以如下测量：例如相比于对照分子的结合来确定一种分子的结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构分子。举例而言，特异性结合可藉由与类似于目标的对照分子竞争来确定。

特定抗原或表位的特异性结合可以通过例如抗体来展现，所述抗体针对抗原或表位的KD为至少约10^-4M、至少约10^-5M、至少约10^-6M、至少约10^-7M、至少约10^-8M、至少约10^-9M、或者至少约10^-10M、至少约10^-11M、至少约10^-12M或更大，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。典型地，特异性结合抗原的抗体的KD是对照分子相对于抗原或表位的KD的20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。

而且，特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过针对抗原或表位的KA或Ka为以下的抗体来表现：针对相对于对照物的表位大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。结合亲和力通常使用Biacore、SPR或BLI测定来测量。

IV.CD28和B7H3抗原结合结构域

本文提供了结合B7H3或CD28的抗原结合结构域(ABD)和ABD组合物。在一些实施方案中，一个或多个Abd包含在本文所述的抗体格式中，包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

A.CD28抗原结合结构域和抗体

在一方面，本文提供了结合人CD28的CD28抗原结合结构域(ABD)，以及包含这种CD28抗原结合结构域的组合物(例如，抗体，包括本文提供的异源二聚抗体)。在一些实施方案中，本文描述的CD28抗原结合结构域是有利地提供共刺激活性的激动性CD28 ABD。因此，本文提供的此类CD28 ABD可用于增强免疫反应，例如，当用作单一疗法或与其它疗法(例如，用于治疗特定癌症的抗癌疗法)联合使用时。

如本领域的技术人员将理解的，适合的CD28结合结构域可以包括如在序列表和附图中所描绘的或如其被加下划线的一组6个CDR，或在如本文所述并且如表2中所示的使用不同编号方案的情况下，使用在图18-21和23以及序列表中所描绘的那些序列的可变重(VH)结构域和可变轻结构域(VL)序列内的其它比对鉴定的CDR。适合的CD28 ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个VH和VL序列。

在一个实施方案中，CD28抗原结合结构域包括本文(包括附图和序列表)所述的任何CD28结合结构域的6个CDR(即，vhCDR1-3和vlCDR1-3)。在一些实施方案中，结合人CD28的CD28 ABD是以下CD28 ABD中的一个：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。在示例性实施方案中，CD28 ABD是CD28ABD：1A7[CD28]_H1L1或1A7[CD28]_H1.14L1.。

除了在附图和序列表中所公开的形成ABD到CD28的亲本CDR组之外，本文提供了具有包含本文公开的CD28 ABD CDR的至少一个修饰的CDR的变体CD28 ABD(例如，图18-21和23以及序列表)。在一个实施方案中，与本文(包括附图和序列表)所述的CD28 ABD的6个CDR相比，CD28 ABD包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸修饰的一组6个CDR。在示例性实施方案中，与以下CD28 ABD中的一个的6个CDR相比，CD28 ABD包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸修饰的一组6个CDR：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。在示例性实施方案中，CD28 ABD是CD28 ABD：1A7[CD28]_H1L1或1A7[CD28]_H1.14L1.。

在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，CD28 ABD能够结合CD28抗原，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。

在一些实施方案中，CD28 ABD包含与如本文(包括附图和序列表)所述的CD28 ABD的6个CDR至少90％、95％、97％、98％或99％相同的6个CDR。在示例性实施方案中，CD28ABD包括与以下CD28ABD中的一个的6个CDR至少90％、95％、97％、98％或99％相同的6个CDR：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.1IA1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_HIL1(图18-21和23以及序列表)。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，CD28 ABD能够结合CD28，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD28ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。

在另一示例性实施方案中，CD28 ABD包括本文(包括附图和序列表)所述的CD28ABD中的任一个的可变重(VH)结构域和可变轻(VL)结构域。在示例性实施方案中，CD28 ABD是以下CD28ABD中的一个：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。

除了本文公开的亲本CD28可变重结构域和可变轻结构域之外，本文提供了包含可变重结构域和/或可变轻结构域的CD28 ABD，所述可变重结构域和/或可变轻结构域是本文公开的CD28 ABD VH和VL结构域的变体。在一个实施方案中，变体VH结构域和/或VL结构域与本文(包括附图和序列表)所述的CD28 ABD的VH和/或VL结构域相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化。在示例性实施方案中，变体VH结构域和/或VL结构域具有来自以下CD28 ABD中的一个的VH和/或VL结构域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化：1A7[CD28]_HIL1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_HIL1(图18-21和23以及序列表)。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，CD28 ABD能够结合CD28，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。

在一个实施方案中，变体VH和/或VL结构域与如本文(包括附图和序列表)所述的CD28 ABD的VH和/或VL至少90％、95％、97％、98％或99％相同。在示例性实施方案中，变体VH和/或VL结构域与以下CD28 ABD中的一个的VH和/或VL至少90％、95％、97％、98％或99％相同：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，CD28 ABD能够结合CD28，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。

在一个实施方案中，CD28抗原结合结构域包含具有1A7_H1.14的vhCDR1-3(即，vhCDR1-3)的可变重结构域(VH)(图19)。在一些实施方案中，CD28抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，CD28 ABD能够结合CD28抗原，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。此类CD28结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

在一个实施方案中，与1A7_H1.14的vhCDR1-3相比，CD28ABD包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸修饰的vhCDR1-3的可变重结构域(VH)(图19)。在一些实施方案中，CD28抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，CD28 ABD能够结合CD28抗原，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。此类CD28结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

在一些实施方案中，CD28 ABD包含具有与1A7_H1.14的6个vhCDR1-3至少90％、95％、97％、98％或99％相同的vhCDR1-3的可变重结构域(VH)(图19)。在一些实施方案中，CD28抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，CD28 ABD能够结合CD28，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。此类CD28结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

在另一示例性实施方案中，CD28 ABD包含可变重(VH)结构域1A7_H1.14(图19)。在一些实施方案中，CD28抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，CD28 ABD能够结合CD28，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。此类CD28结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1 Fab-scFv-Fc”、“2+1 Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

除了本文公开的亲本CD28可变重结构域之外，本文提供了包含1A7_H1.14的变体的可变重结构域的CD28 ABD(图16)。在一个实施方案中，变体VH结构域与1A7_H1.14相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化(图19)。在一些实施方案中，CD28抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，CD28 ABD能够结合CD28，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。此类CD28结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

在一个实施方案中，变体VH结构域与1A7_H1.14至少90％、95％、97％、98％或99％相同(图19)。在一些实施方案中，CD28抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，CD28 ABD能够结合CD28，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。此类CD28结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1Fa＝b-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

感兴趣的特异性抗CD28 ABD包含VH结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ IDNO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ IDNO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ IDNO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ IDNO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ IDNO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ IDNO：649、SEQ ID NO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：1198和SEQ ID NO：1199，与SEQ IDNO：874的VL结构域配对。

在其它情况下，抗CD28 VH结构域具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ IDNO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ IDNO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ IDNO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ IDNO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ IDNO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ IDNO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：1198和SEQ ID NO：1199，并且VL结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：874、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ IDNO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：665、SEQ IDNO：666、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：673、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQ IDNO：677、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：684、SEQ ID NO：685、SEQ ID NO：686、SEQ ID NO：687、SEQ IDNO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ IDNO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ IDNO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQ IDNO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQ ID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQ IDNO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQ ID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：740、SEQ ID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQ IDNO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQ ID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ ID NO：750、SEQ ID NO：751、SEQ ID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQ IDNO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ ID NO：756。

在一些情况下，抗CD28结合结构域具有VH结构域和VL结构域，其具有选自以下对的氨基酸序列：a)SEQ ID NO：1和5，b)SEQ ID NO：9和13，c)SEQ ID NO：17和21，d)SEQ IDNO：25和29，e)SEQ ID NO：33和37，f)SEQ ID NO：41和45；g)SEQ ID NO：49和53，h)SEQ IDNO：57和61，i)SEQ ID NO：65和69，j)SEQ ID NO：73和77，和k)SEQ ID NO：81和85。

B.B7H3抗原结合结构域

在一个方面，本文提供了B7H3抗原结合结构域(ABD)和包含此类B7H3抗原结合结构域(ABD)的组合物，包括抗B7H3抗体。此类B7H3结合结构域和相关抗体(例如，抗B7H3 x抗CD28双特异性抗体)可用于例如治疗B7H3相关癌症。

如本领域的技术人员将理解的，适合的B7H3结合结构域可以包括如在序列表和图26-31中所描绘的或如CDR被加下划线的一组6个CDR，或在如本文所述并且如表2中所示的使用不同编号方案的情况下，使用在图26-31以及序列表中所描绘的那些序列的可变重(VH)结构域和可变轻结构域(VL)序列内的其它比对鉴定的CDR(参见表2)。适合的B7H3ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab结构域的整个VH和VL序列。

在一个实施方案中，B7H3抗原结合结构域包括本文(包括附图和序列表)所述的B7H3ABD的6个CDR(即，vhCDR1-3和v1CDR1-3)。在示例性实施方案中，B7H3 ABD是以下B7H3ABD中的一个：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704(图26-31以及序列表)。

除了在图和序列表中公开的形成针对B7H3的ABD的亲本CDR集外，本文还提供了具有CDR的B7H3 ABD变体，所述CDR包括本文公开的B7H3 ABD CDR的至少一种修饰。在一个实施方案中，与本文(包括附图和序列表)所述的B7H3 ABD的6个CDR相比，B7H3 ABD包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸修饰的一组6个CDR。在示例性实施方案中，与以下B7H3 ABD中的一个的6个CDR相比，B7H3 ABD包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸修饰的一组6个CDR：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704(图26-31以及序列表)。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，变体B7H3 ABD能够结合B7H3抗原，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，B7H3 ABD能够结合人B7H3抗原(参见图2)。

在一个实施方案中，B7H3 ABD包括与如本文(包括附图和序列表)所述的B7H3 ABD的6个CDR至少90％、95％、97％、98％或99％相同的6个CDR。在示例性实施方案中，B7H3 ABD包括与以下B7H3 ABD中的一个的6个CDR至少90％、95％、97％、98％或99％相同的6个CDR：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb1l、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704(图26-31以及序列表)。在某些实施方案中，如通过Biacore，表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，B7H3 ABD能够结合B7H3抗原，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，B7H3 ABD能够结合人B7H3抗原(参见图2)。

在另一例示性实施方案中，B7H3 ABD包括本文(包括附图和序列表)所述的B7H3ABD中的任一个的可变重(VH)结构域和可变轻(VL)结构域。在示例性实施方案中，B7H3 ABD是以下B7H3 ABD中的一个：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb1 8、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704(图26-31以及序列表)。在示例性实施方案中，B7H3 ABD是以下B7H3 ABD中的一个：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1或6A1[B7H3]_H1L1。

除了本文公开的亲本B7H3可变重结构域和可变轻结构域之外，本文提供了包含可变重结构域和/或可变轻结构域的B7H3 ABD，所述可变重结构域和/或可变轻结构域是本文公开的B7H3 ABD VH和VL结构域的变体。在一个实施方案中，变体VH结构域和/或VL结构域与本文(包括附图和序列表)所述的B7H3ABD的VH和/或VL结构域相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化。在示例性实施方案中，变体VH结构域和/或VL结构域具有来自以下B7H3 ABD中的一个的VH和/或VL结构域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704(图26-31以及序列表)。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，B7H3 ABD能够结合B7H3，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，B7H3 ABD能够结合人B7H3抗原(参见图2)。

在一个实施方案中，变体VH和/或VL结构域与如本文(包括附图和序列表)所描述的B7H3 ABD的VH和/或VL至少90％、95％、97％、98％或99％相同。在示例性实施方案中，变体VH和/或VL结构域与以下B7H3 ABD中的一个的VH和/或VL至少90％、95％、97％、98％或99％相同：2E4A3.189[B7H3]_HIL1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704(图26-31以及序列表)。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，B7H3 ABD能够结合B7H3，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，B7H3 ABD能够结合人B7H3抗原(参见图2)。

在一个实施方案中，B7H3抗原结合结构域包括具有2E4A3.189_H1.22的vhCDR1-3(即，vhCDR1-3)的可变重结构域(VH)(图27)。在一些实施方案中，B7H3抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何B7H3或CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是2E4A3.189_L1(图26)、1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，B7H3 ABD能够结合B7H3抗原，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，B7H3 ABD能够结合人B7H3抗原(参见图2)。此类B7H3结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

在一个实施方案中，与2E4A3.189_H1.22的vhCDR1-3相比，B7H3 ABD包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸修饰的vhCDR1-3的可变重结构域(VH)(图27)。在一些实施方案中，B7H3抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何B7H3或CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是2E4A3.189_L1(图26)、1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，B7H3 ABD能够结合B7H3抗原，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，B7H3 ABD能够结合人B7H3抗原(参见图2)。此类B7H3结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

在一些实施方案中，B7H3 ABD包含具有与2E4A3.189_H1.22的6个vhCDR1-3至少90％、95％、97％、98％或99％相同的vhCDR1-3的可变重结构域(VH)(图27)。在一些实施方案中，B7H3抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何B7H3或CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是2E4A3.189_L1(图26)、1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，B7H3 ABD能够结合B7H3，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，B7H3 ABD能够结合人B7H3抗原(参见图2)。此类B7H3结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

在另一示例性实施方案中，B7H3 ABD包含可变重(VH)结构域2E4A3.189_H1.22(图27)。在一些实施方案中，B7H3抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何B7H3或CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是2E4A3.189_L1(图26)、1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，B7H3 ABD能够结合B7H3，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，B7H3 ABD能够结合人B7H3抗原(参见图1)。此类B7H3结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

除了本文公开的亲本B7H3可变重结构域之外，本文还提供了B7H3 ABD，其包含可变重结构域，所述可变重结构域是可变重(VH)结构域2E4A3.189_H1.22的变体(图27)。在一个实施方案中，变体VH结构域与可变重(VH)结构域2E4A3.189_H1.22相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化(图27)。在一些实施方案中，B7H3抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何B7H3或CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是2E4A3.189_L1(图26)、1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，B7H3 ABD能够结合B7H3，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，B7H3 ABD能够结合人B7H3抗原(参见图2)。此类B7H3结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

在一个实施方案中，变体VH结构域与2E4A3.189_H1.22至少90％、95％、97％、98％或99％相同(图27)。在一些实施方案中，B7H3抗原结合结构域进一步包含本文提供的任何B7H3或CD28结合结构域可变轻结构域。在示例性实施方案中，可变轻结构域是2E4A3.189_L1(图26)、1A7_L1(图18)或其变体。在某些实施方案中，如通过Biacore、表面等离振子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如八位位组测定)测定中的至少一种测定，B7H3 ABD能够结合B7H3，后一种测定在许多实施方案中有特定用途。在特定实施方案中，B7H3 ABD能够结合人B7H3抗原(参见图2)。此类B7H3结合结构域可包含在本文提供的任何抗体中，包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体。

在一些实施方案中，抗B7H3 ABD具有VH结构域和VL结构域，其具有以下对的氨基酸序列：a)来自奥博妥单抗的SEQ ID NO：89和93；b)来自依诺妥珠单抗的SEQ ID NO：97和101；c)来自BRCA84D的SEQ ID NO：105和109；d)来自BRCA69D的SEQ ID NO：113和117；e)来自PRCA157的SEQ ID NO：121和125；f)来自huPRCA157的SEQ ID NO：129和133；g)来自Mab-D的SEQ ID NO：137和141；h)来自humAb-D的SEQ ID NO：145和149；i)来自m30的SEQ ID NO：153和157；j)来自M30-H1-L4的SEQ ID NO：161和165；k)来自SP265的SEQ ID NO：169和173；1)来自S10-H50L58的SEQ ID NO：177和181；m)来自8H9的SEQ ID NO：185和189；n)来自m852的SEQ ID NO：193和197；o)来自m857的SEQ ID NO：201和205；p)来自m8524的SEQ ID NO：209和213；q)来自1-1的SEQ ID NO：217和221；r)来自1-2的SEQ ID NO：225和229；s)来自1-4的SEQ ID NO：233和237；t)来自1-5的SEQ ID NO：241和245；u)来自1-7的SEQ ID NO：249和253；v)来自2-5的SEQ ID NO：257和261；w)来自2-8的SEQ ID NO：265和269；x)来自chAb2的SEQ ID NO：273和277；y)来自chAb3的SEQ ID NO：281和285；z)来自chAb4的SEQ ID NO：289和293；aa)来自chAb18的SEQ ID NO：297和301；bb)来自chAb13的SEQ ID NO：305和309；cc)来自chAb12的SEQ ID NO：313和317；dd)来自chAb14的SEQ ID NO：321和325；ee)来自chAb6的SEQ ID NO：329和333；ff)来自chAb11的SEQ ID NO：337和341；gg)来自chAB16的SEQ ID NO：345和349；hh)来自chAb10的SEQ ID NO：353和357；ii)来自ChAb7的SEQ ID NO：361和365；jj)来自chAb8的SEQ ID NO：369和373；kk)来自chAb17的SEQ ID NO：377和381；ll)来自chAb5的SEQ ID NO：385和389；mm)来自huAb3v2.5的SEQ ID NO：393和397；nn)来自huAb3v2.6的SEQ ID NO：401和405；pp)来自huAb13v1的SEQ ID NO：409和413；qq)来自TPP-5706的SEQ ID NO：417和421；rr)来自TPP-6642的SEQ ID NO：425和429；ss)来自TPP-6850的SEQ ID NO：433和437；tt)来自TPP-3803的SEQ ID NO：441和445；uu)来自TRL4542的SEQID NO：449和453；vv)来自h1702的SEQ ID NO：457和461；ww)来自h1703的SEQ ID NO：465和469；xx)来自huA3的SEQ ID NO：473和477；yy)来自huA9的SEQ ID NO：481和485；和zz)来自m1704的SEQ ID NO：489和493。参见USSN 63/092,272中的图17。

在一些实施方案中，抗B7H3 ABD具有氨基酸序列为SEQ ID NO：942(2E4A3.189_H1.22)的VH结构域和氨基酸序列为SEQ ID NO：874(1A7[CD28]_L1，其为B7H3和CD28的共同轻链)的VL结构域。

V.抗体

在一个方面，本文提供了抗CD28抗体和抗B7H3抗体。本文提供的抗体可包括本文提供的任何B7H3和/或CD28结合结构域(例如，“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”抗体)。

本文提供的抗体包含不同的抗体结构域。如本文所述以及所属领域中已知，本文所述的抗体包含重链和轻链内的不同结构域，所述结构域也可以是重叠的。这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、可变重结构域、可变轻结构域、轻恒定结构域、FAb结构域和scFv结构域。

如本文所示，存在可以用于共价附接所列举结构域(例如，scFv、Fab、Fc结构域等)的多个适合的接头(用于用作结构域接头或scFv接头)，包含通过重组技术产生的传统肽键。图7中描绘了使主题抗体的结构域彼此连接的示例性接头。在一些实施方案中，接头肽可以主要包含以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽应该具有足以连接两个分子的长度，以便其相对于彼此呈现正确的构象，从而使其保留所期望的活性。在一个实施方案中，接头具有约1个至50个氨基酸的长度，优选约1个至30个氨基酸的长度。在一个实施方案中，可使用长度为1个至20个氨基酸的接头，在一些实施方案中使用约5个至约10个氨基酸。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为一(并且通常为3到4)的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性接头。可替代地，多种非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚环氧烷或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物可以用作接头。

