JP2022552183A - 特性が改善されたｐｄ－１標的化ｉｌ－１５／ｉｌ－１５ｒαｆｃ融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、バリアントＩＬ－１５タンパク質を含む融合タンパク質、バリアント抗ＰＤ－１抗原結合ドメインを含む融合タンパク質、並びにバリアントＩＬ－１５タンパク質及びバリアント抗ＰＤ－１抗原結合ドメインを含む融合タンパク質に関する。本発明はまた、そのような融合タンパク質を作製するための、核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び方法、並びにがんの処置におけるそのような融合タンパク質の使用に関する。【選択図】図１５４Ｃ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１１日に出願された米国仮出願第６２／９１４，２６５号；２０１９年１０月１１日に出願された米国仮出願第６２／９１４，３１７号；及び２０２０年４月１６日に出願された米国仮出願第６３／０１１，２０８号の優先権を主張し、これらの内容はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表

本出願は、ＡＳＣＩＩ形式にて電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年１０月９日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーの名称は０００２１８－０００５－ＷＯ１＿－＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズは７６４，８６３バイトである。

がん免疫療法における２つの非常に有望なアプローチには、サイトカインベースの処置及びＰＤ－１などの免疫チェックポイントタンパク質の遮断が含まれる。

ＩＬ－２及びＩＬ－１５などのサイトカインは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞の増殖及び分化を助ける機能を果たす。両方のサイトカインは、共通のガンマ鎖（γｃ；ＣＤ１３２）及びＩＬ－２受容体β鎖（ＩＬ－２Ｒβ；ＣＤ１２２）の２つの共有受容体並びに各サイトカインに固有のα鎖受容体：ＩＬ－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα；ＣＤ２５）又はＩＬ－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα；ＣＤ２１５）からなる三量体複合体に結合することによってそれらの細胞シグナル伝達機能を発揮する。両方のサイトカインは、腫瘍学において潜在的に有益な治療薬と考えられており、ＩＬ－２は、転移性腎細胞癌腫及び悪性黒色腫の患者における使用が承認されている。現在、組換えＩＬ－１５の承認された使用はないが、いくつかの臨床試験が進行中である。しかし、潜在的な薬物として、両方のサイトカインは非常に速いクリアランスを受け、半減期は数分で測定される。ＩＬ－２免疫療法は、急速なクリアランスを克服するために高用量で投与された場合、全身毒性に関連している。このような全身毒性は、最近の臨床試験においてＩＬ－１５免疫療法でも報告されている（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１５，１９５（５）：２３５３－６４）。

ＰＤ－１などの免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１などの免疫チェックポイントリガンドへの結合時に活性化Ｔ細胞を枯渇させることによって自己免疫を排除するために、Ｔ細胞活性化後に上方制御される。しかしながら、免疫チェックポイントタンパク質はまた、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）においても上方制御され、免疫チェックポイントリガンドは腫瘍細胞上で過剰発現され、腫瘍細胞による免疫回避に寄与する。Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ）及びＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペンブロリズマブ）などの薬物による免疫チェックポイント相互作用の遮断によるＴＩＬの抑制解除は、がんの処置に非常に有効であることが証明されている。ニボルマブ及びペンブロリズマブなどのチェックポイント遮断療法の有望性にもかかわらず、多くの患者は、チェックポイント遮断単独に対して十分な応答を達成できていない。

したがって、高用量を必要とせず、全身毒性を回避するために腫瘍を標的とするサイトカインを用いた治療戦略のための腫瘍学的処置の必要性は満たされていない。さらに、患者の応答率を増加させる可能性があるチェックポイント遮断と積み重ねるための追加の治療様式を特定する必要がある。追加の治療様式はチェックポイント遮断と競合すべきではないため、これは特に複雑であり得る。本発明は、安全性プロファイルを改善するための半減期の向上及びＴＩＬのより選択的な標的化を有し、それらが組み合わされ得るチェックポイント遮断抗体と競合しないＰＤ－１標的化ＩＬ－１５融合タンパク質を提供することによって、これらの必要性及び警告に対処する。

本発明の第１の態様は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かってｉ）ＩＬ－１５／Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン；ｉｉ）第１のドメインリンカー；ｉｉｉ）ＩＬ－１５ドメイン；及びｉｖ）第１のバリアントＦｃドメインを含む第１のモノマー；ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖（式中ＣＨ２－ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）を含む第２のモノマー；並びにｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマーを含む、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供し、ここでＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、ＶＨは、配列番号５と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＦ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆアミノ酸置換を含むバリアント可変重ドメインであり、ＶＬは、配列番号１６８と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｎ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔを含むバリアント可変軽ドメインである。

いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１７６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアントＩＬ－１５ドメインである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａ、又はそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアントＩＬ－１５ドメインである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは、アミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５ドメインである。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインは、ヒンジドメインの全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む。

本発明の第２の態様は、ａ）ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；ｉｉ）第１のドメインリンカー；ｉｉｉ）配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５タンパク質；及びｉｖ）第１のバリアントＦｃドメインを含む、第１のモノマー；ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖（式中ＣＨ２－ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）を含む第２のモノマー；並びにｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマーを含む、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供し、ここでＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成する。

いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１６８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１７６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、ニボルマブ及び／又はペンブロリズマブとヒトＰＤ－１との結合について競合しない。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインは、ヒンジドメインの全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む。

本発明の第３の態様は、ａ）ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；ｉｉ）第１のドメインリンカー；ｉｉｉ）配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５タンパク質；及びｉｖ）第１のバリアントＦｃドメインを含む、第１のモノマー；ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖（式中ＣＨ２－ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）を含む第２のモノマー；並びにｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマーを含む、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供し、ここでＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、ＶＨは、配列番号５と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＦ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆアミノ酸置換を含むバリアント可変重ドメインであり、ＶＬは、配列番号１６８と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｎ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔを含むバリアント可変軽ドメインである。

いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号１７６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインは、ヒンジドメインの全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む。

本発明の第４の態様は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かってｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；ｉｉ）第１のドメインリンカー；ｉｉｉ）配列番号２と比較してＮ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアントＩＬ－１５タンパク質；及びｉｖ）第１のバリアントＦｃドメインを含む第１のモノマー；ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖（式中ＣＨ２－ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）を含む第２のモノマー；並びにｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマーを含む、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供し、ここでＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメインを形成し、ＶＨは、配列番号５と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｗ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメインであり、ＶＬドメインが、ｉ）配列番号１６８；及びｉｉ）配列番号１６８と比較してＫａｂａｔナンバリングでＮ２７ｄＨ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメインからなる群から選択され、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換をさらに含む。

いくつかの実施形態では、バリアント重ドメインは配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、バリアント軽ドメインは配列番号１７６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、バリアント重ドメインはＨ１．１７６（配列番号３１８）であり、バリアント軽ドメインはＬ１．１４０（配列番号１７６）であり、バリアントＩＬ－１５タンパク質はアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、バリアント重ドメインはＨ１．１７６（配列番号３１８）であり、バリアント軽ドメインはＬ１．１４０（配列番号１７６）であり、バリアントＩＬ－１５タンパク質はアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む。

いくつかの実施形態では、第１のドメインリンカーは、ＧＧＧＧＡ（配列番号８）を含む。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインは、ヒンジドメインの全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む。

本発明の第５の態様は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；ｉｉ）第１のドメインリンカー；ｉｉｉ）バリアントＩＬ－１５タンパク質；及び ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメインを含む第１のモノマー；ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖（式中ＣＨ２－ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）を含む第２のモノマー；並びにｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマーを含む、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供し、ここでＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメインを形成し、ＶＨは、配列番号５と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｗ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメインであり、ＶＬドメインが、ｉ）配列番号１６８；及びｉｉ）配列番号１６８と比較してＫａｂａｔナンバリングでＮ２７ｄＨ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメインからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、バリアント重ドメインは、Ｈ１．１７６、Ｈ１．１７７、Ｈ１．１７８、Ｈ１．１７９、Ｈ１．１８０、Ｈ１．１８１、Ｈ１．１８２、Ｈ１．１８３、Ｈ１．１８４、Ｈ１．１８５、Ｈ１．１８６、Ｈ１．１８７、Ｈ１．１８８、Ｈ１．１８９、Ｈ１．１９０、Ｈ１．１９１、Ｈ１．１９２、Ｈ１．１９３、Ｈ１．１９４、Ｈ１．１９５、Ｈ１．１９６、Ｈ１．１９７、Ｈ１．１９８、Ｈ１．１９９、Ｈ１．２００、Ｈ１．２０１、Ｈ１．２０２、Ｈ１．２０３、Ｈ１．２０４、Ｈ１．２０５、Ｈ１．２０６、Ｈ１．２０７、Ｈ１．２０８、Ｈ１．２０９、Ｈ１．２１０、Ｈ１．２１１、Ｈ１．２１２、Ｈ１．２１３、Ｈ１．２１４、Ｈ１．２１５、Ｈ１．２１６、Ｈ１．２１７、Ｈ１．２１８、Ｈ１．２１９、Ｈ１．２２０、Ｈ１．２２１、Ｈ１．２２２、Ｈ１．２２３及びＨ１．２２４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バリアント軽ドメインは、Ｌ１．１、Ｌ１．３、Ｌ１．４５、Ｌ１．１１７、Ｌ１．１２９、Ｌ１．１３５、Ｌ１．１３６及びＬ１．１４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バリアント重ドメインは配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、バリアント軽ドメインは配列番号１７６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインは、ヒンジドメインの全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む。

本発明の第６の態様は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；ｉｉ）第１のドメインリンカー；ｉｉｉ）配列番号２と比較してＮ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアントＩＬ－１５タンパク質；及びｉｖ）第１のバリアントＦｃドメインを含む、第１のモノマー；ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖（式中ＣＨ２－ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）を含む第２のモノマー；並びにｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマーを含む、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供し、ここでＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ヒトＰＤ－１に結合し、かつヒトＰＤ－１への結合についてニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと競合しない抗原結合ドメインを形成する。

いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む。

いくつかの実施形態では、第１のドメインリンカーは、ＧＧＧＧＡ（配列番号８）である。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインは、ヒンジドメインの全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む。

上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインはＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第２のバリアントＦｃドメインはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む（ＥＵナンバリングによる）。

上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ独立して、ＥＵナンバリングで、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む。

上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第１のＦｃドメインは、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含む。

上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む。

上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第１のモノマーは、配列番号２２５のアミノ酸配列を含む。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第２のモノマーは、配列番号２４４のアミノ酸配列を含む。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第３のモノマーは、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第１のモノマーは配列番号２２５のアミノ酸配列を含み、第２のモノマーは配列番号２４４のアミノ酸配列を含み、第３のモノマーは配列番号１９６のアミノ酸配列を含む。

本発明の第７の態様は、ａ）配列番号５と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｗ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメイン、及びｂ）、ｉ）配列番号１６８；及びｉｉ）配列番号１６８と比較してＫａｂａｔナンバリングでＮ２７ｄＨ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメインからなる群から選択される可変軽ドメインを含む抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物を提供し、ここでＡＢＤは、ヒトＰＤ－１に結合する。

いくつかの実施形態では、バリアント重ドメインは、Ｋａｂａｔナンバリングでアミノ酸置換Ｆ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆを有し、バリアント軽ドメインは、Ｋａｂａｔナンバリングでアミノ酸置換Ｎ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔを有する。

いくつかの実施形態では、バリアント重ドメインは、Ｈ１．１７６、Ｈ１．１７７、Ｈ１．１７８、Ｈ１．１７９、Ｈ１．１８０、Ｈ１．１８１、Ｈ１．１８２、Ｈ１．１８３、Ｈ１．１８４、Ｈ１．１８５、Ｈ１．１８６、Ｈ１．１８７、Ｈ１．１８８、Ｈ１．１８９、Ｈ１．１９０、Ｈ１．１９１、Ｈ１．１９２、Ｈ１．１９３、Ｈ１．１９４、Ｈ１．１９５、Ｈ１．１９６、Ｈ１．１９７、Ｈ１．１９８、Ｈ１．１９９、Ｈ１．２００、Ｈ１．２０１、Ｈ１．２０２、Ｈ１．２０３、Ｈ１．２０４、Ｈ１．２０５、Ｈ１．２０６、Ｈ１．２０７、Ｈ１．２０８、Ｈ１．２０９、Ｈ１．２１０、Ｈ１．２１１、Ｈ１．２１２、Ｈ１．２１３、Ｈ１．２１４、Ｈ１．２１５、Ｈ１．２１６、Ｈ１．２１７、Ｈ１．２１８、Ｈ１．２１９、Ｈ１．２２０、Ｈ１．２２１、Ｈ１．２２２、Ｈ１．２２３及びＨ１．２２４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バリアント軽ドメインは、Ｌ１．１、Ｌ１．３、Ｌ１．４５、Ｌ１．１１７、Ｌ１．１２９、Ｌ１．１３５、Ｌ１．１３６及びＬ１．１４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バリアント重ドメインは配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、バリアント軽ドメインは配列番号１７６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、組成物は、全長抗ＰＤ－１抗体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３２４３５である。

本発明の第８の態様は、配列番号２と比較して、バリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物であって、バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ及びＱ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換をさらに含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ １５タンパク質は、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ １５タンパク質は、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ １５タンパク質は、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む。

本発明の第９の態様は、ａ）ｉ）配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５タンパク質と；ｉｉ）ドメインリンカーと；ｉｉｉ）第１のバリアントＦｃドメインとを含む第１の融合タンパク質；及びｂ）ｉ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインと；ｉｉ）ドメインリンカー；とｉｉｉ）第２のバリアントＦｃドメインとを含む第２の融合タンパク質を含む、ヘテロ二量体タンパク質を提供する。

いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５融合タンパク質は、配列番号３１９のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインはＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第２のバリアントＦｃドメインはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む（ＥＵナンバリングによる）。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、４２８Ｌ／４３４Ｓを含む。

いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質は配列番号２０８のアミノ酸配列を含み、第２の融合タンパク質は配列番号９５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質は配列番号２１１のアミノ酸配列を含み、第２の融合タンパク質は配列番号２０６のアミノ酸配列を含む。

本発明のさらなる態様は、（ａ）上記融合タンパク質のいずれか；（ｂ）上記の抗ＰＤ－１ ＡＢＤのいずれか；（ｃ）バリアントＩＬ－１５タンパク質を含む上記組成物のいずれか、又は（ｄ）上記ヘテロ二量体タンパク質のいずれかを発現するための核酸分子、核酸組成物、発現ベクター、発現ベクター組成物、宿主細胞及び方法を提供する。

本発明のさらなる態様は、薬学的に許容され得る担体と、（ａ）上記融合タンパク質のいずれか；（ｂ）上記の抗ＰＤ－１ ＡＢＤのいずれか；（ｃ）バリアントＩＬ－１５タンパク質を含む上記組成物のいずれか、又は（ｄ）上記ヘテロ二量体タンパク質のいずれかとを含む医薬組成物を提供する。

本発明のさらなる態様は、治療有効量の（ａ）上記融合タンパク質のいずれか；（ｂ）上記の抗ＰＤ－１ ＡＢＤのいずれか；（ｃ）バリアントＩＬ－１５タンパク質を含む上記組成物のいずれか；（ｄ）上記ヘテロ二量体タンパク質のいずれか；又は（ｅ）上記の医薬組成物のいずれかを、がんの処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本方法は、治療有効量のチェックポイント遮断抗体を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、チェックポイント遮断抗体は抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント遮断抗体はニボルマブ又はペンブロリズマブである。

本発明のさらなる態様は、がんの処置を必要とする対象におけるがんを処置するための医薬の製造における、（ａ）上記融合タンパク質のいずれか；（ｂ）上記の抗ＰＤ－１ ＡＢＤのいずれか；（ｃ）バリアントＩＬ－１５タンパク質を含む上記組成物のいずれか；（ｄ）上記ヘテロ二量体タンパク質のいずれか；又は（ｅ）上記の医薬組成物のいずれかの使用を提供する。

いくつかの実施形態では、医薬は、治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与されるように製剤化される。いくつかの実施形態では、チェックポイント遮断抗体は抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント遮断抗体はニボルマブ又はペンブロリズマブである。

本発明のさらなる態様は、がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置での使用のための、（ａ）上記融合タンパク質のいずれか；（ｂ）上記の抗ＰＤ－１ ＡＢＤのいずれか；（ｃ）バリアントＩＬ－１５タンパク質を含む上記組成物のいずれか；（ｄ）上記ヘテロ二量体タンパク質のいずれか；又は（ｅ）上記の医薬組成物のいずれかを提供する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質抗ＰＤ－１ ＡＢＤ、バリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物、ヘテロ二量体タンパク質又は医薬組成物は、治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、チェックポイント遮断抗体は抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント遮断抗体はニボルマブ又はペンブロリズマブである。

本特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面（複数可）を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、申請に応じて、必要な手数料を支払うことにより、特許庁から提供されることになる。

図１Ａ及び図１Ｂは、ＩＬ－１５及びその受容体の配列を示す。

図２は、臨床開発を容易にするためにヒトとカニクイザルの両方に結合する抗原結合ドメインの開発を促進するための、ヒトとカニクイザルの両方のＰＤ－１の配列を示す。

図３Ａ～図３Ｅは、Ｆｃヘテロ二量体化バリアントセット（スキューバリアント及びｐＩバリアントを含む）の有用な対を示す。対応する「モノマー２」バリアントが存在しないバリアントが存在する。これらは、いずれかのモノマー上で単独で使用することができるｐＩバリアントである。

図４は、アイソステリックのバリアント抗体の定常領域及びそれらのそれぞれの置換のリストを示す。ｐＩ＿（－）はより低いｐＩバリアントを示し、ｐＩ＿（＋）はより高いｐＩバリアントを示す。これらは、本発明の他のヘテロ二量体化バリアント（及び他のバリアントのタイプも同様に本明細書に概説される）と、任意に、かつ独立して組み合わせることができる。

図５は、ＦｃγＲ結合を消失させる有用な除去バリアント（「ノックアウト」又は「ＫＯ」バリアントと呼ばれることもある）を示す。一般に、除去バリアントは両方のモノマーに見られるが、場合によっては１つのモノマーのみにあってもよい。

図６Ａ～図６Ｅは、本発明のＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の「非サイトカイン」成分の特に有用な実施形態を示す。

図７Ａ～図７Ｆは、本発明のＩＬ－１５／Ｒα×抗ＰＤ－１二機能性タンパク質の「非サイトカイン」／「非Ｆｖ」成分の特に有用な実施形態を示す。

図８は、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質において使用するためのいくつかの例示的な可変長ドメインリンカーを示す。いくつかの実施形態では、これらのドメインリンカーは、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＣ末端をＦｃ領域のＮ末端に連結する用途を見出す。いくつかの実施形態では、これらのドメインリンカーは、ＩＬ－１５をＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合する用途を見出す。いくつかの実施形態では、これらのドメインリンカーは、一本鎖ＦｖをＦｃ鎖に連結する用途を見出す。いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結するために使用されるｓｃＦｖリンカーであり、任意に荷電され得る。いくつかの実施形態では、これらのリンカーを組み合わせてもよい。例えば、ＧＧＧＧＳリンカーを「半ヒンジ」リンカーと組み合わせてもよい。

図９は、１つ又は複数のｓｃＦｖを成分として利用するヘテロ二量体抗体のｐＩを増加又は減少させるのに使用されるいくつかの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。（＋Ｈ）陽性リンカーは、本明細書において特定の用途が見出される。単一電荷を有する単一の先行技術のｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（８）：９８９－９９５（１９９３）から「Ｗｈｉｔｌｏｗ」と称される。このリンカーは、ｓｃＦｖにおいて、凝集を減少させ、タンパク質分解安定性を増強するために使用されたことに留意すべきである。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＣ末端をＦｃ領域のＮ末端に連結する；及び／又はＩＬ－１５をＩＬ－１５／Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に連結する用途を見出す。

図１０Ａ～図１０Ｄは、サイトカイン配列を含まない、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃフォーマット骨格の配列を示す（例えば、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ））。これらの骨格はまた、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のある特定の実施形態において用途を見出すことができることに留意することが重要である。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づいており、両方の鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、及び両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づいており、両方の鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、及び両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づいており、両方の鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｓ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、及び両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づいており、両方の鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｄ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアント、Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅスキューバリアントを有する鎖上のＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、及び両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づいており、両方の鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、及び両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づいており、両方の鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、及び両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアント、並びに両方の鎖上のＮ２９７Ａバリアントを含む。骨格７は、突然変異がＮ２９７Ｓであることを除いて、６と同一である。骨格６及び７の代替フォーマットは、両方の鎖上の除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外することができる。骨格８は、ヒトＩｇＧ４に基づいており、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、並びに当技術分野で知られているようにＦａｂアーム交換を除去させる両方の鎖上のＳ２２８Ｐ（ＥＵナンバリング、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）バリアントを含む。骨格９は、ヒトＩｇＧ２に基づいており、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアントを含む。骨格１０は、ヒトＩｇＧ２に基づいており、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント並びに両方の鎖上のＳ２６７Ｋバリアントを含む。骨格１１は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｘｔｅｎｄ突然変異を含むことを除いて、骨格１と同一である。骨格１２は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づいており、両方の同一鎖上にＣ２２０Ｓ、両方の同一鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格１３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づいており、両方の鎖上のＣ２２０Ｓ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキューバリアントを有する鎖上のＰ２１７Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６Ｋ ｐＩバリアント、及び両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。

当業者によって理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、図１４Ａ～図１４Ｇに概略的に示されるように、ＩＬ－１５／Ｒα－ヘテロＦｃ、ｎｃＩＬ－１５／Ｒα及びｓｃＩＬ－１５／Ｒαを含むがこれらに限定されない、本明細書に概説される任意のＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）対と共に使用することができる。さらに、任意のＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントを任意の組合せでこれらの図１０Ａ～図１０Ｃの骨格に組み込むことができる。

これらの骨格のそれぞれには、列挙された配列と９０、９５、９８及び９９％同一（本明細書で定義）である配列、及び／又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０の追加のアミノ酸置換（図の「親」と比較して、当業者には理解できるように、親ヒトＩｇＧ１（又は骨格によってはＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４）と比較してすでに多数のアミノ酸改変が含まれている）が含まれる。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキュー、ｐＩ及び除去バリアントに加えて、追加のアミノ酸改変（一般にアミノ酸置換）を含み得る。

図１１は、サイトカイン配列（例えば、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ））又はＶＨを含まず、さらに図１２に示される同族軽鎖骨格を除外した、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用なＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合フォーマット骨格の配列を示す。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づいており、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＣ２２０Ｓ及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、並びに、両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づいており、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑバリアントを有する鎖内のＣ２２０Ｓ並びに、両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づいており、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアントを有する鎖上のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ ｐＩバリアント、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑバリアントを有する鎖上のＱ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２１７Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６Ｋ ｐＩバリアント並びに、両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む。

ある特定の実施形態において、これらの配列は、３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプのものであり得る。他の実施形態では、これらの配列は、Ｎ２９７Ａ又はＮ２９７Ｓ置換のいずれかを含み得る。いくつかの他の実施形態では、これらの配列は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｘｔｅｎｄ突然変異を含み得る。さらに他の実施形態では、これらの配列は、代わりにヒトＩｇＧ４に基づくことができ、当技術分野で公知のようにＦａｂアーム交換を除去する、両方の鎖上のＳ２２８Ｐ（ＥＵナンバリング、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）バリアントを含む。またさらなる実施形態では、これらの配列は、代わりにヒトＩｇＧ２に基づくことができる。さらに、これらの配列は、代わりに、図３Ａ～図３Ｅ、図４、及び図５に示される他のスキューバリアント、ｐＩバリアント、及び除去バリアントを利用し得る。

当業者によって理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、図５３に概略的に示されるように、ｓｃＩＬ－１５／Ｒα、ｎｃＩＬ－１５／Ｒα、及びｄｓＩＬ－１５Ｒαを含むがこれらに限定されない、本明細書に概説される任意のＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）対と共に使用することができる。さらに、当業者によって理解され、以下に概説されるように、任意のＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントをこれらの骨格に組み込むことができる。さらに、当業者によって理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、ｓｃＦｖ又はＦａｂのいずれかを含む、本明細書に概説される任意のＶＨ及びＶＬ対と共に使用することができる。

これらの骨格のそれぞれには、列挙された配列と９０、９５、９８及び９９％同一（本明細書で定義）である配列、及び／又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０の追加のアミノ酸置換（図の「親」と比較して、当業者には理解できるように、親ヒトＩｇＧ１（又は骨格によってはＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４）と比較してすでに多数のアミノ酸改変が含まれている）が含まれる。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキュー、ｐＩ及び除去バリアントに加えて、追加のアミノ酸改変（一般にアミノ酸置換）を含み得る。

図１２は、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質において用途が見出される同族軽鎖（すなわち、定常軽鎖）の「非Ｆｖ」骨格を示す。

図１３Ａ～１３Ｇは、本発明のＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質に関するいくつかのフォーマットを示す。ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合物又は「ＩＬ－１５／Ｒα－ヘテロＦｃ」（図１３Ａ）は、ヘテロ二量体Ｆｃの一方の側に組換え融合されたＩＬ－１５及びヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に組換え融合されたＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含む。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）は、Ｆｃ領域のＣ末端とＮ末端との間に可変長のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを有し得る。一本鎖ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物又は「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ」（図１３Ｂ）は、可変長リンカー（「一本鎖」ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体又は「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれる）によってＩＬ－１５に融合したＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み、次いで、これをヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合し、分子の他方の側は「Ｆｃのみ」又は「空Ｆｃ」である。非共有結合ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ又は「ｎｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ」（図１３Ｃ）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域に融合したＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含むが、ＩＬ－１５は、非共有結合ＩＬ－１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされ、分子の他方の面は「Ｆｃのみ」又は「空Ｆｃ」である。二価の非共有結合性ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物又は「二価のｎｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ」（図１３Ｄ）は、ホモ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含むが、ＩＬ－１５は、非共有結合性ＩＬ－１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。二価一本鎖ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物又は「二価ｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ」（図１３Ｅ）は、可変長リンカー（「一本鎖」ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体又は「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれる）によってＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合したＩＬ－１５を含み、次いで、これをホモ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合する。Ｆｃ－非共有結合ＩＬ－１５／Ｒα融合物又は「Ｆｃ－ｎｃＩＬ－１５／Ｒα」（図１３Ｆ）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域のＣ末端に融合したＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含むが、ＩＬ－１５は、非共有結合ＩＬ－１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされ、分子の他方の面は「Ｆｃのみ」又は「空Ｆｃ」である。Ｆｃ－一本鎖ＩＬ－１５／Ｒα融合物又は「Ｆｃ－ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」（図１３Ｇ）は、可変長リンカー（「一本鎖」ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体又は「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれる）によってＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合したＩＬ－１５を含み、次いで、これをヘテロ二量体Ｆｃ領域のＣ末端に融合し、分子の他方の側は「Ｆｃのみ」又は「空Ｆｃ」である。

図１４は、「ＩＬ－１５／Ｒα－ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に下線を付し、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図８に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー及びＦｃ領域の境界を示す。

図１５は、「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に下線を付し、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図８に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー及びＦｃ領域の境界を示す。

図１６は、「ｎｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に下線を付し、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図８に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー及びＦｃ領域の境界を示す。

図１７Ａ～１７Ｃは、ＦＡＣＳによって測定されるＫｉ６７発現に基づくｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２１４７８）及びｎｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２１４７９）の例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質によるＡ）ＮＫ（ＣＤ５６^＋／ＣＤ１６^＋）細胞、Ｂ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＣ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖の誘導を示す図である。

図１８は、ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ及び共通γ鎖と複合体化したＩＬ－１５の構造を示す。効力を低下させるように設計された置換の位置を示す。

図１９Ａ～図１９Ｃは、効力を低下させることを目的として操作された例示的なＩＬ－１５バリアントの配列を示す。これらのバリアントＩＬ－１５配列のそれぞれには、列挙された配列と９０、９５、９８及び９９％同一（本明細書で定義）である配列、及び／又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０の追加のアミノ酸置換を含む配列が含まれる。当業者に明らかであるように、ＩＬ－１５バリアントは、本明細書中に記載されるＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質及びＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のいずれかにおいて使用され得る。

図２０は、効力を低下させることを目的として操作されたＩＬ－１５バリアントを含む「ＩＬ－１５／Ｒα－ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に下線を付し、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図６５に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー及びＦｃ領域の境界を示す。

図２１Ａ～図２１Ｂは、効力を低下させることを目的として操作されたＩＬ－１５バリアントを含む「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に下線を付し、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図６５に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー及びＦｃ領域の境界を示す。

図２２Ａ～図２２Ｂは、示された試験物とのインキュベーション後にＫｉ６７を発現する、Ａ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－細胞及びＢ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－細胞のパーセンテージを示す。

図２３は、ＸＥＮＰ１５０７４（モアトビズマブ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃに基づく二価抗ＲＳＶ ｍＡｂ）のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれ、斜線は可変領域の境界を示す。

図２４は、Ａ）ＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃに基づく二価抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）、Ｂ）ＸＥＮＰ２１６４１（ペンブロリズマブ）、及び、Ｃ）ＸＥＮＰ２８４３７（ペンブロリズマブ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃに基づく二価抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれ、斜線は可変領域の境界を示す。

図２５は、ハイブリドーマクローン１Ｃ１１及び重鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有するヒトＩｇＧ１の可変領域に基づくキメラ及びヒト化抗ＰＤ－１抗体であるＸＥＮＰ２１５７５の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれ、斜線は可変ドメインの境界を示す。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。当業者によって理解されるように、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質において使用するためのＦａｂ又はｓｃＦｖとしてフォーマットされ得る。

図２６は、重鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価ヒトＩｇＧ１フォーマットの抗ＰＤ－１ ｍＡｂ Ａ及びｍＡｂ Ｂの例示的なヒト化バリアントの配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれ、斜線は可変ドメインの境界を示す。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。当業者によって理解されるように、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質において使用するためのＦａｂ又はｓｃＦｖとしてフォーマットされ得る。

図２７は、正規化ＢＬＩ応答Ｏｃｔｅｔによって示される、ＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブに基づく二価抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）、ＸＥＮＰ２１４６１（ペンブロリズマブ）、キメラｍＡｂ Ａ（ｃｈｍＡｂ Ａ）、キメラｍＡｂ Ｂ（ｃｈｍＡｂ Ｂ）、及び１Ｃ１１に基づくｍＡｂのエピトープ・ビニングを示す。０．５を超える正規化ＢＬＩ応答は、抗体対が同じエピトープにビニング（ｂｉｎ ｔｏ）しないことを示す。

図２８Ａ～図２８Ｈは、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質に関するいくつかのフォーマットを示す。「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ ｓｃＦｖ」フォーマット（図２８Ａ）は、可変長リンカー（「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれる）によってＩＬ－１５に融合されたＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み、次いでこれがヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合され、ｓｃＦｖがヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に融合される。「ｓｃＦｖ ｘ ｎｃＩＬ－１５／Ｒα」フォーマット（図２８Ｂ）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したｓｃＦｖを含み、ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に融合し、ＩＬ－１５は、非共有結合ＩＬ－１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマット（図２８Ｃ）は、可変長リンカー（「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれる）によってＩＬ－１５に融合されたＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み、次いでこれがヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合され、可変重鎖（ＶＨ）はヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に融合され、対応する軽鎖はＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。「ｎｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマット（図２８Ｄ）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に融合され、対応する軽鎖はＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ－１５は非共有結合ＩＬ－１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。「ｍＡｂ－ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」フォーマット（図２８Ｅ）は、第１及び第２のヘテロ二量体ＦｃのＮ末端に融合されたＶＨを含み、ＩＬ－１５はＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合され、次いでこれがヘテロ二量体Ｆｃ領域の１つのＣ末端にさらに融合され、対応する軽鎖はＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。「ｍＡｂ－ｎｃＩＬ－１５／Ｒα」フォーマット（図２８Ｆ）は、第１及び第２のヘテロ二量体ＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロ二量体Ｆｃ領域のＣ末端に融合され、対応する軽鎖はＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ－１５は非共有結合ＩＬ－１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。「ｃｅｎｔｒａｌ－ＩＬ－１５／Ｒα」フォーマット（図２８Ｇ）は、ＩＬ－１５のＮ末端に組換え融合されたＶＨを含み、これが次いで、ヘテロ二量体Ｆｃの一方の側にさらに融合され、ＶＨがＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に組換え融合され、これが次いでヘテロ二量体Ｆｃの他方の側にさらに融合され、対応する軽鎖は、ＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。「ｃｅｎｔｒａｌ－ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」フォーマット（図２８Ｈ）は、ＩＬ－１５に融合されたＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に融合されたＶＨを含み、これが次いで、ヘテロ二量体Ｆｃの一方の側にさらに融合され、ＶＨがヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に融合され、対応する軽鎖は、ＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。

図２９は、「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマットの例示的な［Ｃ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＣＤＲは太字である。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はイタリック体であり、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図６５及び図６６に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。当業者には明らかであるように、記載される標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれは、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含むことができ、又は除外することができる。図３０Ａ～図３０Ｂは、Ｏｃｔｅｔ（並びに関連するセンサーグラム）によって決定されるＰＤ－１に対するＸＥＮＰ２２５５３の親和性を示す。

図３０Ａ～図３０Ｃは、「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマットの例示的な［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はイタリック体であり、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図６５及び図６６に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。当業者には明らかであるように、記載される標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれは、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含むことができ、又は除外することができる。図３２Ａ～図３２Ｄは、（Ａ）ＸＥＮＰ２１６４１（ペンブロリズマブ）及び（Ｂ）ＸＥＮＰ２８４３７（ペンブロリズマブ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃに基づく二価抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれ、斜線は可変領域の境界を示す。

図３１Ａ～図３１Ｂは、対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はイタリック体であり、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図６５及び図６６に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。当業者には明らかなように、記載される標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれは、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）も含み得る。

図３２Ａ～図３２Ｂは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（ＸＥＮＰ２８５３２、ＸＥＮＰ２８６９２、及びＸＥＮＰ２５８５０）並びに対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（ＸＥＮＰ２６００７）及び抗ＰＤ－１ ｍＡｂ（ＸＥＮＰ２８５１９）とのインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を示す。

図３３Ａ～図３３Ｂは、ＸＥＮＰ２５８５０（例示的なＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）による、Ａ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２５^＋、及び、Ｂ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２５^＋に対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。新鮮な細胞を点線で示し、活性化された細胞を実線で示す。新鮮な細胞は全てＣＤ２５陰性である。

図３４Ａ～図３４Ｂは、ニボルマブに基づくＸＥＮＰ１６４３２、ペンブロリズマブ、又は抗ＲＳＶ ｍＡｂ ＸＥＮＰ１５０７４のいずれかとのプレインキュベーション後の、Ａ）［Ｃ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２５９３７、及び、Ｂ）［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２８５３２による、ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２５^＋ＰＤ－１^＋Ｔ細胞に対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。

図３５は、示された試験物を投与した後の経時的な（初期体重のパーセンテージとしての）ｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの体重の変化を示す。

図３６Ａ～図３６Ｂは、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける示された試験物の初回投与後１４日目の、Ａ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞数及びＢ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞数を示す。

図３７Ａ～図３７Ｂは、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける示された試験物の初回投与後１０日目の、Ａ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＣＤ２５発現を示す。

図３８は、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける示された試験物の初回投与後１０日目のＣＤ８^＋Ｔ細胞対ＣＤ４^＋Ｔ細胞の比を示す。

図３９Ａ～図３９Ｂは、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける示された試験物の初回投与後１０日目の、Ａ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞数及びＢ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞数を示す。

図４０Ａ～図４０Ｂは、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける示された試験物の初回投与後１０日目の、Ａ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＣＤ２５発現を示す。

図４１は、示された相対濃度での初回投与後のカニクイザルにおける示された試験物の経時的な血清濃度を示す。

図４２は、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有する例示的な［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質であるＸＥＮＰ２９４８４及びＸＥＮＰ２９４８５の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はイタリック体であり、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。

図４３Ａ～図４３Ｂは、ニボルマブ又はペンブロリズマブと競合しない追加の例示的な抗ＰＤ－１ ＡＢＤの可変重鎖及び可変軽鎖を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。

図４４Ａ～図４４Ｂは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２８５３２並びに対照ＸＥＮＰ２４３０６（非標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）及びＸＥＮＰ２６００７（ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）による処置後の、ＰＤ－１^＋Ａ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４５ＲＯ^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４５ＲＯ^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。

図４５Ａ～図４５Ｂは、重鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価ヒトＩｇＧ１フォーマットの抗ＰＤ－１ ｍＡｂ Ｃの例示的なヒト化バリアントの配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれ、斜線は可変ドメインの境界を示す。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。当業者によって理解されるように、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質において使用するためのＦａｂ又はｓｃＦｖとしてフォーマットされ得る。 図４６は、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける示される試験物の初回投与後１４日目の、（Ａ）ＣＤ４５^＋細胞数、（Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞数、（Ｃ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞数、及び（Ｄ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞数を示す。

図４６は、Ｏｃｔｅｔによって決定されたヒトＰＤ－１及びカニクイザルＰＤ－１に対するＸＥＮＰ２８５３６、ＸＥＮＰ２８５３７、ＸＥＮＰ２８５３８、ＸＥＮＰ２８５３９及びＸＥＮＰ２８５１９の親和性を示す。

図４７は、ＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブに基づく二価抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）、ＸＥＮＰ２１４６１（ペンブロリズマブ）及びキメラｍＡｂ Ｃ（ｃｈｍＡｂ Ｃ）のエピトープ・ビニングを示す。０．５を超える正規化ＢＬＩ応答は、抗体対が同じエピトープにビニング（ｂｉｎ ｔｏ）しないことを示す。データは、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ Ｃがニボルマブ及びペンブロリズマブと同じエピトープにビニング（ｂｉｎ ｔｏ）しないことを示している。

図４８Ａ～図４８Ｃは、ｍＡｂ Ｃに基づくＰＤ－１標的アームを含む「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマット及び様々なＩＬ－１５効力バリアントの例示的な［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表Ｘに示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図６５及び図６６に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。当業者には明らかなように、記載されるＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれは、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）も含み得る。

図４９Ａ～図４９Ｃは、ｍＡｂ Ｃに基づくＰＤ－１標的アームを含む「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマット及び様々なＩＬ－１５効力バリアント（さらにＸｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含む）の例示的な［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図６５及び図６６に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。 図５０Ａ～図５０Ｂは、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける示される試験物の初回投与後１０日目の、（Ａ）ＣＤ４５^＋細胞数、（Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞数、（Ｃ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞数、及び（Ｄ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞数を示す。

図５０Ａ～図５０Ｂは、増殖細胞のパーセンテージ（ＣＦＳＥ希釈に基づいて決定）によって示される、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（及び対照）による、Ａ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖の誘導を示す。データは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、非標的化ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα－Ｆｃ融合物（並びに対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）と比較して、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を誘導するのにより強力であったことを示す。

図５１は、増殖細胞のパーセンテージ（ＣＦＳＥ希釈に基づいて決定）によって示される、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（及び対照）による、ＬＡＧ－３陽性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の誘導を示す。データは、ＸＥＮＰ２８５３２が、非標的化ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα－Ｆｃ融合物（並びに対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）と比較して、ＣＤ８^＋ＬＡＧ－３^＋Ｔ細胞の増殖を誘導するのにより強力であったことを示す。さらに、ＸＥＮＰ２８５４３は、バルクＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖よりもＣＤ８^＋ＬＡＧ－３^＋Ｔ細胞増殖を誘導するのにより強力であった（２７６．８対７１．９４のＥＣ５０）。まとめると、これは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、腫瘍環境中に見出されるようなチェックポイントを発現するＴ細胞に対して選択的であり得るという考えを支持する。

図５２Ａ～図５２Ｂは、ＣＤ２５を発現する細胞のパーセンテージによって示される、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（及び対照）とのインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－メモリＴ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ナイーブＴ細胞の活性化を示す。

図５３Ａ～図５３Ｂは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（及び対照）とのインキュベーション後にＰＤ－１を発現する、Ａ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。

図５４Ａ～図５４Ｃは、Ａ）５０ｎｇ／ｍｌ、Ｂ）１００ｎｇ／ｍｌ、及びＣ）５００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で予め刺激し、示された試験物と共にインキュベートしたＰＢＭＣによるＩＦＮγ分泌を示す。データは、ＸＥＮＰ２８５３２及びＸＥＮＰ２８５４３の両方が、ＩＦＮγ分泌を強力に刺激することができたことを示す。注目すべきことに、ＸＥＮＰ２８５３２（ｍＡｂ Ａに基づくＰＤ－１標的アーム）は、ＩＦＮγ分泌を誘導することにおいて、ＸＥＮＰ２８５４３（ｍＡｂ Ｃに基づくＰＤ－１標的アーム）よりも活性であるようであった。

図５５Ａ～図５５Ｂは、ニボルマブに基づくＸＥＮＰ１６４３２、ペンブロリズマブ、又は抗ＲＳＶ ｍＡｂ ＸＥＮＰ１５０７４のいずれかとのプレインキュベーション後の、ｍＡｂ Ｃに基づくＰＤ－１標的アームとの［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（ＸＥＮＰ２８５４３）による、Ａ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２５^＋ＰＤ－１^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２５^＋ＰＤ－１^＋Ｔ細胞に対するＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。データは、ＰＤ－１遮断がＸＥＮＰ２８５４３の活性を妨害しないことを示す。

図５６は、示された試験物を投与した後の経時的な（初期体重のパーセンテージとしての）ｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの体重の変化を示す。

図５７Ａ～図５７Ｃは、示される試験物による初回投与後の、Ａ）１１日目、Ｂ）１４日目、及びＣ）１８日目の、ｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの体重（初期体重のパーセンテージとして）を示す。対応のないｔ検定を用いてｐ値を決定した。データは、１１日目までに、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物とＰＤ－１遮断との組合せが、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物単独による処置よりもＧＶＨＤを有意に増強したことを示す。

図５８Ａ～図５８Ｆは、示される試験物による初回投与後１４日目のｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血液中のヒトＡ）ＣＤ４５^＋細胞、Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞、Ｃ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、Ｄ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｅ）γδ Ｔ細胞、及びＦ）ＮＫ細胞の数を示す。

図５９Ａ～図５９Ｂは、示される試験物による初回投与後１４日目のｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血液中のヒトＡ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ２５ ＭＦＩによって示される）の活性化を示す。

図６０は、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて投与したｐｐ６５－ＭＣＦ７マウス及びｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける経時的な腫瘍体積（キャリパー測定によって決定される）を示す。

図６１Ａ～図６１Ｆは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて投与したｐｐ６５－ＭＣＦ７マウス及びｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける、２６日目（図６１Ａ）、２８日目（図６１Ｂ）、３０日目（図６１Ｃ）、３３日目（図６１Ｄ）、３５日目（図６１Ｅ）、及び３７日目（図６１Ｆ）（ＰＢＭＣ生着及び試験物の初回投与の後）の腫瘍体積（キャリパー測定によって決定される）を示す。ｐ値を対応のないｔ検定によって決定した。データは、２８日目までに、ＸＥＮＰ２８５４３とＰＤ－１遮断の組合せが、ＰＤ－１遮断単独での処置よりも腫瘍サイズを有意に減少させたことを示す。

図６２Ａ～図６２Ｂは、示される試験物による初回投与後７日目のｐｐ６５－ＭＣＦ７マウス及びｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血液中のヒトＡ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ２５ ＭＦＩによって示される）の活性化を示す。データは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の初期活性化の有意な増強を可能にしたことを示す。統計は、対応のないｔ検定を使用して対数変換データに対して行われた。

図６３Ａ～図６３Ｅは、示される試験物による初回投与後１４日目のｐｐ６５－ＭＣＦ７マウス及びｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血液中のヒトＡ）ＣＤ４５^＋細胞、Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞、Ｃ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、Ｄ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の数を示す。データは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて、ＰＤ－１遮断単独よりも１４日目までに多数のリンパ球集団の増殖を有意に増強することを可能にしたことを示す。統計は、対応のないｔ検定を使用して対数変換データに対して行われた。

図６４Ａ～図６４Ｂは、重鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価ヒトＩｇＧ１フォーマットの抗ＰＤ－１ ｍＡｂ Ｃの例示的な親和性操作バリアントの配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれ、斜線は可変ドメインの境界を示す。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表Ｘに示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。当業者によって理解されるように、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質において使用するためのＦａｂ又はｓｃＦｖとしてフォーマットされ得る。図６７Ａは、ＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブに基づく二価抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）、ＸＥＮＰ２１４６１（ペンブロリズマブ）及びキメラｍＡｂ Ｃ（ｃｈｍＡｂ Ｃ）のエピトープ・ビニングを示す。０．５を超える正規化ＢＬＩ応答は、抗体対が同じエピトープにビニング（ｂｉｎ ｔｏ）しないことを示す。データは、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ Ｃがニボルマブ及びペンブロリズマブと同じエピトープにビニング（ｂｉｎ ｔｏ）しないことを示している。

図６５Ａ～図６５Ｉは、Ｏｃｔｅｔによって決定された親和性操作ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１Ｌ１バリアント（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを含む二価ＩｇＧ１フォーマット）の見かけの解離定数（ＫＤａｐｐ）、会合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）、並びにｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１Ｌ１に対する改善倍率を示す。可変重鎖領域又は可変軽鎖領域における置換（列挙されている場合）は、Ｘｅｎｃｏｒナンバリング（対応するＫａｂａｔ位置が次の列に列挙されている）に基づく。可変重鎖領域又は可変軽鎖領域のいずれかに単一点突然変異を有する３０４個のバリアントのうち、本発明者らは、ＷＴよりも２倍超改善された親和性を有する１１個のバリアント（ｍＡｂ Ｃ ［ＰＤ－１］＿Ｈ１＿Ｌ１．１及びｍａｂ＿Ｃ ［ＰＤ－１］＿Ｈ１＿Ｌ１．３を含む）のみを同定した。

図６６は、Ｏｃｔｅｔによって決定される（ＰＤ－１標的化ＩＬ１５／Ｒα－Ｆｃのコンテキストにおける）好ましい単一置換ＶＨバリアント及び単一置換ＶＬバリアントを組み合わせた親和性操作ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１Ｌ１バリアントの見かけの解離定数（ＫＤａｐｐ）、会合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）を示す。可変重鎖領域又は可変軽鎖領域における置換（列挙されている場合）は、Ｘｅｎｃｏｒナンバリング（対応するＫａｂａｔ位置が次の列に列挙されている）に基づく。Ｈ１．１３２＿Ｌ１はＨ１．１９＿Ｌ１よりも高い親和性を提供するにもかかわらず、Ｈ１．１９＿Ｌ１．１はＨ１．１３２＿Ｌ１．１よりも高い親和性を可能にする。

図６７は、Ｏｃｔｅｔによって決定される（ＰＤ－１標的化ＩＬ１５／Ｒα－Ｆｃのコンテキストにおける）ＶＨ及び／又はＶＬにおける複数の置換を組み合わせた親和性操作ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１Ｌ１バリアントの見かけの解離定数（ＫＤａｐｐ）、会合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）を示す。可変重鎖領域又は可変軽鎖領域における置換（列挙されている場合）は、Ｘｅｎｃｏｒナンバリング（対応するＫａｂａｔ位置が次の列に列挙されている）に基づく。三重置換ＶＬバリアントＮ３１Ｈ／Ｋ３６Ｙ／Ｓ９９Ｔ（Ｌ１．１４０；ＫａｂａｔナンバリングではＮ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔ）は、野生型よりもＫＤにおいて３６倍の改善を示し、ＶＨバリアントと十分に結合して、野生型よりもＫＤにおいて約１００倍の改善を発揮する。

図６８Ａ～図６８Ｊは、親和性最適化ｍＡｂ Ｃ ＡＢＤに基づくＰＤ－１標的アームを含む「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマット及び様々なＩＬ－１５効力バリアントの例示的な［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図６５及び図６６に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。当業者には明らかなように、記載されるＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれは、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）も含むことができ、又は除外することもできる。

図６９Ａ～図６９Ｃは、親和性最適化ｍＡｂ Ｃ ＡＢＤに基づくＰＤ－１標的アームを含む「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマット及び様々なＩＬ－１５効力バリアント（さらにＸｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含む）の例示的な［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表Ｘに示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図６５及び図６６に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。

図７０Ａ～図７０Ｂは、増殖細胞のパーセンテージ（ＣＦＳＥ希釈に基づいて決定）によって示される、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）による、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の誘導を示す。データは、ＸＥＮＰ３００４６（親和性増強ＰＤ－１標的アームを有する）が、ＸＥＮＰ２８５４３よりも強力にＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の増殖を誘導する（２倍の増加）ことを示す。さらに、データは、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ）バリアントがＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の活性に劇的な影響を及ぼさないことを示す。

図７１Ａ～図７１Ｂは、ＣＤ２５を発現する細胞のパーセンテージによって示される、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）とのインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞の活性化を示す。

図７２Ａ～図７２Ｂは、ＣＤ２５を発現する細胞のパーセンテージによって示される、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）とのインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞の活性化を示す。

図７３Ａ～図７３Ｂは、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）とのインキュベーション後にＰＤ－１を発現する、Ａ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。データは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物がＣＤ４^＋細胞においてＰＤ－１の下方制御を誘導すること、及び下方制御がＰＤ－１親和性と相関することを示す。

図７４は、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）で処置したｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける経時的な（初期体重のパーセンテージとしての）体重の変化を示す。死亡マウスには７０％を使用した。

図７５Ａ～図７５Ｄは、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）で処置したｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスのＡ）１１日目、Ｂ）１４日目、Ｃ）１８日目及びＤ）２１日目の体重を示す。死亡マウスには７０％を使用した。ｐ値は、対応のないｔ検定を用いて決定した。データは、ＸＥＮＰ３００４６単独（親和性増強ＰＤ－１標的アームを有する）による処置が、１１日目及び１８日目に測定して、ＰＢＳ処置と比較して有意な体重減少をもたらしたのに対して、ＸＥＮＰ２８５４３単独による処置は（ＰＢＳ処置と比較して）有意な体重減少をもたらさなかったことを示す。

図７６Ａ～図７６Ｃは、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）を投与した後の７日目、１１日目及び１４日目のｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおけるＡ）ＩＦＮγ、Ｂ）ＩＬ－１０及びＣ）ＩＬ－２Ｒαの血清濃度を示す。

図７７Ａ～図７７Ｂは、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）を投与したｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血液における７日目のＡ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ２５ ＭＦＩによって示される）の活性化を示す（統計は、対応のないｔ検定を使用して対数変換データに対して行われた）。

図７８Ａ～図７８Ｅは、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）を投与したｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血液における１１日目のＡ）ＣＤ４５^＋細胞、Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞、Ｃ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｄ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及び、Ｅ）ＮＫ細胞の数を示す（統計は、対応のないｔ検定を使用して対数変換データに対して行われた）。

図７９Ａ～図７９Ｅは、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）を投与したｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血液における１４日目のＡ）ＣＤ４５^＋細胞、Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞、Ｃ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｄ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及び、Ｅ）ＮＫ細胞の数を示す。

図８０Ａ～図８０Ｂは、増殖細胞のパーセンテージ（ＣＦＳＥ希釈に基づいて決定）によって示される、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）による、Ａ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖の誘導を示す。データは、ＸＥＮＰ３０２７２（ＰＤ－１に対して３．１ｎＭのＫ_Ｄ を有する）が、ＸＥＮＰ３００４６（ＰＤ－１に対して５．４ｎＭのＫ_Ｄ を有する）よりも、様々なＴ細胞集団の増殖及び活性化を誘導するのにより強力であることを示す。注目すべきことに、ＸＥＮＰ３０４２９（ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有するＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）は、ＸＥＮＰ３００４６（ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有するＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）と比較して、ＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋Ｔ細胞に対してわずかに１．８～２．５低い活性しかなかったが、ＸＥＮＰ３０４３２（ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有する代用ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ）は、ＸＥＮＰ３００４６と比較して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対して１２倍低い活性を有し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対して５３０倍低い活性を有した（増殖活性に基づく）。これは、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有するＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、腫瘍環境外では実質的に不活性のままでありながら、腫瘍環境中で活性を保持するはずであることを示唆している。

図８１Ａ～図８１Ｃは、ＣＤ２５ ＭＦＩによって示される、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）とのインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞の活性化を示す。

図８２Ａ～図８２Ｃは、ＣＤ２５ ＭＦＩによって示される、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）とのインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞の活性化を示す。

図８３Ａ～図８３Ｃは、ＰＤ－１ ＭＦＩによって示される、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）とのインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－Ｔ細胞及びＣ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞上のＰＤ－１の発現を示す。

図８４Ａ～図８４Ｃは、ＰＤ－１ ＭＦＩによって示される、様々なＰＤ－１親和性を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びＩＬ－１５効力バリアント（及び対照）とのインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^－Ｔ細胞及びＣ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞上のＰＤ－１の発現を示す。

図８５Ａ～図８５Ｄは、示される試験物による初回投与後１０日目のＮＳＧマウスにおける、Ａ）ＣＤ４５細胞、Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞、Ｃ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＤ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖（細胞数によって示される）を示す。データは、より高い効力のＩＬ－１５が様々なリンパ球集団のより大きな拡大をもたらすことを示す。

図８６Ａ～図８６Ｂは、示される試験物による初回投与後１０日目のＮＳＧマウスにおける、Ａ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化（ＣＤ２５染色によって示される）を示す。データは、より高い効力のＩＬ－１５が様々なリンパ球集団のより大きな拡大をもたらすことを示す。

図８７Ａ～図８７Ｃは、増殖細胞のパーセンテージ（ＣＦＳＥ希釈に基づいて決定される）によって示されるようなＸｔｅｎｄ Ｆｃを有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及び対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物による、Ａ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖、Ｂ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣ）ＮＫ細胞増殖の誘導を示す。注目すべきことに、データは、ＸＥＮＰ３００４６のＥＣ５０がＸＥＮＰ３０２９０（ＸＥＮＰ３００４６に対するＸｔｅｎｄ類似体）のＥＣ５０に匹敵することを示す。

図８８Ａ～図８８Ｂは、ＣＤ２５ ＭＦＩによって示されるようなＸｔｅｎｄ Ｆｃを有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及び対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物による、Ａ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化を示す。

図８９Ａ～図８９Ｂは、ＰＤ－１ ＭＦＩによって示されるようなＸｔｅｎｄ Ｆｃを有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及び対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物による、Ａ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＰＤ－１調節を示す。実施例９Ｂと一致して、試験物はＴ細胞に対するＰＤ－１を下方制御した。

図９０は、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて投与したｐｐ６５－ＭＣＦ７マウス及びｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける経時的な腫瘍体積（キャリパー測定によって決定される）を示す。

図９１Ａ～図９１Ｈは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて投与したｐｐ６５－ＭＣＦ７マウス及びｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける、１１日目、１４日目、１７日目、１９日目、２１日目、２４日目、２６日目及び２８日目（ＰＢＭＣ生着及び試験物の初回投与の後）の腫瘍体積（キャリパー測定によって決定される）を示す。統計は、マン・ホイットニー検定を使用してベースライン補正データに対して行なわれた。＊ ＰＢＳ対照と比較して、処置が有意に（ｐ＜０．０５）拡大を増強したことを示す。＃ ＸＥＮＰ３１１２３による処置と比較して、処置が有意に（ｐ＜０．０５）拡大を増強したことを示す。† ＰＤ－１遮断（ＸＥＮＰ１６４３２）単独と比較して、処置が有意に（ｐ＜０．０５）拡大を増強したことを示す。データは、２８日目までに、ＸＥＮＰ３０２９０（０．１、０．３、又は１ｍｇ／ｋｇ）又はＸＥＮＰ３０５１６（０．３、１、又は３ｍｇ／ｋｇ）とＰＤ－１遮断との全ての組合せが、ＰＤ－１遮断単独による処置よりも腫瘍サイズを有意に減少させたことを示す。

図９２Ａ～図９２Ｆは、示される試験物による初回投与後１４日目のｐｐ６５－ＭＣＦ７マウス及びｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血液中のヒトＡ）ＣＤ４５＋細胞、Ｂ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、Ｃ）ＮＫ細胞、Ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＥ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の数、並びにＦ）ＣＤ８ Ｔ細胞対ＣＤ４ Ｔ細胞の比を示す。対応のないｔ検定を使用して対数変換データに対して行われたＣＤ４５＋細胞増殖の統計。† ＰＤ－１遮断（ＸＥＮＰ１６４３２）単独と比較して、処置が有意に拡大を増強したことを示す。

図９３Ａ～図９３Ｆは、示される試験物による初回投与後２１日目のｐｐ６５－ＭＣＦ７マウス及びｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血液中のヒトＡ）ＣＤ４５^＋細胞、Ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞、Ｃ）ＮＫ細胞、Ｄ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＥ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数、並びにＦ）ＣＤ８ Ｔ細胞対ＣＤ４ Ｔ細胞の比を示す。† ＰＤ－１遮断（ＸＥＮＰ１６４３２）単独と比較して、処置が有意に拡大を増強したことを示す。

図９４は、（任意の試験物による処置前の）ＣＤ３４^＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスにおける様々なリンパ球集団上のＰＤ－１発現レベル（ＭＦＩによって示される）を示す。データは、マウスがヒトと同様のＰＤ－１発現プロファイル、すなわちエフェクターメモリ集団上のより高い発現を有することを示す。

図９５は、０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３００４６（ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１＿Ｌ１．１及びＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含む［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ）での処置後７日目のＣＤ３４＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスにおける様々なリンパ球集団の増加倍数を示す。ＸＥＮＰ３００４６は、エフェクターメモリ集団において１００倍を超える増殖を示す。

図９６は、０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３０４２９（ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１＿Ｌ１．１及びＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含む［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ）での処置後７日目のＣＤ３４^＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスにおける様々なリンパ球集団の増加倍数を示す。

図９７は、０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ２６００７（ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含む対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ）での処置後７日目のＣＤ３４^＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスにおける様々なリンパ球集団の増加倍数を示す。ＸＥＮＰ２６００７は、様々なリンパ球集団の非常に低い増殖を示し、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が最小限の末梢リンパ球増殖を有することを示している。

