JP2024524891A - インターロイキン－１５に基づく免疫サイトカイン - Google Patents
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Abstract
本発明は、とりわけ、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインに基づく）及び抗体を含む免疫サイトカインに関する。本発明は、核酸、ベクター、方法及び医学的使用も提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は、とりわけ、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインに基づく）及び抗体を含む免疫サイトカインに関する。
インターロイキン１５（ＩＬ－１５）は、細胞傷害性リンパ球及びメモリー表現型ＣＤ８＋ Ｔ細胞の生成を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖及び維持を刺激する天然に存在するサイトカインであるが、インターロイキン２とは対照的に、活性化誘導細胞死を媒介せず、Ｔｒｅｇを一貫して活性化せず、毛細血管漏出症候群を引き起こすことがより少ない（Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ｄｕｂｏｉｓら、２０２０）。とりわけ癌の治療におけるＩＬ－１５及び数が増えてきているＩＬ－１５類似体／スーパーゴニストの有効性及び制限を実証する広範な前臨床研究及び臨床研究が実施されており、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＳｃｈｌｕｎｓによって概説されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＳｃｈｌｕｎｓ ２０１７）。
ＩＬ－１５は、インターロイキン２（ＩＬ－２）と同様に、α、β及びγサブユニットを有するヘテロ三量体受容体を介して作用するが、それらは共通のγ鎖受容体（γｃ又はγ）及びＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ（ＩＬ－２Ｒβ、ＣＤ１２２としても知られる）を共有し、γ鎖受容体はＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９及びＩＬ－２１とも共有する。このヘテロ三量体受容体は、第３のサブユニットとして、ＩＬ－２又はＩＬ－１５についての特定のサブユニット、すなわち、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）又はＩＬ－１５Ｒα（ＣＤ２１５）を含有する。下流のＩＬ－２及びＩＬ－１５ヘテロ三量体受容体は、細胞内シグナル伝達のためにＪＡＫ１（Ｊａｎｕｓ（ヤヌス）キナーゼ１）、ＪＡＫ３、及びＳＴＡＴ３／５（シグナル伝達性転写因子（シグナル伝達兼転写活性化因子）３及び５）分子を共有し、同様の機能をもたらすが、両方のサイトカインは、Ｗａｌｄｍａｎｎ（２０１５、例えば表１を参照）及びＣｏｎｌｏｎ（２０１９）において概説されるように、異なる役割も有する。
従って、ＩＬ－２、ＩＬ－１５又はその誘導体の結合による異なるヘテロ三量体受容体の活性化は、免疫系の特異的調節及び潜在的な副作用をもたらす可能性を有している。最近、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化を特異的に標的とすることを目的として、ＩＬ－１５又はＩＬ－１５多様体を含む新規化合物が設計された。これらは、中親和性ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγ、すなわち、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞及びγδ Ｔ細胞で発現される、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及びγｃサブユニットからなる受容体を標的とする化合物である。これは、ＩＬ－１５トランスプレゼンテーションによって媒介される安全かつ強力な免疫刺激にとって重要であるが、設計された化合物ＳＯＴ１０１（ＳＯ－Ｃ１０１、ＲＬＩ－１５）、ＡＬＴ－８０３及びｈｅｔＩＬ－１５は、ＩＬ－１５Ｒαサブユニット（の一部）を既に含有し、それゆえ抗原提示細胞によるαサブユニットのトランスプレゼンテーションを模擬する。ＳＯ－Ｃ１０１は、ＩＬ－１５Ｒαの共有結合したｓｕｓｈｉ（スシ）＋ドメインを含むので、中親和性ＩＬ－１５Ｒβγのみに結合する。このため、ＳＯ－Ｃ１０１は、ＩＬ－１５ＲαにもＩＬ－２Ｒαにも結合しない。同様に、ＡＬＴ－８０３及びｈｅｔＩＬ－１５は、それぞれＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン又は可溶性ＩＬ－１５Ｒαを保有し、それゆえ中親和性ＩＬ－１５Ｒβγ受容体に結合する。従って、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５類似体／スーパーゴニストは、癌及び感染性疾患（感染症）の治療のための有望な臨床段階開発候補である。
標的化サイトカイン送達の方法として、免疫サイトカインと呼ばれる抗体－サイトカイン融合分子が開発されている。このようなタンパク質は、抗原結合特性及びサイトカイン活性の両方を保持する。抗体部分を腫瘍関連抗原、血管新生抗原、腫瘍微小環境抗原又は免疫チェックポイントに標的化することによって、免疫サイトカインは腫瘍微小環境に隔離され、サイトカイン部分は、免疫細胞で発現されるその同族受容体を介してシグナル伝達し、抗腫瘍応答を誘導することができる。例えば、抗体がチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）である場合、抗体とサイトカインの組み合わせは、ＣＰＩを通して免疫系に対する「ブレーキ」を持ち上げ、サイトカインを通して免疫細胞を刺激することによって、癌に対する免疫応答を増強することになる。抗体が腫瘍抗原を標的とする場合、抗体エフェクター機能は、抗体エフェクター機能に関与する免疫細胞を活性化するサイトカインの存在によって増強される可能性がある。
しかしながら、承認されたＩＬ－１５ベースの免疫サイトカインはまだ市販されていない。最近、ＣＥＡ及びＦＡＰに対して標的化されたＩＬ－２ベースの免疫サイトカインが中止されたようである。
従って、免疫サイトカインの設計を改善することが引き続き必要とされている。
Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．、Ｓ．Ｄｕｂｏｉｓら、（２０２０）． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１（８６８）
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｔ．Ｏ．及びＫ．Ｓ．Ｓｃｈｌｕｎｓ（２０１７）． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ １９０：１５９－１６８
Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ． （２０１５）． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ３（３）：２１９－２２７
Ｃｏｎｌｏｎ，Ｋ．Ｃ．ら、（２０１９）． Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ ３９（１）：６－２１
本発明者らは、本発明において、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒのｓｕｓｈｉドメインに基づく）活性及び免疫サイトカインを形成する抗体の調節を可能にする変異／タンパク質修飾ツールボックスを開発した。本発明者らは、免疫エフェクター細胞に対する高すぎる親和性に起因する標的介在性の薬物消失（ｔａｒｇｅｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を最小限にし、免疫サイトカインの半減期の増加をもたらすために、ＩＬ－１５スーパーアゴニストのＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及び／又はγｃ受容体への結合を低下させる好適な単変異又は二重変異を特定した。異なる変異は、低減された結合のレベルを調整することを可能にする。ＩＬ－１５スーパーアゴニストにおける他の変異は、翻訳後修飾に関してＩＬ－１５多様体の均質性を改善してもよい。ＩＬ－１５スーパーアゴニストの活性を調節することは、抗体に融合した１つ又は２つのサイトカインの存在を変化させることも含んでもよい。それゆえ、上記ツールボックスは、ヘテロ二量体抗体を可能にする変異も含む。抗体エフェクター機能を調節するためのツールボックス変異は、抗体依存性細胞傷害活性を増強するか若しくは低下させるＦｃ変異及び／又は抗体のインビボ半減期若しくは安定性を増加させる変異を含んでもよい。上記ツールボックスは、脱フコシル化（アフコシル化、ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体を産生することによって抗体依存性細胞傷害活性を増強することも含む。上記ツールボックスは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体等の特定の必要性に適合された抗体の異なる形式をさらに含む。本発明者らは、本発明において、ＣＰＩ活性又は腫瘍抗原標的化抗体及びＩＬ－１５スーパーアゴニストの活性を組み合わせることを目的とする例示的な免疫サイトカインも設計した。ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβへの結合が減少したＲＬＩ分子に融合した、減少したＡＤＣＣ活性を有するヘテロ二量体化ペムブロリズマブに基づく免疫サイトカインは、ＣＰＩとサイトカインとの組み合わせである。ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβへの結合が低下したＲＬＩ分子に融合したヘテロ二量体化ｈＣｌ１ａ、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（ＡＤＣＣ活性が増強されていてもよい）に基づく免疫サイトカインは、腫瘍抗原標的化抗体とサイトカインとの組み合わせである。
定義
免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる「抗体」は、ヒト及びほとんどの哺乳動物において、ジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）から構成される大きいＹ字形タンパク質である。軽鎖は１つの可変ドメインＶＬ及び１つの定常ドメインＣＬからなるが、重鎖は１つの可変ドメインＶＨ及び３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３を含む。構造的に、抗体は、それぞれ１つのＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを含む２つの抗原結合断片（フラグメント）（Ｆａｂ）、並びに２つの重鎖の２つのＣＨ２及びＣＨ３を含むＦｃ断片又はドメインにも分割される。
免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる「抗体」は、ヒト及びほとんどの哺乳動物において、ジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）から構成される大きいＹ字形タンパク質である。軽鎖は１つの可変ドメインＶＬ及び１つの定常ドメインＣＬからなるが、重鎖は１つの可変ドメインＶＨ及び３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３を含む。構造的に、抗体は、それぞれ１つのＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを含む２つの抗原結合断片（フラグメント）（Ｆａｂ）、並びに２つの重鎖の２つのＣＨ２及びＣＨ３を含むＦｃ断片又はドメインにも分割される。
本明細書で使用される「抗体多様体（バリアント）」又は「抗体機能的多様体」は、例えば、抗体のエフェクター機能を調節するため、抗体安定性及びインビボ半減期を調節するため、並びに／又は抗体Ｆｃドメインのヘテロ二量体化を誘導するための修飾を有する抗体に関する。このような多様体は、変異及び／又は翻訳後修飾によって達成されてもよい。抗体多様体は、Ｎ末端リジンの短縮化（切断）を有する抗体重鎖も含む。他の含まれるバリエーションは、色素、放射性核種、毒素又は他の結合部分等の他の部分への化学的又は酵素的カップリングのための重鎖及び／又は軽鎖のＮ末端タグ又はＣ末端タグである。さらに、抗体多様体は、化学的修飾、それらのグリコシル化の修飾、又は他の部分への化学的連結のための人工アミノ酸での置換を含んでもよい。
本明細書で使用される抗体多様体は、２つ以上の異なるエピトープを潜在的に認識する免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）ベースの二重特異性抗体にも関する。様々な形式の二重特異性抗体が当該技術分野において公知であり、例えば、Ｇｏｄａｒら（２０１８）及びＳｐｉｅｓｓら（２０１５）によって概説されている。本発明に係る二重特異性形式は、Ｆｃドメインを含む。本発明の免疫サイトカインに関して、２つのＲＬＩコンジュゲートは、ある部分に別様に連結されない場合、両方の軽鎖のＣ末端又は両方の重鎖のＣ末端のいずれかに融合されてもよく、あるいは、１つのＲＬＩコンジュゲートは、ヘテロ二量体二重特異性形式のために１つの重鎖のＣ末端に、又は異なる軽鎖を有するヘテロ二量体二重特異性形式の重鎖若しくは１つの軽鎖に融合されてもよい。
抗体機能的多様体は、対応する非修飾抗体と同じエピトープ又は標的に結合することができる。総称的に使用される場合の用語「抗体」は、本明細書で定義される抗体多様体を含む。
抗体機能的多様体は、対応する非修飾抗体と同じエピトープ又は標的に結合することができる。総称的に使用される場合の用語「抗体」は、本明細書で定義される抗体多様体を含む。
本明細書で使用される「コンジュゲート」は、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）若しくはその誘導体とインターロイキン１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）若しくはその誘導体のｓｕｓｈｉドメインとの非共有結合又は共有結合複合体のいずれかに関する。非共有結合複合体は、２つのポリペプチドの同時発現によって、又は別々の発現、（部分的）精製及びその後のそのようなポリペプチドの親和性によりそのような複合体を形成するための組み合わせによって形成されてもよい。好ましくは、コンジュゲートは、２つのポリペプチドが遺伝的に（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ）融合され、組換えにより発現されて単一のポリペプチド鎖をもたらしインタクトな複合体を形成する、融合タンパク質である。
本明細書で使用される「免疫サイトカイン」は、本発明に係るコンジュゲートに遺伝的に融合した抗体又はその機能的多様体を含むポリペプチドに関する。
ＲＬＩが特定の免疫サイトカイン構築物内で言及される場合、それはＲＬＩ２である。
ＥＵ番号付けスキームが、開示された抗体又は部分抗体配列に適用されている。
「インビボ半減期」又はＴ１／２は、（終末相（ｔｅｒｍｉｎａｌ））血漿半減期を指すか、又はＴ１／２は、排出の半減期又は終末相の半減期であり、すなわち、投与後、インビボ半減期は、分布の擬似平衡に達した後に血漿濃度／血中濃度が５０％減少するのに必要な時間である（Ｔｏｕｔａｉｎ及びＢｏｕｓｑｕｅｔ－Ｍｅｌｏｕ、２００４）。血液／血漿中の薬物、ここではポリペプチドである免疫サイトカインアゴニストの測定は、典型的にはポリペプチド特異的ＥＬＩＳＡによって行われる。特定の薬物のインビボ半減期は、任意の哺乳動物において決定することができる。例えば、インビボ半減期は、ヒト、霊長類又はマウスにおいて決定することができる。ヒトにおいて決定されたインビボ半減期は、マウスにおけるインビボ半減期とはかなり異なる可能性があるが、すなわち、特定の薬物についてのマウスにおけるインビボ半減期は、ヒトにおける同じ薬物について決定されたインビボ半減期よりも通常短いが、マウスにおいて決定されたこのようなインビボ半減期は、依然として、ヒトにおける特定のインビボ半減期の指標を与える。従って、マウスにおける特定の薬物について決定されたインビボ半減期から、ヒトにおけるその薬物のインビボ半減期を推定することができる。これは、ヒトに関与する単なる科学的目的のための実験の禁止に起因して、ヒトにおける特定の薬物のインビボ半減期の直接的な決定が稀にしか可能ではないため、特に重要である。あるいは、半減期は、ヒトにおける半減期により類似する霊長類（例えば、カニクイザル）において決定することができる。
「組み合わせて投与される」と記載される場合、これは、典型的には、２つの薬剤が共調剤され、同時投与されることを意味するのではなく、むしろ、１つの薬剤が、他の薬剤と組み合わせたその使用を特定するラベルを有することを意味する。そのため、例えば、免疫サイトカインは、癌の治療又は管理に使用するためのものであり、この使用は、免疫サイトカイン及びさらなる治療剤を同時に、別々に、又は逐次的に投与すること、又はその逆を含む。しかし、本出願におけるいかなるものも、それらの２つの組み合わされた薬剤がひとまとまり若しくはキットとして提供されること、又はさらには投薬スケジュールが合致する場合に共調剤され、一緒に投与されることを排除すべきではない。そのため、「組み合わせて投与される」は、（ｉ）薬物が、関節注入、関節注射等で一緒に投与されること、（ｉｉ）薬物が、各薬物の所与の投与方法に従って別々であるが並行して投与されること、及び（ｉｉｉ）薬物が、別々にかつ逐次的に投与されることを含む。
この文脈における並行投与は、好ましくは、両方の治療が一緒に開始されること、例えば、治療レジメン内の各薬物の最初の投与が同じ日に投与されることを意味する。潜在的な異なる治療スケジュールを考慮すると、以降の日／週／月の間に、投与が常に同じ日に起こらなくてもよいことは明らかである。概して、並行投与は、両方の薬物が各治療サイクルの開始時に同時に体内に存在することを目的とする。この文脈における逐次投与は、好ましくは、両方の治療が逐次的に開始される、例えば、第２の薬物が活性になる前に第１の薬物に対する身体の薬力学的応答を可能にするために、第１の薬物の最初の投与が、第２の薬物の最初の投与より少なくとも１日、好ましくは数日又は１週間早く行われることを意味する。その後、治療スケジュールは、互いに重複若しくは断続的であってもよく、又は直接続いてもよい。
この文脈における並行投与は、好ましくは、両方の治療が一緒に開始されること、例えば、治療レジメン内の各薬物の最初の投与が同じ日に投与されることを意味する。潜在的な異なる治療スケジュールを考慮すると、以降の日／週／月の間に、投与が常に同じ日に起こらなくてもよいことは明らかである。概して、並行投与は、両方の薬物が各治療サイクルの開始時に同時に体内に存在することを目的とする。この文脈における逐次投与は、好ましくは、両方の治療が逐次的に開始される、例えば、第２の薬物が活性になる前に第１の薬物に対する身体の薬力学的応答を可能にするために、第１の薬物の最初の投与が、第２の薬物の最初の投与より少なくとも１日、好ましくは数日又は１週間早く行われることを意味する。その後、治療スケジュールは、互いに重複若しくは断続的であってもよく、又は直接続いてもよい。
用語「約」は、値と共に使用される場合、その値±１０％、好ましくはその値の±５％、とりわけ±１％を意味する。
用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書及び請求項において使用される場合、その用語は他の要素を除外しない。本発明の目的のために、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下において、群が少なくともある数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態のみからなる群も開示すると理解されるべきである。
単数の名詞に言及するときに不定冠詞又は定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」又は「ｔｈｅ」が使用される場合、他に何かが具体的に述べられていない限り、これはその名詞の複数形を含む。
従って、「少なくとも１種の化学療法剤」等における用語「少なくとも１つの」、「少なくとも１種の」は、１種以上の化学療法剤を意味するということを意味してもよい。用語「そ（れら）の組み合わせ」は、同じ文脈において、複数の化学療法剤を含む組み合わせを指す。
技術用語は、それらの共通の意味で使用される。特定の意味が特定の用語に伝えられる場合、用語の定義は、用語が使用される文脈において以下で与えられる。
ラテン語ｑｕａｑｕｅ／ｅａｃｈ、ｅｖｅｒｙ（各、毎）に由来する「ｑｘｗ」は、ｘ週毎を表し、例えばｑ２ｗは２週毎を表す。
「ｓ．ｃ．」又は「ＳＣ」は皮下を表す。
「ｉ．ｖ．」又は「ＩＶ」は静脈内を表す。
「ｉ．ｐ．」又は「ＩＰ」は腹腔内を表す。
Ｃｍａｘは最大濃度を表す。
ＡＵＣは曲線下面積を表す。
「ｓ．ｃ．」又は「ＳＣ」は皮下を表す。
「ｉ．ｖ．」又は「ＩＶ」は静脈内を表す。
「ｉ．ｐ．」又は「ＩＰ」は腹腔内を表す。
Ｃｍａｘは最大濃度を表す。
ＡＵＣは曲線下面積を表す。
第１の態様では、本発明は、サイトカインコンジュゲートと抗体又はその機能的断片とを含む免疫サイトカインに関する。このサイトカインコンジュゲートは、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）又はその誘導体及びインターロイキン１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）又はその誘導体のｓｕｓｈｉドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。当該免疫サイトカインに含まれる抗体又はその機能的多様体は、ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、（同じＩｇＧクラスの野生型Ｆｃドメインを有する同じ免疫サイトカインと比較して）改変されたエフェクター機能及び／又は（同じＩｇＧクラスの野生型Ｆｃドメインを有する同じ免疫サイトカインと比較して）増加したインビボ半減期を有することを特徴とする。上記コンジュゲートは、両方の抗体重鎖若しくは抗体軽鎖のＣ末端に、若しくはヘテロ二量体Ｆｃドメインの場合、１つの抗体重鎖のＣ末端に直接的又は間接的に融合されてもよい。当該免疫サイトカインのインビボ半減期の増加は、ＦｃＲｎ結合を増加させるＦｃ変異によって達成されてもよい。
上記抗体又はその機能的多様体のＦｃドメインは、重鎖、又はヘテロ二量体Ｆｃドメインの場合、一方若しくは両方の重鎖のＣ末端リジンの切断等のさらなる修飾も含んでもよい。加えて、間接的融合のために、グリシン及びセリンのような残基から構成される柔軟なリンカーが抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端に導入されて、隣接するコンジュゲートが抗体Ｆｃドメインに対して自由に移動するようにされてもよい。
１つの実施形態では、当該免疫サイトカインに含まれる抗体又はその機能的多様体は、表４に開示される抗体ｈＣｌ１ａ、ｈＣｌ１ｂ、ｈＣｌ１ｃ、ｈＣｌ１ｄ、ｈＣｌ１ｅ、ｈＣｌ１ｆ、ｈＣｌ１ｇ、ｈＣｌ１ｈ、ｈＣｌ１ｉ及びｈＣｌ１ｊではない。
１つの実施形態では、当該免疫サイトカインに含まれる抗体又はその機能的多様体は、表４に開示される抗体ｈＣｌ１ａ、ｈＣｌ１ｂ、ｈＣｌ１ｃ、ｈＣｌ１ｄ、ｈＣｌ１ｅ、ｈＣｌ１ｆ、ｈＣｌ１ｇ、ｈＣｌ１ｈ、ｈＣｌ１ｉ及びｈＣｌ１ｊである。
１つの実施形態では、本発明は、標的に結合する抗体又はその機能的多様体であって、この抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、合成ＩｇＧ若しくは二重特異性抗体、又はそのＦｃ操作バージョンである抗体又はその機能的多様体を提供する。好ましい実施形態では、この抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ４クラス抗体である。標的が腫瘍細胞上に存在する場合、好ましい抗体形式（フォーマット）はＩｇＧ１である。標的が免疫細胞上に存在する場合、好ましい抗体形式はＩｇＧ４である。抗体形式がＩｇＧ１である場合、免疫グロブリンのＦｃ領域は、複数のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）及び補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）と優先的に相互作用し、抗体依存性細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）、抗体依存的細胞食作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＣＰ）又は補体依存性細胞傷害活性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を介した標的細胞の排除等の免疫エフェクター機能を媒介する。治療アプローチについては、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を増強又はサイレンシングすることが有益であってもよい。ＡＤＣＣ等のＦｃ媒介性エフェクター機能は、抗体が腫瘍細胞を標的とする場合には、増強されてもよく、抗体がＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４等の免疫細胞上に存在するチェックポイント阻害剤を標的とする場合、サイレンシングされてもよい。抗体が、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４等の免疫細胞上に存在するチェックポイント阻害剤を標的とする場合、抗体は、Ｆｃ媒介性エフェクター機能の弱い誘導因子であるＩｇＧ４形式であってもよい。別の実施形態では、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４等のチェックポイント阻害剤を標的とする抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を強力に低減又はサイレンシングするように、例えば、ＦｃγＲ及びＣ１ｑ結合が低減するように操作されたＩｇＧ１形式であってもよい。抗腫瘍治療用抗体の開発におけるＩｇＧサブクラスの選択方法に関する多くの指針は、Ｙｕ Ｊ．ら（Ｙｕ、Ｓｏｎｇら、２０２０）に見出されてもよい。
抗体のＦｃ媒介性機能は、Ｆｃ操作免疫グロブリンを用いて調節されてもよい。表２は、そのようなＦｃ操作の例を示す。
ＡＤＣＣの誘発における抗体又はエフェクター細胞の有効性を決定するためのいくつかの実験室的方法が存在する。通常、ある表面露出抗原を発現する標的細胞株は、その抗原に特異的な抗体又は免疫サイトカインとともにインキュベートされる。インキュベーション後、Ｆｃ受容体ＣＤ１６（Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ））を発現するエフェクター細胞は、抗体又は免疫サイトカイン標識標的細胞と共インキュベートされる。エフェクター細胞は、典型的にはＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）であり、ＰＢＭＣのうちの小さいパーセンテージはＮＫ細胞である。あるいは、精製されたＮＫ細胞が使用されてもよい。さらなる代替法は、ヒトＣＤ１６を外因的に発現するヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７）（ＮＫ９２－ｈＣＤ１６）の使用である。数時間にわたって、抗体、標的細胞、及びエフェクター細胞の間に複合体が形成され、これが標的の細胞膜の溶解をもたらす。標的細胞に何らかの種類の標識を予め負荷した場合、その標識は細胞溶解の量に比例して放出される。細胞傷害性は、溶液中の標識の量を、健康な無傷（インタクトの）細胞内に残っている標識の量と比較して測定することによって定量することができる。標識は、Ｐｅｒｕｓｓｉａ及びＬｏｚａ（Ｐｅｒｕｓｓｉａ及びＬｏｚａ ２０００）に記載されている放射性標識５１Ｃｒであってもよい。予め負荷された標的細胞を使用する代わりに、ＡＤＣＣ活性は、ＬＤＨ細胞傷害性アッセイを使用しても測定されてもよい。ＬＤＨ細胞傷害性アッセイは、細胞の細胞傷害性を決定するための単純かつ信頼できる方法を提供する比色分析である。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、ＡＤＣＣ中に起こる原形質膜損傷等の原形質膜への損傷時に細胞培養培地中に放出される多くの異なる細胞型に存在する細胞質酵素である。ＬＤＨアッセイプロトコルは、酵素カップリング反応に基づく。細胞から放出されたＬＤＨは、乳酸を酸化してＮＡＤＨを生成し、次いでこれは水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）と反応して黄色を生成することができる。生成された色の強度は、溶解細胞の数と直接相関する。ＡＤＣＣ活性は、実施例９に開示されるようにも測定されてもよい。
標的細胞及びエフェクター細胞を使用するＡＤＣＣアッセイの代替として、免疫サイトカインのＦｃ受容体結合は、実施例２４に記載されるように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によっても試験することができる。
１つの実施形態では、当該免疫サイトカインに含まれる抗体又はその機能的多様体の改変されたエフェクター機能は、同じＩｇＧクラスの野生型Ｆｃドメインを有する同じ免疫サイトカインと比較して、抗体依存性細胞傷害活性の低下である。抗体エフェクター機能は、表２の対応するセクションに列挙される変異を介して（変異によって）ＦｃγＲ及びＣ１ｑ結合を低下させることによって低減されてもよい。
１つの実施形態では、抗体又はその機能的多様体がＩｇＧ１である場合、ＡＤＣＣの低下は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、好ましくはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇから選択される変異によって達成されてもよい。
別の実施形態では、抗体又はその機能的多様体がＩｇＧ４である場合、ＡＤＣＣの低下は、Ｌ２３５Ｅ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＥ２３３Ｐ／Ｆ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｒ４０９Ｋ、好ましくはＬ２３５Ｅから選択される変異によって達成されてもよい。
さらに別の実施形態では、抗体又はその機能的多様体がＩｇＧ２である場合、ＡＤＣＣの低下は、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ又はＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓから選択される変異によって達成されてもよい。
１つの実施形態では、抗体又はその機能的多様体がＩｇＧ２（ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ）及びＩｇＧ４のハイブリッド又はその機能的多様体であり、ＩｇＧ２由来のＣＨ１＋ヒンジ領域及びＩｇＧ４由来のＣＨ２＋ＣＨ３領域（ＩｇＧ２アミノ酸１１８～２６０及びＩｇＧ４アミノ酸２６１～４４７）を含む場合に、ＡＤＣＣの低下が達成されてもよい。
好ましい実施形態では、ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣの低下は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）変異を介して達成され、配列番号２６のＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含んでもよい。
別の好ましい実施形態では、ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣの低下は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ（「ＬＡＬＡＰＧ」）変異を介して達成され、配列番号２７のＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含んでもよい。
実施例２３及び図１３は、免疫サイトカインｈＣｌ１ａ ＬＡＬＡＰＧ－ＲＬＩ ＤＡＮＡが、ＮＫ９２細胞の存在下でＡ５４９－ＣＬＤＮ１８．２細胞又はＰＡ－ＴＵ－８９８８において試験した場合、ｈＣｌ１ａ抗体単独のｈＣｌ１ａ－ＲＬＩ ＤＡＮＡ免疫サイトカインと比較して、ＡＤＣＣ活性をほぼ消失させたことを示す。ｈＣｌ１ａ ＬＡＬＡ抗体も、ｈＣｌ１ａ抗体と比較してＡＤＣＣ活性を低下したが、ＡＤＣＣ活性は完全には消失しない。
別の好ましい実施形態では、ＩｇＧ４抗体を選択する場合、Ｆｃ媒介性エフェクター機能の既に低い誘導は、Ｌ２３５Ｅ変異、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＥ２３３Ｐ／Ｆ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｌ３０９Ｖ／Ｒ４０９Ｋ変異を介してさらに低減されてもよい。
好ましい実施形態では、ＩｇＧ４抗体のＡＤＣＣの低下は、Ｌ２３５Ｅ変異を介して達成され、配列番号４３のＩｇＧ４ ＦＣ領域を含んでもよい。
本発明の別の実施形態では、当該免疫サイトカインに含まれる抗体又はその機能的多様体の改変されたエフェクター機能は、増強されたＡＤＣＣである。
１つの実施形態では、上記抗体は、表２の対応するセクションに列挙される変異を介して及び／又は脱フコシル化によって増加したＦｃγＲＩＩＩａ結合によってＡＤＣＣを増強するように修飾されてもよい。
１つの実施形態では、ＡＤＣＣは、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ又はＬ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａから選択される変異を介してＩｇＧ１抗体又はその多様体において増強される。
好ましい実施形態では、ＡＤＣＣは、好ましくは、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（「ＤＥ」）、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ（「ＤＬＥ」）、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（「ＡＡＡ」）、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ（「ＴＬ」）又はＶ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ（「ＩＥ」）から選択される変異を介してＩｇＧ１抗体又はその多様体において増強される。
１つの実施形態では、ＡＤＣＣは、ＤＥ変異を介してＩｇＧ１抗体において増強され、配列番号３０のＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含んでもよい。
別の実施形態では、ＡＤＣＣは、ＤＬＥ変異を介してＩｇＧ１抗体において増強され、配列番号３１のＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含んでもよい。
別の実施形態では、ＡＤＣＣは、ＡＡＡ変異を介してＩｇＧ１抗体において増強され、配列番号３４のＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含んでもよい。
さらに別の実施形態では、ＡＤＣＣは、ＴＬ変異を介してＩｇＧ１抗体において増強され、配列番号３６のＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含んでもよい。
別の実施形態では、ＡＤＣＣは、ＩＥ変異を介してＩｇＧ１抗体において増強され、配列番号３７のＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含んでもよい。
さらに別の実施形態では、ＡＤＣＣは、脱フコシル化を介して抗体のフコース含有量を減少させることによっても増強されてもよい（Ｐｅｒｅｉｒａ、Ｃｈａｎら、２０１８）。フコース（６－デオキシ－Ｌ－ガラクトース）は、哺乳動物細胞において産生される多くのＮ及びＯ結合グリカンの共通成分である。ＣＨ２ドメインの各々における保存されたＮ－グリコシル化部位Ａｓｎ２９７（Ｎ２９７）におけるＩｇＧ１のＦｃ Ｎ－グリカン上のコアフコースの不存在は、ナチュラルキラー細胞等の免疫エフェクター細胞上に存在するＦｃγＲＩＩＩａに対するＩｇＧ１ Ｆｃ結合親和性を増加させ、ＡＤＣＣ活性の増強をもたらすことが示されている。フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）は、ＧＤＰ－フコースからアクセプター基質にフコース残基を転移させる。ＦＵＴ８は、ＩｇＧ１のコアフコシル化のためにＮ－グリカン上の最も内側のＮ－アセチルグルコサミンにα１，６結合を介してフコースを転移させる唯一のα１，６－フコシルトランスフェラーゼである。脱フコシル化抗体は、ＦＵＴ８遺伝子がノックアウトされている（ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）技術）ＣＨＯ細胞において産生されてもよい。このような細胞株において産生された抗体は、従来のＣＨＯ細胞において産生された同じ抗体と比較して増強されたＡＤＣＣを示した（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、２００４）。あるいは、抗体は、フコース合成経路が偏向され、脱フコシル化抗体をももたらす糖操作細胞株（ＧｌｙｍａＸ（登録商標）、ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ（プロパイオジェン））（Ｒｏｓｅｎｌｏｃｈｅｒ、Ｂｏｈｒｓｃｈら ２０１５、Ｄｅｋｋｅｒｓ、Ｐｌｏｍｐら ２０１６）において産生されてもよい。
１つの実施形態では、抗体は、抗体の脱フコシル化を介して増加したＦｃγＲＩＩＩａ結合によってＡＤＣＣを増強するように修飾されてもよい。
別の実施形態では、抗体は、抗体の脱フコシル化と組み合わせて、表２の対応するセクションに列挙される変異の１つを介して増加したＦｃγＲＩＩＩａ結合によってＡＤＣＣを増強するように修飾されてもよい。
好ましい実施形態では、ＩｇＧ１抗体は、抗体の脱フコシル化と組み合わせて、ＡＡＡ変異を介したＦｃγＲＩＩＩａ結合の増加を介してＡＤＣＣを増強するように修飾されてもよい。
ＡＤＣＣ活性を増強する異なるＦｃ変異、又は脱フコシル化、又は脱フコシル化と組み合わせた変異を有する免疫サイトカインのＡＤＣＣ活性は、細胞ベースのＡＤＣＣアッセイによって測定した場合の、実施例２３及び図１４に示されている。すべての変異は、Ｆｃドメイン変異を伴わないヘテロ二量体免疫サイトカイン又は抗体単独と比較して、試験した免疫サイトカインのＡＤＣＣ活性を同様の程度まで増加させた。同様に、脱フコシル化も、免疫サイトカインのＡＤＣＣ活性を増強した。脱フコシル化とＡＡＡ変異との組み合わせもＡＤＣＣを増強したが、ＤＥ又はＤＬＥと脱フコシル化との組み合わせは、ＤＥ、ＤＬＥ又は脱フコシル化の単独と比較してＡＤＣＣ活性をさらに低下させた。
エフェクター機能を調節する変異を有する免疫サイトカインのＦｃ受容体結合は、実施例２４に記載されるように、ＳＰＲによっても試験した。ＳＰＲにより、ＡＤＣＣ活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８及びＦｃγＲＩＩＩａ Ｆ１５８、並びにＡＤＣＣ阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂへの抗体Ｆｃ結合を評価することができた。ＳＰＲ試験により、全体として、ＡＤＣＣを増強する変異を有する免疫サイトカインは、抗体グリコシル化が変異によって影響されない限り、ＡＤＣＣを増強する変異を有さない免疫サイトカインよりも高いＡ／Ｉ比を示すことが確認された。
Ｆｃドメインへの変異の導入も、免疫サイトカインの安定性及び開発可能性に影響を及ぼしてもよく、免疫サイトカインに使用される各特定の抗体に依存してもよい。より具体的には、Ｆｃ変異を有する免疫サイトカインの融解温度及びグリコシル化が試験された（実施例２５参照）。全体として、ｈＣｌ１ａベースの免疫サイトカインについて、ＴＬ及びＩＥ変異は好ましくないグリコシル化を導入し、ＤＥ及びＤＬＥ変異はＣＨ２ドメインの融解温度を低下させてその安定性に影響を及ぼしたが、ＡＡＡ変異は、場合により脱フコシル化と組み合わせて、ｈＣｌ１ａベースの免疫サイトカインの安定性及び開発可能性に影響を及ぼさなかった。
別の実施形態では、抗体の安定性を改善するために抗体のＦｃドメインになされる修飾は、Ｆａｂアーム交換を回避するためのＩｇＧ４抗体におけるＳ２２８Ｐ変異（Ｓｉｌｖａ、Ｖｅｔｔｅｒｌｅｉｎら、２０１５）（配列番号３９）であってもよい。
１つの実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、サイトカインに融合した重鎖を１つだけ有するためには、ヘテロ二量体であってもよい。ヘテロ二量体化は、抗体のＣＨ３鎖における２つのＦｃドメイン（ＣＨ３Ａ鎖及びＣＨ３Ｂ鎖）の各々の変異によって達成されてもよい。下記表３は、ヘテロ二量体Ｆｃ多様体の設計を要約する（Ｈａ、Ｋｉｍら、２０１６）。
１つの実施形態では、抗体のヘテロ二量体化は、ＫｉＨ、ＫｉＨＳ－Ｓ、ＨＡ－ＴＦ、ＺＷ１、７．８．６０、ＤＤ－ＫＫ、ＥＷ－ＲＶＴ、ＥＷ－ＲＶＴＳ－Ｓ、ＳＥＥＤ又はＡ１０７のヘテロ二量体Ｆｃ多様体のいずれか１つを使用することによって達成されてもよい。
好ましい実施形態では、抗体のヘテロ二量体化は、「Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（ＫｉＨ）」Ｆｃ多様体をもたらす、一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗ変異（配列番号２８）及び他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異（配列番号２９）を介して達成される。実施例２では、２つのＲＬＩ２コンジュゲートでホモ二量体化した免疫サイトカインの効力が、ヘテロ二量体化した免疫サイトカインの効力と比較される。表１１は、１つのＲＬＩ２コンジュゲートのみがヘテロ二量体免疫サイトカイン（ＲＴＸ－ＲＬＩ ｘ１）に存在するが、それにもかかわらず、驚くべきことに、その効力は、ホモ二量体免疫サイトカイン（ＲＴＸ－ＲＬＩ ２ｘ）の効力の５０％を依然として上回ることを示す。
ヘテロ二量体免疫サイトカインを産生する方法は、実施例３に見出すことができる。ホモ二量体免疫サイトカインと比較したこのようなヘテロ二量体免疫サイトカインの効力の測定は、実施例５及び表１５に見出すことができる。本発明の１つの目的は、コンジュゲートの効力を減少させることであるので、本発明者らは、本明細書で、Ｃ末端に融合した２つのＲＬＬ２コンジュゲートを有するホモ二量体免疫サイトカインが効力のわずかな減少を有したのに対して、１つのＲＬＩ２コンジュゲートのみを有するヘテロ二量体免疫サイトカインがｋｉｔ２２５細胞に対する効力の約１０倍の低下を示したことを示す。
好ましくは、ＲＬＩ２コンジュゲートは、ｋｎｏｂ重鎖に融合される。
本発明のヘテロ二量体免疫サイトカインの例示的な配列は、ＳＯＴ２０１（ペムブロリズマブ多様体ベースのヘテロ二量体免疫サイトカイン）については、配列番号２１（「ＨＣ ｋｎｏｂ－ＲＬＩ２ＡＱＮＡ」）、配列番号２２又は配列番号１０１（末端リジンが欠失している又はしていない「ＨＣ ｈｏｌｅ」、）及び配列番号２３（ＬＣ）、好ましくは配列番号２１、配列番号１０１及び配列番号２３に、ｈＣｌ１ａ多様体ベースのヘテロ二量体免疫サイトカインについては配列番号８５（「ＨＣ ｋｎｏｂ－ＲＬＩ２ＡＱＤＡＮＡ」）、配列番号８７（「ＨＣ ｈｏｌｅ」）及び配列番号８８（ＬＣ）に、別のｈＣｌ１ａ多様体ベースのヘテロ二量体免疫サイトカインについては配列番号１１１（「ＨＣ ｋｎｏｂ－ＲＬＩ２ＡＱＮＡ」）、配列番号１１０（「ＨＣ ｈｏｌｅ」）及び配列番号８８（（ＬＣ）に、リツキシマブに基づくヘテロ二量体免疫サイトカインについては配列番号９７（「ＨＣ ｋｎｏｂ ＡＡＡ－ＲＬＩ２ＡＱＮＡ」）、配列番号９８（「ＨＣ ｈｏｌｅＡＡＡ」）及び配列番号９９（ＬＣ）に、又はセツキシマブに基づくヘテロ二量体免疫サイトカインについては配列番号９４（「ＨＣ ｋｎｏｂ－ＲＬＩ２ＡＱＤＡＮＡ」）、配列番号９５（「ＨＣ ｈｏｌｅ」）及び配列番号９２（ＬＣ）に見出すことができる。
