KR20230146133A - Tnf 계열 리간드 삼량체를 포함하는 항원 결합 분자 - Google Patents

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KR20230146133A
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산드라 그라우-리하르츠
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빅토르 레비츠키
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외르크 토마스 레굴라
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Abstract

본 발명은, (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 신규 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것으로서, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

TNF 계열 리간드 삼량체를 포함하는 항원 결합 분자{ANTIGEN BINDING MOLECULES COMPRISING A TNF FAMILY LIGNAD TRIMER}
본 발명은, (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 신규 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것으로, 이때 상기 항원 결합 분자는 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인(ectodomain) 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 상기 분자들의 제조 방법 및 상기 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.
TNF(tumor necrosis factor, 종양 괴사 인자) 수용체 상위계열(superfamily)의 분자와 상호작용하는 리간드는 면역계의 구성 및 기능에서 중요한 역할을 한다. 면역 반응, 조혈작용 및 형태형성과 같은 정상적인 기능들을 조절하는 동시에, TNF 계열 리간드들(사이토카인으로도 불림)은 종양형성, 이식 거부반응, 패혈성 쇼크, 바이러스 복제, 골흡수, 류마티스성 관절염 및 당뇨에서 한 역할을 한다(Aggarwal, 2003). TNF 리간드 계열은, 'TNF 상동성 도메인'(THD)에 의해 형성된 보존된 C-말단 도메인의 존재를 특징으로 하는 19개의 II형(즉, 세포내 N 말단 및 세포외 C-말단) 막관통 단백질을 암호화하는 18개의 유전자를 포함한다. 상기 도메인은 수용체 결합을 담당하므로, TNF 리간드 계열 구성원의 생물 활성에 중요하다. 계열 구성원들 사이의 서열 동일성은 약 20 내지 30%이다(Bodmer, 2002). TNF 리간드 계열의 구성원들은 자기-조립형, 비공유성 삼량체로서 그의 생물학적 기능을 발휘한다(Banner et al., Cell 1993, 73, 431-445). 따라서, TNF 계열 리간드들은 TNFR 상위계열의 상응하는 수용체들에 결합하고 상기 수용체들을 활성화시킬 수 있는 삼량체를 형성한다.
TNF 수용체 상위계열의 구성원인 4-1BB(CD137)는 처음에 그 발현이 T-세포 활성화에 의해 유도되는 분자로서 확인되었다(Kwon and Weissman, 1989). 후속 연구들은 T- 및 B-림프구(Snell et al., 2011; Zhang et al., 2010), NK-세포(Lin et al., 2008), NKT-세포(Kim et al., 2008), 단핵구(Kienzle and von Kempis, 2000; Schwarz et al., 1995), 호중구(Heinisch et al., 2000), 비만세포(Nishimoto et al., 2005) 및 수지상 세포뿐 아니라, 내피 및 평활근 세포(Broll et al., 2001; Olofsson et al., 2008)와 같은 비-조혈 기원을 갖는 세포들에서 4-1BB의 발현을 입증하였다. 상이한 세포 유형들에서 4-1BB의 발현은 주로 유도성이며, 다양한 자극 신호들, 예를 들면, T-세포 수용체(TCR) 또는 B-세포 수용체 유발 뿐 아니라, 전-염증성 사이토카인의 공-자극 분자 또는 수용체를 통해 유도된 신호전달에 의해 주도된다(Diehl et al., 2002; von Kempis et al., 1997; Zhang et al., 2010).
4-1BB 리간드(4-1BBL 또는 CD137L)의 발현은 더 제한되며, B-세포, 수지상 세포(DC) 및 대식세포와 같은 전문적 항원 제공 세포(APC) 상에서 관찰된다. 4-1BBL의 유도성 발현은 αβ 및 γδ T-세포 아집단 둘 다를 포함한 T-세포, 및 내피 세포에 특징적이다([Shao and Schwarz, 2011]에서 검토됨).
CD137 신호전달은 NK 세포의 IFNγ 분비 및 증식을 자극할 뿐 아니라(Buechele et al., 2012; Lin et al., 2008; Melero et al., 1998), 그의 증가된 생존 및 사이토카인을 분비하고 공-자극 분자를 상향조절하는 능력에 의해 나타나듯이 DC 활성화를 촉진하는 것으로 알려져 있다(Choi et al., 2009; Futagawa et al., 2002; Wilcox et al., 2002). 그러나, CD137은 T-세포의 CD4+ 및 CD8+ 아집단 둘 다에서 TCR-유도된 활성화를 조절하는 공-자극 분자로서 가장 잘 규정된다. TCR 유발과 함께, 작용성(agonistic) 4-1BB-특이적 항체는 T-세포의 증식을 증대시키고, 림포카인 분비를 자극하고, 활성화-유도된 세포 사멸에 대한 T-림프구의 민감성을 감소시킨다([Snell et al., 2011]에서 검토됨).
시험관내에서 T-세포에 대한 4-1BB 항체의 상기 공-자극 효과에 따라, 많은 실험 종양 모델에서 종양 함유 마우스에 상기 항체를 투여하면 강력한 항-종양 효과를 이끌어낸다(Melero et al., 1997; Narazaki et al., 2010). 그러나, 4-1BB는 통상적으로 다른 면역조절 화합물(Curran et al., 2011; Guo et al., 2013; Morales-Kastresana et al., 2013; Teng et al., 2009; Wei et al., 2013), 화학치료 시약(Ju et al., 2008; Kim et al., 2009), 종양-특이적 백신접종(Cuadros et al., 2005; Lee et al., 2011) 또는 방사선치료(Shi and Siemann, 2006)와 함께 투여될 때에만 항-종양제로서 그의 효능을 나타낸다. 생체내 고갈 실험은 CD8+ T-세포가 4-1BB-특이적 항체의 항-종양 효과에서 가장 결정적인 역할을 하는 것을 입증하였다. 그러나, 항-4-1BB를 포함하는 종양 모델 또는 병용 요법에 따라서, DC, NK-세포 또는 CD4+ T-세포와 같은 다른 유형의 세포들의 기여도 보고된 바 있다(Melero et al., 1997; Murillo et al., 2009; Narazaki et al., 2010; Stagg et al., 2011).
4-1BB 작용물질은 또한, 상이한 림프구 아집단에 대한 그의 직접적인 효과 이외에, 종양 혈관 내피 상에서의 세포간 부착 분자 1(ICAM1) 및 혈관 세포 부착 분자 1(VCAM1)의 4-1BB-매개된 상향조절을 통해, 종양내 활성화된 T-세포의 침윤 및 체류를 유도할 수 있다(Palazon et al., 2011).
4-1BB 유발은 또한 종양 미세환경에서 또는 만성 감염시에 면역 내성의 파괴에 기여할 수 있는 가용성 항원에 노출됨으로써 유도된 T-세포 무반응(anergy) 상태를 역전시킬 수 있다(Wilcox et al., 2004).
생체내에서 4-1BB 작용성 항체의 면역조절 성질은 항체 분자 상에 야생형 Fc-부분의 존재를 필요로 함으로써, TNFR-상위계열의 다른 세포자살-유도 또는 면역조절 구성원에 특이적인 작용성 항체들에 대해 기술되었듯이 Fc-수용체 결합이 상기 시약들의 약리학적 활성에 필요한 중요한 사건임을 시사하는 것으로 보인다(Li and Ravetch, 2011; Teng et al., 2009). 그러나, 기능적으로 활성인 Fc 도메인을 갖는 4-1BB-특이적 작용성 항체의 전신 투여는 또한, 마우스에서 기능성 Fc-수용체의 부재하에서 감소되거나 상당히 개선되는 간 독성과 연관된 CD8+ T-세포의 증식을 유도한다(Dubrot et al., 2010). 인간 임상 시험 (ClinicalTrials.gov, NCT00309023)에서, 12주동안 3주에 1회씩 투여된 Fc-반응능(Fc-competent) 4-1BB 작용성 항체(BMS-663513)는 흑색종, 난소 또는 신장 세포 암종을 갖는 환자에서 질환의 안정화를 유도하였다. 그러나, 또 다른 시험에서 제공된 동일 항체(NCT00612664)는 4급 간염을 유발하여 시험 종료를 초래하였다(Simeone and Ascierto, 2012).
총괄하여, 이용가능한 전임상 및 임상 데이터는 효과적인 4-1BB 작용물질이 임상적으로 높은 필요성이 있음을 명백하게 입증한다. 그러나, 신세대 약물 후보들은 조혈 세포 및 내피 세포의 표면 상에 4-1BB를 효과적으로 고정시켜야할 뿐 아니라 통제불가능한 부작용을 방지하기 위해 Fc-수용체에 대한 결합 이외의 다른 메카니즘을 통해 상기 고정을 달성할 수 있어야 한다. 후자는 종양-특이적 또는 종양-결합 잔기에 우선적인 결합 및 상기 잔기 상에서의 올리고머화를 통해 성취될 수 있다.
4-1BB 리간드 및 단일쇄 항체 단편(Mueller et al., 2008; Hornig et al., 2012) 또는 중쇄의 C-말단에 융합된 단일 4-1BB 리간드(Zhang et al, 2007)의 1개의 세포외 도메인으로 이루어진 융합 단백질이 제조되었다. WO 2010/010051 호는 서로에 결합되고 항체 일부에 융합되는 3개의 TNF 리간드 엑토도메인으로 이루어지는 융합 단백질의 제조를 개시하고 있다.
그러나, 종양-특이적 또는 종양-결합 표적에 우선적으로 결합할 수 있는 잔기를 동시자극 TNF 리간드 삼량체를 형성할 수 있는 잔기와 결합시키고 약학적으로 유용할 만큼 충분한 안정성을 갖는 새로운 항원 결합 분자가 여전히 요구된다. 삼량체화 TNF 리간드 엑토도메인들 중 하나는 분자의 다른 2개의 TNF 리간드 엑토도메인이 아닌 또 다른 폴리펩티드 상에 위치하긴 하지만, 본 발명의 항원 결합 분자는 둘 다를 포함하고 놀랍게도 이들은 삼량체성이면서 따라서 생물학적으로 활성인 TNF 리간드를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다).