図９８は、０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３０４３２（ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含む対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ）での処置後７日目のＣＤ３４^＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスにおける様々なリンパ球集団の増加倍数を示す。ＸＥＮＰ３０４３２は、様々なリンパ球集団の非常に低い増殖を示し、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が最小限の末梢リンパ球増殖を有することを示している。

図９９Ａ～図９９Ｆは、０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３００４６、ＸＥＮＰ３０４２９、ＸＥＮＰ２６００７又はＸＥＮＰ３０４３２による処置後のＣＤ３４^＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスにおける、Ａ）ＣＤ４５細胞、Ｂ）ＣＤ３^＋細胞、Ｃ）ＣＤ４^＋細胞、Ｄ）ＣＤ８^＋細胞、Ｅ）γδ細胞、及びＦ）ＮＫ細胞の経時的な倍率変化を示す。

図１００Ａ～図１００Ｄは、０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３００４６、ＸＥＮＰ３０４２９、ＸＥＮＰ２６００７又はＸＥＮＰ３０４３２による処置後のＣＤ３４^＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスにおける、Ａ）ＣＤ４ナイーブ細胞、Ｂ）ＣＤ４セントラルメモリ細胞、Ｃ）ＣＤ４ターミナルエフェクター細胞、及びＤ）ＣＤ４エフェクターメモリ細胞の経時的な倍率変化を示す。データは、ＸＥＮＰ３００４６及びＸＥＮＰ３０４２９が、ＣＤ４エフェクターメモリ細胞などのＰＤ－１^＋集団に対して選択的であることを示す。注目すべきことに、ＣＤ４ナイーブ細胞のＸＥＮＰ３０４２９増殖は最小であった。このことは、ＩＬ－１５アームの効力の低下が選択性を改善することを示している。

図１０１Ａ～図１０１Ｄは、０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３００４６、ＸＥＮＰ３０４２９、ＸＥＮＰ２６００７又はＸＥＮＰ３０４３２による処置後のＣＤ３４^＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスにおける、Ａ）ＣＤ８ナイーブ細胞、Ｂ）ＣＤ８セントラルメモリ細胞、Ｃ）ＣＤ８ターミナルエフェクター細胞、及びＤ）ＣＤ８エフェクターメモリ細胞の経時的な倍率変化を示す。データは、ＸＥＮＰ３００４６及びＸＥＮＰ３０４２９が、ＣＤ８エフェクターメモリ細胞などのＰＤ－１^＋集団に対して選択的であることを示す。注目すべきことに、ＣＤ８ナイーブ細胞のＸＥＮＰ３０４２９増殖は最小であった。このことは、ＩＬ－１５アームの効力の低下が選択性を改善することを示している。

図１０２Ａ～図１０２Ｂは、Ａ）０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３００４６又はＢ）０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３０４２９による処置後７日目のＣＤ３４＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスにおけるリンパ球拡大とベースラインＰＤ－１発現との間の相関を示す。

図１０３Ａ～図１０３Ｂは、０．３×ＸＥＮＰ２２８５３、１×ＸＥＮＰ２５９３７又は０．３×ＸＥＮＰ２４３０６を投与したカニクイザルにおけるＡ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＢ）ＮＫ細胞の増殖を示す。データは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖を維持しながらＮＫ細胞増殖を減少させることを示す。

図１０４Ａ～図１０４Ｂは、０．３×ＸＥＮＰ２２８５３、１×ＸＥＮＰ２５９３７又は０．３×ＸＥＮＰ２４３０６を投与したカニクイザルにおけるＡ）ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞、及びＢ）ＣＤ８^＋エフェクターメモリＴ細胞の増殖を示す。データは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、ＣＤ８^＋エフェクターメモリＴ細胞を選択的に拡大することを示す。

図１０５Ａ～図１０５Ｅは、ＸＥＮＰ３０２９０（ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ］）又はＸＥＮＰ３０３６２（αＲＳＶ ｘ ＩＬ－１５［Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ］）のいずれかを投与した後のカニクイザルにおける、Ａ）ＣＤ８^＋ＰＤ１^＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８幹細胞メモリ、Ｃ）ＣＤ８ナイーブ、Ｄ）γδ Ｔ細胞、及びＥ）ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の増殖を示す。まとめると、データは、ＸＥＮＰ３０２９０（高いＰＤ－１親和性及びより高いＩＬ－１５効力を有する）が、中程度のＰＤ１^－細胞増殖を伴って２～３週間にわたって持続的な末梢薬力学を可能にしたことを示す。特に、γδ Ｔ細胞は、最も高い増殖倍率の細胞集団であり；ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞は、最も低い増殖倍率の細胞集団であり；ＣＤ８^＋幹細胞メモリ細胞は、最も高い増殖関連集団である。

図１０６Ａ～図１０６Ｅは、ＸＥＮＰ３０５１６（ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］）又はＸＥＮＰ３０５１８（αＲＳＶ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］）のいずれかを投与した後のカニクイザルにおける、Ａ）ＣＤ８^＋ＰＤ１^＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８幹細胞メモリ、Ｃ）ＣＤ８ナイーブ、Ｄ）γδ Ｔ細胞、及びＥ）ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞の増殖を示す。まとめると、データは、ＸＥＮＰ３０５１６（高いＰＤ－１親和性及びより低いＩＬ－１５効力を有する）が、有意なＰＤ１^－細胞増殖を伴わずに持続的な末梢薬力学を可能にしたことを示す。特に、γδ Ｔ細胞は、最も高い増殖倍率の細胞集団であり；ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞は、最も低い増殖倍率の細胞集団であり；ＣＤ８^＋幹細胞メモリ細胞は、最も高い増殖関連集団である。

図１０７は、ＸＥＮＰ３０２９０、ＸＥＮＰ３０２９１、ＸＥＮＰ２９４３９又はＸＥＮＰ３０５１６を投与したカニクイザルにおける経時的な血清濃度レベルの変化を示す。データは、最も高いＰＤ－１親和性及びより高いＩＬ－１５効力を有するＸＥＮＰ３０２９０が、より低いＰＤ－１親和性を有するＸＥＮＰ３０２９１及びＸＥＮＰ２９４３９の両方よりも速いクリアランスをもたらしたことを示す。しかしながら、最も高いＰＤ－１親和性を有するがより低いＩＬ－１５効力を有するＸＥＮＰ３０５１６は、ＸＥＮＰ３０２９０よりも遅いクリアランスをもたらした。

図１０８は、ＸＥＮＰ３０２９０、ＸＥＮＰ３０２９２、又はＸＥＮＰ３０５１６を投与したカニクイザルにおける経時的な血清濃度レベルの変化を示す。データは、より低いＩＬ－１５効力を有するＸＥＮＰ３０５１６が、ＸＥＮＰ３０２９０よりも遅いクリアランスをもたらしたことを示す。

図１０９は、ＸＥＮＰ３０２９１又はＸＥＮＰ３０２９３を投与したカニクイザルにおける経時的な血清濃度レベルの変化を示す。

図１１０は、ＸＥＮＰ２９４３９又はＸＥＮＰ３０３０２を投与したカニクイザルにおける経時的な血清濃度レベルの変化を示す。

図１１１は、ＸＥＮＰ３０３６２又はＸＥＮＰ３０５１８を投与したカニクイザルにおける経時的な血清濃度レベルの変化を示す。データは、より高いＩＬ－１５効力が、より速いクリアランスと相関することを示す。

図１１２Ａ～図１１２Ｃは、Ａ）ＸＥＮＰ３０２９０、Ｂ）ＸＥＮＰ３０５１６、又はＣ）ＸＥＮＰ３０３６２を投与したカニクイザルにおける様々なリンパ球集団におけるＰＤ－１発現の経時的変化を示す。データは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＰＤ－１発現を増加させるが、対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＰＤ－１発現を増加させないことを示す。

図１１３は、全てのＴ細胞メモリサブセットのピーク増殖倍率と、ＸＥＮＰ３０２９０又はＸＥＮＰ３０５１６によって誘導されるピークＰＤ－１発現との間の相関を示す。

図１１４は、グリコシル化を除去することを目的として操作された例示的なＩＬ－１５バリアントの配列を示す。これらのバリアントＩＬ－１５配列のそれぞれには、列挙された配列と９０、９５、９８及び９９％同一（本明細書で定義）である配列、及び／又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０の追加のアミノ酸置換を含む配列が含まれる。当業者に明らかであるように、ＩＬ－１５バリアントは、本明細書中に記載されるＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質及びＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のいずれかにおいて使用され得る。加えて、本明細書中に記載されるＩＬ－１５改変のそれぞれは、単独で、又は、本明細書中に記載されるような任意の他のＩＬ－１５改変との組合せで使用され得る。

図１１５Ａ～図１１５Ｃは、グリコシル化を排除するように操作された「ＩＬ－１５／Ｒα－ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に下線を付し、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図７に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー及びＦｃ領域の境界を示す。当業者には明らかなように、記載されるＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれは、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含むことができ、又は除外することができる。

図１１６Ａ～図１１６Ｇは、グリコシル化を排除するように操作された「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマットの例示的なＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はイタリック体であり、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図９及び図１０Ａ～図１１６Ｇに示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。当業者には明らかなように、記載される標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれは、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含むことができ、又は除外することができる。

図１１７Ａ～図１１７Ｆは、グリコシル化を排除するように操作された「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマットの対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はイタリック体であり、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図９及び図１０に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。当業者には明らかなように、記載される標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれは、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含むことができ、又は除外することができる。

図１１８Ａ～図１１８Ｂは、ｉ）ＸＥＮＰ３０５１６、ＸＥＮＰ３１９８１、ＸＥＮＰ３１９８２、ＸＥＮＰ３１９８４、ＸＥＮＰ３１９８５、ＸＥＮＰ３１９８６、及びＸＥＮＰ３１９８７の精製部２を示すクロマトグラム、及び、ｉｉ）図１５４Ａに示されるような陰イオン交換分離からの主ピークの分析的陰イオン交換クロマトグラフィ（分析的ＡＩＥＸ）特性評価を示す。図１１８Ａは、ＸＥＮＰ３０５１６、ＸＥＮＰ３１９８１、ＸＥＮＰ３１９８２、ＸＥＮＰ３１９８４、及びＸＥＮＰ３１９８５を示す。図１１８Ｂは、ＸＥＮＰ３１９８６及びＸＥＮＰ３１９８７を示す。構築物は、ＸＥＮＰ３０５１６（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］ｗ／（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号７））、ＸＥＮＰ３１９８１（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ］ｗ／（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号７））、ＸＥＮＰ３１９８２（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］ｗ／（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号７））、ＸＥＮＰ３１９８４（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］ｗ／（Ｇ４Ａ）リンカー（配列番号８））、ＸＥＮＰ３１９８５（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａ］ｗ／（Ｇ４Ａ）リンカー（配列番号８））、ＸＥＮＰ３１９８６（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］ｗ／（Ｇ４Ａ）リンカー（配列番号８））、及びＸＥＮＰ３１９８７（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４＿］ｗ／（Ｇ４Ａ）リンカー（配列番号８））である。

図１１９は、糖鎖工学ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によるＣＤ８エフェクターメモリＴ細胞増殖の誘導を示す。グリコシル化保持活性を除去するように操作されたＩＬ－１５バリアントを含む試験物のそれぞれは、予想外に、ＩＬ－１５グリコシル化を除去するように操作されていないＸＥＮＰ３０５１６（及びＧｌｙ－Ａｌａリンカーを有する対応するＸＥＮＰ３１９８４）よりも強力であった。「（Ｇ４Ｓ）リンカー」は配列番号７であり、「（Ｇ４Ａ）リンカー」は配列番号８である。

図１２０は、糖鎖工学ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及び糖鎖工学ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によるＣＤ４及びＣＤ８エフェクターメモリＴ細胞増殖の誘導を示す。対応するＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物と比べたＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の効力の増加倍率は、（末梢リンパ球と比べたＴＩＬに関する）選択性を示すように示されている。

図１２１Ａ～図１２１Ｄは、Ａ）ＸＥＮＰ３０２９０対ＸＥＮＰ３０３６２；Ｂ）ＸＥＮＰ３１９７９対ＸＥＮＰ３２１６３；Ｃ）ＸＥＮＰ３０５１６対ＸＥＮＰ３０５１８；及びＤ）ＸＥＮＰ３１９８６対ＸＥＮＰ３２１６９によるＣＤ８エフェクターメモリＴ細胞の増殖を示す。データは、Ｎ結合型グリコシル化の除去が効力を増加させるが、選択性も改善することを示す。「（Ｇ４Ｓ）リンカー」は配列番号７であり、「（Ｇ４Ａ）リンカー」は配列番号８である。

図１２２は、糖鎖工学ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて投与したｐｐ６５－ＭＣＦ７マウス及びｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける経時的な腫瘍体積（キャリパー測定によって決定される）を示す。糖鎖工学バリアントＸＥＮＰ３１９８１６は、（低用量でさえ）抗腫瘍活性の増強を示し、ＰＤ－１遮断と生産的に組み合わせた。配列番号７として「（Ｇ４Ｓ）リンカー」、及び、配列番号８として「（Ｇ４Ａ）リンカー」。

図１２３は、糖鎖工学ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて投与したｐｐ６５－ＭＣＦ７マウス及びｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける１７日目までの腫瘍体積（キャリパー測定によって決定される）の変化を示す。

図１２４は、糖鎖工学ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて投与したｐｐ６５－ＭＣＦ７マウス及びｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血中の１４日目のＣＤ８＋細胞数を示す。

図１２５Ａ～１２５Ｅは、１倍の低用量のＸＥＮＰ３０２９０（ＰＤ１ ｘ ＩＬ１５［Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ］）を投与したカニクイザルにおける、Ａ）ＣＤ８＋ＰＤ１＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋幹細胞メモリ、Ｃ）ＣＤ８ナイーブ（ＰＤ１ｌｏｗ）、Ｄ）γδ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の増殖を示す。データは、ＸＥＮＰ３０２９０が１倍の低用量でＰＤ１＋細胞増殖を誘導したことを示す。

図１２６Ａ～１２６Ｅは、１０倍の高用量のＸＥＮＰ３０２９０（ＰＤ１ ｘ ＩＬ１５［Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ］）及び対応するＲＳＶ標的化代用ＸＥＮＰ３０３６２を投与したカニクイザルにおける、Ａ）ＣＤ８＋ＰＤ１＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋幹細胞メモリ、Ｃ）ＣＤ８ナイーブ（ＰＤ１ｌｏｗ）、Ｄ）γδ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の増殖を示す。データは、ＸＥＮＰ３０２９０が１０倍の高用量で良好なＰＤ１＋細胞増殖を誘導したが、ＲＳＶ標的化対照ＸＥＮＰ３０３６２の活性によって示されるように、ＰＤ１－細胞に対して中程度の活性を有することを示す。「（Ｇ４Ｓ）リンカー」は、配列番号７である。

図１２７Ａ～図１２７Ｅは、１０倍の高用量のＸＥＮＰ３０５１６ＰＤ１ ｘ ＩＬ１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］）を投与したカニクイザルにおけるＡ）ＣＤ８^＋ＰＤ１^＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８^＋幹細胞メモリ、Ｃ）ＣＤ８ナイーブ（ＰＤ１^ｌｏｗ）、Ｄ）γδ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の増殖を示す。データは、ＸＥＮＰ３０５１６が１０倍の高用量で良好なＰＤ１^＋細胞増殖を誘導したことを示す。

図１２８Ａ～１２８Ｅは、３０倍の非常に高い用量のＸＥＮＰ３０５１６（ＰＤ１ ｘ ＩＬ１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］）及び対応するＲＳＶ標的化代用ＸＥＮＰ３０５１８を投与したカニクイザルにおける、Ａ）ＣＤ８＋ＰＤ１＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋幹細胞メモリ、Ｃ）ＣＤ８ナイーブ（ＰＤ１ｌｏｗ）、Ｄ）γδ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の増殖を示す。データは、ＸＥＮＰ ３０５１６が、優れた選択性を維持しながら、３０倍の非常に高い用量でより大きなＰＤ１＋拡大を誘導したことを示す。「（Ｇ４Ｓ）リンカー」は、配列番号７である。

図１２９Ａ～図１２９Ｅは、１倍の低用量のＸＥＮＰ３１９８６（ＰＤ１ ｘ ＩＬ１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］）及び対応するＲＳＶ標的化代用ＸＥＮＰ３２１６９を投与したカニクイザルにおけるＡ）ＣＤ８^＋ＰＤ１^＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８^＋幹細胞メモリ、Ｃ）ＣＤ８ナイーブ（ＰＤ１^ｌｏｗ）、Ｄ）γδ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の増殖を示す。データは、ＸＥＮＰ３１９８６が優れた選択性で１倍の低用量で良好なＰＤ１^＋細胞増殖を誘導したことを示す。「（Ｇ４Ａ）リンカー」は、配列番号８である。

図１３０Ａ～図１３０Ｅは、３倍の中用量のＸＥＮＰ３１９８６（ＰＤ１ｘＩＬ１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］）及び対応するＲＳＶ標的化代用ＸＥＮＰ３２１６９を投与したカニクイザルにおけるＡ）ＣＤ８^＋ＰＤ１^＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８^＋幹細胞メモリ、Ｃ）ＣＤ８ナイーブ（ＰＤ１^ｌｏｗ）、Ｄ）γδ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の増殖を示す。データは、ＸＥＮＰ３１９８６が、優れた選択性を維持しながら、３倍の中用量でＰＤ１^＋細胞増殖の増強を誘導したことを示す。「（Ｇ４Ａ）リンカー」は、配列番号８である。

図１３１Ａ～図１３１Ｅは、１０倍の高用量のＸＥＮＰ３１９８６（ＰＤ１ ｘ ＩＬ１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］）及び対応するＲＳＶ標的化代用ＸＥＮＰ３２１６９を投与したカニクイザルにおけるＡ）ＣＤ８^＋ＰＤ１^＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８^＋幹細胞メモリ、Ｃ）ＣＤ８ナイーブ（ＰＤ１^ｌｏｗ）、Ｄ）γδ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の増殖を示す。データは、ＸＥＮＰ３１９８６が、優れた選択性を維持しながら、１０倍の高用量で非常に大きなＰＤ１^＋細胞増殖を誘導したことを示す。「（Ｇ４Ａ）リンカー」は、配列番号８である。

図１３２は、ＩＬ－１５［Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ］、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］、又はＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］のいずれかを含む様々な濃度の様々なＰＤ－１標的化又はＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を投与したカニクイザルにおけるＣＤ８^＋ＰＤ１^＋Ｔ細胞の増殖を要約している。

図１３３Ａ～１３３Ｅは、ＩＬ－１５［Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ］、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］、又はＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］のいずれかを含む様々な濃度の様々なＰＤ－１標的化又はＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を投与したカニクイザルにおける、Ａ）ＣＤ８^＋ＰＤ１^＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８^＋幹細胞メモリ、Ｃ）ＣＤ８ナイーブ（ＰＤ１^ｌｏｗ）、Ｄ）γδ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の選択比とピーク増殖倍率との相関を示す。まとめると、データは、用量の増加がより高い選択性をもたらすことを示している。加えて、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］バリアントを含むＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］バリアントを含むＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物よりも選択的であり、それは、ＩＬ－１５［Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ］ バリアントを含むＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物よりも選択的であった。

図１３４は、カニクイザルにおける示された試験物の血清濃度の経時的変化を示す。驚くべきことに、同じ用量で、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］バリアントを含む脱グリコシル化ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ ＸＥＮＰ３１８９６は、ＸＥＮＰ３１８９６がＸＥＮＰ３０５１６と比較して増強された効力／薬力学を有するにもかかわらず、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］バリアントを含むグリコシル化ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ ＸＥＮＰ３０５１６と比較して増強された薬物動態を示した。「（Ｇ４Ｓ）リンカー」は配列番号７であり、「（Ｇ４Ａ）リンカー」は配列番号８である。

図１３５は、カニクイザルにおける示された試験物の血清濃度の経時的変化を示す。同じ用量で、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］バリアントを含む脱グリコシル化ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ ＸＥＮＰ３２１６９は、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］バリアントを含むグリコシル化ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ ＸＥＮＰ３２１６９と比較して増強された薬物動態を示した。「（Ｇ４Ｓ）リンカー」は配列番号７であり、「（Ｇ４Ａ）リンカー」は配列番号８である。

図１３６は、ＷＴ ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１Ｌ１と比較したＴｒｐ操作ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１Ｌ１バリアントの結合を示すＯｃｔｅｔセンサーグラムを示す。ナンバリングはＫａｂａｔによる。データは、不安定なトリプトファンを修復すると、ＰＤ－１への結合の完全な喪失又は実質的により弱い結合が生じたことを示している。

図１３７Ａ～図１３７Ｇは、重鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価ヒトＩｇＧ１フォーマットのｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１Ｌ１の例示的なＴｒｐ操作及び親和性修復バリアントの配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれ、斜線は可変ドメインの境界を示す。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。当業者によって理解されるように、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質において使用するためのＦａｂ又はｓｃＦｖとしてフォーマットされ得る。

図１３８Ａ～図１３８Ｇは、ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１Ｌ１の例示的なＴｒｐ操作及び親和性修復バリアントを有する「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」の例示的なＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はイタリック体であり、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図９及び図１０に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。当業者には明らかなように、記載される標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれは、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含むことができ、又は除外することができる。

図１３９は、Ｏｃｔｅｔによって決定される修復されたＰＤ－１結合を有するＴｒｐ操作ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１Ｌ１バリアントの見かけの解離定数（ＫＤａｐｐ）、会合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）を示す。可変重鎖領域又は可変軽鎖領域における置換（列挙されている場合）は、Ｘｅｎｃｏｒナンバリング（対応するＫａｂａｔ位置が次の列に列挙されている）に基づく。ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１．１７６＿Ｌ１．１４０、ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１．１７７＿Ｌ１．１４０、及びｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１．１８０＿Ｌ１．１４０を含む、ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１＿Ｌ１．１のものに近いＰＤ－１親和性結合を回復させるいくつかのバリアントを同定した。

図１４０Ａ～図１４０Ｂは、ＰＤ－１に対するＡ）ＸＥＮＰ３１９８６（ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ１］＿Ｈ１＿Ｌ１．１を有する）、及びＢ）ＸＥＮＰ３２４３５（Ｔｒｐ操作／親和性修復ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ１］＿Ｈ１．１７６＿Ｌ１．１４０を有する）の結合を示すＯｃｔｅｔセンサーグラムを示す。データは、修復された分子がＰＤ－１に対して同等の親和性を有することを示す。

図１４１は、Ｔｒｐ操作ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によるＣＤ８エフェクターメモリＴ細胞増殖の誘導を示す。Ｔｒｐを除去するように操作されたＰＤ－１結合ドメインを有するＸＥＮＰ３２４３５、ＸＥＮＰ３２４３６及びＸＥＮＰ３２４３９は、（ＰＤ－１に対する類似の親和性を有するにもかかわらず）ＸＥＮＰ３１９８６と同等又はそれ以上にＣＤ８^＋エフェクターメモリＴ細胞の増殖において強力である。

図１４２は、「ＩＬ－１５／Ｒα－ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質であるＸＥＮＰ２０８１８（ＷＴ ＩＬ－１５）、ＸＥＮＰ２２８２１（ＩＬ－１５［Ｎ６５Ｄ］）及びＸＥＮＰ２４０４５（ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］）の配列を示す。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に下線を付し、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図７に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー及びＦｃ領域の境界を示す。

図１４３は、非標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２０８１８及びＸＥＮＰ２４０４５並びに様々なＰＤ－１標的化又は対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物による処置後のラパマイシン拡大Ｔｒｅｇの増殖を示す。データは、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（標的化及び非標的化）がラパマイシン拡大Ｔｒｅｇの増殖を誘導することを示す（Ｔａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ希釈によって測定）。注目すべきことに、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、標的化されていないＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物と比較して、Ｔｒｅｇの増殖を誘導する効力がはるかに低かった。

図１４４Ａ～図１４４Ｂは、１×１０^５個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを５μｇ／ｍｌの示された試験物及び増加する数のラパマイシン拡大Ｔｒｅｇと共にインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ８エフェクターメモリＴ細胞、及びＢ）ＣＤ４エフェクターメモリＴ細胞（ＣＦＳＥ希釈によって決定）の増殖を示す。データは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、ＣＤ８及びＣＤ４エフェクターメモリＴ細胞増殖の、Ｔｒｅｇ誘導性の抑制の効力をシフトさせた（低下させた）ことを示す。注目すべきことに、対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によるシフトは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によって誘導される効力の低下よりも小さかった。

図１４５Ａ～図１４５Ｂは、１×１０^５個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを５μｇ／ｍｌの示された試験物及び増加する数のラパマイシン拡大Ｔｒｅｇと共にインキュベートした後の、Ａ）Ｔｒｅｇ対ＣＤ８エフェクターメモリＴ細胞、及びＢ）Ｔｒｅｇ対ＣＤ４エフェクターメモリＴ細胞の比を示す。データは、試験物なしと比較して、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＴｒｅｇ／Ｔ_ＥＭ比を増加させたが、それでもなお、Ｔ_ＥＭ細胞増殖はＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によって増強されることを示す。これは、Ｔｒｅｇは増殖するが、増殖したＴｒｅｇは抑制能力の低下を示すことを示す。

図１４６Ａ～図１４６Ｂは、完全Ｔｒｅｇ培地（１０％ ＦＢＳ、０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２、１００ ｎｇ／ｍｌラパマイシンを含むＲＰＭＩ）；ラパマイシンを含まない完全Ｔｒｅｇ培地；又は１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５（１０％ ＦＢＳ、０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８を含むＲＰＭＩ；ＩＬ－２なし；ラパマイシンなし）で６日間前培養したラパマイシン拡大ＴｒｅｇとＣＤ３刺激ＰＢＭＣをインキュベートした後の、増殖パーセンテージＡ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＦＳＥ希釈によって決定）を示す。データは、ＩＬ－１５で前処理したＴｒｅｇが抑制能の障害を示すことを示す。

図１４７Ａ～図１４７Ｂは、５μｇ／ｍｌ ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２２８２１なし（Ａ）又はあり（Ｂ）で１４日間処置したＰＢＭＣ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＦＯＸＰ３の発現を示す。データは、ＸＥＮＰ２２８２１による処置がＣＤ４^＋Ｔ細胞集団上のＦＯＸＰ３発現を減少させたことを示す。

図１４８Ａ～図１４８Ｂは、５μｇ．ｍｌ ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２２８２１なし（Ａ）又はあり（Ｂ）で１４日間処置したＰＢＭＣ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＣＤ４５ＲＡ及びＦＯＸＰ３の発現を示す。データは、ＸＥＮＰ２２８２１による処置がＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－集団をＦｏｘＰ３^ｈｉｇｈからＦｏｘＰ３^ｌｏｗにシフトさせることを示しており、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物による処置が集団をｅＴｒｅｇ（５．２４％から２．７２％への減少した集団）から、活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞（１８．２％から２８．６％への増加した集団）に実際にシフトさせたことを示している。

図１４９Ａ～図１４９Ｂは、５μｇ／ｍｌ ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２２８２１なし（Ａ）又はあり（Ｂ）で１４日間処置したＰＢＭＣ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＣＲ４の発現を示す。データは、ＸＥＮＰ２２８２１による処置がＣＤ４^＋Ｔ細胞集団上のＣＣＲ４発現を減少させたことを示す。

図１５０Ａ～図１５０Ｂは、１００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）上のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣと、１０μｇ／ｍｌのＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４０４５及び示される濃度のＴＧＦβ１とのインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８ Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖（ＣＦＳＥ希釈によって決定）を示す。データは、ＴＧＦβがＴ細胞の増殖を用量依存的に抑制するが、注目すべきことに、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合は、試験した全ての用量でＴ細胞増殖のＴＧＦβ抑制を妨げることを示す。

図１５１Ａ～図１５１Ｂは、Ｏｃｔｅｔによって決定される修復されたＰＤ－１結合を有するＴｒｐ操作ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１Ｌ１バリアントの見かけの解離定数（Ｋ_Ｄａｐｐ）、会合速度（ｋ_ａ）及び解離速度（ｋ_ｄ）を示す。可変重鎖領域における置換（列挙されている場合）は、Ｘｅｎｃｏｒナンバリング（対応するＫａｂａｔ位置が次の列に列挙されている）に基づく。

図１５２Ａ～図１５２Ｎは、ニボルマブ又はペンブロリズマブと競合しない追加の例示的な抗ＰＤ－１ ＡＢＤの可変重鎖及び可変軽鎖を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。

図１５３Ａ～図１５３Ｂは、例示的なＰＤ－１標的化ＩＬ－１５構築物の配列を示す。図１５３Ａは、ＸＥＮＰ３１３２６を示す。図１５３Ｂは、ＸＥＮＰ３１３２９を示す。本明細書で留意され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように使用されるナンバリングに応じてわずかに異なり得、したがって、本明細書には、下線が引かれているＣＤＲだけでなく、他のナンバリングシステムを使用してＶＨドメイン及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも含まれる。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はイタリック体であり、リンカーに二重下線を付し（当業者には理解されるように、リンカーは他のリンカーに置き換えることができ、その一部は図９及び図１０に示されている）、斜線（／）はＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、リンカー、可変領域及び定常／Ｆｃ領域の境界を示す。当業者には明らかなように、記載される標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のそれぞれは、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を含むことができ、又は除外することができる。

図１５４Ａ～図１５４Ｃは、Ａ）ＸＥＮＰ３１３２６対ＸＥＮＰ３１３２９、Ｂ）ＸＥＮＰ３０５１６及びＸＥＮＰ３２９２７対ＸＥＮＰ３０５１８、並びに、Ｃ）ＸＥＮＰ３１９８６及びＸＥＮＰ３２４３５対ＸＥＮＰ３２１６９による、ＣＤ３エフェクターメモリＴ細胞増殖の誘導を示す。データは、（ＸＥＮＰ３１３２６対ＸＥＮＰ３１３２９の比較によって示されるように）標的化単独が、限られた選択性（ＲＳＶ標的化及びＰＤ１標的化のＥＣ５０の２．４倍の差）を提供することを示している。ＩＬ－１５効力の低下と組み合わせたＰＤ１標的化（ＸＥＮＰ３０５１６及びＸＥＮＰ３２９２７対ＸＥＮＰ３０５１８の比較；ＸＥＮＰ３１９８６及びＸＥＮＰ３２４３５対ＸＥＮＰ３２１６９の比較によって示される）は、有意に増強された選択性を提供する。注目すべきことに、驚くべきことに、脱グリコシル化バリアントは選択性をさらに高める（脱グリコシル化バリアントを用いた場合は２４６倍の選択性であり、用いなかった場合の１０５倍の選択性と対照的である）。

図１５５Ａ及び図１５５Ｂは、ＸｍＡｂ２４３０６及び様々な濃度のラパマイシン拡大Ｔｒｅｇの存在下での（図１５５Ａ）ＣＤ８＋及び（図１５５Ｂ）ＣＤ４＋応答細胞の増殖を示す。

図１５６は、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２０８１８及びＸＥＮＰ２４０４５による処置後のラパマイシン拡大Ｔｒｅｇの増殖を示す。データは、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物がラパマイシン拡大Ｔｒｅｇの増殖を誘導することを示す（Ｔａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ希釈によって測定）。注目すべきことに、ＸＥＮＰ２４０４５は、ＸＥＮＰ２０８１８と比較してＴｒｅｇの増殖を誘導する効力の低下を実証している。

図１５７Ａ及び図１５７Ｂは、１×１０^５個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを５μｇ／ｍｌの示された試験物及び増加する数のラパマイシン拡大Ｔｒｅｇと共にインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ８エフェクターメモリＴ細胞、及びＢ）ＣＤ４エフェクターメモリＴ細胞（ＣＦＳＥ希釈によって決定）の増殖を示す。データは、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、ＣＤ８及びＣＤ４エフェクターメモリＴ細胞増殖の、Ｔｒｅｇ誘導性の抑制の効力をシフトさせた（低下させた）ことを示す。

図１５８Ａ及び図１５８Ｂは、１×１０^５個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを５μｇ／ｍｌの示された試験物及び増加する数のラパマイシン拡大Ｔｒｅｇと共にインキュベートした後の、Ａ）Ｔｒｅｇ対ＣＤ８エフェクターメモリＴ細胞、及びＢ）Ｔｒｅｇ対ＣＤ４エフェクターメモリＴ細胞の比を示す。データは、試験物なしと比較して、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＴｒｅｇ／Ｔ_ＥＭ比を増加させたが、それでもなお、Ｔ_ＥＭ細胞増殖はＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によって増強されることを示す。これは、Ｔｒｅｇは増殖するが、増殖したＴｒｅｇは抑制能力の低下を示すことを示す。

図１５９Ａ及び図１５９Ｂは、完全Ｔｒｅｇ培地（１０％ＦＢＳ、０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２、１００ｎｇ／ｍｌラパマイシンを含むＲＰＭＩ）；ラパマイシンを含まない完全Ｔｒｅｇ培地；又は１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５（１０％ＦＢＳ、０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８を含むＲＰＭＩ；ＩＬ－２なし；ラパマイシンなし）で６日間前培養したラパマイシン拡大ＴｒｅｇとＣＤ３刺激ＰＢＭＣをインキュベートした後の、増殖パーセンテージＡ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＦＳＥ希釈によって決定）を示す。データは、ＩＬ－１５で前処理したＴｒｅｇが抑制能の障害を示すことを示す。

図１６０Ａ及び図１６０Ｂは、５μｇ／ｍｌ ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２２８２１なし（Ａ）又はあり（Ｂ）で１４日間処置したＰＢＭＣ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＦＯＸＰ３の発現を示す。データは、ＸＥＮＰ２２８２１による処置がＣＤ４^＋Ｔ細胞集団上のＦＯＸＰ３発現を減少させたことを示す。

図１６１Ａ及び図１６１Ｂは、５μｇ／ｍｌ ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２２８２１なし（Ａ）又はあり（Ｂ）で１４日間処置したＰＢＭＣ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＣＤ４５ＲＡ及びＦＯＸＰ３の発現を示す。データは、ＸＥＮＰ２２８２１による処置がＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－集団をＦｏｘＰ３^ｈｉｇｈからＦｏｘＰ３^ｌｏｗにシフトさせることを示しており、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物による処置が集団をｅＴｒｅｇ（５．２４％から２．７２％への減少した集団）から、活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞（１８．２％から２８．６％への増加した集団）に実際にシフトさせたことを示している。

図１６２Ａ及び図１６２Ｂは、５μｇ／ｍｌ ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２２８２１なし（Ａ）又はあり（Ｂ）で１４日間処置したＰＢＭＣ中のＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＣＲ４の発現を示す。データは、ＸＥＮＰ２２８２１による処置がＣＤ４^＋Ｔ細胞集団上のＣＣＲ４発現を減少させたことを示す。

図１６３Ａ及び図１６３Ｂは、１００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）上のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣと、１０μｇ／ｍｌのＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４０４５及び示される濃度のＴＧＦβ１とのインキュベーション後の、Ａ）ＣＤ８ Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖（ＣＦＳＥ希釈によって決定）を示す。データは、ＴＧＦβがＴ細胞の増殖を用量依存的に抑制するが、注目すべきことに、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合は、試験した全ての用量でＴ細胞増殖のＴＧＦβ抑制を妨げることを示す。

図１６４は、単剤ＰＤ－１遮断、非標的化効力低下ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４０４５（単剤として、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて）、又は、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化効力低下糖鎖工学ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃを投与したｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ｈｕＣＤ３４＋ＮＳＧマウスにおける経時的な腫瘍体積（キャリパー測定によって決定）を示す。全ての群は、ＰＢＳ対照による処置と比較して、１５日目までに有意に増強された腫瘍活性を示し（ｐ≦０．０５）、ＰＤ－１遮断と組み合わせることによって抗腫瘍活性に対する明らかな利益があった。

図１６５は、単剤ＰＤ－１遮断、非標的化効力低下ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４０４５（単剤として、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて）、又は、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化効力低下糖鎖工学ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃを投与したｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ｈｕＣＤ３４＋ＮＳＧマウスにおける、７日目及び１３日目までのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す。ＰＤ－１遮断と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－１５は、ＰＤ－１遮断と組み合わせた非標的化ＩＬ－１５－Ｆｃ融合物と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の増殖を有意に増強した。ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５とＰＤ－１遮断の組合せは、単剤ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５と比較して、リンパ球増殖を有意に増加させた。

図１６６は、単剤ＰＤ－１遮断、非標的化効力低下ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４０４５（単剤として、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて）、又は、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化効力低下糖鎖工学ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃを投与したｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ｈｕＣＤ３４＋ＮＳＧマウスにおける、１３日目のＣＤ８ Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ比を示す。ＣＤ８：Ｔｒｅｇ比は、ＰＤ１標的化ＩＬ１５（さらにＰＤ－１遮断との組合せ）で改善される。対応のないｔ検定を使用して対数変換データに対して行われた統計。

図１６７Ａ～図１６７Ｅは以下を示す：Ａ）全ＣＤ４５リンパ球集団のＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ、Ｂ）全ＣＤ８集団のエフェクターメモリＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージ、Ｃ）全ＣＤ８集団のＣＤ８ナイーブのパーセンテージ、Ｄ）全ＣＤ３集団のＴｒｅｇのパーセンテージ、及びＥ）単剤ＰＤ－１遮断又は［ＮＣ］ＰＤ－１標的化効力低下糖鎖工学ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ（単剤として、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて）を投与したｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ｈｕＣＤ３４＋ＮＳＧマウスの腫瘍組織における９日目のＴｒｅｇに対するエフェクターメモリＣＤ８ Ｔ細胞の比。データは、ＸＥＮＰ３２９８６が、単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて、腫瘍において、総ＣＤ３＋Ｔ細胞を増加させ、Ｔ細胞表現型をエフェクターメモリＣＤ８＋にシフトさせること；ＸＥＮＰ３２９８６が、単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて、腫瘍においてＣＤ８：Ｔｒｅｇ比を増加させること；低用量の０．０１ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３２９８６が、ＰＤ－１遮断との併用で有意な薬力学を可能にしたことを示す。

図１６８Ａ～図１６８Ｌは、単剤ＰＤ－１遮断、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］ＸＥＮＰ３２９２７（０．１、０．３若しくは１ｍｇ／ｋｇの単剤として、又は０．３ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１遮断と組み合わせて）、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］ＸＥＮＰ３２４３５（０．０３、０．１若しくは０．３ｍｇ／ｋｇの単剤として、又は０．１ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１遮断と組み合わせて）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせたＲＳＶ標的化ＩＬ－１５対照を投与したｈｕＰＢＭＣ及びｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ＮＳＧ－ＤＫＯマウスにおける経時的な腫瘍体積（キャリパー測定によって決定）のベースライン補正した変化を示す。

図１６９は、単剤ＰＤ－１遮断、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］ＸＥＮＰ３２９２７（０．１、０．３若しくは１ｍｇ／ｋｇの単剤として、又は０．３ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１遮断と組み合わせて）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせたＲＳＶ標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］対照を投与したｈｕＰＢＭＣ及びｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ＮＳＧ－ＤＫＯマウスにおける経時的な腫瘍体積（キャリパー測定によって決定）のベースライン補正した中央値の変化を示す。ＸＥＮＰ３２９２７は、ＰＤ－１遮断単独と比較して、ＰＤ－１遮断と組み合わせて０．３ｍｇ／ｋｇで（１７、２０、２２及び２７日目にｐ＜０．０５）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせて１ｍｇ／ｋｇで（１５及び１７日目にｐ＜０．０５）、有意な腫瘍退縮を誘導した（マン・ホイットニー検定を使用してベースライン補正データに対して統計を行った）。

図１７０は、単剤ＰＤ－１遮断、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］ＸＥＮＰ３２４３５（０．０３、０．１、若しくは０．３ｍｇ／ｋｇの単剤として、又は０．１ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１遮断と組み合わせて）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせたＲＳＶ標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］対照を投与したｈｕＰＢＭＣ及びｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ＮＳＧ－ＤＫＯマウスにおける経時的な腫瘍体積（キャリパー測定によって決定）のベースライン補正した中央値の変化を示す。ＸＥＮＰ３２４３５は、ＰＤ－１遮断単独と比較して、ＰＤ－１遮断と組み合わせて０．１ｍｇ／ｋｇで（１３日目及び１５日目にｐ＜０．０５）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせて０．３ｍｇ／ｋｇで（１３日目、１５日目、及び１７日目にｐ＜０．０５）、有意な腫瘍退縮を誘導した。注目すべきことに、ＸＥＮＰ３２４３５は、このモデルにおいて単剤として有意な腫瘍退縮を示した（ＰＤ－１遮断単剤と比較して１７日目にｐ＜０．０５）。マン・ホイットニー検定を使用してベースライン補正データに対して行なわれた統計。

図１７１は、単剤ＰＤ－１遮断、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］ＸＥＮＰ３２９２７（０．１、０．３若しくは１ｍｇ／ｋｇの単剤として、又は０．３ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１遮断と組み合わせて）、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］ＸＥＮＰ３２４３５（０．０３、０．１若しくは０．３ｍｇ／ｋｇの単剤として、又は０．１ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１遮断と組み合わせて）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせたＲＳＶ標的化ＩＬ－１５対照を投与したｈｕＰＢＭＣ及びｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ＮＳＧ－ＤＫＯマウスにおける１７日目までの腫瘍体積の変化を示す。マン・ホイットニー検定を使用してベースライン補正データに対して行なわれた統計。データは、ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５（いずれかのＩＬ－１５バリアントを含む）が、ＰＤ－１遮断単独と比較して、ＰＤ－１遮断と組み合わせて活性を増強しなかったことを示す。

図１７２Ａ～図１７２Ｄは、以下を示す：単剤ＰＤ－１遮断、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］ＸＥＮＰ３２９２７（０．１、０．３若しくは１ｍｇ／ｋｇの単剤として、又は０．３ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１遮断と組み合わせて）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせたＲＳＶ標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］対照を投与したｈｕＰＢＭＣ及びｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ＮＳＧ－ＤＫＯマウスにおける、Ａ）７日目のＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化及びＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化（ＣＤ２５発現によって示される）；並びに、Ｃ）１４日目のＣＤ４＋Ｔ細胞数及びＤ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数。データは、ＸＥＮＰ３２９２７が０．１～１ｍｇ／ｋｇで活性であったことを示す。

図１７３Ａ～図１７３Ｄは、以下を示す：単剤ＰＤ－１遮断、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］ＸＥＮＰ３２４３５（０．０３、０．１、若しくは０．３ｍｇ／ｋｇの単剤として、又は０．１ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１遮断と組み合わせて）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせたＲＳＶ標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］対照を投与したｈｕＰＢＭＣ及びｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ＮＳＧ－ＤＫＯマウスにおける、Ａ）７日目のＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化及びＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化（ＣＤ２５発現によって示される）；並びに、Ｃ）１４日目のＣＤ４＋Ｔ細胞数及びＤ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数。データは、ＸＥＮＰ３２４３５が０．０３～０．３ｍｇ／ｋｇの多くの濃度で活性であったことを示す。

図１７４は、単剤ＰＤ－１遮断、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］ＸＥＮＰ３２９２７（０．１、０．３若しくは１ｍｇ／ｋｇの単剤として、又は０．３ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１遮断と組み合わせて）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせたＲＳＶ標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］対照を投与したｈｕＰＢＭＣ及びｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ＮＳＧ－ＤＫＯマウスにおける経時的な血清ＩＦＮγ濃度を示す。

図１７５は、単剤ＰＤ－１遮断、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］ＸＥＮＰ３２４３５（０．０３、０．１、若しくは０．３ｍｇ／ｋｇの単剤として、又は０．１ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１遮断と組み合わせて）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせたＲＳＶ標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］対照を投与したｈｕＰＢＭＣ及びｐｐ６５－ＭＣＦ７移植ＮＳＧ－ＤＫＯマウスにおける経時的な血清ＩＦＮγ濃度を示す。

図１７６Ａ～図１７６Ｅは、１倍用量での静脈内投与によるＸＥＮＰ３２４３５ＰＤ１ｘＩＬ１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］）で処置したカニクイザルにおける、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋幹細胞メモリＴ細胞、Ｃ）ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、Ｄ）γδ Ｔ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の増殖を示す。

図１７７Ａ～図１７７Ｅは、図１７５Ａ～図１７５Ｅと比較して１２倍用量での静脈内投与によるＸＥＮＰ３２４３５ＰＤ１ｘＩＬ１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］）で処置したカニクイザルにおける、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋幹細胞メモリＴ細胞、Ｃ）ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、Ｄ）γδ Ｔ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の増殖を示す。

図１７８Ａ～図１７８Ｅは、１倍用量での静脈内投与によるＸＥＮＰ３２９２７（ＰＤ１ｘＩＬ１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］）で処置したカニクイザルにおける、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋幹細胞メモリＴ細胞、Ｃ）ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、Ｄ）γδ Ｔ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の増殖を示す。

図１７９Ａ～図１７９Ｅは、図１７７Ａ～図１７７Ｅに対して２０倍用量での静脈内投与によるＸＥＮＰ３２９２７（ＰＤ１ｘＩＬ１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］）で処置したカニクイザルにおける、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋幹細胞メモリＴ細胞、Ｃ）ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、Ｄ）γδ Ｔ細胞、及びＥ）ＮＫ細胞の増殖を示す。

図１８０は、脱グリコシル化ＸＥＮＰ３２４３５を静脈内投与により１倍及び１２倍の用量で用いて処置したカニクイザルにおける試験物の血清濃度の経時的変化を示す。

図１８１は、グリコシル化ＸＥＮＰ３２９２７を静脈内投与により１倍及び２０倍の用量で用いて処置したカニクイザルにおける試験物の血清濃度の経時的変化を示す。

図１８２Ａ～図１８２Ｂは、以下を示す：示された試験物とのインキュベーション後のマウス脾細胞における、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数及びＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＫｉ－６７発現パーセンテージ。データは、マウス代用ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５分子がＰＤ１＋マウスＴ細胞に対して高度に選択的であったことを示す。

図１８３Ａ及び図１８３Ｂは、以下を示す：ＸＥＮＰ３３８６９とは異なるｍｕＰＤ－１エピトープに結合する（すなわち競合しない）代替的なマウス代用ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５分子ＸＥＮＰ３６２１７を含む示された試験物とのインキュベーション後のマウス脾細胞における、Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数及びＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＫｉ－６７発現パーセンテージ。データは、ＸＥＮＰ３６２１７がＰＤ１＋マウスＴ細胞に対しても高度に選択的であったことを示す。

図１８４Ａ～図１８４Ｋは、ＰＤ－Ｌ１遮断ｍｕＰＤ１ｘＩＬ１５代用ＸＥＮＰ３３８６９の投与に対する抗腫瘍及び薬力学的応答を示す。Ａ）グループアウト後３日目及び６日目に記録された切除腫瘍重量；Ｂ）腫瘍におけるフローサイトメトリによって測定されるＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞の計数；Ｃ）腫瘍におけるＣＤ８：Ｔｒｅｇ比；Ｄ）腫瘍におけるフローサイトメトリによって測定されるＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞の頻度；Ｅ）脾臓におけるフローサイトメトリによって測定されるＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞の頻度；Ｆ）脾臓におけるフローサイトメトリによって測定されるＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞の計数；Ｇ）脾臓におけるＣＤ８：Ｔｒｅｇ比；Ｈ）腫瘍におけるフローサイトメトリによって測定されるグランザイムＢ＋ＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞の頻度；Ｉ）腫瘍におけるフローサイトメトリによって測定されるグランザイムＢ＋ＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞のＭＦＩ；Ｊ）脾臓におけるフローサイトメトリによって測定されるグランザイムＢ＋ＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞の頻度；Ｋ）脾臓におけるフローサイトメトリによって測定されるグランザイムＢ＋ＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞のＭＦＩ。

図１８５Ａ～図１８５Ｈは、ＰＤ－Ｌ１非ブロッキングｍｕＰＤ１ｘＩＬ１５代用ＸＥＮＰ３６２１３、ＸＥＮＰ３６２１６及びＸＥＮＰ３６２１７と比較した、ＰＤ－Ｌ１遮断ｍｕＰＤ１ｘＩＬ１５代用ＸＥＮ３３８６９の投与に対する抗腫瘍及び薬力学的応答を示す。Ａ）グループアウト後６日目に記録された切除腫瘍重量；Ｂ）腫瘍におけるフローサイトメトリによって測定されるＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞の計数；Ｃ）腫瘍におけるフローサイトメトリによって測定されるＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞の頻度；Ｄ）腫瘍におけるＣＤ８：Ｔｒｅｇ比；Ｅ）脾臓におけるフローサイトメトリによって測定されるＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞の計数；Ｆ）脾臓におけるＣＤ８：Ｔｒｅｇ比；Ｇ）脾臓におけるフローサイトメトリによって測定されるＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞の頻度；Ｈ）腫瘍及び脾臓におけるフローサイトメトリによって測定されるグランザイムＢ＋ＣＤ８、ＣＤ４、Ｔｒｅｇ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞の頻度。

図１８６Ａ及び図１８６Ｂは、対照及びマウス反応性ａＰＤ－Ｌ１と比較した、静脈内投与後の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＭＣ３８同系腫瘍モデルの成長に対するＰＤ－Ｌ１遮断ｍｕＰＤ１ｘＩＬ１５ ＸＥＮＰ３３８６９処置の効果を示す。Ａ）生データ及びフィッティング。Ｂ）各群のフィッティング増殖曲線の重ね合わせ。

図１８７Ａ及び図１８７Ｂは、対照及びマウス反応性ａＰＤ－Ｌ１と比較した、種々の用量レベルでの静脈内投与後の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＭＣ３８同系腫瘍モデルの成長に対するＰＤ－Ｌ１遮断ｍｕＰＤ１ｘＩＬ１５ ＸＥＮＰ３３８６９処置の効果を示す。ＸＥＮＰ３３８６９と抗ＰＤＬ１との併用活性も評価した。Ａ）生データ及びフィッティング。Ｂ）各群のフィッティング増殖曲線の重ね合わせ。

図１８８Ａ及び１８８Ｂは、対照及びマウス反応性ａＰＤ－Ｌ１と比較した、静脈内投与後の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＭＣ３８同系腫瘍モデルの成長に対する、ＰＤ－Ｌ１非遮断ｍｕＰＤ１ｘＩＬ１５ ＸＥＮＰ３６２１７による処置と比較した、ＰＤ－Ｌ１遮断ｍｕＰＤ１ｘＩＬ１５代用ＸＥＮＰ３３８６９による処置の効果を示す。ＸＥＮＰ３３８６９及びＸＥＮＰ３６２１７と抗ＰＤＬ１との併用活性も評価した。Ａ）生データ及びフィッティング。Ｂ）各群のフィッティング増殖曲線の重ね合わせ。

図１８９Ａ～図１８９Ｈは、ビヒクル又はマウス反応性ａＰＤ－Ｌ１による処置と比較した、静脈内投与によるＭＣ３８同系腫瘍モデルを有する雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるｍｕＰＤ１ｘＩＬ１５代用ＸＥＮＰ３３８６９による処置後の１８Ｆ標識抗マウスＣＤ８トレーサーのポジトロン放出断層撮影のイメージング及び定量化を示す。Ａ）各処置群からの代表的な画像であり、腫瘍位置を矢印で示している。Ｂ）処置後１２日目に測定した非結合対照トレーサーと比較したＣＤ８トレーサー取り込み腫瘍。Ｃ）血液Ｄ）腫瘍Ｅ）脾臓Ｆ）腋窩リンパ節Ｇ）鼠径リンパ節及びＨ）肝臓におけるＣＤ８トレーサー取り込みの時間経過。

Ｉ．呼称
本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、いくつかの異なるフォーマットで列挙されている。各ポリペプチドには固有の「ＸＥＮＰ」番号が与えられるが、当技術分野で理解されるように、より長い配列はより短い配列を含み得る。例えば、抗ＰＤ－１に対するＦａｂを含むモノマーの重鎖（例えば、図２８Ｃを参照）は、第１のＸＥＮＰ番号を有するが、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、異なるＸＥＮＰ番号を有することができる。いくつかの分子は３つのポリペプチドを有するので、成分を含むＸＥＮＰ番号を名称として使用する。したがって、「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα Ｘ Ｆａｂ」中にある分子ＸＥＮＰ２９４８４は、一般に「ＸＥＮＰ２９４８４鎖１」、「ＸＥＮＰ２９４８４鎖２」及び「ＸＥＮＰ２９４８４鎖３」と呼ばれる３つの配列又は同等物を含むが、当業者であれば配列アラインメントによってこれらを容易に同定することができるであろう。これらのＸＥＮＰ番号は、配列表並びに識別子にあり、図で使用されている。さらに、３つの成分を含む１つの分子は、複数の配列識別子をもたらす。例えば、Ｆａｂモノマーのリストは、全長配列、可変重配列及び可変重配列の３つのＣＤＲを有し；軽鎖は、全長配列、可変軽配列及び可変軽配列の３つのＣＤＲを有し；ｓｃＦｖ－Ｆｃドメインは、全長配列、ｓｃＦｖ配列、可変軽配列、３つの軽ＣＤＲ、ｓｃＦｖリンカー、可変重配列、及び３つの重ＣＤＲを有し；ｓｃＦｖドメインを有する本明細書の全ての分子は、単一の荷電ｓｃＦｖリンカー（＋Ｈ）を使用するが、他のものも使用できることに留意されたい。さらに、特定の可変ドメインの命名呼称は、「Ｈｘ．ｘｘ＿Ｌｙ．ｙｙ」タイプのフォーマットを使用し、数字は特定の可変鎖配列に対する固有の識別子である。したがって、ＸＥＮＰ３０４８６のＦａｂ側の可変ドメイン（ＰＤ－１に結合する）は「Ｈ１．１３２」であり、これは、可変重ドメインＨ１．１３２が使用され、ＸＥＮＰ３０４８６において、軽ドメインＬ１．１３５と組み合わされたことを示す。したがって、「ｍＡｂＣ［ＰＤ－１］＿Ｈ１．１３２＿Ｌ１．１３５」という表記は、可変重ドメインＨ１．１３２が軽ドメインＬ１．１３４と組み合わされたことを示す。これらの配列がｓｃＦｖに組み合わされる場合、この表記は、ｓｃＦｖがＮ末端からＣ末端に向かってＶＨ－リンカー－ＶＬ配向であることを示す。重可変ドメイン及び軽可変ドメインの同一の配列を有するが、逆の順序であるこの分子は、「ｍＡｂＣ［ＰＤ－１］＿Ｌ１．１３５＿Ｈ１．１３２」と命名される。同様に、異なる構築物は、配列表及び図から明らかなように、重鎖及び軽鎖を「混合及び適合」することができる。
ＩＩ．定義

本出願がより完全に理解され得るように、いくつかの定義を以下に記載する。そのような定義は、文法上の等価物を包含することを意味する。

本明細書における「除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）」とは、活性の低下又は除去を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合を除去する」は、Ｆｃ領域アミノ酸バリアントが、特異的バリアントを含まないＦｃ領域と比較して、５０％未満の結合開始を有し、７０－８０－９０－９５－９８％を超える活性の喪失が好ましく、一般に、活性は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおいて検出可能な結合のレベル未満であることを意味する。ＦｃγＲ結合の除去において特に使用されるのは、図６に示されるものである。しかしながら、特に明記しない限り、本発明のＦｃモノマーは、ＦｃＲｎ受容体への結合を保持する。

本明細書で使用される「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。ＡＤＣＣはＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、ＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。本明細書で論じるように、本発明の多くの実施形態は、ＡＤＣＣ活性を完全に除去する。

本明細書で使用される「ＡＤＣＰ」又は抗体依存性細胞媒介性食作用とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介反応を意味する。

本明細書において「抗原結合ドメイン」又は「ＡＢＤ」とは、ポリペプチド配列の一部として存在する場合、本明細書で論じる標的抗原に特異的に結合する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを意味する。したがって、「ＰＤ－１抗原結合ドメイン」は、本明細書中に概説されるようにヒトＰＤ－１抗原に結合する。当技術分野で知られているように、これらのＣＤＲは、一般に、可変重ＣＤＲの第１のセット（ｖｈＣＤＲ又はＶ_ＨＣＤＲ）及び可変軽ＣＤＲの第２のセット（ｖｌＣＤＲ又はＶ_ＬＣＤＲ）として存在し、それぞれ、３つのＣＤＲ（重鎖の場合はｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、及び、軽鎖の場合はｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３）を含む。ＣＤＲは、可変重ドメイン及び可変軽ドメインにそれぞれ存在し、一緒になってＦｖ領域を形成する。したがって、いくつかの場合において、抗原結合ドメインの６つのＣＤＲは、可変重鎖及び可変軽鎖によってもたらされる。「Ｆａｂ」フォーマットでは、６つのＣＤＲのセットは、２つの異なるポリペプチド配列、可変重ドメイン（ｖｈ又はＶ_Ｈ；ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む）及び可変軽ドメイン（ｖｌ又はＶ_Ｌ；ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む）によってもたらされ、ｖｈドメインのＣ末端は重鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端に結合し、ｖｌドメインのＣ末端は定常軽ドメインのＮ末端に結合している（したがって、軽鎖を形成している）。ｓｃＦｖフォーマットでは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、一般に本明細書に概説されるリンカーの使用によって、単一のポリペプチド配列に共有結合しており、（Ｎ末端から始まって）ｖｈ－リンカー－ｖｌ又はｖｌ－リンカー－ｖｈのいずれかであり得る。

超可変領域は一般に、軽鎖可変領域中のアミノ酸残基約２４～３４（ＬＣＤＲ１；「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）並びに重鎖可変領域中の約３１～３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は重鎖を示す）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）由来のアミノ酸残基；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）並びに／又は超可変ループを形成するそのアミノ酸残基（例えば軽鎖可変領域中の残基２６－３２（ＬＣＤＲ１）、５０－５２（ＬＣＤＲ２）及び９１－９６（ＬＣＤＲ３）、並びに重鎖可変領域中の２６－３２（ＨＣＤＲ１）、５３－５５（ＨＣＤＲ２）及び９６－１０１（ＨＣＤＲ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７）を包含する。本発明の特異的ＣＤＲを以下に記載する。