１つの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、ホモ二量体Ｆｃドメインを有する免疫サイトカインと比較して、細胞培養における発現時に免疫サイトカインのより高い収率をもたらす。ヘテロ二量体抗体形式は、重鎖及び軽鎖の誤対合（ｍｉｓｐａｉｒｉｎｇ）に起因してより低い発現を有することが一般に予想されるが、驚くべきことに、ヘテロ二量体免疫サイトカインについて、ＫｉＨ技術を使用するヘテロ二量体構築物は、それぞれのホモ二量体構築物と比較してより高い発現を有することが観察された（実施例３を参照）。
免疫サイトカインがヘテロ二量体でない場合、上記コンジュゲートは、抗体の軽鎖のＣ末端にも融合されてもよい（例えば、配列番号４５）。グリシン又はセリン及びグリシンからなるリンカーが、抗体に対する融合コンジュゲートの柔軟性を可能にするために、軽鎖のＣ末端とコンジュゲートのＮ末端との間に存在してもよい。
あるいは、ＲＬＩ２ＡＱを片方又は両方の重鎖のＣ末端に融合させるためにリンカーが使用されてもよい。このようなリンカーは、好ましくはグリシン又はグリシン及びセリンから構成され、より好ましくはＧＧＧＧＳ単位から３０～５０アミノ酸の長さで構成され、とりわけ配列番号１００のＬ４０リンカーである。
別の実施形態では、本発明は、免疫サイトカインであって、免疫サイトカインのインビボ半減期が増加し、抗体又はその機能的多様体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体又はその機能的多様体であり、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ又はＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌから選択される変異を含む、免疫サイトカインに関する。
Ｆｃドメインは、抗体の安定性及び血清半減期において中心的な役割を果たす。抗体のインビボ半減期は、ＦｃＲｎ結合を増加させるＦｃドメインにおけるＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ又はＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異を介して増加されてもよい（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ、Ｗｏｏｄｓら ２００２；Ｚａｌｅｖｓｋｙ、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら ２０１０）。
１つの実施形態では、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４型の抗体の半減期は、それぞれ配列番号３５及び配列番号４４のＦｃドメインのＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）変異を介して増加する。
別の実施形態では、本発明は、免疫サイトカインであって、抗体又はその機能的多様体が低下したＡＤＣＣを有し、その抗体又はその機能的多様体がＩｇＧ４抗体又はその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ変異及びＫｉＨ－ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む、免疫サイトカインに関する。抗体標的が、免疫細胞上に存在するチェックポイント阻害剤、例えば、Ｔ細胞の表面上のＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４である場合に、ＡＤＣＣを低下させることは、これらの免疫細胞に対するＮＫ細胞誘導性細胞傷害性を回避するために有益であってもよい。ＩｇＧ４抗体は、抗体を安定化させるためにＳ２２８Ｐ変異も必要に応じて含有してもよい。Ｌ２３５Ｅ変異を有するＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、配列番号４３の配列であってもよい。Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４ ＣＨ１－ヒンジドメインは、配列番号３９の配列のものであってもよい。ＩｇＧ４抗体のＫｉＨ－ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、配列番号４１（「ｋｎｏｂ」）及び配列番号４２（「ｈｏｌｅ」）の配列であってもよい。任意選択で、一方又は好ましくは両方の重鎖は、末端リジン欠失（ｄＫ）、すなわち配列番号４１（「ｋｎｏｂ」）及び配列番号４２（「ｈｏｌｅ」）の配列を有してもよい。別の実施形態では、両方の重鎖が末端リジンを有する。
実施例１０～実施例２６は、このような免疫サイトカインに関する。
１つの実施形態では、免疫サイトカインのコンジュゲートは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン又はその誘導体と、リンカーと、ＩＬ－１５又はその誘導体とを含む融合タンパク質であり、好ましくは、ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインは、配列番号５の配列、より好ましくは、配列番号６のＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉ＋断片を含み、リンカーは、１８～２２アミノ酸の長さを有し、好ましくはグリシン又はセリン及びグリシンから構成され、より好ましくは配列番号７の配列を有し、ＩＬ－１５は配列番号２の配列を有する。
配列番号７の柔軟なリンカーを介して配列番号２の成熟ヒトＩＬ－１５のＮ末端に融合した配列番号６のＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉ＋断片を有する融合タンパク質は、受容体－リンカー－インターロイキン２を表すＲＬＩ２又は配列番号８の配列を有するＳＯ－Ｃ１０１と呼ばれ、低い免疫原性を有する臨床段階ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγスーパーアゴニストである。これは、このような融合タンパク質を、免疫サイトカイン形式で使用される好ましいコンジュゲートにする。
好ましい実施形態では、当該免疫サイトカインは、翻訳後修飾に関してＩＬ－１５多様体の均質性を増加させる少なくとも１つの変異を含むＩＬ－１５多様体であって、好ましくは、この変異は、ＩＬ－１５成熟ヒトＩＬ－１５（配列番号２）のＮ７７における脱アミド化及び／又はＮ７９におけるグリコシル化を低減し、より好ましくは、上記変異は、変異Ｇ７８Ａ、Ｇ７８Ｖ、Ｇ７８Ｌ又はＧ７８Ｉ、及びＮ７９Ｑ、Ｎ７９Ｓ又はＮ７９Ｔから選択され、最も好ましくは、上記変異はＧ７８Ａ／Ｎ７９Ｑ（「ＡＱ変異」）であるＩＬ－１５多様体を含む。
免疫サイトカインの均質性を増大させるＩＬ－１５変異並びにＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及び／又はγｃ受容体への結合を低下させるＩＬ－１５変異は、本発明の免疫サイトカインにおいて独立に使用されてもよいし、又は本発明の免疫サイトカインにおいて組み合わされてもよい。
別の好ましい実施形態では、当該免疫サイトカインは、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及び／又はγｃ受容体への結合を低下させる少なくとも１つの変異を含むＩＬ－１５多様体を含み、好ましくは、この変異アミノ酸は、配列番号２の配列を有するＩＬ－１５成熟ヒトＩＬ－１５のＮ１、Ｎ４、Ｓ７、Ｄ８、Ｋ１０、Ｋ１１、Ｄ３０、Ｄ６１、Ｅ６４、Ｎ６５、Ｌ６９、Ｎ７２、Ｅ９２、Ｑ１０１、Ｑ１０８、Ｉ１１１から選択され、より好ましくは変異アミノ酸はＤ６１、Ｎ６５及びＱ１０１から選択され、最も好ましくは変異アミノ酸はＮ６５である。
ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及び／又はγｃ受容体への結合を低下させる上記変異は、好ましくはＮ１Ｄ、Ｎ１Ａ、Ｎ１Ｇ、Ｎ４Ｄ、Ｓ７Ｙ、Ｓ７Ａ、Ｄ８Ａ、Ｄ８Ｎ、Ｋ１０Ａ、Ｋ１１Ａ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ａ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｅ、Ｎ６５Ｒ、Ｎ６５Ｋ、Ｌ６９Ｒ、Ｎ７２Ｒ、Ｑ１０１Ｄ、Ｑ１０１Ｅ、Ｑ１０８Ｄ、Ｑ１０８Ａ、Ｑ１０８Ｅ及びＱ１０８Ｒ、好ましくはＤ８Ａ、Ｄ８Ｎ、Ｄ６１Ａ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ７２Ｒ、Ｑ１０１Ｄ、Ｑ１０１Ｅ及びＱ１０８Ａ、より好ましくはＤ６１Ａ、Ｎ６５Ａ及びＱ１０１、最も好ましくはＮ６５Ａから選択される置換、又はＤ８Ｎ／Ｎ６５Ａ、Ｄ６１Ａ／Ｎ６５Ａ若しくはＤ６１Ａ／Ｎ６５Ａ／Ｑ１０１Ｄから選択される組み合わされた置換である。
別の実施形態では、当該免疫サイトカインは、好ましくはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＯＬＲ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＥＡ、ＧＤ２、Ｏ－アセチル－ＧＤ－２、ＧＭ１、ＣＡＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８から選択される腫瘍抗原に、好ましくはＦＡＰ、フィブロネクチンのＥＤＡドメイン、フィブロネクチンのＥＤＢドメイン及びＬＲＲＣ１５、好ましくはＦＡＰ及びフィブロネクチンのＥＤＢドメインから選択される腫瘍細胞外マトリックス抗原に、血管新生抗原、好ましくはＶＥＧＦ、若しくはエンドグリン（ＣＤ１０５）に結合する抗体若しくはその機能的多様体を含むか、又は、免疫調節抗体若しくはその機能的多様体であり、この免疫調節抗体は、好ましくはＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ１３７／４－１ ＢＢアゴニスト、ＣＤ１３４／ＯＸ４０アゴニスト及びＴＮＦＲＳＦ１８／ＧＩＴＲアゴニストから選択される共刺激受容体を刺激するか、又は免疫調節抗体は、好ましくはＰＤ－１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニスト、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト、阻害性ＫＩＲアンタゴニスト、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２アンタゴニスト、ＨＡＶＣＲ２／ＴＩＭ－３／ＣＤ３６６アンタゴニスト及びＡＤＯＲＡ２Ａアンタゴニストから、より好ましくはＰＤ－１アンタゴニストから選択される免疫抑制受容体を阻害する。
上記に列挙した標的に対する抗体は、当該技術分野において周知であるか、又は標準的な免疫化若しくはファージディスプレイプロトコルによって作製することができる。非ヒト抗体はヒト化することができる。抗ＥＧＦＲ抗体の例は、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、及びマツズマブである。抗ＨＥＲ２抗体の例は、トラスツズマブ、ペルツズマブ又はマルゲツキシマブである。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の例は、ゾルベツキシマブ及び以下の本発明の抗体である。抗ＣＥＡ抗体の例はアルシツモマブである。抗ＧＤ２の例はｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａである。抗Ｏ－アセチル－ＧＤ－２の例はｃ．８Ｂ６である。ＦＧＦＲ２、ＦＯＬＲ１、ＧＭ１、ＣＡＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１９。抗ＣＤ２０抗体の例は、リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブ、トシツモマブ及びユブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）である。抗ＣＤ３８抗体の例は、ダラツムマブ、ＭＯＲ２０２及びイサツキシマブである。
抗ＦＡＰ抗体の例は、シブロツズマブ及びＢ１２（米国特許出願公開第２０２０－０２４６３８３Ａ１号明細書）である。フィブロネクチンの抗ＥＤＡドメイン抗体の例はＦ８抗体（（Ｖｉｌｌａ、Ｔｒａｃｈｓｅｌら、２００８）、国際公開第２０１０／０７８９４５号パンフレット、国際公開第２０１４／１７４１０５号パンフレット）であり、フィブロネクチンの抗ＥＤＢドメインの例はＬ１９抗体（（Ｐｉｎｉ、Ｖｉｔｉら、１９９８）、国際公開第１９９９／０５８５７０号パンフレット）であり、抗ＬＲＲＣ１５抗体の例はサムロタマブ（Ｓａｍｒｏｔａｍａｂ）／ｈｕＭ２５（国際公開第２０１７／０９５８０５号パンフレット）である。
抗ＶＥＧＦ抗体の例はベバシズマブ及びラニビズマブである。抗エンドグリン抗体の例はＴＲＣ１０５（国際公開第２０１００３９８７３Ａ２号パンフレット）である。
抗ＣＤ４０アゴニスト抗体の例は、セリクレルマブ（ｓｅｌｉｃｒｅｌｕｍａｂ）、ＡＰＸ００５Ｍ、ＣｈｉＬｏｂ７／４、ＡＤＣ－１０１３、ＳＥＡ－ＣＤ４０及びＣＤＸ－１１４０（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ２０２０）である。抗ＣＤ１３７／４－１ ＢＢアゴニスト抗体の例は、ウレルマブ及びウトミルマブ（Ｃｈｅｓｔｅｒ、Ｓａｎｍａｍｅｄら、２０１８）である。抗ＣＤ１３４／ＯＸ４０アゴニスト抗体の例は、ＰＦ－０４５１８６００、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＯＸＲ０９１６、ＭＥＤＩ０５６２、ＩＮＣＡＧＮ０１９４９（Ｆｕ、Ｌｉｎら、２０２０）である。抗ＴＮＦＲＳＦ１８／ＧＩＴＲアゴニスト抗体の例はＤＴＡ－１である。
ＰＤ－１アンタゴニストの例は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ２抗体である。抗ＰＤ－１アンタゴニスト抗体（拮抗性抗体）の例は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、トリパリマブ及びチスレリズマブ（ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）（Ｄｏｌｇｉｎ、２０２０）である。抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト抗体の例は、アテゾリズマブ及びアベルマブである。抗ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト抗体の例はイピリムマブである。抗ＬＡＧ３アンタゴニスト抗体の例はレラトリマブである。抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の例は、チラゴルマブ（ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ）、ビボストリマブ（Ｖｉｂｏｓｔｏｌｉｍａｂ）、ドムバナリマブ（Ｄｏｍｖａｎａｌｉｍａｂ）、エチギリマブ（Ｅｔｉｇｉｌｉｍａｂ）、ＢＭＳ－９８６２０７、ＥＯＳ－４４８、ＣＯＭ９０２、ＡＳＰ８３７４、ＳＥＡ－ＴＧＴ、ＢＧＢ－Ａ１２１７、ＩＢＩ－９３９及びＭ６２２３である。
抗ＢＴＬＡアンタゴニスト抗体の例はＴＡＢ００４である。抗ＨＡＶＣＲ２／ＴＩＭ－３アンタゴニスト抗体の例は、ＬＹ３３２１３６７、ＭＢＧ４５３及びＴＳＲ－０２２である。
好ましい実施形態は、コンジュゲートが配列番号１０の配列を含み、抗体が配列番号２０のペムブロリズマブ由来重鎖ｋｎｏｂ配列、配列番号２２のペムブロリズマブ由来重鎖ｈｏｌｅ配列、及び配列番号１６の軽鎖配列を含み、上記コンジュゲートがリンカーなしでＣ末端重鎖ｋｎｏｂ配列に融合される、好ましくは配列番号２１の免疫サイトカインである。
１つの実施形態では、本発明の免疫サイトカインは、配列番号１０又は配列番号１１の配列のコンジュゲートを含み、抗体は、表４のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体であり、ＩｇＧ１多様体は、表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体であり、表２のＤＥ、ＤＬＥ、ＡＡＡ、ＴＬ又はＩＥ変異を介して、又は脱フコシル化を介して、又は上に列挙された変異と脱フコシル化との組み合わせを介して増強されたＡＤＣＣ活性を有する。
別の実施形態では、本発明の免疫サイトカインは、配列番号１０又は配列番号１１の配列のコンジュゲートを含み、抗体は、表４のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体であり、ＩｇＧ１多様体は、表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体である。
好ましい実施形態では、本発明の免疫サイトカインは、配列番号１０の配列のコンジュゲートと、それぞれ配列番号４６及び配列番号４７のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体とを含み、ＩｇＧ１多様体は、表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体である。
好ましい実施形態では、本発明の免疫サイトカインは、配列番号１０の配列のコンジュゲートと、それぞれ配列番号４６及び配列番号４７のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体とを含み、ＩｇＧ１多様体は、表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体であり、表２のＤＥ、ＤＬＥ、ＡＡＡ、ＴＬ又はＩＥ変異を介して、又は脱フコシル化を介して、又は上に列挙された変異と脱フコシル化との組み合わせを介して増強されたＡＤＣＣ活性を有する。
別の好ましい実施形態では、本発明の免疫サイトカインは、配列番号１０の配列のコンジュゲートと、それぞれ配列番号４６及び配列番号４７のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体とを含み、ＩｇＧ１多様体は、表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体であり、脱フコシル化を介して増強されたＡＤＣＣ活性を有する。
好ましい実施形態では、当該免疫サイトカインは、配列番号１１の配列のコンジュゲートを含み、抗体多様体は、配列番号８４の重鎖ｋｎｏｂ配列、配列番号８７の重鎖ｈｏｌｅ配列及び配列番号８８の軽鎖配列を有するヘテロ二量体ＩｇＧ１抗ＣＬＤＮ１８．２抗体である。
好ましい免疫サイトカインの例示的な配列は、配列番号８５（「ＨＣ ｋｎｏｂ」）、配列番号８７（「ＨＣ ｈｏｌｅ」）及び配列番号８８（ＬＣ）であってもよい。
好ましい免疫サイトカインの別の例示的な配列は、配列番号８６（「ＨＣ ｋｎｏｂ」）、配列番号８７（「ＨＣ ｈｏｌｅ」）及び配列番号８８（ＬＣ）であってもよい。
好ましい免疫サイトカインのさらに別の例示的な配列は、配列番号１１１（「ＨＣ ｋｎｏｂ」）、配列番号１１０（「ＨＣ ｈｏｌｅ」）及び配列番号８８（ＬＣ）であってもよい。
別の好ましい実施形態では、本発明の免疫サイトカインは、配列番号１０の配列のコンジュゲートを含み、抗体多様体は、配列番号８４の重鎖ｋｎｏｂ配列、配列番号８７の重鎖ｈｏｌｅ配列及び配列番号８８の軽鎖配列を有するヘテロ二量体ＩｇＧ１抗ＣＬＤＮ１８．２抗体である。
驚くべきことに、抗Ｃｌａｕｄｉｎ（クローディン）１８．２抗体ｈＣｌ１ａに融合したＲＬＩ２ＡＱ ＤＡＮＡ変異体は、ＲＬＩ２ＡＱ ＮＡ変異体と比較してより高いＡＤＣＣを示した。
さらに別の実施形態では、本発明の免疫サイトカインは、配列番号１０の配列のコンジュゲートと、それぞれ配列番号４６及び配列番号４７のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体とを含み、ＩｇＧ１多様体は表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体であり、ＩｇＧ１ ＦｃドメインにＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＤＥ）のＡＤＣＣ増強変異を有する。
さらに別の実施形態では、本発明の免疫サイトカインは、配列番号１１の配列のコンジュゲートと、それぞれ配列番号４６及び配列番号４７のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体とを含み、ＩｇＧ１多様体は表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体であり、ＩｇＧ１ ＦｃドメインにＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＤＥ）ＡＤＣＣ増強変異を有する。
別の実施形態では、本発明の免疫サイトカインは、配列番号１０の配列を有する融合タンパク質を含み、抗体多様体は、配列番号９１のＶＨ配列及び配列番号９２のＶＬ配列を有するヘテロ二量体ＩｇＧ１抗ＥＧＦＲ抗体であり、ＩｇＧ１多様体は、表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体であり、表２の対応するセクションに列挙されるＦＣ変異を介して、又は脱フコシル化を介して、又は変異と脱フコシル化との組み合わせを介して増強されたＡＤＣＣ活性を有する。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される免疫サイトカインをコードする核酸に関する。
さらに別の実施形態では、本発明は、当該免疫サイトカインをコードする核酸を含むベクターに関する。
さらなる実施形態では、本発明は、当該免疫サイトカインをコードするベクター又は核酸を含む宿主細胞に関する。
本発明の別の実施形態は、治療に使用するための当該免疫サイトカイン、核酸又はベクターに関する。
本発明のさらに別の実施形態は、当該免疫サイトカイン、核酸又はベクターと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物に関する。
別の実施形態では、当該免疫サイトカイン、核酸又はベクターは、腫瘍性疾患若しくは感染性疾患に罹患している、腫瘍性疾患若しくは感染性疾患を発症するリスクがある、及び／又は腫瘍性疾患若しくは感染性疾患と診断される対象の治療に使用するためのものであってもよい。
別の実施形態では、本発明は、腫瘍性疾患若しくは感染性疾患に罹患している、腫瘍性疾患若しくは感染性疾患を発症するリスクがある、及び／又は腫瘍性疾患若しくは感染性疾患と診断される患者を治療する方法であって、当該免疫サイトカイン、核酸又はベクターを投与する工程を含む方法に関する。
典型的な臨床開発経路は標準治療との組み合わせであるので、本発明の免疫サイトカインは、他の薬剤と組み合わせて投与されてもよく、典型的には、特定の適応症の標準治療は承認されている。本発明の免疫サイトカインは、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ－３、抗ＣＴＬＡ４抗体又は抗ＴＩＧＩＴ抗体、好ましくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体であってもよいチェックポイント阻害剤と組み合わされてもよい。これらの抗体は、免疫細胞、とりわけＴ細胞が癌細胞を死滅させることを遮断（ブロッキング）又は下方制御する細胞相互作用を遮断／それに拮抗するという点で共通しており、従って、これらの抗体はすべてアンタゴニスト抗体である。抗ＰＤ－１抗体の例は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＢＭＳ－９３６５５８、ＳＨＲ１２１０、ＩＢＩ３０８、ＰＤＲ００１、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＢＣＤ－１００及びＪＳ００１である。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の例は、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＫＮ０３５及びＭＧＤ０１３（ＰＤ－１及びＬＡＧ－３に二重特異的）である。ＰＤ－Ｌ２抗体の例はｓＨＩｇＭ１２である。抗ＬＡＧ－３抗体の例は、レラトリマブ（ＢＭＳ９８６０１６）、Ｓｙｍ０２２、ＲＥＧＮ３７６７、ＴＳＲ－０３３、ＧＳＫ２８３１７８１、ＭＧＤ０１３（ＰＤ－１及びＬＡＧ－３に二重特異的）並びにＬＡＧ５２５（ＩＭＰ７０１）である。抗ＴＩＭ－３抗体の例は、ＴＳＲ－０２２及びＳｙｍ０２３である。抗ＣＴＬＡ－４抗体の例は、イピリムマブ及びトレメリムマブ（チシリムマブ）である。抗ＴＩＧＩＴ抗体の例は、チラゴルマブ（ＭＴＩＧ７１９２Ａ、ＲＧ６０５８）及びエチギリマブである。
配列
実施例１：一般的材料及び方法
ｋｉｔ２２５での効力アッセイ
ＩＬ－２及びＩＬ－１５の両方の活性は、Ｈｏｒｉら（１９８７）によって記載されるように、ｋｉｔ２２５細胞の増殖の誘導によって決定することができる。ｋｉｔ２２５細胞（Ｈｏｒｉ、Ｕｃｈｉｙａｍａら、１９８７）をｋｉｔ２２５基本培地中で継代し、継代４～７で効力アッセイに使用した。効力アッセイの前に、ｋｉｔ２２５細胞を、ＩＬ－２を含まないｋｉｔ２２５基本培地中で２４時間培養した（飢餓期間）。１×１０４ｋｉｔ２２５細胞を９６ウェルプレートに蒔き（プレーティングし）、ＲＬＩ－１５及びそれぞれの分子ＰＥＭ－ＲＬＩ－１５の連続希釈物を細胞に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２±３時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌ（ウェル中の体積の１０％）のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（アラマーブルー）を各ウェルに添加し、６時間後、吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、６２０ｎｍ参照を用いて５６０ｎｍで測定した（１５秒間検出する前に混合を設定した）。いくつかの場合において、より低い効力のＲＬＩ２変異体を試験した場合、ｋｉｔ２２５細胞とのインキュベーションは、３日間（７２時間±３時間）から５日間に延長した。
ｋｉｔ２２５での効力アッセイ
ＩＬ－２及びＩＬ－１５の両方の活性は、Ｈｏｒｉら（１９８７）によって記載されるように、ｋｉｔ２２５細胞の増殖の誘導によって決定することができる。ｋｉｔ２２５細胞（Ｈｏｒｉ、Ｕｃｈｉｙａｍａら、１９８７）をｋｉｔ２２５基本培地中で継代し、継代４～７で効力アッセイに使用した。効力アッセイの前に、ｋｉｔ２２５細胞を、ＩＬ－２を含まないｋｉｔ２２５基本培地中で２４時間培養した（飢餓期間）。１×１０４ｋｉｔ２２５細胞を９６ウェルプレートに蒔き（プレーティングし）、ＲＬＩ－１５及びそれぞれの分子ＰＥＭ－ＲＬＩ－１５の連続希釈物を細胞に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２±３時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌ（ウェル中の体積の１０％）のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（アラマーブルー）を各ウェルに添加し、６時間後、吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、６２０ｎｍ参照を用いて５６０ｎｍで測定した（１５秒間検出する前に混合を設定した）。いくつかの場合において、より低い効力のＲＬＩ２変異体を試験した場合、ｋｉｔ２２５細胞とのインキュベーションは、３日間（７２時間±３時間）から５日間に延長した。
好ましくは、例えば、ＣＴＬＬ－２細胞を使用するＳｏｍａｎら（Ｓｏｍａｎ、Ｙａｎｇら、２００９）によって記載されるように、ＩＬ－２又はＩＬ－１５刺激による増殖活性化を決定するために、比色分析又は蛍光等の方法が使用される。ｋｉｔ２２５細胞等の細胞株の代替として、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はバフィーコートを使用することができる。ＩＬ－２又はＩＬ－１５の活性を決定するための好ましいバイオアッセイは、ＳＴＡＴ５－ＲＥ ＣＴＬＬ－２細胞を使用するＩＬ－２／ＩＬ－１５ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＣＳ２０１８Ｂ０３／Ｂ０７／Ｂ０５）である。
分析したＲＬＩ多様体の濃度は以下の通りであった。
ＲＬＩ２上清。 ０．１３３ｍｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡ、２回の実験からの平均）
ＲＬＩ２ＡＱ上清。 ０．０２９７ｍｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡ、２回の実験からの平均）
ＲＬＩ２上清。 ０．１３３ｍｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡ、２回の実験からの平均）
ＲＬＩ２ＡＱ上清。 ０．０２９７ｍｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡ、２回の実験からの平均）
ＲＬＩ２の特性
純度（ＲＰ－ＵＰＬＣ） ９９．８％
調剤 ２０ｍＭヒスチジン、６％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ６．５
保存温度 －２０℃
純度（ＲＰ－ＵＰＬＣ） ９９．８％
調剤 ２０ｍＭヒスチジン、６％（ｗ／ｖ）ソルビトール、ｐＨ６．５
保存温度 －２０℃
ｋｉｔ２２５基本培地
ＲＰＭＩ（４６０ｍＬ）＋ＦＢＳ（３０ｍＬ）＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（グルタマックス）（５ｍＬ）＋ペニシリン－ストレプトマイシン（５ｍＬ）＋フラスコに添加したサイトカイン（７５ｃｍ２）；ＩＬ－２（５ｎｇ／ｍＬ）。サイトカインは培養直前に培地に添加した。
ＲＰＭＩ（４６０ｍＬ）＋ＦＢＳ（３０ｍＬ）＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（グルタマックス）（５ｍＬ）＋ペニシリン－ストレプトマイシン（５ｍＬ）＋フラスコに添加したサイトカイン（７５ｃｍ２）；ＩＬ－２（５ｎｇ／ｍＬ）。サイトカインは培養直前に培地に添加した。
ｈＰＢＭＣ効力アッセイ
バフィーコートを健常ドナーから得た。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ勾配によって単離し、３回洗浄し、９６ウェルプレート中でＴ細胞完全培地に再懸濁した。免疫サイトカインを示した濃度で添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートした。免疫細胞集団の増殖をフローサイトメトリによって検出した。
バフィーコートを健常ドナーから得た。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ勾配によって単離し、３回洗浄し、９６ウェルプレート中でＴ細胞完全培地に再懸濁した。免疫サイトカインを示した濃度で添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートした。免疫細胞集団の増殖をフローサイトメトリによって検出した。
Ｔ細胞完全培地
ＲＰＭＩ１６４０培地、ＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ １×、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ＮＥＡＡ １×（非必須アミノ酸混合物）、２－メルカプトエタノール０．０５ｍＭ及び１０％ＡＢヒト血清（熱不活化）。
ＲＰＭＩ１６４０培地、ＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ １×、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ＮＥＡＡ １×（非必須アミノ酸混合物）、２－メルカプトエタノール０．０５ｍＭ及び１０％ＡＢヒト血清（熱不活化）。
ヒトＮＫ細胞（ｈＮＫ）の単離：健常ドナー由来の新鮮な血液を、冷ＰＢＳ－ＥＤＴＡ、ｐｈ７．４で１：１の比率で希釈し、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配単離によって単離した。単離したＰＢＭＣを完全培養培地に再懸濁した。ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ステムセル・テクノロジーズ）、米国）を製造業者の説明書に従って使用してＰＢＭＣからｈＮＫ細胞を単離した。各ドナーの単離ｈＮＫ細胞を、３×１０６細胞／ｍｌの濃度で１０％血清を含むＮＫ培地に再懸濁した。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイ
製造業者の説明書に従ってアッセイを行った（Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｊ１２５０）。手短に述べると、ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を９６ウェルプレートに蒔き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で１６～２０時間インキュベートした。その後、示した濃度のＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカイン及びＰＤ－１エフェクター細胞を上記細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で６時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬をウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートし、発光測定を行った。
製造業者の説明書に従ってアッセイを行った（Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｊ１２５０）。手短に述べると、ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を９６ウェルプレートに蒔き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で１６～２０時間インキュベートした。その後、示した濃度のＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカイン及びＰＤ－１エフェクター細胞を上記細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で６時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬をウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートし、発光測定を行った。
カニクイザル研究
示したＰＥＭ－ＲＬＩ分子の薬物動態を、カニクイザル（ｎ＝２～３）において、示した用量を投与した後に１日目又は１５日目に試験した。血清分離のための血液を、投与の１時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、８４時間後、９６時間後、１２０時間後及び１６８時間後に採取した（いくつかの時間点は、いくつかの場合において省略したことがある）。血清中の免疫サイトカインの濃度を、表５の抗体を用いてＥＬＩＳＡにより決定した。選択した免疫細胞集団（ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞）のフローサイトメトリ評価のための血液を、投与前、５日目、８日目、１２日目、１５日目、１９日目、２２日目及び２６日目に採取した。
示したＰＥＭ－ＲＬＩ分子の薬物動態を、カニクイザル（ｎ＝２～３）において、示した用量を投与した後に１日目又は１５日目に試験した。血清分離のための血液を、投与の１時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、８４時間後、９６時間後、１２０時間後及び１６８時間後に採取した（いくつかの時間点は、いくつかの場合において省略したことがある）。血清中の免疫サイトカインの濃度を、表５の抗体を用いてＥＬＩＳＡにより決定した。選択した免疫細胞集団（ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞）のフローサイトメトリ評価のための血液を、投与前、５日目、８日目、１２日目、１５日目、１９日目、２２日目及び２６日目に採取した。
マウス有効性研究
これらの研究の目的は、雌ｈＰＤ１シングルＫＩ ＨｕＧＥＭＭマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｐｄｃｄ１ｅｍ１（ｈＰＤＣＤ１）／Ｓｍｏｃ）（ｎ＝８マウス／群）におけるＨｕＣｅｌｌ ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞株の処置における単剤療法としてのＰＥＭ－ＲＬＩ２ ＮＡ ｘ１及びペムブロリズマブのインビボ治療有効性を評価することであった。各マウスの右下腹部に、腫瘍発生のためにＰＢＳ０．１ｍｌ中のＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞（１×１０６）を皮下接種した。平均腫瘍サイズが１０８ｍｍ３に達したときに無作為化を開始した。４０匹のマウスをこの研究に登録した。すべての動物を５つの試験群に無作為に割り当てた。無作為化は、「Ｍａｔｃｈｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ」法（ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ソフトウェア、バージョン３．１．３９９．１９）に基づいて行った。無作為化日の日付を０日目（Ｄ０）と表記した。腫瘍細胞接種後、動物の罹患率及び死亡率を毎日（又はＳｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒの裁量で、必要に応じてより頻繁に）チェックした。腫瘍体積を、キャリパーを使用して２次元で週に３回測定し、体積を、式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２（式中、Ｖは腫瘍体積であり、Ｌは腫瘍長（最も長い腫瘍寸法）であり、Ｗは腫瘍幅（Ｌに垂直な最も長い腫瘍寸法）である）を使用してｍｍ３で表した。ＰＥＭ－ＲＬＩ２ ＮＡ ｘ１を０日目に２０ｍｇ／ｋｇでＩＶ投与し、ペムブロリズマブを０日目、３日目、６日目及び９日目に５ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与した。腫瘍観察を１８日間続けた。これと同時に、ＰＥＭ－ＲＬＩ２ ＮＡ ｘ１（Ｎ６５Ａ及びＡＱ変異を有するＩＬ－１５）を０日目に５、１０でＩＶ投与した。腫瘍観察を６日間続けた。
これらの研究の目的は、雌ｈＰＤ１シングルＫＩ ＨｕＧＥＭＭマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｐｄｃｄ１ｅｍ１（ｈＰＤＣＤ１）／Ｓｍｏｃ）（ｎ＝８マウス／群）におけるＨｕＣｅｌｌ ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞株の処置における単剤療法としてのＰＥＭ－ＲＬＩ２ ＮＡ ｘ１及びペムブロリズマブのインビボ治療有効性を評価することであった。各マウスの右下腹部に、腫瘍発生のためにＰＢＳ０．１ｍｌ中のＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞（１×１０６）を皮下接種した。平均腫瘍サイズが１０８ｍｍ３に達したときに無作為化を開始した。４０匹のマウスをこの研究に登録した。すべての動物を５つの試験群に無作為に割り当てた。無作為化は、「Ｍａｔｃｈｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ」法（ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ソフトウェア、バージョン３．１．３９９．１９）に基づいて行った。無作為化日の日付を０日目（Ｄ０）と表記した。腫瘍細胞接種後、動物の罹患率及び死亡率を毎日（又はＳｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒの裁量で、必要に応じてより頻繁に）チェックした。腫瘍体積を、キャリパーを使用して２次元で週に３回測定し、体積を、式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２（式中、Ｖは腫瘍体積であり、Ｌは腫瘍長（最も長い腫瘍寸法）であり、Ｗは腫瘍幅（Ｌに垂直な最も長い腫瘍寸法）である）を使用してｍｍ３で表した。ＰＥＭ－ＲＬＩ２ ＮＡ ｘ１を０日目に２０ｍｇ／ｋｇでＩＶ投与し、ペムブロリズマブを０日目、３日目、６日目及び９日目に５ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与した。腫瘍観察を１８日間続けた。これと同時に、ＰＥＭ－ＲＬＩ２ ＮＡ ｘ１（Ｎ６５Ａ及びＡＱ変異を有するＩＬ－１５）を０日目に５、１０でＩＶ投与した。腫瘍観察を６日間続けた。
混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
バフィーコートを健常ドナーから得た。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ勾配によって単離し、３回洗浄した。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ勾配によって単離し、３回洗浄した。ｈＰＢＭＣドナーの対を、１ｎＭの等モル濃度のペムブロリズマブ及びＰＥＭ Ｌ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１とともに６日間培養した。細胞上清中のＩＦＮγ産生を、ヒトＩＦＮ－γ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（アールアンドディ・システムズ）、番号ＤＹ２５８Ｂ）を用いて決定した。データは、ＩＦＮγ産生の相対応答［％］として表し、１２対のｈＰＢＭＣ健常ドナーからの平均±ＳＥＭを表す。
バフィーコートを健常ドナーから得た。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ勾配によって単離し、３回洗浄した。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ勾配によって単離し、３回洗浄した。ｈＰＢＭＣドナーの対を、１ｎＭの等モル濃度のペムブロリズマブ及びＰＥＭ Ｌ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１とともに６日間培養した。細胞上清中のＩＦＮγ産生を、ヒトＩＦＮ－γ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（アールアンドディ・システムズ）、番号ＤＹ２５８Ｂ）を用いて決定した。データは、ＩＦＮγ産生の相対応答［％］として表し、１２対のｈＰＢＭＣ健常ドナーからの平均±ＳＥＭを表す。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び抗ＲＬＩウエスタンブロット分析