其它接头序列可以包含CL/CH1结构域的任何长度的任何序列，但不包含CL/CH1结构域的所有残基；例如，CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。接头可以源自免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。接头可以源自任何同种型的免疫球蛋白重链，包含例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。接头序列还可以源自其它蛋白质，如Ig样蛋白(例如，TCR、FcR、KIR)、铰链区来源的序列以及来自其它蛋白质的其它天然序列。

在一些实施方案中，接头是“结构域接头”，其用于将如本文所概述的任何两个结构域连接在一起。例如，在2+1Fab₂-scFv-Fc格式中，可以存在将Fab的CH1结构域的C末端与scFv的N末端附接的结构域接头，其中另一个任选的结构域接头将scFv的C末端与CH2结构域附接(但是在许多实施方案中，铰链用作此结构域接头)。虽然可使用任何合适的接头，许多实施方案利用甘氨酸-丝氨酸聚合物作为结构域接头，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n以及(GGGS)n，其中n是至少为一(并且通常为3到4到5)的整数，以及允许两个域的重组连接并且具有足够长度和柔性以使得每个结构域保留其生物功能的任何肽序列。在一些情况下，并且注意“链性”，如下所概述，可以使用如在scFv接头的一些实施方案中使用的带电荷的结构域接头。图7中描绘了例示性有用的结构域接头。

在一些实施方案中，接头是用于共价附接如本文所讨论的VH和VL结构域的scFv接头。在许多情况下，scFv接头是带电荷的scFv接头，多个所述带电荷的scFv接头示出在图6中。因此，本文提供了带电荷的scFv接头以用于促进第一单体与第二单体之间的pI分离。也就是说，通过并入带正电荷或负电荷(或在使用不同单体上的scFv的支架的情况下两者皆有)的带电荷的scFv接头，这允许包括带电荷的接头的单体更改pI而不对Fc结构域做出进一步改变。这些带电荷的接头可以被取代到含有标准接头的任何scFv中。再次，如本领域的技术人员将理解的，根据期望的pI变化，带电荷的scFv接头用在正确的“链”或单体上。例如，如本文所讨论的，为了形成1+1Fab-scFv-Fc格式异源二聚抗体，计算每个期望抗原结合结构域的Fv区的原始pI，并且一个被选择成形成scFv，并且根据pI，选择正或负接头。

带电荷的结构域接头还可以用于增加本发明的单体的pI分离，并且因此图6中所包含的那些在本文中可以用于利用接头的任何实施方案中。

所提供的B7H3结合结构域和CD28结合结构域可以包含在任何有用的抗体格式中，包括例如经典的免疫球蛋白，以及本文提供的“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”格式(参见例如图25)。其它有用的抗体格式包括但不限于“mAb-Fv”、“mAb-scFv”、“中心Fv”、“单臂scFv-mAb”、“scFv-mAb”、“双重scFv”和“三叉”格式抗体，如US20180127501A1中所公开，其通过引用并入本文，特别是在与抗体格式相关的相关部分中(参见例如图2)。

在一些实施方案中，主题抗体包含本文提供的B7H3 ABD中的一个或多个。在一些实施方案中，抗体包含一个B7H3 ABD。在其它实施方案中，抗体包含两个B7H3 ABD。在示例性实施方案中，B7H3 ABD包括以下B7H3 ABD中的一个的可变重结构域和可变轻结构域：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2F4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704(图26-31以及序列表)。在一些实施方案中，B7H3ABD是以下B7H3 ABD：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9、m1704(图26-31以及序列表)。

在示例性实施方案中，抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含一个或两个B7H3ABD，包括本文提供的B7H3 ABD中的任一个。包含此类B7H3 ABD的双特异性抗体包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”双特异性格式抗体(图25)。在示例性实施方案中，B7H3 ABD是以下B7H3 ABD中的一个：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9、m1704(图26-31以及序列表)。在例示性实施方案中，B7H3结合结构域是Fab。在一些实施方案中，此类双特异性抗体是异源二聚双特异性抗体，所述异源二聚双特异性抗体包括本文所述的任何异源二聚化偏斜变体、pI变体和/或消融变体。参见图8。

在一些实施方案中，主题抗体包含本文提供的CD28 ABD中的一个或多个。在一些实施方案中，抗体包含一个CD28 ABD。在其它实施方案中，抗体包含两个CD28 ABD。在示例性实施方案中，抗体包含CD28 ABD中的一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGNl412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。

在例示性实施方案中，抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含一个或两个CD28ABD，包含本文提供的CD28 ABD中的任一个。包含此类CD28 ABD的双特异性抗体包括例如“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”双特异性格式抗体(图25)。在示例性实施方案中，CD28 ABD是以下CD28 ABD中的一个：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_HIL1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。在示例性实施方案中，CD28 ABD是包含在“1+1Fab-scFv-Fc”或“2+1Fab₂-scFv-Fc”双特异性格式抗体中的抗CD28 scFv(图25)。在一些实施方案中，此类双特异性抗体是异源二聚双特异性抗体，所述异源二聚双特异性抗体包括本文所述的任何异源二聚化偏斜变体、pI变体和/或消融变体。参见图8。

A.嵌合抗体和人源化抗体

在某些实施方案中，本文提供的主题抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类抗体可以包括人类抗体或由其组成，所述人类抗体包括作为特定种系序列的“产物”或“源自”特定种系序列的重链可变区或轻链可变区。作为人类生殖系免疫球蛋白序列“的产物”或“来源于”其的人类抗体可以通过将人类抗体的氨基酸序列与人类生殖系免疫球蛋白的氨基酸序列比较且选择与人类抗体的序列在序列方面最接近(也就是说，最大同一性％)的人类生殖系免疫球蛋白序列(使用本文所概述的方法)来鉴别出来。由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变，作为特定人类生殖系免疫球蛋白序列“的产物”或“来源于”特定人类生殖系免疫球蛋白序列的人类抗体与生殖系序列相比可含有氨基酸差异。然而，人源化抗体通常与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％相同，并且在与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)进行比较时，含有将抗体鉴定为源自人类序列的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少95％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，源自特定人类种系序列的人源化抗体将显示出与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于10-20个氨基酸差异(在引入本文中的任何偏斜变体、pI变体和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常较低)。在某些情况下，相比于由生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，人源化抗体可显示不超过5个或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸差异(同样，在引入本文的任何偏斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体数目通常较低)。

在一个实施方案中，亲本抗体已经发生亲和力成熟，如所属领域中已知。可以利用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟，例如如USSN 11/004,590中所述。基于选择的方法可以用于人源化和/或亲和成熟抗体可变区，包括但不限于以下文献中所述的方法：Wu等人，1999，《分子生物学杂志》294：151-162；Baca等人，1997，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》272(16)：10678-10684；Rosok等人，1996,《生物化学杂志》271(37)：22611-22618；Rader等人，1998，《美国国家科学院院刊》95：8910-8915；Krauss等人，2003,《蛋白质工程化(Protein Engineering)》16(10)：753-759，其以引用的方式整体并入本文中。其它人源化方法可涉及仅移植部分CDR，包括但不限于以下文献中所述的方法：USSN09/810,510；Tan等人，2002，《免疫学杂志》169：1119-1125；De Pascalis等人，2002，《免疫学杂志》169：3076-3084，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。

B.抗CD28 x抗肿瘤相关抗原(TAA)抗体

在另一方面，本文提供了抗CD28 x抗TAA抗体。在一些实施方案中，抗CD28 x抗TAA抗体包括CD28结合结构域和一个或多个结合肿瘤相关抗原的结合结构域。在一些实施方案中，抗体的CD28结合结构域是激动性CD28结合结构域，其通过结合T细胞上的CD28来提供共刺激功能。因此，本文提供的抗CD28 x抗TAA抗体选择性地增强表达特定TAA(例如，B7H3)的肿瘤部位的免疫反应。在一些实施方案中，抗CD28 x抗TAA抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，抗CD28 x抗TAA抗体是三特异性抗体。在一些实施方案中，抗CD28 x抗TAA抗体是二价抗体。在一些实施方案中，抗CD28x抗TAA抗体是三价抗体。在一些实施方案中，抗CD28x抗TAA抗体是双特异性二价抗体。在示例性实施方案中，抗CD28x抗TAA抗体是双特异性三价抗体。

如本文更全面概述，抗CD28 x抗TAA抗体可以呈多种格式，如下所概述。示例性格式包括本文提供的“1+1Fab-scFv-Fc”、“2+1Fab₂-scFv-Fc”、“1+1共同轻链”和“2+1共同轻链”格式(参见例如图25)。其它有用的抗体格式包括但不限于“mAb-Fv”、“mAb-scFv”、“中心Fv”、“单臂scFv-mAb”、“scFv-mAb”、“双重scFv”和“三叉”格式抗体，如US20180127501A1中所公开，其通过引用并入本文，特别是在与抗体格式相关的相关部分中(参见例如图2)。

抗CD28 x抗TAA抗体可以包括任何合适的CD28 ABD，包括本文所述的那些。在一些实施方案中，CD28ABD是激动性ABD，其在与CD28结合时提供共刺激功能。在一些实施方案中，抗CD28 x抗TAA抗体包括CD28结合结构域，其包括以下CD28结合结构域中的一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_HIL1、281VI4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0和hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)或其变体。

本文提供的抗CD28 x抗TAA抗体可以包括一个或多个TAA结合结构域。在一些实施方案中，抗CD28 x抗TAA抗体包括一个TAA结合结构域。在某些实施方案中，抗CD28 x抗TAA抗体包括两个TAA结合结构域。任何合适的TAA结合结构域都可以包含在主题抗CD28 x抗TAA抗体中，这取决于选择用于靶向的肿瘤。可被本文提供的抗CD28 x抗TAA抗体靶向的TAA包括但不限于：B7H、CD20、CD38、CD123；ROR1、ROR2、BCMA；PSMA；SSTR2；SSTR5、CD19、FLT3、CD33、PSCA、ADAM17、CEA、Her2、EGFR、EGFR-vIII、CD30、FOLR1、GD-2、CA-IX、Trop-2、CD70、CD38、间皮素(mesothelin)、EphA2、CD22、CD79b、GPNMB、CD56、CD138、CD52、CD74、CD30、CD123、RON、ERBB2和EGFR。例如，在US20160355608和US20170209492中描述了另外的TAA，在此将其并入与肿瘤相关抗原相关的相关部分中。可包含在本发明抗CD28 x抗TAA抗体中的合适TAA结合结构域已被公开，例如US20190248898A1(SSTR2)、US20200165356A1(FAP)、US20170320947A1(PSMA)，这些文献均通过引用并入与TAA结合结构域相关的相关部分中。

在某些实施方案中，抗CD28 x抗TAA抗体包括B7H3结合结构域。在一些实施方案中，这种抗CD28 x抗B7H3(本文也称为“αB7H3 x αCD28”或“αCD28 x αB7H3”)双特异性抗体包括至少一个B7H3 ABD和至少一个CD28结合结构域。在示例性实施方案中，抗CD28 x抗B7H3双特异性抗体包括两个B7H3结合结构域。在一些实施方案中，双特异性抗体的CD28结合结构域是激动性CD28结合结构域，其通过结合T细胞上的CD28来提供共刺激功能。因此，本文提供的双特异性αB7H3 x αCD28选择性地增强表达B7H3的肿瘤部位的免疫反应。

抗CD28 x抗B7H3双特异性抗体可包括任何合适的CD28 ABD和B7H3 ABD，包括本文所述的那些。在一些实施方案中，抗CD28 x抗B7H3双特异性抗体包括CD28结合结构域，其包括以下CD28结合结构域中的一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_HIL1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)或其变体。在一些实施方案中，B7H3 ABD包括下列B7H3 ABD中的一个的可变重结构域和可变轻结构域：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704(图26-31和序列表)或其变体。

应注意，除非本文另外说明，否则以名称列出的抗原的顺序不赋予结构；也就是说，抗B7H3 X抗CD281+1Fab-scFv-Fc抗体可以具有与B7H3或CD28结合的scFv，但是在一些情况下，所述顺序指定了如所指示结构。

此外，在其中主题抗体包含scFv的实施方案中，scFv可以从N末端至C末端处于VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH的取向。在一些格式中，一个或多个ABD通常是Fab，其包括在一条蛋白质链上的VH结构域(通常作为重链的组分)和在另一条蛋白质链上的VL(通常作为轻链的组分)。

如本领域的技术人员将理解的，任何一组6个CDR或VH和VL结构域可以呈scFv格式或Fab格式，所述格式然后被添加到重恒定结构域和轻恒定结构域，其中重恒定结构域包括变体(包含在CH1结构域以及Fc结构域内)。序列表中含有的scFv序列利用特定带电荷的接头，而如本文概述的，可以使用不带电荷的或其它带电荷的接头，包含图6中所描述的那些。

另外，如上文所讨论的，序列表中使用的用于鉴定CDR的编号是Kabat，然而，可以使用不同的编号，所述不同的编号将改变如表2所示的CDR的氨基酸序列。

对于本文所列出的所有可变重结构域和可变轻结构域，可以制备另外的变体。如本文概述的，在一些实施方案中，一组6个CDR可以具有0个、1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(其中氨基酸取代有特定用途)以及可变重结构域和可变轻结构域的框架区的变化，只要框架(除CDR之外)保持与选自图1中的美国专利7,657,380中列出的那些序列的人种系序列至少约80％、85％或90％同一性，所述美国专利的附图和图例通过引用整体并入本文。因此，例如，如本文所描述的相同CDR可以与来自人种系序列的不同框架序列组合，只要框架区保持与选自图1中的美国专利7,657,380中列出的那些序列的人种系序列至少80％、85％或90％同一性。可替代地，CDR可以具有氨基酸修饰(例如，一组CDR中的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(也就是说，只要一组6个CDR的变化的总数量小于6个氨基酸修饰，CDR就可以被修饰，其中CDR的任何组合被改变；例如，vlCDR1中可以存在一个改变，vhCDR2中可以存在两个改变，vhCDR3中不存在改变等))，并且具有框架区改变，只要框架区与选自图1中的美国专利7,657,380中列出的那些序列的人种系序列保持至少80％、85％或90％同一性。

C.异源二聚抗体

在示例性实施方案中，本文提供的抗CD28 x抗TAA(例如，抗CD28 x抗B7H3)抗体是异源二聚双特异性抗体，其包括两个变体Fc结构域序列。此类变体Fc结构域包含氨基酸修饰以促进异源二聚抗体的自组装和/或纯化。

抗体技术中正存在的一个问题是期望“双特异性”抗体同时与两种不同抗原结合，通常由此允许不同抗原接近且从而产生新功能和新疗法。通常，这些抗体是通过将每条重链和轻链的基因纳入宿主细胞中来产生。这通常导致期望的异源二聚体(A-B)以及两个同源二聚(A-A和B-B(不包含轻链异源二聚体问题))形成。然而，形成双特异性抗体的主要障碍是难以使期望异源二聚抗体的形成偏向于同源二聚的形成和/或难以从同二聚抗体中纯化异源二聚抗体。

存在多种机制可以用于产生主题异源二聚抗体。另外，如本领域的技术人员将理解的，这些不同的机制可以组合以确保高异源二聚化。促进异源二聚体的产生和纯化的氨基酸修饰通常统称为“异源二聚化变体”。如下文所讨论的，异源二聚化变体包含“偏斜”变体(例如，下文所述“杵和臼(knobs and holes)”和“电荷对”变体)以及“pI变体”，这允许从同源二聚纯化异源二聚体。如在美国专利US 9,605,084(其全部内容通过引用并入本文)中一般性描述的，并且特别是如下文对异源二聚化变体所讨论，异源二聚化的有用机理包括美国专利US 9,605,084中所述的“杵和臼”(“KIH”)、美国专利US 9,605,084中描述的“静电转向(electrostatic steering)”或“电荷对”、美国专利US 9,605,084中描述的pI变体以及美国专利US 9,605,084中概述的一般其它Fc变体及以下内容。

可用于形成和纯化主题异源二聚抗体(例如，双特异性抗体)的异源二聚化变体在下文进一步详细讨论。

1.偏斜变体

在一些实施方案中，异源二聚抗体包含偏斜变体，所述偏斜变体是在第一Fc结构域(A)和/或第二Fc结构域(B)中的一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰有利于形成Fc异源二聚体(包含第一Fc结构域和第二Fc结构域的Fc二聚体)；(A-B)超过Fc同源二聚(包含第一Fc结构域中的两个或第二Fc结构域中的两个的Fc二聚体；A-A或B-B)。适合的偏斜变体包括在美国公开申请2016/0355608的图29以及图3和9中，所述美国公开申请特此通过引用整体并且具体地针对其偏斜变体的公开内容并入。

一种特定类型的偏斜变体在本领域中通常被称为“杵和臼”，是指产生空间影响以有利于异源二聚体形成并且不利于同源二聚形成的氨基酸工程化，如在USSN 61/596,846；Ridgway等人，《蛋白质工程化》9(7)：617(1996)；Atwell等人，《分子生物学杂志》1997270：26；美国专利8,216,805中所述，所有所述文献通过引用整体并且具体地针对“杵和臼”突变的公开内容并入。这在本文中有时被称为“空间变体”。附图鉴定了依赖于“杵和臼”的多个“单体A-单体B”对。另外，如在Merchant等人，《自然生物科技(Nature Biotech.)》16：677(1998)中所述，这些“杵和臼”突变可以与二硫键组合以进一步有利于形成Fc异源二聚体。

用于生成异源二聚体的另一种方法有时被称为“静电转向”，如特此通过引用整体并入的Gunasekaran等人，《生物化学杂志》285(25)：19637(2010)所述。这在本文中有时被称作“电荷对”。在此实施方案中，静电用于使形成朝着异源二聚化偏斜。如本领域的技术人员将理解的，这些电荷对还可能影响pI并因此对影响纯化，并且因此在一些情况下还可以被视为pI变体。然而，由于这些电荷对被生成以迫使进行异源二聚化并且不用作纯化工具，因此其被分类为“偏斜变体”。这些电荷包含但不限于与D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E(例如，这些是“单体对应组”)和与C220R/E224R/P228R/K409R配对的C220E/P228E/368E。

在一些实施方案中，偏斜变体有利地并且同时有利于基于“杵和臼”机制以及“静电转向”机制的异源二聚化。在一些实施方案中，异源二聚抗体包含一组或多组此类异源二聚化偏斜变体。这些变体以成“对”的“组”出现。也就是说，将一组对并入第一单体中且将另一组对并入第二单体中。应注意，这些组不一定表现为“杵和臼”变体，其中在一个单体上的残基与另一个单体上的残基之间存在一一对应。也就是说，这些成对的组相反可以形成两个单体之间的界面，所述界面鼓励异源二聚体形成并且不鼓励同源二聚形成，从而允许在生物学条件下自发形成的异源二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％(25％同源二聚A/A：50％异源二聚体A/B：25％同源二聚B/B)。图4中描绘了示例性的异源二聚化“偏斜”变体。在示例性实施方案中，异源二聚抗体包含S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T41 1T/E360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L；K370S：S364K/E357Q；或T366S/L368A/Y407V：T366W(任选地包括桥接二硫键，T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)“偏斜”变体氨基酸取代集。在示例性实施方案中，异源二聚抗体包含“S364K/E357Q：L368D/K370S”氨基酸取代集。就命名而言，配对“S364K/E357Q：L368D/K370S”意指一个单体包括具有氨基酸取代S364K和E357Q的Fc结构域，且另一单体包括具有氨基酸取代L368D和K370S的Fc结构域；如上所述，这些配对的“链性”取决于起始pI。

