KR20240024242A - 인터루킨-15 기반 면역 사이토카인 - Google Patents

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다비드 베샤르
사르카 페추코바
주자나 안토소바
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로저 렌조 빌리
루카스 바머르트
로렌츠 발트마이어
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Abstract

본 발명은 특히 IL-15 초작용제 (IL-15 및 IL-15Rα의 스시 도메인 기반) 및 항체를 포함하는 면역 사이토카인에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵산, 벡터, 방법 및 의학적 용도를 제공한다.

Description

인터루킨-15 기반 면역 사이토카인
본 발명은 특히 IL-15 초작용제 (IL-15 및 IL-15Rα의 스시 도메인 기반) 및 항체를 포함하는 면역 사이토카인에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵산, 벡터, 방법 및 의학적 용도를 제공한다.
인터루킨 15 (Interleukin 15, IL-15)는 자연적으로 발생하는 사이토카인 (cytokine)으로 세포 독성 림프구와 기억 표현형 CD8+ T 세포의 생성을 유도하고 자연 살해 (natural killer, NK) 세포의 증식과 유지를 자극하지만, 인터루킨 2와 달리 활성화에 의한 세포 사멸을 매개하지 않고, 지속적으로 트레그 (Tregs)를 활성화하지 않으며 모세혈관 누출 증후군을 덜 유발한다 (Waldmann 외. 2020). 특히 암치료에서 IL-15 및 증가하는 수의 IL-15 유사체/초작용제 (analogs/superagonists)의 효과와 한계를 입증하는 광범위한 전임상 및 임상 연구가 수행되었으며, 이에 대해 Robinson과 Schluns가 검토하였다 (Robinson and Schluns 2017).
IL-15는 인터루킨 2 (IL-2)와 마찬가지로 α, β 및 γ 서브 유닛을 가진 이종 삼중 수용체 (heterotrimeric receptors)를 통해 작용하는 반면에 IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-21과도 공유되는 공통 감마 사슬 수용체 (γc 또는 γ)와 IL-2/IL-15Rβ (IL-2Rβ, CD122로도 알려져 있음)를 공유한다. 세 번째 서브유닛으로, 이종 삼중 수용체는 IL-2 또는 IL-15에 대한 특정 서브유닛, 즉 IL-2Rα(CD25) 또는 IL-15Rα(CD215)를 포함한다. 다운스트림 (downstream)에 있는 IL-2와 IL-15 이종 삼중 수용체는 세포 내 신호 전달을 위해 JAK1 (야누스 키나아제 1), JAK 3, 및 STAT3/5 (신호 전달자 및 전사 3 및 5의 활성화제) 분자를 공유하여 유사한 기능을 수행하지만 두 사이토카인은 Waldmann (2015, 표 1 참조) 및 Conlon (2019)이 검토한 것처럼 서로 다른 역할을 수행한다.
따라서, IL-2, IL-15 또는 이의 유도체의 결합에 의한 서로 다른 이종삼중 수용체의 활성화는 잠재적으로 면역 체계의 특정 조절 및 잠재적 부작용을 초래할 수 있다. 최근에는 IL-15 또는 IL-15 변이체를 포함하는 새로운 화합물이 NK 세포와 CD8+ T 세포의 활성화를 구체적으로 표적으로 하는 것을 목표로 설계되었다. 이러한 화합물은 중간 친화력 IL-2/IL-15Rβγ, 즉 IL-2/IL-15Rβ와 γc 서브유닛으로 구성된 수용체를 표적으로 하는 화합물로, NK 세포, CD8+ T 세포, NKT 세포 및 γδ T 세포에서 발현된다. 이는 IL-15 전달을 통한 안전하고 강력한 면역 자극을 위해 매우 중요한데, 설계된 화합물인 SO-C101(RLI-15), ALT-803 및 hetIL-15는 이미 IL-15Rα 서브유닛을 포함하고 있어 항원 제시 세포에 의한 α 서브유닛의 전달을 모사할 수 있다. SO-C101은 IL-15Rα의 공유 결합된 스시+ 도메인을 구성하기 때문에 중간 친화도 IL-15Rβγ에만 결합한다. 결과적으로 SO-C101은 IL-15Rα나 IL-2Rα에는 결합하지 않는다. 마찬가지로, ALT-803과 hetIL-15는 각각 IL-15Rα 스시 도메인 (sushi domain) 또는 용해성 IL-15Rα (soluble IL-15Rα)를 가지고 있으므로 중간 친화력 (mid-affinity) IL-15Rβγ 수용체에 결합한다. 따라서 IL-15 및 IL-15 유사체/초작용제 (analogs/superagonists)는 암 및 감염성 질환 치료를 위한 임상 단계의 유망한 개발 후보 물질이다.
사이토카인을 표적으로 전달하는 방법으로 면역 사이토카인 (immunocytokines)이라고 하는 항체-사이토카인 융합 분자가 개발되었다. 이러한 단백질은 항원 결합 특성과 사이토카인 활성을 모두 보유한다. 종양 관련 항원, 신생 혈관 형성 항원, 종양 미세 환경 항원 또는 면역 체크 포인트에 항체 부분을 표적화함으로써 면역 사이토카인은 종양 미세 환경에 격리되고, 사이토카인 부분은 면역 세포에 발현되는 동종 수용체를 통해 신호를 전달하여 항종양 반응을 유도할 수 있다. 예를 들어, 항체가 체크 포인트 억제제 (check point inhibitor, CPI)인 경우, 항체와 사이토카인의 조합은 CPI를 통해 면역 체계의 "브레이크 (brakes)"를 해제하고 사이토카인을 통해 면역 세포를 자극함으로써 암에 대한 면역 반응을 강화한다. 항체가 종양 항원을 표적으로 하는 경우, 항체 이펙터 (antibody effector) 기능에 관여하는 면역 세포를 활성화하는 사이토카인의 존재로 인해 항체 이펙터 기능이 향상될 수 있다.
하지만, 아직 승인된 IL-15 기반 면역 사이토카인은 시중에 나와 있지 않다. 최근 CEA와 FAP를 표적으로 하는 IL-2 기반 면역 사이토카인은 개발이 중단된 것으로 보인다.
따라서, 면역 사이토카인의 설계를 개선해야 할 필요성이 지속적으로 제기되고 있다.
WO 2018/184964A1 WO2019/166946A1
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Figure pct00001
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본 출원인은 현재 IL-15 초작용제 (IL-15 및 IL-15Rα의 스시 도메인 기반) 활성과 면역 사이토카인을 형성하는 항체를 조절할 수 있는 돌연변이/단백질 변형 툴박스 (modification toolbox)를 개발하였다. 본 출원인은 면역 효과 세포에 대한 너무 높은 친화력으로 인한 표적 매개 약물 침착을 최소화하고 면역 사이토카인의 반감기를 증가시키기 위해 IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체에 대한 IL-15 작용제의 결합을 감소시키는 적절한 단일 또는 이중 돌연변이를 확인하였다. 결합 감소 수준을 다양한 돌연변이를 통해 조정할 수 있다. IL-15 초작용제의 다른 돌연변이는 번역 후 변형과 관련하여 IL-15 변이체의 균질성을 향상시킬 수 있다. IL-15 강화제의 활성 조절에는 항체에 융합된 하나 또는 두 개의 사이토카인의 존재를 변화시키는 것도 포함될 수 있다. 따라서 툴박스에는 이종이합체 항체를 허용하는 돌연변이도 포함되어 있다. 항체 이펙터 기능을 조절하는 툴박스 돌연변이에는 항체 의존성 세포 독성을 강화 또는 감소시키는 Fc 돌연변이 및/또는 항체의 생체 내 반감기 또는 안정성을 증가시키는 돌연변이가 포함될 수 있다. 본 툴박스에는 아푸코실화 항체를 생산하여 항체 의존성 세포 독성을 강화하는 방법도 포함되어 있다. 본 툴박스에는 IgG1 또는 IgG4 항체와 같이 특정 요구에 맞는 다양한 형식의 항체도 포함되어 있다. 본 출원인은 또한 CPI 활성 또는 종양 항원 표적 항체와 IL-15 초강력 항체의 활성을 결합하는 것을 목표로 하는 예시적인 면역 사이토카인을 설계하였다. 합체화된 펨브롤리주맙에 기반한 면역 사이토카인으로, IL-2/IL-15Rβ에 대한 결합이 감소된 RLI 분자에 융합된 ADCC 활성이 감소된 면역 사이토카인은 CPI와 사이토카인의 조합이다. 선택적으로 ADCC 활성이 강화된 항-CLDN18.2 항체, 이합체화된 hCl1a를 기반으로 하는 면역 사이토카인은 IL-2/IL-15Rβ에 대한 결합이 감소된 RLI 분자에 융합된 종양 항원 표적 항체와 사이토카인의 조합이다.
정의
"면역글로불린 (immunoglobulin, Ig)으로도 알려진 '항체'는 인간과 대부분의 포유류에서 이황화 결합으로 연결된 두 개의 중쇄 (heavy chains, HC)와 두 개의 경쇄 (light chains, LC)로 구성된 커다란 Y자형 단백질이다. 경쇄는 하나의 가변 도메인 VL과 하나의 상수 도메인 CL로 구성되며, 중쇄는 하나의 가변 도메인 VH와 3개의 상수 도메인 CH1, CH2, CH3로 구성된다. 구조적으로도 항체는 두 개의 항원 결합 단편 (antigen-binding fragments, Fab)으로 나뉘며, 각각 하나의 VL, VH, CL, CH1 도메인과 두 개의 중쇄 중 두 개의 CH2와 CH3를 포함하는 Fc 단편 또는 도메인을 포함한다.
본 발명에 있어서, “항체 변이체 (antibody variant)” 또는 “항체 기능 변이체 (antibody functional variant)”는 예를 들어, 이펙터 기능 (effector function)을 조절하거나, 항체 Fc 도메인의 이종이합체화 (heterodimerization)를 유도하는 등의 변형을 갖는 항체와 관련된다. 이러한 변이체는 돌연변이 및/또는 번역 후 변형에 의해 달성될 수 있다. 항체 변이체는 또한 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 중쇄에서 N-말단 라이신이 절단된 항체 중쇄를 포함한다. 염료, 방사성 핵종, 독소 또는 기타 결합 모이어티와 같은 다른 모이어티에 화학적 또는 효소적 결합을 위한 중쇄 및/또는 경쇄의 N- 또는 C- 말단 태그가 포함된 변형도 있다. 또한, 항체 변이체는 화학적 변형, 글리코실화의 변형 또는 다른 모이어티에 화학적 결합을 위한 인공 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 항체 변이체는 또한 잠재적으로 두 개 이상의 서로 다른 에피토프를 인식하는 면역글로불린 감마 (IgG) 기반 이중특이성 항체와 관련이 있다. 다양한 형태의 이중 특이항체가 당업에 공지되어 있으며, 예를 들어, Godar et al. (2018) 및 Spiess et al. (2015)에서 검토된 바 있다. 본 발명에 따른 이중 특이적 포맷은 Fc 도메인을 포함한다. 본 발명의 면역사이토카인 (Immunocytokines)과 관련하여, 2개의 RLI 접합체는, 모이어티 (moiety)에 달리 연결되지 않으면 두 경쇄의 C-말단 또는 두 중쇄의 C-말단에 융합될 수 있으며; 대안적으로, 하나의 RLI 접합체는 이중특이적 형식에 대해 하나의 중쇄의 C-말단에 융합될 수 있거나, 또는 상이한 경쇄를 갖는 이종이합체 이중특이적 형식의 중쇄 또는 하나의 경쇄에 융합될 수 있다. 항체 기능 변이체는 해당 비변형 항체와 동일한 에피토프 또는 표적에 결합할 수 있다. 일반적으로 사용되는 '항체'라는 용어는 본 명세서상에 정의된 항체의 변형을 포함한다.
본 발명에 있어서, “접합체”는 인터루킨 15 (IL-15) 또는 그 유도체의 비공유 (non-covalent) 또는 공유 (covalent) 복합체 및 인터루킨 15-수용체 알파 (IL-15Rα) 또는 그 유도체의 스시 도메인에 관한 것이다. 비공유 복합체는 두 폴리펩타이드의 공동 발현 (co-expression) 또는 분리 발현 (separate expression), (부분) 정제 및 후속 조합에 의해 형성될 수 있으며, 이러한 폴리펩타이드의 친화성으로 인해 이러한 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 접합체는 두 개의 폴리펩타이드가 유전적으로 융합되고 재조합에 의해 발현되어 단일 폴리펩타이드 사슬을 생성하여 온전한 복합체를 형성하는 융합 단백질이다.
본 발명에 있어서, “면역사이토카인 (immunocytokine)”은 본 발명에 따른 접합체에 유전적으로 융합된 항체 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
특정 면역사이토카인 구조 내에서 RLI가 언급된다면, 이는 RLI2이다.
개시된 항체 또는 부분 항체 서열에는 EU 넘버링 체계가 적용되었다.
"생체 내 반감기" 또는 T½는 (말기) 혈장 반감기 또는 T½는 제거 반감기 또는 말기 반감기를 의미하며, 즉 투여 후 생체 내 반감기는 유사 분포 평형에 도달한 후 혈장/혈중 농도가 50% 감소하는데 필요한 시간이다 (Toutain and Bousquet-Melou 2004). 혈액/혈장 내 약물, 여기서는 폴리펩타이드인 면역사이토카인 작용제의 측정은 일반적으로 폴리펩타이드에 특이적 ELISA를 통해 수행된다. 특정 약물의 생체 내 반감기는 모든 포유류에서 측정할 수 있다. 예를 들어, 생체 내 반감기는 사람, 영장류 또는 마우스에서 측정할 수 있다. 인간에서 결정된 생체 내 반감기는 마우스에서 결정된 생체 내 반감기와 상당히 다를 수 있지만, 즉 특정 약물에 대한 생쥐의 생체 내 반감기는 일반적으로 동일한 약물에 대한 인간의 생체 내 반감기보다 짧지만, 마우스에서 결정된 생체 내 반감기는 여전히 인간의 특정 생체 내 반감기에 대한 표시를 제공한다. 따라서 마우스 (mice)에서 특정 약물의 생체 내 반감기가 결정되면 사람의 생체 내 반감기를 추정할 수 있다. 이는 사람을 대상으로 한 과학적 목적의 실험이 금지되어 있기 때문에 특정 약물의 생체 내 반감기를 직접 측정하는 것이 거의 불가능하므로 특히 중요하다. 또는 인간의 반감기와 더 유사한 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이)에서 반감기를 측정할 수도 있다.
“병용 투여 (administered in combination)”라고 명시된 경우 이것은 일반적으로 두 약제의 공동 조제 및 공동 투여를 의미하는 것이 아니라 한 약제가 다른 약제와 함께 사용하도록 명시된 라벨이 부착되어 있다는 의미이다. 그래서, 예를 들면, 면역 사이토카인은 암을 치료 또는 관리하는데 사용되는데, 이러한 경우 면역 사이토카인과 추가 치료제를 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여하거나 그 반대의 경우도 포함된다. 그러나 본 발명의 어떤 내용도 번들 (bundle) 또는 키트 (kit)로 제공되거나 투약 스케줄이 일치하는 경우 함께 조제 및 투여되는 두 가지 복합제를 배제해서는 안 된다. 따라서, "병용 투여"에는 (i) 약물을 공동 주입, 공동 주사 또는 이와 유사한 방식으로 함께 투여하는 경우, (ii) 약물을 개별적으로 투여하되 각 약물의 주어진 투여 방법에 따라 병용으로 투여하는 경우, (iii) 약물을 개별적으로 순차적으로 투여하는 경우가 포함된다.
이 맥락에서 병행 투여는 두 치료가 함께 시작되는 것이 바람직하며, 예를 들어 치료 요법 내에서 각 약물의 첫 번째 투여를 같은 날에 투여하는 것을 의미한다. 잠재적으로 다른 치료 일정을 고려할 때 다음 날/주/월 동안 투여가 항상 같은 날에 이루어지지 않을 수 있다. 일반적으로 병행 투여는 각 치료 주기가 시작될 때 두 약물이 동시에 체내에 존재하는 것을 목표로 한다. 이러한 맥락에서 순차적 투여는 두 치료가 순차적으로 시작되는 것이 바람직하며, 예를 들어 첫 번째 약물의 첫 번째 투여는 두 번째 약물이 활성화되기 전에 첫 번째 약물에 대한 신체의 약역학적 반응 (pharmacodynamic response)을 허용하기 위해 두 번째 약물의 첫 번째 투여보다 적어도 하루, 바람직하게는 며칠 또는 1주일 전에 이루어집니다. 그런 다음 치료 일정은 서로 겹치거나 간헐적으로 또는 바로 이어서 진행할 수 있다.
'약'이라는 용어는 값과 함께 사용될 때 해당 값의 10%, 가급적 5%, 특히 1%를 더하거나 뺀 값을 의미한다.
본 명세서 및 청구범위에서 "포함하는"이라는 용어가 사용되는 경우, 다른 요소를 배제하는 것은 아니다. 본 발명의 목적상, "구성하는"이라는 용어는 "포함하는"이라는 용어의 바람직한 실시예로 간주된다. 이하에서 그룹이 적어도 특정 수의 실시예를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이는 또한 이러한 실시예로만 구성되는 그룹을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
단수 명사를 지칭할 때 부정관사 또는 정관사를 사용하는 경우 (예를 들어, "a", "an" 또는 "the"), 특별히 다른 내용이 명시되지 않는 한 해당 명사의 복수형도 포함된다.
따라서 "적어도 하나의 화학요법제 (at least one chemotherapeutic agent)"에서와 같이 "적어도 하나 (at least one” such as in)"라는 용어는 하나 이상의 화학요법제를 의미할 수 있다. 같은 맥락에서 "이들의 조합 (combinations thereof)"이라는 용어는 둘 이상의 화학요법제를 포함하는 조합을 의미한다.
기술 용어는 상식적인 의미로 사용된다. 특정 용어에 특정한 의미가 전달되는 경우 해당 용어가 사용되는 문맥에서 용어의 정의는 다음과 같이 제공된다.
"qxw", 라틴어 쿼크/각각에서 유래, 매 x주마다마다 (예를 들어, 매 2번째 주마다 q2w).
"s.c." 또는 "SC"는 피하 주사.
"i.v." 또는 "IV"는 정맥 주사.
"i.p." 또는 "IP"는 복강 주사.
Cmax는 최대 농도
AUC는 곡선 아래 면적
표 1: 분자목록
본 발명의 설명
본 발명의 일 측면에 있어서, 본 발명은 사이토카인 접합체 및 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 면역 사이토카인에 관한 것이다. 사이토카인 접합체는 인터루킨 15 (IL-15) 또는 이의 유도체의 아미노산 서열과 인터루킨 15-수용체 알파 (IL-15Rα) 또는 이의 유도체의 스시 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 면역 사이토카인에 포함된 항체 또는 항체의 기능적 변이체는 이종이합체 Fc 도메인, 변형된 이펙터 기능 (동일한 IgG 계열의 야생형 Fc 도메인을 갖는 동일한 면역 사이토카인과 비교) 및/또는 증가된 생체 내 반감기 (동일한 IgG 계열의 야생형 Fc 도메인을 갖는 동일한 면역 사이토카인과 비교)를 특징으로 한다. 접합체는 두 항체 중쇄 또는 항체 경쇄의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 융합되거나, 이종이합체 Fc 도메인의 경우 한 항체 중쇄의 C-말단에 융합될 수 있다.
면역 사이토카인의 생체 내 반감기 증가는 FcRn 결합을 증가시키는 Fc 돌연변이를 통해 이루어질 수 있다.
항체 또는 항체의 기능적 변이체의 Fc 도메인은 중쇄의 C-말단 라이신의 절단, 또는 이종이합체 Fc 도메인의 경우, 하나 또는 양쪽 중쇄의 절단과 같은 추가 변형을 포함할 수도 있다. 또한, 간접 융합의 경우 글리신 (glycine) 및 세린 (serine)과 같은 잔기로 구성된 유연한 링커를 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 도입하여 인접한 접합체가 항체 Fc 도메인에 대하여 자유롭게 이동할 수 있도록 할 수 있다.
일 양태에 있어서, 면역 사이토카인에 포함된 항체 또는 항체의 기능적 변이체는 표 1에 개시된 바와 같이 항체 hCl1a, hCl1b, hCl1c, hCl1d, hCl1e, hCl1f, hCl1g, hCl1h, hCl1i 및 hCl1j가 아닌 항체이다.
일 양태에 있어서, 상기 면역 사이토카인에 포함된 항체 또는 항체의 기능적 변이체는 표 4에 개시된 바와 같이 항체 hCl1a, hCl1b, hCl1c, hCl1d, hCl1e, hCl1f, hCl1g, hCl1h, hCl1i 및 hCl1j이다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 표적에 결합하는 항체 또는 항체의 기능적 변이체를 제공하며, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG4, 합성 IgG 또는 이중 특이적 항체 또는 이들의 Fc-엔지니어링 버전이다. 바람직한 일 양태에 있어서, 항체는 IgG1 또는 IgG4 클래스 항체이다. 표적이 종양 세포에 존재하는 경우, 선호되는 항체 형식은 IgG1이다. 표적이 면역 세포에 존재하는 경우, 선호되는 항체 형식은 IgG4이다. 항체 형식이 IgG1인 경우, 면역글로불린의 Fc 영역은 여러 Fcγ 수용체 (FcγR) 및 보체 단백질 (예를 들어, C1q)과 우선적으로 상호작용하고, 항체 의존성 세포 독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC), 항체 의존성 세포 포식 작용 (antibody-dependent cellular phagocytosis, ADCP) 또는 보체 의존성 세포 독성 (complement-dependent cytotoxicity, CDC)을 통해 표적 세포 제거와 같은 면역 이펙터 (immune effector) 기능을 매개한다. 치료적 접근의 경우, Fc 매개 이펙터 기능을 강화하거나 침묵시키는 것이 도움이 될 수 있다. 항체가 종양 세포를 표적으로 하는 경우 ADCC와 같은 Fc 매개 이펙터 기능이 강화될 수 있고, 항체가 PD-1 또는 CTLA-4와 같은 면역 세포에 존재하는 체크포인트 억제제를 표적으로 하는 경우 기능이 꺼질 수 (silenced) 있다. 항체가 PD-1 또는 CTLA-4와 같은 면역 세포에 존재하는 체크 포인트 억제제를 표적으로 하는 경우, 항체는 Fc-매개 이펙터 기능을 잘 유도하지 못하는 IgG4 형식일 수 있다. 다른 일 양태에 있어서, PD-1 또는 CTLA-4와 같은 체크 포인트 억제제를 표적으로 하는 항체는 ADCC 및/또는 CDC 활성을 강력하게 감소시키거나 꺼지도록 조작된 IgG1 포맷, 예를 들어, FcγR 및 C1q 결합이 감소된 것 일 수 있다. 항종양 치료 항체를 개발할 때 IgG 하위 클래스를 선택하는 방법에 대한 충분한 지침은 Yu J. et al (Yu, Song et al. 2020)에서 찾을 수 있다.
항체 Fc 매개 기능은 Fc 엔지니어링 면역글로불린을 사용하여 조절할 수 있다. 표 2는 이러한 Fc 엔지니어링의 예를 보여준다.
표 2: 항체 이펙터 기능을 조절하기 위한 변형의 예. 달리 명시되지 않는 한, 돌연변이는 IgG1 서브클래스에 있다. Wang 등 (Wang, Mathieu et al. 2018)에서 발췌.
ADCC를 유도하는 항체 또는 이펙터 세포의 효능을 결정하기 위한 여러 가지 실험실 방법이 존재한다. 일반적으로 특정 표면에 노출된 항원을 발현하는 표적 세포주를 해당 항원에 특이적인 항체 또는 면역 사이토카인과 함께 배양한다. 배양 시, Fc 수용체 CD16 (Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a) 및 FcγRIIIb(CD16b))을 발현하는 이펙터 세포를 항체 또는 면역 사이토카인이 표지된 표적 세포와 함께 배양한다. 이펙터 세포는 일반적으로 말초혈액 단핵구 (PBMC)이며, 이 중 일부가 NK 세포이며, 정제된 NK 세포를 사용할 수도 있다. 또 다른 대안으로는 인간 CD16(NK92-hCD16)을 외인성 발현하는 인간 NK 세포주 NK92(ATCC CRL-2407)를 사용하는 것이 있다. 몇 시간 동안 항체, 표적 세포, 이펙터 세포 사이에 복합체가 형성되어 표적의 세포막이 용해된다. 표적 세포에 일종의 라벨이 미리 부착되어 있는 경우, 세포 용해량에 비례하여 라벨이 방출된다. 세포 독성은 건강하고 손상되지 않은 세포 내에 남아 있는 라벨의 양과 용액 내 라벨의 양을 비교하여 측정함으로써 정량화할 수 있다. 이 라벨은 Perussia와 Loza (Perussia and Loza 2000)에 설명된 대로 방사성 레이블 51Cr일 수 있다. 미리 로드된 표적 세포를 사용하는 대신 LDH 세포 독성 분석법을 사용하여 ADCC 활성을 측정할 수도 있다. LDH 세포 독성 분석은 세포의 세포 독성을 측정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공하는 비색 분석법이다. 젖산 탈수소효소 (Lactate dehydrogenase, LDH)는 다양한 세포 유형에 존재하는 세포소화 효소로, ADCC 중에 발생하는 원형질막 손상과 같이 원형질막이 손상되면 세포 배양액으로 방출된다. LDH 분석 프로토콜은 효소 결합 반응을 기반으로 한다: 세포에서 방출된 LDH는 젖산염을 산화시켜 NADH를 생성한 다음 수용성 테트라졸륨염 (water soluble tetrazolium salt, WST)과 반응하여 노란색을 생성할 수 있다. 생성된 색의 강도는 용해된 세포의 수와 직접적인 상관관계가 있다. 실시예 9에 개시된 바와 같이 ADCC 활성을 측정할 수도 있다.
표적 및 이펙터 세포를 사용하는 ADCC 분석의 대안으로, 실시예 24에 설명된 대로 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance, SPR)을 통해 면역 사이토카인의 Fc 수용체 결합을 테스트할 수도 있다.
일 양태에 있어서, 면역 사이토카인에 포함된 항체 또는 이의 기능적 변이체의 변형된 이펙터 기능은 동일한 IgG 계열의 야생형 Fc 도메인을 갖는 동일한 면역 사이토카인에 비해 항체 의존적 세포 독성이 감소한다. 항체 이펙터 기능은 해당하는 섹션의 표 2에 나열된 돌연변이를 통해 FcγR 및 C1q 결합을 감소시킴으로써 감소될 수 있다.
일 양태에 있어서, 기능적 변이체의 항체가 IgG1인 경우, ADCC의 감소는 L234A/L235A, P329G, L234A/L235A/P329G, G236R/L328R, D265A, N297A, N297Q, N297G 또는 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 중에서 선택된, 바람직하게는 L234A/L235A/P329G에서 선택된 돌연변이를 통해 달성할 수 있다.
다른 일 양태에 있어서, 기능적 변이체의 항체가 IgG4인 경우, ADCC의 감소는 L235E, F234A/L235A, F234A/L235A/P329G, P329G, S228P/L235E, S228P/F234A/L235A 또는 E233P/F234V/L235A/D265A/R409K 중에서 선택된, 바람직하게는 L235E에서 선택된 돌연변이를 통해 달성될 수 있다.
또 다른 일 양태에 있어서, 기능적 변이체의 항체가 IgG2인 경우, H268Q/V309L/A330S/P331S 또는 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 중에서 선택된 변이를 통해 ADCC 감소가 달성될 수 있다.
일 양태에 있어서, 기능적 변이체의 항체가 IgG2(IgG2a 또는 IgG2b) 및 IgG4 하이브리드 또는 이의 기능적 변이체이며 IgG2의 CH1 및 힌지 영역 (hinge region) 및 CH2 및 CH3 유래의 IgG4 (IgG2 아미노산 118~260 및 IgG4 아미노산 261 내지 447) 영역을 포함할 때 ADCC의 감소가 달성될 수 있다.
바람직한 일 양태에 있어서, IgG1 항체의 ADCC 감소는 L234A/L235A ("LALA") 돌연변이를 통해 달성될 수 있으며, 서열번호 26의 IgG1 Fc 영역을 포함할 수 있다.
다른 바람직한 일 양태에 있어서, IgG1 항체의 ADCC 감소는 L234A/L235A/P329G (“LALAPG”) 돌연변이를 통해 달성될 수 있으며, 서열번호 26의 IgG1 Fc 영역을 포함할 수 있다.
실시예 23과 도 13은 면역 사이토카인 hCl1a LALAPG-RLI DANA를 NK92 세포가 있는 상태에서 A549-CLDN18.2 세포 또는 PA-TU-8988에 테스트했을 때 hCl1a 항체 단독의 면역 사이토카인 hCl1a-RLI DANA와 비교할 때 ADCC 활성이 거의 사라진다는 것을 보여준다. hCl1a LALA 항체도 hCl1a 항체와 비교했을 때 ADCC 활성을 감소시켰지만, ADCC 활성이 완전히 제거된 것은 아니다.
다른 바람직한 일 양태에 있어서, IgG4 항체를 선택할 때, L235E 돌연변이, F234A/L235A 또는 E233P/F234V/L235A/D265A/L309V/R409K 돌연변이를 통해 이미 저하된 Fc 매개 이펙터 기능의 유도가 더욱 감소될 수 있다.
바람직한 일 양태에 있어서, IgG4 항체의 ADCC 감소는 L235E 돌연변이를 통해 달성될 수 있으며, 서열번호 43의 IgG4 FC 영역을 포함할 수 있다.
다른 일 양태에 있어서, 면역사이토카인에 포함된 항체 또는 이의 기능적 변이체의 변형된 이펙터 기능은 향상된 ADCC이다.
일 양태에 있어서, 항체는 해당 섹션의 표 2에 나열된 돌연변이를 통해 및/또는 어푸코실화 (Afucosylation)에 의해 증가된 FcγRIIIa 결합을 통해 ADCC를 향상시키도록 변형될 수 있다.
일 양태에 있어서, ADCC는 F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S298A/E333A/K334A, K392T/P396L, V264I/I332E 또는 L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A 중에서 선택된 변이를 통하여 Ig G1 항체 또는 이의 변이체에서 강화된다.
바람직한 일 양태에 있어서, ADCC는 바람직하게는 IgG1 항체 또는 그 변이체에서 S239D/I332E("DE"), S239D/I332E/A330L("DLE"), S298A/E333A/K334A("AAA"), K392T/P396L("TL") 또는 V264I/I332E("IE") 중에서 선택된 변이를 통해 강화된다.
일 양태에 있어서, ADCC는 IgG1 항체에서 DE 돌연변이를 통해 강화되며, 서열번호 30의 IgG1 Fc 영역을 포함할 수 있다.
다른 일 양태에 있어서, ADCC는 IgG1 항체에서 DLE 돌연변이를 통해 강화되며, 서열번호 31의 IgG1 Fc 영역을 포함할 수 있다.
다른 일 양태에 있어서, ADCC는 IgG1 항체에서 AAA 돌연변이를 통해 강화되며, 서열번호 34의 IgG1 Fc영역을 포함할 수 있다.
또 다른 일 양태에 있어서, ADCC는 IgG1 항체에서 TL 돌연변이를 통해 강화되며, IgG1 항체는 서열번호 36의 IgG1 Fc 영역을 포함할 수 있다.
