CN106659775B - 基于il-15的分子及其方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出使用基于IL‑15的超兴奋剂复合体和抗体来有效治疗患有癌症和传染性疾病的对象的联合疗法。

Description

基于IL-15的分子及其方法和用途

相关申请

基于35 U.S.C.§119(e)，本申请主张2014年6月30日提交的美国专利临时申请案US 62/018,899的优先权，上述临时申请案通过引用而整体并入本文。

技术领域

本发明通常关于治疗癌症和病原体的疗法领域。

背景技术

在本文中揭示的本发明之前，急需研发新的策略来扩大及/或指导对抗癌症和被感染细胞的免疫活性。

发明内容

本发明基于，至少部分基于，下述令人惊奇的发现：抗体与ALT-803的组合可用于增强对抗瘤形成(如，胶质母细胞瘤、前列腺癌、血癌、B细胞瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、实性肿瘤、尿路上皮/膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肾细胞癌、乳腺癌、胃癌和食道癌、头颈癌、结直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、和鳞状细胞头颈癌)或感染(如，人类免疫缺陷病毒的病毒感染)的免疫应答，ALT-803是白介素-15(IL-15)超兴奋突变体与二聚体 IL-15受体α/Fc融合蛋白的复合体。

通过向对象给药有效量的抗体(或抗体样分子)和有效量的包含 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合体(ALT-803)的医药组合物来治疗对象体内瘤形成或感染的方法，其中，该ALT-803包含二聚体IL-15RαSu/Fc和两个IL-15N72D分子。一方面，该IL-15N72D分子包含SEQ ID NO:3。一个例示性IL-15RαSu/Fc包含 SEQ ID NO:6。

该对象优选需要此治疗的哺乳动物，如已经诊断患有瘤形成或感染或其倾向的对象。该哺乳动物是任何哺乳动物，如，人、灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马、以及家畜或驯养用于食用的动物，如，牛、绵羊、鸡和山羊。一个优选的具体实施例中，该哺乳动物是人。

适用于使用本文中揭示的方法治疗的瘤形成包括胶质母细胞瘤、前列腺癌、急性髓性白血病、B细胞瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、实性肿瘤、尿路上皮/膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肾细胞癌、乳腺癌、胃癌和食道癌、头颈癌、结直肠癌、及卵巢癌。使用本文中揭示的方法治疗的例示性感染是人类免疫缺陷病毒 (HIV)感染。本文中揭示的方法也可用来治疗细菌感染(如，革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌)(Oleksiewicz et al.2012.Arch BiochemBiophys.526:124-31)。

较佳地，本文中揭示的组合物的给药也在治疗该疾病后，预防瘤形成或感染的进一步复发。

此外，本发明的方法可用于自体免疫疾病的有效治疗，其中，抑制或减少与自体免疫应答相关的细胞对患者提供临床益处。此类细胞包括白细胞，特别是B 细胞或T细胞，以及，此类自体免疫疾病包括类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、牛皮癣、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、强直性脊柱炎、1型糖尿病和全身性红斑狼疮(Chan etal.2010.Nat Rev Immunol.10:301-16)。

ALT-803的例示性有效剂包括0.1μg/kg与100mg/kg体重之间，如，0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、 300、400、500、600、700、800、或900μg/kg体重，或1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100mg/kg体重。

一些例子中，每天给药ALT-803，如，每24小时给药一次。或，每天连续给药ALT-803，或每天给药若干次，如每1小时一次、如每2小时一次、每3小时一次、每4小时一次、每5小时一次、如每6小时一次、每7小时一次、每8小时一次、每9小时一次、每10小时一次、每11小时一次、或每12小时一次。

ALT-803的例示性有效日剂量包括0.1μg/kg与100μg/kg体重之间，如，0.1、 0.3、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95、或99μg/kg体重。

或者，约每周给药ALT-803一次，如每7天约一次。或，每周给药ALT-803 两次，每周三次，每周四次，每周五次，每周六次，或每周七次。ALT-803的例示性有效周剂量包括0.0001mg/kg与4mg/kg体重之间，如，0.001、0.003、0.005、 0.01.0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、或4mg/kg体重。例如，ALT-803的有效周剂量为 0.1μg/kg体重与400μg/kg体重之间。或者，以固定剂量或基于身体表面积(即，每m²)而给药ALT-803。

一些例子中，对象接收两个6周的循环，每个循环由4周ALT-803静脉剂量和之后的2周休息期组成。基本上，主治医生或兽医决定适宜的量和剂量方案。

本文中揭示的组合物经全身性给药、静脉给药、皮下给药、肌肉给药、膀胱内给药、或滴注给药。该抗体和ALT-803可同步给药或依次给药。

该抗体(Ab)优选肿瘤特异性抗体、免疫检查点抑制剂(immune checkpointinhibitor)、或抗病毒抗体。优选抗体由重链和轻链免疫球蛋白(Ig)蛋白质构成，其可包括啮齿动物型、人类型、嵌合型和人源化形式。此外，本文中揭示的方法可采用抗体样分子，如包含抗原结合域(如，单链抗体、Fab、Fv、T细胞受体结合域、配体结合域或受体结合域)的分子。一些例子中，这些域优选链接至Fc域。该Ig 可以是任何已知的同种型(如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgG2a、IgG2b、及IgM)。本文中揭示的一些使用染病靶向Ab(或抗体样分子)的应用中，该Ab(或抗体样分子)含有能与Fc受体反应以介导抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的重链或Fc域。其它例子中，可使用共轭至效应分子的抗体。其它应用如免疫检查点阻断剂的使用中，优选Ab (或抗体样分子)含有不能有效介导ADCC或ADCP的重链或Fc域(如，IgG4 Fc)。

某些具体实施例中，用于该抗体的抗原包含细胞表面受体或配体。又一具体实施例中，该抗原包含CD抗原、细胞因子或趋化因子受体或配体、成长因子受体或配体、组织因子、细胞粘附分子、MHC/MHC样分子、Fc受体、Toll样受体、 NK受体、TCR、BCR、阳性/阴性协同刺激受体或配体、死亡受体或配体、肿瘤关联的抗原、或病毒编码的抗原。

该肿瘤特异性抗体优选能结合至肿瘤细胞上的抗原。批准用于治疗癌症患者的肿瘤特异性抗体包括利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗、及奥比曲妥珠单抗(obinutuzumab)(抗CD20 Abs)；曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(抗HER2 Abs)；西妥昔单抗和帕尼单抗(抗EGFR Abs)；以及阿伦单抗(抗CD52 Ab)。同样，具有CD20(⁹⁰Y 标记的替依莫单抗、¹³¹I标记的托西莫单抗)、HER2(曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine))、CD30(brentuximab vedotin)及CD33(吉妥单抗)特异性的抗体-效应分子共轭体已经批准用于癌症治疗(Sliwkowski MX,Mellman I.2013Science 341:1192)。

此外，本发明的优选抗体可包括多种该领域已知的肿瘤特异性的其它抗体。这些用于治疗癌症的抗体及其各自靶标包括但不限于，nivolumab(抗PD-1Ab)、 TA99(抗gp75)、3F8(抗GD2)、8H9(抗B7-H3)、阿巴伏单抗(abagovomab)(抗 CA-125(仿制品))、阿德木单抗(adecatumumab)(抗EpCAM)、阿夫土珠单抗 (afutuzumab)(抗CD20)、alacizumab pegol(抗VEGFR2)、阿妥莫单抗(altumomab pentetate)(抗CEA)、amatuximab(抗间皮素)、AME-133(抗CD20)、麻安莫单抗 (anatumomab mafenatox)(抗TAG-72)、阿泊珠单抗(apolizumab)(抗HLA-DR)、阿西莫单抗(抗CEA)、巴维昔单抗(抗磷酯酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(抗CD22)、贝利木单抗(抗BAFF)、贝索单抗(besilesomab)(抗CEA相关抗原)、贝伐单抗(抗VEGF-A)、比伐单抗(bivatuzumab mertansine)(抗CD44 v6)、blinatumomab(抗CD19)、 BMS-663513(抗CD137)、brentuximab vedotin(抗CD30(TNFRSF8))、莫坎妥珠单抗(cantuzumabmertansine)(抗粘蛋白CanAg)、cantuzumab ravtansine(抗MUC1)、卡罗单抗(capromabpendetide)(抗前列腺癌细胞)、carlumab(抗MCP-1)、卡妥索单抗(catumaxomab)(抗EpCAM、CD3)、cBR96-阿霉素免疫偶联物(抗路易斯-Y抗原)、CC49(抗TAG-72)、cedelizumab(抗CD4)、Ch.14.18(抗GD2)、ch-TNT(抗DNA 关联的抗原)、西他土珠单抗(citatuzumabbogatox)(抗EpCAM)、西妥木单抗 (cixutumumab)(抗IGF-1受体)、clivatuzumabtetraxetan(抗MUC1)、conatumumab(抗 TRAIL-R2)、CP-870893(抗CD40)、dacetuzumab(抗CD40)、达利珠单抗(daclizumab) (抗CD25)、dalotuzumab(抗胰岛素样生长因子I受体)、daratumumab(抗CD38(环状ADP核糖水解酶))、demcizumab(抗DLL4)、地莫单抗(detumoma)(抗B淋巴瘤细胞)、drozitumab(抗DR5)、duligotumab(抗HER3)、dusigitumab(抗ILGF2)、ecromeximab(抗GD3神经节苷脂)、依觉洛单抗(edrecolomab)(抗EpCAM)、 elotuzumab(抗SLAMF7)、elsilimomab(抗IL-6)、enavatuzumab(抗TWEAK受体)、 enoticumab(抗DLL4)、ensituximab(抗5AC)、epitumomab cituxetan(抗episialin)、 epratuzumab(抗CD22)、ertumaxomab(抗HER2/neu,CD3)、etaracizumab(抗整合素ανβ3)、法拉莫单抗(faralimomab)(抗干扰素受体)、farletuzumab(抗叶酸受体1)、 FBTA05(抗CD20)、ficlatuzumab(抗HGF)、figitumumab(抗IGF-1受体)、 flanvotumab(抗TYRPl(糖蛋白75))、fresolimumab(抗TGFβ)、futuximab(抗EGFR)、 galiximab(抗CD80)、ganitumab(抗IGF-I)、gemtuzumab ozogamicin(抗CD33)、 girentuximab(抗碳酸酐酶9(CA-IX))、glembatumumabvedotin(抗GPNMB)、 guselkumab(抗IL13)、ibalizumab(抗CD4)、ibritumomab tiuxetan(抗CD20)、 icrucumab(抗VEGFR-1)、igovomab(抗CA-125)、IMAB362(抗CLDN18.2)、 IMC-CS4(抗CSF1R)、IMC-TR1(TGFβRII)、imgatuzumab(抗EGFR)、inclacumab (抗选择素P)、indatuximab ravtansine(抗SDC1)、inotuzumab ozogamicin(抗CD22)、 intetumumab(抗CD51)、ipilimumab(抗CD152)、iratumumab(抗CD30(TNFRSF8))、 KM3065(抗CD20)、KW-0761(抗CD194)、LY2875358(抗MET)labetuzumab(抗 CEA)、lambrolizumab(抗PDCDl)、lexatumumab(抗TRAIL-R2)、lintuzumab(抗 CD33)、lirilumab(抗KIR2D)、lorvotuzumabmertansine(抗CD56)、lucatumumab(抗 CD40)、lumiliximab(抗CD23(IgE受体))、mapatumumab(抗TRAIL-Rl)、 margetuximab(抗ch4D5)、matuzumab(抗EGFR)、mavrilimumab(抗GMCSF受体 a链)、milatuzumab(抗CD74)、minretumomab(抗TAG-72)、mitumomab(抗GD3神经节苷脂)、mogamulizumab(抗CCR4)、moxetumomab pasudotox(抗CD22)、 nacolomabtafenatox(抗C242抗原)、naptumomab estafenatox(抗5T4)、narnatumab (抗RON)、necitumumab(抗EGFR)、nesvacumab(抗血管生成素2)、nimotuzumab(抗 EGFR)、nivolumab(抗IgG4)、nofetumomab merpentan、ocrelizumab(抗CD20)、 ocaratuzumab(抗CD20)、olaratumab(抗PDGF-Rα)、onartuzumab(抗c-MET)、 ontuxizumab(抗TEMl)、oportuzumabmonatox(抗EpCAM)、oregovomab(抗 CA-125)、otlertuzumab(抗CD37)、pankomab(抗MUC1的肿瘤特异性糖基化)、 parsatuzumab(抗EGFL7)、pascolizumab(抗IL-4)、patritumab(抗HER3)、 pemtumomab(抗MUC1)、pertuzumab(抗HER2/neu)、pidilizumab(抗PD-1)、pinatuzumab vedotin(抗CD22)、pintumomab(抗腺癌抗原)、polatuzumab vedotin(抗CD79B)、pritumumab(抗波形蛋白)、PR0131921(抗CD20)、quilizumab(抗IGHE)、racotumomab(抗N-羟乙酸神经氨酸)、radretumab(抗纤连蛋白外域B)、ramucirumab (抗VEGFR2)、rilotumumab(抗HGF)、robatumumab(抗IGF-1受体)、roledumab(抗 RHD)、rovelizumab(抗CD11和CD18)、samalizumab(抗CD200)、satumomab pendetide(抗TAG-72)、seribantumab(抗ERBB3)、SGN-CD19A(抗CD19)、 SGN-CD33A(抗CD33)、sibrotuzumab(抗FAP)、siltuximab(抗IL-6)、solitomab(抗 EpCAM)、sontuzumab(抗episialin)、tabalumab(抗BAFF)、tacatuzumab tetraxetan(抗α-胎蛋白)、taplitumomab paptox(抗CD 19)、telimomab aritox、tenatumomab(抗固生蛋白C)、teneliximab(抗CD40)、teprotumumab(抗CD221)、TGN1412(抗CD28)、 ticilimumab(抗CTLA-4)、tigatuzumab(抗TRAIL-R2)、TNX-650(抗IL-13)、 tositumomab(抗CS20)、tovetumab(抗CD140a)、TRBS07(抗GD2)、tregalizumab(抗 CD4)、tremelimumab(抗CTLA-4)、TRU-016(抗CD37)、tucotuzumab celmoleukin(抗EpCAM)、ublituximab(抗CD20)、urelumab(抗4-1BB)、vantictumab(抗卷曲受体)、vapaliximab(抗AOC3(VAP-1))、vatelizumab(抗ITGA2)、veltuzumab(抗CD20)、vesencumab(抗NRP1)、visilizumab(抗CD3)、volociximab(抗整合素α5β1)、 vorsetuzumabmafodotin(抗CD70)、votumumab(抗肿瘤抗原CTAA16.88)、 zalutumumab(抗EGFR)、zanolimumab(抗CD4)、zatuximab(抗HER1)、ziralimumab (抗CD147(basigin))、RG7636(抗ETBR)、RG7458(抗MUC16)、RG7599(抗 NaPi2b)、MPDL3280A(抗PD-L1)、RG7450(抗STEAPl)、和GDC-0199(抗Bc1-2)。

可用于本发明的其它抗体或肿瘤靶标结合蛋白(如，TCR域)包括，但不限于，那些结合下列抗原(癌症标志表示非限制性实例)的：氨基肽酶N(CD13)、膜联蛋白Al、B7-H3(CD276，多种癌症)、CA125(卵巢癌)、CA15-3(癌)、CA19-9(癌)、 L6(癌)、Lewis Y(癌)、Lewis X(癌)、α胎蛋白(癌)、CA242(结直肠癌)、胎盘碱性磷酸酶(癌)、前列腺特异性抗原(前列腺癌)、前列腺酸性磷酸酶(前列腺癌)、表皮生长因子(癌)、CD2(霍奇金氏病、NHL淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、CD3ε(T细胞淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、自体免疫疾病、恶性腹水)、CD 19(B细胞恶性肿瘤)、CD20(非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞瘤、自体免疫疾病)、CD21(B细胞淋巴瘤)、CD22(白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、SLE)、CD30(霍奇金氏淋巴瘤)、 CD33(白血病、自体免疫疾病)、CD38(多发性骨髓瘤)、CD40(淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(CLL))、CD51(转移性黑色素瘤、肉瘤)、CD52(白血病)、CD56(小细胞肺癌、卵巢癌、梅克尔细胞癌、及脂质肿瘤、多发性骨髓瘤)、CD66e(癌)、 CD70(转移性肾细胞癌和非霍奇金氏淋巴瘤)、CD74(多发性骨髓瘤)、CD80(淋巴瘤)、CD98(癌)、CD123(白血病)、粘蛋白(癌)、CD221(实性肿瘤)、CD227(乳腺癌、卵巢癌)、CD262(NSCLC及其它癌症)、CD309(卵巢癌)、CD326(实性肿瘤)、 CEACAM3(结直肠癌、胃癌)、CEACAM5(CEA、CD66e)(乳腺癌、结直肠癌和肺癌)、DLL4(A样-4)、EGFR(多种癌症)、CTLA4(黑色素瘤)、CXCR4(CD 184， heme-肿瘤学，实性肿瘤)、Endoglin(CD 105、实性肿瘤)、EPCAM(上皮细胞粘附分子，膀胱癌、头颈癌、结肠癌、NHL前列腺癌、和卵巢癌)、ERBB2(肺癌、乳腺癌、前列腺癌)、FCGR1(自体免疫疾病)、FOLR(叶酸受体，卵巢癌)、FGFR(癌)、 GD2神经节苷脂(癌)、G-28(细胞表面抗原糖脂质，黑色素瘤)、GD3个体基因型 (癌)、热休克蛋白(癌)、HER1(肺癌、胃癌)、HER2(乳腺癌、肺癌和卵巢癌)、 HLA-DR10(NHL)、HLA-DRB(NHL、B细胞白血病)、人体绒毛膜促性腺激素(癌)、 IGF1R(实性肿瘤、血液癌)、IL-2受体(T细胞白血病和淋巴瘤)、IL-6R(多发性骨髓瘤、RA、卡斯尔曼氏病、IL6依赖性肿瘤)、整合素(ανβ3、α5β1、α6β4、α11β3、α5β5、ανβ5，用于多种癌症)、MAGE-1(癌)、MAGE-2(癌)、MAGE-3(癌)、MAGE 4(癌)、抗转铁蛋白受体(癌)、p97(黑色素瘤)、MS4A1(跨膜4域子族A成员1，非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、白血病)、MUC1(乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、支气管癌和胃肠癌)、MUC16(CA125)(卵巢癌)、CEA(结直肠癌)、gp1OO(黑色素瘤)、MARTI (黑色素瘤)、MPG(黑色素瘤)、MS4A1(跨膜4域子族A，小细胞肺癌、NHL)、核仁素、Neu致癌基因产物(癌)、P21(癌)、连接素-4(癌)、抗体的补位(N-羟乙酰基神经氨酸，乳腺癌、黑色素瘤癌症)、PLAP样睾丸碱性磷酸酶(卵巢癌、睾丸癌)、 PSMA(前泪腺肿瘤)、PSA(前列腺癌)、ROB04、TAG72(与糖蛋白72相关的肿瘤、 AML、胃癌、结直肠癌、卵巢癌)、T细胞跨膜蛋白(癌症)、Tie(CD202b)、组织因子、TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B，癌)、TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B，多发性骨髓瘤、NHL、其它癌症、RA和SLE)、TPBG (滋养层糖蛋白，肾细胞癌)、TRAIL-R1(肿瘤坏死凋亡诱导配体受体1，淋巴瘤、 NHL、结直肠癌、肺癌)、VCAM-1(CD 106，黑色素瘤)、VEGF、VEGF-A、VEGF-2 (CD309)(多种癌症)。已经有对一些其它肿瘤关联抗原靶标的综述(Gerber,et al, mAbs 2009 1:247-253；Novellino et al,Cancer Immunol Immunother.2005

54:187-207；Franke,et al,Cancer Biother Radiopharm.2000,15:459-76；Guo,et al., Adv Cancer Res.2013；119:421-475,Parmiani et al.J Immunol.2007,178:1975-9)。这些抗原包括分化簇(CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD 10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD14、CD15、CD16、CDwl7、CD18、CD21、CD23、CD24、 CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD31、CD32、CD34、CD35、CD36、CD37、 CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、 CD53、CD54、CD55、CD58、CD59、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、 CD68、CD69、CD71、CD72、CD79、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、 CD89、CD90、CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD106、CD109、 CD117、CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、 CD143、CD144、CD147、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、 CD166、.CD168、CD184、CDwl86、CD195、CD202(a、b)、CD209、CD235a、CD271、CD303、CD304)、膜联蛋白A1、核仁素、内皮因子(CD105)、ROB04、氨基肽酶N样-4(DLL4)、VEGFR-2(CD309)、CXCR4(CD184)、Tie2、B7-H3、 WT1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER-2/neu、个体基因型、MAGE A3、p53非突变体、NY-ESO-1、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras突变体、gp1OO、 p53突变体、蛋白酶3(PR1)、bcr-abl、酪氨酸酶、生存素、hTERT、肉瘤迁移中断点、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、 NA17、PAX3、ALK、雄性激素受体、细胞周期素B1、多唾液酸、MYCN、RhoC、 TRP-2、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYPIB I、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、 STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、 SSX2、XAGE 1、B7H3、豆素、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、 MAD-CT-2、和Fos相关抗原1。

此外，本发明的优选抗体包括该领域已知的那些具有对于与被感染细胞相关的抗原和表位靶标具有特异性的抗体。此类靶标包括但不限于来自下述感兴趣的致病因子的靶标：HIV病毒(特别是源自HIV包膜尖刺和/或gp120及gp41表位的抗原)、人乳头状瘤病毒(HPV)、结核分支杆菌、无乳链球菌、耐甲氧西林金色葡萄球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎球菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、嗜血杆菌B、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、绿脓假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产杆菌、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯性疱疹病毒I、单纯性疱疹病毒II、人血清细小病毒样病毒、呼吸道合胞体病毒、水痘-带状疱疹病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T 细胞白血病病毒、Epstein-Barr病毒、鼠科动物白血病病毒、腮腺炎病的、水疱性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病病毒、仙台病毒、猫科动物白血病病毒、呼肠孤病毒、骨髓灰质炎病毒、猿猴病毒40、鼠乳腺肿瘤病毒、登革病毒、风疹病毒、西尼罗河病毒、恶性疟原虫、间日疟原虫、刚地弓形虫、蓝氏锥虫、克氏锥虫、罗德西亚锥虫、布氏锥虫、曼氏裂体吸虫、日本裂体吸虫、牛巴贝虫、柔嫩艾美球虫、旋盘尾丝虫、利什曼原虫、旋毛虫、小泰累尔氏犁浆虫、泡状带绦虫、羊绦虫、牛肉绦虫、细粒棘球绦虫、科氏中殖孔绦虫、关节炎支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、拉氏无胆甾原体、唾液支原体和肺炎支原体。

