ES2899890T3 - Moléculas basadas en IL-15 y métodos de uso de las mismas - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo y una composición farmacéutica que comprende un complejo de IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc (ALT- 803), en donde dicho ALT-803 comprende una IL-15RαSu/Fc dimérica y dos moléculas IL-15N72D, para su uso en un método de tratamiento de un cáncer de vejiga en un sujeto; en donde la molécula de IL-15N72D comprende SEQ ID NO: 3; en donde IL-15RαSu/Fc comprende SEQ ID NO: 6; y en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-PD-1.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas basadas en IL-15 y métodos de uso de las mismas
Solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de la prioridad según la sección 119(e) del título 35 del U.S.C. a la solicitud provisional de EE. UU. N.°: 62/018.899, presentada el 30 de junio de 2014.
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, al campo de las terapias para el tratamiento de cáncer y agentes infecciosos.
Antecedentes de la invención
Antes de la invención descrita en el presente documento, hubo una necesidad urgente de desarrollar nuevas estrategias para aumentar y/o dirigir la actividad inmunitaria contra el cáncer y las células infectadas.
X. Wu et al., Cancer Research 73(10): 3075-3086, 2013, desvela el uso de un superagonista de IL-15, ALT-803, en modelos murinos singénicos de mieloma múltiple.
El documento de patente US 2014/134128 A1 desvela el uso del superagonista de IL-15 ALT-803 en el tratamiento de una neoplasia o una infección vírica en un sujeto.
El documento de patente WO 2014/066527 A2 desvela usos terapéuticos de IL15Ra y complejos IL15/IL15Ra, opcionalmente junto con una molécula heteróloga.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que un anticuerpo anti-PD-1 en combinación con ALT-803, un complejo de un mutante superagonista de interleucina-15 (IL-15) y una proteína de fusión dimérica de receptor a de IL-15/Fc, es útil para potenciar una respuesta inmunitaria contra un carcinoma de vejiga.
Las referencias a los métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción se deben interpretar como referencias a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) por terapia (o para diagnóstico).
Los métodos de tratamiento de un cáncer de vejiga en un sujeto se llevan a cabo administrando al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 y una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un complejo IL-15N72D:IL-15RaSu/Fc (ALT-803), en donde ALT-803 comprende una IL-15RaSu/Fc dimérica y dos moléculas IL-15N72D. La molécula IL-15N72D comprende SEQ ID NO: 3. IL-15RaSu/Fc comprende SEQ ID NO: 6.
El sujeto es preferentemente un mamífero en necesidad de dicho tratamiento, por ejemplo, un sujeto que ha sido diagnosticado con un cáncer de vejiga o una predisposición al mismo. El mamífero es cualquier mamífero, por ejemplo, un humano, un primate, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo, así como ganado o animales criados para el consumo de alimentos, por ejemplo, ganado vacuno, ovejas, cerdos, pollos y cabras. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano.
Preferentemente, la administración de las composiciones descritas en el presente documento también previene la futura reaparición del cáncer de vejiga después del tratamiento de la enfermedad.
Las dosis eficaces a modo de ejemplo de ALT-803 incluyen entre 0,1 qg/kg y 100 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 qg/kg de peso corporal o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg de peso corporal.
En algunos casos, ALT-803 se administra diariamente, por ejemplo, cada 24 horas. O, ALT-803 se administra continuamente o varias veces al día, por ejemplo, cada 1 hora, cada 2 horas, cada 3 horas, cada 4 horas, cada 5 horas, cada 6 horas, cada 7 horas, cada 8 horas, cada 9 horas, cada 10 horas, cada 11 horas, o cada 12 horas.
Las dosis diarias eficaces a modo de ejemplo de ALT-803 incluyen entre 0,1 qg/kg y 100 qg/kg de peso corporal, por ejemplo, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 qg/kg de peso corporal.
Alternativamente, ALT-803 se administra aproximadamente una vez a la semana, por ejemplo, aproximadamente una vez cada 7 días. O, ALT-803 se administra dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana, cinco veces a la semana, seis veces a la semana o siete veces a la semana. Las dosis semanales eficaces a modo de ejemplo de ALT-803 incluyen entre 0,0001 mg/kg y 4 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, 0,001, 0,003, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,2, 3 o 4 mg/kg de peso corporal. Por ejemplo, una dosis semanal eficaz de ALT-803 es entre 0,1 pg/kg de peso corporal y 400 pg/kg de peso corporal. Alternativamente, ALT-803 se administra en una dosis fija o se basa en el área superficial del cuerpo (es decir, por m2).
En algunos casos, los sujetos reciben dos ciclos de 6 semanas que consisten en 4 dosis intravenosas semanales de ALT-803, seguido por un periodo de descanso de 2. Por último, lugar, el médico adjunto o veterinario decide la cantidad apropiada y la pauta posológica.
Las composiciones descritas en el presente documento se administran por vía sistémica, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intravesical o por instilación. El anticuerpo y ALT-803 se pueden administrar simultáneamente o uno detrás de otro.
El anticuerpo (Ab) es un anticuerpo específico de tumor o un inhibidor del punto de regulación inmunitario. Los anticuerpos preferidos están compuestos de proteínas inmunoglobulina (Ig) de cadena pesada y ligera, que pueden incluir formas de roedor, humanas, quiméricas y humanizadas. Además, el método descrito en el presente documento podría utilizar moléculas de tipo anticuerpo, tales como moléculas que comprenden un dominio de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpo monocatenario, Fab, Fv, dominio de unión al receptor de linfocitos T, dominio de unión al ligando o dominio de unión al receptor). En algunos casos, estos dominios se unen preferentemente a un dominio Fc. La Ig puede ser de cualquiera de los isotipos conocidos (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG2a, IgG2b e IgM). En algunas aplicaciones descritas en el presente documento usando Ab dirigidos afectados (o moléculas de tipo anticuerpo), el Ab (o molécula de unión al anticuerpo) contiene una cadena pesada o dominio Fc capaz de interactuar con receptores de Fc para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o la fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP). En otros casos, se pueden usar anticuerpos conjugados con moléculas efectoras. En otras aplicaciones, tales como el uso de un bloqueante del punto de regulación inmunitario, el Ab preferido (o molécula de tipo anticuerpo) contiene una cadena pesada o dominio Fc (por ejemplo, Fc de IgG4) que es incapaz de mediar eficazmente en ADCC o ADCP.
El anticuerpo específico de tumor es capaz de unirse al antígeno PD-1 sobre una célula tumoral.
Se conocen en la técnica diversos anticuerpos específicos de tumor. Los anticuerpos y sus dianas respectivas para el tratamiento del cáncer incluyen, pero no se limitan a, lambrolizumab (anti-PDCD1).
El anticuerpo es específico para una molécula del punto de regulación inmunitario, PD-1, y actúa de inhibidor de la actividad supresora del punto de regulación inmunitario o de un agonista de la actividad estimulante del punto de regulación inmunitario. Los anticuerpos anti-PD-1 preferidos de la invención incluyen nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, TSR-042, ANB011, AMP-514 y AMP-224 (una fusión ligando-Fc).
En un aspecto, la adición de ALT-803 al tratamiento con anticuerpo in vitro o in vivo aumenta la citotoxicidad de las células inmunitarias frente a células enfermas o asociadas a enfermedad. En algunos casos, ALT-803 es capaz de estimular células inmunitarias para aumentar la actividad de ADCC o ADCP contra células tumorales mediada por un anticuerpo específico de enfermedad (o molécula de tipo anticuerpo). En una realización, el tratamiento de células inmunitarias con ALT-803 aumenta la actividad de ADCC o ADCP contra células enfermas o asociadas a enfermedad mediada por una anticuerpo específico de diana afectado en al menos 5 %, por ejemplo, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 100 %. En una realización preferida, las células inmunitarias se tratan con ALT-803 y se usan para destruir células tumorales por ADCC o ADCP mediada por un anticuerpo específico de tumor, en donde el nivel de muerte celular tumoral es al menos 5 % superior, por ejemplo, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 100 % superior al observado con células inmunitarias que no se trataron con ALT-803. En realizaciones preferidas, la ADCC o ADCP específica de tumor en el sujeto aumenta en al menos 5 %, por ejemplo, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 100 % después de la administración de ALT-803 y del anticuerpo. En realizaciones particulares, la actividad de ADCC basada en linfocitos NK aumenta por el tratamiento con ALT-803.
En otros casos, ALT-803 estimula a los linfocitos T CD4+ y CD8+ para destruir células enfermas o asociadas a enfermedad, por ejemplo, células tumorales. Preferentemente, el tratamiento con ALT-803 estimula la actividad de células citolíticas inmunitarias y los bloqueantes del punto de regulación inmunitario inhiben respuestas inmunosupresoras, de forma que en combinación estos tratamientos proporcionan actividad altamente eficaz y/o duradera contra el tumor o las células infectadas. En algunas realizaciones, ALT-803 aumenta los niveles en suero de interferón gamma (IFN-y ) y/o IL-6, estimula la proliferación de linfocitos NK y T y regula por incremento la expresión de linfocitos NK y T de marcadores de activación que incluyen CD25, CD69, perforina y granzima. La inducción de estos marcadores puede potenciar la sensibilidad o actividad citolítica de las células inmunitarias contra células enfermas. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento estimulan a los linfocitos NK para destruir las células tumorales.
En otras realizaciones, ALT-803 induce la actividad y/o nivel de otras células inmunitarias innatas que incluyen neutrófilos o células monocíticas. Dichas células son conocidas por mediar en ADCC y ADCP de anticuerpos terapéuticos contra células enfermas, por ejemplo, células tumorales (Golay, et al., Blood. 2013 122:3482-91, Richards, et al., Mol Cancer Ther 2008 7:2517-27). Preferentemente, la terapia de combinación de ALT-803 y anticuerpos proporciona mejores respuestas clínicas en pacientes con cáncer mediante un mecanismo que está mediado, al menos en parte, por células inmunitarias innatas. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento estimulan los neutrófilos o células monocíticas para destruir células tumorales.
Preferentemente, los métodos descritos en el presente documento producen un número reducido/disminuido de células tumorales en comparación con el número de células tumorales antes de la administración de las composiciones en el presente documento. Alternativamente, los métodos descritos en el presente documento producen una progresión reducida de la enfermedad de cáncer de vejiga. Preferentemente, los métodos descritos en el presente documento producen una prolongada supervivencia de un sujeto en comparación con los sujetos sin tratar.
Un kit que es útil para el tratamiento de cáncer de vejiga es aquél que comprende una cantidad eficaz de ALT-803, un anticuerpo anti-PD-1 e instrucciones para el uso del kit para el tratamiento de cáncer de vejiga.
En ciertas variantes de los complejos de proteína de fusión solubles desvelados en el presente documento, el polipéptido IL-15 es una variante de IL-15 que tiene una secuencia de aminoácidos diferente del polipéptido IL-15 nativo. El polipéptido IL-15 humano se denomina en el presente documento huIL-15, hIL-15, huIL15, hIL15, IL-15 natural (wt) y las variantes del mismo se denominan usando el aminoácido nativo, su posición en la secuencia madura y el aminoácido de variante. Por ejemplo, huIL15N72D se refiere a IL-15 humana que comprende una sustitución de N a D en la posición 72. En un aspecto, la variante de IL-15 funciona como un agonista de IL-15 como se demuestra, por ejemplo, por la elevada actividad de unión por los receptores de IL-15RPyC en comparación con el polipéptido IL-15 nativo. Alternativamente, la variante de IL-15 funciona como un antagonista de IL-15 como se demuestra por, por ejemplo, la reducida actividad de unión por los receptores de IL-15RPyC en comparación con el polipéptido nativo de IL-15.
Los métodos de destrucción de una célula diana se llevan a cabo poniendo en contacto una pluralidad de células con un anticuerpo y ALT-803, en donde la pluralidad de células adicional incluye células inmunitarias que llevan las cadenas de IL-15R reconocidas por el dominio de IL-15, o células inmunitarias que llevan cadenas del receptor de Fc reconocidas por el dominio Fc, y las células diana que llevan un antígeno reconocido por un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20), y la destrucción de las células diana. Por ejemplo, las células diana son células tumorales o células infectadas (por ejemplo, víricamente infectadas).
Un método de destrucción de células enfermas que expresan un antígeno diana se lleva a cabo tratando células inmunitarias con una cantidad eficaz de un complejo IL-15N72D:IL-15RaSu/Fc (ALT-803), mezclando las células inmunitarias tratadas con ALT-803 con un anticuerpo específico para un antígeno diana y células enfermas que expresan dicho antígeno diana, y destruyendo la células enfermas por ADCC o ADCP mediada por las células inmunitarias tratadas con ALT-803 y anticuerpo específico de antígeno diana. En un aspecto, el nivel de destrucción de células enfermas aumenta en al menos 5 %, por ejemplo, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 100 % en comparación con el mediado por células inmunitarias que no se trataron con ALT-803.
La divulgación también proporciona métodos de prevención o tratamiento de enfermedad en un paciente en el que las células enfermas expresan un antígeno asociado a enfermedad, incluyendo el método las etapas de: poner en contacto una pluralidad de células con un anticuerpo y ALT-803, y dañar o destruir las células enfermas lo suficiente para prevenir o tratar la enfermedad en el paciente. En variantes preferidas, la terapia de combinación con ALT-803 y un anticuerpo puede disminuir la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia del paciente.
La divulgación proporciona métodos de estimulación de respuestas inmunitarias en un mamífero administrando al mamífero una cantidad eficaz de un anticuerpo y una cantidad eficaz de ALT-803.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos usados en la presente invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como se usa en el presente documento, los siguientes términos tienen los significados atribuidos a ellos a continuación, a menos que se especifique lo contrario.
Por "agente" se indica un péptido, molécula de ácido nucleico, o compuesto pequeño. Un agente terapéutico a modo de ejemplo es ALT-803.
Por "ALT-803" se indica un complejo que comprende IL-15N72D no covalentemente asociado con una proteína de fusión dimérica IL-15RaSu/Fc y que tiene actividad inmunoestimuladora. En una realización, la proteína de fusión IL-15N72D y/o IL-15RaSu/Fc comprende una, dos, tres, cuatro o más variaciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia. Una secuencia de aminoácidos de IL-15N72D a modo de ejemplo se proporciona a continuación.
Por "mejorar" se indica disminuir, suprimir, atenuar, reducir, detener o estabilizar el desarrollo o la progresión de una enfermedad.
Por "análogo" se indica una molécula que no es idéntica, pero tiene características funcionales o estructurales análogas. Por ejemplo, un análogo de polipéptido retiene la actividad biológica de un polipéptido correspondiente que existe de forma natural, mientras que tiene ciertas modificaciones bioquímicas que potencian la función de análogo con respecto a un polipéptido que existe de forma natural. Dichas modificaciones bioquímicas podrían aumentar la resistencia de proteasas de análogo, permeabilidad de membranas, o semivida, sin alterar, por ejemplo, la unión al ligando. Un análogo puede incluir un aminoácido no natural.
La invención incluye anticuerpos o fragmentos de dichos anticuerpos, mientras que presenten la actividad biológica deseada. También se incluyen en la invención anticuerpos quiméricos, tales como anticuerpos humanizados. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que es no humana. La humanización se puede realizar, por ejemplo, usando los métodos descritos en la técnica, sustituyendo al menos una porción de una región determinante de la complementariedad de roedor por las regiones correspondientes de un anticuerpo humano.
El término "anticuerpo" o "inmunoglobulina" pretende englobar tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. El anticuerpo preferido es un anticuerpo monoclonal reactivo con el antígeno. El término "anticuerpo" también pretende englobar mezclas de más de un anticuerpo reactivo con el antígeno (por ejemplo, una mezcla de diferentes tipos de anticuerpos monoclonales reactivos con el antígeno). El término "anticuerpo" pretende además englobar anticuerpos completos, fragmentos biológicamente funcionales de los mismos, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos genéticamente alterados, tales como anticuerpos quiméricos que comprenden porciones de más de una especie, anticuerpos bifuncionales, conjugados de anticuerpo, anticuerpos humanizados y humanos. Los fragmentos biológicamente funcionales de los anticuerpos, que también se pueden usar, son los fragmentos de péptido derivados de un anticuerpo que son suficientes para unirse al antígeno. "Anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende incluir todo el anticuerpo, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fv) capaces de unirse al epítope, antígeno o fragmento antigénico de interés.
Por "unión a" una molécula se indica que tiene una afinidad fisicoquímica por esa molécula.
"Detectar" se refiere a identificar la presencia, ausencia o cantidad de analito que va a detectarse.
Por "enfermedad" se indica cualquier afección o trastorno que dañe o interfiera con la función normal de una célula, tejido u órgano. Los ejemplos de enfermedades incluyen neoplasias e infecciones.
Por los términos "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" de una formulación o componente de formulación se indica una cantidad suficiente de formulación o componente, solo o en una combinación, para proporcionar el efecto deseado. Por ejemplo, por "una cantidad eficaz" se indica una cantidad de un compuesto, solo o en una combinación, requerida para mejorar los síntomas de una enfermedad con respecto a un paciente no tratado. La cantidad eficaz del (de los) compuesto(s) activo(s) usado(s) para poner en práctica la presente invención para el tratamiento terapéutico de una enfermedad varía dependiendo del modo de administración, la edad, el peso corporal y la salud general del sujeto. Por último, lugar, el médico adjunto o veterinario decidirá la cantidad apropiada y la pauta posológica. Dicha cantidad se denomina una cantidad "eficaz".
Por "fragmento" se indica una porción de un polipéptido o molécula de ácido nucleico. Esta porción contiene, preferentemente, al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o el 90 % de la longitud entera de la molécula de ácido nucleico o polipéptido de referencia. Por ejemplo, un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos o aminoácidos. Sin embargo, la invención también comprende polipéptidos y fragmentos de ácido nucleico, mientras que presenten la actividad biológica deseada de los polipéptidos de longitud completa y ácido nucleico, respectivamente. Se emplea un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud. Por ejemplo, segmentos de polinucleótidos ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5000, aproximadamente 3000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50 pares de bases en longitud (incluyendo todas las longitudes intermedias) están incluidos en muchas implementaciones de la presente invención. Similarmente, se emplea un fragmento de polipéptido de casi cualquier longitud. Por ejemplo, los segmentos de polipéptidos ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 5.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, o aproximadamente 50 aminoácidos de longitud (incluyendo todas las longitudes intermedias) están incluidos en muchas implementaciones de la presente invención.
Los términos "aislado", "purificado" o "biológicamente puro" se refieren a un material que está libre a grados variables de componentes que normalmente lo acompañan como se encuentra en su estado nativo. "Aislado" indica un grado de separación de la fuente original o de los alrededores. "Purificar" indica un grado de separación que es superior al aislamiento.
Una proteína "purificada" o "biológicamente pura" está suficientemente libre de otros materiales, de forma que cualquier impureza no afecte materialmente las propiedades biológicas de la proteína o cause otras consecuencias adversas. Es decir, un ácido nucleico o péptido de la presente invención se purifica si está sustancialmente libre de material celular, material vírico, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La pureza y la homogeneidad normalmente se determinan usando técnicas de química analítica, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. El término "purificado" puede indicar que un ácido nucleico o proteína da lugar a esencialmente una banda en un gel electroforético. Para una proteína que se puede someter a modificaciones, por ejemplo, fosforilación o glucosilación, diferentes modificaciones pueden dar lugar a diferentes proteínas aisladas, que pueden ser purificadas por separado.
Similarmente, por "sustancialmente puro" se indica un nucleótido o polipéptido que se ha separado de los componentes que lo acompañan de forma natural. Normalmente, los nucleótidos y los polipéptidos son sustancialmente puros cuando están al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o incluso el 99 %, en peso, libres de las proteínas y moléculas orgánicas que existen de forma natural con las que están de forma natural asociados.
Por "ácido nucleico aislado" se indica un ácido nucleico que está libre de los genes que lo flanquean en el genoma que existe de forma natural del organismo del que deriva el ácido nucleico. El término cubre, por ejemplo: (a) un ADN que es parte de una molécula de ADN genómico que existe de forma natural, pero que no está flanqueado por ninguna de las secuencias de ácidos nucleicos que flanquean esa parte de la molécula en el genoma del organismo en el que ocurre de forma natural; (b) un ácido nucleico incorporado en un vector o en el ADN genómico de un procariota o eucariota de un modo, de forma que la molécula resultante no sea idéntica a ningún vector o ADN genómico que existe de forma natural; (c) una molécula separada, tal como un ADNc, un fragmento genómico, un fragmento producido por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o un fragmento de restricción; y (d) una secuencia de nucleótidos recombinante que es parte de un gen híbrido, es decir, un gen que codifica una proteína de fusión. Las moléculas de ácido nucleico aisladas según la presente invención incluyen además moléculas producidas sintéticamente, así como cualquier ácido nucleico que ha sido alterado químicamente y/o que tiene esqueletos modificados. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado es un polinucleótido de ADNc o ARN purificado. Las moléculas de ácido nucleico aisladas también incluyen moléculas de ácido ribonucleico mensajero (ARNm).
Por un "polipéptido aislado" se indica un polipéptido de la invención que se ha separado de los componentes que lo acompañan de forma natural. Normalmente, el polipéptido se aísla cuando está al menos el 60 %, en peso, libre de las proteínas y las moléculas orgánicas que existen de forma natural con las que está asociado de forma natural. Preferentemente, la preparación es al menos 75 %, más preferentemente al menos 90 %, y lo más preferentemente al menos 99 %, en peso, de un polipéptido de la invención. Un polipéptido aislado de la invención se puede obtener, por ejemplo, por extracción de una fuente natural, por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica dicho polipéptido; o por síntesis química de la proteína. La pureza se puede medir por cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o por análisis de HPLC.
Por "marcador" se indica cualquier proteína o polinucleótido que tenga una alteración en el nivel de expresión o actividad que está asociado con una enfermedad o trastorno.
Por "neoplasia" se indica una enfermedad o trastorno caracterizado por un exceso de proliferación o apoptosis reducida. Neoplasias ilustrativas para las que la divulgación se puede usar incluyen, pero no se limitan a, leucemias (por ejemplo, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin, enfermedad no hodgkiniana), macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas y tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer gástrico y de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer rectal, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de los conductores biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, cáncer uterino, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, schwannoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma), tales como mieloma múltiple, linfoma de células beta, carcinoma urotelial/de vejiga o melanoma. Como se usa en el presente documento, "obtener", como en "obtener un agente", incluye sintetizar, comprar o adquirir de otro modo el agente.
Por "reducir" se indica una alteración negativa de al menos el 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o el 100 %.
Por "referencia" se indica una condición normal o de control.
Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, un segmento de un ADNc de longitud completa o secuencia de genes, o el ADNc completo o secuencia de genes. Para polipéptidos, la longitud de la secuencia de polipéptidos de referencia, en general, será al menos aproximadamente 16 aminoácidos, preferentemente al menos aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente 25 aminoácidos, e incluso más preferentemente aproximadamente 35 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos, o aproximadamente 100 aminoácidos. Para ácidos nucleicos, la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia será, en general, al menos aproximadamente 50 nucleótidos, preferentemente al menos aproximadamente 60 nucleótidos, más preferentemente al menos aproximadamente 75 nucleótidos, e incluso más preferentemente aproximadamente 100 nucleótidos o aproximadamente 300 nucleótidos, o cualquier número entero aproximado o intermedio.
Por "se une específicamente a" se indica un compuesto o anticuerpo que reconoce y se une a un polipéptido de la invención, pero que no reconoce sustancialmente ni se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que incluye de forma natural un polipéptido de la invención.
Las moléculas de ácidos nucleicos útiles en los métodos de la invención incluyen cualquier molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido de la invención o un fragmento del mismo. Dichas moléculas de ácidos nucleicos no necesitan ser 100 % idénticas a una secuencia de ácidos nucleicos endógena, sino que normalmente presentarán identidad sustancial. Los polinucleótidos que tienen "identidad sustancial" con una secuencia endógena normalmente son capaces de hibridarse con al menos una cadena de una molécula de ácido nucleico bicatenaria. Las moléculas de ácidos nucleicos útiles en los métodos de la invención incluyen cualquier molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido de la invención o un fragmento del mismo. Dichas moléculas de ácidos nucleicos no necesitan ser 100 % idénticas a una secuencia de ácidos nucleicos endógena, sino que normalmente presentarán identidad sustancial. Los polinucleótidos que tienen "identidad sustancial" con una secuencia endógena normalmente son capaces de hibridarse con al menos una cadena de una molécula de ácido nucleico bicatenaria. Por "hibridar" se indica emparejar para formar una molécula bicatenaria entre secuencias de polinucleótidos complementarias (por ejemplo, un gen descrito en el presente documento), o porciones de las mismas, en diversas condiciones de rigurosidad (véase, por ejemplo, Wahl, G. M. y S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol.
152:507).