在一些实施方案中，本文提供的偏斜变体可以任选地并且独立地与任何其它修饰(包括但不限于其它偏斜变体(参见例如，美国公开申请2012/0149876的图37中，所述美国公开申请通过引用并入本文，特别针对偏斜变体的公开内容并入)、pI变体、同种型变体、FcRn变体、消融变体等)一起并入异源二聚抗体的第一Fc结构域和第二Fc结构域中的一个或两个中。此外，单个修饰也可以独立地并且任选地包含在主题异源二聚抗体中或从主题异源二聚抗体中排除。

在一些实施方案中，本文概述的偏斜变体可以任选且独立地与任何pI变体(或其它变体，如Fc变体、FcRn变体等)一起并入一个或两个重链单体中，并且可以独立地且任选地包含或不包含在主题异源二聚抗体中。

2.用于异源二聚体的pI(等电点)变体

在一些实施方案中，异源二聚抗体包含有利地允许从同源二聚蛋白质分离异源二聚抗体(例如，抗B7H3 x抗CD28双特异性抗体)的纯化变体。

存在若干种基本机制可以导致易于纯化异源二聚化抗体。例如，对抗体重链单体A和B中的一者或两者的修饰，使得每个单体具有不同的pI，允许从单体A-A和B-B蛋白等电纯化异源二聚A-B抗体。可替代地，一些支架格式，如“1+1Fab-scFv-Fc”格式、“2+1Fab₂-scFv-Fc”格式和“2+1CLC”格式允许基于大小进行分离。如本文所述，还可能使用偏斜变体，相对于同源二聚“偏斜”异源二聚体的形成。因此，异源二聚化偏斜变体和pI变体的组合特别用于本文提供的异源二聚抗体中。

另外，如下文更全面地概述的，根据异源二聚抗体的格式，可以使用包含在单体的恒定区和/或Fc结构域内的pI变体和/或结构域接头。在一些实施方案中，异源二聚抗体包含对于还可以产生pI变化的替代性功能的另外的修饰，如Fc、FcRn和KO变体。

在一些实施方案中，本文提供的主题异源二聚抗体包含至少一个单体，所述至少一个单体具有改变单体的pI的一个或多个修饰(即，“pI变体”)。通常，如本领域的技术人员将理解的，pI变体存在两种通用类别：提高蛋白质pI(碱性变化)的变体和降低蛋白质pI(酸性变化)的变体。如本文所述，可以进行这些变体的所有组合：一种单体可以是野生型，或者不显示与野生型显著不同的pI的变体，并且另一种可以是更碱性或更酸性的。可替代地，改变每种单体，一种具有更强碱性且一种具有更强酸性。

根据异源二聚抗体的格式，pI变体可以包含在单体的恒定和/或Fc结构域内，或者可以使用带电荷的接头，结构域接头或scFv接头。也就是说，利用如“1+1Fab-scFv-Fc”等一个或多个scFv的抗体格式可以包含出于纯化目的给出另外的pI助推的带电荷的scFv接头(带正电荷或负电荷)。如本领域的技术人员将理解，一些1+1Fab-scFv-Fc和2+1Fab₂-scFv-Fc格式可与仅带电scFv接头一起使用而无另外的pI调整，但是本发明还提供了在单体中的一个或两个上的pI变体和/或带电结构域接头。另外，用于替代功能的额外氨基酸工程化也可赋予pI变化，例如Fc、FcRn和KO变体。

在将pI用作分离机制以允许纯化异源二聚蛋白的本发明异源二聚抗体中，将氨基酸变体引入到单体多肽中的一个或两个单体多肽中。也就是说，所述单体之一(为了简单起见，在本文中被称为“单体A”)的pI可以被工程化为远离单体B，或单体A和单体B两者均可以随着单体A的pI增加和单体B的pI降低而改变。如下文更全面地概述的，任一个或两个单体的pI变化可以通过以下来完成：去除或添加带电荷的残基(例如，用带正电或带负电的氨基酸残基来代替中性氨基酸，例如甘氨酸到谷氨酸)、将带电荷的残基从带正电荷或带负电荷改变为相反电荷(例如，天冬氨酸到赖氨酸)或将带电荷的残基改变为中性残基(例如，电荷损失；赖氨酸到丝氨酸)。图3和图4中示出了多种这些变体。

因此，在一些实施方案中，主题异源二聚抗体包含在恒定区中的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)并入单体中的一个或两个中来更改二聚体蛋白的单体中的至少一个(如果不是两个)的等电点(pI)以形成“pI抗体”。如本文所示，如果两种单体的pI差别小至0.1pH单位，则可以实现异源二聚体与两种同源二聚的分离，其中0.2、0.3、0.4和0.5或更高都可用于本发明。

如本领域技术人员将理解，每个或两个单体上要包含的用于得到良好分离的pI变体的数量将部分地取决于组分的起始pI，例如在1+1Fab-scFv-Fc、2+1Fab₂-scFv-Fc、1+1CLC和2+1CLC格式中，所关注scFv(1+1Fab-scFv-Fc、2+1Fab₂-scFv-Fc)和Fab的起始pI。即，为了确定对哪个单体进行工程化或处于哪个“方向”(例如，更具阳性或更具阴性)，计算这两种靶抗原的Fv序列并据此作出决定。如本领域已知的，不同的Fv将具有用于本发明中的不同起始pI。通常，如本文概述的，pI经工程化而使得每种单体的总pI差异达到至少约0.1log，如本文概述的优选0.2到0.5。

在pI变体用于实现异源二聚化的情况下，通过使用一个或多个重链的一个或多个恒定区，提供了用于设计和纯化双特异性蛋白质(包含抗体)的更模块化方法。因此，在一些实施方案中，异源二聚化变体(包含偏斜和pI异源二聚化变体)并不包含在可变区中，使得每个单独的抗体必须工程化。另外，在一些实施方案中，通过导入来自不同IgG同种型的pI变体以便在不引入显著免疫原性的情况下改变pI来显著降低pI变体导致免疫原性的可能性。因此，待解决的另一个问题是阐明具有高人类序列含量的低pI恒定结构域，例如最小化或避免任何特定位置的非人类残基。可替代地或除同种型取代外，通过利用同配取代(例如，Asn至Asp；和Gln至Glu)显著降低了pI变体导致免疫原性的可能性。

如下文所论述，可能与这个pI工程化一起发生的负效应同样是血清半衰期延长和FcRn结合增加。也就是说，如在美国公开申请US 2012/0028304(以引用方式整体并入)中所述，降低抗体恒定结构域(包含在抗体和Fc融合中找到的那些)的pI可能导致血清保留在体内更长时间。具有增加的血清半衰期的这些pI变体也促进了pI变化以进行纯化。

另外，应注意，pI变体给予了双特异性抗体的分析和质量控制过程另外益处，因为在同源二聚存在时消除、最小化和区分的能力是显著的。类似地，可靠地测试异源二聚抗体产生的再现性的能力是重要的。

通常，特定用途的实施方案依赖于包含偏斜变体的变体组，相比于同源二聚化形成，所述偏斜变体与pI变体结合促成异源二聚化形成，所述pI变体增加两个单体之间的pI差异以促进将异源二聚体从同源二聚中纯化出来。

pI变体的示例性组合示出于美国公开申请2016/0355608中的图4和5以及图30中，所有所述文献通过引用整体并入本文，特别是针对pI变体的公开内容并入。图3和4中示出了pI变体的优选组合。如本文所概述且如图中所示，这些变化是相对于IgG1展示，而且所有同型以及同型杂合体均可以按此方式改变。在重链恒定结构域来自IgG2-4的情况下，也可以使用R133E和R133Q。

在一个实施方案中，pI变体的优选组合具有包括208D/295E/384D/418E/421D变体(在相对于人IgG1时是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)的一个单体(负Fab侧)和包括带正电荷的scFv接头的第二单体(正scFv侧)，包含(GKPGS)₄(SEQ ID NO：796)。然而，如本领域的技术人员将理解的，第一单体包含CHI结构域，其包含位置208。因此，在不包含CH1结构域的构建体中(例如对于在其中一个结构域上不利用CH1结构域的抗体)，优选的负pI变体Fc组包括295E/384D/418E/421D变异(当相对于人IgG1时，Q295E/N384D/Q418E/N421D)。

因此，在一些实施方案中，一个单体具有来自图4的一组取代并且另一个单体具有带电荷的接头(呈带电荷的scFv接头的形式，因为所述单体包括如格式所指示的scFv或带电荷的结构域接头，所述带电荷的结构域接头可以选自图6中所描绘的那些)。

在一些实施方案中，在Fc结构域的铰链中进行修饰，包括基于EU编号的位置216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229和230。因此，可以在位置216-230中的一个或多个中制造pI突变并且特别是取代，其中1个、2个、3个、4个或5个突变是有用的。再次地，考虑了单独的或与其它结构域中的其它pI变体一起的所有可能的组合。

可用于降低铰链结构域的pI的具体取代包括但不限于221位处的缺失、222位处的非天然缬氨酸或苏氨酸、223位处的缺失、224位处的非天然谷氨酸、225位处的缺失、235位处的缺失，以及236位处的缺失或非天然丙氨酸。在一些情况下，仅在铰链结构域中进行pI取代，并且在其它情况下，这些取代以任何组合添加到其它结构域中的其它pI变体。

在一些实施方案中，可以在CH2区结构域中制造突变，包括基于EU编号的位置233、234、235、236、274、296、300、309、320、322、326、327、334和339。应该注意，可以进行233-236的改变以增加IgG2主链中的效应子功能(以及327A)。同样，这14个位置的所有可能的组合都可以进行；例如，本文提供的抗CD28或抗B7H3抗体可包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个CH2 pI取代的变体Fc结构域。

可用于降低CH2结构域的pI的具体取代包括但不限于：位置274处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置296处的非天然苯丙氨酸、位置300处的非天然苯丙氨酸、位置309处的非天然缬氨酸、位置320处的非天然谷氨酸、位置322处的非天然谷氨酸、位置326处的非天然谷氨酸、位置327处的非天然甘氨酸、位置334处的非天然谷氨酸、位置339处的非天然苏氨酸，以及CH2内的和与其它结构域的所有可能组合。

在此实施方案中，修饰可以独立地并且任选地选自CH3区的位置355、359、362、384、389、392、397、418、419、444和447(EU编号)。可用于降低CH3结构域的pI的具体取代包括但不限于：位置355处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置384处的非天然丝氨酸、位置392处的非天然天冬酰胺或谷氨酸、位置397处的非天然甲硫氨酸、位置419处的非天然谷氨酸、位置359处的非天然谷氨酸、位置362处的非天然谷氨酸、位置389处的非天然谷氨酸、位置418处的非天然谷氨酸、位置444处的非天然谷氨酸，以及位置447处的缺失或非天然天冬氨酸。

3.同种型变体

另外，主题异源二聚抗体的许多实施方案依赖于特定位置处的pI氨基酸从一个IgG同种型到另一个的“引进(importation)”，由此降低或消除将不想要的免疫原性引入到变体中的可能性。在美国公开2014/0370013的图21中示出了多种这些变体，所述美国公开特此通过引用并入。也就是说，出于多种原因，IgG1是治疗性抗体的常用同种型，包含高效应子功能。然而，IgG1的重恒定区具有比IgG2的重恒定区更高的pI(8.10相对于7.31)。通过将特定位置的IgG2残基引入IgG1主链中，使得所得单体的pI降低(或提高)且另外展现出较长的血清半衰期。例如，IgG1具有位置137处的甘氨酸(pI为5.97)，并且IgG2具有谷氨酸(pI为3.22)；输入谷氨酸将影响所得蛋白质的pI。如下文所描述的，通常需要多个氨基酸取代来显著影响变体抗体的pI。然而，应注意，如下文所讨论的，即便是IgG2分子发生变化也允许血清半衰期增加。

在其它实施方案中，进行非同种型氨基酸变化，以减少所得蛋白质的总电荷状态(例如通过将更高的pI氨基酸变为更低的pI氨基酸)，或允许在结构中调节稳定性等等，如下文更进一步描述。

另外，通过pI工程化重恒定结构域和轻恒定结构域两者，可以看到异源二聚体的每个单体的显著变化。如本文所讨论，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电点聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。

4.计算pI

本文提供的抗体的每个单体的pI可以取决于变体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，所述总单体包含变体重链恒定结构域和融合配偶体。因此，在一些实施方案中，使用美国公开2014/0370013中的图19的图表，基于变体重链恒定结构域计算pI变化。如本文所讨论的，要工程化哪个单体通常由Fv和支架区的固有pI来决定。可替代地，可以比较每个单体的pI。

5.还赋予更好的FcRn体内结合的pI变体

在pI变体减小单体的pI的情况下，pI变体可以具有提高体内血清固位的附加益处。

虽然仍在审查中，但是据信，Fc区在体内具有较长的半衰期，因为在核内体中以pH6与FcRn的结合螯合了Fc(Ghetie和Ward，1997《今日免疫学(Immunol Today.)》18(12)：592-598，所述文献特此通过引用整体并入)。核内体区室然后使Fc循环到细胞表面。一旦区室向胞外空间打开，则约7.4的较高pH诱导将Fc释放回到血液中。在小鼠中，Dall′Acqua等人显示了，在pH为6和pH为7.4时具有增加的FcRn结合的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度和与野生型Fc相同的半衰期(Dall′Acqua等人，2002，《免疫学杂志》169：5171-5180，所述文献通过引用整体并入)。据认为，在pH为7.4时FcRn的Fc的增加的亲和力阻止将Fc释放回到血液中。因此，将增加Fc体内半衰期的Fc突变理想地将增强较低pH下的FcRn结合，同时仍允许Fc在较高pH下释放。在6.0至7.4的pH范围内，氨基酸组胺酸改变了其电荷状态。因此，在Fc/FcRn复合物中的重要位置处发现His残基不足为奇。

最近，已经提出，带具有较低等电点的可变区的抗体还可以具有较长的血清半衰期(Igawa等人，2010《蛋白质工程设计与选择(PEDS)》23(5)：385-392，所述文献以引用方式整体并入)。然而，对其机制仍知之甚少。而且，可变区因抗体而有所不同。具有降低的pI和延长的半衰期的恒定区变体将会提供更具模块化的方法来提高抗体的药代动力学性质，如本文所描述的。

D.用于另外功能的另外Fc变体

除了上文所讨论的异源二聚化变体之外，存在出于各种原因可以作出的许多有用的Fc氨基酸修饰，包含但不限于更改与一个或多个FcγR受体的结合、更改与FcRn受体的结合等，如以下所讨论的。

因此，本文提供的抗体(异源二聚以及同二聚)可以包含具有或不具有本文概述的异源二聚化变体(例如，pI变体和空间变体)的此类氨基酸修饰。每组变体可以独立地且任选地包含在内或不包含在任何特定异源二聚蛋白中。

1.FcγR变体

因此，存在可以作出以更改与FcγR受体中的一个或多个的结合的多个有用Fc取代。在某些实施方案中，主题抗体包含更改与一种或多种FcγR受体的结合的修饰(即，“FcγR变体”)。导致增加的结合以及减少的结合的取代可以是有用的。例如，已知增加与FcγRIIIa的结合通常导致ADCC增加(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；其中表达FcγR的非特异性毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞裂解的细胞介导的反应)。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb的结合减弱(抑制性受体)也可能是有利的。可用于主题抗体的氨基酸取代包含在美国专利8,188,321(具体地图41)和8,084,582以及美国公开申请第20060235208号和第20070148170号中所列举的氨基酸取代，所有所述美国专利通过引用整体明确并入本文，特别是针对影响Fcγ受体结合的在其中公开的变体明确并入本文。可使用的特定变体包含但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。此类修饰可以包含在主题抗体的一个或两个Fc结构域中。

在一些实施方案中，主题抗体包含增加血清半衰期的一个或多个Fc修饰。如特此通过引用整体并入的USSN 12/341,769中具体公开的可用于增加与FcRn受体的结合并且增加血清半衰期的Fc取代包含但不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I或V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。此类修饰可以包含在主题抗体的一个或两个Fc结构域中。

2.消融变体

在一些实施方案中，异源二聚抗体(例如，抗B7H3 x抗CD28双特异性抗体)包括减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如，FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合以避免另外的作用机制的一个或多个修饰。此类修饰被称为“FcγR消融变体”或“Fc敲除(FcKO或KO)”变体。在这些实施方案中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合以避免另外的作用机制。也就是说，例如，在许多实施方案中，特别是在使用与CD28单价地结合的双特异性抗体中，通常期望的是消融FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性。在一些实施方案中，本文所述的主题抗体的Fc结构域中的至少一个包括一种或多种Fcγ受体消融变体。在一些实施方案中，本文所述的主题抗体的Fc结构域两者均包括一种或多种Fcγ受体消融变体。图5中描绘了这些消融变体，并且各自可以独立且任选地包含在内或不包含在内，优选方面利用了选自由以下组成的组的消融变体：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。应注意本文中提及的消融变体消融FcγR结合，但是通常不消融FcRn结合。

如本领域所已知的，人IgG1的Fc结构域具有与Fcγ受体的最高结合，并且因此，在异源二聚抗体的主链中的恒定结构域(或Fc结构域)为IgG1时，可以使用消融变体。例如，可替代地或除了IgG1背景下的消融变体之外，糖基化位置297处的突变(通常突变成A或S)可以显著消融与FcγRIIIa的结合。人IgG2和IgG4具有与Fcγ受体天然减少的结合，并且因此那些主链可以在有或没有消融变体的情况下使用。

E.异源二聚变体和Fc变体的组合

如本领域技术人员将理解的，所有所述异源二聚化变体(包括偏斜和/或pI变体)都可以任选地并且独立地以任何方式组合，只要其保留其“链性”或“单体划分”。另外，所有这些变体可以组合成任何异源二聚化格式。

在pI变体的情况下，虽然附图中示出了有特定用途的实施方案，但是可以遵循更改两个单体之间的pI差异以促进纯化的基本规则，生成其它组合。

另外，任何异源二聚化变体，偏斜和pI，也独立地并且任选地与Fc消融变体、Fc变体、FcRn变体组合，如本文总体概述的。

图8包括异源二聚1+1Fab-scFv-Fc、2+1Fab₂-scFv-Fc、1+1CLC和2+1CLC格式抗体的一些实施方案中所包括的变体的示例性组合。在一些实施方案中，异源二聚抗体包含如图8所示的变体的组合。在某些实施方案中，抗体是异源二聚11+1Fab-scFv-Fc、2+1Fab₂-scFv-Fc、1+1CLC或2+1CLC格式抗体。