其它具体实施例中，该抗体(或抗体样分子)具有对于免疫检查点分子或其配体的特异性，且用作免疫检查点压制活性的抑制剂或用作免疫检查点刺激活性的激动剂。此类免疫检查点分子及配体包括PD1、PDL1、PDL2、CTLA4、CD28、CD80、 CD86、B7-H3、B7-H4、B7-H5、ICOS-L、ICOS、BTLA、CD137L、CD137、HVEM、 KIR、4-1BB、OX40L、CD70、CD27、OX40、GITR、IDO、TIM3、GAL9、VISTA、 CD155、TIGIT、LIGHT、LAIR-1、Siglecs和A2aR(PardollDM.2012.Nature Rev Cancer 12:252-264；Thaventhiran T,et al.2012.J Clin CellImmunol S12:004)。此外，本发明的优选抗体包括ipilimumab和tremelimumab(抗CTLA4)、nivolumab、 pembrolizumab、pidilizumab、TSR-042、ANB011、AMP-514和AMP-224(配体-Fc融合)(抗PD1)、MPDL3280A、MEDI4736、MEDI0680、和BMS-9365569(抗PDL1)、 MEDI6469(抗OX40激动剂)、BMS-986016、IMP701、IMP731、和IMP321(抗 LAG3)。

一方面，在体外或体内将ALT-803加入抗体治疗中增加了对于对抗染病或疾病相关细胞的免疫细胞的细胞毒性。一些例子中，ALT-803能刺激免疫细胞，以扩大通过疾病特异性抗体(或抗体样分子)介导而对抗肿瘤、被感染的或自体免疫疾病相关细胞的ADCC或ADCP活性。一个具体实施例中，使用ALT-803治疗免疫细胞，将通过疾病靶向特异性抗体对抗疾病相关染病细胞的ADCC或ADCP活性增加至少5％，如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少 35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少 70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。一个优选的具体实施例中，使用ALT-803治疗免疫细胞，且使用该免疫细胞经由肿瘤特异性抗体介导的ADCC或ADCP来杀死肿瘤细胞，其中，肿瘤细胞死亡的水平为，比使用未经ALT-803治疗的免疫细胞得到的水平高至少5％或更多，如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。一个优选的具体实施例中，在给药ALT-803和抗体后，对象体内的肿瘤特异性ADCC或ADCP被扩大至少5％，如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在特别的具体实施例中，通过ALT-803治疗，扩大了基于NK细胞的ADCC活性。

其它例子中，ALT-803刺激CD4⁺和CD8⁺T细胞，以杀死染病或疾病关联的细胞，如肿瘤细胞或被感染的细胞。优选地，ALT-803治疗刺激免疫细胞的细胞溶解活性，而免疫检查点阻断剂治疗则抑制免疫压制应答，因此，这些治疗的联合提供更有效且/或更长久的对抗肿瘤或被感染细胞的活性。一些具体实施例中， ALT-803增加干扰素γ(IFN-γ)及/或IL-6的血清水平，刺激NK细胞和T细胞的增殖，并上调活化标记物包括CD25、CD69、穿孔素和颗粒酶的NK细胞和T细胞表达。这些标记物的引入可增强对免疫细胞抗染细胞的响应能力或细胞溶解活性。例如，本文中揭示的方法刺激NK细胞，以杀死肿瘤或被感染的细胞。

其它具体实施例中，ALT-803诱发其它先天免疫细胞包括中性粒细胞或单核细胞的活性及/或水平。已知此类细胞介导对抗染病细胞如肿瘤细胞或被感染细胞的治疗性抗体的ADCC和ADCP(Golay,et al.Blood.2013 122:3482-91；Richards,et al, Mol CancerTher 2008 7:2517-27)。优选地，ALT-803和抗体的联合疗法对患有癌症或感染的患者提供改善的临床响应，治疗机制为至少部分地由天然免疫细胞介导。例如，本文中揭示的方法刺激嗜中性粒细胞或单核细胞以杀死肿瘤或被感染的细胞。

优选地，本文中揭示的方法导致肿瘤或被感染的细胞数目比给药本发明组合物之前的肿瘤或被感染的细胞数目减少/降低。或者，本文中揭示的方法导致该瘤形成或感染的疾病进展降低。优选地，本文中揭示的方法导致对象的存活时间比未治疗对象的存活时间长。

一些例子中，通过向对象给药有效量的卡介苗(BCG)和有效量的包含ALT-803 的药物组合物来实施用于治疗该对象体内瘤形成或感染的方法，其中，该ALT-803 包含二聚体IL-15RαSu/Fc及两个IL-15N72D分子。例如，对象每周经由设置在膀胱中的导尿管接收BCG加上ALT-803，持续6周。

也提供用于治疗瘤形成的试剂盒，该试剂盒包含有效量的ALT-803、抗体、及使用该试剂盒治疗瘤形成的使用说明书。

用于治疗感染的试剂盒包含有效量的ALT-803、抗体、以及使用该试剂盒治疗感染的使用说明书。

在本发明可溶性融合蛋白复合体的某些方面中，IL-15多肽是具有不同于天然IL-15多肽的氨基酸序列的IL-15突变体。本文中，人类IL-15多肽指代为huIL-15、 hIL-15、huIL15、hIL15、IL-15野生型(wt)，且其突变体指代为使用成熟序列中其位置处的天然氨基酸和突变体氨基酸。例如，huIL15N72D指代人类IL-15，其包含在72位的N取代为D。一方面，IL-15突变体起IL-15激动剂的功能，如通过 IL-15RβγC受体的结合活性比天然IL-15多肽增加而表明。

或者，该IL-15突变体起IL-15拮抗剂的功能，如通过IL-15RβγC受体的结合活性比天然IL-15多肽减少而表明。

通过令复数个细胞与抗体和ALT-803接触而实施用于杀死靶标细胞的方法，其中，该复数个细胞进一步包括荷有通过IL-15域识别的IL-15R链的免疫细胞、或荷有通过Fc域识别的Fc受体链的免疫细胞、以及荷有通过该抗体(如，抗CD20 抗体)识别的抗原的靶标细胞，并杀死该靶标细胞。例如，该靶标细胞是肿瘤细胞或被感染(如，病毒感染)的细胞。

通过下述实施用于杀死表达靶标抗原的染病细胞的方法：使用有效量的 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合体(ALT-803)治疗免疫细胞，将经ALT-803治疗的免疫细胞与对靶标抗原和表达所述靶标抗原的染病细胞具有特异性的抗体混合，并经由通过该经ALT-803治疗的免疫细胞和靶标抗原特异性抗体介导的ADCC或 ADCP杀死染病细胞。一方面，与通过未经ALT-803治疗的细胞介导的方法相比，本方法杀死染病细胞的水平增加至少5％，如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。

本发明也提供预防或治疗患者体内疾病的方法，该方法中，染病细胞表达与疾病关联的抗原，该方法包括下述步骤：令复数个细胞与抗体和ALT-803接触，以及毁坏或杀死足以预防或治疗该患者体内该疾病的染病细胞。优选的具体实施例中，使用ALT-803和抗体的联合疗法可减少疾病进展且/或延长患者存活时间。

本发明提供通过对哺乳动物给药有效量的抗体和有效量的ALT-803来刺激该哺乳动物免疫应答的方法。

除了定义排除的，本文中使用的全部科技术语具有所属领域技术人员一般理解的意义。下述参考文献对技术人员提供本发明中使用的多数术语的通常定义：《微生物及分子生物学词典(第二版)》(Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and MolecularBiology(2nd ed.1994))；《剑桥科技词典》(The Cambridge Dictionary of Science andTechnology(Walker ed.,1988))；《遗传学词汇》(The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991))；以及，《哈珀柯林斯生物学词典》(Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991))。本文中，除非明确排除，下述术语具有其下方揭示的意义。

“剂”意指肽、核酸分子、或小化合物。例示性治疗剂是ALT-803。

“ALT-803”意指一种复合体，其包含与二聚体IL-15RαSu/Fc融合蛋白非共价关联的IL-15N72D，且具有免疫刺激活性。一个具体实施例中，该IL-15N72D及/或 IL-15RαSu/Fc融合蛋白包含一个、两个、三个、四个或更多个相对于参考序列的氨基酸突变。例示性IL-15N72D氨基酸序列于下文中提供。

“缓解”意指减少、压制、削弱、缩减、阻滞或稳定化疾病的发展或进展。

“类似物”意指不同但具有类似功能性或结构性特征的分子。例如，多肽类似物保留相对于天然多肽的生物学活性，同时具有某些相对于天然多肽增强该类似物功能的生化改性。此类生化改性可增加该类似物的抗蛋白酶性、膜渗透性、或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可包括非天然氨基酸。

本发明包括抗体或此类抗体的片段，只要它们展现所希望的生物学活性即可。本发明也包括嵌合抗体，如人源化抗体。通常，人源化抗体具有自其非人类来源引入的一个或多个胺基酸残基。例如，可使用该领域揭示的方法，通过将啮齿类的至少部分的互补性决定区取代为人类抗体的相应区而实施人源化。

术语“抗体”或“免疫球蛋白”倾向于涵盖多克隆和单克隆两类。优选抗体为可与抗原反应的单克隆抗体。术语“抗体”也倾向于涵盖超过一种可与抗原反应的抗体的混合物(如，不同类型的可与抗原反应的单克隆抗体的鸡尾酒混合物)。术语“抗体”进一步倾向于涵盖完整抗体、其生物学功能性片段、单链抗体，及从基因方面改变的抗体如包含来自超过一个物种的部位的嵌合抗体、双功能抗体、抗体共轭体、人源化和人类抗体。也可使用的生物学功能性抗体是那些源自足够结合至抗原的抗体的肽片段。本文中，“抗体”意指包括整个抗体以及能结合表位、抗原、或感兴趣的抗原片段的任何抗体片段(如，F(ab')2、Fab'、Fab、Fv)。

“结合至”分子意指对该分子具有理化亲和性。

“检测”指代鉴定待检测的分析质存在、不存在、或其量。

“疾病”意指毁坏或干扰细胞、组织或器官正常功能的任何情况或病变。疾病的实例包括瘤形成及感染。

术语“有效量”和“治疗有效量”的配方或配方组分意指，单独或联合使用的该配方或组分的量足以提供所希望的效果。例如，“有效量”意指相对于未治疗患者缓解疾病症状所需的单独或联合使用的化合物的量。用以实践本发明的用于治疗性处置疾病的活性化合物的有效量依给药方式和给药对象的年龄、体重及一般健康状况而改变。基本上，主治医生或兽医将决定适宜的量和剂量方案。此量指代为“有效”量。

“片段”抑制多肽或核酸分子的一部分。这一部分优选含有参考核酸分子或多肽的整体长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。例如，片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、 400、500、600、700、800、900、或1000个核苷酸或氨基酸。但是，本发明也包含多肽和核酸片段，只要它们展现全长度多肽和核酸分别展现的所希望的生物学活性即可。可采用几乎任何长度的核苷酸片段。例如，本发明的多数履行操作中包括总长度为约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50对碱基(包括全部中间长度)的例示性多核苷酸片段。同样，可采用几乎任何长度的多肽片段。例如，本发明的多数履行操作中包括总长度为约10,000、约5,000、约3,000、约2,000、约1,000、约5,000、约1,000、约500、约200、约 100、或约50个氨基酸(包括全部中间长度)。

术语“分离”、“纯化”、或“生物学纯”指代不含有不同程度的来自在其天然状态下发现的正常伴随组分的材料。“分离”表示从原始来源或周围物质分隔的程度。“纯度”表示高于分离的分隔程度。

“纯化的”或“生物学纯”蛋白质足够不含有其它材料，因此，任何杂质并不在物质上影响该胆汁的生物学性质也不造成其它不利后果。即，本发明的核酸或肽实质上不含当通过重组DNA技术生产时的细胞物质、病毒物质、或培养基，也不含当化学合成时的化学前体或其它化学品。典型使用分析化学技术，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱，来测定纯度和同质性。术语“纯化的”可表示，核酸或蛋白质于电泳凝胶中实质上产生一个条带。对于可进行改性如磷酸化或糖基化的蛋白质，不同的改性可能产生不同的经分离蛋白质，该蛋白质可分别纯化。

同样，“实质上纯”意指已经从其天然伴随组分分隔的核苷酸或多肽。典型地，以重量计，当核苷酸和多肽的至少60％、70％、80％、90％、95％、甚或99％不含它们天然关联的蛋白质和天然有机分子时，它们是实质上纯的。

“分离的核酸”意指核酸，其不含在该核酸来源的有机体的天然基因组中处于其侧翼的基因。该术语覆盖，例如：(a)DNA是天然基因组DNA分子的一部分，但其两侧未与该分子于生物体天然基因组中的侧翼部分的核酸序列侧接；(b)以一定方式并入载体或并入原核生物或真核细胞基因组DNA的核酸，因此所得分子并不与任何天然载体或基因组DNA相同；(c)独立的分子如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链反应(PCR)生产的片段、或限制性片段；以及(d)重组核苷酸序列，其实杂交基因的一部分，即编码融合蛋白的基因。根据本发明的分离的核酸分子进一步包括合成生产的分子、以及任何已经化学改性及/或具有经改性的骨架核酸。例如，分离的核酸是纯化的cDNA或RNA多核苷酸。分离的核酸分子也包括信使核糖核酸(mRNA)分子。

“分离的多肽”意指，已经从其天然伴随组分分隔的本发明的多肽。典型地，当其重量的至少60％不含其天然关联的蛋白质和天然出现的有机分子时，该多肽是分离的。优选地，以重量计，该制剂为至少75％，更优选至少90％，且最优选至少99％的本发明的多肽。例如，本发明的分离的多肽可通过从天然来源提取而获得，通过编码此多肽的重组核酸的表达而获得，或通过化学合成该蛋白质而获得。可通过任何适宜的方法如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或HPLC分析来测量纯度。

“标记物”意指在与疾病或病变相关的表达水平或活性上具有变革的任何蛋白质或多核苷酸。

“瘤形成”意指以过量增殖或减少的细胞凋亡为特征的疾病或病变。可应用本发明的例示性瘤形成包括，但不限于，白血病(如，急性白血病、急性淋巴性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏症、非霍奇金氏症)、特发性巨球蛋白血症、重链疾病、及实性肿瘤如肉瘤和癌(如，纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和食道癌、头颈癌、直肠癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎性癌、胚胎性癌肉瘤(Wilm's tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、和成视网膜细胞瘤)。特别的具体实施例中，该瘤形成是多发性骨髓瘤、β细胞淋巴瘤、尿路上皮/膀胱癌或色素瘤。本文中，“获得一剂”中的“获得”包括合成、购买、或其它获取该剂的方式。

“降低”意指负向变更5％、10％、25％、50％、75％、或100％。

“参考”意指标准或对照条件。

“参考序列”是定义用作序列比较的基准的序列。参考序列可以是具体序列的子集或整体；例如，全长度cDNA或基因序列的片段、或完全的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度将通常为至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，且甚至更优选约35个氨基酸，约50个氨基酸，或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度将通常为至少约50个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，且甚至更优选约100 个核苷酸或约300个核苷酸，或约等于它们或它们之间的任何整数。

“特异性结合”意指化合物或抗体识别并结合本发明的多肽，但其实质上不识别并结合样品如天然地包括本发明的多肽的生物样品中的其它分子。

可用于本发明方法中的核酸分子包括编码本发明多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但典型将展现实质上的一致性。具有与内源性序列的“实质上的一致性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但典型将展现实质上的一致性。具有与内源性序列的“实质上的一致性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”意指在互补性核苷酸序列(如，本文中揭示的基因)、或其部位之间在多种严格条件下配对以形成双链分子(见，如，Wahl,G.M. and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。

例如，严格的盐浓度一般将为少于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选少于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，且更优选少于约250mM NaCl和 25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可在有机溶剂如甲醛的缺席下获得，而高严格性杂交可在至少约35％甲醛且更优选至少约50％甲醛的存在下获得。严格的温度条件一般将包括至少约30℃，更优选至少约37℃，且最优选至少约42℃的温度。改变额外的参数，如杂交时间、清洁剂如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、及包括和不包括运载体DNA，是该领域技术人员所熟知的。通过如需要者合并这些各种条件，实现各种水平的严格性。一个优选的具体实施例中，杂交将于30℃出现在750 mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中。一个更优选的具体实施例中，杂交将于37℃出现在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲醛、和100 μg/ml变性鲑精DNA(ssDNA)中。一个最优选的具体实施例中，杂交将于42℃出现在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲醛、和200μg/ml ssDNA 中。这些条件的可用改变对于该领域技术人员来说显而易见。

对于大多数应用，杂交之后的洗涤步骤也可在严格性上有所改变。可通过盐浓度和温度定义洗涤严格性条件。如上所述，可通过降低盐浓度或增加温度而增加洗涤严格性。例如，洗涤步骤的严格盐浓度优选为小于约30mM NaCl和3mM 柠檬酸三钠，且最优选为小于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件一般将包括至少约25℃，更优选至少约42℃，且甚至更优选至少约 68℃的温度。一个优选的具体实施例中，洗涤步骤将于25℃出现在30mM NaCl、 3mM柠檬酸三钠、和0.1％SDS中。一个更优选的具体实施例中，洗涤步骤将于 42℃出现在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠、和0.1％SDS中。一个更优选的具体实施例中，洗涤步骤将于68℃出现在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠、和0.1％ SDS中。这些条件的额外改变对于该领域技术人员来说显而易见。杂交技术是该领域技术人员所熟知的，且揭示于例如Benton and Davis(Science 196:180,1977)、 Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)、Ausubel et al.

(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)、Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,AcademicPress,New York)、及Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York中。

“实质上相同”意指多肽或核酸分子展现至少50％的与参考氨基酸序列(例如，本文中揭示的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文中揭示的任一核酸序列)的一致性。优选地，此序列与用于比较的序列在氨基酸水平或核酸方面具有至少 60％，更优选80％或85％，且更优选90％、95％甚或99％的一致性。

典型使用序列分析软件(例如，遗传性计算机基团(Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis. 53705)的序列分析软件包的BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX 程序)来测量序列一致性。该软件通过对各种取代、消除、及/或其它改性的同源性程度赋值而匹配相同或类似的序列。保守取代典型包括下述基团中的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；及苯丙氨酸、酪氨酸。例示性的检测一致性程度的途径中，可使用BLAST程序，e^-3与e^-100之间的可能性级别表明紧密相关的序列。

“对象”意指哺乳动物，包括但不限于，人类或非人哺乳动物如牛科、马科、犬科、羊科或猫科动物。该对象优选为需要此治疗的哺乳动物，如经诊断患有B细胞淋巴瘤或其倾向的对象。该哺乳动物是任何哺乳动物，如人、灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马、以及家畜或驯养用于食用的动物如牛、绵羊、猪、鸡和山羊。一个优选的具体实施例中，该哺乳动物是人。

本文中提供的范围理解为该范围内全部数值的简化。例如，1至50的范围理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50组成的组的任意数字、数字的组合、或子区间。

本文中，术语“治疗(treating和treatment)”指代将剂或配方给药至受苦于有害状态、病变或疾病的临床有症状的个体，以造成严重性及/或症状频率下降、消除症状及/或其根本原因、及/或促进损害的改善或补救的效果。应知晓，尽管没有排除，但治疗病变或情况并不需要完全消除与其相关的病变、情况或症状。

对患有瘤形成的患者的治疗可包括下述之任何治疗：辅助疗法(也称为佐助疗法或佐治)，摧毁被认为在初始疗法(如，手术)移除已知肿瘤后可能存在的残留肿瘤细胞，从而预防可能的癌症复发；新辅助疗法，在手术之前进行，以令癌症缩小；诱导疗法，造成缓解，典型用于急性白血病；巩固疗法(也称为强化疗法)，一旦实现缓解即进行，以维持该缓解；维持疗法，以更低或更少的剂量频率进行，以帮助延长该缓解；一线疗法(也称为标准疗法)；二线(或三线、四线等)(也称为挽救疗法)，在疾病未对一线疗法产生响应或疾病再次发作时进行；以及姑息性疗法 (也称为支持疗法)，解决症状管理问题而不预期显着减轻癌症。

术语“预防(preventing和prevention)”指代将剂或组合物给药至易受有害状态、病变或疾病影响或易感染有害状态、病变或疾病影响的具有临床症状的个体，且因此关于预防症状及/或其根本原因的出现。

除非具体设定或从语境中明显可见，本文中，术语“或”应理解为包括。除非具体设定或从语境中明显可见，本文中，术语“一”和“该”应理解为单数或复数。

除非具体设定或从语境中明显可见，本文中，术语“约”应理解为处于该领域正常公差的范围内，例如，处于均值的2标准偏差范围内。约可理解为处于所设定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％的范围内。除非语境中明确为反义，本文中提供的全部数值均由约修饰。

本文中，变量的任何定义中，化学基团的列示表述包括该变量作为任何单一基团或所列基团的组合的定义。本文中，变量或形式的具体实施例的表述包括该具体实施例作为任何单一具体实施例或与任何其它具体实施例或其部分的组合。

本文中提供的任何组合物或方法可与一种或多种本文中提供的任何其它组合物或方法合用。

过渡性术语“包含”，与“包括”、“含有”、或“特征在于”同义，是包括性的或开放性的，且并不排除额外的、未引用的元件或方法步骤。与之相比，过渡性术语“由…组成”不包括该主张中未具化的任何元件、步骤或成分。过渡性短语“主要由…组成”限制所主张的具体材料或步骤“和那些并不在材料上影响本发明所主张的本质特征和新颖特征”的范畴。