특정 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기,
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다), 및
(c) 안정하게 결합할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛(subunit)으로 이루어진 Fc 도메인.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
[이때, 상기 항원 결합 분자는,
(i) 제 1 폴리펩티드가 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고 제 2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 각각 함유하고, 이때 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나, 또는
(ii) 상기 제 1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하고, 이때 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나, 또는
(iii) 상기 제 1 폴리펩티드가 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 각각 함유하고, 이때 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1 및 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 VH 또는 VL에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다].
특정 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원은 인간 T-세포 활성화를 동시자극하는 것이다. 따라서, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 TNF 리간드 계열 구성원이 인간 T-세포 활성화를 동시자극하는 것을 특징으로 한다. 보다 특히, TNF 리간드 계열 구성원은 4-1BBL 및 OX40L로부터 선택된다.
한 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원은 4-1BBL이다.
또 다른 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 96, 서열번호 373, 서열번호 374 및 서열번호 375로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인 또는 그의 단편은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 96으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 특히, TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인은 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 184 또는 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) CH1 또는 CL 도메인을 함유하는 제 1 폴리펩티드, 및 CL 또는 CH1 도메인을 함유하는 제 2 폴리펩티드(이때, 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합된다) 각각을 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 양태에서, 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기,
(b) CH1 도메인을 함유하는 제 1 폴리펩티드 및 CL 도메인을 함유하는 제 2 폴리펩티드(이때, 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합되고, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH1 도메인에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 도메인에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다).
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기,
(b) CL 도메인을 함유하는 제 1 폴리펩티드 및 CH1 도메인을 함유하는 제 2 폴리펩티드(이때, 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합되고, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CL 도메인에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH1 도메인에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다).
또 다른 양태에서, 본 발명은, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 항체, 항체 단편 및 스캐폴드(scaffold) 항원 결합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 항체 단편인, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특히, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 항체 단편, Fab 분자, 교차 Fab 분자, 단일쇄 Fab 분자, Fv 분자, scFv 분자, 단일 도메인 항체, VH 및 스캐폴드 항원 결합 단백질로 이루어진 군에서 선택된다.
한 양태에서, 본 발명은, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 스캐폴드 항원 결합 단백질인, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명은, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인, 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
본 발명은 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 양태에서, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개의 잔기를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(Fibroblast Activation Protein, FAP), 암배아 항원(Carcinoembryonic Antigen, CEA), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(Melanoma-associated Chondroitin Sulfate Proteoglycan, MCSP), 상피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군에서 선택되는, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다.
한 양태에서, 본 발명은, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 7 또는 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 8 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 9 또는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 10 또는 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 11 또는 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 12 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명은, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하거나, 또는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 CH1 또는 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편이 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 경쇄 상의 CL 또는 CH1 도메인에 융합되는, 본 발명에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 본 발명은, 펩티드 링커가 (G4S)2, 즉 서열번호 13의 펩티드 링커인, 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다. 한 양태에서, 제 1 펩티드 링커는 (G4S)2이고, 제 2 펩티드 링커는 GSPGSSSSGS(서열번호 57)이고, 제 3 펩티드 링커는 (G4S)2이다. 또 다른 양태에서, 제 1, 제 2 및 제 3 펩티드 링커는 (G4S)2이다.
본 발명은 또한, 안정하게 결합할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
특히, (c) 안정하게 결합할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 또한 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하며, 이때 상기 Fab 중쇄는 C-말단에서 Fc 도메인 내의 CH2 도메인의 N-말단에 융합된다.
또 다른 양태에서, Fc 도메인은 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특히, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 특정 양태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (c) 안정하게 결합할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것으로, 이때 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특히, Fc 도메인은 IgG 중쇄의 위치 234 및 235(EU 번호) 및/또는 329(EU 번호)에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특히, 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(EU 번호)를 갖는 IgG1 Fc 도메인을 포함하는, 본 발명에 따른 삼량체성 TNF 계열 리간드-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 각각 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다:
둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄,
그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 제 2 중쇄 또는 경쇄에 융합된 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드, 및
그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 제 2 경쇄 또는 중쇄에 융합된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인을 포함하는 제 2 펩티드.
또 다른 양태에서, 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 펩티드가 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 펩티드가 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 VH 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 펩티드가 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 VL 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
또한, TNF 리간드 계열 구성원에 인접한 CL 도메인에서 위치 123(EU 번호)에서의 아미노산이 아르기닌(R)으로 치환되고 위치 124(EU 번호)에서의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, TNF 리간드 계열 구성원에 인접한 CH1 도메인에서 위치 147(EU 번호) 및 위치 213(EU 번호)에서의 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환된, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄,
(b) 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자, 및
(b) 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
특정 양태에서, 본 발명은 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 한 양태에서, 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 14, 서열번호 108, 서열번호 111, 서열번호 113, 서열번호.115, 서열번호 139 및 서열번호 148로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 15, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 112, 서열번호 114 및 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다:
(i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 115, 서열번호 117, 서열번호 119 및 서열번호 173으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120 및 서열번호 174로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하고, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다).
특히, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특히, 다음을 포함하는, 본원에서 상기 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(ii) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(iii) 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은, 표적 세포 항원이 CD19인, 본원에서 상기 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양태에서, CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 195 또는 서열번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 196 또는 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 197 또는 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 198 또는 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 199 또는 서열번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 200 또는 서열번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하거나, 또는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 14, 서열번호 108, 서열번호 111 및 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 15, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 112 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 115, 서열번호 117, 서열번호 119 및 서열번호 173으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120 및 서열번호 174로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
한 양태에서, 본 발명은 CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특히, 다음을 포함하는, 청구항 제 1 항 내지 제 14 항, 제 29 항, 제 30 항 및 제 32 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(ii) 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(iii) 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 310의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(iv) 서열번호 313의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 314의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은, 표적 세포 항원이 CEA인, 본원에서 상기 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양태에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 321의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 322의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 323의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 324의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 326의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 결합 분자가 제공된다.
한 양태에서, 다음을 포함하는, 본원에서 상기 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 14, 서열번호 108, 서열번호 111 및 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 15, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 112 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 115, 서열번호 117, 서열번호 119 및 서열번호 173으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120 및 서열번호 174로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
한 양태에서, 본 발명은, CEA 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특히, 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 337의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 338의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(ii) 서열번호 341의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 342의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄.
또 다른 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원이 OX40L인, 본원에서 상기 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 한 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인이 서열번호 53 또는 서열번호 54의 아미노산 서열, 특히 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 청구항 제 1 항 내지 제 5 항, 제 10 항 내지 제 24 항, 제 29 항, 제 30 항, 제 32 항 내지 제 34 항, 제 38 항 내지 제 40 항, 제 44 항 및 제 45 항 중 어느 한 항의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 371 또는 서열번호 372의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 53 또는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다).
또 다른 양태에서, 표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 7 또는 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 8 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 9 또는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 10 또는 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 11 또는 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 12 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
특히, 다음을 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 결합 분자가 제공된다:
(i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 355로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 356의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본 발명은 또한, 본 발명의 상기 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터, 및 본 발명의 상기 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포이다.
또 다른 양태에서, (i) 본 발명의 숙주 세포를 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, (ii) 상기 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 제조 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 상기 본 발명의 방법에 의해 생성된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에는 약제로 사용하기 위한, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 포함된다. 한 양태에서, 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 암의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물 치료 효과량을 그를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 특히 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 용도가 제공된다. 구체적 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 임의의 상기 실시양태에서, 개체는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
도 1은 분할된 삼량체성 인간 4-1BB 리간드의 조립을 위한 구성성분들을 나타낸다. 도 (1A)는 C-말단에서 인간 CH1 또는 CL 도메인 또는 VL 또는 VH 도메인에 융합되는 이량체성 리간드를 나타내고, 도 (1B)는 인간 CL 또는 CH1 도메인 또는 VL 또는 VH 도메인에 융합되는 단량체성 리간드를 나타낸다. 도 (1C)는 N-말단에서 인간 CH3 도메인에 융합되는 이량체성 리간드를 나타내고, 도 (1D)는 N-말단에서 인간 CH3 도메인에 융합되는 단량체성 리간드를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 4-1BBL-삼량체-함유 항원 결합 분자 구조물 1.1 내지 1.10을 나타낸다. 이들 구조물의 제조 및 생성은 실시예 1에 기술되어 있다. VH 및 VL 도메인은 항-FAP 항체 28H1의 도메인들이고, 진한 검은색 점은 놉-인투-홀(knob-into-hole) 변형을 나타낸다. *는 CH1 및 CL 도메인에서의 아미노산 변형(소위 하전된 잔기들)을 상징한다.
도 3은 분할된 삼량체 뮤린 4-1BB 리간드의 조립을 위한 구성성분들을 나타낸다. 도 (3A)는 C-말단에서 뮤린 CL 도메인에 융합되는 이량체성 리간드를 나타내고, 도 (3B)는 C-말단에서 뮤린 CH1 도메인에 융합되는 단량체성 리간드를 나타낸다. FAP 표적화 분할 삼량체 뮤린 4-1BB 리간드의 조립을 위한 구성성분들. 도 (3C)는 실시예 1.3에서 보다 상세하게 기술된 바와 같은 조립된 뮤린 4-1BBL-삼량체-함유 항원 결합 분자를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 4-1BBL-삼량체-함유 항원 결합 분자 구조물 2.1 내지 2.6을 나타낸다. 이들 구조물의 제조 및 생성은 실시예 2에 기술되어 있다. VH 및 VL 도메인은 항-FAP 항체 4B9의 도메인들이고, 진한 검은색 점은 놉-인투-홀 변형을 나타낸다. *는 CH1 및 CL 도메인에서의 아미노산 변형(소위 하전된 잔기들)을 상징한다.
도 5A 및 도 5B는 항-FAP Fab 분자 대신 DP47 Fab 분자를 포함하는 구조물 1.1 및 1.2의 "비표적화" 변이체를 나타낸다. 상기 분자들은 대조군 A 및 대조군 B로 각각 지칭된다. 제조는 실시예 1.4에 기술되어 있다. 도 5C는 실시예 3에서 제조된 바와 같은 단량체 4-1BB Fc(kih) 구조물의 그림이다.
