KR20210092338A - Il-15-베이즈드 분자 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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KR20210092338A
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Abstract

본 발명은 암 및 감염성 질환을 가진 대상자를 효과적으로 치료하기 위한 IL-15-베이즈드 수퍼아고니스트 복합체 및 항체를 사용하는 병용 요법을 특징으로 한다.

Description

IL-15-베이즈드 분자 및 이의 사용 방법{IL-15-BASED MOLECULES AND METHODS OF USE THEREOF}
[관련 출원]
본 출원은 본 명세서에 그 전문이 참고문헌으로 편입된 미국 가출원 제 62/018,899호(2014년 6월 30일 출원)에 대해 35 U.S.C.§119(e)에 따라 우선권을 주장한다.
[발명의 분야]
본 발명은 일반적으로 암 및 감염원의 치료 요법 분야에 관한 것이다.
본 명세서에 기술된 발명 이전에, 암 및 감염된 세포에 대한 면역 활성을 증가시키며 그리고/또는 지시하는 새로운 전략을 개발할 절실한 요구가 있었다.
본 발명은, 인터루킨-15(IL-15) 수퍼아고니스트 돌연변이와 2량체 IL-15 리셉터 α/Fc 융합 단백질의 복합체인 ALT-803와 함께 항체가 신생물(neoplasia)(예, 교아세포종(glioblastoma), 전립선암, 혈액암(hematological cancer), B-세포 신생물, 다발성 골수종(multiple myeloma), B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma), T-세포 림프종, 고형 종양, 요로상피세포/방광암종, 악성 흑색종(melanoma), 폐암, 신장세포암(renal cell carcinoma), 유방암, 위 및 식도암(gastric and esophageal cancer), 두경부암(head and neck cancer), 대장암(colorectal cancer), 난소암(ovarian cancer), 비-소세포성 폐암(non-small cell lung carcinoma), B-세포 비호지킨 림프종(B cell non-Hodgkin lymphoma), 및 편평세포 두경부암종(squamous cell head and neck carcinoma)) 또는 감염(예, 인체 면역결핍 바이러스에 의한 바이러스 감염)에 대한 면역 반응을 증가시키는데 유용하다는 예기치 않은 발견에, 적어도 부분적으로 기초한다.
대상자에서 신생물 또는 감염을 치료하는 방법은, 유효량의 항체(또는 항체 유사 분자(antibody-like molecule)) 및 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체(ALT-803)를 포함하는 유효량의 약학 조성물을 대상자에게 투여함으로써 수행되며, 여기서 상기 ALT-803은 2량체 IL-15RαSu/Fc 및 두 개의 IL-15N72D 분자를 포함한다. 일 견지로, IL-15N72D 분자는 SEQ ID NO:3을 포함한다. 예시적인 IL-15RαSu/Fc는 SEQ ID NO:6을 포함한다.
대상자는 바람직하게 이러한 치료가 요구되는 포유류이다. 예를 들어, 신생물 또는 감염 또는 이의 소인(predisposition)으로 진단된 대상자이다. 포유류는 예를 들어, 인간, 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말과 같은 어느 포유류뿐만 아니라 예를 들어, 소, 양, 돼지, 닭 및 염소와 같은 식량 소비용으로 키우는 가축 또는 동물들이다. 바람직한 구현으로, 포유류는 인간이다.
본 명세서에 기재된 방법으로 치료하기에 적절한 신생물은 악성 뇌교종(glioblastoma), 전립선암(prostate cancer), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukiemia), B-세포 신생물(B-cell neoplasm), 다발성 골수종(multiple myeloma), B-세포 림프종, 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 만성 림프성 백혈병, 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma), T-세포 림프종, 고형 종양, 요로상피세포/방광암종, 악성 흑색종(melanoma), 폐암, 신장세포암(renal cell carcinoma), 유방암, 위 및 식도암(gastric and esophageal cancer), 두경부암(head and neck cancer), 대장암(colorectal cancer) 및 난소암(ovarian cancer)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법을 이용한 치료를 위한 예시적인 감염은 인체 면역결핍 바이러스(HIV)에 의한 감염이다. 본 명세서에 기재된 방법은 또한 박테리아 감염(예, 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아)(Oleksiewicz et al. 2012. Arch Biochem Biophys. 526:124-31)을 치료하기에 유용하다.
바람직하게, 본 명세서에 기재된 조성물의 투여는 또한 상기 질병의 치료 후 신생물 또는 감염의 향후 재발을 억제한다.
또한, 본 발명의 방법은 자가면역 질병의 효과적인 치료에 유용하며, 여기서 자가면역 반응과 연관된 세포들의 저해 또는 감소는 환자에게 임상적 이득을 제공한다. 이러한 세포들은 백혈구, 특히 B- 또는 T-세포를 포함하며, 이러한 자가면역 질병은 류마티스성 관절염, 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis), 건선(psoriasis), 크론병, 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 타입 I 당뇨병 및 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)을 포함한다(Chan et al. 2010. Nat Rev Immunol. 10:301-16).
ALT-803의 예시적인 유효 투여량은 0.1㎍/kg 내지 100mg/kg 체중을 포함하며, 예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900㎍/kg 체중 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100mg/kg 체중이다.
일부 경우에, ALT-803은 예를 들어, 매 24시간과 같이 매일 투여된다. 또는, ALT-803은 예를 들어, 매 1시간, 매 2시간, 매 3시간, 매 4시간, 매 5시간, 매 6시간, 매 7시간, 매 8시간, 매 9시간, 매 10시간, 매 11시간 또는 매 12시간과 같이 하루에 연속적으로 또는 수회 투여된다.
ALT-803의 예시적인 유효 일일 투여량은 0.1㎍/kg 내지 100mg/kg 체중을 포함하며, 예를 들어, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99㎍/kg 체중이다.
변형적으로, ALT-803은 매 7일에 약 1회와 같이 주당 약 1회 투여된다. 또는 ALT-803은 주당 2회, 주당 3회, 주당 4회, 주당 5회, 주당 6회 또는 주당 7회 투여된다. ALT-803의 예시적인 유효 주당 투여량은 0.0001mg/kg 내지 4mg/kg 체중을 포함하며, 예를 들어, 0.001, 0.003, 0.005, 0.01. 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 또는 4mg/kg 체중이다. 예를 들어, ALT-803의 유효 주당 투약량은 0.1μg/kg 체중과 400μg/kg 체중 사이이다. 변형적으로, ALT-803은 고정된 투여량으로 또는 체표면적(즉, m2 당)에 기초하여 투여된다.
일부 경우에, 대상자는 4주 ALT-803 정맥내 투여 후 2주 휴지기로 구성된 두 개의 6주 사이클을 받는다. 궁극적으로, 담당 의사 또는 수의사는 적절한 양 및 투여법을 결정한다.
본 명세서에 기재된 조성물은 전신성으로, 정맥내, 피하, 근육내, 방광내 또는 점적(instillation)에 의해 투여된다. 항체 및 ALT-803은 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다.
바람직하게, 상기 항체(Ab)는 종양-특이적 항체, 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor) 또는 항바이러스 항체이다. 바람직한 항체는 중쇄 및 경쇄 면역글로블린(Ig) 단백질을 포함하여 구성되며, 이는 설치류, 인간, 키메릭 및 인간화된 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 방법은 항원 바인딩 도메인(예, 단일 사슬 항체, Fab, Fv, T-세포 리셉터 바인딩 도메인, 리간드 바인딩 도메인 또는 리셉터 바인딩 도메인)을 포함하는 분자들과 같은 항체-유사 분자들을 이용할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 도메인들은 바람직하게 Fc 도메인에 연결된다. Ig는 어느 알려진 아이소타입(예, IgA, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG2a, IgG2b, 및 IgM)의 것일 수 있다. 질병에 걸린 표적된 Abs(또는 항체-유사 분자들)을 이용하는 본 명세서에 기재된 일부 적용에 있어서, 그 Ab(또는 항체-유사 분자)는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP)을 매개하는 Fc 리셉터와 상호작용할 수 있는 중쇄 또는 Fc 도메인을 함유한다. 다른 경우에, 이펙터 분자와 컨주게이트된 항체들이 사용될 수 있다. 면역 관문 블로커의 사용과 같은 다른 적용에 있어서, 바람직한 Ab(또는 항체-유사 분자)는 ADCC 또는 ADCP를 효과적으로 매개할 수 있는 중쇄 또는 Fc 도메인(예, IgG4 Fc)을 함유한다.
특정 구현으로, 상기 항체에 대한 항원은 세포 표면 리셉터 또는 리간드를 포함한다. 다른 구현으로, 상기 항원은 CD 항원, 사이토카인 또는 케모카인 리셉터 또는 리간드, 성장인자 리셉터 또는 리간드, 조직인자, 세포 부착 분자, MHC/MHC-유사 분자, Fc 리셉터, 톨 유사 리셉터, NK 리셉터, TCR, BCR, 양성/음성 동시-자극 리셉터 또는 리간드, 사멸 리셉터 또는 리간드, 종양 관련 항원, 또는 바이러스 암호화된 항원을 포함한다.
바람직하게, 종양-특이적 항체는 종양 세포 상의 항원에 바인딩할 수 있다. 암에 걸린 환자의 치료용으로 승인된 종양-특이적 항체는 리툭시맵, 오파투무맵, 및 오비누투주맵(항-CD20 Abs); 트라스투주맵 및 퍼투주맵(항-HER2 Abs); 세툭시맵 및 파니투무맵(항-EGFR Abs); 및 알렘투주맵(항-CD52 Ab)을 포함한다. 마찬가지로, CD20(90Y-표지된 이브리투모맵 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 131I-표지된 토시투모맵(tositumomab)), HER2(아도-트라스투주맵 엠탄신(ado-trastuzumab emtansine)), CD30(브렌툭시맵 베도틴(brentuximab vedotin)) 및 CD33(겜투주맵 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin))에 특이적인 항체-이펙터 분자 컨주게이트들이 암 치료용으로 승인되었다(Sliwkowski MX, Mellman I. 2013 Science 341:1192).
또한, 본 발명의 바람직한 항체는 당해 기술분야에 알려진 다양한 다른 종양-특이적 항체들을 포함할 수 있다. 상기 항체들 및 암 치료를 위한 이들의 각 표적은 이에 한정하는 것은 아니나, 니볼루맵(nivolumab)(항-PD-1 Ab), TA99(항-gp75), 3F8(항-GD2), 8H9(항-B7-H3), 아바고보맵(abagovomab)(항-CA-125(모방품)), 아데카투무맵(adecatumumab)(항-EpCAM), 아푸투주맵(afutuzumab)(항-CD20), 알라시주맵 페골(alacizumab pegol)(항-VEGFR2), 알투모맵 펜테테이트(altumomab pentetate)(항-CEA), 아마툭시맵(amatuximab)(항-메소텔린), AME-133(항-CD20), 아나투모맵 메페나톡스(anatumomab mafenatox)(항-TAG-72), 아폴리주맵(apolizumab)(항-HLA-DR), 아시투모맵(arcitumomab)(항-CEA), 바비툭시맵(bavituximab)(항-포스파티딜세린), 벡투모맵(bectumomab)(항-CD22), 벨리무맵(belimumab)(항-BAFF), 베실레소맵(besilesomab)(항-CEA-관련 항원), 베바시주맵(bevacizumab)(항-VEGF-A), 비바투주맵 메르탄신(bivatuzumab mertansine)(항-CD44 v6), 블리나투모맵(blinatumomab)(항-CD19), BMS-663513(항-CD137), 브렌툭시맵 베도틴(brentuximab vedotin)(항-CD30(TNFRSF8)), 칸투주맵 메르탄신(cantuzumab mertansine)(항-뮤신 CanAg), 칸투주맵 라브탄신(cantuzumab ravtansine)(항-MUC1), 카프로맵 펜데타이드(capromab pendetide)(항-전립선암종 세포), 칼루맵(carlumab)(항-MCP-1), 카투맥소맵(catumaxomab)(항-EpCAM, CD3), cBR96-독소루비신 면역컨주게이트(항-Lewis-Y 항원), CC49 (항-TAG-72), 세델리주맵(cedelizumab)(항-CD4), Ch.14.18(항-GD2), ch-TNT(항-DNA 관련 항원), 시타투주맵 보가톡스(citatuzumab bogatox)(항-EpCAM), 식수투무맵(cixutumumab)(항-IGF-1 리셉터), 클리바투주맵 테트라세탄(clivatuzumab tetraxetan)(항-MUC1), 코나투무맵(conatumumab)(항-TRAIL-R2), CP-870893(항-CD40), 다세투주맵(dacetuzumab)(항-CD40), 다클리주맵(daclizumab)(항-CD25), 달로투주맵(dalotuzumab)(항-인슐린-유사 성장인자 I 리셉터), 다라투무맵(daratumumab)(항-CD38(시클릭 ADP 리보스 하이드롤라아제)), 뎀시주맵(demcizumab)(항-DLL4), 데투모맵(detumomab)(항-B-림프종 세포), 드로지투맵(drozitumab)(항-DR5), 둘리고투맵(duligotumab)(항-HER3), 두시지투맵(dusigitumab)(항-ILGF2), 에크로멕시맵(ecromeximab)(항-GD3 갱글리오사이드), 에드레콜로맵(edrecolomab)(항-EpCAM), 엘로투주맵(elotuzumab)(항-SLAMF7), 엘실리모맵(elsilimomab)(항-IL-6), 에나바투주맵(enavatuzumab)(항-TWEAK 리셉터), 에노티큐맵(enoticumab)(항-DLL4), 엔시툭시맵(ensituximab)(항-5AC), 에피투모맵 시툭세탄(epitumomab cituxetan)(항-에피시알린), 에프라투주맵(epratuzumab)(항-CD22), 에르투맥소맵(ertumaxomab)(항-HER2/neu, CD3), 에타라시주맵(etaracizumab)(항-인테그린 anti-integrin αvβ3), 파랄리모맵(faralimomab)(항-인터페론 리셉터), 팔렛투주맵(farletuzumab)(항-폴레이트 리셉터 1), FBTA05(항-CD20), 피클라투주맵(ficlatuzumab)(항-HGF), 피지투무맵(figitumumab)(항-IGF-1 리셉터), 플란보투맵(flanvotumab)(항-TYRP1(글리코프로틴 75)), 프레솔리무맵(fresolimumab)(항-TGFβ), 푸툭시맵(futuximab)(항-EGFR), 갈릭시맵(galiximab)(항-CD80), 가니투맵(ganitumab)(항-IGF-I), 겜투주맵 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin)(항-CD33), 지렌툭시맵(girentuximab)(항-카보닉 안하이드라아제 9(CA-IX)), 글렘바투무맵 베도틴(glembatumumab vedotin)(항-GPNMB), 구셀쿠맵(guselkumab)(항-IL13), 이발리주맵(ibalizumab)(항-CD4), 이브리투모맵 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan)(항-CD20), 이크루쿠맵(icrucumab)(항-VEGFR-1), 이고보맵(igovomab)(항-CA-125), IMAB362(항-CLDN18.2), IMC-CS4(항-CSF1R), IMC-TR1(TGFβII), 임가투주맵(imgatuzumab)(항-EGFR), 인클라큐맵(inclacumab)(항-셀렉틴 P), 인다툭시맵 라브탄신(indatuximab ravtansine)(항-SDC1), 이노투주맵 오조가미신(inotuzumab ozogamicin)(항-CD22), 인테투무맵(intetumumab)(항-CD51), 이필리무맵(ipilimumab)(항-CD152), 이라투무맵(iratumumab)(항-CD30(TNFRSF8)), KM3065(항-CD20), KW-0761(항-CD194), LY2875358(항-MET) 라베투주맵(labetuzumab)(항-CEA), 람브롤리주맵(lambrolizumab)(항-PDCD1), 렉사투무맵(lexatumumab)(항-TRAIL-R2), 린투주맵(lintuzumab)(항-CD33), 리릴루맵(lirilumab)(항-KIR2D), 로보투주맵 메르탄신(lorvotuzumab mertansine)(항-CD56), 루카투무맵(lucatumumab)(항-CD40), 루밀릭시맵(lumiliximab)(항-CD23(IgE 리셉터)), 마파투무맵(mapatumumab)(항-TRAIL-R1), 마르게툭시맵(margetuximab)(항-ch4D5), 마투주맵(matuzumab)(항-EGFR), 마브릴리무맵(mavrilimumab)(항-GMCSF 리셉터 α-쇄), 밀라투주맵(milatuzumab)(항-CD74), 민레투모맵(minretumomab)(항-TAG-72), 미투모맵(mitumomab)(항-GD3 갱글리오사이드), 모가물리주맵(mogamulizumab)(항-CCR4), 목세투모맵 파수도톡스(moxetumomab pasudotox)(항-CD22), 나콜로맵 타페나톡스(nacolomab tafenatox)(항-C242 항원), 납투모맵 에스타페나톡스(naptumomab estafenatox)(항-5T4), 나르나투맵(narnatumab)(항-RON), 네시투무맵(necitumumab)(항-EGFR), 네스바큐맵(nesvacumab)(항-안지오포이에틴 2), 니모투주맵(nimotuzumab)(항-EGFR), 니볼루맵(nivolumab)(항-IgG4), 노페누모맵 메르펜탄(nofetumomab merpentan), 오크렐리주맵(ocrelizumab)(항-CD20), 오카라투주맵(ocaratuzumab)(항-CD20), 올라라투맵(olaratumab)(항-PDGF-Rα), 오나르투주맵(onartuzumab)(항-c-MET), 온툭시주맵(ontuxizumab)(항-TEM1), 오포르투주맵 모나톡스(oportuzumab monatox)(항-EpCAM), 오레고보맵(oregovomab)(항-CA-125), 오틀레투주맵(otlertuzumab)(항-CD37), 판코맵(pankomab)(MUC1의 항-종양 특이적 글리코실화), 파르사투주맵(parsatuzumab)(항-EGFL7), 파스콜리주맵(pascolizumab)(항-IL-4), 파트리투맵(patritumab)(항-HER3), 펨투모맵(pemtumomab)(항-MUC1), 퍼투주맵(pertuzumab)(항-HER2/neu), 피딜리주맵(pidilizumab)(항-PD-1), 피나투주맵 베도틴(pinatuzumab vedotin)(항-CD22), 핀투모맵(pintumomab)(항-아데노카시노마 항원), 폴라투주맵 베도틴(polatuzumab vedotin)(항-CD79B), 프리투무맵(pritumumab)(항-비멘틴), PRO131921(항-CD20), 퀼리주맵(quilizumab)(항-IGHE), 라코투모맵(racotumomab)(항-N-글리콜릴뉴라미닉산), 라드레투맵(radretumab)(항-피브로넥틴 엑스트라 도메인-B), 라뮤시루맵(ramucirumab)(항-VEGFR2), 릴로투무맵(rilotumumab)(항-HGF), 로바투무맵(robatumumab)(항-IGF-1 리셉터), 롤레두맵(roledumab)(항-RHD), 로벨리주맵(rovelizumab)(항-CD11 & CD18), 사말리주맵(samalizumab)(항-CD200), 사투모맵 펜데타이드(satumomab pendetide)(항-TAG-72), 세리반투맵(seribantumab)(항-ERBB3), SGN-CD19A(항-CD19), SGN-CD33A(항-CD33), 시브로투주맵(sibrotuzumab)(항-FAP), 실툭시맵(siltuximab)(항-IL-6), 솔리토맵(solitomab)(항-EpCAM), 손투주맵(sontuzumab)(항-에피시알린), 타발루맵(tabalumab)(항-BAFF), 타카투주맵 테트라세탄(tacatuzumab tetraxetan)(항-알파-페토프로틴), 타플리투모맵 팝톡스(taplitumomab paptox)(항-CD19), 텔리모맵 아리톡스(telimomab aritox), 테나투모맵(tenatumomab)(항-테나신 C), 테넬릭시맵teneliximab)(항-CD40), 테프로투무맵(teprotumumab)(항-CD221), TGN1412(항-CD28), 티실리무맵(ticilimumab)(항-CTLA-4), 티가투주맵(tigatuzumab)(항-TRAIL-R2), TNX-650(항-IL-13), 토시투모맵(tositumomab)(항-CS20), 토베투맵(tovetumab)(항-CD140a), TRBS07(항-GD2), 트레갈리주맵(tregalizumab)(항-CD4), 트레멜리무맵(tremelimumab)(항-CTLA-4), TRU-016(항-CD37), 투코투주맵 셀몰루킨(tucotuzumab celmoleukin)(항-EpCAM), 유블리툭시맵(ublituximab)(항-CD20), 유렐루맵(urelumab)(항-4-1BB), 반틱투맵(vantictumab)(항-프리즐드 리셉터(anti-Frizzled receptor)), 바팔릭시맵(vapaliximab)(항-AOC3(VAP-1)), 바텔리주맵(vatelizumab)(항-ITGA2), 벨투주맵(veltuzumab)(항-CD20), 베센큐맵(vesencumab)(항-NRP1), 비실리주맵(visilizumab)(항-CD3), 볼록식시맵(volociximab)(항-인테그린 α5β1), 보르세투주맵 마포도틴(vorsetuzumab mafodotin)(항-CD70), 보투무맵(votumumab)(항-종양 항원 CTAA16.88), 잘루투무맵(zalutumumab)(항-EGFR), 자놀리무맵(zanolimumab)(항-CD4), 자툭시맵(zatuximab)(항-HER1), 지랄리무맵(ziralimumab)(항-CD147(바시진(basigin))), RG7636(항-ETBR), RG7458(항-MUC16), RG7599(항-NaPi2b), MPDL3280A(항-PD-L1), RG7450(항-STEAP1), 및 GDC-0199(항-Bcl-2)를 포함한다.
본 발명에 유용한 다른 항체들 또는 종양 바인딩 단백질들(예, TCR 도메인)은 이에 한정하는 것은 아니나, 하기 항원들에 바인딩하는 것들을 포함한다(암 징후는 비제한적인 예를 나타냄): 아미노펩티다아제 N(CD13), 아넥신 A1, B7-H3(CD276, 다양한 암들), CA125(난소암), CA15-3(암종), CA19-9(암종), L6(암종), 루이스 Y(암종), 루이스 X(암종), 알파 페토프로틴(암종), CA242(대장암), 태반 알칼린 포스파타아제(암종), 전립선 특이 항원(전립선), 전립선산 포스파타아제(전립선), 표피성장인자(암종), CD2(호지킨병, NHL 림프종, 다발성 골수종), CD3 엡실론(T 세포 림프종, 폐, 유방, 위, 난소암, 자가면역질환, 악성 복수(malignant ascites), CD19(B 세포 악성 종양), CD20(비호지킨 림프종, B-세포 신생물, 자가면역 질환), CD21(B-세포 림프종), CD22(백혈병, 림프종, 다발성 골수종, SLE), CD30(호지킨 림프종), CD33(백혈병, 자가면역질환), CD38(다발성 골수종), CD40(림프종, 다발성 골수종, 백혈병(CLL)), CD51(전이성 흑색종, 육종), CD52(백혈병), CD56(소세포 폐암, 난소암, 마켈 세포 암종, 및 액상 종양, 다발성 골수종), CD66e(암종), CD70(전이성 신세포암 및 비호지킨 림프종), CD74(다발성 골수종), CD80(림프종), CD98(암종), CD123(백혈병), 뮤신(암종), CD221(고형 종양), CD227(유방, 난소암), CD262(NSCLC 및 다른 암들), CD309(난소암), CD326(고형 종양), CEACAM3(결장, 위암(gastric cancers)), CEACAM5(CEA, CD66e)(유방, 결장 및 폐암), DLL4(A-유사-4), EGFR(다양한 암들), CTLA4(흑색종), CXCR4(CD184, 헴-종양학(heme-oncology), 고형 종양), 엔도글린(CD 105, 고형 종양), EPCAM(표피세포 부착 분자, 방광, 머리, 목, 결장, NHL 전립선, 및 난소암), ERBB2(폐, 유방, 전립선암), FCGR1(자가면역 질환), FOLR(엽산 리셉터(folate receptor), 난소암), FGFR(암종), GD2 갱글리오사이드(암종), G-28(세포 표면 항원 글리코리피드, 흑색종), GD3 이디오타입(idiotype)(암종), 열 충격 단백질(암종), HER1(폐, 위암(stomach cancers)), HER2(유방, 폐 및 난소암), HLA-DR10(NHL), HLA-DRB(NHL, B 세포 백혈병), 인간 융모성 고나도트로핀(암종), IGF1R(고형 종양, 혈액암), IL-2 리셉터(T-세포 백혈병 및 림프종), IL-6R(다발성 골수종, RA, 캐슬만병(Castleman's disease), IL6 의존성 종양), 인테그린(다양한 암들에 대한 αvβ3, α5β1, α6β4, α11β3, α5β5, αvβ5), MAGE-1(암종), MAGE-2(암종), MAGE-3(암종), MAGE 4(암종), 항-트랜스페린 리셉터(암종), p97(흑색종), MS4A1(멤브레인-스패닝 4-도메인 서브패밀리 A 멤버 1(membrane-spanning 4-domains subfamily A member 1), 비호지킨 B 세포 림프종, 백혈병), MUC1(유방, 난소, 자궁경부, 기관지 및 위장암), MUC16(CA125)(난소암), CEA(결장암(colorectal cancer)), gp100(흑색종), MARTI(흑색종), MPG(흑색종), MS4A1(멤브레인-스패닝 4-도메인 서브패밀리 A, 소 세포 폐암, NHL), 뉴클레오린(nucleolin), 네우 종양형성 유전자 산물(Neu oncogene product)(암종), P21(암종), 넥틴-4(암종), 항-(N-글리콜릴뉴라미닉산, 유방, 흑색종 암의 파라토프(paratope of anti-(N- glycolylneuraminic acid, breast, melanoma cancers), PLAP-유사 고환 알칼린 포스파타아제(난소, 고환암), PSMA(전립선 종양), PSA(전립선), ROB04, TAG 72(종양 관련 글리코프로틴 72, AML, 위(gastric), 결장(colorectal), 난소암), T 세포 트랜스멤브레인 프로틴(암), 타이(Tie)(CD202b), 조직 인자, TNFRSF10B(종양 괴사 인자 리셉터 수퍼패밀리 멤버 10B(tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B), 암종), TNFRSF13B(종양 괴사 인자 리셉터 수퍼패밀리 멤버 13B, 다발성 골수종, NHL, 다른 암들, RA 및 SLE), TPBG(트로포블라스트 글리코프로틴(trophoblast glycoprotein), 신장 세포 암종), TRAIL-R1(종양 괴사 아포토시스 유도 리간드 리셉터 1(tumor necrosis apoptosis inducing ligand receptor 1), 림프종, NHL, 결장, 폐암), VCAM-1(CD106, 흑색종), VEGF, VEGF-A, VEGF-2(CD309)(다양한 암들). 일부 다른 종양 관련 항원 표적들이 리뷰되었다(Gerber, et al, mAbs 2009 1:247-253; Novellino et al, Cancer Immunol Immunother. 2005 54:187-207, Franke, et al, Cancer Biother Radiopharm. 2000, 15:459-76, Guo, et al., Adv Cancer Res. 2013; 119: 421-475, Parmiani et al. J Immunol. 2007 178:1975-9). 이러한 항원들의 예는 분화 클러스터(Cluster of Differentiations)(CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CDl la, CDl lb, CDl lc, CD12w, CD14, CD15, CD16, CDwl7, CD18, CD21, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD31, CD32, CD34, CD35, CD36, CD37, CD41, CD42, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49b, CD49c, CD53, CD54, CD55, CD58, CD59, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD68, CD69, CD71, CD72, CD79, CD81, CD82, CD83, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD95, CD96, CD100, CD103, CD105, CD106, CD109, CD117, CD120, CD127, CD133, CD134, CD135, CD138, CD141, CD142, CD143, CD144, CD147, CD151, CD152, CD154, CD156, CD158, CD163, CD166, .CD168, CD184, CDwl86, CD195, CD202(a, b), CD209, CD235a, CD271, CD303, CD304), 아넥신 Al, 뉴클레오린(nucleolin), 엔도글린(endoglin)(CD105), ROB04, 아미노-펩티다아제 N, -유사-4(amino-peptidase N, -like-4(DLL4)), VEGFR-2(CD309), CXCR4(CD184), Tie2, B7-H3, WT1, MUC1, LMP2, HPV E6 E7, EGFRvIII, HER-2/neu, 이디오타입(idiotype), MAGE A3, p53 비돌연변이(nonmutant), NY-ESO-1, GD2, CEA, MelanA/MARTl, Ras 돌연변이, gp100, p53 돌연변이, 프로테이나아제3(proteinase3)(PR1), bcr-abl, 티로시나아제, 서비빈(survivin), hTERT, 육종 트랜스로케이션 브레이크포인츠(sarcoma translocation breakpoints), EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, EpCAM, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 리셉터, 사이클린 B l, 폴리시알산(polysialic acid), MYCN, RhoC, TRP-2, GD3, 푸코실f GMl, 메소텔린, PSCA, MAGE Al, sLe(a), CYPIB I, PLACl, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, 카보닉 안하이드라아제(carbonic anhydrase) IX, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질(sperm protein) 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레규마인(legumain), 타이(Tie) 2, Page4, VEGFR2, MAD- CT-1, FAP, PDGFR-β, MAD-CT-2, 및 Fos-관련 항원 1을 포함한다.