从下述优选具体实施例的说明书和权利要求书可明确获知本发明的其它特征和优点。除非定义排除，本文中使用的全部科技术语具有与其所属领域技术人员一般理解的相同的意义。尽管可使用与本文中揭示的那些类似或等价的方法来实践或测试本发明，适当的方法和材料揭示于下文中。本文中引用的全部外国专利公开案和专利申请案通过引用而并入本文。本文中引用的由保藏号表明的基因银行(Genbank)和NCBI提交书通过引用而并入本文。本文中引用的其它全部已出版的参考文献、文档、手稿和科技文献通过引用而并入本文。存在冲突时，以本说明书包括定义为准。此外，该材料、方法和实施例仅做例示性说明而非限制用。

附图说明

图1A至图1F是一系列说明ALT-803对于人免疫细胞子集的体外增殖的效果的折线图。从两位健康供体血液的血沉棕黄层中分隔出人PBMC(供体A，图1A、图1C及图1E；供体B，图1B、图1D和图1F)，并在具有或不具有ALT-803的RPMI-10中培养5天(图1A和图1B)或标注时间(图1C、图1D、图1E和图1F)。以图1A和图1B中标注的浓度及10nM加入ALT-803，并使用RPMI-10作为图1C 至图1F中所示研究的培养基对照(Ctrl)。孵化结束时，使用荧光染料标记的具有对于CD4、CD8(作为T细胞的标记物)和CD16(作为NK细胞的标记物)的特异性的抗体来染色PBMC。使用FACSuite软件在FACSverse上分析细胞子集的百分比。对来自独立供体的三分重复样品进行图1A和图1B的分析，并对每一时间点的单个样品进行图1C和图1D的分析。图1E和图1F分别表示从图1C和图1D中获得的结果测定的CD4/CD8比。

图2A和图2B显示说明ALT-803对于来自不同供体的人免疫细胞子集体外增殖效果的散点图。从7位健康供体血液的血沉棕黄层分隔出人PBMC，并于单纯的培养基中或于含有0.5nM IL-15或ALT-803的培养基中培养7天。孵化结束时，使用荧光染料标记的免疫细胞子集特异性抗体染色PBMC并计数。如图2A和图 2B中所示，使用FACSuite软件在FACSverse上分析细胞子集的百分比，并计算绝对细胞计数。

图3A、图3B、图3C、及图3D是说明在使用ALT-803孵化后，免疫细胞子集上CD25分子和CD69分子上调的柱状图。从两位健康供体血液的血沉棕黄层分隔出人PBMC，并以具有标注浓度的ALT-803的RPMI-10中培养5天。使用荧光颜料标记的CD4、CD8 (作为T细胞的标记物)、CD335 (作为NK细胞的标记物)、CD25和CD69 (作为活化标记物)特异性抗体染色经ALT-803活化的PBMC。使用FACSuite软件在FACSverse上分析CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和NK细胞上CD25和CD69表达的荧光强度[几何均值(MFI)]。

图4A至图4D是说明ALT-803造成的人CD8⁺T细胞和NK细胞中颗粒酶B 和穿孔素表达上调的柱状图。从血液的血沉棕黄层分隔出人PBMC，并在具有标注浓度的ALT-803的RPMI-10中培养5天。使用荧光染料标记的CD8、CD16和 CD335(作为NK细胞的标记物)特异性抗体染色经ALT-803活化的PBMC，随后使用荧光染料标记的颗粒酶B或穿孔素特异性抗体染色。使用FACSuite软件在FACSverse上分析CD8⁺T细胞(图4A：供体1和图4C：供体2)和NK细胞(图4B：供体1和图4D：供体2)上颗粒酶B和穿孔素表达的均值荧光强度(MFI：几何均值)。

图5A、图5B、和图5C是一系列说明ALT-803对于培养中的人和鼠免疫细胞的细胞因子产生和细胞增殖效果的柱状图。人PBMC(图5A)和鼠脾细胞(图5B)在含有标注量的ALT-803的培养基中培养4天。细胞培养中分泌的细胞因子的改变显示于图5A和图5B中。基于紫染料稀释的细胞增殖响应的改变显示于图5C中。

图6A至图6D是一系列说明由ALT-803诱发的人PBMC对抗Daudi人B细胞淋巴瘤和K562人骨髓性白血病细胞的细胞毒性的折线图和柱状图。使用人PBMC 作为效应子细胞，使用Celltrace紫色标记的Daudi细胞和K562细胞作为靶标细胞。将人PBMC与K562细胞(图6A)、Daudi细胞(图6B)、或具有10nM Rituximab(抗 CD20 Ab)的Daudi细胞(图6C)以标注的E:T比在具有或不具有10nM ALT-803的 RPMI-10中混合。该细胞混合物在37℃培养3天，在FACSVerse流式细胞分析仪上通过紫色标记的靶标细胞的碘化丙啶染色分析来评估Daudi和K562靶标细胞的生存能力。将人PBMC与紫色标记的K562或Daudi细胞以10:1的比率混合，或与Daudi细胞加上Rituximab(ADCC)以2:1的比率在具有或不具有10nM ALT-803 的RPMI-10中混合。于37℃孵化1至3天后，测定靶标细胞的％细胞毒性(图6D)。

图7A和图7B是一系列说明ALT-803对于人PBMC对抗K562和Daudi细胞的细胞毒性的浓度依赖性诱导的折线图。使用人PBMC作为效应子细胞，使用 Celltrace紫标记的Daudi细胞和K562细胞作为靶标细胞。将来自两位供体(A和 B)的人PBMC与紫色标记的K562细胞或Daudi细胞以20:1的E:T比率在具有标注浓度的ALT-803的RPMI-10中混合。在37℃孵化3天后，在FACSVerse流式细胞分析仪上通过紫色标记的靶标细胞的碘化丙啶染色分析来评估Daudi和K562 靶标细胞的生存能力。

图8A至图8D是一系列显示ALT-803扩大肿瘤特异性Ab对抗肿瘤细胞的 ADCC的折线图。将来自供体1(图8A)或供体2(图8B)的新鲜的人PBMC与紫色标记的CD20阳性Daudi人B细胞淋巴瘤细胞以2:1的E:T比率在仅具有标注浓度 (0.01至10nM)的ALT-803或具有ALT-803及10nM Rituximab(抗CD20 Ab)的 RPMI-10中混合。在37℃孵化2天后，在FACSVerse流式细胞分析仪上通过紫色标记的靶标细胞的碘化丙啶染色分析来评估Daudi细胞的生存能力。在后续研究中，通过MACS从正常人PBMC中分离出NK细胞，并使用该NK细胞作为效应子细胞。将NK细胞(图8C)和耗尽NK的PBMC(图8D)分别与紫色标记的Daudi 细胞以1:1的E:T比率在含有标注浓度(0.01或0.1nM)的ALT-803且具有或不具有 10nM Rituximab或HOAT Ab的RPMI-10中混合。该细胞于37℃孵化2天。在 BD FACSVerse上通过紫色标记的Daudi细胞的碘化丙啶染色分析来评估Daudi细胞的生存能力。

图9A和图9B是藉由鼠脾细胞显示ALT-803扩大肿瘤特异性Ab对抗肿瘤细胞的ADCC的柱状图和折线图。在图9A显示的研究中，从使用PBS、ALT-803(0.2 mg/kg)、Rituximab(10mg/kg)或ALT-803+Rituximab治疗后的荷瘤SCID鼠分离出脾细胞。将该脾细胞与Celltrace紫标记的Daudi细胞以20:1的E:T比率在仅培养基或含有ALT-803(10nM)、Rituximab(10nM)或ALT-803+Rituximab的培养基的存在下混合。在37℃孵化2天后，评估Daudi靶标细胞的存活能力。也从使用 ALT-803(0.2mg/kg)治疗后的Balb/c鼠分离出脾细胞(图9B)。将该脾细胞与 Celltrace紫标记的HER2阳性的SK-BR-3人乳腺癌细胞以10:1的E:T比率在仅培养基或含有多种浓度的抗HER2抗体(克隆24D2)、ALT-803、或两种剂的培养基的存在下混合。在37℃孵化24小时后，评估SK-BR-3靶标细胞的存活能力。

图10是显示SCID鼠体内ALT-803加上抗CD20抗体对抗人B淋巴瘤的抗肿瘤功效的柱状图。使用PBS、ALT-803(0.2mg/kg)、Rituximab(10mg/kg)或 ALT-803+Rituximab治疗荷有Daudi细胞肿瘤的Fox Chase SCID雌性鼠。在末次治疗的4天后，测定骨髓中的Daudi细胞。

图11是显示SCID鼠体内ALT-803加上抗CD20抗体对抗人B淋巴瘤的抗肿瘤功效的柱状图。使用PBS、Rituximab、或Rituximab加上各种浓度的ALT-803 治疗荷有Daudi细胞肿瘤的Fox Chase SCID雌性鼠。在末次治疗的4天后，测定骨髓中的Daudi细胞。

图12是显示荷有Daudi细胞肿瘤的小鼠在ALT-803加上抗CD20 Ab疗法后的存活时间延长的折线图。使用PBS、Rituximab(10mg/kg)、ALT-803(0.05mg/kg) 或Rituximab+ALT-803治疗荷有Daudi细胞肿瘤的Fox Chase SCID雌性鼠。监控该鼠的存活时间，并绘制Kaplan-Meier存活曲线。

图13A和图13B是一系列显示荷有CT26结肠癌肺转移的鼠在ALT-803和 ALT-803加上抗CTLA-4Ab疗法后存活时间延长的折线图。使用图中标注的PBS、 ALT-803、IL-15单一疗法及其与抗CTLA4 Ab和抗PD-L1 Ab的组合疗法来治疗荷有CT26结肠癌肺转移的BALB/c鼠。监控该鼠的存活时间，并绘制Kaplan-Meier 存活曲线。

图14A和图14B是一系列说明荷有5T33P骨髓瘤的鼠在ALT-803加上抗 PD-L1 Ab疗法后存活时间延长的折线图。图14A中，使用图中标注的PBS、 ALT-803、IL-15单一疗法及其与抗CTLA4 Ab和抗PD-L1 Ab(0.2mg/鼠)的组合疗法来治疗荷有5T33P骨髓瘤的C57BL/6鼠。监控该鼠的存活时间，并绘制 Kaplan-Meier存活曲线。图14B中，使用图中标注的PBS、次优ALT-803(0.05 mg/kg)、次优抗PD-L1 Ab(5μg)、或ALT-803+抗PD-L1 Ab的组合来治疗荷有5T33P骨髓瘤的C57BL/6鼠。监控该鼠的存活时间，并绘制Kaplan-Meier存活曲线。

图15A和图15B是一系列显示PD1和CTLA4的配体在肿瘤细胞上的表达的图。使用PD-L1、CD86和CD80(红线)特异性抗体或同种型对照(黑线)染色CT26 (图15A)和5T33P(图15B)肿瘤细胞，随后使用流式细胞分析仪分析。

图16A、图16B、图16C、图16D、图16E、及图16F时一系列显示在使用 ALT-803多剂量治疗后和治疗后回收所观察到的鼠体内改变的柱状图。

图17是显示ALT-803在食蟹猴体内的药代动力学模式的折线图。

图18A至图18H是一系列显示多剂量ALT-803治疗和治疗后回收的食蟹猴体内免疫细胞计数改变的折线图。

图19A和图19B是一系列显示荷有正位MB491uc膀胱肿瘤的鼠在ALT-803 加上检查点阻滞疗法后存活时间延长的折线图。图19A中，使用图中标注的PBS、 ALT-803、及ALT-803与抗CTLA4 Ab和抗PD-L1 Ab的联合疗法来治疗荷有正位 MB491uc膀胱肿瘤的C57BL/6鼠。监控该鼠的存活时间，并绘制Kaplan-Meier存活曲线。80天后，ALT-803+抗PD-L1/抗CTLA4-Ab组的存活鼠和未治疗的同龄鼠再次挑战MB491uc肿瘤细胞的囊内给药。进一步监控鼠的存活。图19B中，使用图中标注的PBS、ALT-803、抗PD-1Ab、抗CTLA-4Ab、或联合疗法治疗荷有MB491uc膀胱肿瘤的C57BL/6鼠。监控该鼠的存活时间，并绘制Kaplan-Meier存活曲线。

图20是一系列显示PD1和CTLA4的配体在MB491uc肿瘤细胞上的表达的流式细胞分析图。使用PD-L1、CD86和CD80(蓝线)特异性抗体或同种型对照(黑线) 染色MB491uc肿瘤细胞，随后使用流式细胞分析仪分析。

图21A至图21C是一系列显示ALT-803和TA99在同基因鼠科动物黑色素瘤模型中的组合效果的折线图。图21A中，将B16F10黑色素瘤细胞(2x l0⁵个)经皮下注射入C57BL/6鼠身体的一侧。一旦形成可触知的肿瘤，即在研究的第10、14、 17、21和24天，对该鼠随机静脉注射0.2mg/kg ALT-803、10mg/kg TA99、ALT-803 +TA99的组合、或PBS对照。图21B和图21C显示对该组合疗法的抗肿瘤免疫力中牵涉的不同细胞子集的效果或功能的评估。分别通过腹腔内注射大鼠mAb GK1.5(抗CD4)和53.6.72(抗CD8a)来实施CD4⁺和CD8⁺T细胞的耗尽。通过腹腔内给药鼠科动物mAb PK136(抗NK1.1)来实现NK细胞的耗尽。对于巨噬细胞的耗尽，对小鼠腹腔内注射载有氯膦酸盐的脂质体(Clophosome)。使用肿瘤生长(图 21B)和鼠存活(图21C)来评价该耗尽的影响。存活曲线显示，当动物由于肿瘤转移或肿瘤到达肿瘤负荷的阈值尺寸(一个维度>20mm)而死亡时的研究天数。n＝8/ 组。**：p<0.01；***：p<0.001。

图22A至图22D是一系列说明脾和肿瘤微环境中ALT-803介导的免疫细胞增加的柱状图。图22A至图22D中，在研究的第0天(SD0)对鼠(n＝6)注射(皮下) B16F10黑色素瘤细胞(2x l0⁵个)，在SD17静脉注射TA99、ALT-803、ALT-803+ TA99的组合、或PBS进行治疗。在SD20，使用流式细胞分析仪定量CD8⁺T细胞 (CD8a⁺)、CD4⁺T细胞(CD4⁺)、NK细胞(panNK⁺)、B细胞(CD19⁺)、及巨噬细胞(F4/80⁺) 在脾细胞(图22A)和TIL(7-AAD^-CD45⁺，图22B)中的百分比。测量并绘制脾细胞群落(图22C)和TIL(图22D)的CD8⁺T细胞中CD8⁺CD44^高记忆T细胞的百分比。

图23A至图23C是一系列说明ALT-803+TA99提供对于肿瘤挑战的免疫保护的折线图。图23A至图23B中，在研究的第0天(SD0)，经皮下移植B16F10细胞 (2x l0⁵个)的鼠(n＝20)立即静脉注射PBS、TA99、或TA99+ALT-803进行治疗。治疗三周并监控两个月后，未经任何处置的动物和幸存动物再次进行身体对侧皮下注射B16F10细胞(2x l0⁵个)的挑战。测量并绘制初始肿瘤挑战过程中动物的无肿瘤(动物皮下肿瘤体积保持在<50mm³)存活时间(图23A)和再次挑战过程中的肿瘤生长(图23B)。TB＝荷肿瘤。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001。图23C中，在研究的第58天(SD-58)，将鼠科动物黑色素瘤B16F10细胞(2x l0⁵个/鼠)皮下注射入C57BL/6鼠身体的一侧。如图23A图中所示对该鼠注射B16F10细胞，从第0 天开始，每周静脉注射两次ALT-803(0.2mg/kg)和TA99(10mg/kg)进行治疗，注射三周。在接种肿瘤后第46天，对无肿瘤小鼠腹腔内给药抗CD4(GK1.5)、抗CD8 (53-6.72)和/或抗NK(PK136)，以耗尽CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、或NK细胞。为了评价无肿瘤鼠的抗肿瘤记忆响应，在第一次接种肿瘤后的第58天(SD0)，将 B16F10细胞(2x l0⁵个/鼠)皮下注射至身体对侧。对未治疗的首次实验鼠注射 B16F10细胞作为对照。存活曲线总结了当动物由于肿瘤转移或阈值尺寸(肿瘤体积>4000mm³)而死亡时的研究天数。n＝10/组。

图24A至图24E是一系列显示ALT-803活化CD4⁺T细胞并上调其PD-L1表达但降低CD8⁺T细胞上的PD-1表达的柱状图。进行测试物质的单一注射后的第三天，使用抗CD25(图24A)或抗PD-L1(图24B和图24C)抗体染色来自荷肿瘤鼠 (n＝6)的TIL(7-AAD^-CD45⁺)级分(图24A和图24C)和脾(图24B)的CD4⁺T细胞 (CD4⁺)，再通过流式细胞分析仪定量。进行测试物质的单一注射后的第三天，使用抗PD-1(图24D和图24E)染色来自荷肿瘤鼠(n＝6)脾(图24D)和TIL(7-AAD^-CD45⁺) 级分(图24E)的CD8⁺T细胞(CD8⁺；图24D和图24E)，再通过流式细胞分析仪定量。使用均值荧光强度(MFI)将PD-L1和PD-1的表达分级。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001。

图25A至图25D是一系列显示ALT-803活化NK细胞并下调NK细胞上PD-1 表达的柱状图。进行测试物质的单一注射后的第三天，使用抗KLRG1抗体(图25A 和图25B)和抗PD-1抗体(图25C和图25D)染色来自荷肿瘤鼠(n＝6)脾(图25A和图 25C)和TIL(7-AAD^-CD45⁺)级分(图25B和图25D)的NK细胞(panNK⁺)，再使用流式细胞分析仪定量。使用均值荧光强度(MFI)将KLRG1和PD-1的表达分级。*： p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001。

图26A至图26B是一系列显示ALT-803/TA99和抗PD-L1 mAb在同基因鼠科动物黑色素瘤模型中的组合效果的折线图。图26A中，将B16F10黑色素瘤细胞(2 x l0⁵个)皮下注射入C57BL/6鼠的右背侧。一旦形成可触知的肿瘤，在研究的第10、 14、17、21和24天，对鼠随机使用0.2mg/kg ALT-803(i.v.)和10mg/kg TA99(i.v.) 治疗，同时使用或不使用100μg/鼠的抗PD-L1 Ab 10F.9G2(i.p.)。*：p<0.05；***： p<0.001。图26B显示PD-L1在B16F10细胞上的体外和体内表达。使用荧光染料标记的抗PD-L1抗体(红色)染色从体外培养(实线)和荷肿瘤鼠(虚线)获得的B16F10 细胞，使用流动细胞分析仪分析。包括抗体同种型(黑色)作为阴性对照。

具体实施方式

本发明基于，至少部分地基于，下述令人惊奇的发现：抗体与ALT-803的组合可用于增强对抗瘤形成(如，胶质母细胞瘤、前列腺癌、血癌、B细胞瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、实性肿瘤、尿路上皮/膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肾细胞癌、乳腺癌、头颈癌、结直肠癌、及卵巢癌)或感染(如，人免疫缺陷性病毒感染)的免疫应答，该ALT-803是白介素15(IL-15)超兴奋剂突变体与二聚体IL-15受体α/Fc融合蛋白的复合体。

ALT-803

ALT-803包含IL-15突变体，该突变体具有增加的结合IL-2Rβγ的能力和提升的生物学活性(美国专利US 8,507,222，通过引用而并入本文)。IL-15的这一超兴奋剂突变体揭示于出版物(J Immunol 2009 183:3598)中，以及已经由美国专利及商标局授权的专利和待授权的专利申请(如，US 12/151,980和US 13/238,925)中。这一IL-15超兴奋剂与可溶性IL-15α受体融合蛋白(IL-15RαSu/Fc)的组合导致具有高潜在IL-15体外和体内活性的蛋白复合体(Han et al.,2011,Cytokine,56:804-810； Xu,et al.,2013Cancer Res.73:3075-86；Wong,et al.,2013,Oncolmmunology 2:e26442)。这一IL-15超兴奋剂复合体(IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc)指代为ALT-803。药代动力学分析表明，该复合体在静脉注射给药至鼠体内后的半衰期为25小时。 ALT-803在免疫活性鼠体内展现了杰出的对抗侵略性实体和血液肿瘤模型的抗肿瘤活性。其可作为单一疗法给药，剂量方案为每周两次或每周一次；或作为与抗体的组合疗法。ALT-803的抗肿瘤响应也是持久的。使用ALT-803治疗后治愈的荷肿瘤鼠，对于使用相同肿瘤细胞的再次挑战也具有高度抗性，表明ALT-803诱发了对抗再次引入的肿瘤细胞的有效免疫记忆响应。

白介素-15

对于效应子NK细胞和CD8⁺记忆T细胞的发展、增殖和活化，白介素15(IL-15) 是重要的细胞因子。IL-15结合至IL-15受体α(IL-15Rα)，并存在于至效应子细胞上IL-2/IL-15受体β-一般γ链(IL-15Rβγ_c)复合体的转化中。IL-15和IL-2共享与 IL-15Rβγ_c的结合，并通过STAT3和STAT5通路发出信号。但是，IL-2也支持 CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺调节性T(Treg)细胞的维护，并诱发经活化的CD8⁺T细胞的死亡。这些效果可限制IL-2对抗肿瘤的治疗活性。IL-15并不与IL-2分享这些免疫压制活性。此外，IL-15是已知向效应子CD8⁺T细胞提供抗凋亡信令的唯一的细胞因子。IL-15，或单独给药或作为与IL-15Rα的复合体而给药，在实验动物模型中展现了潜在的对抗已确认实性肿瘤的抗肿瘤活性，并因此已经证实为可潜在地治愈癌症的最有希望的免疫治疗性药物之一。

为了促进基于IL-15的癌症疗法的临床发展，已经证实IL-15突变体 (IL-15N72D)具有比IL-15增加的生物学活性(Zhu et al.,J Immunol,183:3598-3607, 2009)。IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合复合体(ALT-803)的创建进一步改进了这一 IL-15超兴奋剂(IL-15N72D)的药代动力学和生物学活性，因此，该超兴奋剂复合体具有至少25倍于体内天然细胞因子的活性(Han et al.,Cytokine,56:804-810,2011)。