도 6은 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(FAP 분할 4-1BBL 삼량체, 속이 채워진 원) 또는 DP-47 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 분자(DP47 분할 4-1BBL 삼량체, 속이 빈 원)의 휴지(나이브(naive)) 또는 활성화된 인간 PMBC에 대한 결합에 관한 것이다. 구체적으로, 휴지(나이브) 또는 활성화 인간 CD8+ T 세포에 대한 결합은 도 (6A)에 나타나 있고, 나이브 또는 활성화 인간 CD4+ T 세포에 대한 결합은 도 (6B)에 나타나 있고, 휴지(나이브) 또는 활성화 인간 NK 세포에 대한 결합은 도 (6C)에 나타나 있다. 2차 검출 항체로 사용된 거대수생 홍조류(red macrophytic algae) 피코에리트린(Phycoerythrin)(R-PE)-표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 평균 형광 강도(Median of fluorescence intensity, MFI)로서 결합을 나타내었다. MFI는 유동세포분석에 의해 측정하였으며, 블랭크 대조군의 MFI를 차감함으로써 기준선 보정되었다.
도 7에는 PHA-L 및 프로류킨(Proleukin) 예비활성화된 인간 PBMC 및 항-인간 CD3/항-인간 CD28 재활성화된 인간 PBMC로부터의 인간 4-1BB 발현 T 세포에 대한 상이한 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물의 결합이 나타나 있다. 결합은 R-피코에리트린-형광색소 접합된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편을 사용하여 검출하였다. 실시예 1의 시험된 구조물 1.1 내지 1.10의 평균 형광 강도(MFI) 대 농도를 나타내었다. 더 잘 표시하기 위해, 결합 곡선을, 비교 곡선들로서 구조물 1.1(1가 FAP-표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih)) 및 대조군 B(CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 1가 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih))를 사용하여 4개의 상이한 블롯들로 분할하였다. 결합은 CD3+ CD8+ T 세포(도 7a) 및 CD3+ CD4+ T 세포(도 7b) 상에서 모니터링하였다. CD8 T 세포 상에서의 4-1BB 발현 수준이 정상적으로는 CD4 T 세포 상에서보다 더 높다. 모든 버전들이 인간 4-1BB에 매우 유사한 친화도하에 결합한다.
도 8은 신선한 PBMC로부터의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 대한(도 8a), 또는 인간 4-1BB 발현 PHA-L 및 프로류킨 예비활성화 및 항-인간 CD3/항-인간 CD28 재활성화 인간 PBMC에 대한(도 8b) 상이한 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물의 결합을 나타낸다. 결합은 R-피코에리트린-형광색소 접합된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편을 사용하여 검출하였다. 실시예 2의 시험된 구조물 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 및 2.6 및 대조군 분자 대조군 B, 대조군 C, 대조군 E 및 대조군 F의 평균 형광 강도(MFI) 대 농도를 나타내었다. 더 잘 표시하기 위해, 결합 곡선을, 비교 곡선들로서 구조물 2.1(1가 FAP-표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih)) 및 대조군 B(CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 1가 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih))를 사용하여 2개의 상이한 블롯들로 분할하였다. 결합은 CD45+ CD3+ CD8+ T 세포(아래쪽 블롯) 및 CD45+ CD3+ CD4+ T 세포(위쪽 블롯) 상에서 모니터링하였다. CD8 T 세포 상에서의 4-1BB 발현 수준이 정상적으로는 CD4 T 세포 상에서보다 더 높다. 모든 구조물들이 인간 4-1BB에 매우 유사한 친화도하에 결합하는 반면, 2가 구조물 2.3 및 그의 비표적화 대조군 C는 더 낮은 MFI를 나타낸다. 이것은 4-1BB-결합의 입체 장애 및/또는 Fc-접합된 분할 4-1BB 리간드에 의해 유도된 2차 검출 항체로 인한 더 낮은 검출에 기인할 수 있다.
도 9에는 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(FAP 분할 4-1BBL 삼량체, 속이 채워진 원) 또는 DP47 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(DP47 분할 4-1BBL 삼량체; 속이 빈 원)의 활성화된 마우스 비장세포에 대한 결합이 나타나 있다. 특히, 활성화된 마우스 CD4+ T 세포에 대한 결합은 도 9A에 나타나 있고 활성화된 마우스 CD8+ T 세포에 대한 결합은 도 9B에 나타나 있다. 항-마우스 CD137-특이적 인간 IgG1 P329G LALA 항체(클론 Lob12.3)가 양성 대조군(삼각형)으로 사용되었다. 결합은, 2차 검출 항체로 사용된 R-PE-표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 MFI 대 시험한 분할 4-1BBL 삼량체 구조물의 농도(nM)를 플로팅함으로써 특성화된다. MFI는 유동세포분석으로 측정하였으며 블랭크 대조군의 MFI를 차감함으로써 기준선 보정되었다.
도 10은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)-발현 인간 흑색종 (A) MV-3 세포주 및 (B) WM-266-4 세포주에 대한 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(속이 채워진 원: FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 구조물 1.1, 속이 빈 원: DP47 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 대조군 A)의 결합을 나타낸다. 상기 결합은 2차 검출 항체로 사용된 R-PE-표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 MFI 대 시험한 분할 4-1BBL 삼량체 구조물의 농도(nM)를 플로팅함으로써 특성화된다. MFI는 유동세포분석으로 측정하였으며, 블랭크 대조군의 MFI를 차감함으로써 기준선 보정되었다.
도 11에는 인간-FAP 발현 인간 흑색종 MV-3 세포(도 11a) 및/또는 NIH/3T3-huFAP 클론39 형질감염된 마우스 배아 섬유아세포(도 11b)에 대한 상이한 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물의 결합이 나타나 있다. 결합은 R-피코에리트린-형광색소 또는 플루오레세인-형광색소 접합된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편을 사용하여 검출하였다. 시험한 구조물들의 평균 형광 강도(MFI) 대 농도를 나타내었다. 더 잘 표시하기 위해, 결합 곡선을, 4개(도 11a) 또는 2개 블롯(도 11b)으로 나눈 반면, 구조물 1.1(1가 FAP-표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih))가 비교 곡선으로 사용된다. 2가 FAP-표적화 구조물(구조물 1.5, 1.7 및 1.8)을 제외하고 모든 구조물들이 인간 FAP에 유사한 친화도하에 결합한다. 이들은 더 낮은 EC50 값 및 더 낮은 평균 형광 강도를 갖는 경향을 나타내었다. 이것은 그의 2가 표적화로 설명될 수 있다(결합활성이 높을수록, 2개 에피토프의 점유로 인해 동시에 더 적은 분자들이 결합할 수 있으므로 더 낮은 MFI를 야기한다). 구조적 차이도 또한 구조물 1.8(완전 2가 표적화) 및 구조물 1.5 및 1.7(단지 일부의 2가 표적화) 사이의 차이를 설명할 수 있다.
도 12에는 인간-FAP 발현 인간 흑색종 MV-3 세포(도 12a) 및 WM-266-4 세포(도 12b)에 대한 상이한 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 및 2.6의 결합이 나타나 있다. 결합은 R-피코에리트린-형광색소 접합된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편을 사용하여 검출하였다. 시험한 구조물들의 평균 형광 강도(MFI) 대 농도를 나타내었다. 더 잘 표시하기 위해, 결합 곡선을, 2개 블롯으로 나눈 반면, 구조물 2.1(1가 FAP-표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih))가 비교 곡선으로 사용된다. 2가 FAP-표적화 구조물 2.3을 제외하고 모든 구조물들이 인간 FAP에 유사한 친화도하에 결합한다. 상기 구조물 2.3은 더 낮은 EC50 값 및 더 낮은 평균 형광 강도를 나타내는 경향을 갖는다. 이것은 그의 2가 표적화로 설명될 수 있으며, 상기 2가 표적화는 더 높은 결합활성을 야기하지만 세포 표면상에 FAP 분자의 더 낮은 점유를 야기하여 더 낮은 MFI를 야기한다.
도 13은 신선한 비장세포로부터의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 대한(도 13A) 또는 활성화된 마우스 비장세포로부터의 마우스 4-1BB 발현 항-마우스 CD3/항-마우스 CD28 단일클론 작용성 항체에 대한(도 13B) 상이한 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 마우스 4-1BB Fc(kih) 구조물의 결합을 나타낸다. 결합은 FITC-형광색소 접합된 항-마우스 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편을 사용하여 검출하였다. 시험한 구조물들의 평균 형광 강도(MFI) 대 농도를 나타내었다. 결합은 CD3+ CD8+ T 세포(왼쪽 블롯) 및 CD3+ CD4+ T 세포(오른쪽 블롯) 상에서 모니터링하였다. CD8 T 세포 상에서의 4-1BB 발현 수준이 정상적으로는 CD4 T 세포 상에서보다 더 높다. 모든 구조물들은 마우스 4-1BB에 매우 유사한 친화도하에 결합한다.
도 14에는 인간 FAP 발현 종양 세포에 대한 상이한 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 마우스 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물의 결합을 나타내었다. 결합은 FITC-형광색소 접합된 항-마우스 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편을 사용하여 검출하였다. 시험한 구조물들의 평균 형광 강도(MFI) 대 농도를 나타내었다. 결합은 MV-3 세포(도 14A) 및 WM-266-4 세포(도 14B) 상에서 모니터링하였다. FAP-표적화 분할 삼량체 마우스 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물 M.1 및 M.2는 FAP에 매우 유사한 친화도하에 결합한다.
도 15는 리포터 세포주를 사용한 실시예 6.1에 기술된 NFκB 활성 분석의 일반 원리를 예시하는 도식을 나타낸다. 인간 4-1BB 발현 HeLa 리포터 세포주를 사용한 활성화 분석 구성을 나타내었다. 리포터 세포 상에서 발현된 4-1BB의 가교결합은 NFκB 활성화 및 NFκB-매개된 루시퍼라제 발현을 유도한다. 세포의 용해후에 루시퍼라제는 루시페린의 옥시루시페린으로의 산화를 촉진할 수 있다. 상기 화학 반응은 NFκB-매개된 루시퍼라제 발현의 강도와 명확하게 상관되며, 광 방출 강도(방출광의 단위)에 의해 측정될 수 있다. FAP-발현 종양 세포 대 리포터 세포주 HeLa-huCD137-NFκB-luc의 비는 5 대 1이었다.
