CN112105645A - Il-15/il-15ra异二聚体fc融合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新颖IL‑15/IL‑15Rα异二聚体Fc融合蛋白及其用途。IL‑15/IL‑15Rα异二聚体Fc融合蛋白可以施用于患者以治疗癌症。在某些情况下，IL‑15/IL‑15Rα异二聚体Fc融合蛋白与检查点阻断抗体例如PD‑1抗体联合施用。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年4月18日提交的美国临时申请62/659,563、2018年6月12日提交的美国临时申请62/684,143、2018年8月29日提交的美国临时申请62/724,396和2018年11月7日提交的美国临时申请62/756,800的优先权，其公开内容通过引用全部并入本文。
背景技术
在癌症免疫治疗中，两种非常有前途的方法包括基于细胞因子的治疗和对免疫检查点蛋白例如PD-1的阻断。
细胞因子例如IL-2和IL-15有助于B细胞、T细胞和NK细胞的增殖和分化。这两种细胞因子均通过与三聚复合物结合而发挥其细胞信号传导功能，所述三聚复合物由两个共有受体，即共同γ链(γc；CD132)和IL-2受体β链(IL-2Rβ；CD122)，以及每种细胞因子特有的α链受体：IL-2受体α(IL-2Rα；CD25)或IL-15受体α(IL-15Rα；CD215)组成。这两种细胞因子均被认为是肿瘤学中潜在有价值的治疗剂，并且IL-2已被批准用于患有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。尽管正在进行几项临床试验，但目前尚未批准使用重组IL-15。然而，作为潜在的药物，两种细胞因子都具有非常快的清除率，在几分钟内测量半衰期。当以高剂量给药以克服快速清除时，IL-2免疫疗法已与全身毒性相关。在最近的临床试验中，IL-15免疫疗法也报道了这种全身毒性(Guo等人，J Immunol，2015，195(5)：2353-64)。
T细胞活化后，免疫检查点蛋白例如PD-1被上调，以通过与免疫检查点配体例如PD-L1结合而耗尽活化的T细胞来排除自身免疫。但是，免疫检查点蛋白在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中也被上调，并且免疫检查点配体在肿瘤细胞上过度表达，从而有助于肿瘤细胞的免疫逃逸。已证明，通过例如
(纳武单抗)和
(派姆单抗)的药物阻断免疫检查点相互作用而抑制TIL在癌症治疗中高度有效。尽管例如纳武单抗和派姆单抗的检查点阻断疗法有前景，但许多患者仍然无法对单独的检查点阻断取得足够的反应。
因此，在肿瘤治疗中仍存在对利用细胞因子的治疗策略的未满足的需求，该细胞因子不需要高剂量并且靶向肿瘤以避免全身毒性。此外，需要确定其他治疗方式以与检查点阻断相叠加，提高患者的反应率。本发明通过提供降低的效力的IL-15/Rα-Fc融合蛋白，其具有增强的药代动力学和药效学并与检查点阻断抗体协同结合，解决了这些需求和警告。
发明内容
本发明涉及与检查点阻断抗体组合施用新型IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白。在一些实施方案中，检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
在一些方面，本文提供了一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括施用：
治疗有效量的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白，其包括：
a)第一单体，其从N-端至C-端包含：
i)IL-15受体α(IL-15Rα)寿司结构域(sushi domain)；
ii)第一结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和
b)第二单体，其从N-端至C-端包含：
i)变体IL-15结构域，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和选自N4D/N65D、D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代的任一个；
ii)第二结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；
其中根据EU编号，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q；并且
治疗有效量的检查点阻断抗体，其选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代D30N/N65D。在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代N4D/N65D。
在一些实施方案中，IL-15Rα寿司结构域包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有S364K/E357Q：L368D/K370S取代。在一些实施方案中，第一变体Fc结构域具有S364K/E357Q取代和第二变体Fc结构域L368D/K370S取代。
在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自包含M428L/N434S取代。
在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和检查点阻断抗体同时或顺序施用。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗(pidilizumab)。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306或XENP24045的氨基酸序列。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是纳武单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是派姆单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是匹地珠单抗。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是纳武单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是派姆单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是匹地珠单抗。
在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑素瘤癌、膀胱癌、肾癌、肾脏癌、肝癌、头颈癌、结肠直肠癌、黑素瘤、胰腺癌、胃癌、食道癌、间皮瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
在一些实施方案中，本文概述的治疗癌症的方法导致患者中最小的血管渗漏水平。
在一些实施方案中，在施用后患者中的血管渗漏水平为血清白蛋白降低20％或更低。
在一些方面，本文提供了一种治疗患者癌症的方法，该方法包括对患者施用包含IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和检查点阻断抗体的联合疗法，其中IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合体包括：
a)第一单体，其从N-端至C-端包含：
i)IL-15受体α(IL-15Rα)寿司结构域；
ii)第一结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和
b)第二单体，其从N-端至C-端包含：
i)变体IL-15结构域，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和选自N4D/N65D、D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代的任一个；
ii)第二结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；
其中根据EU编号，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q；并且检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代D30N/N65D。在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代N4D/N65D。
在一些实施方案中，IL-15Rα寿司结构域包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有S364K/E357Q：L368D/K370S取代。在一些实施方案中，第一变体Fc结构域具有S364K/E357Q取代和第二变体Fc结构域L368D/K370S取代。
在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自包含M428L/N434S取代。
在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306(SEQ IDNO：XX)或XENP24045(SEQ ID NO：XX)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是纳武单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是派姆单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是匹地珠单抗。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是纳武单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是派姆单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是匹地珠单抗。
在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑素瘤癌、膀胱癌、肾癌、肾脏癌、肝癌、头颈癌、结肠直肠癌、黑素瘤、胰腺癌、胃癌、食道癌、间皮瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
在一些实施方案中，本文描述的治疗癌症的方法导致患者中最小的血管渗漏水平。
在一些实施方案中，在施用后患者中的血管渗漏水平为血清白蛋白降低20％或更低。
在一些方面，本文提供了一种在患者中诱导T细胞扩增的方法，包括施用：
治疗有效量的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白，其包括：
a)第一单体，其从N-端至C-端包含：
i)IL-15受体α(IL-15Rα)寿司结构域；
ii)第一结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和
b)第二单体，其从N-端至C-端包含：
i)变体IL-15结构域，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和选自N4D/N65D、D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代的任一个；
ii)第二结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；其中根据EU编号，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q；并且
治疗有效量的检查点阻断抗体，其选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代D30N/N65D。在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代N4D/N65D。
在一些实施方案中，IL-15Rα寿司结构域包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有S364K/E357Q：L368D/K370S取代。在一些实施方案中，第一变体Fc结构域具有S364K/E357Q取代和第二变体Fc结构域L368D/K370S取代。
在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自包含M428L/N434S取代。
在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和检查点阻断抗体同时或顺序施用。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306(SEQ ID NO：XX)或XENP24045(SEQ ID NO：XX)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是纳武单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是派姆单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是匹地珠单抗。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是纳武单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是派姆单抗。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是匹地珠单抗。
在一些实施方案中，患者患有癌症。在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑素瘤癌、膀胱癌、肾癌、肾脏癌、肝癌、头颈癌、结肠直肠癌、黑素瘤、胰腺癌、胃癌、食道癌、间皮瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
在一些实施方案中，T细胞扩增为T细胞增加至少2倍。在一些实施方案中，T细胞扩增为T细胞增加2倍至15倍。
在一些实施方案中，该方法不增加诱导低白蛋白血症的可能性。
在一些实施方案中，T细胞包含肿瘤浸润淋巴细胞。
在一些方面，本发明提供了联合疗法，其包含IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体的检查点阻断抗体。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包括：
a)第一单体，其从N-端至C-端包含：
i)IL-15受体α(IL-15Rα)寿司结构域；
ii)第一结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和
b)第二单体，其从N-端至C-端包含：
i)变体IL-15结构域，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和选自N4D/N65D、D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代的任一个；
ii)第二结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；
其中根据EU编号，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q。
在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代D30N/N65D。在一些实施方案中，变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代N4D/N65D。
在一些实施方案中，IL-15Rα寿司结构域包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有S364K/E357Q：L368D/K370S取代。在一些实施方案中，第一变体Fc结构域具有S364K/E357Q取代和第二变体Fc结构域L368D/K370S取代。
在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自包含M428L/N434S取代。
在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗(pidilizumab)。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306(SEQ IDNO：XX)或XENP24045(SEQ ID NO：XX)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是纳武单抗。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是派姆单抗。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是匹地珠单抗。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是纳武单抗。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是派姆单抗。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是匹地珠单抗。
附图说明
图1描绘了与它的受体IL-15Rα(CD215)、IL-15Rβ(CD122)和共同γ链(CD132)复合物IL-15的结构。
图2A和图2B描绘了IL-15及其受体的序列。
图3A-图3E描绘异二聚变体组的有用对(包括偏斜和pI变体)。在图3D和图3E中，有些变体没有相应的“单体2”变体；这些是pI变体，可以单独用于任一单体。
图4描绘了等排变体抗体恒定区和其相应取代的清单。pI_()表示较低pI变体，而pI_(+)表示较高pI变体。这些可以与本发明的其它异源二聚化变体(以及其它变体类型，如本文所概述的)任选且独立地组合。
图5描绘了消融了FcγR结合的适用消融变体(有时称为“基因剔除”或“KO”变体)。通常，在两种单体上都发现了消融变体，尽管在一些情况下其可能仅在一种单体上。
图6A-图6E示出了本发明的“非细胞因子”成分的特别有用的实施方案。
图7描绘了多个示例性可变长度连接子。在一些实施方案中，这些连接子可用于将IL-15和/或IL-15Rα(寿司)的C端连接于Fc区的N端。在一些实施方案中，这些连接子可用于将IL-15与IL-15Rα(寿司)融合。
图8A-图8D展示基于人类IgG1的几个有用的IL-15/Rα-Fc形式主链序列，而无细胞因子序列(例如，Il-15和/或IL-15Rα(寿司))。主链1基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链2基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K：L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链3基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K：L368E/K370S偏斜变体、具有L368E/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链4基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、D401K：K360E/Q362E/T411E偏斜变体、具有K360E/Q362E/T411E偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链5基于人类IgG1(356D/358L同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。主链6基于人类IgGl(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体以及两条链上的N297A变体。除了突变是N297S之外，主链7与6相同。主链6和7的替代形式可以不含两条链中的消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。主链8基于人类IgG4，并且包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的S228P(EU编号，这是Kabat中的S241P)变体，其消融如所属领域已知的Fab臂交换。主链9基于人类IgG2，并且包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体。主链10基于人类IgG2，并且包括S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、具有L368D/K370S偏斜变体的链上的Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体以及两条链上的S267K变体。除了其包含M428L/N434SXtend突变之外，主链11与主链1相同。主链12基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含：两条相同的链上的C220S、两条相同的链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。主链13基于人类IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括两条链上的C220S、S364K/E357Q：L368D/K370S偏斜变体、具有S364K/E357Q偏斜变体的链上的P217R/P229R/N276K pI变体和两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。
如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，这些序列可与本文概述的任何IL-15和IL-15Rα(寿司)对一起使用，包括但不限于IL-15/Rα-异源Fc、ncIL-15/Rα、scIL-15/Rα和dsIL-15/Rα，如图9A-9G和39中示意性描绘。另外，任何IL-15和/或IL-15Rα(寿司)变体可以任何组合并入这些图8A-8D主链中。
这些主链中的每个主链内包含与所列举序列90％、95％、98％和99％相同的序列(如本文所定义的)，和/或含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个额外的氨基酸取代(如与附图的“亲本”相比，所述额外的氨基酸取代如本领域的技术人员将了解的如与亲本人IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比已经含有多个氨基酸修饰)。即，除了此图的主链内所含的偏斜变体、pI变体和烧蚀变体之外，所列举主链可以含有额外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。
图9A-图9G描绘用于本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的几种形式。IL-15Rα异二聚体Fc融合物或“IL-15/Rα-异源Fc”(图9A)包含以重组方式与异二聚体Fc的一侧融合的IL-15和以重组方式与异二聚体Fc的另一侧融合的IL-15Rα(寿司)。IL-15和IL-15Rα(寿司)可以在Fc区的C端与N端之间具有可变长度的Gly-Ser连接子。单链IL-15/Rα-Fc融合物或“scIL-15/Rα-Fc”(图9B)包含通过可变长度的连接子与IL-15融合的IL-15Rα(寿司)(称为“单链”IL-15/IL-15Rα(寿司)复合物或“scIL-15/Rα”)，其随后与异二聚体Fc区的N端融合，分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”。非共价IL-15/Rα-Fc或“ncIL-15/Rα-Fc”(图9C)包含与异二聚体Fc区融合的IL-15Rα(寿司)，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物，分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”。二价非共价IL-15/Rα-Fc融合物或“二价ncIL-15/Rα-Fc”(图9D)包含与同源二聚体Fc区的N端融合的IL-15Rα(寿司)，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。二价单链IL-15/Rα-Fc融合物或“二价scIL-15/Rα-Fc”(图9E)包含通过可变长度的连接子与IL-15Rα(寿司)融合的IL-15(称为“单链”IL-15/IL-15Rα(寿司)复合物或“scIL-15/Rα”)，其随后与同源二聚体Fc区的N端融合。Fc-非共价IL-15/Rα融合物或“Fc-ncIL-15/Rα”(图9F)包含与异二聚体Fc区的C端融合的IL-15Rα(寿司)，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物，分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”。Fc-单链IL-15/Rα融合物或“Fc-scIL-15/Rα”(图9G)包含通过可变长度的连接子与IL-15Rα(寿司)融合的IL-15(称为“单链”IL-15/IL-15Rα(寿司)复合物或“scIL-15/Rα”)，其随后与异二聚体Fc区的C端融合，分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”。
图10描绘了“IL-15/Rα-异源Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP20818和XENP21475的序列，其中另外的XENP20819、XENP21471、XENP21472、XENP21473、XENP21474、XENP21476、XENP21477的序列在WO2018071919中分别在图104A-104D中列出并且分别为SEQID NO：418-423、424-429、430-435、436-441、442-447、454-459和460-465。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图11描述了“scIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP21478的序列，其中另外的XENP21993、XENP21994、XENP21995、XENP23174、XENP23175、XENP24477和XENP24480的序列在WO2018071919中分别在图104G、104H、104AG、104AU和104AV中列出，并分别为SEQ ID NOS：514-518、519-523、524-528、849-853、1063-1067和1078-1082。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图12A-图12B描绘了“ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP21479、XENP22366和XENP24348的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图13描绘了“二价ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP21978的序列，其中另外的XENP21979的序列在WO2018071919中图104E中列出，并且为SEQ IDNOS：480-483。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图14描绘“二价scIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图15描绘了XENP22637的序列，即“Fc-ncIL-15/Rα”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白，其中另外的XENP22638的序列在WO2018071919中图104T中列出，并且为SEQ IDNOS：668-672。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图16描绘“Fc-scIL-15/Rα”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图17A-图17E提供了用于XENP20818的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白形式的数据。图17A描述了XENP20818的IL-15/Rα-Fc融合蛋白形式。图17B描绘了通过SEC确定的XENP20818的纯度和均质性。图17C描绘了通过CEF确定的XENP20818的纯度和均质性。图17D描绘了由Ocnet确定的XENP20818对IL-2Rβ的亲和力。图17E描绘了由DSF确定的XENP20818的稳定性。
图18A-图18E提供了用于XENP21478的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白形式的数据。图18A描述了XENP21478的IL-15/Rα-Fc融合蛋白形式。图18B描绘了通过SEC确定的XENP21478的纯度和均质性。图18C描绘了通过CEF确定的XENP21478的纯度和均质性。图18D描绘了由Ocnet确定的XENP21478对IL-2Rβ的亲和力。图18E描绘了由DSF确定的XENP21478的稳定性。
图19A-图19E提供了用于XENP21479的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白形式的数据。图19A描述了XENP21479的IL-15/Rα-Fc融合蛋白形式。图19B描述了通过SEC确定的XENP21479的纯度和均质性。图19C描绘了通过CEF确定的XENP21479的纯度和均质性。图19D描绘了由Ocnet确定的XENP21479对IL-2Rβ的亲和力。图19E描绘了由DSF确定的XENP21479的稳定性。
图20A-图20C描绘通过具有如由FACS测量的基于Ki67表达的不同连接子长度的IL-15/Rα-异源Fc形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导NK(CD56+/CD16+)细胞(图20A)、CD4+ T细胞(图20B)和CD8+ T细胞(图20C)增殖。
图21A-图21C描绘通过如由FACS测量的基于Ki67表达的scIL-15/Rα-Fc形式(XENP21478)和ncIL-15/Rα-Fc形式(XENP21479)的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导NK(CD56+/CD16+)细胞(图21A)、CD4+ T细胞(图21B)和CD8+ T细胞(图21C)增殖。
图22描绘了在SEB刺激的PBMC测定中，通过说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白、同种型对照和二价抗PD-1抗体相对于PBS对照的IL-2分泌增强。
图23描绘了用XENP20818和重组IL-15处理后的PBMC移植的NSG小鼠的存活曲线。
图24描绘了在植入人PBMC并用所示浓度的XENP20818处理后第7天，NSG小鼠血清中IFNγ的浓度。
图25A-25C描绘了用所示浓度的XENP20818治疗后7天，在人PBMC移植的NSG小鼠全血中的CD4+T细胞(图25A)、CD8+T细胞(图25B)和CD45+细胞(图25C)计数。
图26描绘展示工程化的二硫键对位置的IL-15/Rα异二聚体的结构模型。
图27描绘为了充当工程化的半胱氨酸残基的骨架，用C端处的额外残基工程化的说明性IL-15Rα(寿司)变体的序列。
图28描绘为了与用半胱氨酸工程化的IL-15Rα(寿司)变体形成共价二硫键，用半胱氨酸工程化的说明性IL-15变体的序列。
图29描绘为了与用半胱氨酸工程化的IL-15变体形成共价二硫键，用半胱氨酸工程化的说明性IL-15Rα(寿司)变体的序列。
图30A-图30C描绘了在IL-15和IL-15Rα(寿司)之间具有和不具有工程二硫键的IL-15/Rα异二聚体。非共价IL-15/Rα异二聚体或“ncIL-15/Rα异二聚体”(图30A)包含分别转染且非共价连接的IL-15Rα(寿司)和IL-15。二硫键键合的IL-15/Rα异二聚体或“dsIL-15/Rα异二聚体”(图30B)包含因工程半胱氨酸单独转染并共价连接的IL-15Rα(寿司)和IL-15。单链IL-15/Rα异二聚体或“scIL-15/Rα异二聚体”(图30C)包含通过可变长度的Gly-Ser连接子与IL-15融合的IL-15Rα(寿司)。
图31描述了XENP21996即说明性ncIL-15/Rα异二聚体的序列。重要的是要注意这些序列在IL-15Rα(寿司)的C端使用聚组氨酸(His6或HHHHHH(SEQ ID NO：XX))C端标签产生。
图32描绘了说明性dsIL-15/Rα异二聚体XENP22004、XENP22005、XENP22006、XENP22008和XENP22494的序列，其中另外的XENP22007、XENP22009、XENP22010、XENP22011、XENP22012和XENP22493的序列分别在WO2018071919中的图104J、104K和104I中描绘并作为SEQ ID NO：543-544、545-546、547-548、551-552、553-554和647-648。重要的是要注意这些序列在IL-15Rα(寿司)的C端使用聚组氨酸(His6或HHHHHH)C端标签产生。
图33描绘了说明性scIL-15/Rα异二聚体XENP22049的序列。重要的是要注意这些序列在IL-15的C端使用聚组氨酸(His6或HHHHHH)C端标签产生。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα与连接子之间的边界。
图34描绘具有和不具有工程化的二硫键的说明性IL-15/Rα异二聚体的纯度和均匀性，如由CEF测定的。
图35描绘具有和不具有工程化的二硫键的说明性IL-15/Rα异二聚体的纯度和均匀性，如由CEF测定的。
图36描绘了具有和不具有工程二硫键的说明性IL-15/Rα异二聚体的稳定性和解链温度，如DSF的解链曲线所示。
图37描绘了具有和不具有工程二硫键的说明性IL-15/Rα异二聚体的稳定性和解链温度，如DSF的解链曲线所示。
图38描绘了具有和没有工程二硫键的IL-15/Rα异二聚体的表达产量、分子量、通过MOE软件计算的IL-15和IL-15Rα(寿司)之间亲和力的预测变化、解链温度以及对IL-2Rβ的亲和力。相关单体后的括号中示出了突变。
图39A-图39D描绘了用于本发明的具有工程化二硫键的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的其他形式。二硫键键合的IL-15/Rα异二聚体Fc融合物或“dsIL-15/Rα-异源Fc”(图39A)与“IL-15/Rα-异源Fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。二硫键键合的IL-15/Rα Fc融合物或“dsIL-15/Rα-Fc”(图39B)与“ncIL-15/Rα-Fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。二价二硫键键合的IL-15/Rα-Fc或“二价dsIL-15/Rα-Fc”(图39C)与“二价ncIL-15/Rα-Fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。Fc-二硫键键合的IL-15/Rα融合物或“Fc-dsIL-15/Rα”(图39D)与“Fc-ncIL-15/Rα”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。
图40A-图40B描绘“dsIL-15/Rα-异源Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP22013、XENP22014、XENP22015和XENP22017的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图41A-图41B描绘“dsIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP22357、XENP22358、XENP22359、XENP22684和XENP22361的序列。XENP 22360、22362、22363、22364、22365、22366的其他序列分别在WO2018/071919中的图104O、104P、104Q和104R中描绘，并分别示为SEQ ID NO：612-616、622-626、627-631、632-636、637-641和642-646，通过引用将其全部内容合并在此。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图42描绘“二价dsIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP22634、XENP22635和XENP22636的序列。XENP22687的其他序列在WO2018/071919中在图104V中描绘并且为SEQ ID NOS：685-688，在此通过引用整体引入。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图43描绘“Fc-dsIL-15/Rα”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP22639和XENP22640的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图44描绘具有和不具有如由CEF测定的工程化的二硫键的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的纯度和均匀性。
图45A-45C描绘通过具有和不具有如由FACS测量的基于Ki67表达的工程化的二硫键的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导NK(CD56+/CD16+)细胞(图45A)、CD8+ T细胞(图45B)和CD4+ T细胞(图45C)增殖。
图46描绘与IL-15Rα、IL-2Rβ和共同γ链复合的IL-15的结构。示出了被设计来降低效能的取代位置。
图47A-图47C描绘了为了降低效能而工程化的说明性IL-15变体的序列。在这些变体IL-15序列的每一个内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％一致(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列。在一非限制性实例中，所列举的序列可以含有额外的氨基酸修饰，例如有助于形成如实施例2中所述的共价二硫键的氨基酸修饰。
图48A-图48H描绘了为效能降低而工程化的“IL-15/Rα-异源Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP22816、XENP22819、XENP22820、XENP22821、XENP22822、XENP22829、XENP22834、XENP23554、XENP23557、XENP23561、XENP24018、XENP24019、XENP24045、XENP24051和XENP24052的序列。另外的XENPs 22815、22817、22818、22823、22824、22825、22826、22827、22828、22830、22831、22832、22833、23555、23559、23560、24017、24020、24043和24048的序列描绘在WO2018071919的图104Z、104AA、104AC、104AD、104AE、104AF、104AJ、104AK、104AM、104AN和104AO中并且分别为SEQ ID NOS：729-734、741-746、747-752、777-782、783-788、789-794、795-800、801-806、807-812、819-824、825-830、831-836、837-842、887-892、899-904、905-910、937-942、955-960、961-966和979-984。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图49A-图49D描绘了为较低效能而工程化的“scIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP24015、XENP24050、XENP24475、XENP24476、XENP24478、XENP24479和XENP24481的序列。另外的XENP24013、24014、24016的序列描绘在WO2018071919中的图104AK和104AL中并且为SEQ ID NOS：914-921、922-926和932-936。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图50A-图50B描绘了为较低效能而工程化的“ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP24349、XENP24890和XENP25138的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图51描绘了为较低效能而工程化的说明性ncIL-15/Rα异二聚体XENP22801和XENP22802的序列。另外的XENPs 22791、22792、22793、22794、22795、22796、22803、22804、22805、22806、22807、22808、22809、22810、22811、22812、22813、22814的序列描绘在WO2018071919的图104V、104W、104X、104Y和104Z中并且分别为SEQ ID NOS：689-690、691-692、693-694、695-696、697-698、699-700、705-706、707-708、709-710、711-712、713-714、715-716、717-718、719-720、721-722、723-724、725-726和727-728。重要的是要注意这些序列在IL-15Rα(寿司)的C端使用聚组氨酸(His6或HHHHHH)C端标签产生。
图52描绘了为较低效能而工程化的“二价ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP24342的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图53描绘了为较低效能而工程化的“dsIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP23472和XENP23473的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图54A-图54C描绘通过如由FACS测量的基于Ki67表达的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导NK细胞(图54A)、CD8+(CD45RA-)T细胞(图54B)和CD4+(CD45RA-)T细胞(图54C)增殖。
图55描绘了通过变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导NK和CD8+ T细胞增殖的EC50，和相对于XENP20818的EC50的倍数减小。
图56A-图56C描绘了用于图59A-59D中描绘的实验的淋巴细胞和亚群的门控。图56A显示门控的淋巴细胞群。图56B显示了CD3阴性和CD3阳性亚群。图56C显示了CD3阴性细胞的CD16阴性和CD16阳性亚群。
图57A-图57C描绘了用于图59A-59D中描绘的实验的CD3+淋巴细胞亚群的门控。图57A显示了CD3+ T细胞的CD4+、CD8+和γδT细胞亚群。图57B显示了CD4+ T细胞的CD45RA(-)和CD45RA(+)亚群。图57C显示了CD8+ T细胞的CD45RA(-)和CD45RA(+)亚群。
图58A-图58B描绘了在用XENP22821孵育人PBMC之前(图58A)和之后(图58B)的CD69和CD25表达。
图59A-图59D描绘了与所示的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白孵育四天的人PBMC中的细胞增殖。图59A-C显示了增殖NK细胞(CD3-CD16+)(图59A)、CD8+ T细胞(CD3+CD8+CD45RA-)(图59B)和CD4+ T细胞(CD3+CD4+CD45RA-)(图59C)的百分比。图59D显示了各种IL-15/IL-15RαFc异二聚体相对于对照(XENP20818)的EC 50的倍数变化。
图60A-图60D描绘了与所示变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白孵育三天的人PBMC中的细胞增殖。图60A-C展示增殖CD8+(CD45RA-)T细胞(图60A)、CD4+(CD45RA-)T细胞(图60B)、γδT细胞(图60C)和NK细胞(图60D)的百分比。
图61A-图61C描绘了用另外的IL-15/Rα变体处理后，CD8+ T细胞(图61A)、CD4+ T细胞(图61B)和NK细胞(图61C)上Ki67表达的百分比。
图62A-62E描绘在用IL-15/Rα变体处理之后(图62A)CD8+(CD45RA-)T细胞、(图62B)CD4+(CD45RA-)T细胞、(图62C)γδ T细胞、(图62D)NK(CD16+CD8α-)细胞和(图62E)NK(CD56+CD8α-)细胞上的Ki67表达的百分比。
图63A-63E描绘在用IL-15/Rα变体处理之后CD8+(CD45RA-)T细胞(图63A)、CD4+(CD45RA-)T细胞(图63B)、γδ T细胞(图63C)、NK(CD16+CD8α-)细胞(图63D)和NK(CD56+CD8α-)细胞(图63E)上的Ki67表达的百分比。
图64A-图64D描绘在用为了降低效能而用不同连接子长度工程化的额外IL-15/Rα变体处理之后(图64A)CD8+ T细胞、(图64B)CD4+ T细胞、(图64C)γδ T细胞和(图64D)NK(CD16+)细胞上的Ki67表达的百分比。
图65A-图65D描绘了在用额外IL-15/Rα变体处理之后(图65A)CD8+ T细胞、(图65B)CD4+ T细胞、(图65C)γδ T细胞和(图65D)NK(CD16+)细胞上的Ki67表达的百分比。
图66A-图66D描绘了用于图67A-67C中描绘的实验的淋巴细胞和其亚群的门控。图66A显示了淋巴细胞群的门控。图66B显示了CD4+和CD8+ T细胞。图66C显示了表达CD45RA和CD27的CD4+ T细胞亚群。图66D显示了表达CD45RA和CD27的CD8+ T细胞亚群。
图67A-图67C描绘了将PBMC与所示浓度的所示变体IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白孵育4天后CD8+ T细胞(CD45RA-CD27-)(图67A)和CD4+ T细胞(CD45RA-CD27-)(图67B)的STAT5磷酸化。图67C显示了各种IL-15/IL-15RαFc异二聚体相对于对照(XENP20818)的EC 50的倍数变化。
图68A-图68B描绘了在与指定的测试物孵育之后，小鼠脾细胞中CD8+CD45RA-T细胞(图68A)和CD4+CD45RA-T细胞(图68B)上的STAT5磷酸化。
图69描绘在0.1mg/kg单次剂量下的C57BL/6小鼠中各种IL-15/Rα-F融合蛋白或对照的IV-TV剂量PK。
图70描绘了半衰期与NK细胞效能的相关性。
图71描绘了IL-15/Rα-Fc亲和力变体的半衰期与小鼠STAT5信号转导的相关性。
图72描绘了在给C57BL/6白化病小鼠给药8天后测试物的血清浓度。
图73描绘了用指定的测试物给药8天后C57BL/6白化病小鼠脾脏中的CD8+ T细胞计数。
图74显示了CD45+细胞水平可预测疾病。
图75A-图75B描绘了变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白对移植的增强，如第4天(图75A)和第8天(图75B)的CD45+细胞计数所指示的。
图76A-图76C描绘了在用所示的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白或对照处理植入了人PBMC的NSG小鼠后第4天(图76A)、第7天(图76B)和第11天(图76C)的IFNγ水平。
图77A-图77C描绘了在用所示的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白或对照处理植入了人PBMC的NSG小鼠后第4天(图77A)、第7天(图77B)和第11天(图77C)的CD45+淋巴细胞计数。
图78A-图78C描绘了在用所示的IL-15/Rα-Fc融合蛋白或对照处理植入了人PBMC的NSG小鼠后第4天(图78A)、第7天(图78B)和第11天(图78C)的NK细胞(CD16+CD56+CD45RA+)计数。
图79A-图79B描绘了在用所示的IL-15/Rα-Fc融合蛋白或对照处理植入了人PBMC的NSG小鼠后第7天(图79A)和第11天(图79B)的CD8+ T细胞(CD8+CD45RA+)计数。
图80A-图80B描绘了在用所示的IL-15/Rα-Fc融合蛋白或对照处理植入了人PBMC的NSG小鼠后第7天(图80A)和第11天(图80B)的CD4+ T细胞(CD4+CD45RA+)计数。
图81描绘了在用另外的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后的huPBMC植入的小鼠的血清中在第4、7和11天的IFNγ水平。
图82A-图82C描绘了在用另外的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后huPBMC植入的小鼠的血清中第4天(图82A)、第7天(图82B)和第11天(图82C)的CD8+ T细胞计数。
图83A-图83C描绘了在用另外的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后huPBMC植入的小鼠的血清中第4天(图83A)、第7天(图83B)和第11天(图83C)的CD4+ T细胞计数。
图84A-图84C描绘了在用另外的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后huPBMC植入的小鼠的血清中第4天(图84A)、第7天(图84B)和第11天(图84C)的CD45+ T细胞计数。
图85A-图85C描绘了在用另外的IL-15/Rα变体处理后第4天(图85A)、第7天(图85B)和第11天(图85C)植入huPBMC的小鼠的体重占初始体重的百分比。每个点代表一只NSG小鼠。将体重降至初始体重的70％以下的小鼠实施安乐死。死老鼠占70％。
图86A-图86B描绘了在与指示的测试物孵育之后表达Ki67的食蟹猕猴CD8+ T细胞(图86A)和食蟹猕猴NK细胞(图86B)的百分比。
图87A-图87E描绘了用XENP20818给药食蟹猕猴后的淋巴细胞计数。图87A-E分别示出了CD56+ NK细胞(图87A)、CD16+ NK细胞(图87B)、γδT细胞(CD45RA+CD3+CD4-CD8-)(图87C)、CD8+ T细胞(图87D)和CD4+ T细胞(图87E)的绝对计数的倍数变化。
图88A-图88E描绘了在用XENP20818给药食蟹猕猴后CD56+ NK细胞(图88A)、CD16+NK细胞(图88B)、CD8+ T细胞(CD45RA+)(图88C)、CD8+ T细胞(CD45RA-)(图88D)和CD4+ T细胞(CD45RA-)(图88E)的增殖。
图89A-图89E描绘了用XENP22819给食蟹猕猴给药后的淋巴细胞计数。图89A-图89E分别示出了CD56+ NK细胞(图89A)、CD16+ NK细胞(图89B)、γδT细胞(CD45RA+CD3+CD4-CD8-)(图89C)、CD8+ T细胞(图89D)和CD4+ T细胞(图89E)的绝对计数的倍数变化。
图90A-图90E描绘了在用XENP22819给药食蟹猕猴后CD56+ NK细胞(图90A)、CD16+NK细胞(图90B)、CD8+ T细胞(CD45RA+)(图90C)、CD8+ T细胞(CD45RA-)(图90D)和CD4+ T细胞(CD45RA-)(图90E)的增殖。
图91A-图91E描绘了用XENP22821给食蟹猕猴给药后的淋巴细胞计数。图91A-91E分别示出了CD56+ NK细胞(图91A)、CD16+ NK细胞(图91B)、γδT细胞(CD45RA+CD3+CD4-CD8-)(图91C)、CD8+ T细胞(图91D)和CD4+ T细胞(图91E)的绝对计数的倍数变化。
图92A-图92E描绘了在用XENP22821给药食蟹猕猴后CD56+ NK细胞(图92A)、CD16+NK细胞(图92B)、CD8+ T细胞(CD45RA+)(图92C)、CD8+ T细胞(CD45RA-)(图92D)和CD4+ T细胞(CD45RA-)(图92E)的增殖。