F.有用的抗体格式

正如本领域技术人员所理解的和下面更全面讨论的，本文提供的异源二聚双特异性抗体可以呈现几种不同的构型，如图33和34所描绘。

如本领域的技术人员将理解的，本发明的异源二聚格式可以具有不同的化合价并且可以是双特异性的。也就是说，本发明的异源二聚抗体可以是二价和双特异性的，或三价和双特异性的，其中第一抗原通过两个结合结构域结合，并且第二抗原通过第二结合结构域结合。如本文所述，当CD28是靶抗原中的一个时，优选CD28仅单价结合。

本发明利用CD28抗原结合结构域与B7H3结合结构域的组合。如本领域的技术人员将理解，可以使用如在任何图(具体地参见图16-21)中所描绘的抗CD28 CDR、抗CD28可变轻结构域和可变重结构域、Fab和scFv的任何集合。类似地，可以使用任何抗B7H3抗原结合结构域，无论是否可以使用如在任何图(例如，图29-31)中所描绘的CDR、可变轻结构域和可变重结构域、Fab和scFv，任选地并且独立地以任何组合组合。

1.1+1Fab-scFv-Fc格式(“开瓶器(Bottle Opener)”)

在本文提供的主题双特异性抗体(例如，抗CD28 x抗B7H3抗体)中特别有用的一种异源二聚抗体格式是“1+1Fab-scFv-Fc”或“开瓶器”格式，如图33A所示。1+1Fab-scFv-Fc格式抗体包含第一单体，其为“常规”重链(VH1-CH1-铰链-CH2-CH3)，其中VH1为第一可变重结构域，并且CH2-CH3为第一Fc结构域。1+1Fab-scFv-Fc还包含轻链，所述轻链包含第一可变轻结构域VL1和恒定轻结构域CL。轻链与第一单体的VH1-CH1相互作用以形成第一抗原结合结构域，即Fab。抗体的第二单体包含第二结合结构域和第二Fc结构域，所述第二结合结构域是单链Fv(“scFv”，如下文所定义)。scFv包含第二可变重结构域(VH2)和第二可变轻结构域(VL2)，其中VH2使用可带电荷的scFv接头附接至VL2(参见例如图6)。scFv使用结构域接头附接至重链(参见例如，图7)。通过使用恒定区(例如，Fc结构域、CH1结构域和/或铰链区)中的如下文更全面地描述的促进异源二聚抗体形成的氨基酸变体(例如，上文所讨论的异源二聚化变体)，这两个单体被放在一起。此结构在本文中有时被称为“开瓶器”格式，这是由于与开瓶器具有大致视觉相似度。在一些实施方案中，1+1Fab-scFv-Fc格式抗体是二价抗体。

本发明的“1+1Fab-scFv-Fc”格式具有若干个明显优势。如本领域所已知的，依赖于两个scFv构建体的抗体类似物常常具有稳定性和聚合问题，在本发明中可以通过添加“常规”的重链和轻链配对来缓解所述稳定性和聚合问题。另外，如与依赖于两个重链和两个轻链的格式相反，不存在重链和轻链错误配对(例如，重链1与轻链2配对等)的问题。

在1+1Fab-scFv-Fc格式抗体的一些实施方案中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的一个是CD28结合结构域，并且另一个结合结构域是肿瘤相关抗原(TAA)结合结构域。在一些实施方案中，其中1+1Fab-scFv-Fc包含CD28结合结构域和肿瘤相关抗原(TAA)结合结构域，其是结合CD28的scFv和结合TAA的Fab。在一些实施方案中，TAA是B7H3。图35描绘了呈1+1Fab-scFv-Fc格式的示例性抗B7H3 x抗CD28双特异性抗体。

在一些实施方案中，1+1Fab-scFv-Fc格式抗体的第一Fc结构域和第二Fc结构域是变体Fc结构域，其包含异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和9所示的一组氨基酸取代)。特别有用的异源二聚化偏斜变体包含S364K/E357Q：L368D/K370S、L368D/K370S：S364K、L368E/K370S：S364K、T41 1T/E360E/Q362E：D401K、L368D/K370S：S364K/E357L、K370S：S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C(EU编号)。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域中的一个包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域中的另一个包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号进行的。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，变体Fc结构域包含消融变体(包括图5中所示的那些)。在一些实施方案中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域中的每一个包含消融变体E233P/L234V/L235A/G236/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包含pI变体(包括图4中所示的那些)。在示例性实施方案中，第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

在示例性实施方案中，第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，本文提供的1+1Fab-scFv-Fc格式抗体的scFv包含带电荷的scFv接头(包括图6中所示的那些)。在一些实施方案中，本文提供的1+1Fab-scFv-Fc格式抗体包含FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q；第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域中的每一个都包含消融变体E233P/L234V/L235A/G236/S267K；并且第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。在一些实施方案中，本文提供的1+1Fab-scFv-Fc格式抗体的scFv包含(GKPGS)₄带电荷的scFv接头。在一些实施方案中，本文提供的1+1Fab-scFv-Fc格式抗体包含FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，第一结合结构域或第二结合结构域中的一个结合CD28，并且另一个结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)(参见图34A)。主题1+1Fab-scFv-Fc格式抗体中可包含任何合适的CD28结合结构域，包括本文提供的任何CD28结合结构域。在一些实施方案中，CD28结合结构域是以下CD28结合结构域中的一个或其变体：1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。

在mAb-scFv格式的一些实施方案中，抗CD28 ABD具有VH结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ IDNO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ IDNO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650、SEQ IDNO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671和SEQ IDNO：672，和VL结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：874、SEQ IDNO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ IDNO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO：666、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：673、SEQ IDNO：674、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：684、SEQ IDNO：685、SEQ ID NO：686、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ IDNO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ IDNO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ IDNO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQ ID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ IDNO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQ ID NO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQ ID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：739、SEQ IDNO：740、SEQ ID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQ ID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ ID NO：750、SEQ IDNO：751、SEQ ID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQ ID NO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ ID NO：756。

在一些实施方案中，1+1Fab-scFv-Fc格式抗体的第一结合结构域或第二结合结构域中的一个结合肿瘤相关抗原(TAA)。合适的TAA包括本文公开的任何TAA。在示例性实施方案中，TAA是B7H3。任何合适的B7H3结合结构域可包含在主题1+1Fa＝b-scFv-Fc格式抗体中，包括本文提供的任何B7H3结合结构域。在一些实施方案中，B7H3结合结构域是以下B7H3结合结构域中的一个或其变体：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、hu1mAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9、m1704(图26-31以及序列表)。

在一些实施方案中，抗-B7H3 ABD具有VL结构域，其具有选自可变重结构域组成的组的氨基酸序列，所述可变重结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：500、SEQID NO：501、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：511、SEQID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：523、SEQID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：534、SEQID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：544、SEQ ID NO：545、SEQID NO：546、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：552、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：554、SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：556、SEQID NO：557、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：560、SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：563、SEQ ID NO：564、SEQ ID NO：565、SEQ ID NO：566、SEQ ID NO：567、SEQID NO：568、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：571、SEQ ID NO：572、SEQ ID NO：573、SEQ ID NO：574、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQID NO：579、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：581、SEQ ID NO：582、SEQ ID NO：583和SEQ ID NO：584；及VL结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：874和SEQ ID NO：932。

在一些实施方案中，抗B7H3 ABD包含具有SEQ ID NO：946的氨基酸序列的VH结构域；和具有SEQ ID NO：950的氨基酸序列的可变轻结构域。

在一些实施方案中，抗B7H3 ABD包含具有SEQ ID NO：956的氨基酸序列的VH结构域；和具有SEQ ID NO：960的氨基酸序列的可变轻结构域。

在一些实施方案中，抗B7H3 ABD包含具有SEQ ID NO：964的氨基酸序列的VH结构域；和具有SEQ ID NO：968的氨基酸序列的可变轻结构域。

在一些实施方案中，抗B7H3 ABD包含具有SEQ ID NO：972的氨基酸序列的VH结构域；和具有SEQ ID NO：976的氨基酸序列的可变轻结构域。

在一些实施方案中，1+1Fab-scFv-Fc格式的抗体包含结合CD28的第一结合结构域和结合B7H3的第二结合结构域。在一些实施方案中，CD28结合结构域是以下CD28结合结构域中的一个或其变体：1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。

在一些实施方案中，B7H3结合结构域是以下B7H3结合结构域中的一个或其变体：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9和m1704(图26-31以及序列表)。

在一些实施方案中，抗B7H3 ABD具有VH结构域和VL结构域，其具有选自以下对的氨基酸序列：a)来自奥博妥单抗的SEQ ID NO：89和93；b)来自依诺妥珠单抗的SEQ ID NO：97和101；c)来自BRCA84D的SEQ ID NO：105和109；d)来自BRCA69D的SEQ ID NO：113和117；e)来自PRCA157的SEQ ID NO：121和125；f)来自huPRCA157的SEQ ID NO：129和133；g)来自Mab-D的SEQ ID NO：137和141；h)来自humAb-D的SEQ ID NO：145和149；i)来自m30的SEQ IDNO：153和157；j)来自M30-H1-L4的SEQ ID NO：161和165；k)来自SP265的SEQ ID NO：169和173；1)来自S10-H50L58的SEQ ID NO：177和181；m)来自8H9的SEQ ID NO：185和189；n)来自m852的SEQ ID NO：193和197；o)来自m857的SEQ ID NO：201和205；p)来自m8524的SEQ IDNO：209和213；q)来自1-1的SEQ ID NO：217和221；r)来自1-2的SEQ ID NO：225和229；s)来自1-4的SEQ ID NO：233和237；t)来自1-5的SEQ ID NO：241和245；u)来自1-7的SEQ ID NO：249和253；v)来自2-5的SEQ ID NO：257和261；w)来自2-8的SEQ ID NO：265和269；x)来自chAb2的SEQ ID NO：273和277；y)来自chAb3的SEQ ID NO：281和285；z)来自chAb4的SEQ IDNO：289和293；aa)来自chAb18的SEQ ID NO：297和301；bb)来自chAb13的SEQ ID NO：305和309；cc)来自chAb12的SEQ ID NO：313和317；dd)来自chAb14的SEQ ID NO：321和325；ee)来自chAb6的SEQ ID NO：329和333；ff)来自chAb11的SEQ ID NO：337和341；gg)来自chAB16的SEQ ID NO：345和349；hh)来自chAb10的SEQ ID NO：353和357；ii)来自ChAb7的SEQ ID NO：361和365；jj)来自chAb8的SEQ ID NO：369和373；kk)来自chAb17的SEQ ID NO：377和381；ll)来自chAb5的SEQ ID NO：385和389；mm)来自huAb3v2.5的SEQ ID NO：393和397；nn)来自huAb3v2.6的SEQ ID NO：401和405；pp)来自huAb13v1的SEQ ID NO：409和413；qq)来自TPP-5706的SEQ ID NO：417和421；rr)来自TPP-6642的SEQ ID NO：425和429；ss)来自TPP-6850的SEQ ID NO：433和437；tt)来自TPP-3803的SEQ ID NO：441和445；uu)来自TRL4542的SEQID NO：449和453；vv)来自h1702的SEQ ID NO：457和461；ww)来自h1703的SEQ ID NO：465和469；xx)来自huA3的SEQ ID NO：473和477；yy)来自huA9的SEQ ID NO：481和485；和zz)来自m1704的SEQ ID NO：489和493。参见USSN 63/092,272中的图17。

图10示出了在1+1Fab-scFv-Fc格式抗体中有用的一些示例性Fc结构域序列。图10中描绘的“单体1”序列通常指“Fab-Fc重链”的Fc结构域，并且“单体2”序列指“scFv-Fc重链”的Fc结构域。此外，图12-15提供了可包含在1+1Fab-scFv-Fc格式的第一单体或第二单体中的示例性CH1-铰链结构域、CH1结构域和铰链结构域。此外，图16提供了可以此格式使用的有用CL序列。

2.2+1Fab₂-scFv-Fc格式(中心scFv格式)

在本文提供的主题双特异性抗体(例如，抗CD28 x抗B7H3抗体)中特别有用的一种异源二聚抗体格式是图33B中所示的2+1Fab₂-scFv-Fc格式(也称为“中心scFv格式”)。这种抗体格式包含三个抗原结合结构域：两个Fab部分和插入一个单体的VH-CH1与CH2-CH3区域之间的一个scFv。在这种格式的一些实施方案中，Fab部分各自结合肿瘤相关抗原(TAA)，并且“额外”scFv结构域结合CD28。在一些实施方案中，2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体是三价抗体。

在2+1Fab₂-scFv-Fc格式的一些实施方案中，第一单体包含标准重链(即VH1-CH1-铰链-CH2-CH3)，其中VH1是第一可变重结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域。第二单体包含另一个第一可变重结构域(VH1)、CH1结构域(和任选的铰链)、第二Fc结构域以及包含scFv可变轻结构域(VL2)、scFv接头和scFv可变重结构域(VH2)的scFv。使用任选的结构域接头(VH1-CH1-[任选的接头]-VH2-scFv接头-VH2-[任选的接头]-CH2-CH3或scFv的相反取向、VH1-CH1-[任选的接头]-VL2-scFv接头-VH2-[任选的接头]-CH2-CH3)来将scFv共价地附接在第二单体的CH1结构域的C端与第二Fc结构域的N端之间。任选的接头可以是任何合适的肽接头，包括例如图7中包括的结构域接头。这个实施方案还利用了包含可变轻结构域(VL1)和恒定轻结构域(CL)的共同轻链。共同的轻链与第一单体和第二单体的VH1-CH1结合以形成两个相同的Fab。在一些实施方案中，相同的Fab各自结合肿瘤相关抗原(例如，B7H3)。就本文的许多实施方案来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。

在一些实施方案中，2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体的第一Fc结构域和第二Fc结构域是变体Fc结构域，其包含异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和9中所示的一组氨基酸取代)。特别有用的异源二聚化偏斜变体包含S364K/E357Q：L368D/K370S、L368D/K370S：S364K、L368E/K370S：S364K、T411T/E360E/Q362E：D401K、L368D/K370S：S364K/E357L、K370S：S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C(EU编号)。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域中的一个包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域中的另一个包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号进行的。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，变体Fc结构域包含消融变体(包括图5中所示的那些)。在一些实施方案中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域中的每一个包含消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，本文提供的2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体的scFv包含带电荷的scFv接头(包括图6中所示的那些)。在一些实施方案中，本文提供的2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体包含FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q；第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域中的每一个都包含消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K；并且第一单体的恒定结构域(CHI-铰链-CH2-CH3)包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。在一些实施方案中，本文提供的2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体的scFv包含(GKPGS)₄带电荷的scFv接头。在一些实施方案中，本文提供的2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体包含FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体的第二单体的scFv是CD28结合，并且第一单体和第二单体的VH1以及共同轻链的VL1各自形成结合肿瘤相关抗原(TAA，例如B7H3)的结合结构域(参见图34B)。主题者2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体中可包含任何合适的CD28结合结构域，包括本文提供的任何CD28结合结构域。在一些实施方案中，CD28结合结构域是以下CD28结合结构域中的一个或其变体：1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。在mAb-scFv格式的一些实施方案中，抗CD28 ABD具有VH结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ IDNO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ IDNO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650、SEQ ID NO：651、SEQ IDNO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671和SEQ ID NO：672，和VL结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：874、SEQ ID NO：652、SEQ IDNO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ IDNO：664、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO：666、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：673、SEQ ID NO：674、SEQ IDNO：675、SEQ ID NO：676、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：684、SEQ ID NO：685、SEQ IDNO：686、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ IDNO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQ IDNO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718、SEQ IDNO：719、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQ ID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：729、SEQ IDNO：730、SEQ ID NO：731、SEQ ID NO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQ ID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：740、SEQ IDNO：741、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQ ID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ ID NO：750、SEQ ID NO：751、SEQ IDNO：752、SEQ ID NO：753、SEQ ID NO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ ID NO：756。

在一些实施方案中，第一单体和第二单体的VH1和2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体的共同轻链的VL1各自形成结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域(参见图34B)。合适的TAA包括本文公开的任何TAA。在示例性实施方案中，TAA是B7H3。主题2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体中可包含任何合适的B7H3结合结构域，包括本文提供的任何B7H3结合结构域。在一些实施方案中，B7H3结合结构域是以下B7H3结合结构域中的一个或其变体：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRI4542、h1702、h1703、huA3、huA9、m1704(图26-31以及序列表)。在一些实施方案中，抗B7H3 ABD具有VH结构域和VL结构域，其具有选自以下对的氨基酸序列：a)来自奥博妥单抗的SEQ ID NO：89和93；b)来自依诺妥珠单抗的SEQ ID NO：97和101；c)来自BRCA84D的SEQ ID NO：105和109；d)来自BRCA69D的SEQ ID NO：113和117；e)来自PRCA157的SEQ ID NO：121和125；f)来自huPRCA157的SEQ ID NO：129和133；g)来自Mab-D的SEQ ID NO：137和141；h)来自humAb-D的SEQ IDNO：145和149；i)来自m30的SEQ ID NO：153和157；j)来自M30-H1-L4的SEQ ID NO：161和165；k)来自SP265的SEQ ID NO：169和173；1)来自S10-H50L58的SEQ ID NO：177和181；m)来自8H9的SEQ ID NO：185和189；n)来自m852的SEQ ID NO：193和197；o)来自m857的SEQ IDNO：201和205；p)来自m8524的SEQ ID NO：209和213；q)来自1-1的SEQ ID NO：217和221；r)来自1-2的SEQ ID NO：225和229；s)来自1-4的SEQ ID NO：233和237；t)来自1-5的SEQ IDNO：241和245；u)来自1-7的SEQ ID NO：249和253；v)来自2-5的SEQ ID NO：257和261；w)来自2-8的SEQ ID NO：265和269；x)来自chAb2的SEQ ID NO：273和277；y)来自chAb3的SEQ IDNO：281和285；z)来自chAb4的SEQ ID NO：289和293；aa)来自chAb18的SEQ ID NO：297和301；bb)来自chAb13的SEQ ID NO：305和309；cc)来自chAb12的SEQ ID NO：313和317；dd)来自chAb14的SEQ ID NO：321和325；ee)来自chAb6的SEQ ID NO：329和333；ff)来自chAb11的SEQ ID NO：337和341；gg)来自chAB16的SEQ ID NO：345和349；hh)来自chAb10的SEQ IDNO：353和357；ii)来自ChAb7的SEQ ID NO：361和365；jj)来自chAb8的SEQ ID NO：369和373；kk)来自chAb17的SEQ ID NO：377和381；ll)来自chAb5的SEQ ID NO：385和389；mm)来自huAb3v2.5的SEQ ID NO：393和397；nm)来自huAb3v2.6的SEQ ID NO：401和405；pp)来自huAb13v1的SEQ ID NO：409和413；qq)来自TPP-5706的SEQ ID NO：417和421；rr)来自TPP-6642的SEQ ID NO：425和429；ss)来自TPP-6850的SEQ ID NO：433和437；tt)来自TPP-3803的SEQ ID NO：441和445；uu)来自TRL4542的SEQ ID NO：449和453；vv)来自h1702的SEQ IDNO：457和461；ww)来自h1703的SEQ ID NO：465和469；xx)来自huA3的SEQ ID NO：473和477；yy)来自huA9的SEQ ID NO：481和485；和zz)来自m1704的SEQ ID NO：489和493。参见USSN63/092,272中的图17。