Por ejemplo, la concentración rigurosa de sales será, en general, inferior a NaCl aproximadamente 750 mM y citrato de trisodio 75 mM, preferentemente inferior a NaCl aproximadamente 500 mM y citrato de trisodio 50 mM, y más preferentemente inferior a NaCl aproximadamente 250 mM y citrato de trisodio 25 mM. La hibridación de baja rigurosidad se puede obtener en ausencia de disolvente orgánico, por ejemplo, formamida, mientras que la hibridación de alta rigurosidad se puede obtener en presencia de al menos aproximadamente 35 % de formamida, y más preferentemente al menos aproximadamente 50 % de formamida. Las condiciones de temperatura rigurosas incluirán, en general, temperaturas de al menos aproximadamente 30 °C, más preferentemente de al menos aproximadamente 37 °C, y lo más preferentemente de al menos aproximadamente 42 °C. El variar parámetros adicionales, tales como el tiempo de hibridación, la concentración de detergente, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS), y la inclusión o exclusión de ADN portador, es bien conocido por los expertos en la técnica. Los diversos niveles de rigurosidad se llevan a cabo combinando estas diversas condiciones según se necesite. En una realización preferida, la hibridación ocurrirá a 30 °C en NaCl 750 mM, citrato de trisodio 75 mM y 1 % de SDS. En una realización más preferida, la hibridación ocurrirá a 37 °C en NaCl 500 mM, citrato de trisodio 50 mM, 1 % de SDS, 35 % de formamida y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón (ADNes) desnaturalizado. En una realización más preferida, la hibridación ocurrirá a 42 °C en NaCl 250 mM, citrato de trisodio 25 mM, 1 % de SDS, 50 % de formamida y 200 pg/ml de ADNes. Variaciones útiles en estas condiciones serán rápidamente evidentes para los expertos en la técnica.
Para la mayoría de las aplicaciones, las etapas de lavado que siguen a la hibridación también variarán en rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad del lavado se pueden definir por la concentración de sales y por la temperatura. Como antes, la rigurosidad del lavado se puede aumentar disminuyendo la concentración de sales o aumentando la temperatura. Por ejemplo, la concentración rigurosa de sales para las etapas de lavado será preferentemente inferior a NaCl aproximadamente 30 mM y citrato de trisodio 3 mM, y lo más preferentemente inferior a NaCl aproximadamente 15 mM y citrato de trisodio 1,5 mM. Las condiciones de temperatura rigurosas para las etapas de lavado incluirán, en general, una temperatura de al menos aproximadamente 25 °C, más preferentemente de al menos aproximadamente 42 °C, e incluso más preferentemente de al menos aproximadamente 68 °C. En una realización preferida, las etapas de lavado ocurrirán a 25 °C en NaCl 30 mM, citrato de trisodio 3 mM y 0,1 % de SDS. En una realización más preferida, las etapas de lavado ocurrirán a 42 °C en NaCl 15 mM, citrato de trisodio 1,5 mM y 0,1 % de SDS. En una realización más preferida, las etapas de lavado ocurrirán a 68 °C en NaCl 15 mM, citrato de trisodio 1,5 mM y 0,1 % de SDS. Las variaciones adicionales en estas condiciones serán rápidamente evidentes para los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas de hibridación y se describen, por ejemplo, en Benton y Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein y Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York, 2001); Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nueva York); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.
Por "sustancialmente idéntico" se indica un polipéptido o molécula de ácido nucleico que presenta al menos 50 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, una cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento) o secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, una cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en el presente documento). Preferentemente, dicha secuencia es al menos 60 %, más preferentemente 80 % o 85 %, y más preferentemente 90 %, 95 %, o incluso 99 %, idéntica al nivel de aminoácidos o ácido nucleico con respecto a la secuencia usada para la comparación.
La identidad de secuencia normalmente se mide usando software de análisis de secuencias (por ejemplo, los programas Sequence Analysis Software Package de Genetics Computer Group, centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP o PILEUP/PRETTYBOX). Dicho software hace corresponder secuencias idénticas o similares asignando grados de homología a diversas sustituciones, deleciones y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservativas normalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En un enfoque a modo de ejemplo para determinar el grado de identidad, se puede usar un programa BLAST, con una puntuación de probabilidad entre e-3 y e-100 que indica una secuencia estrechamente relacionada.
Por "sujeto" se indica un mamífero, que incluye, pero no se limita a, un mamífero humano o no humano, tal como un bovino, equino, canino, ovino o felino. El sujeto es preferentemente un mamífero en necesidad de dicho tratamiento, por ejemplo, un sujeto que ha sido diagnosticado con linfoma de linfocitos B o una predisposición al mismo. El mamífero es cualquier mamífero, por ejemplo, un humano, un primate, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo, así como ganado o animales criados para el consumo de alimentos, por ejemplo, ganado vacuno, ovejas, cerdos, pollos y cabras. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano.
Se entiende que los intervalos proporcionados en el presente documento son clave para todos los valores dentro del intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números o subintervalo del grupo que consiste en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50.
Los términos "tratar" y "tratamiento", como se usan en el presente documento, se refiere a la administración de un agente o formulación a un individuo clínicamente sintomático aquejado con una afección adversa, trastorno o enfermedad, para efectuar una reducción en la intensidad y/o frecuencia de síntomas, eliminar los síntomas y/o su causa subyacente, y/o facilitar la mejoría o remedio del daño. Se apreciará que, aunque no se descarta, el tratamiento de un trastorno o afección no requiere que el trastorno, la afección o los síntomas asociados con él sean completamente eliminados.
El tratamiento de pacientes con neoplasia puede incluir cualquiera de los siguientes: terapia adyuvante (también llamada terapia auxiliar o terapia complementaria) para destruir células tumorales residuales que pueden estar presentes después de que el tumor conocido sea extirpado por la terapia inicial (por ejemplo, cirugía), lo que así previene la posible reaparición del cáncer; terapia neoadyuvante administrada antes del procedimiento quirúrgico para encoger el cáncer; terapia de inducción para causar una remisión, normalmente para leucemia aguda; terapia de consolidación (también denominada terapia de intensificación) administrada una vez se logra una remisión para mantener la remisión; terapia de mantenimiento administrada en dosis menores o menos frecuentes para ayudar en la prolongación de una remisión; la terapia de primera línea (también denominada terapia convencional); una terapia de segunda (o 3a, 4a, etc.) línea (también denominada terapia de último recurso) se administra si una enfermedad no ha respondido o ha vuelto a ocurrir después de la terapia de primera línea; y terapia paliativa (también denominada terapia de apoyo) para tratar el tratamiento sintomático sin esperar reducir significativamente el cáncer.
Los términos "prevenir" y "prevención" se refieren a la administración de un agente o composición a un individuo clínicamente asintomático que es susceptible o tiene predisposición a una afección adversa particular, trastorno o enfermedad, y así se refiere a la prevención de la aparición de síntomas y/o su causa subyacente.
A menos que se establezca específicamente o sea obvio del contexto, como se usa en el presente documento, se entiende que el término "o" es inclusivo. A menos que se establezca específicamente o sea obvio del contexto, como se usa en el presente documento, se entiende que los términos "un", "una", "el" y "la" son singular o plural.
A menos que se establezca específicamente o sea obvio del contexto, como se usa en el presente documento, se entiende que el término "aproximadamente" está dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándar de la media. Se puede entender que aproximadamente está dentro del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 % o 0,01 % del valor establecido. A menos que sea evidente de otro modo del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en el presente documento están modificados por el término aproximadamente.
La relación de un listado de grupos químicos en cualquier definición de una variable en el presente documento incluye definiciones de esa variable como cualquier grupo individual o combinación de grupos enumerados. La relación de una realización para una variable o aspecto en el presente documento incluye esa realización como una única realización o en combinación con cualquier otra realización o porción de la misma.
Cualquier composición o método proporcionado en el presente documento se puede combinar con una o más de cualquiera de las otras composiciones y métodos proporcionados en el presente documento.
El término de transición "que comprende", que es sinónimo con "que incluye", "que contiene" o "caracterizado por", es incluyente o de extremos abiertos y no excluye elementos no citados adicionales o etapas de método. Por el contrario, el término de transición "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o componente no especificado en la reivindicación. El término de transición "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados "y aquellos que no afectan materialmente la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s)" de la invención reivindicada.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferidas de la misma, y de las reivindicaciones. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la práctica o la prueba de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos desvelados en el presente documento son ilustrativos solo y no pretenden ser limitantes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1A-Figura 1F son una serie de gráficos de líneas que demuestran los efectos de ALT-803 en la proliferación in vitro de subconjuntos de células inmunitarias humanas. Se separaron CMSP humanas de capas leucocíticas de sangre de dos donantes sanos (Donante-A, la Figura 1A, la Figura 1C y la Figura 1E; Donante-B, la Figura 1B, la Figura 1D y la Figura 1F) y se cultivaron en RPMI-10 con o sin ALT-803 durante 5 días (Figura 1A y la Figura 1B) o los tiempos indicados (Figura 1C, la Figura 1D, la Figura 1E y la Figura 1F). ALT-803 se añadió a las concentraciones indicadas en la Figura 1A y la Figura 1B, y a 10 nM con RPMI-10 sirviendo de control de medio (Ctrl) para los estudios mostrados en las Figuras 1C - Figura 1F. Al final de la incubación, se tiñeron CMSP con anticuerpos marcados con fluorocromo específicos para CD4, CD8 (como marcadores de linfocitos T) y CD16 (como un marcador de linfocitos NK). Los porcentajes de los subconjuntos de células se analizaron en un FACSverse con el software FACSuite. Se analizaron muestras por triplicado de donantes individuales para la Figura 1A y la Figura 1B y se analizaron muestras individuales para cada momento de tiempo para la Figura 1C y la Figura 1D. La Figura 1E y la Figura 1F representan las relaciones CD4/CD8 determinadas a partir de los resultados obtenidos en la Figura 1C y la Figura 1D, respectivamente.
La Figura 2A y la Figura 2B muestran gráficos de puntos que muestran los efectos de ALT-803 sobre la proliferación in vitro de subconjuntos de células inmunitarias humanas de diferentes donantes. Se separaron CMSP humanas de capas leucocíticas de la sangre de 7 donantes sanos y se cultivaron en medio solo o medio que contenía IL-15 0,5 nM o ALT-803 durante 7 días. Al final de la incubación, se contaron las CMSP y se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorocromo específicos de los subconjuntos de células inmunitarias. Los porcentajes de los subconjuntos de células se analizaron en un FACSverse con el software FACSuite y se calcularon las cifras absolutas de células, como se muestra en la Figura 2A y la Figura 2B.
La Figura 3A, la Figura 3B, la Figura 3C y la Figura 3D son gráficos de líneas que muestran la regulación por incremento de moléculas CD25 y CD69 en subconjuntos de células inmunitarias después de la incubación con ALT-803. Se separaron CMSP humanas de las capas leucocíticas de la sangre de dos donantes sanos (paneles izquierdos y derechos) y se cultivaron en RPMI-10 con ALT-803 a la concentración indicada durante 5 días. Las CMSP activadas con ALT-803 se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorocromo específicos para CD4, CD8 (como marcadores de linfocitos T), CD335 (como marcadores de linfocitos NK), CD25 y CD69 (como marcadores de activación). La intensidad fluorescente [media geométrica (MFI)] de la expresión de CD25 y CD69 en linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y linfocitos NK se analizó en un FACSverse con el software FACSuite.
La Figura 4A-Figura 4D son gráficos de líneas que muestran la regulación por incremento de la expresión de granzima B y perforina en linfocitos T CD8+ humanos y linfocitos NK por ALT-803. Se separaron CMSP humanas de capas leucocíticas de la sangre y se cultivaron en RPMI-10 con ALT-803 a las concentraciones indicadas durante 5 días. Las CMSP activadas con ALT-803 se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorocromo específicos para CD8, CD16 y CD335 (como marcadores de linfocitos NK) y luego se tiñeron intracelularmente con anticuerpos marcados con fluorocromo específicos para granzima B o perforina. La intensidad fluorescente media (MFI: media geométrica) de la expresión de la granzima B y de perforina en linfocitos T CD8+ (Figura 4A: Donante1 y la Figura 4C: Donante-2) y linfocitos NK (Figura 4B: Donante-1 y la Figura 4D: Donante-2) se analizó en un FACSverse con el software FÁCSuite.
La Figura 5A, la Figura 5B y la Figura 5C son una serie de gráficos de barras que muestran los efectos de ALT-803 sobre la producción de citocinas y la proliferación celular por células inmunitarias humanas y de ratón en cultivo. Se incubaron CMSP humanas (Figura 5A) y esplenocitos de ratón (Figura 5B) en medio que contenía ALT-803 como se indica durante 4 días. Los cambios en las citocinas secretadas en los medios de cultivo celular se muestran en la Figura 5A y la Figura 5B. Los cambios en las respuestas de proliferación celular basadas en la dilución de colorante violeta se muestran en la Figura 5C.
La Figura 6A-Figura 6D son una serie de gráficos de líneas y un gráfico de barras que muestran la citotoxicidad de CMSP humanas frente a las células Daudi humanas de linfoma de linfocitos B y K562 de leucemia mielógena humana inducidas por ALT-803. Se usaron CMSP humanas como células efectoras y se usaron células Daudi y K562 marcadas con CellTrace como células diana. Las CMSP humanas se mezclaron con células K562 (Figura 6A), células Daudi (Figura 6B) o células Daudi con rituximab (Ab anti-CD20) a 10 nM (Figura 6C) en la relación E:T indicada en RPMI-10 con o sin ALT-803 a 10 nM. Las mezclas de células se incubaron a 37 °C durante 3 días y se evaluó la viabilidad de células diana Daudi y K562 por análisis de tinción con yoduro de propidio de células diana marcadas con violeta en un citómetro de flujo FACSVerse. Se mezclaron CMSP humanas con células K562 o Daudi marcadas con violeta en una relación 10:1 o con células Daudi más rituximab (ADCC) en una relación 2:1 en RPMI-10 con o sin ALT-803 a 10 nM. Después de 1 a 3 días de incubación a 37 °C, se determinó el % de citotoxicidad de las células diana (Figura 6D).
La Figura 7A y la Figura 7B son una serie de gráficos de líneas que muestran la inducción dependiente de la concentración de ALT-803 de la citotoxicidad de CMSP humanas contra células K562 y Daudi. Se usaron CMSP humanas como células efectoras y se usaron células Daudi y K562 marcadas con CellTrace Violet como células diana. Se mezclaron CMSP humanas de dos donantes (A y B) con células K562 o células Daudi marcadas con violeta en una relación E:T de 20:1 en RPMI-10 con las concentraciones indicadas de ALT-803. Después de una incubación de 3 días a 37 °C, se evaluó la viabilidad de células diana Daudi y K562 por análisis de tinción con yoduro de propidio de células diana marcadas con violeta en un citómetro de flujo FACSVerse.
La Figura 8A-Figura 8D son una serie de gráficos de líneas que muestran que ALT-803 aumenta ADCC de Ab específicos de tumor contra células tumorales. Se mezclaron CMSP humanas frescas del donante-1 (Figura 8A) o donante-2 (Figura 8B) con células Daudi CD20-positivo humanas de linfoma de linfocitos B marcadas con violeta en E:T=2:1 en RPMI-10 con ALT-803 a la concentración indicada (0,01-10 nM) solo o con rituximab (Ab anti-CD20) a 10 nM. Después de 2 días de incubación a 37 °C, se evaluó la viabilidad de las células Daudi por análisis de tinción con yoduro de propidio de células Daudi marcadas con violeta en un BD FACSVerse. En un estudio de seguimiento, se aislaron linfocitos NK de CMSP humanas normales por MACS y se usaron como células efectoras. Se mezclaron linfocitos NK (Figura 8C) y CMSP reducidas en NK (Figura 8D) con células Daudi marcadas con violeta a E:T=1:1 en RPMI-10 que contenía ALT-803 en la concentración indicada (0,01 o 0,1 nM) con y sin rituximab o Ab HOAT a 10 nM. Las células se incubaron a 37 °C durante 2 días. Se evaluó la viabilidad de células Daudi por análisis de células Daudi marcadas con violeta teñidas con yoduro de propidio en un BD FACSVerse.
La Figura 9A y la Figura 9B son un gráfico de barras y un gráfico de líneas que muestran que ALT-803 aumenta ADCC de Ab específicos de tumor contra células tumorales por esplenocitos de ratón. En el estudio mostrado en la Figura 9A, se aislaron esplenocitos de ratones SCID portadores de tumor tras el tratamiento con PBS, ALT-803 (0,2 mg/kg), rituximab (10 mg/kg) o ALT-803+rituximab. Los esplenocitos y las células Daudi marcadas con CellTrace Violet se mezclaron a E:T = 20:1 en presencia de medio solo o medio que contiene ALT-803 (10 nM), rituximab (10 nM) o ALT-803+rituximab. Después de 2 días de incubación a 37 °C durante 2 días, se evaluó la viabilidad de células Daudi diana. Los esplenocitos también se aislaron de ratones Balb/c tras el tratamiento con ALT-803 (0,2 mg/kg) (Figura 9B). Los esplenocitos y las células de cáncer de mama humano SK-BR-3 HER2-positivo marcadas con CellTrace Violet se mezclaron a E:T = 10:1 en presencia de medio solo o medio que contenía diversas concentraciones de anticuerpo anti-HER2 (clon 24D2), ALT-803 o ambos agentes. Después de 24 horas de incubación a 37 °C, se evaluó la viabilidad de células SK-BR-3 diana.
La Figura 10 es un gráfico de barras que muestra la eficacia antitumoral de ALT-803 más anticuerpo anti-CD20 contra el linfoma B humano en ratones SCID. Se trataron ratones hembra Fox Chase SCID portadores de tumores de células Daudi con PBS, ALT-803 (0,2 mg/kg), rituximab (10 mg/kg) o ALT-803+rituximab. Las células Daudi en médula ósea se determinaron 4 días después del último tratamiento.
La Figura 11 es un gráfico de barras que muestran la eficacia antitumoral de ALT-803 más el anticuerpo anti-CD20 contra el linfoma B humano en ratones SCID. Se trataron ratones hembra Fox Chase SCID portadores de tumores de células Daudi con PBS, rituximab o rituximab más diversas concentraciones de ALT-803. Las células Daudi en médula ósea se determinaron 4 días después del último tratamiento.
La Figura 12 es un gráfico de líneas que muestra la supervivencia prolongada de ratones portadores de tumores de células Daudi después de una terapia con ALT-803 más Ab anti-CD20. Se trataron ratones hembra Fox Chase SCID portadores de tumores de células Daudi con PBS, rituximab (10 mg/kg), ALT-803 (0,05 mg/kg) o rituximab más ALT-803. Se monitorizó la supervivencia de los ratones y se representaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier.
La Figura 13A y la Figura 13B son una serie de gráficos de líneas que muestran la supervivencia prolongada de ratones portadores de metástasis al pulmón de carcinoma de colon CT26 después de la terapia con ALT-803 y ALT-803 más Ab anti-CTLA-4. Se trataron ratones BALB/c portadores de metástasis al pulmón de carcinoma de colon CT26 con monoterapias con PBS, ALT-803, IL-15 y terapias de combinación con Ab anti-CTLA4 y Ab anti-PD-L1 como se indica en las figuras. Se monitorizó la supervivencia de los ratones y se representaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier.
La Figura 14A y la Figura 14B son una serie de gráficos de líneas que muestran la supervivencia prolongada de ratones portadores de tumores de mieloma 5T33P después de una terapia con ALT-803 más Ab anti-PD-L1. En la Figura 14A, se trataron ratones C57BL/6 portadores de tumores de mieloma 5T33P con monoterapias con PBS, ALT-803, IL-15 y terapias de combinación con Ab anti-CTLA4 y anti-PD-L1 Ab (0,2 mg/ratón) como se indica en la figura. Se monitorizó la supervivencia de los ratones y se representaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. En la Figura 14B, se trataron ratones C57BL/6 portadores de tumores de mieloma 5T33P con PBS, ALT-803 insuficiente (0,05 mg/kg), Ab anti-PD-L1 insuficiente (5 pg) o combinación ALT-803 Ab anti-PD-L1 como se indica en la figura. Se monitorizó la supervivencia de los ratones y se representaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier.
La Figura 15A y la Figura 15B son una serie de gráficos que muestran la expresión de ligandos para PD1 y CTLA4 sobre la superficie de células tumorales. Se tiñeron células tumorales CT26 (Figura 15A) y 5T33P (Figura 15B) con anticuerpos contra PD-L1, CD86 y CD80 (línea roja) o controles de isotipo (línea negra) y luego se analizaron por citometría de flujo.
La Figura 16A, la Figura 16B, la Figura 16C, la Figura 16D, la Figura 16E y la Figura 16F son una serie de gráficos de barras que muestran cambios en los ratones observados después de un tratamiento de múltiples dosis con ALT-803 y recuperación postratamiento.
La Figura 17 es un gráfico de líneas que muestra el perfil farmacocinético de ALT-803 en macacos cangrejeros.
La Figura 18A-Figura 18H son una serie de gráficos de líneas que muestran cambios en las cifras de células inmunitarias después del tratamiento con múltiples dosis de ALT-803 y recuperación postratamiento en macacos cangrejeros.
La Figura 19A y la Figura 19B es una serie de gráficos de líneas que muestran la supervivencia prolongada de ratones portadores de tumores de vejiga ortotópicos MB49luc después de la terapia con ALT-803 más bloqueo del punto de regulación. En la Figura 19A, ratones C57BL/6 portadores de tumores de vejiga ortotópicos MB49luc se trataron con terapias de combinación con PBS, ALT-803 y ALT-803 con Ab anti-CTLA4 y Ab anti-PD-L1 como se indica en la figura. Se monitorizó la supervivencia de los ratones y se representaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. Después de 80 días, los ratones supervivientes del grupo ALT-803 Ab anti-PD-L1/anti-CTLA4 y ratones de la misma edad sin tratamiento previo se volvieron a exponer a la administración intravesicular de células tumorales MB49luc. La supervivencia del ratón se monitorizó adicionalmente. En la Figura 19B, ratones C57BL/6 portadores de tumores de vejiga MB49luc se trataron con PBS, ALT-803, Ab anti-PD-1, Ab anti-CTLA-4 o terapia de combinación como se indica en la figura. Se monitorizó la supervivencia de los ratones y se representaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier.
La Figura 20 es una serie de gráficos de citometría de flujo que muestran la expresión de ligandos para PD1 y CTLA4 sobre la superficie de células tumorales MB49luc. Se tiñeron células tumorales MB49luc con anticuerpos contra PD-L1, CD86 y CD80 (línea azul) o controles de isotipo (línea negra) y luego se analizaron por citometría de flujo.
La Figura 21A-Figura 21C es una serie de gráficos de líneas que muestran el efecto combinatorio de ALT-803 y TA99 en el modelo de melanoma murino singénico. En la Figura 21A, células de melanoma B16F10 (2x105) se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de ratones C57BL/6. Una vez se formaron tumores palpables, los ratones se aleatorizaron y se trataron por vía intravenosa con 0,2 mg/kg de ALT-803, 10 mg/kg de TA99, una combinación de ALT-803 TA99, o control de PBS, en el día de estudio 10, 14, 17, 21 y 24. La Figura 21B y la Figura 21C muestran la evaluación de las funciones efectoras de diferentes subconjuntos de células implicadas en la inmunidad antitumoral de terapia combinada. La reducción de linfocitos T CD4+ y CD8+ fue realizada por inyección intraperitoneal del mAb de rata GK1.5 (anti-CD4) y 53.6.72 (anti-CD8a), respectivamente. La reducción de linfocitos NK se logró por administración intraperitoneal del mAb murino PK136 (anti-NK1.1). Para la reducción de macrófagos, los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal con liposomas cargados con clodronato (Clophosome). El impacto de la reducción se evaluó usando tanto el crecimiento tumoral (Figura 21B) como la supervivencia de los ratones (Figura 21C). Las curvas de supervivencia muestran los días de estudio cuando los animales murieron debido a la metástasis tumoral o el tumor alcanzó el tamaño umbral (una dimensión > 20 mm) para carga tumoral. n=8/grupo. **: p<0,01; ***: p<0,001.
La Figura 22A-Figura 22D es una serie de gráficos de barras que muestran el aumento mediado por ALT-803 de células inmunitarias en el bazo y el microentorno del tumor. En la Figura 22A-Figura 22D, los ratones (n=6) se inyectaron (por vía subcutánea) con células de melanoma B16F10 (2x105) en el día de estudio 0 (SD0) y se trataron por vía intravenosa con TA99, ALT-803, una combinación de ALT-803 TA99 o PBS en SD17. En SD20, los porcentajes de linfocitos T CD8+ (CD8a+), linfocitos T CD4+ (CD4+), linfocitos NK (panNK+), linfocitos B (CD19+) y macrófagos (F4/80+) se cuantificaron en esplenocitos (Figura 22A) y TIL (7-AAD-CD45+, la Figura 22B) usando citometría de flujo. Se midieron y representaron los porcentajes de linfocitos T de memoria CD8+CD44alto entre la población de linfocitos T CD8+ del bazo (Figura 22C) y TIL (Figura 22D).