精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び抗ＲＬＩウエスタンブロットによって分析した。
精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び抗ＲＬＩウエスタンブロットによって分析した。
クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色：タンパク質バンドは、変性条件下でそれらの分子量に従って可視化される。
簡潔に述べると、１体積のローディングバッファー（βメルカプトエタノールを含むか又は含まない）を３体積の試料に添加して分析し（次いで、１×ローディングバッファーに程度の差はあれ希釈し）、ホモジナイズし、９５℃で５分間変性させた。変性試料をＣｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸゲルにロードし、１×ＴＧＳ緩衝液中、定電圧（３００Ｖ）及び制限電流（ゲルの種類に応じてゲルあたり７５ｍＡ又は１３５ｍＡ）でランニング緩衝液中で、ゲルの種類に応じて１８分又は２１分間泳動させる。ゲルをカセットから取り出し、水中で５分間３回洗浄し、Ｂｉｏｓａｆｅ染色溶液（Ｂｉｏｒａｄ（バイオラッド））で２０分間染色し、水中で２０分間３回洗浄した後、水中で３時間最終脱染洗浄する。次いで、染色したゲルをゲルスキャナーでスキャンする。
簡潔に述べると、１体積のローディングバッファー（βメルカプトエタノールを含むか又は含まない）を３体積の試料に添加して分析し（次いで、１×ローディングバッファーに程度の差はあれ希釈し）、ホモジナイズし、９５℃で５分間変性させた。変性試料をＣｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸゲルにロードし、１×ＴＧＳ緩衝液中、定電圧（３００Ｖ）及び制限電流（ゲルの種類に応じてゲルあたり７５ｍＡ又は１３５ｍＡ）でランニング緩衝液中で、ゲルの種類に応じて１８分又は２１分間泳動させる。ゲルをカセットから取り出し、水中で５分間３回洗浄し、Ｂｉｏｓａｆｅ染色溶液（Ｂｉｏｒａｄ（バイオラッド））で２０分間染色し、水中で２０分間３回洗浄した後、水中で３時間最終脱染洗浄する。次いで、染色したゲルをゲルスキャナーでスキャンする。
ウエスタンブロット分析：次いで、ゲルをニトロセルロース膜に転写し、異なる抗体を用いたウエスタンブロット分析に使用する。移動の終わりに、そのゲルを、ニトロセルロース膜へのタンパク質転写のために使用する。参照例（Ｂｉｏｒａｄ番号１７０－４１５５、Ｔｒａｎｓ－ＢｌｏｔＲ Ｔｕｒｂｏ（商標） Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）について、転写パラメータは、２．５Ａ、２５Ｖ、７分（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルについて）又は２．５Ａ、２５Ｖ、３分（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮゲルについて）である。次いで、ｉＢｉｎｄ（商標）Ｆｌｅｘ溶液中での膜飽和後、抗体インキュベーション及び洗浄工程をｉＢｉｎｄシステム中で行う。露出後、完全に乾燥したら、分析のために膜をスキャンする。使用した一次抗体は抗ＲＬＩ２－ＰＲ０１抗体（Ｃｙｔｕｎｅ、希釈１：２５０００）であり、使用した二次抗体はロバ抗ウサギＩｇＧ－ＡＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルーズ・バイオテクノロジー）、希釈１：５０００）であった。
キャピラリー電気泳動
キャピラリー電気泳動によるタンパク質分析は、定電界中での篩マトリックスによるＬＤＳ標識タンパク質多様体の分離に依存する。Ｌａｂｃｈｉｐ ＧＸＩＩ機器は、９６ウェルプレート上にロードされたタンパク質試料を特徴付けるために単独のシッパー（ｓｉｐｐｅｒ）マイクロ流体チップを使用する。マイクロ流体チップ技術は、タンパク質試料の分離及び分析を可能にする。レーザ誘起シグナルの検出及び分析後、提供されるデータは以下のとおりである：ラダー及びマーカー較正標準を用いた相対タンパク質濃度、分子サイズ及びパーセント純度。
試料を、５μＬの試料及び３５μＬのＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓａｍｐｌｅ ＢｕｆｆｅｒをＤＴＴの存在下又は不存在下で３５ｍＭの最終濃度で混合することによって変性させる。必要であれば、試料をＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ中に１ｍｇ／ｍＬで予め希釈する。混合物を１００℃で５分間加熱することによって変性を行う。次いで、７０μＬの水を添加し、試料を２，０００ｇで１０分間遠心分離する。次いで、（９６ウェルプレート中の）試料を、チップ移入及び分析のためにＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ機器にロードする。
キャピラリー電気泳動によるタンパク質分析は、定電界中での篩マトリックスによるＬＤＳ標識タンパク質多様体の分離に依存する。Ｌａｂｃｈｉｐ ＧＸＩＩ機器は、９６ウェルプレート上にロードされたタンパク質試料を特徴付けるために単独のシッパー（ｓｉｐｐｅｒ）マイクロ流体チップを使用する。マイクロ流体チップ技術は、タンパク質試料の分離及び分析を可能にする。レーザ誘起シグナルの検出及び分析後、提供されるデータは以下のとおりである：ラダー及びマーカー較正標準を用いた相対タンパク質濃度、分子サイズ及びパーセント純度。
試料を、５μＬの試料及び３５μＬのＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓａｍｐｌｅ ＢｕｆｆｅｒをＤＴＴの存在下又は不存在下で３５ｍＭの最終濃度で混合することによって変性させる。必要であれば、試料をＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ中に１ｍｇ／ｍＬで予め希釈する。混合物を１００℃で５分間加熱することによって変性を行う。次いで、７０μＬの水を添加し、試料を２，０００ｇで１０分間遠心分離する。次いで、（９６ウェルプレート中の）試料を、チップ移入及び分析のためにＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ機器にロードする。
グリコシル化／脱アミド化変異体
ＲＬＩ２分子は、Ｎ１７６（ＲＬＩ番号付け）に主要なグリコシル化部位を有し、Ｎ１６８に次位の部位を有する。Ｎ２０９ではグリコシル化は見られない。グリカンは、複雑で、主に二分岐で、フコシル化された、ほとんどシアリル化されないＧ０～Ｇ２である。細胞培養において、約４０～５０％のタンパク質がグリコシル化され、Ｎ１６８は約５％である。上記のように精製した後、約１４～２５％のＲＬＩ２がグリコシル化されている。異なるレベルのグリコシル化は、効力、安定性に対するいかなる影響も示さず、薬物動態に対してわずかな影響しか示さず、グリコシル化ＲＬＩ２はより短い半減期を有するが、活性薬理学的成分の不均質性は、規制の観点から依然として問題がある。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されるＩＬ－１５において特定される脱アミド化のための潜在的なホットスポット（Ｎｅｌｌｉｓ、Ｍｉｃｈｉｅｌら、２０１２）は、Ｎ７７（ＩＬ－１５番号付け）／Ｎ１７４（ＲＬＩ番号付け）である。Ｎ７９のＮ－グリコシル化はＮ７７脱アミド化を部分的に妨げることが記載されている（Ｔｈａｙｓｅｎ－Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｃｈｅｒｔｏｖａら、２０１６）が、本発明者らは、実際に、質量分析において、Ｎ７７がＣＨＯ発現ＲＬＩ２において脱アミド化されることを見て、脱アミド化がＲＬＩ２及びＲＬＩベースの産物の潜在的な不均質性についての実際の問題であると特定した。それゆえ、脱アミド化は回避されるべきである。
図１Ａは、ＲＬＩ２ ｗｔ（変異なし）が実際に、約２０ｋＤａ及び２５ｋＤａの２つの主要バンド及び少数のより小さいバンドを有する不均質産物であり、すべてが抗ＲＬＩ２抗体に対して免疫反応性であり、これによりＲＬＩ２タンパク質の異なる修飾物であることを示す。
本発明者らは、グルタミンへの保存的置換が脱アミド化のリスクを解決しなかったので、Ｎ７７の脱アミド化を消失させてそれにより極性アミドを取り除くための自明なやり方としてＮ７７を変異させることを回避することを望んだ。位置Ｎ７７における潜在的な脱アミド化を消失させるために、ＲＬＩ２における単置換Ｇ７８Ａ（ＩＬ－１５番号付け）／Ｇ１７５Ａ（ＲＬＩ番号付け）を代わりに導入した（ＲＬＩ２Ａ）。脱アミド化の喪失はクーマシー染色又はウエスタンブロットでは見られなかったが、ＲＰ－ＵＰＬＣにおける主要な酸性ピーク（ｐＩ６．０）は、脱アミド化の喪失について予想されるように、ｃＩＥＦにおいて有意に減少し、これは、脱アミド化ホットスポットＮ１７４が実際に脱アミド化されたことを確認する（データは示さず）。ＰＥＭ－ＲＬＩ ＡＱ構築物の質量分析も、脱アミド化がないことを示した（データは示さず）。
驚くべきことに、Ｇ７８Ａ変異は、グリコシル化のわずかな増加をもたらし（図１Ａを参照。図１Ｂにおいてよりよく見られる）、ＲＬＩ２ ｗｔと比較してより大きい／より多くのグリコシル化された種を伴った。このような新たなグリコシル化パターンを示すさらなるバンドが現れる（図１Ｂの破線のボックス３を参照）。ＲＰ－ＵＰＬＣピークもわずかにシフトした（データは示さず）。この変化したグリコシル化パターンは、グリコシル化に対する脱アミノ化変異Ｇ７８Ａの影響が予測できなかったため、予想外であった。
ＩＬ－１５の主要グリコシル化部位を破壊するために導入されたＱ（ＲＬＩ２ＡＱ、ＲＬＩ２ＡＱ）によるＮ７９（ＩＬ－１５番号付け）／Ｎ１７６（ＲＬＩ番号付け）の追加的な置換によって、ＲＬＩ２のより大きい種の顕著な減少が観察された（図１Ｂの破線のボックス１を参照）。残余のより大きいバンド（図１Ｂの実線のボックス２を参照）は、おそらく、ＲＬＩ分子の約２０％のＮ７１（ＩＬ－１５番号付け）／Ｎ１６８（ＲＬＩ番号付け）におけるグリコシル化を表し、この分子は、ＲＬＩ２ ｗｔ及びＲＬＩ２と比較してわずかに増加しているようである。ボックス１のバンドは、Ｎ１７６でグリコシル化されたＲＬＩ２を表し得るが、ボックス３のバンドは、Ｎ１７６及びＮ１６８でグリコシル化されたＲＬＩ２を表し得る。しかしながら、ボックス３のバンドは、Ｎ１７６において好ましくないシアル酸グリカン構造を有してグリコシル化されたＲＬＩ２である可能性もある。いかなる理論にも束縛されるものではないが、Ｎ７１におけるグリコシル化のこの驚くべき増加は、主要部位Ｎ７９におけるグリコシル化が、ＲＬＩ２ ｗｔにおけるＮ７１におけるグリコシル化を立体的に妨害し、そのような妨害はＮ７９が変異されると軽減されるということを説明しる可能性がある。
まとめると、ＡＱ置換を有するＲＬＩ２ＡＱ、従ってＩＬ－１５ＡＱも、非常に改善された均質性及び脱アミド化のリスクの低減を有するＲＬＩ２、又はＩＬ－１５、多様体を表す。
ＲＬＩ多様体の生物学的活性に対するグリコシル化の効果／影響を比較するために、本発明者らは、部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン） Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＸＬ Ｋｉｔ）によって、ＩＬ－１５の３つの潜在的グリコシル化部位Ｎ７１／Ｎ７９／Ｎ１６０（ＲＬＩについてはＮ１６８／Ｎ１７６／Ｎ２０９）を特異的に不活性化した。Ｎ７１をＳで置換し、Ｎ７９をＱで置換し、Ｎ１６０をＳで置換することにより、ＲＬＩ２Ｎ１６８Ｓ／Ｎ１７６Ｑ／Ｎ２０９Ｓ及びＲＬＩ１Ｎ１６８Ｓ／Ｎ１７６Ｑ／Ｎ２０９Ｓを生成した。Ｎ７９（＝ＲＬＩのＮ１７６）における主要なＮ－グリコシル化占有を確認するために、ＲＬＩ２Ｎ１７６Ｑ変異体を作製した。ＣＨＯ細胞における一過性発現は、特有の２５ｋＤａバンドをもたらす（図２、右のペインを参照）。
主要グリコシル化部位のみで変異したＲＬＩタンパク質（ＲＬＩ２Ｎ１７６Ｑ）も、特有の２５ｋＤａバンドを示し、それゆえ、ＣＨＯにおいて発現（一過性発現）されるＲＬＩのＮ１７６残基上の主要なグリコシル化占有が確認された。一過性ＣＨＯ細胞において発現された脱グリコシル化変異体の分泌収率は、それらのグリコシル化／元の対応物と同様であった。従って、発現レベルへの脱グリコシル化の有意な影響はなかった。同じことがピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現系でも観察された（データは示さず）。
さらには、Ｎ－グリコシル化部位上のこれらの変異は、ｋｉｔ２２５又は３２Ｄβ細胞上のＲＬＩのインビトロ増殖活性に有意な影響を誘導しないようである。通常のように、すべてのＲＬＩバージョン（ＲＬＩ１又はＲＬＩ２、グリコシル化又は非グリコシル化、ＣＨＯ又はバキュロ又はピキア）は、同様に、ｋｉｔ２２５細胞株の増殖を刺激した。
ＲＬＩ２ＡＱ多様体の効力
ＩＬ－２及びＩＬ－１５の両方の活性は、Ｈｏｒｉら（１９８７）によって記載されるように、ｋｉｔ２２５細胞の増殖の誘導によって決定することができる。ｋｉｔ２２５細胞（Ｈｏｒｉ、Ｕｃｈｉｙａｍａら、１９８７）をｋｉｔ２２５基本培地中で継代し、継代４～７で効力アッセイに使用した。効力アッセイの前に、ｋｉｔ２２５細胞を、ＩＬ－２を含まないｋｉｔ２２５基本培地中で２４時間培養した（飢餓期間）。１×１０４ｋｉｔ２２５細胞を９６ウェルプレートに蒔き、ＲＬＩ－１５及びそれぞれの分子ＰＥＭ－ＲＬＩ－１５の連続希釈物を細胞に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２±３時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌ（ウェル中の体積の１０％）のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを各ウェルに添加し、６時間後、吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、６２０ｎｍ参照を用いて５６０ｎｍで測定した（１５秒間検出する前に混合を設定した）。いくつかの場合において、より低い効力のＲＬＩ２変異体を試験した場合、ｋｉｔ２２５細胞とのインキュベーションは、３日間（７２時間±３時間）から５日間に延長した。
ＩＬ－２及びＩＬ－１５の両方の活性は、Ｈｏｒｉら（１９８７）によって記載されるように、ｋｉｔ２２５細胞の増殖の誘導によって決定することができる。ｋｉｔ２２５細胞（Ｈｏｒｉ、Ｕｃｈｉｙａｍａら、１９８７）をｋｉｔ２２５基本培地中で継代し、継代４～７で効力アッセイに使用した。効力アッセイの前に、ｋｉｔ２２５細胞を、ＩＬ－２を含まないｋｉｔ２２５基本培地中で２４時間培養した（飢餓期間）。１×１０４ｋｉｔ２２５細胞を９６ウェルプレートに蒔き、ＲＬＩ－１５及びそれぞれの分子ＰＥＭ－ＲＬＩ－１５の連続希釈物を細胞に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２±３時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌ（ウェル中の体積の１０％）のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを各ウェルに添加し、６時間後、吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、６２０ｎｍ参照を用いて５６０ｎｍで測定した（１５秒間検出する前に混合を設定した）。いくつかの場合において、より低い効力のＲＬＩ２変異体を試験した場合、ｋｉｔ２２５細胞とのインキュベーションは、３日間（７２時間±３時間）から５日間に延長した。
好ましくは、例えば、ＣＴＬＬ－２細胞を使用するＳｏｍａｎら（Ｓｏｍａｎ、Ｙａｎｇら、２００９）によって記載されるように、ＩＬ－２又はＩＬ－１５刺激による増殖活性化を決定するために、比色分析又は蛍光等の方法が使用される。ｋｉｔ２２５細胞等の細胞株の代替として、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はバフィーコートを使用することができる。ＩＬ－２又はＩＬ－１５の活性を決定するための好ましいバイオアッセイは、ＳＴＡＴ５－ＲＥ ＣＴＬＬ－２細胞を使用するＩＬ－２／ＩＬ－１５ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｋｉｔバイオアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＣＳ２０１８Ｂ０３／Ｂ０７／Ｂ０５）である。
分析したＲＬＩ多様体の濃度は以下の通りであった。
ＲＬＩ２上清。 ０．１３３ｍｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡ、２回の実験からの平均）
ＲＬＩ２ＡＱ上清。 ０．０２９７ｍｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡ、２回の実験からの平均）
ＲＬＩ２上清。 ０．１３３ｍｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡ、２回の実験からの平均）
ＲＬＩ２ＡＱ上清。 ０．０２９７ｍｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡ、２回の実験からの平均）
従って、上清としてのグリコシル化変異体ＲＬＩ２ＡＱは、上清からのＲＬＩ２と比較した場合、ｋｉｔ２２５及び／又は３２Ｄｂ細胞を刺激する非常に類似した効力を示した。これは驚くべきことであった。というのは、多くの糖タンパク質についてグリコシル化の喪失はより低い活性をもたらすからである。
ＩＬ－２／ＩＬ－１５βγ受容体へのＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）結合実験においても、ＲＬＩ２とＲＬＩ ＡＱとの間のｋｏｎ速度、ｋｏｆｆ速度及び平衡定数Ｋｄにおける関連する差は観察されなかった（データは示さず）。
要約すると、ＡＱ置換を有するＲＬＩ２ＡＱ、従って同様にＩＬ－１５ＡＱは、非常に改善された均質性、脱アミド化のリスクの低減を有し、免疫細胞を活性化する同等の効力を有するＲＬＩ２、又はＩＬ－１５、多様体を表す。
高グリコシル化ＲＬＩ２及び低グリコシル化ＲＬＩ２のカニクイザルＰＫ／ＰＤ研究
高グリコシル化ＲＬＩ２及び低グリコシル化ＲＬＩ２をそれらのＰＫ及びＰＤ特性に関して比較するために、２００Ｌ規模の生産キャンペーンを実行し、Ｓ０ＳＰ及びＸ０ＳＰデプスフィルターで回収し、タンパク質をＰＰＡカラム上に捕捉した。溶媒界面活性剤処理によってウイルスを不活化し、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅカラム及びヒドロキシアパタイトＩＩ型カラム（フロースルー（素通り）モード）を介して精製を継続し、続いてナノ濾過による第２のウイルス除去工程を行った。ＲＬＩ調製物をＣａｐｔｏ Ｉｍｐｒｅｓ Ｐｈｅｎｙｌカラム（ＣＰＩ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＩＣ）上でポリッシング（最終精製）し（ｐｏｌｉｓｈｅｄ）、高グリコシル化ＲＬＩ２についての選択した画分をプールし（ＲＬＩ－１５－ＨＧ）、低グリコシル化ＲＬＩ２についての選択した画分をプールした（ＲＬＩ－１５－ＬＧ）（図５Ａ～Ｃを参照）。最後に、ＵＦＤＦ濾過を、１０ｋＤａカットオフＵＦ膜上で最終調剤緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、６％ソルビトール、ｐＨ６．５）中へ行った。ＲＬＩ－１５－ＨＧは、ＲＬＩの大部分をグリコシル化ＲＬＩ異性体の上側のバンドに示すが、ＲＬＩ－１５－ＬＧは、グリコシル化ＲＬＩ異性体のより小さな画分のみを含有する（図５Ｂ及びＣ）。
高グリコシル化ＲＬＩ２及び低グリコシル化ＲＬＩ２をそれらのＰＫ及びＰＤ特性に関して比較するために、２００Ｌ規模の生産キャンペーンを実行し、Ｓ０ＳＰ及びＸ０ＳＰデプスフィルターで回収し、タンパク質をＰＰＡカラム上に捕捉した。溶媒界面活性剤処理によってウイルスを不活化し、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅカラム及びヒドロキシアパタイトＩＩ型カラム（フロースルー（素通り）モード）を介して精製を継続し、続いてナノ濾過による第２のウイルス除去工程を行った。ＲＬＩ調製物をＣａｐｔｏ Ｉｍｐｒｅｓ Ｐｈｅｎｙｌカラム（ＣＰＩ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＩＣ）上でポリッシング（最終精製）し（ｐｏｌｉｓｈｅｄ）、高グリコシル化ＲＬＩ２についての選択した画分をプールし（ＲＬＩ－１５－ＨＧ）、低グリコシル化ＲＬＩ２についての選択した画分をプールした（ＲＬＩ－１５－ＬＧ）（図５Ａ～Ｃを参照）。最後に、ＵＦＤＦ濾過を、１０ｋＤａカットオフＵＦ膜上で最終調剤緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、６％ソルビトール、ｐＨ６．５）中へ行った。ＲＬＩ－１５－ＨＧは、ＲＬＩの大部分をグリコシル化ＲＬＩ異性体の上側のバンドに示すが、ＲＬＩ－１５－ＬＧは、グリコシル化ＲＬＩ異性体のより小さな画分のみを含有する（図５Ｂ及びＣ）。
合計３匹の雄及び３匹の雌のカニクイザルをＰＫ／ＰＤ研究に含めた。動物を、クロスオーバー投与設計に従って、毎日の皮下投与により、ＲＬＩ２をＲＬＩ－１５－ＨＧ及びＲＬ１－１５－ＬＧとして１５μｇ／ｋｇ（名目用量）で受ける２つの群に割り振った。投与は、１０日間のウォッシュアウト期間によって隔てられた４日間の２期間（２×４）にわたって行った（１日目～４日目：雄についてはＲＬＩ－１２５－ＬＧ及び雌についてはＲＬＩ－１５－ＨＧ、１５日目～１８日目：雄についてはＲＬＩ－１５－ＨＧ及び雌についてはＲＬＩ－１５－ＬＧ）。薬力学的パラメータ（ＮＫ、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞におけるＫｉ６７発現を含む）を、処置前期間、５日目、１２日目及び１９日目に収集した血液試料から分析した。薬物動態学的調査のための血液試料を、１日目及び１５日目に各処置期間における最初の投与後に、以下の時間点ですべての動物から採取した：投与前並びに投与の０．５時間、１時間、２時間、６時間、１２時間及び２４時間後。生物分析を行った。加えて、バックアップ血清試料（Ｄ１（投与前））。Ｄ１５（投与前）及びＤ１６（２４時間）を免疫原性評価（ＡＤＡ判定）に部分的に使用した。
薬物動態（ＰＫ）分析は、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェア（バージョン６．４、Ｃｅｒｔａｒａ Ｌ．Ｐ．（サターラ））でのノンコンパートメント解析を使用して実施した。
薬物動態プロファイル：１日目及び１５日目の投与後のサンプリング期間の大部分にわたって定量可能な量のＲＬＩ２を測定したので、すべての処置動物を試験項目に曝露した。主要な薬物動態パラメータを表１０に要約する。
Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０－ｔによる曝露は、雄性動物と雌性動物とで異なっていた。Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０－ｔは、雄よりも雌において約２倍高かった。この性別の違いとは無関係に、ＲＬＩ－１５－ＨＧ及びＲＬＩ－１５－ＬＧの薬物動態の差も観察された。驚くべきことに、ＲＬＩ－１５－ＨＧによる暴露は、ＲＬＩ－１５－ＬＧによる暴露よりも低かった。ＲＬＩ－１５－ＨＧとＲＬＩ－１５－ＬＧとの間の比は、動物の性別に依存せずに、Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０－ｔについてそれぞれ０．６０６及び０．４５３であった。
免疫原性を決定するためのＤＣ－Ｔ細胞ベースのアッセイ
バフィーコートを健常ドナーから得た。この血液をＰＢＳ－ＥＤＴＡで希釈し（１７５ｍＬの希釈血液を得た）、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ勾配（１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ＋３５ｍＬの希釈血液）によって単離した。ＣＤ１４＋単球を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（１７８５８、ＳｔｅｍＣｅｌｌ（ステムセル））を製造業者の説明書に従って使用して単離した。ＣＤ１４－画分を新しいファルコンチューブにピペットで移し、残りを１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次いでＣｒｙｏＳｔｏｒｅ培地に再懸濁し、凍結し、－８０℃で一時的に保存した。単離したＣＤ１４＋単球をＤＣ培地（ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦを補充したＣｅｌｌＧｒｏ）に再懸濁した。細胞を、５％ＣＯ２を用いて３７℃で５日間インキュベートし、回収し、４８ウェルプレートに播種した。ｉＤＣにタンパク質を４時間負荷（ロード）し、サイトカインカクテル（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β＋ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦ）を用いて一晩成熟させた。続いてＰＢＳ及びＴ細胞培地で４回洗浄した。細胞を自己ＣＦＳＥ染色ＣＤ４＋ Ｔ細胞と１：１０の比で共培養し（陰性磁気分離（磁選））、７日間培養した。ＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリによって検出した。
バフィーコートを健常ドナーから得た。この血液をＰＢＳ－ＥＤＴＡで希釈し（１７５ｍＬの希釈血液を得た）、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ勾配（１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ＋３５ｍＬの希釈血液）によって単離した。ＣＤ１４＋単球を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（１７８５８、ＳｔｅｍＣｅｌｌ（ステムセル））を製造業者の説明書に従って使用して単離した。ＣＤ１４－画分を新しいファルコンチューブにピペットで移し、残りを１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次いでＣｒｙｏＳｔｏｒｅ培地に再懸濁し、凍結し、－８０℃で一時的に保存した。単離したＣＤ１４＋単球をＤＣ培地（ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦを補充したＣｅｌｌＧｒｏ）に再懸濁した。細胞を、５％ＣＯ２を用いて３７℃で５日間インキュベートし、回収し、４８ウェルプレートに播種した。ｉＤＣにタンパク質を４時間負荷（ロード）し、サイトカインカクテル（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β＋ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦ）を用いて一晩成熟させた。続いてＰＢＳ及びＴ細胞培地で４回洗浄した。細胞を自己ＣＦＳＥ染色ＣＤ４＋ Ｔ細胞と１：１０の比で共培養し（陰性磁気分離（磁選））、７日間培養した。ＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリによって検出した。
実施例２：リツキシマブ（ＲＴＸ）に基づく抗ＣＤ２０免疫サイトカイン
この免疫サイトカインはリツキシマブ（ＶＨ：配列番号９６、ＶＬ：配列番号９９）に基づいた。表１１に列挙した免疫サイトカインを生成し、それらの提供されたアッセイについて試験した。
この免疫サイトカインはリツキシマブ（ＶＨ：配列番号９６、ＶＬ：配列番号９９）に基づいた。表１１に列挙した免疫サイトカインを生成し、それらの提供されたアッセイについて試験した。
ＲＴＸ－ＲＬＩ免疫サイトカインは、ＲＬＩ２と比較して低用量でインビボでの効力の増加を示し、異なるＲＴＸ－ＲＬＩ免疫サイトカインは、ＲＬＩ２を含むか若しくはＲＬＩ２ＡＱを含むかによらず、ｘ２若しくはｘ１であるかによらず、又はリンカーを伴うか若しくは伴わないかによらず、互いに同等であった。
実施例３：ホモ二量体ＲＬＩ２免疫サイトカインの産生収率の低下
免疫サイトカインをＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、プロテインＡを使用する標準的な抗体精製プロトコルを使用して精製した。簡潔には、Ｍａｂ ｓｅｌｅｃｔ ｓｕｒｅ（ＧＥ）を使用して、Ｆｃの存在に起因して免疫サイトカイン産物を捕捉した。Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓ（ＣＥＸ）を結合／溶出モードで使用して、オリゴマー化免疫サイトカイン材料及び部分的に非カップリング抗体ＲＴＸ又はＰＥＭ、並びにエンドトキシン（内毒素）及びＤＮＡ夾雑物を分離した。分取ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）を、残留するオリゴマー化ＩＣＫ非カップリング抗体を除去するために使用した。免疫サイトカインを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ３０ｋＤａを用いて２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
ＲＴＸ免疫サイトカイン（ＲＴＸ－ＩＣＫ）の上流産生は、２５ｋＤａ及び５０ｋＤａタンパク質、裸のＲＴＸ又はＲＴＸ－ＲＬＩ ｘ２（ＲＴＸ ＫｉＨ－ＲＬＩ ｘ１）、オリゴマー化したＲＴＸ－ＲＬＩを表す上清中の夾雑物の存在を生じ、２つのＲＬＩ２分子を有するホモ二量体構築物とＫｉＨ技術を使用して１つのＲＬＩ２分子を有するヘテロ二量体構築物との間で産生に差があった。ヘテロ二量体抗体形式は、重鎖の誤対合に起因してより低い発現を有することが一般に予想されるが、驚くべきことに、ヘテロ二量体免疫サイトカインについて、ＫｉＨ技術を使用するヘテロ二量体構築物は、それぞれのホモ二量体構築物と比較してより高い発現を有することが観察された。従って、最適化されていない産生収率は、ＲＴＸ－ＲＬＩ２ ｘ２（７０～１００ｍｇ／ｌ）と比較してＲＴＸ－ＲＬＩ２ ｘ１（２２０～３００ｍｇ／ｌ）について約３倍高く、ＰＥＭ－ＲＬＩ２ ｘ２（１０～２０ｍｇ／ｌ）と比較してＰＥＭ－ＲＬＩ２ ｘ１（９０～１２０ｍｇ／ｌ）について６倍といっそう高かったが、これらの最適化されていない発現において、ＩｇＧ４ ＰＥＭ構築物は、概して、ＩｇＧ１ ＲＴＸ構築物と比較してより悪い発現を有した。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本発明者らは、正確に折り畳まれたホモ二量体免疫サイトカインの発現の有意な喪失は、折り畳まれるべき抗体の各重鎖に連結された２つのＲＬＩ分子が適切な抗体折り畳み（フォールディング）を妨害することに関連していると推測する。これは、ＲＬＩ分子が互いに相互作用し、これにより、適切なホモ二量体を形成するための重鎖Ｃ末端の自由を制限する傾向を有するためである。
免疫サイトカインをＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、プロテインＡを使用する標準的な抗体精製プロトコルを使用して精製した。簡潔には、Ｍａｂ ｓｅｌｅｃｔ ｓｕｒｅ（ＧＥ）を使用して、Ｆｃの存在に起因して免疫サイトカイン産物を捕捉した。Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓ（ＣＥＸ）を結合／溶出モードで使用して、オリゴマー化免疫サイトカイン材料及び部分的に非カップリング抗体ＲＴＸ又はＰＥＭ、並びにエンドトキシン（内毒素）及びＤＮＡ夾雑物を分離した。分取ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）を、残留するオリゴマー化ＩＣＫ非カップリング抗体を除去するために使用した。免疫サイトカインを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ３０ｋＤａを用いて２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
ＲＴＸ免疫サイトカイン（ＲＴＸ－ＩＣＫ）の上流産生は、２５ｋＤａ及び５０ｋＤａタンパク質、裸のＲＴＸ又はＲＴＸ－ＲＬＩ ｘ２（ＲＴＸ ＫｉＨ－ＲＬＩ ｘ１）、オリゴマー化したＲＴＸ－ＲＬＩを表す上清中の夾雑物の存在を生じ、２つのＲＬＩ２分子を有するホモ二量体構築物とＫｉＨ技術を使用して１つのＲＬＩ２分子を有するヘテロ二量体構築物との間で産生に差があった。ヘテロ二量体抗体形式は、重鎖の誤対合に起因してより低い発現を有することが一般に予想されるが、驚くべきことに、ヘテロ二量体免疫サイトカインについて、ＫｉＨ技術を使用するヘテロ二量体構築物は、それぞれのホモ二量体構築物と比較してより高い発現を有することが観察された。従って、最適化されていない産生収率は、ＲＴＸ－ＲＬＩ２ ｘ２（７０～１００ｍｇ／ｌ）と比較してＲＴＸ－ＲＬＩ２ ｘ１（２２０～３００ｍｇ／ｌ）について約３倍高く、ＰＥＭ－ＲＬＩ２ ｘ２（１０～２０ｍｇ／ｌ）と比較してＰＥＭ－ＲＬＩ２ ｘ１（９０～１２０ｍｇ／ｌ）について６倍といっそう高かったが、これらの最適化されていない発現において、ＩｇＧ４ ＰＥＭ構築物は、概して、ＩｇＧ１ ＲＴＸ構築物と比較してより悪い発現を有した。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本発明者らは、正確に折り畳まれたホモ二量体免疫サイトカインの発現の有意な喪失は、折り畳まれるべき抗体の各重鎖に連結された２つのＲＬＩ分子が適切な抗体折り畳み（フォールディング）を妨害することに関連していると推測する。これは、ＲＬＩ分子が互いに相互作用し、これにより、適切なホモ二量体を形成するための重鎖Ｃ末端の自由を制限する傾向を有するためである。
ＫｉＨ変異及びＬ２３５Ｅ変異の両方は、ＰＥＭ－ＲＬＩ２構築物の産生収率に有意な影響を及ぼさなかったのに対して、ＹＴＥ変異は、単独で又はＬ２３５Ｅと組み合わせて、発現レベルを２倍低下させた。
実施例４：低減されたインビトロ効力のためのＩＬ－１５変異タンパク質
ＩＬ－２Ｒβ及び／又はγ受容体へのＲＬＩコンジュゲートの結合及びそれによるインビトロ効力を減少させ、ＲＬＩ２含有産物の不均質性を低減するために、変異をＲＬＩ２コンジュゲートのＩＬ－１５部分内に導入した。示したアミノ酸置換を、成熟ヒトＩＬ－１５配列において行った（表１２を参照）。
ＩＬ－２Ｒβ及び／又はγ受容体へのＲＬＩコンジュゲートの結合及びそれによるインビトロ効力を減少させ、ＲＬＩ２含有産物の不均質性を低減するために、変異をＲＬＩ２コンジュゲートのＩＬ－１５部分内に導入した。示したアミノ酸置換を、成熟ヒトＩＬ－１５配列において行った（表１２を参照）。
ＩＬ－２Ｒβ及び／又はγへの結合に影響を及ぼす試験したＩＬ－１５置換は、ｋｉｔ２２５細胞に対するＲＬＩ分子の効力を著しく低下させた。単一変異体Ｎ６５ＡはＮＱＤ三重変異体と同様の効力の低下をもたらす（表１３参照）。他の置換は、効力にわずかな影響しか及ぼさなかった。
抗体に結合しないで試験したＲＬＩ－１５変異タンパク質についても、ＮＡ変異は、ここではｋｉｔ２２５細胞でのＥＣ５０として測定して、活性の約２対数（ｌｏｇ）の減少をもたらす。
実施例５：ホモ二量体及びヘテロ二量体ＣＤ２０標的免疫サイトカインの比較
抗ＣＤ２０抗体リツキシマブに基づく免疫サイトカインは、両方の抗体重鎖のＣ末端へのＲＬＩ２ ｗｔコンジュゲートの融合（「ｘ２」）によって、又は一方の重鎖の１つのＣ末端への１つのＲＬＩ２変異タンパク質の融合（「ｘ１」）によるリツキシマブのＫｉＨ多様体を使用することによって生成した。リツキシマブ（「ＲＴＸ」）に基づく免疫サイトカインを、ｋｉｔ２２５細胞に対するそれらのインビトロ効力について試験した（実施例１及び表１５を参照）。
抗ＣＤ２０抗体リツキシマブに基づく免疫サイトカインは、両方の抗体重鎖のＣ末端へのＲＬＩ２ ｗｔコンジュゲートの融合（「ｘ２」）によって、又は一方の重鎖の１つのＣ末端への１つのＲＬＩ２変異タンパク質の融合（「ｘ１」）によるリツキシマブのＫｉＨ多様体を使用することによって生成した。リツキシマブ（「ＲＴＸ」）に基づく免疫サイトカインを、ｋｉｔ２２５細胞に対するそれらのインビトロ効力について試験した（実施例１及び表１５を参照）。
Ｃ末端に融合した２つのＲＬＩ２コンジュゲートを有するホモ二量体ＲＴＸ－ＲＬＩ ２ｘ免疫サイトカインは、効力のわずかな減少を有したのに対して、１つのＲＬＩ２コンジュゲートのみを有するヘテロ二量体免疫サイトカインは、ｋｉｔ２２５細胞に対する効力の約１０倍の低下を示した。
同様の活性が、インビトロでの７日間の刺激後にｈＮＫ細胞ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化（Ｋｉ６７＋細胞）に対して観察された。
ｋｉｔ２２５に対する免疫サイトカインの効力は、活性化ヒトＮＫ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋メモリーＴ細胞に対する免疫サイトカインの効力と相関することができる。ＲＴＸ－ＲＬＩ２ ｘ１のみが約３倍の低下を有した。
実施例６：リツキシマブに基づく抗ＣＤ２０免疫サイトカインのＰＤ活性
免疫サイトカインを、健常Ｂａｌｂ／ｃマウス（２匹のマウス／群）に１日目にＩＶ投与した等モル用量のＲＴＸ－ＩＣＫの投与の後の脾臓由来の免疫細胞に対するＰＤ活性について試験した。ＲＬＩ２を２０μｇ／マウスで４連続日（１日目～４日目）に毎日ＳＣ注射した。免疫細胞集団の活性化を、フローサイトメトリによって５日目に検出した。以下の抗体（表１７）をＰＤ試験（マウス）に使用した。
免疫サイトカインを、健常Ｂａｌｂ／ｃマウス（２匹のマウス／群）に１日目にＩＶ投与した等モル用量のＲＴＸ－ＩＣＫの投与の後の脾臓由来の免疫細胞に対するＰＤ活性について試験した。ＲＬＩ２を２０μｇ／マウスで４連続日（１日目～４日目）に毎日ＳＣ注射した。免疫細胞集団の活性化を、フローサイトメトリによって５日目に検出した。以下の抗体（表１７）をＰＤ試験（マウス）に使用した。
インビボでＲＴＸ－ＲＬＩ２ ｘ２、ＲＴＸ－ＲＬＩ ＡＱ ｘ２及びＲＴＸ－Ｌ４０－ＲＬＩ２ ｘ２の間にＰＤ活性の差はなかった（図１５）。等モル量のＲＴＸ－ＲＬＩ２ ｘ１のＰＤ活性は、たった１つのＲＬＩ２分子／抗体に起因してより低かったが、二重のＲＴＸ－ＲＬＩ ｘ２分子と比較して、免疫細胞の相対数において約２０～３０％少ないに過ぎなかった。
実施例７：インビボでのＲｅｎｃａマウス転移モデルにおけるリツキシマブに基づく抗ＣＤ２０免疫サイトカインの抗転移活性
等モル用量での抗ＣＤ２０免疫サイトカインの抗転移活性を、Ｂａｌｂ／ｃマウスのＲｅｎｃａ腎細胞癌転移モデルにおいて試験した。３μｇ／用量のＩＣＫを１日目（Ｄ１）にＩＶ注射し、１６日目に肺を採取し、肺湿重量を測定した。
等モル用量での抗ＣＤ２０免疫サイトカインの抗転移活性を、Ｂａｌｂ／ｃマウスのＲｅｎｃａ腎細胞癌転移モデルにおいて試験した。３μｇ／用量のＩＣＫを１日目（Ｄ１）にＩＶ注射し、１６日目に肺を採取し、肺湿重量を測定した。
インビボで、ＲＴＸ－ＲＬＩ２ＡＱ ｘ２、ＲＴＸ－ＲＬＩ２ＡＱ ｘ２、ＲＴＸ－Ｌ４０－ＲＬＩ２ＡＱ ｘ２及びＲＴＸ－ＲＬＩ２ＡＱ ｘ１の間でＲＬＩ２ＡＱ部分の抗転移活性において有意差は観察されなかった（図１６）。３μｇ／用量の単回注射は、対照と比較して転移の３０～４０％の減少をもたらした。
実施例８：Ａ２０－ｈＣＤ２０／Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける抗ＣＤ２０ ＲＴＸ－ＲＬＩ２ＡＱ免疫サイトカインの抗腫瘍有効性
ＲＴＸ－ＲＬＩ２ＡＱ ｘ２免疫サイトカインの抗腫瘍有効性を、Ａ２０－ｈＣＤ２０腫瘍細胞株（ＣｒｏｗｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（クラウン・バイオサイエンス）、米国）をｓ．ｃ．移植したＢａｌｂ／ｃマウスにおいて試験した。マウスを、ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ動物管理ソフトウェアパッケージ（ｖ３．０、ＳｔｕｄｙＬｏｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（スタディログ・システムズ）、米国）によって提供されるマッチした分布関数を使用して腫瘍体積に基づいて処置群に無作為化して、１日目に群間及び群内の最小量のばらつきを達成した。ＲＴＸ－ＲＬＩ２ＡＱ ｘ２を０．１５ｍｇ／ｋｇで１日目及び８日目に投与し、ＲＬＩ２を１ｍｇ／ｋｇで１～４日目の４連続日に投与した。腫瘍体積を、研究期間中週２回測定し、測定を、キャリパーを使用して２次元で行い、体積を、式「Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２」（式中、Ｖは腫瘍体積であり、Ｌは腫瘍長（最も長い腫瘍寸法）であり、Ｗは腫瘍幅（Ｌに垂直な最も長い腫瘍寸法）である）を使用してｍｍ３で表した。
ＲＴＸ－ＲＬＩ２ＡＱ ｘ２免疫サイトカインの抗腫瘍有効性を、Ａ２０－ｈＣＤ２０腫瘍細胞株（ＣｒｏｗｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（クラウン・バイオサイエンス）、米国）をｓ．ｃ．移植したＢａｌｂ／ｃマウスにおいて試験した。マウスを、ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ動物管理ソフトウェアパッケージ（ｖ３．０、ＳｔｕｄｙＬｏｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（スタディログ・システムズ）、米国）によって提供されるマッチした分布関数を使用して腫瘍体積に基づいて処置群に無作為化して、１日目に群間及び群内の最小量のばらつきを達成した。ＲＴＸ－ＲＬＩ２ＡＱ ｘ２を０．１５ｍｇ／ｋｇで１日目及び８日目に投与し、ＲＬＩ２を１ｍｇ／ｋｇで１～４日目の４連続日に投与した。腫瘍体積を、研究期間中週２回測定し、測定を、キャリパーを使用して２次元で行い、体積を、式「Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２」（式中、Ｖは腫瘍体積であり、Ｌは腫瘍長（最も長い腫瘍寸法）であり、Ｗは腫瘍幅（Ｌに垂直な最も長い腫瘍寸法）である）を使用してｍｍ３で表した。
ＲＴＸ－ＲＬＩ２ＡＱ ｘ２の２回のｉ．ｖ．注射は、対照と比較した場合、Ａ２０－ｈＣＤ２０／ｂａｌｂｃマウス腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍効力を示した。ＲＴＸ－ＲＬＩ免疫サイトカインと比較して、ほぼ１０倍高い用量（又はこの免疫サイトカインの分子量が大きいために、さらに高い匹敵する等モル用量）で４回投与した場合、ＲＬＩ２について同様の有効性が示された（図１７）。
実施例９：リツキシマブ単独と比較したリツキシマブに基づく抗ＣＤ２０免疫サイトカインのＡＤＣＣ活性
Ｄａｕｄｉ細胞株を、ＮＫ９２－ＣＤ１６細胞を伴って又は伴わずに、示した濃度のＲＴＸ及びＲＴＸ－ＲＬＩ２分子とともにインキュベートした。Ｄａｕｄｉ細胞死をＤＡＰＩ陽性細胞のパーセンテージとして評価し、フローサイトメトリによって検出した。
Ｄａｕｄｉ細胞株を、ＮＫ９２－ＣＤ１６細胞を伴って又は伴わずに、示した濃度のＲＴＸ及びＲＴＸ－ＲＬＩ２分子とともにインキュベートした。Ｄａｕｄｉ細胞死をＤＡＰＩ陽性細胞のパーセンテージとして評価し、フローサイトメトリによって検出した。
ウェルあたり４×１０４個のＤａｕｄｉ腫瘍細胞（ＣＤ２０を発現するＢ細胞リンパ腫）を９６ウェルプレートに播種した。ＮＫ９２－ＣＤ１６細胞を、ＲＴＸ－ＲＬＩ２ＡＱ分子の連続希釈物（濃度０．００１、０．０１、０．１、１、１０及び１００ｎＭ）とともに１：５の比で添加した。細胞を加湿５％ＣＯ２中、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ＮＫ細胞及び腫瘍細胞の識別のためのＣＤ５６－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、ＣＤ１９－ＰＥ抗体、並びに死んだ腫瘍細胞（ＣＤ１９＋ＤＡＰＩ＋細胞）を特定するためのＤＡＰＩで染色し、フローサイトメトリによって分析した。