Fc域

ALT-803包含IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合复合体。已经报导了将IgG的Fc 区域和另一蛋白的该区域联合的融合蛋白，如各种细胞因子和可溶性受体(见，例如，Capon etal.,Nature,337:525-531,1989；Chamow et al.,Trends Biotechnol., 14:52-60,1996；美国专利US 5,116,964和US 5,541,087)。该原型融合蛋白是通过 IgG Fc铰链区域内的半胱氨酸残基链接的同型二聚体蛋白，获得与IgG分子类似的分子，但不具该重链变量和C_H1域及轻链。包含该Fc域的融合蛋白的二聚体本性在提供与其它分子的高阶相互作用(即，二价或双特异性结合)中可能具有优势。由于结构上的同源，Fc融合蛋白展现与类似同种型的人IgG相当的体内药代动力学模式。IgG类的免疫球蛋白是人血液中含量最多的蛋白质，其循环半衰期可长达 21天。为延长IL-15或IL-15融合蛋白的循环半衰期及/或增加其生物学活性，已经做成一种含有IL-15域的融合蛋白复合体(如，ALT-803)，其中，该IL-15域非共价键结至IL-15RαSu，而该IL-15RαSu共价链接至人重链IgG蛋白的Fc部位。

术语“Fc”指代抗体的非抗原结合片段。此“Fc”可能是单体形式或多聚体形式。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选为人源，且可以式任何免疫球蛋白，但优选IgG1 和IgG2。天然的Fc由单体多肽和非共价联合组成，该单体多肽可由共价键(即，二硫键)链接为二聚体或多聚体形式。依据类别(如，IgG、IgA、IgE)或子类别(如， IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)，天然Fc分子中单体次单元之间的分子间二硫键的数目为1至4的范围。天然Fc的一个实例是从IgG的木瓜蛋白酶消解获得的经二硫键而键结的二聚体(见，Ellison et al.(1982),Nucleic Acids Res.10:4071-9)。本文中，术语“天然Fc”是单体形式、二聚体形式、及多聚体形式的统称。Fc域含有用于蛋白A、蛋白G、各种Fc受体、及补体蛋白的结合位点。

一些具体实施例中，术语“Fc变体”指代从天然Fc改性的分子或序列，但仍包含用于救援受体FcRn的结合位点。国际专利WO 97/34631(1997年9月25日公开)和WO 96/32478揭示了例示性Fc变体以及与救援受体的相互作用，该专利通过引用而并入本文。因此，术语“Fc变体”包含从非人天然Fc人源化的分子或序列。再者，天然Fc包含可移除的位点，因为这些位点提供本发明的融合分子并不需要的结构特征或生物学活性。因此，某些具体实施例中，术语“Fc变体”包含缺少天然Fc的一个或多个位点或残基的分子或序列，该位点或残基影响或牵涉入(1)二硫键形成、(2)与所选择的宿主细胞不相容、(3)在所选择的宿主细胞内表达时的 N-端异质性、(4)糖基化、(5)与补体的相互反应、(6)结合至非救援受体的Fc受体、(7)抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、或(8)抗体依赖性的细胞吞噬作用(ADCP)。Fc变体进一步详细揭示于后文中。

术语“Fc域”涵盖天然Fc及上文定义的Fc变体分子和序列。正如Fc变体及天然Fc，术语“Fc域”包括单体形式或多聚体形式的分子，无论是从整个抗体消解的或通过重组基因标号或其它手段生产的。

融合蛋白复合体

本发明提供ALT-803，其实IL-15N72D与IL-15RαSu/Fc之间的蛋白复合体。某些具体实施例中，该ALT-803多肽可用作融合至其它蛋白域的支架。此类融合蛋白复合体中，第一融合蛋白包含共价链接至白介素15(IL-15)或其功能性片段的第一生物学活性多肽；且第二融合蛋白包含共价链接至可溶性白介素15受体α (IL-15Rα)多肽或其功能性片段的第二生物学活性多肽，其中，第一融合蛋白的 IL-15域结合至第二融合蛋白的可溶性IL-15Rα域，以形成可溶性融合蛋白复合体。本发明的融合蛋白复合体也包含链接至该第一和第二融合蛋白的一者或两者的免疫球蛋白Fc域或其功能性片段。优选地，链接至该第一和第二融合蛋白的该Fc 域相互反应以形成融合蛋白复合体。此复合体可通过在免疫球蛋白Fc域之间形成二硫键而稳定化。某些具体实施例中，本发明的可溶性融合蛋白复合体包括IL-15多肽、IL-15变体或其功能性片段以及可溶性IL-15Rα多肽或其功能性片段，其中， IL-15和IL-15Rα多肽的一者或两者进一步包括免疫球蛋白Fc域或其功能性片段。

又一具体实施例中，该第一和第二生物学活性多肽的一者或两者包含抗体或其功能性片段。

另一具体实施例中，用于该抗体域的抗原包含细胞表面受体或配体。

又一具体实施例中，该抗原包括CD抗原、细胞因子或趋化因子受体或配体、生长因子受体或配体、组织因子、细胞粘附分子、MHC/MHC样分子、Fc受体、 Toll样受体、NK受体、TCR、BCR、阳性/阴性协同刺激受体或配体、死亡受体或配体、肿瘤相关的抗原、或病毒编码的抗原。

本文中，术语“生物学活性多肽”或“效应子分子”意指，可产生本文中讨论的所希望的效果的氨基酸序列如蛋白质、多肽或肽；糖或多糖；脂质或糖脂质、糖蛋白、或脂蛋白。效应子分子也包括化学剂。还预期编码生物学活性或效应子蛋白、多肽、或肽的效应子分子核酸。因此，适宜的分子包括调节因子、酶、抗体、或药物以及DNA、RNA和寡核苷酸。该生物学活性多肽或效应分子可以是天然出现的，或其可从已知成分如通过重组或化学合成方法而合成且可包括异源性组分。生物学活性多肽或效应子分子通常为介于约0.1与100KD之间或更大至约1000 KD，优选介于约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30与50KD之间，如通过标准分子大小测定技术如离心或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所判断的。本发明的所希望的效果包括，但不限于，例如，形成具有增加的结合活性的本发明的融合蛋白复合体；杀死靶标细胞，以诸如诱发细胞增殖或细胞死亡、启动预防或治疗疾病中的免疫应答、或用作诊断目标的检测分子。对于该检测，可使用化验，例如，包括培养细胞以令其增殖的连续步骤的化验。

根据本发明而将该效应子分子共价链接至本发明的融合蛋白复合体提供的大量显着优点。本发明的融合蛋白复合体可制造为含有单一效应子分子，包括已知结构的肽。此外，可在类似的DNA载体中生产多种效应子分子。即，无数的不同效应子分子可链接至融合蛋白复合体，用于识别被感染的细胞或染病的细胞。再者，对于治疗性应用，可给药编码该融合蛋白复合体的DNA表达载体至对象而用于该融合蛋白复合体的体内表达，而不是给药本发明的融合蛋白复合体至该对象。该途径避免了典型与重组蛋白质的制备关联的昂贵的纯化步骤，且避免了抗原摄取和与传统途径相关的加工处理的复杂性。

注意，本文中揭露的融合蛋白和抗体的成分，如，效应子分子共轭体如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质毒素、免疫球蛋白域或其它生物活性分子以及任何肽链接基，几乎可以任何样式组织，只要该融合蛋白或抗体具有想要的功能即可。特别地，如需要，该融合蛋白的各成分可通过至少一个适当的肽链接序列与另一成分分隔开来。此外，该融合蛋白可包括标签，如促进该融合蛋白的改性、鉴别及/或纯化。

药物治疗剂

本发明提供包含ALT-803作为治疗剂的药物组合物。一方面，ALT-803是全身性给药的，例如，配伍于药学可接受的缓冲剂如生理盐水中。优选的给药路径包括，例如，在患者体内提供连续、维持性水平的组合物的滴注入膀胱中、皮下注射、静脉注射、腹膜内注射、肌肉注射、或皮内注射。使用处于生理学可接受的载剂内的治疗有效量的本文中鉴别的治疗剂实施对人类患者或其它动物的治疗。适当的载剂及其配方揭示于，例如，E.W.Martin等人编着的《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)中。待给药的治疗剂的量依据给药方式、患者的年龄和体重、及该瘤形成或感染的临床症状而变。通常，该量处于其它与瘤形成或感染相关疾病的治疗中使用的其它剂用量的范围内，但在某些例子中，因为该化合物的特异性增加，将会需要更低的量。以该领域技术人员通过已知的方法确定的增强对象免疫应答或降低瘤形成细胞增殖、存活或侵袭性的量给药化合物。或者，可以降低病毒或其它感兴趣的病原体的感染的剂量给药该化合物。

药物组合物的配方

给药ALT-803用于治疗瘤形成或感染，可通过导致与其它成分合并的治疗剂的浓度足以缓解、减轻或安定化瘤形成或感染的任何适当手段进行。ALT-803可以任何适宜的量包含于任何适当的载剂物质中，且基于该组合物的总重，以重量计，通常以1至95％的量存在。该组合物可提供为适用于非经肠(如，皮下、静脉、肌肉、囊内、或腹腔内)给药路径的剂型。该药物组合物可根据传统药学实践进行配置(见，如，Lippincott Williams和Wilkins在2000年出版的A.R.Gennaro编纂的《雷明顿：药学科学与实践(第20版)》(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(20th ed.))；以及J.Swarbrick和J.C.Boylan编纂的《制药技术百科全书》 (Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,1988-1999,Marcel Dekker,New York))。

可通过从鼠或非人灵长类所使用的化合物的量外推而初步确定人类的剂量，而熟练技工能够辨识该领域中人类的剂量相对于动物模型改变的原则。某些具体实施例中，预期该剂量可从约0.1μg化合物/kg体重至约5000μg化合物/kg体重之间改变；或从约1μg/kg体重至约4000μg/kg体重之间改变，或从约10μg/kg体重至约3000μg/kg体重之间改变。其它具体实施例中，这一剂量可为约0.1、0.3、0.5、 1、3、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、 550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、 1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、 3000、3500、4000、4500、或5000μg/kg体重。其它具体实施例中，设想该剂量可处于0.5μg化合物/kg体重至约20μg化合物/kg体重的范围内。其它具体实施例中，该剂量可为约0.5、1、3、6、10、或20mg/kg体重。当然，常规以此治疗策略进行，这一剂量可依据初始临床试验的结果和特定患者所需上调或下调。

在特别的具体实施例中，将ALT-803配制于适用于非经肠给药的赋形剂中。在特别的具体实施例中，以0.5μg/kg至约15μg/kg(如，0.5、1、3、5、10、或15 μg/kg)给药ALT-803。

对于膀胱癌的治疗，通过滴注入膀胱中而给药ALT-803。滴注方法是已知的。见，例如，Lawrencia,et al.,Gene Ther 8,760-8(2001)；Nogawa,et al.,J Clin Invest 115,978-85(2005)；Ng,et al.,Methods Enzymol 391,304-13 2005；Tyagi,et al.,J Urol171,483-9(2004)；Trevisani,et al.,J Pharmacol Exp Ther 309,1167-73(2004)；Trevisani,et al.,Nat Neurosci 5,546-51(2002))；(Segal,et al.,1975)。(Dyson,etal., 2005)。(Batista,et al.,2005；Dyson,et al.,2005)。某些具体实施例中，预期用于滴注的ALT-803剂量可从约5至1000μg/剂之间改变。其它具体实施例中，该膀胱内剂量可为约25、50、100、200、或400μg/剂。其它具体实施例中，通过与标准治疗剂包括丝裂霉素C或卡介苗(BCG)联合滴注入膀胱内而给药ALT-803。

药物组合物是与适宜的赋形剂配制为药物组合物，并于给药后以受控的方式释放治疗剂。实例包括单个或多个单元的片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮剂、乳液、微胶囊、微球、分子络合物、纳米颗粒、贴剂、及脂质体。

非经肠组合物

该包含ALT-803的药物组合物可通过注射、输液或移植(皮下、静脉、肌肉、囊内、腹膜内等)以剂型、配方、或经由适当的输送装置或含有传统的、无毒的、药学可接受的载剂和佐剂进行非经肠给药。此类组合物的配方和制备是药物配方领域技术人员所熟知的。配方可在上文的《Remington:The Science and Practice of Pharmacy》中找到。

用于非经肠用途的包含ALT-803的组合物可提供为单位剂型(如，单剂安瓿、注射器或袋中)，或可提供于含有若干剂的小瓶中，且该小瓶中可加入适当的防腐剂(见下文)。该组合物可以是溶液、悬浮液、乳液、输液装置、或用于移植的输送装置的形式，或可作为干粉存在，而该干粉可与水或其它适当的运载剂在使用前重构。该组合物除了包括减轻或缓解瘤形成或感染的活性剂之外，还可包括适当的非经肠给药可接受的载剂和/或赋形剂。该活性治疗剂可并入微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中用于控释。此外，该组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、 pH调节剂、张度调节剂、和/或分散剂。

如上文说明，包含ALT-803的药物组合物可以是适用于无菌注射的形式。为了制备这一组合物，将适当的活性抗肿瘤/抗感染治疗剂溶解或悬浮于非经肠给药可接受的液体运载剂中。在可接受的运载剂和溶剂中，可采用水、通过加入适宜量的盐酸、氢氧化钠或适当缓冲液而调节至适当pH的水、1,3-丁二醇、林格溶液，以及等渗氯化钠溶液和葡萄糖溶液。该水性配方也可含有一种或多种防腐剂(如，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在该化合物之一仅少溶或微溶于水的例子中，可加入溶解增强剂或助溶剂，或该溶剂可包括10至60％w/w的丙二醇等。

本发明提供治疗瘤形成或感染性疾病及/或其病变或症状的方法，该方法包含给药治疗有效量的包含本文所提出化合物的药物组合物至一对象(如，哺乳动物如人)。因此，一个具体实施例为治疗患有或易感瘤形成或感染性疾病或其病变或症状的对象的方法。该方法包括给药治疗量的本文中的化合物至该哺乳动物以治疗疾病或其病变或症状的步骤，其中，该量足以在一定条件下治疗待治疗的疾病或病变。

本文的方法包括对该对象(包括鉴别为需要此治疗的对象)给药有效量的本文揭示的化合物或本文揭示的组合物，以产生给效果。鉴别需要此治疗的对象处于对象或医疗服务人员判断的范畴，且可以是主观的(如，主张)或客观的(如，通过测试或诊断方法可测量的)。

本发明的治疗性方法(其包括预防性治疗)通常包含将治疗有效量的本文的化合物，如本文提出的化合物，给药至由此需要的对象(如，动物、人)，该对象包括哺乳动物，特别是人。该治疗将会适当地施用至罹患、具有、易感瘤形成或感染疾病、病变或其症状，或处于瘤形成或感染类疾病、病变或其症状的风险下的对象，特别是人。确定这些对象“处于风险下”可通过任何客观或主观决定通过诊断性测试或对象或医疗服务人员的主张(如，基因测试、酶或蛋白质标记物、标记物(如本文中定义的)、家族病史等)而做出。ALT-803可用于治疗任何其它病变，只要该治疗需要免疫应答的增加即可。

一个具体实施例中，本发明提供监控治疗进展的方法。该方法包括测定罹患或易感与瘤形成或感染相关的并不或症状的对象体内的诊断性标记物(标记物) (如，任何本文中描绘的由本文的化合物调整的靶标、蛋白质或其指示剂等)或诊断性测量(如，筛选、化验)，其中，该对象已经给药治疗有效量的足以治疗疾病或其症状的本文的化合物。可将该方法中测得的标记物水平与监控正常对照或其它患病患者体内标记物的已知水平比较，以构建该对象的疾病状态。在优选的具体实施例中，在测得该第一水平之后的时间点测得该对象体内标记物的第二水平，比较两种水平，以监控疾病的进程或治疗的功效。某些优选的具体实施例中，在开始根据本发明进行治疗之前测得该对象体内治疗前的标记物水平；随后，将这一治疗前的标记物水平与治疗开始后该对象体内的标记物水平相比较，以确定该治疗的功效。

联合疗法

优选将ALT-803与抗瘤形成或抗感染治疗剂如抗体如肿瘤特异性抗体或免疫检查点抑制剂联合给药。该抗体和ALT-803可同步给药或依次给药。一些具体实施例中，抗体治疗是疾病迹象的既定疗法，且将ALT-803治疗加入抗体方案中改善了对于患者的治疗性益处。这一改善可作为每一患者的响应增加或患者群体的响应增加而予以测量。

联合疗法也可以较低或更低频率剂量的抗体提供改善的响应，导致更容易接纳的治疗方案。如文，ALT-803和抗体的联合疗法可通过多种机制提供提升的临床活性，该机制包括扩大的ADCC、ADCP、及/或NK细胞、T细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞水平或免疫应答。

若需要，ALT-803与任何传统疗法联合给药，该传统疗法包括但不限于手术、放疗、化疗、基于蛋白质的疗法、或生物学疗法。化疗药物包括烷基化剂(如，基于铂的药物、四嗪、氮杂环丙烷、亚硝基脲、氮芥)、抗代谢剂(如，抗叶酸剂、氟嘧啶、脱氧核苷酸类似物、硫嘌呤)、抗微管剂(如，长春花生物碱、紫杉烷)、拓扑异构酶抑制剂(如，拓扑异构酶I抑制剂和拓扑异构酶II抑制剂)、细胞毒性抗生素(如，蒽环类)和免疫调节药物(如，萨利多胺及类似物)。

试剂盒或药物系统

包括ALT-803的药物组合物可组装于用于治疗瘤形成或感染的试剂盒或药物系统中。根据本发明这一方面的试剂盒或药物系统包含载剂工具，如盒子、纸板箱、管子，其内部具有严格限制的一个或多个容器，如小瓶、管子、安瓿、瓶子、注射器或袋子。本发明的试剂盒或药物系统也可包含相关的ALT-803使用说明书。

重组蛋白质表达

通常，本发明的融合蛋白复合体(如，ALT-803的成分)的制备可通过本文中揭露的步骤和公认的重组DNA技术实施。

通常，通过在适当的表达运载体中使用编码多肽的核酸分子或其片段的全部或一部分来转化适当的宿主细胞而生产重组多肽。分子生物学领域技术人员应理解，可使用多种表达系统的任一种来提供该重组蛋白。所使用的精确宿主细胞对于本发明并不特别重要。事实上，可在任何真核生物宿主(如，酿酒酵母、昆虫细胞，如Sf21细胞，或哺乳动物细胞，如，NIH 3T3、HeLa、COS或优选CHO细胞)内生产重组多肽。这些细胞可从多种来源获得(如，美国模式培养物保藏所(the American Type Culture Collection),Rockland,Md；又见，如，Ausubel et al.,Current Protocol in Molecular Biology,New York:JohnWiley and Sons,1997)。转染方法和表达运载剂的选择将取决于所选择的宿主系统。转化方法揭示于例如Ausubel et al. (前文)中；表达运载剂可选自《克隆载体：实验室手册》(Cloning Vectors:A Laboratory Manual(P.H.Pouwels et al.,1985,Supp.1987))中提供的那些。

存在多种用于制造重组多肽的表达系统。可用于生产此类多肽的表达载体包括，而不限于，染色体源载体、游离基因源载体和病毒源载体，如，源自细菌质粒的载体、源自噬菌体的载体、源自转座子的载体、源自酵母游离基因的载体、源自插入元件的载体、源自酵母染色体元件的载体、源自病毒如杆状病毒、乳多孔病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、家禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录酶病毒的载体、及源自其组合的载体。

一旦该重组多肽被表达，即使用诸如亲和色谱将其分离。一个实施例中，培育为对抗该多肽的抗体(如，如本文中揭示者生产的)可粘附在柱上并用以分离该重组多肽。可在亲和色谱之前，通过标准方法(见，如前文的Ausubel et al.)实施育有多肽的细胞的裂解和分馏。一旦分离，若需要，该重组蛋白可通过例如高效液相色谱进一步纯化(见，如，Fisher编纂的《生物化学和分子生物学实验室技术》

(Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology,eds.,Work and Burdon,Elsevier,1980))。

本文中，本发明的生物活性多肽或效应子分子可包括因子如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质毒素、免疫球蛋白域或其它生物活性蛋白质如酶。生物活性多肽也可包括共轭至其它化合物的共轭体，该其它化合物例如非蛋白质毒素、细胞毒性剂、化疗剂、可检测标记、放射活性材料等。

通过影响其它细胞的细胞生产的任何因子定义本发明的细胞因子，且该细胞因子可响应大量细胞免疫多效性的任一种。细胞因子的实例包括但不限于IL-2家族、干扰素(IFN)、IL-10、IL-1、IL-17、TGF和TNF细胞因子家族，以及IL-1至 IL-35、IFN-α、IFN-β、IFNγ、TGF-β、TNF-α和TNFβ。

本发明的一方面，该第一融合蛋白包含第一生物活性多肽，该第一生物活性多肽共价链接至白介素-15(IL-15)域或其功能性片段。IL-15是影响T细胞活化和增殖的细胞因子。影响免疫细胞活化和增殖的IL-15活性与IL-2的一些方面类似，但二者具备根本性差异(Waldmann,T A,2006,Nature Rev.Immunol.6:595-601)。

本发明的另一方面，该第一融合蛋白包含白介素-15(IL-15)域，该域是IL-15 变体(本文中也指代为IL-15突变体)。该IL-15变体优选包含不同于天然(或野生型) IL-15蛋白质的不同氨基酸序列。该IL-15变体优选结合该IL-15Rα多肽和功能作为IL-15兴奋剂或拮抗剂。具有兴奋剂活性的IL-15变体优选具有超兴奋剂活性。一些具体实施例中，该IL-15变体可起到不依赖于其与IL-15Rα的关联的IL-15兴奋剂或拮抗剂的功能。通过与野生型IL-15相当或相对增加的生物活性来例示IL-15 兴奋剂。通过比野生型IL-15降低的生物活性活性或通过抑制IL-15介导的响应的能力来例示IL-15拮抗剂。一些实施例中，将活性增加或降低的IL-15变体结合至该IL-15RβγC受体。一些具体实施例中，IL-15变体的序列与天然IL-15序列相比具有至少一个氨基酸变化，如取代或消除，该变化导致IL-15兴奋剂或拮抗剂活性。该氨基酸取代/消除优选处于IL-15的与IL-15Rβ和/或γC相互反应的域中。该氨基酸取代/消除更优选并不影响至该IL-15Rα多肽的结合或生产该IL-15变体的能力。可基于推定的或已知的IL-15结构，将IL-15与同源分子如具有已知结构的IL-2 比较，通过本文中提供的合理或随机的突变发生和功能试验或其它经验方法，鉴别用以生成IL-15变体的适当氨基酸取代/消除。其它适当的氨基酸取代可以是保守的或非保守的改变和其它氨基酸的插入。本发明的IL-15变体优选含有一个或超过一个位于成熟人IL-15序列第6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、 109、111、或112位的氨基酸取代/消除；特别地，D8N(“D8”指代天然的成熟的人 IL-15序列中该氨基酸和残基的位置，而“N”指代IL-15变体中该经取代的氨基酸残基位置)、I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P或Q108A取代导致具有拮抗剂活性的IL-15变体，而N72D取代导致具有兴奋剂活性的IL-15变体。