La Figura 23A-Figura 23C es una serie de gráficos de líneas que muestran que ALT-803 TA99 proporciona protección inmunitaria de la reexposición al tumor. En la Figura 23A-Figura 23B, los ratones (n=20) implantados por vía subcutánea con células B16F10 (2x105) en el día de estudio 0 (SD0) fueron tratados inmediatamente por vía intravenosa con PBS, TA99 o TA99 ALT-803. Después de tres semanas de tratamiento y dos meses de monitorización, animales sin tratamiento previo y supervivientes se volvieron a exponer contralateralmente por inyección subcutánea de células B16F10 (2x105). Se midieron y representaron la supervivencia sin tumor (animales que mantienen una masa tumoral subcutánea < 50 mm3) de animales durante la exposición tumoral inicial (Figura 23A) y el crecimiento tumoral durante la reexposición (Figura 23B). TB = portador de tumor. *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001. En la Figura 23C, células B16F10 de melanoma murino (2x105/ratón) se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de ratones C57BL/6 en el día de estudio -58 (SD-58). Los ratones se inyectaron con células B16F10 como en la Figura 23A y se trataron con ALT-803 (0,2 mg/kg) y TA99 (10 mg/kg) por vía intravenosa dos veces a la semana durante tres semanas empezando en el día 0. Para reducir los linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ o linfocitos NK, se administraron anti-CD4 (GK1.5), anti-CD8 (53-6.72) y/o anti-NK (PK136) por vía intraperitoneal en los ratones sin tumor 46 días después de la inoculación del tumor. Para evaluar la respuesta de memoria antitumoral de ratones sin tumor, se inyectaron células B16F10 (2x105/ratón) por vía subcutánea contralateralmente en los ratones sin tumor 58 días (SD0) después de la primera inoculación de tumor. Los ratones sin tratamiento previo inyectados con células B16F10 sirvieron de control. La curva de supervivencia resume los días de estudio cuando los animales murieron debido a la metástasis tumoral o al tamaño umbral (volumen del tumor > 4000 mm cúbicos). n=10/grupo.
La Figura 24A-Figura 24E es una serie de gráficos de barras que muestran que ALT-803 activa linfocitos T CD4+ y regula por incremento su expresión de PD-L1, pero reduce la expresión de PD-1 en linfocitos T CD8+. Los linfocitos T CD4+ (CD4+) de la fracción de TIL (7-AAD-CD45+) (Figura 24A y Figura 24C) y el bazo (Figura 24B) de ratones portadores de tumores (n=6) se tiñeron con anticuerpos anti-CD25 (Figura 24A) o anti-PD-L1 (Figura 24B y Figura 24C) tres días después de una única inyección de productos experimentales, seguido por cuantificación por citometría de flujo. Los linfocitos T CD8+ (CD8+; Figura 24D y Figura 24E) del bazo (Figura 24D) y la fracción de TIL (7-AAD-CD45+) (Figura 24E) de ratones portadores de tumores (n=6) se tiñeron con el anticuerpo anti-PD-1 (Figura 24D y Figura 24E) tres días después de una única inyección de productos experimentales, seguido por cuantificación por citometría de flujo. La expresión de PD-L1 y PD-1 se puntúa usando intensidad media de fluorescencia (MFI). *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.
La Figura 25A-Figura 25D es una serie de gráficos de barras que muestran que ALT-803 activa linfocitos NK y regula por disminución la expresión de PD-1 en linfocitos NK. Los linfocitos NK (panNK+) del bazo (Figura 25A y Figura 25C) y la fracción de TIL (7-AAD-CD45+) (Figura 25B y Figura 25D) de ratones portadores de tumores (n=6) se tiñeron con anticuerpos anti-KLRG1 (Figura 25A y Figura 25B) y anti-PD-1 (Figura 25C y Figura 25D) tres días después de una única inyección de productos experimentales, seguido por cuantificación por citometría de flujo. La expresión de KLRG1 y PD-1 se puntúa usando intensidad media de fluorescencia (MFI). *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.
La Figura 26A-Figura 26B es una serie de gráficos de líneas que muestra el efecto combinatorio de ALT-803/TA99 y el mAb anti-PD-L1 en el modelo de melanoma murino singénico. En la Figura 26A, células de melanoma B16F10 (2x105) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco dorsal derecho de ratones C57BL/6. Una vez se formaron tumores palpables, los ratones se aleatorizaron y se trataron con 0,2 mg/kg de ALT-803 (i.v.) y 10 mg/kg de TA99 (i.v.), con o sin 100 gg/ratón de Ab anti-PD-L1 10F.9G2 (i.p.) el día de estudio 10, 14, 17, 21 y 24. *: p<0,05; ***: p<0,001. La Figura 26B muestra la expresión in vitro e in vivo de PD-L1 en células B16F10. Las células B16F10 recogidas del cultivo in vitro (líneas continuas), así como ratones portadores de tumores (líneas discontinuas), se tiñeron con anticuerpo anti-PD-L1 marcado con fluoróforo (rojo) y se sometieron a citometría de flujo. El isotipo del anticuerpo (negro) se incluyó como control negativo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que un anticuerpo en combinación con ALT-803, un complejo de un mutante superagonista de interleucina-15 (IL-15) y una proteína de fusión dimérica de receptor a de IL-15/Fc, es útil para potenciar una respuesta inmunitaria contra una neoplasia (por ejemplo, un glioblastoma, cáncer de próstata, cáncer hematológico, neoplasias de linfocitos B, mieloma múltiple, linfoma de linfocitos B, linfoma de Hodgkin, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, linfoma cutáneo de linfocitos T, linfoma de linfocitos T, un tumor sólido, carcinoma urotelial/de vejiga, melanoma, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal y cáncer de ovario) o una infección (por ejemplo, una infección con virus de la inmunodeficiencia humana).
ALT-803
ALT-803 comprende un mutante de IL-15 con elevada capacidad para unirse a IL-2RpY y potenciada actividad biológica (patente de EE. UU. N.° 8.507.222). Este mutante superagonista de IL-15 se describió en una publicación (J Immunol 2009 183:3598) y se ha concedido una patente por la Oficina de Patentes y Marcas de EE. UU. sobre el superagonista y están en tramitación varias solicitudes de patente (por ejemplo, N.° de serie de EE. UU. 12/151.980 y 13/238.925). Este superagonista de IL-15 en combinación con una proteína de fusión de receptor de IL-15a soluble (IL-15RaSu/Fc) da como resultado un complejo de proteínas con actividad de IL-15 altamente potente in vitro e in vivo (Han et al., 2011, Cytokine, 56: 804-810; Xu, et al., 2013 Cancer Res. 73:3075-86, Wong, et al., 2013, Oncolmmunology 2:e26442). Este complejo de superagonista de IL-15 (IL-15N72D:IL-15RaSu/Fc) se denomina ALT-803. El análisis farmacocinético indica que el complejo tiene una semivida en ratones de 25 horas después de la administración i.v. ALT-803 presenta una impresionante actividad antitumoral contra modelos de tumor sólido agresivo y hematológico en ratones inmunocompetentes. Se puede administrar como una monoterapia usando una pauta posológica i.v. de dos veces a la semana o semanalmente o como terapia de combinación con un anticuerpo. La respuesta antitumoral de ALT-803 también es duradera. Los ratones portadores de tumores que se curaron después del tratamiento con ALT-803 también fueron altamente resistentes a la reexposición a las mismas células tumorales, que indica que ALT-803 induce respuestas de memoria inmunológicas eficaces contra las células tumorales reintroducidas.
Interleucina-15
La interleucina-15 (IL-15) es una importante citocina para el desarrollo, la proliferación y la activación de linfocitos NK efectores y linfocitos T CD8+ de memoria. La IL-15 se une al receptor a de IL-15 (IL-15Ra) y se presenta en trans al complejo de IL-2/cadena y común del receptor p de IL-15 (IL-15RpYc) en células efectoras. La IL-15 y la IL-2 comparten unión con IL-15RpYc, y señalizan mediante las vías STAT3 y STAT5. Sin embargo, la IL-2 también soporta el mantenimiento de linfocitos T reguladores (Treg) CD4+CD25+FoxP3+ e induce la muerte celular de linfocitos T CD8+ activados. Estos efectos pueden limitar la actividad terapéutica de IL-2 contra tumores. La IL-15 no comparte estas actividades inmunosupresoras con IL-2. Además, la IL-15 es la única citocina que se sabe que proporciona señalización antiapoptótica a los linfocitos T CD8+ efectores. La IL-15, ya sea administrada sola o como un complejo con IL-15Ra, presenta potentes actividades antitumorales contra tumores sólidos bien establecidos en modelos animales experimentales y, por lo tanto, se ha identificado como uno de los fármacos inmunoterapéuticos más prometedores que posiblemente podrían curar el cáncer.
Para facilitar el desarrollo clínico de un terapéutico para el cáncer basado en IL-15, se identificó un mutante de IL-15 (IL-15N72D) con elevada actividad biológica en comparación con IL-15 (Zhu et al., J Immunol, 183: 3598-3607, 2009). La farmacocinética y la actividad biológica de este superagonista de IL-15 (IL-15N72D) mejoró adicionalmente por la creación del complejo de fusión IL-15N72D:IL-15RaSu/Fc (ALT-803), de forma que el complejo superagonista tiene al menos 25 veces la actividad de la citocina nativa in vivo (Han et al., Cytokine, 56: 804-810, 2011).
Dominio Fc
ALT-803 comprende un complejo de fusión de IL-15N72D:IL-15RaSu/Fc. Se ha informado de proteínas de fusión que combinan las regiones Fc de IgG con los dominios de otra proteína, tales como diversas citocinas y receptores solubles (véase, por ejemplo, Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol., 14:52-60, 1996); patentes de EE. UU. N.° 5.116.964 y 5.541.087). La proteína de fusión prototipo es una proteína homodimérica unida mediante restos de cisteína en la región bisagra de Fc de IgG, dando como resultado una molécula similar a una molécula de IgG sin la cadena pesada variable ni dominios Ch1 ni cadenas ligeras. La naturaleza dimérica de las proteínas de fusión que comprenden el dominio Fc puede ser ventajosa en proporcionar interacciones de mayor orden (es decir, unión bivalente o biespecífica) con otras moléculas. Debido a la homología estructural, las proteínas de fusión de Fc presentan un perfil farmacocinético in vivo comparable al de la IgG humana con un isotipo similar. Las inmunoglobulinas de la clase IgG están entre las proteínas más abundantes en la sangre humana, y sus semividas de circulación se pueden alcanzar hasta en 21 días. Para prolongar la semivida en circulación de IL-15 o una proteína de fusión de IL-15 y/o para aumentar su actividad biológica, se han hecho complejos de proteína de fusión que contienen el dominio de IL-15 unido no covalentemente con IL-15RaSu unido covalentemente con la porción Fc de la proteína IgG de cadena pesada humana (por ejemplo, ALT-803).
El término "Fc" se refiere a un fragmento que no se une al antígeno de un anticuerpo. Dicho "Fc" puede estar en forma monomérica o multimérica. La fuente de inmunoglobulina original de Fc nativo es preferentemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque se prefieren IgG 1 e IgG2. Los Fc nativos están constituidos por polipéptidos monoméricos que se pueden unir en formas diméricas o multiméricas por asociación covalente (es decir, enlaces disulfuro) y no covalente. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre las subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativas varía desde 1 hasta 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2). Un ejemplo de un Fc nativo es un dímero unido a disulfuro resultante de la digestión con papaína de una IgG (véase Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). El término "Fe nativo", como se usa en el presente documento, es genérico para las formas monoméricas, diméricas y multiméricas. Los dominios Fc contienen sitios de unión para la proteína A, proteína G, diversos receptores de Fc y proteínas del complemento.
En algunas realizaciones, el término "variante de Fc" se refiere a una molécula o secuencia que se modifica a partir de un Fc nativo, pero todavía comprende un sitio de unión para el receptor de recuperación, FcRn. Las solicitudes internacionales WO 97/34631 (publicada el 25 de septiembre de 1997) y WO 96/32478 describen variantes de Fc a modo de ejemplo, así como la interacción con el receptor de recuperación. Por lo tanto, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que se humaniza a partir de un Fc nativo no humano. Además, un Fc nativo comprende sitios que se pueden retirar debido a que proporcionan características estructurales o actividad biológica que no son requeridas por las moléculas de fusión de la presente invención. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios de Fc nativos o residuos que afectan o participan en (1) la formación de enlaces disulfuro, (2) la incompatibilidad con una célula hospedadora seleccionada, (3) la heterogeneidad aminoterminal tras la expresión en una célula hospedadora seleccionada, (4) la glucosilación, (5) la interacción con el complemento, (6) la unión a un receptor de Fc distinto de un receptor de recuperación, (7) la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), o (8) la fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP). Las variantes de Fc se describen con más detalle en lo sucesivo.
El término "dominio Fc" engloba Fc nativo y moléculas de variante de Fc y secuencias como se han definido anteriormente. Al igual que con las variantes de Fc y Fc nativos, el término "dominio Fc" incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, tanto si se digieren del anticuerpo completo como si se producen por expresión génica recombinante o por otros medios.
Complejos de proteínas de fusión
La invención proporciona ALT-803, que es un complejo de proteínas entre IL-15N72D y IL-15RaSu/Fc. En ciertas realizaciones, los polipéptidos ALT-803 podrían servir de armazón para la fusión con otros dominios de proteína. En dichos complejos de proteína de fusión, una primera proteína de fusión comprende un primer polipéptido biológicamente activo unido covalentemente a interleucina-15 (IL-15) o fragmento funcional de la misma; y la segunda proteína de fusión comprende un segundo polipéptido biológicamente activo unido covalentemente al polipéptido de receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra) soluble o fragmento funcional del mismo, donde el dominio de IL-15 de una primera proteína de fusión se une al dominio de IL-15Ra soluble de la segunda proteína de fusión para formar un complejo de proteínas de fusión soluble. Los complejos de proteína de fusión de la invención también comprenden un dominio Fc de inmunoglobulina o un fragmento funcional del mismo unido con uno o ambos de la primera y segunda proteínas de fusión. Preferentemente, los dominios Fc unidos a la primera y segunda proteínas de fusión interactúan para formar un complejo de proteínas de fusión. Dicho complejo se puede estabilizar por formación de enlaces disulfuro entre los dominios Fc de inmunoglobulina. En ciertas realizaciones, los complejos de proteína de fusión solubles de la invención incluyen un polipéptido IL-15, variante de IL-15 o un fragmento funcional del mismo y un polipéptido de IL-15Ra soluble o un fragmento funcional del mismo, en donde uno o ambos de los polipéptidos IL-15 y IL-15Ra incluyen además un dominio Fc de inmunoglobulina o un fragmento funcional del mismo.
En una realización adicional, uno o ambos del primer y segundo polipéptidos biológicamente activos comprenden un anticuerpo o fragmento funcional del mismo.
En otra realización, el antígeno para el dominio de anticuerpo comprende un receptor de la superficie celular o ligando.
En una realización adicional, el antígeno comprende un antígeno CD, receptor o ligando de citocina o quimiocina, receptor o ligando de factor de crecimiento, factor tisular, molécula de adhesión a células, MHC/moléculas similares a MHC, receptor de Fc, receptor del tipo toll, receptor NK, TCR, BCR, receptor o ligando coestimulante positivo/negativo, receptor o ligando de muerte, antígeno asociado a tumor, o antígeno codificado por virus.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido biológicamente activo" o "molécula efectora" indica una secuencia de aminoácidos, tal como una proteína, polipéptido o péptido; un azúcar o polisacárido; un lípido o un glucolípido, glucoproteína o lipoproteína que puede producir los efectos deseados como se trata en el presente documento. Las moléculas efectoras también incluyen agentes químicos. También se contemplan ácidos nucleicos de moléculas efectoras que codifican una proteína biológicamente activa o efectora, polipéptido o péptido. Por lo tanto, las moléculas adecuadas incluyen factores reguladores, enzimas, anticuerpos o fármacos, así como ADN, ARN y oligonucleótidos. Los polipéptidos biológicamente activos o la molécula efectora pueden existir de forma natural o se pueden sintetizar a partir de componentes conocidos, por ejemplo, por síntesis recombinante o química, y pueden incluir componentes heterólogos. Un polipéptido biológicamente activo o molécula efectora tiene, en general, entre aproximadamente 0,1 y 100 KD o más de aproximadamente 1000 KD, preferentemente entre aproximadamente 0,1, 0,2, 0,5, 1,2, 5, 10, 20, 30 y 50 KD como se evalúa por técnicas de dimensionado de moléculas convencionales, tales como centrifugación o electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Los efectos deseados de la invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la formación de un complejo de proteínas de fusión de la invención con elevada actividad de unión, destrucción de una célula diana, por ejemplo, ya sea para inducir la proliferación celular o la muerte celular, iniciar una respuesta inmunitaria, en prevenir o tratar una enfermedad, o para actuar de molécula de detección para fines diagnósticos. Para dicha detección, se podría usar un ensayo, por ejemplo, un ensayo que incluye etapas secuenciales de cultivo de células para proliferar las mismas.
El enlace covalente de la molécula efectora con los complejos de proteína de fusión de la invención según la invención proporciona varias ventajas significativas. Se pueden producir complejos de proteína de fusión de la invención que contienen una única molécula efectora, que incluye dicho péptido de estructura conocida. Además, se puede producir una amplia variedad de moléculas efectoras en vectores de ADN similares. Es decir, se puede unir una biblioteca de diferentes moléculas efectoras a los complejos de proteína de fusión para el reconocimiento de células infectadas o enfermas. Además, para aplicaciones terapéuticas, en vez de la administración de un complejo de proteínas de fusión de la invención a un sujeto, se puede administrar un vector de expresión de ADN que codifica el complejo de proteínas de fusión para la expresión in vivo del complejo de proteínas de fusión. Dicho enfoque evita las caras etapas de purificación normalmente asociadas a la preparación de proteínas recombinantes y evita las complejidades de captación de antígeno y procesamiento asociado a enfoques convencionales.
Como se observa, los componentes de las proteínas de fusión y los anticuerpos desvelados en el presente documento, por ejemplo, conjugados de molécula efectora, tales como citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, toxinas de proteína, dominios de inmunoglobulina u otras moléculas bioactivas y conectores peptídicos, pueden ser organizados de casi cualquier modo a condición de que la proteína de fusión o anticuerpo tenga la función para la que estaba prevista. En particular, cada componente de la proteína de fusión puede estar separado de otro componente en al menos una secuencia conectora peptídica adecuada, si se desea. Además, las proteínas de fusión pueden incluir marcas, por ejemplo, para facilitar la modificación, identificación y/o purificación de la proteína de fusión.
Terapéuticos farmacéuticos
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden ALT-803 para su uso como un terapéutico. En un aspecto, ALT-803 se administra por vía sistémica, por ejemplo, formulado en un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina fisiológica. Las vías de administración preferibles incluyen, por ejemplo, instilación en la vejiga, inyecciones subcutáneas, intravenosas, intraperitoneales, intramusculares o intradérmicas que proporcionan niveles sostenidos continuos de la composición en el paciente. El tratamiento de pacientes humanos u otros animales se lleva a cabo usando una cantidad terapéuticamente eficaz de un terapéutico identificado en el presente documento en un vehículo fisiológicamente aceptable. Los vehículos adecuados y su formulación se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. La cantidad del agente terapéutico a administrar varía dependiendo del modo de administración, la edad y el peso corporal del paciente, y de los síntomas clínicos de la neoplasia o infección. En general, las cantidades estarán en el intervalo de los usados para otros agentes usados en el tratamiento de otras enfermedades asociadas a neoplasia o infección, aunque en ciertos casos se necesitarán menores cantidades debido al aumento de la especificidad del compuesto. Un compuesto se administra a una dosis que potencia una respuesta inmunitaria de un sujeto, o que reduce la proliferación, supervivencia o invasividad de una célula neoplásica, como se ha determinado por un método conocido por un experto en la técnica. Alternativamente, el compuesto se administra a una dosis que reduce la infección por un virus u otro patógeno de interés.
Formulación de composiciones farmacéuticas
La administración de ALT-803 para el tratamiento de una neoplasia o una infección puede ser por cualquier medio adecuado que da como resultado una concentración del terapéutico que, combinado con otros componentes, es eficaz en mejorar, reducir o estabilizar una neoplasia o infección. ALT-803 puede estar contenido en cualquier cantidad apropiada en cualquier vehículo, sustancia adecuada y, en general, está presente en una cantidad de 1 -95 % en peso del peso total de la composición. La composición se puede proporcionar en una forma farmacéutica que es adecuada para una vía de administración parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intravesicular o por vía intraperitoneal). Las composiciones farmacéuticas se pueden formular según la práctica farmacéutica convencional (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York).
Las cantidades de administración humana se pueden determinar inicialmente extrapolando la cantidad de compuesto usado en ratones o primates no humanos, como reconoce un experto que es habitual en la técnica para modificar la dosis para seres humanos en comparación con modelos animales. En ciertas realizaciones se prevé que la dosis pueda variar entre aproximadamente 0,1 gg de compuesto/kg de peso corporal y aproximadamente 5000 gg de compuesto/kg de peso corporal; o desde aproximadamente 1 gg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 4000 gg/kg de peso corporal o desde aproximadamente 10 gg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 3000 gg/kg de peso corporal. En otras realizaciones, esta dosis puede ser aproximadamente 0,1,0,3, 0,5, 1,3, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 o 5000 gg/kg de peso corporal. En otras realizaciones, se prevé que las dosis puedan estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 gg de compuesto/kg de peso corporal a aproximadamente 20 gg de compuesto/kg de peso corporal. En otras realizaciones, las dosis pueden ser aproximadamente 0,5, 1, 3, 6, 10 o 20 mg/kg de peso corporal. Por supuesto, esta cantidad de administración se puede ajustar hacia arriba o hacia abajo, como se hace habitualmente en dichos protocolos de tratamiento, dependiendo de los resultados de los ensayos clínicos iniciales y las necesidades de un paciente particular.
En realizaciones particulares, ALT-803 se formula en un excipiente adecuado para administración parenteral. En realizaciones particulares, ALT-803 se administra a 0,5 pg/kg - aproximadamente 15 pg/kg (por ejemplo, 0,5, 1,3, 5, 10 o 15 pg/kg).
Para el tratamiento de cáncer de vejiga, ALT-803 se administra por instilación en la vejiga. Los métodos de instilación son conocidos. Véase, por ejemplo, Lawrencia, et al., Gene Ther 8, 760-8 (2001); Nogawa, et al., J Clin Invest 115, 978-85 (2005); Ng, et al., Methods Enzymol 391,304-13 2005; Tyagi, et al., J Urol 171,483-9 (2004); Trevisani, et al., J Pharmacol Exp Ther 309, 1167-73 (2004); Trevisani, et al., Nat Neurosci 5, 546-51 (2002)); (Segal, et al., 1975). (Dyson, et al., 2005). (Batista, et al., 2005; Dyson, et al., 2005). En ciertas realizaciones, se prevé que la dosis de ALT-803 para la instilación pueda variar de entre aproximadamente 5 y 1000 pg/dosis. En otras realizaciones, las dosis intravesicales pueden ser aproximadamente 25, 50, 100, 200 o 400 pg/dosis. En otras realizaciones, ALT-803 se administra por instilación en la vejiga en combinación con terapias habituales, que incluye mitomicina C o Bacille Calmette-Guerin (BCG).
Las composiciones farmacéuticas se formulan con excipientes apropiados en una composición farmacéutica que, tras la administración, libera el terapéutico en un modo controlado. Los ejemplos incluyen composiciones unitarias individuales o múltiples en comprimido o cápsula, disoluciones de aceite, suspensiones, emulsiones, microcápsulas, microesferas, complejos moleculares, nanopartículas, parches y liposomas.
Composiciones parentales
La composición farmacéutica que comprende ALT-803 se puede administrar por vía parenteral por inyección, infusión o implantación (subcutánea, intravenosa, intramuscular, por vía intravesicular, intraperitoneal, o similares) en formas farmacéuticas, formulaciones, o por dispositivos de administración o implantes adecuados que contienen vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables convencionales no tóxicos. La formulación y la preparación de dichas composiciones se conocen bien por los expertos en la técnica de la formulación farmacéutica. Las formulaciones se pueden encontrar en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, arriba.
Las composiciones que comprenden ALT-803 para el uso parenteral se pueden proporcionar en formas farmacéuticas unitarias (por ejemplo, en ampollas monodosis, jeringas o bolsas), o en viales que contienen varias dosis y en las que se puede añadir un conservante adecuado (véase a continuación). La composición puede estar en forma de una disolución, una suspensión, una emulsión, un dispositivo de infusión o un dispositivo de administración para implantación, o se puede presentar como un polvo seco a reconstituir con agua u otro vehículo adecuado antes de uso. Aparte del agente activo que reduce o mejora una neoplasia o infección, la composición puede incluir vehículos y/o excipientes aceptables por vía parenteral adecuados. El (Los) agente(s) terapéutico(s) activo(s) se pueden incorporar en microesferas, microcápsulas, nanopartículas, liposomas, o similares, para la liberación controlada. Además, la composición puede incluir agentes de suspensión, solubilizantes, estabilizantes, de ajuste del pH, de ajuste de la tonicidad y/o dispersantes.