도 16에는 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 1.1)에 의한 NFκB 신호전달 경로의 활성화가 FAP-발현 표적 세포에 대한 그의 결합에 분명하게 의존하는 것을 나타내었다. 인간 CD137 발현 NFκB 리포터 HeLa 세포를 상이한 수준의 세포 표면 FAP 발현을 나타내는 지시된 종양 세포들과 함께 공-배양하였다. 루시퍼라제 활성은, 세포를 지시된 농도에서 4-1BBL-함유 분자의 부재 또는 존재하에서 6 시간동안 배양한 후에 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 평가하였다. 속이 채워진 원은 구조물 1.1을 나타낸다. 속이 빈 원은 DP47 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(대조군 A)를 나타낸다. 그래프 (A)에서는 세포주 NIH/3T3-인간 FAP 클론 39를 표적 세포로 사용하였고, 그래프 (B)는 표적 세포로서 MV3 세포주를 사용한 활성화를 나타내고, 그래프 (C)는 표적 세포로서 WM-266-4 세포주를 사용한 활성화를 나타낸다. 활성은, 0.5초동안 측정된 방출광의 단위(URL) 대 시험한 분할 4-1BBL 삼량체 구조물의 농도(nM)를 블롯화함으로써 특성화된다. URL은 루시페린의 옥시루시페린으로의 루시퍼라제-매개 산화로 인해 방출된다.
도 17은 실시예 6.1에 기술된 분석으로 측정된 바와 같은 NFκB-활성화-유도된 루시퍼라제 발현 및 활성을 나타낸다. 초당 방출광의 카운트(count)(CPS)를 0.5 초/웰동안 측정하고 FPA-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물의 사용 농도에 대해 플로팅한다. 인간 4-1BB-발현 HeLa-리포터 세포를 가교결합 인간-FAP 발현 인간 흑색종 세포주 MV-3(도 17b) 또는 WM-266-4(도 17c)의 부재(도 17a) 또는 존재하에서 6 시간동안 배양하였다. CPS를 측정하고 상이한 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물들의 농도에 대해 블롯화하였다. 세포 비는 1개 인간 4-1BB-발현 HeLa 리포터 세포 대 5개 종양 세포이다. 더 잘 표시하기 위해, 활성화 곡선을, 비교 곡선으로서 구조물 1.1(1가 FAP-표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih)) 및 대조군 B(CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 1가 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih))를 사용하여 4개의 상이한 디스플레이-블롯들로 분할하였다. 도 17a는 가교결합 FAP-발현 종양 세포 부재하에서의 활성화를 나타내고, 도 17b는 가교결합 FAP-발현 MV-3 종양 세포의 존재하에서의 활성화를 나타내고, 도 17c는 가교결합 FAP-발현 WM-266-4 종양 세포의 존재하에서의 활성화를 나타낸다.
도 18은 실시예 2의 구조물들에 대해 측정된 바와 같은 NFκB-활성화-유도된 루시퍼라제 발현 및 활성을 나타낸다. 방출광 단위(URL)를 0.5 초/웰동안 측정하고 FPA-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물들의 사용 농도에 대해 플로팅한다. 인간 4-1BB-발현 HeLa-리포터 세포를 가교결합 인간-FAP 발현 인간 흑색종 세포주 MV-3 또는 WM-266-4의 부재 또는 존재하에서 6 시간동안 배양하였다. URL을 측정하고 상이한 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 및 2.6 및 대조군 B, C, E 및 F의 농도에 대해 블롯화하였다. 세포 비는 1개 4-1BB-발현 HeLa 리포터 세포 대 5개 종양 세포이다. 더 잘 표시하기 위해, 활성화 곡선을, 구조물 2.1(1가 FAP-표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih))를 사용하여 2개의 상이한 디스플레이-블롯들로 분할하였다.
도 19에는 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이 4-1BB 발현 T293-HEK 리포터 세포주를 사용한 활성화 분석 구성을 나타내었다. 리포터 세포 상에서 발현된 사이노몰구스 원숭이 4-1BB의 가교결합은 NFκB 활성화 및 NFκB-매개된 루시퍼라제 발현을 유도한다. 세포의 용해후에 루시퍼라제는 루시페린의 옥시루시페린으로의 산화를 촉진할 수 있다. 상기 화학 반응은 NFκB-매개된 루시퍼라제 발현의 강도와 명확하게 상관되며, 광 방출 강도(방출광의 단위)에 의해 측정될 수 있다.
도 20은 NFκB-활성화-유도된 루시퍼라제 발현 및 활성을 나타낸다. 방출광 단위(URL)를 0.5 초/웰동안 측정하고 FPA-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물의 사용 농도에 대해 플로팅한다. 사이노몰구스 원숭이 4-1BB-발현 T293-HKE-리포터 세포를 가교결합 인간-FAP 발현 인간 흑색종 세포주 MV-3 또는 WM-266-4의 부재 또는 존재하에서 6 시간동안 배양하였다. URL을 측정하고 상이한 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물들의 농도에 대해 블롯화하였다. 세포 비는 1개 4-1BB-발현 T293-HEK 리포터 세포 대 5개 MV-3 또는 2개 WM-266-4 세포이다. 더 잘 표시하기 위해, 활성화 곡선을, 비교 곡선으로 구조물 2.1을 사용하여 2개의 상이한 블롯들로 분할하였다.
도 21은 실시예 6.3에 기술된 T-세포 활성화 분석의 원리를 예시하는 도식이다. 상이한 적정 농도의 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물들의 존재하에서 HLA-A2-NLV-특이적 CD8 T 세포 및 NLV-펄스된 HLA-A2+ FAP+ 인간 흑색종 세포주 MV-3을 사용한 도식적 활성화 분석 구성을 나타내었다. 세포를 28 시간동안 배양하였으며, 마지막 4 시간은 모네신-함유 골지-스톱(Golgi-Stop)의 존재하에서 배양하였다. NLV-특이적 CD8 T 세포 대 MV-3 종양 세포의 비는 1:8이다.
도 22a 내지 22e 및 23a 내지 23e는 실시예 1에서 제조된 바와 같은 상이한 적정 농도의 상이한 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물의 존재하에서 HLA-A2-NLV-특이적 CD8 T 세포 및 NLV-펄스된 HLA-A2+ FAP+ 인간 흑색종 세포주 MV-3을 사용한 활성화 분석에 관한 것이다. 더 잘 표시하기 위해, 발현 곡선을, 비교 곡선들로서 구조물 1.1(1가 FAP-표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih)) 및 대조군 B(1가 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih))를 사용하여 여러개의 상이한 디스플레이-블롯으로 분할하였다. 결과는 4개의 독립적인 유사한 실험들에서 수득되었으며, NLV-특이적 CD8+ T 세포의 연장된 IFNγ 분비 및 CD137 발현은 NLV-HLA-A2 복합체의 인식을 통한 T-세포의 동시 활성화(신호 1) 및 FAP-표적화 인간 분할 4-1BBL에 의한 4-1BB-유발(신호 2)에 분명하게 의존함을 보여준다. 4-1BB 상향조절의 효과는 도 22의 그래프들에 나타낸 반면, CD8+ T 세포의 INFγ 발현의 효과는 도 23의 그래프들에 나타내었다. 빈도는 항상 전체 CD8+ T 세포 집단중 양성 세포의 백분율로 나타낸다. 모든 FAP-표적화 변이체들은 24시간의 자극후에 도 22에서 4-1BB-상향조절(양성 피드백 루프)로서 나타내고 도 23에서 IFNγ 발현으로 나타낸 NLV-펩티드 활성화된 CD8 T 세포의 유사한 활성화 개선을 유도하였다. 곡선들의 차이는 정상적인 오류 편차의 범위안에 들며 의미가 없다.
도 24 및 25는 적정된 농도의 상이한 실시예 2의 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물들의 존재하에서 HLA-A2-NLV-특이적 CD8 T 세포 및 NLV-펄스 HLA-A2+ FAP+ 인간 흑색종 세포주 MV-3을 사용한 활성화 분석을 나타낸다. 더 잘 표시하기 위해, 발현 곡선을, 비교 곡선들로서 구조물 2.1(1가 FAP-표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih)) 및 대조군 B를 사용하여 2개의 상이한 디스플레이-블롯으로 분할하였다. 모든 FAP-표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물들은, 24시간의 자극후에 도 24에서 4-1BB-상향조절(양성 피드백 루프)로서 나타내고 도 25에서 IFNγ 발현으로 나타낸 HLA-A2-NLV-펩티드 특이적 CD8 T 세포의 유사한 활성화 개선을 나타낸다. 곡선들의 차이는 정상적인 오류 편차의 범위안에 들며 의미가 없다.
도 26은 실시예 6.4에 기술된 바와 같은 실험을 예시하는 도식이다.
도 27은 CD8+ T 세포 증식의 유도를 나타낸다. 증식 CD8+ T 세포의 빈도 대 시험한 구조물들의 농도를 나타내었다.
도 28a는 건강한 NOG 마우스에서 구조물 1.2 및 대조군 B의 단일 용량 PK 실험에 관한 것이다. 시간 경과에 따른 구조물 농도의 감소를 나타내었다. 도 28b는 줄기 세포로 인간화된 종양 함유 NOG 마우스에서 구조물 2.1, 2.3, 대조군 B 및 대조군 C의 단일 용량 PK 실험의 결과를 나타낸다. 도 28c는 건강한 NOG 마우스에서 구조물 2.1 및 2.3을 비교하는 단일 용량 PK 실험에 관한 것이다.
도 29는 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드의 조립을 위한 구성성분을 나타낸다. 도 (29A)는 C-말단에서, 돌연변이 E123R 및 Q124K(하전된 잔기들)를 갖는 인간 CL 도메인에 융합되는 이량체 리간드를 나타내고, 도 (29B)는 돌연변이 K147E 및 K213E(하전된 잔기들)를 갖는 인간 CH1 도메인에 융합되는 단량체 4-1BB 리간드를 나타낸다. 2가 CD19-표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-254) 항원 결합 분자(구조물 3.3)의 조립을 위한 구성성분들. 도 (29C)는 인간 IgG1 Fc 홀(hole) 쇄의 C-말단에 융합되는 이량체 리간드를 나타낸다. 도 (29D)는 인간 IgG1 Fc 놉(knob) 쇄의 C-말단에 융합되는 단량체 리간드를 나타낸다.