또한, 본 발명의 바람직한 항체는 당해 기술분야에 알려진 감염 세포와 연관된 항원 및 에피토프 표적에 특이적인 것들을 포함한다. 이러한 표적은 이에 한정하는 것은 아니나, 하기의 관심있는 감염원들로부터 유래된 것들을 포함한다: HIV virus(특히 HIV 엔벨로프 스파이크 및/또는 gp120 및 gp41 에피토프로부터 유래된 항원), 인유두종 바이러스(Human papilloma virus)(HPV), 마이코박테리움 터버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 메티실린-저항성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 네이세리아 고노호에아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 뉴모코커스(Pneumococcus), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡술라텀(Histoplasma capsulatum), - 인플루엔자에(influenzae) B, 트레포네마 팔리덤(Treponema pallidum), 라임병 스피로케테스(Lyme disease spirochetes), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 브루셀라 아보터스(Brucella abortus), 라비에스 바이러스(rabies virus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스 I(herpes simplex virus I), 헤르페스 심플렉스 바이러스 II(herpes simplex virus II), 인간 혈청 파보-유사 바이러스(human serum parvo-like virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 바리셀라-조스터 바이러스(varicella-zoster virus), B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 홍역 바이러스(measles virus), 아데노바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus), 뮤린 백혈병 바이러스(murine leukemia virus), 멈프스 바이러스(mumps virus), 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus), 신드비스 바이러스(sindbis virus), 림프구성 맥락수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus), 사마귀 바이러스(wart virus), 블루 텅 바이러스(blue tongue virus), 센다이 바이러스(Sendai virus), 고양이 백혈병 바이러스(feline leukemia virus), 레오바이러스(reovirus), 폴리오 바이러스(polio virus), 시미안 바이러스(simian virus) 40, 마우스 유방종양 바이러스(mouse mammary tumor virus), 뎅기 바이러스(dengue virus), 루벨라 바이러스(rubella virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 플라스모듐 팔시파럼(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 트리파노소마 랑겔리(Trypanosoma rangeli), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 트리파노소마 로데시엔세이(Trypanosoma rhodesiensei), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni), 쉬스토소마 자포니컴(Schistosoma japonicum), 바베시아 보비스(Babesia bovis), 엘메리아 테넬라(Elmeria tenella), 온코세카 볼벌러스(Onchocerca volvulus), 레이슈마니아 트로피카(Leishmania tropica), 트리치넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis), 테일레리아 파르바(Theileria parva), 타에니아 히다티게나(Taenia hydatigena), 타에니아 오비스(Taenia ovis), 타에니아 사지나타(Taenia saginata), 에키토코커스 그라눌로서스(Echinococcus granulosus), 메소세스토이데스 코르티(Mesocestoides corti), 마이코플라스마 아르트리티디스(Mycoplasma arthritidis), M. 히오리니스(M. hyorhinis), M. 오랄레(M. orale), M 아르기니니(M arginini), 아콜렙플라스마 레이들로위(Acholeplasma laidlawii), M. 살리바륨(M. salivarium) 및 M. 뉴모니아에(M. pneumoniae).
다른 구현으로, 상기 항체(또는 항체-유사 분자)는 면역 관문 분자 또는 이의 리간드에 특이적이며, 면역 관문 억제 활성의 인히비터로서 또는 면역 관문 자극 활성의 아고니스트로서 작용한다. 이러한 면역 관문 분자 및 리간드는 PD1, PDL1, PDL2, CTLA4, CD28, CD80, CD86, B7-H3, B7-H4, B7-H5, ICOS-L, ICOS, BTLA, CD137L, CD137, HVEM, KIR, 4-1BB, OX40L, CD70, CD27, OX40, GITR, IDO, TIM3, GAL9, VISTA, CD155, TIGIT, LIGHT, LAIR-1, Siglecs 및 A2aR를 포함한다(Pardoll DM. 2012. Nature Rev Cancer 12:252-264, Thaventhiran T, et al. 2012. J Clin Cell Immunol S12:004). 또한, 본 발명의 바람직한 항체는 이필리무맵(ipilimumab) 및 트리멜리무맵(tremelimumab)(항-CTLA4), 니볼루맵(nivolumab), 펨브롤리주맵(pembrolizumab), 피딜리주맵(pidilizumab), TSR-042, ANB011, AMP-514 및 AMP-224(a ligand-Fc fusion)(항-PD1), MPDL3280A, MEDI4736, MEDI0680, 및 BMS-9365569(항-PDL1), MEDI6469(항-OX40 아고니스트), BMS-986016, IMP701, IMP731, 및 IMP321(항-LAG3)을 포함한다.
일 견지로, 시험관내 또는 생체내에서 항체 치료에 대한 ALT-803의 첨가는 질병에 걸린 또는 질병 관련 세포에 대한 면역 세포의 세포독성을 증가시킨다. 일부 경우에, ALT-803은 질병-특이적 항체(또는 항체-유사 분자)에 의해 매개되는 종양, 감염된 또는 자가면역 질병-관련 세포들에 대해 ADCC 또는 ADCP 활성을 증가시키는 면역 세포를 자극할 수 있다. 일 구현으로, ALT-803을 이용한 면역 세포의 치료는 질병 표적-특이적 항체에 의해 매개되는 질병에 걸린 또는 질병-관련 세포에 대해 ADCC 또는 ADCP를, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%와 같이 적어도 5% 증가시킨다. 바람직한 구현으로, 면역 세포들은 ALT-803으로 처리되며, ADCC 또는 ADCP 매개 종양 특이적 항체를 통해 종양 세포들을 사멸시키는데 사용되며, 여기서 종양 세포 사멸 수준은, ALT-803으로 처리되지 않은 면역 세포들에서 나타나는 것보다 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 더 높은 것과 같이, 적어도 5% 더 높다. 바람직한 구현으로, 대상자에서 종양-특이적 ADCC 또는 ADCP는 ALT-803 및 항체 투여 후에 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%와 같이 적어도 5% 증가된다. 특정 구현으로, NK 세포-베이즈드 ADCC 활성이 ALT-803 처리에 의해 증가된다.
다른 경우에, ALT-803은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 자극하여 예를 들어, 종양 세포 또는 감염된 세포와 같은 질병에 걸린 혹은 질병-관련 세포를 사멸시킨다. 바람직하게, ALT-803 처리는 면역세포 세포용해 활성을 자극하고, 면역 관문 블로커 처리는 면역억제 반응을 저해하여, 이러한 처리들과 함께 종양 또는 감염된 세포들에 대해 고 효과적이며 그리고/또는 지속적인 활성을 제공한다. 일부 구현으로, ALT-803은 인터페론 감마(IFN-γ) 및/또는 IL-6의 혈청 수준을 증가시키며, NK 및 T 세포 증식을 자극하고, CD25, CD69, 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)을 포함하는 활성화 마커들의 NK 및 T 세포 발현을 상향 조절한다. 이러한 마커들의 유도는 질병에 걸린 세포들에 대한 면역 세포들의 반응성 또는 세포용해 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법들은 NK 세포들을 자극하여 종양 또는 감염된 세포들을 사멸시킨다.
다른 구현으로, ALT-803은 호중구 또는 단핵구성 세포를 포함하는 다른 선천적인 면역 세포들의 활성 및/또는 수준을 유도한다. 이러한 세포들은 예를 들어, 종양 세포 또는 감염된 세포들과 같은 질병에 걸린 세포들에 대한 치료적 항체들의 ADCC 및 ADCP를 매개하는 것으로 알려져 있다(Golay, et al. Blood. 2013 122:3482-91, Richards, et al, Mol Cancer Ther 2008 7:2517-27). 바람직하게, ALT-803과 항체의 병용 요법(combination therapy)은 적어도 부분적으로, 선천적인 면역 세포들에 의해 매개되는 메커니즘을 통해 암이나 감염에 걸린 환자들에서 향상된 임상적 반응을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법들은 호중구 또는 단핵구성 세포들을 자극하여 종양 또는 감염된 세포들을 사멸시킨다.
바람직하게, 본 명세서에 기재된 방법들은 본 명세서에 기재된 조성물의 투여 전의 종양 또는 감염된 세포들의 수에 비해, 종양 또는 감염된 세포들의 감소된/줄어든 수를 이끈다. 변형적으로, 본 명세서에 기재된 방법들은 신생물 또는 감염의 감소된 질병 진행을 이끈다. 바람직하게, 본 명세서에 기재된 방법들은 미처리된 대상자들에 비해 대상자의 연장된 생존을 이끈다.
일부 경우에, 대상자에서 신생물 또는 감염을 치료하는 방법은 유효량의 바실러스 칼메트-게랑(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG), 및 ALT-803을 포함하는 유효량의 약학 조성물을 대상자에게 투여함으로써 수행되며, 여기서 ALT-803은 2량체 IL-15RαSu/Fc 및 두 개의 IL-15N72D 분자를 포함한다. 예를 들어, 대상자는 6 연속 주동안 방광 내의 요도관을 통해 매주 BCG와 ALT-803을 받는다.
또한, 신생물의 치료를 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는 유효량의 ALT-803, 항체 및 신생물의 치료를 위한 키트의 사용 설명서를 포함한다.
감염의 치료를 위한 키트는 유효량의 ALT-803, 항체 및 감염의 치료를 위한 키트의 사용 설명서를 포함한다.
본 발명의 가용성 융합 단백질 복합체의 특정 견지로, IL-15 폴리펩타이드는 네이티브 IL-15 폴리펩타이드와 다른 아미노산 서열을 갖는 IL-15 변이체이다. 인간 IL-15 폴리펩타이드는 본 명세서에서 huIL-15, hIL-15, huIL15, hIL15, IL-15 와일드 타입(wt)으로 칭하여지며, 그리고 이의 변이체는 네이티브 아미노산, 이의 성숙 서열 내의 위치 및 변이 아미노산을 이용하여 칭하여진다. 예를 들어, huIL 15N72D는 위치 72에서 N의 D로의 치환을 포함하는 인간 IL-15를 가리킨다. 일 견지로, IL-15 변이체는 예를 들어, 네이티브 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15RβγC 리셉터에 대한 증가된 바인딩 활성에 의해 나타내어지는 것과 같이 IL-15 아고니스트로 기능한다. 변형적으로, IL-15 변이체는 예를 들어, 네이티브 IL-15 폴리펩타이드에 비해 IL-15RβγC 리셉터에 대한 감소된 바인딩 활성에 의해 나타내어지는 것과 같이 IL-15 안타고니스트로 기능한다.
표적 세포를 사멸시키는 방법은 다수의 세포들을 항체와 ALT-803과 접촉시키는 것으로서, 여기서 다수의 세포들은 IL-15 도메인에 의해 인지되는 IL-15R 사슬을 갖는 면역 세포들, 또는 Fc 도메인에 으해 인지되는 Fc 리셉터 사슬을 갖는 면역 세포들, 및 상기 항체에 의해 인지되는 항원을 갖는 표적 세포들을 더 포함하는 접촉, 및 상기 표적 세포들을 사멸시키는 것에 의해 수행된다. 예를 들어, 표적 세포들은 종양 세포 또는 감염된(예, 바이러스 감염된) 세포이다.
표적 항원을 발현하는 질병에 걸린 세포들을 사멸시키는 방법은 유효량의 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체(ALT-803)로 면역 세포들을 표적하고, 상기 ALT-803 처리된 면역 세포들을 표적 항원 및 상기 표적 항원을 발현하는 질병에 걸린 세포들에 특이적인 항체와 혼합하고, 상기 ALT-803 처리된 면역 세포들 및 표적 항원-특이적 항체에 의해 매개되는 ADCC 또는 ADCP를 통해 질병에 걸린 세포들을 사멸시키는 것으로 수행된다. 일 견지로, 질병에 걸린 세포 사멸의 수준은 ALT-803으로 처리되지 않은 면역 세포들에 의해 매개된 것에 비해 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%와 같이 적어도 5% 증가된다.
본 발명은 또한 환자에서 질병을 억제하거나 또는 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 질병에 걸린 세포들은 질병 관련 항원을 발현하며, 상기 방법은 다수의 세포들을 항체 및 ALT-803과 접촉시키는 단계, 및 환자에서 상기 질병을 억제하거나 또는 치료하기에 충분하도록 질병 세포들에 손상을 주거나 또는 사멸시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구현으로, ALT-803과 항체의 병용 요법은 질병 진행을 감소시키며 그리고/또는 환자 생존을 연장시킬 수 있다.
본 발명은 유효량의 항체 및 유효량의 ALT-803을 포유류에 투여함으로써 포유류에서 면역 반응을 자극시키는 방법을 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 숙련자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기의 참고문헌들은 본 발명에 사용된 다수의 용어들의 일반적 정의를 갖는 한 기술을 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al.(eds.), Springer Verlag(1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본 명세서에서 사용된 하기 용어들은 달리 언급하지 않는 한 다음과 같은 의미를 갖는다.
"제제(agent)"는 펩타이드, 핵산 분자 또는 소 화합물을 의미한다. 예시적인 치료 제제는 ALT-803이다.
"ALT-803"은 2량체 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질과 비공유 결합된 IL-15N72D를 포함하며 면역 자극 활성을 갖는 복합체를 의미한다. 일 구현으로, IL-15N72D 및/또는 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질은 레퍼런스 서열에 비해 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 아미노산 변이를 포함한다. 예시적인 IL-15N72D 아미노산 서열은 하기에 제공된다.
"개선하다(ameliorate)"라는 것은 질병의 발달 또는 진행을 감소시키거나, 억제하거나, 약화시키거나, 축소시키거나, 저지하거나 또는 안정화시키는 것을 의미한다.
"유사체(analog)"란, 동일하진 않지만 유사한 기능적 또는 구조적 특징을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 유사체는 이에 상응하는 자연적으로 발생하는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보유하나, 자연적으로 발생하는 폴리펩타이드에 비해 그 유사체의 기능을 증가시키는 특정 생화학적 변형을 갖는다. 이러한 생화학적 변형은 예를 들어, 리간드 바인딩과 같은 변화없이 유사체의 프로테아제 저항성, 멤브레인 투과성, 또는 반감기를 증가시킬 수 있다. 유사체는 비자연적인 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명은 원하는 생물학적 특성을 나타내는 한 항체들 또는 이러한 항체들의 프래그먼트들을 포함한다. 또한 인간화된 항체와 같은 키메릭 항체가 본 발명에 포함된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 안으로 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 인간화는 예를 들어, 설치류 상보성 결정 리전의 적어도 일부를 인간 항체의 이에 상응하는 리전으로 치환함으로써 당해 기술분야에 기술된 방법들을 이용하여 수행될 수 있다.
용어 "항체" 또는 "면역글로블린"은 폴리클로날 및 모노클로날 항체 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 바람직한 항체는 항원에 대해 반응적인 모노클로날 항체이다. 용어 "항체"는 또한 항원에 반응적인 하나 이상의 항체의 혼합물을 포함하는 것으로 의도된다(예, 항원에 반응적인 여러 타입의 모노클로날 항체들의 칵테일). 용어 "항체"는 또한 항체 전체, 이의 생물학적으로 기능적인 프래그먼트, 단일 사슬 항체, 및 하나 이상의 종들의 일부를 포함하는 키메릭 항체와 같은 유전적으로 변형된 항체, 이작용성 항체, 항체 컨주게이트, 인간화된 항체 및 인간 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 생물학적으로 기능적인 항체 프래그먼트가 또한 사용될 수 있으며, 이는 항원에 바인딩하기에 충분한 항체로부터 유래된 펩타이드 프래그먼트들이다. 본 명세서에서 "항체"는 항체 전체뿐만 아니라, 관심있는 에피토프, 항원 또는 항원 프래그먼트에 바인딩할 수 있는 어느 항체 프래그먼트(예, F(ab')2, Fab', Fab, Fv)를 포함하는 것을 의미한다.
분자"에 대한 바인딩(binding to)"이란, 그 분자에 대한 물리화학적 친화도를 갖는 것을 의미한다.
"검출(Detect)"이란, 검출할 분석물의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 칭한다.
"질병(disease)"이란, 정상적인 기능의 세포, 조직 또는 기관에 손상을 주거나 방해하는 어느 컨디션 또는 질환을 의미한다. 질병의 예는 신생물 및 감염을 포함한다.
제형 또는 제형 성분의 용어 "유효량(effective amount)" 및 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"이란, 제형 또는 성분이 단독 또는 조합으로 원하는 효과를 제공하는 충분한 양을 의미한다. 예를 들어, "유효량(effective amount)"은, 단독 또는 조합으로 미처리된 환자에 비해 질병의 증상을 개선하는데 필요한 화합물의 양을 의미한다. 질병의 치료학적 치료를 위해 본 발명을 실시하는데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여방식, 대상자의 연령, 체중 및 일반적인 건강에 따라 달라진다. 궁극적으로, 담당의사 또는 수의사는 적절한 양 및 투여 요법을 결정할 것이다. 이러한 양은 "유효"량이라 칭한다.
"프래그먼트"란 폴리펩타이드 또는 핵산 분자의 일부를 의미한다. 이 부분은 바람직하게, 레퍼런스 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 함유한다. 예를 들어, 프래그먼트는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 뉴클레오타이드 또는 핵산을 함유할 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한 각각, 전장 폴리펩타이드 및 핵산의 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 폴리펩타이드 및 핵산 프래그먼트를 포함한다. 거의 어느 길이의 핵산 프래그먼트가 이용된다. 예를 들어, (모든 중간물질 길이를 포함하여) 약 10,000, 약 5000, 약 3000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50 염기쌍 길이의 총 길이를 갖는 예시적인 폴리뉴클레오타이드 세그먼트가 본 발명의 많은 구현에 포함된다. 마찬가지로, 거의 어느 길이의 폴리펩타이드 프래그먼트가 이용된다. 예를 들어, (모든 중간물질 길이를 포함하여) 약 10,000, 약 5,000, 약 3,000, 약 2,000, 약 1,000, 약 5,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 또는 약 50 아미노산 길이의 총 길이를 갖는 예시적인 폴리펩타이드 세그먼트가 본 발명의 많은 구현에 포함된다.
용어 "분리된(isolated)", "정제된(purified)" 또는 "생물학적으로 순수한(biologically pure)"이란, 이의 네이티브 상태에서 발견되는 바와 같이 이를 정상적으로 수반하는 성분들이 다양한 정도로 함유되지 않은 물질을 가리킨다. "분리하다(Isolate)"라는 것은 오리지널 공급원 또는 주위로부터 어느 정도의 분리를 가리킨다. "정제하다(Purify)"라는 것은 분리보다 더 높은 분리도를 가리킨다.
"정제된(purified)" 또는 "생물학적으로 순수한(biologically pure)" 단백질은, 어느 불순물이 그 단백질의 생물학적 특성에 실질적으로 영향을 주지 않거나 또는 다른 유해한 결과를 일으키지 않도록 다른 물질들이 충분히 없는 것이다. 즉, 본 발명의 핵산 또는 펩타이드는, 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 경우에 세포성 물질, 바이러스 물질 또는 배지가, 또는 화학적으로 합성되는 경우에 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 함유되지 않는다면, 정제된 것이다. 순도 및 동질성은 전형적으로, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 이용하여 검출된다. 용어 "정제된(purified)"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 필수적으로 하나의 밴드를 일으키는 것을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 인산화 또는 글리코실화와 같은 변형을 받을 수 있는 단백질에 있어서, 다양한 변형들은 다양한 분리된 단백질들을 일으킬 수 있으며, 이는 개별적으로 정제될 수 있다.
마찬가지로, "실질적으로 순수한(substantially pure)"이란, 자연적으로 이를 수분하는 성분들로부터 분리된 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 전형적으로, 상기 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 이들이 자연적으로 관련된 단백질 및 자연적으로 발생하는 유기 분자들이 중량으로 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 99% 없는 경우에 실질적으로 순수한 것이다.
"분리된 핵산(isolated nucleic acid)"이란, 이로부터 핵산이 유래되는 유기체의 자연적으로 발생하는 게놈에서 이에 플랭크된 유전자가 없는 핵산을 의미한다. 이 용어는, 예를 들어 (a) 자연적으로 발생하는 게노믹 DNA 분자의 일부이나, 자연적으로 발생하는 유기체의 게놈에서 상기 분자의 그 일부에 플랭크된 핵산 서열들 모두에 의해 프랭크되지 않은 DNA; (b) 결과적으로 형성되는 분자가 어느 자연적으로 발생하는 벡터 또는 게노믹 DNA와 동일하지 않도록 되는 방식으로 벡터 내로 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게노믹 DNA 내로 편입된 핵산; (c) 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생산된 cDNA, 게노믹 프래그먼트, 프래그먼트와 같은 분리된 분자(separate molecule); 및 (d) 하이브리드 유전자, 즉 융합 단백질을 암호화하는 유전자의 일부인 재조합 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 합성적으로 생산된 분자들뿐만 아니라, 화학적으로 변형된 및/또는 변형된 백본을 갖는 어느 핵산들을 더 포함한다. 예를 들어, 분리된 핵산은 정제된 cDNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드이다. 분리된 핵산 분자는 또한 메신저 리보뉴클레익 산(mRNA) 분자를 포함한다.
"분리된 폴리펩타이드(isolated polypeptide)"란, 자연적으로 이를 수반하는 성분들로부터 분리된 본 발명의 폴리펩타이드를 의미한다. 전형적으로, 상기 폴리펩타이드는 자연적으로 관련된 단백질들 및 자연적으로 발생하는 유기 분자들이 중량으로 적어도 60% 없는 경우에 분리된 것이다. 바람직하게, 제조물은 본 발명의 폴리펩타이드가 중량으로 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 99%이다. 본 발명의 분리된 폴리펩타이드는 예를 들어, 자연 공급원으로부터의 추출에 의해, 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 그 단백질을 화학적으로 합성함으로써 획득될 수 있다. 순도는 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의한 것과 같은 어느 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다.
"마커(marker)"란 질병 또는 질환과 관련된 발현 수준 또는 활성의 변형을 갖는 어느 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.
"신생물(neoplasia)"이란, 과도한 증식 또는 감소된 아포토시스로 특징지어진 질병 또는 질환을 의미한다. 본 발명이 사용될 수 있는 예시적인 신생물은 이에 한정하는 것은 아니나, 백혈병(예, 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukiemia), 급성 골수아세포성 백혈병(acute myeloblastic leukemia), 급성 전골수성 백혈병(acute promyelocytic leukemia), 급성 골수단구 백혈병(acute myelomonocytic leukemia), 급성 단구성 백혈병(acute monocytic leukemia), 급성 적백혈병(acute erythroleukemia), 만성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병), 전성 다혈구증(polycythemia vera), 림프종(호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma)), 발텐스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄병(heavy chain disease), 및 육종 및 암종과 같은 고형 종양(예, 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골육종(osteogenic sarcoma), 척색종(chordoma), 혈관육종(angiosarcoma), 내피육종(endotheliosarcoma), 림프관 육종(lymphangiosarcoma), 림프관 내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장암(colon carcinoma), 췌장암(pancreatic cancer), 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 식도암(gastric and esophageal cancer), 두경부암(head and neck cancer), 직장암(rectal cancer), 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 기저세포암(basal cell carcinoma), 선암(adenocarcinoma), 한선암종(sweat gland carcinoma), 피지선암종(sebaceous gland carcinoma), 유듀암종(papillary carcinoma), 유두상선암(papillary adenocarcinomas), 낭선암종(cystadenocarcinoma), 수질암종(medullary carcinoma), 기관지원성암종(bronchogenic carcinoma), 신세포암(renal cell carcinoma), 간세포암(hepatoma), 닐 도관암(nile duct carcinoma), 융모암(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 태생성 암종(embryonal carcinoma), 빌름스 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁암(uterine cancer), 고환암(testicular cancer), 폐암종(lung carcinoma), 소세포 폐암(small cell lung carcinoma), 방광암종(bladder carcinoma), 상피암종(epithelial carcinoma), 신경교종(glioma), 다형 교아종(glioblastoma multiforme), 성상세포종(astrocytoma), 수아세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상의세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모 세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 핍지교종(oligodenroglioma), 쉬반종(schwannoma), 뇌수막종(meningioma), 흑색종(melanoma), 신경아세포종(neuroblastoma) 및 망막아세포종(retinoblastoma))을 포함한다. 특정 구현으로, 신생물은 다발성 골수종, 베타-세포 림프종, 요로상피/방광암종 또는 흑색종이다. 본 명세서에 사용된 "제제를 획득하는 것(obtaining an agent)"에서 "획득하는 것(obtaining)"은 합성, 구입 또는 그렇지 않으면 제제를 얻는 것을 포함한다.
"감소(reduces)"란, 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 네가티브 변화를 의미한다.
"레퍼런스(reference)"란 스탠다드 또는 컨트롤 컨디션을 의미한다.
"레퍼런스 서열(reference sequence)"은 서열 비교를 위한 기준으로 사용되는 정의된 서열이다. 레퍼런스 서열은 명시된 서열의 서브셋 또는 전체일 수 있다. 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 세그멘트, 또는 컴플리트 cDNA 또는 유전자 서열이다. 폴리펩타이드에 있어서, 레퍼런스 폴리펩타이드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16 아미노산, 바람직하게 적어도 약 20 아미노산, 보다 바람직하게 적어도 약 25 아미노산, 그리고 보다 바람직하게 약 35 아미노산, 약 50 아미노산, 또는 약 100 아미노산이 될 것이다. 핵산에 있어서, 레퍼런스 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 50 뉴클레오타이드, 바람직하게 적어도 약 60 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게 적어도 75 뉴클레오타이드, 그리고 보다 바람직하게 약 100 뉴클레오타이드 또는 약 300 뉴클레오타이드 또는 그 부근이나 이들 사이의 어느 정수가 될 것이다.
"특이적으로 바인딩하다(specifically binds)"라는 것은 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드를 자연적으로 포함하는 생물학적 시료와 같은 시료에서 본 발명의 폴리펩타이드를 인지하고 바인딩하지만 실질적으로 다른 분자들을 인지하고 바인딩하지 않는 화합물 또는 항체를 의미한다.
본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 프래그먼트를 암호화하는 어느 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없으나, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열과 "실질적인 동일성(substantial identity)"을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 이중 스트랜드 핵산 분자 중 적어도 하나의 스트랜드와 하이브리드할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 프래그먼트를 암호화하는 어느 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없으나, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열과 "실질적인 동일성(substantial identity)"을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 이중 스트랜드 핵산 분자 중 적어도 하나의 스트랜드와 하이브리드할 수 있다. "하이브리드화(hybridize)"란, 다양한 엄격한 조건하에서, 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열들 사이에 이중 스트랜드 분자를 형성하는 쌍(예, 본 명세서에 기재된 유전자), 또는 이의 일부를 의미한다(참조 예, Wahl, G. M. and S. L. Berger(1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R.(1987) Methods Enzymol. 152:507).
예를 들어, 엄격한 염 농도는 보통 약 750mM NaCl 및 75mM 트리소듐 시트레이트 미만, 바람직하게 약 500mM NaCl 및 50mM 트리소듐 시트레이트 미만, 그리고 보다 바람직하게 약 250mM NaCl 및 25mM 트리소듐 시트레이트 미만이 될 것이다. 저 엄격성 하이브리드화는 예를 들어, 포름아미드와 같은 유기 용매의 부재하에서 획득될 수 있으나, 고 엄격성 하이브리드화는 적어도 약 35% 포름아미드, 그리고 보다 바람직하게 적어도 약 50% 포름아미드의 존재하에서 획득될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 보통 적어도 약 30℃, 보다 바람직하게 적어도 약 37℃, 그리고 가장 바람직하게 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 하이브리드화 시간, 예를 들어, 소듐 도데실 설페이트(SDS)와 같은 디터전트의 농도, 및 캐리어 DNA의 포함 또는 배제와 같은 부가적인 파라미터들을 변화시키는 것은 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 다양한 수준의 엄격성은 필요에 따라 이러한 다양한 조건들을 조합함으로써 이루어진다. 바람직한 구현으로, 하이브리드화는 750mM NaCl, 75mM 트리소듐 시트레이트 및 1% SDS에서 30℃에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 구현으로, 하이브리드화는 500mM NaCl, 50mM 트리소듐 시트레이트, 1% SDS, 35% 포름아미드 및 100 .mu.g/ml 변성 연어 정자 DNA(ssDNA)에서 37℃에서 일어날 것이다. 가장 바람직한 구현으로, 하이브리드화는 250mM NaCl, 25mM 트리소듐 시트레이트, 1% SDS, 50% 포름아미드 및 200 ㎍/ml ssDNA에서 42℃에서 일어날 것이다. 이러한 조건에서의 유용한 변화는 당해 기술분야의 숙련자에게 쉽게 알 수 있을 것이다.
대부분의 적용에 있어서, 하이브리드화에 후속하는 세정 단계는 또한 엄격성이 다를 것이다. 세정 엄격성 조건은 염 농도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 상술한 바와 같이, 세정 엄격성은 염 농도를 감소시키거나 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 세정 단계를 위한 엄격한 염 농도는 바람직하게 약 30mM NaCl 및 3mM 트리소듐 시트레이트 미만, 그리고 가장 바람직하게 약 15mM NaCl 및 1.5mM 트리소듐 시트레이트 미만이 될 것이다. 세정 단계를 위한 엄격한 온도 조건은 보통 적어도 약 25℃, 보다 바람직하게 적어도 약 42℃, 그리고 보다 바람직하게 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 바람직한 구현으로, 세정 단계는 30mM NaCl, 3mM 트리소듐 시트레이트, 및 0.1% SDS에서 25℃에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 구현으로, 세정 단계는 15mM NaCl, 1.5mM 트리소듐 시트레이트, 및 0.1% SDS에서 42℃에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 구현으로, 세정 단계는 15mM NaCl, 1.5mM 트리소듐 시트레이트, 및 0.1% SDS에서 68℃에서 일어날 것이다. 이러한 조건에서의 부가적인 변화는 당해 기술분야의 숙련자에게 쉽게 알 수 있을 것이다. 하이브리드화 기술은 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Benton 및 Davis(Science 196:180, 1977); Grunstein 및 Hogness(Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger 및 Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); 및 Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에 기재되어 있다.
"실질적으로 동일한(substantially identical)"이란, 레퍼런스 아미노산 서열(예, 본 명세서에 기재된 아미노산 서열들 중 어느 하나) 또는 핵산 서열(예, 본 명세서에 기재된 핵산 서열들 중 어느 하나)과 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게, 이러한 서열은 비교를 위해 사용된 서열에 대해 아미노산 수준 또는 핵산에 있어서 적어도 60%, 보다 바람직하게 80% 또는 85%, 그리고 보다 바람직하게 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다.
서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 이용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형들에 대해 상동성 정도를 배정함으로써 동일하거나 유사한 서열들을 매치시킨다. 보존성 치환은 전형적으로 하기 그룹 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루신, 루신; 아스파트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 검출하는 예시적인 방법으로, 밀접한 관계를 갖는 서열을 나타내는 e-3 내지 e-100 사이의 가능성 스코어와 함께 BLAST 프로그램이 사용될 수 있다.
"대상자(subject)"란, 이에 한정하는 것은 아니나 인간 또는 소, 말, 개, 양이나 고양이와 같은 비인간 포유류를 포함하는 포유류를 의미한다. 대상자는 바람직하게, 예를 들어, B 세포 림프종 또는 이에 대한 소인으로 진단된 대상자와 같이, 이러한 치료가 요구되는 포유류이다. 포유류는 예를 들어, 인간, 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말과 같은 어느 포유류뿐만 아니라, 예를 들어, 소, 양, 돼지, 닭 및 염소와 같은 식량 소비용으로 키워지는 가축이나 동물들이다. 바람직한 구현으로, 포유류는 인간이다.