Como se indica anteriormente, las composiciones farmacéuticas que comprenden ALT-803 pueden estar en una forma adecuada para inyección estéril. Para preparar dicha composición, el (los) terapéutico(s) antineoplásico(s)/antiinfeccioso(s) activo(s) adecuado(s) se disuelven o suspenden en un vehículo líquido aceptable por vía parenteral. Entre vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están agua, agua ajustada hasta un pH adecuado mediante la adición de una cantidad apropiada de ácido clorhídrico, hidróxido sódico o un tampón adecuado, 1,3-butanodiol, disolución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico y disolución de dextrosa. La formulación acuosa también puede contener uno o más conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoato de metilo, etilo o n-propilo). En casos en los que uno de los compuestos sea solo moderadamente o ligeramente soluble en agua, se puede añadir un agente potenciador o solubilizante de la disolución, o el disolvente puede incluir 10-60 % p/p de propilenglicol o similares.
La presente invención proporciona métodos de tratamiento de enfermedad neoplásica o infecciosa y/o trastornos o síntomas de la misma, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un compuesto de las fórmulas en el presente documento a un sujeto (por ejemplo, un mamífero tal como un humano). Por lo tanto, una realización es un método de tratamiento de un sujeto que padece o susceptible a una enfermedad neoplásica o infecciosa o trastorno o síntoma de la misma. El método incluye la etapa de administrar al mamífero una cantidad terapéutica de una cantidad de un compuesto en el presente documento suficiente para tratar la enfermedad o trastorno o síntoma de la misma, en condiciones tales que se trate la enfermedad o el trastorno.
Los métodos en el presente documento incluyen administrar al sujeto (incluyendo un sujeto identificado como en necesidad de tal tratamiento) una cantidad eficaz de un compuesto descrito en el presente documento, o una composición descrita en el presente documento para producir dicho efecto. La identificación de un sujeto en necesidad de dicho tratamiento puede ser a criterio de un sujeto o un profesional sanitario y puede ser subjetiva (por ejemplo, opinión) u objetiva (por ejemplo, medible por una prueba o método de diagnóstico).
Los métodos terapéuticos de la invención (que incluyen tratamiento profiláctico) comprenden en general la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos en el presente documento, tal como un compuesto de las fórmulas en el presente documento, a un sujeto (por ejemplo, animal, humano) en necesidad de los mismos, que incluyen un mamífero, particularmente un humano. Dicho tratamiento será administrado adecuadamente a sujetos, particularmente a seres humanos, que padecen, que tienen, susceptibles a o en riesgo de una enfermedad neoplásica o infecciosa, trastorno, o síntoma de la misma. La determinación de los sujetos "en riesgo" se puede hacer por cualquier determinación objetiva o subjetiva por una prueba de diagnóstico u opinión de un sujeto o personal sanitario (por ejemplo, prueba genética, enzima o marcador de proteína, Marcador (como se define en el presente documento), antecedentes familiares, y similares). Se puede usar ALT-803 en el tratamiento de cualquier otro trastorno en el que se desea un aumento en una respuesta inmunitaria.
En una realización, la invención proporciona un método de monitorización del progreso del tratamiento. El método incluye la etapa de determinar un nivel de marcador de diagnóstico (Marcador) (por ejemplo, cualquier diana delineada en el presente documento modulada por un compuesto en el presente documento, una proteína o indicador de la misma, etc.) o medición de diagnóstico (por ejemplo, cribado, ensayo) en un sujeto que padece o susceptible a un trastorno o síntomas del mismo asociados a neoplasia o infección en la que el sujeto ha sido administrado con una cantidad terapéutica de un compuesto en el presente documento suficiente para tratar la enfermedad o síntomas de la misma. El nivel de Marcador determinado en el método se puede comparar con niveles conocidos de Marcador en cualquiera de controles normales sanos o en otros pacientes afectados para establecer el estado de enfermedad del sujeto. En realizaciones preferidas, un segundo nivel de Marcador en el sujeto se determina en un momento de tiempo después de la determinación del primer nivel, y los dos niveles se comparan para monitorizar el curso de la enfermedad o la eficacia de la terapia. En ciertas realizaciones preferidas, se determina un nivel de pretratamiento de Marcador en el sujeto antes del comienzo del tratamiento según la presente invención; este nivel de pretratamiento del Marcador se puede comparar entonces con el nivel de Marcador en el sujeto después de que comience el tratamiento, para determinar la eficacia del tratamiento.
Terapias de combinación
Preferentemente, ALT-803 se administra en combinación con un terapéutico antineoplásico o antiinfeccioso, tal como un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo específico de tumor o un inhibidor del punto de regulación inmunitario. El anticuerpo y ALT-803 se pueden administrar simultáneamente o uno detrás de otro. En algunas realizaciones, el tratamiento con anticuerpo es una terapia establecida para la indicación de enfermedad y la adición de tratamiento con ALT-803 al régimen con anticuerpo mejora el beneficio terapéutico a los pacientes. Dicha mejora se podría medir como respuestas elevadas basándose en un paciente o respuestas elevadas en la población de pacientes. La terapia de combinación también podría proporcionar respuestas mejoradas en dosis menores o menos frecuentes del anticuerpo, dando como resultado una pauta de tratamiento mejor tolerada. Como se indica, la terapia combinada de ALT-803 y un anticuerpo podría proporcionar actividad clínica mejorada mediante diversos mecanismos, que incluyen un aumento de ADCC, ADCP y/o niveles de linfocitos NK, linfocitos T, neutrófilos o células monocíticas, o respuestas inmunitarias.
Si se desea, ALT-803 se administra en combinación con cualquier terapia convencional, que incluye, pero no se limita a, cirugía, radioterapia, quimioterapia, terapia basada en proteínas o terapia biológica. Los fármacos quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes (por ejemplo, fármacos basados en platino, tetrazinas, aziridinas, nitrosoureas, mostazas nitrogenadas), antimetabolitos (por ejemplo, antifolatos, fluoropirimidinas, análogos de desoxinucleósidos, tiopurinas), agentes antimicrotúbulos (por ejemplo, alcaloides de la vinca, taxanos), inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, inhibidores de la topoisomerasa I y II), antibióticos citotóxicos (por ejemplo, antraciclinas) y fármacos inmunomoduladores (por ejemplo, talidomida y análogos).
Kits o sistemas farmacéuticos
Las composiciones farmacéuticas que comprenden ALT-803 se pueden ensamblar en kits o sistemas farmacéuticos para su uso en el tratamiento de una neoplasia o infección. Los kits o sistemas farmacéuticos según este aspecto de la invención comprenden un medio de transporte, tal como una caja, cartón, tubo, que tiene en estrecho confinamiento en su interior uno o más medios de recipiente, tales como viales, tubos, ampollas, botellas, jeringas o bolsas. Los kits o sistemas farmacéuticos de la invención también pueden comprenden instrucciones asociadas al uso de ALT-803.
Expresión de proteínas recombinantes
En general, la preparación de los complejos de proteína de fusión de la invención (por ejemplo, componentes de ALT-803) se puede llevar a cabo mediante procedimientos desvelados en el presente documento y por técnicas de ADN recombinante reconocidas.
En general, los polipéptidos recombinantes se producen por transformación de una célula hospedadora adecuada con toda o parte de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido o fragmento de la misma en un vehículo de expresión adecuado. Los expertos en el campo de la biología molecular entenderán que se puede usar cualquiera de una amplia variedad de sistemas de expresión para proporcionar la proteína recombinante. La célula hospedadora precisa usada no es crítica para la invención. Un polipéptido recombinante se puede producir en prácticamente cualquier hospedador eucariota (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, células de insecto, por ejemplo, células Sf21, o células de mamífero, por ejemplo, células NIH 3T3, HeLa, COS o preferentemente CHO). Dichas células están disponibles de una amplia variedad de fuentes (por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockland, Md.; por tanto, véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocol in Molecular Biology, Nueva York: John Wiley and Sons, 1997). El método de transfección y la elección del vehículo de expresión dependerán del sistema de hospedador seleccionado. Los métodos de transformación se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (arriba); se pueden elegir los vehículos de expresión de los proporcionados, por ejemplo, en Cloning Vectors: A Laboratory Manual (P. H. Pouwels et al., 1985, Sup. 1987).
Existe una variedad de sistemas de expresión para la producción de polipéptidos recombinantes. Los vectores de expresión útiles para producir dichos polipéptidos incluyen, sin limitación, vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófago, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus de la variolovacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudovirus de la rabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos.
Una se expresa vez el polipéptido recombinante, se aísla, por ejemplo, usando cromatografía de afinidad. En un ejemplo, un anticuerpo (por ejemplo, producido como se describe en el presente documento) producido contra el polipéptido se puede unir a una columna y usar para aislar el polipéptido recombinante. La lisis y el fraccionamiento de células que albergan los polipéptidos antes de la cromatografía de afinidad se pueden realizar por métodos convencionales (véase, por ejemplo, Ausubel et al., arriba). Una vez aislada, la proteína recombinante se puede purificar más, si se desea, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución (véase, por ejemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980).
Como se usa en el presente documento, los polipéptidos biológicamente activos o moléculas efectoras de la invención pueden incluir factores, tales como citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, toxinas de proteína, dominios de inmunoglobulina u otras proteínas bioactivas, tales como enzimas. Los polipéptidos biológicamente activos también pueden incluir conjugados con otros compuestos, tales como toxinas no de proteína, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, marcas detectables, materiales radiactivos y similares.
Las citocinas de la invención se definen por cualquier factor producido por células que afectan a otras células y son responsables de cualquiera de varios efectos múltiples de inmunidad celular. Los ejemplos de citocinas incluyen, pero no se limitan a, la familia de IL-2, interferón (IFN), IL-10, IL-1, IL-17, TGF y familias de citocinas de TNF, y a IL-1 a IL-35, IFN-a, IFN-p, IFNy, TGF-p, TNF-a y TNFp.
En un aspecto de la invención, la primera proteína de fusión comprende un primer polipéptido biológicamente activo unido covalentemente al dominio de interleucina-15 (IL-15) o un fragmento funcional del mismo. La IL-15 es una citocina que afecta a la activación y proliferación de linfocitos T. La actividad de IL-15 en la afectación de la activación celular inmunitaria y la proliferación es similar en algunos respectos a IL-2, aunque se han caracterizado bien las diferencias fundamentales (Waldmann, T A, 2006, Nature Rev. Immunol. 6:595-601).
En otro aspecto de la invención, la primera proteína de fusión comprende un dominio de interleucina-15 (IL-15) que es una variante de IL-15 (también denominada en el presente documento mutante de IL-15). La variante de IL-15 comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos diferente que la proteína IL-15 nativa (o natural). La variante de IL-15 se une preferentemente al polipéptido IL-15Ra y funciona como un agonista o antagonista de IL-15. Preferentemente, las variantes de IL-15 con actividad agonista tienen actividad superagonista. En algunas realizaciones, la variante de IL-15 puede funcionar como un agonista o antagonista de IL-15 independientemente de su asociación con IL-15Ra. Los agonistas de IL-15 se ejemplifican por actividad biológica comparable o elevada en comparación con IL-15 natural. Los antagonistas de IL-15 se ejemplifican por disminución de actividad biológica en comparación con IL-15 natural o por la capacidad para inhibir respuestas mediadas por IL-15. En algunos ejemplos, la variante de IL-15 se une con actividad elevada o reducida con respecto a los receptores de IL-15RPyC. En algunas realizaciones, la secuencia de la variante de IL-15 tiene al menos un cambio de aminoácido, por ejemplo, sustitución o deleción, en comparación con la secuencia de IL-15 nativa, dando dichos cambios como resultado actividad agonista o de antagonista de IL-15. Preferentemente, las sustituciones/deleciones de aminoácidos son en los dominios de IL-15 que interactúan con IL-15Rp y/o yC. Más preferentemente, las sustituciones/deleciones de aminoácidos no afectan la unión al polipéptido IL-15Ra o la capacidad para producir la variante de IL-15. Las sustituciones/deleciones de aminoácidos adecuadas para generar variantes de IL-15 se pueden identificar basándose en estructuras originales o conocidas de IL-15, comparaciones de IL-15 con moléculas homólogas, tales como IL-2 con estructura conocida, mediante mutagénesis racional o al azar y ensayos funcionales, como se proporciona en el presente documento, u otros métodos empíricos. Sustituciones adecuadas adicionales de aminoácidos pueden ser cambios conservativos o no conservativos e inserciones de aminoácidos adicionales. Preferentemente, las variantes de IL-15 de la invención contienen una o más de una sustitución/deleción de aminoácidos en la posición 6, 8, 10, 61,65, 72, 92, 101, 104, 105, 108, 109, 111 o 112 de la secuencia de IL-15 humana madura; particularmente, las sustituciones D8N ("D8" se refiere a la posición de aminoácidos y restos en secuencia de IL-15 humana madura y "N" se refiere al resto de aminoácido sustituido en esa posición en la variante de IL-15), I6S, D8A, D61A, N65A, N72R, V104P o Q108A dan como resultado variantes de IL-15 con actividad de antagonista y las sustituciones N72D dan como resultado variantes de IL-15 con actividad agonista.
Las quimiocinas, similares a las citocinas, se definen como cualquier factor o molécula químico que cuando se expone a otras células son responsables de cualquiera de varios efectos múltiples de inmunidad celular. Las quimiocinas adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, las familias de quimiocinas CXC, CC, C y CX3C y a CCL-1 a CCL-28, CXC-1 a CXC-17, XCL-1, XCL-2, CX3CL1, MIP-1 b, IL-8, MCP-1 y Rantes.
Los factores de crecimiento incluyen cualquier molécula que cuando se expone a una célula particular, induce la proliferación y/o diferenciación de la célula afectada. Los factores de crecimiento incluyen proteínas y moléculas químicas, algunos de los cuales incluyen: GM-CSF, G-CSF, factor de crecimiento humano y factor de crecimiento de células madre. Los factores de crecimiento adicionales también pueden ser adecuados para su uso descrito en el presente documento.
Las toxinas o agentes citotóxicos incluyen cualquier sustancia que tenga un efecto letal o un efecto inhibidor sobre el crecimiento cuando se exponga a células. Más específicamente, la molécula efectora puede ser una toxina de célula de, por ejemplo, origen vegetal o bacteriano, tal como, por ejemplo, toxina diftérica (DT), toxina shiga, abrina, toxina del cólera, ricina, saporina, exotoxina de pseudomonas (PE), proteína antivírica de hierba carmín o gelonina. Los fragmentos biológicamente activos de dichas toxinas se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, la cadena A de DT y la cadena A de ricina. Además, la toxina puede ser un agente activo en la superficie celular, tal como, por ejemplo, enzimas de fosfolipasa (por ejemplo, fosfolipasa C).
Además, la molécula efectora puede ser un fármaco quimioterapéutico tal como, por ejemplo, vindesina, vincristina, vinblastina, metotrexato, adriamicina, bleomicina o cisplatino.
Además, la molécula efectora puede ser una molécula detectablemente marcada adecuada para estudios de diagnóstico o de obtención de imágenes. Dichas marcas incluyen biotina o estreptavidina/avidina, una nanopartícula o cristal detectable, una enzima o fragmento catalíticamente activo de la misma, una marca fluorescente, tal como proteína verde fluorescente, FITC, ficoeritrina, cychome, rojo Texas o puntos cuánticos; un radionúclido, por ejemplo, yodo-131, itrio-90, renio-188 o bismuto-212; moléculas fosforescentes o quimioluminiscentes o una marca detectable por PET, ultrasonidos o IRM, tal como contrastes de Gd o basados en iones metálicos paramagnéticos. Véanse, por ejemplo, Moskaug, et al. J. Biol. Chem. 264, 15709 (1989); Pastan, I. et al. Cell 47, 641, 1986; Pastan et al., Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem. 61,331, (1992); "Chimeric Toxins" Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 25, 355 (1982); solicitud PCT publicada N.° WO 94/29350; solicitud PCT publicada WO 94/04689; solicitud PCT publicada WO2005046449 y patente de EE. UU. N° 5.620.939 para divulgación referente a la preparación y el uso de proteínas que comprenden efectores o marcas.
Una fusión de proteína o complejo conjugado que incluye dominios de IL-15 y IL-15Ra covalentemente unidos tiene varios usos importantes. Las células o tejido susceptible a ser dañado o destruido pueden ser fácilmente ensayado por los métodos desvelados en el presente documento.
Los polipéptidos IL-15 y IL-15Ra de la invención corresponden adecuadamente en secuencia de aminoácidos a moléculas de IL-15 y IL-15Ra que existen de forma natural, por ejemplo, moléculas de IL-15 y IL-15Ra de un humano, ratón u otro roedor, u otro mamífero. Las secuencias de estos polipéptidos y ácidos nucleicos codificantes se conocen en la bibliografía, que incluyen ARNm de interleucina 15 humana (IL15) -- GenBank: U14407.1, ARNm de interleucina 15 (IL15) de Mus musculus -- GenBank: U14332.1, ARNm del precursor de cadena alfa del receptor de interleucina-15 humana (IL15RA) -- GenBank: U31628.1, receptor de interleucina 15 de Mus musculus, cadena alfa -- GenBank: BC095982.1.
En algunos escenarios, puede ser útil hacer polivalente la fusión de proteína o complejos conjugados de la presente invención, por ejemplo, para aumentar la valencia de sc-TCR o sc-anticuerpo. En particular, las interacciones entre los dominios de IL-15 y IL-15Ra del complejo de proteínas de fusión proporcionan un medio de generación de complejos polivalentes. Además, la proteína de fusión polivalente se puede hacer uniendo covalente o no covalentemente entre una y cuatro proteínas (la misma o diferentes) usando, por ejemplo, técnicas de marcado de biotina-estreptavidina habituales, o por conjugación con soportes sólidos adecuados, tales como perlas de látex. Las especies polivalentes también son proteínas químicamente reticuladas adecuadas (por ejemplo, reticuladas con nanopartículas). Por ejemplo, la proteína se puede modificar incluyendo secuencias que codifican secuencias de marcas que se pueden modificar, tal como la marca de biotinilación BirA o restos de aminoácidos con cadenas laterales químicamente reactivas, tales como Cys o His. Dichas marcas de aminoácidos o aminoácidos químicamente reactivos pueden estar situadas en una variedad de posiciones en la proteína de fusión o anticuerpo, preferentemente distal al sitio activo del polipéptido biológicamente activo o molécula efectora. Por ejemplo, el extremo C de una proteína de fusión soluble puede estar unido covalentemente a una marca u otra proteína fusionada que incluye dicho(s) aminoácido(s) reactivo(s). Se pueden incluir cadenas laterales para unir químicamente dos o más proteínas de fusión con una nanopartícula adecuada para dar una molécula multivalente. Las nanopartículas a modo de ejemplo incluyen dendrímeros, liposomas, partículas de núcleo-envoltura o partículas basadas en PLGA.
En otra realización de la invención, uno o ambos de los polipéptidos del complejo de proteínas de fusión comprende un dominio de inmunoglobulina. Alternativamente, la proteína de fusión del dominio de unión a proteína-IL-15 se puede unir además a un dominio de inmunoglobulina. Los dominios de inmunoglobulina preferidos comprenden regiones que permiten la interacción con otros dominios de inmunoglobulina para formar proteínas multicatenarias como se proporciona anteriormente. Por ejemplo, la cadena pesada de las regiones de inmunoglobulina, tales como Ch2-Ch3 de IgG1, son capaces de interactuar establemente para crear la región Fc. Los dominios de inmunoglobulina preferidos, que incluyen los dominios Fc, también comprenden regiones con funciones efectoras, que incluyen la actividad de unión al receptor de Fc o a la proteína del complemento, y/o con sitios de glucosilación. En algunas realizaciones, los dominios de inmunoglobulina del complejo de proteínas de fusión contienen mutaciones que reducen o aumentan la actividad de unión al receptor de Fc o del complemento o glucosilación, por lo que se afecta la actividad biológica de la proteína resultante. Por ejemplo, los dominios de inmunoglobulina que contienen mutaciones que reducen la unión de los receptores de Fc se podrían usar para generar el complejo de proteínas de fusión de la invención con menor actividad de unión con las células portadoras del receptor de Fc, que puede ser ventajoso para reactivos diseñados para reconocer o detectar antígenos específicos.
Ácidos nucleicos y vectores
La invención proporciona además secuencias de ácidos nucleicos, y particularmente secuencias de ADN que codifican las presentes proteínas (por ejemplo, componentes de ALT-803). Preferentemente, la secuencia de ADN es llevada por un vector apto para la replicación extracromosómica, tal como un fago, virus, plásmido, fagémido, cósmido, YAC o episoma. En particular, se puede usar un vector de ADN que codifica una proteína de fusión deseada para facilitar los métodos preparativos descritos en el presente documento y para obtener cantidades significativas de la proteína de fusión. La secuencia de ADN se puede insertar en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante de proteínas insertada. Se puede utilizar una variedad de sistemas de hospedador-vector para expresar la secuencia codificante de proteína. Éstos incluyen sistemas de células de mamífero infectadas con virus (por ejemplo, virus de la variolovacuna, adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos, tales como levadura que contiene vectores de levadura, o bacterias transformadas con ADN de bacteriófago, ADN de plásmido o ADN de cósmido. Dependiendo del sistema de hospedador-vector utilizado, se puede usar uno cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados. Véase, Sambrook et al., arriba, y Ausubel et al., arriba.
En la invención se incluyen métodos de preparación de un complejo de proteínas de fusión soluble, comprendiendo el método introducir en una célula hospedadora un vector de ADN como se describe en el presente documento que codifica la primera y segunda proteínas de fusión, cultivar la célula hospedadora en medio en condiciones suficientes para expresar las proteínas de fusión en la célula o el medio, y permitir la asociación entre el dominio de IL-15 de una primera proteína de fusión y el dominio de IL-15Ra soluble de una segunda proteína de fusión para formar el complejo de proteínas de fusión soluble, purificar el complejo de proteínas de fusión soluble de las células hospedadoras o medio.
En general, un vector de ADN preferido según la invención comprende una secuencia de nucleótidos unida por enlaces fosfodiéster que comprende, en una dirección 5' a 3', un primer sitio de clonación para la introducción de una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido biológicamente activo, unida operativamente a una secuencia que codifica una molécula efectora.
Los componentes de la proteína de fusión codificados por el vector de ADN se pueden proporcionar en un formato de casete. Por el término "casete" se indica que cada componente puede ser fácilmente sustituido por otro componente por métodos recombinantes habituales. En particular, un vector de ADN configurado en un formato de casete es particularmente deseable cuando el complejo de fusión codificado se va a usar contra patógenos que pueden tener o tienen la capacidad de desarrollar serotipos.
Para preparar el vector que codifica un complejo de proteínas de fusión, la secuencia que codifica el polipéptido biológicamente activo se une a una secuencia que codifica el péptido efector mediante el uso de ligasas adecuadas. El ADN que codifica el presente péptido se puede obtener aislando ADN de fuentes naturales, tales como de una estirpe celular adecuada o por métodos de síntesis conocidos, por ejemplo, el método de triéster de fosfato. Véase, por ejemplo, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M. J. Gait, ed., 1984). Los oligonucleótidos sintéticos también se pueden preparar usando un sintetizador de oligonucleótidos automático comercialmente disponible. Una vez aislado, el gen que codifica el polipéptido biológicamente activo se puede amplificar por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otro medio conocido en la técnica. Los cebadores de PCR adecuados para amplificar el gen de polipéptido biológicamente activo pueden añadir sitios de restricción al producto de PCR. El producto de PCR incluye preferentemente sitios de corte y empalme para el péptido efector y secuencias conductoras necesarias para la apropiada expresión y secreción del complejo de fusión de polipéptido biológicamente activo - efector. El producto de PCR también incluye preferentemente una secuencia que codifica la secuencia conectora, o un sitio de enzima de restricción para la unión de dicha secuencia.
Las proteínas de fusión descritas en el presente documento se producen preferentemente por técnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, una vez se aísla una molécula de ADN que codifica el polipéptido biológicamente activo, la secuencia se puede unir con otra molécula de ADN que codifica el polipéptido efector. La secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido biológicamente activo se puede unir directamente con una secuencia de ADN que codifica el péptido efector o, más normalmente, una secuencia de ADN que codifica la secuencia conectora como se trata en el presente documento se puede intercalar entre la secuencia que codifica el polipéptido biológicamente activo y la secuencia que codifica el péptido efector y unir usando ligasas adecuadas. La molécula de ADN híbrida resultante se puede expresar en una célula hospedadora adecuada para producir el complejo de proteínas de fusión. Las moléculas de ADN se unen entre sí en una orientación 5' a 3' de forma que, después de la unión, no se altere el marco traduccional de los polipéptidos codificados (es decir, las moléculas de ADN se unen entre sí dentro del marco de lectura). Las moléculas de ADN resultantes codifican una proteína de fusión dentro del marco de lectura.