ＲＴＸ－ＲＬＩ２ＡＱ分子のＡＤＣＣ活性は、リツキシマブ対照よりもわずかに低かった。しかしながら、ＲＴＸ－ＲＬＩ ＡＱ及びＲＴＸ－ＲＬＩ １ｘのそれぞれ７０％又は８０％と比較して、リツキシマブ単独のＡＤＣＣ活性によって細胞の６０％しか死滅しなかった（図１８）。
実施例１０：ＰＤ－１標的免疫サイトカインにおけるＩＬ－１５ Ｎ６５Ａ変異はｋｉｔ２２５細胞に対する効力の低下を示す
抗ＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブに基づく免疫サイトカインを様々な形式で生成した。ペムブロリズマブは、抗体のＦｃ部分に安定化Ｓ２２８Ｐ変異を有するヒト化ＩｇＧ４－κ抗体である。免疫サイトカインにおける使用のためにこの構築物を改善するために、ペムブロリズマブ（「ＰＥＭ」）のバリエーションを試験した。ＩｇＧ４抗体クラスは比較的低いＡＤＣＣ活性を有するということが公知であるが、Ｌ２３５Ｅ変異（Ａｌｅｇｒｅ、Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９２）（「ＬＥ」）を、ＡＤＣＣをさらに低下させるために導入した（配列番号４３）。免疫原性／抗薬物抗体の潜在的可能性を制限するために、より複雑なＡＤＣＣ不活性化変異を回避した。１つ又は２つのＲＬＩ２分子を、ＰＥＭ抗体のＣ末端に遺伝的に融合させた。ホモ二量体ＰＥＭ多様体（「ｘ２」）の場合、１つのＲＬＩ２分子を各重鎖に融合させたのに対し、ヘテロ二量体ＰＥＭ多様体（「ｘ１」）は、ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ（ＫｉＨ）技術（Ｅｌｌｉｏｔｔ、Ｕｌｔｓｃｈら、２０１４）を用いて作製し、１つのＲＬＩ２分子は、Ｔ３３６Ｗ置換を有するｋｎｏｂ重鎖（配列番号４１）に融合したのに対し、ｈｏｌｅ重鎖（ＲＬＩ２融合を有さない）は、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ置換を含んでいた（配列番号４２）。ＲＬＩ２を重鎖に融合させた場合、産物の不均質性を低減するために末端リジン（Ｋ）を欠失させた（「ｄＫ」）。さらに、異なるＲＬＩ２変異タンパク質を使用して、抗体の重鎖に融合させた。すべてのＲＬＩ２分子は、産物の不均質性を低減するためのＡＱ（Ｇ７８Ａ／Ｎ７９Ｑ）置換を有し、ＩＬ－２／ＩＬ－１５ＲβγへのＲＬＩ２の結合を低下させる以下の置換をＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカインにおいて試験した：ＤＡ、ＮＡ、ＮＤ、ＡＤ（Ｋ１０Ａ Ｑ１０１Ｄ）及びＮＱＤ。作製したＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカインを表１８、左列に列挙する。
抗ＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブに基づく免疫サイトカインを様々な形式で生成した。ペムブロリズマブは、抗体のＦｃ部分に安定化Ｓ２２８Ｐ変異を有するヒト化ＩｇＧ４－κ抗体である。免疫サイトカインにおける使用のためにこの構築物を改善するために、ペムブロリズマブ（「ＰＥＭ」）のバリエーションを試験した。ＩｇＧ４抗体クラスは比較的低いＡＤＣＣ活性を有するということが公知であるが、Ｌ２３５Ｅ変異（Ａｌｅｇｒｅ、Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９２）（「ＬＥ」）を、ＡＤＣＣをさらに低下させるために導入した（配列番号４３）。免疫原性／抗薬物抗体の潜在的可能性を制限するために、より複雑なＡＤＣＣ不活性化変異を回避した。１つ又は２つのＲＬＩ２分子を、ＰＥＭ抗体のＣ末端に遺伝的に融合させた。ホモ二量体ＰＥＭ多様体（「ｘ２」）の場合、１つのＲＬＩ２分子を各重鎖に融合させたのに対し、ヘテロ二量体ＰＥＭ多様体（「ｘ１」）は、ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ（ＫｉＨ）技術（Ｅｌｌｉｏｔｔ、Ｕｌｔｓｃｈら、２０１４）を用いて作製し、１つのＲＬＩ２分子は、Ｔ３３６Ｗ置換を有するｋｎｏｂ重鎖（配列番号４１）に融合したのに対し、ｈｏｌｅ重鎖（ＲＬＩ２融合を有さない）は、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ置換を含んでいた（配列番号４２）。ＲＬＩ２を重鎖に融合させた場合、産物の不均質性を低減するために末端リジン（Ｋ）を欠失させた（「ｄＫ」）。さらに、異なるＲＬＩ２変異タンパク質を使用して、抗体の重鎖に融合させた。すべてのＲＬＩ２分子は、産物の不均質性を低減するためのＡＱ（Ｇ７８Ａ／Ｎ７９Ｑ）置換を有し、ＩＬ－２／ＩＬ－１５ＲβγへのＲＬＩ２の結合を低下させる以下の置換をＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカインにおいて試験した：ＤＡ、ＮＡ、ＮＤ、ＡＤ（Ｋ１０Ａ Ｑ１０１Ｄ）及びＮＱＤ。作製したＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカインを表１８、左列に列挙する。
準備したＩＬ－１５置換を有するいくつかのホモ二量体又はヘテロ二量体のＰＥＭ－ＲＬＩ２ＡＱ免疫サイトカインの効力を、ＲＬＩ２を標準として使用し相対的効力について１００％に設定して、ｋｉｔ２２５細胞におけるインビトロＥＣ５０を測定することによって比較した（表１８）。目的は、ｋｉｔ２２５細胞においてＲＬＩ２の最も効力が低い変異タンパク質を特定することであった。示した結果は、２～５回の実験の平均である。
ＰＥＭ－ＲＬＩ－ＮＡ ｘ１内のＲＬＩ２ＡＱＮＡは、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγを低下させる単一変異を有する最も効力が低いＲＬＩ変異タンパク質として特定され、これは、３つのアミノ酸置換を有するＮＱＤ変異よりも依然として約１０倍活性であり、これにより、免疫原性の比較的高いリスクを有する。
ヘテロ二量体ＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカインを、還元条件下及び非還元条件下でキャピラリー電気泳動によって分析した（図１）。すべての免疫サイトカインは高い純度を示し、抗体重鎖、重鎖＋ＲＬＩ（ＨＣ－ＲＬＩ）及び軽鎖が明確に分離していた。ＨＣ－ＲＬＩバンドのすぐ上のかすかなバンドは、重鎖上のグリコシル化ＲＬＩを表す。驚くべきことに、グリコシル化は、ＮＡ変異体に関して低減されるようであった。
実施例１１：Ｆｃ多様体（ＬＥ、ＹＴＥ又はＬＥ－ＹＴＥ）を有するＰＥＭ－ＲＬＩ ｘ１又はＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１分子はインビトロでｋｉｔ２２５細胞に対するそれらの効力に差異を示さない
ＡＤＣＣを低下させる（ＬＥ置換）か、又は増加したＦｃＲｎ結合を介してインビボ半減期を増加させる（ＹＴＥ置換）か、又は両方の組み合わせ（ＬＥ－ＹＴＥ）を持つように設計されたＦｃ多様体を有するいくつかのヘテロ二量体ＰＥＭ－ＲＬＩ ｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１の効力を、ｋｉｔ２２５細胞を使用してＥＣ５０を決定することによってインビトロで比較し（表１９）、ＲＬＩ２を標準として使用し、相対的効力について１００％に設定した。データは２回の実験の平均を表す。
ＡＤＣＣを低下させる（ＬＥ置換）か、又は増加したＦｃＲｎ結合を介してインビボ半減期を増加させる（ＹＴＥ置換）か、又は両方の組み合わせ（ＬＥ－ＹＴＥ）を持つように設計されたＦｃ多様体を有するいくつかのヘテロ二量体ＰＥＭ－ＲＬＩ ｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１の効力を、ｋｉｔ２２５細胞を使用してＥＣ５０を決定することによってインビトロで比較し（表１９）、ＲＬＩ２を標準として使用し、相対的効力について１００％に設定した。データは２回の実験の平均を表す。
ＲＬＩコンジュゲート中にＩＬ－１５不活性化ＮＡ変異を有さないＲＬＩ２ＡＱとのヘテロ二量体融合物におけるＰＥＭのＦｃ多様体（ＰＥＭ－ＬＥ、ＹＴＥ、又はＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ｘ１）は、ｋｉｔ２２５に対してＰＥＭ－ＲＬＩ ｘ１と同様の効力を実証した。同様に、ＲＬＩコンジュゲート中に不活性化ＩＬ－１５ ＮＡ変異を有するすべての比較した構築物は、試験したＦｃ多様体によらず、ｋｉｔ２２５細胞に対して同様の（低下した）効力を示した。従って、抗体Ｆｃ領域における試験した変異は、ＰＥＭ－ＲＬＩ構築物の効力に影響を及ぼさなかった。
実施例１２：インビトロでのｋｉｔ２２５に対する効力におけるＰＥＭ ＬＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１、ＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＱＤ ｘ１分子の評価
２つのバッチから選択したＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカイン構築物を、ｋｉｔ２２５細胞を用いて、インビトロでＲＬＩ２と比較して効力に関して比較した。分子の効力をＥＣ５０として評価し、ＲＬＩ２分子に関連する相対的効力としても計算した。データは１つの実験を表す。表２０に示すように、ｋｉｔ２２５細胞に対するＥＣ５０を決定することによって測定した試験免疫サイトカインの効力に関して、高いバッチ間の一貫性が観察された。
２つのバッチから選択したＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカイン構築物を、ｋｉｔ２２５細胞を用いて、インビトロでＲＬＩ２と比較して効力に関して比較した。分子の効力をＥＣ５０として評価し、ＲＬＩ２分子に関連する相対的効力としても計算した。データは１つの実験を表す。表２０に示すように、ｋｉｔ２２５細胞に対するＥＣ５０を決定することによって測定した試験免疫サイトカインの効力に関して、高いバッチ間の一貫性が観察された。
実施例１３：インビトロでのｋｉｔ２２５及びｈＰＢＭＣに対する効力におけるＰＥＭ ＬＥ－ＲＬＩ ＮＡｘ１、ＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＱＤ ｘ１分子の比較
ＬＥ／ＹＴＥ Ｆｃ修飾を伴って又は伴わずに、１つ又は２つのＲＬＩ２分子を保有する選択したＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカイン構築物（ＰＥＭ－ＲＬＩ）。示したＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカインを、インビトロで７日間、６人の健常ドナー由来のヒトＰＢＭＣの刺激のために様々な濃度で使用した。ヒトＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する効力を、ｋｉｔ２２５細胞に対する効力と比較した（表２１参照）。
驚くべきことに、Ｎ６５Ａ ＩＬ－１５変異体（「ＮＡ」）については、インビトロでのｋｉｔ２２５におけるヒトＮＫ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化に関して、１つ又は２つのＲＬＩ２分子を保有する分子（ｘ１及びｘ２免疫サイトカインを比較する）の効力の差は観察されなかった。他の実験から既知であるとおり、抗体のＦｃ部分におけるＬＥ／ＹＴＥは、融合ＲＬＩ分子の効力に影響を及ぼさない。ＩＬ－１５ ＮＱＤ変異タンパク質を含有する免疫サイトカインは、約１０倍のさらなる低下した効力を有した。ヒトＰＢＭＣ効力データは６人のドナーの平均である。ｋｉｔ２２５データは２～３回の実験の平均である。
ＬＥ／ＹＴＥ Ｆｃ修飾を伴って又は伴わずに、１つ又は２つのＲＬＩ２分子を保有する選択したＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカイン構築物（ＰＥＭ－ＲＬＩ）。示したＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカインを、インビトロで７日間、６人の健常ドナー由来のヒトＰＢＭＣの刺激のために様々な濃度で使用した。ヒトＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する効力を、ｋｉｔ２２５細胞に対する効力と比較した（表２１参照）。
驚くべきことに、Ｎ６５Ａ ＩＬ－１５変異体（「ＮＡ」）については、インビトロでのｋｉｔ２２５におけるヒトＮＫ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化に関して、１つ又は２つのＲＬＩ２分子を保有する分子（ｘ１及びｘ２免疫サイトカインを比較する）の効力の差は観察されなかった。他の実験から既知であるとおり、抗体のＦｃ部分におけるＬＥ／ＹＴＥは、融合ＲＬＩ分子の効力に影響を及ぼさない。ＩＬ－１５ ＮＱＤ変異タンパク質を含有する免疫サイトカインは、約１０倍のさらなる低下した効力を有した。ヒトＰＢＭＣ効力データは６人のドナーの平均である。ｋｉｔ２２５データは２～３回の実験の平均である。
実施例１４：インビトロでのｋｉｔ２２５細胞におけるＨＣ又はＬＣに結合した低効力ＰＥＭ－ＲＬＩ変異体の評価
変異Ｆｃ抗体部分（ＬＥ－ＹＴＥ）を有する又は有さないＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカインにおけるいくつかの低効力ＩＬ－１５変異タンパク質を、参照としてのＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ２ ＮＡ ｘ１と比較して、それらの効力に関して比較した。「Ｌｃ」免疫サイトカインでは、ＲＬＩコンジュゲートを抗体の軽鎖のＣ末端に融合した（が、他のすべての構築物は両方の重鎖の一方のＣ末端に融合したＲＬＩコンジュゲートを有する）。インビトロ効力試験は、変更したプロトコル（長期細胞インキュベーション）でｋｉｔ２２５細胞株を使用して達成した。分子の効力をＥＣ５０として評価し、ＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１分子に対する相対的効力としても計算した。表２２のデータは２～４回の実験の平均を表す。
変異Ｆｃ抗体部分（ＬＥ－ＹＴＥ）を有する又は有さないＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカインにおけるいくつかの低効力ＩＬ－１５変異タンパク質を、参照としてのＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ２ ＮＡ ｘ１と比較して、それらの効力に関して比較した。「Ｌｃ」免疫サイトカインでは、ＲＬＩコンジュゲートを抗体の軽鎖のＣ末端に融合した（が、他のすべての構築物は両方の重鎖の一方のＣ末端に融合したＲＬＩコンジュゲートを有する）。インビトロ効力試験は、変更したプロトコル（長期細胞インキュベーション）でｋｉｔ２２５細胞株を使用して達成した。分子の効力をＥＣ５０として評価し、ＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１分子に対する相対的効力としても計算した。表２２のデータは２～４回の実験の平均を表す。
置換の組み合わせＱＤＱＡ（Ｑ１０１Ｄ／Ｑ１０８Ａ）、ＮＱＤ（Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ）、ＤＡＮＡ（Ｄ６１Ａ／Ｎ６５Ａ）及びＤＡＮＡＱＤ（Ｄ６１Ａ／Ｎ６５Ａ／Ｑ１０１Ｄ）は、ＤＡＮＡＱＤ構築物について測定不可能になるまでＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカイン構築物の効力をさらに低下させた。抗体の軽鎖に融合したＲＬＩコンジュゲートを有する免疫サイトカインは、抗体の一方の重鎖上に同じＩＬ－１５変異を有する１つのみのＲＬＩコンジュゲートを有する構築物と比較して、同様の効力を示した。
実施例１５：変異Ｆｃ部分を有する又は有さない低効力変異体の比較
目的は、変異Ｆｃ抗体部分（ＬＥ－ＹＴＥ）を伴う又は伴わないＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１よりも効力の低いいくつかの変異タンパク質の効力を評価し比較することであった。これらの分子は、ペムブロリズマブ（ＩｇＧ４）及びＲＬＩ－１５の融合タンパク質（ＰＥＭ－ＲＬＩ－１５）である。ＲＬＩ２を標準として使用した。インビトロ効力試験は、ｋｉｔ２２５細胞株を用いて達成した。分子の効力をＥＣ５０として評価し、裸のＲＬＩ－１５分子に関連する相対的効力としても計算した。データは、３．５日又は７日のｋｉｔ２２５増殖後のいくつかの実験の平均を表す。
目的は、変異Ｆｃ抗体部分（ＬＥ－ＹＴＥ）を伴う又は伴わないＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１よりも効力の低いいくつかの変異タンパク質の効力を評価し比較することであった。これらの分子は、ペムブロリズマブ（ＩｇＧ４）及びＲＬＩ－１５の融合タンパク質（ＰＥＭ－ＲＬＩ－１５）である。ＲＬＩ２を標準として使用した。インビトロ効力試験は、ｋｉｔ２２５細胞株を用いて達成した。分子の効力をＥＣ５０として評価し、裸のＲＬＩ－１５分子に関連する相対的効力としても計算した。データは、３．５日又は７日のｋｉｔ２２５増殖後のいくつかの実験の平均を表す。
実施例１６：ペムブロリズマブの機能性は、ＲＬＩ２又はＲＬＩ２変異タンパク質の融合によっても、抗体のＦｃ修飾によっても影響されない
ペムブロリズマブの抗ＰＤ－１抗体誘導体の機能性を、生物発光細胞ベースのアッセイ「ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ」（Ｊ１２５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用説明書に従って使用してＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断を測定することによって決定した。示したＰＥＭ ＲＬＩ免疫サイトカインを試験して、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するそれらの活性に関するそれらの効力を評価した（表２４参照）。試験した免疫サイトカイン間で有意差は観察されなかった。それゆえ、免疫サイトカインのＰＥＭ部分の機能性（ＰＤ－１遮断）は、結合したＲＬＩ２分子の数、ＲＬＩ２コンジュゲートにおける変異又は抗体のＦｃ部分における変異とは無関係に保存されている。
ペムブロリズマブの抗ＰＤ－１抗体誘導体の機能性を、生物発光細胞ベースのアッセイ「ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ」（Ｊ１２５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用説明書に従って使用してＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断を測定することによって決定した。示したＰＥＭ ＲＬＩ免疫サイトカインを試験して、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するそれらの活性に関するそれらの効力を評価した（表２４参照）。試験した免疫サイトカイン間で有意差は観察されなかった。それゆえ、免疫サイトカインのＰＥＭ部分の機能性（ＰＤ－１遮断）は、結合したＲＬＩ２分子の数、ＲＬＩ２コンジュゲートにおける変異又は抗体のＦｃ部分における変異とは無関係に保存されている。
実施例１７：ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１免疫サイトカインはマウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍有効性を示す
ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１免疫サイトカインのインビボ治療有効性を、雌ヒトＰＤ－１シングルＫＩ ＨｕＧＥＭＭマウス（ｎ＝８マウス／群）におけるＨｕＣｅｌｌ ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍の処置における単剤療法としてのペムブロリズマブと比較した。無作為化０日目に平均腫瘍サイズが１０８ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１を０日目に２０ｍｇ／ｋｇでＩＶ投与し、ペムブロリズマブを０日目、３日目、６日目及び９日目に５ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与した。
ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１免疫サイトカインのインビボ治療有効性を、雌ヒトＰＤ－１シングルＫＩ ＨｕＧＥＭＭマウス（ｎ＝８マウス／群）におけるＨｕＣｅｌｌ ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍の処置における単剤療法としてのペムブロリズマブと比較した。無作為化０日目に平均腫瘍サイズが１０８ｍｍ３に達した時点で処置を開始した。ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１を０日目に２０ｍｇ／ｋｇでＩＶ投与し、ペムブロリズマブを０日目、３日目、６日目及び９日目に５ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与した。
ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１は、対照未処置群と比較して（ｐ値は＜０．０５であった）、及びペムブロリズマブ処置群と同様に、このモデルにおいて腫瘍体積を強く減少させた（図７を参照）。免疫サイトカインについては、ペムブロリズマブとの顕著な差異は見られなかったが、免疫サイトカインの単回注射は、ペムブロリズマブの４回の投与と同様の結果を達成したことに留意されたい。さらに、マウスはＲＬＩに対して約１０倍低い感受性であることが公知であるので、ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１の完全な機能性は、このマウスモデルにおいて試験することができず、従って、ヒトにおける処置効果はより良好であると予想される。
実施例１８：ＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１分子は混合リンパ球反応におけるＩＦＮ－γ産生をペムブロリズマブ及びＲＬＩ－１５単剤療法よりも増強する
ＰＥＭ－ＲＬＩ構築物がＴ細胞活性化及びＩＦＮγ産生を増強する潜在能力を評価するために、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）を採用した。ＭＬＲは、同じ種の２人の遺伝的に異なる個体由来の白血球を共培養して、細胞幼若化（細胞芽球形質転換、ｃｅｌｌ ｂｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＤＮＡ合成及び増殖をもたらすインビトロアッセイである。ＭＬＲの生成は、細胞集団の表面上に発現され、主要組織適合性複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）によってコードされる同種決定因子の不適合性の結果として生じる。
ＰＥＭ－ＲＬＩ構築物がＴ細胞活性化及びＩＦＮγ産生を増強する潜在能力を評価するために、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）を採用した。ＭＬＲは、同じ種の２人の遺伝的に異なる個体由来の白血球を共培養して、細胞幼若化（細胞芽球形質転換、ｃｅｌｌ ｂｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＤＮＡ合成及び増殖をもたらすインビトロアッセイである。ＭＬＲの生成は、細胞集団の表面上に発現され、主要組織適合性複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）によってコードされる同種決定因子の不適合性の結果として生じる。
ＩＦＮγ産生を介したＴ細胞活性化を、インビトロでのＭＬＲアッセイにおいて、ＰＥＭ ＲＬＩ－ＮＡ ｘ２、ＰＥＭ ＲＬＩ－ＮＱＤ ｘ１、ＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ ＹＴＥ－ＲＬＩ ｘ１分子について評価した。ＰＥＭ－ＲＬＩ構築物をＲＬＩ２及びペムブロリズマブと比較した。対応する対照としてはるかに適していると思われる、抗体に融合されていないそれぞれのＲＬＩ－１５変異タンパク質は、本研究の時点では入手できなかった。
ミスマッチのヒトＰＢＭＣドナー対をＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１（１０００ｎＭ）とインキュベートした場合、等モル量のペムブロリズマブと比較してＩＦＮγ産生が増加し、調整したＲＬＩ２濃度は３００倍低下し、ＲＬＩ２ ＮＡ変異タンパク質の効力に等しくなった。データは、ペムブロリズマブ及びＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１については６つのドナー対の、ＲＬＩ２については３つのドナー対の平均±ＳＥを表す（図８を参照）。
ミスマッチのヒトＰＢＭＣドナー対をＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１（１０００ｎＭ）とインキュベートした場合、等モル量のペムブロリズマブと比較してＩＦＮγ産生が増加し、調整したＲＬＩ２濃度は３００倍低下し、ＲＬＩ２ ＮＡ変異タンパク質の効力に等しくなった。データは、ペムブロリズマブ及びＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１については６つのドナー対の、ＲＬＩ２については３つのドナー対の平均±ＳＥを表す（図８を参照）。
実施例１９：ＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１分子はＰＥＭ－ＲＬＩ ｗｔ ｘ１分子より長いインビボ半減期を示し、これは高いＰＤ活性と相関する
ＰＥＭ－ＲＬＩ ｘ１及びＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１の薬物動態を、カニクイザル（ｎ＝２）において、１日目及び１５日目にそれぞれ１０又は３０μｇ／ｋｇ（ＰＥＭ－ＲＬＩ ｘ１）及び３０又は９０μｇ／ｋｇ（ＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１）の投与後に試験した。血清分離のための血液を、１時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間、９６時間、１２０時間及び１６８時間に採取した。血清中のＰＥＭ－ＲＬＩ ｘ１及びＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。選択した免疫細胞集団（ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖 － Ｋｉ６７＋、リンパ球数）のフローサイトメトリ評価のための血液を投与前、５日目、８日目、１２日目、１５日目、１９日目、２２日目及び２６日目に採取した。
ＩＬ－２／１５Ｒβγに対して低下したＲＬＩ－１５親和性を有するＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬ１ ＮＡ ｘ１分子は、カニクイザルにおけるＩＶ投与後にＰＥＭ－ＲＬ１ ｘ１に対して有意に延長された半減期を示した（図９Ａ）。リンパ球の数の増加（図９Ｂ）並びにＫｉ６７陽性によって決定したＮＫ細胞（図９Ｃ）及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（図９Ｄ）の増殖の増加によって示されるように、ＩＬ－２Ｒβγに対する親和性が著しく減少し効力が著しく減少したＲＬＩ変異タンパク質を有するＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１分子は、ＰＥＭ抗体との融合物において高いＰＤ活性を保持した（図９）。
ＰＥＭ－ＲＬＩ ｘ１及びＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１の薬物動態を、カニクイザル（ｎ＝２）において、１日目及び１５日目にそれぞれ１０又は３０μｇ／ｋｇ（ＰＥＭ－ＲＬＩ ｘ１）及び３０又は９０μｇ／ｋｇ（ＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１）の投与後に試験した。血清分離のための血液を、１時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間、９６時間、１２０時間及び１６８時間に採取した。血清中のＰＥＭ－ＲＬＩ ｘ１及びＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。選択した免疫細胞集団（ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖 － Ｋｉ６７＋、リンパ球数）のフローサイトメトリ評価のための血液を投与前、５日目、８日目、１２日目、１５日目、１９日目、２２日目及び２６日目に採取した。
ＩＬ－２／１５Ｒβγに対して低下したＲＬＩ－１５親和性を有するＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬ１ ＮＡ ｘ１分子は、カニクイザルにおけるＩＶ投与後にＰＥＭ－ＲＬ１ ｘ１に対して有意に延長された半減期を示した（図９Ａ）。リンパ球の数の増加（図９Ｂ）並びにＫｉ６７陽性によって決定したＮＫ細胞（図９Ｃ）及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（図９Ｄ）の増殖の増加によって示されるように、ＩＬ－２Ｒβγに対する親和性が著しく減少し効力が著しく減少したＲＬＩ変異タンパク質を有するＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１分子は、ＰＥＭ抗体との融合物において高いＰＤ活性を保持した（図９）。
実施例２０：ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ２分子は、ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１分子を超える利益を示さない（ＰＫ及びＰＤプロファイル）
ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ２の薬物動態を、１日目に３０μｇ／ｋｇを投与した後のカニクイザル（ｎ＝２）において試験して、抗体に結合した１つのＲＬＩ２分子に勝る２つのＲＬＩ２分子の利益を評価した。血清分離のための血液を、１時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間に採取した。血清中のＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ２の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。選択した免疫細胞集団（ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖 － Ｋｉ６７＋、リンパ球数）のフローサイトメトリ評価のための血液を投与前、５日目、８日目、１２日目、１５日目、１９日目、２２日目及び２６日目に採取した。
カニクイザルにおけるＩＶ投与後の血清濃度によって決定した薬物動態（図１０Ａ）又はリンパ球数によって決定した薬力学（変化倍率、図１０Ｂ）、％Ｋｉ６７＋ ＮＫ細胞（図１０Ｃ）及び％Ｋｉ６７＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図１０Ｄ）に関して、抗体に結合したＩＬ－２／１５Ｒβγに対する親和性が低下した２つのＲＬＩ２分子を有するＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカインの、１つの分子のＲＬＩ２に勝る利益はなかった。
ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ２の薬物動態を、１日目に３０μｇ／ｋｇを投与した後のカニクイザル（ｎ＝２）において試験して、抗体に結合した１つのＲＬＩ２分子に勝る２つのＲＬＩ２分子の利益を評価した。血清分離のための血液を、１時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間に採取した。血清中のＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ２の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。選択した免疫細胞集団（ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖 － Ｋｉ６７＋、リンパ球数）のフローサイトメトリ評価のための血液を投与前、５日目、８日目、１２日目、１５日目、１９日目、２２日目及び２６日目に採取した。
カニクイザルにおけるＩＶ投与後の血清濃度によって決定した薬物動態（図１０Ａ）又はリンパ球数によって決定した薬力学（変化倍率、図１０Ｂ）、％Ｋｉ６７＋ ＮＫ細胞（図１０Ｃ）及び％Ｋｉ６７＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図１０Ｄ）に関して、抗体に結合したＩＬ－２／１５Ｒβγに対する親和性が低下した２つのＲＬＩ２分子を有するＰＥＭ－ＲＬＩ免疫サイトカインの、１つの分子のＲＬＩ２に勝る利益はなかった。
実施例２１：ＬＥ変異を有するＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１分子は、ＬＥ／ＹＴＥ変異を有する分子よりも長い半減期を示す
ＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ ＬＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１の薬物動態を、１日目の６００μｇ／ｋｇのＩＶ投与後に、カニクイザル（ｎ＝３）において試験した。血清分離のための血液を、１時間、８時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間及び１２０時間に採取した。血清中のＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ ＬＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。ＹＴＥ変異は、ＦｃＲｎ結合を増加させ、これにより血漿半減期を増加させることが報告されているが、１つのＲＬＩ ＮＡ変異タンパク質を有する免疫サイトカイン形式では、半減期は、驚くべきことに、ＬＥ変異のみを有する構築物と比較して減少した（図１１）。
ＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ ＬＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１の薬物動態を、１日目の６００μｇ／ｋｇのＩＶ投与後に、カニクイザル（ｎ＝３）において試験した。血清分離のための血液を、１時間、８時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間及び１２０時間に採取した。血清中のＰＥＭ ＬＥ／ＹＴＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ ＬＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。ＹＴＥ変異は、ＦｃＲｎ結合を増加させ、これにより血漿半減期を増加させることが報告されているが、１つのＲＬＩ ＮＡ変異タンパク質を有する免疫サイトカイン形式では、半減期は、驚くべきことに、ＬＥ変異のみを有する構築物と比較して減少した（図１１）。
実施例２２：より低い効力の変異体ＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＱＤ ｘ１はＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＡｘ１分子よりも長い半減期を示す
ＰＥＭ ＬＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＱＤ ｘ１（ＮＱＤはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを指す）の薬物動態を、１日目の６００μｇ／ｋｇのＩＶ投与後に、カニクイザル（ｎ＝３）において試験した。血清分離のための血液を、１時間、８時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間に採取した。血清中のＰＥＭ Ｌ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＱＤ ｘ１の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。ＮＡ変異体と比較してさらに低下した効力を示した三重変異体ＮＱＤを有するＰＥＭ－ＲＬＩ構築物（表１３参照）は、Ｎ６５Ａ置換を有するＰＥＭ－ＲＬＩ構築物と比較して、インビボでさらに増加した半減期を示した（図１２）。
ＰＥＭ ＬＥ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＱＤ ｘ１（ＮＱＤはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを指す）の薬物動態を、１日目の６００μｇ／ｋｇのＩＶ投与後に、カニクイザル（ｎ＝３）において試験した。血清分離のための血液を、１時間、８時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間に採取した。血清中のＰＥＭ Ｌ－ＲＬＩ ＮＡ ｘ１及びＰＥＭ－ＲＬＩ ＮＱＤ ｘ１の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。ＮＡ変異体と比較してさらに低下した効力を示した三重変異体ＮＱＤを有するＰＥＭ－ＲＬＩ構築物（表１３参照）は、Ｎ６５Ａ置換を有するＰＥＭ－ＲＬＩ構築物と比較して、インビボでさらに増加した半減期を示した（図１２）。
実施例２３：改変されたエフェクター機能を有する抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２ ｈＣｌ１ａ抗体に基づく免疫サイトカインのＡＤＣＣ活性
細胞株
ヒト細胞株ＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏａｒｒａｙ（クリエイティブ・バイオアレイ）、カタログ番号ＣＳＣ－Ｃ０３２６）及びＣｌａｕｄｉｎ１８．２を過剰発現するＡ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）（Ａ５４９－Ｃｌｄｎ１８．２）を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｇｉｂｃｏ（ギブコ））、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン））及び２μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。
Ａ５４９細胞を、トランスポザーゼ発現構築物（ｐｃＤＮＡ３．１－ｈｙ－ｍＰＢ）、転位性の全長ｈｕＣＬＤＮ１８．２を有する構築物（ｐＰＢ－Ｐｕｒｏ－ｈｕＣＬＤＮ１８．２）を、ピューロマイシン耐性カセット及びトランスフェクション対照としてのＥＧＦＰを有する構築物（ｐＥＧＦＰ－Ｎ３）（Ｗａｌｄｍｅｉｅｒ、Ｈｅｌｌｍａｎｎら、２０１６）とともに用いてエレクトロポレーションによって同時トランスフェクトした。エレクトロポレーション後、細胞を５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベータ中３７℃の増殖培地中で２日間回復させた。トランスフェクションは、ＥＧＦＰ発現のＦＣ分析によって検証した。次いで、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を、ピューロマイシンを１μｇ／ｍｌで培養物に添加することによって選択し、さらに増殖させて、１０％ＤＭＳＯを含むＦＣＳ中で凍結ストックを生成した。トランスフェクトした細胞におけるＣＬＤＮ１８．２の発現をＦＣによって分析した。
より均質なＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ細胞集団を有するために、細胞をＦＡＣＳによって選別して、より高いＣＬＤＮ１８．２発現を有する細胞のみを選択した。手短に言えば、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＣＳ）に懸濁したＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ細胞を、氷上で３０分間、２μｇ／ｍｌのゾルベツキシマブとともにインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄した後、細胞をＰＥ標識Ｆｃγ特異的ＩｇＧヤギ抗ヒト二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（イーバイオサイエンス））とともに氷上で３０分間インキュベートした。洗浄後、染色した細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）機器によって分析及び選別し、高発現細胞から中等度発現細胞を分離した。選別後、採取したＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ－Ｈｉｇｈ細胞（ＰａＴｕ）を増殖培地に再懸濁し、増殖させ、凍結したアリコートを液体Ｎ２中に保存した。
ヒトＣＤ１６を外因的に発現するヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７）（ＮＫ９２－ｈＣＤ１６、本明細書ではＮＫ９２と呼ぶ）を、Ｃｌｅｍｅｎｃｅａｕら、２０１３（Ｃｌｅｍｅｎｃｅａｕ、Ｖｉｖｉｅｎら、２０１３）に記載されているように生成した。この細胞を、１０％ＡＢヒト血清（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ（ワン・ラムダ））、２ｍＭグルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｇｉｂｃｏ）及び５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（ぺプロテック））を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。すべての細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃に維持した。
細胞株
ヒト細胞株ＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏａｒｒａｙ（クリエイティブ・バイオアレイ）、カタログ番号ＣＳＣ－Ｃ０３２６）及びＣｌａｕｄｉｎ１８．２を過剰発現するＡ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）（Ａ５４９－Ｃｌｄｎ１８．２）を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｇｉｂｃｏ（ギブコ））、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン））及び２μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。