다른 일 양태에 있어서, ADCC는 IgG1 항체에서 IE 돌연변이를 통해 강화되며, IgG1 항체는 서열번호 37의 IgG1 Fc 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 일 양태에 있어서, ADCC는 또한 아푸코실화를 통해 항체의 푸코스 함량을 줄임으로써 향상시킬수 있다 ((Pereira, Chan et al. 2018). 포도당(6-데옥시-L-갈락토스)은 포유류 세포에서 생성되는 많은 N- 및 O-결합 글리칸의 공통 성분이다. 각 CH2 도메인에 있는 보존된 N-당화 부위 Asn297(N297)에 IgG1의 Fc N-글리칸에 핵심 푸코스가 없으면 자연살해세포와 같은 면역 효과 세포에 존재하는 FcγRIIIa에 대한 IgG1 Fc 결합 친화성이 증가하고 ADCC 활성이 향상되는 것으로 나타났다. 푸코실전달효소(FUT)는 GDP-푸코스에서 수용체 기질로 푸코스 잔여물을 옮긴다. FUT8은 α1,6-푸코실전달효소 중 유일하게 α1,6 결합을 통해 푸코스를 N-글리칸의 가장 안쪽 N-아세틸글루코사민으로 전달하여 IgG1의 핵심 푸코실화를 촉진하는 효소이다. 아푸코실화 항체는 FUT8 유전자가 녹아웃된 CHO 세포에서 생산될 수 있다 (포텔리전트® 기술). 이러한 세포주에서 생산된 항체는 기존의 CHO 세포에서 생산된 동일한 항체와 비교하여 향상된 ADCC를 나타내었다 (Yamane-Ohnuki, Kinoshita et al. 2004). 또는, 포도당 합성 경로가 편향된 글리코 엔지니어링 세포주에서 항체를 생산하여 아푸코실화 항체 (GlymaX®, ProBioGen)를 생성할 수도 있다 (Rosenlocher, Bohrsch et al. 2015, Dekkers, Plomp et al. 2016).
일 양태에 있어서, 항체의 아푸코실화를 통해 FcγRIIIa 결합을 증가시켜 ADCC를 향상시키도록 항체를 변형할 수 있다.
다른 일 양태에 있어서, 항체의 아푸코실화와 결합하여 해당 섹션의 표 2에 나열된 돌연변이 중 하나를 통해 FcγRIIIa 결합을 증가시켜 ADCC를 향상시키도록 항체를 변형할 수 있다.
바람직한 일 양태에 있어서, IgG1 항체는 항체의 아푸코실화와 결합하여 AAA 돌연변이를 통한 FcγRIIIa 결합 증가를 통해 ADCC를 강화하도록 변형될 수 있다.
세포 기반 ADCC 분석법으로 측정한 ADCC 활성을 강화하는 다른 Fc 돌연변이 또는 아푸코실화 또는 아푸코실화와 결합된 돌연변이를 가진 면역 사이토카인의 ADCC 활성은 실시예 23 및 도 14에 나타내었다. 모든 돌연변이는 Fc 도메인 돌연변이가 없거나 항체만 있는 이종이합체 면역 사이토카인과 비교했을 때 테스트한 면역 사이토카인의 ADCC 활성을 비슷한 정도로 증가시켰다. 마찬가지로, 아푸코실화는 면역 사이토카인의 ADCC 활성도 향상시켰다. 아푸코실화와 AAA 돌연변이의 조합도 ADCC를 향상시킨 반면, DE 또는 DLE와 아푸코실화 조합은 DE, DLE 또는 아푸코실화 단독에 비해 ADCC 활성을 더욱 낮추었다.
이펙터 기능을 조절하는 돌연변이가 있는 면역 사이토카인의 Fc 수용체 결합도 실시예 24에 설명된 대로 SPR로 테스트하였다. SPR을 통해 ADCC 활성화 수용체 FcγRIIIa V158, FcγRIIIa F158 및 ADCC 억제 수용체 FcγRIIb에 대한 항체 Fc의 결합을 평가할 수 있었다. SPR 테스트를 통해 전반적으로, ADCC를 향상시키는 돌연변이가 있는 면역사이토카인은 항체 글리코실화가 돌연변이의 영향을 받지 않는 한 돌연변이가 없는 면역 사이토카인보다 ADCC를 강화하는 A/I 비율이 더 높은 것으로 나타났다.
Fc 도메인에 돌연변이를 도입하면 면역 사이토카인의 안정성과 개발 가능성에도 영향을 미칠 수 있으며 Fc 도메인에 돌연변이를 도입하는 것은 면역 사이토카인에 사용되는 각 특정 항체에 따라 달라질 수 있다. 더욱 자세히 설명하자면, Fc 돌연변이가 있는 면역 사이토카인의 용해 온도와 당화 (글리코실화)를 테스트하였다 (실시예 25 참조). 전반적으로, hCl1a 기반 면역 사이토카인의 경우, TL 및 IE 돌연변이는 불리한 글리코실화를 유발하고 DE 및 DLE 돌연변이는 CH2 도메인 용융 온도를 낮추어 안정성에 영향을 미친 반면, 선택적으로 아푸코실화와 결합된 AAA 돌연변이는 hCl1a 기반 면역사이토카인의 안정성과 발달성에 영향을 미치지 않았다.
다른 일 양태에 있어서, 안정성을 향상시키기 위해 항체의 Fc 도메인에 만들어진 변형은 Fab arm 교환을 피하기 위한 IgG4 항체의 S228P 돌연변이일 수 있다 (서열번호 39) (Silva, Vetterlein et al. 2015).
일 양태에 있어서, 항체 Fc 도메인은 사이토카인에 융합된 단 하나의 중쇄를 갖도록 이종이합체일 수 있다. 이종이합체화는 항체의 2개 Fc 도메인 각각의 CH3 사슬의 돌연변이 (CH3A 사슬 및 CH3B 사슬)에 의해 달성될 수 있다. 아래 표 3은 이종이합체 Fc 변이체에 대한 설계를 요약한다 (Ha, Kim et al. 2016).
표 3: 이종이합체 Fc 변이체 디자인의 예
일 양태에 있어서, 항체의 이종이합체화는 다음 이종이합체 Fc 변이체 중 하나를 사용하여 달성할 수 있다: KiH, KiHS-S, HA-TF, ZW1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTS-S, SEED 또는 A107.
바람직한 일 양태에 있어서, 항체의 이종이합체화는 한쪽 중쇄의 CH3 도메인 (서열번호 28)에서 T366W 돌연변이와 반대쪽 중쇄의 CH3 도메인 (서열번호 29)에서 T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 통해 이루어지며, 그 결과 "손잡이-인투홀(KiH)" Fc 변이체가 생성된다. 실시예 2에서는 두 개의 RLI2 접합체로 동종이합체화된 면역 사이토카인의 효능을 이종이합체화된 면역 사이토카인의 효능과 비교한다. 표 11에 따르면 이종이합체 면역 사이토카인 (RTX-RLI x1)에는 단 하나의 RLI2 접합체만 존재하지만, 놀랍게도 그 효능은 여전히 동종이합체 면역 사이토카인 (RTX-RLI 2x)의 효능의 50 %를 상회한다.
이종이합체 면역 사이토카인을 생성하는 방법은 실시예 3에서 확인할 수 있다. 이러한 이종이합체 면역 사이토카인의 효능을 동종이합체 면역 사이토카인과 비교하여 측정한 결과는 실시예 5와 표 15에서 확인할 수 있다. 본 발명의 일 목적은 접합체의 효능을 감소시키는 것이므로, 본 출원인들은 두 개의 RLL2 접합체가 C-말단을 융합한 동종이합체 면역 사이토카인은 효능이 약간 감소한 반면, 하나의 RLI2 접합체만을 가진 이합체 면역 사이토카인은 kit225 세포에서 약 10배의 효능 감소를 보였다는 것을 보여주었다.
바람직하게는, RLI2 접합체는 노브 중쇄에 융합된다.
본 발명의 이종이합체 면역 사이토카인의 예시적인 서열은 서열번호 21 (" HC 노브-RLI2AQNA"), 서열번호 22 또는 서열번호 101 (말단 라이신 결실이 있거나없는 "HC 홀") 및 서열번호 23 (LC)에서 찾을 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 21, SOT201 (펨브롤리주맙 변이체 기반 이종이합체 면역 사이토카인)의 경우 서열번호 101 및 서열번호 23; hCl1a-변이체 기반 이종이합체 면역 사이토카인의 경우 서열번호 85 ("HC 노브-RLI2AQDANA"), 서열번호 87 ("HC 홀") 및 서열번호 88 (LC); 서열번호 111 ("HC 노브- RLI2AQNA"), 서열번호 110 ("HC 홀") 및 서열번호 88 (LC); 다른 hCl1a-변이체 기반 이종이합체 면역 사이토카인의 경우, 서열번호 97 ("HC 노브 AAA-RLI2AQNA"), 서열번호 98 ("HC 홀 AAA") 및 서열번호 99 (LC), 리툭시맙에 기반한 이종이합체 면역 사이토카인 또는 세툭시맙에 기반한 이종이합체 면역 사이토카인의 경우 서열번호 94 ("HC 노브-RLI2AQDANA"), 서열번호 95 ("HC 홀") 및 서열번호 92 (LC)이다.
일 양태에 있어서, 이종이합체 Fc 도메인은 동종이합체 Fc 도메인을 가진 면역 사이토카인에 비해 세포 배양에서 발현 시 더 높은 수율의 면역 사이토카인을 생성한다. 일반적으로 이종이합체 항체 형태는 중쇄와 경쇄가 잘못 결합되어 발현이 낮을 것으로 예상되지만, 놀랍게도 이종이합체 면역 사이토카인의 경우 KiH 기술을 사용한 이종이합체 구조가 각각의 동종이합체 구조에 비해 발현이 높은 것으로 관찰되었다 (실시예 3 참조).
면역 사이토카인이 이종이합체가 아닌 경우, 접합체는 항체의 경쇄의 C-말단 (서열번호 45)에 융합될 수도 있다. 글리신 (glycines) 또는, 세린 (serines)과 글리신으로 구성된 링커는 항체에 대해 융합된 접합체에 유연성을 주기 위해 경쇄의 C-말단과 접합체의 N-말단 사이에 위치할 수 있다.
또는 링커를 사용하여 하나 또는 두 개의 중쇄의 C-말단에 RLI2AQ를 융합할 수도 있다. 이러한 링커는 글리신 또는 글리신과 세린으로 구성되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 길이가 30 내지 50 아미노산인 GGGGS 단위, 특히 서열번호 100의 L40 링커로 구성되는 것이 바람직하다.
다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 면역 사이토카인에 관한 것으로서, 상기 면역 사이토카인은 생체 내 반감기가 증가되고 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체가 IgG1 또는 IgG4 항체, 또는 기능적 변이체이며 M252Y/S254T/T256E, M428L/N434S 또는 T250Q/M428L로부터 선택된 돌연변이를 포함한다.
Fc 도메인은 항체의 안정성과 혈청 반감기에 핵심적인 역할을 한다. 항체 생체 내 반감기는 Fc 도메인의 M252Y/S254T/T256E 또는 M428L/N434S 돌연변이를 통해 FcRn 결합을 증가시켜 증가시킬 수 있다 (Dall'Acqua, Woods et al. 2002, Zalevsky, Chamberlain et al. 2010).
일 양태에 있어서, IgG1 또는 IgG4 유형의 항체의 반감기는 각각 서열번호 35 및 서열번호 44의 Fc 도메인인 M252Y/S254T/T256E("YTE") 돌연변이를 통해 증가된다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 면역 사이토카인에 관한 것으로 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 ADCC를 감소시키고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L235E 돌연변이 및 KiH-헤테로다이머릭 Fc 도메인을 포함하는 면역 사이토카인에 관한 것이다. 항체 표적이 T세포 표면의 PD-1 또는 CTLA-4와 같이 면역세포에 존재하는 체크포인트 억제제인 경우, 이러한 면역세포에 대한 NK세포의 세포 독성을 피하기 위해 ADCC를 감소시키는 것이 도움이 될 수 있다. IgG4 항체는 항체를 안정화하기 위해 선택적으로 S228P 돌연변이를 포함할 수 있다. L235E 돌연변이가 있는 IgG4 Fc 도메인은 서열번호 43 일 수 있다. S228P 돌연변이가 있는 IgG4 CH1-힌지 도메인은 서열이 서열번호 39일 수 있다. IgG4 항체의 KiH-이종이합체 Fc 도메인은 서열 서열번호 41("노브") 및 서열번호 42 ("홀")일 수 있다. 선택적으로, 하나 또는 바람직하게는 두 중쇄 모두 말단에 라이신 결질 (dK)을 가질 수 있으며, 즉, 서열 서열번호 41(“노브”) 및 서열번호 42(“홀”)을 가질 수 있다. 다른 일 양태에 있어서 두 중쇄는 모두 말단 라이신을 갖는다.
실시예 10 내지 실시예 26은 이러한 면역 사이토카인과 관련이 있다.
일 양태에 있어서 면역 사이토카인의 접합체는 N- 내지 C- 말단 순서로, IL-15Rα 스시 도메인 또는 이의 유도체, 링커 및 IL-15 또는 이의 유도체의 융합 단백질을 포함하며, 바람직하게는 상기 IL-15Rα 스시 도메인은 서열번호 5를 포함하며, 더욱 바람직하게는 상기 IL-15Rα 스시 도메인은 서열번호 6을 포함하며, 상기 링커는 18 내지 22 아미노산의 길이를 가지고 바람직하게는 글리신 (glysines) 또는 세린 및 글리신 (serines and glycines)으로 구성되며, 더욱 바람직하게는 서열번호 7의 서열을 가지며, 상기 IL-15는 서열번호 2의 서열을 갖는다.
서열번호 6의 IL-15Rα 스시+ 단편이 서열번호 7의 플렉시블 링커 (flexible linker)를 통해 성숙한 인간 IL-15의 N-말단에 융합된 융합 단백질은 수용체-링커-인터루킨 2의 경우 RLI2 또는 서열이 8인 SO-C101로 불리며, 면역원성이 낮은 임상 단계의 IL-2/IL-15Rβγ 슈퍼 작용제이다. 따라서 이러한 융합 단백질은 면역 사이토카인 형태로 사용하기에 바람직한 접합체이다.
바람직한 일 양태에 있어서, 상기 면역 사이토카인은 번역 후 변형과 관련하여 IL-15 변이체의 균질성을 증가시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 바람직하게는 상기 돌연변이는 IL-15 성숙인간 IL-15 (서열번호 2)의 N77에서의 탈아미드화 및/또는 N79에서의 글리코실화를 감소시키고, 더욱 바람직하게는 상기 돌연변이는 G78A, G78V, G78L or G78I, 및 N79Q, N79S 또는 N79T 중에서 선택된 돌연변이이며, 가장 바람직하게는 상기 돌연변이는 G78A/N79Q이다.
면역사이토카인의 균질성을 증가시키는 IL-15 돌연변이 및 IL-2/IL-15Rβ및/또는 γ수용체에 대한 결합을 감소시키는 IL-15 돌연변이는 본 발명의 면역사이토카인에서 독립적으로 사용될 수 있거나 본 발명의 면역사이토카인에서 조합될 수 있다.
바람직한 다른 일 양태에 있어서, 면역사이토카인은 IL-2/IL-15Rβ및/또는 γc수용체에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 IL-15 변이체를 포함하며, 바람직하게는 돌연변이된 아미노산은 N1, N4, S7, D8, K10, K11, D30, D61, E64, N65, L69, N72, E92, Q101, Q108, 서열번호 2의 서열을 갖는 IL-15 성숙 인간 IL-15의 I111 중에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 상기 돌연변이된 아미노산이 D61, N65 및 Q101로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 돌연변이된 아미노산은 N65이다.
IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이는 바람직하게는 N1D, N1A, N1G, N4D, S7Y, S7A, D8A, D8N, K10A, K11A, D30N, D61A, D61N, E64Q, N65D, N65A, N65E, N65R, N65K, L69R, N72R, Q101D, Q101E, Q108D, Q108A, Q108E 및 Q108R 중에서 선택되고, 바람직하게는 D8A, D8N, D61A, D61N, N65A, N65D, N72R, Q101D, Q101E 및 Q108A 중에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 D61A, N65A 및 Q101, 가장 바람직하게는 N65A 또는 D8N/N65A, D61A/N65A 또는 D61A/N65A/Q101D 중에서 선택되는 결합된 치환(combined substitution)이다.
다른 일 양태에 있어서, 면역사이토카인은 종양 항원에 결합하는 항체 또는 이의 기능적 변이체를 포함하고, 항체 또는 이의 기능적 변이체는 바람직하게는, EGFR, HER2, FGFR2, FOLR1, CLDN18.2, CEA, GD2, O-아세틸-GD-2 (O-Acetyl-GD-2), GM1, CAIX, EPCAM, MUC1, PSMA, c-MET, ROR1, GPC3, CD19, CD20, CD38 중에서 선택되는 종양 항원과 결합하고; 종양 세포외 기질 항원, 바람직하게는 FAP, 피브로넥틴 (fibronectin)의 EDA 도메인, 피브로넥틴의 EDB 도메인 및 LRRC15, 바람직하게는 FAP 및 피브로넥틴의 EDB 도메인 중에서 선택된 종양 세포외 기질 항원에 결합하며; 신생 혈관 형성 항원, 바람직하게는 VEGF 또는 엔도글린 (Endoglin)에 결합하고; (CD105); 또는 상기 면역 사이토카인은 면역 조절 항체 또는 이의 기능적 변이체이되, 상기 조절 항체는 공동 자극 수용체, 바람직하게는 CD40 작용제, CD137/4-1BB 작용제, CD134/OX40 작용제 및 TNFRSF18/GITR 작용제 중에서 선택되는 공동 자극 수용체를 자극하고, 또는 상기 면역 조절 항체는 면역 억제 수용체, 바람직하게는 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG3 길항제, TIGIT 길항제, 억제성 KIRs 길항제, BTLA 길항제, HAVCR2 길항제 및 ADORA2A 길항제 중에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 PD-1 길항제인 면역 억제 수용체를 억제한다.
위에 나열된 표적에 대한 항체는 당업자에게 잘 알려져 있거나 표준 면역 또는 파지 디스플레이 프로토콜을 통해 생성할 수 있다. 비인간 항체도 인간화할 수 있다. 항-EGFR 항체의 예로는 세툭시맙 (세툭시맙), 파니투무맙 (panitumumab), 잘루투무맙 (zalutumumab), 니모투주맙 (nimotuzumab), 마투주맙 (matuzumab) 등이 있다. 항 HER2 항체의 예로는 트라스투주맙 (trastuzumab), 퍼투주맙 (permtuzumab) 또는 마게툭시맙 (margetuximab)이 있다. 항-CLDN18.2 항체의 예로는 졸베툭시맙 (졸베툭시맙) 및 아래 본 발명의 항체가 있다. 항-CEA 항체의 예로는 아르시투모맙이 있다. 항-GD2의 예로는 hu14.18K322A가 있다. 항 O-아세틸-GD-2의 예로는 c.8B6이 있다. 항 CD20 항체의 예로는 리툭시맙 (리툭시맙), 오크레리주맙 (ocrelizumab), 오비누투주맙 (obinutuzumab), 오파투무맙 (ofatumumab), 이브리투맙 (ibritumomab), 토시투맙 (tositumomab), 유블리툭시맙 (ublituximab)이 있다. 항-CD38 항체의 예로는 다라투무맙 (daratumumab), MOR202 및 이사툭시맙 (isatuximab)이 있다.
항-FAP 항체의 예로는 시브로투주맙과 B12 (US 2020-0246383A1)가 있다. 피브로넥틴의 항-EDA 도메인 항체의 예로는 F8 항체 ((Villa, Trachsel 외. 2008), WO 2010/078945, WO 2014/174105), 피브로넥틴의 항-EDB 도메인 항체의 예로는 L19 항체 ((Pini, Viti 외. 1998), WO 1999/058570), 항-LRC15 항체의 예로는 Samrotamab/huM25(WO 2017/095805)가 있다.
항-VEGF 항체의 예로는 베바시주맙과 라니비주맙이 있다. 항-엔도글린 항체의 예로는 TRC 105 (WO 2010039873A2)가 있다.
항-CD40 작용 항체의 예로는 셀리크루맙, APX005M, ChiLob7/4, ADC-1013, SEA-CD40 및 CDX-1140이 있다 (Vonderheide 2020). 항-CD137/4-1BB 작용 항체의 예로는 우렐루맙과 우토밀루맙이 있다 (Fu, Lin et al. 2020). 항-TNFRSF18/GITR 작용 항체의 예로는 DTA-1이 있다.
PD-1 길항제의 예로는 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 또는 항 PD-L2 항체가 있다. 항 PD-1 길항 항체의 예로는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 토리팔리맙 및 티셀리주맙이 있다 (Dolgin 2020). 항 PD-L1 길항 항체의 예로는 아테졸리주맙과 아벨루맙이 있다. 항-CTLA-4 길항 항체의 예로는 이필리무맙이 있다. 항-LAG3 길항 항체의 예로는 릴랫리무맙이 있다. 항-TIGIT 길항 항체의 예로는 티라골루맙 (Tiragolumab), 비보스톨리맙 (Vibostolimab), 돔바날리맙 (Domvanalimab), 에티길리맙 (Etigilimab), BMS-986207, EOS-448, COM902, ASP8374, SEA-TGT, BGB-A1217, IBI-939 및 M6223이 있다.
항-BTLA 길항 항체의 예로는 TAB004가 있다. 항 HAVCR2/TIM-3 길항 항체의 예로는 LY3321367, MBG453 및 TSR-022가 있다.
바람직한 일 양태에 있어서 면역 사이토카인은, 상기 접합체는 서열번호 10 및 상기 항체는 서열번호 30의 펨브롤리주맙 유래 중쇄 노브 서열, 서열번호 22의 펨브롤리주맙 유래 중쇄 홀 서열 및 서열번호 16의 경쇄 서열을 포함하며, 상기 접합체는 링커 없이 C-말단 중쇄 노브 서열에 융합되며, 바람직하게는 서열번호 21에 융합된다.
일 양태에 있어서, 본 발명의 면역 사이토카인은 서열번호 10 또는 서열번호 11의 접합체 및 항체를 포함하며, 항체는 표 4의 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 항-CLDN18.2 이합체 IgG1 항체 변이체, 표 3의 KiH 돌연변이를 통해 이종이합체화되는 IgG1 변이체, 표 2의 DE, DLE, AAA, TL 또는 IE 돌연변이 또는 아푸코실화를 통해 ADCC 활성이 강화된 것, 또는 상기 나열된 돌연변이와의 아푸코실화 조합을 통한 것이다.
다른 일 양태에 있어서, 본 발명의 면역 사이토카인은 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열을 포함하고 항체는 표 4의 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 항-CLDN18.2 이종이합체 IgG1 항체 변이체이며, 표 3의 KiH 돌연변이를 통해 이종이합체인 IgG1 변이체이다.
표 4: 항-CLDN18.2 항체의 VH 및 VL 도메인 서열
바람직한 일 양태에 있어서, 본 발명의 면역 사이토카인은 서열번호 10 서열과 항-CLDN18.2 이종이합체 IgG1 항체 변이체의 접합체를 포함하며, 상기 항-CLDN18.2 이종이합체 IgG1 항체 변이체는 각각 서열번호 46 및 서열번호 47의 VH 및 VL 도메인 서열을 가지며, 표 3의 KiH 변이를 통해 이종이합체 된다.
바람직한 일 양태에 있어서, 본 발명의 면역 사이토카인은 서열번호 10 서열과 서열번호 46 및 서열번호 47의 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 항-CLDN18.2 이종이합체 IgG1 항체 변이체를 포함하며, 각각의 IgG1항체 변이체는 표 3의 KiH 돌연변이를 통해 이종이합체화되고, 표 2의 DE, DLE, AAA, TL 또는 IE 돌연변이를 통해 또는 아푸코실화를 통해 또는 상기 나열된 돌연변이와 아푸코실화의 조합을 통해 ADCC 활성이 강화된다.
바람직한 다른 일 양태에 있어서, 본 발명의 면역 사이토카인은 서열번호 10과 서열번호 46 및 서열번호 47의 VH 및 VL 도메인 서열을 가지는 항- -CLDN18.2 이종이합체 IgG1 항체 변이체, 각각 표 3의 KiH 돌연변이를 통해 이합체화되고, 아푸코실화를 통해 ADCC 활성이 강화된다.
바람직한 일 양태에 있어서, 면역 사이토카인은 서열번호 11의 접합체를 포함하고, 항체 변이체는 서열번호 84의 중쇄 노브, 서열번호 87의 중쇄 홀 및 서열번호 88의 경쇄를 갖는 이종이합체 IgG1 항-CLDN18.2 항체이다.
바람직한 면역 사이토카인의 예시적인 서열은 서열번호 85 (“HC 노브”), 서열번호 87 (“HC 홀”) 및 서열번호 88 (LC)일 수 있다.
바람직한 면역 사이토카인의 또 다른 예시적인 서열은 서열번호 86 ("HC 노브"), 서열번호 87 ("HC 홀") 및 서열번호 88 (LC)일 수 있다.
바람직한 면역 사이토카인에 대한 또 다른 예시적인 서열은 서열번호 111("HC 노브"), 서열번호 110 ("HC 홀") 및 서열번호 88 (LC)일 수 있다.
바람직한 다른 일 양태에 있어서 본 발명의 면역 사이토카인은 서열번호 10의 접합체를 포함하며, 여기서 항체 변이체는 서열번호 84의 중쇄 노브 서열, 서열번호 87의 중쇄 홀 서열 및 서열번호 88의 경쇄 서열을 갖는 이종이합체 IgG1 항-GLDN18.2 항체이다.
놀랍게도, 항클라우딘18.2 항체 hCl1a에 융합된 RLI2AQ DANA 돌연변이는 RLI2AQ NA 돌연변이에 비해 더 높은 ADCC를 나타내었다.
또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명의 면역 사이토카인은 서열번호 10 서열과 각각 서열번호 46 및 서열번호 47의 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 항-CLDN18.2 이합체 IgG1 항체 변이체의 접합체를 포함하고, 각각의 IgG1 항체 변이체는 표 3의 KiH 돌연변이를 통한 이종이합체이고, IgG1 Fc 도메인에 S239D/I332E(DE) ADCC 강화 돌연변이를 갖는다.
또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명의 면역 사이토카인은 서열번호 11 서열의 접합체와 서열번호 46 및 서열번호 47 서열의 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 항- CLDN18.2 이종이합체 IgG1 항체 변이체를 포함하며, 본 발명의 면역 사이토카인은 표 3에 기재된 바와 같으며, IgG1 변이체는 표 3의 KiH 돌연변이를 통한 이종이합체이고, IgG1 Fc 도메인에 S239D/I332E(DE) ADCC 강화 돌연변이를 갖는다.
다른 일 양태에 있어서, 본 발명의 면역 사이토카인은 서열번호 10의 서열을 갖는 융합 단백질을 포함하고 항체 변이체는 서열번호 91의 VH 서열 및 서열번호 92의 VL 서열을 갖는 이종이합체 IgG1 항-EGFR 항체이고, IgG1 변이체는 표 3의 KiH 돌연변이를 통해 이종이합체이며, 해당 섹션의 표 2에 나열된 FC 돌연변이 또는 아푸코실화를 통해 또는 돌연변이와 아푸코실화의 조합을 통해 ADCC 활성이 강화된다.
다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 면역 사이토카인을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 면역 사이토카인에 대한 핵산 코딩을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
추가적인 일 양태에 있어서, 본 발명은 면역 사이토카인을 코딩하는 벡터 또는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 치료에 사용하기 위한 면역 사이토카인, 핵산 또는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 면역 사이토카인, 핵산 또는 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 일 양태에 있어서, 면역 사이토카인, 핵산 또는 벡터는 종양 질환 또는 감염성 질환을 앓고 있거나 발병 위험이 있거나 진단을 받은 피험자의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다.
다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 면역 사이토카인, 핵산 또는 벡터를 투여하는 것을 포함하는 종양 질환 또는 감염성 질환을 앓고 있거나, 발병 위험이 있거나, 진단을 받은 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일반적인 임상 개발 경로는 표준 치료와의 병용이므로, 본 발명의 면역 사이토카인은 일반적으로 승인된 특정 적응증의 표준 치료인 다른 약제와 병용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 면역 사이토카인은 체크포인트 억제제 (checkpoint inhibitor)와 결합될 수 있는데, 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-LAG3, 항-TIM-3, 항-CTLA4 항체 또는 항-TIGIT 항체, 바람직하게는 항-PD-L1 항체 또는 항-PD-1 항체일 수 있다. 이 항체들은 면역 세포, 특히 T 세포가 암세포를 죽이는 것을 차단하거나 하향 조절하는 세포 상호 작용을 차단/길항한다는 공통점이 있으며, 따라서 이 항체들은 모두 길항 항체이다. 항 PD-1 항체의 예로는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙(REGN2810), BMS-936558, SHR1210, IBI308, PDR001, BGB-A317, BCD-100 및 JS001 등이 있다; 항 PD-L1 항체의 예로는 아벨루맙, 아테졸리주맙, 더발루맙, KN035 및 MGD013(PD-1 및 LAG-3에 대한 이중 특이성)이 있으며, 항 PD-L2 항체의 예로는 sHIgM12가 있다; 항-LAG-3 항체의 예로는 relatlimab (BMS 986016), Sym022, REGN3767, TSR-033, GSK2831781, MGD013(PD-1 및 LAG-3에 이중 특이적) 및 LAG525(IMP701), 항-TIM-3 항체의 예로는 TSR-022 및 Sym023이 있다; 항-CLA-4 항체의 예로는 이필리무맙과 트레멜리무맙(티실리무맙), 항-TIGIT 항체의 예로는 티라골루맙 (MTIG7192A, RG6058) 및 에티길리맙이 있다.
서열목록
서열번호 1: 인간 IL-15 (인간 IL-15)
1 MRISKPHLRS ISIQCYLCLL LNSHFLTEAG IHVFILGCFS AGLPKTEANW VNVISDLKKI
061 EDLIQSMHID ATLYTESDVH PSCKVTAMKC FLLELQVISL ESGDASIHDT VENLIILANN
121 SLSSNGNVTE SGCKECEELE EKNIKEFLQS FVHIVQMFIN TS 162
신호 펩타이드는 밑줄을 쳤다.
서열번호 2: 성숙한 인간 IL-15 (mature 인간 IL-15)
1 NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH
061 DTVENLIILA NNSLSSN GN V TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS 114
G78 및 N79 굵게/밑줄로 표시하였다.
서열번호 3: 성숙한 인간 IL-15 AQ (mature 인간 IL-15AQ)
1 NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH
061 DTVENLIILA NNSLSSN AQ V TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS 114
A78 및 Q79가 굵게/밑줄로 표시되었다.