图93A-图93E描绘了用XENP22822给食蟹猕猴给药后的淋巴细胞计数。图93A-E分别示出了CD56+NK细胞(图93A)、CD16+ NK细胞(图93B)、γδT细胞(CD45RA+CD3+CD4-CD8-)(图93C)、CD8+ T细胞(图93D)和CD4+ T细胞(图93E)的绝对计数的倍数变化。
图94A-图94E描绘了在用XENP22822给药食蟹猕猴后CD56+ NK细胞(图94A)、CD16+NK细胞(图94B)、CD8+ T细胞(CD45RA+)(图94C)、CD8+ T细胞(CD45RA-)(图94D)和CD4+ T细胞(CD45RA-)(图94E)的增殖。
图95A-图95E描绘了用XENP22834给食蟹猕猴给药后的淋巴细胞计数。图95A-E分别示出了CD56+ NK细胞(图95A)、CD16+ NK细胞(图95B)、γ8T细胞(CD45RA+CD3+CD4-CD8-)(图95C)、CD8+ T细胞(图95D)和CD4+ T细胞(图95E)的绝对计数的倍数变化。
图96A-图96E描绘了在用XENP22834给药食蟹猕猴后CD56+ NK细胞(图96A)、CD16+NK细胞(图96B)、CD8+ T细胞(CD45RA+)(图96C)、CD8+ T细胞(CD45RA-)(图96D)和CD4+ T细胞(CD45RA-)(图96E)的增殖。
图97A-图97E描绘了用XENP23343给食蟹猕猴给药后的淋巴细胞计数。图97A-E分别示出了CD56+ NK细胞(图97A)、CD16+ NK细胞(图97B)、γδT细胞(CD45RA+CD3+CD4-CD8-)(图97C)、CD8+ T细胞(图97D)和CD4+ T细胞(图97E)的绝对计数的倍数变化。
图98A-图98E描绘了在用XENP23343给药食蟹猕猴后CD56+ NK细胞(图98A)、CD16+NK细胞(图98B)、CD8+ T细胞(CD45RA+)(图98C)、CD8+ T细胞(CD45RA-)(图98D)和CD4+ T细胞(CD45RA-)(图98E)的增殖。
图99A-图99C描绘了具有M428L/N434S取代的“IL-15/Rα-异源Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP23343、XENP23504、XENP24113、XENP24301、XENP24306和XENP24341的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图100描绘了具有M428L/N434S取代的“scIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP25938(也称为XENP24294)的序列。
图101描绘了具有M428L/N434S取代的“ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP24383的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图102描绘了具有M428L/N434S取代的“二价ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP24346和XENP24351的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图7中)，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图103A-图103C描绘了用具有M428L/N434S Fc突变的IL-15/Rα变体处理后，人CD8+ T细胞(图103A)、人CD4+ T细胞(图103B)和人NK细胞(图103C)上Ki67表达的百分比。
图104A-图104D描绘了用XmAb24306(也称为XENP24306)处理后，人CD8+ T细胞(图104A)、人CD4+ T细胞(图104B)、人NK细胞(图104C)和人γδ T细胞(图104D)上Ki67表达的百分比。
图105A-图105C描绘了用WT IL-15/Rα-Fc和具有M428L/N434S Fc突变的效能降低的IL-15/Rα变体处理后，食蟹猕猴CD8+ T细胞(图105A)、食蟹猕猴CD4+ T细胞(图105B)和食蟹猕猴NK细胞(图105C)上Ki67表达的百分比。
图106描绘了用XENP20818或XmAb24306处理后，食蟹猕猴CD8α+CD45RA-T细胞上Ki67表达的百分比。
图107A-图107C描绘了在用另外的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后huPBMC植入的小鼠的全血中第4天(图107A)和第7天(图107B)以及脾中第8天(图107C)的CD4+ T细胞计数。
图108A-图108C描绘了在用另外的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后huPBMC植入的小鼠的全血中(图108A)第4天和(图108B)第7天以及脾中(图108C)第8天的CD8+ T细胞计数。
图109A-图109C描绘了在用另外的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后huPBMC植入的小鼠的全血中第4天(图109A)和第7天(图109B)以及脾中第8天(图109C)的CD8+ T细胞计数。
图110A-图110F描绘了在用另外的IL-15/Rα变体处理后第-2天(图110A)、第1天(图110B)、第5天(图110C)、第8天(图110D)和第11天(图110E)植入huPBMC的小鼠的体重占初始体重的百分比。每个点代表一只NSG小鼠。图110F描绘了用IL-15/Rα变体处理后的huPBMC植入小鼠的体重随时间的变化。
图111A-图111D描绘了在与指示的测试物孵育之后表达Ki67的CD8+CD45RA-T细胞(图111A)、CD4+CD45RA-T细胞(图111B)、γδ T细胞(图111C)和CD16+ NK细胞(图111D)的百分比。
图112A-图112D描绘了用IL-15/Rα变体处理后食蟹猴的CD8+ T细胞(图112A)、CD4+ T细胞(图112B)、NK细胞(图112C)和γδT细胞(图112D)计数。
图113A-113H描绘了食蟹猴中所指示的测试物随时间和半衰期的血清浓度。
图114A-图114F描绘了AF647标记的测试物(具有Xtend和无结构域连接子的WTIL-15/Rα-Fc和IL-15/Rα-Fc亲和变体)与CD8+CD45RA-T细胞(图114A)、CD8+CD45RA+T细胞(图114B)、CD4+CD45RA-T细胞(图114C)、CD4+CD45RA+T细胞(图114D)、CD16+NK细胞(图114E)和γδT细胞(图114F)在新鲜和活化的PBMC中的结合。
图115A-图115F描绘了AF647标记的测试物(具有Xtend和具有结构域连接子的WTIL-15/Rα-Fc和IL-15/Rα-Fc亲和变体)与(图115A)CD8+CD45RA-T细胞、(图115B)CD8+CD45RA+T细胞、(图115C)CD4+CD45RA-T细胞、(图115D)CD4+CD45RA+T细胞、(图115E)CD16+NK细胞和(图115F)γδT细胞在新鲜和活化的PBMC中的结合。
图116A-图116F描绘了AF647标记的测试物(其他形式的WT IL-15/Rα-Fc和IL-15/Rα-Fc融合蛋白，具有Xtend变体，例如FcRn变体)与(图116A)CD8+CD45RA-T细胞、(图116B)CD8+CD45RA+ T细胞、(图116C)CD4+CD45RA-T细胞、(图116D)CD4+CD45RA+ T细胞、(图116E)CD16+ NK细胞和(图116F)γδT细胞在新鲜和活化的PBMC中的结合。
图117描绘了AF647标记的测试物(包括XENP24341和XENP24113)与CD8+CD45RA- T细胞在活化的PBMC中的结合。
图118A-118B描绘在(图118A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)和(图118B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD8+ T细胞上的CD25表达。
图119A-119B描绘在(图119A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)和(图119B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD4+ T细胞上的CD25表达。
图120A-120B描绘在(图120A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)和(图120B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD8+ T细胞上的CD69表达。
图121A-121B描绘在(图121A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)和(图121B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD4+ T细胞上的CD69表达。
图122A-122B描绘在(图122A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)和(图122B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD8+ T细胞中的细胞内IFNγ表达。
图123A-123B描绘在(图123A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)和(图123B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD4+ T细胞中的细胞内IFNγ表达。
图124A-图124C描绘了在第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD8+ T细胞的(图124A)Ki-67+/IFNγ-、(图124B)Ki-67+/IFNγ+和(图124C)Ki-67-/IFNγ+馏分的百分比。
图125A-图125C描绘了在第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD4+ T细胞的(图125A)Ki-67+/IFNγ-、(图125B)Ki-67+/IFNγ+和(图125C)Ki-67-/IFNγ+馏分的百分比。
图126A-图126C描绘了在第1组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD8+ T细胞的(图126A)Ki-67+/IFNγ-、(图126B)Ki-67+/IFNγ+和(图126C)Ki-67-/IFNγ+级分的百分比。
图127A-图127C描绘了在第1组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD4+ T细胞的(图127A)Ki-67+/IFNγ-、(图127B)Ki-67+/IFNγ+和(图127C)Ki-67-/IFNγ+级分的百分比。
图128A-128B描绘在(图128A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)和(图128B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD8+ T细胞上的CD107a表达。
图129A-129B描绘在(图129A)第1组(与亲本MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)和(图129B)第2组(与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指定测试物一起培育的纯化的T细胞)中CD4+ T细胞上的CD107a表达。
图130A-图130B描绘在与纯化的T细胞和指定测试物一起培育之后其余的靶细胞[图130A：亲本MCF-7肿瘤细胞；图130B：表达pp65的MCF-7肿瘤细胞]。
图131A-图131B描绘在与纯化的T细胞和指定测试物一起培育之后死细胞数[图131A：亲本MCF-7肿瘤细胞；图131B：表达pp65的MCF-7肿瘤细胞]。
图132描绘了纯化的T细胞与亲本MCF-7肿瘤细胞或表达pp65的MCF-7肿瘤细胞在有或没有抗HLA-A抗体的情况下孵育后CD8+ T细胞的Ki-67+/IFNγ+级分的百分比。
图133描绘了纯化的T细胞与亲本MCF-7肿瘤细胞或表达pp65的MCF-7肿瘤细胞在有或没有抗-HLA-A抗体的情况下孵育后靶细胞(即亲本MCF-7肿瘤细胞或表达pp65的MCF-7肿瘤细胞)的数目。
图134A-图134B描绘了在纯化的T细胞与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指示的测试物一起孵育后，在(图134A)CD8+ T细胞和(图134B)CD4+ T细胞上的CD25表达。
图135A-图135B描绘了在纯化的T细胞与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指示的测试物一起孵育后，在(图135A)CD8+ T细胞和(图135B)CD4+ T细胞上的CD69表达。
图136A-图136B描绘了在纯化的T细胞与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指示的测试物一起孵育后，在(图136A)CD8+ T细胞和(图136B)CD4+ T细胞上的Ki67表达。
图137A-图137B描绘了在纯化的T细胞与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指示的测试物一起孵育后(图137A)CD8+ T细胞和(图137B)CD4+ T细胞的Ki-67+/IFNγ+级分的百分比。
图138A-图138B描绘了在纯化的T细胞与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指示的测试物一起孵育后(图138A)CD8+ T细胞和(图138B)CD4+ T细胞的CD69+/IFNγ+级分的百分比。
图139A-图139B描绘了在纯化的T细胞与表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和指示的测试物一起孵育后(图139A)CD8+ T细胞和(图139B)CD4+ T细胞的CD69+/Ki67+级分的百分比。
图140描绘在与纯化的T细胞和指定测试物一起培育之后的其余靶细胞(表达pp65的MCF-7肿瘤细胞)。
图141描绘在与纯化的T细胞和指定测试物一起培育之后的死细胞(表达pp65的MCF-7肿瘤细胞)数目。
图142A-图142B描绘了在用XENP24045(XmAb24306的非Xtend类似物)处理后，植入表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和pp65反应性人PBMC的小鼠中的平均肿瘤体积(图142A)和肿瘤体积的变化(图142B)。
图143A-图143D描绘了在用XENP24045(XmAb24306的非Xtend类似物)处理后，植入表达pp65的MCF-7肿瘤细胞和pp65反应性人PBMC的小鼠的全血中的CD45+细胞(图143A)、CD4+细胞(图143B)、CD8+细胞(图143C)和NK细胞(图143D)计数。
图144描绘了食蟹猕猴中在不同浓度下随时间和半衰期的各种测试物的血清浓度。
图145描绘了食蟹猕猴中在1倍和3倍剂量下XENP22821随时间的Cmax归一化血清浓度。
图146A-图146E描绘了在给予指示的测试物后在食蟹猕猴中CD8+ T细胞(图146A)、CD4+ T细胞(图146B)、CD16+ NK细胞(图146C)、CD56+ NK细胞(图146D)和γST细胞(图146E)计数的平均倍数变化。
图147A-图147B描绘了在以3倍剂量或0.6倍剂量的XENP24306给药后在食蟹猕猴全血中CD8+ T细胞(图147A)和γδT细胞(图147B)随时间的倍数变化。
图148描绘了在用0.3X剂量XENP22821和0.6X剂量XENP24306给药后，在表达Ki67的食蟹猕猴淋巴结中CD8α+CD45RA+ T细胞的百分比。
图149描绘了在用0.3X剂量XENP22821和0.6X剂量XENP24306给药后在表达Ki67的食蟹猕猴全血中CD8α+CD45RA+ T细胞的百分比(左轴)和细胞计数的倍数变化(右轴)。
图150描绘了在用0.3X剂量XENP22821给药后，在表达Ki67的食蟹猕猴PBMC中各种淋巴细胞群的百分比。
图151描绘了在用0.6X剂量XENP24306给药后，在表达Ki67的食蟹猕猴PBMC中各种淋巴细胞群的百分比。
图152描绘了在用0.6X剂量的XmAb24306给药后，在表达Ki67的食蟹猕猴全血中的CD8α+CD45RA+ T细胞的百分比和XmAb24306的血清浓度随时间的叠加图。
图153描绘了在用0.6X剂量的XmAb24306给药后，在食蟹猕猴全血中CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、CD56+CD8α+ NK细胞和γδT细胞的计数随时间的倍数变化。
图154描绘了在用0.6X剂量的XmAb24306给药后，在食蟹猕猴全血中CD8+ T细胞和Treg的计数随时间的倍数变化。
图155A-图155C显示了使用XENP20818或XmAb24306给药后食蟹猕猴全血中CD8+ T细胞(图155A)、CD4+ T细胞(图155B)和CD16+ NK细胞(图155C)随时间的叠加图。
图156A-图156C描绘了用XENP20818或XmAb24306以其EC50浓度处理24小时后(图156A)全PBMC、(图156B)纯化的NK细胞和(图156C)纯化的CD8+ T细胞中免疫相关基因表达的与未处理相比的倍数变化。
图157A-图157C描绘了用XENP20818或XmAb24306以其EC50浓度处理48小时后(图157A)全PBMC、(图157B)纯化的NK细胞和(图157C)纯化的CD8+ T细胞中基因表达的与未处理相比的倍数变化。
图158A-图159B描绘了在经EC50浓度的(图158A)XmAb24306或IL-15和(图158B)XmAb24306或IL-2处理48小时后在全PBMC中基因表达的与未处理相比的倍数变化。
图159A-图159B描绘了在存在XmAb24306和各种浓度的雷帕霉素扩展的Treg的情况下(图159A)CD8+和(图159B)CD4+应答性T细胞的增殖。
图160描绘了具有消融变体(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，“IgG1_PVA_/S267k”)的二价抗PD-1mAb XENP16432的序列。CDR是带下划线的。如本文所提及且对含有CDR每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，CDR位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的CDR且还包括使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。另外，每个CDR在序列表中具有其自身的SEQ ID NO：或序列标识符，且每个VH和VL结构域在序列表中具有其自身的SEQ ID NO：或序列标识符。
图161A-图161B描绘了在第一剂量的所示测试物之后的(图161A)第6天和(图161B)第10天小鼠全血中的CD8+ T细胞。
图162A-图162B描绘了在第一剂量的所示测试物之后的(图162A)第6天和(图162B)第10天小鼠全血中的CD4+ T细胞。
图163A-图163B描绘了在第一剂量的所示测试物之后的(图163A)第6天和(图163B)第10天小鼠全血中的CD45+ T细胞。
图164A-图164B描绘了在第一剂量的所示测试物之后的(图164A)第6天和(图164B)第10天小鼠全血中的NK细胞。
图165描绘了在第一剂量所示测试物后第7天，NSG小鼠血清中的IFNγ。
图166A-图166D描绘了在第一剂量所示测试物后第7天(图166A)、第11天(图166B)、第14天(图166C)和第18天(图166D)的小鼠的体重。
图167描绘了与XENP20818孵育后表达Ki67的所示淋巴细胞群的百分比。
图168描绘了在与XENP20818、XENP22821、XENP24050和XENP24306孵育之后，CD8+CD45RA+ T细胞上的STAT5磷酸化。
图169描绘了在与XENP20818、XENP22819、XENP22821和XENP22834孵育后，CD8+CD45RA+ T细胞上的STAT5磷酸化。
图170描绘了在与各自EC50下的XENP20818或XENP24306孵育后，表达Ki67的CD8+CD45RA-T细胞随时间的百分比。
图171描绘了在与各自EC50下的XENP20818或XENP24306孵育后，CD8+CD45RA-T细胞上随时间的BCL2表达。
图172描绘了在与各自EC50下的XENP20818或XENP24306孵育后，CD8+CD45RA-T细胞上随时间的CD25表达。
图173描绘了与XENP24045或XENP20818孵育后，新鲜人PBMC与受刺激人PBMC中CD8+ T细胞上的STAT5磷酸化。
图174描绘了在人PBMC与指定剂量的XENP24306和指定剂量的板结合的抗CD3(OKT3)孵育后，增殖CD8+CD45RA-百分比(如通过CFSE稀释法测定的)。
图175描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后第10天，在huPBMC移植的NSG小鼠中的血清IFNγ浓度。
图176描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后第17天，在huPBMC移植的NSG小鼠的血液中的CD45+细胞计数。
图177描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后第25天，huPBMC移植的NSG小鼠的体重(以初始体重的百分比计)。
图178描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后第7天，在huPBMC移植的NSG小鼠中的血清IFNγ浓度。
图179A、图179B、图179C和图179D描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后第10天，在huPBMC移植的NSG小鼠的血液中的A)CD45+细胞，B)CD3+ T细胞，C)CD4+ T细胞，D)CD8+ T细胞计数。
图180描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后第11天，huPBMC移植的NSG小鼠的体重(以初始体重的百分比计)。
图181描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后，huPBMC移植的NSG小鼠的体重(以初始体重的百分比计)的时间过程。
图182描绘了用XENP16432和/或XENP24045给药的pp65-MCF7和huPBMC移植的NSG小鼠中在第21天的CD45+细胞计数。
图183描绘了用XENP16432和/或XENP24045给药的pp65-MCF7和huPBMC移植的NSG小鼠中在第31天的肿瘤体积。
图184描绘了用XENP16432和/或XENP24045给药的pp65-MCF7和huPBMC(1.5x 106)移植的NSG小鼠中(huPBMC移植后)随时间的肿瘤体积。
图185描绘了用XENP16432和/或XENP24045给药的pp65-MCF7和huPBMC(5x 106)移植的NSG小鼠中(huPBMC移植后)随时间的肿瘤体积。
图186描述了包含野生型IL-15的scIL-15/Rα-Fc融合体XENP21993的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图中，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图187描绘了包含野生型IL-15和Xtend Fc(M428L/N434S)变体的IL-15/Rα-异源Fc融合体XENP22853的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图中，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图188描绘了包含IL-15(N4D/N65D)变体和Xtend Fc(M428L/N434S)取代的scIL-15/Rα-Fc融合体XENP24294的序列。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图中，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图189描绘了在以所示相对浓度的第一剂量之后，在食蟹猕猴中所指定的测试物随时间的血清浓度。
图190描绘了XENP22853和相应的WT非Xtend XENP20818随时间的相对血清浓度。
图191描绘了为降低效能而工程化并包含D30N取代的说明性IL-15变体的序列。在这些变体IL-15序列的每一个内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％一致(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列。在非限制性实例中，所列举的序列可以含有额外的氨基酸修饰，例如有助于形成如实施例2中所述的共价二硫键的氨基酸修饰。
图192A-图192C描绘了具有包含D30N取代的IL-15变体的说明性scIL-15/Rα-Fc融合体。IL-15和IL-15Rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图中，并且斜线(/)表示IL-15、IL-15Rα、连接子与Fc区之间的边界。
图193A、图193B、图193C、图193D、图193E、图193F和图193G描绘了在与指定的测试物孵育后A)CD4+CD45RA-，B)CD4+CD45RA+，C)CD8+CD45RA-，D)CD8+CD45RA+，E)CD16+NK细胞，F)CD56+NK细胞和G)γδ细胞表达Ki67的百分比。
图194A、图194B、图194C、图194D和图194E显示了机制PK/RO/TMDD模型描绘了相对PD效果，如实施例18所示。值得注意的是，预测的RO-AUC值与实验确定的PD-AUC(药效学AUC)非常相关，表明RO-AUC是要优化的目标值，从而可以预测最佳Kd值。
图195显示了示意图，其说明了以下假设：受体介导的内在化是影响各种IL-15的PK/PD关系的关键因素。k增殖表示增殖速率。kdeathCTL表示细胞死亡速率。Kd表示解离常数。kel表示消除速率。k输注表示输注入中央血液的速率。ksyn表示IL-15受体的合成速率。kdeg表示IL-15受体的降解速率。
图196描绘了来自多个食蟹猕猴研究的PK数据的叠加图，这些数据输入到基于图195所描绘的模型的模拟中。
图197描绘了基于图1中描绘的模型的估计KD值与实验测量的结合的EC50值线性相关。
图198描绘了基于图195中描绘的模型的模拟PK曲线、受体占有率(RO)曲线和药效动力学曲线。该模型证明，降低的效能延长了暴露，并且存在针对最大药效(即T细胞扩增)的最佳KD。
图199A-图199F描述了A)预测的RO-AUC值与实验确定的PD-AUC(药效学AUC)，B)预测的RO-AUC值与实验确定的PD-Max(峰值CD8+ T细胞计数)，C)预测的RO-AUC值与实验确定的ALB-min(最低血清白蛋白浓度)，D)预测的RO-Max(最大受体占有率)与实验确定的PD-AUC，E)预测的RO-Max与实验确定的PD-Max，以及F)预测的RO-Max与实验确定的ALB-Min之间的相关性。值得注意的是，预测的RO-AUC值与实验确定的PD-AUC和PD-max很好地相关，而预测的RO-Max值与实验确定的ALB-Min很好地相关。
图200描绘了针对IL-15/Rα-异源Fc融合体的Xtend或非Xtend形式，对各种KD值进行的模拟扫描(基于图195所描绘的模型)，揭示了预测的最佳KD大约为200nM，类似于XmAb24306的估计KD值。
图201A和图201B描绘了在用XENP16432和/或XENP24045给药的pp65-MCF7和huPBMC移植的NSG小鼠中，A)人CD8+ T细胞计数和B)在人类CD8+ T细胞上的CD25表达。***表示p≤0.001，而**表示p≤0.01，如通过未配对的t检验确定的。发现用XENP24045和抗PD-1mAb的组合治疗在以后的天数显著增强了CD8+ T细胞的扩增，并诱导了CD8+ T细胞的更早活化。
图202A-图202C描绘了在以0.3X剂量XENP20818、0.3X剂量XmAb24306和0.6X剂量XmAb24306给药后，食蟹猕猴中A)CD8+ T细胞，B)CD16+ NK细胞和C)淋巴细胞的扩增。数据显示，药效降低的XmAb24306增强了药效学。
图203描述了在用0.3X剂量XENP20818、0.3X剂量XmAb24306和0.6X剂量XmAb24306给药之后，食蟹猕猴血清白蛋白的变化百分比(作为血管渗漏的指标)。数据显示，效力降低的XmAb24306赋予了增强的耐受性(如白蛋白下降的降低所示)。
图204A-图204F描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后第7天，在huPBMC移植的NSG小鼠的血液中的A)CD45+细胞，B)CD3+ T细胞，C)CD4+ T细胞，D)CD8+ T细胞，E)CD16+CD56+ NK细胞计数，以及CD4与CD8比。
图205A-图205F描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后第14天，在huPBMC移植的NSG小鼠的血液中的A)CD45+细胞，B)CD3+ T细胞，C)CD4+ T细胞，D)CD8+ T细胞，E)CD16+CD56+ NK细胞计数，以及CD4与CD8比。数据显示，到第14天，用0.3mg/kg或0.1mg/kgXENP24306和3mg/kg XENP16432的组合治疗显著增强了CD3+ T细胞扩增，超过了单独使用3mg/kg XENP16432的治疗(统计按对数进行-使用不成对的t检验转换的数据)。
图206A-图206F描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后第21天，在huPBMC移植的NSG小鼠的血液中的A)CD45+细胞，B)CD3+ T细胞，C)CD4+ T细胞，D)CD8+ T细胞，E)CD16+CD56+ NK细胞计数，以及CD4与CD8比。
图207A-207I描述了在第一次给予指定浓度的指定测试物后，在A)第3天，B)第6天，C)第10天，D)第13天，E)第17天，F)第20天，G)第25天，H)第28天，以及I)第29天，植入huPBMC的NSG小鼠的体重变化(作为GVHD的指标)。数据显示，到第10天，用0.3mg/kg、0.1mg/kg或0.01mg/kg XENP24306和3mg/kg XENP16432的组合治疗显著增强了GVHD，超过了单独使用3mg/kg XENP16432的治疗(统计使用不成对的t检验进行)。
图208描绘了在指示浓度的指示测试物给药后，huPBMC移植的NSG小鼠的体重随时间的变化(作为GVHD的指标)。
图209A-图209C描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后的A)第7天，B)第14天和C)第21天的huPBMC移植的NSG小鼠中的血清IFNγ浓度。
图210A-图210F描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后第14天，在pp65-MCF-7和huPBMC移植的NSG小鼠的血液中的A)CD45+细胞，B)CD3+ T细胞，C)CD4+ T细胞，D)CD8+ T细胞，E)CD16+CD56+ NK细胞计数，以及CD4与CD8比。*表示与PBS处理组相比，p＜0.05，未配对t检验，指定组；
表示与XENP16432处理组相比，p＜0.04，未配对t检验，指定组。在进行统计分析之前，先对数据进行对数转换。数据显示，到第14天，单独用XENP24306或XENP24306与XENP16432组合治疗的每个组均明显增强了淋巴细胞扩增，超过了PBS治疗。值得注意的是，到第14天，用XENP24306和XENP16432的组合治疗的每个组，无论XENP24306的浓度如何，以及单独使用更高浓度的XENP24306，都显著增强了淋巴细胞扩增，超过了XENP16432治疗。
图211A-图211F描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后第21天，在pp65-MCF-7和huPBMC移植的NSG小鼠的血液中的A)CD45+细胞，B)CD3+ T细胞，C)CD4+ T细胞，D)CD8+ T细胞，E)CD16+CD56+ NK细胞计数，以及CD4与CD8比。*表示与PBS处理组相比，p＜0.05，未配对t检验，指定组；
表示与XENP16432处理组相比，p＜0.04，未配对t检验，指定组。在进行统计分析之前，先对数据进行对数转换。
图212A-图212I描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后，在A)第4天，B)第6天，C)第8天，D)第11天，E)第13天，F)第15天，G)第19天，H)第22天和I)第25天，pp65-MCF-7和huPBMC移植的NSG小鼠中肿瘤体积的变化(经基线校正)。数据显示，到第11天，与单独使用XENP16432的治疗相比，以1.0mg/kg、0.3mg/kg或0.1mg/kg的XENP24306和3mg/kgXENP16432的组合治疗显著减小了肿瘤体积(使用未配对的t检验进行统计，基线校正肿瘤测量结果)。
图213A-图213B描绘了在指示浓度的指示测试物给药后，pp65-MCF-7和huPBMC移植的NSG小鼠的随时间的A)肿瘤体积变化和B)体重变化(作为GVHD的指标)。数据表明，尽管在C、F和G组所有小鼠都死亡，但这与GVHD相对应(如通过体重变化表示的)。
图214A-图214C描绘了在第一次给予指定浓度的指定测试物后的A)第7天，B)第14天和C)第21天的pp65-MCF-7和huPBMC移植的NSG小鼠中的血清IFNγ浓度。*表示与PBS处理组相比，p＜0.05，未配对t检验，指定组；
表示与XENP16432处理组相比，p＜0.04，未配对t检验，指定组。在进行统计分析之前，先对数据进行对数转换。数据表明，到第7天，与单独使用XENP16432的治疗相比，用1.0mg/kg、0.3mg/kg或0.1mg/kg的XENP24306和3mg/kgXENP16432的组合治疗可显著增强IFNγ分泌。
具体实施方式
I.定义
为了能更全面地了解本申请，下文阐述几种定义。这类定义意味着涵盖语法等效物。
“消融”在本文中意指结合和/或活性的减少或去除。因此，举例来说，“消融FcγR结合”意指初始结合比不含有特定变体的Fc区小50％的Fc区氨基酸变体，其中优选小于70-80-90-95-98％的结合损失，并且一般来说，结合低于在Biacore分析中可检测到的结合水平。FcγR结合的烧蚀中的特定用途是如图5所示的那些变体。然而，除非另外指出，否则本发明的Fc单体保持与FcRn的结合。
如本文所用的“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞的裂解。ADCC与FcγRIIIa的结合相关；与FcγRIIIa的结合增加导致ADCC活性增加。如本文所论述，本发明的许多实施方案完全消融ADCC活性。
本文所用的“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并且随后引起靶细胞的吞噬作用。
本文的“修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或与蛋白质化学连接的部分的改变。举例来说，修饰可以是连接到蛋白质的改变的碳水化合物或PEG结构。本文的“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另外指出，否则氨基酸修饰始终是由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
本文的“氨基酸取代”或“取代”是指用不同的氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代是针对并非天然存在于特定位置、并非天然存在于生物体内或任何生物体内的氨基酸。举例来说，取代E272Y或272Y是指在位置272处的谷氨酸被酪氨酸替换的变体多肽，在这种情况下是Fc变体。为清楚起见，已经工程化以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍然编码精氨酸)以提高宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；即，不管形成编码相同蛋白质的新型基因，但如果蛋白质在其起始的特定位置处具有相同的氨基酸，那么其不是氨基酸取代。取代可以包含天然存在的氨基酸，以及在一些情况下合成氨基酸。实例包括美国专利第6,586,207号；WO 98/48032；WO 03/073238；US2004-0214988A1；WO 05/35727A2；WO05/74524A2；J.W.Chin等人，(2002)，《美国化学学会杂志(Journal of the AmericanChemical Society)》124：9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，《化学生物化学(ChemBioChem)》11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PICAS美国(United States ofAmerica)99：11020-11024；和L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，《化学(Chem.)》1-10，所有所述文献以引用的方式整体并入本文中。
如本文所用的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列的特定位置处添加氨基酸残基或序列。举例来说，-233E表示在位置233之后和位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后和位置234之前插入AlaAspGlu。
如本文所使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列的特定位置处去除氨基酸残基或序列。举例来说，E233-、E233#、E233()或E233del表示在位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示从位置233开始的序列GluAspAla的缺失。
如本文所用，“变体蛋白质”、“蛋白质变体”或“变体”意指通过至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白质的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物或编码其的氨基序列或编码其的DNA或氨基酸序列。优选地，蛋白变体与亲本蛋白相比具有至少一种氨基酸修饰，例如，与亲本相比，从约一种到约七十种氨基酸修饰，并且优选地从约一种到约五种氨基酸修饰。修饰可以是添加、缺失或取代。如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽，例如Fc亲本多肽，是人野生型序列，例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区，尽管具有变体的人序列也可以充当“亲本多肽”，例如可包括IgG1/2杂合物。本文的蛋白质变体序列将优选与亲本蛋白质序列具有至少约80％的一致性，并且最优选至少约90％的一致性，更优选至少约95-98-99％的一致性。
因此，如本文所用的“抗体变体”或“变体抗体”意指通过至少一个氨基酸修饰与亲本抗体不同的抗体，如本文所用的“IgG变体”或“变体IgG”意指通过至少一个氨基酸修饰与亲本IgG(同样，在许多情况下，来自人类IgG序列)不同的抗体，并且如本文所用的“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指通过至少一个氨基酸修饰与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。如本文所用的“Fc变体”或“变体Fc”意味着包含Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。修饰可以是添加、缺失或取代。本发明的Fc变体是根据构成其的氨基酸修饰来定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽在位置434处具有丝氨酸残基的取代的Fc变体，其中编号是根据EU索引。同样，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。WT氨基酸的身份标识可以是非特定的，在此情况下前述变体称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如428L/434S与434S/428L是相同的Fc变体，以此类推。对于本发明中讨论的与抗体有关的所有位置，除非另有说明，否则氨基酸位置编号是根据EU索引。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引是指EU抗体的编号(Edelman等人，1969，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》63：78-85，在此通过引用整体并入)。修饰可以是添加、缺失或取代。取代可以包含天然存在的氨基酸，以及在一些情况下合成氨基酸。
如本文所用，“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基可以包括天然存在的氨基酸和肽键或合成拟肽结构，即“类似物”，如类肽(参见Simon等人，《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》89(20)：9367(1992)，其通过引用整体并入)。氨基酸可以是天然存在的或合成的(例如不是由DNA编码的氨基酸)；如将由本领域技术人员所理解。举例来说，出于本发明的目的，同型苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸被认为是合成氨基酸，并且可以使用D-和L-(R或S)构型的氨基酸。本发明的变体可以包含修饰，其包括使用例如Schultz和同事研发的技术掺入的合成氨基酸，所述技术包括但不限于Cropp和Shultz，2004，《遗传学趋势(Trends Genet.)》20(12)：625-30，Anderson等人，2004，《美国国家科学院院刊》101(2)：7566-71，Zhang等人，2003，303(5656)：371-3和Chin等人，2003，《科学(Science)》301(5635)：964-7所描述的方法，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。另外，多肽可包括一个或多个侧链或末端的合成衍生、糖基化、聚乙二醇化、环状排列、环化、与其它分子的连接子、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。当生物功能分子包含两种或更多种蛋白质时，每种蛋白质可称为“单体”或称为“子单元”或称为“结构域”；并且生物功能分子可称为“复合物”。
如本文所用，“残基”意味着蛋白质中的位置和其相关的氨基酸身份标识。举例来说，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人类抗体IgG1中位置297处的残基。
如本文所用，“IgG子类修饰”或“同型修饰”意指将IgG同型的一个氨基酸转化成不同比对的IgG同型中的对应的氨基酸的氨基酸修饰。举例来说，因为在EU位置296处IgG1包含酪氨酸且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。
如本文所用的“非天然存在的修饰”意指不是同型的氨基酸修饰。例如，因为IgG均不包括位置434处的丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂交体)的取代434S被视为非天然存在的修饰。
如本文所使用的，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指由DNA和RNA编码的20个天然存在的氨基酸之一。
如本文所用，“效应功能”意味着由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。
如本文所用的“IgG Fc配体”或“Fc配体”意指与IgG抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物的任何生物体的分子，优选多肽。Fc配体包括但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人，2002，《免疫评论(Immunological Reviews)》190：123-136，其以引用的方式整体并入本文中)。Fc配体可以包括结合Fc的未发现分子。特定的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。
如本文所用的“Fcγ受体”、“FcγR”或“FcγR(FcgammaR)”意指结合IgG抗体Fc区并且由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，这个家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人，2002，《免疫学快报(Immunol Lett)》82：57-65，其以引用的方式整体并入本文中)，以及任何未发现的人类FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
如本文所用的“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区，并且至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。如所属领域所知，功能性FcRn蛋白包含两个多肽，通常称为重链和轻链。轻链是β-2微球蛋白(β2微球蛋白)，并且重链由FcRn基因编码。除非本文另外指出，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2微球蛋白的复合物。多种Fc变体可用于增加与FcRn的结合，并且在一些情况下，增加血清半衰期。通常，除非另外指出，否则本发明的Fc单体保持与FcRn的结合(并且如下所只指出，可包括氨基酸变体以增加与FcRn的结合)。
如本文所用，“亲本多肽”意指随后经过修饰来产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽或者天然存在的多肽的变体或工程化版本。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。因此，如本文所用的“亲本免疫球蛋白”意味着未修饰的免疫球蛋白多肽，其被修饰以产生变体，并且如本文所用的“亲本抗体”意味着未修饰的抗体，其被修饰以产生变体抗体。应注意“亲本抗体”包含如下文概述的已知的市售、以重组方式产生的抗体。
如本文所用的“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指包含抗体的恒定区，在一些情况下排除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH1)或其一部分的全部或一部分，并且在一些情况下进一步排除铰链的全部或一部分的多肽。因此，Fc可指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH2和CH3)，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及任选地这些结构域的柔性铰链N端的全部或一部分。对于IgA和IgM，Fc可以包含J链。对于IgG来说，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3(Cγ2和Cγ3)以及位于CH1(Cγ1)与CH2(Cγ2)之间的较低铰链区。尽管Fc区的边界可以变化，但是人类IgG重链Fc区通常被定义为包括其羧基端的残基E216、C226或A231，其中编号根据如Kabat中的EU索引。在一些实施方案中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如改变与一种或多种FcγR或FcRn的结合。
如所属领域技术人员将理解，重链恒定区结构域的确切编号和放置在不同编号系统之间可以是不同的。根据EU和Kabat编号的重链恒定区的有用比较如下，参见Edelman等人，1969，《美国国家科学院院刊》63：78-85和Kabat等人，1991，《免疫学相关蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第5版，美国公共卫生服务部(United States Public Health Service)，美国国家卫生研究院(National Institutesof Health)，贝塞斯达(Bethesda)，其以引用的方式整体并入本文中。
表1
| EU编号 | Kabat编号 | |
| CH1 | 118-215 | 114-223 |
| 铰链 | 216-230 | 226-243 |
| CH2 | 231-340 | 244-360 |
| CH3 | 341-447 | 361-478 |
如本文所用的“融合蛋白”意指至少两种蛋白质的共价接合。融合蛋白可包含人工序列，例如如本文所述的结构域连接子。本文中的“Fc融合蛋白”或“免疫粘附素”意指包含通常与一种或多种不同的蛋白质(任选通过如本文所述的结构域连接子)，例如与如本文所述的IL-15和/或IL-15R连接的Fc区的蛋白质。在一些例子中，两种Fc融合蛋白可以形成同源二聚体Fc融合蛋白或异二聚体Fc融合蛋白，后者是优选的。在一些情况下，异二聚体Fc融合蛋白的一种单体包含单独的Fc结构域(例如，空Fc结构域)，并且另一种单体是Fc融合物，其包含变体Fc结构域和蛋白结构域，例如受体、配体或其它结合搭配物。
如本文所用，“位置”意指蛋白质序列中的位置。位置可以顺序编号，或根据确定的形式(例如用于抗体编号的EU索引)编号。
在本发明的异二聚体蛋白中的单体的上下文中，“链型”在本文中意指类似于DNA中的“匹配”的两条链，将异源二聚化变体并入每种单体中以保持、形成和/或增强“匹配”以形成异二聚体的能力。举例来说，如果将一些pI变体工程化到单体A(例如使得pI更高)中，那么同样可以使用的作为“电荷对”的空间变体不会干扰pI变体，例如将使得pI更高的电荷变体放在相同“链”或“单体”上以保留两种功能。类似地，对于如下文更充分地概述的以组对出现的“偏斜”变体，技术人员将认为pI决定会进入并入所述对中的一组的链或单体，从而使得还使用偏斜变体的pI使pI分离最大化。
在本文中，“野生型或WT”意指在自然界发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包含等位变异。WT蛋白质具有未经过有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本发明的异二聚体蛋白通常是分离的或重组的。“分离”当用于描述本文中公开的各种多肽时，意指一种多肽，其已经被鉴别且从表达其的细胞或细胞孵育物中分离和/或回收。通常，通过至少一个纯化步骤制备经分离的多肽。“分离的蛋白质”意指基本上不含来自细胞孵育物的其它蛋白质的蛋白质，例如宿主细胞蛋白。“重组”是指使用重组核酸技术在外源宿主细胞中产生抗体。
关于蛋白质序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为，在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以实现最大序列同一性百分比之后并且在不将任何保守取代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中的与特定(亲代)序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域的技术内的各种方式实现，例如使用可开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在进行比较的序列的全长内实现最大比对所需的任何算法。一种特定程序是美国公开号20160244525的[0279]到[0280]段落中所概述的ALIGN-2程序，所述美国专利在此通过引用并入。
本发明的氨基酸序列(“发明序列”)与亲代氨基酸序列之间的同一性的程度被计算为在两个序列的比对中精确匹配的数除以“发明序列”的长度或亲代序列的长度，以最短者为准。结果以同一性百分比表示。
在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸序列是至少50％、60％、70％、80％或90％相同的。在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸序列是至少95％、97％、98％、99％或甚至100％相同的。