当業者には理解されるように、ＣＤＲの正確なナンバリング及び配置は、異なるナンバリングシステム間で異なり得る。しかしながら、可変重及び／又は可変軽配列の開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことを理解されたい。したがって、各可変重領域の開示はｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示はｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３）の開示である。

ＣＤＲナンバリングの有用な比較は以下の通りである（Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３）を参照：

本明細書を通して、可変ドメインの残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１～１０７及び重鎖可変領域の残基１～１１３）を指す場合、Ｋａｂａｔナンバリングシステムが一般に使用され、Ｆｃ領域についてはＥＵナンバリングシステムが使用される（例えば、前出のＫａｂａｔら（１９９１））。

本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全なＣＤＲセット」は、３つの可変軽ＣＤＲ及び３つの可変重ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれ、より大きな可変軽又は可変重ドメインの一部であり得る。さらに、本明細書でより十分に概説されるように、可変重ドメイン及び可変軽ドメインは、重鎖及び軽鎖が使用される場合（例えばＦａｂが使用される場合）は別々のポリペプチド鎖上に、又は、ｓｃＦｖ配列の場合は単一のポリペプチド鎖上にあり得る。

ＣＤＲは、抗体の抗原結合部位、より具体的にはエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域中の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の集団であり、通常、特定の構造特性及び特定の電荷特性を有する。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。

エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば特異的抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基を含み得る。換言すれば、アミノ酸残基は特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。

エピトープは、立体構造又は直鎖のいずれかであり得る。立体構造エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。立体構造エピトープ及び非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で、立体構造エピトープに対する結合が失われるが、非立体構造エピトープに対する結合は失われないことから区別され得る。

エピトープは、典型的には、固有の空間的立体構造内に、少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個又は８～１０個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力を示す簡単なイムノアッセイ（例えば「ビニング」）で検証することができる。以下に概説されるように、本発明は、本明細書中に列挙される抗原結合ドメイン及び抗体だけでなく、列挙される抗原結合ドメインによって結合されるエピトープと結合について競合するものも含む（又はＮＣ［ＰＤ－１］Ｆｖの場合、本発明の抗ＰＤ－１ ＣＤＲは、列挙された抗体と同じエピトープへの結合について競合しない）。

成分が本発明において使用される抗体に関して、各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。Ｋａｂａｔらは、重鎖及び軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存度に基づいて、彼らは個々の一次配列をＣＤＲ及びフレームワークに分類し、そのリストを作成した（参照により全体が組み込まれる、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１－３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。）。

免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖にいくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書において「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、明確な三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において興味深いのは、定常重（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体に関連して、ＩｇＧアイソタイプはそれぞれ３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧの文脈における「ＣＨ」ドメインは以下の通りである。「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスによる１１８～２２０位を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスによる２３７～３４０位を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスによる３４１～４４７位を指す。本明細書に示され、以下に記載されるように、ｐＩバリアントは、以下に記載されるＣＨ領域及びヒンジ領域の１つ又は複数に存在し得る。

重鎖の別のタイプのＩｇドメインはヒンジ領域である。本明細書において「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」又は「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１及び第２の定常ドメインの間にアミノ酸を含む可撓性ポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ２１５位で終了し、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ２３１位で開始する。したがって、ＩｇＧについて、抗体ヒンジは、本明細書では、２１６位（ＩｇＧ１のＥ２１６）～２３０位（ＩｇＧ１のＰ２３０）を含むと定義され、ナンバリングはＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、例えばＦｃ領域の文脈において、下部ヒンジが含まれ、「下部ヒンジ」の開始部は一般に２２６位を指す。本明細書で述べるように、ｐＩバリアントはヒンジ領域にも作製することができる。

当業者には理解されるように、重定常領域ドメインの正確なナンバリング及び配置は、異なるナンバリングシステム間で異なり得る。ＥＵ及びＫａｂａｔによる重定常領域ナンバリングの有用な比較は以下の通りである。参照により全体が組み込まれるＥｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５ 及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａを参照。

軽鎖は一般に、２つのドメイン、可変軽ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含み、可変重ドメインと共にＦｖ領域を形成する）、及び定常軽鎖領域（ＣＬ又はＣκと呼ばれることが多い）を含む。

本明細書に概説されるさらなる置換のための別の関心領域は、Ｆｃ領域である。

したがって、本発明は、異なるタンパク質ドメインを提供する。本明細書に記載され、当技術分野で知られているように、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、重鎖及び軽鎖内に異なるドメインを含み、これらは重複してもよい。これらのドメインには、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－Ｆｃドメイン、又は、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、軽定常ドメイン、Ｆａｂドメイン及びｓｃＦｖドメインが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１）を除く抗体の定常領域、及び場合によってはヒンジの一部を含むポリペプチドを意味する。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３（Ｃγ２及びＣγ３）並びにＣＨ１（Ｃγ１）とＣＨ２（Ｃγ２）との間のヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むと定義され、ナンバリングはＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う。したがって、ＩｇＧの文脈における「ＣＨ」ドメインは以下の通りである。「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスによる１１８～２１５位を指す。「ヒンジ」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスによる２１６～２３０位を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスによる２３１～３４０位を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスによる３４１～４４７位を指す。したがって、「Ｆｃドメイン」には、－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、及び任意に、ヒンジドメイン（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）が含まれる。

したがって、「Ｆｃドメイン」には、－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、及び任意に、ヒンジドメインが含まれ、多くの場合、これはドメインリンカーとして働く。本明細書の実施形態では、ｓｃＦｖがＦｃドメインに結合している場合、Ｆｃドメインのヒンジの全部又は一部に結合しているのはｓｃＦｖ構築物のＣ末端である。例えば、それは一般に、ヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳ（配列番号９）に結合される。同様に、ＩＬ－１５成分（ＩＬ－１５複合体、ＩＬ－１５ドメイン又はＩＬ－１５ Ｒαドメイン）がＦｃドメインに結合している場合、それは一般に、（ドメインリンカーとして）Ｆｃドメインのヒンジの全部又は一部に同様に結合している。例えば、それは一般に、ヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳ（配列番号９）に結合される。

本発明は、一般にＩｇＧクラスに基づくＦｃドメインに関し、ＩｇＧクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４は、ＩｇＧ３よりも頻繁に使用される。ＩｇＧ１は、３５６（Ｄ又はＥ）及び３５８（Ｌ又はＭ）の多形を有する異なるアロタイプを有することに留意すべきである。本明細書に示される配列は、３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプを使用するが、他のアロタイプも本明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプの代わりに３５６Ｄ／３５８Ｌを有することができる。

さらに、本明細書の配列の多くは、２２０位にセリンで置換された少なくとも一つのシステインを有する。一般に、これは、本明細書中に示される配列のほとんどについて「ｓｃＦｖモノマー」又は「ＩＬ－１５複合体」側であるが、ジスルフィド形成を減少させるために「Ｆａｂモノマー」側又は両方であってもよい。本明細書の配列内に具体的に含まれるのは、これらの置換されたシステイン（Ｃ２２０Ｓ）の一方又は両方である。

本明細書において「重鎖」又は「重鎖ドメイン」とは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（ＣＨ２－ＣＨ３はＦｃドメインを含む）を意味する。重鎖は、可変重ドメインと、ＣＨ２－ＣＨ３を含むＣＨ１（任意）－ヒンジ－Ｆｃドメインを含む定常ドメインとを含む。軽鎖は、可変軽鎖及び軽定常ドメイン（ＶＬ－ＣＬ）を含む。

本明細書において「改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入及び／若しくは欠失、又はタンパク質に化学的に連結された部分に対する変化を意味する。例えば、改変は、タンパク質に結合した変化した炭水化物又はＰＥＧ構造であり得る。本明細書において「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を意味する。明確にするために、特に明記しない限り、アミノ酸改変は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡでのコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものである。

本明細書において「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置に天然には存在せず、生物内又は任意の生物内に天然には存在しないアミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｅ２７２Ｙ又は２７２Ｙは、２７２位のグルタミン酸がチロシンで置換されているバリアントのポリペプチド（この場合はＦｃバリアント）を指す。明確にするために、核酸コード配列を変更するが、出発アミノ酸を変更しないように操作されたタンパク質（例えば、宿主生物の発現レベルを増加させるためにＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（依然としてアルギニンをコードする）に交換する）は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子が作成されたにもかかわらず、タンパク質が、出発となる特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。

本明細書で使用される「アミノ酸挿入」又は「挿入」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、－２３３Ｅ又は２３３Ｅは、２３３位の後かつ２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、－２３３ＡＤＥ又はＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後かつ２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。

本明細書で使用される「アミノ酸欠失」又は「欠失」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸残基又は配列の除去を意味する。例えば、Ｅ２３３－、Ｅ２３３＃、Ｅ２３３（）、Ｅ２３３＿又はＥ２３３ｄｅｌは、２３３位におけるグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３－又はＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。

本明細書で使用される「バリアントタンパク質」又は「タンパク質バリアント」又は「バリアント」とは、少なくとも１つのアミノ酸改変によって親タンパク質のものとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質バリアントは、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、又はそれをコードするアミノ配列を指し得る。好ましくは、タンパク質バリアントは、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変、例えば、親タンパク質と比較して約１～約７０個のアミノ酸改変、好ましくは約１～約５個のアミノ酸改変を有する。以下に記載されるように、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４由来のＦｃ領域などのヒト野生型配列である。本明細書におけるタンパク質バリアント配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５～９８～９９％の同一性を有する。バリアントタンパク質は、バリアントタンパク質自体、タンパク質バリアントを含む組成物、又はそれをコードするＤＮＡ配列を指すことができる。

したがって、本明細書で使用される「Ｆｃバリアント」又は「バリアントＦｃ」とは、Ｆｃドメイン内にアミノ酸改変を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸改変に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓ又は４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位に置換セリンを有するＦｃバリアントであり、ナンバリングはＥＵインデックスに従う。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを有するＦｃバリアントを定義する。ＷＴアミノ酸の識別は未特定であってもよく、その場合、上記バリアントは４２８Ｌ／４３４Ｓと呼ばれる。置換が提供される順序は任意であり、すなわち、例えば、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、Ｎ４３４Ｓ／Ｍ４２８Ｌと同じＦｃバリアントであることなどに留意されたい。抗体に関連する本発明で論じられる全ての位置について、特に明記しない限り、アミノ酸位置ナンバリングはＥＵインデックスに従う。ＥＵインデックス又はＫａｂａｔ若しくはＥＵナンバリングスキームのようなＥＵインデックスは、ＥＵ抗体のナンバリングを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５、参照により全体が本明細書中に組み込まれる）。改変は、付加、欠失又は置換であり得る。置換は、天然に存在するアミノ酸、及び場合によっては合成アミノ酸を含み得る。例としては、米国特許第６，５８６，２０７号；国際公開第９８／４８０３２号；国際公開第０３／０７３２３８号；米国特許出願公開第２００４／０２１４９８８Ａ１号；国際公開第０５／３５７２７Ａ２号；国際公開第０５／７４５２４Ａ２号；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６－９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１：１１３５－１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０－１１０２４；及びＬ．Ｗａｎｇ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１－１０が挙げられ、全て参照により全体が組み込まれる。

本明細書で使用される場合、本明細書における「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。本明細書で使用される「残基」とは、タンパク質中の位置及びその関連するアミノ酸同一性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７又はＮ２９７とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１における２９７位の残基である。

本明細書で使用される「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単離されたこの領域、又は全長抗体、抗体フラグメント若しくはＦａｂ融合タンパク質との関連におけるこの領域を指し得る。

本明細書で使用される「Ｆｖ」又は「Ｆｖフラグメント」又は「Ｆｖ領域」とは、単一の抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、ＡＢＤを形成するポリペプチドを意味する。当業者には理解されるように、これらは一般に、２本の鎖から構成されるか、又は（一般に、本明細書で論じられるリンカーを用いて）組み合わされてｓｃＦｖを形成することができる。

本明細書において「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」とは、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖドメインを形成するために、一般に本明細書で論じられるｓｃＦｖリンカーを使用して可変軽ドメインに共有結合した可変重ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端へのいずれかの配向であり得る（ｖｈ－リンカー－ｖｌ又はｖｌ－リンカー－ｖｈ）。

本明細書で使用される「ＩｇＧサブクラス改変」又は「アイソタイプ改変」とは、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を異なる整列したＩｇＧアイソタイプの対応するアミノ酸に変換するアミノ酸改変を意味する。例えば、ＩｇＧ１はＥＵ２９６位にチロシンを含みＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むので、ＩｇＧ２のＦ２９６Ｙ置換はＩｇＧサブクラス改変と考えられる。

したがって、本明細書で使用される「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的及び抗原的特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのうちのいずれかを意味する。治療用抗体は、アイソタイプ及び／又はサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。

本明細書で使用される「可変領域」とは、それぞれκ、λ、及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶκ、Ｖλ、及び／又はＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ又は複数のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。本発明の可変重ドメイン及び可変軽ドメインに関して、各重及び軽抗体鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０個又はそれを超えるアミノ酸の可変領域を含み、当技術分野及び本明細書において一般に「Ｆｖドメイン」又は「Ｆｖ領域」と呼ばれる。可変領域には、重鎖及び軽鎖のＶドメインごとに３つのループが集まって抗原結合部位を形成している。各ループは、アミノ酸配列の変異が最も顕著な相補性決定領域（以下、「ＣＤＲ」という）と称される。「可変」とは、可変領域の特定のセグメントが、配列において抗体間で広範囲にわたって異なるという事実を指す。可変領域内の可変性は均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、各々９～１５アミノ酸長又はそれよりも長い「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性の短い領域によって分離されている、１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の伸長部からなる。

各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。したがって、可変重ドメインはＶＨＦＲ１－ＶＨＣＤＲ１－ＶＨＦＲ２－ＶＨＣＤＲ２－ＶＨＦＲ３－ＶＨＣＤＲ３－ＶＨＦＲ４を含み、可変軽ドメインはＶＬＦＲ１－ＶＬＣＤＲ１－ＶＬＦＲ２－ＶＬＣＤＲ２－ＶＬＦＲ３－ＶＬＣＤＲ３－ＶＬＦＲ４を含む。

本明細書で使用される「天然に存在しない改変」とは、アイソタイプではないアミノ酸改変を意味する。例えば、ＩｇＧのいずれも４３４位にセリンを含まないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４（又はそれらのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、天然に存在しない改変と考えられる。

本明細書で使用される「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」とは、ＤＮＡ及びＲＮＡによってコードされる２０個の天然アミノ酸のうちの１つを意味する。

本明細書で使用される「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体又はリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」又は「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ及びＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ－１及びＦｃγＲＩＩｂ－２を含む）、及びＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７－６５（全体が参照により組み込まれる））、並びに、任意の未発見のヒトＦｃγＲ又はＦｃγＲアイソフォーム又はアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「ＦｃＲｎ」又は「胎児性Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃＲｎ遺伝子によって少なくとも部分的にコードされるタンパク質を意味する。当技術分野で知られているように、機能性ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖及び軽鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ２ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。本明細書で特に明記しない限り、ＦｃＲｎ又はＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ２ミクログロブリンとの複合体を指す。様々なＦｃＲｎバリアントを使用して、ＦｃＲｎ受容体への結合を増加させ、場合によっては血清半減期を増加させることができる。一般に、特に明記しない限り、本発明のＦｃモノマーは、ＦｃＲｎ受容体への結合を保持する（以下に述べるように、ＦｃＲｎ受容体への結合を増加させるアミノ酸バリアントを含むことができる）。

本明細書で使用される「親ポリペプチド」とは、後にバリアントを生成するように改変される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、又は天然に存在するポリペプチドのバリアント若しくは操作バージョンであり得る。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。

本明細書において「重定常領域」とは、抗体のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３部分を意味する。

本明細書において「Ｆｃ融合タンパク質」又は「イムノアドヘシン」とは、本明細書に記載のＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５Ｒなどの異なるタンパク質に（任意に本明細書に記載のリンカー部分を介して）一般に連結されたＦｃ領域を含むタンパク質を意味する。いくつかの例では、２つのＦｃ融合タンパク質は、ホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質又はヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を形成することができ、後者が好ましい。場合により、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の一方のモノマーは、Ｆｃドメインのみを含み（例えば、空Ｆｃドメイン）、他方のモノマーは、バリアントＦｃドメイン及びタンパク質ドメインを含むＦｃ融合物、例えばＩＬ－１５複合体である。本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の一方のモノマーは、ＩＬ－１５複合体を含むＦｃ融合タンパク質であり、他方のモノマーは、（関連する軽鎖を有する）伝統的な重鎖である。

本明細書で使用される「位置」とは、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、連続的に、又は確立されたフォーマット、例えば抗体ナンバリングのためのＥＵインデックスに従ってナンバリングされ得る。

本明細書における本発明のヘテロ二量体抗体のモノマーの文脈における「鎖化（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」とは、「一致する」ＤＮＡの２本の鎖と同様に、ヘテロ二量体化バリアントが、ヘテロ二量体を形成するために「一致する」能力を維持するように各モノマーに組み込まれることを意味する。例えば、いくつかのｐＩバリアントがモノマーＡに操作される場合（例えば、ｐＩをより高くする）、同様に利用することができる「電荷対」である立体的バリアントはｐＩバリアントと干渉せず、例えば、ｐＩをより高くする電荷バリアントは、両方の機能性を維持するために同じ「鎖」又は「モノマー」に置かれる。同様に、以下でより十分に概説されるように、セットのペアになる「スキュー」バリアントについて、当業者は、スキューのｐＩも使用してｐＩ分離が最大化されるように、ペアの１つのセットを組み込む鎖又はモノマーを決定する際にｐＩを考慮するであろう。

本明細書で使用される「標的細胞」とは、標的抗原、この場合ＰＤ－１及び／又はＩＬ－１５受容体を発現する細胞を意味する。

本明細書において「野生型又はＷＴ」とは、対立遺伝子変異を含む、天然に見られるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する。

本発明の二重特異性ヘテロ二量体タンパク質は、一般に単離されているか又は組換え体である。「単離された」とは、本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために使用されるとき、抗体が発現された細胞又は細胞培養物から特定され、分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程により調製される。「単離されたタンパク質」は、異なる結合特異性を有する他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質を指す。「組換え体」は、タンパク質が外因性宿主細胞において組換え核酸技術を使用して生成されることを意味する。

タンパク質配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性最大パーセントが得られるように、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに、特定の（親）配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当技術分野における技術の範囲内にある種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成され得る。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたって最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。１つの特定のプログラムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６０２４４５２５号の段落０２７９～０２８０に概説されているＡＬＩＧＮ－２プログラムである。

本発明のアミノ酸配列（「発明配列」）と親アミノ酸配列との同一性の程度は、２つの配列のアラインメントにおける完全一致の数を「本発明の配列」の長さ又は親配列の長さのいずれか短い方で割ったものとして計算される。結果は、同一性パーセントで表される。

いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％同一である。いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は、少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、又は更には１００％同一である。

特定の抗原又はエピトープ（この場合、ヒトＰＤ－１）に、「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的」とは、非特異的相互作用と測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、ある分子の結合を、一般に結合活性を持たない類似の構造の分子である対照分子の結合との比較で決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似している対照分子との競合によって決定し得る。

特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、少なくとも約１０^－４Ｍ、少なくとも約１０^－５Ｍ、少なくとも約１０^－６Ｍ、少なくとも約１０^－７Ｍ、少なくとも約１０^－８Ｍ、少なくとも約１０^－９Ｍ、あるいは少なくとも約１０^－１０Ｍ、少なくとも約１０^－１１Ｍ、少なくとも約１０^－１２Ｍ、又はそれを超える抗原又はエピトープに対するＫＤを有するＡＢＤによって示すことができ、ＫＤは、特定のＡＢＤ－抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合するＡＢＤは、抗原又はエピトープと比較して、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍又はそれよりも大きいＫＤを有する。

また、特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照と比較して、エピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、又はそれよりも高い、抗原又はエピトープに対するＫＡ又はＫａを有する抗体によって示すことができ、ＫＡ又はＫａは、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は、一般に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）又はバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくアッセイ（例えば、Ｏｃｔｅｔ）を用いて測定される。
ＩＩＩ．序論

本発明のいくつかの態様は、チェックポイント阻害剤ＰＤ－１抗原に結合することができ、ＩＬ－１５複合体の存在に起因して共通のγ鎖（γｃ；ＣＤ１３２）及び／又はＩＬ－２受容体β鎖（ＩＬ－２Ｒβ；ＣＤ１２２）と複合体形成することができる標的化ヘテロ二量体融合タンパク質を提供する。一般に、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、３つの機能的成分：本明細書において一般に「ＩＬ－１５複合体」又は「ＩＬ－１５／Ｒα複合体」と呼ばれるＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）成分、融合タンパク質をＰＤ－１を発現する細胞に運ぶことによって「標的」部分として働く抗ＰＤ－１成分、及びＦｃ成分を有し、これらはそれぞれ異なる形態をとることができ、それぞれ他の成分と任意の構成で組み合わせることができる。

しかしながら、本発明の標的化ヘテロ二量体融合タンパク質の抗ＰＤ－１成分は、ニボルマブ又はペンブロリズマブなどの既知の抗ＰＤ－１抗体と結合について競合しない。すなわち、承認されたαＰＤ－１抗体（「ＮＣ［ＰＤ－１］」）と結合について競合しない抗ＰＤ－１（αＰＤ－１）抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含むことによって、本発明の融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体療法との効率的な併用療法を可能にする。すなわち、承認された処置と結合について競合しない抗ＰＤ－１ ＡＢＤ（「ＮＣ－αＰＤ－１ ＡＢＤ」）を含むことによって、非競合ＡＢＤを使用して融合タンパク質を腫瘍に標的化することができるが、追加の抗ＰＤ－１抗体による治療的処置を依然として可能にする（両方ともＰＤ－１に非競合的に結合することができるため）。さらに、いくつかの実施形態では、ＮＣ－αＰＤ－１ ＡＢＤは、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１の相互作用を完全に遮断すること（ｍＡｂ Ａバリアントに基づく実施形態）、相互作用を部分的に遮断すること（ｍＡｂＣバリアント）、又は、相互作用を全く遮断しないこと（ｍＡｂＢバリアント）もできる。

当業者によって理解され、本明細書に概説されるように、異なる標的化ヘテロ二量体融合タンパク質、非競合構築物「ＮＣ－αＰＤ－１ Ｘ ＩＬ－１５／Ｒα」のいくつかの異なるフォーマットを図２８に示す。

さらに、本発明のいくつかの態様は、図１３に示されるように、ヒトＰＤ－１に対する抗原結合ドメインを含有しない「非標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質」に対する本実施形態の比較に依存する。

さらに、本発明の非標的又は標的ヘテロ二量体融合タンパク質のいずれかを、抗ＰＤ－１、抗ＴＩＭ－３、抗ＬＡＧ－３、抗ＴＩＧＩＴなどを含むチェックポイント受容体に対する他の抗体と組み合わせることができる。

したがって、本発明は、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質を生成するためにいくつかの異なる方法で組み立てることができるいくつかの異なる機能的成分を提供する。上記のように、融合タンパク質は、ＩＬ－１５ドメイン及びＩＬ－１５受容体成分を含むＩＬ－１５複合体を含む。

いくつかの態様は、低下した又は最小の免疫抑制活性を有する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導することができるＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質を提供する。一態様では、そのようなヘテロ二量体融合タンパク質は、エフェクターメモリＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）増殖を促進する。一実施形態では、ヘテロ二量体融合タンパク質は、Ｔ_ＥＭに対するＴｒｅｇの比（Ｔｒｅｇ／Ｔ_ＥＭ）を増加させる。場合によっては、本明細書に概説されるＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のいずれか１つによる処置は、Ｔｒｅｇを抑制性Ｔｒｅｇ細胞型から非抑制性活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞に変換する。一実施形態では、ＦＯＸＰ３^ｈｉＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４^＋であるエフェクターＴｒｅｇは、分化して、ＦＯＸＰ３^ｌｏＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４^＋である活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞になる。いくつかの実施形態では、活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞はＣＣＲ４発現が低下している。

また、Ｔ細胞増殖のＴＧＦβ抑制を逆転させるＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質も本明細書で提供される。腫瘍環境では、ＴＧＦβは、悪性細胞及びＴｒｅｇを含む免疫細胞によって発現される。ＴＧＦβは、Ｔ細胞の増殖を抑制する機能も有し、抗腫瘍免疫応答を抑制する。本発明のＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質による処置は、Ｔ細胞の増殖のＴＧＦβ抑制を防止する。１つの実施形態において、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の投与は、腫瘍環境においてＴ細胞に対するＴＧＦβ活性に対抗し、したがって、Ｔ細胞増殖及び抗腫瘍免疫応答を促進する。

本発明のいくつかの態様は、異なる向きのＩＬ－１５及びＩＬ－１５受容体α（ＩＬ－１５ Ｒα）タンパク質ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に関する。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインに由来することができ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは本発明において特定の用途を見出す。

したがって、本発明のいくつかの態様は、異なる抗体ドメインを提供する。本明細書に記載され、当技術分野で知られているように、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、異なるドメインを含み、これらは重複してもよい。これらのドメインには、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、及び重定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－Ｆｃドメイン、又は、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）が含まれるが、これらに限定されない。

Ｆｃドメインタンパク質の本明細書に概説されるいくつかの構築物及び配列では、ＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒαタンパク質フラグメントのＣ末端はドメインリンカーのＮ末端に結合しており、そのＣ末端は定常ＦｃドメインのＮ末端に結合しているが（Ｎ－ＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒαタンパク質フラグメント－リンカー－Ｆｃドメイン－Ｃ）、これは切り替えることができる（Ｎ－Ｆｃドメイン－リンカー－ＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒαタンパク質フラグメント－Ｃ）。本明細書で概説される他の構築物及び配列では、第１のタンパク質フラグメントのＣ末端は、任意にドメインリンカーを介して、第２のタンパク質フラグメントのＮ末端に結合し、第２のタンパク質フラグメントのＣ末端は、任意にドメインリンカーを介して、定常ＦｃドメインのＮ末端に結合する。本明細書に概説されるさらに他の構築物及び配列では、第１のタンパク質フラグメント又は第２のタンパク質フラグメントに結合していない定常Ｆｃドメインが提供される。ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書中に記載される例示的な単量体Ｆｃドメインタンパク質の２つ以上を含有し得る。さらに別の構築物では、第１のタンパク質フラグメントのＮ末端は、任意にドメインリンカーを介して、第２のタンパク質フラグメントのＣ末端に結合し、第２のタンパク質フラグメントのＮ末端は、任意にドメインリンカーを介して、定常ＦｃドメインのＣ末端に結合する。
Ａ．ＩＬ－１５複合体

図に示されるように、ＩＬ－１５複合体はいくつかの形態をとることができる。上記のように、ＩＬ－１５タンパク質単独では、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質と複合体化した場合よりも安定性が低い。当技術分野で知られているように、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、ＩＬ－１５結合活性を保持する受容体の最短領域である「ｓｕｓｈｉドメイン」を含有する。したがって、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質全体を含むヘテロ二量体融合タンパク質を作製することができるが、本明細書における好ましい実施形態は、単にｓｕｓｈｉドメインを使用する複合体を含み、その配列が図に示されている。

したがって、ＩＬ－１５複合体は一般に、ＩＬ－１５タンパク質及びＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインを含む（全長配列が使用されるという別段の注記がない限り、「ＩＬ－１５Ｒα」、「ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）」及び「ｓｕｓｈｉ」は、全体を通して交換可能に使用される）。一緒に複合体化される場合、命名法は、「ＩＬ－１５／Ｒα」として「スラッシュ」、「／」で示され、ＩＬ－１５ドメイン及びＩＬ－１５Ｒαドメインが存在することを意味する。
１．ＩＬ－１５ドメイン

当業者によって理解されるように、ＩＬ－１５ドメインは、野生型ヒト配列であり得るか、又は、バリアント、特に以下に記載されるような効力バリアントを含むように操作され得る。

いくつかの実施形態では、ヒトＩＬ－１５タンパク質は、前駆体配列であるＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００５７６．１又は配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。場合により、ヒトＩＬ－１５のコード配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０００５８５に示される。本明細書に概説されるＦｃ融合ヘテロ二量体タンパク質の例示的なＩＬ－１５タンパク質は、配列番号１のアミノ酸４９～１６２に対応する配列番号２（成熟ＩＬ－１５）のアミノ酸配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２と少なくとも９０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは、アミノ酸置換を含むように操作されている。

したがって、いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列のバリアント、並びにＣ４２Ｓ、Ｌ４５Ｃ、Ｑ４８Ｃ、Ｖ４９Ｃ、Ｌ５２Ｃ、Ｅ５３Ｃ、Ｅ８７Ｃ及びＥ８９Ｃからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸置換である。ヘテロ二量体融合タンパク質のＩＬ－１５タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個のアミノ酸置換を有し得る。
ａ．ＩＬ－１５効力バリアント

さらに、いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ヒトタンパク質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２８１０７に一般的に記載されているように、低下した効力を付与するように操作される。すなわち、本明細書中に記載されるように、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質におけるＩＬ－１５の効力の低下（任意に、本明細書中に記載されるＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳなどのＸｔｅｎｄ－Ｆｃ置換の有無にかかわらず）は、そのようなタンパク質が投与される対象における薬力学及び薬物動態の両方を高めることができる。同様に、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２８１０７の実施例７に示されるように、効力の低下したＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃバリアント（ＸＥＮＰ２２８２１など）は、リンパ球数を、本明細書に記載される野生型ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質（ＸＥＮＰ２０８１８など）よりも長い期間にわたって増大させることができる。注目すべきことに、ＸＥＮＰ２２８２１のＸｔｅｎｄ類似体であるＸＥＮＰ２３３４３は、ＸＥＮＰ２２８２１を超えてリンパ球増殖の期間をさらに延長した。さらに、ＩＬ－１５の効力の低下は、治療指数を改善することができる（すなわち、より少ない毒性でより高い投薬を可能にする）。

ＸｍＡｂ２４３０６などの「非標的分子」についてのＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２８１０７の実施例８に示されるように、本明細書においてＮＣ－αＰＤ－１ Ｘ ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質に組み込まれるものなどのＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｔｒｅｇ抑制によって誘導されるエフェクターＴ細胞増殖を克服することができる。

同様に、以下の実施例４に示されるように、ＮＣ－αＰＤ－１ Ｘ ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質は、ある範囲の用量レベルにわたって白血球増殖を促進し、異種ＧＶＨＤを悪化させ得る。注目すべきことに、ＮＣ－αＰＤ－１ Ｘ ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質と抗ＰＤ－１抗体との併用療法は、特に低用量でシナジー（例えば、相乗効果）を示した。

したがって、本発明は、Ｎ１Ｄ；Ｎ４Ｄ；Ｄ８Ｎ；Ｄ３０Ｎ；Ｄ６１Ｎ；Ｅ６４Ｑ；Ｎ６５Ｄ；Ｑ１０８Ｅ；Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ；Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ４Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ；Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ；Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ；Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ；Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｅ６４Ｑ；Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅの群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアントＩＬ－１５タンパク質を含むがこれらに限定されない、効力の低下及び薬物動態学の増加をもたらすいくつかの適切なＩＬ－１５アミノ酸バリアントを提供する。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５融合タンパク質は、配列番号３１９のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－１５：ＩＬ－２β及びＩＬ－１５：共通γ鎖の界面におけるアイソステリック置換であり得る。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のヒト成熟ＩＬ－１５タンパク質などのヒトＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。いくつかの場合、ヒト成熟ＩＬ－１５タンパク質などのヒトＩＬ－１５タンパク質は、アミノ酸置換を有さない。

いくつかの実施形態では、ヒト成熟ＩＬ－１５バリアントタンパク質は、１つ又は複数のアミノ酸突然変異（例えば、置換、挿入及び／又は欠失）を有する。いくつかの例では、突然変異は、ヒトＩＬ－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）タンパク質とジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を導入する。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸バリアントＤ３０Ｎを有するヒトＩＬ－１５バリアントを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及びＤ３０Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及び少なくともＤ３０Ｎ置換を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸置換Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄを有するヒトＩＬ－１５バリアントを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ置換を有する配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及び少なくともＮ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ置換を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸バリアントＮ１Ｄを有するヒトＩＬ－１５バリアントを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及びＮ１Ｄ置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及び少なくともＮ１Ｄ置換を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸バリアントＮ４Ｄを有するヒトＩＬ－１５バリアントを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及びＮ４Ｄ置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及び少なくともＮ４Ｄ置換を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸バリアントＥ６４Ｑを有するヒトＩＬ－１５バリアントを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及びＥ６４Ｑ置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及び少なくともＥ６４Ｑ置換を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸バリアントＮ６５Ｄを有するヒトＩＬ－１５バリアントを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及びＮ６５Ｄ置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及び少なくともＮ６５Ｄ置換を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸置換Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎを有するヒトＩＬ－１５バリアントを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及びＮ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及び少なくともＮ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ置換を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸置換Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎを有するヒトＩＬ－１５バリアントを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及びＮ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及び少なくともＮ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ置換を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑを有するヒトＩＬ－１５バリアントを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及び少なくともＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ置換を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを有するヒトＩＬ－１５バリアントを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ置換を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及び少なくともＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ置換を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを有するヒトＩＬ－１５バリアントを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ置換を有する配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列及び少なくともＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ置換を含む。
ｂ．ＩＬ－１５グリコシル化バリアント

さらに、ＩＬ－１５ドメインは、単独で又は効力バリアントと組み合わせて、グリコシル化及び／又はグリコシル化の不均一性を低減するためのアミノ酸バリアントを有することができる。適切なグリコシル化バリアントには、単独又は互いに組み合わせた使用について、配列番号２と比較してＮ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａが含まれるが、これらに限定されない。本発明の多くの実施形態において特定の用途が見出されるグリコシル化バリアントのセットは、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａである。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５融合タンパク質は、配列番号３１９のアミノ酸配列を含む。
ｃ．効力及びグリコシル化バリアントの組合せ

多くの実施形態において、効力バリアントとグリコシル化バリアントとの組合せが、ｓｕｓｈｉドメイン（一般に、配列番号２０のトランケート型野生型配列）とのＩＬ－１５複合体の一部を形成するＩＬ－１５ドメインにおいて使用される。

したがって、いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは効力バリアントＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びグリコシル化バリアントＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは効力バリアントＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びグリコシル化バリアントＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは効力バリアントＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びグリコシル化バリアントＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは効力バリアントＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びグリコシル化バリアントＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑを含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５融合タンパク質は、配列番号３１９のアミノ酸配列を含む。
２．ＩＬ－１５／Ｒαドメイン

ＩＬ－１５ドメイン（任意に、上に概説したようなアミノ酸バリアントを含む）に加えて、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、「ｓｕｓｈｉ」ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、ヒトＩＬ－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００２１８０．１又は配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。場合により、ヒトＩＬ－１５Ｒαのコード配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００２１８９．３に示される。本明細書に概説されるＦｃ融合ヘテロ二量体タンパク質の例示的なＩＬ－１５ Ｒαタンパク質は、配列番号３（例えば、配列番号３のアミノ酸３１～９５）のｓｕｓｈｉドメイン、又は換言すれば、配列番号２０のアミノ酸配列を含むことができ、又はそれからなることができる。すなわち、特定の実施形態は、受容体の細胞外ドメインのトランケート型を利用する。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、Ｄ９６、Ｐ９７、Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７、Ｄ９６／Ｃ９７、Ｄ９６／Ｐ９７／Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、及びＤ９６／Ｃ９７／Ａ９８からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸挿入を有する配列番号２０のアミノ酸配列を有し、ここで、そのアミノ酸位置は、全長ヒトＩＬ－１５Ｒαタンパク質又は配列番号３に対するものである。例えば、Ｄ（例えば、Ａｓｐ）、Ｐ（例えば、Ｐｒｏ）、Ａ（例えば、Ａｌａ）、ＤＰ（例えば、Ａｓｐ－Ｐｒｏ）、ＤＣ（例えば、Ａｓｐ－Ｃｙｓ）、ＤＰＡ（例えば、Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ａｌａ）、ＤＰＣ（例えば、Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ）、又はＤＣＡ（例えば、Ａｓｐ－Ｃｙｓ－Ａｌａ）などのアミノ酸を、配列番号２０のＩＬ－１５Ｒαタンパク質のＣ末端に付加することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列と、Ｋ３４Ｃ、Ａ３７Ｃ、Ｇ３８Ｃ、Ｓ４０Ｃ及びＬ４２Ｃからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸置換とを有し、そのアミノ酸位置は配列番号２０に対するものである。配列番号２０のＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上のアミノ酸突然変異（例えば、置換、挿入及び／又は欠失）を有し得る。アミノ酸改変がｓｕｓｈｉドメインに対して行われる場合、バリアントｓｕｓｈｉドメインは、生物学的活性、例えばＩＬ－１５への結合を保持しなければならない。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と、Ｄ９６、Ｐ９７、Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７、Ｄ９６／Ｃ９７、Ｄ９６／Ｐ９７／Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、及びＤ９６／Ｃ９７／Ａ９８からなる群から選択されるアミノ酸挿入とを有し、ここで、そのアミノ酸位置は、全長ヒトＩＬ－１５Ｒαタンパク質又は配列番号３に対するものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と、Ｋ３４Ｃ、Ａ３７Ｃ、Ｇ３８Ｃ、Ｓ４０Ｃ及びＬ４２Ｃからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸置換とを有し、そのアミノ酸位置は配列番号４に対するものである。アミノ酸改変がＩＬ－１５Ｒαタンパク質に対して行われる場合、バリアントＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、生物学的活性、例えばＩＬ－１５への結合を保持しなければならない。
３．異なるフォーマットのＩＬ－１５複合体

したがって、ＩＬ－１５複合体は一般に、ＩＬ－１５タンパク質及びＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインを含む。一緒に複合体化される場合、命名法は、「ＩＬ－１５／Ｒα」として「スラッシュ」、「／」で示され、ＩＬ－１５ドメイン及びＩＬ－１５Ｒαドメインが存在することを意味する。

図２８に示されるように、ＩＬ－１５／Ｒα複合体は、２つの異なるフォーマット；非共有結合性会合又は共有結合性複合体のいずれかであり得る。図２８Ｂ、図２８Ｄ、図２８Ｆ及び図２８Ｇに示されるように、ＩＬ－１５タンパク質及びＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）は共有結合しておらず、むしろ、規則的なリガンド－リガンド相互作用によって自己集合する。本明細書においてより十分に記載されるように、それは、（一般に任意のドメインリンカーを使用して）Ｆｃドメインに共有結合されたＩＬ－１５ドメイン又はｓｕｓｈｉドメインのいずれかであり得る。

あるいは、ＩＬ－１５／Ｒα複合体は、図２８Ａ、図２８Ｃ、図２８Ｅ及び図２８Ｈに一般的に示されるようなドメインリンカーを用いた共有結合である。これらの場合のそれぞれにおいて、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５ＲαのＮ末端からＣ末端への配向を切り替えることができる。すなわち、図２８Ａにおいて、本発明は、ＩＬ－１５ドメインがＮ末端にあり、ＩＬ－１５Ｒαドメインがリンカーを使用してＦｃドメインに結合している場合も含む。同様に、図２８Ｃにおいて、本発明はまた、ＩＬ－１５ドメインがＮ末端にあり、ＩＬ－１５Ｒαドメインがリンカーを使用してＦｃドメインに結合している場合を含む。図２８Ｅにおいて、本発明はまた、ＩＬ－１５ドメインがＦｃドメインのＣ末端にあり（ドメインリンカーを使用して連結される）、ＩＬ－１５Ｒαドメインがリンカーを使用してＩＬ－１５ドメインに結合している場合を含む。最後に、図２８Ｈは、ＩＬ－１５ドメインがＩＬ－１５Ｒαドメインに対してＮ末端である場合も含み得る。
Ｂ．非競合的抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン

本発明の抗ＰＤ－１成分（例えば、抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ））は、一般に、ヒトＰＤ－１（その配列が図２に示される）に結合することができるがペンブロルジマブ及びニボリマブなどの市販の抗ＰＤ－１抗体と競合しないＦｖドメインを形成する可変重ドメイン及び可変軽ドメイン内に含まれる６つのＣＤＲのセットである。これは、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質の腫瘍への優れた標的化を可能にし、したがってＩＬ－１５／Ｒα複合体の局所作用を可能にするが、同じＰＤ－１エピトープについて競合することなく、有効な抗ＰＤ－１抗体との併用処置も可能にする。

本発明のＮＣ－αＰＤ－１抗原結合ドメインは、図２８Ａ及び図２８Ｂに示されるものなどのｓｃＦｖドメインとして、又は図２８Ｃ及び図２８Ｄ（ＰＤ－１の一価結合）並びに図２８Ｅ、図２８Ｆ、図２８Ｇ及び図２８Ｈ（ＰＤ－１の二価結合）に示されるものなどの２つの異なるポリペプチド上に存在するＦａｂドメインとしての２つの一般的なフォーマットをとることができ、これらは以下により完全に記載される。

出発ｍＡｂＣ Ｈ１＿Ｌ１配列と比較して、いくつかの有用なアミノ酸バリアントが同定されている。
１．酸化バリアント

本発明の態様は、特に有用な非競合的抗ＰＤ－１ Ｆｖ、「［ＮＣ］ｍＡｂ Ｃ」がＶＨ－ＣＤＲ３（ＸｅｎｃｏｒナンバリングでのＷ１１２；ＫａｂａｔナンバリングでのＷ１００）中にトリプトファンを含み、酸化（データは示さず）及びその後のＰＤ－１結合の喪失を起こしやすいという事実に関する。すなわち、図１５１に示すように、この位置での潜在的な酸化を排除するアミノ酸置換は、ヒトＰＤ－１に対するＡＢＤの結合親和性を低下させる。したがって、上記のように結合親和性の増加を与えるさらなるバリアントをＷ１００Ｆバリアントと組み合わせて、下記のように、この結合親和性が回復され得るかどうかを調べた。
２．親和性バリアント

図６５Ａ～図６５Ｉに示されるように、可変重ドメイン中には、配列番号５と比較して、限定されないがＦ３４Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ及びＬ９８Ｒ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含む、Ｗ１００Ｆ酸化バリアントの親和性を増加させるために使用され得るいくつかの適切なバリアントが、それぞれ単独又は組合せで存在する。

さらに、可変軽ドメイン中には、配列番号１６８と比較して、単独で又は組み合わせて使用することができるＮ２７ｄＨ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含むがこれらに限定されない、いくつかの適切なバリアントがある。
３．酸化及び親和性バリアントの組合せ

したがって、本発明は、適切な親和性結合を回復するための１つ以上の親和性バリアントと組み合わせて、ＶＨドメイン中に酸化バリアントＷ１００Ｆを含むバリアントを有するＮＣ－ｍＡｂＣ ＡＢＤを提供する。

いくつかの実施形態では、ＶＨアミノ酸置換（親ＶＨドメイン（配列番号５）と比較）は、Ｆ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｆ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｙ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｅ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｖ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｄ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｈ／Ｗ１００Ｆ）；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｗ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｔ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｒ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｒ９７Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｔ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｌ９８Ｑ／Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｆ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＮ；Ｖ９９Ｉ／Ｗ１００Ｆ／Ｐ１００ｂＳ；Ｇ９６Ｈ／Ｌ９８Ｖ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｑ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｇ９６Ｖ／Ｒ９７Ａ／Ｖ９９Ａ／Ｗ１００Ｆ／Ｐ１００ｂＳ；Ｒ９７Ｑ／Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｒ９７Ｋ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｌ９８Ｓ／ＳＷ１００Ｆ；Ｌ９８Ｆ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｗ／Ｌ９８Ｈ／Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｒ９７Ｔ／Ｌ９８Ｋ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｓ／Ｖ９９Ｉ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｌ／Ｖ９９Ｉ／Ｗ１００Ｆ；Ｇ９６Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｓ／Ｌ９８Ｖ／Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｓ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｒ９７Ｓ／Ｖ９９Ｙ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｙ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｒ／Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｐ１００ｂＳ；Ｒ９７Ｈ／Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｈ１．２２４ Ｌ９８Ｒ／Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＮＣＰＤ－１ ｍＡｂＣ ＡＢＤのＶＬは、アミノ酸置換Ｎ２７ｄＨ（親ＶＬドメイン（配列番号１６８）と比較）を有し、ＶＨアミノ酸置換（親ＶＨドメイン（配列番号５）と比較）は、Ｆ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｆ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｙ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｅ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｖ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｄ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｈ／Ｗ１００Ｆ）；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｗ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｔ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｒ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｒ９７Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｔ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｌ９８Ｑ／Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｆ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＮ；Ｖ９９Ｉ／Ｗ１００Ｆ／Ｐ１００ｂＳ；Ｇ９６Ｈ／Ｌ９８Ｖ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｑ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｇ９６Ｖ／Ｒ９７Ａ／Ｖ９９Ａ／Ｗ１００Ｆ／Ｐ１００ｂＳ；Ｒ９７Ｑ／Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｒ９７Ｋ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｌ９８Ｓ／ＳＷ１００Ｆ；Ｌ９８Ｆ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｗ／Ｌ９８Ｈ／Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｒ９７Ｔ／Ｌ９８Ｋ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｓ／Ｖ９９Ｉ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｌ／Ｖ９９Ｉ／Ｗ１００Ｆ；Ｇ９６Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｓ／Ｌ９８Ｖ／Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｓ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｒ９７Ｓ／Ｖ９９Ｙ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｙ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｒ／Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｐ１００ｂＳ；Ｒ９７Ｈ／Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｈ１．２２４ Ｌ９８Ｒ／Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＮＣＰＤ－１ ｍＡｂＣ ＡＢＤのＶＬは、アミノ酸置換Ｎ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔ（親ＶＬドメイン（配列番号１６８）と比較）を有し、ＶＨアミノ酸置換（親ＶＨドメイン（配列番号５）と比較）は、Ｆ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｆ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｙ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｅ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｖ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｄ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｈ／Ｗ１００Ｆ）；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｗ／Ｗ１００Ｆ；Ｆ３２Ｌ／Ｓ５２ａＧ／Ｒ９７Ｔ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｒ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｒ９７Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｔ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｌ９８Ｑ／Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｆ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＮ；Ｖ９９Ｉ／Ｗ１００Ｆ／Ｐ１００ｂＳ；Ｇ９６Ｈ／Ｌ９８Ｖ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｑ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｇ９６Ｖ／Ｒ９７Ａ／Ｖ９９Ａ／Ｗ１００Ｆ／Ｐ１００ｂＳ；Ｒ９７Ｑ／Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｒ９７Ｋ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｌ９８Ｓ／ＳＷ１００Ｆ；Ｌ９８Ｆ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｗ／Ｌ９８Ｈ／Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＡ；Ｒ９７Ｔ／Ｌ９８Ｋ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｓ／Ｖ９９Ｉ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｌ／Ｖ９９Ｉ／Ｗ１００Ｆ；Ｇ９６Ａ／Ｗ１００Ｆ；Ｒ９７Ｓ／Ｌ９８Ｖ／Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｓ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ／Ｓ１００ａＴ；Ｒ９７Ｓ／Ｖ９９Ｙ／Ｗ１００Ｆ；Ｖ９９Ｙ／Ｗ１００Ｆ；Ｌ９８Ｒ／Ｗ１００Ｆ；Ｗ１００Ｆ／Ｐ１００ｂＳ；Ｒ９７Ｈ／Ｌ９８Ｑ／Ｗ１００Ｆ；Ｈ１．２２４ Ｌ９８Ｒ／Ｖ９９Ｌ／Ｗ１００Ｆからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＮＣ－ＰＤ－１ ｍＡｂＣ ＡＢＤは、Ｈ１．１７６、Ｈ１．１７７、Ｈ１．１７８、Ｈ１．１７９、Ｈ１．１８０、Ｈ１．１８１、Ｈ１．１８２、Ｈ１．１８３、Ｈ１．１８４、Ｈ１．１８５、Ｈ１．１８６、Ｈ１．１８７、Ｈ１．１８８、Ｈ１．１８９、Ｈ１．１９０、Ｈ１．１９１、Ｈ１．１９２、Ｈ１．１９３、Ｈ１．１９４、Ｈ１．１９５、Ｈ１．１９６、Ｈ１．１９７、Ｈ１．１９８、Ｈ１．１９９、Ｈ１．２００、Ｈ１．２０１、Ｈ１．２０２、Ｈ１．２０３、Ｈ１．２０４、Ｈ１．２０５、Ｈ１．２０６、Ｈ１．２０７、Ｈ１．２０８、Ｈ１．２０９、Ｈ１．２１０、Ｈ１．２１１、Ｈ１．２１２、Ｈ１．２１３、Ｈ１．２１４、Ｈ１．２１５、Ｈ１．２１６、Ｈ１．２１７、Ｈ１．２１８、Ｈ１．２１９、Ｈ１．２２０、Ｈ１．２２１、Ｈ１．２２２、Ｈ１．２２３、Ｈ１．２２４を含むがこれらに制限されない、図４３に示したものから選択されるＶＨを有する。

いくつかの実施形態では、ＮＣ－ＰＤ－１ ｍＡｂＣ ＡＢＤは、Ｌ１．１、Ｌ１．３、Ｌ１．４５、Ｌ１．１１７、Ｌ１．１２９、Ｌ１．１３５、Ｌ１．１３６及びＬ１．１４０を含むがこれらに限定されない、図４３に示したものから選択されるＶＬを有する。

いくつかの実施形態では、ＮＣ－ＰＤ－１ ｍＡｂＣ ＡＢＤは、Ｈ１．１７６＿Ｌ１．１４０配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＮＣ－ＰＤ－１ ｍＡｂＣ ＡＢＤは、Ｈ１．１７６＿Ｌ１．１配列を有する。

ＶＨドメインのいずれかは、本明細書において有用な特定の組合せで、ＶＬドメインのいずれかと組み合わせることができることに留意されたい。

本明細書に示されるように、「Ｆａｂ」フォーマットの抗ＰＤ－１ ＡＢＤの使用に加えて、抗ＰＤ－１ ＡＢＤは、代替的にｓｃＦｖの形態であってもよく、ｖｈドメイン及びｖｌドメインは、任意に荷電ｓｃＦｖリンカーであり得るｓｃＦｖリンカーを使用して連結される。当業者には理解されるように、ｓｃＦｖは、Ｎ－ｖｈ－ｓｃＦｖリンカー－ｖｌ－Ｃ又はＮ－ｖｌ－ｓｃＦｖリンカー－ｖｈ－ＣとしてＮ末端からＣ末端へ組み立てることができ、ｓｃＦｖドメインのＣ末端は一般にヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに連結されている。適切なＦｖ（ＣＤＲセット及び可変重／可変軽ドメインを含む）は、ｓｃＦｖフォーマット又はＦａｂフォーマットで使用することができ、これを図４３に示す。当業者にさらに理解されるように、ヒンジ（これはまた、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４由来の野生型ヒンジ又はそのバリアント、例えば親ＩｇＧ４ヒンジポリペプチドに対して２２８位に置換プロリンを有するＩｇＧ４ Ｓ２４１Ｐ若しくはＳ２２８Ｐヒンジバリアントであり得る（ナンバリングＳ２２８ＰはＥＵインデックスに従っており、Ｓ２４１ＰはＫａｂａｔナンバリングである））の全部又は一部を、ｓｃＦｖとＣＨ２－ＣＨ３ドメインとの間のドメインリンカーとして使用することができ、又は図に示すような異なるドメインリンカーを使用することができる。
Ｃ．Ｆｃドメイン

ＩＬ－１５複合体及び標的ＮＣ－αＰＤ－１ Ｆｖドメインに加えて、本発明は、成分としてヘテロ二量体Ｆｃドメインをさらに提供する。図２８に示されるように、これらのヘテロ二量体Ｆｃドメインは、一般には２つのポリペプチド鎖（例えば、図２８Ａでは、一方のモノマーがＩＬ－１５／Ｒα複合体を含み、他方のモノマーが抗ＰＤ－１ ｓｃＦｖを含む）、３つのポリペプチド鎖（例えば、図２８Ｃでは、一方のモノマーがＩＬ－１５／Ｒα複合体を含み、第２のモノマーが重鎖を含み、第３のモノマーが軽鎖である）などのいずれかを含む単一の構築物においてＩＬ－１５／Ｒα及び標的抗ＰＤ－１ドメインを一緒にするのに役立つ。

本発明のＦｃドメイン成分は本明細書に記載のとおりであり、一般にスキューバリアント及び／又は任意のｐＩバリアント及び／又は除去バリアントを含む。例えば、「ＩＶヘテロ二量体抗体（ＩＶ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という見出しの国際公開第２０１７／２１８７０７号パンフレットの開示（ＩＶ．Ａ、ＩＶ．Ｂ、ＩＶ．Ｃ、ＩＶ．Ｄ、ＩＶ．Ｅ、ＩＶ．Ｆ、ＩＶ．Ｇ、ＩＶ．Ｈ及びＩＶ．Ｉの節を含む）を参照されたい。これらの節は全て、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。本発明のヘテロ二量体タンパク質において特に使用されるのは、その中で概説されるような「スキューバリアント」、「ｐＩバリアント」、「除去バリアント」及びＦｃＲｎバリアントを含むＦｃドメインである。特に有用なＦｃドメインは、図８に示されているものである。

Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインに由来することができ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは本発明において特定の用途を見出す。以下に、本発明のヘテロ二量体Ｆｃタンパク質のＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲαＦｃ融合モノマー及びチェックポイント抗体フラグメントに有用なＦｃドメインを記載する。

各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定し、Ｋａｂａｔらは、重鎖及び軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存度に基づいて、彼らは個々の一次配列をＣＤＲ及びフレームワークに分類し、そのリストを作成した（参照により全体が組み込まれる、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１－３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。）。本明細書を通して、可変ドメインの残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１～１０７及び重鎖可変領域の残基１～１１３）を指す場合、Ｋａｂａｔナンバリングシステムが一般に使用され、Ｆｃ領域についてはＥＵナンバリングシステムが使用される（例えば、前出のＫａｂａｔら（１９９１））。

免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖にいくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書において「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、明確な三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において興味深いのは、定常重（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体に関連して、ＩｇＧアイソタイプはそれぞれ３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧの文脈における「ＣＨ」ドメインは以下の通りである。「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスによる１１８～２２０位を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスによる２３７～３４０位を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスによる３４１～４４７位を指す。本明細書に示され、以下に記載されるように、ｐＩバリアントは、以下に記載されるＣＨ領域及びヒンジ領域の１つ又は複数に存在し得る。

重鎖の別のタイプのＩｇドメインはヒンジ領域である。本明細書において「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」又は「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１及び第２の定常ドメインの間にアミノ酸を含む可撓性ポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ２２０位で終了し、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ２３７位で開始する。したがって、ＩｇＧについて、抗体ヒンジは、本明細書では、２２１位（ＩｇＧ１のＤ２２１）～２３６位（ＩｇＧ１のＧ２３６）を含むと定義され、ナンバリングはＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、例えばＦｃ領域の文脈において、下部ヒンジが含まれ、「下部ヒンジ」は一般に２２６位又は２３０位を指す。本明細書で述べるように、ｐＩバリアントはヒンジ領域にも作製することができる。

したがって、本発明は、異なる抗体ドメイン、例えば、異なるＦｃドメインを提供する。本明細書に記載され、当技術分野で知られているように、本発明のヘテロ二量体タンパク質は、異なるドメインを含み、これらは重複してもよい。これらのドメインには、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、及び重定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－Ｆｃドメイン、又は、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）が含まれるが、これらに限定されない。

したがって、「Ｆｃドメイン」は、－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、及び任意にヒンジドメインを含み、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来し得、ＦｃドメインはＩｇＧ１に由来する。本明細書のいくつかの実施形態では、タンパク質フラグメント（例えば、ＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒα）がＦｃドメインに結合している場合、Ｆｃドメインのヒンジの全部又は一部に結合しているのはＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒα構築物のＣ末端である。例えば、それは一般に、ヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳ（配列番号９）に結合される。他の実施形態では、タンパク質フラグメント（例えば、ＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒα）がＦｃドメインに結合している場合、ＦｃドメインのＣＨ１ドメインに結合しているのはＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒα構築物のＣ末端である。

Ｆｃドメインタンパク質の本明細書に概説されるいくつかの構築物及び配列では、ＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒαタンパク質フラグメントのＣ末端はドメインリンカーのＮ末端に結合しており、そのＣ末端は定常ＦｃドメインのＮ末端に結合しているが（Ｎ－ＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒαタンパク質フラグメント－リンカー－Ｆｃドメイン－Ｃ）、これは切り替えることができる（Ｎ－Ｆｃドメイン－リンカー－ＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒαタンパク質フラグメント－Ｃ）。本明細書で概説される他の構築物及び配列では、第１のタンパク質フラグメントのＣ末端は、任意にドメインリンカーを介して、第２のタンパク質フラグメントのＮ末端に結合し、第２のタンパク質フラグメントのＣ末端は、任意にドメインリンカーを介して、定常ＦｃドメインのＮ末端に結合する。本明細書に概説されるさらに他の構築物及び配列では、第１のタンパク質フラグメント又は第２のタンパク質フラグメントに結合していない定常Ｆｃドメインが提供される。ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書中に記載される例示的な単量体Ｆｃドメインタンパク質の２つ以上を含有し得る。

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインを一緒に連結するために使用される、以下により十分に考察されるような「ドメインリンカー」であり、その一部は図８に示されている。任意の適切なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号１０）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１３）を含むグリシン－セリンポリマー（ｎは、少なくとも１である整数（及び一般に１～２～３～４～５）である）、並びに各ドメインがその生物学的機能を保持することを可能にするのに十分な長さ及び柔軟性を有する２つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。場合によっては、本明細書中に概説される「鎖化」に注目して、荷電ドメインリンカー。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、自己集合してヘテロ二量体Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを形成する２つの異なる重鎖バリアントＦｃ配列の使用に依存するヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供する。