También se pueden incluir otras secuencias de nucleótidos en la construcción del gen. Por ejemplo, una secuencia promotora, que controla la expresión de la secuencia que codifica el polipéptido biológicamente activo fusionado con el péptido efector, o una secuencia conductora, que dirige la proteína de fusión hacia la superficie celular o el medio de cultivo, se puede incluir en la construcción o puede estar presente en el vector de expresión en el que se inserta la construcción. Se prefiere particularmente una inmunoglobulina o promotor del CMV.
En la obtención de un polipéptido de variante biológicamente activo, las secuencias codificantes de IL-15, IL-15Ra o del dominio Fc, los expertos habituales en la técnica reconocerán que los polipéptidos se pueden modificar por ciertas sustituciones, adiciones, deleciones de aminoácidos, y modificaciones postraduccionales, sin pérdida ni reducción de la actividad biológica. En particular, es bien conocido que es poco probable que las sustituciones de aminoácidos conservativas, es decir, sustitución de un aminoácido por otro aminoácido de tamaño, carga, polaridad y conformación similar, alteren significativamente la función de la proteína. Los 20 aminoácidos habituales que son los constituyentes de las proteínas pueden ser ampliamente clasificados en cuatro grupos de aminoácidos conservativos del siguiente modo: el grupo no polar (hidrófobo) incluye alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano y valina; el grupo polar (sin carga, neutro) incluye asparagina, cisteína, glutamina, glicina, serina, treonina y tirosina; el grupo positivamente cargado (básico) contiene arginina, histidina y lisina; y el grupo negativamente cargado (ácido) contiene ácido aspártico y ácido glutámico. Es poco probable que la sustitución en una proteína de un aminoácido por otro dentro del mismo grupo tenga un efecto adverso sobre la actividad biológica de la proteína. En otro caso, se pueden hacer modificaciones en las posiciones de aminoácidos para reducir o potenciar la actividad biológica de la proteína. Dichos cambios se pueden introducir aleatoriamente o por mutaciones específicas del sitio en propiedades estructurales o funcionales conocidas o supuestas de resto(s) dirigido(s). Después de la expresión de la proteína de variante, los cambios en la actividad biológica debido a la modificación pueden ser fácilmente evaluados usando ensayos de unión o funcionales.
La homología entre secuencias de nucleótidos se puede determinar por análisis de hibridación de ADN, en donde la estabilidad del híbrido de ADN bicatenario depende del grado de apareamiento de bases que ocurre. Las condiciones de alta temperatura y/o bajo contenido de sal reducen la estabilidad del híbrido, y se pueden variar para prevenir la hibridación de secuencias que tienen menos de un grado de homología seleccionado. Por ejemplo, para secuencias con aproximadamente 55 % de contenido de G-C, las condiciones de hibridación y de lavado de 40-50 °C, 6 x SSC (tampón cloruro sódico/citrato de sodio) y 0,1 % de SDS (dodecilsulfato de sodio) indican aproximadamente 60-70 % de homología, las condiciones de hibridación y de lavado de 50-65 °C, 1 x SSC y 0,1 % de SDS indican aproximadamente 82-97 % de homología, y las condiciones de hibridación y de lavado de 52 °C, 0,1 x SSC y 0,1 % de SDS indican aproximadamente 99-100 % de homología. También está disponible una amplia variedad de programas informáticos para comparar secuencias de nucleótidos y de aminoácidos (y la medición del grado de homología), y una lista que proporciona fuentes de software tanto comercialmente disponible como libre se encuentra en Ausubel et al. (1999). Los algoritmos de comparación de secuencias y de alineamiento de múltiples secuencias fácilmente disponibles son, respectivamente, los programas Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1997) y ClustalW. BLAST está disponible en la malla mundial en ncbi.nlm.nih.gov y una versión de ClustalW está disponible en 2.ebi.ac.uk.
Los componentes de la proteína de fusión pueden estar organizados en casi cualquier orden, siempre que cada uno sea capaz de realizar su función prevista. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido biológicamente activo está situado en el extremo carboxiterminal o aminoterminal de la molécula efectora.
Las moléculas efectoras preferidas de la invención tendrán tamaños propicios para la función para la que están previstos los dominios. Las moléculas efectoras de la invención se pueden preparar y fusionar con el polipéptido biológicamente activo mediante una variedad de métodos que incluyen métodos de reticulación química bien conocidos. Véanse, por ejemplo, Means, G. E. y Feeney, R. E. (1974) en Chemical Modification of Proteins, Holden-Day. Véase también S. S. Wong (1991) en Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press. Sin embargo, en general, se prefiere usar manipulaciones recombinantes para preparar la proteína de fusión dentro del marco de lectura.
Como se observa, una molécula de fusión o una molécula de conjugado según la invención puede ser organizada de varias formas. En una configuración a modo de ejemplo, el extremo C del polipéptido biológicamente activo está operativamente unido al extremo N de la molécula efectora. Ese enlace se puede lograr por métodos recombinantes, si se desea. Sin embargo, en otra configuración, el extremo N del polipéptido biológicamente activo se une al extremo C de la molécula efectora.
Alternativamente, o además, una o más moléculas efectoras adicionales se puede insertar en el polipéptido biológicamente activo o complejos conjugados, en caso de necesidad.
Vectores y expresión
Se pueden emplear varias estrategias para expresar ALT-803. Por ejemplo, una construcción que codifica ALT-803 se puede incorporar en un vector adecuado usando enzimas de restricción para hacer cortes en el vector para la inserción de la construcción, seguido por unión. El vector que contiene la construcción de gen se introduce luego en un hospedador adecuado para la expresión de la proteína de fusión. Véase, en general, Sambrook et al., arriba. La selección de vectores adecuados se puede hacer empíricamente basándose en factores relacionados con el protocolo de clonación. Por ejemplo, el vector debe ser compatible con, y tener el replicón apropiado para el hospedador que se emplea. El vector debe ser capaz de acomodar la secuencia de ADN que codifica el complejo de proteínas de fusión que se va a expresar. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células eucariotas y procariotas, preferentemente las células que pueden ser fácilmente transformadas y presentan un rápido crecimiento en medio de cultivo. En concreto, las células hospedadoras preferidas incluyen procariotas, tales como E. coli, Bacillus subtillus, etc., y eucariotas, tales como células de animales y cepas de levadura, por ejemplo, S. cerevisiae. Las células de mamífero son generalmente preferidas, particularmente J558, NSO, SP2-O o CHO. Otros hospedadores adecuados incluyen, por ejemplo, células de insecto, tales como Sf9. Se emplean condiciones de cultivo convencionales. Véase Sambrook, arriba. Entonces se pueden seleccionar estirpes celulares transformadas o transfectadas estables. Las células que expresan un complejo de proteínas de fusión de la invención se pueden determinar por procedimientos conocidos. Por ejemplo, la expresión de un complejo de proteínas de fusión unido a una inmunoglobulina se puede determinar por un ELISA específico para la inmunoglobulina unida y/o por inmunotransferencia. Otros métodos de detección de la expresión de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos biológicamente activos unidos a dominios de IL-15 o IL-15Ra se desvelan en los ejemplos.
Como se mencionó, en general, anteriormente, se puede usar una célula hospedadora para fines preparativos para propagar ácido nucleico que codifica una proteína de fusión deseada. Por lo tanto, una célula hospedadora puede incluir una célula procariota o eucariota en la que se pretende específicamente la producción de la proteína de fusión. Por lo tanto, las células hospedadoras incluyen específicamente células de levadura, mosca, gusano, planta, rana, mamífero y órganos que son capaces de propagar el ácido nucleico que codifica la fusión. Los ejemplos no limitantes de estirpes celulares de mamífero que se pueden usar incluyen células CHO dhfr (Urlaub y Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), células 293 (Graham et al., J Gen. Virol., 36:59 (1977)) o células de mieloma, como SP2 o NSO (Galfre y Milstein, Meth. Enzymol., 73(B):3 (1981)).
Las células hospedadoras capaces de propagar el ácido nucleico que codifica un complejo de proteínas de fusión deseada también engloban células eucariotas no de mamífero, que incluyen células de insecto (por ejemplo, Sp. frugiperda), levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris., K. lactis, H. polymorpha; como se revisa, en general, por Fleer, R., Current Opinion in Biotechnology, 3(5):486496 (1992)), células fúngicas y vegetales. También se contemplan ciertos procariotas, tales como E. coli y Bacillus.
El ácido nucleico que codifica una proteína de fusión deseada se puede introducir en una célula hospedadora por técnicas convencionales para transfectar las células. El término ''transfectar'' o "transfección" pretende englobar todas las técnicas convencionales para introducir el ácido nucleico en células hospedadoras, que incluyen coprecipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, electroporación, microinyección, transducción y/o integración vírica. Los métodos adecuados para transfectar células hospedadoras se pueden encontrar en Sambrook et al., arriba, y otros manuales de laboratorio.
Se pueden usar diversos promotores (región reguladora de la iniciación de la transcripción) según la invención. La selección del promotor apropiado depende del hospedador de expresión propuesto. Se pueden usar promotores de fuentes heterólogas, en tanto que sean funcionales en el hospedador elegido.
La selección de promotores también depende de la eficiencia deseada y del nivel de producción de péptidos o proteínas. Los promotores inducibles, tales como tac, se emplean frecuentemente para aumentar espectacularmente el nivel de expresión de proteínas en E. coli. La expresión en exceso de proteínas puede ser perjudicial para las células hospedadoras. Por consiguiente, se puede limitar el crecimiento de células hospedadoras. El uso de sistemas de promotores inducibles permite a las células hospedadoras cultivar hasta densidades aceptables antes de la inducción de la expresión génica, lo que facilita así mayores rendimientos de producto.
Se pueden usar según la invención diversas secuencias señal. Se puede usar una secuencia señal que es homóloga a la secuencia codificante del polipéptido biológicamente activo. Alternativamente, también se puede usar una secuencia señal que se ha seleccionado o diseñado para la eficiente secreción y procesamiento en el hospedador de expresión. Por ejemplo, pares adecuados de secuencia señal/célula hospedadora incluyen la secuencia señal sacB de B. subtilis para la secreción en B. subtilis, y el factor de apareamiento a de Saccharomyces cerevisiae o secuencias señal phoI de fosfatasa ácida de P. pastoris para la secreción de P. pastoris. La secuencia señal se puede unir directamente mediante la secuencia que codifica el sitio de escisión de la peptidasa señal con la secuencia codificante de proteína, o mediante un puente de nucleótidos corto que consiste normalmente en menos de diez codones, donde el puente garantiza el marco de lectura correcto de la secuencia de proteínas en la dirección 3'.
Se han identificado elementos para potenciar la transcripción y traducción para sistemas de expresión de proteínas eucariotas. Por ejemplo, la localización del promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 1000 pb en cualquier lado de un promotor heterólogo puede elevar los niveles transcripcionales de 10 a 400 veces en células vegetales. La construcción de expresión debe también incluir las secuencias de iniciación de la traducción apropiadas. La modificación de la construcción de expresión para incluir una secuencia consenso de Kozak para la apropiada iniciación traduccional puede aumentar el nivel de traducción en 10 veces.
Se emplea frecuentemente un marcador selectivo, que puede ser parte de la construcción de expresión o estar separado de ella (por ejemplo, llevado por el vector de expresión), de manera que el marcador pueda integrarse en un sitio diferente del gen de interés. Los ejemplos incluyen marcadores que confieren resistencia a antibióticos (por ejemplo, bla confiere resistencia a ampicilina para células hospedadoras de E. coli, nptII confiere resistencia a kanamicina a una amplia variedad de células procariotas y eucariotas), o que permite al hospedador crecer en medio mínimo (por ejemplo, HIS4 permite a P. pastoris o His- a S. cerevisiae crecer en ausencia de histidina). El marcador de selección tiene sus propias regiones reguladoras de la iniciación y de la terminación de la transcripción y la traducción para permitir la expresión independiente del marcador. Si se emplea resistencia a antibióticos como marcador, la concentración del antibiótico para la selección variará dependiendo del antibiótico, oscilando, en general, desde 10 hasta 600 pg del antibiótico/ml de medio.
La construcción de expresión se ensambla empleando técnicas conocidas de ADN recombinante (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999). La digestión y la unión con enzima de restricción son las etapas básicas empleadas para unir dos fragmentos de ADN. Los extremos del fragmento de ADN pueden requerir modificación antes de la unión, y esto se puede llevar a cabo rellenando extremos protuberantes, delecionando porciones terminales del (de los) fragmento(s) con nucleasas (por ejemplo, ExolII), mutagénesis dirigida al sitio, o añadiendo nuevos pares de bases por PCR. Se pueden emplear policonectores y adaptadores para facilitar la unión de fragmentos seleccionados. La construcción de expresión se ensambla normalmente en etapas que emplean rondas de restricción, unión y transformación de E. coli. Se conocen en la técnica numerosos vectores de clonación adecuados para la construcción de la construcción de expresión (AZAP y pBLUESCRIPT SK-1, Stratagene, La Jolla, CA, pET, Novagen Inc., Madison, WI, citado en Ausubel et al., 1999) y la elección particular no es crítica para la invención. La selección del vector de clonación se influirá por el sistema de transferencia de genes seleccionado para la introducción de la construcción de expresión en la célula hospedadora. Al final de cada etapa, la construcción resultante se puede analizar por restricción, secuencia de ADN, hibridación y análisis de PCR.
La construcción de expresión se puede transformar en el hospedador como la construcción del vector de clonación, ya sea lineal o circular, o se puede retirar del vector de clonación y usar tal cual o introducir en un vector de administración. El vector de administración facilita la introducción y el mantenimiento de la construcción de expresión en el tipo seleccionado de célula hospedadora. La construcción de expresión se introduce en las células hospedadoras por cualquiera de varios sistemas de transferencia génica conocidos (por ejemplo, competencia natural, transformación químicamente mediada, transformación de protoplastos, electroporación, transformación biolística, transfección o conjugación) (Ausubel et al., 1999; Sambrook et al., 1989). El sistema de transferencia génica seleccionado depende de las células hospedadoras y los sistemas de vector usados.
Por ejemplo, la construcción de expresión se puede introducir en células de S. cerevisiae por transformación o electroporación de protoplastos. La electroporación de S. cerevisiae se realiza fácilmente, y da eficiencias de transformación comparables a la transformación de esferoplastos.
La presente invención proporciona además un proceso de producción para aislar una proteína de fusión de interés. En el proceso, una célula hospedadora (por ejemplo, una levadura, hongo, insecto, célula bacteriana o de animal), en la que se ha introducido un ácido nucleico que codifica la proteína del interés operativamente unida a una secuencia reguladora, se cultiva a escala de producción en un medio de cultivo para estimular la transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de interés. Posteriormente, la proteína de fusión de interés se aísla de células hospedadoras recogidas o del medio de cultivo. Se pueden usar técnicas de purificación de proteínas habituales para aislar la proteína de interés del medio o de las células recogidas. En particular, las técnicas de purificación se pueden usar para expresar y purificar una proteína de fusión deseada a gran escala (es decir, en al menos cantidades de miligramo) de una variedad de implementaciones que incluyen botellas rotatorias, matraces de agitación, placas de cultivo de tejido, biorreactor, o un fermentador.
Un complejo de proteínas de fusión expresado se puede aislar y purificar por métodos conocidos. Normalmente, el medio de cultivo se centrifuga o filtra y luego el sobrenadante se purifica por afinidad o cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo, cromatografía de afinidad en proteína A o proteína G, o un protocolo de inmunoafinidad que comprende el uso de anticuerpos monoclonales que se unen al complejo de fusión expresado. Las proteínas de fusión de la presente invención se pueden separar y purificar por la combinación apropiada de técnicas conocidas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, métodos que utilizan solubilidad, tales como precipitación de sales y precipitación de disolventes, métodos que utilizan la diferencia en el peso molecular, tales como diálisis, ultrafiltración, filtración en gel y electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, métodos que utilizan una diferencia en la carga eléctrica, tales como la cromatografía en columna de intercambio iónico, métodos que utilizan afinidad específica, tal como cromatografía de afinidad, métodos que utilizan una diferencia en la hidrofobia, tales como cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa, y métodos que utilizan una diferencia en el punto isoeléctrico, tales como electroforesis por isoelectroenfoque, columnas de afinidad por metal, tal como Ni-NTA. Véase, en general, Sambrook et al. y Ausubel et al., arriba, para la divulgación referente a estos métodos.
Se prefiere que las proteínas de fusión de la presente invención sean sustancialmente puras. Es decir, las proteínas de fusión hayan sido aisladas de sustituyentes celulares que las acompañan de forma natural de manera que las proteínas de fusión estén presentes preferentemente en al menos 80 % o 90 % al 95 % de homogeneidad (p/p). Las proteínas de fusión que tienen al menos 98 al 99 % de homogeneidad (p/p) son las más preferidas para muchas aplicaciones farmacéuticas, clínicas y de investigación. Una vez sustancialmente purificada, la proteína de fusión debe estar sustancialmente libre de contaminantes para aplicaciones terapéuticas. Una vez parcialmente purificadas o hasta pureza sustancial, las proteínas de fusión solubles se pueden usar terapéuticamente, o en la realización de ensayos in vitro o in vivo como se desvela en el presente documento. La pureza sustancial se puede determinar por una variedad de técnicas convencionales, tales como cromatografía y electroforesis en gel.
Los presentes complejos de proteína de fusión son adecuados para su uso in vitro o in vivo con una variedad de células que son cancerosas o están infectadas o que pueden llegar a infectarse por una o más enfermedades.
La interleucina-15 humana (hIL-15) se presenta en trans a células efectoras inmunitarias por la cadena de receptor a de IL-15 (hIL-15Ra) humana expresada en células presentadoras de antígenos. IL-15Ra se une a hIL-15 con alta afinidad (38 pM), principalmente mediante el dominio sushi extracelular (IL-15RaSu). Como se describe en el presente documento, los dominios de IL-15 y IL-15RaSu se pueden usar para generar un complejo soluble (por ejemplo, ALT-803) o como un armazón para construir complejos de fusión de múltiples dominios.
Los dominios de IgG, particularmente el fragmento Fc, se han usado satisfactoriamente como armazones diméricos para varias moléculas terapéuticas que incluyen fármacos biológicos autorizados. Por ejemplo, etanercept es un dímero del receptor del factor de necrosis tumoral-a p75 (TNF-a) soluble (sTNFR) humano unido al dominio Fc de IgG 1 humana. Esta dimerización permite al etanercept ser hasta 1.000 veces más potente en inhibir la actividad de TNF-a que sTNFR monomérico y proporciona la fusión con una semivida en suero cinco veces mayor que la forma monomérica. Como resultado, etanercept es eficaz en la neutralización de la actividad proinflamatoria de TNF-a in vivo y mejora los resultados de los pacientes para varias indicaciones autoinmunitarias diferentes.
Además de su actividad de dimerización, el fragmento Fc también proporciona funciones efectoras citotóxicas mediante la activación del complemento y la interacción con receptores de Fcy presentados en linfocitos citolíticos espontáneos (NK), neutrófilos, células de monocitos, fagocitos y células dendríticas. En el contexto de los anticuerpos terapéuticos contra el cáncer y otras proteínas de fusión de dominio de anticuerpo-Fc, estas actividades desempeñan probablemente una función importante en la eficacia observada en modelos de tumor animal y en pacientes con cáncer. Sin embargo, estas respuestas efectoras citotóxicas pueden no ser suficientes en varias aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, ha habido un interés considerable en mejorar y expandir la actividad efectora del dominio Fc y desarrollar otros medios para aumentar la actividad o el reclutamiento de respuestas inmunitarias citolíticas, que incluyen linfocitos NK y linfocitos T en el sitio de enfermedad por moléculas inmunoterapéuticas.
En un esfuerzo por desarrollar un terapéutico inmunoestimulante derivado de humano, se usaron dominios de receptor de IL-15 humana (hIL-15) y de IL-15. La hIL-15 es un miembro de la familia de citocinas de haz de cuatro hélices a pequeñas que se asocia con la cadena a del receptor de hIL-15 (hIL-15Ra) con una alta afinidad de unión (constante de disociación en equilibrio (KD) ~10-11 M). El complejo resultante se presenta luego en trans a los complejos de receptor p de IL-2/15 humana/cadena y común (hIL-15RpYC) presentados sobre la superficie de linfocitos T y linfocitos NK. Esta interacción de citocina/receptor da como resultado la expansión y la activación de linfocitos T efectores y linfocitos NK, que desempeñan una función importante en erradicar células víricamente infectadas y malignas. Normalmente, hIL-15 y hIL-15Ra se coproducen en células dendríticas para formar complejos intracelularmente que son posteriormente secretados y presentados como moléculas heterodiméricas sobre superficies celulares. Por lo tanto, las características de las interacciones hIL-15 y hIL-15Ra sugieren que estos dominios de unión intercatenarios podrían servir de un complejo inmunoestimulante derivado de humano y como armazón para preparar moléculas diméricas solubles capaces de la unión específica de diana.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están perfectamente dentro del alcance del experto. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía, tales como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller y Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Estas técnicas son aplicables a la producción de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención y, como tales, se pueden considerar en la preparación y la práctica de la invención. Las técnicas particularmente útiles para las realizaciones particulares serán tratadas en las secciones que siguen.
Los siguientes ejemplos se exponen de manera que se proporcione a los expertos habituales en la técnica una divulgación completa y descripción de cómo preparar y hacer uso de los métodos de ensayo, cribado y terapéuticos de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención.
Ejemplo 1: Inducción de la proliferación y activación de linfocitos por ALT-803
Se usaron capas leucocíticas de sangre humana de individuos normales para aislar células mononucleares de sangre periférica (CMSP) con Histopaque-1077. Las CMSP se cultivaron a 37 °C con 5 % de CO2 en medio RPMI-10 (RPMI-1640, 2-mercaptoetanol, penicilina-estreptomicina-glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio y 10 % de suero bovino fetal) con las diversas cantidades de ALT-803. Por "ALT-803" se indica un complejo que comprende IL-15N72D no covalentemente asociado a una proteína de fusión dimérica IL-15RaSu/Fc, en donde dicho complejo presenta actividad inmunoestimulante. Opcionalmente, la proteína de fusión IL-15N72D y/o IL-15RaSu/Fc comprende una, dos, tres, cuatro o más variaciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia. A continuación, se proporciona una secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de IL-15N72D (véase, por ejemplo, documento de patente N.° de serie US 13/769.179).
A continuación, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos de IL-15N72D a modo de ejemplo (con péptido conductor) (SEQ ID n O: 1):
(Péptido conductor)
atggagacagacacactcctgttatgggtactgctgctctgggttccaggttccaccggt-(IL-15N72D)
aactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttc
accccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgataca
gtagaaaatctgatcatcctagcaaacgacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggag
gaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttct
(Codón de terminación)
taa
A continuación, se proporciona una secuencia de aminoácidos de IL-15N72D a modo de ejemplo (con péptido conductor) (SEQ ID NO: 2):
(Péptido conductor)
METDTLLLWVLLLWVPGSTG-(IL-15N72D)
NW VN VISDLKKIEDLIQ SMHID ATL YTE SD VHP S CK VT AMKCFLLELQ VISLE S GD AS IHDT VENLIIL AND SL S SN GN VTE S GCKECEELEEKNIKEFLQ SF VHIV QMFINT S
En algunos casos, el péptido conductor se escinde del polipéptido IL-15N72D maduro (SEQ ID NO: 3):
(IL-15N72D)
NWVNVI SDLKKIEDLIQ SMHID ATL YTESD VHP SCKVT AMKCFLLELQ VISLESGD AS IHDT VENLIIL AND SL S SN GN VTE S GCKECEELEEKNIKEFLQ SF VHI V QMFINT S
A continuación, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos de IL-15RaSu/Fc a modo de ejemplo (con péptido conductor) (SEQ ID n O: 4):
(Péptido conductor)
atggacagacttacttcttcattcctgctcctgattgtccctgcgtacgtcttgtcc-(IL-15RaSu)
atcacgtgccctccccccatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaa
ctctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccc
cagtctcaaatgtattaga-(IgG1 CH2-CH3 (dominio Fc))
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccc
caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc
aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtg
tggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagccc
ccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgac
caagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccgg
agaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggt
ggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccggg
taaa-(Codón de terminación)
taa
A continuación, se proporciona una secuencia de aminoácidos de IL-15RaSu/Fc a modo de ejemplo (con péptido conductor) (SEQ ID NO: 5):
(Péptido conductor)
MDRLTSSFLLLIVPAYVLS-(IL-15RaSu)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWT TPSLKCIR-(IgG 1 CH2-CH3 (dominio Fc))
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK
En algunos casos, la proteína IL-15RaSu/Fc madura carece de la secuencia conductora (SEQ ID NO: 6):
(IL-15RaSu)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWT TPSLKCIR-(IgG 1 CH2-CH3 (dominio Fc))
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCYYVDYSHEDPEY KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK
Para evaluar la proliferación y la activación del subconjunto de linfocitos, células tratadas con ALT-803 se tiñeron con cualquiera de una combinación de anticuerpos Brilliant Violet 510-anti-CD4, PECY7-anti-CD8 y Brilliant Violet 421-anti-CD16 para marcadores superficiales, seguido por tinción intracelular con anticuerpo FITC-anti-granzima B o una combinación de anticuerpos Brilliant Violet-anti-CD4, PE-anti-CD8, PECY7-anti-CD335, PerCP-CY5.5-anti-CD69 y APC-anti-CD25 para marcadores superficiales, seguido por tinción intracelular con anticuerpo FITC-anti-perforina. Para la tinción intracelular, las células se fijaron con tampón de fijación (PBS con 2 % de paraformaldehído) y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las células fijadas se permeabilizaron en tampón de permeabilización (PBS con 0,1 % de saponina y 0,05 % de azida de sodio) y se tiñeron con anticuerpos marcados con FITC específicos de granzima B o perforina humana. El porcentaje de linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y linfocitos NK CD16+ en las CMSP activadas con ALT-803, y la expresión de los marcadores de activación CD25 y CD69 en linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y linfocitos NK CD335+, se analizaron en un citómetro de flujo FACSVerse usando el software FACSuite.
