EA037557B1 - Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства tnf - Google Patents

Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства tnf Download PDF

Info

Publication number
EA037557B1
EA037557B1 EA201791057A EA201791057A EA037557B1 EA 037557 B1 EA037557 B1 EA 037557B1 EA 201791057 A EA201791057 A EA 201791057A EA 201791057 A EA201791057 A EA 201791057A EA 037557 B1 EA037557 B1 EA 037557B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
domain
heavy chain
Prior art date
Application number
EA201791057A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201791057A1 (ru
Inventor
Мария Аманн
Петер Брюнкер
Кристина Клаус
Клаудиа Феррара-Коллер
Зандра Грау-Рихардс
Кристиан Кляйн
Виктор Левитски
Эккехард Мёсснер
Йёрг Томас Регула
Пабло Умана
Original Assignee
Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54695680&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA037557(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of EA201791057A1 publication Critical patent/EA201791057A1/ru
Publication of EA037557B1 publication Critical patent/EA037557B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2815—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

В изобретении описаны новые содержащие тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающие молекулы, которые содержат: (а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, отличающиеся тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к новым антигенсвязывающим молекулам, содержащим тримерный лиганд семейства TNF, которые содержат: (а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, при этом антигенсвязывающие молекулы отличаются тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и отличаются тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент. Изобретение относится также к способам получения указанных молекул и способам их применения.
Предпосылки создания изобретения
Лиганды, взаимодействующие с молекулами из суперсемейства рецептора TNF (фактор некроза опухоли), играют основные роли в организации и функции иммунной системы. Несмотря на то что они регулируют нормальные функции, такие как иммунные ответы, гематопоэз и морфогенез, лиганды семейства TNF (которые называют также цитокинами), участвуют в онкогенезе, отторжении трансплантатов, септическом шоке, репликации вирусов, ревматоидном артрите и диабете (Aggarwal, 2003). Семейство лигандов TNF содержит 18 генов, которые кодируют 19 трансмембранных белков типа II (т.е. внутриклеточных N-концевых и внеклеточных С-концевых), отличающихся присутствием консервативного С-концевого домена, обозначенного как домен гомологии TNF (THD). Указанный домен ответствен за связывание с рецептором и поэтому имеет решающее значение для биологической активности представителей семейства лигандов TNF. Идентичность последовательностей между представителями семейства составляет ~20-30% (Bodmer, 2002). Представители семейства лигандов TNF проявляют свою биологическую функцию в виде образовавшихся в результате самосборки нековалентных тримеров (Banner и др., Cell, 73, 1993, сс. 431-445). Так, представители семейства лигандов TNF образуют тример, который обладает способностью связываться с соответствующими рецепторами суперсемейства TNFR и активировать их.
4-1ВВ (CD137), представитель суперсемейства TNF-рецепторов, впервые был идентифицирован в качестве молекулы, экспрессия которой индуцируется Т-клеточной активацией (Kwon и Weissman, 1989). В последующих исследованиях продемонстрирована экспрессия 4-1ВВ в Т- и В-лимфоцитах (Snell и др., 2011; Zhang и др., 2010), NK-клетках (Lin и др., 2008), NKT-клетках (Kim и др., 2008), моноцитах (Kienzle и von Kempis, 2000; Schwarz и др., 1995), нейтрофилах (Heinisch и др., 2000), тучных клетках (Nishimoto и др., 2005) и дендритных клетках, а также в клетках негематопоэтического происхождения, таких как эндотелиальные клетки и клетки гладких мышц (Broil и др., 2001; Olofsson и др., 2008). Экспрессия 4-1ВВ в различных типах клеток является в значительной степени индуцибельной и запускается различными стимуляторными сигналами, такими как сигналы, которые запускаются Т-клеточным рецептором (TCR) или В-клеточным рецептором, а также передачей сигналов, индуцируемой костимуляторными молекулами или рецепторами провоспалительных цитокинов (Diehl и др., 2002; von Kempis и др., 1997; Zhang и др., 2010).
Экспрессия лиганда для 4-1ВВ (4-1BBL или CD137L) является более ограниченной и встречается на специализированных антигенпрезентующих клетках (АРС), таких как В-клетки, дендритные клетки (DC) и макрофаги. Индуцибельная экспрессия 4-1BBL характерна для Т-клеток, включая как αβ-, так и γδсубпопуляции Т-клеток, и эндотелиальных клеток (см. обзор Shao и Schwarz, 2011).
Известно, что передача сигналов CD137 стимулирует секрецию IFNy и пролиферацию NK-клеток (Buechele и др., 2012; Lin и др., 2008; Melero и др., 1998), а также повышает активацию DC, что продемонстрировано по их увеличенной выживаемости и способности секретировать цитокины и осуществлять повышающую регуляцию костимуляторных молекул (Choi и др., 2009; Futagawa и др., 2002; Wilcox и др., 2002). Однако CD137 наиболее хорошо охарактеризован в качестве костимуляторной молекулы, которая модулирует индуцируемую TCR активацию как CD4'-. так и CD8+-субпопуляций Т клеток. В сочетании с осуществляемой TCR стимуляцией агонистические 4-1ВВ-специфические антитела повышают пролиферацию Т-клеток, стимулируют секрецию лимфокинов и понижают чувствительность Тлимфоцитов к индуцированной активации смерти клеток (обобщено в обзоре Snell и др., 2011).
В соответствии с указанными костимуляторными действиями антител к 4-1ВВ на Т-клетки in vitro, их введение несущим опухоли мышам приводило к эффективным противоопухолевым действиям на многих экспериментальных моделях опухолей (Melero и др., 1997; Narazaki и др., 2010). Однако 4-1ВВ, как правило, проявляет действие в качестве противоопухолевого агента только при введении в комбинации с другими иммуномодуляторами (Curran и др., 2011; Guo и др., 2013; Morales-Kastresana и др., 2013; Teng и др., 2009; Wei и др., 2013), химиотерапевтическими реагентами (Ju и др., 2008; Kim и др., 2009), в сочетании со специфической для опухоли вакцинацией (Cuadros и др., 2005; Lee и др., 2011) или лучевой терапией (Shi and Siemann, 2006). В экспериментах по истощению in vivo продемонстрировано, что CD8+-Т-клетки играют наиболее решающую роль в противоопухолевом воздействии 4-1ВВспецифических антител. Однако в зависимости от модели опухоли или комбинированной терапии, которая включает антитело к 4-1ВВ, описано участие других типов клеток, таких как DC, NK-клетки или CD4+-Т-клетки (Melero и др., 1997; Murillo и др., 2009; Narazaki и др., 2010; Stagg и др., 2011).
- 1 037557
Помимо их непосредственных воздействий на различные субпопуляции лимфоцитов, агонисты 41ВВ могут также индуцировать инфильтрацию и удерживание активированных Т-клеток в опухоли посредством опосредуемой 4-1ВВ повышающей регуляции молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM1) и адгезивной молекулы сосудистых клеток 1 (VCAM1) на сосудистом эндотелии опухоли (Palazon и др.,
2011).
Стимуляция 4-1ВВ может также обращать состояние Т-клеточной анергии, индуцированное экспозицией растворимого антигена, что может вносить вклад в нарушение иммунологической толерантности в микроокружении опухоли или при хронических инфекциях (Wilcox и др., 2004).
По видимому, для проявления иммуномодулирующих свойств агонистических антител к 4-1ВВ in vivo требуется присутствие Fc-области дикого типа в молекуле антитела, что свидетельствует о том, что связывание с Fc-рецептора является важным событием, необходимым для фармакологической активности указанных реагентов, что описано для агонистических антител, специфических в отношении других индуцирующих апоптоз или иммуномодулирующих представителей TNFR-суперсемейства (Li и Ravetch, 2011; Teng и др., 2009). Однако системное введение 4-1ВВ-специфических агонистических антител с функционально активным Fc-доменом индуцирует также экспансию CD8+-Т-клеток, с которой ассоциирована токсичность для печени (Dubrot и др., 2010), что снижается или практически элиминируется в отсутствии функциональных Fc-рецепторов у мышей. В клинических испытаниях на людях (ClinicalTrials.gov, NCT00309023), Fc-компетентные агонистические антитела к 4-1ВВ (BMS-663513) при их введении один раз каждые три недели в течение 12 недель индуцировали стабилизацию болезни у пациентов с меланомой, раком яичника или почечно-клеточной карциномой. Однако это же антитело в другом испытании (NCT00612664) вызывало гепатит 4-й степени, что привело к прекращению испытания (Simeone и Ascierto, 2012).
В целом, доступные результаты доклинических и клинических испытаний четко демонстрируют, что существует значительная клиническая потребность в эффективных агонистах 4-1ВВ. Однако новое поколение перспективных лекарственных средств должно не только эффективно привлекать 4-1ВВ к поверхности гематопоэтических и эндотелиальных клеток, но также должно обладать способностью достигать этого посредством механизмов отличных от связывания с Fc-рецепторами во избежание неконтролируемых побочных действий. Выполнение последнего условия можно обеспечивать посредством преимущественного связывания со специфическими для опухолей или ассоциированными с тканями фрагментами и олигомеризации.
Были созданы слитые белки, состоящие из одного внеклеточного домена лиганда для 4-1ВВ и фрагмента одноцепочечного антитела (Mueller и др., 2008; Hornig и др., 2012) или одного лиганда для 41ВВ, слитого с С-концом тяжелой цепи (Zhang и др., 2007). В WO 2010/010051 описано создание слитых белков, которые состоят из трех эктодоменов лиганда TNF, сцепленных друг с другом и слитых с участком антитела.
Однако все еще существует потребность в новых антигенсвязывающих молекулах, которые объединяют фрагмент, который обладает способностью связываться преимущественно со специфическими для опухолей или ассоциированными с опухолевыми тканями мишенями, с фрагментом, который обладает способностью образовывать костимуляторный тримерный лиганд TNF, и которые обладают достаточной стабильностью, позволяющей применять их в фармацевтике. Антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат оба указанных компонента и, как неожиданно было установлено, они содержат тримерный и поэтому биологически активный лиганд TNF, хотя один из образующих тримерный лиганд TNF эктодоменов локализован на полипептиде, отличном от полипептида, на котором расположены два других эктодомена в молекуле лиганда TNF.
Краткое изложение сущности изобретения
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного предста- 2 037557 вителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, и (в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц, которые обладают способностью к стабильной ассоциации.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что:
(I) первый полипептид содержит СН1- или CL-домен и второй полипептид содержит CL- или СН1домен соответственно, при этом второй полипептид сцеплен с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1- и CL-доменом и при этом первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с СН1- или CL-доменом пептидным линкером, и при этом второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который соединен пептидным линкером с CL- или СН1доменом указанного полипептида, или (II) первый полипептид содержит СН3-домен, и второй полипептид содержит СН3-домен соответственно, и при этом первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с С-концом СН3-домена пептидным линкером, и при этом второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который соединен пептидным линкером с С-концом СН3-домена указанного полипептида, или (III) первый полипептид содержит VH-CL- или VL-CH1-домен и второй полипептид содержит VLCH1-домен или VH-CL-домен соответственно, при этом второй полипептид сцеплен с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1- и CL-доменом, и при этом первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с VH или VL пептидным линкером, и при этом второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, соединенный через пептидный линкер с VL или VH указанного полипептида.
В конкретном объекте изобретения представитель семейства лигандов TNF представляет собой лиганд, который костимулирует активацию человеческих Т-клеток. Таким образом, антигенсвязывающая молекула, которая содержит тримерный лиганд семейства TNF, содержит: (а) по меньшей мере один фрагмент, который обладает способностью специфическим связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, где представитель семейства лигандов TNF костимулирует активацию человеческих Т-клеток. Более конкретно, представителя семейства лигандов TNF выбирают из 4-1BBL и OX40L.
В одном из объектов изобретения представителем семейства лигандов TNF является 4-1BBL.
В следующем объекте изобретения эктодомен представителя семейства лигандов TNF содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 и SEQ ID NO: 375, прежде всего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 96.
В другом объекте изобретения эктодомен представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 96, прежде всего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 96. Более конкретно эктодомен представителя семейства лигандов TNF содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с анти- 3 037557 геном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 183.
Еще одним объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97 и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 184 или SEQ ID NO: 185.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый полипептид, который содержит СН1- или CL-домен, и второй полипептид, который содержит CL- или СН1-домен соответственно, при этом второй полипептид сцеплен с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1- и CL-доменом, и где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом и с СН1- или CL-доменом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который соединен пептидным линкером с CL- или СН1-доменом указанного полипептида.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый полипептид, который содержит СН1-домен, и второй полипептид, который содержит CL-домен, при этом второй полипептид сцеплен с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1- и CL-доменом, и где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с СН1-доменом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который соединен пептидным линкером с CLдоменом указанного полипептида.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый полипептид, который содержит CL-домен, и второй полипептид, который содержит СН1-домен, при этом второй полипептид сцеплен с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1- и CL-доменом, и где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с CL-доменом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который соединен пептидным линкером с СН1-доменом указанного полипептида.
Следующим объектом изобретения является указанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, выбирают из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела и антигенсвязывающего белка-каркаса (скаффолд-белок).
Одним из объектов изобретения является указанная выше антигенсвязывающая молекула, содер- 4 037557 жащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, представляет собой фрагмент антитела.
В частности, участок, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клеткимишени, выбирают из группы, состоящей из фрагмента антитела, молекулы Fab, кроссовер-молекулы Fab, одноцепочечной молекулы Fab, молекулы Fv, молекулы scFv, однодоменного антитела, aVH и антигенсвязывающего белка-каркаса.
Одним из объектов изобретения является указанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, представляет собой антигенсвязывающий белок-каркас.
В изобретении предложена указанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени.
В изобретении предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени. Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит один участок, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени. Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит два участка, обладающих способностью специфически связываться с антигеном клеткимишени.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, где антиген клетки-мишени выбирают из группы, включающей фибробласт-активирующий белок (FAP), карциноэмбриональный антиген (СЕА), ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD19, CD20 и CD33.
В конкретном объекте изобретения антиген клетки-мишени представляет собой фибробластактивирующий белок (FAP).
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит VH-домен, который содержит (I) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 100, (II) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 101, и (III) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 102, и VL-домен, который содержит (IV) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 103, (V) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 104, и (VI) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 105.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит VH-домен, который содержит (I) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, (II) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (III) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и VL-домен, который содержит (IV) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, (V) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (VI) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит VH-домен, который содержит (I) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100, (II) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 101, и (III) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 102, и VL-домен, который содержит (IV) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, (V) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, и (VI) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105.
Одним из объектов изобретения является указанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107.
Следующим объектом изобретения является предлагаемая в изобретении антигенсвязывающая мо- 5 037557 лекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, соединенные друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на его С-конце с СН1- или CL-доменом тяжелой цепи с помощью второго пептидного линкера, и в которой один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент слит на его С-конце с CL- или СН1-доменом легкой цепи с помощью третьего пептидного линкера.
Конкретным объектом изобретения является указанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой пептидный линкер представляет собой (G4S)2, т.е. пептидный линкер, имеющий SEQ ID NO: 13. В одном из объектов изобретения первый пептидный линкер представляет собой (G4S)2, второй пептидный линкер представляет собой GSPGSSSSGS (SEQ ID NO: 57) и третий пептидный линкер представляет собой (G4S)2. В другом объекте изобретения первый, второй и третий пептидные линкеры представляют собой (G4S)2.
Изобретение относится также к указанной выше антигенсвязывающей молекуле, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит Fc-домен, состоящей из первой и второй субъединиц, обладающих способностью к стабильной ассоциации.
В частности, предлагаемая в изобретении антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит (в) Fc-домен, состоящей из первой и второй субъединиц, обладающих способностью к стабильной ассоциации, содержит также (а) молекулу Fab, которая обладает способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, в которой тяжелая цепь Fab слита на С-конце с N-концом СН2-домена в Fc-домене.
В следующем объекте изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG, прежде всего Fcдомен IgG1 или Fc-домен IgG4. Более предпочтительно Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG1. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен содержит модификацию, усиливающую ассоциацию первой и второй субъединиц Fc-домена.
Другим объектом изобретения является указанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит (в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц, обладающих способностью к стабильной ассоциации, в которой Fc-домен содержит одну или несколько аминокислотную(ых) замену(н), которая(ые) снижает(ют) связывание с Fc-рецептором, прежде всего с FcY-рецептором.
В частности, Fc-домен содержит аминокислотные замены в положениях 234 и 235 (EU-нумерация) и/или 329 (EU-нумерация) тяжелых цепей IgG. Более конкретно, описана антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, которая содержит Fc-домен IgG1 с аминокислотными заменами L234A, L235A и P329G (EU-нумерация).
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, обе образующие молекулу Fab, которая обладает способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слитый на его Сконце с помощью второго пептидного линкера со второй тяжелой или легкой цепью, и второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF, слитый на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера со второй легкой или тяжелой цепью соответственно.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на его С-конце с помощью второго пептидного линкера с СН1-доменом, который является частью тяжелой цепи, а второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, слит на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера с CLдоменом, который является частью легкой цепи.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на его С-конце с помощью второго пептидного линкера с CL-доменом, который является частью легкой цепи, а второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, слит на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера с СН1доменом, который является частью тяжелой цепи.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на его С-конце с помощью второго пептидного линкера с VH-доменом, который является частью тяжелой цепи, а второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейст- 6 037557 ва лигандов TNF или его фрагмент, слит на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера с VLдоменом, который является частью легкой цепи.
Предложена также антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой в CL-домене, примыкающем к представителю семейства лигандов TNF, аминокислота в положении 123 (EU-нумерация) заменена на аргинин (R) и аминокислота в положении 124 (EU-нумерация) заменена на лизине (K) и в которой в СН1, примыкающем к представителю семейства лигандов TNF, аминокислоты в положении 147 (EU-нумерация) и в положении 213 (EU-нумерация) заменены на глутаминовую кислоту (Е).
Следующим объектом изобретения является описанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит:
(а) первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, обе образующие молекулу Fab, которая обладает способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени;
(б) вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит:
(а) молекулу Fab, которая обладает способностью специфически связываться с FAP; и (б) вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит участок, обладающий способностью специфически связываться с FAP. Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность of SEQ ID NO: 107, (II) вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 148, и (III) вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114 и SEQ ID NO: 115.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 173, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 174.
Еще одним объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит СН3-домен и второй полипептид содержит СН3-домен соответственно, и в которой первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с С-концом СН3-домена пептидным линкером, и в которой второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, соединенный через пептидный линкер с С-концом СН3-домена указанного полипептида.
В частности, указанная антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства
- 7 037557
TNF, содержит два участка, которые обладают способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит два участка, обладающих способностью специфически связываться с FAP. В частности, предложена описанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 121, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, или (II) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, или (III) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125.
Другим конкретным объектом изобретения является описанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антиген клетки-мишени представляет собой CD19.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с CD19, содержит VH-домен, который содержит (I) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 195 или SEQ ID NO: 252, (II) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 196 или SEQ ID NO: 253, и (III) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197 или SEQ ID NO: 254, и VL-домен, который содержит (IV) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 198 или SEQ ID NO: 249, (V) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 199 или SEQ ID NO: 250, и (VI) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 200 или SEQ ID NO: 251.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с CD19, содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202, или в которой участок, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202, или первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 113, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 и SEQ ID NO: 114.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202, или первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 173, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 174.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит два фрагмента, обладающих способностью специфически связываться с CD19. В частности, предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный ли- 8 037557 ганд семейства TNF, по одному из пп.1-14, 29, 30 и 32-34 формулы изобретения, где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 210, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, или (II) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 213, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 214, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, или (III) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 310, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 279, или (IV) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 313, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 314, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 279.
Другим конкретным объектом изобретения является описанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антиген клетки-мишени представляет собой СЕА.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с СЕА, содержит VH-домен, который содержит (I) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 321, (II) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 322, и (III) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 323, и VL-домен, который содержит (IV) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 324, (V) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 325, и (VI) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 326.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с СЕА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 113, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 и SEQ ID NO: 114.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 173, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 174.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит два фрагмента, обладающих способностью специфически связываться с СЕА. В частности, предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 337, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 338, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334, или (II) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 341, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334.
Следующим объектом изобретения является описанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где представителем семейства лигандов TNF является OX40L. Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой эктодомен представителя семейства лигандов TNF содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54, прежде всего аминокислотную
- 9 037557 последовательность SEQ ID NO: 53.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, по одному из пп.1-5, 10-24, 29, 30, 32-34, 38-40, 44 и 45 формулы изобретения, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 371 или SEQ ID: 372, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антиген клетки-мишени представляет собой фибробласт-активирующий белок (FAP), и фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит VH-домен, который содержит (I) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 100, (II) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 101, и (III) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 102, и VL-домен, который содержит (IV) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 103, (V) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 104, и (VI) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 105.
В частности, предложена описанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 355, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 356.
Другим объектом изобретения является выделенный полинуклеотид, который кодирует описанную выше антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF. Изобретение относится также к вектору, прежде всего экспрессионному вектору, который содержит выделенный полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, и к клетке-хозяину, которая содержит выделенный полинуклеотид или вектор, предлагаемый в изобретении. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, прежде всего клетку млекопитающего.
Другим объектом изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретение, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых (I) культивируют клетку, предлагаемую в изобретении, в условиях, пригодных для экспрессии антигенсвязывающей молекулы, и (II) выделяют антигенсвязывающую молекулу. Изобретение относится также к антигенсвязывающей молекуле, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, которая получена способом, предлагаемым в изобретении.
Изобретение относится также к фармацевтической композиции, которая содержит антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемую в изобретении, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
Под объем изобретения подпадает также антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, или фармацевтическая композиция, предлагаемая в изобретении, для применения в качестве лекарственного средства. Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, или фармацевтическая композиция, предлагаемая в изобретении, для применения для лечения заболевания у индивидуума, который нуждается в этом. В конкретном варианте осуществления изобретения предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, или фармацевтическая композиция, предлагаемая в изобретении, для применения для лечения рака.
Предложено также применение антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у индивидуума, который нуждается в этом, прежде всего для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, а также способ лечения заболевания у индивидуума, заключающийся в том, что вводят указанному индивидууму в терапевтически эффективном количестве композицию, которая содержит антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемую в изобретении, в фармацевтически приемлемой форме. В кон- 10 037557 кретном варианте осуществления изобретения заболевание представляет собой рак. В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения индивидуум предпочтительно представляет собой млекопитающее, прежде всего человека.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано на фиг. 1 - компоненты для сборки разделенных тримерных лигандов для человеческого 4-1ВВ. На фиг. (1А) показан димерный лиганд, слитый на С-конце с человеческим СН1- или CL-доменом или VLили VH-доменом, а на фиг. (1Б) показан мономерный лиганд, слитый с человеческим CL- или СН1доменом или VL- или VH-доменом. На фиг. (1В) показан димерный лиганд, слитый на N-конце с человеческим СН3-доменом, а на фиг. (1Г) показан мономерный лиганд, слитый на N-конце с человеческим СН3-доменом;
на фиг. 2 - конструкции 1.1-1.10 предлагаемых в изобретении антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный 4-1BBL. Предварительная подготовка и получение этих конструкций описаны в примере 1. VH- и VL-домены представляют собой домены антитела к FAP 28H1, жирной черной точкой обозначена модификация типа knob-into-hole (kih). Символом * обозначены аминокислотные модификации в СН1- и CL-доменах (так называемые заряженные остатки);
на фиг. 3 - компоненты для сборки разделенных тримерных лигандов для человеческого 4-1ВВ. На фиг. (3А) показан димерный лиганд, который слит на С-конце с мышиным CL-доменом, а на фиг. (3Б) показан мономерный лиганд, слитый на С-конце с мышиным СН1-доменом. Показаны компоненты для сборки нацеленного на FAP разделенного тримерного лиганда для мышиного 4-1ВВ. На фиг. (3В) показаны антигенсвязывающие молекулы, содержащие собранный тримерный мышиный 4-1BBL, описанные более подробно в примере 1.3;
на фиг. 4 - конструкции 2.1-2.6 предлагаемых в изобретении антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный 4-1BBL. Предварительная подготовка и получение этих конструкций описаны в примере 2. VH- и VL-домены представляют собой домены антитела к FAP 4B9, жирной черной точкой обозначена модификация типа knob-into-hole. Символом * обозначены аминокислотные модификации в СН1- и CL-доменах (так называемые заряженные остатки);
на фиг. 5А и 5Б - ненаправленные на определенную мишень (ненацеленные) варианты конструкций 1.1 и 1.2, содержащие молекулу Fab DP47 (зародышевая линия человеческих антител) вместо молекулы Fab к FAP. Молекулы обозначены как контроль А и контроль Б соответственно. Получение описано в примере 1.4. На 5В - изображение конструкции: мономерный 4-1ВВ-Fc(kih), получение которой описано в примере 3;
на фиг. 6 - данные о связывании антигенсвязывающей молекулы, содержащей нацеленный на FAP тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) (FAP разделенный тримерный 4-1BBL, обозначена закрашенными окружностями) или ненацеленной полученной на основе DP47 антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с (kih) (DP47 разделенный тримерный 41BBL, незакрашенные окружности) с покоящимися (наивными) или активированными человеческими РМВС. В частности, данные о связывании с покоящимися (наивными) или активированными человеческими CD8 -Т-клетками представлены на фиг. (6А), с покоящимися (наивными) или активированными человеческими CD4+-Т-клетками - на фиг. (6Б) и с покоящимися (наивными) или активированными человеческими NK-клетками - на фиг. (6В). Представлены данные о связывании в виде медианного значения интенсивности флуоресценции (MFI) меченного с помощью полученного из красных макрофитных водорослей фикоэритрина (R-РЕ) F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, Fcyспецифического, который применяли в качестве вторичного антитела. MFI измеряли с помощью проточной цитометрии и осуществляли коррекцию на фоновый уровень путем вычитания MFI для пустого контроля;
на фиг. 7 - связывание различных нацеленных на FAP или ненацеленных конструкций, содержащих тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih), с экспрессирующими человеческий 4-1ВВ Тклетками из предварительно активированных PHA-L и пролейкином и повторно активированных антителом к человеческому CD3/k человеческому CD28 человеческих РВМС. Связывание обнаруживали с помощью конъюгированного с флуорохромом, таким как R-фикоэритрин, F(ab')2-фрaгментa козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического. Представлены медианные значения интенсивности флуоресценции (MFI) в зависимости от концентрации тестируемых конструкций 1.1-1.10, описанных в примере 1. Для лучшей формы представления кривые связывания разделяли на 4 различные группы графиков, в каждой из которых в качестве кривых сравнения приводили кривые связывания конструкции 1.1 (одновалентная нацеленная на FAP содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 41BB-Fc (kih)) и контрольной конструкции Б (одновалентная ненацеленная содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) с CH-CL-кроссовером и заряженными остатками). Связывание оценивали с использованием CD3+CD8+-Т-клеток (фиг. 7А) и CD3+CD4+-Т-клеток (фиг. 7Б). Уровень экспрессии 4-1ВВ на CD8-T-клетках в норме выше, чем на CD4-Т-клетках. Все версии связывались с человеческим 4-1ВВ с практически одинаковой аффинностью;
- 11 037557 на фиг. 8 - данные о связывании различных нацеленных на FAP или ненацеленных конструкций, содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih), с CD4+- или CD8+-Tклетками из свежевыделенных РВМС (фиг. 8А) или с экспрессирующими человеческий 4-1ВВ предварительно активированными PHA-L и пролейкином и повторно активированными антителом к человеческому CD3/k человеческому CD28 человеческими РВМС (фиг. 8Б). Связывание обнаруживали с помощью конъюгированного с флуорохромом, таким как R-фикоэритрин, F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического. Представлены медианные значения интенсивности флуоресценции (MFI) в зависимости от концентрации тестируемых конструкций 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 и 2.6, описанных в примере 2, контрольных молекул, а именно контроль Б, контроль В, контроль Д и контроль Е. Для лучшей формы представления кривые связывания разделяли на 2 различные группы графиков, в каждой из которых в качестве кривых сравнения приводили кривые связывания конструкции 2.1 (одновалентная нацеленная на FAP содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih)) и контрольной конструкции Б (одновалентная ненацеленная содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) с CH-CL-кроссовером и заряженными остатками). Связывание оценивали с использованием CD45 CD3 CD8+-Т-клеток (нижняя группа графиков) и CD45+CD3+CD4+-Т-клеток (верхняя группа графиков). Уровень экспрессии 4-1ВВ на CD8-T-клетках в норме выше, чем на CD4-Т-клетках. Все конструкции связывались практически с одинаковой аффинностью с человеческим 4-1ВВ, однако двухвалентная конструкция 2.3 и соответствующий ей ненацеленный контроль В характеризовались более низким значением MFI. Это может быть связано со стерической помехой связыванию 4-1ВВ и/или более низким уровнем детекции вторичного идентифицирующего антитела, что обусловлено конъюгированным с Fc разделенным лигандом для 4-1ВВ;
на фиг. 9 - данные о связывании нацеленной на FAP антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) (FAP разделенный тримерный 4-1BBL, обозначена закрашенными окружностями) или ненацеленной полученной на основе DP47 антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih), с активированными мышиными спленоцитами. В частности, данные о связывании с активированными мышиными CD4+-Т-клетками представлены на фиг. (9А), а с активированными мышиными CD8+-Т-клетками - на фиг. (9Б). В качестве положительного контроля применяли специфическое в отношении мышиного CD137 человеческое антитело в виде IgG1 P329G LALA (клон Lob12.3) (треугольники). Связывание характеризовали на основе графика зависимости значений MFI для меченного с помощью R-PE F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического, применяемого в качестве вторичного идентифицирующего антитела, от концентрации (в нМ) тестируемых конструкций, содержащих разделенный тримерный 41BBL. MFI измеряли с помощью проточной цитометрии и осуществляли коррекцию на фоновый уровень путем вычитания MFI для пустого контроля;
на фиг. 10 - данные о связывании антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) (закрашенными окружностями обозначена конструкция 1.1: нацеленная на FAP антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih), незакрашенными окружностями обозначена контрольная молекула А: ненацеленная полученная на основе DP47 антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih)) с экспрессирующими фибробласт-активирующий белок (FAP) клетками человеческой меланомы (А) линии MV-3 и (Б) линии WM-266-4. Связывание характеризовали на основе графика зависимости значений MFI для меченного с помощью R-PE F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, Fcyспецифического, применяемого в качестве вторичного идентифицирующего антитела, от концентрации (в нМ) тестируемых конструкций, содержащих разделенный тримерный 4-1BBL. MFI измеряли с помощью проточной цитометрии и осуществляли коррекцию на фоновый уровень путем вычитания MFI для пустого контроля;
на фиг. 11 - данные о связывании различных нацеленных на FAP или ненацеленных конструкций, содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih), с экспрессирующими человеческий FAP клетками человеческой меланомы MV-3 (фиг. 11А) и/или с трансфектированными клетками эмбриональных мышиных фибробластов линии NIH/3T3-huFAP, клон 39 (фиг. 11Б). Связывание обнаруживали с помощью конъюгированных с флуорохромом, таким как R-фикоэритрин или флуоресцеин, F(ab')2-фрагментов козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфических. Показана зависимость медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) от концентрации тестируемых конструкций. Для лучшей формы представления кривые связывания разделяли на 4 (фиг. 11А) или две (фиг. 11Б) различные группы графиков, при этом кривую для конструкции 1.1 (одновалентная нацеленная на FAP содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih)) применяли в качестве кривой сравнения. Все конструкции связывались с человеческим FAP со сходной аффинностью за исключением двухвалентных нацеленных на FAP конструкций (конструкции 1.5, 1.7 и 1.8). Для них обнаружена тенденция к получению более низких величин ЕС50 и более низких медианных значений интенсивности флуоресценции. Это можно объяснить их двухвалентным таргетингом (более высокая авидность, меньшее количество молекул может связываться одновременно из-за оккупации двух эпитопов,
- 12 037557 что приводит к более низким значениям MFI). Различия между конструкцией 1.8 (полный двухвалентный таргетинг) и конструкциями 1.5 и 1.7 (только частичный двухвалентный таргетинг) могут быть объяснены также структурными различиями;
на фиг. 12 - данные о связывании различных нацеленных на FAP или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 и 2.6 с экспрессирующими человеческий FAP клетками человеческой меланомы MV-3 (фиг. 12А) и WM-266-4 (фиг. 12Б). Связывание обнаруживали с помощью конъюгированного с флуорохромом, таким как Rфикоэритрин, F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического. Показана зависимость медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) от концентрации тестируемых конструкций. Для лучшей формы представления кривые связывания разделяли на две различные группы графиков, при этом кривую для конструкции 2.1 (одновалентная нацеленная на FAP содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih)) применяли в качестве кривой сравнения. Все конструкции связывались с человеческим FAP со сходной аффинностью за исключением двухвалентной нацеленной на FAP конструкции 2.3. Для нее характерны более низкие величины ЕС50 и более низкие медианные значения интенсивности флуоресценции. Это можно объяснить ее двухвалентным таргетингом, приводящим к более высокой авидности, но меньшему уровню оккупации или количеству молекул FAP на клеточной поверхности, что обусловливало более низкие значения MFI;
на фиг. 13 - данные о связывании различных нацеленных на FAP или ненацеленных содержащих разделенный тримерный мышиный лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций с CD4+- или CD8+-Т-клетками из свежевыделенных спленоцитов (фиг. 13А) или с экспрессирующими мышиный 4-1ВВ активированными агонистическими моноклональными антителами к мышиному CD3/k мышиному CD28 мышиными спленоцитами (фиг. 13Б). Связывание обнаруживали с помощью конъюгированного с флуорохромом, таким как ФИТЦ, F(ab')2-фрагмента козьего IgG против мышиного IgG, FcY-специфического. Показана зависимость медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) от концентрации тестируемых конструкций. Оценивали связывание на CD3+ CD8+-Т-клетках (левая группа графиков) и CD3+ CD4+-Tклетках (правая группа графиков). Уровень экспрессии 4-1ВВ на CD8-Т-клетках в норме выше, чем на CD4-Т-клетках. Все конструкции связывались с мышиным 4-1ВВ практически с одинаковой аффинностью;
на фиг. 14 - данные о связывании различных нацеленных на FAP или ненацеленных содержащих разделенный тримерный мышиный лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций с экспрессирующими человеческий FAP опухолевыми клетками. Связывание обнаруживали с помощью конъюгированного с флуорохромом, таким как ФИТЦ, F(ab')2-фрагмента козьего IgG против мышиного IgG, FcY-специфического. Показана зависимость медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) от концентрации тестируемых конструкций. Оценивали связывание на клетках MV-3 (фиг. 14А) и клетках WM-266-4 (фиг. 14Б). Нацеленные на FAP содержащие разделенный тримерный мышиный лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкции M.1 и М.2 связывались с FAP практически с одинаковой аффинностью;
на фиг. 15 - схема, иллюстрирующая общий принцип анализа NFkB-активности, который описан в примере 6.1, с использованием линии репортерных клеток. Показана схема анализа активации с использованием экспрессирующей человеческий 4-1ВВ линии репортерных клеток HeLa. Перекрестносшитый 4-1ВВ, экспрессируемый на репортерных клетках, индуцирует активацию NFkB и опосредуемую NFkB экспрессию люциферазы. После лизиса клеток люцифераза может катализировать окисление люциферина с образованием оксилюциферина. Для этой химической реакции характерна положительная корреляция с уровнем опосредуемой NFkB экспрессии люциферазы, и его можно измерять по уровню испускания света (в единицах испускаемого света). Соотношение экспрессирующих FAP опухолевых клеток и репортерной клеточной линии HeLa-huCD137-NFkB-luc составляло 5:1;
на фиг. 16 - данные, демонстрирующие, что активация пути передачи сигнала NFkB нацеленной на FAP антигенсвязывающей молекулой, содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) (конструкция 1.1) прямо зависела от ее связывания с экспрессирующими FAP клетками-мишенями. Экспрессирующие человеческий CD137 репортерные клетки HeLa-NFKB совместно культивировали с указанными клетками, характеризующимися различными уровнями экспрессии FAP на клеточной поверхности. Люциферазную активность оценивали согласно методу, описанному в примере 6.1, после культивирования клеток в присутствии содержащих 4-1BBL молекул в указанных концентрациях или без них в течение 6 ч. Закрашенными окружностями обозначена конструкция 1.1. Незакрашенными окружностями обозначена ненацеленная антигенсвязывающая молекула на основе DP47, содержащая лиганд для 41ВВ в слиянии Fc(kih) (контроль А). Клеточную линию NIH/3T3-человеческий FAP, клон 39 применяли в качестве клеток-мишеней на графике (А), на графике (Б) показана активация при использовании в качестве клеток-мишеней клеток линии MV3, а на графике (В) - при использовании в качестве клетокмишеней клеток линии WM-266-4. Для характеризации активности строили график зависимости единиц испускаемого света (URL), измеренных в течение 0,5 с, от концентрации в нМ тестируемых содержащих разделенный тримерный 4-1BBL конструкций. Испускание URL происходит в результате опосредуемого люциферазой окисления люциферина с образованием оксилюциферина;
- 13 037557 на фиг. 17 - данные об активации индуцируемой NFkB экспрессии люциферазы и активности, для измерения которых использовали анализ, описанных в примере 6.1. Количество испускаемого света в секунду (CPS) измеряли в течение 0,5 с/лунку и строили график зависимости от применяемой концентрации нацеленных на FAP или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций. Экспрессирующие человеческий 4-1ВВ репортерные клетки HeLa инкубировали в течение 6 ч в отсутствии (фиг. 17А) или в присутствии экспрессирующих перекрестносшитый человеческий FAP клеток человеческой меланомы линии MV-3 (фиг. 17Б) или WM-266-4 (фиг. 17В). Измеряли CPS и строили график зависимости от концентраций различных нацеленных на FAP или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций. Соотношение клеток составляло: одна экспрессирующая человеческий 4-1ВВ репортерная клетка HeLa на пять опухолевых клеток. Для лучшей формы представления кривые активации разделяли на четыре различные группы графиков, при этом кривые для конструкции 1.1 (одновалентная нацеленная на FAP содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih)) и контрольной молекулы Б (одновалентная ненацеленная содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 41BB-Fc (kih) с CH-CL-кроссовером и заряженными остатками) применяли в качестве кривых сравнения. На фиг. 17А представлены данные об активации в отсутствии экспрессирующих перекрестносшитый FAP опухолевых клеток, на фиг. 17Б представлены данные об активации в присутствии экспрессирующих перекрестносшитый FAP опухолевых клеток MV-3, а на фиг. 17В представлены данные об активации в присутствии экспрессирующих перекрестносшитый FAP опухолевых клеток WM-266-4;
на фиг. 18 - данные об активации индуцируемой NFkB экспрессии люциферазы и активности, полученные для конструкций, описанных в примере 2. Единицы испускаемого света (URL) оценивали в течение 0,5 с/лунку и строили график зависимости от применяемой концентрации нацеленных на FAP или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций. Экспрессирующие человеческий 4-1ВВ репортерные клетки HeLa инкубировали в течение 6 ч в отсутствии или в присутствии экспрессирующих перекрестносшитый человеческий FAP клеток человеческой меланомы линии MV-3 или WM-266-4. URL оценивали и строили график зависимости от концентраций различных нацеленных на FAP или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-LBB-Fc (kih) конструкций 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 и 2.6 и контрольных конструкций Б, В, Д и Е. Соотношение клеток составляло: одна экспрессирующая человеческий 4-1ВВ репортерная клетка HeLa на пять опухолевых клеток. Для лучшей формы представления кривые активации разделяли на две различные группы графиков, в каждой из которых (для сравнения) использовали кривую для конструкции 2.1 (одновалентная нацеленная на FAP содержащая тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih));
на фиг. 19 - схема анализа активации репортерной линии клеток T293-HEK, экспрессирующих 41ВВ обезьян циномолгус. Перекрестносшитый 4-1ВВ обезьян циномолгус, экспрессируемый на репортерных клетках, индуцирует активацию NFkB и опосредуемую NFkB экспрессию люциферазы. После лизиса клеток люцифераза может катализировать окисление люциферина с образованием оксилюциферина. Для этой химической реакции характерна положительная корреляция с уровнем опосредуемой NFkB экспрессии люциферазы, и его можно измерять по уровню испускания света (в единицах испускаемого света);
на фиг. 20 - данные об индуцированной активацией NFkB экспрессии люциферазы и активности. Уровень испускаемого света (в единицах URL) измеряли в течение 0,5 с/лунку и строили график зависимости от применяемой концентрации нацеленных на FAP или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций. Репортерные клетки T293-HEK, экспрессирующие 4-1ВВ обезьян циномолгус, инкубировали в течение 6 ч в отсутствии или в присутствии экспрессирующих перекрестносшитый человеческий FAP клеток человеческой меланомы линии MV-3 или WM-266-4. URL оценивали и строили график зависимости от концентраций различных нацеленных на FAP или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций. Соотношение клеток составляло: одна экспрессирующая 4-1ВВ репортерная клетка T293-HEK на пять клеток MV-3 или две клетки WM-266-4. Для лучшей формы представления кривые активации разделяли на две различные группы графиков, в каждой из которых в качестве кривой сравнения использовали кривую для конструкции 2.1;
на фиг. 21 - схема, иллюстрирующая принцип анализа Т-клеточной активации, описанного в примере 6.3. Представлена схема осуществления анализа активации с использованием HLA-A2-NLVспецифических CD8-T-клеток и подвергнутых импульсной обработке NLV клеточной линии HLA-A2+ FAP+ человеческой меланомы MV-3 в присутствии различных определенных титрованием концентраций нацеленных на FAP или ненацеленных конструкций, содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih). Клетки инкубировали в течение 28 ч, последние 4 ч в присутствии содержащего монезин реагента Golgi-Stop. Соотношение NLV-специфических CD8-Т-клеток и опухолевых клеток MV-3 составляло 1:8;
на фиг. 22А-Д и 23А-Д - результаты анализа активации, в которых использовали HLA-A2-NLV
- 14 037557 специфические CD8-T-клетки и подвергнутую импульсной обработке NLV клеточную линию HLA-A2+ FAP+ человеческой меланомы MV-3 в присутствии различных определенных титрованием концентраций нацеленных на FAP или ненацеленных конструкций, содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih), полученных в примере 1. Для лучшей формы представления кривые экспрессии разделяли на несколько различных групп графиков, в которых в качестве кривых сравнения применяли кривые, полученные для конструкции 1.1 (одновалентная нацеленная на FAP содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih)) и контрольной молекулы Б (одновалентная ненацеленная содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih)). Результаты получали в четырех независимых аналогичных экспериментах и установлено, что пролонгированная секреция IFNy и экспрессия CD137 NLV-специфическими CD8+-Т-клетками прямо зависели от одновременной активации Т-клеток посредством распознавания комплексов NLV-HLA-A2 (сигнал 1) и стимуляции 4-1ВВ с помощью нацеленного на FAP человеческого разделенного 4-1BBL (сигнал 2). Данные о роли повышающей регуляции 4-1ВВ представлены на графиках на фиг. 22, в то время как данные о воздействие на экспрессию INFy CD8+-Т-клетками представлены на графиках на фиг. 23. В каждом случае приведены данные о частоте встречаемости (в процентах) позитивных клеток в общей популяции CD8+-Т-клеток. Все нацеленные на FAP варианты индуцировали сходное повышение активации активированных NLV-пептидом CD8-Т-клеток, что представлено на фиг. 22 в виде повышающей регуляции 41ВВ (петля положительной обратной связи), и на фиг. 23 в виде экспрессии IFNy после 24-часовой стимуляции. Различия между кривыми находились в пределах ошибки стандартного отклонения и не являлись значимыми;
на фиг. 24 и 25 - результаты анализа активации, в котором использовали HLA-A2-NLVспецифические CD8-T-клетки и подвергнутую импульсной обработке NLV клеточную линию HLA-A2+ FAP+ человеческой меланомы MV-3 в присутствии различных полученных титрованием концентраций нацеленных на FAP или ненацеленных конструкций, полученных в примере 2, которые содержали разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih). Для лучшей формы представления кривые экспрессии разделяли на две различные группы графиков, в которых в качестве кривых сравнения применяли кривые, полученные для конструкции 2.1 (одновалентная нацеленная на FAP содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih)) и контрольной молекулы Б (одновалентная ненацеленная содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih)) и для контроля Б. Установлено, что все нацеленные на FAP содержащие разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкции характеризовались сходным повышением активации специфических для NLV-пептида CD8-T-клеток, что представлено на фиг. 24 в виде повышающей регуляции 4-1ВВ (петля положительной обратной связи), и на фиг. 25 в виде экспрессии IFNy после 24-часовой стимуляции. Различия между кривыми находились в пределах ошибки стандартного отклонения и не являлись значимыми;
на фиг. 26 - схема, иллюстрирующая эксперимент, описанный в примере 6.4;
на фиг. 27 - данные о индукции пролиферации CD8+-Т-клеток. Представлены данные о частоте встречаемости (уровне) пролиферирующих CD8+-Т-клеток в зависимости от концентрации тестируемых конструкций;
на фиг. 28А - результаты ФК-эксперимента с использованием одной дозы конструкции 1.2 и контроля Б, проведенного на здоровых NOG-мышах. Продемонстрировано снижение концентрации конструкций в течение времени. На 28Б - результаты ФК-эксперимента с использованием одной дозы конструкций 2.1, 2.3, контроля Б и контроля В, проведенного на несущих опухоли NOG-мышах, гуманизированных с помощью стволовых клеток. На фиг. 28В - результаты ФК-эксперимента с использованием одной дозы конструкции 2.1 и 2.3, проведенного на здоровых NOG-мышах;
на фиг. 29 - компоненты для сборки разделенных тримерных лигандов для человеческого 4-1ВВ. На фиг. 29А - димерный лиганд, слитый на С-конце с человеческим CL-доменом с мутациями E123R и Q124K (заряженные остатки), на фиг. 29Б - мономерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CH1доменом с мутациями К147Е и К213Е (заряженные остатки). Представлены компоненты для сборки двухвалентной нацеленной на CD19 антигенсвязывающей молекулы, содержащей разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) (конструкция 3.3). На фиг. 29В показан димерный лиганд, слитый с С-концом цепи Fc человеческого IgG1 с впадиной. На фиг. 29Г показан мономерный лиганд, слитый с С-концом цепи Fc человеческого IgG1 с выступом;
на фиг. 30 - конструкции 3.1-3.6 нацеленных на CD19 содержащих тримерный 4-1BBL антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в изобретении. Предварительная подготовка и получение этих конструкций описано в примере 3. VH- и VL-домены представляют собой домены антитела к CD19 8В8-018, жирной черной точкой обозначена модификация типа knob-into-hole. Символом * обозначены аминокислотные модификации в СН1- и CL-доменах (так называемые заряженные остатки);
на фиг. 31А - иллюстрация стратегии рандомизации CDR-участков родительского клона 8В8. Показаны вариабельные домены родительского клона 8В8 и CDR-участки (выделенные прямоугольником) согласно нумерации Кэбота. (X) обозначает рандомизированные положения. На фиг. 31Б - схематическое
- 15 037557 описание стратегии создания библиотеки. Показаны стратегии ПЦР-амплификации и клонирования, применяемые для создания библиотеки на основе 8В8 с А) рандомизированными CDR1- и CDR2участками в легкой и тяжелой цепи или Б) рандомизированными CDR1- и CDR3-участками легкой цепи и CDR3-участком тяжелой цепи. Указаны соответствующие ферменты, применяемые для клонирования в фагмиде;
на фиг. 32 - результаты сравнительного анализа первичной структуры последовательности родительского клона 8В8 антитела к CD19 с отобранными связывающими агентами с созревшей аффинностью. Показаны все последовательности клона 8В8 и всех отобранных связывающих агентов с созревшей аффинностью. CDR и тяжелых, и легких цепей обозначены рамкой;
на фиг. 33 - результаты SPR-анализа родительского клона 8В8 и его вариантов с созревшей аффинностью. Показаны сенсограммы, полученные для клона 8В8 и его производных с созревшей аффинностью, в которых отсутствуют горячие точки N27d и N28 в LCDR1;
на фиг. 34 - иллюстрация схемы анализа измерения одновременного связывания нацеленной на CD19 содержащей тримерный разделенный 4-1BBL конструкции с hu4-1BB и huCD19 (пример 8.2);
на фиг. 35 - графики, описывающие одновременное связывание нацеленных на CD19 содержащих тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул (конструкции 3.1, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 и 4.4) (аналит 1) с иммобилизованным человеческим 4-1ВВ и человеческим CD19 (аналит 2);
на фиг. 36 - результаты анализа связывания различных нацеленных на CD19 или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций с экспрессирующими 4-1ВВ CD4- и CD8-T-клетками из предварительно активированных PHA-L и пролейкином и повторно реактивированных антителом к человеческому CD3/k человеческому CD28 человеческих РВМС. Связывание обнаруживали с помощью конъютированного с флуорохромом, таким как Rфикоэритрин, F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического. Показана зависимость медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) от концентрации тестируемых конструкций. Для лучшей формы представления кривые связывания разделяли на две различные группы графиков, при этом кривые для конструкции 3.4 и контроля Е (контроль изотипа huIgG1 P329G LALA) применяли в качестве кривых сравнения. Оценивали связывание на CD45+CD3+CD8+-Т-клетках (фиг. 36А) и CD45+CD3+CD4+-Т-клетках (фиг. 36Б). Уровень экспрессии 4-1ВВ на CD8-T-клетках в норме выше, чем на CD4-Т-клетках. Все конструкции связывались с человеческим 4-1ВВ практически со сходной аффинностью;
на фиг. 37 - результаты анализа связывания различных нацеленных на CD19 или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) антигенсвязывающих молекул с экспрессирующими человеческий CD 19 клеточными линиями В-клеточной лимфомы, такими как диффузная крупноклеточная неходжскинская В-клеточная лимфома SU-DHL-8 (37А), острый лимфобластный лейкоз из клеток-предшественников В-лимфоцитов Nalm6 (37Б), диффузная крупноклеточная лимфобластная лимфома Toledo (37B) и диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома OCILy18 (37Г). Связывание обнаруживали с помощью конъютированного с флуорохромом, таким как Rфикоэритрин, F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического. Показана зависимость медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) от концентрации тестируемых конструкций. Для лучшей формы представления кривые связывания разделяли на три различные группы графиков, при этом кривые для конструкции 3.4 и контроля Е (контроль изотипа hulgGI P329G LALA) применяли в качестве кривых сравнения. Все конструкции связывались с человеческим CD19 практически со сходной аффинностью;
на фиг. 38 - данные об индуцированной активацией NFkB экспрессии люциферазы и активности нацеленных на CD19 или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) антигенсвязывающих молекул. Уровень испускаемого света (в единицах URL) измеряли в течение 0,5 с/лунку и строили график зависимости от применяемой концентрации нацеленных на CD19 или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций 3.1 и 3.3 и контрольных молекул Б и В. Экспрессирующие человеческий 4-1ВВ репортерные клетки HeLa инкубировали в течение 7,5 ч в присутствии экспрессирующих перекрестносшитый человеческий CD19 клеток SU-DHL-8 или клеток Пфейфера или без них. Измеряли URL и строили график зависимости от концентраций различных нацеленных на CD19 или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций. Соотношение клеток составляло: одна экспрессирующая 4-1ВВ репортерная клетка T293-HEK на 2,5 или 5 опухолевых клеток;
на фиг. 39 - данные о связывании различных гуманизированных вариантов Т84.66 IgG на экспрессирующих СЕА клетках человеческой аденокарциномы желудка. На основе полученных данных был отобран гуманизированный вариант 1 для включения в нацеленные на СЕА содержащие тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) антигенсвязывающие молекулы;
на фиг. 40 - конструкции 5.1-5.6 нацеленных на СЕА содержащих тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в изобретении. Предварительная подготовка и получения указанных конструкций описано в примере 11. VH- и VL-домены представляют собой
- 16 037557 домена антитела к СЕА T84.66-LCHA, жирной черной точкой обозначена модификация типа knob-intohole. Символом * обозначены аминокислотные модификации в СН1- и CL-доменах (так называемые заряженные остатки);
на фиг. 41А - схематическое изображение человеческого антигена NA3B3A2-avi His, применяемого для оценки связывания нацеленных на СЕА, содержащих тримерный разделенный 4-1BBL-Fc (kih) антигенсвязывающих молекул. На фиг. 41Б - схематическое изображение схемы анализа измерения одновременного связывания нацеленной на СЕА содержащей тримерный разделенный 4-1BBL конструкции с hu4-1BB и человеческим NA3B3A2 (пример 12.1);
на фиг. 42 - графики, на которых продемонстрировано одновременное связывание нацеленных на СЕА содержащих тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул (конструкции 5.4, 5.6, 5.7 и 5.8 (аналит 1) с иммобилизованными человеческим 4-1ВВ и человеческим NA3B3A2 (аналит 2);
на фиг. 43 - результаты анализа связывания различных нацеленных на СЕА или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций с экспрессирующими 4-1ВВ CD4- и CD8-T-клетками из предварительно активированных PHA-L и пролейкином и повторно реактивированных антителом к человеческому CD3/k человеческому CD28 человеческих РВМС. Связывание обнаруживали с помощью конъюгированного с флуорохромом, таким как Rфикоэритрин, F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического. Показана зависимость медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) от концентрации тестируемых конструкций. Для лучшей формы представления кривые связывания разделяли на две различные группы графиков, при этом кривые для конструкции 5.4 и контроля Е (контроль изотипа huIgG1 P329G LALA) применяли в качестве кривых сравнения. Оценивали связывание на CD45+ CD3' CD8+-Т-клетках (нижняя группа графиков) и CD45+CD3+CD4+-Т-клетках (верхняя группа графиков). Уровень экспрессии 4-1ВВ на CD8-Т-клетках в норме выше, чем на CD4-Т-клетках. Все конструкции связывались с человеческим 41ВВ практически со сходной аффинностью;
на фиг. 44 - результаты анализа связывания нацеленных на СЕА или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций с экспрессирующей человеческий СЕА линией клеток рака желудка человека MKN-45 (слева) и линией клеток колоректальной аденокарциномы человека LS180 (справа). Связывание обнаруживали с помощью конъюгированного с флуорохромом, таким как R-фикоэритрин, F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, Fcyспецифического. Показана зависимость медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) от концентрации тестируемых конструкций;
на фиг. 45 - данные об индуцированной активацией NFkB экспрессии люциферазы и активности нацеленных на СЕА или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) антигенсвязывающих молекул. Уровень испускаемого света (в единицах URL) измеряли в течение 0,5 с/лунку и строили график зависимости от применяемой концентрации нацеленных на СЕА или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций 5.4, 5.6, 5.7 и 5.3 и контрольных молекул. Экспрессирующие человеческий 4-1ВВ репортерные клетки HeLa инкубировали в течение 6 ч в присутствии экспрессирующих перекрестносшитый человеческий СЕА клеток рака желудка человека MKN-45. Соотношение клеток составляло: одна экспрессирующая 4-1ВВ репортерная клетка T293-HEK на три опухолевые клетки;
на фиг. 46А и 46Б - компоненты для сборки одновалентной нацеленной на FAP конструкции, содержащей разделенный тримерный человеческий лиганд для ОХ40 (конструкция 6.1). На фиг. 46А показан димерный лиганд, слитый с CL-доменом человеческого IgG1, на фиг. 46Б - мономерный лиганд, слитый с СН1-доменом человеческого IgG1. На фиг. 46В - нацеленная на FAP содержащая тримерный OX40L антигенсвязывающая молекула (конструкция 6.1). На фиг. 46Г - ненацеленная конструкция на основе DP47 человеческого IgG1 PGLALA (контроль Е);
на фиг. 47А - результаты анализа связывания нацеленной на FAP содержащей тримерный человеческий Ox40L конструкции с FAP-позитивными клетками WM-266-4. WM-266-4-клетки экспрессируют высокие уровни человеческого фибробласт-активирующего белка (huFAP). С клетками WM-266-4 связывались только нацеленные на FAP содержащие лиганд для OX40-Fc (kih) конструкции (закрашенные квадраты), но не контрольная конструкция 5 (закрашенные ромбы). Связывание представлено в виде медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) для меченного с помощью флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического, применяемого в качестве вторичного идентифицирующего антитела. MFI измеряли с помощью проточной цитометрии. На оси х отложена концентрация конструкций антител. На фиг. 47Б - результаты анализа связывания нацеленной на FAP содержащей лиганд для OX40-Fc (kih) конструкции с негативными по человеческому FAP и негативными по человеческому ОХ40 клетками А549, меченными с помощью NucLight Red®. Установлено, что нацеленная на FAP содержащая лиганд для OX4O-Fc (kih) конструкция не связывалась с ОХ40-негативными, FAP-негативными опухолевыми клетками А549. Связывание представлено в виде медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) для меченного с помощью ФИТЦ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического, применяемого в качестве
- 17 037557 вторичного идентифицирующего антитела. MFI измеряли с помощью проточной цитометрии и осуществляли коррекцию на фоновый уровень путем вычитания MFI для пустого контроля;
на фиг. 48А - результаты анализа связывания конструкции FAP-Ox40L с покоящимися и активированными человеческими CD4-Т-клетками. ОХ40 не экспрессируется на покоящихся человеческих CD4Т-клетках (левая часть). В отсутствии экспрессирующих человеческий ОХ40 клеток связывание не обнаружено (графики слева). После активации человеческих РВМС имеет место повышающая регуляция ОХ40 на CD4+-Т-клетках (правая часть). Конструкция FAP-OX40L связывалась с ОХ40+активированными CD4-Т-клетками. Связывание представлено в виде медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) для меченного с помощью ФИТЦ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического, применяемого в качестве вторичного идентифицирующего антитела. MFI измеряли с помощью проточной цитометрии и осуществляли коррекцию на фоновый уровень путем вычитания MFI для пустого контроля. На оси х отложена концентрация конструкций антител. На фиг. 48Б представлены данные, демонстрирующие, что ОХ40 не экспрессируется на покоящихся человеческих CD8-T-клетках (левая часть). В отсутствии экспрессирующих человеческий ОХ40 клеток связывание не обнаружено (графики слева). После активации человеческих РВМС имеет место повышающая регуляция ОХ40 на CD8+-Т-клеткαх (правая часть). Экспрессия ОХ40 на человеческих CD8+-Т-клетках ниже, чем на CD4+-Т-клетках и варьируется в зависимости от донора и момента времени. Уровень экспрессии ОХ40 на представленных CD8-T-клеткαх был низким. Конструкция FAP-OX40L связывалась с ОХ40+-активированными CD4-Т-клеткaми. Связывание представлено в виде медианных значений интенсивности флуоресценции (MFI) для меченного с помощью ФИТЦ F(аb')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического, применяемого в качестве вторичного идентифицирующего антитела. MFI измеряли с помощью проточной цитометрии и осуществляли коррекцию на фоновый уровень путем вычитания MFI для пустого контроля. На оси х отложена концентрация конструкций антител;
на фиг. 49 - данные, демонстрирующие активацию пути передачи сигнала NFkB с помощью нацеленной на FAP содержащей разделенный тримерный человеческий OX40L антигенсвязывающей молекулы (FAP-OX40L) в репортерных клетках HeLa_hOx40_NFKB_Luc1. Представлены данные об активации с использованием перекрестной сшивки (правый график) или без нее (левый график) с применением вторичного антитела. Репортерные клетки культивировали в течение 5 ч в присутствии FAP-OX40L в указанных концентрациях с или без перекрестной сшивки с поликлональным вторичным антителом, F(ab)2фрагментом козьего IgG против huIgG1, FcY-специфическим, применяемым в соотношении 1:2. Люциферазную активность оценивали согласно методу, описанному в примере 6.1. Для характеризации активности использовали единицы испускания света (URL), измеренные в течение 0,5 с, в зависимости от концентрации в нМ тестируемой конструкции. Испускание URL происходило в результате опосредуемого люциферазой окисления люциферина с образованием оксилюциферина;
на фиг. 50А - данные об активации NFkB с помощью FAP-OX40L в репортерных клетках HeLa_hOX40_NFKB_Luc1 в присутствии FAP-позитивных клеток. Представлены данные об активации пути передачи сигнала NFkB в репортерных клетках с помощью FAP-OX40L в присутствии характеризующихся низким уровнем экспрессии человеческого FAP клеток NIH-3T3 (соотношение: 3 опухолевые FAP-клетки на 1 репортерную клетку). Опосредуемую NFkB люциферазную активность характеризовали с использованием единиц испускания света (URL), измеренных в течение 0,5 с, в зависимости от концентрации в нМ тестируемых соединений. Испускание URL происходило в результате опосредуемого люциферазой окисления люциферина с образованием оксилюциферина. Осуществляли коррекцию величин на фоновый уровень путем вычитания URL для пустого контроля. Для более эффективного сравнения определяли площадь под кривой для соответствующих представленных кривых дозовой зависимости в качестве маркера агонистической способности каждой конструкции. Результаты сравнения проиллюстрированы на фиг. 50Б. Площадь под кривой рассчитывали с помощью программы GraphPad Prism. Осуществляли коррекцию величин на фоновый уровень путем вычитания величины для пустого контроля;
на фиг. 51 - данные об опосредуемой ОХ40 костимуляции субоптимально стимулированных TCR покоящихся человеческих РВМС (пример 15.5). Перекрестная гиперсшивка FAP-Ox40L в результате присутствия клеток NIH/3T3-huFAP, клон 39 значительно повышала выживаемость и пролиферацию человеческих CD4- и CD8-Т-клеток. Представлены данные о количестве случаев присутствия живых CD4+(слева) и CD8+- (справа) Т-клеток. Вычитали фоновые значения, полученные для образцов, содержащих только антитело к человеческому CD3 (клон V9, huIgG1), покоящиеся человеческие РВМС и клетки NIH/3T3-huFAP клона 39. Таким образом, продемонстрировано усиливающее действие костимуляции ОХ40, но отсутствие воздействия самой субоптимальной стимуляции антителом к CD3. На графиках внизу (озаглавленных пролиферация представлены данные о поддержании субоптимальной стимуляции TCR покоящихся человеческих РВМС при использовании иммобилизованной на клеточной поверхности конструкции FAP-OX40L.
Подробное описание изобретения
Определения.
Если не указано иное, то технические и научные понятия, применяемые в описании, имеют значе- 18 037557 ния, которые обычно используют в области техники, к которой относится изобретение. Для целей интерпретации настоящей заявки следует применять приведенные ниже определения, и если это возможно, то понятия, применяемые в единственном числе, включают также их применение во множественном числе и наоборот.
В контексте настоящего описания понятие антигенсвязывающая молекула в наиболее широком смысле относится к молекуле, которая специфически связывается с антигенной детерминантой. Примерами антигенсвязывающих молекул являются антитела, фрагменты антител и антигенсвязывающие белки-каркасы (скаффолд-белки).
В контексте настоящего описания понятие фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени относится к полипептидной молекуле, которая специфически связывается с антигенной детерминатной. В одном из объектов изобретения антигенсвязывающий фрагмент обладает способностью активировать передачу сигнала через антиген его клетки-мишени. В конкретном объекте изобретения антигенсвязывающий фрагмент обладает способностью направлять субстанцию, с которой он связан (например, тримерный лиганд семейства TNF), к сайту-мишени, например к определенному типу опухолевых клеток или стромы опухоли, несущих антигенную детерминанту. Фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, включают антитела и их фрагменты, более подробно представленные в настоящем описания. Кроме того, фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, включают антигенсвязывающие белки-каркасы, более подробно представленные в настоящем описании, например, связывающие домены, основой который являются созданные повторы белков или созданные повторы доменов (см., например, WO 2002/020565).
Касательно антитела или его фрагмента понятие участок, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени относится к части молекулы, которая содержит область, специфически связывающуюся и комплементарную части антигена или всему антигену. Фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, может представлять собой, например, один или несколько вариабельных доменов антитела (которые называют также вариабельными областями антитела). В частности, фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, содержит вариабельную область легкой цепи антитела (VL) и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH).
В контексте настоящего описания понятие антитело используется в его наиболее широком смысле, и оно относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, моноспецифические и мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.
Понятие моноклональное антитело в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например содержащих мутации, встречающиеся в естественных условиях или возникающие в процессе производства препарата моноклонального антитела, указанные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты на антигене.
В контексте описания понятие моноспецифическое антитело означает антитело, которое имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. Понятие биспецифическая означает, что антигенсвязывающая молекула обладает способностью специфически связываться по меньшей мере с двумя различными антигенными детерминантами. Как правило, биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит два антигенсвязывающих сайта, каждый из которых является специфическим в отношении различных антигенных детерминант. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула обладает способностью одновременно связываться с двумя антигенными детерминантами, прежде всего с двумя антигенными детерминантами, экспрессируемыми на двух различных клетках.
В контексте настоящего описания понятие валентность означает наличие определенного количества сайтов связывания в антигенсвязывающей молекуле. Так, понятия двухвалентная, четырехвалентная и шестивалентная означает присутствие двух сайтов связывания, четырех сайтов связывания и шести сайтов связывания соответственно в антигенсвязывающей молекуле.
Понятия полноразмерное антитело, интактное антитело и цельное антитело в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, практически сходную с нативной структурой антитела. Понятие нативные антитела относится к встречающимся в естественных условиях молекулам иммуноглобулинов с различными структурами. Например, нативные антитела IgG-класса представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. Начиная с N- конца к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет
- 19 037557 вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следует три константных домена (CH1, CH2 и СН3), которые называют также константной областью тяжелой цепи. Аналогично этому, начиная с N-конца к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен легкой цепи (CL), который называют также константной областью легкой цепи. Тяжелая цепь антитела может относиться к одному из пяти типов, которые обозначают как α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) или μ (IgM), некоторые из которых можно дополнительно подразделять на подтипы, например γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) и α2 (IgA2). Легкая цепь антитела может принадлежать к одному из двух типов, называемых каппа (к) и лямбда (λ), в зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена.
Понятие фрагмент антитела относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, обладающую способностью связываться с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примерами фрагментов антител являются (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, димерные антитела (диабоди), тримерные антитела (триабоди), тетрамерные антитела (тетрабоди), кросс-Fab-фрагменты; линейные антитела: одноцепочечные молекулы антител (например, scFv); и однодоменные антитела. Обзор некоторых фрагментов антител см., например, у Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, c. 129-134. Обзор scFv-фрагментов см., например, у Pluckthun в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1994, c. 269-315; см. также WO 93/16185; и US № 5571894 и 5587458. Обсуждение Fab- и F(ab')2фрагментов, содержащих остатки эпитопа, связывающегося с рецептором спасения, и обладающих удлиненным временем полужизни in vivo, см. в US № 5869046. Димерные антитела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими (см., например, ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, c. 129134; и Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, c. 6444-6448. Тримерные и тетрамерные антитела описаны также у Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, c. 129-134. Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи или его часть или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (фирма Domantis, Inc., Валтам, шт. Массачусетс; см., например US № 6248516 В1). Фрагменты антител можно создавать с помощью различных методик, включая (но, не ограничиваясь только ими) протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получать с использованием рекомбинантных клеток-хозяев (например, E.coli или фага), как указано в настоящем описании.
Расщепление интактных антител папаином приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, которые называют Fab-фрагментами, каждый из которых содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, а также константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. В контексте настоящего описания понятие Fab-фрагмент относится к фрагменту антитела, содержащему фрагмент легкой цепи, который содержит VL-домен и константный домен легкой цепи (CL), и VH-домен и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильный конец СН1-домена тяжелой цепи, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-SH обозначает Fab'-фрагменты, в который остаток(тки) цистеина константных доменов несет(ут) тиольные группы. Обработка пепсином позволяет получать F(ab')2-фрагменты, которые имеют два антигенсвязывающих сайта (два Fab-фрагмента) и часть Fc-области.
Понятие Kpocc-Fab-фрагмент или xFab-фрагмент или кроссовер-Fab-фрагмент относится к Fab-фрагменту, в котором либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи обменены. Возможны две различные композиции цепи кроссовер-молекулы Fab, и они могут входить в биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении: с одной стороны, имеет место обмен вариабельными областями тяжелой и легкой цепи Fab, т.е. кроссовер-молекула Fab содержит пептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области тяжелой цепи (СН1), и пептидную цепь, состоящую из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области легкой цепи (CL). Указанную кроссовер-молекулу Fab обозначают также как CrossFab(VLVH). С другой стороны, когда друг на друга обменены константные области тяжелой и легкой цепи Fab, то кроссовер-молекула Fab содержит пептидную цепь, состоящую из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области легкой цепи (CL), и пептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области тяжелой цепи (СН1). Указанную кроссовер-молекулу Fab обозначают также как CrossFab(CLCH1).
Одноцепочечный Fab-фрагмент или scFab представляет собой полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела, константного домена 1 (СН1) антитела, вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела, константного домена легкой цепи (CL) антитела и линкера, в котором указанные домены антитела и указанный линкер имеют один из следующих порядков расположения в
- 20 037557 направлении от N-конца к С-концу: а) VH-CH1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-СН1, в) VH-CLлинкер-VL-СН1 или г) VL-СН1-линкер-VH-CL; и в котором указанный линкер представляет собой полипептид, состоящий по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно примерно от 32 до 50 аминокислот. Указанные одноцепочечные Fab-фрагменты стабилизируют с помощью встречающейся в естественных условиях дисульфидной связи между CL-доменом и CH1-доменом. Кроме того, указанные одноцепочечные молекулы Fab можно дополнительно стабилизировать посредством создания межцепочечных дисульфидных связей путем встраивания остатков цистеина (например, в положение 44 в вариабельной тяжелой цепи и в положение 100 в вариабельной легкой цепи согласно нумерации Кэбота).
Одноцепочечный кроссовер-Fab-фрагмент или x-scFab представляет собой полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела, константного домена 1 (СН1) антитела, вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела, константного домена легкой цепи (CL) антитела и линкера, в котором указанные домены антитела и указанный линкер имеют один из следующих порядков расположения в направлении от N-конца к С-концу: a) VH-CL-линкер-VL-СН1 и б) VL-СН1-линкер-VHCL; где VH и VL вместе образуют антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с антигеном, и в котором указанный линкер представляет собой полипептид, состоящий по меньшей мере из 30 аминокислот. Кроме того, указанные молекулы x-scFab можно дополнительно стабилизировать посредством создания межцепочечных дисульфидных связей путем встраивания остатков цистеина (например, в положение 44 в вариабельной тяжелой цепи и в положение 100 в вариабельной легкой цепи согласно нумерации Кэбота).
Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) представляет собой слитый белок вариабельных областей тяжелой (VH) и легких (VL) цепей антитела, соединенных коротким линкерным пептидом, который содержит от 10 до примерно 25 аминокислот. Линкер, как правило, представляет собой богатый глицином линкер для придания гибкости, а также богатый серином или треонином для обеспечения растворимости, и он может соединять либо N-конец VH с С-концом VL, либо наоборот. Указанный белок сохраняет специфичность исходного антитела, несмотря на удаление константных областей и интродукцию линкера. Антитела в виде scFv описаны, например, у Houston J.S., Methods in Enzymol., 203, 1991, cc. 46-96). Кроме того, фрагменты антител содержат одноцепочечные полипептиды, которые имеют характеристики VH-домена, а именно, обладают способностью к сборке с VL-доменом, или характеристики VL, а именно, обладают способностью к сборке с VH-доменом с образованием антигенсвязывающего сайта, и тем самым обладают антигенсвязывающим свойством полноразмерных антител.
Антигенсвязывающие белки-каркасы (скаффолд-белки)) известны в данной области, например, фибронектин и созданные содержащие анкириновые повторы белки (DARPin), применяли в качестве альтернативных каркасов для антигенсвязывающих доменов (см. Gebauer и Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody Therapeutics. Curr. Opin. Chem. Biol., 13, 2009, cc. 245-255 и Stumpp и др., Darpins: A new generation of protein Therapeutics. Drug Discov. Today 13, 2008, cc. 695-701). В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий белок-каркас выбран из группы, включающей CTLA-4 (эвибоди (Evibody)), липокаины (антикалин (Anticalin)), полученную из белка А молекулу, такую как Z-домен белка A (Affibody, SpA), А-домен (авимер/максибоди (Avimer/Maxibody)), сывороточный трансферрин (транс-боди), белок, содержащий анкириновые повторы (DARPin), вариабельный домен легкой цепи или тяжелой цепи антитела (однодоменное антитело, sdAb), вариабельный домен тяжелой цепи антитела (нанободи, aVH), VNAR-фрагменты, фибронектин (аднектин (AdNectin)), лектиновый домен С-типа (тетранектин), вариабельный домен нового антигенного рецептора β-лактамазы (VNARфрагменты), человеческий γ-кристаллин или убиквитин (молекулы-аффилины (Affilin), домен Кунитцтипа человеческих ингибиторов протеаз, микрободи, такие как белки из семейства knottin (кноттины, ингибиторы цистеинового узла), пептидные аптамеры и фибронектин (аднектин).
CTLA-4 (ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами антиген 4) относится к CD28семейству рецепторов, которые главным образом экспрессируются на CD4+-Т-клетках. Его внеклеточный домен имеет укладку, напоминающую укладку вариабельного домена Ig. Петли, соответствующие CDR антител, можно заменять на гетерологичную последовательность для придания различных связывающих свойств. Молекулы CTLA-4, сконструированные таким образом, что они обладают различными связывающими специфичностями, известны также как эвибоди (например, US № 7166697B1). Дополнительные сведения см. в Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 2001, cc. 31-45.
Липокаины относятся к семейству внеклеточных белков, которые транспортируют малые гидрофобные молекулы, такие как стероиды, билины, ретиноиды и липиды. Они имеют жесткую вторичную структуру в виде β-складки с рядом петель на открытом конце конической структуры, их можно создавать для связывания с различными антигенами-мишенями. Антикалины состоят из 160-180 аминокислот и их получают из липокаинов. Дополнительные сведения см. в Biochim. Biophys. Acta 1482, 2000, cc. 337350, в US № 7250297 B1 и US № 2007/0224633.
Аффибоди представляет собой каркас, полученный из белка А Staphylococcus aureus, который можно создавать для связывания с антигеном. Домен состоит из трехспирального пучка, содержащего примерно 58 аминокислот. Библиотеки были созданы путем рандомизации поверхностных остатков. Допол- 21 037557 нительные сведения см. в Protein Eng. Des. Sel. 17, 2004, cc. 455-462 и ЕР 1641818 А1.
Авимеры представляют собой мультидоменные белки, полученные из А-домена семейства белковкаркасов. Нативные домены, состоящие примерно из 35 аминокислот, адоптируют определенную связанную дисульфидами структуру. Разнообразие создают путем перестановки встречающихся в естественных условиях вариаций, характерных для семейства А-доменов. Дополнительные сведения см. в Nature Biotechnology 23(12), 2005, cc. 1556-1561 и Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), июнь 2007, cc. 909-917.
Трансферрин представляет собой мономерный сывороточный транспортный гликопротеин. Трансферрины можно создавать для связывания с различными антигенами-мишенями путем встраивания пептидных последовательностей в приемлемую поверхностную петлю. Примеры сконструированных трансферинновых каркасов включают транс-боди. Дополнительные сведения см. в J. Biol. Chem. 274, 1999, cc. 24066-24073.
Сконструированные белки, содержащие анкириновые повторы (DARPin), получают из анкирина, который относится к семейству белков, опосредующих присоединение интегральных мембранных белков к цитоскелету. Один анкириновый повтор представляет собой состоящий из 33 остатков мотив, включающий две α-спирали и β-изгиб. Их можно создавать для связывания с различными антигенамимишенями путем рандомизации остатков в первой α-спирали и β-изгибе каждого повтора. Их связывающую поверхность раздела можно увеличивать путем увеличения количества модулей (метод созревания аффинности). Дополнительные сведения см. в J. Mol. Biol. 332, 2003, cc. 489-503, PNAS 100(4), 2003, cc. 1700-1705 и J. Mol. Biol. 369, 2007, cc. 1015-1028, а также в US № 2004/0132028 A1.
Однодоменное антитело представляет собой фрагмент антитела, состоящий из единичного мономерного вариабельного домена антитела. Впервые единичный домен был получен из вариабельного домена тяжелой цепи антитела верблюдов (нанабоди или VHH-фрагменты). Кроме того, понятие однодоменное антитело включает авономный вариабельный домен человеческой тяжелой цепи (aVH) или VNARфрагменты, полученные из акул.
Фибронектин представляет собой каркас, который можно создавать для связывания антигена. Аднектины состоят из каркаса из встречающейся в естественных условиях аминокислотной последовательности 10-го домена из 15 повторяющихся единиц человеческого фибронектина типа III (FN3). Можно создавать три петли на одном конце β-сэндвича, что позволяет аднектину специфически распознавать представляющую интерес терапевтическую мишень. Дополнительные сведения см. в Protein Eng. Des. Sel. 18, 2005, cc. 435-444, US № 2008/0139791, WO 2005/056764 и US № 6818418 B1.
Пептидные аптамеры представляют собой комбинаторные распознающие молекулы, которые состоят из константного белка-каркаса, как правило, тиоредоксина (TrxA), который содержит ограниченную вариабельную пептидную петлю, встроенную в активный сайт. Дополнительные сведения см. в Expert Opin. Biol. Ther. 5, 2005, cc. 783-797.
Микрободи получают из встречающихся в естественных условиях микробелков, состоящих из 2550 аминокислот, которые содержат 3-4 цистеиновых мостика - примеры микробелков включают KalataBI и конотоксин и кноттины. Микробелки имеют петлю, которую можно подвергать инженерии таким образом, чтобы она включала вплоть до 25 аминокислот, без воздействия на общую укладку микробелка. Дополнительные сведения о создании кноттин-доменов см. в WO 2008/098796.
Понятие антигенсвязывающая молекула, которая связывается с таким же эпитопом, что и референс-молекула, относится к антигенсвязывающей молекуле, которая блокирует связывание референсмолекулы с ее антигеном на 50% или более при оценке в условиях конкуренции, и, наоборот, референсмолекула блокирует связывание антигенсвязывающей молекулы с ее антигеном на 50% или более при оценке в условиях конкуренции.
Понятие антигенсвязывающий домен относится к части антигенсвязывающей молекулы, которая содержит область, специфически связывающуюся и являющуюся комплементарной части антигена или полному антигену. Если антиген является крупным, то антигенсвязывающая молекула может связываться только с конкретной частью антигена, которую называют эпитопом. Антигенсвязывающий домен может представлять собой, например, один или несколько вариабельных доменов антитела (которые называют также вариабельными областями). Предпочтительно антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH).
В контексте настоящего описания понятие антигенная детерминанта является синонимом понятий антиген и эпитоп и относится к сайту (например, участку, состоящему из смежных аминокислот, или конформационной конфигурации, состоящей из различных областей несмежных аминокислот) на полипептидной макромолекуле, с которой связывается антигенсвязывающий фрагмент с образованием комплекса антигенсвязывающий фрагмент-антиген. Пригодные антигенные детерминанты могут присутствовать, например, на поверхности опухолевых клеток, на поверхности инфицированных вирусом клеток, на поверхности других больных клеток, на поверхности иммунных клеток, клеток, находящихся в свободном состоянии в сыворотке крови и/или во внеклеточном матриксе (ЕСМ). Белки, которые можно применять в качестве антигенов в настоящем изобретении, если не указано иное, могут представлять
- 22 037557 собой любые нативные формы белков из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы). В конкретном варианте осуществления изобретения антиген представляет собой человеческий белок. В контексте настоящего описания при ссылке на конкретный белок подразумевается полноразмерный, непроцессированный белок, а также любая форма белка, полученная в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты белка, например сплайсинговые варианты или аллельные варианты.
Понятие специфически связывается означает, что связывание является избирательным в отношении антигена и его можно отличать от нежелательных или неспецифических взаимодействий. Способность антигенсвязывающей молекулы связываться со специфическим антигеном можно определять с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или других методик, известных специалисту в данной области, например, с помощью методики на основе поверхностного плазмонного резонанса (осуществляя анализ с помощью устройства BIAcore) (Liljeblad и др., Glyco J. 17, 2000, cc. 323329), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr. Res. 28, 2002, cc. 217-229). В одном из вариантов осуществления изобретения уровень связывания антигенсвязывающей молекулы с неродственным белком составляет менее чем примерно 10% от уровня связывания антигенсвязывающей молекулы с антигеном, при измерении, например, с помощью SPR. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула, которая связывается с антигеном, характеризуется величиной константы диссоциации (KD), составляющей < 1 мкМ, < 100 нМ, < 10 нМ, < 1 нМ, < 0,1 нМ, < 0,01 нМ или < 0,001 нМ (например, 10-8М или менее, например, от 10-8 до 10-13М, например от 10-9 до 10-13М).
Понятие аффинность или аффинность связывания относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между индивидуальным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, то в контексте настоящего описания понятие аффинность связывания относится к присущей компонентам связывающейся пары (например, антителу и антигену) аффинности связывания, отражающей взаимодействие по типу 1:1. Аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно, как правило, характеризовать с помощью константы диссоциации (KD), которая представляет собой отношение констант скорости реакции диссоциации и ассоциации (koff и kon соответственно). Таким образом, эквивалентные аффинности могут соответствовать различным константам скорости, если соотношение констант скорости остается таким же. Аффинность можно оценивать общепринятыми методами, известными в данной области, включая представленные в настоящем описании методы. Конкретным методом измерения аффинности является метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
В контексте настоящего описания понятие антиген клетки-мишени относится к антигенной детерминанте, присутствующей на поверхности клетки-мишени, например клетке в опухоли, такой как раковая клетка или клетка стромы опухоли. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген клетки-мишени представляет собой антиген на поверхности опухолей клетки. В одном из вариантов осуществления изобретения антиген клетки-мишени выбирают из группы, включающей фибробластактивирующий белок (FAP), карциноэмбриональный антиген (СЕА), ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD19, CD20 и CD33. В частности, антиген клетки-мишени представляет собой фибробласт-активирующий белок (FAP).
Понятие фибробласт-активирующий белок (FAP), известный также как пролилэндопептидаза FAP или сепраза (КФ 3.4.21), если не указано иное, относится к любой нативной форме FAP из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди), приматы кроме человека (например, обезьяны циномолгус (яванский макак-крабоед) и грызуны (например, мыши и крысы). Понятие относится к полноразмерному непроцессированному FAP, а также к любой форме FAP, полученной в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты FAP, например, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, обладает способностью специфически связываться с FAP человека, мышей и/или обезьян циномолгус. Аминокислотная последовательность человеческого FAP представлена в UniProt (www.uniprot.org), код доступа № Q12884 (версия 149, SEQ ID NO: 20) или в NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2. Внеклеточный домен (ECD) человеческого FAP простирается от аминокислотного положения 26 до 760. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности меченного His человеческого FAP-ECD представлены в SEQ ID NO: 15 и 16 соответственно. Аминокислотная последовательность мышиного FAP представлена в UniProt, код доступа № Р97321 (версия 126, SEQ ID NO: 23) или NCBI RefSeq NP_032012.1. Внеклеточный домен (ECD) мышиного FAP простирается от аминокислотного положения 26 до 761. В SEQ ID NO: 24 и 25 представлены аминокислотная и нуклеотидная последовательности меченного His мышиного FAP-ECD соответственно. В SEQ ID NO: 26 и 27 представлены аминокислотная и нуклеотидная последовательности соответственно меченного FAPECD обезьян циномолгус. Предпочтительно анти-FAP-связывающая молекула, предлагаемая в изобретении, связывается с внеклеточным доменом FAP. Примеры анmи-FAP-связывающих молекул приведены в международной заявке на патент WO 2012/020006 А2.
- 23 037557
Понятие карциноэмбриональный антиген (СЕА), известный также как родственный молекуле клеточной адгезии 5 карциноэмбриональный антиген (СЕАСАМ5), если не указано иное, относится к любой нативной форме СЕА из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди), приматы кроме человека (например, обезьяны циномолгус) и грызуны (например, мыши и крысы). Аминокислотная последовательность человеческого СЕА представлена в UniProt, код доступа № Р06731 (версия 151, SEQ ID NO: 28). СЕА ранее был идентифицирован в качестве ассоциированного с опухолью антигена (Gold и Freedman, J Exp Med., 121, 1965, cc. 439-462; Berinstein N.L., J. Clin. Oncol., 20, 2002, cc. 2197-2207). Хотя СЕА первоначально был классифицирован в качестве белка, который экспрессируется только в эмбриональной ткани, в настоящее время СЕА обнаружен в некоторых типах здоровых тканей взрослых особей. Эти ткани имеют в основном эпителиальное происхождение и включают клетки желудочно-кишечной, респираторной и мочеполовой систем, а также клетки ободочной кишки, шейки матки, потовых желез и предстательной железы (Nap и др., Tumour. Biol., 9(2-3), 1988, cc. 145-153; Nap и др., Cancer Res., 52(8), 1992, cc. 23292339). В опухолях эпителиального происхождения, а также их метастазах СЕА присутствует в качестве ассоциированного с опухолью антигена. Хотя присутствие СЕА само по себе не свидетельствует о превращении в раковую клетку, распределение СЕА является показательным. В здоровой ткани СЕА, как правило, экспрессируется на апикальной поверхности клетки (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2), 1999, cc. 67-81), делая ее недоступной для антитела, присутствующего в кровотоке. В отличие от здоровой ткани в случае раковых клеток СЕА имеет тенденцию к экспрессии по всей их поверхности (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2), 1999, cc. 67-81). Указанное изменение схемы экспрессии делает СЕА доступным для связывания с антителом в раковых клетках. Помимо этого, в раковых клетках возрастает уровень экспрессии СЕА. Кроме того, повышенный уровень экспрессии СЕА стимулирует повышенную межклеточную адгезию, что может приводить к метастазам (Marshall J., Semin Oncol., 30 (приложение 8), 2002, cc. 30-36). Преобладание экспрессии СЕА в различных типах опухолей, как правило, является очень высоким. В соответствии с опубликованными данными анализ, проведенный авторами изобретения, который осуществляли в образцах тканей, подтвердил его высокое преобладание, при этом он обнаружен примерно в 95% образцов колоректальной карциномы (CRC), 90% образцов рака поджелудочной железы, 80% образцов рака желудка, 60% образцов немелкоклеточного рака легкого (NSCLC, где имела место совместная экспрессия с HER3) и 40% образцов рака молочной железы; низкий уровень экспрессии обнаружен при мелкоклеточном раке легкого и глиобластоме.
СЕА легко отщепляется от клеточной поверхности и проникает в кровоток из опухолей либо непосредственно, либо через лимфатические сосуды. Благодаря этой особенности уровень СЕА в сыворотке использовали в качестве клинического маркера для диагностики различных видов рака и скрининга в отношении рецидива различных видов рака, прежде всего колоректального рака (Goldenberg D.M., The International Journal of Biological Markers, 7, 1992, cc. 183-188; Chau I. и др., J. Clin. Oncol., 22, 2004, cc. 1420-1429; Flamini и др., Clin. Cancer Res.; 12(23), 2006, cc. 6985-6988).
Понятие ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP), известный также как хонроитинсульфат-протеогликан 4 (CSPG4), если не указано иное, относится к любой нативной форме MCSP из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди), приматы кроме человека (например, обезьяны циномолгус) и грызуны (например, мыши и крысы). Аминокислотная последовательность человеческого MCSP представлена в UniProt, код доступа № Q6UVK1 (версия 103, SEQ ID NO: 29).
Понятие рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) известный также как протоонкоген сErbB-1 или рецепторная тирозинпротеинкиназа erbB-1, относится, если не указано иное, к любой нативной форме EGFR из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди), приматы кроме человека (например, обезьяны циномолгус) и грызуны (например, мыши и крысы). Аминокислотная последовательность человеческого EGFR представлена в UniProt, код доступа № Р00533 (версия 211, SEQ ID NO: 30).
Понятие CD19 относится к антигену CD19 лимфоцитов, известному также как поверхностный антиген В4 В-лифоцитов или антиген Т-клеточной поверхности Leu-12, и относится, если не указано иное, к любой нативной форме CD19 из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди), приматы кроме человека (например, обезьяны циномолгус) и грызуны (например, мыши и крысы). Аминокислотная последовательность человеческого CD19 представлена в UniProt, код доступа № Р15391 (версия 160, SEQ ID NO: 31). Понятие относится к полноразмерному непроцессированному CD19, а также любой форме человеческого CD19, полученной в результате процессинга в клетке, если антитело, указанное в настоящем описании, связывается с ним. CD19 представляет собой структурно определенный рецептор клеточной поверхности, экспрессируемый на поверхности человеческих В-клеток, включая (но не ограничиваясь только ими) пре-Вклетки, В-клетки на ранней стадии развития (т.е. незрелые В-клетки), зрелые В-клетки при терминальной дифференцировке в плазматические клетки и злокачественные В-клетки. CD19 экспрессируется в большинстве случаях при пре-В-клеточных острых лимфобластных лейкозах (ALL), неходжскинских лимфомах, В-клеточных хронических лимфоцитарных лейкозах (CLL), пролимфоцитарных лейкозах, воло
- 24 037557 сатоклеточных лейкозах, острых лимфоцитарных лейкозах общего типа и при некоторых острых лимфобластных лейкозах с нулевым фенотипом. Экспрессия CD19 на плазматических клетках позволяет предположить также, что он может экспрессироваться на дифференцированных В-клеточных опухолях, таких как множественная миелома. Таким образом, антиген CD19 является мишенью для иммунотерапии при лечении неходжскиной лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза.
Понятие CD20 относится к антигену В-лимфоцитов CD20, известному также как трансмембранный четырехдоменный представитель 1 подсемейства А (MS4A1), поверхностный антиген В1 Влимфоцитов или антиген поверхности лейкоцитов Leu-16, и относится, если не указано иное, к любой нативной форме CD20 из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди), приматы кроме человека (например, обезьяны циномолгус) и грызуны (например, мыши и крысы). Аминокислотная последовательность человеческого CD20 представлена в UniProt, код доступа № Р11836 (версия 149, SEQ ID NO: 32).
Понятие CD33 относится к поверхностному антигену миелоидных клеток CD33, известному также как SIGLEC3 или gp67, и относится, если не указано иное, к любой нативной форме CD33 из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди), приматы кроме человека (например, обезьяны циномолгус) и грызуны (например, мыши и крысы). Аминокислотная последовательность человеческого CD33 представлена в UniProt, код доступа № Р20138 (версия 157, SEQ ID NO: 33).
Понятие вариабельная область или вариабельный домен относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антигенсвязывающей молекулы с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-е изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена.