趋化因子，类似于细胞因子，定义为下述任何化学因子或分子：当暴露于其它细胞时，其响应大量细胞免疫多效性中的任一种。适当的趋化因子可包括但不限于CXC、CC、C、和CX.sub.3C趋化因子家族和CCL-1至CCL-28、CXC-1至 CXC-17、XCL-1、XCL-2、CX3CL1、MIP-1b、IL-8、MCP-1、和Rantes。

生长因子包括当暴露于特定细胞时诱发被影响的细胞的增殖和/或分化的任何分子。生长因子包括蛋白质和化学分子，它们中的一些包括：GM-CSF、G-CSF、人生长因子和干细胞生长因子。其它生长因子也可适用于本文中揭示的用途。

毒素或细胞毒性剂包括当暴露于细胞时具有致死效应或生长抑制效应的任何物质。更具体地说，该效应子分子可以是诸如来自植物或细菌的细胞毒素，如白喉毒素(DT)、志贺毒素、相思豆毒素、霍乱毒素、蓖麻毒素、皂角素、假单胞菌外毒素(PE)、美洲商陆抗病毒蛋白、或白树毒素。这些毒素的生物学活性片段是该领域已知的，且包括例如DT A链和蓖麻毒素A链。此外，该毒素可以是在细胞表面具有活性的剂，如磷脂酶类(如，磷脂酶C)。

再者，该效应子分子可以是化疗药物如，举例而言，长春地辛、长春新碱、长春花碱、甲氨蝶呤、阿霉素、争光霉素、或顺铂。

此外，该效应子分子可以是适用于诊断或成像研究的可检测的标记的分子。此类标记包括生物素或链霉亲和素/抗生物素蛋白、可检测的纳米颗粒或晶体、酶或其催化活性片段、荧光标记如绿色荧光蛋白、FITC、藻红素、cychome、德州红或量子点；放射性核素，如碘-131、钇-90、铼-188或铋-212；磷光或化学发光分子或可通过PET、超声或MRI检测的标记，如基于Gd或顺磁金属离子的造影剂。见，如，Moskaug,et al.J.Biol.Chem.264,15709(1989)；Pastan,I.et al.Cell 47,641, 1986；Pastan et al.,Recombinant Toxins asNovel Therapeutic Agents,Ann.Rev. Biochem.61,331,(1992)；"Chimeric Toxins"Olsnes and Phil,Pharmac.Ther.,25,355 (1982)；PCT公开案WO 94/29350；PCT公开案WO94/04689；PCT公开案 WO2005046449；和美国专利US 5,620,939中与作成和使用包含效应子标签的蛋白质的相关揭露。

包括共价链接的IL-15和IL-15Rα的蛋白融合或共轭复合体，具有若干重要的用途。易被损害或杀死的细胞或组织可通过本文中揭露的方法轻易化验。

本发明的IL-15多肽和IL-15Rα多肽的氨基酸序列适当符合天然IL-15分子和 IL-15Rα分子如人、鼠或其它啮齿类动物或其它哺乳动物的IL-15分子和IL-15Rα分子。这些多肽和编码核酸的序列可于文献中获知，包括人白介素15(IL15) mRNA-GenBank：U14407.1；小家鼠白介素15(IL15)mRNA-GenBank：U14332.1；人白介素-15受体α链前体(IL15RA)mRNA-GenBank：U31628.1；小家鼠白介素 15受体α链-GenBank：BC095982.1。

一些设定中，它可用于作成本发明的多价蛋白融合或共轭复合体，以诸如增加sc-TCR或sc-抗体的价态。特别地，该融合蛋白复合体的IL-15域与IL-15Rα域之间的反应提供了生成多价复合体的手段。此外，可通过将1至4个蛋白(相同或不同)共价或非共价链接在一起，如使用标准生物素链亲和素标记技术，或通过共轭至适当的固体支撑物如乳胶微球，而作成该多价融合蛋白。化学交联的蛋白质(例如，交联至纳米颗粒)也是适当的多价物质。例如，该蛋白质可通过下述而改性：包括编码序列的可修饰标签如生物素酰化BirA标签的序列或具有化学反应性侧链如Cys或His的氨基酸残基的序列。此类氨基酸标签或化学反应性氨基酸可位于该融合蛋白或抗体的多个位置，优选位于该生物学活性多肽或效应子分子的活性位点的远侧。例如，可溶性融合蛋白的C端可共价链接至标签或其它包括此反应性氨基酸的融合蛋白。可包括适当的侧链以将两个或更多个融合蛋白化学链接至适当的纳米颗粒，以给出多价分子。例示性纳米颗粒包括树枝状大分子、脂质体、芯-壳颗粒或基于PLGA的颗粒。

本发明的另一具体实施例中，该融合蛋白复合体的一个或两个多肽包含免疫球蛋白域。或者，该蛋白结合域-IL-15融合蛋白可进一步链接免疫球蛋白域。优选的免疫球蛋白域包含如上文提供的可允许与其它免疫球蛋白域相互反应以形成多链蛋白质的区域。例如，该免疫球蛋白重链区域，如IgG1 C_H2-C_H3，能稳定地相互反应以创建Fc区域。包括Fc域的免疫球蛋白域优选也包含具有效应子功能的区域，包括Fc受体或补体蛋白结合活性，及/或具有糖基化位点。一些具体实施例中，该融合蛋白复合体的免疫球蛋白域含有突变，该突变减小或扩大Fc受体或补体集合活性或糖基化，从而影响所得蛋白质的生物学活性。例如，含有降低其与Fc受体结合的突变的免疫球蛋白域，可用以生成本发明的融合蛋白复合体，该复合体与荷有Fc受体的结合活性较低，这可能对于设计为识别或检测特异抗原的试剂有益。

核酸和载体

本发明进一步提供编码本发明蛋白(如，ALT-803的成分)的核酸序列和特定 DNA序列。优选地，该DNA序列由适用于染色体外复制的载体如噬菌体、病毒、质粒、噬菌粒、粘粒、YAC、或游离基因所载。特别地，编码所希望的融合蛋白的DNA载体可用以促进本文中揭示的制备性方法，且用以获得该融合蛋白的显着数量。DNA序列可插入适宜的表达载体中，即，含有转录和转译所插入的蛋白编码序列所必需元件的载体。多种宿主-载体系统可用以表达该蛋白质编码序列。这些包括病毒(如，牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；病毒(如，巴库洛病毒(baculovirus))感染的昆虫细胞系统；微生物如含有酵母的酵母载体，或使用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。依据所采用的宿主-载体系统，可使用大量适当的转录和转译元件中的任何一个。见，前文的Sambrook et al.及前文的Ausubel et al.。

本发明包括用于作成可溶性融合蛋白复合体的方法，该方法包含将本文中揭示的编码该第一和第二融合蛋白的DNA载体引入宿主细胞；在培养基中在足以表达该细胞内融合蛋白的条件下培养，或在该培养基中在允许第一融合蛋白的IL-15 域与第二融合蛋白的可溶性IL-15Rα域关联以形成可溶性融合蛋白复合体的条件下培养；以及，从该宿主细胞或培养基中纯化该可溶性融合蛋白复合体。

通常，根据本发明的DNA载体优选包含通过磷酸二酯键连接的核苷酸序列，该序列包含，在5'至3'方向，用于引入编码生物学活性多肽的第一核苷酸序列、有效链接至编码效应子分子的序列的第一克隆位点。

由该DNA载体编码的融合蛋白成分可提供为卡匣格式。术语“卡匣”意指，每一组分可通过标准重组方法轻易取代为另一组分。特别地，当所编码的融合复合体待用来对抗可能具有或已经具有发展血清型的能力的病原体时，配置为卡匣格式的DNA载体尤其是所希望的。

为了令该载体编码融合蛋白复合体，使用适当的连接酶将编码生物学活性多肽的序列链接至编码该效应子肽的序列。可通过从天然来源如从适当细胞分离 DNA或通过已知合成方法如磷酸三酯方法获得编码现有肽的DNA。见，如， Oligonucleotide Synthesis,IRL Press(M.J.Gait,ed.,1984)。也可使用可商购的寡核苷酸合成器制备合成寡核苷酸。一旦分离，编码该生物学活性多肽的基因可通过聚合酶链反应(PCR)或该领域已知的其它手段进行扩增。用以扩增该生物学活性多肽基因的适当PCR引物可将限制位点加至PCR产物中。该PCR产物优选包括用于效应子肽的剪接位点，和该生物学活性多肽-效应子融合复合体的适宜表达和分泌所必需的前导序列。该PCR产物也优选包括编码该链接序列的序列，或用于结扎该序列的限制酶位点。

本文中揭示的融合蛋白优选通过标准重组DNA技术生产。例如，一旦编码该生物学活性多肽的DNA分子被分离出来，序列可被结扎至编码该效应子多肽的另一DNA分子。编码生物学活性多肽的核苷酸序列可直接接合入编码效应子肽的 DNA序列中，或者，更典型地，本文中讨论的编码该链接序列的DNA序列可插置于该编码生物学活性多肽的序列与该编码效应子肽的主流之间并使用适当的连接酶接合。所得杂交DNA分子可在适当的宿主细胞内表达，以生产融合蛋白复合体。将DNA分子以5'至3'取向彼此结扎，因此在结扎后，所编码多肽的平移框并未变更(即，DNA分子在框中结扎至彼此)。所得DNA分子编码框内融合蛋白。

其它核苷酸序列也可包括于基因构造中。例如，启动子序列，其控制编码融合至效应子肽的生物学活性多肽的序列的表达，或前导序列，其引导该融合蛋白至细胞表面或培养基，均可包括于该构造中或存在于表达载体中，而该构造被插入该载体。免疫球蛋白或CMV启动子为特优选。

在获得变体生物学活性多肽、IL-15、IL-15Rα或Fc域编码序列中，该领域技术人员应认识到，可通过某些氨基酸的取代、加成、消除、及转译后修饰来修饰多肽，而不损失或减少生物学活性。特别地，已知保守氨基酸取代，即一个氨基酸取代为具有相似尺寸、电荷、极性和构象的另一氨基酸，不大可能显着变革蛋白质功能。广义上，作为蛋白质构件的20个标准氨基酸分为如下四组保守氨基酸：非极性(疏水性)组，包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸；极性(不带电，中性)组，包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；带正电荷(碱性)组，含有精氨酸、组氨酸和赖氨酸；以及，带负电荷(酸性)组，含有天冬氨酸和谷氨酸。蛋白质中一个氨基酸取代为同组内另一氨基酸，不大可能对该蛋白质的生物学活性具有负面影响。其它例子中，可对氨基酸位置做出修饰以减少或提升该蛋白质的生物学活性。基于靶向残基的已知的或推测的结构或功能性质，可随机引入或经位点特异性突变而引入这些改变。在该变体蛋白表达之后，可使用结合或功能化验轻易评估由于该修饰造成的生物学活性的改变。

可通过DNA杂交分离来测定核苷酸序列之间的同源性，其中，双链DNA杂交种的稳定性取决于出现的碱基配对程度。高温及/或低盐含量的条件减少了该杂交种的稳定性，且可改变条件以防止同源性低于所选程度的序列的退火。例如，对于具有约55％G-C含量的序列，40至50℃、6x SSC(氯化钠/柠檬酸钠缓冲液) 和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的杂交和洗涤条件表明约60至70％的同源性；50 至65℃、1x SSC和0.1％SDS的杂交和洗涤条件表明约82至97％的同源性；而52℃、0.1x SSC和0.1％SDS的杂交和洗涤条件表明约99至100％的同源性。也可获得大量用于比较核苷酸和氨基酸序列(及测量同源性程度)的计算机程序，提供可商购和免费两类软件来源的清单可在Ausubel et al.(1999)中找到。可轻易获得的序列比较和多序列比对算法分别为局部序列排比检索基本工具(Basic Local AlignmentSearch Tool,BLAST)(Altschul et al.,1997)和ClustalW程序。BLAST可在www.ncbi.nlm.nih.gov获得，而ClustalW版本可在2.ebi.ac.uk获得。

融合蛋白的成分几乎可组织为任何次序，只要各自能实施其预设功能即可。例如，一个具体实施例中，该生物学活性多肽位于该效应子分子的C端或N端。

本发明的效应子分子优选将具有有益于那些域的预设功能的尺寸。可通过多种方法作成本发明的效应子分子并将其融合至该生物学活性多肽，该方法包括熟知的化学交联方法。见，如，Means,G.E.和Feeney,R.E.(1974)的Chemical Modification of Proteins,Holden-Day。又见，S.S.Wong(1991)的Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC Press。但是，通常优选使用重组操作来作成该框内融合蛋白。

注意，根据本发明的融合分子或共轭分子可以多种路径组织。在一个例示性构型中，该生物学活性多肽的C端有效链接至该效应子分子的N端。若需要，可通过重组方法实现该链接。但是，在另一构型中，该生物学活性多肽的N端链接至该效应子分子的C端。

或者或此外，如需要，一个或多个额外的效应子分子可插入该生物学活性多肽或共轭复合体中。

载体和表达

可采用大量策略来表达ALT-803。例如，可使用限制酶将编码ALT-803的构造并入适当的载体中，以在该载体内作成用于在结扎后插入该构造的切段。之后，将该含有基因构造的载体引入适当的融合蛋白表达宿主中。见，通常，前文的Sambrook et al.。可基于与克隆方案相关的因子而做出适当载体的选择。例如，该载体应与所采用的宿主相容并具有与后者相适宜的复制子。该载体必须能接纳编码待表达的融合蛋白复合体的DNA序列。适当的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞，优选那些能轻易转化且在培养基中展现快速生长的细胞。具体地，优选的宿主细胞包括原核生物如大肠杆菌、枯草杆菌等，以及真核生物如动物细胞和酵母菌株如啤酒酵母。哺乳动物细胞通常为优选，特别是J558、NSO、SP2-0或CHO。其它适当的宿主包括，如，昆虫细胞如Sf9。采用传统的培养条件。见，前文的 Sambrook。随后，可选择适当的转化或转染的细胞株。表达本发明的融合蛋白复合体的细胞可通过已知过程测得。例如，链接至免疫球蛋白的融合蛋白复合体的表达可通过对于经链接的免疫球蛋白具有特异性的ELISA测得及/或通过免疫印迹法测得。检测融合蛋白的表达的其它方法揭露于实施例中，该融合蛋白包含链接至IL-15或IL-15Rα域的生物学活性多肽。

如上文通常所述，宿主细胞可用于制备性目的，以繁殖编码所希望的融合蛋白的核酸。因此，宿主细胞可包括原核细胞或真核细胞，希望该融合蛋白在该细胞中特异性地生产。因此，宿主细胞具体包括能繁殖编码该融合蛋白的核酸的酵母、苍蝇、虫子、植物、青蛙、哺乳动物细胞和器官。所使用的哺乳动物细胞株的非限制性实例包括CHO dhfr细胞(Urlaub and Chasm,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77:4216(1980))、293细胞(Graham etal.,J Gen.Virol,36:59(1977))或骨髓瘤细胞样 SP2或NSO(Galfre and Milstein,Meth.Enzymol.,73(B):3(1981))。

能繁殖编码所希望的融合蛋白复合体的宿主细胞同样涵盖非哺乳动物真核细胞，包括昆虫(如，草地贪夜蛾)、酵母(如，啤酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉森酵母；通常由Fleer,R.综述于Current Opinion in Biotechnology,3(5):486496(1992)中)、真菌及植物细胞。也预期某些原核生物如大肠杆菌和芽孢杆菌。

可通过用于转染细胞的标准技术将编码所希望的融合蛋白的核酸引入宿主细胞。术语“转染(transfecting或transfection)”倾向于涵盖用于将核酸引入宿主细胞的全部传统技术，包括磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、显微注射、病毒转导及/或整合。用于转染宿主细胞的适当方法可在前文的 Sambrook et al.及其它实验室手册中找到。

可根据本发明使用各种启动子(转录起始调整区域)。依据所提议的表达宿主选择适宜的启动子。可使用来自异种来源的启动子，只要它们在所选宿主中起作用即可。

启动子的选择也取决于所希望的功效以及肽或蛋白质生产的水平。一般采用诱导型启动子如tac，以剧烈增加大肠杆菌内蛋白质表达的水平。蛋白质的过表达可能对宿主细胞有害。因此，宿主细胞的生长可能受限。使用诱导型启动子系统允许待培养的该宿主细胞在诱发基因表达之前具有可接受的密度，从而促成更高的产率。

可根据本发明使用各种信号序列。可使用与该生物学活性多肽编码序列同种的信号序列。或者，也可使用已经选择或设计为在表达宿主中有效分泌及处理的信号序列。例如，适当的信号序列/宿主细胞对包括用于在枯草芽孢杆菌内分泌的枯草芽孢杆菌sacB信号序列，以及用于毕赤酵母分泌的酿酒酵母α-交配因子或毕赤酵母酸性磷酸酶phoI信号序列。可通过编码该信号肽酶裂解位点的序列，或通过一般少于10个密码子组成的短核苷酸桥，将该信号序列直接接至该蛋白质编码序列，其中，该桥确保下游蛋白质序列的正确阅读框。

用于提升转录和转译的元件已经被鉴别用于真核蛋白表达系统。例如，将花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子1000bp设置于异种启动子的任意一侧，可将植物细胞中的转录水平提高10至400倍。该表达构造也应包括适宜的转译起始序列。将该表达构造修饰为包括用于适当转译起始的Kozak共有序列，可将转译水平增加10倍。

一般使用选择性标记物，该标记物可以是表达构造的一部分或自后者分隔(如，由该表达载体运载)，因此，该标记物可一体化在不同于该兴趣基因的位点。实例包括赋予对抗生素具有耐药性的标记物(如，赋予大肠杆菌以氨苄西林耐药性的 bla，赋予多种原核细胞和真核细胞以卡那霉素耐药性的nptII)，或容许宿主在动物培养基上生长的标记物(如，HIS4标记毕赤酵母或His^-啤酒酵母在组氨酸的缺失下生长)。可选标记物具有其自身的转录和转译起始以及终止调整区域，以允许该标记物的非依赖性表达。若采用抗生素耐药性作为标记物，则用于选择的抗生素浓度将依据抗生素种类而变，一般为从10至600μg的抗生素/mL培养基的范围。

通过采用已知重组DNA技术组装该表达构造(Sambrook et al.,1989；Ausubel etal.,1999)。限制酶消解和结扎是所采用的将DNA的两个片段结合的基本步骤。该 DNA片段的两端可能需要在结扎前进行修饰，这可以通过填充悬垂、使用核酸酶 (如，ExoIII)消除该片段的末端部分、定点突变、或通过PCR加入新的碱基对而完成。可采用多联剂和适配剂来促成所选片段的接合。典型地，采用限制、结扎、和大肠杆菌的转化的循环来分阶段组装该表达构造。大量适用于该表达构造的构建的克隆载体是该领域已知的(λZAP和pBLUESCRIPT SK-1，Stratagene,La Jolla, CA,pET,Novagen Inc.,Madison,WI，在Ausubel et al.,1999中引用)，且特定选择对于本发明并非关键。克隆载体的选择将受到所选择用于将该表达构造引入宿主细胞的基因转移系统的影响。每一阶段结束时，可通过限制分析、DNA序列分析、杂交分析和PCR分析来分析所得构造。

该表达构造可转换至宿主内作为克隆载体构造，或线性或环状，或可从该克隆载体移除并直接使用或引入输送载体上。该输送载体促进该表达构造至所选宿主细胞类型的引入和前者在后者中的维持。通过大量已知基因转移系统(如，天然能力、化学介导的转化、原生质体转化、电穿孔、基因枪转化、转染、或共轭)的任一种将该表达构造引入宿主细胞内(Ausubel et al.,1999；Sambrook et al.,1989)。依据所使用的宿主细胞和载体系统选择该基因转移系统。

例如，可通过原生质体转化或电穿孔将该表达构造引入啤酒酵母细胞内。啤酒酵母的电穿孔可轻易完成，且酵母转化效率与原生质球转化相当。

本发明进一步提供用于分离感兴趣的融合蛋白的生产过程。该过程中，已经将编码该感兴趣的蛋白质并有效链接至调控序列的核酸引入其内的宿主细胞(如，酵母、真菌、昆虫、细菌或动物细胞)，以生产规模在培养基中生长以刺激该编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列的转录。随后，从收获的宿主细胞分离或从培养基分离出该感兴趣的融合蛋白。可使用标准蛋白质纯化技术来从培养基或所收获的细胞分离该感兴趣的蛋白。特别地，可使用该纯化技术在实际器具中大规模(即，至少毫克级)表达和纯化想要的融合蛋白，该实际器具包括滚瓶、搅拌瓶反应器、组织培养板、生物反应器、或发酵罐。

可通过已知方法分离并纯化所表达的蛋白融合复合体。典型将该培养基离心或过滤，并随后通过亲和色谱或免疫亲和色谱如蛋白-A或蛋白-G亲核色谱或包含使用结合所表达的融合复合体的单克隆抗体的免疫亲和方案来纯化上清液。可通过已知技术的适宜组合来分隔并纯化本发明的融合蛋白。这些方法包括，例如，使用溶解度的方法，如盐沉淀和溶剂沉淀；使用分子量差异的方法，如透析、超滤、凝胶过滤、和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；使用电荷差异的方法，如离子交换柱色谱；使用特异亲和性的方法，如亲和色谱；使用疏水性差异的方法，如反相高效液相色谱；以及使用等电点差异的方法，如等电点聚焦电泳、金属亲和柱如 Ni-NTA。通常见前文Sambrook et al.和Ausubel et al.中关于这些方法的公开。