서열번호 4: 인간 IL-15Rα (인간 IL-15Rα)
1 MAPRRARGCR TLGLPALLLL LLLRPPATRG ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN
61 SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKCIRDPALV HQRPAPPSTV TTAGVTPQPE
121 SLSPSGKEPA ASSPSSNNTA ATTAAIVPGS QLMPSKSPST GTTEISSHES SHGTPSQTTA
181 KNWELTASAS HQPPGVYPQG HSDTTVAIST STVLLCGLSA VSLLACYLKS RQTPPLASVE
241 MEAMEALPVT WGTSSRDEDL ENCSHHL 267
서열번호 5: IL-15Rα의 스시 도메인 (sushi domain of IL-15Rα)
001 CPPPMSVEHA DIWVKSYSLY SRERYICNSG FKRKAGTSSL TECVLNKATN VAHWTTPSLK 60
061 C
서열번호 6: IL-15Rα의 스시 + 단편
001 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS
061 LKCIRDPALV HQRPAPP
서열번호 7: 링커
001 SGGSGGGGSG GGSGGGGSGG 20
서열번호 8: RLI2 (SOT101)
001 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS
061 LKCIRDPALV HQRPAPPSGG SGGGGSGGGS GGGGSGGNWV NVISDLKKIE DLIQSMHIDA
121 TLYTESDVHP SCKVTAMKCF LLELQVISLE SGDASIHDTV ENLIILANNS LSSN GN VTES
181 GCKECEELEE KNIKEFLQSF VHIVQMFINT S 211
서열번호 9: RLI2AQ
001 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS
061 LKCIRDPALV HQRPAPPSGG SGGGGSGGGS GGGGSGGNWV NVISDLKKIE DLIQSMHIDA
121 TLYTESDVHP SCKVTAMKCF LLELQVISLE SGDASIHDTV ENLIILANNS LSSN AQ VTES
181 GCKECEELEE KNIKEFLQSF VHIVQMFINT S 211
서열번호 10: RLI2AQ N162A (N65A) 또는 RLI-15AQA
001 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS
061 LKCIRDPALV HQRPAPPSGG SGGGGSGGGS GGGGSGGNWV NVISDLKKIE DLIQSMHIDA
121 TLYTESDVHP SCKVTAMKCF LLELQVISLE SGDASIHDTV E A LIILANNS LSSN AQ VTES
181 GCKECEELEE KNIKEFLQSF VHIVQMFINT S 211
서열번호 11: RLI2AQ D158A/N162A (D158A/N162A)
001 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS
061 LKCIRDPALV HQRPAPPSGG SGGGGSGGGS GGGGSGGNWV NVISDLKKIE DLIQSMHIDA
121 TLYTESDVHP SCKVTAMKCF LLELQVISLE SGDASIH A TV E A LIILANNS LSSN AQ VTES
181 GCKECEELEE KNIKEFLQSF VHIVQMFINT S 211
서열번호 12: 펨브롤리주맙 중쇄 (HC) - 인간 IgG4 k 아이소타입
001 QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF 060
061 NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS 120
121 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180
181 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV 240
241 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 300
301 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 360
361 NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG 420
421 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
펨브롤리주맙 HC는 S228P 돌연변이가 안정화되어 있으며, 여기서 면역 사이토카인의 경우 이질성을 줄이기 위해 말단 K가 삭제(dK)되었다.
서열번호 13: 펨브롤리주맙 HC CDR1
001 NYYMY
서열번호 14: pembrolizumab HC CDR2
001 GINPSNGGTNFNEKFKN
서열번호 15: 펨브롤리주맙 HC CDR3
001 RDYRFDMGFDY
서열번호 16: 펨브롤리주맙 경쇄
001 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL LIYLASYLES 060
061 GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF 120
121 IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 180
181 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
서열번호 17: 펨브롤리주맙 LC CDR1
001 RASKGVSTSGYSYLH
서열번호 18: 펨브롤리주맙 LC CDR2
001 LASYLES
서열번호 19: 펨브롤리주맙 LC CDR3
001 QHSRDLPLT
서열번호 20: 펨브롤리주맙 HC 노브: IgG4 S228P.L235E.T366W.dK
001 QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF 060
061 NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS 120
121 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180
181 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV 240
241 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 300
301 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 360
361 NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG 420
421 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG 446
서열번호 21: SOT201 HC 노브: IgG4 S228P/L235E/T366W/dK-RLI2.N162A/G175A/N176Q
001 QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF 060
061 NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS 120
121 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180
181 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCP P CP APEF E GGPSV 240
241 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 300
301 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 360
361 NQVSL W C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL Y SRL TVDKSRWQEG 420
421 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGITCP PPMSVEHADI WVKSYSLYSR ERYICNSGFK 480
481 RKAGTSSLTE CVLNKATNVA HWTTPSLKCI RDPALVHQRP APPSGGSGGG GSGGGSGGGG 540
541 SGGNWVNVIS DLKKIEDLIQ SMHIDATLYT ESDVHPSCKV TAMKCFLLEL QVISLESGDA 600
601 SIHDTVE A LI ILANNSLSSN AQ VTESGCKE CEELEEKNIK EFLQSFVHIV QMFINTS 657
서열번호 22: HC 홀: S228P.L235E.T366S.L368A.Y407V
001 QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF 060
061 NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS 120
121 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180
181 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCP P CP APEF E GGPSV 240
241 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 300
301 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 360
361 NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SRL TVDKSRWQEG 420
421 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK
서열번호 23: SOT201 LC
001 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL LIYLASYLES 060
061 GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF 120
121 IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 180
181 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC 218
서열번호 24: 힌지가 있는 IgG1 CH1
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP
서열번호 25: IgG1 Fc
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 26: IgG1 Fc LALA
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 27: IgG1 Fc LALA PG
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 28: IgG1 Fc KiH - 노브
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 29: IgG1 Fc KiH - 홀
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 30: IgG1 Fc DE (S239D/I332E)
APELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 31: IgG1 Fc DLE (S239D/A330L/I332E)
APELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 32: IgG1 Fc DAE (S239D/I332E/G236A)
APELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 33: IgG1 Fc GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E)
APELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 34: IgG1 Fc AAA (S298A/E333A/K334A)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 35: IgG1 Fc YTE (M252Y/S254T/T256E)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 36: IgG1 Fc TL (K392T/P396L)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYTTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 37: IgG1 Fc IE (V264I/I332E)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVIDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 38: CL (카파)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 39: IgG4 CH1 힌지 S228P
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP
서열번호 40: IgG4 Fc
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 41: IgG4 Fc KiH - 노브
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 42: IgG4 Fc KiH - 홀
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 43: IgG4 Fc LE (L235E)
APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 44: IgG4 Fc YTE (M252Y/S254T/T256E)
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
서열번호 45: LC (카파) - RLI AQ
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
서열번호 46: hCl1a VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSS
서열번호 47: hCl1a VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIFSVKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSNFPLTFGQGTKVEIK
서열번호 48: hCl1b VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSS
서열번호 49: hCl1b VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIFSVKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSNFPLTFGQGTKVEIK
서열번호 50: hCl1c VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSS
서열번호 51: hCl1c VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIFAIKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKVEIK
서열번호 52: hCl1d VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSS
서열번호 53: hCl1d VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYSNFAWYQQKPGKAPKLLIYSVNRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKVEIK
서열번호 54: hCl1e VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMYWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSS
서열번호 55: hCl1e VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIFSVKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSNFPLTFGQGTKVEIK
서열번호 56: hCl1f VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSS
서열번호 57: hCl1f VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYSVKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSNFPLTFGQGTKVEIK
서열번호 58: hCl1g VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSS
서열번호 59: hCl1g VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYSNFAWYQQKPGKAPKLLIYSVNRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKVEIK
서열번호 60: hCl1h VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMYWVRQAPGQRLEWMGWINAYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVYYGYTMDAWGQGTLVTVSS
서열번호 61: hCl1h VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYSVKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSNFPLTFGQGTKVEIK
서열번호 62: hCl1i VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMYWVRQAPGQRLEWMGWINAYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVYYGYTMDAWGQGTLVTVSS
서열번호 63: hCl1i VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIFSVKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSNFPLTFGQGTKVEIK
서열번호 64: hCl1j VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMYWVRQAPGQRLEWMGWINAYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVYYGYTMDAWGQGTLVTVSS
서열번호 65: hCl1j VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIFAIKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKVEIK
서열번호 66: hGBA-1 VH
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGNIYPGASDTRYAPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLWRGNSFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 67: hGBA-1 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPFTFGQGTKVEIK
서열번호 68: hGBA-2 VH
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGNIYPGDADTRYAPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARMWRGNSFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 69: hGBA-2 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPFTFGQGTKVEIK
서열번호 70: hGBA-3 VH
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGASDTNYAPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARIWRGNSFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 71: hGBA-3 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPLTFGQGTKVEIK
서열번호 72: hGBA-4 VH
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDAYTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRLWRGNSFDAWGQGTLVTVSS
서열번호 73: hGBA-4 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPLTFGQGTKVEIK
서열번호 74: hGBA-5 VH
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGAAYTRYAPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLWRGNSFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 75: hGBA-5 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYSYPFTFGQGTKVEIK
서열번호 76: hGBA-6 VH
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGNIYPGASYTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRQWRGNSFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 77: hGBA-6 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPFTFGQGTKVEIK
서열번호 78: hGBA-7 VH
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGNIYPGEAYTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRLWRGNSFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 79: hGBA-7 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPFTFGQGTKVEIK
서열번호 80: hGBA-8 VH
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGNIYPSESYTNYAPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRLWRGNSFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 81: hGBA-8 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPFTFGQGTKVEIK
서열번호 82: hGBA-9 VH
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPSAAYTRYAPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRMWRGNSFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 83: hGBA-9 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYSYPFTFGQGTKVEIK
서열번호 84: hCl1a HC AAA 노브
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열번호 85: hCl1a HC AAA 노브 RLI2 DANA
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHATVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
서열번호 86: hCl1a HC AAA 노브 RLI2 NA
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
서열번호 87: hCl1a HC AAA 홀
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열번호 88: hCl1a LC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIFSVKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSNFPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 89: 졸베툭시맙 (IMAB362) VH
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTRSWRGNSFDYWGQGTTLTVSS
서열번호 90: 졸베툭시맙 (IMAB362) VL
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIK
서열번호 91: 세툭시맙 VH
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA
서열번호 92: 세툭시맙 VL
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK
서열번호 93: 세툭시맙 HC AAA 노브
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열번호 94: 세툭시맙 HC AAA 노브 RLI2 DANA
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHATVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
서열번호 95 세툭시맙 HC AAA 홀
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열번호 96: 리툭시맙 중쇄
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열번호 97 리툭시맙 HC AAA 노브 RLI AQNA
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLE SGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
서열번호 98 리툭시맙 HC AAA 홀
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열번호 99 리툭시맙 LC
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 100: L40 링커
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호 101: SOT201 HC 홀: S228P.L235E.T366S.L368A.Y407V/dK
001 QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF 060
061 NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS 120
121 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180
181 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV 240
241 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 300
301 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 360
361 NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSRL TVDKSRWQEG 420
421 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
서열번호 102: mPD1.VH-h1.HC.D265A.E356K.N399K.dk-RLI.N162A.G175A.N176Q
murine (뮤린) antiPD-1 (mIgG1 D265A HC1 - RLI-15AQA)
EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSSYRWNWIRKFPGNRLEWMGYINSAGISNYNPSLKRRISITRDTSKNQFFLQVNSVTTEDAATYYCARSDNMGTTPFTYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
서열번호 103: mPD1.VH-h1.HC.D265A.K409E.K439D.dk
murine (뮤린) antiPD-1 (mIgG1 D265A HC2)
EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSSYRWNWIRKFPGNRLEWMGYINSAGISNYNPSLKRRISITRDTSKNQFFLQVNSVTTEDAATYYCARSDNMGTTPFTYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVV A ISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTDGSYFVYS E LNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEDSLSHSP
서열번호 104: mPD1.VL-hk.LC 뮤린 항PD-1 (mIgG1 경쇄)
DIVMTQGTLPNPVPSGESVSITCRSSKSLLYSDGKTYLNWYLQRPGQSPQLLIYWMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDVGIYYCQQGLEFPTFGGGTKLELKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
서열번호 105: 인간 IL-2
001 APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE 060
061 EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR 120
121 WITFCQSIIS TLT 133
서열번호 106: IL-2v
1 AP A SSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML T A KF A MPKKA TELKHLQCLE 060
061 EELKPLEEVL N G AQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR 120
121 WITF A QSIIS TLT
서열번호 107: IL-15 M1
001 A WVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTES N VHPSCKVTAM KCFLL G LQ R I SLESGDASIH 060
061 DTVENLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS 114
서열번호 108: IL-15 M2
001 G WVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTES N VHPSCKVTAM KCFLL G LQ R I SLESGDASIH 060
061 DTV Q NLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS 114
서열번호 109: hCl1a HC 노브
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열번호 110: hCl1a HC 홀
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열번호 111: hCl1a HC 노브 RLI2 NA
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
서열번호 112: PD1-IL2v HC1: IL2v가 포함된 HC (Fc 노브, LALAPG), IL2v.T3A.F42A.Y45A.L72G.C125A
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSAPASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
서열번호 113: PD1-IL2v HC2: HC (Fc 홀 LALAPG)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
서열번호 114: PD1-IL2v LC
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRSSTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 115: mPD1-IL2v HC1: mPD-1.VH-h1.HC.D265A.E356K.N399K.dk-IL2v.T3A.F42A.Y45A.L72G.C125A murine (뮤린) antiPD-1 (mIgG1 D265A HC1 - IL-2v)
EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSSYRWNWIRKFPGNRLEWMGYINSAGISNYNPSLKRRISITRDTSKNQFFLQVNSVTTEDAATYYCARSDNMGTTPFTYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPAPASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
서열번호 116: mPD1-IL2v HC2: mPD-1.VH-h1.HC.D265A.K409E.K439D.dk murine (뮤린) 항PD-1 (mIgG1 D265A HC2)
EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSSYRWNWIRKFPGNRLEWMGYINSAGISNYNPSLKRRISITRDTSKNQFFLQVNSVTTEDAATYYCARSDNMGTTPFTYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTDGSYFVYSELNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEDSLSHSP
서열번호 117: mPD1-IL2v LC: mPD-1.VL-hk.LC murine (뮤린) 항PD-1 (mIgG1 경쇄)
DIVMTQGTLPNPVPSGESVSITCRSSKSLLYSDGKTYLNWYLQRPGQSPQLLIYWMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDVGIYYCQQGLEFPTFGGGTKLELKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
서열번호 118: hPD-1-IL15 (M1) HC1: xhPD-1.VH-h1.HC.L234A.L235A.G237A.T366S.L368A.Y407V.dk-IL15m1.N1A.D30N.E46G.V49R
anti-인간 PD-1 (Fc LALA KiH 홀 - IL-15m1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSSITNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLTTGTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGG A WVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTES N VHPSCKVTAMKCFLL G LQ R ISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
서열번호 119: hPD-1-IL15 (M1) HC2: xhPD-1.VH-h1.HC.L234A.L235A.G237A.T366W.dk 항-인간 PD-1 (Fc LALA KiH 노브)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSSITNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLTTGTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 120: hPD-1-IL15 (M1) LC: xhPD-1.VL-hk.LC anti-인간 PD-1 (경쇄)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLWDSGNQKNFLTWYQQKPGKAPKLLIYWTSYRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNDYFYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 121: hPD-1-IL15 (M2) HC1: xhPD-1.VH-h1.HC.L234A.L235A.G237A.T366S.L368A.Y407V.dk-IL15m1.N1G.D30N.E46G.V49R.E64Q
anti-인간 PD-1 (Fc LALA KiH 홀 - IL-15m2)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSSITNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLTTGTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGG G WVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTES N VHPSCKVTAMKCFLL G LQ R ISLESGDASIHDTV Q NLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
서열번호 122: hPD-1-IL15 (M2) HC2: xhPD-1.VH-h1.HC.L234A.L235A.G237A.T366W.dk anti-인간 PD-1 (Fc LALA KiH 노브)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSSITNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLTTGTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 123: hPD-1-IL15 (M2) LC: xhPD-1.VL-hk.LC 항-인간 PD-1 (경쇄)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLWDSGNQKNFLTWYQQKPGKAPKLLIYWTSYRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNDYFYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 124: Kadmon HC1: 2-8 S354C/T366W LALAPG 개선된 링커
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPS
LKCIRDPALVHQRPAPPSGGGGSGGGGSGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDA
TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVESLIILANNSLSSNGNVTES
GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG
SEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY
YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWVDVWGQGTTVTVSSAS
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL
YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT
KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 125: Kadmon HC2: 서열번호 223: 1-4 Y349C/T366S/L368A/Y407V LALAPG
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY
ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWVDVWGQGTTVTVSSAST
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FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY
RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTK
NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 126: Kadmon LC: 서열번호 219 - 38B2:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSFPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열번호 127: mSOT202 HC 노브
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서열번호 128: mSOT202 HC 홀
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서열번호 129: mSOT202 LC
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서열번호 130: mSOT202 LALAPG HC 노브
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서열번호 131: mSOT202 LALAPG HC 홀
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서열번호 132: mSOT202 아이소타입 HC 노브
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서열번호 133: mSOT202 아이소타입 HC 홀
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서열번호 134: mSOT202 아이소타입 LC
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서열번호 135: mSOT202 아이소타입 LALAPG HC 노브
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서열번호 136: mSOT202 아이소타입 LALAPG HC 홀
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서열번호 137: RLI-15AQ 펩타이드
ELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNAQV
서열번호 138: RLI-15AQA 펩타이드
ELQVISLESGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQV
서열번호 139: RLI-15 NA 펩타이드
VEALIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEK
서열번호 140: RLI-15AQA 펩타이드
VEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEK
도 1: (A) 비환원 조건에서 RLI2 RLI2 wt), G78A 치환 RLI2 RLI2 A) 및 G78A/N79Q 치환 RLI2 RLI2 AQ)의 LMW SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 (항-RLI-15) 분석. 쿠마시 염색의 경우 0.5㎍ 또는 2㎍ 또는 단백질이 사용되었고 (레인 2, 4, 6, 8, 10, 12), 웨스턴 블롯의 경우 25㎍의 단백질이 사용됨 (레인 3, 7, 11).
(B) 환원 (R) 및 비환원 (NR) 조건에서 RLI2(RLI2 wt), G78A 치환이 있는 RLI2(RLI2 A) 및 G78A/N79Q 치환이 있는 RLI2(RLI2 AQ)의 모세관 전기영동 변성, 분석. 점선 상자 1은 글리코실화 부위 #2(메인)의 밴드, 상자 2는 글리코실화 부위 #1(마이너)의 밴드, 점선 상자 3은 RLI2 A의 새로운 글리코실화 부위를 나타냄. 이름 없는 레인은 16, 21, 30, 48 및 68 kDa의 마커임.
도 2: 쿠마시 블루 (Coomassie blue)(왼쪽 패널), 질산은 (가운데 패널)으로 염색하고 항IL15 웨스턴 블롯 (오른쪽 패널)으로 검출한 SDS-PAGE (7.5 내지 18%)로 CHO 세포에서 발현된 3개의 탈글리코실화된 RLI 변이체 분석: 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: RLI2 N176Q , 레인 3: RLI2 N168S/N176Q/N209S , 레인 4: RLI1 N168S/N176Q/N209S .
도 3: 32Db 세포 또는 Kit225 세포의 활성화에 의해 측정된 상청액으로부터의 RLI2 및 RLI2AQ의 효능. (A) 32Db 세포, 21시간, (B) Kit225 세포, 4시간.
도 4: Kit225 세포의 활성화에 의해 측정된 상청액의 RLI2AQ와 비교하였을 때 정제 또는 상층액에서 추출한 RLI2의 상대적 효능.
도 5: 높게 글리코실화된 RLI2와 낮게 글리코실화된 RLI2의 비교
(A) 280 nm에서 측정한 버퍼 B의 농도에 따른 CPI HIC 용출 프로파일. 왼쪽 상자는 높게 글리코실화된 RLI2 ("RLI-15-HG")에 대한 모아진 분획 2B1 1-3을 나타내고, 오른쪽 상자는 낮게 글리코실화된 RLI2("RLI-15-LG")에 대한 모아진 분획 4B1 1-3을 나타냄. (B) RLI-15-HG의 2B1 1-3 분획, RLI2 참조 표준 및 주어진 kDa의 분자량 래더 (ladders)의 SDS PAGE. (C) RLI-15-LG의 4B1 1-3 분획, RLI2 참조 표준 및 주어진 kDa의 분자량 래더의 SDS PAGE.
도 6: 선택된 PEM-RLI 구조의 모세관 전기영동 (Capillary electrophoresis).
도 7: 암컷 hPD-1 단일 KI HuGEMM 마우스에 이식된 HuCell MC38-hPD-L1 종양 세포주를 치료할 때 펨브롤리주맙과 비교한 PEM-RLI NA x1의 생체 내 치료 효능.
도 8: 혼합 림프구 반응 (hPBMC 기증자): 대조군 (PBMC만 해당), 펨브롤리주맙 및 PEM LE-RLI2AQ NA x1에 대한 INFγ 분비량 (pg/ml).
도 9: 시노몰구스 원숭이에게 1일차 및 15일차에 각각 10 또는 30 ug/kg PEM-RLI x1과 30 또는 90 ug/kg PEM LE/YTE-RLI NA x1을 정맥 주사 (IV) 투여한 후 IL-2Rβγ 결합이 감소한 PEM-RLI 구조의 약물동력학 (pharmacokinetics) 및 약물역학 (pharmacodynamics)을 정상 결합의 PEM-RLI와 비교함.
(A) 투여 후 시간에 따른 혈청 내 구조물의 농도 (시간 단위). 10 μg/kg PEM-RLI x1 (회색 실선), 30 ug/kg PEM-RLI x1 (회색 점선), 30 μg/kg PEM LE/YTE-RLI NA x1 (검은색 점선) 또는 90 ug/kg PEM LE/YTE-RLI NA x1 (검은색 실선); 정량 하한을 위한 LLOQ. (B) 일 단위 시간에 따른 림프구 수 (배율 변화). (C) Ki67+ NK 세포의 %. (D) Ki67+ CD8+ T 세포의 %: 회색은 PEM-RLI x1, 검은색은 PEM LE/YTE-RLI NA x1, 그룹당 두 마리의 동물 (그룹 내 개별 동물의 경우 전체 원 및 열린 원).
도 10: 시노몰구스 원숭이에서 30 μg/kg을 1회 정맥 주사 (IV) 투여한 후 PEM-RLI NA x1과 PEM-RLI NA x2의 약물동력학 및 약물역학 비교함. (A) 정량 하한을 위해 LLOQ를 사용하여 시간에 따른 혈청 내 구성물의 농도 (시간); (B) 시간에 따른 림프구 수 (배율 변화)를 일 단위로 표시함. (C) Ki67+ NK 세포의 %; (D) Ki67+ CD8+ T 세포의 %: 검은색으로 표시된 두 개의 개별 동물이 채워진 원과 빈 원이 있는 PEM-RLI NA x1, 회색으로 표시된 두 개의 개별 동물이 채워진 원과 빈 원이 있는 PEM-RLI NA x2.
도 11: 600 μg/kg을 1회 정맥 주사 (IV) 투여한 후 시노몰구스 원숭이에서 PEM LE/YTE-RLI NA x1과 PEM LE-RLI NA x1의 약동학을 비교한 결과. 혈청 내 구성 물질의 농도는 시간에 따른 농도를 시간 단위로 표시하고, 정량 하한은 LLOQ로 표시함: 검은색 원/점선으로 표시된 PEM LE/YTE-RLI NA x1 및 회색 원과 실선으로 표시된 PEM LE-RLI NA x1.
도 12: 600 μg/kg을 1회 정맥 주사 (IV) 투여한 후 시노몰구스 원숭이에서 PEM LE-RLI NA x1과 PEM-RLI NQD x1의 약물동력학 비교. 혈청 내 구조물의 농도는 시간에 따른 농도를 시간 단위로 표시하고, 정량 하한은 LLOQ로 표시함: 회색 원/선으로 표시된 PEM LE-RLI NA x1 및 검은색 원/선으로 표시된 PEM-RLI NQD x1.
도 13: 이펙터 기능이 변형되지 않은 hCl1a 항체를 기반으로 한 면역 사이토카인과 ADCC 활성이 감소된 면역 사이토카인 및 항체 hCl1a 및 졸베툭시맙 (Zolbetuximab)을 기반으로 한 면역 사이토카인의 ADCC 활성 비교. ADCC 표적 세포는 CLDN18.2를 과발현하는 A549 세포(A549-CLDN18.2) 또는 CLDN18.2를 내인성적으로 발현하는 PA-TU-8988S 세포(PATU)임.
도 14: 이펙터 기능이 변형되지 않은 hCl1a 항체를 기반으로 한 면역 사이토카인과 ADCC 활성이 강화된 면역 사이토카인 및 항체 hCl1a 및 졸베툭시맙에 대한 면역 사이토카인의 ADCC 활성 비교. ADCC 표적 세포는 CLDN18.2를 과발현하는 A549 세포 (A549-CLDN18.2) 또는 CLDN18.2를 내인성적으로 발현하는 PA-TU-8988S 세포 (PATU)임. (A): DLE 돌연변이; (B): DE 돌연변이; (C): AAA 돌연변이; (D): TL 돌연변이; (E): IE 돌연변이; (F): 아푸코실화된 면역 사이토카인.
도 15: Balb/c 마우스에서 RTX-RLI2AQ 면역 사이토카인의 PD 활성: 유세포 분석법으로 CD8+ T 세포 또는 NK 세포의 백분율 (왼쪽 패널) 또는 활성화 (Ki67+ - 오른쪽 패널)를 측정함.
도 16: 폐 무게로 측정한 생체 내 렌카 (Renca) 마우스 전이 모델에서 RTX-RLI2AQ 면역 사이토카인의 항전이 활성도.
도 17: A20-hCD20/Balb/c 마우스에서 RTX-RLI 면역 사이토카인의 항종양 효능: 종양 성장은 시간에 따라 개별 마우스에 대해 표시됨. A: 1 내지 4일째 피하 주사 (s.c.)한 버퍼 대조군, B: 1 내지 4일째 피하 주사한 1mg/kg의 RLI2 대조군, C: 1일차 및 8일차에 0.15mg/kg의 RTX-RLI2AQ를 정맥 주사 (IV)한 대조군.
도 18: 리툭시맙 단독 투여와 비교한 리툭시맙 기반 RTX-RLI 면역 사이토카인의 ADCC 활성. 테스트한 폴리펩타이드의 농도에 따라 DAPI 양성에 의해 결정된 죽은 종양 세포의 %를 측정함: 검은색 원: 리툭시맙, 회색 원: 리툭시맙 + NK92 세포, 점선이 있는 검은색 삼각형: RTX-RLI2AQ x2, 실선이 있는 검은색 삼각형: RTX-RLI2AQ x2 + NK92 세포; 회색 사각형: RTX-RLI2AQ x1, 검은색 사각형: RTX-RLI2AQ x1 + NK92 세포.
도 19: (A) 키트루다 (Keytruda)와 SOT201의 농도 증가에 따른 PD-1/PD-L1 차단율(pM)을 %로 나타냄
(b) IL-2/IL-15Rβγ에 대한 결합이 감소하지 않고 IL-15 모이어티를 갖는 SOT201 또는 SOT201 wt의 양이 증가하는 건강한 기증자의 인간 PBMC를 시험관 내에서 7일간 자극한 후 유세포 분석으로 측정한 Ki67+ NK 세포 및 CD8+ T 세포의 %.
(C) 건강한 C57BL/6 마우스 (n=2/그룹)의 비장에서 유세포분석을 통해 등가 분자량 5mg/kg의 마우스 대리체 분자 mSOT201 화합물 (항-뮤린 PD-1 항체 RMP1-14 융합 RLI-15AQA)을 정맥 주사 (IV)한 후 5일 후 단일 활성 대조군으로 항-뮤린 PD-1 항체 단독 또는 항-인간 PD1 마우스 IgG1-RLI-15AQA(hPD1-mSOT201)와 비교함.
도 20: (A) 1일차 (종양 부피 80 내지 100mm3의 무작위 배정일)에 대조군 (NaCl, mSOT201, hPD1-mSOT201 또는 mPD1을 mSOT201(5mg/kg)과 등가로 정맥 주사 (IV)한 C57BL/6 마우스의 17일 동안의 종양 부피(mm³)(n=10 마우스/그룹).
(B) 치료 후 100일까지 생존한 MC38 종양 보유 마우스의 해당 비율.
도 21: (A) RNA 시퀀스 데이터의 메타게놈에 의해 결정된 MC38 종양 보유 마우스의 mSOT201 처리 종양 샘플(N=3) 및 대조군 샘플(N=4)에서 표시된 적응성 및 선천성 면역 세포 및 암 관련 섬유아세포(CAF)와 관련된 유전자 세트의 상대적 발현 수준. 박스 플롯: 최소, 중앙값, 최대.
(B) 확립된 종양 (80 내지 100mm³)에 mSOT201(5mg/kg) 정맥 주사 (IV) 처리 후 7일째에 MC38 종양 보유 마우스의 비장 또는 림프절에서 표시된 세포의 유세포 분석에 의한 % Ki67+ 세포로 측정한 세포 증식도 (n=2).
도 22: (A) MC38 종양을 보유한 C57BL/6 마우스에 대조군(NaCl), mSOT201을 1회 정맥 주사 (IV)한 후 21일 동안의 종양 부피 (mm³), mPD1-IL-2βγ 작용제 (항뮤린 PD-1 항체 RMP1-14에 융합된 IL-2v)와 CD25 결합이 없어진 경우 또는 RLI-15AQA와 항뮤린 PD-1 항체 mPD1(RMP1-14)의 조합(n=10 마우스/그룹)을 정맥 주사한 경우.
(B) 건강한 C57/BL6 마우스에서 5일째와 8일째에 정맥 주사 (IV) 투여 후 유세포 분석법으로 검출한 CD8+ T 세포와 NK 세포의 Ki67+ 세포 비율로 측정한 세포 증식도.
(C) MC38 종양을 보유한 C57BL/6 마우스의 7일째 비장 또는 림프절에 있는 CD8+ T 세포의 Ki67+ 세포 비율(%) mSOT201, mPD1-IL-2v 또는 RLI-15AQA와 mPD-1의 조합으로 정맥 주사 (IV) 처리함. 무작위 배정 1일차, 종양 부피 100mm3(n=10/그룹).
도 23: (A) 유세포 분석 및 혈액학에 의해 1일째에 0.6 mg/kg의 SOT201을 1회 정맥 주사 (IV) 투여한 후 시노몰구스 원숭이의 혈액에서 Ki67+의 비율과 NK 및 CD8+ T 세포의 절대 세포 수의 배 변화, 각 그래프 곡선은 한 마리의 동물을 나타냄.
(B) (화살표로 표시된) 1일 및 21일에 0.3 mg/kg의 SOT201을 정맥 주사 (IV) 투여한 후 시노몰구스 원숭이의 혈액 내 NK 및 CD8+ T 세포의 Ki67+ 비율을 유세포 분석법으로 측정한 결과, 각 그래프 곡선은 한 마리의 동물을 나타냄.
도 24: 생체 내에서 마우스 SOT201 대리체를 처리한 후의 NK 및 CD8+ T 세포 증식.
(A) 건강한 C57BL/6 마우스의 비장에서 hPD1-mSOT201, mPD-1, mSOT201, mSOT201 wt 및 mPD1-IL2v로 처리한 후 5일 및 8일째에 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 증식. CD8+ T 세포와 NK 세포에서 Ki67의 발현을 유세포 분석법으로 검출함. 분자를 1일째에 5mg/kg의 mSOT201과 동등한 용량으로 정맥 주사 (IV) 투여함: hPD1-mSOT201은 5.37 mg/kg, mPD-1은 4.51 mg/kg, mSOT201 wt의 0.25 mg/kg과 등가 용량으로 투여함: mPD1-IL2v는 0.26 mg/kg으로 투여함. 유세포 분석은 5일째와 8일째에 수행하였음. 데이터는 매일 그룹당 2명에 대한 평균 ± SEM을 나타냄.
(B) 건강한 C57BL/6 마우스의 비장에서 hPD1-mSOT201, mPD-1, mSOT201, mSOT201 wt 및 mPD1-IL2v 처리 후 5일 및 8일째의 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 증식. CD8+ T 세포와 NK 세포에서 Ki67의 발현을 유세포 분석법으로 검출하였음. 분자들은 1일차에 mSOT201의 10 mg/kg에 등가인 용량으로 정맥 주사 (IV) 투여됨: hPD1-mSOT201은 10.74 mg/kg, mPD-1은 9.02 mg/kg, mSOT201 wt의 0.1 mg/kg에 등가인 용량으로 투여됨: mPD1-IL2v는 0.1 mg/kg으로 투여됨. 유세포 분석은 5일째와 8일째에 수행하였음. 데이터는 매일 그룹당 2명에 대한 평균 ± SEM을 나타냄.
도 25: 생체 내 PD-1 민감성 및 PD-1 내성 종양 모델에서 마우스 SOT201 대리체.