본 명세서에 제공되는 범위는 그 범위 내의 모든 값들에 대하여 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1-50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50을 구성하는 그룹으로부터 어느 수, 수들의 조합, 또는 부분 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료(또는 처리)하는 것(treating)" 및 "치료(또는 처리)(treatment)"는 유해한 컨디션, 질환 또는 질병에 걸린 임상적으로 증상이 있는 개체에 제제 또는 제형을 투여하여 증상의 심각성 및/또는 빈도의 감소에 영향을 주거나, 증상 및/또는 이들의 기저 원인을 제거하거나, 그리고/또는 손상의 개선 또는 교정을 촉진하는 것을 지칭한다. 제외하는 것은 아니나 질환 또는 컨디션을 치료하는 것은, 이와 관련된 질환, 컨디션 또는 증상이 완전히 제거되는 것을 요구하는 것은 아님이 분명할 것이다.
신생물을 가진 환자의 치료는 하기 중 어느 것을 포함할 수 있다: 알려진 종양이 초기 치료(예, 수술)에 의해 제거된 후에 존재할 수 있는 잔류 종양 세포들을 파괴하고 이에 따라 가능한 암 재발을 억제하는 보조제 치료(부가물 치료 또는 보조 요법이라고도 함); 암을 수축시키기 위한 수술 방법 이전에 주어지는 전보조 치료; 차도(remission)를 일으키기 위한, 전형적으로 급성 백혈병에 대해 차도를 일으키기 위한 유도 요법; 차도가 한 번 주어지는 공고 요법(consolidation therapy)(강화 요법이라고도 함)은 차도를 지속시키 위해 달성됨; 보다 낮거나 적은 빈도로 주어진 유지 요법(maintenance therapy)은 차도를 연장시키는데 도움을 줌; 제1선 치료(first line therapy)(표준 치료라고도 함); 제2선(또는 제3선, 제4선 등) 치료(구조 요법이라고도 함)는, 만일 질병이 제1선 치료 후에 반응하지 않거나 재발하는 경우에 주어짐; 및 현저하게 암을 감소시키는 것으로 예측되지 않은 증상 관리를 해소하기 위한 고식적 치료(palliative therapy)(지지 요법이라고도 함).
용어 "예방하는(preventing)" 및 "예방(prevention)"은 특정 유해한 컨디션, 질환 또는 질병에 민감하거나 성향이 있는 임상적으로 증상이 없는 개체에 제제 또는 조성물을 투여하는 것을 칭하며, 이에 따라 증상 및/또는 이들의 기저 원인의 발생을 예방하는 것과 관련된다.
특별히 언급이 없거나 문맥상 명백한 경우, 본 명세서에 사용된 용어 "또는(or)"은 포괄적인 것으로 이해된다. 특별히 언급이 없거나 문맥상 명백한 경우, 본 명세서에 사용된 용어 "하나의(a 또는 an)" 및 "그 또는 상기(the)"는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
특별히 언급이 없거나 문맥상 명백한 경우, 본 명세서에 사용된 용어 "약(about)"은 예를 들어 평균의 2 표준편차 내와 같이, 당해 기술분야에서 일반적으로 관용적인 범위 내인 것으로 이해된다. 약은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 내로 이해될 수 있다. 문맥상 명백하지 않다면, 본 명세서에 제공된 모든 수치는 용어 약으로 조정된다.
본 명세서에서 어느 변량의 정의에서 화학기의 리스트의 언급은 리스트된 그룹의 어느 단일 그룹 또는 조합으로 그 변량의 정의를 포함한다. 본 명세서에서 변량 또는 견지에 대한 구현의 언급은 어느 단일 구현으로서 또는 어느 다른 구현 또는 이의 일부와 함께한 구현을 포함한다.
본 명세서에 제공된 어느 조성물 또는 방법은 본 명세서에 제공된 하나 이상의 어느 다른 조성물 및 방법과 함께 조합될 수 있다.
"포함하는(including)", "함유하는(containing)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 유의어인 전이 용어 "포함하는(comprising)"는 포괄적이거나 개방형이며, 부가적인, 언급되지 않은 성분들 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다. 이와 대조적으로, 전이구 "로 구성된(consisting of)"은 청구항에 명시되지 않은 어느 성분, 단계 또는 구성분을 배제한다. 전이구 "로 필수적으로 구성된(consisting essentially of)"은 명시된 물질들 또는 단계들, 및 청구된 발명의 "기본적이고 새로운 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들"로 청구항의 범위를 한정한다.
본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 이의 바람직한 구현들의 하기 설명 및 청구범위로부터 분명해 질 것이다. 달린 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료들이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용시 사용될 수 있으나, 적절한 방법 및 재료들이 하기에 기재된다. 본 명세서에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허출원은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 본 명세서에 인용된 모든 다른 공개 참고문헌, 문서, 원고 및 과학 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서는 조절될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 이에 한정하려는 것은 아니다.
도 1a-도 1f는 인간 면역 세포 서브셋의 시험관내 증식에 대한 ALT-803의 영향을 나타내는 일련의 라인 그래프이다. 인간 PBMCs를 두 명의 건강한 도너(도너-A, 도 1a, 도 1c, 및 도 1e; 도너-B, 도 1b, 도 1d 및 도 1f)의 혈관 연막(blood buffy coats)으로부터 분리하고, ALT-803을 함유하거나 함유하지 않은 RPMI-10에서 5일간(도 1a 및 도 1b) 또는 배양시간동안(도 1c, 도 1d, 도 1e 및 도 1f) 배양하였다. ALT-803을 도 1a 및 도 1b에 나타낸 농도로, 그리고 도 1c-도 1f에 나타낸 시험용 배지 컨트롤로서 제공된 RPMI-10 10nM로 첨가하였다. 배양 마지막에, PBMCs를 CD4, CD8(T 세포에 대한 마커로서) 및 CD16(NK 세포의 마커로서)에 특이적인 형광 색소-표지된 항체로 염색하였다. 세포 서브셋의 퍼센트를 FACSuite 소프트웨어를 이용하여 FACSverse에서 분석하였다. 개체 도너들로부터 3중 시료들을 도 1a 및 도 1b에 대해 분석하였으며, 각 타임 포인트에 대한 단일 시료들은 도 1c 및 도 1d에 대해 분석되었다. 도 1e 및 도 1f는 각각, 도 1c 및 도 1d에서 획득된 결과로부터 검출된 CD4/CD8 비를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 다른 도너들로부터 인간 면역 세포 서브셋의 시험관내 증식에 대한 ALT-803의 영향을 나타내는 점 도표(dot plots)를 보여준다. 인간 PBMCs를 7명의 건강한 도너들의 혈관 연막(blood buffy coats)으로부터 분리하고, 배지 단독으로, 또는 0.5nM IL-15 또는 ALT-803을 함유하는 배지에서 7일간 배양하였다. 배양 마지막에, PBMCs를 카운트하고, 면역 세포 서브셋에 특이적인 형광 색소-표지된 항체로 염색하였다. 세포 서브셋의 퍼센트를 FACSuite 소프트웨어를 이용하여 FACSverse에서 분석하고, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 절대 세포수를 산출하였다.
도 3a, 도 3b, 도 3c 및 도 3d는 ALT-803으로 배양한 후 면역 세포 서브셋에 대한 CD25 및 CD69 분자의 상향조절을 나타내는 라인 그래프이다. 인간 PBMCs를 두 명의 건강한 도너(좌측 및 우측 패널)의 혈관 연막(blood buffy coats)으로부터 분리하고, 명시된 농도에서 5일간 ALT-803을 함유한 RPMI-10에서 배양하였다. ALT-803 활성화된 PBMCs를 CD4, CD8(T 세포에 대한 마커로서), CD335(NK 세포의 마커로서), CD25 및 CD69(활성화 마커로서)에 특이적인 형광 색소-표지된 항체로 염색하였다. CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 CD25 및 CD69 발현의 형광 강도 [기하학적 평균(MFI)]를 FACSuite 소프트웨어를 이용하여 FACSverse에서 분석하였다.
도 4a-도 4d는 CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 ALT-803에 의한 그랜자임 B 및 퍼포린 발현의 상향조절을 나타내는 라인 그래프이다. 인간 PBMCs를 혈관 연막(blood buffy coats)으로부터 분리하고, 명시된 농도에서 5일간 ALT-803을 함유한 RPMI-10에서 배양하였다. ALT-803 활성화된 PBMCs를 CD8, CD16 및 CD335(NK 세포의 마커로서)에 특이적인 형광 색소-표지된 항체로 염색한 다음, 그랜자임 B 및 퍼포린에 특이적인 형광 색소-표지된 항체로 세포내 염색하였다. CD8+ T 세포(도 4a:도너-1 및 도 4c:도너-2) 및 NK 세포(도 4b:도너-1 및 도 4d:도너-2)에서 그랜자임 B 및 퍼포린 발현의 평균 형광 강도(MFI:기하학적 평균)를 FACSuite 소프트웨어를 이용하여 FACSverse에서 분석하였다.
도 5a, 도 5b, 및 도 5c는 배양시 인간 및 마우스 면역 세포에 의한 사이토카인 생산 및 세포 증식에 대한 ALT-803의 영향을 나타내는 일련의 바 차트이다. 인간 PBMCs(도 5a) 및 마우스 지라세포(도 5b)를 ALT-803을 함유하는 배지에서 4일간 배양하였다. 세포 배지내의 분비된 사이토카인의 변화를 도 5a 및 5b에 나타내었다.
도 6a-도 6d는 ALT-803에 의해 유도된 Daudi 인간 B-세포 림프종 및 K562 인간 골수성 백혈병 세포에 대한 인간 PBMCs의 세포독성을 나타내는 일련의 라인 그래프 및 바 차트이다. 인간 PBMCs는 이펙터 세포로 사용되었으며, Celltrace Violet-표지된 Daudi 및 K562 세포는 표적 세포로 사용되었다. 인간 PBMCs는 10nM ALT-803을 함유하거나 함유하지 않는 RPMI-10에서 명시된 E:T 비율로, K562 세포(도 6a), Daudi 세포(도 6b) 또는 10nM의 리툭시맵(항-CD20 Ab)을 함유한 Daudi 세포(도 6c)와 혼합되었다. 세포 혼합물들은 37℃에서 3일간 배양되고, Daudi 및 K562 표적 세포의 생존도를 FACSVerse 플로우 사이토미터에서 바이올렛-표지된 표적 세포의 프로피듐 요오드 염색의 분색에 의해 평가하였다. 인간 PBMCs를 10:1 비로 바이올렛-표지된 K562 또는 Daudi 세포와 혼합하거나, 또는 10nM로 ALT-803을 함유하거나 함유하지 않은 RPMI-10에서 2:1 비로 Daudi 세포+리툭시뱁(ADCC)과 혼합하였다. 37℃에서 1-3일 배양 후, 표적 세포의 % 세포독성을 검출하였다(도 6d).
도 7a 및 도 7b는 K562 및 Daudi 세포에 대한 인간 PBMC 세포독성의 ALT-803 농도 의존적 유도를 나타내는 일련의 라인 그래프이다. 인간 PBMC는 이펙터 세포로 사용되었으며, Celltrace Violet-표지된 Daudi 및 K562 세포는 표적 세포로 사용되었다. 두 명의 도너(A 및 B)로부터 얻은 인간 PBMCs는 명시된 ALT-803 농도를 함유하는 RPMI-10에서 20:1의 E:T 비율로, 바이올렛-표지된 K562 세포 또는 Daudi 세포와 혼합되었다. 37℃에서 3일간 배양한 후, Daudi 및 K562 표적 세포의 생존도를 FACSVerse 플로우 사이토미터에서 바이올렛-표지된 표적 세포의 프로피듐 요오드 염색의 분색에 의해 평가하였다.
도 8a-도 8d는 ALT-803이 종양 세포에 대해 종양 특이적 Ab의 ADCC를 증가시킴을 보여주는 일련의 라인 그래프이다. 도너-1(도 8a) 또는 도너-2(도 8b)로부터 얻은 신선한 인간 PBMCs는 명시된 농도(0.01-10nM)의 ALT-803 단독 또는 10nM의 리툭시맵(항-CD20 Ab)을 함유한 RPMI-10에서 2:1의 E:T로 바이올렛-표지된 CD20-양성 Daudi 인간 B-세포 림프종 세포와 혼합되었다. 37℃에서 2일간 배양한 후, Daudi 세포 생존도를 BD FACSVerse에서 바이올렛-표지된 Daudi 세포의 프로피듐 요오드 염색의 분색에 의해 평가하였다. 후속 시험에서, NK 세포는 MACS에 의해 정상 인간 PBMCs로부터 분리되었으며, 이펙터 세포로 사용되었다. NK 세포(도 8c) 및 NK-고갈된 PBMCs(도 8d)는 10nM의 리툭시맵 또는 HOAT Ab를 함유한 채, 그리고 이를 함유하지 않은 채, 명시된 농도(0.01 또는 0.1nM)로 ALT-803을 함유하는 RPMI-10에서 1:1의 E:T로 바이올렛-표지된 Daudi 세포와 혼합되었다. 세포들은 37℃에서 2일간 배양되었다. Daudi 세포 생존도를 BD FACSVerse에서 프로피듐 요오드 염색된 바이올렛-표지된 Daudi 세포의 분색에 의해 평가하였다.
도 9a 및 도 9b는 ALT-803이 마우스 지라세포에 의해 종양 세포에 대해 종양 특이적 Ab의 ADCC를 증가시킴을 보여주는 일련의 바 차트이다. 도 9a에 나타낸 시험에서, 지라세포는 종양을 갖는 SCID 마우스로부터 분리되었으며, 이후에 PBS, ALT-803(0.2mg/kg), 리툭시맵(10mg/kg) 또는 ALT-803+리툭시맵으로 처리되었다. 지라세포 및 Celltrace 바이올렛-표지된 Daudi 세포는 배지 단독으로 또는 ALT-803(10nM), 리툭시맵(10nM) 또는 ALT-803+리툭시맵을 함유하는 배지의 존재하에서 20:1의 E:T 비로 혼합되었다. 37℃에서 2일간 배양한 후, Daudi 표적 세포 생존도를 평가하였다. 지라세포는 또한 Balb/c 마우스로부터 분리되었으며, 이후에 ALT-803(0.2mg/kg)으로 처리되었다(도 9b). 지라세포 및 Celltrace 바이올렛-표지된 HER2-양성 SK-BR-3 인간 유방암 세포가 배지 단독으로 또는 다양한 농도의 항-HER2 항체(클론 24D2), ALT-803(10nM) 또는 두 제제를 모두 함유하는 배지의 존재하에서 10:1의 E:T로 혼합되었다. 37℃에서 24시간 배양한 후, SK-BR-3 표적 세포 생존도를 평가하였다.
도 10은 SCID 마우스에서 인간 B 림프종에 대한 ALT-803+CD20 항체의 항종양 효과를 나타내는 바 차트이다. Daudi 세포 종양을 갖는 Fox Chase SCID 암컷 마우스를 PBS, ALT-803(0.2mg/kg), 리툭시맵(10mg/kg) 또는 ALT-803+리툭시맵으로 처리하였다. 골수에서 Daudi 세포는 마지막 처리 후 4일에 측정되었다.
도 11은 SCID 마우스에서 인간 B 림프종에 대한 ALT-803+CD20 항체의 항종양 효과를 나타내는 바 그래프이다. Daudi 세포 종양을 갖는 Fox Chase SCID 암컷 마우스를 PBS, 리툭시맵 또는 리툭시맵+다양한 농도의 ALT-803으로 처리하였다. 골수에서 Daudi 세포는 마지막 처리 후 4일에 측정되었다.
도 12는 ALT-803+항CD20 Ab 치료 후 Daudi 세포 종양을 갖는 마우스의 연장된 생존을 나타내는 라인 그래프이다. Daudi 세포 종양을 갖는 Fox Chase SCID 암컷 마우스를 PBS, 리툭시맵(10mg/kg), ALT-803(0.05mg/kg), 또는 리툭시맵+ALT-803으로 처리하였다. 마우스의 생존을 모니터하고 Kaplan-Meier 생존 곡선을 플롯팅하였다.
도 13a 및 도 13b는 ALT-803 및 ALT-803+항CTLA-4 Ab 치료 후, CT26 결장암 폐 전이를 갖는 마우스의 연장된 생존을 나타내는 일련의 라인 그래프이다. CT26 결장암 폐 전이를 갖는 BALB/c 마우스를 상기 도에 나타낸 바와 같이 PBS, ALT-803, IL-15 단일요법으로 및 항-CTLA4 Ab 및 항-PD-L1 Ab와의 병용 치료로 처리하였다. 마우스의 생존을 모니터하고 Kaplan-Meier 생존 곡선을 플롯팅하였다.
도 14a 및 도 14b는 ALT-803+항PD-L1 Ab 치료 후, 5T33P 골수종양을 갖는 마우스의 연장된 생존을 나타내는 일련의 라인 그래프이다. 도 14a에서, 5T33P 골수종양을 갖는 C57BL/6 마우스를 상기 도에 나타낸 바와 같이 PBS, ALT-803, IL-15 단일요법으로 및 항-CTLA4 Ab 및 항-PD-L1 Ab(0.2mg/마우스)와의 병용 치료로 처리하였다. 마우스의 생존을 모니터하고 Kaplan-Meier 생존 곡선을 플롯팅하였다. 도 14b에서, T33P 골수종양을 갖는 C57BL/6 마우스는 상기 도에 나타낸 바와 같이 PBS, 차선의 ALT-803(0.05mg/kg), 차선의 항-PDL1 Ab(5㎍) 또는 ALT-803 + 항PD-L1 Ab의 조합으로 처리되었다. 마우스의 생존을 모니터하고 Kaplan-Meier 생존 곡선을 플롯팅하였다.
도 15a 및 도 15b는 종양 세포의 표면에서 PD1 및 CTLA4에 대한 리간드의 발현을 나타내는 일련의 그래프이다. CT26(도 15a) 및 5T33P(도 15b) 종양 세포는 PD-L1, CD86 및 CD80(붉은 선) 또는 아이소타입 컨트롤(검은 선)에 대한 항체로 염색된 다음 플로우 사이토메트리로 분석되었다.
도 16a, 도 16b, 도 16c, 도 16d, 도 16e, 및 도 16f는 ALT-803 및 후처리 회복으로 다중투여 처리한 후에 관찰된 마우스에서 변화를 나타내는 일련의 바 그래프이다.
도 17은 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkeys)에서 ALT-803의 약물동태학 프로파일을 나타내는 라인 그래프이다.
도 18a-도 18h는 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkeys)에서 ALT-803 및 후처리 회복 후에 면역 세포수의 변화를 나타내는 일련의 라인 그래프이다.
도 19a 및 도 19b는 ALT-803 + 체크포인트 차단 치료(checkpoint blockade therapy) 후에 동소(orthotopic) MB49luc 방광 종양을 갖는 마우스의 연장된 생존을 나타내는 일련의 라인 그래프이다. 도 19a에서, 동소 MB49luc 방광 종양을 갖는 C57BL/6 마우스는 상기 도에 나타낸 바와 같이 PBS, ALT-803으로, 그리고 항-CTLA4 Ab 및 항-PDL1 Ab와의 병용 치료로 처리되었다. 마우스의 생존을 모니터하고 Kaplan-Meier 생존 곡선을 플롯팅하였다. 80일 후, ALT-803 + 항-PD-L1/항-CTLA4-Ab 그룹의 생존 마우스 및 처리 나이브(naive) 동일 연령 마우스를 MB49luc 종양 세포의 방광내 투여로 재접종(rechallenge)되었다. 마우스 생존을 추가로 모니터하였다. 도 19b에서, MB49luc 종양을 갖는 C57BL/6 마우스는 상기 도에 나타낸 바와 같이 PBS, ALT-803, 항-PD-1 Ab, 항-CTLA-4 Ab 또는 병용 치료로 처리되었다. 마우스의 생존을 모니터하고 Kaplan-Meier 생존 곡선을 플롯팅하였다.
도 20은 MB46luc 종양 세포의 표면에서 PD1 및 CTLA4에 대한 리간드의 발현을 나타내는 일련의 플로우 사이토메트리 그래프이다. MB49luc 종양 세포는 PD-L1, CD86 및 CD80에 대한 항체들(파란 선) 또는 아이소타입 컨트롤로 염색된 다음, 플로우 사이토메트리로 분석되었다.
도 21a-도 21c는 공통 유전자 뮤린 흑색종 모델에서 ALT-803 및 TA99의 조합 효과를 나타내는 일련의 라인 그래프이다. 도 21a에서, B16F10 흑색종 세포(2x105)는 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하주사되었다. 감지할 수 있는 종양이 형성되면, 마우스는 랜덤화되고, 시험 10, 14, 17, 21 및 24일에 0.2mg/kg ALT-803, 10mg/kg TA99, ALT-803 + TA99의 조합, 또는 PBS 컨트롤로 정맥내 처리되었다. 도 21b 및 도 21c는 병용 치료의 항-종양 면역성에 연루된 다양한 세포 서브셋의 이펙터 기능의 평가를 나타낸다. CD4+ 및 CD8+ T 세포의 고갈은 각각, 랫트 mAb GK1.5(항-CD4) 및 53.6.72(항-CD8a)의 복강내 주사에 의해 모두 이루어졌다. NK 세포 고갈은 뮤린 mAB PK136(항-NK1.1)의 복강내 투여에 의해 이루어졌다. 마크로파아지의 고갈을 위해, 마우스는 클로트로네이트-부하된(clodronate-loaded) 리포좀(Clophosome)으로 복강내 주사되었다. 고갈의 영향은 종양 성장(도 21b) 및 마우스 생존(도 21c) 모두를 사용하여 평가되었다. 생존 곡선은 동물들이 종양 전이로 인해 사망하거나 또는 부담된 종양에 대해 종양이 역치 사이즈(일 치수>20mm)에 도달한 경우에 시험일을 나타낸다. n=8/그룹. **:p<0.01; ***:p<0.001.
도 22a-도 22d는 ALT-803-매개가 비장 및 종양 미세환경에서 면역 세포를 증가시킴을 나타내는 일련의 바 차트이다. 도 22a-도 22d에서, 마우스(n=6)는 시험일 0(SD0)에서 B16F10 흑색종 세포(2x105)로 주입되고, SD17에 TA99, ALT-803, ALT-803 + TA99 또는 PBS로 정맥내 처리되었다. SD20에, CD8+ T 세포(CD8a+), CD4+ T 세포(CD4+), NK 세포(panNK+), B 세포(CD19+), 및 마크로파아지(F4/80+)를 플로우 사이토메트리를 이용하여 비장세포(도 22a) 및 TILs(7-AAD-CD45+, 도 22b)에서 정량하였다. 비장(도 22c) 및 TIL(도 22d)의 CD8+ T 세포 집단 중에서 CD8+CD44high 메모리 T 세포의 퍼센트를 측정하고 플롯팅하였다.
도 23a-도 23c는 ALT-803 + TA99가 종양 재접종으로부터 면역 보호를 제공함을 나타내는 일련의 라인 그래프이다. 도 23a-도 23b에서, 시험일 0(SD0)에 B16F10 세포(2x105)로 피하 이식된 마우스(n=20)를 PBS, TA99, 또는 TA99 + ALT-803으로 즉시 정맥내 처리되었다. 3주의 처리 및 2개월의 모니터링 후, 나이브 및 생존 동물들은 B16F10 세포(2x105)의 피하 주사에 의해 대측성으로(contralaterally) 재접종되었다. 초기 종양 접종 동안의 동물들의 종양이 없는 생존(<50mm3의 피하 종양 성장을 유지하는 동물들) 및 재접종 동안의 종양 성장(도 23b)을 측정하고 플롯팅하였다. TB=종양-함유. *:p<0.05; **:p<0.01; ***:p<0.001. 도 23c에서, 뮤린 흑색종 B16F10 세포(2x105/마우스)를 시험일 -58(SD-58)에 C57BL/6 마우스의 옆구리내로 피하 주사하였다. 마우스는 도 23a에서와 같이 B16F10 세포로 주사되고, 0일에 시작하여 3주간 일주일에 2회 정맥내로 ALT-803(0.2mg/kg) 및 TA99(10mg/kg)으로 처리되었다. CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 NK 세포를 고갈시키기 위해, 항-CD4(GK1.5), 항-CD8(53-6.72) 및/또는 항-NK(PK136)를 종양 접종 후 46일에 종양이 없는 마우스 내로 복강내 투여하였다. 종양이 없는 마우스의 항-종양 메모리 반응을 평가하기 위해, B16F10 세포(2x105/마우스)를 제1 종양 접종 후 58일(SD0)에 종양이 없는 마우스 내로 대측성으로 피하주사하였다. B16F10 세포 주입된 처리 나이브 마우스는 컨트롤로서 함께 제공되었다. 생존 곡선은, 동물들이 종양 전이로 인해 사망하거나 또는 역치 사이즈(종양 용적 > 4000 세제곱 mm)에 도달한 경우에 시험일을 요약한다. n=10/그룹.
도 24a-도 24e는 ALT-803이 CD4+ T 세포를 활성화시키고, 이들의 PD-L1 발현을 상향조절하나, CD8+ T 세포에서 PD-1 발현을 낮추는 것을 보여주는 일련의 바 차트이다. 시험 물질의 단일 주사 후 3일에, TIL(7-AAD-CD45+) 프랙션의 CD4+ T 세포(도 24a 및 도 24c) 및 종양을 갖는 마우스의 비장(도 24b)은 항-CD25(도 24a) 또는 항-PD-L1(도 24b 및 도 24c) 항체로 염색되고, 그 후 플로우 사이토메트리 정량화가 이루어졌다. 시험 물질의 단일 주사 후 3일에, 비장(도 24d)으로부터 얻은 CD4+ T 세포(CD8+; 도 24d 및 도 24e) 및 종양을 갖는 마우스(n=6)의 TIL(7-AAD-CD45+) 프랙션(도 24e)은 항-PD-1(도 24d 및 도 24e) 항체로 염색되고, 그 후 플로우 사이토메트리 정량화가 이루어졌다. PD-L1 및 PD-1의 발현은 평균 형광 강도(MFI)를 이용하여 스코어링된다. *:p<0.05; **:p<0.01; ***:p<0.001.
도 25a-도 25d는 ALT-803이 NK 세포를 활성화시키고, NK 세포에서 PD-L1 발현을 하향조절하는 것을 나타내는 일련의 바 차트이다. 시험 물질의 단일 주사 후 3일에, 종양을 갖는 마우스(n=6)의 비장(도 25a 및 도 25c)의 NK 세포(panNK+;) 및 TIL(7-AAD-CD45+) 프랙션(도 25b 및 도 25d)은 항-KLRG1(도 25a 및 도 25b) 및 항-PD-L1(도 25c 및 도 25d) 항체로 염색되고, 그 후 플로우 사이토메트리 정량화가 이루어졌다. KLRG1 및 PD-1의 발현은 평균 형광 강도(MFI)를 이용하여 스코어링된다. *:p<0.05; **:p<0.01; ***:p<0.001.
도 26a-도 26b는 공통 유전자 뮤린 흑색종 모델에서 ALT-803/TA99 및 항-PD-L1 mAb의 조합 효과를 나타내는 일련의 라인 그래프이다. 도 26a에서, B16F10 흑색종 세포(2x105)는 C57BL/6 마우스의 우측 등 옆구리 내로 피하주사되었다. 감지할 수 있는 종양이 형성되면, 마우스는 랜덤화되고, 시험 10, 14, 17, 21 및 24일에 100㎍/마우스 항-PD-L1 10F.9G2(i.p.)와 함께하거나, 또는 하지 않고, 0.2mg/kg ALT-803, 10mg/kg TA99(i.v.)로 처리되었다, *:p<0.05; ***:p<0.001. 시험관내 배양물로부터 수거한 B16F10 세포(실선)뿐만 아니라, 종양을 갖는 마우스(파선)는 플로로포어-표지된 항-PL-L1 항체로 염색되고(붉은 색), 플로우 사이토메트리가 이루어졌다. 항체 아이소타입(검은 색)은 음성 컨트롤로서 포함되었다.
본 발명은 인터루킨-15(IL-15) 수퍼아고니스트 돌연변이와 2량체 IL-15 리셉터 α/Fc 융합 단백질의 복합체인 ALT-803와 함께 항체가 신생물(neoplasia)(예, 교아세포종(glioblastoma), 전립선암, 혈액암(hematological cancer), B-세포 신생물, 다발성 골수종(multiple myeloma), B-세포 림프종, 호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma), T-세포 림프종, 고형 종양, 요로상피세포/방광암종, 악성 흑색종(melanoma), 폐암, 신장세포암(renal cell carcinoma), 유방암, 위 및 식도암(gastric and esophageal cancer), 두경부암(head and neck cancer), 대장암(colorectal cancer), 난소암(ovarian cancer), 비소세포성 폐암(, non-small cell lung carcinoma), B-세포 비호지킨 림프종(B cell non-Hodgkin lymphoma), 및 편평세포 두경부암종(squamous cell head and neck carcinoma)) 또는 감염(예, 인체 면역결핍 바이러스에 의한 바이러스 감염)에 대한 면역 반응을 증가시키는데 유용하다는 예기치 않은 발견에, 적어도 부분적으로 기초한다.
ALT-803
ALT-803은 IL-2Rβγ에 바인딩하는 증가된 능력 및 증가된 생물학적 활성을 갖는 IL-15 돌연변이를 포함한다(미국 특허 제 8,507,222호, 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨). 이 IL-15의 수퍼아고니스트 돌연변이는 공개물에 기재되었으며(J Immunol 2009 183:3598), 미국 특허 및 상표청에 수퍼아고니스트로 등록되었으며, 여러 특허출원이 계류중이다(예, 미국 일련번호 제 12/151,980호 및 13/238,925호). 가용성 IL-15α 리셉터 융합 단백질(IL-15RαSu/Fc)와 함께 이 IL-15 수퍼아고니스트는 시험관내 및 생체내에서 고 효능 IL-15 활성을 갖는 단백질 복합체를 형성한다(Han et al., 2011, Cytokine, 56: 804-810; Xu, et al., 2013 Cancer Res. 73:3075-86, Wong, et al., 2013, OncoImmunology 2:e26442). 이 IL-15 수퍼아고니스트 복합체(IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc)는 ALT-803이라 칭하여진다. 약물동태학 분석은 상기 복합체가 i.v. 투여 후에 25시간의 마우스에서의 반감기를 갖는 것으로 나타났다. ALT-803은 면역적격 마우스에서 공격적인 고형 및 혈액학적 종양 모델에 대해 인상적인 항-종양 활성을 나타낸다. 이는 일주일에 2회 또는 매주 i.v. 투여 요법을 이용한 단일 요법으로, 또는 항체와 함께 병용 치료로서 투여될 수 있다. ALT-803 항-종양 반응은 또한 지속적이다. ALT-803 처리 후에 치료된 종양을 갖는 마우스는 또한 동일한 종양 세포로 재접종하는 것에 대해 매우 저항적이었으며, 이는 ALT-803이 재도입된 종양 세포에 대해 효과적인 면역학적 메모리 반응을 유도함을 나타낸다.