优选本发明的融合蛋白大体上是纯的。即，该融合蛋白已经从其天然伴生的细胞取代物分离，因此该融合蛋白优选以至少80％或90％至95％同质性(w/w)而存在。同质性(w/w)为至少98至99％的融合蛋白对于多数药物、临床和研究应用是最优选的。对于治疗性应用，大体上纯的融合单体应基本不含杂质。一旦纯化为部分或大体纯度，则可溶性融合蛋白可用于治疗性用途，或用于实施体内外化验，如本文中公开。

可通过多种标准技术如色谱和凝胶电泳测定大体纯度。

本发明的融合蛋白复合体适用于在体外或体内用于多种癌性细胞或被感染细胞或可能被一种或多种疾病感染的细胞。

人白介素-15(hIL-15)通过在抗原提呈細胞上表达的人IL-15受体α链 (hIL-15Rα)转而出现在免疫效应子细胞上。IL-15Rα主要通过细胞外sushi域 (IL-15RαSu)以高亲和性(38pM)结合hIL-15。如本文中所述，该IL-15和IL-15RαSu 域可用以生成可溶性复合体(如，ALT-803)或用作支架以构建多域融合复合体。

IgG域，特别是Fc片段，已经成功作为二聚物支架用于包括批准的生物学药物的大量治疗剂分子中。例如，依那西普是链接至人IgG1的Fc域的可溶性人p75 肿瘤坏死因子α(TNF-α)受体(sTNFR)的二聚物。该二聚作用令依那西普抑制TNF-α活性的潜力高达1,000倍于单体性sTNFR，并向该融合提供比单体形式长5倍的血清半衰期。结果，依那西普在中和体内TNF-α的促炎活性和改善患者恢复大量不同自体免疫指示中有效。

除了其二聚作用活性，该Fc片段也通过补体活化和与表现于自然杀伤(NK) 细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、吞噬细胞和树突细胞上的Fcγ受体的相互反应而提供细胞毒性效应子功能。在抗癌治疗性抗体和其它抗体域-Fc融合蛋白的情境中，这些活性似乎在动物肿瘤模型和癌症患者体内观察到的功效中扮演重要角色。但是，在大量治疗性应用中，这些细胞毒性效应子响应可能并不足够。因此，改善并扩展Fc域的效应子活性以及发展其它增加细胞溶解免疫应答的活性或补充已经收到广泛关注，该免疫应答包括经由免疫治疗性分子的处于疾病位点的NK细胞和T细胞。

在发展人源免疫刺激治疗剂的尝试中，使用人IL-15(hIL-15)和IL-15受体域。hIL-15是细胞因子的小的四α螺旋束家族成员，与具有高结合亲和性(平衡解离常数(KD)～10^-11M)的hIL-15受体α链(hIL-15Rα)相关联。随后，所得复合体转而出现在显示于T细胞和NK细胞表面上的人IL-2/15受体β/普通γ链(hIL-15RβγC)复合体上。这一细胞因子/受体相互反应导致效应子T细胞和NK细胞的膨胀和活化，该细胞在根除病毒感染的细胞和恶性细胞中扮演重要角色。正常情况下，hIL-15 和hIL-15Rα在树突细胞中同时产生以形成细胞内复合体，该细胞内复合体随后被分泌并作为异质二聚物分子显示于细胞表面上。因此，hIL-15与hIL-15Rα相互反应的特征提示，这些中间链结合域可用作人源免疫刺激复合体并作为支架来制作能进行靶向特异性结合的可溶性二聚物分子。

除非明确排除，本发明的实践采用分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术(包括重组技术)，这些技术处于该领域技术人员的能力范围内。这些技术在文献中有完整解释，该文献如《分子克隆：实验室手册(第二版)》(MolecularCloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,1989))；

《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis(Gait,1984))；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture(Freshney,1987))；《酶学方法》(Methods in Enzymology)《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology(Weir,1996))；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller and Calos,1987))；《现代分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,1987))；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,1994))；《免疫学实验指南》(Current Protocols in Immunology(Coligan,1991))。这些技术适用于生产本发明的多核苷酸和多肽，以及，同样，可被认为是作成和实践本发明。特别有用于特定具体实施例的技术将在下文中讨论。

提出下述实施例，以向该领域技术人员提供如何作成并使用本发明的化验、筛选和治疗性方法的完全公开和说明，该实施例并非用来限制发明人所认定的其发明的范畴。

实施例

实施例1：通过ALT-803诱发淋巴细胞增殖和活化

使用使用Histopaque-1077从来自健康人血液的血沉棕黄层分离周边血单核细胞(PBMC)。在37℃使用5％CO₂在具有各种ALT-803量的RPMI-10培养基 (RPMI-1640、2-巯基乙醇、青霉素-链霉素-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、和10％胎牛血清)中培养该PBMC。“ALT-803”指一复合体，该复合体包含与二聚物 IL-15RαSu/Fc融合蛋白非共价相关联的IL-15N72D，其中，所述复合体展现免疫刺激活性。视需要，该IL-15N72D和/或IL-15RαSu/Fc融合蛋白包含1个、2个、 3个、4个或更多个相对于参考序列的氨基酸变更。例示性IL-15N72D氨基酸序列提供如下(见，如，美国专利US 13/769,179，通过引用并入本文)。

例示性IL-15N72D核酸序列提供如下(具有前导肽)(SEQ ID NO:1)：

(前导肽)

atggagacagacacactcctgttatgggtactgctgctctgggttccaggttccaccggt-

(IL-15N72D)

aactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtg atgttc

accccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatg ataca

gtagaaaatctgatcatcctagcaaacgacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaac tggag gaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttct

(终止密码子)

taa

例示性IL-15N72D氨基酸序列提供如下(具有前导肽)(SEQ ID NO:2)：

(前导肽)

METDTLLLWVLLLWVPGSTG-

(IL-15N72D)

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESG DAS

IHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

一些例子中，该前导肽从成熟的IL-15N72D多肽(SEQ ID NO:3)裂解：

(IL-15N72D)

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESG DAS

IHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

例示性IL-15RαSu/Fc核酸序列(具有前导肽)提供如下(SEQ ID NO:4)：

(前导肽)

atggacagacttacttcttcattcctgctcctgattgtccctgcgtacgtcttgtcc-

(IL-15RαSu)

atcacgtgccctccccccatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacat ttgtaa

ctctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggaca acccc cagtctcaaatgtattaga-

(IgG1 CH2-CH3(Fc域))

gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttc cccc

caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctg aggtc

aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgta ccgtg

tggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccc agccc

ccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgag ctgac

caagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggca gccgg

agaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagag caggt

ggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtct ccggg taaa-

(终止密码子)

taa

例示性IL-15RαSu/Fc氨基酸序列(具有前导肽)提供如下(SEQ ID NO:5)：

(前导肽)

MDRLTS S FLLLI VP A Y VLS–

(IL-15RαSu)

ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAH WT TPSLKCIR-

(IgG1 CH2-CH3(Fc域))

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEV

KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKA

LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NG

QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSL SLSPGK

一些例子中，成熟的IL-15RαSu/Fc蛋白缺失了该前导序列(SEQ ID NO:6)：

(IL-15RαSu)

ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAH WT TPSLKCIR-

(IgG1 CH2-CH3(Fc域))

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEV

KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKA

LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NG

QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSL SLSPGK

为了评估淋巴细胞子集增殖和活化，使用亮紫510-抗CD4、PECY7-抗CD8、和亮紫421-抗CD16抗体的组合染色经ALT-803治疗的细胞进行表面标志，再使用FITC-抗颗粒酶B抗体进行细胞内染色；或使用亮紫-抗CD4、PE-抗CD8、PECY7- 抗CD335、PerCP-CY5.5-抗CD69和APC-抗CD25抗体的组合染色经ALT-803治疗的细胞进行表面标志，再使用FITC-抗穿孔素抗体进行细胞内染色。对于细胞内染色，使用固定化缓冲液(含有2％多聚甲醛的PBS)固定细胞，再于室温孵化20分钟。使用透化缓冲液(含有0.1％皂素和0.05％叠氮化钠的PBS)令被固定的细胞通透，再使用FITC标记的对人颗粒酶B或穿孔素具有特异性的抗体进行染色。在 FACSVerse流式细胞分析仪上使用FACSuite软件分析CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和CD16⁺NK细胞在经ALT-803活化的PBMC中的百分比以及CD25活化标记物和CD69活化标记物在CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和CD335⁺NK细胞上的表达。

与培养基对照相比，在含有0.01至10nM ALT-803的培养基中孵化5天后，来自不同供体的人PBMC中的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或NK细胞的百分比并无显着变化(图1A和图1B)。由于先前研究已经显示，ALT-803可在体外促进人 PMBC的增殖响应，因此延长培养孵化时间以增加此化验的灵敏度。如图1C(供体A)和图1D(供体B)中所示，在10nM ALT-803的存在下培养7天后，与在ALT-803 缺失下孵化的细胞中所观察者相比，PBMC培养物中CD4⁺T细胞的百分比减少，而CD8⁺T细胞的百分比增加。当分析CD4/CD8比率时，这一发现更明显(图1E：供体A；图1F：供体B)。在ALT-803存在或缺失下孵化长达10天后，PBMC培养物中NK细胞的百分比并无显着差异(图1C和图1D)。

比较ALT-803与IL-15对于来自不同供体的人免疫细胞子集增殖的体外效果。将0.5nM ALT-803或0.5nM IL-15加入人PBMC培养物中，孵化7天后，导致淋巴细胞计数增加约2倍。在增加CD8⁺T细胞子集和NK细胞子集的绝对数目方面， ALT-803和IL-15潜力相当(图2A和图2B)。ALT-803也显着增加CD4⁺T细胞的绝对计数，而IL-15增加Treg细胞的绝对计数。

此外，为了理解ALT-803的免疫刺激效果，检查活化标记物CD25和CD69 在免疫细胞子集上的表达。如图3A至图3D所示，使用ALT-803的体外治疗能通过CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞而以浓度依赖方式增加CD25表达。注意，与在CD8⁺T细胞或NK细胞上所见相比，通过ALT-803实现的CD25上调在CD4⁺ T细胞上最为显着。被ALT-803诱发的通过CD8⁺T细胞实现的CD25表达最少。与CD25相反，ALT-803孵化造成NK细胞上CD69表达的大幅上调，而对于通过 CD4⁺T细胞实现的CD69表达未见治疗效果或仅见极弱的治疗效果。

也进行研究以评估ALT-803能否诱导NK细胞和CD8⁺T细胞表达更高水平的颗粒酶和穿孔素，而颗粒酶和穿孔素在细胞溶解响应中扮演角色。使用上文揭示的ALT-803在体外活化人PBMC，之后使用Ab染色以区分CD8⁺T细胞子集和NK 细胞子集，随后使用FITC标记的对人颗粒酶B或穿孔素具有特异性的抗体进行细胞内染色。如图4A至图4D所示，ALT-803能通过CD8⁺T细胞(图4A和图4C) 和NK细胞(图4B和图4D)以浓度依赖方式上调颗粒酶B和穿孔素的表达。此外， ALT-803介导诱发的CD8⁺T和NK两种细胞内的颗粒酶B表达比ALT-803介导的穿孔素表达的效果更显着。这些发现与下述概念一致：ALT-803诱发的颗粒酶B 及/或穿孔素表达可扮演角色以提升使用ALT-803孵化后的PBMC的细胞毒性。

进行额外的研究以比较ALT-803对人免疫细胞和鼠免疫细胞的效果。先前研究已经显示，蛋白质对于人PBMC的免疫刺激效果会依据该蛋白质是否以水性或固定化形式存在而显着改变。因此，使用ALT-803作为可溶性蛋白质或作为塑料固定化的湿润的或经空气干燥的所制备的蛋白质，进行人细胞和鼠细胞的细胞因子释放和增殖化验。测试0.08、0.8和44nM的ALT-803，分别对应于人静脉注射剂量为0.3、3.0和170μg/kg的最大血清浓度。对于增殖化验，使用Celltrace^TM紫 (Invitrogen)标记从脾细胞富集(CD3⁺T细胞富集柱，R&D系统)的人PBMC和鼠 CD3⁺细胞，并在含有PBS或ALT-803的孔中培养。作为阳性对照，将27nM的抗 CD3 Ab(对于鼠脾细胞，145-2C11；对于人PBMC，OKT3)加入相同化验格式的独立孔中。将细胞孵化4天，随后使用流式细胞分析仪分析，以基于紫色染料稀释而测定细胞增殖。此外，如上所述，将人和鼠免疫细胞培养24和48h，使用人和鼠Th1/Th2/Th17流式细胞小球微阵列细胞因子试剂盒根据制造商提供的使用说明书(BD Biosciences)测量释放入培养基中的细胞因子。对于免疫细胞子集分析，将人PBMC在各种浓度的ALT-803或IL-15中培养，并使用CD4、CD8、CD335、 CD16或CD19特异性抗体染色或使用人Treg试剂盒(BioLegend)染色。一些实验中，也使用上述的CD69、颗粒酶B或穿孔素特异性抗体染色细胞。

使用固定化的ALT-803孵化1天或4天(图5A)，导致人PBMC释放的IFN-γ提高。使用ALT-803治疗的人PBMC的4天培养物中，可溶性IL-6也增加，但这一效果并非剂量依赖性的(图5A)。相反，ALT-803对于人PBMC的4天培养物释放的TNF-α、IL-4、IL-10、或IL-17A没有效果。当在平行培养物中测试时，阳性对照抗CD3 mAb诱发了IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-4和IL-17A的释放。与人免疫细胞相比，鼠脾细胞在使用ALT-803孵化后展现类似但强度较低的IFN-γ释放(图 5B)。ALT-803也诱发来自鼠脾细胞的TNF-α生产，但显示对于IL-6、IL-2、IL-10、 IL-4和IL-17A无显着限制效果。相反，使用固定化的抗CD3抗体孵化的鼠科动物淋巴细胞显示，所测试的全部细胞因子的释放显着提高。同时，这些发现表明， ALT-803主要刺激人和鼠免疫细胞生产IFN-γ，与抗CD3抗体诱发的细胞因子的广泛情况形成对比。

还评价ALT-803在体外诱发CellTrace^TM紫标记的人和鼠免疫细胞增殖的能力。使用0.7nM至44nM的可溶性ALT-803孵化后，鼠淋巴细胞的可判增殖明显(图 5C)。高剂量可溶性ALT-803组中，高达83％的细胞在4天的孵化周期过程中进行 1至6个细胞分裂循环。在未治疗的鼠科动物细胞或那些使用0.07nM可溶性ALT-803治疗的细胞中，检测到少量增殖或未检测到增殖。不出所料，使用固定化的抗CD3抗体孵化的鼠科动物淋巴细胞展现强烈的增殖响应。在人PBMC培养物中也观察到了ALT-803剂量依赖性的淋巴细胞增殖，但与鼠细胞中所见相比，这一响应相当小。总之，响应高剂量ALT-803而增殖的全部人淋巴细胞少于20％且这些响应少于阳性对照抗CD3抗体所诱发的那些。此外，在不同供体的血液淋巴细胞中，观察到了对于ALT-803和抗CD3 Ab两者的细胞增殖响应的独立改变。

实施例2：通过ALT-803和与抗体组合的ALT-803诱发细胞介导的细胞毒性

使用从血沉棕黄层分离的人PBMC作为效应子细胞，评估ALT-803是否影响细胞介导的细胞毒性。使用Daudi人B细胞淋巴瘤细胞和K562人骨髓性白血病细胞作为靶标细胞，并在5μΜ的RPMI-10中在37℃使用Celltrace紫标记20分钟，如制造商所述。将该效应子细胞与紫色标记的靶标细胞混合，并在37℃使用5％ CO₂于具有或不具有ALT-803的RPMI-10中孵化标注的时间。一些实验中，将在 Daudi细胞表面上表达的CD20特异性抗CD20 Ab(Rituximab，10nM)加入该效应子：Daudi细胞培养物中，以测定ALT-803对于抗CD20 Ab介导的抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)的效果。通过离心并再次悬浮于不具酚红而具有2μg/ml碘化丙啶的RPMI-10中，收获效应子细胞与靶标细胞的混合物。使用流式细胞分析仪通过测定碘化丙啶阳性染色后死亡的紫色标记的靶标细胞，评价效应子细胞对抗靶标细胞的细胞毒性。

如图6A至图6D所示，新鲜的人PBMC在ALT-803不存在下具有对抗Daudi 细胞和K562细胞的弱细胞毒性。相反，PBMC在10nM ALT-803的存在下对抗Daudi和K562肿瘤靶标细胞的非常强的细胞毒性。Daudi肿瘤细胞表达CD20分子，其可由抗CD20 Ab(Rituximab)识别。如本文中指示，CD20是用于血液肿瘤和自体免疫疾病的治疗性抗体治疗的确定靶标。人PBMC能通过仅由Rituximab介导的ADCC手段裂解Daudi细胞(图6C，培养基对照)。有趣的是，ALT-803也能显着扩大人PBMC对抗Daudi细胞的Rituximab介导的ADCC活性。如图6D所示，观察到对于PBMC细胞毒性和ADCC的随时间增加的ALT-803介导的效果，进行一天的ALT-803孵化后可见极小响应或无响应，而孵化时间每延长一天，则观察到提高的靶标细胞杀伤。

此外，调查对抗K562和Daudi细胞的人PBMC细胞毒性的ALT-803浓度依赖性诱导。将新鲜的人PBMC与Celltrace紫标记的K562细胞或Daudi细胞在具有各种浓度(从0.01nM至10nM)的ALT-803的RPMI-10培养基中混合，孵化3 天。如上所述，使用流式细胞分析仪评估人PBMC对抗靶标细胞的细胞毒性。与图6A至图6D中的结果一致，ALT-803能扩大10nM的人PBMC对抗Daudi和 K562细胞的细胞毒性(图7A和图7B：供体A和供体B)。此外，也说明低至0.01nM 的ALT-803增加人PBMC对抗靶标细胞的细胞毒性。来自两个个体的PBMC展现显着不同的对抗不同肿瘤靶标细胞的细胞毒性活性。来自供体A(图7A)的PBMC 展现比对抗Daudi细胞所见高得多的对抗K562细胞的基线和ALT-803诱发的细胞毒性。相反，来自供体B(图7B)的PBMC展现类似的对抗两种不同靶标细胞的基线和ALT-803诱发的细胞毒性。这一发现对于理解不同患者的ALT-803介导的临床响应的潜在可变性是重要的。将类似的细胞毒性化验合并，作为患者对于 ALT-803的免疫应答的推定评价，作为这一分子的临床应用的一部分。

进一步评价ALT-803对于肿瘤特异性ADCC的浓度依赖性效果。如图8A至图8B所示，浓度低至0.01nM的ALT-803能扩大抗CD20 mAb(10nM)对抗人Daudi B淋巴瘤细胞的ADCC活性。这一响应是以2:1的E:T比使用Daudi细胞孵化的人PMBC效应子细胞观察到的，表明该活性的灵敏度。为了鉴定作为所观察到的靶肿瘤细胞杀伤原因的免疫效应子，通过MACS从人PBMC分离出NK细胞，并使用该NK细胞作用上述ADCC化验的效应子细胞。与使用总人PBMC的结果类似，NK细胞能经由Rituximab介导的ADCC活性而杀死Daudi细胞，且该效果通过加入ALT-803而得以提升(图8C)。相反，在这一设定中，NK细胞耗尽的PBMC (非NK细胞)并不显示Daudi细胞杀伤检测的ADCC活性(图8D)。此外，将对照抗体HOAT(人源化抗人组织因子IgG1Ab)加入NK细胞中，并未提供可检测的加入或不加入ALT-803而对抗Daudi细胞的ADCC活性。

还检查ALT-803扩大鼠免疫细胞对抗人Daudi细胞的ADCC活性。本研究中，在研究的第0天(SD0)，对SCID鼠接种Daudi细胞(每鼠10x 10⁶个)，并在SD15 和SD18使用ALT-803(0.2mg/kg)、Rituximab(10mg/kg)、或ALT-803(0.2mg/kg)+ Rituximab(10mg/kg)治疗。在第二次治疗的4天后牺牲该鼠，获取脾细胞。因此，该脾细胞可具有不同的活化状态，作为体内治疗的结果。随后，将该脾细胞与Daudi 靶标细胞以20:1的E:T比在RPMI-10培养基中或具有Rituximab(10nM)、ALT-803 (10nM)或Rituximab(10nM)+ALT-803(10nM)的培养基中混合。在37℃孵化2 天后，在BD FACSVerse上通过紫色标记的Daudi细胞的碘化丙啶染色分析来评价 Daudi靶标细胞生存能力。如图9A所示，将ALT-803加入源自对照治疗鼠的脾细胞中能扩大该抗CD20 mAb引导的对抗人Daudi细胞的ADCC。此外，使用ALT-803 进行体内刺激导致脾细胞在抗CD20 mAb引导的对抗人Daudi细胞的ADCC中更有活性。这些结果与使用人免疫细胞所得结果一致，表明ALT-803治疗可加强肿瘤特异性ADCC响应。

检查ALT-803扩大免疫细胞对抗人肿瘤细胞的ADCC活性。HER-2是确定的用于实性肿瘤的治疗性抗体治疗的靶标，该实性肿瘤包括乳腺癌以及胃或胃食管连接部腺癌。为了评估ALT-803对于对抗HER-2阳性肿瘤的ADCC活性，使用过表达HER-2的SK-BR-3人乳腺癌细胞株作为靶标细胞株，并使用抗人HER-2抗体(克隆24D2)作为以肿瘤细胞为靶向的Ab。为了生成活化的效应子细胞，在研究天数(SD)的第0天，对Balb/c鼠静脉注射0.2mg/kg ALT-803。在SD3，牺牲鼠并收获脾脏。将活化的脾细胞与CellTrace紫色标记的SK-BR-3细胞以10:1的E:T 比混合。将细胞在37℃在含有各种浓度的抗HER2抗体(克隆24D2)、ALT-803或两种剂的R10培养基中联合培养。24小时后，收集细胞混合物，使用碘化丙啶染色死亡细胞。使用流式细胞分析仪检查死亡的SK-BR-3细胞的百分比。如图9B 所示，与培养基对照相比，使用活化的脾细胞在抗HER2 Ab或ALT-803的单独存在下孵化SK-BR-3细胞，并未导致SK-BR-3细胞死亡。然而，ALT-803(0.01至 1.0nM)与抗HER2抗体(克隆24D2)(0.1至10nM)的联合治疗显着增加了脾免疫细胞对抗SK-BR-3人乳腺癌细胞的ADCC活性。这些结果证实，ALT-803可扩大对于疗法上确定的若干不同疾病靶标的ADCC响应。