도 30은 본 발명의 CD19-표적화 4-1BBL-삼량체-함유 항원 결합 분자 구조물 3.1 내지 3.6을 나타낸다. 이들 구조물의 제조 및 생성은 실시예 3에 기술되어 있다. VH 및 VL 도메인은 항-CD19 항체 8B8-018의 도메인들이고, 진한 흑색점은 놉-인투-홀 변형을 나타낸다. *는 CH1 및 CL 도메인에서의 아미노산 변형(소위 하전된 잔기들)을 상징한다.
도 31a에는 모 클론 8B8의 CDR 영역들에 대한 무작위선정 전략이 예시되어 있다. 모 클론 8B8의 가변 도메인 및 카바트(Kabat)의 번호체계에 따른 CDR 영역들(박스안)을 나타내었다. (X)는 무작위선정된 위치들을 나타낸다. 도 31b는 라이브러리 제작 전략을 도식적으로 기술한 것을 나타낸다. a) 경쇄 및 중쇄에 무작위선정된 CDR1 및 CDR2 영역들을 갖거나, 또는 b) 경쇄에 무작위선정된 CDR1 및 CDR3 영역 및 중쇄에 CDR3 영역을 갖는 8B8-기반 라이브러리의 제작에 사용된 PCR 증폭 및 클로닝 전략을 나타내었다. 파지미드로의 클로닝에 사용된 각각의 효소들이 표시되어 있다.
도 32는 선택된 친화도-증진된 결합자(binder)들과 모 항-CD19 클론 8B8을 정렬한 것을 나타낸다. 클론 8B8 및 모든 선택된 친화도-증진된 결합자들의 서열을 나타내었다. 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 프레임안에 나타내었다.
도 33은 모 8B8 클론 및 그의 친화도-증진된 변이체들의 SPR 분석에 관한 것이다. 클론 8B8, 및 LCDR1 N27d 및 N28 다발점(hotspot)이 없는 그의 친화도-증진된 유도체들의 센서그램을 나타내었다.
도 34는 CD19 표적화 삼량체 분할 4-1BBL의 hu4-1BB 및 huCD19에 대한 동시 결합을 측정하는 분석의 구성을 예시한다(실시예 8.2).
도 35의 그래프들은 고정화된 인간 4-1BB 및 인간 CD19(분석물 2)에 대한 CD19 표적화 삼량체 4-1BBL FC 융합 항원 결합 분자 구조물 3.1, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 및 4.4(분석물 1)의 동시 결합을 나타낸다.
도 36은 PHA-L 및 프로류킨 예비활성화 및 항-인간 CD3/항-인간 CD28 재활성화 인간 PBMC의 4-1BB 발현 CD4 및 CD8 T 세포에 대한 상이한 CD19-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물들의 결합을 나타낸다. 결합은 R-피코에리트린-형광색소 접합된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편을 사용하여 검출하였다. 시험한 구조물들의 평균 형광 강도(MFI) 대 농도를 나타내었다. 더 잘 표시하기 위해, 결합 곡선을, 비교 곡선들로서 구조물 3.4 및 대조군 F(이소타입 대조군 huIgG1 P329G LALA)를 사용하여 3개의 상이한 블롯들로 분할하였다. 결합은 CD45+ CD3+ CD8+ T 세포(도 36a) 및 CD45+ CD3+ CD4+ T 세포(도 36b) 상에서 모니터링하였다. CD8 T 세포상에서의 4-1BB 발현이 정상적으로는 CD4 T 세포상에서보다 더 높다. 모든 구조물들이 인간 4-1BB에 매우 유사한 친화도하에 결합한다.
도 37은 인간-CD19 발현 B 세포 림프종 세포주: 미만성 거대 비-호지킨 B 세포 림프종 SU-DHL-8(도 37a), 급성 B 세포 전구체 림프구성 백혈병 Nalm6(도 37b), 미만성 거대 세포 림프아구 림프종 톨레도(Toledo)(도 37c) 및 미만성 거대 B 세포 림프종 OCI-Ly18(도 37d)에 대한 CD19-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 항원 결합 분자의 결합을 나타낸다. 결합은 R-피코에리트린-형광색소 접합된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편을 사용하여 검출하였다. 시험한 구조물들의 평균 형광 강도(MFI) 대 농도를 나타내었다. 더 잘 표시하기 위해, 결합 곡선을, 비교 곡선들로서 구조물 3.4 및 대조군 F(이소타입 대조군 huIgG1 P329G LALA)를 사용하여 3개의 상이한 블롯들로 분할하였다. 모든 구조물들이 인간 CD-19에 매우 유사한 친화도하에 결합한다.
도 38은 CD19-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 항원 결합 분자들의 NFκB-활성화-유도된 루시퍼라제 발현 및 활성에 관한 것이다. 방출광 단위(URL)를 0.5 초/웰동안 측정하고 CD19-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물 3.1 및 3.3 및 대조군 분자 B 및 C의 사용 농도에 대해 플로팅한다. 인간 4-1BB-발현 HeLa-리포터 세포를 가교결합 인간-CD19 발현 SU-DHL-8 또는 파이퍼(Pfeiffer) 세포의 부재 또는 존재하에서 7.5 시간동안 배양하였다. URL을 측정하고 상이한 CD19-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물들의 농도에 대해 블롯화하였다. 세포 비는 1개 4-1BB-발현 HeLa 리포터 세포 대 2.5개 또는 5개 종양 세포이다.
도 39는 CEA-발현 인간 위선암 세포 상에서 T84.66 IgG의 상이한 인간화 변이체들의 결합을 나타낸다. 데이터에 근거하여, 인간화 변이체 1을 CEA-표적화 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 항원 결합 분자 내에 혼입시키기 위해 선택하였다.
도 40은 본 발명의 CEA 표적화 4-1BBL-삼량체-함유 항원 결합 분자 구조물 5.1 내지 5.6을 나타낸다. 이들 구조물의 제조 및 생성은 실시예 11에 기술되어 있다. VH 및 VL 도메인은 항-CEA 항체 T84.66-LCHA의 도메인들이고, 진한 흑색점은 놉-인투-홀 변형을 나타낸다. *는 CH1 및 CL 도메인에서의 아미노산 변형(소위 하전된 잔기들)을 상징한다.
도 41A는 CEA-표적화 삼량체 분할 4-1BBL Fc(kih) 항원 결합 분자의 결합을 평가하기 위해 사용된 항원인 인간 NA3B3A2-avi His를 도식적으로 기술한 것을 나타낸다. 도 41B는 hu4-1BB 및 인간 NA3B3A2에 대한 CEA-표적화 삼량체 분할 4-1BBL의 동시 결합을 측정하는 분석의 구성을 예시한다(실시예 12.1).
도 42의 그래프들은 고정화된 인간 4-1BB 및 인간 NA3B3A2(분석물 2)에 대한 CEA 표적화 삼량체 4-1BBL FC 융합 항원 결합 분자 구조물 5.4, 5.6, 5.7 및 5.8(분석물 1)의 동시 결합을 나타낸다.
도 43에는 PHA-L 및 프로류킨 예비활성화 및 항-인간 CD3/항-인간 CD28 재활성화 인간 PBMC의 4-1BB 발현 CD4 및 CD8 T 세포에 대한 상이한 CEA-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물들의 결합이 나타나 있다. 결합은 R-피코에리트린-형광색소 접합된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편을 사용하여 검출하였다. 시험 구조물들의 평균 형광 강도(MFI) 대 농도를 나타내었다. 더 잘 표시하기 위해, 결합 곡선을, 비교 곡선들로서 구조물 5.4 및 대조군 F(이소타입 대조군 huIgG1 P329G LALA)를 사용하여 2개의 상이한 블롯들로 분할하였다. 결합은 CD45+ CD3+ CD8+ T 세포(아래쪽 블롯) 및 CD45+ CD3+ CD4+ T 세포(위쪽 블롯) 상에서 모니터링하였다. CD8 T 세포상에서의 4-1BB 발현 수준이 정상적으로는 CD4 T 세포상에서보다 더 높다. 모든 구조물들이 인간 4-1BB에 매우 유사한 친화도하에 결합한다.
도 44는 인간-CEA 발현 인간 위 세포주 MKN-45(왼쪽) 및 인간 대장 선암 세포주 LS180(오른쪽)에 대한 CEA-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물들의 결합을 나타낸다. 결합은 R-피코에리트린-형광색소 접합된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편을 사용하여 검출하였다. 시험한 구조물들의 평균 형광 강도(MFI) 대 농도를 나타내었다.
도 45는 CEA-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 항원 결합 분자들의 NFκB-활성화-유도된 루시퍼라제 발현 및 활성에 관한 것이다. 방출광 단위(URL)를 0.5 초/웰동안 측정하고 CEA-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물 5.4, 5.6, 5.7 및 5.8 및 대조군 분자들의 사용 농도에 대해 블롯화한다. 인간 4-1BB-발현 HeLa-리포터 세포를 가교결합 인간-CEA 발현 인간 위암 세포주 MKN-45의 부재 또는 존재하에서 6 시간동안 배양하였다. 세포 비는 1개 4-1BB-발현 HeLa 리포터 세포 대 3개 종양 세포이다.
도 46A 및 46B에는 1가 FAP 표적화 분할 삼량체 인간 OX40 리간드(구조물 6.1)의 조립을 위한 구성성분들이 나타나 있다. 도 46A는 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 이량체 리간드에 관한 것이고, 도 46B는 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합된 단량체 리간드에 관한 것이다. 도 46C는 FAP 표적화 OX40L-삼량체-함유 항원 결합 분자 구조물 6.1을 나타낸다. 도 46D에는 DP47 "비표적화" 인간 IgG1 PGLALA(대조군 F)가 나타나 있다.