인터루킨-15
인터루킨-15(IL-15)는 이펙터 NK 세포 및 CD8+ 메모리 T 세포의 발달, 증식 및 활성화를 위한 중요한 사이토카인이다. IL-15는 IL-15 리셉터 α(IL-15α)에 바인딩하고, 이펙터 세포상에 IL-15 리셉터 β-공통 γ 사슬(IL-15Rβγc) 복합체를 트랜스로 프리젠팅된다. IL-15 및 IL-2는 IL-15Rβγc에 대한 바인딩을 공유하고, STAT3 및 STAT5 경로를 통해 신호를 보낸다. 그러나, IL-2는 또한 CD4+CD25+FoxP3+ 조절 T(Treg) 세포의 유지를 뒷받침하며, 활성화된 CD8+ T 세포의 세포 사멸을 유도한다. 이러한 효과는 종양에 대한 IL-2의 치료 활성을 제한할 수 있다. IL-15는 IL-2와 이러한 면역억제 활성을 공유하지 않는다. 또한, IL-15는 이펙터 CD8+ T 세포에 대한 항-아포토틱 신호를 제공하는 것으로 알려진 사이토카인일 뿐이다. IL-15는 단독으로 투여되거나, IL-15Rα와 복합체로서 투여되는데, 이는 실험동물 모델에서 잘 확립된 고형 종양에 대해 강력한 항-종양 활성을 나타내어, 잠재적으로 암을 치료할 수 있는 가장 유망한 면역치료 약물 중 하나인 것으로 확인되었다.
IL-15-베이즈드 암 치료의 임상적 발달을 촉진하기 위해, IL-15에 비해 증가된 생물학적 활성을 갖는 IL-15 돌연변이(IL-15N72D)가 확인되었다(Zhu et al., J Immunol, 183: 3598-3607, 2009). 이 IL-15 수퍼아고니스트(IL-15N72D)의 약물동태학 및 생물학적 활성은 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질(ALT-803)의 생성에 의해 더욱 개선되었으며, 이에 따라 상기 수퍼아고니스트 복합체는 적어도 25배의 생체내 네이티브 사이토카인 활성을 갖는다(Han et al., Cytokine, 56: 804-810, 2011).
Fc 도메인
ALT-803은 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 융합 단백질 복합체를 포함한다. IgG의 Fc 리전을 다양한 사이토카인 및 가용성 리셉터들과 같은 다른 단백질의 도메인과 결합하는 융합 단백질들이 보고되었다(참조, 예 Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol., 14:52-60, 1996; U.S. Pat. Nos. 5,116,964 및 5,541,087). 원형 융합 단백질은 IgG Fc의 힌지 리전내의 시스테인 잔기를 통해 연결된 호모다이머 단백질이며, 이는 중쇄 가변 및 CH1 도메인 및 경쇄가 없는 IgG 분자와 유사한 분자를 형성한다. 상기 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질들의 다이머 특성은 다흔 분자들과의 고위 상호작용(즉, 다가 또는 이중 특이적 바인딩)을 제공하는데 유용할 수 있다. 구조적 상동성에 기인하여, Fc 융합 단백질은 유사한 아이소타입을 갖는 인간 IgG의 약물동태학 프로파일에 상당하는 생체내 약물동태학 프로파일을 나타낸다. IgG 클래스의 면역글로블린은 인간 혈액 내에서 가장 풍부한 단백질이며, 이들의 순환 반감기는 21일 정도로 길 수 있다. IL-15 또는 IL-15 융합 단백질의 순환 반감기를 연장시키기 위해, 그리고/또는 이의 생물학적 활성을 증가시키기 위해, 인간 중쇄 IgG 단백질의 Fc 부분에 공유결합된 IL-15RαSu에 비공유결합된 IL-15 도메인을 함유하는 융합 단백질 복합체가 제조되었다(예, ALT-803).
용어 "Fc"는 항체의 비-항원-바인딩 프래그먼트를 칭한다. 이러한 "Fc"는 모노머릭 또는 멀티머릭 형태일 수 있다. 네이티브 Fc의 오리지널 면역글로블린 공급원은 바람직하게 인간 오리진의 것이며, 어느 면역글로블린일 수 있으나, IgG 1 및 IgG2가 바람직하다. 네이티브 Fc's는 공유(즉, 이황화 결합) 및 비공유 결합에 의해 다이머릭 또는 멀티머릭 형태로 결합될 수 있는 모노머릭 폴리펩타이드들로 구성된다. 네이티브 Fc 분자의 모노머 서브유닛들 사이의 분자간 이황화 결합의 수는 클래스(예, IgG, IgA, IgE) 또는 서브클래스(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2)에 따라 1 내지 4 범위이다. 네이티브 Fc의 일 예는 IgG의 파파인 다이제션으로부터 형성된 이황화 결합된 다이머이다(참조 Ellison et al.(1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). 본 명세서에 사용된 용어 "네이티브(native) Fc"는 모노머릭, 다이머릭 및 멀티머릭 형태에 대해 포괄적인 것이다. Fc 도메인은 단백질 A, 단백질 G, 다양한 Fc 리셉터 및 컴플리먼트 단백질에 대한 바인딩 사이트를 함유한다.
일부 구현으로, 용어 "Fc 변이체(variant)"는 네이티브 Fc로부터 변형되었으나 여전히 샐비지(salvage) 리셉터, FcRn에 대한 바인딩 사이트를 포함하는 분자 또는 서열을 칭한다. 국제출원 WO 97/34631(1997년 9월 25일 공개) 및 WO 96/32478에는 예시적인 Fc 변이체들이 기재되어 있을 뿐만 아니라, 샐비지 리셉터와의 상호작용에 대해 기재되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 비인간 네이티브 Fc로부터 인간화된 분자 또는 서열을 포함한다. 더욱이, 네이티브 Fc는 이들이 본 발명의 융합 분자를 필요로 하지 않는 구조적 특징이나 생물학적 활성을 제공하기 때문에 제거될 수 있는 사이트를 포함한다. 따라서, 특정 구현에서, 용어 "Fc 변이체"는 (1) 이황화 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 비혼화성, (3) 선택된 숙주 세포에서 발현시 N-말단 이질성, (4) 글리코실화, (5) 컴플리먼트와의 상호작용, (6) 샐비지 리셉터와 다른 Fc 리셉터에 대한 바인딩, (7) 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC), 또는 (8) 항체 의존적 세포성 식세포작용(ADCP)에 영향을 주거나 연루된 하나 이상의 네이티브 Fc 사이트 또는 잔기가 결여된 분자 또는 서열을 포함한다. Fc 변이체는 이후에 보다 상세히 설명된다.
용어 "Fc 도메인"은 상기 정의한 바와 같은 네이티브 Fc 및 Fc 변이체 분자 및 서열을 포함한다. Fc 변이체 및 네이티브 Fc's와 관련되어, 용어 "Fc 도메인"은, 전체 항체로부터 다이제션되거나 또는 재조합 유전자 발현 또는 다른 수단에 의해 생산되든지 모노머릭 또는 멀티머릭 형태로 분자를 포함한다.
융합 단백질 복합체
본 발명은 IL-15N72D과 IL-15RαSu/Fc 간의 단백질 복합체인 ALT-803을 제공한다. 특정 구현으로, ALT-803 폴리펩타이드는 다른 단백질 도메인에 대한 융합을 위한 스캐폴드로서 제공될 수 있다. 이러한 융합 단백질 복합체에서, 제 1 융합 단백질은 인터루킨-15(IL-15) 또는 이의 기능성 프래그먼트에 공유결합된 제 1의 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드를 포함하며; 그리고 제 2 융합 단백질은 가용성 인터루킨-15 리셉터 알파(IL-15Rα) 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 프래그머트에 공유결합된 제 2의 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인은 제 2 융합 단백질의 가용성 IL-15Rα 도메인에 바인딩하여 가용성 융합 단백질 복합체를 형성한다. 본 발명의 융합 단백질 복합체는 또한 제 1 및 제 2 융합 단백질 중 하나 또는 둘 모두에 결합된 면역글로블린 Fc 도메인 또는 이의 기능성 프래그먼트를 포함한다. 바람직하게, 제 1 및 제 2 융합 단백질에 결합된 Fc 도메인은 상호작용하여 융합 단백질 복합체를 형성한다. 이러한 복합체는 면역글로블린 Fc 도메인들 사이의 이황화 결합 형성에 의해 안정화될 수 있다. 특정 구현으로, 본 발명의 가용성 융합 단백질 복합체는 IL-15 폴리펩타이드, IL-15 변이체 또는 이의 기능성 프래그먼트 및 가용성 IL-15Rα 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 프래그먼트를 포함하며, 여기서 IL-15 및 IL-15Rα 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 면역글로블린 Fc 도메인 또는 이의 기능성 프래그먼트를 더 포함한다.
다른 구현으로, 제 1 및 제 2의 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 항체 또는 이의 기능성 프래그먼트를 포함한다.
다른 구현으로, 상기 항체 도메인에 대한 항원은 세포 표면 리셉터 또는 리간드를 포함한다.
다른 구현으로, 상기 항원은 CD 항원, 사이토카인 또는 케모카인 리셉터 또는 리간드, 성장인자 리셉터 또는 리간드, 조직 인자, 세포 부착 분자, MHC/MHC-유사 분자, Fc 리셉터, 톨-유사 리셉터, NK 리셉터, TCR, BCR, 양성/음성 동시 자극 리셉터 또는 리간드, 사멸 리셉터 또는 리간드, 종양 관련 항원, 또는 바이러스 암호화된 항원을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드" 또는 "이펙터 분자"는 본 명세서에 언급된 바와 같은 원하는 효과를 생성할 수 있는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드와 같은 아미노산 서열; 당 또는 다당류; 리피드 또는 글리코리피드, 글리코단백질, 또는 리포단백질을 의미한다. 또한, 생물학적으로 활성적인 또는 이펙터 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드를 암호화하는 이펙터 분자 핵산이 예상된다. 따라서, 적절한 분자는 조절 인자, 효소, 항체, 또는 약물뿐만 아니라 DNA, RNA 및 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드 또는 이펙터 분자는 자연적으로 발생할 수 있으며, 또는 이는 예를 들어, 재조합 또는 화학적 합성에 의해 알려진 성분들로부터 합성될 수 있으며, 이종성 성분들을 포함할 수 있다. 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드 또는 이펙터 분자는 원심분리 또는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 표준 분자 사이징 기술에 의해 측정시 일반적으로 약 0.1 내지 100 KD 이상 또는 최대 약 1000 KD이며, 바람직하게 약 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30 및 50 KD이다. 본 발명의 원하는 효과는 이에 한정하는 것은 아니나, 예를 들어 증가된 바인딩 활성을 갖는 본 발명의 융합 단백질 복합체, 세포 증식이나 세포 사멸을 유도하는 표적 세포 사멸, 질병 예방 또는 치료시 면역 반응 개시, 또는 진단 목적을 위한 검출 분자로서의 작용을 포함한다. 이러한 검출을 위해, 어세이는 예를 들어 세포를 배양하고 이를 증식하는 연속적인 단계들을 포함하는 어세이가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 본 발명의 융합 단백질 복합체에 이펙터 분자를 공유결합하는 것은 다수의 현저한 이점을 제공한다. 이러한 알려진 구조의 펩타이드를 포함하는 단일 이펙터 분자를 함유하는 본 발명의 융합 단백질 복합체가 생산될 수 있다. 또한, 광범위하게 다양한 이펙터 분자들이 유사한 DNA 벡터에서 생산될 수 있다. 즉, 다양한 이펙터 분자들의 라이브러리가 감염된 또는 질병에 걸린 세포들의 인지를 위해 상기 융합 단백질 복합체에 결합될 수 있다. 또한, 치료학적 적용을 위해, 대상자에게 본 발명의 융합 단백질 복합체의 투여보다는, 상기 융합 단백질을 암호화하는 DNA 발현 벡터가 상기 융합 단백질 복합체의 생체내 발현을 위해 투여될 수 있다. 이러한 접근법은 재조합 단백질의 제조와 전형적으로 관련된 비용이 드는 정제단계를 회피하며, 또한 항원 흡수 및 통상적인 접근법들과 관련된 공정들의 복잡성을 회피한다.
상기 언급한 바와 같이, 예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 단백질 독소, 면역글로블린 도메인 또는 다른 생체활성 분자 및 어느 펩타이드 링커와 같은 이펙터 분자 컨주게이트와 같은 융합 단백질 및 본 명세서에 기재된 항체들의 성분들은 거의 어느 방식으로 조직될 수 있으며, 단 상기 융합 단백질 또는 항체는 이것이 의도된 기능을 갖는 것을 조건으로 한다. 특히, 상기 융합 단백질의 각 성분은 원하는 경우에 적어도 하나의 적절한 펩타이드 링커에 의해 다른 성분으로부터 간격을 둘 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질은 예를 들어 상기 융합 단백질의 변형, 확인 및/또는 정제를 촉진하기 위해 태그를 포함할 수 있다.
약학 치료
본 발명은 치료에 사용되는 ALT-803을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 견지로, ALT-803은 예를 들어 생리 식염수와 같은 약학적으로 허용되는 버퍼에 제형화되어 전신성으로 투여된다. 바람직한 투여 경로는 예를 들어 방광내 점적, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 또는 피하 주입을 포함하며, 이는 연속적이며 지속적인 수준의 조성물을 환자에게 제공한다. 인간 환자 또는 다른 동물의 치료는 생리학적으로 허용되는 캐리어 내에 본 발명에서 확인된 치료의 치료 유료량을 이용하여 수행된다. 적절한 캐리어 및 이들의 제형은 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin에 기재되어 있다. 투여될 치료제의 양은 투여방식, 환자의 연령 및 체중, 및 신생물 또는 감염의 임상적 증상에 따라 달라진다. 일반적으로, 양은 신생물 또는 감염과 관련된 다른 질병의 치료에 사용되는 다른 제제들에 사용되는 양의 범위 내일 것이나, 상기 화합물의 증가된 특이성으로 인해 특정 예로, 보다 낮은 양이 요구될 것이다. 화합물은 대상자의 면역 반응을 증가시키거나 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 방법에 의해 검출시 신생 세포의 증식, 생존 또는 칩입성을 감소시키는 투여량으로 투여된다. 변형적으로, 상기 화합물은 바이러스 또는 다른 관심있는 병원체에 의한 감염을 감소시키는 투여량으로 투여된다.
약학 조성물의 제형화
신생물 또는 감염의 치료를 위한 ALT-803의 투여는 다른 성분들과 함께 신생물 또는 감염을 개선, 감소 또는 안정화하는데 효과적인 치료제의 농도를 형성하는 어느 적절한 수단에 의해 이루어질 수 있다. ALT-803은 어느 적절한 캐리어 물질에 어느 적절한 양으로 함유될 수 있으며, 일반적으로 조성물의 총 중량의 1-95중량%의 양으로 존재한다. 상기 조성물은 비경구(예, 피하, 정맥내, 근육내, 소포내(intravesicularly) 또는 복강내) 투여 경로에 적절한 투여 형태로 제공될 수 있다. 상기 약학 조성물은 통상적인 약학적 수행에 따라 제형화될 수 있다(참조, 예 Remington: The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York).
숙련자는 동물 모델에 비해 인간에 대한 투여량을 조절하는 것이 당해 기술분야에 통상적인 것으로 인식할 수 있으므로, 인간 투여량은 마우스 또는 비인간 영장류에 사용된 화합물의 양으로부터 추정하여 처음에 결정될 수 있다. 특정 구현으로, 투여량은 약 0.1㎍ 화합물/kg 체중 내지 약 5000㎍ 화합물/kg 체중; 또는 약 1㎍/kg 체중 내지 약 4000㎍/kg 체중 또는 약 10㎍/kg 체중 내지 3000㎍/kg 체중으로 달라질 수 있음이 예상된다. 다른 구현으로, 이 투여량은 약 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000㎍/kg 체중일 수 있다. 다른 구현으로, 투여량은 약 0.5㎍ 화합물/kg 체중 내지 약 20㎍ 화합물/kg 체중일 수 있음이 예상된다. 다른 구현으로, 투여량은 약 0.5, 1, 3, 6, 10 또는 20mg/kg 체중일 수 있다. 물론, 이러한 투여량은 이러한 처리 프로토콜에서 통상적으로 이루어지는 바와 같이 상향 또는 하향 조절될 수 있으며, 이는 초기 임상 시험의 결과 및 특정 환자의 요구에 따라 달라진다.
특정 구현으로, ALT-803은 비경구 투여에 적절한 부형제에서 제형화된다. 특정 구현으로, ALT-803은 0.5㎍/kg - 약 15㎍/kg(예, 0.5, 1, 3, 5, 10, 또는 15㎍/kg)으로 투여된다.
방광암의 치료를 위해, ALT-803은 방광 내로의 점적에 의해 투여된다. 점적 방법은 알려져 있다. 참조, 예 Lawrencia, et al., Gene Ther 8, 760-8 (2001); Nogawa, et al., J Clin Invest 115, 978-85 (2005); Ng, et al., Methods Enzymol 391, 304-13 2005; Tyagi, et al., J Urol 171, 483-9 (2004); Trevisani, et al., J Pharmacol Exp Ther 309, 1167-73 (2004); Trevisani, et al., Nat Neurosci 5, 546-51 (2002)); (Segal, et al., 1975). (Dyson, et al., 2005). (Batista, et al., 2005; Dyson, et al., 2005). 특정 구현으로, 점적을 위한 ALT-803 투여량은 약 5-1000㎍/dose로 달라질 수 있다. 다른 구현으로, ALT-803은 미토마이신 C 또는 Bacille Calmette-Guerin(BCG)을 포함하는 표준 치료와 함께 방광 내로 점적에 의해 투여된다.
약학 조성물은 투여시 조절된 방식으로 치료제를 방출하는 약학 조성물 내로 적절한 부형제와 함께 제형화된다. 단일 또는 다중 유닛 정제 또는 캡슐 조성물, 오일 용액, 서스펜션, 에멀젼, 마이크로캡슐, 마이크로스피어, 분자 복합체, 나노파티클, 패치 및 리포좀을 포함한다.
비경구 조성물
ALT-803을 포함하는 약학 조성물은 투여 형태, 제형 또는 적절한 운반 장치 또는 통상적인 무독성의 약학적으로 허용되는 캐리어 및 보저제를 함유하는 이식물로 주사, 인퓨전 또는 주입(피하, 정맥내, 근육내, 소포내, 복강내 등)에 의해 비경구로 투여될 수 있다. 이러한 조성물의 제형화 및 제조는 약학 제형화 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 제형화는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy(상기 참조)에서 찾아볼 수 있다.
비경구 사용을 위한 ALT-803을 포함하는 조성물은 단위 투여 형태(예, 단일-투여 앰플, 주사 또는 백), 또는 여러 투여량을 함유하는 바이얼로 제공될 수 있으며, 적절한 보존제가 첨가될 수 있다(하기 참조). 상기 조성물은 용액, 에멀젼, 인퓨젼 장치, 또는 이식을 위한 운반 장치의 형태에 존재할 수 있으며, 또는 이는 사용하기 전에 물 또는 다른 적절한 비이클로 재구성되기 위한 드라이 파우더로 제공될 수 있다. 신생물 또는 감염을 감소시키거나 개선하는 활성 제제 외에,상기 조성물은 적절한 비경구적으로 허용되는 캐리어 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 활성 치료 제제(들)은 조절된 방출을 위해 마이크로스피어, 마이크로캡슐, 나노파티클, 리포좀 등으로 편입될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서스펜딩, 가용화, 안정화, pH-조절제, 강직성 조절제(tonicity adjusting agents) 및/또는 분산제들을 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, ALT-803을 포함하는 약학 조성물은 멸균 주입용으로 적절한 형태로 존재할 수 있다. 이러한 조성물을 제조하기 위해, 적절한 활성 항종양성/항-감염성 치료제(들)이 비경구적으로 허용되는 액체 비이클에 용해 또는 현탁된다. 그 중에 사용될 수 있는 허용가능한 비이클 및 용매는 물, 적절한 양의 염산, 소듐 하이드록시드 또는 적절한 버퍼의 첨가로 적절한 pH로 조절된 물, 1,3-부탄디올, 링거액 및 등장성 소듐 클로라이드 용액 및 덱스트로즈 용액이다. 수성 제형은 또한 하나 이상의 보존제(예, 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트)를 함유할 수 있다. 상기 화합물들 중 하나가 단지 물에 간헐적으로 또는 약하게 가용적인 경우에, 용해 증진제 또는 가용화제가 첨가될 수 있으며, 또는 그 용매는 10-60% w/w의 프로필렌 글리콜 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 식의 화합물을 포함하는 치료 유효량의 약학 조성물을 대상자(예, 인간과 같은 포유류)에게 투여하는 것을 포함하는 신생물 또는 감염성 질병 및/또는 질환 또는 이의 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, 일 구현은 신생물 또는 감염성 질병 또는 질환 또는 이의 증상으로부터 고통받거나 이에 민감한 대상자를 치료하는 방법이다. 상기 방법은 상기 질병 또는 질환이 치료되는 조건하에서 상기 질병 또는 질환 또는 이의 증상을 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 화합물의 치료양을 포유류에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 본 명세서에 기재된 화합물의 유효량을 (이러한 치료가 요구되는 것으로 확인된 대상자를 포함하는) 대상자에게 그 효과가 나타나도록 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료가 요구되는 대상자를 확인하는 것은 대상자 또는 보건 의료 전문가의 판단이 될 수 있으며, 주관적(예, 의견) 또는 객관적(예, 시험이나 진단 방법에 의한 측정)일 수 있다.
(예방적 치료를 포함하는) 본 발명의 치료 방법은 포유류, 특히 인간을 포함하는 본 발명의 치료가 요구되는 대상자(예, 동물, 인간)에게 본 발명의 식의 화합물과 같은 본 발명의 화합물의 치료 유효량의 투여를 포함한다. 이러한 치료는 대상자, 특히 신생물 또는 감염성 질병, 질환, 또는 이의 증상으로부터 고통받거나, 이를 갖거나, 이에 민감하거나, 이에 위험이 있는 대상자에게 적절히 투여될 것이다. "위험이 있는(at risk)" 대상자들의 검출은 진단 시험 또는 대상자나 건강 의료 제공자(예, 유전학적 시험, 효소 또는 단백질 마커, (본 명세서에 정의된) Marker, 가족력 등)에 의해 어느 주관적 또는 객관적 검출에 의해 이루어질 수 있다. ALT-803은 면역 반응의 증가가 원하여지는 어느 다른 질병들의 치료에 사용될 수 있다.
일 구현으로, 본 발명은 치료 진척을 모니터하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 신생물 또는 감염과 관련된 질병 또는 이의 증상에 걸린 또는 이에 민감한 대상자에서 진단 마커(Marker)(예, 본 발명의 화합물에 의해 조절되는 본 명세서에 기재된 어느 표적, 단백질 또는 이의 인디케이터 등) 또는 진단 측정치(예, 스크린, 어세이)의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 대상자는 상기 질병 또는 이의 증상을 치료하기에 충분한 본 발명의 화합물의 치료량을 투여받는다. 상기 방법에서 검출된 Marker의 수준은 건강한 정상 컨트롤 또는 다른 병에 시달리는 환자들에서 알려진 수준의 Marker와 비교되어 대상자의 질병 상태를 확립할 수 있다. 바람직한 구현으로, 대상자에서 제 2 수준의 Marker가 제 1 수준의 검출보다 늦은 시점에 검출되며, 두 수준은 비교되어 질병 코스 또는 치료 효능이 모니터된다. 특정 바람직한 구현으로, 대상자에서 전처리 수준의 Marker가 본 발명에 따른 치료를 시작하기 전에 검출되며, 이 전처리 수준의 Marker는 그 다음에 치료 시작 후 대상자에서 Marker의 수준괴 비교되어 치료 효능이 검출된다.
병용 치료
바람직하게, ALT-803은 예를 들어, 종양 특이적 항체 또는 면역 관문 인히비터와 같은 항체와 같은 항-종양 또는 항-감염성 치료제와 함께 투여된다. 항체 및 ALT-803은 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 일부 구현으로, 상기 항체 치료는 상기 질병 인디케이션을 위한 확립된 치료이며, 상기 항체 요법에 대한 ALT-803 치료의 첨가는 환자에 대한 치료 이익을 향상시킨다. 이러한 향상은 환자 기준으로 증가된 반응으로서 또는 환자 집단에서 증가된 반응으로서 측정될 수 있다. 병용 치료는 또한 보다 낮거나 적은 빈도의 항체 투여량에서 향상된 반응을 제공할 수 있으며, 이는 보다 우수한 관용적인 치료 요법을 형성한다. 언급한 바와 같이, ALT-803과 항체의 병용 치료는 증가된 ADCC, ADCP, 및/또는 NK 세포, T-세포, 호중구 또는 모노사이트 세포 수준 또는 면역 반응을 포함하는 다양한 메커니즘을 통해 임상적 활성을 증가시킬 수 있다.
필요에 따라, ALT-803은 이에 한정하는 것은 아니나, 수술, 방사선 요법, 화학요법, 단백질-베이즈드 치료 또는 생물학적 치료를 포함하는 어느 통상적인 치료와 함께 투여된다. 화학치료 약물은 알킬화제(예, 백금-베이즈드 약물, 테트라진, 아지리딘, 니트로소우레아, 니트로겐 머스타드), 항-대사물(예, 항-폴레이트, 플로로피리미딘, 데옥시뉴클레오사이드 유사체, 티오퓨린), 항-마이크로튜뷸 제제(예, 빈카 알칼로이드, 탁산), 토포이소머라아제 인히비터(예, 토포이소머라아제 I 및 II 인히비터), 세포독성 항생제(예, 안트라시클린) 및 면역조절 약물(예, 탈리도마이드 및 유사체)을 포함한다.
키트 및 약학 시스템
ALT-803을 포함하는 약학 조성물은 신생물 또는 감염을 치료하는데 사용하기 위해 키트 또는 약학 시스템으로 어셈블리될 수 있다. 본 발명의 이러한 견지에 따른 키트 또는 약학 시스템은 바이얼, 튜브, 앰플, 병, 주사기 또는 백과 같이, 그 안에 하나 이상의 용기 수단들을 폐쇄 감금으로 갖는 박스, 카톤(carton), 튜브와 같은 캐리어 수단을 포함한다. 본 발명의 키트 또는 약학 시스템은 또한 ALT-803을 사용하기 위한 관련 기구들을 포함할 수 있다.
재조합 단백질 발현
일반적으로, 본 발명의 융합 단백질 복합체(예, ALT-803의 성분들)의 제조물은 본 명세서에 기재된 방법들에 의해 그리고 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다.
일반적으로, 재조합 폴리펩타이드는 적절한 발현 비이클에서 폴리펩타이드-암호화 핵산 분자의 전체 또는 일부 또는 이의 프래그먼트를 이용한 적절한 숙주 세포의 형질전환에 의해 생산된다. 분자생물학 분야의 숙련자는 어느 광범위하게 다양한 발현 시스템이 재조합 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 사용되는 특정한 숙주 세포는 본 발명에 중요하지 않다. 재조합 폴리펩타이드는 사실상 어느 진핵 숙주에서 생산될 수 있다(예, 사카로비세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 예, Sf21 세포, 또는 포유류 세포, 예, NIH 3T3, HeLa, COS 또는 바람직하게 CHO 세포). 이러한 세포는 광범위한 공급원으로부터 구입가능하다(예, American Type Culture Collection, Rockland, Md.; 또한, 참조 예, Ausubel et al., Current Protocol in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons, 1997). 트랜스펙션 방법 및 발현 비이클의 선택은 선택된 숙주 시스템에 따라 달라질 것이다. 형질전환 방법은 예를 들어, Ausubel et al.(상기 참조); expression vehicles may be chosen from those provided, e.g., in Cloning Vectors: A Laboratory Manual(P. H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987)에 기재되어 있다.
재조합 폴리펩타이드의 생산을 위해 다양한 발현 시스템이 존재한다. 이러한 폴리펩타이드를 생산하는데 유용한 발현 벡터는 이에 한정하는 것은 아니나, 예를 들어, 박테리아 플라스미드로부터, 박테리오파아지로부터, 트랜스포손으로부터, 이스트 에피솜으로부터, 인서션 엘리먼트로부터, 이스트 염색체 엘리먼트로부터, 배큘로바이러스, SV40과 같은 파포바바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 포울 폭스 바이러스, 슈도래비스 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터와 같은 염색체, 에피솜 및 바이러스 유래 벡터, 및 이의 조합으로부터 유래된 벡터를 포함한다.
재조합 폴리펩타이드가 발현되면, 이는 예를 들어 친화도 크로마토그래피를 이용하여 분리된다. 일 예로, 상기 폴리펩타이드에 대해 발생한 (예, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된) 항체가 컬럼에 부착되고 재조합 폴리펩타이드를 분리하는데 사용될 수 있다. 친화도 크로마토그래피 이전에 폴리펩타이드-은닉된 세포의 라이시스 및 프랙션화는 표준 방법에 의해 수행될 수 있다(참조 예, Ausubel et al., 상기 참조). 분리되면, 재조합 단백질은 필요에 따라 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 더욱 정제될 수 있다(참조 예, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980).
본 명세서에 사용된, 본 발명의 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드 또는 이펙터 분자는 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 단백질 독소, 면역글로블린 도메인 또는 효소와 같은 다른 생체활성 단백질과 같은 인자들을 포함할 수 있다. 또한, 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드는 비-단백질 독소, 세포독성제, 화학치료제, 검출가능한 표지, 방사성 물질 등과 같은 다른 화합물과의 컨주게이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 사이토카인은 다른 세포들에 영향을 주는 세포들에 의해 생산되는 어느 인자들에 의해 정의되며, 세포성 면역의 어느 다수의 다중 영향에 대해 책임이 있다.