“抗原结合结构域”或“ABD”在本文中意指对抗原决定簇赋予其结合特异性的抗原结合分子的部分。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广泛的意义上是指特异性结合到抗原决定簇的任何分子。抗原结合分子可以是蛋白质、碳水化合物、脂质或其它化合物。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白和其衍生物或片段，例如Fab和scFv。抗原结合分子的额外实例是受体和配体。
“特异性结合”或“特异性结合到”特定抗原或表位，或“对”特定抗原或表位“有特异性”意指结合可测量地不同于非特异性相互作用。特异性结合可以如下测量：例如相比于对照分子的结合来确定一种分子的结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构分子。例如，特异性结合可以通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定。
特异性结合的强度或亲和力可以根据相互作用的解离常数(KD)表示，其中较小的KD表示较大的亲和力，并且较大的KD表示较低的亲和力。结合特性可以通过所属领域众所周知的方法，例如生物层干涉测量法和基于表面等离振子共振的方法来确定。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原或受体/配体复合物缔合和解离的速率，其中速率取决于复合物搭配物的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，可以确定缔合速率(ka)和解离速率(kd)，并且kd/ka的比例等于解离常数KD(《自然(Nature)》361：186-187(1993)和Davies等人(1990)《生物化学年鉴(Annual RevBiochem)》59：439-473)。
针对特定分子或表位的特异性结合可以例如通过抗原或表位的KD为至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、替代地至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M、或更大的抗原结合分子来展现。通常，特异性结合抗原的抗原结合分子的KD是对照分子相对于抗原或表位大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
另外，可以例如通过抗原或表位的ka或缔合速率对于表位相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍的抗原结合分子来展现对特定分子或表位的特异性结合。
“表位”在本文中意指与特定抗原结合结构域，例如抗体分子的可变区(称为互补位)相互作用的决定子。表位是例如氨基酸或糖侧链的分子的分组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个分子可具有超过一个表位。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖面积内。表位可以是构形的也可以是线性的。构形表位是由来自线性多肽链的不同区段的氨基酸空间并置而产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构形和非构形表位的区别可以在于在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。表位通常包括独特空间构象中的至少3个，并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗原结合分子可以在简单的免疫分析中验证，显示一种抗原结合分子阻断另一种抗原结合分子与靶抗原结合的能力，例如“装箱”。如下所概述，本发明不仅包括本文中所列举的抗原结合分子和抗原结合结构域，还包括与所列举的抗原结合分子或抗原结合结构域结合的表位竞争结合的抗原结合分子和抗原结合结构域。
“融合”或“共价连接”在本文中意指组分(例如，IL-15和Fc结构域)通过肽键直接或经由本文概述的结构域连接子连接。
如本文所用，术语“单链”是指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。
在进一步描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然可以变化。还应理解，在此所使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不旨在为限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
II.抗体
如下所述，通常使用术语“抗体”。可以用于本发明的抗体可以采用如本文所述的多种形式，包括本文所述和图中所描绘的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。
传统的抗体结构单元通常包含四聚体。每种四聚体典型地由相同的两对多肽链组成，每对具有一条“轻链”(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重链”(典型地具有约50-70kDa的分子量)。人类轻链被分类为κ和λ轻链。本发明涉及通常基于IgG类的双特异性抗体，其具有几种子类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，IgG1、IgG2和IgG4比IgG3更频繁地使用。应注意IgG1具有在356(D或E)和358(L或M)处具有多型性的不同同种异型。本文所描绘的序列使用356E/358M同种异型，然而在本文中包括另一同种异型。也就是说，本文所包括的包括IgG1 Fc结构域的任何序列可能具有356D/358L，替换356E/358M同种异型。
此外，本文的多种抗体具有至少一个位置220处的半胱氨酸替换为丝氨酸；通常对本文所描绘的大多数序列而言，这是在“scFv单体”侧，尽管其也可以在“Fab单体”侧，或两者，以减少二硫化物形成。特别包含在本文的序列内的是半胱氨酸替换的(C220S)序列中的一个或两个。
因此，如本文所用，“同型”意指根据其恒定区的化学和抗原特征界定的免疫球蛋白的任一子类。应了解治疗抗体还可以包含同型和/或子类的杂合体。举例来说，如US公开案2009/0163699中所示，其以引用的方式并入，本发明包含使用人类IgG1/G2杂合体。
高变区通常包含来自轻链可变区中约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)的氨基酸残基；Kabat等人，《免疫学相关蛋白质的序列(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)》，第5版.马里兰州贝塞斯达美国国家卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.)(1991)和/或那些形成高变环的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196：901-917。下面描述本发明的特定CDR。
如所属领域的技术人员将了解，CDR的精确编号和布置在不同系统中可以不同。然而，应理解，可变重链和/或可变轻链序列的公开包含相关(固有)CDR的公开。因此，每个重链可变区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个轻链可变区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人，《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27(1)：55-77(2003)：
表2
在通篇本发明说明书中，当提及可变结构域中的残基(大致是轻链可变区中的残基1-107和重链可变区中的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统且Fc区使用EU编号系统(例如Kabat等人，同上(1991))。
重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。本文的“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“铰链结构域”意指包括抗体的第一恒定结构域与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。结构上，IgG CH1结构域结束于EU位置215处，且IgG CH2结构域开始于残基EU位置231处。因此本文中对于IgG而言定义抗体铰链包含位置216(在IgG1中为E216)至230(在IgG1中为p230)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些情况下，使用“铰链片段”，其在铰链结构域的N端和C端中任一个或两个处含有较少氨基酸。如本文所提及，pI变体还可在铰链区中制成。
轻链通常包含两个结构域，即可变轻链结构域(含有轻链CDR并与可变重链结构域一起形成Fv区)和轻链恒定区(通常称为CL或Cκ)。
下文概述的用于其它取代的另一所关注区是Fc区。
本发明提供了大量不同的CDR组。在这种情况下，“完整CDR组”包含三个可变轻链和三个可变重链CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些可以相应地是较大可变轻链结构域或可变重链结构域的一部分。另外，如本文中更全面地概述，当使用重链和轻链时(例如当使用Fab时)，可变重链结构域和可变轻链结构域可以位于单独的多肽链上，或在scFv序列的情况下位于单个多肽链上。
CDR有助于抗体的抗原结合位点，或更具体地说，表位结合位点的形成。“表位”是指与抗体分子可变区中的特定抗原结合位点(称为互补位)相互作用的决定子。表位是如氨基酸或糖侧链的分子的聚组，且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可以具有超过一个表位。
表位可以包含直接涉及结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和未直接涉及结合的其它氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换而言之，氨基酸残基位于特异性抗原结合肽的覆盖区范围内。
表位可以是构形的也可以是线性的。构形表位是由来自线性多肽链的不同区段的氨基酸空间并置而产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构形和非构形表位的区别可以在于在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。
表位典型地包括呈独特空间构象的至少3个且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫分析中验证，展示一种抗体阻断另一种抗体与目标抗原结合的能力，例如“框并”。如下文所概述，本发明不仅包括本文所列举的抗原结合结构域和抗体，还包括竞争与所列举的抗原结合结构域结合的表位结合的抗原结合结构域和抗体。
因此，本发明提供不同的抗体结构域。如本文所述以及所属领域中已知，本发明的异二聚体抗体包括重链和轻链内的不同结构域，其也可以是重叠的。这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重链恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、可变重链结构域、可变轻链结构域、轻链恒定结构域、FAb结构域和scFv结构域。
因此，“Fc结构域”包括-CH2-CH3结构域和任选的铰链结构域(-H-CH2-CH3)。在本文的实施方案中，当scFv连接于Fc结构域时，scFv构建体的C端连接于Fc结构域的全部或部分铰链；例如，其通常连接于是铰链的开始的序列EPKS。重链包含可变重链结构域和恒定结构域，其包括包含CH2-CH3的CH1-任选的铰链-Fc结构域。轻链包括可变轻链结构域和轻链恒定结构域。scFv包括可变重链、scFv连接子以及可变轻链结构域。在本文所概述的大多数构建体和序列中，可变重链的C端连接到scFv连接子的N端，scFv连接子的C端连接到可变轻链的N端(N-vh-连接子-vl-C)，尽管此顺序可以调换(N-vl-连接子-vh-C)。
本发明的一些实施方案包含至少一个scFv结构域，其虽然不是天然存在的，但是通常包括由scFv连接子连接在一起的可变重链结构域和可变轻链结构域。如本文所概述，虽然scFv结构域通常由N端到C端定向为vh-scFv连接子-vl，但是针对任一个scFv结构域(或使用Fab的vh和vl序列构筑的那些)这种定向可以逆向，成为vl-scFv连接子-vh，其中取决于形式)任选的连接子位于一个末端或两个末端。
如本文所示，存在多种可以用于共价连接所列举的结构域的适合的连接子(用作结构域连接子或scFv连接子)，包括传统肽键，其通过重组技术来生成。在一些实施方案中，连接子肽可能主要包含以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。连接子肽应该具有足以连接两个分子的长度，以便其相对于彼此呈现正确的构象，从而使其保留所期望的活性。在一个实施方案中，连接子具有约1到50个氨基酸的长度，优选约1到30个氨基酸的长度。在一个实施方案中，可以使用长度为1个到20个氨基酸的连接子，在一些实施方案中使用约5个到约10个氨基酸。有用的连接子包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为一(并且通常为3到4)的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性连接子。或者，多种非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚环氧烷或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物可以用作连接子。
其它连接子序列可以包括CL/CH1结构域的任何长度的任何序列，但不包括CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。连接子可以来源于免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。连接子可以来源于任何同型的免疫球蛋白重链，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。连接子序列还可以来源于其它蛋白质，如Ig样蛋白质(例如TCR、FcR、KIR)、铰链区源序列，和来自其它蛋白质的其它天然序列。
在一些实施方案中，连接子是“结构域连接子”，其用于将如本文所概述的任何两个域连接在一起。举例来说，可存在将Fab的CH1结构域的C端连接于scFv的N端的结构域连接子，并且另一任选的结构域连接子将scFv的C端连接于CH2结构域(尽管在许多实施方案中，使用铰链作为这个结构域连接子)。虽然可使用任何合适的连接子，许多实施方案利用甘氨酸-丝氨酸聚合物作为结构域连接子，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n以及(GGGS)n，其中n是至少为一(并且通常3到4到5)的整数，以及允许两个域的重组连接并且具有足够长度和柔性以使得每个结构域保留其生物功能的任何肽序列。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，可以使用如在scFv连接子的一些实施方案中使用的带电荷的结构域连接子。
在一些实施方案中，连接子是scFv连接子，用于共价连接如本文所论述的vh结构域和vl结构域。在许多情况下，scFv连接子是带电scFv连接子。
相应地，本发明进一步提供带电scFv连接子，以辅助第一单体与第二单体之间的pI分离。也就是说，通过并入带正或负(或两者，在不同单体上使用scFv的骨架的情况下)电的scFv连接子，由此允许包含带电连接子的单体改变pI而不会在Fc结构域中产生进一步的变化。这些带电连接子可以被取代到含有标准连接子的任何scFv中。此外，如所属领域的技术人员将了解，根据所期望的pI变化，在适当的“链”或单体上使用带电scFv连接子。举例来说，如本文所论述，为了产生三重F形式异二聚体抗体，计算每个所期望抗原结合结构域的Fv区的初始pI，且选择其一来产生scFv，且依据pI选择正性或负性连接子。
带结构域连接子也可以用来增加本发明的单体的p1分离，并因此包括在本文中的那些可以用于利用连接子的本文任何实施方案中。
特定来说，一些形式的抗体，通常称为“异二聚体抗体”，意指蛋白质具有至少两种自组装到异二聚体Fc结构域中的相关Fc序列和至少两个Fv区，无论作为Fab或作为scFv。
III.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本发明的检查点阻断抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类抗体可以包含人类抗体或由人类抗体组成，所述人类抗体包含作为特定种系序列“的产物”或“来源于”特定种系序列的重链或轻链可变区。作为人类生殖系免疫球蛋白序列“的产物”或“来源于”其的人类抗体可以通过将人类抗体的氨基酸序列与人类生殖系免疫球蛋白的氨基酸序列比较且选择与人类抗体的序列在序列方面最接近(也就是说，最大一致性％)的人类生殖系免疫球蛋白序列(使用本文所概述的方法)来鉴别出来。由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变，作为特定人类生殖系免疫球蛋白序列“的产物”或“来源于”特定人类生殖系免疫球蛋白序列的人类抗体与生殖系序列相比可含有氨基酸差异。然而，人源化抗体典型地在氨基酸序列方面与由人类生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％一致，且当相比于其它物种(例如鼠类生殖系序列)的生殖系免疫球蛋白氨基酸序列时，含有将所述抗体标识为来源于人类序列的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体的氨基酸序列与生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95％、96％、97％、98％或99％或甚至至少96％、97％、98％或99％一致。典型地，来源于特定人类生殖系序列的人源化抗体相比于由人类生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列将显示不超过10-20个氨基酸差异(在引入本文的任何歪斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体数目通常较低)。在某些情况下，相比于由生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，人源化抗体可显示不超过5或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异(同样，在引入本文的任何歪斜、pI和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体数目通常较低)。
在一个实施方案中，亲本抗体已经发生亲和成熟，如所属领域中已知。可以利用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟，例如如USSN 11/004,590中所述。基于选择的方法可以用于人类化和/或亲和成熟抗体可变区，包括但不限于以下文献中所述的方法：Wu等人，1999，《分子生物学杂志》294：151-162；Baca等人，1997，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》272(16)：10678-10684；Rosok等人，1996，《生物化学杂志》271(37)：22611-22618；Rader等人，1998，《美国国家科学院院刊》95：8910-8915；Krauss等人，2003，《蛋白质工程化(Protein Engineering)》16(10)：753-759，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。其它人源化方法可涉及仅移植部分CDR，包括但不限于以下文献中所述的方法：USSN 09/810,510；Tan等人，2002，《免疫学杂志》169：1119-1125；De Pascalis等人，2002，《免疫学杂志》169：3076-3084，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。
IV.异二聚体Fc融合蛋白
本发明涉及异二聚体Fc融合蛋白，其包括处于不同方向的IL-15和IL-15受体α(IL-15Rα)蛋白结构域。Fc结构域可以衍生自IgG Fc结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc结构域，其中IgG1 Fc结构域在本发明中特别有用。
每条链的羧基端部分限定主要负责效应功能的恒定区。Kabat等人收集了重链和轻链可变区的许多一级序列。基于序列的保守度，其将单个一级序列分类为CDR和框架并且列出其列表(参见《免疫学相关序列》，第5版，NIH公开案第91-3242号，E.A.Kabat等人，其以引用的方式整体并入本文中)。在整个本发明说明书中，当提及可变结构域中的残基(大致是轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统并且Fc区使用EU编号系统(例如Kabat等人，同上(1991))。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在几种免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(Ig)结构域”在本文中意指具有不同三级结构的免疫球蛋白区域。本发明相关的是重链结构域，包括重链恒定(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的上下文中，IgG同种型各自具有三个CH区。因此，IgG情形下的“CH”结构域如下：“CH1”根据如Kabat中的EU索引是指位置118-215。“铰链”是指根据如Kabat中的EU索引的位置216-230。“CH2”根据如Kabat中的EU索引是指位置231-340，“CH3”根据如Kabat中的EU索引是指位置341-447。如表1中所示，在不同的编号系统中，重链结构域的确切编号和放置可能有所不同。如本文所示和下文所述，pI变体可以在一个或多个CH区以及下文讨论的铰链区中。
重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中意指包含抗体的第一与第二重链恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置215处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置237处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置216(IgG1中的E216)到230(IgGl中的P230)，其中编号根据如Kabat中的EU索引。在一些实施方案中，例如在Fc区的上下文中，包括铰链，通常是指位置216-230。如本文所提及，pI变体还可在铰链区中制成。
因此，本发明提供不同的抗体结构域。如本文所述和所属领域已知，本发明的异二聚体蛋白包含不同结构域，其也可以重叠。这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域和重链恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)。
因此，“Fc结构域”包括-CH2-CH3结构域和任选的铰链结构域。在一些实施方案中，Fc结构域还包括CH1结构域的一部分。在一些实施方案中，当蛋白质片段(例如IL-15或IL-15Rα)连接于Fc结构域时，IL-15或IL-15Rα构建体的C端连接于Fc结构域的全部或部分铰链；例如其通常连接于作为铰链起点的序列EPKS。在本文其它实施方案中，当蛋白质片段(例如IL-15或IL-15Rα)连接于Fc结构域时，蛋白质片段的N端连接于CH3结构域的C端。
在Fc结构域蛋白的一些本文概述的构建体和序列中，IL-15或IL-15Rα蛋白片段的C端连接于结构域连接子的N端，其C端连接到恒定Fc结构域的N端(N-IL-15或IL-15Rα蛋白片段-连接子-Fc结构域-C)，但其可以转换(N-Fc结构域-连接子-IL-15或IL-15Rα蛋白片段-C)。在本文概述的其它构建体和序列中，任选地第一蛋白质片段的C端通过结构域连接子连接于第二蛋白质片段的N端，任选地第二蛋白质片段的C端通过结构域连接子连接于恒定Fc结构域的N端。在本文概述的又其它构建体和序列中，提供不与第一蛋白质片段或第二蛋白质片段连接的恒定Fc结构域。异二聚体Fc融合蛋白可含有两种或更多种本文所述的例示性单体Fc结构域蛋白。在又另一构建体中，任选地第一蛋白质片段的N端通过结构域连接子连接于第二蛋白质片段的C端，任选地第二蛋白质片段的N端通过结构域连接子连接于恒定Fc结构域的C端。
在一些实施方案中，连接子是“结构域连接子”，其用于将如本文概述的任何两个结构域连接在一起，其中一些描绘于图87中。虽然可以使用任何合适的连接子，但许多实施方案使用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少一的整数(并且通常为0到1到2到3到4到5)以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，连接子是带电荷的结构域连接子。
因此，在一些实施方案中，本发明提供异二聚体Fc融合蛋白，其依赖于使用两种不同的重链变体Fc序列，其将自组装以形成异二聚体Fc结构域融合多肽。
在一个实施方案中，异二聚体Fc融合蛋白含有至少两个恒定结构域，其可以被工程化以产生异二聚体，例如pI工程化。可以使用的其它Fc结构域包括含有一个或多个已经过pI工程化的本发明的CH1、CH2、CH3和铰链结构域的片段。特别地，图9A-9G和39A-39D中所描绘的形式是异二聚体Fc融合蛋白，意指所述蛋白质具有自组装成异二聚体Fc结构域和至少一种蛋白质片段(例如，1、2或更多种蛋白质片段)的两个相关联的Fc序列。在一些情况下，第一蛋白质片段与第一Fc序列连接，并且第二蛋白质片段与第二Fc序列连接。在其他情况下，第一蛋白质片段与第一Fc序列连接，并且第一蛋白质片段非共价连接至不与Fc序列连接的第二蛋白质片段。在一些情况下，异二聚体Fc融合蛋白含有与第二蛋白质片段连接的第一蛋白质片段，其与第一Fc序列连接，和第二Fc序列，其不与第一或第二蛋白质片段连接。
本发明涉及新的构建体，以提供允许与一种或多种结合搭配物、配体或受体结合的异二聚体Fc融合蛋白。异二聚体Fc融合构建体基于抗体重链的两个Fc结构域的自组装性质，例如组装成“二聚体”的两个“单体”。异二聚体Fc融合物通过改变如下面更充分讨论的每种单体的氨基酸序列来制备。因此，本发明一般涉及异二聚体Fc融合蛋白的形成，其可以几种方式共同接合结合搭配物或配体或受体，这依赖于每条链上不同的恒定区中的氨基酸变体，以促进异二聚体形成和/或允许异二聚体比同源二聚体更易于纯化。
有许多机制可用于产生本发明的异二聚体。此外，如所属领域的技术人员将了解，这些机制可以组合以确保高度异二聚化。因此，引起异二聚体产生的氨基酸变体称为“异二聚化变体”。如下文所论述，异二聚化变体可以包括空间变体(例如下文所述的“杵和臼”或“歪斜”变体以及下文所述的“电荷对”变体)以及“pI变体”，其允许从异二聚体中纯化同二聚体。正如WO2014/145806(以全文引用的方式并入本文中)中大体所述，并且如下文关于“异源二聚化变体”的论述具体所述，适用的异源二聚化机制包括“杵和臼”(“KIH”；本文中有时称为“偏斜”变体)(参见WO2014/145806中的论述)、如WO2014/145806中所述的“静电转向”或“电荷对”、如WO2014/145806中所述的pI变体，以及如WO2014/145806和下文中所概述的一般其它Fc变体。
在本发明中，存在可以产生易于纯化异二聚体蛋白和抗体的几种基础机制；一种依赖于pI变体的使用，以便每种单体和后续每种二聚体物质具有不同pI，因此允许对A-A、A-B和B-B二聚体蛋白进行等电纯化。可替代地，某些形式还允许基于尺寸进行分离。如下面进一步概述，还可以“偏斜”形成异二聚体而非同源二聚体。因此，空间异源二聚化变体与pI或电荷对变体的组合在本发明中特别有用。
一般来说，本发明中特定使用的实施方案依赖于包括偏斜变体的变体组，其相对于同源二聚化形成促进异源二聚化形成，与pI变体偶联，这增加两种单体与每种二聚体物质之间的pI差异。
另外，如下面更全面概述，取决于异二聚体Fc融合蛋白的形式，pI变体可以含于单体的恒定和/或Fc结构域内，或者可以使用结构域连接子。也就是说，本发明还提供在一种或两种单体上的pI变体，和/或带电荷的结构域连接子。另外，用于替代功能的额外氨基酸工程化也可赋予pI变化，例如Fc、FcRn和KO变体。
在使用pI作为分离机制以允许对异二聚体蛋白纯化的本发明中，可以将氨基酸变体引入一个或两个单体多肽中；即，一种单体(为了简单起见，本文中称为“单体A”)的pI可以加以工程化以与单体B分离，或单体A和B两者都可以改变，其中单体A的pI增加，而单体B的pI降低。如所论述，任一种或两种单体的pI变化可以如下进行：除去或添加带电荷的残基(例如用带正或负电荷的氨基酸残基置换中性氨基酸，例如谷氨酰胺置换成谷氨酸)、将带电荷的残基从正或负电荷变为相反电荷(例如天冬氨酸变为赖氨酸)或将带电荷的残基变为中性残基(例如电荷的失去；赖氨酸变为丝氨酸)。多种这些变体展示于图中。
因此，在本发明的这一实施方案中，提供在至少一种单体中形成足够的pI变化，使得异二聚体可以与同源二聚体分离。如所属领域技术人员将了解，并且如下文进一步所论述，这可通过使用“野生型”重链恒定区和已经工程化成以增加或降低其pI的变体区进行(wt A∶B+或wt A∶B-)，或通过增加一个区并且减少另一区进行(A+∶B-或A-∶B+)。
因此，通常，本发明的一些实施方案的组分是恒定区中的氨基酸变体，其涉及通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)并入一种或两种单体中来改变二聚体蛋白的至少一种(如果不是两种)单体的等电点(pI)。如果两种单体的pI相差小到0.1个pH单位(0.2、0.3、0.4和0.5或更大pH单位都能适用于本发明中)，那么可以实现异二聚体与两种同源二聚体的分离。
如所属领域技术人员将理解，为了获得良好分离而包括在每种或两种单体上的pI变体的数量将部分取决于组分的起始pI。也就是说，为了确定要工程化哪种单体或在哪种“方向”(例如更正或更负)，计算Fc结构域、并且在一些情况下，连接于Fc结构域的蛋白结构域的序列，并且据此作出决定。如所属领域所知，不同的Fc结构域和/或蛋白结构域将具有在本发明中利用的不同起始pI。一般来说，如本文中所概述，pI经过工程化而使得每种单体的总pI差异达到至少约0.1log，如本文中所概述优选0.2到0.5。
此外，如所属领域技术人员将理解和本文概述，在一些实施方案中，异二聚体可以基于尺寸与同源二聚体分离。如图中所示，例如，几种形式允许基于尺寸分离异二聚体和同源二聚体。
在使用pI变体实现异源二聚化的情况下，通过使用Fc结构域的恒定区，提供设计和纯化异二聚体Fc融合蛋白的更模块化方法。因此，在一些实施方案中，必须工程化异源二聚化变体(包括偏斜和纯化异源二聚化变体)。另外，在一些实施方案中，通过导入来自不同IgG同型的pI变体以便在不引入显著免疫原性的情况下改变pI来显著降低pI变体导致免疫原性的可能性。因此，要解决的另一个问题是阐明具有高人类序列含量的低pI恒定结构域，例如在任何特定位置最小化或避免非人类残基。
这种pI工程化可以得到的额外益处也是血清半衰期延长和FcRn结合增加。也就是说，如USSN 13/194,904(以全文引用的方式并入本文中)中所述，降低抗体恒定结构域(包括在抗体和Fc融合物中发现的那些)的pI可导致体内更长的血清滞留。这些用于增加血清半衰期的pI变体也促进用于纯化的pI变化。
另外，应该注意的是，异源二聚化变体的pI变体为Fc融合蛋白的分析和质量控制方法提供额外的益处，因为消除、最小化和区分同源二聚体何时存在的能力是显著的。类似地，可靠地测试异二聚体Fc融合蛋白产生的再现性的能力是重要的。
A.异二聚化变体
本发明提供异二聚体蛋白，包括呈多种形式的异二聚体Fc融合蛋白，其利用异二聚体变体以允许异二聚体形成和/或从同源二聚体纯化。异二聚体融合构建体基于两个Fc结构域的自组装性质，例如组装成“二聚体”的两个“单体”。
存在许多合适的异源二聚化偏斜变体组的对。这些变体以成“对”“组”方式出现。也就是说，将一组对并入第一单体中且将另一组对并入第二单体中。应注意，这些组不一定表现为“臼包杵”型变体，其中一个单体上的残基与另一个单体上的残基之间存在一对一对应；也就是说，组中的这些对形成了两个单体之间的界面，促进了异二聚体形成且阻碍了同型二聚体形成，从而使在生物学条件下自发形成异二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％(25％同型二聚体A/A：50％异二聚体A/B：25％同型二聚体B/B)。
B.空间变体
在一些实施方案中，通过添加空间变体可以辅助异二聚体的形成。也就是说，通过改变每个重链中的氨基酸，不同重链缔合形成异二聚体结构的可能性大于与相同Fc氨基酸序列形成同二聚体的可能性。合适的空间变体包括在USSN 15/141,350的图29中，所有这些文献都以全文引用的方式并入本文中，以及图84中。
一种机制在所属领域通常称为“杵和臼”，是指形成空间影响以利于异二聚体形成和不利于同源二聚体形成的氨基酸工程化，如在USSN 61/596,846，Ridgway等人，《蛋白质工程》9(7)：617(1996)；Atwell等人，《分子生物学杂志》1997 270：26；美国专利第8,216,805号中所述，所有这些都以全文引用的方式并入本文中。附图标识了许多依赖于“杵和臼”的“单体A-单体B”对。另外，如Merchant等人，《自然·生物技术》16：677(1998)中所述，这些“杵和臼”突变可以与二硫键组合以歪斜形成异二聚化。
一种用于产生异二聚体抗体的另一种机制有时称为“静电转向”，如Gunasekaran等人，《生物化学杂志》285(25)：19637(2010)中所述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。这在本文中有时被称作“电荷对”。在这个实施方案中，静电用于使形成偏向异源二聚化。如所属领域技术人员将了解，这些还可以影响pI，并且因此影响纯化，并且因此在一些情况下还可以被视为pI变体。然而，由于这些是为了强制发生异二聚化而产生且不是作为纯化工具使用，因此其被分类为“空间变体”。这些包括但不限于与D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E(例如这些是“单体对应组”)和与C220R/E224R/P228R/K409R配对的C220E/P228E/368E。
其它单体A和单体B变体可以任选地和独立地以任何量与其它变体(例如本文中概述的pI变体或US 2012/0149876的图37中所示的其它空间变体，其所有以引用的方式明确并入本文中)组合。
在一些实施方案中，本文所概述的空间变体可以任选地且独立地与任何pI变体(或其它变体，如Fc变体、FcRn变体等)一起并入一个或两个单体中，且可以独立地且任选地包含于本发明的蛋白质中或从本发明的蛋白质中排除。
在图3A-3E中找到合适的偏斜变体的列表。在多个实施方案中，特别适用的组中的对，其包含(但不限于)S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L、K370S：S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V：T366W(任选地包括二硫桥键，T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)。就命名法而言，对“S364K/E357Q：L368D/K370S”意指单体中的一者具有双变体组S364K/E357Q并且另一者具有双变体组L368D/K370S；如上文所提及，这些对的“链型”取决于起始pI。
C.用于异二聚体的pI(等电点)变体
一般来说，如所属领域的技术人员将了解，pI变体存在两种通用类别：提高蛋白质pI(碱性变化)的变体和降低蛋白质pI(酸性变化)的变体。如本文所述，可以使用这些变体的所有组合：一种单体可以是野生型，或者不显示与野生型显著不同的pI的变体，并且另一种可以是更碱性或更酸性的。可替代地，可以改变每种单体，一种更碱性，并且一种更酸性。
pI变体的优选组合展示于USSN 15/141,350的图30中，所有这些文献都以全文引用的方式并入本文中。如本文所概述且如图中所示，这些变化是相对于IgG1展示，而且所有同型以及同型杂合体均可以按此方式改变。在重链恒定域来自IgG2-4的情况下，也可以使用R133E和R133Q。pI变体如图4所示。
在一个实施方案中，如果Fc单体之一包括CH1结构域，那么pI变体的优选组合具有包含208D/295E/384D/418E/421D变体(当相对于人类IgG1时为N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)的一种单体。在一些例子中，第二单体包含带正电荷的结构域连接子，包括(GKPGS)4。在一些情况下，第一单体包括CH1结构域，包括位置208。因此，在不包括CH1结构域的构建体中(例如对于在其中一个结构域上不利用CH1结构域的异二聚体Fc融合蛋白)，优选的负pI变体Fc组包括295E/384D/418E/421D变体(当相对于人类IgG1时为Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
在一些实施方案中，突变在Fc结构域的铰链结构域中进行，包括位置216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229和230。因此，pI突变和特别是取代可以在位置216-230中的一个或多个中进行，其中1、2、3、4或5个突变可用于本发明。同样，单独或与其它结构域中的其它pI变体一起考虑所有可能的组合。
可用于降低铰链结构域的pI的特定取代包括但不限于位置221处的缺失、位置222处的非天然缬氨酸或苏氨酸、位置223处的缺失、位置224处的非天然谷氨酸、位置225处的缺失、位置235处的缺失和位置236处的缺失或非天然丙氨酸。在一些情况下，仅在铰链结构域中进行pI取代，并且在其它情况下，这些取代以任何组合添加到其它结构域中的其它pI变体。
在一些实施方案中，可以在CH2区域中进行突变，包括位置233、234、235、236、274、296、300、309、320、322、326、327、334和339。同样，可以对这14个位置进行所有可能的组合；例如，pI抗体可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CH2 pI取代。
可用于降低CH2结构域的pI的特定取代包括但不限于位置274处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置296处的非天然苯丙氨酸、位置300处的非天然苯丙氨酸、位置309处的非天然缬氨酸、位置320处的非天然谷氨酸、位置322处的非天然谷氨酸、位置326处的非天然谷氨酸、位置327处的非天然甘氨酸、位置334处的非天然谷氨酸、位置339处的非天然苏氨酸以及CH2和其它结构域内的所有可能组合。
在这个实施方案中，突变可以独立地和任选地选自位置355、359、362、384、389、392、397、418、419、444和447。可用于降低CH3结构域的pI的特定取代包括但不限于位置355处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置384处的非天然丝氨酸、位置392处的非天然天冬酰胺或谷氨酸、位置397处的非天然蛋氨酸、位置419处的非天然谷氨酸、位置359处的非天然谷氨酸、位置362处的非天然谷氨酸、位置389处的非天然谷氨酸、位置418处的非天然谷氨酸、位置444处的非天然谷氨酸和位置447处的缺失或非天然天冬氨酸。
D.同型变体
另外，本发明的许多实施方案依赖于将来自一种IgG同型的特定位置的pI氨基酸“引进”另一种IgG同型中，从而减少或排除变体中引入非所需免疫原性的可能性。这些的许多示于美国公开申请第2014/0370013号的图21中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。也就是说，IgGl是治疗性抗体的常见同型，其原因有多种，包括高效应功能。然而，IgG1的重链恒定区具有比IgG2的重链恒定区更高的pI(8.10相对于7.31)。通过将特定位置的IgG2残基引入IgG1骨架中，使得所得单体的pI降低(或提高)且另外展现出较长的血清半衰期。举例来说，IgG1在位置137处具有甘氨酸(pI 5.97)，并且IgG2具有谷氨酸(pI 3.22)；导入谷氨酸会影响所得蛋白质的pI。如下所述，通常需要许多氨基酸取代来显著影响变体Fc融合蛋白的pI。然而，应该注意，如下文所论述，即使IgG2分子的变化也允许增加血清半衰期。
在其它实施方案中，进行非同型氨基酸变化，以减少所得蛋白质的总电荷状态(例如通过将更高的pI氨基酸变为更低的pI氨基酸)，或允许在结构中调节稳定性等等，如下文进一步描述。
此外，通过pI工程化重链和轻链恒定结构域，可以看到异二聚体的每种单体的显著变化。如本文所论述，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电点聚焦或对等电点敏感的其它方法来实现分离。
E.计算pI
每种单体的pI可以依赖于变体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，包括变体重链恒定结构域和融合搭配物。因此，在一些实施方案中，使用美国公开申请第2014/0370013号的图19中的图表，基于变体重链恒定结构域计算pI的变化。如本文所讨论，要工程化的单体通常由每种单体的固有pI决定。
F.还赋予更好的FcRn体内结合的pI变体
在pI变体降低单体pI的情况下，其可以具有改善体内血清滞留时间的额外好处。
虽然仍处于审查，但是相信Fc区使体内半衰期延长，原因是在核内体中在pH 6结合到FcRn隔绝了Fc(Ghetie和Ward，1997《今日免疫学(Immunol Today)》18(12)：592-598，此文献完全并入本文供参考)。随后内体隔室使Fc再循环到细胞表面。一旦区室打开到细胞外空间，较高的pH(约7.4)诱导Fc释放回到血液中。Dall′Acqua等人表明，在小鼠中，在pH 6和pH 7.4下的FcRn结合增加的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度以及与野生型Fc相同的半衰期(Dall′Acqua等人，2002，《免疫学杂志》169：5171-5180，其以引用的方式整体并入本文中)。Fc对FcRn的亲和力在pH 7.4增强被认为是禁止了Fc释放回到血液中。因此，延长Fc体内半衰期的Fc突变理想地增强了较低pH下的FcRn结合，同时仍允许Fc在较高pH下释放。在6.0到7.4的pH范围内，氨基酸组胺酸的电荷状态发生变化。因此，在Fc/FcRn复合物中的重要位置找到His残基并不出乎意料。
G.用于额外功能的额外Fc变体
除pI氨基酸变体之外，可以出于多种原因(包括但不限于改变与一种或多种FcγR的结合、改变与FcRn的结合等)而产生多个适用的Fc氨基酸修饰。
相应地，本发明的蛋白质可以包括氨基酸修饰，包括本文所概述的异二聚化变体，包括pI变体和空间变体。每组变体可以独立地且任选地包括于任何特定异二聚体蛋白质中或从任何特定异二聚体蛋白质中排除。
H.FcγR变体
相应地，可以产生多个适用的Fc取代来改变与一种或多种Fcγ受体的结合。导致结合增加以及结合减少的取代可能是有用的。举例来说，已知与FcγRIIIa的结合增加引起ADCC增加(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别目标细胞上的所结合抗体且随后促使目标细胞溶解)。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb的结合减弱(抑制性受体)也可能是有利的。可以用于本发明中的氨基酸取代包括USSN 11/124,620(尤其是图41)、11/174,287、11/396,495、11/538,406中列出的氨基酸取代，所有这些文献全文以及尤其是针对其中所揭露的变体所述内容特此并入本文中供参考。可以使用的特定变体包括但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。
另外，增加对FcγRIIc的亲和力的氨基酸取代也可包括在本文概述的Fc结构域变体中。举例来说，USSN 11/124,620和14/578,305中描述的取代是有用的。
另外，存在额外的Fc取代，其可用于增加与FcRn的结合和增加血清半衰期，如具体公开于USSN 12/341,769中，以全文引用的方式并入本文中，包括但不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I or V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。
I.消融变体
类似地，另一类功能变体是“FcγR消融变体”或“Fc基因剔除(FcKO或KO)”变体。在这些实施方案中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合，以避免其它作用机制。即，例如，在许多实施方案中，特别是在使用免疫调节蛋白时，期望消融FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性，使得一个Fc结构域包含一个或多个Fcγ受体消融变体。这些消融变体在USSN 15/141,350的图31中描绘，所有文献以全文引用的方式并入本文中，并且每一个都可以独立地和任选地被包括或排除，其中优选的方面利用选自由以下组成的群组的消融变体：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。应注意本文中提及的消融变体消融FcγR结合，但是通常不消融FcRn结合。消融FcγR结合的有用消融变体(有时称为“敲除”或“KO”变体)如图5所示。
J.异二聚体变体与Fc变体的组合
如所属领域的技术人员将了解，所述异二聚化变体(包括歪斜和/或pI变体)全部可以任选地且独立地按任何方式组合，只要其保持其“链型”或“单体分区”。另外，所有这些变体可以按任一种异二聚化形式组合。
在pI变体的情况下，虽然图中展示了可以特别使用的实施方案，但是可以根据改变两种单体之间的pI差异以辅助纯化的基本规则来产生其它组合。
另外，任何异源二聚化变体、偏斜和pI也可独立地和任选地与如本文一般概述的Fc消融变体、Fc变体、FcRn变体组合。
另外，单体Fc结构域可包含一组氨基酸取代，其包括C220S/S267K/L368D/K370S或C220S/S267K/S364K/E357Q。
另外，异二聚体Fc融合蛋白可包含偏斜变体(例如，如USSN 15/141,350的图IA-1C中所示的一组氨基酸取代，所有文献以全文引用的方式并入本文中)，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的群组：S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L：K370S：S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V：T366W；和T366S/L368A/Y407V：T366W(任选地包括桥接二硫化物，T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)、任选的消融变体、任选的带电荷的结构域连接子；和任选的pI变体。
在一些实施方案中，根据EU索引，Fc结构域包含一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：236R、S239D、S239E、F243L、M252Y、V259I、S267D、S267E、S67K、S298A、V308F、L328F、L328R、330L、I332D、I332E、M428L、N434A、N434S、236R/L328R、S239D/I332E、236R/L328F、V259I/V308F、S267E/L328F、M428L/N43S、Y436I/M428L、N436V/M428L、V436I/N434S、Y436V/N434S、S239D/I332E/330L、M252Y/S54T/T256E、V259I/V308F/M428L、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del和E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
在一个实施方案中，可用于本发明的偏斜和pI变体的特定组合是T366S/L368A/Y407V：T366W(任选地包括桥接二硫化物，T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)，其中一种单体包含Q295E/N384D/Q418E/N481D和另一个带正电荷的结构域连接子。如所属领域所理解，“臼包杵”型变体不改变pI，并且因此可用于任一单体。
在某些实施方案中，Fc结构域包括包含M428L/N434S的氨基酸取代。在一些实施方案中，未靶向的IL-15/Rα异二聚体Fc融合蛋白的每个Fc结构域包括包含M428L/N434S的氨基酸取代。
图6A-6E提供了包含本文所述的IL-15和IL-15Rα蛋白的异二聚体Fc融合蛋白的Fc结构域的有用实施方案。
V.IL-15和IL-15Rα蛋白结构域
本发明提供了含有IL-15和IL-15Rα蛋白的异二聚体Fc融合蛋白。如图所示，IL-15复合物可以采用几种形式。如上所述，IL-15蛋白本身不如与IL-15Rα蛋白复合时稳定。如本领域所知，IL-15Rα蛋白含有“sushi结构域”，它是保留IL-15结合活性的受体的最短区域。因此，尽管可以制备包含整个IL-15Rα蛋白的异二聚体融合蛋白，但本文的优选实施方案包括仅使用寿司结构域的复合物，其序列示于图中。
因此，IL-15复合物通常包含IL-15蛋白和IL-15Rα的寿司结构域(除非另有说明使用全长序列，否则“IL-15Rα”、“IL-15Rα(寿司)”和“寿司”在整个本文中可互换使用。该复合物可以以三种不同的形式使用。如图9A、9C、9D和9F所示，IL-15蛋白和IL-15Rα(寿司)不是共价连接的，而是通过规则配体-配体相互作用自组装。如本文更全面描述的，它可以是与Fc结构域共价连接的IL-15结构域或寿司结构域(通常使用任选的结构域连接子)。可替代地，它们可以使用如图9B、9E和9G所示的结构域连接子共价连接。图9B将寿司域描述为N末端结构域，尽管这可以颠倒。最后，IL-15和寿司结构域中的每一个都可以被设计成含有半胱氨酸氨基酸，其形成二硫键以形成复合物，如图39A-39D中一般地显示，同样，其中IL-15结构域或寿司结构域(使用任选的结构域连接子)与Fc结构域共价连接。
在一些实施方案中，人类IL-15蛋白具有NCBI参考序列第NP_000576.1号或SEQ IDNO：1中所阐述的氨基酸序列。在一些情况下，人类IL-15的编码序列阐述于NCBI参考序列第NM_000585号中。本文概述的Fc融合异二聚体蛋白的例示性IL-15蛋白可具有SEQ ID NO：2(成熟IL-15)的氨基酸序列或SEQ ID NO：1的氨基酸49-162。在一些实施方案中，IL-15蛋白具有与SEQ ID NO：2至少90％、例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在一些实施方案中，IL-15蛋白质具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列和一个或多个选自C42S，L45C，Q48C，V49C，L52C，E53C，E87C和E89C的氨基酸取代。Fc融合蛋白的IL-15蛋白可具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸取代。
氨基酸取代可以是IL-15：IL-2β和IL-15：共同γ链界面处的等排取代。在一些实施方案中，人IL-15蛋白例如人成熟IL-15蛋白具有一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D、Q108E和其任何组合。在一些实施方案中，Fc融合蛋白的人IL-15蛋白具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代N4D/N65D。在一些情况下，Fc融合蛋白的人IL-15蛋白与包括N4D/N65D取代的SEQ ID NO：2具有至少97％或98％的序列同一性。在一些实施方案中，Fc融合蛋白的人IL-15蛋白具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代D30N/N65D。在一些情况下，Fc融合蛋白的人IL-15蛋白与包括D30N/N65D取代的SEQ ID NO：2具有至少97％或98％的序列同一性。在一些实施方案中，Fc融合蛋白的人IL-15蛋白具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。在一些情况下，Fc融合蛋白的人IL-15蛋白与包括D30N/E64Q/N65D取代的SEQ ID NO：2具有至少96％或97％的序列同一性。
在一些实施方案中，人IL-15蛋白，例如Fc融合蛋白的人成熟IL-15蛋白，与SEQ IDNO：2的氨基酸序列相同。在某些情况下，人IL-15蛋白(例如人成熟IL-15蛋白)没有氨基酸取代。