实施例3：ALT-803+肿瘤特异性抗体治疗在荷瘤鼠体内的抗肿瘤活性

进一步在荷有Daudi肿瘤的SCID鼠体内评估ALT-803扩大抗CD20 mAb的抗肿瘤活性。这些鼠具有很可能介导对抗肿瘤的ADCC响应的功能性NK细胞。对于本研究，对FoxChase SCID雌性鼠(Harlan，C.B-17/IcrHsd-Prkdc-scid：6周龄) 静脉接种(i.v.)Daudi细胞(每鼠10x 10⁶个)(3鼠/组)。在肿瘤接种的15天后以及此后的三天后，静脉注射PBS,ALT-803(0.2mg/kg)、Rituximab(10mg/kg)或ALT-803 (0.2mg/kg)+Rituximab(10mg/kg)来治疗荷瘤鼠。第二次治疗的4天后，牺牲鼠，测定骨髓中的Daudi细胞水平。使用PE-共轭的抗人HLA-DR抗体(Biolegend)染色后，使用流式细胞分析仪评价股骨骨髓细胞中Daudi细胞的百分比。图10所示的结果表明，ALT-803和抗CD20 mAb单一疗法能降低荷瘤鼠骨髓中Daudi细胞的百分比。然而，ALT-803加上抗CD20 mAb的组合提供最大的抗肿瘤活性，将骨髓 Daudi细胞从对照鼠的38％降低至经ALT-803+Rituximab治疗鼠的5％。这一模型的剂量响应研究确认，低至0.02mg/kg的ALT-803能扩大抗CD20 mAb的抗肿瘤活性(图11)。

还评估ALT-803加上抗CD20 mAb改善荷有Daudi细胞肿瘤小鼠的存活时间的能力。对于本研究，对Fox Chase SCID雌性鼠静脉接种(i.v.)Daudi细胞(每鼠10 x 10⁶个)。在肿瘤接种15天后和此后的三天后，静脉注射PBS,ALT-803(次优的 0.05mg/kg)、Rituximab(10mg/kg)或ALT-803(0.05mg/kg)+Rituximab(10mg/kg) 来治疗荷瘤鼠。监控该鼠的存活时间(包括后肢麻痹的发病率)。如图12所示，PBS 组、次优ALT-803组和Rituximab单一疗法组的荷瘤鼠显示26至30天的中等存活时间，而使用次优ALT-803加上Rituximab治疗的鼠具有超过50天的中等存活时间，表明联合疗法显着延长了荷有B细胞淋巴瘤鼠的存活时间。同时，这些结果确认了ALT-803与肿瘤特异性抗体的组合在体内的协同抗肿瘤效果。还值得注意的是，ALT-803加上抗CD20 mAb的组合并未在用于上述研究的荷瘤动物体内造成显着的毒性征兆，表明这些组合的耐受性良好。

实施例4：与免疫检查点阻断剂组合的ALT-803在荷瘤鼠体内的抗肿瘤活性

包括抗CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、LAG-3、BTLA、 TIM-3、VISTA、IDO、A2aR、HVEM、KIRs、NKG2A、NKG2D、CEACAM-1、 2B4、CD200R、及其配体以及本文中揭示的其它靶标的抗体的免疫检查点阻断剂可能通过抑制免疫压制信号而促进免疫应答。如上所述，ALT-803是免疫刺激分子，其促进NK细胞和T细胞的增殖和活性。但是，其效力可能受限于可削弱免疫应答的抑制性检查点和途径。废除这些负调控因子并提升ALT-803活性的策略应能提供治疗性益处。

为了检查ALT-803与CTLA-4-CD80/CD86途径阻断的组合的抗肿瘤活性，使用静脉注射接种CT26鼠科动物直肠癌细胞株的BALB/c鼠发展肺转移模型。在第 0天(SD0)，向每组4至6只鼠静脉注射2x 10⁵个CT26肿瘤细胞。在ALT-803 组中，每只鼠从SD1开始每周接受两次4μg静脉注射的ALT-803，注射两周。伴随ALT-803的注射，一些鼠从SD1开始接受每周两次静脉注射给药的抗PD-L1抗体(Ab)(克隆9G2)、抗CTLA-4(克隆UC10-4F10-11)Ab或两者，每次注射给药量为100μg(每一Ab)，注射两周。重组人IL-15组中，每只鼠从SD1开始每天一次、每周5次地接受腹腔内(i.p.)给药的5μg的IL-15，给药两周。伴随IL-15的给药，动物还在SD1、SD4、SD8和SD11接受抗PD-L1 Ab和抗CTLA-4Ab(每次注射100μg)的静脉注射治疗。对照鼠接受注射PBS。每天评价鼠的存活时间作为功效终点。

如图13所示，依据研究，荷有CT26肿瘤的BALB/c鼠的存活时间中值为15 至20天。当与对照组比较时，单独使用ALT-803治疗显着延长了荷瘤鼠的存活时间。将抗PD-L1 Ab治疗加入ALT-803中，并未对这些鼠的存活时间有所改善。相反，与PBS组和合ALT-803组相比，ALT-803和抗CTLA4 Ab(具有或不具有抗 PD-L1 Ab)的组合显着增加了荷CT26肿瘤鼠的存活时间。使用该肿瘤模型的先前研究显示，抗CTLA4 Ab单一疗法并未改善存活时间。因此，ALT-803与抗CTLA4 Ab(而非抗PD-L1 Ab)的组合在提供更有效的抗肿瘤响应中协同作用，如通过延长的荷瘤鼠存活时间而测量的。

进一步在免疫活性C57BL/6鼠的5T33P骨髓瘤模型中评估PD-1阻断或PD-L1 阻断与ALT803的组合的效果。在SD0，对每组5只鼠静脉注射1x 10⁷个5T33P 肿瘤细胞。在SD4开始治疗。在IL-15组中，每只鼠在SD4和SD11接受静脉注射的5μg IL-15。伴随IL-15的注射，一些动物也接受每周一次的抗PD-L1 Ab(克隆9G2，200μg/鼠/腹腔内注射)或抗CTLA-4Ab(克隆UC10-4F10-11，200μg/鼠/ 腹腔内注射)，分别在SD4和SD11注射。在ALT-803组中，每只鼠在SD4和SD11 接受两次静脉注射的1μg/鼠/注射的次优ALT-803。伴随ALT-803的注射，一些鼠如上文所述接受抗PD-L1 Ab、抗CTLA-4Ab或两种抗体。此外，每组小鼠接受抗 PD-L1Ab或抗CTLA-4Ab单一疗法或接受PBS注射。每天评价鼠的存活时间及/ 或双后肢的完全麻痹作为研究终点。如图14A所示，荷5T33P肿瘤的C57BL/6鼠的存活时间中值为24天。使用次优剂量的ALT-803进行治疗并未显着改变动物存活时间，但给药次优ALT-803加上抗PD-L1Ab则导致该研究组中全部动物的存活时间为至少50天。相反，ALT-803与抗CTLA4 Ab的组合并未显着延长鼠的存活时间。此外，当作为单一疗法和组合疗法测试ALT-803和抗PD-L1 Ab的次优剂量时，在使用ALT-803+抗PD-L1 Ab治疗后的荷5T33P肿瘤的C57BL/6鼠中观察到比使用单一疗法治疗的鼠显着延长的存活时间(图14B)。因此，ALT-803加上抗 PD-L1 Ab的组合在荷骨髓瘤的鼠体内提供协同抗肿瘤活性。

为了更好理解ALT-803联合疗法在这两种模型中的相异活性，将肿瘤细胞株染色来区分PD1和CTLA4受体的配体。如图15所示，CT26细胞表达CTLA4的配体而非PD1。相反，5T33P肿瘤细胞表达PD-L1而非CTLA4的配体。这些结果与抗CTLA4与ALT-803的组合和抗PD-L1 Ab与ALT-803的组合在这些肿瘤模型的每一个中的抗肿瘤活性一致，表明使用免疫检查点受体的配体染色肿瘤可提供响应ALT-803加上免疫检查点阻断剂的预测性指示。

使用Zeng et al.2013Int J Radiat Oncol Biol Phys.,86:343-9中揭示的用于胶质母细胞瘤的确定的模型，在已经颅内移植有胶质母细胞瘤细胞株GL261-luc的 C57BL/6鼠体内，进行ALT-803单一疗法和ALT-803与抗PD-1mAb联合疗法的研究。在肿瘤移植7至10天后开始使用多剂量的ALT-803(3剂或4剂)或抗PD-1 mAb(3剂)作为单一疗法进行治疗，当与使用PBS治疗的对照组相比时，展现类似的抗肿瘤活性的增加和动物存活时间的延长。ALT-803与抗PD1 mAb的联合治疗进一步延长了荷瘤鼠的存活时间中值。此外，在使用抗PD-1Ab和ALT-803单一疗法治疗的鼠中观察到的长期(移植超过60天后)无肿瘤幸存者的百分比为20％，而抗PD-1mAb与4剂ALT-803的组合将这一数值增加到了40％。有趣的是，“治愈的”鼠对于肿瘤的再次挑战具有抗性，暗示该治疗诱发对抗肿瘤的免疫记忆响应。这些结果表明，将ALT-803的免疫刺激活性与检查点阻断剂抗PD-1Ab组合，对于延长荷胶质母细胞瘤鼠的存活时间具备有益效果。

还值得注意的是，ALT-803加上检查点抑制剂阻断的组合并未在用于上述研究的荷瘤动物体内造成任何显着的毒性征兆，表明这些组合的耐受性良好。

实施例5：ALT-803在鼠体内的毒性

为了评估ALT-803在动物中的安全性情况和治疗指数并估量人剂量的安全和效力，使用鼠和食蟹猴进行多剂ALT-803治疗的毒性研究。每周经尾部静脉对 C57BL/6N鼠(10鼠/性别/组)给药0.1、1.0或4.0mg/kg的ALT-803或PBS，持续4 周。最后一次注射的4天后(第26天)，实施包括体检、血液化学、血液学、肉眼尸检、称量体重和器官重量、以及组织病理学的评价(5鼠/性别/组)。在最后一次治疗的14天后(第36天)，对剩余鼠实施类似评价。在第二个研究中，对C57BL/6N 鼠(15鼠/性别/组)每周4次静脉注射0.1或1.0mg/kg的ALT-803或PBS进行治疗。在最后一次注射的4天后(第26天)(10鼠/性别/组)或4周后(第50天)(5鼠/性别/ 组)实施上述毒性评价。

在连续4周每周静脉注射0.1、1.0或4.0mg/kg的ALT-803或PBS的健康 C57BL/6N鼠体内，评价ALT-803的安全和药效动力学情况。在治疗开始后4至 20天，接受4.0mg/kg ALT-803的鼠展现毒性(即，减重、脱发)和死亡的征兆。尸检并未确定死亡原因，但观察结果(即，肺水肿、脾增大)与细胞因子诱发的致死炎性响应一致。在使用1.0或0.1mg/kg ALT-803治疗的鼠中未观察到死亡例。在最后一剂ALT-803(第26天)的4天后，观察到脾肿瘤和白血球(WBC)计数的剂量依赖性增加(图16)。WBC中，使用1.0mg/kg ALT-803治疗的鼠的淋巴细胞、嗜中性粒细胞、和单核细胞的绝对计数各自比对照组增加了超过8倍。治疗的两周后(第 36天)和四周后(第50天)(图16A至图16F)，使用1.0mg/kg ALT-803治疗的鼠的嗜中性粒细胞的计数保持增长，但淋巴细胞计数恢复到对照水平。组织病理学分析证实，在第26天的脾、肝、胸腺、肾、肺和淋巴结中免疫细胞增殖和淋巴细胞渗透的ALT-803剂量依赖性刺激在第36天和第50天达到较低的水平。这些研究的结果界定了鼠体内对多剂ALT-803治疗的耐受最高为1mg/kg。

实施例6：ALT-803在食蟹猴体内的毒性、药效动力学(PD)、和药代动力学(PK)

在实验室管理规范的规定下实施研究，以评估多剂静脉注射给药的ALT-803 对食蟹猴的效果。每周使用0.03或0.1mg/kg的ALT-803或PBS以约3分钟静脉注射给药来治疗动物(5猴/性别/组)，持续4周(第1、8、15和22天给药)。纵观该研究的生存期，评价动物的临床和行为观察、食物摄取、体重、心脏和眼功能。取血用于血液学、化学和凝血评价(给药前，和给药后第5、26和36天)并用于免疫细胞分析。取血清用于使用定量酶联免疫吸附化验(ELISA)方法进行的免疫原性测试和PK分析。收集尿液进行尿分析(给药前，和第4、25和35天)。在最后一次注射的4天后(第26天)(3动物/性别/组)和2周后(第36天)(2动物/性别/组)，实施包括体检、肉眼尸检、器官重量测量和组织病理学的临床病理学化验。

基于与可耐受的鼠科动物剂量的类比，在健康食蟹猴体内评价以0.1和0.03 mg/kg进行多剂静脉注射治疗的ALT-803的活性和毒性情况。第一次给药后的PK 分析估算出ALT-803的第一个消除半衰期为约7.6小时，剂量水平之间并未出现显着差异(图17)。对于0.1mg/kg ALT-803的C_max值为30nM，与所给药剂量的完全回收一致，而C_max和AUC_INF值表明0.03mg/kg剂量时的回收少了30％。但是，甚至在低剂量水平，血清中C_max为6nM，仍然比体外发现的用以刺激免疫细胞增殖、活化和细胞毒性的0.1nM浓度高50倍。

连续4周每周接受ALT-803注射的猴，在治疗开始的2周内，显示剂量依赖性的食欲下降。但是，在研究过程中，不存在平均体重或任何其它剂量相关的临床或行为观察结果方面的显着差异。此外，经ALT-803治疗的动物的器官重量与对照组相比并无显着差异。

在每周进行ALT-803治疗后观察到的生物学最相关改变为血液WBC和淋巴细胞计数的剂量依赖性增加(图18A至图18H)。4周的给药期结束时，接受0.1mg/kg ALT-803的动物体内的绝对淋巴细胞计数增加了1.5倍，随后在2周的回收期后恢复至对照水平。淋巴细胞子集中，治疗后可见短暂的NK细胞以及CD4⁺和CD8⁺T 细胞计数的剂量依赖性增加(图18A-图18F)。使用0.1mg/kg ALT-803治疗的猴体内的血液单核细胞计数也增加，而各治疗组之间的血液嗜中性粒细胞水平并无不同。这些结果与先前给药IL-15至恒河猴和猕猴的研究形成对照，先前研究中报导的主要毒性为3/4级的短暂嗜中性粒细胞减少。

基于在最后一次给药ALT-803的4天后进行的组织病理学分析，除了血液免疫细胞水平的改变之外，经ALT-803治疗的猴的肝、肾和肺中的轻度多病灶淋巴细胞性浸润症存在剂量依赖性增加。在给药频率增加的使用ALT-803治疗的动物中，也发现了分散性轻度肝坏疽。这一时间点的临床化学显示，与对照组相比，高剂量ALT-803组的血清白蛋白降低(0.1mg/kg ALT-801，3.85±0.12g/dL；PBS， 4.46±0.13g/dL；P<0.01)，这可能是肝脏中炎性响应的后果。但是，ALT-803治疗的动物体内的血清肝酶水平与对照组相比并未提高。在大多数动物体内观察到骨髓增生，但在高剂量ALT-803组的严重性增加。ALT-803治疗组在治疗2周后降低了所影响的器官主要病灶的发病率和严重性，且与对照组动物中发现的一致。通常，本研究中观察到的ALT-803介导的对于血液和组织淋巴细胞的效果，与使用最高0.1mg/kg的IL-15每周两次治疗或以10至50μg/kg每天治疗的非人灵长类中报导的短暂响应一致。

实施例7：静脉和皮下ALT-803的比较性研究

来自持续进行的使用重组人IL-15(rhIL-15)产品的试验的新兴数据认为，静脉给药对于IL-15可能并非最优，因为它诱发高C_max和二级细胞因子释放(IL-6和 IFN-γ)，而这影响其耐受性并因此限制其应用。使用IL-2进行的临床前研究和临床研究表明，皮下给药更安全且提供好得多的耐受性。例如，Waldmann及同仁进行了人体内的rhIL-15的第一实性肿瘤试验，每天静脉推注，连续推注12天(Conlon et al.,2015.J.Clin.Oncol.,33:74-82)。在3.0和1.0μg/kg每天的群体中观察到的剂量限制性毒性为3级低血压、血小板减少、以及丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶升高(AST)。所声明的最大耐受剂量(MTD)为每天0.3μg/kg。皮下给药的耐受性增加是C_max相较于相同水平的静脉给药减少且循环中rIL-15产品水平更耐久的预期结果。降低C_max允许整体递送更多药物。

为了将这些发现扩展到ALT-803，进行C57BL/6鼠体内的临床前研究以在药代动力学、免疫刺激和抗肿瘤效力方面评估ALT-803的i.v.(静脉)和s.c.(皮下)给药。对使用0.2mg/kg ALT-801治疗的C57BL/6鼠的初步研究显示，静脉给药的预计半衰期为5.3小时而皮下给药为3.8小时。ALT-803的最大血清浓度和时间点为皮下给药后20小时的650ng/ml和静脉给药后2小时的1700ng/ml。就免疫刺激观点而言，皮下或静脉给药的ALT-803可同等程度地诱发CD8⁺T细胞和NK细胞的增殖。此外，ALT-803的静脉和皮下给药同样活化免疫细胞，以减轻荷5T33骨髓瘤鼠骨髓中的肿瘤负荷。最高0.2mg/kg的静脉和皮下两种ALT-803给药方式在正常和荷瘤的C57BL/6鼠体内的耐受性良好。

对C57BL/6鼠每周皮下注射1mg/kg ALT-803，注射4周，由此进行的毒性效应的随访研究显示，免疫系统相关改变与先前毒理学研究中所见者类似，在该先前毒理学研究中，使用相同的ALT-803剂量方案和静脉途径治疗C57BL/6鼠。连续4周每周皮下注射1mg/kgALT-803的鼠中未见死亡。除了第一次皮下注射 ALT-803后轻微的体重减轻和惯例的驼背姿态以外，本研究过程中未观察到与毒性相关的测试项目的临床征兆。外周血检查显示，WBC和淋巴细胞计数的数目比PBS 对照组有所增加。总的来说，使用ALT-803治疗的动物体内的WBC和淋巴细胞比注射PBS的鼠均增加了9倍。在皮下注射ALT-803进行治疗的鼠体内，也观察到了嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的增加。观察到使用ALT-803治疗的鼠的脾、淋巴结和肝脏重量的显着增加(分别为5.5倍、3倍和1.3 倍)。先前已有报导，接受多剂量ALT-803静脉治疗的鼠中存在相当广泛的免疫细胞增大和淋巴器官重量增加。

总之，ALT-803的临床前研究的结果表明，与静脉给药相比，皮下给药降低了 C_max，但保持免疫刺激活性和抗肿瘤效力而不增大毒性。

实施例8：ALT-803与免疫检查点阻断剂的组合在荷原位膀胱肿瘤的鼠体内的抗肿瘤活性

除了实施例4中揭示的研究之外，评估ALT-803与免疫检查点阻断剂的组合在荷原位MB491uc膀胱癌的鼠体内的抗肿瘤活性。在第0天，对C57BL/6鼠(n＝ 6/组)进行MB491uc细胞(3x 10⁴个细胞/膀胱)的膀胱内滴注，之后进行膀胱的聚赖氨酸预处理。在接种MB491uc肿瘤细胞后的第7、10、14和17天，给药PBS、 ALT-803(0.2mg/kg，i.v.)、或ALT-803(0.2mg/kg)加上抗PD-L1和抗CTLA4 Abs(各自为100μg/注射，i.p.)。维持该鼠，以评价治疗组之间的存活率作为效力终点。 ALT-803治疗比PBS组显着延长了荷MB491uc鼠的存活时间(图19A)。但是， ALT-803与抗PD-L1和抗CTLA4 Ab的组合比单一疗法对照组进一步延长了存活时间。这一效果也见于ALT-803+抗PD1和ALT-803+抗PD1/抗CTLA4 mAb的联合疗法(图19B)。

此外，通过ALT-803加上抗PD-L1/抗CTLA4 Ab疗法治愈肿瘤的鼠，对来自膀胱肿瘤的再次挑战具有抗性，无需进一步的药物治疗；而年龄匹配的未进行治疗的鼠在接种肿瘤细胞后发展出肿瘤并死亡(图19A)。这些结果表明，ALT-803单一疗法及其与抗PD-L1、抗PD-1和抗CTLA4 Ab的联合疗法对治疗和膀胱肿瘤的鼠有效，包括治愈性响应；且该ALT-803/抗PD-L1/抗CTLA4 Ab联合疗法提供对于后续肿瘤挑战的免疫记忆响应。还值得注意的是，ALT-803加上检查点抑制剂阻断的组合并未在上述研究中使用的荷肿瘤动物体内造成显着的毒性征兆，这表明这些组合的耐受性良好。如图20所示，MB491uc细胞表达CTLA4和PD-1的配体。如是，这些结果与抗CTLA4、抗PD-1和抗PD-L1 Ab与ALT-803的组合在这一肿瘤模型中的抗肿瘤活性相一致。

实施例9：ALT-803和抗gp75抗体TA99在鼠科动物黑色素瘤模型中的联合疗法

使用同基因C57BL/6鼠中的皮下B16F10黑色素瘤肿瘤模型，进一步评估 ALT-803加上治疗性肿瘤抗原特异性抗体对抗实性肿瘤的效力。这一模型也具有评价T细胞和其它免疫细胞对抗所确立肿瘤和肿瘤再次挑战的活性的优点。用于靶向治疗的一个重要的黑色素瘤特异性抗原是gp75(TYRP-1，酪氨酸酶相关蛋白1)，一种牵涉于黑素体内黑色素合成的75kDa蛋白质(Kobayashi T,et al.1994.EMBO J. 13:5818-25)。TA99(鼠IgG2a)是对人和鼠科动物gp75具有特异性的单克隆抗体 (mAb)(Thomson TM,et al.1985.J InvestDermatol.85:169-74)。使用这一抗体进行治疗，通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)有效废除了同基因鼠内的皮下鼠科动物 B16F10黑色素瘤(Hara I,et al.1995.J Exp Med.182:1609-14)。