사이토카인의 예는 이에 한정하는 것은 아니나, IL-2 패밀리, 인터페론(IFN), IL-10, IL-1, IL-17, TGF 및 TNF 사이토카인 패밀리, 및 IL-1 내지 IL-35, IFN-α, IFN-β, IFNγ, TGF-β, TNF-α 및 TNFβ를 포함한다.
본 발명의 일 견지로, 제 1 융합 단백질은 인터루킨-15(IL-15) 도메인 또는 이의 기능성 프래그먼트에 공유결합된 제 1의 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드를 포함한다. IL-15는 T-세포 활성화 및 증식에 영향을 주는 사이토카인이다. 면역 세포 활성화 및 증식에 있어서 IL-15 활성은 일부 견지에서 IL-2와 유사하나, 기본적인 차이는 잘 특성화되어 있다(Waldmann, T A, 2006, Nature Rev. Immunol. 6:595-601).
본 발명의 다른 견지로, 제 1 융합 단백질은 IL-15 변이체(본 명세서에서 IL-15 돌연변이라고도 함)인 인터루킨-15(IL-15) 도메인을 포함한다. IL-15 변이체는 바람직하게 네이티브(또는 와일드 타입) IL-15 단백질과 다른 아미노산 서열을 포함한다. IL-15 변이체는 바람직하게 IL-15Rα 폴리펩타이드에 바인딩하며, IL-15 아고니스트 또는 안타고니스트로 기능한다. 바람직하게, 아고니스트 활성을 갖는 IL-15 변이체는 수퍼 아고니스트 활성을 갖는다. 일부 구현에서, IL-15 변이체는 IL-15Rα와의 연관성과 독립적으로 IL-15 아고니스트 또는 안타고니스트로서 기능할 수 있다. IL-15 아고니스트는 와일드 타입 IL-15와 비교하여 대등하거나 또는 증가된 생물학적 활성으로 예시된다. IL-15 안타고니스트는 와일드 타입 IL-15와 비교하여 감소된 생물학적 활성에 의해 예시되거나, 또는 IL-15-매개된 반응을 저해하는 능력에 의해 예시된다. 일부 구현으로, IL-15 변이체는 IL-15RβγC 리셉터에 증가된 또는 감소된 활성으로 바인딩한다. 일부 구현으로, IL-15 변이체의 서열은 네이티브 IL-15 서열과 비교하여 예를 들어, 치환 또는 결실과 같은 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 이러한 변화는 IL-15 아고니스트 또는 안타고니스트 활성을 일으킨다. 바람직하게, 아미노산 치환/결실은 IL-15Rβ 및/또는 γC와 상호작용하는 IL-15의 도메인에 존재한다. 보다 바람직하게, 아미노산 치환/결실은 IL-15Rα 폴리펩타이드에 대한 바인딩 또는 IL-15 변이체를 생산하는 능력에 영향을 미치지 않는다. IL-15 변이체를 생성하기 위한 적절한 아미노산 치환/결실은 추정 또는 알려진 IL-15 구조, 알려진 구조를 갖는 IL-2와 같은 상동성 분자와 IL-15의 비교에 기초하여, 본 명세서에 제공되는 바와 같은 래셔널(rational) 또는 랜덤 돌연변이생성, 또는 다른 경험적인 방법을 통해 확인될 수 있다. 부가적으로 적절한 아미노산 치환은 보존적이거나 비보존적인 변화 및 부가적인 아미노산의 삽입일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 IL-15 변이체는 성숙 인간 IL-15 서열의 6, 8, 10, 61, 65, 72, 92, 101, 104, 105, 108, 109, 111, 또는 112 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환/결실을 함유하며; 특히, D8N("D8"은 네이티브 성숙 인간 IL-15 서열에서 아미노산 및 잔기 위치를 칭하며, "N"은 IL-15 변이체에서 그 위치에서의 치환된 아미노산 잔기를 칭함), I6S, D8A, D61A, N65A, N72R, V104P 또는 Q108A 치환은 안타고니스트 활성을 갖는 IL-15 변이체를 형성하며, N72D 치환은 아고니스트 활성을 갖는 IL-15 변이체를 형성한다.
사이토카인과 유사한 케모카인은 다른 세포들에 노출될 경우에 어느 다수의 세포성 면역의 다중 영향에 책임이 있는 어느 화학 인자 또는 분자로 정의된다. 적절한 케모카인은 이에 한정하는 것은 아니나 CXC, CC, C, 및 CS.sub.3C 케모카인 패밀리 및 CCL-1 내지 CCL-28, CXC-1 내지 CXC-17, XCL-1, XCL-2, CX3CL1, MIP-1b, IL-8, MCP 및 Rantes를 포함할 수 있다.
성장 인자는 특정 세포에 노출될 경우에 영향을 받은 세포의 증식 및/또는 분화를 유도하는 어느 분자를 포함한다. 성장 인자는 단백질 및 화학 분자를 포함하며, 이의 일부는 GM-CSF, 인간 성장 인자 및 줄기 세포 성장 인자를 포함한다. 또한, 부가적인 성장 인자들이 본 명세서에 나타낸 용도에 적절할 수 있다.
독소 및 세포독성 제제는 세포에 노출될 경우에 성장에 치명적인 영향 또는 저해 영향을 갖는 어느 물질을 포함한다. 보다 구체적으로, 이펙터 분자는 예를 들어, 디프테리아 독소(DT), 쉬가 독소, 아브린(abrin), 콜레라 독소, 리신(ricin), 사포린(saporin), 슈도모나스 엑소톡신(PE), 포크위드 항바이러스 단백질 또는 겔로닌(gelonin)와 같은 식물이나 박테리아 기원의 세포 독소일 수 있다. 이러한 독소의 생물학적으로 활성적인 프래그먼트는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 DT A 사슬 및 리신 A 사슬을 포함한다. 또한, 상기 독소는 예를 들어, 포스포리파아제 효소(예, 포스포리파아제 C)와 같이 세포 표면에 활성적인 제제일 수 있다.
또한, 이펙터 분자는 예를 들어, 빈데신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 블레오마이신 또는 시스플라틴과 같은 화학치료 약물일 수 있다.
또한, 이펙터 분자는 진단 또는 이미징 스터디에 적절한 검출가능하게 표지되는 분자일 수 있다. 이러한 표지는 바이오틴 또는 스트렙타비딘/아비딘, 검출가능한 나노파티클 또는 크리스탈, 효소 또는 이의 촉매 활성 프래그먼트, 그린 형광 단백질과 같은 형광 표지, FITC, 피코에리트린, 사이콤(cychome), 텍사스 레드 또는 퀀텀 도트; 요오드-131, 이트륨-90, 레늄-188 또는 비스무스-212와 같은 방사성 핵종; 인광 또는 화학발광 분자 또는 PET에 의해 검출가능한 표지, 초음파 또는 Gd- 또는 파라마그네틱 금속 이온계 콘트라스트 제제와 같은 MRI를 포함한다. 이펙터 또는 태그를 포함하는 단백질들을 제조 및 사용하는 것과 관련된 설명에 대해 하기 예시들을 참조바람: Moskaug, et al. J. Biol. Chem. 264, 15709(1989); Pastan, I. et al. Cell 47, 641, 1986; Pastan et al., Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem. 61, 331,(1992); "Chimeric Toxins" Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 25, 355(1982); published PCT application no. WO 94/29350; published PCT application no. WO 94/04689; published PCT application no. WO2005046449 and U.S. Pat. No. 5,620,939.
공유결합된 IL-15 및 IL-15Rα 도메인을 포함하는 단백질 융합 또는 컨주게이트 복합체는 여러 가지 중요한 용도를 갖는다. 손상되거나 사멸되는 것에 민감한 세포 또는 조직은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 쉽게 어세이될 수 있다.
본 발명의 IL-15 및 IL-15Rα 폴리펩타이드는 예를 들어, 인간, 마우스 또는 다른 설치류 또는 다른 포유류의 IL-15 및 IL-15Rα 분자와 같은 자연적으로 발생하는 IL-15 및 IL-15Rα 분자에 대한 아미노산 서열에 적절히 상응한다. 이러한 폴리펩타이드 및 핵산을 암호화하는 서열은 human interleukin 15(IL15) mRNA--GenBank: U14407.1, Mus musculus interleukin 15(IL15) mRNA--GenBank: U14332.1, human interleukin-15 receptor alpha chain precursor(IL15RA) mRNA--GenBank: U31628.1, Mus musculus interleukin 15 receptor, alpha chain--GenBank: BC095982.1을 포함하는 문헌에 알려져 있다.
일부 설정에서, 본 발명의 단백질 융합 또는 컨주게이트 복합체를 예를 들어, sc-TCR 또는 sc-항체의 밸런시(valency)를 증가시키기 위해 다가로 만드는 것이 유용할 수 있다. 특히, 상기 융합 단백질 복합체의 IL-15 및 IL-15Rα 도메인 사이의 상호작용은 다가 복합체를 생성하는 수단을 제공한다. 또한, 다가 융합 단백질은 예를 들어, 스탠다드 바이오틴-스트렙타비딘 라벨링 기술을 사용하여, 또는 라텍스 비드와 같은 적절한 고형 지지체와의 접합에 의해 하나와 4개의 단백질들(동일하거나 다른) 사이에 서로 공유결합되거나 비공유 결합시킴으로써 만들어질 수 있다. (예를 들어, 나노파티클에 교차결합된) 화학적으로 교차결합된 단백질이 또한 적절한 다가종이다. 예를 들어, 상기 단백질은 바이오티닐화 BirA 태그와 같이 변형될 수 있는 태그 서열을 암호화하는 서열 또는 Cys 또는 His와 같은 화학적으로 반응적인 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 포함함으로써 변형될 수 있다. 이러한 아미노산 태그 또는 화학적으로 반응적인 아미노산은 융합 단백질 또는 항체 내의 다양한 위치에 위치할 수 있으며, 바람직하게 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드 또는 이펙터 분자의 활성 사이트에 대하여 말단에 위치할 수 있다. 예를 들어, 가용성 융합 단백질의 C-말단은 이러한 반응적 아미노산(들)을 포함하는 태그 또는 다른 융합 단백질에 공유결합될 수 있다. 적절한 측쇄는 다가 분자를 제공하기 위해 적절한 나노파티클에 둘 이상의 융합 단백질을 화학적으로 결합하도록 포함될 수 있다. 예시적인 나노파티클은 덴드리머, 리포좀, 코어-쉘 파티클 또는 PLGA-베이즈드 파티클을 포함한다.
본 발명의 다른 구현으로, 상기 융합 단백질 복합체의 폴리펩타이드들 중 하나 또는 둘 모두는 면역글로블린 도메인을 포함한다. 변형적으로, 단백질 바인딩 도메인-IL-15 융합 단백질은 또한 면역글로블린 도메인과 결합될 수 있다. 바람직한 면역글로블린 도메인은 다른 면역글로블린 도메인과 상호작용하여 상기 제공된 바와 같은 다중쇄 단백질을 형성할 수 있는 리전을 포함한다. 예를 들어, IgG1 CH2-CH3와 같은 면역글로블린 중쇄 리전은 안정하게 상호작용하여 Fc 리전을 생성할 수 있다. Fc 도메인을 포함하는 바람직한 면역글로블린 도메인은 또한 Fc 리셉터 또는 컴플리먼트 단백질 바인딩 활성을 포함하는 이펙터 기능을 갖는, 그리고/또는 글리코실화 사이트를 갖는 리전을 포함한다. 일부 구현으로, 상기 융합 단백질 복합체의 면역글로블린 도메인은 Fc 리셉터 또는 컴플리먼트 바인딩 활성 또는 글리코실화를 감소 또는 증가시키는 돌연변이를 함유하여, 이에 따라 결과적으로 형성되는 단백질의 생물학적 활성에 영향을 준다. 예를 들어, Fc 리셉터에 대한 바인딩을 감소시키는 돌연변이를 함유하는 면역글로블린 도메인은 Fc 리셉터를 갖는 세포들에 대해 보다 낮은 바인딩 활성을 갖는 본 발명의 융합 단백질 복합체를 생성하는데 사용될 수 있으며, 이는 특이적인 항원들을 인지 또는 검출하도록 디자인된 제제들에 유용할 수 있다.
핵산 및 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 단백질(예, ALT-803의 성분들)을 암호화하는 핵산 서열 및 특히 DNA 서열을 제공한다. 바람직하게, 상기 DNA 서열은 파아지, 바이러스, 플라스미드, 파아지미드, 코스미드, YAC, 또는 에피솜과 같은 염색체외 복제에 적합한 벡터에 의해 운반된다. 특히, 원하는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 벡터는 본 명세서에 기재된 제조 방법을 촉진하고, 상기 융합 단백질의 현저한 양을 획득하는데 사용될 수 있다. 상기 DNA 서열은 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질을 암호화하는 서열의 전사 및 번역을 위해 필수적인 엘리먼트들을 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이들은 바이러스(예, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 등)로 감염된 다양한 포유류 세포 시스템; 바이러스(예, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 이스트 벡터를 함유하는 이스트 또는 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물을 포함한다. 사용되는 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적절한 전사 및 번역 엘리먼트들 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 참조, Sambrook et al.(상기 참조) 및 Ausubel et al.(상기 참조)
적절한 융합 단백질 복합체를 제조하는 방법이 본 발명에 포함되며, 상기 방법은 숙주 세포 내로 제 1 및 제 2 융합 단백질을 암호화하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 DNA 벡터를 도입시키는 단계, 상기 숙주 세포를 상기 세포 및 배지에서 상기 융합 단백질을 발현시키기에 충분한 조건하에 배지에서 상기 숙주 세포를 배양하고, 제 1 융합 단백질의 IL-15 도메인과 제 2 융합 단백질의 IL-15Rα 도메인 사이의 결합이 이루어지도록 하는 단계, 상기 숙주 세포 또는 배지로부터 가용성 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 바람직한 DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로, 이펙터 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된, 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드를 암호화하는 제 1 뉴클레오타이드 서열의 도입을 위한 제 1 클로닝 사이트를 포함하는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 DNA 벡터에 의해 암호화된 융합 단백질 성분들은 카세트 형태로 제공될 수 있다. 용어 "카세트(cassette)"는 각 성분이 표준 재조합 방법에 의해 다른 성분으로 쉽게 치환될 수 있음을 의미한다. 특히, 카세트 형태로 형성된 DNA 벡터는, 암호화된 융합 복합체가 혈청형을 발달시키는 능력을 가질 수 있거나 갖는 병원체에 대해 사용되는 경우에 특히 바람직하다.
융합 단백질 복합체를 암호화하는 벡터를 제조하기 위해, 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 적절한 리가아제의 사용에 의해 이펙터 펩타이드를 암호화하는 서열에 연결된다. 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 DNA는 적절한 세포주와 같은 자연 공급원으로부터 DNA를 분리함으로써 또는 예를 들어, 포스페이트 트리에스테르 방법과 같은 알려진 합성법에 의해 획득될 수 있다. 참조, 예, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press(M. J. Gait, ed., 1984). 합성 올리고뉴클레오타이드가 또한 상업적으로 구입가능한 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성기를 이용하여 제조될 수 있다. 분리되면, 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 당해 기술분야에 알려진 다른 수단에 의해 증폭될 수 있다. 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드 유전자를 증폭시키기에 적절한 PCR 프라이머는 PCR 산물에 제한 사이트가 첨가될 수 있다. PCR 산물은 바람직하게, 이펙터 펩타이드를 위한 스플라이스 사이트 및 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드-이펙터 융합 복합체의 적절한 발현 및 분비를 위해 필요한 리더 서열을 포함한다. 또한, PCR 산물은 바람직하게 링커 서열을 암호화하는 서열, 또는 이러한 서열의 라이게이션을 위한 제한 효소 사이트를 포함한다.
본 명세서에 기재된 융합 단백질은 바람직하게 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 예를 들어, 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자가 분리되면, 서열은 이펙터 폴리펩타이드를 암호화하는 다른 DNA 분자와 라이게이션될 수 있다. 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 이펙터 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 직접 결합되거나, 또는 보다 전형적으로, 본 명세서에 언급된 바와 같은 링커 서열을 암호화하는 DNA 서열이 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드를 암호화하는 서열과 이펙터 펩타이드를 암호화하는 서열 사이에 끼어들고 적절한 리가아제를 이용하여 결합될 수 있다. 결과적으로 형성된 하이브리드 DNA 분자는 적절한 숙주 세포에서 발현되어 상기 융합 단백질 복합체를 생산할 수 있다. 상기 DNA 분자는 5'에서 3' 방향으로 서로 라이게이션되어, 라이게이션후에, 암호화된 폴리펩타이드의 번역 프래임은 변하지 않는다(즉, 상기 DNA 분자는 서로 인-프래임(in-frame)으로 라이게이션된다). 결과적으로 형성된 DNA 분자는 인-프래임 융합 단백질을 암호화한다.
다른 뉴클레오타이드 서열이 또한 상기 유전자 구조물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 이펙터 펩타이드에 상기 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 발현을 조절하는 프로모터 서열, 또는 상기 융합 단백질을 세포 표면 또는 배지로 지시하는 리더 서열이 상기 구조물에 포함되거나 또는 그 구조물이 삽입되는 발현 벡터에 존재할 수 있다. 면역글로블린 또는 CMV 프로모터가 특히 바람직하다.
다양한 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드, IL-15, IL-15Rα 또는 Fc 도메인 암호화 서열을 획득하는데 있어서, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 폴리펩타이드들이 생물학적 활성의 손실 또는 또는 감소없이 특정 아미노산 치환, 부가, 결실 및 번역후 변형에 의해 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 특히, 보존적인 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산의 유사한 크기, 전하, 극성 및 형태의 다른 아미노산으로의 치환은 단백질 기능을 현저히 변화시키지 않는 것은 잘 알려져 있다. 단백질들의 구성분들인 20개의 표준 아미노산들은 다음과 같이 광범위하게 4 그룹의 보존적 아미노산으로 분류될 수 있다: 비극성(소수성) 그룹은 알라닌, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판 및 발린을 포함하며; 극성(비전하, 중성) 그룹은 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함하며; 양 전하된(염기성) 그룹은 아르기닌, 히스티딘 및 리신을 포함하며; 그리고 음 전하된(산성) 그룹은 아스파트산 및 글루탐산을 포함한다. 단백질에서 하나의 아미노산의 동일한 그룹 내의 다른 아미노산으로의 치환은 그 단백질의 생물학적 활성에 유해한 영향을 잘 주지 않는다. 다른 예로, 아미노산 위치에 대한 변형은 그 단백질의 생물학적 활성을 감소시키거나 증가시키기 위해 이루어질 수 있다. 이러한 변화는 랜덤으로 도입되거나 또는 표적 잔기(들)의 알려진 또는 추정되는 구조 또는 기능적 특성에 기초하여 부위-특이적 돌연변이를 통해 도입될 수 있다. 변이 단백질의 발현 후, 그 변형에 기인한 생물학적 활성의 변화는 바인딩 또는 기능적 어세이를 이용하여 쉽게 평가될 수 있다.
뉴클레오타이드 서열 사이의 상동성은 DNA 하이브리드화 분석에 의해 검출될 수 있으며, 여기서 이중 스트랜드 DNA 하이브리드의 안정성은 발생하는 염기쌍의 정도에 따라 달라진다. 고온 및/또는 저염 함량의 조건은 하이브리드의 안정성을 감소시키며, 선택된 상동성 정도보다 낮은 서열들의 어닐링을 억제하도록 달라질 수 있다. 예를 들어, 약 55% G-C 함량을 갖는 서열에 대해, 40-50℃, 6 x SSC(소듐 클로라이드/소듐 시트레이트 버퍼) 및 0.1% SDS(소듐 도데실 설페이트)의 하이브리드화 및 세정 조건은 약 60-70% 상동성을 나타내며, 50-65℃, 1 x SSC 및 0.1% SDS의 하이브리드화 및 세정 조건은 약 82-97% 상동성을 나타내며, 그리고 52℃, 0.1 x SSC 및 0.1% SDS의 하이브리드화 및 세정 조건은 약 99-100% 상동성을 나타낸다. 뉴클레오타이드와 아미노산 서열을 비교하는 (그리고 상동성 정도를 측정하는) 광범위한 범위의 컴퓨터 프로그램이 또한 유용하며, 상업적으로 구입가능한 소프트웨어 및 프리 소프트웨어 모두의 공급원을 제공하는 리스트는 Ausubel et al.(1999)에서 찾아볼 수 있다. 쉽게 구입가능한 서열 비교 및 다중 서열 정렬 알고리즘은 각각, Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., 1997) 및 ClustalW programs이다. BLAST는 ncbi.nlm.nih.gov and a version of ClustalW is available at 2.ebi.ac.uk에서 월드와이드웹상에서 구입가능하다.
상기 융합 단백질의 성분들은 각각이 이의 의도된 기능을 수행할 수 있는 한, 거의 어느 순서로 조직될 수 있다. 예를 들어, 일 구현으로, 상기 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드는 이펙터 분자의 C 또는 N 말단 끝에 위치한다.
본 발명의 바람직한 이펙터 분자는 이러한 도메인들이 의도된 기능에 도움이 되는 크기를 가질 것이다. 본 발명의 이펙터 분자는 잘 알려진 화학적 교차-결합 방법을 포함하여 다양한 방법에 의해 제조되고 융합되어 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이를 형성할 수 있다. 참조, 예, Means, G. E. 및 Feeney, R. E.(1974) in Chemical Modification of Proteins, Holden-Day. See also, S. S. Wong(1991) in Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press. 그러나, 일반적으로 재조합 조작을 이용하여 인-프래임 융합 단백질을 제조하는 것이 바람직하다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 융합 분자 또는 컨주게이트 분자는 여러 방식으로 조직화될 수 있다. 예시적인 형태로, 상기 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드의 C-말단은 상기 이펙터 분자의 N-말단에 작동가능하게 연결된다. 그 결합은 필요에 따라 재조합 방법에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 다른 형태로, 상기 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드의 N-말단은 상기 이펙터 분자의 C-말단에 연결된다.
변형적으로, 또는 부가적으로, 하나 이상의 부가적인 이펙터 분자가 필요에 따라 상기 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드 또는 컨주게이트 복합체 내로 삽입될 수 있다.
벡터 및 발현
ALT-803을 발현하기 위해 다수의 전략이 사용될 수 있다. 예를 들어, ALT-803을 암호화하는 구조물은 라이게이션 후에 구조물의 삽입을 위해 벡터 내에 컷을 형성하도록 제한 효소를 이용하여 적절한 벡터 내로 편입될 수 있다. 유전자 구조물을 함유하는 벡터는, 그 다음 융합 단백질의 발현을 위해 적절한 숙주 내로 도입된다. 일반 참조, Sambrook et al.(상기 참조)
적합한 벡터의 선택은 클로닝 프로토콜과 관련된 인자에 기초하여 실험적으로 이루어질 수있다. 예를 들어, 벡터는 사용될 호스트와 호환 가능해야하며 적절한 호스트를 위한 리플리콘을 가져야한다. 벡터는 발현될 융합 단백질 복합체를 암호화하는 DNA 서열을 수용할 수 있어야한다. 적합한 숙주 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포, 바람직하게는 용이하게 형질 전환될 수 있고, 배지에서 급속한 성장을 나타내는 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtillus) 등의 원핵 생물 및 동물 세포 및 이스트 균주와 같은 진핵 생물, 예를 들어 S. 세레비지아에(S. cerevisiae)를 포함한다. 포유 동물 세포가 일반적으로 바람직하며, 특히 J558, NSO, SP2-O 또는 CHO가 바람직하다. 다른 적합한 숙주는 예를 들어 Sf9와 같은 곤충 세포를 포함한다. 통상적인 배양 조건이 사용된다. 참조 Sambrook(상기 참조) 그 다음, 안정한 형질전환 또는 트랜스펙션된 세포주가 선택될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질 복합체를 발현하는 세포는 공지된 절차에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 면역 글로불린에 결합된 융합 단백질 복합체의 발현은 결합된 면역 글로불린에 특이적인 ELISA 및/또는 면역 블롯팅에 의해 검출될 수있다. IL-15 또는 IL-15Rα 도메인에 결합된 생물학적으로 활성적인 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 발현을 검출하기 위한 다른 방법이 실시예에 개시된다.
일반적으로 상기 언급한 바와 같이, 숙주 세포는 원하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 증식시키기 위한 준비 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 융합 단백질의 생산이 특이적으로 의도된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함할 수있다. 따라서, 숙주 세포는 구체적으로 융합체를 암호화하는 핵산을 증식시킬 수 있는, 이스트, 파리, 웜(worm), 식물, 개구리, 포유류 세포 및 기관을 포함한다. 사용될 수있는 포유 동물 세포주의 비제한적인 예는 CHO dhfr- 세포(Urlaub 및 Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216(1980)), 293 세포(Graham et al., J Gen Virol., 36:59 (1977)) 또는 SP2 또는 NSO와 같은 골수종 세포(Galfre 및 Milstein, Meth.Enzymol., 73 (B): 3 (1981))를 포함한다.
원하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 번식시킬 수 있는 숙주 세포는 또한 곤충(예, Sp. 프루지페르다(Sp. frugiperda), 효모 (예를 들어 S. 세레비지아에(S. cerevisiae), S. 폼베(S. pombe), P. 파스토리스(P. pastoris), K. 락티스(K. lactis), H. 폴리모파(H. polymorpha); Fleer, R., Current Opinion in Biotechnology, 3 (5) : 486496 (1992)에 의해 일반적으로 리뷰됨), 균류 및 식물 세포를 포함하여 비포유류 진핵 세포를 포함한다. 이. 콜라이(E. coli) 및 바실러스(Bacillus)와 같은 특정 원핵 생물도 고려된다.
원하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 세포를 트랜스펙션하는 표준 기술에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 용어 "트랜스펙팅"또는 "트랜스펙션"은 칼슘 포스페이트 공동 침전, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 리포펙션, 일렉트로폴레이션, 마이크로 인젝션, 바이러스 트랜스덕션 및/또는 집적화를 포함하는 숙주 세포 내로 핵산을 도입하기 위한 모든 통상적인 기술을 포함한다. 숙주 세포를 트랜스펙션하는 적합한 방법은 Sambrook et al.(상기 참조) 및 기타 실험실 교과서에서 찾아볼 수 있다.
다양한 프로모터(전사 개시 조절 리전)가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 적절한 프로모터의 선택은 제안된 발현 숙주에 따라 달라진다. 이종 공급원으로부터의 프로모터는 선택된 숙주에서 기능적으로 사용되는 한 사용될 수 있다.
프로모터 선택은 또한 펩타이드 또는 단백질 생산의 원하는 효율 및 수준에 따라 달라진다. 택(tac)과 같은 유도성 프로모터는 이. 콜라이(E. coli)에서 단백질 발현 수준을 극적으로 증가시키기 위해 종종 사용된다. 단백질의 과발현은 숙주 세포에 해로울 수 있다. 결과적으로, 숙주 세포의 성장이 제한될 수 있다. 유도성 프로모터 시스템의 사용은 숙주 세포가 유전자 발현 유도 전에 수용 가능한 밀도로 배양되어 높은 생산 수율을 용이하게 한다.
다양한 신호 시퀀스가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 생물학적으로 활성적 인 폴리펩타이드 암호화 서열에 상동성인 신호 서열이 사용될 수 있다. 대안으로, 발현 숙주에서 효율적인 분비 및 처리를 위해 선택되거나 디자인된 신호 서열이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 적절한 신호 서열/숙주 세포 쌍은 B. 서브틸리스(B. subtilis)에서의 분비를 위한 B. 서브틸리스(B. subtilis) sacB 신호 서열 및 P. 파스토리스(P. pastoris) 분비를 위한 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) α-매이팅 인자 또는 P. 파스토리스(P. pastoris) 산 포스파타아제 phoI 신호 서열을 포함한다. 신호 서열은 신호 펩티다아제 절단 부위를 암호화하는 서열을 통해 단백질 코딩 서열에 직접 결합되거나, 또는 결합이 다운스트림 단백질 서열의 정확한 판독 프레임을 보장하는 보통 10 개 미만의 코돈으로 이루어진 짧은 뉴클레오티드 결합을 통해 직접 연결될 수 있다.
진핵 생물 단백질 발현 시스템에서 전사 및 번역을 향상시키는 엘리먼트가 확인되었다. 예를 들어, 콜리 플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 프로모터를 이종 프로모터의 양쪽에 1000 bp 위치시키면, 식물 세포에서 전사 수준을 10-400 배 증가시킬 수 있다. 발현 구조물은 또한 적절한 번역 개시 서열을 포함해야한다. 적절한 번역 개시를 위한 Kozak 컨센서스 서열을 포함하도록 발현 구조물을 변형하면 번역 수준이 10 배 증가할 수 있다.
선택적인 마커가 종종 사용되며, 이것은 마커가 관심 유전자와 상이한 위치에서 통합될 수 있도록 발현 구조물의 일부이거나 또는 발현 벡터로부터 분리되거나(예를 들어 발현 벡터에 의해 운반된다). 예로서 항생제에 내성을 부여하는 마커(예, bla는 E. 콜라이(E.coli) 숙주 세포에 대한 암피실린 내성을, nptII에는 다양한 원핵 및 진핵 세포에 대한 카나마이신 내성을 부여한다), 또는 숙주가 최소 배지에서 성장하는 것을 가능하게 한다(예, HIS4는 P. 파스토리스(P. pastoris) 또는 His-S. 세레비지아에(His-S. cerevisiae)가 히스티딘의 부재하에 성장하는 것을 가능하게 한다). 선별 마커는 마커의 독립적 발현을 허용하기 위해 자체 전사 및 번역 개시 및 종결 조절 리전을 갖는다. 항생제 내성이 마커로 사용되는 경우, 선별을 위한 항생제의 농도는 항생제에 따라 다르며, 일반적으로 배지의 항생제/mL 당 10 ~ 600㎍ 범위이다.