Понятие гипервариабельный участок или HVR в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательности которых являются гипервариабельными, и/или которые образуют структуры в виде петель (гипервариабельные петли). Как правило, нативные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, H2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR, как правило, содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из определяющих комплементарность участков (CDR), последние отличаются наиболее выраженной вариабельностью последовательности и/или участвуют в распознавании антигенов. Приведенные в качестве примера гипервариабельные петли включают аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2), и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917). Приведенные в качестве примера CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) включают аминокислотные остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35В (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) (Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD,1991). Гипервариабельные участки (HVR) часто обозначают как определяющие комплементарность участки (CDR), и эти понятия в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо, и они относятся к участкам вариабельной области, которые образуют антигенсвязывающие области. Эта конкретная область описана у Kabat и др., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1983 и у Chothia и др., J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917, причем эти определения относятся к перекрывающимся аминокислотным остаткам или поднаборам аминокислотных остатков при их сравнении друг с другом. Однако в контексте настоящего описания подразумевается возможность применения любого определения CDR антитела или его вариантов. Соответствующие аминокислотные остатки, из которых состоят CDR, как они определены в каждой из процитированных выше ссылок, представлены в сравнении ниже в табл. А. Точные номера остатков, которые образуют конкретный CDR, должны варьироваться в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области на основе данных об аминокислотной последовательности вариабельной области антитела легко могут определять, какие остатки входят в конкретный CDR.
Таблица А. Определения CDR
Кэбот Хотиа AbM2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-32
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
Нумерация всех входящих в CDR остатков в табл. А дана в соответствии с номенклатурой, предложенной Кэботом с соавторами (см. ниже).
Обозначение AbM с прописной буквой b, использованное в табл. А, относится к CDR, как они
- 25 037557 определены программой для моделирования антител AbM компании Oxford Molecular Group.
Кэбот с соавторами предложили также систему нумерации (номенклатуру) последовательностей вариабельных областей, которую можно применять для любого антитела. Обычный специалист в данной области может однозначно применять эту систему нумерации по Кэботу к любой последовательности вариабельной области, не имея никаких экспериментальных данных, кроме сведений о самой последовательности. В контексте настоящего описания понятие нумерация по Кэботу относится к системе нумерации, описанной у Kabat и др., Sequence of Proteins of Immunological Interest, изд-во U.S. Dept. of Health and Human Services, 1983. Если не указано иное, то ссылки на нумерацию положений конкретных аминокислотных остатков в вариабельной области антитела даны в соответствии с системой нумерации по Кэботу.
За исключением CDR1 в VH, CDR, как правило, содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. CDR содержат также определяющие специфичность остатки или SDR, которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR, содержащиеся в областях CDR, обозначают как укороченные -CDR или a-CDR. Приведенные в качестве примера a-CDR (aCDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и а-CDR-H3) содержат аминокислотные остатки 31-34 (L1), 50-55 (L2), 89-96 (L3), 31-35B (H1), 50-58 (H2) и 95-102 (Н3) (см. Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, cc. 1619-1633). Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) в настоящем описании нумеруют согласно Kabat и др., выше.
В контексте настоящего описания понятие с созревшей аффинностью касательно антигенсвязывающих молекул (например, антител) относится к антигенсвязывающей молекуле, полученной из антигенсвязывающей референс-молекулы, например, с помощью мутации, которая связывается с тем же антигеном, предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что и референс-антитело; и обладает более высокой аффинностью к антигену, чем антигенсвязывающая референс-молекула. Созревание аффинности, как правило, включает модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких CDR антигенсвязывающей молекулы. Как правило, антигенсвязывающая молекула с созревшей аффинностью связывается с тем же эпитопом, что и исходная антигенсвязывающая референсмолекула.
Каркасные участки или FR представляют собой участки вариабельных доменов, отличные от остатков гипервариабельных участков (HVR). FR вариабельного домена, как правило, представлены четырьмя FR-доменами: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR, как правило, расположены в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Для целей настоящего описания акцепторный человеческий каркасный участок означает каркасный участок, содержащий аминокислотную последовательность каркасного участка вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасного участка вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящий из каркасного участка человеческого иммуноглобулина или консенсусного человеческого каркасного участка, указанного ниже. Акцепторный человеческий каркасный участок происходящий из каркасного участка человеческого иммуноглобулина или консенсусного человеческого каркасного участка может содержать такую же аминокислотную последовательность или может содержать замены в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество аминокислотных замен составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность акцепторного человеческого каркасного участка VL идентична последовательности каркасного участка VL человеческого иммуноглобулина или последовательности консенсусного человеческого каркасного участка.
Понятие химерное антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из конкретного источника или конкретных видов, а остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или других видов.
Понятие класс антитела относится к типу константного домена или константной области, входящего/входящей в тяжелую цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно.
Понятие гуманизированное антитело относится к химерному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело может содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. Понятие гуманизированная форма антитела, например нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подвергали гуманизации. Другие формы гуманизированных антител, подпадающие под объем настоящего изобретения, представляют собой антитела, в которых константная область дополни- 26 037557 тельно модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом для создания свойств, которые требуются согласно изобретению, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания с Fcрецептора (FcR).
Человеческое антитело представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком или человеческой клеткой, или полученную из источника, отличного от человека, с использованием спектра человеческих антител или других кодирующих человеческое антитело последовательностей. Из указанного определения человеческого антитела специально исключено гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.
В контексте настоящего описания понятие Fc-домен или Fc-область относится к С-концевой области тяжелой цепи антитела, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие относится к нативной последовательности Fc-областей и вариантам Fc-областей. Fc-область IgG содержит СН2-домен IgG и СН3-домен IgG. СН2-домен Fc-области человеческого IgG, как правило, простирается от аминокислотного остатка, находящегося примерно в положении 231, до аминокислотного остатка, находящегося примерно в положении 340. В одном из вариантов осуществления изобретения к СН2-домену присоединена углеводная цепь. В контексте настоящего описания СН2-домен может иметь нативную последовательность СН2-домена или последовательность варианта СН2-домена. СН3-домен содержит сегмент С-концевых остатков до СН2-домена в Fc-области (т.е. от аминокислотного остатка, находящегося примерно в положении 341, до аминокислотного остатка, находящегося примерно в положении 447 IgG). В контексте настоящего описания СН3-домен может иметь нативную последовательность СН3-домена или последовательность варианта СН3-домена (например, СН3-домен с интродуцированной выпуклостью (выступ) в одной его цепи и с соответствующей интродуцированной полостью (впадина) в другой его цепи; см. US № 5821333, специально включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Указанные варианты СН3-доменов можно применять для усиления гетеродимеризации двух неидентичных тяжелых цепей антитела, согласно описанному в настоящем описании методу. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может либо присутствовать, либо отсутствовать. Если специально не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константном участке соответствует системе EUнумерации, которую называют также EU-индексом, описанной у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-e изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Технология knob-into-hole описана, например, в US № 5731168; US № 7695936; у Ridgway и др., Prot Eng 9, 1996, cc. 617-621 и Carter, J. Immunol. Meth. 248, 2001, cc. 7-15. В целом, метод включает интродукцию выпуклости (выступ) на поверхности раздела первого полипептида и соответствующей полости (впадина) в поверхности раздела второго полипептида, в результате выпуклость может помещаться в полость, усиливая тем самым образование гетеродимера и препятствуя образованию гомодимера. Выпуклости конструируют путем замены аминокислот с небольшими боковыми цепями на поверхности раздела первого полипептида на аминокислоты с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан). Компенсирующие полости идентичного или сходного с выпуклостями размера конструируют в поверхности раздела второго полипептида путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с менее крупными боковыми цепями (например, аланин или треонин). Выпуклость и полость можно создавать, изменяя нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептиды, например, с помощью сайтспецфического мутагенеза или с использованием пептидного синтеза. В конкретном варианте осуществления изобретения модификация, приводящая к образованию выступа, включает аминокислотную замену T366W в одной из двух субъединиц Fc-домена, и модификация, приводящая к образованию впадины, включает аминокислотные замены T366S, L368A и Y407V в другой одной из двух субъединиц Fc-домена. В другом конкретном варианте осуществления изобретения субъединица Fc-домена, которая содержит модификацию, приводящую к образованию выступа, дополнительно содержит аминокислотную замену S354C, а субъединица Fc-домена, которая содержит модификацию, приводящую к образованию впадины, дополнительно содержит аминокислотную замену Y349C. Интродукция этих двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидного мостика между двумя субъединицами Fc-домена, дополнительно стабилизирующего димер (Carter, J. Immunol. Methods 248, 2001, cc. 7-15). Нумерации соответствует EU-индексу ( Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
Подразумевается, что область, эквивалентная Fc-области иммуноглобулина включает встречающиеся в естественных условиях аллельные варианты Fc-области иммуноглобулина, а также варианты, имеющие изменения, приводящие к заменам, добавлениям или делециям, которые не снижают существенно способность иммуноглобулина опосредовать эффекторные функции (такие как антителообусловленная клеточнозависимая цитотоксичность). Например, одну или несколько аминокислот можно изымать путем делеции из N-конца или С-конца Fc-области иммуноглобулина без существенного снижения биологической функции. Указанные варианты можно выбирать согласно общим правилам, известным в данной области, так, чтобы оказывать минимальное воздействие на активность (см., напри- 27 037557 мер, Bowie J.U. и др., Science 247, 1990, cc. 1306-1310).
Понятие эффекторные функции относится к видам биологической активности, присущим Fcобласти антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: способность связываться с C1q и комплементзависимая цитотоксичность (CDC), способность связываться с Fc-рецептором, антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), антитело-обусловленный клеточнозависимый фагоцитоз (ADCP), секреция цитокинов, опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора) и активация В-клеток.
Активирующий Fc-рецептор представляет собой Fc-рецептор, который после взаимодействия с Fc-областью антитела осуществляет процесс передачи сигналов, которые стимулируют осуществление несущей рецептор клеткой эффекторных функций. Активирующие Fc-рецепторы включают FcYRIIIa (CD 16a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) и FcaRI (CD89). Конкретный активирующий Fc-рецептор представляет собой человеческий FcYRIIIa (см. UniProt, код доступа № Р08637, версия 141).
Понятие представитель семейства лигандов TNF или лиганд семейства TNF относится к провоспалительному цитокину. Цитокины в целом и, в частности, представители семейства лигандов TNF играют решающую роль в стимуляции и координации иммунной системы. К настоящему времени идентифицировано 19 цитокинов в качестве представителей суперсемейства лигандов TNF (фактор некроза опухоли) на основе сходства последовательностей, функциональных и структурных характеристик. Все эти лиганды представляют собой трансмембранные белки типа II с С-концевым внеклеточным доменом (эктодомен), N-концевым внутриклеточным доменом и единичным трансмембранным доменом. Сконцевой внеклеточный домен, который обозначают как домен гомологии TNF (THD), характеризуется идентичностью 20-30% аминокислот между представителями суперсемейства и ответствен за связывание с рецептором. Эктодомен TNF ответствен также за способность лигандов TNF образовывать тримерные комплексы, которые распознаются их специфическими рецепторами.
Представителей лигандов семейства TNF выбирают из группы, включающей лимфотоксин α (известный также как LTA или TNFSF1), TNF (известный также как TNFSF2), LTe (известный также как TNFSF3), OX40L (известный также как TNFSF4), CD40L (известный также как CD154 или TNFSF5), FasL (известный также как CD95L, CD178 или TNFSF6), CD27L (известный также как CD70 или TNFSF7), CD30L (известный также как CD153 или TNFSF8), 4-1BBL (известный также как TNFSF9), TRAIL (известный также как APO2L, CD253 или TNFSF10), RANKL (известный также как CD254 или TNFSF11), TWEAK (известный также как TNFSF12), APRIL (известный также как CD256 или TNFSF13), BAFF (известный также как CD257 или TNFSF13B), LIGHT (известный также как CD258 или TNFSF14), TL1A (известный также как VEGI или TNFSF15), GITRL (TNFSF18), EDA-A1 (известный также как эктодисплазин А1) и EDA-A2 (известный также как эктодисплазин А2). Понятие относится, если не указано иное, к любому нативному лиганду семейства TNF из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди), приматы кроме человека (например, обезьяны циномолгус) и грызуны (например, мыши и крысы). В конкретных вариантах осуществления изобретения представителя семейства лигандов TNF выбирают из группы, состоящей из OX40L, FasL, CD27L, TRAIL, 4-1BBL, CD40L и GITRL. В конкретном варианте осуществления изобретения представителя семейства лигандов TNF выбирают из 4-1BBL и OX40L.
Дополнительную информацию, в частности о последовательностях представителей семейства лигандов TNF, можно почерпнуть из публично доступных баз данных, таких как Uniprot (www.uniprot.org). Например, человеческие лиганды TNF имеют следующие аминокислотные последовательности: человеческий лимфотоксин α (UniProt, код доступа. Р01374, SEQ ID NO: 34), человеческий TNF (UniProt, код доступа № Р01375, SEQ ID NO: 35), человеческий лимфотоксин β (UniProt, код доступа № Q06643, SEQ ID NO: 36), человеческий OX40L (UniProt, код доступа № Р23510, SEQ ID NO: 37), человеческий CD40L (UniProt, код доступа № Р29965, SEQ ID NO: 38), человеческий FasL (UniProt, код доступа № Р48023, SEQ ID NO: 39), человеческий CD27L (UniProt, код доступа № P32970, SEQ ID NO: 40), человеческий CD30L (UniProt, код доступа № P32971, SEQ ID NO: 41), 4-1BBL (UniProt, код доступа № P41273, SEQ ID NO: 42), TRAIL (UniProt, код доступа № P50591, SEQ ID NO: 43), RANKL (UniProt, код доступа № 014788, SEQ ID NO: 44), TWEAK (UniProt, код доступа № 043508, SEQ ID NO: 45), APRIL (UniProt, код доступа № 075888, SEQ ID NO: 46), BAFF (UniProt, код доступа № Q9Y275, SEQ ID NO: 47), LIGHT (UniProt, код доступа № 043557, SEQ ID NO: 48), TL1A (UniProt, код доступа № 095150, SEQ ID NO: 49), GITRL (UniProt, код доступа № Q9UNG2, SEQ ID NO: 50) и эктодисплазин A (UniProt, код доступа № Q92838, SEQ ID NO: 51).
Эктодомен представляет собой домен мембранного белка, который простирается во внеклеточное пространство (т.е. пространство вне клетки-мишени). Эктодомены, как правило, представляют собой участки белков, которые инициируют контакт с поверхностями, что приводит к трансдукции сигнала. Таким образом, эктодомен представителя семейства лигандов TNF, указанный в настоящем описании, представляет собой участок белка лиганда TNF, который простирается во внеклеточное пространство
- 28 037557 (внеклеточный домен), но включает также более короткие участки, ответственные за тримеризацию и связывание с соответствующим TNF-рецептором. Таким образом, понятие эктодомен представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент относится к внеклеточному домену представителя семейства лигандов TNF, который образует внеклеточный домен или его участки, которые все еще могут связываться с рецептором (домен, связывающий рецептор).
Понятие костимуляторный представитель семейства лигандов TNF или костимуляторный лиганд семейства TNF относится к подгруппе представителей семейства лигандов TNF, которые обладают способностью оказывать костимуляторное действие на пролиферацию и производство цитокинов Тклетками. Указанные лиганды семейства TNF могут костимулировать TCR-сигналы после взаимодействия с их соответствующими TNF-рецепторами, и взаимодействие с их рецепторами приводит к рекрутменту TNFR-ассоциированных факторов (TRAF), которые инициируют каскады передачи сигналов, что приводит к Т-клеточной активации. Костимуляторные лиганды семейства TNF выбирают из группы, состоящей из 4-1BBL, OX40L, GITRL, CD70, CD30L и LIGHT, более конкретно костимуляторные лиганды семейства TNF выбирают из 4-1BBL и OX40L.
Как описано выше, 4-1BBL представляет собой трансмембранный белок типа II и является одним из представителей семейства лигандов TNF. Установлено, что полный или полноразмерный 4-1BBL, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, образует тримеры на поверхности клеток. Образование тримеров определяется специфическими мотивами эктодомена 4-1BBL. Указанные мотивы в контексте настоящего описания обозначают как область тримеризации. Аминокислоты 50254 последовательности человеческого 4-1BBL (SEQ ID NO: 52) образуют внеклеточный домен 4-1BBL, но даже его фрагменты могут образовывать тримеры. В конкретных вариантах осуществления изобретения понятие эктодомен 4-1BBL или его фрагмент относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4 (аминокислоты 52-254 человеческого 4-1BBL), SEQ ID NO: 1 (аминокислоты 71-254 человеческого 4-1BBL), SEQ ID NO: 3 (аминокислоты 80-254 человеческого 4-1BBL) и SEQ ID NO: 2 (аминокислоты 85-254 человеческого 4-1BBL), или полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 96 (аминокислоты 71-248 человеческого 4-1BBL), SEQ ID NO: 375 (аминокислоты 52-248 человеческого 4-1BBL), SEQ ID NO: 374 (аминокислоты 80-248 человеческого 4-1BBL) и SEQ ID NO: 373 (аминокислоты 85-248 человеческого 41BBL), но понятие включает также другие фрагменты эктодомена, обладающие способностью к тримеризации.
Как описано выше, OX40L представляет собой другой трансмембранный белок типа II и является дополнительным представителем семейства лигандов TNF. Полный или полноразмерный OX40L имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37. Аминокислоты 51-183 последовательности человеческого OX40L (SEQ ID NO: 53) образуют внеклеточный домен OX40L, но под понятие подпадают также и его фрагменты, которые обладают способностью образовывать тримеры. В конкретных вариантах осуществления изобретения понятие эктодомен OX40L или его фрагмент относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 53 (аминокислоты 51183 человеческого OX40L) или SEQ ID NO: 54 (аминокислоты 52-183 человеческого OX40L), но понятие включает также другие фрагменты эктодомена, обладающие способностью к тримеризации.
Понятие пептидный линкер относится к пептиду, содержащему одну или несколько аминокислот, как правило примерно 2-20 аминокислот. Пептидные линкеры известны в данной области и указаны в настоящем описании Приемлемыми неиммуногенными линкерными пептидами являются, например, пептидные линкеры (G4S)n, (SG4)n или G4(SG4)n, в которых n, как правило, обозначает число от 1 до 10, как правило от 1 до 4, в частности 2, т.е. пептиды, выбранные из группы, состоящей из GGGGS (SEQ ID NO: 128), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 13), SGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 55) и GGGGS GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 56), но также включают последовательности GSPGSSSSGS (SEQ ID NO: 57), GSGSGSGS (SEQ ID NO: 58), GSGSGNGS (SEQ ID NO: 59), GGSGSGSG (SEQ ID NO: 60), GGSGSG (SEQ ID NO: 61), GGSG (SEQ ID NO: 62), GGSGNGSG (SEQ ID NO: 63), GGNGSGSG (SEQ ID NO: 64) и GGNGSG (SEQ ID NO: 65). Наибольший интерес представляют пептидные линкеры (G4S)1 или GGGGS (SEQ ID NO: 128), (G4S)2 или GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 13) и d GSPGSSSSGS (SEQ ID NO: 57), более предпочтительно (G4S)2 или GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 13) и GSPGSSSSGS (SEQ ID NO: 57).
Понятие аминокислота в контексте настоящего описания обозначает группу встречающихся в естественных условиях карбокси-а-аминокислот, таких как аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновая кислота (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовая кислота (glu, E), глицин (gly, G), гистидин (his, H), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, M), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, P), серин (ser, S), треонин (thr, T), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).
Понятие одноцепочечный слитый белок в контексте настоящего описания относится к одноцепочечному полипептиду, состоящему из одного или двух эктодоменов указанного представителя семейства лигандов TNF, который слит с участком антигенсвязывающего фрагмента или Fc-областью. Слияние можно осуществлять с помощью непосредственного связывания N- или С-концевой аминокислоты антигенсвязывающего участка через пептидный линкер с С- или N-концевой аминокислотой эктодомена ука- 29 037557 занного представителя семейства лигандов TNF.
Под понятием слитый или связанный подразумевают, что компоненты (например, полипептид и эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF) соединены пептидными связями либо непосредственно, либо через один или несколько пептидных линкеров.
Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности относительно полипептидной (белковой) референс-последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в полипептидной референспоследовательности, после выравнивания последовательностей и интродукции при необходимости брешей для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и при этом какиелибо консервативные замены не учитываются при оценке идентичности последовательностей. Сравнительный анализ для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными путями, которые находятся в компетенции специалиста в данной области, например, с использованием публично доступных компьютерных программ, таких как программа BLAST, BLAST-2, ALIGN SAWI или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения величину % идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием предназначенной для сравнения последовательностей компьютерной программы ALIGN-2. Предназначенная для сравнения последовательностей компьютерная программа ALIGN-2 разработана фирмой Genentech, Inc., и исходный код помещен на хранение вместе с документацией для пользователя в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под регистрационным номером U.S. Copyright Registration, № TXU510087. Программа ALIGN-2 представляет собой публично доступную программу фирмы Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, шт. Калифорния, или ее можно компилировать из исходного кода. Программу ALIGN-2 можно компилировать для применения в операционной системе UNIX, включая цифровую версию UNIX V4.0D. В программе ALIGN-2 все параметры для сравнения последовательностей являются заданными и не должны изменяться. В ситуациях, когда ALIGN-2 применяют для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотных последовательностей данной аминокислотной последовательности А относительно или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью Б (которую другими словами можно обозначать как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или отличается определенным % идентичности аминокислотной последовательности относительно или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью Б), рассчитывают следующим образом:
100 х частное X/Y, где X обозначает количество аминокислотных остатков, оцененных программой сравнительного анализа последовательностей ALIGN-2 как идентичные совпадения при сравнительном анализе последовательностей А и Б с помощью указанной программы и где Y обозначает общее количество аминокислотных остатков в Б. Должно быть очевидно, что, когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, то % идентичности аминокислотной последовательности А относительно аминокислотной последовательности Б не должен быть равен % идентичности аминокислотной последовательности Б относительно аминокислотной последовательности А. Если специально не указано иное, то в контексте настоящего описания все величины % идентичности аминокислотных последовательностей получают согласно процедуре, описанной в последнем из предшествующих параграфов, с помощью компьютерной программы ALIGN-2.
Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются варианты аминокислотных последовательностей содержащих тримерный лиганд TNF антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем описании. Например, может оказаться желательным повышать аффинность связывания и/или другие биологические свойства содержащих тримерный лиганд TNF антигенсвязывающих молекул. Варианты аминокислотных последовательностей содержащих тримерный лиганд TNF антигенсвязывающих молекул можно получать путем интродукции соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулы, или путем пептидного синтеза. Указанные модификации включают, например, делеции и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечной конструкции можно использовать любую комбинацию делеций, инсерций и замен, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, способностью связываться с антигеном. Представляющие интерес сайты для замещающего мутагенеза включают HVR и каркасные участки (FR). Консервативные замены представлены в табл. Б под заголовком предпочтительные замены и дополнительно описаны ниже со ссылкой на классы (1)(6) боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно интродуцировать в представляющую интерес молекулу и продукты подвергать скринингу в отношении требуемой активности, например, сохранения/повышения способности к связыванию антигена, пониженной иммуногенности или улучшенной ADCC или CDC.
- 30 037557
Таблица Б
Исходный остаток Приведенные в качестве примера замены Предпочтительные замены
Ala (А) Val; Leu; Не Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (Ν) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
He (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин Leu
Leu (L) норлейцин; lie; Val; Met; Ala; Phe lie
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; lie Leu
Phe(F) Trp; Leu; Val; lie; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин Leu
Аминокислоты можно группировать на основе общих свойств боковых цепей следующим образом:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Под неконсервативными заменами подразумевают замену представителя одного из указанных классов на представителя из другого класса.
Понятие варианты аминокислотной последовательности включает полученные в результате замены варианты, в которых имеют место аминокислотные замены одного или нескольких остатков в гипервариабельном участке родительской антигенсвязывающей молекулы (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, образовавшийся(еся) вариант(ы), выбранный(ые) для дальнейшего изучения, должен(ны) иметь модификации (например, улучшения) определенных биологических свойств (например, повышенная аффинность, пониженная иммуногенность) относительно родительской антигенсвязывающей молекулы и/или должен(ны) практически сохранять определенные биологические свойства родительской антигенсвязывающей молекулы. Примером полученного в результате замены варианта является антитело с созревшей аффинностью, которое можно легко получать, например, с помощью методов созревания аффинности на основе фагового дисплея, которые указаны в настоящем описании. В целом, метод состоит в следующем: один или несколько остатков HVR подвергают мутации и вариант антигенсвязывающих молекул экспонируют на фаге и подвергают скринингу в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания). В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции могут затрагивать один или несколько HVR, если указанные изменения не снижают существенно способность антигенсвязывающей молекулы связываться с антигеном. Например, в HVR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, указанные в настоящем описании), которые не снижают существенно аффинность связывания. Ценным методом идентификации остатков или областей антитела, которые можно подвергать мутагенезу, является так называемый аланин-сканирующий мутагенез, описанный у Cunningham B.C. и Wells J.A., Science 244, 1989, cc. 1081-1085. При осуществлении этого метода остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (например, аланин или полиаланин) для решения вопроса о том, будет ли это влиять на взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замены можно интродуцировать в те положения аминокислот, для которых продемонстрирована функциональная чувствительность к начальным заменам. В альтернативном или дополнительном варианте изучают кристаллическую структуру комплекса антиген-антигенсвязывающая молекула для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Указанные контактирующие остатки и соседние остатки можно рассматривать в качестве мишеней или исключать из рассмотрения в качестве кандидатов для замены. Варианты можно подвергать скринингу для решения вопроса о том, обладают ли они требуемыми свойствами.
Аминокислотные инсерции включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, варьирующие по
- 31 037557 длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или большее количество остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примером результата осуществления концевых инсерций является содержащая тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающая молекула с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекул слияние N- или С-концов антитела с полипептидом, который удлиняет время полужизни в сыворотке содержащих тримерный лиганд TNF антигенсвязывающих молекул.
В некоторых вариантах осуществления изобретения содержащие тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающие молекулы, представленные в настоящем описании, изменяют с целью повышения или понижения степени гликозилирования антитела. Добавление или делецию сайтов гликозилирования в антителе можно легко осуществлять. Варианты гликозилирования молекул легко можно получать путем такого изменения аминокислотной последовательности, которое позволяет создавать или удалять один или несколько сайтов гликозилирования. Если содержащая тримерный лиганд TNF антигенсвязывающая молекула содержит Fc-область, то можно изменять присоединенный к ней углевод. Нативные антитела, которые продуцируются клетками млекопитающих, как правило, содержат разветвленный биантенный олигосахарид, который, как правило, присоединен с помощью N-связи к Asn297 СН2-домена Fc-области (см., например, Wright А. и Morrison S.L., TIBTECH 15, 1997, сс. 26-32). Олигосахарид может включать различные углеводы, например маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в стебле биантенной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах осуществления изобретения модификации олигосахарида в содержащей тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающей молекуле, предлагаемой в изобретении, можно осуществлять для создания вариантов с определенными улучшенными свойствами. Одним из объектов изобретения являются содержащие тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающие молекулы, имеющие углеводную структуру, в которой снижено содержание фукозы, присоединенной (прямо или косвенно) к Fc-области. Указанные фукозилированные варианты могут обладать улучшенной ADCC-функцией (см., например, US № 2003/0157108 (Presta L.) или US № 2004/0093621 (фирма Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Другие варианты содержащих тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в изобретении, включают варианты с двурассекающими олигосахаридами, например, в которых биантенный олигосахарид, присоединенный к Fc-области, двурассекается с помощью GlcNAc. Указанные варианты могут обладать пониженным уровнем фукозилирования и/или улучшенной ADCCфункцией, см., например, WO 2003/011878 (Jean-Mairet и др.); US № 6602684 (Umana и др.) и US 2005/0123546 (Umana и др.). Предложены также варианты по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области. Такие варианты антител могут обладать повышенной CDC-функцией, и они описаны, например, WO 1997/30087 (Patel и др.); WO 1998/58964 (Raju S.) и WO 1999/22764 (Raju S.).
В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться желательным создавать сконструированные с помощью цистеина варианты содержащей тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, например, тиоМАт, в которых один или несколько остатков в молекуле заменены на остатки цистеина. В конкретных вариантах осуществления изобретения замененные остатки находятся в доступных сайтах молекулы. Путем замены этих остатков на цистеин реакционноспособные тиольные группы помещаются в доступные сайты антитела и могут использоваться для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как фрагменты, представляющие собой лекарственное средство, или фрагменты, представляющие собой линкер, связанный с лекарственным средством, с созданием иммуноконъюгата, указанного ниже в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения любой(ые) один или несколько следующих остатков может(гут) быть заменен(ы) на цистеин: V205 (нумерация по Кэботу) легкой цепи; А118 (EU-нумерация) тяжелой цепи и S400 (EU-нумерация) Fc-области тяжелой цепи. Сконструированные с помощью цистеина антигенсвязывающие молекулы можно получать согласно методу, например, описанному в US № 7521541.
В некоторых объектах изобретения содержащие тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающие молекулы, представленные в настоящем описании, можно дополнительно модифицировать таким образом, чтобы они содержали дополнительные небелковые фрагменты, известные в данной области и легко доступные. Фрагменты, пригодные для дериватизации антитела, включают (но, не ограничиваясь только ими) водорастворимые полимеры. Примерами водорастворимых полимеров являются (но, не ограничиваясь только ими) полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры) и декстран- или поли(н-винилпиролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущество при производстве благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным.
Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьироваться и, если присоединено
- 32 037557 более одного полимера, то они могут представлять собой одинаковые или различные молекулы. В целом, количество и/или тип полимеров, применяемых для дериватизации, можно определять с учетом таких особенностей (но, не ограничиваясь только ими), как конкретные свойства или функции антитела, подлежащие усовершенствованию, предполагается ли применение производного биспецифического антитела в терапии в определенных условиях и т.д.
Другим объектом изобретения являются конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, которые можно избирательно нагревать, воздействуя на них излучением. В одном из вариантов осуществления изобретения небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2005, cc. 11600-11605). Излучение может иметь любую длину волны и включает (но, не ограничиваясь только ими) длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой уничтожаются клетки, ближайшие к конъюгату: антитело-небелковый фрагмент.
Согласно другому объекту изобретения можно получать иммуноконъюгаты содержащих тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающих молекул. Иммуноконъюнат представляет собой антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичной(ыми) молекулой(амии), включая (но, не ограничиваясь только ими) цитотоксический агент.
Понятие полинуклеотид относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты или конструкции, например матричной РНК (мРНК), РНК вирусного происхождения или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать обычную фосфодиэфирную связь или нетрадиционную связь (например, амидную связь, такую, которая присутствует в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Понятие молекула нуклеиновой кислоты относится к любому одному или нескольким сегментам нуклеиновой кислоты, например, фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде.
Под выделенной молекулой нуклеиновой кислоты или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, т.е. ДНК или РНК, которая отделена от ее нативного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий входящий в вектор полипептид, рассматривается как выделенный для целей настоящего изобретения. Другими примерами выделенного полинуклеотида являются рекомбинантные полинуклеотиды, присутствующие в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные (частично или полностью) полинуклеотиды, находящиеся в растворе. Выделенный полинуклеотид включает молекулу полинуклеотида, входящую в клетки, которые в норме содержат молекулу полинуклеотида, но молекула полинуклеотида присутствует вне хромосомы или имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в хромосоме в естественных условиях. Выделенные молекулы РНК включают полученные in vivo или in vitro РНК-транскрипты, предлагаемые в настоящем изобретении, а также формы с позитивной и негативной цепью и двухцепочечные формы. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем изобретении, включают также указанные молекулы, полученные с помощью синтеза. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может представлять собой или может включать регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосом или терминатор транскрипции.
Под нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом, имеющей/имеющим нуклеотидную последовательность, которая, например, на 95% идентична нуклеотидной референс-последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, подразумевается, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична референс-последовательности за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов нуклеотидной референс-последовательности. Другими словами, для получения полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 95% нуклеотидной референспоследовательности, вплоть до 5% нуклеотидов в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другой нуклеотид, или вплоть до 5% нуклеотидов от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти изменения референс-последовательности могут иметь место в положениях на 5'- или 3'-конце нуклеотидной референс-последовательности или в ином положении между этими концевыми положениями, и их встраивают либо индивидуально между остатками в референс-последовательности, либо их встраивают в референс-последовательность в виде одной или нескольких смежных групп. На практике решение вопроса о том, идентична ли конкретная полинуклеотидная последовательность по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, можно решать, как правило, с использованием известных компьютерных программ, например, указанных выше для полипептидов (например, ALIGN-2).
Понятие кассета экспрессии относится к полинуклеотиду, полученному с помощью рекомбинации или синтеза, который содержит серии специфических нуклеотидных элементов, которые обеспечивают транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Рекомбинантную кассету экспрессии можно встраивать в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Как правило, рекомбинантная кассета экспрессии, представляющая собой часть экспрессионного вектора, включает среди прочих последовательностей подлежащую транскрипции нуклеотидную последовательность и промотор. В некоторых вариантах осуществления изобре- 33 037557 тения кассета экспрессии, предлагаемая в изобретении, содержит полинуклеотидные последовательности, которые кодируют биспецифические антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, или их фрагменты.
Понятие вектор или экспрессионный вектор является синонимом понятия экспрессионная конструкция и относится к молекуле ДНК, которую применяют для интродукции и обеспечения экспрессии конкретного гена, с которой он функционально связан в клетке-мишени. Понятие включает вектор, представляющий собой самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он интродуцирован. Экспрессионный вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит кассету экспрессии. Экспрессионные векторы позволяют осуществлять транскрипцию стабильной мРНК в больших количествах. Когда экспрессионный вектор находится внутри клетки-мишени, то молекула рибонуклеиновой кислоты или белок, который кодируется геном, продуцируется в результате клеточного механизма транскрипции и/или трансляции. В одном из вариантов осуществления изобретения экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, содержит кассету экспрессии, которая включает полинуклеотидные последовательности, которые кодируют биспецифические антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, или их фрагменты.
В контексте настоящего описания понятия клетка-хозяин, линия клеток-хозяев и культура клеток-хозяев используются взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство указанных клеток. К клеткам-хозяевам относятся трансформанты и трансформированные клетки, которые включают первичные трансформированные клетки, а также потомство, выведенное из них, независимо от количества пересевов. Потомство может не быть строго идентичным родительской клетке по составу нуклеиновых кислот, а может нести мутации. Под данное понятие подпадает мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, что и отобранная путем скрининга или селекции исходная трансформированная клетка. Клетка-хозяин представляет собой любой тип клеточной системы, которую можно применять для создания биспецифических антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в настоящем изобретении. Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, такие как (но, не ограничиваясь только ими) СНО-клетки, BHK-клетки, NSO-клетки, SP2/0-клетки, клетки миеломы линии YO, клетки мышиной миеломы линии Р3Х63, PER-клетки, PER.C6-клетки или клетки гибридомы, клетки дрожжей, клетки насекомых и клетки растений, но также клетки, находящиеся в трансгенном животном, трансгенном растении или в культивируемой растительной или животной ткани.
Понятие эффективное количество агента относится к количеству, необходимому для обеспечения физиологического изменения в клетке или ткани, в которую его вводят.
Понятие терапевтически эффективное количество агента, например фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному при применении в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата.
Терапевтически эффективное количество агента, например, элиминирует, снижает, замедляет, минимизирует или предупреждает нежелательные явления заболевания.
Индивидуум или субъект представляет собой млекопитающее. Млекопитающие представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) одомашненных животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, люди и приматы кроме человека, такие как мартышки), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). Предпочтительно индивидуум или субъект представляет собой человека.
Понятие фармацевтическая композиция относится к препарату, который находится в такой форме, что он обеспечивает биологическую активность входящего в его состав действующего вещества, которое должно обладать эффективностью, и который не содержит дополнительных компонентов, которые обладают неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому следует вводить композицию.
Фармацевтически приемлемый носитель относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от действующего вещества, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемые носители включают (но, не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
Понятие листовка-вкладыш в упаковку в контексте настоящего описания относится к инструкциям, которые обычно помещают в поступающие в продажу упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или мерах предосторожности при применении указанных терапевтических продуктов.
В контексте настоящего описания понятие лечение (и его грамматические вариации, такие как лечить или процесс лечения) относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики или в процессе развития клинической патологии. Требуемыми действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления
- 34 037557 изобретения молекулы, предлагаемые в изобретении, применяют для задержки развития болезни или замедления прогрессирования болезни.
В контексте настоящего описания понятие рак относится к пролиферативным заболеваниям, таким как лимфомы, лимфолейкозы, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), альвеолярноклеточный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожная или внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, гастральный рак, рак ободочной кишки (CRC), рак молочной железы, трижды негативный рак молочной железы, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркома мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечно-клеточная карцинома, карцинома почечной лоханки, мезотелиома, печеночно-клеточный рак, билиарный рак, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоли позвоночника, глиома ствола головного мозга, мультиформная глиобластома, астроцитомы, шванномы, эпендимомы, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденома гипофиза и саркома Юинга, меланома, множественная миелома, В-клеточный рак (лимфома), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый лимфобластный лейкоз (ALL), волосатоклеточный лейкоз, хронический миелобластный лейкоз, включая рефрактерные варианты любого из указанных выше видов рака и комбинации одного или нескольких видов рака.
Содержащие тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении.
В изобретении предложены новые содержащие тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающие молекулы с наиболее предпочтительными свойствами, такими как технологичность, стабильность, аффинность связывания, биологическая активность, эффективность целенаправленного действия (таргетинг) и пониженная токсичность.
Первым объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, и (в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц, обладающих способностью к стабильной ассоциации.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, где представитель семейства лигандов TNF костимулирует активацию человеческих Т-клеток.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пеп- 35 037557 тидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, при этом эктодомены представителя семейства лигандов TNF во всех случаях являются идентичными.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по п. 1 формулы изобретения, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что (I) первый полипептид содержит СН1- или CL-домен и второй полипептид содержит CL- или СН1-домен соответственно, при этом второй полипептид сцеплен с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1- и CL-доменом, и при этом первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с СН1- или CL-доменом пептидным линкером, и при этом второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который соединен пептидным линкером с CL- или СН1-доменом указанного полипептида, или (II) первый полипептид содержит СН3-домен и второй полипептид содержит СН3-домен соответственно, и при этом первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с С-концом СН3-домена пептидным линкером, и при этом второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который соединен пептидным линкером с С-концом СН3-домена указанного полипептида, или (III) первый полипептид содержит VH-CL- или VL-CH1-домен и второй полипептид содержит VLCH1-домен или VH-CL-домен соответственно, при этом первый полипептид сцеплен с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1- и CL-доменом и при этом первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с VH или VL пептидным линкером, и при этом второй полипептид содержит один эктодомен представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, соединенный через пептидный линкер с VL или VH указанного полипептида.
В конкретном объекте изобретения антигенсвязывающая молекула содержит тримерный лиганд семейства TNF, который костимулирует активацию человеческих Т-клеток, выбранный из 4-1BBL и OX40L. Более конкретно представитель семейства лигандов TNF представляет собой 4-1BBL.
В другом объекте изобретения эктодомен представителя семейства лигандов TNF содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 и SEQ ID NO: 375, прежде всего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 96. В одном из объектов изобретения эктодомен представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 96, прежде всего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 96. В конкретном объекте изобретения эктодомен представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID nO: 3 и SEQ ID NO: 4. В конкретном объекте изобретения первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97 и второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с анти- 36 037557 геном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 183.
Еще одним объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 184 или SEQ ID NO: 185.
В другом объекте изобретения представитель семейства лигандов TNF представляет собой OX40L. Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой эктодомен представителя семейства лигандов TNF содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54, прежде всего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53.
Еще одним объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 371 или SEQ ID: 372, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54 соответственно.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый полипептид, содержащий СН1- или CL-домен, и второй полипептид, содержащий CLили СН1-домен соответственно, при этом второй полипептид сцеплен с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1-и CL-доменом, и где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с СН1- или CL-доменом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, соединенный через пептидный линкер с CL- или СН1-доменом указанного полипептида.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый полипептид, содержащий СН1-домен, и второй полипептид, содержащий CL-домен, при этом второй полипептид сцеплен с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1- и CLдоменами, и где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с СН1-доменом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, соединенный через пептидный линкер с CLдоменом указанного полипептида.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый полипептид, содержащий CL-домен, и второй полипептид, содержащий СН1-домен, при этом второй полипептид сцеплен с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1- и CLдоменами, и где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с CL-доменом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, соединенный через пептидный линкер с СН1доменом указанного полипептида.
- 37 037557
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) один участок, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клеткимишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) более одного фрагмента, который обладает способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, соединенный через пептидный линкер с указанным полипептидом.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) два фрагмента, обладающих способностью специфически связываться с антигеном клеткимишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит СН3-домен и второй полипептид содержит СН3-домен соответственно, и тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с С-концом СН3-домена пептидным линкером, тем, что второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, соединенный через пептидный линкер с С-концом СН3-домена указанного полипептида. В частности, указанная антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, содержит два фрагмента, которые обладают способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) два фрагмента, обладающих способностью специфически связываться с антигеном клеткимишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагменты, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, в которой два фрагмента, обладающих способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, связываются с двумя различными антигенами клетки-мишени.
Следующим объектом изобретения является описанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, выбирают из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела и антигенсвязывающего белка-каркаса.
Следующим объектом изобретения является описанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, выбирают из группы, состоящей из фрагмента антитела, молекулы Fab, кроссовер-молекулы Fab, одноцепочечной молекулы Fab, молекулы Fv, молекулы scFv, однодоменного антитела, aVH и антигенсвязывающего белка-каркаса. В одном из объектов изобретения фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, представ- 38 037557 ляет собой aVH или антигенсвязывающий белок-каркас. В одном из объектов изобретения фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, представляет собой антигенсвязывающий белок-каркас. В одном из объектов изобретения фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, представляет собой антигенсвязывающий белок-каркас, который обладает способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени.
В частности, антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, содержит один или два фрагмента, обладающих способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, представляет собой кроссовер-молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени. В частности, фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, представляет собой Fab, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени.
Кроме того, предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, указанная в настоящем описании, для которой антиген клетки-мишени выбирают из группы, включающей фибробласт-активирующий белок (FAP), ассоциированный с меланомой хондроитинсульфатпротеогликан (MCSP), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), карциноэмбриональный антиген (СЕА), CD19, CD20 и CD33.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, в которой пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на С-конце с СН1-доменом тяжелой цепи с помощью второго пептидного линкера, и в которой один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент слит на С-конце с CL-доменом легкой цепи с помощью третьего пептидного линкера.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, в которой пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или его фрагменты, соединенные друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слиты на С-конце с CL-домен тяжелой цепи с помощью второго пептидного линкера, и в которой один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF слит на С-конце с СН1-доменом легкой цепи с помощью третьего пептидного линкера.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, в которой пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на С-конце с CL-доменом легкой цепи с помощью второго пептидного линкера, и в которой один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF слит на Сконце с СН1-доменом тяжелой цепи с помощью третьего пептидного линкера.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, указанная выше, в которой пептидный линкер представляет собой (G4S)2. В одном из объектов изобретения первый пептидный линкер представляет собой (G4S)2 (SEQ ID NO: 13), второй пептидный линкер представляет собой GSPGSSSSGS (SEQ ID NO: 57) и третий пептидный линкер представляет собой (G4S)2 (SEQ ID NO: 13). В частности, изобретение относится к антигенсвязывающей молекуле, содержащей тримерный лиганд TNF, указанной выше, в которой первый пептидный линкер представляет собой (G4S)2 (SEQ ID NO: 13), второй пептидный линкер представляет собой (G4S)2 (SEQ ID NO: 13) и третий пептидный линкер представляет собой (G4S)2 (SEQ ID NO: 13).
В другом объекте изобретения антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, указанная выше, содержит Fc-домен, который состоит из первой и второй субъединиц, обладающих способностью к стабильной ассоциации.
В частности, антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, содержит: (а) молекулу Fab, обладающую способностью, специфически связываться с антигеном клетки-мишени, в которой тяжелая цепь Fab слита на С-конце с N-концом СН2домена в Fc-домене, и (в) Fc-домен, который состоит из первой и второй субъединиц, обладающих способностью к стабильной ассоциации.
В другом объекте изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG, в частности Fc-домен IgG1 или Fc-домен IgG4. Более конкретно Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG1. В конкретном объекте изобретения Fc-домен содержит модификацию, усиливающую ассоциацию первой и второй субъединиц Fc-домена.
Модификации Fc-домена, приводящие к снижению связывания с Fc-рецептором и/или эффекторной функции.
Fc-домен антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемых в изобретении, состоит из пары полипептидных цепей, которые содержат домены тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина. Например, Fc-домен молекулы иммуноглобулина G (IgG) представляет
- 39 037557 собой димер, каждая субъединица которого содержит константные домены СН2 и СН3 тяжелой цепи
IgG. Две субъединицы Fc-домена обладают способностью к стабильной ассоциации друг с другом.
Fc-домен придает антигенсвязывающей молекуле, предлагаемой в изобретении, предпочтительные фармакокинетические свойства, включая продолжительное время полужизни в сыворотке, что обеспечивает хорошее накопление в ткани-мишени и предпочтительное соотношение распределения в тканикрови. Однако в то же время он может приводить к нежелательной направленности биспецифических антител, предлагаемых в изобретении, к клеткам, которые экспрессируют Fc-рецепторы, а не к предпочтительным несущим антиген клеткам. Таким образом, в конкретных объектах изобретения Fc-домен антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении, обладает пониженной аффинностью связывания с Fc-рецептором и/или пониженной эффекторной функцией по сравнению с нативным Fc-доменом IgG1. B одном из объектов изобретения Fc не связывается существенно с Fc-рецептором и/или не индуцирует эффекторную функцию. В конкретном объекте изобретения Fc-рецептор представляет собой FcY-рецептор. В одном из объектов изобретения Fcрецептор представляет собой человеческий Fc-рецептор. В конкретном объекте изобретения Fc-рецептор представляет собой активирующий человеческий FcY-рецептор, более конкретно человеческий FcYRIIIa, FcyRI или FcYRIIa, наиболее предпочтительно человеческий FcYRIIIa. В одном из объектов изобретения Fc-домен не индуцирует эффекторную функцию. Пониженная эффекторная функция может представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) пониженную(ые) одну или несколько из следующих функций: пониженная комплементзависимая цитотоксичность (CDC), пониженная антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), пониженный антитело-обусловленный клеточнозависимый фагоцитоз (ADCP), пониженная секреция цитокинов, пониженное опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, пониженное связывание с NK-клетками, пониженное связывание с макрофагами, пониженное связывание с моноцитами, пониженное связывание с полиморфноядерными клетками, пониженная непосредственная передача сигнала, индуцирующего апоптоз, пониженное созревание дендритных клеток или пониженное Т-клеточное примирование.
В некоторых объектах изобретения одну или несколько аминокислотных модификаций можно интродуцировать в Fc-область антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, представленной в настоящем описании, создавая тем самым вариант Fc-области. Вариант Fcобласти может сдержать последовательность человеческой Fc-области (например, Fc-области человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких аминокислотных положениях.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени;
(б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, и (в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц, обладающих способностью к стабильной ассоциации, в которой Fc-домен содержит одну или несколько аминокислотную(ых) замену(н), которая(ые) снижает(ют) связывание с Fc-рецептором, в частности с FcY-рецептором.
В одном из объектов изобретения Fc-домен антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении, содержит одну или несколько аминокислотную(ых) мутацию(ий), которая(ые) снижает(ют) аффинность связывания с Fc-домена с Fc-рецептором и/или эффекторную функцию. Как правило, одинаковая(ые) одна или несколько аминокислотных мутаций присутствует(ют) в каждой из двух субъединиц Fc-домена. В частности, Fc домен содержит аминокислотную замену в положении Е233, L234, L235, N297, Р331 и Р329 (EU-нумерация). В частности, Fcдомен содержит аминокислотные замены в положениях 234 и 235 (EU-нумерация) и/или 329 (EUнумерация) тяжелых цепей IgG. Более конкретно, предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, которая содержит Fc-домен с аминокислотными замены L234A, L235A и P329G (P329G LALA, EU-нумерация) в тяжелых цепях IgG. Аминокислотные замены L234A и L235A обозначают как LALA-мутация. Комбинация P329G LALA аминокислотных замен практически полностью элиминирует связывание с FcY-рецептором Fc-домена человеческого IgG1, и описана в опубликованной заявке на патент WO 2012/130831 А1, в которой описаны методы получения указанных мутантных Fc-доменов и методы определения их свойства, таких как связывание с Fc-рецептором или эффекторные функции. EU-нумерация означает систему нумерации согласно EU-индексу, описанную у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Fc-домены с пониженной способностью связываться с Fc-рецептором и/или эффекторной функцией
- 40 037557 включают также Fc-домены с заменой одного или нескольких остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 в Fc-домене (US № 637056). К указанным мутантам Fc относятся мутанты Fc с заменами в двух или большем количестве из аминокислотных положений 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант Fc-домена DANA с заменой остатков 265 и 297 на аланин (US № 7332581).
В другом объекте изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG4. Антитела подкласса IgG4 обладают пониженной аффинностью к связыванию с Fc-рецепторами и пониженными эффекторными функциями по сравнению с антителами подкласса IgG1. В одном из объектов изобретения Fcдомен представляет собой Fc-домен IgG4, который содержит аминокислотные замены в положении S228 (нумерация по Кэботу), конкретно аминокислотную замену S228P. В более конкретном объекте изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG4, который содержит аминокислотные замены в положениях L235E и S228P, и P329G (EU-нумерация). Указанные мутанты Fc-домена IgG4 и их способность связываться с FcY-рецептором описаны в WO 2012/130831.
Мутантные Fc-домены можно получать путем аминокислотной делеции, замены, инсерции или модификации с использованием генетических или химических методов, хорошо известных в данной области. Генетические методы могут включать сайтнаправленный мутагенез кодирующей ДНК последовательности, ПЦР, синтез генов и т.п. Правильность нуклеотидных замен можно подтверждать, например, секвенированием.
Связывание с Fc-рецепторами можно легко определять, например, с помощью ELISA или поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием стандартного оборудования, такого как устройство BIAcore (фирма GE Healthcare), и с применением таких Fc-рецепторов, которые можно получать методом рекомбинантной экспрессии. Приемлемый указанный анализ связывания представлен в настоящем описании. Альтернативно этому, аффинность связывания с Fc-доменов или активирующих клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, содержащих Fc-домен, с Fc-рецепторами можно оценивать с использованием клеточных линий, для которых известно, что они экспрессируют конкретные Fc-рецепторы, такие как человеческие NK-клетки, экспрессирующие FcγШa-рецептор.
Эффекторную функцию Fc-домена или биспецифических антител, предлагаемых в изобретении, которые содержат Fc-домен, можно оценивать методами, известными в данной области. Приемлемый анализ для оценки ADCC представлен в настоящем описании. Другие примеры анализов in vitro, предназначенных для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы, описаны в US № 5500362; у Hellstrom и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1986, cc. 7059-7063 и Hellstrom и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, cc. 1499-1502; US № 5821337; у Bruggemann и др., J. Exp. Med. 166, 1987, cc. 1351-1361. Альтернативно этому, можно применять методы, основанные на нерадиоактивном анализе (см., например, ACTI™ - нерадиоактивный анализ цитотоксичности с помощью проточной цитометрии (фирма CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, шт. Калифорния); и CytoTox 96®- нерадиоактивный анализ цитотоксичности (фирма Promega, Мэдисон, шт. Висконсин)). Приемлемыми эффекторными клетками для таких анализов являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клеткикиллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, с использованием созданных на животных моделей, описанных у Clynes и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, cc. 652-656.
В некоторых вариантах осуществления изобретения снижают связывание с Fc-домена с компонентом системы комплемента, в частности с C1q. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых Fc-домен конструируют так, чтобы он обладал пониженной эффекторной функцией, указанная пониженная эффекторная функция включает пониженную CDC. Можно осуществлять анализы связывания C1q для решения вопроса о том, могут ли биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, связываться с C1q и, как следствие, обладают ли они CDC-активностью (см., например, анализы связывания с C1q и С3с с помощью ELISA, описанные в WO 2006/029879 и WO 2005/100402). Для оценки активации комплемента можно осуществлять анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro и др., J. Immunol. Methods 202, 1996, с. 163; Cragg и др., Blood 101, 2003, cc. 1045-1052 и Cragg и Glennie, Blood 103, 2004, cc. 2738-2743).
В конкретном объекте изобретения Fc-домен содержит модификацию, усиливающую ассоциацию первой и второй субъединиц Fc-домена.
Модификации Fc-домена, усиливающие гетеродимеризацию.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит: (а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом пептидным линкером, и тем, что второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, и (в) Fcдомен, состоящий из первой и второй субъединиц, обладающих способностью к стабильной ассоциации, и в которой Fc-домен содержит одну или несколько аминокислотную(ых) замену(н), которая(ые) снижа- 41 037557 ет(ют) связывание с Fc-рецептором, прежде всего FcY—рецептором. Таким образом, они содержат разные фрагменты, слитые с одной или с другой из двух субъединиц Fc-домена, которые, как правило, присутствуют в двух неидентичных полипептидных цепях (тяжелые цепи). Рекомбинантная совместная экспрессия этих полипептидов и последующая димеризация приводят к нескольким возможным комбинациям двух полипептидов. Для повышения выхода и чистоты антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, при их получении методами рекомбинации целесообразно интродуцировать в Fc-домен антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемых в изобретении, модификацию, которая усиливает ассоциацию требуемых полипептидов.
Таким образом, Fc-домен антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемых в изобретении, содержит модификацию, которая усиливает ассоциацию первой и второй субъединиц Fc-домена. Сайт наиболее сильного белок-белкового взаимодействия двух субъединиц Fc-домена человеческого IgG находится в СН3-домене Fc-домена. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения указанная модификация находится в СН3-домене Fc-домена.
В конкретном варианте осуществления изобретения указанная модификация представляет собой так называемую модификацию типа knob-in-hole, которая включает модификацию, приводящую к образованию выступа на одной из двух субъединиц Fc-домена и к образованию впадины в другой одной из двух субъединиц Fc-домена. Таким образом, конкретным объектом изобретения является описанная выше антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит молекулу IgG, в которой Fc-область первой тяжелой цепи содержит первый модуль димеризации, а Fc-область второй тяжелой цепи содержит второй модуль димеризации, что обеспечивает гетеродимеризацию двух тяжелых цепей молекулы IgG, и первый модуль димеризации содержит выступы, а второй модуль димеризации содержит впадины в соответствии с технологией knob-into-hole.
Технология knob-into-hole описана, например, в US № 5731168; US № 7695936; у Ridgway и др., Prot. Eng. 9, 1996, сс. 617-621 и Carter, J. Immunol. Meth. 248, 2001, сс. 7-15. В целом, метод включает интродукцию выпуклости (выступ) на поверхности раздела первого полипептида и соответствующей полости (впадина) в поверхности раздела второго полипептида, в результате выпуклость может помещаться в полость, усиливая тем самым образование гетеродимера и препятствуя образованию гомодимера. Выпуклости конструируют путем замены аминокислот с небольшими боковыми цепями на поверхности раздела первого полипептида на аминокислоты с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан). Компенсирующие полости идентичного или сходного с выпуклостями размера конструируют в поверхности раздела второго полипептида путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с менее крупными боковыми цепями (например, аланин или треонин).
Таким образом, согласно конкретному объекту изобретения в СН3-домене первой субъединицы Fcдомена антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемых в изобретении, аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет больший объем боковой цепи, что приводит к образованию выпуклости в СН3-домене первой субъединицы, которая может помещаться в полость в СН3-домене второй субъединицы, и в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет меньший объем боковой цепи, что приводит к образованию полости в СН3-домене второй субъединицы, в которую может помещаться выпуклость в СН3-домене первой субъединицы.
Выпуклость и полость можно создавать путем изменения нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза или путем пептидного синтеза.
В конкретном объекте изобретения в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена остаток треонина в положении 366 заменен остатком триптофана (T366W), и в СН3-домене второй субъединицы Fcдомена остаток тирозина в положении 407 заменен остатком валина (Y407V). Более конкретно, во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток треонина в положении 366 заменен остатком серина (T366S) и остаток лейцина в положении 368 заменен остатком аланина (L368A). Более конкретно, в первой субъединице Fc-домена дополнительно остаток серина в положении 354 заменен остатком цистеина (S354C) и во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток тирозина в положении 349 заменен остатком цистеина (Y349C). Интродукция этих двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидного мостика между двумя субъединицами Fc-домена, дополнительно стабилизирующего димер (Carter, J. Immunol. Methods 248, 2001, сс. 7-15).
В альтернативном варианте осуществления изобретения модификация, усиливающая ассоциацию первой и второй субъединиц Fc-домена, представляет собой модификацию, которая опосредует определяемые электростатическим действием воздействия, например, описанные в публикации РСТ WO 2009/089004. В целом, указанный метод включает замену одного или нескольких аминокислотных остатков на поверхности раздела двух субъединиц Fc-домена на заряженные аминокислотные остатки, в результате чего образование гомодимера становится электростатически невыгодным, а гетеродимеризация становится электростатически выгодной.
Модификации в CH1/CL-доменах.
Для дальнейшего улучшения правильного спаривания антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, могут включать различные замены заряженных аминокислот (так на
- 42 037557 зываемые заряженные остатки). Эти модификации интродуцируют в скрещенные или нескрещенные СН1- и CL-домены. Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой в одном из CL-доменов аминокислота в положении 123 (EU-нумерация) заменена на аргинин (R) и аминокислота в положении 124 (EU-нумерация) заменена на лизин (K) и в которой в одном из СН1-доменов аминокислоты в положении 147 (EU-нумерация) и положении 213 (EU-нумерация) заменены на глутаминовую кислоту (Е).
Более конкретно, в изобретении предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой в CL-домене, примыкающем к представителю семейства лигандов TNF, аминокислота в положении 123 (EU-нумерация) заменена на аргинин (R) и аминокислота в положении 124 (EU-нумерация) заменена на лизин (K), и в которой в CH1-домене, примыкающем к представителю семейства лигандов TNF, аминокислоты в положении 147 (EU-нумерация) и положении 213 (EUнумерация) заменены на глутаминовую кислоту (Е).
Конкретные антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, обе образующие молекулу Fab, которая обладает способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слитого на его Сконце с помощью второго пептидного линкера со второй тяжелой или легкой цепью, и второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF, слитый на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера со второй легкой или тяжелой цепью соответственно.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на его С-конце с СН1-доменом, который является частью тяжелой цепи, и второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, слит на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера с CL-доменом, который является частью легкой цепи.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на его С-конце с помощью второго пептидного линкера с CL-доменом, который является частью тяжелой цепи, и второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, слит на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера с СН1доменом, который является частью легкой цепи.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на его С-конце с помощью второго пептидного линкера с VH-доменом, который является частью тяжелой цепи, и второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, слит на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера с VLдоменом, который является частью легкой цепи.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по пп.21-23 формулы изобретения, в которой в CL-домене, примыкающем к представителю семейства лигандов TNF, аминокислота в положении 123 (EU-нумерация) заменена на аргинин (R) и аминокислота в положении 124 (EU-нумерация) заменена на лизин (K), и в которой в СН1домене, примыкающем к представителю семейства лигандов TNF, аминокислоты в положении 147 (EUнумерация) и положении 213 (EU-нумерация) заменены на глутаминовую кислоту (Е). Указанные модификации приводят к появлению так называемых заряженных остатков с предпочтительными свойствами, позволяющими избегать нежелательных воздействий, таких, например, как ошибочное спаривание.
Кроме того, предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, указанная в настоящем описании, антиген клетки-мишени которой выбирают из группы, включающей фибробласт-активирующий белок (FAP), ассоциированный с меланомой хондроитинсульфатпротеогликан (MCSP), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), карциноэмбриональный антиген (CEA), CD19, CD20 и CD33.
Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, антигеном клетки-мишени которых является FAP.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, антигеном клетки-мишени которой является фибробласт-активирующий белок (FAP).
- 43 037557
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит VH-домен, содержащий (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 100, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 101, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 102, и VL-домен, содержащий (IV) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 103, (V) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 104, и (VI) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 105.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит VH-домен, содержащий (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и VL-домен, содержащий (IV) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, (V) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (VI) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит VH-домен, содержащий (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 101, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 102, и VL-домен, содержащий (IV) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, (V) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, и (VI) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105.
В другом объекте изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17.
В другом объекте изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 106, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 107.
В одном из объектов изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107.
В конкретном объекте изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17. В другом конкретном объекте изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107. В конкретном объекте изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с FAP, содержит VH-домен, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 106, и VL-домен, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 107.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, который содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID
- 44 037557
NO: 98 и SEQ ID NO: 99, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, который содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97, а второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, который содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, который содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97, а второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, которая содержит первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, обе образующие молекулу Fab, которая обладает способностью специфические связываться с антигеном клетки-мишени, вторую тяжелую цепь, содержащую два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, и слиты на Сконце с помощью второго пептидного линкера с СН1-доменом, и вторую легкую цепь, содержащую один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, слитую на ее С-конце с помощью третьего пептидного линкера с CL-доменом, и где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и первую легкую цепь, которая содержит VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и первую легкую цепь, которая содержит VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 113, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 и SEQ ID NO: 114.
Следующим конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, и где антигенсвязывающая молекула содержит первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, обе образующие молекулу Fab, которая обладает способностью специфические связываться с антигеном клетки-мишени, вторую тяжелую цепь, содержащую два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, соединенные друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слитые на С-конце с помощью второго пептидного линкера с CL-доменом, и вторую легкую цепь, содержащую один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, слитый на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера с СН1-доменом, и где антигенсвязывающая молекула содержит:
- 45 037557 (I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и первую легкую цепь, которая содержит VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и первую легкую цепь, которая содержит VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 173, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 174.
Более конкретно, предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, обе образующие молекулу Fab, которая обладает способностью специфические связываться с антигеном клетки-мишени, в которой первая тяжелая цепь содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и первая легкая цепь содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, и (б) вторую тяжелую цепь, содержащую два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, соединенные друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слитые на его Сконце с помощью второго пептидного линкера с CL-доменом, и вторую легкую цепь, содержащую один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, слитый на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера с СН1-доменом, при этом вторая тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119 или SEQ ID NO: 173 и вторая легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120 или SEQ ID NO: 174. В частности, вторая тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119 и вторая легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120.
Кроме того, в изобретении предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит СН3-домен и второй полипептид содержит СН3-домен соответственно, и в которой первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с С-концом СН3-домена с помощью пептидного линкера, и в которой второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который соединен с помощью пептидного линкера с С-концом СН3-домена указанного полипептида.
В конкретном объекте изобретения указанная антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, содержит два фрагмента, которые обладают способностью специфически связываться с антигеном клетки мишени.
Более конкретно, указанная антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, содержит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 121, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, или (II) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, или (III) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая выбрана из группы, включающей:
а) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15;
б) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116;
в) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ
- 46 037557
ID NO: 136, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109;
г) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140;
д) молекулу, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 121, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122;
е) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110;
ж) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116;
з) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 149;
и) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 111, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 112; и
к) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая выбрана из группы, включающей:
а) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116;
б) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118;
в) молекулу, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124;
г) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:
119, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120;
д) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174; и
е) молекулу, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127.
В частности, в изобретении предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой представителем семейства лигандов TNF является OX40L и антигеном клетки-мишени является фибробласт-активирующий белок (FAP), и фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит VH-домен, который содержит (I) CDR-H1, содержащий
- 47 037557 аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 100, (II) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 101, и (III) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 102, и VL-домен, который содержит (IV) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 103, (V) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 104, и (VI) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 105.
В конкретном объекте изобретения антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, содержит:
(I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 355, и (III) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 356.
Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, антигеном клетки-мишени которых является CD19.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, антигеном клетки-мишени которой является CD19.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD19, содержит VH-домен, содержащий (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 195 или SEQ ID NO: 252, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 196 или SEQ ID NO: 253, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197 или SEQ ID NO: 254, и VL-домен, содержащий (IV) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 198 или SEQ ID NO: 249, (V) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 199 или SEQ ID NO: 250, и (VI) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 200 или SEQ ID NO: 251.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, представляет собой молекулу Fab, которая обладает способностью специфически связываться с CD19 и содержит VH-домен, содержащий (I) CDRH1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 195, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 196, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197, и VL-домен, содержащий (IV) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 198, (V) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 199, и (VI) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 200.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в изобретении, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, представляет собой молекулу Fab, которая обладает способностью специфически связываться с CD19 и содержит VH-домен, содержащий (I) CDRH1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 252, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 253, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 254, и VL-домен, содержащий (IV) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 249, (V) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 250, и (VI) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность NO: 251.
В другом объекте изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с CD19, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 201, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 202.
В другом объекте изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с CD19, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 357, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична
- 48 037557 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 358.
В другом объекте изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с CD19, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202, или фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с CD19, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358.
Другим объектом изобретения является предлагаемая в изобретении антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, который содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Другим объектом изобретения является предлагаемая в изобретении антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, который содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97 и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96.
Другим объектом изобретения является предлагаемая в изобретении антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, который содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Конкретным объектом изобретения является предлагаемая в изобретении антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, который содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97 и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, которые обе образуют молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, вторую тяжелую цепь, содержащую два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагментов, соединенных друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слитых на С-конце с помощью второго пептидного линкера с СН1-доменом, и вторую легкую цепь, содержащую один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который слит на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера с CL-доменом, и где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокис-
- 49 037557 лотную последовательность SEQ ID NO: 202, или первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 113, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 и SEQ ID NO: 114.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, которые обе образуют молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, вторую тяжелую цепь, содержащую два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагментов, соединенных друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слитых на С-конце с помощью второго пептидного линкера с CL-доменом, и вторую легкую цепь, содержащую один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который на слит на его Сконце с помощью третьего пептидного линкера с СН1-доменом, и где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202, или первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 173, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 174.
Кроме того, изобретение относится к антигенсвязывающей молекуле, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит СН3-домен и второй полипептид содержит СН3-домен соответственно и в которой первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с С-концом СН3-домена с помощью пептидного линкера, и в которой второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, соединенный через пептидный линкер с С-концом СН3-домена указанного полипептида.
В конкретном объекте изобретения указанная антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, содержит два фрагмента, которые обладают способностью специфически связываться с антигеном клетки мишени.
Более конкретно, указанная антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, содержит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 210, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, или (II) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 213, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 214, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, или (III) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 310, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 279, или (IV) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 313, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 314, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность 279.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая выбрана из группы, включающей:
а) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115, и
- 50 037557 вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116;
б) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 206, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118;
в) молекулу, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 210;
г) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120;
д) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174; и
е) молекулу, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 213, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 214.
В частности, в изобретении предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая выбрана из группы, включающей:
а) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность NO: 116;
б) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118;
в) молекулу, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 210;
г) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120;
д) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174; и
е) молекулу, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 213, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 214.
В частности, в изобретении предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120.
Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, антигеном клетки-мишени которых является СЕА.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, антигеном клетки-мишени которой является СЕА.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с СЕА, содержит VH-домен, содержащий (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 321, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 322, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 323, и VL- 51 037557 домен, содержащий (IV) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:
324, (V) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 325, и (VI) CDRL3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 326.
Конкретным объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, представляет собой молекулу Fab, которая обладает способностью специфически связываться с СЕА и содержит VH-домен, содержащий (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 321, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 322, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 323, и VL-домен, содержащий (IV) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 324, (V) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 325, и (VI) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 326.
В другом объекте изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с СЕА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 327, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 328.
В другом объекте изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с СЕА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 327, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 328.
В другом объекте изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с СЕА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 329, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 330.
В одном из объектов изобретения фрагмент, который обладает способностью специфически связываться с СЕА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330.
Другим объектом изобретения является предлагаемая в изобретении антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться антигеном клетки-мишени, который содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Другим объектом изобретения является предлагаемая в изобретении антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться антигеном клетки-мишени, который содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330, и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, которые обе образуют молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, вторую тяжелую цепь, содержащую два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагментов, соединенных друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слитые на С-конце с помощью второго пептидного линкера с СН1-доменом, и вторую легкую цепь, содержащую один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который на слит на его Сконце с помощью третьего пептидного линкера с CL-доменом, и где антигенсвязывающая молекула со- 52 037557 держит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 113, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 и SEQ ID NO: 114.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, где антигенсвязывающая молекула содержит первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, которые обе образуют молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, вторую тяжелую цепь, содержащую два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагментов, соединенных друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слитых на его С-конце с помощью второго пептидного линкера с CL-доменом, и вторую легкую цепь, содержащую один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, который на слит на его Сконце с помощью третьего пептидного линкера с СН1-доменом, и где антигенсвязывающая молекула содержит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330, (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 173, и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 174.
Кроме того, изобретение относится к антигенсвязывающей молекуле, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит:
(а) по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит СН3-домен и второй полипептид содержит СН3-домен соответственно и в которой первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, которые соединены друг с другом и с С-концом СН3-домена с помощью пептидного линкера, и в которой второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент, соединенный через пептидный линкер с С-концом СН3-домена указанного полипептида.
В конкретном объекте изобретения указанная антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, содержит два фрагмента, которые обладают способностью специфически связываться с антигеном клетки мишени.
Более конкретно, указанная антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, содержит:
(I) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 337, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 338, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334, или (II) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 341, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334.
Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая выбрана из группы, включающей:
а) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116;
б) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118;
в) молекулу, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 337, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 338;
- 53 037557
г) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 334, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120;
д) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174; и
е) молекулу, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 341, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342.
В частности, в изобретении предложена антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120.
Полинуклеотиды.
Изобретение относится также к выделенным полинуклеотидам, которые кодируют антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, представленную в настоящем описании, или ее фрагмент.
Выделенные полинуклеотиды, которые кодируют антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемые в изобретении, можно экспрессировать в виде индивидуального полинуклеотида, который кодирует полную антигенсвязывающую молекулу, или в виде нескольких (например, двух или большего количества) совместно экспрессируемых полинуклеотидов. Полипептиды, кодируемые совместно экспрессируемыми полинуклеотидами, можно соединять, например, через дисульфидные связи или другими путями с образованием функциональной антигенсвязывающей молекулы. Например, часть иммуноглобулина, представляющая собой легкую цепь, может кодироваться полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, кодирующего часть, представляющую собой тяжелую цепь иммуноглобулина. При совместной экспрессии полипептиды тяжелой цепи должны связываться с полипептидами легкой цепи с образованием иммуноглобулина.
В некоторых объектах изобретения выделенный полинуклеотид кодирует описанную полную антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемую в изобретении. В частности, выделенный полинуклеотид кодирует полипептид, содержащийся в описанной антигенсвязывающей молекуле, которая содержит тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении.
Одним из объектов настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, который кодирует антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, где полинуклеотид содержит: (а) последовательность, которая кодирует фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, (б) последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или два их фрагмента, которые соединены друг с другом с помощью пептидного линкера, и (в) последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент.
Другим объектом изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд для 4-1ВВ, где полинуклеотид содержит: (а) последовательность, которая кодирует фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, (б) последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий два эктодомена 4-1BBL или два его фрагмента, которые соединены друг с другом с помощью пептидного линкера, и (в) последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий один эктодомен 4-1BBL или его фрагмент.
Другим объектом изобретения является выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий два фрагмента 4-1BBL, которые содержат аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 90, 95, 98 или 100% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 96, и полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий один фрагмент 4-1BBL, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 90, 95, 98 или 100% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 96.
Кроме того, предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд для ОХ40, где полинуклеотид содержит: (а) последовательность, которая кодирует фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клеткимишени, (б) последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий два эктодомена OX40L или два его фрагмента, которые соединены друг с другом с помощью пептидного линкера, и (в) последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий один эктодомен OX40L или его фрагмент.
- 54 037557
Другим объектом изобретения является выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий два фрагмента 4-1BBL, которые содержат аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 90, 95, 98 или 100% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54, и полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий один фрагмент 4-1BBL, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 90, 95, 98 или 100% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54.
Другими объектами изобретения являются полинуклеотиды, содержащие последовательность, которая по меньшей мере примерно на 90, 95, 98 или 100% идентична конкретным кДНК-последовательностям, указанным в настоящем описании. Конкретным объектом изобретения является полинуклеотид, содержащий последовательность, которая идентична одной из конкретных кДНК-последовательностей, указанных в настоящем описании.
В других объектах изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 5, 6, 97, 98, 99, 183, 184 или 185. В другом объекте изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в одной из SEQ ID NO: 14, 15, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115,116, 117, 118, 119, 120, 173 или 174.
В следующих объектах изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 129,130,
131, 132, 133, 134, 137, 138, 141, 142, 143, 144, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 162, 163, 165, 166, 167,168,
169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 203, 204, 207, 208, 211, 212, 215, 216, 273, 274, 277, 278, 281,282,
285, 286, 289, 290, 293, 294, 297, 298, 301, 302, 305, 307, 308, 311, 312, 315, 316, 331, 332, 335, 336,339,
340, 343, 344, 347, 348, 353 или 354.
В некоторых объектах изобретения полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В других вариантах осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК). РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может быть одноцепочечной или двухцепочечной.
Методы рекомбинации.
Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемые в изобретении, можно получать, например, путем твердофазного пептидного синтеза (например, твердофазный синтез Меррифилда) или методом рекомбинации. Для рекомбинантного получения один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, или ее полипептидные фрагменты, например описанные выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Указанный полинуклеотид можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур. Одним из объектов изобретения является вектор, предпочтительно экспрессионный вектор, содержащий один или несколько полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении. Методы, хорошо известные специалистам в данной области, можно применять для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующую последовательность антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF (фрагмента), наряду с приемлемыми контролирующими транскрипцию/трансляцию сигналами. Эти методы включают технологии рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и рекомбинации/генетической рекомбинации in vivo (см., например, методы, описанные у Maniatis и др., Maniatis и др., Molecular Cloning A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989; и Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology, изд-во Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989). Экспрессионный вектор может представлять собой часть плазмиды, вируса или может представлять собой фрагмент нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор включает кассету экспрессии, в которой полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, или ее полипептидные фрагменты (т.е. кодирующую область), клонируют с обеспечением функциональной связи с промотором и/или другими элементами, контролирующими транскрипцию или трансляцию. В контексте настоящего описания кодирующая область представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя стоп-кодон (TAG, TGA или ТАА) не транслируется в аминокислоту, он, в случае его присутствия, может рассматриваться как часть кодирующей области, однако любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны, 5'- и 3'-нетранслируемые области и т.п., не являются частью кодирующей области. Две или большее количество кодирующих областей может присутствовать в индивидуальной полинуклеотидной конструкции, например индивидуальном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например отдельных (различных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область или может содержать две или большее количество кодирующих областей, например вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, может кодировать один или несколько полипептидов, которые пост- или котранляционно разделяются на конечные белки посредством протеолитического расщепления. Кроме того, вектор, поли
- 55 037557 нуклеотид или нуклеиновая кислота, предлагаемый/предлагаемая в изобретении, может кодировать гетерологичные кодирующие области, либо слитые, либо не слитые с полинуклеотидом, который кодирует антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, или ее полипептидные фрагменты, предлагаемые в изобретении, или их варианты или производные. Гетерологичные кодирующие области включают (но, не ограничиваясь только ими) специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. Функциональная связь имеет место, когда кодирующая область генного продукта, например полипептида, ассоциирована с одной или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта находилась под воздействием или контролем регуляторной(ых) последовательности(ей). Два ДНК-фрагмента (таких как кодирующая область полипептида и ассоциированный с ней промотор) являются функционально связанными, если индукция промоторной функции приводит к транскрипции мРНК, кодирующей требуемый генный продукт, и если природа связи между двумя ДНКфрагментами не оказывает воздействия на способность регулирующих экспрессию последовательностей направлять экспрессию генного продукта, или не оказывает воздействия на способность ДНК-матрицы к транскрипции. Таким образом, промоторная область должна быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор обладает способностью осуществлять транскрипцию нуклеиновой кислоты. Промотор может представлять собой специфический для клетки промотор, который обеспечивает значительную транскрипцию ДНК только в предварительно отобранных клетках. Другие контролирующие транскрипцию элементы, помимо промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, можно функционально связывать с полинуклеотидом для обеспечения специфической для клетки транскрипции.
Приемлемые промоторы и другие контролирующие транскрипцию области представлены в настоящем описании. Специалистам в данной области известно широкое разнообразие контролирующих транскрипцию областей. Они включают (но, не ограничиваясь только ими) контролирующие транскрипцию области, которые функционируют в клетках позвоночных животных, такие как (но, не ограничиваясь только ими) сегменты промоторов и энхансеров из цитомегаловирусов (например, немедленно-ранний промотор в сочетании с интроном-А), обезьяньего вируса 40 (например, ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие контролирующие транскрипцию области включают области, выведенные из генов позвоночных животных, таких как ген актина, белка теплового шока, бычьего гормона роста и кроличьего Р-глобина, а также другие последовательности, которые могут контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные приемлемые контролирующие транскрипцию области включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также индуцибельные промоторы (например, промоторы, индуцируемые тетрациклинами). Аналогично этому, обычным специалистам в данной области известно широкое разнообразие контролирующих трансляцию элементов. Они включают (но, не ограничиваясь только ими) сайты связывания рибосом, кодоны инициации трансляции и терминирующие кодоны и элементы, выведенные из вирусных систем (в частности внутренний сайт связывания (посадки) рибосом или IRES, который обозначают также как CITE-последовательность). Кассета экспрессии может включать также другие характерные структуры, такие как сайт инициации репликации и/или интегрированные в хромосому элементы, такие как длинные концевые повторы (LTR) ретровирусов, или инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV).
Кодирующие области полинуклеотида и нуклеиновой кислоты, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть ассоциированы с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, которые направляют секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом, предлагаемым в настоящем изобретении. Например, если требуется секреция антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, или ее полипептидных фрагментов, то ДНК, кодирующую сигнальную последовательность, можно помещать против хода транскрипции относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, или ее полипептидные фрагменты. Согласно гипотезе, касающейся сигналов, белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, который/которая отщепляется от зрелого белка после инициации экспорта растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Обычным специалистам в данной области должно быть очевидно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных животных, как правило, имеют сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, который отщепляется от транслируемого полипептида с образованием секретируемой или зрелой формы полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения используют нативный сигнальный пептид, например сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина или функциональное производное указанной последовательности, которое сохраняет способность обеспечивать секрецию полипептида, функционально связанного с ним. Альтернативно этому, можно применять гетерологичный сигнальный пептид млекопитающих или его функциональное производное. Например, лидерную последовательность дикого типа можно заменять на лидерную последовательность человеческого тканевого активатора плазминогена (ТРА) или мышиной β-глюкуронидазы.
ДНК, кодирующую короткую белковую последовательность, которую можно применять для облег- 56 037557 чения дальнейшей очистки (например, гистидиновую метку), или предназначенную для мечения слитого белка, можно включать внутрь или на концы полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении, или ее полипептидные фрагменты.
Дополнительным объектом изобретения является клетка-хозяин, содержащая один или несколько полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении. Некоторыми вариантами осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая один или несколько векторов, предлагаемых в изобретении. Полинуклеотиды и векторы могут обладать любыми особенностями, индивидуально или в сочетании, указанными в настоящем описании касательно полинуклеотидов и векторов соответственно. В одном из объектов изобретения клетка-хозяин содержит (например, трансформирована или трансфектирована) вектор, содержащий полинуклеотид, который кодирует антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемую в изобретении (или ее часть). В контексте настоящего описания понятие клетка-хозяин относится к любому типу клеточной системы, которую можно конструировать для получения слитых белков, предлагаемых в изобретении, или их фрагментов. Клетки-хозяева, пригодные для репликации и для поддержания экспрессии антигенсвязывающих молекул, хорошо известны в данной области. Такие клетки можно трансфектировать или трансдуцировать соответствующим образом конкретным экспрессионным вектором и можно выращивать большее количество содержащих вектор клеток с целью внесения в ферментеры для крупномасштабных процессов получения антигенсвязывающей молекулы в достаточных для клинических применений количествах. Приемлемыми клеткамихозяевами являются прокариотические микроорганизмы, такие как Е.coli, или различные эукариотические клетки, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки насекомых или т.п. Например, полипептиды можно получать в бактериях, в частности, когда отсутствует потребность в гликозилировании. После экспрессии полипептид можно выделять из пасты бактериальных клеток в растворимую фракцию и можно дополнительно очищать. Помимо прокариот, в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, которые кодируют полипептид, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были гуманизированы, что позволяет получать полипептид с частично или полностью человеческой схемой гликозилирования (см. Gerngross, Nat. Biotech. 22, 2004, cc. 1409-1414 и Li и др., Nat. Biotech. 24, 2006, cc. 210-215).
Клетки-хозяева, которые можно использовать для экспрессии (гликозилированных) полипептидов, получают также из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных животных). Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, а также можно применять клетки растений. Были выявлены многочисленные бакуловирусные штаммы и соответствующие пригодные для них в качестве хозяев клетки насекомых, прежде всего для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. В качестве хозяев можно применять также культуры растительных клеток (см., например, US № 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях). В качестве хозяев можно применять также клетки позвоночных животных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью SV40 (C0S-7); линия клеток почки эмбриона человека (293 или клетки линии 293, субклонированные с целью выращивания в суспензионной культуре, Graham и др., J. Gen. Virol., 36, 1977, с. 59); клетки почки детеныша хомяка (BHK); клетки Сертоли мыши (ТМ4клетки, описанные, например, у Mather, Biol. Reprod., 23, 1980, cc. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76,); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени бычьей крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например, у Mather и др., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, сс. 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другими ценными линиями клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая dhfr--CHO-клетки (Urlaub и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с. 4216); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0, P3X63 и Sp2/0. Обзор конкретных линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно применять для производства белка, см., например, у Yazaki и Wu, в: Methods in Molecular Biology под ред. В.К.С. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, cc. 255-268. Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например культивируемые клетки млекопитающих, клетки дрожжей, клетки насекомых, клетки бактерий и клетки растений (но не ограничиваясь только ими), а также клетки, находящиеся в организме трансгенного животного, трансгенного растения или культивируемой растительной или животной ткани. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, предпочтительно клетку млекопитающего, такую как клетка яичника китайского хомячка (СНО), клетка почки человеческого эмбриона (HEK) или лимфоидная клетка (например, клетка Y0, NS0, Sp20). В данной области известны стандартные технологии для экспрессии чужеродных генов в этих системах. Клетки, экспрессирующие полипептид, содержащий либо тяжелую, либо легкую цепь иммуноглобулина, можно конструировать таким образом, чтобы в них происходила экспрессия других цепей иммуноглобулина, например,
- 57 037557 таким образом, чтобы экспрессируемый продукт представлял собой иммуноглобулин, который имеет как тяжелую, так и легкую цепь. Одним из объектов изобретения является способ получения антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении, или ее полипептидных фрагментов, где способ заключается в том, что культивируют клетку-хозяина, содержащую полинуклеотиды, которые кодируют антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемую в изобретении, или ее полипептидные фрагменты, представленные в настоящем описании, в условиях, пригодных для экспрессии антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении, или ее полипептидных фрагментов, и выделяют антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемую в изобретении, или ее полипептидные фрагменты из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).
В антигенсвязывающей молекуле, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении, компоненты (по меньшей мере один фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, один полипептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты, и полипептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF или его фрагмент) не сливают генетически друг с другом. Полипептиды создают так, что их компоненты (два эктодомена представителя семейства лигандов TNF или их фрагменты и другие компоненты, такие как СН или CL) были слиты друг с другом непосредственно или через линкерную последовательность. Состав и длину линкера можно определять с помощью методов, хорошо известных в данной области, и можно оценивать эффективность. Примеры линкерных последовательностей, расположенных между различными компонентами антигенсвязывающих молекул, представлены в приведенных в настоящем описании последовательностях. Можно включать также дополнительные последовательности для встраивания сайта расщепления, если требуется разделение индивидуальных компонентов слитого белка, например последовательность, распознаваемую эндопептидазой.
В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени (например, Fab-фрагменты), образующие часть антигенсвязывающей молекулы, содержат, по меньшей мере, вариабельную область иммуноглобулина, которая обладает способностью связываться с антигеном. Вариабельные области могут образовывать часть встречающихся в естественных условиях или не встречающихся в естественных условиях антител или их фрагментов или могут быть получены из них. Методы получения поликлональных антител и моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например, Harlow и Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). He встречающиеся в естественных условиях антитела можно создавать с помощью твердофазного пептидного синтеза, можно получать с помощью методов рекомбинации (например, описанных в US № 4186567) или можно получать, например, путем скрининга комбинаторных библиотек, содержащих вариабельные области тяжелых цепей и вариабельные области легких цепей (см., например, US № 5969108 на имя McCafferty).
Согласно изобретению можно использовать иммуноглобулин из любого вида животного. Примерами иммуноглобулинов, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются (но, не ограничиваясь только ими) конструкции, полученные из организма мышей, приматов или человека. Если слитый белок предназначен для применения на человеке, то можно использовать химерную форму иммуноглобулина, в которой константные области иммуноглобулина получают из человеческого антитела. Гуманизированную или полностью человеческую форму иммуноглобулина можно получать также с помощью методов, хорошо известных в данной области (см., например, US № 5565332 на имя Winter). Для осуществления гуманизации можно применять различные методы, такие как (но, не ограничиваясь только ими): (а) трансплантация нечеловеческих (например, из антитела-донора) CDR в человеческий (например, антитело-реципиент) каркасный участок и константные области, сохраняющие или не сохраняющие имеющие решающее значение остатки каркасного участка (например, остатки, важные для сохранения хорошей антигенсвязывающей аффинности или функций антитела), (б) трансплантация только нечеловеческих определяющих специфичность участков (SDR или а-CDR; остатки имеют решающее значение для взаимодействия антитело-антиген) в человеческие каркасные и константные области, или (в) трансплантация полных нечеловеческих вариабельных доменов, но их маскировка напоминающим человеческий сегментом путем замены поверхностных остатков. Обзор гуманизированных антител и методов их получения см., например, у Almagro и Fransson, Front Biosci 13, 12008, cc. 1619-1633, и они описаны также, например, у Riechmann и др., Nature 332, 1988, cc. 323-329; Queen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc. 10029-10033; US, № 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Jones и др., Nature 321, 1986, cc. 522-525; Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1984, cc. 6851-6855; Morrison и Oi, Adv. Immunol. 44, 1988, cc. 65-92; Verhoeyen и др., Science 239, 1988, cc. 1534-1536; Padlan, Molec. Immun. 31(3), 1994, cc. 169-217; Kashmiri и др., Methods 36, 2005, cc. 25-34) (описание трансплантации SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28, 1991, cc. 489-498 (описание метода изменения поверхности (повторное покрытие)); Dall'Acqua и др., Methods 36, 2005, cc. 43-60 (описание перестановки FR) и Osbourn и др., Methods 36, 2005, cc. 61-68, и Klimka и др., Br. J. Cancer. 83, 2000, cc. 252-260 (описание подхода на основе целенаправленной селекции для перестановки FR). Конкретные иммуноглобулины, предлагаемые в
- 58 037557 изобретении, представляют собой человеческие иммуноглобулины. Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно получать с помощью различных методик, известных в данной области. Человеческие антитела описаны в целом, у van Dijk и van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, cc. 368-374 и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20, 2008, cc. 450-459. Человеческие вариабельные области могут образовывать часть человеческих моноклональных антител или могут быть получены из них с помощью метода гибридом (см., например, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, изд-во Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, cc. 51-63). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно получать также путем введения иммуногена трансгенному животному, которое модифицировано таким образом, что может продуцировать интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на контрольное заражение антигеном (см., например, Lonberg, Nat. Biotech. 23, 2005, cc. 1117-1125). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно создавать также путем выделения последовательностей вариабельных областей Fv-клона, отобранных из человеческих фаговых дисплейных библиотек (см., например, Hoogenboom и др. в: Methods in Molecular Biology, под ред. O'Brien и др., изд-во Human Press, Totowa, NJ, 178, 2001, cc. 1-37); и McCafferty и др., Nature з48, 552-554; Clackson и др., Nature 352, 1991, cc. 624-628). Фаг, как правило, экспонирует фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv-(scFv)-фрагментов, либо в виде Fab-фрагментов.
В некоторых объектах изобретения фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени (например, Fab-фрагменты), входящие в антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, создают так, чтобы они обладали повышенной аффинностью связывания согласно методам, описанным, например, в публикации РСТ WO 2012/020006 (см. примеры, в которых описано созревание аффинности) или в опубликованной заявке на патент U.S. № 2004/0132066. Способность антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в изобретении, связываться со специфической антигенной детерминантой можно оценивать количественно либо с помощью твердофазного ферментного анализа (ELISA), либо другими методиками, известными специалисту в данной области, например с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса (Liljeblad и др., Glyco J. 17, 2000, cc. 323-329), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr. Res. 28, 2002, cc. 217-229). Анализы в условиях конкуренции можно применять для идентификации антигенсвязывающей молекулы, конкурирующей с референс-антителом за связывание с конкретным антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанная конкурирующая антигенсвязывающая молекула связывается с тем же самым эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается антигенсвязывающая референс-молекула. Подробные приведенные в качестве примеров методы картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлены у Morris, Epitope Mapping Protocols, в Methods in Molecular Biology, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 66, 1996. При осуществлении приведенного в качестве примера анализа в условиях конкуренции иммобилизованный антиген инкубируют в растворе, содержащем первую меченую антигенсвязывающую молекулу, которая связывается с антигеном, и вторую немеченую антигенсвязывающую молекулу, которая подлежит тестированию в отношении ее способности конкурировать с первой антигенсвязывающей молекулой за связывание с антигеном. Вторая антигенсвязывающая молекула может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный антиген инкубируют в растворе, содержащем первую меченую антигенсвязывающую молекулу, но не содержащем вторую немеченую антигенсвязывающую молекулу. После инкубации в условиях, обеспечивающих связывание первого антитела с антигеном, избыток несвязанного антитела удаляют и оценивают количество метки, ассоциированной с иммобилизованным антигеном. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным антигеном, существенно снижено в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это свидетельствует о том, что вторая антигенсвязывающая молекула конкурирует с первой антигенсвязывающей молекулой за связывание с антигеном (см. Harlow и Lane. Antibodies: A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, гл. 14, 1988).
Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд TNF, предлагаемые в изобретении, полученные с помощью представленных в настоящем описании методов, можно очищать с использованием известных в данной области методик, таких как жидкостная хроматография высокого разрешения, ионообменная хроматография, гель-электрофорез, аффинная хроматография, гель-фильтрация и т.п. Фактические условия, применяемые для очистки конкретного белка, зависят, в частности, от таких факторов, как чистый заряд, гидрофобность, гидрофильность и т.д., и они должны быть очевидны специалисту в данной области. Для очистки антитела с помощью аффинной хроматографии можно использовать лиганд, рецептор или антиген, с которым связывается антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд TNF. Например, для очистки с помощью аффинной хроматографии слитых белков, предлагаемых в изобретении, можно использовать матрикс с белком А или белком G. Последовательное применение аффинной хроматографии на белке А или G и гель-фильтрации можно применять для выделения антигенсвязывающей молекулы практически согласно методу, описанному в разделе Примеры. Чистоту антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд TNF, или ее фрагментов можно определять с помощью любого из широкого разнообразия хорошо известных аналитических методов,
- 59 037557 включая гель-электрофорез, жидкостную хроматографию высокого давления и т.п. Например, установлено, что антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд TNF, которые экспрессировали с помощью методов, которые описаны в разделе Примеры, являются интактными и правильно собранными, что продемонстрировано с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и невосстанавливающих условиях.
Анализы.
Антигенсвязывающие молекулы, представленные в настоящем описании, можно идентифицировать, подвергать скринингу или характеризовать их физические/химические свойства и/или виды биологической активности с помощью различным анализов, известных в данной области.
1) Анализы аффинности.
Аффинность антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, к соответствующему TNF-рецептору можно определять с помощью методов, изложенных в разделе Примеры, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR), используя стандартную инструментальную базу, например устройство BIAcore (фирма GE Healthcare) и рецепторы или белки-мишени, которые можно получать с помощью рекомбинантной экспрессии. Аффинность антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, к антигену клетки-мишени можно определять с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR), используя стандартную инструментальную базу, например устройство BIAcore (фирма GE Healthcare) и рецепторы или белки-мишени, которые можно получать с помощью рекомбинантной экспрессии. Конкретный иллюстративный и приведенный в качестве примера вариант измерения аффинности связывания описан в примере 4. Согласно одному из объектов изобретения величину KD измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса с помощью устройства BIACORE® T100 (фирма GE Healthcare) при 25°С.
2) Анализы связывания и другие анализы.
Связывание антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, представленной в настоящем описании, с соответствующими экспрессируемыми клетками рецепторами, можно оценивать с использованием клеточных линий, экспрессирующих конкретный рецептор или антиген-мишень, например, с помощью проточной цитометрии (FACS). В одном из объектов изобретения в анализах связывания использовали свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), экспрессирующие TNF-рецептор. Указанные клетки применяли непосредственно после выделения (наивные РМВС) или после стимуляции (активированные РМВС). В другом объекте изобретения применяли активированные мышиные спленоциты (экспрессирующие молекулу TNF-рецептора) для демонстрации связывания антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении, с соответствующими экспрессирующими TNF-рецептор клетками.
В другом объекте изобретения применяли линии раковых клеток, экспрессирующих антиген клетки-мишени, например FAP, для демонстрации связывания антигенсвязывающих молекул с антигеном клетки-мишени.
В другом объекте изобретения можно применять анализы в условиях конкуренции для идентификации антигенсвязывающей молекулы, которая конкурирует с конкретным антителом или антигенсвязывающей молекулой за связывание с мишенью или TNF-рецептором соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанная конкурирующая антигенсвязывающая молекула связывается с тем же самым эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается специфическое антитело к мишени или специфическое антитело к TNF-рецептору. Подробные приведенные в качестве примеров методы картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлены у Morris, Epitope Mapping Protocols, в Methods in Molecular Biology, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 66, 1996.
3) Анализы активности.
Одним из объектов изобретения являются анализы, предназначенные для идентификации антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, которые связываются со специфическим антигеном клетки-мишени или со специфическим TNF-рецептором, которые обладают биологической активностью. Биологическая активность может включать, например, агонистическую передачу сигнала через TNF-рецептор на клетках, которые экспрессируют антиген клетки-мишени. Предложены также антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, которые идентифицированы с помощью анализов как обладающие биологической активностью in vitro.
В некоторых объектах изобретения антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, тестируют в отношении указанной биологической активности. Анализы оценки биологической активности молекул, предлагаемых в изобретении, описаны в примере 6. Кроме того, анализов для детекции клеточного лизиса (например, путем измерения высвобождения ЛДГ), кинетики индукции апоптоза (например, путем измерения активности каспазы 3/7) или апоптоза (например, с использованием TUNEL-анализа) хорошо известны в данной области. Кроме того, биологическую активность указанных комплексов можно оценивать по их воздействию на выживаемость, пролиферацию и секрецию лифокинов различными субпопуляциями лимфоцитов, такими как NK-клетки, NKT-клетки или
- 60 037557 γδΤ-клетки, или оценивать их способность модулировать фенотип и функцию антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, моноциты/макрофаги или В-клетки.
Фармацевтические композиции, препаративные формы и пути введения.
Следующим объектом изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие любую из антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, представленных в настоящем описании, например предназначенные для применения в любом из указанных ниже терапевтических способов. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любую из антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, представленных в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любую из антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, представленных в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, указанное ниже.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат в терапевтически эффективном количестве одну или несколько антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, которая(ые) растворена(ы) или диспергирована(ы) в фармацевтически приемлемом носителе. Понятия фармацевтически или фармакологически приемлемый относится к молекулярным субстанциям и композициям, которые, в целом, нетоксичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях, т.е. не вызывают вредные, аллергические или другие нежелательные реакции при введении при необходимости животному, такому, например, как человек. Приготовление фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере одну антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, и необязательно дополнительное действующее вещество, должно быть очевидно специалистам в данной области в свете настоящего описания, например, из справочника Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., изд-во Mack Printing Company, 1990, включенного в настоящее описание в качестве ссылки. В частности, композиции представляют собой лиофилизированные препаративные формы или водные растворы. В контексте настоящего описания фармацевтически приемлемый носитель включает любые и все растворители, буферы, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактерильные агенты, противогрибные агенты), агенты для придания изотоничности, соли, стабилизаторы и их комбинации, которые должны быть известны обычному специалисту в данной области.
Парентеральные композиции включают композиции, созданные для введения путем инъекции, например подкожной, внутрикожной, внутрь повреждения, внутривенной, внутриартериальной, внутримышечной, подоболочечной или внутрибрюшинной инъекции. Для инъекции антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемые в изобретении, можно включать в препаративные формы в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический соляной буфер. Раствор может содержать предназначенные для получения препаративной формы агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно этому, слитые белки могут находиться в порошкообразной форме, предназначенной для восстановления перед применением приемлемым наполнителем, например, стерильной не содержащей пирогенов водой. Стерильные инъецируемые растворы приготавливают путем включения слитых белков, предлагаемых в изобретении, в требуемом количестве в соответствующий растворитель при необходимости в сочетании с различными другими ингредиентами, перечисленными ниже. Стерильность можно легко обеспечивать, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Как правило, дисперсии получают путем включения различных стерилизованных действующих веществ в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и/или другие ингредиенты. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов, суспензий или эмульсий предпочтительными методами получения являются вакуумная сушка или сушка вымораживанием, которые позволяют получать порошок действующего вещества в сочетании с любым дополнительным требуемым ингредиентом из предварительно стерилизованной фильтрацией жидкой среды. При необходимости жидкая среда перед осуществлением инъекции должна быть соответствующим образом забуферена и жидкому разбавителю сначала придана изотоничность с помощью достаточного количества соляного раствора или глюкозы. Композиция должны быть стабильной в условиях приготовления и хранения и защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Принято поддерживать загрязнение эндотоксинами на минимальном безопасном уровне, например менее 0,5 нг/мг белка. Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают (но, не ограничиваясь только ими): буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмонийхлорид; гексаметонийхлорид; бензалконийхлорид; бензетонийхлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метилили пропилпарабен; катехол, резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и мета-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и
- 61 037557 другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностноактивные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Водные суспензии для инъекций могут содержать соединения, которые повышают вязкость суспензии, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, сорбит, декстран или т.п. Необязательно суспензия может содержать также стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений, что позволяет получать высококонцентрированные растворы. Кроме того, суспензии действующих веществ можно получать в виде соответствующих масляных предназначенных для инъекции суспензий. Приемлемые липофильные растворители или наполнители включают жирные нелетучие масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеаты или триглицериды, или липосомы.
Действующие вещества можно заключать в микрокапсулы, например, полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например в гидроксипропилметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (18-е изд., изд-во Mack Printing Company, 1990). Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие полипептид, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например пленки или микрокапсулы. В конкретном варианте осуществления изобретения для достижения пролонгированной абсорбции инъецируемой композиции можно применять в композиции агенты, замедляющие абсорбцию, такие, например, как моностеарат алюминия, желатин или их комбинации.
В контексте настоящего описания фармацевтически приемлемые носители включают также диспергирующие агенты интерстициальных лекарственных средств, такие как растворимые активные в нейтральной среде гликопротеины гиалуронидаз (sHASEGP), например человеческие растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, фирма Baxter International, Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и методы их применения, в том числе rHuPH20, описаны в публикациях патентов США 2005/0260186 и 2006/0104968. Согласно одному из объектов изобретения sHASEGP объединяют с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.
Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в US № 6267958. Водные композиции антител включают композиции, описанные в № US 6171586 и WO 2006/044908, последние композиции включают гистидин-ацетатный буфер.
Помимо описанных выше композиций, слитые белки можно приготавливать также в виде препарата в форме депо. Указанные препаративные формы длительного действия можно применять путем имплантации (например, подкожной или внутримышечной) или внутримышечной инъекции. Так, например, слитые белки можно включать в препаративные формы в сочетании с приемлемыми полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде умеренно растворимых производных, например, умеренно растворимой соли.
Фармацевтические композиции, содержащие слитые белки, предлагаемые в изобретении, можно приготавливать с помощью общепринятых процессов смешения, растворения, эмульгирования, капсулирования, захвата или лиофилизации. Фармацевтические композиции можно включать в препаративные формы с помощью общепринятого метода с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, разбавителей, эксципиентов или вспомогательных веществ, которые облегчают обработку белков, с получением препаратов, которые можно применять в фармацевтических целях. Соответствующая форма зависит от выбранного пути введения.
Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерные лиганды семейства TNF, можно включать в композиции в виде свободной кислоты или свободного основания, в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли представляют собой соли, которые практически сохраняют биологическую активность свободной кислоты или свободного основания. Они включают кислотноаддитивные соли, например соли, образованные со свободными аминогруппами белковой композиции, или образованные с неорганическими кислотами, такими, например, как соляная или фосфорная кислота, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная или миндальная кислота. Соли, образованные со свободной карбоксильной группой, можно получать также из неорганических оснований, таких, например, как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа; или таких органических оснований как изопропиламин, триметиламин, гистидин или прокаин. Фармацевтические соли имеют тенденцию к более высокой растворимости в водных и других протонных растворителях по сравнению с соответствующими формами в виде свободных оснований.
Композиция, представленная в настоящем описании, может содержать также более одного действующего вещества, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно вещества с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Такие действующие вещества должны присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для решения поставленной задачи.
- 62 037557
Композиции, предназначенные для применения in vivo, как правило, должны быть стерильными.
Это легко можно осуществлять путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
Способы и композиции для терапевтического применения.
Любую из антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, представленных в настоящем описании, можно применять в терапевтических способах.
Для применения в терапевтических способах антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемые в изобретении, можно включать в состав препаративных форм, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину заболевания, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам.
Одним из объектов изобретения являются антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемые в изобретении, предназначенные для применения в качестве лекарственного средства. Следующими объектами изобретения являются антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемые в изобретении, предназначенные для применения при лечении заболевания, прежде всего для применения для лечения рака. Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемые в изобретении, предназначенные для применения в способе лечения. Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, которая представлена в настоящем описании, предназначенная для применения при лечении заболевания у индивидуума, который нуждается в этом. Некоторыми объектами изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предназначенная для применения в способе лечения индивидуума, который имеет заболевание, заключающемся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве слитый белок. В некоторых объектах изобретения заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак. Примеры видов рака включают солидные опухоли, рак мочевого пузыря, почечно-клеточную карциному, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак молочной железы, рак яичника, рак матки, рак шейки матки, рак эндометрия, рак пищевода, рак ободочной кишки, колоректальный рак, ректальный рак, рак желудка, рак предстательной железы, рак крови, рак кожи, плоскоклеточную карциному, рак кости и рак почки, меланому, В-клеточную лимфому, В-клеточный лейкоз, неходжскинскую лифому и острый лимфобластный лейкоз. В конкретном варианте осуществления изобретения заболевание представляет собой рак. Таким образом, предложены антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, указанные в настоящем описании, для применения для лечения рака. Субъект, пациент или индивидуум, нуждающийся в лечении, как правило, представляет собой млекопитающее, более конкретно человека.
Другим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, указанная в настоящем описании, для применения для лечения инфекционных заболеваний, в частности, для лечения вирусных инфекций. Следующим объектом изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, указанная в настоящем описании, для применения для лечения аутоиммунных заболеваний, таких, например, как волчанка.
Одним из объектов изобретения является антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, указанная в настоящем описании, для применения для лечения плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC), рака молочной железы, колоректального рака (CRC), рака поджелудочной железы (РАС), рака желудка, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) и мезотелиомы, когда антиген клетки-мишени представляет собой FAP.
Одним из объектов изобретения является применение антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, для производства или приготовления лекарственного средства, которое предназначено для лечения заболевания у индивидуума, нуждающегося в этом. В одном из объектов изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения заболевания, заключающемся в том, что вводят индивидууму, который имеет заболевание, в терапевтически эффективном количестве лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение, прежде всего рак. Таким образом, одним из объектов изобретения является применение антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении, для производства или приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака. Примеры видов рака включают солидные опухоли, рак мочевого пузыря, почечно-клеточную карциному, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак молочной железы, рак яичника, рак матки, рак шейки матки, рак эндометрия, рак пищевода, рак ободочной кишки, колоректальный рак, ректальный рак, рак желудка, рак предстательной железы, рак крови, рак кожи, плоскоклеточную карциному, рак кости и рак почки, меланому, В-клеточную лимфому, В-клеточный лейкоз, неходжскинскую лифому и острый лимфобластный лейкоз. Другие нарушения клеточной пролиферации, которые можно лечить с использо- 63 037557 ванием антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в настоящем изобретении, включают (но, не ограничиваясь только ими) неоплазмы, локализованные в: животе, кости, молочной железе, пищеварительной системе, печени, поджелудочной железе, брюшине, эндокринных железах (надпочечник, паращитовидная, гипофиз, яички, яичник, тимус, щитовидная), глазу, голове и шеи, нервной системе (центральной и периферической), лимфатической системе, тазовой области, коже, мягкой ткани, селезенке, грудном отделе и мочеполовой системе. Также под объем изобретения подпадают предраковые состояния или повреждения и метастазы рака. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак выбирают из группы, включающей почечно-клеточный рак, рак кожи, рак легкого, колоректальный рак, рак молочной железы, рак головного мозга, рак головы и шеи. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что в некоторых случаях антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, не может обеспечивать исцеление, а может только оказывать частичное благоприятное воздействие. В некоторых вариантах осуществления изобретения физиологические изменения, характеризующиеся некоторым благоприятным действием, рассматриваются также как терапевтически ценные. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения количество антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, которое обеспечивает физиологическое изменение, рассматривается как эффективное количество или терапевтически эффективное количество.
Другим объектом изобретения является применение антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, указанной в настоящем описании, для производства или приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения инфекционных заболеваний, в частности для лечения вирусных инфекций или для лечения аутоиммунных заболеваний, таких, например, как волчанка.
Следующим объектом изобретения является способ лечения заболевания у индивидуума, заключающийся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемую в изобретении. В одном из вариантов осуществления изобретения указанному индивидууму вводят композицию, которая содержит слитый белок, предлагаемый в изобретении, в фармацевтически приемлемой форме. В некоторых объектах изобретения заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение. В конкретном объекте изобретения заболевание представляет собой рак. В некоторых объектах изобретения способ заключается также в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например противораковое средство, если заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак. Индивидуум в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может представлять собой млекопитающее, предпочтительно человека.
Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая доза антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении (при ее применении индивидуально или в сочетании с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими средствами), должна зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, пути введения, веса тела пациента, типа слитого белка, серьезности и течения заболевания, от того, вводят ли слитый белок в превентивных или терапевтических целях, предшествующих или осуществляемых одновременно терапевтических вмешательств, истории болезни пациента и ответа на слитый белок и от предписания лечащего врача. Практикующий специалист, ответственный за введение, в любом случае, должен определять концентрацию действующего(их) вещества(в) в композиции и соответствующую(ие) дозу(ы) для индивидуального пациента. Различные схемы введения доз включают (но, не ограничиваясь только ими) однократное введение или несколько введений в различные моменты времени, болюсное введение и пульсирующую инфузию.
Антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, можно вводить пациенту в виде одной обработки или серий обработок. В зависимости от типа и серьезности заболевания возможная начальная доза антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, для введения пациенту, например, с использованием одного или нескольких индивидуальных введений или с помощью непрерывной инфузии, может составлять примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-10 мг/кг). Типичная суточная доза может составлять от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от отмеченных выше факторов. Для повторных введений в течение нескольких дней или более продолжительного периода в зависимости от состояния лечение, как правило, должно продолжаться до достижения требуемого подавления имеющихся симптомов заболевания. В качестве примера, доза слитого белка может составлять от примерно 0,005 до примерно 10 мг/кг. В другом примере (но, не ограничиваясь только указанным) доза на одно введение может составлять от примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 50, примерно 100, примерно 200, примерно 350, примерно 500 мкг/кг веса тела, примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 50, примерно 100, примерно 200, примерно 350, примерно 500 до примерно 1000 мг/кг веса тела или более, и находиться в любом указанном диапазоне. В качестве примеров (но, не ограничиваясь только ими) указанного диапазона значений, можно вводить от примерно 5 до примерно 100 мг/кг веса тела, от примерно 5 мкг/кг веса тела до примерно 500 мг/кг веса тела и т.д. с учетом указанных выше уровней доз. Так, пациенту можно вводить одну или не
- 64 037557 сколько доз, составляющих примерно 0,5, 2,0, 5,0 или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Указанные дозы можно вводить прерывисто, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати или, например, примерно шесть доз слитого белка). Можно вводить начальную более высокую ударную дозу, после которой применять одну или несколько более низких доз. Однако можно использовать другие схемы введения доз. Успех такой терапии легко оценивать с помощью общепринятых методик и анализов.
Антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемую в изобретении, как правило, следует применять в количестве, эффективном для достижения поставленной цели. При применении для лечения или предупреждения болезненного состояния антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемые в изобретении, или их фармацевтические композиции, вводят или применяют в терапевтически эффективном количестве. Определение терапевтически эффективного количества находится в компетенции специалистов в данной области, прежде всего в свете представленного подробного описания изобретения.
Для системного введения терапевтически эффективную дозу можно сначала определять с помощью анализов in vitro, например анализов с использованием клеточных культур. Затем дозу можно включать в форму для изучения на животных моделях для достижения концентрации в кровотоке, находящейся в диапазоне, включающем значение IC50, определенное на клеточной культуре. Указанную информацию можно использовать для более точного определения доз, которые можно применять на людях.
Начальные дозы можно оценивать также, исходя из данных, полученных in vivo, например, на животных моделях, используя методики, хорошо известные в данной области. Обычный специалист в данной области легко может оптимизировать применение на людях на основе данных, полученных на животных.
Уровень доз и интервал можно регулировать индивидуально для получения уровней в плазме антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, которые являются достаточными для поддержания терапевтического действия. Обычные дозы, предназначенные для введения пациенту путем инъекции, составляют от примерно 0,1 до 50 мг/кг/день, как правило, от примерно 0,5 до 1 мг/кг/день. Для достижения терапевтически эффективных уровней в плазме можно вводить несколько доз каждый день. Уровни в плазме можно оценивать, например, с помощью ЖХВР.
В случаях местного применения или избирательного поглощения эффективная местная концентрация антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, может не соответствовать концентрации в плазме. Специалист в данной области может оптимизировать терапевтически эффективные местные дозы без чрезмерных экспериментов.
Применение в терапевтически эффективной дозе антигенсвязывающих молекул, содержащих тримерный лиганд семейства TNF, представленных в настоящем описании, должно, как правило, обеспечивать терапевтическую пользу, не вызывая существенной токсичности. Токсичность и терапевтическую эффективность слитого белка можно определять с помощью стандартных фармацевтических процедур на культурах клеток или экспериментальных животных. Анализы на клеточных культурах или опыты на животных можно применять для определения значений LD50 (доза, смертельная для 50% популяции) и ED50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Соотношение доз, характеризующих токсические и терапевтические действия, обозначают как терапевтический индекс, который можно выражать в виде соотношения LD50/ED50. Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, имеющие высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемая в настоящем изобретении, характеризуется высоким терапевтическим индексом. Данные, полученные в анализах с использованием клеточных культур и в опытах на животных, можно применять для определения диапазона доз, которые можно применять на людях. Доза лежит предпочтительно в диапазоне концентраций в кровотоке, которые включают ED50, обладающих невысокой токсичностью или не обладающих токсичностью. Доза может варьироваться в зависимости от различных факторов, например, от применяемой лекарственной формы, применяемого пути введения, состояния индивидуума и т.п. Точную препаративную форму, путь введения и дозу может выбирать индивидуально врач в зависимости от состояния пациента (см., например, Fingl и др. в The Pharmacological Basis of Therapeutics, гл. 1, 1975, с. 1, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки).
Лечащему врачу пациентов, которым вводят слитые белки, предлагаемые в изобретении, должно быть очевидно, как и когда заканчивать, прерывать или регулировать введение из-за токсичности, дисфункции органов и т.п. И, наоборот, лечащему врачу должно быть известно, как регулировать лечение в сторону применения более высоких доз, если клинический ответ является неадекватным (предотвращая токсичность). Величина вводимой дозы при лечении представляющего интерес нарушения должна варьироваться в зависимости от серьезности состояния, подлежащего лечению, пути введения и т.п. Серьезность состояния можно, например, оценивать среди прочего с помощью стандартных прогностических методов оценки. Кроме того, доза и предполагаемая частота введения дозы должны также варьироваться в зависимости от возраста, веса тела и ответа индивидуального пациента.
- 65 037557
Другие средства и варианты лечения.
Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемые в изобретении, можно вводить в сочетании с одним или несколькими другими средствами. Например, слитый белок, предлагаемый в изобретении, можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством. Понятие терапевтическое средство включает любое средство, которое вводят для лечения симптома или заболевания у индивидуума, который нуждается в таком лечении. Указанное дополнительное терапевтическое средство может представлять собой любое действующее вещество, которое можно применять при конкретном показании, подлежащем лечению, предпочтительно с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательное действие друг на друга. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой противораковое средство.
Указанные другие средства могут присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для указанных целей. Эффективное количество указанных других средств зависит от количества применяемого слитого белка, типа нарушения или лечения, и других указанных выше факторов. Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства TNF, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием указанных в настоящем описании путей введения, или в дозах, составляющих примерно от 1 до 99% от указанных в настоящем описании доз, или в любой дозе и с использованием любого пути введения, которые согласно эмпирическим/клиническим данным рассматриваются как приемлемые.
Отмеченные выше комбинированные терапии предусматривают совместное введение (когда два или большее количество терапевтических средств включают в одну и ту же или в отдельные композиции) и раздельное введение, в этом случае введение антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF, предлагаемой в изобретении, можно осуществлять до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства и/или адъюванта.
Изделия.
Другим объектом изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения, предупреждения и/или диагностирования указанных выше нарушений. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковку, которые размещены на контейнере или прилагаются к нему. Приемлемыми контейнерами являются, например, банки, пузырьки, шприцы, пакеты для внутривенного (IV) раствора и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд TNF, предлагаемую в изобретении.
На этикетке или листовке-вкладыше в упаковку указано, что композицию применяют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать: (а) первый контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд TNF, предлагаемую в изобретении; и (б) второй контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Согласно этому варианту осуществления изобретения изделие может содержать листовку-вкладыш в упаковку, которая содержит информацию о том, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния.
В альтернативном или дополнительном варианте изделие может дополнительно включать второй (или третий) контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие материалы, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Таблица В (последовательности)
SEQ ID NO: Обозначение Последовательность
1 человеческий (hu) 4-1BBL (71-254) REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLH TEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
2 hu 4-1BBL (85-254) LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLT GGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEG SGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS
- 66 037557
AFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQG ATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
3 hu 4-1BBL (80-254) DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLA GVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVV AGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSE ARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQ LTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
4 hu 4-1BBL (52-254) PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLR QGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLS YKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSV SLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGF QGRLLHL S AGQRL G VHLHTE AR ARH A WQLTQG AT VL GLFRVTPEIP AGLP SPRSE
5 димерный hu 41BBL (71-254), соединенный c помощью (G4S)2линкера REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLH TEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQ NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVV AKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRS AAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAG QRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPA GLPSPRSE
6 мономерный hu 41BBL (71-254) плюс (G4S)2линкер REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLH TEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGSGGGGS
7 анти-РАР(28Н1), CDR-H1 SHAMS
8 анти-РАР(28Н1), CDR-H2 AIWASGEQYYADSVKG
9 анти-РАР(28Н1), CDR-H3 GWLGNFDY
10 анти-РАР(28Н1), CDR-L1 RASQSVSRSYLA
11 анти-РАР(28Н1), CDR-L2 GASTRAT
12 анти-РАР(28Н1), CDR-L3 QQGQVIPPT
13 (G4S)2 GGGGSGGGGS
14 димерный hu 41BBL (71-254)CHl-Fc-цепь c «выступом» REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLH TEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQ NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVV AKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRS AAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAG QRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPA GLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL
- 67 037557
Q S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICN VNHKP SNTK VD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK
15 мономерный hu 41BBL (71-254)-CL REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLH TEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
16 анти-РАР(28Н1), VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWV RQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQG TLVTVSS
17 анти-РАР(28Н1), VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQ QKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISR LEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK
18 анти-РАР(28Н1), Fc-цепь c «впадиной» см.таблицу 2
19 анти-РАР(28Н1), легкая цепь см.таблицу 2
20 человеческий (hu) FAP UniProt № Q12884
21 эктодомен hu FAP + поли-1у5-метка + hisg-метка RP SR VHNSEENTMR ALTLKDILNGTF S YKTFFPN WIS G QEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASN YGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGE FVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRP GDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALW WSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIP YPKAGAKNPVVRIFHDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASS DYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFRE DWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAI S Y YKIF SDKD GYKHIH YIKDT VEN AIQIT S GK WE AINIF RVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVT CHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHD GRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEIT LWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAV NWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRK LGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGY VSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFM GLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTA DDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGL S GL STNHL YTHMTHFLKQCF SL SD GKKKKKKGHHHH HH
22 нуклеотидная последовательность конструкции CGCCCTTCAAGAGTTCATAACTCTGAAGAAAATACA ATGAGAGCACTCACACTGAAGGATATTTTAAATG GAACATTTTCTTATAAAACATTTTTTCCAAACTGGAT
- 68 037557
эктодомен hu FAP + поли-1у5-метка + his6-MeTKa TTCAGGACAAGAATATCTTCATCAATCTGCAGATAA CAATATAGTACTTTATAATATTGAAACAGGACAATC ATATACCATTTTGAGTAATAGAACCATGAAAAGTGT GAATGCTTCAAATTACGGCTTATCACCTGATCGGCA ATTTGTATATCTAGAAAGTGATTATTCAAAGCTTTG GAGATACTCTTACACAGCAACATATTACATCTATGA CCTTAGCAATGGAGAATTTGTAAGAGGAAATGAGCT TCCTCGTCCAATTCAGTATTTATGCTGGTCGCCTGTT GGGAGTAAATTAGCATATGTCTATCAAAACAATATC TATTTGAAACAAAGACCAGGAGATCCACCTTTTCAA ATAACATTTAATGGAAGAGAAAATAAAATATTTAAT GGAATCCCAGACTGGGTTTATGAAGAGGAAATGCTT GCTACAAAATATGCTCTCTGGTGGTCTCCTAATGGA AAATTTTTGGCATATGCGGAATTTAATGATACGGAT ATACCAGTTATTGCCTATTCCTATTATGGCGATGAAC AATATCCTAGAACAATAAATATTCCATACCCAAAGG CTGGAGCTAAGAATCCCGTTGTTCGGATATTTATTAT CGATACCACTTACCCTGCGTATGTAGGTCCCCAGGA AGTGCCTGTTCCAGCAATGATAGCCTCAAGTGATTA TTATTTCAGTTGGCTCACGTGGGTTACTGATGAACG AGTATGTTTGCAGTGGCTAAAAAGAGTCCAGAATGT TTCGGTCCTGTCTATATGTGACTTCAGGGAAGACTG GCAGACATGGGATTGTCCAAAGACCCAGGAGCATAT AGAAGAAAGCAGAACTGGATGGGCTGGTGGATTCTT TGTTTCAACACCAGTTTTCAGCTATGATGCCATTTCG TACTACAAAATATTTAGTGACAAGGATGGCTACAAA CATATTCACTATATCAAAGACACTGTGGAAAATGCT ATTCAAATTACAAGTGGCAAGTGGGAGGCCATAAAT ATATTCAGAGTAACACAGGATTCACTGTTTTATTCTA GCAATGAATTTGAAGAATACCCTGGAAGAAGAAAC ATCTACAGAATTAGCATTGGAAGCTATCCTCCAAGC AAGAAGTGTGTTACTTGCCATCTAAGGAAAGAAAGG TGCCAATATTACACAGCAAGTTTCAGCGACTACGCC AAGTACTATGCACTTGTCTGCTACGGCCCAGGCATC CCCATTTCCACCCTTCATGATGGACGCACTGATCAA GAAATTAAAATCCTGGAAGAAAACAAGGAATTGGA AAATGCTTTGAAAAATATCCAGCTGCCTAAAGAGGA AATTAAGAAACTTGAAGTAGATGAAATTACTTTATG GTACAAGATGATTCTTCCTCCTCAATTTGACAGATC AAAGAAGTATCCCTTGCTAATTCAAGTGTATGGTGG TCCCTGCAGTCAGAGTGTAAGGTCTGTATTTGCTGTT AATTGGATATCTTATCTTGCAAGTAAGGAAGGGATG GTCATTGCCTTGGTGGATGGTCGAGGAACAGCTTTC CAAGGTGACAAACTCCTCTATGCAGTGTATCGAAAG CTGGGTGTTTATGAAGTTGAAGACCAGATTACAGCT GTCAGAAAATTCATAGAAATGGGTTTCATTGATGAA AAAAGAATAGCCATATGGGGCTGGTCCTATGGAGG ATACGTTTCATCACTGGCCCTTGCATCTGGAACTGGT CTTTTCAAATGTGGTATAGCAGTGGCTCCAGTCTCC AGCTGGGAATATTACGCGTCTGTCTACACAGAGAGA TTCATGGGTCTCCCAACAAAGGATGATAATCTTGAG CACTATAAGAATTCAACTGTGATGGCAAGAGCAGAA TATTTCAGAAATGTAGACTATCTTCTCATCCACGGA ACAGCAGATGATAATGTGCACTTTCAAAACTCAGCA CAGATTGCTAAAGCTCTGGTTAATGCACAAGTGGAT TTCCAGGCAATGTGGTACTCTGACCAGAACCACGGC
- 69 037557
TTATCCGGCCTGTCCACGAACCACTTATACACCCAC ATGACCCACTTCCTAAAGCAGTGTTTCTCTTTGTCAG ACGGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGGGCCACCACCAT САССАТСАС
23 мышиный FAP UniProt № Р97321
24 эктодомен мышиного FAP +поли-1у5-метка + Ы56-метка RP SR VYKPEGNTKR ALTLKDILNGTF S YKT YFPN WISE QEYLHQSEDDNIVFYNIETRESYIILSNSTMKSVNATDY GLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLQNGEF VRGYELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPG DPPFQITYTGRENRIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWW SPDGKFLAYVEFNDSDIPIIAYSYYGDGQYPRTINIPYP KAGAKNPVVRVFIVDTTYPHHVGPMEVPVPEMIASSD YYFSWLTWVSSERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFRED WHAWECPKNQEHVEESRTGWAGGFFVSTPAFSQDAT SYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAIYIF RVTQD SLFYS SNEFEGYPGRRNIYRISIGNSPP SKKC VT CHLRKERCQYYTASFSYKAKYYALVCYGPGLPISTLH DGRTDQEIQVLEENKELENSLRNIQLPKVEIKKLKDGG LTFWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVKSVF AVNWITYLASKEGIVIALVDGRGTAFQGDKFLHAVYR KLGVYEVEDQLTAVRKFIEMGFIDEERIAIWGWSYGG YVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASIYSERFM GLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTA DDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGIL S GRSQNHL YTHMTHFLKQCF SL SD GKKKKKKGHHHH HH
25 нуклеотидная последовательность конструкции эктодомен мышиного FAP + поли-1у5-метка + Ы56-метка CGTCCCTCAAGAGTTTACAAACCTGAAGGAAACACA AAGAGAGCTCTTACCTTGAAGGATATTTTAAATG GAACATTCTCATATAAAACATATTTTCCCAACTGGA TTTCAGAACAAGAATATCTTCATCAATCTGAGGATG ATAACATAGTATTTTATAATATTGAAACAAGAGAAT CATATATCATTTTGAGTAATAGCACCATGAAAAGTG TGAATGCTACAGATTATGGTTTGTCACCTGATCGGC AATTTGTGTATCTAGAAAGTGATTATTCAAAGCTCT GGCGATATTCATACACAGCGACATACTACATCTACG ACCTTCAGAATGGGGAATTTGTAAGAGG ATACGAGCTCCCTCGTCCAATTCAGTATCTATGCTG GTCGCCTGTTGGGAGTAAATTAGCATATGTATATCA AAACAATATTTATTTGAAACAAAGACCAGGAGATCC ACCTTTTCAAATAACTTATACTGGAAGAGAAAATAG AATATTTAATGGAATACCAGACTGGGTTTATGAAGA GGAAATGCTTGCCACAAAATATGCTCTTTGGTGGTC TCCAGATGGAAAATTTTTGGCATATGTAGAATTTAA TGATTCAGATATACCAATTATTGCCTATTCTTATTAT GGTGATGGACAGTATCCTAGAACTATAAATATTCCA TATCCAAAGGCTGGGGCTAAGAATCCGGTTGTTCGT GTTTTTATTGTTGACACCACCTACCCTCACCACGTGG GCCCAATGGAAGTGCCAGTTCCAGAAATGATAGCCT CAAGTGACTATTATTTCAGCTGGCTCACATGGGTGT CCAGTGAACGAGTATGCTTGCAGTGGCTAAAAAGAG TGCAGAATGTCTCAGTCCTGTCTATATGTGATTTCAG GGAAGACTGGCATGCATGGGAATGTCCAAAGAACC AGGAGCATGTAGAAGAAAGCAGAACAGGATGGGCT GGTGGATTCTTTGTTTCGACACCAGCTTTTAGCCAGG ATGCCACTTCTTACTACAAAATATTTAGCGACAAGG ATGGTTACAAACATATTCACTACATCAAAGACACTG
- 70 037557
TGGAAAATGCTATTCAAATTACAAGTGGCAAGTGGG AGGCCATATATATATTCCGCGTAACACAGGATTCAC TGTTTTATTCTAGCAATGAATTTGAAGGTTACCCTGG AAGAAGAAACATCTACAGAATTAGCATTGGAAACTC TCCTCCGAGCAAGAAGTGTGTTACTTGCCATCTAAG GAAAGAAAGGTGCCAATATTACACAGCAAGTTTCAG CTACAAAGCCAAGTACTATGCACTCGTCTGCTATGG CCCTGGCCTCCCCATTTCCACCCTCCATGATGGCCGC ACAGACCAAGAAATACAAGTATTAGAAGAAAACAA AGAACTGGAAAATTCTCTGAGAAATATCCAGCTGCC TAAAGTGGAGATTAAGAAGCTCAAAGACGGGGGAC TGACTTTCTGGTACAAGATGATTCTGCCTCCTCAGTT TGACAGATCAAAGAAGTACCCTTTGCTAATTCAAGT GTATGGTGGTCCTTGTAGCCAGAGTGTTAAGTCTGT GTTTGCTGTTAATTGGATAACTTATCTCGCAAGTAA GGAGGGGATAGTCATTGCCCTGGTAGATGGTCGGGG CACTGCTTTCCAAGGTGACAAATTCCTGCATGCCGT GTATCGAAAACTGGGTGTATATGAAGTTGAGGACCA GCTCACAGCTGTCAGAAAATTCATAGAAATGGGTTT CATTGATGAAGAAAGAATAGCCATATGGGGCTGGTC CTACGGAGGTTATGTTTCATCCCTGGCCCTTGCATCT GGAACTGGTCTTTTCAAATGTGGCATAGCAGTGGCT CCAGTCTCCAGCTGGGAATATTACGCATCTATCTAC TCAGAGAGATTCATGGGCCTCCCAACAAAGGACGAC AATCTCGAACACTATAAAAATTCAACTGTGATGGCA AGAGCAGAATATTTCAGAAATGTAGACTATCTTCTC ATCCACGGAACAGCAGATGATAATGTGCACTTTCAG AACTCAGCACAGATTGCTAAAGCTTTGGTTAATGCA CAAGTGGATTTCCAGGCGATGTGGTACTCTGACCAG AACCATGGTATATTATCTGGGCGCTCCCAGAATCAT TTATATACCCACATGACGCACTTCCTCAAGCAATGC TTTTCTTTATCAGACGGCAAAAAGAAAAAGAAAAAG GGCCACCACCATCACCATCAC
26 эктодомен FAP обезьян циномолгус + поли-1у5-метка + Ывб-метка RPPR VHNSEENTMR ALTLKDILNGTF S YKTFFPN WIS G QEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASN YGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGE FVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRP GDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALW WSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIP YPKAGAKNPFVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSD YYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFRED WQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAIS Y YKIF SDKD GYKHIH YIKDT VEN AIQIT S GK WE AINIFR VTQDSLFYSSNEFEDYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTC HLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDG RTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITL WYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAV NWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRK LGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGY VSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFM GLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTA DDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGL S GL STNHL YTHMTHFLKQCF SL SD GKKKKKKGHHHH НН
27 нуклеотидная последовательность CGCCCTCCAAGAGTTCATAACTCTGAAGAAAATACA ATGAGAGCACTCACACTGAAGGATATTTTAAATG
- 71 037557
конструкции эктодомен FAP обезьян циномолгус + поли-1у5-метка + Ывб-метка GGACATTTTCTTATAAAACATTTTTTCCAAACTGGAT TTCAGGACAAGAATATCTTCATCAATCTGCAGATAA CAATATAGTACTTTATAATATTGAAACAGGACAATC ATATACCATTTTGAGTAACAGAACCATGAAAAGTGT GAATGCTTCAAATTATGGCTTATCACCTGATCGGCA ATTTGTATATCTAGAAAGTGATTATTCAAAGCTTTG GAGATACTCTTACACAGCAACATATTACATCTATGA CCTTAGCAATGGAGAATTTGTAAGAGGAAATGAGCT TCCTCGTCCAATTCAGTATTTATGCTGGTCGCCTGTT GGGAGTAAATTAGCATATGTCTATCAAAACAATATC TATTTGAAACAAAGACCAGGAGATCCACCTTTTCAA ATAACATTTAATGGAAGAGAAAATAAAATATTTAAT GGAATCCCAGACTGGGTTTATGAAGAGGAAATGCTT GCTACAAAATATGCTCTCTGGTGGTCTCCTAATGGA AAATTTTTGGCATATGCGGAATTTAATGATACAGAT ATACCAGTTATTGCCTATTCCTATTATGGCGATGAAC AATATCCCAGAACAATAAATATTCCATACCCAAAGG CCGGAGCTAAGAATCCTTTTGTTCGGATATTT АТТАТ CGATACCACTTACCCTGCGTATGTAGGTCCCCAGGA AGTGCCTGTTCCAGCAATGATAGCCTCAAGTGATTA TTATTTCAGTTGGCTCACGTGGGTTACTGATGAACG AGTATGTTTGCAGTGGCTAAAAAGAGTCCAGAATGT TTCGGTCTTGTCTATATGTGATTTCAGGGAAGACTG GCAGACATGGGATTGTCCAAAGACCCAGGAGCATAT AGAAGAAAGCAGAACTGGATGGGCTGGTGGATTCTT TGTTTCAACACCAGTTTTCAGCTATGATGCCATTTCA TACTACAAAATATTTAGTGACAAGGATGGCTACAAA CATATTCACTATATCAAAGACACTGTGGAAAATGCT ATTCAAATTACAAGTGGCAAGTGGGAGGCCATAAAT ATATTCAGAGTAACACAGGATTCACTGTTTTATTCTA GCAATGAATTTGAAGATTACCCTGGAAGAAGAAAC ATCTACAGAATTAGCATTGGAAGCTATCCTCCAAGC AAGAAGTGTGTTACTTGCCATCTAAGGAAAGAAAGG TGCCAATATTACACAGCAAGTTTCAGCGACTACGCC AAGTACTATGCACTTGTCTGCTATGGCCCAGGCATC CCCATTTCCACCCTTCATGACGGACGCACTGATCAA GAAATTAAAATCCTGGAAGAAAACAAGGAATTGGA AAATGCTTTGAAAAATATCCAGCTGCCTAAAGAGGA AATTAAGAAACTTGAAGTAGATGAAATTACTTTATG GTACAAGATGATTCTTCCTCCTCAATTTGACAGATC AAAGAAGTATCCCTTGCTAATTCAAGTGTATGGTGG TCCCTGCAGTCAGAGTGTAAGGTCTGTATTTGCTGTT AATTGGATATCTTATCTTGCAAGTAAGGAAGGGATG GTCATTGCCTTGGTGGATGGTCGGGGAACAGCTTTC CAAGGTGACAAACTCCTGTATGCAGTGTATCGAAAG CTGGGTGTTTATGAAGTTGAAGACCAGATTACAGCT GTCAGAAAATTCATAGAAATGGGTTTCATTGATGAA AAAAGAATAGCCATATGGGGCTGGTCCTATGGAGG ATATGTTTCATCACTGGCCCTTGCATCTGGAACTGGT CTTTTCAAATGTGGGATAGCAGTGGCTCCAGTCTCC AGCTGGGAATATTACGCGTCTGTCTACACAGAGAGA TTCATGGGTCTCCCAACAAAGGATGATAATCTTGAG CACTATAAGAATTCAACTGTGATGGCAAGAGCAGAA TATTTCAGAAATGTAGACTATCTTCTCATCCACGGA ACAGCAGATGATAATGTGCACTTTCAAAACTCAGCA CAGATTGCTAAAGCTCTGGTTAATGCACAAGTGGAT
- 72 037557
TTCCAGGCAATGTGGTACTCTGACCAGAACCACGGC TTATCCGGCCTGTCCACGAACCACTTATACACCCAC ATGACCCACTTCCTAAAGCAGTGTTTCTCTTTGTCAG ACGGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGGGCCACCACCAT CACCATCAC
28 человеческий СЕА UniProt № P06731
29 человеческий MCSP UniProt № Q6UVK1
30 человеческий EGFR UniProt № P00533
31 человеческий CD 19 UniProt № P15391
32 человеческий CD20 Uniprot № Pl 1836
33 человеческий CD33 UniProt № P20138
34 человеческий лимфотоксин а UniProt №P01374
35 человеческий TNF UniProt №P01375
36 человеческий лимфотоксин β UniProt № Q06643
37 человеческий OX40L UniProt №P23510
38 человеческий CD40L UniProt № P29965
39 человеческий FasL UniProt № P48023
40 человеческий CD27L UniProt № P32970
41 человеческий CD30L UniProt № P32971
42 человеческий 41BBL UniProt №P41273
43 человеческий TRAIL UniProt № P50591
44 человеческий RANKL UniProt № 014788
45 человеческий TWEAK UniProt № 043508
46 человеческий APRIL UniProt № 075888
47 человеческий BAFF UniProt № Q9Y275
48 человеческий LIGHT UniProt № 043557
49 человеческий TL1A UniProt № 095150
50 человеческий GITRL UniProt № Q9UNG2
51 человеческий эктодисплазин А UniProt № Q92838
52 hu 4-1BBL (50-254) ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLD LRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAF GFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
53 hu OX40L (51-183) Q VSHRYPRIQ SIK VQFTEYKKEKGFILT SQKEDEIMK V QNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLF QLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDF HVNGGELILIHQNPGEFCVL
- 73 037557
54 hu OX40L (52-183) VSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQ NNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQ LKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFH VNGGELILIHQNP GEFC VL
55 пептидный линкер (SG4)2 SGGGGSGGGG
56 пептидный линкер G4(SG4)2 GGGGSGGGGSGGGG
57 пептидный линкер GSPGSSSSGS
58 пептидный линкер (G4S)4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
59 пептидный линкер GSGSGNGS
60 пептидный линкер GGSGSGSG
61 пептидный линкер GGSGSG
62 пептидный линкер GGSG
63 пептидный линкер GGSGNGSG
64 пептидный линкер GGNGSGSG
65 пептидный линкер GGNGSG
66 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (71-254)СН1-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 2
67 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 41BBL (71-254)-CLl См. таблицу 2
68 нуклеотидная последовательность конструкции антиРАР(28Н1)-Рс-цепь с «впадиной» См. таблицу 2
69 нуклеотидная последовательность конструкции антиFAP (28Н1), легкая цепь См. таблицу 2
70 мышиный (mu) 41BBL UniProt № Q3U1Z9-1
71 нуклеотидная последовательность конструкции димерный mu 41BBL (104-309, C137,160,246S)СН1-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 13
72 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный mu 41BBL (104-309, См. таблицу 13
- 74 037557
C137, 160, 246S)CL
73 нуклеотидная последовательность конструкции антиFAP, Fc-цепь с мутацией КК См. таблицу 13
74 нуклеотидная последовательность легкой цепи антиFAP См. таблицу 13
75 димерный mu 41BBL (104-309, С137, 160, 246S) CL-Fc-цепь с мутацией DD См. таблицу 13
76 мономерный mu 41BBL (104-309, С137,160, 246S)CL1 См. таблицу 13
77 анти-FAP, Fc-цепь с мутацией КК См. таблицу 13
78 анти-FAP, легкая цепь См. таблицу 13
79 нуклеотидная последовательность DP47, Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 18
80 нуклеотидная последовательность легкой цепи DP47 См. таблицу 18
81 DP47, Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 18
82 DP47, легкая цепь См. таблицу 18
83 человеческий 4IBB-Fc(kih) См. таблицу 31
84 обезьяний (циномолгус) 4IBB-Fc(kih) См. таблицу 31
85 мышиный 4-1ВВFc(kih) См. таблицу 31
86 нуклеотидная последовательность Fc-цепи с «впадиной» См. таблицу 32
87 нуклеотидная последовательность конструкции человеческий 4IBB-Fc(kih) См. таблицу 32
88 нуклеотидная последовательность конструкции обезьяний (циномолгус) 4- См. таблицу 32
- 75 037557
IBB-Fc(kih)
89 нуклеотидная последовательность конструкции 4IBB-Fc(kih) См. таблицу 32
90 Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 32
91 конструкция человеческий 4IBB-Fc(kih) См. таблицу 32
92 конструкция обезьяний (циномолгус) 4IBB-Fc(kih) См. таблицу 32
93 конструкция мышиный 4-1ВВFc(kih) См. таблицу 32
94 нуклеотидная последовательность человеческого 4IBB-His См. таблицу 33
95 человеческий 4IBB-His См. таблицу 33
96 человеческий (hu) 4-1BBL (71-248) REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLH TEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
97 димерный hu 41BBL (71-248), соединенный с помощью (G4S)2линкера REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLH TEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSG GGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLI DGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAG VYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGA AALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLG VHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
98 димерный hu 41BBL (80-254), соединенный с помощью (G4S)2линкера DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLA GVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVV AGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSE ARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQ LTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSD PAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAG VSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVA GEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEA RNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQL TQGAT VLGLFRVTPEIP AGLP SPRSE
99 димерный hu 41BBL (52-254), соединенный с помощью (G4S)2линкера PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLR QGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLS YKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSV SLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGF QGRLLHL S AGQRL G VHLHTE AR ARH A WQLTQG AT VL GLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSPWAVSGARA SPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVA
- 76 037557
QNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELV VAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLR SAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSA GQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIP AGLPSPRSE
100 анти-РАР(4В9), CDR-H1 SYAMS
101 анти-РАР(4В9), CDR-H2 AIIGSGASTYY AD S VKG
102 анти-РАР(4В9), CDR-H3 GWFGGFNY
103 анти-РАР(4В9), CDR-L1 RASQSVTSSYLA
104 анти-РАР(4В9), CDR-L2 VGSRRAT
105 анти-РАР(4В9), CDR-L3 QQGIMLPPT
106 анти-РАР(4В9), VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWV RQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQG TLVTVSS
107 анти-РАР(4В9), VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQ QKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIS RLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
108 димерный hu 41BBL (71-254)СН1*-Рс-цепь с «выступом» см.таблицу 4
109 мономерный hu 41BBL (71-254)-CL* см.таблицу 4
ПО мономерный hu 41BBL (71-254)(G4S)1-CL* см.таблицу 7
111 димерный hu 41BBL (52-254)СН1*-Рс-цепь с «выступом» см.таблицу 10
112 мономерный hu 41BBL (52-254)-CL* см.таблицу 10
113 димерный hu 41BBL (80-254)СН1*-Рс-цепь с «выступом» см.таблицу 11
114 мономерный hu 41BBL (80-254)-CL* см.таблицу 11
115 димерный hu 41BBL (71-254)СЬ*-Рс-цепь c «выступом» см.таблицу 3
116 мономерный hu 41BBL (71-254)CH1* см.таблицу 3
117 димерный hu 41BBL (71-254)-CLFc-цепь c см.таблицу 22
- 77 037557
«выступом»
118 мономерный hu 41BBL (71-254)-СН1 см.таблицу 22
119 димерный hu 41BBL (71-248)СВ*-Рс-цепь с «выступом» см.таблицу 24
120 мономерный hu 41BBL (71-248)СН1* см.таблицу 24
121 анти-FAP (28H1)Fc-цепь с «впадиной»,слитая с димерным 41BBL (71-254) см.таблицу 6
122 анти-FAP (28Н1)Fc-цепь с «выступом», слитая с мономерным 41BBL (71-254) см.таблицу 6
123 анти-FAP (4B9)-Fcцепь с «впадиной», слитая с димерным 4-1BBL (71-254) см.таблицу 23
124 анти-FAP (4B9)-Fcцепь с «выступом», слитая с мономерным 41BBL (71-254) см.таблицу 23
125 анти-FAP (4В9), легкая цепь см.таблицу 21
126 анти-FAP (4B9)-Fcцепь с «впадиной», слитая с димерным 4-1BBL (71-248) см.таблицу 26
127 анти-FAP (4B9)-Fcцепь, с «выступом», слитая с мономерным 41BBL (71-248) см.таблицу 26
128 пептидный линкер GGGGS
129 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (71-254) СЬ*-Рс-цепь с «выступом» см.таблицу 3
130 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 41BBL (71-254) СН1* см.таблицу 3
131 нуклеотидная см.таблицу 4
- 78 037557
последовательность конструкции димерный hu 41BBL (71-254) CHP-Fc-цепь с «выступом»
132 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 41BBL (71-254)-CL* см.таблицу 4
133 нуклеотидная последовательность конструкции антиFAP (28Н1) (VHCL)-Fc-uenb с «впадиной» см.таблицу 4
134 нуклеотидная последовательность легкой цепи (VLCH1) анти-FAP (28Н1) см.таблицу 4
135 анти-FAP (VHCL) (28Н1), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 4
136 анти-FAP (28Н1), легкая цепь (VLCH1) см.таблицу 4
137 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 41BBL (71-254) CHP-Fc-цепь с «выступом» см.таблицу 5
138 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (71-254) CL* см.таблицу 5
139 мономерный hu 41BBL (71-254) СЬ*-Рс-цепь с «выступом» см.таблицу 5
140 димерный hu 41BBL (71-254)-CL* см.таблицу 5
141 нуклеотидная последовательность конструкции антиFAP (28Н1)- Fcцепь с «впадиной», слитая с димерным hu 4-1BBL (71-254) см.таблицу 6
142 нуклеотидная см.таблицу 6
- 79 037557
последовательность конструкции антиFAP (28H1)-Fcцепь с «выступом», слитая с мономерным hu 41BBL (71-254)
143 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 41BBL (71-254)(G4S)i-CL* см.таблицу 7
144 нуклеотидная последовательность конструкции [антиFAP (28H1)]2-Fcцепь с «впадиной» см.таблицу 8
145 [анти-F АР (28Н1)]2-Рс-цепь с «впадиной» см.таблицу 8
146 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (71-254) анти-FAP (VHCL*)Fc-цепь с «выступом» см.таблицу 9
147 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 41BBL (71-254) анти-FAP (VLCH1*) см.таблицу 9
148 димерный hu 41BBL (71-254) анти-FAP (VHCL*)Fc-цепь с «выступом» см.таблицу 9
149 мономерный hu 41BBL (71-254) анти-FAP (VLCH1*) см.таблицу 9
150 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (52-254) CHP-Fc-цепь с «выступом» см.таблицу 10
151 нуклеотидная последовательность конструкции см.таблицу 10
- 80 037557
мономерный hu 41BBL (52-254) CL*
152 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (80-254) СН1*-Рс-цепь с «выступом» см.таблицу 11
153 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 41BBL (80-254) CL* см.таблицу 11
154 нуклеотидная последовательность DP47, Fc-цепь с мутацией КК см.таблицу 14
155 нуклеотидная последовательность легкой цепи DP47 см.таблицу 14
156 DP47, Fc-цепь с мутацией КК см.таблицу 14
157 легкая цепь DP47 см.таблицу 14
158 нуклеотидная последовательность конструкции димерный mu 41BBL (104-309, C160S) - CL-Fcцепь с мутацией DD см.таблицу 15
159 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный мышиный 4-1BBL (104-309, C160S) СН1 см.таблицу 15
160 димерный mu 41BBL (104-309, C160S) - CL-Fcцепь с мутацией DD см.таблицу 15
161 мономерный мышиный 4-1BBL (104-309, C160S) СН1 см.таблицу 15
162 нуклеотидная последовательность анти-FAP (4В9), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 21
- 81 037557
163 нуклеотидная последовательность легкой цепи антиFAP (4В9) см.таблицу 21
164 анти-FAP (4В9), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 21
165 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (71-254) CL-Fc-цепь с «выступом» см.таблицу 22
166 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 41BBL (71-254) СН1 см.таблицу 22
167 нуклеотидная последовательность конструкции антиFAP (4В9)-Рс-цепь с «впадиной», слитая с димерным hu 4-1BBL (71-254) см.таблицу 23
168 нуклеотидная последовательность конструкции антиFAP (4В9)-Рс-цепь с «выступом», слитая с мономерным hu 41BBL (71-254) см.таблицу 23
169 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (71-248) СЬ*-Рс-цепь с «выступом» см.таблицу 24
170 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 41BBL (71-248) СН1* см.таблицу 24
171 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (71-248) CL-Fc-цепь с «выступом» см.таблицу 25
- 82 037557
172 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 41BBL (71-248) СН1 см.таблицу 25
173 димерный hu 41BBL (71-248) CL-Fc-цепь с «выступом» см.таблицу 25
174 мономерный hu 41BBL (71-248) СН1 см.таблицу 25
175 нуклеотидная последовательность конструкции антиFAP (4В9)-Рс-цепь с «впадиной», слитая с димерным hu 4-1BBL (71-248) см.таблицу 26
176 нуклеотидная последовательность конструкции антиFAP (4В9)-Рс-цепь с «выступом», слитая с мономерным hu 41BBL (71-248) см.таблицу 26
177 нуклеотидная последовательность конструкции DP47Fc-цепь с «впадиной», слитая с димерным hu 41BBL (71-254) см.таблицу 27
178 нуклеотидная последовательность конструкции DP47Fc-цепь с «выступом», слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-254) см.таблицу 27
179 ОР47-Рс-цепь с «впадиной», слитая с димерным hu 41BBL (71-254) см.таблицу 27
180 DP47, Fc-цепь с «выступом», слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-254) см.таблицу 27
181 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи DP47 (hu IgGl PGLALA) см.таблицу 29
182 DP47, тяжелая цепь см.таблицу 29
- 83 037557
(hu IgGl PGLALA)
183 мономерный hu 41BBL (71-254) плюс (G4S)iлинкер REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLH TEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGS
184 мономерный hu 41BBL (71-248) плюс (G4S)2 линкер REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLH TEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSG GGGS
185 мономерный hu 41BBL (71-248) плюс (G4S)iлинкер REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPL SWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLH TEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGS
186 нуклеотидная последовательность конструкции человеческий антиген CD19-Fcцепь с «выступом»avi-метка см.таблицу 43
187 полипептидная последовательность конструкции человеческий антиген CD19-Fcцепь с «выступом»avi-метка см.таблицу 43
188 нуклеотидная последовательность конструкции антиген CD 19 обезьян циномолгус-Fcцепь с «выступом»avi-метка см.таблицу 43
189 полипептидная последовательность конструкции антиген CD 19 обезьян циномолгус-Fcцепь с «выступом»avi-метка см.таблицу 43
190 гуманизированное анти-СО19 (8В8), HVR-L1 NSNGNT
191 гуманизированное анти-СО19 (8В8) HVR-H2 KFNG
192 гуманизированное TEKFQGRVTM
- 84 037557
анти-СО19 (8B8), варианты 1-9, HVR-H2
193 гуманизированное анти-СО19 (8В8), вариант 5, HVR-L1 LENPNGNT
194 гуманизированное анти-СО19 (8В8), вариант 9, HVR-L1 LENPSGNT
195 анти-CD 19 (8В8018), CDR-H1 DYIMH
196 анти-CD 19 (8B8018), CDR-H2 YINPYNDGSKYTEKFQG
197 анти-СО19 (8B8018), CDR-H3 GTYYYGSALFDY
198 анти-СО19 (8В8018), CDR-L1 KSSQSLENPNGNTYLN
199 анти-СО19 (8В8018), CDR-L2 RVSKRFS
200 анти-СО19 (8В8018), CDR-L3 LQLTHVPYT
201 анти-СО19 (8В8018), VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTS DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFD YWGQGTTVTVSS
202 анти-СО19 (8В8018), VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLENPNGNTYLN WYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGTKLEIK
203 нуклеотидная последовательность анти-СО19 (8В8018), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 47
204 нуклеотидная последовательность легкой цепи антиCD19 (8В8-018) см.таблицу 47
205 анти-СО19(8В8018), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 47
206 легкая цепь антиCD19(8B8-018) см.таблицу 47
207 нуклеотидная последовательность конструкции антиCD19 (8B8-018)-Fcцепь с «впадиной»димерный лиганд см.таблицу 49
208 нуклеотидная последовательность конструкции антиCD19 (8B8-018)-Fcцепь с «выступом»мономерный лиганд см.таблицу 49
- 85 037557
209 анти-СП19 (8B8018)- Fc-цепь с «впадиной»димерный лиганд см.таблицу 49
210 анти-СО19 (8В8018)- Fc-цепь с «выступом» мономерный лиганд см.таблицу 49
211 нуклеотидная последовательность конструкции антиCD19 (8В8-018)Fc-цепь с «впадиной»димерный лиганд (71-248) см.таблицу 52
212 Нуклеотидная последовательность конструкции антиCD19 (8В8-018)Fc-цепь с «выступом»мономерный лиганд (71-248) см.таблицу 52
213 анти-СО19 (8В8018)-Рс-цепь с «впадиной»димерный лиганд (71-248) см.таблицу 52
214 анти-СО19 (8В8018)- Fc-цепь с «выступом»мономерный лиганд (71-248) см.таблицу 52
215 нуклеотидная последовательность родительского клона CD19 (8В8), VH GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTA AAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGGCCTGCAAGGCT TCTGGATACACATTCACTGACTATATTATGCACTGG GTGAAGCAGAAGACTGGGCAGGGCCTTGAGTGGAT TGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTTCTAAGTA CACTGAGAAGTTCAACGGCAAGGCCACACTGACTTC AGACAAATCTTCCATCACAGCCTACATGGAGCTCAG CAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTG TGCAAGAGGGACCT АТТАТТ ATGGTAGCGCCCTCTT TGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTC CTCG
216 нуклеотидная последовательность родительского клона CD19 (8В8), VL GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCT GTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGG TCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACC TATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCT CCACAACTCCTGATCTACAGGGTTTCCAAACGATTT TCTGGGGTCCTAGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCA GGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGA GGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGCCTACAACTT ACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAG
- 86 037557
CTGGAAATAAAA
217 CD 19 LI, обратный случайный (праймер) см.таблицу 53
218 CD 19 L2, прямой случайный (праймер) см.таблицу 53
219 CD 19 Hl, обратный случайный (праймер) см.таблицу 53
220 CD 19 Н2, прямой случайный (праймер) см.таблицу 53
221 CD 19 НЗ, обратный константный (праймер) см.таблицу 53
222 LMB3 см.таблицу 53
223 D19 L1, прямой константный (праймер) см.таблицу 54
224 CD 19 L3, обратный случайный (праймер) см.таблицу 54
225 CD 19 L3, прямой константный (праймер) см.таблицу 54
226 CD 19 НЗ, обратный случайный (праймер) см.таблицу 54
227 нуклеотидная последовательность меченной SNAP конструкции ECD человеческого CD19-PDGFR GGCCGCCGCTAGCGGCATCGACTACAAGGACGACG ATGACAAGGCCGGCATCGATGCCATCATGGACAAA GACTGCGAAATGAAGCGCACCACCCTGGATAGCCCT CTGGGCAAGCTGGAACTGTCTGGGTGCGAACAGGGC CTGCACGAGATCAAGCTGCTGGGCAAAGGAACATCT GCCGCCGACGCCGTGGAAGTGCCTGCCCCAGCCGCC GTGCTGGGCGGACCAGAGCCACTGATGCAGGCCACC GCCTGGCTCAACGCCTACTTTCACCAGCCTGAGGCC ATCGAGGAGTTCCCTGTGCCAGCCCTGCACCACCCA GTGTTCCAGCAGGAGAGCTTTACCCGCCAGGTGCTG TGGAAACTGCTGAAAGTGGTGAAGTTCGGAGAGGTC ATCAGCTACCAGCAGCTGGCCGCCCTGGCCGGCAAT CCCGCCGCCACCGCCGCCGTGAAAACCGCCCTGAGC GGAAATCCCGTGCCCATTCTGATCCCCTGCCACCGG GTGGTGTCTAGCTCTGGCGCCGTGGGGGGCTACGAG GGCGGGCTCGCCGTGAAAGAGTGGCTGCTGGCCCAC GAGGGCCACAGACTGGGCAAGCCTGGGCTGGGTGA TATCCCCGAGGAACCCCTGGTCGTGAAGGTGGAAGA GGGCGACAATGCCGTGCTGCAGTGCCTGAAGGGCAC CTCCGATGGCCCTACCCAGCAGCTGACCTGGTCCAG AGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGCTGTCTCT GGGCCTGCCTGGCCTGGGCATCCATATGAGGCCTCT GGCCATCTGGCTGTTCATCTTCAACGTGTCCCAGCA GATGGGCGGCTTCTACCTGTGTCAGCCTGGCCCCCC ATCTGAGAAGGCTTGGCAGCCTGGCTGGACCGTGAA CGTGGAAGGATCCGGCGAGCTGTTCCGGTGGAACGT
- 87 037557
GTCCGATCTGGGCGGCCTGGGATGCGGCCTGAAGAA CAGATCTAGCGAGGGCCCCAGCAGCCCCAGCGGCA AACTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCCAAGG ACAGACCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCTCCTTGCC TGCCCCCTAGAGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCC AGGACCTGACAATGGCCCCTGGCAGCACACTGTGGC TGAGCTGTGGCGTGCCACCCGACTCTGTGTCTAGAG GCCCTCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCTAAGGGCC CTAAGAGCCTGCTGAGCCTGGAACTGAAGGACGAC AGGCCCGCCAGAGATATGTGGGTCATGGAAACCGG CCTGCTGCTGCCTAGAGCCACAGCCCAGGATGCCGG CAAGTACTACTGCCACAGAGGCAACCTGACCATGAG CTTCCACCTGGAAATCACCGCCAGACCCGTGCTGTG GCACTGGCTGCTGAGAACAGGCGGCTGGAAGGTCG ACGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAT GCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTG CCACACTCCTTGCCCTTTAAGGTGGTGGTGATCTCA GCCATCCTGGCCCTGGTGGTGCTCACCATCATCTCCC TTATCATCCTCATCATGCTTTGGCAGAAGAAGCCAC GT
228 нуклеотидная последовательность меченной SNAP конструкции ECD CD 19 обезьян циномолгус PDGFR CCGGCCGCCGCTAGCGGCATCGACTACAAGGACGAC GATGACAAGGCCGGCATCGATGCCATCATGGACAA AGACTGCGAAATGAAGCGCACCACCCTGGATAGCCC TCTGGGCAAGCTGGAACTGTCTGGGTGCGAACAGGG CCTGCACGAGATCAAGCTGCTGGGCAAAGGAACATC TGCCGCCGACGCCGTGGAAGTGCCTGCCCCAGCCGC CGTGCTGGGCGGACCAGAGCCACTGATGCAGGCCAC CGCCTGGCTCAACGCCTACTTTCACCAGCCTGAGGC CATCGAGGAGTTCCCTGTGCCAGCCCTGCACCACCC AGTGTTCCAGCAGGAGAGCTTTACCCGCCAGGTGCT GTGGAAACTGCTGAAAGTGGTGAAGTTCGGAGAGG TCATCAGCTACCAGCAGCTGGCCGCCCTGGCCGGCA ATCCCGCCGCCACCGCCGCCGTGAAAACCGCCCTGA GCGGAAATCCCGTGCCCATTCTGATCCCCTGCCACC GGGTGGTGTCTAGCTCTGGCGCCGTGGGGGGCTACG AGGGCGGGCTCGCCGTGAAAGAGTGGCTGCTGGCCC ACGAGGGCCACAGACTGGGCAAGCCTGGGCTGGGT GATATCCCCCAGGAACCCCTGGTCGTGAAGGTGGAA GAGGGCGACAATGCCGTGCTCCAGTGTCTCGAGGGC ACCTCCGATGGCCCTACACAGCAGCTCGTGTGGTGC AGAGACAGCCCCTTCGAGCCCTTCCTGAACCTGTCT CTGGGCCTGCCTGGCATGGGCATCAGAATGGGCCCT CTGGGCATCTGGCTGCTGATCTTCAACGTGTCCAAC CAGACCGGCGGCTTCTACCTGTGTCAGCCTGGCCTG CCAAGCGAGAAGGCTTGGCAGCCTGGATGGACCGT GTCCGTGGAAGGATCTGGCGAGCTGTTCCGGTGGAA CGTGTCCGATCTGGGCGGCCTGGGATGCGGCCTGAA GAACAGAAGCAGCGAGGGCCCTAGCAGCCCCAGCG GCAAGCTGAATAGCAGCCAGCTGTACGTGTGGGCCA AGGACAGACCCGAGATGTGGGAGGGCGAGCCTGTG TGTGGCCCCCCTAGAGATAGCCTGAACCAGAGCCTG AGCCAGGACCTGACAATGGCCCCTGGCAGCACACTG TGGCTGAGCTGTGGCGTGCCACCCGACTCTGTGTCC AGAGGCCCTCTGAGCTGGACACACGTGCGGCCTAAG GGCCCTAAGAGCAGCCTGCTGAGCCTGGAACTGAAG GACGACCGGCCCGACCGGGATATGTGGGTGGTGGAT
- 88 037557
ACAGGCCTGCTGCTGACCAGAGCCACAGCCCAGGAT GCCGGCAAGTACTACTGCCACAGAGGCAACTGGACC AAGAGCTTTTACCTGGAAATCACCGCCAGACCCGCC CTGTGGCACTGGCTGCTGAGAATCGGAGGCTGGAAG GTCGACGAGCAGAAGCTGATCTCCGAAGAGGACCT GAACGCCGTGGGCCAGGATACCCAGGAAGTGATCG TGGTGCCCCACAGCCTGCCCTTCAAGGTGGTCGTGA TCAGCGCCATTCTGGCCCTGGTGGTGCTGACCATCA TCAGCCTGATCATCCTGATTATGCTGTGGCAGAAAA AGCCCCGC
229 полипептидная последовательность меченной SNAP конструкции ECD человеческого CD 19 -PDGFR Ρ АА AS GID YKDDDDK AGID AIMDKD CEMKRTTLD SPL GKLELSGCEQGLHEIKLLGKGTSAADAVEVPAPAAVL GGPEPLMQATAWLNAYFHQPEAIEEFPVPALHHPVFQ QESFTRQVLWKLLKVVKFGEVISYQQLAALAGNPAAT AAVKTALSGNPVPILIPCHRVVSSSGAVGGYEGGLAV KEWLLAHEGHRLGKPGLGDIPEEPLVVKVEEGDNAVL QCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIH MRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGW TVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPS GKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLS QDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGP KSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGK YYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVDE QKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILAL VVLTIISLIILIMLWQKKPR
230 полипептидная последовательность меченной SNAP конструкции ECD человеческого CD 19 -PDGFR PAA AS GID YKDDDDK AGID AIMDKD CEMKRTTLD SPL GKLELSGCEQGLHEIKLLGKGTSAADAVEVPAPAAVL GGPEPLMQATAWLNAYFHQPEAIEEFPVPALHHPVFQ QESFTRQVLWKLLKVVKFGEVISYQQLAALAGNPAAT AAVKTALSGNPVPILIPCHRVVSSSGAVGGYEGGLAV KEWLLAHEGHRLGKPGLGDIPQEPLVVKVEEGDNAVL QCLEGTSDGPTQQLVWCRDSPFEPFLNLSLGLPGMGIR MGPLGIWLLIFNVSNQTGGFYLCQPGLPSEKAWQPGW TVSVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSG KLNSSQLYVWAKDRPEMWEGEPVCGPPRDSLNQSLS QDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVRPKGP KSSLLSLELKDDRPDRDMWVVDTGLLLTRATAQDAG KYYCHRGNWTKSFYLEITARPALWHWLLRIGGWKVD EQKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILA L VVLTIISLIILIMLWQKKPR
231 анти-СО19 (8В85Н09), CDR-L1 см.таблицу 56
232 анти-СО19 (8В85Н09), CDR-L2 см.таблицу 56
233 анти-СО19 (8В85Н09), CDR-L3 см.таблицу 56
234 анти-СО19 (8В85Н09), CDR-H1 см.таблицу 57
235 анти-СО19 (8В85Н09), CDR-H2 см.таблицу 57
236 анти-СО19 (8В85Н09), CDR-H3 см.таблицу 57
237 анти-СО19 (8В87Н07), CDR-L1 см.таблицу 56
238 анти-СО19 (8В8- см.таблицу 56
- 89 037557
7H07), CDR-L2
239 анти-СО19 (8В87Н07), CDR-L3 см.таблицу 56
240 анти-СО19 (8В87Н07), CDR-H1 см.таблицу 57
241 анти-СО19 (8В87Н07), CDR-H2 см.таблицу 57
242 анти-СО19 (8В87Н07), CDR-H3 см.таблицу 57
243 анти-СО19 (8В82В03), CDR-L1 см.таблицу 56
244 анти-СО19 (8В82В03), CDR-L2 см. таблицу 56
245 анти-СО19 (8В82В03), CDR-L3 см.таблицу 56
246 анти-СО19 (8В82В03), CDR-H1 см.таблицу 57
247 анти-СО19 (8В82В03), CDR-H2 см.таблицу 57
248 анти-СО19 (8В82В03), CDR-H3 см.таблицу 57
249 анти-СО19 (8В82В11), CDR-L1 см.таблицу 56
250 анти-СО19 (8В8- 2В11), CDR-L2 см.таблицу 56
251 анти-СО19 (8В82В11), CDR-L3 см.таблицу 56
252 анти-СО19 (8В82В11), CDR-H1 см.таблицу 57
253 анти-СО19 (8В82В11), CDR-H2 см.таблицу 57
254 анти-СО19 (8В82В11), CDR-H3 см.таблицу 57
255 анти-СО19 (8В85А07), CDR-L1 см.таблицу 56
256 анти-СО19 (8В85А07), CDR-L2 см.таблицу 56
257 анти-CD 19 (8В85А07), CDR-L3 см.таблицу 56
258 анти-СО19 (8В85А07), CDR-H1 см.таблицу 57
259 анти-СО19 (8В85А07), CDR-H2 см.таблицу 57
260 анти-СО19 (8В85А07), CDR-H3 см.таблицу 57
261 анти-СО19 (8В85В08), CDR-L1 см.таблицу 56
262 анти-СО19 (8В85В08), CDR-L2 см.таблицу 56
263 анти-СО19 (8В85В08), CDR-L3 см.таблицу 56
264 анти-СО19 (8В85В08), CDR-H1 см.таблицу 57
265 анти-СО19 (8В85В08), CDR-H2 см.таблицу 57
- 90 037557
266 анти-СО19 (8B85B08), CDR-H3 см.таблицу 57
267 анти-СО19 (8B85D08), CDR-L1 см.таблицу 56
268 анти-СО19 (8B85D08), CDR-L2 см.таблицу 56
269 hth-CD19 (8B85D08), CDR-L3 см.таблицу 56
270 анти-СО19 (8B85D08), CDR-H1 см.таблицу 57
271 анти-СО19 (8B85D08), CDR-H2 см.таблицу 57
272 анти-СО19 (8B85D08), CDR-H3 см.таблицу 57
273 нуклеотидная последовательность легкой цепи родительского антитела к CD 19 (8В8) см.таблицу 58
274 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи родительского антитела к CD 19 (8В8) см.таблицу 58
275 легкая цепь родительского антитела к CD 19 (8В8) см.таблицу 58
276 тяжелая цепь родительского антитела к CD 19 (8В8) см.таблицу 58
277 нуклеотидная последовательность легкой цепи антиCD19 (8В8-2В11) см.таблицу 59
278 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антиCD19 (8В8-2В11) см.таблицу 59
279 анти-СО19 (8В8- 2В11), легкая цепь см.таблицу 59
280 анти-СО19 (8В8- 2В11) тяжелая цепь см.таблицу 59
281 нуклеотидная последовательность анти-СВ19 (8В87Н07) см.таблицу 59
282 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антиCD19 (8В8-7Н07) см.таблицу 59
283 анти-СО19 (8В8- см.таблицу 59
- 91 037557
7H07), легкая цепь
284 анти-СО19 (8В87Н07), тяжелая цепь см.таблицу 59
285 нуклеотидная последовательность легкой цепи антиCD19 (8В8-2В03) см.таблицу 59
286 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антиCD19 (8В8-2В03) см.таблицу 59
287 анти-СО19 (8В8- 2В03), легкая цепь см.таблицу 59
288 анти-СО19 (8В82В03), тяжелая цепь см.таблицу 59
289 нуклеотидная последовательность легкой цепи антиCD19 (8В8-5А07) см.таблицу 59
290 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антиCD19 (8В8-5А07) см.таблицу 59
291 анти-СО19 (8В8- 5А07), легкая цепь см.таблицу 59
292 анти-СО19 (8В85А07), тяжелая цепь см.таблицу 59
293 нуклеотидная последовательность легкой цепи антиCD19 (8B8-5D08) см.таблицу 59
294 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антиCD19 (8B8-5D08) см.таблицу 59
295 анти-СО19 (8В8- 5D08), легкая цепь см.таблицу 59
296 анти-СО19 (8В85D08), тяжелая цепь см.таблицу 59
297 нуклеотидная последовательность легкой цепи антиCD19 (8В8-5В08) см.таблицу 59
298 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антиCD19 (8В8-5В08) см.таблицу 59
299 анти-СО19 (8В8- 5В08), легкая цепь см.таблицу 59
300 анти-СО19 (8В85В08), тяжелая см.таблицу 59
- 92 037557
цепь
301 нуклеотидная последовательность легкой цепи антиCD19 (8В8-5Н09) см.таблицу 59
302 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антиCD19 (8В8-5Н09) см.таблицу 59
303 легкая цепь антиCD19 (8В8-5Н09) см.таблицу 59
304 тяжелая цепь антиCD19 (8В8-5Н09) см.таблицу 59
305 нуклеотидная последовательность анти-СП19 (8В82В11), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 62
306 анти-СО19 (8В82В11), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 62
307 нуклеотидная последовательность конструкции антиCD19 (8В8-2В11)Fc-цепь с «впадиной»димерный лиганд см.таблицу 64
308 нуклеотидная последовательность конструкции антиCD19 (8В8-2В11)Fc-цепь с «выступом»мономерный лиганд см.таблицу 64
309 анти-СП19 (8В82В11)-Рс-цепь с «впадиной»димерный лиганд см.таблицу 64
310 анти-СО19 (8В82В11)-Рс-цепь с «выступом»мономерный лиганд см.таблицу 64
311 нуклеотидная последовательность конструкции антиCD19 (8В8-2В11)Fc-цепь с «впадиной»димерный лиганд (71-248) см.таблицу 67
312 нуклеотидная последовательность см.таблицу 67
- 93 037557
конструкции антиCD19 (8В8-2В11)Fc-цепь с «выступом»мономерный лиганд (71-248)
313 анти-СО19 (8В82В11)- Fc-цепь с «впадиной»димерный лиганд (71-248) см.таблицу 67
314 анти-СО19 (8В8- 2B11)-Fc с «выступом»мономерный лиганд (71-248) см.таблицу 67
315 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антиСВР (8В8-018) (huIgGl PGLALA) см.таблицу 72
316 тяжелая цепь антиCD19 (8В8-018) (huIgGl PGLALA) см.таблицу 72
317 анти-mu СЕА Т84.66, VH MKCSWVIFFL MAVVTGVNSE VQLQQSGAEL VEPGASVKLS CTASGFNIKD TYMHWVKQRP EQGLEWIGRI DPANGNSKYV PKFQGKATIT ADTSSNTAYL QLTSLTSEDT AVYYCAPFGY YVSDYAMAYW GQGTSVTVSS
318 анти-mu СЕА Т84.66, VL METDTLLLWV LLLWVPGSTG DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT MSCRAGESVD IFGVGFLHWY QQKPGQPPKL LIYRASNLES GIPVRFSGTG SRTDFTLIID PVEADDVATY YCQQTNEDPY TFGGGTKLEI К
319 IGHV1-69*O8, IMGT код доступа Z14309 TAAGGGGCTT CCTAGTCCTA AGGCTGAGGA AGGGATCCTG GTTTAGTTAA AGAGGATTTT АТТСАССССТ GTGTCCTCTC CACAGGTGTC CAGTCCCAGG TCCAGCTGGT GCAATCTGGG GCTGAGGTGA AGAAGCCTGG GTCCTCGGTG AAGGTCTCCT GCAAGGCTTC TGGAGGCACC TTCAGCAGCT ATACTATCAG CTGGGTGCGA CAGGCCCCTG GACAAGGGCT TGAGTGGATG GGAAGGATCA ТСССТАТССТ TGGTACAGCA AACTACGCAC AGAAGTTCCA GGGCAGAGTC ACGATTACCG CGGACAAATC CACGAGCACA GCCTACATGG AGCTGAGCAG CCTGAGATCT GAGGACACGG CCGTGTATTA CTGTGCGAGA GA
320 IGKV3-ll*01, IMGT код доступа CTGCAGCTGG AAGCTCAGCT CCCACCCAGC TGCTTTGCAT GTCCCTCCCA GCTGCCCTAC CTTCCAGAGC ССАТАТСААТ GCCTGTGTCA GAGCCCTGGG GAGGAACTGC TCAGTTAGGA CCCAGAGGGA ACCATGGAAG CCCCAGCTCA GCTTCTCTTC CTCCTGCTAC TCTGGCTCCC AGGTGAGGGG AACATGAGGT GGTTTTGCAC
- 94 037557
ATTAGTGAAA ACTCTTGCCA CCTCTGCTCA GCAAGAAATA TAATTAAAAT TCAAAGTATA ТСААСААТТТ TGGCTCTACT CAAAGACAGT TGGTTTGATC TTGATTACAT GAGTGCATTT CTGTTTTATT ТССААТТТСА GATACCACCG GAGAAATTGT GTTGACACAG TCTCCAGCCA CCCTGTCTTT GTCTCCAGGG GAAAGAGCCA CCCTCTCCTG CAGGGCCAGT CAGAGTGTTA GCAGCTACTT AGCCTGGTAC CAACAGAAAC CTGGCCAGGC TCCCAGGCTC CTCATCTATG ATGCATCCAA CAGGGCCACT GGCATCCCAG CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTGGGACAG АСТТСАСТСТ CACCATCAGC AGCCTAGAGC CTGAAGATTT TGCAGTTTAT TACTGTCAGC AGCGTAGCAA CTGGCCTCCC ACAGTGATTC CACATGAAAC АААААССССА ACAAGACCAT CAGTGTTTAC TAGATTATTA TACCAGCTGC ТТССТТТАСА GACAGCTAGT GGGGTGGCCA CTCAGTGTTA GCATCTCAGC TCTATTTGGC CATTTTGGAG TTCAAGT
321 анти-СЕ A, CDR-H1 см.таблицу 81
322 анти-СЕА, CDR-H2 см.таблицу 81
323 анти-СЕА, CDR-НЗ см.таблицу 81
324 анти-СЕА, CDR-L1 см.таблицу 81
325 анти-СЕА, CDR-L2 см.таблицу 81
326 анти-СЕА, CDR-L3 см.таблицу 81
327 родительский СЕАсвязывающий агент, VH см.таблицу 81
328 родительский СЕАсвязывающий агент, VL см.таблицу 81
329 гуманизированный СЕА-связывающий агент, VH см.таблицу 81
330 гуманизированный СЕА-связывающий агент, VL см.таблицу 81
331 нуклеотидная последовательность анти-СЕА (Т84.66LCHA), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 82
332 нуклеотидная последовательность легкой цепи антиСЕА (Т84.66LCHA) см.таблицу 82
333 анти-СЕА (Т84.66LCHA), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 82
334 анти-СЕА (Т84.66LCHA), легкая цепь см.таблицу 82
335 нуклеотидная последовательность см.таблицу 84
- 95 037557
конструкции антиСЕА (Т84.66LCHA)- Fc-цепь с «впадиной»димерный лиганд
336 нуклеотидная последовательность конструкции антиСЕА (Т84.66LCHA)- Fc-цепь с «выступом»мономерный лиганд см.таблицу 84
337 анти-СЕА (Т84.66LCHA)- Fc-цепь с «впадиной»димерный лиганд см.таблицу 84
338 анти-СЕА (Т84.66LCHA)- Fc-цепь с «выступом»мономерный лиганд см.таблицу 84
339 нуклеотидная последовательность конструкции антиСЕА (Т84.66LCHA)- Fc-цепь с «впадиной»димерный лиганд (71-248) см.таблицу 87
340 нуклеотидная последовательность конструкции антиСЕА (Т84.66LCHA),-Fc-цепь с «выступом»мономерный лиганд (71-248) см.таблицу 87
341 анти-СЕА (Т84.66LCHA)- Fc-цепь с «впадиной»димерный лиганд (71-248) см.таблицу 87
342 анти-СЕА (Т84.66LCHA)- Fc-цепь с «выступом»мономерный лиганд (71-248) см.таблицу 87
343 нуклеотидная последовательность анти-СЕА (Т84.66), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 88
344 нуклеотидная последовательность см.таблицу 88
- 96 037557
легкой цепи антиСЕА (Т84.66)
345 анти-СЕА (Т84.66), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 88
346 анти-СЕА (Т84.66), легкая цепь см.таблицу 88
347 нуклеотидная последовательность конструкции антиCEA(T84.66)-Fcцепь с «впадиной»димерный лиганд см.таблицу 89
348 нуклеотидная последовательность конструкции антиСЕА (T84.66)-Fcцепь с «выступом»мономерный лиганд см.таблицу 89
349 анти-СЕА (Т84.66)- Fc-цепь с «впадиной»димерный лиганд см.таблицу 89
350 анти-СЕА (Т84.66)Fc-цепь с «выступом»мономерный лиганд см.таблицу 89
351 нуклеотидная последовательность hu NA3B3A2-avi His см.таблицу 92
352 человеческий NA3B3A2-avi-His см.таблицу 92
353 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu OX40L (51-183) СЕ*-Рс-цепь с «выступом» см.таблицу 97
354 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu OX40L (51-183) СН1* см.таблицу 97
355 димерный hu OX40L (51-183) СЕ*-Ес-цепь с «выступом» см.таблицу 97
356 мономерный hu OX40L (51-183) СН1* см.таблицу 97
- 97 037557
357 анти-СО19 (8В82В11), VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTS DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFD YWGQGTTVTVSS
358 анти-СО19 (8В82В11), VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGTTYLN WYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFGQGTKLEIK
359 анти-СО19 (8В87Н07), VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTS DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSELFD YWGQGTTVTVSS
360 анти-СО19 (8В87Н07), VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLN WYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCLQATHIPYTFGQGTKLEIK
361 анти-СО19 (8В82В03), VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYITHW VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTS DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPDLFD YWGQGTTVTVSS
362 анти-СО19 (8В82В03), VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLN WYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGXKLEIK
363 анти-СО19 (8В85А07), VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTS DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFD YWGQGTTVTVSS
364 анти-СО19 (8В85А07), VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLN WYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCLQPGHYPGTFGQGTKLEIK
365 анти-СО19 (8В85D08), VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTS DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSELFD YWGQGTTVTVSS
366 анти-СО19 (8В85D08), VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLN WYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCLQLTHEPYTFGQGTKLEIK
367 анти-СО19 (8В85В08), VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTS DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFD YWGQGTTVTVSS
368 анти-СО19 (8В85В08), VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLN WYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCLQLDSYPNTFGQGTKLEIK
369 анти-СО19 (8В85Н09), VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHW VRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTS DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFD YWGQGTTVTVSS
370 анти-СО19 (8В85Н09), VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLESSTGNTYLN WYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCLQLIDYPVTFGQGTKLEIK
371 димерный huOX40L (51-183), соединенный с помощью (G4S)2линкера QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKV QNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLF QLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDF HVNGGELILIHQNPGEFCVLGGGGSGGGGSQVSHRYP RIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVHN CDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRS
- 98 037557
VNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELI LIHQNPGEFCVL
372 димерный huOX40L (52-183), соединенный c помощью (G4S)2линкера VSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQ NNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQ LKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFH VNGGELILIHQNPGEFCVLGGGGSGGGGSVSHRYPRIQ SIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDG FYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNS LMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIH QNPGEFCVL
373 hu 4-1BBL (85-248) LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLT GGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEG SGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS AFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQG ATVLGLFRVTPEIPAGL
374 hu 4-1BBL (80-248) DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLA GVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVV AGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSE ARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQ LTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
375 hu 4-1BBL (52-248) PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLR QGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLS YKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSV SLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGF QGRLLHL S AGQRL G VHLHTE AR ARH A WQLTQG AT VL GLFRVTPEIPAGL
Общую информацию, касающуюся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческих иммуноглобулинов, см. у Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Аминокислоты цепей антител нумеровали и обозначали в соответствии с системой EU-нумерации согласно Кэботу (Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991), которая описана выше.
Примеры
Ниже представлены примеры способов и композиций, предлагаемых в изобретении. Как должно быть очевидно, можно воплощать на практике различные другие варианты осуществления изобретения в целом с учетом представленного выше описания изобретения.
Методы рекомбинантной ДНК.
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии применяли согласно инструкциям производителей. Общую информацию, касающуюся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческих иммуноглобулинов, см. у Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во NIH, публикация N91-3242, 1991.
Секвенирование ДНК.
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования двух цепей.
Синтез генов.
Требуемые сегменты генов либо создавали с помощью ПЦР с использованием соответствующих матриц, либо синтезировали на фирме Geneart AG (Регенсбург, Германия) из синтетических олигонуклеотидов и ПЦР-продуктов посредством автоматического синтеза генов. В тех случаях, когда точная генная последовательность не была доступна, создавали олигонуклеотидные праймеры на основе последовательностей ближайших гомологов и гены выделяли с помощью ОТ-ПЦР из РНК, полученной из соответствующей ткани. Сегменты генов, фланкированные единичными сайтами, распознаваемыми рестрикционными эндонуклеазами, клонировали в стандартных клонирующих/секвенирующих векторах. Плазмидную ДНК очищали из трансформированных бактерий и определяли концентрацию с помощью УФспектроскопии. Последовательность ДНК субклонированных фрагментов генов подтверждали ДНКсеквенированием. Создавали сегменты генов с требуемыми сайтами рестрикции, позволяющими субклонировать их в соответствующих экспрессионных векторах. Все конструкции создавали с 5'-концевой последовательностью ДНК, кодирующей лидерный пептид, который направляет секрецию белков в эукариотических клетках.
Методики культивирования клеток.
Применяли стандартные методики культивирования клеток, описанные в Current Protocols in Cell Biology, под ред. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. и Yamada K.M., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 2000.
- 99 037557
Очистка белков.
Белки очищали из профильтрованных супернатантов клеточных культур согласно стандартному протоколу. В целом, метод состоял в следующем: белки вносили в колонку с белок А-Сефарозой (фирма GE Healthcare, Швеция) и промывали с помощью ЗФР. Элюцию белков осуществляли при значении рН 2,8, после чего немедленно проводили нейтрализацию образца. Агрегированные белки отделяли от мономерных антител с помощью гель-фильтрации (Супердекс 200, фирма GE Healthcare) в ЗФР или в 20 мМ гистидине, 150 мМ NaCl, рН 6,0. Фракции мономерных антител объединяли, концентрировали (при необходимости), используя, например, центрифужный концентратор MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), замораживали и хранили при температуре -20 или -80°С. Часть образцов использовали для последующего аналитического анализа белков и аналитической характеризации, например, с помощью ДСН-ПААГ, гель-фильтрации (SEC) или масс-спектрометрии.
ДСН-ПААГ.
Гелевую систему NuPAGE® Pre-Cast (фирма Invitrogen) применяли согласно инструкции производителя. В частности, применяли 10% или 4-12% гели NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast (pH 6,4) и подвижный буфер NuPAGE® MES (восстановленные гели с антиоксидантной добавкой для подвижного буфера NuPAGE®) или MOPS (невосстановленные гели).
Аналитическая гель-фильтрация.