图11示出了可以2+1Fab₂-scFv-Fc格式使用的一些示例性Fc结构域序列。图11中描绘的“单体1”序列通常指”Fab-Fc重链”的Fc结构域，并且“单体2”序列指“Fab-scFv-Fc重链”的Fc结构域。此外，图12-15提供了可包含在2+1Fab₂-scFv-Fc格式的第一单体或第二单体中的示例性CH1-铰链结构域、CH1结构域和铰链结构域。此外，图16提供了可以此格式使用的有用CL序列。图36描述了呈2+1Fab₂-scFv-Fc格式的示例性抗B7H3 x抗CD28双特异性抗体。

3.1+1CLC格式

在本文提供的主题双特异性抗体(例如，抗CD28 x抗B7H3抗体)中特别有用的一种异源二聚抗体格式是“1+1共同轻链”或“1+1CLC”格式，其描绘于图33C中。1+1CLC格式抗体包含第一单体，其包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；第二单体，其包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重结构域，并且CH2-C3是第二Fc结构域；和第三单体“共同轻链”，其包含VL-CL，其中VL是共同可变轻结构域，并且CL是恒定轻结构域。在此类实施方案中，VL与VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性的第一结合结构域；并且VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的第二结合结构域。在一些实施方案中，1+1CLC格式的抗体是二价抗体。

在一些实施方案中，1+1CLC格式的第一Fc结构域和第二Fc结构域是变体Fc结构域，其包含异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和9中所示的一组氨基酸取代)。特别有用的异源二聚化偏斜变体包含S364K/E357Q：L368D/K370S、L368D/K370S：S364K、L368E/K370S：S364K、T41 1T/E360E/Q362E：D401K、L368D/K370S：S364K/E357L、K370S：S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C(EU编号)。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域中的一个包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域中的另一个包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号进行的。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，第一单体或第二单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包含pI变体(包括图4所示的那些)。在示例性实施方案中，第一单体或第二单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，本文提供的1+1CLC格式抗体包含FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q；第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域中的每一个都包含消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K；并且第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，本文提供的1+1CLC格式抗体进一步包含FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，第一结合结构域或第二结合结构域中的一个结合CD28，并且另一个结合结构域结合肿瘤相关抗原(TAA)(参见图34C)。主题1+1CLC格式抗体中可包含任何合适的CD28结合结构域，包括本文提供的任何CD28结合结构域。在一些实施方案中，CD28结合结构域是以下CD28结合结构域中的一个或其变体：1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。在示例性实施方案中，CD28结合结构域包含1A7[CD28]_H1.14可变重结构域。在一些实施方案中，CD28结合结构域包含本文提供的任何CD28结合结构域的1A7[CD28]_H1.14可变重结构域或其变体和轻可变结构域。在示例性实施方案中，CD28结合结构域是1A7[CD28]_H1.14L1或其变体。在mAb-scFv格式的一些实施方案中，抗CD28 ABD具有VH结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ IDNO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ IDNO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ IDNO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：670、SEQ IDNO：671和SEQ ID NO：672，和VL结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：874、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ IDNO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO：666、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ IDNO：673、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ IDNO：684、SEQ ID NO：685、SEQ ID NO：686、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ IDNO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ IDNO：706、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ IDNO：717、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQ ID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ IDNO：728、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQ ID NO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQ ID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ IDNO：739、SEQ ID NO：740、SEQ ID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQ ID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ IDNO：750、SEQ ID NO：751、SEQ ID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQ ID NO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ ID NO：756。

在一些实施方案中，1+1CLC格式抗体的第一结合结构域或第二结合结构域中的一个结合肿瘤相关抗原(TAA)。合适的TAA包括本文公开的任何TAA。在示例性实施方案中，TAA是B7H3。任何合适的B7H3结合结构域可包含在主题1+1CLC格式抗体中，包括本文提供的任何B7H3结合结构域。在一些实施方案中，B7H3结合结构域是以下B7H3结合结构域中的一个或其变体：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9、m1704(图26-31以及序列表)。

在一些实施方案中，抗B7H3 ABD具有VH结构域和VL结构域，其具有选自以下对的氨基酸序列：a)来自奥博妥单抗的SEQ ID NO：89和93；b)来自依诺妥珠单抗的SEQ ID NO：97和101；c)来自BRCA84D的SEQ ID NO：105和109；d)来自BRCA69D的SEQ ID NO：113和117；e)来自PRCA157的SEQ ID NO：121和125；f)来自huPRCA157的SEQ ID NO：129和133；g)来自Mab-D的SEQ ID NO：137和141；h)来自humAb-D的SEQ ID NO：145和149；i)来自m30的SEQ IDNO：153和157；j)来自M30-H1-L4的SEQ ID NO：161和165；k)来自SP265的SEQ ID NO：169和173；1)来自S10-H50L58的SEQ ID NO：177和181；m)来自8H9的SEQ ID NO：185和189；n)来自m852的SEQ ID NO：193和197；o)来自m857的SEQ ID NO：201和205；p)来自m8524的SEQ IDNO：209和213；q)来自1-1的SEQ ID NO：217和221；r)来自1-2的SEQ ID NO：225和229；s)来自1-4的SEQ ID NO：233和237；t)来自1-5的SEQ ID NO：241和245；u)来自1-7的SEQ ID NO：249和253；v)来自2-5的SEQ ID NO：257和261；w)来自2-8的SEQ ID NO：265和269；x)来自chAb2的SEQ ID NO：273和277；y)来自chAb3的SEQ ID NO：281和285；z)来自chAb4的SEQ IDNO：289和293；aa)来自chAb18的SEQ ID NO：297和301；bb)来自chAb13的SEQ ID NO：305和309；cc)来自chAb12的SEQ ID NO：313和317；dd)来自chAb14的SEQ ID NO：321和325；ee)来自chAb6的SEQ ID NO：329和333；ff)来自chAb11的SEQ ID NO：337和341；gg)来自chAB16的SEQ ID NO：345和349；hh)来自chAb10的SEQ ID NO：353和357；ii)来自ChAb7的SEQ ID NO：361和365；jj)来自chAb8的SEQ ID NO：369和373；kk)来自chAb17的SEQ ID NO：377和381；11)来自chAb5的SEQ ID NO：385和389；mm)来自huAb3v2.5的SEQ ID NO：393和397；nn)来自huAb3v2.6的SEQ ID NO：401和405；pp)来自huAb13v1的SEQ ID NO：409和413；qq)来自TPP-5706的SEQ ID NO：417和421；rr)来自TPP-6642的SEQ ID NO：425和429；ss)来自TPP-6850的SEQ ID NO：433和437；tt)来自TPP-3803的SEQ ID NO：441和445；uu)来自TRL4542的SEQID NO：449和453；vv)来自h1702的SEQ ID NO：457和461；ww)来自h1703的SEQ ID NO：465和469；xx)来自huA3的SEQ ID NO：473和477；yy)来自huA9的SEQ ID NO：481和485；和zz)来自m1704的SEQ ID NO：489和493。参见USSN 63/092,272中的图17。

在示例性实施方案中，CD28结合结构域包含1A7[B7H3]_H1.14可变重结构域。在一些实施方案中，B7H3结合结构域包含本文提供的CD28或B7H3结合结构域中的任一个的2E4A3.189[B7H3]_H1.22可变重结构域和轻可变结构域。在示例性实施方案中，B7H3结合结构域包含2E4A3.189[B7H3]_H1.22可变重结构域或其变体和1A7[CD28]_L1可变轻结构域或其变体。

在一些实施方案中，1+1CLC格式抗体包含结合CD28的第一结合结构域和结合B7H3的第二结合结构域。在特定实施方案中，第一结合结构域(即CD28结合结构域)的可变重结构域是1A7[CD28]_H1.14可变重结构域或其变体。在一些实施方案中，第二结合结构域(即B7H3结合结构域)的可变重结构域是2E4A3.189[B7H3]_H1.22可变重结构域或其变体。在一些实施方案中，1+1CLC格式抗体包含共同轻链，所述共同轻链包含本文提供的CD28或B7H3结合结构域中的任一个的可变轻结构域。在一些实施方案中，可变轻结构域是1A7[CD28]_L1可变轻结构域或其变体。图37描绘了呈1+1CLC格式的示例性抗B7H3 x抗CD28双特异性抗体。

4.2+1CLC格式

在本文提供的主题双特异性抗体(例如，抗CD28 x抗B7H3抗体)中特别有用的另一种异源二聚抗体格式是“2+1共同轻链”或“2+1CLC”格式，其描绘于图33D中。2+1CLC格式包含第一单体，其包含VH1-CH1-接头-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1各自是第一可变重结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；第二单体，其包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；和第三单体，其包含“共同轻链”VL-CL，其中VL是共同可变轻结构域，并且CL是恒定轻结构域。VL与第一单体的每个vh1配对以形成两个第一结合结构域，每个结构域具有第一抗原结合特异性；并且VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的第二结合结构域。第一单体的接头可以是任何合适的接头，包括图7中描述的结构域接头中的任一个或其组合。在一些实施方案中，接头是EPKSCGKPGSGKPGS(SEQ ID NO：1182)。在一些实施方案中，2+1CLC格式的抗体是三价抗体。

在一些实施方案中，2+1CLC格式的第一Fc结构域和第二Fc结构域是变体Fc结构域，其包含异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和9中所示的一组氨基酸取代)。特别有用的异源二聚化偏斜变体包含S364K/E357Q：L368D/K370S、L368D/K370S：S364K、L368E/K370S：S364K、T411T/E360E/Q362E：D401K、L368D/K370S：S364K/E357L、K370S：S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C(EU编号)。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域中的一个包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域中的另一个包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号进行的。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，本文提供的2+1CLC格式抗体进一步包含FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q；第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域中的每一个都包含消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K；并且第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。在一些实施方案中，本文提供的2+1CLC格式抗体进一步包含FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，两个第一结合结构域中的每一个结合肿瘤相关抗原(TAA)，并且第二结合结构域结合CD28(参见图34D)。主题2+1CLC格式抗体中可包含任何合适的CD28结合结构域，包括本文提供的任何CD28结合结构域。在一些实施方案中，CD28结合结构域是以下CD28结合结构域中的一个或其变体：1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。在示例性实施方案中，CD28结合结构域包含1A7[CD28]_H1.14可变重结构域。在一些实施方案中，CD28结合结构域包含本文提供的任何CD28结合结构域的1A7[CD28]_H1.14可变重结构域或其变体和轻可变结构域。在示例性实施方案中，CD28结合结构域是1A7[CD28]_H1.14L1或其变体。

在一些实施方案中，两个第一结合结构域中的每一个都结合肿瘤相关抗原(TAA)。在某些实施方案中，两个第一结合结构域结合相同的TAA。合适的TAA包括本文公开的任何TAA。在示例性实施方案中，TAA是B7H3。任何合适的B7H3结合结构域可包含在主题2+1CLC格式抗体中，包括本文提供的任何B7H3结合结构域。在一些实施方案中，B7H3结合结构域是以下B7H3结合结构域中的一个或其变体：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9、m1704(图26-31以及序列表)。

在一些实施方案中，2+1CLC格式抗体包括两个各自结合B7H3的第一结合结构域和一个结合CD28的第二结合结构域。在一些实施方案中，每个第一结合结构域(即B7H3结合结构域)的可变重结构域是2E4A3.189[B7H3]_H1.22可变重结构域或其变体。在特定实施方案中，第二结合结构域(即CD28结合结构域)的可变重结构域是1A7[CD28]_H1.14可变重结构域或其变体。在一些实施方案中，2+1CLC格式抗体包含共同轻链，所述共同轻链包含本文提供的CD28或B7H3结合结构域中的任一个的可变轻结构域。在一些实施方案中，可变轻结构域是1A7[CD28]_L1可变轻结构域或其变体。图38描绘了呈2+1CLC格式的示例性抗B7H3 x抗CD28双特异性抗体。

图13描绘了在2+1CLC格式的实施方案中使用的“CH1+半铰链”结构域接头的序列。在2+1CLC格式中，“CH1+半铰链”序列用于将第一可变重结构域(V_H)连接至双特异性抗体的Fab-Fab-Fc侧上的第二V_H结构域。

5.2+1mAb-scFv格式

在本文提供的主题双特异性抗体(例如，抗CD28 x抗B7H3抗体)中发现特别有用的一种异源二聚抗体格式是图33E所示的2+1mAb-scFv格式。这种抗体格式包括三个抗原结合结构域：两个Fab部分和一个附接至重链中的一条的C末端的scFv。在这种格式的一些实施方案中，Fab部分各自结合肿瘤相关抗原(TAA)，在这种情况下，人B7H3和“额外”scFv结构域结合CD28。也就是说，这种mAb-scFv格式是三价抗体。

在这些实施方案中，第一链或单体从N末端至C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，第二单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-scFv结构域，其中scFv结构域包含第二VH(VH2)、第二VL(VL2)和scFv接头。对于本文的所有scFv结构域，scFv结构域可以从N末端至C末端处于VH2-scFv接头-VL2或VL2-scFv接头-VH2的任一取向。因此，第二单体从N末端至C末端可以包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-VH2-scFv接头-VL2或VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-VL2-scFv接头-VH2。组合物还包含轻链VL1-CL。在这些实施方案中，VH1-VL1各自形成第一ABD，并且VH2-VL2形成第二ABD。在一些实施方案中，第一ABD结合肿瘤靶抗原，包括人B7H3，并且第二ABD结合人CD28。

在一些实施方案中，2+1mAb-scFv格式抗体的第一Fc结构域和第二Fc结构域是变体Fc结构域，其包括异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和9中所示的一组氨基酸取代)。特别有用的异源二聚化偏斜变体包含S364K/E357Q：L368D/K370S、L368D/K370S：S364K、L368E/K370S：S364K、T411T/E360E/Q362E：D401K、L368D/K370S：S364K/E357L、K370S：S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C(EU编号)。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域中的一个包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第一变体Fc结构域或第二变体Fc结构域中的另一个包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号进行的。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，本文提供的2+1mAb-scFv格式抗体的scFv包括带电荷的scFv接头(包括图6中所示的那些)。在一些实施方案中，本文提供的2+1mAb-scFv格式抗体包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q；第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域中的每一个都包含消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K；并且第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。在一些实施方案中，本文提供的2+1mAb-scFv格式抗体的scFv包括(GKPGS)₄带电荷的scFv接头。在一些实施方案中，本文提供的2+1mAb-scFv格式抗体包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号进行的。

在一些实施方案中，2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体的第二单体的scFv是CD28结合，并且第一单体和第二单体的VH1以及共同轻链的VL1各自形成结合肿瘤相关抗原(TAA，例如B7H3)的结合结构域(参见图26B)。主题2+1mAb-scFv格式抗体中可包含任何合适的CD28结合结构域，包括本文提供的任何CD28结合结构域。在一些实施方案中，CD28结合结构域是以下CD28结合结构域中的一个或其变体：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.14L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1(图18-21和23以及序列表)。

在一些实施方案中，第一单体和第二单体的VH1和2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体的共同轻链的VL1各自形成结合肿瘤相关抗原(TAA)的结合结构域(参见图26B)。合适的TAA包括本文公开的任何TAA。在示例性实施方案中，TAA是B7H3。主题2+1Fab₂-scFv-Fc格式抗体中可包含任何合适的B7H3结合结构域，包括本文提供的任何B7H3结合结构域。在一些实施方案中，B7H3结合结构域是以下B7H3结合结构域中的一个或其变体：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、奥博妥单抗、依诺妥珠单抗、BRCA84D、BRCA69D、PRCA157、huPRCA157、mAb-D、humAb-D、M30、M30-H1-L4、SP265、S10-H50L58、8H9、m852、m857、m8524、1-1、1-2、1-4、1-5、1-7、2-5、2-8、chAb2、chAb3、chAb4、chAb18、chAb13、chAb12、chAb14、chAb6、chAb11、chAb16、chAb10、chAb7、chAb8、chAb17、chAb5、huAb3v2.5、huAb3v2.6、huAb13v1、TPP-5706、TPP-6642、TPP-6850、TPP-3803、TRL4542、h1702、h1703、huA3、huA9、m1704(图26-31以及序列表)。

图10至11显示了可以2+1mAb-scFv格式使用的一些示例性Fc结构域序列。图10中描述的“单体1”序列通常指“Fab-Fc重链”的Fc结构域，并且“单体2”序列指“Fab-Fc-scFv”重链的Fc结构域。此外，图12至14提供了可用于“Fab-Fc重链”单体或“Fab-Fc-scFv”重链的示例性CH1(任选包括铰链或半铰链结构域)。图15提供了可用于“Fab-Fc重链”单体或“Fab-Fc-scFv”重链的示例性铰链结构域。此外，图16提供了可以这种格式使用的有用的CL序列。

6.单特异性、单克隆抗体

如本领域的技术人员将理解的，本文概述的新型Fv序列还可以用于单特异性抗体(例如，“传统单克隆抗体”)或非异源二聚双特异性格式两者。因此，本发明提供了单克隆(单特异性)抗体，所述单克隆抗体包括6个CDR和/或来自附图的vh和v1序列，通常具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，其中IgG1、IgG2和IgG4(包含包括S228P氨基酸取代的IgG4恒定区)在一些实施方案中有特定用途。也就是说，本文中的具有“H_L”名称的任何序列可以连接到人IgG1抗体的恒定区。

在一些实施方案中，单特异性抗体是B7H3单特异性抗体。在某些实施方案中，单特异性抗B7H3抗体包括以下B7H3抗原结合结构域中的任一个的6个CDR：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2FAA3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1、3C4[B7H3]_HIL1.1和4F12[B7H3]_H2L1.1(图26-31)。在一些实施方案中，单特异性B7H3抗体包括以下B7H3抗原结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：2E4A3.189[B7H3]_H1L1、2E4A3.189[B7H3]_H1/1A7[CD28]_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22_L1、2E4A3.189[B7H3]_H1.22/1A7[CD28]_L1、6A1[B7H3]_H1L1，3C4[B7H3]_H1L1.1和4F12[B7H3]_H2L1.1(图26-31)。

在一些实施方案中，单特异性抗体是CD28单特异性抗体。在某些实施方案中，单特异性抗CD28抗体包括以下CD28抗原结合结构域中的任一个的6个CDR：1A7[CD28]_H1L1和1A7[CD28]_H1.14_L1(图18和19)在一些实施方案中，单特异性抗CD28抗体包括CD28抗原结合结构域中的任一个的可变重结构域和可变轻结构域：1A7[CD28]_H1L1和1A7[CD28]_H1.14_L1(图18和19)。

VI.核酸

另一方面，本文提供了编码抗原结合结构域的核酸组合物以及本文提供的抗B7H3和抗CD28抗体(例如，αB7H3 x αCD28双特异性抗体)。

如本领域的技术人员将理解的，核酸组合物将依赖于异源二聚体蛋白的格式和支架。因此，例如，当格式需要三个氨基酸序列时，例如对于1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab₂-scFv-Fc格式、1+1CLC和2+1CLC格式，可以将三个多核苷酸并入一个或多个表达载体中以进行表达。在示例性实施方案中，每种多核苷酸被并入不同的表达载体中。