도 47a는 FAP 양성 WM-264-4 세포에 대한 FAP 표적화 분할 삼량체 인간 Ox40L의 결합을 나타낸다. WM-266-4 세포는 높은 수준의 인간 섬유아세포 활성화 단백질(huFAP)을 발현한다. FAP 표적화 OX40 리간드 Fc(kih) 구조물들(속이 채워진 사각형)만 WM-266-4 세포에 결합하였으며, 대조군 5(속이 채워진 다이아몬드)는 결합하지 않았다. 2차 검출 항체로 사용된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 평균 형광 강도(MFI)로서 결합을 나타내었다. MFI는 유동세포분석으로 측정하였다. x-축은 항체 구조물들의 농도를 나타낸다. 도 47b는 인간 FAP 인간 Ox40 음성 A549 누크라이트 레드(NucLight Red) 세포에 대한 FAP 표적화 OX40 리간드 Fc(kih) 구조물의 결합을 나타낸다. FAP 표적화 OX40 리간드 Fc(kih) 구조물은 OX40 음성 FAP 음성 A549 종양 세포에 대한 결합을 나타내지 않았다. 결합은 2차 검출 항체로 사용된 FITC 표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 평균 형광 강도(MFI)로서 나타내었다. MFI는 유동세포분석으로 측정하고 블랭크 대조군의 MFI를 차감함으로써 기준선 보정되었다.
도 48A에는 휴지 및 활성화된 인간 CD4 T 세포에 대한 FAP-Ox40L의 결합이 나타나 있다. Ox40은 휴지 인간 CD4 T 세포 상에서는 발현되지 않는다(왼쪽). 인간 Ox40 발현 세포의 부재하에서는 결합이 관찰되지 않았다(왼쪽 그래프). 인간 PBMC의 활성화 후에 Ox40은 CD4+ T 세포 상에서 상향조절된다(오른쪽). Ox40+에 결합된 FAP-Ox40L은 CD4 T 세포를 활성화시켰다. 결합은 2차 검출 항체로 사용된 FITC 표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 평균 형광 강도(MFI)로서 나타내었다. MFI는 유동세포분석으로 측정하고 블랭크 대조군의 MFI를 차감함으로써 기준선 보정되었다. x-축은 항체 구조물들의 농도를 나타낸다. 도 48B는 Ox40이 휴지 인간 CD8 T 세포 상에서는 발현되지 않음을 나타낸다(왼쪽). 인간 Ox40 발현 세포의 부재하에서는 결합이 관찰되지 않았다(왼쪽 그래프). 인간 PBMC의 활성화 후에 Ox40은 CD8+ T 세포 상에서 상향조절된다(오른쪽). 인간 CD8+ T 세포 상에서의 Ox40 발현은 CD4+ T 세포 상에서보다 낮으며 공여체와 시점 사이에서 달라진다. Ox40의 발현은 나타낸 CD8 T 세포 상에서 낮았다. Ox40+에 결합된 FAP-Ox40L은 CD8 T 세포를 활성화시켰다. 결합은 2차 검출 항체로 사용된 FITC 표지된 항-인간 IgG Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편의 평균 형광 강도(MFI)로서 나타내었다. MFI는 유동세포분석으로 측정하고 블랭크 대조군의 MFI를 차감함으로써 기준선 보정되었다. x-축은 항체 구조물들의 농도를 나타낸다.
도 49에는 HeLa_hOx40_NFκB_Luc1 리포터 세포에서 FAP 표적화 분할 삼량체 인간 OX40L 항원 결합 분자(FAP-OX40L)에 의한 NFκB 신호전달 경로의 활성화가 나타나 있다. 2차 항체에 의한 가교결합 하에서(오른쪽 그래프) 또는 가교결합의 부재하에서(왼쪽 그래프)의 활성화를 나타내었다. 리포터 세포는 FAP-OX40L의 존재하에서 나타낸 농도에서 1:2의 비의 가교결합 2차 다중클론 항-huIgG1 Fcγ-특이적 염소 IgG F(ab)2 단편의 존재 또는 부재하에 5 시간동안 배양하였다. 루시퍼라제 활성은 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 평가하였다. 활성은 0.5초동안 측정된 방출광 단위(URL) 대 시험 구조물의 농도(nM)를 블롯화함으로써 특성화된다. URL은 루시페린의 옥시루시페린으로의 루시퍼라제-매개된 산화로 인해 방출된다.
도 50A에는 FAP 양성 세포의 존재하에 HeLa_hOx40_NFκB_Luc1 리포터 세포에서 FAP-OX40L에 의한 NFκB의 활성화가 나타나 있다. 낮은 FAP 발현 NIH-3T3 인간 FAP 세포의 존재하에서(3개 FAP + 종양 세포 대 1개 리포터 세포) FAP-OX40L에 의한 리포터 세포에서 NFκB 신호전달 경로의 활성화가 나타나 있다. NFκB-매개된 루시퍼라제 활성은 0.5초동안 측정된 방출광 단위(URL) 대 시험 화합물의 농도(nM)를 블롯화함으로써 특성화된다. 값들은 블랭크 대조군의 URL을 차감함으로써 기준선 보정된다. 더 잘 비교하기 위해, 각각의 블롯화된 용량-반응 곡선들의 곡선하 면적을 각 구조물의 작용물질 능력에 대한 마커로서 정량화하였다. 상기 비교는 도 50B에 예시되어 있다. 면적은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 산출하였다. 값들은 블랭크 대조군의 값을 차감함으로써 기준선 보정된다.
도 51은 최적이하로(suboptimally) TCR 유발된 휴지 인간 PBMC의 OX40 매개된 동시자극을 나타낸다(실시예 15.5). 본 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포에 의한 FAP-Ox40L의 초가교결합은 인간 CD4 및 CD8 T 세포에서 생존 및 증식을 강하게 촉진하였다. 활력있는 CD4+(왼쪽) 및 CD8+(오른쪽) T 세포의 이벤트 수(event count)를 나타내었다. 항-인간 CD3(클론 V9, huIgG1), 휴지 인간 PBMC 및 NIH/3T3-huFAP 클론 39 만을 함유하는 샘플들의 기준선 값을 차감하였다. 따라서, OX40 동시자극의 증진 효과를 여기에 나타내었지만 최적이하 항-CD3 자극 자체의 효과는 나타내지 않았다. 도면들에서, 아래쪽에는 세포 표면 고정화된 FAP-Ox40L을 사용한 휴지 인간 PBMC의 최적이하 TCR 자극의 해제 - 증식을 나타내었다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서를 설명하기 위해, 하기의 정의들이 적용될 것이고, 적절한 경우, 단수형으로 사용된 용어는 또한 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 분자"는 그의 가장 일반적인 의미에서 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 말한다. 항원 결합 분자의 예는 항체, 항체 단편 및 스캐폴드 항원 결합 단백질이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기"는 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 말한다. 한 양태에서, 항원 결합 잔기는 그의 표적 세포 항원을 통해 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 특정 양태에서, 항원 결합 잔기는 그것이 부착되는 물질(예를 들면, TNF 계열 리간드 삼량체)을 표적 부위로, 예를 들면, 항원 결정기를 갖는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 기질로 유도할 수 있다. 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 본원에서 더 정의되는 바와 같은 항체 및 그의 단편을 포함한다. 또한, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 본원에서 더 정의되는 바와 같은 스캐폴드 항원 결합 단백질, 예를 들면, 설계된 반복 단백질 또는 설계된 반복 도메인을 기반으로 하는 결합 도메인을 포함한다(예를 들면, WO 2002/020565 호 참조).
항체 또는 그의 단편과 관련하여, 용어 "표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기"는 항원의 일부 또는 전체에 특이적으로 결합하고 상기 항원의 일부 또는 전체에 상보적인 영역을 포함하는 분자의 부분을 말한다. 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는, 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 불린다)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 일반적인 의미로 사용되며, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 단일특이적 및 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 경우 항체 단편을 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 다양한 항체 구조물들을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 말한다, 즉, 상기 집단을 구성하는 개개 항체들은 동일하고/하거나, 예를 들면, 자연적으로 발생하는 돌연변이를 함유하거나 또는 단일클론 항체 제제의 생성시 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미미한 양으로 존재한다)를 제외하고, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단일특이적"은 그 각각이 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미한다. 용어 "이중특이적"은 항원 결합 분자가 2개 이상의 별개의 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 상기 부위 각각은 상이한 항원 결정기에 대해 특이적이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정기, 특히 2개의 별개의 세포 상에서 발현된 2개의 항원 결정기에 동시에 결합할 수 있다.
본 출원 내에서 사용된 바와 같은 용어 "결합가(valent)"는 항원 결합 분자에 특정 수의 결합 부위의 존재를 의미한다. 따라서, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 항원 결합 분자에 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 의미한다.
용어 "전장 항체(full length antibody)", "온전한 항체(intact antibody)" 및 "전항체(whole antibody)"는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. "천연(native) 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들면, 천연 IgG-클래스 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 중쇄 불변 영역으로도 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 경쇄 불변 영역으로도 불리는 경쇄 불변 도메인(CL)을 갖는다. 항체의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)으로 불리는 5가지 유형들 중 하나로 지정될 수 있으며, 상기 유형들 중 일부는 아형(subtype), 예를 들면, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 더 분류될 수 있다. 항체의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
"항체 단편"은 온전한(intact) 항체가 결합하는 항원과 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체가 아닌 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 교차-Fab 단편; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예를 들면, scFv); 및 단일 도메인 항체가 포함되나 이로 한정되지는 않는다. 특정 항체 단편에 대한 검토를 위해서는, 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조하시오. scFv 단편에 대한 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌[Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; 또한 WO 93/16185 호; 및 미국 특허 제 5,571,894 및 5,587,458 호를 참조하시오. 재생 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 고찰을 위해서는, 미국 특허 제 5,869,046 호를 참조하시오. 디아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다(예를 들면, EP 404 097 호; WO 1993/01161 호; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)] 참조). 트리아바디 및 테트라바디도 또한 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]에 기술되어 있다. 단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인 전체 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠 월탐 소재); 예를 들면, 미국 특허 제 6,248,516 B1 호 참조)이다. 항체 단편은, 본원에 기술된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질분해성 절단, 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 파지)에 의한 생성을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
온전한 항체의 파파인 절단은, 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인을 함유하는 "Fab" 단편으로 불리는, 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성한다. 따라서, 용어 "Fab 단편"은 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인(CL)을 포함하는 경쇄 단편, 및 중쇄의 VH 도메인 및 제 1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편을 말한다. Fab' 단편은 항체 힌지(hinge) 영역으로부터 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 수개의 잔기들의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 갖는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위(2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부분을 갖는 F(ab')2 단편을 제공한다.