Гель-фильтрацию (SEC) для определения агрегированного и олигомерного состояния антител осуществляли с помощью ЖХВР-хроматографии. В целом, метод состоял в следующем: очищенные на белке А антитела вносили в колонку Tosoh TSKgel G3000SW в 300 мМ NaCl, 50 мМ KH2PO4/K2HPO4, рН 7,5 в системе Agilent HPLC 1100 или в колонку Супердекс 200 (фирма GE Healthcare) в 2 х ЗФР в системе Dionex HPLC. Элюированные белки оценивали количественно с помощью УФ-абсорбции и интегрирования площадей пиков. В качестве стандарта служил BioRad Gel Filtration Standard 151-1901.
Масс-спектрометрия.
В этом разделе описана характеризация мультиспецифических антител с VH/VL-обменом (VH/VL CrossMab) в отношении их правильной сборки. Ожидаемые первичные структуры анализировали с помощью масс-спектрометрии с использованием ионизация электроспреем (ESI-MC) дегликозилированных интактных CrossMab и дегликозилированных расщепленных плазмином или в альтернативном варианте дегликозилированных/ограничено расщепленных LysC CrossMab.
VH/VL-CrossMab дегликозилировали с помощью N-гликозидазы F в фосфатном или Трис-буфере при 37°С в течение вплоть до 17 ч с использованием белка в концентрации 1 мг/мл. Расщепление плазмином или ограниченное расщепление LysC (фирма Roche) осуществляли с использованием 100 мкг дегликозилированных VH/VL-CrossMab в Трис-буфере, рН 8 при комнатной температуре в течение 120 ч и при 37°С в течение 40 мин соответственно. Перед осуществлением масс-спектрометрии образцы обессоливали посредством ЖХВР на колонке Сефадекс G25 (фирма GE Healthcare). Общую массу определяли с помощью ESI-MC с использованием системы maXis 4G UHR-QTOF MS (фирма Bruker Daltonik), снабженной источником TriVersa NanoMate (фирма Advion).
Определение связывания и аффинности связывания мультиспецифических антител с соответствующими антигенами с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (BIACORE).
Связывание созданных антител с соответствующими антигенами исследовали с помощью поверхностного плазмонного резонанса, используя устройство BIACORE (фирма GE Healthcare Biosciences AB, Уппсала, Швеция). В целом, метод состоял в следующем: для измерения аффинности антитела в виде козьих античеловеческих IgG, JIR 109-005-098 иммобилизовали на СМ5-чипе с помощью аминного сочетания для презентации антител против соответствующего антигена. Связывание измеряли в HBS-буфере (HBS-P (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,005% Твин 20, рН 7,4) при 25°С (или альтернативно этому при 37°С). Добавляли антиген (фирма R&D Systems или очищенный в лаборатории заявителей) в различных концентрациях в растворе. Ассоциацию измеряли путем инъекции антигена в течение промежутка времени, составляющего от 80 с до 3 мин; диссоциацию измеряли путем промывки поверхности чипа HBSбуфером в течение 3-10 мин и величину KD определяли с использованием модели связывания 1:1 Ленгмюра. Данные, полученные для отрицательного контроля (например, кривые для буфера) вычитали из кривых для образцов для коррекции на присущий системе сдвиг основного уровня и для снижения шумового сигнала. Использовали соответствующую программу Biacore Evaluation для анализа сенсограмм и для расчета данных, касающихся аффинности.
Пример 1.
1.1. Получение нацеленных содержащих лиганд для человеческого 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
Различные фрагменты последовательности ДНК, кодирующей часть эктодомена (аминокислоты 71254, 52-254 и 80-254) человеческого лиганда для 4-1ВВ, синтезировали на основе последовательности Р41273 из базы данных Uniprot (SEQ ID NO: 42).
В качестве компонентов для сборки антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд TNF, полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ, разделенных (G4S)2-линкерами,
- 100 037557 и слитый с CH1- или CL-доменом человеческого IgG1, клонировали, согласно схеме, представленной на фиг. 1А (человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий СН1 или CL), или представленной на фиг. 1В (человеческий СН3, (G4S)2коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ).
Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ и слитый с CL- или СН1-доменом человеческого IgG1, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 1Б (человеческий лиганд для 41ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий CL или СН1), или представленной на фиг. 1Г (человеческий СН3, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ).
Полинуклеотиды субклонировали в рамке считывания с СН2- и СН3-доменами тяжелой цепи человеческого IgG1 с необязательными пептидными линкерами, например в случае конструкции 1 полипептид, представляющий собой димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим СН1-доменом, субклонировали в рамке считывания с СН2- и СН3-доменами тяжелой цепи с выступом человеческого IgG1 (Merchant, Zhu и др. 1998), используя линкер (GSPGSSSSGS), имеющий SEQ ID NO: 57.
Последовательности ДНК вариабельной области тяжелой и легкой цепи, кодирующие связывающий агент, специфический для фибробласт-активирующего белка (FAP), т.е. 28Н1, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной (Carter, J. Immunol. Methods 248, 2001, cc. 7-15), либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Конструирование и получение связывающих FAP агентов описано в WO 2012/020006 А2, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
В табл. 1 обобщены характеристики полученных конструкций. Конструкции 1-10 отличались их геометрией, валентностью в отношении FAP, эктодоменом лиганда для 4-1ВВ, наличием кроссовера СН1- и CL-доменов (CrossMab-технология), мутациями в СН1- и CL-доменах и различными пептидными линкерами в полипептиде, содержащем один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (мономерная цепь 4-1BBL).
Таблица 1. Характеризация полученных содержащих тримерный лиганд TNF антигенсвязывающих молекул (FAP разделенные тримеры 4-1BBL)
Конструкция Валентность в отношении FAP Связывающий FAP агент Эктодомен 4-1BBL «Скрещенные» СН1-CLдомены Заряженные остатки Линкер с 41BBL в легкой цепи
1.1 одновалентная 28Н1 71-254 нет нет (G4S)2
1.2 одновалентная 28Н1 71-254 да (лиганд) да(лиганд) (G4S)2
1.3 одновалентная 28Н1 71-254 да (FAP Fab) да (лиганд) (G4S)2
1.4 одновалентная 28Н1 71-254 нет да (лиганд) (G4S)2
1.5 двухвалентная 28Н1 71-254 нет нет (G4S)2
1.6 одновалентная 28Н1 71-254 нет да(лиганд) (G4S)i
1.7 двухвалентная 28Н1 71-254 да (лиганд) да (лиганд) (G4S)2
1.8 двухвалентная 28Н1 71-254 да (FAP Fab, слитый с лигандом) да(лиганд) (G4S)2
1.9 одновалентная 28Н1 52-254 нет да (лиганд) (G4S)2
1.10 одновалентная 28Н1 80-254 нет да (лиганд) (G4S)2
Во избежание ошибочного спаривания в большинстве конструкций одну пару СН1 - и CL-доменов заменяли соответствующей другой (кроссовер доменов) согласно методу, описанному в WO 2009/080253 А1.
Для дополнительного повышения правильного спаривания интродуцировали различные заряженные аминокислоты в скрещенные или нескрещенные СН1- и CL-домены в виде заряженных остатков в конструкциях 2-4 и 6-10. В человеческий CL-домен интродуцировали мутации E123R Q124K, а мутации К147Е и К213Е клонировали в человеческом СН1-домене.
Для всех конструкций применяли технологию гетеродимеризации knobs-into-holes с мутациями S354C/T366W в СН3-домене цепи с выступом и соответствующими мутациями Y349C/T366S/L368A/ Y407V в СН3-домене цепи с впадиной (Carter, J. Immunol. Methods 248, 2001, cc. 7-15).
Мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala интродуцировали в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-Y-рецепторами согласно методу, описанному в публикации Международной заявки на патент WO 2012/130831 А1.
Например, в конструкции 1 комбинация лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W в первом СН3-домене, с нацеленной конструкцией анти-FAP-Fc-цепь с впадиной, содержащей мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V во втором СН3-домене, позволяла получать гетеродимер, который включал собранную конструкцию тримерного лиганда для 4-1ВВ и FAP-связывающего Fab (фиг. 2, график 1.1).
В табл. 2 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 1.1).
- 101 037557
Таблица 2. Последовательности нацеленной на FAP содержащей тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.1)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
66 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1-Fc-цепь с «выступом» AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCC AGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAG CGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTG AGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAG GCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGA GAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGC CCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCA GCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCG AGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCT GCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCAC ACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAG GGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGA TTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGG CGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACT GTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAG GGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGA TTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGC AGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGA TACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTAT GTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGG AGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCC ACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACT GTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGC GCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCG
- 102 037557
GACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAG CCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCT GGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTG CCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGAAGCGGAGGG GGAGGAAGTGCTAGCACCAAGGGCCCTAGCGTGTTCCCTC TGGCCCCTAGCAGCAAGAGCACAAGTGGAGGAACAGCCG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGT GACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTG CACACATTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACT CTCTGAGCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCTAGCTCTCTGGG CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGC AACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGC GACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGCCCTGCCCCTGAAG CTGCTGGTGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCC AAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACC TGCGTGGTGGTCGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGA AGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGC CAAGACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC CATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGT GGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAA GACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAG CAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTC TGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC GGGTAAA
67 мономерный hu 4-1BBL (71-254)-CL AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCT GCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCT CCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGG AGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGC ACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGA AATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT CTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAA CGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAG CAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCG TCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
68 анти-FAP, Fc-цепь c «впадиной» GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAG CCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCT
- 103 037557
TCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGC TCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCC TCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGT TCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCT GCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTA CTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGG GGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACCA AGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAG CACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCG GAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCT GCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACC GTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGA AGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCC CACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAG TCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGG GAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCAT CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTG ACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCT TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGC TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTC ATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
69 анти-FAP, легкая цепь GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCTCTGA GCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCCCA GTCCGTGTCCCGGTCCTACCTCGCCTGGTATCAGCAGAAG CCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCATCGGCGCCTCTA CCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGG CTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAA CCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCAGG TCATCCCTCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAAT CAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGT ACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACC TACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGAC TACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT
14 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1-Fc-цепь с «выступом» REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG
- 104 037557
LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLA LHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHL SAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAG LPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK
15 мономерный hu 4-1BBL (71-254) -CL1 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
18 анти-РАР(28Н1), Fcцепь с «впадиной» EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TS G VHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICN VNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK
19 анти-FAP (28Н1), легкая цепь EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPG QAPRLLHGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV YYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KD STYSLS STLTLSK AD YEKHKVY АСЕ VTHQGL S SP VTKSFN RGEC
В табл. 3 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 1.2) с CH1-CL-кроссовером и заряженными остатками.
- 105 037557
Таблица 3. Последовательности нацеленной на FAP содержащей тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 1.2)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
129 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СЕ*-Ес-цепь с «выступом» AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCT GCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCT CCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGG AGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGA ACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGA CAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGC TGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCT GGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGA AGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTA CTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCT GGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGC AGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCT GACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAA CAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGC GCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCC AGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACT GTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCG GACTGCCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGTTCCG GAGGGGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTT TATCTTCCCACCCAGCGACCGGAAGCTGAAGTCTGGCACA GCCAGCGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCCGCG AGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGA GCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTGACCGAGCAGGACAGCA AGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAG CAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGA AGTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGC TTCAACCGGGGCGAGTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTC CATGCCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTAGCGTGTT CCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGC CGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCC ACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACG GCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGG AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCA AGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA
- 106 037557
TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
130 мономерный hu 4-1BBL (71-254) -СН1* AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCT GCAGCTCTGGCTCTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCT CCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCCGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGACTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGAGCCAGGCACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCTGCCGGCCTGCCTAGCCCTAGATCTGAAGGCGG CGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGCTAGCACAAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCACA TCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGGAAGATT ACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGC CCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAG AGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGC CCAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGT GAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGT GGAACCCAAGTCCTGC
68 анти-FAP, Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 2
69 анти-FAP, легкая цепь См. таблицу 2
115 димерный hu 4-1BBL (71-254) - CL* -Fc-цепь с «выступом» REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLA LHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHL SAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAG LPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
116 мономерный hu 4-1BBL (71-254) -СН1* REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLA
PSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDE KVEPKSC
18 анти-РАР(28Н1), Fcцепь с «впадиной» См.таблицу 2
19 анти-FAP (28Н1), легкая цепь См.таблицу 2
В табл. 4 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.3) (FAP разделенный тример с СН1-CL-кроссовером в анти-FAP Fab и заряженными остатками в содержащих 41BBL цепях).
- 107 037557
Таблица 4. Последовательности нацеленной на FAP содержащей тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.3)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
131 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1*-Ес-цепь с «выступом» AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCT GCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCT CCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGG AGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGA ACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGA CAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGC TGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCT GGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGA AGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTA CTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCT GGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGC AGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCT GACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAA CAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGC GCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCC AGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACT GTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCG GACTGCCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGAAGCG GAGGGGGAGGAAGTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGT TCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCA
- 108 037557
CAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCGAGGACTACTTCCCCGA GCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCC GGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCC TGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAG CCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAGCCCAAG AGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCAC CTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACC AGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT CCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACAC CCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACA ACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAA
132 мономерный hu 4-1BBL (71-254) -CL* AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCT GCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCT CCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGG AGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGC ACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATCGGAAGTTGA AATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT CTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAA CGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAG CAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCG TCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
133 анти-FAP (VHCL) (28H1), Fc-цепь c «впадиной» GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAG CCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCT TCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGC TCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCC TCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGT TCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCT GCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTA CTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGG
- 109 037557
GGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCGTGG CCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAGCGACGAGCA GCTGAAGTCCGGCACAGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAAC AACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG GACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAATCCGTG ACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCAC AAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCA GCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGACA AGACCCACACCTGTCCCCCTTGCCCTGCCCCTGAAGCTGC TGGTGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAG GACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCG TGGTGGTCGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTT CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAA GACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCC CTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTG CGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGT GAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA АА
134 анти-FAP (VLCH1) (28H1), легкая цепь GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGGCACCCTGAGCCTGA GCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCC AGAGCGTGAGCCGGAGCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGA AGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCATCGGCGCCAG CACCCGGGCCACCGGCATCCCCGATAGATTCAGCGGCAGC GGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGGCTGG AACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCA GGTGATCCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAA ATCAAGAGCAGCGCTTCCACCAAAGGCCCTTCCGTGTTTC CTCTGGCTCCTAGCTCCAAGTCCACCTCTGGAGGCACCGC TGCTCTCGGATGCCTCGTGAAGGATTATTTTCCTGAGCCT GTGACAGTGTCCTGGAATAGCGGAGCACTGACCTCTGGAG TGCATACTTTCCCCGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGACTGTAC AGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCT TGT
108 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1*-Рс-цепь с «выступом» REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLA LHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHL SAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAG LPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS
- 110 037557
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK
109 мономерный hu 4-1BBL (71-254) -CL* REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFP PSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
135 анти-FAP (VHCL) (28Н1), Fc-цепь с «впадиной» EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVS LSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К
136 анти-FAP (VLCH1) (28Н1), легкая цепь EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPG QAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV YYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLS S VVT VP S S SLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKS С
В табл. 5 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.4) (FAP разделенный тример с анти-FAP Fab, мономерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с CH1-цепью с выступом, и с заряженными остатками в содержащих 4-1BBL цепях).
Таблица 5. Последовательности нацеленной на FAP содержащей тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.4)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
137 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1*-Рс-цепь с «выступом» AGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTG CTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCC AGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAG CGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTG
- 111 037557
AGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAG GCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGA GAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGC CCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCA GCTCTGGCTCTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCG AGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCCGGCTGCT GCACCTGTCTGCCGGCCAGAGACTGGGAGTGCATCTGCAC ACAGAGGCCAGAGCCAGGCACGCCTGGCAGCTGACACAG GGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGA TTCCTGCCGGCCTGCCTAGCCCTAGATCTGAAGGCGGCGG AGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGCTAGCACCAAGGGCCC CTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCGAGGACTACT TCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCT GACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGT TCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTT CTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAA CCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGA GCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTG CCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGA CCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAG TACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCA AGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG TGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAA CCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCG ACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA GAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTG ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
138 димерный hu 4-1BBL (71-254) -CL* AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCT GCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCT CCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGG AGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGA ACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGA CAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGC TGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCT GGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGA
- 112 037557
AGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTA CTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCT GGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGC AGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCT GACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAA CAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGC GCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCC AGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACT GTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCG GACTGCCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGTTCCG GAGGGGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTT CATCTTCCCGCCATCTGATCGGAAGTTGAAATCTGGAACT GCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGA GCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCG AAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT
68 анти-FAP (28Н1), Fcцепь с «впадиной» см.таблицу 2
69 анти-FAP (28Н1), легкая цепь См. таблицу 2
139 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СЬ*-Рс-цепь с «выступом» REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLA LHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHL SAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAG LPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK
140 димерный hu 4-1BBL (71-254) -CL* REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLA LHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHL SAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAG LPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
18 анти-FAP (28Н1), Fcцепь с «впадиной» см.таблицу 2
19 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см. таблицу 2
В табл. 6 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.5) (FAP разделенный тример с 2 анти-FAP Fab, димерный и мономерный лиганд для 4-1ВВ, слитый на С-конце каждой тяжелой цепи соответственно).
- 113 037557
Таблица 6. Последовательности нацеленной на FAP содержащей тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.5)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
141 анти-FAP (28Н1) - Fcцепь с «впадиной», слитая с димерным hu 41BBL (71-254) GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAG CCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCT TCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGC TCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCC TCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGT TCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCT GCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTA CTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGG GGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACCA AGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAG CACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCG GAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCT GCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACC GTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGA AGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCC CACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAG TCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGG GAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCAT CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTG ACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCT TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGC TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTC ATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGA AGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGC CCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCA
- 114 037557
TGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGA TGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGC GTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACC AAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTG TTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAG GATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTG AGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGG ATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATT TGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAG AGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGA CACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGC CTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTT CTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAG GATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGC CGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTG GTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCT GGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGG GGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGT GGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAA CTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTG TCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTG GCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGC CTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGG ACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTG CATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGC TGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGAC ACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAA
142 анти-FAP (28H1) - Fcцепь с «выступом» слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-254) GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAG CCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCT TCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGC TCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCC TCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGT TCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCT GCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTA CTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGG GGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACCA AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAG CACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAG GCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGA AAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCC ACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGT CTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCT CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGA
- 115 037557
CCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTT CTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGG CCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTG GACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCG TGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCT GCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCC AGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAA GCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCC CCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCAT GTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGAT GGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCG TGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCA AAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTT CTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGG ATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGA GAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGA TCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTT GGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGA GGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGAC ACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCT GTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCT CCAAGAAGCGAA
69 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см.таблицу 2
121 анти-FAP (28Н1) - Fcцепь с «впадиной», слитая с димерным hu 41BBL (71-254) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TS G VHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICN VNHK Р SNTK VDKK VEPK S CDKTHTCPPCP APE A AGGP S VFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGP LSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQ LELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPP ASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQ LTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPE LSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLA GVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFG FQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLF RVTPEIPAGLPSPRSE
122 анти-FAP (28Н1) Fc-цепь с «выступом», слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-254) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TS G VHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICNVNHK Р SNTK VDKK VEPKS CDKTHTCPP СР APE A AGGP S VFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGP LSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQ LELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPP ASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQ LTQG ATVLGLFRVTPEIP AGLP SPRSE
19 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см.таблицу 2
В табл. 7 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.6) (FAP разделенный тример с анти-FAP Fab, мономерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с CL* через (G4S)-линкер).
- 116 037557
Таблица 7. Последовательности нацеленной на FAP содержащей тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.6)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
131 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1*-Рс-цепь с «выступом» см.таблицу 4
143 мономерный hu 4-1BBL (71-254) -(G4S)i-CL* AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCT GCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCT CCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGG AGGCGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATCGGAAGTTGAAATCTGGAACTGCCT CTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGC CAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGG TAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGA CAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGT CACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTC AACAGGGGAGAGTGT
68 анти-FAP (28Н1), Fcцепь с «впадиной» см.таблицу 2
69 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см.таблицу 2
108 димерный hu 4-1BBL см.таблицу 4
(71-254) - СН1*-Рс-цепь с «выступом»
ПО мономерный hu 4-1BBL (71-254) -(G4S)i- CL* REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRK LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
18 анти-FAP (28Н1), Fcцепь с «впадиной» см.таблицу 2
19 анти-FAP (28Н1) легкая цепь см.таблицу 2
В табл. 8 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.7) (FAP разделенный тример с двойным анти-FAP Fab на N-конце Fc-цепи с впадиной и заряженными остатками в скрещенных СН1 и CL, слитых с лигандами для 4-1ВВ).
- 117 037557
Таблица 8. Последовательности нацеленной на FAP содержащей тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.7)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
129 димерный hu 4-1BBL (71-254) - CL*-Fc-nenb с «выступом» см.таблицу 3
130 мономерный hu 4-1BBL (71-254) -СН1* см.таблицу 3
144 [анти-FAP (28H1)]2-Fcцепь с «впадиной» GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAG CCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCT TCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGC TCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCC TCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGT TCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCT GCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTA CTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGG GGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAGCACA AAGGGACCTAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGT CTACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAA GGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCT GGCGCTCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGC TGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGAC AGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGC AACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAG AAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACGGCGGAGGGGGATCT GGCGGCGGAGGATCCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGC
- 118 037557
GGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCT GCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCC TGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGT CCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTC TGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAG AACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGG ACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAA CTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCC AGCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCC CCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGT GTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACC TTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGA GCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCA GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGT GGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCC CTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTG CGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGT GAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA АА
69 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см. таблицу 2
115 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СЬ*-Рс-цепь с «выступом» см. таблицу 3
116 мономерный hu 4-1BBL (71-254) -СН1* см. таблицу 3
145 [анти-FAP (28Н1)]2 - Fcцепь с «впадиной» EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TS G VHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICN VNHK PSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPG GSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGE QYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA KGWLGNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKVDKKVEPKS CD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR
EPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
19 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см. таблицу 2
В табл. 9 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 1.8) (FAP разделенный тример, лиганды для 4-1ВВ, слитые с анти-FAP CrossFab, с заряженными остатками, на цепи с выступом).
- 119 037557
Таблица 9. Последовательности нацеленной на FAP молекулы, содержащей тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) (конструкция 1.8)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
146 димерный hu 4-1BBL (71-254) - FAP (VHCL*)Fc-цепь с «выступом» AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCT GCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCT CCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGG AGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGA ACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGA CAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGC TGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCT GGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGA AGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTA CTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCT GGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGC AGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCT GACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAA CAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGC GCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCC AGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACT GTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCG GACTGCCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGTTCCG GAGGCGGAGGATCTGAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCG GAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTG
- 120 037557
CGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCT GGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGT CCGCCATCTGGGCCTCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTC TGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAG AACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGG ACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAA CTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCC AGCGCTAGCGTGGCTGCACCATCTGTCTTTATCTTCCCACC CAGCGACCGGAAGCTGAAGTCTGGCACAGCCAGCGTCGT GTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTG CAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGC CAGGAAAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACC TACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACT ACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACC AGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGG CGAGTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGCCCTGCC CCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCC CAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCTG AAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCC TGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGT GCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAA CAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC CAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCT CCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACA CCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAA
147 мономерный hu 4-1BBL (71-254) -FAP (VLCH1*) AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCT GCAGCTCTGGCTCTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCT CCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCCGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGACTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGAGCCAGGCACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCTGCCGGCCTGCCTAGCCCTAGATCTGAAGGCGG CGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGAGATCGTGCTGAC CCAGTCTCCCGGCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGAGA GCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCCGG AGCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCC CCAGACTGCTGATCATCGGCGCCAGCACCCGGGCCACCGG CATCCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGAC TTCACCCTGACCATCAGCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCG
- 121 037557
CCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCAGGTGATCCCCCCCAC CTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGTCCTCTGCT AGCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCA GCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCC TGGTGGAAGATTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTG GAATTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCA GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCG TCGTGACAGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGT GGACGAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGC
68 анти-FAP (28Н1), Fcцепь с «впадиной» см.таблицу 2
69 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см.таблицу 2
148 димерный hu 4-1BBL (71-254) - FAP (VHCL*)Fc-цепь с «выступом» REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLA LHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHL SAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAG LPSPRSEGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDY WGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNN F YPRE АК VQ WK VDN ALQ S GNSQE S VTEQD SKD S TY SL S STL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK
149 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - FAP (VLCH1*) REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLS LSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGAST RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPP TFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVE DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP S S SLGTQTYICNVNHKP SNTKVDEKVEPKSC
18 анти-FAP (28Н1), Fcцепь с «впадиной» см.таблицу 2
19 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см.таблицу 2
В табл. 10 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP молекулы, содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (52-254) в слиянии с Fc (kih) (конструкция 1.9) (FAP разделенный тример с аминокислотами 52-254 эктодомена 4-1BBL и заряженными остатками в содержащих лиганд цепях).
- 122 037557
Таблица 10. Последовательности нацеленной на FAP молекулы, содержащей тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) (конструкция 1.9)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
150 димерный hu 4-1BBL (52-254) - СН1*-Ес-цепь с «выступом» CCTTGGGCTGTGTCTGGCGCTAGAGCCTCTCCTGGATCTG CCGCCAGCCCCAGACTGAGAGAGGGACCTGAGCTGAGCC CCGATGATCCTGCCGGACTGCTGGATCTGAGACAGGGCAT GTTCGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGAT GGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCG TGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCA AAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTT CTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAGGG ATCTGGATCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCCCTG AGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGG ATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATT TGGGTTTCAAGGCAGACTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAG AGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGA CACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGC CTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGACTGCCCA GCCCTAGATCTGAAGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAG GATCCCCTTGGGCTGTGTCTGGCGCTAGAGCCTCTCCTGG ATCTGCCGCCAGCCCCAGACTGAGAGAGGGACCTGAGCT GAGCCCCGATGATCCTGCCGGACTGCTGGACCTGCGGCAG GGAATGTTCGCTCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGA TTGACGGACCTCTGTCCTGGTACTCCGACCCTGGCCTGGC AGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGA TACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTAT GTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGG AGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCC TCTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACT GTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGC GCCTTCGGGTTCCAAGGACGGCTGCTGCATCTGAGCGCCG GACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAG CCCGGCATGCTTGGCAGCTGACCCAGGGGGCAACTGTGCT GGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCCGCTGGCCTG CCTAGCCCAAGAAGTGAAGGGGGAGGCGGATCTGGCGGA GGGGGATCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCC TGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG CTCTGGGCTGCCTGGTCGAGGACTACTTCCCCGAGCCCGT GACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTG CACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATA GCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGC GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA
- 123 037557
GCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGT CAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGC CAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCT GTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCT TCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGC AGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT CCGGGTAAA
151 мономерный hu 4-1BBL (52-254) -CL* CCTTGGGCTGTGTCTGGCGCTAGAGCCTCTCCTGGATCTG CCGCCAGCCCCAGACTGAGAGAGGGACCTGAGCTGAGCC CCGATGATCCTGCCGGACTGCTGGATCTGAGACAGGGCAT GTTCGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGAT GGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCG TGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCA AAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTT CTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAGGG ATCTGGATCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCCCTG AGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGG ATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATT TGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAG AGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGA CACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGC CTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTT CTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAG GATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATCGGAAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGT ACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACC TACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGAC TACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT
68 анти-FAP (28H1), Fcцепь с «впадиной» см.таблицу 2
69 анти-FAP (28H1), легкая цепь см.таблицу 2
111 димерный hu 4-1BBL (52-254) - СН1*-Рс-цепь с «выступом» PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMF AQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKEL VVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAA GAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVH LHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGG GSGGGGSPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLL DLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSY KEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHL
- 124 037557
QPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSA GQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLP SPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK
112 мономерный hu 4-1BBL (52-254) -CL* PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMF AQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKEL VVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAA GAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVH LHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGG GSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
18 анти-FAP (28Н1), Fcцепь с «впадиной» см.таблицу 2
19 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см.таблицу 2
В табл. 11 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP молекулы, содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (80-254) в слиянии с Fc (kih) (конструкция 1.10) (FAP разделенный тример с аминокислотами 80-254 эктодомена 4-1BBL и заряженными остатками в содержащих лиганд цепях).
Таблица 11. Последовательности нацеленной на FAP молекулы, содержащей тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) (конструкция 1.10)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
152 димерный hu 4-1BBL (80-254) - СН1*-Рс-цепь с «выступом» GATCCTGCCGGCCTGCTGGATCTGCGGCAGGGAATGTTTG CCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCC CCTGAGCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCA CTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAA CTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTC AGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTG GCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCCCTGAGAAG CGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTG CCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGT TTCAAGGCAGACTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCT GGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGC CTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTC
- 125 037557
AGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGACTGCCCAGCCCTA GATCTGAAGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCCG ACCCAGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGAATGTTCGC TCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCT CTGTCCTGGTACTCCGACCCTGGCCTGGCAGGGGTGTCCC TGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAAC TGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCA GCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGG ATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCTCTGCGCTCTG CTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCC ACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTC CAAGGACGGCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTG GGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTT GGCAGCTGACCCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCG CGTGACACCTGAGATCCCCGCTGGCCTGCCTAGCCCAAGA AGTGAAGGGGGAGGCGGATCTGGCGGAGGGGGATCTGCT AGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCA GCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCC TGGTCGAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTG GAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCC GCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCG TGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGT GGACGAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCA CACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGG ACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGG TGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACT GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAA AGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGG TCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGG CAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGG CGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGG GATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTG GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
153 мономерный hu 4-1BBL (80-254) - CL* GATCCTGCCGGCCTGCTGGATCTGCGGCAGGGAATGTTTG CCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCC CCTGAGCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCA CTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAA CTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTC AGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTG GCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCCCTGAGAAG CGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTG CCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGT TTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCT GGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGC CTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTC AGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAA
- 126 037557
GAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTC GTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCT GATCGGAAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCC TGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTG GAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGA GAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAG CCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGG CCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGA GTGT
68 анти-FAP (28Н1), Fcцепь с «впадиной» см.таблицу 2
69 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см. таблицу 2
113 димерный hu 4-1BBL (80-254) - СН1*-Рс-цепь с «выступом» DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQG RLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVT PEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSDPAGLLDLRQGMFAQLVA QNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKA GVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAAL ALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEA RARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGG GGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQV SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
114 мономерный hu 4-1BBL (80-254) -CL* DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQG RLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVT PEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKD STYSLS STLTLSKAD YEKHKVY АСЕ VTHQGL S SP VTKSF NRGEC
18 анти-FAP (28Н1), Fcцепь с «впадиной» см.таблицу 2
19 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см. таблицу 2
1.2. Получение нацеленных на FAP (28H1) конструкций, содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc.
Кодирующие последовательности нацеленных содержащих тримерный лиганд TNF в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул клонировали в плазмидном векторе, в котором экспрессия вставки контролируется промотором MPSV и который содержит синтетическую полиА-последовательность, локализованную на 3'-конце CDS. Кроме того, вектор содержал последовательность OriP EBV для поддержки эписомальной формы плазмиды.
Нацеленную содержащую тримерный лиганд TNF в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающую молекулу получали путем котрансфекции клеток HEK293-EBNA экспрессионными векторами для клеток млекопитающих с использованием полиэтиленимина (ПЭИ). Клетки трансфектировали соответствующими экспрессионными векторами в соотношении 1:1:1:1 (например, вектор для конструкции димерный лиганд-(СН1 или CL)-цепь с выступом:вектор для слияния мономерный лиганд-(CL или СН1):вектор для тяжелой цепи с впадиной анти-FAP Fab:вектор для легкой цепи анти-FAP) для получения конструкций 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10. Для двухвалентной конструкции 5 применяли соотношение 1:1:1 (вектор для тяжелой цепи с впадиной:вектор для тяжелой цепи с выступом:вектор для легкой цепи анти-FAP).
Для производства в 500-миллилитровые встряхиваемые колбы засевали 300 млн клеток HEK293 EBNA за 24 ч до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 10 мин при 210xg и супернатант заменяли 20 мл предварительно нагретой среды CD CHO. Экспрессионные векторы (200 мкг общей ДНК) смешивали в 20 мл среды CD CHO. После добавления 540 мкл ПЭИ раствор интенсивно перемешивали в течение 15 с и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/ПЭИ, переносили в 500-миллилитровую встряхиваемую колбу и инку
- 127 037557 бировали в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО2. После инкубации добавляли 160 мл среды Excell, дополненной 6 мМ L-глутамином, 5 г/л соевого пептида (PEPSOY) и 1,2 мМ вальпроевой кислоты, и клетки культивировали в течение 24 ч. Через 1 день после трансфекции добавляли 12% Feed 7 и глюкозу (конечная концентрация 3 г/л). После культивирования в течение 7 дней супернатант собирали центрифугированием в течение 30-40 мин при 400xg. Раствор стерилизовали фильтрацией (0,22 мкмфильтр), дополняли азидом натрия до конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и выдерживали при 4°С.
Нацеленную содержащую тримерный лиганд TNF в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающую молекулу очищали из супернатантов клеточных культур с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А с последующей гель-фильтрацией. Для осуществления аффинной хроматографии супернатант вносили в колонку MabSelect Sure (CV = 5-15 мл, смола фирмы GE Healthcare), уравновешенную буфером, содержащим 20мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия (рН 7,5). Несвязанный белок удаляли путем промывки таким же буфером, используя его в объеме, кратном по меньшей 6 объемам колонки. Связанный белок элюировали, используя линейный градиент (20 CV) или ступенчатую элюцию (8 CV), буфером, содержащим 20 мМ цитрат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин (рН 3,0). При осуществлении элюции с использованием линейного градиента осуществляли дополнительную ступенчатую элюцию с применением объема, кратного 4 объемам колонки.
Значение рН собранных фракций регулировали, добавляя 1/10 (об./об.) 0,5М фосфата натрия, рН 8,0. Белок концентрировали перед внесением в колонку HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную раствором, содержащим 20 мМ гистидин, 140 мМ хлорид натрия, 0,01 об.% Твин 20, рН 6,0.
Концентрацию белка определяли путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу нацеленной содержащей тримерный лиганд TNF в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы анализировали с помощью ДСН-ПААГ в присутствии восстановителя (5 мМ 1,4-дитиотреитол) и без него и осуществляли окрашивание кумасси SimpleBlue™ SafeStain, (фирма Invitrogen, США) или с помощью КЭ-ДСН, используя устройство Caliper LabChip GXII (фирма Perkin Elmer). Содержание агрегатов в образцах анализировали, используя колонку для аналитической гельфильтрации TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh), уравновешенную подвижным буфером, содержащим 25 мМ K2HPO4, 125 мМ NaCl, 200 мМ моногидрохлорид L-аргинина, 0,02% (мас./об.) NaN3, рН 6,7 при 25°С.
В табл. 12 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономеров нацеленных на FAP содержащих тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул.
Таблица 12. Данные биохимического анализа нацеленных на FAP содержащих тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул
Конструкция Выход [мг/л] Мономер [%] (SEC)
конструкция 1.1 12,7 95
конструкция 1.2 25,2 97
конструкция 1.3 22 92
конструкция 1.4 14,2 99
конструкция 1.5 14 99
конструкция 1.6 12 98
конструкция 1.7 3,4 99
конструкция 1.8 5,4 98
конструкция 1.9 П,2 98
конструкция 1.10 19,8 99
1.3. Получение нацеленных содержащих тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
Аналогично нацеленным содержащим тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающим молекулам получали нацеленные на мышиный FAP содержащие тримерный 41BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы.
Последовательность ДНК, кодирующую часть эктодомена (аминокислоты 104-309) мышиного лиганда для 4-1ВВ, синтезировали на основе последовательности Q3U1Z9-1 из базы данных Uniprot (SEQ ID NO: 70). Для создания конструкции М.1 цистеины в положениях 137, 160 и 246 заменяли в результате мутации на серин с помощью стандартной ПЦР, в то время как для создания конструкции М.2 цистеин в положении 160 и 246 заменяли в результате мутации на серии (C160S).
Сборку мышиного лиганда осуществляли аналогично методу, описанному для человеческого 41BBL и представленному на фиг. 3А и 3Б. Димерный 4-1BBL, разделенный (G4S)2-линкерами, сливали с CL-доменом мышиного IgG1 (фиг. 3А) и мономерный 4-1BBL сливали с СН-доменом мышиного IgG1 (фиг. 3Б). Полинуклеотид, который содержал димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с мышиным CLдоменом, субклонировали в рамке считывания с СН2- и СН3-доменами тяжелой цепи мышиного IgG1,
- 128 037557 создавая конструкции, представленные на фиг. 3В.
Для мышиных конструкций интродуцировали мутации Lys392Asp и Lys409Asp (DD) в тяжелую цепь, содержащую мышиный 4-1BBL, и мутации Glu356Lys и Asp399Lys (KK) интродуцировали в тяжелую цепь, содержащую анти-FAP Fab, с получением асимметричных молекул (Gunasekaran K. и др., J.
Biol. Chem., 285(25), 18 июня 2010 г., cc. 19637-19646).
Мутации Asp265Ala и Pro329Gly (DAPG) интродуцировали в константную область тяжелых цепей для элиминации связывания с Fc-гамма-рецепторами.
В табл. 13 представлены соответственно кДНК и аминокислотные последовательности нацеленной на FAP содержащей тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающей молекулы (конструкция M.1).
Таблица 13. Последовательности нацеленной на FAP мышиной конструкции М.1
SEQ ID NO: Описание Последовательность
71 димерный мышиный 41BBL (104-309, C137,160,246S) - CL-Fcцепь с мутацией DD AGAACCGAGCCCAGACCCGCCCTGACCATCACCACCAGC CCTAACCTGGGCACCAGAGAGAACAACGCCGACCAAGTG ACCCCCGTGTCCCACATCGGCAGCCCCAATACCACACAGC AGGGCAGCCCTGTGTTCGCCAAGCTGCTGGCCAAGAACCA GGCCAGCCTGAGCAACACCACCCTGAACTGGCACAGCCA GGATGGCGCCGGAAGCAGCTATCTGAGCCAGGGCCTGAG ATACGAAGAGGACAAGAAAGAACTGGTGGTGGACAGCCC TGGCCTGTACTACGTGTTCCTGGAACTGAAGCTGAGCCCC ACCTTCACCAACACCGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTGT CACTGGTGCTGCAGGCCAAACCCCAGGTGGACGACTTCGA CAACCTGGCCCTGACCGTGGAACTGTTCCCCAGCAGCATG GAAAACAAGCTGGTGGATCGGAGCTGGTCCCAGCTTCTGC TGCTGAAGGCCGGACACAGACTGAGCGTGGGCCTGAGGG CTTATCTGCACGGCGCCCAGGACGCCTACAGAGACTGGGA GCTGAGCTACCCCAACACAACCAGCTTCGGCCTGTTCCTC GTGAAGCCCGACAACCCTTGGGAAGGCGGCGGAGGATCT GGCGGAGGCGGATCTAGAACAGAGCCTCGGCCTGCCCTG ACAATTACCACATCCCCCAATCTGGGCACCCGGGAAAACA ATGCAGATCAAGTGACACCTGTGTCTCATATTGGCTCCCC AAACACTACCCAGCAGGGCTCCCCCGTGTTTGCTAAACTG CTGGCTAAAAATCAGGCCTCCCTGTCTAACACAACACTGA ACTGGCACTCCCAGGACGGCGCTGGCAGCTCTTACCTGAG TCAGGGACTGCGCTATGAGGAAGATAAGAAAGAACTGGT GGTGGATTCCCCCGGACTGTACTATGTGTTTCTGGAACTG AAACTGTCCCCTACCTTTACAAATACCGGGCACAAAGTGC AGGGATGGGTGTCCCTGGTGCTGCAGGCTAAGCCTCAGGT GGACGATTTTGATAATCTGGCTCTGACAGTGGAACTGTTT
- 129 037557
CCTAGCAGCATGGAAAACAAGCTGGTGGACAGAAGCTGG TCCCAGCTCCTGCTGCTGAAGGCCGGACACAGACTGAGCG TGGGCCTGAGAGCCTATCTGCACGGCGCCCAGGACGCCTA CAGAGACTGGGAGCTGAGCTACCCCAACACAACCAGCTT CGGCCTGTTCCTCGTGAAGCCCGACAACCCTTGGGAAGGC GGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGATCCAGAGCTGATGCT GCCCCTACCGTGTCCATCTTCCCACCCAGCAGCGAGCAGC TGACATCTGGGGGAGCTAGCGTCGTGTGCTTCCTGAACAA CTTCTACCCCAAGGACATCAACGTGAAGTGGAAGATCGAC GGCAGCGAGCGGCAGAACGGCGTGCTGAATAGCTGGACC GACCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCATGAGCAGC ACCCTGACCCTGACCAAGGACGAGTACGAGCGGCACAAC AGCTACACATGCGAGGCCACCCACAAGACCAGCACCAGC CCCATCGTGAAGTCCTTCAACCGGAACGAGTGCGTGCCCA GAGACTGCGGCTGCAAGCCTTGCATCTGCACCGTGCCTGA GGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAAGGAC GTGCTGACCATCACCCTGACACCCAAAGTGACCTGCGTGG TGGTGGCCATCAGCAAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCA GTTGGTTCGTGGACGACGTGGAAGTGCACACCGCTCAGAC CAAGCCCAGAGAGGAACAGATCAACAGCACCTTCAGAAG CGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACTGGCTGAAC GGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACAGCGCCGCCTTT GGCGCCCCTATCGAGAAAACCATCTCCAAGACCAAGGGC AGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACAATCCCCCCACCCA AAGAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCTGACCTGCA TGATCACCAATTTCTTCCCAGAGGATATCACCGTGGAATG GCAGTGGAACGGCCAGCCCGCCGAGAACTACGACAACAC CCAGCCTATCATGGACACCGACGGCTCCTACTTCGTGTAC AGCGACCTGAACGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGC AACACCTTCACCTGTAGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACA ACCACCACACCGAGAAGTCCCTGTCCCACAGCCCTGGCAA G
72 мономерный мышиный 41BBL (104-309, C137,160,246S) - CL AGAACCGAGCCCAGACCCGCCCTGACCATCACCACCAGC CCTAACCTGGGCACCAGAGAGAACAACGCCGACCAAGTG ACCCCCGTGTCCCACATCGGCAGCCCCAATACCACACAGC AGGGCAGCCCTGTGTTCGCCAAGCTGCTGGCCAAGAACCA GGCCAGCCTGAGCAACACCACCCTGAACTGGCACAGCCA GGATGGCGCCGGAAGCAGCTATCTGAGCCAGGGCCTGAG ATACGAAGAGGACAAGAAAGAACTGGTGGTGGACAGCCC TGGCCTGTACTACGTGTTCCTGGAACTGAAGCTGAGCCCC ACCTTCACCAACACCGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTGT CACTGGTGCTGCAGGCCAAACCCCAGGTGGACGACTTCGA CAACCTGGCCCTGACCGTGGAACTGTTCCCCAGCAGCATG GAAAACAAGCTGGTGGATCGGAGCTGGTCCCAGCTTCTGC TGCTGAAGGCCGGACACAGACTGAGCGTGGGCCTGAGGG CCTATCTGCATGGCGCCCAGGACGCCTACAGAGACTGGGA GCTGAGCTACCCCAACACAACCAGCTTCGGCCTGTTCCTC GTGAAGCCCGACAACCCTTGGGAAGGCGGCGGAGGCTCC GGAGGAGGCGGAAGCGCTAAGACCACCCCCCCCAGCGTG TACCCTCTGGCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCA TGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGA GCCTGTGACCGTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAG CGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTG TACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACCT GGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCCTGC
- 130 037557
CAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCCGGGA CTGC
73 анти-FAP (28H1), Fc-цепь с мутацией КК в тяжелой цепи GAAGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAG CCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCT TCACCTTCTCCTCCCACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGC TCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCTGGGCC TCCGGCGAGCAGTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGT TCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCT GCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTA CTACTGTGCCAAGGGCTGGCTGGGCAACTTCGACTACTGG GGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCAGCGCTAAGACC ACCCCCCCTAGCGTGTACCCTCTGGCCCCTGGATCTGCCG CCCAGACCAACAGCATGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAA GGGCTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGACCTGGAACAGC GGCAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGC TGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGT GCCTAGCAGCACCTGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAA CGTGGCCCACCCTGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAA AATCGTGCCCCGGGACTGCGGCTGCAAGCCCTGCATCTGC ACCGTGCCCGAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCA AGCCCAAGGACGTGCTGACCATCACCCTGACCCCCAAAGT GACCTGCGTGGTGGTGGCCATCAGCAAGGACGACCCCGA GGTGCAGTTCTCTTGGTTTGTGGACGACGTGGAGGTGCAC ACAGCCCAGACAAAGCCCCGGGAGGAACAGATCAACAGC ACCTTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGG ACTGGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACA GCGCCGCCTTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAA GACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACCAT CCCCCCACCCAAAAAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTC CCTGACCTGCATGATCACCAACTTTTTCCCCGAGGACATC ACCGTGGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCCGCCGAGAAC TACAAGAACACCCAGCCCATCATGAAGACCGACGGCAGC TACTTCGTGTACAGCAAGCTGAACGTGCAGAAGTCCAACT GGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGTAGCGTGCTGCACGA GGGCCTGCACAACCACCACACCGAGAAGTCCCTGAGCCA CTCCCCCGGCAAG
74 анти-FAP (28Н1), легкая цепь GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCTCTGA GCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCCCA GTCCGTGTCCCGGTCCTACCTCGCCTGGTATCAGCAGAAG CCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCATCGGCGCCTCTA CCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGG CTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAA CCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCCAGG TCATCCCTCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAAT CAAGCGTGCCGATGCTGCACCAACTGTATCGATTTTCCCA CCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCG TGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGT CAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGT CCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCAC CTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGA GTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCAC AAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGA ATGAGTGT
75 димерный мышиный 41BBL (104-309, RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGSPNTTQQGSP VFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEED
- 131 037557
C137,160,246S) - CL-Fcцепь с мутацией DD KKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQA KPQVDDFDNLALTVELFPSSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHR LSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPW EGGGGSGGGGSRTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSH IGSPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSS YLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHK VQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPSSMENKLVDRS WSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTS FGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSRADAAPTVSIFPPSSEQLT SGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQ DSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKS FNRNECVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPK VTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTF RSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGR PKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQW NGQPAENYDNTQP1MDTDGSYFVYSDLNVQKSNWEAGNTF TCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
76 мономерный мышиный 41BBL (104-309, C137,160,246S) -CL RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGSPNTTQQGSP VFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEED KKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQA KPQVDDFDNLALTVELFPSSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHR LSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPW EGGGGSGGGGSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK GYFPEP VT VT WNS GSL S S G VHTFP A VLQ SDL YTL S S S VT VP S STWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
77 анти-FAP (28Н1), Fc-цепь с мутацией КК EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAP GKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSSAKTT PPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGS L S S G VHTFP A VLQ SDL YTL S S S VT VP S ST WP SQT VTCN V АНР ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTIT LTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQ INSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISK TKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVE WQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEA GNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
78 анти-FAP (28Н1), легкая цепь EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPG QAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV YYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSG GASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDS KDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFN RNEC
В табл. 14 представлены соответственно кДНК и аминокислотные последовательности ненацеленной (DP47) содержащей тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающей молекулы (контроль М.1).
- 132 037557
Таблица 14. Последовательности ненацеленной мышиной конструкции контроль М.1
SEQ ID NO: Описание Последовательность
71 димерный мышиный 41BBL (104-309, C137,160,246S) - CL-Fcцепь с мутацией DD См. таблицу 13
72 мономерный мышиный 41BBL (104-309, C137,160,246S) - СН1 См. таблицу 13
154 DP47, Fc-цепь с мутацией КК GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGC CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATT CACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGT AGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCG TATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGG CCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAAGACCACC CCCCCTAGCGTGTACCCTCTGGCCCCTGGATCTGCCGCCC AGACCAACAGCATGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG GCTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGACCTGGAACAGCGG CAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTG CAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGC CTAGCAGCACCTGGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGT GGCCCACCCTGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAAT CGTGCCCCGGGACTGCGGCTGCAAGCCCTGCATCTGCACC GTGCCCGAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGC CCAAGGACGTGCTGACCATCACCCTGACCCCCAAAGTGAC CTGCGTGGTGGTGGCCATCAGCAAGGACGACCCCGAGGT GCAGTTCTCTTGGTTTGTGGACGACGTGGAGGTGCACACA GCCCAGACAAAGCCCCGGGAGGAACAGATCAACAGCACC TTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACT GGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACAGCG CCGCCTTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGAC CAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACCATCCC CCCACCCAAAAAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCT GACCTGCATGATCACCAACTTTTTCCCCGAGGACATCACC GTGGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCCGCCGAGAACTAC AAGAACACCCAGCCCATCATGAAGACCGACGGCAGCTAC TTCGTGTACAGCAAGCTGAACGTGCAGAAGTCCAACTGGG AGGCCGGCAACACCTTCACCTGTAGCGTGCTGCACGAGGG CCTGCACAACCACCACACCGAGAAGTCCCTGAGCCACTCC CCCGGCAAG
155 DP47, легкая цепь GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGT CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCA GAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAA CCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCA GCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTG GATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGA GCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGT AGCTCACCGCTGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAA ATCAAACGTGCCGATGCTGCACCAACTGTATCGATTTTCC
- 133 037557
CACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGT CGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAAT GTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGC GTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGC ACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGAC GAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTC ACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAG GAATGAGTGT
75 димерный мышиный 41BBL (104-309, C137,160,246S) - CL-Fcцепь с мутацией DD см.таблицу 13
76 мономерный мышиный 41BBL (104-309, C137,160,246S) - СН1 См. таблицу 13
156 DP47, Fc-цепь с мутацией КК EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP GKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPS VYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSS GVHTFP AVLQSDLYTLS S S VT VP S ST WPSQT VTCNVAHP AS S TKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTP KVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINS TFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTK GRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQ WNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNT FTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
157 DP47, легкая цепь EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPG QAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV YYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSG GASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDS KDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFN RNEC
В табл. 15 представлены кДНК и аминокислотные последовательности нацеленной на FAP содержащей тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающей молекулы (конструкция М2).
Таблица 15. Последовательности нацеленной на FAP мышиной конструкции М.2
SEQ ID NO: Описание Последовательность
158 димерный мышиный 41BBL (104-309, C160S) CL-Fc-цепь с мутацией DD AGAACCGAGCCCAGACCCGCCCTGACCATCACCACCAGC CCTAACCTGGGCACCAGAGAGAACAACGCCGACCAAGTG ACCCCCGTGTCCCACATCGGCTGCCCCAATACCACACAGC AGGGCAGCCCTGTGTTCGCCAAGCTGCTGGCCAAGAACCA GGCCAGCCTGAGCAACACCACCCTGAACTGGCACAGCCA GGATGGCGCCGGAAGCAGCTATCTGAGCCAGGGCCTGAG ATACGAAGAGGACAAGAAAGAACTGGTGGTGGACAGCCC
- 134 037557
TGGCCTGTACTACGTGTTCCTGGAACTGAAGCTGAGCCCC ACCTTCACCAACACCGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTGT CACTGGTGCTGCAGGCCAAACCCCAGGTGGACGACTTCGA CAACCTGGCCCTGACCGTGGAACTGTTCCCCTGCAGCATG GAAAACAAGCTGGTGGATCGGAGCTGGTCCCAGCTTCTGC TGCTGAAGGCCGGACACAGACTGAGCGTGGGCCTGAGGG CTTATCTGCACGGCGCCCAGGACGCCTACAGAGACTGGGA GCTGAGCTACCCCAACACAACCAGCTTCGGCCTGTTCCTC GTGAAGCCCGACAACCCTTGGGAAGGCGGCGGAGGCTCC GGAGGAGGCGGATCTAGAACAGAGCCTCGGCCTGCCCTG ACAATTACCACATCCCCCAATCTGGGCACCCGGGAAAACA ATGCAGATCAAGTGACACCTGTGTCTCATATTGGGTGCCC CAACACTACCCAGCAGGGGTCCCCAGTGTTTGCTAAACTG CTGGCTAAAAATCAGGCCTCCCTGTCTAACACAACACTGA ATTGGCATAGTCAGGACGGGGCTGGCAGCAGCTACCTGTC TCAGGGACTGCGCTATGAGGAAGATAAGAAAGAACTGGT GGTGGATTCCCCCGGACTGTACTATGTGTTTCTGGAACTG AAACTGTCCCCTACCTTTACAAATACCGGGCACAAAGTGC AGGGATGGGTGTCCCTGGTGCTGCAGGCTAAGCCTCAGGT GGACGATTTTGATAATCTGGCTCTGACAGTGGAACTGTTT CCTTGCTCTATGGAAAACAAACTGGTGGACCGCTCTTGGA GCCAGTTGCTGCTGCTGAAAGCTGGCCACCGGCTGTCTGT GGGACTGAGAGCATACCTGCATGGGGCACAGGATGCCTA CCGGGATTGGGAACTGTCCTACCCTAACACTACTTCCTTC GGACTGTTCCTCGTGAAACCTGATAATCCCTGGGAGGGCG GAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGATCCAGAGCTGATGCTG CCCCTACCGTGTCCATCTTCCCACCCAGCAGCGAGCAGCT GACATCTGGGGGAGCTAGCGTCGTGTGCTTCCTGAACAAC TTCTACCCCAAGGACATCAACGTGAAGTGGAAGATCGAC GGCAGCGAGCGGCAGAACGGCGTGCTGAATAGCTGGACC GACCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCATGAGCAGC ACCCTGACCCTGACCAAGGACGAGTACGAGCGGCACAAC AGCTACACATGCGAGGCCACCCACAAGACCAGCACCAGC CCCATCGTGAAGTCCTTCAACCGGAACGAGTGCGTGCCCA GAGACTGCGGCTGCAAGCCTTGCATCTGCACCGTGCCTGA GGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAAGGAC GTGCTGACCATCACCCTGACACCCAAAGTGACCTGCGTGG TGGTGGCCATCAGCAAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCA GTTGGTTCGTGGACGACGTGGAAGTGCACACCGCTCAGAC CAAGCCCAGAGAGGAACAGATCAACAGCACCTTCAGAAG CGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACTGGCTGAAC GGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACAGCGCCGCCTTT GGCGCCCCTATCGAGAAAACCATCTCCAAGACCAAGGGC AGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACAATCCCCCCACCCA AAGAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCTGACCTGCA TGATCACCAATTTCTTCCCAGAGGATATCACCGTGGAATG GCAGTGGAACGGCCAGCCCGCCGAGAACTACGACAACAC CCAGCCTATCATGGACACCGACGGCTCCTACTTCGTGTAC AGCGACCTGAACGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGC AACACCTTCACCTGTAGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACA ACCACCACACCGAGAAGTCCCTGTCCCACAGCCCTGGCAA G
159 мономерный мышиный 4-1BBL (104-309, C160S) AGAACCGAGCCCAGACCCGCCCTGACCATCACCACCAGC CCTAACCTGGGCACCAGAGAGAACAACGCCGACCAAGTG
- 135 037557
- СН1 ACCCCCGTGTCCCACATCGGCTGCCCCAATACCACACAGC AGGGCAGCCCTGTGTTCGCCAAGCTGCTGGCCAAGAACCA GGCCAGCCTGAGCAACACCACCCTGAACTGGCACAGCCA GGATGGCGCCGGAAGCAGCTATCTGAGCCAGGGCCTGAG ATACGAAGAGGACAAGAAAGAACTGGTGGTGGACAGCCC TGGCCTGTACTACGTGTTCCTGGAACTGAAGCTGAGCCCC ACCTTCACCAACACCGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTGT CACTGGTGCTGCAGGCCAAACCCCAGGTGGACGACTTCGA CAACCTGGCCCTGACCGTGGAACTGTTCCCCTGCAGCATG GAAAACAAGCTGGTGGATCGGAGCTGGTCCCAGCTTCTGC TGCTGAAGGCCGGACACAGACTGAGCGTGGGCCTGAGGG CTTATCTGCACGGCGCCCAGGACGCCTACAGAGACTGGGA GCTGAGCTACCCCAACACAACCAGCTTCGGCCTGTTCCTC GTGAAGCCCGACAACCCTTGGGAAGGCGGCGGAGGCTCC GGAGGAGGCGGAAGCGCTAAGACCACCCCCCCCAGCGTG TACCCTCTGGCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCA TGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGA GCCTGTGACCGTGACCTGGAACAGCGGCAGCCTGAGCAG CGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTG TACACCCTGAGCAGCTCCGTGACCGTGCCTAGCAGCACCT GGCCCAGCCAGACAGTGACCTGCAACGTGGCCCACCCTGC CAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATCGTGCCCCGGGA CTGC
73 анти-FAP (28Н1), Fcцепь с мутацией КК см.таблицу 13
74 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см.таблицу 13
160 димерный мышиный 41BBL (104-309, C160S) CL-Fc-цепь с мутацией DD RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSP VFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEED KKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQA KPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHR LSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPW EGGGGSGGGGSRTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSH IGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSS YLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHK VQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRS WSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTS FGLFLVKPDNPWEGGGGSGGGGSRADAAPTVSIFPPSSEQLT SGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQ DSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKS FNRNECVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPK VTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTF RSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGR PKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQW NGQPAENYDNTQPIMDTDGSYFVYSDLNVQKSNWEAGNTF TCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
161 мономерный мышиный 4-1BBL (104-309, C160S) - СН1 RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSP VFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEED KKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQA KPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHR LSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPW EGGGGSGGGGSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK GYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPS
STWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
77 анти-FAP (28Н1), Fcцепь с мутацией КК см.таблицу 13
78 анти-FAP (28Н1), легкая цепь см.таблицу 13
В табл. 16 представлены кДНК и аминокислотные последовательности ненацеленной (DP47) содержащей тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающей молекулы (контроль М.2).
- 136 037557
Таблица 16. Последовательности ненацеленной мышиной конструкции (контроль М.2)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
158 димерный mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CL-Fc-цепь с мутацией DD См. таблицу 15
159 мономерный mu 4-1BBL (104-309, C160S) - СН1 См. таблицу 15
154 DP47, Fc-цепь с мутацией КК См. таблицу 14
155 легкая цепь DP47 См. таблицу 14
160 димерный mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CL-Fc-цепь с мутацией DD См. таблицу 15
161 мономерный mu 4-1BBL (104-309, C160S) - СН1 См. таблицу 15
156 DP47, Fc-цепь с мутацией КК См. таблицу 14
157 легкая цепь DP47 См. таблицу 14
Содержащие мышиный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы получали и очищали согласно методу, описанному выше для содержащих человеческий 4-1BBL конструкций.
В табл. 17 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономеров нацеленных на FAP и ненацеленных содержащих тримерный мышиный 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
Таблица 17. Обобщение характеристик полученных нацеленных на FAP и ненацеленных содержащих мышиный тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул
Конструкция Выход [mg/1] Мономер [%] (SEC)
конструкция М.1 2,6 95
контроль М.2 2,3 96
конструкция М.2 8,5 98
контроль М.2 8,1 97
1.4. Получение и очистка ненацеленых содержащих тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул (контрольные молекулы).
Контрольные молекулы получали согласно методу, описанному выше для нацеленных на FAP конструкций 1 и 2, с единственным различием, состоящим в том, что анти-FAP связывающий агент (VH-VL) заменяли на антитело зародышевой линии, обозначенное DP47, не связывающееся с антигеном. Контроль представлял собой ненацеленную одновалентную конструкцию разделенного тримерного человеческого лиганда для 4-1BB-Fc (kih) (контроль А, фиг. 5А), а в случае контроля Б конструкция содержала также CH-CL-кроссовер с заряженными остатками (фиг. 5Б). Последовательности ДНК вариабельных областей тяжелой и легкой цепей FAP-связывающего агента заменяли на ДНК контрольной зародышевой линии (DP47) и субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с выступом, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Ненацеленные содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязанные молекулы получали согласно методу, описанному выше для нацеленных на FAP конструкций. Клетки трансфектировали соответствующими экспрессионными векторами в соотношении 1:1:1:1 (вектор для конструкции димерный лиганд-CH1 или -CL*-цепь с выступом:вектор для слияния мономерный лиганд-CL или -СН1*:вектор для тяжелой цепи с впадиной DP47 Fab:вектор для легкой цепи DP47).
В табл. 18 представлены соответственно кДНК и аминокислотные последовательности ненацеленной (DP47) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) антигенсвязывающей молекулы (контроль А).
- 137 037557
Таблица 18. Последовательности ненацеленной (DP47) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) антигенсвязывающей молекулы (DP47 разделенный тример 4-1BBL) (контроль А)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
66 димерный hu 4-1BBL (71-254) - CHl-Fc -цепь с «выступом» См. таблицу 2
67 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - CL См. таблицу 2
79 DP47, Fc-цепь с «впадиной» GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGC CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATT CACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGT AGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCG TATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGG CCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCA CCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTAC AGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAA GTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCAC CGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCA AGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTG GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
- 138 037557
80 легкая цепь DP47 GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGT CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCA GAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAA CCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCA GCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTG GATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGA GCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGT AGCTCACCGCTGACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGGAA ATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCC CGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGT TGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAA GTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACT CCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCA CCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAG ACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCC ATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAG GGGAGAGTGT
14 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 2
15 мономерный hu 4-1BBL (71-254) -CL См. таблицу 2
81 DP47, Fc-цепь с «впадиной» EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP GKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFP AVLQS S GLYSLS S VVT VP SS SLGTQTYICNVNHKP SN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKS R WQQGN VF S CS VMHE ALHNH YTQKSL SL SP GK
82 легкая цепь DP47 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPG QAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV YYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
В табл. 19 представлены кДНК и аминокислотные последовательности ненацеленной (DP47) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы с CH1-CLкроссовером и заряженными остатками в плечах, содержащих лиганд для 4-1ВВ (контроль Б).
Таблица 19. Последовательности ненацеленной (DP47) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (DP47 разделенный тример 4-1BBL) (контроль Б)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
96 димерный hu 4-1BBL (71-254) - CL*-Fc-penb с «выступом» См. таблицу 3
97 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1* См. таблицу 3
79 DP47, Fc-цепь с «впадиной» См.таблицу 18
80 легкая цепь DP47 См.таблицу 18
98 димерный hu 4-1BBL (71-254) - CL*-Fc-penb с «выступом» См. таблицу 3
99 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1* См. таблицу 3
81 DP47-Fc-penb с «впадиной» См.таблицу 18
82 легкая цепь DP47 См.таблицу 18
В табл. 20 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономеров ненацеленных (DP47) содержащих тримерный лиганд для 4-1BBL в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул.
- 139 037557
Таблица 20. Обобщение характеристик полученных ненацеленных (DP47) содержащих тример
4-1BBL в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул (контрольные молекулы)
Конструкция Мономер [%] (SEC) Выход [мг/л] ЖХ/МС (без восстановл.)
контроль А 97 3,7 теоретическое значение*: 179069,7 Да экспериментальное значение: 179116,2 Да * без концевых лизинов
контроль Б 99 15,4
Пример 2.
2.1. Получение нацеленных на FAP (4B9) содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
Различные фрагменты последовательности ДНК, кодирующей часть эктодомена (аминокислоты 71254 и 71-248) человеческого лиганда для 4-1ВВ, синтезировали на основе последовательности Р41273 из базы данных Uniprot (SEQ ID NO: 42).
2.1.1. Получение одновалентной нацеленной на FAP (4B9) содержащей тримерный лиганд для 41ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами с заряженными остатками (конструкция 2.1).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-254), разделенных (G4S)2линкерами, и слитый с CL-доменом человеческого IgG1, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 1А: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий CL.
Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-254) и слитый с СН1-доменом человеческого IgG1, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 1Б: человеческий лиганд для 41ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН.
Полипептид, кодирующий димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL-домером, субклонировали в рамке считывания с СН2- и СН3-доменами тяжелой цепи с выступом человеческого IgG1 (Merchant, Zhu и др. 1998), используя линкер (G4S)2 или в альтернативном варианте (GSPGSSSSGS).
Для повышения правильного спаривания интродуцировали следующие мутации в скрещенные CH-CL-домены. В димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL, интродуцировали мутации E123R и Q124K. В мономерном лиганде для 4-1ВВ, слитым с человеческим СН1, мутации К147Е и К213Е клонировали в человеческом CH1-домене.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для фибробласт-активирующего белка (FAP), клон 4В9, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Конструирование и получение связывающих FAP агентов описано в WO 2012/020006 А2, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala интродуцировали в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-Y-рецепторами согласно методу, описанному в публикации Международной заявки на патент WO 2012/130831.
Для всех конструкций использовали технологию гетеродимеризации knobs-into-hole с мутациями S354C/T366W в цепи с выступом и соответствующими мутациями Y349C/T366S/L368A/Y407V в цепи с впадиной.
Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-FAP-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V, и легкая цепь анти-FAP, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и FAP-связывающий Fab (фиг. 4, конструкция 2.1).
В табл. 21 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP (4B9) содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвяызвающей молекулы, содержащей CH1-CL-кроссовер и заряженные остатки (конструкция 2.1).
- 140 037557
Таблица 21. Последовательности одновалентной нацеленной на FAP (4B9) молекулы, содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) (конструкция 2.1)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
129 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СЬ*-Рс-цепь c «выступом» См. таблицу 3
130 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - CHI* См. таблицу 3
162 анти-FAP (4B9), Fc-цепь с «впадиной» GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAG CCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCT TCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGC CCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGC TCTGGCGCCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCC GGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGT ACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCG TGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTA CTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCTAGC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCA AGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGG TCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAA CAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGG TCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA CAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACAC ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA
- 141 037557
GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGT CTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
163 легкая цепь анти-FAP (4В9) GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCTCTGA CCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCCCAG TCCGTGACCTCCTCCTACCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGC CCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCAACGTGGGCAGTCG GAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGC TCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAAC CCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGGCATCAT GCTGCCCCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATC AAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGC CATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGT GTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCC AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCT ACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACT ACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT
115 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СЬ*-Рс-цепь с «выступом» См. таблицу 3
116 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1* См. таблицу 3
164 анти-FAP (4В9), Fc-цепь с «впадиной» EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP GKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TS G VHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICN VNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
125 легкая цепь анти-FAP (4В9) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPG QAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFA VYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKD STYSLS STLTLSKAD YEKHKVY АСЕ VTHQGL S SP VTKSF NRGEC
2.1.2. Получение одновалентной нацеленной на FAP (4В9) содержащей тримерный лиганд для 41ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами без заряженных остатков (конструкция 2.2).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-254), разделенных (G4S)2линкерами, и слитый с CL-доменом человеческого IgG1, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 1А: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий CL.
Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-254) и слитый с СН1-доменом человеческого IgG1, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 1Б: человеческий лиганд для 41ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН1.
Полинуклеотид, кодирующий димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL-доменом, субклонировали в рамке считывания с СН2- и СН3-доменами тяжелой цепи с выступом человеческого IgG1 (Merchant, Zhu и др. 1998), используя линкер (G4S)2 или в альтернативном варианте (GSPGSSSSGS).
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для фибробласт-активирующего белка (FAP), клон 4В9, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala интродуцировали в константную область тяжелых це- 142 037557 пей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-γ-рецепторами (WO 2012/130831).
Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-FAP-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/
L368A/Y407V, и легкая цепь анти-FAP, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и FAP-связывающий Fab (фиг. 4, конструкция 2.2).
В табл. 22 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP (4B9) содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы, содержащей CH1-CL-кроссовер без заряженных остатков (конструкция 2.2).
Таблица 22. Последовательности одновалентной нацеленной на FAP (4B9) молекулы, содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih), (конструкция 2.2)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
165 димерный hu 4-1BBL (71-254) - CL-Fc-цепь с «выступом» AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCT GCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCT CCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGG AGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGA ACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGA CAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGC TGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCT GGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGA AGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTA CTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCT GGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGC AGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCT GACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAA CAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGC GCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCC AGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACT GTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCG GACTGCCAAGCCCTAGATCAGAAGGGGGCGGAGGTTCCG GAGGGGGAGGATCTCGTACGGTGGCCGCTCCCTCCGTGTT TATCTTTCCCCCATCCGATGAACAGCTGAAAAGCGGCACC GCCTCCGTCGTGTGTCTGCTGAACAATTTTTACCCTAGGG AAGCTAAAGTGCAGTGGAAAGTGGATAACGCACTGCAGT CCGGCAACTCCCAGGAATCTGTGACAGAACAGGACTCCA AGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACACTGTC TAAGGCTGATTATGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA AGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGC TTCAACAGGGGAGAGTGTGACAAGACCCACACCTGTCCCC CTTGTCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCTGTGTTC CTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCC GGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCA CGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGG CGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGGA GCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGA
- 143 037557
AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC AGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAA GAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAG CCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACT CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAG AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
166 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCT GCAGCTCTGGCTCTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCT CCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCCGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGACTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGAGCCAGGCACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCTGCCGGCCTGCCTAGCCCTAGATCTGAAGGCGG CGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGCTAGCACCAAAGG CCCTTCCGTGTTTCCTCTGGCTCCTAGCTCCAAGTCCACCT CTGGAGGCACCGCTGCTCTCGGATGCCTCGTGAAGGATTA TTTTCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAATAGCGGAGCA CTGACCTCTGGAGTGCATACTTTCCCCGCTGTGCTGCAGT CCTCTGGACTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCC CAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTG GAACCCAAGTCTTGT
162 анти-FAP (4В9), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 21
163 легкая цепь анти- FAP (4В9) См. таблицу 21
117 димерный hu 4-1BBL (71-254) - CL-Fc-цепь с «выступом» REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGG LSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLA LHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHL SAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAG LPSPRSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECD KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPP VLD SD G SFFL Y SKLT VDKSRWQQGN VF S CS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
118 мономерный hu 4-1BBL REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS
(71-254) - СН1 DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICN VNHKP SNTK VDK KVEPKSC
164 анти-FAP (4В9), F-цепь с «впадиной» См. таблицу 21
125 легкая цепь анти-FAP (4В9) См. таблицу 21
2.1.3. Получение двухвалентной нацеленной на FAP (4В9) содержащей тримерный лиганд для 41ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы, в которой димерный и мономерный лиганды для 4-1ВВ слиты на С-конце каждой тяжелой цепи (конструкция 2.3).
- 144 037557
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-254), разделенных (G4S)2линкерами, сливали с С-концом Fc-цепи с впадиной человеческого IgG1, получая согласно схеме, представленной на фиг. 1B: Fc-цепь с впадиной человеческого IgG1, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-254) и слитый с С-концом Fc-цепи с выступом человеческого IgG1, получали согласно схеме, представленной на фиг. 1Г: Fc с выступом человеческого IgG1, (G4S)2коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ.
Полинуклеотид, кодирующий димерный лиганд для 4-1ВВ, субклонировали в рамке считывания на С-конце СН2- и СН3-доменов тяжелой цепи с впадиной 4 человеческого IgG1 (Merchant, Zhu и др. 1998), используя (G4S)2-коннектор. Полинуклеотид, кодирующий мономерный лиганд для 4-1ВВ, субклонировали в рамке считывания на С-конце СН2- и СН3-доменов тяжелой цепи с выступом человеческого IgG1 (Merchant, Zhu и др. 1998), используя (G4S)2-коннектор.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для фибробласт-активирующего белка (FAP), клон 4В9, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, с выступом, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala интродуцировали в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-Y-рецепторами (WO 2012/130831).
Комбинация: анти-FAP huIgG1, содержащая димерный лиганд цепь с впадиной с мутациями Y349C/T366S/L368A/Y407V, анти-FAP huIgG1, содержащая мономерный лиганд цепь с выступом с мутациями S354C/T366W, и легкая цепь анти-FAP, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и два FAP-связывающих Fab (фиг. 4, конструкция 2.3).
В табл. 23 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на FAP (4B9) молекулы, содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) (конструкция 2.3) (FAP разделенный тример с 2 анти-FAP Fab, димерный и мономерный лиганды для 4-1ВВ, слитые на Сконце каждой тяжелой цепи соответственно).
Таблица 23. Последовательности двухвалентной нацеленной на FAP (4B9) молекулы, содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) (конструкция 2.3)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
167 анти-FAP (4В9)-Рс-цепь с «впадиной»,слитая с димерным hu 4-1BBL (71254) GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCA GCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCG GCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCC AGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATC ATCGGCTCTGGCGCCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTG AAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAA CACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGG ACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGC GGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGT GTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCT GGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG CTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCG TGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGC GTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTG TATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGC CTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCA AGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA GCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA
- 145 037557
AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCG AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTG ACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGG CTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAG CTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGT CTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCA CTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGG CGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCT GAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTG CGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTG CTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCT GGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTA CAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCG GCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAG TGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCC TGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAG CTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCG AGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTG CTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGAC ACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCC CCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAA GGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGG ACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGA TCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGA ATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCG ACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTG TCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAA AGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAG GCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCT GGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGC AGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTC TAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGAC GCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTG CATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCA GCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGT GACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATC AGAA
168 анти-FAP (4В9)-Рс-цепь с «выступом», слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-254) GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCA GCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCG GCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCC AGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATC ATCGGCTCTGGCGCCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTG AAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAA CACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGG ACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGC GGCTTCAACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGT
- 146 037557
GTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCT GGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGC GTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCA AATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG CACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAA GACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG TCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGA GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC CACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTG ACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGC TTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAA CGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTG TGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAAC TGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTG TTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCA CTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAG GCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCC TGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCT GCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGT GCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCC TGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTA CAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCG GCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAG TGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCC TGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAG CTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCG AGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTG CTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGAC ACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCC CCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAA
163 Легкая цепь анти-FAP (4В9) см. табл. 21
123 анти-FAP (4В9)-Рс-цепь с «впадиной»,слитая с димерным hu 4-1BBL (71254) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA PGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFP AVLQS S GLYSLS S VVT VP S S SLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKN QVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
- 147 037557
LSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQ LVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELV VAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAA GAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGV HLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEG GGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNV LLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGV YYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEA RARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
124 анти-FAP (4В9)-Рс-цепь с «выступом», слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-254) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA PGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFP AVLQS S GLYSLS S VVT VP S S SLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKN QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQ LVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELV VAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAA GAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGV HLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
125 легкая цепь анти-FAP (4В9) См.таблицу 21
2.1.4. Получение одновалентной нацеленной на FAP (4В9) содержащей тримерный лиганд для 41ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами с заряженными остатками (конструкция 2.4).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-248), разделенных (G4S)2линкерами, в слиянии с CL-доменом человеческого IgG1, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 1А: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий CL. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-248), в слиянии с СН-доменом человеческого IgG1, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 1Б: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН1.
Полинуклеотид, кодирующий димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL-доменом, субклонировали в рамке считывания с СН2- и СН3-доменами тяжелой цепи с выступом человеческого IgG1 (Merchant, Zhu и др. 1998), используя линкер (G4S)2 или в альтернативном варианте (GSPGSSSSGS). Для улучшения правильного спаривания интродуцировали указанные ниже мутации в скрещенные CHCL: в димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL, мутации E123R и Q124K; в мономерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим СН1, мутации К147Е и К213Е.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для фибробласт-активирующего белка (FAP), клон 4В9, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala интродуцировали в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-гамма-рецепторами (WO 2012/130831).
Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-FAP-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/ L368A/Y407V, и легкая цепь анти-FAP, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и FAP-связывающий Fab (фиг. 4, конструкция 2.4).
В табл. 24 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP (4B9) содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвяызвающей молекулы, содержащей CH1-CL-кроссовер с заряженными остатками (конструкция 2.4).
- 148 037557
Таблица 24. Последовательности одновалентной нацеленной на FAP (4B9) молекулы, содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih), (конструкция 2.4)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
169 димерный hu 4-1BBL (71-248) - CL*- Fc-цепь с «выступом» AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC
AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCC GCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCA GCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGACTGGGAGGCGGCGGATCTGGCGGCG GAGGATCTAGAGAAGGACCCGAGCTGTCCCCTGACGATC CAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCA GCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTG AGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGA CTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGG TGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCT GGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATC TGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCA GCAGGGGCTGCAGCACTGGCCCTGACTGTGGACCTGCCCC CAGCTTCTTCCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCA AGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGG AGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGG CAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCG TGACACCTGAGATCCCCGCTGGACTGGGCGGAGGCGGTTC CGGAGGGGGAGGATCTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTC TTTATCTTCCCACCCAGCGACCGGAAGCTGAAGTCTGGCA CAGCCAGCGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCCG CGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCA GAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTGACCGAGCAGGACAG CAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGC GAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAG AGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGACAAGACCCACACCTGT CCTCCATGCCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTAGCG TGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGAT CAGCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTG TCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGG ACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGG AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCT CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGA CCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTT CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCT GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACC GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
170 мономерный hu 4-1BBL (71-248) - CHI* AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC
- 149 037557
AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCC GCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCA GCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGACTGGGAGGCGGAGGTTCCGGAGGCG GAGGATCTGCTAGCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCT GGCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGC CCTGGGCTGCCTGGTGGAAGATTACTTCCCCGAGCCCGTG ACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGC ACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTC TCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGC ACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACGAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGC
162 анти-FAP (4В9), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 21
163 анти-FAP (4В9), легкая цепь см.таблицу 21
119 димерный hu 4-1BBL (71-248) - СЬ*-Рс-цепь с «выступом» REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDL RQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKE DTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQP LRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQ RLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGG GSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
120 мономерный hu 4-1BBL (71-248) - СН1* REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKVDEKVEPK SC
164 анти-FAP (4В9), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 21
125 анти-FAP (4В9), легкая цепь см.таблицу 21
2.1.5. Получение одновалентной нацеленной на FAP (4В9) содержащей тримерный лиганд для 41ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами без заряженных остатков (конструкция 2.5).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-248), разделенных (G4S)2-линкерами, в слиянии с CL-доменом человеческого IgG1, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 1А: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий CL. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-248), в слиянии с СН-доменом человеческого IgG1, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 1Б: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН.
Полинуклеотид, кодирующий димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL-доменом, субклонировали в рамке считывания с СН2- и СН3-доменами тяжелой цепи с выступом человеческого IgG1 (Merchant, Zhu и др. 1998), используя линкер (G4S)2 или в альтернативном варианте (GSPGSSSSGS).
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для фибробласт-активирующего белка (FAP), клон 4В9, субклонировали в
- 150 037557 рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala интродуцировали в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-гамма-рецепторами (WO 2012/130831).
Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-FAP-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/ L368A/Y407V, и легкая цепь анти-FAP, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и FAP-связывающий Fab (фиг. 4, конструкция 2.5).
В табл. 25 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP (4B9) содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвяызвающей молекулы, содержащей CH1-CL-кроссовер без заряженных остатков (конструкция 2.5).
Таблица 25. Последовательности одновалентной нацеленной на FAP (4B9) молекулы, содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih), (конструкция 2.5)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
171 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 4-1BBL (71-248) - CL-Fcцепь с «выступом» AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCC GCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCA GCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGACTGGGAGGCGGCGGATCTGGCGGCG GAGGATCTAGAGAAGGACCCGAGCTGTCCCCTGACGATC CAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCA GCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTG AGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGA CTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGG TGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCT GGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATC TGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCA GCAGGGGCTGCAGCACTGGCCCTGACTGTGGACCTGCCCC CAGCTTCTTCCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCA AGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGG AGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGG CAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCG TGACACCTGAGATCCCCGCTGGACTGGGCGGAGGCGGTTC CGGAGGGGGAGGATCTCGTACGGTGGCCGCTCCCTCCGTG TTTATCTTTCCCCCATCCGATGAACAGCTGAAAAGCGGCA CCGCCTCCGTCGTGTGTCTGCTGAACAATTTTTACCCTAGG GAAGCTAAAGTGCAGTGGAAAGTGGATAACGCACTGCAG TCCGGCAACTCCCAGGAATCTGTGACAGAACAGGACTCCA AGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACACTGTC TAAGGCTGATTATGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA AGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGC TTCAACAGGGGAGAGTGTGACAAGACCCACACCTGTCCCC CTTGTCCTGCCCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCTGTGTTC CTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCC GGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCA CGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGG CGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCGCGGGAGGA GCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC
- 151 037557
AGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAA GAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAG CCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACT CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAG AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
172 мономерный hu 4-1BBL (71-248) - СН1 AGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGA CTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGG CCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTA CAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGC CTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCC AAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGC GGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCT GGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCC GCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCA GCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCT GCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTG CACACAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACA CAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCG AGATTCCAGCCGGACTGGGAGGCGGAGGTTCCGGAGGCG GAGGATCTGCTAGCACCAAAGGCCCTTCCGTGTTTCCTCT GGCTCCTAGCTCCAAGTCCACCTCTGGAGGCACCGCTGCT CTCGGATGCCTCGTGAAGGATTATTTTCCTGAGCCTGTGA CAGTGTCCTGGAATAGCGGAGCACTGACCTCTGGAGTGCA TACTTTCCCCGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGACTGTACAGCC TGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCA CCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGT
162 анти-FAP (4В9), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 21
163 анти-FAP (4В9), легкая цепь см.таблицу 21
173 димерный hu 4-1BBL (71248) - CL-Fc-цепь с «выступом» REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDL RQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKE DTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQP LRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQ RLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGG GSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
174 мономерный hu 4-1BBL REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS
(71-248) - СН1 DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRV VAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGAT VLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICN VNHKP SNTK VDKK VEPK SC
164 анти-FAP (4В9), Fc-цепь с «впадиной» см.таблицу 21
125 анти-FAP (4В9), легкая цепь см.таблицу 21
2.1.6. Получение двухвалентной нацеленной на FAP (4В9) содержащей тримерный лиганд для 41ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы, в которой димерный и мономерный
- 152 037557 лиганды для 4-1ВВ слиты на С-конце каждой тяжелой цепи (конструкция 2.6).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-248), разделенных (G4S)2линкерами, сливали с С-концом Fc-цепи с впадиной человеческого IgG1, получая согласно схеме, представленной на фиг. 1B: Fc-цепь с впадиной человеческого IgG1, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-254) и слитый с С-концом Fc-цепи с выступом человеческого IgG1, получали согласно схеме, представленной на фиг. 1Г: Fc с выступом человеческого IgG1, (G4S)2коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ.
Полинуклеотид, кодирующий димерный лиганд для 4-1ВВ, субклонировали в рамке считывания на С-конце СН2- и СН3- доменов тяжелой цепи человеческого IgG1 на цепи с впадиной (Merchant, Zhu и др. 1998), используя (G4S)2-коннектор. Полипептид, кодирующий мономерный лиганд для 4-1ВВ, субклонировали в рамке считывания на С-конце СН2- и СН3-доменов тяжелой цепи с выступом человеческого IgG1 (Merchant, Zhu и др. 1998), используя (G4S)2-коннектор.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для фибробласт-активирующего белка (FAP), клон 4В9, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, с выступом, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala интродуцировали в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-γ-рецепторами (WO 2012/130831).
Комбинация: анти-FAP huIgG1, содержащая димерный лиганд цепь с впадиной с мутациями Y349C/T366S/L368A/Y407V, анти-FAP huIgG1, содержащая мономерный лиганд цепь с выступом с мутациями S354C/T366W, и легкая цепь анти-FAP, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и два FAP-связывающих Fab (фиг. 4, конструкция 2.6).
В табл. 26 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на FAP (4B9) молекулы, содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) (конструкция 2.6) (FAP разделенный тример с 2 анти-FAP Fab, димерный и мономерный лиганды для 4-1ВВ, слитые на Сконце каждой тяжелой цепи соответственно).
Таблица 26. Последовательности двухвалентной нацеленной на FAP (4B9) молекулы, содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) (конструкция 2.6)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
175 нуклеотидная последовательность конструкции анти-FAP (4В9)-Рс-цепь с «впадиной», слитая с димерным hu 4-1BBL (71248) GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAG CCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCT TCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGC CCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGC TCTGGCGCCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCC GGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGT ACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCG TGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTA CTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCTAGC ACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCA AGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGG TCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAA CAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGG TCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA CAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACAC ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGT
- 153 037557
ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGT CTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCG GCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGC TGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCA GGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTG ATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGG CTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGG ACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACT ACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGG CGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAG CCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGA CAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAG CGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCC GGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGG GCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTG CTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCC TGGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGG GACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGA TCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAAT GTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACC CAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTA CAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGG GGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTG GTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGC ATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACT GGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCC AGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATC TGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGA AGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGC AACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCT GCCGGACTG
176 нуклеотидная последовательность антиFAP (4В9)-Рс-цепь с «выступом», слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-248) GAGGTGCAGCTGCTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAG CCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCT TCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGC CCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCATCGGC TCTGGCGCCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCC GGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGT ACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCG TGTACTACTGCGCCAAGGGATGGTTCGGCGGCTTCAACTA CTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCAGCGCTAGC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCA AGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC
- 154 037557
TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTG TCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACAT GCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGT CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGAC GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGG AGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGA GCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAG GGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGT GCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTG ACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTC AGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTAC ACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGC GGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTG AGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGG GCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGAT CGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCT GGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGAC ACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTAC GTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCG AAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCC TCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACA GTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCG CATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGG CCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGC TAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCT GGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTG
163 анти-FAP (4B9), легкая цепь см.таблицу 21
126 анти-FAP (4В9)-Рс-цепь с «впадиной», слитая с димерным hu 4-1BBL (71248) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP GKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TS G VHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICN VNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGP LSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQ LELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPP ASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQ LTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDP
- 155 037557
AGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTG GLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSL ALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLL HLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIP AGL
127 анти-FAP (4В9)-Рс-цепь с «выступом», слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-248) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP GKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TS G VHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICN VNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGP LSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQ LELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPP ASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQ LTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
125 анти-FAP (4В9), легкая цепь см. таблицу 21
2.2. Получение ненацеленных содержащих тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул (контрольные молекулы).
Дополнительные контрольные молекулы в случае контроля А и Б получали согласно методу, описанному выше в примере 1.4. Двухвалентный вариант (контроль В) получали аналогично двухвалентным конструкциям 2.3 и 2.6, а одновалентный вариант (контроль Д) получали аналогично конструкции 2.5 (содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248)), с единственным различием, состоящем в том, что анти-FAP связывающий агент (VH-VL) заменяли на антитело зародышевой линии, обозначенное DP47, не связывающееся с антигеном.
В табл. 27 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной ненацеленной (DP47) молекулы, содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) (контроль В). В табл. 28 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной ненацеленной (DP47) молекулы, содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) (контроль Д).
- 156 037557
Таблица 27. Последовательности двухвалентной ненацеленной на FAP (DP47) молекулы, содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) (контроль В)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
177 нуклеотидная последовательность конструкции DP47-FCцепь с «впадиной», слитая с димерным hu 4-1BBL (71-254) GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGC CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATT CACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGT AGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCG TATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGG CCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAG GGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCA CCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGG ACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGG AGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTG CAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCG TGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAA CGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAA GGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCC ACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGT CTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCT CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGA CCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTGCGCAGTCAAAGGCTT CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCT GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACC GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGAGGCGGCGGAA GCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCC CCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCAT GTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGAT GGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCG TGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCA AAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTT CTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGG ATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGA GAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGA TCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTT GGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGA GGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGAC
- 157 037557
ACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCT GTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCT CCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGAGGA TCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCCCTGACGATCCAGCCG GGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAATGTTCGCCCAGCTGGT GGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGG TACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGG GACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGG CTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACT GAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTC CCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGC GCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGGACCTGCCACCAGCCT CTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGAC GCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCA TCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTG ACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACAC CTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGCCCTAGATCAGAA
178 нуклеотидная последовательность конструкции DP47-FCцепь с «выступом», слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-254) GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGC CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATT CACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGT AGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCG TATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGG CCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCA CCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTAC AGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAA GTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCAC CGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGAGATGAGCTGACCA AGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTCAAGGGCTTCTA CCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCA GCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGAC AGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGG ACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCA GCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGA AGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGGAGGCGGCGGAAGCG GAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCG ATGATCCTGCTGGACTGCTGGACCTGCGGCAGGGCATGTT TGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGGC
- 158 037557
CCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCTGGACTGGCTGGCGTGT CACTGACAGGCGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACCAAAG AACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTT TCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATC TGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGA AGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGGCACTGACAGTGGATC TGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCGGAATAGCGCATTTGG GTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGG CTGGGAGTGCATCTGCACACAGAGGCCAGGGCTAGACAC GCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCTACAGTGCTGGGCCTGT TCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAGCCGGCCTGCCTTCTCC AAGAAGCGAA
80 нуклеотидная последовательность DP47 легкая цепь см.таблицу 18
179 ОР47-Рс-цепь с «впадиной», слитая с димерным hu 4-1BBL (71254) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP GKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGP LSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQ LELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPP ASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQ LTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPE LSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLA GVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFG FQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLF RVTPEIPAGLPSPRSE
180 DP47-Fc-uenb с «выступом», слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-254) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP GKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLV KGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLD SDGSFFLY SKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGS GGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGP LSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQ LELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPP ASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQ LTQG ATVLGLFRVTPEIP AGLP SPRSE
82 DP47, легкая цепь см. таблицу 18 |
- 159 037557
Таблица 28. Последовательности одновалентной ненацеленной (DP47) молекулы, содержащей человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih), (контроль Д)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
171 димерный hu 4-1BBL (71-248) - CLFc-цепь с «выступом» См.таблицу 25
172 мономерный hu 4-1BBL (71-248) СН1 См.таблицу 25
79 DP47, Fc-цепь с «впадиной» См.таблицу 18
80 легкая цепь DP47 См.таблицу 18
173 димерный hu 4-1BBL (71-248) - CLFc-цепь с «выступом» См.таблицу 25
174 мономерный hu 4-1BBL (71-248) СН1 См.таблицу 25
81 DP47, Fc-цепь с «впадиной» См.таблицу 18
82 легкая цепь DP47 См.таблицу 18
2.3. Получение ненацеленного человеческого IgG1 в качестве контроля Е.
Дополнительная контрольная молекула, которую применяли в анализах, представляла собой ненацеленную молекулу DP47, контрольная зародышевая линия, человеческий IgG1 с мутациями Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala для элиминации связывания с Fc-гамма-рецепторами, которую получали согласно методу, описанному в публикации Международной заявки на патент WO 2012/130831.
В табл. 29 представлены кДНК и аминокислотные последовательности ненацеленной (DP47) молекулы huIgG1 PGLALA (контроль Е).
Таблица 29. Последовательности ненацеленной молекулы DP47 huIgG1 (контроль Е)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
181 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи DP47 (huIgGl PGLALA) GAGGTGCAATTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGC CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATT CACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGT AGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCG TATATTACTGTGCGAAAGGCAGCGGATTTGACTACTGGGG
- 160 037557
CCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCA CCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTAC AGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAA GTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCAC CGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCA AGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
80 легкая цепь DP47 См.таблицу 18
182 тяжелая цепь DP47 (hu IgGl PGLALA) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP GKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFP AVLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICNVNHKP SN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK
82 легкая цепь DP47 См.таблицу 18
2.4. Получение одновалентных и двухвалентных нацеленных на FAP (4B9) конструкций, содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc, и контрольных молекул.