本発明は、１つ以上の結合パートナー、リガンド又は受容体への結合を可能にするヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供するための新規構築物に関する。ヘテロ二量体Ｆｃ融合構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、「二量体」に集合する２つの「モノマー」の自己集合性に基づく。ヘテロ二量体Ｆｃ融合物は、下記により十分に考察されるように、各モノマーのアミノ酸配列を変化させることによって作製される。したがって、本発明は一般に、ヘテロ二量体形成を促進するために、及び／又はホモ二量体上のヘテロ二量体の精製を容易にするために、各鎖上の異なる定常領域中のアミノ酸バリアントに依存していくつかの方法で結合パートナー又はリガンド又は受容体と共係合することができるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の作製に関する。

本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができる多くの機構が存在する。さらに、当業者によって理解されるように、これらの機構は、高いヘテロ二量体化を確実にするために組み合わせることができる。したがって、ヘテロ二量体の産生をもたらすアミノ酸バリアントは、「ヘテロ二量体化バリアント」と呼ばれる。以下に論じるように、ヘテロ二量体化バリアントは、立体的バリアント（例えば、以下に記載される「ノブ及びホール」又は「スキュー」バリアント、及び以下に記載される「電荷対」バリアント）並びに「ｐＩバリアント」を含むことができ、これはヘテロ二量体からのホモ二量体の精製を可能にする。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１４５８０６号に一般的に記載されており、具体的には「ヘテロ二量体化バリアント」の議論について以下に記載されているように、ヘテロ二量体化に有用な機構には、「ノブ及びホール」（「ＫＩＨ」；本明細書ではしばしば、「スキュー」バリアント（国際公開第２０１４／１４５８０６号の議論を参照）、国際公開第２０１４／１４５８０６号に記載されている「静電ステアリング」又は「電荷対」、国際公開第２０１４／１４５８０６号に記載されているｐＩバリアント、及び国際公開第２０１４／１４５８０６号及び以下に概説されている一般的な追加のＦｃバリアント）が含まれる。

本発明では、ヘテロ二量体抗体の精製を容易にすることができるいくつかの基本的な機構が存在する。各モノマーが異なるｐＩを有し、したがってＡ－Ａ、Ａ－Ｂ及びＢ－Ｂ二量体タンパク質の等電的精製を可能にするように、ｐＩバリアントの使用に依存する。あるいは、いくつかのフォーマットはまた、サイズに基づいて分離を可能にする。以下でさらに概説されるように、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成を「ゆがめる（スキュー（ｓｋｅｗ））」ことも可能である。したがって、立体的ヘテロ二量体化バリアントとｐＩバリアント又は電荷対バリアントとの組合せは、本発明において特定の用途が見出される。

一般に、本発明における特定の使用の実施形態は、２つのモノマー間のｐＩ差を増加させるｐＩバリアントと組み合わせて、ホモ二量体化形成よりもヘテロ二量体化形成を促進するスキューバリアントを含むバリアントのセットに依存する。

さらに、下記により十分に概説されるように、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のフォーマットに応じて、ｐＩバリアントは、モノマーの定常ドメイン及び／又はＦｃドメイン内に含まれ得るか、又はドメインリンカーが使用され得る。すなわち、本発明は、モノマー及び／又は荷電ドメインリンカーの一方又は両方に存在するｐＩバリアントも提供する。さらに、別の機能性のためのさらなるアミノ酸工学もまた、Ｆｃ、ＦｃＲｎ及びＫＯバリアントなどのｐＩ変化を付与し得る。

ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にする分離機構としてｐＩを利用する本発明では、アミノ酸バリアントをモノマーポリペプチドの一方又は両方に導入することができる。すなわち、モノマーの一方（本明細書では単純化のために「モノマーＡ」と呼ぶ）のｐＩをモノマーＢとは異なって設計することができ、又はモノマーＡ及びＢの両方を変更して、モノマーＡのｐＩを増加させ、モノマーＢのｐＩを減少させることができる。論じられるように、モノマーのいずれか又は両方のｐＩ変化は、荷電残基を除去又は添加すること（例えば、中性アミノ酸が、正又は負に荷電したアミノ酸残基に、例えばグリシンからグルタミン酸に置換される）、荷電残基を正又は負から反対の電荷に変化させること（例えばアスパラギン酸からリジンへ）、又は荷電残基を中性残基に変化させること（例えば、電荷の損失；リジンからセリン）によって行うことができる。これらのバリアントのいくつかを図に示す。

したがって、本発明のこの実施形態は、ヘテロ二量体がホモ二量体から分離され得るように、モノマーの少なくとも１つにおいてｐＩの十分な変化を生じさせることを提供する。当業者には理解されるように、また以下にさらに論じるように、これは、「野生型」重鎖定常領域及びそのｐＩを増加又は減少させるように操作されたバリアント領域 を使用することによって（ｗｔ Ａ－＋Ｂ又はｗｔ Ａ－－Ｂ）、又は一方の領域を増加させ、他方の領域を減少させることによって（Ａ＋Ｂ－又はＡ－Ｂ＋）行なうことができる。

したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の成分は、アミノ酸置換（「ｐＩバリアント」又は「ｐＩ置換」）をモノマーの一方又は両方に組み込むことによって、二量体タンパク質のモノマーの両方ではないにしても少なくとも一方の等電点（ｐＩ）を変化させることを目的とした定常領域中のアミノ酸バリアントである。本明細書で示されるように、ヘテロ二量体と２つのホモ二量体の分離は、２つのモノマーのｐＩが０．１ｐＨ単位だけ異なれば達成することができ、０．２、０．３、０．４及び０．５以上の全てが本発明における使用を見出す。

当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各モノマー又は両方のモノマーに含まれるべきｐＩバリアントの数は、成分の出発ｐＩに部分的に依存する。当技術分野で知られているように、異なるＦｃは、本発明で利用される異なる出発ｐＩを有する。一般に、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ ｌｏｇの各モノマーの合計ｐＩ差をもたらすように操作され、本明細書に概説されるように０．２から０．５が好ましい。

当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各モノマー又は両方のモノマーに含まれるべきｐＩバリアントの数は、成分の出発ｐＩに部分的に依存する。すなわち、どのモノマーを操作するか、又はどの「方向」（例えば、より陽性又はより陰性）で操作するかを決定するために、Ｆｃドメインの配列、及び場合によってはＦｃドメインに連結されたタンパク質ドメインが計算され、そこから決定がなされる。当技術分野で知られているように、異なるＦｃドメイン及び／又はタンパク質ドメインは、本発明で利用される異なる出発ｐＩを有する。一般に、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ ｌｏｇの各モノマーの合計ｐＩ差をもたらすように操作され、本明細書に概説されるように０．２から０．５が好ましい。

さらに、当業者によって理解され、本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体は、サイズに基づいてホモ二量体から分離することができる。図に示されるように、例えば、いくつかのフォーマットは、サイズに基づいてヘテロ二量体及びホモ二量体の分離を可能にする。

ｐＩバリアントを使用してヘテロ二量体化を達成する場合、Ｆｃドメインの定常領域を使用することにより、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を設計及び精製するためのよりモジュール式のアプローチが提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化バリアント（スキューバリアント及び精製ヘテロ二量体化バリアントを含む）を操作しなければならない。さらに、いくつかの実施形態では、ｐＩバリアントから生じる免疫原性の可能性は、ｐＩが有意な免疫原性を導入することなく変化するように、異なるＩｇＧアイソタイプからｐＩバリアントを取り込むことによって有意に低減される。したがって、解決すべきさらなる問題は、高いヒト配列含有量を有する低ｐＩ定常ドメインの解明、例えば、任意の特定の位置における非ヒト残基の最小化又は回避である。

このｐＩ操作で起こり得る副次的利益は、血清半減期の延長及びＦｃＲｎ結合の増加でもある。すなわち、米国特許出願第１３／１９４，９０４号（参照によりその全体が組み込まれる）に記載されているように、抗体定常ドメイン（抗体及びＦｃ融合物に見出されるものを含む）のｐＩを低下させることにより、インビボでの血清保持をより長くすることができる。血清半減期を増加させるためのこれらのｐＩバリアントはまた、精製のためのｐＩ変化を促進する。

さらに、ヘテロ二量体バリアントのｐＩバリアントは、ホモ二量体が存在する場合を排除、最小化及び区別する能力が重要であるため、Ｆｃ融合タンパク質の分析及び品質管理プロセスにさらなる利点を与えることに留意すべきである。同様に、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質産生の再現性を確実に試験する能力が重要である。
１．ヘテロ二量体化バリアント

本発明は、ヘテロ二量体の形成及び／又はホモ二量体からの精製を可能にするためにヘテロ二量体バリアントを利用する、様々なフォーマットのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質を提供する。ヘテロ二量体融合構築物は、２つのＦｃドメイン、例えば、「二量体」に集合する２つの「モノマー」の自己集合性に基づく。

ヘテロ二量体化スキューバリアントのセットのいくつかの適切な対が存在する。これらのバリアントは、「セット」の「ペア」で提供される。すなわち、ペアの一方のセットが第１のモノマーに取り込まれ、ペアの他方のセットが第２のモノマーに取り込まれる。これらのセットは、必ずしも「ノブ・イン・ホール」バリアントとして挙動するわけではなく、一方のモノマー上の残基と他方のモノマー上の残基との間に１対１の対応関係があることに留意されたい。すなわち、これらのセットのペアは、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を抑制する２つのモノマー間の界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体の割合を、予想される５０％（２５％ホモ二量体Ａ／Ａ：５０％ヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％ホモ二量体Ｂ／Ｂ）ではなく９０％超にすることを可能にする。

適切なスキューバリアントのリストを図３に示す。多くの実施形態で特に使用されるのは、以下を含むがこれらに限定されないセットのペアである。Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意に架橋ジスルフィドを含む、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ）。命名法に関して、ペア「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、モノマーの一方が二重バリアントセットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、他方が二重バリアントセットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味する。上記のように、これらの対の「鎖化」は出発ｐＩに依存する。
２．立体的バリアント

いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体の形成は、立体的バリアントの添加によって促進され得る。すなわち、各重鎖のアミノ酸を変化させることにより、異なる重鎖が会合してヘテロ二量体構造を形成する可能性が、同じＦｃアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成する可能性よりも高くなる。適切な立体的バリアントは、米国特許出願第１５／１４１，３５０号の図２９に含まれており、その全ては、図８と同様に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

１つの機構は、当技術分野では一般に「ノブ及びホール」と呼ばれ、ヘテロ二量体形成を有利に、ホモ二量体形成を不利にする立体的影響を作り出すアミノ酸工学を指し、任意に使用することも可能である。これは、米国特許出願第 ６１／５９６，８４６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７ ２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、「ノブ及びホール」と呼ばれることもある。図は、「ノブ及びホール」に依存するいくつかの「モノマーＡ－モノマーＢ」ペアを特定する。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブ及びホール」突然変異は、ジスルフィド結合と組み合わせて、形成をゆがめてヘテロ二量体化することができる。

ヘテロ二量体の生成に使用されるさらなる機構は、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されるように（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、「静電ステアリング」と呼ばれることがある。これは、本明細書では「電荷対」と呼ばれることがある。この実施形態では、静電を使用して、形成をヘテロ二量体化にゆがませる。当業者には理解されるように、これらはｐＩ、したがって精製にも影響を及ぼし得、したがって場合によってはｐＩバリアントとも見なされ得る。しかし、これらはヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製ツールとして使用されなかったので、「立体的バリアント」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対にされたＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「モノマー対応セット」である）、及び、Ｃ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対にされたＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれるが、これらに限定されない。

任意に、かつ独立して任意の量で他のバリアントと組み合わせることができる追加のモノマーＡ及びモノマーＢバリアント、例えば、本明細書に概説されているｐＩバリアント又は米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号の図３７に示されている他の立体的バリアントは、全て参照により本明細書に明示的に組み込まれている。

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される立体的バリアントは、任意かつ独立して、任意のｐＩバリアント（又は他のバリアント、例えばＦｃバリアント、ＦｃＲｎバリアントなど）とともに一方又は両方のモノマーに組み込むことができ、独立かつ任意に本発明のタンパク質に含めるか又は除外することができる。
３．ヘテロ二量体のｐＩ（等電点）バリアント

一般に、当業者によって理解されるように、ｐＩバリアントには２つの一般的なカテゴリー：タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性変化）及びタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性変化）がある。本明細書に記載されるように、これらのバリアントの全ての組合せを行うことができ、一方のモノマーは野生型であってもよく、又は野生型と有意に異なるｐＩを示さないバリアントであってもよく、他方はより塩基性又はより酸性であってもよい。あるいは、各モノマーを、一方はより塩基性に、一方はより酸性に変化させる。

ｐＩバリアントの好ましい組合せは、米国特許出願第１５／１４１，３５０号の図３０に示されており、その全てが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で概説し、図に示すように、これらの変化はＩｇＧ１と比較して示されているが、全てのアイソタイプをこの方法で変更することができ、アイソタイプハイブリッドも同様である。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２－４由来である場合、Ｒ１３３Ｅ及びＲ１３３Ｑも使用することができる。

一実施形態では、ｐＩバリアントの好ましい組合せは、Ｆｃモノマーの１つがＣＨ１ドメインを含む場合、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１と比較した場合、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つのモノマーを有する。いくつかの例では、第２のモノマーは、（ＧＫＰＧＳ）_４（配列番号１４）を含む正に帯電したドメインリンカーを含む。いくつかの場合、第１のモノマーは、２０８位を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まない構築物（例えば、ドメインの１つでＣＨ１ドメインを利用しないヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の場合）において、好ましい陰性ｐＩバリアントＦｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１と比較した場合、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。

いくつかの実施形態において、突然変異は、位置２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２３３、２３４、２３５及び２３６を含むＦｃドメインのヒンジドメインにおいて行われる。２３３～２３６の変化は、ＩｇＧ２骨格においてエフェクター機能（３２７Ａと共に）を増加させるために行うことができることに留意されたい。したがって、ｐＩ突然変異及び特に置換は、２２１～２２５位の１つ又は複数で行うことができ、１、２、３、４又は５個の突然変異が本発明で使用される。ここでも、全ての可能な組合せが、単独で、又は他のドメインにおける他のｐＩバリアントとの組合せで企図される。

ヒンジドメインのｐＩを低下させるのに使用する特定の置換には、２２１位での欠失、２２２位での非天然バリン又はトレオニン、２２３位での欠失、２２４位での非天然グルタミン酸、２２５位での欠失、２３５位での欠失及び２３６位での欠失又は非天然アラニンが含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、ｐＩ置換のみがヒンジドメインで行われ、他の場合では、これらの置換は任意の組合せで他のドメインにおける他のｐＩバリアントに追加される。

いくつかの実施形態では、位置２７４、２９６、３００、３０９、３２０、３２２、３２６、３２７、３３４及び３３９を含むＣＨ２領域に突然変異を作製することができる。ここでも、これらの１０個の位置の全ての可能な組合せを行うことができる。例えば、ｐＩ抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のＣＨ２ ｐＩ置換を有し得る。

ＣＨ２ドメインのｐＩを低下させるのに使用する特定の置換としては、２７４位の非天然グルタミン又はグルタミン酸、２９６位の非天然フェニルアラニン、３００位の非天然フェニルアラニン、３０９位の非天然バリン、３２０位の非天然グルタミン酸、３２２位の非天然グルタミン酸、３２６位の非天然グルタミン酸、３２７位の非天然グリシン、３３４位の非天然グルタミン酸、３３９位の非天然トレオニン、並びにＣＨ２内及び他のドメインとの全ての可能な組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

この実施形態では、突然変異は独立かつ任意に、位置３５５、３５９、３６２、３８４、３８９、３９２、３９７、４１８、４１９、４４４及び４４７から選択することができる。ＣＨ３ドメインのｐＩを低下させるのに使用する特定の置換としては、３５５位の非天然グルタミン又はグルタミン酸、３８４位の非天然セリン、３９２位の非天然アスパラギン又はグルタミン酸、３９７位の非天然メチオニン、４１９位の非天然グルタミン酸、３５９位の非天然グルタミン酸、３６２位の非天然グルタミン酸、３８９位の非天然グルタミン酸、４１８位の非天然グルタミン酸、４４４位の非天然グルタミン酸、及び４４７位の欠失又は非天然アスパラギン酸が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＩバリアントの例示的な実施形態は、図５を含む図に提供されている。

さらに、いくつかの場合には、ＩＬ－１５ドメインとＩＬ－１５Ｒαドメインとの間のドメインリンカーを荷電させることができ、ｓｃＦｖリンカー（特定のフォーマットで存在する場合）を荷電させることができる。
４．アイソタイプ・バリアント

さらに、本発明の多くの実施形態は、１つのＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの特定の位置でのｐＩアミノ酸の「取込み」に依存しており、したがって、望ましくない免疫原性がバリアントに導入される可能性を低減又は排除する。これらの多くは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示されている。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由で、治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２の重定常領域よりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置のＩｇＧ２残基をＩｇＧ１骨格に導入することにより、得られたモノマーのｐＩは低下（又は増加）し、さらに長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有する。グルタミン酸を導入すると、得られるタンパク質のｐＩに影響を及ぼす。以下に記載されるように、バリアントＦｃ融合タンパク質のｐＩに有意に影響を及ぼすためには、いくつかのアミノ酸置換が一般に必要とされる。しかしながら、ＩｇＧ２分子の変化でさえ、血清半減期の増加を可能にすることに、以下に考察するように留意すべきである。

他の実施形態では、得られるタンパク質の全体的な電荷状態を低下させるため（例えば、より高いｐＩアミノ酸をより低いｐＩアミノ酸に変化させることによる）、又は以下でさらに説明するように、安定性などのために構造内に収容することを可能にするために、非アイソタイプアミノ酸の変更が行われる。

さらに、重及び軽定常ドメインの両方をｐＩ操作することによって、ヘテロ二量体の各モノマーにおける有意な変化を認めることができる。本明細書で論じるように、２つのモノマーのｐＩが少なくとも０．５異なることにより、イオン交換クロマトグラフィ若しくは等電点電気泳動又は等電点に敏感な他の方法による分離が可能になり得る。
５．ｐＩの算出

各モノマーのｐＩは、バリアント重鎖定常ドメインのｐＩ及びバリアント重鎖定常ドメイン及び融合パートナーを含む全モノマーのｐＩに依存し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図１９のチャートを使用して、バリアント重鎖定常ドメインに基づいて計算される。本明細書で論じるように、どのモノマーを操作するかは、一般に、各モノマーの固有のｐＩによって決定される。
６．より良好なＦｃＲｎのインビボでの結合も与えるｐＩバリアント

ｐＩバリアントがモノマーのｐＩを減少させる場合、それらはインビボでの血清保持を改善するという追加の利点を有することができる。

まだ試験中であるが、エンドソームにおけるｐＨ６でのＦｃＲｎへの結合がＦｃを捕捉するので、Ｆｃ領域はインビボでより長い半減期を有すると考えられている（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，１９９７ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２－５９８、全体が参照により組み込まれる）。次いで、エンドソーム区画は、Ｆｃを細胞表面に再利用する。区画が細胞外空間に開口すると、より高いｐＨ（約７．４）は、Ｆｃの放出を誘導して血液中に戻す。マウスでは、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６及びｐＨ７．４でＦｃＲｎ結合が増加したＦｃ突然変異体は、実際に血清濃度が低下し、野生型Ｆｃと同じ半減期を有することを示した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１－５１８０、全体が参照により組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃのＦｃＲｎに対する親和性の増加は、Ｆｃの血液中への放出を妨げると考えられる。したがって、インビボでのＦｃの半減期を増加させるＦｃ突然変異は、理想的には、より低いｐＨでＦｃＲｎ結合を増加させるが、より高いｐＨではＦｃの放出を依然として可能にする。アミノ酸ヒスチジンは、６．０～７．４のｐＨ範囲でその電荷状態を変化させる。したがって、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体中の重要な位置にＨｉｓ残基を見出すことは驚くべきことではない。
７．さらなる機能性のためのさらなるＦｃバリアント

ｐＩアミノ酸バリアントに加えて、１つ以上のＦｃγＲ受容体への結合の変化、ＦｃＲｎ受容体への結合の変化などを含むがこれらに限定されない様々な理由のために行うことができるいくつかの有用なＦｃアミノ酸改変がある。

したがって、本発明のタンパク質は、ｐＩバリアント及び立体的バリアントを含む、本明細書に概説されるヘテロ二量体化バリアントを含むアミノ酸改変を含むことができる。バリアントの各セットは、独立かつ任意に、任意の特定のヘテロ二量体タンパク質に含まれ得るか、又は除外され得る。
８．ＦｃγＲバリアント

したがって、ＦｃγＲ受容体の１つ以上への結合を変化させるために行うことができるいくつかの有用なＦｃ置換が存在する。結合の増加及び結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害；ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応）をもたらすことが知られている。同様に、ＦｃγＲＩＩｂ（阻害性受容体）への結合の減少も、状況によっては有益であり得る。本発明での使用が見出されるアミノ酸置換としては、米国特許出願第１１／１２４，６２０号（特に図４１）、同第１１／１７４，２８７号、同第１１／３９６，４９５号、同第１１／５３８，４０６号に列挙されているものが挙げられ、これらの全ては、その全体が、特に、そこに開示されているバリアントについて、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。用途が見出される特定のバリアントには、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ及び２９９Ｔが含まれるが、これらに限定されない。

さらに、ＦｃγＲＩＩｃに対する親和性を増加させるアミノ酸置換も、本明細書に概説するＦｃドメインバリアントに含めることができる。例えば、米国特許出願第１１／１２４，６２０号及び同第１４／５７８，３０５号に記載されている置換は有用である。

さらに、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／３４１，７６９号に具体的に開示されるように、ＦｃＲｎ受容体への結合の増加及び血清半減期の増加に使用される追加のＦｃ置換があり、それには４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６Ｉ又はＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ及び２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌが含まれるがこれらに限定されない。
９．除去バリアント

同様に、機能的バリアントの別のカテゴリーは、「ＦｃγＲ除去バリアント」又は「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯ又はＫＯ）」バリアントである。これらの実施形態では、いくつかの治療適用のために、さらなる作用機序を回避するために、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ １、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）の１つ又は複数又は全部へのＦｃドメインの正常な結合を低減又は除去することが望ましい。すなわち、例えば、多くの実施形態では、特に、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を除去してＡＤＣＣ活性を排除又は有意に低下させることが望ましい二重特異性免疫調節抗体の使用において、Ｆｃドメインの１つが１つ以上のＦｃγ受容体除去バリアントを含む。これらの除去バリアントは、米国特許出願第１５／１４１，３５０号の図３１に示されており、これらは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、それぞれ独立かつ任意に含まれ得るか、又は除外され得、好ましい態様は、ＥＵインデックスに従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される除去バリアントを利用する。本明細書で言及される除去バリアントは、ＦｃγＲ結合を除去するが、一般にＦｃＲｎ結合を除去しないことに留意されたい。

ｐＩバリアントの例示的な実施形態は、図５を含む図に提供されている。
１０．ヘテロ二量体バリアント及びＦｃバリアントの組合せ

当業者には理解されるように、列挙されたヘテロ二量体化バリアント（スキューバリアント及び／又はｐＩバリアントを含む）の全ては、それらがそれらの「鎖化」又は「モノマー分配」を保持する限り、任意に、かつ独立して任意の方法で組み合わせることができる。さらに、これらのバリアントは全て、ヘテロ二量体化フォーマットのいずれかに組み合わせることができる。

ｐＩバリアントの場合、特定の用途を見出す実施形態が図に示されているが、精製を容易にするために２つのモノマー間のｐＩ差を変更するという基本原則に従って、他の組合せを生成することができる。

さらに、ヘテロ二量体化バリアント、スキュー及びｐＩのいずれもまた、本明細書で一般的に概説されるように、Ｆｃ除去バリアント、Ｆｃバリアント、ＦｃＲｎバリアントと独立かつ任意に組み合わされる。

さらに、単量体Ｆｃドメインは、Ｃ２２０Ｓ／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ又はＣ２２０Ｓ／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含むアミノ酸置換のセットを含み得る。

さらに、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、スキューバリアント（例えば、米国特許出願第１５／１４１，３５０号の図１Ａ～図１Ｃに示されるようなアミノ酸置換のセット（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））を含むことができ、特に有用なスキューバリアントは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意に除去バリアント、任意に荷電ドメインリンカー及び重鎖は、ｐＩバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、２３６Ｒ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２４３Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｖ２５９Ｉ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２９８Ａ、Ｖ３０８Ｆ、３２８Ｆ、３２８Ｒ、３３０Ｌ、３３２Ｄ、３３２Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｓ、２３６Ｒ／３２８Ｒ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、２３６Ｒ／３２８Ｆ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｙ４３６Ｉ／Ｍ４２８Ｌ、Ｙ４３６Ｖ／Ｍ４２８Ｌ、Ｙ４３６Ｉ／Ｎ４３４Ｓ、Ｙ４３６Ｖ／Ｎ４３４Ｓ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ及びＰＶＡ／Ｓ２６７Ｋからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、Ｆｃドメインはアミノ酸置換２３９Ｄ／３３２Ｅを含む。他の場合において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ又はＰＶＡ／Ｓ２６７Ｋを含む。

一実施形態では、本発明で使用されるスキューバリアント及びｐＩバリアントの特定の組合せは、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意に架橋ジスルフィドを含む、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ）であり、一方のモノマーがＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含み、他方のモノマーが正に帯電したドメインリンカーを含む。当技術分野で理解されるように、「ノブ・イン・ホール」バリアントはｐＩを変化させず、したがっていずれかのモノマーに使用することができる。

一実施形態では、本発明で使用されるスキューバリアント及びｐＩバリアントの特定の組合せは、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑであり、一方のモノマーはＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含む。

Ｆｃ二量体化バリアントのセット（スキューバリアント及びｐＩバリアントを含む）の有用な対を図４Ａ～図４Ｅに提供する。追加のｐＩバリアントを図５に示す。有用な除去バリアントを図６に示す。本発明のＩＬ－１５／Ｒαｘ抗ＰＤ１ ＡＢＤヘテロ二量体融合タンパク質の非サイトカイン成分の有用な実施形態を図７Ａ～７Ｅ及び図８Ａ～８Ｆに提供する。
Ｄ．ドメインリンカー

本発明の３つの成分（本発明の抗ＰＤ－１ Ｆｖ、ＩＬ－１５／Ｒα複合体及びヘテロ二量体化Ｆｃドメイン）は、任意に、ドメインリンカーを使用して一緒に連結される。直接的な共有結合を行うことができるが（例えば、ＩＬ－１５複合体のＣ末端をＦｃドメインのＣＨ２ドメインのＮ末端に連結する）、一般に、柔軟性を与え、時には機能を与えるリンカーが使用される。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５タンパク質がＦｃドメインのＮ末端に結合しており、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質がＩＬ－１５タンパク質のＮ末端に結合している。他の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質がＦｃドメインのＮ末端に結合しており、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質がＩＬ－１５タンパク質に非共有結合している。さらに他の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質がＦｃドメインのＣ末端に結合しており、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質がＩＬ－１５タンパク質に非共有結合している。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質及びＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、ドメインリンカー（例えば、「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」フォーマット）を介して一緒に結合している。任意に、タンパク質は、リンカーを介して結合されず、本明細書に概説されるように天然の自己集合又はジスルフィド結合のいずれかを利用する。他の実施形態では、ＩＬ－１５タンパク質及びＩＬ－１５Ｒαタンパク質は非共有結合している。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５タンパク質は、リンカーを介してＦｃドメインに結合している。ある特定の実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質は、例えばリンカーを用いずにＦｃドメインに直接結合している。特定の実施形態では、ＩＬ－１５タンパク質は、ヒンジ領域又はそのフラグメントを介してＦｃドメインに結合している。他の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、リンカーを介してＦｃドメインに結合している。他の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、例えばリンカーを用いずにＦｃドメインに直接結合している。特定の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαタンパク質は、ヒンジ領域又はそのフラグメントを介してＦｃドメインに結合している。任意に、ＩＬ－１５タンパク質又はＩＬ－１５Ｒαタンパク質をＦｃドメインに結合させるためにリンカーが使用されない。

いくつかの例では、ＰＤ－１ ＡＢＤは、ドメインリンカーを介してＦｃドメインのＮ末端に共有結合している。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ ＡＢＤは、例えばリンカーを用いずにＦｃドメインに直接結合している。特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＡＢＤは、ヒンジ領域又はそのフラグメントを介してＦｃドメインに結合している。

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインを一緒に連結するために使用される「ドメインリンカー」である。リンカーペプチドは、主に以下のアミノ酸残基を含み得る。Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、又はＴｈｒ。リンカーペプチドは、所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるように２つの分子を連結するのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１～５０アミノ酸長、好ましくは約１～３０アミノ酸長である。一実施形態では、１～２０アミノ酸長のリンカーが使用され得、いくつかの実施形態では、約５～約１０アミノ酸が使用される。有用なリンカーとしては、例えば（ＧＳ）ｎ（配列番号１５）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１７）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１８）を含むグリシン－セリンポリマー（ｎは少なくとも１である整数（一般に３～４）である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び他の柔軟なリンカーが挙げられる。あるいは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーがリンカーとしての用途を見出すことができ、それはリンカーとしての用途を見出すことができる。

いくつかの実施形態では、ドメインリンカーはＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のヒンジ領域の全部又は一部を含み、前者は多くの実施形態において有用である。いくつかのヒンジドメインリンカーを図８に示す。当業者には理解されるように、図８によるドメインリンカーは、組み合わせることもできる。

いくつかの実施形態では、ドメインリンカーはｓｃＦｖリンカーである。一般に、ｓｃＦｖリンカーは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが正しいフォーマットで会合することを可能にするのに十分な柔軟性及び長さを有する。いくつかの場合、ｓｃＦｖリンカーは、ヘテロ二量体タンパク質のフォーマット及び成分のｐＩに応じて、図８に一般的に概説され、以下に論じられるように、荷電され得る。

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、荷電ｓｃＦｖリンカーであり、そのいくつかは国際公開第２０１７／２１８７０７号の図７に示されている。したがって、本発明は、第１のモノマーと第２のモノマー（例えば、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαモノマー及びＰＤ－１ ＡＢＤモノマー）との間のｐＩにおいて分離を容易にするための荷電ｓｃＦｖリンカーをさらに提供する。すなわち、正又は負（又はその両方、異なるモノマー上のｓｃＦｖを使用する、及び／又はｓｃＦｖ中の１つの荷電リンカーと、ＩＬ－１５及びｓｕｓｈｉドメインを連結するか、又はＩＬ－１５／Ｒα成分をＦｃドメインに連結するためのものとを使用する足場の場合）のいずれかの荷電ｓｃＦｖリンカーを組み込むことによって、これにより、荷電リンカーを含むモノマーは、Ｆｃドメインにさらなる変化を起こさずにｐＩを変化させることができる。これらの荷電リンカーは、標準的なリンカーを含有する任意のｓｃＦｖに置換することができる。ここでも、当業者には理解されるように、荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｐＩの所望の変化に従って、正しい「鎖」又はモノマー上で使用される。例えば、本明細書で論じられるように、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質を作製するために、所望のドメインのそれぞれに対するＦｖ領域の元のｐＩが計算され、ｓｃＦｖを作製するために１つが選択され、ｐＩに応じて、正又は負のリンカーが選択される。

荷電ドメインリンカーもまた、本発明のモノマーのｐＩ分離を増加させるために使用することができ、したがって、図１０に含まれるものは、リンカーが利用される本明細書の任意の実施形態で使用することができる。

他のリンカー配列は、任意の長さのＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の配列（例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５～１２アミノ酸残基）を含み得るが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基を含むわけではない。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えばＣκ又はＣλに由来し得る。リンカーは、例えばＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、Ｃ及びＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、及び他のタンパク質由来の他の天然配列などの他のタンパク質に由来し得る。
１．グリコシル化バリアント・リンカー

抗ＰＤ－１ Ｆｖについて上述したように、グリコシル化は、場合によっては望ましくないことがある不均一性をもたらし得る。したがって、いくつかの場合には、ＩＬ－１５ドメインとＩＬ－１５Ｒαドメインとを連結してＩＬ－１５複合体を形成するドメインリンカーについて、例えば図８に示されるような（ＧＧＧＧＡ）ｎリンカー（配列番号１９）（ｎは１～５である）が使用される。
ＩＶ．本発明の有用なフォーマット

図２８Ａ～図２８Ｈに示されるように、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）Ｆｃ融合タンパク質のいくつかの有用なフォーマットが存在する。一般に、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、３つの機能的成分：ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）成分、抗ＰＤ－１成分、及びＦｃ成分を有し、これらは本明細書において概説されるようにそれぞれ異なる形態をとることができ、それぞれ他の成分と任意の構成で組み合わせることができる。

以下のフォーマットのいずれにおいても、第１及び第２のＦｃドメインは、ａ）Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；ｂ）Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；ｃ）Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；ｄ）Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；ｅ）Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；ｆ）Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びｇ）Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有することができる。

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃドメインは、ＥＵナンバリングでＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換のさらなるセットを有する。

任意に、第１及び／又は第２のＦｃドメインは、ＥＵナンバリングで、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換のさらなるセットを有する。

任意に、第１及び／又は第２のＦｃドメインは、半減期延長のためにＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを有する。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃドメインは、半減期延長のために４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを有する。

したがって、以下のフォーマットのいずれかの特に有用なバリアントは、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（モノマーがＣＨ１ドメインを含む場合）又はｐＩバリアントＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（モノマーがＣＨ１ドメインを含まない場合）を含む負のモノマーとを有する。
Ａ．ｓｃＩＬ－１５／Ｒα Ｘ ｓｃＦｖ

一実施形態を図２８Ａに示し、２つのモノマーを含む。これは一般に「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα Ｘ ｓｃＦｖ」と呼ばれ、「ｓｃ」は「単鎖」を表し、共有結合ドメインリンカーを使用したＩＬ－１５及びｓｕｓｈｉドメインの結合を指す。「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ ｓｃＦｖ」フォーマット（図２８Ａを参照）は、可変長リンカー（「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれる）によってＩＬ－１５に融合されたＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み、次いでこれがヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合され、ｓｃＦｖがヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に融合される。

図２８Ａのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ Ｆｖドメインは、ｍＡｂＣ Ｈ．１７６＿Ｌ１．１４０、Ｈ１．１９＿Ｌ１．１４０、Ｈ１＿Ｌ１．１、Ｈ１．１９＿Ｌ１、Ｈ１．４８＿Ｌ１、Ｈ１．１２５＿Ｌ１、Ｈ１．３０＿Ｌ１、Ｈ１．１３２＿Ｌ１、Ｈ１＿Ｌ１．１ Ｈ１＿Ｌ１．３、Ｈ１＿Ｌ１．４５、Ｈ１＿Ｌ１．１１７、Ｈ１＿Ｌ１．１２９、Ｈ１．１９＿Ｌ１．１、Ｈ１．３２＿Ｌ１．１、Ｈ１．１６９＿Ｌ１．１、Ｈ１．１６９＿Ｌ１．１、Ｈ１．１７５＿Ｌ１．１、Ｈ１．１７５＿Ｌ１．１、Ｈ１＿Ｌ１．１４０、Ｈ１＿Ｌ１．１３５、Ｈ１＿Ｌ１．１３６、Ｈ１．１３２＿Ｌ１．１３５、Ｈ１．１３２＿Ｌ１．１４０、Ｈ１．１７５＿Ｌ１．１３５及びＨ１．１７５＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せからなる群から選択される。

図２８Ａのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ．１７６＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せであり、ＩＬ－１５ドメインはＮ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。

図２８Ａのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１＿Ｌ１．１のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せからなる群から選択され、ＩＬ－１５ドメインはＮ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。
Ｂ．ｓｃＦｖ Ｘ ｎｃＩＬ－１５／Ｒα

この実施形態は、図２８Ｂに示されており、３つのモノマーを含む。これは一般に「ｎｃＩＬ－１５／Ｒα Ｘ ｓｃＦｖ」又は「ｓｃＦｖ Ｘ ｎｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」は「非共有結合」を表し、ＩＬ－１５及びｓｕｓｈｉドメインの自己集合性非共有結合を指す。「ｓｃＦｖ ｘ ｎｃＩＬ－１５／Ｒα」フォーマット（図３４Ｂを参照）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したｓｃＦｖを含み、ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に融合し、ＩＬ－１５は、非共有結合ＩＬ－１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。

図２８Ｂのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ．１７６＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せであり、ＩＬ－１５ドメインはＮ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。

図２８Ｂのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１＿Ｌ１．１のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せからなる群から選択され、ＩＬ－１５ドメインはＮ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。
Ｃ．ｓｃＩＬ－１５／Ｒα Ｘ Ｆａｂ

この実施形態は、図２８Ｃに示されており、３つのモノマーを含む。これは一般に、「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα Ｘ Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ Ｘ ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれ、互換的に使用され、「ｓｃ」は「単鎖」を表す。ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂフォーマット（図２８Ｃを参照）は、可変長リンカー（「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれる）によってＩＬ－１５に融合されたＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み、次いでこれがヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合される（ここでは第２のドメインリンカーの役割を果たすヒンジを含む）。すなわち、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のモノマーは、バリアントＩＬ－１５－第１のドメインリンカー－ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン－第２のドメインリンカー－ＣＨ２－ＣＨ３である。いくつかの場合、第２のドメインリンカーは、図８に示すように完全なヒンジドメインである。第２のモノマーは、重鎖、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３であり、対応する軽鎖（第３のモノマー）は、ＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。

いくつかの図２８Ｃの実施形態において、抗ＰＤ－１ Ｆｖドメインは、ｍＡｂＣ Ｈ．１７６＿Ｌ１．１４０、Ｈ１＿Ｌ１、Ｈ１．１９＿Ｌ１．１４０、Ｈ１＿Ｌ１．１、Ｈ１．１９＿Ｌ１、Ｈ１．４８＿Ｌ１、Ｈ１．１２５＿Ｌ１、Ｈ１．３０＿Ｌ１、Ｈ１．１３２＿Ｌ１、Ｈ１＿Ｌ１．１ Ｈ１＿Ｌ１．３、Ｈ１＿Ｌ１．４５、Ｈ１＿Ｌ１．１１７、Ｈ１＿Ｌ１．１２９、Ｈ１．１９＿Ｌ１．１、Ｈ１．３２＿Ｌ１．１、Ｈ１．１６９＿Ｌ１．１、Ｈ１．１６９＿Ｌ１．１、Ｈ１．１７５＿Ｌ１．１、Ｈ１．１７５＿Ｌ１．１、Ｈ１＿Ｌ１．１４０、Ｈ１＿Ｌ１．１３５、Ｈ１＿Ｌ１．１３６、Ｈ１．１３２＿Ｌ１．１３５、Ｈ１．１３２＿Ｌ１．１４０、Ｈ１．１７５＿Ｌ１．１３５及びＨ１．１７５＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せからなる群から選択される。

図２８Ｃのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１．１７６＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せであり、ＩＬ－１５ドメインは、効力のためのアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びグリコシル化のためのアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。さらに、ＩＬ－１５とｓｕｓｈｉドメインとの間のドメインリンカーはＧＧＧＧＡ（配列番号８）である。

図２８Ｃのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びＸｔｅｎｄ ４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｘｔｅｎｄ ４２８Ｌ／４３４Ｓバリアント及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１．１７６＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せであり、ＩＬ－１５ドメインは、効力のためのアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びグリコシル化のためのアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。さらに、ＩＬ－１５とｓｕｓｈｉドメインとの間のドメインリンカーはＧＧＧＧＡ（配列番号８）である。

図２８Ｃのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１．１７６＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せであり、ＩＬ－１５ドメインは、効力のためのアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びグリコシル化のためのアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。さらに、ＩＬ－１５とｓｕｓｈｉドメインとの間のドメインリンカーはＧＧＧＧＡ（配列番号８）である。

図２８Ｃのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びＸｔｅｎｄ ４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｘｔｅｎｄ ４２８Ｌ／４３４Ｓバリアント及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１．１７６＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せであり、ＩＬ－１５ドメインは、効力のためのアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びグリコシル化のためのアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。さらに、ＩＬ－１５とｓｕｓｈｉドメインとの間のドメインリンカーはＧＧＧＧＡ（配列番号８）である。

特に有用な実施形態では、融合タンパク質は、図１３８Ａに示される配列を有するＸＥＮＰ３２４３５である。

図２８Ｃのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１＿Ｌ１．１のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せからなる群から選択され、ＩＬ－１５ドメインはＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。

ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂフォーマットの例示的な非競合ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質（図２８Ｃ）のアミノ酸配列を図３０、図４８、図４９及び図６８に提供する。

いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン－ドメインリンカー－バリアントＩＬ－１５－ドメインリンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、第２のモノマーは、重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。第３のモノマーは、軽鎖ＶＬ－ＣＬである。この実施形態のためのバリアントの好ましい組合せは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５６８２６の図７Ｃに見出される。

ｓｃＩＬ－１５／Ｒα Ｘ Ｆａｂフォーマットでは、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

ｓｃＩＬ－１５／Ｒα Ｘ Ｆａｂフォーマットでは、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ－Ｆｃモノマー上）及びＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ－１５複合体モノマー上）、ｐＩバリアントＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ－１５複合体側）、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋを両モノマー上に、及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを両側に利用する。
Ｄ．ｎｃＩＬ－１５／Ｒα Ｘ Ｆａｂ

この実施形態は、図２８Ｄに示されており、３つのモノマーを含む。これは一般に、交換可能に「ｎｃＩＬ－１５／Ｒα Ｘ Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ Ｘ ｎｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」は「非共有結合」を表し、ＩＬ－１５及びｓｕｓｈｉドメインの自己集合性非共有結合を指す。ｎｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂフォーマット（図３４Ｄを参照）は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に融合され、対応する軽鎖はＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ－１５は非共有結合ＩＬ－１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。

いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン－ドメインリンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、第２のモノマーは、重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。第３のモノマーはＩＬ－１５ドメインである。ｎｃＩＬ－１５／Ｒα Ｘ Ｆａｂフォーマットでは、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

図２８Ｄのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ．１７６＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せであり、ＩＬ－１５ドメインはＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。

図２８Ｄのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１＿Ｌ１．１のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せからなる群から選択され、ＩＬ－１５ドメインはＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。
Ｅ．ｍＡｂ－ｓｃＩＬ－１５／Ｒα

この実施形態は図２８Ｅに示されており、３つのモノマーを含む（ただし、融合タンパク質は四量体である）。これは一般に「ｍＡｂ－ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｓｃ」は「単鎖」を表す。ｍＡｂ－ｓｃＩＬ－１５／Ｒαフォーマット（図３４Ｅを参照）は、第１及び第２のヘテロ二量体ＦｃのＮ末端に融合されたＶＨを含み、ＩＬ－１５はＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合され、次いでこれがヘテロ二量体Ｆｃ領域の１つのＣ末端にさらに融合され、対応する軽鎖はＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。

いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。第２のモノマーは、ｓｃＩＬ－１５複合体、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ドメインリンカー－ｓｕｓｈｉドメイン－ドメインリンカー－ＩＬ－１５を有する重鎖を含む。第３の（及び第４の）モノマーは、軽鎖ＶＬ－ＣＬである。これは一般に「ｍＡｂ－ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｓｃ」は「単鎖」を表す。ｍＡｂ－ｓｃＩＬ－１５／Ｒαフォーマットでは、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

図２８Ｅのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ．１７６＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せであり、ＩＬ－１５ドメインはＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。

図２８Ｅのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１＿Ｌ１．１のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せからなる群から選択され、ＩＬ－１５ドメインはＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。
Ｆ．ｍＡｂ－ｎｃＩＬ－１５／Ｒα

この実施形態は図２８Ｆに示されており、４つのモノマーを含む（ただし、ヘテロ二量体融合タンパク質は五量体である）。これは一般に「ｍＡｂ－ｎｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」は「非共有結合」を表す。ｍＡｂ－ｎｃＩＬ－１５／Ｒαフォーマット（図３４Ｆ）は、第１及び第２のヘテロ二量体ＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロ二量体Ｆｃ領域の１つのＣ末端に融合され、対応する軽鎖はＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ－１５は非共有結合ＩＬ－１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。

いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。第２のモノマーは、ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）ドメイン、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ドメインリンカー－ｓｕｓｈｉドメインを有する重鎖を含む。第３のモノマーはＩＬ－１５ドメインである。第４の（及び第５の）モノマーは、軽鎖ＶＬ－ＣＬである。ｍＡｂ－ｎｃＩＬ－１５／Ｒαフォーマットでは、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

図２８Ｆのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ．１７６＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せであり、ＩＬ－１５ドメインはＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。

図２８Ｆのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１＿Ｌ１．１のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せからなる群から選択され、ＩＬ－１５ドメインはＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。
Ｇ．Ｃｅｎｔｒａｌ－ＩＬ－１５／Ｒα

この実施形態は、図２８Ｇに示されており、四量体を形成する４つのモノマーを含む。これは一般に「Ｃｅｎｔｒａｌ－ＩＬ－１５／Ｒα」と称される。ｃｅｎｔｒａｌ－ＩＬ－１５／Ｒαフォーマット（図２８Ｇを参照）は、ＩＬ－１５のＮ末端に組換え融合されたＶＨを含み、これが次いで、ヘテロ二量体Ｆｃの一方の側にさらに融合され、ＶＨがＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に組換え融合され、これが次いでヘテロ二量体Ｆｃの他方の側にさらに融合され、対応する軽鎖は、ＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。

図２８Ｇのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ．１７６＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せであり、ＩＬ－１５ドメインはＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。

図２８Ｇのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１＿Ｌ１．１のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せからなる群から選択され、ＩＬ－１５ドメインはＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。
Ｈ．Ｃｅｎｔｒａｌ ｓｃＩＬ－１５／Ｒα

この実施形態は、図２８Ｈに示されており、四量体を形成する４つのモノマーを含む。これは一般に「ｃｅｎｔｒａｌ－ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｓｃ」は「単鎖」を表す。ｃｅｎｔｒａｌ－ｓｃＩＬ－１５／Ｒαフォーマット（図３４Ｈを参照）は、ＩＬ－１５に融合されたＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に融合されたＶＨを含み、これが次いで、ヘテロ二量体Ｆｃの一方の側にさらに融合され、ＶＨがヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に融合され、対応する軽鎖は、ＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。

図２８Ｈのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ．１７６＿Ｌ１．１４０のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せであり、ＩＬ－１５ドメインはＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。

図２８Ｈのフォーマットでは、いくつかの態様は、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正のモノマーと、スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ及びｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ及び任意に４２８Ｌ／４３４Ｓ ＦｃＲｎバリアントを含む負のモノマーとを有するＦｃドメインを含む。これらの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは野生型（配列番号２０）であり、抗ＰＤ－１ ＦｖドメインはＨ１＿Ｌ１．１のＶＨドメインとＶＬドメインの組合せからなる群から選択され、ＩＬ－１５ドメインはＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択されるバリアントを含む。
Ｖ．本発明の有用な実施形態

選択された承認された抗ＰＤ－１抗体と結合について競合しないＩＬ－１５タンパク質及び抗ＰＤ－１ ＡＢＤの１つ又は複数の操作されたアミノ酸置換を有するＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のＩＬ－１５バリアントは、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のＩＬ－１５バリアントは、Ｄ３０Ｎ置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のＩＬ－１５バリアントは、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のＩＬ－１５バリアントは、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ置換を有する。そのようなＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ含有融合タンパク質は、ＮＫ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の増殖を誘導又は促進することができる。注目すべきことに、ＩＬ－１５ Ｆｃ側に外因性リンカー（例えば、ヒンジドメインが唯一のドメインリンカーである）を有さないＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ含有融合タンパク質は、より弱い増殖活性を示した。

より低い効力、増大した薬物動態学、及び／又は増大した血清半減期を有するＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質が、本明細書中に提供される。本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質を、親構築物と比較してその効力を低下させるように操作した。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸置換を、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のＩＬ－１５／Ｒα複合体及び／又はＦｃドメインに導入した。いくつかの実施形態では、対照構築物（例えば、親構築物）と比較して効力が低下したＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質は、実質的により長い血清半類似体を有する。ある特定の実施形態において、血清半減期は、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍又はそれ以上増加した。

効力が低下するように操作された対照ｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質と抗ＰＤ－１抗体との併用療法と比較して、動物モデル（例えば、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウス）においてＧＶＨＤを増強したＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質が本明細書において提供される。例示的な非競合ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の投与は、ＩＬ－１５及びＰＤ－１遮断の組合せと比較して、より大きな効果をもたらした。

非競合ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質を含む本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質は、限定するものではないが、活性化リンパ球、活性化Ｔ細胞（例えば、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び活性化ＣＤ８＋細胞）、及び活性化腫瘍浸潤リンパ球（例えば、活性化ＴＩＬ）を含む免疫細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導することができる。
ＶＩ．非標的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質

本発明の一態様は、ａ）ｉ）配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５タンパク質と；ｉｉ）ドメインリンカーと；ｉｉｉ）第１のバリアントＦｃドメインとを含む第１の融合タンパク質；及びｂ）ｉ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインと；ｉｉ）ドメインリンカー；とｉｉｉ）第２のバリアントＦｃドメインとを含む第２の融合タンパク質を含む、ヘテロ二量体タンパク質を提供する。

いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５融合タンパク質は、配列番号３１９のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインはＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第２のバリアントＦｃドメインはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む（ＥＵナンバリングによる）。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、それぞれ独立して、４２８Ｌ／４３４Ｓを含む。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、両方とも４２８Ｌ／４３４Ｓを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、図１１５Ａ～図１１５ＣのＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６７、ＸＥＮＰ３１９６８、ＸＥＮＰ３１９６９、ＸＥＮＰ３１９７０、ＸＥＮＰ３１９７１、ＸＥＮＰ３１９７２及びＸＥＮＰ３１９７３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６９である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９７２である。いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質は配列番号２０８のアミノ酸配列を含み、第２の融合タンパク質は配列番号９５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質は配列番号２１１のアミノ酸配列を含み、第２の融合タンパク質は配列番号２０６のアミノ酸配列を含む。

一態様において、免疫抑制活性の低下又は最小化を必要とする患者において、免疫抑制活性が低下又は最小化した制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導する方法であって、患者に、治療有効量のＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を投与することからなる方法が本明細書において提供され、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）バリアントＩＬ－１５タンパク質；ｉｉ）第１のドメインリンカー；及びｉｉｉ）ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む、第１のモノマー；並びに（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；ｉｉ）第２のドメインリンカー；及びｉｉｉ）ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む、第２のモノマーを含む。

いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のバリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と、Ｎ１Ｄ；Ｎ４Ｄ；Ｄ８Ｎ；Ｄ３０Ｎ；Ｄ６１Ｎ；Ｅ６４Ｑ；Ｎ６５Ｄ；Ｑ１０８Ｅ；Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ；Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ４Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ；Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ；Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ；Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ；Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｅ６４Ｑ；Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と、Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ；及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５融合タンパク質は、配列番号３１９のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ある特定の実施形態において、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ＥＵナンバリングによる）を含む。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、図１１５Ａ～図１１５ＣのＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６７、ＸＥＮＰ３１９６８、ＸＥＮＰ３１９６９、ＸＥＮＰ３１９７０、ＸＥＮＰ３１９７１、ＸＥＮＰ３１９７２及びＸＥＮＰ３１９７３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６９である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９７２である。

いくつかの実施形態では、非標的化ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ドメインリンカーを使用して第１のバリアントＦｃドメインに連結されたバリアントＩＬ－１５タンパク質（配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／ Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む）を含む第１の融合タンパク質を含む第１のモノマーを含む。第２のモノマーは、ドメインリンカーを使用して第２のバリアントＦｃドメインに連結されたＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインを含む第２の融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６９及びＸＥＮＰ３１９７２から選択される。

いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体融合タンパク質は、エフェクターメモリＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）増殖を促進する。一実施形態では、ヘテロ二量体融合タンパク質は、Ｔ_ＥＭに対するＴｒｅｇの比（Ｔｒｅｇ／Ｔ_ＥＭ）を増加させる。場合によっては、本明細書に概説されるＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のいずれか１つによる処置は、Ｔｒｅｇを抑制性Ｔｒｅｇ細胞型から非抑制性活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞に変換する。一実施形態では、ＦＯＸＰ３^ｈｉＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４^＋であるエフェクターＴｒｅｇは、分化して、ＦＯＸＰ３^ｌｏＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４^＋である活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞になる。いくつかの実施形態では、活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞はＣＣＲ４発現が低下している。

いくつかの実施形態では、患者はがんを有する。

有用な非標的ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、２０１６年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４０８，６５５号；２０１６年１１月１日に出願された米国仮出願第６２／４１６，０８７号；２０１７年１月６日に出願された米国仮出願第６２／４４３，４６５号；２０１７年３月２８日に出願された米国仮出願第６２／４７７，９２６号；２０１７年１０月１６日に出願された米国特許出願公開第２０１８／０１１８８０５号；２０１７年１０月１６日に出願された国際公開第２０１８０７１９１９号；２０１８年４月１８日に出願された米国仮出願第６２／６５９，５６３号；２０１８年６月１２日に出願された米国仮出願第６２／６８４，１４３号；２０１８年８月２９日に出願された米国仮出願第６２／７２４，３９６号；２０１８年１１月７日に出願された米国仮出願第６２／７５６，８００号；２０１９年４月１８日に出願された米国特許出願第１６／３８８，１７４号；及び２０１９年４月１８日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ １９／２８１０７号に詳細に記載されており、特に、その中の図面、説明文、配列表及び特許請求の範囲を参照して、開示はその全体が参照により組み込まれる。

Ｔ細胞増殖のＴＧＦβ媒介抑制の逆転を必要とする患者においてＴ細胞増殖のＴＧＦβ媒介抑制を逆転させるのに使用するための特に有用な非標的ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸｍＡｂ２４３０６（「ＸＥＮＰ２４３０６」としても知られる）であり、その配列は図２０に示されている。

さらに、標的化ＩＬ－１５／Ｒα Ｘ ＰＤ－１ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質はまた、免疫抑制活性が低下した又は最小の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を、それを必要とする患者において誘導するための方法において使用される。図中の標的化された構築物のいずれも、特定の用途のＸＥＮＰ３２４３５と共に、本出願において用途が見出され得る。

一態様において、Ｔ細胞増殖のＴＧＦβ媒介性抑制の逆転を必要とする患者において、Ｔ細胞増殖のＴＧＦβ媒介性抑制を逆転させる方法であって、患者に、治療有効量のＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を投与することからなる方法が本明細書において提供され、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）バリアントＩＬ－１５タンパク質；ｉｉ）第１のドメインリンカー；及びｉｉｉ）ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む、第１のモノマー；並びに（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；ｉｉ）第２のドメインリンカー；及びｉｉｉ）ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む、第２のモノマーを含む。

いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のバリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と、Ｎ１Ｄ；Ｎ４Ｄ；Ｄ８Ｎ；Ｄ３０Ｎ；Ｄ６１Ｎ；Ｅ６４Ｑ；Ｎ６５Ｄ；Ｑ１０８Ｅ；Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ；Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ４Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ；Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ；Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ；Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ；Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｅ６４Ｑ；Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と、Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ；及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５融合タンパク質は、配列番号３１９のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ある特定の実施形態において、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ＥＵナンバリングによる）を含む。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、図１１５Ａ～図１１５ＣのＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６７、ＸＥＮＰ３１９６８、ＸＥＮＰ３１９６９、ＸＥＮＰ３１９７０、ＸＥＮＰ３１９７１、ＸＥＮＰ３１９７２及びＸＥＮＰ３１９７３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６９である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９７２である。

いくつかの実施形態では、非標的化ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ドメインリンカーを使用して第１のバリアントＦｃドメインに連結されたバリアントＩＬ－１５タンパク質（配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／ Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む）を含む第１の融合タンパク質を含む第１のモノマーを含む。第２のモノマーは、ドメインリンカーを使用して第２のバリアントＦｃドメインに連結されたＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインを含む第２の融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６９及びＸＥＮＰ３１９７２から選択される。

いくつかの実施形態では、患者は、投与後にＴ細胞増殖の増加を示す。一実施形態では、Ｔ細胞増殖はＣＤ４ Ｔ細胞増殖である。一実施形態では、Ｔ細胞増殖はＣＤ８ Ｔ細胞増殖である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞増殖はＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞増殖である。

いくつかの実施形態では、患者はがんを有する。

有用な非標的ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、２０１６年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４０８，６５５号；２０１６年１１月１日に出願された米国仮出願第６２／４１６，０８７号；２０１７年１月６日に出願された米国仮出願第６２／４４３，４６５号；２０１７年３月２８日に出願された米国仮出願第６２／４７７，９２６号；２０１７年１０月１６日に出願された米国特許出願公開第２０１８／０１１８８０５号；２０１７年１０月１６日に出願された国際公開第２０１８０７１９１９号；２０１８年４月１８日に出願された米国仮出願第６２／６５９，５６３号；２０１８年６月１２日に出願された米国仮出願第６２／６８４，１４３号；２０１８年８月２９日に出願された米国仮出願第６２／７２４，３９６号；２０１８年１１月７日に出願された米国仮出願第６２／７５６，８００号；２０１９年４月１８日に出願された米国特許出願第１６／３８８，１７４号；及び２０１９年４月１８日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／２８１０７号に詳細に記載されており、特に、その中の図面、説明文、配列表及び特許請求の範囲を参照して、開示はその全体が参照により組み込まれる。

Ｔ細胞増殖のＴＧＦβ媒介抑制の逆転を必要とする患者においてＴ細胞増殖のＴＧＦβ媒介抑制を逆転させるのに使用するための特に有用な非標的ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸｍＡｂ２４３０６（「ＸＥＮＰ２４３０６」としても知られる）であり、その配列は図２０に示されている。

さらに、標的化ＩＬ－１５／Ｒα Ｘ ＰＤ－１ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質はまた、Ｔ細胞増殖のＴＧＦβ媒介抑制の逆転を必要とする患者におけるＴ細胞増殖のＴＧＦβ媒介抑制を逆転させるための方法においても使用される。図中の標的化された構築物のいずれも、特定の用途のＸＥＮＰ３２４３５と共に、本出願において用途が見出され得る。