용어 "교차-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차형 Fab 단편"은, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는 Fab 단편을 말한다. 교차형 Fab 분자의 2개의 상이한 쇄 조성이 가능하며 본 발명의 이중특이성 항체에 포함된다. 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환된다, 즉, 교차형 Fab 분자는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 교차형 Fab 분자는 또한 교차Fab(VLVH)로도 지칭된다. 다른 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환되는 경우, 교차형 Fab 분자는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 교차형 Fab 분자는 또한 교차Fab(CLCH1)으로 지칭된다.
"단일쇄 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드이고, 이때 상기 항체 도메인들 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서들: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL 중 하나를 가지고; 상기 링커는 30개 이상의 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일쇄 Fab 단편은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 천연 다이설파이드 결합을 통해 안정화된다. 또한, 상기 단일쇄 Fab 분자들은 시스테인 잔기의 삽입(예를 들면, 카바트 번호체계에 따른 가변 중쇄 중 위치 44 및 가변 경쇄 중 위치 100)에 의한 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 더 안정화될 수 있다.
"교차형 단일쇄 Fab 단편" 또는 "x-scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드이며, 이때 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서: a) VH-CL-링커-VL-CH1 및 b) VL-CH1-링커-VH-CL 중 하나를 가지고; VH 및 VL은 함께, 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하고, 상기 링커는 30개 이상의 아미노산의 폴리펩티드이다. 또한, 상기 x-scFab 분자들은 시스테인 잔기의 삽입(예를 들면, 카바트 번호체계에 따른 가변 중쇄 중 위치 44 및 가변 경쇄 중 위치 100)에 의한 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 더 안정화될 수 있다.
"단일쇄 가변 단편(scFv)"은 10 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩티드에 의해 연결된, 항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역들의 융합 단백질이다. 링커는 통상적으로 유연성을 위해 글리신이 풍부할 뿐 아니라 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하며, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결시킬 수 있거나 또는 그 반대도 가능하다. 상기 단백질은 불변 영역들의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 항체는, 예를 들면, 문헌[Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96]에 기술되어 있다. 또한, 항체 단편은, VL 도메인과 함께 기능성 항원 결합 부위로 조립될 수 있는 VH 도메인의 특징을 갖거나, 또는 VH 도메인과 함께 기능성 항원 결합 부위로 조립될 수 있는 VL 도메인의 특징을 가짐으로써 전장 항체의 항원 결합 성질을 제공하는 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다.
"스캐폴드 항원 결합 단백질"은 당해 분야에 공지되어 있다, 예를 들면, 피브로넥틴 및 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)이 항원-결합 도메인에 대한 대체 스캐폴드로서 사용되었다(예를 들면, 문헌[Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) and Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discov Today 13: 695-701 (2008)] 참조). 본 발명의 한 양태에서, 스캐폴드 항원 결합 단백질은 CTLA-4(에비바디(Evibody)), 리포칼린(Lipocalin)(안티칼린(Anticalin)), 단백질 A-유래 분자, 예를 들면, 단백질 A의 Z-도메인(어피바디(Affibody)), A-도메인(아비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)), 혈청 트랜스페린(트랜스-바디); 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin), 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인(단일-도메인 항체, sdAb), 항체 중쇄의 가변 도메인(나노바디, aVH), VNAR 단편, 피브로넥틴(어드넥틴(AdNectin)), C-형 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 새로운 항원 수용체 베타-락타마제의 가변 도메인(VNAR 단편), 인간 감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴(어필린(Affilin) 분자); 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠(kunitz) 유형 도메인, 크노틴(knottin) 계열로부터의 단백질과 같은 미소체(microbody), 펩티드 압타머 및 피브로넥틴(어드넥틴)으로 이루어진 군에서 선택된다.
CTLA-4(세포독성 T 림프구-결합 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포 상에서 발현되는 CD28-계열 수용체이다. 그의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 접힘(fold)을 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 상이한 결합 성질을 부여하는 이종 서열로 치환될 수 있다. 상이한 결합 특이성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 또한 에비바디로도 알려져 있다(예를 들면, US 7166697 B1 호). 에비바디는 항체(예를 들면, 도메인 항체)의 단리된 가변 영역과 대략 동일한 크기이다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조하시오.
리포칼린(Lipocalin)은 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질과 같은 소형 소수성 분자를 운반하는 세포외 단백질의 한 계열이다. 이들은 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원추형 구조의 개방 말단에서 다수의 루프를 갖는 견고한 베타-시트 2차 구조를 갖는다. 안티칼린(Anticalin)은 160 내지 180개 아미노산의 크기이며, 리포칼린으로부터 유도된다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)], US 7250297 B1 호 및 US 20070224633 호를 참조하시오.
어피바디(affibody)는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는, 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유도된 스캐폴드이다. 상기 도메인은 약 58개 아미노산의 3-나선형 다발로 이루어진다. 라이브러리는 표면 잔기들의 무작위선정에 의해 제작되었다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)] 및 EP 1641818A1 호를 참조하시오.
아비머(Avimer)는 A-도메인 스캐폴드 계열로부터 유도된 다중도메인 단백질이다. 약 35개 아미노산의 천연 도메인은 한정된 다이설파이드 결합 구조를 취한다. A-도메인의 계열에 의해 나타난 자연적 변이의 셔플링에 의해 다양성이 발생된다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) and Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조하시오.
트랜스페린은 단량체성 혈청 운반 당단백질이다. 트랜스페린은 허용적인 표면 루프 내에 펩티드 서열의 삽입에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 스캐폴드의 예로는 트랜스-바디(Trans-body)가 포함된다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조하시오.
설계된 안키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Proteins, DARPin)은 세포골격에 대한 내재성 막 단백질의 부착을 매개하는 단백질의 한 계열인 안키린으로부터 유도된다. 단일 안키린 반복서열은 2개의 알파-나선 및 베타-회전으로 이루어지는 33개 잔기 모티프이다. 이들은 각 반복서열의 첫번째 알파-나선 및 베타-회전에서 잔기들을 무작위선정함으로써 상이한 표적 항원들에 결합하도록 조작될 수 있다. 그의 결합 계면은 모듈의 수를 증가시킴으로서 증가될 수 있다(친화도 증진 방법). 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) and J. MoI. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 US20040132028A1 호를 참조하시오.
단일-도메인 항체는 단일 단량체성 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 첫번째 단일 도메인은 카멜리드(camelid)로부터의 항체 중쇄의 가변 도메인으로부터 유도되었다(나노바디 또는 VHH 단편). 또한, 용어 단일-도메인 항체는 상어로부터 유도된 자율적 인간 중쇄 가변 도메인(aVH) 또는 VNAR 단편을 포함한다.
피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스캐폴드이다. 어드넥틴(Adnectin)은 제 3형 인간 피브로넥틴(FN3)의 15개 반복 단위들의 10번째 도메인의 천연 아미노산 서열의 주쇄로 이루어진다. 베타-샌드위치의 한 말단에서 3개의 루프가, 어드넥틴이 해당 치료 표적을 특이적으로 인식할 수 있도록 조작될 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)], US 20080139791 호, WO 2005056764 호 및 US 6818418B1 호를 참조하시오.
펩티드 압타머(peptide aptamer)는 불변 스캐폴드 단백질, 전형적으로는 활성 부위에 삽입된 제한적 가변 펩티드 루프를 함유하는 티오레독신(TrxA)으로 이루어지는 조합적 인식 분자이다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조하시오.
미소체(microbody)는 3 내지 4개의 시스테인 가교를 함유하는, 25 내지 50개 아미노산 길이를 갖는 천연 미소단백질(microprotein)로부터 유도되며, 미소단백질의 예로는 칼라타BI(KalataBI) 및 코노톡신 및 크노틴이 포함된다. 미소단백질은 미소단백질의 전체 접힘에 영향을 미치지 않고 25개 이하의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 조작된 크노틴 도메인에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 WO 2008098796 호를 참조하시오.
기준 분자와 "동일 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자"는 경쟁 분석법에서 그 항원에 대한 기준 분자의 결합을 50% 이상 차단하는 항원 결합 분자를 말하며, 반대로, 기준 분자는 경쟁 분석법에서 그 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합을 50% 이상 차단한다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전체에 특이적으로 결합하고 그와 상보적인 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 부분을 말한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 단지 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 상기 부분은 에피토프로 지칭된다. 항원 결합 도메인은, 예를 들면, 하나 이상의 가변 도메인(가변 영역으로도 불림)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결정기"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이며, 항원 결합 잔기가 결합되어 항원 결합 잔기-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자상의 부위(예를 들면, 아미노산의 연속 신장부 또는 비-연속 아미노산의 상이한 영역들로 구성된 입체형태 구조)를 말한다. 유용한 항원 결정기는, 예를 들면, 종양 세포의 표면상에서, 바이러스-감염된 세포의 표면상에서, 다른 질병에 걸린 세포의 표면상에서, 면역 세포의 표면상에서, 혈청내에서 유리하는 상태로, 및/또는, 세포외 기질(ECM) 중에서 발견할 수 있다. 본원에서 항원으로 유용한 단백질은, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 형태의 단백질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정 단백질을 언급할 때, 상기 용어는 "전장"의 비가공된 단백질 뿐 아니라 세포에서의 가공으로부터 비롯되는 임의 형태의 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 단백질의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이며 원치않거나 비-특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력은 효소-결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 또는 당해 분야에 기술을 가진 자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(비아코어(BIAcore) 기기 상에서 분석됨)[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)], 및 전통적인 결합 분석법[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)]을 통해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 비관련 단백질에 대한 항원 결합 분자의 결합 정도는, 예를 들면, SPR로 측정시 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항원에 결합하는 분자는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM 또는 ≤0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
"친화도" 또는 "결합 친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들면, 항체)와 그의 결합 상대(예를 들면, 항원) 사이의 비-공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 따라서, 등가의 친화도들은 속도 상수들의 비가 동일하게 유지되는 한, 상이한 속도 상수들을 포함할 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 친화도를 측정하기 위한 특정 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들면, 암세포 또는 종양 기질의 세포와 같은 종양내 세포의 표면상에 존재하는 항원 결정기를 말한다. 특정 실시양태에서, 표적 세포 항원은 종양 세포의 표면상의 항원이다. 한 실시양태에서, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 암배아 항원(CEA), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군에서 선택된다. 특히, 표적 세포 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이다.