Кодирующие последовательности нацеленных и ненацеленных конструкций, содержащих разделенных тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih), клонировали в плазмидном векторе, в котором экспрессия вставки контролировалась промотором MPSV и который содержал синтетическую полиАпоследовательность, локализованную на 3'-конце CDS. Кроме того, вектор содержал последовательность OriP EBV для поддержки эписомальной формы плазмиды.
Содержащую разделенный тримерный лиганд к 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулу получали путем котрансфекции клеток HEK293-EBNA экспрессионными векторами для клеток млекопитающих с использованием полиэтиленимина. Клетки трансфектировали соответствующими экспрессионными векторами. Для конструкций 2.1, 2.2, 2.4 и 2.5 и соответствующих контрольных молекул использовали соотношение 1:1:1:1 (например, вектор для конструкции димерный лиганд-CL-цепь с выступом :вектор для слияния мономерный лиганд -СН1: вектор для анти-FAP Fab-цепи с впадиной:вектор для легкой цепи анти-FAP). Для конструкций 2.3 и 2.6 и их контрольных молекул использовали соотношение 1:1:1 (вектор для huIgG1-Fc-цепь с впадиной-димерный лиганд:вектор для huIgG1-Fc-цепь с выступоммономерный лиганд:вектор для легкой цепи анти-FAP.
Для двухвалентной конструкции 5 применяли соотношение 1:1:1 (вектор для тяжелой цепи с впадиной:вектор для тяжелой цепи с выступом:вектор для легкой цепи анти-FAP). Человеческие IgG, которые применяли в качестве контроля в анализах, получали аналогично методу, описанному для получения биспецифических конструкций (для трансфекции применяли только вектор для легкой цепи и вектор для тяжелой цепи).
Для производства в 500-миллилитровые встряхиваемые колбы засевали 300 млн клеток HEK293 EBNA за 24 ч до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 10 мин при 210 х g и супернатант заменяли 20 мл предварительно нагретой среды CD CHO. Экспрессионные векторы (200 мкг общей ДНК) смешивали в 20 мл среды CD CHO. После добавления 540 мкл ПЭИ раствор интенсив
- 161 037557 но перемешивали в течение 15 с и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/ПЭИ, переносили в 500-миллилитровую встряхиваемую колбу и инкубировали в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО2. После инкубации добавляли 160 мл среды Excell, дополненной 6 мМ L-глутамином, 5 г/л соевого пептида (PEPSOY) и 1,2 мМ вальпроевой кислоты, и клетки культивировали в течение 24 ч. Через 1 день после трансфекции добавляли 12% Feed 7 и глюкозу (конечная концентрация 3 г/л). После культивирования в течение 7 дней супернатант собирали центрифугированием в течение 30-40 мин при по меньшей мере 400 х g. Раствор стерилизовали фильтрацией (0,22 мкм-фильтр), дополняли азидом натрия до конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и выдерживали при 4°С.
Нацеленные и ненацеленные содержащие тримерный лиганд TNF в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающие молекулы и человеческий IgG1 очищали из супернатантов клеточных культур с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А с последующей гель-фильтрацией. Для осуществления аффинной хроматографии супернатант вносили в колонку MabSelect Sure (CV = 5-15 мл, смола фирмы GE Healthcare), уравновешенную буфером, содержащим фосфат натрия (20 мМ), цитрат натрия (20 мМ) (рН 7,5). Несвязанный белок удаляли путем промывки таким же буфером, используя его в объеме, кратном по меньшей 6 объемам колонки. Связанный белок элюировали, применяя линейный градиент (20 CV) или ступенчатую элюцию (8 CV), с использованием буфера, содержащего 20 мМ цитрат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин (рН 3,0). При осуществлении элюции с использованием линейного градиента осуществляли дополнительную ступенчатую элюцию с применением объема, кратного 4 объемам колонки.
Значение рН собранных фракций регулировали, добавляя 1/10 (об./об.) 0,5М фосфата натрия, рН 8,0. Белок концентрировали перед внесением в колонку HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную раствором, содержащим 20 мМ гистидин, 140 мМ хлорид натрия, 0,01 об.% Твин20, рН 6,0.
Концентрацию белка определяли путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу нацеленной содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы анализировали с помощью ДСН-ПААГ в присутствии восстановителя (5 мМ 1,4дитиотреитол) и без него и осуществляли окрашивание кумасси SimpleBlue™ SafeStain, (фирма Invitrogen, США) или с помощью КЭ-ДСН, используя устройство Caliper LabChip GXII (фирма Perkin Elmer). Содержание агрегатов в образцах анализировали, используя колонку для аналитической гель-фильтрации TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh), уравновешенную подвижным буфером, содержащим 25 мМ K2HPO4, 125 мМ NaCl, 200 мМ моногидрохлорид L-аргинина, 0,02% (мас./об.) NaN3, pH 6,7, при 25°С.
В табл. 30 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономеров нацеленных на FAP (4B9) и ненацеленных содержащих тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул и контрольных молекул.
Таблица 30. Данные биохимического анализа нацеленных на FAP (4B9) и ненацеленных содержащих тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул и контрольных молекул
Конструкция Мономер [%] (SEC) Выход [мг/л]
конструкция 2.1 95 15,8
конструкция 2.3 97 П,5
конструкция 2.4 97 14,1
конструкция 2.5 100 16,5
контроль В (двухвалентный) 98 12,6
контроль Д (одновалентный) 93 4,1
контроль Е (зародышевая линия DP47 человеческого IgGl PGLALA 100 50
Пример 3.
Получение, очистка и характеризация 4-1ВВ.
Последовательности ДНК, кодирующие эктодомены 4-1ВВ человека, мышей или обезьян циномолгус (табл. 31), субклонировали в рамке считывания с СН2- и СН3-доменами тяжелой цепи с выступом человеческого IgG1 (Merchant и др., 1998). Интродуцировали сайт расщепления протеазой AcTEV между эктодоменом антигена и Fc человеческого IgG1. Avi-метку для направленного биотинилирования интродуцировали на С-конец конструкции антигена-Fc с выступом. Комбинация конструкции антиген-Fcцепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, с Fc-цепью с впадиной, содержащей мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V, позволяла создавать гетеродимер, включающий единичную копию цепи, содержащей эктодомен 4-1ВВ, с получением мономерной формы сцепленного с Fc антигена (фиг. 5В). В табл. 32 представлены кДНК и аминокислотные последовательности слитых конструкций антиген-Fc.
- 162 037557
Таблица 31. Нумерация аминокислот эктодоменов (ECD) антигена и их происхождение
SEQ ID NO: Конструкция Источник ECD
83 ECD человеческого 4-IBB синтезирован на основе Q07011 Ак 24-186
84 ECD 4-1BB обезьян циномолгус выделен из крови обезьян циномолгус Ак 24-186
85 ECD мышиного 4-IBB синтезирован на основе Р20334 Ак 24-187
Таблица 32. кДНК и аминокислотные последовательности молекул, содержащих мономерный антиген в слиянии с Fc(kih)
SEQ ID NO: Антиген Последовательность
86 нуклеотидная последовательность Fcцепи с «впадиной» GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAC TCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACA TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGC CAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCC CCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTC TCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACA AGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT CCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAA
87 нуклеотидная последовательность конструкции человеческий антиген 4lBB-Fc-цепь с «выступом» CTGCAGGACCCCTGCAGCAACTGCCCTGCCGGCACCTTCT GCGACAACAACCGGAACCAGATCTGCAGCCCCTGCCCCCC CAACAGCTTCAGCTCTGCCGGCGGACAGCGGACCTGCGAC ATCTGCAGACAGTGCAAGGGCGTGTTCAGAACCCGGAAA GAGTGCAGCAGCACCAGCAACGCCGAGTGCGACTGCACC CCCGGCTTCCATTGTCTGGGAGCCGGCTGCAGCATGTGCG AGCAGGACTGCAAGCAGGGCCAGGAACTGACCAAGAAGG GCTGCAAGGACTGCTGCTTCGGCACCTTCAACGACCAGAA GCGGGGCATCTGCCGGCCCTGGACCAACTGTAGCCTGGAC GGCAAGAGCGTGCTGGTCAACGGCACCAAAGAACGGGAC GTCGTGTGCGGCCCCAGCCCTGCTGATCTGTCTCCTGGGG CCAGCAGCGTGACCCCTCCTGCCCCTGCCAGAGAGCCTGG CCACTCTCCTCAGGTCGACGAACAGTTATATTTTCAGGGC GGCTCACCCAAATCTGCAGACAAAACTCACACATGCCCAC CGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAG
- 163 037557
AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCA AGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGAGGCCTGAA CGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATTGAATGGCACGAG
88 нуклеотидная последовательность конструкции антиген 41ВВ обезьян циномолгусFc-цепь с «выступом» TTGCAGGATCTGTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCT GTGATAATAACAGGAGTCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCC AAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGAC ATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAAGACCAGGAAG GAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCATTT CAGGGTATCACTGCCTGGGGGCAGAGTGCAGCATGTGTG AACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAATTGACAAAAAAAG GTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAATGACCAGAA ACGTGGCATCTGTCGCCCCTGGACAAACTGTTCTTTGGAT GGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGAC GTGGTCTGCGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCAGGAG CATCCTCTGCGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGG ACACTCTCCGCAGGTCGACGAACAGTTATATTTTCAGGGC GGCTCACCCAAATCTGCAGACAAAACTCACACATGCCCAC CGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCA AGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGAGGCCTGAA CGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATTGAATGGCACGAG
89 конструкция мышиный антиген 4-1ВВ-Рс-цепь с «выступом» GTGCAGAACAGCTGCGACAACTGCCAGCCCGGCACCTTCT GCCGGAAGTACAACCCCGTGTGCAAGAGCTGCCCCCCCA GCACCTTCAGCAGCATCGGCGGCCAGCCCAACTGCAACAT CTGCAGAGTGTGCGCCGGCTACTTCCGGTTCAAGAAGTTC TGCAGCAGCACCCACAACGCCGAGTGCGAGTGCATCGAG GGCTTCCACTGCCTGGGCCCCCAGTGCACCAGATGCGAGA AGGACTGCAGACCCGGCCAGGAACTGACCAAGCAGGGCT GTAAGACCTGCAGCCTGGGCACCTTCAACGACCAGAACG GGACCGGCGTGTGCCGGCCTTGGACCAATTGCAGCCTGGA CGGGAGAAGCGTGCTGAAAACCGGCACCACCGAGAAGGA
- 164 037557
CGTCGTGTGCGGCCCTCCCGTGGTGTCCTTCAGCCCTAGC ACCACCATCAGCGTGACCCCTGAAGGCGGCCCTGGCGGA CACTCTCTGCAGGTCCTGGTCGACGAACAGTTATATTTTC AGGGCGGCTCACCCAAATCTGCAGACAAAACTCACACAT GCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTC AGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGT CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAG TACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG AACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCT GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGG CTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACAC GCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGAGGC CTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATTGAATGGCAC GAG
90 Fc-цепь с «впадиной» DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
91 конструкция человеческий антиген 4lBB-Fc-цепь с «выступом» LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICR QCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCK QGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLV NGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQVDEQ LYFQGGSPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFE AQKIEWHE
92 конструкция обезьяний (циномолгус) антиген 4lBB-Fc-цепь с «выступом» LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICR QCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCK QGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLV NGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQVDEQ LYFQGGSPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFE AQKIEWHE
93 конструкция мышиный антиген 4-1ВВ-Рс-цепь с «выступом» VQNSCDNCQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPNCNICR VCAGYFRFKKFCSSTHNAECECIEGFHCLGPQCTRCEKDCRP GQELTKQGCKTCSLGTFNDQNGTGVCRPWTNCSLDGRSVL KTGTTEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGPGGHSLQVLVD EQLYFQGGSPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDI FEAQKIEWHE
Все последовательности, кодирующие слияния 4-1BB-Fc, клонировали в плазмидном векторе, в котором экспрессия вставки контролировалась промотором MPSV и который содержал синтетическую полиА-последовательность, локализованную на 3'-конце CDS. Кроме того, вектор содержал последова- 165 037557 тельность OriP EBV для поддержки эписомальной формы плазмиды.
Для получения биотинилированных слитых молекул антиген/Fc клетки HEK293 EBNA на экспоненциальной фазе роста совместно трансфектировали тремя векторами, кодирующими два компонента слитого белка (цепи с выступом и впадиной), а также BirA, фермент, необходимый для реакции биотинилирования. Использовали соответствующие векторы в соотношении 2:1:0,05 (ECD антигенаAcTEV-Fc с выступом:Fc с впадиной:BirA).
Для получения белка в 500-миллилитровые встряхиваемые колбы засевали 400 млн клеток HEK293 EBNA за 24 ч до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 5 мин при 210 х g и супернатант заменяли предварительно нагретой средой CD CHO. Экспрессионные векторы ресуспендировали в 20 мл среды CD CHO, содержащей 200 мкг векторной ДНК. После добавления 540 мкл полиэтиленимина (ПЭИ) раствор интенсивно перемешивали в течение 15 с и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/ПЭИ, переносили в 500миллилитровую встряхиваемую колбу и инкубировали в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО2. После инкубации добавляли 160 мл среды F17 и клетки культивировали в течение 24 ч. Среду для производства дополняли 5 мкМ кифунензином. Через 1 день после трансфекции в культуру добавляли 1 мМ вальпроевую кислоту и 7% Feed 1 с добавками, и клетки культивировали в течение 24 ч. После культивирования в течение 7 дней супернатант собирали центрифугированием клеток в течение 15 мин при 210 х g. Раствор стерилизовали фильтрацией (0,22 мкм-фильтр), дополняли азидом натрия до конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и выдерживали при 4°С.
Секретированные белки очищали из супернатантов клеточных культур с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А с последующей гель-фильтрацией. Для осуществления аффинной хроматографии супернатант вносили в колонку HiTrap ProteinA HP (CV = 5 мл, фирма GE Healthcare), уравновешенную 40 мл буфера, содержащего 20 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, рН 7,5. Несвязанный белок удаляли путем промывки буфером, содержащим 20 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, 0,5М хлорид натрия (рН 7,5), используя его в объеме, кратном по меньшей 10 объемам колонки. Связанный белок элюировали, используя линейный рН-градиент хлорида натрия (от 0 до 500 мМ), созданного с помощью взятого в объеме, кратном более 20 объемам колонки, буфера, содержащего 20 мМ цитрат натрия, 0,01 об.% Твин-20, рН 3,0. Затем колонку промывали, используя в объеме, кратном 10 объемам колонки, буфер, содержащий 20 мМ цитрат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 0,01 об.% Твин-20, рН 3,0.
Значение рН собранных фракций регулировали, добавляя 1/40 (об./об.) 2М Трис, рН 8,0. Белок концентрировали и фильтровали перед внесением в колонку HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную раствором, содержащим 2 мМ MOPS, 150 мМ хлорид натрия, 0,02% (мас./об.) азида натрия, рН 7,4.
Для определения аффинности к человеческому рецептору субклонировали также эктодомен человеческого 4-1ВВ в рамке считывания с avi-меткой (GLNDIFEAQKIEWHE) и гексагистидиновой меткой.
Очистку белка осуществляли согласно методу, описанному выше для содержащего Fc слитого белка. Секретированные белки очищали из супернатантов клеточных культур с помощью хелатирующей хроматографии с последующей гель-фильтрацией. Первую хроматографическую стадию осуществляли в картридже NiNTA Superflow (5 мл, фирма Qiagen), уравновешенном буфером, содержащим 20 мМ фосфат натрия, 500 нМ хлорид натрия, рН 7,4. Элюцию осуществляли с использованием градиента от 5 до 45% буфера для элюции, взятого в объеме, кратном более 12 объемам колонки (20 мМ фосфат натрия, 500 нМ хлорид натрия, 500 мМ имидазол, рН 7,4). Белок концентрировали и фильтровали перед внесением в колонку HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную раствором, содержащим 2 мМ MOPS, 150 мМ хлорид натрия, 0,02% (мас./об.) азида натрия, рН 7,4 (табл. 33).
- 166 037557
Таблица 33. Последовательности мономерной молекулы человеческий 4-1BB-His
SEQ ID NO: Антиген Последовательность
94 нуклеотидная последовательность человеческого 4IBB-His CTGCAGGACCCCTGCAGCAACTGCCCTGCCGGCACCTTCTGCGACA ACAACCGGAACCAGATCTGCAGCCCCTGCCCCCCCAACAGCTTCAG CTCTGCCGGCGGACAGCGGACCTGCGACATCTGCAGACAGTGCAAG GGCGTGTTCAGAACCCGGAAAGAGTGCAGCAGCACCAGCAACGCC GAGTGCGACTGCACCCCCGGCTTCCATTGTCTGGGAGCCGGCTGCA GCATGTGCGAGCAGGACTGCAAGCAGGGCCAGGAACTGACCAAGA AGGGCTGCAAGGACTGCTGCTTCGGCACCTTCAACGACCAGAAGCG GGGCATCTGCCGGCCCTGGACCAACTGTAGCCTGGACGGCAAGAGC GTGCTGGTCAACGGCACCAAAGAACGGGACGTCGTGTGCGGCCCCA GCCCTGCTGATCTGTCTCCTGGGGCCAGCAGCGTGACCCCTCCTGCC CCTGCCAGAGAGCCTGGCCACTCTCCTCAGGTCGACGAACAGTTAT ATTTTCAGGGCGGCTCAGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAA GATCGAGTGGCACGAGGCTCGAGCTCACCACCATCACCATCAC
95 человеческий 4IBB-His LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVF RTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKD CCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSP GAS S VTPP АР AREPGHSPQ VDEQLYFQ GGS GLNDIFE AQKIEWHEARA НННННН
Пример 4.
Биохимическая характеризация нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающей молекулы с помощью поверхностного плазмонного резонанса.
Связывание нацеленных на FAP содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул с рекомбинантным 4-1ВВ оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Все эксперименты на основе SPR осуществляли с помощью устройства Biacore T100 при 25°С с использованием HBS-EP в качестве подвижного буфера (0,01М HEPES, pH 7,4, 0,15M NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% сурфактанта Р20, фирма Biacore, Фрейбург/Германия).
Авидность взаимодействия между нацеленными на FAP или ненацеленными содержащими тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающими молекулами и рекомбинантным 41ВВ (человека, обезьян циномолгус (cyno) и мышей) определяли согласно описанному ниже методу. Данные продемонстрировали, что как нацеленные содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающие молекулы, так и ненацеленные (DP47) содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающие молекулы связывались с сопоставимой авидностью с 4-1ВВ человека и обезьян циномолгус, но с очень низкой авидностью с мышиным гомологом.
Молекулы, содержащие рекомбинантный биотинилированный 4-1ВВ человека, обезьян циномолгус и мышей в слиянии с Fc(kih), непосредственно сшивали на SA-чипе, используя инструкцию по стандартному сочетанию (фирма Biacore, Фрейбург/Германия). Уровень иммобилизации соответствовал примерно 30 RU. Нацеленные на FAP содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающие молекулы или содержащие DP47 ненацеленные контрольные молекулы пропускали через проточные ячейки, используя диапазон концентраций от 0,39 до 200 нМ, со скоростью потока 30 мкл/мин в течение 120 с. Мониторинг диссоциации осуществляли в течение 180 с. Различия всех показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в пустой проточной референсячейке.
Для измерения аффинности осуществляли непосредственное сочетание до достижения уровня, соответствующего примерно 7200 резонансных единиц (RU), античеловеческого Fc-специфического антитела на СМ5-чипе при рН 5,0, используя стандартный набор для аминного сочетания (фирма GE Healthcare). Захватывали нацеленные на FAP или ненацеленные содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающие молекулы в концентрации 50 нМ при скорости потока 30 мкл/мин в течение 60 с на проточной ячейке 2. Серийные разведения (1,95-1000 нМ) человеческого 41ВВ-avi-His пропускали через обе проточные ячейки со скоростью 30 мкл/мин в течение 180 с для регистрации фазы ассоциации. Мониторинг фазы диссоциации осуществляли в течение 180 с и для запуска заменяли раствор образца на HBS-ЕР. Поверхность чипа регенерировали после каждого цикла, используя две инъекции по 60 с 10 мМ глицином-HCl, рН 2,1. Различия всех показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в проточной референс-ячейке 1. Для оценки взаимодействия между содержащими тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающими молекулами и hu4-1ВВ avi His, определяли константы аффинности на основе констант скорости путем подгонки кривых связывания к модели связывания 1: 1 Ленгмюра, используя программу Biaeval (фирма GE Healthcare).
- 167 037557
Таблица 34. Подгонка к модели связывания 1:1 Ленгмюра и константы аффинности
Лиганд Аналит ка (1/Мс) kd (1/с) KD (М)
«FAP разделенный тример 4-1BBL» (конструкция 1.1) hu4-lBB 4,8Е+04 2,6Е-02 5,5Е-07
«DP47 разделенный тример 4-1BBL» (контроль А) hu4-lBB 6,2Е+04 3,ЗЕ-02 5,2Е-07
Пример 5.
Функциональная характеризация нацеленных содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
5.1. Связывание с наивными в сравнении с активированными человеческими РМВС нацеленных на FAP содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул.
Лейкоцитарные пленки получали из центра донорской крови Цюриха. Для выделения свежих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) лейкоцитарную пленку разводили таким же объемом D-ЗФР (фирма Gibco by Life Technologies, каталожный № 14190 326). В 50-миллилитровые полипропиленовые центрифужные пробирки (фирма ТРР, каталожный № 91050) вносили 15 мл Histopaque 1077 (фирма SIGMA Life Science, каталожный № 10771, полисахароза (фиколл) и диатризоат натрия, плотность доведена до 1,077 г/мл) и наслаивали раствор разведенной лейкоцитарной пленки на Histopaque 1077. Пробирки центрифугировали в течение 30 мин при 400 х g. Затем РВМС собирали из интерфазы, промывали трижды D-ЗФР и ресуспендировали в среде для Т-клеток, состоящей из среды RPMI 1640 (фирма Gibco by Life Technology, каталожный № 42401-042), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, фирма Gibco by Life Technology, каталожный № 16000-044, партия 941273, обработана гамма-лучами, свободная от микоплазм и инактивированная тепловой обработкой при 56°С в течение 35 мин), 1 об.% GlutaMAX-I (фирма GIBCO by Life Technologies, каталожный № 35050 038), 1 мМ пируватом натрия (фирма SIGMA, каталожный № S8636), 1 об.% содержащей заменимые аминокислоты среды MEM (фирма SIGMA, каталожный № М7145) и 50 мкМ β-меркаптоэтанолом (фирма SIGMA, M3148).
РВМС использовали непосредственно после выделения или стимулировали для индукции экспрессии 4-1ВВ на клеточной поверхности Т- и NK-клеток путем культивирования в течение 4 дней в среде для Т-клеток, дополненной 200 ед./мл пролейкина (фирма Novartis Pharma Schweiz AG, CHCLB-P-476700-10340) и 2 мкг/мл PHA-L (фирма SIGMA, каталожный № L2769), в 6-луночном планшете для культуры ткани и затем в течение 1 дня в 6-луночном планшете для культуры ткани, сенсибилизированном 10 мкг/мл антитела к человеческому CD3 (клон ОКТ3, фирма BioLegend, каталожный № 317315) и 2 мкг/мл антитела к человеческому CD28 (клон CD28.2, фирма BioLegend, каталожный №: 302928), в среде для Т-клеток при 37°С и 5% СО2.
Для определения связывания содержащих тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул с человеческими РВМС 0,1 х 106 наивных или активированных РВМС добавляли в каждую лунку круглодонных 96-луночных планшетов для суспензионных клеток (фирма Greiner bio-one, Cellstar, каталожный № 650185). Планшеты центрифугировали в течение 4 мин при 400xg и 4°С. Супернатант отбрасывали. Затем клетки окрашивали, используя 100 мкл/лунку D-ЗФР, содержащего разведенный в соотношении 1:1000 краситель из набора LIVE/DEAD® с фиксирующим голубым красителем для мертвых клеток (Fixable Blue Dead Cell Stain) для УФ-возбуждения (фирма Life Technologies, Molecular Probes, L23105) или фиксирующий краситель для определения жизнеспособности eF660 (фирма eBioscience 650864-18) или краситель из набора LIVE/DEAD® с фиксирующим зеленым красителем для мертвых клеток (Fixable Green Dead Cell Stain) (фирма Life Technologies, Molecular Probes, L-23101), в течение 30 мин при 4°С в темноте. Если в качестве красителя LIVE/DEAD® применяли DAPI, то эту стадию пропускали. Клетки однократно промывали 200 мкл холодного FACS-буфера (D-ЗФР, дополненный 2 об.% FBS, 5 мМ ЭДТА, рН 8 (фирма Amresco, каталожный № Е177) и 7,5 мМ азидом натрия (фирма Sigma-Aldrich, S2002).
Затем добавляли 50 мкл/лунку холодного (4°С) FACS-буфера, содержащего различные определенные титрованием концентрации содержащих тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул, и клетки инкубировали в течение 120 мин при 4°С, промывали 4 раза 200 мкл/лунку при 4°С FACS-буфером и ресуспендировали. Клетки дополнительно окрашивали, используя 50 мкл/лунку холодного (4°С) FACS-буфера, содержащего 0,67 мкг/мл антитела к человеческому CD3-PerCP-Cy5.5 (клон UCHT1, IgG1K мыши, фирма BioLegend, каталожный № 300430) или 0,16 мкл антитела к человеческому CD3-PE/Cy7 (клон SP34-2, IgG1K мыши, фирма BD Pharmingen, каталожный № 557749, партия 33324597), 0,67 мкг/мл антитела к человеческому CD45-AF488 (клон HI30, IgG1K, мыши, фирма BioLegend, каталожный № 304017), или 0,12 мкг/мл антитела к человеческому CD56-ФИТЦ (клон NCAM16.2, IgG2bK мыши, фирма BD Pharmingen, каталожный № 345811), или 1 мкл антитела к человеческому CD56-APC (клон В159, IgG1K мыши, фирма BD Pharmingen, каталожный № 555518, партия 3098894), 0,25 мкг/мл антитела к человеческому CD4-BV421 (клон RPA-T4, IgG1K мыши, фирма BioLegend, каталожный № 300532), или 0,23 мкг/мл антитела к человеческому CD4-BV421 (клон OKT4, IgG2bK мыши, фирма BioLegend, каталожный № 317434), 0,25 мкл антитела к человеческому CD8a-АРС (клон RPA-T8, IgG1K мыши, фирма, BD Pharmingen, каталожный № 555369), или 0,67 мкл антитела к человеческому
- 168 037557
CD8a-APC/Cy7 (клон RPA-T8, IgG1K мыши, фирма BioLegend, каталожный № 301016), или 0,83 нг/мл антитела к человеческому CD8a-BV711 (клон RPA-T8, IgG1K мыши, фирма BD Pharmingen, каталожный № 301044) и 5 мкг/мл конъюгированного с РЕ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического AffmiPure (фирма Jackson ImmunoResearch, каталожный № 109116098 или 109116170). Клетки промывали дважды FACS-буфером. Если клетки окрашивали фиксирующим красителем для определения жизнеспособности, то их фиксировали с использованием 50 мкл/лунку D-ЗФР, содержащего 1% формальдегида (фирма Sigma, HT501320-9.5L). Клетки ресуспендировали в FACSбуфере и получали данные на следующий день или в этот же день с использованием устройства с 5 лазерами LSR-Fortessa (фирма BD Bioscience, снабженного программой DIVA) или анализатора с 3 лазерами Miltenyi Quant Analyzer 10 (фирма Mitenyi Biotec) и программы Flow Jo (FlowJo X 10.0.7). Если применяли окрашивание DAPI для обнаружения мертвых клеток, то их ресуспендировали в 80 мкл/лунку FACSбуфера, содержащего 0,2 мкг/мл DAPI (фирма Santa Cruz Biotec, каталожный № Sc-3598), и данные получали в тот же день с помощью устройства с 5 лазерами LSR-Fortessa (фирма BD Bioscience, снабженного программой DIVA).
Как продемонстрировано на фиг. 6, как нацеленные на FAP, так и ненацеленные содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы не связывались с покоящимися человеческими CD4+-Т-клетками и не отличались поддающимся обнаружению связыванием с покоящимися CD8+-Т-клетками и NK-клетками. В противоположность этому, обе конструкции сильно связывались с активированными NK, CD8+- или CD4+-Т-клетками, хотя для последних обнаружена примерно в 10 раз более низкая интенсивность специфической флуоресценции по сравнению с NK-клетками и в 20 раз пониженная интенсивность специфической флуоресценции по сравнению с CD8+-Т-клетками.
На фиг. 7А и 7Б продемонстрировано связывание конструкций 1.1-1.10, полученных согласно методу, описанному в примере 1, с экспрессирующими 4-1ВВ активированными человеческими CD3+CD8+Т-клетками и экспрессирующими 4-1ВВ активированными человеческими CD3+CD4+-Т-клетками соответственно. В табл. 35 представлены величины ЕС5о, полученные для конструкций 1.1-1.10.
Таблица 35. Связывание на активированных человеческих CD3+CD8+-Т-клетках и CD3+ CD4+-Т-клетках
Конструкция ЕС50 [нМ] 4-lBB+CD8+ ЕС50 [нМ] 4-lBB+CD4+
Контроль Б 0,11 16,21
1.1 0,43 4,99
1.2 0,18 20,79
1.3 0,07 2,82
1.4 0,19 0,34
1.5 0,17 2,67
1.6 0,19 0,95
1.7 0,26 16,47
1.8 0,14 2,77
1.9 0,18 12,92
1.10 0,12 0,3
На фиг. 8А и 8Б продемонстрировано связывание конструкций 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 и 2.6, полученных согласно методу, описанному в примере 2, на CD4+- и CD8+-клетках из свежей человеческой крови и на активированных экспрессирующих 4-1ВВ CD4+-Т-клетках и CD8+-Т-клетках соответственно. Дискриминационные окна устанавливали на живые CD45+CD3+CD4+- или CD45+CD3+CD8+-Т-клетки, и строили график зависимости MFI для конъюгированного с РЕ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического AffiniPure от определенных титрованием концентраций вариантов нацеленных содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc конструкций. В табл. 36 представлены величины ЕС50, полученные для конструкций 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 и 2.6.
Таблица 36. Связывание на активированных экспрессирующих 4-1ВВ CD4+-Т-клетках и CD8+-Т-клетках
Конструкция ЕС50 [нМ] 4-lBB+CD8+ ЕС50 [нМ] 4-lBB+CD4+
контроль Б 0,36 0,42
контроль В 0,39 0,41
контроль Д 0,57 0,76
2.1 0,21 0,24
2.3 0,44 0,3
2.4 0,3 0,38
2.5 0,35 0,68
2.6 0,33 0,24
5.2. Связывание нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc анти-
- 169 037557 генсвязывающей молекулы с активированными мышиными спленоцитами.
Мышиные селезенки собирали в 3 мл ЗФР и получали суспензию единичных клеток с использованием мягких пробирок MACS (фирма Miltenyi Biotec, каталожный № 130-096-334) и мягкого разрушителя MACS Octo (фирма Miltenyi Biotec). Затем спленоциты фильтровали через 30-мкметровые фильтры для предварительного разделения (фирма Miltenyi Biotec, каталожный № 130-041-407) и центрифугировали в течение 7 мин при 350 х g и 4°С. Супернатант удаляли аспирацией и клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640, дополненной 10 об.% FBS, 1 об.% GlutaMAX-I, 1 мМ пируватом натрия, 1 об.% содержащей заменимые аминокислоты среды MEM, 50 мкМ β-меркаптоэтанолом и 10% пенициллинастрептомицина (фирма SIGMA, каталожный № Р4333). Культивировали 106 клеток/мл в течение 2 дней в 6-луночном планшете для культуры ткани, сенсибилизированном 10 мкг/мл IgG армянского хомяка к мышиному CD3ε (клон 145-2С11, BioLegend, каталожный № 100331) и 2 мкг/мл IgG сирийского хомяка к мышиному CD28 (клон 37.51, фирма BioLegend, каталожный № 102102).
Активированные мышиные спленоциты собирали, промывали в D-ЗФР, подсчитывали количество клеток и 0,1х106 клеток переносили в каждую лунку 96-луночного планшета с U-образным дном, не обработанного тканевой культурой. Супернатант удаляли и клетки окрашивали, используя 100 мкл/лунку D-ЗФР, содержащего в разведении 1:5000 фиксирующий краситель для определения жизнеспособности eF660 (фирма Bioscience, каталожный № 65-0864-18) в течение 30 мин при 4°С. Клетки промывали ЗФР и окрашивали в 50 мкл FACS-буфера, содержащего в различных концентрациях нацеленных на FAP содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул (FAP разделенный тример 4-1BBL), ненацеленных содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул (DP47 разделенный тример 4-1BBL) или МАт к мышиному CD137 в виде человеческого IgG1 P329G LALA (клон Lob. 12.3, фирма BioXcell, каталожный № ВЕ0169). Клетки инкубировали в течение 120 мин при 4°С. Клетки промывали 4 раза FACS-буфером и окрашивали, используя 50 мкл/лунку FACS-буфера, содержащего 10 мкг/мл очищенного антитела к мышиному CD16/CD32 в виде крысиного IgG-Fc-Block (фирма BD Pharmingen, каталожный № 553142, клон 2.4G2), 5 мкг/мл антитела к мышиному CD8b в виде крысиного IgG2bκ-ФИТЦ (фирма BioLegend, каталожный № 126606, клон YTS156.7.7), 0,67 мкг/мл антитела к мышиному CD3 в виде крысиного IgG2bK-APC-Cy7 (фирма BioLegend, каталожный № 100222, клон 17А2), 0,67 мкг/мл антитела к мышиному CD4 в виде крысиного IgG2bK-PE-Cy7 (фирма BioLegend, каталожный № 100422, клон GK1.5), 2 мкг/мл антитела к мышиному NK1.1 (линия С3Н х BALB/c) в виде IgG2aK-PerCp-Cy5.5 (фирма BioLegend, каталожный № 108728, клон PK136) и 10 мкг/мл конъюгированного с РЕ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического AffmiPure, обладающего минимальной перекрестной реактивностью к бычьим, мышиным и кроличьим сывороточным белкам (фирма Jackson ImmunoResearch, каталожный № 109-116170), в течение 30 мин при 4°С. Клетки промывали дважды, используя 200 мкл/лунку холодного FACSбуфера. Клетки фиксировали, используя 50 мкл/лунку D-ЗФР, содержащего 1% формальдегида. Клетки ресуспендировали в FACS-буфере и получали данные на следующий день с помощью устройства с 5 лазерами LSR-Fortessa (фирма BD Bioscience, снабженного программой DIVA).
Как продемонстрировано на фиг. 9, нацеленные на FAP содержащие тримерный лиганд для hu41BB в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы (FAP разделенный тример hu4-1BBL) и ненацеленные содержащие тримерный лиганд для hu4-1BB в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы (DP47 разделенный тример hu4-1BBL) не связывались с мышиным 4-1ВВ. Поэтому активность не удалось протестировать в иммунокомпетентных мышах. Для изучения механизма действия in vivo следует применять либо гуманизированные мышиные модели, созданные на иммунонекомпетентных мышах, либо суррогатные молекулы, содержащие тримеры мышиного 4-1BBL, показанные на фиг. 3.
5.3. Связывание с экспрессирующими FAP опухолевыми клетками.
Для анализов связывания на экпрессирующих FAP клетках применяли клеточную линию человеческой меланомы MV-3 (см. Ruiter и др., Int. J. Cancer, 48(1), 1991, cc. 85-91), WM-266-4 (ATTC CRL-1676) или клеточную линию NIH/3T3-huFAP, клон 39. Для создания последней клеточной линии клетки NIH/3T3 трансфектировали человеческим FAP (NIH/3T3-huFAP, клон 39). Клетки создавали путем трансфекции фибробластов мышиных эмбрионов NIH/3T3 (АТСС CRL-1658) экспрессирующей pETR4921 плазмидой, кодирующей человеческий FAP под контролем промотора CMV. Клетки поддерживали в присутствии 1,5 мкг/мл пуромицина (фирма InvivoGen, каталожный №: ant-pr-5). Добавляли 0,1 х106 экспрессирующих FAP опухолевых клеток в каждую лунку круглодонных 96-луночных планшетов для суспензионных клеток (фирма Greiner bio-one, cellstar, каталожный № 650185).
Клетки однократно промывали 200 мкл D-ЗФР и дебрис ресуспендировали. Добавляли 100 мкл/лунку холодного (4°С) D-ЗФР-буфера, содержащего в разведении 1:5000 фиксирующий краситель для определения жизнеспособности eFluor 450 (фирма eBioscience, каталожный № 65-0863-18) или фиксирующий краситель для определения жизнеспособности eFluor 660 (фирма eBioscience, каталожный № 65-0864-18), и планшеты инкубировали в течение 30 мин при 4°С. Клетки однократно промывали 200 мкл холодного (4°С) D-ЗФР-буфера и ресуспендировали, используя 50 мкл/лунку холодного (4°С) FACSбуфера (D-ЗФР, дополненный 2 об.% FBS, 5 мМ ЭДТА, рН 8 (фирма Amresco, каталожный № Е177) и 7,5
- 170 037557 мМ азидом натрия (фирма Sigma-Aldrich S2002), который содержал в различных полученных титрованием концентрациях содержащих тример 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы, с последующей инкубацией в течение 1 ч при 4°С. После 4 промывок с использованием 200 мкл/лунку клетки окрашивали, применяя 50 мкл/лунку холодного (4°С) FACS-буфера, содержащего 30 мкг/мл конъюгированного с ФИТЦ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического AffiniPure (фирма Jackson ImmunoResearch, каталожный № 109-096-098) или 5 мкг/мл конъюгированного с РЕ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического AffiniPure (фирма Jackson ImmunoResearch, каталожный № 109-116-098 или 109-116-170), в течение 30 мин при 4°С. Клетки промывали дважды 200 мкл (4°С) FACS-буфера и затем ресуспендировали в 50 мкл/лунку D-ЗФР, содержащего 1% формальдегида. В этот же или на следующий день клетки ресуспендировали в 100 мкл FACSбуфера и данные получали с помощью устройства с 5 лазерами LSR-Fortessa (фирма BD Bioscience, снабженного программой DIVA) или анализатора с 3 лазерами Miltenyi Quant Analyzer 10 (фирма Mitenyi Biotec) и программы Flow Jo (FlowJo X 10.0.7). Как продемонстрировано на фиг. 10, нацеленная на FAP содержащая тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) антигенсвязывающая молекула (FAP разделенный тример 4-1BBL) (конструкция 1.1), в отличие от ненацеленной содержащей DP47-Fab конструкции (DP47 разделенный тример 4-1BBL), т.е. контроль А, эффективно связывалась с экспрессирующими человеческий фибробласт-активирующий белок (FAP) клетками меланомы MV-3 (10А) или клетками WM-266-4 (10Б).
На фиг. 11А показано связывание конструкций 1.1-1.10, полученных согласно методу, описанному в примере 1, с экспрессирующими человеческий FAP клетками человеческой меланомы MV-3, а на фиг. 11Б показано связывание конструкций 1.1., 1.2, 1.3 и 1.5 с экспрессирующими человеческий FAP трансфектированными клетками эмбриональных мышиных фибробластов клетками NIH/3T3-huFAP, клон 39. В табл. 37 представлены величины ЕС50, полученные для конструкций 1.1-1.10.
Таблица 37. Связывание с экспрессирующими человеческий FAP опухолевыми клетками
Конструкция ЕС50 [нМ] FAP+ MV-3 ЕС5о [нМ] NIH/3T3-hu FAP
1.1 4,14 12,2
1.2 5,36 9,35
1.3 - 14,97
1.4 5,13 -
1.5 0,53 10,06
1.6 8,16 -
1.7 4,09 -
1.8 2,79 -
1.9 4,22 -
1.10 4,31 -
На фиг. 12 продемонстрировано связывание различных нацеленных на FAP (4В9) или ненацеленных содержащих разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций с экспрессирующими человеческий FAP клетками человеческой меланомы MV-3 (фиг. 12А) и клетками WM266-4 (фиг. 12Б). Конструкции 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 и 2.6 получали согласно методу, описанному в примере 2, а контроли получали согласно методу, указанному выше в настоящем описании. Дискриминационные окна устанавливали на живые опухолевые клетки и строили график зависимости MFI для конъюгированного с РЕ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического AffiniPure от определенных титрованием концентраций нацеленных содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc конструкций. В табл. 38 представлены полученные величины EC50.
Таблица 38. Связывание с экспрессирующими человеческий FAP опухолевыми клетками
Конструкция ЕС50 [нМ] FAP+ MV-3 ЕС50 [нМ] FAP+ WM-266-4
2.1 1,66 0,99
2.3 0,53 0,42
2.4 0,83 0,59
2.5 1,66 Е2
5.4. Функциональная характеризация нацеленных содержащих тримерный мышиный лиганд для 41ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул.
5.4.1. Связывание с активированными мышиными спленоцитами.
Мышиные селезенки собирали в 3 мл ЗФР и получали суспензию единичных клеток с использованием пробирок gentleMACS (фирма Miltenyi Biotec, каталожный № 130-096-334) и диссоциатора gentleMACS Octo (фирма Miltenyi Biotec). Затем спленоциты фильтровали через 30-мкметровые фильтры для предварительного разделения (фирма Miltenyi Biotec, каталожный № 130-041-407) и центрифугировали в течение 7 мин при 350xg и 4°С. Супернатант удаляли аспирацией и клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640, дополненной 10 об.% FBS, 1 об.% GlutaMAX-I, 1 мМ пируватом натрия, 1 об.% содержащей заменимые аминокислоты среды MEM, 50 мкМ β-меркаптоэтанолом.
- 171 037557
Для связывания использовали непосредственно свежевыделенные мышиные спленоциты. Для индукции экспрессии мышиного 4-1ВВ на Т-клетках мышиные спленоциты активировали следующим образом: 106 клеток/мл культивировали в течение 2 дней в 6-луночном планшете для культуры ткани, сенсибилизированным 10 мкг/мл IgG армянского хомяка к мышиному CD3ε (клон 145-2С11, BioLegend, каталожный № 100331) и 2 мкг/мл IgG сирийского хомяка к мышиному CD28 (клон 37.51, фирма BioLegend, каталожный № 102102).
Свежевыделенные мышиные спленоциты или активированные мышиные спленоциты собирали, промывали в D-ЗФР (фирма Gibco life technologies, каталожный № 14190-136), подсчитывали количество клеток и 0,1 х106 клеток переносили в каждую лунку 96-луночного планшета с U-образным дном, не обработанного тканевой культурой. Супернатант удаляли и клетки окрашивали, используя 100 мкл/лунку холодного (4°С) D-ЗФР, содержащего в разведении 1:1000 краситель из набора LIVE/DEAD® с фиксирующим водным красителем для мертвых клеток (Fixable Aqua Dead Cell Stain) (фирма Life Technologies, L34957), в течение 30 мин при 4°С. Клетки промывали холодным D-ЗФР и окрашивали, используя 50 мкл/лунку холодного FACS-буфера (D-ЗФР, дополненный 2 об.% FBS, 5 мМ ЭДТА, рН 8 (фирма Amresco, каталожный № Е177) и 7,5 мМ азидом натрия (фирма Sigma-Aldrich S2002)), который содержал в различных концентрациях молекулы, содержащие тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih), или IgG1K мыши, применяемый в качестве контроля изотипа (фирма BioLegend, каталожный № 400153, клон МОРС-21). Клетки инкубировали в течение 120 мин при 4°С, промывали 4 раза холодным D-ЗФР и окрашивали, используя 50 мкл/лунку холодного FACS-буфера, содержащего 30 мкг/мл конъюгированного с ФИТЦ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против мышиного IgG, FcY-специфического (фирма Jackson Immunoresearch, каталожный № 115-096-071), в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки промывали дважды холодным D-ЗФР и окрашивали, используя 50 мкл/лунку FACS-буфера, дополненного 10 мкг/мл очищенного антитела к мышиному CD16/CD32 в виде крысиного IgG-Fc-Block (фирма BD Pharmingen, каталожный № 553142, клон 2.4G2), 0,67 мкг/мл антитела к мышиному CD8a-АРС-Су7 (фирма BioLegend, каталожный № 100714, клон 53-6.7), 0,67 мкг/мл антитела к мышиному CD3ε-PerCP-Cy5.5 (фирма BioLegend, каталожный № 100328, клон 145-2С11), 0,67 мкг/мл антитела к мышиному CD4 в виде крысиного IgG2bK-PE-Cy7 (фирма BioLegend, каталожный № 100422, клон GK1.5), в течение 30 мин при 4°С. Клетки промывали дважды, используя 200 мкл/лунку холодного D-ЗФР, фиксировали, применяя 50 мкл/лунку D-ЗФР, содержащего 1% формальдегида, и ресуспендировали в FACS-буфере. Данные для клеток получали с помощью анализатора с 3 лазерами MACSQuant 10 (фирма Mitenyi Biotec) и программы Flow Jo v10.0.7 (фирма FlowJo LLC). Дискриминационные окна устанавливали на CD3+CD8+- или CD3+CD4+-Т-клетки и анализировали медианное значение интенсивности флуоресценции (MFI) для конъюгированного с ФИТЦ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против мышиного IgG, FcY-специфического AffiniPure и стандартизовали путем вычитания MFI для пустого контроля (без добавления содержащей тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) молекулы). Строили график зависимости значений MFI от концентрации применяемых содержащих тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) молекул для характеризации связывания с клеткой, с которой связана молекула мышиного 4-1ВВ.
Как продемонстрировано на фиг. 13, содержащие мышиный 4-1BBL конструкции M.1 и М.2, а также соответствующие контрольные молекулы (контроль М.1 и контроль М.2) связывались практически с одинаковой аффинностью с мышиным 4-1ВВ. В табл. 39 представлены полученные величины ЕС50 для конструкций M.1 и М.2 и контрольных молекул.
Таблица 39. Связывание на активированных экспрессирующих 4-1ВВ CD4+-Т-клетках и CD8+-Т-клетках
Конструкция ЕС50 [нМ] 4-lBB+CD8+ ЕС50 [нМ] 4-lBB+CD4+
контроль М.1 0,95 0,74
М.1 0,87 0,52
контроль М.2 0,78 0,6
М.2 0,54 0,42
5.4.2. Связывание на экспрессирующих FAP опухолевых клетках Для анализов связывания на экпрессирующих FAP клетках применяли клеточную линию человеческой меланомы MV-3 (см. Ruiter и др., Int. J. Cancer, 48(1), 1991, cc. 85-91), WM-266-4 (ATTC CRL-1676) (анти-FAP-специфический клон 28Н1 обладает перекрестной реактивность к мышиному/человеческому антигену). Добавляли 0,1 х106 экспрессирующих FAP опухолевых клеток в каждую лунку круглодонных 96-луночных планшетов для суспензионных клеток (фирма Greiner bio-one, Cellstar, каталожный № 650185). Клетки однократно промывали 200 мкл D-ЗФР и дебрис ресуспендировали в 100 мкл/лунку холодного (4°С) D-ЗФР-буфера, содержащего в разведении 1: 1000 краситель из набора LIVE/DEAD® с фиксирующим водным красителем для мертвых клеток (Fixable Aqua Dead Cell Stain) (фирма Life Technologies, L34957), и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. Клетки однократно промывали 200 мкл холодного (4°С) D-ЗФР-буфера и ресуспендировали, используя 50 мкл/лунку холодного (4°С) FACS-буфера (D-ЗФР, дополненный 2 об.% FBS,
- 172 037557 мМ ЭДТА, рН 8 (фирма Amresco, каталожный № Е177) и 7,5 мМ азидом натрия (фирма Sigma-Aldrich S2002), который включал в полученных серийными разведениями концентрациях молекулы, содержащие тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih), с последующей инкубацией в течение 1 ч при 4°С. После 4 промывок с использованием 200 мкл/лунку клетки окрашивали, применяя 50 мкл/лунку холодного (4°С) FACS- буфера, содержащего 30 мкг/мл конъюгированного с ФИТЦ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против мышиного IgG, Fcγ-специфического (фирма Jackson ImmunoResearch, каталожный № 115-096-071), в течение 30 мин при 4°С. Клетки промывали дважды 200 мкл (4°С) FACS-буфера, фиксировали, используя 50 мкл/лунку D-ЗФР, содержащего 1% формальдегида, и ресуспендировали в FACSбуфере. Данные для клеток получали с помощью анализатора с 3 лазерами MACSQuant 10 (фирма Mitenyi Biotec) и программы Flow Jo (FlowJo X 10.0.7). Дискриминационные окна устанавливали на живые клетки и анализировали медианное значение интенсивности флуоресценции (MFI) для конъюгированного с ФИТЦ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против мышиного IgG, Fcy-специфического и стандартизовали путем вычитания MFI для пустого контроля (без добавления содержащей тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) молекулы). Строили график зависимости значений MFI от концентрации применяемых содержащих тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) молекул для характеризации связывания с клеткой, с которой связана молекула мышиного 4-1ВВ. Как и ожидалось, содержащие мышиный 4-1BBL конструкции М.1 и М.2, связывались практически с одинаковой аффинностью с FAP, в то время как контрольные молекулы не связывались с ним.
На фиг. 14 показано связывание нацеленных на FAP или ненацеленных содержащих разделенный тримерный мышиный лиганд для 4-1BB-Fc (kih) конструкций М.1 и М.2 с экспрессирующими человеческий FAP клетками человеческой меланомы MV-3 (фиг. 14А) и клетками WM-266-4 (фиг. 14Б). В табл. 40 представлены полученные величины EC50.
Таблица 40. Связывание с экспрессирующими человеческий FAP опухолевыми клетками
Конструкция ЕС50 [нМ] FAP+ MV-3 ЕС5о [нМ] FAP+ WM-266-4
М.1 7,26 5,14
М.2 6,9 5,63
Пример 6.
Биологическая активность нацеленных содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
6.1. Активация NF-кВ в клетках HeLa, экспрессирующих человеческий 4-1ВВ.
Создание клеток HeLa, экспрессирующих человеческий 4-1ВВ и NF-KB-люциферазу.
Клеточную линию карциномы шейки матки HeLa (ATCC CCL-2) трансдуцировали плазмидой, основой которой является экспрессионный вектор pETR10829, содержащий последовательность человеческого 4-1ВВ (Uniprot, код доступа Q07011) под контролем промотора CMV, и ген, обусловливающий устойчивость к пуромицину. Клетки культивировали в среде DMEM, дополненной 10 об.% FBS, 1 об.% GlutaMAX-I и 3 мкг/мл пуромицина.
Трансдуцированные 4-1ВВ клетки HeLa тестировали в отношении экспрессии 4-1ВВ с помощью проточной цитометрии: 0,2х106 живых клеток ресуспендировали в 100 мкл FACS-буфера, содержащего 0,1 мкг конъюгированного с PerCP/Су5.5 мышиного IgG1K, клон 4В4-1 к человеческому 4-1ВВ (BioLegend, каталожный № 309814) или контроль изотипа (конъюгированное с PerCP/Су5.5 применяемое в качестве контроля изотипа мышиное антитело IgG1K, клон МОРС-21, фирма BioLegend, каталожный № 400150), и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. Клетки промывали дважды FACS-буфером, ресуспендировали в 300 мкл FACS-буфера, содержащего 0,06 мкг DAPI (фирма Santa Cruz Biotec, каталожный № Sc-3598), и данные получали с использованием устройства с 5 лазерами LSR-Fortessa (фирма BD Bioscience, программа DIVA). Осуществляли серийные разведения для создания единичных клонов с использованием следующего метода: трансдуцированные человеческим 4-1ВВ клетки HeLa ресуспендировали в среде до достижения плотности 10, 5 и 2,5 клеток/мл и 200 мкл клеточных суспензий переносили в обработанные круглодонные 96-луночные планшеты для культуры ткани (6 планшетов на каждую плотность клеток, фирма ТРР, каталожный № 92697). Единичные клоны собирали, размножали и тестировали в отношении экспрессии 4-1ВВ согласно описанному выше методу. Клон с наиболее высоким уровнем экспрессии 4-1ВВ (клон 5) отбирали для последующей трансфекции экспрессионным вектором для NF-кВ-люциферазы 5495p Tranlucent HygB. Вектор придавал трансфектированным клеткам как устойчивость к гигромицину В, так и способность экспрессировать люциферазу под контролем NF-kBреагирующего элемента (каркасный вектор фирмы Panomics, каталожный № LR0051 с интродуцированной устойчивостью к НуВ). Клон 5 клеток HeLa с человеческим 4-1ВВ культивировали до 70% конфлюэнтности. Вносили 50 мкг (40 мкл) линеаризированного (с помощью рестриктаз AseI и SalI) экспрессионного вектора 5495р Tranlucent HygB в кювету модульной системы для электропорации Gene Pulser/MicroPulser с 0,4-сантиметровой щелью (фирма Biorad, каталожный № 65-2081). Добавляли 2,5х106 клеток клона 5 HeLa с человеческим 4-1ВВ в 400 мкл среды DMEM без добавок и осторожно перемешивали с раствором плазмиды. Трансфекцию клеток осуществляли с помощью общей системы Gene Pulser
- 173 037557
Xcell (фирма Biorad, каталожный № 165-2660), применяя следующие установки: экспоненциальный импульс, емкость 500 мкФ, напряжение 160 В, сопротивлениее да. Немедленно после импульсной обработки трансфектированные клетки переносили в 75 см2-колбу для культуры ткани (фирма ТРР, каталожный № 90075) с 15 мл теплой (37°С) среды DMEM, дополненной 10 об.% FBS и 1 об.% GlutaMAX-I. На следующий день добавляли культуральную среду, содержащую 3 мкг/мл пуромицина и 200 мкг/мл гигромицина В (фирма Roche, каталожный № 10843555001). Выжившие клетки размножали и осуществляли их серийное разведение согласно описанному выше методу с получением единичных клонов.
Клоны тестировали в отношении экспрессии 4-1ВВ согласно описанному выше методу и в отношении NF-кВ-люциферазной активности следующим образом: клоны собирали в селекционной среде и подсчитывали с помощью устройства Cell Counter Vi-cell xr 2.03 (фирма Beckman Coulter, каталожный № 731050). Плотность клеток доводили до 0,33x106 клеток/мл и 150 мкл указанной клеточной суспензии переносили в каждую лунку стерильного белого плоскодонного 96-луночного планшета для культуры ткани с крышкой (фирма Greiner bio-one, каталожный № 655083) и в качестве контроля - в обычный плоскодонный 96-луночный планшет для культуры ткани (фирма ТРР, каталожный № 92096) для определения выживаемости и плотности клеток на следующий день. Клетки инкубировали при 37°С и 5% СО2 в течение ночи. На следующий день добавляли 50 мкл среды, содержащей в различных концентрациях рекомбинантный человеческий фактор некроза опухоли альфа (rhTNF-α, фирма PeproTech, каталожный № 300-01 А), в каждую лунку 96-луночного планшета, получая конечную концентрацию rhTNFα 100, 50, 25, 12,5, 6,25 и 0 нг/лунку. Клетки инкубировали в течение 6 ч при 37°С и 5% СО2 и затем промывали три раза, применяя 200 мкл/лунку D-ЗФР. Добавляли репортерный буфер для лизиса (фирма Promega, каталожный № Е3971) в каждую лунку (40 мкл) и планшеты выдерживали в течение ночи при 20°С. На следующий день планшеты с замороженными клетками и идентифицирующий буфер (система для анализа люциферазы 1000, фирма Promega, каталожный № Е4550) подвергали оттаиванию, доводя до комнатной температуры. Добавляли 100 мкл идентифицирующего буфера в каждую лунку и планшет анализировали максимально быстро с использованием ридера для микропланшетов SpectraMax М5/М5е и программы SoftMax Pro (фирма Molecular Devices). Измеренные единицы испускаемого света в течение 500 мс/лунку (URL), превышающие контроль (без добавления rhTNF-α), принимали за люциферазную активность. Для дальнейшего исследования был отобран клон 26 NF-KB-luc-4-1BB-HeLa, характеризующийся наиболее высокой люциферазной активностью и значительным уровнем экспрессии 4-1ВВ.
Активация NF-кВ В клетках Hela, экспрессирующих человеческий 4-1ВВ, при совместном культивировании с экспрессирующими FAP опухолевыми клетками.
Клетки HeLa, экспресссирующие NF-кВ-люциферазу и человеческий 4-1ВВ, собирали и ресуспендировали в среде DMEM, дополненной 10 об.% FBS и 1 об.% GlutaMAX-I, до концентраций 0,2x106 клеток/мл. 100 мкл (2x104 клеток) указанной клеточной суспензии переносили в каждую лунку стерильного белого плоскодонного 96-луночного планшета для культуры ткани с крышкой (фирма Greiner bio-one, каталожный № 655083) и планшет инкубировали при 37°С и 5% СО2 в течение ночи. На следующий день добавляли 50 мкл среды, содержащей в концентрациях, определенных титрованием, нацеленные на FAP содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы (FAP разделенный тример 4-1BBL) или ненацеленные (DP47) содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы (DP47 разделенный тример 4-1BBL). Экспрессирующие FAP опухолевые клетки (MV3, WM-266-4 или NIH/3T3-huFAP, клон 39) ресуспендировали в среде DMEM, дополненной 10 об.% FBS и 1 об.% GlutaMAX-I, до концентрации 2x106 клеток/мл.
Суспензию экспрессирующих FAP опухолевых клеток (50 мкл, конечное соотношение 1:5) или только среду добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение 6 ч при 37°С и 5% СО2. Клетки промывали два раза 200 мкл/лунку D-ЗФР. Добавляли в каждую лунку 40 мкл свежеприготовленного репортерного буфера для лизиса (фирма Promega, каталожный № Е3971) и планшет выдерживали в течение ночи при -20°С. На следующий день планшеты с замороженными клетками и идентифицирующий буфер (система для анализа люциферазы 1000, фирма Promega, каталожный № Е4550) подвергали оттаиванию, доводя до комнатной температуры. Добавляли 100 мкл идентифицирующего буфера в каждую лунку и максимально быстро измеряли люциферазную активность с помощью ридера для микропланшетов SpectraMax М5/М5е и программы SoftMax Pro (фирма Molecular Devices), подсчитывая испускание света в URL (единицы испускаемого света в течение 0,5 с/лунку), или с помощью планшетридера для считывания нескольких меток Victor3 1420 (multilabel counter plate reader) (фирма Perkin Elmer) и программы Perkin Elmer 2030 Manager, определяя испускание света в виде импульсов в секунду (CPS), и строили график зависимости от концентрации тестируемых конструкций.
Нацеленная на FAP содержащая тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающая молекула (FAP разделенный тример 4-1BBL) инициировала активацию пути передачи сигналов NFkB в репортерной клеточной линии в присутствии экспрессирующих FAP опухолевых клеток. В противоположность этому, ненацеленный вариант такой же молекулы не инициировал такое же действие при применении в любых тестируемых концентрациях (фиг. 16). Указанная активность нацеленного 4-1BBL строго зависела от экспрессии FAP на клеточной поверхности опухолевых клеток, поскольку никакой
- 174 037557 активации NF-κΒ не удалось обнаружить при культивировании NF-кВ-репортерной клеточной линии с
FAP-негативными опухолевыми клетками даже в присутствии нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающей молекулы.
Данные об измеренной активности конструкций 1.1-1.10 представлены на 17, а данные, полученные для конструкций 2.1, 2.4 и 2.5, представлены на фиг. 18.
6.2. Активация NFkB в клетках HEK Т293, экспрессирующих 4-1ВВ обезьян циномолгус.
Создание клеток HEK Т293, экспрессирующих 4-1ВВ обезьян циномолгус и NFKB-люциферазу.
Для получения вирусоподобных частиц (VLP) клетки почки человеческого эмбриона (HEK) Т293/17 (АТСС CRL-11268) трансфектировали с использованием реагента Lipofectamine® LTX с реагентом PLUS™ (фирма Life Technologies, каталожный № 15338100) в сочетании с вектором pETR14372, кодирующим кассету репортерного гена NFκВ-люцифераза-IRIS-GFP (NFkB-Iuc-GFP) согласно протоколу производителя. Через 6 ч осуществляли замещение средой DMEM, дополненной 10% FBS, и VLP собирали через 4 дня. Свежие клетки HEK 293Т трансдуцировали при конфлюэнтности 70-80% с помощью полученной конструкции pETR14372-VLP и 4 мкг/мл полибрена. Клетки культивировали в течение 24 ч и осуществляли замену среды. Трансдуцированные клетки HEK Т293/17 собирали и серийно разводили до получения 1 клетки/лунку для скрининга в отношении стабильных единичных клонов. Единичные клоны стимулировали 25 нг/мл TNF-α (фирма PeproTech Inc., каталожный № 300-01А) в среде и подвергали скринингу в отношении положительного GFP-сигнала в течение времени с использовании системы для флуоресцентной микроскопии Incuyte Zoom (фирма Essen Bioscience). После регистрации GFPсигнала клетки тестировали в отношении люциферазной активности с помощью набора для оценки люциферазы Nano Glo (фирма Promega, N1120) согласно протоколу производителя. Люциферазную активность измеряли с помощью планшет-ридера для считывания нескольких меток Victor3 1420 (фирма Perkin Elmer) и программы Perkin Elmer 2030 Manager. Определяли испускание света в виде импульсов в секунду (CPS) в течение 0,5 с/лунку. Установлено, что клон 61 отличается наиболее высоким уровнем экспрессии GFP и люциферазы после активации TNF-α, и его также использовали для создания репортерной линии клеток.
С помощью описанного выше метода получали новые VLP с использованием вектора pETR14879, кодирующего 4-1ВВ обезьян циномолгус и ген устойчивости к пуромицину, и клеточную линию HEK 293Т NFKB-fluc-GFP, клон 61 трансдуцировали при конфлюэнтности 70-80% полученной конструкции pETR14879-VLP и 4 мкг/мл полибрена. Клетки культивировали в течение 24 ч и осуществляли обмен среды. Через 4 дня после трансдукции клетки окрашивали конъюгированным с РЕ античеловеческим, дающим перекрестную реакцию с 4-1ВВ обезьян циномогус антителом (мышиный IgG1K, клон МОРС21, фирма BioLegend, каталожный № 309804) в D-ЗФР, содержащем 1% FBS, осуществляли сортинг с помощью FACS (ARIA, фирма BD) и высевали из расчета 5 клеток/лунку в среду DMEM, дополненную 10% FBS, которая содержала 1 мкг/мл пуромицина (фирма InvivoGen, каталожный № ant-pr). Выращенные клоны тестировали согласно методу, описанному для оценки GFP и люциферазной активности, после стимуляции TNF-α и в отношении высокого уровня экспрессии 4-1ВВ обезьян циномолгус с помощью проточной цитометрии. Дважды позитивные клоны отбирали и тестировали в отношении люциферазной активности в присутствии одновалентной нацеленной на FAP конструкции 2.1 или контроля Б и FAP-экспрессирующих клеток MV-3 или WM-266-4 клетки. Был отобран HEK T293/17-NF-kB-1uc-GFPcy4-1BB-эксnрессирующий клон 61-13 для применения во всех дополнительных экспериментах.
Активация NFkB в репортерных клетках HEK Т293/17, экспрессирующих 4-1ВВ обезьян циномолгус, при совместном культивировании с экспрессирующими FAP опухолевыми клетками.
Клетки HEK T293/17-NFκB-luc-GFP-cy4-1BB-экспрессuрующего клона 61-13, собирали и ресуспендировали в среде DMEM, дополненной 10 об.% FBS и 1 об.% GlutaMAX-I, до достижения концентрации 0,2x106 клеток/мл. 100 мкл (2x104 клеток) указанной клеточной суспензии переносили в каждую лунку стерильного белого плоскодонного 96-луночного планшета для культуры ткани с крышкой (фирма Greiner bio-one, каталожный № 655083) и планшет инкубировали при 37°С и 5% СО2 в течение ночи. На следующий день добавляли 50 мкл среды, содержащей в различных концентрациях, полученных титрованием, нацеленные на FAP или ненацеленные содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы. Экспрессирующие FAP опухолевые клетки (MV3 и WM-266-4) ресуспендировали в среде до достижения концентрации 2x106 клеток/мл. Суспензию экспрессирующих FAP опухолевых клеток (50 мкл) добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение 6 ч при 37°С и 5% СО2. Принцип анализа проиллюстрирован на фиг. 19. После инкубации клетки промывали три раза 200 мкл/лунку D-ЗФР. Добавляли в каждую лунку 40 мкл свежеприготовленного репортерного буфера для лизиса (фирма Promega, каталожный № Е3971) и планшеты выдерживали в течение ночи при 20°С. На следующий день планшеты с замороженными клетками и идентифицирующий буфер (система для анализа люциферазы 1000, фирма Promega, каталожный № Е4550) подвергали оттаиванию, доводя до комнатной температуры. Добавляли 100 мкл идентифицирующего буфера в каждую лунку и максимально быстро измеряли люциферазную активность с использованием ридера для микропланшетов SpectraMax M5/M5e (время интегрирования 500 мс, без фильтра, учитывая все длины волн) (фирма Molecular
- 175 037557
Devices). Определяли испускание света в единицах испускаемого света (URL) в течение 0,5 с/лунку и строили график зависимости от концентрации тестируемых конструкций, т.е. нацеленных на FAP или ненацеленных содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул. Результаты для конструкций, описанных в примере 2, представлены на фиг. 20.
6.3. Анализ на основе антигенспецифических CD8+-Т-клеток.
Выделение и культивирование антигенспецифических CD8-Т-клеток.
Образцы свежей крови получали из инфицированного HLA-A2+ CMV добровольца. РВМС выделяли согласно описанному выше методу. CD8-Т-клетки очищали из РВМС, применяя набор для выделения с использованием негативной селекции человеческих CD8-T-клеток согласно рекомендациям производителя (фирма Miltenyi Biotec, каталожный № 130-094-156). 10 млн выделенных CD8-T-клеток ресуспендировали в 1 мл стерильного D-ЗФР, дополненного 1 об.% FBS, вместе с 50 мкл меченного РЕ HLA-A2пентамера, содержащего полученный из CMV пептид NLVPMVATV (фирма ProImmune, каталожный № F008-2B), и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки промывали дважды 3 мл стерильного D-ЗФР, дополненного 1 об.% FBS. Клетки ресуспендировали в 1 мл D-ЗФР, дополненного 1 об.% FBS, содержащего 1 мкг/мл антитела к человеческому CD8-ФИТЦ (клон LT8, фирма Abcam, каталожный № Ab28010), и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. Клетки промывали дважды, ресуспендировали до концентрации 5x106 клеток/мл в D-ЗФР, дополненном 1 об.% FBS, и фильтровали через предназначенное для предварительного разделения 30-микрометровое клеточное сито в виде нейлоновой сети (фирма Miltenyi Biotec, каталожный № 130-041-407). Специфические для NLV-пептида CD8+-Tклетки выделяли с помощью FACS-сортинга, используя клеточный сортер ARIA (фирма BD Bioscience с программой DIVA), согласно следующим установкам: 100-микрометровое сопло и маска чистоты сортировки. Отсортированные клетки собирали в 15-миллилитровую полипропиленовую центрифужную пробирку (фирма ТРР, каталожный № 91015), содержащую 5 мл среды RPMI 1640, дополненной 10 об.% FBS, 1 об.% GlutaMAX-I и 400 ед./мл пролейкина. Отсортированные клетки центрифугировали в течение 7 мин при 350xg при комнатной температуре и ресуспендировали в такой же среде до концентрации 0,53x106 клеток/мл. Добавляли 100 мкл/лунку указанной клеточной суспензии в каждую лунку предварительно подготовленного фидер-планшета.
Активированные PHA-L облученные аллогенные фидерные клетки получали из РВМС согласно описанному ранее методу (Levitsky и др., 1998) и распределяли в 96-луночные культуральные планшеты из расчета 2x 105 фидерных клеток на лунку.
После культивирования в течение 1 дня удаляли 100 мкл среды/лунку из лунки, содержащей отсортированные CD8+-Т-клетки, и заменяли свежей средой RPMI 1640, дополненной 10 об.% FBS и 1 об.% GlutaMAX-I и 400 ед./мл пролейкина, во время культивированная эту процедуру регулярно повторяли (каждые 2-4 дня). Сразу после того как начиналась пролиферация клеток, их переносили в 24-луночный плоскодонный планшет для культуры ткани (фирма ТРР, 92024). Клетки регулярно размножали/расщепляли и реактивировали с использованием нового препарата фидерных клеток.
Анализ активации антигенспецифических CD8+-Т-клеток.
MV3-клетки собирали и промывали D-ЗФР и 2x 107 клеток ресуспендировали в 250 мкл разбавителя С из набора для оценки флуоресценции PKH-26 Red Fluorescence Cell linker (фирма Sigma, каталожный № PKH26GL). 1 мкл раствора PKH26-Red-stain разводили 250 мкл разбавителя С и добавляли к суспензии MV3-клеток, которую затем инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре в темноте. После этого добавляли 0,5 мл FBS и клетки инкубировали в течение 1 мин и промывали однократно средой для Т-клеток, состоящей из среды RPMI 1640, дополненной 10 об.% FBS, 1 об.% GlutaMAX-I, 1мМ пируватом натрия, 1 об.% содержащей заменимые аминокислоты среды MEM и 50мкМ β-меркаптоэтанолом. 1x106 MV3-клеток/мл ресуспендировали в среде для Т-клеток и разделяли на три пробирки. Синтетический пептид NLVPMVATV (полученный из библиотеки Thinkpeptides®) добавляли до конечной концентрация 1х10-9М или 1x10-8M и клетки инкубировали в течение 90 мин. MV3-клетки однократно промывали средой для Т-клеток и ресуспендировали до плотности 0,5x106 клеток/мл, вносили (100 мкл/лунку) в 96-луночный круглодонный планшет для клеточной суспензии (фирма Greiner bio-one, Cellstar, каталожный № 650185) и инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% СО2. Принцип анализа проиллюстрирован на фиг. 21.
На следующий день добавляли 50 мкл/лунку среды для Т-клеток, содержащей в различных определенных титрованием концентрациях нацеленные содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы. Собирали NLV-специфические CD8-Т-клетки, добавляли CFDA-SE (сложный N-сукцинимидиловый эфир 5(6)-карбоксифлуоресцеиндиацетата, фирма SIGMA-Aldrich, каталожный № 21888-25MG-F) до конечной концентрации 40 нМ и клетки инкубировали при вращении в течение 15 мин при 37°С. Мечение прекращали, добавляя FBS, клетки промывали и ресуспендировали в среде для Т-клеток до конечной концентрации 0,125x106 клеток/мл. 50 мкл суспензии указанных меченных CFSE CD8-Т-клеток добавляли в каждую лунку (конечное соотношение Е:Т = 1:8). Планшеты с клетками инкубировали в течение 24 ч, 50 мкл/лунку удаляли и добавляли в каждую лунку 50 мкл среды для Т-клеток, содержащей 2,64 мкл/мл стоп-реагента Гольджи (Golgi stop) (ингибитор белкового транс- 176 037557 порта, содержащий монезин, фирма BD Bioscience, каталожный № 554724) (конечная концентрация 0,66 мкл/мл). Клетки инкубировали в течение 4 ч и затем планшеты промывали 200 мкл/лунку D-ЗФР и окрашивали, используя по 100 мкл/лунку (4°С) D-ЗФР, содержащего разведенный в соотношении 1:5000 фиксирующий краситель для определения жизнеспособности (Fixable Viability Dye) eF450 (фирма eBioscience, каталожный № 65-0864), в течение 30 мин при 4°С. Планшеты с клетками промывали 200 мкл/лунку D-ЗФР, после чего окрашивали конъюгированными с флуоресцентным красителем антителами: антитело к человеческому CD 137-PerCP/Су5.5 (клон 4В4-1, IgG1K мыши, фирма BioLegend, каталожный № 309814), антитело к человеческому CD8-BV605 (клон RPA-T8, IgG1K мыши, фирма BioLegend, каталожный № 301012) или 0,67 мкг/мл антитела к человеческому CD8a-APC/Cy7 (клон RPA-T8, IgG1K мыши, фирма BioLegend, каталожный № 301016) и антитело к человеческому CD25 РЕ/Су7 (клон ВС96, IgG1K мыши, фирма BioLegend, каталожный № 302612). После инкубации в течение 30 мин при 4°С клетки промывали дважды, используя 200 мкл/лунку FACS-буфера, ресуспендировали в 50 мкл/лунку свежеприготовленного FoxP3 Fix/Perm-буфера (фирма eBioscience каталожный № 00-5123 и 00-5223) и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. Планшеты промывали дважды, используя 200 мкл/лунку Perm-буфера (D-ЗФР, дополненный 2 об.% FBS, 1% (мас./об.) сапонина (фирма Sigma Life Science, S7900) и 1% (мас./об.) азида натрия (фирма Sigma-Aldrich, S2002), и окрашивали, используя 50 мкл/лунку Perm-буфера (фирма eBioscience, каталожный № 00-8333-56), содержащего 0,25 мкг/мл антитела к человеческому IFNy-APC (клон В27, IgG1K мыши, фирма BioLegend, каталожный № 506510) или 0,33 мкг/мл антитела к человеческому IFNy-BV510 (клон 4S.B3, IgG1K мыши, фирма BioLegend, каталожный №502543). Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 4°С и промывали дважды, используя 200 мкл/лунку Perm-буфера. Для фиксации добавляли 50 мкл/лунку D-ЗФР, содержащего 1% формальдегида. В этот же или на следующий день клетки ресуспендировали в 100 мкл/лунку FACS-буфера и данные получали с использованием проточного цитометра с 5 лазерами LSR-Fortessa (фирма BD Bioscience, с программой DIVA) или анализатора с 3 лазерами Miltenyi Quant Analyzer 10 (фирма Miltenyi Biotec) и программы Flow Jo (FlowJo X 10.0.7).
Как продемонстрировано на фиг. 22 и 23 для конструкций 1.1-1.10 и на фиг. 24 и 25 для конструкций 2.1, 2.3 и 2.4, антигенспецифические CD8+-Т-клетки в отличие от нестимулированных контролей, характеризовались повышенными уровнями поверхностной экспрессии 4-1ВВ в присутствии нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающей молекулы (FAP разделенный тримерный 4-1ВВ). Указанное действие 4-1BBL зависело от дозы и для него требовался FAPтаргетинг, поскольку добавление ненацеленной контрольной молекулы не влияло на уровень экспрессии 4-1ВВ. Кроме того, у Т-клеток, активированных более высокой концентрацией пептида (1х10-8М), обнаружена устойчивая секреция INFy в присутствии нацеленной на FAP содержащей тримерный лиганд для 41ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающей молекулы (FAP разделенный тримерный 4-1BBL). В совокупности эти данные демонстрируют, что нацеленная на антиген содержащая тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающая молекула модулирует поверхностный фенотип и реактивность антигенспецифических Т-клеток в зависимости от таргетинга.
6.4. Сравнение нацеленных на клетку и ненацеленных содержащих мышиный 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
Получали нацеленные и ненацеленные содержащие мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы (FAP разделенный тримерный мышиный 4-1BBL и DP47 разделенный тримерный мышиный 4-1BBL) согласно методу, описанному в примере 1.3.
Для сравнения биологической активности нацеленных на клетку и ненацеленных содержащих тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекул, меченные красителем для оценки пролиферации (Proliferation Dye) eFlour670 (eBioscience, каталожный №65-0840-90) или красителем фиолетовым для оценки пролиферации CellTrace™ (Violet Cell Proliferation) (фирма Cell tracer, каталожный № C34557) свежевыделенные мышиные спленоциты совместно культивировали в течение 3-4 дней в 96-луночных планшетах для культуры ткани с U-образным дном (фирма ТТР, каталожный № 92097) с прикрепленными облученными 50 Гр клетками NIH/3T3-huFAP, клон 39 (описание процедуры получения см. в 5.3) в среде RPMI 1640 (фирма Gibco, каталожный № 42401-042), дополненной 10 об.% FBS, 1 об.% GlutaMAX-I, 1 мМ пируватом натрия, 1 об.% содержащей заменимые аминокислоты среды MEM и 50мкМ β-меркаптоэтанолом, в присутствии 0,5 мкг/мл IgG сирийского хомяка к мышиному CD3 (клон 145-2С11, фирма BD, каталожный № 553057), и добавляли указанную перспективную (кандидат) молекулу лекарственного средства в указанном диапазоне концентраций (фиг. 26). Через 3 или 4 дня клетки промывали FACS-буфером и окрашивали в течение 30 мин при 4°С, используя по 25 мкл/лунку FACS-буфера, содержащего крысиное антитело IgG2a-BV711 к мышиному CD8 (фирма BioLegend, каталожный № 100747, клон 53-6.7) и крысиное антитело IgG2a-BV421 к мышиному CD4 (фирма BioLegend, каталожный № 100544, клон RM4-5) и 0,67 мкг/мл IgG-PE сирийского хомяка к мышиному CD137 (4-1ВВ) (фирма BioLegend, каталожный № 106106, клон 17В5) и крысиное антитело IgG2b к мышиному CD25-PErCP-Cy5.5 (фирма BioLegend, каталожный № 1019112). Клетки промывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в приготовленном Fix/Perm-буфере (Foxp3/буфер из набо
- 177 037557 ра для окрашивания фактора транскрипции, фирма eBioscience, каталожный № 00-5523-00). Клетки промывали дважды свежеприготовленным Perm-буфером и совместно окрашивали, используя по 25 мкл/лунку Perm-буфера, содержащего флуоресцентно меченые антитела против цитотоксической линии фактора транскрипции Eomes, т.е. крысиное антитело IgG2a-AlexaFluor488 к мышиному Eomes (фирма eBioscience, каталожный № 534875, клон Dan11mag) и, если CD137 не окрашивали, то применяли антитело против цитотоксической эффекторной молекулы гранзима В, т.е. крысиный IgG2a к мышиному гранзиму В-РЕ (фирма eBioscience, каталожный № 128822, клон 16G6), в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем клетки промывали дважды, ресуспендировали в FACS-буфере и данные получали с использованием проточного цитометра с 5 лазерами LSR-Fortessa (фирма BD Bioscience, снабженного программой DIVA) или анализатора с 3 лазерами MACSQuant Analyzer 10 (фирма Miltenyi Biotech) и программы Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC). Дискриминационные окна устанавливали на живые CD8+-Tклетки и CD4+-Т-клетки и определяли частоту (встречаемости) пролиферирующих клеток, а также уровни экспрессии CD25, Eomes и гранзима В или CD137. Строили график зависимости частоты пролиферации, а также частоты и MFI маркеров активации от концентрации применяемых содержащих тримерный мышиный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) молекул, для выявления функциональной активности. Как продемонстрировано на 27, удалось обнаружить повышение пролиферации CD8+-Т-kлетоk при применении конструкций M.1 и М.2.
6.5. Изменения в печени мышей, обработанных антителом к мышиному 4-1ВВ Lob 12 3 (muIgG1 Wt) или конструкцией М.2.
Мышей линии C57BL/6, несущих MC38-muFAP (модель мышиного колоректального рака) обрабатывали s с один раз в неделю в течение 3 недель агонистическими антителами к мышиному 4-1ВВ, нацеленными на FAP (опыт по оценке эффективности 020-GA1401 Эксперимент по определению эффективности нацеленной на 4-1ВВ терапии в комбинации с a-PD-L1 на s.c.-модели MC38-muFAP, созданной на мышах С57В6). Применяемые антитела представляли собой Lob 12 3 muIgG1 Wt (с Fc дикого типа, клон Lob 12 3 от фирмы BioXcell, каталожный № ВЕ0169) или конструкцию М 2 с DAP G-мутацией (неактивный Fc) Два антитела вводили один раз в неделю в течение трех последовательных недель. По 4 животных на группу умерщвляли через 7 дней после последней обработки и печень оценивали с помощью микроскопа.
Изменения в печени, включающие локусы гепатоцеллюлярной дегенерации с накоплением F4/80позитивных макрофагов и пониженным количеством смешенной популяции воспалительных клеток (главным образом лимфоцитов), что часто характеризуется вазоцентрическим распределением, обнаружены только у животных, которых обрабатывали Lob 12 3 muIgG1 Wt. Обнаружены редкие единичные клеточные некрозы гепатоцитов и инфильтраты периваскулярных мононуклеарных клеток в воротную вену печени. Никаких связанных с обработкой проявлений не обнаружено в печени животных, которые получали конструкцию М 2 (табл. 41).
Таблица 41. Встречаемость гистопатологических проявлений (п=4/группу)
Обработка Наполнитель Lob 12 3 muIgGl Wt Конструкция Μ 2
локусы гепатоцеллюлярной дегенерации с макрофагами и воспалительными клетками - 4 -
инфильтраты периваскулярных воспалительных клеток - 4 -
некроз единичных клеток - 4 -
Гепатит, связанный с перекрестной сшивкой с FcyR в печени, обнаружены у пациентов, которых лечили Urelumab BMS-663513 (Ascierto P.A. и др., 2010) и у мышей, для обработки которых применяли мышиный суррогат. Отсутствие проявлений в печени у животных, которых обрабатывали антителом с неактивным Fc, подтверждают указанную гипотезу.
6.6. Определение фармакокинетических параметров содержащих тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
Для решения вопроса о том, пригодны ли содержащие тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, для фармацевтического применения, определяли фармакокинетические параметры (ФК-данные), такие как клиренс, объем распределения или время полувыведения (tj/2) у мышей. Для этой цели осуществляли следующие эксперименты.
Эксперимент А. Однодозовое ФК-исследование конструкции 1.2 и контроля Б на здоровых NOGмышах.
Самок линии NOG, возраст которых в начале эксперимента составлял 8-10 недель (купленные в виварии Taconic, SOPF), содержали в условиях отсутствия специфических патогенов с суточным циклом 12 ч света/12 ч темноты согласно соответствующим руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местным правительственным органом (Р 2011128). После доставки животных выдерживали в течение 1 недели для того, чтобы они могли привыкнуть к новым условиям, и для обследования. На регулярной основе осуществляли постоянный мони
- 178 037557 торинг состояния здоровья.
Для оценки экспозиции конструкции 1.2 и контроля Б проводили однодозовое фармакокинетическое исследование (SDPK). Мышам линии NOG вводили с помощью i.v.-болюсной инъекции 2,5 мг/кг агента и отбирали образцы крови в выбранные моменты времени для фармакокинетической оценки. Образцы мышиной сыворотки анализировали с помощью ELISA. Биотинилированный человеческий 4-1ВВ, тестируемые образцы, меченное дигоксигенином антитело к huCH1 и идентифицирующее антитело к дигоксигенину (POD) добавляли в 96-луночный сенсибилизированный стрептивидином титрационный микропланшет и инкубировали после каждой стадии в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет промывали три раза после каждой стадии для удаления несвязанных субстанций. И, наконец, связанный с пероксидазой комплекс визуализировали, добавляя в качестве субстрата раствор ABTS для образования окрашенного продукта реакции. Интенсивность окраски продукта реакции, которую определяли фотометрически при 405 нм (длина референс-волны 490 нм), пропорциональна концентрации аналита в образце сыворотки. Калибровочный диапазон стандартной кривой для конструкций составлял от 0,156 до 10 нг/мл, при этом концентрация 3 нг/мл соответствовала нижнему предел количественного определения (LLOQ). На фиг. 28А продемонстрировано снижение концентрации с течением времени, обнаруженное в этом эксперименте.
Эксперимент Б. Однодозовое ФК-исследование конструкций 2.1, 2.3, контроля Б и контроля В на несущих опухоли NOG-мышах, гуманизированных стволовыми клетками.
Для оценки экспозиции конструкций 2.1, 2.3, контроля Б и контроля В проводили однодозовое фармакокинетическое исследование (SDPK). Самок NSG-мышей, несущих человеческие стволовые клетки, получали от фирмы Jackson Laboratories. Мышей содержали в условиях отсутствия специфических патогенов с суточным циклом 12 ч света/12 ч темноты согласно соответствующим руководствам (GVSolas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местным правительственным органом (ZH193-2014). После доставки животных выдерживали в течение 1 недели для того, чтобы они могли привыкнуть к новым условиям, и для обследования. На регулярной основе осуществляли постоянный мониторинг состояния здоровья.
Человеческие MKN45-клетки (человеческая карцинома желудка) исходно получали из АТСС и после размножения депонировали во внутреннем банке клеток фирмы Glycart. Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FCS. Клетки культивировали при 37°С в насыщенной водным паром атмосфере с 5% CO2. Полученный in vitro пассаж 9, жизнеспособность которого составляла 97%, применяли для подкожной инъекции. Линия человеческих фибробластов NIH-3T3 была создана на фирме Roche Nutley для экспрессии человеческого FAP. Применяли клон 39, представляющий собой полученный in vitro пассаж 12, жизнеспособность которого составляла 98%. Смешивали 50 мкл клеточной суспензии (1х106 MKN45-клеток +1х106 3Т3-huFAP) с 50 мкл матригеля и инъецировали подкожно в боковую область анестезированных мышей. Путем болюсной i.v.-инъекции вводили 10 мг/кг агентов гуманизированным мышам, когда средний размер опухолей достигал 190 мм3. Получали образцы крови в выбранные моменты времени для фармакокинетической оценки. Образцы мышиной сыворотки анализировали с помощью ELISA. Биотинилированный человеческий 4-1ВВ, тестируемые образцы, меченное дигоксигенином антитело к huCH1 и идентифицирующее антитело к дигоксигенину (POD) добавляли в 96-луночный сенсибилизированный стрептивидином титрационный микропланшет и инкубировали после каждой стадии в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет промывали три раза после каждой стадии для удаления несвязанных субстанций. И, наконец, связанный с пероксидазой комплекс визуализировали, добавляя в качестве субстрата раствор ABTS для образования окрашенного продукта реакции. Интенсивность окраски продукта реакции, которую определяли фотометрически при 405 нм (длина референсволны 490 нм), пропорциональна концентрации аналита в образце сыворотки. Калибровочный диапазон стандартной кривой для конструкций составлял от 0,156 до 10 нг/мл, при этом концентрация 3 нг/мл соответствовала нижнему предел количественного определения (LLOQ). На фиг. 28Б продемонстрировано снижение концентрации конструкций с течением времени, обнаруженное в этом эксперименте.
Эксперимент В. Однодозовое ФК-исследование конструкций 2. 1 и 2.3 на здоровых NOG-мышах.
Самок мышей линии NOG, возраст которых в начале эксперимента составлял 8-10 недель (купленные в виварии Taconic, SOPF), содержали в специфических беспатогенных условиях с суточным циклом 12 ч света/12 ч темноты согласно соответствующим руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местным правительственным органом (Р 2011128). После доставки животных выдерживали в течение 1 недели для того, чтобы они могли привыкнуть к новым условиям, и для обследования. На регулярной основе осуществляли постоянный мониторинг состояния здоровья.
Для оценки экспозиции конструкций 2.1 и 2.3 проводили однодозовое фармакокинетическое исследование (SDPK). Мышам линии NOG вводили с помощью болюсной i.v.-инъекции 2,5 мг/кг агента и отбирали образцы крови в выбранные моменты времени для фармакокинетической оценки. Образцы мышиной сыворотки анализировали с помощью ELISA. Биотинилированный человеческий 4-1BB, тестируемые образцы, меченное дигоксигенином антитело к huCH1 и идентифицирующее антитело к дигоксигенину (POD) добавляли в 96-луночный сенсибилизированный стрептивидином титрационный микро
- 179 037557 планшет и инкубировали после каждой стадии в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет промывали три раза после каждой стадии для удаления несвязанных субстанций. И, наконец, связанный с пероксидазой комплекс визуализировали, добавляя в качестве субстрата раствор ABTS для образования окрашенного продукта реакции. Интенсивность окраски продукта реакции, которую определяли фотометрически при 405 нм (длина референс-волны 490 нм), пропорциональна концентрации аналита в образце сыворотки. Калибровочный диапазон стандартной кривой для конструкций составлял от 0,156 до 10 нг/мл, при этом концентрация 3 нг/мл соответствовала нижнему предел количественного определения (LLOQ). На фиг. 28В продемонстрировано снижение концентрации с течением времени.
Протестированные конструкции 2.1 и 2.3 оказались достаточно стабильными в организме и обладали ФК-параметрами в диапазоне, приемлемом для создания фармацевтических средств. Из полученных результатов можно сделать заключение также о том, что конструкция 2.1 оказалась несколько более стабильной.
6.7. Превалирование FAP в человеческих опухолях.
Изучали превалирование FAP в человеческих опухолях согласно методу, описанному в WO 2014/161845, для принятия решения о возможности клинического применения нацеленных на FAP конструкций.
Крысиное антитело к человеческой сепразе (IgG2a, клон D8) фирма Vitatex (MABS1001) применяли для иммуноокрашивания FFPET-(фиксированных формалином, залитых в парафин тканей)-срезов толщиной 2,5 мкм различных указанных опухолей с помощью системы Ventana Benchmark XT. Срезы подвергали стандартной СС1-обработке с последующей инкубацией антитела в течение 60 мин при 37°С в концентрации 5 мкг/мл в разбавителе для антител фирмы Dako (S3022) и позитивное окрашивание выявляли с помощью системы детекции Ultraview DAB (фирма Ventana, № 760-4456). Антитело соответствующего изотипа фирмы Abcam (ab18450) применяли в качестве отрицательного контроля. Стромальный FAP+-инфильтрат присутствовал в человеческих опухолях различных типов, включая плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC), рак молочной железы, колоректальный рак (CRC), рак поджелудочной железы (РАС), рак желудка, немелкоклеточную карциному легкого (NSCLC) и мезотелиому, что демонстрирует потенциальный клинический интерес применения нацеленных на FAP конструкций (табл. 42).
Таблица 42. Превалирование FAP в человеческих опухолях
Тип опухоли % случаев РАР+-инфильтрата от среднего до высокого уровня Кол-во изученных образцов
HNSCC 90 10
рак молочной железы (ВС) 77 105
тройной негативный ВС 80 7
CRC 77 90
РАС 74 19
рак желудка 68 28
NSCLC 66 90
мезотелиома 60 10
Пример 7.
7.1. Получение нацеленных на CD19 (8В8-018) содержащих тримерый лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
7.1.1. Получение, очистка и характеризация слияния антиген CD19-Fc для процесса фагового дисплея.