別の態様では、Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３の発現レベルの低下を必要とする患者において、Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３の発現レベルを低下させる方法であって、患者に、治療有効量のＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を投与することからなる方法が本明細書において提供され、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）バリアントＩＬ－１５タンパク質；ｉｉ）第１のドメインリンカー；及びｉｉｉ）ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む、第１のモノマー；並びに（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；ｉｉ）第２のドメインリンカー；及びｉｉｉ）ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む、第２のモノマーを含む。

いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のバリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と、Ｎ１Ｄ；Ｎ４Ｄ；Ｄ８Ｎ；Ｄ３０Ｎ；Ｄ６１Ｎ；Ｅ６４Ｑ；Ｎ６５Ｄ；Ｑ１０８Ｅ；Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ；Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ４Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ；Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ；Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ；Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ；Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｅ６４Ｑ；Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と、Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ；及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５融合タンパク質は、配列番号３１９のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ある特定の実施形態において、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ＥＵナンバリングによる）を含む。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、図１１５Ａ～図１１５ＣのＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６７、ＸＥＮＰ３１９６８、ＸＥＮＰ３１９６９、ＸＥＮＰ３１９７０、ＸＥＮＰ３１９７１、ＸＥＮＰ３１９７２及びＸＥＮＰ３１９７３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６９である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９７２である。

いくつかの実施形態では、患者は、投与後に非抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖集団を有する。

いくつかの実施形態では、患者は、投与後に活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞の増殖集団を有する。

いくつかの実施形態では、患者は、投与後にエフェクターメモリＴ細胞に対するＴｒｅｇの比（Ｔｒｅｇ／Ｔ_ＥＭ）が増加している。

本発明の任意の実施形態では、患者はがんを有する。

有用な非標的ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、２０１６年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４０８，６５５号；２０１６年１１月１日に出願された米国仮出願第６２／４１６，０８７号；２０１７年１月６日に出願された米国仮出願第６２／４４３，４６５号；２０１７年３月２８日に出願された米国仮出願第６２／４７７，９２６号；２０１７年１０月１６日に出願された米国特許出願公開第２０１８／０１１８８０５号；２０１７年１０月１６日に出願された国際公開第２０１８０７１９１９号；２０１８年４月１８日に出願された米国仮出願第６２／６５９，５６３号；２０１８年６月１２日に出願された米国仮出願第６２／６８４，１４３号；２０１８年８月２９日に出願された米国仮出願第６２／７２４，３９６号；２０１８年１１月７日に出願された米国仮出願第６２／７５６，８００号；２０１９年４月１８日に出願された米国特許出願第１６／３８８，１７４号；及び２０１９年４月１８日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／２８１０７号に詳細に記載されており、特に、その中の図面、説明文、配列表及び特許請求の範囲を参照して、開示はその全体が参照により組み込まれる。

Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３の発現レベルの低下を必要とする患者においてＴ細胞におけるＦＯＸＰ３の発現レベルを低下させるのに使用するための特に有用な非標的ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸｍＡｂ２４３０６（「ＸＥＮＰ２４３０６」としても知られる）であり、その配列は図２０に示されている。

さらに、標的化ＩＬ－１５／Ｒα Ｘ ＰＤ－１ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質はまた、Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３の発現レベルの低下を必要とする患者においてＴ細胞におけるＦＯＸＰ３の発現レベルを低下させるための方法においても使用される。図中の標的化された構築物のいずれも、特定の用途のＸＥＮＰ３２４３５と共に、本出願において用途が見出され得る。

さらに別の態様では、がんを有する患者において活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞を増殖させるための方法であって、患者に、治療有効量のＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を投与することからなる方法が本明細書において提供され、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）バリアントＩＬ－１５タンパク質；ｉｉ）第１のドメインリンカー；及びｉｉｉ）ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む、第１のモノマー；並びに（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；ｉｉ）第２のドメインリンカー；及びｉｉｉ）ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む、第２のモノマーを含む。

いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のバリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と、Ｎ１Ｄ；Ｎ４Ｄ；Ｄ８Ｎ；Ｄ３０Ｎ；Ｄ６１Ｎ；Ｅ６４Ｑ；Ｎ６５Ｄ；Ｑ１０８Ｅ；Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ；Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ；Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ４Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ；Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ；Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ；Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ；Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｅ６４Ｑ；Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ；及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と、Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ；Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ；Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ；及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５タンパク質は、配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＩＬ－１５融合タンパク質は、配列番号３１９のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ある特定の実施形態において、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ＥＵナンバリングによる）を含む。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、図１１５Ａ～図１１５ＣのＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６７、ＸＥＮＰ３１９６８、ＸＥＮＰ３１９６９、ＸＥＮＰ３１９７０、ＸＥＮＰ３１９７１、ＸＥＮＰ３１９７２及びＸＥＮＰ３１９７３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９６９である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸＥＮＰ３１９７２である。

いくつかの実施形態では、活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞はＦＯＸＰ３^ｌｏＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ４^＋Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態では、活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞はＣＣＲ４発現が低下しているか、又はＣＣＲ４^ｌｏ／－である。

いくつかの実施形態では、患者は、投与後にエフェクターメモリＴ細胞に対するＴｒｅｇの比（Ｔｒｅｇ／Ｔ_ＥＭ）が増加している。

有用な非標的ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、２０１６年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４０８，６５５号；２０１６年１１月１日に出願された米国仮出願第６２／４１６，０８７号；２０１７年１月６日に出願された米国仮出願第６２／４４３，４６５号；２０１７年３月２８日に出願された米国仮出願第６２／４７７，９２６号；２０１７年１０月１６日に出願された米国特許出願公開第２０１８／０１１８８０５号；２０１７年１０月１６日に出願された国際公開第２０１８０７１９１９号；２０１８年４月１８日に出願された米国仮出願第６２／６５９，５６３号；２０１８年６月１２日に出願された米国仮出願第６２／６８４，１４３号；２０１８年８月２９日に出願された米国仮出願第６２／７２４，３９６号；２０１８年１１月７日に出願された米国仮出願第６２／７５６，８００号；２０１９年４月１８日に出願された米国特許出願第１６／３８８，１７４号；及び２０１９年４月１８日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／２８１０７号に詳細に記載されており、特に、その中の図面、説明文、配列表及び特許請求の範囲を参照して、開示はその全体が参照により組み込まれる。

活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を必要とする患者において活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞を増殖させるのに使用するための特に有用な非標的ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＸｍＡｂ２４３０６（「ＸＥＮＰ２４３０６」としても知られる）であり、その配列は図２０に示されている。

さらに、標的化ＩＬ－１５／Ｒα Ｘ ＰＤ－１ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質はまた、活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を必要とする患者において活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞を増殖させるための方法においても使用される。図中の標的化された構築物のいずれも、特定の用途のＸＥＮＰ３２４３５と共に、本出願において用途が見出され得る。
ＶＩＩ．本発明の核酸

本発明はさらに、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸組成物（又は、単量体Ｆｃドメインタンパク質の場合、それらをコードする核酸も）を提供する。

当業者によって理解されるように、核酸組成物は、ヘテロ二量体ＩＬ－１５／ＲαＦｃ融合タンパク質のフォーマットに依存する。したがって、例えば、フォーマットが３つのアミノ酸配列を必要とする場合、３つの核酸配列を発現のために１つ以上の発現ベクターに組み込むことができる。同様に、いくつかのフォーマットでは、２つの核酸のみが必要である。同様に、それらを１つ又は２つの発現ベクターに入れることができる。

当該分野で公知であるように、本発明の成分をコードする核酸は、当該分野で公知であり、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を産生するために使用される宿主細胞に応じて、発現ベクターに組み込むことができる。一般に、核酸は、任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択マーカー、リボソーム結合部位、誘導物質など）に作動可能に連結される。発現ベクターは、染色体外ベクター又は組み込みベクターであり得る。

次いで、本発明の核酸及び／又は発現ベクターは、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び／又は真菌細胞を含む当技術分野で周知の任意の数の異なるタイプの宿主細胞に形質転換され、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）とともに、多くの実施形態で使用が見出される。

いくつかの実施形態では、各モノマーをコードする核酸は、フォーマットに応じて適用可能であるように、それぞれ単一の発現ベクター内に、一般に異なる又は同じプロモーター制御下で含有される。本発明における特定の使用の実施形態では、これらの２つ又は３つの核酸のそれぞれは、異なる発現ベクターに含まれる。

本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、当技術分野で周知の発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦産生されると、イオン交換クロマトグラフィ工程を含む伝統的な融合タンパク質又は抗体精製工程が行われる。本明細書で論じるように、２つのモノマーのｐＩが少なくとも０．５異なることにより、イオン交換クロマトグラフィ若しくは等電点電気泳動又は等電点に敏感な他の方法による分離が可能になり得る。すなわち、各モノマーが異なるｐＩを有し、ヘテロ二量体も異なるｐＩを有するように、各モノマーの等電点（ｐＩ）を変化させるｐＩ置換を含めることにより、ヘテロ二量体の等電精製（例えば、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム）が容易になる。これらの置換はまた、精製後の任意の混入ホモ二量体（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ及び分析ＩＥＸカラム）の決定及び監視に役立つ。
ＶＩＩＩ．二重特異性免疫チェックポイント抗体ｘ ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体免疫調節融合タンパク質の生物学的及び生化学的機能性

一般に、本発明のＦｃ融合タンパク質は、がんを有する患者に投与され、有効性は、本明細書に記載のいくつかの方法で評価される。したがって、がん負荷、腫瘍の大きさ、転移の存在又は程度の評価などの標準的な有効性アッセイを実行することができるが、免疫腫瘍の処置は、免疫状態評価に基づいて評価することもできる。これは、インビトロアッセイ及びインビボアッセイの両方を含むいくつかの方法で行うことができる。例えば、免疫状態（例えば、ｉｐｉ処置後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在）の変化の評価を、腫瘍負荷量、大きさ、浸潤性、ＬＮの関与、転移などの「旧式」測定と併せて行うことができる。したがって、以下のいずれか又は全てを評価することができる。ＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化又は増殖、ＣＤ８^＋Ｔ（ＣＴＬ）細胞の活性化又は増殖、ＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介性細胞傷害活性及び／又はＣＴＬ媒介性細胞枯渇、ＮＫ細胞活性及びＮＫ媒介性細胞枯渇に対する融合タンパク質の阻害効果、Ｔｒｅｇ細胞の分化及び増殖、Ｔｒｅｇ又は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）媒介性免疫抑制又は免疫寛容に対する融合タンパク質の増強効果、並びに／あるいは免疫細胞による炎症促進性サイトカイン産生、例えばＴ細胞又は他の免疫細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－α産生に対する融合タンパク質の効果。

いくつかの実施形態では、処置の評価は、例えばＣＦＳＥ希釈法、免疫エフェクター細胞のＫｉ６７細胞内染色、及び^３Ｈ－チミジン取り込み法を使用して、免疫細胞増殖を評価することによって行われる。

いくつかの実施形態では、処置の評価は、以下の１つ又は複数を含む活性化関連マーカーの遺伝子発現の増加又はタンパク質レベルの増加を評価することによって行われる：ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、及びＣＤ１０７Ａの表面発現によって測定される細胞脱顆粒。

一般に、遺伝子発現アッセイは、当技術分野で公知のように行われる。

一般に、タンパク質発現測定も、当技術分野で公知のように同様に行われる。

いくつかの実施形態では、処置の評価は、酵素活性（プロテアーゼ活性を含む）、細胞膜透過性、細胞接着、ＡＴＰ産生、補酵素産生、及びヌクレオチド取り込み活性などの多数の細胞パラメータを推定することによって、標的細胞生存率検出によって測定される細胞傷害活性を評価することによって行われる。これらのアッセイの具体例としては、限定されないが、トリパンブルー又はＰＩ染色、^５１Ｃｒ又は^３５Ｓ放出法、ＬＤＨ活性、ＭＴＴ及び／又はＷＳＴアッセイ、カルセイン－ＡＭアッセイ、発光ベースのアッセイなどが挙げられる。

いくつかの実施形態では、処置の評価は、サイトカイン産生によって測定されるＴ細胞活性を評価し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３を含むがこれらに限定されないサイトカインを使用して、周知の技術を使用して培養上清中の細胞内で測定することによって行われる。

したがって、処置の評価は、以下のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して行うことができる。（ｉ）免疫応答の増加、（ｉｉ）αβ及び／又はγδ Ｔ細胞の活性化の増加、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加、（ｉｖ）ＮＫ及び／又はＮＫＴ細胞活性の増加、（ｖ）αβ及び／又はγδ Ｔ細胞抑制の緩和、（ｖｉ）炎症促進性サイトカイン分泌の増加、（ｖｉｉ）ＩＬ－２分泌の増加；（ｖｉｉｉ）インターフェロン－γ産生の増加、（ｉｘ）Ｔｈ１応答の増加、（ｘ）Ｔｈ２応答の減少、（ｘｉ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくとも１つの細胞数及び／又は活性の減少又は排除。
Ａ．競合的結合を測定するためのアッセイ

一般に、本明細書に記載されるようなエピトープ・ビニング・アッセイ、並びに当技術分野で公知のような他の競合阻害アッセイを実行して、ＮＣＰＤ－１ ＦｖがＰＤ－１への結合について承認された抗体と競合するかどうかを決定することができる。エピトープ・ビニングは、抗体をペアワイズのコンビナトリアル様式で試験するために競合免疫アッセイを使用するプロセスであり、同じ結合領域、すなわち、抗原の同じ又は密接に関連するエピトープについて競合する抗体は、ビンに一緒にグループ化される。したがって、ニボルマブ及び／又はペンブロリズマブとは異なるエピトープにビニング（ｂｉｎｓ ｔｏ）する抗体は、ニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと競合しないと考えられる。

競合しない抗体は、試験されている抗体又は免疫学的に機能的なフラグメントが共通の抗原への参照抗体の特異的結合を防止又は阻害しないアッセイによって決定され得る。典型的には、そのようなアッセイは、固体表面又は細胞に結合した精製抗原（例えば、ＰＤ－１又はそのドメイン若しくはフラグメント）の使用を含む。競合的阻害は、第２の抗体の存在下で固体表面又は細胞に結合した第１の抗体の量を決定することによって測定される。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、競合抗体は、共通の抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％又はそれ以上阻害される。逆に、参照抗体が結合する場合、参照抗体は、好ましくは、続いて添加される試験抗体（すなわち、ＰＤ－１抗体）の結合を少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例において、試験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％又はそれ以上阻害される。

一般に、ビニング又は競合的結合は、当技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イムノアッセイ、例えば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫ラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ及びプロテインＡイムノアッセイを用いて決定され得る。そのようなイムノアッセイは日常的であり、当技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ，（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。さらに、交差ブロッキングアッセイを使用することができる（例えば、国際公開第２００３／４８７３１号及びＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅを参照）。

競合的阻害（したがって、「ビン」）を決定するために使用される他の技術には、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴；例えばＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いたバイオレイヤー干渉法；又は、例えばＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はマルチプレックスＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用するフローサイトメトリビーズアレイが含まれる。バイオレイヤー干渉法を使用して競合結合を決定するための１つの特定の方法は、本明細書の実施例２及び７に提供されている。

Ｌｕｍｉｎｅｘは、大規模な多重化抗体ペアリングを可能にするビーズベースの免疫アッセイのプラットフォームである。このアッセイは、標的抗原に対する抗体対の同時結合パターンを比較する。対の一方の抗体（捕捉ｍＡｂ）はＬｕｍｉｎｅｘビーズに結合され、各捕捉ｍＡｂは異なる色のビーズに結合される。他方の抗体（検出ｍＡｂ）は蛍光シグナル（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ））に結合する。このアッセイは、抗原に対する抗体の同時結合（ペアリング）を分析し、類似のペアリングプロファイルを有する抗体を一緒にグループ化する。検出ｍＡｂ及び捕捉ｍＡｂの同様のプロファイルは、２つの抗体が同じ又は密接に関連するエピトープに結合することを示す。一実施形態において、ペアリングのプロファイルは、試験される抗体のパネル上の任意の特定の抗体と最も密接に相関する抗体を同定するためにピアソン相関係数を使用して決定することができる。実施形態では、抗体対のピアソン相関係数が少なくとも０．９である場合、試験／検出ｍＡｂは、参照／捕捉ｍＡｂと同じビンにあると決定される。他の実施形態では、ピアソンの相関係数は、少なくとも０．８、０．８５、０．８７又は０．８９である。さらなる実施形態では、ピアソンの相関係数は、少なくとも０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９又は１である。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイから得られたデータを分析する他の方法は、米国特許第８，５６８，９９２号に記載されている。Ｌｕｍｉｎｅｘが１００種類の異なるビーズ（又はそれ以上）を同時に分析する能力は、ほぼ無制限の抗原及び／又は抗体表面を同時に提供し、バイオセンサーアッセイ（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）に対し、抗体エピトープのプロファイリングにおけるスループット及び分解能の改善をもたらす。

同様に、表面プラズモン共鳴を含むビニング技術は、本発明と適合性である。本明細書で使用される場合、「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムの特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システムなどの市販の装置を使用して、選択された抗体が定義された抗原への結合について互いに競合するかどうかを容易に決定することができる。

他の実施形態において、試験抗体が参照抗体と結合について「競合する」かどうかを決定するために使用され得る技術は、「バイオレイヤー干渉法」（２つの表面：バイオセンサーチップ上の固定化タンパク質の層及び内部参照層から反射された白色光の干渉パターンを分析する光学分析技術）である。バイオセンサーチップに結合する分子の数が変化すると、リアルタイムで測定できる干渉パターンのシフトが生じる。このようなバイオレイヤー干渉法アッセイは、以下のようにＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ装置を使用して行うことができる。参照抗体（Ａｂ１）を抗マウス捕捉チップ上に捕捉し、次いで、高濃度の非結合抗体を使用してチップをブロックし、ベースラインを収集する。次いで、単量体の組換え標的タンパク質を特異的抗体（Ａｂ１）によって捕捉し、チップを、対照として同じ抗体（Ａｂ１）を含むウェル又は異なる試験抗体（Ａｂ２）を含むウェルに浸漬する。結合レベルを対照Ａｂ１と比較することによって決定して、さらなる結合が起こらない場合、Ａｂ１及びＡｂ２は「競合」抗体であると決定される。Ａｂ２とのさらなる結合が観察される場合、Ａｂ１及びＡｂ２は互いに競合しないと決定される。このプロセスは、固有のビンを表す９６ウェルプレート内の抗体の全列を使用して、固有の抗体の大きなライブラリをスクリーニングするために拡大することができる。複数の実施形態において、試験抗体は、参照抗体が共通の抗原に対する試験抗体の特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する場合、参照抗体と競合する。他の実施形態では、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％又はそれ以上阻害される。
Ｂ．有効性を測定するためのアッセイ

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化は、当技術分野で公知の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して評価される。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、異なる因子のリン酸化若しくは脱リン酸化によって、又は他の翻訳後修飾を測定することによって測定される免疫応答の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばサイトカイン分泌によって、又は増殖によって、又は例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現の変化によって測定されるαβ及び／又はγδ Ｔ細胞の活性化の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばがん細胞などの標的細胞の直接死滅によって、又はサイトカイン分泌によって、又は増殖によって、又は例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現の変化によって測定される細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばがん細胞などの標的細胞の直接死滅によって、又はサイトカイン分泌によって、又は例えばＣＤ１０７ａなどの活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＮＫ及び／又はＮＫＴ細胞活性の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばサイトカイン分泌によって、又は増殖によって、又は例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現の変化によって測定されるαβ及び／又はγδ Ｔ細胞抑制の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＬｕｍｉｎｅｘによって、又はマルチプレックスビーズに基づく方法によって、又は細胞内染色及びＦＡＣＳ分析によって、又はＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定される炎症促進性サイトカイン分泌における増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＬｕｍｉｎｅｘによって、又はマルチプレックスビーズに基づく方法によって、又は細胞内染色及びＦＡＣＳ分析によって、又はＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定されるＩＬ－２分泌における増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＬｕｍｉｎｅｘによって、又はマルチプレックスビーズに基づく方法によって、又は細胞内染色及びＦＡＣＳ分析によって、又はＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定されるインターフェロンγ産生における増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばサイトカイン分泌によって、又は活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ１応答の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばサイトカイン分泌によって、又は活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ２応答の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばフローサイトメトリ又はＩＨＣによって測定される制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくとも１つの細胞数及び／又は活性を増加又は減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばフローサイトメトリ又はＩＨＣによって測定されるＭ２マクロファージ細胞数の増加又は減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばサイトカイン分泌によって、又は活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＭ２マクロファージの腫瘍形成促進活性の増加又は減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばフローサイトメトリ又はＩＨＣによって測定されるＮ２好中球増加の増加又は減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばサイトカイン分泌によって、又は活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＮ２好中球の腫瘍形成促進活性の増加又は減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばサイトカイン分泌によって、又は増殖によって、又は例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴ細胞活性化の阻害の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばがん細胞などの標的細胞の直接死滅によって、又はサイトカイン分泌によって、又は増殖によって、又は例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＣＴＬ活性化の阻害の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば活性化マーカーの発現の変化によって測定されるαβ及び／又はγδ Ｔ細胞の枯渇の増加又は減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばサイトカイン分泌によって、又は増殖によって、又は例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現の変化によって測定されるαβ及び／又はγδ Ｔ細胞応答の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばサイトカイン分泌によって、又は増殖によって、又は例えばＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７などの活性化マーカーの発現の変化によって測定される抗原特異的メモリ応答の刺激の活性化の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルシンＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、又は例えばＣＦＳＥ希釈若しくはヨウ化プロピジウム染色などのフローサイトメトリベースのアッセイによって測定されるがん細胞のアポトーシス又は溶解の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルシンＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、又は例えばＣＦＳＥ希釈若しくはヨウ化プロピジウム染色などのフローサイトメトリベースのアッセイによって測定されるがん細胞の細胞傷害効果又は細胞増殖抑制効果の刺激の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルシンＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、又は例えばＣＦＳＥ希釈若しくはヨウ化プロピジウム染色などのフローサイトメトリベースのアッセイによって測定されるがん細胞の直接的な死滅の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばサイトカイン分泌によって、又は増殖によって、又は活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ１７活性の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルシンＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、又は例えばＣＦＳＥ希釈若しくはヨウ化プロピジウム染色などのフローサイトメトリベースのアッセイによって測定される補体依存性細胞傷害性及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性の誘導の増加又は減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、Ｔ細胞活性化は、例えばがん細胞などの標的細胞の直接死滅によって、又はサイトカイン分泌によって、又は増殖によって、又は例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴ細胞の場合、増殖、活性化の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ１）、細胞傷害性（標的細胞を死滅させる能力）及びサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７Ａ）の増加は、がん細胞の死滅の増強と一致する免疫調節を示す。

一実施形態では、ＮＫ細胞活性化は、例えばがん細胞などの標的細胞の直接死滅によって、又はサイトカイン分泌によって、又は例えばＣＤ１０７ａなどの活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＮＫ細胞の場合、増殖、細胞傷害性（標的細胞を死滅させ、ＣＤ１０７ａ、グランザイム及びパーフォリンの発現を増加させる能力）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγ及びＴＮＦ）及び細胞表面受容体発現（例えば、ＣＤ２５）の増加は、がん細胞の死滅の増強と一致する免疫調節を示す。

一実施形態では、γδ Ｔ細胞活性化は、例えばサイトカイン分泌によって、又は増殖によって、又は活性化マーカーの発現の変化によって測定される。

一実施形態では、Ｔｈ１細胞活性化は、例えばサイトカイン分泌によって、又は活性化マーカーの発現の変化によって測定される。

活性又は応答の適切な増加（又は、上記に概説したように適宜、減少）は、参照試料又は対照試料、例えば本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体を含有しない試験試料のいずれかのシグナルに対し、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９８～９９％の増加である。同様に、参照試料又は対照試料と比較して少なくとも１、２、３、４又は５倍の増加が有効性を示す。
ＩＸ．チェックポイント遮断抗体

本明細書に記載される本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質は、チェックポイント遮断抗体を含む他の治療剤、例えば限定されないが、ＰＤ－１阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、又はそれらの組合せと組み合わされる。

下記で議論される抗体に加えて、さらなる開示が、組み合わせて使用するためにその全体が具体的にチェックポイント抗体の議論のために参照により組み込まれる米国特許出願第６２／７８４，３３４号に見出される。
Ａ．抗ＰＤ１抗体

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質は、チェックポイント遮断抗体、例えば抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせてがんを有する対象に投与することができる。

多くの態様において、ＰＤ－１阻害剤は、本明細書中に概説される抗ＰＤ－１非競合Ｆｖ配列と結合について競合しないものから選択される抗ＰＤ－１抗体である。特に使用されるのは、限定されないが、ニボルマブ及びペンブロリズマブを含む、米国又は海外でヒトにおける使用のために承認された抗ＰＤ－１抗体である。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はニボルマブである。ニボルマブの代替名としては、ＭＤＸ－１１０６、ＭＤＸ－１１０６－０４、ＯＮＯ－４５３８又はＢＭＳ－９３６５５８が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号９４６４１４－９４－４）である。ニボルマブは、ＰＤ１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）及びＰＤ１に特異的に結合する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８，００８，４４９号及び国際公開第２００６／１２１１６８号に開示されている。一実施形態では、ＰＤ－１の阻害剤はニボルマブであり、本明細書に開示される配列（又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば、指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上の配列）を有する。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はペンブロリズマブである。ペンブロリズマブ（ラムブロリズマブ、ＭＫ－３４７５、ＭＫ０３４７５、ＳＣＨ－９００４７５又はＫＥＹＴＲＵＤＡ^{（登録商標）}とも呼ばれる；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ－１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ－１抗体は、Ｈａｍｉｄ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６９（２）：１３４－４４、米国特許第８，３５４，５０９号及び国際公開第２００９／１１４３３５号に開示されている。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はピジリズマブである。ピジリズマブ（ＣＴ－０１１；Ｃｕｒｅ Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピジリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、米国特許第８，７４７，８４７号及び国際公開第２００９／１０１６１１号に開示されている。

他の抗ＰＤ１抗体としては、とりわけ、ＡＭＰ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、例えば、米国特許第８，６０９，０８９号、米国特許出願公開第２０１００２８３３０号及び／又は米国特許出願公開第２０１２０１１４６４９号に開示されている抗ＰＤ１抗体が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域に融合したＰＤ－Ｌｌ又はＰＤ－Ｌ２の細胞外又はＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤はＡＭＰ－２２４（Ｂ７－ＤＣＩｇ；Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ；例えば、国際公開第２０１０／０２７８２７号及び国際公開第２０１１／０６６３４２号に開）であり、ＰＤ－１とＢ７－Ｈ１との間の相互作用を遮断するＰＤ－Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体である。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体を、本発明のＩＬ－１５／Ｒα ｘ抗ＰＤ１ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と組み合わせて使用することができる。いくつかの抗ＰＤ－１抗体が存在し、それらとしては、限定されないが、２つの現在ＦＤＡ承認されている抗体、ペンブロリズマブ及びニボリズマブ、並びに限定されないが、チスレリズマブ、Ｓｙｍ０２１、ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｎｇｅｎｅｒｏｎにより開発）、ＪＮＪ－６３７２３２８３（Ｊ ａｎｄ Ｊにより開発）、ＳＨＲ－１２１０、ピジリズマブ、ＡＭＰ－２２４、ＭＥＤＩｏ６８０、ＰＤＲ００１及びＣＴ－００１、並びにＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔ．＆Ｏｎｃｏｌ．（２０１７）１０：１３６に概説されるその他のものを含む現在の臨床試験におけるものが挙げられ、その中の抗体は参照により明確に組み込まれる。
Ｂ．抗ＴＩＭ３抗体

本発明のＩＬ－１５／ＲαＸ［ＮＣ］ＰＤ－１ヘテロ二量体融合タンパク質はまた、抗ＴＩＭ－３抗体と同時投与され得る。例示的な非限定的な抗ＴＩＭ－３抗体分子は、参照によりその全体が組み込まれる、２０１５年８月６日に公開された「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ＴＩＭ－３ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題する米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号明細書に開示されている。

ＭＢＧ４５３、Ｓｙｍ０２３、ＢＧＢ－Ａ４２５及びＴＳＲ－０２２を含むがこれらに限定されない臨床開発中のいくつかのＴＩＭ－３抗体がある。

一実施形態では、抗ＴＩＭ－３抗体分子は、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２３のアミノ酸配列；又は米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１～４に記載されるアミノ酸配列；又は表１～４のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は上記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列を含む、少なくとも１つ又は２つの重鎖可変ドメイン（任意に定常領域を含む）、少なくとも１つ又は２つの軽鎖可変ドメイン（任意に定常領域を含む）、又は両方を含む。抗ＴＩＭ－３抗体分子は、任意に、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号に示される、重鎖、軽鎖、又はその両方からのリーダー配列又はそれと実質的に同一の配列を含む。

さらに別の実施形態では、抗ＴＩＭ－３抗体分子は、本明細書に記載の抗体、例えば、ＡＢＴＩＭ３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０４、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０５、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０６、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０７、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０８、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ０９、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１０、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１３、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１４、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１５、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１６、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１７、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１８、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ１９、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２０、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２１、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２２、ＡＢＴＩＭ３－ｈｕｍ２３のいずれかから選択される抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、又は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）；又は米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１～４に記載されるアミノ酸配列；又は表１～４のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は上記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列を含む。

さらに別の実施形態では、抗ＴＩＭ－３抗体分子は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１～４に示されるアミノ酸配列を含むか、又は表１～４に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、重鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、又は３つのＣＤＲ（又は集合的に全てのＣＤＲ）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つ又は複数（又は集合的に全てのＣＤＲ）は、表１～４に示されるアミノ酸配列又は表１～４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６又はそれ以上の変化、例えばアミノ酸の置換又は欠失を有する。

さらに別の実施形態では、抗ＴＩＭ－３抗体分子は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１～４に示されるアミノ酸配列を含むか、又は表１～４に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、軽鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、又は３つのＣＤＲ（又は集合的に全てのＣＤＲ）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つ又は複数（又は集合的に全てのＣＤＲ）は、表１～４に示されるアミノ酸配列又は表１～４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６又はそれ以上の変化、例えばアミノ酸の置換又は欠失を有する。ある特定の実施形態において、抗ＴＩＭ－３抗体分子は、軽鎖ＣＤＲ中の置換、例えば、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３中の１つ又は複数の置換を含む。

別の実施形態では、抗ＴＩＭ－３抗体分子は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１～４に示されるアミノ酸配列を含むか、又は表１～４に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＣＤＲ（又は集合的に全てのＣＤＲ）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つ又は複数（又は集合的に全てのＣＤＲ）は、表１～４に示されるアミノ酸配列又は表１～４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６又はそれ以上の変化、例えばアミノ酸の置換又は欠失を有する。
Ｃ．抗ＣＴＬＡ４抗体

本発明のＩＬ－１５／ＲαＸ［ＮＣ］ＰＤ－１ヘテロ二量体融合タンパク質はまた、抗ＣＴＬＡ－４抗体と同時投与され得る。本明細書に概説される併用療法で使用するのに適した抗ＣＴＬＡ－４抗体には、現在ＦＤＡによって承認されている１つの抗体イピリムマブ、及びＣＰ－６７５，２０６及びＡＧＥＮ－１８８４を含む開発中の他のいくつかが含まれるが、これらに限定されない。さらなる例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、トレメリムマブ（ファイザーから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、ＣＰ－６７５，２０６として知られていた）及びｄｉｍ（ＭＤＸ－０１０としても知られているＣＴＬＡ－４抗体、ＣＡＳ番号４７７２０２－００－９）が挙げられる。他の例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、例えば、米国特許第５，８１１，０９７号に開示されている。

一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、例えば、米国特許第５，８１１，０９７号、米国特許第７，６０５，２３８号、国際公開第００／３２２３１号及び国際公開第９７／２０５７４号に開示され、本明細書に開示される配列（又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば、指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上の配列）を有する、イピリムマブである。

一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、例えば、米国特許第６，６８２，７３６号及び国際公開第００／３７５０４号に開示され、本明細書に開示される配列（又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば、指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上の配列）を有する、トレメリムマブである。
Ｄ．抗ＰＤ－Ｌ１抗体

本発明のＩＬ－１５／ＲαＸ［ＮＣ］ＰＤ－１ヘテロ二量体融合タンパク質はまた、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と同時投与され得る。例示的な非限定的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体分子は、参照によりその全体が組み込まれる、２０１６年４月２１日に公開された「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ＰＤ－Ｌ１ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題する米国特許出願公開第２０１６／０１０８１２３号明細書に開示されている。

一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体分子は、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８－Ｃｌｏｎｅ－Ｋ、ＢＡＰ０５８－Ｃｌｏｎｅ－Ｌ、ＢＡＰ０５８－Ｃｌｏｎｅ－Ｍ、ＢＡＰ０５８－Ｃｌｏｎｅ－Ｎ、若しくはＢＡＰ０５８－Ｃｌｏｎｅ－Ｏのいずれかのアミノ酸配列；又は米国特許出願公開第２０１６／０１０８１２３号の表１に記載されるアミノ酸配列；又は表１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は上記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列を含む、少なくとも１つ又は２つの重鎖可変ドメイン（任意に定常領域を含む）、少なくとも１つ又は２つの軽鎖可変ドメイン（任意に定常領域を含む）、又は両方を含む。

さらに別の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体分子は、本明細書に記載の抗体、例えば、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５８－ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５８－Ｃｌｏｎｅ－Ｋ、ＢＡＰ０５８－Ｃｌｏｎｅ－Ｌ、ＢＡＰ０５８－Ｃｌｏｎｅ－Ｍ、ＢＡＰ０５８－Ｃｌｏｎｅ－Ｎ、若しくはＢＡＰ０５８－Ｃｌｏｎｅ－Ｏのいずれかから選択される抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、又は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）；又は米国特許出願公開第２０１６／０１０８１２３号の表１に記載されるアミノ酸配列；又は表１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は上記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は抗体分子である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ、ＭＤＸ－１１０５、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、又はＢＭＳ９３６５５９から選択される。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブである。アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ及びＡｔｅｚｏ（登録商標）とも呼ばれる；Ｒｏｃｈｅ）は、ＰＤ－Ｌ１に結合するモノクローナル抗体である。アテゾリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国特許第８，２１７，１４９号に開示されており、本明細書に開示される配列（又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％又はそれ以上同一の配列）を有する。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアベルマブである。アベルマブ（Ａ０９－２４６－２とも呼ばれる；Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ）は、ＰＤ－Ｌ１に結合するモノクローナル抗体である。アベルマブ及び他のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国特許第９，３２４，２９８号及び国際公開第２０１３／０７９１７４号に開示されており、本明細書に開示される配列（又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％又はそれ以上同一の配列）を有する。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はデュルバルマブである。デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６とも呼ばれる；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）は、ＰＤ－Ｌ１に結合するモノクローナル抗体である。デュルバルマブ及び他のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国特許第８，７７９，１０８号に開示されており、本明細書に開示される配列（又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％又はそれ以上同一の配列）を有する。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＢＭＳ－９３６５５９である。ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５とも呼ばれる；ＢＭＳ）は、ＰＤ－Ｌ１に結合するモノクローナル抗体である。ＢＭＳ－９３６５５９及び他のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号及び国際公開第２００７００５８７４号に開示されており、本明細書に開示される配列（又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％又はそれ以上同一の配列）を有する。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、本発明のＩＬ－１５／Ｒα ｘ抗ＰＤ１ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と組み合わせて使用することができる。現在ＦＤＡ承認されている３つの抗体、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブを含むいくつかの抗ＰＤ－Ｌ１抗体、並びに、限定されないがＬＹ３３００００５４及びＣＳ１００１並びにＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔ．＆Ｏｎｃｏｌ．（２０１７）１０：１３６に概説されるその他のものを含む現在の臨床試験におけるものが存在し、その中の抗体は参照により明確に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２阻害剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）と組み合わせて使用することができる。
Ｅ．抗ＴＩＧＩＴ抗体

本発明のＩＬ－１５／ＲαＸ［ＮＣ］ＰＤ－１ヘテロ二量体融合タンパク質はまた、抗ＴＩＧＩＴ抗体と同時投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体はＯＭＰ－３１３Ｍ３２である。ＯＭＰ－３１３Ｍ３２（ＯｎｃｏＭｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、ＴＩＧＩＴに結合するモノクローナル抗体である。ＯＭＰ－３１３Ｍ３２及び他のヒト化抗ＴＩＧＩＴ抗体は、米国特許出願公開第２０１６０３７６３６５号及び国際公開第２０１６１９１６４３号に開示されており、本明細書に開示される配列（又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％又はそれ以上同一の配列）を有する。

いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体はＢＭＳ－９８６２０７である。ＢＭＳ－９８６２０７（ＯＮＯ－４６８６とも呼ばれる；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＴＩＧＩＴに結合するモノクローナル抗体である。ＢＭＳ－９８６２０７及び他のヒト化抗ＴＩＧＩＴ抗体は、米国特許出願公開第２０１６０１７６９６３号及び国際公開第２０１６１０６３０２号に開示されており、本明細書に開示される配列（又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％又はそれ以上同一の配列）を有する。

いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体はＭＴＩＧ７１９２である。ＭＴＩＧ７１９２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、ＴＩＧＩＴに結合するモノクローナル抗体である。ＭＴＩＧ７１９２及び他のヒト化抗ＴＩＧＩＴ抗体は、米国特許出願公開第２０１７０８８６１３号、国際公開第２０１７０５３７４８号、及び国際公開第２０１６０１１２６４号に開示されており、本明細書に開示される配列（又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％又はそれ以上同一の配列）を有する。

いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体を、本発明のＩＬ－１５／Ｒα ｘ抗ＰＤ１ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質と組み合わせて使用することができる。臨床開発中のいくつかのＴＩＧＩＴ抗体、ＢＭＳ－９８６２０７、ＯＭＰ－３１３Ｍ３２及びＭＴＩＧ７１９２Ａがある。
Ｆ．抗ＬＡＧ－３抗体

本発明のＩＬ－１５／ＲαＸ［ＮＣ］ＰＤ－１ヘテロ二量体融合タンパク質はまた、抗ＬＡＧ－３抗体と同時投与され得る。例示的な非限定的な抗ＬＡＧ－３抗体分子は、参照によりその全体が組み込まれる、２０１５年９月１７日に公開された「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ＬＡＧ－３ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題する米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号明細書に開示されている。

一実施形態では、抗ＬＡＧ－３抗体分子は、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１８、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１９、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ２０、ｈｕＢＡＰ０５０（Ｓｅｒ）（例えば、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０１－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０２－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０３－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０４－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０５－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０６－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０７－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０８－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０９－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１０－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１１－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１２－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１３－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１４－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１５－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１８－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１９－Ｓｅｒ、又はＢＡＰ０５０－ｈｕｍ２０－Ｓｅｒ）、ＢＡＰ０５０－クローン－Ｆ、ＢＡＰ０５０－クローン－Ｇ、ＢＡＰ０５０－クローン－Ｈ、ＢＡＰ０５０－クローン－Ｉ、又はＢＡＰ０５０－クローン－Ｊのいずれかのアミノ酸配列；又は米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に記載されるか、又は表１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は上記の配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）の配列を含む、少なくとも１つ又は２つの重鎖可変ドメイン（任意に定常領域を含む）、少なくとも１つ又は２つの軽鎖可変ドメイン（任意に定常領域を含む）、又は両方を含む。

さらに別の実施形態では、抗ＬＡＧ－３抗体分子は、本明細書中に記載の抗体、例えば、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０１、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０２、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０３、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０４、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０５、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０６、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０７、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０８、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０９、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１０、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１１、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１２、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１３、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１４、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１５、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１６、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１７、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１８、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１９、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ２０、ｈｕＢＡＰ０５０（Ｓｅｒ）（例えば、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０１－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０２－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０３－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０４－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０５－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０６－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０７－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０８－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ０９－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１０－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１１－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１２－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１３－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１４－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１５－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１８－Ｓｅｒ、ＢＡＰ０５０－ｈｕｍ１９－Ｓｅｒ、又はＢＡＰ０５０－ｈｕｍ２０－Ｓｅｒ）、ＢＡＰ０５０－クローン－Ｆ、ＢＡＰ０５０－クローン－Ｇ、ＢＡＰ０５０－クローン－Ｈ、ＢＡＰ０５０－クローン－Ｉ、又はＢＡＰ０５０－クローン－Ｊのいずれかから選択される抗体；又は米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に記載されるか、又は表１のヌクレオチド配列によってコードされるか；又は上記の配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）の配列によってコードされる抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、又は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ－３抗体はＢＭＳ－９８６０１６である。ＢＭＳ－９８６０１６（ＢＭＳ９８６０１６とも呼ばれる；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＬＡＧ－３に結合するモノクローナル抗体である。ＢＭＳ－９８６０１６及び他のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体は、米国特許出願公開第２０１１／０１５０８９２号、国際公開第２０１０／０１９５７０号及び国際公開第２０１４／００８２１８号に開示されている。

いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体はＬＡＧ５２５である。ＬＡＧ５２５（ＩＭＰ７０１とも呼ばれる；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は、ＬＡＧ３に結合するモノクローナル抗体である。ＬＡＧ５２５及び他のヒト化抗ＬＡＧ３抗体は、米国特許第９，２４４，０５９号及び国際公開第２００８１３２６０１号に開示されており、本明細書に開示される配列（又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％又はそれ以上同一の配列）を有する。

他の例示的な抗ＬＡＧ－３抗体は、例えば、米国特許出願公開第２０１１１５０８９２号及び米国特許出願公開第２０１８０６６０５４号に開示されている。

いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ－３抗体を、本発明のＩＬ－１５／Ｒα ｘ抗ＰＤ１二官能性ヘテロ二量体融合タンパク質と組み合わせて使用することができる。リジェネロンによるＲＥＧＮ３７６７及びＴＳＲ－０３３（Ｔｅｓａｒｏ）を含むいくつかの抗ＬＡＧ－３抗体が臨床開発中である。
Ｘ．医薬製剤

本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃタンパク質の医薬製剤は、所望の純度を有するそのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を１つ又は複数の任意の薬学的に許容され得る担体と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。

本明細書の製剤はまた、処置される特定の適応症に必要に応じて２つ以上の活性成分を含んでもよく、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含んでもよい。例えば、限定されないが、ＰＤ－１阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、又はそれらの組合せなどのチェックポイント遮断抗体をさらに提供することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、チェックポイント遮断抗体はニボルマブ又はペンブロリズマブである。そのような有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。

インビボ投与に使用される製剤は一般に、滅菌される。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜によりフィルタにかけることによって、容易に達成され得る。
ＸＩ．治療方法及び組成物

一旦作製されると、本発明の組成物は、一般に、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の結合を用いてＴ細胞活性化を促進することによって（例えば、Ｔ細胞はもはや抑制されない）、がんを処置することによって、いくつかの腫瘍学的用途において用途が見出される。

したがって、本発明のヘテロ二量体Ｆｃタンパク質組成物は、これらのがんの処置に使用される。

本明細書で提供されるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のいずれも治療方法に使用され得る。

一態様では、医薬として使用するためのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が提供される。さらなる態様では、がんの処置に使用するためのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が提供される。ある特定の実施形態において、処置方法において使用するためのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が提供される。ある特定の実施形態において、本発明は、有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を個体に投与することを含む、がんを有する個体を処置する方法に使用するためのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供する。そのような一実施形態では、本方法は、例えば、以下に記載のような、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、本発明は、Ｔ細胞活性化の促進（例えば、Ｔ細胞はもはや抑制されない）に使用するためのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、個体におけるＴ細胞活性化を促進する（例えば、Ｔ細胞はもはや抑制されない）方法に使用するためのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、Ｔ細胞活性化を促進するために有効なヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を個体に投与することを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供する。上記の実施形態のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。

さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製におけるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の使用を提供する。一実施形態では、医薬は、がんの処置のためのものである。さらなる実施形態では、医薬は、がんを処置する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む方法における使用のためのものである。そのような一実施形態では、本方法は、例えば、以下に記載のような、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、医薬は、Ｔ細胞活性化を促進するため（例えば、Ｔ細胞はもはや抑制されない）のものである。さらなる実施形態では、医薬は、個体におけるＴ細胞活性化を促進する（例えば、Ｔ細胞はもはや抑制されない）方法において使用するためのものであり、Ｔ細胞活性化を促進するために有効な量の医薬を個体に投与することを含む。上記実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであってもよい。

さらなる態様において、本発明は、がんを処置するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、そのようながんを有する個体に、有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を投与することを含む。そのような一実施形態では、本方法は、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体へ投与することをさらに含む。上記実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであってもよい。

さらなる態様では、本発明は、個体においてＴ細胞活性化を促進する（例えば、Ｔ細胞はもはや抑制されない）方法を提供する。一実施形態では、本方法は、Ｔ細胞活性化を促進するために有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を個体に投与することを含む。一実施形態では、「個体」は、ヒトである。

更なる態様では、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかにおける使用のための、本明細書に提供されるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施形態では、医薬製剤は、本明細書で提供されるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のいずれかと、薬学的に許容され得る担体を含む。別の実施形態では、医薬製剤は、本明細書に提供されるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のうちのいずれかと、例えば、以下の記載される少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。

本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与されてもよい。ある特定の実施形態において、追加の治療剤は、チェックポイント遮断抗体、例えば、限定されないが、ＰＤ－１阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤又はそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、チェックポイント遮断抗体はニボルマブ又はペンブロリズマブである。

上述したそのような併用療法は、併用投与（ここでは、２つ以上の治療剤が同一又は別個の製剤中に含まれる）及び別個の投与を包含し、この場合、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与は、追加の治療剤又は薬剤の投与に先立って、同時に、及び／又はそれに続いて、行われ得る。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与及び追加の治療剤の投与は、互いの約一カ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に行われる。本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
Ａ．投与

これに関連して、本明細書で使用される「組み合わせた」投与は、２つの処置が障害による対象の苦痛の経過中に対象に送達されること、例えば、２つ以上の処置が、対象が障害と診断された後、障害が治癒若しくは排除される前、又は他の理由で処置が中止される前に送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、一方の処置の送達は、第２の処置の送達が開始されたときに依然として行われているので、投与に関して重複がある。これは、本明細書では「同時」又は「同時送達」と呼ばれることがある。他の実施形態では、一方の処置の送達は、他方の処置の送達が始まる前に終了する。いずれの場合のいくつかの実施形態では、併用投与のおかげで処置はより効果的である。例えば、第２の処置がより効果的であり、例えば、より少ない第２の処置で同等の効果が見られるか、又は第２の処置が、第１の処置がない場合に第２の処置を行った場合に見られるよりも大きな程度に症状を軽減するか、又は類似の状況が第１の処置で見られる。いくつかの実施形態では、送達は、症状又は障害に関連する他のパラメータの減少が、一方の処置を他方の非存在下で送達した場合に観察されるものよりも大きくなるようなものである。２つの処置の効果は、部分的に相加的であってもよく、完全に相加的であってもよく、又は相加的よりも大きいものであってもよい。送達は、送達される第１の処置の効果が、第２の処置が送達されるときに依然として検出可能であるようなものであり得る。
Ｂ．インビボ投与のための製剤

本発明の使用のためのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、良好な医療行為と一致する方法で調合され、投薬され（ｄｏｓｅｄ）、そして投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）であろう。これに関連して考慮すべき要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、当該疾患を予防又は処置するために現在使用されている１つ又は複数の試薬と一緒に製剤化されている必要はないが、任意に製剤化される。そのような他の試薬の有効量は、製剤中に存在するヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の量、障害又は処置のタイプ、及び上記の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同じ投薬量及び投与経路によって、又は本明細書に記載の投薬量の約１～９９％、又は適切であると経験的／臨床的に判断される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。

本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度を有する抗体を任意の薬学的に許容され得る担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］に一般的に概説される）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で貯蔵のために調製される。
Ｃ．投与様式

本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（及び任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって、例えば静脈内投与することができる。対象に応じて適切な投与経路及び投与スケジュールを決定することは当業者の範囲内である。

本明細書に開示されるＰＤ－１標的ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質及び本発明の化学療法剤は、ボーラスとしての静脈内投与又は一定期間にわたる連続注入などの公知の方法に従って、対象に投与される。
ＸＩＩ．製造物品

本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、組成物を含む容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質である。
ＸＩＩＩ．番号付けされた実施形態

本開示の特定の実施形態は、以下の番号が付けられた段落に記載されている。
Ａ１．抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物であって、
ａ）配列番号５と比較して、Ｗ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメイン；並びに
ｂ）可変軽ドメインであって、
ｉ）配列番号１６８；及び
ｉｉ）配列番号１６８と比較して、Ｎ２７ｄＨ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメイン；からなる群から選択される可変軽ドメイン
を含み、
上記ＡＢＤが、ヒトＰＤ－１に結合し、かつ、ニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと上記ヒトＰＤ－１との結合について競合しない、組成物。
Ａ２．上記バリアント重ドメインが、アミノ酸置換Ｆ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆを有し、上記バリアント軽ドメインが、アミノ酸置換Ｎ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔを有する、Ａ１に記載の組成物。
Ａ３．上記バリアント重ドメインが、Ｈ１．１７６、Ｈ１．１７７、Ｈ１．１７８、Ｈ１．１７９、Ｈ１．１８０、Ｈ１．１８１、Ｈ１．１８２、Ｈ１．１８３、Ｈ１．１８４、Ｈ１．１８５、Ｈ１．１８６、Ｈ１．１８７、Ｈ１．１８８、Ｈ１．１８９、Ｈ１．１９０、Ｈ１．１９１、Ｈ１．１９２、Ｈ１．１９３、Ｈ１．１９４、Ｈ１．１９５、Ｈ１．１９６、Ｈ１．１９７、Ｈ１．１９８、Ｈ１．１９９、Ｈ１．２００、Ｈ１．２０１、Ｈ１．２０２、Ｈ１．２０３、Ｈ１．２０４、Ｈ１．２０５、Ｈ１．２０６、Ｈ１．２０７、Ｈ１．２０８、Ｈ１．２０９、Ｈ１．２１０、Ｈ１．２１１、Ｈ１．２１２、Ｈ１．２１３、Ｈ１．２１４、Ｈ１．２１５、Ｈ１．２１６、Ｈ１．２１７、Ｈ１．２１８、Ｈ１．２１９、Ｈ１．２２０、Ｈ１．２２１、Ｈ１．２２２、Ｈ１．２２３及びＨ１．２２４からなる群から選択される、前述のＡ段落のいずれかに記載の組成物。
Ａ４．上記バリアント軽ドメインが、Ｌ１．１、Ｌ１．３、Ｌ１．４５、Ｌ１．１１７、Ｌ１．１２９、Ｌ１．１３５、Ｌ１．１３６及びＬ１．１４０からなる群から選択される、前述のＡ段落のいずれかに記載の組成物。
Ａ５．上記バリアント重ドメインがＨ１．１７６であり、上記バリアント軽ドメインがＬ１．１４０である、前述のＡ段落のいずれかに記載の組成物。
Ａ６．上記融合タンパク質がＸＥＮＰ３２４３５である、前述のＡ段落のいずれかに記載の組成物。
Ａ７．核酸組成物であって、
ａ）上述のＡクレームのいずれかに記載の上記可変軽ドメインをコードする第１の核酸；及び
ｂ）上述のＡクレームのいずれかに記載の上記可変重ドメインをコードする第２の核酸を含む、核酸組成物。
Ａ８．発現ベクター組成物であって、
ａ）クレームＡ７の上記第１の核酸を含む第１の発現ベクター；及び
ｂ）クレームＡ７の上記第２の核酸を含む第２の発現ベクター
を含む、発現ベクター組成物。
Ｂ１．配列番号２と比較してバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物であって、上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、組成物。
Ｂ２．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ及びＱ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換をさらに含む、段落Ｂ１に記載の組成物。
Ｂ３．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、前述のＢ段落のいずれかに記載の組成物。
Ｂ４．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、前述のＢ段落のいずれかに記載の組成物。
Ｂ５．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む、前述のＢ段落のいずれかに記載の組成物。
Ｂ６．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、前述のＢ段落のいずれかに記載の組成物
Ｂ７．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、前述のＢ段落のいずれかに記載の組成物。
Ｃ１．標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含む、第１のモノマー：
ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
ｉｉ）第１のドメインリンカー；
ｉｉｉ）バリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、該ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
を含み、
上記ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、ヒトＰＤ－１に結合し、かつ該ヒトＰＤ－１に関する結合についてニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと競合しない抗原結合ドメインを形成し、上記ＶＨは、配列番号５と比較して、Ｗ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメインであり、上記ＶＬドメインは、以下：
ｉ）配列番号１６８；及び
ｉｉ）配列番号１６８と比較して、Ｎ２７Ｄ－Ｈ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメイン；からなる群から選択される可変軽ドメイン
を含み、
Ｃ２．上記バリアント重ドメインが、Ｈ１．１７６、Ｈ１．１７７、Ｈ１．１７８、Ｈ１．１７９、Ｈ１．１８０、Ｈ１．１８１、Ｈ１．１８２、Ｈ１．１８３、Ｈ１．１８４、Ｈ１．１８５、Ｈ１．１８６、Ｈ１．１８７、Ｈ１．１８８、Ｈ１．１８９、Ｈ１．１９０、Ｈ１．１９１、Ｈ１．１９２、Ｈ１．１９３、Ｈ１．１９４、Ｈ１．１９５、Ｈ１．１９６、Ｈ１．１９７、Ｈ１．１９８、Ｈ１．１９９、Ｈ１．２００、Ｈ１．２０１、Ｈ１．２０２、Ｈ１．２０３、Ｈ１．２０４、Ｈ１．２０５、Ｈ１．２０６、Ｈ１．２０７、Ｈ１．２０８、Ｈ１．２０９、Ｈ１．２１０、Ｈ１．２１１、Ｈ１．２１２、Ｈ１．２１３、Ｈ１．２１４、Ｈ１．２１５、Ｈ１．２１６、Ｈ１．２１７、Ｈ１．２１８、Ｈ１．２１９、Ｈ１．２２０、Ｈ１．２２１、Ｈ１．２２２、Ｈ１．２２３及びＨ１．２２４からなる群から選択される、段落Ｃ１に記載の融合タンパク質。
Ｃ３．上記バリアント軽ドメインが、Ｌ１．１、Ｌ１．３、Ｌ１．４５、Ｌ１．１１７、Ｌ１．１２９、Ｌ１．１３５、Ｌ１．１３６及びＬ１．１４０からなる群から選択される、前述のＣ段落のいずれかに記載の融合タンパク質。
Ｃ４．上記バリアント重ドメインがＨ１．１７６であり、上記バリアント軽ドメインがＬ１．１４０である、前述のＣ段落のいずれかに記載の融合タンパク質。
Ｄ１．標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含む、第１のモノマー：
ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
ｉｉ）第１のドメインリンカー；
ｉｉｉ）配列番号２と比較して、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、バリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、該ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
を含み、
上記ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、ヒトＰＤ－１に結合し上記ヒトＰＤ－１に関する結合についてニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと競合しない抗原結合ドメインを形成する、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
Ｄ２．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、前述のＤ段落のいずれかに記載の融合タンパク質。
Ｄ３．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、前述のＤ段落のいずれかに記載の組成物。
Ｄ４．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む、前述のＤ段落のいずれかに記載の組成物。
Ｄ５．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、前述のＤ段落のいずれかに記載の組成物。
Ｄ６．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、前述のＤ段落のいずれかに記載の組成物。
Ｄ７．上記第１のドメインリンカーがＧＧＧＧＡである、前述のＤ段落のいずれかに記載の組成物。
Ｅ１．標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含む、第１のモノマー：
ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
ｉｉ）第１のドメインリンカー；
ｉｉｉ）配列番号２と比較して、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、バリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、該ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
を含み、
上記ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、ヒトＰＤ－１に結合し、かつ該ヒトＰＤ－１に関する結合についてニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと競合しない抗原結合ドメインを形成し、上記ＶＨは、配列番号５と比較して、Ｗ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメインであり、上記ＶＬドメインは、以下：
ｉ）配列番号１６８；及び
ｉｉ）配列番号１６８と比較して、Ｎ２７Ｄ－Ｈ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメイン；からなる群から選択される可変軽ドメイン
を含み、
上記バリアントＩＬ－１５タンパク質は、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
Ｅ２．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換をさらに含む、前述のＥ段落のいずれかに記載の融合タンパク質。
Ｅ３．上記バリアント重ドメインがＨ１．１７６であり、上記バリアント軽ドメインがＬ１．１４０である、前述のＥ段落のいずれかに記載の融合タンパク質。
Ｅ４．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む、前述のＥ段落のいずれかに記載の融合タンパク質。
Ｅ５．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、前述のＥ段落のいずれかに記載の融合タンパク質。
Ｅ６．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、前述のＥ段落のいずれかに記載の融合タンパク質。
Ｅ７．上記バリアント重ドメインがＨ１．１７６であり、上記バリアント軽ドメインがＬ１．１４０であり、上記バリアントＩＬ－１５タンパク質がアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、前述のＥ段落のいずれかに記載の融合タンパク質。
Ｅ８．上記バリアント重ドメインがＨ１．１７６であり、上記バリアント軽ドメインがＬ１．１４０であり、上記バリアントＩＬ－１５タンパク質がアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、前述のＥ段落のいずれかに記載の融合タンパク質。
Ｅ９．上記第１のドメインリンカーがＧＧＧＧＡを含む、前述のＥ段落のいずれかに記載の融合タンパク質。