在一些实施方案中，人成熟IL-15变体蛋白具有一个或多个氨基酸突变(例如，取代、插入和/或缺失)。在某些情况下，该突变引入了半胱氨酸残基，该残基可以与人IL-15受体α(IL-15Rα)蛋白形成二硫键。
在一些实施方案中，人类IL-15受体α(IL-15Rα)蛋白具有NCBI参考序列第NP_002180.1号或SEQ ID NO：3中所阐述的氨基酸序列。在一些情况下，人类IL-15Rα的编码序列阐述于NCBI参考序列第NM_002189.3号中。本文概述Fc融合异二聚体蛋白的IL-15Rα蛋白的例示性可包含SEQ ID NO：3的寿司结构域(例如，SEQ ID NO：3的氨基酸31-95)或由其组成，或换句话说，SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-15Rα蛋白具有SEQ IDNO：4的氨基酸序列和选自由以下组成的群组的氨基酸插入：D96、P97、A98、D96/P97、D96/C97、D96/P97/A98、D96/P97/C98和D96/C97/A98，其中氨基酸位置是相对于全长人类IL-15Rα蛋白或SEQ ID NO：3。举例来说，可以将例如D(例如Asp)、P(例如Pro)、A(例如Ala)、DP(例如Asp-Pro)、DC(例如Asp-Cys)、DPA(例如Asp-Pro-Ala)、DPC(例如Asp-Pro-Cys)或DCA(例如Asp-Cys-Ala)的氨基酸添加到SEQ ID NO：4的IL-15Rα蛋白的C端。在一些实施方案中，IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列和一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：K34C、A37C、G38C、S40C和L42C，其中氨基酸位置是相对于SEQ ID NO：4。SEQ ID NO：4的IL-15Rα(寿司)蛋白可具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个氨基酸突变(例如，取代、插入和/或缺失)。
SEQ ID NO：1是
SEQ ID NO：2是
SEQ ID NO：3是
SEQ ID NO：4是
在一些实施方案中，本发明提供了包含具有氨基酸变体D30N的人IL-15变体的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和D30N取代。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和至少D30N取代。
在一些实施方案中，本发明提供了包含具有氨基酸变体N1D的人IL-15变体的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和N1D取代。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和至少N1D取代。
在一些实施方案中，本发明提供了包含具有氨基酸变体N4D的人IL-15变体的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和N4D取代。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和至少N4D取代。
在一些实施方案中，本发明提供了包含具有氨基酸变体E64Q的人IL-15变体的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和E64Q取代。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和至少E64Q取代。
在一些实施方案中，本发明提供了包含具有氨基酸变体E65Q的人IL-15变体的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和E65Q取代。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和至少E65Q取代。
在一些实施方案中，本发明提供了包含具有氨基酸取代N1D/D30N的人IL-15变体的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和N1D/D30N取代。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和至少N1D/D30N取代。
在一些实施方案中，本发明提供了包含具有氨基酸取代N4D/D30N的人IL-15变体的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2和N4D/D30N取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和至少N4D/D30N取代。
在一些实施方案中，本发明提供了包含具有氨基酸取代D30N/E64Q的人IL-15变体的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质包含SEQ ID NO：2和D30N/E64Q取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和至少D30N/E64Q取代。
在一些实施方案中，本发明提供了包含具有氨基酸取代D30N/N65D的人IL-15变体的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和D30N/N65D取代。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和至少D30N/N65D取代。
在一些实施方案中，本发明提供了包含具有氨基酸取代D30N/E64Q/N65D的人IL-15变体的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和D30N/E64Q/N65D取代。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和至少D30N/E64Q/N65D取代。
VI.结构域连接子
在一些实施方案中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白通过连接子连接在一起。任选地，蛋白质不通过连接子连接。在其它实施方案中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白是非共价连接的。
在一些实施方案中，IL-15蛋白通过连接子与Fc结构域连接。在某些实施方案中，IL-15蛋白直接连接至Fc结构域，例如没有连接子。在特定的实施方案中，IL-15蛋白经由铰链区或其片段连接至Fc结构域。在一些实施方案中，IL-15Rα蛋白通过连接子连接至Fc结构域。在其他实施方案中，IL-15Rα蛋白直接连接至Fc结构域，例如不用连接子。在特定的实施方案中，IL-15Rα蛋白通过铰链区或其片段连接至Fc结构域。在某些情况下，不使用连接子将IL-15蛋白或IL-15Rα蛋白连接至Fc结构域。
在一些实施方案中，连接子是“结构域连接子”，其用于将如本文所概述的任何两个域连接在一起。虽然可以使用任何合适的连接子，但许多实施方案使用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少0的整数(并且通常为0到1到2到3到4到5)以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。在某些情况下，有用的连接子包括(GGGGS)0或(GGGGS)1或(GGGGS)2。有用的结构域连接子如图7所示。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，可以如本文所讨论和图7和本文中所示使用带电荷的结构域连接子。
VII.本发明的适用形式
如图9A-9G和图39A-39D所示，本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白有许多有用的形式。一般而言，本发明的异二聚体融合蛋白具有两个功能成分：IL-15/IL-15Rα(寿司)成分和Fc成分，它们都可以采取本文概述的不同形式，并且都可以与任何配置中的其他成分结合。
第一和第二Fc结构域可以具有选自以下的一组氨基酸取代：a)S267K/L368D/K370S：S267K/LS364K/E357Q；和b)S364K/E357Q：L368D/K370S；c)L368D/K370S：S364K；d)L368E/K370S：S364K；e)T411E/K360E/Q362E：D401K；f)L368D/K370S：S364K/E357L和g)K370S：S364K/E357Q(根据EU编号)。在一些实施方案中，第一Fc结构域具有L368D/K370S取代，并且第二Fc结构域具有S364K/E357Q取代。在一些实施方案中，第一Fc结构域具有S364K/E357Q取代，并且第二Fc结构域具有L368D/K370S取代。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。
任选地，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。
任选地，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有用于半衰期延长的428L/434S变体。在一些情况下，第一和/或第二Fc结构域具有延长半衰期的M428L/N434S变体。在一些实施方案中，第一Fc结构域具有M428L/N434S取代，并且第二Fc结构域具有M428L/N434S取代
A.IL-15/Rα-异源Fc形式
在该实施方案中，如图9A所示，异二聚体融合蛋白包含两个单体(两个Fc单体)。第一单体包含(从N末端到C末端)IL-15-任选的结构域连接子-CH2-CH3，其中结构域连接子有时包含全部或部分的铰链。第二单体包含IL-15/Rα(寿司)结构域-任选的结构域连接子-CH2-CH3，其中结构域连接子有时包含全部或部分的铰链。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，一个优选的实施方案利用了偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在一些情况下，L368D/K370S变体在第一单体上，而S354K/E357Q变体在第二单体上。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15D30N/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6A所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15D30N/N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 D30N/N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6A所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15D30N/E64Q/N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N4D变体。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N4D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6A所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N65D变体。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6A所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15N4D/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6A所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D/N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D/N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6A所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 Q108E变体。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 Q108E变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15 Q108E变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15 Q108E变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 Q108E变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 Q108E变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 Q108E变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6A所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 Q108E变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15RR(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15Q108E变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选实施方案利用IL-15野生型变体。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选实施方案利用IL-15野生型变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15野生型变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15野生型变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15野生型变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6A所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15野生型变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15野生型变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选实施方案显示在WO2018/071919中：图48A(包含链1(17693)和链2(15908)的XENP22822)，图94A(包含链1和链2的XENP23504)，图104AO(包含链1和链2的XENP24045)，图104AQ(包含链1和链2的XENP24306)，图48A(包含链1和链2的XENP22821)，图94A(包含链1和链2的XENP23343)，图104AJ(包括链1和链2的XENP23557)，图104AP(包括链1和链2的XENP24113)，图104AP(包括链1和链2的XENP24051)，图104AR(包括链1和链2的XENP24341)，图104AP(包括链1和链2的XENP24052)，以及图104AP(包括链1和链2的XENP24301)，所有这些均通过引用整体并入本文。
在IL-15/Rα-异源Fc形式中，优选实施方案显示在图10中(包括链1(15902)和链2(15908)的XENP22822)和(包括链1(16479)和链2(16481)的XENP21475))。
B.scIL-15-Rα-Fc
在该实施方案中，如图9B所示，异二聚体融合蛋白包含两个单体。第一单体包含(从N末端到C末端)IL-15/Rα(寿司)-结构域连接子-IL-15-任选的结构域连接子-CH2-CH3，其中该结构域连接子有时包含全部或部分的铰链。第二单体包含和“空”Fc，其包含铰链-CH2-CH3的全部或部分。这被称为“scIL-15/Rα-Fc”，“sc”代表“单链”(例如，IL-15/Rα寿司复合物)。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S，并且在每个Fc单体上使用428L/434S变体。在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S，并且在每个Fc单体上使用M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15D30N/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；以及Fc单体，其包含图6B所示的氨基酸取代。在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 D30N/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；scIL-15/Rα-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 D30N/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；scIL-15/Rα-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15D30N/E64Q/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；以及Fc单体，其包含图6B所示的氨基酸取代。在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；scIL-15/Rα-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；scIL-15/Rα-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N65D变体。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；以及Fc单体，其包含图6B所示的氨基酸取代。在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；scIL-15/Rα-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；scIL-15/Rα-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N4D/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；以及Fc单体，其包含图6B所示的氨基酸取代。在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N4D/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；scIL-15/Rα-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N4D/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；scIL-15/Rα-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；以及Fc单体，其包含图6B所示的氨基酸取代。在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；scIL-15/Rα-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体和IL-15Rα(寿司)结构域；scIL-15/Rα-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案包括XENP21478，其包括链1(16478)和链2(8924)，并且如图11所示。该形式的其他实施方案包括XENP21993、XENP21994、XENP21995、XENP23174、XENP23175、XENP24477和XENP24480，并在WO2018071919中显示在图104G、104H、104AG、104AU和104AV中，氨基酸序列分别见于SEQ ID NOS：514-518、519-523、524-528、849-853、1063-1067和1078-1082中。
C.ncIL-15/Rα-Fc
在该实施方案中，如图9C所示，异二聚体融合蛋白包含三个单体。第一单体包含(从N末端到C末端)IL-15/Rα(寿司)-结构域连接子-CH2-CH3，其中该结构域连接子有时包含全部或部分的铰链。第二单体包含和“空”Fc，其包含铰链-CH2-CH3的全部或部分。第三单体是IL-15。这被称为“ncIL-15/Rα-Fc”，“nc”代表“非共价”)。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，一个优选的实施方案利用了偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6C所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体；IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N4D变体。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N4D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N4D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6C所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N4D变体；IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N65D变体。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6C所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N65D变体；IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6C所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N4D/N65D变体；IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在ncIL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在ncIL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6C所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体；IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15变体Q108E。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15变体Q108E和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15变体Q108E和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15变体Q108E和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 Q108E变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6C所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 Q108E变体、IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15 Q108E变体；IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15野生型变体。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15野生型变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在ncIL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15野生型变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在ncIL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15野生型变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15野生型变体、IL-15Rα(寿司)结构域和包含图6C所示氨基酸取代的Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15野生型变体、IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含单链，其包含人成熟IL-15野生型变体；IL-15Rα(寿司)结构域；空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在ncIL-15/Rα-异源Fc形式中，优选的实施方案显示在WO2018071919中的图104AS(包括链1和链2的XENP24349)和图104AT(包括链1和链2的XENP24383)中，所有这些均通过引用整体并入本文。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案显示在图12A和图12B中，例如XENP21479，其包括链1(16484)和链2(8793)和链3(16481)；XENP22366，其包括链1(16478)和链2(8924)和链3()；和XENP22366，包括链1(16484)和链2(8793)和链3(15908)；和XENP24348。
D.二价nclL-15/Rα-Fc
在该实施方案中，如图9D所示，同型二聚体融合蛋白包含四个单体。第一和第二单体包含(从N末端到C末端)IL-15/Rα(寿司)-结构域连接子-CH2-CH3，其中该结构域连接子有时包含全部或部分的铰链。第三和第四单体包含IL-15。这被称为“二价ncIL-15/Rα-Fc”，“nc”代表“非共价”)。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，一个优选的实施方案利用了偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 D30N/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6C所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15 D30N/N65D变体；第一IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及第二IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15D30N/N65D变体；第一IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；以及第二IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N65D变体。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6C所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15 N65D变体；第一IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及第二IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15 N65D变体；第一IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；以及第二IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6C所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15 N1D/N65D变体；第一IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及第二IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15N1D/N65D变体；第一IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；以及第二IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 Q108E变体。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 Q108E变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15 Q108E变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 Q108E变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 Q108E变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6C所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15 Q108E变体；第一IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及第二IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-Q108E变体；第一IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；以及第二IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15野生型变体。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15野生型变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15野生型变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15野生型变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15野生型变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6C所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15野生型变体；第一IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；以及第二IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-野生型变体；第一IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(寿司)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；以及第二IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含人IL-15Rα(消融)结构域，以及Fc单体，其包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案显示在WO2018071919中的图104E中(包括链1和链2的XENP21979)，并在序列表中为SEQ ID NOS：480-483，所有这些均在本文中通过引用整体并入。
在二价ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案如图13所示，例如XENP21978，其包括链1(17023)和链2(16484)。
E.二价scIL-15/Rα-Fc
在该实施方案中，如图9e所示，同型二聚体融合蛋白包含两个单体。第一和第二单体包含(从N末端到C末端)IL-15/Rα(寿司)-结构域连接子-IL-15-任选的结构域连接子-CH2-CH3，其中该结构域连接子有时包含铰链的全部或部分。这被称为“二价scIL-15/Rα-Fc”，“sc”代表“单链”(例如，IL-15/Rα寿司复合物的)。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，一个优选的实施方案利用了偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15 D30N/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。
在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15D30N/N65D变体、两个IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6D所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15D30N/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 D30N/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 D30N/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 D30N/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、两个IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6D所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N65D变体。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用在每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15N65D变体、两个IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6D所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15 N4D/N65D变体、两个IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6D所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N4D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N4D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N4D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15N4D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15 N1D/N65D变体、两个IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6D所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N1D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N1D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N1D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15N1D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 Q108E变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15 Q108E变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。
在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15 Q108E变体、两个IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6D所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 Q108E变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 Q108E变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 Q108E变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 Q108E变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15野生型变体。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15野生型变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15野生型变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15野生型变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含两个人成熟IL-15野生型变体、两个IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6D所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N1D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N1D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，二价scIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含第一IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N1D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和第二IL-15/Rα(寿司)-Fc单体，其包含与人IL-15Rα(寿司)结构域连接的人成熟IL-15 N1D/N65D变体，其连接至Fc单体，Fc单体包含氨基酸取代C220S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在二价scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案如图14所示。
F.Fc-ncIL-15/Rα
在该实施方案中，如图9F所示，异二聚体融合蛋白包含三个单体。第一单体(从N末端到C末端)包含CH2-CH3-结构域连接子-IL-15/Rα(寿司)，其中Fc包含铰链的全部或部分。第二单体包含和“空”Fc，其包含铰链-CH2-CH3的全部或部分。第三单体是IL-15。这被称为“ncIL-15/Rα-Fc”，“nc”代表“非共价”)。
在ncIL-15/Rα-Fc(或Fc-ncIL-15/Rα)形式中，一个优选的实施方案利用了偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15 D30N/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15 D30N/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 D30N/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 D30N/N65D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 D30N/N65D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15 N4D变体。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15 N4D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N4D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 N4D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15N4D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15 N65D变体。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15 N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在ncIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 N65D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15N65D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 N4D/N65D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 N4D/N65D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 N1D/N65D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 N1D/N65D变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在ncIL-15/Rα-Fc形式中，一个优选的实施方案利用了偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15 Q108E变体。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15 Q108E变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15 Q108E变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15 Q108E变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 Q108E变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 Q108E变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15 Q108E变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15野生型变体。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15野生型变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15野生型变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15野生型变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人成熟IL-15野生型变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15野生型变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白包含人IL-15野生型变体，包含与Fc单体的C末端连接的人IL-15Rα(寿司)结构域的Fc-IL-15/Rα(寿司)单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，包括XENP22638的优选实施方案显示在WO2018071919中的图104T中以及在序列表中为SEQ ID NOS：668-672，其全部通过引用整体并入本文。
在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选实施方案包括XENP22637作为链1(17603)和链2(8927)和链3(16484)并且如图15所示。
G.Fc-scIL-15/Rα
在该实施方案中，如图9G所示，异二聚体融合蛋白包含两个单体。第一单体(从N末端到C末端)包含CH2-CH3-任选的结构域连接子-IL-15/Rα(寿司)-结构域连接子-IL-15，其中Fc包含铰链的全部或部分。第二单体包含和“空”Fc，其包含铰链-CH2-CH3的全部或部分。这被称为“Fc-scIL-15/Rα”或“scIL-15/Rα-Fc”，“sc”代表“单链”(例如，IL-15/Rα寿司复合物的)。
在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含人成熟IL-15变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，一个优选的实施方案利用了偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15 D30N/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15 D30N/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含人成熟IL-15 D30N/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 D30N/N65D变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 D30N/N65D变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15 D30N/E64Q/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15 N65D变体。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15 N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含人成熟IL-15 N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 N65D变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 N65D变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15 N4D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N4D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含人成熟IL-15 N4D/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 N4D/N65D变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 N4D/N65D变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15 N1D/N65D变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用每个Fc单体上的IL-15 N1D/N65D变体、偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含人成熟IL-15 N1D/N65D变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 N1D/N65D变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 N1D/N65D变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15变体Q108E。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15变体Q108E和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S。在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15变体Q108E和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15变体Q108E和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含人成熟IL-15 Q108E变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 Q108E变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代
P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15 Q108E变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用IL-15野生型变体。
在Fc-scIL-15/Rα形式中，优选实施方案利用IL-15野生型变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15野生型变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和428L/434S变体。在Fc-ncIL-15/Rα形式中，优选的实施方案利用两个Fc单体上的IL-15野生型变体和偏斜变体对S364K/E357Q：L368D/K370S和M428L/N434S变体。
在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含人成熟IL-15野生型变体、IL-15Rα(寿司)结构域；和包含图6E所示氨基酸取代的两个Fc单体。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15野生型变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，Fc-scIL-15/Rα融合蛋白包含Fc-IL-15/Rα(寿司)结构域，其包含Fc单体，该Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体L368D/K370S、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S，使得Fc结构域连接至与人成熟IL-15野生型变体连接的人IL-15Rα(寿司)结构域；和空-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI变体S364K/E357Q、等排pI取代P217R/P228R/N276K、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N343S。