Для экспрессии и очистки эктодомена CD19 человека и обезьян циномолгус в мономерном состоянии (последовательность человеческого CD19 см. в SEQ ID NO: 31) соответствующий ДНК-фрагмент сливали с геном человеческого IgG1-Fc, содержащего мутации, приводящие к образованию выступа (человеческая последовательность: SEQ ID NO: 186; обезьянья (последовательность обезьян циномолгус: SEQ ID NO: 188), и трансфектировали партнером (контрагентом) Fc-впадина) (SEQ ID NO: 86) (Merchant и др., 1998). Интродуцировали сайт расщепления IgA (PTPPTP) между эктодоменом антигена и Fcцепью с выступом. Интродуцировали Avi-метку для направленного биотинилирования на С-конец конструкции антиген-Fc-выступ и интродуцировали мутации H435R и Y436F в Fc-цепь с впадиной с целью очистки (Jendeberg L. и др. J. Immunological methods, 1997). Комбинация конструкции антиген-Fcцепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W (человеческая последовательность: SEQ ID NO: 187; последовательность обезьян циномолгус: SEQ ID NO: 189), с Fc-цепью с впадиной, содержащей мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V (SEQ ID NO: 90), позволяла получать гетеродимерный фрагмент Fc-слияния, который включал единичную копию эктодомена CD19 (аналог содержащей 4-1ВВ конструкции, представленной на фиг. 5В). В табл. 43 представлены кДНК и аминокислотные последовательности конструкции антиген в слиянии с Fc.
- 180 037557
Таблица 43. кДНК и аминокислотные последовательности молекулы, содержащей мономерный антиген CD19 человека и обезьян циномолгус в слиянии с Fc(kih)
SEQ ID NO: Антиген Последовательность
86 нуклеотидная последовательность Fcцепи с «впадиной» см.таблицу 32
186 нуклеотидная последовательность конструкции человеческий антиген СП19-Рс-цепь с «выступом»-ау1-метка CCCGAGGAACCCCTGGTCGTGAAGGTGGAAGAGGGCGACAATGCCGT GCTGCAGTGCCTGAAGGGCACCTCCGATGGCCCTACCCAGCAGCTGA CCTGGTCCAGAGAGAGCCCCCTGAAGCCCTTCCTGAAGCTGTCTCTG GGCCTGCCTGGCCTGGGCATCCATATGAGGCCTCTGGCCATCTGGCT GTTCATCTTCAACGTGTCCCAGCAGATGGGCGGCTTCTACCTGTGTC AGCCTGGCCCCCCATCTGAGAAGGCTTGGCAGCCTGGCTGGACCGTG AACGTGGAAGGATCCGGCGAGCTGTTCCGGTGGAACGTGTCCGATCT GGGCGGCCTGGGATGCGGCCTGAAGAACAGATCTAGCGAGGGCCCCA GCAGCCCCAGCGGCAAACTGATGAGCCCCAAGCTGTACGTGTGGGCC AAGGACAGACCCGAGATCTGGGAGGGCGAGCCTCCTTGCCTGCCCCC TAGAGACAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACAATGGCCC CTGGCAGCACACTGTGGCTGAGCTGTGGCGTGCCACCCGACTCTGTG TCTAGAGGCCCTCTGAGCTGGACCCACGTGCACCCTAAGGGCCCTAA GAGCCTGCTGAGCCTGGAACTGAAGGACGACAGGCCCGCCAGAGATA TGTGGGTCATGGAAACCGGCCTGCTGCTGCCTAGAGCCACAGCCCAG GATGCCGGCAAGTACTACTGCCACAGAGGCAACCTGACCATGAGCTT CCACCTGGAAATCACCGCCAGACCCGTGCTGTGGCACTGGCTGCTGA GAACAGGCGGCTGGAAGGTCGACGCTAGCGGTGGTAGTCCGACACCT CCGACACCCGGGGGTGGTTCTGCAGACAAAACTCACACATGCCCACC GTGCCCAGCACCTGAAGCCGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCGGAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGT CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC GACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTC TGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA TCCGGAGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATTGAATGGCA С GAG
90 полипептидная последовательность Fcцепи с «впадиной» см.таблицу 32
- 181 037557
187 полипептидная последовательность конструкции человеческий антиген СО19-Рс-цепь с «выступом»-ау1 метка PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSL GLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTV NVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWA KDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSV SRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQ DAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVDASGGSPTP PTPGGGSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SGGLNDIFEAQKIEWHE
188 нуклеотидная последовательность конструкции антиген CD 19 обезьян циномолгус-Рс-цепь с «выступом»-ау1 -метка CCCCAGGAACCCCTGGTCGTGAAGGTGGAAGAGGGCGACAATGCCGT GCTCCAGTGCCTGGAAGGCACCTCCGATGGCCCTACACAGCAGCTCG TGTGGTGCAGAGACAGCCCCTTCGAGCCCTTCCTGAACCTGTCTCTG GGCCTGCCTGGCATGGGCATCAGAATGGGCCCTCTGGGCATCTGGCT GCTGATCTTCAACGTGTCCAACCAGACCGGCGGCTTCTACCTGTGTC AGCCTGGCCTGCCAAGCGAGAAGGCTTGGCAGCCTGGATGGACCGTG TCCGTGGAAGGATCTGGCGAGCTGTTCCGGTGGAACGTGTCCGATCT GGGCGGCCTGGGATGCGGCCTGAAGAACAGAAGCAGCGAGGGCCCTA GCAGCCCCAGCGGCAAGCTGAATAGCAGCCAGCTGTACGTGTGGGCC AAGGACAGACCCGAGATGTGGGAGGGCGAGCCTGTGTGTGGCCCCCC TAGAGATAGCCTGAACCAGAGCCTGAGCCAGGACCTGACAATGGCCC CTGGCAGCACACTGTGGCTGAGCTGTGGCGTGCCACCCGACTCTGTG TCCAGAGGCCCTCTGAGCTGGACACACGTGCGGCCAAAGGGCCCTAA GAGCAGCCTGCTGAGCCTGGAACTGAAGGACGACCGGCCCGACCGGG ATATGTGGGTGGTGGATACAGGCCTGCTGCTGACCAGAGCCACAGCC CAGGATGCCGGCAAGTACТАСTGCCACAGAGGCAACTGGACCAAGAG CTTTTACCTGGAAATCACCGCCAGACCCGCCCTGTGGCACTGGCTGC TGAGAATCGGAGGCTGGAAGGTCGACGCTAGCGGTGGTAGTCCGACA CCTCCGACACCCGGGGGTGGTTCTGCAGACAAAACTCACACATGCCC ACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAA AGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGAGCCCCCATCGAGAAAACCATCT CCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCC CCATGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT AAATCCGGAGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATTGAATG GCACGAG
189 полипептидная последовательность конструкции антигенСО19 обезьян циномолгус-Рс-цепь с «выступом»-ау1-метка PQEPLVVKVEEGDNAVLQCLEGTSDGPTQQLVWCRDSPFEPFLNLSL GLPGMGIRMGPLGIWLLIFNVSNQTGGFYLCQPGLPSEKAWQPGWTV SVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLNSSQLYVWA KDRPEMWEGEPVCGPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSV SRGPLSWTHVRPKGPKSSLLSLELKDDRPDRDMWVVDTGLLLTRATA QDAGKYYCHRGNWTKSFYLEITARPALWHWLLRIGGWKVDASGGSPT PPTPGGGSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KSGGLNDIFEAQKIEWHE
Для получения слитых молекул, содержащих мономерный антиген/Fc, находящиеся на экспоненциальной фазе роста растущие в суспензии СНО-клетки совместно трансфектировали двумя плазмидами, кодирующими два компонента слитого белка (цепи с выступом и впадиной), используя стандартные методы.
Секретированный белок очищали из супернатанта клеточной культуры с помощью аффинной хроматографии на белке А с последующей гель-фильтрацией. Для осуществления аффинной хроматографии супернатант вносили в колонку MabSelect Sure (CV = 5-15 мл, смола фирмы GE Healthcare), уравновешенную буфером, содержащим фосфат натрия (20 мМ), цитрат натрия (20 мМ) (рН 7,5). Несвязанный белок удаляли путем промывки таким же буфером, используя его в объеме, кратном по меньшей 6 об. колонки. Связанный белок элюировали, используя линейный градиент: стадия 1,10 CV от 0 до 60% буфера для элюции (буфер, содержащий 20 мМ цитрат натрия, 500 мМ хлорид натрия (рН 2,5)); стадия 2, 2 CV от 60 до 100% буфера для элюции. При осуществлении элюции с использованием линейного градиента осуществляли дополнительную ступенчатую элюцию с применением объема, кратного 2 об. колонки, 100%-ного буфера для элюции.
Значение рН собранных фракций регулировали, добавляя 1/40 (об./об.) 2М Трис, рН 8,0. Белок концентрировали и фильтровали перед внесением в колонку HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную раствором, содержащим 2 мМ MOPS, 150 мМ хлорид натрия, 0,02% (мас./об.) азид на- 182 037557 трия, рН 7,4.
В табл. 44 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономеров слитого белка, содержащего мономерный антиген CD19 человека и обезьян циномолгус и Fc(kih).
Таблица 44. Биохимический анализ слитого белка, содержащего мономерный антиген CD19 человека и обезьян циномолгус и Fc(kih)
Конструкция Мономер [%] (SEC) Выход [мг/л]
слитый белок, содержащий мономерный человеческий CD 19 и Fc(kih) 91 0,2
слитый белок, содержащий мономерный CD 19 обезьян циномолгус и Fc(kih) 95 3,56
Часть очищенного антигена биотинилировали in vitro с использованием набора BirA biotin-protein ligase standard reaction (фирма Avidity, каталожный № BirA500) согласно инструкциям производителя. Степень биотинилирования слияния, содержащего человеческий CD19, составляла 94%, а соответствующей содержащей CD19 обезьян циномолгус конструкции - 100%. Затем биотинилированный белок применяли для селекции, скрининга и характеризации полученных из 8В8 клонов с созревшей аффинностью, у которых отсутствовали горячие точки деамидирования N27d и N28.
7.1.2. Создание клона 8В8-018 антитела к CD19.
7.1.2.1. Иммунизация и создание мышиных антител к человеческому CD19 (метод гибридом).
Мышей линии Balb/c иммунизировали 6 раз и подвергали бустер-иммунизации с использованием трансфектированных CD19 клеток HEK293 (средняя плотность рецептора 35000 на клетку). Осуществляли мониторинг иммунного ответа путем тестирования образцов сыворотки с помощью ELISA для несущих CD19 клеток на трансфектированных человеческим CD19 клетках NIH-3T3. Селезеночные клетки мышей с достаточными титрами антитела к человеческому CD19 применяли для иммортализации путем слияния с клеточной линией мышиной миеломы Р3Х63 Ag8.653. Осуществляли три слияния и супернатанты гибридом подвергали скринингу с использованием предназначенного для анализа клеток ELISA с применением трансфектированных человеческим CD19 клеток NIH-3T3 и осуществляли анализ связывания с помощью FACS, применяя клетки Дауди (CD19+) и CD19--клетки для специфических в отношении человеческого CD19 антител (см. пример 1 в WO 2011/147834).
7.1.2.2. Скрининг гибридом и оценка биологической функции в отношении клеток антитела к CD19.
ELISA для анализа клеток для скрининга антител против человеческого CD19.
Предназначенный для анализа клеток ELISA применяли для скрининга гибридом и для идентификации тех гибридом, которые секретируют антитела против человеческого CD19. Клетки NIH3T3, трансфектированные человеческим CD19, применяли в качестве позитивных клеток; нетрансфектированные NIH3T3-клетки применяли в качестве применяемых в качестве отрицательного контроля клеток. Для оценки позитивных гибридом определяли соотношение между ОП для трансфектированных и нетрансфектированых NIH3T3-клеток.
Культуральная среда: DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 мг/мл), 10% FCS, Na-пируват, NEAA, глутамин.
Антитела, применяемые в качестве положительного контроля: моноклональное антитело к CD19 (IgG1), фирма Pharmingen, каталожный № 555409, с = 1 мг/мл.
Идентифицирующее антитело: козий антимышиный IgG (H+L), конъюгированный с HRP, фирма Bio-Rad, каталожный № 170-06516.
Разведение 1: 2000 в 1х блокирующем реагенте для ELISA.
Другие реагенты: фибронектин, фирма Roche, каталожный № 838039, с = 1 мг/мл.
Глутаровый альдегид: 25% маточный раствор, фирма Grade Agar Scientific, № R102, конечная концентрация: 0,05% в ЗФР.
Блокирующий реагент для ELISA: 10х маточный раствор, фирма Roche, каталожный № 1112589.
ТМВ-субстрат: фирма Roche, каталожный № 11432559.
Стоп-раствор: 1М H2SO4, фирма BioRad, каталожный № 170-6516, разведение 1: 2000 в 1х блокирующем реагенте для ELISA.
День 1.
Сенсибилизация фибронектином: 5 мкг/см2 в ЗФР; 96-луночный планшет = 32 см2; 160 мкг/планшет в 6 мл;
ЗФР, 50 мкл/лунку;
инкубация в течение 45 мин при КТ, аспирация сенсибилизирующего раствора;
посев 1,25х104 клеток/лунку в 50 мкл культуральной среды в 96-луночный планшет;
инкубация в течение 40 ч при 37°С;
добавление в верхнюю половину планшета: NIH3T3-клетки, экспрессирующие CD19;
добавление в нижнюю половину планшета: нетрансфектированные NIH3T3-клетки.
День 3.
Добавление антитела, представляющего собой положительный контроль, или образцов (суперна- 183 037557 тант или мышиная сыворотка) в 50 мкл культуральнй среды;
инкубация 2 ч при 4°С;
удаление среды, фиксация клеток 100 мкл глутарового альдегида (0,05% в ЗФР);
промывка два раза 200 мкл ЗФР;
добавление идентифицирующего антитела 1:2000, 50 мкл/лунку;
инкубация 2 ч при КТ;
промывка три раза 200 мкл ЗФР;
добавление 50 мкл ТМВ, инкубация в течение 30 мин при КТ;
прекращение реакции путем добавления 25 мкл 1М H2SO4; определение экстинкции при 450 нМ/620 нМ;
расчет результатов: соотношение между ОП для NIH3T3 CD19:ОП для нетрансфектированных NIH3T3.
Для отобранных антител продемонстрировано специфическое связывание с трансфектированными CD19 NIH3T3-клетками по сравнению с нетрансфектированными NIH3T3-клетками (см. пример 2 в WO 2011/147834).
7.1.2.3. Гуманизация антитела к CD 19.
CD19-связывающую специфичность мышиного антитела переносили в человеческий акцепторный каркасный участок для элиминации потенциальных проявлений иммуногенности, возникающей в ответ на сегменты последовательностей, которые человеческий организм может распознавать как чужие. Это осуществляли путем трансплантации полных гипервариабельных участков (CDR) мышиного (донорского) антитела в человеческий (акцепторный) каркасный участок, и этот процесс обозначают как CDRтрансплантация или гуманизация антитела.
Выравнивали мышиную аминокислотную последовательность относительно коллекции V-генов человеческой зародышевой линии антитела и сортировали с учетом идентичности и гомологии последовательности. Перед селекцией каждой конкретной акцепторной последовательности следует определять структуры так называемых канонических петель донорского антитела (Morea V. и др., Methods, т. 20, вып.3, 2000, сс. 267-279). Структуры указанных канонических петель определяли по типу остатков, присутствующих в так называемых канонических положениях. Эти положения лежат (частично) вне CDRучастков, и они должны сохранять функциональную эквивалентность в конечной конструкции для сохранения конформации CDR родительского (донорского) антитела. Последовательность человеческой зародышевой линии VBASE_VH1_1 выбирали в качестве акцепторной для тяжелой цепи, а последовательность VBASE_VK2_5 выбирали для легкой цепи.
7.1.2.4. Удаление горячих точек деамидирования.
Было установлено, что гуманизированное антитело к человеческому CD19 дикого типа имеет три горячие точки деамидирования в HVR-L1: NSNGNT (SEQ ID NO: 190). Кроме того, было установлено, что в HVR-H2 присутствует дополнительная горячая точка деамидирования: KFNG (SEQ ID NO: 191). Для удаления горячей точки деамидирования в HVR-H2 интродуцировали точечную мутацию N (Asn) на Q (Gln) в положении 64 (нумерация согласно Кэботу). Таким образом, антитело, представленное в настоящем описании, имеет HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность TEKFQGRVTM (SEQ ID NO: 192).
Для удаления горячих точек деамидирования в легкой цепи для получения гуманизированного антитела к человеческому CD19 с улучшенной устойчивостью к деамидированию интродуцировали индивидуальные мутации в положения 27d, 27e, 28 и 29 по Кэботу и двойную мутация в положения 27е и 28 (нумерация согласно Кэботу). В целом, создавали 9 вариантов (var.1-var.9) гуманизированного антитела дикого типа (var.0) (см. табл. 45).
Таблица 45. Варианты гуманизированного антитела к CD19 дикого типа
Кэбот 2222 Кэбот 6
положение 7789 положение 4
LC: de НС:
var. 0 : wt QSLENSNGNTYLNW TEKFNGKATM
var.1:N27dH QSLEHSNGNTYLNW TEKFQGRVTM
var.2:N27dQ QSLEQSNGNTYLNW TEKFQGRVTM
var.3:S27eA QSLENANGNTYLNW TEKFQGRVTM
var.4:S27eV QSLENVNGNTYLNW TEKFQGRVTM
var.5:S27eP QSLENPNGNTYLNW TEKFQGRVTM
var.6:N2 8Q QSLENSQGNTYLNW TEKFQGRVTM
var.7:G2 9A QSLENSNANTYLNW TEKFQGRVTM
var.8:G2 9V QSLENSNVNTYLNW TEKFQGRVTM
var.9:S27eP/N28S QSLENPSGNTYLNW TEKFQGRVTM
- 184 037557
Вариант (Параметр 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
KD (BIAcore) [нМ] 5 250 136 2 1 6 54 4 16 45
11/2 [мин] - 0,1 1,1 105,2 191,5 43,6 4,4 51,5 17,6 4
Связывание с человеческим CD 19 после инкубации при pH 7,4 [%] 46 0 75 84 85 95 91 72 83 83
Связывание с человеческим CD 19 после инкубации при pH 6,0 [%] 90 0 95 95 97 99 97 86 91 87
Основной пик по данным SEC после инкубации [%] 95 95 95 > 95 > 95 95 95 95 95 -
Было установлено, что для всех горячих точек деамидирования в HVR-L1 можно применять единичную мутацию в положении 27е согласно Кэботу, приводящую к замене S (серин) на Р (пролин). Она представляет собой не мутацию предрасположенного к деамидированию остатка N (аспарагин), а мутацию соседнего участка.
Таким образом, антитело, представленное в настоящем описании, имеет HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность LENPNGNT (SEQ ID NO: 193). В одном из вариантов осуществления изобретения гуманизированное антитело к человеческому CD19 содержит HVR-L1, который имеет аминокислотную последовательность LENPSGNT (SEQ ID NO: 194).
Кроме того, эти антитела сохраняют перекрестную реактивность к CD19 обезьян циномолгус, что продемонстрировано ниже в табл. 46.
Таблица 46
ЕС50 [мкг/мл] var.0 Var.5 var.9
huCD19 ECD 0,087 0,084 0,089
су CD 19 ECD 0,313 0,255 0,435
Для гуманизированного антитела к человеческому CD19 дикого типа (var.0) после очистки обнаружен уровень деамидирования, составляющий примерно 7,5%. После хранения в течение 2 недель при рН 7,4 количество деамидированного антитела возрастало примерно до 18,5%. Для варианта антитела с мутаций S27eP (var.5) обнаружен уровень деамидирования, составляющий примерно 2%, и образование 2% сукцинимида после очистки. При хранении при рН 7,4 в течение 2 недель присутствовало только примерно 7,5% деамидированного антитела. Var. 5 был обозначен как клон 8В8-018 и выбран для создания нацеленных на CD19 содержащих тримерный лиганд семейства TNF антигенсвязывающих молекул.
7.1.3. Получение одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами с заряженными остатками (конструкция 3.1).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-254), разделенных (G4S)2линкерами и слитых с CL-доменом человеческого IgG1, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 29А: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий CL. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-254), и слитый с СН-доменом человеческого IgG1, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 29Б: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН.
Полинуклеотид, кодирующий димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL-доменом, субклонировали в рамке считывания с СН2- и СН3-доменами тяжелой цепи с выступом человеческого IgG1 (Merchant, Zhu и др. 1998). Для улучшения правильного спаривания интродуцировали указанные ниже мутации в скрещенные CH-CL. В димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL, мутации E123R и Q124K. В мономерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим СН1, мутации К147Е и К213Е.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для CD19, клон 8В8-018, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-γ-рецепторами (согласно методу, описанному в WO 2012/130831).
Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-CD19-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V, и легкая цепь анти-CD19, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и CD19-связывающий Fab (фиг. 30, конструкция 3.1).
В табл. 47 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной
- 185 037557 на CD19 (8В8-018) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL и заряженными остатками (конструкция 3.1).
Таблица 47. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на D19(8B8-O18) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL и заряженными остатками (конструкция 3.1)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
129 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 4-1BBL (71-254) - CL*Fc-цепь с «выступом» см.таблицу 3
130 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-254) СН1* см.таблицу 3
203 нуклеотидная последовательность антиCD19(8B8-018), Fc-цепь с «впадиной» CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTCAAGAAA CCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGCAAGGCAAGCGGAT ACACCTTCACCGACTATATCATGCATTGGGTCAGGCAGGC CCCTGGCCAAGGTCTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCA TATAATGATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGAA GAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGCACTGCTTA CATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTGATGACACCGCAGTG TATTACTGTGCCAGGGGCACATATTACTACGGCTCAGCTC TGTTCGACTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGA GCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACC GTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACA CCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCT GAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACC CAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGAC
- 186 037557
AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTG CAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCT GAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGC CCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTG CGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGT GAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA АА
204 нуклеотидная последовательность антиCD19 (8В8-018), легкая цепь GACATCGTCATGACCCAGACACCCCTGTCCCTCTCTGTGA CCCCTGGCCAGCCAGCCTCAATTAGCTGCAAGTCCTCTCA AAGTCTGGAGAACCCCAATGGGAACACTTACCTTAATTGG TATCTGCAGAAACCCGGACAATCCCCTCAACTCCTGATCT ACAGGGTCTCTAAGAGATTCTCAGGCGTGCCAGATCGCTT TAGCGGTTCCGGGTCTGGCACAGACTTCACCTTGAAGATT AGTCGGGTTGAAGCTGAGGATGTGGGAGTCTATTACTGTC TGCAGCTCACTCATGTGCCCTACACCTTTGGTCAGGGCAC AAAACTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTG TTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCA CCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCG CGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCA GTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTGACCGAGCAGGACTCC AAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGT CCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCG AAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTC CTTCAACCGGGGCGAGTGC
115 димерный hu 4-1BBL (71254) - CL*-Fc-ijenb с «выступом» см.таблицу 3
116 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1* см.таблицу 3
205 анти-СО19 (8В8-018), Fcцепь с «впадиной» QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYM ELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
206 анти-СО19 (8В8-018), DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLENPNGNTYLNWYL
легкая цепь QKP GQ SPQLLIYRVSKRF S G VPDRF S GS GS GTDFTLKI SR VE А EDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
* обозначает заряженные остатки.
7.1.4. Получение одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами без заряженных остатков (конструкция 3.2).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-254), разделенных (G4S)2линкерами и слитых с CL-доменом человеческого IgG1, клонировали аналогично схеме, представленной на фиг. 29А, но без аминокислотных мутаций в CL-домене: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий CL. Полипептид, содержа- 187 037557 щий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-254), и слитый с СН1-доменом человеческого IgG1, клонировали аналогично схеме, представленной на фиг. 29Б, но без аминокислотных мутаций в СН1-домене:
человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН1.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для CD19, клон 8В8-018, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-гамма-рецепторами (согласно методу, описанному в WO 2012/130831). Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-CD19-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V, и легкая цепь анти-CD19 позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и CD19-связывающий Fab (фиг. 30, конструкция 3.2).
В табл. 48 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL без заряженных остатков (конструкция 3.2). Таблица 48. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL без заряженных остатков (конструкция 3.2)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
165 нуклеотидная последовательность конструкции димерный лиганд (71-254)- CL-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 22
166 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1 См. таблицу 22
203 нуклеотидная последовательность анти-СП19 (8В8-018), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 47
204 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-СО19 (8В8018) См. таблицу 47
117 димерный лиганд (71-254) - CL-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 22
118 мономерный лиганд (71-254) -СН1 См. таблицу 22
205 анти-СО19 (8В8-018), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 47
206 легкая цепь анти-CD 19 (8В8-018) См. таблицу 47
7.1.5. Получение двухвалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 3.3).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-254), разделенных (G4S)2линкерами, сливали с С-концом Fc-цепи с впадиной человеческого IgG1, согласно схеме, представленной на фиг. 29В: Fc-цепь с впадиной человеческого IgG1, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-254), и слитый с С-концом Fc-цепи с выступом человеческого IgG1, получали согласно схеме, представленной на фиг. 29Г: Fc-цепь с выступом человеческого IgG1, (G4S)2коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для CD19, клон 8В8-018, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, выступом, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-гамма-рецепторами (согласно методу, описанному в WO 2012/130831). Комбинация: анти-CD19 huIgG1, содержащая димерный лиганд цепь с впадиной с мутациями Y349C/T366S/L368A/Y407V, анти-CD19 huIgG1, содержащая мономерный лиганд цепь с выступом с мутациями S354C/T366W, и легкая цепь анти-CD19, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и два FAP-связывающих Fab (фиг. 30, конструкция 3.3).
В табл. 49 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 3.3).
- 188 037557
Таблица 49. Последовательности пар оснований двухвалентной нацеленной CD19 (8В8-018) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с включающей Fc (kih) PGLALA (конструкция 3.3)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
207 нуклеотидная последовательность конструкции анти-CD 19 (8В8-018)-Рс-цепь с «впадиной»-димерный лиганд CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTCAAGAAA CCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGCAAGGCAAGCGGAT ACACCTTCACCGACTATATCATGCATTGGGTCAGGCAGGC CCCTGGCCAAGGTCTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCA TATAATGATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGAA GAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGCACTGCTTA CATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTGATGACACCGCAGTG TATTACTGTGCCAGGGGCACATATTACTACGGCTCAGCTC TGTTCGACTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGA GCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACC GTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACA CCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCT GAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACC CAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGAC AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTG CAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC
- 189 037557
GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCT GAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGC CCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTG CGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGT GAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTG GAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGC CCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACC TGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGT GCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCT GGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACA AAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCG TGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGT GGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCAT CTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGG CACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCG GAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTG TCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAG GCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCT ACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAG CCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGGCGGAT CTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACTGTCCC CTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAGGGAA TGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATTGA CGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGG GTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGATACAA AAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTT TTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGG CTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTG CGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACTGTGG ACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGCGCCTT CGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAG CGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGC ATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACT GTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTGCCAAGC CCTAGATCAGAA
208 нуклеотидная последовательность антиCD19 (8В8-018)-Рс-цепь с «выступом»-мономерный лиганд CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTCAAGAAA CCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGCAAGGCAAGCGGAT ACACCTTCACCGACTATATCATGCATTGGGTCAGGCAGGC CCCTGGCCAAGGTCTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCA TATAATGATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGAA GAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGCACTGCTTA CATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTGATGACACCGCAGTG TATTACTGTGCCAGGGGCACATATTACTACGGCTCAGCTC TGTTCGACTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGA GCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC
- 190 037557
ACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA GCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAA ACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAG GGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC TCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTG CAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGT CTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCA CCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTA CTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGG CAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCAC AACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCG GAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGC CCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTGGACC TGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGT GCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCT GGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACA AAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCG TGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGT GGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCAT CTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCTCTGG CACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGGCCCG GAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTG TCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAG GCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCT ACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAG CCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAA
204 нуклеотидная последовательность антиCD19 (8В8-018), легкая цепь см.таблицу 47
209 анти-СВ19 (8B8-018)-Fcцепь с «впадиной»димерный лиганд QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYM ELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG
- 191 037557
GSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLID GPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGP ELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGL AGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAG EGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAF GFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGL FRVTPEIPAGLPSPRSE
210 анти-СП19 (8B8-018)-Fcцепь с «выступом»мономерный лиганд QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYM ELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLID GPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGAT VLGLFRVTPEIP AGLP SPRSE
206 анти-СП19(8В8-018), легкая цепь см.таблицу 47
7.1.6. Получение одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами с заряженными остатками (конструкция 3.4).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-248), разделенных (G4S)2линкерами и слитых с CL-доменом человеческого IgG1, клонировали аналогично схеме, представленной на фиг 29А: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий CL. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-248), и слитый с СН-доменом человеческого IgG1, клонировали аналогично схеме, представленной на фиг. 29Б: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН.
Полипептид, кодирующий димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL-доменом, субклонировали в рамке считывания с СН2- и СН3-доменами тяжелой цепи с выступом человеческого IgG1 (Merchant, Zhu и др. 1998). Для улучшения правильного спаривания интродуцировали указанные ниже мутации в скрещенные CH-CL. В димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL, мутации E123R и Q124K. В мономерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим СН1, мутации К147Е и К213Е.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для CD19, клон 8В8-018, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-гамма-рецепторами (согласно методу, описанному в WO 2012/130831). Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-CD19-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V, и легкая цепь анти-CD19, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и CD19-связывающий Fab (фиг. 30, конструкция 3.4).
В табл. 50 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL и заряженными остатками (конструкция 3.4). Таблица 50. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL и заряженными остатками (конструкция 3.4)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
169 нуклеотидная последовательность конструкции димерный лиганд (71-248) - СЬ*-Рс-цепь с «выступом» См. таблицу 24
- 192 037557
170 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-248) - СН1* См. таблицу 24
203 нуклеотидная последовательность анти-СП19 (8В8-018), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 47
204 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-СО19 (8В8018) См. таблицу 47
119 димерный лиганд (71-248) - СЬ*-Рс-цепь с «выступом» См. таблицу 24
120 мономерный лиганд (71-248)-СН1* См. таблицу 24
205 анти-СО19 (8В8-018), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 47
206 легкая цепь анти-CD 19 (8В8-018) См. таблицу 47
* обозначает заряженные остатки.
7.1.7. Получение одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами без заряженных остатков (конструкция 3.5).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-248), разделенных (G4S)2линкерами и слитых с CL-доменом человеческого IgG1, клонировали аналогично схеме, представленной на фиг. 29А, но без аминокислотных мутаций в CL-домене: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий CL. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-248), и слитый с СН1-доменом человеческого IgG1, клонировали аналогично схеме, представленной на фиг. 29Б, но без аминокислотных мутаций в СН1-домене: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН1.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для CD19, клон 8В8-018, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-гамма-рецепторами (согласно методу, описанному в WO 2012/130831). Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-CD19-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V, и легкая цепь анти-CD19, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и CD19-связывающий Fab (фиг. 30, конструкция 3.5).
В табл. 51 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL без заряженных остатков (конструкция 3.5). Таблица 51. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL без заряженных остатков (конструкция 3.5)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
171 нуклеотидная последовательность конструкции димерный лиганд (71-248) - CL-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 25
172 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный лиганд (71-248)-СН1 См. таблицу 25
203 нуклеотидная последовательность анти-СП19 (8В8-018), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 47
204 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-СО19 (8В8018) См. таблицу 47
173 димерный лиганд (71-248) - CL-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 25
174 мономерный лиганд (71-248)-СН1 См. таблицу 25
205 анти-СО19 (8В8-018), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 47
206 легкая цепь анти-CD 19 (8В8-018) См. таблицу 47
7.1.8. Получение двухвалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 3.6).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-248), разделенных (G4S)2линкерами, сливали с С-концом Fc-цепи с впадиной человеческого IgG1, согласно схеме, представленной на фиг. 29В: Fc-цепь с впадиной человеческого IgG1, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-248), и слитый с С-концом Fc-цепи с выступом человеческого IgG1, получали согласно схеме, представленной на фиг. 29Г: Fc-цепь с выступом человеческого IgG1, (G4S)2коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для CD19, клон 8В8-018, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-y-рецепторами (согласно методу, описанному в WO
- 193 037557
2012/130831). Комбинация: aHTu-CD19 huIgGl, содержащая димерный лиганд цепь с впадиной с мутациями Y349C/T366S/L368A/Y407V, анти-CD19 huIgG1, содержащая мономерный лиганд цепь с выступом с мутациями S354C/T366W и легкая цепь анти-CD19, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и два FAP-связывающих Fab (фиг. 30, конструкция 3.6).
В табл. 52 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 3.6).
Таблица 52. кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на CD19 (8В8-018) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ(71-248) в слиянии с Fc (kih) (конструкция 3.6)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
211 нуклеотидная последовательность конструкции анти-CD 19 (8В8-018)-Рс-цепь с «впадиной»-димерный лиганд (71-248) CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTCAAGAAA CCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGCAAGGCAAGCGGAT ACACCTTCACCGACTATATCATGCATTGGGTCAGGCAGGC CCCTGGCCAAGGTCTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCA TATAATGATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGAA GAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGCACTGCTTA CATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTGATGACACCGCAGTG TATTACTGTGCCAGGGGCACATATTACTACGGCTCAGCTC TGTTCGACTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGA GCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGC CCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACC GTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACA CCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCT GAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACC CAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGAC AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTG CAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC
- 194 037557
GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCT GAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGC CCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTG CGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGT GAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTG GAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGC CCTGAGCTGAGCCCTGATGATCCTGCCGGACTGCTGGACC TGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGT GCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCT GGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACA AAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCG TGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGT GGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCAT CTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGG CACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCG GAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTG TCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAG GCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCT ACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCAG CAGGCCTGGGAGGCGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATCTA GAGAAGGACCCGAGCTGTCCCCCGACGATCCCGCTGGGCT GCTGGATCTGAGACAGGGCATGTTCGCTCAGCTGGTGGCT CAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGTACT CCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGGGAC TGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGGCTA AAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAG GCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTG GCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCAGCAGGGGCTG CAGCACTGGCCCTGACTGTGGACCTGCCCCCAGCTTCTTC CGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCT GCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCATCTG CATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTC AGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCTGA GATCCCAGCCGGGCTC
212 нуклеотидная последовательность конструкции анти-CD 19 (8В8-018)-Рс-цепь с «выступом»-мономерный (71-248) лиганд CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTCAAGAAA CCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGCAAGGCAAGCGGAT ACACCTTCACCGACTATATCATGCATTGGGTCAGGCAGGC CCCTGGCCAAGGTCTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCA TATAATGATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGAA GAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGCACTGCTTA CATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTGATGACACCGCAGTG TATTACTGTGCCAGGGGCACATATTACTACGGCTCAGCTC TGTTCGACTATTGGGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGA GCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC ACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG
- 195 037557
GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA GCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAA ACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAG GGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC TCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCTG CAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGT CTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCA CCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTA CTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGG CAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCAC AACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCG GAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGGGC CCTGAGCTGAGCCCTGATGATCCTGCCGGACTGCTGGACC TGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGT GCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATCCT GGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTACA AAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCG TGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGT GGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCAT CTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCTGG CACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCCCG GAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACCTG TCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGAG GCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGCT ACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCTG CCGGGCTC
204 нуклеотидная последовательность антиCD19 (8В8-018), легкая цепь см.таблицу 47
213 анти-СО19 (8B8-018)-Fcцепь с «впадиной»димерный лиганд (71-248) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYM ELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLID
- 196 037557
GPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDD PAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLT GGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSV SLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRL LHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEI PAGL
214 анти-СО19 (8B8-018)-Fcцепь с «выступом»мономерный (71-248) лиганд QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYM ELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLID GPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
206 анти-СП19 (8В8-018), легкая цепь см.таблицу 47
7.2. Получение нацеленных на CD19 (антитело, полученное из клона 8В8 с созревшей аффинностью) содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул и соответствующих контрольных молекул.
7.2.1. Создание полученных из 8В8 с созревшей аффинностью анти-CD19-связывающих агентов, лишенных горячих точек.
7.2.1.1. Селекция CD19-специфических антител с созревшей аффинностью.
Деамидирование остатков аспарагина в положениях 27d и 28, локализованных в CDR1 легкой цепи гуманизированного клона 8В8, приводит к значительному снижению биологической активности. Поэтому создавали 2 фаговые дисплейные библиотеки, в которых: а) оба остатка аспарагина в положениях 27d и 28 элиминировали и б) дополнительно рандомизировали CDR тяжелой и легкой цепей для отбора вариантов 8В8 с повышенной аффинностью.
7.2.1.2. Создание библиотек 8В8 с созревшей аффинностью, лишенных горячих точек в LCDR1.
Создание полученных из 8В8 антител с созревшей аффинностью без сайтов деамидирования N27d и N28, локализованных в LCDR1, осуществляли с помощью фагового дисплея с применением стандартного протокола (Silacci и др., 2005). На первой стадии ДНК-последовательности VL и VH гуманизированного родительского клона 8В8 (SEQ ID NO: 215 и SEQ ID NO: 216) клонировали в фагмиде заявителей, которую затем применяли в качестве матрицы для рандомизации. На следующей стадии создавали две библиотеки для отбора предпочтительных клонов с помощью фагового дисплея. Для элиминации вышеуказанных положений горячих точек в обеих библиотеках применяли рандомизированный праймер LCDR1 (SEQ ID NO: 217), который обеспечивал присутствие только аминокислот S T Q Е в положениях 27d и 28. Библиотеку для созревания 1 рандомизировали в CDR1 и CDR2 и легкой, и тяжелой цепей, в то время как библиотеку для созревания 2 рандомизировали в CDR1 и CDR3 легкой цепи и в CDR3 тяжелой цепи. Рандомизированные положения в соответствующих CDR-участках представлены на фиг. 31А. Для создания библиотеки для созревания 1, рандомизированной в CDR1 и CDR2 и легкой, и тяжелой цепей, объединяли три фрагмента с помощью ПЦР для сращивания (генома) перекрывающимися расширениями (SOE) и клонировали в фаговом векторе (фиг. 31Б). Применяли следующие комбинации праймеров для создания фрагментов библиотек: фрагмент 1: LMB3 (SEQ ID NO: 222) и CD19 L1 обратный случайный (рассеянный) праймер (SEQ ID NO: 217), фрагмент 2: CD19 L2 прямой случайный праймер (SEQ ID NO: 218) и CD19 H1 обратный случайный праймер (SEQ ID NO: 219) и фрагмент 3 (CD19 Н2 прямой случайный праймер (SEQ ID NO: 220) и CD19 Н3 обратный константный праймер (SEQ ID NO: 221) (табл. 53). После сборки полноразмерного рандомизированного фрагмента в достаточных количествах его расщепляли NcoI/NheI параллельно с идентично обработанным акцепторным фагмидным вектором. 3-кратный молярный избыток библиотеки-вставки лигировали с 10 мкг фагмидного вектора. Очищенные полученные в результате лигирования продукты применяли для 20 трансформаций, что приводило к получению 2х109 трансформантов. Фагмидные частицы, экспонирующие библиотеку 8В8 с созревшей аффинностью, выделяли (спасали) и очищали путем ПЭГ/NaCl-очистки с целью применения для селекций.
- 197 037557
Аналогичным образом создавали вторую библиотеку, рандомизированную в CDR1 и CDR3 легкой цепи и в CDR3 тяжелой цепи. Применяли следующие комбинации праймеров для создания фрагментов библиотек: фрагмент 1: LMB3 (SEQ ID NO: 222) и CD19 L1 обратный случайный праймер (SEQ ID NO: 217), фрагмент 2: CD19 L1 прямой константный праймер (SEQ ID NO: 223) и CD19 L3 обратный случайный праймер (SEQ ID NO: 224) и фрагмент 3: CD19 L3 обратный константный праймер (SEQ ID NO: 225) и CD19 Н3 обратный случайный праймер (SEQ ID NO: 226) (табл. 54). После сборки полноразмерного рандомизированного фрагмента в достаточных количествах его расщепляли NcoI/KpnI параллельно с идентично обработанным акцепторным фагмидным вектором. 3-кратный молярный избыток библиотеки-вставки лигировали с 20 мкг фагмидного вектора. Очищенные полученные в результате лигирования продукты применяли для 40 трансформаций, что приводило к получению 2х109 трансформантов. Фагмидные частицы, экспонирующие библиотеку 8В8 с созревшей аффинностью выделяли (спасали) и очищали путем ПЭГ/NaCl-очистки с целью применения для селекций.
Таблица 53. Праймеры библиотеки для созревания аффинности 8В8 и удаления горячих точек L1_L2/H1_H2
SEQ ID Обозначение Последовательность
217 CD19 LI обратный случайный праймер CAG CTG CGG GCT CTG ACC CGG ТТТ CTG GAG АТА CCA GTT CAG 1 CGT 2 GCC 3 GGA 4 ТТС CAG AGA TTG GCT GGA ТТТ GCA AGA ААТ G 1: 40% Y, 6% A/S/T/G/P/D/N/E/Q/V, 2: 40% N, 6% A/S/T/Y/G/P/D/E/Q/V, 3: 25% S/T/Q/E, 4: 25% S/T/Q/E
218 CD19 L2 прямой случайный праймер СТС CAG AAA CCG GGT CAG AGC CCG CAG CTG CTG АТС ТАС 5 GTA ТСТ 6 CGC 7 8 GGC GTT 9 GAT CGT ТТС AGC GGT ТСТ GGA ТСС GGC АСС 5: 30% R, 20% Е, 5% A/S/T/Y/G/P/D/N/Q/V. 6: 30% К, 20% S, 5% A/N/T/Y/G/P/D/E/Q/V, 7: 40% F, 5% A/S/T/Y/G/P/D/E/Q/V/I/L, 8: 40% S, 6.6% A/T/Y/G/P/D/E/Q/V, 9: 50% Р, 50% L
219 CD19 Н1 обратный случайный праймер CAT CCA СТС CAG ACC CTG GCC CGG GGC CTG ACG AAC CCA 10 CAT 11 12 13 14 GAA 15 GTA ACC AGA TGC TTT GCA GCT САС TTT AAC GGA AGC 10: 52% H, 4% G/A/S/P/T/N/Y/D/E/Q/V/1,11: 30% I, 15% Y, 5% G/A/S/T/P/N/H/D/E/Q/V,12: 52% Y, 4% G/A/S/P/T/N/H/D/E/Q/V/I,13: 30% D, 15% G, 5% A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I, 14: 52% T, 4% G/A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I, 15: 52% T, 4% G/A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I
220 CD 19 Н2 прямой случайный праймер CAG GCC CCG GGC CAG GGT CTG GAG TGG ATG GGC 16 ATT 17 CCA 18 19 20 21 TCC 22 TAT ACC 23 AAA TTC CAG GGC CGC GTC ACG ATG ACC 16: 45% Y, 5% A/S/P/T/N/H/D/E/Q/V/I, 17: 52% N, 4% G/A/S/P/Y/T/H/D/E/Q/V/I, 18: 40% Y, 5% G/A/S/P/T/N/H/D/E/Q/V/I, 19: 30% N, 15% S, 5% G/A/T/P/Y/H/D/E/Q/V/I, 20: 30% D, 15% G, 5% A/S/T/P/Y/N/H/E/Q/V/I, 21: 52% G, 4% N/A/S/P/Y/T/H/D/E/Q/V/I, 22: 30% K, 15% N, 4% G/A/S/P/Y/T/H/D/E/Q/V/I, 23: 30% E, 15% Q, 5% G/A/S/T/P/Y/N/H/D/V/I
221 CD 19 НЗ обратный константный праймер CGTCACCGGTTCGGGGAAGTAGTCCTTGACCAG
222 LMB3 CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC
- 198 037557
Таблица 54. Праймеры библиотеки для созревания аффинности
8В8 и удаления горячих точек L1_L3/H3
SEQ ID Обозначение Последовательность
223 CD19 L1 прямой константный праймер TGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCCGCAG
217 CD19 L1 обратный случайный праймер См. таблицу 53
224 CD19 L3 обратный случайный праймер ТТТ AAT ТТС CAG ТТТ AGT ТСС TTG ACC GAA GGT 24 25 26 27 28 29 CTG CAG АСА АТА GTA GAC GCC AAC GTC ТТС AGC 24: 52% Y, 4% G/A/S/T/N/P/D/E/Q/V/L/I, 25: 52% Р, 4% G/A/S/T/Y/N/H/D/E/Q/V/I, 26: 42% V, 10% L, 4% G/A/S/T/Y/N/P/D/E/Q/V/I, 27: 52% Н, 4% G/A/S/T/Y/N/P/D/E/Q/V/I, 28: 42% Т, 10% I, 4% G/A/S/T/Y/N/P/D/E/Q/V/L, 29: 45% L, 11% G, 4% A/S/T/Y/N/P/D/E/Q/V/I
225 CD19 L3 прямой константный праймер ACCTTCGGTCAAGGAACTAAACTGGAAATTAAACG
226 CD19 НЗ обратный случайный праймер ТТ GGT GCT AGC AGA GCT ТАС GGT САС CGT GGT ACC TTG GCC CCA GTA АТС ААА 30 31 32 33 34 35 36 37 38 GCG TGC АСА АТА GTA AAC AGC GGT GTC 30: 50% L, 3.8% G/A/S/T/P/H/Y/N/D/E/Q/V/I, 31: 50% А, 4,2% G/S/T/P/H/Y/N/D/E/Q/V/I, 32: 50% S, 4,2% G/A/T/P/H/Y/N/D/E/Q/V/I, 33: 50% G, 4,2% S/A/T/P/H/Y/N/D/E/Q/V/I, 34: 50% Y, 4,2% G/A/T/P/H/S/N/D/E/Q/V/I, 35: 50% Y, 4,2% G/A/T/P/H/S/N/D/E/Q/V/I, 36: 50% Y, 4,2% G/A/T/P/H/S/N/D/E/Q/V/I, 37: 50% Т, 4,2% G/A/Y/P/H/S/N/D/E/Q/V/I, 38: 50% G, 4,2% Y/A/T/P/H/S/N/D/E/Q/V/I
222 LMB3 См. таблицу 53
7.2.1.3. Селекция полученных из 8В8 клонов с созревшей аффинностью, лишенных горячих точек N27d и N28 в LCDR1.
Для селекции клонов с созревшей аффинностью, лишенных горячих точек N27d и N28 в LCDR1, осуществляли два подхода селекции с помощью фагового дисплея.
При использовании первого подхода селекцию осуществляли на слитом белке человеческий CD19Fc с использованием обеих фаговых дисплейных библиотек. Раунды пэннинга осуществляли в растворе согласно следующей схеме: 1) связывание ~ 1012 фагмидных частиц с 30 нМ биотинилированным белком CD19-Fc в течение 0,5 ч в общем объеме 1 мл, 2) захват биотинилированного белка CD19-Fc и специфически связанных фаговых частиц путем добавления 5,4х107 покрытых стрептивидином магнитных гранул в течение 10 мин, 3) промывка гранул с использованием 5 раз 1 мл ЗФР/Твин20 и 5 раз 1 мл ЗФР, 4) элюция фаговых частиц путем добавления 1 мл 100 мМ ТЭА в течение 10 мин и нейтрализация путем добавления 500 мкл 1М Трис/HCl, рН 7,4, 5) повторное заражение находящихся на экспоненциальной фазе роста бактерий Е.coli TG1 и 6) заражение хелперного фага VCSM13 и последующее осаждение с помощью ПЭГ/NaCl фагмидных частиц, предназначенных для применения в следующих раундах селекции. Селекции осуществляли с использованием 3 раундов, применяя понижающиеся концентрации антигена (30х10-9М, 10х10-9М и 3х10-9М). В раунде 2 и 3 захват комплексов антиген:фаг осуществляли, используя покрытые нейтравидином планшеты вместо стрептивидиновых гранул. Нейтравидиновые планшеты промывали 5 раз ЗФР/Твин20 и 5 раз ЗФР. В раунде 3 нейтравидиновый планшет инкубировали в течение ночи в 2 л ЗФР для селекции по скорости диссоциации (off-rate-селекция) перед элюцией фага из планшета Кроме того, белок, содержащий CD19 обезьян циномогус-Fc, применяли в раунде 2 для обогащения перекрестно-реактивными связывающими агентами.
При использовании второго подхода селекции фаговый пэннинг осуществляли на клетках, кратковременно экспрессирующих на клеточной поверхности ECD CD19 либо человека, либо обезьян циномолгус Для кратковременной трансфекции HEK-клеток создавали экспрессионные плазмиды, которые несли ДНК-последовательности (в направлении от 5' к 3') следующих белковых сегментов Flag-метка, SNAP-метка, ECD CD19 либо человека, либо обезьян циномолгус и трансмембранная область рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFR) (SEQ ID NO: 227 и 228). Экспрессию соответствующих белков (SEQ ID NO: 229 и 230) на клеточной поверхности подтверждали проточной цитометрией, используя для детекции антитело к Flag. В первом раунде селекции обе библиотеки экспонировали на клетках, экспрес- 199 037557 сирующих слитый белок, содержащий ECD CD19 либо человека, либо обезьян циномолгус Для последующих раундов пэннинга виды ECD CD19 соответственно изменяли. Клетки, кратковременно трансфектированные нерелевантным мембранным белком, применяли для предпроверки (преклиринга).
Раунды пэннинга осуществляли согласно следующей схеме:
1) трансфекция HEK-клеток конструкциями, экспрессирующими либо ECD CD19, либо нерелевантный трансмембранный белок, согласно описанной выше стандартной процедуре;
2) инкубация клеток в целом в течение 48 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% СО2. Выделение клеток путем центрифугирования (3 мин при 250 х g) и ресуспендирование 1х107 ECD CD19-позитивных клеток и 1 х 107 негативных клеток в ЗФР/5% БСА соответственно;
3) преклиринг неспецифического фага путем инкубации фаговой библиотеки с 1х107 CD19негативных клеток в течение 60 мин при 4°С с использованием осторожного вращения на ротаторе для пробирок;
4) центрифугирование клеток при 250 х g в течение 3 мин и перенос супернатанта в свежую пробирку и добавление 1х107 CD19-позитивных клеток и инкубация в течение 60 мин при 4°С с использованием осторожного вращения на ротаторе для пробирок;
5) промывка клеток путем центрифугирования в течение 1 мин при 250хg, аспирация супернатанта и ресуспендирование в 1 мл ЗФР (8 раз);
6) элюция фага с помощью 1 мл 100 мМ ТЭА, инкубация в течение 5 мин при КТ и нейтрализация элюата 500 мкл 1М Трис-HCl, рН 7,6;
7) повторное заражение бактерий Е.coli TG1 на экспоненциальной фазе роста; и
8) заражение хелперным фагом VCSM13 и последующее осаждение ПЭГ/NaCl фагмидных частиц, предназначенных для использования в последующих раундах селекции. Селекции проводили с использованием более 3 раундов.
Для обоих подходов селекции специфические связывающие агенты идентифицировали с помощью ELISA следующим образом: 100 мкл 30 нМ биотинилированного белка CD19-Fc на лунку применяли для сенсибилизации нейтравидиновых планшетов. Добавляли содержащие Fab бактериальные супернатанты и связывание Fab выявляли посредством их Flag-меток, используя вторичное антитело к Flag/HRP.
Клоны, которые выявлены как ELISA-позитивные на рекомбинантном человеческом CD19, дополнительно тестировали с помощью ELISA, основанного на анализе клеток, в котором применяли клетки, кратковременно трансфектированные содержащими ECD человеческого CD19 экспрессионными плазмидами (SEQ ID NO: 227). Указанный анализ осуществляли следующим образом: через 48 ч после трансфекции HEK-клетки собирали и центрифугировали при 250 х g в течение 5 мин. Затем клетки ресуспендировали в охлажденном на льду ЗФР, дополненном 2% БСА, до получения 4х106 клеток/мл и инкубировали в течение 20 мин на льду для блокады неспецифических сайтов связывания. По 4 х 105 клеток в 100 мкл вносили в каждую лунку 96-луночного планшета и центрифугировали при 250 х g и 4°С в течение 3 мин. Супернатант аспирировали и 50 мкл бактериального супернатанта, содержащего растворимые Fab-фрагменты, разводили 50 мкл охлажденного на льду ЗФР/2% БСА, добавляли в планшет, смешивали с клетками и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. Затем клетки промывали 3 раза охлажденным на льду ЗФР перед добавлением из расчета 100 мкл на лунку ЗФР/2% БСА, содержащего в разведении 1:2000 антитело к Fab-HRP. После инкубации в течение 1 ч клетки вновь промывали 3 раза охлажденным на льду ЗФР. Для проявления добавляли 100 мкл субстрата 1-step ultra TMB-ELISA на лунку. После инкубации в течение 10 мин супернатант переносили в новый 96-луночный планшет, содержащий 40 мкл 1М H2SO4 на лунку, и абсорбцию измеряли при 450 нМ. Клоны, для которых характерны сигналы, выраженно превышающие фоновый уровень, подвергали скринингу в отношении кинетических характеристик с помощью SPR-анализа на устройстве ProteOn XPR36.
7.2.1.4. Идентификация вариантов 8В8 с созревшей аффинностью с помощью SPR.
Для характеризации ELISA-позитивных клонов скорость диссоциации измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса и сравнивали с родительским гуманизированным клоном 8В8.
При осуществлении этого эксперимента 7000 RU поликлонального антитела к человеческому Fab иммобилизовали на всех 6 каналах GLM-чипа с помощью амминного сочетания (Na-ацетат, рН 4,5, 25 мкл/мин, 240 с) (вертикальная ориентация). Каждый содержащий антитело бактериальный супернатант фильтровали и 2-кратно разводили ЗФР, а затем инъецировали в течение 360 с со скоростью 25 мкл/мин до достижения уровней иммобилизации, соответствующих 100-400 единиц ответа (RU), в вертикальной ориентации. Инъекция конструкции мономерный CD19-Fc: для измерения кинетических характеристик за один прогон (one-shot-кинетика) направление инъекции изменяли на горизонтальную ориентацию, инъецировали одновременно трехкратные серийные разведения очищенной конструкции мономерный CD19-Fc (концентрации, варьирующие в диапазоне от 150 до 6 нМ) со скоростью 50 мкл/мин параллельно в различные каналы 1-4, продолжительность ассоциации составляла 180 с, а продолжительность диссоциации 300 с. Fc-фрагмент человеческого IgG (150 нМ) инъецировали в канал 5 в качестве отрицательного контроля специфического связывания с конструкцией мономерный CD19-Fc. В шестой канал инъецировали буфер (ЗФРТ), создавая параллельный (in-line) пустой контроль для сопоставления. Реге- 200 037557 нерацию осуществляли с помощью двух импульсных обработок 10 мМ глицином, рН 1,5 и 50 мМ NaOH в течение 30 с со скоростью 90 мкл/мин (горизонтальная ориентация). Константы скорости диссоциации (kof) рассчитывали с использованием простой модели связывания 1: 1 Ленгмюра с помощью программы ProteOn Manager v3.1 путем одновременной аппроксимации сенсограмм. Идентифицировали клоны, экспрессирующие Fab с наиболее низкими константами скорости диссоциации (табл. 55). Следует отметить, что константы скорости диссоциации клонов 5А07 и 5В08 не удалось определить из-за несоответствующей аппроксимации. Несмотря на это оба клоны были отобраны, поскольку полученные результаты позволяют предположить очень низкую диссоциацию. Вариабельные домены соответствующих фагмид секвенировали. Важно отметить, что оба остатка аспарагина в LCDR1 (положения 27d и 28) заменяли на серин или треонин, демонстрируя удаление обоих сайтов деамидирования. Сравнительный анализ первичной структуры представлен на фиг. 32. CDR наиболее перспективных клонов представлены в табл. 56 (вариабельные области легкой цепи) и табл. 57 (вариабельные области тяжелой цепи) (клон 5Н09: (SEQ ID NO: 231-236); клон 7Н07: (SEQ ID NO: 237-242); клон 2В03: (SEQ ID NO: 243-248); клон 2B11: (SEQ ID NO: 249-254); клон 5А07: (SEQ ID NO: 255-260); клон 5В08: (SEQ ID NO: 261-266); клон 5D08: (SEQ ID NO: 267-272).
Таблица 55. Константы диссоциации отобранных клонов, полученных в результате скринингового анализа с использованием бактериального супернатанта
Клон Константа диссоциаци kd (1/с)
Родительский 8В8 3,01Е-4
5Н09 2,58Е-4
7Н07 5,75Е-5
2В03 3,24Е-5
2В11 4,37Е-6
5А07 n.d.
5В08 n.d.
5D08 1,95Е-4
Таблица 56. Последовательности CDR отобранных легких цепей 8В8
Клон SEQ ID NO CDR-L1 SEQ ID NO CDR-L2 SEQ ID NO CDR-L3
5Н09 231 KSSQSLESSTGNTYLN 232 RVSKRFS 233 LQLIDYPVT
7Н07 237 KSSQSLETSTGNTYLN 238 RVSKRFS 239 LQATHIPYT
2В03 243 KSSQSLETSTGNTYLN 244 RVSKRFS 245 LQLTHVPYT
2В11 249 KSSQSLETSTGTTYLN 250 RVSKRFS 251 LQLLEDPYT
5А07 255 KSSQSLETSTGNTYLN 256 RVSKRFS 257 LQPGHYPGT
5В08 261 KSSQSLETSTGNTYLN 262 RVSKRFS 263 LQLDSYPNT
5D08 267 KSSQSLETSTGNTYLN 268 RVSKRFS 269 LQLTHEPYT
Таблица 57. Последовательности CDR отобранных тяжелых цепей 8В8
Клон SEQ ID NO CDR- H1 SEQ ID NO CDR-H2 SEQ ID NO CDR-H3
5H09 234 DYIMH 235 YINPYNDGSKYTEKFQG 236 GTYYYGSALFDY
7H07 240 DYIMH 241 YINPYNDGSKYTEKFQG 242 GTYYYGSELFDY
2B03 246 DYITH 247 YINPYNDGSKYTEKFQG 248 GTYYYGPDLFDY
2B11 252 DYIMH 253 YINPYNDGSKYTEKFQG 254 GTYYYGPQLFDY
5A07 258 DYIMH 259 YINPYNDGSKYTEKFQG 260 GTYYYGSALFDY
5B08 264 DYIMH 265 YINPYNDGSKYTEKFQG 266 GTYYYGPQLFDY
5D08 270 DYIMH 271 YINPYNDGSKYTEKFQG 272 GTYYYGSELFDY
7.2.2. Характеризация полученных из 8В8 антител с созревшей аффинностью.
7.2.2.1. Клонирование вариабельных доменов антител в экспрессионных векторах.
Последовательности ДНК вариабельных областей тяжелых и легких цепей отобранных анти-CD19- 201 037557 связывающих агентов субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. В тяжелую цепь интродуцировали мутации Pro329Gly,
Leu234Ala и Leu235Ala для элиминации связывания с Fc-γ-рецепторами согласно методу, описанному в публикации Международной заявки на патент WO 2012/130831 А1.
кДНК и аминокислотные последовательности анти-CD19 IgG представлены в табл. 58 и 59 соответственно. Все кодирующие антитело последовательности клонировали в экспрессионном векторе, в котором транскрипция вставки находилась под контролем химерного промотора MPSV и который содержал синтетическую сигнальную полиА-последовательность, локализованную на 3'-конце CDS. Кроме того, вектор содержал последовательность OriP EBV для поддержки эписомальной формы плазмиды.
Таблица 58. кДНК и аминокислотные последовательности клона анти-CD19 8В8 в формате P329GLALA человеческого IgG1
SEQ ID NO: Клон и цепь Последовательность
273 легкая цепь родительского 8В8 GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAG ATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAA TGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCA CAACTCCTGATCTACAGGGTTTCCAAACGATTTTCTGGGGTCCTAGACA GGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCA GAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGCCTACAACTTACACA TGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGL4C GGTGGCTGCA CCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCCA TCTGA TGA GCAGTTGAAA TCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAA ТАА СТТСТА ТСССА GA GA GG CCAAAGTA CA GTGGAA GGTGGA ТАА CGCCCTCCAA TCGGGTAA СТСССА GG A GAGTGTCA CA GAGCA GGA CA GCAA GGA CA GCA ССТА С A GCCTCA GCAGCA CCCTGA CGCTGA GCAAA GCA GA СТА CGA GAAA С A CAAAGTCTA CGCCTGCG АА GTCA СССА ТС A GGGCCTGA GCTCGCCCGTCA СААА GA GCTTCAA С A GGG GAGAGTGT
274 тяжелая цепь родительского 8В8 GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTT CAGTGAAGATGGCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATAT TATGCACTGGGTGAAGCAGAAGACTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGG ATATATTAATCCTTACAATGATGGTTCTAAGTACACTGAGAAGTTCAAC GGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCTTCCATCACAGCCTACATGG AGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAG AGGGACCTATTATTATGGTAGCGCCCTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGC ACCACTCTCACAGTCTCCTCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC CCTGGCA СССТССТССАА GA GCA CCTCTGGGGGCA С A GCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAA GGA СТА CTTCCCCGAA CCGGTGA CGGTGTCGTGGAA СТС A G GCGCCCTGA CCA GCGGCGTGCA С A CCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCA G GA СТСТА СТСССТСА GCA GCGTGGTGA CCGTGCCCTCCA GCAGCTTGGGCA СССА GA ССТА С A TCTGCAA CGTGAA ТСА САА GCCCA GCAA С А ССАА GGTGG А САА GAAA GTTGA GCCCAAA TCTTGTGA САААА СТС А С А С A TGCCCA CCGTG СССА GCA CCTGAA GCTGCAGGGGGA CCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAA А СССАА GGA CA СССТСА TGA TCTCCCGGA CCCCTGA GGTCA CA TGCGTGGT GGTGGA CGTGA GCCA CGAA GA CCCTGA GGTCAAGTTCAA CTGGTA CGTGGA CGGCGTGGA GGTGCA TAA TGCCAA GA CAAA GCCGCGGGA GGA GCAGTA CA A CA GCA CGTA CCGTGTGGTCA GCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCA GGA CTGGC TGAA TGGCAA GGA GT A CAA GTGCAA GGTCTCCAA CAAA GCCCTCGGCGCCC CCA TCGA GA AAA CCA TCTCCAAA GCCAAA GGGCA GCCCCGA GAA CCA CAGG TGTA CA CCCTGCCCCCA TCCCGGGA TGA GCTGA CCAA GAA CCA GGTCA GCC TGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG A GA GCAA TGGGCA GCCGGA GAA САА СТА CAA GA CCA CGCCTCCCGTGCTGG A CTCCGA CGGCTCCTTCTTCCTCTA CA GCAA GCTCA CCGTGGA CAA GA GCA G
GTGGCA GCA GGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCA TGA GGCTCTGCA CAA CCA СТА CA CGCA GAA GA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
275 легкая цепь родительского 8В8 DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQL LIYRVSKRFSGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCLQLTHVPYTF GGGTK LEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
276 тяжелая цепь родительского 8В8 EVQLQQSGPELVKPGASVKMACKASGYTFTDYIMHWVKQKTGQGLEWIG YINPYNDGSKYTEKFNGKATLTSDKSSITAYMELSSLTSEDSAVYYCARGT NNNGSRLYONWGQGYYLYNSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEP VTVS WNSGAL TSG VHTFPA VL QSSGL YSLSSVVTVPSSSL G TQ TYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS L TCL VKGFYPSDIA VE WESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 202 037557
Таблица 59. кДНК и аминокислотные последовательности клонов aHTu-CD19 с созревшей аффинностью в формате P329GLALA человеческого IgG1
SEQ ID NO: Клон и цепь Последовательность
277 2В11, легкая цепь GATATTGTCATGACTCAAACTCCACTGTCTCTGTCCGTGACCCCGGGTC AGCCAGCGAGCATTTCTTGCAAATCCAGCCAATCTCTGGAAACCTCCAC CGGCACCACGTACCTGAACTGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCC GCAGCTGCTGATCTACCGTGTATCTAAGCGCTTCTCCGGCGTTCCTGATC GTTTCAGCGGTTCTGGATCCGGCACCGACTTTACTCTGAAAATCAGCCG TGTGGAAGCTGAAGACGTTGGCGTCTACTATTGTCTGCAGCTGCTGGAA GATCCATACACCTTCGGTCAAGGAACGAAACTGGAAATTAAACGTACG GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGA AATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAG AGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAG CCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAA AGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACA AAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
278 2В11, тяжелая цепь CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCTT CCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATAT CATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGG CTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAG GGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACATGG AACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCACG CGGTACCTACTACTACGGTCCACAGCTGTTTGATTACTGGGGCCAAGGT ACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGT CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCC TGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGT CAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGT
- 203 037557
CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
279 2B11, легкая цепь DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGTTYLNWYLQKPGQSPQLLI YRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFG QGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
280 2В11, тяжелая цепь Q VQL VQS G АЕ VKKPG AS VK VS СК AS GYTFTD YIMHW VRQ АР GQ GLEWM GYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR GTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
281 7Н07, легкая цепь GATATTGTTATGACTCAAACTCCACTGTCTCTGTCCGTGACCCCGGGTC AGCCAGCGAGCATTTCTTGCAAATCCAGCCAATCTCTGGAAACCTCCAC CGGCAACACGTACCTGAACTGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCC GCAGCTGCTGATCTACCGTGTATCTAAGCGCTTCTCCGGCGTTCCTGATC GTTTCAGCGGTTCTGGATCCGGCACCGACTTTACTCTGAAAATCAGCCG TGTGGAAGCTGAAGACGTTGGCGTCTACTATTGTCTGCAGGCAACCCAT ATCCCATACACCTTCGGTCAAGGAACTAAACTGGAAATTAAACGTACGG TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAAC TCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGC CTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
282 7Н07, тяжелая цепь CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCTT CCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATAT CATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGG CTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAG GGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACATGG AACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCACG CGGTACCTACTACTACGGTTCTGAACTGTTTGATTACTGGGGCCAAGGT ACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGT CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCC TGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGT CAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGT CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG
- 204 037557
CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
283 7H07, легкая цепь DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLL I YR VSKRF S G VPDRF S GS GS GTDFTLKISRVE AED VG VYYCLQ АТШР YTF G QGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
284 7Н07, тяжелая цепь QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWM GYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR GTYYYGSELFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
285 2В03, легкая цепь GATATTGTTATGACTCAAACTCCACTGTCTCTGTCCGTGACCCCGGGTC AGCCAGCGAGCATTTCTTGCAAATCCAGCCAATCTCTGGAAACCTCCAC CGGCAACACGTACCTGAACTGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCC GCAGCTGCTGATCTACCGTGTATCTAAGCGCTTCTCCGGCGTTCCTGAT CGTTTCAGCGGTTCTGGATCCGGCACCGACTTTACTCTGAAAATCAGCC GTGTGGAAGCTGAAGACGTTGGCGTCTACTATTGTCTGCAGTTGACCCA CGTTCCGTACACCTTCGGTCAAGGAANNAAACTGGAAATTAAACGTAC GGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
286 2В03, тяжелая цепь CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCT TCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATA TCACGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGG GCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCC AGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACAT GGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCA CGCGGTACCTACTACTACGGTCCAGATCTGTTTGATTACTGGGGCCAAG GTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTAC AGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG CAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTC AGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACC
- 205 037557
ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
287 2B03, легкая цепь DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLL IYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTF GQGXKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
288 2В03, тяжелая цепь QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYITHWVRQAPGQGLEWM GYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR GTYYYGPDLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К
289 5А07, легкая цепь GATATTGTTATGACTCAAACTCCACTGTCTCTGTCCGTGACCCCGGGTC AGCCAGCGAGCATTTCTTGCAAATCCAGCCAATCTCTGGAAACCTCCAC CGGCAACACGTACCTGAACTGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCC GCAGCTGCTGATCTACCGTGTATCTAAGCGCTTCTCCGGCGTTCCTGAT CGTTTCAGCGGTTCTGGATCCGGCACCGACTTTACTCTGAAAATCAGCC GTGTGGAAGCTGAAGACGTTGGCGTCTACTATTGTCTGCAGCCAGGTCA TTACCCAGGTACCTTCGGTCAAGGAACTAAACTGGAAATTAAACGTAC GGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
290 5А07, тяжелая цепь CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCT TCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATA TCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGG GCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCC AGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACAT GGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCA CGCGGTACTTACTACTACGGTTCCGCCCTCTTTGATTACTGGGGCCAAG GTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTAC AGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG CAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTC AGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACC
- 206 037557
ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
291 5A07, легкая цепь DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLL I YR VSKRF S G VPDRF S GS GS GTDFTLKISRVE AED VG VYYCLQPGH YP GTF GQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
292 5А07, тяжелая цепь QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWM GYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR GTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К
293 5D08, легкая цепь GATATTGTTATGACTCAAACTCCACTGTCTCTGTCCGTGACCCCGGGTC AGCCAGCGAGCATTTCTTGCAAATCCAGCCAATCTCTGGAAACCTCCAC CGGCAACACGTACCTGAACTGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCC GCAGCTGCTGATCTACCGTGTATCTAAGCGCTTCTCCGGCGTTCCTGAT CGTTTCAGCGGTTCTGGATCCGGCACCGACTTTACTCTGAAAATCAGCC GTGTGGAAGCTGAAGACGTTGGCGTCTACTATTGTCTGCAGCTGACCCA TGAACCATACACCTTCGGTCAAGGAACTAAACTGGAAATTAAACGTAC GGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
294 5D08, тяжелая цепь CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCT TCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATA TCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGG GCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCC AGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACAT GGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCA CGCGGTACCTACTACTACGGTTCTGAACTGTTTGATTACTGGGGCCAAG GTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTAC AGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG CAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTC AGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACC
- 207 037557
ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
295 5D08, легкая цепь DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLL IYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHEPYTF GQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GL S SP VTKSFNRGE С
296 5D08, тяжелая цепь Q VQL VQS G АЕ VKKPG AS VK VS СК AS GYTFTD YIMHW VRQ АР GQ GLEWM GYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR GTYYYGSELFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
297 5В08, легкая цепь GATATTGTTATGACTCAAACTCCACTGTCTCTGTCCGTGACCCCGGGTC AGCCAGCGAGCATTTCTTGCAAATCCAGCCAATCTCTGGAAACCTCCAC CGGCAACACGTACCTGAACTGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCC GCAGCTGCTGATCTACCGTGTATCTAAGCGCTTCTCCGGCGTTCCTGAT CGTTTCAGCGGTTCTGGATCCGGCACCGACTTTACTCTGAAAATCAGCC GTGTGGAAGCTGAAGACGTTGGCGTCTACTATTGTCTGCAGCTGGATTC TTACCCAAACACCTTCGGTCAAGGAACTAAACTGGAAATTAAACGTAC GGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
298 5В08, тяжелая цепь CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCT TCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATA TCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGG GCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCC AGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACAT GGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCA CGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGCTGTTTGATTACTGGGGCCAAG GTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTAC AGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG CAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTC AGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG
- 208 037557
CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
299 5B08, легкая цепь DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLL IYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLDSYPNTF GQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
300 5В08, тяжелая цепь Q VQL VQS G АЕ VKKPG AS VK VS СК AS GYTFTD YIMHW VRQ АР GQ GLEWM GYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR GTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К
301 5Н09, легкая цепь GATATTGTTATGACTCAAACTCCACTGTCTCTGTCCGTGACCCCGGGTC AGCCAGCGAGCATTTCTTGCAAATCCAGCCAATCTCTGGAATCTTCCAC CGGCAACACGTACCTGAACTGGTATCTCCAGAAACCGGGTCAGAGCCC GCAGCTGCTGATCTACCGTGTATCTAAGCGCTTCTCCGGCGTTCCTGAT CGTTTCAGCGGTTCTGGATCCGGCACCGACTTTACTCTGAAAATCAGCC GTGTGGAAGCTGAAGACGTTGGCGTCTACTATTGTCTGCAGCTGATCGA TTACCCAGTTACCTTCGGTCAAGGAACTAAACTGGAAATTAAACGTACG GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGA AATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAG AGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAG CCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAA AGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACA AAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
302 5Н09, тяжелая цепь CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAACCGGGCGCT TCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTCACTGACTATA TCATGCACTGGGTTCGTCAGGCCCCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGG GCTACATTAACCCATACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCC AGGGCCGCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTACAT GGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTTTACTATTGTGCA CGCGGTACCTACTACTACGGTTCTGCACTGTTTGATTACTGGGGCCAAG GTACCACGGTGACCGTAAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTAC AGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG CAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTC AGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG
- 209 037557
CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
303 5Н09, легкая цепь DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLESSTGNTYLNWYLQKPGQSPQLL IYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLIDYPVTFG QGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
304 5Н09, тяжелая цепь QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWM GYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR GTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К
7.2.2.2. Определение аффинности отобранных антител с помощью SPR.
Для точного определения аффинности с помощью SPR отобранные антитела к CD19 получали путем котрансфекции клеток HEK293-EBNA экспрессионными векторами для клеток млекопитающих, используя полиэтиленимин. Клетки трансфектировали соответствующими экспрессионными векторами в соотношении 1:1 (вектор для тяжелой цепи: вектор для легкой цепи) согласно стандартной процедуре. Через 7 дней после трансфекции измеряли титр антитела в супернатанте и все титры уравновешивали до 10 мкг/мл.
Аффинность (KD) родительского антитела 8В8, а также его производных измеряли с помощью SPR, используя устройство ProteOn XPR36 (фирма Biorad) при 25°С. 7000 RU поликлонального антитела к человеческому Fab иммобилизовали на всех 6 каналах GLM-чипа с помощью амминного сочетания (Naацетат, рН 4,5, 25 мкл/мин, 240 с) (вертикальная ориентация). Каждый содержащий антитело супернатант HEK фильтровали и разводили ЗФРТ (10 мМ фосфат, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,4, 0,005% Твин 20) до концентрации 10 мкг/мл, а затем инъецировали в течение 360 с со скоростью 25 мкл/мин до достижения уровней иммобилизации, соответствующих 500-800 единиц ответа (RU), в вертикальной ориентации. Инъекция конструкции мономерный CD19-Fc: для измерения кинетических характеристик за один прогон (one-shot-кинетика) направление инъекции изменяли на горизонтальную ориентацию, трехкратные серийные разведения очищенной конструкции мономерный CD19-Fc (концентрации, варьирующие в диапазоне от 150 до 6 нМ) инъецировали одновременно со скоростью 50 мкл/мин параллельно в различные каналы 1-4, продолжительность ассоциации составляла 180 с, а продолжительность диссоциации 300 с. Fc-фрагмент человеческого IgG (150 нМ) инъецировали в канал 5 в качестве отрицательного контроля специфического связывания с конструкцией мономерный CD19-Fc. В шестой канал инъецировали буфер (ЗФРТ), создавая параллельный (in-line) пустой контроль для сопоставления. Обобщение соответствующих сенсограмм представлено на фиг. 33. Регенерацию осуществляли с помощью двух импульсных обработок 10 мМ глицином, рН 1,5 и 50 мМ NaOH в течение 30 с со скоростью 90 мкл/мин (горизонтальная ориентация). Константы скорости диссоциации (koff) рассчитывали с использованием простой модели связывания 1:1 Ленгмюра с помощью программы ProteOn Manager v3.1 путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия диссоциации (KD) рассчитывали как соотношение kof/kon. Обобщение результатов кинетических и термодинамических исследований представлено в табл. 60. Константа диссоциации всех клонов с созревшей аффинностью улучшалась по сравнению с их родительским клоном 8В8.
- 210 037557
Таблица 60. Обобщение кинетических и термодинамических данных, характеризующих взаимодействие между анти-CD 19 huIgG1 и человеческим CD 19
Клон Ка (1/Мс) Kd (1/с) KD (М)
родительский 8В8 5,66Е+4 1,34Е-4 2,36Е-9
5Н09 7,91Е+4 1,50Е-5 L89E-10
7Н07 7,45Е+4 5,57Е-5 7,47Е-10
2В03 6,02Е+4 5,00Е-5 8,31Е-10
2В11 6,34Е+4 ЗД4Е-5 4,95Е-10
5А07 6,98Е+4 3,07Е-5 4,40Е-10
5В08 6,81Е+4 5,26Е-5 7,72Е-10
Клон Ка (1/Мс) Kd (1/с) KD (М)
5D08 8,88Е+4 8,44Е-5 9,51Е-10
7.2.2.3. Получение и очистка анти-CD19 IgG1 P329G LALA.
Отобранные антитела к CD19 получали путем котрансфекции клеток HEK293-EBNA экспрессионными векторами для клеток млекопитающих, используя полиэтиленимин. Клетки трансфектировали соответствующими экспрессионными векторами в соотношении 1:1 (вектор для тяжелой цепи: вектор для легкой цепи).
Для получения в 500-миллилитровые встряхиваемые колбы засевали 400 млн клеток HEK293 EBNA за 24 ч до трансфекции. Перед трансфекцией клетки центрифугировали в течение 5 мин при 210xg и супернатант заменяли предварительно нагретой средой CD CHO. Экспрессионные векторы (200 мкг общей ДНК) смешивали в 20 мл среды CD CHO. После добавления 540 мкл ПЭИ раствор интенсивно перемешивали в течение 15 с и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/ПЭИ, переносили в 500-миллилитровую встряхиваемую колбу и инкубировали в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО2. После инкубации добавляли 160 мл среды F17 и клетки культивировали в течение 24 ч. Через 1 день после трансфекции в культуру добавляли 1 мМ вальпроевую кислоту и 7% Feed 1 с добавками. После культивирования в течение 7 дней супернатант собирали центрифугированием в течение 15 мин при 210xg. Раствор стерилизовали фильтрацией (0,22 мкмфильтр), дополняли азидом натрия до конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и выдерживали при 4°С.
Очистку молекул антител из супернатантов клеточных культур осуществляли с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А, описанной выше в качестве примера очистки слияний антиген-Fc. Белок концентрировали и фильтровали перед внесением в колонку HiTrap Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную раствором, содержащим 20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl, pH 6,0.
Концентрацию белка очищенных антител определяли, измеряя ОП при 280 нМ, используя коэффициент молярной экстинкции, который рассчитывали на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу антител анализировали с помощью КЭ-ДСН в присутствии восстановителя и без него (фирма Invitrogen, США), используя устройство LabChipGXII (фирма Caliper). Содержание агрегатов в образцах антител анализировали с помощью колонки для аналитической гель-фильтрации TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh), уравновешенной подвижным буфером, содержащим 25 мМ K2HPO4, 125 мМ NaCl, 200 мМ моногидрохлорд L-аргинина, 0,02% (мас./об.) NaN3, pH 6,7, при 25°С (табл. 61).
Таблица 61. Результаты биохимического анализа клонов анти-CD19 P329G LALA IgG1
Клон Выход [мг/л] Мономер [%] кэ-дсн (не восстан.)
родительский 8В8 25,3 100 99,1
2В11 35,4 100 98,4
7Н07 89,8 100 99,4
2В03 182 100 100
5А07 90,2 100 99,4
5D08 90,2 100 99,3
5В08 24,1 99,6 100
5Н09 29,9 100 98,1
Для получения биспецифических конструкций отбирали клон 2B11, поскольку в нем отсутствовали три горячие точки деамидирования.
Последовательность ДНК, кодирующей часть эктодомена (аминокислоты 71-254 и 71-248) человеческого лиганда для 4-1BB, синтезировали на основе P41273-последовательности из базы данных Uniprot.
7.2.3. Получение одновалентной нацеленной на CD19 (8B8-2B11) содержащей тримерный лиганд
- 211 037557 для 4-1BB (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами с заряженными остатками (конструкция 4.1).
Конструкцию 4.1 получали согласно методу, описанному для конструкции 3.1 (фиг. 30), но используя последовательности ДНК, кодирующие вариабельную область тяжелой и легкой цепи специфического для CD19 связывающего агента клона 8B8-2B11.
В табл. 62 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8B8-2B11) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1BB (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами и с заряженными остатками (конструкция 4.1).
Таблица 62. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами с заряженными остатками (конструкция 4.1)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
129 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 4-1BBL (71-254) - CL*Fc-цепь с «выступом» см.таблицу 3
130 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-254) СН1* см.таблицу 3
305 нуклеотидная последовательность антиCD19(8B8-2B11), Fc-цепь с «впадиной» CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAAC CGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTA CACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCC CCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCAT ACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCC GCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTA CATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTT TACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGC TGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAG CTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCC CCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCTCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCG TGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACAC CTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTG AGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCC AGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACA AAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGC AGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAG GACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG TGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCT GAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGC CCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTCGTG CGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGT GAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG
- 212 037557
GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA АА
277 нуклеотидная последовательность антиСВР (8В8-2В11), легкая цепь см.таблицу 59
115 димерный hu 4-1BBL (71254) - CL*-Fc-uenb с «выступом» см.таблицу 3
116 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1* см.таблицу 3
306 анти-СО19 (8В8-2В11), Fc-цепь с «впадиной» QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYM ELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
206 анти-СВР (8В8-2Ы1), легкая цепь см.таблицу 59
* обозначает заряженные остатки.
7.2.4. Получение одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами без заряженных остатков (конструкция 4.2).
Конструкцию 4.2 получали согласно методу, описанному для конструкции 3.2 (фиг. 30), но используя последовательности ДНК, кодирующие вариабельную область тяжелой и легкой цепи специфического для CD19 связывающего агента клона 8В8-2В11.
В табл. 63 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами без заряженных остатков (конструкция 4.2).
Таблица 63. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами без заряженных остатков (конструкция 4.2)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
165 нуклеотидная последовательность конструкции димерный лиганд (71-254)-СЕ-Рс-цепь с «выступом» См. таблицу 22
166 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1 См. таблицу 22
305 нуклеотидная последовательность анти-СВР (8В8-2В11), Fcцепь с «впадиной» См. таблицу 62
277 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-СО19 (8В82В11) См. таблицу 59
117 димерный лиганд (71-254) - CL-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 22
118 мономерный лиганд (71-254)-СН1 См. таблицу 22
306 анти-СО19 (8В8-2В11), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 62
279 легкая цепь анти-CD 19 (8В8-018) См. таблицу 59
7.2.5. Получение двухвалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 4.3).
Конструкцию 4.3 получали согласно методу, описанному для конструкции 3.3 (фиг. 30), но используя последовательности ДНК, кодирующие вариабельную область тяжелой и легкой цепи специфического для CD19 связывающего агента клона 8В8-2В11.
В табл. 64 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 4.3).
- 213 037557
Таблица 64. кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 4.3)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
307 нуклеотидная последовательность антиCD19 (8В8-2В11)-Рс-цепь с «впадиной»-димерный CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAAC CGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTA CACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCC CCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCAT ACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCC
лиганд GCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTA CATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTT TACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGC TGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAG CTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCC CCA GCA GCAA GA GCA CCA GCGGCGGCA CA GCCGCTCTGGGC TGCCTGGTCAA GGA СТА CTTCCCCGA GCCCGTGA CCGTGTCC TGGAA CA GCGGA GCCCTGA CCTCCGGCGTGCA CA CCTTCCC CGCCG TGCTGCA GAGTTCTGGCCTGTA TA GCCTGA GCAGCGT GGTCA CCGTGCCTTCTA GCA GCCTGGGCA CCCA GA CCTA CA T CTGCAA CGTGAA CCA CAA GCCCA GCAA CA CCAA GGTGGA CAA GAA GGTGGA GCCCAA GA GCTGCGA CAAAA CTCA CA CA TGCCC A CCGTGCCCA GCA CCTGAA GCTGCA GGGGGA CCGTCA GTCT TCCTCTTCCCCCCAAAA CCCA A GGA CA CCCTCA TGA TCTCCC GGA CCCCTGA GGTCA CA TGCGTGGTGGTGGA CGTGA GCCA C GAA GA CCCTGA GGTCAA GTTCAA CTGGTA CGTGGA CGGCGTG GA GGTGCA TAA TGCCAA GA CAAA GCCGCGGGAGGA GCAGTA CAA CA GCA CGTA CCGTGTGGTCA GCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCA GGA CTGGCTGAA TGGCAA GGAGTA CAA GTGCAA GGTCTC CAA CAAA GCCCTCGGCGCCCCCA TCGA GAAAA CCA TCTCCAA A GCCAAA GGGCA GCCCCGA GAA CCA CA GGTGTGCA CCCTGC CCCCA TCCCGGGA TGA GCTGA CCAA GAA CCA GGTCA GCCTCT CGTGCGCAGTCAAA GGCTTCTA TCCCA GCGA CA TCGCCGTGG A GTGGGA GA GCAA TGGGCA GCCGGA GAA CAA СТА CAA GA CC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTG A GCAA GCTCA CCGTGGA CAA GAGCAGGTGGCAGCA GGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCA TGA GGCTCTGCA CAA CCA СТА CA CGCA GAA GA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGA GGCG GCGGAA GCGGA GGAGGAGGA TCCA GA GA GGGCCCTGA GCT GA GCCCCGA TGA TCCTGCTGGA CTGCTGGA CCTGCGGCA GG GCA TGTTTGCTCA GCTGGTGGCCCA GAA CGTGCTGCTGA TCG A TGGCCCCCTGTCCTGGTA CA GCGA TCCTGGACTGGCTGGC GTGTCA CTGA CA GGCGGCCTGA GCTA CAAA GA GGA CA CCAAA GAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTT CAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGG CTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGC TGCTGGCGCTGCA GCTCTGGCA CTGA CA GTGGA TCTGCCTCC TGCCA GCTCCGA GGCCCGGAA TA GCGCA TTTGGGTTTCAA GG CAGGCTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGC A TCTGCA CA CA GA GGCCA GGGCTA GA CA CGCCTGGCA GCTG A CA CA GGGCGCTA CAGTGCTGGGCCTGTTCA GA GTGA CCCC CGA GA TTCCA GCCGGCCTGCCTTCTCCAA GAA GCGAA GGCG GA GGCGGA TCTGGCGGCGGA GGA TCTA GA GA GGGA CCCGAA CTGTCCCCTGA CGA TCCA GCCGGGCTGCTGGA TCTGA GA CA G GGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGATT GA CGGA CCTCTGA GCTGGTA CTCCGA CCCA GGGCTGGCAGG GGTGTCCCTGA CTGGGGGA CTGTCCTA CAAA GAA GA TA CAAA AGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTT CA GCTGGAA CTGA GGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCA G GA TCTGTGTCCCTGGCTCTGCA TCTGCA GCCA CTGCGCTCTG CTGCTGGCGCAGCTGCA CTGGCTCTGA CTGTGGA CCTGCCA C CA GCCTCTA GCGA GGCCA GAA A CA GCGCCTTCGGGTTCCAA G GA CGCCTGCTGCA TCTGA GCGCCGGA CA GCGCCTGGGAGTG CA TCTGCA TA CTGAA GCCA GA GCCCGGCA TGCTTGGCA GCTG
- 214 037557
ACTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACCT GA GA TCCCTGCCGGA CTGCCAA GCCCTA GA TGA GAA
308 нуклеотидная последовательность антиCD19 (8В8-2В11)-Рс-цепь с «выступом»мономерный лиганд CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAAC CGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTA CACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCC CCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCAT ACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCC GCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTA CATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTT TACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGC TGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAG CTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACC СТССТССАА GA GCA CCTCTGGGGGCA С A GCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGT GGAA СТС A GGCGCCCTGA CCA GCGGCGTGCA С A CCTTCCCG GCTGTCCTA CAGTCCTCA GGA СТСТА CTCCCTCAGCA GCGTG GTGA CCGTGCCCTCCA GCA GCTTGGGCA СССА GA ССТА С А ТС TGCAA CGTGAA ТСА САА GCCCAGCAA С А ССАА GGTGGA САА G AAAGTTGA GCCCAAA TCTTGTGA САААА СТС А С А С A TGCCCA С CGTGCCCA GCA CCTGAA GCTGCA GGGGGA CCGTCAGTCTTC СТСТТССССССАААА СССАА GGA СА СССТСА TGA TCTCCCGG A CCCCTGA GGTCA С A TGCGTGGTGGTGGA CGTGA GCCA CGA A GA CCCTGA GGTCAA GTTCAA CTGGTA CGTGGA CGGCGTGGA GGTGCA TAA TGCCAA GA CAAA GCCGCGGGA GGA GCA GTA CA A CA GCA CGTA CCGTGTGGTCA GCGTCCTCA CCGTCCTGCA CC A GGA CTGGCTGAA TGGCAA GGAGTA CAAGTGCAA GGTCTCCA A CAAA GCCCTCGGCGCCCCCA TCGA GAAAA CCA TCTCCAAA G CCAAA GGGCA GCCCCGA GAA CCA CA GGTGTA CA CCCTGCCC CCCTGCA GA GA TGA GCTGA CCAA GAA CCA GGTGTCCCTGTGG TGTCTGGTCAA GGGCTTCTA CCCCA GCGA TA TCGCCGTGGA G TGGGA GA GCAA CGGCCAGCCTGA GAA САА СТА САА GA CCA CC CCCCCTGTGCTGGA CA GCGA CGGCA GCTTCTTCCTGTA CTCC AAA CTGA CCGTGGA CAA GA GCCGGTGGCA GCA GGGCAA CGT GTTCA GCTGCA GCGTGA TGCA CGA GGCCCTGCA CAA CCA СТА CA CCCA GAAGTCCCTGA GCCTGA GCCCCGGCGGA GGCGGCG GAA GCGGA GGAGGAGGA TCCA GA GA GGGCCCTGA GCTGA GC CCCGA TGA TCCTGCTGGACTGCTGGA CCTGCGGCAGGGCAT GTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGG CCCCCTGTCCTGGTA CA GCGA TCCTGGA CTGGCTGGCGTGTC A CTGA CA GGCGGCCTGA GCTA CA AA GA GGA CA CCAAA GAA CT GGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCT GGAA CTGCGGA GA GTGG TGGCCGGCGAA GGA TCTGGCTCTG TGTCTCTGGCCCTGCA TCTGCA GCCTCTGA GAA GCGCTGCTG GCGCTGCA GCTCTGGCA CTGA CA GTGGA TCTGCCTCCTGCCA GCTCCGA GGCCCGGAA TA GCGCA TTTGGGTTTCAA GGCA GG CTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCT GCA CA CA GA GGCCA GGGCTA GA CA CGCCTGGCAGCTGA CA C A GGGCGCTA CA GTGCTGGGCCTGTTCA GAGTGA CCCCCGA G A TTCCA GCCGGCCTGCCTTCTCCAA GAA GCGA A
277 нуклеотидная последовательность антиCD19 (8В8-018), легкая см.таблицу 59
- 215 037557
цепь
309 анти-СО19 (8В8-2В11)- Fc-цепь с «впадиной»димерный лиганд QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYM ELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSG VHTFPA VL QSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQ YNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTIS KAKGQPREPQ VCTLPPSRDEL TKNQ VSLSCA VKGFYPSDIA VE W ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDP A GLLDLRQGMFA QL VA QNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGGL SYKEDTKEL VVAKAGVYYVFFQLELRRVVA GEGSGSVSLALHLQ PLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRL GVHLHTEARARHA WQLTQGA TVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGG GGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFA QL VA QNVLLID GPLS WYSDPGLA G VSL TGGLSYKED TKEL WAKA G VYYVFFQLE LRR VVA GEGSGSVSLALHL QPLRSAA GAAALAL TVDLPPA SSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHA WQL TQGA TVLG LFR VTPEIPA GLPSPRSE
310 анти-СО19 (8В8-2В11)- Fc-цепь с «выступом»мономерный лиганд QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYM ELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG A L TSG VHTFPA VL QSSGL YSLSS VVTVPSSSL G TQ TYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQ YNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPCRDEL TKNQ VSL WCL VKGFYPSDIA VE WESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDD PA GLLDLRQGMFA QL VA QNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGG LSYKED TKEL WAKA G VYYVFFQLELRR VVA GEGSGSVSLALHL QPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQR LGVHLHTEARARHA WQLTQGA TVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
279 анти-СП19 (8В8-018), легкая цепь См. таблицу 59
7.2.6. Получение одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами с заряженными остатками (конструкция 4.4).