本開示の特定の実施形態は、以下の番号が付けられた段落に記載されている。
１．標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含む、第１のモノマー：
ｉ）ＩＬ－１５／Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン；
ｉｉ）第１のドメインリンカー；
ｉｉｉ）ＩＬ－１５ドメイン；及び
ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、該ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
を含み、
上記ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、上記ＶＨは、配列番号５と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＦ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆアミノ酸置換を含むバリアント可変重ドメインであり；上記ＶＬは、配列番号１６８と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＮ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔを含むバリアント可変軽ドメインである、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
２．上記ＶＨが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、上記ＶＬが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、段落１に記載の融合タンパク質。
３．上記ＩＬ－１５ドメインが、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアントＩＬ－１５ドメインである、段落１又は２のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
４．上記ＩＬ－１５ドメインが、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａ、又はそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアントＩＬ－１５ドメインである、段落１～３のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
５．上記ＩＬ－１５ドメインが、アミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５ドメインである、段落１～４のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
６．第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、段落１～５のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
７．第１のモノマーが、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、段落１～６のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
８．標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
ａ）以下を含む第１のモノマー：
ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
ｉｉ）第１のドメインリンカー；
ｉｉｉ）配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、該ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
を含み、
上記ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成する、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
９．上記ＶＨが配列番号５のアミノ酸配列を含み、上記ＶＬが配列番号１６８のアミノ酸配列を含む、段落８に記載の融合タンパク質。
１０．上記ＶＨが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、上記ＶＬが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、段落８に記載の融合タンパク質。
１１．上記ＡＢＤが、ニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと上記ヒトＰＤ－１との結合について競合しない、段落８に記載の融合タンパク質。
１２．第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、段落８～１１のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
１３．第１のモノマーが、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、段落８～１２のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
１４．標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
ａ）以下を含む第１のモノマー：
ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
ｉｉ）第１のドメインリンカー；
ｉｉｉ）配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、該ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
を含み、
上記ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、上記ＶＨは、配列番号５と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＦ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆアミノ酸置換を含むバリアント可変重ドメインであり；上記ＶＬは、配列番号１６８と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＮ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔを含むバリアント可変軽ドメインである、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
１５．上記ＶＨが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、上記ＶＬが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、段落１４に記載の融合タンパク質。
１６．第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、段落１４又は１５に記載の融合タンパク質。
１７．第１のモノマーが、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、段落１４～１６のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
１８．段落１～１７のいずれか一つに記載の融合タンパク質であって、上記第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、融合タンパク質。
１９．ＥＵナンバリングで、上記第１のバリアントＦｃドメインがＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、上記第２のバリアントＦｃドメインがＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む、段落１８に記載の融合タンパク質。
２０．上記第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ独立して、ＥＵナンバリングで、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、段落１～１９のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
２１．第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む、段落２０に記載の融合タンパク質。
２２．上記第１のＦｃドメインが、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含む、段落１～２１のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
２３．第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む、段落１～２２のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
２４．第１のモノマーが配列番号２２５のアミノ酸配列を含み、上記第２のモノマーが配列番号２４４のアミノ酸配列を含み、上記第３のモノマーが配列番号１９６のアミノ酸配列を含む、段落１、８及び１４のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
２５．核酸組成物であって、
ａ）段落１～２４のいずれか一つに記載の上記第１のモノマーをコードする第１の核酸分子；
ｂ）段落１～２４のいずれか一つに記載の上記第２のモノマーをコードする第２の核酸分子；及び／又は
ｃ）段落１～２４のいずれか一つに記載の上記第３のモノマーをコードする第３の核酸分子
をそれぞれ含む、核酸組成物。
２６．発現ベクター組成物であって、
ａ）段落２５に記載の上記第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター；
ｂ）段落２５に記載の上記第２の核酸分子を含む第２の発現ベクター；及び／又は
ｃ）段落２５に記載の上記第３の核酸分子を含む第３の発現ベクター
を含む、発現ベクター組成物。
２７．段落２５に記載の上記第１の核酸分子、段落２５に記載の上記第２の核酸分子、及び段落２５に記載の上記第３の核酸分子を含む、発現ベクター。
２８．段落２６に記載の発現ベクター組成物又は段落２７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
２９．２８に記載の宿主細胞を、上記融合タンパク質が産生される条件下で培養すること、及び上記融合タンパク質を回収することを含む、融合タンパク質を作製する方法。
３０．標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含む、第１のモノマー：
ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
ｉｉ）第１のドメインリンカー；
ｉｉｉ）配列番号２と比較して、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、バリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、該ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
を含み、
上記ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメインを形成し、上記ＶＨは、配列番号５と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＷ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメインであり、上記ＶＬドメインは、以下：
ｉ）配列番号１６８；及び
ｉｉ）配列番号１６８と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｎ２７ｄＨ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメイン；からなる群から選択され、
上記バリアントＩＬ－１５タンパク質は、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
３１．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換をさらに含む、段落３０に記載の融合タンパク質。
３２．上記バリアント重ドメインが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、上記バリアント軽ドメインが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、段落３０又は３１に記載の融合タンパク質。
３３．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む、段落３０～３２のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
３４．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、段落３０～３３のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
３５．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、段落３０～３４のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
３６．上記バリアント重ドメインがＨ１．１７６であり、上記バリアント軽ドメインがＬ１．１４０であり、上記バリアントＩＬ－１５タンパク質がアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、段落３０～３５のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
３７．上記バリアント重ドメインがＨ１．１７６であり、上記バリアント軽ドメインがＬ１．１４０であり、上記バリアントＩＬ－１５タンパク質がアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、段落３０～３６のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
３８．上記第１のドメインリンカーがＧＧＧＧＡ（配列番号８）を含む、段落３０～３７のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
３９．第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、段落３０～３８のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
４０．第１のモノマーが、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、段落３０～３９のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
４１．段落３０～４０のいずれか一つに記載の融合タンパク質であって、上記第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、融合タンパク質。
４２．ＥＵナンバリングで、上記第１のバリアントＦｃドメインがＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、上記第２のバリアントＦｃドメインがＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む、段落４１に記載の融合タンパク質。
４３．上記第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ独立して、ＥＵナンバリングで、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、段落３０～４２のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
４４．第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む、段落４３に記載の融合タンパク質。
４５．上記第１のＦｃドメインが、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含む、段落３０～４４のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
４６．第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む、段落３０～４５のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
４７．第１のモノマーが、配列番号２２５のアミノ酸配列を含む、段落３０～４６のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
４８．第２のモノマーが、配列番号２４４のアミノ酸配列を含む、段落３０～４７のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
４９．第３のモノマーが、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む、段落３０～４８のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
５０．第１のモノマーが配列番号２２５のアミノ酸配列を含み、第２のモノマーが配列番号２４４のアミノ酸配列を含み、第３のモノマーが配列番号１９６のアミノ酸配列を含む、段落３０～４９のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
５１．核酸組成物であって、
ａ）段落３０～５０のいずれか一つに記載の上記第１のモノマーをコードする第１の核酸分子；
ｂ）段落３０～５０のいずれか一つに記載の上記第２のモノマーをコードする第２の核酸分子；及び／又は
ｃ）段落３０～５０のいずれか一つに記載の上記第３のモノマーをコードする第３の核酸分子
を含む、核酸組成物。
５２．発現ベクター組成物であって、
ａ）段落５１に記載の上記第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター；
ｂ）段落５１に記載の上記第２の核酸分子を含む第２の発現ベクター；及び／又は
ｃ）段落５１に記載の上記第３の核酸分子を含む第３の発現ベクター
を含む、発現ベクター組成物。
５３．段落５１に記載の上記第１の核酸分子、段落５１に記載の上記第２の核酸分子、及び段落５１に記載の上記第３の核酸分子を含む、発現ベクター。
５４．段落５２に記載の発現ベクター組成物又は段落５３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
５５．段落５４に記載の宿主細胞を、上記融合タンパク質が産生される条件下で培養すること、及び上記融合タンパク質を回収することを含む、融合タンパク質を作製する方法。
５６．標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含む、第１のモノマー：
ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
ｉｉ）第１のドメインリンカー；
ｉｉｉ）バリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、該ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
を含み、
上記ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメインを形成し、上記ＶＨは、配列番号５と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＷ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメインであり、上記ＶＬドメインは、以下：
ｉ）配列番号１６８；及び
ｉｉ）配列番号１６８と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｎ２７ｄＨ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメイン
からなる群から選択される、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
５７．上記バリアント重ドメインが、Ｈ１．１７６、Ｈ１．１７７、Ｈ１．１７８、Ｈ１．１７９、Ｈ１．１８０、Ｈ１．１８１、Ｈ１．１８２、Ｈ１．１８３、Ｈ１．１８４、Ｈ１．１８５、Ｈ１．１８６、Ｈ１．１８７、Ｈ１．１８８、Ｈ１．１８９、Ｈ１．１９０、Ｈ１．１９１、Ｈ１．１９２、Ｈ１．１９３、Ｈ１．１９４、Ｈ１．１９５、Ｈ１．１９６、Ｈ１．１９７、Ｈ１．１９８、Ｈ１．１９９、Ｈ１．２００、Ｈ１．２０１、Ｈ１．２０２、Ｈ１．２０３、Ｈ１．２０４、Ｈ１．２０５、Ｈ１．２０６、Ｈ１．２０７、Ｈ１．２０８、Ｈ１．２０９、Ｈ１．２１０、Ｈ１．２１１、Ｈ１．２１２、Ｈ１．２１３、Ｈ１．２１４、Ｈ１．２１５、Ｈ１．２１６、Ｈ１．２１７、Ｈ１．２１８、Ｈ１．２１９、Ｈ１．２２０、Ｈ１．２２１、Ｈ１．２２２、Ｈ１．２２３及びＨ１．２２４からなる群から選択される、段落５６に記載の融合タンパク質。
５８．上記バリアント軽ドメインが、Ｌ１．１、Ｌ１．３、Ｌ１．４５、Ｌ１．１１７、Ｌ１．１２９、Ｌ１．１３５、Ｌ１．１３６及びＬ１．１４０からなる群から選択される、段落５６又は５７に記載の融合タンパク質。
５９．上記バリアント重ドメインが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、上記バリアント軽ドメインが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、段落５６～５８のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
６０．第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、段落５６～５９のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
６１．第１のモノマーが、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、段落５６～６０のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
６２．段落５６～６１のいずれか一つに記載の融合タンパク質であって、上記第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、融合タンパク質。
６３．ＥＵナンバリングで、上記第１のバリアントＦｃドメインがＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、上記第２のバリアントＦｃドメインがＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む、段落６２に記載の融合タンパク質。
６４．上記第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ独立して、ＥＵナンバリングで、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、段落５６～６３のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
６５．第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む、段落６４に記載の融合タンパク質。
６６．上記第１のＦｃドメインが、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含む、段落５６～６５のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
６７．第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む、段落５６～６６のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
６８．核酸組成物であって、
ａ）段落５６～６７のいずれか一つに記載の上記第１のモノマーをコードする第１の核酸分子；
ｂ）段落５６～６７のいずれか一つに記載の上記第２のモノマーをコードする第２の核酸分子；及び／又は
ｃ）段落５６～６７のいずれか一つに記載の上記第３のモノマーをコードする第３の核酸分子
を含む、核酸組成物。
６９．発現ベクター組成物であって、
ａ）段落６８に記載の上記第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター；
ｂ）段落６８に記載の上記第２の核酸分子を含む第２の発現ベクター；及び／又は
ｃ）段落６８に記載の上記第３の核酸分子を含む第３の発現ベクター
を含む、発現ベクター組成物。
７０．段落６８に記載の上記第１の核酸分子、段落６８に記載の上記第２の核酸分子、及び段落６８に記載の上記第３の核酸分子を含む、発現ベクター。
７１．段落６９に記載の発現ベクター組成物又は段落７０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
７２．段落７１に記載の宿主細胞を、上記融合タンパク質が産生される条件下で培養すること、及び上記融合タンパク質を回収することを含む、融合タンパク質を作製する方法。
７３．標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含む、第１のモノマー：
ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
ｉｉ）第１のドメインリンカー；
ｉｉｉ）配列番号２と比較して、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、バリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、該ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
を含み、
上記ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、ヒトＰＤ－１に結合し上記ヒトＰＤ－１への結合についてニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと競合しない抗原結合ドメインを形成する、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
７４．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、段落７３に記載の融合タンパク質。
７５．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、段落７３又は７４に記載の融合タンパク質。
７６．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む、段落７３～７５のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
７７．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、段落７３～７６のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
７８．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、段落７３～７７のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
７９．上記第１のドメインリンカーがＧＧＧＧＡ（配列番号８）である、段落７３～７８のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
８０．第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、段落７３～７９のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
８１．第１のモノマーが、ＩＬ－１５ドメインと第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、段落７３～８０のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
８２．段落７３～８１のいずれか一つに記載の融合タンパク質であって、上記第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、融合タンパク質。
８３．ＥＵナンバリングで、上記第１のバリアントＦｃドメインがＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、上記第２のバリアントＦｃドメインがＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む、段落８２に記載の融合タンパク質。
８４．上記第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ独立して、ＥＵナンバリングで、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、段落７３～８３のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
８５．第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む、段落８４に記載の融合タンパク質。
８６．上記第１のＦｃドメインが、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含む、段落７３～８５のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
８７．第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む、段落７３～８６のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
８８．核酸組成物であって、
ａ）段落７３～８７のいずれか一つに記載の上記第１のモノマーをコードする第１の核酸分子；
ｂ）段落７３～８７のいずれか一つに記載の上記第２のモノマーをコードする第２の核酸分子；及び／又は
ｃ）段落７３～８７のいずれか一つに記載の上記第３のモノマーをコードする第３の核酸分子
を含む、核酸組成物。
８９．発現ベクター組成物であって、
ａ）段落８８に記載の上記第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター；
ｂ）段落８８に記載の上記第２の核酸分子を含む第２の発現ベクター；及び／又は
ｃ）段落８８に記載の上記第３の核酸分子を含む第３の発現ベクター
を含む、発現ベクター組成物。
９０．段落８８に記載の上記第１の核酸分子、段落８８に記載の上記第２の核酸分子、及び段落８８に記載の上記第３の核酸分子を含む、発現ベクター。
９１．段落８９に記載の発現ベクター組成物又は段落９０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
９２．段落９１に記載の宿主細胞を、上記融合タンパク質が産生される条件下で培養すること、及び上記融合タンパク質を回収することを含む、融合タンパク質を作製する方法。
９３．抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物であって、
ａ）配列番号５と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｗ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメイン；並びに
ｂ）可変軽ドメインであって、
ｉ）配列番号１６８；及び
ｉｉ）配列番号１６８と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｎ２７ｄＨ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメイン；からなる群から選択される可変軽ドメイン
を含み、
上記ＡＢＤがヒトＰＤ－１に結合する、組成物。
９４．上記バリアント重ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングで、アミノ酸置換Ｆ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆを有し、上記バリアント軽ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングでアミノ酸置換Ｎ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔを有する、段落９３に記載の組成物。
９５．上記バリアント重ドメインが、Ｈ１．１７６、Ｈ１．１７７、Ｈ１．１７８、Ｈ１．１７９、Ｈ１．１８０、Ｈ１．１８１、Ｈ１．１８２、Ｈ１．１８３、Ｈ１．１８４、Ｈ１．１８５、Ｈ１．１８６、Ｈ１．１８７、Ｈ１．１８８、Ｈ１．１８９、Ｈ１．１９０、Ｈ１．１９１、Ｈ１．１９２、Ｈ１．１９３、Ｈ１．１９４、Ｈ１．１９５、Ｈ１．１９６、Ｈ１．１９７、Ｈ１．１９８、Ｈ１．１９９、Ｈ１．２００、Ｈ１．２０１、Ｈ１．２０２、Ｈ１．２０３、Ｈ１．２０４、Ｈ１．２０５、Ｈ１．２０６、Ｈ１．２０７、Ｈ１．２０８、Ｈ１．２０９、Ｈ１．２１０、Ｈ１．２１１、Ｈ１．２１２、Ｈ１．２１３、Ｈ１．２１４、Ｈ１．２１５、Ｈ１．２１６、Ｈ１．２１７、Ｈ１．２１８、Ｈ１．２１９、Ｈ１．２２０、Ｈ１．２２１、Ｈ１．２２２、Ｈ１．２２３及びＨ１．２２４からなる群から選択される、段落９３又は９４に記載の組成物。
９６．上記バリアント軽ドメインが、Ｌ１．１、Ｌ１．３、Ｌ１．４５、Ｌ１．１１７、Ｌ１．１２９、Ｌ１．１３５、Ｌ１．１３６及びＬ１．１４０からなる群から選択される、段落９３～９５のいずれか一つに記載の組成物。
９７．上記バリアント重ドメインが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、上記バリアント軽ドメインが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、段落９３～９６のいずれか一つに記載の組成物。
９８．上記組成物が全長抗ＰＤ－１抗体を含む、段落９３～９７のいずれか一つに記載の組成物。
９９．上記組成物が融合タンパク質を含む、段落９３～９８のいずれか一つに記載の組成物。
１００．上記融合タンパク質がＸＥＮＰ３２４３５である、段落９９に記載の組成物。
１０１．核酸組成物であって、
ａ）段落９３～１００のいずれか一つに記載の上記可変軽ドメインをコードする第１の核酸分子；及び／又は
ｂ）段落９３～１００のいずれか一つに記載の上記可変重ドメインをコードする第２の核酸分子
を含む、核酸組成物。
１０２．発現ベクター組成物であって、
ａ）段落１０１に記載の上記第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター；及び／又は
ｂ）段落１０１に記載の上記第２の核酸分子を含む第２の発現ベクター
を含む、発現ベクター組成物。
１０３．段落１０１に記載の上記第１の核酸分子及び段落１０１に記載の上記第２の核酸分子を含む発現ベクター。
１０４．段落１０２に記載の発現ベクター組成物又は段落１０３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
１０５．抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物を作製する方法であって、上記融合タンパク質が産生される条件下で段落１０４に記載の宿主細胞を培養すること、及び上記融合タンパク質を回収することを含む、方法。
１０６．配列番号２と比較してバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物であって、上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、組成物。
１０７．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ及びＱ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換をさらに含む、段落１０６に記載の組成物。
１０８．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、段落１０６又は１０７に記載の組成物。
１０９．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、段落１０６～１０８のいずれか一つに記載の組成物。
１１０．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む、段落１０６～１０９のいずれか一つに記載の組成物。
１１１．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、段落１０６～１１０のいずれか一つに記載の組成物。
１１２．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、段落１０６～１１１のいずれか一つに記載の組成物。
１１３．段落１０６～１１２のいずれか一つに記載の上記バリアントＩＬ－１５タンパク質をコードする核酸分子を含む核酸組成物。
１１４．段落１１３に記載の上記核酸分子を含む発現ベクター。
１１５．段落１１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
１１６．バリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物を作製する方法であって、上記融合タンパク質が産生される条件下で段落１１５に記載の宿主細胞を培養すること、及び上記融合タンパク質を回収することを含む、方法。
１１７．ヘテロ二量体タンパク質であって、
ａ）以下を含む第１の融合タンパク質：
ｉ）配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５タンパク質；
ｉｉ）ドメインリンカー；及び
ｉｉｉ）第１のバリアントＦｃドメイン；並びに
ｂ）以下を含む第２の融合タンパク質：
ｉ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン；
ｉｉ）ドメインリンカー；及び
ｉｉｉ）第２のバリアントＦｃドメイン、
を含むヘテロ二量体タンパク質。
１１８．上記バリアントＩＬ－１５タンパク質が配列番号３１９のアミノ酸配列を含む、段落１１７に記載のヘテロ二量体タンパク質。
１１９．段落１１７又は１１８に記載のヘテロ二量体タンパク質であって、上記第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、ヘテロ二量体タンパク質。
１２０．ＥＵナンバリングで、上記第１のバリアントＦｃドメインがＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、上記第２のバリアントＦｃドメインがＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む、段落１１９に記載のヘテロ二量体タンパク質。
１２１．上記第１のバリアントＦｃドメイン及び第２のバリアントＦｃドメインが４２８Ｌ／４３４Ｓを含む、段落１１７～１２０のいずれか一つに記載の融合タンパク質。
１２２．上記第１の融合タンパク質が配列番号２０８のアミノ酸配列を含み、上記第２の融合タンパク質が配列番号９５のアミノ酸配列を含む、段落１１７に記載の融合タンパク質。
１２３．上記第１の融合タンパク質が配列番号２１１のアミノ酸配列を含み、上記第２の融合タンパク質が配列番号２０６のアミノ酸配列を含む、段落１１７に記載の融合タンパク質。
１２４．段落１～２４、３０～５０、５６～６７、及び７３～８７のいずれか一つに記載の融合タンパク質と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
１２５．段落９３～１００のいずれか一つに記載の抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
１２６．段落１０６～１１２のいずれか一つに記載のバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
１２７．段落１１７～１２３のいずれか一つに記載のヘテロ二量体タンパク質と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
１２８．治療有効量の、段落１～２４、３０～５０、５６～６７及び７３～８７のいずれか一つに記載の融合タンパク質又は段落１２４に記載の医薬組成物を、がんの処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法。
１２９．治療有効量のチェックポイント遮断抗体を投与することをさらに含む、段落１２８に記載の方法。
１３０．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１２９に記載の方法。
１３１．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１３０に記載の方法。
１３２．治療有効量の、段落９３～１００のいずれか一つに記載の抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物又は段落１２５に記載の医薬組成物を、がんの処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法。
１３３．治療有効量のチェックポイント遮断抗体を投与することをさらに含む、段落１３２に記載の方法。
１３４．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１３３に記載の方法。
１３５．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１３４に記載の方法。
１３６．治療有効量の、段落１０６～１１２のいずれか一つに記載のバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は段落１２６に記載の医薬組成物を、がんの処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法。
１３７．治療有効量のチェックポイント遮断抗体を投与することをさらに含む、段落１３６に記載の方法。
１３８．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１３７に記載の方法。
１３９．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１３８に記載の方法。
１４０．治療有効量の、段落１１７～１２３のいずれか一つに記載のヘテロ二量体タンパク質又は段落１２７に記載の医薬組成物を、がんの処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法。
１４１．治療有効量のチェックポイント遮断抗体を投与することをさらに含む、段落１４０に記載の方法。
１４２．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１４１に記載の方法。
１４３．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１４２に記載の方法。
１４４．段落１～２４、３０～５０、５６～６７及び７３～８７のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は段落１２４に記載の医薬組成物の、がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置のための医薬の製造における使用。
１４５．医薬が、治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与されるように製剤化される、段落１４４に記載の使用。
１４６．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１４５に記載の使用。
１４７．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１４６に記載の使用。
１４８．段落９３～１００のいずれか一つに記載の抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物又は段落１２４に記載の医薬組成物の、がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置のための医薬の製造における使用。
１４９．医薬が、治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与されるように製剤化される、段落１４８に記載の使用。
１５０．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１４９に記載の使用。
１５１．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１５０に記載の使用。
１５２．段落１０６～１１２のいずれか一つに記載のバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は段落１２６に記載の医薬組成物の、がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置のための医薬の製造における使用。
１５３．医薬が、治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与されるように製剤化される、段落１５２に記載の使用。
１５４．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１５３に記載の使用。
１５５．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１５４に記載の使用。
１５６．段落１１７～１２３のいずれか一つに記載のヘテロ二量体タンパク質又は段落１２７に記載の医薬組成物の、がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置のための医薬の製造における使用。
１５７．医薬が、治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与されるように製剤化される、段落１５６に記載の使用。
１５８．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１５７に記載の使用。
１５９．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１５８に記載の使用。
１６０．がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置での使用のための、段落１～２４、３０～５０、５６～６７及び７３～８７のいずれか一つに記載の融合タンパク質又は段落１２４に記載の医薬組成物。
１６１．治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与される、段落１６０に記載の、使用のための融合タンパク質又は医薬組成物。
１６２．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１６１に記載の、使用のための融合タンパク質又は医薬組成物。
１６３．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１６２に記載の、使用のための融合タンパク質又は医薬組成物。
１６４．がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置での使用のための、段落９３～１００のいずれか一つに記載の抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物又は段落１２５に記載の医薬組成物。
１６５．治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与される、段落１６４に記載の、使用のための抗ＰＤ－１ ＡＢＤを含む組成物又は医薬組成物。
１６６．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１６５に記載の、使用のための抗ＰＤ－１ ＡＢＤを含む組成物又は医薬組成物。
１６７．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１６６に記載の、使用のための抗ＰＤ－１ ＡＢＤを含む組成物又は医薬組成物。
１６８．がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置での使用のための、段落１０６～１１２のいずれか一つに記載のバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は段落１２６に記載の医薬組成物。
１６９．治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与される、段落１６８に記載の、使用のためのバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は医薬組成物。
１７０．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１６９に記載の、使用のためのバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は医薬組成物。
１７１．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１７０に記載の、使用のためのバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は医薬組成物。
１７２．がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置での使用のための、段落１１７～１２３のいずれか一つに記載のヘテロ二量体タンパク質又は段落１２６に記載の医薬組成物。
１７３．治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与される、段落１７２に記載の、使用のためのヘテロ二量体タンパク質又は医薬組成物。
１７４．チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、段落１７３に記載の、使用のためのヘテロ二量体タンパク質又は医薬組成物。
１７５．チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、段落１７４に記載の、使用のためのヘテロ二量体タンパク質又は医薬組成物。
ＸＩＶ．実施例

本発明を説明するために、実施例を以下に提供する。これらの実施例は、本発明を特定の用途又は動作理論に限定することを意味するものではない。本発明で論じられる全ての定常領域位置について、ナンバリングはＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う（参照により全体が組み込まれる、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）。抗体の当業者は、この慣例が、免疫グロブリンファミリーにおける保存された位置に対する正規化された参照を可能にする、免疫グロブリン配列の特定の領域における非連続的なナンバリングからなることを理解するであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義される任意の所与の免疫グロブリンの位置は、その連続配列に必ずしも対応しない。

一般的及び具体的な科学技術は、米国特許出願公開第２０１５／０３０７６２９号、米国特許出願公開第２０１４／０２８８２７５号及び国際公開第２０１４／１４５８０６号に概説されており、これらの全ては、特にそこに概説されている技術について、その全体が参照により明示的に組み込まれる。２０１６年１１月１日に出願された米国特許第６２，４１６，０８７号の実施例１及び２は、対応する図を含め、その全体が参照により明示的に組み込まれる。
実施例１：ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ
１Ａ：ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質の操作

ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体の短い半減期に対処するために、本発明者らは、Ｆｃ融合物（本明細書では、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質と総称する）としてＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体を、複合体の産生を促進し、複合体のＦｃＲｎ媒介性の再利用を促進し、半減期を延長する目的で生成した。

ＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインをコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成によって構築し、続いてＦｃ融合パートナー（例えば、図１０に示すような定常領域）を含むｐＴＴ ５発現ベクターにサブクローニングした。例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質フォーマットの図解を図１３Ａ～図１３Ｇに示す。

ＩＬ－１５／Ｒα－ヘテロＦｃフォーマット（図１３Ａ）の例示的なタンパク質はＸＥＮＰ２０８１８であり、その配列は、このフォーマットのさらなるタンパク質の配列と共に図１４に示されている。ｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃフォーマット（図１３Ｂ）の例示的なタンパク質はＸＥＮＰ２１４７８であり、その配列を図１５に示す。ｎｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃフォーマット（図１３Ｃ）の例示的なタンパク質はＸＥＮＰ２１４７９であり、その配列を図１６に示す。

タンパク質を、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生させ、プロテインＡクロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィを含む２段階精製プロセスによって精製した。

ｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２１４７８）及びｎｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２１４７９）の例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質を細胞増殖アッセイで試験した。ヒトＰＢＭＣを、示された濃度の試験物で処理した。処置の４日後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ８－ＦＩＴＣ（ＲＰＡ－Ｔ８）、抗ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＯＫＴ４）、抗ＣＤ２７－ＰＥ（Ｍ－Ｔ２７１）、抗ＣＤ５６－ＢＶ４２１（５．１Ｈ１１）、抗ＣＤ１６－ＢＶ４２１（３Ｇ８）及び抗ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ６０５（Ｈｉ１００）で染色して、以下の細胞型について判定した：ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＮＫ細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）。Ｋｉ６７は、細胞増殖に厳密に関連するタンパク質であり、抗Ｋｉ６７－ＡＰＣ（Ｋｉ－６７）及びＦｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を用いて細胞内Ｋｉ６７の染色を行った。上記の細胞上のＫｉ６７のパーセンテージを、ＦＡＣＳを使用して測定した（図１７Ａ～図１７Ｃに示す）。データは、例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質がＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の強い増殖を誘導したことを示す。
１Ｂ：より低い効力のために操作されたＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質

ＰＫをさらに改善し、半減期を延長するために、本発明者らは、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の効力を低下させると、抗原シンクが減少し、したがって循環半減期が増加すると推論した。ＩＬ－１５：ＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－１５：共通γ鎖界面の結晶構造を調べることによって、並びにＭＯＥソフトウェアを用いたモデル化によって、効力を低下させるために置換され得るこれらの界面における残基を予測した。図１８は、本発明者らが（免疫原性のリスクを低下させるために）アイソステリック置換を操作した予測残基の位置を示すＩＬ－１５：受容体複合体の構造モデルを示す図である。効力を低下させることを目的として操作された例示的なＩＬ－１５バリアントの配列を図１９に示す。

ＩＬ－１５又はＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成によって構築し、続いてＦｃ融合パートナー（例えば、図１０に示すような定常領域）を含むｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。上記のように同定された置換は、標準的な突然変異誘発技術によって組み込まれた。効力が低下するように操作された「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質としては、ＸＥＮＰ２９２８１、ＸＥＮＰ２４０５０、ＸＥＮＰ２９２８４、ＸＥＮＰ２９２８５、ＸＥＮＰ２９２８６が挙げられ、その配列は図２１に示されている。タンパク質を実施例１Ａに一般的に記載されるように産生し、精製した。
１Ｂ（ａ）：効力低下のために操作されたＩＬ－１５バリアントを含むｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ活性

ＩＬ－１５バリアントを含む例示的なｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質を細胞増殖アッセイで試験した。ヒトＰＢＭＣを、示された濃度の示された試験物と共に３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３－ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４－ＦＩＴＣ（ＲＰＡ－Ｔ４）、抗ＣＤ８－ｅＦ６６０（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６－ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ－ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＨＩ１００）、抗ＣＤ５６－ＢＶ６０５（５．１Ｈ１１）、及び抗Ｋｉ６７－ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ－６７）で染色し、フローサイトメトリによって分析した。図２２は、増殖を示すＫｉ６７を発現するＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞集団のパーセンテージを示す。

データは、効力を低下させる目的で操作されたＩＬ－１５バリアントを含む例示的なｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のいくつかが、ＷＴ ＩＬ－１５を含むｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物と比較して、低下した効力を示したことを示す。注目すべきことに、データは、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含むｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）又はＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含むｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物と比較して、ｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物に関連して、様々なリンパ球集団の増殖において活性を有さないか、又は活性が劇的に低下したことを示す。一方、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ）バリアントを含むｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、ＷＴ ＩＬ－１５を含むｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物と比較して、効力の低下がほとんど又は全くなかった。
実施例２：ＰＤ－１標的アーム

上記のように、ＰＤ－１発現は、活性化腫瘍浸潤リンパ球上で上方制御される。したがって、本発明のＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質をＰＤ－１発現リンパ球に標的化することは、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を腫瘍環境に向かわせ、全身毒性を回避するための有用なアプローチであり得る。さらに、本発明の標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質をＰＤ－１遮断抗体と組み合わせること、又はＰＤ－１遮断抗体による処置の後に本発明の標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質を投与することが有用であり得るので、標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質のＰＤ－１標的アームがＰＤ－１遮断抗体と同じ又は類似のエピトープに結合しないことが重要である。本明細書で企図されるＰＤ－１遮断抗体には、ニボルマブ及びペンブロリズマブが含まれるが、これらに限定されない。

可変領域が本明細書での使用が意図されるいくつかの抗ＰＤ－１ ｍＡｂの配列を図２５～図２６に示す。上記の抗ＰＤ－１結合ドメインがニボルマブ及びペンブロリズマブと競合したかどうかを調べるために、本発明者らはキメラｍＡｂに対してタンデム・エピトープ・ビニングを行った。タンデム・エピトープ・ビニングを、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ装置を使用して行った。ＨＩＳ１Ｋバイオセンサーを最初に使用してＰＤ－１－Ｈｉｓを捕捉し、続いて１００ｎＭの第１の抗体に浸漬し、次いで１００ｎＭの第２の抗体に浸漬した。試験した抗体は、ＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブに基づく二価抗ＰＤ－１ ｍＡｂ；配列を図２４Ａに示す）、ＸＥＮＰ２１４６１（ペンブロリズマブ；配列を図２４Ｂに示す）、キメラｍＡｂ Ａ、キメラｍＡｂ Ｂ及び１Ｃ１１に基づくｍＡｂであった。ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃも、抗体によるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断を調べるために含めた。ＢＬＩ反応は、バイオセンサーをＨＢＳ－ＥＰバッファに浸した後、抗ＰＤ－１抗体に浸したときのＢＬＩ反応に対して正規化された。抗体対が０．５未満の正規化されたＢＬＩ応答を提供した場合、その対は、競合するか又は部分的に競合し、同じエピトープ・ビンにある（すなわち、非常に類似するか又は大きく重複するエピトープを認識する）と考えられた。抗体対が０．５を超える正規化されたＢＬＩ応答を提供した場合、その対は非競合的であり、異なるエピトープにビニングされると考えられた。抗体対のそれぞれに関する正規化されたＢＬＩ応答を図２７に要約する。

ビニングは、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ Ａ及びｍＡｂ Ｂがニボルマブ又はペンブロリズマブと競合しない一方で、１Ｃ１１に基づくｍＡｂがニボルマブ及びペンブロリズマブの両方と競合したことを示す。さらに、ｍＡｂ ＡはＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するようには見えないが、ｍＡｂ ＢはＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する。

簡略化のために、ニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと競合するＰＤ－１結合ドメインを本明細書では抗ＰＤ－１［Ｃ］と呼び、ニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと競合しないＰＤ－１結合ドメインを抗ＰＤ－１［ＮＣ］と呼ぶ。
実施例３：ＰＤ－１標的ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物

ここで、本発明者らは、本明細書においてＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物と総称される、ＰＤ－１を標的化するＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の生成及び特徴付けを記載する。
３Ａ：ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の生成及び物理的特性評価

ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン、又は抗ＰＤ－１可変領域をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成によって構築し、続いてＦｃ融合パートナー（例えば、図１１に示すような定常領域）を含むｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。例示的なＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の図解を図２８に示す。

特定の例示的なフォーマットである「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマット（図２８Ｃ）は、可変長リンカー（「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα」と呼ばれる）によってＩＬ－１５に融合されたＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み、次いでこれがヘテロ二量体Ｆｃ領域のＮ末端に融合され、可変重鎖（ＶＨ）はヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に融合され、対応する軽鎖はＶＨとＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。

本発明者らは、抗ＰＤ－１［Ｃ］標的アーム及び抗ＰＤ－１［ＮＣ］標的アームの両方を用いて、このフォーマットのＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を生成した。抗ＰＤ－１［Ｃ］標的アームを含む融合物は、本明細書では［Ｃ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物と呼ばれ、抗ＰＤ－１［ＮＣ］標的アームを含む融合物は、本明細書では［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物と呼ばれる。

実施例１Ｂ（ａ）に記載されるように、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｄ６４Ｎ／Ｎ６５Ｄ）効力バリアントを含むｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、様々なリンパ球集団の増殖がほぼ完全に不活性であった。したがって、本発明者らは、ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有するプロトタイプＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（［Ｃ］及び［ＮＣ］の両方）を作製した。ヒト化１Ｃ１１の可変領域を使用してプロトタイプ［Ｃ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を生成し、ヒト化ｍＡｂ Ａ及びｍＡｂ Ｂの可変領域を使用してプロトタイプ［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を生成した。例示的な［Ｃ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質自体の配列を図２９に示し、例示的な［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質自体の配列を図３０に示す。例示的な［Ｃ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質ＸＥＮＰ２５８５０及び［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物も、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）を用いて作製した。本発明者らはまた、対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質ＸＥＮＰ２６００７も生成し、その配列を図３１に示す。

タンパク質を、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生させ、プロテインＡクロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィを含む２段階精製プロセスによって精製した。
３Ｂ：ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はインビトロで活性である

ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の活性を調べる最初の実験では、ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で４８時間刺激し、次いで、ＣＦＳＥ標識し、示された試験物と３７℃で４日間インキュベートした。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈によって測定し、Ｚｏｍｂｉｅ色素を使用して死細胞を除外した。増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示すデータを図３２に示す。

データは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（［Ｃ］及び［ＮＣ］バージョンの両方）のそれぞれが、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の増殖において活性であることを示す。さらに、対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物もＴ細胞の増殖において活性であったが、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＸＥＮＰ２８５１９単独では活性でなかった。
３Ｃ：ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は活性化リンパ球に選択的である

サイトカインがそれらの受容体に結合した後、受容体に結合したヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）は、ＳＴＡＴタンパク質をリン酸化し、その後、核に移行してさらなる下流プロセスを調節する。したがって、ＳＴＡＴタンパク質（特に、ＳＴＡＴ５ａ及びＳＴＡＴ５ｂを含むＳＴＡＴ５）のリン酸化は、その受容体へのＩＬ－１５の結合によって引き起こされる最も初期のシグナル伝達事象の１つである。したがって、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が種々の細胞型においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する能力を調べた。

この実験のために、新鮮ＰＢＭＣと活性化ＰＢＭＣの両方を使用した。ＰＤ－１発現が上方制御された腫瘍環境における活性化リンパ球の代用として使用される活性化ＰＢＭＣは、１００ｎｇ／ｍＬのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で新鮮なＰＢＭＣを２日間刺激することによって調製した。新鮮なＰＢＭＣ及び活性化ＰＢＭＣを、３７℃で１５分間、示された濃度のＸＥＮＰ２５８５０と共にインキュベートした。インキュベーション後の様々な細胞集団をゲーティングするために、ＰＢＭＣを室温で３０～４５分間、抗ＣＤ３－ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４－ＢＶ６０５（ＲＰＡ－Ｔ４）及び抗ＣＤ８－Ａｌｅｘａ７００（ＳＫ１）で染色した。細胞を洗浄し、予め冷却した（－２０℃）９０％メタノールと共に２０～６０分間インキュベートした。メタノールインキュベーション後、細胞を再度洗浄し、抗ＣＤ２５－ＢＶ４２１（Ｍ－Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ５１０（ＨＩ１００）及び抗ｐＳＴＡＴ５－Ａｌｅｘａ６４７（ｐＹ６８７）で染色して、様々な細胞集団及びＳＴＡＴ５リン酸化をマークした。様々なＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞集団におけるＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示すデータを図３３に示す。注目すべきことに、データは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合タンパク質ＸＥＮＰ２５８５０が、活性化ＰＢＭＣ由来のＴ細胞に対する増大した効果を示した一方で、新鮮ＰＢＭＣ由来のＴ細胞に対する最小限の効果を維持したことを示す。これは、臨床状況において、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、腫瘍環境において、活性化腫瘍浸潤リンパ球に対して選択的であることを示唆している。
実施例４：［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＰＤ－１遮断と組み合わされる
４Ａ：ＰＤ－１遮断はインビトロで［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の活性を妨害しない

新鮮なＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で２日間刺激した。活性化ＰＢＭＣを、１００μｇ／ｍＬのＸＥＮＰ１６４３２、ペンブロリズマブ、又はＸＥＮＰ１５０７４（対照としての抗ＲＳＶ ｍＡｂ）と３０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、ＰＢＭＣを指示された濃度の指示された試験物と共に３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後の様々な細胞集団をゲーティングするために、ＰＢＭＣを最初に抗ＣＤ３－ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４－ＢＶ６０５（ＲＰＡ－Ｔ４）、抗ＣＤ２５－ＢＶ４２１（Ｍ－Ａ２５１）及び抗ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ５１０（ＨＩ１００）抗体で染色した。１回目の染色後、ＰｅｒＦｉｘ ＥＸＰＯＳＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）を用いて細胞を透過処理した。透過処理後、細胞を抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ－Ｔ８）、抗ｐＳＴＡＴ５－ＡＦ６４７及び抗ＰＤ－１－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ７５０（ＥＨ１２．２Ｈ７）で染色した。２回目の染色の後、細胞をフローサイトメトリによって分析して、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ２５＋ＰＤ－１＋（図３４に示される）及びＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ２５＋ＰＤ－１＋Ｔ細胞（データ示さず）上のＳＴＡＴ５リン酸化を調べた。

データは、ＰＢＭＣとＸＥＮＰ１６４３２又はペンブロリズマブとのプレインキュベーションが、ＰＢＭＣを抗ＲＳＶ ｍＡｂ ＸＥＮＰ１５０７４とプレインキュベーションした場合と比較して、［Ｃ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２５９３７によるＴ細胞の活性化を減少させたことを示しており、予想通り、抗ＰＤ－１ ｍＡｂが［Ｃ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２５９３７のＴ細胞への結合を妨げたことを示している。一方、ＰＢＭＣとＸＥＮＰ１６４３２又はペンブロリズマブとのプレインキュベーションは、ＰＢＭＣを抗ＲＳＶ ｍＡｂ ＸＥＮＰ１５０７４とプレインキュベートした場合と比較して、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２８５２３によるＴ細胞の活性化に影響を及ぼさなかった。これは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、負の効果なしに抗ＰＤ－１ ｍＡｂと積層され得ることを示唆している。
４Ｂ：［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、インビボでＰＤ－１遮断と相乗的に組み合わされる

ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を、ＮＳＧ（ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－γ）免疫不全マウスにおいて行った移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルにおいて評価した。ＮＳＧマウスにヒトＰＢＭＣを移植すると、ヒトＰＢＭＣはマウス細胞に対して自己免疫応答を発症し、続いてＧＶＨＤを発症する。したがって、ＧＶＨＤは抗腫瘍応答のモデルである。ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によるｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの処置は、移植Ｔ細胞の増殖を増強し、ＧＶＨＤを増強するはずである。

最初のＧＶＨＤ研究では、ＮＳＧマウスに、－１日目にＩＶ－ＯＳＰを介して１０×１０^６個のヒトＰＢＭＣを生着させ、０、７、１４、及び２１日目に、示された濃度の示された試験物を腹腔内投与した。体重をＧＶＨＤの指標として週に２回評価し（図３５に示す初期体重のパーセンテージとしての体重の変化）、７、１０及び１４日目に採血して様々なリンパ球の拡大を評価した（１４日目のデータをそれぞれ図３６に示す）。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現も、Ｔ細胞活性化マーカーとして評価した（図３７に示される）。

データは、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞数によって示されるように、ＰＤ－１遮断単独（ＸＥＮＰ１６４３２又はＸＥＮＰ２８４３７のいずれか）並びにｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ ＸＥＮＰ２４０５０単独と比較して、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合（［Ｃ］及び［ＮＣ］の両方）のそれぞれがＧＶＨＤを増強したことを示す。しかしながら、上記のインビトロデータと一致して、［Ｃ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２５８５０をＸＥＮＰ２８４３７と組み合わせると、様々な細胞数の減少がもたらされ、一方、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２８５３２（ｍＡｂ Ａに基づく）とＸＥＮＰ２８６９２（ｍＡｂ Ｂに基づく）とを組み合わせると、細胞数によって示されるように、ＧＶＨＤがさらに増強された。図３５に示されるようなＧＶＨＤの指標としての体重の変化、並びに図３７に示されるようなＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を用いても、同様の傾向が観察される。さらに、図３８に示されるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するより低いＣＤ８＋Ｔ細胞比によって示されるように、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によるＣＤ４＋Ｔ細胞の優先傾向があるようである。

第２のＧＶＨＤ研究では、ＮＳＧマウスに、－１日目にＩＶ－ＯＳＰを介して１０×１０^６個のヒトＰＢＭＣを生着させ、０、７、１４、及び２１日目に、示された濃度の示された試験物を腹腔内投与した。ＧＶＨＤの指標として体重を週に２回評価し、７、１０及び１４日目に採血して、様々なリンパ球の拡大を評価した（１０日目について図３９に示す）。図４０に示すように、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋細胞上のＣＤ２５の発現も評価した。

上記のように、データは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、抗ＰＤ－１遮断単独と比較してＴ細胞数を拡大したことを示す。さらに、データは、より高濃度（０．３ｍｇ／ｋｇ対０．１ｍｇ／ｋｇ）の［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２８５３２によるＧＶＨＤの増強によって示されるように、Ｔ細胞拡大に対する明確な用量応答を示す。注目すべきことに、ＸＥＮＰ２８５３２（０．３ｍｇ／ｋｇ）とＰＤ－１遮断ｍＡｂ ＸＥＮＰ２８４３７の組み合わせは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現を増強した。
実施例５：代替ＩＬ－１５効力バリアントを有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の作製
５Ａ：ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含むＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、好ましい薬物動態よりも低いことを示す

Ｘｔｅｎｄを含むＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ効力バリアントの薬物動態を調査する研究では、カニクイザルに、初回の単回静脈内（ｉ．ｖ．）用量のＸＥＮＰ２２８５３（Ｘｔｅｎｄを含むＷＴ ＩＬ－１５／Ｒα－ヘテロＦｃ）、ＸＥＮＰ２４３０６（Ｘｔｅｎｄを含むＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα－ヘテロＦｃ）、ＸＥＮＰ２４１１３（Ｘｔｅｎｄを含むＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα－ヘテロＦｃ）、ＸＥＮＰ２４２９４（Ｘｔｅｎｄを含むｓｃＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα－Ｆｃ）及びＸＥＮＰ２５９３７（Ｘｔｅｎｄを含む［Ｃ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα－Ｆｃ）を様々な濃度で投与した。

図４１は、初回投与後の経時的な試験物の血清濃度を示す。予想されるように、（ＸＥＮＰ２４３０６及びＸＥＮＰ２４１１３におけるように）Ｘｔｅｎｄ置換に加えて効力バリアントを組み込むことにより、（ＸＥＮＰ２２５８３と比較して）ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の薬物動態が大きく改善される。予想外にも、ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含むＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合ＸＥＮＰ２５９３７は、ＸＥＮＰ２４３０６と比較して実質的に劣った薬物動態を示した。同様に、ＩＬ－１５／Ｒα－ヘテロＦｃ融合物ＸＥＮＰ２４１１３及びｓｃＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４２９４（同じＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）効力バリアントを有する）もまた、ＸＥＮＰ２４３０６と比較して実質的に劣った薬物動態を示した。これは、劣った薬物動態が、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のフォーマットではなく、特定のＩＬ－１５効力バリアントに起因し得ることを示唆している。（実施例１Ｂ（ａ）に記載されているように）ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有するＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物よりも大きいインビトロ効力を示すＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有するＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物に基づいてＸＥＮＰ２５９３７（並びにＸＥＮＰ２４１１３）の薬物動態の減少が予想されたが、薬物動態の減少は予想外にも効力の増加に不均衡であった。したがって、本発明者らは、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物において使用するための代替のＩＬ－１５効力バリアントを同定しようとした。
５Ｂ：ＩＬ－１５：ＣＤ１３２界面に改変を有するＩＬ－１５バリアントを含むＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の操作

本発明者らは、ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントは、ＣＤ１２２への結合に関与するＩＬ－１５界面に両方の置換を有するが、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）は、ＩＬ－１５：ＣＤ１２２界面に２つの置換（Ｅ６４Ｑ及びＮ６５Ｄ）及びＣＤ１３２への結合を担うＩＬ－１５界面における１つの置換（Ｄ３０Ｎ）を有することに注目した。したがって、本発明者らは、ＩＬ－１５：ＣＤ１３２界面における改変が、ＸＥＮＰ２４３０６について観察された優れた薬物動態に寄与し得ると推論した。したがって、本発明者らは、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含むさらなる例示的なＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を作製し、その配列を図４２に示す。
実施例６：ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＴ細胞上のＰＤ－１の内在化を誘導する

ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合の活性を調べる別の実験では、ＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣを３７℃で４日間、２０ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）及び以下の試験物とインキュベートした：ＸＥＮＰ２８５３２（ｍＡｂ Ａに基づくαＰＤ－１アームを含むＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）、ＸＥＮＰ２４３０６（対照非標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）及びＸＥＮＰ２６００７（対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）。次いで、細胞を、実施例２Ｃ及び図３４に示されるように、ＸＥＮＰ２８５３２のＰＤ－１標的アームと結合について競合しないαＰＤ－１ ＸＥＮＰ１６４３２で標識し、フローサイトメトリによって分析した。ＰＤ－１＋である様々なＴ細胞集団のパーセンテージを示すデータを図４４に示す。本発明者らは、驚くべきことに、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物による処置後のＴ細胞上のＰＤ－１の用量依存的減少を、対照ＸＥＮＰ２４３０６及びＸＥＮＰ２６００７による処置と比較して観察し、ＰＤ－１受容体が内在化されたことが示された。これは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ分子の最終的なクリアランスに続いて、ＰＤ－１リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）による免疫阻害が減少したままであり得る、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃに関する潜在的な長期持続作用を示唆する。
実施例７：カニクイザル交差反応性［ＮＣ］ＰＤ－１ ｍＡｂ Ｃの同定

臨床開発を容易にするために、カニクイザルにおける薬物動態、薬力学及び毒性などの［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の様々なパラメータを調べることが有用である。したがって、本発明者らは、ヒト及びカニクイザルＰＤ－１に関して交差反応性である［ＮＣ］ＰＤ－１標的アームを同定しようとした。本発明者らは、ストリング・コンテンツ最適化（例えば、２０１０年２月２日に発行された米国特許第７，６５７，３８０号明細書を参照）を使用してヒト化した追加の抗ＰＤ－１結合ドメイン（本明細書ではｍＡｂ Ｃと呼ばれる）を同定し、その配列を図４３（可変ドメイン配列）及び図４５（ＸＥＮＰ２８５３６、ＸＥＮＰ２８５３７、ＸＥＮＰ２８５３８及びＸＥＮＰ２８５３９としての二価ｍＡｂ）に示す。
７Ａ：抗ＰＤ－１ ｍＡｂ Ｃはヒト及びカニクイザルＰＤ－１に関して交差反応性である

本発明者らは、上記で一般的に記載されるように、Ｏｃｔｅｔを使用して、ヒト及びカニクイザルＰＤ－１へのＸＥＮＰ２８５３６、ＸＥＮＰ２８５３７、ＸＥＮＰ２８５３８及びＸＥＮＰ２８５３９の結合を調べた。特に、抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサーを使用して抗体を捕捉し、複数の濃度のヒト及びカニクイザルＰＤ－１－Ｈｉｓに浸漬してＫＤを決定した。そのデータを図４６に示す。データは、ヒト化バリアントＸＥＮＰ２５８３６及びＸＥＮＰ２５８３７の両方が、同様のＫＤでヒト及びカニクイザルに結合したことを示す。注目すべきことに、ヒト化バリアントＸＥＮＰ２５８３８及びＸＥＮＰ２８５３９は、ヒトＰＤ－１及びカニクイザルＰＤ－１に結合する能力を両方とも失った。比較すると、ＸＥＮＰ２８５１９（ヒト化ｍＡｂ Ａ）はヒトＰＤ－１により強く結合するが、カニクイザルＰＤ－１に対して交差反応性ではない。
７Ｂ：抗ＰＤ－１ ｍＡｂ Ｃはニボルマブ及びペンブロリズマブと結合について競合しない

ｍＡＢ Ｃがニボルマブ及びペンブロリズマブと競合したかどうかを調べるために、本発明者らは、実施例２Ｃに記載されるようにキメラｍＡｂ Ｃに対してタンデム・エピトープ・ビニングを行った。ＸＥＮＰ１６４３２、ＸＥＮＰ２１４６１及びキメラｍＡｂ Ｃについてのデータを図４７に示す。ビニングは、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ Ｃがニボルマブ又はペンブロリズマブと競合せず、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用の部分的遮断薬であることを示す。
実施例８：ｍＡｂ Ｃに基づく［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物

ｍＡｂ Ｃ及びＩＬ－１５バリアントに基づく「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマットの［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を、実施例３に一般的に記載されるように操作及び作製した（その例示的な配列を図４８に示す）。融合物は、ＩＬ－１５：ＣＤ１３２界面に改変を含むＩＬ－１５バリアントが増強された薬物動態を有し得るという実施例５に記載される概念に沿って、ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアント並びにＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを用いて作製されたことに留意されたい。さらに、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）類似体の配列を図４９に示す。
８Ａ：ｍＡｂ Ｃに基づく［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はインビトロで活性である
８Ａ（ａ）：Ｔ細胞増殖の誘導

ヒトＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で４８時間刺激し、ＣＦＳＥで標識し、以下の試験物と共に３７℃で４日間インキュベートした：ＸＥＮＰ２８５４３（ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１Ｌ１及びＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）に基づく［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２８５３２（ｍＡｂ Ａ＿Ｈ１Ｌ１及びＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）に基づく［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４３０６（ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）に基づく非標的化ＩＬ－１５／ＲαヘテロＦｃ）、及びＸＥＮＰ２６００７（モタビズマブ及びＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）に基づく対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ）。インキュベーション後、細胞を以下の抗体：抗ＬＡＧ－３－ＰＥ（３ＤＳ２２３Ｈ）、抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＳＫ１）、抗ＣＤ３－ＰＥ－Ｃｙ７（ＯＫＴ３）、抗ＰＤ－１－Ａｌｅｘａ６４７（ＸＥＮＰ１６４３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇキットで染色）、抗ＣＤ４５ＲＯ－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ７５０（ＵＣＨＬ１）、抗ＨＬＡ－ＤＲ－Ａｌｅｘａ７００（Ｌ２４３）、抗ＴＩＧＩＴ－ＢＶ４２１（Ａ１５１５３Ｇ）、抗ＣＤ１６－ＢＶ６０５（３Ｇ６）、抗ＣＤ５６－ＢＶ６０５（ＨＣＤ５６）、抗ＣＤ２５－ＢＶ７１１（Ｍ－Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ７８５（ＨＩ１００）、抗ＣＤ４－ＢＵＶ３９５（ＳＫ３）、及びＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ－ＢＶ５１０で染色し、様々な細胞集団についてフローによって分析した。

本発明者らは、ＣＦＳＥ希釈（死細胞を排除するためのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ）に基づいて様々なＴ細胞集団の増殖を調査した。そのデータを図５０に示す。両方の［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導した。注目すべきことに、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、非標的化ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα－Ｆｃ融合物（並びに対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導するのにより強力であったが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導においてはあまり協力でなかった。さらに、ＸＥＮＰ２８５３２（ｍＡｂ Ａに基づくＰＤ－１標的アーム）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の増殖を誘導することにおいて、ＸＥＮＰ２８５４３（ｍＡｂ Ｃに基づくＰＤ－１標的アーム）よりも強力であるように見えた。

興味深いことに、図５１が示すように、ＸＥＮＰ２８５３２が、非標的化ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα－Ｆｃ融合物（並びに対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）と比較して、ＣＤ８＋ＬＡＧ－３＋Ｔ細胞の増殖を誘導するのにより強力であった。さらに、ＸＥＮＰ２８５４３は、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞増殖よりもＣＤ８＋ＬＡＧ－３＋Ｔ細胞増殖を誘導するのにより強力であった（２７６．８対７１．９４のＥＣ５０）。まとめると、これは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、腫瘍環境中に見出されるようなチェックポイントを発現するＴ細胞に対して選択的であり得るという考えを支持する。

図５２に示されるように、本発明者らはまた、メモリ（ＣＤ４５ＲＡ－）集団及びナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋）集団の増殖を調べた。注目すべきことに、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－Ｔ細胞の増殖の誘導において非標的ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα－Ｆｃ融合物よりも強力であったが、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞の増殖の誘導においてはそれほど強力ではなく、メモリＴ細胞に対する選択性を示唆した。

最後に、本発明者らは、様々なＴ細胞集団（本明細書に示されるように、ｍＡｂ Ａ及びｍＡｂ Ｃとは異なるエピトープにビニング（ｂｉｎｓ ｔｏ）するＸＥＮＰ１６４３２を使用して染色した）におけるＰＤ－１の発現を調べた。データは、図５３に示されるように、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の両方による処置後のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－Ｔ細胞上のＰＤ－１の用量依存的減少を示し、対照ＸＥＮＰ２４３０６及びＸＥＮＰ２６００７による処置と比較して、ＰＤ－１受容体が内在化されたことを示している。注目すべきことに、ＰＤ－１の下方制御は、ｍＡｂ Ａに基づくＰＤ－１標的アームを用いて、ＸＥＮＰ２８５３２によってより強力に誘導された。
８Ａ（ｂ）：サイトカイン分泌の誘導

ヒトＰＢＭＣを様々な濃度のプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で４８時間３７℃で事前刺激し、ＣＦＳＥで標識し、示された試験物と共に３７℃で４日間インキュベートした。上清を回収し、Ｖ－ＰＬＥＸ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １ Ｈｕｍａｎキット（製造業者のプロトコルによる；Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）によって評価した。図５４に示されるデータは、ＸＥＮＰ２８５３２及びＸＥＮＰ２８５４３の両方が、ＩＦＮγ分泌を強力に刺激することができたことを示す。注目すべきことに、ＸＥＮＰ２８５３２（ｍＡｂ Ａに基づくＰＤ－１標的アーム）は、ＩＦＮγ分泌を誘導することにおいて、ＸＥＮＰ２８５４３（ｍＡｂ Ｃに基づくＰＤ－１標的アーム）よりも活性であるようであった。
８Ａ（ｃ）：ＰＤ－１遮断はインビトロでのｍＡｂ Ｃに基づく［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の活性を妨害しない

本発明者らは、実施例４Ａに記載されているように、ｍＡｂ Ｃに基づく［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の活性によるＰＤ－１遮断の潜在的な干渉を調べた。図５５に示されるデータは、ＰＢＭＣとＸＥＮＰ１６４３２又はペンブロリズマブとのプレインキュベーションは、ＰＢＭＣを抗ＲＳＶ ｍＡｂ ＸＥＮＰ１５０７４とプレインキュベートした場合と比較して、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２８５４３によるＴ細胞の活性化に影響を及ぼさなかったことを示している。これは、ｍＡｂ Ｃに基づくＰＤ－１標的アームを有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、負の効果なしに抗ＰＤ－１ ｍＡｂと積層され得ることを示唆している。
８Ｂ：ｍＡｂ Ｃに基づく［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はインビボでＧＶＨＤを増強し、ＰＤ－１遮断と組み合わされる