在scIL-15/Rα-Fc形式中，优选的实施方案如图16所示。
VIII.本发明的具体实施方案
本文提供了包含不同形式的非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白和检查点阻断抗体的组合物。还提供了包括给受试者例如人受试者施用非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白和检查点阻断抗体的方法。
在一些实施方案中，本文描述的组合物的检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自由纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗。
在一些实施方案中，本文描述的组合物的非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白以本文描述的形式组织，例如IL-15/IL-15Rα-异源Fc形式、scIL-15/Rα-Fc形式、ncIL-15/Rα-Fc形式、二价ncIL-15/Rα-Fc形式、二价scIL-15/Rα-Fc形式、Fc-ncIL-15/Rα形式、或Fc-scIL-15/Rα形式。在一些实施方案中，非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白具有IL-15/IL-15Rα-异源Fc形式。
在一些实施方案中，所述组合物的非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白具有IL-15/IL-15Rα-异源Fc形式，并包含人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白包含人成熟IL-15 N65D变体；人IL-15Rα(寿司)结构域；IL-15-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和IL-15Rα(寿司)-Fc单体，其包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含抗PD-1抗体和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI0取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，所述组合物包含抗PD-1抗体和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含纳武单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，本文所述组合物或方法包含纳武单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含派姆单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，所述组合物包含派姆单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含匹地珠单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，本文所述组合物或方法包含匹地珠单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/E64Q/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含抗PD-1抗体和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 N4D/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI0取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，所述组合物包含抗PD-1抗体和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 N4D/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含纳武单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 N4D/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，本文所述组合物或方法包含纳武单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 N4D/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含派姆单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 N4D/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，本文所述组合物或方法包含派姆单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 N4D/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含匹地珠单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 N4D/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，本文所述组合物或方法包含匹地珠单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 N4D/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含抗PD-1抗体和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI0取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，本文所述组合物或方法包含抗PD-1抗体和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含纳武单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，本文所述组合物或方法包含纳武单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含派姆单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，本文所述组合物或方法包含派姆单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，本文所述的组合物或方法包含匹地珠单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D和消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q以及消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一些实施方案中，本文所述组合物或方法包含匹地珠单抗和非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，其包含：(a)第一单体，其(从N端至C端)包含与IL-15-Fc单体连接的人成熟IL-15 D30N/N65D变体，该IL-15-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代L368D/K370S、等排pI取代Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S；和(b)第二单体，其(从N端到C端)包含与IL-15Rα(寿司)-Fc单体连接的人IL-15Rα(寿司)域，该IL-15Rα(寿司)-Fc单体包含氨基酸取代C220S、异二聚体pI取代S364K/E357Q、消融取代E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和FcRn取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，所述组合物包含选自纳武单抗、派姆单抗和匹地珠单抗的抗PD-1抗体，以及XENP24306(如本领域技术人员理解的，包括其序列标识符)。在一些实施方案中，组合物包含纳武单抗和XENP24306。在一些实施方案中，组合物包含派姆单抗和XENP24306。在一些实施方案中，组合物包含匹地珠单抗和XENP24306。在一些实施方案中，所述组合物包含选自纳武单抗、派姆单抗和匹地珠单抗的抗PD-1抗体，以及XENP24045(如本领域技术人员理解的，包括其序列标识符)。在一些实施方案中，该组合物包含纳武单抗和XENP24045。在一些实施方案中，该组合物包含派姆单抗和XENP24045。在一些实施方案中，该组合物包含匹地珠单抗和XENP24045。
在一些实施方案中，联合疗法或治疗包含选自纳武单抗、派姆单抗和匹地珠单抗的抗PD-1抗体，以及XENP24306(如本领域技术人员理解的，包括其序列标识符)。在一些实施方案中，联合疗法或治疗包括纳武单抗和XENP24306。在一些实施方案中，联合疗法或治疗包括派姆单抗和XENP24306。在一些实施方案中，联合疗法或治疗包括匹地珠单抗和XENP24306。在一些实施方案中，联合疗法或治疗包含选白纳武单抗、派姆单抗和匹地珠单抗的抗PD-1抗体，以及XENP24045(如本领域技术人员理解的，包括其序列标识符)。在一些实施方案中，联合疗法或治疗包括纳武单抗和XENP24045。在一些实施方案中，联合疗法或治疗包括派姆单抗和XENP24045。在一些实施方案中，联合疗法或治疗包括匹地珠单抗和XENP24045。在一些情况下，联合疗法可用于在受试者中治疗癌症、诱导T细胞扩增和/或导致的最小血管渗漏。在一些实施方案中，将联合疗法施用于受试者并诱导受试者中的T细胞扩增。在一些情况下，扩增的T细胞群体，例如TIL群体，比当单独施用抗PD-1抗体或非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白时更大。在一些实施方案中，与单独施用抗PD-1抗体或非靶向IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白相比，将联合疗法施用于受试者并导致最小水平的血管渗漏。
在一些实施方案中，治疗癌症的方法包含选自纳武单抗、派姆单抗和匹地珠单抗的抗PD-1抗体，以及XENP24306(如本领域技术人员理解的，包括其序列标识符)。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括纳武单抗和XENP24306。在一些实施方案中，组合物包含派姆单抗和XENP24306。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括匹地珠单抗和XENP24306。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包含选自纳武单抗、派姆单抗和匹地珠单抗的抗PD-1抗体，以及XENP24045(如本领域技术人员理解的，包括其序列标识符)。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括纳武单抗和XENP24045。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括派姆单抗和XENP24045。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括匹地珠单抗和XENP24045。
在一些实施方案中，用于在受试者中扩增T细胞的方法包含选自纳武单抗、派姆单抗和匹地珠单抗的抗PD-1抗体，以及XENP24306(如本领域技术人员理解的，包括其序列标识符)。在一些实施方案中，用于在受试者中扩增T细胞的方法包括纳武单抗和XENP24306。在一些实施方案中，用于在受试者中扩增T细胞的方法包括派姆单抗和XENP24306。在一些实施方案中，用于在受试者中扩增T细胞的方法包括匹地珠单抗和XENP24306。在一些实施方案中，用于在受试者中扩增T细胞的方法包含选自纳武单抗、派姆单抗和匹地珠单抗的抗PD-1抗体，以及XENP24045(如本领域技术人员理解的，包括其序列标识符)。在一些实施方案中，用于在受试者中扩增T细胞的方法包括纳武单抗和XENP24045。在一些实施方案中，用于在受试者中扩增T细胞的方法包括派姆单抗和XENP24045。在一些实施方案中，用于在受试者中扩增T细胞的方法包括匹地珠单抗和XENP24045。
施用抗PD-1抗体和示例性IL-15/Rα-Fc融合变体的治疗在受试者中诱导T细胞(包括活化的T细胞)的增殖。如实施例22所示，与单独的抗PD-1抗体相比，抗PD-1抗体(例如，XENP16432)和IL-15/Rα-Fc融合变体(例如，XENP24306)的组合可表现出体内淋巴细胞的扩增扩展。在一些实施方案中，抗PD-1抗体和示例性IL-15/Rα-Fc融合变体的施用诱导IFNγ产生。在某些情况下，通过施用抗PD-1抗体和IL-15/Rα-Fc融合蛋白增加IFNγ的产生水平。与单独的抗PD-1抗体或IL-15/Rα-Fc融合蛋白相比，在施用包含抗PD-1抗体和IL-15/Rα-Fc融合蛋白的治疗后，IFNγ的水平更高。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体和示例性IL-15/Rα-Fc融合变体的施用减小了肿瘤大小。在一些情况下，与单独的抗PD-1抗体或IL-15/Rα-Fc融合蛋白相比，在施用包含抗PD-1抗体和IL-15/Rα-Fc融合蛋白的治疗后，肿瘤大小更小。
在一些实施方案中，该组合物或方法包括抗PD-1抗体和本发明的任一种异二聚体融合蛋白。如本领域技术人员将理解的并且在下文中更全面地讨论，本发明的异二聚体融合蛋白可具有多种构型，如在图9A-9G和图39A-39D中一般描绘的。示例性融合蛋白的氨基酸序列在图12A、12B、13、14、15、16、40A、40B、41A、41B、42、43、48A-48H、49A-49D、50A-50B、51、52、53、99A-99C、100、101和102中提供，如从序列标识符将显而易见的。
在一些实施方案中，所述组合物或方法包括抗PD-1抗体和任何示例性“IL-15/Rα异源Fc”和“dsIL-15/Rα异源Fc”蛋白。本文概述的许多实施方案总体上依赖于包含第一单体(第一融合蛋白)和第二单体(第二融合蛋白)的形式，所述第一单体包含使用第一结构域连接子共价附接至第一Fc结构域的N末端的IL-15蛋白结构域，所述第二单体包含使用第二结构域连接子共价附接至第二Fc结构域的N-末端的IL-15Rα蛋白结构域。该形式的示例性实施方案(“IL-15/Rα异源Fc”和“dsIL-15/Rα异源Fc”)包括但不限于XENP20818、XENP20819、XENP21471、XENP21472、XENP21473、XENP21474、XENP21475、XENP21476、XENP21477、XENP22013、XENP22815、XENP22816、XENP22817、XENP22818、XENP22819、XENP22820、XENP22821、XENP22822、XENP22823、XENP22824、XENP22825、XENP22826、XENP22827、XENP22828、XENP22829、XENP22830、XENP22831、XENP22832、XENP22833、XENP22834、XENP22815、XENP22816、XENP22817、XENP22818、XENP22819、XENP22820、XENP22821、XENP23343、XENP23554、XENP23555、XENP23557、XENP23559、XENP23561、XENP24018、XENP24019、XENP24020、XENP24051、XENP24052、XENP23504、XENP24306、XENP24306、XENP23343、XENO24113、XENP24341和XENP24301(包括相应的序列标识符)。
在一些实施方案中，组合物或方法包括抗PD-1抗体和IL-15/Rα异二聚体Fc融合蛋白，所述蛋白具有以下的“IL-15/Rα异源Fc”和“dsIL-15/Rα异源Fc”形式：XENP22357、XENP22358、XENP22359、XENP22360、XENP22362、XENP22363、XENP22364、XENP22365、XENP22366、XENP22684、XENP22361、XENP22816、XENP22819、XENP22820、XENP22821、XENP22822、XENP22829、XENP22834、XENP23554、XENP23557、XENP23561、XENP24018、XENP24019、XENP24045、XENP24051、XENP24052、XENP23343、XENP23504、XENP24113、XENP24301、XENP24306、XENP24341、XENP23472、XENP23473、XENP22815、XENP22817、XENP22818、XENP22823、XENP22824、XENP22825、XENP22826、XENP22827、XENP22828、XENP22830、XENP22831、XENP22832、XENP22833、XENP23555、XENP23559、XENP23560、XENP24017、XENP24020、XENP24043或XENP24048(包括相应的序列标识符)。这些形式的示例性氨基酸序列在图41A、41B、48A、48B、48C、48D、48E、48F、48G、48H、53、90A、99B和99C中列出，如从序列标识符显而易见的。
在一些实施方案中，所述组合物或方法包括抗PD-1抗体和scIL-15/Rα-Fc异二聚体融合蛋白，其包含的融合蛋白包含通过第一结构域连接子共价附接至第二蛋白结构域的N末端的第一蛋白结构域，其通过第二结构域连接子共价附至第一Fc结构域的N末端，以及第二Fc结构域(例如空Fc结构域)。在某些情况下，第一蛋白结构域是IL-15Rα蛋白结构域，第二蛋白结构域是IL-15蛋白结构域。该形式(“scIL-15/Rα-Fc”)的示例性实施方案包括但不限于XENP21478(包括相应的序列标识符)。
在一些实施方案中，所述组合物或方法包含抗PD-1抗体和具有以下“scIL-15/Rα-Fc”形式的IL-15/Rα异二聚体Fc融合蛋白：XENP24013、XENP24014、XENP24016、XENP24015、XENP24050、XENP24475、XENP24476、XENP24478、XENP24479、XENP24481和XENP25938(包括相应的序列标识符)。如从序列标识符显而易见，这种形式的示例性氨基酸序列在图49A、49B、49C、49D和100中列出。
在一些实施方案中，所述组合物或方法包括抗PD-1抗体和ncIL-15/Rα-Fc或dsIL-15/Rα-Fc异二聚体融合蛋白，其包含经由结构域连接子与第一Fc结构域的N端共价连接的第一蛋白结构域、第二Fc结构域(例如，空Fc结构域)、和非共价连接至第一蛋白结构域的第二蛋白结构域。在一些情况下，第一蛋白结构域是IL-15蛋白结构域，第二蛋白结构域是IL-15Rα蛋白结构域。该形式(“ncIL-15/Rα-Fc”或“dsIL-15/Rα-Fc”)的示例性实施方案包括但不限于XENP21479，XENP22357、XENP22354、XENP22355、XENP22356、XENP22357、XENP22358、XENP22359、XENP22360、XENP22361、XENP22362、XENP22363、XENP22364、XENP22365、XENP22366、XENP22637、XENP24348、XENP24349和XENP24383(包括相应的序列标识符)。
在一些实施方案中，具有“ncIL-15/Rα-Fc”形式的IL-15/Rα异二聚体Fc融合蛋白是XENP21479、XENP22366、XENP24348、XENP24383、XENP24349、XENP24890和XENP25138(包括相应的序列标识符)。这些形式的示例性氨基酸序列在图12A、12B、50A、50B和101中列出，如从序列标识符显而易见的。
在一些实施方案中，所述组合物或方法包括抗PD-1抗体和二价ncIL-15/Rα-Fc或二价dsIL-15/Rα-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含第一融合蛋白，其包含通过第一结构域连接子共价连接至所述第一Fc结构域的N末端的第一蛋白结构域；第二融合蛋白，其包含通过第二结构域连接子共价连接至所述第二Fc结构域的N末端的第二蛋白结构域；第三蛋白结构域，其非共价连接到所述第一融合蛋白的第一蛋白结构域；和第四蛋白结构域，其非共价连接到所述第二融合蛋白的所述第二蛋白结构域。在一些情况下，第一和第二蛋白结构域是IL-15Rα蛋白结构域，而第三和第四蛋白结构域是IL-15蛋白结构域。该形式的示例性实施方案(“二价ncIL-15/Rα-Fc”或“二价dsIL-15/Rα-Fc”)包括但不限于XENP21978、XENP22634、XENP24342和XENP24346(包括相应的序列身份标识)。
在一些实施方案中，具有“二价ncIL-15/Rα-Fc”形式的IL-15/Rα异二聚体Fc融合蛋白是XENP21978、XENP24342、XENP24346和XENP24351(包括相应的序列标识符)。如从序列标识符显而易见，这种形式的示例性氨基酸序列在图13、52和102中列出。
如从序列标识符显而易见，本文在图14中概述了另一种有用的形式(“二价scIL-15/Rα-Fc”)。
在一些实施方案中，所述组合物或方法包括抗PD-1抗体和Fc-ncIL-15/Rα融合蛋白或Fc-dsIL-15/Rα融合蛋白，其包含第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包含使用结构域连接子共价连接至第一蛋白结构域的N端的第一Fc结构域，第二Fc结构域(例如，空Fc结构域)，和非共价连接至所述第一蛋白结构域的第二蛋白结构域。这种形式(“Fc-ncIL-15/Rα”或“Fc-dsIL-15/Rα”)的示例性实施方案包括但不限于XENP22637和XENP22639，以及图15中所描绘的那些，如从序列标识符显而易见的。在一些实施方案中，第一蛋白质和第二蛋白质通过连接子连接(图9G)。
在一些实施方案中，具有“Fc-ncIL-15/Rα”形式的IL-15/Rα异二聚体Fc融合蛋白是XENP22637和XENP22638。这种形式的示例性氨基酸序列在图15中列出，如从序列标识符中显而易见的。
在一些实施方案中，具有“Fc-scIL-15/Rα”形式的IL-15/Rα异二聚体Fc融合蛋白如图16所示，如从序列标识符中显而易见的。
在一些实施方案中，具有“Fc-dsIL-15/Rα”的IL-15/Rα异二聚体Fc融合蛋白是XENP22639和XENP22640，这种形式的示例性氨基酸序列在图42中列出，如从序列标识符中显而易见的。
对于本文概述的任何异二聚体Fc融合蛋白，第一结构域连接子和第二结构域连接子可以相同或不同。另外，异二聚体蛋白的第一Fc结构域和第二Fc结构域可具有不同的氨基酸序列。
本发明的Fc结构域包含IgG Fc结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc结构域，其中IgG1、IgG2和IgG4 Fc结构域在某些实施方案中具有特定用途。在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含选自以下的一组氨基酸取代：L368D/K370S和S364K；L368D/K370S和S364K/E357L；L368D/K370S和S364K/E357Q；T411E/K360E/Q362E和D401K；L368E/K370S和S364K；K370S和S364K/E357Q；K370S和S364K/E357Q；S267K/L368D/K370S和S267K/S364K/E357Q(根据EU编号)。在一些情况下，根据EU编号，本文概述的任何异二聚体Fc融合形式的第一和/或第二Fc结构域可具有包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的另一组氨基酸取代。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。
另外的异二聚体变体可以独立地并且任选地包括并选自附图中概述的变体。这些组合物可进一步包含消融变体、pI变体、带电变体、同型变体等。
本文提供了包含抗PD-1抗体和在IL-15/Rα界面具有工程二硫键的IL-15/Rα-Fc异二聚体融合蛋白的组合物(参见例如实施例2)。此类IL-15/Rα-Fc融合蛋白可诱导或促进免疫细胞的增殖，包括NK细胞、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞。
本文还提供了包含抗PD-1抗体和为降低效力而工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白(也称为“IL-15/Rα-Fc亲和力变体”；参见例如实施例3)的组合物。在一些情况下，IL-15/Rα-Fc融合蛋白变体显示出改善的药代动力学、降低的效力和延长的(例如，增加的)半衰期。
在一些实施方案中，还用Xtend(FcRn)Fc取代来工程化包含抗PD-1抗体和为了降低的效力而工程化的IL-15/Rα-Fc融合变体的组合物，使得每个Fc单体包含氨基酸取代M428L/N434S。这种IL-15/Rα-Xtend Fc变体的示例性实施方案在图99A-99C、100、101和102中描绘(也见表6)。IL-15/Rα-Xtend Fc变体的施用在受试者中诱导T细胞(包括活化的T细胞)增殖。如实施例4D中所示，与没有连接子的相应IL-15/Rα-Fc亲和变体(仅铰链；例如XENP24341)相比，具有结构域连接子的IL-15/Rα-Fc亲和变体(例如，XENP24113)可以在体内显示出淋巴细胞的扩增扩展。IL-15/Rα-Fc亲和力变体可以提供延长的T细胞药理作用。
本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白可以优先与T细胞和NK细胞结合，并且在某些情况下，在受试者的癌症环境中选择性靶向活化的T细胞。值得注意的是，没有结构域连接子的IL-15/Rα-Fc融合变体(例如，IL-15/Rα-Fc亲和变体)(仅铰链；例如，XENP24341)与具有域连接子的相应的IL-15/Rα-Fc亲和变体(例如XENP24113)相比显示了与各种淋巴细胞群体的更少的结合(见图117)。
本文所述的IL-15/Rα-Fc融合蛋白可增强活化的T细胞的抗肿瘤作用(见实施例5B和5C)。在一个实施方案中，本文描述的IL-15/Rα-Fc融合蛋白可以诱导CD8+ T细胞(例如，活化的CD8+ T细胞)和CD4+ T细胞(例如，活化的CD4+ T细胞)的增殖。在某些情况下，IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导CD8+ T细胞的增殖可以超过CD4+ T细胞。在某些实施方案中，本文描述的IL-15/Rα-Fc融合蛋白可诱导CD8+ T细胞(例如CD8+ T细胞的CD69+/IFNγ+级分和/或CD69+/Ki-67+级分)和CD4+ T细胞(例如CD4+ T细胞的CD69+/IFNγ+级分和/或CD69+/Ki-67+级分)的增殖。本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白可以促进杀死肿瘤细胞，并且可以选择性地扩增包括肿瘤浸润淋巴细胞在内的活化淋巴细胞。值得注意的是，IL-15/Rα-Fc融合蛋白可以优先诱导CD8+和CD4+ T细胞的增殖。
在一些实施方案中，本文所述的IL-15/Rα-Fc融合蛋白可增强被施用此类蛋白的受试者的抗肿瘤作用。如下所述的实施例中所述(参见实施例5D)，与没有这种IL-15/Rα-Fc融合蛋白的治疗相比，用IL-15/Rα-Fc融合蛋白治疗显著降低了患有肿瘤的受试者的肿瘤生长。
在一些实施方案中，本文所述的具有和不具有Xtend-Fc取代的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的效力的降低可增强被施用此类蛋白的受试者的药效学和药代动力学。如以下所述实施例(参见实施例6)中所示，本发明的具有Xtend(FcRn)取代(例如，每个Fc单体上的M428L/N434S变体)的IL-15/Rα-Fc融合蛋白，例如XmAb24306和XENP23343，与没有Xtend取代的相应IL-15/Rα-Fc融合蛋白相比，在受试者体内的血清半衰期更长。在某些情况下，如半衰期延长所示，Xtend取代显著改善了暴露。
下文显示(参见实施例7)，与本文所述的野生型IL-15/Rα-Fc融合蛋白如XENP20818相比，效力降低的IL-15/Rα-Fc变体如XENP22821可以使淋巴细胞计数扩展更长的持续时间。值得注意的是，XENP22821的Xtend类似物XENP23343进一步延长了淋巴细胞扩展的持续时间，超过了XENP22821。
如下文所述的实施例中所述(参见实施例8)，IL-15/Rα-Fc融合蛋白例如但不限于XmAb24306(也称为XENP24306)可以克服抗CD3诱导的效应T细胞增殖的Treg抑制。
如本文所述(参见实施例9)，IL-15/Rα-Fc融合蛋白，例如但不限于XENP24045，可以在一定范围剂量水平上促进白细胞扩增并加剧异种GVHD。值得注意的是，XENP24045和抗PD-1抗体(例如XENP13432)的联合疗法表现出协同作用(例如，协同效应)，尤其是在低剂量时。
在一些实施方案中，本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白是XENP23557(参见图48E)。XENP23557包括链1(人_IL15_N4D/N65D_(GGGGS)1_Fc(216)_IgG1_pI(-)_等排_A_C220S/PVA_/S267K/L368D/K370S(18786))和链2(人_IL15Ra(寿司)_(GGGGS)1_Fc(216)_IgG1_C220S/PVA_/S267K/S364K/E357Q(15908))。
在一些实施方案中，本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白是XENP24045(参见图48E)。XENP24045包括链1(人_IL15_D30N/E64Q/N65D_(GGGGS)1_Fc(216)_IgG1_pI(-)_等排_A_C220S/PVA_/S267K/L368D/K370S)和链2(人_IL15Rα(寿司)_(GGGGS)1_Fc(216)_IgG1_C220S/PVA_/S267K/S364K/E357Q)。
在一些实施方案中，本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白是XENP24113(参见图99B)。XENP24113包括链1(人_IL15_N4D/N65D_(GGGGS)1_Fc(216)_IgG1_pI(-)_等排_A_C220S/PVA_/S267K/L368D/K370S/M428L/N434S)和链2(人_IL15Rα(寿司)_(GGGGS)1_Fc(216)_IgG1_C220S/PVA_/S267K/S364K/E357Q/M428L/N434S)。
在一些实施方案中，本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白是XENP24306(参见图99C)。XENP24306包括链1(人_IL15_D30N/E64Q/N65D_(GGGGS)1_Fc(216)_IgG1_pI(-)_等排_A_C220S/PVA_/S267K/L368D/K370S/M428L/N434S)和链2(人_IL15Rα(寿司)_(GGGGS)1_Fc(216)_IgG1_C220S/PVA_/S267K/S364K/E357Q/M428L/N434S)。
因此，一方面，本发明提供了一种异二聚体蛋白，其包含：a)包含第一蛋白结构域和第一Fc结构域的第一融合蛋白，其中使用第一结构域连接子将第一蛋白结构域共价连接至第一Fc结构域的N末端；b)包含第二蛋白结构域和第二Fc结构域的第二融合蛋白，其中使用第二结构域连接子将第二蛋白质结构域共价连接至Fc结构域的N末端；其中第一和第二Fc结构域具有选自由以下的一组氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/LS364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q(根据EU编号)，并且其中第一蛋白结构域包含IL-15蛋白，第二蛋白结构域包含IL-15Rα蛋白。在一些实施方案中，第一蛋白结构域直接共价连接至第一Fc结构域的N末端，而不使用第一结构域连接子，和/或第二蛋白结构域直接共价连接至第二Fc结构域的N末端，而不使用第二结构域连接子。在一些实施方案中，本发明还提供了检查点阻断抗体，例如抗PD-1抗体。
在某些情况下，异二聚体蛋白选自XENP20818、XENP20819、XENP21471、XENP21472、XENP21473、XENP21474、XENP21475、XENP21476、XENP21477、XENP22013、XENP22815、XENP22816、XENP22817、XENP22818、XENP22819、XENP22820、XENP22821、XENP22822、XENP22823、XENP22824、XENP22825、XENP22826、XENP22827、XENP22828、XENP22829、XENP22830、XENP22831、XENP22832、XENP22833、XENP22834、XENP23343、XENP23554、XENP23555、XENP23557、XENP23559、XENP24019和XENP24020(包括相应的序列标识符)。
在进一步方面，本发明提供了一种异二聚体蛋白，其包含：a)包含第一蛋白结构域、第二蛋白结构域和第一Fc结构域的融合蛋白，其中使用第一结构域连接子将第一蛋白结构域共价连接至第二蛋白结构域的N末端；并且其中使用第二结构域连接子将第二蛋白质结构域共价连接至第一Fc结构域的N末端；b)第二Fc结构域；其中第一和第二Fc结构域具有选自由以下的一组氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/LS364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q(根据EU编号)，并且其中第一蛋白结构域包含IL-15Rα蛋白，第二蛋白结构域包含IL-15蛋白。在某些情况下，还提供了检查点阻断抗体，例如抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，异二聚体蛋白可以是XENP21478。
在另一方面，本发明提供了一种异二聚体蛋白，其包含：a)包含第一蛋白结构域和第一Fc结构域的融合蛋白，其中使用结构域连接子将第一蛋白结构域共价连接至第一Fc结构域的N末端；b)第二Fc结构域；和c)第二蛋白结构域，其非共价连接至第一蛋白结构域；其中第一和第二Fc结构域具有选自由以下的一组氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/LS364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q(根据EU编号)，并且其中第一蛋白结构域包含IL-15Rα，第二蛋白结构域包含IL-15蛋白。在某些情况下，还提供了检查点阻断抗体，例如抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，异二聚体蛋白可以选自XENP21479、XENP22357、XENP22354、XENP22355、XENP22356、XENP22357、XENP22358、XENP22359、XENP22360、XENP22361、XENP22362、XENP22363、XENP22364、XENP22365、XENP22366和XENP22637(包括相应的序列标识符)。
在另一方面，本发明提供了一种异二聚体蛋白，其包含：a)包含第一蛋白结构域和第一Fc结构域的第一融合蛋白，其中使用结构域连接子将第一蛋白结构域共价连接至所述第一Fc结构域的N末端；b)第二融合蛋白，其包括包含第二蛋白结构域的第二重链和包含第二Fc结构域的第一第二重链，其中使用结构域连接子将第二蛋白结构域共价连接至第二Fc结构域的C末端；c)与第一融合蛋白的第一蛋白结构域非共价连接的第三蛋白结构域；和d)与第二融合蛋白的第二蛋白结构域非共价连接的第四蛋白结构域，其中第一和第二Fc结构域具有选自以下的一组氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/LS364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q(根据EU编号)，并且其中第三蛋白结构域和第四蛋白结构域包含IL-15蛋白。在一些实施方案中，异二聚体蛋白可以是XENP21978或XENP22634。在某些情况下，还提供了检查点阻断抗体，例如抗PD-1抗体。
在另一方面，本发明提供了一种异二聚体蛋白，其包含：a)包含第一Fc结构域和第一蛋白结构域的第一融合蛋白，其中使用结构域连接子将第一Fc结构域共价连接至第一蛋白结构域的N末端；b)第二Fc结构域；和c)第二蛋白结构域，其非共价连接至第一融合蛋白的第一蛋白结构域；其中第一和第二Fc结构域具有选自由以下的一组氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/LS364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q(根据EU编号)，并且其中第一蛋白结构域包含IL-15Rα蛋白，第二蛋白结构域包含IL-15蛋白。在某些情况下，还提供了检查点阻断抗体，例如抗PD-1抗体。
在本发明的任何实施方案中，根据EU编号，第一和/或第二Fc结构域可具有包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的另一组氨基酸取代。在一些情况下，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。
在本发明的任何实施方案中，IL-15蛋白具有选自全长人IL-15和截短的人IL-15的多肽序列，并且IL-15Rα蛋白具有选自全长人IL-15Rα和人IL-15Rα的寿司结构域的多肽序列。在一些情况中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代或添加：E87C：D96/P97/C98；E87C：D96/C97/A98；V49C：S40C；L52C：S40C；E89C：K34C；Q48C：G38C；E53C：L42C；C42S：A37C；和L45C：A37C。
在另一方面，本发明提供了检查点阻断抗体和选自以下的异二聚体蛋白：XENP20818、XENP20819、XENP21471、XENP21472、XENP21473、XENP21474、XENP21475、XENP21476、XENP21477、XENP21478、XENP21479、XENP21978、XENP22013、XENP22015、XENP22017、XENP22354、XENP22355、XENP22356、XENP22357、XENP22358、XENP22359、XENP22360、XENP22361、XENP22362、XENP22363、XENP22364、XENP22365、XENP22366、XENP22637和XENP22639(包括相应的序列标识符)。在一些方面，本发明提供异二聚体蛋白，其选自XENP20818、XENP20819、XENP21471、XENP21472、XENP21473、XENP21474、XENP21475、XENP21476、XENP21477、XENP22013、XENP22815、XENP22816、XENP22817、XENP22818、XENP22819、XENP22820、XENP22821、XENP22822、XENP22823、XENP22824、XENP22825、XENP22826、XENP22827、XENP22828、XENP22829、XENP22830、XENP22831、XENP22832、XENP22833、XENP22834、XENP23343、XENP23554、XENP23555、XENP23557、XENP23559、XENP24019和XENP24020(包括相应的序列标识符)。除了制备这些蛋白质和用其治疗患者的方法之外，还提供核酸、表达载体和宿主细胞。
在一些方面，本文提供了一种在有需要的患者中治疗癌症并使所述患者的血管渗漏水平最小化的方法。这样的方法包括施用治疗有效量的本文所述的检查点阻断抗体例如抗PD-1抗体和治疗有效量的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白或本文所述的药物组合物至患者。
在一些实施方案中，该方法还包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。在一些实施方案中，检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或杜巴单抗(durbalumab)。
在一些实施方案中，施用IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和抗PD-1抗体后，患者血清白蛋白中血管渗漏水平减少20％或更少，例如减少20％，减少19％，减少18％，减少17％，减少16％，减少20％，减少20％，减少20％，减少20％，减少20％，减少15％，减少14％，减少13％，减少12％，减少11％，减少10％，或更少的减少。在某些情况下，血清白蛋白的这种减少发生在施用后的第1天至第15天。在一些实施方案中，在施用IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和抗PD-1抗体后的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或更晚发生所述减少(或可检测)。
在一些实施方案中，在施用IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和抗PD-1抗体后，患者表现出淋巴细胞增加2倍至15倍，例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍或15倍。在某些情况下，淋巴细胞的这种增加发生在施用后的第1天至第15天。在一些实施方案中，在施用后的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或更晚发生淋巴细胞增加(或可检测)。
在一些实施方案中，在施用IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和抗PD-1抗体后，患者表现出外周CD8+ T细胞增加2倍至13倍，例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、或13倍。在某些情况下，外周CD8+ T细胞的这种增加发生在施用后的第1天至第15天。在一些实施方案中，在施用后的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或更晚发生外周CD8+ T细胞增加(或可检测)。
在一些方面，本文提供了一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增而不增加引起低白蛋白血症的可能性的方法，包括施用治疗有效量的本文所述的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白或本文所述患者的药物组合物至所述患者。在一些实施方案中，该方法还包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。在一些实施方案中，检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗。
在一些实施方案中，T细胞扩增为T细胞增加至少2倍，例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍或更多倍。在一些实施方案中，T细胞扩增为T细胞增加2倍至15倍，例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍或15倍。在一些情况下，在施用IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合物和检查点阻断抗体例如抗PD-1抗体后的第1天至第15天，发生T细胞的这种扩增。在一些实施方案中，在施用IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和检查点阻断抗体如抗PD-1抗体后的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或更晚发生T细胞扩增(或可检测)。
在一些实施方案中，本文所述的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白与抗PD-1抗体的组合相比于含有对照IL-15或IL-15Rα的蛋白增强了淋巴细胞的扩增，并且还导致白蛋白下降的减少(数据在图203中描述)。白蛋白下降的减少表明IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和抗PD-1抗体具有更高的治疗指数。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白与抗PD-1抗体组合促进外周CD8+ T细胞增加至少3倍(200％)。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白与抗PD-1抗体组合介导或促进白蛋白降低的程度不超过15％的降低。在一些情况下，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白与抗PD-1抗体的组合引起或诱导白蛋白水平的降低低于含对照IL-15或IL-15Ra的蛋白。在一些实施方案中，向本文所述的患者施用IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和抗PD-1抗体，其促进外周CD8+ T细胞增加至少11倍(1000％)，同时保持白蛋白水平在20％降低以上。
本发明提供了通过施用检查点阻断抗体和与IL-15Rα蛋白复合的IL-15蛋白在患者中诱导T细胞扩增的方法，该改进包括向患者施用抗PD-1抗体以及与IL-15Rα蛋白复合的IL-15变体蛋白，其中所述IL-15变体蛋白具有降低的亲和力，使得患者发生低白蛋白血症的可能性降低。
在本文描述的方法的一些实施方案中，变体IL-15具有一个或多个选自N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D和Q108E的氨基酸取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有N1D取代或至少N1D取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有N4D取代或至少N4D取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有N1D取代或至少D8N取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有D30N取代或至少D30N取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有D61N取代或至少D61N取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有E64Q取代或至少E64Q取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有N65D取代或至少N65D取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有Q108E取代或至少Q108E取代。
在本文描述的方法的一些实施方案中，IL-15变体蛋白具有选自N4D、N65D、N4D/N65D、D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有N4D取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有N65D取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有N4D/N65D取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有D30N/N65D取代。在一些实施方案中，变体IL-15具有D30N/E64Q/N65D取代。
在本文描述的方法的一些实施方案中，与IL-15Rα蛋白复合的IL-15变体蛋白是本文描述的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白中的任何一种。
因此，一方面，本发明提供了一种IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白，其包含：(a)包含第一蛋白结构域和第一Fc结构域的第一融合蛋白，其中使用第一结构域连接子将第一蛋白结构域共价连接至第一Fc结构域的N末端；(b)包含第二蛋白结构域和第二Fc结构域的第二融合蛋白，其中使用第二结构域连接子将第二蛋白质结构域共价连接至Fc结构域的N末端；其中第一和第二Fc结构域具有选自由以下的一组氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/LS364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q(根据EU编号)，并且其中第一蛋白结构域包含IL-15蛋白，第二蛋白结构域包含IL-15Rα蛋白。在一些实施方案中，第一蛋白结构域直接共价连接至第一Fc结构域的N末端，而不使用第一结构域连接子，和/或第二蛋白结构域直接共价连接至第二Fc结构域的N末端，而不使用第二结构域连接子。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组包含Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些实施方案中，其中根据EU编号，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。在一些实施方案中，根据EU编号，第一和/或第二Fc结构域具有另外的氨基酸取代M428L/N434S。
在一些实施方案中，IL-15蛋白具有选自全长人IL-15蛋白和截短的人IL-15蛋白的多肽序列，并且所述IL-15Rα蛋白具有选自由全长人IL-15Rα蛋白和人IL-15Rα蛋白的寿司结构域的多肽序列。在某些实施方案中，IL-15蛋白具有一个或多个选自N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D和Q108E的氨基酸取代。在特定的实施方案中，IL-15蛋白具有选自N4D、N65D、N4D/N65D和D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代。
在一些实施方案中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白具有一组分别选自由以下组成的群组的氨基酸取代或添加：E87C：D96/P97/C98；E87C：D96/C97/A98；V49C：S40C；L52C：S40C；E89C：K34C；Q48C：G38C；E53C：L42C；C42S：A37C；和L45C：A37C。
在一些实施方案中，第一蛋白结构域直接共价连接至第一Fc结构域的N末端，而不使用第一结构域连接子，和/或第二蛋白结构域直接共价连接至第二Fc结构域的N末端，而不使用第二结构域连接子。
在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白选自XENP20818、XENP22013、XENP22014、XENP22015、XENP22017、XENP23343、XENP23504、XENP23557、XENP24045、XENP24113、XENP24301、XENP24306和XENP24341。
除了制备这些蛋白质和用其治疗患者的方法之外，还提供核酸、表达载体和宿主细胞。
一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文所述的IL-15/IL-15RαFc融合异二聚体蛋白中的任一种和药学上可接受的载体。在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含选自XENP20818、XENP22013、XENP22014、XENP22015、XENP22017、XENP23343、XENP23504、XENP23557、XENP24045、XENP24113、XENP24301、XENP24306和XENP24341的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白；和药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向该患者施用治疗有效量的本文所述的任何IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白或其药物组合物。在一些实施方案中，该方法还包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。在某些实施方案中，检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。在一些情况中，抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗。在一些情况中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或杜巴单抗。