Конструкцию 4.4 получали согласно методу, описанному для конструкции 3.4 (фиг. 30), но используя последовательности ДНК, кодирующие вариабельную область тяжелой и легкой цепи специфического для CD19 связывающего агента клона 8В8-2В11.
В табл. 65 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами и с заряженными остатками (конструкция 4.4).
Таблица 65. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами с заряженными остатками (конструкция 4.4)
SEQ ID NO Описание Последовательность
169 нуклеотидная последовательность конструкции димерный лиганд (71248) - СЕ*-Рс-цепь с «выступом» См таблицу 24
170 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-248) - СН1* См таблицу 24
305 нуклеотидная последовательность анти-CD 19 (8В8-2В11), Fc-цепь с «впадиной» См таблицу 62
277 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-СО19 (8В8-2В11) См таблицу 59
119 димерный лиганд (71-248) - СЬ*-Рс-цепь с «выступом» См таблицу 24
120 мономерный лиганд (71-248)-СН1 * См таблицу 24
306 анти-СО19 (8В8-2В11), Fc-цепь с «впадиной» См таблицу 62
279 легкая цепь aHTH-CD19 (8В8-2В11) См таблицу 59
- 216 037557 * обозначает заряженные остатки.
7.2.7. Получение одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами без заряженных остатков (конструкция 4.5).
Конструкцию 4.5 получали согласно методу, описанному для конструкции 3.5 (фиг. 30), но используя последовательности ДНК, кодирующие вариабельную область тяжелой и легкой цепи специфического для CD19 связывающего агента клона 8В8-2В11.
В табл. 66 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами без заряженных остатков (конструкция 4.5).
Таблица 66. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на CD19 (8В82В11)содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CL-доменами без заряженных остатков (конструкция 4.5)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
171 нуклеотидная последовательность конструкции димерный лиганд (71-248) - CL-Fc-цепь с «выступом» см. таблицу 25
172 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный лиганд (71-248)-СН1 см. таблицу 25
305 нуклеотидная последовательность анти-СО19 (8В8-2В11), Fcцепь с «впадиной» см. таблицу 62
277 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-СО19 (8В82В11) см. таблицу 59
173 димерный лиганд (71-248) - CL-Fc-цепь с «выступом» см. таблицу 25
174 мономерный лиганд (71-248)-СН1 см. таблицу 25
306 анти-СО19 (8В8-2В11), Fc-цепь с «впадиной» см. таблицу 62
279 легкая цепь анти-CD 19 (8В8-2В11) см. таблицу 59
7.2.8. Получение двухвалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 4.6).
Конструкцию 4.6 получали согласно методу, описанному для конструкции 3.6 (фиг. 30), но используя последовательности ДНК, кодирующие вариабельную область тяжелой и легкой цепи специфического для CD19 связывающего агента клона 8В8-2В11.
В табл. 67 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 4.6).
Таблица 67. кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на CD19 (8В8-2В11) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 4.6)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
311 нуклеотидная последовательность конструкции анти-CD 19 (8В8-2В11)-Рс-цепь с «впадиной»-димерный CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAAC CGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTA CACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCC CCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCAT ACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCC
- 217 037557
лиганд (71-248) GCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTA CATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTT TACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGC TGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAG CTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCC CCA GCA GCAA GA GCA CCA GCGGCGGCA CA GCCGCTCTGGGC TGCCTGGTCAA GGA СТА CTTCCCCGA GCCCGTGA CCGTGTCC TGGAA CA GCGGA GCCCTGA CCTCCGGCGTGCA CA CCTTCCC CGCCGTGCTGCA GAGTTCTGGCCTGTA TA GCCTGA GCA GCGT GGTCA CCGTGCCTTCTA GCA GCCTGGGCA CCCA GA CCTA CA T CTGCAA CGTGAA CCA CAA GCCCA GCAA CA CCAA GGTGGA CAA GAA GGTGGA GCCCAA GA GCTGCGA CAAAA CTCA CA CA TGCCC A CCGTGCCCA GCA CCTGAA GCTGCA GGGGGA CCG TCA GTCT TCCTCTTCCCCCCAAAA CCCA A GGA CA CCCTCA TGA TCTCCC GGA CCCCTGA GGTCA CA TGCGTGGTGGTGGA CGTGA GCCA C GAA GA CCCTGA GGTCAAGTTCAA CTGGTA CGTGGA CGGCGTG GA GGTGCA TAA TGCCAA GA CAAA GCCGCGGGAGGA GCAGTA CAA CA GCA CGTA CCGTGTGGTCA GCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCA GGA CTGGCTGAA TGGCAA GGAGTA CAA GTGCAA GGTCTC CAA CAAA GCCCTCGGCGCCCCCA TCGA GAAAA CCA TCTCCAA A GCCAAA GGGCA GCCCCGA GAA CCA CA GGTGTGCA CCCTGC CCCCA TCCCGGGA TGA GCTGA CCAA GAA CCA GGTCA GCCTCT CGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG A GTGGGA GA GCAA TGGGCA GCCGGA GAA CAA СТА CAA GA CC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTG A GCAA GCTCA CCGTGGA CAA GAGCAGGTGGCAGCA GGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCA TGA GGCTCTGCA CAA CCA СТА CA CGCA GAA GA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGA GGCG GCGGAA GCGGA GGAGGAGGA TCCA GA GA GGGCCCTGA GCT GA GCCCTGA TGA TCCTGCCGGA CTGCTGGA CCTGCGGCA GG GAA TGTTTGCCCA GCTGGTGGCCCA GAA CGTGCTGCTGA TCG A TGGCCCCCTGTCCTGGTA CA GCGA TCCTGGACTGGCTGGC GTGTCA CTGA CA GGCGGCCTGA GCTA CAAA GA GGA CA CCAAA GAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTT CA GCTGGAA CTGCGGA GA GTGGTGGCCGGCGAA G GA TCTGG CTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGATCTGC TGCTGGCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCC TGCCA GCAGCGA GGCCCGGAA TA GCGCA TTTGGGTTTCAA GG CAGGCTGCTGCA CCTGTCTGCCGGCCA GA GGCTGGGA GTGC A TCTGCA CA CA GA GGCCA GGGCTA GA CA CGCCTGGCA GCTG A CA CA GGGCGCTA CAGTGCTGGGCCTGTTCA GA GTGA CCCC CGA GA TTCCA GCA GGCCTGGGA GGCGGCGGATCTGGCGGC GGA GGA TCTA GA GAA GGA CCCGA GCTGTCCCCCGA CGA TCC CGCTGGGCTGCTGGA TCTGA GA CA GGGCA TGTTCGCTCA GCT GGTGGCTCA GAA TGTGCTGCTGA TTGA CGGA CCTCTGA GCTG GT A CTCCGA CCCA GGGCTGGCA GGGGTGTCCCTGA CTGGGG GA CTGTCCTA CAAA GAA GA TA CAAAA GAA CTGGTGGTGGCTA AA GCTGGGGTGTA СТА TGTGTTTTTTCA GCTGGAA CTGA GGC GGGTGGTGGCTGGGGA GGGCTCA GGA TCTGTGTCCCTGGCT CT GCA TCTGCA GCCA CTGCGCTCTGCAGCA GGGGCTGCA GC A CTGGCCCTGA CTGTGGA CCTGCCCCCA GCTTCTTCCGA GGC CA GAAA CA GCGCCTTCGGGTTCCAA GGA CGCCTGCTGCA TCT GA GCGCCGGA CA GCGCCTGGGA GTGCA TCTGCA TA CTGAA G CCA GA GCCCGGCA TGCTTGGCA GCTGA CTCA GGGGGCAA CT GTGCTGGGA CTGTTTCGCGTGA CA CCTGA GA TCCCA GCCGG
- 218 037557
GCTC
312 нуклеотидная последовательность конструкции анти-CD 19 (8В8-2В11)-Рс-цепь с «выступом»-мономерный (71-248) лиганд CAGGTGCAATTGGTTCAATCTGGTGCTGAAGTAAAAAAAC CGGGCGCTTCCGTTAAAGTGAGCTGCAAAGCATCTGGTTA CACCTTCACTGACTATATCATGCACTGGGTTCGTCAGGCC CCGGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTACATTAACCCAT ACAACGACGGTTCCAAATATACCGAGAAATTCCAGGGCC GCGTCACGATGACCAGCGACACTTCTATCTCCACCGCGTA CATGGAACTGTCTAGACTGCGTTCTGACGACACCGCTGTT TACTATTGTGCACGCGGTACCTACTACTACGGTCCACAGC TGTTTGATTACTGGGGCCAAGGTACCACGGTGACCGTAAG CTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACC СТССТССАА GA GCA CCTCTGGGGGCA С A GCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGT GGAA СТС A GGCGCCCTGA CCA GCGGCGTGCA С A CCTTCCCG GCTGTCCTA CAGTCCTCA GGA СТСТА CTCCCTCAGCA GCGTG GTGA CCGTGCCCTCCA GCA GCTTGGGCA СССА GA ССТА С А ТС TGCAA CGTGAA ТСА САА GCCCAGCAA С А ССАА GGTGGA САА G AAAGTTGA GCCCAAA TCTTGTGA САААА СТС А С А С A TGCCCA С CGTGCCCA GCA CCTGAA GCTGCA GGGGGA CCGTCAGTCTTC СТСТТССССССАААА СССАА GGA CA СССТСА TGA TCTCCCGG A CCCCTGA GGTCA С A TGCGTGGTGGTGGA CGTGA GCCA CGA A GA CCCTGA GGTCAA GTTCAA CTGGTA CGTGGA CGGCGTGGA GGTGCA TAA TGCCAA GA CAAA GCCGCGGGA GGA GCA GT A CA A CA GCA CGTA CCGTGTGGTCA GCGTCCTCA CCGTCCTGCA CC A GGA CTGGCTGAA TGGCAA GGAGTA CAAGTGCAA GGTCTCCA A CAAA GCCCTCGGCGCCCCCA TCGA GAAAA CCA TCTCCAAA G CCAAA GGGCA GCCCCGA GAA CCA CA GGTGTA CA CCCTGCCC CCCTGCA GA GA TGA GCTGA CCAA GAA CCA GGTGTCCCTGTGG TGTCTGGTCAAGGGCTTCTA CCCCA GCGA TA TCGCCGTGGA G TGGGA GA GCA A CGGCCA GCCTGA GAA CA А СТА CA A GA CCA CC CCCCCTGTGCTGGA CA GCGA CGGCA GCTTCTTCCTGTA CTCC AAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGT GTTCA GCTGCA GCGTGA TGCA CGA GGCCCTGCA CAA CCA СТА CA CCCA GAAGTCCCTGA GCCTGA GCCCCGGCGGA GGCGGCG GAA GCGGA GGAGGAGGA TCCA GA GA GGGCCCTGA GCTGA GC CCTGA TGA TCCTGCCGGA CTGCTGGA CCTGCGGCA GGGAA T GTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATCGATGG CCCCCTGTCCTGGTA CA GCGA TCCTGGA CTGGCTGGCGTGTC A CTGA CA GGCGGCCTGA GCTA CAAA GA GGA CA CCAAA GAA CT GGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCT GGAA CTGCGGA GA GTGG TGGCCGGCGAA GGA TCTGGCTCTG TGTCTCTGGCCCTGCA TCTGCA GCCTCTGA GA TCTGCTGCTG GCGCCGCTGCTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCA GCA GCGA GGCCCGGAA TA GCGCA TTTGGGTTTCAA GGCAGG CTGCTGCACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCT GCA CA CA GA GGCCA GGGCTA GA CA CGCCTGGCAGCTGA CA C A GGGCGCTA CA GTGCTGGGCCTGTTCA GAGTGA CCCCCGA G A TTCCTGCCGGGCTC
277 нуклеотидная последовательность антиСВ^ (8В8-2В11), легкая цепь см.таблицу 59
313 анти-СВ19 (8В8-2В11)-Fcцепь с «впадиной»- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYM
- 219 037557
димерный лиганд (71-248) ELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG A L TSG VHTFPA VL QSSGL YSLSSVVTVPSSSL G TQ TYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQ YNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTIS KAKGQPREPQ VCTLPPSRDEL TKNQ VSLSCA VKGFYPSDIA VE W ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKL TVDKSR WQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDP A GLLDLRQGMFA QL VA QNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGGL SYKEDTKEL VVAKAGVYYVFFQLELRRVVA GEGSGSVSLALHLQ PLRSAA GAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSA GQRL GVHLHTEARARHA WQLTQGA TVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGG GGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFA QL VA QNVLLIDGPLSWY SDPGLA G VSL TGGLSYKED TKEL WAKA G VYYVFFQLELRR WA GEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGF QGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHA WQLTQGATVLGLFRFTP EIPAGL
314 анти-СО19 (8B8-2B11)-Fcцепь с «выступом»мономерный (71-248) лиганд QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYM ELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSG VHTFPA VL QSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQ YNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPCRDEL TKNQ VSL WCL VKGFYPSDIA VE WESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDD PA GLLDLRQGMFA QL VA QNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGG LSYKED TKEL WAKA G VYYVFFQLELRR VVA GEGSGSVSLALHL QPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQR L G VHLHTEARARHA WQL TQGA TVL GLFR VTPEIPA GL
279 анти-СП19 (8В8-018), легкая цепь см.таблицу 59
7.3. Получение ненацеленных содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc конструкций и человеческих IgG в качестве контрольных молекул.
7.3.1. Получение ненацеленных содержащих тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул (контрольные молекулы).
Указанные контрольные молекулы получали согласно методу, описанному выше для нацеленной на CD19 конструкции 3.1 (обозначена как контроль Б), 3.3 (обозначена как контроль В), 3.4 (обозначена как контроль Г) и 3.5 (обозначена как контроль Д), с единственным различием, состоящем в том анти-CD19связывающий агент (VH-VL) заменяли на представляющий собой зародышевую линию контроль, обозначенный DP47, который не связывается с антигеном (см. фиг. 30).
В табл. 68 представлены соответственно кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной ненацеленной (DP47) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc(kih), содержащей скрещенные CH-CL с заряженными остатками молекулы, представляющей собой контроль Б.
В табл. 69 представлены соответственно кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной ненацеленной (DP47) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc(kih) молекулы, представляющей собой контроль В.
В табл. 70 представлены соответственно кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной ненацеленной (DP47) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc(kih) содержащей скрещенные CH-CL с заряженными остатками молекулы, представляющей собой контроль Г.
В табл. 71 представлены соответственно кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной ненацеленной (DP47) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc(kih) без заряженных остатков в CH-CL-кроссовер-молекулы, представляющей собой контроль Д.
- 220 037557
Таблица 68. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной ненацеленной (DP47) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc(kih) молекулы с CH-CL-кроссовером и с заряженными остатками (контроль Б)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
96 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (71-254) - СЕ*-Ес-цепь с «выступом» См. таблицу 3
97 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1* См. таблицу 3
79 нуклеотидная последовательность DP47, Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 18
80 нуклеотидная последовательность легкой цепи DP47 См. таблицу 18
98 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СЕ*-Ес-цепь с «выступом» См. таблицу 3
99 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1* См. таблицу 3
81 DP47, Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 18
82 легкая цепь DP47 См. таблицу 18
* обозначает заряженные остатки.
Таблица 69. кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной ненацеленной (DP47) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc(kih) молекулы (контроль В)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
177 нуклеотидная последовательность конструкции DP47, Fc-цепь с «впадиной», слитая с димерным hu 4-1BBL (71-254) См. таблицу 27
178 нуклеотидная последовательность конструкции DP47, Fc-цепь с «выступом», слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-254) См. таблицу 27
80 нуклеотидная последовательность легкой цепи DP47 См. таблицу 18
179 DP47, Fc-цепь с «впадиной», слитая с димерным hu 4-1BBL (71254) См. таблицу 27
180 DP47, Fc-цепь с «выступом», слитая с мономерным hu 4-1BBL (71-254) См. таблицу 27
82 легкая цепь DP47 См. таблицу 18
Таблица 70. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной ненацеленной (DP47), содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc(kih) молекулы с CH-CL-кроссовером и с заряженными остатками (контроль Г)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
169 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (71-248) - СЕ*-Ес-цепь с «выступом» См. таблицу 24
170 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-248) - СН1* См. таблицу 24
79 нуклеотидная последовательность DP47, Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 18
80 нуклеотидная последовательность легкой цепи DP47 См. таблицу 18
119 димерный hu 4-1BBL (71-254) - СЕ*-Ес-цепь с «выступом» См. таблицу 24
120 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1* См. таблицу 24
81 DP47, Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 18
82 легкая цепь DP47 См. таблицу 18
* обозначает заряженные остатки.
Таблица 71. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной ненацеленной (DP47) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc(kih) молекулы с
CH-CL-кроссовером и без заряженных остатков (контроль Д)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
171 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 41BBL (71-248) - CL-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 25
172 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-248) - СН1 См. таблицу 25
79 нуклеотидная последовательность DP47, Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 18
80 нуклеотидная последовательность легкой цепи DP47 См. таблицу 18
173 димерный hu 4-1BBL (71-248) - CL-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 25
174 мономерный hu 4-1BBL (71-248) - СН1 См. таблицу 25
81 DP47, Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 18
82 легкая цепь DP47 См. таблицу 18
7.3.2. Антитела в качестве контрольных молекул.
Получали два контрольных человеческих IgG1, содержащих PGLALA.
- 221 037557
В табл. 72 представлены кДНК и аминокислотные последовательности aHTu-CD19 huIgGl PGLALA (клон 8В8-018), т.е. контроля Ж.
В табл. 73 представлены кДНК и аминокислотные последовательности контрольной зародышевой линии DP47 huIgG1 PGLALA (контроль Е).
Таблица 72. кДНК и аминокислотные последовательности анти-CD19 (8В8-018) huIgG1 PGLALA (контроль Ж)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
315 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи CD 19 (8В8-018) (huIgGl PGLALA) CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTC AAGAAACCCGGGGCTTCTGTGAAGGTTTCATGC AAGGCAAGCGGATACACCTTCACCGACTATATC ATGCATTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGCCAAGGT CTCGAATGGATGGGCTACATTAACCCATATAAT GATGGCTCCAAATACACCGAGAAGTTTCAGGGA AGAGTCACTATGACATCTGACACCAGTATCAGC ACTGCTTACATGGAGCTGTCCCGCCTTCGGTCTG ATGACACCGCAGTGTATTACTGTGCCAGGGGCA CATATTACTACGGCTCAGCTCTGTTCGACTATTG GGGGCAGGGAACCACAGTAACCGTGAGCTCCG CAAGTACTAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG CACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCC CCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCG CCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTG TCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCA CCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAG CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA CCGTGCCCAGCACCTGAAGCAGCTGGGGGACCG TCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACA TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAA AGCCCTCGGAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC TCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACA AGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGCA АА
204 нуклеотидная последовательность легкой цепи CD19 (8В8-018) см.таблицу 47
316 тяжелая цепь CD19 (8В8-018) (huIgGl PGLALA) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIM HWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGR VTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTY YYGSALFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKP SNTK VDKK VEPK S CDKTHTCPP СР APE A AGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK
206 легкая цепь CD19 (8В8-018) См. таблицу 47
- 222 037557
Таблица 73. кДНК и аминокислотные последовательности контрольной зародышевой линии DP47 huIgG1 PGLALA (контроль Е)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
181 нуклеотидная последовательность тяжелой цепи DP47 (hu IgGl PGLALA) См. таблицу 29
80 нуклеотидная последовательность легкой цепи DP47 См. таблицу 18
182 тяжелая цепь DP47 (hu IgGl PGLALA) См. таблицу 29
82 легкая цепь DP47 См. таблицу 18
7.4. Получение нацеленных на CD19 содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул и соответствующих контрольных молекул.
Кодирующие последовательности нацеленных и ненацеленных содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) антигенсвязывающих молекул клонировали в плазмидном векторе, в котором экспрессия вставки контролируется промотором MPSV и который содержит синтетическую полиА-последовательность, локализованную на 3'-конце CDS. Кроме того, вектор содержал последовательность OriP EBV для поддержки эписомальной формы плазмиды.
Содержащую разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) антигенсвязывающую молекулу получали путем совместной трансфекции клеток HEK293-EBNA экспрессионными векторами для клеток млекопитающих с использованием полиэтиленимина. Клетки трансфектировали соответствующими экспрессионными векторами. Для вариантов 1, 2, 4, 5 и соответствующих контролей Б, Г и Д применяли соотношение 1:1:1:1 (вектор для конструкции димерный лиганд-CL-цепь с выступом:вектор для слияния мономерный лиганд-CH1:вектор для анти-CD19 Fab с цепью с впадиной:вектор для легкой цепи анти-CD19). Для вариантов 3, 6 и соответствующих контроля В применяли соотношение 1:1:1 (вектор для конструкции huIgG1-Fc-цепь с впадиной-димерный лиганд :вектор для конструкции huIgG1-Fc-цепь с выступом-мономерный лиганд:вектор для легкой цепи антиCD19). Человеческие IgG, применяемые в качестве контролей в этом анализе, получали методом, применяемым для биспецифической конструкции (для трансфекции применяли только вектор для легкой цепи и вектор для тяжелой цепи в соотношении 1:1).
Для производства в 500-миллилитровые встряхиваемые колбы засевали 300 млн клеток HEK293 EBNA за 24 ч до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 10 мин при 210 х g и супернатант заменяли 20 мл предварительно нагретой среды CD CHO. Экспрессионные векторы (200 мкг общей ДНК) смешивали в 20 мл среды CD CHO. После добавления 540 мкл ПЭИ раствор интенсивно перемешивали в течение 15 с и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/ПЭИ, переносили в 500-миллилитровую встряхиваемую колбу и инкубировали в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО2. После инкубации добавляли 160 мл среды Excell, дополненной 6 мМ L-глутамином, 5 г/л соевого пептида (PEPSOY) и 1,2 мМ вальпроевой кислотой, и клетки культивировали в течение 24 ч. Через 1 день после трансфекции добавляли 12% Feed 7 (аминокислота и глюкоза). После культивирования в течение 7 дней супернатант собирали центрифугированием в течение 30-40 мин при по меньшей мере 400xg. Раствор стерилизовали фильтрацией (0,22 мкм-фильтр), дополняли азидом натрия до конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и выдерживали при 4°С.
Содержащую разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающую молекулу, а также IgG, очищали из супернатантов клеточных культур с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А с последующей гель-фильтрацией. Для осуществления аффинной хроматографии супернатант вносили в колонку MabSelect Sure (CV = 5-15 мл, смола фирмы GE Healthcare), уравновешенную буфером, содержащим фосфат натрия (20 мМ), цитрат натрия (20 мМ) (рН 7,5). Несвязанный белок удаляли путем промывки таким же буфером, используя его в объеме, кратном по меньшей 6 об. колонки. Связанный белок элюировали, используя или линейный градиент (20 CV), или ступенчатую элюцию (8 CV), буфером, содержащим 20 мМ цитрат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин (рН 3,0). При осуществлении элюции с использованием линейного градиента осуществляли дополнительную ступенчатую элюцию с применением объема, кратного 4 об. колонки.
Значение рН собранных фракций регулировали, добавляя 1/10 (об./об.) 0,5М фосфата натрия, рН 8,0. Белок концентрировали перед внесением в колонку HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную раствором, содержащим 20 мМ гистидин, 140 мМ хлорид натрия, 0,01 об.% Твин20, рН 6,0.
Концентрацию белка определяли путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу нацеленной содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулы анализировали с помощью ДСН-ПААГ в присутствии восстановителя (5 мМ 1,4дитиотреитол) и без него и осуществляли окрашивание кумасси SimpleBlue™ SafeStain, (фирма Invitrogen, США). Содержание агрегатов в образцах анализировали, используя колонку для аналитической гель-фильтрации TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh), уравновешенную подвижным буфером, содержащим 25 мМ K2HPO4, 125 мМ NaCl, 200 мМ моногидрохлорид L-аргинина, 0,02% (мас./об.) NaN3, рН
- 223 037557
6,7 при 25°С.
В табл. 74 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономеров нацеленных на CD19 содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул.
Таблица 74. Результаты биохимического анализа нацеленных на CD19 содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул
Конструкция Мономер [%] (SEC) Выход [мг/л]
одновалентная нацеленная на CD19 (8В8-018) содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc с CH-CLкроссовером с заряженными остатками (конструкция 3.1) 98 8,6
двухвалентная нацеленная на CD19 (8В8-018) содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (конструкция 3.3) 100 11,3
одновалентная нацеленная на CD19 (8В8-018) содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc с CH-CLкроссовером с заряженными остатками (конструкция 3.4) 99 И,5
одновалентная нацеленная на CD19 (8В8-018), содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc с CH-CL-кроссовером без заряженных остатков (конструкция 3.5) 97 13,3
двухвалентная нацеленная на CD19 (8В8-018) содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (конструкция 3.6) 96 19,9
одновалентная нацеленная на CD 19 (8В8-2В11) содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc с CH-CL-кроссовером с заряженными остатками (конструкция 4.4) 99,2 21,2
В табл. 75 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономера ненацеленных (DP47) содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии в Fc (kih) как одновалентных (контроль Б, Г и Д), так и двухвалентных (контроль В) молекул.
Таблица 75. Результаты биохимического анализа ненацеленных (DP47) содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекул
Конструкция Мономер [%] (SEC) Выход [мг/л]
одновалентная «ненацеленная» (DP47) содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) (контроль Б) 99 15,4
двухвалентная «ненацеленная» (DP47) содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) (контроль В) 98 12,6
одновалентная «ненацеленная» (DP47) содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) (контроль Г) 99,5 25,9
одновалентная «ненацеленная» (DP47) содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) (контроль Д) 93,3 4,1
В табл. 76 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономера человеческого анти-CD19 (8В8-018) IgG1 PGLALA и IgG1 PGLALA зародышевой линии DP47 (контроль Е).
Таблица 76. Результаты биохимического анализа контрольных человеческих IgG1 PGLALA
Конструкция Мономер [%] (SEC) Выход [мг/л]
hhth-CD19 (8В8-018) huIgGl PGLALA 100 36,6
человеческий IgGl PGLALA зародышевой линии DP47 100 50
Пример 8.
Функциональная характеризация нацеленных на CD19 содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
8.1. Поверхностный плазмонный резонанс (аффинность).
Связывание нацеленных на CD19 содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул (конструкции 3.4 и 3.6) с рекомбинантным 4-1BB-Fc(kih) и CD19 оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Все эксперименты на основе SPR осуществляли с помощью устройства Biacore T100 при 25°С с использованием HBS-EP в качестве подвижного буфера (0,01М HEPES, рН 7,4, 0,15М NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% сурфактанта Р20, фирма
- 224 037557
Biacore, Фрейбург/Германия).
Взаимодействие с 4-1ВВ человека и обезьян циномолгус.
Антитело к человеческому Fab (фирма Biacore, Фрейбург/Германия) непосредственно связывали с СМ5-чипом при рН 5,0, используя набор для стандартного аминного сочетания (фирма Biacore, Фрейбург/Германия). Уровень иммобилизации соответствовал примерно 8000 RU. Нацеленные на CD19 содержащие разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc молекулы захватывали в течение 60 с в концентрации 2 и 5 нМ (инъецировали также контроль Г). Рекомбинантный человеческий или обезьяний (циномолгус) 4-1ВВ-avi His пропускали в диапазоне концентраций от 2,7 до 2000 нМ (3-кратные разведения) со скоростью потока 30 мкл/мин через проточные ячейки в течение 120 с. Мониторинг фазы диссоциации осуществляли в течение 180 с. Различия всех показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в проточной референс-ячейке. В этом случае антигены пропускали по поверхности с иммобилизованным антителом к человеческому Fab, но инъецировали HBS-EP вместо антител.
Взаимодействие с человеческим CD19.
Антитело к человеческому Fab (фирма Biacore, Фрейбург/Германия) непосредственно связывали с СМ5-чипом при рН 5,0, используя набор для стандартного аминного сочетания (фирма Biacore, Фрейбург/Германия). Уровень иммобилизации соответствовал примерно 8000 RU. Нацеленные на CD19 содержащие разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc молекулы или контрольное антитело (анти-CD19 (8В8-018) huIgG1 PGLALA) захватывали в течение 60 с в концентрации 20 нМ. Рекомбинантный человеческий CD19-Fc(kih) пропускали в диапазоне концентраций от 7,8 до 500 нМ (2кратное разведение) со скоростью потока 30 мкл/мин через проточные ячейки в течение 120 с. Мониторинг фазы диссоциации осуществляли в течение 130/1800 с. Различия всех показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в проточной референс-ячейке. В этом случае антигены пропускали по поверхности с иммобилизованным антителом к человеческому Fab, но инъецировали HBS-EP вместо антител.
Кинетические константы определяли с помощью программы Biacore T200 Evaluation (vAA, фирма Biacore AB, Уппсала/Швеция), осуществляя аппроксимацию путем численного интегрирования уравнений для скорости на основе модели связывания 1: 1 Ленгмюра.
Биспецифические конструкции 3.4, 3.6 и контроль Г характеризовались сходным связыванием с 41ВВ. В табл. 77 представлены средние значения и стандартные отклонения (в скобках), полученные в двух экспериментах (в которых концентрации конструкций в растворе, в котором осуществляли захват, составляли 2 или 5 нМ). Биспецифические конструкции 3.4 и 3.6 связывались с человеческим CD19 с такой же аффинностью, что и IgG. Константы аффинности, характеризующие взаимодействие, определяли путем аппроксимации на основе модели связывания 1: 1 Ленгмюра. Данные, полученные при оценке с использованием hu4-1BB и су4-1ВВ, представлены в виде средних значений и стандартных отклонений (в скобках) (два эксперимента, в которых концентрации в растворе, в котором осуществляли захват, составляли 2 или 5 нМ).
- 225 037557
Таблица 77. Связывание нацеленных на CD19 содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc молекул с рекомбинантным человеческим (hu) 4-1BB, обезьяньим (су) 4-1ВВ и человеческим (hu) CD19
Антиген Ka (1/Mc) Kd 1/c) KD (M)
одновалентная нацеленная на CD19 (8В8-018) содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) молекула с CH-CL-кроссовером с заряженными остатками (конструкция 3.4) hu 4-1ВВ 7,2E+04 (5,9E+03) 2,5E-02 (1,0E-05) 3,4E-07 (2,8E-08)
су 4-1BB l,2E+05 (8,6E+03) l,3E-02 (l,8E-04) 1,1E-O7 (9,9E-09)
hu CD19 2,77E+04 2,67E-04 9,64E-09
двухвалентная нацеленная на CD19 (8В8-018) содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) молекула (конструкция 3.6) hu 4-1BB 6,9E+04 (E7E+03) 2,4E-02 (l,5E-04) 3,5E-07 (1, IE-08)
су 4-1BB 1.1E+05 (7,7E+03) l,4E-02 (3, IE-04) l,3E-07 (l,3E-08)
hu CD19 2,55E+04 2,69E-04 L06E-08
одновалентная «ненацеленная» (DP47) содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) молекула с CH-CL-кроссовером и с заряженными остатками (контроль Г) hu 4-1BB 7,3E+04 (3,9E+03) 2,6E-02 (6,3E-04) 3,5E-07 (1,0E-08)
су 4-1BB l,2E+05 (l,9E+03) l,4E-02 (1,0E-04) l,2E-07 (2,9E-09)
анти-СО19 (8В8-018) huIgGl PGLALA hu CD19 2Д2Е+04 2,61E-04 L23E-08
8.2. Поверхностный плазмонный резонанс (одновременное связывание).
Оценивали способность одновременно связываться с человеческим 4-1ВВ-Fc(kih) и человеческим CD19 с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Все эксперименты на основе SPR осуществляли с помощью устройства Biacore T100 при 25°С с использованием HBS-EP в качестве подвижного буфера (0,01М HEPES, рН 7,4, 0,15М NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% сурфактанта Р20, фирма Biacore, Фрейбург/Германия). Биотинилированную конструкцию человеческий 4-1BB-Fc(kih) связывали непосредственно с проточной ячейкой стрептивидинового (SA) сенсорного чипа. Применяли уровни иммобилизации, соответствующие вплоть до 250 резонансным единицам (RU).
Нацеленные на CD19 содержащие тримерный разделенный 4-1BBL конструкции (конструкции 3.1, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 4.4) пропускали в концентрации 200 нМ со скоростью потока 30 мкл/мин через проточные ячейки в течение 90 с и время фазы диссоциации устанавливали на 0 с. Человеческий CD19 инъецировали в качестве второго аналита, пропуская его со скоростью потока 30 мкл/мин через проточные ячейки в течение 90 с в концентрации 500 нМ (фиг. 34). Мониторинг фазы диссоциации осуществляли в течение 120 с. Различия всех показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в проточной референс-ячейке, в которой не иммобилизовали белок.
Как продемонстрировано на графиках на фиг. 35, все биспецифические конструкции обладали способностью одновременно связываться с человеческим 4-1ВВ и человеческим CD19.
Пример 9.
Функциональная характеризация нацеленных на CD19 содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
9.1. Связывание нацеленных на CD19 содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул на активированных человеческих РМВС.
Для оценки связывания содержащих тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул с человеческими РВМС использовали в различных полученных титрованием концентрациях нацеленные на CD19 содержащие тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы, осуществляя анализ, описанный в примере 5.2.
На фиг. 36А и 36Б продемонстрировано связывание конструкций 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 и 3.6, полученных согласно методу, описанному в примере 7, на активированных экспрессирующих 4-1ВВ CD4+-Т-клетках и CD8+-Т-клетках соответственно. Дискриминационные окна устанавливали на живые CD45+CD3+CD4+или CD45+CD3+CD8+-Т-клетки и строили график зависимости MFI для конъюгированного с РЕ F(ab')2фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, Fcy-специфического AffiniPure от полученных титрованием концентраций нацеленных содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-IBB в слиянии с Fc вариантов. В табл. 78 представлены полученные величины ЕС50, определенные для конструкций 3.1, 3.3.
- 226 037557
3.4, 3.5 и 3.6 и контрольных молекул.
Таблица 78. Связывание на активированных экспрессирующих
4-1ВВ CD4+-Т-клетках и CD8+-Т-клетках
Конструкция ЕС50 [нМ] 4-lBB+CD8+ ЕС50 [нМ] 4-lBB+CD4+
контроль Б 0,05 0,26
контроль В 0,02 0,30
контроль Г 0,04 0,28
контроль Д 0,13 1,22
3.1 0,03 0,28
3.3 0,01 0,29
3.4 0,15 2,04
3.5 0,04 1,03
3.6 0,05 0,21
9.2. Связывание с экспрессирующими CD19 опухолевыми клетками.
Для анализов связывания на экспрессирующих CD19 опухолевых клетках применяли следующие экспрессирующие человеческий CD19 клеточные линии лимфомы: клетки диффузной крупноклеточной неходжкинской В-клеточной лимфомы (B-NHL) линии SU-DHL-8 (DSMZ ACC573), клетки острого лимфобластного лейкоза из клеток-предшественников В-лимфоцитов линии Nalm6 (DSMZ ACC-128), клетки диффузной крупноклеточной лимфобластной лимфомы линии Toledo (ATCC CRL-2631) и клетки диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы линии OCI-Ly18 (DSMZ ACC-699). Анализы осуществляли согласно методу, описанному выше в примере 5.3 для экспрессирующих FAP линий опухолевых клеток MV-3 и WM-266-4.
Дискриминационные окна устанавливали на живые опухолевые клетки и строили график зависимости MFI для конъютированного с РЕ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, Fcyспецифического AffiniPure от полученных титрованием концентраций нацеленных содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc конструкций.
На фиг. 37А продемонстрировано связывание конструкций 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 и 3.6, полученных согласно методу, описанному в примере 7, с клетками диффузной крупноклеточной неходжкинской Вклеточной лимфомы (B-NHL) линии SU-DHL-8, на фиг. 37Б - связывание конструкций 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 и 3.6 с клетками острого лимфобластного лейкоза из клеток-предшественников В-лимфоцитов линии Nalm6. На фиг. 37В продемонстрировано связывание конструкций 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 и 3.6 с клетками диффузной крупноклеточной лимфобластной лимфомы линии Toledo, а на фиг. 37Г - связывание конструкций 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 и 3.6 с клетками диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы линии OCILy18. В табл. 79 представлены полученные величины ЕС50, определенные для конструкций 3.1, 3.3. 3.4, 3.5 и 3.6 и контрольных молекул.
Таблица 79. Связывание с экспрессирующими CD19 опухолевыми клетками
Конструкция ЕС50 [нМ] SU-DHL-8 ЕС50 [нМ] Nalm6 ЕС50 [нМ] Toledo ЕС50 [нМ] OCI-Lyl8
3.1 0,64 0,43 0,29 0,29
3.3 0,15 0,14 0,10 0,09
3.4 0,31 0,39 0,29 0,26
3.5 0,54 0,43 0,27 0,31
3.6 0,14 0,12 0,09 0,10
контроль Ж 0,09 0,10 0,06 0,07
Пример 10.
Биологическая активность нацеленных на CD19 содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
10.1. Активация NF-кВ в клетках HeLa, экспрессирующих человеческий 4-1ВВ.
Клетки HeLa, экспрессирующие человеческий 4-1ВВ и NF-кВ-люциферазу, создавали согласно методу, описанному в примере 6.1.
Активация NF-кВ В клетках Hela, экспрессирующих человеческий 4-1ВВ, при совместном культивировании с экспрессирующими CD19 опухолевыми клетками.
Клетки HeLa, экспрессирующие NF-кВ-люциферазу и человеческий 4-1ВВ, собирали и ресуспендировали в среде DMEM, дополненной 10 об.% FBS и 1 об.% GlutaMAX-I, до концентрации 0,2х106 клеток/мл. 100 мкл (2 х 104 клеток) указанной клеточной суспензии переносили в каждую лунку стерильного белого плоскодонного 96-луночного планшета для культуры ткани с крышкой (фирма Greiner bio-one, каталожный № 655083) и планшет инкубировали при 37°С и 5% СО2 в течение ночи. На следующий день добавляли 50 мкл среды, содержащей в концентрациях, полученных титрованием, нацеленные на CD19 содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы (CD19 разделенный тример 4-1BBL) или ненацеленные (DP47) содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы (DP47 разделенный тример 4-1BBL). Экспрессирующие CD19
- 227 037557 линии клеток В-клеточной лимфомы (линия клеток диффузной крупноклеточной неходжкинской Вклеточной лимфомы (B-NHL) SU-DHL-8 (DSMZ ACC573) и клетки человеческой неходжкинской Вклеточной лимфомы линии Пфейфер (АТСС CRL-2632)) ресуспендировали в среде DMEM, дополненной об.% FBS и 1 об.% GlutaMAX-I, до концентрации 2x106 клеток/мл.
Суспензию экспрессирующих CD19 клеток В-клеточной лимфомы (50 мкл, конечное соотношение 1:5) или только среду добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение 6 ч при 37°С и 5% СО2. Клетки промывали два раза 200 мкл/лунку D-ЗФР. Добавляли в каждую лунку 40 мкл свежеприготовленного репортерного буфера для лизиса (фирма Promega, каталожный № Е3971) и планшет выдерживали в течение ночи при -20°С. На следующий день планшеты с замороженными клетками и идентифицирующий буфер (система для анализа люциферазы 1000, фирма Promega, каталожный № Е4550) подвергали оттаиванию при комнатной температуре. Добавляли 100 мкл идентифицирующего буфера в каждую лунку и максимально быстро измеряли люциферазную активность с использованием ридера для микропланшетов SpectraMax M5/M5e и программы SoftMax Pro (фирма Molecular Devices), подсчитывая испускание света в URL (единицы испускаемого света в течение 0,5 с/лунку), или планшет-ридера для считывания нескольких меток Victor3 1420 (multilabel counter plate reader) (фирма Perkin Elmer) и программы Perkin Elmer 2030 Manager, определяя испускание света в виде количества импульсов в секунду (CPS), и строили график зависимости от концентрации тестируемых конструкций.
Нацеленные на CD19 содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы (конструкции 3.1 и 3.3) инициировали активацию пути передачи сигналов NFkB в репортерной клеточной линии в присутствии экспрессирующих CD19 клеток В-клеточной лимфомы. В противоположность этому, ненацеленные контрольные молекулы не инициировали такое же действие при применении в любых тестируемых концентрациях (фиг. 38).
Пример 11.
11.1. Получение нацеленных на СЕА (T84.66-LCHA) содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
1.1.1. Гуманизация клона анти-СЕА Т84.66.
Новые гуманизированные варианты мышиного антитела Т84.66 (Wagener и др., J. Immunol. 130, 1983, с. 2308, Neumaier и др., J. Immunol. 135, 1985, с. 3604) создавали путем трансплантации CDR в последовательности человеческих акцепторных каркасных участков зародышевой линии.
Гуманизация антитела нечеловеческого происхождения в основном включала трансплантацию остатков CDR из нечеловеческого антитела (донор) в каркасный участок человеческого антитела (акцептор). Как правило, акцепторный каркасный участок выбирают путем выравнивания последовательности донора относительно коллекции потенциальных акцепторных последовательностей и выбора одной из них, которая либо обладает приемлемой гомологией с донором, либо характеризуется сходными аминокислотами в некоторых положениях, которые имеют решающее значение для структуры и активности. При создании настоящего изобретения выбор акцепторного каркасного участка осуществляли путем выравнивания последовательности мышиного белка Т84.66 (NCBI, код доступа № САА36980 для тяжелой цепи (SEQ ID NO: 317), и САА36979 (SEQ ID NO: 318) для легкой цепи) относительно коллекции последовательностей человеческой зародышевой линии и отбора такой человеческой последовательности, для которой характерна высокая идентичность последовательности. При создании настоящего изобретения последовательность IGHV1-69*08 из базы данных IMGT выбирали в качестве последовательности акцепторного каркасного участка тяжелой цепи (IMGT, код доступа Z14309, SEQ ID NO: 319), а последовательность IGKV3-11*01 (IMGT, код доступа Х01668, SEQ ID NO: 320) выбирали в качестве последовательности акцепторного каркасного участка легкой цепи. В указанные два акцепторных каркасных участка трансплантировали три гипервариабельных участка (CDR) вариабельных доменов мышиных тяжелой и легкой цепей. Поскольку каркасный участок 4 (FR4) не являлся частью вариабельной области гена V зародышевой линии, то сравнительный анализ первичной структуры этого положения осуществляли индивидуально. Последовательность JH4 выбирали для тяжелой цепи, а последовательность JK2 выбирали для легкой цепи.
11.1.2. Связывание различных гуманизированных вариантов Т84.66 IgG с клетками.
Связывание различных гуманизированных вариантов Т84.66 IgG тестировали на экспрессирующих СЕА клетках человеческой аденокарциномы желудка (MKN45, DSMZ АСС 409).
Клетки собирали, подсчитывали количество, оценивали жизнеспособность и ресуспендировали из расчета 2x106 клеток/мл в FACS-буфере (100 мкл ЗФР, 0,1% БСА). 100 мкл клеточной суспензии (содержащей 0,2x106 клеток) инкубировали в круглодонном 96-луночном планшете в течение 30 мин при 4°С с возрастающими концентрациями анти-СЕА IgG (4 нг/мл - 60 мкг/мл), дважды промывали холодным ЗФР, 0,1% БСА, повторно инкубировали в течение еще 30 мин при 4°С с вторичным антителом, представляющим собой конъюгированный с РЕ F(ab')2-фрагмент козьего IgG против человеческого IgG, Fcyспецифический AffmiPure (фирма Jackson Immuno Research Lab, РЕ №109-116-170), промывали дважды холодным ЗФР, 0,1% БСА и немедленного анализировали с помощью FACS, используя устройство FACS CantoII (программа FACS Diva). Получали кривые связывания и рассчитывали величины ЕС50 с помо- 228 037557 щью программы GraphPadPrism5.
На фиг. 39 представлены различные схемы связывания отобранных гуманизированных вариантов
Т84.66 IgG с человеческим СЕА, который экспрессировался на MKN45-клетках. На основе рассчитанных характеризующих связывание величин ЕС50 (табл. 80) для дополнительного исследования выбирали гуманизированный вариант 1.
Таблица 80. Связывание различных гуманизированных вариантов Т84.66 IgG с клетками (величины ЕС50, полученные на основе кривых связывания, представленных на фиг. 39, для расчета которых применяли программу Graph Pad Prism)
ЕС50 (мкг/мл)
родительский химерный клон Т84.66 0,99
ЕС50 (мкг/мл)
гуманизированный вариант 1 1,5
гуманизированный вариант 2 8,6
гуманизированный вариант 3 1,4
гуманизированный вариант 4 ЗД
гуманизированный вариант 5 -
гуманизированный вариант 6 -
Гуманизированный вариант 1 обозначали ниже как T84.66-LCHA. Аминокислотные последовательности его CDR и VH и VL, а также аминокислотные последовательности VH- и VL-доменов родительского химерного клона Т84.66 представлены в табл. 81.
Таблица 81. Аминокислотные последовательности вариабельных доменов анти-СЕА клона T84.66-LCHA и его родительского антитела Т84.66
Описание Последовательность SEQ ID NO:
СЕА CDR-H1 DTYMH 321
СЕА CDR-H2 RIDPANGNSKYVPKFQG 322
СЕА CDR-H3 FGYYVSDYAMAY 323
СЕА CDR-L1 RAGESVDIFGVGFLH 324
СЕА CDR-L2 RASNRAT 325
СЕА CDR-L3 QQTNEDPYT 326
родительский СЕАсвязывающий агент, VH EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGL EWIGRIDPANGNSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQLTSLTSEDT AVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSVTVSS 327
родительский СЕАсвязывающий агент, VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATMSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPG QPPKLLIYRASNLESGIPVRFSGTGSRTDFTLIIDPVEADDVATYYC QQTNEDPYTFGGGTKLEIK 328
гуманизированный СЕА-связывающий агент анти-СЕА (T84.66-LCHA), VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQG LEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSE DTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS 329
гуманизированный СЕА-связывающий агент анти-СЕА (T84.66-LCHA), VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQ APRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ QTNEDPYTFGQGTKLEIK 330
11.2. Получение нацеленных на СЕА (T84.66-LCHA) содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
Различные фрагменты последовательности ДНК, кодирующей часть эктодомена (аминокислоты 71254 и 71-248) человеческого лиганда для 4-1ВВ синтезировали на основе Р41273-последовательности из базы данных Uniprot (SEQ ID NO: 42).
11.2.1. Получение одновалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами с заряженными остатками (конструкция 5.1).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-254), разделенных (G4S)2линкерами и слитых с человеческим IgG1-CL-доменом, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 29А: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий CL. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-254) и слитый с человеческим IgG1-CH-доменом, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 29Б: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН.
Для улучшения правильного спаривания интродуцировали указанные ниже мутации в скрещенные CH-CL. В димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL, мутации E123R и Q124K. В мономерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим СН1, мутации К147Е и К213Е.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для СЕА, клон T84.66-LCHA, субклонировали в рамке считывания либо с
- 229 037557 константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-γ-рецепторами согласно методу, описанному в
WO 2012/130831.
Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-СЕА-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/ L368A/Y407V, и легкая цепь анти-СЕА, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и СЕА-связывающий Fab (фиг. 40, конструкция 5.1).
В табл. 82 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL и заряженными остатками (конструкция 5.1).
Таблица 82. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленнойна СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) молекулы с CH-CL-кроссовером с заряженными остатками (конструкция 5.1)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
129 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 4-1BBL (71-254) - CL*Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 3
130 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-254) СН1* См. таблицу 3
331 нуклеотидная последовательность антиСЕА (T84.66-LCHA), Fcцепь с «впадиной» CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAA CCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGC TTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCAGG CCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAATCGACC CCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGG GCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAGCACCTCCACCGC CTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGTGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACT ACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGT GTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGA CCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCA CACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGC CTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCA CCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGC TGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCC CATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTC GTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAG ACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCA GGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA
- 230 037557
332 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-СЕА (T84.66-LCHA) GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGTCACTGT CTCCAGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGTAGAGCCGGCG AGAGCGTGGACATCTTCGGCGTGGGATTTCTGCACTGGTA TCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCTAC AGAGCCAGCAACCGGGCCACAGGCATCCCCGCCAGATTTT CTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAG CAGCCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAG CAGACCAACGAGGACCCCTACACCTTTGGCCAGGGCACC AAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCT TCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAAC TGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAAT CGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGA GCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCG AAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGT
115 димерный hu 4-1BBL (71254) - CIA-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 3
116 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1* См. таблицу 3
333 анти-СЕА (T84.66-LCHA), Fc-цепь с «впадиной» QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQA PGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
334 легкая цепь анти-СЕА (T84.66-LCHA) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQ KPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPED FAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
* обозначает заряженные остатки.
11.2.2. Получение одновалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами без заряженных остатков (конструкция 5.2).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-254), разделенных (G4S)2линкерами и слитых с человеческим IgG1-CL-доменом, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 29А, но без аминокислотных мутаций в CL-домене: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий CL. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-254) и слитый с человеческим IgG1-CH1-доменом, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 29Б, но без аминокислотных мутаций в СН1-домене: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН1.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для СЕА, клон T84.66-LCHA, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1.
Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-y-рецепторами согласно методу, описанному в WO 2012/130831. Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-СЕА-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V, и легкая цепь анти-СЕА, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и СЕА-связывающий Fab (фиг. 40, конструкция 5.2).
В табл. 83 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL без заряженных остатков (конструкция 5.2).
- 231 037557
Таблица 83. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на
СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254)в слиянии с Fc (kih) молекулы с CH-CL-кроссовером без заряженных остатков (конструкция 5.2)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
165 нуклеотидная последовательность конструкции димерный лиганд (71-254)- CL-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 22
166 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1 См. таблицу 22
331 нуклеотидная последовательность анти-СЕА (T84.66-LCHA), Fcцепь с «впадиной» См. таблицу 82
332 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-СЕА (T84.66-LCHA) См. таблицу 82
117 димерный лиганд (71-254) - CL-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 22
118 мономерный лиганд (71-254) - СН1 См. таблицу 22
333 анти-СЕА (T84.66-LCHA), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 82
334 легкая цепь анти-СЕА (T84.66-LCHA) См. таблицу 82
11.2.3. Получение двухвалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 5.3).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-254), разделенных (G4S)2линкерами, сливали с С-концом Fc-цепи с впадиной человеческого IgG1, согласно схеме, представленной на фиг. 29В: Fc-цепь с впадиной человеческого IgG1, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганд для 4-1ВВ (71-254) и слитый с С-концом Fc-цепи с выступом человеческого IgG1 получали согласно схеме, представленной на фиг. 29Г: Fc-цепь с выступом человеческого IgG1, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для СЕА, клон T84.66-LCHA, субклонировали в рамке считывания с константной тяжелой цепью с впадиной, с выступом, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-γ-рецепторами согласно методу, описанному в WO 2012/130831. Комбинация: анти-СЕА huIgG1, содержащая димерный лиганд цепь с впадиной с мутациями Y349C/T366S/L368A/Y407V, анти-СЕА huIgG1, содержащая мономерный лиганд цепь с выступом с мутациями S354C/T366W, и легкая цепь анти-СЕА, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и два СЕА-связывающих Fab (фиг. 40, конструкция 5.3).
В табл. 84 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 5.3).
- 232 037557
Таблица 84. кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на
СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) PGLALA молекулы (конструкция 5.3)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
335 нуклеотидная последовательность конструкции антиCEA(T84.66-LCHA)-Fcцепь с «впадиной» димерный 4-1BBL (71254) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAA CCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGC TTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCAGG CCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAATCGACC CCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGG GCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAGCACCTCCACCGC CTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGTGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACT ACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGT GTCCT СТ GCTAGCACCA AGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGG ессее a gca gcaa ga gca cca gcggcggca ca gccgctctg GGCTGCCTGGTCAA GGA СТА CTTCCCCGA GCCCGTGA CCGT GTCCTGGAA CA GCGGA GCCCTGA CCTCCGGCGTGCA CA CCT TCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCA GCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCACCCAGACCT A CA TCTGCAA CGTGAA CCA CAA GCCCA GCAA CA CCAA GGTGG A CAA GAA GGTGGA GCCCAA GA GCTGCGA CAAAA CTCA CA CA T GCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGCAGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCAA GGA CA CCCTCA TGA TCT CCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CA CGAA GA CCCTGA GGTCAA GTTCAA CTGGTA CGTGGA CGGC GTGGA GGTGCA TAA TGCCAA GA CAAA GCCGCGGGA GGA GCA GT A CAA CA GCA CGTA CCGTGTGGTCA GCGTCCTCA CCGTCCT GCA CCA GGA CTGGCTGAA TGGCAA GGAGTA CAA GTGCAA GGT CTCCAA CAAA GCCCTCGGCGCCCCCA TCGA GAAAA CCA TCTC CAAA GCCAAA GGGCA GCCCCGA GAA CCA CAGGTG TGC A CCC TGCCCCCA TCCCGGGA TGA GCTGA CCAA GAA CCA GGTCA GC CTCTCGTGCGCA GTCAAA GGCTTCTA TCCCAGCGA CA TCGCC GTGGAGTGGGA GA GCAA TGGGCA GCCGGA GAA CAA СТА CAA GA CCA CGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGA CGGCTCCTTCTTCCT CGTGA GCAA GCTCA CCGTGGA CAA GA GCA GGTGGCA GCA GG GGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGC A TGA GGCTCTGCA CA A CCA СТА CA CGCA GAA GA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGA G GCGGCGGAA GCGGA GGA GGA GGA TCCA GA GA GGGCCCTGA GCTGA GCCCCGA TGA TCCTGCTGGA CTGCTGGA CCTGCGGC AGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGA TCGA TGGCCCCCTGTCCTGGTA CA GCGA TCCTGGA CTGGCTG GCGTGTCA CTGA CA GGCGGCCTGA GCTA CAAA GA GGA CA CC AAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGGCGTGTACTACGTGTTC TTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTGGTGGCCGGCGAAGGATC TGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCA TCTGCAGCCTCTGA GAA G CGCTGCTGGCGCTGCA GCTCTGGCA CTGA CA GTGGA TCTGC CTCCTGCCA GCTCCGA GGCCCGGAA TA GCGCA TTTGGGTTTC AA GGCA GGCTGCTGCA CCTGTCTGCCGGCCA GAGGCTGGGA GTGCA TCTGCA CA CA GA GGCCA GGGCTA GA CA CGCCTGGCA GCTGA CA CA GGGCGCTA CA GTGCTGGGCCTGTTCA GAGTGA
- 233 037557
CCCCCGA GA ТТССА GCCGGCCTGCCTTCTCCAA GAA GCGAA G GCGGA GGCGGA TCTGGCGGCGGA GGA ТСТА GA GAGGGA С С CGAA CTGTCCCCTGA CGA ТССА GCCGGGCTGCTGGA TCTGA G А СА GGGAA TGTTCGCCCA GCTGGTGGCTCA GAA TGTGCTGCT GA TTGA CGGA CCTCTGA GCTGGTA CTCCGA СССА GGGCTGG С A GGGGTGTCCCTGA CTGGGGGA CTGTCCTA СААА GAA GA ТА CAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGT ТТТТТСА GCTGGAA CTGA GGCGGGTGGTGGCTGGGGA GGGC ТС A GGA TCTGTGTCCCTGGCTCTGCA TCTGCA GCCA CTGCGC TCTGCTGCTGGCGCA GCTGCA CTGGCTCTGA CTG TGGA CCTG ССА ССА GCCTCTA GCGA GGCCA GAAA СА GCGCCTTCGGGTTC САА GGA CGCCTGCTG С A TCTGA GCGCCGGA CAGCGCCTGGG A GTGCA TCTGCA ТА CTGAA GCCA GA GCCCGGCA TGCTTGGCA GCTGA СТСА GGGGGCAA CTGTGCTGGGA CTGTTTCGCGTGA С A CCTGA GA TCCCTGCCGGA CTGCCAA GCCCTA GA ТСА GAA
336 нуклеотидная последовательность конструкции антиCEA(T84.66-LCHA)-Fcцепь с «выступом»мономерный 41-BBL (71254) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAA CCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGC TTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCAGG CCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAATCGACC CCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGG GCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAGCACCTCCACCGC CTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGTGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACT ACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGT GTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC А СССТССТССАА GA GCA CCTCTGGGGGCA С A GCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCAA GGA СТА CTTCCCCGAA CCGGTGA CGGTGT CGTGGAA СТСА GGCGCCCTGA CCA GCGGCGTGCA СА ССТТС CCGGCTGTCCTA СА GTCCTCA GGA СТСТА CTCCCTCAGCA GC GTGGTGA CCGTGCCCTCCA GCA GCTTGGGCA СССА GA ССТА С A TCTGCAA CG TGAA ТСА САА GCCCA GCAA С А ССАА GGTGGA САА GAAA GTTGA GCCCAAA TCTTG TGA СААА А СТСА С А С A TGC CCA CCGTGCCCA GCA CCTGAA GCTGCA GGGGGA CCGTCA GT СТТССТСТТССССССАААА СССАА GGA СА СССТСА TGA ТСТСС CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA CGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGA GGTGCA TAA TGCCAA GA СААА GCCGCGGGAGGA GCAGT ACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC A CCAGGACTGGCTGAA TGGCAA GGAGTA САА GTGCAAGGTCT ССАА СААА GCCCTCGGCGCCCCCA TCGA GAAAA ССА ТСТССА АА GCCAAA GGGCA GCCCCGA GAA ССА СА GGTGTA С A CCCTG CCCCCCTGCA GA GA TGA GCTGA ССАА GAA ССА GGTGTCCCTG TGGTGTCTGGTCAA GGGCTTCTA ССССА GCGA ТА TCGCCGTG GA GTGGGA GA GCAA CGGCCA GCCTGA GAA САА СТА САА GA С С A CCCCCCCTGTGCTGGA С A GCGA CGGCAGCTTCTTCCTGTA СТССААА CTGA CCGTGGA САА GA GCCGGTGGCAGCA GGGCA A CGTGTTCA GCTGCA GCGTGA TGCA CGA GGCCCTGCA САА CC А СТА СА СССА GAA GTCCCTGA GCCTGA GCCCCGGCGGA GGC GGCGGA A GCGGA GGAGGAGGA ТССА GA GA GGGC CCTGA GC TGA GCCCCGA TGA TCCTGCTGGA CTGCTGGA CCTGCGGCA G GGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGAACGTGCTGCTGATC GA TGGCCCCCTGTCCTGGTA CA GCGA TCCTGGA CTGGCTGG CGTGTCA CTGA CA GGCGGCCTGA GCTA CAAA GA GGA СА CCAA A GAA CTGGTGGTGGCCAA GGCCGGCGTGTA СТА CGTGTTCTT
- 234 037557
ТС A GCTGGAA CTGCGGA GA GTGGTGGCCGGCGAA GGA TCTG GCTCTGTGTCTCTGGCCCTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCG CTGCTGGCGCTGCA GCTCTGGCA CTGA CA GTGGA TCTGCCTC CTGCCA GCTCCGA GGCCCGGAA TA GCGCA TTTGGGTTTCAA G GCA GGCTGCTGCA CCTG TCTGCCGGCCA GA GGCTGGGA G TG CA TCTGCA CA CA GA GGCCA GGGCTA GA CA CGCCTGGCAGCT GA CA CA GGGCGCTA CAGTGCTGGGCCTGTTCA GA GTGA CCC CCGA GA TTCCA GCCGGCCTGCCTTCTCCAA GAA GCGAA
332 нуклеотидная последовательность антиCEA(T84.66-LCHA), легкая цепь см.таблицу 82
337 анти-СЕА(Т84.66-ЕСНА)- Fc-цепь с «впадиной»димерный 41-BBL (71254) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQA PGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSG VHTFPA VL QSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQ YNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKAL GAPIEKTIS KAKGQPREPQ VCTLPPSRDEL TKNQ VSLSCA VKGFYPSDIA VE W ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDDP A GLLDLRQGMFA QL VA QNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGGL SYKEDTKEL VVAKAGVYYVFFQLELRRVVA GEGSGSVSLALHLQ PLRSAA GAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSA GQRL GVHLHTEARARHA WQLTQGA TVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGG GGSGGGGSREGPELSPDDPA GLLDLRQGMFA QL VA QNVLLID GPLS WYSDPGLA G VSL TGGLSYKED TKEL VVA KA G VYYVFFQLE LRR VVA GEGSGSVSLALHL QPLRSAA GAA AL AL TVDLPPA SSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHA WQL TQGA TVLG LFR VTPEIPA GLPSPRSE
338 анти-СЕА(Т84.66-ЕСНА)Fc-цепь с «выступом»мономерный 4-1BBL (71254) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQA PGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSG VHTFPA VL QSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQ YNSTYR VVSVL TVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPCRDEL TKNQ VSL WCL VKGFYPSDIA VE WESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKL TVDKSR WQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPELSPDD PA GLLDLRQGMFA QL VA QNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGG LSYKED TKEL WAKA G VYYVFFQLELRR VVA GEGSGSVSLALHL QPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQR LGVHLHTEARARHA WQLTQGA TVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
334 анти-СЕА(Т84.66-ЕСНА), легкая цепь см.таблицу 82
11.2.4. Получение одновалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами с заряженными остатками (конструкция 5.4).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-248), разделенных (G4S)2-линкерами и слитых с человеческим IgG1-CL-доменом, клонировали аналогично схеме, представленной на фиг. 29А: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий CL. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-248) и слитый с человеческим IgG1-CH-доменом, клонировали аналогично схеме, представленной на фиг. 29Б: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН.
Полипептид, кодирующей димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL-доменом, субклонировали в рамке считывания с СН2- и СН3-доменами тяжелой цепи с выступом человеческого IgG1 (Merchant, Zhu и др. 1998). Для улучшения правильного спаривания интродуцировали указанные ниже мутации в скрещенные CH-CL. В димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL, интродуцировали мутации E123R и Q124K. В мономерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим СН1, - мутации К147Е и К213Е.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связываю
- 235 037557 щего агента, специфического для СЕА, клон T84.66-LCHA, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-гамма-рецепторами согласно методу, описанному в WO 2012/130831. Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-СЕА-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V, и легкая цепь анти-СЕА, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и СЕА-связывающий Fab (фиг. 40, конструкция 5.4).
В табл. 85 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL и заряженными остатками (конструкция 5.4).
Таблица 85. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на
СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) молекулы с CH-CL-кроссовером с заряженными остатками (конструкция 5.1)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
169 нуклеотидная последовательность конструкции димерный лиганд (71-248) - СЕ*-Рс-цепь с «выступом» См. таблицу 24
170 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-248) - СН1* См. таблицу 24
331 нуклеотидная последовательность анти-СЕА (T84.66-LCHA), Fcцепь с «впадиной» См. таблицу 82
332 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-СЕА (T84.66-LCHA) См. таблицу 82
119 димерный лиганд (71-248) - СЕ*-Ес-цепь с «выступом» См. таблицу 24
120 мономерный лиганд (71-248)-СН1* См. таблицу 24
333 анти-СЕА (T84.66-LCHA), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 62
334 легкая цепь анти-СЕА (T84.66-LCHA) См. таблицу 59
* обозначает заряженные остатки.
11.2.5. Получение одновалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами без заряженных остатков (конструкция 5.5).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-248), разделенных (G4S)2линкерами и слитых с человеческим IgG1-CL-доменом, клонировали аналогично схеме, представленной на фиг. 29А, но без аминокислотных мутаций в CL-домене: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий CL. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-248) и слитый с человеческим IgG1-CH1-доменом, клонировали аналогично схеме, представленной на фиг. 29Б, но без аминокислотных мутаций в СН1-домене: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН1.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для СЕА, клон T84.66-LCHA, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-Y-рецепторами согласно методу, описанному в WO 2012/130831. Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/ T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-СЕА-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V, и легкая цепь анти-СЕА, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и СЕА-связывающий Fab (фиг. 40, конструкция 5.5).
В табл. 86 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL без заряженных остатков (конструкция 5.5).
- 236 037557
Таблица 86. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на
СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) молекулы с CH-CL-кроссовером без заряженных остатков (конструкция 5.5)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
171 нуклеотидная последовательность конструкции димерный лиганд (71-248) - CL-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 25
172 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный лиганд (71-248)-СН1 См. таблицу 25
331 нуклеотидная последовательность анти- СЕА (T84.66-LCHA), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 82
332 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-СЕА (T84.66-LCHA) См. таблицу 82
173 димерный лиганд (71-248) - CL-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 25
174 мономерный лиганд (71-248)-СН1 См. таблицу 25
333 анти-СЕА (T84.66-LCHA), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 82
334 легкая цепь анти-СЕА (T84.66-LCHA) См. таблицу 82
11.2.6. Получение двухвалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 5.6).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-248), разделенных (G4S)2линкерами, сливали с С-концом Fc-цепи с впадиной человеческого IgG1, согласно схеме, представленной на фиг. 29В: Fc-цепь с впадиной человеческого IgG1, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганд для 4-1ВВ (71-248) и слитый с С-концом Fc-цепи с выступом человеческого IgG1 получали согласно схеме, представленной на фиг 29Г: Fc-цепь с выступом человеческого IgG1, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для СЕА, клон T84.66-LCHA, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, с выступом, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-γ-рецепторами согласно методу, описанному в WO 2012/130831. Комбинация: анти-СЕА huIgG1, содержащая димерный лиганд цепь с впадиной с мутациями Y349C/T366S/L368A/Y407V, анти-СЕА huIgG1, содержащая мономерный лиганд цепь с выступом с мутациями S354C/T366W, и легкая цепь анти-СЕА, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и два СЕА-связывающих Fab (фиг. 40, конструкция 5.6).
В табл. 87 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 5.6).
- 237 037557
Таблица 87. кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на СЕА (T84.66-LCHA) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) молекулы (конструкция 5.6)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
339 нуклеотидная последовательность конструкции антиСЕА (Т84.66ЕСНА)-Ес-цепь с «впадиной»димерный 4-1BBL (71-248) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAA CCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGC TTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCAGG CCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAATCGACC CCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGG GCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAGCACCTCCACCGC CTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGTGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACT ACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGT GTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTG GCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGA CCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCA CACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATAGC CTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGGCA CCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGC TGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCCCC CATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTCTC GTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTG GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAG ACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCA GGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAG GGCCCTGAGCTGAGCCCTGATGATCCTGCCGGACTGCTGG ACCTGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAA CGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGAT CCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCT ACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCG GCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGT GGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTG CATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTC TGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGC CCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCAC CTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAG AGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCG CTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCC AGCAGGCCTGGGAGGCGGCGGATCTGGCGGCGGAGGATC TAGAGAAGGACCCGAGCTGTCCCCCGACGATCCCGCTGG
- 238 037557
GCTGCTGGATCTGAGACAGGGCATGTTCGCTCAGCTGGTG GCTCAGAATGTGCTGCTGATTGACGGACCTCTGAGCTGGT ACTCCGACCCAGGGCTGGCAGGGGTGTCCCTGACTGGGG GACTGTCCTACAAAGAAGATACAAAAGAACTGGTGGTGG CTAAAGCTGGGGTGTACTATGTGTTTTTTCAGCTGGAACT GAGGCGGGTGGTGGCTGGGGAGGGCTCAGGATCTGTGTC CCTGGCTCTGCATCTGCAGCCACTGCGCTCTGCAGCAGGG GCTGCAGCACTGGCCCTGACTGTGGACCTGCCCCCAGCTT CTTCCGAGGCCAGAAACAGCGCCTTCGGGTTCCAAGGACG CCTGCTGCATCTGAGCGCCGGACAGCGCCTGGGAGTGCAT CTGCATACTGAAGCCAGAGCCCGGCATGCTTGGCAGCTGA CTCAGGGGGCAACTGTGCTGGGACTGTTTCGCGTGACACC TGAGATCCCAGCCGGGCTC
340 нуклеотидная последовательность конструкции антиСЕА (Т84.66ЕСНА)-Ес-цепь с «выступом»мономерный (71248) 4-1BBL CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAA CCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGC TTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGCCAGG CCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATGGGCAGAATCGACC CCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGG GCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCAGCACCTCCACCGC CTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGTGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGACT ACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGT GTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACC CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTG CAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCT GAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGC CCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCCT GCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGT GTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGAC CACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTG TACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAG GGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGC ACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGG CGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGAGG GCCCTGAGCTGAGCCCTGATGATCCTGCCGGACTGCTGGA CCTGCGGCAGGGAATGTTTGCCCAGCTGGTGGCCCAGAAC GTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGATC CTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGCTA CAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCCGG CGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAGTG GTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCTGC
- 239 037557
ATCTGCAGCCTCTGAGATCTGCTGCTGGCGCCGCTGCTCT GGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCAGCGAGGCC CGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCACC TGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACAGA GGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGCGC TACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTCCT GCCGGGCTC
332 нуклеотидная последовательность анти-СЕА (Т84.66LCHA), легкая цепь см.таблицу 82
341 анти-СЕА (Т84.66ЕСНА)-Рс-цепь с «впадиной»димерный 4-1BBL (71-248) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQA PGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLID GPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDD PAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLT GGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSV SLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRL LHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEI PAGL
342 анти-СЕА (Т84.66ЬСНА)-Рс-цепь с «выступом»мономерный (71248) 4-1BBL QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQA PGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLID GPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL
334 анти-СО19(8В8- 018), легкая цепь см.таблицу 82
11.2.7. Получение одновалентной нацеленной на СЕА (Т84.66) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH1-CLдоменами с заряженными остатками (конструкция 5.7).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-254), разделенных (G4S)2-линкерами, и слитых с человеческим IgG1-CL-доменом, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 29А: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2коннектор, человеческий CL. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-254) и слитый с человеческим IgG1-CH-доменом, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 29Б: человеческий лиганд для 4-1ВВ, (G4S)2-коннектор, человеческий СН.
Для улучшения правильного спаривания интродуцировали указанные ниже мутации в скрещенные CH-CL. В димерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим CL, - мутации E123R и Q124K. В мономерный лиганд для 4-1ВВ, слитый с человеческим СН1, - мутации К147Е и К213Е.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для СЕА, клон Т84.66, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с высту- 240 037557 пом и впадиной для элиминации связывания с Fc-гамма-рецепторами согласно методу, описанному в
WO 2012/130831.
Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти-СЕА-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/L368A/Y407V, и легкая цепь анти-СЕА, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и СЕА-связывающий Fab. Конструкция 5.7 соответствует конструкции 5.1, представленной на фиг. 40.
В табл. 88 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на СЕА (Т84.66) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL и заряженными остатками (конструкция 5.7).
Таблица 88. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на СЕА (Т84.66) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) молекулы с CH-CL-кроссовером с заряженными остатками (конструкция 5.7)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
129 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu 4-1BBL (71-254) - CL*Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 3
130 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu 4-1BBL (71-254) СН1* См. таблицу 3
343 нуклеотидная последовательность антиСЕА (Т84.66), Fc-цепь с «впадиной» GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAACTGGTGGAA CCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGAGCTGTACCGCCAGCGGCT TCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAAGCAGC GGCCTGAGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCAGAATCGACC CCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGG GCAAGGCCACCATCACCGCCGACACCAGCAGCAACACAG CCTACCTGCAGCTGACCAGCCTGACCTCCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGAC TACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACC GTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCC TGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG CTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGT GACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTG CACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATA GCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGC GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA GCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGT CAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGC CAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCC CCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTC TCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACA AGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT CCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC
- 241 037557
CGGGTAAA
344 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-СЕА (Т84.66) GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCTCTCTGGCCGTGT CTCTGGGACAGAGGGCCACCATGTCTTGCAGAGCCGGCG AGAGCGTGGACATCTTCGGCGTGGGATTTCTGCACTGGTA TCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTAC AGAGCCAGCAACCTGGAAAGCGGCATCCCCGTGCGGTTT AGCGGCACCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGATCATCG ACCCCGTGGAAGCCGACGACGTGGCCACCTACTACTGCCA GCAGACCAACGAGGACCCCTACACCTTTGGCGGAGGCAC CAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTC TTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAA TCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGC GAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG AGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
115 димерный hu 4-1BBL (71254) - CIA-Fc-цепь с «выступом» См. таблицу 3
116 мономерный hu 4-1BBL (71-254) - СН1* См. таблицу 3
345 анти-СЕА (Т84.66), Fcцепь с «впадиной» EVQLQQSGAELVEPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRP EQGLEWIGRIDPANGNSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQL TSLTSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
346 легкая цепь анти-СЕА (Т84.66) DIVLTQSPASLAVSLGQRATMSCRAGESVDIFGVGFLHWYQ QKPGQPPKLLIYRASNLESGIPVRFSGTGSRTDFTLIIDPVEAD DVATYYCQQTNEDPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQD SKD ST Y SL S STLTL SK AD YEKHK VY АСЕ VTHQ GL S SP V TKSFNRGEC
* обозначает заряженные остатки.
11.2.8. Получение двухвалентной нацеленной на СЕА (Т84.66) содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 5.8).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда для 4-1ВВ (71-254), разделенных (G4S)2-линкерами, сливали с С-концом Fc-цепи с впадиной человеческого IgG1, согласно схеме, представленной на фиг. 29В: Fc-цепь с впадиной человеческого IgG1, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1BB, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ. Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для 4-1ВВ (71-254) и слитый с С-концом Fc-цепи с выступом человеческого IgG1, получали согласно схеме, представленной на фиг 29Г: Fc-цепь с выступом человеческого IgG1, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для 4-1ВВ.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для СЕА, клон Т84.66, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, с выступом, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-γ-рецепторами согласно методу, описанному в WO 2012/130831. Комбинация: анти-СЕА huIgG1, содержащая димерный лиганд цепь с впадиной с мутациями Y349C/T366S/L368A/Y407V, анти-СЕА huIgG1, содержащая димерный лиганд цепь с выступом с мутациями S354C/T366W, и легкая цепь анти- СЕА, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для 4-1ВВ и два СЕА-связывающих Fab. Конструкция 5.8 соответствует конструкции 5.3, представленной на фиг. 40.
В табл. 89 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на СЕА (Т84.66) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы (конструкция 5.8).
- 242 037557
Таблица 89. кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной нацеленной на СЕА (Т84.66) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) PGLALA молекулы (конструкция 5.8)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
347 нуклеотидная последовательное ть конструкции анти-СЕА (Т84.66)-Рс-цепь с «впадиной»димерный 4-1BBL (71-254) GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAACTGGTGGAA CCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGAGCTGTACCGCCAGCGGCT TCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAAGCAGC GGCCTGAGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCAGAATCGACC CCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGG GCAAGGCCACCATCACCGCCGACACCAGCAGCAACACAG CCTACCTGCAGCTGACCAGCCTGACCTCCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGAC TACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACC GTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCC TGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCG CTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGT
- 243 037557
GACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTG CACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATA GCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCTTCTAGCAGCCTGGG CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGC GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA GCTGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGT CAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGC CAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGCACCCTGCC CCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTC TCGTGCGCAGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACA AGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT CCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGA GAGGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGC TGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCA GAACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGC GATCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGA GCTACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGG CCGGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAG AGTGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCC CTGCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAG CTCTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGA GGCCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTG CACCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACA CAGAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGG GCGCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGAT TCCAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAAGGCGGAGG CGGATCTGGCGGCGGAGGATCTAGAGAGGGACCCGAACT GTCCCCTGACGATCCAGCCGGGCTGCTGGATCTGAGACAG GGAATGTTCGCCCAGCTGGTGGCTCAGAATGTGCTGCTGA TTGACGGACCTCTGAGCTGGTACTCCGACCCAGGGCTGGC AGGGGTGTCCCTGACTGGGGGACTGTCCTACAAAGAAGA TACAAAAGAACTGGTGGTGGCTAAAGCTGGGGTGTACTAT GTGTTTTTTCAGCTGGAACTGAGGCGGGTGGTGGCTGGGG AGGGCTCAGGATCTGTGTCCCTGGCTCTGCATCTGCAGCC ACTGCGCTCTGCTGCTGGCGCAGCTGCACTGGCTCTGACT GTGGACCTGCCACCAGCCTCTAGCGAGGCCAGAAACAGC GCCTTCGGGTTCCAAGGACGCCTGCTGCATCTGAGCGCCG GACAGCGCCTGGGAGTGCATCTGCATACTGAAGCCAGAG CCCGGCATGCTTGGCAGCTGACTCAGGGGGCAACTGTGCT GGGACTGTTTCGCGTGACACCTGAGATCCCTGCCGGACTG CCAAGCCCTAGATCAGAA
348 нуклеотидная последовательное ть конструкции анти-СЕА (Т84 66)-Рс-цепь с GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAACTGGTGGAA CCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGAGCTGTACCGCCAGCGGCT TCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAAGCAGC GGCCTGAGCAGGGCCTGGAATGGATCGGCAGAATCGACC CCGCCAACGGCAACAGCAAATACGTGCCCAAGTTCCAGG
- 244 037557
«выступом»мономерный 41BBL (72-254) GCAAGGCCACCATCACCGCCGACACCAGCAGCAACACAG CCTACCTGCAGCTGACCAGCCTGACCTCCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCCCCTTCGGCTACTACGTGTCCGAC TACGCCATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACC GTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC TGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGC CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTC CCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGC ACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGC TGCAGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC CCTGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTG GTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTG GAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCC TGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGC AGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCT GCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCC GGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCAGAGA GGGCCCTGAGCTGAGCCCCGATGATCCTGCTGGACTGCTG GACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCTCAGCTGGTGGCCCAGA ACGTGCTGCTGATCGATGGCCCCCTGTCCTGGTACAGCGA TCCTGGACTGGCTGGCGTGTCACTGACAGGCGGCCTGAGC TACAAAGAGGACACCAAAGAACTGGTGGTGGCCAAGGCC GGCGTGTACTACGTGTTCTTTCAGCTGGAACTGCGGAGAG TGGTGGCCGGCGAAGGATCTGGCTCTGTGTCTCTGGCCCT GCATCTGCAGCCTCTGAGAAGCGCTGCTGGCGCTGCAGCT CTGGCACTGACAGTGGATCTGCCTCCTGCCAGCTCCGAGG CCCGGAATAGCGCATTTGGGTTTCAAGGCAGGCTGCTGCA CCTGTCTGCCGGCCAGAGGCTGGGAGTGCATCTGCACACA GAGGCCAGGGCTAGACACGCCTGGCAGCTGACACAGGGC GCTACAGTGCTGGGCCTGTTCAGAGTGACCCCCGAGATTC CAGCCGGCCTGCCTTCTCCAAGAAGCGAA
344 нуклеотидная последовательное ть анти-СЕА (Т84.66), легкая цепь см.таблицу 88
349 Е VQLQQ S G AEL VEP G AS VKL S СТ AS GFNIKDT YMH W VKQRP EQGLEWIGRIDPANGNSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQL TSLTSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN
- 245 037557
KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSC AVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLID GPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGP ELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGL AGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAG EGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAF GFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGL FRVTPEIPAGLPSPRSE
350 анти-СЕА (Т84.66)-Ес-цепь с «выступом»мономерный 41BBL (71-254) Е VQLQQ S G AEL VEP G AS VKL S СТ AS GFNIKDT YMH W VKQRP EQGLEWIGRIDPANGNSKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQL TSLTSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTSVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSGGGGSREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLID GPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVF FQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGAT VLGLFRVTPEIP AGLP SPRSE
346 анти-СЕА (Т84.66), легкая цепь см.таблицу 88
11.3. Получение ненацеленных содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc молекул и человеческого IgG в качестве контрольных молекул.
11.3.1. Получение ненацеленных содержащих тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул (контрольные молекулы).
Указанные контрольные молекулы получали согласно методу, описанному выше для нацеленной на СЕА конструкции 5.1 (обозначена как контроль Б), 5.3 (обозначена как контроль В), 3.4 (обозначена как контроль Г) и 3.5 (обозначена как контроль Д), с единственным различием, состоящем в том, что антиСЕА-связывающий агент (VH-VL) заменяли на представляющий собой зародышевую линию контроль, обозначенный DP47, который не связывается с антигеном (см. фиг. 40). кДНК и аминокислотные последовательности контроля Б, представляющего собой одновалентную ненацеленную (DP47) содержащую разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) молекулу со скрещенными CHCL с заряженными остатками, представлены выше в табл. 68 (см. пример 7.3.1). В табл. 69 представлены кДНК и аминокислотные последовательности двухвалентной ненацеленной (DP47) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) молекулы, представляющей собой контроль В. В табл. 70 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной ненацеленной (DP47) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) молекулы с CH-CL-кроссовером с заряженными остатками, представляющей собой контроль Г. В табл. 71 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной ненацеленной (DP47) содержащей разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) молекулы без заряженных остатков в CH-CL-кроссовером, представляющей собой контроль Д.
11.3.2. Антитела в качестве контрольных молекул.
Дополнительным контролем, применяемым в анализах, который был обозначен как контроль Е, являлся ненацеленный (DP47) контроль зародышевой линии, который представлял собой человеческий IgG1, содержащий мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala для элиминации связывания с Fc-γрецепторами. кДНК и аминокислотные последовательности контроля Е представлены выше в табл. 73.
11.4. Получение нацеленных на СЕА содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул и соответствующих контрольных молекул.
Кодирующие последовательности нацеленных и ненацеленных содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) антигенсвязывающих молекул клонировали в плазмидном векторе, в котором экспрессия вставки контролируется промотором MPSV и который содержит синтетическую полиА-последовательность, локализованную на 3'-конце CDS. Кроме того, вектор содержал последовательность OriP EBV для поддержки эписомальной формы плазмиды.
Содержащую разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc(kih) молекулу получали путем совместной трансфекции клеток HEK293-EBNA экспрессионными векторами для клеток млекопи
- 246 037557 тающих с использованием полиэтиленимина. Клетки трансфектировали соответствующими экспрессионными векторами. Для вариантов 1, 2, 4, 5 и их контролей Б, Г и Д применяли соотношение 1:1:1:1 (вектор для конструкции димерный лиганд-CL-цепь с выступом:вектор для слияния мономерный лиганд-CH1:вектор для анти-СЕА Fab с цепью с впадиной:вектор для легкой цепи анти-СЕА). Для вариантов 3, 6 и соответствующего контроля В применяли соотношение 1:1:1 (вектор для цепи huIgG1 Fc с впадиной-димерный лиганд:вектор для цепи huIgG1 Fc с выступом- мономерный лиганд:вектор для легкой цепи анти-СЕА). Человеческие IgG, применяемые в качестве контролей в этом анализе, получали методом, применяемым для биспецифической конструкции (для трансфекции применяли только вектор для легкой цепи и вектор для тяжелой цепи в соотношении 1:1).
Для производства в 500-миллилитровые встряхиваемые колбы засевали 300 млн клеток HEK293 EBNA за 24 ч до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 10 мин при 210xg и супернатант заменяли 20 мл предварительно нагретой среды CD CHO. Экспрессионные векторы (200 мкг общей ДНК) смешивали в 20 мл среды CD CHO. После добавления 540 мкл ПЭИ раствор интенсивно перемешивали в течение 15 с и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/ПЭИ, переносили в 500-миллилитровую встряхиваемую колбу и инкубировали в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО2. После инкубации добавляли 160 мл среды Excell, дополненной 6 мМ L-глутамином, 5 г/л соевого пептида (PEPSOY) и 1,2 мМ вальпроевой кислотой, и клетки культивировали в течение 24 ч. Через 1 день после трансфекции добавляли 12% Feed (аминокислота и глюкоза). После культивирования в течение 7 дней супернатант собирали центрифугированием в течение 30-40 мин по меньшей мере при 400xg. Раствор стерилизовали фильтрацией (0,22 мкмфильтр), дополняли азидом натрия до конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и выдерживали при 4°С.
Содержащую разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекулу, а также IgG, очищали из супернатантов клеточных культур с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А с последующей гель-фильтрацией. Для осуществления аффинной хроматографии супернатант вносили в колонку MabSelect Sure (CV = 5-15 мл, смола фирмы GE Healthcare), уравновешенную буфером, содержащим фосфат натрия (20 мМ), цитрат натрия (20 мМ) (рН 7,5). Несвязанный белок удаляли путем промывки таким же буфером, используя его в объеме, кратном по меньшей 6 об. колонки. Связанный белок элюировали, используя или линейный градиент (20 CV), или ступенчатую элюцию (8 CV), буфером, содержащим 20 мМ цитрат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин (рН 3,0). При осуществлении элюции с использованием линейного градиента осуществляли дополнительную ступенчатую элюцию с применением объема, кратного 4 об. колонки.
Значение рН собранных фракций регулировали, добавляя 1/10 (об./об.) 0,5М фосфата натрия, рН 8,0. Белок концентрировали перед внесением в колонку HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную раствором, содержащим 20 мМ гистидин, 140 мМ хлорид натрия, 0,01 об.% Твин20, рН 6,0.
Концентрацию белка определяли путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу нацеленной содержащей тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы анализировали с помощью ДСН-ПААГ в присутствии восстановителя (5 мМ 1,4-дитиотреитол) и без него и осуществляли окрашивание кумасси SimpleBlue™ SafeStain, (фирма Invitrogen, США), или анализировали с помощью КЭ-ДСН, используя устройство LabChipGXII (фирма (Perkin Elmer). Содержание агрегатов в образцах антител анализировали с помощью колонки для аналитической гель-фильтрации TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh), уравновешенной подвижным буфером, содержащим 25 мМ K2HPO4, 125 мМ NaCl, 200 мМ моногидрохлорид L-аргинина, 0,02% (мас./ об.) NaN3, рН 6,7, при 25°С.
В табл. 90 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономеров нацеленных на СЕА содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул.
Таблица 90. Результаты биохимического анализа нацеленных на СЕА содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекул
Конструкция Мономер [%] (SEC) Выход [мг/л]
одновалентная нацеленная на CEA (T84.66-LCHA) содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc молекула с CH-CLкроссовером с заряженными остатками (конструкция 5.4) 98 L4
двухвалентная нацеленная на CEA (T84.66-LCHA) содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc молекула (конструкция 5.6) 98 0,4
одновалентная нацеленная на CEA (Т84.66) содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc молекула с CH-CLкроссовером с заряженными остатками (конструкция 5.7) 97 15
двухвалентная нацеленная на CEA (Т84.66) содержащая разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc молекула (конструкция 5.8) 96 2
- 247 037557
В табл. 91 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономеров ненацеленных (DP47) содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекул, как одновалентных (контроль Б, Г и Д), так и двухвалентных (контроль В), и человеческого IgG1PGLALA зародышевой линии DP47 (контроль Е).
Таблица 91. Результаты биохимического анализа ненацеленных (DP47) содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) молекул
Конструкция мономер [%] (SEC) Выход [мг/л]
одновалентная «ненацеленная» (DP47) содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) молекула(контроль Б) 99 15,4
двухвалентная «ненацеленная» (DP47) содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-254) в слиянии с Fc (kih) молекула (контроль В) 98 12,6
одновалентная «ненацеленная» (DP47) содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) молекула (контроль Г) 99.5 25,9
одновалентная «ненацеленная» (DP47) содержащая разделенный тримерный человеческий лиганд для 4-1ВВ (71-248) в слиянии с Fc (kih) молекула(контроль Д) 93.3 4,1
человеческий IgGl PGLALA зародышевой линии DP47 100 50
Пример 12.
Функциональная характеризация нацеленных на СЕА содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
12.1. Поверхностный плазмонный резонанс (одновременное связывание).
Получение huNA3B3A2 в качестве антигена нацеленных на СЕА содержащих тримерный разделенный 4-1BBL конструкций.
Антиген, применяемый для анализа связывания с СЕА методом SPR, представлял собой гибридную молекулу, состоящую из доменов A3 и В3 человеческого СЕАСАМ5 (СЕА) и доменов N и А2 человеческого CEACAM1 (BGP1), аналогичную описанной для NABA (Durbin Н. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(10), 10 мая 1994, сс. 4313-4317). Антиген обозначали как NA3B3A2 и его схематическое изображение представлено на фиг. 41.
В табл. 92 представлены нуклеотидная и аминокислотная последовательности huNA3B3A2-avi-His.