Ａ５４９細胞を、トランスポザーゼ発現構築物（ｐｃＤＮＡ３．１－ｈｙ－ｍＰＢ）、転位性の全長ｈｕＣＬＤＮ１８．２を有する構築物（ｐＰＢ－Ｐｕｒｏ－ｈｕＣＬＤＮ１８．２）を、ピューロマイシン耐性カセット及びトランスフェクション対照としてのＥＧＦＰを有する構築物（ｐＥＧＦＰ－Ｎ３）（Ｗａｌｄｍｅｉｅｒ、Ｈｅｌｌｍａｎｎら、２０１６）とともに用いてエレクトロポレーションによって同時トランスフェクトした。エレクトロポレーション後、細胞を５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベータ中３７℃の増殖培地中で２日間回復させた。トランスフェクションは、ＥＧＦＰ発現のＦＣ分析によって検証した。次いで、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を、ピューロマイシンを１μｇ／ｍｌで培養物に添加することによって選択し、さらに増殖させて、１０％ＤＭＳＯを含むＦＣＳ中で凍結ストックを生成した。トランスフェクトした細胞におけるＣＬＤＮ１８．２の発現をＦＣによって分析した。
より均質なＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ細胞集団を有するために、細胞をＦＡＣＳによって選別して、より高いＣＬＤＮ１８．２発現を有する細胞のみを選択した。手短に言えば、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＣＳ）に懸濁したＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ細胞を、氷上で３０分間、２μｇ／ｍｌのゾルベツキシマブとともにインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄した後、細胞をＰＥ標識Ｆｃγ特異的ＩｇＧヤギ抗ヒト二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（イーバイオサイエンス））とともに氷上で３０分間インキュベートした。洗浄後、染色した細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）機器によって分析及び選別し、高発現細胞から中等度発現細胞を分離した。選別後、採取したＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ－Ｈｉｇｈ細胞（ＰａＴｕ）を増殖培地に再懸濁し、増殖させ、凍結したアリコートを液体Ｎ２中に保存した。
ヒトＣＤ１６を外因的に発現するヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７）（ＮＫ９２－ｈＣＤ１６、本明細書ではＮＫ９２と呼ぶ）を、Ｃｌｅｍｅｎｃｅａｕら、２０１３（Ｃｌｅｍｅｎｃｅａｕ、Ｖｉｖｉｅｎら、２０１３）に記載されているように生成した。この細胞を、１０％ＡＢヒト血清（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ（ワン・ラムダ））、２ｍＭグルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｇｉｂｃｏ）及び５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（ぺプロテック））を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。すべての細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃に維持した。
細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ
Ａ５４９－Ｃｌｄｎ１８．２又はＰａＴｕ細胞を９６ウェルプレートに適切な濃度（Ａ５４９－Ｃｌｄｎ１８．２ － ２００００細胞、ＰａＴｕ － ３００００細胞）で播種し、２４時間インキュベートした。ＮＫ９２細胞又は単離したヒトＮＫ細胞を遠心分離によって回収し、洗浄し、ＡＤＣＣアッセイ培地（２ｍＭグルタミン及び１０％熱不活化（５６℃で２０分間）プール済み補体ヒト血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（イノベイティブ・リサーチ））を補充したＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッドなし））に再懸濁した。接着細胞（標的細胞Ｔ）を含む９６ウェルプレートから培地を除去し、ＡＤＣＣアッセイ培地中の懸濁液中のＮＫ９２細胞（エフェクター細胞Ｅ）を、接着標的細胞に、Ａ５４９－Ｃｌｄｎ１８．２について１０のＥ：Ｔ比及びＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ細胞について５のＥ：Ｔ比で添加した。試験する抗体又は免疫サイトカイン（ＩＣＫ）を０．００１～１００ｎＭ又は０．０００１～１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で添加した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体（Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ（商標） Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（バイオレジェンド）、カタログ番号４０３５０２）を非特異的対照として含めた。混合物を３７℃で一晩インキュベートした。２４時間後、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ａｂｃａｍ（アブカム）、ａｂ６５３９３）を製造業者の説明書に従って使用して、死細胞から放出された乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性として表される細胞傷害性を測定した。１０μｌの上清を新しい９６ウェルプレートに移し、ＬＤＨ基質と混合し、発色した色の変化を、分光光度計を用いて４５０ｎｍのＯＤで測定した。次式に従って細胞傷害性を計算した：細胞傷害性（％）＝（（試験試料－エフェクター細胞対照－低対照）／（高対照－低対照））×１００；「試験試料」：エフェクター／標的混合物；「エフェクター細胞対照」：ＮＫ９２細胞のみを有する１つのウェル（エフェクター細胞から放出されるＬＤＨ活性を決定する）；「低対照」：標的細胞のみを有する１つのウェル（未処置の標的細胞からのＬＤＨ活性の自発的放出を決定する）；「高対照」：溶解緩衝液で透過処理した標的細胞を有する１つのウェル（最大放出可能ＬＤＨ活性を決定する）。
Ａ５４９－Ｃｌｄｎ１８．２又はＰａＴｕ細胞を９６ウェルプレートに適切な濃度（Ａ５４９－Ｃｌｄｎ１８．２ － ２００００細胞、ＰａＴｕ － ３００００細胞）で播種し、２４時間インキュベートした。ＮＫ９２細胞又は単離したヒトＮＫ細胞を遠心分離によって回収し、洗浄し、ＡＤＣＣアッセイ培地（２ｍＭグルタミン及び１０％熱不活化（５６℃で２０分間）プール済み補体ヒト血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（イノベイティブ・リサーチ））を補充したＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッドなし））に再懸濁した。接着細胞（標的細胞Ｔ）を含む９６ウェルプレートから培地を除去し、ＡＤＣＣアッセイ培地中の懸濁液中のＮＫ９２細胞（エフェクター細胞Ｅ）を、接着標的細胞に、Ａ５４９－Ｃｌｄｎ１８．２について１０のＥ：Ｔ比及びＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ細胞について５のＥ：Ｔ比で添加した。試験する抗体又は免疫サイトカイン（ＩＣＫ）を０．００１～１００ｎＭ又は０．０００１～１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で添加した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体（Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ（商標） Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（バイオレジェンド）、カタログ番号４０３５０２）を非特異的対照として含めた。混合物を３７℃で一晩インキュベートした。２４時間後、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ａｂｃａｍ（アブカム）、ａｂ６５３９３）を製造業者の説明書に従って使用して、死細胞から放出された乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性として表される細胞傷害性を測定した。１０μｌの上清を新しい９６ウェルプレートに移し、ＬＤＨ基質と混合し、発色した色の変化を、分光光度計を用いて４５０ｎｍのＯＤで測定した。次式に従って細胞傷害性を計算した：細胞傷害性（％）＝（（試験試料－エフェクター細胞対照－低対照）／（高対照－低対照））×１００；「試験試料」：エフェクター／標的混合物；「エフェクター細胞対照」：ＮＫ９２細胞のみを有する１つのウェル（エフェクター細胞から放出されるＬＤＨ活性を決定する）；「低対照」：標的細胞のみを有する１つのウェル（未処置の標的細胞からのＬＤＨ活性の自発的放出を決定する）；「高対照」：溶解緩衝液で透過処理した標的細胞を有する１つのウェル（最大放出可能ＬＤＨ活性を決定する）。
図１３は、改変されたエフェクター機能を有するｈＣｌ１ａ抗体に基づく免疫サイトカインのＡＤＣＣ活性を示す。試験した免疫サイトカインはすべてヘテロ二量体Ｆｃドメインを有し、１つのＲＬＩ２ＡＱコンジュゲートが重鎖のうちの１つのＣ末端に融合していた。ＡＤＣＣを低下させるエフェクタードメインの変異を有する免疫サイトカインを試験した場合、免疫サイトカインｈＣｌ１ａ ＬＡＬＡＰＧ－ＲＬＩ ＤＡＮＡは、ｈＣｌ１ａ抗体単独のｈＣｌ１ａ－ＤＡＮＡ免疫サイトカインと比較した場合、ＮＫ９２細胞の存在下でＡ５４９－ＣＬＤＮ１８．２細胞（上のパネル）又はＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ（下のパネル）に対して試験した場合、ほぼ消失したＡＤＣＣ活性を示した。ｈＣｌ１ａ－ＬＡＬＡ抗体も、ｈＣｌ１ａ抗体と比較して低下したＡＤＣＣ活性を示したが、しかしながらＡＤＣＣ活性は完全には消失しなかった。コンジュゲートの添加は、抗体単独のＡＤＣＣ活性と比較した場合に、ＡＤＣＣ活性が低下した際の、免疫サイトカインのＡＤＣＣ活性に影響を及ぼさなかった。表２５は、試験した各免疫サイトカイン又は抗体について測定したＡＤＣＣ ＥＣ５０値を要約する。ＥＣ５０値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ（グラフパッド） Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用し、組み込みの「ｌｏｇ（ＡＧＯＮＩＳＴ） ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ － ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ （ｆｏｕｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４つのパラメータ））」ＥＣ５０決定を用いて決定した。
ＡＤＣＣを増強するエフェクタードメインの変異を有する免疫サイトカインを試験した場合、ＦｃドメインにＤＬＥ、ＤＥ、ＡＡＡ、ＴＥ又はＩＥ変異を有するｈＣｌ１ａ抗体に基づくすべての試験した免疫サイトカインは、それらの変異を有さない同じ免疫サイトカイン又は抗体単独と比較して、増強されたＡＤＣＣ活性を示した（図１４）。
ＡＤＣＣ活性を増強するために、脱フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）も試験した。図１４Ｆは、Ａ５４９－Ｃｌｄｎ１８．２及びＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ細胞において、脱フコシル化免疫サイトカインｈＣｌ１ａ－ＤＡＮＡ ａｆｕｃが、ｈＣｌ１ａ－ＤＡＮＡと比較して増強されたＡＤＣＣ活性、並びに上記のＤＥ及びＤＬＥ変異を有する免疫サイトカインに匹敵するＡＤＣＣ活性を有することを示す。しかしながら、脱フコシル化をエフェクタードメイン増強の変異と組み合わせた場合、脱フコシル化は、驚くべきことに、ＤＥ又はＤＬＥの変異によって誘導されるＡＤＣＣ増強に悪影響を及ぼした（図１４Ｂ及びＡを参照）。それにもかかわらず、脱フコシル化をＡＡＡ変異と組み合わせた場合には、増強されたＡＤＣＣ活性は維持された（図１４Ｃ）
ＡＤＣＣを増強するエフェクタードメインの変異を有する免疫サイトカインを試験した場合、ＦｃドメインにＤＬＥ、ＤＥ、ＡＡＡ、ＴＥ又はＩＥ変異を有するｈＣｌ１ａ抗体に基づくすべての試験した免疫サイトカインは、それらの変異を有さない同じ免疫サイトカイン又は抗体単独と比較して、増強されたＡＤＣＣ活性を示した（図１４）。
ＡＤＣＣ活性を増強するために、脱フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）も試験した。図１４Ｆは、Ａ５４９－Ｃｌｄｎ１８．２及びＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｓ細胞において、脱フコシル化免疫サイトカインｈＣｌ１ａ－ＤＡＮＡ ａｆｕｃが、ｈＣｌ１ａ－ＤＡＮＡと比較して増強されたＡＤＣＣ活性、並びに上記のＤＥ及びＤＬＥ変異を有する免疫サイトカインに匹敵するＡＤＣＣ活性を有することを示す。しかしながら、脱フコシル化をエフェクタードメイン増強の変異と組み合わせた場合、脱フコシル化は、驚くべきことに、ＤＥ又はＤＬＥの変異によって誘導されるＡＤＣＣ増強に悪影響を及ぼした（図１４Ｂ及びＡを参照）。それにもかかわらず、脱フコシル化をＡＡＡ変異と組み合わせた場合には、増強されたＡＤＣＣ活性は維持された（図１４Ｃ）
実施例２４：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＡＤＣＣ活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８及びＦｃγＲＩＩＩａ Ｆ１５８並びにＡＤＣＣ阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂへの抗体Ｆｃ結合の評価
ヒトＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ｈＦｃγＲＩＩＩａ；ＣＤ１６ａ）は、位置１５８の２つの多型多様体、ｈＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８及びｈＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８として存在する。ＦｃγＲＩＩＩａはＡＤＣＣ活性を活性化し、ＦｃγＲＩＩｂはＡＤＣＣを阻害する。免疫サイトカインのＡＤＣＣ活性は、受容体に対するそれらの親和性をＳＰＲによって測定する場合、ＦｃγＲＩＩｂへのＥＣ５０結合親和性に対するＦｃγＲＩＩＩａへのＥＣ５０結合親和性の比として表すことができる。
ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ（サイティバ）、シカゴ、イリノイ州、米国）で、ＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ）を用い、ＴＨＥ Ｈｉｓタグ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ジェンスクリプト））を用いて固定化して行った。ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８、ＦｃγＲＩＩＩａ Ｆ１５８又はＦｃγＲＩＩｂタンパク質を１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ランニングバッファー中で１０μｌ／分の流量、３０秒の接触時間で捕捉に使用した。脱フコシル化を伴って又は伴わずにＤＬＥ及びＤＥを有する構築物を除き、３０μｌ／分の流量で、３００秒／３００秒の会合時間／解離時間を用いて適切な範囲の濃度連続希釈で、試験した各免疫サイトカインについて会合／解離の速度を測定した。ＤＬＥ及びＤＥを有する構築物については、１２０ｓ／１２００ｓの会合／解離時間を適用した。下記表２６は、ＳＰＲ測定の結果を要約する。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ｈＦｃγＲＩＩＩａ；ＣＤ１６ａ）は、位置１５８の２つの多型多様体、ｈＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８及びｈＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８として存在する。ＦｃγＲＩＩＩａはＡＤＣＣ活性を活性化し、ＦｃγＲＩＩｂはＡＤＣＣを阻害する。免疫サイトカインのＡＤＣＣ活性は、受容体に対するそれらの親和性をＳＰＲによって測定する場合、ＦｃγＲＩＩｂへのＥＣ５０結合親和性に対するＦｃγＲＩＩＩａへのＥＣ５０結合親和性の比として表すことができる。
ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ（サイティバ）、シカゴ、イリノイ州、米国）で、ＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ）を用い、ＴＨＥ Ｈｉｓタグ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ジェンスクリプト））を用いて固定化して行った。ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８、ＦｃγＲＩＩＩａ Ｆ１５８又はＦｃγＲＩＩｂタンパク質を１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ランニングバッファー中で１０μｌ／分の流量、３０秒の接触時間で捕捉に使用した。脱フコシル化を伴って又は伴わずにＤＬＥ及びＤＥを有する構築物を除き、３０μｌ／分の流量で、３００秒／３００秒の会合時間／解離時間を用いて適切な範囲の濃度連続希釈で、試験した各免疫サイトカインについて会合／解離の速度を測定した。ＤＬＥ及びＤＥを有する構築物については、１２０ｓ／１２００ｓの会合／解離時間を適用した。下記表２６は、ＳＰＲ測定の結果を要約する。
「ａｆｕｃ」は脱フコシル化を指す。
Ａ／Ｉ比は、ＡＤＣＣ活性化受容体（「Ａ」；ＦｃγＲＩＩＩ）に対する結合強度を、ＡＤＣＣ阻害受容体（「Ｂ」；ＦｃγＲＩＩｂ）に対する結合強度と比較して評価することを可能にする。この比が高いほど、抗体又は免疫サイトカインの活性化受容体への結合が強くなる。
ＳＰＲデータは、全体的に、ＡＤＣＣを増強する変異を有するすべての免疫サイトカインが、ＴＬ変異の一部であるＡＤＣＣを増強する変異を有さない免疫サイトカインよりも高いＡ／Ｉ比を示すことを確認する。ＴＬ変異の比較的低いＡ／Ｉ比は、そのような変異のグリコシル化の増加に起因している可能性がある（実施例２５参照）。
実施例２５：増強されたＡＤＣＣ活性を有するｈＣｌ１ａに基づく免疫サイトカインの安定性／開発可能性
ＡＤＣＣを増強するＤＬＥ、ＤＥ、ＡＡＡ、ＴＬ若しくはＩＥ変異を有するか、又は脱フコシル化されているｈＣｌ１ａに基づく免疫サイトカインを、ＣＨ２ドメインの融解温度、配列不安定性（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）及びグリコシル化（Ｎ－グリカン）プロファイルを評価することによって、それらの安定性及び開発可能性を評価した。
ＡＤＣＣを増強するＤＬＥ、ＤＥ、ＡＡＡ、ＴＬ若しくはＩＥ変異を有するか、又は脱フコシル化されているｈＣｌ１ａに基づく免疫サイトカインを、ＣＨ２ドメインの融解温度、配列不安定性（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）及びグリコシル化（Ｎ－グリカン）プロファイルを評価することによって、それらの安定性及び開発可能性を評価した。
ＣＨ２ドメインの融解温度を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＰＥＡＱ－ＤＳＣ自動化システム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ（マルバーン・パナリティカル））を使用する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定した。手短に述べると、免疫サイトカイン試料をその保存緩衝液中で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。加熱は、１℃／分の速度で２０℃から１００℃まで行った。次いで、タンパク質溶液をその場で（ｉｎ ｓｉｔｕ）冷却し、同じ熱的スキャンを実行して、第１のスキャンから差し引くためのベースラインを得た。
Ｎ－グリカン分析のために、タンパク質を最初にＤＴＴで還元し、次いで注入用ガラスインサートバイアルを備えたＨＰＬＣカラムに移した。タンパク質を逆相クロマトグラフィーによって分離し、ＵＶ検出器と組み合わせたＷａｔｅｒｓ（ウォーターズ）／ＸＥＶＯＧ２ＸＳ－ＱＴＯＦオンラインＬＣ－ＭＳによって検出した。検出されたグリカン鎖の分子量を既知のＮ－グリカン型と一致させ、Ｎ－グリカン相対存在量を計算し、検出されたピークの強度によって表した。
ＡＤＣＣ増強変異を有する免疫サイトカイン構築物のアミノ酸配列を、表２７に記載するように、以下のさらなる配列不安定性（ＡＤＣＣ増強変異を有さない構築物には存在しない）の存在について分析した。
ＴＬ変異は、Ｎ－グリコシル化配列不安定性（ＩｇＧ１配列中のＮ３９０に近接した変異Ｋ３９２Ｔ）を導入した。他の変異によって配列不安定性は導入されなかった（表２８参照）。
スコア３：開発中に必要とされる品質属性の注意深い監視／評価；
スコア２：予定表及び／又はコストにかなりの影響を与える可能性が高い；
スコア１：適切に制御できない高リスク。
全体として、脱フコシル化は安定性及び開発可能性に影響を及ぼさず、従って免疫サイトカインのＡＤＣＣ活性を増強するために使用されてもよい。ＤＬＥ及びＤＥ変異は、Ｔｍ１（ＣＨ２ドメインの融解温度）のかなりの低下を引き起こし（表２９参照）、免疫サイトカインの溶液中での安定性に影響を及ぼす潜在性を有していた。しかしながら、これらの変異は免疫サイトカインのグリコシル化に影響を与えなかった。ＴＬ変異によって導入された配列不安定性は、望ましくないシアリル化され高マンノースのグリカン種の導入をもたらした（表３０参照）。これらの種は、免疫サイトカインのｐＫに悪影響を与える可能性がある。同様に、ＩＥ変異を有する免疫サイトカインは、高い割合のマンノース種を有し、これは、それら免疫サイトカインの特性に影響を与える潜在性を有していた。ＡＡＡ変異を有する免疫サイトカインは、マンノース種の増加をもたらした（表３０参照）。しかしながら、脱フコシル化免疫サイトカインの生成は、グリコシル化を開発可能性に関して許容可能なレベルに部分的に戻した。それゆえ、ｈＣｌ１ａに基づく免疫サイトカインの増強が望まれる場合、ＡＡＡ変異は、任意選択で脱フコシル化と組み合わせて、その安定性及び開発可能性に最も少ない影響しか及ぼさない推奨される変異であってもよい。脱フコシル化は、評価した特性に影響を及ぼさなかった。ＤＬＥ及びＤＥ変異は、Ｔｍのかなりの減少を引き起こし、分子を不安定化させる潜在性を有していた。ＴＬ変異は、さらなるグリコシル化部位をＦｃに導入した。ＩＥ変異を有する構築物は、高い割合のマンノース種を有していた。
実施例２６：マウスインビボ有効性試験
この研究の目的は、マウスモデルにおけるｈＣｌ１ａ－ＲＬＩ免疫サイトカインのインビボ治療有効性を試験することである。雌ＮＭＲＩヌードマウスに、５～７週齢で、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を外因的に発現する膵臓ヒト細胞株由来異種移植片ＢＸＰＣ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６８７（商標））（ＢＸＰＣ３－ＣＬＤＮ１８．２）を移植する。腫瘍を片側皮下注射によって移植する。これらの動物を、約１００ｍｍ３の腫瘍体積に基づいて無作為化する。マウスを異なる群（群あたりｎ＝７）に割り当て、１日目に表３１に従って処置する。動物を週２回、体重減少及び腫瘍体積についてチェックする。腫瘍体積は、キャリパーによって測定し、式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２（式中、Ｖは腫瘍体積であり、Ｌは腫瘍長（最も長い腫瘍寸法）であり、Ｗは腫瘍幅（Ｌに垂直な最も長い腫瘍寸法）である）を使用してｍｍ３で表す。２０００ｍｍ３の腫瘍負荷に達するか、又は著しい体重減少（連続する２日間で全体的に３０％超、又は２０％超）を経験すると、マウスを安楽死させる。
この研究の目的は、マウスモデルにおけるｈＣｌ１ａ－ＲＬＩ免疫サイトカインのインビボ治療有効性を試験することである。雌ＮＭＲＩヌードマウスに、５～７週齢で、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を外因的に発現する膵臓ヒト細胞株由来異種移植片ＢＸＰＣ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６８７（商標））（ＢＸＰＣ３－ＣＬＤＮ１８．２）を移植する。腫瘍を片側皮下注射によって移植する。これらの動物を、約１００ｍｍ３の腫瘍体積に基づいて無作為化する。マウスを異なる群（群あたりｎ＝７）に割り当て、１日目に表３１に従って処置する。動物を週２回、体重減少及び腫瘍体積についてチェックする。腫瘍体積は、キャリパーによって測定し、式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２（式中、Ｖは腫瘍体積であり、Ｌは腫瘍長（最も長い腫瘍寸法）であり、Ｗは腫瘍幅（Ｌに垂直な最も長い腫瘍寸法）である）を使用してｍｍ３で表す。２０００ｍｍ３の腫瘍負荷に達するか、又は著しい体重減少（連続する２日間で全体的に３０％超、又は２０％超）を経験すると、マウスを安楽死させる。
実施例２７：抗ＰＤ－１抗体及びＳＯＴ２０１はＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化において相乗作用する
ＳＯＴ２０１は、ｋｎｏｂ重鎖のＣ末端でＲＬＩ－１５ＡＱＡに融合した、重鎖のＴ３６６Ｗ－ｋｎｏｂ／Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ－ｈｏｌｅ置換、Ｌ２３５Ｅ置換を有し、末端Ｋを欠失したヒト化ＩｇＧ４ペムブロリズマブに由来する抗体（配列番号２１、配列番号１０１、配列番号２３を参照）を有するヘテロ二量体免疫サイトカインである。ＳＯＴ２０１及びＫｅｙｔｒｕｄａ（キイトルーダ）（登録商標）（ペムブロリズマブ）を、実施例１に従ってＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断アッセイにおいて比較した。図１９Ａは、ＳＯＴ２０１が抗ＰＤ－１抗体Ｋｅｙｔｒｕｄａと同様にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を効果的に遮断することを示す。ＳＯＴ２０１及びペムブロリズマブについて決定したＫＤ値を表３２に示す。
ＳＯＴ２０１は、ｋｎｏｂ重鎖のＣ末端でＲＬＩ－１５ＡＱＡに融合した、重鎖のＴ３６６Ｗ－ｋｎｏｂ／Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ－ｈｏｌｅ置換、Ｌ２３５Ｅ置換を有し、末端Ｋを欠失したヒト化ＩｇＧ４ペムブロリズマブに由来する抗体（配列番号２１、配列番号１０１、配列番号２３を参照）を有するヘテロ二量体免疫サイトカインである。ＳＯＴ２０１及びＫｅｙｔｒｕｄａ（キイトルーダ）（登録商標）（ペムブロリズマブ）を、実施例１に従ってＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断アッセイにおいて比較した。図１９Ａは、ＳＯＴ２０１が抗ＰＤ－１抗体Ｋｅｙｔｒｕｄａと同様にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を効果的に遮断することを示す。ＳＯＴ２０１及びペムブロリズマブについて決定したＫＤ値を表３２に示す。
１１人の健常ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、ＲＬＩ２ＡＱ Ｎ６５Ａ（ＲＬＩ－１５ＡＱＡ）多様体を有するＳＯＴ２０１で、又はＳＯＴ２０１と同じ抗体重鎖及び軽鎖を有するがＩＬ－２／ＩＬ－１５ＲβγへのＩＬ－１５部分の結合が減少していないＲＬＩ２ＡＱ多様体を有する対照分子（「ＳＯＴ２０１ ｗｔ」）を用いてインビトロで７日間刺激した。細胞増殖を、フローサイトメトリ分析によってＫｉ－６７＋ ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を測定することによって決定した。ＳＯＴ２０１は、受容体結合が低下していないＲＬＩ－１５分子を有する比較可能な免疫サイトカイン分子（ＳＯＴ２０１ ｗｔ）と比較して、より高いＥＣ５０濃度でＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を活性化する（図１９Ｂ）。
ＲＬＩ－１５ＡＱＡに融合した、ヘテロ二量体化のための類似の置換（Ｅ３５６Ｋ、Ｎ３９９Ｋ／Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９Ｄ）、ＡＤＣＣサイレンシング（Ｄ２６５Ａ）及び安定化（ｄＫ）を有する抗マウスＰＤ－１抗体ＲＭＰ１－１４（ＢｉｏＸＣｅｌｌ（バイオエクセル）、レバノン（Ｌｅｂａｎｏｎ）、ニューハンプシャー州、米国）を含むマウス代用物ＳＯＴ２０１（ｍＳＯＴ２０１：配列番号１０２、配列番号１０３及び配列番号１０４を参照）を、モノクローナル抗マウスＰＤ－１抗体ＲＭＰ１－１４それ自体（ｍＰＤ１）、及びｍＳＯＴ２０１と同様のインビボ半減期を有するＲＬＩ－１５ＡＱＡ対照としての抗ヒトＰＤ１マウスＩｇＧ１－ＲＬＩ－１５ＡＱＡ（ｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１）（これは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいていかなるＰＤ－１遮断活性も発揮しない）によって表される単独活性対照と比較した。細胞増殖（Ｋｉ６７）は、健常Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝２／群）における５ｍｇ／ｋｇのｍＳＯＴ２０１に等モル量の化合物のＩＶ注射の５日後に、フローサイトメトリによって脾臓において検出した。マウス代用物ｍＳＯＴ２０１における抗ＰＤ－１抗体及びＲＬＩ－１５ＡＱＡ変異タンパク質部分は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖に対して相乗効果を示した（図１９Ｃ）。
実施例２８：ＭＣ３８マウスモデルにおける腫瘍退縮
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｈＰＤ１トランスジェニック）に同系ＭＣ３８細胞株を移植した。試験薬剤ｍＳＯＴ２０１、ｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１及びｍＰＤ１を、１日目（無作為化日、腫瘍体積８０～１００ｍｍ３）に、５ｍｇ／ｋｇのｍＳＯＴ２０１に等モル量でＩＶ注射し（ｎ＝１０／群）、対照（ＮａＣｌ）と比較した。ｍＳＯＴ２０１は、単回ＩＶ投与後に１０匹中９匹のマウスにおいて腫瘍退縮を誘導したのに対し、これと比較して、モノクローナル抗マウスＰＤ－１抗体（ｍＰＤ１）、及びマウスにおいて抗ＰＤ－１効果を発揮しない抗ヒトＰＤ－１マウスＩｇＧ１－ＲＬＩ－１５変異タンパク質免疫サイトカイン（ｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１）は、対照マウスと比較して腫瘍成長に対してわずかな効果を示しただけであった（図２０Ａ）。同様に、抗マウスＰＤ－１抗体単独（ｍＰＤ１）又はＲＬＩ－１５ＡＱＡ変異タンパク質単独の対照としての抗ヒトＰＤ１マウスＩｇＧ１－ＲＬＩ－１５変異タンパク質免疫サイトカイン（ｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１）と比較した融合タンパク質（ｍＳＯＴ２０１）中の抗マウスＰＤ－１抗体及びＲＬＩ－１５ＡＱＡ変異タンパク質の相乗活性は、処置後１００日までの時間経過における生存マウスにおいて示される（図２０Ｂ）。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｈＰＤ１トランスジェニック）に同系ＭＣ３８細胞株を移植した。試験薬剤ｍＳＯＴ２０１、ｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１及びｍＰＤ１を、１日目（無作為化日、腫瘍体積８０～１００ｍｍ３）に、５ｍｇ／ｋｇのｍＳＯＴ２０１に等モル量でＩＶ注射し（ｎ＝１０／群）、対照（ＮａＣｌ）と比較した。ｍＳＯＴ２０１は、単回ＩＶ投与後に１０匹中９匹のマウスにおいて腫瘍退縮を誘導したのに対し、これと比較して、モノクローナル抗マウスＰＤ－１抗体（ｍＰＤ１）、及びマウスにおいて抗ＰＤ－１効果を発揮しない抗ヒトＰＤ－１マウスＩｇＧ１－ＲＬＩ－１５変異タンパク質免疫サイトカイン（ｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１）は、対照マウスと比較して腫瘍成長に対してわずかな効果を示しただけであった（図２０Ａ）。同様に、抗マウスＰＤ－１抗体単独（ｍＰＤ１）又はＲＬＩ－１５ＡＱＡ変異タンパク質単独の対照としての抗ヒトＰＤ１マウスＩｇＧ１－ＲＬＩ－１５変異タンパク質免疫サイトカイン（ｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１）と比較した融合タンパク質（ｍＳＯＴ２０１）中の抗マウスＰＤ－１抗体及びＲＬＩ－１５ＡＱＡ変異タンパク質の相乗活性は、処置後１００日までの時間経過における生存マウスにおいて示される（図２０Ｂ）。
実施例２９：ＭＣ３８腫瘍における抗腫瘍免疫に関連する経路及び遺伝子の誘導並びに脾臓及びリンパ節における免疫細胞の活性化
ＲＮＡ単離：ＲＮＡ試料を、ｍＳＯＴ２０１（５ｍｇ／ｋｇ）の単回ＩＶ投与の７日後に同系ＭＣ３８腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍から単離した。１日目（無作為化日、腫瘍体積８０～１００ｍｍ３）に３匹のマウスをｍＳＯＴ２０１（５ｍｇ／ｋｇ）でＩＶ処置し、４匹の対照マウスを未処置のままにした。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｃｒｏＫｉｔを用いて腫瘍組織からＲＮＡを単離した。Ａｇｉｌｅｎｔ（アジレント） Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＲＮＡ Ｎａｎｏ Ｃｈｉｐ及びＱｕｂｉｔ ＨＳ ＲＮＡアッセイを使用して、ＲＮＡ試料の質をチェックした。
ＲＮＡ単離：ＲＮＡ試料を、ｍＳＯＴ２０１（５ｍｇ／ｋｇ）の単回ＩＶ投与の７日後に同系ＭＣ３８腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍から単離した。１日目（無作為化日、腫瘍体積８０～１００ｍｍ３）に３匹のマウスをｍＳＯＴ２０１（５ｍｇ／ｋｇ）でＩＶ処置し、４匹の対照マウスを未処置のままにした。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｃｒｏＫｉｔを用いて腫瘍組織からＲＮＡを単離した。Ａｇｉｌｅｎｔ（アジレント） Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＲＮＡ Ｎａｎｏ Ｃｈｉｐ及びＱｕｂｉｔ ＨＳ ＲＮＡアッセイを使用して、ＲＮＡ試料の質をチェックした。
ＲＮＡ配列分析：配列決定ライブラリーを、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｋｉｔ ｖ３－Ｐｉｃｏ Ｉｎｐｕｔ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ米国（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．））によってＲＮＡ試料から調製し、キャピラリーゲル電気泳動システム（ＨＳ ＤＮＡチップを有するＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）及びＱｕｂｉｔ ＨＳ ＤＮＡアッセイを用いてライブラリー品質管理を実施し、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００でＮｏｖａＳｅｑ ６０００ ３００ ｃｙｃｌｅｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用して２ｘ１５１ｂｐランで配列決定を行った。
データ分析：生データを、以下の工程を含む標準的なＲＮＡ－ｓｅｑパイプラインに従って処理した：品質管理（ＦａｓｔＱＣ及びＦａｓｔｑＳｃｒｅｅｎによる）、アダプタートリミング（ｓｅｑｔｋを用いることによってＲｅａｄ２において８ｂｐトリミング）、参照ゲノムＧＲＣｍ３９へのマッピング（ＨＩＳＡＴ２を用いる）及び転写物計数（ｈｔ－ｓｅｑを用いる）。得られたアウトプット、各試料についての転写物の数を含む定量ファイルを、Ｒパッケージ及びｇｇｐｌｏｔ２、ｔｙｄｉｖｅｒｓｅ、ｄｐｌｙｒを介してさらに処理した。生のカウントを、ＤＥＳｅｑ２によって比正規化の中央値に正規化した。遺伝子発現差異分析は、Ｒ中のＤＥＳｅｑ２（バージョン１．２４．０）を用いて行った（ａｂｓ（ｌｏｇ２ＦＣ）＝１、ＦＤＲ＜０．０５）。ヒートマップは、Ｒ中のＣｏｍｐｌｅｘＨｅａｔｍａｐパッケージを使用して作成した。ＤＥＧの機能及び濃縮の分析は、ＣｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ及びウェブベースのツール遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ、ＧＯ）を使用して行った。細胞集団分析のためのＴＰＭ値を計算するために、トリミングされたｆａｓｔｑファイルに対してｓａｌｍｏｎツールを使用した。細胞集団の分析は、ＴＩＭＥＲ ２．０及びｘＣｅｌｌツールによって行った。
結果：発現差異分析（ａｂｓ（ｌｏｇ２ＦＣ）＝１、ＦＤＲ＜０．０５）は、対照試料と比較して、ｍＳＯＴ２０１処置腫瘍において８００個のマウス遺伝子の上方制御及び１９１０個のマウス遺伝子の下方制御をもたらした。遺伝子オントロジー（ＧＯ）ターム（ｔｅｒｍ）の濃縮分析は、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞の活性化、細胞傷害性、細胞死滅、サイトカイン産生、細胞走化性及び細胞接着に関連した上方制御されたＤＥＧを主に特定したが、下方制御された遺伝子は、腫瘍発生及び腫瘍シグナル伝達に関連した。これらのデータは、ｍＳＯＴ２０１が腫瘍微小環境において自然免疫及び適応免疫の両方を活性化することを示す。次に、本発明者らは、腫瘍微小環境における異なる免疫細胞集団の相対存在量を推定するために「メタジーン」マーカーを採用した。全トランスクリプトームの知見に従って、ｍＳＯＴ２０１処置試料を、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ｐ＜０．００１）、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞（ｐ＜０．０００５）、ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞（ｐ＝０．００１）、ＣＤ８＋ セントラルメモリーＴ細胞（ｐ＜０．００１）、γδ Ｔ細胞（ｐ＝０．０００２）、ＮＫ細胞（ｐ＜０．００１）、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ｐ＝０．０１５７）、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞（ｐ＝０．１１７６）、ＣＤ４＋エフェクターメモリーＴ細胞（ｐ＝０．００３）、Ｂ細胞（ｐ＝０．０６０２）、骨髄樹状細胞（ｐ＝０．０１２０）に関連する遺伝子セットについて濃縮した。他方、癌関連線維芽細胞に関連する遺伝子セットは著しく減少した（ｐ＝０．０２５４）（図２１Ａ）。
ｍＳＯＴ２０１は、ＭＣ３８腫瘍保持マウスの脾臓及びリンパ節において選択された免疫細胞集団の増殖を誘導した（図２１Ｂ）。樹立した腫瘍（８０～１００ｍｍ３）のｍＳＯＴ２０１処置後７日目に、フローサイトメトリによって細胞増殖（Ｋｉ６７）を検出した（ｎ＝２）。
実施例３０：ｋｉｔ２２５細胞における異なるＩＬ２／ＩＬ－１５ＲβγアゴニストのＥＣ５０値
ＲＬＩ－１５（ＳＯＴ１０１）、ＳＯＴ２０１（ＰＥＭ－ＲＬＩ－１５ＡＱＡ）、ｈＰＤ－１－ＩＬ－２ｖ及びαｈＰＤ１－ＩＬ－１５ｍ Ｍ１のＥＣ５０値を、実施例１に記載したように決定した。ｈＰＤ－１－ＩＬ－２ｖにおいて、１つのＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２ｖ（配列番号１０６）は、国際公開第２０１８／１８４９６４Ａ１号パンフレットに記載されるように、抗ヒトＰＤ－１抗体の一方の重鎖のＣ末端に融合されている（国際公開第２０１８／１８４９６４Ａ１号パンフレットの中の配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２５の配列）。αｈＰＤ１－ＩＬ－１５ｍ Ｍ１において、変異Ｎ１Ａ－Ｄ３０Ｎ－Ｅ４６Ｇ－Ｖ４９Ｒを有する１つのＩＬ－１５変異タンパク質（配列番号１０７）は、国際公開第２０１９／１６６９４６Ａ１号パンフレット（その中の図１Ｄ、その中の配列番号８９、配列番号７４及び配列番号６５を参照）に記載されるように抗ヒトＰＤ－１抗体の一方の重鎖のＣ末端に融合される。ＥＣ５０値を表３３に示す。
ＲＬＩ－１５（ＳＯＴ１０１）、ＳＯＴ２０１（ＰＥＭ－ＲＬＩ－１５ＡＱＡ）、ｈＰＤ－１－ＩＬ－２ｖ及びαｈＰＤ１－ＩＬ－１５ｍ Ｍ１のＥＣ５０値を、実施例１に記載したように決定した。ｈＰＤ－１－ＩＬ－２ｖにおいて、１つのＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２ｖ（配列番号１０６）は、国際公開第２０１８／１８４９６４Ａ１号パンフレットに記載されるように、抗ヒトＰＤ－１抗体の一方の重鎖のＣ末端に融合されている（国際公開第２０１８／１８４９６４Ａ１号パンフレットの中の配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２５の配列）。αｈＰＤ１－ＩＬ－１５ｍ Ｍ１において、変異Ｎ１Ａ－Ｄ３０Ｎ－Ｅ４６Ｇ－Ｖ４９Ｒを有する１つのＩＬ－１５変異タンパク質（配列番号１０７）は、国際公開第２０１９／１６６９４６Ａ１号パンフレット（その中の図１Ｄ、その中の配列番号８９、配列番号７４及び配列番号６５を参照）に記載されるように抗ヒトＰＤ－１抗体の一方の重鎖のＣ末端に融合される。ＥＣ５０値を表３３に示す。
試験されるさらなる興味深い候補は、変異Ｎ１Ｇ－Ｄ３０Ｎ－Ｅ４６Ｇ－Ｖ４９Ｒ－Ｅ６４Ｑを有する１つのＩＬ－１５変異タンパク質（配列番号１０８）が、国際公開第２０１９／１６６９４６Ａ１号パンフレット（その中の図１Ｃ、その中の配列番号９０、配列番号７４及び配列番号６５を参照）に記載される抗ヒトＰＤ－１抗体の一方の重鎖のＣ末端に融合されている、αｈＰＤ１－ＩＬ－１５ｍ Ｍ２である。
従って、ＳＯＴ２０１は、ｋｉｔ２２５細胞においてＰＤ１－ＩＬ－２ｖ及びαｈＰＤ１－ＩＬ－１５ｍ Ｍ１よりも実質的に低いＥＣ５０を有し、より高い投与量及びより長いインビボ半減期を可能にし、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を破壊する活性に関して、より強く、より長く持続する効果も発揮すると予想される。
実施例３１：ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるｍＳＯＴ２０１とｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγアゴニストとの比較