另外的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白在例如以下文献中有详细描述：2016年10月14日提交的美国序列第62/408,655号、2016年11月1日提交的美国序列第62/416,087号、2017年1月6日提交的美国序列第62/443,465号、2017年3月28日提交的美国序列第62/477,926号、2017年10月16日提交的美国专利申请第15/785,401号和WO2018071919，所述文献以全文引用的方式明确地并入，尤其参考其中的附图、图例和权利要求书。
一方面，本发明提供了一种在有需要的患者中治疗癌症并使患者中的血管渗漏水平最小化的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白或本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，该方法还包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。在一些实施方案中，检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或杜巴单抗。
在一些实施方案中，在施用后患者中的血管渗漏水平为血清白蛋白降低20％或更低。
在一些实施方案中，患者在施用后淋巴细胞表现出2倍至15倍的增加。
在一些实施方案中，患者在施用后外周CD8+ T细胞表现出2倍至13倍的增加。
在一方面，本发明提供了一种在有需要的患者中诱导T细胞扩增而不增加引起低白蛋白血症的可能性的方法，包括施用治疗有效量的本文所述的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白或本文所述患者的药物组合物至所述患者。
在一些实施方案中，该方法还包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。
在一些实施方案中，检查点阻断抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或杜巴单抗。
在一些实施方案中，T细胞扩增为T细胞增加至少2倍。在一些实施方案中，T细胞扩增为T细胞增加2倍至15倍。
在一些方面，本发明提供了通过施用与IL-15Rα蛋白复合的IL-15蛋白在患者中诱导T细胞扩增的方法，该改进包括向患者施用与IL-15Rα蛋白复合的IL-15变体蛋白，其中所述IL-15变体蛋白具有降低的亲和力，使得患者发生低白蛋白血症的可能性降低。
在本文描述的方法的一些实施方案中，变体IL-15具有一个或多个选自N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D和Q108E的氨基酸取代。
在本文描述的方法的一些实施方案中，IL-15变体蛋白具有选自N4D、N65D、N4D/N65D和D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代。
在本文描述的方法的一些实施方案中，与IL-15Rα蛋白复合的IL-15变体蛋白是本文描述的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白中的任何一种。
IX.本发明的核酸
本发明进一步提供了编码本发明的异二聚体Fc融合蛋白的核酸组合物(或者，在单体Fc结构域蛋白的情况下，也提供编码那些的核酸)。
如本领域的技术人员将理解的，核酸组合物将取决于异二聚体蛋白的形式。因此，例如，当形式需要三个氨基酸序列时，可以将三个核酸序列并入一个或多个表达载体中以用于表达。类似地，一些形式仅需要两个核酸；再次，其可以被放入一个或两个表达载体中。
如本领域已知的，对本发明的成分进行编码的核酸可以并入到如本领域已知并且取决于用于产生本发明的异二聚体Fc融合蛋白的宿主细胞的表达载体中。通常，核酸可操作地连接到任何数量的调节元件(启动子、复制起点、可选择标记、核糖体结合位点、诱导剂等)。表达载体可以是染色体外的或整合载体。
然后将本发明的核酸和/或表达载体转化到所属领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞中，包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞(例如CHO细胞)在许多实施方案中使用。
在一些实施方案中，如果取决于形式适用的话，对每个单体进行编码的核酸通常在不同或相同的启动子对照条件下各自包含在单个表达载体内。在特别用于本发明的实施方案中，这两个或这三个核酸中的每个核酸包含在不同表达载体上。
通过孵育包括如本领域众所周知的一个或多个表达载体的宿主细胞来制备本发明的异二聚体Fc融合蛋白。一旦产生，就进行传统的融合蛋白或抗体纯化步骤，包含离子交换色谱法步骤。如本文所讨论，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。也就是说，将改变每种单体的等电点(pI)的pI取代纳入，使得每种单体具有不同pI并且异二聚体也具有不同pI，从而促进异二聚体的等电纯化(例如阴离子交换色谱、阳离子交换色谱)。这些取代还有助于确定和监测纯化后任何污染的同源二聚体(例如，IEF凝胶、cIEF和分析型IEX柱)。
X.IL-15/IL-15Rα异二聚体免疫调节Fc融合蛋白的生物学和生化功能
通常，以本文所述的多种方式，将本发明的异二聚体Fc融合蛋白施用于患有癌症的患者，并评估功效。因此，虽然可以进行标准的功效分析，如癌症负荷、肿瘤大小、转移的存在或程度的评估等，但也可以基于免疫状态评估来评定免疫肿瘤学治疗。这可以通过多种方式完成，包括体外和体内分析。举例来说，可以与“旧式(old fashioned)”测量一起评估免疫状态变化(例如，在ipi处理后ICOS+CD4+ T细胞的存在)，“旧式”测量如肿瘤负荷、大小、浸润性、LN参与、转移等。因此，可以评估以下中的任一个或全部：PVRIG对CD4+ T细胞活化或增殖、CD8+ T(CTL)细胞活化或增殖、CD8+ T细胞介导的细胞毒性活性和/或CTL介导的细胞耗竭、NK细胞活性和NK介导的细胞耗竭的抑制作用；PVRIG对Treg细胞分化和增殖和Treg或骨髓来源的抑制细胞(MDSC)介导的免疫抑制或免疫耐受的增强作用；和/或PVRIG对通过免疫细胞产生的促炎性细胞因子的影响，例如通过T细胞或其它免疫细胞产生的IL-2、IFN-γ或TNF-α。
在一些实施方案中，通过使用例如CFSE稀释法、免疫效应细胞的Ki67细胞内染色以及3H-胸苷并入法评估免疫细胞增殖来评定治疗。
在一些实施方案中，通过评估基因表达的增加或活化相关标志物的蛋白质含量的增加来评定处理，所述标志物包括以下中的一个或多个：CD25、CD69、CD137、ICOS、PD1、GITR、OX40以及通过CD107A的表面表达测量的细胞脱粒。
一般来说，如本领域中已知地进行基因表达分析。
一般来说，还如所属领域中已知地，类似地进行蛋白质表达测量。
在一些实施方案中，通过评估众多细胞参数来评定通过目标细胞活力检测测量的细胞毒性活性，从而评定处理，所述细胞参数，如酶活性(包含蛋白酶活性)、细胞膜渗透性、细胞粘附、ATP产生、辅酶产生以及核苷酸吸收活性。这些分析的具体实例包括但不限于台盼蓝(Trypan Blue)或PI染色、51Cr或35S释放法、LDH活性、MTT和/或WST分析、钙黄绿素-AM分析、基于发光的分析以及其它分析。
在一些实施方案中，通过评定由细胞因子产生测量的T细胞活性，使用细胞因子，使用众所周知的技术，细胞内测量孵育物上清液来评定治疗，所述细胞因子包括但不限于：IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13。
因此，可以使用评估以下中的一个或多个的分析来评定治疗：(i)免疫反应的增加；(ii)αβ和/或γδ T细胞活化的增加；(iii)细胞毒性T细胞活性的增加；(iv)NK和/或NKT细胞活性的增加；(v)αβ和/或γδ T细胞抑制的缓解；(vi)促炎性细胞因子分泌的增加；(vii)IL-2分泌的增加；(viii)干扰素γ产生的增加；(ix)Th1反应的增加；(x)Th2反应的减少；(xi)减少或消除调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性。。
A.测量功效和效能的分析
在一些实施方案中，使用如本领域已知的混合淋巴细胞反应(MLR)分析来评定T细胞活化。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量免疫反应的增加或减少，如例如通过不同因子的磷酸化或去磷酸化或通过测量其它翻译后修饰所测量。IL-15通过STAT5磷酸化介导IFNγ表达和分泌。因此，在一些实施方案中，如STAT5的磷酸化所指示的，信号传导途径测定测量了免疫应答的增加或降低。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导途径分析测量αβ和/或γδT细胞活化的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量细胞毒性T细胞活性的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导途径分析测量NK和/或NKT细胞活性的增加或减少，如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过如例如CD107a等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量促炎性细胞因子分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导途径分析测量IL-2分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导途径分析测量干扰素γ产生的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量Th1反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量Th2反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量M2巨噬细胞细胞数量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量M2巨噬细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量N2嗜中性粒细胞增量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量N2嗜中性粒细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量T细胞活化抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量CTL活化抑制的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞耗竭的增加或减少，如例如通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδ T细胞反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导途径分析测量抗原特异性记忆反应的刺激的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD45RA、CCR7等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。。
在一个实施方案中，信号传导途径分析测量癌细胞的细胞凋亡或裂解的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导途径分析测量对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用的刺激的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导途径分析测量癌细胞的直接杀伤的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导通路分析测量Th17活性的增加或减小，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，信号传导途径分析测量补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的诱导的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施方案中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或活化标志物(例如CD137、CD107a、PD1等)的表达变化来测量T细胞活化。对于T细胞，增殖、细胞表面活化标志物(例如CD25、CD69、CD137、PD1)、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力)和细胞因子产生(例如IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。
在一个实施方案中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过活化标志物(例如CD107a等)的表达变化来测量NK细胞活化。对于NK细胞，增殖、细胞毒性(杀伤靶细胞并且增加CD107a、颗粒酶和穿孔素表达的能力)、细胞因子产生(例如IFNγ和TNF)和细胞表面受体表达(例如CD25)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。
在一个实施方案中，例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化来测量γδ T细胞活化。
在一个实施方案中，例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化来测量Th1细胞活化。
相比参考样品或对照样品例如不含本发明的抗PVRIG抗体的测试样品中的信号，活性或反应的适当增加(或如上所述适当减少)是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％至99％的增加。类似地，与参考或对照样品相比，增加至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍显示功效。
XI.检查点阻断抗体
在一些实施方案中，将本文所述的含有IL-15和IL-15Rα蛋白的异二聚体Fc融合蛋白与其他治疗剂组合，所述其他治疗剂包括检查点阻断抗体，例如但不限于PD-1抑制剂、TIM3抑制剂、CTLA4抑制剂、PD-L1抑制剂、TIGIT抑制剂、LAG3抑制剂或其组合。
A.抗PD1抗体
在一些实施方案中，本文所述的IL-15/Rα-Fc融合蛋白可以与检查点阻断抗体例如抗PD-1抗体联合施用给患有癌症的受试者。在某些情况下，抗PD-1抗体包括XENP13432(一种基于纳武单抗的二价抗PD-1mAb，期具有消融的效应子功能；XENP13432的氨基酸序列如图160所示)。
示例性的非限制性抗PD-1抗体分子公开于2015年7月30日公开的标题为“PD-1的抗体分子及其用途”的US2015/0210769中，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，包含BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D或BAP049-克隆-E的氨基酸序列；或如US 2015/0210769的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。抗PD-1抗体分子任选地包含来自重链、轻链或两者的前导序列，如US 2015/0210769的表4中所示；或与其基本相同的序列。
在另一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D或BAP049-克隆-E的任一种；或如表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0210769的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。
在又一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述轻链可变区包含US 2015/0210769的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方案中，抗PD-1抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子在轻链可变区的102位的轻链CDR3中包括取代，例如在根据表1的轻可变区的102位的半胱氨酸取代为酪氨酸或半胱氨酸取代为丝氨酸残基(例如，对于鼠或嵌合的、未修饰的，为SEQ ID NO：16或24；或对于修饰的序列，为SEQ ID NO：34、42、46、54、58、62、66、70、74、或78的任一个)。
在又一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或统称所有CDR)，所述重和轻链可变区包含US 2015/0210769的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包括：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：4的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO：13的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：33的VLCDR3氨基酸序列，各自公开于US 2015/0210769的表1中；
(b)VH，其包含选自SEQ ID NO：1的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：2的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO：10的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：32的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0210769的表1中；
(c)VH，其包含SEQ ID NO：224的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO：13的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：33的VLCDR3氨基酸序列，各自公开于US 2015/0210769的表1中；或者
(d)VH，其包含SEQ ID NO：224的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：2的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO：10的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：32的VLCDR3氨基酸序列，各自公开于US 2015/0210769的表1中。
在另一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含(i)重链可变区(VH)，其包含选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：224的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列；和(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：13的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14的VLCDR2氨基酸序列，和SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的VLCDR3氨基酸序列，各自公开在US2015/0210769的表1中。
在其他实施方案中，PD-1抑制剂是选自纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗的抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗的替代名称包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗(CAS注册号：946414-94-4)。纳武单抗是一种完全人源的IgG4单克隆抗体，可特异性阻断PD1。在US8,008,449和WO2006/121168中公开了纳武单抗(克隆5C4)和特异性结合PD1的其他人单克隆抗体。在一个实施方案中，PD-1的抑制剂是纳武单抗，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗(也被称为帕姆单抗、MK-3475、MK03475、SCH-900475或
Merck)是人源化的IgG4单克隆抗体，其结合PD-1。派姆单抗和其他人源化抗PD-1抗体公开于Hamid，O.等人(2013)New England Journal of Medicine369(2)：134-44、US 8,354,509和WO2009/114335中。
在一个实施方案中，PD-1的抑制剂是派姆单抗，其公开于例如US 8,354,509和WO2009/114335中，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是匹地珠单抗。匹地珠单抗(CT-011；Cure Tech)是与PD1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。匹地珠单抗和其他人源化抗PD-1单克隆抗体在US8,747,847和WO2009/101611中公开。
其他抗PD1抗体包括AMP 514(Amplimmune)等等，例如US 8,609,089、US2010028330和/或US 20120114649中公开的抗PD1抗体。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是免疫粘附素，例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如，公开于WO2010/027827和WO2011/066342中)，其是阻断PD-1和B7-H1之间相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。有几种抗PD-1抗体，包括但不限于两种目前已获得FDA批准的抗体派姆单抗和纳武单抗，以及目前正在临床测试中的抗体，包括但不限于替雷利珠单抗(tislelizumab)、Sym021、REGN2810(Rengeneron研发)、JNJ-63723283(J and J研发)、SHR-1210、匹地珠单抗、AMP-224、MEDIo680、PDR001和CT-001，以及Liu等人在J.Hemat.&Oncol.(2017)10：136中列出的其他抗体，其中的抗体明确通过引用并入。
在一些实施方案中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白可以与PD-1抑制剂(例如，抗PD-1抗体)组合使用。在某些实施方案中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)与抗PD-1抗体组合施用。
B.抗TIM3抗体
示例性的非限制性抗TIM-3抗体分子公开于2015年8月6日公开的标题为“TIM-3的抗体分子及其用途”的美国2015/0218274中，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，抗TIM-3抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23的氨基酸序列；或如US 2015/0218274的表1-4中所述；或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。抗TIM-3抗体分子任选地包含来自重链、轻链或两者的前导序列，如US 2015/0218274中所示；或与其基本相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TIM-3抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如选自以下任一种的抗体：ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23的氨基酸序列；或如US 2015/0218274的表1-4中所述；或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又一个实施方案中，抗TIM-3抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0218274的表1-4中所示的氨基酸序列，或由表1-4中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1-4中所示的氨基酸序列或由表1-4所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。
在又一个实施方案中，抗TIM-3抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述轻链可变区包含US 2015/0218274的表1-4中所示的氨基酸序列，或由表1-4中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1-4中所示的氨基酸序列或由表1-4所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方案中，抗TIM-3抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在又一个实施方案中，抗TIM-3抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或统称所有CDR)，所述重和轻链可变区包含US 2015/0218274的表1-4中所示的氨基酸序列，或由表1-4中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1-4中所示的氨基酸序列或由表1-4所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。
在一个实施方案中，抗TIM-3抗体分子包括：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO：9的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：10的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：5的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：12的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：14的VLCDR3氨基酸序列，各自公开于US 2015/0218274的表1-4中；
(b)VH，其包含选自SEQ ID NO：3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：4的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO：5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO：6的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：8的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1-4中；
(c)VH，其包含选自SEQ ID NO：9的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：25的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO：5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO：12的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：14的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1-4中；
(d)VH，其包含选自SEQ ID NO：3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：24的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO：5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO：6的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：8的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US2015/0218274的表1-4中；
(e)VH，其包含选自SEQ ID NO：9的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：31的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO：5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO：12的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：14的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1-4中；或
(f)VH，其包含选自SEQ ID NO：3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：30的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO：5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO：6的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：8的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US2015/0218274的表1-4中。
示例性的抗TIM-3抗体在美国专利号：8,552,156、WO 2011/155607、EP 2581113和美国公开号：2014/044728中公开，并且包括Sym023(Symphogen的临床开发中)、TSR-22(在Tesaro的临床开发中)、LY3321367(在礼来的临床开发中)、BGTB-A425(在BeiGene的临床开发中)、MBG453(在诺华的临床开发中)和INCAGN02390(在Incyte的临床开发中)。
在一些实施方案中，抗TIM-3抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。在临床开发中有几种TIM-3抗体，包括但不限于MBG453和TSR-022。
在一些实施方案中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白可以与TIM-3抑制剂(例如，抗TIM3抗体)组合使用。在某些实施方案中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)与抗TIM3抗体组合施用。
C.抗CTLA4抗体
示例性抗CTLA4抗体包括替西木单抗(tremelimumab)(可从Pfizer获得的IgG2单克隆抗体，前称ticilimumab，CP-675,206)；和伊匹单抗(ipilimumab)(CTLA-4抗体，也称为MDX-010，CAS编号477202-00-9)。其他示例性的抗CTLA-4抗体公开于例如美国专利5,811,097。
在一个实施方案中，抗CTLA4抗体是伊匹单抗，其公开于例如US 5,811,097、US 7,605,238、WO00/32231和WO97/20574中，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一个实施方案中，抗CTLA4抗体是替西木单抗，例如在US 6,682,736和WO00/37504中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。因此，用于本文概述的联合疗法的合适的抗CTLA-4抗体包括但不限于一种当前FDA批准的抗体依匹单抗，以及另外几种正在开发中的抗体，包括CP-675,206和AGEN-1884。
在一些实施方案中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白可以与CTLA-4抑制剂(例如，抗CTLA-4抗体)组合使用。在某些实施方案中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)与抗CTLA-4抗体组合施用。
D.抗PD-L1抗体
示例性的非限制性抗PD-L1抗体分子公开于2016年4月21日公开的标题为“PD-L1的抗体分子及其用途”的US 2016/0108123中，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-克隆-K、BAP058-克隆-L、BAP058-克隆-M、BAP058-克隆-N或BAP058-克隆-O的任一种的氨基酸序列；或如US 2016/0108123的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-克隆-L、BAP058-克隆-M、BAP058-克隆-N或BAP058-克隆-O的任一个；或如US 2016/0108123的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述重链可变区包含US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。
在又一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述轻链可变区包含US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在又一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或统称所有CDR)，所述重和轻链可变区包含US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括：
(i)重链可变区(VH)，其包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：2的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：9的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：10的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：11的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123的表1中公开。
在另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括：
(i)重链可变区(VH)，其包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：5的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：12的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：14的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123的表1中公开。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO：1的VHCDR1氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO：4的VHCDR1氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO：195的VHCDR1氨基酸序列，每个在US 2016/0108123的表1中公开。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是抗体分子。在一些实施方案中，抗PD-L1抑制剂选自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C、MDX-1105、阿特唑单抗、杜巴单抗、阿伐单抗或BMS936559。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。阿特珠单抗(也称为MPDL3280A和
Roche)是与PD-L1结合的单克隆抗体。阿特珠单抗和其他人源化抗PD-L1抗体在US8,217,149中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是阿伐单抗。阿伐单抗(也称为A09-246-2；MerckSerono)是与PD-L1结合的单克隆抗体。阿阀单抗和其他人源化抗PD-L1抗体在US 9,324,298和WO2013/079174中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是德瓦鲁单抗(durvalumab)。德瓦鲁单抗(也称为MEDI4736；AstraZeneca)是与PD-L1结合的单克隆抗体。德瓦鲁单抗和其他人源化抗PD-L1抗体在US 8,779,108中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是BMS-936559。BMS-936559(也称为MDX-1105；BMS)是与PD-L1结合的单克隆抗体。BMS-936559和其他人源化抗PD-L1抗体在US 7,943,743和WO2007005874中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。有几种抗PD-L1抗体，包括三种目前已被FDA批准的抗体阿特珠单抗、阿伐单抗、德瓦鲁单抗以及目前在临床测试中的抗体，包括但不限于LY33000054和CS1001，以及Liu等人在J.Hemat.&Oncol.(2017)10：136中列出的其他抗体，其中的抗体明确通过引用并入。
在一些实施方案中，本文所述的IL-15/Rα异二聚体融合蛋白可以与PD-L1或PD-L2抑制剂(例如，抗PD-L1抗体)组合使用。
E.抗TIGIT抗体
在一些实施方案中，抗TIGIT抗体是OMP-313M32。OMP-313M32(OncoMedPharmaceuticals)是与TIGIT结合的单克隆抗体。US20160376365和WO2016191643中公开了OMP-313M32和其他人源化抗TIGIT抗体，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施方案中，抗TIGIT抗体是BMS-986207。BMS-986207(也称为ONO-4686；Bristol-Myers Squibb)是与TIGIT结合的单克隆抗体。BMS-986207和其他人源化抗TIGIT抗体在US20160176963和WO2016106302中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施方案中，抗TIGIT抗体是MTIG7192。MTIG7192(Genentech)是与TIGIT结合的单克隆抗体。MTIG7192和其他人源化抗TIGIT抗体在US2017088613、WO2017053748和WO2016011264中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
在一些实施方案中，抗TIGIT抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。TIGIT抗体在临床开发中有几种，BMS-986207(在BMS进行临床开发)、OMP-313M32(在OncoMed进行临床开发)、MTIG7192A(在Genentech进行临床开发)和AB154(在ArcusBiosciences进行临床开发)。
在一些实施方案中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白可以与TIGIT抑制剂(例如，抗TIGIT抗体)组合使用。在某些实施方案中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)与抗TIGIT抗体组合施用。
在某些情况下，抗TIGIT抗体可与XENP24306结合使用，包括但不限于BMS-986207(在BMS进行临床开发)、OMP-313M32(在OncoMed进行临床开发)、MTIG7192A(在Genentech进行临床开发)和AB154(在Arcus Biosciences进行临床开发)。
F.抗LAG3抗体
示例性的非限制性抗LAG-3抗体分子公开于2015年9月17日公开的标题为“LAG-3的抗体分子及其用途”的US 2015/0259420中，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子包含至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(如BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、BAP050-克隆-G、BAP050-克隆-H、BAP050-克隆-I或BAP050-克隆-J的任一种的氨基酸序列；或如US 2015/0259420的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(如BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、BAP050-克隆-G、BAP050-克隆-H、BAP050-克隆-I或BAP050-克隆-J的任一种；或如US 2015/0259420的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
在又一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0259420的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。
在又一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或统称所有CDR)，所述轻链可变区包含US 2015/0259420的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在又一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或统称所有CDR)，所述重和轻链可变区包含US 2015/0259420的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个CDR(或全部所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。
在一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子包括：
(i)重链可变区(VH)，其包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：2的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：12的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开。
在另一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子包括：
(i)重链可变区(VH)，其包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：5的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：15的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开。
在一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO：1的VHCDR1氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO：4的VHCDR1氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO：286的VHCDR1氨基酸序列，其各自公开于US2015/0259420的表1中。
在一些实施方案中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。BMS-986016(也称为BMS986016；Bristol-Myers Squibb)是与LAG-3结合的单克隆抗体。BMS-986016和其他人源化的抗LAG-3抗体公开于US 201I/0150892、WO2010/019570和WO2014/008218。
在一些实施方案中，抗LAG3抗体是LAG525。LAG525(也称为IMP701；诺华公司)是与LAG3结合的单克隆抗体。LAG525和其他人源化抗LAG3抗体在US 9,244,059和WO2008132601中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
其他示例性抗LAG3抗体公开于例如US2011150892和US2018066054中。
在一些实施方案中，抗LAG-3抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。在临床开发中有几种抗LAG-3抗体，包括Regeneron的REGN3767、TSR-033(Tesaro)、BMS-986016(BMS)和Sym022(Symphogen)。
在一些实施方案中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白可以与LAG3抑制剂(例如，抗LAG3抗体)组合使用。在某些实施方案中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)与抗LAG3抗体组合施用。
在一些实施方案中，抗LAG-3抗体可以与XENP24306组合使用，包括但不限于Regeneron的REGN3767、TSR-033(Tesaro)、BMS-986016(BMS)和Sym022(Symphogen)。
XII.联合疗法
在一些方面，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白与另一种治疗剂组合施用。如本文所用，“组合”施用是指在受试者患有疾病的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在诊断出受试者患有该疾病之后且在该疾病已治愈或消除或因其他原因停止治疗之前进行两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当开始第二种递送时，一种治疗的递送仍在进行中，因此在施用方面存在重叠。在本文中有时将其称为“同时”或“并发递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方案中，由于联合施用，治疗更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，与第二种治疗在不使用第一种治疗的情况下施用相比，第二种治疗在更少的第二种治疗下可以看到相同的效果，或者第二种治疗在更大程度上减轻了症状，或对于第一种治疗看到类似的情况。在一些实施方案中，递送使得症状或与病症有关的其他参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的减少。两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。递送可以使得当递送第二种时仍然可以检测到递送的第一种治疗的效果。
本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)和至少一种另外的治疗剂可以同时以相同或分开的组合物或顺序施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)，然后可以施用另外的药剂，或者可以颠倒施用顺序。
本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白(例如XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)和/或其他治疗剂、程序或方式可在活性病症期间或缓解或较不活性疾病期间内施用。IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)可以在其他治疗之前、与治疗同时、在治疗之后或在疾病缓解期间施用。
组合使用时，IL-15/RαFc融合蛋白(例如XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)和其他药剂(例如第二种或第三种药剂)或全部可以以低于或等于单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的量或剂量的量或剂量施用。在一些实施方案中，IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)、其他药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的施用量或剂量比单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的量或剂量低(例如至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施方案中，IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)、其他药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的导致期望效果(例如癌症治疗)的量或剂量比单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的实现相同治疗效果所需的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
在进一步方面，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)可用于与以下联合的治疗方案中：化学疗法，放射，免疫抑制剂例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506，针对检查点抑制剂的抗体，或其他免疫消融剂例如CAMPATH，其他抗体疗法，癌得星(cytoxan)，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR90165，细胞因子，和照射，肽疫苗，如Izumoto等人2008JNeurosurg 108：963-971所述的。
在某些情况下，本发明的化合物与其他治疗剂例如其他抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐药)、止痛药、细胞保护剂及其组合结合。