발현 구조물은 공지된 재조합 DNA 기술(Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999)을 이용하여 어셈블리된다. 제한 효소 다이제션 및 라이게이션은 DNA의 두 프래그먼트를 연결하는데 사용되는 기본 단계이다. DNA 프래그먼트의 말단은 라이게이션 전에 변형을 필요로 할 수 있으며, 오버행을 채우고, 뉴클레아제(예, ExoIII)로 프래그먼트(들)의 말단 부분을 제거하거나, 부위 특이적 돌연변이 유발 (site directed mutagenesis) 또는 PCR에 의한 새로운 염기쌍을 첨가함으로써 달성 할 수 있다. 선택된 프래그먼트의 결합을 용이하게 하기 위해 폴리링커 및 어댑터가 사용될 수 있다. 발현 구조물은 전형적으로 E. 콜라이(E.coli)의 제한, 결합 및 형질전환의 라운드를 사용하여 단계적으로 어셈블리된다. 발현 구조물의 작제에 적합한 수많은 클로닝 벡터가 당해 기술분야에 공지되어있으며(γZAP 및 pBLUESCRIPT SK-1, Stratagene, La Jolla, CA, pET, 위스콘신 주 매디슨 소재의 Novagen Inc., Ausubel et al., 1999에 인용됨), 특정 선택은 본 발명에 중요하지 않다. 클로닝 벡터의 선택은 발현 구조물의 숙주 세포로의 도입을 위해 선택된 유전자 전달 시스템에 의해 영향을 받을 것이다. 각 단계의 끝에서, 결과적으려 형성된 구조물은 제한, DNA 서열, 하이브리드화 및 PCR 분석에 의해 분석될 수 있다.
발현 구조물은 클로닝 벡터 구조물로서 선형 또는 원형 중 하나로 숙주 내로 형질전환되거나, 또는 클로닝 벡터로부터 제거되어 그대로 사용되거나 운반 벡터 상에 도입될 수 있다. 운반 벡터는 선택된 숙주 세포 타입에서 발현 구조물의 도입 및 유지를 용이하게 한다. 발현 구조물은 다수의 공지된 어느 유전자 전달 시스템(예, 내츄럴 컴피턴스(natural competence), 화학 매개 형질전환, 원형질체 형질전환, 일렉트로포레이션, 생물학적 형질 전환, 트랜스펙션 또는 컨주게이션)에 의해 숙주 세포로 도입된다(Ausubel et al., 1999; Sambrook et al., 1989). 선택된 유전자 전달 시스템은 사용된 숙주 세포와 벡터 시스템에 따라 달라진다.
예를 들어, 발현 구조물은 원형질체 형질전환 또는 일렉트로포레이션에 의해 S. 세레비지아에(S. cerevisiae) 세포로 도입될 수있다. S. 세레비지아에(S. cerevisiae)의 일렉트로포레이션은 쉽게 달성되며, 스페로플라스트(spheroplast) 형질변형에 필적하는 형질전환 효율을 산출한다.
본 발명은 또한 관심있는 융합 단백질을 분리하기 위한 생산 방법을 제공한다. 이 방법에서, 조절 서열에 작동가능하게 연결된 관심 단백질을 암호화하는 핵산이 도입된 숙주 세포(예를 들어, 이스트, 균류, 곤충, 박테리아 또는 동물 세포)는 생산 규모로 관심있는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 전사를 자극하는 배양 배지에서 성장된다. 이어서, 관심있는 융합 단백질을 수거된 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 분리한다. 표준 단백질 정제 기술은 배지 또는 수거된 세포로부터 관심있는 단백질을 분리하는데 사용될 수 있다. 특히, 정제 기술은 롤러 병, 스피너 플라스크, 조직 배양 플레이트, 생물 반응기 또는 발효기를 포함하는 다양한 실행으로부터 대규모 (즉, 적어도 밀리그램 양)의 원하는 융합 단백질을 발현 및 정제하는데 사용될 수 있다.
발현된 단백질 융합 복합체는 공지된 방법으로 분리 및 정제될 수 있다. 전형적으로, 배양 배지를 원심분리하거나 여과한 후, 상청액을 친화성 또는 면역 친 화성 크로마토그래피(예 : 단백질-A 또는 단백질-G 친화성 크로마토그래피 또는 발현된 융합 복합체에 결합하는 모노클로날 항체의 사용을 포함하는 면역 친화성 프로토콜에 의해 정제된다. 본 발명의 융합 단백질은 공지된 기술의 적절한 조합에 의해 분리 및 정제될 수 있다. 이들 방법으로서는, 예를 들면, 염 침전이나 용매 침전 등의 용해성을 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 겔 여과, SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동 등의 분자량의 차이를 이용한 방법, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피와 같은 전기의 차이를 이용하는 방법, 친화성 크로마토그래피와 같은 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 포커싱 전기영동과 같은 등전점의 차이를 이용한 방법, Ni-NTA와 같은 금속 친화성 컬럼을 포함한다. 이러한 방법들에 대한 기술내용은 일반적으로 Sambrook et al. 및 Ausubel et al.(상기 참조)를 참조바람.
본 발명의 융합 단백질은 실질적으로 순수한 것이 바람직하다. 즉, 융합 단백질은 바람직하게는 적어도 80% 또는 90% 내지 95% 동질성(w/w)으로 존재하도록 융합 단백질이 자연적으로 수반되는 세포 치환체로부터 분리되어있다. 적어도 약 98 내지 99% 동질성(w/w)을 갖는 융합 단백질이 많은 제약, 임상 및 연구 분야에 가장 바람직하다. 일단 실질적으로 정제되면, 융합 단백질은 치료용으로 실질적으로 오염물이 없어야한다. 부분적으로 또는 상당한 순도로 일단 정제되면, 가용성 융합 단백질은 치료적으로 또는 본 명세서에 개시된 바와 같이 시험관내 또는 생체내 분석을 수행하는데 사용될 수 있다. 실질적인 순도는 크로마토그래피 및 겔 전기 영동과 같은 다양한 표준 기술로 결정될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 복합체는 암성이거나 감염되었거나 하나 이상의 질병에 감염될 수 있는 다양한 세포에서의 시험관내 또는 생체내 사용에 적합하다.
인간 인터루킨-15(hIL-15)는 항원 제시 세포에서 발현되는 인간 IL-15 리셉터 α 사슬(hIL-15Rα)에 의해 면역 이펙터 세포로 트랜스-프리젠팅된다. IL-15Rα는 주로 세포외 수쉬(suchi) 도메인(IL-15RαSu)을 통해 hIL-15를 고친화성(38pM)으로 결합시킨다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, IL-15 및 IL-15RαSu 도메인은 가용성 복합체(예, ALT-803)를 생성하거나 다중 도메인 융합 복합체를 제조하기 위한 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
IgG 도메인, 특히 Fc 프래그먼트는 승인된 생물학적 약물을 포함하는 다수의 치료용 분자에 대한 2량체 스캐폴드로서 성공적으로 사용되어왔다. 예를 들어, 에타너셉트(etanercept)는 인간 IgG1의 Fc 도메인에 연결된 가용성 인간 p75 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 리셉터(sTNFR)의 2량체이다. 이러한 2량체화는 에타너셉트가 단량체 sTNFR보다 TNF-α 활성을 억제하는데 최대 1000 배 더 강력하며, 단량체 형태보다 5 배 더 긴 혈청 반감기를 제공한다. 그 결과, 에타너셉트는 생체내에서 TNF-α의 전-염증 활성을 중화시키고 다수의 상이한 자가 면역 징후에 대한 환자 결과를 개선하는데 효과적이다.
이의 2량체화 활성에 부가적으로, Fc 프래그먼트는 또한 자연 살해 세포(NK), 호중구, 단구 세포, 식세포 및 덴드리틱 세포에서 디스플레이되는 Fcγ 리셉터와의 보체 활성화 및 상호 작용을 통해 세포 독성 이펙터 기능을 제공한다. 항암 치료용 항체 및 다른 항체 도메인-Fc 융합 단백질과 관련하여, 이들 활성은 동물 종양 모델 및 암 환자에서 관찰된 효능에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 그러나, 이러한 세포 독성 이펙터 반응은 많은 치료 응용에서 충분하지 않을 수 있다. 따라서, Fc 도메인의 이펙터 활성을 개선 및 확대시키고, 면역 요법 분자를 통해 질병 부위에서 NK 세포 및 T 세포를 포함하는 세포 용해 면역 반응의 활성 또는 동원을 증가시키는 다른 수단을 개발하는 데 상당한 관심이 있어왔다.
인간 유래 면역 자극 치료제를 개발하기 위한 노력으로, 인간 IL-15(hIL-15) 및 IL-15 리셉터 도메인이 사용되었다. hIL-15는 hIL-15 리셉터 α-사슬(hIL-15Rα)과 높은 바인딩 친화성(평형 해리 상수(KD)~10-11 M)을 갖는 작은 4 개의 α-헬릭스 번들 사이토킨 패밀리의 멤버이다. 결과적으로 형성된 복합체는 그 다음, T 세포 및 NK 세포의 표면 상에 디스플레이된 인간 IL-2/15 수용체 β/공통 γ 사슬(hIL-15RβγC) 복합체에 트랜스-프리젠팅된다. 이 사이토킨/리셉터 상호작용은 바이러스 감염된 세포 및 악성 세포를 박멸하는데 중요한 역할을 하는 이펙터 T 세포 및 NK 세포의 팽창 및 활성화를 초래한다. 일반적으로, hIL-15 및 hIL-15Rα는 수상 돌기 세포에서 동시에 생산되어 세포 내에서 복합체를 형성하고 이어서 세포 표면에 이종 2량체 분자로 분비되고 디스플레이된다. 따라서, hIL-15 및 hIL-15Rα 상호작용의 특징은 이러한 사슬간 바인딩 도메인이 인간 유래 면역 자극 복합체 및 표적 특이적 바인딩이 가능한 가용성 2량체 분자를 만들기 위한 스캐폴드로서 작용할 수 있음을 제시한다.
본 발명의 실시는 달리 명시하지 않는 한, 당해 분야의 숙련자에게 충분히 허용되는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 제2판(Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis"(Gait, 1984); "Animal Cell Culture"(Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology"(Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel, 1987); "PCR : The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology"(Coligan, 1991)와 같은 문헌에 전체적으로 설명되어 있다. 이들 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 생산에 적용 가능하며, 본 발명을 제조하고 실시하는데 고려될 수 있다. 특정 구현에 대한 특히 유용한 기술은 다음 장에서 언급될 것이다.
하기 실시예는 당업자에게 어떻게 제조하고, 본 발명의 분석, 스크리닝 및 치료 방법을 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시된 것이며, 발명자가 이의 발명으로서 간주하는 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: ALT-803에 의한 림프구 증식 및 활성화 유도
Histopaque-1077을 가진 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 분리하기 위해 정상적인 개체로부터 얻은 인간의 혈액 버피 코트를 사용했다. 다양한 양의 ALT-803와 함께 RPMI-10 배지(RPMI-1640, 2-메르캅토에탄올, 페니실린-스트렙토마이신-글루타민, 비필수 아미노산, 소듐 피루베이트 및 10% 소태아 혈청)에서 PBMC를 37℃에서 5% CO2로 배양하였다. "ALT-803"은 그 복합체가 면역 자극 활성을 나타내는 2량체 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질과 비공유 결합된 IL-15N72D를 포함하는 복합체를 의미한다. 선택적으로, IL-15N72D 및/또는 IL-15RαSu/Fc 융합 단백질은 레퍼런스 서열에 대해 1, 2, 3, 4 개 이상의 아미노산 변이체를 포함한다. 예시적인 IL-15N72D 아미노산 서열은 하기에 제공된다. (예를 들어, 본원에 참고문헌으로 편입된 미국 특허 출원 제13/769,179호 참조)
예시적인 IL-15N72D 핵산 서열은 (리더 펩타이드와 함께) 하기에 제공된다(SEQ ID NO: 1):
(리더 펩타이드)
atggagacagacacactcctgttatgggtactgctgctctgggttccaggttccaccggt-
(IL-15N72D)
aactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacgacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttct
(정지 코돈)
taa
예시적인 IL-15N72D 아미노산 서열은 (리더 펩타이드와 함께) 하기에 제공된다(SEQ ID NO: 2):
(리더 펩타이드)
METDTLLLWVLLLWVPGSTG-
(IL-15N72D)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
일부 경우, 리더 펩타이드는 성숙 IL-15N72D 폴리펩타이드로부터 절단된다(SEQ ID NO: 3):
(IL-15N72D)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
예시적인 IL-15RαSu/Fc 핵산 서열은 (리더 펩타이드와 함께) 하기에 제공된다(SEQ ID NO: 4):
(리더 펩타이드)
atggacagacttacttcttcattcctgctcctgattgtccctgcgtacgtcttgtcc-
(IL-15RαSu)
atcacgtgccctccccccatgtccgtggaacacgcagacatctgggtcaagagctacagcttgtactccagggagcggtacatttgtaactctggtttcaagcgtaaagccggcacgtccagcctgacggagtgcgtgttgaacaaggccacgaatgtcgcccactggacaacccccagtctcaaatgtattaga-
(IgG1 CH2-CH3 (Fc 도메인))
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa-
(정지 코돈)
taa
예시적인 IL-15RαSu/Fc 아미노산 서열은 (리더 펩티드와 함께) 하기에 제공된다(SEQ ID NO: 5):
(리더 펩타이드)
MDRLTSSFLLLIVPAYVLS-
(IL-15RαSu)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR-
(IgG1 CH2-CH3(Fc 도메인))
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
일부 경우, 성숙 IL-15RαSu/Fc 단백질은 리더 서열을 갖지 않는다(SEQ ID NO: 6):
(IL-15RαSu)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR-
(IgG1 CH2-CH3(Fc 도메인))
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
림프구 서브섹 증식과 활성화를 평가하기 위해, ALT-803으로 처리한 세포를 표면 마커에 대해 Brilliant Violet 510-항-CD4, PECY7-항-CD8 및 Brilliant Violet 421-항-CD16 항체의 조합으로 염색한 다음, 표면 마커에 대해 FITC-항-그랜자임 B 항체 또는 Brilliant Violet-항-CD4, PE-항-CD8, PECY7-항-CD335, PerCP-CY5.5-항-CD69 및 APC-항-CD25 항체의 조합으로 세포 내 염색 처리한 후, FITC-항- 퍼포린 항체로 세포 내 염색을 수행하였다. 세포 내 염색을 위해, 세포를 고정 버퍼(2% 파라포름 알데히드를 함유한 PBS)로 고정시키고, 실온에서 20분 동안 배양 하였다. 고정된 세포를 투과 버퍼(0.1% 사포닌 및 0.05% 소듐 아지드가 함유된 PBS)에서 투과성으로 만들고, 인간 그랜자임 B 또는 퍼포린에 특이적인 FITC- 표지된 항체로 염색하였다. ALT-803 활성화된 PBMCs에서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 CD16+ NK 세포의 퍼센트 및 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 CD335+ NK 세포 상에서 CD25 및 CD69 활성화 마커의 발현을 FACSuite 소프트웨어를 이용하여 FACSVerse 플로우 사이토미터에서 분석하였다.
0.01 내지 10nM ALT-803을 함유하는 배지에서 5일 배양한 후 다른 도너로부터의 인간 PBMCs에서의 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 NK 세포의 퍼센트는 배지 컨트롤(도 1a 및 도 1b)과 비교하여 유의한 변화가 없었다. ALT-803이 시험관내에서 인간 PMBCs의 증식 반응을 자극할 수 있다는 이전의 연구 결과에서 나타났기 때문에, 배양 시간은 이 분석법의 민감도를 증가시키기 위해 연장되었다. 도 1c(도너-A) 및 도 1d(도너-B)에 나타낸 바와 같이, 10nM ALT-803 존재 하에서 7일 배양한 후에, CD4+ T 세포의 퍼센트는 감소하였고 CD8+ T 세포의 퍼센트는 ALT-803의 부재하에 배양된 세포에서 관찰된 것과 비교하여 PBMC 배양물에서 증가하였다. 이 발견은 CD4/CD8 비율이 분석되었을 때 더욱 명백해졌다(도 1e: 도너 -A 및 도 1F: 도너 -B). ALT-803의 존재 또는 부재 하에서 10일까지 배양한 PBMC 배양물에서 NK 세포의 퍼센트에는 유의한 차이가 없었다(도 1c 및 d).
ALT-803의 시험관내 효과는 다른 도너로부터의 인간 면역 세포 서브셋의 증식성에 대해 IL-15와 비교되었다. 인간 PBMC 배양물에 0.5nM ALT-803 또는 0.5nM IL-15를 첨가하면 7일 배양 기간 후 림프구 수가 ~2 배 증가했다. ALT-803은 CD8+ T 세포 및 NK 세포 서브셋의 절대 수를 증가시킬 때 IL-15만큼 강력하였다(그림 2a 및 그림 2b). ALT-803은 또한 CD4+ T 세포의 절대 수를 유의하게 증가시켰지만 IL-15는 Treg 세포의 절대수를 증가시켰다.
또한, ALT-803의 면역 자극 효과를 이해하기 위해 면역 세포 서브셋에 대한 활성화 마커, CD25 및 CD69의 발현을 조사하였다. 도 3a 내지 도 3d에 나타낸 바와 같이, ALT-803으로 시험관내 처리는 농도 의존적 방식으로 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 NK 세포에 의한 CD25 발현을 증가시킬 수 있었다. 특히, ALT-803에 의한 CD25의 상향조절은 CD8+ T 세포 또는 NK 세포에 비해 CD4+ T 세포에서 가장 현저하였다. CD8+ T 세포에 의한 CD25 발현은 ALT-803에 의해 최소한으로 유도되었다. CD25와는 대조적으로, CD69 발현은 ALT-803 배양에 의해 NK 세포에서 높게 발현되는 반면, CD4+ T 세포에 의한 CD69 발현에는 치료 효과가 거의 없거나, 또는 전혀 나타나지 않았다.
이 연구는 또한 ALT-803이 NK 세포와 CD8+ T 세포가 세포 용해 반응에 중요한 역할을 하는 그랜자임과 퍼포린의 더 높은 수준을 발현할 수 있는지를 평가하기 위해 수행되었다. 인간 PBMCs는 전술 한 바와 같이 ALT-803으로 시험관내에서 활성화시킨 후, Ab 염색을 하여 CD8+ T 세포 및 NK 세포 서브셋을 분화시킨 다음, 인간 그랜자임 B 또는 퍼포린에 특이적인 FITC-표지된 항체로 세포내 염색하였다. 도 4a 내지 도 4d에 도시된 바와 같이, ALT-803은 농도 의존적 방식으로 CD8+ T 세포(도 4a 및 도 4c) 및 NK 세포(도 4c 및 도 4d)에 의해 그랜자임 B 및 퍼포린의 발현을 상향조절할 수 있었다. 또한, ALT-803 매개성의 CD8+ T 세포와 NK 세포에서의 그랜자임 B 발현 유도는 퍼포린 발현에 대한 ALT-803 매개 효과보다 더 현저하였다. 이러한 발견은 ALT-803에 의해 유도된 그랜자임 B 및/또는 퍼포린의 발현이 ALT-803과 함께 인큐베이션한 후 PBMCs의 세포독성을 증가시키는 역할을 할 수 있다는 개념과 일치한다.
인간 및 마우스 면역 세포에 대한 ALT-803의 효과를 비교하기 위한 추가적인 연구가 수행되었다. 이전의 연구들은 단백질이 수용성 또는 고정화된 형태로 존재하는지 여부에 따라 인간 PBMCs에 대한 단백질의 면역 자극 효과가 크게 달라질 수 있음을 보여 주었다. 따라서, ALT-803을 가용성 단백질 또는 플라스틱 고정된 습식 또는 공기 건조 단백질로 제조하여 인간 및 마우스 세포에 사이토카인 방출 및 증식 분석을 수행하였다. ALT-803은 인간에서 각각, 0.3, 3.0 및 170μg/kg i.v. 투여량의 최대 혈청 농도에 해당하는 0.08, 0.8 및 44nM에서 시험하였다. 증식 분석을 위해 비장 세포(CD3 + T Cell Enrichment column, R & D System)에서 농축된 인간 PBMCs와 마우스 CD3+ 세포를 CelltraceTM Violet(Invitrogen)으로 표지하고 PBS 또는 ALT-803이 함유되어있는 웰에서 배양했다. 양성 대조군으로서, 27nM의 항-CD3 Ab(마우스 비장 세포에 대해서는 145-2C11 및 인간 PBMCs에 대해서는 OKT3)를 동일한 분석 포맷으로 별도의 웰에 첨가하였다. 세포를 4일간 배양한 후, 플로우 사이토메트리로 분석하여 보라색 염료 희석에 기초한 세포 증식을 검출하였다. 추가로, 인간 및 마우스 면역 세포를 24시간 및 48시간 동안 상기 기재된 바와 같이 배양하고 배지로 방출된 사이토카인을 제조사의 설명서(BD Biosciences)에 따라 인간 및 마우스 Th1/Th2/Th17 사이토메트릭 비드 어레이 사이토카인 키트를 사용하여 측정 하였다. 면역 세포 서브셋 분석을 위해, 인간 PBMCs를 다양한 농도의 ALT-803 또는 IL-15에서 배양하고 CD4, CD8, CD335, CD16 또는 CD19에 특이적인 항체 또는 인간 Treg 키트(BioLegend)로 염색하였다. 일부 실험에서, 세포는 또한 전술한 바와 같이 CD69, 그랜자임 B 또는 퍼포린에 특이적인 항체로 염색되었다.
1일 또는 4일 동안 고정화된 ALT-803와의 인큐베이션(도 5a)은 인간 PBMCs에 의한 IFN-γ 방출을 증가시켰다. 가용성 IL-6도 ALT-803으로 처리한 4일간의 인간 PBMC 배양에서 증가하였으나, 이 효과는 투여량 의존적이지 않았다(도 5a). 대조적으로, ALT-803은 4일 인간 PBMC 배양물에 의한 TNF-α, IL-4, IL-10 또는 IL-17A 방출에 영향을 미치지 않았다. 평행 배양에서 시험했을 때, 양성 대조 항-CD3 mAb는 IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-4 및 IL-17A의 방출을 유도하였다. 인간 면역 세포와 비교하여, 마우스 비장 세포는 ALT-803(도 5b)과 함께 배양한 후 IFN-γ 방출에 대해 유사하지만 덜 강렬한 반응을 나타내었다. ALT-803은 또한 마우스 비장 세포로부터 TNF-α 생성을 유도하였으나, IL-6, IL-2, IL-10, IL-4 및 IL-17A의 수준에는 유의한 영향을 나타내지 않았다. 반대로, 고정화된 항-CD3 항체로 배양된 뮤린 림프구는 시험된 모든 사이토카인의 현저하게 상승된 방출을 나타내었다. 함께, 이러한 결과는 ALT-803이 항-CD3 항체에 의해 유도된 사이토카인의 광범위한 프로파일과 대조적으로 인간 및 마우스 면역 세포에 의한 IFN-γ 생성을 주로 자극한다는 것을 나타낸다.
CellTrace TM Violet 표지된 인간 및 마우스 면역 세포의 시험관내 증식을 유도하는 ALT-803의 능력도 평가되었다. 언급된 마우스 림프구의 증식은 0.7nM 내지 44nM 가용성 ALT-803(도 5c)과 함께 배양한 후 명백하였다. 고 투여량의 가용성 ALT-803 그룹의 세포 중 최대 83%가 4일 배양 기간 동안 1~6 라운드의 세포 분열을 겪었다. 처리되지 않은 뮤린 세포 또는 0.07nM의 가용성 ALT-803으로 처리된 세포에서 거의 또는 전혀 증식이 검출되지 않았다. 예상한 바와 같이, 고정화된 항-CD3 항체로 배양된 뮤린 림프구는 강한 증식 반응을 나타내었다. ALT-803 투여량 의존 림프구 증식은 또한 인간 PBMC 배양에서 관찰되었지만, 이 반응은 마우스 세포에서 관찰된 것보다 상당히 적었다. 전체적으로, 모든 인간 림프구의 20% 미만이 고 투여량 ALT-803에 반응하여 증식하였고, 이들 반응은 양성 대조 항-CD3 항체에 의해 유도된 것보다 적었다. 또한, ALT-803 및 항-CD3 Ab 모두에 대한 세포 증식 반응의 개별적인 변화가 다른 도너의 혈액 림프구에서 관찰되었다.
실시예 2: ALT-803 및 항체와 조합된 ALT-803에 의한 세포-매개 세포 독성 유도
ALT-803이 세포 매개 세포 독성에 영향을 주는지 평가하기 위해, 혈액 버피 코트에서 분리된 인간 PBMCs를 이펙터 세포로 사용했다. Daudi 인간 B 세포 림프종 세포와 K562 인간 골수성 백혈병 세포를 표적 세포로 사용하고, RPMI-10 중 5μM에서 Celltrace Violet으로 37℃에서 20분 동안 제조자의 설명대로 표지하였다. 이펙터 세포를 보라색 표지된 표적 세포와 혼합하고 명시된 시간 동안 ALT-803와 함께 그리고 함께 하지 않고, RPMI-10 중 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다. 일부 실험에서, Daudi 세포의 표면 상에 발현된 CD20에 특이적인 항-CD20 Ab(리툭시맵, 10nM)를 이펙터:Daudi 세포 배양물에 첨가하여, 항-CD20 Ab-매개 항체-의존성 세포독성(ADCC)에 대한 ALT-803의 영향을 검출하였다. 이펙터 세포와 표적 세포의 혼합물을 원심 분리에 의해 수거하고 2㎍/ml의 프로피듐 요오드로 페놀 레드없이 RPMI-10에 재현탁시켰다. 표적 세포에 대한 이펙터 세포의 세포 독성은 프로피듐 요오드 양성 염색 후 죽은 보라색 표지된 표적 세포의 퍼센트를 측정하여 플로우 사이토메트리로 평가하였다.
도 6a 내지 도 6d에 나타낸 바와 같이, 신선한 인간 PBMCs는 ALT-803의 부재하에서 Daudi 및 K562 세포에 대해 약한 세포독성을 나타냈다. 대조적으로, PBMCs는 10nM에서 ALT-803의 존재하에 Daudi 및 K562 종양 표적 세포에 대해 매우 강한 세포독성을 나타냈다. Daudi 종양 세포는 항-CD20 Ab(리툭시맵)에 의해 인지될 수 있는 CD20 분자를 발현한다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, CD20은 혈액 종양 및 자가 면역 질환의 치료용 항체 치료를 위한 확립된 표적이다. 인간 PBMCs는 리툭시 맵 단독으로 매개된 ADCC에 의해 Daudi 세포를 용해시킬 수 있다 (도 6c, 배지 컨트롤). 흥미롭게도, ALT-803은 Daudi 세포에 대한 인간 PBMCs의 리툭시맵-매개된 ADCC 활성을 현저히 증가시킬 수 있었다. 도 6d에 도시된 바와 같이, PBMC 세포독성 및 ADCC에 대한 ALT-803-매개된 효과의 시간 의존적 증가가 관찰되었고, ALT-803 인큐베이션 1일 후에 반응이 거의 나타나지 않거나 전혀 보이지 않았고, 각 추가 배양한 날마다 증가된 표적 세포 사멸이 관찰되었다.
또한, K562 및 Daudi 세포에 대한 인간 PBMC 세포독성의 ALT-803 농도 의존 유도가 조사되었다. 신선한 인간 PBMCs를 다양한 농도(0.01nM 내지 10nM)의 ALT-803을 갖는 RPMI-10 배지에서 Celltrace Violet으로 표지된 K562 세포 또는 Daudi 세포와 혼합한 다음 3일 동안 인큐베이션하였다. 표적 세포에 대한 인간 PBMCs의 세포독성을 상술한 플로우 사이토메트리로 평가하였다. 도 6a - 도 6d의 결과와 일치하여, ALT-803은 10nM에서 Daudi 및 K562 세포에 대한 인간 PBMCs의 세포 독성을 증가시킬 수 있었다(도 7a 및 도 7b: 도너-A & 도너-B). 또한, 0.01nM 만큼 낮은 ALT-803은 또한 표적 세포에 대한 인간 PBMCs의 세포독성이 증가함을 입증하였다. 2명의 개체로부터의 PBMCs는 상이한 종양 표적 세포에 대해 현저히 상이한 세포독성 활성을 나타냈다. 도너-A(도 7a)로부터의 PBMCs는 Daudi 세포보다 훨씬 높은 기준선 및 ALT-803-유도된 세포독성을 나타냈다. 대조적으로, 도너 -B로부터의 PBMCs(도 7B)는 2 개의 상이한 표적 세포에 대하여 유사한 기준선 및 ALT-803-유도 된 세포독성을 나타냈다. 이 발견은 다른 환자에서 ALT-803-매개된 임상 반응의 잠재적 다양성을 이해하는데 중요할 수 있다. 유사한 세포 독성 시험은 이 분자의 임상적 사용의 일부로서 ALT-803에 대한 환자의 면역 반응의 결과로서 평가된다.
종양 특이적 ADCC에 대한 ALT-803의 농도 의존적 효과도 또한 평가되었다. 도 8a 내지 도 8b에 도시된 바와 같이, 0.01nM 만큼 낮은 농도의 ALT-803은 인간 Daudi B 림프종 세포에 대한 항-CD20mAb(10nM)의 ADCC 활성을 증가시킬 수 있었다. 이 반응은 Daudi 세포와 2:1 E:T 비율로 배양한 인간 PMBC 이펙터 세포에서 관찰되었으며, 이는 그 활성의 민감도를 나타낸다. 관찰된 표적 종양 세포 사멸을 일으키는 면역 이펙터를 확인하기 위해, NK 세포를 MACS에 의해 인간 PBMCs로부터 분리하고 상기 ADCC 분석에서 이펙터 세포로서 사용하였다. 총 인간 PBMC의 결과와 유사하게, NK 세포는 ALT-803의 첨가에 의해 증강된 리툭시맵-매개된 ADCC 활성을 통해 Daudi 세포를 사멸시킬 수 있었다(도 8c). 대조적으로, NK 세포가 고갈된 PBMCs(비 NK 세포)는 이 설정에서 Daudi 세포 사멸 검출가능한 ADCC 활성을 나타내지 않았다(도 8d). 더욱이, NK 세포에 대한 컨트롤 항체, HOAT(인간화된 항-인간 조직 인자 IgG1 Ab)의 첨가는 Daudi 세포에 대해 ALT-803의 첨가 여부에 관계없이 검출가능한 ADCC 활성을 제공하지 않았다.