No hubo cambio significativo en el porcentaje de linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ o linfocitos NK en las CMSP humanas de diferentes donantes después de 5 días de incubación en medio que contenía ALT-803 0,01 a 10 nM en comparación con el control de medio (Figura 1A y Figura 1B). Puesto que estudios previos han mostrado que ALT-803 puede estimular respuestas proliferativas de CMSP humanas in vitro, se extendió el tiempo de incubación del cultivo para aumentar la sensibilidad de este ensayo. Como se muestra en la Figura 1C (Donante-A) y la Figura 1D (Donante-B), después de 7 días de cultivo en presencia de ALT-803 10 nM, disminuyó el porcentaje de linfocitos T CD4+ y aumentó el porcentaje de linfocitos T CD8+ en cultivos de CMSP cuando se comparó con lo observado en células incubadas en ausencia de ALT-803. Este hallazgo fue más evidente cuando se analizó la relación CD4/CD8 (Figura 1E: Donante-A y Figura 1F: Donante-B). No hubo diferencia significativa en el porcentaje de linfocitos NK en cultivos de CMSP incubadas hasta 10 días en presencia o ausencia de ALT-803 (Figura 1C y D).
Los efectos in vitro de ALT-803 se compararon con IL-15 en subconjuntos proliferativos de células inmunitarias humanas de diferentes donantes. La adición de cualquiera de ALT-803 0,5 nM o IL-15 0,5 nM a cultivos de CMSP humanas produjo un aumento de ~2 veces en las cifras de linfocitos después de un periodo de incubación de 7 días. ALT-803 fue tan potente como IL-15 en aumentar la cifra absoluta de subconjuntos de linfocitos T CD8+ y linfocitos NK (Figura 2A y Figura 2B). ALT-803 también aumentó significativamente las cifras absolutas de linfocitos T CD4+, mientras que IL-15 aumentó las cifras absolutas de linfocitos Treg.
Además, se examinó la expresión de marcadores de activación, CD25 y CD69, en los subconjuntos de células inmunitarias para entender los efectos inmunoestimulantes de ALT-803. Como se muestra en la Figura 3A-Figura 3D, el tratamiento in vitro con ALT-803 fue capaz de aumentar la expresión de CD25 por linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y linfocitos NK en un modo dependiente de la concentración. En particular, la regulación por incremento de CD25 por ALT-803 fue más significativa en linfocitos T CD4+ en comparación con lo observado en linfocitos T CD8+ o NK. La expresión de CD25 por linfocitos T CD8+ fue mínimamente inducida por ALT-803. A diferencia de CD25, la expresión de CD69 estuvo altamente regulada por incremento en linfocitos NK por incubación de ALT-803, mientras que se observaron pocos efectos del tratamiento o ninguno en la expresión de CD69 por linfocitos T CD4+.
Los estudios también se realizaron para evaluar si ALT-803 podría inducir linfocitos NK y linfocitos T CD8+ para expresar mayores niveles de granzima y perforina, que desempeñan una función clave en las respuestas citolíticas. Las CMSP humanas se activaron in vitro con ALT-803 como se ha descrito anteriormente y fue seguido por tinción con Ab para diferenciar subconjuntos de linfocitos T CD8+ y linfocitos NK y luego se tiñeron intracelularmente con anticuerpos marcados con FITC específicos para granzima B o perforina humana. Como se muestra en la Figura 4A-Figura 4D, ALT-803 fue capaz de regular por incremento la expresión de la granzima B y la perforina por linfocitos T CD8+ (Figura 4A y Figura 4C) y linfocitos NK (Figura 4B y Figura 4D) en un modo dependiente de la concentración. Además, la inducción mediada por ALT-803 de la expresión de granzima B en tanto linfocitos T CD8+ como linfocitos NK fue más significativa que los efectos mediados por ALT-803 sobre la expresión de perforina. Estos resultados están de acuerdo con la idea de que la expresión inducida por ALT-803 de la granzima B y/o perforina puede desempeñar una función en potenciar la citotoxicidad de las CMSP después de la incubación con ALT-803.
Se realizaron estudios adicionales para comparar los efectos de ALT-803 en células inmunitarias humanas y de ratón. Estudios previos han mostrado que los efectos inmunoestimulantes de las proteínas sobre las CMSP humanas podrían variar significativamente dependiendo de si la proteína está presente en una forma acuosa o inmovilizada. Por lo tanto, se realizaron ensayos de liberación y de proliferación de citocinas en células humanas y de ratón usando ALT-803 como proteína soluble o como proteína húmeda o secada al aire inmovilizada sobre plástico o preparada. ALT-803 se probó a 0,08, 0,8 y 44 nM, que corresponde a concentraciones máximas en suero en el ser humano de una dosis i.v. de 0,3, 3,0 y 170 pg/kg, respectivamente. Para ensayos de proliferación, las CMSP humanas y las células CD3+ de ratón enriquecidas de esplenocitos (columna de enriquecimiento de linfocitos T CD3+, R&D System) se marcaron con CellTrace™ Violet (Invitrogen) y se cultivaron en pocillos que contenían PBS o ALT-803. Como control positivo, se añadió 27 nM de Ab anti-CD3 (145-2C11 para esplenocitos de ratón y OKT3 para CMSP humanas) a pocillos separados en los mismos formatos de ensayo. Las células se incubaron durante 4 días y luego se analizaron por citometría de flujo para determinar la proliferación celular basándose en la dilución de colorante violeta. Además, se cultivaron células inmunitarias humanas y de ratón como se ha descrito anteriormente durante 24 y 48 h y las citocinas liberadas en los medios se midieron usando kits para citocinas de matrices de perlas citométricas Th1/Th2/Th17 humanas y de ratón según las instrucciones del fabricante (BD Biosciences). Para el subconjunto de células inmunitarias, se cultivaron CMSP humanas en diversas concentraciones de ALT-803 o IL-15 y se tiñeron con anticuerpos específicos para CD4, CD8, CD335, CD16 o CD19 o con un kit de Treg humanos (BioLegend). En algunos experimentos, también se tiñeron células con anticuerpos específicos para CD69, granzima B o perforina como se ha descrito anteriormente.
La incubación con ALT-803 inmovilizado durante un día o cuatro días (Figura 5A) produjo una elevada liberación de IFN-y por CMSP humanas. La IL-6 soluble también aumentó en cultivos de CMSP humanas de 4 días tratados con ALT-803, aunque este efecto no fue dependiente de la dosis (Figura 5A). A diferencia, ALT-803 no tuvo efecto sobre la liberación de TNF-a, IL-4, IL-10 o IL-17A por cultivos de CMSP humanas de 4 días. Cuando se probaron en cultivos paralelos, un mAb anti-CD3 de control positivo indujo la liberación de IFN-y , TNF-a, IL-10, IL-4 e IL-17A. En comparación con las células inmunitarias humanas, los esplenocitos de ratón presentaron una respuesta similar, pero menos intensa, para la liberación de IFN-y después de la incubación con ALT-803 (Figura 5B). ALT-803 también indujo la producción de TNF-a de esplenocitos de ratón, pero no mostró efecto significativo sobre los niveles de IL-6, IL-2, IL-10, IL-4 e IL-17A. En cambio, los linfocitos murinos incubados con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado mostraron una liberación significativamente elevada de todas las citocinas probadas. Juntos, estos hallazgos indican que ALT-803 estimula principalmente la producción de IFN-y por células inmunitarias humanas y de ratón, a diferencia del amplio perfil de citocinas inducidas por anticuerpos anti-CD3.
También se evaluó la capacidad de ALT-803 para inducir la proliferación in vitro de células inmunitarias humanas y de ratón marcadas con CellTrace™ Violet. La pronunciada proliferación de linfocitos de ratón fue evidente después de la incubación con ALT-803 soluble 0,7 nM a 44 nM (Figura 5C). Hasta el 83 % de las células en el grupo de dosis alta de ALT-803 soluble se sometió a de una a seis rondas de división celular durante el periodo de incubación de 4 días. Se detectó poca o ninguna proliferación en células murinas sin tratar o tratadas con ALT-803 soluble 0,07 nM. Como era de esperar, los linfocitos murinos incubados con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado presentaron fuertes respuestas proliferativas. La proliferación de linfocitos dependiente de la dosis de ALT-803 también se observó en cultivos de CMSP humanas, pero esta respuesta fue considerablemente inferior a la observada para células de ratón. En general, menos del 20 % de todos los linfocitos humanos proliferaron en respuesta a ALT-803 de alta dosis y estas respuestas fueron inferiores a las inducidas por el anticuerpo anti-CD3 de control positivo. Además, se observaron variaciones individuales en las respuestas de células proliferativas a tanto ALT-803 como al Ab anti-CD3 en los linfocitos de sangre de diferentes donantes.
Ejemplo 2: Inducción de citotoxicidad mediada por célula por ALT-803 y ALT-803 en combinación con anticuerpos
Para evaluar si ALT-803 afectó la citotoxicidad mediada por célula, se usaron CMSP humanas aisladas de capas leucocíticas de sangre como células efectoras. Se usaron células Daudi humanas de linfoma de linfocitos B y células K562 humanas de leucemia mielógena como células diana y se marcaron con CellTrace Violet a 5 pM en RPMI-10 a 37 °C durante 20 minutos como se describe por el fabricante. Las células efectoras se mezclaron con las células diana marcadas con violeta y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2 en RPMI-10 con y sin ALT-803 durante los tiempos indicados. En algunos experimentos, el Ab anti-CD20 (rituximab, 10 nM) específico para CD20 expresado sobre la superficie de células Daudi se añadió al cultivo de células efectoras:Daudi para determinar los efectos de ALT-803 sobre la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) mediada por el Ab anti-CD20. Las mezclas de células efectoras y células diana se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en RPMI-10 sin rojo de fenol con 2 pg/ml de yoduro de propidio. La citotoxicidad de las células efectoras frente a las células diana se evaluó por citometría de flujo determinando el porcentaje de células diana marcadas con violeta muertas después de la tinción positiva con yoduro de propidio.
Como se muestra en la Figura 6A-Figura 6D, CMSP humanas recientes tuvieron una débil citotoxicidad contra células Daudi y K562 en ausencia de ALT-803. A diferencia, las CMSP tuvieron citotoxicidad muy fuerte contra células diana Daudi y K562 de tumor en presencia de ALT-803 a 10 nM. Las células Daudi de tumor expresan moléculas de CD20, que pueden ser reconocidas por el Ab anti-CD20 (rituximab). Como se indica en el presente documento, CD20 es una diana establecida para el tratamiento terapéutico con anticuerpo de tumores hematológicos y enfermedades autoinmunitarias. Las CMSP humanas son capaces de lisar células Daudi por medio de ADCC mediada por rituximab solo (Figura 6C, control de medio). Es interesante señalar que ALT-803 también fue capaz de aumentar significativamente la actividad de ADCC mediada por rituximab de CMSP humanas contra células Daudi. Como se muestra en la Figura 6D, se observó un aumento dependiente del tiempo en los efectos mediados por ALT-803 sobre la citotoxicidad de CMSP y ADCC, con poca o ninguna respuesta observada después de un día de incubación con ALT-803 y elevada destrucción de células diana observada con cada día adicional de incubación.
Además, se investigó la inducción dependiente de la concentración de ALT-803 de la citotoxicidad de CMSP humanas contra células K562 y Daudi. Se mezclaron CMSP humanas nuevas con células K562 o células Daudi marcadas con CellTrace Violet en medio RPMI-10 con diversas concentraciones (desde 0,01 nM hasta 10 nM) de ALT-803, seguido por incubación durante 3 días. La citotoxicidad de las CMSP humanas contra las células diana se evaluó por citometría de flujo como se ha descrito anteriormente. De acuerdo con los resultados en la Figura 6A-Figura 6D, ALT-803 fue capaz de aumentar la citotoxicidad de CMSP humanas contra células Daudi y K562 a 10 nM (Figura 7A y Figura 7B: Donante-A y Donante-B). Además, ALT-803 a tan solo 0,01 nM también mostró elevada citotoxicidad de CMSP humanas contra las células diana. Las CMSP de dos individuos presentaron actividades citotóxicas significativamente diferentes contra las diferentes células diana tumorales. Las CMSP del Donante-A (Figura 7A) presentaron citotoxicidad basal e inducida por ALT-803 mucho más alta contra células K562 que las células Daudi. A diferencia, las CMSP del Donante-B (Figura 7B) presentaron citotoxicidad basal e inducida por ALT-803 similar contra las dos células diana diferentes. Este resultado puede ser importante en el entendimiento de la posible variabilidad de las respuestas clínicas mediadas por ALT-803 en diferentes pacientes. Se incorporan ensayos de citotoxicidad similares como una evaluación corolaria de las respuestas inmunitarias de los pacientes a ALT-803 como parte del uso clínico de esta molécula.
También se evaluaron adicionalmente los efectos dependientes de la concentración de ALT-803 sobre la ADCC específica de tumor. Como se muestra en la Figura 8A-Figura 8B, ALT-803 a concentraciones de tan solo 0,01 nM fueron capaces de aumentar la actividad de ADCC del mAb anti-CD20 (10 nM) contra células Daudi humanas de linfoma B. Esta respuesta se observó con células efectoras de CMSP humanas incubadas con células Daudi en una relación 2:1 de E:T, que indica la sensibilidad de esta actividad. Para identificar el efector inmunitario responsable de la destrucción de células tumorales diana observada, se aislaron los linfocitos NK de CMSP humanas por MACS y se usaron como las células efectoras en el ensayo de ADCC anterior. Similarmente a los resultados con CMSP humanas totales, linfocitos NK fueron capaces de destruir las células Daudi por actividad de ADCC mediada por rituximab, que se potenció mediante la adición de ALT-803 (Figura 8C). A diferencia, las CMSP reducidas en linfocitos NK (linfocitos no NK) no mostraron actividad de ADCC detectable de destrucción de células de Daudi en este contexto (Figura 8D). Además, la adición de un anticuerpo de control, HOAT (Ab anti-IgG1 de factor de tejido humano humanizado), a linfocitos NK no proporcionó actividad de ADCC detectable contra células Daudi con o sin adición de ALT-803.
También se examinó la capacidad de ALT-803 para aumentar la actividad de ADCC de células inmunitarias de ratón contra células Daudi humanas. En este estudio, se inocularon ratones SCID con células Daudi (10 x 106 por ratón) en el día de estudio 0 (SD0) y se trataron SD15 y SD18 con ALT-803 (0,2 mg/kg), rituximab (10 mg/kg) o ALT-803 (0,2 mg/kg) rituximab (10 mg/kg). Los ratones se sacrificaron 4 días después del segundo tratamiento y se prepararon los esplenocitos. Por lo tanto, los esplenocitos pueden tener diferentes estados de activación como resultado del tratamiento in vivo. Entonces se mezclaron los esplenocitos con células Daudi diana en la relación E:T 20:1 en medio RPMI-10 solo o medio con rituximab (10 nM), AlT-803 (10 nM) o rituximab (10 nM) ALT-803 (10 nM). Después de 2 días de incubación a 37 °C, se evaluó la viabilidad de células diana Daudi por análisis de tinción con yoduro de propidio de células Daudi marcadas con violeta en un BD FACSVerse. Como se muestra en la Figura 9A, la adición de ALT-803 a los esplenocitos derivados de ratones tratados con control fue capaz de aumentar la ADCC dirigida contra el mAb anti-CD20 contra células Daudi humanas. Además, la estimulación in vivo con ALT-803 produjo esplenocitos que fueron más activos en ADCC dirigida contra el mAb anti-CD20 contra células Daudi humanas. Estos resultados están de acuerdo con el hallazgo del uso de células inmunitarias humanas que indican que el tratamiento con ALT-803 puede potenciar las respuestas de ADCC específicas de tumor.
Se examinó la capacidad de ALT-803 para aumentar la actividad de ADCC de células inmunitarias contra otras células tumorales humanas. HER-2 es una diana establecida para el tratamiento terapéutico con anticuerpo de tumores sólidos, que incluye cáncer de mama y adenocarcinoma gástrico o de la unión gastroesofágica. Para evaluar los efectos de ALT-803 sobre la actividad de ADCC contra tumores HER-2-positivo, se usó la línea de cáncer de mama de células humanas SK-BR-3 que expresa en exceso HER-2 como una estirpe celular diana y se usó un anticuerpo anti-HER-2 humano (clon 24D2) como un Ab dirigido contra células tumorales. Para generar células efectoras activadas, se inyectaron ratones Balb/c con 0,2 mg/kg de ALT-803 por vía intravenosa el día de estudio (SD) 0. En SD3, los ratones se sacrificaron y se recogieron los bazos. Los esplenocitos activados se mezclaron con células SK-BR-3 marcadas con CellTrace Violet en la relación 10:1 de E:T. Las células se cocultivaron a 37 °C en medio R10 que contenía diversas concentraciones del anticuerpo anti-HER2 (clon 24D2), ALT-803 o ambos agentes. Después de 24 horas, se recogieron mezclas de células y las células muertas se tiñeron con yoduro de propidio. El porcentaje de células SK-BR-3 muertas se examinó usando citometría de flujo. Como se muestra en las Figuras 9B, la incubación de células SK-BR-3 con esplenocitos activados en presencia de cualquiera del Ab anti-HER2 o ALT-803 solo no dio como resultado la muerte de células SK-BR-3 en comparación con controles de medio. Sin embargo, el tratamiento combinado de ALT-803 (a 0,01 - 1,0 nM) con anticuerpo anti-HER2 (clon 24D2) (a 0,1 a 10 nM) aumentó significativamente la actividad de ADCC de las células inmunitarias esplénicas contra células SK-BR-3 de cáncer de mama humano. Estos resultados verifican que ALT-803 puede aumentar las respuestas de ADCC a varias dianas de enfermedad terapéuticamente establecidas diferentes.
Ejemplo 3: Actividad antitumoral del tratamiento con ALT-803 anticuerpo específico de tumor en ratones portadores de tumor
Se evaluó adicionalmente la capacidad de ALT-803 para aumentar la actividad antitumoral del mAb anti-CD20 en ratones SCID portadores de tumores Daudi. Estos ratones tienen linfocitos NK funcionales que probablemente median en las respuestas de ADCC contra los tumores. Para este estudio, se inocularon ratones hembra Fox Chase SCID (Harlan, C.B-17/IcrHsd-Prkdc-scid: 6 semanas de edad) por vía intravenosa (i.v.) con células Daudi (10 x 106 por ratón) (3 ratones/grupo). Los ratones portadores de tumores se trataron i.v. con PBS, ALT-803 (0,2 mg/kg), rituximab (10 mg/kg) o ALT-803 (0,2 mg/kg) rituximab (10 mg/kg) 15 días después de la inoculación tumoral y tres días después. Cuatro días después del segundo tratamiento, se sacrificaron los ratones y se determinaron los niveles de células Daudi en médula ósea. Se evaluó el porcentaje de células Daudi de las células de la médula ósea del fémur después de la tinción con anticuerpo anti-HLA-DR humano conjugado con PE (Biolegend) y análisis de citometría de flujo. Los resultados mostrados en la Figura 10 indican que las monoterapias con ALT-803 y el mAb anti-CD20 son capaces de reducir el porcentaje de células Daudi en la médula ósea de ratones portadores de tumor. Sin embargo la combinación de ALT-803 más el mAb anti-CD20 proporcionó la mayor actividad antitumoral reductora de células Daudi en la médula ósea desde el 38 % en ratones de control hasta el 5 % en ratones tratados con ALT-803 rituximab. Los estudios de respuesta a dosis en este modelo confirmaron que tan solo 0,02 mg/kg de ALT-803 fueron capaces de aumentar la actividad antitumoral del mAb anti-CD20 (Figura 11).
También se evaluó la capacidad de ALT-803 más el mAb anti-CD20 para mejorar la supervivencia de ratones portadores de tumores de células Daudi. Para este estudio, se inocularon ratones hembra Fox Chase SCID por vía intravenosa (i.v.) con células Daudi (10 x 106 por ratón). Los ratones portadores de tumores se trataron i.v. con PBS, ALT-803 (insuficiente 0,05 mg/kg), rituximab (10 mg/kg) o ALT-803 (0,05 mg/kg) rituximab (10 mg/kg) 15 días después de la inoculación del tumor y tres días después. Se monitorizó la supervivencia (incluyendo morbilidad basada en la parálisis de las patas traseras) de los ratones. Como se muestra en la Figura 12, los ratones portadores de tumores de los grupos de monoterapia con PBS, ALT-803 insuficiente y rituximab mostraron una mediana de la supervivencia de 26 - 30 días, mientras que los ratones tratados con ALT-803 insuficiente más rituximab tuvieron una supervivencia media superior a 50 días, que indica que la terapia combinada prolonga significativamente la supervivencia de los ratones portadores de linfomas de linfocitos B. Juntos, estos resultados confirman los efectos antitumorales sinérgicos de ALT-803 en combinación con anticuerpos específicos de tumor in vivo. También es notorio que la combinación de ALT-803 más el mAb anti-CD20 no provocó ningún signo significativo de toxicidad en los animales portadores de tumores para los estudios descritos anteriormente, que indica que estas combinaciones son bien toleradas.
Ejemplo 4: Actividad antitumoral de ALT-803 en combinación con bloqueantes del punto de regulación inmunitario en ratones portadores de tumores
Los bloqueantes del punto de regulación inmunitario que incluyen anticuerpos contra CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, LAG-3, BTLA, TIM-3, VISTA, IDO, A2aR, HVEM, KIRs, NKG2A, NKG2D, CEACAM-1, 2B4, CD200R, y sus ligandos y otras dianas descritas en el presente documento, pueden ser capaces de promover respuestas inmunitarias que inhiben señales supresoras inmunitarias. Como se indica anteriormente, ALT-803 es una molécula inmunoestimulante que promueve la proliferación y la actividad de linfocitos NK y linfocitos T. Sin embargo, su eficacia se puede limitar por puntos de regulación inhibidores y vías que pueden atenuar respuestas inmunitarias. Las estrategias que abolen estos reguladores negativos y potencian la actividad de ALT-803 podrían proporcionar un beneficio terapéutico.
Para examinar la actividad antitumoral de ALT-803 en combinación con el bloqueo de la vía CTLA-4 - CD80/CD86, se desarrolló un modelo de metástasis pulmonar usando ratones BALB/c inyectados i.v. con la estirpe celular murina CT26 de carcinoma de colon. Se inyectaron i.v. grupos de 4-6 ratones con 2 x 105 células tumorales CT26 en el día 0 (SD0). En los grupos ALT-803, cada ratón recibió 4 pg i.v. de ALT-803 dos veces a la semana durante dos semanas empezando en SD1. Junto con ALT-803, algunos ratones recibieron cualquiera de anticuerpo (Ab) anti-PD-L1 (clon 9G2), Ab anti-CTLA-4 (clon UC10-4F10-11), o ambos, a 100 pg por inyección (por Ab) administrado i.v. dos veces a la semana durante 2 semanas empezando en SD1. En los grupos de lL-15 humana recombinante, cada ratón recibió 5 pg de IL-15 por vía intraperitoneal (i.p.) diariamente, 5 veces a la semana durante 2 semanas, empezando en SD1. Junto con IL-15, los animales también recibieron i.v. tratamiento de tanto Ab anti-PD-L1 como Ab anti-CTLA-4 (100 pg por inyección) en SD1, SD4, SD8 y SD11. Los ratones de control recibieron inyecciones de PBS. Los ratones se evaluaron diariamente para supervivencia como un criterio de valoración de la eficacia.
Como se muestra en la Figura 13, la mediana de la supervivencia de los ratones BALB/c portadores de tumores CT26 fue 15 a 20 días dependiendo del estudio. El tratamiento con ALT-803 solo prolongó significativamente la supervivencia de los ratones portadores de tumores cuando se comparó con el grupo de control. La adición del tratamiento con el Ab anti-PD-L1 a ALT-803 no pareció mejorar la supervivencia en estos ratones. A diferencia, la combinación de ALT-803 y el Ab anti-CTLA4 (con o sin el Ab anti-PD-L1) aumentó significativamente la supervivencia de ratones portadores de tumores CT26 en comparación con los grupos de PBS y ALT-803. Estudios previos en este modelo de tumor mostraron que la monoterapia con el Ab anti-CTLA4 no mejoró la supervivencia. Por lo tanto, la combinación de ALT-803 y el Ab anti-CTLA4 (pero no el anti-PD-L1) actúa sinérgicamente proporcionando respuestas antitumorales más eficaces, como se mide por la supervivencia prolongada en ratones portadores de tumor.