ｍＳＯＴ２０１（マウスＳＯＴ２０１代用物）を、対照（ＮａＣｌ）、ＩＬ－２ｖ ＩＬ－２変異タンパク質に融合した抗マウスＰＤ－１抗体ＲＭＰ１－１４（ｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγアゴニスト）、及びＲＬＩ－１５ＡＱＡとｍＰＤ１抗体との組み合わせと、実施例２８に記載した単回ＩＶ投与でＭＣ３８腫瘍モデルにおいて比較した。ｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγの投与は、健常Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける５ｍｇ／ｋｇのｍＳＯＴ２０１のＩＶ投与後の５日目のＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖に合致するように選択し、０．２５ｍｇ／ｋｇのｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγの等価用量となった。細胞増殖（Ｋｉ６７＋）はフローサイトメトリによって検出した。ｍＳＯＴ２０１はＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化を誘導し、これはｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγアゴニストとは対照的に８日目まで持続した（図２２Ｂ）。
ｍＳＯＴ２０１（マウスＳＯＴ２０１代用物）を、対照（ＮａＣｌ）、ＩＬ－２ｖ ＩＬ－２変異タンパク質に融合した抗マウスＰＤ－１抗体ＲＭＰ１－１４（ｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγアゴニスト）、及びＲＬＩ－１５ＡＱＡとｍＰＤ１抗体との組み合わせと、実施例２８に記載した単回ＩＶ投与でＭＣ３８腫瘍モデルにおいて比較した。ｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγの投与は、健常Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける５ｍｇ／ｋｇのｍＳＯＴ２０１のＩＶ投与後の５日目のＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖に合致するように選択し、０．２５ｍｇ／ｋｇのｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγの等価用量となった。細胞増殖（Ｋｉ６７＋）はフローサイトメトリによって検出した。ｍＳＯＴ２０１はＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化を誘導し、これはｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγアゴニストとは対照的に８日目まで持続した（図２２Ｂ）。
ｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγは、ＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２ｖ（配列番号１０６）が、ＩＬ－２Ｒαに対する親和性を低下させるＩＬ－２配列に対する置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（国際公開第２０１８／１８４９６４Ａ１号パンフレット、例えば、２７頁及び２８頁にまたがる段落を参照）、並びにさらなる置換、位置３におけるＯ－グリコシル化を排除するためのＴ３Ａ（２８頁及び２９頁にまたがる段落）、並びに発現又は安定性を増加させるためのＣ１２５Ａ（３０頁、３番目の段落）を含むＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニストである。
ＳＯＴ２０１のマウス代用物（ｍＳＯＴ２０１）は、ｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγアゴニストについての１０匹中５匹と比較して、単回ＩＶ投与後に１０匹のＭＣ３８腫瘍保持マウス中９匹において腫瘍退縮を誘導したが、ＲＬＩ－１５ＡＱＡとｍＰＤ１抗体との組み合わせは、対照マウスと比較して腫瘍成長の遅延のみをもたらした（図２２Ａ）。
ｍＳＯＴ２０１は、ＭＣ３８腫瘍保持マウスにおいてＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を誘導し、これは、ｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγアゴニスト、及びｍＰＤ１と組み合わせた等モル量のＲＬＩ－１５ＡＱＡとは対照的に、投与後７日間持続した。ＭＣ３８腫瘍の処置は、無作為化１日目、腫瘍体積１００ｍｍ３であった（ｎ＝１０／群）。
さらに、ｍＳＯＴ２０１は、８日目に増殖細胞の顕著な減少を示したｍＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβγアゴニストとは対照的に、８日目に依然として持続するＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の著しく長い活性化を誘導した（図２２Ｂ）。
ＳＯＴ２０１は、ＭＣ３８腫瘍保持マウスの脾臓及びリンパ節においてもＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を誘導し、これは、ｍＰＤ１－ＩＬ－２ｖ及び等モル量のＲＬＩ－１５ＡＱＡ及びｍＰＤ１抗体の組み合わせとは対照的に、投与後７日間持続した（図２２Ｃ）。
実施例３２：カニクイザルにおけるＳＯＴ２０１のＰＫプロファイル
ＳＯＴ２０１を０．６ｍｇ／ｋｇで１日目にカニクイザルにＩＶ投与し、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖（Ｋｉ６７＋）及び絶対細胞数をフローサイトメトリ及び血液学により経時的に決定した。ＳＯＴ２０１は、ＩＶ投与後にカニクイザルの血液中でＮＫ（５日目に約９０％）及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（５日目に約８０％）の高い増殖及び拡大を誘導した（図２３Ａ）。薬物動態パラメータを表３４に示す。
ＳＯＴ２０１を０．６ｍｇ／ｋｇで１日目にカニクイザルにＩＶ投与し、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖（Ｋｉ６７＋）及び絶対細胞数をフローサイトメトリ及び血液学により経時的に決定した。ＳＯＴ２０１は、ＩＶ投与後にカニクイザルの血液中でＮＫ（５日目に約９０％）及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（５日目に約８０％）の高い増殖及び拡大を誘導した（図２３Ａ）。薬物動態パラメータを表３４に示す。
ＳＯＴ２０１は、カニクイザルにおいて反復的ＩＶ投与後にＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化を誘導した（図２３Ｂ）。
実施例３３：マウスＳＯＴ２０１代用物のＰＤ活性
この研究の第１の目的は、マウス代用分子ｍＳＯＴ２０１（実施例２７参照）による処置が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１又はｍＰＤ－１による処置と比較して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖に対して相加的／相乗的効果を有するかどうかを評価することであった。研究の第２の目的は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてｍＳＯＴ２０１ ｗｔマウス代用分子の薬力学的活性をマウス代用分子ｍＰＤ１－ＩＬ２ｖと比較することであった。試験したマウス代用分子の説明を表３５に記載する。ＰＤ活性を５日目及び８日目に評価した。ＦＡＣＳ分析を上記のように実施した。
この研究の第１の目的は、マウス代用分子ｍＳＯＴ２０１（実施例２７参照）による処置が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１又はｍＰＤ－１による処置と比較して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖に対して相加的／相乗的効果を有するかどうかを評価することであった。研究の第２の目的は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてｍＳＯＴ２０１ ｗｔマウス代用分子の薬力学的活性をマウス代用分子ｍＰＤ１－ＩＬ２ｖと比較することであった。試験したマウス代用分子の説明を表３５に記載する。ＰＤ活性を５日目及び８日目に評価した。ＦＡＣＳ分析を上記のように実施した。
ペムブロリズマブはマウスＰＤ－１を認識しないので、ｈＰＤ－１－ｍＳＯＴ２０１は、同様のＰＫプロファイルを有する非結合抗体に結合したＲＬＩ－１５ＡＱＡの対照を表し、それゆえ、そのようなＰＫプロファイルを有するＲＬＩ－１５ＡＱＡ分子のＰＤ活性を反映する。ｍＰＤ－１分子は、抗ＰＤ－１抗体単独のＰＤ活性を反映する。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化に関して、ｍＳＯＴ２０１は、等モル量で投与したその単独成分代用物ｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１及びｍＰＤ－１と比較して、５日目及びさらには８日目において、相加効果より多い（すなわち相乗的）効果を示す。比較すると、５日目に予想される高い活性を考慮してより低く投与したｍＰＤ１－ＩＬ２ｖ及びｍＳＯＴ２０１ ｗｔの両方（両方ともより活性なＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニストを有する）は、５日目にＣＤ８＋ Ｔ細胞のわずかに高い活性化を示すが、そのような効果は短時間しか持続せず、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化は８日目にｍＳＯＴ２０１についてはるかに強い。活性化ＮＫ細胞を見ると、差異はそれほど顕著ではない。予想通り、ｍＰＤ－１はＮＫ細胞を活性化しないが、ｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１、ｍＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ｍＳＯＴ２０１及びｍＳＯＴ２０１ ｗｔは５日目に強く活性化し、ｍＳＯＴ２０１は他のものよりもいくらか弱い。８日目に、再びｍＳＯＴ２０１は、ｍＰＤ１－ＩＬ２ｖ及びｍＳＯＴ２０１ ｗｔと比較してＮＫ細胞のより強い活性化を示す（図２４Ａ）。
ｍＳＯＴ２０１、ｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１及びｍＰＤ－１をＡの２倍の量で投与したが、ｍＳＯＴ２０１ ｗｔ及びｍＰＤ１－ＩＬ２ｖは、実験Ａにおいて細胞の最大活性化に既に達している可能性が高いので、より低い量で投与した場合にも、同様の様子が観察された（図２４Ｂを参照）。予想通り、ｍＳＯＴ２０１ ｗｔ及びｍＰＤ１－ＩＬ２ｖは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方の活性化の低下を示し、これらの活性化は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞については、この場合も８日目に低下して対照レベルになった。
これらのデータは、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγへの結合が顕著に低下したＳＯＴ２０１がその抗ＰＤ－１部分とともにＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の強力かつ長期持続性の活性化因子であるのに対し、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニスト活性がより高い分子は、とりわけＣＤ８＋ Ｔ細胞のはるかに短い活性化を示すということを示す。シス（すなわち、同じＣＤ８＋ Ｔ細胞上）又はトランス（すなわち、近接した異なるＣＤ８＋ Ｔ細胞間）でのＰＤ－１発現ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＰＤ－１及びＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγの同時結合というアビディティー（結合活性）効果が、ＣＤ８＋ Ｔ細胞のそのような優先的な活性化をもたらすと仮定される。
実施例３４：ＰＤ－１感受性及びＰＤ－１処置耐性マウスモデルにおけるｍＳＯＴ２０１の抗腫瘍有効性活性
この研究の目的は、抗ＰＤ－１処置感受性（ＣＴ２６、ＭＣ３８）及び抗ＰＤ－１処置耐性（Ｂ１６Ｆ１０、ＣＴ２６ ＳＴＫ１１ ｋｏ）マウスモデルにおけるｍＳＯＴ２０１の抗腫瘍活性を評価することであった。試験したマウス代用分子の説明を表３７に記載する。
この研究の目的は、抗ＰＤ－１処置感受性（ＣＴ２６、ＭＣ３８）及び抗ＰＤ－１処置耐性（Ｂ１６Ｆ１０、ＣＴ２６ ＳＴＫ１１ ｋｏ）マウスモデルにおけるｍＳＯＴ２０１の抗腫瘍活性を評価することであった。試験したマウス代用分子の説明を表３７に記載する。
ＳＯＴ２０１のマウス代用分子、ｍＳＯＴ２０１、は、その単独成分代用物ｍＰＤ－１及びｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１と比較して、試験したＰＤ－１感受性腫瘍モデルＣＴ２６及びＭＣ３８において相乗効果を示し、１０匹中５匹及び１０匹中９匹で完全奏効を示す（図２５Ａ）。
抗ＰＤ－１療法に耐性であることが公知である腫瘍モデルにおいてさえ、ｍＳＯＴ２０１は、その単独成分と比較して相乗効果を示したが、治療効果は上記感受性モデルほど強くはなく、Ｂ１６Ｆ１０モデルについて１０匹のマウスのうち１匹のみが完全奏効を示した。
実施例３５：ｍＳＯＴ２０１対ＲＬＩ－１５ＡＱＡ変異タンパク質＋抗ＰＤ－１抗体の抗腫瘍有効性活性
この研究の目的は、ＭＣ３８マウスモデルにおけるｍＳＯＴ２０１対ＲＬＩ－１５ ＡＱＡ変異タンパク質＋抗ＰＤ－１処置の抗腫瘍活性を評価することであった。試験したマウス代用分子の説明を表３８に記載する。
この研究の目的は、ＭＣ３８マウスモデルにおけるｍＳＯＴ２０１対ＲＬＩ－１５ ＡＱＡ変異タンパク質＋抗ＰＤ－１処置の抗腫瘍活性を評価することであった。試験したマウス代用分子の説明を表３８に記載する。
抗ＰＤ－１部分とＩＬ－２／ＩＬ－１５βγアゴニストＲＬＩ－１５ＡＱＡとの融合（２用量、Ｇ２及びＧ３）は、個々の等モル量の成分の組み合わせ（Ｇ４：ＲＬＩ－１５ＡＱＡ＋ｍＰＤ１、又はＧ１１：ｈＰＤ１－ｍＳＯＴ２０１＋ｍＰＤ１）と比較して強い相乗効果を示した。図２６参照。ＰＤ－１陽性免疫細胞の活性化の時間的及び空間的連鎖は、個々の成分による免疫細胞の活性化よりも機構的に強いと仮定される。
実施例３６：ｍＳＯＴ２０１対ＳＯＴ１０１＋抗ＰＤ－１抗体の抗腫瘍有効性活性
この研究の目的は、ＭＣ３８マウスモデルにおけるｍＳＯＴ２０１対ＳＯＴ１０１＋抗ＰＤ－１処置の抗腫瘍活性を評価することであった。試験したマウス代用分子の説明を表３９に記載する。
この研究の目的は、ＭＣ３８マウスモデルにおけるｍＳＯＴ２０１対ＳＯＴ１０１＋抗ＰＤ－１処置の抗腫瘍活性を評価することであった。試験したマウス代用分子の説明を表３９に記載する。
２ｍｇ／ｋｇのｍＳＯＴ２０１の単回投与（Ｇ３）は、１ｍｇ／ｋｇのＲＬＩ２ＡＱの４回投与＋５ｍｇ／ｋｇのｍＰＤ１の単回投与（Ｇ８）又は１ｍｇ／ｋｇのＲＬＩ２ＡＱの４回投与＋５ｍｇ／ｋｇのｍＰＤ１の４回投与（Ｇ９）による併用療法とほぼ同じ治療効果を示した。しかしながら、５ｍｇ／ｋｇのｍＳＯＴ２０１の単回投与（Ｇ２）は、個々の成分の複数回投与（Ｇ８及びＧ９）よりも性能が優れている。
実施例３７：ｍＳＯＴ２０１対ＳＯＴ１０１＋抗ＰＤ－１抗体処置の下での免疫細胞活性化の差異に関する機構研究
この研究の目的は、ＭＣ３８マウスモデルにおいて同様の有効用量のｍＳＯＴ２０１対ＳＯＴ１０１＋抗ＰＤ－１処置の抗腫瘍活性を評価することであった。試験したマウス代用分子の説明は表３９に記載されている。
この研究の目的は、ＭＣ３８マウスモデルにおいて同様の有効用量のｍＳＯＴ２０１対ＳＯＴ１０１＋抗ＰＤ－１処置の抗腫瘍活性を評価することであった。試験したマウス代用分子の説明は表３９に記載されている。
両方の処置における様々な免疫細胞集団の相対数の差を、腫瘍、脾臓及びリンパ節において検出した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びαβＴＣＲ保有ＣＤ３＋細胞の相対的増殖は、脾臓及びリンパ節において両方の処置の間で変化しなかった。しかしながら、腫瘍において、ｍＳＯＴ２０１は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞のより高い相対的増加を誘導したが、ＲＬＩ２ＡＱ＋抗ＰＤ－１処置の組み合わせはより多くのＮＫ細胞を増加させた。興味深いことに、ｍＳＯＴ２０１は、脾臓及びリンパ節においてより高い割合のγδＴＣＲ保有ＣＤ３＋細胞を誘導したが、ＲＬＩ２ＡＱ＋抗ＰＤ－１併用処置は、主に腫瘍においてより高い割合のγδＴＣＲ保有ＣＤ３＋細胞を誘導した（図２８参照）。
実施例３８：免疫原性を決定するためのＤＣ－Ｔ細胞ベースのアッセイ及びＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ（フルオロスポット）アッセイ
この研究の目的は、１つのＲＬＩ－１５変異タンパク質を有するペムブロリズマブベースの免疫サイトカイン（ＰＥＭ－ＲＬＩ－１５候補分子）の免疫原性リスクをインビトロで評価することであった。ＤＣ－Ｔ細胞アッセイ法をこの目的に使用し、試験産物をまず未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）とともにインキュベートし、成熟ＤＣ（ｍＤＣ）のＭＨＣ分子に負荷した候補分子のプロセシングされたペプチドとして、自己Ｔ細胞に後で提示させた。７日間の共インキュベーション期間の後、Ｔ細胞増殖を抗薬物抗体形成の代理マーカーとして測定した。ＤＣによって誘導されるＴ細胞増殖の検出を使用して、結果に強い影響を及ぼし得る試験系におけるＲＬＩ－１５成分の刺激活性を軽減したが、この強い影響は免疫原性に起因するものではない。キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）を陽性対照として使用した。これは、ＫＬＨは強い免疫応答誘導を誘導することが公知であるからである。ペムブロリズマブを陰性対照として使用した。タンパク質を負荷しなかった対照ＤＣを、非特異的Ｔ細胞増殖の評価のための対照として使用した。
この研究の目的は、１つのＲＬＩ－１５変異タンパク質を有するペムブロリズマブベースの免疫サイトカイン（ＰＥＭ－ＲＬＩ－１５候補分子）の免疫原性リスクをインビトロで評価することであった。ＤＣ－Ｔ細胞アッセイ法をこの目的に使用し、試験産物をまず未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）とともにインキュベートし、成熟ＤＣ（ｍＤＣ）のＭＨＣ分子に負荷した候補分子のプロセシングされたペプチドとして、自己Ｔ細胞に後で提示させた。７日間の共インキュベーション期間の後、Ｔ細胞増殖を抗薬物抗体形成の代理マーカーとして測定した。ＤＣによって誘導されるＴ細胞増殖の検出を使用して、結果に強い影響を及ぼし得る試験系におけるＲＬＩ－１５成分の刺激活性を軽減したが、この強い影響は免疫原性に起因するものではない。キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）を陽性対照として使用した。これは、ＫＬＨは強い免疫応答誘導を誘導することが公知であるからである。ペムブロリズマブを陰性対照として使用した。タンパク質を負荷しなかった対照ＤＣを、非特異的Ｔ細胞増殖の評価のための対照として使用した。
表４０によるＰＥＭ－ＲＬＩ－１５候補分子を、ｉＤＣの刺激のためにそれぞれ２つの濃度で使用した。ＤＣの成熟は、炎症誘発性サイトカインによって誘導した。２４時間後、ｍＤＣを洗浄し、ＣＦＳＥで予め染色した自己ＣＤ４＋ Ｔ細胞とインキュベートした。Ｔ細胞の増殖を、７日後にフローサイトメトリによるＣＦＳＥ検出に基づいて評価した。
このアッセイは、ＲＬＩ Ｎ６５Ａ変異タンパク質のまだなお高すぎる活性が直接的なＴ細胞活性化及びＲＬＩ－１５活性への波及（ｓｐｉｌｌ ｏｖｅｒ）を生じるため、ＳＯＴ２０１（ＰＥＭ Ｌ－ＲＬＩ Ｎ６５Ａ ｘ１）では実施することができなかった。
ヒトＣＤ１４＋単球（３回の別々の実験から１１人の健常ドナー）から生成したＤＣを、１０μｇ／ｍｌ（図示せず）又は５０μｇ／ｍｌのＰＥＭ－ＲＬＩ－１５候補分子、ペムブロリズマブ又はＫＬＨとともに２４時間、成熟シグナル（炎症誘発性サイトカインＴＮＦα及びＩＬ－１β）の存在下でインキュベートした。続いて、タンパク質を負荷した洗浄したｍＤＣを、自己ＣＦＳＥ染色ＣＤ４＋ Ｔ細胞とともに培養した。７日後にフローサイトメトリによってＴ細胞増殖を測定した。ＣＦＳＥｌｏｗ細胞を、細胞周期をまわっている細胞とみなして、増殖するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合をＣＦＳＥシグナルに基づいて評価した。ＫＬＨを陽性対照として使用し、ペムブロリズマブを陰性対照として使用した（図２９参照）。ＰＥＭ－ＲＬＩ－１５候補分子ＰＥＭ Ｌ－ＲＬＩ ＤＡＮＡ ｘ１／ＰＥＭ ＬＹ－ＲＬＩ ＤＡＮＡ ｘ１は、陰性対照と比較して、Ｔ細胞の有意な増殖を誘導せず、これは、低い免疫原性リスクを反映していた（１１人のドナーのうちの１人において検出された陽性応答）。候補分子ＰＥＭ ＬＹ－ＲＬＩ ＤＡＮＡＱＤ ｘ１は、陰性対照と比較してＴ細胞の有意な増殖を誘導し（ｐ＝０．０２０８、対応のあるｔ検定）、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγへの結合を低下させるための３つの変異を有するこのＲＬＩ－１５変異タンパク質についての潜在的な免疫原性リスクを指摘した（１１人のドナーのうちの４人において検出された陽性応答）。
過度に活性なＲＬＩ－１５変異タンパク質は免疫応答を刺激しているので、ＤＣ－Ｔ細胞アッセイは、ＲＬＩ－１５（野生型配列）と比較してＲＬＩ－１５ＡＱＡの免疫原性を試験するのに適していない。従って、置換が導入されたペプチドの対を、置換にまたがって生成し、Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイにおいて試験した。
４０人のドナーのＣＤ８枯渇ＰＢＭＣを播種し、ＲＰＭＩ＋１０％ｈｕＡｂ及びＩＬ－７中で試験ペプチドとともにインキュベートした。培地を、１日目にＩＬ－７について更新（リフレッシュ）し、４日目にＩＬ－７及びＩＬ－２について更新した。７日目に、ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣを回収し、一晩静置し、翌日ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレート上に播種し、ペプチドで再刺激した。９日目に、ＩＮＦ－γ及びＴＮＦ－α ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレートを発色させた。
図２９Ｂは、すべての試験条件について信頼区間が０と重なることを示し、これは、変異体ペプチドを対合した野生型配列と比較すると、平均ｄＳＦＵのシフトの証拠がないことを意味する。それゆえ、Ｎ６５Ａ置換及びＧ１７５Ａ／Ｎ１７６Ｑ置換対の両方について、免疫原性の関連する増加は見られない。
図２９Ｂは、すべての試験条件について信頼区間が０と重なることを示し、これは、変異体ペプチドを対合した野生型配列と比較すると、平均ｄＳＦＵのシフトの証拠がないことを意味する。それゆえ、Ｎ６５Ａ置換及びＧ１７５Ａ／Ｎ１７６Ｑ置換対の両方について、免疫原性の関連する増加は見られない。
実施例３９：異なる抗ＰＤ－１ ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニスト免疫サイトカインの効力
以下の抗ＰＤ－１ ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニスト免疫サイトカイン（表４２）を作製して、それらの活性を比較した。
以下の抗ＰＤ－１ ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニスト免疫サイトカイン（表４２）を作製して、それらの活性を比較した。
抗ＰＤ－１ ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニスト免疫サイトカインの効力を、ｋｉｔ２２５細胞（表４３参照）及びｈＰＢＭＣ（表４４参照）で決定した。
実施例４０：抗ＰＤ－１ ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニスト免疫サイトカインのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断活性
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の遮断活性を評価するために、抗ＰＤ－１ ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニスト免疫サイトカインを、上記のようにＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号Ｊ１２５０）を使用して試験した。結果を表４５に示す。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の遮断活性を評価するために、抗ＰＤ－１ ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニスト免疫サイトカインを、上記のようにＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号Ｊ１２５０）を使用して試験した。結果を表４５に示す。
ＳＯＴ２０１は、３つの試験した抗ＰＤ－１ ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニスト免疫サイトカインのうちで最も高いＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断活性を示す。
実施例４１：ｋｉｔ２２５細胞に対する改変されたエフェクター機能を有するヒト及びマウス代用物ＳＯＴ２０２分子の効力
ＳＯＴ２０２は、ｋｎｏｂ重鎖のＣ末端でＲＬＩ－１５ＡＱＡに融合した、重鎖のＴ３６６Ｗ－ｋｎｏｂ／Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ－ｈｏｌｅ置換を有し、末端Ｋを欠失したヒト化ＩｇＧ１ ｈＣｌ１ａに由来する抗体（配列番号１１１、配列番号１１０及び配列番号８８を参照）を有するヘテロ二量体免疫サイトカインである。以下の実施例において、ＳＯＴ２０２－ＸＸＸという用語は、表１３に示すＲＬＩ２におけるＤＡＮＡ変異等のさらなる修飾変異がＳＯＴ２０２になされた分子を示す。明確にするために、ＳＯＴ２０２－ＤＡＮＡは、追加のＤＡ（Ｄ６１Ａ）変異のみがＳＯＴ２０２と異なるが、これは、ＳＯＴ２０２がすでにＮＡ（Ｎ６５Ａ）変異を含むためである（番号はＩＬ－１５番号付けを指す）。示した、抗体のＡＤＣＣ特性を改変するＩｇＧ１分子のエフェクタードメインにおける変異、例えば、表２に示すＡＡＡ、ＤＥ及びＤＬＥ変異。用語「ａｆｕｃ」は、脱フコシル化ＩｇＧ１分子を表す。脱フコシル化抗体も、改変されたＡＤＣＣ特性を有する。
ＳＯＴ２０２は、ｋｎｏｂ重鎖のＣ末端でＲＬＩ－１５ＡＱＡに融合した、重鎖のＴ３６６Ｗ－ｋｎｏｂ／Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ－ｈｏｌｅ置換を有し、末端Ｋを欠失したヒト化ＩｇＧ１ ｈＣｌ１ａに由来する抗体（配列番号１１１、配列番号１１０及び配列番号８８を参照）を有するヘテロ二量体免疫サイトカインである。以下の実施例において、ＳＯＴ２０２－ＸＸＸという用語は、表１３に示すＲＬＩ２におけるＤＡＮＡ変異等のさらなる修飾変異がＳＯＴ２０２になされた分子を示す。明確にするために、ＳＯＴ２０２－ＤＡＮＡは、追加のＤＡ（Ｄ６１Ａ）変異のみがＳＯＴ２０２と異なるが、これは、ＳＯＴ２０２がすでにＮＡ（Ｎ６５Ａ）変異を含むためである（番号はＩＬ－１５番号付けを指す）。示した、抗体のＡＤＣＣ特性を改変するＩｇＧ１分子のエフェクタードメインにおける変異、例えば、表２に示すＡＡＡ、ＤＥ及びＤＬＥ変異。用語「ａｆｕｃ」は、脱フコシル化ＩｇＧ１分子を表す。脱フコシル化抗体も、改変されたＡＤＣＣ特性を有する。
ｋｉｔ２２５細胞の増殖の誘導に対するヒト及びマウス代用物のＳＯＴ２０２ ＡＤＣＣ改変分子の活性を実施例１に記載のように評価し、ＥＣ５０及びＳＯＴ１０１と比較した相対的効力を表４６及び表４７に示す。マウスＳＯＴ２０２は、ＳＯＴ２０２のヒトｈＩｇＧ１定常ドメインをそのマウス等価物のｍＩｇＧ２ａで置き換えることによって生成した（ｍＳＯＴ２０２：配列番号１１２、配列番号１２８及び配列番号１２９；ｍＳＯＴ２０２０ ＬＡＬＡＰＧ：配列番号１３０、配列番号１３１及び配列番号１２９；ｍＳＯＴ２０２アイソタイプ：ｍＳＯＴ２０２アイソタイプＨＣ ｋｎｏｂ、配列番号１３３及び配列番号１３４；ｍＳＯＴ２０２ ＬＡＬＡＰＧアイソタイプ：配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３４）。
この効力アッセイは、ＳＯＴ２０２がｋｉｔ２２５細胞に対してＳＯＴ２０１と同じ効力（表３６参照）を示すこと、及びＡＤＣＣ改変が免疫サイトカインの効力に影響を及ぼさなかったことを示す。それゆえ、このツールボックスは、ｋｉｔ２２５細胞の活性化に関する免疫サイトカインの効力に影響を及ぼすことなく、抗体のＡＤＣＣ活性を調整することを可能にする。
ヒトＳＯＴ２０２については、ＡＤＣＣ改変（ＬＡＬＡＰＧ変異）は、ｋｉｔ２２５細胞の活性化に関してマウスＳＯＴ２０２代用物の効力に影響を及ぼさなかった。しかしながら、マウスＳＯＴ２０２代用物は、それらのヒト対応物よりも効力が低い。これは、ヒトＮＫ細胞及びマウスＮＫ細胞でＩＬ－１５Ｒβγとの同時シグナル伝達に必要とされるＣＤ１６をｋｉｔ２２５細胞が発現しないことによる可能性が高い。
実施例４２：ヒトＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に対するヒトＳＯＴ２０２ ＡＤＣＣ改変分子の効力
ヒトＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖の誘導に対するヒトＳＯＴ２０２ ＡＤＣＣ改変分子の活性を実施例１に記載したように（ｈＰＢＭＣ効力アッセイ）評価し、ＥＣ５０及びＳＯＴ２０２と比較した相対的効力を図３０及び表４８に示す。
ヒトＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖の誘導に対するヒトＳＯＴ２０２ ＡＤＣＣ改変分子の活性を実施例１に記載したように（ｈＰＢＭＣ効力アッセイ）評価し、ＥＣ５０及びＳＯＴ２０２と比較した相対的効力を図３０及び表４８に示す。
ＡＤＣＣを増強するＤＬＥ及びＤＥ変異を有するＳＯＴ２０２－ＤＡＮＡは、ＡＤＣＣ改変のないＳＯＴ２０２－ＤＡＮＡと比較して、ヒトＮＫ細胞活性を大きく増加させた。脱フコシル化ＳＯＴ２０２もＡＤＣＣ活性を増加させたが、その程度はＤＥ及びＤＬＥ変異よりも低かった。他方、ＡＤＣＣを低下させる変異、例えばＬＡＬＡＰＧ変異は、ＮＫ細胞の活性化をほとんど消失させた。これらの変異は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化に対してわずかな効果しか有さなかった。理論に束縛されるものではないが、増強する変異によるＣＤ１６受容体へのより高い結合は、ＩＬ－１５Ｒβγシグナル伝達と相乗作用すると想定される。
実施例４３：ＳＯＴ２０１分子と比較したヒトＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に対するヒトＳＯＴ２０２分子の効力
ヒトＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖の誘導に対するヒトＳＯＴ２０２分子の活性をＳＯＴ２０１の活性と比較した。ＥＣ５０並びにＳＯＴ２０２及びＳＯＴ２０１と比較した相対的効力を図３１及び表４９に示す。
ヒトＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖の誘導に対するヒトＳＯＴ２０２分子の活性をＳＯＴ２０１の活性と比較した。ＥＣ５０並びにＳＯＴ２０２及びＳＯＴ２０１と比較した相対的効力を図３１及び表４９に示す。
ヒトＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖の誘導に対するヒトＳＯＴ２０２分子の活性をＳＯＴ２０１－ＤＡＮＡの活性と比較した。ＥＣ５０並びにＳＯＴ２０２及びＳＯＴ２０１と比較した相対的効力を図３２及び表４９に示す。ＮＡ変異のみを有する分子と比較して、ＤＡＮＡ変異を有する分子の刺激活性の低下は、先の実施例において既に記載したように、この変異のより低い刺激活性を確認する。脱フコシル化を介して増強されたＡＤＣＣ活性を有するＳＯＴ２０２分子（ＮＡ変異を有するＳＯＴ２０２）はＮＫ細胞活性を増加させるが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性を増加させず、実施例４２に示す結果を確認する。ＳＯＴ２０１は、ＩｇＧ４抗体に基づき、従って、ＩｇＧ４抗体は、固有の低いＡＤＣＣ活性を有する。
ＳＯＴ２０２及びＳＯＴ２０１分子は、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞に対して同じ効力を有するが、ＮＫ細胞に対しては同じではない。脱フコシル化はヒトＮＫ細胞活性を増加させた。
実施例４４：ｍＳＯＴ２０２は、健常Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓における免疫細胞を活性化する
マウスＳＯＴ２０２は、ＳＯＴ２０２のヒトｈＩｇＧ１定常ドメインをそのマウス等価物のｍＩｇＧ２ａ（配列番号１２７、配列番号１２８及び配列番号１２９）で置き換えることによって生成した。細胞増殖（Ｋｉ６７）を、健常Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける５、１０又は２０ｍｇ／ｋｇのｍＳＯＴ２０２の化合物のＩＶ注射の５日後に、フローサイトメトリによって脾臓において検出した。ｍＳＯＴ２０２は、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の用量依存性刺激を示した（図３３（Ａ）及び（Ｂ））。
マウスＳＯＴ２０２は、ＳＯＴ２０２のヒトｈＩｇＧ１定常ドメインをそのマウス等価物のｍＩｇＧ２ａ（配列番号１２７、配列番号１２８及び配列番号１２９）で置き換えることによって生成した。細胞増殖（Ｋｉ６７）を、健常Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける５、１０又は２０ｍｇ／ｋｇのｍＳＯＴ２０２の化合物のＩＶ注射の５日後に、フローサイトメトリによって脾臓において検出した。ｍＳＯＴ２０２は、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の用量依存性刺激を示した（図３３（Ａ）及び（Ｂ））。
実施例４５：ｍＳＯＴ２０２は、ＡＤＣＣ活性とＮＫ細胞増殖に対するＲＬＩ２刺激との間の相乗作用を誘導する
細胞増殖（Ｋｉ６７）を、健常Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける５ｍｇ／ｋｇのｍＳＯＴ２０２分子のＩＶ注射の５日後及び１０日後にフローサイトメトリによって脾臓において検出した。ｍＳＯＴ２０２（ｈＣｌ１ａ－ｍＩｇＧ２ａ－ＮＡ １ｘ）のＮＫ細胞に対する増殖活性は、ｍＳＯＴ２０２－ＬＡＬＡＰＧ（ＡＤＣＣ活性を有さないｈＣｌ１ａ－ｍＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡＰＧ－ＮＡ １ｘ）の効果に加えたｈＣｌ１ａ－ｍＩｇＧ２ａ（ＲＬＩ２なしの分子）の効果よりも高く、これは、ｍＳＯＴ２０２中の抗体のＡＤＣＣ活性と、ＣＤ１６シグナル伝達によると考えられるＲＬＩ２の増殖活性との間の相乗作用を示す（図３４（Ａ））。それゆえ、ＡＤＣＣは、ＮＫ細胞の活性の増加に寄与する可能性がある。ＣＤ８＋ Ｔ細胞刺激については、相乗作用は、この実験モデルでは測定できなかった（図３４（Ｂ））。
細胞増殖（Ｋｉ６７）を、健常Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける５ｍｇ／ｋｇのｍＳＯＴ２０２分子のＩＶ注射の５日後及び１０日後にフローサイトメトリによって脾臓において検出した。ｍＳＯＴ２０２（ｈＣｌ１ａ－ｍＩｇＧ２ａ－ＮＡ １ｘ）のＮＫ細胞に対する増殖活性は、ｍＳＯＴ２０２－ＬＡＬＡＰＧ（ＡＤＣＣ活性を有さないｈＣｌ１ａ－ｍＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡＰＧ－ＮＡ １ｘ）の効果に加えたｈＣｌ１ａ－ｍＩｇＧ２ａ（ＲＬＩ２なしの分子）の効果よりも高く、これは、ｍＳＯＴ２０２中の抗体のＡＤＣＣ活性と、ＣＤ１６シグナル伝達によると考えられるＲＬＩ２の増殖活性との間の相乗作用を示す（図３４（Ａ））。それゆえ、ＡＤＣＣは、ＮＫ細胞の活性の増加に寄与する可能性がある。ＣＤ８＋ Ｔ細胞刺激については、相乗作用は、この実験モデルでは測定できなかった（図３４（Ｂ））。
本発明は、以下の実施形態によって説明される。
１． 免疫サイトカインであって、
ａ． インターロイキン１５（ＩＬ－１５）又はその誘導体及びインターロイキン１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）又はその誘導体のｓｕｓｈｉドメインを含むポリペプチドを含むコンジュゲートと、
ｂ． 抗体又はその機能的多様体であって、
ｉ． ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、
ｉｉ． 改変されたエフェクター機能、及び／若しくは
ｉｉｉ． 増加したインビボ半減期
を特徴とする抗体又はその機能的多様体と
を含み、
上記コンジュゲートは、両方の抗体重鎖若しくは抗体軽鎖のＣ末端に、若しくはｉ．の場合、１つの抗体重鎖のＣ末端に直接的又は間接的に融合されている
免疫サイトカイン。
ａ． インターロイキン１５（ＩＬ－１５）又はその誘導体及びインターロイキン１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）又はその誘導体のｓｕｓｈｉドメインを含むポリペプチドを含むコンジュゲートと、
ｂ． 抗体又はその機能的多様体であって、
ｉ． ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、
ｉｉ． 改変されたエフェクター機能、及び／若しくは
ｉｉｉ． 増加したインビボ半減期
を特徴とする抗体又はその機能的多様体と
を含み、
上記コンジュゲートは、両方の抗体重鎖若しくは抗体軽鎖のＣ末端に、若しくはｉ．の場合、１つの抗体重鎖のＣ末端に直接的又は間接的に融合されている
免疫サイトカイン。
２． 上記改変されたエフェクター機能は低下した抗体依存性細胞傷害活性であり、上記抗体又はその機能的多様体は、
ａ． ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ若しくはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓから選択される変異を含むか、
ｂ． ＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ若しくはＥ２３３Ｐ／Ｆ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｒ４０９Ｋから選択される変異を含むか、
ｃ． ＩｇＧ２（ＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧ２ｂ）及びＩｇＧ４のハイブリッド若しくはその機能的多様体であり、ＩｇＧ２由来のＣＨ１及びヒンジ領域を含み、ＣＨ２及びＣＨ３領域はＩｇＧ４由来である（ＩｇＧ２アミノ酸１１８～２６０及びＩｇＧ４アミノ酸２６１～４４７）か、又は
ｄ． ＩｇＧ２抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ若しくはＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓから選択される変異を含み、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
実施形態１に記載の免疫サイトカイン。
ａ． ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ若しくはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓから選択される変異を含むか、
ｂ． ＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ若しくはＥ２３３Ｐ／Ｆ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｒ４０９Ｋから選択される変異を含むか、
ｃ． ＩｇＧ２（ＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧ２ｂ）及びＩｇＧ４のハイブリッド若しくはその機能的多様体であり、ＩｇＧ２由来のＣＨ１及びヒンジ領域を含み、ＣＨ２及びＣＨ３領域はＩｇＧ４由来である（ＩｇＧ２アミノ酸１１８～２６０及びＩｇＧ４アミノ酸２６１～４４７）か、又は
ｄ． ＩｇＧ２抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ若しくはＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓから選択される変異を含み、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
実施形態１に記載の免疫サイトカイン。
３． 上記抗体又はその機能的多様体は、
（ａ）ＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ変異を含むか、又は
（ｂ）ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む
実施形態２に記載の免疫サイトカイン。
（ａ）ＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ変異を含むか、又は
（ｂ）ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む
実施形態２に記載の免疫サイトカイン。
４． 上記改変されたエフェクター機能は増強された抗体依存性細胞傷害活性であり、上記抗体又はその機能的多様体は、
ａ． ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、一方の重鎖において、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ若しくはＬ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａから、
好ましくは、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅから選択される変異を含み、他方の重鎖において、Ｄ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ／Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅ変異をさらに含み、かつ／又は
ｂ． 脱フコシル化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
実施形態１に記載の免疫サイトカイン。
ａ． ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、一方の重鎖において、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ若しくはＬ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａから、