実施例４Ｂに記載される第２のＧＶＨＤ研究において、本発明者らはまた、単独で、及びＰＤ－１遮断と組み合わせて、様々な濃度でのＸＥＮＰ２８５４３のインビボ活性を調べた。経時的な体重の変化（初期体重のパーセンテージとして）を表すデータを図５６に示し、１１、１４、及び１８日目の体重（初期体重のパーセンテージとして）を表すデータを図５７に示す。本発明者らはまた、種々のリンパ球集団の拡大及び活性化を調べた。そのデータを１４日目について図５８～５９に示す。まとめると、データは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物とＰＤ－１遮断との組み合わせが、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物単独による処置よりもＧＶＨＤを有意に増強したことを示す。効果の増強は、より低濃度（すなわち０．１ｍｇ／ｋｇ）の［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物とＰＤ－１遮断との組み合わせの状況において特に顕著である。
８Ｃ：ｍＡｂ Ｃに基づく［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、ＰＤ－１遮断と組み合わされてＮＳＧマウスにおける抗腫瘍活性を増強する

ＮＳＧマウス（１０匹／群）に、３×１０^６個のｐｐ６５形質導入ＭＣＦ－７細胞を－１５日目に皮内接種した。次いで、マウスに５×１０^６個のヒトＰＢＭＣ（又は対照としてＰＢＳ）を腹腔内注射し、０日目に示された試験物で処置し、７、１４、２１、２９及び３６日目に示された試験物でさらに処置した。腫瘍体積を週に３回キャリパーによって測定し、体重を週に１回測定し、血液を週に１回採取した。

経時的な腫瘍体積を図６０に示し、２６、２８、３０、３３、３５、及び３７日目の腫瘍体積をそれぞれ図６１Ａ～図６１Ｆに示す。データは、２８日目までに、ＸＥＮＰ２８５４３とＰＤ－１遮断の組み合わせが、ＰＤ－１遮断単独での処置よりも腫瘍サイズを有意に減少させたことを示す。本発明者らはまた、種々のリンパ球集団の拡大及び活性化を調べた。そのデータを図６２～６３に示す。注目すべきことに、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、単独又はＰＤ－１遮断と組み合わせて、ＰＤ－１遮断単独と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の早期（投与後７日目）の誘導を有意に増強することができ、ＰＤ－１遮断と組み合わせた［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の両方とも、ＰＤ－１遮断単独と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化の早期（投与後７日目）の誘導を有意に増強することを可能にした。さらに、１４日目までに、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて、ＰＤ－１遮断単独と比較して多数のリンパ球集団の増殖を有意に増強することを可能にしたことを示す。
実施例９：親和性最適化ＰＤ－１標的アームを有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物
９Ａ：ｍＡｂ Ｃに基づくＡＢＤの親和性最適化

実施例８Ａに記載されるように、ＰＤ－１のインビトロ下方制御、Ｔ細胞の増殖、及びサイトカイン分泌の誘導などの特定の状況では、ＸＥＮＰ２８５３２（ｍＡｂ Ａに基づくＰＤ－１標的アーム）は、ＸＥＮＰ ２８５４３（ｍＡｂ Ｃに基づくＰＤ－１標的アーム）よりも強力及び／又は活性であるように見えた。実施例７Ａで述べたように、ヒト化ｍＡｂ Ａに基づく二価ｍＡｂ（ＸＥＮＰ２８５１９）は、ヒト化ｍＡｂ Ｃに基づく二価ｍＡｂ（ＸＥＮＰ ２８５３６）よりも強くヒトＰＤ－１に結合した。これを考慮して、本発明者らは、ＰＤ－１に対するＰＤ－１標的アームの親和性がＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の活性に影響を及ぼし得ると推論した。したがって、本発明者らは、ｍＡｂ Ｃの親和性最適化バリアントを操作した。ＸＥＮＰ２８５３６の可変重又は可変軽領域に点突然変異を導入するために、標準的な突然変異誘発によってバリアントのライブラリを構築した。その例示的な配列を図４３（可変ドメイン配列）及び図６４（二価ｍＡｂ）に示す。親和性操作されたｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１Ｌ１バリアント（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有する二価ＩｇＧ１フォーマット）の親和性スクリーニングを、上記で一般的に記載されるようにＯｃｔｅｔで実施した。そのデータを図６５に示す。可変重領域又は可変軽領域のいずれかに単一点突然変異を有する３０４個のバリアントのうち、本発明者らは、ＷＴよりも２倍超改善された親和性を有する１１個のバリアント（ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１＿Ｌ１．１及びｍａｂ＿Ｃ［ＰＤ－１］＿Ｈ１＿Ｌ１．３を含む）のみを同定した。好ましいＶＨ置換は、位置３２、５２Ａ、及び９７（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）であった。好ましいＶＬ置換は位置２７Ｄ、３０、９３及び９４（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）であった。

親和性をさらに高めるために、好ましい単一置換ＶＨバリアント及び単一置換ＶＬバリアントを組み合わせた。これらの新規ＶＨ／ＶＬコンボ・バリアントは、ＰＤ－１標的化ＩＬ１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のコンテキストで構築された。ＰＤ－１に対する融合物の親和性を示すデータを図６６に示す。注目すべきことに、Ｈ１．１３２＿Ｌ１はＨ１．１９＿Ｌ１よりも高い親和性を提供したにもかかわらずＨ１．１９＿Ｌ１．１はＨ１．１３２＿Ｌ１．１よりも高い親和性を有し、Ｈ１．１９と同様にＶＨにおけるＦ３２Ｌ置換（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）によって提供される相乗的親和性増強を示唆している。

次に、ＶＨ及び／又はＶＬにおける好ましい単一置換を、ＰＤ－１標的化ＩＬ １５／Ｒα－Ｆｃ融合物のコンテキストで構築された新しいバリアントと組み合わせた。ＰＤ－１に対する融合物の親和性を示すデータを図６７に示す。三重置換ＶＬバリアントＬ１．１４０（２７Ｄ位のヒスチジン、３０位のチロシン、及び９３位のトレオニンを含み、ナンバリングはＫａｂａｔによる）は、野生型よりもＫＤにおいて３６倍の改善を示し、ＶＨバリアント（例えば、Ｈ１．１３２及びＨ１．１７５）とよく組み合わさって、野生型よりもＫＤにおいて約１００倍の改善を発揮する。

注目すべきことに、ＶＨ又はＶＬにおける単一置換を組み合わせることによって、並びにＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の効力及び選択性を調整するのに有用であるＶＨバリアント及びＶＬバリアントを組み合わせることによって、親和性バリアントのラダーを作製した。

親和性増強ｍＡｂ Ｃ及びＩＬ－１５バリアントに基づく「ｓｃＩＬ－１５／Ｒα ｘ Ｆａｂ」フォーマットの［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を、実施例３に一般的に記載されるように操作及び作製した（その例示的な配列を、ＸＥＮＰ３００４６、ＸＥＮＰ３００４７、ＸＥＮＰ３００４９、及びＸＥＮＰ３００５０として図６８に示す）。さらに、Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）類似体の配列を図６９に示す。
９Ｂ：改善されたＰＤ－１結合を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、インビトロで増強された活性を有する

次に、本発明者らは、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物に対する親和性増強ＰＤ－１標的アーム（並びにＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ）バリアント）の影響を調べた。ヒトＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で４８時間刺激し、次いでＣＦＳＥで標識し、試験物と３７℃で４日間インキュベートした。細胞を以下の抗体：抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｂｙ５．５（ＳＫ１）、抗ＣＤ３－ＰＥ－Ｃｙ７（ＯＫＴ３）、抗ＰＤ－１－Ａｌｅｘａ６４７（ＸＥＮＰ１６４３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇキットで染色）、抗ＣＤ４５ＲＯ－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ７５０（ＵＣＨＬ１）、抗ＨＬＡ－ＤＲ－Ａｌｅｘａ７００（Ｌ２４３）、抗ＣＤ１０７ａ－ＢＶ４２１（Ｈ４Ａ３）、抗ＣＤ１６－ＢＶ６０５（３Ｇ６）、抗ＣＤ５６－ＢＶ６０５（ＨＣＤ５６）、抗ＣＤ２５－ＢＶ７１１（Ｍ－Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ７８５（Ｍ－Ａ２５１）、抗ＣＤ４－ＢＵＶ３９５（ＳＫ３）、及びＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＢＶ５１０）で染色し、様々な細胞集団についてフローサイトメトリによって分析した。

本発明者らは、ＣＦＳＥ希釈（死細胞を排除するためのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ）に基づいて様々なＴ細胞集団の増殖を調べた。そのデータを図７０に示し、ＣＤ２５（後期Ｔ細胞活性化マーカー）の発現に基づく様々なＴ細胞集団の活性化のデータを図７１～７２に示し、種々の集団におけるＰＤ－１の発現のデータを、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＰＤ－１＋Ｔ細胞について図７３に示す。

まとめると、データは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の活性がＰＤ－１親和性と相関することを示す。例えば、図７０に示されるように、ＸＥＮＰ３００４６（親和性増強ＰＤ－１標的アームを有する）が、ＸＥＮＰ２８５４３よりも強力にＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の増殖を誘導する（２倍の増加）。注目すべきことに、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によるＴ細胞上のＰＤ－１の下方制御でさえ、図７３に示されるように、ＰＤ－１親和性と相関する。さらに、データは、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ）バリアントがＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の活性に劇的な影響を及ぼさないことを示す。
９Ｃ：改善されたＰＤ－１結合を有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、インビボで増強された活性を有する

ＮＳＧマウスに、ＩＶ－ＯＳＰを介して１０×１０^６個のヒトＰＢＭＣを－１日目に移植し、０、７、及び１４日目に以下の試験物を腹腔内投与した：ＸＥＮＰ２８４３７（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ６７Ｋ除去バリアントを有するペンブロリズマブに基づく抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）及びＸＥＮＰ２９４８１（Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ ＩＬ－１５バリアントを有する対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物；配列は図３１に示される）。体重をＧＶＨＤの指標として週に２回評価した。そのデータを初期体重の変化として図７４～図７５に示す。注目すべきことに、ＸＥＮＰ３００４６単独（親和性増強ＰＤ－１標的アームを有する）による処置が、１１日目及び１８日目に測定して、ＰＢＳ処置と比較して有意な体重減少をもたらしたのに対して、ＸＥＮＰ２８５４３単独による処置は（ＰＢＳ処置と比較して）有意な体重減少をもたらさなかった。

血液を７、１０、及び１４日目に採取して、ヒトリンパ球の拡大とサイトカイン分泌を調べた。そのデータを図７６に示す。まとめると、データは一般に、親和性増強ＰＤ－１標的アームを有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物による増強された活性を示す。さらに、データは、［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－ＦｃがＰＤ－１遮断と生産的に結合することを示す（ＸＥＮＰ２８４３７）。

さらに、図７８及び図７９に示されるように、ＸＥＮＰ３００４６は、１１日目までにＣＤ４５＋細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を有意に増強した（１４日目まで全ての集団（ＮＫ細胞を除く）について持続されるＸＥＮＰ２８５４３による投与と比較して）。さらに、図７７に示すように、ＸＥＮＰ３００４６は、ＸＥＮＰ２８５４３と比較して、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の早期（投与後７日目）の活性化を有意に増強した（ＣＤ２５発現によって示される）。
実施例１０：ＰＤ－１親和性及びＩＬ－１５効力を調整することによるＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の微調整の効力及び選択性

ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、ＰＤ－１標的アームを介して腫瘍環境に標的化されることを目的として設計されたが、サイトカイン部分は依然として腫瘍部位に到達する前にシグナル伝達することができ、全身毒性に寄与し得る。したがって、本発明者らは、実施例１Ｂ（ａ）に記載されているように活性が劇的に低下したＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有するＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を構築することによってＩＬ－１５効力をさらに低下させようとした。ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含む例示的なＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の配列を、図３０及び図４８～図４９に、ＸＥＮＰ３０４２８、ＸＥＮＰ３０４２９、ＸＥＮＰ３０４３０、ＸＥＮＰ３０５１９、ＸＥＮＰ３０５１６、ＸＥＮＰ３０５１７及びＸＥＮＰ３０４５５として示す。さらに、本発明者らは、腫瘍環境の外側でＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含むＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の挙動を調べるための代用として作用するために、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含むＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物であるＸＥＮＰ３０４３２を構築した（その配列を図３２に示す）。
１０Ａ：ＰＤ－１親和性及びＩＬ－１５効力について調整された［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のインビトロ活性

様々なＰＤ－１結合親和性及びＩＬ－１５効力を有するさらなる［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のインビトロ活性。ヒトＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で４８時間刺激し、次いでＣＦＳＥで標識し、試験物と３７℃で４日間インキュベートした。細胞を以下の抗体：抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＳＫ１）、抗ＣＤ３－ＰＥ－Ｃｙ７（ＯＫＴ３）、抗ＰＤ－１－Ａｌｅｘａ６４７（ＸＥＮＰ１６４３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇキットで染色）、抗ＣＤ４５ＲＯ－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ７５０（ＵＣＨＬ１）、抗ＨＬＡ－ＤＲ－Ａｌｅｘａ７００（Ｌ２４３）、抗ＣＤ１０７ａ－ＢＶ４２１（Ｈ４Ａ３）、抗ＣＤ１６－ＢＶ６０５（３Ｇ６）、抗ＣＤ５６－ＢＶ６０５（ＨＣＤ５６）、抗ＣＤ２５－ＢＶ７１１（Ｍ－Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ７８５（Ｍ－Ａ２５１）、抗ＣＤ４－ＢＵＶ３９５（ＳＫ３）、及びＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＢＶ５１０）で染色し、様々な細胞集団についてフローサイトメトリによって分析した。

本発明者らは、ＣＦＳＥ希釈（死細胞を排除するためのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ）に基づいて様々なＴ細胞集団の増殖を調べた。そのデータを図８０に示し、ＣＤ２５（後期Ｔ細胞活性化マーカー）の発現に基づく様々なＴ細胞集団の活性化のデータを図８１～８２に示し、種々の集団におけるＰＤ－１の発現のデータを図８３～８４に示す。

データは、ＸＥＮＰ３０２７２（より高い親和性のＰＤ－１結合を有する）が、ＸＥＮＰ３００４６（より低い親和性のＰＤ－１結合を有する）よりも、様々なＴ細胞集団の増殖及び活性化を誘導するのにより強力であることを示しており、ＰＤ－１親和性を調整することの重要性を実証している。注目すべきことに、ＸＥＮＰ３０４２９（ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有するＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）は、ＸＥＮＰ３００４６（ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有するＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物）と比較して、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞に対してわずかに１．８～２．５低い活性しかなかったが、ＸＥＮＰ３０４３２（ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有する代用ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ）は、ＸＥＮＰ３００４６と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して１２倍低い活性を有し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して５３０倍低い活性を有した（図８０に示されるように増殖活性に基づく）。これは、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有するＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、腫瘍環境外では実質的に不活性のままでありながら、腫瘍環境中で活性を保持するはずであることを示唆している。
１０Ｂ：ＩＬ－１５効力について調整された［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のインビボ活性

ＩＬ－１５効力について調整された［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によるリンパ球のインビボ増殖をＧＶＨＤ研究において調べた。ＮＳＧマウスに、－１日目にＩＶ－ＯＳＰを介して１０×１０^６個のヒトＰＢＭＣを生着させ、０、７、及び１４日目に、示された濃度の示された試験物を腹腔内投与した。様々なリンパ球の拡大及び活性化を評価するために、７、１０、及び１４日目に血液を採取した（そのデータを図８５～図８６に示す）。まとめると、データは、ＰＤ－１親和性が同等である場合、より高い効力のＩＬ－１５（例えば、ＸＥＮＰ３００４６）は、より低い効力のＩＬ－１５（例えば、ＸＥＮＰ３０４２９）と比較して、Ｔ細胞のより大きな拡大（及び早期活性化）を可能にすることを示す。
実施例１１：Ｘｔｅｎｄを有する［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ

［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のＸｔｅｎｄ類似体を、薬物動態学及び薬力学をさらに拡張する目的で操作した。その配列を図全体に示す。
１１Ａ：Ｘｔｅｎｄ類似体はインビトロで同等の活性を示す

本発明者らは、Ｘｔｅｎｄ類似体が非Ｘｔｅｎｄ分子に匹敵するかどうかを調べた。ヒトＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で４８時間刺激し、次いでＣＦＳＥで標識し、試験物と３７℃で４日間インキュベートした。使用した試験物は、ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ）、又はＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントのいずれかを有する標的化ＩＬ－１５／Ｒα－ＸｔｅｎｄＦｃ融合物であり、ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１Ｌ１（低親和性）、ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１＿Ｌ１．１（高親和性）、ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１＿Ｌ１．３（中親和性）又はαＲＳＶに基づく標的アームであった。試験物とのインキュベーション後、細胞を以下の抗体：抗ＣＤ２５－ＰＥ（Ｍ－Ａ２５１）、抗ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７（ＳＫ１）、抗ＰＤ－１－Ａｌｅｘａ６４７（ＸＥＮＰ１６４３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７抗体標識キットで染色）、抗ＣＤ４５ＲＯ－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ７５０（ＵＣＨＬ１）、抗ＣＤ１６－ＢＶ６０５（３Ｇ６）、抗ＣＤ５６－ＢＶ６０５（ＨＣＤ５６）、抗ＣＣＲ７－ＧＶ７１１（Ｇ０４３Ｈ７）、抗ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ７８５（ＨＩ１００）、抗ＣＤ４－ＢＵＶ３９５（ＳＫ３）、抗ＣＤ３－ＢＵＶ４９６（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ９５－ＢＵＶ７３７（ＤＸ２）、抗ＣＤ２８－ＢＶ６５０（ＣＤ２８．２）、及びＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＢＶ５１０）で染色し、様々な細胞集団についてフローサイトメトリによって分析した。

本発明者らは、ＣＦＳＥ希釈（死細胞を排除するためのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ）に基づいて様々なリンパ球集団の増殖を調べた。そのデータを図８７に示し、ＣＤ２５発現に基づく様々なＴ細胞集団の活性化のデータを図８８に示し、種々の集団におけるＰＤ－１の発現のデータを図８９に示す。まとめると、データは実施例１０と同じ傾向を示す。さらに、データは、Ｘｔｅｎｄ類似体が非Ｘｔｅｎｄ類似体に匹敵することを示す。例えば、データは、ＸＥＮＰ３００４６のＥＣ５０がＸＥＮＰ３０２９０（ＸＥＮＰ３００４６に対するＸｔｅｎｄ類似体）のＥＣ５０に匹敵することを示す。
１１Ｂ：Ｘｔｅｎｄ類似体は抗腫瘍活性を示し、ＰＤ－１遮断と組み合わされる

この研究のために、ＭＨＣ Ｉ／ＩＩ－ＤＫＯ（ＮＳＧ－ＤＫＯ）であり、したがってＧＶＨＤに耐性であるＮＳＧマウスを使用した。ＮＳＧ－ＤＫＯマウス（１０匹／群）に、３×１０^６個のｐｐ６５形質導入ＭＣＦ－７細胞を－１５日目に皮内接種した。次いで、マウスに２．５ ｘ １０^６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内注射し、０日目に示された試験物／試験物の組み合わせで処置し、７、１４、及び２１日目に示された試験物でさらに処置した。腫瘍体積を週に３回キャリパーによって測定し、体重を週に１回測定し、血液を週に１回採取した。

経時的な腫瘍体積を図９０に示し、１１、１４、１７、１９、２１、２４、２６、及び２８日目の腫瘍体積を図９１に示す（マン・ホイットニー検定を使用してベースライン補正データに対して統計を行った）。データは、１１日目までに、ＸＥＮＰ３０２９０（１ｍｇ／ｋｇ）単独及びＸＥＮＰ３０５１６（３ｍｇ／ｋｇ）とＰＤ－１遮断との組み合わせが、ＰＤ－１遮断単独での処置よりも腫瘍サイズを有意に減少させたことを示す。２８日目までに、ＸＥＮＰ３０２９０（０．１、０．３、又は１ｍｇ／ｋｇ）又はＸＥＮＰ３０５１６（０．３、１、又は３ｍｇ／ｋｇ）とＰＤ－１遮断との全ての組合せが、ＰＤ－１遮断単独による処置よりも腫瘍サイズを有意に減少させた。

様々なリンパ球集団の増殖を示すデータを図９２～図９３に示す（対になっていないｔ検定を使用して対数変換されたデータに対して行われたＣＤ４５＋細胞増殖の統計）。注目すべきことに、１４日目までに、様々な用量のＸＥＮＰ３０２９０又はＸＥＮＰ３０５１６は、単独又はＰＤ－１遮断と組み合わせて、ＰＤ－１遮断単独と比較してリンパ球の増殖を有意に増強することが可能であった。実施例１０に示されるデータと一致して、対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物もリンパ球を増殖させたが、ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、それらの対応物の（すなわち、等価なＩＬ－１５バリアントを有する）ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物よりもはるかに少ないリンパ球の増殖を誘導した。ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを有するＸＥＮＰ３０５１８は、より強力なＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含むＸＥＮＰ３０３６２よりもリンパ球の増殖を誘導しなかった。上記のように、これは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が腫瘍環境では活性であるが、腫瘍環境外では実質的に不活性のままであることを示す。
実施例１２：ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＰＤ－１＋リンパ球集団を選択的に拡大する

実施例３Ｃは、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が活性化リンパ球に対して選択的であることを示した。ここで、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物がＰＤ－１＋リンパ球集団に対して特に選択的であることがインビボでさらに実証される。

宿主に対する反応性のない機能的なヒト免疫系を発達させるためにヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を移植したＮＳＧマウスであるＣＤ３４＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から入手した。本発明者らは、試験物を投与する前に、マウスから採取した血液中の様々なリンパ球集団におけるＰＤ－１発現レベルを調べた（そのデータを図９４に示す）。データは、ＣＤ３４＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスがヒトと同様のＰＤ－１発現プロファイル、すなわちエフェクターメモリ集団上のより高いＰＤ－１発現を有することを示す。ＣＤ４５＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスにおけるＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の活性は、ヒトにおける分子の活性を反映するはずである。

マウスに、０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３００４６（ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１＿Ｌ１．１及びＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含む［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ；ｎ＝５）、０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３０４２９（ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１＿Ｌ１．１及びＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含む［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ；ｎ＝５）、０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ２６００７（ＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含む対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ；ｎ＝４）又は０．３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３０４３２（ＩＬ－１５（ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含む対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ；ｎ＝５）を０日目に腹腔内投与した。様々なリンパ球集団の拡大を調べるために、０日目、４日目、７日目及び１０日目に血液を採取した。そのデータを図９５～図１０２に示す。

データは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（ＸＥＮＰ３００４６及びＸＥＮＰ３０４２９）が、ＰＤ－１＋細胞集団（例えば、ＣＤ４及びＣＤ８エフェクターメモリ集団）を増殖させ、ＸＥＮＰ３００４６によるエフェクターメモリ集団が１００倍を超える増殖であることを示す。図１０２は、ＸＥＮＰ３００４６及びＸＥＮＰ３０４２９による細胞増殖の量が、各リンパ球集団におけるベースラインＰＤ－１発現と相関することを示す。さらに、図１００及び図１０１に示すように、ＸＥＮＰ３０４２９は、ＣＤ４及びＣＤ８ナイーブ細胞の増殖をほとんど誘導せず（ＰＤ－１低）、ＩＬ－１５アームの効力の低下が活性化Ｔ細胞に対する選択性を改善することを示している。注目すべきことに、対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（ＸＥＮＰ２６００７及びＸＥＮＰ３０４３２）は非常に低いレベルの増殖を示し、本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が最小限の末梢リンパ球増殖を有するはずであることを示している。
実施例１３：カニクイザルにおけるＰＤ－１親和性及びＩＬ－１５効力について調整された［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の薬物動態及び薬力学

実施例５Ａに記載されるカニクイザル研究から収集されたデータのさらなる分析に基づいて、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、カニクイザルにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させながらＮＫ細胞活性化を減少させることが見出された（図１０３を参照）。注目すべきことに、図１０４に示されるように、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、ＣＤ８エフェクターメモリＴ細胞に対して選択的であった。

カニクイザルにおける別のインビボ研究では、ＰＤ－１親和性及びＩＬ－１５効力について調整された［ＮＣ］ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の薬物動態及び薬力学を調べた。カニクイザル（ｎ＝３）を１３日間馴化させ（－１３日目から開始）、引き続いて１日目に表示の試験物の第１の低用量（３倍用量）の静脈内投与、及び２２日目に表示の試験物のより高い第２の用量（１０倍用量）の静脈内投与を行った。薬物動態及び薬力学の両方を調べるために、研究全体を通して血液を採取した。そのデータを図１０５～図１０６に示す。

図１０５は、ＸＥＮＰ３０２９０（ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ］）又はＸＥＮＰ３０３６２（αＲＳＶ ｘ ＩＬ－１５［Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ］）のいずれかを投与した後のカニクイザルにおける様々なリンパ球集団の拡大を示す。まとめると、データは、ＸＥＮＰ３０２９０（高いＰＤ－１親和性及びより高いＩＬ－１５効力を有する）が、中程度のＰＤ１－細胞増殖を伴って２～３週間にわたって持続的な末梢薬力学を可能にしたことを示す。特に、γδ Ｔ細胞は、最も高い増殖倍率の細胞集団であり；ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞は、最も低い増殖倍率の細胞集団であり；ＣＤ８＋幹細胞メモリ細胞は、最も高い増殖関連集団である。

図１０６は、ＸＥＮＰ３０５１６（ｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］）又はＸＥＮＰ３０５１８（αＲＳＶ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］）のいずれかを投与した後のカニクイザルにおける様々なリンパ球集団の拡大を示す。まとめると、データは、ＸＥＮＰ３０５１６（高いＰＤ－１親和性及びより低いＩＬ－１５効力を有する）が、有意なＰＤ１－細胞増殖を伴わずに持続的な末梢薬力学を可能にしたことを示す。ＸＥＮＰ３０２９０と一致して、γδ Ｔ細胞は、最も高い増殖倍率の細胞集団であり；ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞は、最も低い増殖倍率の細胞集団であり；ＣＤ８＋幹細胞メモリ細胞は、最も高い増殖関連集団である。

図１０７～１１１は、異なるＰＤ－１親和性（ＲＳＶ標的化対照を含む）及び／又はＩＬ－１５効力を有する様々な試験物の薬物動態を示す。まとめると、データは、ＰＫに対するＰＤ－１親和性及びＩＬ－１５効力の両方の明らかな影響を示す。例えば、図１０７に示されるように、最も高いＰＤ－１親和性及びより高いＩＬ－１５効力を有するＸＥＮＰ３０２９０が、より低いＰＤ－１親和性を有するＸＥＮＰ３０２９１及びＸＥＮＰ２９４３９の両方よりも速いクリアランスをもたらした。しかしながら、最も高いＰＤ－１親和性を有するが、より低いＩＬ－１５効力を有するＸＥＮＰ３０５１６は、ＸＥＮＰ３０２９０よりも遅いクリアランスをもたらした。この同じ傾向が、より高いＩＬ－１５効力及びより低いＩＬ－１５効力をそれぞれ有するαＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物であるＸＥＮＰ３０３６２及びＸＥＮＰ３０５１８について図１１１に示される。注目すべきことに、ＩＬ－１５［Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ］を含む試験物及びＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ］を含む試験物についてＰＫに明らかな差はないようであった。

最後に、図１１２は、ＸＥＮＰ３０２９０、ＸＥＮＰ３０５１６及びＸＥＮＰ３０３６２による処置後の様々なリンパ球集団におけるＰＤ１発現を示す。データは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物がＰＤ－１発現を増加させることを示す。図１１３は、全てのＴ細胞メモリサブセットのピーク増殖倍率とピークＰＤ－１発現との間の相関を示す。これの意味はさらなる調査を必要とし得るが、ＰＤ－１発現の増加は、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物による増強された効果のための正のフィードバック・ループを提供し得る。
実施例１４：グリコシル化を除去するためのＩＬ－１５バリアントの操作

ＩＬ－１５のグリコシル化は、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（ＰＤ－１標的化融合物を含む）の不均一性に影響を及ぼし、活性及び／又は産生に影響を及ぼし得る。したがって、ＩＬ－１５バリアントを、不均一性を低下させることを目的として操作した。これに向けて、様々な戦略が検討された。

ＩＬ－１５上のグリコシル化部位には、Ｎ７１、Ｎ７９及びＮ１１２（ヒトＩＬ－１５成熟形態配列に従って番号付けされている）が含まれる。糖鎖欠失に対する第１のアプローチは、これらの部位に改変を導入することであり、例示的な改変はＮ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ及び／又はＮ１１２Ｑを含む。別のアプローチは、グリコシル化モチーフＡｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒを破壊するためにＮ７１、Ｎ７０及び／又はＮ１１２の周りに改変を導入することであり、例示的な改変はＳ１１４＿及びＳ１１４Ａを含む。

さらに、Ｆｃ融合物中のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー中のセリンがＯ－グリコシル化を受け得ることが以前に報告されている。したがって、（Ｆｃ融合物のコンテキストで）不均一性を減少させるための最終的なアプローチは、これまでに使用されたＧｌｙ－ＳｅｒリンカーをＧｌｙ－Ａｌａリンカーで置き換えることである。

上記の様々なアプローチを単独及び組み合わせて検討した。例示的な糖鎖操作されたＩＬ－１５バリアントの配列を図１１４に示し、例示的な非標的ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物及びグリコシル化を除去するように操作された標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の配列を図１１５～図１１７に示す。
１４Ａ：糖鎖工学ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の物理的特性評価

ＸＥＮＰ３０５１６（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］ｗ／（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号７））、ＸＥＮＰ３１９８１（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ］ｗ／（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号７））、ＸＥＮＰ３１９８２（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］ｗ／（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号７））、ＸＥＮＰ３１９８４（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］ｗ／（Ｇ４Ａ）リンカー（配列番号８））、ＸＥＮＰ３１９８５（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａ］ｗ／（Ｇ４Ａ）リンカー（配列番号８））、ＸＥＮＰ３１９８６（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］ｗ／（Ｇ４Ａ）リンカー（配列番号８））、及びＸＥＮＰ３１９８７（ｍＡｂ Ｃ Ｈ１＿Ｌ１．１ ｘ ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４＿］ｗ／（Ｇ４Ａ）リンカー（配列番号８））を、上記に一般的に記載されるとおりに製造し、分析ＩＥＸによって特徴付けた。

タンパク質を、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生させ、プロテインＡクロマトグラフィ（精製部１）とそれに続く陰イオン交換クロマトグラフィ（精製部２）を含む２段階精製プロセスによって精製した。精製部２を示すクロマトグラムを図１１８Ａに示す。クロマトグラムは、以下に一般的に記載されるような不均一性について分析アニオン交換クロマトグラフィ（分析ＡＩＥＸ）によってさらに特徴付けられた主ピークの単離を示す。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）システムで行った。２８０ｎＭのＵＶ検出波長で、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）緩衝液中０～４０％ＮａＣｌ勾配を使用して、１．０ｍＬ／分でＰｒｏｔｅｏｍｉｘ ＳＡＸ－ＮＰ５の５μＭ非多孔質カラム（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，Ｄｅｌ．）に試料を注入した。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＯｐｅｎＬＡＢ ＣＤＳ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＩＣ ｖｅｒｓｉｏｎ Ｃ．０１．０７を用いて行った。ピークの分析的ＡＩＥＸ特性評価を示すクロマトグラムを図１１８Ｂに示す。ＸＥＮＰ３０５１６及びＸＥＮＰ３１９８４は、実質的なグリコシル化由来の不均一性に特徴的な広いピークとして提示された。ＸＥＮＰ３１９８２、ＸＥＮＰ３１９８５、ＸＥＮＰ３１９８６及びＸＥＮＰ３１９８７（より少ない程度であるがＸＥＮＰ３１９８１）は、グリコシル化由来の不均一性の除去に成功したことを示す２つの別個のピークとして示された。
１４Ｂ：糖鎖工学ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のインビトロ特性評価

最初の実験では、ＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ＯＫＴ３）で４８時間刺激し、次いでＣＦＳＥ（ＨＥＫ細胞において生産）と３７℃で４日間インキュベートした。様々なＴ細胞集団の増殖を、ＣＦＳＥ希釈（死細胞を排除するためのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ）に基づいて決定した。ＣＤ８＋エフェクターメモリＴ細胞のデータを図１１９に示す。グリコシル化保持活性を除去するように操作されたＩＬ－１５バリアントを含む試験物のそれぞれは、予想外に、ＩＬ－１５グリコシル化を除去するように操作されていないＸＥＮＰ３０５１６（及びＧｌｙ－Ａｌａリンカーを有する対応するＸＥＮＰ３１９８４）よりも強力であった。

上記の実験における知見を考慮すると、分子の効力も腫瘍環境の外側にシフトし、選択性が失われることが予想された。したがって、新たなＩＬ－１５バリアントを含むＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合対照も、腫瘍環境外での糖鎖工学ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の挙動を調べるための代用物として作用するように構築した。第２の実験では、Ｔ細胞の増殖における、（糖鎖工学を用いた及び用いない）ＩＬ－１５バリアントを含む「ＰＤ－１標的化」対「ＲＳＶ標的化」ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（ＣＨＯ細胞において生産）のインビトロ活性を、上記で一般的に記載されるように調べた。ＣＤ４及びＣＤ８エフェクターメモリＴ細胞に対する様々な試験物（「ＰＤ－１標的」対「ＲＳＶ標的」）のＥＣ５０を示すデータを図１２０及び図１２１に示す。予想外にも有利にも、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑバリアントは、エフェクターメモリＴ細胞に対するＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃの選択性を向上させることが見出された（対応するＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃに対する効力の増加倍数によって示される）。結果として、ＩＬ－１５におけるグリコシル化を除去するためのＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、及びＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）との間のＧｌｙ－Ａｌａリンカーをさらに含む、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）効力バリアントを有するＸＥＮＰ３１９８６は、全ての試験物の中で最大の選択性を示す。
１４Ｃ：糖鎖工学ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のインビボ特性評価

糖鎖工学ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のインビボ活性を、実施例１１Ｂに記載したものと同様のマウス腫瘍モデルにおいて調べた。特に、ＮＳＧ－ＤＫＯマウス（１０匹／群）に、３×１０^６個のｐｐ６５形質導入ＭＣＦ－７細胞を－１８日目に皮内接種した。次いで、マウスに２．５ ｘ １０^６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内注射し、０日目に示された試験物／試験物の組み合わせで処置し、７、１４、及び２１日目に示された試験物でさらに処置した。腫瘍体積を週に３回キャリパーによって測定し、体重を週に１回測定し、血液を週に１回採取した。経時的な腫瘍体積の変化を図１２２に示し、１７日目については図１２３に示す。１４日目までのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示すデータを図１２４に示す。インビトロのデータと一致して、糖鎖工学バリアントは、（低用量でさえ）Ｔ細胞拡大及び抗腫瘍活性の増強を示し、ＰＤ－１遮断と生産的に組み合わせた。
１４Ｄ：糖鎖工学ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、インビボでの向上した薬力学、薬物動態及び選択性を実証する

カニクイザル（ｎ＝３）を１３日間順化させ（－１３日目から開始）、その後、示されたＰＤ－１標的化（及び対照ＲＳＶ標的化）ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物を様々な用量濃度（１倍の低用量、３倍の中用量、１０倍の高用量、又は３０倍の超高用量）で静脈内投与した。薬物動態及び薬力学の両方を調べるために、研究全体を通して血液を採取した。そのデータを図１２５～図１３３に示す。

以下の観察を行った：ＸＥＮＰ３０２９０は１倍の低用量でＰＤ１＋細胞増殖を誘導し（図１２５）；ＸＥＮＰ３０２９０は、１０倍の高用量で良好なＰＤ１＋細胞増殖を誘導したが、ＲＳＶ標的化対照ＸＥＮＰ３０３６２の活性によって示されるように、ＰＤ１－細胞に対しては中程度の活性を有しており（図１２６）；ＸＥＮＰ３０５１６は、１０倍の高用量で良好な選択性で良好なＰＤ１＋細胞増殖を誘導し（図１２７）；ＸＥＮＰ３０５１６は、優れた選択性を維持しながら３０倍の非常に高用量でより大きなＰＤ１＋増殖を誘導し（図１２８）；ＸＥＮＰ３１９８６は、優れた選択性で１倍の低用量で良好なＰＤ１＋細胞増殖を誘導し（図１２９）；ＸＥＮＰ３１９８６は、優れた選択性を維持しながら３倍の中用量でＰＤ１＋細胞増殖の増強を誘導し（図１３０）；ＸＥＮＰ３１９８６は、優れた選択性を維持しながら１０倍の高用量で非常に大きなＰＤ１＋細胞増殖を誘導した（図１３１）。まとめると、データは、用量の増加がより高い選択性をもたらすことを示している。加えて、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］バリアントを含むＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］バリアントを含むＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物よりも選択的であり、それは、ＩＬ－１５［Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ］バリアントを含むＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物よりも選択的であった。

予想外にも、図１３４のデータは、同じ用量で、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］バリアントを含む脱グリコシル化ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ ＸＥＮＰ３１８９６は、ＸＥＮＰ３１８９６がＸＥＮＰ３０５１６と比較して増強された効力／薬力学を有するにもかかわらず、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］バリアントを含むグリコシル化ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ ＸＥＮＰ３０５１６と比較して増強された薬物動態を示したことを示す。ＰＤ－１標的化分子と一致して、図１３５に示されるデータは、同じ用量で、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］バリアントを含む脱グリコシル化ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ ＸＥＮＰ３２１６９が、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］バリアントを含むグリコシル化ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ ＸＥＮＰ３２１６９と比較して薬物動態の増強を示したことを示しており、このことは、曝露の増強が、ＩＬ－１５からＮ結合型グリカンを除去することに起因することを示している。したがって、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄからの効力の低下が曝露を増加させ、グリコシル化の除去が曝露を増加させるので、ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］バリアントにおける組み合わせは、両方の効果からの最適な曝露及びその後のＴ細胞増殖を付与する。
実施例１５：ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］バリアントを操作して不安定なトリプトファンを除去する

ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］は、ＶＨ－ＣＤＲ３（ＸｅｎｃｏｒナンバリングでのＷ１１２；ＫａｂａｔナンバリングでのＷ１００）中のトリプトファンを含み、それは、酸化及びその後のＰＤ－１結合の喪失を起こしやすい（データは示さず）。

したがって、不安定なトリプトファンを除去するための作戦が開始された。ＶＨ中の１００位（Ｋａｂａｔナンバリング）のトリプトファンのＦ、Ｌ、Ｙ、Ｉ、Ｈ、Ｑ、Ｓ、Ｅ及びＲによる置換を含むｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１Ｌ１バリアントを生成し、ＰＤ－１（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有する二価ＩｇＧ１フォーマットのコンテキスト）への結合をＯｃｔｅｔを使用して調べた。図１３６に示されるセンサーグラムは、不安定なトリプトファンを修復すると、ＰＤ－１への結合の完全な喪失又は実質的により弱い結合が生じたことを示している。

親和性を回復させるために、以前に同定された親和性増強ＶＨ置換（実施例９参照）をＷ１００Ｆ（Ｋａｂａｔナンバリング）と組み合わせた。さらに、新しいＶＨを、以前に同定された（実施例９参照）親和性増強ＶＬバリアントＬ１．１４０と対にした。Ｏｃｔｅｔを使用して、ＰＤ－１への新しいバリアント（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有する二価ＩｇＧ１フォーマットのコンテキスト）の結合を調べた。そのデータを図１３９に示す。ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ１］＿Ｈ１．１７６＿Ｌ１．１４０、ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ１］＿Ｈ１．１７７＿Ｌ１．１４０、及びｍＡｂ Ｃ［ＰＤ１］＿Ｈ１．１８０＿Ｌ１．１４０を含むｍＡｂ Ｃ［ＰＤ１］＿Ｈ１＿Ｌ１．１のものに近いＰＤ－１親和性結合を回復させるいくつかのバリアントが同定された、その配列は、二価ｍＡｂとして図１３７に、及び、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のコンテキストにおいて図１３８に示されている。図１４０は、ＸＥＮＰ３１９８６及びＸＥＮＰ３２４３５（Ｔｒｐ操作／親和性修復されたｍＡｂ Ｃ［ＰＤ１］＿Ｈ１．１７６＿Ｌ１．１４０を有する）のセンサーグラムを示し、修復された分子がＰＤ－１に対して同等の親和性を有することを示す。さらに、酸化修復は非競合エピトープに影響を及ぼさなかった（データは示さず）。
１５Ａ：Ｔｒｐ操作されたＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のインビトロ特性評価

ＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ＯＫＴ３）で４８時間刺激し、次いでＣＦＳＥ（ＨＥＫ細胞において生産）と３７℃で４日間インキュベートした。様々なＴ細胞集団の増殖を、ＣＦＳＥ希釈（死細胞を排除するためのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ）に基づいて決定した。ＣＤ８＋エフェクターメモリＴ細胞のデータを図１４１に示す。データは、Ｔｒｐを除去するように操作されたＰＤ－１結合ドメインを有するＸＥＮＰ３２４３５、ＸＥＮＰ３２４３６及びＸＥＮＰ３２４３９は、（ＰＤ－１に対する類似の親和性を有するにもかかわらず）ＸＥＮＰ３１９８６と同等又はそれ以上にＣＤ８＋エフェクターメモリＴ細胞の増殖において強力であることを示す。この傾向は、ＣＤ４エフェクターメモリＴ細胞並びに総ＣＤ８ Ｔ細胞及び総ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖について一貫している（データは示さず）。
１５Ｂ：親和性を回復させるための付加Ｔｒｐ操作ｍＡｂ Ｃ［ＰＤ－１］バリアントの生成

Ｔｒｐ操作ｍＡｂ＿Ｃ［ＰＤ－１］の親和性を回復させるために利用した別のアプローチはファージの作戦であった。ファージライブラリを、可変重鎖ＣＤＲ３に導入された突然変異を有するｍＡｂ＿Ｃ［ＰＤ－１］Ｈ１．１５１＿Ｌ１．１（配列は図１３７ＡにＸＥＮＰ３２３４４として示される）に基づいて作製した。ライブラリから同定された可変領域を二価ｍＡｂとしてフォーマットし、その配列を図１５２Ａ～図１５２ＪにＸＥＮＰ３２８０５～ＸＥＮＰ３２８４０として示す。

新規ｍＡｂ＿Ｃ［ＰＤ－１］バリアントを、上記で一般的に記載されるようにＯｃｔｅｔによって親和性についてスクリーニングした。特に、抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＡＨＣ）バイオセンサーを使用して試験物を捕捉し、複数の濃度のＰＤ－１に浸漬した。解離定数（Ｋ_Ｄ）、会合速度（ｋ_ａ）及び解離速度（ｋ_ｄ）を示すデータを図６５に示す。

次いで、結合増強及び特異的親和性増強の置換を実証する上記のｍＡｂ＿Ｃ［ＰＤ－１］バリアント由来の可変重ドメインを、以前に同定された（実施例９参照）親和性増強ＶＬバリアントＬ１．１４０と組み合わせ、二価ｍＡｂとしてフォーマット化した（その配列は図１５２Ｊ～図１５２ＭにＸＥＮＰ３３４４１～３３４５５として示されている）。
実施例１６：ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５はＴ細胞増殖の抑制を逆転させる

増殖エフェクターＴ細胞に加えて、ＩＬ－１５はまた、Ｔｒｅｇ上の受容体に結合し、その増殖を増強することができる。しかしながらＴｒｅｇは免疫応答を抑制するので、腫瘍学的処置には好ましくないと考えられる。

ラパマイシンはインビトロでＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇの増殖を促進し、結果として生じる増殖したＴｒｅｇはＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を抑制することが以前に報告されている（例えば、Ｂａｔｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｎｄ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７（１２）８３３８－８３４７；及びＳｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｒａｐａｍｙｃｉｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８（１）３２０－３２９を参照）。したがって、ＩＬ－１５、Ｔｒｅｇ、及び他のＴ細胞の間の関係を調べる本明細書の実験では、ラパマイシンで増殖させたＴｒｅｇを使用した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して陰性選択によってヒトＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を用いて、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清＋０．１μｇ／ｍｌのラパマイシン＋５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２中で１～４日間Ｔｒｅｇを増殖させた。Ｔｒｅｇを、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）でコーティングしたＴ７５フラスコに移し、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清＋０．１μｇ／ｍｌのラパマイシン＋５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２＋０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ ｍＡｂで培養した。ラパマイシンで増殖させたＴｒｅｇを利用する実験を、ＰＢＭＣからのＣＤ４＋Ｔ細胞の初期濃縮の少なくとも８日後に行った。
１６Ａ：ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＴｒｅｇの増殖を低下させる

ＩＬ－１５によるＴｒｅｇの増殖を調べるために、１．２５×１０^５個のＴａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｔｒｅｇを、示された用量の例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２０８１８（ＷＴ ＩＬ－１５）又はＸＥＮＰ２４０４５（ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］）（配列は図１４２に示される）、並びに１０％ウシ胎児血清（他のサプリメントなし）を含むＲＰＭＩ中の例示的なＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物と共に４日間インキュベートした。図１４３に示されるデータは、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（標的化及び非標的化）がラパマイシン拡大Ｔｒｅｇの増殖を誘導することを示す。注目すべきことに、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、標的化されていないＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物と比較して、Ｔｒｅｇの増殖を誘導する効力がはるかに低かった。
１６Ｂ：ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はエフェクターＴ細胞増殖を増強し、Ｔｒｅｇ抑制を減少させる

１×１０^５個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ（固定数）を、示された比率のＴａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ標識ラパマイシン拡張Ｔｒｅｇ、及び５μｇ／ｍｌの例示的な標的ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物とともに、プレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３；１００ｎｇ／ｍｌ）上に播種した。３７℃で４日間インキュベートした後、細胞をフローサイトメトリによって分析した。増殖をＣＦＳＥ（Ｔ細胞について）又はＴａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｒｅｇ用について）希釈によって測定し、Ｚｏｍｂｉｅ色素を使用して死細胞を除外した。

図１４４に示されるデータは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、ＣＤ８及びＣＤ４エフェクターメモリＴ細胞増殖の、Ｔｒｅｇ誘導性の抑制の効力をシフトさせた（低下させた）ことを示す。特に、対照ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によるシフトは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によって誘導される効力の低下よりも小さかった（これも、これが非常に腫瘍環境特有の効果であるべきであることを示す）。

図１４５に示すデータは、Ｔｒｅｇ／ＣＤ８ ＴＥＭ及びＴｒｅｇ／ＣＤ４ ＴＥＭ細胞数の比を示す。データは、試験物なしと比較して、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＴｒｅｇ／ＴＥＭ比を増加させたが、それでもなお、ＴＥＭ細胞増殖はＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によって増強されることを示す。これは、Ｔｒｅｇは増殖するが、増殖したＴｒｅｇは抑制能力の低下を顕著に示すことを示す。
１６Ｃ：Ｔ細胞増殖抑制の低下メカニズム
１６Ｃ（ａ）：ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物で処理したＴｒｅｇは、経時的にｅＴｒｅｇ集団の減少を示す

抑制低下の機序を調べるための最初の実験では、Ｔｒｅｇを、ａ）完全Ｔｒｅｇ培地（１０％ＦＢＳ、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、１００ｎｇ／ｍのｌラパマイシンを含むＲＰＭＩ）、ｂ）ラパマイシンを含まない完全Ｔｒｅｇ培地、又はｃ）１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５（１０％ＦＢＳ、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８を含むＲＰＭＩ；ＩＬ－２なし；ラパマイシンなし）を含む培地のいずれかで６日間増殖させた。１×１０^５個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、示された用量のＴａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｔｒｅｇとともに、プレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３；１００ｎｇ／ｍｌ）上に播種した。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を決定した。そのデータを図１４６に示す。データは、ＩＬ－１５で前処理されたＴｒｅｇが抑制能力の障害を示すことを示し、ＩＬ－１５がＴｒｅｇをより低い免疫抑制表現型に変換することを示唆する。

この観察をさらに調べるために、ラパマイシンで増殖させたＴｒｅｇをＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２２８２１（ＩＬ－１５［Ｎ６５Ｄ］；配列を図１４２に示す）で１４日間処理し、フローサイトメトリによって分析した。驚くべきことに、ＣＤ４＋細胞上のＣＤ２５及びＦＯＸＰ３の発現を示す図１４７のデータは、ＸＥＮＰ２２８２１による処理がＦＯＸＰ３発現を減少させたことを示す。ＦＯＸＰ３は一般にＴｒｅｇのマーカーであるが、ＦＯＸＰ３ｈｉｇｈ ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－は真に抑制性のｅＴｒｅｇであり、ＦＯＸＰ３ｌｏｗ ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－は非抑制性の活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞である（Ｍｉｙａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ＦｏｘＰ３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３０（６）：８９９－９１１）。ＣＤ４＋細胞上のＣＤ４５ＲＡ及びＦＯＸＰ３の発現を示す図１４８のデータは、ＸＥＮＰ２２８２１による処置がＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－集団をＦｏｘＰ３ｈｉｇｈからＦｏｘＰ３ｌｏｗにシフトさせることを示しており、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物による処置が集団をｅＴｒｅｇ（５．２４％から２．７２％への減少した集団）から、活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞（１８．２％から２８．６％への増加した集団）に実際にシフトさせたことを示している。

さらに、ＣＤ４＋細胞上のＣＤ２５及びＣＣＲ４の発現を示す図１４９のデータは、ＸＥＮＰ２２８２１による処理がＣＣＲ４発現を減少させたことを示す。ＣＣＲ４が免疫抑制に関与することは以前に報告されているＭｏｌｉｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＣＣＲ４ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｏｎ Ｅａｒｌｙ ａｎｄ Ｌａｔｅ Ｅｖｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｓｅｖｅｒｅ Ｓｅｐｓｉｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．１０（７））。

まとめると、これは、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物（非標的化及び標的化）が既存のＴｒｅｇ集団を拡大するが、Ｔｒｅｇを非免疫抑制表現型（例えば、ＦｏｘＰ３ｌｏｗ及びＣＣＲ４ｌｏｗ／－）に拡大することによってエフェクターＴ細胞増殖の抑制を逆転させることを示している。
１６Ｃ（ｂ）：ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＴ細胞増殖のＴＧＦβ抑制を逆転させる

腫瘍環境において、ＴＧＦβは、悪性細胞及び免疫細胞（例えばＴｒｅｇ）の両方によって発現され、Ｔ細胞増殖を抑制する機能を有し、抗腫瘍免疫応答の抑制をもたらす（Ｔｅｉｃｈｅｒ，ＢＡ．（２００７）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３（２１））。

ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物とＴＧＦβとの間の相互作用を調べるための実験では、ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍｌの例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４０４５の有無にかかわらず、表示用量のＴＧＦβ１と共に、３７℃で４日間、１００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）上でインキュベートした。４日後、細胞をフローサイトメトリによって分析した。Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈によって測定した。そのデータを図１５０に示す。データは、ＴＧＦβがＴ細胞の増殖を用量依存的に抑制するが、注目すべきことに、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合は、試験した全ての用量でＴ細胞増殖のＴＧＦβ抑制を妨げることを示す。

これは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物がＴ細胞増殖の抑制を逆転させる別のメカニズムが、ＴＧＦβの抑制作用を逆転させることによるものであることを示している。

本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の作用機序をさらにプローブするために、ヒトにおけるＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントの低下した効力と比較してマウスにおける同様の低下した効力を有するＩＬ－１５バリアントを有しマウスＰＤ－１結合ドメインを有するＰＤ－１標的化マウス代用ＩＬ－１５分子を作製した。マウス脾細胞を使用するインビトロアッセイでは、ＰＤ－１標的化マウス代用ＩＬ－１５分子がＰＤ１＋マウスＴ細胞に対して高度に選択的であることが見出された（データは示さず）。

ＰＤ－１標的化マウス代用ＩＬ－１５分子の活性をＭＣ３８担がんマウスにおいて調べて、末梢及び腫瘍内の薬力学を評価した。この研究からのデータは示されていないが、結果をここに要約する。この研究は、ＰＤ－１標的化マウス代用ＩＬ－１５分子が、マウスの腫瘍体積及び重量を減少させることを示した。注目すべきことに、６日目に、腫瘍におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞及びグランザイムＢ発現の増加があった。Ｔｒｅｇは脾臓で増殖したが、腫瘍では顕著に減少した。まとめると、これは腫瘍におけるＣＤ８：Ｔｒｅｇ比の増加を可能にした。さらに、ＰＤ－１標的化マウス代用ＩＬ－１５分子は、脾臓においてＣＤ８^＋Ｔ、ＮＫ及びＮＫＴ細胞を実質的に増殖させたが腫瘍においてＣＤ８^＋Ｔ及びＮＫ細胞を適度に増殖させただけの非標的化マウス代用ＩＬ－１５分子と比較して、ＮＫ及びＮＫ Ｔ細胞の増殖を促進しなかったことが見出された。
１６Ｄ：非標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はエフェクターＴ細胞増殖を増強し、Ｔｒｅｇ抑制を減少させる

１×１０^５個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ（自家）を、プレート結合抗ＣＤ３（１００ｎｇ／ｍｌ；ＯＫＴ３）上で、１０μｇ／ｍｌのＸｍＡｂ ２４３０６を含むＴａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｔｒｅｇの２倍希釈物と３７℃で３日間共培養した。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋応答細胞の増殖をＣＦＳＥ又はＴａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ希釈によって測定し、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）による染色を使用して死細胞を除外した。そのデータを図１５５Ａ～図１５５Ｂに示す。データは、ＸｍＡｂ２４３０６が、抗ＣＤ３によって誘導されるエフェクターＴ細胞の増殖のＴｒｅｇ抑制を克服することを示す。
実施例１７：低下したＩＬ１５効力と組み合わせたＰＤ１標的化は選択性を可能にする

ヒトＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で４８時間刺激し、次いでＣＦＳＥで標識し、試験物と３７°Ｃで４日間インキュベートした。データは、（図１５４ＡにおいてＸＥＮＰ３１３２６対ＸＥＮＰ３１３２９の比較によって示されるように）ＰＤ１標的化単独が、限られた選択性（ＲＳＶ標的化及びＰＤ１標的化のＥＣ５０の２．４倍の差）を提供することを示している。しかしながら、ＩＬ－１５効力の低下と組み合わせたＰＤ１標的化（図１５４ＢのＸＥＮＰ３０５１６及びＸＥＮＰ３２９２７対ＸＥＮＰ３０５１８の比較；図１５４ＣのＸＥＮＰ３１９８６及びＸＥＮＰ３２４３５対ＸＥＮＰ３２１６９の比較によって示される）は、有意に増強された選択性を提供する。いくつかの例では、脱グリコシル化バリアントは選択性をさらに高めた（脱グリコシル化バリアントを用いた場合は２４６倍の選択性であり、用いなかった場合の１０５倍の選択性と対照的である）。いくつかの分析によれば、ＸＥＮＰ３０５１６及びＸＥＮＰ３２９２７は、ＸＥＮＰ３０５１８と比較して約３３９倍の選択性を有することが示され、ＸＥＮＰ３１９８６及びＸＥＮＰ３２４３５は、ＸＥＮＰ３２１６９と比較して約２９９倍の選択性を有することが示された。
実施例１８：ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃはより少ない免疫抑制性Ｔｒｅｇの増殖を誘導する

実施例１６Ｄ並びに図１５５Ａ及び図１５５Ｂに示されるように、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物は、抗ＣＤ３によって誘導されるエフェクターＴ細胞増殖のＴｒｅｇ抑制を克服することができる。このセクションでは、このような反転のメカニズムをさらに調べる。

最初の研究では、Ｔｒｅｇ抑制の逆転がＴｒｅｇ増殖の減少に起因するかどうかを調べた。１．２５×１０^５個のＴａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｔｒｅｇを、１０％ウシ胎児血清（他のサプリメントなし）を含むＲＰＭＩ中の示された用量の例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２０８１８（ＷＴ ＩＬ－１５）又はＸＥＮＰ２４０４５（ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］）と共に４日間インキュベートした。図１５６に示されるデータは、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物がラパマイシン拡大Ｔｒｅｇの増殖を誘導することを示す。注目すべきことに、ＸＥＮＰ２４０４５は、ＸＥＮＰ２０８１８と比較してＴｒｅｇの増殖を誘導する効力の低下を実証している。いずれにせよ、これは、Ｔｒｅｇ抑制の逆転がＴｒｅｇ増殖の減少の結果ではなかったことを示す。

１×１０^５個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ（固定数）を、示された比率のＴａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ標識ラパマイシン拡張Ｔｒｅｇ、及び５μｇ／ｍｌのＸＥＮＰ２４０４５とともに、プレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３；１００ｎｇ／ｍｌ）上に播種した。３７℃で４日間インキュベートした後、細胞をフローサイトメトリによって分析した。増殖をＣＦＳＥ（Ｔ細胞について）又はＴａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｒｅｇ用について）希釈によって測定し、Ｚｏｍｂｉｅ色素を使用して死細胞を除外した。図１５７Ａ及び図１５７Ｂに示されるデータは、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が、ＣＤ８及びＣＤ４エフェクターメモリＴ細胞増殖の、Ｔｒｅｇ誘導性の抑制の効力をシフトさせた（低下させた）ことを示す。図１５８Ａ及び図１５８Ｂに示すデータは、Ｔｒｅｇ／ＣＤ８ Ｔ_ＥＭ及びＴｒｅｇ／ＣＤ４ Ｔ_ＥＭ細胞数の比を示す。データは、試験物なしと比較して、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＴｒｅｇ／Ｔ_ＥＭ比を増加させたが、それでもなお、Ｔ_ＥＭ細胞増殖はＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物によって増強されることを示す。これは、Ｔｒｅｇは増殖するが、増殖したＴｒｅｇは抑制能力の低下を顕著に示すことを示す。