如本领域所已知，对本文公开的结合结构域和抗体的组分进行编码的核酸可以并入如本领域已知并且取决于用于产生本发明的异源二聚抗体的宿主细胞的表达载体中。通常，核酸可操作地连接到任何数量的调控元件(启动子、复制起点、可选择标记、核糖体结合位点、诱导剂等)。表达载体可以是染色体外的或整合的载体。

本发明的多核苷酸和/或表达载体然后转化成如本领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞，包括哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)可用于许多实施方案中。

在一些实施方案中，编码每种单体的多核苷酸各自包含在单个表达载体中，通常在不同或相同的启动子控制下。在本发明的特别有用的实施方案中，这些多核苷酸中的每一种都包含在不同的表达载体中。如本文所示并且如特此通过引用并入的US 62/025,931所示，不同的载体比率可以用于驱使异源二聚体形成。也就是说，令人惊讶地，虽然蛋白质包括1∶1∶2比率的第一单体∶第二单体∶轻链(在本文中具有包括异源二聚抗体的三个多肽的许多实施方案的情况下)，但是这些并非得到最佳结果的比率。

通过培养包含如本领域众所周知的表达载体的宿主细胞来制备本文提供的抗体和ABD。一旦产生，就执行传统抗体纯化步骤，包含离子交换色谱法步骤。如本文所讨论，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电点聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。也就是说，包含改变每个单体的等电点(pI)的pI取代使得每个单体具有不同的pI并且异源二聚体也具有不同的pI，从而促进“1+1Fab-scFv-Fc”异源二聚体的等电纯化(例如，阴离子交换柱、阳离子交换柱)。这些取代还有助于测定和监测任何污染的双重scFv-Fc和纯化后mAb同源二聚(例如，IEF凝胶、cIEF和分析型IEX柱)。

VII.抗CD28 x抗TAA抗体的生物和生物化学功能

通常，将本文所述的双特异性抗CD28 x抗TAA抗体(例如，抗CD28 x抗B7H3抗体)施用于患有癌症(例如，B7H3相关癌症)的患者，并且以本文所述的多种方式评估功效。因此，在可以进行标准功效测定时，如癌症负载、肿瘤大小、对存在或转移程度的评估等，可以也可以基于免疫状态评估来估计免疫肿瘤学治疗。这可以多种方式进行，包括体外和体内测定。

A.用于体内施用的抗体组合物

通过将具有期望程度的纯度的抗体与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(如《雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)》，第16版，Osol，A.编辑[1980])进行混合来制备根据本发明使用的抗体的调配物，以供以冻干调配物或水溶液的形式进行储存。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包含缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

VIII.治疗

一旦制成，通过治疗癌症，通常通过增强免疫反应(例如，T细胞活化和增殖)，特别是当与抗癌疗法(如抗PD1)和抗肿瘤双特异性抗体一起使用时，本发明的组合物可用于许多肿瘤学应用。在一些实施方案中，本文提供的抗体通过在表达感兴趣的TAA(例如，B7H3)的肿瘤微环境中提供T细胞的激动性共刺激来增强免疫反应(例如，T细胞活化和增殖)。

在一些实施方案中，本文提供的抗CD28 x抗TAA双特异性抗体与抗肿瘤疗法一起施用，所述抗肿瘤疗法包括例如检查点抑制剂(例如，抗PD1抗体)或抗肿瘤双特异性抗体。

A.抗CD28 x抗TAA/抗TAA双特异性抗体

在一些实施方案中，本文提供的抗CD28 x抗TAA双特异性抗体与抗肿瘤双特异性抗体一起施用，所述抗肿瘤双特异性抗体是T细胞接合双特异性抗体，例如结合人Cd3的那些抗体。

在经典T细胞/APC相互作用中，存在由TCR与肽-MHC的反应性提供的第一信号(信号1)和由在APC上表达的CD80/CD86的CD28交联提供的第二信号(信号2)，其一起完全活化T细胞(参见图31A)。相反，在用靶向TAA的CD3双特异性抗体(即，抗CD3 x抗TAA双特异性抗体)治疗时，仅提供第一信号。

不受任何特定操作理论的束缚，据信本文提供的抗CD28 x抗TAA双特异性抗体可通过CD28共刺激增强抗CD3 x抗TAA双特异性抗体的抗肿瘤反应(参见图31B和实施例4E和4F)。因此，一方面，本文提供了通过向患者施用本文提供的抗CD3 x抗TAA双特异性抗体和抗CD28 x抗TAA双特异性抗体来治疗患者癌症的方法。在某些情况下，两种抗体的TTA是相同的；因此，例如，可以共同施用抗CD28 X B7H3双特异性抗体和抗CD3 X B7H3抗体。在一些情况下，TTA是不同的。在一些实施方案中，施用抗CD3 x抗TAA双特异性抗体和抗CD28 x抗TAA双特异性抗体增强了患者体内针对肿瘤的免疫反应。在一些实施方案中，抗CD3 x抗TAA双特异性抗体和抗CD28 x抗TAA结合同一肿瘤上的不同TAA。在示例性实施方案中，抗CD28x抗TAA是本文提供的抗CD28 x抗B7H3抗体。

B.抗CD28 x抗TTA/检查点抑制剂

在一些实施方案中，本文提供的抗CD28 x抗TAA双特异性抗体与检查点抑制剂(例如，抗PD1抗体)一起施用。不受任何特定操作理论的束缚，据信检查点阻断(例如PD-1阻断)是将TIL上的T细胞共刺激受体与激动性抗CD28 x抗TAA双特异性抗体的接合叠加的有用的治疗方式，因为其将在实体肿瘤中提供广泛的用途并避开CD28途径的CTLA4抑制。因此，在另一方面，本文提供了通过向患者施用本文提供的抗CD28 x抗TAA双特异性抗体和检查点抑制剂来治疗患者癌症的方法。在一些实施方案中，施用抗CD28 x抗TAA双特异性抗体和检查点抑制剂增强了患者体内针对肿瘤的免疫反应。在一些实施方案中，检查点抑制剂是PD-1、PD-L1或CTLA4抑制剂。在示例性实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA4抗体。

C.施用方式

本文提供的抗体根据已知的方法，如静脉内施用(作为团注物(bolus)或通过在一段时间内连续输注)施用于受试者。

D.治疗方式

在本发明的方法中，疗法用于提供关于疾病或病状的阳性治疗反应。

“阳性治疗反应”旨在改善疾病或病症和/或改善与疾病或病症相关联的症状。例如，阳性治疗反应将指对疾病的以下改善中的一种或多种：(1)减少赘生性细胞的数量；(2)增加赘生性细胞死亡；(3)抑制赘生性细胞存活；(5)抑制(即减慢到某种程度并且优选地停止)肿瘤生长；(6)增加患者存活率；以及(7)与疾病或病症相关联的一个或多个症状的一些缓解。

可以通过对那个疾病或病症具有特异性的标准化反应标准来确定任何给定疾病或病症的阳性治疗反应。可以使用筛选技术诸如磁共振成像(MRI)扫描、x-射线成像、计算机断层(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样，包含骨髓吸出(BMA)和对循环中的肿瘤细胞计数来估计针对肿瘤形态(即总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)改变的肿瘤反应。

除了这些阳性治疗反应之外，正经受疗法的受试者可能经历与疾病相关联的症状的改善的有益效果。

根据本发明的治疗包括所使用的“治疗有效量的”药物。“治疗有效量”指以剂量计并且持续所需的时间段以实现所希望的治疗结果的有效的量。

治疗有效量可根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重等因素以及药物在个体中引发期望反应的能力而变化。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用超过治疗有益效果的量。

用于肿瘤治疗的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。可以在预示人肿瘤的功效的动物模型系统中评定化合物抑制癌症的能力。

可替代地，通过熟练的从业者已知的体外测定，组合物的这种特性可以通过检验化合物抑制肿瘤生长或诱导凋亡的能力来评定。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小或以其它方式减轻受试者的症状。本领域的普通技术人员将能够基于如受试者的大小、受试者症状的严重程度和特定的组合物或所选择的施用途径这种因素确定这种量。

调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单个团注物，或者可以随时间施用若干分次剂量，或者可以按治疗状况的紧急情况所表明的成比例地减少或增加剂量。为了方便施用和剂量的均匀性，肠胃外组合物可以按剂量单位调配。如本文所用的剂量单位指作为针对要治疗受试者的单一剂量适合的物理上离散的单位；各单位含有与所需药物载体缔合的、经计算产生所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。

针对本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，和(b)个体敏感性对复合用于治疗的此类活性化合物造成的本领域固有限制。

用于本发明的双特异性抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病状并且可以由本领域的技术人员确定。

所有引用的参考文献通过引用以其全部内容明确地并入本文。

尽管出于说明的目的已经在上文描述了本发明的特定实施方案，但是本领域技术人员将了解的是，在不脱离如所附权利要求所描述的本发明的情况下可以做出许多细节变化。

实施例

下文提供的实施例旨在说明本发明。这些实施例不旨在将本发明限制于任何特定的应用或操作理论。对于本发明中论述的所有恒定区位置，编号均根据EU索引，如Kabat(Kabat等人，1991，《免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》，第5版，美国公共卫生署(United States Public HealthService)，国立卫生研究院(National Institute of Health)，贝塞斯达(Bethesda)，所述文献通过引用整体并入)中所述。抗体领域中的技术人员将理解，这个规约由免疫球蛋白序列的特定区结构域中的非顺序编号组成，所述非顺序编号使得能够对免疫球蛋白家族中的保守位置进行归一化的引用。因此，如通过EU索引定义的任何给定免疫球蛋白的位置不一定对应于其顺序序列。

在美国公开2015/0307629、2014/0288275和WO2014/145806中概述了一般和具体的科学技术，其均通过引用明确地整体并入本文中，并且特别是针对其中概述的技术。

背景

虽然检查点阻断免疫疗法已被证明是有效的，但许多患者仍然无法实现反应。TIL上的T细胞共刺激受体与激动性抗体的接合可以提供能够克服免疫检查点的负信号的额外的正信号，并且可以是与检查点阻断叠加的有用的治疗方式。然而，共刺激受体的全身激动作用仍然可能导致全身毒性。已经发现B7H3在癌细胞和肿瘤血管细胞中广泛过表达，并且可以用作肿瘤靶标。因此，设计了aB7H3 x aCD28双特异性抗体(bsAb)，目的是将激动性CD28结合结构域靶向肿瘤环境，从而降低潜在的全身毒性。

实施例1：CD28结合结构域

1A：新的CD28结合结构域

一种被认为避免与TGN1412相关的超激动作用的方法是产生具有结合于CD28和/或结合于与TGN1412不同的CD28表位的较低亲和力的新的CD28结合结构域。在一个产生这种新的CD28结合结构域的活动中，针对CD28淘选内部重新开始的噬菌体文库。在另一项活动中，大鼠杂交瘤用于产生额外的CD28结合结构域。

1A(a)：噬菌体衍生的克隆1A7

应注意，此噬菌体文库利用了具有引入LCDR3的多样性的人类种系VL。示例性噬菌体衍生的克隆1A7的氨基酸序列描绘于图18中。

将噬菌体衍生的克隆格式化为二价mAb以研究其的结合特性。通过Gibson组装构建含有所选克隆的可变重结构域和可变轻结构域的质粒，并且将所述质粒亚克隆到含有IgG1恒定区的编码序列的pTT5表达载体中(使用E233P/L234V/L235A/G236del/S67K消融变体)。在HEK293E中转染DNA以进行表达，并且使用蛋白A色谱法从上清液中纯化所得的二价mAb。

使用Octet(一种基于生物层干涉法(BLI)的方法)来筛选噬菌体衍生的二价mAb对CD28的亲和力。Octet的实验步骤通常包括以下：固定化(将配体捕获到生物传感器上)；缔合(将配体涂布的生物传感器浸入含有分析物的孔中)；和解离(将生物传感器返回到含有缓冲液的孔中)。对于XENP28428(基于克隆1A7)和额外的噬菌体衍生的比较物，所得的表观解离常数(KD_app)描绘于图24中。

研究了噬菌体衍生的二价mAb与细胞表面CD28的结合。在4℃下，将人PBMC与指定浓度的XENP28428或比较物噬菌体衍生的mAb一起孵育1小时然后将细胞用Alexa647AffiniPure F(ab′)₂片段山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性二抗(JacksonImmunoResearch，West Grove，Penn.)在4℃下染色1小时，并且通过流式细胞术进行分析。数据(图25)显示噬菌体衍生的mAb能够结合人PBMC，但其最大结合比现有技术的抗CD28mAb HuTN228(XENP27181，其序列描绘于图23中)弱得多。

鉴于较弱的CD28结合，1A7通过在VH和/或VL中引入取代而被进一步亲和力工程化。这种亲和力工程化的VH和VL区的序列描述为SEQ ID NO：585-756(图19-20中描绘了示例性序列)；图21中描绘了示例性亲和力工程化的VH/VL对的序列。FR和CDR的共有序列描绘于图44中。对CD28的示例性亲和力工程化1A7 VH/VL对的亲和力描绘于图22中。值得注意的是，在scFv的情形中VH和VL结构域的取向影响结合亲和力。此外，与scFv相反，在Fab结构域的情形中格式化VH和VL结构域(以共同轻链双特异性mAb格式使用)也影响结合亲和力。

1B：额外的CD28结合结构域

可在本发明的αB7H3 x αCD28 bsAb抗体中使用的额外CD28结合结构域的VH、VL和CDR序列被描绘为SEQ ID NO：1-88。

实施例2：B7H3结合结构域

2A：新的B7H3结合结构域

在一个产生新的B7H3结合结构域的活动中，针对B7H3淘选内部重新开始的噬菌体文库。在另一项活动中，大鼠杂交瘤用于产生额外的B7H3结合结构域。

2A(a)：噬菌体衍生的克隆2E4A3.189

应注意，这种噬菌体文库旨在发现适用于共同轻链双特异性抗体格式的结合结构域。因此，除了没有任何多样性之外，其利用了与实施例1A(a)中相同的人种系VL。示例性噬菌体衍生的克隆2E4A3.189的氨基酸序列描绘于图26中。虽然这种噬菌体衍生的克隆可用于实现共同轻链双特异性抗体格式，但其对B7H3的结合亲和力非常弱并需要亲和力工程化。如将在实施例3B中进一步描述，2E4A3.189的VH与1A7的VL有效配对，但是1A7的VH不与2E4A3.189的VL有效配对(尽管有一个氨基酸差异)。因此，为了提高亲和力，2E4A3.189被工程化成仅在VH中进行取代，其序列被描绘为SEQ ID NO：497-584并描绘于图27中，并且与1A7的VL配对。FR和CDR的共有序列描绘于图75中。

2B：杂交瘤衍生的克隆

B7H3结合结构域获自大鼠和兔杂交瘤，并且使用字符串内容优化进行人源化(参见例如，2010年2月2日授权的美国专利第7,657,380号)。图28-31分别描绘了示例性人源化大鼠杂交瘤衍生的克隆6A1和3C4以及人源化兔杂交瘤衍生的克隆4F12和38E2的氨基酸序列。在1+1bsAb格式的情形中测定杂交瘤克隆(和亲和力工程化的2E4A3.189噬菌体克隆)对人和食蟹猴B7H3的结合亲和力(以获得单价结合亲和力)，其数据如图32中所描绘。

2C：额外的B7H3结合结构域

可在本发明的B7H3 x CD28 bsAb中使用的额外B7H3结合结构域的VH、VL和CDR序列被描绘为SEQ ID NO：89-96。

实施例3：工程化AB7H3 X ACD28 BSAB

设想了B7H3 x CD28 bsAb的多种格式，其示例性格式在下文和图33中概述。应注意，在每种情况下，CD28双特异性抗体对于CD28都是单价的，并且并入了Fc变体以工程化消融FcγR结合(例如图5中描述的那些)，以避免潜在的超激动作用。

3A：FAB-SCFV-FC格式

3A(a)：1+1Fab-scFv-Fc格式

一种利用Fab结构域和scFv的格式是1+1Fab-scFv-Fc格式(示意性地描绘于图34A中)，其包含第一单体，所述第一单体包含共价附接至第一异源二聚Fc结构域的具有第一抗原结合特异性的单链Fv(“scFv”)；第二单体，所述第二单体包含共价附接至互补的第二异源二聚Fc结构域的重链可变区(VH)；以及轻链(LC)，所述轻链被单独转染以使得具有第二抗原结合特异性的Fab结构域与可变重结构域一起形成。图35描绘了呈1+1Fab-scFv-Fc格式的示例性αB7H3 x αCD28 bsAb(基于如实施例1和2中所描述的结合结构域)的序列。

3A(b)：2+1Fab2-scFv-Fc格式

另一种这样的格式是2+1Fab2-scFv-Fc格式(示意性地描绘于图34B中)，其包含第一单体，所述第一单体包含共价附接至scFv(具有第一抗原结合特异性)的VH结构域，所述scFv共价附接至第一异源二聚Fc结构域；第二单体，所述第二单体包含共价附接至互补的第二异源二聚Fc结构域的VH结构域；以及LC，所述LC被单独转染以使得具有第二抗原结合特异性的Fab结构域与VH结构域一起形成。图36描绘了呈2+1Fab2-scFv-Fc格式的示例性αB7H3 x αCD28 bsAb(基于如实施例1和2中所描述的结合结构域)的序列。

3B：通用轻链格式

如以上实施例1和2中所述，用于发现CD28和B7H3结合结构域的噬菌体文库利用了相同的人种系VL，但CD28文库包括LCDR3中的多样性。发现克隆1A7的可变轻结构域与抗B7H3克隆2E4A3.189的可变轻结构域在LCDR3中仅有一个氨基酸不同。因此，考虑了克隆1A7和克隆2E4A3.189在共同轻链构建体中的可能用途。然而，令人惊讶地发现2E4A3.189的VH与1A7的VL有效配对，但是1A7的VH不与2E4A3.189的VL有效配对，尽管在LCDR3中只有一个氨基酸差异。此外，如上所述，噬菌体衍生的克隆1A7表现出比现有技术的抗CD28mAbHuTN228弱得多的结合，从而为亲和力优化提供了机会。因此，产生了亲和力优化文库，首先关注仅在1A7和2E4A3.189的可变重结构域中的取代。示例性亲和力优化的1A7可变结构域H1.1和H1.14以及亲和力优化的2E4A3.189可变重结构域H1.3和H1.22的氨基酸序列分别描绘于图19和27中。

3B(a)：1+1共同轻链格式

一种共同轻链格式是1+1共同轻链(CLC)格式(示意性地描绘于图34C中)，其包含含有VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的第一单体、含有VH2-CH1-铰链-CH2-CH3的第二单体和含有VL-CL的第三单体。VL与VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性的结合结构域；VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的结合结构域。图37描绘了呈1+1CLC格式的示例性αB7H3 x αCD28 bsAb(基于如本文所描述的结合结构域)的序列。