设计本文中揭示的实验，以确定这一活性是否能通过与ALT-803的组合而进一步扩大，并评价作为抗肿瘤效力原因的免疫应答。通常，在第0天(SD0)，对 C57BL/6NHsd鼠(7周龄，雌性)下部背侧皮下注射处于200μL PBS中的2x l0⁵个 B16F10肿瘤细胞。对于本研究中除肿瘤再次挑战之外的全部实验，从SD10开始，每周给药两次进行治疗，持续两周(在研究的第10、14、17、21和24天给药)，给药时间点为当超过75％的动物具有可触知的B16F10肿瘤时。更具体地，将鼠分为几组，并注射200μL PBS(i.v.)(运载剂对照)、0.2mg/kg ALT-803(i.v.)、10mg/kg TA99(i.v.)、100μg/鼠的抗PD-L1 mAb 10F.9G2(i.p.)、或ALT-803、TA99和/或 10F.9G2的联合疗法。对于消耗实验，分别从SD3和SD9开始，每周一次腹腔内注射200μg/鼠消耗抗体(抗CD4 GK1.5、抗CD8a 53.6.72和抗NKl.l PK136)，或每四天一次腹腔内注射100μL/鼠Clophosome(用于消耗巨噬细胞的荷有氯膦酸盐的脂质体)。对于牵涉终究再次挑战的实验，从SD0开始，每周给药三次10mg/kg TA99 (i.v.)，每周给药一次0.2mg/kgALT-803(i.v.)，给药三周。约三个月后，对从初始肿瘤挑战中幸存的无肿瘤鼠身体对侧皮下注射处于200μL PBS中的2x l0⁵个 B16F10肿瘤细胞。从治疗第一天直至结束，每天测量肿瘤的体积，使用式1/2(长度x宽度²)计算。牺牲荷有一个维度>20mm的肿瘤的鼠，视为死亡。将不具可触知肿瘤或皮下肿瘤体积小于<50mm³的鼠视为无肿瘤。

在初步研究中，使用TA99、ALT-803、TA99+ALT-803、或PBS对照对荷有已确立的肿瘤的鼠(n＝8)进行每周两次的治疗，持续两周(图21A)。由于延迟的治疗性介入，在任何治疗组中均为观察到肿瘤退化。但是，与PBS治疗组相比，肿瘤进展被TA99(p<0.001)和ALT-803(p<0.001)显着抑制。联合疗法导致对肿瘤生长的抑制比单一疗法显着提升(p<0.001)，表示ALT-803向对抗肿瘤的抗体依赖性免疫力提供额外的保护。

为了确定哪个免疫细胞子集是ALT-803/TA99介导的抗黑色素瘤免疫力的原因，通过腹膜内给药细胞类型特异性抗体或脂质体而在治疗进程之前或贯穿该进程中消耗T淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞。CD8⁺T细胞、NK细胞和巨噬细胞的损耗显着降低了联合疗法对于肿瘤生长的抑制(p<0.001；图21B)，表示全部三个细胞子集均对ALT-803和TA99的效力有贡献。

令人惊奇的是，与无损耗的ALT-803+TA99治疗组相比，CD4⁺T细胞的损耗不仅造成肿瘤抑制的显着提升(p<0.001；图21B)，而且造成动物存活时间的显着增加(p<0.01；图21C)。考虑到CD4⁺T细胞严重牵涉入免疫调控功能中，这一发现表示这些细胞(或CD4⁺T细胞的子集)在对抗B16F10肿瘤的ALT-803/TA99介导的免疫力中起免疫压制作用而非免疫活化作用。

检查治疗对于来自治疗3天后的荷B16F10黑色素瘤肿瘤鼠的脾细胞和肿瘤浸润白血球(TIL)中的免疫细胞的效果。与PBS对照相比，给药ALT-803后，存在 CD8⁺T细胞和NK细胞群落的增加，以及CD4⁺T细胞、B细胞和巨噬细胞群落的减少(图22A和图22B)。正如预期，TA99并未改变脾细胞或TIL中免疫细胞子集的百分比，但造成肿瘤相关巨噬细胞的小幅减少。ALT-803/TA99的组合显示与单独使用ALT-803相似的免疫细胞群落改变。单独使用ALT-803或将其与TA99组合，导致CD8⁺T细胞的记忆表型(CD44^高)的显着增加，由来自脾细胞和TIL的数据支持(图22C和图22D)。由于TIL中的基线CD8⁺CD44^高T细胞群落两倍高于脾脏中的该细胞群落，TIL中记忆CD8⁺T细胞的ALT-803介导的扩展并不突出(1.2 倍，p<0.01；而脾脏中为2.5倍，p<0.001)。TA99略微降低了TIL中记忆CD8⁺T 细胞的百分比(p<0.05)，可能是因为更多效应子CD8⁺T细胞被驱使加入对抗黑色素瘤的抗体依赖性免疫力中。

为了评价ALT-803增强的免疫记忆是否会对改善的对抗肿瘤细胞的长期免疫力有贡献，在尝试治愈挑战B16F10肿瘤的鼠的第0天，开始ALT-803+TA99治疗。在这一治疗方案中，将ALT-803加入TA99疗法中，并不提供对动物存活时间的改善，但在SD60观察到无肿瘤动物的百分比适度增加(图23A)。但是，与年龄匹配但未经治疗的鼠相比，当来自ALT-803+TA99组的幸存鼠进行B16F10细胞的再次挑战时，观察到肿瘤发展的显着延迟(图23B)。这些发现支持下述假设：先前的ALT-803治疗诱发了免疫细胞响应，而这一响应对于经受后续肿瘤再次挑战的动物的“疫苗”保护是关键。为了评价哪一种细胞牵涉入这一保护效应中，在进行肿瘤细胞再次挑战之前，进行ALT-803+TA99“治愈”鼠的损耗研究。结果显示，给药PBS的ALT-803+TA99“治愈”鼠保持不受B16F10肿瘤再次挑战的伤害；而那些使用损耗CD8、CD4或NK细胞的抗体治疗的“治愈”鼠显示，对于对抗来自皮下B16F10肿瘤再次挑战的死亡不具免疫保护(图23C)。这些结果表明，这些细胞类型全部牵涉入初始肿瘤接种后由ALT-803+TA99治疗介导的保护效应中。

还评估该模型中免疫细胞活化和PD-1/PD-L1轴的角色。单剂的ALT-803上调肿瘤浸润CD4⁺T细胞中的CD25⁺细胞(p<0.05)，而TA99下调此活化标记物(p<0.01；图24A)。此外，ALT-803治疗显着增加周边(p<0.001；图24B)和肿瘤内(p<0.01；图24C)的CD4⁺T细胞上的PD-L1表达。TA99治疗仅导致TIL中CD4⁺T细胞上的PD-L1表达的轻微减少(p<0.05)，而TA99和ALT-803不足以改变来自仅使用 ALT-803的影响。因此，ALT-803及其与治疗性抗体的组合的有效性将可能受限于由CD4⁺T细胞强化的免疫检查点抑制剂途径。

还评价ALT-803在荷B16F10肿瘤的鼠体内对CD8⁺T细胞上的PD-1表达的效果。与PBS对照组相比，单剂的ALT-803导致脾脏CD8⁺T细胞上PD-1表达的适度减少，将其回复至接近首次试验鼠(图24C)。此外，ALT-803、TA99、和 ALT-803+TA99的组合疗法全部将肿瘤浸润CD8⁺T细胞上的PD-1表达减少约3 倍(图24D)。

IL-15的一个重要的抗肿瘤作用机制是通过NK细胞的活化。当检查NK上的活化标记物KLRG1时，发现B16F10黑色素瘤尽管产生免疫性的能力极差，但可诱发脾NK细胞上KLRG1的适度增加(p<0.05；图25A)。ALT-803治疗进一步增加脾脏中NK细胞的活化(p<0.05；图25A)，且更重要的是，它造成肿瘤浸润NK 细胞上的KLRG1表达大幅增加(4倍，p<0.001；图25B)。这可能解释ALT-803为什么能有效推动TA99介导的对抗B16F10肿瘤的ADCC，其中，NK细胞是牵涉入这一响应的主要免疫细胞。与CD8⁺T细胞相似，ALT-803也下调脾脏(p<0.01；图25C)和肿瘤(p<0.05；图25D)中NK细胞上的PD-1表达，意味着ALT-803可本质地削弱来自通过CD8⁺T细胞和NK细胞的PD-1臂的检查点途径的抑制，不依赖额外的检查点阻断。

为了探索检查点阻断是否会进一步提升ALT-803和TA99的联合抗抗肿瘤功能，使用具有或不具有抗PD-L1 mAb 10F.9G2的ALT-803+TA99在延迟干预模型中治疗荷有已确立的B16F10肿瘤的鼠(n＝8)(图26A)。单独使用抗PD-L1 mAb以小系数(p<0.05)减缓肿瘤生长。因此，尽管观察到B16F10细胞下体内外均组成性表达PD-L1(图26B)，但抗PD-L1 mAb未能成功作为用于抑制该模型中黑色素瘤生长的潜在单一疗法。从肿瘤生长曲线判断，ALT-803+TA99与抗PD-L1 mAb的组合确实展现比ALT-803+TA99疗法更高的抗肿瘤活性(p<0.05)。

总体而言，这些研究的结果表明，ALT-803与肿瘤特异性抗体组合可提供抗肿瘤活性并延长荷已确立的实性肿瘤的鼠的存活时间。这一治疗也提供对抗进一步肿瘤再次挑战的免疫保护。这些效果是NK细胞和T细胞介导的，该细胞响应治疗而活化并增殖。此外，与检查点抑制剂的治疗量组合可进一步扩大该ALT-803+ 肿瘤特异性抗体方案的抗肿瘤效力。结果，ALT-803单一疗法和ALT-803联合治疗策略可用于多种治疗瘤形成的治疗途径，包括辅助治疗、新辅助治疗、诱发治疗、巩固治疗、维持治疗、一线治疗、≥二线治疗，及与手术、放疗或化疗联合。

还应注意，单独使用ALT-803或将其与抗肿瘤抗体和/或检查点抑制剂阻断的组合并未在上述研究中使用的荷瘤动物体内造成任何显着的毒性征兆，这表明这些组合的耐受性良好。

实施例10：ALT-803在恶性肿瘤患者中的临床研究

如下述者在恶性肿瘤患者体内评估ALT-803。

在患有恶性黑色素瘤和其它实性肿瘤的患者体内进行ALT-803的多中心临床研究。实施该研究，记录在前两个群体中的每一位患者的个人剂量递增和在后三个群体中三位患者的最小值，以测得ALT-803的最大耐受剂量(MTD)或最优生物学剂量(OBD)。登记患者接受两个6周循环，每一循环由4周的每周ALT-803静脉给药和之后的2周休息期组成。

患有稳定或向好性疾病的患者适合接受最多两个额外的6周循环。一位患者接受0.3μg/kg ALT-803剂量水平。所报道的药物引起的不良反应为短暂的低烈度的发热、寒颤、恶心和呕吐。下一位患者接受0.5μg/kg剂量水平。所报道的不良反应全部为轻度至中度，包括恶心、疲劳和瘙痒。三位患者参与并完成以1μg/kg ALT-803剂量水平进行治疗的该研究。所报导的这些患者的不良反应全部为轻度至中度，包括发冷、持续恶化的便秘和高血压。这一试验的研究草案修订为肾细胞癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞头颈癌。三位患者，包括一位患有肾细胞癌的患者，接受3μg/kg剂量水平。迄今为止，所报导的不良反应为轻度至中度，包括发热、疲劳、呕吐和肌肉痛。这些经ALT-903治疗的任何患者体内均未见剂量限制性毒性、3/4级毒性或严重的不良反应，表明这一治疗的耐受性良好。已经报导一些患者体内的疾病趋稳，并预期治疗介导的临床益处(包括肿瘤负担、疾病进展或复发、或毒性的减轻，或无进展生存率、进展时间、响应耐久性、生存时间、或生命品质的增加)。

在患有恶性血液病的患者体内进行ALT-803的多中心临床研究，该患者在进行自体干细胞移植后复发(ASCT)。这一研究的第一期在标准剂量递增3+3设计下进行毒性研究。参与的患者每周一次接受静脉给药的ALT-803，持续4周。六位患者参与并完成以1μg/kgALT-803剂量水平进行治疗的该研究。对于前三位患者，所报导的研究药物引起的不良反应为发热、发冷、寒颤和水肿。两位患者在给药 ALT-803后约4至5小时出现1级发热，并随后在给药ALT-803后6至7小时平息。两位患者出现2级寒颤，两位患者出现2级发冷，以及一位患者出现1级发冷。一位出现2级寒颤的患者在4个ALT-803剂量中的3个时需要杜冷丁。一位经历2级水肿，且另一位患者经历1级水肿。前三位患者经历无症状的低血压，但这些患者在给药流体后即恢复正常而未见低血压复发。所治疗的患者无一进行预先补液。还观察到一位患者在给药第二剂ALT-803后出现2级皮肤瘙痒，这与移植物抗宿主疾病一致。第四、第五和第六位患者接受该研究治疗而未报导不良反应。三位患者完成以3μg/kg ALT-803剂量水平进行治疗的研究。这些患者在每一次给药前接受补液，所报导的不良反应包括在给药ALT-803后6至10小时出现 1级发热和发冷。三位患者参与并完成以6μg/kg ALT-803剂量水平进行治疗的研究。这一群体中最常报导的不良反应包括轻度至中度的发热、寒颤和流感样症状。两位患者以10μg/kg ALT-803剂量水平进行治疗。第一位患者在给药ALT-803后所报导的不良反应包括短暂的发热、恶心和呕吐。不良反应在给药后3小时左右开始，并持续大约4小时。该患者也经历了低烈度的无症状低血压。静脉输液，血压恢复至基线。第二位患者在第一次给药ALT-803后经历了短暂的发热和发冷。使用杜冷丁控制发冷。这些使用ALT-903治疗的任何患者体内均未见剂量限制性毒性、3/4级毒性或严重的不良反应，表明这一治疗的耐受性良好。该草案修订为将ALT-803给药方式从静脉注射改为以6μg/kg剂量水平开始的皮下注射。患者的参与将以静脉给药10μg/kg剂量水平持续至全部三位患者参与至这一群体中。患者随后开始参与6μg/kg的皮下注射。预期治疗介导的临床益处(包括肿瘤负担、疾病进展或复发、或毒性的减轻，或无进展生存率、进展时间、响应耐久性、生存时间、或生命品质的增加)。

进行临床生物标记物评价。对于患有恶性血友病的患者在ASCT后的研究，可基于对该患者给药前和给药后的NK、CD4⁺、CD8⁺和NKT细胞子集和血清细胞因子进行Ki-67分析而获得初始数据。在从1μg/kg至6μg/kg ALT-803的剂量范围内以剂量依赖性方式诱发IFN-γ和IL-6两者的血清水平。以≥3μg/kg的剂量水平给药ALT-803之后，全部患者体内的Ki67⁺NK、CD8⁺和CD4⁺T细胞均增加。因此，初始数据表明，对于这一适应症，ALT-803一贯地促进以≥3μg/kg的剂量水平给药的患者体内NK、T和NKT细胞的活化和增殖。同样，在给药ALT-803后诱发患有实性肿瘤的患者体内的IFN-γ和IL-6的血清水平，表明这些患者体内的治疗相关的免疫刺激。

在患有复发的或难治的多发性骨髓瘤的患者体内进行ALT-803的多中心临床研究。该研究的第一期包括经典(3+3)剂量递增，以测定MTD或最小有效剂量(MED) 并指定用于第II期两阶段拓展的剂量水平。该剂量水平为1、3、6、10和20μg/kg 的ALT-803。参与的患者将接受两个6周循环，每一循环由4周的每周静脉给药 ALT-803和之后的2周休息期组成。患有稳定或向好性疾病的患者适合接受最多两个额外的6周循环。三位患者参与并完成以1μg/kg ALT-803剂量水平进行治疗的该研究。所报道的不良反应全部为轻度至中度，包括便秘、恶心、疲劳、ALC减少和WBC计数减少。全部患者接受术前用药。两位患者进行3μg/kgALT-803剂量水平的治疗。所报导的不良反应包括轻度至中度的发热、寒颤和嗜中性白血球减少。使用ALT-903治疗的任何患者体内未见剂量限制性独特、3/4级毒性或严重的不良反应，表明这一治疗的耐受性良好。预期治疗介导的临床益处(包括肿瘤负担、疾病进展或复发、或毒性的减轻，或无进展生存率、进展时间、响应耐久性、生存时间、或生命品质的增加)。在给药ALT-803后，诱发患有多发性骨髓瘤的患者体内的IFN-γ和IL-6的血清水平，表明这些患者体内的治疗相关免疫刺激。

在患有未经BCG治疗的非肌层浸润性膀胱癌的患者体内进行ALT-803与卡介苗(BCG)的组合的多中心临床研究。本研究的第一期包括经典(3+3)剂量递增，以测定ALT-803的MTD和ALT-803与BCG的组合的推荐剂量(RD)而用于拓展期。该剂量水平为100、200和400μg/滴注ALT-803加上标准BCG(50mg/滴注)。拓展期由接受RD水平的ALT-803与单独使用BCG或BCG的组合的患者的非比较性随机设计组成。参与的患者将每周经由导尿管在膀胱中接受BCG加上ALT-803，持续6周。三位患者参与并完成了以100μg/滴注的ALT-803进行的第一群体的治疗。所报导的研究药物引起的不良反应包括中度恶性、头痛、尿血和泌尿管疼痛以及温和的非感染性膀胱炎。三位患者参与并完成了以200μg/滴注的ALT-803加上BCG进行的治疗。所报导的研究药物引起的不良反应包括中度尿血和尿失禁。两位参与的患者作为使用400μg/滴注的ALT-803进行治疗的群体。这些使用 ALT-903加上BCG进行治疗的患者体内未见剂量限制性毒性、3/4级毒性或严重的不良反应，表明这一治疗的耐受性良好。这些经治疗的患者大多在治疗后至少9 个月内展现无疾病复发(在这一适应症中考虑完全响应)，表明治疗相关的临床活性。在一些患者体内，也观察到了泌尿细胞因子的治疗相关性增加。预期治疗介导的临床益处(包括肿瘤负担、疾病进展或复发、或毒性的减轻，或无进展生存率、进展时间、响应耐久性、生存时间、或生命品质的增加)。

在患有复发的或难治的无痛性B细胞非霍奇金氏淋巴瘤的患者体内进行 ALT-803加上rituximab的多中心临床研究。该研究的第一期包括经典(3+3)剂量递增，以测定MTD或MED并指定用于第II期两阶段拓展的剂量水平。该剂量水平为1、3和6μg/kg的ALT-803。参与的患者将接受一个4周诱发循环，该循环由连续4周每周通过静脉注射给药ALT-803和标准rituximab(375mg/m²)组成。患有稳定或向好性疾病的患者将接受最高4个巩固性治疗循环，每一循环为ALT-803加上rituximab的单一疗程，每8周重复一次，总计4个额外的ALT-803和rituximab 剂量。一位患者参与，且当前正在接受1μg/kg ALT-803剂量水平的治疗。因此，迄今为止所报导的这一患者的不良反应为轻度至中度且包括水肿、ALC减少和 WBC计数减少。使用ALT-903+rituximab治疗的患者体内未见剂量限制性毒性、 3/4级毒性或严重的不良反应，表明这一治疗的耐受性良好。预期治疗介导的临床益处(包括肿瘤负担、疾病进展或复发、或毒性的减轻，或无进展生存率、进展时间、响应耐久性、生存时间、或生命品质的增加)。

将在患有晚期或转移性非小细胞肺癌的患者体内进行ALT-803加上nivolumab(抗PD-1Ab)的多中心临床研究。该研究的第一期包括剂量递增，以测定ALT-803 的MTD并指定用于第II期两阶段拓展的剂量水平。该剂量水平为6、10、和15μg/kg 的皮下ALT-803。参与的患者将接受两个6周循环，每一循环由5周每周给药 ALT-803和每两周静脉给药标准nivolumab(3mg/kg)组成。患有稳定或向好性疾病的患者将接受额外的6周ALT-803加上nivolumab的循环。预期治疗介导的临床益处(包括肿瘤负担、疾病进展或复发、或毒性的减轻，或无进展生存率、进展时间、响应耐久性、生存时间、或生命品质的增加)。

其它具体实施例

尽管本发明已经结合其详细说明书一起予以揭示，前述说明书倾向于例示性说明而非限制本发明范畴，本发明的范畴由权利要求书的范畴所界定。其它方面、优点和修饰处于权利要求书的范畴内。

本文中指代的专利和科技文献构建该领域技术人员可获得的知识。本文中引述的全部美国专利和已公开或未公开的美国专利申请案通过引用而并入本文。本文中引述的全部已公开的外国专利和专利申请案通过引用而并入本文。由本文中引述的保藏号表示的Genbank和NCBI保藏物通过引用而并入本文。本文中引述的全部其它已出版的参考文献、文档、手稿和科学文献通过引用而并入本文。

尽管已经参考本发明的优选具体实施例对本发明进行特定显示和揭示，但该领域技术人员应理解，可对本发明内容的形式和细节作出各种改变而不悖离由权利要求书所涵盖的本发明范畴。

Claims (7)

1.一种有效量的抗体和有效量的医药组合物于制备用于治疗对象体内膀胱癌的药物的用途，该医药组合物包含IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合体ALT-803，其特征在于，所述ALT-803由二聚体IL-15RαSu/Fc和两个IL-15N72D分子组成；

所述IL-15N72D分子的氨基酸序列 如SEQ ID NO: 3所示；

所述IL-15RαSu/Fc的氨基酸序列 如SEQ ID NO: 6所示；以及

所述抗体是抗程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)抗体和抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抗体。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，

(a) 每天给药有效量的所述ALT-803；或

(b) 每周一次或两次给药有效量的所述ALT-803。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，有效量的所述ALT-803为0.1 μg/kg与1 mg/kg之间。

4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，该医药组合物是全身给药。

5.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，该医药组合物是静脉给药、皮下给药、肌肉给药、膀胱内给药、或通过滴注给药。

6.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，所述对象是人。

7.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，所述抗体和所述ALT-803是同步给药或依次给药。

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