인간 Daudi 세포에 대한 마우스 면역 세포의 ADCC 활성을 증가시키기 위한 ALT-803의 능력을 또한 조사하였다. 이 연구에서는 SCID 마우스에게 연구 0일째(SD0)에 Daudi 세포(마우스 당 10x106)를 접종하고, SD15 및 SD18에 ALT-803(0.2mg/kg), 리툭시 맵(10mg/kg), 또는 ALT-803(0.2mg/kg) + 리툭시맵(10mg/kg)으로 처리하였다. 마우스를 두 번째 치료 4일 후에 희생시키고, 췌장 세포를 준비 하였다. 따라서, 췌장 세포는 생체내 처리의 결과로서 상이한 활성화 상태를 가질 수 있다. 그 다음, 비장 세포를 RPMI-10 배지 단독 또는 리툭시맵(10nM), ALT-803(10nM) 또는 리툭시맵(10nM) + ALT-803(10nM)을 함유한 배지에서 E:T 비율 20:1에서 Daudi 표적 세포와 혼합하였다. 37 ℃에서 2일간 배양한 후, BD FACSVerse에서 violet-표지된 Daudi 세포의 프로피듐 요오드 염색을 분석하여 Daudi 표적 세포 생존력을 평가하였다. 도 9a에 나타낸 바와 같이, 컨트롤 처리된 마우스로부터 유래된 비장세포에 ALT-803을 첨가하면, 인간 Daudi 세포에 대한 항-CD20 mAb 지시된 ADCC를 증가시킬 수 있었다. 또한, ALT-803으로 생체내 자극은 인간 Daudi 세포에 대하여 항-CD20 mAb 지시된 ADCC에서보다 활성인 비장세포를 초래하였다. 이러한 결과는 ALT-803 치료가 종양 특이적 ADCC 반응을 강화시킬 수 있다는 것을 나타내는 인간 면역 세포를 이용한 결과와 일치한다.
다른 인간 종양 세포에 대한 면역 세포의 ADCC 활성을 증가시키는 ALT-803의 능력을 조사하였다. HER-2는 유방암 및 위암 또는 위식도 접합부 선암을 포함한 고형 종양의 치료용 항체 치료를 위한 확립된 표적이다. HER-2 양성 종양에 대한 ADCC 활성에 대한 ALT-803의 영향을 평가하기 위해, HER-2를 과발현하는 SK-BR-3 인간 유방암 세포주를 표적 세포주 및 항-인간 HER-2 항체(클론 24D2)를 종양 세포 표적 Ab로서 사용하였다. 활성화된 이펙터 세포를 생성하기 위해, Balb/c 마우스에 시험일(SD) 0에 0.2mg/kg ALT-803을 정맥내 주사하였다. SD3에, 마우스를 희생시키고, 비장을 수거하였다. 활성화된 비장 세포를 CellTrace 바이올렛-표지된 SK-BR-3 세포와 10:1 E:T 비율로 혼합하였다. 세포를 다양한 농도의 항-HER2 항체(클론 24D2), ALT-803 또는 두 가지 제제를 포함한 R10 배지에서 37℃에서 공동배양하였다. 24시간 후, 세포 혼합물을 수집하고 사멸된 세포를 프로피듐 요오드로 염색하였다. 사멸된 SK-BR-3 세포의 퍼센트를 플로우 사이토메트리를 이용하여 조사하였다. 도 9b에 나타낸 바와 같이, 항-HER2 Ab 또는 ALT-803 단독의 존재하에 활성화된 비장 세포와 SK-BR-3 세포의 배양은 배지 컨트롤에 비해 SK-BR-3 세포 사멸을 초래하지 않았다. 그러나, ALT-803(0.01-1.0nM)과 항-HER2 항체(클론 24D2)(0.1-10nM)를 병용 처리한 결과, SK-BR-3 인간 유방암 세포에 대한 비장 면역 세포의 ADCC 활성이 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 ALT-803이 여러 가지 치료학적으로 확립된 질병 표적에 대한 ADCC 반응을 증가시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 3: 종양 보유 마우스에서의 ALT-803 + 종양-특이적 항체 치료의 항 종양 활성
Daudi 종양을 보유한 SCID 마우스에서 항-CD20 mAb의 항-종양 활성을 증가시키는 ALT-803의 능력을 추가로 평가하였다. 이 마우스는 종양에 대한 ADCC 반응을 쉽게 매개하는 기능성 NK 세포를 가지고 있다. 본 시험을 위해, Fox Chase SCID 암컷 마우스(Harlan, C.B-17/IcrHsd-Prkdc-scid: 6주령)에 Daudi 세포(마우스 당 10x106)(3 마리/그룹)를 정맥내(i.v.) 접종했다. 종양 보유 마우스를 i.v. 종양 접종 후 15 일째 및 3일 후 PBS, ALT-803(0.2mg/kg), 리툭시맵(10mg/kg) 또는 ALT-803(0.2mg/kg) + 리툭시맵 (10mg/kg)으로 처리하였다. 두 번째 치료 후 4 일째에 마우스를 희생시키고 골수에서 Daudi 세포의 수준을 검출하였다. 대퇴골 골수 세포의 Daudi 세포의 퍼센트를 PE-컨주게이트된 항-인간 HLA-DR 항체(Biolegend) 및 플로우 사이토메트리 분석으로 염색한 후 평가하였다. 도 10에 나타낸 결과는 ALT-803 및 항-CD20 mAb 단일 요법이 종양 보유 마우스의 골수에서 Daudi 세포의 퍼센트를 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 그러나 ALT-803과 항-CD20 mAb의 조합은 골수 Daudi 세포를 컨트롤 마우스에서 38%로부터 ALT-803 + 리툭시맵 처리 마우스에서 5%로 감소시키는 가장 큰 항종양 활성을 제공했다. 이 모델에서 투여량 반응 시험은 0.02mg/kg ALT-803이 항-CD20 mAb의 항종양 활성을 증가시킬 수 있음을 확인했다(도 11).
Daudi 세포 종양을 가진 마우스의 생존율을 향상시키는 ALT-803 + 항-CD20 mAb의 능력도 평가되었다. 이 시험을 위해 Fox Chase SCID 암컷 마우스에게 Daudi 세포(마우스 당 10x106)를 정맥내(i.v.) 접종했다. 종양 보유 마우스를 i.v. 종양 접종 15일 후 및 3일 후에 PBS, ALT-803 (준 최적 0.05mg/kg), 리툭시맵(10mg/kg) 또는 ALT-803(0.05mg/kg) + 리툭시맵(10mg/kg)으로 i.v. 처리하였다. 마우스의 생존(뒷다리 마비에 기초한 이환율 포함)을 모니터링하였다. 도 12에서 알 수 있듯이, PBS, 준 최적의 ALT-803과 리툭시맵 단일 요법군의 종양 억제 마우스의 생존율은 26-30일의 중간 생존율을 보였으나, ALT-803과 리툭시맵의 병용 치료를 받은 마우스의 평균 생존율은 50일 이상이었으며, 이는 병용 요법이 B 세포 림프종을 가진 마우스의 생존을 현저하게 연장시킨다는 것을 나타낸다. 이와 함께, 이러한 결과는 생체내에서 종양 특이적 항체와 함께 ALT-803의 상승적인 항종양 효과를 확인한다. ALT-803과 항-CD20 mAb의 병용이 위에 기술된 시험을 위해 종양 보유 동물에서 어떠한 중대한 징후도 유발하지 않았음이 주목할 만하다. 이는 이러한 병용이 잘 용인됨을 나타낸다.
실시예 4: 종양 보유 마우스에서 면역관문 블로커와 병용된 ALT-803의 항종양 활성
CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, LAG-3, BTLA, TIM-3, VISTA, IDO, A2aR, HVEM, KIRs, NKG2A, NKG2D, CEACAM-1, 2B4, CD200R 및 이들의 리간드 및 본 명세서에 기재된 다른 표적들은 면역 억제 신호를 억제함으로써 면역 반응을 촉진 할 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, ALT-803은 NK 세포 및 T 세포의 증식 및 활성을 촉진시키는 면역 자극 분자이다. 그러나, 그 효과는 면역 반응을 약화시킬 수있는 억제 관문 및 경로에 의해 제한될 수 있다. 이러한 음성 조절자들을 폐기하고 ALT-803의 활성을 강화시키는 전략은 치료 이익을 제공 할 수 있다.
CTLA-4-CD80/CD86 경로의 차단과 함께 ALT-803의 항종양 활성을 조사하기 위해, CT26 뮤린 대장암종 세포주로 i.v. 주사한 BALB/c 마우스를 사용하여 폐 전이 모델을 개발하였다. 4-6 마리의 마우스 그룹에 0일(SD0)에 2x105 CT26 종양 세포를 i.v. 주사하였다. ALT-803 그룹에서, 각 마우스는 4μg의 i.v. ALT-803은 SD1에 시작하여 2주 동안 1주일에 두 번씩 받았다. ALT-803과 함께, 일부 마우스는 SD1에 시작하여 2주 동안 1주일에 두 번씩 i.v. 투여된 주사당(Ab 당) 100㎍에 항-PD-L1 항체(Ab)(클론 9G2), 항-CTLA-4(클론 UC10-4F10-11) Ab 또는 모두를 받았다. 재조합 인간 IL-15 그룹에서, 각각의 마우스는 SD1에 시작하여 2주 동안 5㎍의 IL-15를 매일 복강내(i.p.), 1주일에 5회 받았다. IL-15와 함께 동물들도 SD1, SD4, SD8 및 SD11에 항-PD-L1 Ab 및 항-CTLA-4 Ab(주사당 100㎍)의 치료. 컨트롤 마우스는 PBS 주사를 받았다. 마우스를 효능 종점으로 생존을 위해 매일 평가 하였다.
도 13에 도시된 바와 같이, CT26 종양을 갖는 BALB/c 마우스의 중간값 생존율은 시험에 따라 15일 내지 20일이었다. ALT-803 단독으로 처리한 경우 컨트롤 그룹에 비해 종양 보유 마우스의 생존기간이 유의하게 연장되었다. ALT-803에 대한 항-PD-L1 Ab 처리의 첨가는 이들 생쥐의 생존율을 개선시키지 못하는 것으로 나타났다. 대조적으로, ALT-803 및 항-CTLA4 Ab(항-PD-L1 Ab를 함유하거나 또는 함유하지 않는)의 병용은 PBS 및 ALT-803 그룹에 비해 CT26 종양 보유 마우스의 생존을 현저하게 증가시켰다. 이 종양 모델에 대한 이전의 시험들은 항-CTLA4 Ab 단일 요법이 생존율을 향상시키지 못했다는 것을 보여 주었다. 따라서, ALT-803 및 항-CTLA4 Ab(항 PD-L1 Ab는 아님)의 병용은 종양 보유 마우스에서 연장된 생존에 의해 측정된 바와 같이 보다 효과적인 항종양 반응을 제공하는데 상승적으로 작용한다.
ALT803과 병용 투여된 PD-1-PD-L1 차단 효과는 면역 적격 C57BL/6 마우스의 5T33P 골수종 모델에서 더욱 평가되었다. 5마리의 마우스 그룹에 SD0에서 1x107 개의 5T33P 종양 세포로 i.v. 주입하였다. 치료는 SD4에서 시작되었다. IL-15 그룹에서, 각 마우스에는 SD4 및 SD11에 5μg의 IL-15 i.v. 투여하였다. IL-15와 함께 일부 동물은 또한 SD4와 SD11 각각에 일주일에 한 번 항-PD-L1 Ab(클론 9G2, 200㎍/마우스/주사 i.p.) 또는 항-CTLA-4 Ab(클론 UC10-4F10-11, 200㎍/마우스/주사 i.p.) 받았다. ALT-803 그룹에서, 각 마우스는 SD4 및 SD11에 1μg/마우스/주사로 준 최적의 ALT-803의 2 회의 i.v. 주사를 받았다. ALT-803과 함께, 일부 마우스는 상기한 바와 같이 항-PD-L1 Ab, 항-CTLA-Ab 또는 두 항체를 투여받았다. 또한, 마우스 그룹은 항-PD-L1 Ab 또는 항-CTLA-4 Ab 단일 요법을 받고, PBS 주사를 받았다. 마우스를 시험 종점으로서 양쪽 뒷다리에서 생존 및/또는 완전 마비에 대해 매일 평가하였다. 도 14a에 나타낸 바와 같이, 5T33P 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스의 중간값 생존율은 24일이었다. ALT-803의 준 최적 투여량으로 치료한 결과, 동물의 생존율은 크게 변하지 않았지만, ALT-803과 항-PD-L1 Ab의 병용 투여는 50일 이상이 시험 그룹에서 모든 동물의 생존을 가져왔다. 대조적으로, ALT-803과 항-CTLA Ab의 병용은 마우스 생존을 유의하게 연장시키지 못했다. 또한, ALT-803 + 항-PD-L1 Ab의 준 최적 수준이 단일 요법으로 및 병용으로 시험된 경우, ALT-803 + 항-PD-L1의 처리 후 5T33P 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에서 유의하게 더 긴 생존이 관찰되었다. Ab 단독 요법으로 치료한 마우스와 비교하였다(도 14b). 따라서, ALT-803 + 항-PD-L1 Ab의 병용은 골수종 종양이 있는 마우스에서 상승 작용 항암 활성을 제공한다.
이 두 모델에서 ALT-803 병용 요법의 다양한 활성을 더 잘 이해하기 위해, 종양 세포주를 PD1 및 CTLA4 리셉터의 리간드에 대해 염색하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, CT26 세포는 CTLA4에 대한 리간드를 발현하나, PD1은 발현하지 않는다. 대조적으로, 5T33P 종양 세포는 CTLA4에 대한 리간드가 아닌 PD-L1을 발현한다. 이러한 결과는 이들 종양 모델 각각에서 ALT-803을 조합한 항-CTLA4 및 항-PD-L1 Abs의 항종양 활성과 일치하며, 면역관문 블로커에 대한 리간드로 종양을 염색하는 것이 ALT-803 + 면역관문 블로커에 대한 반응의 예측 인디케이터로 제공할 수 있음을 나타낸다.
Zeng et al. 2013 Int J Radiat Oncol Biol Phys., 86:343-9에 기술된 교아종에 대한 확립된 모델을 사용하여, ALT-803 단일 요법 및 항-PD-1 mAb와의 병용에 대한 연구가 또한 교아종 세포주 GL261-luc로 두개뇌로 이식된 C57BL/6 마우스에서 실시되었다. 종양 이식 후 7 내지 10일 후에 시작하여 단일 요법으로 ALT-803(3 또는 4 투여량) 또는 항-PD-1 mAb(3 투여량)의 다중 투여로 치료한 결과, PBS-처리된 컨트롤에 비해 항종양 활성이 유사하게 증가하고 동물의 생존기간이 연장되었다. ALT-803과 항-PD1 mAb 치료의 병용은 종양 보유 마우스의 중간값 생존기간을 연장시켰다. 또한, ALT-803의 4 투여량과 함께한 항-PD-1 mAb는 장기간 종양이 없는 생존자의 퍼센트(>60일 이식 후)가 항-PD-1 Ab 및 ALT-803 단일 요법으로 처리된 마우스에서 관찰된 20% 비율에서 40%로 증가하였다. 흥미롭게도 "치료된" 마우스는 종양 재접종에 저항성이 있었으며, 이는 종양에 대한 치료-유도된 면역 메모리 반응을 암시한다. 이러한 결과는, ALT-803의 면역 자극 활성을 상기 관문 블로커, 항-PD-1 Ab와 병용시키면, 교아세포종 종양 보유 마우스의 생존기간을 연장시키는데 유익한 효과가 있음을 시사한다.
ALT-803 + 관문 인히비터 차단의 병용이 위에서 언급한 시험에서 종양 보유 동물에서 중대한 징후를 일으키지 않았음이 주목할 만하며, 이는 이러한 병용이 잘 받아 들여지고 있음을 나타낸다.
실시예 5: 마우스에서 ALT-803의 독성
동물에서의 ALT-803의 안전성 프로파일 및 치료 지수를 평가하고 안전하고 효과적인 인간 투여량을 평가하기 위해, 마우스 및 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkeys)에서 다중 투여 ALT-803 치료에 대한 독성 시험을 수행하였다. 매주 꼬리 정맥을 통해 0.1, 1.0 또는 4.0mg/kg ALT-803 또는 PBS를 C57BL/6N 마우스(10마우스/성/그룹)에게 4주 연속 투여하였다. 마지막 주사 후 4일(26일)에, 신체 검사, 혈액 화학 검사, 혈액 검사, 총체 부검(gross necropsy), 체중 및 장기 무게 측정 및 조직 병리학 검사를 포함한 평가를 수행하였다(5마우스/성/그룹). 마지막 평가 후 14일(36일)에, 남은 마우스에 대해서도 유사한 평가를 수행하였다. 두 번째 시험에서, C57BL/6N 마우스(15마우스/성/그룹)를 4주간 i.v. 0.1 또는 1.0mg/kg ALT-803 또는 PBS의 주사로 처리하였다. 상술한 독성 평가는 마지막 주사 후 4일(26일)(10마우스/성/그룹) 또는 4주(50일)(5마우스/성/그룹)에 수행되었다.
ALT-803의 안전성 및 약력학 프로파일은 4주 연속 주당 0.1, 1.0 또는 4.0mg/kg ALT-803 또는 PBS로 i.v. 주사한 건강한 C57BL/6N 마우스에서 평가하였다. 4.0mg/kg ALT-803을 투여받은 마우스는 치료 개시 후 4 내지 20일 사이에 독성(즉, 체중 감소, 탈모) 및 사망의 징후를 나타냈다. 사후 부검은 사망 원인을 결정하지 않았지만 관찰(즉, 폐부종, 확장된 비장)은 사이토카인-유도된 치사 염증 반응과 일치하였다. 1.0 또는 0.1mg/kg ALT-803으로 처리한 마우스에서는 사망률이 관찰되지 않았다. 비장 중량과 백혈구(WBC)수의 투여량 의존적 증가는 ALT-803의 마지막 투여 후 4일(26일)에 나타났다(도 16). WBCs 중에서, 림프구, 호중구 및 단핵 세포에 대한 절대수는 컨트롤에 비해 1.0mg/kg ALT-803 처리된 마우스에서 각각 8배 이상 증가했다. 치료 후 2주(36일) 및 4주(50일)(도 16a 내지 도 16f)에, 1.0mg/kg ALT-803 처리된 마우스에서 호중구 수가 증가가 유지되었지만, 림프구 수는 컨트롤 수준으로 되돌아 갔다. 조직병리학적 분석은 26일에 비장, 간, 흉선, 신장, 폐 및 림프절에서 면역 세포 증식 및 림프구 침윤에 대한 ALT-803 투여량 의존적 자극을 확인하였으며, 36일 및 50일에는 적게 나타났다. 이러한 시험결과는 마우스에서 1mg/kg까지 다중 ALT-803 치료의 허용 투여량을 정의하였다.
실시예 6: 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkeys)에서 ALT-803의 독성, 약력학(PD) 및 약물동태학(PK)
Good Laboratory Practice 규정에 따라 시노몰구스 원숭이에서 ALT-803의 다중 i.v. 투여의 효과를 평가하기 위한 연구가 수행되었다. 동물(5마리의 원숭이/성/그룹)을 0.03 또는 0.1mg/kg ALT-803 또는 PBS를 ~3분 i.v. 주사로 투여하여 4주 연속으로(1, 8, 15 및 22일) 처리하였다. 시험중 살아있는 단계 전반에 걸쳐 동물을 임상 및 행동 관찰, 음식 소비, 체중, 심장 및 안구 기능에 대해 평가하였다. 혈액학, 화학 및 응집 평가(투여 전 및 투여 후 5, 26 및 36일) 및 면역 세포 분석을 위해 혈액을 채취하였다. 면역원성 시험 및 퀄러화이드 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 방법을 사용하여 수행되는 PK 분석을 위해 혈청을 채취하였다. 소변 검사를 위해 소변을 채취하였다(사전 투여 및 4, 25 및 35일). 마지막 검사 후 4일(26일)(3마리/성/그룹) 및 2주(2마리/성/그룹)에, 신체 검사, 총체 부검, 장기 무게 측정 및 조직 병리 검사를 포함한 임상 병리학 평가를 수행하였다.
허용가능한 마우스 투여량에 대한 알로메트릭 스케일링에 기초하여, 0.1 및 0.03mg/kg으로의 ALT-803의 다중 투여 i.v. 처리의 활성 및 독성 프로파일이 건강한 시노몰구스 원숭이에서 평가되었다. 첫 번째 투여 후 PK 분석은 약 7.6시간에 ALT-803의 제거 반감기를 추정했는데, 이는 투여량 수준에 따라 크게 차이가 없는 것으로 보였다(도 17). 0.1mg/kg ALT-803에 대한 30nM의 Cmax 값은 투여된 투여량의 완전한 회복과 일치하는 반면, Cmax 및 AUCINF 값은 0.03mg/kg 투여량에서 ~30% 미만의 회복을 나타낸다. 그러나 저 투여량 수준에서도 혈청내 6nM의 Cmax는 시험 관내에서 면역 세포 증식, 활성화 및 세포독성을 자극하는 것으로 밝혀진 0.1nM 농도보다 50 이상 높았다.
ALT-803을 4주 연속 주사한 원숭이는 치료 기간의 첫 2 주 동안 식욕 감소를 보였다. 그러나, 연구 기간 동안 그룹간에 평균 체중이나 다른 투여량 관련 임상 또는 행동 관찰에 유의한 차이는 없었다. 또한, ALT-803 처리 동물에서 컨트롤에 비해 기관 중량이 유의하게 다르지 않았다.
매주 ALT-803 치료 후에 관찰된 가장 생물학적으로 관련된 변화는 혈중 WBC 및 림프구 수의 투여량 의존성 증가였다(도 18a - 도 18h). 4주 투여 기간의 마지막에 절대 림프구 수는 0.1mg/kg ALT-803을 투여받은 동물에서 1.5배 증가한 다음, 2주간의 회복 기간 후에 컨트롤 수준으로 돌아왔다. 림프구 서브셋 중에, NK 세포 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포수의 일시적인 투여량 의존적 증가가 치료 후 나타났다(도 18a - 도 18f). 또한, 혈액 단핵 세포 수가 0.1mg/kg ALT-803 처리된 원숭이에서 증가한 반면, 혈액 호중구 수준은 처리 그룹간에 차이가 없었다. 이러한 결과는 보고된 주요 독성이 3/4 등급의 일시적 호중구 감소증이었던, 머케크(macaques)와 레서스(rhesus) 원숭이에 대한 IL-15 투여의 이전 연구와 대조적이다.
혈액 면역 세포 수준의 변화 이외에, ALT-803의 마지막 투여 후 4일 동안 조직 병리학에 기초한 ALT-803 처리된 원숭이의 간, 신장 및 폐에서의 경증 다병성 림프구 침윤(mild multifocal lymphocytic infiltration)의 투여량-의존성 증가가 있었다. ALT-803 처리 동물에서 빈번한 가벼운 간 괴사가 또한 빈도 증가로 나타났다. 이 시점에서의 임상 화학은 컨트롤과 비교하여 고 투여량 ALT-803 그룹에서 혈청 알부민의 감소를 보였으며(0.1mg/kg ALT-801, 3.85±0.12g/dL; PBS, 4.46±0.13g/dL; P<0.01), 이것은 간에서의 염증 반응의 결과일 수 있다. 그러나, 컨트롤에 비해 ALT-803 처리 동물에서 혈청 간 효소 수준은 상승하지 않았다. 대부분의 동물에서 골수 증식이 관찰되었지만, 고 투여량 ALT-803 그룹에서는 중증도가 증가했다. ALT-803 처리 그룹에서 영향을 받은 장기 대다수의 병변은 치료 후 2주까지 발병률과 중증도가 감소하였고, 컨트롤 동물에서 발견된 결과와 일치했다. 일반적으로, 이 시험에서 관찰된 혈액 및 조직 림프구에 대한 ALT-803 매개 효과는 IL-15로 1주일에 2회 0.1mg/kg 또는 매일 10 내지 50㎍/kg으로 처리된 비인간 영장류에 대해 보고된 일시적인 반응과 일치한다.
실시예 7: 정맥내 및 피하 ALT-803의 비교 시험
재조합 인간 IL-15(rhIL-15) 산물을 사용하는 진행중인 임상 시험에서 나온 새로운 데이터는 높은 Cmax와 이차적인 사이토카인 방출(IL-6 및 IFN-γ)을 유도하기 때문에, IL-15에 대한 정맥내 투여가 최적이 아닌 것으로 보여, 이는 제한적이다. IL-2를 이용한 전임상 및 임상 시험 결과에 따르면, 피하 투여가 더 안전하고 내약성이 훨씬 우수한 것으로 나타났다. 예를 들어, Waldmann과 동료 연구자들은 매일 12일 동안 정맥내 볼러스 주입(bolus infusion)을 사용하여 인간에서 rhIL-15의 첫 번째 고형 종양 시험을 실시했다(Conlon et al., 2015. J. Clin. Oncol., 33: 74-82). 하루에 3.0 및 1.0μg/kg 코호트(cohort)에서 관찰된 투여량 제한 독성은 3등급 저혈압, 혈소판 감소증, 알라닌 트랜스아미나아제(ALT) 및 아스파테이트 트랜스아미나아제(AST)의 증가였다. 최대 내약 투여량(MTD)은 0.3μg/kg/day로 정하였다. 피하 투여의 증가된 내성은 정맥내 투여되는 동일 투여량 수준 및 순환중인 rIL-15 산물의 보다 지속적인 수준과 비교하여 감소된 Cmax의 결과로서 예상된다. Cmax를 낮추면 전반적으로 더 많은 약물 전달이 가능하다.
이러한 결과를 ALT-803으로 확대하기 위해 전임상 시험을 실시하여 C57BL/6 마우스에서 약물동력학, 면역 자극 및 항종양 효능 측면에서 ALT-803의 i.v.(정맥내) 및 s.c.(피하) 투여를 평가하였다. 0.2mg/kg ALT-801로 처리된 C57BL/6 마우스의 초기 시험은 i.v. 투여에 대해 5.3시간의 추정된 반감기 및 s.c. 투여에 대해 3.8시간의 추정 반감기를 나타내었다. ALT-803의 최대 혈청 농도는 s.c. 투여 후 20시간 시점에서 650ng/ml이었으며, i.v. 투여 후 2시간 시점에서 1700ng/ml이었다. 면역 자극의 관점에서, ALT-803 s.c. 또는 i.v. 투여는 동등하게 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 증식을 유도할 수 있었다. 또한, ALT-803의 i.v. 및 s.c. 투여는 면역 세포를 유사하게 활성화시켜 5T33 골수종 보유 마우스의 골수내 종양 부담을 감소시켰다. ALT-803의 i.v. 및 s.c. 투여 모두 최대 0.2mg/kg에서 정상 및 종양 보유 C57BL/6 마우스에서 잘 용인되었다.
매주 C57BL/6 마우스에 4주 동안 s.c. 주사한 1mg/kg ALT-803의 독성 영향에 대한 후속 시험은, C57BL/6 마우스가 i.v. 경로를 사용하여 동일한 ALT-803 투여 요법으로 치료된 이전의 독성학 시험에서 보인 것과 유사한 면역 시스템 관련 변화를 나타내었다. 4주간 1mg/kg ALT-803의 s.c 주사 후, 마우스에서는 사망이 관찰되지 않았다. 첫 번째 ALT-803 s.c. 주사 후, 약간의 체중 감소 및 구부린 자세의 관찰을 제외하고는, 이 시험 동안 시험 물질 관련 독성의 임상 징후는 관찰되지 않았다. 말초 혈액을 조사한 결과, PBS 컨트롤에 비해 WBC 및 림프구 수가 증가했다. 전체적으로, PBS 주사된 마우스와 비교하여 ALT-803으로 처리된 동물에서 WBC 및 림프구 모두 9배 증가하였다. 호중구, 단핵 백혈구, 호산구 및 호염기구의 증가 또한 s.c. ALT-803 처리 마우스에서 관찰되었다. ALT-803 처리 마우스의 비장, 림프절 및 간 중량의 유의한 증가(각각 5.5, 3 및 1.3배)가 관찰되었다. 면역 세포의 비교가능한 광범위한 기반 확대 및 림프관 기관의 증가된 중량은 ALT-803로 다중 i.v. 처리받은 마우스에 대해 이전에 보고되었다.
전반적으로, ALT-803의 전임상 시험의 결과는 s.c. 투여가 i.v. 투여에 비해 Cmax를 감소시키나, 독성이 과하지 않으면서 면역 자극 활성 및 항종양 효능을 유지함을 보여주었다.
실시예 8: 동소 방광 종양을 갖는 마우스에서의 면역 관문 블로커와 병용된 ALT-803의 항암 활성
실시예 4에 기재된 시험에 추가하여, 면역 관문 블로커와 병용된 ALT-803의 항종양 활성을 동소 MB49luc 방광 종양을 갖는 마우스에서 평가하였다. C57BL/6 마우스(n=6/그룹)는 방광의 폴리라이신 전처리 후, 시험 0일에 MB49luc 세포(3x104 cells/방광)를 주입하였다. PBS, ALT-803(0.2㎎/㎏, i.v.) 또는 ALT-803(0.2㎎/㎏) + 항-PDL1 및 항-CTLA4 Abs(각각 100㎍/주사, i.p.)를 MB49luc 종양 세포 점적 후 7, 10, 14 및 17일에 투여하였다. 마우스들은 유효 종말점으로서 치료 그룹 중 생존율을 평가하기 위해 유지되었다. ALT-803 처리는 PBS와 비교하여 MB49luc 보유 마우스의 생존을 유의하게 연장시켰다(도 19a). 그러나, ALT-803과 항-PD-L1 및 항-CTLA4 Abs의 병용은 단일 요법의 컨트롤과 비교하여 생존을 더욱 연장시켰다. 이 효과는 ALT-803 + 항-PD1 및 ALT-803 + 항-PD1/항-CTLA4 mAbs의 병용 요법으로도 나타났다(도 19b).