(A) 항 PD-1 민감성 종양 모델
MC38/C57BL/6 마우스 모델: 0일째에 4.51 mg/kg mPD-1 (문헌과 비교한 최적 용량 미만, mSOT201과 등가로 선택), 5 mg/kg mSOT201 또는 5.37 mg/kg hPD1-mSOT201 (mSOT201과 등가로 선택)을 1회 복강 주사 (i.p.)투여; D0 = 종양 용적 ~ 80-100 mm3, 10마리/그룹으로 무작위 배정일;
CT26/BALB/c 마우스 모델: 0일, 3일, 6일, 9일에 9.02 mg/kg mPD-1(문헌과 비교한 유효 용량), 10 mg/kg mSOT201, 10.74 mg/kg hPD1-mSOT201(mSOT201과 등가)을 4회 복강 주사 (i.p.) 투여; D0 = 종양 용적 ~100 mm3, 10 마우스/그룹으로 무작위 배정일.
(B) 항 PD-1 내성 종양 모델
CT26 STK11 ko 마우스 모델: 0일, 3일, 6일, 9일에 9.02 mg/kg mPD-1(문헌과 비교한 유효 용량), 10 mg/kg mSOT201, 10.74 mg/kg hPD1-mSOT201(mSOT201과 동등한 용량)을 4회 복강 주사 (i.p.) 투여; D0 = 종양 부피 ~100 mm3, 10마리/그룹으로 무작위 배정일; 실험용 마우스의 종양 부피는 1 mm3임.
B16F10/C57BL/6 마우스 모델: 0일, 3일, 6일, 9일에 9.02 mg/kg mPD-1 (문헌과 비교한 유효 용량), 10 mg/kg mSOT201, 10.74 mg/kg hPD1-mSOT201 (mSOT201과 동등한 용량)을 4회 복강 주사 (i.p.) 투여; 0일 = 종양 부피 ~100 mm3, 10마리/그룹 무작위 배정일
대조군에 존재하는 모든 마우스의 컷오프 일, CR = 완전 반응
도 26: 생체 내 mSOT201과 RLI-15AQA 뮤테인 + 항 PD-1의 비교.
MC38/C57BL/6 마우스 모델과 다음 그룹:
G1 모의 대조군
G4: 0일째에 0.64 mg/kg RLI-15 AQA , 피하 주사 (s.c.) 단일 투여
+ 0일째에 4.51 mg/kg mPD-1 복강 주사 (i.p.) 단일 투여
G2 0일째에 5mg/kg mSOT201 정맥 주사 (i.v.) 단일 투여
G3 0일째에 2mg/kg mSOT201 정맥 주사 (i.v.) 단일 투여
G6 0일째에 4.51mg/kg mPD1 복강 주사 (i.p) 단일 투여 (문헌과 비교하여 최적 용량이 아니며, mSOT201과 등가로 선택됨),
G11 0일째에 5mg/kg hPD1-mSOT201 정맥 주사 (i.v) 단일 투여
+ 0일째에 4.36mg/kg mPD-1 복강 주사 (i.p) 단일 투여,
0일차 = 종양 부피가 ~80 내지 100 mm³인 무작위 배정일, 마우스 10마리/그룹
대조군에 존재하는 모든 마우스의 컷오프일, CR = 완전 반응.
도 27: MC38/C57BL/6 마우스 모델 - D0 = 무작위 배정일 ~80-100 mm3, 마우스 10마리/그룹. CR = 완전한 반응
G1 모의 대조군
G2 0일째에 5 mg/kg mSOT201, 정맥 주사 (i.v.) 단일 투여
G3 0일째에 2 mg/kg mSOT201, 정맥 주사 (i.v.) 단일 투여
G7 0, 1, 2 및 3일째에 1 mg/kg of RLI2 AQ , 피하 주사 (s.c.) 4회 투여
G5 0일째에 1 mg/kg RLI2 AQ , 피하 주사 (s.c.) 단일 투여 + 0일째에 5 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p) 단일 투여
G8 0, 1, 2 및 3일째에 1 mg/kg of RLI2 AQ , 피하 주사 (s.c.) 4회 투여 + 0일째에 5 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 단일 투여
G9 0, 1, 2 및 3일째에 1 mg/kg of RLI2 AQ , 피하 주사 (s.c.) 4회 투여 + 4 0, 3, 6 및 9일째에 5 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 4회 투여
G6 0일째에 5 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 단일 투여
G10 0, 3, 6 및 9일째에 5 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 4회 투여
대조군에 존재하는 모든 마우스의 컷-오프일
도 28: 생체 내 mSOT201과 RLI2AQ + 항 PD-1 종양 성장 비교. MC38/C57BL/6 마우스 모델
(A) 시간에 따른 평균 종양 부피 (mm³)로 16일째에 개별 동물에 대해 표시되며, 수평선은 평균 종양 부피를 나타냄.
G1 모의 대조군
G2 0일째에 2 mg/kg of mSOT201, 정맥 주사 (i.v.) 단일 투여
G3 0 및 1일째에 2 mg/kg RLI2 AQ , 피하 주사 (s.c.) 2회 투여
+ 0, 3, 6 및 9일째에 2 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 4회 투여.
1회 실험만, D0 = 종양 부피 ~ 80-100mm³, 마우스 10마리/그룹에서 무작위 배정일.
CR = 완전한 응답
유세포 분석법을 사용하여 SOT201(위 G2) 및 RLI2AQ + 항-PD-1(위 G3) 처리 후 7일째 비장, 림프절 및 종양에서 NK 세포, CD8+ T 세포 및 αβTCR 및 γδdTCR(T 세포)를 발현하는 세포의 상대적 확장을 조사함. 3개의 종양 샘플을 모으고 3개의 비장 및 림프절 샘플을 개별적으로 분석함.
(B) 림프절, 비장 및 종양에서 나온 CD8+ T 세포(위쪽 줄)와 NK 세포(아래쪽 줄)에 대한 모세포의 빈도(모세포 집단 대비 상대적 백분율)를 %로 표시함.
(C) 림프절, 비장 및 종양에서 채취한 αβTCR+ CD3+ T 세포 (위쪽 줄)와 βγTCR+ CD3+ T 세포(아래쪽 줄)의 모세포 빈도를 %로 표시함.
도 29: (A) DC-T 세포 기반 분석에서의 면역원성 (Immunogenicity). 후보 분자가 있는 iDC를 로딩한 후, CFSE로 사전 염색된 자가 CD4+ T 세포로 배양한 후, 순환 세포의 대리자로서 CFSElow로 염색된 CD4+ T 세포를 검출한 후 % CFSElow로 염색된 CD4+ T 세포로 표시된 PEM-RLI-15 후보 분자에 대한 T 세포 반응임. 11명의 기증자 ± SEM 평균이 표시됨. 단백질 없이 배양하여 비특이적 T 세포 증식을 유도한 대조군 DC와 비교하여 유의미한 차이를 보여줌. * p≤0.05, *** p≤0.001.
(B) 도입된 치환체 N65A 및 G175A/N176Q에 걸쳐 있는 RLI-15 펩타이드의 IFN-γ 및 TNF-α에 대한 플루오로스팟 분석. 40명의 기증자로 구성된 테스트 집단에서 각 야생형 펩타이드 대비 Mut2 또는 Mut3 펩타이드가 평균 dSFU에 미치는 영향을 95% 신뢰 구간(CI)으로 추정함. SFU = 스팟 형성 단위, dSFU = 재자극 스팟의 SFU에서 재자극되지 않은 스팟의 SFU를 뺀 값임.
도 30: 이펙터 기능이 변형된 SOT202 분자의 hPBMC 증식 유도 능력 비교. 분리된 hPBMC의 증식은 SOT202-DANA, SOT202-afuc-DANA, SOT202-DLE-DANA, SOT202-DE-DANA 및 SOT202-LALAPG-DANA에 대해 평가되었음. 세포를 7일 동안 시험관 내에서 자극하였음. 6명의 기증자 ± SEM의 평균이 표시됨. 유세포 분석법으로 Ki67+ 세포를 계수하여 NK(위) 및 CD8+ T 세포(아래)의 증식을 측정함.
도 31: SOT202 분자와 SOT201의 hPBMC 증식 유도 능력 비교. 분리된 hPBMC의 증식은 SOT202, SOT202-afuc, SOT201-DANA, SOT202-DANA 및 SOT202-afuc-DANA에 대해 평가되었음. 유세포 분석법으로 Ki67+ 세포를 계수하여 NK(위) 및 CD8+ T 세포(아래)의 증식을 측정함.
도 32: 이펙터 기능이 변형된 SOT202-DANA 분자와 SOT201-DANA의 hPBMC 증식 유도 능력 비교. 분리된 hPBMC의 증식은 SOT201-DANA, SOT202-DANA, SOT202-afuc-DANA, SOT202-LALAPG-DANA 및 hCl1a(SOT202-mab로도 표시)에 대해 평가되었음. 유세포 분석법으로 Ki67+ 세포를 계수하여 NK(위) 및 CD8+ T 세포(아래)의 증식을 측정함.
도 33: (A) mSOT202로 자극한 후 건강한 C57BL/6 마우스의 비장에서 검출된 CD8+ T 세포 또는 NK 세포의 세포 증식 (Ki67+). 세포 증식은 Ki67 염색으로 검출하고 5, 10 또는 20 mg/kg의 mSOT202 화합물(hCl1a-mIgG2a-NA 1x) 또는 hCl1a-mIgG2a를 정맥 주사한 후 5일 후에 유세포 분석법으로 측정함. (B) (A)와 동일한 실험 조건에서 NK 세포 및 CD8+ T 세포의 백분율.
도 34: 건강한 C57BL/6 마우스의 비장에서 mSOT202, mSOT202-LALAPG 및 hCl1a-mIgG2a로 자극한 후 검출된 NK 세포(A) 또는 CD8+ T 세포(B)의 세포 증식. 위: 세포 증식을 Ki67 염색으로 감지하고 유세포 분석법으로 화합물을 5mg/kg으로 정맥 주사한 후 5일 및 10일 후에 측정함. 아래쪽: NK 세포 및 CD8+ T 세포의 백분율.
실시예
실시예 1: 일반 재료 및 방법
kit225의 역가 분석
IL-2와 IL-15의 활성은 Hori et al. (1987)이 설명한 대로 kit225 세포의 증식 유도를 통해 확인할 수 있다. kit225 세포 (Hori, Uchiyama et al. 1987)를 kit225 기본 배지에서 통과시키고 4-7번 통과시켜 효능 분석에 사용하였다. 효능 분석 전, kit225 세포를 IL-2가 없는 kit225 기본 배지에서 24시간 (기아 기간) 동안 배양했다. 1x104 kit225 세포를 96웰 플레이트에 플레이트하고 RLI-15 및 각 분자의 PEM-RLI-15를 연속적으로 희석하여 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 72±3시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 웰에 10μl (웰 내 부피의 10%)의 알라마르 블루 (Alamar Blue)를 첨가하고 6시간 후 Tecan Spark 흡광도 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 620 nm 기준으로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다 (15초 동안 검출 전에 혼합을 설정). 일부 경우, 효능이 낮은 RLI2 돌연변이를 테스트했을 때는 kit225 세포를 사용한 배양 기간을 3일 (72시간 ± 3시간)에서 5일로 연장하였다.
바람직하게는, 예를 들어 CTLL-2 세포를 사용하여 소만 등이 설명한 것처럼, 비색법 또는 형광과 같은 방법을 사용하여 IL-2 또는 IL-15 자극에 의한 증식 활성화를 측정한다 (Soman, Yang et al. 2009). kit225 세포와 같은 세포주의 대안으로 인간 말초혈액 단핵세포 (PBMC) 또는 버피코트를 사용할 수 있다. IL-2 또는 IL-15의 활성을 측정하는 데 선호되는 바이오 분석법은 STAT5-RE CTLL-2 세포를 사용하는 IL-2/IL-15 바이오 분석 키트이다 (Promega Catalog number CS2018B03/B07/B05).
분석된 RLI 변이체의 농도는 다음과 같다:
RLI2 상청액. 0.133 mg/ml(ELISA, 2개 실험 평균)
RLI2AQ 상청액. 0.0297 mg/ml(ELISA, 2개 실험 평균)
RLI2의 속성
순도(RP-UPLC) 99.8%
제형20mM 히스티딘, 6%(w/v) 소르비톨, pH 6.5
보관 온도 -20℃
Kit225 기본 배지
플라스크 (75cm2)에 RPMI(460mL) + FBS(30mL) + 글루타맥스(5mL) + 페니실린-스트렙토마이신 (5mL) + 사이토카인, IL-2(5ng/mL)를 첨가한다. 사이토카인은 배양 직전에 배지에 첨가하였다.
hPBMC 효능 분석
건강한 기증자로부터 버피 코트를 얻었다. PBMC를 피콜파크 (Ficoll Paque) 게이지로 분리하고 세 번 세척한 후 96웰 플레이트의 T세포 완전 배지에 다시 현탁하였다. 면역 사이토카인을 표시된 농도로 첨가하고 37℃에서 5% CO2로 7일간 배양했하였다. 면역 세포 집단의 증식을 유세포 분석법으로 검출하였다.
T 세포 완전 배지
RPMI 1640 배지, CTS 글루타맥스 - I 1X, 페니실린-스트렙토마이신 100 U/mL, 피루브산 나트륨 1mM, NEAA 1X (비필수 아미노산 혼합물), 2-메르캡토에탄올 0.05mM 및 10% AB 인간 혈청 (열 불활성화).
사용된 항체 목록
인간 NK 세포(hNK) 분리 : 건강한 기증자로부터 채취한 신선한 혈액을 차가운 PBS-EDTA, ph7.4로 1:1 비율로 희석하고 Ficoll-Paque 구배 분리를 통해 PBMC를 분리하였다. 분리된 PBMC를 완전한 배양액에 재부유시켰다. 제조업체 지침에 따라 EasySep 인간 NK 세포 분리 키트 (미국 스템셀 테크놀로지스, 미국)를 사용하여 PBMC에서 hNK 세포를 분리하였다. 각 기증자로부터 분리한 hNK 세포를 10% 혈청을 함유한 NK 배지에 3 x 106 세포/ml 농도로 재부유시켰다.
PD-1/PD-L1 차단 생물학적 분석법
분석은 제조업체의 지침에 따라 수행되었다 (Promega PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay J1250). 간단히 말해서, PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포를 96 웰 플레이트에 플레이트하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 16 내지 20시간 배양하였다. 그 후 표시된 농도의 PEM-RLI 면역 사이토카인과 PD-1 이펙터 세포를 세포에 추가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 배양 기간이 끝나면 Bio-Glo™ 시약을 웰에 첨가하고 실온에서 15분간 배양한 후 발광 측정을 수행하였다.
시노몰구스 원숭이 연구
1일차 또는 15일차에 표시된 용량을 투여한 후 시노몰구스 원숭이(n=2-3)를 대상으로 표시된 PEM-RLI 분자의 약동학을 테스트하였다. 혈청 분리를 위한 혈액은 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 96시간, 120시간 및 168시간에 채취하였다 (일부 시점은 생략되었을 수 있음). 혈청 내 면역 사이토카인의 농도는 표 5의 항체를 사용하여 ELISA로 측정하였다. 선택된 면역 세포 집단 (NK 및 CD8+ T 세포)의 유세포 분석 평가를 위해 투여 전, 투여 5일, 8일, 12일, 15일, 19일, 22일 및 26일에 혈액을 채취하였다.
표 5: 시노몰구스 원숭이 연구에 사용된 항체 목록
실시예 37 (Tscm 세포 패널)에 사용된 항체 목록
마우스 효능 연구
이 연구의 목적은 암컷 hPD1 단일 KI HuGEMM 마우스 (C57BL/6-Pdcd1em1(hPDCD1)/Smoc)의 HuCell MC38-hPD-L1 종양 세포주 치료에서 단일 요법으로 PEM-RLI2 NA x1과 펨브롤리주맙의 생체 내 치료 효능을 평가하는 것이었다 (그룹당 n=8 마우스). 각 마우스의 우측 아래 옆구리 부위에 종양 발생을 위해 MC38-hPD-L1 종양 세포 (1×106)를 0.1ml의 PBS에 담아 피하 접종하였다. 평균 종양 크기가 108mm3에 도달하면 무작위 배정을 시작하였다. 40마리의 쥐 (mice)를 연구에 등록하였다. 모든 동물은 5개의 연구 그룹에 무작위로 배정하였다. 무작위 배정은 "일치 분포" 방법 (StudyDirectorTM 소프트웨어, 버전 3.1.399.19)에 따라 수행하였다. 무작위 배정일은 0일 (D0)로 표시하였다. 종양 세포 접종 후, 동물의 이환율과 사망률을 매일 (또는 연구 책임자의 재량에 따라 필요에 따라 더 자주) 확인하였다. 종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 주당 3회 2차원으로 측정했으며, 부피는 다음 공식을 사용하여 mm3로 표현하였다: "V = (L × W × W)/2, 여기서 V는 종양 부피, L은 종양 길이(가장 긴 종양 치수), W는 종양 너비(L에 수직인 가장 긴 종양 치수)이다. 0일째에 PEM-RLI2 NA x1을 20 mg/kg으로 정맥 주사 (IV) 투여하고 0, 3, 6, 9일째에 펨브롤리주맙을 5 mg/kg으로 복강 주사 (IP) 투여하였다. 18일 동안 종양을 관찰하였다. 이와 동시에, 0일째인 5일, 10일에 PEM-RLI2 NA x1(IL-15, N65A 및 AQ 돌연변이)을 정맥 주사 (IV)로 투여하였다. 6일 동안 종양을 관찰하였다.
혼합 림프구 반응
버피 코트는 건강한 기증자로부터 얻었다. PBMC를 Ficoll Paque 게이지로 분리하고 세 번 세척하였다. PBMC를 Ficoll Paque 게이지로 분리하고 세 번 세척하였다. 한 쌍의 hPBMC 기증자를 등가 농도의 펨브롤리주맙(pembrolizumab)과 PEM L-RLI NA x1을 1 nM에서 6일 동안 배양하였다. 세포 상청액에서 IFNγ 생성을 인간 IFN-γDuoSet ELISA (R&D systems, No. DY258B)를 사용하여 측정하였다. 데이터는 IFNγ 생산의 상대적 반응[%]으로 표시되며 -12쌍의 건강한 hPBMC 기증자로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다.
SDS-PAGE 및 항-RLI 웨스턴 블롯 분석
정제된 단백질을 SDS-PAGE와 항-RLI 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
쿠마시 염색: 변성된 상태의 분자량에 따라 단백질 밴드가 시각화된다.
간단히 말해서, 분석할 시료 3부피에 1부피의 로딩 버퍼 (베타 메르캅토에탄올 포함 또는 미포함)를 첨가하고 (1X 로딩 버퍼로 다소 희석), 균질화하여 95 ℃에서 5분간 변성시켰다. 변성된 샘플을 Criterion TGX 겔에 로드하고 1X TGS 버퍼에서 겔 유형에 따라 18분 또는 21분 동안 일정한 전압 (300V)과 제한된 전류 (겔당 75mA 또는 135mA)로 흐르는 버퍼에서 실행하였다. 젤을 카세트에서 꺼내 물로 5분간 3회 세척하고, 바이오세이프 염색 용액 (Biosafe staining solution, Biorad)으로 20분간 염색하고, 물로 20분간 3회 세척한 후 물로 3시간 동안 최종 염색 제거 세척을 하였다. 그런 다음 염색된 젤을 젤 스캐너로 스캔하였다.
웨스턴 블롯 분석: 젤을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮긴 다음 다른 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 사용한다. 이동이 끝나면 젤은 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 단백질을 옮기는 데 사용된다. 참조 예시 (Biorad#170-4155, Trans-BlotR Turbo™ 전사 스타터 시스템)의 경우, 전사 파라미터는 2.5 A, 25 V, 7분 (Criterion 겔의 경우) 또는 2.5 A, 25 V, 3분(Mini-PROTEAN 겔의 경우)이다. iBind™ Flex 용액에서 멤브레인을 포화시킨 후, 항체 배양 및 세척 단계는 iBind 시스템에서 수행된다. 노출 후 완전히 건조되면 분석을 위해 멤브레인을 스캔하였다. 사용된 1차 항체는 항 RLI2-PR01 항체 (사이튠, 희석 1:25000)이고, 사용된 2차 항체는 당나귀 항-토끼 IgG-AP 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지, 희석 1:5000)이다.
모세관 전기영동
모세관 전기영동에 의한 단백질 분석은 일정한 전기장에서 체질 매트릭스를 통해 LDS 표지 단백질 변이체를 분리하는 방식에 의존한다. Labchip GXII 기기는 단일 시퍼 미세유체 칩을 사용하여 96웰 플레이트에 로드된 단백질 샘플을 특성화한다. 미세 유체 칩 기술을 통해 단백질 샘플을 분리하고 분석할 수 있다. 레이저 유도 신호 검출 및 분석 후 제공되는 데이터는 래더 및 마커 보정 표준을 사용한 상대적 단백질 농도, 분자 크기 및 순도 백분율이다.
샘플은 최종 농도 35mM에서 DTT의 존재 여부에 관계없이 5μL 샘플과 35μL의 HT 단백질 샘플 버퍼를 혼합하여 변성켰다. 필요한 경우, 샘플을 HT 단백질 샘플 버퍼에 1mg/mL로 미리 희석하였다. 혼합물을 100℃에서 5분간 가열하여 변성을 수행하였다. 그런 다음 70μL의 물을 추가하고 샘플을 2,000g에서 10분간 원심분리하였다. 그런 다음 샘플(96웰 플레이트에 담긴)을 랩칩 GXII 기기에 로드하여 칩 전송 및 분석을 진행하였다.
표 6: 특성 요약
글리코실화/탈아미드화 돌연변이체
표 7: 글리코실화 및 탈아미드화에 관련된 아미노산 개요
RLI2 분자의 주요 글리코실화 부위는 N176(RLI 넘버링)이고 부위는 N168에 있다. N209에서는 글리코실화가 보이지 않는다. 글리칸은 복잡하고, 주로 이년성 (biantennary)이며, 푸코실화되어 있고, 시알릴화가 거의 없는 G0~G2이다. 세포 배양에서 단백질의 약 40~50%가 글리코실화되며, N168에서 약 5%가 글리코실화된다. 상기 설명한 대로 정제하면 RLI2의 약 14~25%가 글리코실화된다. 다양한 수준의 당화 수준은 효능, 안정성에 영향을 미치지 않으며, 당화 처리된 RLI2는 반감기가 짧아 약동학에 약간의 영향만 미치지만, 활성 약리 성분의 이질성은 규제 관점에서 여전히 문제가 되고 있다.
대장균에서 발현되는 IL-15에서 확인된 탈아미드화의 잠재적 핫스팟은 N77(IL-15 번호)/N174(RLI 번호)이다 (Nellis, Michiel et al. 2012). N79의 N-글리코실화가 N77 탈아미드화를 부분적으로 방지한다고 설명되었지만 (Thaysen-Andersen, Chertova et al. 2016), 발명자들은 실제로 질량 분석법을 통해 CHO 발현 RLI2에서 N77이 탈아미드화되는 것을 확인했으며, 탈아미드화가 RLI2 및 RLI 기반 제품의 잠재적 이질성에 대한 실제 문제이므로 탈아미드화를 피해야 함을 확인하였다.
도 1A는 (돌연변이가 없는) RLI2 wt가 실제로 약 20 및 25kDa의 두 개의 주요 밴드와 몇 개의 마이너 밴드를 가진 이질적인 생산물(product)이며, 모두 항 RLI2 항체에 면역 반응하여 RLI2 단백질의 다른 변형을 일으킨다는 것을 보여 준다.
본 출원인은 글루타민을 보수적으로 치환해도 탈아미드화 위험이 해결되지 않았기 때문에 N77의 탈아미드화를 없애고 극성 아미드를 제거하기 위한 확실한 방법으로 돌연변이를 피하고자 하였다. 대신 RLI2(RLI2 A)의 단일 치환 G78A(IL-15 번호)/G175A(RLI 번호)를 도입하여 N77 위치에서 탈아미드화 가능성을 없앴다. 탈아미드화의 손실은 쿠마시 염색이나 웨스턴 블롯에서는 보이지 않지만, 탈아미드화의 손실이 예상되는 cIEF에서는 탈아미드화 핫스팟 N174의 주요 산성 피크 (pI 6.0)가 크게 감소하여 탈아미드화가 실제로 제거되었음을 확인하였다 (데이터는 표시되지 않음). 또한 PEM-RLI AQ 구조의 질량 분석 결과 탈산화가 전혀 없는 것으로 나타났다 (데이터는 표시되지 않음).
놀랍게도 G78A 돌연변이는 글리코실화가 약간 증가하여 (도 1A 참조, 그림 1B에서 더 잘 보임) RLI2 중량에 비해 더 크고 더 많은 글리코실화된 종으로 이어졌다. 이러한 새로운 글리코실화 패턴을 나타내는 추가 밴드가 나타난다 (도 1B의 점선 상자 3 참조). 또한 RP-UPLC 피크도 약간 이동하였다 (데이터는 표시되지 않음). 탈아미드화 돌연변이 G78A가 글리코실화에 미치는 영향을 예측할 수 없었기 때문에 이러한 변화된 글리코실화 패턴은 예상치 못한 것이었다.
IL-15의 주요 당화 부위를 방해하기 위해 도입된 Q(RLI2 AQ, RLI2AQ)로 N79(IL-15 번호)/N176(RLI 번호)을 추가로 치환하면 더 큰 종의 RLI2가 현저히 감소하는 것이 관찰되었다 (도 1B의 점선 상자 1 참조). 잔류하는 더 큰 밴드 (도 1B의 실선 박스 2 참조)는 RLI 분자의 약 20%에 해당하는 N71(IL-15 번호)/N168(RLI 번호)의 당화를 나타내는 것으로 보이며, 이는 RLI2 wt 및 RLI2에 비해 약간 증가된 것으로 보인다. 박스 1의 밴드는 N176에서 글리코실화된 RLI2를 나타낼 수 있고, 박스 3의 밴드는 N176 및 N168에서 글리코실화된 RLI2를 나타낼 수 있다. 그러나 상자 3의 밴드는 N176에서 불리한 시알산 글리칸 구조로 글리코실화된 RLI2일 수도 있다. 어떤 이론에 얽매이지 않고, N71에서의 이러한 놀라운 글리코실화 증가는 주요 부위인 N79에서의 글리코실화가 RLI2 wt의 N71에서의 글리코실화를 입체적으로 방해하고, N79가 돌연변이를 일으키면 이러한 방해가 완화되는 것으로 설명할 수 있다.
AQ가 치환된 RLI2AQ와 그에 따른 IL-15AQ는 균질성이 매우 개선되고 탈아미드화 위험이 감소한 RLI2 또는 IL-15 변종을 나타낸다.
당화가 RLI 변이체의 생물학적 활성에 미치는 영향/영향을 비교하기 위해, 당사는 부위지향적 돌연변이 유발법 (Stratagene 부위지향적 돌연변이 유발 XL 키트)을 통해 IL-15의 3개의 잠재적 당화 부위 N71/N79/N160(RLI의 경우 N168/N176/N209)을 특이적으로 비활성화시켰다. N71을 S로 치환하고, N79를 Q로 치환하고, N160을 S로 치환하여 RLI2 N168S/N176Q/N209S 및 RLI1 N168S/N176Q/N209S 를 생성하였다. N79(=RLI의 N176)에서의 주요 N-글리코실화 점유를 확인하기 위해 RLI2 N176Q 돌연변이체를 만들었다. CHO 세포에서 일시적으로 발현하면 고유한 25kDa 밴드가 나타난다 (도 2, 오른쪽 패널 참조).
주요 글리코실화 부위 (RLI2N176Q)에서만 돌연변이된 RLI 단백질은 또한 독특한 25kDa 밴드를 나타냈으며, 따라서 CHO에서 발현된 RLI의 N176 잔기 (일시적 발현)에 대한 주요 글리코실화 점유 (glycosylation occupancy)를 확인하였다. 일시적 CHO 세포에서 발현된 탈당화 돌연변이체의 분비 수율은 당화/원형 돌연변이체와 유사하였다. 따라서 탈당화가 발현 수준에 미치는 영향은 크지 않았다. 이는 피키아 파스토리스 발현 시스템 (Pichia pastoris expression system)에서도 동일하게 관찰되었다 (데이터는 표시되지 않음).
또한, N-글리코실화 부위의 이러한 돌연변이는 kit225 또는 32Dβ 세포에서 RLI의 시험관 내 증식 활성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 일반적으로 그렇듯이 모든 RLI 버전(RLI1 또는 RLI2, 글리코실화 또는 비글리코실화, CHO 또는 바쿨로 또는 피치아)은 kit225 세포주의 증식을 유사하게 자극하였다.
RLI2 AQ 변이체의 효능
IL-2와 IL-15의 활성은 Hori 등(1987)이 설명한 대로 kit225 세포의 증식 유도를 통해 확인할 수 있다. kit225 세포 (Hori, Uchiyama et al. 1987)를 kit225 기본 배지에서 통과시키고 4-7번 통과하여 효능 분석에 사용하였다. 효능 분석 전, kit225 세포를 IL-2가 없는 kit225 기본 배지에서 24시간 (기아 기간) 동안 배양하였다. 1x104 kit225 세포를 96웰 플레이트에 플레이트하고 RLI-15 및 각 분자의 PEM-RLI-15를 연속적으로 희석하여 세포에 첨가하였다. 세포를 37 ℃, 5% CO2에서 72±3시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 웰에 10μl (웰 내 부피의 10%)의 알라마르 블루를 첨가하고 6시간 후 Tecan Spark 흡광도 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 620 nm 기준으로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다 (15초 동안 검출 전에 혼합을 설정). 일부 경우, 효능이 낮은 RLI2 돌연변이를 테스트할 때 kit225 세포를 사용한 배양 기간을 3일 (72시간 ± 3시간)에서 5일로 연장하였다.
바람직하게는, 예를 들어 CTLL-2 세포를 사용하여 소만 등이 설명한 것처럼, 비색법 또는 형광과 같은 방법을 사용하여 IL-2 또는 IL-15 자극에 의한 증식 활성화를 측정한다 (Soman, Yang et al. 2009). kit225 세포와 같은 세포주의 대안으로 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC) 또는 버피코트를 사용할 수 있다. IL-2 또는 IL-15의 활성을 측정하는데 선호되는 바이오 분석법은 STAT5-RE CTLL-2 세포 (Promega 카탈로그 번호 CS2018B03/B07/B05)를 사용하는 IL-2/IL-15 바이오 분석 키트이다.
분석된 RLI 변이체의 농도는 다음과 같다:
RLI2 상청액. 0.133 mg/ml (ELISA, 2개 실험 평균)
RLI2AQ 상청액. 0.0297 mg/ml (ELISA, 2개 실험 평균)
표 8: 32Db 세포 또는 kit225 세포의 활성화에 의해 결정된 상층액의 RLI2AQ와 비교한 RLI2의 EC50 값(nM)
표 9: Kit225 세포 증식의 활성화에 의해 결정된 상청액의 RLI2와 RLI2AQ의 상대적 효능
따라서 상청액으로 당화 돌연변이체 RLI2AQ는 상청액에서 추출한 RLI2와 비교했을 때 kit225 및/또는 32Db 세포를 자극하는 효능이 매우 유사하였다. 많은 당단백질에서 당화가 손실되면 활성이 낮아지기 때문에 이는 놀라운 결과이다.
또한 IL-2/IL-15 βγ 수용체에 대한 SPR (바이오코어)의 결합 실험에서도 RLI2와 RLI AQ 간의 kon 속도, koff 속도 및 평형 상수 Kd의 관련성이 관찰되지 않았다 (데이터는 표시되지 않음).