3B(b)：2+1共同轻链格式

另一种共同轻链格式是2+1CLC格式(示意性地描绘于图34D中)，其包括含有VHI-CH1-铰链-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的第一单体、含有VH2-CH1-铰链-CH2-CH3的第二单体和含有VL-CL的第三单体。VL与第一VH1和第二VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性的结合结构域；VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的结合结构域。图38描绘了呈2+1CLC格式的示例性αB7H3 x αCD28 bsAb(基于如本文所描述的结合结构域)的序列。

3C：2+1 MAB-SCFV格式

利用Fab结构域和scFv的另一种格式是2+1mAb-scFv格式(示意性地描绘于图34E中)，其包含第一单体，所述第一单体包含共价附接至第一异源二聚Fc结构域的VH结构域，所述第一异源二聚Fc结构域共价附接至scFv(具有第一抗原结合特异性)；第二单体，所述第二单体包含共价附接至互补的第二异二异源二聚Fc结构域的VH结构域；和LC，所述LC被单独转染以使得具有第二抗原特异性的Fab结构域与VH结构域一起形成。图39描述了呈2+1mAb-scFv格式的示例性αB7H3 x αCD28 bsAb(基于如本文所描述的结合结构域)的序列。

实施例4：开发B7H3 X CD28 BSAB

在经典T细胞/APC相互作用中，存在由TCR与肽-MHC的反应性提供的第一信号(信号1)和由在APC上表达的CD80/CD86的CD28交联提供的第二信号(信号2)，其一起完全活化T细胞(参见图40A)。相反，在使用CD3双特异性的治疗中，仅提供了第一信号。在如治疗实体肿瘤的一些情况下，可能有用的是构建CD28信号，所述信号可由CD28双特异性提供，其想法是通过CD28共刺激促进活化和增殖(参见图40B)。可替代地，当信号1已经由内源性TCR与新表位的反应性提供时，仅提供信号2与CD28双特异性抗体可能足以增强抗肿瘤活性。尽管如此，将CD28信号与检查点阻断叠加以减轻任何检查点介导的对增加的CD28信号的抑制可能是有用的(图41)。以下部分在前述情形中表征了本发明的BTH3x CD28双特异性抗体。在本部分中，B7H3 x CD28 bsAb以各种格式和各种结合结构域进行工程化，目的是优化治疗特性。

4A：调节B7H3 X CD28 BSAB活性

将单价结合肿瘤相关抗原的1+1CD28双特异性格式的活性与二价结合肿瘤相关抗原的2+1CD28双特异性格式的活性进行比较。将50,000个CD3+T细胞与A549或SKOV-3癌细胞以10∶1的效应子∶靶比率一起孵育，并且用剂量滴定的指定B7H3 x CD28抗体和盘结合的1μg/mL盘结合CD3抗体(OKT3)处理。T细胞接种后1天，使用MSD测定(Meso Scale Discovery,Rockville，Md.)测量细胞因子。图42中描绘的数据显示B7H3 x CD28双特异性抗体诱导T细胞释放细胞因子。值得注意的是，具有二价B7H3结合的XENP34339比具有单价B7H3结合的XENP34717更有效地诱导细胞因子释放。应注意，当使用具有更高亲和力结合的B7H3结合结构域时，效力的差异不太明显(数据未显示)。

在另一个实验中，研究了CD28结合亲和力对活性的影响。MCF7癌细胞(经转染以表达抗CD3 scFv以便提供“信号1”)与效应细胞以1∶1的效应子∶靶比率和所示浓度的XENP34339、XENP35612、XENP35611和XENP34336一起孵育。每个bsAb都呈2+1CLC格式。XENP34339、XENP35612和XENP35611各自包括2E4A3.189_H1.22_1A7_L1 B7H3结合结构域，而XENP34336包含较低亲和力的2E4A3.189_H1.3_1A7_L1 B7H3结合结构域。XENP34339、XENP35612、XENP35611和XENP34336分别包括具有77nM、270nM、610nM和440nM结合亲和力的CD28结合结构域。图43中描绘的数据显示，对CD28亲和力的增加增强了B7H3 x CD28 bsAb的效力。

在另一组实验中，研究了一组B7H3 x CD28 bsAb在其它癌细胞的存在下的活性。CD3+T细胞与MDA-MB-2331、LnCAP或DU145癌细胞以1∶1的E∶T比率、恒定剂量的示例性B7H33x CD3 bsAb以及剂量滴定的B7H3 x CD28 bsAb一起孵育。数据如图43中所描绘。与上述一致，对CD28亲和力的增加增强了B7H3 x CD28 bsAb的效力(XENP34398＞XENP37808)。此外，数据还指示，对B7H3亲和力的增加增强了B7H3 x CD28 bsAb的效力(例如，XENP34398＞XENP37810；XENP35151和XENP35153＞XENP34732；并且XENP37807＞XENP37982)。此外，数据指示，与2+1mAb-scFv格式相比，2+1CLC格式在增强IL-2分泌方面更有效(XENP34398>XENP37807)。

4B：调节CD28 BSAB药代动力学特征

接下来，研究了本发明的各种B7H3 x CD28 bsAb的药代动力学特征。

在第一项研究中，在一系列剂量水平下，在食蟹猴中测试XENP34398(具有2+1CLC格式)、XENP36781(具有2+1mAb-scFv格式)和XENP34395(具有2+1中心scFv格式)的药代动力学。如图45中所描绘，在每个所测试剂量水平下，发现呈2+1CLC格式的XENP34398具有明显优于2+1mAb-scFv格式的药代动力学，而2+1mAb-scFv格式又略优于2+1Fab₂-scFv-Fc格式。尽管除了格式之外，这些分子之间还存在其它差异(例如，B7H3结合结构域的差异)，但数据表明，在B7H3 x CD28 bsAb的情形中，2+1CLC格式可能是有利的。

如实施例2中所述，用各种B7H3结合结构域(及其各种格式)工程化另外的B7H3 xCD28bsAb，并且在另一项食蟹猴研究中研究药代动力学特征。图46A-C描绘了比较XENP34398、XENP37808和XENP37810，其中的每一个都是呈2+1CLC格式的bsAb。XENP34398和XENP37810具有相同的CD28结合结构域(1A7_H1.14_L1 Fab)但不同的亲和力B7H3结合结构域(基于相同的噬菌体衍生的克隆，但XENP34398中的变体比XENP37810中的变体具有更高的亲和力B7H3结合)。XENP34398和XENP37808具有相同的B7H3结合结构域(2E4A3.189_H1.22_1A7_L1)但不同的亲和力CD28结合结构域(基于1A7，但XENP34398中的变体比XENP37808中的变体具有更紧密的结合亲和力)。图46D-F描绘了XENP34732、XENP35151和XENP35153的比较，其中的每一个都是呈1+1Fab-scFv-Fc格式的bsAb并具有相同的CD28结合结构域(1A7_H1.14_L1 scFv)但不同的B7H3结合结构域(分别为6A1、4F12和38E2)。数据显示，具有不同B7H3结合结构域的3种分子中的每一种都具有不同的PK特征，尽管在其它方面是相同的。特别地，与XENP34732和XENP35153(分别具有6A1和38E2结合结构域)相比，XENP35151(具有4F12结合结构域，如实施例2B中所述，其具有比6A1和38E2更紧密的结合亲和力)表现出更差的PK特征。这表明，至少在1+1格式中，B7H3的结合亲和力可能影响药代动力学特征。图46G-H描绘了XENP37807和XENP37982的比较，其中的每一个都是呈2+1mAb-scFv格式的bsAb并具有相同的CD28结合结构域(1A7_H1.14_L1 scFv)但不同的B7H3结合结构域(分别为2E4和3C4)。

4C：所选B7H3 X CD28 BSAB抗体的总结

图47描绘了本发明的几个B7H3 x CD28 bsAb的特性的总结。应注意，本汇总表中描绘的一些数据可能与工作示实施例中其它地方描绘的实验数据不同，因为其中一些数据说明了来自开发早期阶段的实验数据。

实施例5：示例性B7H3 X CD28双特异性抗体的额外特征

示例性B7H3 x CD28 bsAbs XENP34339(或Xtend类似物XENP34398)和XENP35612(或Xtend类似物XENP37808)被进一步表征以总体上证明本发明的B7H3 x CD28双特异性抗体的有用特性。

5A：XENP34339恢复CD28信号传导

CTLA-4是与CD28竞争CD28配体CD80和CD86的免疫检查点受体；因此，在存在CTLA-4的情况下(如在肿瘤环境中所发现)，CD28信号传导被抑制。在混合淋巴细胞反应中研究了本发明的CD28双特异性抗体对CD28信号传导的恢复。将100,000个CD3+T细胞与10,000个具有高B7H3表达的树突细胞(STEMCELL Technologies，Vancouver,Canada)一起孵育，并且用剂量滴定的B7H3 x CD28双特异性抗体XENP34339处理1μg/mL CTLA-4-Fc。T细胞接种后3天，使用MSD测定测量细胞因子。图48中描绘的数据显示，XENP34339使内源性CD28信号传导水平成为可能(即不存在CTLA-4-Fc引入的阻断)。

5B：XENP34339与PD-1阻断剂有效组合

检查点阻断(例如，PD-1阻断)可能是将TIL上的T细胞共刺激受体与激动性抗体的接合叠加的有用的治疗模式，因为其将在实体种瘤中提供广泛的用途并避开CD28途径的CTLA4抑制。因此，研究了B7H3 x CD28双特异性抗体XENP34339和XENP34389与XENP16432(基于纳武单抗的可变区的二价抗PD-1mAb；图17中描绘的序列)的组合。用100ng/ml HLA-A2*0201限制性CMV pp65(NLVPMVATV)肽(NLV肽)处理10,000个MDA-MB-231癌细胞过夜。第二天，添加来自CMV+供体的100,000个CD3富集细胞以及XENP16432(PD-1阻断；10μg/ml)、XENP34339(呈2+1CLC格式的B7H3 x CD28，具有基于2E4A3.189的B7H3结合结构域和基于1A7的CD28结合结构域；1μg/ml)、XENP34389(呈2+1Fab2-scFv-Fc格式的B7H3 x CD28，具有基于6A1的B7H3结合结构域和基于1A7的CD28结合结构域；1μg/ml)以及B7H3 x CD28与XENP16432的组合。治疗后1天，使用MSD测定测定细胞上清液中的细胞因子(图50显示了使用来自2个不同供体的CD3+T细胞的实验的数据)。数据显示，与单独XENP34339一起孵育诱导T细胞释放细胞因子，并且与PD-1阻断协同组合以增强细胞因子释放。值得注意的是，XENP34389(2+1Fab2-scFv-Fc格式)没有与PD-1阻断协同组合。在类似的实验中，在100ng/mL NLV肽的存在下，接种20,000个MCF7癌细胞。24小时后，从CMV+PBMC供体中分离出200,000个CD3+T细胞(10∶1 E∶T)，并且添加测试品(PBS对照、单独的XENP34339、单独的PD-1mAbXENP16432或XENP34339+XENP16432)。6天后，通过流式细胞术评估细胞。与上述一致，图51中描绘的数据PD-1阻断通过XENP34339增强了NLV四聚体阳性CD8⁺T细胞的扩增。

为了研究观察到的XENP34339的差异是由B7H3结合结构域的差异还是双特异性抗体格式的差异引起的，使用Octet对XENP34339和XENP34389的组分结合结构域进行了生物物理学表征。在确定2E4A3.189和6A1对B7H3抗原的结合亲和力的第一个实验中，将XENP34339和XENP34389重新格式化为与B7H3抗原单价结合(分别为XENP34717和XENP34728，其序列描绘于图37和36中)。使用抗小鼠Fc生物传感器来捕获B7H3的小鼠Fc融合体(是完整的胞外V1C1-V2V2结构域或是单独的V1C1或V2C2结构域)，并且浸入多种浓度的XENP34717或XENP34728中。通过用1∶1Langmuir结合模型对结合数据进行全局拟合来进行动力学分析。产生的解离常数(KD)描绘于图52中，并且数据显示6A1结合结构域提供了比2E4A3.189稍微更紧密的与B7H3的结合。接下来，研究了CD28结合结构域对呈2+1CLC格式和2+1Fab2-scFv-Fc格式的CD28抗原的结合亲和力。抗HIS捕获(HIS1K)生物传感器用于捕获CD28-Fc-His蛋白并浸入多种浓度的XENP34339或XENP34389中。通过用1：1Langmuir结合模型以及稳态模型对结合数据进行全局拟合来进行动力学分析。所得解离常数(KD)描绘于图53中。数据显示，与2+1Fab₂-scFc-Fc格式相比，2+1CLC格式能够更紧密地结合CD28抗原。总之，数据表明，在XENP34339和XENP34389活性中观察到的差异是由于双特异性抗体格式的差异。

5C：XENP34339在低效应子与靶比率下克服了癌细胞对CD3双特异性抗体的抗性

据文献报道，非炎症冷肿瘤(如前列腺癌)具有低效应子：靶比率。因此，使用xCELLigence实时细胞分析仪(ACEA Biosciences，San Diego，CA)评估呈1∶1效应子：靶的细胞杀伤。首先接种2,500个LNCaP癌细胞。48小时后，添加呈1∶1的效应子∶靶的新鲜富集的CD3+T细胞以及呈指定浓度的抗体(单独的αPSMA x αCD3 XENP31602或XENP31602与XENP34339组合；XENP31602的序列描绘于图54中)。T细胞接种后5天记录细胞杀伤。图55中描绘的数据显示，与单独孵育养癌细胞和T细胞相比，单独的XENP31602难以增强细胞杀伤，从而指示在低1∶1效应子与靶比率下存在对CD3双特异性抗体的抗性。

值得注意的是，添加B7H3 x CD28克服了癌细胞对CD3双特异性抗体的抗性。尽管此实验利用了PSMA x CD3双特异性抗体，但是有理由预期在将本发明的B7H3 x CD28双特异性抗体与其它CD3双特异性抗体(包括利用图56所描绘的CD3结合结构域的抗体)组合时会有类似的结果。

5D：只有在同时存在B7H3和PSMA的情况下，XENP34339与PSMA X CD3双特异性抗体结合才能增强活性

首先接种10,000个癌细胞(LNCaP[PSMA+B7H3+]、22RV1[PSMA+B7H3+]、SKOV-3[PSMA-B7H3+]或OVCAR-8[PSMA-B7H3+])。第二天，以1∶1效应子：靶比率添加新鲜富集的CD3+T细胞与1μg/ml XENP34339以及剂量滴定的CD3双特异性抗体(αPSMA x αCD3XENP31602)。T细胞接种后一天，使用MSD测定测量细胞因子，并且使用流式细胞术计数CD3+T细胞，其数据描绘于图57-60中。数据显示单独的CD3双特异性XENP31602在低1∶1效应子∶靶比率下诱导很少或没有T细胞活性和增殖。然而，在存在作为PSMA+B7H3+的LNCaP和22Rv1的情况下，添加αB7H3 x αCD28 XENP34339增强了αPSMA x αCD3 XENP31602的活性。然而，值得注意的是，在存在作为PSMA-B7H3+的SKOV-2和OVCAR-8的情况下，添加XENP343398不会增强活性。对与CD28双特异性抗体相关的肿瘤抗原和与CD3双特异性抗体相关的肿瘤抗原的这种需求产生了用于选择性靶向针对更可能共表达多种肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的免疫反应的AND门。这种协同AND门还可以对具有较低靶密度的肿瘤产生活性，其中肿瘤细胞可以表达多种肿瘤相关抗原，尽管密度较低。

5E：将XENP34339或XENP35612与CD3双特异性抗体组合增加体内抗肿瘤活性

在体内研究中，在第-23天，将NSG小鼠右腹皮下植入2x10⁶个pp-65表达MDA-MB-231细胞。在第-1天，将小鼠腹膜内移植5×10⁶个人PBMC。然后在第0天、第8天、第14天、第21天和第28天用单独的第一种示例性B7H3 x CD3双特异性抗体(CD3bsAb1)(0.5mg/kg)、单独的第二种示例性B7H3 x CD3双特异性抗体(CD3bsAb2)(0.5mg/kg)或XENP34339(5.0mg/kg)与CD3bsAb1或CD3bsAb2的组合治疗小鼠。通过卡尺测量监测肿瘤体积，图61-62中示出了其数据(第1剂量后的天数)。每周一次抽取血液以研究淋巴细胞扩增，图63描绘了第14天CD45+细胞的数据。数据显示，向CD3双特异性抗体中添加CD28共刺激增加了体内抗肿瘤活性。值得注意的是，CD28共刺激使淋巴细胞扩增增加了600倍。

在另一项体内研究中，使用NSG小鼠，其是MHC I/II-DKO(NSG-DKO)并因此对GVHD和另一种CD3双特异性抗体(PSMA x CD3)具有抗性。在第-7天，每只NSG-DKO小鼠接种5x10⁶个22RV1肿瘤细胞。在第O天，向小鼠移植来自随机供体的5×10⁶个人PBMC细胞。然后在第0天、第7天、第14天和第21天用单独的低或高浓度剂量的示例性PSMA x CD3双特异性抗体XENP32220(序列如图54所描绘)或与XENP34339组合对小鼠进行腹膜内治疗。每周抽取血液和血清。与用单独的CD3 bsAb进行治疗相比，用CD3和CD28 bsAb治疗增强了T细胞扩增(如图64A-C中的淋巴细胞计数所示，并且特别是图64D-E中表达Ki67增殖标记的T细胞)以及T细胞活化(如图65中CD4⁺和CD8⁺T细胞上的CD25和PD1表达所指示)。

在另一项研究中，使用从杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)(Bar Harbor,Maine)获得的CD34+Hu-NSG小鼠，其移植有人CD34+造血干细胞以便开发对宿主无反应性的功能性人免疫系统。在第-15天，用4×10⁶个pp65-MDA-MB231细胞皮内接种小鼠。然后在第0天、第7天和第14天用单独的B7H3 x CD3 bsAb、单独的XENP35612、B7H3 x CD3 bsAb与XENP35612的组合或B7H3 x CD3 bsAb与XENP34339的组合对小鼠进行腹膜内治疗。通过卡尺测量监测肿瘤体积，图66-67中示出了其数据(第1剂量后的天数)。在第23天收获肿瘤以研究肿瘤浸润性淋巴细胞的扩增，其数据描绘于图68中。数据显示XENP35612与CD3bsAb很好地组合以抑制肿瘤生长。值得注意的是，与在早期时间点(即第6天和第9天)用单独的B7H3 x CD3治疗相比，B7H3 x CD28与B7H3 x CD3的组合能够显著增强抗肿瘤活性。此外，作为单一试剂的XENP35612显著地扩大了肿瘤浸润性淋巴细胞的扩增；与单独的B7H3x CD3bsAb相比，XENP35612和B7H3 x CD3 bsAb的组合显著增强了肿瘤浸润性淋巴细胞的扩增。

5F：XENP34339和XENP37808不是超激动的

根据Stebbings方案(Stebbings R.等人，2007)，通过空气干燥评估XENP34339和XENP37808的潜在超激动特性。通过在室温下在SpeedVacTM中干燥2小时实现测试品的风干。用10μg风干的XENP34339或XENP37808处理人PBMC持续24小时，并且将活性与超激动TGN1412(XENP29154；其序列描绘于图69中)或PBS对照进行比较。风干的TGN1412促进未受刺激的人PBMC分泌IFNγ、IL-6、IL-2和TNF细胞因子。相比之下，用风干的XENP34339和XENP37808处理的PBMC中的细胞因子水平保持与阴性对照PBS相似(数据显示在图70-71中)。