또한, ALT-803 + 항-PD-L1/항-CTLA4 Ab 치료에 의해 종양이 치유된 마우스는 추가의 약물 치료 없이 방광 종양 재접종에 저항적이었지만, 연령이 일치하는 치료-나이브 마우스는 종양이 발달하였고, 종양세포 점적 후 죽었다(도 19a). 이 결과는 ALT-803 단일 요법 및 항-PD-L1, 항-PD-1 및 항-CTLA4 Abs와의 병용 요법이 치료 반응을 포함하는 방광 종양 보유 마우스를 치료하는데 효과적이었고, ALT-803/항-PD-L1/항-CTLA4 Ab 병용 요법은 후속 종양 재접종에 면역 메모리 반응을 제공하였음을 나타낸다. ALT-803과 관문 인히비터 차단제의 병용이 위에서 언급한 시험에서 종양 보유 동물에서 어떠한 중대한 징후를 일으키지 않았음이 주목할 만하며, 이는 이러한 조합이 잘 받아들여지고 있음을 나타낸다. 도 20에 나타낸 바와 같이, MB49luc 세포는 CTLA4 및 PD-1에 대한 리간드를 발현한다. 이와 같은 결과는이 종양 모델에서 ALT-803과 조합된 항-CTLA4, 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 Abs의 항 종양 활성과 일치한다.
실시예 9: 뮤린 흑색종 모델에서 ALT-803 및 항-gp75 항체, TA99의 병용 요법
공통 유전자 C57BL/6 마우스의 피하 B16F10 흑색종 종양 모델을 사용하여 고형 종양에 대한 치료 종양 항원 특이적 항체와 ALT-803의 효능을 추가로 평가하였다. 이 모델은 또한 확립된 종양 및 종양 재접종에 대한 T 세포 및 다른 면역 세포의 활성을 평가하는 이점이 있다. 표적 치료를 위한 중요한 흑색종 특이 항원 중 하나는 멜라노솜(melanosomes)에서 멜라닌 합성에 관여하는 75kDa 단백질인 gp75(TYRP-1, 티로시나아제-연관 단백질-1)이다(Kobayashi T, et al. 1994, EMBO J. 13: 5818- 25). TA99(마우스 IgG2a)는 인간 및 뮤린 gp75에 특이적인 모노클로날 항체(mAb)이다(ThomsonTM, et al., 1985, J Invest Dermatol., 85: 169-74). 이 항체로 치료하면 항원 의존성 세포 독성(ADCC)의 활성화를 통해 공통 유전자 마우스에서 피하 뮤린 B16F10 흑색종을 효과적으로 제거한다(Hara I, et al., 1995. J Exp Med. 182: 1609-14).
여기에 기재된 실험은 이 활성이 ALT-803과의 병용에 의해 추가로 증가될 수 있는지 여부를 검출하고, 항종양 효능을 담당하는 면역 반응을 평가하도록 고안되었다. 일반적으로, C57BL/6NHsd 마우스(7주령 암컷)에게 시험 0일(SD0)에 200μL PBS에 함유된 2×105 B16F10 종양 세포로 아래 등 옆구리에 s.c. 주사하였다. 이 시험에서 종양 재접종을 제외한 모든 실험에서 동물들의 75%이상이 감지가능한 B16F10 종양을 가졌을 시점인 SD10에서 시작하여 2주 동안 주 2회(시험일 10, 14, 17, 21 및 24일) 치료제를 투여하였다. 보다 구체적으로, 마우스를 그룹으로 나누고, 200㎕의 PBS(i.v.)(비히클 컨트롤), 0.2mg/kg ALT-803(i.v.), 10mg/kg TA99(i.v.), 100㎍/마우스 항-PD-L1 mAb 10F.9G2(i.p.) 또는 ALT-803, TA99 및/또는 10F.9G2의 병용 요법으로 주사하였다. 고갈 실험을 위해, 200㎍/마우스 고갈 항체(항-CD4 GK1.5, 항-CD8a 53.6.72 및 항-NK1.1 PK136)를 매주 1회 i.p. 주사하거나, 또는 100μL/마우스 클로포좀(Clophosome)(마크로파아지 고갈을 위한 클로드로네이트 로딩된 리포좀)을 매 4일에 한 번씩 주사하였으며, 이는 각각 SD3 및 SD9부터 시작하여 i.p. 실험의 종점까지 수행하였다. 종양 재접종을 포함하는 실험을 위해, 10mg/kg TA99(i.v.)를 주 3회 투여하였고, 0.2mg/kg ALT-803(i.v.)을 SD0부터 시작하여 3주 동안 1주일에 1회 투여하였다. 약 3개월 후, 초기 종양 접종으로부터 구제된 종양-프리 마우스에게 200㎕ PBS 중의 2×105 B16F10 종양 세포로 대측성으로 s.c. 주사하였다. 종양 용적은 치료 첫날부터 시작하여 마지막까지 매일 측정하고 ½(길이×넓이2)의 공식을 사용하여 측정하였다. 종양 하중이 일 치수로 20 mm를 초과하는 마우스를 희생시키고 사망으로 간주되었다. 감지가능한 종양이 없는 마우스 또는 안정한 s.c. 질량 <50 mm3은 종양이 없는 것으로 간주되었다.
초기 시험에서, 확립된 종양을 가진 마우스(n=8)를 TA99, ALT-803, TA99 + ALT-803 또는 PBS 컨트롤로 2주 동안 매주 2회 처리하였다(도 21a). 지연된 치료 적 개입으로 인해 어떤 처리 그룹에서도 종양 퇴행이 관찰되지 않았다. 그러나, 종양 진행은 PBS-치료 그룹에 비해 TA99(p<0.001)와 ALT-803(p<0.001)에 의해 유의하게 억제되었다. 병용 요법은 단일 요법(p<0.001)과 비교하여 종양 성장의 억제를 현저히 증진시켰으며, ALT-803이 종양에 대한 항체-의존성 면역에 대한 추가적인 보호를 제공함을 시사한다.
어떤 면역 세포 서브셋이 ALT-803/TA99-매개 항-흑색종 면역에 관여하는지를 검출하기 위해, T 림프구, NK 세포 및 마크로파아지는 세포 타입-특이적 항체 또는 리포좀의 복강내 투여에 의해 치료 과정 전 및 치료 과정 동안 고갈되었다. CD8+ T 세포, NK 세포 및 마크로파아지의 고갈은 병용 요법에 의한 종양 성장 억제를 유의하게 낮추었으며(p<0.001;도 21b), 이는 세 개의 세포 서브셋 모두가 ALT-803 및 TA99의 효능에 기여한다는 것을 시사한다. 놀랍게도, CD4+ T 세포의 고갈은 고갈이 없는 ALT-803 + TA99 처리 그룹과 비교하여 종양 억제의 현저한 증가(p<0.001; 도 21b)뿐만 아니라, 동물 생존의 현저한 증가(p<0.01; 도 21c)를 초래하였다. CD4+ T 세포가 면역 조절 기능에 많이 관여되어 있음을 고려할 때, 이 발견은 이러한 세포(또는 CD4+ T 세포의 서브셋)가 B16F10 종양에 대한 초기 ALT-803/TA99-매개 면역에서의 면역 반응보다 면역 억제성(immunosuppressive)임을 시사한다.
면역 세포에 대한 치료 효과를 투여치료 후 3일에 B16F10 흑색종 종양이 있는 마우스에서 채취한 비장 세포 및 종양 침윤성 백혈구(TIL)에서 조사하였다. ALT-803 투여 후, PBS 컨트롤에 비해 CD8+ T 세포 및 NK 세포 집단의 증가뿐만 아니라 CD4+ T 세포, B 세포 및 마크로파아지 집단의 감소가 있었다(도 22a 및 도 22b). 예상대로, TA99는 종양 관련 마크로파아지의 작은 감소를 제외하고는 비장 세포 또는 TILs에서 면역 세포 서브셋의 비율을 변경하지 않았다. ALT-803/TA99 조합은 면역 세포 집단에서 ALT-803 단독과 비슷한 변화를 보였다. ALT-803 단독 또는 TA99와의 조합은 CD8+ T 세포의 메모리 표현형(CD44high)의 현저한 증가를 가져왔고, 이는 비장 세포와 TILs의 데이터에 의해 뒷받침되었다(도 22c 및 도 22d). TIL에서 기준 CD8+CD44high T 세포 집단이 비장 세포에서 이 세포 집단보다 2배 더 크기 때문에, TILs에서 ALT-803-매개된 메모리 CD8+ T 세포의 확장은 덜 두드러졌다(1.2배, p<0.01 vs. 비장에서 2.5배, p<0.001). TA99는 TIL에서 메모리 CD8+ T 세포의 비율을 약간 줄였다. 아마도 더 많은 이펙터 CD8+ T 세포가 흑색종에 대한 항체 의존성 면역에 관여하기 때문일 것이다.
ALT-803 증강된 면역 메모리가 종양 세포에 대한 장기 면역 증진에 기여할 수 있는지 평가하기 위해, B16F10 종양으로 접종한 마우스를 치료하기 시도로 ALT-803 + TA99 치료를 시험 0일에 시작하였다. 이 치료 요법에서, TA99 치료에 ALT-803의 첨가는 SD60에서 종양이 없는 동물의 퍼센트가 적당히 증가하는 것을 제외하고는 동물 생존율이 개선되지 않았다(도 23a). 그러나, ALT-803 + TA99 그룹의 생존 마우스가 B16F10 세포로 재접종된 경우에, 연령-일치 치료 나이브 마우스와 비교하여 종양 발생의 유의한 지연이 관찰되었다(도 23b). 이러한 발견은 ALT-803을 이용한 사전 치료가 후속 종양 재접종을 받은 동물들의 "백신(vaccinal)" 보호에 중요한 면역 세포 반응을 유도한다는 가설을 뒷받침한다. 어떤 세포가 이 보호 효과에 관여했는지 평가하기 위해, 종양 세포 재접종 전에 ALT-803 + TA99 "치유된(cured)" 마우스에서 고갈 시험이 수행되었다. 그 결과는, PBS를 투여한 ALT-803 + TA99 "치유된" 마우스가 B16F10 종양 재접종으로부터 보호된 채로 남아있는 반면, CD8, CD4 또는 NK 세포를 고갈시키는 항체로 처리된 "치유된" 마우스는 피하 B16F10 종양 재접종으로부터 사망에 대해 면역 보호를 나타내지 않았음을 보여주었다(도 23c). 이들 결과는, 이러한 모든 세포 타입이 초기 종양 접종 후 ALT-803 + TA99 처리에 의해 매개되는 보호 효과에 관여함을 나타낸다.
면역 세포 활성화 및 PD-1/PD-L1 축의 역할 또한 이 모델에서 평가되었다. ALT-803의 단일 투여는 종양 침윤 CD4+ T 세포에서 CD25+ 세포를 상향조절하였으며(p<0.05), 한편으로 TA99는 이 활성화 마커를 하향조절하였다(p<0.01; 도 24a). 또한, ALT-803 처리는 말초(p<0.001; 도 24b) 및 종양(p<0.01; 도 24c) 모두에서 CD4+ T 세포에서 PD-L1 발현을 유의하게 증가시켰다. TA99 처리는 TIL에서만 CD4+ T 세포에서 PD-L1 발현을 약간 감소시켰고(p<0.05), ALT-803을 사용한 TA99는 ALT-803 단독 투여의 영향을 변화시키기에 충분하지 못했다. 따라서, ALT-803의 효과와 치료 항체와의 조합은 아마도 CD4+ T 세포에 의한 강화된 면역 관문 인히비터 경로에 의해 제한될 수 있다.
CD8+ T 세포에서의 PD-1 발현에 대한 ALT-803 효과가 또한 B16F10 종양 보유 마우스에서 평가되었다. ALT-803의 단일 투여는 비장 CD8+ T 세포에서 PD-1 발현이 PBS 대조군에 비해 완만하게 감소되어 나이브 마우스에 가까운 수준으로 회복되었다(도 24c). 또한, ALT-803, TA99 및 ALT-803 + TA99 병용 요법은 모두 종양 침윤 CD8+ T 세포에서 PD-1 발현을 약 3배 감소시켰다(도 24d).
IL-15의 중요한 항-종양 작용 메커니즘은 NK 세포의 활성화를 통한 것이다. 활성화 마커 KLRG1을 NK 세포에서 검사하였을 때, B16F10 흑색종은 면역원성은 낮지만 비장 NK 세포에서 KLRG1의 중간 정도의 증가를 유도할 수 있음이 밝혀졌다(p<0.05; 도 25a). ALT-803 처리는 비장에서 NK 세포의 활성화를 더욱 증가시켰고(p<0.05,도 25a), 더욱 중요하게 종양 침윤 NK 세포에서 KLRG1 발현을 크게 증가시켰다(4배, p<0.001; 도 25b). 이는 ALT-803이 NK 세포가 이 반응에 관여하는 주요 면역 세포인 B16F10 종양에 대해 TA99-매개 ADCC를 효과적으로 증대시킬 수 있는 이유를 설명할 수 있다. ALT-803은 또한 CD8+ T 세포와 마찬가지로 비장에서(p<0.01, 도 25c) 그리고 종양에서(p<0.05, 도 25d) NK 세포의 PD-1 발현을 하향조절하였으며, 이는 추가 관문 차단과 독립적으로 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 PD-1 암(arm)을 통해 ALT-803이 관문 경로에서 억제를 본질적으로 약화시킬 수 있음을 암시한다.
관문 차단이 ALT-803과 TA99의 조합 항-종양 기능을 추가로 향상시키는지를 조사하기 위해, 확립된 B16F10 종양을 갖는 마우스(n=8)를 지연된 개입 모델(delayed intervention model)에서 항-PD-L1 mAb 10F.9G2과 함께, 그리고 이를 함께 사용하지 않고, ALT-803 + TA99로 처리하였다(도 26a). 항-PD-L1 mAb 단독으로는 종양 성장이 작은 인자로 나타났다(p<0.05). 따라서, B16F10 세포가 시험관내 및 생체내 모두에서 PD-L1을 구성적으로 발현한다는 관찰에도 불구하고(도 26b), 항-PD-L1 mAb는 이 모델에서 흑색종 성장의 억제에 대한 강력한 단일 요법이 되지 않았다. 종양 성장 곡선으로부터 판단하면, 항-PD-L1 mAb와 조합된 ALT-803 + TA99는 ALT-803 + TA99 치료와 비교하여 더 큰 항-종양 활성을 보였다(p<0.05).
전반적으로, 이러한 시험의 결과들은 ALT-803이 종양 특이적 항체와 함께 항종양 활성을 제공하고 확립된 고형 종양이 있는 마우스의 생존을 연장시킬 수 있음을 나타낸다. 이 치료법은 또한 종양 재접종에 대한 면역 보호를 제공한다. 이러한 효과는 치료에 반응하여 활성화되고 증식하는 NK 및 T 세포에 의해 매개된다. 또한, 관문 인히비터와의 치료적 병용은 ALT-803 + 종양 특이적 항체 요법의 항종양 효능을 더욱 증가시킬 수 있다. 결과적으로, ALT-803 단독 요법과 ALT-803 병용 치료 전략은 보조제, 신-보조제(neo-adjuvant), 유도, 강화, 유지, 제1선, ≥ 제2선 치료 및 수술, 방사선 또는 화학 요법과의 병용을 포함한 종양형성에 대한 다양한 치료 방법에 적용가능하다.
ALT-803 단독으로 또는 항-종양 항체 및/또는 관문 인히비터 차단과의 병용은, 상기 시험에 있어서 종양 보유 동물에서 유의한 독성의 징후를 유발하지 않았으며, 이는 이러한 병용이 잘 용인되는 것으로 나타났다는 것도 주목할 만하다.
실시예 10: 악성 종양 환자에서 ALT-803의 임상적 연구
ALT-803은 다음과 같이 악성 종양 환자에서 평가중이다.
전이성 흑색종 및 다른 고형 종양 환자에서 ALT-803에 대한 다기관 임상 시험이 진행중이다. 이 시험은 ALT-803의 최대 허용 투여량(MTD) 또는 최적 생물학적 투여량(OBD)을 검출하기 위해, 처음 2 코호트(cohort)에 등록할 환자 1명과 마지막 3 코호트에 등록할 최소 3명의 환자를 대상으로 하여 투여량 증가로서 수행된다. 등록된 환자는 4주간 ALT-803 정맥 주사 투여 후 2주간의 휴식 기간으로 구성된 2회의 6-주 주기를 받는다. 질병이 안정적이거나 이득을 받는 환자는 6주 주기를 최대 2회 추가로 받을 수 있다. 1명의 환자가 0.3μg/kg ALT-803 투여량 수준에 등록했다. 보고된 시험 약물에 의한 이상 반응은 일시적인 저등급 열, 경직, 메스꺼움 및 구토였다. 다음 환자는 0.5μg/kg 투여량 수준에 등록했다. 보고된 모든 부작용은 메스꺼움, 피로, 가려움증을 포함하여 경도에서 중등도였다. 3명의 환자가 1μg/kg ALT-803 투여량 수준으로 시험 치료에 등록하고 완료했다. 이 환자들에 대해 보고된 모든 부작용은 오한, 변비 및 고혈압 악화 등 경증부터 중등도까지였다. 이 임상 시험 계획은 신장 세포 암, 비-소세포 폐암 및 편평 세포 두경부암을 포함하도록 수정되었다. 신장 세포암종을 가진 환자 1명을 포함한 3명의 환자가 3㎍/kg 투여량 수준으로 등록했다. 지금까지 보고된 이상 반응은 열, 피로, 구토 및 근육통을 포함하여 경증 내지 중등도였다. 이러한 ALT-903 치료를 받은 어느 환자 중 독성, 3/4등급 독성 또는 중증 부작용을 제한하는 투여량은 없었으며, 이는 이 치료법이 잘 허용되는 것임을 나타낸다. 질병 안정화는 일부 환자에서 보고되었으며, 치료-매개 임상적 이익(감소된 종양 부담, 질병 진행 또는 재발 또는 독성, 또는 증가된 무진행 생존, 진행 시간, 반응 지속 기간, 생존 또는 삶의 질 포함)이 예상된다 .
자가 줄기 세포 이식(ASCT) 후 재발한 혈액학적 악성 종양 환자에서 ALT-803에 대한 다기관 임상 시험이 진행중이다. 이 시험의 첫 번째 단계는 독성에 대한 표준 3+3 디자인의 투여량 증가하에 수행된다. 등록된 환자는 매주 1회 4주간 ALT-803 정맥 주사를 투여받는다. 6명의 환자가 1μg/kg ALT-803 투여량 수준에서 시험 치료를 등록하고 완료했다. 처음 3명의 환자에게 보고된 시험 약물에 의한 이상 반응은 발열, 오한, 경련 및 부종이었다. 2명의 환자에서 1등급 열이 ALT-803 투여 후 약 4-5시간 후에 발생하였고, ALT-803 투여 후 약 6-7 시간 후에 가라앉았다. 2명의 환자에서 2등급 경직이, 2명의 환자에서 2등급의 오한이 발생했으며, 1명의 환자에서 1등급 오한이 발생했다. 1명의 환자에서 발생한 2등급 경직은 4번의 ALT-803 투여 중 3번이 Demerol을 필요로 하였다. 1명의 환자는 2등급의 부종을 경험했고, 다른 1명의 환자는 1등급의 부종을 경험했다. 처음 3명의 환자는 무증상 저혈압을 경험했지만, 저혈압 증상이 재발하지 않고 수액 투여 후 정상 혈압을 보였다. 치료받은 환자 중 어느 누구도 체액으로 사전 수분을 공급받지 않았다. 2등급 피부 발진은 ALT-803의 두 번째 투여 후 한 환자에서 관찰되었는데, 이는 이식편 대 숙주 질환과 일치한다. 4번째, 5번째 및 6번째의 환자는 보고된 AEs가 없는 시험 치료를 받았다. 3명의 환자가 3μg/kg ALT-803 투여량 수준에서 시험 치료를 완료했다. 각 투여 전에 수분 공급을 받은 환자는 ALT-803 투여 후 6시간 및 10시간의 오한과 1등급 열이 포함된 것으로 보고됐다. 3명의 환자가 6μg/kg ALT-803 투여량 수준으로 등록 및 치료를 완료했다. 이 코호트에서 가장 흔하게 보고된 이상 반응은 경증부터 중등도의 열, 경직 및 독감 유사 증상을 포함한다. 두 명의 환자가 10μg/kg ALT-803 투여량 수준에서 치료중이다. ALT-803의 첫 번째 투여 후 첫 번째 환자에 대해 보고된 부작용에는 일시적 발열, 메스꺼움 및 구토가 포함된다. 이상 반응은 투여 후 약 3시간에서 시작하여 약 4시간 지속되었다. 환자는 또한 저등급 무증상 저혈압을 경험했다. IV 액을 투여하고 혈압을 기준선으로 되돌려 보냈다. 두 번째 환자는 ALT-803의 첫 번째 투여 후 일시적인 발열과 오한을 경험했다. 오한은 Demoral로 제어되었다. 이러한 ALT-903 치료를 받은 환자 중 독성, 3/4등급 독성 또는 중증 부작용을 제한하는 투여량은 없었으며, 이는 이 치료법이 잘 용인되는 것으로 나타났다. 이 프로토콜은 ALT-803의 투여를 6μg/kg 투여량 수준에서 시작하여 IV에서 피하 주사로 변경하도록 수정되었다. 환자 등록은 i.v. 투여로 10μg/kg 투여량 수준으로, 총 3명의 환자가 이 코호트에 등록될 때까지 계속될 것이다. 그 다음, 6μg/kg의 피하 주사 환자 등록이 시작될 것이다. 치료-매개 임상적 이익(감소된 종양 부담, 질병 진행 또는 재발 또는 독성, 또는 증가된 무진행 생존, 진행 시간, 반응 지속 기간, 생존 또는 삶의 질)이 예상된다.
임상 바이오마커 평가가 수행되고 있다. ASCT 이후의 혈액학적 악성 종양 환자에 대한 시험을 위해, 환자의 투여전 및 투여후 예비 선량 및 투여 후 표본의 NK, CD4+, CD8+ 및 NKT 세포 서브셋과 혈청 사이토카인의 Ki-67 분석에 대한 예비 자료가 유용하다. IFN-γ와 IL-6 모두의 혈청 수준은 1μg/kg에서 6μg/kg ALT-803의 투여량 범위 내에서 투여량 의존적으로 유도되었다. 모든 환자에서 3μg/kg 이상의 투여량 수준으로 ALT-803 투여한 후에, Ki67+ NK, CD8+ 및 CD4+ T 세포가 증가했다. 따라서, 예비 자료는 ALT-803이 이 징후(indication)와 함께 3μg/kg 이상의 투여량 수준에서 환자의 NK, T 및 NKT 세포의 활성화 및 증식을 지속적으로 촉진한다는 것을 제시한다. 유사하게, IFN-γ 및 IL-6의 혈청 수준은 ALT-803 투여 후 고형 종양 환자에서 유도되었으며, 이는 이들 환자에서 치료 관련 면역 자극을 나타낸다.
재발된 또는 난치성 다발성 골수종 환자에서 ALT-803에 대한 다기관 임상 시험이 진행중이다. 이 시험의 첫 번째 단계는 MTD 또는 최소 유효 투여량(MED)을 검출하고 단계 II 2-단계 확장을 위한 투여량 수준을 지정하기 위한 고전적인(3+3) 선량 증가를 포함한다. 투여 수준은 1, 3, 6, 10 및 20μg/kg의 ALT 803이다. 등록 된 환자는 4주의 ALT-803 정맥 주사 투여 후 2 주간의 휴식 기간으로 구성된 2회 6주 주기를 받게될 것이다. 질병이 안정적이거나 이득을 받는 환자는 6주 주기를 최대 2 회 추가로 받을 수 있다. 3명의 환자가 1μg/kg ALT-803 투여량 수준으로 시험 치료를 등록하고 완료했다. 이 환자들에 대해 보고된 모든 부작용은 변비, 메스꺼움, 피로, ALC 감소 및 백혈구 감소를 포함한 경증 내지 중등도였다. 모든 환자는 사전 약물치료를 받고 있다. 2명의 환자가 3μg/kg ALT-803 투여량 수준에서 치료를 받고 있다. 보고된 이상 반응에는 경증부터 중등도의 발열, 경직 및 호중구 감소증이 포함된다. 이러한 ALT-903 치료를 받은 어느 환자 중 독성, 3/4등급 독성 또는 중증 부작용을 제한하는 투여량은 없었으며, 이는 이 치료법이 잘 용인되었음을 나타낸다. 치료 매개 임상적 이익(감소된 종양 부담, 질병 진행 또는 재발 또는 독성, 또는 증가된 무진행 생존, 진행 시간, 반응 지속 기간, 생존 또는 삶의 질)이 예상된다. ALT-803 투여 후 다발성 골수종 환자에서 IFN-γ와 IL-6의 혈청 수준이 유도되었으며, 이는 이들 환자에서 치료 관련 면역 자극을 나타낸다.
Bacillus Calmette-Guerin(BCG)과 병용 투여 한 ALT-803에 대한 다기관 임상 시험이 BCG-나이브 비-근육 침습성 방광암 환자에서 시행되었다. 이 시험의 첫 번째 단계는 ALT-803의 MTD를 검출하고 확장 단계에 대한 BCG와 병용된 ALT-803의 권장 투여량(RD)을 검출하기 위한 고전적인(3+3) 투여량 증가를 포함한다. 투여량 수준은 100, 200 및 400μg/ALT-803 점적과 표준 BCG(50mg/점적)이다. 확장 단계는 BCG와 병용된 RD 수준의 ALT-803 또는 BCG 단독을 받은 환자의 비-비교 무작위 디자인으로 구성된다. 등록된 환자들은 BCG와 ALT-803을 6주 연속 방광 내 요도 카테터를 통해 매주 받는다. 세 명의 환자가 100μg/ ALT-803 + BCG 점적의 첫 번째 코호트에서 등록 및 치료를 완료했다. 보고된 시험 약물에 의한 이상 반응으로는 가벼운 메스꺼움, 두통, 혈뇨 및 요로 통증 및 중등도의 방광염 비감염성이 포함되었다. 3명의 환자가 200μg/ALT-803 + BCG 점적에서 등록 및 치료를 완료했다. 보고된 시험 약물에 의한 부작용으로 경미한 혈뇨 및 요실금이 포함되었다. 등록된 2명의 환자는 400μg/ALT-803 코호트 점적에서 지속적인 치료를 받고 있다. 이들 ALT-903 + BCG 치료 환자 중 독성, 3/4등급 독성 또는 중증 부작용을 제한하는 투여량은 없었으며, 이는 이 치료법이 잘 용인되었음을 나타낸다. 치료된 환자 중 많은 수가 치료 후 적어도 9개월 동안 질병 재발(이 징후에서 완전한 반응으로 간주된)을 보이지 않았으며, 치료 관련 임상적 활성을 제시한다. 요중 사이토카인의 치료 관련 증가 또한 일부 환자에서 관찰되었다. 치료 매개 임상적 이익(감소된 종양 부담, 질병 진행 또는 재발 또는 독성, 또는 증가된 무진행 생존, 진행 시간, 반응 지속 기간, 생존 또는 삶의 질)이 예상된다.
ALT-803 + 리툭시맵에 대한 다기관 임상 연구가 재발된 또는 난치성 지연형의 B 세포 비호지킨 림프종 환자에서 진행중이다. 이 시험의 첫 번째 단계는 MTD 또는 MED를 검출하고, 단계 II 2-단계 확장을 위한 투여량 수준을 지정하기 위한 고전적인(3+3) 투여량 증가를 포함한다. 투여량 수준은 1, 3 및 6μg/kg의 ALT-803이다. 등록된 환자는 정맥 주사에 4주간의 ALT-803 및 표준 리툭시맵(375mg/m2)의 투여로 구성된 유도주기를 4주간 받게 된다. 안정적이거나 이득을 받는 질병을 가진 환자는 총 4주의 추가 ALT 803과 리툭시맵 투여에 대해 8주마다 반복되는 ALT-803 + 리툭시맵의 단일 처리로 구성된 최대 4회의 통합 치료 주기를 받을 수 있다. 한 명의 환자가 등록되었으며 현재 1μg/kg ALT-803 투여량 수준에서 치료를 받고 있다. 이 환자에 대해 지금까지 보고된 부작용은 부종을 포함하여 경증 내지 중등도였고, ALC는 감소하였고 백혈구 수는 감소했다. ALT-903 + 리툭시맵 치료 환자에서 독성, 3/4등급 독성 또는 심각한 부작용을 제한하는 투여량은 없었으며, 이는 이 치료법이 잘 용인되었음을 나타낸다. 치료 매개 임상적 이익(감소된 종양 부담, 질병 진행 또는 재발 또는 독성, 또는 증가된 무진행 생존, 진행 시간, 반응 지속 기간, 생존 또는 삶의 질)이 예상된다.
후기(advanced) 또는 전이성 비-소세포 폐암 환자에서 ALT-803 + 니볼루맵(항-PD-1 Ab)의 다기관 임상 시험이 실시될 예정이다. 이 시험의 첫 번째 단계는 ALT-803의 MTD를 검출하고, 단계 II 2-단계 확장을 위한 투여량 수준을 지정하기 위한 투여량 증가를 포함한다. 투여량 수준은 6, 10, 15μg/kg의 피하 ALT-803이다. 등록된 환자는 5주간 ALT-803 투여와 2주마다 니볼루맵 표준 정맥내 투여(3mg/kg)으로 구성된 2회의 6주 주기를 받게 된다. 안정적이거나 이득을 받는 질병을 앓고 있는 환자는 6주간 ALT-803과 니볼루맵 주기를 추가로 받을 수 있다. 치료 매개 임상적 이익(감소된 종양 부담, 질병 진행 또는 재발 또는 독성, 또는 증가된 무진행 생존, 진행 시간, 반응 지속 기간, 생존 또는 삶의 질)이 예상된다.
다른 구현들
본 발명이 상세한 설명과 관련하여 설명되었지만, 상기 설명은 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명은 첨부된 청구항의 범위에 의해 정의된다. 다른 측면들, 장점들 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
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본 발명은 특히 본 발명의 바람직한 구현을 참조하여 나타내고, 설명되었으나, 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 발명의 범위를 벗어나지 않고, 형태 및 세부 사항의 변경이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 당해 기술분야의 숙련자에게 이해될 것이다.
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Claims (7)

  1. i) 유효량의 바실러스 칼메트-게랑(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG); 및
    ii) 유효량의 IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체
    를 포함하는, 인간 대상자에서 암 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    대상자는 방광암을 갖는, 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    대상자는 비-근육 침습성 방광암(non-muscle invasive bladder cancer) (NMIBC)을 갖는, 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    대상자는 BCG-나이브 비-근육 침습성 방광암을 갖는, 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc 복합체는 2량체 IL-15RαSu/Fc 및 두 개의 IL-15N72D 분자를 포함하는, 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    약학 조성물은 점적(instillation)에 의해 대상자의 방광내로 투여되는, 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    복합체는 ALT-803인, 약학 조성물.
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