요약하면, AQ가 치환된 RLI2AQ 및 그에 따른 IL-15AQ는 균질성이 매우 개선되고 탈아미드화 위험이 감소하며 면역 세포를 활성화하는 효능이 비슷한 RLI2 또는 IL-15 변종을 나타낸다.
높은 글리코실화 및 낮은 글리코실화 RLI2에 대한 시노몰구스 PK/PD 연구
높은 글리코실화 및 낮은 글리코실화 RLI2의 PK 및 PD 특성을 비교하기 위해 200리터 규모의 생산 캠페인을 실행하고, S0SP 및 X0SP 깊이 필터로 수확한 후 PPA 컬럼에서 단백질을 포획하였다. 바이러스는 용매 세제 처리를 통해 비활성화하고 Capto Adhere 컬럼과 Hydroxyapatite type II 컬럼 (플로우 스루 모드)을 통해 정제를 계속한 후 나노여과를 통해 두 번째 바이러스 제거 단계를 거쳤다. RLI 제제를 Capto Impres Phenyl 컬럼 (CPI Phenyl HIC)에서 연마하고 고글리코실화된 RLI2를 위한 선택된 분획 (RLI-15-HG)을 모으고 저글리코실화된 RLI2를 위한 선택된 분획 (RLI-15-LG)을 모았다 (도 5A-C 참조). 마지막으로, 최종 제형 완충액 (20mM 히스티딘, 6% 소르비톨 pH6.5)으로 10kDa 컷오프 UF 멤브레인에서 UFDF 여과를 수행하였다. RLI-15-HG는 글리코실화된 RLI 이성질체의 상단 밴드에서 대부분의 RLI를 보여주는 반면, RLI-15-LG는 글리코실화된 RLI 이성질체의 작은 부분만 포함하고 있다 (도 5B 및 C).
총 3마리의 수컷과 3마리의 암컷 시노몰구스 원숭이를 PK/PD 연구에 포함하였다. 동물은 교차 투여 설계에 따라 매일 피하 투여하여 15 μg/'kg(공칭 용량)의 RLI2를 RLI-15-HG 및 RL1-15-LG로 투여하는 두 그룹으로 나누었다. 투여는 10일의 휴약 간격을 두고 4일씩 2회(2x4)에 걸쳐 실시하였다 (1일차~4일차: 수컷은 RLI-l5-LG, 암컷은 RLI-15-HG). 15일 내지 18일차: 수컷의 경우 RLI-15-HG, 암컷의 경우 RLI-15-LG). 전 처리 기간에 채취한 혈액 샘플에서 약력학적 파라미터 (NK, CD4+ 및 CD8+ 세포의 Ki67 발현 포함)를 분석하였다. 5일째. 12일차 및 19일차. 약동학 조사를 위한 혈액 샘플은 각 치료 간격의 첫 투여 후 1일째와 15일째에 모든 동물로부터 투여 전과 투여 후 0.5, l, 2, 6, 12, 24시간 시점에 채취하였다. 바이오 분석을 수행하였다. 또한, 백업 혈청 샘플 (D1(프리도스). D15(투여 전) 및 D16 (24시간))을 부분적으로 면역원성 평가 (ADA 측정)에 사용하였다.
약동력학(PK) 분석은 Phoenix™ WinNonlin® 소프트웨어(버전 6.4. Certara L.P.)에서 비구획 분석을 사용하여 수행하였다.
약동력학적 프로파일: 모든 처리된 동물은 1일차 및 15일차 투여 후 샘플링 기간의 대부분에 걸쳐 정량화 가능한 양의 RLI2를 측정하면서 시험 항목에 노출하였다. 주요 약동학 파라미터는 표 10에 요약되어 있다.
표 10: 주요 약동력학 파라미터
암컷과 수컷 동물의 Cmax 및 AUC0t 노출량은 차이가 있었습니다. 암컷이 수컷에 비해 Cmax와 AUC0t가 약 2배 더 높았다. 이러한 성별 차이와는 무관하게 RLI-15-HG와 RLI-15-LG의 약물동력학에서도 차이가 관찰되었다. 놀랍게도 RLI-15-HG에 의한 노출이 RLI-15-LG에 의한 노출보다 낮았다. 동물의 성별에 관계없이 RLI-15-HG와 RLI-15-LG 사이의 비율은 Cmax와 AUC0-t에 대해 각각 0.606과 0.453이었다.
면역원성 측정을 위한 DC-T 세포 기반 분석법
건강한 기증자로부터 버피 코트를 얻었다. 혈액을 PBS-EDTA로 희석하고 (희석된 혈액 175mL를 얻기 위해) Ficoll 패크 농도계 (Ficoll 15mL + 희석된 혈액 35mL)를 사용하여 PBMC를 분리하였다. CD14+ 단핵구는 제조업체의 지침에 따라 EasySep™ Human CD14 양성 선별 키트 II(17858, StemCell)를 사용하여 분리하였다. CD14- 분획을 새로운 팔콘 튜브에 피펫팅하고 나머지는 1200 rpm에서 10분간 원심분리한 다음 CryoStore 배지에 다시 현탁하고 동결하여 -80℃에서 임시 보관하였다. 분리된 CD14+ 단핵구를 DC 배지 (IL-4 및 GM-CSF가 보충된 CellGro)에 다시 부유시켰다. 세포를 5% CO2와 함께 37 ℃에서 5일간 배양하고 수확하여 48웰 플레이트에 시딩하였다. iDC에 단백질을 4시간 동안 로드하고 사이토카인 칵테일 (TNF-α, IL-1β + IL-4 및 GM-CSF)로 하룻밤 동안 성숙시켰다. 이후 PBS와 T 세포 배지로 4회 세척했다. 세포를 1:10 비율(음의 자기 분리)로 자가 CFSE 염색된 CD4+ T 세포와 공동 배양하고 7일간 배양하였다. CFSE 희석은 유세포 분석법으로 검출하였다.
유세포 분석을 통한 CD4+ T 세포 증식 평가에 사용되는 항체와 생존력 염료의 혼합물 (CFSE(FITC)로 염색된 T 세포):
실시예 2: 리툭시맙(RTX) 기반 항-CD20 면역 사이토카인
면역 사이토카인은 리툭시맙을 기반으로 하였다 (VH: 서열번호 96, VL: 서열번호 99). 표 11에 나열된 면역 사이토카인은 제공된 분석을 위해 생성 및 테스트하였다.
표 11 RTX 기반 면역 사이토카인의 효능
RTX-RLI 면역사이토카인은 RLI2와 비교하여 감소된 투여량에서 생체 내 증가 효능을 나타냈으며, 다양한 RTX-RLI 면역사이토카인은 RLI2 또는 RLI2AQ를 포함하든, x2 또는 x1이든, 링커 유무에 관계없이 서로 비슷하게 나타났다.
실시예 3: 동종이합체 RLI2 면역 사이토카인의 생산량 감소
면역 사이토카인을 CHO 세포에서 일시적으로 발현시킨 후 단백질 A를 사용한 표준 항체 정제 프로토콜을 사용하여 정제하였다. 간단히 말하자면, Fc의 존재로 인해 면역 사이토카인 생성물을 포획하기 위해 Mab select sure(GE)를 사용하였다. 결합/용출 모드에서 누비아 HR-S(CEX)를 사용하여 올리고머화된 면역 사이토카인 물질과 부분적으로 결합되지 않은 항체 RTX 또는 PEM, 내독소 및 DNA 오염 물질을 분리하였다. 잔류 올리고머화된 ICK 비결합 항체를 제거하기 위해 전처리 겔 여과 (Superdex 200)를 사용하였다. 면역 사이토카인은 Vivaspin 30 kDa를 사용하여 2mg/ml로 농축하였다.
RTX 면역 사이토카인 (RTX-ICK)의 업스트림 생산 결과, 25-kDa 및 50-kDa 단백질을 나타내는 상청액, 네이키드 RTX 또는 RTX-RLI x2(RTX KiH-RLI x1), 올리고머화된 RTX-RLI에 오염물질이 존재했으며, KiH 기술을 사용하여 2개의 RLI2 분자를 갖는 동종이합체와 1개의 RLI2 분자를 갖는 이합체 구조 사이의 생산 차이가 나타났다. 일반적으로 이종이합체 항체 형태는 중쇄가 잘못 결합되어 발현이 낮을 것으로 예상되지만, 놀랍게도 이종이합체 면역 사이토카인의 경우 KiH 기술을 사용한 이종이합체 구조가 각각의 동일체 구조에 비해 발현이 더 높은 것으로 관찰되었다. 따라서 최적화되지 않은 생산 수율은 RTX-RLI2 x1(220-300 mg/l)의 경우 RTX-RLI2 x2(70-100 mg/l)에 비해 약 3배, PEM-RLI2 x1(90-120 mg/l)의 경우 PEM-RLI2 x2(10-20 mg/l)에 비해 약 6배 더 높았지만, 이러한 최적화되지 않은 발현에서 IgG4 PEM 구조는 일반적으로 IgG1 RTX 구조에 비해 발현이 더 좋지 않았다. 본 출원인은 어떤 이론에 얽매이지 않고, 올바르게 접힌 호모다이머 면역 사이토카인의 발현이 현저히 감소하는 것은 접힐 항체의 각 중쇄에 연결된 두 개의 RLI 분자가 적절한 항체 접힘과 간섭을 일으키기 때문이라고 추측하는데, 이는 RLI 분자가 서로 상호작용하는 경향이 있어 적절한 호모다이머를 형성하는 중쇄 C 말단의 자유도를 제한하기 때문이다.
KiH 돌연변이와 L235E 돌연변이는 모두 PEM-RLI2 구조체의 생산 수율에 큰 영향을 미치지 않았지만, YTE 돌연변이는 단독으로 또는 L235E와 결합하여 발현 수준을 2배나 감소시켰다.
실시예 4: 시험관 내 효능 감소를 위한 IL-15 뮤테인
IL-2Rβ 및/또는 γ수용체에 대한 RLI 접합체의 결합을 감소시켜 시험관 내 효능을 감소시키고, RLI2 함유 제품의 이질성을 감소시키기 위해 RLI2 접합체(접합체)의 IL-15 부분에 돌연변이를 도입하였다. 표시된 아미노산 치환은 성숙한 인간 IL-15 서열에서 이루어졌다 (표 12 참조).
표 12: IL-15의 아미노산 치환 및 RLI2의 각 위치
표 13: kit225 세포에서 IL-15 변이체 (펨브롤리주맙 유래 항체와 융합된)를 가진 RLI2 뮤틴의 효능
IL-2Rβ 및/또는 γ에 대한 결합에 영향을 미치는 IL-15 치환을 테스트한 결과, kit225 세포에서 RLI 분자의 효능이 현저하게 감소하였다. 단일 돌연변이 N65A는 NQD 삼중 돌연변이와 유사한 효능 감소를 초래하였다 (표 13 참조). 다른 치환은 효능에 약간의 영향만 미쳤다.
표 14: kit225 세포에 대한 RLI-15 뮤틴(항체와 융합되지 않은 상태)의 효능
또한 항체와 결합하지 않은 상태에서 테스트한 RLI-15 뮤틴의 경우, NA 돌연변이는 kit225 세포에서 EC50으로 측정한 결과 약 2배의 활성 감소를 유발하였다.
실시예 5: 동종이합체 및 이종이합체 CD20 표적 면역 사이토카인의 비교
항-CD20 항체 리툭시맙에 기반한 면역 사이토카인은 RLI2 wt 접합체를 항체 중쇄의 C-말단("x2")에 융합하거나 하나의 RLI2 뮤테인과 하나의 중쇄의 C-말단("x1")을 융합하여 리툭시맙의 KiH 변형을 사용함으로써 생성하였다. 리툭시맙("RTX") 기반 면역 사이토카인은 kit225 세포에서 시험관 내 효능을 평가하였다 (실시예 1 및 표 15 참조).
표 15: kit225 세포에 대한 동종이합체 또는 이종이합체 RTX-RLI2 면역 사이토카인의 효능
두 개의 RLI2 접합체가 C-말단을 융합한 동이합체 RTX-RLI 2x 면역 사이토카인은 효능이 약간 감소한 반면, 하나의 RLI2 접합체만을 가진 이합체 면역 사이토카인은 kit225 세포에서 약 10배의 효능 감소를 보였다.
시험관 내에서 7일간 자극한 후 hNK 세포 CD8+ T 세포의 활성화(Ki67+ 세포)에서도 유사한 활성이 관찰되었다.
표 16: 인간 PBMC에서 선별된 면역 세포 집단의 EC50(pM)
kit225에 대한 면역 사이토카인의 효능은 활성화된 인간 NK 세포, CD8+ T 세포 및 CD8+ 기억 T 세포에 대한 면역 사이토카인의 효능과 상관관계가 있다. RTX-RLI2 x1만 약 3배 감소하였다.
실시예 6: 리툭시맙에 기반한 항-CD20 면역 사이토카인의 PD 활동
건강한 Balb/c 마우스 (마우스 2마리/그룹)에 1일차에 정맥 주사 (IV)로 RTX-ICK의 등가 용량을 투여한 후 비장의 면역 세포에 대한 면역 사이토카인의 PD 활성을 테스트하였다. RLI2를 4일 연속 (1일~4일차)으로 매일 20 μg/mouse(마우스)씩 SC에 주사하였다. 면역 세포군의 활성화는 5일째에 유세포 분석법으로 확인하였다. PD 연구 (마우스)에는 다음 항체 (표 17)가 사용되었다.
표 17: 유세포 분석용 항체 패널
생체 내에서 RTX-RLI2 x2, RTX-RLI AQ x2, RTX-L40-RLI2 x2 간의 PD 활성에는 차이가 없었다 (도 15). RTX-RLI2 x1의 PD 활성은 RLI2 분자/항체가 하나뿐이기 때문에 동일량에서 더 낮았지만, 두 개의 RTX-RLI x2 분자에 비해 상대적인 면역 세포 수는 약 20~30% 정도 적었다.
실시예 7: 생체 내 렌카 마우스 전이 모델에서 리툭시맙 기반 항-CD20 면역 사이토카인의 항전이 활동
Balb/c 마우스의 렌카 신세포암종 전이 모델에서 항-CD20 면역 사이토카인의 등가 용량에 따른 항전이 활성을 평가하였다. 3 ug/dose ICK를 D1에 정맥 주사하고, 16일째에 폐를 적출하여 폐의 습윤 중량을 측정하였다.
생체 내에서 RTX-RLI2AQ x2, RTX-RLI2AQ x2, RTX-L40-RLI2AQ x2 및 RTX-RLI2AQ x1 간에 RLI2AQ 모이어티의 항전이 활성에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다 (도 16). 3 ug 용량을 1회 주사한 결과 대조군에 비해 전이가 30 내지 40% 감소하였다.
실시예 8: A20-hCD20/Balb/c 마우스에서 항-CD20 RTX-RLI2 AQ 면역 사이토카인의 항종양 효능
A20-hCD20 종양 세포주 (미국 크라운바이오사이언스)를 이식한 Balb/c 마우스 (미국 크라운바이오사이언스)에서 RTX-RLI2AQ x2 면역 사이토카인의 항종양 효능을 테스트하였다. 마우스는 1일차에 그룹 간 및 그룹 내에서 최소한의 변이를 달성하기 위해 StudyDirector 동물 관리 소프트웨어 패키지(v3.0, StudyLog Systems, 미국)에서 제공하는 일치 분포 함수를 사용하여 종양 부피에 따라 무작위로 치료 내 그룹으로 분류하였다. 1일째와 8일째에 RTX-RLI2AQ x2를 0.15 mg/kg으로 투여하고, 1일째부터 4일째까지 연속 4일간 RLI2를 1 mg/kg으로 투여하였다. 종양 부피는 연구 기간 동안 매주 2회 측정하였으며, 캘리퍼를 사용하여 2차원으로 측정하고 "V = (L x W x W)/2" 공식을 사용하여 부피를 mm3로 표현하였다. 여기서 V는 종양 부피, L은 종양 길이(가장 긴 종양 치수), W는 종양 너비(L에 수직인 가장 긴 종양 치수)
RTX-RLI2AQ x2를 2회 정맥 주사한 결과, 대조군과 비교했을 때 A20-hCD20/balbc 마우스 종양 모델에서 유의미한 항종양 효능이 나타났다. RTX-RLI 면역 사이토카인에 비해 거의 10배 더 높은 용량으로 4회 투여했을 때(또는 면역 사이토카인의 분자량이 더 크기 때문에 등가 용량과 비교했을 때 더 높은 용량으로 투여했을 때) RLI2의 효능이 유사하게 나타났다 (도 17).
실시예 9: 리툭시맙 단독 투여와 비교한 리툭시맙 기반 항-CD20 면역관문억제제의 ADCC 활성도
다우디 세포주를 NK92-CD16 세포의 유무에 관계없이 표시된 농도의 RTX 및 RTX-RLI2 분자와 함께 배양하였다. 다우디 세포 사멸은 DAPI 양성 세포의 백분율로 평가하고 유세포 분석법으로 검출하였다.
웰당 4x104개의 다우디 종양 세포 (CD20을 발현하는 B세포 림프종)를 96웰 플레이트에 시딩하였다. NK92-CD16 세포를 1:5 비율로 RTX-RLI2AQ 분자의 연속 희석 (농도 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 및 100 nM)과 함께 첨가하였다. 세포를 5% 이산화탄소를 가습한 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 NK 세포와 종양 세포 구분을 위한 CD56-Alexa Fluor700, CD19-PE 항체와 죽은 종양 세포(CD19+DAPI+ 세포)를 식별하기 위한 DAPI로 염색하고 유세포 분석법으로 분석하였다.
RTX-RLI2AQ 분자의 ADCC 활성은 리툭시맙 대조군보다 약간 낮았다. 그러나 리툭시맙의 ADCC 활성만으로는 세포의 60%만이 사멸한 반면, RTX-RLI AQ와 RTX-RLI 1x는 각각 70%, 80%의 세포가 사멸하였다 (도 18).
실시예 10: PD-1 표적 면역관문억제제에서 IL-15 N65A 돌연변이는 kit225 세포에서 효능이 감소한 것으로 나타났다
항 PD-1 항체 펨브롤리주맙을 기반으로 한 면역 사이토카인은 다양한 형태로 생성되었다. 펨브롤리주맙은 항체의 Fc 부분에 안정화 S228P 돌연변이가 있는 인간화 IgG4-k 항체이다. 면역 사이토카인에 사용하기 위한 구조를 개선하기 위해 펨브롤리주맙("PEM")의 변형을 테스트하였다. IgG4 항체군은 상대적으로 ADCC 활성이 낮은 것으로 알려져 있지만, ADCC를 더욱 감소시키기 위해 L235E 돌연변이(Alegre, Collins 외. 1992)("LE")가 도입되었다 (서열번호 43). 면역원성/항약물 항체의 잠재력을 제한하기 위해 더 복잡한 ADCC 비활성화 돌연변이는 피했다. 하나 또는 두 개의 RLI2 분자가 PEM 항체의 C-말단에 유전적으로 융합되었다. 동종이합체 PEM 변이체("x2")의 경우 각 중쇄에 하나의 RLI2 분자가 융합된 반면, 이종이합체 PEM 변이체("x1")는 노브인홀 (KiH) 기술을 사용(Elliott, Ultsch et al. 2014)하여 만들어졌다, 하나의 RLI2 분자가 T336W 치환을 갖는 손잡이 중쇄 (서열번호 41)에 융합된 반면, 구멍 중쇄 (RLI2 융합이 없는)(서열번호 42)는 T366S/L368A/Y407V 치환으로 구성(포함)되었다. RLI2가 중쇄에 융합된 경우, 제품의 이질성을 줄이기 위해 말단 라이신(K)이 삭제("dK")되었다. 또한, 항체의 중쇄에 융합하기 위해 다른 RLI2 뮤틴을 사용하였다. 모든 RLI2 분자는 제품의 이질성을 줄이기 위해 AQ(G78A/N79Q)로 치환되었고, IL-2/IL-15Rβγ에 대한 RLI2의 결합을 감소시키는 다음과 같은 치환이 PEM-RLI 면역 사이토카인에서 평가하였다: DA, NA, ND, AD(K10A Q101D) 및 NQD. 생성된 PEM-RLI 면역 사이토카인은 표 18 왼쪽 열에 나타내었다.
제공된 IL-15 치환체를 사용한 여러 동이합체 또는 이합체 PEM-RLI2AQ 면역 사이토카인의 효능을 비교하기 위해 kit225 세포 (표 18)에서 시험관 내 EC50을 측정하고 RLI2를 표준으로 사용했으며 상대적 효능을 100%로 설정하였다. 이 실험의 목적은 kit225 세포에서 가장 효능이 낮은 RLI2의 뮤틴을 확인하는 것이었습니다. 표시된 결과는 2 내지 5개 실험의 평균이다.
표 18: kit225에 대한 PEM-RLI2 돌연변이의 효능
RLI: RLI2AQ; ND...미검출(분석 감도 제한)
PEM-RLI-NA x1 내의 RLI2AQNA는 단일 돌연변이로 IL-2/IL-15Rβγ를 낮추는 가장 강력한 RLI 뮤테인으로 확인되었지만, 아미노산 치환이 3개인 NQD 돌연변이보다 여전히 약 10배 더 활성이어서 상대적으로 면역원성 위험이 높다.
이종이합체 PEM-RLI 면역 사이토카인을 환원 및 비환원 조건에서 모세관 전기영동으로 분석하였다 (도 1). 모든 면역 사이토카인은 항체 중쇄, 중쇄 + RLI(HC-RLI) 및 경쇄가 명확하게 분리되어 고순도를 보였다. HC-RLI 밴드 바로 위의 희미한 밴드는 중쇄의 글리코실화된 RLI를 나타낸다다. 놀랍게도 NA 돌연변이의 경우 글리코실화가 감소한 것으로 나타났다.
실시예 11: Fc 변이체(LE, YTE 또는 LE-YTE)가 있는 PEM-RLI x1 또는 PEM-RLI NA x1 분자는 시험관 내 kit225 세포에서 효능에 차이가 없는 것으로 나타났다
ADCC를 감소시키거나 (LE 치환), FcRn 결합 증가를 통해 생체 내 반감기를 증가시키거나 (YTE 치환), 이 두 가지를 결합 (LE-YTE)하도록 설계된 Fc 변이체를 가진 여러 이종이합체 PEM-RLI x1 및 PEM-RLI NA x1의 효능을 kit225 세포 (표 19)를 사용하여 EC50을 측정하여 시험관 내에서 비교하였으며, RLI2를 표준으로 사용하고 상대 효능은 100%로 설정하였다. 데이터는 두 실험의 평균을 나타낸다.
표 19: 항체의 Fc 부분이 변경된 PEM-RLI NA 분자의 효능
RLI: RLI2 AQ ;
RLI 접합체 (PEM-LE, YTE 또는 LE/YTE -RLI x1)에 IL-15 불활성화 NA 돌연변이가 없는 RLI2AQ와의 이종이량체 융합에서 PEM의 Fc 변이체는 kit225의 PEM-RLI x1과 유사한 효능을 입증하였다. 마찬가지로, RLI 접합체에 비활성화 IL-15 NA 돌연변이가 있는 모든 비교 대상 구조는 테스트된 Fc 변종에 관계없이 kit225 세포에서 유사한(감소된) 효능을 나타내었다. 따라서 항체 Fc 영역에서 테스트된 돌연변이는 PEM-RLI 구조체의 효능에 영향을 미치지 않았다.
실시예 12: 시험관 내에서 kit225에 대한 효능의 PEM LE-RLI NA x1, PEM LE/YTE-RLI NA x1 및 PEM-RLI NQD x1 분자의 평가
kit225 세포를 사용하여 두 배치에서 선택된 PEM-RLI 면역 사이토카인 구성을 체외에서 RLI2와 비교하여 효능을 비교하였다. 분자의 효능은 EC50으로 평가하고 RLI2 분자와 관련된 상대적 효능으로 계산하였다. 데이터는 하나의 실험을 나타낸다. 표 20에 나타낸 바와 같이, kit225 세포에 대한 EC50을 측정함으로써 측정된 시험된 면역사이토카인의 효능과 관련하여 높은 배치 간 일관성이 관찰되었다.
표 20: PEM-RLI 구성의 상대적 효능
실시예 13: 시험관 내에서 kit225 및 hPBMC에 대한 PEM LE-RLI NAx1, PEM LE/YTE-RLI NAx1 및 PEM-RLI NQD x1 분자의 역가 비교
LE/YTE Fc 변형 유무에 관계없이 하나 또는 두 개의 RLI2 분자를 갖는 선별된 PEM-RLI 면역 사이토카인 구조체 (PEM-RLI). 6명의 건강한 기증자로부터 채취한 인간 PBMC를 7일 동안 시험관 내에서 자극하기 위해 다양한 농도의 PEM-RLI 면역 사이토카인을 사용하였다. 인간 NK 및 CD8+ T 세포에 대한 효능을 kit225 세포에 대한 효능과 비교하였다 (표 21 참조).
놀랍게도 N65A IL-15 돌연변이체("NA")의 경우, 인간 NK 또는 CD8+ T 세포 또는 시험관 내 kit225의 활성화와 관련하여 하나 또는 두 개의 RLI2 분자를 운반하는 분자의 효능에 차이가 관찰되지 않았다 (x1 및 x2 면역 사이토카인 비교). 다른 실험에서 알려진 바와 같이, 항체의 Fc 부분의 LE/YTE는 융합된 RLI 분자의 효능에 영향을 미치지 않았다. IL-15 NQD 뮤틴을 포함하는 면역 사이토카인은 약 10배의 효능을 더 감소시켰다. 인간 PBMC 효능 데이터는 6명의 기증자 평균이다. Kit225 데이터는 2~3개 실험의 평균이다.
표 21: kit225 및 hPBMC에 대한 PEM-RLI의 상대적 효능
실시예 14: 시험관 내 kit225 세포에서 HC 또는 LC에 부착된 저효능 PEM-RLI 돌연변이의 평가
돌연변이된 Fc 항체 부분(LE-YTE)이 있거나없는 PEM-RLI 면역 사이토카인의 여러 저효능 IL-15 뮤틴을 기준이 되는 PEM LE/YTE-RLI2 NA x1과 비교하여 그 효능을 비교하였다. "Lc" 면역 사이토카인의 경우, RLI 접합체가 항체의 경쇄의 C-말단에 융합된 반면, 다른 모든 구조는 RLI 접합체가 양쪽 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되어 있다. 시험관 내 효능 테스트는 변경된 프로토콜(장기간의 세포 배양)을 적용한 kit225 세포주를 사용하여 수행하였다. 분자의 효능은 EC50으로 평가되었으며, PEM LE/YTE-RLI NA x1 분자와 관련된 상대적 효능으로도 계산되었다. 표 22의 데이터는 2~4개 실험의 평균을 나타낸다.
표 22: kit225에 대한 PEM-RLI2AQ 분자의 효능
치환체 QDQA(Q101D/Q108A), NQD(D30N/E64Q/N65D), DANA(D61A/N65A) 및 DANAQD(D61A/N65A/Q101D)의 조합은 PEM-RLI 면역 사이토카인 구조의 효능을 더욱 감소시켜 DANAQD 구조에서는 측정할 수 없을 때까지 효능을 감소시켰습니다. 항체의 경쇄에 융합된 RLI 접합체를 가진 면역 사이토카인은 항체의 중쇄에 동일한 IL-15 돌연변이가 있는 하나의 RLI 접합체만 있는 구조와 비교했을 때 유사한 효능을 보였다.
실시예 15: Fc 부분의 돌연변이 유무에 따른 저효능 돌연변이 비교
본 실험의 목적은 돌연변이된 Fc 항체 부분(LE-YTE)이 있든 없든 PEM-RLI NA x1보다 효능이 낮은 여러 뮤틴의 효능을 평가하고 비교하는 것이었다. 이 분자들은 펨브롤리주맙 (IgG4)과 RLI-15(PEM-RLI-15)의 융합 단백질이다. RLI2가 표준으로 사용되었다. 시험관 내 효능 테스트는 kit225 세포주를 사용하여 수행하였다. 분자의 효능은 EC50으로 평가되었으며, 네이키드 RLI-15 분자와 관련된 상대적인 효능으로도 계산되었다. 데이터는 kit225를 3.5일 또는 7일 동안 증식시킨 후 여러 실험의 평균을 나타낸다.
표 23: kit225(WP9)에 대한 PEM-RLI 면역 사이토카인의 효능 (최종 후보 분자 3개)
실시예 16: 펨브롤리주맙의 기능은 RLI2 또는 RLI2 뮤틴의 융합이나 항체의 Fc 변형에 영향을 받지 않는다
펨브롤리주맙의 항 PD-1 항체 유도체의 기능성은 사용 지침에 따라 생물발광 세포 기반 분석법 "PD-1/PD-L1 차단 바이오어세이"(J1250, Promega)를 사용하여 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단을 측정하여 결정하였다. PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하는 활성에 대한 효능을 평가하기 위해 표시된 PEM RLI 면역 사이토카인을 테스트하였다 (표 24 참조). 테스트한 면역 사이토카인 간에 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 따라서 면역 사이토카인의 PEM 부분의 기능(PD-1 차단)은 부착된 RLI2 분자의 수, RLI2 접합체의 돌연변이 또는 항체의 Fc 부분의 돌연변이와 무관하게 보존되었다.
표 24: PD-1/PD-L1 차단 생물학적 분석에서 PEM-RLI 분자의 효능(Promega).
실시예 17: 마우스 종양 모델에서 항종양 효능을 보이는 PEM-RLI NA x1 면역 사이토카인
암컷 인간 PD-1 단일 KI HuGEMM 마우스(그룹당 n=8마리)의 HuCell MC38-hPD-L1 종양 치료에서 PEM-RLI NA x1 면역 사이토카인의 생체 내 치료 효능을 단독 요법으로서 펨브롤리주맙과 비교하였다. 치료는 무작위 배정 0일째에 평균 종양 크기가 108mm3에 도달했을 때 시작하였다. 0일째에 PEM-RLI NA x1을 20 mg/kg으로 정맥 주사 (IV) 투여하고 펨브롤리주맙을 0,3,6,9일째에 5 mg/kg으로 복강 주사 (IP) 투여하였다.
이 모델에서 PEM-RLI NA x1은 대조군인 무치료 그룹에 비해 종양 부피를 크게 감소시켰으며 (p-값은 <0.05), 펨브롤리주맙 치료 그룹과 유사하게 종양 부피를 감소시켰다 (도 7 참조). 면역 사이토카인의 경우 펨브롤리주맙과 뚜렷한 차이가 나타나지 않았지만, 면역 사이토카인을 한 번 주사하면 펨브롤리주맙을 네 번 투여한 것과 유사한 결과를 얻을 수 있다는 점에 주목해야한다. 또한, 마우스는 RLI에 대한 민감도가 약 10배 정도 낮은 것으로 알려져 있기 때문에 이 마우스 모델에서는 PEM-RLI NA x1의 전체 기능을 테스트할 수 없으며, 이에 따라 사람에서의 치료 효과는 더 좋을 것으로 예상된다.
실시예 18: 펨브롤리주맙 및 RLI-15 단독 요법에 비해 혼합 림프구 반응에서 PEM LE/YTE-RLI NA x1 분자가 IFN-γ 생성을 향상시킨다.
T세포 활성화 및 IFNγ 생성을 향상시키는 PEM-RLI 구조의 잠재력을 평가하기 위해 혼합 림프구 반응(MLR)을 사용하였다. MLR은 같은 종의 유전적으로 다른 두 개체의 백혈구를 배양하여 세포 아세포 변형, DNA 합성 및 증식을 유도하는 시험관 내 분석법이다. MLR의 생성은 세포 집단의 표면에서 발현되고 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 의해 코딩되는 동종 결정인자의 비호환성의 결과로 발생한다.