在一个实施方案中，本文描述的IL-15/RαFc融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)可以与化学治疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包括蒽环类(例如，阿达比星、柔红霉素、阿霉素(例如，脂质体阿霉素))，蒽二酮衍生物(例如，米托蒽醌)，长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)，烷基化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)，免疫细胞抗体(例如，阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、托西莫单抗、brentuximab)，抗代谢药(包括，例如叶酸拮抗剂、阿糖胞苷、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))，mTOR抑制剂，TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂，蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素A、胶体毒素或硼替佐米)，免疫调节剂例如沙利度胺或沙利度胺衍生物(如来那度胺)，激酶抑制剂例如依鲁替尼(如Imbruvica)，皮质类固醇(如地塞米松、泼尼松)和CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松的组合)，含或不含依托泊苷(例如VP-16)的CHOP(环磷酰胺、羟基柔红霉素、
(长春新碱)和泼尼松的组合)，环磷酰胺和喷妥他汀的组合，苯丁酸氮芥和泼尼松的组合，氟达拉滨和环磷酰胺的组合，或另一种药剂，如盐酸氮芥(例如Mustargen)，阿霉素
甲氨蝶呤，奥沙利铂或阿糖胞苷(ara-C)。
考虑用于联合疗法的一般化学治疗剂包括阿那曲唑
比卡鲁胺
硫酸博来霉素
白消安
白消安注射液
卡培他滨
N4-戊氧羰基5-脱氧5-氟胞苷，卡铂
卡莫司汀
苯丁酸氮芥
顺铂
克拉屈滨
环磷酰胺(
或
)，阿糖胞苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷
阿糖胞苷脂质体注射液
达卡巴嗪(DTIC-
)，放线菌素(Actinomycin D、Cosmegan)，盐酸柔红霉素
柠檬酸柔红霉素脂质体注射液
地塞米松，多西他赛
盐酸阿霉素
依托泊苷
磷酸氟达拉滨
5-氟尿嘧啶
氟他胺
替扎西他滨，吉西他滨(二氟脱氧胞苷)，羟基脲
依达比星
异环磷酰胺
伊立替康
L-天冬酰胺酶
亚叶酸钙，美法仑
6-巯基嘌呤
甲氨蝶呤
米托蒽醌
mylotarg，紫杉醇
phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)，喷妥他汀，带有卡莫司汀植入物的聚苯丙生20
柠檬酸他莫昔芬
替尼泊苷
6-硫鸟嘌呤，硫替太帕，替拉帕明
)，注射用盐酸托泊替康
长春碱
长春新碱
和长春瑞滨
XIII.治疗
一旦制备，通过治疗癌症，通常通过与本发明的异二聚体Fc融合蛋白的结合促进T细胞活化(例如不再抑制T细胞)，本发明的组合物可用于许多肿瘤学应用。
因此，本发明的异二聚体组合物可用于治疗这些癌症，包括但不限于转移性癌症。
A.用于体内施用的异二聚体蛋白组合物
通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备根据本发明使用的抗体的制剂用于储存(如Remington′s PharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.Ed.[1980]概述的)，以冻干制剂或水溶液的形式。[1980]中通常概述的)进行混合来制备根据本发明使用的组合物的调配物，以供以冻干调配物或水溶液的形式进行储存。可接受的载体、缓冲剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
B.施用方式
根据已知方法将本发明的异二聚体蛋白和化学治疗剂施用于受试者，例如以推注静脉内施用或在一段时间内连续输注。
C.治疗方式
在本发明的方法中，疗法用于提供关于疾病或病状的阳性治疗应答。“阳性治疗反应”旨在改善疾病或病况，和/或改善与疾病或病况相关的症状。举例来说，阳性治疗反应是指疾病中的一种或多种以下改善：(1)肿瘤细胞数量的减少；(2)肿瘤细胞死亡增加；(3)抑制肿瘤细胞存活；(5)肿瘤生长的抑制(即，在某种程度上减慢，优选停止)；(6)提高患者生存率；(7)与疾病或病况相关的一种或多种症状有所缓解。
可以通过对所述疾病或病状具有特异性的标准化应答标准来确定任何给定疾病或病状的阳性治疗应答。可以使用筛选技术，例如磁共振成像(MRI)扫描、x射线照相术、计算机断层摄影术(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样，包括骨髓穿刺(BMA)和对循环中的肿瘤细胞计数来评定针对肿瘤形态(例如总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)变化的肿瘤应答。
除了这些阳性治疗应答之外，经受疗法的受试者可能经历与疾病相关联的症状的改善的有益效果。
根据本发明的治疗包括所用药物的“治疗有效量”。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望治疗结果的量。
治疗有效量可以根据如个体的疾病状态、年龄、性别和重量等因素以及药物在个体中引发期望的应答的能力而变化。治疗有效量也是蛋白质或蛋白质部分的治疗有益效果超过其任何毒性或有害效果的量。
用于肿瘤疗法的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。可以在预测人肿瘤中功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。
替代性地，通过熟练的从业者已知的体外测定，组合物的这种特性可以通过检验化合物抑制肿瘤生长或诱导凋亡的能力来评估。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小，或以其他方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和所选择的特定组合物或给药途径等因素来确定这样的量。
调整剂量方案以提供最佳的所期望反应(例如，治疗反应)。举例来说，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可以单位剂型配制，以便于施用和使剂量均匀。如本文所用的单位剂型是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理离散单元；每个单元含有预定量的活性化合物，其经过计算可与所期我的药物载体一起产生所期望的治疗效果。
本发明的单位剂型的规格由以下各项指定并且直接取决于以下各项：(a)活性化合物的独特特征和欲实现的特定治疗效果；和(b)混配这类活性化合物用于治疗个体敏感性在所属领域中固有的限制。
本发明中所用的异二聚体蛋白的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病况并且可以由所属领域的技术人员来确定。
用于本发明的治疗有效量的异二聚体蛋白的示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg。
所有引用的参考文献以全文引用的方式明确地并入本文中。
尽管以上为了说明的目的描述本发明的特定实施方案，但是所属领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求中描述的本发明的情况下，可以进行细节的许多变化。
实施例
以下提供实施例以说明本发明。这些实施例并不意味着将本发明限制于任何特定的应用或操作理论。对于本发明中所论述的所有恒定区位置，根据如Kabat中的EU索引(Kabat等人，1991，《免疫学相关蛋白质序列》第5版，美国公共卫生服务部，美国国家卫生研究院，贝塞斯达，其以引用的方式整体并入本文中)。抗体领域中的技术人员将了解这个规约由以下组成：免疫球蛋白序列的特定区域的非顺序编号、对免疫球蛋白家族中的保守位置实现标准化的称呼。因此，由EU索引定义的任何给定免疫球蛋白的位置不一定对应于其顺序序列。
在美国公开2015/0307629、2014/0288275和WO2014/145806中概述了一般和具体的科学技术，所有这些技术都通过引用明确地并入本文，特别是其中概述的技术。
XIV.实施例1：IL-15/IL-15Rα(寿司)Fc融合蛋白
为了解决IL-15/IL-15Rα异二聚体的短半衰期，我们生成了IL-15/IL-15Rα(寿司)复合物作为Fc融合体(此处称为IL-15/Rα-Fc融合蛋白质)，旨在促进生产和促进FcRn介导的复合物循环和延长半衰期。
A.1A：工程化IL-15/Rα-Fc融合蛋白
通过标准基因合成构筑编码IL-15或IL-15Rα寿司结构域的质粒，然后将其亚克隆到含有Fc融合搭配物(例如，如图8A-8D中描绘的恒定区)的pTT5表达载体中。图9A-9G中描绘说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白形式的卡通示意图。
IL-15Rα异二聚体Fc融合体或“IL-15/Rα-异源Fc”形式包含重组融合到异二聚体Fc一侧的IL-15和重组融合到异二聚体Fc另一侧的IL-15Rα寿司结构域(图9A))。IL-15和IL-15Rα在其各自的Fc区C端和N端之间可以具有可变长度的连接子(参见图7)。这种形式的示例性蛋白质包括XENP20818和XENP21475，其序列如图10所示(也见表2)。包括XENP20819、XENP21471、XENP21472、XENP21473、XENP21474、XENP21476、XENP21477的这种形式的其他蛋白质的序列在WO2018071919中分别在图104A-104D中描绘出并且分别为SEQ ID NO：418-423、424-429、430-435、436-441、442-447、454-459和460-465，通过引用并入本文。
表2
| <u>XENP</u> | <u>IL-15-Fc连接子</u> | <u>IL-15Rα(寿司)-Fc连接子</u> |
| 20818 | (GGGGS)<sub>1</sub> | (GGGGS)<sub>1</sub> |
| 20819 | (GGGGS)<sub>1</sub> | (GGGGS)<sub>4</sub> |
| 21471 | 无 | (GGGGS)<sub>1</sub> |
| 21472 | (GGGGS)<sub>1</sub> | 无 |
| 21473 | (GGGGS)<sub>1</sub> | (GGGGS)<sub>3</sub> |
| 21474 | 无 | (GGGGS)<sub>4</sub> |
| 21475 | 无 | 无 |
| 21476 | (GGGGS)<sub>2</sub> | (GGGGS)<sub>2</sub> |
| 21477 | (GGGGS)<sub>2</sub> | (GGGGS)<sub>4</sub> |
单链IL-15/Rα-Fc融合体或“scIL-15/Rα-Fc”形式包含通过可变长度连接子与IL-15融合的IL-15Rα寿司结构域(称为“单链”IL-15/IL-15Rα复合物或“scIL-15/Rα”)，其然后与异二聚体Fc区的N端融合，该分子的另一侧为“仅Fc”或“空-Fc”异二聚体Fc(图9B)。图7描述了说明性连接子的序列。这种形式的示例性蛋白质是XENP21478，其序列在图11中进行了描绘(也见表3)。包括XENP21993、XENP21994、XENP21995、XENP23174、XENP24477和XENP24480的这种形式的其他蛋白质的序列在WO2018071919中分别在图104G、104H、104AG、104AU和104AV中描绘出并且分别为SEQ ID NOS：514-518、519-523、524-528、849-853、1063-1067和1078-1082，通过引用并入本文。
表3
| XENP | IL-15和IL-15Rα之间的连接子 |
| 21478 | (GGGGS)<sub>6</sub> |
| 21993 | (GGGGS)<sub>5</sub> |
| 21994 | (GGGGS)<sub>4</sub> |
| 21995 | (GGGGS)<sub>3</sub> |
| 23174 | (GKPGS)<sub>6</sub> |
| 23175 | (GKPGS)<sub>5</sub> |
| 24477 | (GGGGS)<sub>7</sub> |
| 24480 | 30AA连接子 |
非共价IL-15/Rα-Fc融合体或“ncIL-15/Rα-Fc”形式包含与异二聚体Fc区融合的IL-15Rα寿司结构域，而IL-15被单独转染，因此形成非共价IL-15/IL-15Rα复合物，该分子的另一侧是“仅Fc”或“空-Fc”异二聚体Fc(图9C)。这种形式的示例性蛋白质包括XENP21479、XENP22366和XENP24348，其序列在图12A-12B中描绘。
二价非共价IL-15/Rα-Fc融合物或“二价ncIL-15/Rα-Fc”形式(图9D)包含与同源二聚体Fc区的N端融合的IL-15Rα(寿司)，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。这种形式的一种示例性蛋白质是XENP21978，其序列如图13描绘。在WO2018071919的图104E中以SEQ ID NOS：480-483描绘了包括XENP21979在内的这种形式的其他蛋白质的序列，其通过引用并入本文。
二价单链IL-15/Rα-Fc融合物或“二价scIL-15/Rα-Fc”形式(图9E)包含通过可变长度的连接子与IL-15Rα(寿司)融合的IL-15(称为“单链”IL-15/IL-15Rα(寿司)复合物或“scIL-15/Rα”)，其随后与同源二聚体Fc区的N端融合。图7描述了说明性连接子的序列。此形式的说明性蛋白质的序列如图14描绘。
Fc-非共价IL-15/Rα融合物或“Fc-ncIL-15/Rα”形式(图9E)包含与异二聚体Fc区的C端融合的IL-15Rα(寿司)，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物，分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”。这种形式的示例性蛋白质是XENP22637，其序列如图15描绘。在WO2018071919的图104T中以SEQ ID NOS：668-672描绘了包括XENP22638在内的这种形式的其他蛋白质的序列，其通过引用并入本文。
Fc-单链IL-15/Rα融合物或“Fc-scIL-15/Rα”形式(图9G)包含通过可变长度的连接子与IL-15Rα(寿司)融合的IL-15(“scIL-15/Rα”)，其随后与异二聚体Fc区的C端融合，分子的另一侧是“仅Fc”或“空Fc”。图7描述了说明性连接子的序列。此形式的说明性蛋白质的序列如图16描绘。
通过在HEK293E细胞中瞬时转染产生蛋白质，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白A色谱(GE Healthcare)和阴离子交换色谱(HiTrapQ 5mL柱，具有5-40％梯度的50mM Tris pH 8.5和50mM Tris pH 8.5，具有1M NaCl)。
B.1B：IL-15/Rα-Fc融合蛋白的纯度和均质性表征
通过尺寸排阻色谱法(SEC)和毛细管等电聚焦(CEF)表征上述几种形式产生的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的纯度和均质性，如下所述。
使用SEC分析蛋白质以测量它们的大小(即流体动力学体积)并确定纯化样品的天然样行为。该分析在Agilent 1200高效液相色谱(HPLC)系统上进行。使用1x PBS，pH 7.4作为流动相在4℃下以1.0mL/min将样品注射到SuperdexTM 20010/300GL色谱柱(GEHealthcare Life Sciences)上，持续25分钟，UV检测波长为280nM。使用Agilent OpenLab色谱数据系统(CDS)ChemStation版本AIC版本C.01.07进行分析。所选IL-15/Rα-Fc融合蛋白的色谱图如图17B、18B和19B所示。
使用LabChip GXII Touch HT(PerkinElmer，Waltham，MA)，使用Protein ExpressAssay LabChip和Protein Express Assay Reagent Kit，使用制造商的说明书，通过CEF电泳分析蛋白质。样品一式两份进行，一次在还原条件下(用二硫苏糖醇)，另一次在非还原条件下。所选IL-15/Rα-Fc融合蛋白的凝胶图像显示在图17C、18C和19C中。
每种融合蛋白的峰对称性和其他物种的相对较低群表明，各种形式均牢靠。
C.1C：表征IL-15/Rα-Fc融合蛋白的亲和力和稳定性
使用基于生物层干涉法(BLI)的方法Octet对IL-15/Rα-Fc融合蛋白进行亲和力筛选。Octet的实验步骤通常包括以下各者：固定(将配体或测试物捕获到生物传感器上)；缔合(将涂覆有配体或测试物的生物传感器浸渍到含有对应测试物或配体的连续稀释液的孔中)；和解离(将生物传感器返回到含有缓冲液的孔中)以便确定测试物的亲和力。含有单独缓冲液的参考孔还包括于数据处理期间的背景校正的方法特别是，使用抗人Fc(AHC)生物传感器捕获测试物，然后将其浸入多种浓度的IL-2Rβ(R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)中进行KD测定。亲和力结果和对应的传感图在图17D、18D和19D中描绘。三种构建体均显示出对IL-1Rβ的高亲和力结合(3-8nM)。
使用差示扫描荧光法(DSF)评估IL-15/Rα-Fc融合蛋白的稳定性。使用Bio-RadCFX连接实时PCR检测系统进行DSF实验。将蛋白质与SYPRO橙色荧光染料混合且在PBS中稀释到0.2mg/mL。SYPRO橙色的最终浓度为10×。在25℃下孵育初始10分钟后，使用1℃/min的加热速率将蛋白质从25℃加热至95℃。每30秒进行一次荧光测量。使用仪器软件计算解链温度(Tm)。稳定性结果和相应的熔融曲线在图17E、18E和19E中描绘。每个构建体在Tm约68℃时显示出良好的整体稳定性。
D.1D：IL-15/Rα-Fc融合蛋白在细胞增殖测定中的活性
在细胞增殖分析中测试如上所述的各种形式的IL-15/Rα-Fc融合蛋白。用指定浓度的测试物处理人类PBMC。处理4天后，PBMC用抗CD8-FITC(RPA-T8)、抗CD4-PerCP/Cy5.5(OKT4)、抗CD27-PE(M-T271)、抗CD56-BV421(5.1H11)、抗CD16-BV421(3G8)和抗CD45RA-BV605(Hi100)染色以便对以下细胞类型进行门控：CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞(CD56+/CD16+)。Ki67是与细胞增殖严格相关的蛋白质，并且使用抗Ki67-APC(Ki-67)和Foxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific，Waltham，Mass.))进行细胞内Ki67的染色。使用FACS(在图20A-20C和图21A-21C中描绘)测量Ki67对上述细胞类型的百分比。
各种IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导CD8+ T细胞和NK细胞的强烈增殖。值得注意的是，增殖活性的差异取决于IL-15-Fc侧的连接子长度。特别地，没有连接子(仅铰链)的构建体，包括XENP21471、XENP21474和XENP21475，表现出较弱的增殖活性。
E.1E：在SEB刺激的PBMC测定中IL-15/Rα-Fc融合蛋白的活性
如上所述，IL-15/Rα异二聚体可以有效地激活T细胞。在SEB刺激的PBMC测定中测试了上述各种形式的IL-15/Rα-Fc融合蛋白。葡萄球菌肠毒素B(SEB)为以类似于经由T细胞受体(TCR)活化所实现的方式引起T细胞活化和增殖的超抗原。SEB刺激人PBMC是测定T细胞活化和增殖的常用方法。
用10ng/mL的SEB与20μg/mL的各种IL-15/Rα-Fc融合蛋白或对照(PBS，同种型对照和二价抗PD-1抗体)联合刺激来自多个供体的人PBMC 72小时。处理后，收集上清液并分析IL-2，其数据如图22所示。数据清楚地表明，IL-15/Rα-Fc融合蛋白比PBS和同种型对照更能增强IL-2的分泌。值得注意的是，许多IL-15/Rα-Fc融合蛋白具有与抗PD-1抗体相同或更好的活性。
F.1F：IL-15/Rα-Fc融合蛋白增强了人PBMC植入的NSG小鼠中的植入和疾病活性
IL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP20818在雌性NSG(NOD-SCID-γ)免疫缺陷小鼠中进行的移植物抗宿主病(GVHD)模型中进行了评估。当向NSG小鼠注射人类PBMC时，人类PBMC发展出针对小鼠细胞的自身免疫应答。注射人PBMC然后注射IL-15/Rα-Fc融合蛋白对NSG小鼠进行治疗增强植入的T细胞的增殖。
通过第0天的IV-OSP将1000万人PBMC移植到NSG小鼠中，然后给予XENP20818(第1天服用1mg/kg，然后每周一次)和重组IL-15(Biolegend；第1天服用0.17mg/kg和然后此后每周一次)。存活曲线如图23所示。数据显示，与接受重组IL-15的小鼠(在第14天全部存活)相比，接受IL-15/Rα-Fc融合蛋白的小鼠表现出快速的发病率和死亡率(在第10天全部死亡)。这可能是由于预期的IL-15/Rα-Fc融合蛋白更长的半衰期。
在另一个实验中，在第0天通过IV-OSP将1000万人PBMC移植到NSG小鼠中，然后在第1天给予XENP20818(1mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg或0.03mg/kg)，然后每周一次)或PBS。包括未移植PBMC的小鼠的对照组，以研究XENP20818对野生型NSG小鼠的任何作用。在第7天收集血液以测量IFNγ，其数据示于图24，并测量CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和CD45+细胞计数，其数据示于图25A-25C。数据显示XENP20818有明确的剂量反应。
XV.实施例2：具有工程化二硫键的IL-15/Rα-Fc异二聚体融合蛋白
为了进一步提高稳定性并延长IL-15/Rα-Fc融合蛋白的半衰期，我们将二硫键设计到IL-15/Rα界面。
A.2A：具有工程化二硫键的IL-15/Rα异二聚体的工程化和表征
通过检查IL-15/Rα复合物的晶体结构，以及通过使用分子操作环境(MolecularOperating Environment(MOE)；加拿大魁北克省蒙特利尔化学计算集团(ChemicalComputing Group，Montreal，Quebec，Canada))软件建模，预测IL-15/Rα界面处的残基可以被半胱氨酸取代以形成共价二硫键，如图26中所描绘。
通过标准基因合成构建了编码IL-15或IL-15Rα(寿司)的质粒，然后将所述质粒亚克隆到pTT5表达载体中。IL-15Rα(寿司)链包括一个C端多组氨酸标签。通过标准诱变技术将如上所述鉴定的残基被半胱氨酸取代。另外，在IL-15Rα中的寿司结构域后多达三个氨基酸被添加到IL-15Rα(寿司)的C端，作为工程化的半胱氨酸的骨架(其说明性序列在图27中描绘)。图28和29中以及序列表中分别描绘用半胱氨酸工程化的说明性IL-15和IL-15Rα(寿司)变体的序列。
在图30A-30C中描绘了具有和不具有工程化二硫键的IL-15/Rα异二聚体的卡通示意图。
在图31中描述了说明性ncIL-15/Rα异二聚体XENP21996的序列。图32中显示了说明性dsIL-15/Rα异二聚体XENP22004、XENP22005、XENP22006、XENP22008和XENP22494的序列。说明性的scIL-15/Rα异二聚体XENP22049的序列在图33中描绘。
产生“野生型”IL-15/Rα异二聚体作为对照，其在C末端带有其他残基，但没有工程化的半胱氨酸。WO2018/071919分别在图104H和104I中以及分别以SEQ ID NOS：531-532、533-534和535-536描绘了这种形式的其他蛋白质(包括XENP22001、XENP22002和XENP22003)的序列，在此通过引用并入。
通过在HEK293E细胞中瞬时转染产生了蛋白质，并且通过Ni-NTA色谱法对其进行了纯化。
纯化蛋白质后，通过毛细管等电聚焦(CEF)对蛋白质表征其纯度和均一性，如实施例1B中所述，其凝胶图像如图34-35描绘。然后，如实施例1C中一般性描述的，使用DSF筛选蛋白质的稳定性，其数据描绘于图36-38。最后，如实施例1C中一般所述，通过Octet筛选蛋白质与IL-2Rβ的结合，其数据描绘于图38。
正如变性非还原性CEF所示，正确形成了许多二硫键，其中与没有工程化二硫键的对照相比，可以看到共价复合物的较大分子量(图34-35)。二硫键结合的IL-15/Rα异二聚体具有高达+13℃的增强的热稳定性(图38)。结合工程化的二硫键不影响与IL-2Rβ的结合(图38)。最有利的二硫键结合对是XENP22005、XENP22006，XENP22008和XENP22494，它们被构建为Fc融合蛋白，如下所述。
B.2B：具有工程化二硫键的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的表征
将具有上述突变的编码IL-15或IL-15Rα寿司结构域的质粒亚克隆到含有Fc融合伴侣(例如，如图8A-8D所示的恒定区)的pTT5表达载体中。图39A-39D中描绘具有工程化二硫键的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的卡通示意图。
二硫键键合的IL-15/Rα异二聚体Fc融合物或“dsIL-15/Rα-异源Fc”(图39A)与“IL-15/Rα-异源Fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。这种形式的示例性蛋白质包括XENP22013、XENP22014，XENP22015和XENP22017，其序列在图40A-40B中进行了描绘。
二硫键键合的IL-15/Rα Fc融合物或“dsIL-15/Rα-Fc”(图39B)与“ncIL-15/Rα-Fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。这种形式的示例性蛋白质包括XENP22357、XENP22358、XENP22359、XENP22684和XENP22361，其序列在图41A-41B中进行了描绘。WO2018071919在图104O、104P、104Q和104R中分别描述了这种形式的其他蛋白质(包括XENP22360、XENP22362、XENP22363、XENP22364、XENP22365、XENP22366)的序列，并且分别为SEQ ID NOS：612-616、622-626、627-631、632-636、637-641和642-646，在此通过引用并入本文。
二价二硫键键合的IL-15/Rα-Fc或“二价dsIL-15/Rα-Fc”(图39C)与“二价ncIL-15/Rα-Fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。这种形式的示例性蛋白质包括XENP22634、XENP22635和XENP22636，其序列如图42所描绘。在WO2018071919的图104V中以SEQ ID NOS：685-688描绘了包括XENP22687在内的这种形式的其他蛋白质的序列，其通过引用并入本文。
Fc-二硫键键合的IL-15/Rα融合物或“Fc-dsIL-15/Rα”(图39D)与“Fc-ncIL-15/Rα”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，IL-15Rα(寿司)和IL-15进一步共价连接。这种形式的示例性蛋白质包括XENP22639和XENP22640，其序列如图43所描绘。
产生“野生型”IL-15/Rα-Fc融合蛋白作为对照，其在C末端带有其他残基，但没有工程化的半胱氨酸。这些对照IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列在WO2018071919中的图104F、104G、104L和104M中描绘，包括XENP21988、XENP21989、XENP21990、XENP21991、XENP21992、XENP22354和XENP22355，并且分别为SEQ ID NOS：484-489、490-495、496-501、502-507、508-513、582-586和587-591，在此通过引用并入本文。
通过在HEK293E细胞中瞬时转染产生蛋白质，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白A色谱(GE Healthcare)和阴离子交换色谱(HiTrapQ 5mL柱，具有5-40％梯度的50mM Tris pH 8.5和50mM Tris pH 8.5，具有1M NaCl)。
在纯化蛋白质后，通过毛细管等电聚焦(CEF)表征其纯度和均一性，如实施例1B所述。如上所述，正如变性非还原性CEF所示，正确形成了许多二硫键，其中与没有工程化二硫键的对照相比，可以看到共价复合物的较大分子量(图44)。
然后在细胞增殖分析中测试蛋白质。将IL-15/Rα-Fc融合蛋白(具有或不具有工程化的二硫键)或对照与PBMC一起培育4天。孵育后，PBMC用抗CD4-PerCP/Cy5.5(RPA-T4)、抗CD8-FITC(RPA-T8)、抗CD45RA-BV510(HI100)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD56-BV421(HCD56)、抗CD27-PE(O323)和抗Ki67-APC(Ki-67)染色以标记各种细胞群并通过FACS分析，如实施例1D中一般描述的。图45A-45C中描绘如Ki67表达所指示的NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的增殖。每种IL-15/Rα-Fc融合蛋白和IL-15对照都诱导NK细胞、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的强烈增殖。
XVI.实施例3：为降低效能并且增加PK和半衰期而工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白
为了进一步改善PK并延长半衰期，我们推断降低IL-15的效力会降低抗原沉降，从而增加半衰期。
A.3A：工程化和生产变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白
通过检查IL-15：IL-2Rβ和IL-15：共同γ链界面的晶体结构，以及通过使用MOE软体建模，预测这些界面处的残基可以被取代以降低效能。图46描绘展示预测残基的位置的IL-15：受体复合物的结构模型，其是工程化的等排取代(以降低免疫原性风险)。为降低效力而设计的说明性IL-15变体的序列在图47A-47C中描述。
通过标准基因合成构筑编码IL-15或IL-15Rα(寿司)的质粒，然后亚克隆到含有Fc融合搭配物(例如，如图8A-8D中描绘的恒定区)的pTT5表达载体中。通过标准诱变技并入如上所述鉴定的取代。
为降低效能而工程化的“IL-15/Rα-异源Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列描绘于图48A-48H，包括XENP22815、XENP22817、XENP22818、XENP22823、XENP22824、XENP22825、XENP22826、XENP22827、XENP22828、XENP22830、XENP22831、XENP22832、XENP22833、XENP23555、XENP23559、XENP23560、XENP24017、XENP24020、XENP24043和XENP24048的其他序列描绘于WO2018071919的图104Z、104AA、104AC、104AD、104AE、104AF、104AJ、104AK、104AM、104AN和104AO中并且分别为SEQ ID NOs：729-734、741-746、747-752、777-782、783-788、789-794、795-800、801-806、807-812、819-824、825-830、831-836、837-842、887-892、899-904、905-910、937-942、955-960、961-966和979-984，在此通过引用并入。
为降低效能而工程化的“scIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列在图49A-49D中描绘，包括XENP24013、XENP24014和XENP24016的其他序列描绘于WO2018071919的图104AK和104AL中并且分别为SEQ ID NOS：914-921、922-926和932-936，通过引用并入本文。
图50A-50B中描绘为效能更低而工程化的“ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。为更低效能而工程化的说明性ncIL-15/Rα异二聚体的序列描绘于图51，包括XENP22791、XENP22792、XENP22793、XENP22794、XENP22795、XENP22796、XENP22803、XENP22804、XENP22805、XENP22806、XENP22807、XENP22808、XENP22809、XENP22810、XENP22811、XENP22812、XENP22813和XENP22814的其他序列描绘于WO2018071919的图104V、104W、104X、104Y和104Z中并且分别为SEQ ID NOS：689-690、691-692、693-694、695-696、697-698、699-700、705-706、707-708、709-710、711-712、713-714、715-716、717-718、719-720、721-722、723-724、725-726和727-728，在此通过引用并入。
图52中描绘为效能更低而工程化的“二价ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。图53中描绘为效能更低而工程化的“dsIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。
通过在HEK293E细胞中瞬时转染产生蛋白质，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白A色谱(GE Healthcare)和阴离子交换色谱(HiTrapQ 5mL柱，具有5-40％梯度的50mM Tris pH 8.5和50mM Tris pH 8.5，具有1M NaCl)。
B.3B：为降低效能而工程化的变体IL-15/Rα-异源Fc和scIL-15/Rα-Fc融合蛋白的体外活性
在许多细胞增殖分析中测试变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白。
在第一次细胞增殖分析中，将IL-15/Rα-Fc融合蛋白(具有或不具有工程化取代)或对照与PBMC一起培育4天。培育后，PBMC用抗CD4-Evolve605(SK-3)、抗CD8-PerCP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD16-eFluor450(CB16)、抗CD56-eFluor450(TULY56)、抗CD3-FITC(OKT3)和抗Ki67-APC(Ki-67)染色以标记各种细胞群并且通过FACS分析，如实施例1D一般性描述。图54A-54C和图55中描绘如Ki67表达所指示的NK细胞、CD8+T细胞和CD4+ T细胞的增殖。大多数IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导每个细胞群的增殖；然而，活性根据特定的工程化取代而变化。
在第二次细胞增殖分析中，将IL-15/Rα-Fc融合蛋白(具有或不具有工程化取代)与PBMC一起培育3天。培育后，PBMC用抗CD3-FITC(OKT3)、抗CD4-Evolve604(SK-3)、抗CD8-PerCP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD16-eFluor450(CB16)、抗CD56-eFluor450(TULY56)、抗CD27-PE(O323)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)和抗Ki67-APC(20Raj1)抗体染色以标记各种细胞群。图56A-56C和57A-57C描述了通过FACS的与XENP22821孵育后各种细胞群的选择。首先基于侧向散射(SSC)和前向散射(FSC)对淋巴细胞进行门控(图56A)。然后基于CD3表达门控淋巴细胞(图56B)。基于CD16表达进一步门控CD3表达阴性的细胞以鉴定NK细胞(CD16+)(图56C)。基于CD4和CD8表达进一步门控CD3+ T细胞以鉴定CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和γδT细胞(CD3+CD4-CD8-)(图57A)。如图57B-C所示，将CD4+和CD8+ T细胞门控以表达CD45RA。最后，基于Ki67表达的百分比确定各种细胞群的增殖，并且数据显示在图59A-59D中。NK和CD8+ T细胞比CD4+ T细胞对IL-15/Rα-Fc融合蛋白更敏感，并且如上所述，增殖活性根据特定的工程化取代而变化。图59D显示各种IL-15/Rα-Fc融合蛋白相对于对照XENP20818的EC50倍数变化。图58A和58B进一步描绘在PBEN与XENP22821一起培育之前和之后，通过针对CD69和CD25(T细胞活化标记物)的表达进行门控，用IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后淋巴细胞的活化。
在第三个实验中，在37℃下将额外变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与人类PBMC一起培育3天。培育后，PBMC用抗CD3-FITC(OKT3)、抗CD4-SB600(SK-3)、抗CD8-PerCP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD16-eFluor450(CB 16)、抗CD25-PE(M-A251)和抗Ki67-APC(Ki-67)染色以标记各种细胞群并且通过FACS分析，如实施例1D中所述。图60A-60D中描绘如Ki67表达所指示的CD8+(CD45RA-)T细胞、CD4+(CD45RA-)T细胞、γδT细胞和NK细胞的增殖。
在第四个实验中，将人类PBMC与指定浓度的额外IL-15/Rα-Fc变体一起培育3天。培育后，PBMC用抗CD3-FITC(OKT3)、抗CD4(SB600)、抗CD8-PerCP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD16-eFluor450(CB16)、抗CD25-PE(M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)和抗Ki67-APC(Ki67)染色，并且通过FACS分析，如实施例1D中一般描述。处理后CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和NK细胞上Ki67的百分比描绘于图61A-61C中。
在第五个实验中，将变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与人PBMC在37℃下孵育3天。培育后，细胞用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(SK1)、抗CD8β-APC(2ST8.5H7)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD56-BV605(NCAM16.2)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色并且通过FACS分析，如实施例1D中一般描述。图62A-62E中描绘CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、γδ T细胞和NK细胞上Ki67的百分比。
在第六个实验中，将变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与人PBMC在37℃下孵育3天。培育后，细胞用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(SK1)、抗CD8β-APC((SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD56-BV605(NCAM16.2)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色并且通过FACS分析，如实施例1D中一般描述。图63A-63E中描绘CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、γδ T细胞和NK细胞上Ki67的百分比。
C.3C：为降低效能而工程化的变体scIL-15/Rα-Fc融合蛋白的体外活性，IL-15和IL-15Rα之间的连接子长度不同
将具有上述某些取代基且在IL-15和IL-15Rα之间具有不同长度连接子的IL-15/Rα-Fc融合蛋白(如表4所示)与人PBMC在所示浓度下在37℃孵育3天。培育后，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8-APC(RPA-T8)、抗CD16-BV605(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Fire750(HI100)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色，并且通过FACS分析，如实施例1D中一般描述。图64A-D中描绘CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、γδT细胞和NK(CD16+)细胞上的Ki67百分比。数据显示，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP21479是CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、NK(CD16+)细胞和γδ T细胞增殖中最有效的诱导物。每种scIL-15/Rα-Fc融合蛋白在诱导增殖方面都不如XENP21479有效，但差异取决于连接子长度以及特定的工程化取代。
表4
D.3D：为效能降低而工程化的其他形式的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白的体外活性
将不同形式的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白(如表5所示)与人PBMC在所示浓度下于37℃孵育3天。培育后，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8-APC(RPA-T8)、抗CD16-BV605(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Fire750(HI100)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色，并且通过FACS分析，如实施例1D中一般描述。图65A-65D中分别描绘CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、γδ T细胞和NK(CD16+)细胞上的Ki67百分比。如上所述，数据显示ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP21479是CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、NK(CD16+)细胞和γδ T细胞增殖中最有效的诱导物。值得注意的是，与野生型(XENP21479)相比，将Q108E取代引入ncIL-15/Rα-Fc形式(XENP24349)显著降低其增殖活性。
表5
| XENP | 形式 | 突变 |
| 24351 | 二价IL-15/Rα-Fc | N4D/N65D |
| 21479 | ncIL-15/Rα-Fc | WT |
| 23472 | dsIL-15/Rα-Fc | N65D |
| 23557 | IL-15/Rα-异源Fc | N4D/N65D |
| 24349 | ncIL-15/Rα-Fc | Q108E |
E.3E：通过变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白的STAT5磷酸化
IL-15和IL-15Rα的转染驱动STAT5磷酸化，并随后导致NK和T细胞(CD4+和CD8+)的增殖。因此，在与所示的IL-15/Rα-Fc测试物孵育15分钟后，分析CD8+和CD4+ T细胞的STAT5磷酸化。PBMC在室温下用抗CD4-BV421(RPA-T4)和抗CD8-A700(SK1)染色30-45分钟。洗涤细胞，并且与预冷(-20℃)90％甲醇一起培育20-60分钟。与甲醇孵育后，再次洗涤细胞，并分别用抗CD45RA-BV510(HI100)、抗CD27-BV605(L128)、抗CD25-PE(M A251)、抗pSTAT5-Alexa647(pY687)和抗FoxP3-Alexa488(259D)染色以标记各种细胞群和STAT5磷酸化。图66A-66D描绘了与XENP22821孵育后各种细胞群的选择。首先基于SSC和FSC对淋巴细胞进行门控(图66A)。然后根据CD4和CD8表达对淋巴细胞进行门控，以鉴定CD4+和CD8+ T细胞(图66B)。然后基于CD45RA和CD27表达进一步门控CD4+和CD8+ T细胞，以鉴定分别在图66C-66D中描绘的其他亚群。最后，确定了各种细胞群中STAT5的磷酸化，数据如图67A-67C所示。T细胞上的STAT5磷酸化以剂量依赖性方式被诱导，并且也根据特定的工程化的取代而变化。图67C显示了相对于对照，变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白的STAT5磷酸化的EC 50的倍数变化。
在另一个实验中，将来自B6小鼠的脾细胞与指示的测试物以指示的浓度孵育15分钟。孵育后，脾细胞用抗CD44-BV605(IM7)染色。洗涤细胞，并且与预冷(-20℃)90％甲醇一起培育20-60分钟。在甲醇孵育后，再次洗涤细胞，并用抗CD3-BV421(145-2C11)、抗CD4-PE(GK1.5)、抗CD8-FITC(53-6.7)和抗pSTAT5-Alexa647(pY694)在室温下染色30-45分钟，以标记各种细胞群和STAT5磷酸化。图68A-68B描述了Alexa647 MFI，其指示小鼠CD8+CD45RA-和CD4+CD45RA-上的STAT5磷酸化。
F.3F：为降低效能而工程化的变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白的PK
为了研究为效能降低而工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白是否具有改善的半衰期和PK，我们在C57BL/6小鼠的PK研究中检查了这些变体。在第0天，通过IV-TV向两组小鼠(每组测试物5只小鼠)给药0.1mg/kg指定的测试物。在给药后60分钟收集血清，然后在第2天、第4天和第7天收集血清用于第1组，并且在第1、3和8天用于第2组。在夹心ELISA中使用抗IL-15和抗IL-15Rα抗体测定IL-15/Rα-Fc融合蛋白的血清含量。结果如图69所示。图70描绘了人NK细胞效能与测试物的半衰期之间的相关性。图71描绘了小鼠STAT5信号传导能力与测试物的半衰期之间的相关性。
如预测的那样，效能降低的变体显示出显著更长的半衰期。值得注意的是，与野生型对照XENP20818的0.5天相比，半衰期延长到近9天(参见XENP22821和XENP22822)。
G.3G：效能降低的IL-15/Rα-Fc融合蛋白增强淋巴细胞的扩增
在C57BL/6白化病小鼠中进行的另一项实验中，以指定的浓度给动物喂以指定的测试物(每组5只小鼠)。在第8天将小鼠放血并处死以评估测试物的血清浓度(图146A-146D)和脾脏中的CD8+ T细胞计数(图73)。
数据显示效力降低的变体，例如XENP22818和XENP22829，促进更大的淋巴细胞扩增。但是，效力降低过多(例如XENP22821)消融淋巴细胞扩增的增强。
H.3H：变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白增强了人PBMC植入的NSG小鼠中的植入和疾病活性
如实施例1F中一般描述的，在雌性NSG免疫缺陷小鼠中进行的GVHD模型中评估变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白。
在第一个研究中，在第0天通过IV-OSP将1000万人PBMC移植到NSG小鼠中，然后在第1天以指定浓度给予IL-15/Rα-Fc融合蛋白。CD45+增殖与体重下降相关(如图74所示)，因此在本研究中第4天和第8天测量了CD45+细胞作为疾病活动的指标(图75A-75B)。数据显示，与对照(PBS)相比，每种IL-15/Rα-Fc融合蛋白均增强人PBMC植入的NSG小鼠中CD45+细胞的增殖。
在另一个研究中，在第0天通过IV-OSP将1000万人PBMC移植到NSG小鼠中，然后在第1天以指定浓度给予IL-15/Rα-Fc融合蛋白。在第4、7和11天测量IFNγ水平和人NK细胞、CD45+淋巴细胞、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞计数(图76A-76C、77A-77C、78A-78B、79A-79B和80A-80B)。数据表明，变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白以剂量依赖性方式增强人NK细胞和T细胞的IFNγ分泌和增殖。值得注意的是，观察到的活性与每个变体的体外效力相关。
在另一项研究中，在第-8天通过IV-OSP将1000万个人类PBMC植入NSG小鼠中，然后在第0天用指定浓度的指定测试物给药。在第4、7和11天测量IFNγ水平和人NK细胞、CD45+淋巴细胞、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞计数。图81描绘了在第4、7和11天小鼠血清中的IFNγ水平。图82A-82C分别描绘了第4、7和11天的CD8+ T细胞计数。图83A-83C分别描绘了在第4、7和11天的CD4+ T细胞计数。图84A-84C分别描绘了在第4、7和11天的CD45+细胞计数。还在第4、7和11天测量小鼠的体重，并在图85A-85C中描绘为初始体重的百分比。
I.3I：IL-15/Rα-Fc融合蛋白增殖食蟹猴淋巴细胞
为便于临床开发，评估食蟹猕猴中的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的各种参数(如药效学、药代动力学和毒性)非常有用。因此，研究了IL-15/Rα-Fc融合蛋白是否能够增殖食蟹猴淋巴细胞。将食蟹猕猴PBMC与指定的测试物一起孵育，并评估Ki67在各种淋巴细胞群体中的表达，其数据如图86所示。
J.3J：IL-15/Rα-Fc融合蛋白在食蟹猴中有活性
给食蟹猴施用单次静脉内(i.v.)剂量的XENP20818(n＝3)、XENP22819(n＝1)、XENP22821(n＝3)、XENP22822(n＝3)、XENP22834(n＝3)和XENP23343(n＝3)。随时间评估了淋巴细胞计数(图87A-87E、89A-89E、91A-91E、93A-93E、95A-95E和97A-97E)和增殖(图88A-88E、90A-90E、92A-92E、94A-94E、96A-96E和98A-98E)。数据显示CD56+ NK细胞(图91A)、CD16+ NK细胞(图91B)、γδT细胞(图91C)、CD8+ T细胞(CD45RA+)(图91D)、CD8+ T细胞(CD45RA-)(图91E)和CD4+ T细胞(图91F)在用XENP22821处理后在第6天达到峰值，随后恢复并正常化。最后，图92A-92E显示Ki67在CD56+ NK细胞(图92A)、CD16+ NK细胞(图92B)、CD8+ T细胞(CD45RA+)(图92C)、CD8+ T细胞(CD45RA-)(图92D)和CD4+ T细胞(图92E)上显著表达表明用XENP22821处理后的增殖活性。在用XENP20818、XENP22819、XENP22822和XENP23343处理后，观察到相似的增殖活性，表明本发明的大多数IL-15/Rα-Fc融合蛋白在食蟹猴中具有活性。
XVII.实施例4：用Xtend Fc工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白
通过Xtend Fc进一步工程化如上所述工程化以降低效能的IL-15/Rα-Fc变体(在下文中称为“IL-15/Rα-XtendFc”融合蛋白)，以通过亚克隆编码IL-15和/或IL-15Rα(寿司)的质粒入pTT5表达载体中进一步延长半衰期，该载体包含具有M428L/N434S取代的Fc融合伴侣(见图8A-8D，骨架11)。在图99A-99C、100、101和102中描述了说明性IL-15/Rα-XtendFc的序列(也见表6)。
表6
| XENP | 形式 | 突变 |
| 24306 | IL-15/Rα-异源Fc | D30N/E64Q/N65D |
| 24341 | IL-15/Rα-异源Fc | N1D/N65D |
| 24301 | IL-15/Rα-异源Fc | N4D/N65D |