5G：XENP37808增强人和食蟹猴PBMC的CD3活性

为了研究食蟹猴是否是毒理学研究的良好模型，进行了一项实验，其中来自11个独特的人供体或12个独特的食蟹猴供体的PBMC在存在用抗CD3 scFv转染的HEK细胞(以提供“信号1”)的情况下以10∶1的E∶T比率给药XENP37808。在1天或5天后，使用MSD测定测量IL-2释放。如图72所描绘的结果(来自一个人供体和一个食蟹猴供体的数据)证实了食蟹猴是一个相对相关的物种。此外，还测试了用抗CD3 scFv转染但B7H3表达被敲除的HEK细胞。与实施例5D中的数据一致，这些结果显示，在存在B7H3的情况下，XENP37808仅增强人PBMC的CD3活性。

5H：XENP34398与XENP37808的额外体外比较

在第一组实验中，每孔接种1,250个22RV1-NLR(具有约170K B7H3抗原的MESF值)或DU145-NLR癌细胞(具有约270K B7H3抗原)。在48小时后，以1∶1的效应子与靶比率添加CD3+T细胞与指定量的B7H3 x CD3和1ug/mL B7H3 x CD28，并且通过Incucyte记录细胞计数。图73中所示的结果表明与B7H3xCD3双特异性结合，XENP34398和XENP37808诱导非常相似的RTCC水平。

在另一组实验中，每孔接种10,000个靶癌细胞(具有约20KB7H3表面密度的OVCAR8；具有约170K B7H3抗原密度的22RV1-NLR；或具有约270K B7H3抗原密度的DU145-NLR)。第二天，在存在1μg/mL的示例性B7H3 x CD3 bsAb的情况下，添加呈1∶1的效应子与靶比率的T细胞与指定量的B7H3 x CD28 mAb。接种后24小时测定IL-2。图74显示的结果描绘了通过在不同密度的细胞系上对XENP34398和XENP37808进行IL-2诱导所测量的非常相似的功能水平。

总之，这些数据显示XENP37808和XENP34398显示出非常相似的活性，并且同样有效。然而，在临床环境中，每一种都有潜在的优势。

Claims

1.一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：

a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-接头-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1各自是第一可变重结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；

b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；以及

c)共同轻链，所述共同轻链从N末端到C末端包含VL-CL，其中VL是可变轻结构域，并且CL是恒定轻结构域，

其中所述共同轻链分别与所述第一单体中的每个VH1-CH1和所述第二单体中的VH2-CH1配对，

其中所述VH1和所述VL一起形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且所述VH2和所述VL一起形成第二ABD，其中所述第一ABD和所述第二ABD中的一个结合人CD28，并且所述第一ABD和所述第二ABD中的另一个结合人B7H3。

2.根据权利要求A1所述的异源二聚抗体，其中所述第一ABD结合人CD28，并且所述第二ABD结合人B7H3。

3.根据权利要求A1所述的异源二聚抗体，其中所述第一ABD结合人B7H3，并且所述第二ABD结合人CD28。

4.根据权利要求3所述的异源二聚抗体，其中所述VH1结构域的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQID NO：505、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQID NO：516、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQID NO：528、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：546、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：549、SEQID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：552、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：554、SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：556、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：559、SEQ IDNO：560、SEQID NO：561、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：563、SEQ ID NO：564、SEQ ID NO：565、SEQ ID NO：566、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：571、SEQID NO：572、SEQ ID NO：573、SEQ ID NO：574、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：581、SEQ ID NO：582、SEQID NO：583和SEQ ID NO：584；并且其中所述VL结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：874。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述VH2结构域的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ IDNO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ IDNO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ IDNO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ IDNO：1199、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650和SEQ ID NO：651。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。

7.根据权利要求6所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下异源二聚化变体的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。

8.根据权利要求7所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。

10.根据权利要求9所述的异源二聚抗体，其中所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一单体或所述第二单体中的一者还包含pI变体。

12.根据权利要求11所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，

其中所述第一Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，

并且其中编号是根据EU编号进行的。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体428L/434S。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体包含SEQ IDNO：1019的氨基酸序列，所述第一单体包含SEQ ID NO：1020的氨基酸序列，并且所述轻链具有SEQ ID NO：1021的氨基酸序列。

16.一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：

a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；

其中所述第一VH结构域和所述VL结构域一起形成第一ABD，并且所述第二VH结构域和所述VL结构域一起形成第二ABD，并且其中所述第一ABD和所述第二ABD中的一个结合人CD28，并且所述第一ABD和所述第二ABD中的另一个结合人B7H3。

17.根据权利要求15所述的异源二聚抗体，其中所述VH1结构域的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQID NO：505、SEQ ID NO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQID NO：516、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQID NO：528、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQID NO：539、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：546、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：549、SEQID NO：550、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：552、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：554、SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：556、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：560、SEQID NO：561、SEQ ID NO：562、SEQ ID NO：563、SEQ ID NO：564、SEQ ID NO：565、SEQ ID NO：566、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：571、SEQID NO：572、SEQ ID NO：573、SEQ ID NO：574、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：581、SEQ ID NO：582、SEQID NO：583和SEQ ID NO：584；并且其中所述VL结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：874。

18.根据权利要求16或17中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述VH2结构域的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：870、、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ IDNO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ IDNO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650和SEQ IDNO：651。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。

20.根据权利要求19所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下异源二聚化变体的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。

21.根据权利要求20所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

22.根据权利要求16至21中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。

23.根据权利要求22所述的异源二聚抗体，其中所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

24.根据权利要求16至23中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一单体或所述第二单体中的一者还包含pI变体。

25.根据权利要求24所述的异源二聚抗体，其中所述第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

26.根据权利要求16至25中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，

其中所述第二Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，

并且其中编号是根据EU编号进行的。

27.根据权利要求16至28中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体428L/434S。

28.一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：

a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-第一结构域接头-scFv-第二结构域接头-CH2-CH3，

其中VH1是第一可变重结构域，scFv是抗CD28 scFv，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；

b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；以及

c)轻链，所述轻链从N末端到C末端包含VL1-CL，其中VL1是可变轻结构域，并且CL是恒定轻结构域，

其中所述VH1结构域和所述第一VL1结构域中的每一个一起形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且所述scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二VL结构域(VL2)，并且所述VH2和所述VL2形成第二ABD，其中所述第一ABD和所述第二ABD中的一个结合人CD28，并且所述第一ABD和所述第二ABD中的另一个结合肿瘤靶抗原(TTA)。

29.根据权利要求28所述的异源二聚抗体，其中所述第一ABD结合人CD28，并且所述第二ABD结合TTA。

30.根据权利要求28所述的异源二聚抗体，其中所述第一ABD结合TTA，并且所述第二ABD结合人CD28。

31.根据权利要求28至30中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N末端到C末端包含VL2-scFv接头-VH2。

32.根据权利要求28至30中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N末端到C末端包含VH2-scFv接头-VL2。

33.根据权利要求28至32中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述VH2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ IDNO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ IDNO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650和SEQ ID NO：651；并且其中所述VL2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：874、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO：666、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：673、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：684、SEQ ID NO：685、SEQ ID NO：686、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQ ID NO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：740、SEQ ID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ ID NO：750、SEQ ID NO：751、SEQ ID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQ ID NO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ ID NO：756。

34.根据权利要求28至33中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述TTA是人B7H3。

35.根据权利要求28至34中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。

36.根据权利要求35所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下异源二聚化变体的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。

37.根据权利要求36所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

38.根据权利要求28至37中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。

39.根据权利要求38所述的异源二聚抗体，其中所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

40.根据权利要求28至39中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一单体或所述第二单体中的一者还包含pI变体。

41.根据权利要求40所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

42.根据权利要求28至41中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，

并且其中编号是根据EU编号进行的。

43.根据权利要求28至42中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体428L/434S。

44.一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：

a)第一单体，所述第一单体包含：

i)scFv，所述scFv包含第一可变重结构域、scFv接头和第一可变轻结构域；和

ii)第一Fc结构域，其中所述scFv使用结构域接头共价附接至所述第一Fc结构域的N末端；

b)第二单体，所述第二单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH是第一可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；和

其中所述VH1和所述VL1一起形成第一ABD，并且其中所述scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二VL结构域(VL2)，其中所述VH2和所述VL2一起形成第二ABD，并且其中所述第一ABD和所述第二ABD中的一个结合CD28，并且所述第一ABD和所述第二ABD中的另一个结合TTA。

45.根据权利要求44所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N末端到C末端包含VL2-scFv接头-VH2。

46.根据权利要求44所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N末端到C末端包含VH2-scFv接头-VL2。

47.根据权利要求44至46中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第二ABD结合人CD28，其中所述VH2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ IDNO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ IDNO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ IDNO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ IDNO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650和SEQ ID NO：651；并且其中所述VL2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：874、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO：666、SEQID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：673、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQ ID NO：677、SEQID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：684、SEQ ID NO：685、SEQ ID NO：686、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：721、SEQID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQ ID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQ ID NO：732、SEQID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQ ID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：740、SEQ ID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743、SEQID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQ ID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ ID NO：750、SEQ ID NO：751、SEQ ID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQ ID NO：754、SEQID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ ID NO：756。

48.根据权利要求44至47中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。

49.根据权利要求48所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下异源二聚化变体的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。

50.根据权利要求49所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

51.根据权利要求44至50中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。

52.根据权利要求51所述的异源二聚抗体，其中所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

53.根据权利要求44至52中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一单体或所述第二单体中的一者还包含pI变体。

54.根据权利要求53所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

55.根据权利要求44至54中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，

并且其中编号是根据EU编号进行的。

56.根据权利要求44至55中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体428L/434S。

57.一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：

a)第一单体，所述第一单体从N末端到C末端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-scFv，

其中所述VH1结构域和所述第一VL1结构域中的每一个一起形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且所述scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二VL结构域(VL2)，并且所述VH2和所述VL2一起形成第二ABD，其中所述第一ABD和所述第二ABD中的一个结合人CD28，并且所述第一ABD和所述第二ABD中的另一个结合肿瘤靶抗原(TTA)。

58.根据权利要求57所述的异源二聚抗体，其中所述第一ABD结合人CD28，并且所述第二ABD结合TTA。

59.根据权利要求57所述的异源二聚抗体，其中所述第一ABD结合TTA，并且所述第二ABD结合人CD28。

60.根据权利要求57至59中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N末端到C末端包含VL2-scFv接头-VH2。

61.根据权利要求57至59中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N末端到C末端包含VH2-scFv接头-VL2。

62.根据权利要求57至61中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述VH2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ ID NO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQ ID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ IDNO：635、SEQ ID NO：636、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ IDNO：646、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650和SEQ ID NO：651；并且其中所述VL2的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：874、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO：666、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ ID NO：673、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ ID NO：684、SEQ ID NO：685、SEQ ID NO：686、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ ID NO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ ID NO：706、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQ ID NO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：740、SEQ ID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ ID NO：750、SEQ ID NO：751、SEQ ID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQ ID NO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ ID NO：756。

63.根据权利要求57至62中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述TTA是人B7H3。

64.根据权利要求57至63中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。

65.根据权利要求64所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含选自以下异源二聚化变体的一组异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q：L368D/K370S；S364K：L368D/K370S；S364K：L368E/K370S；D401K：T411E/K360E/Q362E；和T366W：T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。

66.根据权利要求65所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q：L368D/K370S。

67.根据权利要求57至66中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域各自包含一种或多种消融变体。

68.根据权利要求67所述的异源二聚抗体，其中所述一种或多种消融变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。

69.根据权利要求57至68中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一单体或所述第二单体中的一者还包含pI变体。

70.根据权利要求69所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。

71.根据权利要求57至70中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，

并且其中编号是根据EU编号进行的。

72.根据权利要求57至71中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体428L/434S。

73.一种核酸组合物，所述核酸组合物分别包含：

a)第一核酸，所述第一核酸编码根据权利要求1至72中任一项所述的第一单体；

b)第二核酸，所述第二核酸编码根据权利要求1至72中任一项所述的第二单体；和

c)第三核酸，所述第三核酸编码根据权利要求1至72中任一项所述的轻链。

74.一种表达载体组合物，所述表达载体组合物分别包含：

a)第一表达载体，所述第一表达载体包含根据权利要求73所述的第一核酸；

b)第二表达载体，所述第二表达载体包含根据权利要求73所述的第二核酸；和

c)第三表达载体，所述第三表达载体包含根据权利要求73所述的第三核酸。

75.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求74所述的表达载体组合物。

76.一种制备根据权利要求1至72中任一项所述的异源二聚抗体的方法，所述方法包括在表达所述异源二聚抗体的条件下培养根据权利要求75所述的宿主细胞，以及回收所述异源二聚抗体。

77.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求1至72中任一项所述的异源二聚抗体。

78.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用：

a)根据权利要求1至72中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述TTA是人B7H3；和

b)结合CD3和B7H3的双特异性抗体。

79.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用：

b)选自由抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体组成的组的检查点抑制剂。

80.一种组合物，所述组合物包含抗CD28 ABD，所述抗CD28 ABD包含：

a)可变重结构域，所述可变重结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：870、SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594、SEQ IDNO：595、SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605、SEQ IDNO：606、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：611、SEQ ID NO：612、SEQ ID NO：613、SEQ ID NO：614、SEQ ID NO：615、SEQ ID NO：616、SEQ IDNO：617、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：622、SEQ ID NO：623、SEQ ID NO：624、SEQ ID NO：1198、SEQ ID NO：1199、SEQ ID NO：625、SEQID NO：626、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：632、SEQ ID NO：633、SEQ ID NO：634、SEQ ID NO：635、SEQ ID NO：636、SEQID NO：637、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：642、SEQ ID NO：643、SEQ ID NO：644、SEQ ID NO：645、SEQ ID NO：646、SEQ ID NO：647、SEQID NO：648、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：650、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQID NO：659、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671和SEQ ID NO：672；和

b)可变轻结构域，所述可变轻结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：874、SEQ ID NO：652、SEQ ID NO：653、SEQ ID NO：654、SEQ ID NO：655、SEQ ID NO：656、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：660、SEQ ID NO：661、SEQ IDNO：662、SEQ ID NO：663、SEQ ID NO：664、SEQ ID NO：665、SEQ ID NO：666、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：670、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：672、SEQ IDNO：673、SEQ ID NO：674、SEQ ID NO：675、SEQ ID NO：676、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：681、SEQ ID NO：682、SEQ ID NO：683、SEQ IDNO：684、SEQ ID NO：685、SEQ ID NO：686、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：691、SEQ ID NO：692、SEQ ID NO：693、SEQ ID NO：694、SEQ IDNO：695、SEQ ID NO：696、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：701、SEQ ID NO：702、SEQ ID NO：703、SEQ ID NO：704、SEQ ID NO：705、SEQ IDNO：706、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：711、SEQ ID NO：712、SEQ ID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ IDNO：717、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：721、SEQ ID NO：722、SEQ ID NO：723、SEQ ID NO：724、SEQ ID NO：725、SEQ ID NO：726、SEQ ID NO：727、SEQ IDNO：728、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：731、SEQ ID NO：732、SEQ ID NO：733、SEQ ID NO：734、SEQ ID NO：735、SEQ ID NO：736、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：738、SEQ IDNO：739、SEQ ID NO：740、SEQ ID NO：741、SEQ ID NO：742、SEQ ID NO：743、SEQ ID NO：744、SEQ ID NO：745、SEQ ID NO：746、SEQ ID NO：747、SEQ ID NO：748、SEQ ID NO：749、SEQ IDNO：750、SEQ ID NO：751、SEQ ID NO：752、SEQ ID NO：753、SEQ ID NO：754、SEQ ID NO：755、SEQ ID NO：1200和SEQ ID NO：756。

81.根据权利要求80所述的组合物，其中所述组合物是抗体，所述抗体包含：

a)包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链；和

b)包含VL-CL的轻链。

82.一种组合物，所述组合物包含抗B7H3 ABD，所述抗B7H3 ABD包含：

a)可变重结构域，所述可变重结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：518、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：501、SEQ ID NO：502、SEQ ID NO：503、SEQ ID NO：504、SEQ ID NO：505、SEQ IDNO：506、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：511、SEQ ID NO：512、SEQ ID NO：513、SEQ ID NO：514、SEQ ID NO：515、SEQ ID NO：516、SEQ IDNO：517、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：522、SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：524、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：526、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：528、SEQ IDNO：529、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：532、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：534、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：536、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：539、SEQ IDNO：540、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：542、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：544、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：546、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：550、SEQ IDNO：551、SEQ ID NO：552、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：554、SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：556、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：560、SEQ ID NO：561、SEQ IDNO：562、SEQ ID NO：563、SEQ ID NO：564、SEQ ID NO：565、SEQ ID NO：566、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：571、SEQ ID NO：572、SEQ IDNO：573、SEQ ID NO：574、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：581、SEQ ID NO：582、SEQ ID NO：583和SEQ IDNO：584；和

b)可变轻结构域，所述可变轻结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：874和SEQ ID NO：932。

83.一种组合物，所述组合物包含抗B7H3 ABD，所述抗B7H3 ABD包含：

a)具有SEQ ID NO：946的氨基酸序列的可变重结构域；和

b)具有SEQ ID NO：950的氨基酸序列的可变轻结构域。

84.一种组合物，所述组合物包含抗B7H3 ABD，所述抗B7H3 ABD包含：

a)具有SEQ ID NO：956的氨基酸序列的可变重结构域；和

b)具有SEQ ID NO：960的氨基酸序列的可变轻结构域。

85.一种组合物，所述组合物包含抗B7H3 ABD，所述抗B7H3 ABD包含：

a)具有SEQ ID NO：964的氨基酸序列的可变重结构域；和

b)具有SEQ ID NO：968的氨基酸序列的可变轻结构域。

86.一种组合物，所述组合物包含抗B7H3 ABD，所述抗B7H3 ABD包含：

a)具有SEQ ID NO：972的氨基酸序列的可变重结构域；和

b)具有SEQ ID NO：976的氨基酸序列的可变轻结构域。

87.根据权利要求82至86中任一项所述的组合物，其中所述组合物是抗体，所述抗体包含：

a)包含连接至-CH1-铰链-CH2-CH3的VH的重链；和

b)包含连接至-CL的VL的轻链。

88.一种核酸组合物，所述核酸组合物分别包含：

a)第一核酸，所述第一核酸编码根据权利要求80或82所述的VH；和

b)第二核酸，所述第二核酸编码根据权利要求80或82所述的VL。

89.一种表达载体组合物，所述表达载体组合物包含：

(a)第一表达载体，所述第一表达载体包含根据权利要求88所述的第一核酸；和

(b)第二表达载体，所述第二表达载体包含根据权利要求88所述的第二核酸。

90.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求88所述的核酸组合物或根据权利要求89所述的表达载体组合物。

91.一种制备组合物的方法，所述方法包括在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求90所述的宿主细胞，以及回收所述抗体。