시험관 내 MLR 분석에서 PEM RLI-NA x2, PEM RLI-NQD x1, PEM LE/YTE-RLI NA x1 및 PEM YTE-RLI x1 분자에 대해 IFNγ 생성을 통한 T세포 활성화가 평가되었다. PEM-RLI 구조를 RLI2 및 펨브롤리주맙과 비교하였다. 해당 대조군으로 훨씬 더 적합할 수 있는 항체에 융합되지 않은 각각의 RLI-15 뮤틴은 연구 당시에는 구할 수 없었다.
불일치 인간 PBMC 기증자 쌍을 동량의 펨브롤리주맙과 비교하여 PEM LE/YTE-RLI NA x1(1000 nM)으로 배양하고 조정된 RLI2 농도를 300배 낮추어 RLI2 NA 뮤테인의 효능과 같도록 했을때 IFNγ 생산이 증가하였다. 데이터는 펨브롤리주맙에 대한 6개의 기증자 쌍과 PEM LE/YTE-RLI NA x1 및 RLI2에 대한 3개의 기증자 쌍의 평균 ± SE를 나타낸다 (도 8 참조).
실시예 19: PEM LE/YTE-RLI NA x1 분자는 높은 PD 활성과 상관관계가 있는 PEM-RLI wt x1 분자에 비해 연장된 생체내 반감기를 나타낸다.
1일째와 15일째에 각각 10 또는 30 ug/kg(PEM-RLI x1), 30 또는 90 ug/kg(PEM LE/YTE-RLI NA x1)을 투여한 후 시노몰구스 원숭이(n=2)를 대상으로 PEM-RLI x1 및 PEM LE/YTE-RLI NA x1 약동학을 테스트하였다. 혈청 분리를 위한 혈액은 1시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 60시간, 72시간, 96시간, 120시간 및 168시간에 채취하였다. 혈청 내 PEM-RLI x1 및 PEM LE/YTE-RLI NA x1의 농도는 ELISA로 측정하였다. 선택된 면역 세포 집단 (NK 및 CD8+ T 세포 증식-Ki67+, 림프구 수)의 유세포 분석 평가를 위해 투여 전, 5일, 8일, 12일, 15일, 19일, 22일, 26일에 혈액을 채취하였다.
IL-2/15Rβγ에 대한 RLI-15 친화성이 감소된 PEM LE/YTE-RLI NA x1 분자는 시노몰구스 원숭이 정맥 주사 (IV) 투여 후 PEM-RLI x1에 비해 반감기가 유의하게 연장된 것으로 나타났다 (도 9A). IL-2Rβγ에 대한 친화력이 현저히 감소된 RLI 뮤틴이 있는 PEM LE/YTE-RLI NA x1 분자는 림프구 수 증가 (도 9B)와 Ki67 양성 (도 9.)에 의해 결정되는 NK (도 9C) 및 CD8+ T 세포 (도 9D) 증식의 증가로 나타난 바와 같이 PEM 항체와의 융합에서 높은 PD 활성을 유지한다.
실시예 20: PEM-RLI NA x2 분자는 PEM-RLI NA x1 분자 (PK 및 PD 프로파일)보다 이점이 없는 것으로 나타났다
항체에 부착된 하나의 RLI2 분자에 비해 두 개의 RLI2 분자의 이점을 평가하기 위해 1일째에 30 ug/kg을 투여한 후 시노몰구스 원숭이(n=2)를 대상으로 PEM-RLI NA x1 및 PEM-RLI NAx2 약동학을 테스트하였다. 혈청 분리를 위한 혈액은 1시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 채취하였다. 혈청 내 PEM-RLI NA x1 및 PEM-RLI NA x2의 농도는 ELISA로 측정하였다. 선택된 면역 세포 집단 (NK 및 CD8+ T 세포 증식-Ki67+, 림프구 수)의 유세포 분석 평가를 위한 혈액을 투여 전, 투여 5일, 8일, 12일, 15일, 19일, 22일, 26일에 수집하였다.
시노몰구스 원숭이 정맥 투여 후 혈청 농도 (도 10A)로 측정한 약동학 또는 림프구 수 (폴드 변경, 도 10B), % Ki67+ NK 세포 (도 10C) 및 % Ki67+ CD8+ T 세포 (도 10D)로 측정한 약동학적인 측면에서 항체에 부착된 IL-2/15Rβγ에 대한 친화력이 감소된 두 개의 RLI2 분자를 가진 PEM-RLI 면역 사이토카인은 한 분자의 RLI2에 비해 이득이 없었다.
실시예 21: LE 돌연변이가 있는 PEM-RLI NA x1 분자는 LE/YTE 돌연변이가 있는 분자보다 더 긴 반감기를 나타낸다
1일차에 600 ug/kg 정맥 주사 (IV) 투여 후 시노몰구스 원숭이(n=3)를 대상으로 PEM LE/YTE-RLI NA x1 및 PEM LE-RLI NAx1 약동학을 평가하였다. 혈청 분리를 위한 혈액은 1시간, 8시간, 24시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 96시간 및 120시간에 채취하였다. 혈청 내 PEM LE/YTE-RLI NA x1 및 PEM LE-RLI NAx1의 농도는 ELISA로 측정하였다. YTE 돌연변이는 FcRn 결합을 증가시켜 혈장 반감기를 증가시키는 것으로 보고되었지만, RLI NA 뮤틴이 하나 있는 면역 사이토카인 형태에서는 LE 돌연변이만 있는 구조에 비해 놀랍게도 반감기가 감소하였다 (도 11).
실시예 22: 저효능 돌연변이 PEM-RLI NQD x1은 PEM-RLI NAx1 분자보다 긴 반감기를 표시한다
1일차에 600 ug/kg 정맥 주사 (IV) 투여 후 시노몰구스 원숭이(n=3)를 대상으로 PEM LE-RLI NA x1 및 PEM-RLI NQD x1(D30N/E64Q/N65D용 NQD) 약동력학을 평가하였다. 혈청 분리를 위한 혈액은 1시간, 8시간, 24시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 96시간, 120시간 및 144시간에 채취하였다. 혈청 내 PEM L-RLI NA x1 및 PEM-RLI NQD x1의 농도는 ELISA로 측정하였다. NA 돌연변이에 비해 효능이 더 감소한 삼중 돌연변이 NQD를 가진 PEM-RLI 구조 (표 13 참조)는 N65A 치환을 가진 PEM-RLI 구조에 비해 생체 내 반감기가 더 증가한 것으로 나타났다 (도 12).
실시예 23: 이펙터 기능이 수정된 항-Claudin18.2 hCl1a 항체를 기반으로 한 면역 사이토카인의 ADCC 활성.
세포주:
클라우딘 18.2를 과발현하는 인간 세포주 PA-TU-8988S(크리에이티브 바이오어레이, 카탈로그 번호 CSC-C0326) 및 A549(ATCC CCL-185)(A549-Cldn18. 2)를 10% 태아 소 혈청, 2mM 글루타민 (글루타맥스, 깁코), 100mg/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신 (인비트로젠) 및 2ug/ml 푸로마이신 (깁코)이 보충된 DMEM 배지 (깁코)에서 배양하였다.
A549 세포를 전기천공법으로 전위효소 발현 구조체(pcDNA3.1-hy-mPB), 전위 가능한 전장 huCLDN18.2(pPB-Puro-huCLDN18.2), 푸로마이신 내성 카세트 및 EGFP를 운반하는 구조체(pEGFP-N3)와 함께 전사 대조군으로 공동 감염시켰다 (Waldmeier, Hellmann et al. 2016). 전기천공 후, 5% CO2 대기의 습도 조절 인큐베이터에서 37℃의 성장 배지에서 세포를 이틀 동안 회복하도록 하였다. EGFP 발현에 대한 FC 분석을 통해 형질전환을 확인했습니다. 그런 다음 푸로마이신을 1 ug/ml로 배양액에 첨가하여 CLDN18.2를 발현하는 세포를 선별하고, 10% DMSO가 포함된 FCS에서 동결 스톡을 생성할 수 있도록 배양액을 더 증식시켰다. 감염된 세포에서 CLDN18.2의 발현을 FC로 분석하였다.
보다 균질한 PA-TU-8988S 세포 집단을 얻기 위해 세포를 FACS로 분류하여 CLDN18.2 발현이 더 높은 세포만 선택하였다. 간단히 말해, FACS 버퍼(PBS, 2% FCS)에 현탁된 PA-TU-8988S 세포를 졸베툭시맙(2ug/ml)과 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. FACS 버퍼로 세척한 후, 세포를 PE-표지된 Fcγ-특이적 IgG 염소 항-인간 이차 항체 (eBioscience)와 함께 얼음 위에서 30분간 배양하였다. 세척 후, 염색된 세포를 FACS 버퍼에 재부유시키고, FACSAriaTM 기기로 분석 및 분류하여 중간 발현 세포와 고 발현 세포를 분리하였다. 수집된 PA-TU-8988S-High 세포(PaTu)를 분류한 후 성장 배지에 재부유시키고, 팽창 및 동결한 시료를 액체 N2에 보존하였다. 인간 CD16 (NK92-hCD16, 이하 NK92라고 함)을 외인성 발현하는 인간 NK 세포주 NK92(ATCC CRL-2407)는 클레망소 외 2013 (Clemenceau, Vivien et al. 2013)에 기술된 대로 생성하였다. 세포는 10% AB 인간 혈청 (원 람다), 2mM 글루타민 (글루타맥스, 깁코) 및 5mg/ml IL-2 (페프로테크)가 보충된 RPMI 1640 배지(깁코)에서 배양되었다. 모든 세포는 5% CO2가 포함된 가습된 환경에서 37℃로 유지되었다.
세포 기반 ADCC 분석:
A549-Cldn18.2 또는 PaTu 세포를 96웰 플레이트에 적절한 농도(A549-Cldn18.2 - 20.000세포, PaTu - 30.000세포)로 시드하고 24시간 동안 배양하였다. NK92 세포 또는 분리된 인간 NK 세포를 원심분리하여 수집하고 세척한 후 ADCC 분석 배지 (2mM 글루타민과 10% 열 비활성화 (56℃에서 20분간) 풀보체 인간 혈청(Innovative Research)이 첨가된 RPMI 1640 (페놀 레드 없음)에 다시 현탁시켰다.) 부착된 세포(표적 세포 T)가 포함된 96웰 플레이트의 배지를 제거하고 ADCC 분석 배지(이펙터 세포 E)에 현탁된 NK92 세포를 A549-Cldn18.2의 경우 10, PA-TU-8988S 세포의 경우 5의 E:T 비율로 부착된 표적 세포에 추가하였다. 테스트할 항체 또는 면역 사이토카인 (ICK)은 0.001 내지 100nm 또는 0.0001 내지 10 ug/ml의 농도 범위로 첨가하였다. 인간 IgG1 동형 항체 (Ultra-LEAF™ 정제 인간 IgG1 동형 제어 재조합 항체, 바이오레전드, 제품 번호. 403502)를 비특이적 대조군으로 포함시켰습니다. 혼합물을 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 24시간 후, 제조업체의 지침에 따라 LDH 세포 독성 분석법 (Abcam, ab65393)을 사용하여 죽은 세포에서 방출되는 젖산 탈수소효소 효소의 활성으로 표현되는 세포 독성을 측정하였다: 10 ul의 상층액을 새로운 96웰 플레이트에 옮기고 LDH 기질과 혼합한 후 분광광도계를 사용하여 450nm의 OD에서 발현된 색 변화를 측정하였다. 세포 독성은 다음 공식에 따라 계산하였다: 세포독성 (%) = ((테스트 샘플 - 이펙터 세포 대조군 - 낮은 대조군)/(높은 대조군 - 낮은 대조군)) X 100; "테스트 샘플": 이펙터/표적 혼합; "이펙터 세포 대조군": NK92 세포만 있는 웰 1개(이펙터 세포에서 방출되는 LDH 활성 결정); "낮은 대조군": 표적 세포만 있는 웰 1개(처리되지 않은 표적 세포에서 LDH 활성의 자발적 방출 결정); "높은 제어": 용해 완충액으로 투과된 표적 세포가 있는 웰 1개(방출 가능한 최대 LDH 활성 결정).
도 13은 이펙터 기능이 변형된 hCl1a 항체를 기반으로 한 면역 사이토카인의 ADCC 활성을 보여준다. 테스트한 모든 면역 사이토카인은 이종이합체 Fc 도메인을 가지고 있으며, 하나의 RLI2AQ 접합체가 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되어 있다. ADCC를 감소시키는 이펙터 도메인의 돌연변이가 있는 면역 사이토카인을 테스트했을 때, hCl1a 항체만 있는 hCl1a-DANA 면역 사이토카인과 비교했을 때 NK92 세포가 있는 A549-CLDN18.2 세포 (상단 패널) 또는 PA-TU-8988S (하단 패널)에서 테스트했을 때 hCl1a LALAPG-RLI DANA는 거의 없어진 ADCC 활성을 보였다. hCl1a-LALA 항체도 hCl1a 항체와 비교했을 때 ADCC 활성이 감소하는 것으로 나타났지만, ADCC 활성이 완전히 없어지지는 않았다. 접합체의 첨가는 항체 단독의 ADCC 활성과 비교했을 때 ADCC 활성이 감소된 면역 사이토카인의 ADCC 활성에 영향을 미치지 않았다. 표 25에는 테스트한 각 면역 사이토카인 또는 항체에 대해 측정한 ADCC EC50 값이 요약되어 있다. EC50 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어에 내장된 "로그(작용제) 대 반응 - 가변 기울기 - 가변 기울기(네 가지 매개변수)" EC50 측정으로 결정되었다. ADCC를 강화하는 이펙터 도메인의 돌연변이가 있는 면역 사이토카인을 테스트했을때, 이러한 돌연변이가 없거나 항체만 있는 동일한 면역 사이토카인과 비교했을때, Fc 도메인에 DLE, DE, AAA, TE 또는 IE 돌연변이가 있는 hCl1a 항체를 기반으로 테스트한 모든 면역 사이토카인이 강화된 ADCC 활성을 나타냈다 (도 14).
아푸코실화는 또한 ADCC 활성을 향상시키기 위해 평가하였다. 도 14F는 A549-Cldn18.2 및 PA-TU-8988S 세포에서 아푸코실화된 면역 사이토카인 hCl1a-DANA afuc가 hCl1a-DANA와 비교했을때 ADCC 활성이 향상되었으며, 위에서 설명한 DE 및 DLE 돌연변이가 있는 면역 사이토카인과 비슷한 수준의 ADCC 활성을 나타내는 것을 보여준다. 하지만 아푸코실화를 이펙터 도메인 강화 돌연변이와 결합했을 때, 아푸코실화는 놀랍게도 DE 또는 DLE 돌연변이에 의해 유도된 ADCC 강화에 부정적인 영향을 나타내었다 (도 14B 및 A 참조). 그럼에도 불구하고, 아푸코실화가 AAA 돌연변이와 결합되었을 때 강화된 ADCC 활성은 유지되었다 (도 14C).
표 25: 검사된 면역 사이토카인 및 항체에 대한 ADCC EC50 값
실시예 24: 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 통한 ADCC 활성화 수용체 FcγRIIIa V158, FcγRIIIa F158 및 ADCC 억제 수용체 FcγRIIb에 대한 항체 Fc 결합의 평가
인간 FcγRIIIa 수용체 (hFcγRIIIa; CD16a)는 158번 위치에서 두 가지 다형성 변이체, 즉 hFcγRIIIaV158과 hFcγRIIIaF158로 존재한다. FcγRIIIa는 ADCC 활동을 활성화하는 반면, FcγRIIb는 ADCC를 억제한다. 면역 사이토카인의 수용체에 대한 친화도를 SPR로 측정할 때 면역 사이토카인의 ADCC 활성은 FcγRIIIa에 대한 EC50 결합 친화도와 FcγRIIb에 대한 EC50 결합 친화도의 비율로 표현할 수 있다.
SPR 실험은 Biacore 8K (미국 일리노이주 시카고, Cytiva)에서 수행되었으며, CM5 센서 칩(Cytiva)을 사용하여 고정화 및 His 태그 항체 (Genscript)를 사용하였다. 1×HBS-EP+ 유동 버퍼에서 10μl/min의 유속으로 30초의 접촉 시간으로 FcγRIIIa V158, FcγRIIIa F158 또는 FcγRIIb 단백질을 포획하는데 사용하였다. 결합/해리 시간은 300초/300초의 결합 시간/해리 시간으로 적절한 범위에서 농도 연속 희석하여 30μl/min의 유속으로 테스트된 각 면역 사이토카인에 대해 측정했으며, 아푸코실화 유무에 관계없이 120초/1200초의 결합/해리 시간이 적용된 DLE 및 DE 구조물을 제외하고는 결합/해리 속도를 측정하였다. 하기 표 26에는 SPR 측정 결과가 요약되어 있다.
표 26: SPR 데이터
A/I 비율 = (FcgRIIIa에 대한 친화도)/(FcgRIIb에 대한 친화도)는 친화도 = 1/Kd이다. 아푸코실화된 "AFUC"
A/I 비율을 통해 ADCC 활성화 수용체("A"; FcgRIII)에 대한 결합 강도를 ADCC 억제 수용체("B"; FcγRIIb)에 대한 결합 강도와 비교하여 평가할 수 있다. 비율이 높을수록 항체 또는 면역 사이토카인의 활성화 수용체에 대한 결합이 더 강하다는 것을 의미한다.
SPR 데이터는 전반적으로 ADCC를 강화하는 돌연변이가 있는 모든 면역 사이토카인이 TL 돌연변이의 일부인 ADCC를 강화하는 돌연변이가 없는 면역 사이토카인보다 더 높은 A/I 비율을 보인다는 것을 확인시켜준다. TL 돌연변이에 대한 상대적으로 낮은 A/I 비율은 이러한 돌연변이의 글리코실화가 증가했기 때문일 수 있다 (실시예 25 참조).
실시예 25: ADCC 활성이 강화된 hCl1a 기반 면역 사이토카인의 안정성/개발 가능성
CH2 도메인의 용융 온도, 서열 책임 및 글리코실화(N-글리칸) 프로파일을 평가하여 안정성과 개발 가능성을 평가하는 ADCC를 강화하는 DLE, DE, AAA, TL 또는 IE 돌연변이가 있거나 아푸코실화된 hCl1a 기반의 면역 사이토카인이다.
CH2 도메인의 용융 온도는 MicroCal PEAQ-DSC 자동화 시스템 (말번 파날리티컬)을 사용하여 시차 주사 열량계 (DSC)로 측정하였다. 간단히 말해, 면역 사이토카인 샘플을 보관 버퍼에서 1 mg/ml로 희석하였다. 가열은 20 ℃에서 100 ℃까지 1℃/min의 속도로 수행하였다. 그런 다음 단백질 용액을 현장에서 냉각하고 동일한 열 스캔을 실행하여 첫 번째 스캔에서 빼기 위한 기준선을 얻었다.
N-글리칸 분석을 위해 먼저 단백질을 DTT로 환원시킨 다음 유리 삽입 바이알이 있는 HPLC 컬럼으로 옮겨 주입하였다. 단백질은 역상 크로마토그래피로 분리한 후, UV 검출기와 결합된 Waters/XEVOG2XS-QTOF 온라인 LC-MS로 검출하였다. 검출된 글리칸 사슬의 분자량을 알려진 N-글리칸 유형과 일치시키고, N-글리칸 상대적 풍부도를 계산하여 검출된 피크의 강도로 표시하였다.
표 27에 설명된 대로 ADCC 강화 돌연변이가 있는 면역 사이토카인 구조체의 아미노산 서열을 분석하여 다음과 같은 추가 서열 책임이 있는지 (ADCC 강화 돌연변이가 없는 구조체에는 존재하지 않음) 분석하였다.
표 27: 알려진 서열 라이어빌리티 (liabilities).
TL 돌연변이는 N-글리코실화 서열 라이어빌리티 (IgG1 서열의 N390에 근접한 돌연변이 K392T)을 도입하였다. 다른 돌연변이에서는 서열 라이어빌리티가 나타나지 않았다 (표 28 참조).
표 28: 안정성 및 개발 가능성 요약.
점수 4: 매개변수가 mAb 기반 의약품에 대해 예상되는 범위 내에 있음;
점수 3: 개발 중 품질 속성에 대한 신중한 모니터링/평가가 필요함;
점수 2: 일정 및/또는 비용에 상당한 영향을 미칠 가능성이 있음;
점수 1: 적절히 통제할 수 없는 높은 위험도.
전반적으로 아푸코실화는 안정성 및 개발성에 영향을 미치지 않았으며, 따라서 면역 사이토카인의 ADCC 활성을 향상시키는데 사용될 수 있다. DLE 및 DE 돌연변이는 Tm1(CH2 도메인의 용융 온도)을 상당히 감소시켜 (표 29 참조) 잠재적으로 면역 사이토카인의 용액 내 안정성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났다. 하지만 이러한 돌연변이는 면역 사이토카인의 글리코실화에 영향을 미치지 않았다. TL 돌연변이에 의해 도입된 서열 책임으로 인해 원치 않는 시알릴화 및 고만노스 글리칸 종이 도입되었다 (표 30 참조). 이러한 종은 면역 사이토카인의 pK에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 마찬가지로, IE 돌연변이가 있는 면역 사이토카인은 만노스 종의 비율이 높아 잠재적으로 그 특성에 영향을 미칠 수 있다. AAA 돌연변이를 가진 면역 사이토카인은 만노스 종의 증가를 초래하였다 (표 30 참조). 그러나 아푸코실화된 면역 사이토카인의 생산은 부분적으로 글리코실화를 발달 가능성과 관련하여 허용 가능한 수준으로 되돌려 놓았다. 따라서 hCl1a에 기반한 면역 사이토카인의 강화가 필요한 경우, 선택적으로 아푸코실화와 결합된 AAA 돌연변이가 안정성과 개발 가능성에 가장 적은 영향을 미치는 권장 돌연변이가 될 수 있다. 아푸코실화는 평가된 특성에 영향을 미치지 않았다. DLE 및 DE 돌연변이는 Tm을 상당히 감소시켜 잠재적으로 분자를 불안정하게 만들었다. TL 돌연변이는 Fc에 추가적인 글리코실화 부위를 도입하였다. IE 돌연변이가 있는 컨스트럭트는 만노스 종의 비율이 높았다.
표 29: 용융 온도 (아푸코실화된 경우 "afuc").
표 30: N-글리칸 분석
실시예 26: 마우스 생체 내 효능 연구
본 연구의 목적은 마우스 모델에서 hCl1a-RLI 면역 사이토카인의 생체 내 치료 효능을 평가하는 것이다. 생후 5~7주령에 클라우딘18.2 (BXPC3-CLDN18.2)를 외인성 발현하는 췌장 인간 세포주 유래 이종이식 BXPC3 (ATCC CRL-1687™)를 암컷 NMRI 누드 마우스에 이식하였다. 종양은 일방적인 피하 주사를 통해 이식된다. 동물은 약 100 mm3의 종양 부피를 기준으로 무작위로 배정된다. 마우스를 각기 다른 그룹 (그룹당 n=7)에 배정하고 1일차에 표 31에 따라 치료하였다. 동물의 체중 감소와 종양 부피를 매주 2회 확인하였다. 종양 부피는 캘리퍼로 측정하며 공식을 사용하여 mm3로 표시하였다: "V = (L × W × W)/2, 여기서 V는 종양 부피, L은 종양 길이(가장 긴 종양 치수), W는 종양 너비(L에 수직인 가장 긴 종양 치수)이다. 마우스는 종양 부담이 2000 mm3에 도달하거나 체중이 현저히 감소 (전체적으로 30% 이상 또는 이틀 연속 20% 이상)하면 안락사하였다.
표 31: 마우스 치료 요법 ("afuc"는 아푸코실화된 것을 의미함)
실시예 27: 항-PD-1 항체와 SOT201은 CD8 + T 세포 활성화에 시너지 효과를 발휘한다
SOT201은 인간화 IgG 4 펨브롤리주맙에서 유래한 항체로, T366W-노브/T366S, L368A, Y407V-홀 치환, L235E 치환 및 중쇄의 말단 K를 삭제하고 노브 중쇄의 C-말단에서 RLI-15AQA에 융합한 이종이합체 면역 사이토카인이며, 서열번호 21, 서열번호 101, 서열번호 23을 참고하라. 실시예 1에 따른 PD-1/PD-L1 차단 분석에서 SOT201과 Keytruda®(펨브롤리주맙)를 비교하였다. 도 19A는 SOT201이 항 PD-1 항체 키트루다와 유사하게 PD-1/PD-L1 상호작용을 효과적으로 차단한다는 것을 보여준다. SOT201과 펨브롤리주맙에 대한 결정된 KD 값은 표 32에 나타내었다.
표 32: 4℃ 및 37℃에서 SOT201 및 펨브롤리주맙의 KD 값
11명의 건강한 기증자로부터 채취한 인간 PBMC를 시험관 내에서 7일간 RLI2AQ N65A (RLI-15AQA) 변이체를 가진 SOT201 또는 SOT201과 동일한 항체 중쇄 및 경쇄를 가지지만 IL-15 변이체의 IL-2/IL-15Rβγ (“SOT201 wt")에 대한 결합이 감소되지 않은 RLI2AQ 변이체를 가진 대조 분자와 함께 자극하였다. 세포 증식은 유세포 분석법으로 Ki-67+ NK 세포와 CD8+ T 세포를 측정하여 측정하였다. SOT201은 수용체 결합이 감소되지 않은 RLI-15 분자를 사용한 유사한 면역 사이토카인 분자 (SOT201 wt)에 비해 더 높은 EC50 농도에서 NK 및 CD8+ T 세포의 증식을 활성화하였다 (도 19B).
이합체화 (E356K, N399K/K409E, K439D)를 유사하게 치환한 항-뮤린 PD-1 항체 RMP1-14 (바이오엑스셀, 레바논, 뉴햄프셔, 미국)로 구성된 뮤린 대리체 SOT201 (mSOT201, 서열번호 102, 서열번호 103 및 서열번호 104 참조.), RLI-15AQA에 융합된 ADCC 사일런싱 (Silencing) (D265A) 및 안정화 (dK)를 단일 클론 항-뮤린 PD-1 항체 RMP1-14로 대표되는 단일 활성 대조군(mPD1) 및 C57BL/6 마우스에서 PD-1 차단 활성을 발휘하지 않는 항-인간 PD1 마우스 gG1-RLI-15AQA(DDD)를 mSOT201과 유사한 생체 내 반감기를 갖는 RLI-15AQA 대조군으로 비교하였다. 건강한 C57BL/6 마우스(n=2/그룹)에 mSOT201 5mg/kg의 등가량으로 화합물을 정맥 주사한 후 5일 후 유세포 분석법으로 비장에서 세포 증식(Ki67)을 측정하였다. 항-PD-1 항체와 뮤린 대리체 mSOT201의 RLI-15AQA 뮤틴 모이어티는 CD8+ T 세포 증식에 시너지 효과를 나타냈다 (도 19C).
실시예 28: MC38 마우스 모델에서의 종양 퇴행
C57BL/6 마우스 (hPD1 형질전환 마우스)에 동종 MC38 세포주를 이식하였다. 1일차 (무작위 배정일, 종양 부피 80-100 mm3)(n=10/그룹)에 시험 약제인 mSOT201, hPD1-mSOT201 및 mPD1을 5mg/kg mSOT201의 등가량으로 정맥 주사하고 대조군(NaCl)과 비교하였다. mSOT201은 1회 정맥 주사 (IV) 투여 후 마우스 10마리 중 9마리에서 종양 퇴행을 유도하였으나, 반면, 단일 클론 항-마우스 PD-1 항체(mPD1)와 항-인간 PD-1 마우스 IgG1-RLI-15 뮤테인 면역 사이토카인(hPD1-mSOT201)은 마우스에서 항 PD-1 효과를 나타내지 않았으며 대조군에 비해 종양 성장에 약간의 영향만 나타내었다 (도 20A).
유사하게, 항-뮤린 PD-1 항체와 융합 단백질 (mSOT201)의 RLI-15AQA 뮤틴의 시너지 활성은 항-마우스 PD-1 항체 단독(mPD1) 또는 항 인간PD1 마우스 IgG1-RLI-15 뮤테인 면역 사이토카인 (hPD1-mSOT201)을 대조군으로 사용한 후 생존한 마우스에서 치료 후 100일까지의 시간 경과에 따른 RLI-15AQA 뮤테인 단독의 효과를 보여준다 (도 20B).
실시예 29: MC38 종양에서 항종양 면역과 관련된 경로 및 유전자 유도 및 비장 및 림프절의 면역 세포 활성화
RNA 분리: mSOT201(5mg/kg)을 정맥 주사로 단일 투여한 후 7일 후, C57BL/6 마우스를 보유한 동종 MC38 종양 마우스의 종양에서 RNA 샘플을 분리하였다. 3마리의 마우스는 1일차 (무작위 배정일, 종양 부피 80 내지 100 mm3)에 mSOT201 (5mg/kg)을 정맥 투여하고, 4마리의 대조군 마우스는 치료하지 않고 방치하였다. 종양 조직에서 RNA를 RNeasy MicroKit을 사용하여 분리하였다. RNA 샘플의 품질은 애질런트 바이오애널라이저 RNA 나노 칩과 큐비트 HS RNA 분석기를 사용하여 확인하였다.
RNA 시퀀싱 분석: 시퀀싱 라이브러리는 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico 입력 포유류 키트(Takara Bio USA, Inc.)를 사용하여 RNA 샘플로부터 준비하였고, 라이브러리 품질 관리는 모세관 젤 전기영동 시스템 (HS DNA 칩이 장착된 Agilent Bioanalyzer)과 Qubit HS DNA Assay를 사용하여 수행하였으며, 시퀀싱은 NovaSeq 6000에서 NovaSeq 6000 300 사이클 시약 키트를 사용하여 2x151 bp 실행으로 수행하였다.
데이터 분석: 로우 데이터는 다음과 같은 단계를 포함하는 표준 RNA-seq 파이프라인에 따라 처리되었다: 품질 관리 (FastQC 및 FastqScreen을 통한), 어댑터 트리밍 (seqtk를 사용하여 Read2에서 8bp 트리밍), 참조 게놈 GRCm39에 매핑 (HISAT2 사용) 및 전사체 계수 (ht-seq 사용). 얻은 결과물인 각 샘플의 전사체 수가 포함된 정량화 파일은 R 패키지와 ggplot2, tydiverse, dplyr을 통해 추가로 처리하였다. 원시 카운트는 DESeq2 배율 정규화 중앙값을 통해 정규화하였다. 차등 유전자 발현 분석은 R의 DESeq2(버전 1.24.0)를 사용하여 수행하였다 (abs(log2FC)=1, FDR<0.05). 히트맵은 R의 ComplexHeatmap 패키지를 사용하여 만들었으며, DEG의 기능 및 농축 분석은 ClusterProfiler와 웹 기반 도구인 GO(Gene ontology)를 사용하여 수행하였다. 세포 집단 분석을 위한 TPM 값을 계산하기 위해, 연어 도구는 트리밍된 fastq 파일에 사용하였다. 세포 집단 분석은 타이머 2.0과 xCell 툴로 수행하였다.