Se evaluaron adicionalmente los efectos del bloqueo de PD-1 - PD-L1 en la combinación con ALT803 en el modelo de mieloma de 5T33P en ratones C57BL/6 inmunocompetentes. Los grupos de 5 ratones se inyectaron i.v. con 1x 107 células tumorales 5T33P en SD0. El tratamiento empezó en SD4. En el grupo de IL-15, cada ratón recibió 5 pg de IL-15 i.v. en SD4 y SD11. Junto con IL-15, algunos animales también recibieron el Ab anti-PD-L1 (clon 9G2, 200 pg/ratón/inyección i.p.) o el Ab anti-CTLA-4 (clon UC10-4F10-11,200 pg/ratón/inyección i.p.) una vez a la semana en SD4 y SD11, respectivamente. En el grupo de ALT-803, cada ratón recibió dos inyecciones i.v. de ALT-803 insuficiente a 1 pg/ratón/inyección en SD4 y SD11. Junto con ALT-803, algunos ratones recibieron o Ab anti-PD-L1, Ab anti CTLA-4 o ambos anticuerpos como se indica anteriormente. Además, los grupos de ratones recibieron la monoterapia con Ab anti-PD-L1 o Ab anti-CTLA-4 y recibieron inyecciones de PBS. Los ratones se evaluaron diariamente para supervivencia y/o la parálisis completa en ambas patas traseras como los criterios de evaluación del estudio. Como se muestra en la Figura 14A, la mediana de la supervivencia de ratones C57BL/6 portadores de tumores 5T33P fue 24 días. El tratamiento con una dosis insuficiente de ALT-803 no cambió significativamente la supervivencia de los animales, pero la administración de ALT-803 insuficiente más Ab anti-PD-L1 produjo la supervivencia de todos los animales en este grupo de estudio, durante al menos 50 días. A diferencia, la combinación de ALT-803 y Ab anti-CTLA4 no prolongó significativamente la supervivencia del ratón. Además, cuando se probaron los niveles insuficientes de tanto ALT-803 como Ab anti-PD-LI como monoterapias y en combinación, se observó una supervivencia significativamente mayor en ratones C57BL/6 portadores de tumores 5T33P tras el tratamiento de ALT-803 Ab anti-PD-L1 en comparación con los ratones tratados con cualquier monoterapia (Figura 14B). Por lo tanto, la combinación de ALT-803 más Ab anti-PD-L1 proporciona actividad antitumoral sinérgica en ratones portadores de tumores de mieloma.
Para entender mejor las actividades divergentes de las terapias de combinación con ALT-803 en estos dos modelos, se tiñeron estirpes celulares de tumor para ligandos de los receptores de PD1 y CTLA4. Como se muestra en la Figura 15, las células CT26 expresan ligandos para CTLA4, pero no PD1. A diferencia, las células tumorales 5T33P expresan PD-L1 pero no los ligandos para CTLA4. Estos resultados están de acuerdo con las actividades antitumorales del Ab anti-CTLA4 y anti-PD-L1 en combinación con ALT-803 en cada uno de estos modelos de tumor, que indica que la tinción de tumores con ligandos para los receptores del punto de regulación inmunitario puede proporcionar un indicador predictivo de la respuesta a ALT-803 más los bloqueantes del punto de regulación inmunitario.
Usando un modelo establecido para glioblastoma descrito en Zeng et al. 2013 Int J Radiat Oncol Biol Phys., 86:343-9, también se llevaron a cabo estudios de monoterapia de ALT-803 y ALT-803 en combinación con mAb anti-PD-1 en ratones C57BL/6 que habían sido implantados intracranealmente con la estirpe celular de glioblastoma, GL261 -luc. El tratamiento con dosis múltiples de ALT-803 (3 o 4 dosis) o mAb anti-PD-1 (3 dosis) como monoterapia empezando 7 a 10 días después de la implantación tumoral presentó aumentos similares en la actividad antitumoral y prolongó la supervivencia de los animales cuando se comparó con controles tratados con PBS. La combinación del tratamiento de ALT-803 y mAb anti-PD1 extendió más la mediana de los tiempos de supervivencia de ratones portadores de tumores. Además, el mAb anti-PD-1 en combinación con 4 dosis de ALT-803 aumentó el porcentaje de supervivientes sin tumor a largo plazo (>60 días después de la implantación) hasta el 40 % desde el 20 % de la tasa observada en ratones tratados con la monoterapia de Ab anti-PD-1 y ALT-803. Es interesante señalar que los ratones "curados" fueron resistentes a la exposición al tumor, lo que indica la respuesta de memoria inmunitaria inducida por el tratamiento contra el tumor. Estos resultados indican que la combinación de la actividad inmunoestimulante de ALT-803 con el bloqueante del punto de regulación, Ab anti-PD-1, tiene un efecto beneficioso en prolongar la supervivencia de los ratones portadores de tumores de glioblastoma.
También es notorio que la combinación de ALT-803 más el bloqueo del inhibidor del punto de regulación no provocó signos de toxicidad significativos en los animales portadores de tumores para los estudios descritos anteriormente, que indica que estas combinaciones son bien toleradas.
Ejemplo 5: Toxicidad de ALT-803 en ratones
Para evaluar el perfil de seguridad y el índice terapéutico de ALT-803 en animales y estimar la seguridad y eficacia de las dosis humanas, se realizaron estudios de toxicidad del tratamiento con múltiples dosis de ALT-803 en ratones y macacos cangrejeros. Se administró ratones C57BL/6N (10 ratones/sexo/grupo) con 0,1, 1,0 o 4,0 mg/kg de ALT-803 o PBS por la vena de la cola semanalmente durante 4 semanas consecutivas. Cuatro días después de la última inyección (día 26), se realizaron las evaluaciones que incluyen exploración física, análisis bioquímico de la sangre, hematología, autopsia macroscópica, mediciones de peso corporal y de los órganos e histopatología (5 ratones/sexo/grupo). Se realizaron evaluaciones similares en los restantes ratones catorce días después del último tratamiento (día 36). En un segundo estudio, ratones C57BL/6N (15 ratones/sexo/grupo) se trataron con 4 inyecciones i.v. semanales de 0,1 o 1,0 mg/kg de ALT-803 o PBS. Las evaluaciones de toxicidad que se han descrito anteriormente se realizaron cuatro días (día 26) (10 ratones/sexo/grupo) o 4 semanas después de la última inyección (día 50) (5 ratones/sexo/grupo).
Se evaluaron los perfiles de seguridad y farmacodinámica de ALT-803 en ratones C57BL/6N sanos inyectados i.v. con 0,1, 1.0 o 4,0 mg/kg de ALT-803 o PBS semanalmente durante cuatro semanas consecutivas. Los ratones que recibieron 4.0 mg/kg de ALT-803 presentaron signos de toxicidad (es decir, pérdida de peso, pérdida de pelo) y mortalidad entre 4 y 20 días después del inicio del tratamiento. La autopsia no determinó la causa de la muerte, pero observaciones (es decir, edema pulmonar, bazos engrosados) estuvieron de acuerdo con respuestas inflamatorias letales inducidas por citocinas. No se observó mortalidad en los ratones tratados con 1,0 o 0,1 mg/kg de ALT-803. Se observaron aumentos dependientes de la dosis en los pesos de los bazos y las cifras de glóbulos blancos (WBC) 4 días después de la última dosis de ALT-803 (Día 26) (Figura 16). De los WBC, cada una de las cifras absolutas de linfocitos, neutrófilos y monocitos aumentaron más de 8 veces en los ratones tratados con 1,0 mg/kg de ALT-803 en comparación con los controles. Dos semanas (Día 36) y cuatro semanas (Día 50) después del tratamiento (Figura 16A-Figura 16F), las cifras de neutrófilos siguieron siendo elevadas en los ratones tratados con 1,0 mg/kg de ALT-803, pero las cifras de linfocitos volvieron a los niveles de control. Los análisis histopatológicos verifican estimulación dependiente de la dosis de ALT-803 de la proliferación de células inmunitarias e infiltración de linfocitos en el bazo, hígado, timo, riñón, pulmones y ganglios linfáticos en el día 26 y a un menor grado en el día 36 y día 50. Los resultados de estos estudios definieron la dosis tolerable del tratamiento con múltiples dosis de ALT-803 hasta 1 mg/kg en ratones.
Ejemplo 6: Toxicidad, farmacodinámica (FD) y farmacocinética (FC) de ALT-803 en macacos cangrejeros
Se realizó un estudio según las normas de las prácticas correctas de laboratorio para evaluar los efectos de la administración i.v. de múltiples dosis de ALT-803 en macacos cangrejeros. Los animales (5 monos/sexo/grupo) se trataron semanalmente durante 4 semanas consecutivas (días 1, 8, 15 y 22) con 0,03 o 0,1 mg/kg de ALT-803 o PBS administrado como una inyección i.v. de ~3 min. Durante toda la fase en vida del estudio, los animales se evaluaron para observaciones clínicas y conductuales, consumo de alimentos, peso corporal, función cardíaca y ocular. Se extrajo sangre para evaluaciones de hematología, bioquímica y coagulación (antes de la dosis y días 5, 26 y 36 después de la dosis) y para el análisis de células inmunitarias. Se extrajo suero para pruebas de inmunogenicidad y análisis FC realizados usando métodos cualificados de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). Se recogió orina para análisis de orina (antes de la dosis y los días 4, 25 y 35). Se realizaron evaluaciones de patología clínica que incluyen exploración física, autopsia macroscópica, mediciones del peso de los órganos e histopatología cuatro días (día 26) (3 animales/sexo/grupo) y 2 semanas después de la última inyección (día 36) (2 animales/sexo/grupo).
Basándose en el escalado alométrico hasta la dosis murina tolerable, se evaluaron los perfiles de actividad y toxicidad del tratamiento i.v. de múltiples dosis de ALT-803 a 0,1 y 0,03 mg/kg en macacos cangrejeros sanos. El análisis FC después de la primera dosis estimó 1 semivida de eliminación de ALT-803 en aproximadamente 7,6 h, que no pareció diferir significativamente entre niveles de dosis (Figura 17). El valor Cmáx de 30 nM para 0,1 mg/kg de ALT-803 está de acuerdo con la recuperación completa de la dosis administrada, mientras que los valores de Cmáx y ABC inf indican ~30 % menos de recuperación a la dosis de 0,03 mg/kg. Sin embargo, incluso al nivel de dosis bajo, la Cmáx de 6 nM en el suero fue más de 50 mayor que la concentración de 0,1 nM que se encontró que estimulaba la proliferación, activación y citotoxicidad celular inmunitaria in vitro.
Los monos que recibieron 4 inyecciones consecutivas semanales de ALT-803 mostraron una reducción en el apetito dependiente de la dosis durante las 2 primeras semanas del periodo de tratamiento. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en los pesos corporales medios ni ninguna otra observación clínica relacionada con la dosis o conductual entre los grupos durante el estudio. Además, los pesos de los órganos no fueron significativamente diferentes en los animales tratados con ALT-803 en comparación con controles.
Los cambios biológicamente más relevantes observados tras el tratamiento semanal de ALT-803 fueron aumentos dependientes de la dosis en las cifras de WBC y linfocitos en sangre (Figura 18A-Figura 18H). Al final del periodo de administración de cuatro semanas, las cifras absoluta de linfocitos aumentó 1,5 veces en animales que recibieron 0,1 mg/kg de ALT-803 y luego volvió a los niveles de control después de un periodo de recuperación de 2 semanas. De los subconjuntos de linfocitos, los aumentos transitorios dependientes de la dosis en las cifras de linfocitos NK y linfocitos T CD4+ y CD8+ se observaron después del tratamiento (Figura 18A-Figura 18F). Las cifras de monocitos en sangre también aumentaron en monos tratados con 0,1 mg/kg de ALT-803, mientras que los niveles de neutrófilos en sangre no fueron diferentes entre los grupos de tratamiento. Estos resultados contrastan con estudios previos de administración de IL-15 a macacos y macacos de la India donde la principal toxicidad informada fue neutropenia transitoria de grado 3/4.
Además de los cambios en los niveles de células inmunitarias de la sangre, hubo un aumento dependiente de la dosis en la infiltración linfocítica multifocal leve en los hígados, riñones y pulmones de monos tratados con ALT-803 basándose en la histopatología realizada 4 días después de la última dosis de ALT-803. También se observó necrosis hepática leve diseminada con una elevada frecuencia en animales tratados con ALT-803. La bioquímica clínica en este momento mostró una disminución en la albúmina de suero en el grupo de ALT-803 de dosis alta en comparación con los controles (0,1 mg/kg de ALT-801, 3,85±0,12 g/dl; PBS, 4,46±0,13 g/dl; P<0,01), que puede ser a consecuencia de las respuestas inflamatorias en el hígado. Sin embargo, los niveles de enzimas hepáticas en suero no fueron elevados en animales tratados con ALT-803 en comparación con los controles. Se observó hiperplasia de la médula ósea en la mayoría de los animales, pero con elevada intensidad en el grupo de ALT-803 de alta dosis. Las lesiones en la mayoría de los órganos afectados en los grupos tratados con ALT-803 se redujeron en incidencia e intensidad dos semanas después del tratamiento y estuvieron de acuerdo con los resultados en los animales de control. En general, los efectos mediados por ALT-803 sobre la sangre y los linfocitos de tejido observados en este estudio están de acuerdo con las respuestas transitorias informadas para primates no humanos tratados con IL-15 dos veces a la semana a hasta 0,1 mg/kg o diariamente a 10 a 50 gg/kg.
Ejemplo 7: Estudios comparativos de ALT-803 intravenoso y subcutáneo
Datos nuevos de los ensayos en curso que usan el producto de IL-15 humana recombinante (rhIL-15) indican que no es probable que la administración intravenosa sea insuficiente para IL-15 debido a que induce una alta Cmáx y liberación de citocinas secundarias (IL-6 y IFN-y ) que afecta su tolerabilidad y, por lo tanto, es limitante. Los estudios preclínicos y clínicos con IL-2 indican que la administración subcutánea es más segura y proporciona mucha mejor tolerabilidad. Por ejemplo, Waldmann y colaboradores realizaron el primer ensayo de tumor sólido de rhIL-15 en humano usando una infusión intravenosa en embolada diaria durante 12 días consecutivos (Conlon et al., 2015. J. Clin. Oncol., 33: 74-82). Las toxicidades limitantes de las dosis observadas en la cohorte de 3,0 y 1,0 gg/kg por día fueron hipotensión de grado 3, trombocitopenia y elevaciones de la alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST). Se declaró la dosis máxima tolerada (MTD) a 0,3 gg/kg por día. Se prevé un aumento de la tolerancia de la administración subcutánea como resultado de una disminución de Cmáx en comparación con el mismo nivel de dosis administrado por vía intravenosa y niveles más sostenidos del producto de rIL-15 en circulación. La reducción de Cmáx permite más administración de fármaco en general.
Para extender estos resultados a ALT-803, se realizaron estudios preclínicos para evaluar la administración i.v. (intravenosa) y s.c. (subcutánea) de ALT-803 en términos de farmacocinética, inmunoestimulación y eficacia antitumoral en ratones C57BL/6. Estudios iniciales de ratones C57BL/6 tratados con 0,2 mg/kg de ALT-801 mostraron una semivida estimada de 5,3 horas para la administración i.v. y 3,8 horas para la administración s.c. La máxima concentración en suero de ALT-803 fue 650 ng/ml en el momento de tiempo de 20 horas después de la administración s.c. y 1700 ng/ml en el momento de tiempo de 2 horas después de la administración i.v. En términos de estimulación inmunitaria, ALT-803 administrado s.c. o i.v. pudo inducir igualmente la proliferación de linfocitos T CD8+ y linfocitos NK. Además, la administración i.v. y s.c. de ALT-803 activó similarmente células inmunitarias para reducir la carga tumoral en la médula ósea de ratones portadores de mieloma 5T33. Tanto la administración i.v. como s.c. de ALT-803 hasta 0,2 mg/kg fue bien tolerada en ratones C57BL/6 normales y portadores de tumor.
Un estudio de seguimiento de efectos toxicológicos de 1 mg/kg de ALT-803 inyectado s.c. semanalmente durante 4 semanas en ratones C57BL/6 reveló cambios relacionados con el sistema inmunitario que fueron similares a los observados en un estudio de toxicología previo en que ratones C57BL/6 se trataron con la misma pauta posológica de ALT-803 usando una vía i.v. No se observó mortalidad en los ratones después de las 4 inyecciones s.c. semanales de 1 mg/kg de ALT-803. Con la excepción de una ligera pérdida de peso y la observación de postura encorvada después de la primera inyección s.c. de ALT-803, no se observó signos clínicos de toxicidades relacionadas con el producto experimental durante este estudio. El análisis de la sangre periférica reveló que aumentaron los números de las cifras de WBC y de linfocitos en comparación con los controles de PBS. En general, hubo un aumento de 9 veces para tanto WBC como linfocitos en animales tratados con ALT-803 en comparación con los ratones inyectados con PBS. Un aumento en neutrófilos, monocitos, eosinófilos y basófilos también se observó en ratones tratados s.c. con ALT-803. Se observaron aumentos significativos en el peso del bazo, ganglio linfático e hígado (5,5, 3 y 1,3 veces, respectivamente) de ratones tratados con ALT-803. Previamente se informó de expansión generalizada comparable de células inmunitarias y aumentos de pesos de órganos linfoides para ratones que recibieron el tratamiento i.v. de múltiples dosis con ALT-803.
En general, los resultados de los estudios preclínicos de ALT-803 indicaron que la administración s.c. disminuye la Cmáx en comparación con la administración i.v., pero retiene la actividad inmunoestimulante y la eficacia antitumoral sin exagerar la toxicidad.
Ejemplo 8: Actividad antitumoral de ALT-803 en combinación con bloqueantes del punto de regulación inmunitario en ratones portadores de tumores ortotópicos de vejiga
Además de los estudios descritos en el Ejemplo 4, se evaluó la actividad antitumoral de ALT-803 en combinación con bloqueantes del punto de regulación inmunitario en ratones portadores de tumores ortotópicos de vejiga MB49luc. Se instilaron por vía intravesical ratones C57BL/6 (n = 6/grupo) con células MB49luc (3 x 104 células/vejiga) el día de estudio 0, tras el pretratamiento con polilisina de las vejigas. Se administró PBS, ALT-803 (0,2 mg/kg, i.v.) o ALT-803 (0,2 mg/kg) más Ab anti-PD-L1 y anti-CTLA4 (cada uno a 100 pg/inyección, i.p.) 7, 10, 14 y 17 días después de la instilación de células tumorales MB49luc. Los ratones se mantuvieron para evaluar la tasa de supervivencia entre los grupos de tratamiento como el criterio de valoración de la eficacia. El tratamiento con ALT-803 prolongó significativamente la supervivencia de los ratones portadores de MB49luc en comparación con PBS (Figura 19A). Sin embargo, la combinación de ALT-803 con los Ab anti-PD-L1 y anti-CTLA4 prolongó más la supervivencia en comparación con el control de monoterapia. Este efecto también se observó con la terapia de combinación de ALT-803 mAb anti-PD1 y ALT-803 anti-PD1/anti-CTLA4 (Figura 19B).
Además, los ratones que se curaron de los tumores por terapia con ALT-803 más Ab anti-PD-L1/anti-CTLA4 fueron resistentes a la reexposición al tumor de vejiga sin tratamiento con fármaco adicional, mientras que los ratones sin tratamiento previo de los mismos desarrollaron tumores y murieron después de la instilación de células tumorales (Figura 19A). Estos resultados indican que la monoterapia con ALT-803 y la terapia de combinación con Ab anti-PD-L1, anti-PD-1 y anti-CTLA4 fue eficaz en el tratamiento de los ratones portadores de tumores de vejiga, que incluyen respuestas curativas, y que la terapia de combinación de ALT-803/Ab anti-PD-L1/anti-CTLA4 proporcionó respuestas de memoria inmunitaria después de la exposición al tumor. También es notorio que la combinación de ALT-803 más el bloqueo de los inhibidores del punto de regulación no provocaron signos significativos de toxicidad en los animales portadores de tumores para los estudios descritos anteriormente, que indica que estas combinaciones son bien toleradas. Como se muestra en la Figura 20, las células MB49luc expresan ligandos para CTLA4 y PD-1. Como tales, estos resultados están de acuerdo con las actividades antitumorales de Ab anti-CTLA4, anti-PD-1 y anti-PD-L1 en combinación con ALT-803 en este modelo de tumor.
Ejemplo 9: Terapia combinada de ALT-803 y anticuerpo anti-gp75, TA99, en el modelo de melanoma murino
Se usó el modelo de tumor de melanoma B16F10 subcutáneo en ratones C57BL/6 singénicos para evaluar más la eficacia de ALT-803 más un antígeno terapéutico de anticuerpo específico de tumor contra tumores sólidos. Este modelo también tiene la ventaja de evaluar la actividad de linfocitos T y otras células inmunitarias contra tumores establecidos y la reexposición tumoral. Un antígeno específico de melanoma importante para terapia dirigida es gp75 (TYRP-1, proteína-1 relacionada con tirosinasa), una proteína de 75 kDa que participa en la síntesis de melanina en melanosomas (Kobayashi T, et al. 1994. EMBO J. 13:5818-25). TA99 (IgG2a de ratón) es un anticuerpo monoclonal (mAb) específico para gp75 humano y murino (Thomson TM, et al. 1985. J Invest Dermatol. 85:169-74). El tratamiento con este anticuerpo suprime eficazmente el melanoma murino subcutáneo B16F10 en ratones singénicos mediante la activación de la toxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Hara I, et al. 1995. J Exp Med. 182:1609-14).
Los experimentos descritos en el presente documento se diseñaron para determinar si esta actividad podría ser aumentada aún más por combinación con ALT-803 y evaluar respuestas inmunitarias responsables de la eficacia antitumoral. En general, se inyectó s.c. a ratones C57BL/6NHsd (hembras de 7 semanas) en el flanco dorsal inferior con 2x105 células tumorales B16F10 en 200 gl de PBS el día de estudio 0 (SD0). Para todos los experimentos en este estudio, excepto la reexposición tumoral, los tratamientos se administraron dos veces a la semana durante dos semanas (en el día de estudio 10, 14, 17, 21 y 24) a partir de SD10, el momento de tiempo cuando más del 75 % de los animales tuvieron tumores B16F10 palpables. Más específicamente, los ratones se dividieron en grupos y se les inyectó 200 gl de PBS (i.v.) (control de vehículo), 0,2 mg/kg de ALT-803 (i.v.), 10 mg/kg de TA99 (i.v.), 100 gg/ratón de mAb anti-PD-L1 10F.9G2 (i.p.), o terapia de combinación de ALT-803, TA99 y/o 10F.9G2. Para los experimentos de reducción, se inyectó i.p. 200 gg/ratón de anticuerpos de reducción (anti-CD4 GK1.5, anti-CD8a 53.6.72 y anti-NK1.1 PK136) una vez cada semana o se inyectó i.p. 100 gl/ratón de Clophosome (liposomas cargados con clodronato para la reducción de macrófagos) una vez cada 4 días, a partir de SD3 y SD9 respectivamente, hasta el criterio de valoración del experimento. Para experimentos que implican la reexposición tumoral, se administró 10 mg/kg TA99 (i.v.) tres veces a la semana, se administró 0,2 mg/kg de ALT-803 (i.v.) una vez a la semana, durante tres semanas a partir de SD0. Después de aproximadamente tres meses, los ratones sin tumor rescatados de la exposición tumoral inicial se inyectaron s.c. contralateralmente con 2x105 células B16F10 tumorales en 200 gl de PBS. Los volúmenes de tumor se midieron diariamente desde el primer día de tratamiento hasta el final, y se calcularon usando la fórmula 1/2(LongitudxAnchura2). Se sacrificaron los ratones que llevaban una carga tumoral con una dimensión > 20 mm y se contaron como muertos. Los ratones sin tumor palpable o una masa s.c. estable < 50 mm3 se contaron como sin tumor.
En el estudio inicial, ratones (n=8) portadores de tumor establecido se trataron con TA99, ALT-803, TA99+ALT-803, o control de PBS dos veces a la semana durante dos semanas (Figura 21A). Debido a la intervención terapéutica retardada, no se observó regresión tumoral en ninguno de los grupos de tratamiento. Sin embargo, la progresión tumoral se inhibió significativamente por TA99 (p<0,001) y ALT-803 (p<0,001) en comparación con el grupo tratado con PBS. La terapia combinada produjo una inhibición significativamente mejorada del crecimiento tumoral en comparación con cualquier monoterapia (p<0,001), lo que sugiere que ALT-803 ofrece protección adicional a la inmunidad dependiente de anticuerpo contra el tumor.