| 24383 | ncIL-15/Rα-Fc | Q108E |
| 24346 | 二价IL-15/Rα-Fc | Q108E |
A.4A：其他IL-15/Rα-Fc变体的体外活性
1. 4A(a)：人淋巴细胞的增殖
将人PBMC与所示浓度的IL-15/Rα-XtendFc变体孵育3天。孵育后，将PBMC用抗CD3-FITC(OKT3)、抗CD4-PE(RPA-T4)、抗CD8-eFluor450(SK-1)、抗CD45RA-PE/Cy7(HI100)、抗-CD16-PerCP/Cy5.5(3G8)、抗CD25-APC/Fire750(M-A251)和抗Ki67-APC(Ki-67)染色以标记各种细胞群，并通过FACS分析，如实施例1D中一般描述。图103A-103C描绘了如Ki67表达所示的治疗后CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和NK细胞的增殖。
在另一个实验中，将人PBMC用指定浓度的XENP20818和XENP24306处理。处理后3天，PBMC首先用抗CD3-PerCP/Cy5.5(OKT3)、抗CD4-BV786(RPA-T4)、抗CD8β-PE/Cy7(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD56-BV605和抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)染色。再次洗涤细胞，并且使用eBioscienceTM Foxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)用抗FoxP3-AF488(259D)和抗Ki67-APC染色。图104A-104D描绘了如Ki67表达所示的治疗后CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、NK细胞和γδT细胞的增殖。
2. 4A(b)：食蟹猕猴淋巴细胞的增殖，如Ki67所示
由于选择了Xtend变体来研究食蟹猴的活性，因此研究了它们增殖食蟹猴T细胞的能力。食蟹猴PBMC与选定的测试物在指定浓度下孵育3天。孵育后，将PBMC用抗CD3-FITC(SP34)、抗CD4-PE/Cy7(OKT4)、抗CD8-APC(RPA-T8)、抗CD45RA-APC/Fire750(HI100)、抗-CD16-BV605(3G8)、抗CD25-BV421(M-A251)和抗Ki67-PerCP/Cy5.5(Ki-67)染色以标记各种细胞群，并按FACS分析，如实施例1D中一般所述。图105A-105C描绘了如Ki67表达所示的治疗后CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和NK细胞的增殖。另外，与实施例1D中描绘的数据一致，没有结构域连接子的IL-15/Rα-Fc亲和力变体(仅铰链；即XENP24341)与相应的具有连接子的IL-15/Rα-Fc亲和力变体(例如XENP24113)相比，在食蟹猕猴淋巴细胞增殖中显示出更低的效力。在另一个实验中，将3只动物的食蟹猴PBMC与XENP20818和XMAb24306以指定浓度孵育4天。孵育后，将PBMC用抗CD3-FITC(SP34)、抗CD4-PE/Cy7(OKT4)、抗CD8α-PB(BW135)、抗CD8b-eF660(SIDI8BEE)、抗CD45RA-APC/H7(5H9)、抗CD16-BV605(3G8)、抗CD56-PerCP/Cy5.5(B159)和抗Ki67-PerCP/Cy5.5(Ki-67)染色以标记各种细胞群并通过FACS分析，如实施例1D中一般描述的。图106描绘了如Ki67表达所示的在处理后CD8+CD8α+CD45RA-T细胞的增殖。
B.4B：GVHD模型中IL-15/Rα-XtendFc变体的体内活性
在第-7天通过IV-OSP将1000万个人类PBMC植入NSG小鼠中，然后在第0天用指定浓度的指定测试物(0.3mg/kg)给药。在第4天和第7天收集全血，并在第5-8天或第11天处死小鼠，获取其脾脏，以使用FACS测量CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和CD45+细胞计数。图107A至107C分别描绘了全血中第4天和第7天以及脾脏中第8天的CD4+ T细胞计数。图108A至108C分别描绘了全血中第4天和第7天和脾中第8天的CD8+ T细胞计数。图109A至109C分别描绘了全血中第4天和第7天和脾中第8天的CD4+ T细胞计数。如图110A-110F所示，还在第-8、-2、1、5、8和11天测量小鼠的体重。每个点代表一只雌性NSG小鼠。
C.4C：食蟹猕猴PBMC中变体IL-15/Rα-XtendFc融合蛋白的体外活性
如实施例3I中一般描述的，进行变体IL-15/Rα-XtendFc融合蛋白增殖食蟹猴的能力。特别地，将食蟹猴PBMC与所示的测试物一起孵育3天。孵育后，将细胞用抗CD3 FITC(OKT3)、抗CD4-PE(RPA-T4)、抗CD8-Efluor450(SK-1)、抗CD15 PerCP/Cy5.5(3G8)、抗CD25-APC/Fire750(M-A251)、抗CD45RA-PE/Cy7(HI100)和抗Ki67-APC染色，并通过流式细胞仪进行评估。在图111A-111D中描绘了数据，该数据描绘了表达Ki67的各种淋巴细胞群体的百分比。
D.4D：食蟹猴中变体IL-15/Rα-XtendFc融合蛋白的体内活性
对猴子(n＝3)给予单次静脉内(i.v.)剂量的指定测试物(第1天)，每天采血。随时间评估血液中的CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和NK细胞计数，分别如图112A-112C所示。每个点平均有3只食蟹猴。数据显示每种变体在增殖的免疫细胞中均具有活性，表明本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白可用作人类癌症的治疗剂。另外，与实施例1D和4A中描述的数据一致，与相应的没有连接子的IL-15/Rα-Fc亲和力变体(仅铰链；即XENP24341)相比，具有结构域连接子的IL-15/Rα-Fc亲和力变体(即，XENP24113)证明了食蟹猴淋巴细胞的扩增扩展。还评估了测试物的血清浓度随时间的变化，确定了半衰期，如图113所示。数据表明，XENP24306显示出延长最多的T细胞药理作用。XENP24113还显示出延长的T细胞药理作用。未来的研究将以较低剂量评估XENP24113。
XVIII.实施例5：IL-15/Rα-Fc融合蛋白增强活化的T细胞的抗肿瘤活性
A.5A：IL-15/Rα-Fc融合蛋白优先结合活化的T细胞
在免疫肿瘤学的背景下，对于本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白重要的是在癌症环境中选择性靶向活化的T细胞。为了对此进行研究，使用新鲜的和活化的PBMC进行结合实验。通过用100ng/mL平板结合的抗CD3(OKT3)和1μg/ml的抗IL-2刺激新鲜的PBMC 2天来制备用作肿瘤环境中活化淋巴细胞替代物的活化PBMC。将新鲜的和活化的PBMC与指示的AF647标记的测试物在冰上孵育1小时。孵育后，将PBMC用抗CD3-PE/Cy7(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8-PerCP/Cy5.5(SK1)、抗CD16-BV421(3G8)和抗CD45RA-PE-HI100染色以识别各种细胞群。图114A-114F(对于具有Xtend和不带结构域连接子的IL-15/Rα-Fc亲和变体)、图115A-115F(对于具有Xtend和结构域连接子的IL-15/Rα-Fc亲和变体)以及图116A-116F(具有Xtend的其他形式的IL-15/Rα-Fc融合蛋白)中描绘了如AF647 MFI所示的测试物与各种细胞群的结合。数据表明，本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白优先结合于活化的PBMC中的T细胞和NK细胞，表明它们在免疫肿瘤学中的适用性。另外，与实施例1D、4A和4D中描述的数据一致，没有结构域连接子的IL-15/Rα-Fc融合变体(例如，IL-15/Rα-Fc亲和变体)(仅铰链；例如，XENP24341)与具有连接子的相应的IL-15/Rα-Fc亲和变体(例如XENP24113)相比显示了与各种淋巴细胞群体的更少的结合，如图117所描绘。
B.5B：XmAb24306增强活化的T细胞的抗肿瘤作用
根据制造商的说明，使用EasySepTM人T细胞富集试剂盒(STEMCELL Technologies，加拿大温哥华)从人类PBMC(CMV+HLA-A0201)中纯化T细胞。将纯化的T细胞与CFSE标记的亲本MCF-7肿瘤细胞(在此示例中指定为第1组)或CFSE标记的表达pp65的MCF-7肿瘤细胞(在此示例中指定为第2组)以20∶1 E∶T比和指定测试物一起培育4天。在第3天，将布雷菲德菌素A(BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥)和抗CD107a PerCP/Cy5.5(LAMP-1)加入细胞中。培育后，将细胞与Zombie AquaTM固定活力试剂盒(BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥)一起培育30分钟。洗涤细胞并且用抗CD4-APC/eFluor780(RPA-T4)、抗CD8b-PE/Cy7(SIDI8BEE)、抗CD25-PE(M-A251)和抗CD69-BV605(FN50)在冰上染色1小时。再次洗涤细胞，并且使用eBioscienceTM Foxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)用抗IFNγ-BV421(4S.B3)和抗Ki67-APC染色。通过流式细胞术分析各种细胞群的细胞。基于CFSE染色鉴定靶细胞，并且基于僵尸染色鉴定死亡的靶细胞。基于CD4和CD8表达对效应细胞(CFSE-)进行门控。
CD25和CD69是T细胞活化标记。图118A和118B分别描绘了两组中CD8+ T细胞上的CD25表达(如PE MFI所示)，图119A和119B分别描绘了CD4+ T细胞上的CD25表达。图120A和120B分别描绘了两组中的CD8+ T细胞上的CD69表达(如BV605 MFI所示)，图121A和121B分别描绘了在CD4+ T细胞上的CD69表达。
Ki67是一种与蛋白质增殖严格相关的蛋白质。图122A-122B分别描绘了两组中的CD8+ T细胞中的细胞内IFNγ表达(如BV421 MFI所示)，图123A-123B分别描绘了CD4+ T细胞中的细胞内IFNγ表达。图124A-124C分别显示了第1组中CD8+ T细胞的Ki-67+/IFNγ-、Ki-67+/IFNγ+和Ki-67-/IFNγ+级分。图125A-125C分别显示了第1组中CD4+ T细胞的Ki-67+/IFNγ-、Ki-67+/IFNγ+和Ki-67-/IFNγ+级分。图126A-126C分别显示了第2组中CD8+T细胞的Ki-67+/IFNγ-、Ki-67+/IFNγ+和Ki-67-/IFNγ+级分。图127A-127C分别显示了第2组中CD4+ T细胞的Ki-67+/IFNγ-、Ki-67+/IFNγ+和Ki-67-/IFNγ+级分。
CD107a与脱粒有关并且是细胞溶解活性的进一步指示。图128A-128B分别描绘了两组中的CD8+ T细胞上的CD107a表达(如PerCP/Cy5.5MFI所示)，图129A-129B分别描绘了在CD4+ T细胞上的CD107a表达。
图130A-130B分别描绘了两组的剩余靶细胞(即，亲代MCF-7肿瘤细胞或表达pp65的MCF-7肿瘤细胞)的数量，图13IA-131B描绘了死亡靶细胞的数量。
总体而言，数据表明，本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白不仅促进杀死肿瘤细胞，而且融合蛋白选择性地扩增活化的淋巴细胞，表明对肿瘤浸润的淋巴细胞具有选择性的潜力。值得注意的是，IL-15/Rα-Fc融合蛋白优先诱导CD8+和CD4+ T细胞增殖，如每个种群的Ki67+IFNγ+百分比所示。
在一项证实活化T细胞的优先增殖的类似实验中，将来自人PBMC(CMV+HLA-A0201)的纯化T细胞与亲代或表达pp65的MCF-7肿瘤细胞以30：1E：T的比例孵育，其中不用或用抗HLA-A抗体(W6/32)(以减少/消除通过TCR的T细胞活化)。图132显示了描述为Ki67+/IFNγ+的CD8+ T细胞的百分比的数据。图133描绘了描述剩余靶细胞(例如，亲代MCF-7肿瘤细胞或表达pp65的MCF-7肿瘤细胞)数量的数据。用抗HLA-A抗体孵育并随后降低T细胞活化导致CD8+Ki67+IFNγ+T细胞百分比降低，对靶细胞的杀伤力降低，这进一步说明了活化淋巴细胞的选择性扩增。
C.5C：XENP24113增强活化的T细胞的抗肿瘤作用
根据制造商的说明，使用EasySepTM人T细胞富集试剂盒(STEMCELL Technologies，加拿大温哥华)从人类PBMC(CMV+HLA-A0201)中纯化T细胞。将纯化的T细胞与CFSE标记的表达pp65的MCF-7肿瘤细胞以20∶1 E∶T的比例孵育，并与指定的测试物孵育4天。在第3天，将布雷菲德菌素A(BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥)和抗CD107a-PerCP/Cy5.5(LAMP-1)加入细胞中。培育后，将细胞与Zombie AquaTM固定活力试剂盒(BioLegend，加利福尼亚州圣地亚哥)一起培育30分钟。洗涤细胞并且用抗CD4-APC/eFluor780(RPA-T4)、抗CD8b-PE/Cy7(SIDI8BEE)、抗CD25-PE(M-A251)和抗CD69-BV605(FN50)在冰上染色1小时。再次洗涤细胞，并且使用eBioscienceTM Foxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)用抗IFNγ-BV421(4S.B3)和抗Ki67-APC染色。通过流式细胞术分析各种细胞群的细胞。基于CFSE染色鉴定靶细胞，并且基于僵尸染色鉴定死亡的靶细胞。基于CD4和CD8表达对效应细胞(CFSE-)进行门控。
CD25和CD69是T细胞活化标记。图134A-134B分别描绘了CD8+ T细胞和CD4+ T细胞上的CD25表达(如PE MFI所示)。图135A-135B分别描绘了CD8+ T细胞和CD4+ T细胞上的CD69表达(如BV605 MFI所示)。
Ki67是一种与蛋白质增殖严格相关的蛋白质。图136A-B分别描绘了CD8+ T细胞和CD4+ T细胞中的Ki67表达(如APC MFI所示)。图137A-137B分别描绘了CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的Ki-67+/IFNγ+级分。图138A-138B分别描绘了CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的CD69+/IFNγ+级分。图139A-139B分别描绘了CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的CD69+/Ki-67+级分。图140描绘了剩余的靶细胞(例如，表达pp65的MCF-7肿瘤细胞)的数量，图141描绘了死亡的靶细胞的数量。
与实施例5B一致，如Ki67表达所示，每种IL-15/Rα-Fc融合蛋白优先于CD4+ T细胞诱导CD8+ T细胞的增殖。值得注意的是，CD69+KI67+和CD69+IFNγ+级分的增加均与pp65-MCF7靶标杀伤有关。因此，在增殖活化的T细胞中比XmAb24306具有更高效力的XENP24113在靶标杀灭中也更有效。
D.5D：IL-15/Rα-Fc增强小鼠的抗肿瘤作用
在实施例4B中描述的研究中，包括XmAb24306在内的一些较低效能的变体未能增强GVHD。尽管Xtend取代(M428L/N434S)增强了人和食蟹猴的PK，但这些取代实际上减少了小鼠的暴露。因此对于该实施例中描述的研究，评估了XENP24045(XmAb24306的非Xtend类似物)在小鼠中的抗肿瘤作用。
使NOD SCID γ(NSG)小鼠(每组10只)在第14天后侧皮内移植3×106表达pp65的MCF-7细胞。在第0天，使小鼠腹膜内移植来自HLA匹配型CMV+供体的5×106人类PBMC，所述供体对于T细胞pp65反应性筛选为阳性(或对照小鼠的PBS)。每周用指定测试物或PBS(对于对照小鼠)处理小鼠达4周(总共4次剂量)。通过卡尺测量法监测肿瘤体积，其数据展示于图142A-142B中(第1次给药后天数)。如图143A-143D中所描绘，在第7、12、19和26天抽血，并且通过流式细胞术分析以计数各种淋巴细胞的数量。在此模型中，与仅使用PBMC相比，XENP24045显著降低了肿瘤的生长。
XIX.实施例6：在有和没有Xtend-Fc的情况下IL-15/Rα-Fc融合蛋白的效力降低增强了食蟹猴的药效学和药代动力学
如实施例3J中所述，许多降低效力的IL-15/Rα-Fc变体以及作为XENP22821的Xtend类似物的XENP23343在食蟹猴中是有活性的。
随时间和半衰期测试样品的血清浓度如图144所描绘。数据显示，效力与食蟹猴的暴露呈负相关，其中无活性IL-15/Rα-Fc融合变体XENP22834具有最长的半衰期。这与实施例3F中所述的小鼠中的数据一致。值得注意的是，增加剂量对PK的影响最小，如XENP22821在1倍和3倍剂量下的Cmax标准化血清浓度所表明的(图145中描绘)。此外，Xtend取代显著改善了曝光，如XENP23343的半衰期所示。
另外，如图87A-87E、91A-91E和97A-97E所示，用XENP20818、XENP22821和XENP23343处理后食蟹猕猴的淋巴细胞计数被重新绘制为图146A-146E中它们平均倍数变化的叠加图，以强调药效学的改善。数据清楚地表明，与野生型IL-15/Rα-Fc融合体XENP20818相比，降低效能的IL-15/Rα-Fc变体XENP22821在更长的时间内扩展了淋巴细胞计数。值得注意的是，XENP22821的Xtend类似物XENP23343进一步延长了淋巴细胞扩展的持续时间，超过了XENP22821。
在进一步的研究中，给食蟹猕猴施用单次静脉内(i.v.)剂量的0.3X剂量XENP22821(n＝3)或0.6X剂量XmAb24306，并随时间评估了各种参数。数据显示，XmAb24306在较低的0.6X剂量下(与实施例4D中描绘的3X剂量相比；与在图147A-147B中描绘的两项研究中的淋巴细胞扩增叠加)显示出相似的PK/PD，并具有良好的耐受性。值得注意的是，尽管剂量与XENP22821(0.3X剂量)相似，但XmAb24306(0.6X剂量)显示出比更强效XENP22821更好的PK/PD，在第10天(图149-151)外周Ki-67阳性和在15天(研究结束；图148)淋巴结Ki-67阳性。另外，XmAb24306优先于CD4+ T细胞(包括Treg)扩增CD8+ T细胞(见图153-154)。图155A-155C描绘了来自该研究(在给予XmAb24306之后)和实施例3J中描绘的研究(在给予XENP20818、WT IL-15/Rα-Fc之后)的CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、CD16+ NK细胞计数的叠加图，以进一步说明效能降低所带来的增强的药效作用。
XX.实施例7：效力降低不影响IL-15/Rα-Fc融合蛋白的免疫机制
XmAb24306效力的降低需要更高的浓度才能在效力更高的IL-15/Rα-Fc融合蛋白(例如WT XENP20818)上达到相同水平的T细胞扩增。然而，担心效力的降低和/或更高的浓度将改变与IL-15/Rα-Fc治疗相关的免疫机制。因此，我们在与XENP20818(WT IL-15/Rα-Fc融合蛋白)和XmAb24306在各自的EC50孵育后，研究了PBMC、分离的CD8+ T细胞和分离的NK细胞中免疫相关基因的概况。
根据制造商的说明，使用EasySepTM人CD8+ T细胞富集试剂盒(STEMCELLTechnologies，加拿大温哥华)富集CD8+ T细胞。根据制造商的说明，使用EasySepTM人CD56阳性选择试剂盒II(STEMCELL Technologies，加拿大温哥华)富集NK细胞。将200万新鲜的PBMC、CD8+ T细胞或NK细胞与XENP20818、XmAb24306、重组IL-15或重组IL-2孵育24或48小时。孵育后，使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen，德国希尔登)提取RNA。通过n
PanCancer Immune Profiling Panel(NanoString Technologies，华盛顿州西雅图)测定每个样品100ng RNA。对于如图156A-156C和图157A-157C所示的各种条件，绘制了用XENP20818和XmAb24306处理后基因表达的倍数变化。数据表明，在每种情况下，XENP20818和XmAb24306之间的基因表达谱均具有良好的相关性，这表明在以较高的浓度给予较低效能的IL-15/Rα-异源Fc融合体后，免疫机制不应发生变化。相比之下，在图158A中描述了用XmAb24306相对于IL-15治疗48小时后基因表达倍数变化的相关性。推测较低的相关性是由于重组IL-15也与具有IL-15Rα受体的细胞结合。进一步相比之下，在图158B中描述了用XmAb24306相对于IL-2治疗48小时后基因表达倍数变化的相关性。推测较低的相关性是由于重组IL-2与不同受体(即IL-2Rα)的结合。
XXI.实施例8：IL-15/Rα-Fc融合蛋白和Treg
IL-15除了能增殖效应T细胞外，还可以结合Treg上的受体并增强其增殖；然而，Treg抑制免疫应答，因此被认为不利于肿瘤治疗。在实施例6中描述的研究中，我们发现本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白选择性地使CD8+ T细胞扩增超过Treg。在这里，我们还研究了本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白对效应T细胞的Treg抑制的作用。
先前已经报道了雷帕霉素推进CD4+CD25+FOXP3+ Treg在体外的增殖，并且所得的经过扩增的Treg抑制CD4+和CD8+ T细胞增殖(参见，例如，Battaglia等人，(2006)，“雷帕霉素促进健康受试者和1型糖尿病患者两者的功能性CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的扩增(Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cellsof both healthy subjects and type 1diabetic patients)”，《免疫学杂志(JImmunol.)》177(12)8338-8347；以及Strauss等人，(2007)，“用雷帕霉素孵育的天然存在的人CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的选择性存活(Selective survival of naturallyoccurring human CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells cultured with rapamycin)”，《免疫学杂志》178(1)320-329)。因此，使用EasySepTM人CD4+ T细胞富集试剂盒(干细胞技术公司(STEMCELL Technologies)，加拿大温哥华)，通过阴性选择使CD4+ T细胞从人PBMC中富集。使用DynabeadsTM人Treg膨胀剂(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)使Treg在RPMI1640+10％胎牛血清+0.1μg/ml雷帕霉素+500U/ml IL-2中扩增，持续1-4天。将Treg转移到涂覆有0.5μg/ml抗CD3(OKT3，Biolegend公司，加利福尼亚州圣地亚哥)的T75烧瓶中，并且用RPMI1640+10％胎牛血清+0.1μg/ml雷帕霉素+100U/mlIL-2+0.5μg/ml抗CD28 mAb进行孵育。在最初使CD4+ T细胞从PBMC中富集之后至少8天进行了实验。
将1x 105CFSE标记的PBMC(自体)与2倍稀释的Tag-it紫罗兰色标记的Treg在含有10μg/ml XmAb24306的平板结合抗CD3(100ng/ml；OKT3)上在37℃下共孵育3天。通过CFSE或Tag-it紫稀释法测量CD8+和CD4+应答细胞的增殖，并使用Zombie AquaTM FixableViability Kit(加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend公司)染色以排除死细胞，其数据如图159A-159B所示。数据显示，XmAb24306克服了抗CD3诱导的效应T细胞增殖的Treg抑制作用。
XXII.实施例9：IL-15/Rα-Fc融合蛋白与检查点阻断抗体的组合
接下来，我们研究了本发明的IL-15/Rα-Fc融合蛋白是否适合与检查点阻断堆叠。与实施例5B一样，使用了XmAb24306的非Xtend类似物。使用的检查点阻断抗体是XENP16432(一种基于纳武单抗的二价抗PD-1mAb，具有消融的效应功能；序列描绘于图160中)。在第-1天通过IV-OSP将1000万个人类PBMC植入NSG小鼠中，然后在第0、7、14和21天用指定浓度的指定测试物给药。在第6天和第10天收集全血，以使用FACS以及血清IFNγ浓度测量CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45+细胞和NK细胞计数，并每周两次测量体重。图161A-161B、162A-162B、163A-163B和164A-164B描绘了第6天和第10天的细胞计数，图165描绘了第7天的血清IFNγ浓度，而图166A-166D描绘了第7、11、14和18天的体重变化。每个点代表一只雌性NSG小鼠。数据显示，XENP24045在所有剂量水平下均能促进白细胞扩增并加剧异种GVHD。值得注意的是，XENP24045与PD-1阻断剂(XENP16432)表现出强大的协同作用，尤其是在较低的0.3mg/kg XENP24045剂量下。
XXIII.实施例10：WT IL-15/Rα-Fc对各种淋巴细胞群体的增殖作用
研究在与WT IL-15/Rα-Fc(XENP20818)孵育后表达Ki67的各种淋巴细胞群体的百分比，如本文所述实施例中其他地方一般描述的，其数据如图167所示。
XXIV.实施例11：XENP24306在刺激CD8+CD25+ T细胞上的STAT5磷酸化方面显示出降低的效力
与XENP24306、WT IL-15/Rα-Fc(XENP20818)和其他效能变体孵育后，对CD8+CD45RA+ T细胞上的STAT5磷酸化进行了研究，如实施例中其他地方所述，其数据描述在图168和169中。
XXV.实施例12：当调整剂量时，效能降低显示出类似的信号传导动力学。
用EC50剂量的XENP20818或XENP24306刺激人PBMC，每天测定，持续6天。第3天后将细胞洗去测试物。在图170、171和172分别描绘了数据，该数据描绘表达Ki67的百分比CD8+CD45Rw- T细胞，以及CD8+CD45RA- T细胞上Bcl-2和CD25表达。数据显示，当调整剂量后，效能降低与WT相比显示出相似的信号传导动力学。
XXVI.实施例13：XENP24045优先在活化的T细胞上诱导STAT5磷酸化
与XENP24045(XENP24306的非Xtend类似物)和WT IL-15/Rα-Fc孵育后，对新鲜的和受刺激的人PBMC中CD8+ T细胞上的STAT5磷酸化进行了研究，如本文所述实施例中的其他地方所述，其数据如图173所示。数据显示，XENP20818和XENP24045均在刺激的PBMC中优先诱导CD8+ T细胞上的STAT5磷酸化，表明对活化T细胞的偏好。
XXVII.实施例14：XENP24306优先扩增活化的T细胞
将2x 105CFSE标记的人PBMC与指示剂量的XENP24306在指示剂量的板结合抗CD3(OKT3)上孵育4天。通过CFSE稀释测量T细胞的增殖，并使用僵尸染料排除死细胞。描绘CD8+CD45RA- T细胞增殖百分比的数据如图174所示，并显示了T细胞的活化增强(通过更高浓度的αCD3)使通过XENP24306的CD8+ T细胞的增殖更大。
XXVIII.实施例15：XENP24045和XENP23557在huPBMC移植的NSG小鼠(GVHD模型)中增强了T细胞增殖和IFNγ的产生，并与检查点阻断相结合
在另一项GVHD研究中，单独或与抗PD-1mAb一起，研究了XENP24045(XENP24306的非Xtend类似物)和XENP23557(XENP24113的非Xtend类似物)。在第-1天，通过IV-OSP将5x106人PBMC移植到NSG小鼠中，并在第0、7、14和21天给予指示浓度的指示测试物。图175描述第10天的血清IFNγ浓度，图176描述第17天的CD45+细胞计数，图177描述第25天的体重(作为初始体重的百分比)
数据显示XENP24045和XENP23557增强T细胞增殖和IFNγ产生，并增强GVHD。值得注意的是，数据显示，作为T细胞增殖和IFNγ产生的进一步增强，对二者的剂量反应明显，并且体重变化进一步表明GVHD进一步恶化，对于XENP24045，0.3mg/kg剂量与0.1mg/kg相比，对于XENP23557，0.1mg/kg与0.03mg/kg相比。另外，数据显示IL-15/Rα-Fc融合体很好地与检查点阻断剂叠加，如增强的T细胞增殖和IFNγ切片以及增强的GVHD所表明。
XXIX.实施例16：XENP24045在huPBMC移植的NSG小鼠(GVHD模型)中增强了T细胞增殖和IFNγ的产生，并与检查点阻断相结合
在另一项研究XENP24045(XENP24306的非Xtend类似物)的GVHD研究中，单独或与抗PD-1mAb组合，在第-1天，通过IV-OSP将10x 106人PBMC移植到NSG小鼠中，并在第0、7、14和21天给予指示浓度的指示测试物。
图178描绘了在第7天的血清IFNγ浓度，图179描绘了在第10天的各种淋巴细胞群体的计数，图180-181分别描绘了在第11天和研究期间的体重(作为初始体重的百分比)。与实施例15一致，数据显示XENP24045增强T细胞增殖和IFNγ产生。此外，数据再次显示XENP24045很好地与检查点阻断剂叠加，如增强的T细胞增殖和IFNγ切片以及增强的GVHD所表明。
XXX.实施例17：IL-15-Fc融合体增强了小鼠肿瘤模型中PD-1阻断的抗肿瘤活性
在第-14天，将NSG小鼠(每组10只)皮内接种3x 106pp65转导的MCF-7细胞。然后向小鼠腹膜内注射1.5x 106或5x 106pp65反应性的人PBMC(或PBS作为对照)，并用测试物(PBS，3.0mg/kg XENP16432或0.5mg/kg XENP24045与3mg/kg的XENP16432组合)在第0天处理，并在第7、14和21天用指定的测试物进行进一步处理。图182显示了在植入1.5x 106个huPBMC的小鼠中huPBMC植入后第21天的CD45+细胞计数。图183和184描绘了在植入1.5x106huPBMC的小鼠中在huPBMC植入后第31天以及整个研究期间的肿瘤体积。在研究期间，移植了5x 106huPBMC的小鼠的肿瘤体积如图185所示。数据显示，IL-15-Fc融合体XENP24045在植入1.5x 106huPBMC的小鼠中增强了抗PD-1阻断的抗肿瘤活性。值得注意的是，如图185所示，在植入5x 106huPBMC的小鼠中，与单独使用XENP16432处理相比，将XENP24045与XENP16432结合未增强抗肿瘤活性。这表明：a)将IL-15-Fc融合体与检查点阻断相结合可在治疗肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)数量少的肿瘤治疗方面提供实质性益处；b)在仅对检查点阻断免疫疗法反应不佳的患者中，加入细胞因子免疫疗法如本发明的IL-15-Fc融合蛋白可以增强抗肿瘤反应。
XXXI.实施例18：研究食蟹猴中IL-15-Fc效能变体的药代动力学
在另一项研究具有Xtend的IL-15-Fc效能变体的药代动力学的另一项研究中，以不同浓度，食蟹猕猴被给予第一单次静脉内((i.v.)剂量的XENP22853(具有Xtend的WT IL-15/Rα-异源Fc)、XENP24306(具有Xtend的IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-异源Fc)、XENP24113(具有Xtend的IL-15(N4D/N65D)/Rα-异源)和XENP24294(具有Xtend的scIL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc)。
图189描绘了第一剂量后随时间变化的测试物的血清浓度。图190描绘了XENP22853和相应的WT非Xtend XENP20818(来自食蟹猴的早期研究)随时间的相对血清浓度。与实施例6中描述的数据一致，数据显示单独的Xtend取代(如在XENP22853中)对IL-15-Fc融合体的药代动力学提供了一些改善。值得注意的是，除Xtend取代外，掺入效能变体(如XENP24306和XENP24113)可大大改善IL-15-Fc融合体的药代动力学。出乎意料的是，与XENP24306相比，XENP24113的药代动力学明显较差。同样，scIL-15/Rα-Fc融合体XENP24294(与XENP24113具有相同的IL-15(N4D/N65D)效能变体)与XENP24306相比，药代动力学也明显较差。尽管基于具有IL-15(N4D/N65D)变体的IL-15-Fc融合体，预期XENP24113(和XENP24294)的药代动力学下降，表明其体外效能要高于具有IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的IL-15-Fc融合体(如实施例3B和图61所示)，但药代动力学的降低出乎意料地与效能的增加不成比例。
猴子研究表明，效能降低的IL-15/Rα-异源Fc融合蛋白的半衰期为数天，明显长于IL-15的小于1小时的半衰期。此外，观察到药效学和清除率之间呈显著的负相关关系，由于更持久的暴露，效能降低变体允许更高、更可耐受的剂量和增强的淋巴细胞增殖。基于这些观察，我们假设受体介导的内在化是影响各种IL-15的PK/PD关系的关键因素(如图195示意描绘)。
为了进一步对此进行研究，我们开发了一种基于机制的PK/PD模型来预测最佳药物受体亲和力，在效能与靶标介导的清除率之间平衡。一些结果如图194所示。来自多个食蟹猴研究的PK数据(图196)被输入到这些模拟中，并且允许多个其他参数在PK数据的整体拟合中变化(浮动)。值得注意的是，模拟收敛于估计的KD值，该KD值与实验测量的结合的EC50值线性相关(图197)。利用估计的KD值，生成模拟的PK曲线、受体占用率(RO)曲线和药效学曲线(如图198所示)，这使得能够确定RO曲线下的预测面积(RO-AUC)以及最大受体占用率(RO-Max)。我们绘制了相对于实验确定的PD-AUC的预测RO-AUC值(药效学AUC：CD8+ T细胞随时间的倍数增加曲线下的面积)(图199A)，相对于实验确定的PD-Max的预测RO-AUC值(峰值CD8+ T细胞增加(相对于基线的倍数))(图199B)，相对于实验确定的ALB-min的预测RO-AUC值(相对于基线水平的白蛋白减少百分比的最低点)(图199C)，相对于实验确定的PD-AUC的预测RO-Max(最大受体占用率)值(图199D)，相对于实验确定的PD-Max的预测RO-Max值(图199E)以及相对于实验确定的ALB-Min的预测RO-Max(图199F)。值得注意的是，预测的RO-AUC值与图199A中所示的实验确定的PD-AUC(药效学AUC)以及图198B中所示的PD-Max很好地相关，这表明RO-AUC是要最小化的目标值
最后，针对Xtend形式或非Xtend形式的IL-15/Ra-异源Fc融合蛋白，对各种KD值进行了模拟扫描(如图200所示)，表明预测的最佳KD约为200nM，类似于XmAb24306的估计KD值。
XXXII.实施例19：降低效力的IL-15/Rα-异源Fc融合物与抗PD-1有效地结合以扩增外周T细胞
在实施例17中所述的小鼠肿瘤模型中，与单独使用抗PD-1mAb进行治疗相比，使用XENP24045和抗PD-1mAb进行联合治疗显著增强了抗肿瘤活性(根据未配对t检验，第21、27、38、41和43天，p≤0.05；以及在第24、29、31、34和36天，p≤0.01)。我们进一步研究了外周T细胞的扩增。图201A和图201B显示了描述人CD8+ T细胞扩增的数据(如研究第7、14、21和28天的计数所示)。值得注意的是，在第14、21和28天，与单独使用抗PD-1mAb进行治疗相比，使用XENP24045和抗PD-1mAb进行组合治疗可显著提高CD8+ T细胞计数。进一步如图201B所示，用XENP24045和抗PD-1mAb联合治疗增强CD8+ T细胞的活化(如CD25被CD8 T细胞的表达所示)比单独使用抗PD-1mAb治疗要早得多。
XXXIII.实施例20：降低效力的IL-15/Rα-异源Fc融合体不仅增强药效学，
而且改善耐受性
基于从各种食蟹猕猴研究中收集到的数据，我们发现，与包含WT IL-15的IL-15/Rα-异源Fc融合体相比，IL-15/Rα-异源Fc融合体的工程化降低的效能增强了药效学(叠加在图202A-图202C中的数据显示通过添加0.3X剂量XENP20818、0.3X剂量XmAb24306和0.6X剂量XmAb24306扩增了CD8+ T细胞、CD16+ NK细胞和淋巴细胞)，其中淋巴细胞最多可增加1000％。血管渗漏综合征是与用细胞因子(如IL-2)进行的治疗相关联的标志性毒副作用。血管渗漏的一种指示是低白蛋白血症，一种血清白蛋白浓度的下降。因此，我们研究了按上述剂量给药的食蟹猴的白蛋白下降，并显著发现XmAb24306不仅比XENP20818增强了淋巴细胞的扩增，而且还导致白蛋白下降的减少(图203中所示的数据)，表明了XmAb24306有优越的治疗指数。例如，虽然XmAb24306和XENP20818都促进外周CD8+ T细胞增加至少3倍(200％)(当以相同水平给药时)，但XmAb24306介导的白蛋白减少的程度不超过15％，而XENP20818导致白蛋白减少至少25％。此外，XmAb24306的高2倍(0.6倍)剂量促进了外周CD8+ T细胞至少增加11倍(1000％)，同时保持白蛋白水平在20％降低以上。此外，在实施例18中描述的建模中，似乎预测的RO-Max值与实验确定的ALB-Min很好地相关(见图199F)，这表明RO-Max是要优化的目标值，以微调IL-15和其他细胞因子的耐受性。
XXXIV.实施例21：工程化进一步降低效能的IL-15变体，包括在IL-15：CD132界面处的修饰
如实施例3B和图55所示，野生型scIL-15/Rα-Fc融合体XENP21478在诱导NK细胞和CD8+ T细胞的增殖方面不如野生型IL-15/Rα-异源Fc XENP20818有效。因此，我们认为适合用于IL-15/Rα-异源Fc融合体的降低效能的IL-15变体可能太弱并且不适合用于其他IL-15融合形式，例如scIL-15/Rα-Fc融合体。因此，我们对IL-15(N4D/N65D)变体感兴趣，其可以其他形式用作例如具有IL-15(N4D/N65D)变体的Il-15/Rα-异源Fc融合物，表现出比具有IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的IL-15/Rα-异源Fc融合体更高的体外效能。
然而，如上所示，与具有IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的IL-15-Fc融合体相比，具有IL-15(N4D/N65D)变体的IL-15-Fc融合体显示出较差的药代动力学。我们注意到IL-15(N4D/N65D)在负责与CD122结合的IL-15界面上有两个取代基，而IL-15(D30N/E64Q/N65D)在IL-15：CD122界面上有两个取代基(E64Q和N65D)；并且在IL-15界面上的一个取代基(D30N)负责与CD132的结合。因此，我们认为IL-15：CD132界面处的修饰可有助于XENP24306观察到的优异药代动力学。
鉴于上述情况，我们生成了包含D30N取代的IL-15效能变体的其他文库。在图191中描绘了用于说明性此类IL-15变体的序列，并在细胞增殖测定中产生和研究了包含这些变体的说明性scIL-15/Rα-Fc融合体(其序列在图192中进行了描绘)。
将人PBMC与指定浓度的指定测试物孵育3天。孵育后，将PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8-eF660(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD45RA-APC/Fire750(HI100)、抗CD56-BV605(5.1H11)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色，并通过流式细胞仪进行分析。图193A-图193G描述了指示增殖的表达Ki67的各种淋巴细胞群体的百分比。
正如预期的，数据显示，与包含相同IL-15变体的IL-15/Rα-异源Fc，以及包含IL-15(N4D/N65D)变体的scIL-15/Rα-Fc融合体相比，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的scIL-15/Rα-Fc融合体在各种淋巴细胞群的增殖中不具有活性或者活性急剧降低。但是，许多具有包含D30N取代的IL-15变体的scIL-15/Rα-Fc融合蛋白显示出与WT scIL-15/Rα-FcXENP21993相似的活性。值得注意的是，我们确定了一个特定的IL-15(D30N/N65D)变体，它不仅包含IL-15：CD132界面修饰，而且具有与IL-15(N4D/N65D)变体相似的效能(在scIL-15/Rα-Fc融合蛋白的背景下)。
XXXV.实施例22：其他研究
A.22A：XENP24306增强了植入人PBMC的NSG小鼠(GVHD模型)的T细胞增殖和IFNγ的产生，并有效地结合了检查点阻断
在GVHD研究中，单独或与抗PD-1mAb XENP16432一起，研究了各种浓度的XENP24306。在第-1天，通过IV-OSP将10x 106人PBMC移植到NSG小鼠中，并在第0、7、14和21天给予指示浓度的指示测试物。在第3、7、14和21天抽血以研究淋巴细胞的扩增(图204-206显示了数据)和IFNγ浓度(图209显示了数据)；每周两次评估体重，作为GVHD的指标(数据在图207-208中描绘)。
数据显示，到第10天，用0.3mg/kg、0.1mg/kg或0.01mg/kg XENP24306和3mg/kgXENP16432的组合治疗显著增强了GVHD，超过了单独使用3mg/kg XENP16432的治疗(统计使用不成对的t检验进行)。到第14天，用0.3mg/kg或0.1mg/kg XENP24306和3mg/kgXENP16432的组合治疗显著增强了CD3+ T细胞扩增，超过了单独使用3mg/kg XENP16432的治疗(统计按对数进行-使用不成对的t检验转换的数据)。
B.22B：XENP24306增强PD-1阻断剂在小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性
在小鼠肿瘤模型研究中，单独或与抗PD-1mAb XENP16432一起，研究了各种浓度的XENP24306。在第-15天，用3x 106pp65转导的MCF-7皮内接种NSG小鼠。在第0天，然后给小鼠腹膜内注射1.5x 106个人PBMC，并在第0、7、14和21天用指示的测试物进一步治疗。在第7、14和21天抽血以研究淋巴细胞的扩增(图210-211显示了数据)和IFNγ浓度(图214显示了数据)。每周通过卡尺测量三次来测量肿瘤体积(图212和213A中描绘的数据)，并且每周两次评估体重作为GVHD的指标(图213B中描绘的数据)。
数据显示，到第11天，与单独使用XENP16432的治疗相比，以1.0mg/kg、0.3mg/kg或0.1mg/kg的XENP24306和3mg/kg XENP16432的组合治疗显著减小了肿瘤体积(使用未配对的t检验进行统计，基线校正肿瘤测量结果)。到第7天，与单独使用XENP16432的治疗相比，用1.0mg/kg、0.3mg/kg或0.1mg/kg的XENP24306和3mg/kg XENP16432的组合治疗可显著增强IFNγ分泌。到第14天，单独用XENP24306或XENP24306与XENP16432组合治疗的每个组均明显增强了淋巴细胞扩增，超过了PBS治疗。值得注意的是，到第14天，用XENP24306和XENP16432的组合治疗的每个组，无论XENP24306的浓度如何，以及单独使用更高浓度的XENP24306，都显著增强了淋巴细胞扩增，超过了XENP16432治疗。
提供上述实例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的组合物、系统和方法的实施例的完整公开和描述，而不是旨在限制发明人认为是其发明的范围。对于本领域技术人员而言显而易见，用于执行本公开的上述模式的修改旨在落入所附权利要求的范围内。本说明书中所提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的水平。本公开中引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个参考文献已经以全文引用的方式单独地并入。
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Claims (26)
1.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括施用：
治疗有效量的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白，其包括：
a)第一单体，其从N-端至C-端包含：
i)IL-15受体α(IL-15Rα)寿司结构域；
ii)第一结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和
b)第二单体，其从N-端至C-端包含：
i)变体IL-15结构域，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和选自N4D/N65D、D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代的任一个；
ii)第二结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；
其中根据EU编号，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q；和
治疗有效量的检查点阻断抗体，其选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
2.一种在患者中诱导T细胞扩增的方法，包括施用：
治疗有效量的IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白，其包括：
a)第一单体，其从N-端至C-端包含：
i)IL-15受体α(IL-15Rα)寿司结构域；
ii)第一结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和
b)第二单体，其从N-端至C-端包含：
i)变体IL-15结构域，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和选自N4D/N65D、D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代的任一个；
ii)第二结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；
其中根据EU编号，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q；和
治疗有效量的检查点阻断抗体，其选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述变体IL-15结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。
4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述IL-15Rα寿司结构域包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有S364K/E357Q：L368D/K370S取代。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一变体Fc结构域具有S364K/E357Q取代和第二变体Fc结构域L368D/K370S取代。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域各自包含M428L/N434S取代。
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域各自包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K取代。
9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和检查点阻断抗体同时或顺序施用。
10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306或XENP24045的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且所述抗PD-1抗体是纳武单抗。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是派姆单抗。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24306的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是匹地珠单抗。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且所述抗PD-1抗体是纳武单抗。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是派姆单抗。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包含XENP24045的氨基酸序列(SEQ ID NO：XX)，并且抗PD-1抗体是匹地珠单抗。
18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
19.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑素瘤癌、膀胱癌、肾癌、肾脏癌、肝癌、头颈癌、结肠直肠癌、黑素瘤、胰腺癌、胃癌、食道癌、间皮瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
20.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述方法导致所述患者中最小的血管渗漏水平。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在施用后所述患者中的血管渗漏水平为血清白蛋白降低20％或更低。
22.根据权利要求2至21中任一项所述的方法，其中所述T细胞扩增为T细胞增加至少2倍。
23.根据权利要求2至22中任一项所述的方法，其中所述T细胞扩增为T细胞增加2倍至15倍。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述方法不增加诱导低白蛋白血症的可能性。
25.根据权利要求2至24中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞。
26.一种联合疗法，其包含IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白和选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体和抗CTLA-4抗体的检查点阻断抗体，
其中所述IL-15/IL-15Rα异二聚体Fc融合蛋白包括：
a)第一单体，其从N-端至C-端包含：
i)IL-15受体α(IL-15Rα)寿司结构域；
ii)第一结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第一变体Fc结构域；和
b)第二单体，其从N-端至C-端包含：
i)变体IL-15结构域，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列和选自N4D/N65D、D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代的任一个；
ii)第二结构域连接子；和
iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；
根据EU编号，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域具有一组选自由以下组成的群组的氨基酸取代：S267K/L368D/K370S：S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L和K370S：S364K/E357Q。
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