결과: 차등 발현 분석 (abs(log2FC)=1, FDR<0.05) 결과, 대조군 샘플과 비교하여 mSOT201 처리 종양에서 800개의 마우스 유전자가 상향 조절되고 1910개의 마우스 유전자가 하향 조절되었다. 유전자 온톨로지 (gene Ontology, GO) 용어의 농축 분석은 주로 αβ T 세포, γδT세포, B 세포, NK 세포의 활성화, 세포 독성, 세포 사멸, 사이토카인 생성, 세포 화학 주성 및 세포 부착과 관련된 상향 조절 유전자를 확인했으며, 하향 조절 유전자는 종양 발생 및 종양 신호와 관련이 있는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 mSOT201이 종양 미세환경에서 선천성 면역과 후천성 면역을 모두 활성화한다는 것을 나타낸다. 다음으로, 종양 미세 환경에서 다양한 면역 세포 집단의 상대적 풍부도를 추정하기 위해 '메타유전자' 마커를 사용하였다. 전체 전사체 결과와 일치하며, mSOT201이 처리된 샘플은 CD8+ T 세포 (p<0.001), CD8+ naive 세포 (p<0.0005), CD8+ 이펙터 메모리 T 세포 (p=0.001), CD8+ T 세포 중앙 메모리 (p<0.001), γδd T 세포 (p=0.0002), NK 세포 (p<0.001), CD4+ T 세포 (p=0.0157), CD4+ naive 세포 (p=0.1176), CD4+ 이펙터 기억 T 세포 (p=0.003), B 세포 (p=0.0602), 골수성 수지상 세포 (p=0.0120)와 관련된 유전자 세트가 풍부해졌다. 반면, 암 관련 섬유아세포와 관련된 유전자 세트는 현저하게 감소하였다 (p=0.0254)(도 21A).
mSOT201은 MC38 종양 보유 마우스의 비장 및 림프절에서 선택된 면역 세포 집단의 증식을 유도하였다 (도 21B). 세포 증식(Ki67)은 확립된 종양 (80-100 mm3)에 mSOT201을 처리한 후 7일째에 유세포 분석법으로 검출되었다 (n=2).
실시예 30: kit225 세포에 대한 다양한 IL2/IL-15Rβγ 작용제의 EC50 값
실시예 1에 설명된 대로 RLI-15(SOT101), SOT201 (PEM-RLI-15AQA), hPD-1-IL-2v 및 αhPD1-IL-15m M1의 EC50 값을 측정하였다. hPD-1-IL-2v에서 하나의 IL-2 뮤테인 IL-2v (서열 번호 106)는 WO 2018/184964A1 (그 안에 서열번호 22, 23, 25 포함)에 기술된 대로 항-인간PD-1 항체 하나의 중쇄의 C-말단에 융합되어 있다. αhPD1-IL-15m M1에서 돌연변이 N1A-D30N-E46G-V49R (서열번호 107)을 가진 하나의 IL-15 뮤틴이 WO 2019/166946a1에 기술된 대로 항-인간PD-1 항체 하나의 중쇄의 C-말단에 융합된다 (도 1D 참조, 서열번호 89, 74 및 65 참조). EC50 값은 표 33에 나와 있다.
표 33: kit225 세포에 대한 선택된 IL-2/IL-15Rβγ 작용제의 EC50
테스트할 또 다른 흥미로운 후보물질은 WO 2019/166946a1에 기술된 바와 같이 돌연변이 N1G-D30N-E46G-V49R-E64Q(서열번호 108)가 항-인간PD-1 항체 중쇄의 C-말단에 융합된 IL-15 뮤테인을 가진 αhPD1-IL-15m M2이다 (도 1C 참조, 서열번호 90, 74 및 65 참조).
따라서 PD1-IL-2v 및 αhPD1-IL-15m M1에 비해 SOT201은 kit225 세포에서 EC50이 현저히 낮으며, 더 많은 양을 투여하고 생체 내 반감기를 연장하여 항 PD-1/PD-L1 상호작용을 방해하는 활성을 더 강력하고 오래 지속시키는 효과를 발휘할 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 31: MC38 종양 모델에서 mSOT201과 mPD1-IL-2Rβγ작용제의 비교
실시예 28에 설명된 대로 MC38 종양 모델에서 mSOT201 (마우스 SOT201 대리체)을 대조군(NaCl), IL-2v IL-2 뮤테인에 융합된 항뮤린PD-1 항체 RMP1-14(mPD1-IL-2Rβγ 작용제), RLI-15AQA와 mPD1 항체의 조합을 단일 정맥 주사 투여하여 비교하였다. 건강한 C57/BL6 마우스에 5mg/kg의 mSOT201을 정맥 주사 투여한 후 5일째의 NK 및 CD8+ T 세포 증식과 일치하도록 mPD1-IL-2Rβγ의 용량을 선택했으며, 그 결과 0.25mg/kg의 mPD1-IL-2Rβγ가 동등한 용량으로 나타났다. 세포 증식 (Ki67+)은 유세포 분석법으로 검출하였다. mSOT201은 CD8+ T 세포와 NK 세포의 활성화를 유도했으며, 이는 mPD1-IL-2Rβγagonist와는 대조적으로 8일까지 지속되었다 (도 22B).
mPD1-IL-2Rβγ는 IL-2/IL-15Rβγ 작용제로서, IL-2 뮤테인 IL-2v (서열번호 106)가 IL-2 서열에 대해 F42A, Y45A 및 L72G로 치환되어 IL-2Rα에 대한 친화력을 감소시키고 (WO 2018/184964A1, 예를 들어, 27 및 28 페이지 브릿징 단락 참조) mPD1-IL-2Rβγ는 3번 위치에서 O-글리코실화를 제거하기 위해 T3A를 추가 치환하고(28, 29페이지 연결 단락), 발현 또는 안정성을 높이기 위해 C125A를 추가 치환했다 (30페이지 3번째 단락).
뮤린 대리체 SOT201(mSOT201)는 1회 정맥 주사 투여 후 MC38 종양 보유 마우스 10마리 중 9마리에서 종양 퇴행을 유도한 반면, mPD1-IL-2Rβγ작용제의 경우 10마리 중 5마리에서 종양 성장을 지연시킨 반면, RLI-15AQA와 mPD1 항체의 조합은 대조군 마우스에 비해 종양 성장을 지연시키는데 그쳤다 (도 22A).
mSOT201은 MC38 종양 보유 마우스에서 NK 및 CD8+ T 세포의 증식을 유도하였으며, 이는 mPD1-IL-2Rβγ 작용제 및 mPD1과 같은 양의 RLI-15AQA를 병용 투여한 것과 대조적으로 투여 후 7일간 지속되었다. MC38 종양 치료는 무작위 배정 1일차, 종양 부피 100mm3(n=10/그룹)에 이루어졌다.
또한, mSOT201은 8일째에 증식하는 세포의 현저한 감소를 보인 mPD1-IL-2Rβγ작용제와 대조적으로 8일째에도 여전히 지속되는 CD8+ T 세포와 NK 세포의 활성화를 현저하게 더 오래 유도하였다 (도 22B).
또한 SOT201은 MC38 종양 보유 마우스의 비장과 림프절에서 NK 및 CD8+ T 세포의 증식을 유도하였으며, 이는 mPD1-IL-2v 및 RLI-15AQA와 mPD1 항체 조합의 등극량과 대조적으로 투여 후 7일간 지속되었다 (도 22C).
실시예 32: 시노몰구스 원숭이에서 SOT201의 PK 프로필
시노몰구스 원숭이에게 1일째 0.6 mg/kg의 SOT201을 정맥 주사 투여하고 유세포 분석 및 혈액학을 통해 NK 및 CD8+ T 세포의 증식 (Ki67+) 및 절대 세포 수를 시간 경과에 따라 측정하였다. SOT201은 정맥 주사 투여 후 시노몰구스 원숭이의 혈액에서 NK (5일째 약 90%) 및 CD8+ T 세포(5일째 약 80%)의 높은 증식 및 확장을 유도하였다 (도 23A). 약동학 매개변수는 표 34에 나와 있다.
표 34: 시노몰구스 원숭이에서 SOT201의 약동학 매개변수
SOT201은 시노몰구스 원숭이에게 반복적인 정맥 주사 투여 후 NK 및 CD8+ T 세포의 활성화를 유도하였다 (도 23B).
실시예 33: 마우스 SOT201 대리체의 PD 활성도
본 연구의 첫 번째 목표는 마우스 대리체 분자 mSOT201 (실시예 27 참조)을 사용한 치료가 C57BL/6 마우스에서 hPD1-mSOT201 또는 mPD-1을 사용한 치료와 비교했을 때 CD8+ T 세포 증식에 추가적/시너지 효과가 있는지 평가하는 것이었다. 본 연구의 두 번째 목표는 C57BL/6 마우스에서 mSOT201 wt 마우스 대리체 분자와 마우스 대리체 분자 mPD1-IL2v의 약역학적 활성을 비교하는 것이었다. 테스트한 마우스 대리체 분자에 대한 설명은 표 35에 설명되어 있다. PD 활성은 5일째와 8일째에 평가하였다. FACS 분석은 위에 설명된 대로 수행하였다.
표 35: 마우스 대리체 분자에 대한 설명
표 36: kit225 분석에서 인간 분자와 비교한 마우스 대리체의 역가 비교
펨브롤리주맙은 뮤린 PD-1을 인식하지 못하므로, hPD-1-mSOT201은 유사한 PK 프로파일을 가진 비결합 항체에 결합된 RLI-15AQA에 대한 대조군이며, 따라서 이러한 PK 프로파일을 가진 RLI-15AQA 분자의 PD 활성을 반영한다. mPD-1 분자는 항PD-1 항체 단독의 PD 활성을 반영한다. CD8+ T 세포의 활성화와 관련하여, mSOT201은 단일 성분 대리체인 hPD1-mSOT201 및 mPD-1에 비해 투여 5일째에 추가 효과 (즉, 시너지 효과) 이상을 보였으며, 같은 양으로 투여한 8일째에는 그 이상의 효과를 나타냈다. 이에 비해, 5일째에 높은 활성이 예상되어 더 낮은 용량을 투여한 mPD1-IL2v와 mSOT201 wt (둘 다 더 활성적인 IL-2/IL-15Rβγagonist)는 5일째에 CD8+ T 세포의 활성화가 약간 더 높았지만, 8일째에 mSOT201의 CD8+ T 세포 활성화가 훨씬 더 강하기 때문에 이러한 효과는 단기간만 지속된다. 활성화된 NK 세포를 보면 그 차이가 그렇게 뚜렷하지 않다. 예상대로 mPD-1은 NK 세포를 활성화시키지 않는 반면, hPD1-mSOT201, mPD1-IL2v, mSOT201 및 mSOT201 wt는 5일째에 강하게 활성화되고 mSOT201은 다른 세포에 비해 다소 약하게 활성화된다. 8일째에 다시 mSOT201은 mPD1-IL2v 및 mSOT201 wt에 비해 NK 세포의 활성화가 더 강하게 나타난다 (도 24 A).
비슷한 결과가 관찰되었는데, mSOT201, hPD1-mSOT201 및 mPD-1은 A의 두 배로 투여한 반면, mSOT201 wt 및 mPD1-IL2v는 더 적은 양으로 투여하였다 (도 24 B 참조). 이는 실험 A에서 이미 세포가 최대 활성화에 도달했을 가능성이 높기 때문이다. 예상대로 mSOT201 wt와 mPD1-IL2v는 CD8+ T 세포와 NK 세포의 활성화가 모두 감소했으며, CD8+ T 세포의 경우 8일째에 다시 대조군 수준으로 감소하였다.
이 데이터에 따르면, IL-2/IL-15Rβγ에 대한 결합이 현저히 감소한 SOT201은 항PD-1 모이티어와 함께 NK 및 CD8+ T 세포를 강력하고 오래 활성화하는 반면, IL-2/IL-15Rβγ 작용 활성이 높은 분자는 특히 CD8+ T 세포의 활성화가 훨씬 짧게 나타난다. PD-1과 PD-1을 발현하는 CD8+ T 세포의 IL-2/IL-15Rβγ가 시스(즉, 동일한 CD8+ T 세포) 또는 트랜스 (즉, 근접한 다른 CD8+ T 세포 사이)에서 동시에 결합하는 선호도 효과가 CD8+ T 세포의 이러한 우선적 활성화를 유도한다는 가설이 제기되고 있다.
실시예 34: PD-1 민감성 및 PD-1 치료 저항성 마우스 모델에서 mSOT201의 항종양 효능 활성
이 연구의 목적은 항 PD-1 치료 민감성 (CT26, MC38) 및 항 PD-1 치료 저항성 (B16F10, CT26 STK11 ko) 마우스 모델에서 mSOT201의 항종양 활성을 평가하는 것이었다. 테스트한 마우스 대리체 분자에 대한 설명은 표 37에 나와 있다.
표 37: 마우스 대리체 분자에 대한 설명
SOT201의 뮤린 대리체 분자인 mSOT201은 단일 성분 대리체 분자인 mPD-1 및 hPD1-mSOT201과 비교하여 테스트된 PD-1 민감성 종양 모델 CT26 및 MC38에서 10건 중 5건, 10건 중 9건의 완전 반응을 통해 시너지 효과를 나타내었다 (도 25 A).
항 PD-1 치료에 내성이 있는 것으로 알려진 종양 모델에서도 mSOT201은 단일 성분에 비해 시너지 효과를 보였지만, B16F10 모델의 경우 10마리 중 1마리만이 완전 반응을 보여 민감성 모델에 비해 치료 효과가 강하지는 않았다.
실시예 35: mSOT201의 항종양 효능 활성과 RLI-15AQA 뮤테인 + 항PD-1 항체의 항종양 효능 활성 비교
본 연구의 목적은 MC38 마우스 모델에서 mSOT201의 항종양 활성과 RLI-15 AQA 뮤테인 + 항 PD-1 치료의 항종양 활성을 비교 평가하는 것이었다. 실험에 사용된 마우스 대리체 분자에 대한 설명은 표 38에 나와 있다.
표 38: 마우스 대리체 분자에 대한 설명
항 PD-1 모이티어와 IL-2/IL-15βγ 작용제 RLI-15AQA (두 가지 용량, G2 및 G3)의 융합은 개별 등극 성분의 조합 (G4: RLI-15AQA + mPD1 또는 G11: hPD1-mSOT201 + mPD1)에 비해 강력한 시너지 효과를 보였다 (도 26 참조). PD-1 양성 면역세포 활성화의 시간적, 공간적 연결이 개별 성분에 의한 면역세포 활성화보다 기계적으로 더 강력하다는 가설이 있다.
실시예 36: mSOT201의 항종양 효능 활성과 SOT101 + 항PD-1 항체의 항종양 효능 활성 비교
본 연구의 목적은 MC38 마우스 모델에서 mSOT201과 SOT101 + 항 PD-1 치료의 항종양 활성을 비교 평가하는 것이었다. 실험에 사용된 마우스 대리체 분자에 대한 설명은 표 39에 설명되어 있다.
표 39. 마우스 대리체 분자에 대한 설명
2mg/kg의 mSOT201 단일 용량(G3)은 1mg/kg RLI2AQ 4회 투여 + 5mg/kg mPD1 단일 용량(G8) 또는 1mg/kg RLI2AQ 4회 투여 + 5mg/kg mPD1 4회 투여 (G9)의 병용 요법과 거의 동일한 치료 효과를 보였다. 그러나 5mg/kg의 mSOT201 1회 투여(G2)는 개별 성분을 여러 번 투여하는 것 (G8 및 G9)보다 효과가 더 뛰어났다.
실시예 37: mSOT201과 SOT101 + 항 PD-1 항체 치료시 면역 세포 활성화의 차이에 대한 메커니즘 연구
본 연구의 목적은 MC38 마우스 모델에서 유사한 효능 용량의 mSOT201과 SOT101 + 항 PD-1 치료의 항종양 활성을 평가하는 것이었다. 실험에 사용된 마우스 대리체 분자에 대한 설명은 표 39에 설명되어 있다.
종양, 비장 및 림프절에서 두 치료법 모두에서 다양한 면역 세포 집단의 상대적 수에 차이가 발견되었다. 비장과 림프절에서 CD8+ T 세포와 CD3+ 세포를 보유한 αβTCR의 상대적 확장은 두 치료법 사이에 변화가 없었다. 그러나 종양에서 mSOT201은 CD8+ T 세포의 상대적 증가를 더 많이 유도한 반면, RLI2AQ + 항 PD-1 병용 치료는 더 많은 NK 세포를 증가시켰다. 흥미롭게도 mSOT201은 비장과 림프절에서 CD3+ 세포를 보유한 γδdTCR의 비율을 더 많이 유도한 반면, RLI2AQ + 항 PD-1 병용 치료는 주로 종양에서 CD3+ 세포를 보유한 γδdTCR의 비율을 더 많이 유도하였다 (도 28 참조).
실시예 38: 면역원성 측정을 위한 DC-T 세포 기반 분석 및 형광 스팟 분석
본 연구의 목적은 시험관 내에서 하나의 RLI-15 뮤테인 (PEM-RLI-15 후보 분자)을 함유한 펨브롤리주맙 기반 면역 사이토카인의 면역원성 위험성을 평가하는 것이었다. 이를 위해 DC-T 세포 분석법이 사용되었는데, 시험 제품을 먼저 미성숙 수지상 세포(iDC)와 함께 배양한 후 성숙된 DC(mDC)의 MHC 분자에 탑재된 후보 분자의 가공된 펩타이드로서 자가 T 세포에 제시하는 방식이다. 7일간의 공동 배양 기간 후, 항약물 항체 형성을 위한 대리 마커로서 T 세포 증식을 측정하였다. DC에 의해 유도된 T 세포 증식의 검출은 결과에 강한 영향을 미칠 수 있는 테스트 시스템에서 RLI-15 성분의 자극 활성을 완화하는데 사용되었으며, 이는 면역원성에 기인하지 않아야 한다. KLH는 강력한 면역 반응 유도를 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)을 양성 대조군으로 사용하였다. 펨브롤리주맙은 음성 대조군으로 사용되었다. 비특이적 T 세포 증식을 평가하기 위해 단백질이 없는 대조군 DC를 대조군으로 사용하였다.
표 40: DC-T 세포 기반 분석을 위한 PEM-RLI-15 후보 분자
표 40에 따른 PEM-RLI-15 후보 분자를 각각 두 가지 농도로 iDC를 자극하는 데 사용하였다. DC의 성숙은 염증성 사이토카인에 의해 유도되었다. 24시간 후, mDC를 세척하고 CFSE로 사전 염색한 자가 CD4+ T 세포와 함께 배양하였다. 7일 후 유세포 분석기에 의한 CFSE 검출을 기반으로 T 세포의 증식을 평가하였다.
이 분석은 SOT201(PEM L-RLI N65A x1)으로는 수행할 수 없었는데, 이는 RLI N65A 뮤틴의 활성이 여전히 너무 높아 직접적인 T 세포 활성화로 이어져 RLI-15 활성에 영향을 미쳤기 때문이다.
인간 CD14+ 단핵구 (3개의 개별 실험에서 11명의 건강한 기증자)에서 생성된 DC를 성숙 신호(염증성 사이토카인 TNFα 및 IL-1β)가 있는 상태에서 10μg/ml(표시되지 않음) 또는 50μg/ml의 PEM-RLI-15 후보 분자, 펨브롤리주맙 또는 KLH를 24시간 동안 배양하였다. 단백질이 적재된 세척된 mDC를 자가, CFSE 염색된 CD4+ T 세포와 함께 배양하였다. 7일 후 유세포 분석법으로 T 세포 증식을 측정하였다. 증식하는 CD4+ T 세포의 비율은 CFSE 신호에 따라 평가되었으며, CFSElow 세포는 순환하는 세포로 간주하였다. KLH를 양성 대조군으로, 펨브롤리주맙을 음성 대조군으로 사용하였다 (도 29 참조). PEM-RLI-15 후보 분자 PEM L-RLI DANA x1/PEM LY-RLI DANA x1은 낮은 면역원성 위험을 반영하는 음성 대조군에 비해 T 세포의 유의미한 증식을 유도하지 않았다 (11명의 기증자 중 1명에서 양성 반응이 감지됨). 후보 분자 PEM LY-RLI DANAQD x1은 음성 대조군에 비해 T 세포의 유의미한 증식을 유도했으며 (p=0.0208, paired t test), 이는 IL-2/IL-15Rβγ에 대한 결합을 감소시키는 3개의 변이를 가진 이 RLI-15 뮤틴에 대한 잠재적 면역원성 위험 (11명의 기증자 중 4명에서 양성 반응 검출)을 시사하는 결과이다.
너무 활성화된 RLI-15 뮤틴은 면역 반응을 자극하기 때문에 DC-T 세포 분석법은 RLI-15(야생형 서열)와 비교하여 RLI-15AQA의 면역원성을 테스트하는데 적합하지 않다. 따라서 치환이 도입된 펩타이드 쌍을 치환 부위에 걸쳐 생성하여 형광 스폿 분석법으로 테스트하였다.
표 41: 검증된 펩타이드
40명의 기증자로부터 얻은 CD8이 고갈된 PBMC를 시드하여 테스트 펩타이드와 함께 RPMI + 10% huAb 및 IL-7로 배양하였다. 1일차에는 IL-7로, 4일차에는 IL-7과 IL-2로 배지를 교체하였다. 7일째에 CD8이 고갈된 PBMC를 채취하여 하룻밤 동안 휴지시킨 후 다음 날 FluoroSpot 플레이트에 시드하고 펩타이드로 재자극하였다. 9일째, INF-γ 및 TNF-α 플루오로스팟 플레이트를 개발하였다.
도 29B는 모든 테스트 조건에서 신뢰 구간이 0과 겹치는 것을 보여 주며, 이는 돌연변이 펩타이드와 짝을 이루는 야생형 서열을 비교한 평균 dSFU의 변화 증거가 없음을 의미한다. 따라서 N65A 치환과 G175A/N176Q 치환 쌍 모두에서 면역원성의 관련 증가가 나타나지 않는다.
실시예 39: 다양한 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인의 효능
다음과 같은 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인(표 42)을 만들어 그 활성을 비교하였다.
표 42: 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인
kit225 세포 (표 43 참조)와 hPBMC (표 44 참조)에서 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ작용제 면역 사이토카인의 효능을 측정하였다.
표 43: kit225 분석에서 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인의 효능
표 44: 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인의 hPBMC에 대한 효능
실시예 40: 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인의 PD-1/PD-L1 차단 활성
PD-1/PD-L1 축의 차단 활성을 평가하기 위해 위에서 설명한 대로 PD-1/PD-L1 차단 생물학적 분석법 (Promega, 번호 J1250)을 사용하여 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ작용제 면역 사이토카인의 차단 활성을 평가하였다. 결과는 표 45에 나타내었다.
표 45: 프로메가 차단 분석에서 PD-1/PD-L1 차단 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역관문억제제 면역 사이토카인
SOT201은 테스트된 세 가지 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ작용제 면역 사이토카인 중 가장 높은 PD-1/PD-L1 차단 활성을 보였다.
실시예 41: 이펙터 기능이 수정된 인간 및 마우스 대리체 SOT202 분자가 kit225 세포에 미치는 효능
SOT202는 T366W-노브/T366S, L368A, Y407V-구멍 치환 및 중쇄의 말단 K가 삭제된 인간화 IgG 1 hCl1a에서 추출한 항체가 노브 중쇄의 C-말단에서 RLI-15AQA에 융합된 이종이합체 면역 사이토카인이다 (서열번호 111, 서열번호 110 및 서열번호 88 참조). 다음 예에서 SOT202-XXX라는 용어는 표 13에 표시된 것처럼 RLI2의 DANA 돌연변이와 같이 SOT202에 추가 돌연변이가 발생한 분자를 나타낸다. 명확히 하기 위해, SOT202-DANA는 SOT202에 이미 NA(N65A) 돌연변이가 포함되어 있기 때문에 추가 DA(D61A) 돌연변이만 SOT202와 다르다 (숫자는 IL-15 번호 참조). 표 2에 표시된 바와 같이 IgG1 분자의 이펙터 도메인에 돌연변이가 발생하여 항체의 ADCC 특성이 변경되는 경우 (예를 들어, AAA, DE 및 DLE 돌연변이). "afuc"라는 용어는 아푸코실화 IgG1 분자를 나타낸다. 아푸코실화 항체도 ADCC 특성을 수정하였다.
kit225 세포의 증식 유도에 대한 인간 및 뮤린 대리체 SOT202 ADCC 변형 분자의 활성은 예 1에 설명된 대로 평가되었으며, SOT101과 비교한 EC50 및 상대적 효능은 표 46 및 표 47에 나와 있다. 뮤린 SOT202는 SOT202의 인간 hIgG1 상수 도메인을 뮤린에 상응하는 mIgG2a로 대체하여 생성하였다 (mSOT202: 서열번호 112, 서열번호 128 및 서열번호 129; mSOT2020 LALAPG: 서열번호 130, 서열번호 131 및 서열번호 129; mSOT202 아이소타입: mSOT202 아이소타입 HC 노브, 서열번호 133 및 134; mSOT202 LALAPG 아이소타입: 서열번호 135, 서열번호 136. 서열번호 134).
표 46: kit225 세포에 대한 인간 SOT202 ADCC 변형 분자의 효능
이 효능 분석은 SOT202가 kit225 세포에서 SOT201과 동일한 효능을 나타내며 (표 36 참조), ADCC 변형이 면역 사이토카인의 효능에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 따라서 이 툴박스를 사용하면 kit225 세포의 활성화와 관련하여 면역 사이토카인의 효능에 영향을 주지 않으면서 항체의 ADCC 활성을 조정할 수 있다.
표 47: kit225 세포에 대한 인간 SOT202 분자 및 마우스 SOT202 대리체의 효능
인간 SOT202의 경우, ADCC 변형(LALAPG 돌연변이)은 kit225 세포의 활성화와 관련하여 마우스 SOT202 대리체의 효능에 영향을 미치지 않았다. 그러나 마우스 SOT202 대리체는 인간에 비해 효능이 떨어지는데, 이는 kit225 세포가 인간 NK 세포 및 마우스(생쥐) NK 세포와의 공동 신호 전달에 필요한 CD16을 발현하기 때문일 가능성이 높다.
실시예 42: 인간 NK 및 CD8 + T 세포에 대한 인간 SOT202 ADCC 변형 분자의 효능
인간 NK 및 CD8+ T 세포의 증식 유도에 대한 인간 SOT202 ADCC 변형 분자의 활성은 예 1에 설명된 대로 평가되었으며 (hPBMC 효능 분석), SOT202와 비교한 EC50 및 상대 효능은 그림 30 및 표 48에 나타내었다.
표 48: 인간 NK 및 CD8+ T 세포에 대한 인간 SOT202 ADCC 변형 분자의 효능
ADCC를 강화하는 DLE 및 DE 돌연변이가 있는 SOT202-DANA는 ADCC를 변형하지 않은 SOT202-DANA와 비교했을 때 인간 NK 세포 활성을 크게 증가시켰다.
아푸코실화된 SOT202도 ADCC 활성을 증가시켰지만 DE 및 DLE 돌연변이보다는 그 정도가 적었다. 반면에 LALAPG 돌연변이와 같이 ADCC를 감소시키는 돌연변이는 NK 세포의 활성화를 거의 없앴다. 이러한 돌연변이는 CD8+ T 세포 활성화에 약간의 영향만 미쳤다. 이론에 얽매이지 않고, 돌연변이를 강화하여 CD16 수용체에 대한 결합을 높이면 IL-15Rβγ 신호와 시너지 효과를 내는 것으로 추정된다.
실시예 43: 인간 NK 및 CD8 + T 세포에 대한 인간 SOT202 분자의 효능을 SOT201 분자와 비교한 결과
인간 NK 및 CD8+ T 세포의 증식 유도에 대한 인간 SOT202 분자의 활성을 SOT201의 활성과 비교하였다. 도 31과 표 49에는 SOT202와 SOT201에 대한 EC50 및 상대적 효능이 나와 있다.
표 49: 인간 NK 및 CD8+ T 세포에 대한 인간 SOT202 분자의 효능 (SOT201과 비교)
인간 NK 및 CD8+ T 세포의 증식 유도에 대한 인간 SOT202 분자의 활성을 SOT201-DANA의 활성과 비교하였다. 도 32와 표 49에 SOT202 및 SOT201과 비교한 EC50 및 상대적 효능이 나와 있다. NA 돌연변이만 있는 분자에 비해 DANA 돌연변이가 있는 분자의 자극 활성이 감소한 것은 이전 예에서 이미 설명한 대로 이 돌연변이의 자극 활성이 더 낮다는 것을 확인시켜 준다. 아푸코실화를 통해 ADCC 활성이 강화된 SOT202 분자(NA 돌연변이가있는 SOT202)는 NK 세포 활성은 증가하지만 CD8+ T 세포 활성은 증가하지 않으며, 실시예 42에 나타난 결과를 확인하였다. SOT201은 IgG4 항체를 기반으로 하며, 따라서 IgG4 항체는 본질적으로 낮은 ADCC 활성을 가지고 있다.
표 50: 인간 NK 및 CD8+ T 세포에 대한 인간 SOT202 분자의 효능 (SOT201-DANA와 비교)
SOT202와 SOT201 분자는 인간 CD8+ T 세포에는 동일한 효능을 보이지만 NK 세포에는 효능이 없다. 아푸코실화는 인간 NK 세포의 활성을 증가시켰다.
실시예 44: 건강한 C57BL/6 마우스의 비장에서 면역 세포를 활성화하는 mSOT202
뮤린 SOT202는 SOT202의 인간 hIgG1 상수 도메인을 뮤린에 해당하는 mIgG2a (서열번호 127, 서열번호 128 및 서열번호 129)로 대체하여 생성하였다. 건강한 C57BL/6 마우스에 5, 10 또는 20 mg/kg의 mSOT202 화합물을 정맥 주사한 후 5일 후 유세포 분석법으로 비장에서 세포 증식(Ki67)이 검출되었다. mSOT202는 NK 및 CD8+ T 세포의 용량 의존적 자극을 보여주었다 (도 33(A) 및 (B)).
실시예 45: mSOT202는 ADCC 활성과 NK 세포 증식에 대한 RLI2 자극 간의 시너지 효과를 유도한다
건강한 C57BL/6 마우스에 5mg/kg의 mSOT202 분자를 정맥 주사한 후 5일 및 10일 후 유세포 분석법으로 비장에서 세포 증식(Ki67)이 검출되었다. mSOT202의 NK 세포에 대한 증식 활성은 mSOT202-LALAPG(hCl1a-mIgG2a-NA 1x, ADCC 활성이 없는 분자)의 효과에 hCl1a-mIgG2a(RLI2가 없는 분자)를 더한 효과보다 높았으며 이는 mSOT202의 항체의 ADCC 활성과 RLI2의 증식 활성 사이의 시너지를 보여주는 것 (도 34(A))으로 CD16 신호에 의한 것으로 추정된다. 따라서 ADCC는 NK 세포의 활성 증가에 기여할 수 있다. 이 실험 모델에서는 CD8+ T 세포 자극에 대한 시너지를 측정할 수 없었다 (도 34(B)).
본 발명은 다음의 실시예에 의해 설명된다:
1. 면역 사이토카인은 다음을 포함한다:
a. 인터루킨 15 (IL-15) 또는 이의 유도체와 인터루킨 15-수용체 알파 (IL-15Rα) 또는 이의 유도체의 스시 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 접합체,
및
b. 항체 또는 항체의 기능적 변이체,
상기 항체 또는 항체의 기능적 변이체는 다음의 특징을 갖는다:
i. 이종이합체 Fc 도메인 (heterodimeric Fc domain),
ii. 변형된 이펙터 기능 (modified effector function), 및/또는
iii. 증가된 생체 내 (in vivo) 반감기 (half-life)
상기 접합체는 양쪽 항체 중쇄 또는 항체 경쇄 (both antibody heavy chains or light chains)의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 융합되거나, i.의 경우, 하나의 항체 중쇄의 C-말단에 융합된다.