Para determinar qué subconjuntos de células inmunitarias son responsables de la inmunidad antimelanoma mediada por ALT-803/TA99, linfocitos T, linfocitos NK y macrófagos se redujeron antes y durante todo el ciclo de tratamiento por administración intraperitoneal de anticuerpos o liposomas específicos del tipo de célula. La reducción de linfocitos T CD8+, linfocitos NK y macrófagos redujo significativamente la inhibición del crecimiento tumoral por la terapia combinada (p<0,001; Figura 21B), lo que indica que todos los subconjuntos de tres células contribuyen a la eficacia de ALT-803 y TA99. Sorprendentemente, la reducción de linfocitos T CD4+ no solo causó una mejora significativa de la inhibición tumoral (p<0,001; Figura 21B), sino también un aumento significativo de la supervivencia animal (p<0,01; Figura 21C) en comparación con el grupo de tratamiento de ALT-803 TA99 sin reducción. Considerando que los linfocitos T CD4+ están muy implicados en las funciones reguladoras inmunitarias, este resultado sugiere que las células (o un subconjunto de linfocitos T CD4+) son inmunosupresoras en vez de inmunorreactivas en la inmunidad inicial mediada por ALT-803/TA99 contra tumores B16F10.
Los efectos del tratamiento sobre células inmunitarias se examinaron en esplenocitos y leucocitos infiltrantes de tumores (TIL) recogidos de ratones portadores de tumores de melanoma B16F10 3 días después de la terapia de administración. Tras la administración de ALT-803, hubo un aumento en las poblaciones de linfocitos T CD8+ y linfocitos NK, así como una disminución en las poblaciones de linfocitos T CD4+, linfocitos B y macrófagos, en comparación con el control de PBS (Figura 22A y Figura 22B). Como era de esperar, TA99 no alteró los porcentajes de subconjuntos de células inmunitarias ni en los esplenocitos ni en TIL, excepto que causó una pequeña reducción de los macrófagos asociados al tumor. La combinación de ALT-803/TA99 mostró cambios similares en las poblaciones inmunitarias de células como ALT-803 solo. ALT-803 solo o combinado con TA99 condujo a un aumento significativo en el fenotipo de memoria (CD44alto) de linfocitos T CD8+, respaldado por datos de tanto los esplenocitos como TIL (Figura 22C y Figura 22D). Puesto que la población basal de linfocitos T CD8+CD44alto en TIL es dos veces superior a esta población de células en el bazo, la expansión mediada por ALT-803 de linfocitos T CD8+ de memoria fue menos destacada en TIL (1,2 veces, p<0,01 frente a 2,5 veces en el bazo, p<0,001). TA99 redujo ligeramente el porcentaje de linfocitos T CD8+ de memoria (p<0,05) en TIL, probablemente debido a que más linfocitos T CD8+ efectores fueron conducidos a participar en la inmunidad dependiente de anticuerpo contra melanoma.
Para evaluar si la memoria inmunitaria potenciada por ALT-803 podría contribuir a mejorar la inmunidad a largo plazo contra células tumorales, se empezó el tratamiento con ALT-803 TA99 en el día de estudio 0 en un intento por curar ratones expuestos al tumor B16F10. En esta pauta de tratamiento, la adición de ALT-803 a la terapia de TA99 no proporcionó mejora en la supervivencia de los animales, excepto que se observó un aumento moderado en el porcentaje de animales sin tumor en SD60 (Figura 23A). Sin embargo, cuando los ratones supervivientes del grupo de ALT-803 TA99 se reexpuso a las células B16F10, se observó un retraso significativo en el desarrollo tumoral cuando se comparó con los ratones intactos de la misma edad (Figura 23B). Estos resultados respaldan la hipótesis de que el tratamiento previo con ALT-803 indujo respuestas de células inmunitarias que son críticas para la protección "vacunal" de animales sometidos a una posterior reexposición tumoral. Para evaluar que las células participaron en este efecto protector, se realizaron estudios de reducción en ratones "curados" con ALT-803 TA99 antes de la reexposición a células tumorales. Los resultados mostraron que los ratones "curados" con ALT-803 TA99 administrados con PBS siguieron estando protegidos de la reexposición al tumor B16F10, mientras que los ratones "curados" tratados con anticuerpos que reducen los linfocitos CD8, CD4 o NK no mostraron protección inmunitaria contra la mortalidad de la reexposición subcutánea al tumor B16F10 (Figura 23C). Estos resultados indican que todos estos tipos de células participan en los efectos protectores mediados por el tratamiento con ALT-803 TA99 después de la inoculación tumoral inicial.
También se evaluó en este modelo la función de activación celular inmunitaria y el eje de PD-1/PD-L1. Una dosis única de ALT-803 reguló por incremento las células CD25+ en linfocitos T CD4+ infiltrantes de tumor (p<0,05), mientras que TA99 reguló por disminución este marcador de activación (p<0,01; Figura 24A). Además, el tratamiento con ALT-803 aumentó significativamente la expresión de PD-L1 en linfocitos T CD4+ tanto en la periferia (p<0,001; Figura 24B) como en el tumor (p<0,01; Figura 24C). El tratamiento con TA99 produjo una ligera reducción de la expresión de PD-L1 en linfocitos T CD4+ solo en TIL (p<0,05), y TA99 con ALT-803 no fue suficiente para cambiar el impacto de ALT-803 solo. Por tanto, la eficacia de ALT-803 y su combinación con anticuerpos terapéuticos se podría limitar posiblemente por la vía de inhibidores del punto de regulación inmunitario reforzados por linfocitos T CD4+.
También se evaluaron los efectos de ALT-803 sobre la expresión de PD-1 en linfocitos T CD8+ en ratones portadores de tumores B16F10. La dosis única de ALT-803 condujo a una reducción moderada de la expresión de PD-1 en linfocitos T CD8+ del bazo en comparación con el control de PBS, restaurándolo hasta un nivel próximo a ratones intactos (Figura 24C). Además, la terapia de combinación con ALT-803, TA99 y ALT-803+TA99 redujo toda expresión de PD-1 en linfocitos T CD8+ infiltrantes de tumores en aproximadamente tres veces (Figura 24D).
Un mecanismo de acción antitumoral importante de IL-15 es mediante la activación de linfocitos NK. Cuando el marcador de activación KLRG1 se examinó en linfocitos NK, se encontró que el melanoma B16F10, aunque es muy poco inmunogénico, puede inducir un aumento moderado de KLRG1 en los linfocitos NK del bazo (p<0,05; Figura 25A). El tratamiento con ALT-803 aumentó más la activación de linfocitos NK en bazo (p<0,05; Figura 25A) y, lo que es más importante, causó un gran aumento de la expresión de KLRG1 en linfocitos NK infiltrantes de tumor (4 veces, p<0,001; Figura 25B). Esto podría explicar por qué ALT-803 puede reforzar eficazmente la ADCC mediada por TA99 contra tumores B16F10, donde los linfocitos Nk son una célula inmunitaria importante implicada en esta respuesta. Al igual que los linfocitos T CD8+, ALT-803 también reguló por disminución la expresión de PD-1 en linfocitos NK en bazo (p<0,01; Figura 25C) y tumor (p<0,05; Figura 25D), lo que implica que ALT-803 podría atenuar intrínsecamente la inhibición de la vía del punto de regulación a través del brazo de PD-1 de linfocitos T CD8+ y linfocitos NK, independientemente del bloqueo adicional del punto de regulación.
Para explorar si el bloqueo del punto de regulación potenciaría además la función antitumoral combinatoria de ALT-803 y TA99, se trataron ratones (n=8) portadores de tumores B16F10 establecidos con ALT-803+TA99 con y sin el mAb anti-PD-L1 10F.9G2 en el modelo de intervención retardado (Figura 26A). El mAb anti-PD-L1 solo ralentizó el crecimiento tumoral en un pequeño factor (p<0,05). Por lo tanto, a pesar de la observación de que células B16F10 expresan constitutivamente PD-L1 tanto in vitro como in vivo (Figura 26B), el mAb anti-PD-L1 dejó de ser una potente monoterapia para la inhibición del crecimiento de melanoma en este modelo. Calculando a partir de la curva de crecimiento del tumor, ALT-803+TA99 combinado con el mAb anti-PD-L1 presentó de hecho mayor actividad antitumoral cuando se comparó con la terapia con ALT-803+TA99 (p<0,05).
En general, los resultados de estos estudios indican que ALT-803 en combinación con un anticuerpo específico de tumor puede proporcionar actividad antitumoral y prolongar la supervivencia de ratones portadores de tumores sólidos establecidos. Este tratamiento también proporciona protección inmunitaria contra la reexposición tumoral adicional. Estos efectos están mediados por linfocitos NK y T que se activan y proliferan en respuesta al tratamiento. Además, las combinaciones terapéuticas con inhibidores del punto de regulación pueden aumentar más la eficacia antitumoral del régimen de ALT-803 anticuerpo específico de tumor. Como resultado, la monoterapia con ALT-803 y las estrategias terapéuticas de combinación con ALT-803 son aplicables a diversos enfoques de tratamiento para neoplasia, que incluyen tratamiento adyuvante, neo-adyuvante, de inducción, de consolidación, de mantenimiento, de primera línea, >segunda línea y combinaciones con cirugía, radiación o quimioterapia.
También es notorio que ALT-803 solo o en combinación con anticuerpos antitumorales y/o bloqueo de inhibidores del punto de regulación no provocaron signos de toxicidad significativos en los animales portadores de tumores para los estudios descritos anteriormente, que indica que estas combinaciones son bien toleradas.
Ejemplo 10: Estudios clínicos de ALT-803 en pacientes con tumores malignos
Se evalúa ALT-803 en pacientes con tumores malignos del siguiente modo.
Está en proceso un estudio clínico multicéntrico de ALT-803 en pacientes con melanoma metastásico y otros tumores sólidos. El estudio se realiza como un aumento de la dosis con un paciente incluido en cada una de las dos primeras cohortes y un mínimo de tres pacientes incluidos en las tres últimas cohortes para determinar la dosis máxima tolerada (MTD) o dosis biológica óptima (OBD) de ALT-803. Los pacientes incluidos reciben dos ciclos de 6 semanas que consisten en 4 dosis intravenosas semanales de ALT-803, seguido por un periodo de reposo de 2 semanas. Los pacientes con enfermedad estable o en beneficio que cumplan los requisitos recibirán hasta dos ciclos adicionales de 6 semanas. Se incluyó un paciente en el nivel de dosis de 0,3 pg/kg de ALT-803. Los acontecimientos adversos notificados atribuidos al fármaco del estudio fueron febrícula transitoria, escalofríos moderados, náuseas y vómitos. El siguiente paciente se enroló al nivel de dosis de 0,5 pg/kg. Todos los acontecimientos adversos notificados fueron de leves a moderados, que incluyen náuseas, cansancio y prurito. Se enrolaron tres pacientes y completaron el tratamiento del estudio al nivel de dosis de 1 pg/kg de ALT-803. Todos los acontecimientos adversos notificados para estos pacientes fueron de leves a moderados, que incluyen escalofríos, empeoramiento del estreñimiento e hipertensión. El protocolo del estudio para este ensayo fue modificado para incluir carcinoma de células renales, carcinoma de pulmón de células no pequeñas y carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas. Se han incluido tres pacientes, que incluyen un paciente con carcinoma de células renales, en el nivel de dosis de 3 pg/kg. Los acontecimientos adversos notificados hasta la fecha fueron de leves a moderados, que incluyen fiebre, cansancio, vómitos y mialgia. No ha habido toxicidades limitantes de la dosis, toxicidades de grado 3/4 ni acontecimientos adversos intensos en ninguno de estos pacientes tratados con ALT-903, que indica que este tratamiento fue bien tolerado. Se ha informado de estabilización de la enfermedad en algunos pacientes y se espera beneficio clínico mediado por el tratamiento (que incluye disminución de la carga tumoral, progresión de la enfermedad o recaída o toxicidad, o elevada supervivencia sin progresión, tiempo hasta la progresión, duración de la respuesta, supervivencia, o calidad de vida).
Está en proceso un estudio clínico multicéntrico de ALT-803 en pacientes con tumor maligno hematológico que han recaído después del trasplante autólogo de células madre (ASCT). La primera fase de este estudio se realiza en un diseño habitual 3+3 de aumento de la dosis para toxicidad. Los pacientes incluidos reciben dosis intravenosas de ALT-803 administradas una vez a la semana durante 4 semanas. Se han incluido seis pacientes y completaron el tratamiento del estudio al nivel de dosis de 1 pg/kg de ALT-803. Para los tres primeros pacientes, los acontecimientos adversos notificados atribuidos al fármaco del estudio fueron fiebre, escalofríos moderados, escalofríos intensos y edema. La fiebre de grado 1 en dos pacientes ocurrió aproximadamente 4 a 5 horas después de la administración de ALT-803 y luego disminuyó aproximadamente 6 a 7 horas después de la administración de ALT-803. Los escalofríos intensos de grado 2 ocurrieron en dos pacientes, los escalofríos moderados de grado 2 ocurrieron en dos pacientes y los escalofríos moderados de grado 1 ocurrieron en un paciente. Los escalofríos intensos de grado 2 en un paciente requirieron Demerol para 3 de las 4 dosis de ALT-803. Un paciente tuvo un edema de grado 2 y otro paciente tuvo un edema de grado 1. Los tres primeros pacientes tuvieron hipotensión asintomática, pero los pacientes fueron normotensos después de la administración de líquido sin la reaparición de episodios de hipotensión. Ninguno de los pacientes tratados fue previamente hidratado con líquidos. La erupción cutánea de grado 2 también se observó en un paciente después de la segunda dosis de ALT-803, que estuvo de acuerdo con la enfermedad injerto contra huésped. El cuarto, quinto y sexto pacientes recibieron el tratamiento del estudio sin AE notificados. Tres pacientes completaron el tratamiento del estudio al nivel de dosis de 3 pg/kg de ALT-803. Los pacientes recibieron hidratación antes de cada dosis, los acontecimientos adversos notificados incluyen fiebre de grado 1 y escalofríos moderados 6 y 10 horas después de la administración de ALT-803. Se enrolaron tres pacientes y completaron el tratamiento al nivel de dosis de 6 pg/kg de ALT-803. Los acontecimientos adversos notificados más comunes en esta cohorte incluyen fiebre de leve a moderada, escalofríos intensos y síntomas seudogripales. Dos pacientes están tratándose al nivel de dosis de 10 pg/kg de ALT-803. Los acontecimientos adversos notificados para el primer paciente después de la primera dosis de ALT-803 incluyen fiebre transitoria, náuseas y vómitos. Los acontecimientos adversos empezaron alrededor de 3 horas después de la administración y duraron aproximadamente 4 horas. El paciente también tuvo hipotensión asintomática leve. Se administraron líquidos i.v. y la tensión arterial volvió al nivel basal. El segundo paciente tuvo fiebre transitoria y escalofríos moderados después de la primera dosis de ALT-803. Los escalofríos moderados se controlaron con Demoral. No ha habido toxicidades limitantes de la dosis, toxicidades de grado 3/4 ni acontecimientos adversos graves en ninguno de estos pacientes tratados con ALT-903, que indica que este tratamiento fue bien tolerado. El protocolo fue modificado para cambiar la administración de ALT-803 de inyección i.v. a subcutánea empezando en el nivel de dosis de 6 pg/kg. La inclusión de pacientes continuará al nivel de dosis de 10 pg/kg con administración i.v. hasta que un total de tres pacientes se incluyan en esa cohorte. Entonces se iniciará la inclusión de pacientes para inyección subcutánea a 6 pg/kg. Se espera el beneficio clínico mediado por el tratamiento (que incluye disminución de la carga tumoral, progresión de la enfermedad o recaída o toxicidad, o elevada supervivencia sin progresión, tiempo hasta la progresión, duración de la respuesta, supervivencia o calidad de vida).
Se realiza la evaluación de biomarcadores clínicos. Para el estudio de pacientes con tumor maligno hematológico después de ASCT, están disponibles datos preliminares sobre el análisis de Ki-67 de subconjuntos de linfocitos NK, CD4+, CD8+ y NKT y citocinas del suero de los especímenes antes de la dosis y después de la dosis de los pacientes. Los niveles en suero de tanto IFN-y como IL-6 fueron inducidos de un modo dependiente de la dosis dentro del intervalo de dosis de 1 pg/kg a 6 pg/kg de ALT-803. Los linfocitos T Ki67+ NK, c D8+ y CD4+ aumentaron después de la administración de ALT-803 en el nivel de dosis de >3 pg/kg en todos los pacientes. Por lo tanto, los datos preliminares sugieren que ALT-803 promueve coherentemente la activación y la proliferación de linfocitos NK, T y NKT para pacientes en el nivel de dosis de > 3pg/kg con esta indicación. Similarmente, los niveles en suero de IFN-y e IL-6 se indujeron en pacientes con tumores sólidos tras la administración de ALT-803, que indica estimulación inmunitaria relacionada con el tratamiento en estos pacientes.
Está en proceso un estudio clínico multicéntrico de ALT-803 en pacientes con mieloma múltiple recidivante o resistente al tratamiento. La primera fase de este estudio incluye un aumento de la dosis clásico (3+3) para determinar la MTD o dosis eficaz mínima (MED) y para designar un nivel de dosis para la expansión de dos etapas de fase II. Los niveles de dosis son 1,3, 6, 10 y 20 pg/kg de ALT-803. Los pacientes incluidos recibirán dos ciclos de 6 semanas que consisten en 4 dosis intravenosas de ALT-803 semanales, seguido por un periodo de reposo de 2 semanas. Los pacientes con enfermedad estable o en beneficio que cumplan los requisitos recibirán hasta dos ciclos adicionales de 6 semanas. Se enrolaron tres pacientes y completaron el tratamiento del estudio al nivel de dosis de 1 pg/kg de ALT-803. Todos los acontecimientos adversos notificados para estos pacientes fueron de leves a moderados, que incluyen estreñimiento, náuseas, cansancio, disminución de ALC y disminución del número de leucocitos. Todos los pacientes están recibiendo medicaciones previas. Dos pacientes están recibiendo tratamiento al nivel de dosis de 3 pg/kg de ALT-803. Los acontecimientos adversos notificados incluyen fiebre de leve a moderada, escalofríos intensos y neutropenia. No ha habido toxicidades limitantes de la dosis, toxicidades de grado 3/4 ni acontecimientos adversos graves en ninguno de estos pacientes tratados con ALT-903, que indica que este tratamiento fue bien tolerado. Se espera beneficio clínico mediado por el tratamiento (que incluye disminución de la carga tumoral, progresión de la enfermedad o recaída o toxicidad, o elevada supervivencia sin progresión, tiempo hasta la progresión, duración de la respuesta, supervivencia o calidad de vida). Se indujeron niveles en suero de IFN-y e IL-6 en pacientes con mieloma múltiple tras la administración de ALT-803, que indica estimulación inmunitaria relacionada con el tratamiento en estos pacientes.
Está en proceso un estudio clínico multicéntrico de ALT-803 en combinación con Bacillus Calmette-Guerin (BCG) en pacientes con cáncer de vejiga invasivo no muscular sin tratamiento previo con BCG. La primera fase de este estudio incluye un aumento de la dosis clásico (3+3) para determinar la MTD de ALT-803 y para determinar la dosis recomendada (RD) de ALT-803 combinada con BCG para la fase de expansión. Los niveles de dosis son 100, 200 y 400 pg/instilación de ALT-803 más BCG habitual (50 mg/instilación). La fase de expansión consiste en un diseño aleatorizado no comparativo de pacientes que recibieron ALT-803 al nivel de RD en combinación con BCG o BCG solo. Los pacientes incluidos recibirán BCG más ALT-803 semanalmente por un catéter urinario en la vejiga durante 6 semanas consecutivas. Se enrolaron tres pacientes y completaron el tratamiento en la primera cohorte de 100 pg/instilación de ALT-803 más BCG. Los acontecimientos adversos atribuidos al fármaco del estudio incluyeron náuseas leves, cefalea, hematuria y dolor de las vías urinarias y cistitis no infecciosa moderada. Se han incluido tres pacientes y completaron el tratamiento en los 200 pg/instilación de ALT-803 más BCG. Los acontecimientos adversos notificados atribuidos al fármaco del estudio incluyeron hematuria leve e incontinencia urinaria. Dos pacientes incluidos están con tratamiento en curso en la cohorte de 400 pg/instilación de ALT-803. No ha habido toxicidades limitantes de la dosis, toxicidades de grado 3/4 ni acontecimientos adversos graves en ninguno de estos pacientes tratados con ALT-903 más BCG, que indica que este tratamiento fue bien tolerado. Varios de estos pacientes tratados no presentaron reaparición de la enfermedad (considerada una respuesta completa en esta indicación) durante al menos 9 meses después de la terapia, lo que indica actividad clínica relacionada con el tratamiento. También se observaron aumentos relacionados con el tratamiento en citocinas urinarias en algunos pacientes. Se espera beneficio clínico mediado por el tratamiento (que incluye reducción de la carga tumoral, progresión de la enfermedad o recaída o toxicidad, o elevada supervivencia sin progresión, tiempo hasta la progresión, duración de la respuesta, supervivencia o calidad de vida).
Está en proceso un estudio clínico multicéntrico de ALT-803 más rituximab en pacientes con linfoma no hodgkiniano de linfocitos B de escasa malignidad recidivante o resistente al tratamiento. La primera fase de este estudio incluye un aumento de la dosis clásico (3+3) para determinar MTD o MED y para designar un nivel de dosis para la expansión de dos etapas de fase II. Los niveles de dosis son 1,3 y 6 pg/kg de ALT-803. Los pacientes incluidos recibirán un ciclo de inducción de 4 semanas que consiste en 4 dosis semanales de ALT-803 y rituximab habitual (375 mg/m2) por inyección intravenosa. Los pacientes con enfermedad estable o en beneficio que cumplan los requisitos recibirán hasta cuatro ciclos de tratamiento de consolidación que consiste en un único tratamiento de ALT-803 más rituximab, repetido cada 8 semanas durante un total de 4 dosis adicionales de ALT-803 y rituximab. Se incluyó un paciente y está actualmente recibiendo tratamiento al nivel de dosis de 1 pg/kg de ALT-803. Los acontecimientos adversos notificados hasta ahora para este paciente fueron de leves a moderados, que incluyen edema, disminución de ALC y disminución del número de leucocitos. No ha habido toxicidades limitantes de la dosis, toxicidades de grado 3/4 ni acontecimientos adversos intensos en el paciente tratado con ALT-903 rituximab, que indica que este tratamiento fue bien tolerado. Se espera beneficio clínico mediado por el tratamiento (que incluye disminución de la carga tumoral, progresión de la enfermedad o recaída o toxicidad, o elevada supervivencia sin progresión, tiempo hasta la progresión, duración de la respuesta, supervivencia o calidad de vida).
Se realizará un estudio clínico multicéntrico de ALT-803 más nivolumab (Ab anti-PD-1) en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas avanzado o metastásico. La primera fase de este estudio incluye un aumento de la dosis para determinar MTD de ALT-803 y para designar un nivel de dosis para la expansión de dos etapas de fase II. Los niveles de dosis son 6, 10 y 15 pg/kg de ALT-803 subcutáneo. Los pacientes incluidos recibirán dos ciclos de 6 semanas que consisten en 5 dosis semanales de ALT-803 y nivolumab por vía intravenosa habitual cada 2 semanas (3 mg/kg). Los pacientes con enfermedad estable o en beneficio cumplirán los requisitos para recibir ciclos adicionales de ALT-803 de 6 semanas más nivolumab. Se espera beneficio clínico mediado por el tratamiento (que incluye disminución de la carga tumoral, progresión de la enfermedad o recaída o toxicidad, o elevada supervivencia sin progresión, tiempo hasta la progresión, duración de la respuesta, supervivencia o calidad de vida).

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo y una composición farmacéutica que comprende un complejo de IL-15N72D:IL-15RaSu/Fc (ALT-803), en donde dicho ALT-803 comprende una IL-15RaSu/Fc dimérica y dos moléculas IL-15N72D, para su uso en un método de tratamiento de un cáncer de vejiga en un sujeto;
en donde la molécula de IL-15N72D comprende SEQ ID NO: 3;
en donde IL-15RaSu/Fc comprende SEQ ID NO: 6; y
en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-PD-1.
2. El anticuerpo y la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, caracterizado por que:
(a) dicho ALT-803 se administra diariamente; o
(b) dicho ALT-803 se administra una vez o dos veces a la semana.
3. El anticuerpo y la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 2, caracterizado por que dicho ALT-803 se administra en la alternativa (a) en una cantidad entre 0,1 pg/kg y 100 mg/kg; y en la alternativa (b) en una cantidad de 0,1 pg/kg y 1 mg/kg.
4. El anticuerpo y la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la composición farmacéutica se administra por vía sistémica, por vía intravenosa, subcutánea, por vía intramuscular, por vía intravesical o por instilación.
5. El anticuerpo y la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho sujeto es un ser humano.
6. El anticuerpo y la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicho anticuerpo y dicho ALT-803 se administran simultáneamente o uno detrás de otro.
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