好ましくは、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅから選択される変異を含み、他方の重鎖において、Ｄ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ／Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅ変異をさらに含み、かつ／又は
ｂ． 脱フコシル化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
実施形態１に記載の免疫サイトカイン。
５． 上記ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、ＫｉＨ、ＫｉＨＳ－Ｓ、ＨＡ－ＴＦ、ＺＷ１、７．８．６０、ＤＤ－ＫＫ、ＥＷ－ＲＶＴ、ＥＷ－ＲＶＴＳ－Ｓ、ＳＥＥＤ及びＡ１０７、好ましくはＫｉＨから選択される、実施形態１から実施形態４のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
６． 上記ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、ホモ二量体Ｆｃドメインを有する免疫サイトカインと比較して、細胞培養における発現時に上記免疫サイトカインのより高い収率をもたらす、実施形態１から実施形態５のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
７． 上記免疫サイトカインの半減期が増加し、上記抗体又はその機能的多様体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体又はその機能的多様体であり、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ又はＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌから選択される変異を含み、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
実施形態１から実施形態６のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
番号付けはＥＵ番号付けに従う
実施形態１から実施形態６のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
８． 上記抗体又はその機能的多様体は、低下した抗体依存性細胞傷害活性を有し、上記抗体又はその機能的多様体は、ＩｇＧ４抗体又はその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ変異及びＫｉＨヘテロ二量体化Ｆｃドメインを含む、実施形態１から実施形態３のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
９． 上記コンジュゲートは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン又はその誘導体と、リンカーと、上記ＩＬ－１５又はその誘導体とを含む融合タンパク質であり、好ましくは、上記ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインは配列番号５の配列を含み、
上記リンカーは、１８～２２アミノ酸の長さを有し、好ましくはグリシン又はセリン及びグリシンから構成され、より好ましくは配列番号７の配列を有し、上記ＩＬ－１５は配列番号２の配列を有する
実施形態１から実施形態８のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
上記リンカーは、１８～２２アミノ酸の長さを有し、好ましくはグリシン又はセリン及びグリシンから構成され、より好ましくは配列番号７の配列を有し、上記ＩＬ－１５は配列番号２の配列を有する
実施形態１から実施形態８のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１０． 上記ＩＬ－１５多様体は、
ａ． 翻訳後修飾に関して上記ＩＬ－１５多様体の均質性を増加させる少なくとも１つの変異であって、
好ましくは、この変異は、ＩＬ－１５（配列番号２）のＮ７７における脱アミド化及び／若しくはＮ７９におけるグリコシル化を低減し、
より好ましくは、上記変異は、変異Ｇ７８Ａ、Ｇ７８Ｖ、Ｇ７８Ｌ又はＧ７８Ｉ、及びＮ７９Ｑ、Ｎ７９Ｓ若しくはＮ７９Ｔから選択され、
最も好ましくは、上記変異はＧ７８Ａ／Ｎ７９Ｑである、少なくとも１つの変異、並びに／又は
ｂ． ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及び／若しくはγｃ受容体への結合を低下させる少なくとも１つの変異であって、
好ましくは、この変異アミノ酸は、ＩＬ－１５（配列番号２）のＮ１、Ｎ４、Ｓ７、Ｄ８、Ｋ１０、Ｋ１１、Ｄ３０、Ｄ６１、Ｅ６４、Ｎ６５、Ｌ６９、Ｎ７２、Ｅ９２、Ｑ１０１、Ｑ１０８、Ｉ１１１から選択され、より好ましくは上記変異アミノ酸は、Ｄ６１、Ｎ６５及びＱ１０１から選択され、最も好ましくは上記変異アミノ酸はＮ６５である、少なくとも１つの変異
を含む、実施形態１から実施形態９のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
ａ． 翻訳後修飾に関して上記ＩＬ－１５多様体の均質性を増加させる少なくとも１つの変異であって、
好ましくは、この変異は、ＩＬ－１５（配列番号２）のＮ７７における脱アミド化及び／若しくはＮ７９におけるグリコシル化を低減し、
より好ましくは、上記変異は、変異Ｇ７８Ａ、Ｇ７８Ｖ、Ｇ７８Ｌ又はＧ７８Ｉ、及びＮ７９Ｑ、Ｎ７９Ｓ若しくはＮ７９Ｔから選択され、
最も好ましくは、上記変異はＧ７８Ａ／Ｎ７９Ｑである、少なくとも１つの変異、並びに／又は
ｂ． ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及び／若しくはγｃ受容体への結合を低下させる少なくとも１つの変異であって、
好ましくは、この変異アミノ酸は、ＩＬ－１５（配列番号２）のＮ１、Ｎ４、Ｓ７、Ｄ８、Ｋ１０、Ｋ１１、Ｄ３０、Ｄ６１、Ｅ６４、Ｎ６５、Ｌ６９、Ｎ７２、Ｅ９２、Ｑ１０１、Ｑ１０８、Ｉ１１１から選択され、より好ましくは上記変異アミノ酸は、Ｄ６１、Ｎ６５及びＱ１０１から選択され、最も好ましくは上記変異アミノ酸はＮ６５である、少なくとも１つの変異
を含む、実施形態１から実施形態９のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１１． 上記ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及び／又は上記γｃ受容体への結合を低下させる上記少なくとも１つの変異は、Ｎ１Ｄ、Ｎ１Ａ、Ｎ１Ｇ、Ｎ４Ｄ、Ｓ７Ｙ、Ｓ７Ａ、Ｄ８Ａ、Ｄ８Ｎ、Ｋ１０Ａ、Ｋ１１Ａ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ａ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｅ、Ｎ６５Ｒ、Ｎ６５Ｋ、Ｌ６９Ｒ、Ｎ７２Ｒ、Ｑ１０１Ｄ、Ｑ１０１Ｅ、Ｑ１０８Ｄ、Ｑ１０８Ａ、Ｑ１０８Ｅ及びＱ１０８Ｒ、好ましくはＤ８Ａ、Ｄ８Ｎ、Ｄ６１Ａ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ７２Ｒ、Ｑ１０１Ｄ、Ｑ１０１Ｅ及びＱ１０８Ａ、より好ましくはＤ６１Ａ、Ｎ６５Ａ及びＱ１０１Ｄ、最も好ましくはＮ６５Ａから選択される置換、又はＤ８Ｎ／Ｎ６５Ａ、Ｄ６１Ａ／Ｎ６５Ａ若しくはＤ６１Ａ／Ｎ６５Ａ／Ｑ１０１Ｄから選択される組み合わされた置換である、実施形態１から実施形態１０のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１２． 上記抗体又はその機能的多様体は、
ａ． 好ましくはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＯＬＲ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＥＡ、ＧＤ２、Ｏ－アセチル－ＧＤ－２、ＧＭ１、ＣＡＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ｃ－ＭＥＴ、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８から選択される腫瘍抗原に結合するか、
ｂ． 好ましくはＦＡＰ、フィブロネクチンのＥＤＡドメイン、フィブロネクチンのＥＤＢドメイン及びＬＲＲＣ１５、好ましくはＦＡＰ及びフィブロネクチンのＥＤＢドメインから選択される腫瘍細胞外マトリックス抗原に結合するか、
ｃ． 血管新生抗原、好ましくはＶＥＧＦ、又はエンドグリンに結合するか、
ｄ． 免疫調節抗体又はその機能的多様体であり、
上記免疫調節抗体は、共刺激受容体を刺激し、好ましくはＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ１３７／４－１ＢＢアゴニスト、ＣＤ１３４／ＯＸ４０アゴニスト及びＴＮＦＲＳＦ１８／ＧＩＴＲアゴニストから選択されるか、又は
上記免疫調節抗体は、免疫抑制受容体を阻害し、好ましくはＰＤ－１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニスト、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト、阻害性ＫＩＲアンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＨＡＶＣＲ２アンタゴニスト及びＡＤＯＲＡ２Ａアンタゴニスト、より好ましくはＰＤ－１アンタゴニストから選択される
実施形態１から実施形態１１のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
ａ． 好ましくはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＯＬＲ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＥＡ、ＧＤ２、Ｏ－アセチル－ＧＤ－２、ＧＭ１、ＣＡＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ｃ－ＭＥＴ、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８から選択される腫瘍抗原に結合するか、
ｂ． 好ましくはＦＡＰ、フィブロネクチンのＥＤＡドメイン、フィブロネクチンのＥＤＢドメイン及びＬＲＲＣ１５、好ましくはＦＡＰ及びフィブロネクチンのＥＤＢドメインから選択される腫瘍細胞外マトリックス抗原に結合するか、
ｃ． 血管新生抗原、好ましくはＶＥＧＦ、又はエンドグリンに結合するか、
ｄ． 免疫調節抗体又はその機能的多様体であり、
上記免疫調節抗体は、共刺激受容体を刺激し、好ましくはＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ１３７／４－１ＢＢアゴニスト、ＣＤ１３４／ＯＸ４０アゴニスト及びＴＮＦＲＳＦ１８／ＧＩＴＲアゴニストから選択されるか、又は
上記免疫調節抗体は、免疫抑制受容体を阻害し、好ましくはＰＤ－１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニスト、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト、阻害性ＫＩＲアンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＨＡＶＣＲ２アンタゴニスト及びＡＤＯＲＡ２Ａアンタゴニスト、より好ましくはＰＤ－１アンタゴニストから選択される
実施形態１から実施形態１１のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１３． サイトカインドメインは配列番号１０の配列を含み、
上記抗体は、
ｉ． 配列番号２０の重鎖ｋｎｏｂ配列、
ｉｉ． 配列番号２２の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号１６の軽鎖配列
を含み、上記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
実施形態１のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
上記抗体は、
ｉ． 配列番号２０の重鎖ｋｎｏｂ配列、
ｉｉ． 配列番号２２の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号１６の軽鎖配列
を含み、上記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
実施形態１のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１４． サイトカインドメインは配列番号１０の配列を含み、上記抗体は、
ｉ． 配列番号８４の重鎖ｋｎｏｂ配列、
ｉｉ． 配列番号８７の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号８８の軽鎖配列
を含み、上記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
実施形態１のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
ｉ． 配列番号８４の重鎖ｋｎｏｂ配列、
ｉｉ． 配列番号８７の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号８８の軽鎖配列
を含み、上記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
実施形態１のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１５． サイトカインドメインは配列番号１０の配列を含み、上記抗体は、
ｉ． 配列番号９３の重鎖ｋｎｏｂ配列、
ｉｉ． 配列番号９５の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号９２の軽鎖配列
を含み、上記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
実施形態１のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
ｉ． 配列番号９３の重鎖ｋｎｏｂ配列、
ｉｉ． 配列番号９５の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号９２の軽鎖配列
を含み、上記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
実施形態１のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１６． 実施形態１から実施形態１５のいずれか１つに記載の免疫サイトカインをコードする核酸。
１７． 実施形態１６に記載の核酸を含むベクター。
１８． 実施形態１６に記載の核酸又は実施形態１７に記載のベクターを含む宿主細胞。
１９． 治療に使用するための、実施形態１から実施形態１５のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン、実施形態１６に記載の核酸又は実施形態１７に記載のベクター。
２０． 実施形態１から実施形態１５のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン、実施形態１６に記載の核酸又は実施形態１７に記載のベクターと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
２１． 腫瘍性疾患若しくは感染性疾患に罹患している、腫瘍性疾患若しくは感染性疾患を発症するリスクがある、及び／又は腫瘍性疾患若しくは感染性疾患と診断される対象の治療に使用するための、実施形態１から実施形態１５のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン、実施形態１６に記載の核酸又は実施形態１７に記載のベクター。
２２． 腫瘍性疾患若しくは感染性疾患に罹患している、腫瘍性疾患若しくは感染性疾患を発症するリスクがある、及び／又は腫瘍性疾患若しくは感染性疾患と診断される患者を治療する方法であって、実施形態１から実施形態１５のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン、実施形態１６に記載の核酸又は実施形態１７に記載のベクターを投与する工程を含む、方法。
本発明は、以下の実施形態によっても説明される。
１． 免疫サイトカインであって、
ａ． インターロイキン１５（ＩＬ－１５）又はその誘導体及びインターロイキン１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）又はその誘導体のｓｕｓｈｉドメインを含むポリペプチドを含むコンジュゲートと、
ｂ． ＰＤ－１抗体又はその機能的多様体であって、
ｉ． ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、
ｉｉ． 改変されたエフェクター機能、及び／若しくは
ｉｉｉ． 増加したインビボ半減期
を特徴とするＰＤ－１抗体又はその機能的多様体と
を含み、
上記コンジュゲートは、両方の抗体重鎖若しくは抗体軽鎖のＣ末端に、若しくはｉ．の場合、１つの抗体重鎖のＣ末端に直接的又は間接的に融合されている
免疫サイトカイン。
ａ． インターロイキン１５（ＩＬ－１５）又はその誘導体及びインターロイキン１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）又はその誘導体のｓｕｓｈｉドメインを含むポリペプチドを含むコンジュゲートと、
ｂ． ＰＤ－１抗体又はその機能的多様体であって、
ｉ． ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、
ｉｉ． 改変されたエフェクター機能、及び／若しくは
ｉｉｉ． 増加したインビボ半減期
を特徴とするＰＤ－１抗体又はその機能的多様体と
を含み、
上記コンジュゲートは、両方の抗体重鎖若しくは抗体軽鎖のＣ末端に、若しくはｉ．の場合、１つの抗体重鎖のＣ末端に直接的又は間接的に融合されている
免疫サイトカイン。
２． 上記改変されたエフェクター機能は低下した抗体依存性細胞傷害活性であり、上記抗体又はその機能的多様体は、
ａ． ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ若しくはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓから選択される変異を含むか、
ｂ． ＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ若しくはＥ２３３Ｐ／Ｆ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｒ４０９Ｋから選択される変異を含むか、
ｃ． ＩｇＧ２（ＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧ２ｂ）及びＩｇＧ４のハイブリッド若しくはその機能的多様体であり、ＩｇＧ２由来のＣＨ１及びヒンジ領域を含み、ＣＨ２及びＣＨ３領域はＩｇＧ４由来である（ＩｇＧ２アミノ酸１１８～２６０及びＩｇＧ４アミノ酸２６１～４４７）か、又は
ｄ． ＩｇＧ２抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ若しくはＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓから選択される変異を含み、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
実施形態１に記載の免疫サイトカイン。
ａ． ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ若しくはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓから選択される変異を含むか、
ｂ． ＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ若しくはＥ２３３Ｐ／Ｆ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｒ４０９Ｋから選択される変異を含むか、
ｃ． ＩｇＧ２（ＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧ２ｂ）及びＩｇＧ４のハイブリッド若しくはその機能的多様体であり、ＩｇＧ２由来のＣＨ１及びヒンジ領域を含み、ＣＨ２及びＣＨ３領域はＩｇＧ４由来である（ＩｇＧ２アミノ酸１１８～２６０及びＩｇＧ４アミノ酸２６１～４４７）か、又は
ｄ． ＩｇＧ２抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ若しくはＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓから選択される変異を含み、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
実施形態１に記載の免疫サイトカイン。
３． 上記抗体又はその機能的多様体は、
（ａ）ＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ変異を含むか、又は
（ｂ）ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む
実施形態２に記載の免疫サイトカイン。
（ａ）ＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ変異を含むか、又は
（ｂ）ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む
実施形態２に記載の免疫サイトカイン。
４． 上記ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、ＫｉＨ、ＫｉＨＳ－Ｓ、ＨＡ－ＴＦ、ＺＷ１、７．８．６０、ＤＤ－ＫＫ、ＥＷ－ＲＶＴ、ＥＷ－ＲＶＴＳ－Ｓ、ＳＥＥＤ及びＡ１０７、好ましくはＫｉＨから選択される、実施形態１から実施形態３のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
５． 上記ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、ホモ二量体Ｆｃドメインを有する免疫サイトカインと比較して、細胞培養における発現時に上記免疫サイトカインのより高い収率をもたらす、実施形態１から実施形態４のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
６． 上記免疫サイトカインの半減期が増加し、上記抗体又はその機能的多様体はＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体又はその機能的多様体であり、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ又はＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌから選択される変異を含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う、実施形態１から実施形態５のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
７． 上記抗体又はその機能的多様体は、低下した抗体依存性細胞傷害活性を有し、上記抗体又はその機能的多様体はＩｇＧ４抗体又はその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ変異及びＫｉＨヘテロ二量体化Ｆｃドメインを含む、実施形態１から実施形態６のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
８． 上記コンジュゲートは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン又はその誘導体と、リンカーと、上記ＩＬ－１５又はその誘導体とを含む融合タンパク質であり、好ましくは、上記ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインは配列番号５の配列を含み、リンカーは、１８～２２アミノ酸の長さを有し、好ましくはグリシン又はセリン及びグリシンから構成され、より好ましくは配列番号７の配列を有し、上記ＩＬ－１５は配列番号２の配列を有する、実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
９． サイトカインドメインは配列番号１０の配列を含み、上記抗体は、
ｉ． 配列番号２０の重鎖ｋｎｏｂ配列、
ｉｉ． 配列番号２２の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号２３の軽鎖配列
を含み、上記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
実施形態１から実施形態８のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
ｉ． 配列番号２０の重鎖ｋｎｏｂ配列、
ｉｉ． 配列番号２２の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号２３の軽鎖配列
を含み、上記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
実施形態１から実施形態８のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
本発明の別の態様は、以下の実施形態において説明される。
１． 免疫サイトカインであって、
ａ． インターロイキン１５（ＩＬ－１５）又はその誘導体及びインターロイキン１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒ）又はその誘導体のｓｕｓｈｉドメインを含むポリペプチドを含むコンジュゲートと、
ｂ． Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体又はその機能的多様体であって、
ｉ． ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、
ｉｉ． 改変されたエフェクター機能、及び／若しくは
ｉｉｉ． 増加したインビボ半減期
を特徴とするＣｌａｕｄｉｎ１８．２抗体又はその機能的多様体と
を含み、
上記コンジュゲートは、両方の抗体重鎖若しくは抗体軽鎖のＣ末端に、若しくはｉ．の場合、１つの抗体重鎖のＣ末端に直接的又は間接的に融合されている
免疫サイトカイン。
ａ． インターロイキン１５（ＩＬ－１５）又はその誘導体及びインターロイキン１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒ）又はその誘導体のｓｕｓｈｉドメインを含むポリペプチドを含むコンジュゲートと、
ｂ． Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体又はその機能的多様体であって、
ｉ． ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、
ｉｉ． 改変されたエフェクター機能、及び／若しくは
ｉｉｉ． 増加したインビボ半減期
を特徴とするＣｌａｕｄｉｎ１８．２抗体又はその機能的多様体と
を含み、
上記コンジュゲートは、両方の抗体重鎖若しくは抗体軽鎖のＣ末端に、若しくはｉ．の場合、１つの抗体重鎖のＣ末端に直接的又は間接的に融合されている
免疫サイトカイン。
２． 上記改変されたエフェクター機能は、増強された抗体依存性細胞傷害活性であり、上記抗体又はその機能的多様体は、
ａ． ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、一方の重鎖において、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ若しくはＬ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａから、
好ましくはＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅから選択される変異を含み、他方の重鎖においてＤ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ／Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅ変異をさらに含み、かつ／又は
ｂ． 脱フコシル化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
実施形態１に記載の免疫サイトカイン。
ａ． ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、一方の重鎖において、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ若しくはＬ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａから、
好ましくはＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅから選択される変異を含み、他方の重鎖においてＤ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ／Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅ変異をさらに含み、かつ／又は
ｂ． 脱フコシル化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
実施形態１に記載の免疫サイトカイン。
３． 上記ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、ＫｉＨ、ＫｉＨＳ－Ｓ、ＨＡ－ＴＦ、ＺＷ１、７．８．６０、ＤＤ－ＫＫ、ＥＷ－ＲＶＴ、ＥＷ－ＲＶＴＳ－Ｓ、ＳＥＥＤ及びＡ１０７、好ましくはＫｉＨから選択される、実施形態１又は実施形態２に記載の免疫サイトカイン。
４． 上記ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、ホモ二量体Ｆｃドメインを有する免疫サイトカインと比較して、細胞培養における発現時に上記免疫サイトカインのより高い収率をもたらす、実施形態１から実施形態３のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
５． 上記免疫サイトカインの半減期が増加し、上記抗体又はその機能的多様体はＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体又はその機能的多様体であり、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ又はＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌから選択される変異を含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う、実施形態１から実施形態４のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
６． 上記コンジュゲートは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン又はその誘導体と、リンカーと、上記ＩＬ－１５又はその誘導体とを含む融合タンパク質であり、好ましくは、上記ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインは配列番号５の配列を含み、上記リンカーは、１８～２２アミノ酸の長さを有し、好ましくはグリシン又はセリン及びグリシンから構成され、より好ましくは配列番号７の配列を有し、上記ＩＬ－１５は配列番号２の配列を有する、実施形態１から実施形態５のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
７． 上記コンジュゲートは、配列番号１０又は配列番号１１の配列を含み、上記抗体は、表４のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体であり、上記ＩｇＧ１多様体は、表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体であり、表２のＤＥ、ＤＬＥ、ＡＡＡ、ＴＬ若しくはＩＥ変異を介して、又は脱フコシル化を介して、又は上に列挙された変異と脱フコシル化との組み合わせを介して増強されたＡＤＣＣ活性を有する、実施形態１から実施形態６のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
８． 上記コンジュゲートは配列番号１０の配列を含み、上記抗体は、それぞれ配列番号４６及び配列番号４７のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体であり、上記ＩｇＧ１多様体は、表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体であり、表２のＤＥ、ＤＬＥ、ＡＡＡ、ＴＬ若しくはＩＥ変異を介して、又は脱フコシル化を介して、又は上に列挙された変異と脱フコシル化との組み合わせを介して増強されたＡＤＣＣ活性を有する、実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
９． 上記コンジュゲートは配列番号１０の配列を含み、上記抗体は、それぞれ配列番号４６及び配列番号４７のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体であり、上記ＩｇＧ１多様体は、表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体であり、脱フコシル化を介して増強されたＡＤＣＣ活性を有する、実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１０． 上記コンジュゲートは配列番号１１の配列を含み、上記抗体多様体は、配列番号８４の重鎖ｋｎｏｂ配列、配列番号８７の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び配列番号８８の軽鎖配列を有するヘテロ二量体ＩｇＧ１抗ＣＬＤＮ１８．２抗体である、実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１１． 上記コンジュゲートは配列番号１０の配列を含み、上記抗体多様体は、配列番号８４の重鎖ｋｎｏｂ配列、配列番号８７の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び配列番号８８の軽鎖配列を有するヘテロ二量体ＩｇＧ１抗ＣＬＤＮ１８．２抗体である、実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１２． 上記コンジュゲートは配列番号１０の配列を含み、上記抗体は、それぞれ配列番号４６及び配列番号４７のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体であり、上記ＩｇＧ１多様体は、表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体であり、ＩｇＧ１ ＦｃドメインにＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＤＥ）のＡＤＣＣ増強変異を有する、実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１３． 上記コンジュゲートは配列番号１１の配列を含み、上記抗体は、それぞれ配列番号４６及び配列番号４７のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ヘテロ二量体ＩｇＧ１抗体多様体であり、上記ＩｇＧ１多様体は、表３のＫｉＨ変異を介してヘテロ二量体であり、ＩｇＧ１ ＦｃドメインにＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＤＥ）のＡＤＣＣ増強変異を有する、実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載の免疫サイトカイン。
１４． 配列番号８５（「ＨＣ ｋｎｏｂ」）、配列番号８７（「ＨＣ ｈｏｌｅ」）及び配列番号８８（ＬＣ）の配列の免疫サイトカイン。
１５． 配列番号８６（「ＨＣ ｋｎｏｂ」）、配列番号８７（「ＨＣ ｈｏｌｅ」）及び配列番号８８（ＬＣ）の配列の免疫サイトカイン。
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Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．、Ｗ．Ｄａｎｇ、Ｓ．Ｋａｒｋｉ、Ｏ．Ｖａｆａ、Ｊ．Ｓ．Ｐｅｎｇ、Ｌ．Ｈｙｕｎ、Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｈ．Ｓ．Ｃｈｕｎｇ、Ａ．Ｅｉｖａｚｉ、Ｓ．Ｃ．Ｙｏｄｅｒ、Ｊ．Ｖｉｅｌｍｅｔｔｅｒ、Ｄ．Ｆ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ、Ｒ．Ｊ．Ｈａｙｅｓ及びＢ．Ｉ．Ｄａｈｉｙａｔ（２００６）． 「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３（１１）：４００５－４０１０．
Ｌｅａｂｍａｎ，Ｍ．Ｋ．、Ｙ．Ｇ．Ｍｅｎｇ、Ｒ．Ｆ．Ｋｅｌｌｅｙ、Ｌ．Ｅ．ＤｅＦｏｒｇｅ、Ｋ．Ｊ．Ｃｏｗａｎ及びＳ．Ｉｙｅｒ（２０１３）． 「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｔｅｒｅｄ ＦｃｇａｍｍａＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ」． ＭＡｂｓ ５（６）：８９６－９０３．
Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ，Ａ．、Ｋ．Ｊ．Ｆｒｏｎｉｎｇ、Ｓ．Ａｔｗｅｌｌ、Ｈ．Ａｌｄａｚ、Ａ．Ｐｕｓｔｉｌｎｉｋ、Ｆ．Ｌｕ、Ｆ．Ｈｕａｎｇ、Ｒ．Ｙｕａｎ、Ｓ．Ｈａｓｓａｎａｌｉ、Ａ．Ｋ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ、Ｊ．Ｒ．Ｆｉｔｃｈｅｔｔ、Ｓ．Ｊ．Ｄｅｍａｒｅｓｔ及びＢ．Ｋｕｈｌｍａｎ（２０１６）． 「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔａｔｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ」． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２４（４）：６４１－６５１．
Ｌｏ，Ｍ．、Ｈ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｒ．Ｋ．Ｔｏｎｇ、Ｔ．Ｗ．Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ、Ｊ．Ｍ．Ｖｅｒｎｅｓ、Ｙ．Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｌ．Ｌｉｎ、Ｓ．Ｃｈｕｎｇ、Ｍ．Ｓ．Ｄｅｎｎｉｓ、Ｙ．Ｊ．Ｚｕｃｈｅｒｏ、Ｒ．Ｊ．Ｗａｔｔｓ、Ｊ．Ａ．Ｃｏｕｃｈ、Ｙ．Ｇ．Ｍｅｎｇ、Ｊ．Ｋ．Ａｔｗａｌ、Ｒ．Ｊ．Ｂｒｅｚｓｋｉ、Ｃ．Ｓｐｉｅｓｓ及びＪ．Ａ．Ｅｒｎｓｔ（２０１７）． 「Ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ Ｔｈａｔ Ｍａｉｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｍｉｃｅ」． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９２（９）：３９００－３９０８．
Ｌｕ，Ｄ．、Ｚ．Ｐｏｌｏｎｓｋａｙａ、Ｔ．－Ｐ．Ｃｈａｎｇ、Ｓ．Ｍａｒｔｏｍｏ、Ｘ．Ｌｕｎａ、Ｚ．Ｚｈａｎｇ、Ｆ．Ｍｉｙａｒａ及びＪ．Ｐａｔｅｌ（２０２０）． 「Ａｂｓｔｒａｃｔ ５２５：Ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉ－ＰＤ１－ＩＬ１５ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＤ－１ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ＩＬ－２Ｒ－ｂｅｔａ－ｇａｍｍａ ａｇｏｎｉｓｍ」． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８０（１６＿Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：５２５－５２５．
Ｌｕ，Ｘ．、Ｒ．Ｐ．Ｎｏｂｒｅｇａ、Ｈ．Ｌｙｎａｕｇｈ、Ｔ．Ｊａｉｎ、Ｋ．Ｂａｒｌｏｗ、Ｔ．Ｂｏｌａｎｄ、Ａ．Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｍ．Ｖａｓｑｕｅｚ及びＹ．Ｘｕ（２０１９）． 「Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｌｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １３１ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｓｔａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」． ＭＡｂｓ １１（１）：４５－５７．
Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．、Ｚ．Ｚｈｕ、Ｊ．Ｑ．Ｙｕａｎ、Ａ．Ｇｏｄｄａｒｄ、Ｃ．Ｗ．Ａｄａｍｓ、Ｌ．Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ及びＰ．Ｃａｒｔｅｒ（１９９８）． 「Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ」． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（７）：６７７－６８１．
Ｍｉｍｏｔｏ，Ｆ．、Ｔ．Ｉｇａｗａ、Ｔ．Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、Ｈ．Ｋａｔａｄａ、Ｓ．Ｋａｄｏｎｏ、Ｔ．Ｋａｍｉｋａｗａ、Ｍ．Ｓｈｉｄａ－Ｋａｗａｚｏｅ及びＫ．Ｈａｔｔｏｒｉ（２０１３）． 「Ｎｏｖｅｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ＦｃｇａｍｍａＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ」． ＭＡｂｓ ５（２）：２２９－２３６．
Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．、Ｃ．Ｂａｕｔｉｓｔａ、Ｅ．Ｐｏｎｇ、Ｄ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｊ．Ｊａｃｉｎｔｏ、Ａ．Ｅｉｖａｚｉ、Ｕ．Ｓ．Ｍｕｃｈｈａｌ、Ｓ．Ｋａｒｋｉ、Ｓ．Ｙ．Ｃｈｕ及びＧ．Ａ．Ｌａｚａｒ（２０１１）． 「Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ ｅｎａｂｌｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃｏ－ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ」． ＭＡｂｓ ３（６）：５４６－５５７．
Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．、Ｈ．Ｃｈｅｎ、Ｓ．Ｋａｒｋｉ及びＧ．Ａ．Ｌａｚａｒ（２０１０）． 「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒｅｃｒｕｉｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」． ＭＡｂｓ ２（２）：１８１－１８９．
Ｎａｔｓｕｍｅ，Ａ．、Ｍ．Ｉｎ、Ｈ．Ｔａｋａｍｕｒａ、Ｔ．Ｎａｋａｇａｗａ、Ｙ．Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｋ．Ｋｉｔａｊｉｍａ、Ｍ．Ｗａｋｉｔａｎｉ、Ｓ．Ｏｈｔａ、Ｍ．Ｓａｔｏｈ、Ｋ．Ｓｈｉｔａｒａ及びＲ．Ｎｉｗａ（２００８）． 「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｆ ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ ｍｉｘｅｄ ｉｓｏｔｙｐｅ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８（１０）：３８６３－３８７２．
Ｎｅｌｌｉｓ，Ｄ．Ｆ．、Ｄ．Ｆ．Ｍｉｃｈｉｅｌ、Ｍ．Ｓ．Ｊｉａｎｇ、Ｄ．Ｅｓｐｏｓｉｔｏ、Ｒ．Ｄａｖｉｓ、Ｈ．Ｊｉａｎｇ、Ａ．Ｋｏｒｒｅｌｌ、Ｇ．Ｃ．ｔ．Ｋｎａｐｐ、Ｌ．Ｅ．Ｌｕｃｅｒｎｏｎｉ、Ｒ．Ｅ．Ｎｅｌｓｏｎ、Ｅ．Ｍ．Ｐｒｉｔｔ、Ｌ．Ｖ．Ｐｒｏｃｔｅｒ、Ｍ．Ｒｏｇｅｒｓ、Ｔ．Ｌ．Ｓｕｍｐｔｅｒ、Ｖ．Ｖ．Ｖｙａｓ、Ｔ．Ｊ．Ｗａｙｂｒｉｇｈｔ、Ｘ．Ｙａｎｇ、Ａ．Ｍ．Ｚｈｅｎｇ、Ｊ．Ｌ．Ｙｏｖａｎｄｉｃｈ、Ｊ．Ａ．Ｇｉｌｌｙ、Ｇ．Ｍｉｔｒａ及びＪ．Ｚｈｕ（２０１２）． 「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩＬ－１５ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ７７」． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２９（３）：７２２－７３８．
Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｌ．、Ｓ．Ｇｏｒｌａｔｏｖ、Ｗ．Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｙａｎｇ、Ｌ．Ｈｕａｎｇ、Ｓ．Ｂｕｒｋｅ、Ｈ．Ｌｉ、Ｖ．Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ、Ｔ．Ｚｈａｎｇ、Ｊ．Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ、Ｓ．Ｋｏｅｎｉｇ、Ｓ．Ｊ．Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｐ．Ａ．Ｍｏｏｒｅ、Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＥ．Ｂｏｎｖｉｎｉ（２０１１）． 「Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＧＡＨ２２， ａｎ ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」． Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３（６）：Ｒ１２３．
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Ｐｉｎｉ，Ａ．、Ｆ．Ｖｉｔｉ、Ａ．Ｓａｎｔｕｃｃｉ、Ｂ．Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ、Ｌ．Ｚａｒｄｉ、Ｐ．Ｎｅｒｉ及びＤ．Ｎｅｒｉ（１９９８）． 「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ． Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｅｌｕｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ」． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３（３４）：２１７６９－２１７７６．
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Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｔ．Ｏ．及びＫ．Ｓ．Ｓｃｈｌｕｎｓ（２０１７）． 「Ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ ＩＬ－１５ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ」． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ １９０：１５９－１６８．
Ｒｏｓｅｎｌｏｃｈｅｒ，Ｊ．、Ｖ．Ｂｏｈｒｓｃｈ、Ｍ．Ｓａｃｈａｒｊａｔ、Ｖ．Ｂｌａｎｃｈａｒｄ、Ｃ．Ｇｉｅｓｅ、Ｖ．Ｓａｎｄｉｇ、Ｃ．Ｐ．Ｒ．Ｈａｃｋｅｎｂｅｒｇｅｒ及びＳ．Ｈｉｎｄｅｒｌｉｃｈ（２０１５）． 「Ａｐｐｌｙｉｎｇ Ａｃｙｌａｔｅｄ Ｆｕｃｏｓｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｔｏ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」． Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｓｅｌ） ２（４）：２１３－２３４．
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Ｚｈａｎｇ，Ｔ．、Ｘ．Ｓｏｎｇ、Ｌ．Ｘｕ、Ｊ．Ｍａ、Ｙ．Ｚｈａｎｇ、Ｗ．Ｇｏｎｇ、Ｙ．Ｚｈａｎｇ、Ｘ．Ｚｈｏｕ、Ｚ．Ｗａｎｇ、Ｙ．Ｗａｎｇ、Ｙ．Ｓｈｉ、Ｈ．Ｂａｉ、Ｎ．Ｌｉｕ、Ｘ．Ｙａｎｇ、Ｘ．Ｃｕｉ、Ｙ．Ｃａｏ、Ｑ．Ｌｉｕ、Ｊ．Ｓｏｎｇ、Ｙ．Ｌｉ、Ｚ．Ｔａｎｇ、Ｍ．Ｇｕｏ、Ｌ．Ｗａｎｇ及びＫ．Ｌｉ（２０１８）． 「Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＦｃγＲΙ ｈａｓ ａ ｐｒｏｆｏｕｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ６７（７）：１０７９－１０９０．
国際公開第２０１８／１８４９６４Ａ１号パンフレット
国際公開第２０１９／１６６９４６Ａ１号パンフレット
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Ａｌｅｇｒｅ，Ｍ．Ｌ．、Ａ．Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｖ．Ｌ．Ｐｕｌｉｔｏ、Ｒ．Ａ．Ｂｒｏｓｉｕｓ、Ｗ．Ｃ．Ｏｌｓｏｎ、Ｒ．Ａ．Ｚｉｖｉｎ、Ｒ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｊ．Ｒ．Ｔｈｉｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ、Ｌ．Ｋ．Ｊｏｌｌｉｆｆｅ及びＪ．Ａ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ（１９９２）． 「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ”ｈｕｍａｎｉｚｅｄ” ＯＫＴ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８（１１）：３４６１－３４６８．
Ａｎ，Ｚ．、Ｇ．Ｆｏｒｒｅｓｔ、Ｒ．Ｍｏｏｒｅ、Ｍ．Ｃｕｋａｎ、Ｐ．Ｈａｙｔｋｏ、Ｌ．Ｈｕａｎｇ、Ｓ．Ｖｉｔｅｌｌｉ、Ｊ．Ｚ．Ｚｈａｏ、Ｐ．Ｌｕ、Ｊ．Ｈｕａ、Ｃ．Ｒ．Ｇｉｂｓｏｎ、Ｂ．Ｒ．Ｈａｒｖｅｙ、Ｄ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、Ｄ．Ｚａｌｌｅｒ、Ｆ．Ｗａｎｇ及びＷ．Ｓｔｒｏｈｌ（２００９）． 「ＩｇＧ２ｍ４， ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓｏｔｙｐｅ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ Ｆｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」． ＭＡｂｓ １（６）：５７２－５７９．
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Ｄｅｋｋｅｒｓ，Ｇ．、Ｒ．Ｐｌｏｍｐ、Ｃ．Ａ．Ｋｏｅｌｅｍａｎ、Ｒ．Ｖｉｓｓｅｒ、Ｈ．Ｈ．ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ、Ｖ．Ｓａｎｄｉｇ、Ｔ．Ｒｉｓｐｅｎｓ、Ｍ．Ｗｕｈｒｅｒ及びＧ．Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ（２０１６）． 「Ｍｕｌｔｉ－ｌｅｖｅｌ ｇｌｙｃｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ＩｇＧ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆｃ－ｇｌｙｃａｎｓ」． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：３６９６４．
Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ，Ｃ．Ａ．、Ｆ．Ｊ．Ｂｅｕｒｓｋｅｎｓ、Ｒ．Ｎ．ｄｅ Ｊｏｎｇ、Ｒ．Ｉ．Ｋｏｎｉｎｇ、Ｋ．Ｓｔｒｕｍａｎｅ、Ｍ．Ａ．Ｌｉｎｄｏｒｆｅｒ、Ｍ．Ｖｏｏｒｈｏｒｓｔ、Ｄ．Ｕｇｕｒｌａｒ、Ｓ．Ｒｏｓａｔｉ、Ａ．Ｊ．Ｈｅｃｋ、Ｊ．Ｇ．ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｉ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ａ．Ｊ．Ｋｏｓｔｅｒ、Ｒ．Ｐ．Ｔａｙｌｏｒ、Ｅ．Ｏ．Ｓａｐｈｉｒｅ、Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ、Ｊ．Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ、Ｐ．Ｇｒｏｓ及びＰ．Ｗ．Ｐａｒｒｅｎ（２０１４）． 「Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ＩｇＧ ｈｅｘａｍｅｒｓ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ」． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３（６１７６）：１２６０－１２６３．
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Ｆｏｒｅｒｏ－Ｔｏｒｒｅｓ，Ａ．、Ｓ．ｄｅ Ｖｏｓ、Ｂ．Ｌ．Ｐｏｈｌｍａｎ、Ｍ．Ｐａｓｈｋｅｖｉｃｈ、Ｄ．Ｍ．Ｃｒｏｎｉｅｒ、Ｎ．Ｈ．Ｄａｎｇ、Ｓ．Ｐ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、Ｂ．Ｗ．Ａｌｌａｎ、Ｊ．Ｇ．Ｎｅｌｓｏｎ、Ｃ．Ａ．Ｓｌａｐａｋ、Ｍ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ、Ｂ．Ｋ．Ｌｉｎｋ、Ｊ．Ｅ．Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ及びＫ．Ｎ．Ｇａｎｊｏｏ（２０１２）． 「Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｐｈａｓｅ １ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＡＭＥ－１３３ｖ （ＬＹ２４６９２９８）， ａｎ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｉｎ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ－ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ」． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １８（５）：１３９５－１４０３．
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Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．、Ｍ．Ｐｅｎｔｏｎｙ、Ｍ．Ｓｈｅｎ、Ｌ．Ｇａｒｒｅｔｔ、Ｃ．Ｆｏｒｔｅ、Ａ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ、Ｓ．Ｂ．Ｎｇ、Ｔ．Ｂｏｒｎ、Ｍ．Ｒｅｔｔｅｒ、Ｋ．Ｍａｎｃｈｕｌｅｎｋｏ、Ｈ．Ｓｗｅｅｔ、Ｉ．Ｎ．Ｆｏｌｔｚ、Ｍ．Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ及びＷ．Ｙａｎ（２０１０）． 「Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ＩｇＧ」． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５（２５）：１９６３７－１９６４６．
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Ｈｏｒｉ，Ｔ．、Ｔ．Ｕｃｈｉｙａｍａ、Ｍ．Ｔｓｕｄｏ、Ｈ．Ｕｍａｄｏｍｅ、Ｈ．Ｏｈｎｏ、Ｓ．Ｆｕｋｕｈａｒａ、Ｋ．Ｋｉｔａ及びＨ．Ｕｃｈｉｎｏ（１９８７）． 「Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｒｏｍ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｗｈｏ ｉｓ ｎｏｔ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ ｖｉｒｕｓ」． Ｂｌｏｏｄ ７０（４）：１０６９－１０７２．
Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．、Ｐ．Ｙ．Ｗｏｎｇ、Ｌ．Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ、Ｈ．Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｋ．Ｔｏｔｐａｌ、Ｍ．Ｕｌｔｓｃｈ及びＭ．Ｇ．Ｍｕｌｋｅｒｒｉｎ（２００１）． 「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｒｅｃｒｕｉｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ」． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６（４）：２５７１－２５７５．
Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．、Ｌ．Ｃｏｄａｒｒｉ－Ｄｅａｋ、Ｖ．Ｎｉｃｏｌｉｎｉ、Ｓ．Ｓｅｅｂｅｒ、Ｌ．Ｌａｕｅｎｅｒ、Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄ、Ｅ．Ｂｏｍｍｅｒ、Ｍ．Ｋａｒａｇｉａｎｎｉ、Ｊ．Ｓａｍ、Ｒ．Ｓｃｈｌｅｎｋｅｒ、Ｍ．Ｍａｒｉａｎｉ、Ｐ．Ｐ．Ｓｃｈｗａｌｉｅ、Ｓ．Ｈｅｒｔｅｒ、Ｍ．Ｂａｃａｃ、Ｉ．Ｗａｌｄｈａｕｅｒ、Ａ．Ｆｒｅｉｍｏｓｅｒ－Ｇｒｕｎｄｓｃｈｏｂｅｒ、Ｖ．Ｔｅｉｃｈｇｒａｅｂｅｒ及びＰ．Ｕｍａｎａ（２０１９）． 「Ａｂｓｔｒａｃｔ １５５２：Ａ ｎｏｖｅｌ ＰＤ１－ＩＬ２ｖ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ ｆｏｒ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ＜ｅｍ＞ｃｉｓ＜／ｅｍ＞－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ－２Ｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｎ ＰＤ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＤ－１ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ＩＬ－２Ｒ－ｂｅｔａ－ｇａｍｍａ ａｇｏｎｉｓｍ」． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７９（１３ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：１５５２－１５５２．
Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．、Ｗ．Ｄａｎｇ、Ｓ．Ｋａｒｋｉ、Ｏ．Ｖａｆａ、Ｊ．Ｓ．Ｐｅｎｇ、Ｌ．Ｈｙｕｎ、Ｃ．Ｃｈａｎ、Ｈ．Ｓ．Ｃｈｕｎｇ、Ａ．Ｅｉｖａｚｉ、Ｓ．Ｃ．Ｙｏｄｅｒ、Ｊ．Ｖｉｅｌｍｅｔｔｅｒ、Ｄ．Ｆ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ、Ｒ．Ｊ．Ｈａｙｅｓ及びＢ．Ｉ．Ｄａｈｉｙａｔ（２００６）． 「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３（１１）：４００５－４０１０．
Ｌｅａｂｍａｎ，Ｍ．Ｋ．、Ｙ．Ｇ．Ｍｅｎｇ、Ｒ．Ｆ．Ｋｅｌｌｅｙ、Ｌ．Ｅ．ＤｅＦｏｒｇｅ、Ｋ．Ｊ．Ｃｏｗａｎ及びＳ．Ｉｙｅｒ（２０１３）． 「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｔｅｒｅｄ ＦｃｇａｍｍａＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ」． ＭＡｂｓ ５（６）：８９６－９０３．
Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ，Ａ．、Ｋ．Ｊ．Ｆｒｏｎｉｎｇ、Ｓ．Ａｔｗｅｌｌ、Ｈ．Ａｌｄａｚ、Ａ．Ｐｕｓｔｉｌｎｉｋ、Ｆ．Ｌｕ、Ｆ．Ｈｕａｎｇ、Ｒ．Ｙｕａｎ、Ｓ．Ｈａｓｓａｎａｌｉ、Ａ．Ｋ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ、Ｊ．Ｒ．Ｆｉｔｃｈｅｔｔ、Ｓ．Ｊ．Ｄｅｍａｒｅｓｔ及びＢ．Ｋｕｈｌｍａｎ（２０１６）． 「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔａｔｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ」． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２４（４）：６４１－６５１．
Ｌｏ，Ｍ．、Ｈ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｒ．Ｋ．Ｔｏｎｇ、Ｔ．Ｗ．Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ、Ｊ．Ｍ．Ｖｅｒｎｅｓ、Ｙ．Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｌ．Ｌｉｎ、Ｓ．Ｃｈｕｎｇ、Ｍ．Ｓ．Ｄｅｎｎｉｓ、Ｙ．Ｊ．Ｚｕｃｈｅｒｏ、Ｒ．Ｊ．Ｗａｔｔｓ、Ｊ．Ａ．Ｃｏｕｃｈ、Ｙ．Ｇ．Ｍｅｎｇ、Ｊ．Ｋ．Ａｔｗａｌ、Ｒ．Ｊ．Ｂｒｅｚｓｋｉ、Ｃ．Ｓｐｉｅｓｓ及びＪ．Ａ．Ｅｒｎｓｔ（２０１７）． 「Ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ Ｔｈａｔ Ｍａｉｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｍｉｃｅ」． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９２（９）：３９００－３９０８．
Ｌｕ，Ｄ．、Ｚ．Ｐｏｌｏｎｓｋａｙａ、Ｔ．－Ｐ．Ｃｈａｎｇ、Ｓ．Ｍａｒｔｏｍｏ、Ｘ．Ｌｕｎａ、Ｚ．Ｚｈａｎｇ、Ｆ．Ｍｉｙａｒａ及びＪ．Ｐａｔｅｌ（２０２０）． 「Ａｂｓｔｒａｃｔ ５２５：Ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉ－ＰＤ１－ＩＬ１５ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＤ－１ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ＩＬ－２Ｒ－ｂｅｔａ－ｇａｍｍａ ａｇｏｎｉｓｍ」． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８０（１６＿Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：５２５－５２５．
Ｌｕ，Ｘ．、Ｒ．Ｐ．Ｎｏｂｒｅｇａ、Ｈ．Ｌｙｎａｕｇｈ、Ｔ．Ｊａｉｎ、Ｋ．Ｂａｒｌｏｗ、Ｔ．Ｂｏｌａｎｄ、Ａ．Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｍ．Ｖａｓｑｕｅｚ及びＹ．Ｘｕ（２０１９）． 「Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｌｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １３１ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｓｔａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」． ＭＡｂｓ １１（１）：４５－５７．
Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．、Ｚ．Ｚｈｕ、Ｊ．Ｑ．Ｙｕａｎ、Ａ．Ｇｏｄｄａｒｄ、Ｃ．Ｗ．Ａｄａｍｓ、Ｌ．Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ及びＰ．Ｃａｒｔｅｒ（１９９８）． 「Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ」． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（７）：６７７－６８１．
Ｍｉｍｏｔｏ，Ｆ．、Ｔ．Ｉｇａｗａ、Ｔ．Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、Ｈ．Ｋａｔａｄａ、Ｓ．Ｋａｄｏｎｏ、Ｔ．Ｋａｍｉｋａｗａ、Ｍ．Ｓｈｉｄａ－Ｋａｗａｚｏｅ及びＫ．Ｈａｔｔｏｒｉ（２０１３）． 「Ｎｏｖｅｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ＦｃｇａｍｍａＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ」． ＭＡｂｓ ５（２）：２２９－２３６．
Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．、Ｃ．Ｂａｕｔｉｓｔａ、Ｅ．Ｐｏｎｇ、Ｄ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｊ．Ｊａｃｉｎｔｏ、Ａ．Ｅｉｖａｚｉ、Ｕ．Ｓ．Ｍｕｃｈｈａｌ、Ｓ．Ｋａｒｋｉ、Ｓ．Ｙ．Ｃｈｕ及びＧ．Ａ．Ｌａｚａｒ（２０１１）． 「Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ ｅｎａｂｌｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃｏ－ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ」． ＭＡｂｓ ３（６）：５４６－５５７．
Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．、Ｈ．Ｃｈｅｎ、Ｓ．Ｋａｒｋｉ及びＧ．Ａ．Ｌａｚａｒ（２０１０）． 「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒｅｃｒｕｉｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」． ＭＡｂｓ ２（２）：１８１－１８９．
Ｎａｔｓｕｍｅ，Ａ．、Ｍ．Ｉｎ、Ｈ．Ｔａｋａｍｕｒａ、Ｔ．Ｎａｋａｇａｗａ、Ｙ．Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｋ．Ｋｉｔａｊｉｍａ、Ｍ．Ｗａｋｉｔａｎｉ、Ｓ．Ｏｈｔａ、Ｍ．Ｓａｔｏｈ、Ｋ．Ｓｈｉｔａｒａ及びＲ．Ｎｉｗａ（２００８）． 「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｆ ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ ｍｉｘｅｄ ｉｓｏｔｙｐｅ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８（１０）：３８６３－３８７２．
Ｎｅｌｌｉｓ，Ｄ．Ｆ．、Ｄ．Ｆ．Ｍｉｃｈｉｅｌ、Ｍ．Ｓ．Ｊｉａｎｇ、Ｄ．Ｅｓｐｏｓｉｔｏ、Ｒ．Ｄａｖｉｓ、Ｈ．Ｊｉａｎｇ、Ａ．Ｋｏｒｒｅｌｌ、Ｇ．Ｃ．ｔ．Ｋｎａｐｐ、Ｌ．Ｅ．Ｌｕｃｅｒｎｏｎｉ、Ｒ．Ｅ．Ｎｅｌｓｏｎ、Ｅ．Ｍ．Ｐｒｉｔｔ、Ｌ．Ｖ．Ｐｒｏｃｔｅｒ、Ｍ．Ｒｏｇｅｒｓ、Ｔ．Ｌ．Ｓｕｍｐｔｅｒ、Ｖ．Ｖ．Ｖｙａｓ、Ｔ．Ｊ．Ｗａｙｂｒｉｇｈｔ、Ｘ．Ｙａｎｇ、Ａ．Ｍ．Ｚｈｅｎｇ、Ｊ．Ｌ．Ｙｏｖａｎｄｉｃｈ、Ｊ．Ａ．Ｇｉｌｌｙ、Ｇ．Ｍｉｔｒａ及びＪ．Ｚｈｕ（２０１２）． 「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩＬ－１５ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ７７」． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２９（３）：７２２－７３８．
Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｌ．、Ｓ．Ｇｏｒｌａｔｏｖ、Ｗ．Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｙａｎｇ、Ｌ．Ｈｕａｎｇ、Ｓ．Ｂｕｒｋｅ、Ｈ．Ｌｉ、Ｖ．Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ、Ｔ．Ｚｈａｎｇ、Ｊ．Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ、Ｓ．Ｋｏｅｎｉｇ、Ｓ．Ｊ．Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｐ．Ａ．Ｍｏｏｒｅ、Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＥ．Ｂｏｎｖｉｎｉ（２０１１）． 「Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＧＡＨ２２， ａｎ ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」． Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３（６）：Ｒ１２３．
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Ｘｕ，Ｙ．、Ｌ．Ｃ．Ｃａｒｒａｓｃｏｓａ、Ｙ．Ａ．Ｙｅｕｎｇ、Ｍ．Ｌ．Ｃｈｕ、Ｗ．Ｙａｎｇ、Ｉ．Ｄｊｕｒｅｔｉｃ、Ｄ．Ｃ．Ｐａｐｐａｓ、Ｊ．Ｚｅｙｔｏｕｎｉａｎ、Ｚ．Ｇｅ、Ｖ．ｄｅ Ｒｕｉｔｅｒ、Ｇ．Ｒ．Ｓｔａｒｂｅｃｋ－Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｄ．Ｒｉｇａｓ、Ｓ．Ｈ．Ｃｈｅｎ、Ｅ．Ｋｒａｙｎｏｖ、Ｐ．Ｐ．Ｂｏｏｒ、Ｌ．Ｎｏｏｒｄａｍ、Ｍ．Ｄｏｕｋａｓ、Ｄ．Ｔｓａｏ、Ｊ．Ｎ．Ｉｊｚｅｒｍａｎｓ、Ｊ．Ｇｕｏ、Ｄ．Ｊ．Ｇｒｕｅｎｈａｇｅｎ、Ｊ．Ｅｒｄｍａｎｎ、Ｊ．Ｖｅｒｈｅｉｊ、Ｍ．Ｅ．ｖａｎ Ｒｏｙｅｎ、Ｐ．Ｇ．Ｄｏｏｒｎｅｂｏｓｃｈ、Ｒ．Ｆｅｌｄｍａｎ、Ｔ．Ｐａｒｋ、Ｓ．Ｍａｈｍｏｕｄｉ、Ｍ．Ｄｏｒｙｗａｌｓｋａ、Ｉ．Ｎｉ、Ｓ．Ｍ．Ｃｈｉｎ、Ｔ．Ｍｉｓｔｒｙ、Ｌ．Ｍｏｓｙａｋ、Ｌ．Ｌｉｎ、Ｋ．Ａ．Ｃｈｉｎｇ、Ｋ．Ｃ．Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ、Ｃ．Ｊｉ、Ｌ．Ｍ．Ｌｏｎｄｏｎｏ、Ｂ．Ｋｕａｎｇ、Ｒ．Ｒｉｃｋｅｒｔ、Ｊ．Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ、Ｄ．Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ、Ｔ．Ｈ．Ｈｕａｎｇ及びＪ．Ｃｈａｐａｒｒｏ－Ｒｉｇｇｅｒｓ（２０２１）． 「Ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＩＬ１５ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍｕｔｅｉｎ Ｆｕｓｅｄ ｔｏ ａｎ Ａｎｔｉ－ＰＤ１ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ９（１０）：１１４１－１１５７．
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Ｚｈａｎｇ，Ｔ．、Ｘ．Ｓｏｎｇ、Ｌ．Ｘｕ、Ｊ．Ｍａ、Ｙ．Ｚｈａｎｇ、Ｗ．Ｇｏｎｇ、Ｙ．Ｚｈａｎｇ、Ｘ．Ｚｈｏｕ、Ｚ．Ｗａｎｇ、Ｙ．Ｗａｎｇ、Ｙ．Ｓｈｉ、Ｈ．Ｂａｉ、Ｎ．Ｌｉｕ、Ｘ．Ｙａｎｇ、Ｘ．Ｃｕｉ、Ｙ．Ｃａｏ、Ｑ．Ｌｉｕ、Ｊ．Ｓｏｎｇ、Ｙ．Ｌｉ、Ｚ．Ｔａｎｇ、Ｍ．Ｇｕｏ、Ｌ．Ｗａｎｇ及びＫ．Ｌｉ（２０１８）． 「Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＦｃγＲΙ ｈａｓ ａ ｐｒｏｆｏｕｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ６７（７）：１０７９－１０９０．
国際公開第２０１８／１８４９６４Ａ１号パンフレット
国際公開第２０１９／１６６９４６Ａ１号パンフレット
Claims (17)
- 免疫サイトカインであって、
ａ． インターロイキン１５（ＩＬ－１５）又はその誘導体及びインターロイキン１５－受容体α又はその誘導体のｓｕｓｈｉドメイン（ＩＬ－１５Ｒα）を含むポリペプチドを含むコンジュゲートであって、
前記ＩＬ－１５誘導体は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及び／又はγｃ受容体への結合を低下させる少なくとも１つの変異を含む、コンジュゲートと、
ｂ． 抗体又はその機能的多様体であって、
ｉ． ヘテロ二量体Ｆｃドメイン、
ｉｉ． 改変されたエフェクター機能、及び／若しくは
ｉｉｉ． 増加したインビボ半減期
を特徴とする抗体又はその機能的多様体と
を含み、
前記コンジュゲートは、両方の抗体重鎖若しくは抗体軽鎖のＣ末端に、若しくはｉ．の場合、１つの抗体重鎖のＣ末端に直接的又は間接的に融合されている
免疫サイトカイン。 - 前記免疫サイトカインは抗体の機能的多様体を含む請求項１に記載の免疫サイトカイン。
- 前記改変されたエフェクター機能は低下した抗体依存性細胞傷害活性であり、前記抗体又はその機能的多様体は、
ａ． ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ若しくはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓから選択される変異を含むか、
ｂ． ＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ若しくはＥ２３３Ｐ／Ｆ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｒ４０９Ｋから選択される変異を含むか、
ｃ． ＩｇＧ２（ＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧ２ｂ）及びＩｇＧ４のハイブリッド若しくはその機能的多様体であり、ＩｇＧ２由来のＣＨ１及びヒンジ領域を含み、ＣＨ２及びＣＨ３領域はＩｇＧ４由来である（ＩｇＧ２アミノ酸１１８～２６０及びＩｇＧ４アミノ酸２６１～４４７）か、又は
ｄ． ＩｇＧ２抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ若しくはＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓから選択される変異を含み、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
請求項１又は請求項２に記載の免疫サイトカイン。 - 前記抗体又はその機能的多様体は、
（ａ）ＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ変異を含むか、又は
（ｂ）ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む
請求項３に記載の免疫サイトカイン。 - 前記改変されたエフェクター機能は増強された抗体依存性細胞傷害活性であり、前記抗体又はその機能的多様体は、
ａ． ＩｇＧ１抗体若しくはその機能的多様体であり、一方の重鎖において、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ若しくはＬ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａから、
好ましくはＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３９２Ｔ／Ｐ３９６Ｌ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅから選択される変異を含み、他方の重鎖において、Ｄ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ／Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅ変異をさらに含み、かつ／又は
ｂ． 脱フコシル化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４抗体若しくはその機能的多様体であり、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
請求項１に記載の免疫サイトカイン。 - 前記ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、ＫｉＨ、ＫｉＨＳ－Ｓ、ＨＡ－ＴＦ、ＺＷ１、７．８．６０、ＤＤ－ＫＫ、ＥＷ－ＲＶＴ、ＥＷ－ＲＶＴＳ－Ｓ、ＳＥＥＤ及びＡ１０７、好ましくはＫｉＨから選択される請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の免疫サイトカイン。
- 前記ヘテロ二量体Ｆｃドメインは、ホモ二量体Ｆｃドメインを有する免疫サイトカインと比較して、細胞培養における発現時に前記免疫サイトカインのより高い収率をもたらす請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の免疫サイトカイン。
- 前記免疫サイトカインの半減期が増加し、前記抗体又はその機能的多様体はＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体又はその機能的多様体であり、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ又はＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌから選択される変異を含み、
番号付けはＥＵ番号付けに従う
請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の免疫サイトカイン。 - 前記抗体又はその機能的多様体は、低下した抗体依存性細胞傷害活性を有し、前記抗体又はその機能的多様体はＩｇＧ４抗体又はその機能的多様体であり、Ｌ２３５Ｅ変異及びＫｉＨヘテロ二量体化Ｆｃドメインを含む請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の免疫サイトカイン。
- 前記コンジュゲートは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、前記ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン又はその誘導体と、リンカーと、前記ＩＬ－１５又はその誘導体とを含む融合タンパク質であり、好ましくは前記ＩＬ－１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインは配列番号５の配列を含み、
前記リンカーは、１８～２２アミノ酸の長さを有し、好ましくはグリシン又はセリン及びグリシンから構成され、より好ましくは配列番号７の配列を有し、好ましくは前記ＩＬ－１５は配列番号２の配列を有する
請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の免疫サイトカイン。 - 前記ＩＬ－１５多様体は、
ａ． 翻訳後修飾に関して前記ＩＬ－１５多様体の均質性を増加させる少なくとも１つの変異であって、
好ましくは、前記変異は、ＩＬ－１５（配列番号２）のＮ７７における脱アミド化及び／若しくはＮ７９におけるグリコシル化を低減し、
より好ましくは、前記変異は、変異Ｇ７８Ａ、Ｇ７８Ｖ、Ｇ７８Ｌ若しくはＧ７８Ｉ、及びＮ７９Ｑ、Ｎ７９Ｓ若しくはＮ７９Ｔから選択され、
最も好ましくは、前記変異はＧ７８Ａ／Ｎ７９Ｑである、少なくとも１つの変異、並びに／又は
ｂ． 前記ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及び／若しくは前記γｃ受容体への結合を低下させる少なくとも１つの変異であって、
前記変異アミノ酸は、ＩＬ－１５（配列番号２）のＮ１、Ｎ４、Ｓ７、Ｄ８、Ｋ１０、Ｋ１１、Ｄ３０、Ｄ６１、Ｅ６４、Ｎ６５、Ｌ６９、Ｎ７２、Ｅ９２、Ｑ１０１、Ｑ１０８、Ｉ１１１から選択され、好ましくは、前記変異アミノ酸は、Ｄ６１、Ｎ６５及びＱ１０１から選択され、より好ましくは、前記変異アミノ酸はＮ６５である、少なくとも１つの変異
を含む請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の免疫サイトカイン。 - 前記ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ及び／又は前記γｃ受容体への結合を低下させる前記少なくとも１つの変異は、Ｎ１Ｄ、Ｎ１Ａ、Ｎ１Ｇ、Ｎ４Ｄ、Ｓ７Ｙ、Ｓ７Ａ、Ｄ８Ａ、Ｄ８Ｎ、Ｋ１０Ａ、Ｋ１１Ａ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ａ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｅ、Ｎ６５Ｒ、Ｎ６５Ｋ、Ｌ６９Ｒ、Ｎ７２Ｒ、Ｑ１０１Ｄ、Ｑ１０１Ｅ、Ｑ１０８Ｄ、Ｑ１０８Ａ、Ｑ１０８Ｅ及びＱ１０８Ｒ、好ましくはＤ８Ａ、Ｄ８Ｎ、Ｄ６１Ａ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ７２Ｒ、Ｑ１０１Ｄ、Ｑ１０１Ｅ及びＱ１０８Ａ、より好ましくはＤ６１Ａ、Ｎ６５Ａ及びＱ１０１Ｄ、最も好ましくはＮ６５Ａから選択される置換、又はＤ８Ｎ／Ｎ６５Ａ、Ｄ６１Ａ／Ｎ６５Ａ若しくはＤ６１Ａ／Ｎ６５Ａ／Ｑ１０１Ｄから選択される組み合わされた置換である請求項１１に記載の免疫サイトカイン。
- 前記抗体又はその機能的多様体は、
ａ． 好ましくはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＯＬＲ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＥＡ、ＧＤ２、Ｏ－アセチル－ＧＤ－２、ＧＭ１、ＣＡＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ｃ－ＭＥＴ、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８から選択される腫瘍抗原に結合するか、
ｂ． 好ましくはＦＡＰ、フィブロネクチンのＥＤＡドメイン、フィブロネクチンのＥＤＢドメイン及びＬＲＲＣ１５、好ましくはＦＡＰ及びフィブロネクチンのＥＤＢドメインから選択される腫瘍細胞外マトリックス抗原に結合するか、
ｃ． 血管新生抗原、好ましくはＶＥＧＦ、又はエンドグリンに結合するか、
ｄ． 免疫調節抗体又はその機能的多様体であり、
前記免疫調節抗体は、共刺激受容体を刺激し、好ましくはＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ１３７／４－１ＢＢアゴニスト、ＣＤ１３４／ＯＸ４０アゴニスト及びＴＮＦＲＳＦ１８／ＧＩＴＲアゴニストから選択されるか、又は
前記免疫調節抗体は、免疫抑制受容体を阻害し、好ましくはＰＤ－１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニスト、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト、阻害性ＫＩＲアンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＨＡＶＣＲ２アンタゴニスト及びＡＤＯＲＡ２Ａアンタゴニスト、より好ましくはＰＤ－１アンタゴニストから選択される
請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の免疫サイトカイン。 - サイトカインドメインは配列番号１０の配列を含み、
前記抗体は、
ｉ． 配列番号２０の重鎖ｋｎｏｂ配列、
ｉｉ． 配列番号２２又は配列番号１０１、好ましくは配列番号１０１の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号１６の軽鎖配列
を含み、前記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
請求項１に記載の免疫サイトカイン。 - サイトカインドメインは配列番号１０の配列を含み、
前記抗体は、
ｉ． 配列番号８４の重鎖ｋｎｏｂ配列
ｉｉ． 配列番号８７の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号８８の軽鎖配列
を含み、前記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
請求項１に記載の免疫サイトカイン。 - サイトカインドメインは配列番号１０の配列を含み、
前記抗体は、
ｉ． 配列番号９３の重鎖ｋｎｏｂ配列、
ｉｉ． 配列番号９５の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号９２の軽鎖配列
を含み、前記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
請求項１に記載の免疫サイトカイン。 - サイトカインドメインは配列番号１０の配列を含み、
前記抗体は、
ｉ． 配列番号１０９の重鎖ｋｎｏｂ配列、
ｉｉ． 配列番号１１０の重鎖ｈｏｌｅ配列、及び
ｉｉｉ． 配列番号８８の軽鎖配列
を含み、前記サイトカインドメインは、リンカーなしで重鎖ｋｎｏｂ配列のＣ末端に融合されている
請求項１に記載の免疫サイトカイン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21181271.4 | 2021-06-23 | ||
| EP22163748.1 | 2022-03-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024524891A true JP2024524891A (ja) | 2024-07-09 |
Family
ID=
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