Таблица 92. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности huNA3B3A2-avi-His
SEQ ID NO: Антиген Последовательность
351 нуклеотидная последовательность huNA3B3A2-avi His CAGCTGACCACCGAGTCCATGCCCTTCAACGTGGCCGA GGGCAAAGAGGTGCTGCTGCTGGTCCACAACCTGCCCC AGCAGCTGTTCGGCTACAGCTGGTACAAGGGCGAGCGG GTGGACGGCAACCGGCAGATCGTGGGCTACGCCATCGG CACCCAGCAGGCCACACCCGGCCCTGCCAATAGCGGCA GAGAGACAATCTACCCCAACGCCAGCCTGCTGATCCAG AACGTGACCCAGAACGACACCGGCTTCTACACACTCCA AGTCATCAAGAGCGACCTGGTCAACGAGGAAGCCACCG GCCAGTTCCACGTGTACCCCGAGCTGCCCAAGCCCAGC ATCAGCAGCAACAACAGCAAGCCCGTGGAAGATAAGGA CGCCGTGGCCTTTACCTGCGAGCCCGAGGCCCAGAACA CCACCTACCTGTGGTGGGTCAACGGCCAGAGCCTGCCC GTGTCCCCCAGACTCCAGCTGAGCAACGGCAACAGAAC CCTGACCCTGTTCAACGTGACCCGGAATGACGCCAGAG CCTACGTGTGCGGCATCCAGAACAGCGTGTCCGCCAAC CGCAGCGACCCCGTGACCCTGGATGTGCTGTACGGCCC CGACACCCCCATCATCAGCCCCCCTGACAGCAGCTACCT GAGCGGCGCCAACCTGAACCTGAGCTGCCACAGCGCCA GCAACCCCAGCCCTCAGTACAGCTGGCGGATCAACGGC ATCCCCCAGCAGCACACCCAGGTGCTGTTTATCGCCAAG ATCACCCCCAACAACAACGGCACCTACGCCTGCTTCGTG TCCAACCTGGCCACCGGCCGGAACAACAGCATCGTGAA GTCCATCACCGTGTCCGCCTCCCTGAGCCCCGTGGTGGC CAAGCCTCAGATCAAGGCCAGCAAGACCACCGTGACCG GCGACAAGGACAGCGTGAACCTGACCTGCTCCACCAAC GATACCGGCATCAGCATCCGGTGGTTCTTCAAGAATCA GTCCCTGCCCAGCAGCGAGCGGATGAAGCTGAGCCAGG
- 248 037557
GCAACATCACCCTGTCCATCAACCCCGTGAAAAGAGAG GACGCCGGCACCTATTGGTGCGAGGTGTTCAACCCCATC AGCAAGAACCAGAGCGACCCCATCATGCTGAACGTGAA CTACAACGCCCTGCCCCAAGAAAACCTGATCAATGTTG ATCTGGAAGTGCTGTTCCAGGGCCCAGGCAGCGGCCTG AACGACATCTTCGAAGCCCAGAAAATCGAGTGGCACGA GGCCAGAGCCCACCACCACCATCACCAC
352 человеческий NA3B3A2avi-His QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERV DGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQ NDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSK PVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLS NGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVL YGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGI PQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSIT VSASLSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISI RWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSINPVKREDAGTYWCE VFNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDLEVLFQGPGS GLNDIFEAQKIEWHEARAHHHHHH
Получение белков осуществляли согласно методу, описанному выше для получения слитого с Fc белка (пример 7.1.1). Секретируемые белки очищали из супернатантов клеточных культур с помощью хелатирующей хроматографии с последующей гель-фильтрацией. Первую хроматографическую стадию осуществляли с использованием картриджа NiNTA Superflow (5 мл, фирма Qiagen), уравновешенного в буфере, содержащем 20 мМ фосфат натрия, 500 нМ хлорид натрия, рН 7,4. Элюцию осуществляли, применяя в объеме, кратном более 12 об. колонки, градиент от 5 до 45% буфера для элюции (20 мМ фосфат натрия, 500 нМ хлорид натрия, 500 мМ имидазол, рН 7,4).
Белок концентрировали и фильтровали перед внесением в колонку HiLoad Супердекс 75 (фирма GE Healthcare), уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl, 0,01% Твин-20, рН 6,0. В табл. 93 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономера белка человеческого NA3B3A2-avi-His.
Таблица 93. Биохимический анализ человеческого NA3B3A2-avi-His
Конструкция Мономер [%] (SEC) Выход [мг/л]
человеческий NA3B3A2-avi-His 88 14,1
Способность одновременно связываться с конструкцией человеческий 4-1BB-Fc (kih) и человеческим NA3B3A2 оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Все эксперименты на основе SPR осуществляли с помощью устройства Biacore T100 при 25°С с использованием HBS-EP в качестве подвижного буфера (0,01М HEPES, рН 7,4, 0,15M NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% сурфактанта Р20, фирма Biacore, Фрейбург/Германия). Биотинилированную конструкцию человеческий 4-1BB-Fc(kih) непосредственно связывали с проточной ячейкой стрептивидинового (SA) сенсорного чипа. Применяли уровни иммобилизации, соответствующие вплоть до 250 RU (резонансные единицы).
Нацеленные на СЕА содержащие тримерный разделенный 4-1BBL конструкции (конструкции 5.4, 5.6, 5.7 и 5.8) пропускали в концентрации 200 нМ со скоростью потока 30 мкл/мин через проточные ячейки в течение 90 с и время фазы диссоциации устанавливали на 0 с. Человеческий NA3B3A2 пропускали в качестве второго аналита со скоростью потока 30 мкл/мин через проточные ячейки в течение 90 с в концентрации 500 нМ (фиг. 41Б). Мониторинг фазы диссоциации осуществляли в течение 120 с. Различия всех показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в проточной референс-ячейке, в которой не иммобилизовали белок.
Как продемонстрировано на графиках на фиг. 42, все биспецифические конструкции обладали способностью одновременно связываться с человеческим 4-1ВВ и человеческим NA3B3A2.
12.2. Связывание нацеленных на СЕА содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающих молекул на активированных человеческих РМВС.
Для определения связывания содержащих тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул с человеческими РВМС применяли в различных полученных титрованием концентрациях нацеленные на СЕА содержащие тримерный 4-1BBL в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы в анализе, описанном в примере 5.2.
На фиг. 43 представлены данные о связывании конструкций 5.4, 5.6, 5.7 и 5.8, полученных согласно методу, описанному в примере 11, на активированных 4-1ВВ-экспрессирующих CD4+-Т-клетках и CD8+Т-клетках соответственно. Дискриминационные окна устанавливали на живые CD45+CD3+CD4+- или CD45+CD3+CD8+-Т-клетки и строили график зависимости MFI для конъюгированного с PE F(ab')2фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического AffiniPure от полученных титрованием концентраций нацеленных содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc вариантов. В табл. 94 представлены полученные величины ЕС50, определенные для конструкций 5.4, 5.6, 5.7 и 5.8 и контрольных молекул.
- 249 037557
Таблица 94. Связывание на активированных экспрессирующих
4-1ВВ CD4+-Т-клетках и CD8+-Т-клетках
Конструкция ЕС50 [нМ] 4-lBB+CD8+ ЕС50 [нМ] 4-lBB+CD4+
контроль Б 0,05 0,26
контроль В 0,02 0,30
контроль Г 0,04 0,28
контроль Д 0,13 1,22
5.4 0,13 0,35
5.6 0,06 0,34
5.7 0,0004 0,36
5.8 0,17 0,38
12.2. Связывание с экспрессирующими СЕА опухолевыми клетками.
Для анализов связывания на экспрессирующих СЕА опухолевых клетках применяли следующие линии экспрессирующих человеческий СЕА клеток лимфомы: экспрессирующие СЕА опухолевые клетки человеческого рака желудка линии MKN-45 (АТСС ТСР-1008) и клетки человеческой колоректальной аденокарциномы линии LS180 (АТСС CL-187). Анализы осуществляли согласно методу, описанному в примере 5.3 для экспрессирующих FAP опухолевых клеток линий MV-3 и WM-266-4.
Дискриминационные окна устанавливали на живые опухолевые клетки и строили график зависимости MFI для конъюгированного с РЕ F(ab')2-фрагмента козьего IgG против человеческого IgG, Fcyспецифического AffiniPure от полученных титрованием концентраций нацеленных содержащих разделенный тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc конструкций.
На фиг. 44 представлены данные о связывании конструкции 5.7, полученной согласно методу, описанному в примере 11.2.7, с экспрессирующими человеческий СЕА клетками человеческого рака желудка линии MKN-45 (слева) и клетками человеческой колоректальной аденокарциномы линии LS180 (справа). В табл. 95 представлены полученные величины ЕС50, определенные для экспрессирующих человеческий СЕА клеток человеческого рака желудка линии MKN-45.
Таблица 95. Связывание с экспрессирующими СЕА опухолевыми клетками
Конструкция ЕС50 [нМ] MKN45-8 ЕС50 [нМ] LS180
5.7 11,6 14,4
Пример 13.
Биологическая активность нацеленных на СЕА содержащих тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
13.1. Активация NF-кВ В клетках HeLa, экспрессирующих человеческий 4-1ВВ.
Клетки HeLa, экспрессирующие человеческий 4-1ВВ и NF-кВ-люциферазу, создавали согласно методу, описанному в примере 6.1.
Активация NF-кВ в клетках Hela, экспрессирующих человеческий 4-1ВВ, при совместном культивировании с экспрессирующими СЕА опухолевыми клетками.
Клетки HeLa, экспресссирующие NF-кВ-люциферазу и человеческий 4-1ВВ, собирали и ресуспендировали в среде DMEM, дополненной 10 об.% FBS и 1 об.% GlutaMAX-I, до концентрации 0,2x106 клеток/мл. 100 мкл (2x104 клеток) указанной клеточной суспензии переносили в каждую лунку стерильного белого плоскодонного 96-луночного планшета для культуры ткани с крышкой (фирма Greiner bio-one, каталожный № 655083) и планшет инкубировали при 37°С и 5% СО2 в течение ночи. На следующий день добавляли 50 мкл среды, содержащей в полученных титрованием концентрациях нацеленные на СЕА содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы (СЕА разделенный тример 4-1BBL) или ненацеленные (DP47) содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы (DP47 разделенный тример 4-1BBL). Экспрессирующие СЕА опухолевые клетки человеческого рака желудка линии MKN-45 (АТСС ТСР-1008) ресуспендировали в среде DMEM, дополненной 10 об.% FBS и 1 об.% GlutaMAX-I, до концентрации 2x106 клеток/мл.
Суспензию экспрессирующих СЕА клеток В-клеточной лимфомы (50 мкл, конечное соотношение 1:5) или только среду добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали в течение 6 ч при 37°С и 5% СО2. Клетки промывали два раза 200 мкл/лунку D-ЗФР. Добавляли в каждую лунку 40 мкл свежеприготовленного репортерного буфера для лизиса (фирма Promega, каталожный № Е3971) и планшет выдерживали в течение ночи при -20°С. На следующий день планшеты с замороженными клетками и идентифицирующий буфер (система для анализа люциферазы 1000, фирма Promega, каталожный № Е4550) подвергали оттаиванию при комнатной температуре. Добавляли 100 мкл идентифицирующего буфера в каждую лунку и максимально быстро измеряли люциферазную активность с использованием ридера для микропланшетов SpectraMax M5/M5e и программы SoftMax Pro (фирма Molecular Devices), подсчитывая испускание света в URL (единицы испускаемого света в течение 0,5 с/лунку), или планшет-ридера для считывания нескольких меток Victor3 1420 (фирма Perkin Elmer) и программы Perkin Elmer 2030
- 250 037557
Manager, определяя испускание света в виде импульсов в секунду (CPS), и строили график зависимости от концентрации тестируемых конструкций.
Нацеленные на СЕА содержащие тримерный лиганд для 4-1ВВ в слиянии с Fc антигенсвязывающие молекулы (конструкции 5.7 и 5.8) инициировали активацию пути передачи сигналов NFkB в репортерной клеточной линии в присутствии клеток человеческого рака желудка линии MKN-45. В противоположность этому, ненацеленные контрольные молекулы не инициировали такое же действие при применении в любых тестируемых концентрациях (фиг. 45). В табл. 96 представлены соответствующие величины EC50.
Таблица 96. Связывание с экспрессирующими СЕА опухолевыми клетками
Конструкция ЕС50 [нМ] Без опухолевых клеток MKN-45 ЕС50 [нМ] MKN45
5.4 3,1 0,34
5.6 2,05 0,21
5.7 0,85 0,05
5.8 1,52 0,45
Пример 14.
14.1. Получение нацеленных на FAP содержащих тримерный лиганд для ОХ40 в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
Последовательность ДНК, кодирующую часть эктодомена (аминокислоты 51-183) человеческого лиганда для ОХ40 синтезировали в соответствии с последовательностью Р23510 из базы данных Uniprot. Для снижения гетерогенности человеческого лиганда для ОХ40, обусловленной гликозилированием, остатки аспарагина в положениях 90 и 114 заменяли посредством мутации на аспарагиновую кислоту с помощью сайтнаправленного мутагенеза (согласно Compaan D.M., Hymowitz S.G., Structure 14(8), 2006, сс. 1321-1330).
Полипептид, содержащий два эктодомена лиганда ОХ40, разделенные (G4S)2-линкерами и слитые с человеческим IgG1-CL-доменом, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 46А: человеческий лиганд для ОХ40, (G4S)2-коннектор, человеческий лиганд для ОХ40, (G4S)2-коннектор, человеческий CL.
Полипептид, содержащий один эктодомен лиганда для ОХ40 и слитый с человеческим IgG1-CHдоменом, клонировали согласно схеме, представленной на фиг. 46Б: человеческий лиганд для ОХ40, (G4S)2-коннектор, человеческий CH.
Для улучшения правильного спаривания интродуцировали указанные ниже мутации в скрещенные CH-CL. В димерный лиганд для ОХ40, слитый с человеческим CL, - мутации E123R и Q124K. В мономерный лиганд для ОХ40, слитый с человеческим CH1, - мутации К147Е и К213Е.
Создание и получение FAP-связывающих агентов описано в WO 2012/020006 А2, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающего агента, специфического для FAP, клон 28Н11, субклонировали в рамке считывания либо с константной тяжелой цепью с впадиной, либо с константной легкой цепью человеческого IgG1. Интродуцировали мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala в константную область тяжелых цепей с выступом и впадиной для элиминации связывания с Fc-гамма-рецепторами согласно методу, описанному в WO 2012/130831.
Комбинация: димерный лиганд-Fc-цепь с выступом, содержащая мутации S354C/T366W, мономерное CH1-слияние, нацеленный анти- FAP-Fc-цепь с впадиной, содержащая мутации Y349C/T366S/ L368A/Y407V, и легкая цепь анти- FAP, позволяла создавать гетеродимер, который включал собранный тримерный лиганд для ОХ40 и FAP-связывающий Fab (фиг. 46В, конструкция 6.1).
В табл. 97 представлены кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на FAP (28H1) содержащей разделенный тримерный лиганд для ОХ40 (51-183) в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы со скрещенными CH-CL и заряженными остатками (конструкция 6.1).
- 251 037557
Таблица 97. кДНК и аминокислотные последовательности одновалентной нацеленной на
AP (28H1) содержащей разделенный тримерный лиганд для ОХ40 в слиянии с Fc (kih) молекулы с CH-CL-кроссовером с заряженными остатками (конструкция 6.1)
SEQ ID NO: Описание Последовательность
353 нуклеотидная последовательность конструкции димерный hu OX40L (51-183) - CL*-Fcцепь с «выступом» CAGGTGTCCCACAGATACCCCAGAATCCAGAGCATCAAG GTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTCATC CTGACCAGCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAG GACAACAGCGTGATCATCAACTGCGACGGCTTCTACCTGA TCAGCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGGACATCA GCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCT GAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACAGCCTGATGGTGGCCAG CCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACC GACAACACCAGCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGC GAGCTGATCCTGATTCACCAGAACCCCGGCGAGTTCTGCG TGCTGGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGATCTCAGG TGTCACACCGCTACCCCCGGATTCAGTCCATTAAGGTGCA GTTTACAGAGTATAAGAAAGAAAAAGGCTTTATTCTGACT TCCCAGAAAGAAGATGAGATTATGAAGGTGCAGGATAAT TCTGTGATCATCAATTGTGACGGCTTCTACCTGATCAGCCT GAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGGACATCAGCCTGCA CTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAA AGTGCGGAGCGTGAACAGCCTGATGGTGGCCAGCCTGAC CTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAA CACCAGCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCT GATCCTGATCCACCAGAACCCTGGCGAGTTCTGCGTGCTG GGAGGCGGAGGCTCCGGAGGGGGAGGATCTCGTACGGTG GCTGCACCATCTGTCTTTATCTTCCCACCCAGCGACCGGA AGCTGAAGTCTGGCACAGCCAGCGTCGTGTGCCTGCTGAA TAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG GACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTG ACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCAC AAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTA GCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGACA
- 252 037557
AGACCCACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAAGCTGC TGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAG GACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCG TGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTT CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAA GACCAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCC CTCGGCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT GCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGAC CACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGG GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCA CAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT ААА
354 нуклеотидная последовательность конструкции мономерный hu OX40L (51-183) - СН1* CAGGTGTCCCACAGATACCCCAGAATCCAGAGCATCAAG GTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTCATC CTGACCAGCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAG GACAACAGCGTGATCATCAACTGCGACGGCTTCTACCTGA TCAGCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGGACATCA GCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCT GAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACAGCCTGATGGTGGCCAG CCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACC GACAACACCAGCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGC GAGCTGATCCTGATTCACCAGAACCCCGGCGAGTTCTGCG TGCTGGGAGGCGGAGGTTCCGGAGGCGGAGGATCTGCTA GCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAG CAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCT GGTGGAAGATTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGG AATTCTGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAG CCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGT CGTGACAGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTAC ATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG GACGAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGC
68 нуклеотидная последовательность антиFAP (28Н1), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 2
69 нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-FAP (28Н1) См. таблицу 2
355 димерный hu OX40L (51183) - СЬ*-Рс-цепь с «выступом» QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQDNS VIINCDGFYLISLKGYFSQEVDISLHYQKDEEPLFQLKKVRSV NSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQN PGEFCVLGGGGSGGGGSQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGF ILTSQKEDEIMKVQDNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVDISLH YQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNT SLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGGGSGGGGSRTVAAPS VFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP
KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
356 мономерный hu OX40L (51-183) - СН1* QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQDNS VIINCDGFYLISLKGYFSQEVDISLHYQKDEEPLFQLKKVRSV NSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQN PGEFCVLGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSC
18 анти-FAP (28Н1), Fc-цепь с «впадиной» См. таблицу 2
19 легкая цепь анти- FAP (28Н1) См. таблицу 2
- 253 037557 * обозначает заряженные остатки.
14.2. Получение ненацеленного человеческого IgGl в качестве контроля Е.
Контрольная молекула, применяемая в этих анализах, обозначенная как контроль Е (фиг. 46Г), представляла собой ненацеленную молекулу (DP47, контроль зародышевой линии) человеческого IgG1, содержащую мутации Pro329Gly, Leu234Ala и Leu235Ala для элиминации связывания с Fc-γрецепторами согласно методу, описанному в публикации Международной заявки на патент WO 2012/130831. Ее получение описано в пример 2.3, в табл. 29 представлены кДНК и аминокислотные последовательности ненацеленного (DP47) huIgG1 PGLALA (контроль Е).
14.3. Получение нацеленных на FAP содержащих разделенный тримерный лиганд для ОХ40 в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул и соответствующих контрольных молекул.
Кодирующие последовательности нацеленных и ненацеленных содержащих разделенный тримерный лиганд для ОХ40 в слиянии с Fc (kih) молекул клонировали в плазмидном векторе, в котором экспрессия вставки контролируется промотором MPSV и который содержит синтетическую полиАпоследовательность, локализованную на 3'-конце CDS. Кроме того, вектор содержал последовательность OriP EBV для поддержания эписомальной формы плазмиды.
Содержащую разделенный тримерный лиганд для ОХ40 в слиянии с Fc(kih) молекулу получали путем совместной трансфекции клеток HEK293-EBNA экспрессионными векторами для клеток млекопитающих с использованием полиэтиленимина. Клетки трансфектировали соответствующими экспрессионными векторами. Для вариантов 1, 2, 4, 5 и соответствующих контролей Б, Г и Д применяли соотношение 1:1:1:1 (вектор для конструкции димерный лиганд-CL-цепь с выступом:вектор для слияния мономерный лиганд-СН1:вектор для анти-FAP-Fab с цепью с впадиной:вектор для легкой цепи анти-FAP). Для вариантов 3, 6 и соответствующих контроля В применяли соотношение 1:1:1 (вектор для цепи huIgG1 Fc с впадиной-димерный лиганд:вектор для цепи hulgGI Fc с выступом-мономерный лиганд:вектор для легкой цепи анти-FAP). Человеческие IgG, применяемые в качестве контролей в этом анализе, получали методом, который применяли для биспецифической конструкции (для трансфекции применяли только вектор для легкой цепи и вектор для тяжелой цепи в соотношении 1:1).
Для производства в 500-миллилитровые встряхиваемые колбы засевали 300 млн клеток HEK293 EBNA за 24 ч до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 10 мин при 210xg и супернатант заменяли 20 мл предварительно нагретой среды CD CHO. Экспрессионные векторы (200 мкг общей ДНК) смешивали в 20 мл среды CD CHO. После добавления 540 мкл ПЭИ раствор интенсивно перемешивали в течение 15 с и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/ПЭИ, переносили в 500-миллилитровую встряхиваемую колбу и инкубировали в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО2. После инкубации добавляли 160 мл среды Excell, дополненной 6мМ L-глутамином, 5 г/л соевого пептида (PEPSOY) и 1,2 мМ вальпроевой кислотой, и клетки культивировали в течение 24 ч. Через 1 день после трансфекции добавляли 12% Feed (аминокислота и глюкоза). После культивирования в течение 7 дней супернатант собирали центрифугированием в течение 30-40 мин по меньшей мере при 400xg. Раствор стерилизовали фильтрацией (0,22 мкмфильтр), дополняли азидом натрия до конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и выдерживали при 4°С.
Содержащую разделенный тримерный лиганд для ОХ-40 в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающую молекулу, а также IgG, очищали из супернатантов клеточных культур с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А с последующей гель-фильтрацией. Для осуществления аффинной хроматографии супернатант вносили в колонку MabSelect Sure (CV = 5-15 мл, смола фирмы GE Healthcare), уравновешенную буфером, содержащим фосфат натрия (20 мМ), цитрат натрия (20 мМ) (рН 7,5). Несвязанный белок удаляли путем промывки таким же буфером, используя его в объеме, кратном по меньшей 6 об. колонки. Связанный белок элюировали, используя или линейный градиент (20 CV), или ступенчатую элюцию (8 CV), буфером, содержащим 20 мМ цитрат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин (рН 3,0). При осуществлении элюции с использованием линейного градиента осуществляли дополнительную ступенчатую элюцию с применением объема, кратного 4 об. колонки.
Значение рН собранных фракций регулировали, добавляя 1/10 (об./об.) 0,5М фосфата натрия, рН 8,0. Белок концентрировали перед внесением в колонку HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную раствором, содержащим 20 мМ гистидин, 140 мМ хлорид натрия, 0,01 об.% Твин20, рН 6,0.
Концентрацию белка определяли путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу нацеленной содержащей тримерный лиганд для ОХ40 в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы анализировали с помощью ДСН-ПААГ в присутствии восстановителя (5 мМ 1,4-дитиотреитол) и без него и осуществляли окрашивание кумасси SimpleBlue™ SafeStain, (фирма Invitrogen, США), или анализировали с помощью КЭ-ДСН, используя устройство LabChipGXII (фирма (Perkin Elmer). Содержание агрегатов в образцах антител анализировали с помощью колонки для аналитической гель-фильтрации TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh), уравновешенной подвижным буфером, содержащим 25 мМ K2HPO4, 125 мМ NaCl, 200 мМ моногидрохлорид L-аргинина, 0,02% (мас./об.) NaN3, рН 6,7, при 25°С.
- 254 037557
В табл. 98 обобщены данные о выходе и конечном содержании мономеров нацеленной на FAP содержащей разделенный тримерный лиганд для ОХ40 в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающей молекулы и человеческого IgG1 PGLALA зародышевой линии DP47 (контроль Е).
Таблица 98. Результаты биохимического анализа нацеленных на FAP содержащих разделенный тримерный лиганд для ОХ40 в слиянии с Fc (kih) молекул
Конструкция Мономер [%] (SEC) Выход [мг/л]
одновалентная нацеленная на FAP (28Н1) содержащая разделенный тримерный лиганд для 0x40 в слиянии с Fc молекула с CH-CLкроссовером с заряженными остатками (конструкция 6.1) 93,8 19,7
человеческий IgGl PGLALA зародышевой линии DP47 100 50
Пример 15.
Функциональная характеризация нацеленных содержащих тримерный лиганд для ОХ40 в слиянии с Fc антигенсвязывающих молекул.
15.1. Связывание с экспрессирующими человеческий FAP опухолевыми клетками.
Связывание с находящимся на клеточной поверхности FAP тестировали, используя клетки WM266-4 (ATCC CRL-1676). 0,5x105 клеток WM-266-4 добавляли в каждую лунку круглодонных 96луночных планшетов для суспензионных клеток (фирма Greiner bio-one, Cellstar, каталожный № 650185). Клетки окрашивали в течение 120 мин при 4°С в темноте в 50 мкл/лунку холодного (4°С) FACS-буфера (D-ЗФР (фирма Gibco by Life Technologies, каталожный № 14190 326) с БСА (0,1 об.%, фирма SigmaAldrich, каталожный № А9418), содержащего в полученных титрованием количествах конструкцию антитела к Ох40. После трех промывок избыточным количеством FACS-буфера клетки окрашивали в течение 45 мин при 4°С в темноте в 25 мкл/лунку холодного (4°С) FACS-буфера, содержащего конъюгированный с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) F(ab')2-фрагмент козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфический AffiniPure (фирма Jackson ImmunoResearch, каталожный № 109 096 098).
И, наконец, содержимое планшетов ресуспендировали, используя по 90 мкл/лунку FACS-буфера, содержащего 0,2 мкг/мл DAPI (фирма Santa Cruz Biotec, каталожный № Sc-3598) и данные получали в этот же день с использованием проточного цитометра с 5 лазерами LSR-Fortessa (фирма BD Bioscience, с программой DIVA).
Как продемонстрировано на фиг. 47А, одновалентная нацеленная на FAP (28Н1) содержащая разделенный тримерный лиганд для Ох40 в слиянии с Fc (kih) антигенсвязывающая молекула (FAP-OX40L), в отличие от отрицательного контроля Е, эффективно связывалась с экспрессирующими человеческий FAP клетками-мишенями. Величина ЕС50, характеризующая связывание с FAP-позитивными WM-266-4клетками, составляла 6,9 нМ.
15.2. Связывание с ОХ40- и FAP-негативными опухолевыми клетками.
Отсутствие связывания с ОХ40-негативными FAP-негативными опухолевыми клетками тестировали с использованием клеток А549 NucLight™ Red (фирма Essenbioscience, каталожный № 4491), экспрессирующих флуоресцентный белок NucLight Red, окрашивание которым ограничено ядрами, что позволяет осуществлять разделение с немечеными позитивными по человеческому FAP клетками WM266-4. Родительские клетки А549 (АТСС CCL-185) трансдуцировали лентивирусом Essen CellPlayer NucLight Red (фирма Essenbioscience, каталожный № 4476; EF1a, пуромицин) при MOI 3 (ТЕ/клетку) в присутствии 8 мкг/мл полибрена, следуя стандартному протоколу Essen.
Смесь 5x104 немеченых клеток WM266-4 и немеченых клеток А549 NucLight™ Red в FACS-буфере добавляли в каждую лунку круглодонных 96-луночных планшетов для суспензионных клеток и анализ связывания осуществляли согласно методу, описанному в разделе 15.1.
Как продемонстрировано на фиг. 47Б, конструкция FAP-OX40L не связывалась с ОХ40-негативными FAP-негативными человеческими опухолевыми клетками.
15.3. Связывание с экспрессирующими человеческий ОХ40 клетками: наивные и активированные человеческие мононуклеарные лейкоциты периферической крови (РВМС).
Лейкоцитарные пленки получали из центра донорской крови Цюриха. Для выделения свежих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) лейкоцитарные пленки разводили таким же объемом D-ЗФР (фирма Gibco by Life Technologies, каталожный № 14190 326). В 50-миллилитровые полипропиленовые пробирки (фирма ТРР, каталожный № 91050) вносили 15 мл Histopaque 1077 (фирма SIGMA Life Science, каталожный № 10771, полисахароза (фиколл) и диатризоат натрия, плотность доведена до 1,077 г/мл) и наслаивали раствор разведенной лейкоцитарной пленки на Histopaque 1077. Пробирки центрифугировали в течение 30 мин при 400 xg при комнатной температуре с небольшим ускорением без перерыва. Затем РВМС собирали из интерфазы, промывали трижды D-ЗФР и ресуспендировали в среде для Т-клеток, состоящей из среды RPMI 1640 (фирма Gibco by Life Technology, каталожный № 42401042), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, фирма Gibco by Life Technology, каталожный № 16000-044, партия 941273, обработана γ-лучами, свободная от микоплазм и инактивированная тепловой обработкой при 56°С в течение 35 мин), 1 об.% GlutaMAX-I (фирма GIBCO by Life Technologies, ка- 255 037557 таложный № 35050 038), 1 мМ пируватом натрия (фирма SIGMA, каталожный № S8636), 1 об.% содержащей заменимые аминокислоты среды MEM (фирма SIGMA, каталожный № М7145) и 50 мкМ βмеркаптоэтанолом (фирма SIGMA, М3148).
РВМС использовали непосредственно после выделения (связывание на покоящихся человеческих РВМС) или их стимулировали для индукции сильной экспрессии человеческого ОХ40 на клеточной поверхности Т-клеток (связывание с активированным РВМС). Для этого наивные РВМС культивировали в течение 4 дней в среде для Т-клеток, дополненной 200 ед./мл пролейкина (фирма Novartis) и 2 мкг/мл PHA-L (фирма SIGMA, L2769), в 6-луночном планшете для культуры ткани и затем в течение ночи в 6луночных планшетах для культуры ткани, предварительно сенсибилизированных (10 мкг/мл) антителом к человеческому CD3 (клон OKT3, фирма BioLegend, каталожный № 317315) и (2 мкг/мл) антителом к человеческому CD28 (клон CD28.2, фирма BioLegend, каталожный № 302928), в среде для Т-клеток, дополненной 200 ед./мл пролейкина, при 37°С и 5% СО2.
Для обнаружения ОХ40 смешивали наивные человеческие РВМС и активированные человеческие РВМС. Для получения возможности отличать наивные РВМС от активированных человеческих РВМС наивные клетки метили перед анализом связывания с помощью красителя для анализа пролиферации клеток eFluor670 (фирма eBioscience, каталожный № 65-0840-85).
Для мечения клетки собирали, промывали предварительно нагретым (37°С) D-ЗФР и плотность клеток доводили до 1x107 клеток/мл в D-ЗФР. Добавляли краситель для оценки пролиферации клеток eFluor670 (фирма eBioscience, каталожный № 65-0840-85) к суспензии наивных человеческих РВМС в конечной концентрации 2,5 мМ и конечной плотности клеток 0,5x107 клеток/мл в D-ЗФР. Затем клетки инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте. Для прекращения реакции мечения добавляли 4 мл инактивированной тепловой обработкой FBS и клетки промывали три раза средой для Т-клеток. Затем в каждую лунку круглодонных 96-луночных планшетов для суспензионных клеток (фирма Greiner bio-one, cellstar, каталожный № 650185) добавляли в соотношении 2:1 1x105 смесь покоящихся меченных eFluor670 человеческих РВМС и 0,5x105 немеченых активированных человеческих РВМС.
Клетки окрашивали в течение 120 мин при 4°С в темноте в 50 мкл/лунку холодного (4°С) FACSбуфера, содержащего в полученных титрованием количествах конструкции антител к ОХ40. После трех промывок избыточным количеством FACS-буфера клетки окрашивали в течение 45 мин при 4°С в темноте, используя 25 мкл/лунку холодного (4°С) FACS-буфера, содержащего смесь флуоресцентно меченого антитела к человеческому CD4 (клон RPA-T4, IgG1k мыши, фирма BioLegend, каталожный № 300532), антитела к человеческому CD8 (клон RPa-T8, IgG1k мыши, фирма BioLegend, каталожный № 3010441) и конъюгированного с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) F(ab')2-фрагменmа козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфического AffiniPure (фирма Jackson ImmunoResearch, каталожный № 109 096 098).
И, наконец, содержимое планшетов ресуспендировали, используя по 90 мкл/лунку FACS-буфера, содержащего 0,2 мкг/мл DAPI (фирма Santa Cruz Biotec, каталожный № Sc-3598) и данные получали в этот же день с использованием проточного цитометра с 5 лазерами LSR-Fortessa (фирма BD Bioscience, с программой DIVA).
Как продемонстрировано на фиг. 48А и 48Б, конструкция FAP-OX40L не связывалась с покоящимися человеческими CD4+-Т-клетками или CD8+-Т-клеткaми, негативными по ОХ40. В противоположность этому, конструкция FAP-OX40L связывалась с активированными CD8+- или CD4+-Т-клеткaми, которые экспрессировали ОХ40. Связывание с CD4+-Т-клетками оказалось существенно более сильным по сравнению с CD8+-Т-клетками. Активированные человеческие CD8+-Т-клетки могли экспрессировать только часть от уровней ОХ40, обнаруженных на активированных CD4+-Т-клетках. Уровни экспрессии ОХ40 зависели от кинетических особенностей и силы стимуляции и при создании изобретения условия оптимизировали для экспрессии ОХ40 на CD4+-Т-клеткαх, но не на CD8+-Т-клетках. Таким образом, на CD8-T-клетках индуцировалась лишь незначительная экспрессия ОХ40. Величина ЕС50, характеризующая связывание с ОХ40-позитивными CD4+- или CD8+-Т-клеткαми, составляла 0,15 нМ.
15.4. Активация NFkB в HeLa-клетках, экспрессирующих человеческий ОХ40 и репортерный ген NFкВ -люциферазы.
Агонистическое связывание Ох40 с его лигандом индуцирует передачу сигналов в прямом направлении посредством активации ядерного фактора каппа В (NFkB) (A.D. Weinberg и др., J. Leukoc. Biol. 75(6), 2004, cc. 962-972). Рекомбинантную репортерную линию клеток HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 создавали для экспрессии человеческого Ох40 на их поверхности. Она несла также репортерную плазмиду, содержащую ген люциферазы под контролем чувствительного к NFkB энхансерного сегмента. Стимуляция Ох40 индуцирует зависящую от дозы активацию NFkB, который транслоцируется в ядро, в котором он связывается с чувствительным к NFkB энхансером репортерной плазмиды, повышая экспрессию белка люциферазы. Люцифераза катализирует окисление люциферина, что приводит к образованию оксилюциферина, испускающего свет. Это можно оценивать количественно с помощью люминометра. Таким образом, анализировали способность различных анти-Ох40 молекул индуцировать активацию NFkB в репортерных клетках HeLa_hOx40_NFKB_Luc1 в качестве меры биологической активности.
- 256 037557
Прикрепленные клетки HeLa_hOx40_NFKB_Luc1 собирали, используя буфер для диссоциации клеток (фирма Invitrogen, каталожный № 13151-014), в течение 10 мин при 37°С. Клетки однократно промывали D-ЗФР и плотность клеток доводили до 1,33x105 в среде для анализа, содержащей MEM (фирма Invitrogen, каталожный № 22561-021), 10 об.% инактивированной тепловой обработкой FBS, 1 мМ пируват натрия и 1 об.% заменимых аминокислот. Клетки высевали с плотностью 0,2x105 клеток на лунку в стерильный белый плоскодонный 96-луночный планшет для культуры ткани с крышкой (фирма Greiner bio-one, каталожный № 655083) и выдерживали в течение ночи при 37°С в инкубаторе (Hera Cell 150) в атмосфере с 5% СО2.
На следующий день HeLa_hOx40_NFKB_Luc1 стимулировали в течение 5 ч, добавляя среду для анализа, содержащую в полученных титрованием количествах FAP-Ox40L или отрицательный контроль Е. Для тестирования воздействия перекрестной гипер-сшивки антител к Ох40 добавляли 25 мкл/лунку среды, содержащей в качестве вторичного антитела F(ab')2-фрагмент козьего IgG против человеческого IgG, FcY-специфический (фирма Jackson ImmunoResearch, каталожный № 109 096 098) в соотношении 1:2 (2-кратное превышение количества вторичного антитела относительно первичного антитела). После инкубации супернатант аспирировали и планшеты промывали два раза D-ЗФР. Количественное определение испускания света осуществляли с использованием системы для анализа люциферазы 100 и репортерного лизирующего буфера (оба фирмы Promega, каталожный № Е4550 и каталожный № Е3971) согласно инструкциям производителя. В целом, метод состоял в следующем: клетки лизировали в течение 10 мин при -20°С путем добавления 30 мкл на лунку 1-кратного лизирующего буфера. Клетки подвергали оттаиванию в течение 20 мин при 37°С, после чего добавляли 90 мкл на лунку реагента для анализа люциферазы. Испускание света немедленно оценивали количественно с помощью ридера для микропланшетов SpectraMax M5/M5e (фирма Molecular Devices, США), используя продолжительность интегрирования 500 мс, без какого-либо фильтра для учета всех длин волн. Относительные единицы испускаемого света (URL) корректировали с учетом исходной люминесценции клеток HeLa_hOx40_NFKB_Luc1 и строили график зависимости от логарифма концентрации первичного антитела, используя программу Prism4 (фирма GraphPad Software, США). Кривые аппроксимировали на основе заложенного в программу сигмоидального дозового ответа.
На фиг. 49 представлены данные, демонстрирующие, что ограниченная зависящая от дозы NFKBактивация индуцировалась уже при добавлении FAP-Ox40L (левый график) к репортерной линии клеток. Перекрестная гипер-сшивка FAP-Ox40L с помощью античеловеческих IgG-специфических вторичных антител повышала индукцию опосредуемой NFKB активации люциферазы в зависимости от концентрации (правый график).
Далее при создании изобретения тестировали способность FAP-Ox40L активировать NFKB на основе перекрестной гипер-сшивки конструкций при использовании линий FAP-клеток опухоли.
Тестируемая линия опухолевых клеток представляла собой линию NIH/3T3-huFAP, клон 39. NIH/3T3-huFAP, клон 39 создавали путем трансфекции линии клеток фибробластов мышиных эмбрионов NIH/3T3 (АТСС CRL-1658) экспрессионным вектором pETR4921 для экспрессии huFAP при селекции пуромицином в концентрации 1,5 мкг/мл. Экспрессию FAP на поверхности количественно оценивали с помощью набора Quifikit (фирма Dako, каталожный № K0078) согласно инструкциям производителя. Первичное антитело, применяемое для определения экспрессии FAP на клеточной поверхности, представляло собой перекрестно реактивный человеческий/мышиный клон F11-24 (мышиный IgG1, фирма Calbiochem, каталожный № ОР188). Уровень экспрессии на поверхности NIH/3T3-huFAP клона 39 составлял примерно 90000 huFAP на клетку.
Согласно описанному выше методу прикрепленные клетки HeLa_hOx40_NFKB_Luc1 культивировали в течение ночи при плотности клеток 0,2x 105 клеток на лунку и стимулировали в течение 5 ч средой для анализа содержащей в полученном титрованием количестве FAP-Ox40L. Для тестирования влияния перекрестной гипер-сшивки в результате связывания с присутствующим на клеточной поверхности FAP совместно культивировали 25 мкл/лунку среды, содержащей FAP+-клетки опухоли NIH/3T3-huFAP, клон 39, в соотношении 3:1 (содержание на лунку FAP+-клеток опухоли в три раза выше, чем репортерных клеток). Активированный NFKB количественно оценивали, измеряя испускание света с помощью системы для анализа люциферазы 100 и репортерного лизирующего буфера (оба фирмы Promega, каталожный № Е4550 и каталожный № Е3971).
Как продемонстрировано на фиг. 50, присутствие экспрессирующих FAP опухолевых клеток значительно повышало индукцию опосредуемой NFKB активации люциферазы, когда добавляли FAP-Ox40L. Определяли площадь под кривой для соответствующих представленных кривых дозовой зависимости в качестве маркера агонистической способности каждой конструкции. Как продемонстрировано на фиг. 50Б, присутствие на клеточной поверхности FAP гарантировало более высокий уровень перекрестной сшивки и в результате более выраженную агонистическую активность FAP-Ox40L, чем добавление Fcспецифического вторичного антитела.
15.5. Опосредуемая ОХ40 костимуляция субоптимально индуцированных TCR покоящихся человеческих РВМС и перекрестная гипер-сшивка с помощью FAP, присутствующего на клеточной поверхности.
- 257 037557
В примере 15.4 было продемонстрировано, что добавление FAP+-клеток опухоли может приводить к сильному повышению активности NFkB, индуцируемой нацеленным на FAP OX40L, в человеческих Ох40-позитивных репортерных линиях клеток посредством выраженной олигомеризации рецепторов ОХ40. Кроме того, при создании изобретения тестировали конструкции FAP-OX40L в присутствии клеток NIH/3T3-huFAP, клон 39, в отношении их способности поддерживать субоптимальную стимуляцию TCR покоящихся РВМС-клеток.
Препараты человеческих РВМС содержали (1) покоящиеся Ох40-негативные CD4+- и CD8'-Tклетки и (2) антигенпрезентирующие клетки, несущие различные молекулы FcY-рецептора на своей поверхности, например В-клетки и моноциты. Антитело к человеческому CD3 человеческого IgG1-изотипа может связываться посредством своей Fc-области с присутствующими молекулами FcY-рецептора и опосредовать пролонгированную активацию TCR на покоящихся Ох40-негативных CD4+- и CD8+-Т-клетках. Затем эти клетки в течение нескольких часов начинали экспрессировать Ох40. Функциональные соединения - агонисты Ох40 могут передавать сигнал через рецептор Ох40, присутствующий на активированных CD8+- и CD4+-Т-клетках, и поддерживать опосредуемую TCR стимуляцию.
Покоящиеся меченные CFSE человеческие РВМС стимулировали в течение 5 дней взятым в субоптимальной концентрации антителом к CD3 в присутствии подвергнутых облучению клеток FAP+NIH/3T3-huFAP, клон 39 и FAP-Ox40L в полученных титрованием количествах. Анализировали воздействия на выживание и пролиферацию Т-клеток, осуществляя с помощью проточной цитометрии мониторинг общего количества клеток и концентрации CFSE в живых клетках.
Собирали клетки мышиных эмбриональных фибробластов NIH/3T3-huFAP, клон 39 (см. пример 15.4) с использованием буфера для диссоциации клеток (фирма Invitrogen, каталожный № 13151-014) в течение 10 мин при 37°С. Клетки однократно промывали D-ЗФР. Клетки NIH/3T3-huFAP, клон 39 культивировали при плотности 0,2х105 клеток/лунку в среде для Т-клеток в стерильном круглодонном 96луночном планшете для культуры ткани (фирма ТРР, каталожный № 92097) в течение ночи в инкубаторе (Hera Cell 150) при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% СО2. На следующий день клетки облучали в рентгеновском облучателе дозой 4500 рад для предупреждения последующего избыточного разрастания человеческих РВМС под влиянием опухолевых клеток.
Человеческие РВМС выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла согласно процедуре, описанной в примере 15.3. Затем клетки при плотности клеток 1 х 106 клеток/мл метили CFSE с использованием CFDA-SE (фирма Sigma-Aldrich, каталожный № 2188) в конечной концентрации 50 нМ в течение 10 мин при 37°С. После этого клетки дважды промывали избытком D-ЗФР, содержащим FBS (10 об.%). Меченые клетки выдерживали в среде для Т-клеток при 37°С в течение 30 мин. Затем удаляли неконвертированный CFDA-SE, осуществляя две дополнительные стадии промывки D-ЗФР. Меченные CFSE покоящиеся человеческие РВМС добавляли в каждую лунку при плотности 0,5х105 клеток/лунку. Добавляли антитело к человеческому CD3 (клон V9, человеческий IgG1, описанный у Rodrigues и др., Int J. Cancer Suppl. 7, 1992, cc. 45-50 и в US 6054297) до конечной концентрации 20 нМ и добавляли FAPOX40L в указанных концентрациях. Клетки активировали в течение 5 дней при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% СО2, в инкубаторе (Hera Cell 150). Затем окрашивали поверхность клеток конъюгированными с флуоресцентным красителем антителами к человеческому CD4 (клон RPA-T4, фирма BioLegend, каталожный № 300532) и CD8 (клон RPa-T8, фирма BioLegend, каталожный № 3010441) в течение 20 мин при 4°С. После осуществления стадии промывки FACS-буфером клетки ресуспендировали в 85 мкл/лунку FACS-буфера и анализировали с использованием проточного цитометра Fortessa с 5 лазерами (фирма BD Bioscience, программа DIVA).
Как продемонстрировано на фиг. 51, перекрестная гипер-сшивка конструкций FAP-OX40L в результате присутствия клеток NIH/3T3-huFAP клона 39 выраженно усиливала пролиферацию (см. графики, озаглавленные как события, на верхней панели) и выживание (см. графики, озаглавленные как пролиферация, на нижней панели) стимулированных TCR человеческих CD4+-u CD8+-Т-клеток. Агонистическое действие FAP-OX40L было менее выраженным в отношении CD8+-Т-клеток, чем в отношении CD4+-Т-клеток, что согласуется с более низким уровнем экспрессии ОХ40 на человеческих CD8'-Tклетках.
Процитированные ссылки.
Ascierto P.A., E. Simeone, M. Sznol, Y.X. Fu и I. Melero. Clinical experiences with anti-CD137 and antiPD1 therapeutic antibodies, Semin. Oncol. 37, 2010, cc. 508-516.
Aggarwal B.B., Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword, Nat. Rev. Immunol. 3(9), 2003, cc. 745-756.
Banner D. и др. Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation, Cell 73, 1993, cc. 431-445.
Bodmer J., Schneider P. и Tschopp J., The molecular architecture of the TNF superfamily, Trends in Biochemical Sciences 27(1), 2002, cc. 19-26.
Broil K., Richter G., Pauly S., Hofstaedter F. и Schwarz H., CD137 eapression in tumor vessel walls, High correlation with malignant tumors. Am. J. Clin. Pathol. 115, 2001, cc. 543-549.
- 258 037557
Buechele C., Baessler Т., Schmiedel B.J., Schumacher C.E., Grosse-Hovest L., Rittig K. и Salih H.R., 41BB ligand modulates direct and Rituximab-induced NK-cell reactivity in chronic lymphocytic leukemia, Eur. J.
Immunol. 42, 2012, cc. 737-748.
Choi B.K., Kim Y.H., Kwon P.M., Lee S.C., Kang S.W., Kim M.S., Lee M.J. и Kwon B.S., 4-1BB functions as a survival factor in dendritic cells, J. Immunol. 182, 2009, cc. 4107-4115.
Cuadros C., Dominguez A.L., Lollini P.L., Croft M., Mittler R.S., Borgstrom P. и Lustgarten J., Vaccination with dendritic cells pulsed with apoptotic tumors in combination with anti-OX40 and anti-4-1BB monoclonal antibodies induces T cell-mediated protective immunity in Her-2/neu transgenic mice, Int J Cancer 116, 2005, cc. 934-943.
Curran M.A., Kim M., Montalvo W., Al-Shamkhani А. и Allison J.P., Combination CTLA-4 blockade and 4-1BB activation enhances tumor rejection by increasing T-cell infiltration, proliferation, and cytokine production, PLoS One 6, e19499, 2011.
Diehl L., van Mierlo G.J., den Boer А.Т., van der Voort E., Fransen M., van Bostelen L., Krimpenfort P., Melief C.J., Mittler R., Toes R.E. и Offringa R., In vivo triggering through 4-1BB enables Th-independent priming of CTL in the presence of an intact CD28 costimulatory pathway? J. Immunol. 168, 2002, cc. 3755-3762.
Dubrot J., Milheiro F., Alfaro C, Palazon A., Martinez-Forero I., Perez-Gracia J.L., Morales-Kastresana A., Romero-Trevejo J.L., Ochoa M.C., Hervas-Stubbs S. и др., Treatment with anti-CD137 mAbs causes intense accumulations of liver T cells without selective antitumor immunotherapeutic effects in this organ, Cancer Immunol. Immunother. 59, 2010, cc. 1223-1233.
Futagawa Т., Akiba H., Kodama Т., Takeda K., Hosoda Y., Yagita H. и Okumura K., Expression and function of 4-1BB and 4-1BB ligand on murine dendritic cells, Int. Immunol. 14, 2002, cc. 275-286.
Guo Z., Cheng D., Xia Z., Luan M., Wu L., Wang G. и Zhang S., Combined TIM-3 blockade and CD137 activation affords the long-term protection in a murine model of ovarian cancer, J. Transl. Med. 11, 2013, c. 215.
Heinisch I.V., Daigle I., Knopfli В. и Simon H.U., CD137 activation abrogates granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-mediated anti-apoptosis in neutrophils. Eur. J. Immunol. 30, 2000, cc. 3441-3446.
Hornig N., Kermer V., Frey K., Diebolder P., Kontermann R.E., Mueller D., Combination of a bispecific antibody and costimulatory antibody-ligand fusion proteins for targeted cancer immunotherapy, J. Immunother. 35, 2011, cc. 418-429.
Ju S.A., Cheon S.H., Park S.M., Tam N.Q., Kim Y.M., An W.G. и Kim B.S., Eradication of established renal cell carcinoma by a combination of 5-fluorouracil and анти-4-1BB monoclonal antibody in mice, Int. J. Cancer 122, 2008, cc. 2784-2790.
Kienzle G. и von Kempis J., CD137 (ILA/4-1BB), expressed by primary human monocytes, induces monocyte activation and apoptosis of В lymphocytes. Int. Immunol. 12, 2000, cc. 73-82.
Kim D.H., Chang W.S., Lee Y.S., Lee K.A., Kim Y.K., Kwon B.S. и Kang C.Y., 4-1BB engagement costimulates NKT cell activation and exacerbates NKT cell ligand-induced airway hyperresponsiveness and inflammation. J. Immunol. 180, 2008, cc. 2062-2068.
Kim Y.H., Choi B.K., Oh H.S., Kang W.J., Mittler R.S. и Kwon B.S., Mechanisms involved in synergistic anticancer effects of anti-4-1BB and cyclophosphamide therapy. Mol. Cancer. Ther. 8, 2009, cc. 469-478.
Kwon B.S. и Weissman S.M., cDNA sequences of two inducible T-cell genes. Proc Natl Acad Sci USA 86, 1989, cc. 1963-1967.
Lee H., Park H.J., Sohn H.J., Kim J.M. и Kim S.J., Combinatorial therapy for liver metastatic colon cancer: dendritic cell vaccine and low-dose agonistic anti-4-1BB antibody co-stimulatory signal. J. Surg. Res. 169, e43-50, 2011.
Levitsky V., de Campos-Lima P.O., Frisan Т. и Masucci M.G., The clonal composition of a peptidespecific oligoclonal CTL repertoire selected in response to persistent EBV infection is stable over time. J. Immunol. 161, 1998, cc. 594-601.
Li F. и Ravetch J.V., Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies. Science 333, 2011, cc. 1030-1034.
Lin W., Voskens C.J., Zhang X., Schindler D.G., Wood A., Burch E., Wei Y., Chen L., Tian G., Tamada K. и др., Fc-dependent express of CD137 on human NK cells: insights into agonistic effects of anti-CD137 monoclonal antibodies. Blood 112, 2008, cc. 699-707.
Melero I., Johnston J.V., Shufford W.W., Mittler R.S. и Chen L., NK1.1 cells express 4-1BB (CDw137) costimalatory molecule and are required for tumor immunity elicited by anti-4-1BB monoclonal antibodies. Cell Immunol. 190, 1998, cc. 167-172.
Melero I., Shuford W.W., Newby S.A., Aruffo A., Ledbetter J.A., Hellstrom K.E., Mittler R.S. и Chen L., Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat. Med. 3, 1997, cc. 682-685.
Merchant A.M., Zhu Z., Yuan J.Q., Goddard A., Adams C.W., Presta L.G. и Carter P., An efficient route to human bispecific IgG? Nat. Biotechnol. 16, 1998, cc. 677-681.
Morales-Kastresana A., SanMamed M.F., Rodriguez I, Palazon A., Martinez-Forero I., Labiano S., HervasStubbs S., Sangro В., Ochoa C., Rouzaut А. и др., Combined immunostimulatory monoclonal antibodies extend survival in an aggressive transgenic hepatocellular carcinoma mouse model. Clin. Cancer. Res. 19, (2013, cc.
- 259 037557
6151-6162.
Mueller D., Frey K., Kontermann R.E., A novel antibody-4-1BB1 fusion protein for targeted costimulation in cancer immunotherapy, J. Immunother. 31, 2008, cc. 714-722.
Murillo O., Dubrot J., Palazon A., Arina A., Azpilikueta A., Alfaro C., Solano S., Ochoa M.C., Berasain C., Gabari I. и др. In vivo depletion of DC impairs the anti-tumor effect of agonistic anti-CD137 mAb. Eur. J. Immunol. 39, 2009, cc. 2424-2436.
Narazaki H., Zhu Y., Luo L., Zhu G. и Chen L., CD137 agonist antibody prevents cancer recurrence: contribution of CD137 on both hematopoietic and nonhematopoietic cells. Blood 115, 2010, cc. 1941-1948.
Nishimoto H., Lee S.W., Hong H., Potter K.G., Maeda-Yamamoto M., Kinoshita Т., Kawakami Y., Mittler R.S., Kwon B.S., Ware C.F. и др., Costimulation of mast cells by 4-1BB, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, with the high-affinity IgE receptor, Blood 106, 2005, cc. 4241-4248.
Olofsson P.S., Soderstrom L.A., Wagsater D., Sheikine Y., Ocaya P., Lang F., Rabu C., Chen L., Rudling M., Aukrust P. и др., CD137 is expressed in human atherosclerosis and promotes development of plaque inflammation in hypercholesterolemic mice. Circulation, 117, 2008, cc. 1292-1301.
Palazon A., Teijeira A., Martinez-Forero I., Hervas-Stubbs S., Roncal C., Penuelas I., Dubrot J., MoralesKastresana A., Perez-Gracia J.L., Ochoa M.C. и др., Agonist antu-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes, Cancer Res. 71, 2011, cc. 801-811.
Schwarz H., Valbracht J., Tuckwell J., von Kempis J. и Lotz M., ILA, the human 4-1BB homologue, is inducible in lymphoid and other cell lineages. Blood, 85, 1995, cc. 1043-1052.
Shao Z. и Schwarz H., CD 137 ligand, a member of the tumor necrosis factor family, regulates immune responses via reverse signal transduction, J. Leukoc. Biol. 89, 2011, cc. 21-29.
Shi W. и Siemann D.W., Augmented antitumor effects of radiation therapy by 4-1BB antibody (BMS469492) treatment, Anticancer Res. 26, 2006, cc. 3445-3453.
Simeone E. и Ascierto P.A., Immunomodulating antibodies in the treatment of metastatic melanoma: the experience with anti-CTLA-4, anti-CD 137, and anti-PD1, J. Immunotoxicol. 9, 2012, cc. 241-247.
Snell L.M., Lin G.H., McPherson A.J., Moraes T.J. и Watts Т.Н., T-cell intrinsic effects of GITR and 41BB during viral infection and cancer immunotherapy. Immunol. Rev. 244, 2011, cc. 197-217.
Stagg J., Loi S., Divisekera U., Ngiow S.F., Duret H., Yagita H., Teng M.W. и Smyth M.J., Анти-ЕгЬВ-2 mAb therapy requires type I and II interferons and synergizes with anti-PD-1 or anti-CD137 mAb therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 2011, cc. 7142-7147.
Teng M.W., Sharkey J., McLaughlin N.M., Exley M.A. и Smyth M.J., CD1d-based combination therapy eradicates established tumors in mice. J. Immunol. 183, 2009, cc. 1911-1920.
von Kempis J., Schwarz H. и Lotz M., Differentiation-dependent and stimulus-specific expression of ILA, the human 4-1BB-homologue, in cells of mesenchymal origin, Osteoarthritis Cartilage 5, 1997, cc. 394-406.
Wei H., Zhao L., Li W., Fan K., Qian W., Hou S., Wang H., Dai M., Hellstrom I., Hellstrom K.E. и Guo Y., Combinatorial PD-1 blockade and CD137 activation has therapeutic efficacy in murine cancer models and synergizes with cisplatin. PLoS One 8, e84927, 2013).
Wilcox R.A., Chapoval A.I., Gorski K.S., Otsuji M., Shin Т., Flies D.B., Tamada K., Mittler R.S., Tsuchiya H., Pardoll D.M. и Chen L., Cutting edge: Expression of functional CD137 receptor by dendritic cells, J. Immunol. 168, 2002, cc. 4262-4267.
Wilcox R.A., Tamada K., Flies D.B., Zhu G., Chapoval A.I., Blazar B.R., Kast W.M. и Chen L., Ligation of CD137 receptor prevents and reverses established anergy of CD8+ cytolytic T lymphocytes in vivo. Blood 103, 2004, cc. 177-184.
Zhang N., Sadun R.E., Arias R.S., Flanagan M.L., Sachsman S.M., Nien Y., Khawli L.A., Hu P., Epstein A.L., Targeted and untargeted CD137L fusion proteins for the immunotherapy of experimental solid tumors, Clin. Cancer Res. 13, 2007, cc. 2758-2767.
Zhang X., Voskens C.J., Sallin M., Maniar A., Montes C.L., Zhang Y., Lin W., Li G., Burch E., Tan M. и др., CD137 promotes proliferation and survival of human В cells, J. Immunol. 184, 2010, cc. 787-795.

Claims (54)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предназначенная для лечения рака, и которая содержит:
    (а) по меньшей мере одну Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, выбранным из группы, состоящей из: фибробласт-активирующий белок (FAP), ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), карциноэмбриональный антиген (СЕА), CD19, CD20 и CD33;
    (б) первый и второй полипептиды, которые связаны друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит СН1- или CLдомен и второй полипептид, который содержит CL- или СН1-домен соответственно, при этом второй полипептид связан с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1- и CL-доменом, и где первый полипептид содержит два эктодомена, представителя семейства лигандов TNF, выбранных из 4-1
    - 260 037557
    BBL, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 и SEQ ID NO: 375, или из OX40L, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54, которые связаны друг с другом и с СН1- или CL-доменом пептидным линкером и где второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF, выбранного из 4-1 BBL, включающего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 и SEQ ID NO: 375, или OX40L, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54, которые связаны друг с другом и с СН1- или CL-доменом указанного полипептида;
    (в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц, которые обладают способностью к стабильной ассоциации.
  2. 2. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предназначенная для лечения рака, и которая содержит:
    (а) по меньшей мере одну Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, выбранным из группы, включающей фибробласт-активирующий белок (FAP), ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), карциноэмбриональный антиген (СЕА), CD19, CD20 и CD33, (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит СН3-домен и второй полипептид содержит СН3-домен соответственно, и при этом первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF, выбранных из 4-1 BBL, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 и SEQ ID NO: 375, или OX40L, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54, которые связаны друг с другом и с С-концом СН3-домена пептидным линкером, и при этом второй полипептид содержит только один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF, выбранного из 4-1 BBL, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 и SEQ ID NO: 375, или из OX40L, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54, которые связаны пептидным линкером с С-концом СН3-домена указанного полипептида; и (в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц, которые обладают способностью к стабильной ассоциации.
  3. 3. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF, предназначенная для лечения рака, которая содержит:
    (а) по меньшей мере одну Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, выбранного из группы, включающей фибробласт-активирующий белок (FAP), ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), карциноэмбриональный антиген (СЕА), CD19, CD20 и CD33;
    (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит VH-CL- или VL-CH1-домен и второй полипептид содержит VL-CH1-домен или VH-CL-домен соответственно, при этом второй полипептид связан с первым полипептидом дисульфидной связью между СН1- и CLдоменом и при этом первый полипептид содержит два эктодомена представителя семейства лигандов TNF, выбранных из 4-1 BBL, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 и SEQ ID NO: 375, или из OX40L, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54, которые соединены друг с другом и с VH или VL пептидным линкером, и при этом второй полипептид содержит один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF, выбранного из 4-1 BBL, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 и SEQ ID NO: 375, или OX40L, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54, соединенный через пептидный линкер с VL или VH указанного полипептида; и (в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц, которые обладают способностью к стабильной ассоциации.
  4. 4. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-3, в которой представитель семейства лигандов TNF представляет собой 4-1BBL, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374.
  5. 5. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-4, в которой эктодомен представителя семейства лигандов TNF содержит аминокислотную последо-
    - 261 037557 вательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 96.
  6. 6. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-5, в которой эктодомен представителя семейства лигандов TNF содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96.
  7. 7. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-4, которая содержит:
    (а) по меньшей мере одну Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, выбранным из группы, включающей фибробласт-активирующий белок (FAP), ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), карциноэмбриональный антиген (СЕА), CD19, CD20 и CD33 и (б) первый и второй полипептиды, которые сцеплены друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99, и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SeQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
  8. 8. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-7, где молекула содержит одну Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, выбранным из группы, включающей фибробласт-активирующий белок (FAP), ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), карциноэмбриональный антиген (СЕА), CD19, CD20 и CD33.
  9. 9. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-8, где антиген клетки-мишени представляет собой фибробласт-активирующий белок (FAP).
  10. 10. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-9, в которой Fab-молекула, обладающая способностью специфически связываться с FAP, содержит VH-домен, который содержит: (I) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 100, (II) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 101, и (III) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 102, и VL-домен, который содержит (IV) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 103, (V) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 104, и (VI) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 105.
  11. 11. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-10, в которой Fab-молекула, обладающая способностью специфически связываться с FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107.
  12. 12. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-11, в которой Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG, прежде всего Fc-домен IgG1 или Fc-домен IgG4.
  13. 13. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-12, в которой Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG1, содержащий аминокислотные замены в положениях 234 и 235 (EU-нумерация) и/или 329 (EU-нумерация).
  14. 14. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1 или 3-13, где антигенсвязывающая молекула содержит первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, обе включающие Fab-молекулу, которая обладает способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слитый на его С-конце с помощью второго пептидного линкера со второй тяжелой или легкой цепью, и второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF, слитого на его С-конце с помощью третьего пептидного линкера со второй легкой или тяжелой цепью соответственно.
  15. 15. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1 и 4-14, в которой первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на его С-конце с помощью второго пептидного линкера с СН1-доменом, который является частью тяжелой цепи, а второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF, слит на его Сконце с помощью третьего пептидного линкера с CL-доменом, который является частью легкой цепи.
  16. 16. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1 или 4-14, в которой первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов
    - 262 037557
    TNF, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на его С-конце с помощью второго пептидного линкера с CL-доменом, который является частью тяжелой цепи, а второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF, слит на его Сконце с помощью третьего пептидного линкера с СН1-доменом, который является частью легкой цепи.
  17. 17. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.3-14, в которой первый пептид, содержащий два эктодомена представителя семейства лигандов TNF, которые соединены друг с другом с помощью первого пептидного линкера, слит на его С-конце с помощью второго пептидного линкера с VH-доменом, который является частью тяжелой цепи, а второй пептид, содержащий один эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF, слит на его Сконце с помощью третьего пептидного линкера с VL-доменом, который является частью легкой цепи.
  18. 18. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.15-17, в которой в CL-домене, примыкающем к представителю семейства лигандов TNF, аминокислота в положении 123 (EU-нумерация) заменена на аргинин (R) и аминокислота в положении 124 (EUнумерация) заменена на лизин (K), и в которой в СН1, примыкающем к представителю семейства лигандов TNF, аминокислоты в положении 147 (EU-нумерация) и в положении 213 (EU-нумерация) заменены на глутаминовую кислоту (Е).
  19. 19. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1 или 3-18, где антигенсвязывающая молекула содержит:
    (а) первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, обе образующие Fab-молекулу, которая обладает способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени;
    (б) вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
  20. 20. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1 и 3-15, где антигенсвязывающая молекула, содержащая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с FAP, содержит:
    (I) первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107;
    (II) вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 113; и (III) вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 и SEQ ID NO: 114.
  21. 21. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1, или 3-14, или 16, где антигенсвязывающая молекула, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с FAP, содержит:
    (I) первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или первую тяжелую цепь, содержащую VH-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и первую легкую цепь, содержащую VL-домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107;
    (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 173; и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 174.
  22. 22. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1, или 4-14, или 16, или 21, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с FAP, в которой антигенсвязывающаи молекула выбрана из группы состоящей из:
    а) молекулы, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116;
    б) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118;
    в) молекулу, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность
    - 263 037557
    SEQ ID NO: 125, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:
    123, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124;
    г) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120;
    д) молекулу, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174; и
    е) молекулу, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127.
  23. 23. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1, или 4-14, или 16, или 21, или 22, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с FAP, в которой антигенсвязывающая молекула содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120.
  24. 24. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по п.2, где молекула содержит две Fab-молекулы, обладающие способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени, выбранным из группы, включающей фибробласт-активирующий белок (FAP), ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), карциноэмбриональный антиген (СЕА), CD19, CD20 и CD33.
  25. 25. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по п.24, где антигенсвязывающая молекула содержит:
    (I) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 121, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; или (II) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125; или (III) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125.
  26. 26. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-8, или 12-19, или 22, где антиген клетки-мишени представляет собой CD19.
  27. 27. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-8, или 12-19, или 24, или 26, в которой Fab-молекула, обладающая способностью специфически связываться с CD19, содержит VH-домен, который содержит: (I) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 195 или SEQ ID NO: 252, (II) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 196 или SEQ ID NO: 253, и (III) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197 или SEQ ID NO: 254, и VL-домен, который содержит (IV) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 198 или SEQ ID NO: 249, (V) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 199 или SEQ ID NO: 250, и (VI) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 200 или SEQ ID NO: 251.
  28. 28. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-8, или 12-19, или 24, или 26, или 27, в которой Fab-молекула, обладающая способностью специфически связываться с CD19, содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202, или в которой фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FAP, содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358.
  29. 29. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1, или 4-8, или 12-19, или 26-28, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с CD19, где антигенсвязывающая молекула содержит:
    (I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202, или первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последователь- 264 037557 ность SEQ ID NO: 357, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358;
    (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 113; и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 и SEQ ID NO: 114.
  30. 30. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1, или 4-8, или 12-19, или 26-29, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с CD19, где антигенсвязывающая молекула содержит:
    (I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 201, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 202, или первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358;
    (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 173; и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 174.
  31. 31. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.2, или 4-8, или 26-29, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с CD19, где антигенсвязывающая молекула содержит:
    (I) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 210, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206; или (II) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 213, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 214, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206; или (III) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 310, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 279; или (IV) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 313, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 314, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 279.
  32. 32. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1, или 4-8, или 26-30, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с CD19, где антигенсвязывающая молекула выбрана из группы, состоящей из:
    а) молекулы, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116;
    б) молекулы, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118;
    в) молекулы, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 210;
    г) молекулы, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120;
    д) молекулы, которая содержит первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174; и
    е) молекулы, которая содержит две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 213, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 214.
  33. 33. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1, или 4-8, или 26-30, или 32, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с CD19, где антигенсвязывающая молекула включает первую тяжелую цепь, содержащую
    - 265 037557 аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 205, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120.
  34. 34. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1, или 4-8, или 26-30, или 32, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с CD19, где антигенсвязывающая молекула включает первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 306, первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 279, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120.
  35. 35. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-8, или 12-19 или 22, где антиген клетки-мишени представляет собой СЕА.
  36. 36. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-8, или 12-19, или 22, или 35, в которой Fab-молекула, обладающая способностью специфически связываться с СЕА, содержит VH-домен, который содержит (I) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 321, (II) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 322, и (III) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 323, и VLдомен, который содержит (IV) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 324, (V) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 325, и (VI) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 326.
  37. 37. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-8, или 12-19, или 22, или 35, или 36, в которой Fab-молекула, обладающая способностью специфически связываться с СЕА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330.
  38. 38. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1, или 3-8, или 12-19, или 35-37, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с СЕА, где антигенсвязывающая молекула содержит:
    (I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330;
    (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 113; и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 и SEQ ID NO: 114.
  39. 39. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1, или 3-8, или 12-19, или 35-37, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с СЕА, где антигенсвязывающая молекула содержит:
    (I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330;
    (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 173; и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 174.
  40. 40. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.2, или 4-8, или 35-37, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с СЕА, где антигенсвязывающая молекула содержит:
    (I) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 337, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 338, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334; или (II) первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 341, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342, и две легкие цепи, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334.
  41. 41. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1, или 4-8, или 12-19, или 35-39, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с СЕА, где антигенсвязывающая молекула включает первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333, и первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334, вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, и вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120.
    - 266 037557
  42. 42. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-3, или 9-18, или 24, или 26-28, или 35-37, где представителем семейства лигандов TNF является
    OX40L, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54.
  43. 43. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-3, или 8-18, или 24, или 26-28, или 35-37, или 42, в которой эктодомен представителя семейства лигандов TNF содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53.
  44. 44. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-3, или 8-18, или 24, или 26-28, или 35-37, или 42, или 43, которая содержит:
    (а) по меньшей мере одну Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени; и (б) первый и второй полипептиды, сцепленные друг с другом дисульфидной связью, где антигенсвязывающая молекула отличается тем, что первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 371 или SEQ ID: 372 и тем, что второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54.
  45. 45. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-3, или 8-18, или 24, или 42-44, где антиген клетки-мишени представляет собой фибробластактивирующий белок (FAP), а Fab-молекула, обладающая способностью специфически связываться с FAP, содержит VH-домен, который содержит (I) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 100, (II) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 101, и (III) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 102, и VL-домен, который содержит (IV) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 103, (V) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 104, и (VI) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 105.
  46. 46. Антигенсвязывающая молекула, содержащая тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-3, или 8-18, или 24, или 42-45, где антигенсвязывающая молекула, включающая Fab-молекулу, обладающую способностью специфически связываться с FAP, содержит:
    (I) первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или первую тяжелую цепь, которая содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и первую легкую цепь, которая содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107;
    (II) вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 355; и (III) вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 356.
  47. 47. Выделенный полинуклеотид, который кодирует антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, по одному из пп.1-46.
  48. 48. Экспрессионный вектор, который содержит выделенный полинуклеотид по п.47.
  49. 49. Клетка-хозяин, содержащая выделенный полинуклеотид по п.47 или вектор по п.48.
  50. 50. Способ получения антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-46, включающий стадии, на которых:
    (I) культивируют клетку-хозяина по п.49 в условиях, пригодных для экспрессии антигенсвязывающей молекулы; и (II) выделяют антигенсвязывающую молекулу.
  51. 51. Фармацевтическая композиция для лечения рака, которая содержит антигенсвязывающую молекулу, содержащую тримерный лиганд семейства TNF, по одному из пп.1-46 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
  52. 52. Применение фармацевтической композиции по п.51 в качестве лекарственного средства при лечении рака.
  53. 53. Применение антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-46 в качестве лекарственного средства при лечении рака.
  54. 54. Применение антигенсвязывающей молекулы, содержащей тримерный лиганд семейства TNF по одному из пп.1-46, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.
EA201791057A 2014-11-14 2015-11-13 Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства tnf EA037557B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14193260 2014-11-14
EP15183736 2015-09-03
EP15188142 2015-10-02
PCT/EP2015/076528 WO2016075278A1 (en) 2014-11-14 2015-11-13 Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201791057A1 EA201791057A1 (ru) 2017-10-31
EA037557B1 true EA037557B1 (ru) 2021-04-14

Family

ID=54695680

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201791057A EA037557B1 (ru) 2014-11-14 2015-11-13 Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства tnf

Country Status (32)

Country Link
US (5) US10392445B2 (ru)
EP (3) EP3738609A1 (ru)
JP (2) JP6873901B2 (ru)
KR (2) KR20230146133A (ru)
CN (3) CN114634570A (ru)
AU (3) AU2015345024B2 (ru)
BR (1) BR112017009006A2 (ru)
CA (1) CA2963718A1 (ru)
CL (2) CL2017001000A1 (ru)
CO (1) CO2017003212A2 (ru)
CR (1) CR20170194A (ru)
DK (2) DK3489256T3 (ru)
EA (1) EA037557B1 (ru)
ES (2) ES2871045T3 (ru)
HK (1) HK1255482A1 (ru)
HR (2) HRP20200679T1 (ru)
HU (2) HUE049982T2 (ru)
IL (2) IL282922B (ru)
LT (2) LT3224275T (ru)
MA (2) MA40882B1 (ru)
MX (2) MX2020012798A (ru)
MY (1) MY191428A (ru)
PE (2) PE20170896A1 (ru)
PH (1) PH12017500892A1 (ru)
PL (2) PL3224275T3 (ru)
PT (1) PT3224275T (ru)
RS (2) RS60201B1 (ru)
SG (1) SG11201703597TA (ru)
SI (2) SI3224275T1 (ru)
TW (2) TWI713474B (ru)
UA (1) UA125577C2 (ru)
WO (1) WO2016075278A1 (ru)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010062960A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Cedars-Sinai Medical Center METHODS OF DETERMINING RESPONSIVENESS TO ANTI-TNFα THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
EP3708584A1 (en) 2013-02-26 2020-09-16 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
KR20230109779A (ko) 2013-03-27 2023-07-20 세다르스-신나이 메디칼 센터 Tl1a 기능 및 관련된 신호전달 경로의 저해에 의한섬유증 및 염증의 완화 및 반전
EP4105236A1 (en) 2013-07-19 2022-12-21 Cedars-Sinai Medical Center Anti-tl1a (tnfsf15) antibody for treatment of inflammatory bowel disease
MX2020012798A (es) 2014-11-14 2022-04-07 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de tnf.
MA41460A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Oncomed Pharm Inc Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations
JP6996979B2 (ja) 2015-03-31 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 三量体ｔｎｆファミリーリガンドを含む抗原結合分子
AR106188A1 (es) * 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CN108026177B (zh) * 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗cd19xcd3 t细胞活化性抗原结合分子
US10526413B2 (en) 2015-10-02 2020-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specific for OX40
CA2990755A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffman-La Roche Ag Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules
RU2761077C1 (ru) * 2015-10-02 2021-12-03 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела против cd19 человека, обладающие высокой аффинностью
US10287352B2 (en) 2015-10-02 2019-05-14 Hoffman-La Roche Inc. Bispecific antibodies specific for PD1 and TIM3
US10988543B2 (en) 2015-11-11 2021-04-27 Opi Vi—Ip Holdco Llc Humanized anti-tumor necrosis factor alpha receptor 2 (anti-TNFR2) antibodies and methods of use thereof to elicit an immune response against a tumor
AU2017205089B2 (en) 2016-01-08 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating CEA-positive cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-CEA/anti-CD3 bispecific antibodies
KR20220153109A (ko) 2016-03-17 2022-11-17 세다르스-신나이 메디칼 센터 Rnaset2를 통한 염증성 장 질환의 진단 방법
WO2017194442A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
EP3243836A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
EP3243832A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
CN109952370B (zh) 2016-10-19 2023-09-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于产生免疫缀合物的方法
WO2018081074A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Cedars-Sinai Medical Center Neutralizing anti-tl1a monoclonal antibodies
CN110087682B (zh) * 2016-12-19 2023-12-15 豪夫迈·罗氏有限公司 用靶向性4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
CA3039446A1 (en) * 2016-12-20 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and 4-1bb (cd137) agonists
CR20190309A (es) 2017-01-03 2019-08-21 Hoffmann La Roche Moleculas de unión de3 antígeno biespecíficas que comprenden el clon 20h4.9 anti-4-1bb
RU2769513C2 (ru) 2017-01-05 2022-04-01 Кахр Медикал Лтд. Слитый белок pd1-4-1bbl и способы его применения
US11566060B2 (en) 2017-01-05 2023-01-31 Kahr Medical Ltd. PD1-CD70 fusion protein and methods of use thereof
SI3565828T1 (sl) 2017-01-05 2022-04-29 Kahr Medical Ltd. SIRP1 alfa-41BBL fuzijski protein in postopki za njegovo uporabo
WO2018151820A1 (en) * 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
CN110382542B (zh) 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
CN110573528B (zh) 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
MA49033B1 (fr) 2017-04-03 2022-10-31 Hoffmann La Roche Immunoconjugué d'un anticorps contre pd-1 avec il-2 mutée ou avec il-15
UA128451C2 (uk) 2017-04-05 2024-07-17 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з pd1 і lag3
EP3615564A1 (en) 2017-04-24 2020-03-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibody immune cell inhibitor fusion proteins
WO2019086499A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
EP3502140A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
CN110573531B (zh) * 2018-01-15 2021-04-02 天境生物科技(上海)有限公司 经修饰的Cκ和CH1结构域
CA3092002A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Therapeutic combination of 4-1 bb agonists with anti-cd20 antibodies
TWI841551B (zh) * 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
PE20210652A1 (es) 2018-04-13 2021-03-26 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno dirigidas a her2 que comprenden 4-1bbl
EP3784699A4 (en) 2018-04-25 2022-04-13 Prometheus Biosciences, Inc. OPTIMIZED ANTI-TL1A ANTIBODIES
TW202035447A (zh) 2018-07-04 2020-10-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 新穎雙特異性促效性4-1bb抗原結合分子
MX2021000047A (es) * 2018-07-11 2021-05-12 Kahr Medical Ltd Proteina de fusion variante pd1-4-1bbl y procedimientos de uso de la misma.
WO2020070041A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-fap clone 212
TWI839395B (zh) * 2018-10-09 2024-04-21 瑞士商Ｎｕｍａｂ治療公司 靶向cd137的抗體及其使用方法
JP2022514343A (ja) 2018-12-21 2022-02-10 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 腫瘍標的化アゴニストｃｄ２８抗原結合分子
AR119080A1 (es) 2019-06-04 2021-11-24 Molecular Partners Ag Proteínas multiespecíficas
EP3983538A1 (en) * 2019-06-12 2022-04-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2 compositions and methods for tunable regulation
CN114026224B (zh) 2019-06-26 2024-03-15 豪夫迈·罗氏有限公司 具有sirt-1基因敲除的哺乳动物细胞系
WO2020260329A1 (en) 2019-06-26 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Fusion of an antibody binding cea and 4-1bbl
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
CN114901311A (zh) 2019-10-24 2022-08-12 普罗米修斯生物科学公司 Tnf样配体1a（tl1a）的人源化抗体及其用途
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
CN113512116B (zh) * 2020-04-10 2022-09-20 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
WO2021209050A1 (en) * 2020-04-17 2021-10-21 Biocytogen Jiangsu Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric tnfsf9 and/or 4-1bb
US20230212260A1 (en) 2020-05-15 2023-07-06 Apogenix Ag Multi-specific immune modulators
TWI811703B (zh) 2020-06-19 2023-08-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｃｄ３及ｃｄ１９結合之抗體
CA3187277A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
MX2023000883A (es) * 2020-07-24 2023-02-22 Genentech Inc Metodos para la expresion de una fusion anticuerpo-multimero.
WO2022152656A1 (en) 2021-01-12 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Split antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
KR20230131205A (ko) 2021-01-13 2023-09-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 병용 요법
JP2024508949A (ja) 2021-03-09 2024-02-28 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ－１標的化ｉｌ－２変異体イムノコンジュゲートとｆａｐ／４－１ｂｂ結合分子との併用療法
WO2022243261A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic cd40 antigen binding molecules targeting cea
EP4148067A1 (en) * 2021-09-08 2023-03-15 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the expression of an antibody-multimer-fusion
WO2023073225A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using a hla-a2/wt1 x cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
WO2023088889A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Apogenix Ag CD137 ligands
WO2023088876A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Apogenix Ag Multi-specific immune modulators
WO2023110788A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using a hla-a2/mage-a4 x cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
CN114426585B (zh) * 2022-02-15 2023-10-03 广东香雪干细胞再生医学科技有限公司 融合蛋白及其表达细胞株与应用
CN116462769A (zh) * 2022-04-02 2023-07-21 广东东阳光药业有限公司 一种嵌合受体及其应用
CN114805564B (zh) * 2022-06-10 2023-06-06 郑州大学 特异性识别SARS-CoV-2 S蛋白NTD区域的单克隆抗体及应用
WO2024056861A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for stimulating nk cells and use thereof
WO2024094741A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with anti-cd19/anti-cd28 bispecific antibody

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010010051A1 (en) * 2008-07-21 2010-01-28 Apogenix Gmbh Tnfsf single chain molecules
AU2011265482B2 (en) * 2005-05-06 2013-08-29 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR7801185A (pt) 1977-04-18 1978-11-28 Hitachi Metals Ltd Ornato adaptado para ser fixado por pelo menos um ima permanente
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
ATE102631T1 (de) 1988-11-11 1994-03-15 Medical Res Council Klonierung von immunglobulin sequenzen aus den variabelen domaenen.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
ATE503496T1 (de) 1992-02-06 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
DE69840412D1 (de) 1997-10-31 2009-02-12 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1222292B1 (en) 1999-10-04 2005-08-31 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
IL151853A0 (en) * 2000-04-11 2003-04-10 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
AU2002218166A1 (en) 2000-09-08 2002-03-22 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
AU2003277828B2 (en) 2002-10-29 2009-06-04 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
CN1756768A (zh) * 2003-02-06 2006-04-05 麦克罗梅特股份公司 诱导持久t细胞应答的三聚体多肽构建体
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7993650B2 (en) 2003-07-04 2011-08-09 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for HER2
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
EA202091901A1 (ru) 2003-11-05 2020-11-24 Роше Гликарт Аг АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ К СВЯЗЫВАНИЮ С Fc-РЕЦЕПТОРОМ И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
BRPI0417302A (pt) 2003-12-05 2007-03-06 Compound Therapeutics Inc inibidores de receptores de fator de crescimento endotelial vascular do tipo 2
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
EP2360186B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
SI1791565T1 (sl) 2004-09-23 2016-08-31 Genentech, Inc. Cisteinsko konstruirana protitelesa in konjugati
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2013263717B2 (en) 2005-05-06 2016-05-19 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use
EP1736482A1 (en) 2005-06-20 2006-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) Recombinant trimeric 4-1BBL
DE102005036542A1 (de) 2005-08-03 2007-02-08 Universität Stuttgart CTL-Prodrug
DK2383297T5 (da) 2006-08-14 2022-07-04 Xencor Inc Optimerede antistoffer rettet mod CD19
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
EP2009022A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Apogenix GmbH Trimeric death ligands with enhanced activity (tenascin)
GB0718843D0 (en) 2007-09-26 2007-11-07 Cancer Rec Tech Ltd Materials and methods relating to modifying the binding of antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
WO2010037395A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cancer vaccines and immune monitoring
WO2011020783A2 (en) 2009-08-17 2011-02-24 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates
DK2483310T3 (da) 2009-09-29 2014-09-01 Roche Glycart Ag Bispecifik dødsreceptor-agonistiske antistoffer
PT2542590T (pt) 2010-03-05 2017-08-31 Univ Johns Hopkins Composições e métodos para anticorpos e proteínas de fusão imunomoduladores direcionados
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
US8552024B2 (en) 2010-08-13 2013-10-08 Hoffman-La Roche Inc. Azacyclic compounds
EA034742B1 (ru) 2010-08-13 2020-03-16 Роше Гликарт Аг Антитела к fap, полинуклеотид, вектор и клетка для их получения и их применения
RS62238B1 (sr) 2011-02-10 2021-09-30 Roche Glycart Ag Mutantni interleukin-2 polipeptidi
CN103476795B (zh) 2011-03-29 2016-07-06 罗切格利卡特公司 抗体Fc变体
AU2012237456B2 (en) 2011-04-01 2017-06-29 Universitat Stuttgart Recombinant TNF ligand family member polypeptides with antibody binding domain and uses thereof
ES2938182T3 (es) 2012-04-30 2023-04-05 Biocon Ltd Proteínas de fusión dirigidas/inmunomoduladoras y métodos de preparación de las mismas
CN104540848B (zh) 2012-08-08 2019-05-31 罗切格利卡特公司 白介素-10融合蛋白及其用途
US20140242077A1 (en) * 2013-01-23 2014-08-28 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
EP3708584A1 (en) * 2013-02-26 2020-09-16 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
KR20160005345A (ko) 2013-05-07 2016-01-14 에프. 호프만-라 로슈 아게 삼량체성 항원 결합 분자
CA2935665A1 (en) 2014-02-06 2015-08-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukine 10 immunoconjugates
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
KR102364383B1 (ko) 2014-05-29 2022-02-17 마크로제닉스, 인크. 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법
RU2016150096A (ru) 2014-05-29 2018-07-02 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Белки слияния на основе ox40l и пути их применения
MX2020012798A (es) 2014-11-14 2022-04-07 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de tnf.
JP6996979B2 (ja) 2015-03-31 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 三量体ｔｎｆファミリーリガンドを含む抗原結合分子
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
US10526413B2 (en) 2015-10-02 2020-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specific for OX40
CN108026177B (zh) 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗cd19xcd3 t细胞活化性抗原结合分子
US20170129962A1 (en) 2015-10-02 2017-05-11 Hoffmann-La Roche Inc. Multispecific antibodies
RU2761077C1 (ru) 2015-10-02 2021-12-03 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела против cd19 человека, обладающие высокой аффинностью
RU2018116402A (ru) 2015-10-07 2019-11-07 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Биспецифические антитела, четырехвалентные в отношении костимуляторного tnf-рецептора
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
EP3243836A1 (en) 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
JP6768917B2 (ja) 2016-07-08 2020-10-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ラボラトリ試料を処理するための装置、ラボラトリオートメーションシステム、およびラボラトリ試料をピペット操作するための方法
CN110087682B (zh) 2016-12-19 2023-12-15 豪夫迈·罗氏有限公司 用靶向性4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
CA3039446A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and 4-1bb (cd137) agonists
CR20190309A (es) 2017-01-03 2019-08-21 Hoffmann La Roche Moleculas de unión de3 antígeno biespecíficas que comprenden el clon 20h4.9 anti-4-1bb
WO2019086499A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
KR20200079492A (ko) 2017-11-01 2020-07-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이성 2+1 컨터체
CA3092002A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Therapeutic combination of 4-1 bb agonists with anti-cd20 antibodies
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
TW202035447A (zh) 2018-07-04 2020-10-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 新穎雙特異性促效性4-1bb抗原結合分子
CN113677403A (zh) 2019-04-12 2021-11-19 豪夫迈·罗氏有限公司 包含脂质运载蛋白突变蛋白的双特异性抗原结合分子

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011265482B2 (en) * 2005-05-06 2013-08-29 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use
WO2010010051A1 (en) * 2008-07-21 2010-01-28 Apogenix Gmbh Tnfsf single chain molecules

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EDWIN BREMER: "Targeting of the Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily for Cancer Immunotherapy", ISRN ONCOLOGY, HINDAWI PUBLISHING CORPORATION, vol. 176, no. 2, 1 January 2013 (2013-01-01), pages 974 - 25, XP055184622, ISSN: 20905661, DOI: 10.1155/2013/371854 *
HORNIG NORA; KERMER VANESSA; FREY KATHARINA; DIEBOLDER PHILIPP; KONTERMANN ROLAND E; MUELLER DAFNE: "Combination of a Bispecific Antibody and Costimulatory Antibody-Ligand Fusion Proteins for Targeted Cancer Immunotherapy", JOURNAL OF IMMUNOTHERAPY, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, US, vol. 35, no. 5, 1 June 2012 (2012-06-01), US, pages 418 - 429, XP009163394, ISSN: 1524-9557, DOI: 10.1097/CJI.0b013e3182594387 *
MÜLLER DAFNE; FREY KATHARINA; KONTERMANN ROLAND E: "A novel antibody-4-1BBL fusion protein for targeted costimulation in cancer immunotherapy.", JOURNAL OF IMMUNOTHERAPY, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, US, vol. 31, no. 8, 1 October 2008 (2008-10-01), US, pages 714 - 722, XP009183889, ISSN: 1537-4513 *
N. ZHANG, R. E. SADUN, R. S. ARIAS, M. L. FLANAGAN, S. M. SACHSMAN, Y.-C. NIEN, L. A. KHAWLI, P. HU, A. L. EPSTEIN: "Targeted and Untargeted CD137L Fusion Proteins for the Immunotherapy of Experimental Solid Tumors", CLINICAL CANCER RESEARCH, ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, vol. 13, no. 9, 1 May 2007 (2007-05-01), pages 2758 - 2767, XP055186494, ISSN: 10780432, DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-06-2343 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL251317B (en) 2021-05-31
JP7184938B2 (ja) 2022-12-06
RS61870B1 (sr) 2021-06-30
BR112017009006A2 (pt) 2018-04-10
SI3224275T1 (sl) 2020-07-31
US20190382507A1 (en) 2019-12-19
DK3489256T3 (da) 2021-05-25
CL2019003728A1 (es) 2020-07-17
ES2871045T3 (es) 2021-10-28
CN113372434A (zh) 2021-09-10
TWI757803B (zh) 2022-03-11
CL2017001000A1 (es) 2018-01-12
NZ730933A (en) 2024-02-23
US20220259327A1 (en) 2022-08-18
PT3224275T (pt) 2020-05-04
IL251317A0 (en) 2017-05-29
CN114634570A (zh) 2022-06-17
LT3489256T (lt) 2021-06-10
PH12017500892A1 (en) 2017-11-06
RS60201B1 (sr) 2020-06-30
EP3224275A1 (en) 2017-10-04
EP3489256B1 (en) 2021-03-17
EP3738609A1 (en) 2020-11-18
CO2017003212A2 (es) 2017-09-20
MX2017006250A (es) 2017-11-17
MX2020012798A (es) 2022-04-07
PL3224275T3 (pl) 2020-09-07
IL282922A (en) 2021-06-30
CA2963718A1 (en) 2016-05-19
KR102588377B1 (ko) 2023-10-12
PL3489256T3 (pl) 2021-08-23
MA40882A (fr) 2017-10-04
CN113372434B (zh) 2024-06-04
CN108064237B (zh) 2022-02-11
JP6873901B2 (ja) 2021-05-19
AU2022201144A1 (en) 2022-03-17
MA53242A (fr) 2021-06-23
US11306154B2 (en) 2022-04-19
AU2015345024B2 (en) 2020-10-15
HRP20210739T1 (hr) 2021-06-25
DK3224275T3 (da) 2020-05-04
WO2016075278A1 (en) 2016-05-19
SI3489256T1 (sl) 2021-08-31
US20160200833A1 (en) 2016-07-14
AU2020264337B2 (en) 2021-12-02
US20200247904A1 (en) 2020-08-06
AU2020264337A1 (en) 2021-01-28
UA125577C2 (uk) 2022-04-27
EP3489256A1 (en) 2019-05-29
HUE054122T2 (hu) 2021-08-30
HK1255482A1 (zh) 2019-08-16
US11267903B2 (en) 2022-03-08
US20220259326A1 (en) 2022-08-18
HUE049982T2 (hu) 2020-11-30
JP2018503356A (ja) 2018-02-08
MY191428A (en) 2022-06-27
MA40882B1 (fr) 2020-05-29
IL282922B (en) 2022-08-01
KR20170085552A (ko) 2017-07-24
TW202041527A (zh) 2020-11-16
TWI713474B (zh) 2020-12-21
EA201791057A1 (ru) 2017-10-31
KR20230146133A (ko) 2023-10-18
EP3224275B1 (en) 2020-03-04
SG11201703597TA (en) 2017-06-29
PE20221909A1 (es) 2022-12-23
CN108064237A (zh) 2018-05-22
US10392445B2 (en) 2019-08-27
TW201629094A (zh) 2016-08-16
LT3224275T (lt) 2020-05-25
ES2788979T3 (es) 2020-10-23
CR20170194A (es) 2017-07-10
HRP20200679T1 (hr) 2020-07-24
JP2021097674A (ja) 2021-07-01
PE20170896A1 (es) 2017-07-12
NZ767672A (en) 2024-02-23
AU2015345024A1 (en) 2017-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11306154B2 (en) Methods of treating cancer by administering antigen-binding molecules comprising a TNF family ligand trimer
US20220267395A1 (en) Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
US20210009656A1 (en) C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
US20230123178A1 (en) Antigen Binding Molecules comprising a TNF family ligand trimer and PD1 binding moiety