抑制能の低下の機序を調べるための、Ｔｒｅｇを、ａ）完全Ｔｒｅｇ培地（１０％ＦＢＳ、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、１００ｎｇ／ｍｌのラパマイシンを含むＲＰＭＩ）、ｂ）ラパマイシンを含まない完全Ｔｒｅｇ培地、又はｃ）１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５（１０％ＦＢＳ、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８を含むＲＰＭＩ；ＩＬ－２なし；ラパマイシンなし）を含む培地のいずれかで６日間増殖させた。１×１０^５個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、示された用量のＴａｇ－ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｔｒｅｇとともに、プレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３；１００ｎｇ／ｍｌ）上に播種した。ＣＤ８^＋及びＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を決定した。そのデータを図１５９Ａ及び図１５９Ｂに示す。データは、ＩＬ－１５で前処理されたＴｒｅｇが抑制能力の障害を示すことを示し、ＩＬ－１５がＴｒｅｇをより低い免疫抑制表現型に変換することを示唆する。

この観察をさらに調べるために、ラパマイシンで増殖させたＴｒｅｇをＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２２８２１（ＩＬ－１５［Ｎ６５Ｄ］）で１４日間処理し、フローサイトメトリによって分析した。驚くべきことに、ＣＤ４^＋細胞上のＣＤ２５及びＦＯＸＰ３の発現を示す図１６０Ａ及び図１６０Ｂのデータは、ＸＥＮＰ２２８２１による処理がＦＯＸＰ３発現を減少させたことを示す。ＦＯＸＰ３は一般にＴｒｅｇのマーカーであるが、ＦＯＸＰ３^ｈｉｇｈ ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－は真に抑制性のｅＴｒｅｇであり、ＦＯＸＰ３^ｌｏｗ ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－は非抑制性の活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞である（Ｍｉｙａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ＦｏｘＰ３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３０（６）：８９９－９１１）。ＣＤ４^＋細胞上のＣＤ４５ＲＡ及びＦＯＸＰ３の発現を示す図１６１Ａ及び図１６１Ｂのデータは、ＸＥＮＰ２２８２１による処置がＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^－集団をＦｏｘＰ３^ｈｉｇｈからＦｏｘＰ３^ｌｏｗにシフトさせることを示しており、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物による処置が集団をｅＴｒｅｇ（５．２４％から２．７２％への減少した集団）から、活性化エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞（１８．２％から２８．６％への増加した集団）に実際にシフトさせたことを示している。

さらに、ＣＤ４^＋細胞上のＣＤ２５及びＣＣＲ４の発現を示す図１６２Ａ及び図１６２Ｂのデータは、ＸＥＮＰ２２８２１による処理がＣＣＲ４発現を減少させたことを示す。ＣＣＲ４が免疫抑制に関与することは以前に報告されているＭｏｌｉｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＣＣＲ４ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｏｎ Ｅａｒｌｙ ａｎｄ Ｌａｔｅ Ｅｖｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｓｅｖｅｒｅ Ｓｅｐｓｉｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．１０（７））。

まとめると、これは、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物が既存のＴｒｅｇ集団を拡大するが、Ｔｒｅｇを非免疫抑制表現型（例えば、ＦｏｘＰ３^ｌｏｗ及びＣＣＲ４^ｌｏｗ／^－）に拡大することによってエフェクターＴ細胞増殖の抑制を逆転させることを示している。
実施例１９：ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物はＴ細胞増殖のＴＧＦβ抑制を逆転させる

腫瘍環境において、ＴＧＦβは、悪性細胞及び免疫細胞（例えばＴｒｅｇ）の両方によって発現され、Ｔ細胞増殖を抑制する機能を有し、抗腫瘍免疫応答の抑制をもたらす（Ｔｅｉｃｈｅｒ，ＢＡ．（２００７）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３（２１））。

ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物とＴＧＦβとの間の相互作用を調べるための実験では、ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍｌの例示的なＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４０４５の有無にかかわらず、表示用量のＴＧＦβ１と共に、３７℃で４日間、１００ｎｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）上でインキュベートした。４日後、細胞をフローサイトメトリによって分析した。Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈によって測定した。そのデータを図１６３Ａ及び図１６３Ｂに示す。データは、ＴＧＦβがＴ細胞の増殖を用量依存的に抑制するが、注目すべきことに、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合は、試験した全ての用量でＴ細胞増殖のＴＧＦβ抑制を妨げることを示す。

これは、ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物がＴ細胞増殖の抑制を逆転させる別のメカニズムが、ＴＧＦβの抑制作用を逆転させることによるものであることを示している。
実施例２０：インビボ活性のさらなる特性評価
２０Ａ：ＣＤ３４＋Ｈｕ－ＮＳＧモデルにおけるＰＤ－１標的化低効力糖鎖工学ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物のインビボ抗腫瘍活性

実施例１２におけるように、新規［ＮＣ］ＰＤ－１標的化低効力糖鎖工学ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ３２９８６（単剤として、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて）の活性を、ＣＤ３４＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスにおいて（単剤として、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて非標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃと比較して）調べて、ヒトにおける分子の活性を反映させた。マウス（９～１０匹／群）に、３×１０^６個のｐｐ６５形質導入ＭＣＦ－７細胞を－１４日目に皮内接種した。次いで、０日目に（及び週に１回）、示された試験物でマウスを腹腔内処置した。腫瘍体積を週に３回までキャリパーによって測定し、体重を週に１回測定し、血液を週に１回採取した。

経時的な腫瘍体積の変化を図１６４に示す。全ての群は、ＰＢＳ対照による処置と比較して、１５日目までに有意に増強された腫瘍活性を示した（ｐ≦０．０５）。注目すべきことに、ＰＤ－１遮断と組み合わせることによって抗腫瘍活性に対する明らかな利益があった。種々のリンパ球集団の拡大も調べた。そのデータを、７日目及び１３日目のＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞については図１６５に、１３日目のＣＤ８：Ｔｒｅｇ比については図１６６に示す。注目すべきことに、ＰＤ－１遮断と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－１５は、ＰＤ－１遮断と組み合わせた非標的化ＩＬ－１５－Ｆｃ融合物と比較して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞の両方の増殖を有意に増強した。さらにこのモデルでは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５とＰＤ－１遮断の組み合わせは、単剤ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５と比較して、リンパ球増殖を有意に増加させた。注目すべきことに、ＣＤ８：Ｔｒｅｇ比は、ＰＤ１標的化ＩＬ１５（さらにＰＤ－１遮断との組み合わせ）で改善される。

腫瘍環境における分子の薬力学を調べるため、並びにさらなる用量レベルでのＸＥＮＰ３２８９６の活性を調べるために、別の同様の研究を行った。上記のように、ＣＤ３４＋Ｈｕ－ＮＳＧマウスに、３×１０^６個のｐｐ６５形質導入ＭＣＦ－７細胞を－１４日目に皮内接種した。次いで、０日目に（及び週に１回）、示された試験物でマウスを腹腔内処置した。１群あたり４匹のマウスを９日目に屠殺して、フローサイトメトリによる分析のために腫瘍組織試料を採取した。この試験では、抗腫瘍効果（データは示さず）は、おそらくｈｕＣＤ３４ドナーの違いに起因して、以前の試験と比較して遅かった。しかしながら、この研究は、腫瘍環境における有意な薬力学を明らかにした。図１６７に示すように、フローデータは以下を示す。ＸＥＮＰ３２９８６は、単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて、腫瘍において、総ＣＤ３＋Ｔ細胞を増加させ、Ｔ細胞表現型をエフェクターメモリＣＤ８＋にシフトさせ、ＸＥＮＰ３２９８６は、単独で、又はＰＤ－１遮断と組み合わせて、腫瘍においてＣＤ８：Ｔｒｅｇ比を増加させ、低用量の０．０１ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ３２９８６は、ＰＤ－１遮断との併用で有意な薬力学を可能にする。
２０Ｂ：ＰＤ－１標的化低効力ＩＬ－１５／Ｒα－Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ融合物のインビボ抗腫瘍活性

ＮＳＧ－ＤＫＯマウス（１０匹／群）に、３×１０^６個のｐｐ６５形質導入ＭＣＦ－７細胞を－１９日目に皮内接種した。次いで、マウスに２．５×１０^６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内注射し、０日目に（それからは週に１回）、示された濃度の示された試験物／試験物の組合せで処置した。腫瘍体積を週に３回キャリパーによって測定し、体重を週に１回測定し、血液を週に１回採取した。

ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントを含む試験物（ＲＳＶ標的対照を含む）の経時的な腫瘍体積の変化を図１６８Ａ～１６８Ｇ（各群のマウスについて）及び図１６９（群の中央値）に示す。ＸＥＮＰ３２９２７は、ＰＤ－１遮断単独と比較して、ＰＤ－１遮断と組み合わせて０．３ｍｇ／ｋｇで（１７、２０、２２及び２７日目にｐ＜０．０５）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせて１ｍｇ／ｋｇで（１５及び１７日目にｐ＜０．０５）、有意な腫瘍退縮を誘導した（マン・ホイットニー検定を使用してベースライン補正データに対して統計を行った）。ＸＥＮＰ３２９２７（１ｍｇ／ｋｇ）＋ＸＥＮＰ１６４３２（３ｍｇ／ｋｇ）群では、１匹を除く全ての非応答マウスが２２日目までに死亡したので（図１６８Ｆ参照）、データは、後の時点についてこの用量レベルでの試験物の組合せの真の有効性を捕捉していないことに留意すべきである。

ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ）バリアントを含む試験物（ＲＳＶ標的化対照を含む）の経時的な腫瘍体積の変化を図１６８Ｈ～１６８Ｌ（各群の各マウスについて）及び図１７０（群の中央値）に示す。ＸＥＮＰ３２４３５は、ＰＤ－１遮断単独と比較して、ＰＤ－１遮断と組み合わせて０．１ｍｇ／ｋｇで（１３日目及び１５日目にｐ＜０．０５）、及び、ＰＤ－１遮断と組み合わせて０．３ｍｇ／ｋｇで（１３日目、１５日目、及び１７日目にｐ＜０．０５）、有意な腫瘍退縮を誘導した。注目すべきことに、ＸＥＮＰ３２４３５は、このモデルにおいて単剤として有意な腫瘍退縮を示した（ＰＤ－１遮断単剤と比較して１７日目にｐ＜０．０５）（マン・ホイットニー検定を使用してベースライン補正データに対して統計を行った）。ＸＥＮＰ３２４３５（０．１ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇ）＋ＸＥＮＰ１６４３２（３ｍｇ／ｋｇ）群では、全てのマウスが２０日目までに死亡したため（図１６８Ｊ～図１６８Ｋを参照）、データはこれらの用量レベルでの試験物の組合せの完全な治療可能性を示していないことに留意すべきである。

全ての試験物についての１７日目までの腫瘍体積の変化を図１７１に示す。ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアント及びＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ）バリアントを含む試験物について、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋のＴ細胞活性化（ＣＤ２５発現によって示される）及び増殖（細胞数によって示される）をそれぞれ図１７２Ａ～図１７２Ｄ及び図１７３Ａ～図１７３Ｄに示す。最後に、ＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアント及びＩＬ－１５（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ）バリアントを含む試験物について、経時的なＩＦＮγの血清濃度をそれぞれ図１７４及び図１７５に示す。データは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ］ＸＥＮＰ３２９２７が０．１～１ｍｇ／ｋｇで活性であったこと、及びＰＤ－１標的化ＩＬ－１５［Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ］ＸＥＮＰ３２４３５が０．０３～０．３ ｍｇ／ｋｇのはるかに低い濃度で活性であったことを示す（リンパ球の活性化及び増殖並びにＩＦＮγ分泌によって示される）。注目すべきことに、この研究はまた、ＲＳＶ標的化ＩＬ－１５（いずれかのＩＬ－１５バリアントを含む）が、ＰＤ－１遮断単独と比較して、ＰＤ－１遮断と組み合わせて活性を増強しないことを示し、ＰＤ－１標的化機構の重要性をさらに実証した。
実施例２１：カニクイザルにおける、不安定なトリプトファンが除去されたＭＡＢ Ｃ［ＰＤ－１］バリアントの投与の薬力学的及び薬物動態学的効果

ＰＤ－１ｘＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａの投与の薬力学的効果を決定するために、ＰＤ－１ｘＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａで処置されたカニクイザル由来の末梢血のフローサイトメトリ分析を用いて免疫表現型検査を実施した。雄性カニクイザル（ｎ＝４）に、様々な用量濃度（１×低用量、１２×高用量）のＸＥＮＰ３２４３５又は様々な用量濃度（１倍の低用量、２０倍の高用量）のＸＥＮＰ３２９２７の３回の隔週用量（１、１５及び２９日目に投与）の静脈内（低速ボーラス）注射を行った。薬物動態及び薬力学の両方を調べるために、研究全体を通して血液を採取した。そのデータを図１６６～図１７１に示す。全血試料採取は静脈穿刺によって行った。サイトメトリ免疫表現型分析のために調製した試料を、以下の蛍光色素コンジュゲート抗体で染色した：抗ＦｏｘＰ３－ＦＩＴＣ（２５９Ｄ）又は抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ（ＳＰ３４）；抗ＣＤ８ｂ－ＰＥ（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）又は抗ＣＤ４５－ＰＥ（ＭＢ４－６Ｄ６）；抗ＣＤ５６－ＰＥ－ＣＦ５９４（Ｂ１５９）又は抗ＣＣＲ７－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ５９４（Ｇ０４３Ｈ７）；抗ＣＤ４５－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＭＢ４－６Ｄ６）又は抗ＣＤ２０－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（２Ｈ７）；抗ＣＤ８ａ－ＰＥ－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０（ＢＷ１３５／８０），抗ＣＤ２５－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｍ－Ａ２５１）又は抗ＮＫＧ２Ｄ－ＰＥ－Ｃｙ７（１Ｄ１１）；抗ＰＤ－１－ＡＰＣ（ＥＨ１２．２Ｈ７）又は抗ＣＤ８ｂ－ｅＦｌｕｏｒ６６０（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）；抗Ｋｉ６７－ＡＦ７００（Ｂ５６）又は抗ＣＤ１４－ＡＦ７００（Ｍ５Ｅ２）；抗ＣＤ４５ＲＡ－ＡＰＣ－Ｃｙ７（５Ｈ９）；抗ＣＤ３－ＢＶ４２１（ＳＰ３４）又は抗ＣＤ８ａ－ＢＶ４２１（ＢＭ１３５／８０）；抗ＣＤ２５－ＢＶ５１０（Ｍ－Ａ２５１）又は抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＢＶ５１０（Ｇ４６－６）；抗ＣＤ１４－ＢＶ６０５（Ｍ５Ｅ２）又は抗ＣＤ２８－ＢＶ６０５（ＣＤ２８．２）；抗ＣＤ１６－ＢＶ６５０（３Ｇ８）；抗ＣＤ２０－ＢＶ７１１（２Ｈ７）又は抗ＣＤ９５－ＢＶ７１１（ＤＸ２）；抗ＣＤ４－ＢＶ７８５（ＯＫＴ４）。全ての抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。絶対細胞数のリアルタイム定量化のために、ＢＤ ＴｒｕＣｏｕｎｔ^（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）チューブをＣＤ４５／側方散乱ゲーティングと組み合わせて使用した。

図１７６Ａ～図１７９Ｅは、ＸＥＮＰ３２４３５又はＸＥＮＰ３２９２７．のいずれかを投与した後のカニクイザルにおける様々なリンパ球集団の拡大を示す。以下の観察を行った：ＸＥＮＰ３２４３５は、１倍用量でＣＤ８Ｔ細胞増殖（幹細胞メモリ及びナイーブサブセットを含む）、γδ Ｔ細胞の大きな増殖、及びＮＫ細胞の最小限の増殖を誘導した（図１７６Ａ～図１７６Ｅ）。ＸＥＮＰ３２４３５は、ＮＫ細胞に対する影響を最小限に抑えながら、より高い１２倍用量でＣＤ８Ｔ細胞及びγδ Ｔ細胞のより大きな増殖を誘導した（図１７７Ａ～図１７７Ｅ）。ＸＥＮＰ３２９２７は、１倍用量でのＣＤ８Ｔ細胞増殖（幹細胞メモリ及びナイーブサブセットを含む）、γδ Ｔ細胞の大きな増殖、及びＮＫ細胞の最小限の増殖を誘導した（図１７８Ａ～図１７８Ｅ）。ＸＥＮＰ３２９２７は、ＮＫ細胞に対する影響を最小限に抑えながら、より高い２０倍用量でＣＤ８Ｔ細胞及びγδ Ｔ細胞のより大きな増殖を誘導した（図１７９Ａ～図１７９Ｅ）。まとめると、データは、用量の増加がＣＤ８ Ｔ細胞及びγδ Ｔ細胞のより大きな増殖及びＮＫ細胞の最小限の増殖をもたらすことを示す。

図１８０及び図１８１は、静脈内投与後のカニクイザルにおける試験物ＸＥＮＰ３２４３５又はＸＥＮＰ３２９２７の薬物動態を示す。以下の観察を行った：脱グリコシル化バリアントＸＥＮＰ３２４３５については、全身曝露（初回用量ＡＵＣ；濃度対時間曲線下面積）の増加は、１倍用量と１２倍用量との間で比例する用量よりもわずかに多かった（１４倍）（図１８０）。予想外にも、グリコシル化バリアントＸＥＮＰ３２９２７は曝露の増強を示し、全身曝露の増加（３２倍）は１倍用量と２０倍用量との間で比例する用量よりも多かった（図１８１）。ＸＥＮＰ３２４３５及びＸＥＮＰ３２９２７の１倍用量では、反復投与時にＡＵＣの減少及びクリアランスの増加が観察されたが、これは、観察された標的細胞集団拡大の結果としての標的媒介性薬物配置（ＴＭＤＤ）の増加に起因し得る。このＴＭＤＤ現象は、グリコシル化バリアントと比較して、脱グリコシル化バリアントでより顕著であった。バリアントＸＥＮＰ３２４３５及びＸＥＮＰ３２９２７の両方について反復投与後に蓄積は観察されなかった。まとめると、データは、ＸＥＮＰ３２４３５及びＸＥＮＰ３２９２７の両方がカニクイザルにおいて非線形かつ時変的な薬物動態を示すことを示した。
実施例２２：マウス代用ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５分子

本発明のＰＤ－１標的化ＩＬ－１５／Ｒα－Ｆｃ融合物の作用機序をさらにプローブするために、ヒトにおけるＩＬ－１５（Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）バリアントの低下した効力と比較して、マウスにおける同様の低下した効力を有するＩＬ－１５バリアントを有し、ヒトＰＤ－１に対するｍＡｂ Ｃ＿Ｈ１．１７６＿Ｌ１．１４０の結合親和性と比較して、マウスＰＤ－１に対して同様の結合親和性を有するマウスＰＤ－１結合ドメインを有するマウス代用ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５分子ＸＥＮＰ３３８６９を作製した。異なるＰＤ－１エピトープ（例えば、［ＮＣ］ＰＤ－１の場合）への結合がＰＤ－１標的化ＩＬ－１５分子の生物学的活性に影響を及ぼすかどうかを調べるために、ＸＥＮＰ３３８６９とは異なるｍｕＰＤ－１エピトープに結合する（すなわち競合しない）代替的なマウス代用ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５分子ＸＥＮＰ３６２１７を作製した。
２２Ａ：マウス代用ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５分子のインビトロ特性評価

マウス由来の脾細胞を、示された濃度のマウス代用非標的化低効力ＩＬ－１５、マウス代用ＰＤ－１標的化低効力ＩＬ－１５、及び対照マウス代用ＲＳＶ標的化低効力ＩＬ－１５と共にインキュベートした。図１８２Ａ及び図１８２Ｂのデータは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖（Ｋｉ－６７発現及び細胞数によって示される）を表し、マウス代用ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５分子ＸＥＮＰ３３８６９がＰＤ１＋マウスＴ細胞に対して高度に選択的であったことを示す。図１８３Ａ及び図１８３Ｂは、ＸＥＮＰ３６２１７についての別の実験からの対応するデータを示し、ＰＤ１＋マウスＴ細胞についても高度に選択的であったことを示す。
２２Ｂ：マウス代用ＰＤ－１標的化ＩＬ－１５分子のインビボ性能

ＰＤ－１標的化マウス代用ＩＬ－１５分子の活性をＭＣ３８担がんマウスにおいて調べて、末梢及び腫瘍内の薬力学を評価した。ＭＣ３８腫瘍モデルと同系のマウス系統である６～１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１００万個のＭＣ３８細胞の皮下注射を介して右側腹部に接種した。動物に腫瘍を成長させた。腫瘍サイズが１５０～２００ｍｍ^３に達したら、マウスを無作為に処置群に分けた。腫瘍担持マウスに、静脈内尾静脈注射によってＸＥＮＰ３３８６９の単回用量を投与した。低１倍用量、中３．３倍用量及び高１０倍用量の３つの用量を投与した。処置後３日目及び６日目に腫瘍及び脾臓を収集した。組織をフローサイトメトリ分析のために処理した。免疫表現型分析を、以下の抗体で染色することによって行った：抗グランザイムＢ－ＦＩＴＣ（ＱＡ１６Ａ０２）、抗ＣＤ４９ｂ－ＰＥ（ＤＸ５）、抗Ｋｉ６７－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（１６Ａ８）、抗ＣＤ２５－ＰＥ－Ｃｙ７（ＰＣ６１）、抗Ｆｏｘｐ３－ＢＶ４２１（ＭＦ－１４）、抗ＣＤ６９－ＢＶ５１０（Ｈ１．２Ｆ３）、抗ＣＤ６２Ｌ－ＡＰＣ（ＭＥＬ－１４）、抗ＣＤ４４－ＢＶ６０５（ＩＭ７）、抗ＣＤ４－ＢＶ６５０（ＲＭ４－５）、抗ＣＤ８－ＢＶ７１１（５３－６．７）、抗ＣＤ３－ＢＶ７８５（１４５－２Ｃ１１）、抗ＣＤ４５－ＢＵＶ３９５（３０－Ｆ１１）。全ての抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。

この研究からのデータを図１８４Ａ～図１８４Ｋに示す。以下の観察を行った：処置開始後３日目という早い時期に、１０倍用量のＸＥＮＰ３３８６９は腫瘍重量を減少させ、６日目に、ＸＥＮＰ３３８６９は試験した全ての用量で腫瘍重量を減少させた。ＸＥＮＰ３３８６９は、腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度及び細胞数の増加を誘導したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞などの他の免疫細胞集団に対する影響は最小限であった。ＸＥＮＰ３３８６９の効果は、脾臓と比較して腫瘍においてより顕著であった。腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の堅固な増殖は、Ｔｒｅｇに対する最小限の効果と共に、腫瘍ＣＤ８ Ｔ細胞：Ｔｒｅｇ比の大きな増加をもたらし、それは用量依存的であった。注目すべきことに、６日目に、ＸＥＮＰ３３８６９は、ＣＤ８＋Ｔ細胞並びに腫瘍において調べた他の全ての免疫細胞集団においてグランザイムＢ発現を増加させた。

同様の実験では、ＭＣ３８腫瘍担持マウスに、静脈内尾静脈注射を介してＸＥＮＰ３３８６９、ＸＥＮＰ３６２１３、ＸＥＮＰ３６２１６又はＸＥＮＰ３６２１７の単回用量を投与した。全ての試験物を低１倍用量で投与し、ＸＥＮＰ３６２１３、ＸＥＮＰ３６２１６及びＸＥＮＰ３６２１７は、より高い３．３倍用量でも投与した。処置後６日目に腫瘍及び脾臓を収集した。この研究からのデータを図１８５Ａ～図１８５Ｈに示す。以下の観察を行った：全ての試験物は、ビヒクル処置群と比較した場合、腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の数及び頻度の増加と共に腫瘍重量の減少を誘導した。ＸＥＮＰ３６２１３、ＸＥＮＰ３６２１６及びＸＥＮＰ３６２１７については、腫瘍ＣＤ８ Ｔ細胞：Ｔｒｅｇ比の用量依存的増加が見られた。対照的に、ＣＤ８ Ｔ細胞：Ｔｒｅｇ比は脾臓で減少し、ＸＥＮＰ３６２１３、ＸＥＮＰ３６２１６及びＸＥＮＰ３６２１７が腫瘍部位特異的効果を有することを示した。全ての試験物は、腫瘍中のＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞に対して最小限の効果を有するか、又はその頻度を減少させた。注目すべきことに、グランザイムＢを発現する腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、ＸＥＮＰ３６２１３、ＸＥＮＰ３６２１６及びＸＥＮＰ３６２１７による処理によって用量依存的に増加した。グランザイムＢを発現する脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の全体的な頻度は低かったが、処置後に増加が観察された。

ＭＣ３８同系腫瘍モデルを使用して、腫瘍成長に対するＸＥＮＰ３３８６９の効果を評価した。６～１２週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの右側腹部に１００万個の細胞を皮下接種した。マウスを腫瘍の存在について監視し、腫瘍が確立されたら（約２００ｍｍ^３）、処置を開始した。処置群には、ビヒクル、ＸＥＮＰ３３８６９及びマウス反応性抗ＰＤＬ１が含まれた。ビヒクル及びＸＥＮＰ３３８６９を０日目及び７日目に投与し、抗ＰＤＬ１を０日目、３日目、７日目及び１１日目に投与した。最初の用量を静脈内投与し、その後の用量を腹腔内空間に送達した。腫瘍サイズをデジタルキャリパーによって週２回測定し、腫瘍を最大体積２０００ｍｍ^３に達するまで、又は直径３ｍｍを超える潰瘍を形成するまで成長させた。この研究からのデータを図１８６Ａ～図１８６Ｂに示す。処置開始後１３日目の試験終了時に、ＸＥＮＰ３３８６９は、ビヒクル対照と比較して堅牢な抗腫瘍活性及び抗ＰＤＬ１よりも大きな腫瘍増殖阻害を示した（ＴＧＩ＝それぞれ１１１％及び６１％）。

第２の同様の実験では、ＸＥＮＰ３３８６９の抗腫瘍活性を、１倍、３．３倍及び１０倍を含む用量範囲で評価し、ビヒクル対照又は抗ＰＤＬ１と比較した。２つの低用量、１倍及び３．３倍も抗ＰＤＬ１と組み合わせて投与した。この研究からの結果を図１８７Ａ及び１８７Ｂに示す。１０倍用量は、処置を開始した後、少なくとも４２日目までにマウスの８０％が完全奏効を示し、堅牢で長期持続性の活性を示した。１倍用量及び３．３倍用量では単剤活性がほとんど又は全く観察されなかったが、抗ＰＤＬ１と組み合わせた場合、両方の用量が活性の改善を示した。３．３倍ＸＥＮＰ３３８６９と抗ＰＤＬ１との組合せは最良の組合せ活性を示し、４２日目に１０匹のマウスのうち８匹が完全奏効を示したが、単剤抗ＰＤＬ１は５匹の完全奏効者及び１匹の部分奏効しかもたらさなかった。

第３の実験では、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスを、ビヒクル、抗ＰＤＬ１、ＰＤ－Ｌ１遮断ｍｕＰＤ１ｘＩＬ１５代用ＸＥＮＰ３３８６９、ＰＤ－Ｌ１非遮断ｍｕＰＤ１ｘＩＬ１５ ＸＥＮＰ３６２１７、又はいずれかのＰＤ １標的化ＩＬ１５分子と抗ＰＤＬ１との組み合わせで処置した。ＸＥＮＰ３３８６９及びＸＥＮＰ３６２１７を単剤として低用量の１倍及び高用量の３．３倍で投与した。抗ＰＤＬ１との併用を１倍用量で評価した。データを図１８８Ａ及び図１８８Ｂに示す。全ての処置群は、ビヒクル対照と比較して処置後１４日目に抗腫瘍活性を示す。ＸＥＮＰ３３８６９及びＸＥＮＰ３６２１７で処置した群は、同様の用量依存的な腫瘍増殖阻害を示した。いずれかの分子と抗ＰＤＬ１との組み合わせは、単剤療法と比較してより多数の部分奏効者又は完全奏効者を示した。

経時的なＣＤ８＋Ｔリンパ球の組織分布に対する処置の効果をさらに理解するために、ＰＥＴに基づくイメージング研究を行った。簡潔には、ビヒクル、ＸＥＮＰ３３８６９及び抗ＰＤＬ１処置群からの４匹のマウスを、－１日目（処置の１日前）、４、８及び１２日目に^１８Ｆ標識抗マウスＣＤ８トレーサー、並びに１１日目に非結合コントロールトレーサーを使用して画像化した。組織における非特異的バックグラウンドトレーサーの取り込みと低いＣＤ８特異的取り込みとを識別するために、非結合対照を含めた。尾静脈を介して放射性トレーサーを動物に注射し、１時間後、Ｉｎｖｅｏｎ ＰＥＴ／コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）で１５分間の静的ＰＥＴスキャンを行った。ＶｉｖｏＱｕａｎｔ前臨床画像後処理ソフトウェア（Ｉｎｖｉｃｒｏ）を使用して、組織の複数の軸方向スライス片に対して関心領域（ＲＯＩ）測定を行った。組織の衰退及び減衰補正信号強度を、１ｃｃ当量当たり１グラムの軟組織（％ＩＤ／ｇ）を想定して、組織１ｃｃ当たりの注射用量のパーセンテージとして測定した。

この研究からのデータを図１８９Ａ～図１８９Ｄ．に示す。各処置群からの代表的な画像であり、腫瘍位置を矢印で示している（図１８９Ａ）。脾臓及びリンパ節などのＣＤ８に富む組織は、全ての処置群において明確に可視化された。ＸＥＮＰ３３８６９による処置は有意な腫瘍増殖阻害を生じさせたが、１２日目の処置群間でトレーサー取り込みの有意差は観察されなかった。経時的な異なる組織におけるＣＤ８－トレーサー取り込みは、ＸＥＮＰ３３８６９処置群において、腫瘍ＣＤ８シグナルの初期増加を４日目という早い時期に検出することができたことを示した。処置群間で、血液、脾臓、肝臓及びリンパ節におけるＣＤ８濃度の有意な変化は経時的に観察されなかった。

上記の実施例は、当業者に本発明の組成物、システム及び方法の実施形態を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を与えるために提供され、本発明者らが本発明と見なす範囲を限定することを意図しない。当業者に明らかな本発明を実施するための上記のモードの変更は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示す。本開示において引用された全ての参考文献は、あたかも各参考文献が個別にその全体が参照により組み込まれたのと同程度に、参照により組み込まれる。

全ての見出し及びセクションの名称は、明確性及び参照目的のためにのみ使用され、決して限定的であると見なされるべきではない。例えば、当業者は、本明細書に記載の本発明の趣旨及び範囲に従って、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。

本明細書で引用される全ての参考文献は、個々の刊行物又は特許若しくは特許出願が全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、その全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

当業者には明らかであるように、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本出願の多くの修正及び変形を行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態及び実施例は、例としてのみ提供され、本出願は、特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。

Claims (175)

1. 標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
   ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含む、第１のモノマー：
   ｉ）ＩＬ－１５／Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン；
   ｉｉ）第１のドメインリンカー；
   ｉｉｉ）ＩＬ－１５ドメイン；及び
   ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
   ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、前記ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
   ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
   を含み、
   前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインは、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、前記ＶＨは、配列番号５と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＦ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆアミノ酸置換を含むバリアント可変重ドメインであり；前記ＶＬは、配列番号１６８と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＮ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔを含むバリアント可変軽ドメインである、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
2. 前記ＶＨが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記ＩＬ－１５ドメインが、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアントＩＬ－１５ドメインである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
4. 前記ＩＬ－１５ドメインが、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａ、又はそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアントＩＬ－１５ドメインである、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
5. 前記ＩＬ－１５ドメインが、アミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５ドメインである、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
6. 前記第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
7. 前記第１のモノマーが、前記ＩＬ－１５ドメインと前記第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
8. 標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
   ａ）以下を含む第１のモノマー：
   ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
   ｉｉ）第１のドメインリンカー；
   ｉｉｉ）配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
   ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
   ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、前記ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
   ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
   を含み、
   前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインが、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成する、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
9. 前記ＶＨが配列番号５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１６８のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
10. 前記ＶＨが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
11. 前記ＡＢＤが、ニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと前記ヒトＰＤ－１との結合について競合しない、請求項８に記載の融合タンパク質。
12. 前記第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
13. 前記第１のモノマーが、前記ＩＬ－１５ドメインと前記第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
14. 標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
    ａ）以下を含む第１のモノマー：
    ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
    ｉｉ）第１のドメインリンカー；
    ｉｉｉ）配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
    ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
    ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、前記ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
    ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
    を含み、
    前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインは、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、前記ＶＨは、配列番号５と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＦ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆアミノ酸置換を含むバリアント可変重ドメインであり；前記ＶＬは、配列番号１６８と比較して、ＫａｂａｔナンバリングでＮ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔを含むバリアント可変軽ドメインである、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
15. 前記ＶＨが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
16. 前記第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、請求項１４又は１５に記載の融合タンパク質。
17. 前記第１のモノマーが、前記ＩＬ－１５ドメインと前記第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、ヘテロ二量体タンパク質。
19. ＥＵナンバリングで、前記第１のバリアントＦｃドメインがＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、前記第２のバリアントＦｃドメインがＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
20. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、それぞれ独立して、ＥＵナンバリングで、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
21. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、それぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む、請求項２０に記載の融合タンパク質。
22. 前記第１のＦｃドメインが、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
23. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、それぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
24. 前記第１のモノマーが配列番号２２５のアミノ酸配列を含み、前記第２のモノマーが配列番号２４４のアミノ酸配列を含み、前記第３のモノマーが配列番号１９６のアミノ酸配列を含む、請求項１、８及び１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
25. 核酸組成物であって、
    ａ）請求項１～２４のいずれか一項に記載の前記第１のモノマーをコードする第１の核酸分子；
    ｂ）請求項１～２４のいずれか一項に記載の前記第２のモノマーをコードする第２の核酸分子；及び／又は
    ｃ）請求項１～２４のいずれか一項に記載の前記第３のモノマーをコードする第３の核酸分子
    をそれぞれ含む、核酸組成物。
26. 発現ベクター組成物であって、
    ａ）請求項２５に記載の前記第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター；
    ｂ）請求項２５に記載の前記第２の核酸分子を含む第２の発現ベクター；及び／又は
    ｃ）請求項２５に記載の前記第３の核酸分子を含む第３の発現ベクター
    を含む、発現ベクター組成物。
27. 請求項２５に記載の前記第１の核酸分子、請求項２５に記載の前記第２の核酸分子、及び請求項２５に記載の前記第３の核酸分子を含む、発現ベクター。
28. 請求項２６に記載の発現ベクター組成物又は請求項２７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
29. 請求項２８に記載の宿主細胞を、前記融合タンパク質が産生される条件下で培養すること、及び前記融合タンパク質を回収することを含む、融合タンパク質を作製する方法。
30. 標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
    ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含む、第１のモノマー：
    ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
    ｉｉ）第１のドメインリンカー；
    ｉｉｉ）配列番号２と比較して、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、バリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
    ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
    ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、前記ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
    ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
    を含み、
    前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインが、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメインを形成し、前記ＶＨは、配列番号５と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｗ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメインであり、前記ＶＬドメインは、以下：
    ｉ）配列番号１６８；及び
    ｉｉ）配列番号１６８と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｎ２７ｄＨ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメイン；からなる群から選択される可変軽ドメイン
    を含み、
    前記バリアントＩＬ－１５タンパク質は、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
31. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
32. 前記バリアント重ドメインが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、前記バリアント軽ドメインが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、請求項３０又は３１に記載の融合タンパク質。
33. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
34. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
35. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
36. 前記バリアント重ドメインがＨ１．１７６であり、前記バリアント軽ドメインがＬ１．１４０であり、前記バリアントＩＬ－１５タンパク質がアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
37. 前記バリアント重ドメインがＨ１．１７６であり、前記バリアント軽ドメインがＬ１．１４０であり、前記バリアントＩＬ－１５タンパク質がアミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
38. 前記第１のドメインリンカーがＧＧＧＧＡ（配列番号８）を含む、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
39. 前記第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、請求項３０～３８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
40. 前記第１のモノマーが、前記ＩＬ－１５ドメインと前記第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、請求項３０～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
41. 請求項３０～４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、ヘテロ二量体タンパク質。
42. ＥＵナンバリングで、前記第１のバリアントＦｃドメインがＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、前記第２のバリアントＦｃドメインがＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む、請求項４１に記載の融合タンパク質。
43. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、それぞれ独立して、ＥＵナンバリングで、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項３０～４２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
44. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、それぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
45. 前記第１のＦｃドメインが、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含む、請求項３０～４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
46. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む、請求項３０～４５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
47. 前記第１のモノマーが、配列番号２２５のアミノ酸配列を含む、請求項３０～４６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
48. 前記第２のモノマーが、配列番号２４４のアミノ酸配列を含む、請求項３０～４７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
49. 前記第３のモノマーが、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む、請求項３０～４８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
50. 前記第１のモノマーが配列番号２２５のアミノ酸配列を含み、前記第２のモノマーが配列番号２４４のアミノ酸配列を含み、前記第３のモノマーが配列番号１９６のアミノ酸配列を含む、請求項３０～４９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
51. 核酸組成物であって、
    ａ）請求項３０～５０のいずれか一項に記載の前記第１のモノマーをコードする第１の核酸分子；
    ｂ）請求項３０～５０のいずれか一項に記載の前記第２のモノマーをコードする第２の核酸分子；及び／又は
    ｃ）請求項３０～５０のいずれか一項に記載の前記第３のモノマーをコードする第３の核酸分子
    を含む、核酸組成物。
52. 発現ベクター組成物であって、
    ａ）請求項５１に記載の前記第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター；
    ｂ）請求項５１に記載の前記第２の核酸分子を含む第２の発現ベクター；及び／又は
    ｃ）請求項５１に記載の前記第３の核酸分子を含む第３の発現ベクター
    を含む、発現ベクター組成物。
53. 請求項５１に記載の前記第１の核酸分子、請求項５１に記載の前記第２の核酸分子、及び請求項５１に記載の前記第３の核酸分子を含む、発現ベクター。
54. 請求項５２に記載の発現ベクター組成物又は請求項５３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
55. 請求項５４に記載の宿主細胞を、前記融合タンパク質が産生される条件下で培養すること、及び前記融合タンパク質を回収することを含む、融合タンパク質を作製する方法。
56. 標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
    ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含む、第１のモノマー：
    ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
    ｉｉ）第１のドメインリンカー；
    ｉｉｉ）バリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
    ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
    ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、前記ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
    ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
    を含み、
    前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインが、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合ドメインを形成し、前記ＶＨは、配列番号５と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｗ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメインであり、前記ＶＬドメインは、以下：
    ｉ）配列番号１６８；及び
    ｉｉ）配列番号１６８と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｎ２７ｄＨ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメイン
    からなる群から選択される、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
57. 前記バリアント重ドメインが、Ｈ１．１７６、Ｈ１．１７７、Ｈ１．１７８、Ｈ１．１７９、Ｈ１．１８０、Ｈ１．１８１、Ｈ１．１８２、Ｈ１．１８３、Ｈ１．１８４、Ｈ１．１８５、Ｈ１．１８６、Ｈ１．１８７、Ｈ１．１８８、Ｈ１．１８９、Ｈ１．１９０、Ｈ１．１９１、Ｈ１．１９２、Ｈ１．１９３、Ｈ１．１９４、Ｈ１．１９５、Ｈ１．１９６、Ｈ１．１９７、Ｈ１．１９８、Ｈ１．１９９、Ｈ１．２００、Ｈ１．２０１、Ｈ１．２０２、Ｈ１．２０３、Ｈ１．２０４、Ｈ１．２０５、Ｈ１．２０６、Ｈ１．２０７、Ｈ１．２０８、Ｈ１．２０９、Ｈ１．２１０、Ｈ１．２１１、Ｈ１．２１２、Ｈ１．２１３、Ｈ１．２１４、Ｈ１．２１５、Ｈ１．２１６、Ｈ１．２１７、Ｈ１．２１８、Ｈ１．２１９、Ｈ１．２２０、Ｈ１．２２１、Ｈ１．２２２、Ｈ１．２２３及びＨ１．２２４からなる群から選択される、請求項５６に記載の融合タンパク質。
58. 前記バリアント軽ドメインが、Ｌ１．１、Ｌ１．３、Ｌ１．４５、Ｌ１．１１７、Ｌ１．１２９、Ｌ１．１３５、Ｌ１．１３６及びＬ１．１４０からなる群から選択される、請求項５６又は５７に記載の融合タンパク質。
59. 前記バリアント重ドメインが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、前記バリアント軽ドメインが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
60. 前記第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
61. 前記第１のモノマーが、前記ＩＬ－１５ドメインと前記第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
62. 請求項５６～６１のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、ヘテロ二量体タンパク質。
63. ＥＵナンバリングで、前記第１のバリアントＦｃドメインがＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、前記第２のバリアントＦｃドメインがＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む、請求項６２に記載の融合タンパク質。
64. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、それぞれ独立して、ＥＵナンバリングで、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項５６～６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
65. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、それぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む、請求項６４に記載の融合タンパク質。
66. 前記第１のＦｃドメインが、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含む、請求項５６～６５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
67. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインがそれぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む、請求項５６～６６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
68. 核酸組成物であって、
    ａ）請求項５６～６７のいずれか一項に記載の前記第１のモノマーをコードする第１の核酸分子；
    ｂ）請求項５６～６７のいずれか一項に記載の前記第２のモノマーをコードする第２の核酸分子；及び／又は
    ｃ）請求項５６～６７のいずれか一項に記載の前記第３のモノマーをコードする第３の核酸分子
    を含む、核酸組成物。
69. 発現ベクター組成物であって、
    ａ）請求項６８に記載の前記第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター；
    ｂ）請求項６８に記載の前記第２の核酸分子を含む第２の発現ベクター；及び／又は
    ｃ）請求項６８に記載の前記第３の核酸分子を含む第３の発現ベクター
    を含む、発現ベクター組成物。
70. 請求項６８に記載の前記第１の核酸分子、請求項６８に記載の前記第２の核酸分子、及び請求項６８に記載の前記第３の核酸分子を含む、発現ベクター。
71. 請求項６９に記載の発現ベクター組成物又は請求項７０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
72. 請求項７１に記載の宿主細胞を、前記融合タンパク質が産生される条件下で培養すること、及び前記融合タンパク質を回収することを含む、融合タンパク質を作製する方法。
73. 標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
    ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって以下を含む、第１のモノマー：
    ｉ）ＩＬ－１５ Ｒα ｓｕｓｈｉドメインタンパク質；
    ｉｉ）第１のドメインリンカー；
    ｉｉｉ）配列番号２と比較して、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、バリアントＩＬ－１５タンパク質；及び
    ｉｖ）第１のバリアントＦｃドメイン；
    ｂ）ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマーであって、前記ＣＨ２－ＣＨ３が第２のバリアントＦｃドメインである、第２のモノマー；並びに
    ｃ）ＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー；
    を含み、
    前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインが、ヒトＰＤ－１に結合し前記ヒトＰＤ－１への結合についてニボルマブ及び／又はペンブロリズマブと競合しない抗原結合ドメインを形成する、標的化ＩＬ－１５／Ｒαヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質。
74. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項７３に記載の融合タンパク質。
75. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項７３又は７４に記載の融合タンパク質。
76. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
77. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、請求項７３～７６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
78. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、請求項７３～７７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
79. 前記第１のドメインリンカーがＧＧＧＧＡ（配列番号８）である、請求項７３～７８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
80. 前記第１のバリアントＦｃドメインが、ヒンジドメインの全部又は一部を含む、請求項７３～７９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
81. 前記第１のモノマーが、前記ＩＬ－１５ドメインと前記第１のバリアントＦｃドメインとの間に第２のドメインリンカーをさらに含む、請求項７３～８０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
82. 請求項７３～８１のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、ヘテロ二量体タンパク質。
83. ＥＵナンバリングで、前記第１のバリアントＦｃドメインがＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、前記第２のバリアントＦｃドメインがＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む、請求項８２に記載の融合タンパク質。
84. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、それぞれ独立して、ＥＵナンバリングで、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項７３～８３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
85. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、それぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む、請求項８４に記載の融合タンパク質。
86. 前記第１のＦｃドメインが、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含む、請求項７３～８５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
87. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、それぞれ、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む、請求項７３～８６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
88. 核酸組成物であって、
    ａ）請求項７３～８７のいずれか一項に記載の前記第１のモノマーをコードする第１の核酸分子；
    ｂ）請求項７３～８７のいずれか一項に記載の前記第２のモノマーをコードする第２の核酸分子；及び／又は
    ｃ）請求項７３～８７のいずれか一項に記載の前記第３のモノマーをコードする第３の核酸分子
    を含む、核酸組成物。
89. 発現ベクター組成物であって、
    ａ）請求項８８に記載の前記第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター；
    ｂ）請求項８８に記載の前記第２の核酸分子を含む第２の発現ベクター；及び／又は
    ｃ）請求項８８に記載の前記第３の核酸分子を含む第３の発現ベクター
    を含む、発現ベクター組成物。
90. 請求項８８に記載の前記第１の核酸分子、請求項８８に記載の前記第２の核酸分子、及び請求項８８に記載の前記第３の核酸分子を含む、発現ベクター。
91. 請求項８９に記載の発現ベクター組成物又は請求項９０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
92. 請求項９１に記載の宿主細胞を、前記融合タンパク質が産生される条件下で培養すること、及び前記融合タンパク質を回収することを含む、融合タンパク質を作製する方法。
93. 抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物であって、
    ａ）配列番号５と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｗ１００Ｆアミノ酸置換と、Ｆ３２Ｌ、Ｓ５２ａＧ、Ｒ９７Ｅ、Ｒ９７Ｙ、Ｒ９７Ｗ、Ｌ９８Ｒ、Ｓ１００ａＴ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｔ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＡ、Ｌ９８Ｑ、Ｒ９７Ｑ、Ｖ９９Ｆ、Ｖ９９Ｌ、Ｓ１００ａＮ、Ｖ９９Ｉ、Ｐ１００ｂＳ、Ｇ９６Ｈ、Ｌ９８Ｖ、Ｖ９９Ａ、Ｖ９９Ｑ、Ｇ９６Ｖ、Ｒ９７Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｌ９８Ｆ、Ｒ９７Ｔ、Ｌ９８Ｋ、Ｌ９８Ｓ、Ｖ９９Ｉ、Ｒ９７Ｌ、Ｇ９６Ａ、Ｒ９７Ａ、Ｖ９９Ｓ、Ｒ９７Ｓ、Ｖ９９Ｙ、Ｒ９７Ｈ、Ｌ９８Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含むバリアント可変重ドメイン；並びに
    ｂ）可変軽ドメインであって、
    ｉ）配列番号１６８；及び
    ｉｉ）配列番号１６８と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングで、Ｎ２７ｄＨ、Ｎ２７ｄＳ、Ｋ３０Ｙ、Ｓ９３Ｔ及びＹ９４Ｗからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むバリアント軽ドメイン；からなる群から選択される可変軽ドメイン
    を含み、
    前記ＡＢＤがヒトＰＤ－１に結合する、組成物。
94. 前記バリアント重ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングで、アミノ酸置換Ｆ３２Ｌ／Ｗ１００Ｆを有し、前記バリアント軽ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングでアミノ酸置換Ｎ２７ｄＨ／Ｋ３０Ｙ／Ｓ９３Ｔを有する、請求項９３に記載の組成物。
95. 前記バリアント重ドメインが、Ｈ１．１７６、Ｈ１．１７７、Ｈ１．１７８、Ｈ１．１７９、Ｈ１．１８０、Ｈ１．１８１、Ｈ１．１８２、Ｈ１．１８３、Ｈ１．１８４、Ｈ１．１８５、Ｈ１．１８６、Ｈ１．１８７、Ｈ１．１８８、Ｈ１．１８９、Ｈ１．１９０、Ｈ１．１９１、Ｈ１．１９２、Ｈ１．１９３、Ｈ１．１９４、Ｈ１．１９５、Ｈ１．１９６、Ｈ１．１９７、Ｈ１．１９８、Ｈ１．１９９、Ｈ１．２００、Ｈ１．２０１、Ｈ１．２０２、Ｈ１．２０３、Ｈ１．２０４、Ｈ１．２０５、Ｈ１．２０６、Ｈ１．２０７、Ｈ１．２０８、Ｈ１．２０９、Ｈ１．２１０、Ｈ１．２１１、Ｈ１．２１２、Ｈ１．２１３、Ｈ１．２１４、Ｈ１．２１５、Ｈ１．２１６、Ｈ１．２１７、Ｈ１．２１８、Ｈ１．２１９、Ｈ１．２２０、Ｈ１．２２１、Ｈ１．２２２、Ｈ１．２２３及びＨ１．２２４からなる群から選択される、請求項９３又は９４に記載の組成物。
96. 前記バリアント軽ドメインが、Ｌ１．１、Ｌ１．３、Ｌ１．４５、Ｌ１．１１７、Ｌ１．１２９、Ｌ１．１３５、Ｌ１．１３６及びＬ１．１４０からなる群から選択される、請求項９３～９５のいずれか一項に記載の組成物。
97. 前記バリアント重ドメインが配列番号３１８のアミノ酸配列を含み、前記バリアント軽ドメインが配列番号１７６のアミノ酸配列を含む、請求項９３～９６のいずれか一項に記載の組成物。
98. 前記組成物が全長抗ＰＤ－１抗体を含む、請求項９３～９７のいずれか一項に記載の組成物。
99. 前記組成物が融合タンパク質を含む、請求項９３～９８のいずれか一項に記載の組成物。
100. 前記融合タンパク質がＸＥＮＰ３２４３５である、請求項９９に記載の組成物。
101. 核酸組成物であって、
     ａ）請求項９３～１００のいずれか一項に記載の前記可変軽ドメインをコードする第１の核酸分子；及び／又は
     ｂ）請求項９３～１００のいずれか一項に記載の前記可変重ドメインをコードする第２の核酸分子
     を含む、核酸組成物。
102. 発現ベクター組成物であって、
     ａ）請求項１０１に記載の前記第１の核酸分子を含む第１の発現ベクター；及び／又は
     ｂ）請求項１０１に記載の前記第２の核酸分子を含む第２の発現ベクター
     を含む、発現ベクター組成物。
103. 請求項１０１に記載の前記第１の核酸分子及び請求項１０１に記載の前記第２の核酸分子を含む発現ベクター。
104. 請求項１０２に記載の発現ベクター組成物又は請求項１０３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
105. 抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物を作製する方法であって、前記融合タンパク質が産生される条件下で請求項１０４に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記融合タンパク質を回収することを含む、方法。
106. 配列番号２と比較してバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物であって、前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ７１Ｑ、Ｎ７９Ｑ、Ｎ１１２Ｑ、Ｓ１１４ｄｅｌ及びＳ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、組成物。
107. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ及びＱ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換をさらに含む、請求項１０６に記載の組成物。
108. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ、Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４ｄｅｌ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｓ１１４Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１０６又は１０７に記載の組成物。
109. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ３０Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ３０Ｎ／Ｑ１８０Ｅ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ及びＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１０６～１０８のいずれか一項に記載の組成物。
110. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含む、請求項１０６～１０９のいずれか一項に記載の組成物。
111. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｎ６５Ｄを含む、請求項１０６～１１０のいずれか一項に記載の組成物。
112. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が、アミノ酸置換Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑ及びＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを含む、請求項１０６～１１１のいずれか一項に記載の組成物。
113. 請求項１０６～１１２のいずれか一項に記載の前記バリアントＩＬ－１５タンパク質をコードする核酸分子を含む核酸組成物。
114. 請求項１１３に記載の前記核酸分子を含む発現ベクター。
115. 請求項１１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
116. バリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物を作製する方法であって、前記融合タンパク質が産生される条件下で請求項１１５に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記融合タンパク質を回収することを含む、方法。
117. ヘテロ二量体タンパク質であって、
     ａ）以下を含む第１の融合タンパク質：
     ｉ）配列番号２と比較してアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ及びＮ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑ／Ｎ１１２Ｑを含むバリアントＩＬ－１５タンパク質；
     ｉｉ）ドメインリンカー；及び
     ｉｉｉ）第１のバリアントＦｃドメイン；並びに
     ｂ）以下を含む第２の融合タンパク質：
     ｉ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン；
     ｉｉ）ドメインリンカー；及び
     ｉｉｉ）第２のバリアントＦｃドメイン、
     を含むヘテロ二量体タンパク質。
118. 前記バリアントＩＬ－１５タンパク質が配列番号３１９のアミノ酸配列を含む、請求項１１７に記載のヘテロ二量体タンパク質。
119. 請求項１１７又は１１８に記載のヘテロ二量体タンパク質であって、前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ，Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ，Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵナンバリングによる）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、ヘテロ二量体タンパク質。
120. ＥＵナンバリングで、前記第１のバリアントＦｃドメインがＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、前記第２のバリアントＦｃドメインがＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む、請求項１１９に記載のヘテロ二量体タンパク質。
121. 前記第１のバリアントＦｃドメイン及び前記第２のバリアントＦｃドメインが４２８Ｌ／４３４Ｓを含む、請求項１１７～１２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
122. 前記第１の融合タンパク質が配列番号２０８のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合タンパク質が配列番号９５のアミノ酸配列を含む、請求項１１７に記載の融合タンパク質。
123. 前記第１の融合タンパク質が配列番号２１１のアミノ酸配列を含み、前記第２の融合タンパク質が配列番号２０６のアミノ酸配列を含む、請求項１１７に記載の融合タンパク質。
124. 請求項１～２４、３０～５０、５６～６７、及び７３～８７のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
125. 請求項９３～１００のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
126. 請求項１０６～１１２のいずれか一項に記載のバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
127. 請求項１１７～１２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
128. 治療有効量の、請求項１～２４、３０～５０、５６～６７及び７３～８７のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項１２４に記載の医薬組成物を、がんの処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法。
129. 治療有効量のチェックポイント遮断抗体を投与することをさらに含む、請求項１２８に記載の方法。
130. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１２９に記載の方法。
131. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１３０に記載の方法。
132. 治療有効量の、請求項９３～１００のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物又は請求項１２５に記載の医薬組成物を、がんの処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法。
133. 治療有効量のチェックポイント遮断抗体を投与することをさらに含む、請求項１３２に記載の方法。
134. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１３３に記載の方法。
135. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１３４に記載の方法。
136. 治療有効量の、請求項１０６～１１２のいずれか一項に記載のバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は請求項１２６に記載の医薬組成物を、がんの処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法。
137. 治療有効量のチェックポイント遮断抗体を投与することをさらに含む、請求項１３６に記載の方法。
138. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１３７に記載の方法。
139. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１３８に記載の方法。
140. 治療有効量の、請求項１１７～１２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質又は請求項１２７に記載の医薬組成物を、がんの処置を必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがんを処置する方法。
141. 治療有効量のチェックポイント遮断抗体を投与することをさらに含む、請求項１４０に記載の方法。
142. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１４１に記載の方法。
143. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１４２に記載の方法。
144. 請求項１～２４、３０～５０、５６～６７及び７３～８７のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項１２４に記載の医薬組成物の、がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置のための医薬の製造における使用。
145. 前記医薬が、治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与されるように製剤化される、請求項１４４に記載の使用。
146. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１４５に記載の使用。
147. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１４６に記載の使用。
148. 請求項９３～１００のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物又は請求項１２４に記載の医薬組成物の、がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置のための医薬の製造における使用。
149. 前記医薬が、治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与されるように製剤化される、請求項１４８に記載の使用。
150. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１４９に記載の使用。
151. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１５０に記載の使用。
152. 請求項１０６～１１２のいずれか一項に記載のバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は請求項１２６に記載の医薬組成物の、がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置のための医薬の製造における使用。
153. 前記医薬が、治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与されるように製剤化される、請求項１５２に記載の使用。
154. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１５３に記載の使用。
155. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１５４に記載の使用。
156. 請求項１１７～１２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質又は請求項１２７に記載の医薬組成物の、がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置のための医薬の製造における使用。
157. 前記医薬が、治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与されるように製剤化される、請求項１５６に記載の使用。
158. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１５７に記載の使用。
159. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１５８に記載の使用。
160. がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置での使用のための、請求項１～２４、３０～５０、５６～６７及び７３～８７のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項１２４に記載の医薬組成物。
161. 治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与される、請求項１６０に記載の、使用のための融合タンパク質又は医薬組成物。
162. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１６１に記載の、使用のための融合タンパク質又は医薬組成物。
163. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１６２に記載の、使用のための融合タンパク質又は医薬組成物。
164. がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置での使用のための、請求項９３～１００のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物又は請求項１２５に記載の医薬組成物。
165. 治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与される、請求項１６４に記載の、使用のための抗ＰＤ－１ ＡＢＤを含む組成物又は医薬組成物。
166. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１６５に記載の、使用のための抗ＰＤ－１ ＡＢＤを含む組成物又は医薬組成物。
167. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１６６に記載の、使用のための抗ＰＤ－１ ＡＢＤを含む組成物又は医薬組成物。
168. がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置での使用のための、請求項１０６～１１２のいずれか一項に記載のバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は請求項１２６に記載の医薬組成物。
169. 治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与される、請求項１６８に記載の、使用のためのバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は医薬組成物。
170. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１６９に記載の、使用のためのバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は医薬組成物。
171. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１７０に記載の、使用のためのバリアントＩＬ－１５タンパク質を含む組成物又は医薬組成物。
172. がんの処置を必要とする対象におけるがんの処置での使用のための、請求項１１７～１２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質又は請求項１２６に記載の医薬組成物。
173. 治療有効量のチェックポイント遮断抗体と組み合わせて投与される、請求項１７２に記載の、使用のためのヘテロ二量体タンパク質又は医薬組成物。
174. 前記チェックポイント遮断抗体が抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１７３に記載の、使用のためのヘテロ二量体タンパク質又は医薬組成物。
175. 前記チェックポイント遮断抗体がニボルマブ又はペンブロリズマブである、請求項１７４に記載の、使用のためのヘテロ二量体タンパク質又は医薬組成物。

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