2. 실시예 1의 면역 사이토 카인에 있어서, 상기 변형된 이펙터 기능은 항체 의존성 세포 독성을 감소시키고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는
a. IgG1 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L234A/L235A, P329G, L234A/L235A/P329G, G236R/L328R, D265A, N297A, N297Q, N297G 또는 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고,
b. IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L235E, F234A/L235A, F234A/L235A/P329G, P329G, S228P/L235E, S228P/F234A/L235A 또는 E233P/F234V/L235A/D265A/R409K 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고,
c. IgG2 (IgG2a 또는 IgG2b) 및 IgG4 하이브리드 또는 이의 기능적 변이체이며 IgG2의 CH1 및 힌지 영역 (hinge region)을 포함하고, CH2 및 CH3 영역은 IgG4(IgG2 아미노산 118~260 및 IgG4 아미노산 261 내지 447)로부터 유래하고, 또는
d. d. IgG2 항체 또는 이의 기능적 변이체이며, H268Q/V309L/A330S/P331S 또는 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고,
상기 번호는 EU 번호에 따른다.
3. 실시예 2의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는
(a) IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L235E 돌연변이를 포함하고, 또는
(b) (b) IgG1 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
4. 실시예 1의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 변형된 이펙터 기능은 항체 의존성 세포 독성을 향상시키고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는:
a. IgG1 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S298A/E333A/K334A, K392T/P396L, V264I/I332E 또는 L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A 중에서 선택되는 돌연변이를 포함하고,
바람직하게는 하나의 중쇄에 S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S298A/E333A/K334A, K392T/P396L, V264I/I332E 중에서 선택되는 돌연변이를 포함하고, 반대쪽 중쇄에 D270E/K326D/A330M/K334E 돌연변이를 추가로 포함하고, 및/또는
b. b. 아푸코실화된 (afucosylated) IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이고, 상기 번호는 EU 번호에 따른다.
5. 실시예 1 내지 4 중 어느 하나의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 이종이합체 Fc 도메인 (heterodimeric Fc domain)은 KiH, KiHS-S, HA-TF, ZW1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTS-S, SEED 및 A107 중에서 선택되며, 바람직하게는 KiH이 선택된다.
6. 실시예 1 내지 5 중 어느 하나의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 이종이합체 Fc 도메인은, 동종이합체 (homodimeric) Fc 도메인을 가진 면역 사이토카인에 비해, 세포 배양에서 발현 시 면역 사이토카인의 더 높은 수율을 나타낸다.
7. 실시예 1 내지 6 중 어느 하나의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 면역 사이토카인의 반감기는 증가되고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 IgG1 또는 IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 M252Y/S254T/T256E, M428L/N434S 또는 T250Q/M428L 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고,
상기 번호는 EU 번호에 따른다.
8. 실시예 1 내지 3 중 어느 하나의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 감소된 항체 의존성 세포 독성을 가지고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L235E 돌연변이 및 KiH 이합체화된 (heterodimerized) Fc 도메인을 포함한다.
9. 실시예 1 내지 8 중 어느 하나의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 접합체는 N- 내지 C- 말단 순서로, IL-15Rα 스시 도메인 또는 이의 유도체, 링커 및 IL-15 또는 이의 유도체를 포함하는 융합 단백질이고, 바람직하게는 상기 IL-15Rα 스시 도메인은 서열 번호 5의 서열을 포함하며,
상기 링커는 18 내지 22 아미노산의 길이를 가지고 바람직하게는 글리신 (glysines) 또는 세린 및 글리신 (serines and glycines)으로 구성되며, 더욱 바람직하게는 서열번호 7의 서열을 가지고, 바람직하게는 상기 IL-15는 서열번호 2의 서열을 갖는다.
10. 실시예 1 내지 9 중 어느 하나의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 IL-15 변이체는 다음을 포함한다:
a. 번역 후 변형 (post-translational modifications)과 관련하여 IL-15 변이체의 균질성(homogeneity)을 증가시키는 적어도 하나의 돌연변이로서,
바람직하게는 상기 돌연변이는 IL-15 (서열번호 2)의 N77에서의 탈아미드화 (deamidation) 및/또는 N79에서의 글리코실화 (glycosylation)를 감소시키고,
더욱 바람직하게는 상기 돌연변이는 G78A, G78V, G78L or G78I, 및 N79Q, N79S 또는 N79T 중에서 선택된 돌연변이며,
가장 바람직하게는 상기 돌연변이는 G78A/N79Q인 돌연변이; 및/또는
b. IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이로서,
상기 돌연변이 아미노산 (mutated amino acid)은 IL-15 (서열번호 2)의 N1, N4, S7, D8, K10, K11, D30, D61, E64, N65, L69, N72, E92, Q101, Q108, I111 중에서 선택되고, 바람직하게는 상기 돌연변이 아미노산은 D61, N65 및 Q101 중에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 상기 돌연변이 아미노산은 N65인 돌연변이를 포함한다.
11. 실시예 1 내지 10 중 어느 하나의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이는 N1D, N1A, N1G, N4D, S7Y, S7A, D8A, D8N, K10A, K11A, D30N, D61A, D61N, E64Q, N65D, N65A, N65E, N65R, N65K, L69R, N72R, Q101D, Q101E, Q108D, Q108A, Q108E 및 Q108R 중에서 선택되고, 바람직하게는 D8A, D8N, D61A, D61N, N65A, N65D, N72R, Q101D, Q101E 및 Q108A 중에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 D61A, N65A 및 Q101D 중에서 선택되는 치환(substitution)이고, 가장 바람직하게는 N65A에서 선택되는 치환 또는 D8N/N65A, D61A/N65A 또는 D61A/N65A/Q101D 중에서 선택되는 결합된 치환(combined substitution)이다.
12. 실시예 1 내지 11 중 어느 하나의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는,
a. 종양 항원 (tumor antigen), 바람직하게는 EGFR, HER2, FGFR2, FOLR1, CLDN18.2, CEA, GD2, O-아세틸-GD-2 (O-Acetyl-GD-2), GM1, CAIX, EPCAM, MUC1, PSMA, c-MET, ROR1, GPC3, CD19, CD20, CD38 중에서 선택되는 종양 항원과 결합하고;
b. 종양 세포외 기질 항원 (tumor extracellular matrix antigen), 바람직하게는 FAP, 피브로넥틴 (fibronectin)의 EDA 도메인, 피브로넥틴의 EDB 도메인 및 LRRC15, 바람직하게는 FAP 및 피브로넥틴의 EDB 도메인 중에서 선택된 종양 세포외 기질 항원에 결합하며;
c. 신생 혈관 형성 항원 (neovascularization antigen), 바람직하게는 VEGF 또는 엔도글린 (Endoglin)에 결합하고;
d. 면역 조절 항체 또는 이의 기능적 변이체이되,
상기 면역 조절 항체는 공동 자극 수용체 (co-stimulatory receptor), 바람직하게는 CD40 작용제, CD137/4-1BB 작용제, CD134/OX40 작용제 및 TNFRSF18/GITR 작용제 중에서 선택되는 공동 자극 수용체를 자극하고, 또는
상기 면역 조절 항체는 면역 억제 수용체, 바람직하게는 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG3 길항제, TIGIT 길항제, 억제성 KIRs 길항제, BTLA 길항제, HAVCR2 길항제 및 ADORA2A 길항제 중에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 PD-1 길항제인 면역 억제 수용체를 억제한다.
13. 실시예 1의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 사이토카인 도메인은 서열번호 10의 서열을 포함하고; 및
상기 항체는 다음을 포함한다:
i. 서열번호 20의 중쇄 노브 서열 (heavy chain 노브 sequence)
ii. 서열번호 22 또는 서열번호 101, 바람직하게는 서열번호 101의 중쇄 홀 서열 (heavy chain 홀 sequence), 및
iii) 서열번호 16의 경쇄 서열을 항체로 포함하며,
상기 사이토카인 도메인은 링커 없이 C-말단 중쇄 노브 서열에 융합된다.
14. 실시예 1의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 사이토카인 도메인은 서열번호 10의 서열을 포함하고; 및
상기 항체는 다음을 포함한다:
i. 서열번호 84의 중쇄 노브 서열
ii. 서열번호 87의 중쇄 홀 서열, 및
iii. 서열번호 88의 경쇄 서열,
상기 사이토카인 도메인은 링커 없이 C-말단 중쇄 노브 서열에 융합된다.
15. 실시예 1의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 사이토카인 도메인은 서열번호 10의 서열을 포함하고; 및
상기 항체는 다음을 포함한다:
i. 서열 번호 93의 중쇄 노브 서열,
ii. 서열 번호 95의 중쇄 홀 서열, 및
iii. 서열 번호: 92의 경쇄 서열;
상기 사이토카인 도메인은 링커 없이 C-말단 중쇄 노브 서열에 융합된다.
16. 실시예 1 내지 15 중 어느 하나의 면역 사이토카인을 암호화하는 핵산.
17. 실시예 16의 핵산을 포함하는 벡터.
18. 숙주 세포는 실시예 16의 핵산 또는 실시예 17의 벡터를 포함한다.
19. 실시예 1 내지 15 중 어느 하나의 면역 사이토카인, 실시예 16의 핵산 또는 치료에 사용하기 위한 실시예 17의 벡터.
20. 실시예 1 내지 15 중 임의의 면역 사이토카인, 실시예 16의 핵산 또는 실시예 17의 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
21. 종양성 질환 또는 감염성 질환을 앓고 있거나, 발병 위험이 있거나, 진단을 받은 대상의 치료에 사용하기 위한 실시예 1 내지 15 중 어느 하나의 면역 사이토카인, 실시예 16의 핵산 또는 실시예 17의 벡터.
22. 종양 질환 또는 감염성 질환을 앓고 있거나, 발병 위험이 있거나, 진단을 받은 환자를 치료하는 방법은, 실시예 1 내지 15 중 어느 하나의 면역 사이토카인, 실시예 16의 핵산 또는 실시예 17의 벡터를 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 다음의 실시예에 의해 설명된다:
1. 다음을 포함하는 면역 사이토카인:
a. 인터루킨 15 (interleukin 15, IL-15) 또는 이의 유도체 (derivative)를 포함하는 폴리펩타이드 (polypeptide)와 인터루킨 15-수용체 알파 (interleukin 15-receptor alpha, IL-15Rα) 또는 이의 유도체의 스시 도메인 (sushi domain)을 포함하고,
b. 항체 또는 항체의 기능적 변이체 (variant),
상기 항체의 기능적 변이체는 다음을 특징으로 한다:
i. 이종이합체 Fc 도메인 (heterodimeric Fc domain),
ii. 변형된 이펙터 기능 (modified effector function), 및/또는
iii. 증가된 생체 내 (in vivo) 반감기 (half-life)를 특징으로 하는 항체이고,
상기 접합체는 양쪽 항체 중쇄 또는 항체 경쇄 (both antibody heavy chains or light chains)의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 융합되거나, i.의 경우, 하나의 항체 중쇄의 C-말단에 융합된다.
2. 실시예 1의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 변형된 이펙터 기능은 항체 의존성 세포 독성을 감소시키고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는
a. IgG1 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L234A/L235A, P329G, L234A/L235A/P329G, G236R/L328R, D265A, N297A, N297Q, N297G 또는 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고,
b. IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L235E, F234A/L235A, F234A/L235A/P329G, P329G, S228P/L235E, S228P/F234A/L235A 또는 E233P/F234V/L235A/D265A/R409K 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고,
c. IgG2 (IgG2a 또는 IgG2b) 및 IgG4 하이브리드 또는 이의 기능적 변이체이며 IgG2의 CH1 및 힌지 영역 (hinge region)을 포함하고, CH2 및 CH3 영역은 IgG4(IgG2 아미노산 118 내지 260 및 IgG4 아미노산 261 내지 447)로부터 유래하고, 또는
d. IgG2 항체 또는 이의 기능적 변이체이며, H268Q/V309L/A330S/P331S 또는 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고,
상기 번호는 EU 번호에 따른다.
3. 실시예 2의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는
(a) IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L235E 돌연변이를 포함하고, 또는
(b) IgG1 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
4. 실시예 1 내지 3 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 이종이합체 Fc 도메인 (heterodimeric Fc domain)은 KiH, KiHS-S, HA-TF, ZW1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTS-S, SEED 및 A107 중에서 선택되며, 바람직하게는 KiH이다.
5. 실시예 1 내지 4 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 이종이합체 Fc 도메인은, 동종이합체 (homodimeric) Fc 도메인을 가진 면역 사이토카인에 비해, 세포 배양에서 발현 시 면역 사이토카인의 더 높은 수율을 나타낸다.
6. 실시예 1 내지 5 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 면역 사이토카인의 반감기는 증가되고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 IgG1 또는 IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 M252Y/S254T/T256E, M428L/N434S 또는 T250Q/M428L 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고, 상기 번호는 EU 번호에 따른다.
7. 실시예 1 내지 5 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 감소된 항체 의존성 세포 독성을 가지고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L235E 돌연변이 및 KiH 이합체화된 (heterodimerized) Fc 도메인을 포함한다.
8. 실시예 1 내지 7 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 접합체는 N- 내지 C- 말단 순서로, IL-15Rα 스시 도메인 또는 이의 유도체, 링커 및 IL-15 또는 이의 유도체를 포함하는 융합 단백질이고, 바람직하게는 상기 IL-15Rα 스시 도메인은 서열 번호 5의 서열을 포함하며, 상기 링커는 18 내지 22 아미노산의 길이를 가지고 바람직하게는 글리신 (glysines) 또는 세린 및 글리신 (serines and glycines)으로 구성되며, 더욱 바람직하게는 서열번호 7의 서열을 가지고, 바람직하게는 상기 IL-15는 서열번호 2의 서열을 갖는다.
9. 실시예 1 내지 8 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 사이토카인 도메인은 서열번호 10의 서열을 포함하고; 및
상기 항체는 다음을 포함한다:
i. 서열번호 20의 중쇄 노브 서열 (heavy chain 노브 sequence)
ii. 서열번호 22 또는 서열번호 101, 바람직하게는 서열번호 101의 중쇄 홀 서열 (heavy chain 홀 sequence), 및
iii) 서열번호 16의 경쇄 서열을 항체
상기 사이토카인 도메인은 링커 없이 C-말단 중쇄 노브 서열에 융합된다.
본 발명의 또 다른 측면은 다음 실시예에서 설명한다:
1. 다음을 포함하는 면역 사이토카인:
a. 인터루킨 15 (interleukin 15, IL-15) 또는 이의 유도체 (derivative)를 포함하는 폴리펩타이드 (polypeptide)와 인터루킨 15-수용체 알파 (interleukin 15-receptor alpha, IL-15Rα) 또는 이의 유도체의 스시 도메인 (sushi domain), 및
b. 클라우딘18.2 항체 또는 이의 기능적 변이체,
상기 항체 또는 기능적 변이체는 다음을 특징으로 한다:
i. 이종이합체 Fc 도메인 (heterodimeric Fc domain),
ii. 변형된 이펙터 기능 (modified effector function), 및/또는
iii. 증가된 생체 내 (in vivo) 반감기 (half-life)
상기 접합체는 양쪽 항체 중쇄 또는 항체 경쇄 (both antibody heavy chains or light chains)의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 융합되거나, i.의 경우, 하나의 항체 중쇄의 C-말단에 융합된다.
2. 실시예 1의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 변형된 이펙터 기능은 항체 의존성 세포 독성을 감소시키고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는:
a. IgG1 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S298A/E333A/K334A, K392T/P396L, V264I/I332E 또는 L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A 중에서 선택되는 돌연변이를 포함하고,
바람직하게는 하나의 중쇄에 S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S298A/E333A/K334A, K392T/P396L, V264I/I332E 중에서 선택되는 돌연변이를 포함하고, 반대쪽 중쇄에 D270E/K326D/A330M/K334E 돌연변이를 추가로 포함하고, 및/또는
b. 아푸코실화된 (afucosylated) IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이고, 상기 번호는 EU 번호에 따른다.
3. 실시예 1 내지 2 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 이종이합체 Fc 도메인 (heterodimeric Fc domain)은 KiH, KiHS-S, HA-TF, ZW1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTS-S, SEED 및 A107 중에서 선택되며, 바람직하게는 KiH이다.
4. 실시예 1 내지 2 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 이종이합체 Fc 도메인은, 동종이합체 (homodimeric) Fc 도메인을 가진 면역 사이토카인에 비해, 세포 배양에서 발현 시 면역 사이토카인의 더 높은 수율을 나타낸다.
5. 실시예 1 내지 4 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 면역 사이토카인의 반감기는 증가되고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 IgG1 또는 IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 M252Y/S254T/T256E, M428L/N434S 또는 T250Q/M428L 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고, 상기 번호는 EU 번호에 따른다.
6. 실시예 1 내지 5 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 접합체는 N- 내지 C- 말단 순서로, IL-15Rα 스시 도메인 또는 이의 유도체, 링커 및 IL-15 또는 이의 유도체를 포함하는 융합 단백질이고, 바람직하게는 상기 IL-15Rα 스시 도메인은 서열 번호 5의 서열을 포함하며, 상기 링커는 18 내지 22 아미노산의 길이를 가지고 바람직하게는 글리신 (glysines) 또는 세린 및 글리신 (serines and glycines)으로 구성되며, 더욱 바람직하게는 서열번호 7의 서열을 가지고, 바람직하게는 상기 IL-15는 서열번호 2의 서열을 갖는다.
7. 실시예 1 내지 6 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 접합체는 서열번호 10 또는 서열번호 11을 포함하며, 항체는 표 4의 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 항-CLDN18.2 이종이합체 IgG1 항체 변이체, 표 3의 KiH 돌연변이를 통해 이종이합체화되는 IgG1 변이체, 표 2의 DE, DLE, AAA, TL 또는 IE 돌연변이 또는 아푸코실화를 통해 또는 상기 열거된 돌연변이와 아푸코실화의 조합을 통해 ADCC 활성이 강화된 IgG1 변이체이다.
8. 실시예 1 내지 7 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 접합체는 서열번호 10 또는 서열번호 11을 포함하며, 항체는 각각 서열번호 46 및 서열 번호 47의 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 항-CLDN18.2 이합체 IgG1 항체 변이체이고, 표 3의 KiH 돌연변이를 통해 이종이합체화되고, 표 2의 DE, DLE, AAA, TL 또는 IE 돌연변이를 통해 또는 아푸코실화를 통해 또는 상기 나열된 돌연변이와 아푸코실화의 조합을 통해 ADCC 활성이 강화된 IgG1 변이체이다.
9. 실시예 1 내지 7 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 접합체는 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열을 포함하며, 항체는 각각 서열번호 46 및 서열 번호 47의 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 항-CLDN18.2 이종이합체 IgG1 항체 변이체이고, 표 3의 KiH 돌연변이를 통해 이종이합체화된 IgG1 변이체는 아푸코실화를 통해 강화된 ADCC 활성을 갖는다.
10. 실시예 1 내지 7 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 접합체는 서열번호 11의 서열을 포함하고, 항체 변이체는 서열번호 84의 중쇄 노브 서열, 서열번호 87의 중쇄 홀 서열 및 서열번호 88의 경쇄 서열을 갖는 이종이합체 IgG1 항-CLDN18.2 항체이다.
11. 실시예 1 내지 7 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 접합체는 서열번호 10의 서열을 포함하고, 항체 변이체는 서열번호 84의 중쇄 노브 서열, 서열번호 87의 중쇄 홀 서열 및 서열번호 88의 경쇄 서열을 갖는 이종이합체 IgG1 항-CLDN18.2 항체이다.
12. 실시예 1 내지 7 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 접합체는 서열번호 10의 서열을 포함하고, 항체는 각각 서열번호 46 및 서열번호 47의 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 항-CLDN18.2 이종이합체 IgG1 항체 변이체이며, 상기 IgG1 변이체는 표 3의 KiH 변이를 통한 이종이합체이고, IgG1 Fc 도메인에 S239D/I332E(DE) ADCC-enhancing 변이를 갖는 항체이다.
13. 실시예 1 내지 7 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인에 있어서, 상기 접합체는 서열번호 11의 서열을 포함하고, 항체는 각각 서열번호 46 및 서열번호 47의 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 항-CLDN18.2 이종이합체 IgG1 항체 변이체이며, 상기 IgG1 변이체는 표 3의 KiH 변이를 통한 이종이합체이고, IgG1 Fc 도메인에 S239D/I332E(DE) ADCC-enhancing 변이를 갖는 항체이다.
14. 서열번호 85 (“HC 노브”), 서열번호 87 (“HC 홀”) 및 서열번호 88 (LC) 서열의 면역 사이토카인.
15. 서열번호 86 (“HC 노브”), 서열번호 87 (“HC 홀”) 및 서열번호 88 (LC) 서열의 면역 사이토카인.
SEQUENCE LISTING <110> CYTUNE PHARMA SOTIO Biotech a.s. <120> Interleukin-15 based immunocytokines <130> C10974WO <150> EP21181271.4 <151> 2021-06-23 <150> EP22163748.1 <151> 2022-03-23 <160> 140 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met 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Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser 180 185 190 Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn 195 200 205 Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro 210 215 220 Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys 245 250 255 Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn 275 280 285 Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg 340 345 350 Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp 370 375 380 Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser 405 410 415 Glu Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser 420 425 430 Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Asp Ser 435 440 445 Phe Ser Arg Thr Pro Gly 450 <210> 134 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mSOT202 isotype LC <400> 134 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Arg 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 135 <211> 665 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mSOT202 isotype LALAPG HC knob <400> 135 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Asn Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr 115 120 125 Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr 130 135 140 Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser 180 185 190 Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn 195 200 205 Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro 210 215 220 Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Asn Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys 245 250 255 Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn 275 280 285 Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu 325 330 335 Gly Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg 340 345 350 Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Lys Glu Met Thr Lys 355 360 365 Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp 370 375 380 Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Asn Thr Glu Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser 420 425 430 Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser 435 440 445 Phe Ser Arg Thr Pro Gly Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu 450 455 460 His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg 465 470 475 480 Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu 485 490 495 Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr 500 505 510 Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro 515 520 525 Ala Pro Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 530 535 540 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu 545 550 555 560 Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu 565 570 575 Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys 580 585 590 Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala 595 600 605 Ser Ile His Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser 610 615 620 Leu Ser Ser Asn Ala Gln Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu 625 630 635 640 Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His 645 650 655 Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser 660 665 <210> 136 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mSOT202 isotype LALAPG HC hole <400> 136 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Asn Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr 115 120 125 Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr 130 135 140 Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser 180 185 190 Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn 195 200 205 Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro 210 215 220 Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Asn Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys 245 250 255 Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn 275 280 285 Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu 325 330 335 Gly Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg 340 345 350 Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp 370 375 380 Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser 405 410 415 Glu Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser 420 425 430 Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Asp Ser 435 440 445 Phe Ser Arg Thr Pro Gly 450 <210> 137 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLI-15AQ peptide <400> 137 Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp 1 5 10 15 Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Gln Val 35 <210> 138 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLI-15AQA peptide <400> 138 Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp 1 5 10 15 Thr Val Glu Ala Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Gln Val 35 <210> 139 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLI-15 NA peptide <400> 139 Val Glu Ala Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly 1 5 10 15 Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys 20 25 30 <210> 140 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLI-15AQA peptide <400> 140 Val Glu Ala Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Ala 1 5 10 15 Gln Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys 20 25 30

Claims (17)

  1. a. 인터루킨 15 (interleukin 15, IL-15) 또는 이의 유도체 (derivative)를 포함하는 폴리펩타이드 (polypeptide)와 인터루킨 15-수용체 알파 (interleukin 15-receptor alpha, IL-15Rα) 또는 이의 유도체의 스시 도메인 (sushi domain)을 포함하되,
    상기 IL-15 유도체는 IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이 (mutation)를 포함하는 접합체 (conjugate), 및
    b. 항체 또는 항체의 기능적 변이체 (variant)를 포함하는 면역 사이토카인 (immunocytokine)으로,
    상기 항체의 기능적 변이체는,
    i. 이종이합체 Fc 도메인 (heterodimeric Fc domain),
    ii. 변형된 이펙터 기능 (modified effector function), 및/또는
    iii. 증가된 생체 내 (in vivo) 반감기 (half-life)를 특징으로 하는 항체이고,
    상기 접합체는 양쪽 항체 중쇄 또는 항체 경쇄 (both antibody heavy chains or light chains)의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 융합되거나, i.의 경우, 하나의 항체 중쇄의 C-말단에 융합되는 면역 사이토카인.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역 사이토카인은 항체의 기능적 변이체를 포함하는 면역 사이토카인.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변형된 이펙터 기능은 항체 의존성 세포 독성을 감소시키고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는
    a. IgG1 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L234A/L235A, P329G, L234A/L235A/P329G, G236R/L328R, D265A, N297A, N297Q, N297G 또는 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고,
    b. IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L235E, F234A/L235A, F234A/L235A/P329G, P329G, S228P/L235E, S228P/F234A/L235A 또는 E233P/F234V/L235A/D265A/R409K 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고,
    c. IgG2 (IgG2a 또는 IgG2b) 및 IgG4 하이브리드 또는 이의 기능적 변이체이며 IgG2의 CH1 및 힌지 영역 (hinge region)을 포함하고, CH2 및 CH3 영역은 IgG4 (IgG2 아미노산 118 내지 260 및 IgG4 아미노산 261 내지 447)로부터 유래하고, 또는
    d. IgG2 항체 또는 이의 기능적 변이체이며, H268Q/V309L/A330S/P331S 또는 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고,
    상기 번호는 EU 번호에 따르는 면역 사이토카인.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는
    (a) IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L235E 돌연변이를 포함하고, 또는
    (b) IgG1 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L234A/L235A 돌연변이를 포함하는 면역 사이토카인.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변형된 이펙터 기능은 항체 의존성 세포 독성을 향상시키고, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는:
    a. IgG1 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S298A/E333A/K334A, K392T/P396L, V264I/I332E 또는 L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A 중에서 선택되는 돌연변이를 포함하고,
    바람직하게는 하나의 중쇄에 S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S298A/E333A/K334A, K392T/P396L, V264I/I332E 중에서 선택되는 돌연변이를 포함하고, 반대쪽 중쇄에 D270E/K326D/A330M/K334E 돌연변이를 추가로 포함하고, 및/또는
    b. 아푸코실화된 (afucosylated) IgG1, IgG2 또는 IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이고,
    상기 번호는 EU 번호에 따르는 면역 사이토카인.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이합체 Fc 도메인 (heterodimeric Fc domain)은 KiH, KiHS-S, HA-TF, ZW1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTS-S, SEED 및 A107 중에서 선택되며, 바람직하게는 KiH인 면역 사이토카인.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이합체 Fc 도메인은, 동종이합체 (homodimeric) Fc 도메인을 가진 면역 사이토카인에 비해, 세포 배양에서 발현 시 면역 사이토카인의 더 높은 수율을 나타내는 면역 사이토카인.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 사이토카인의 반감기는 증가되고,
    상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 IgG1 또는 IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 M252Y/S254T/T256E, M428L/N434S 또는 T250Q/M428L 중에서 선택된 돌연변이를 포함하고,
    상기 번호는 EU 번호에 따르는 면역 사이토카인.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 감소된 항체 의존성 세포 독성을 가지고,
    상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는 IgG4 항체 또는 이의 기능적 변이체이며 L235E 돌연변이 및 KiH 이합체화된 (heterodimerized) Fc 도메인을 포함하는 면역 사이토카인.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 N- 내지 C- 말단 순서로, IL-15Rα 스시 도메인 또는 이의 유도체, 링커 및 IL-15 또는 이의 유도체를 포함하는 융합 단백질이고, 바람직하게는 상기 IL-15Rα 스시 도메인은 서열 번호 5의 서열을 포함하며,
    상기 링커는 18 내지 22 아미노산의 길이를 가지고 바람직하게는 글리신 (glysines) 또는 세린 및 글리신 (serines and glycines)으로 구성되며, 더욱 바람직하게는 서열번호 7의 서열을 가지고, 바람직하게는 상기 IL-15는 서열번호 2의 서열을 갖는 면역 사이토카인.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-15 변이체는,
    a. 번역 후 변형 (post-translational modifications)과 관련하여 IL-15 변이체의 균질성(homogeneity)을 증가시키는 적어도 하나의 돌연변이로서,
    바람직하게는 상기 돌연변이는 IL-15 (서열번호 2)의 N77에서의 탈아미드화 (deamidation) 및/또는 N79에서의 글리코실화 (glycosylation)를 감소시키고,
    더욱 바람직하게는 상기 돌연변이는 G78A, G78V, G78L or G78I, 및 N79Q, N79S 또는 N79T 중에서 선택된 돌연변이이며,
    가장 바람직하게는 상기 돌연변이는 G78A/N79Q인 돌연변이; 및/또는
    b. IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이로서,
    상기 돌연변이 아미노산 (mutated amino acid)은 IL-15 (서열번호 2)의 N1, N4, S7, D8, K10, K11, D30, D61, E64, N65, L69, N72, E92, Q101, Q108, I111 중에서 선택되고, 바람직하게는 상기 돌연변이 아미노산은 D61, N65 및 Q101 중에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 상기 돌연변이 아미노산은 N65인 돌연변이를 포함하는 면역 사이토카인.
  12. 제11항에 있어서, 상기 IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이는 N1D, N1A, N1G, N4D, S7Y, S7A, D8A, D8N, K10A, K11A, D30N, D61A, D61N, E64Q, N65D, N65A, N65E, N65R, N65K, L69R, N72R, Q101D, Q101E, Q108D, Q108A, Q108E 및 Q108R 중에서 선택되고, 바람직하게는 D8A, D8N, D61A, D61N, N65A, N65D, N72R, Q101D, Q101E 및 Q108A 중에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 D61A, N65A 및 Q101D 중에서 선택되는 치환(substitution)이고, 가장 바람직하게는 N65A에서 선택되는 치환 또는 D8N/N65A, D61A/N65A 또는 D61A/N65A/Q101D 중에서 선택되는 결합된 치환(combined substitution)인 면역 사이토카인.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 변이체는,
    a. 종양 항원 (tumor antigen), 바람직하게는 EGFR, HER2, FGFR2, FOLR1, CLDN18.2, CEA, GD2, O-아세틸-GD-2 (O-Acetyl-GD-2), GM1, CAIX, EPCAM, MUC1, PSMA, c-MET, ROR1, GPC3, CD19, CD20, CD38 중에서 선택되는 종양 항원과 결합하고;
    b. 종양 세포외 기질 항원 (tumor extracellular matrix antigen), 바람직하게는 FAP, 피브로넥틴 (fibronectin)의 EDA 도메인, 피브로넥틴의 EDB 도메인 및 LRRC15, 바람직하게는 FAP 및 피브로넥틴의 EDB 도메인 중에서 선택된 종양 세포외 기질 항원에 결합하며;
    c. 신생 혈관 형성 항원 (neovascularization antigen), 바람직하게는 VEGF 또는 엔도글린 (Endoglin)에 결합하고;
    d. 면역 조절 항체 또는 이의 기능적 변이체이되,
    상기 면역 조절 항체는 공동 자극 수용체 (co-stimulatory receptor), 바람직하게는 CD40 작용제, CD137/4-1BB 작용제, CD134/OX40 작용제 및 TNFRSF18/GITR 작용제 중에서 선택되는 공동 자극 수용체를 자극하고, 또는
    상기 면역 조절 항체는 면역 억제 수용체, 바람직하게는 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG3 길항제, TIGIT 길항제, 억제성 KIRs 길항제, BTLA 길항제, HAVCR2 길항제 및 ADORA2A 길항제 중에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 PD-1 길항제인 면역 억제 수용체를 억제하는 면역 사이토카인.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 사이토카인 도메인은 서열번호 10의 서열을 포함하고; 및
    상기 항체는
    i. 서열번호 20의 중쇄 노브 서열 (heavy chain 노브 sequence)
    ii. 서열번호 22 또는 서열번호 101, 바람직하게는 서열번호 101의 중쇄 홀 서열 (heavy chain 홀 sequence), 및
    iii) 서열번호 16의 경쇄 서열을 항체로 포함하며,
    상기 사이토카인 도메인은 링커 없이 C-말단 중쇄 노브 서열에 융합된 면역 사이토카인.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 사이토카인 도메인은 서열번호 10의 서열을 포함하고; 및
    상기 항체는
    i. 서열번호 84의 중쇄 노브 서열
    ii. 서열번호 87의 중쇄 홀 서열, 및
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