프로필 엔도펩티다제 FAP 또는 세프라제(Seprase)(EC 3.4.21)로도 알려진, 용어 "섬유아세포 활성화 단백질(FAP)"은 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간), 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 FAP를 말한다. 상기 용어는 "전장", 비가공된 FAP 뿐 아니라 세포에서의 가공으로부터 비롯되는 임의 형태의 FAP를 포함한다. 상기 용어는 또한, FAP의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 인간, 마우스 및/또는 사이노몰구스 FAP에 특이적으로 결합할 수 있다. 인간 FAP의 아미노산 서열은 유니프롯(UniProt) (www.uniprot.org) 등록번호 Q12884(버전 149, 서열번호 20), 또는 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2에 나타나 있다. 인간 FAP의 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 위치 26으로부터 760까지 이른다. His-태그된 인간 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15 및 16에 각각 나타나 있다. 마우스 FAP의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P97321(버전 126, 서열번호 23), 또는 NCBI RefSeq NP_032012.1에 나타나 있다. 마우스 FAP의 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 위치 26으로부터 761에 이른다. 서열번호 24 및 25는 His-태그된 마우스 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다. 서열번호 26 및 27은 His-태그된 사이노몰구스 FAP ECD의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 나타낸다. 바람직하게, 본 발명의 항-FAP 결합 분자는 FAP의 세포외 도메인에 결합한다. 예시적인 항-FAP 결합 분자들은 국제 특허 출원 WO 2012/020006 A2 호에 기술되어 있다.
암배아 항원-관련 세포 부착 분자 5(CEACAM5)로도 알려진, 용어 "암배아 항원(CEA)"은 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간), 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 CEA를 말한다. 인간 CEA의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P06731(버전 151, 서열번호 28)에 나타나 있다. CEA는 오랫동안 종양-연관 항원으로 확인되어 왔다[Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002]. 원래 태아 조직에서만 발현되는 단백질로 분류되었지만, CEA는 현재 여러 정상적인 성인 조직에서 확인되었다. 이들 조직은, 위장관, 기도 및 비뇨생식기의 세포, 및 결장, 자궁, 땀샘 및 전립선의 세포를 포함하여, 기원이 주로 상피이다[Nap et al., Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992]. 상피 기원의 종양뿐 아니라, 그의 전이종양들은 종양 연관 항원으로서 CEA를 함유한다. CEA의 존재 자체가 암성 세포로의 전환을 나타내지는 않지만, CEA의 분포는 상기 전환을 시사한다. 정상 조직에서, CEA는 일반적으로 세포의 선단 표면상에서 발현되어[Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)], CEA가 혈류중에서 항체에 접근할 수 없게 된다. 정상 조직과 대조적으로, CEA는 암성 세포의 전체 표면 위에서 발현되는 경향이 있다[Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)]. 발현 패턴의 상기 변화는 암성 세포에서 CEA가 항원 결합에 접근할 수 있게 한다. 또한, CEA 발현은 암성 세포에서 증가한다. 또한, 증가된 CEA 발현은 증가된 세포내 부착을 촉진하며, 이것은 전이를 야기할 수도 있다[Marshall J., Semin Oncol., 30(a Suppl. 8):30-6, 2003]. 다양한 종양에서 CEA 발현의 출현율은 일반적으로 매우 높다. 발표된 데이터와 일치하게, 조직 샘플에서 수행된 본 발명자들의 분석은, 대장 암종(CRC)에서 약 95%, 췌장암에서 90%, 위암에서 80%, 비-소세포 폐암(NSCLC, 여기서 상기 CEA는 HER3과 동시-발현된다)에서 60% 및 유방암에서 40%로 그의 높은 출현율을 확인하였으며; 소세포 폐암 및 교모세포종에서는 낮은 발현이 발견되었다.
CEA는 신속하게 세포 표면으로부터 분열되고, 직접적으로 또는 림프액을 통해, 종양으로부터 혈류내로 발산된다. 이러한 성질때문에, 혈청 CEA의 수준은 암의 진단 및 암, 특히 대장암의 재발을 스크리닝하기 위한 임상 마커로서 사용되었다[Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006].
콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4)로도 알려진, 용어 "흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)"는 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간), 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 MCSP를 말한다. 인간 MCSP의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 Q6UVK1(버전 103, 서열번호 29)에 나타나 있다. 원발암유전자 c-ErbB-1 또는 수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-1로도 알려진, 용어 "상피 성장 인자 수용체(EGFR)"는 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간), 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 EGFR을 말한다. 인간 EGFR의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P00533(버전 211, 서열번호 30)에 나타나 있다.
용어 "CD19"는 B-림프구 표면 항원 B4 또는 T-세포 표면 항원 Leu-12로도 알려진 B-림프구 항원 CD19를 말하고, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간), 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 CD19를 포함한다. 인간 CD19의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P15391(버전 160, 서열번호 31)에 나타나 있다. 상기 용어는 "전장"의 비가공된 인간 CD19 뿐 아니라, 본원에 보고된 바와 같은 항체가 그에 결합하는 한 세포에서의 가공으로부터 비롯되는 임의 형태의 인간 CD19를 포함한다. CD19는, 프리-B 세포, 초기 발생단계의 B 세포(즉, 미성숙 B 세포), 혈장 세포로의 최종 분화를 통한 성숙 B 세포, 및 악성 B 세포를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 인간 B 세포의 표면에서 발현되는 구조적으로 별개의 세포 표면 수용체이다. CD19는 대부분의 프리-B 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL), 전-림프구성 백혈병, 모양 세포성 백혈병, 공통 급성 림프구성 백혈병, 및 일부 널(Null)-급성 림프모구성 백혈병에 의해 발현된다. 혈장 세포 상에서 CD19의 발현은 CD19가 다발성 골수종과 같은 분화된 B 세포 종양에서 발현될 수 있음을 더욱 시사한다. 그러므로, CD19 항원은 비-호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및/또는 급성 림프모구성 백혈병의 치료에 있어서 면역치료의 표적이다.
"CD20"은 막에 걸쳐진(membrane-spanning) 4-도메인 하위계열 A 구성원 1(MS4A1), B-림프구 표면 항원 B1 또는 백혈구 표면 항원 Leu-16으로도 알려진 B-림프구 항원 CD20을 말하고, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간), 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 CD20을 포함한다. 인간 CD20의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P11836(버전 149, 서열번호 32)에 나타나 있다. "CD33"은 SIGLEC3 또는 gp67로도 알려진 골수 세포 표면 항원 CD33을 말하고, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간), 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 CD33을 포함한다. 인간 CD33의 아미노산 서열은 유니프롯 등록번호 P20138(버전 157, 서열번호 33)에 나타나 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원 결합 분자를 항원에 결합시키는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 초가변 영역(hypervariable region, HVR)을 포함한다(예를 들면, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이면 항원 결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다.
용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 서열에 있어서 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 말한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 상보성 결정 영역은 최고 서열 가변성을 가지고/가지거나 항원 인식에 수반된다. 대표적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에 존재한다[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)]. 예시적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102에 존재한다[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]. 초가변 영역(HVR)은 또한 상보성 결정 영역(CDR)으로도 지칭되며, 상기 용어들은 본원에서 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역 부분과 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 상기 특정 영역은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) and by Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 기술되었으며, 여기서 정의들은 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 아집단을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 언급하기 위한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 바와 같은 용어의 범위 내에 속해야 한다. 상기 인용된 참조문헌 각각에 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 A에 나타내었다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당해 분야에 숙련된 자라면 통상적으로 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 어느 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 결정할 수 있다.
[표 A]
CDR 정의 1
1표 A에서 모든 CDR 정의의 번호는 카바트 등에 의해 나타낸 번호체계 관례에 따른다(하기 참조).
2표 A에서 사용된 바와 같이 소문자 "b"를 갖는 "AbM"은 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 "AbM" 항체 모델링 소프트웨어에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 말한다.
카바트 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 영역 서열에 대한 번호 체계를 정의하였다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 서열 자체 이상의 임의의 실험 데이터를 의지하지 않고, 임의의 가변 영역 서열에 "카바트 번호"의 상기 체계를 분명하게 지정할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "카바트 번호"는 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 나타낸 번호 체계를 말한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체 가변 영역에 특정 아미노산 잔기 위치의 번호에 대한 언급은 카바트 번호 체계를 따른다.
VH에서의 CDR1은 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역들 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에 존재한다(문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조). 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인내 다른 잔기(예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 카바트 등의 상기 문헌에 따라 번호가 부여된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 분자(예를 들면, 항체)의 맥락에서 "친화도 증진된"은, 예를 들면, 돌연변이에 의해 기준 항원 결합 분자로부터 유도된 항원 결합 분자가 기준 항체와 동일 항원에 결합하고, 바람직하게는 동일 에피토프에 결합하고; 기준 항원 결합 분자보다 항원에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것을 말한다. 친화도 증진은 일반적으로 항원 결합 분자의 1개 이상의 CDR 중 1개 이상의 아미노산 잔기의 변형을 수반한다. 전형적으로, 친화도 증진된 항원 결합 분자는 초기 기준 항원 결합 분자와 동일한 에피토프에 결합한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"수용체(acceptor) 인간 프레임워크"는, 본 발명에 있어서, 하기에 정의되는 바와 같은 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유도된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유도된" 수용체 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 서열에 있어 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 동일하다.
용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다.
항체의 "클래스"는 그 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체의 5개 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러개가 서브클래스(이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 1개 이상, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전체를 포함할 것이며, 여기서 HVR(예를 들면, CDR)의 전체 또는 거의 전체가 비-인간 항체에 상응하고, FR의 전체 또는 거의 전체가 인간 항체에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화가 일어난 항체를 말한다. 본 발명에 포함되는 "인간화 항체"의 다른 형태는, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관해 본 발명에 따른 성질을 제공하기 위해 불변 영역이 원래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형되거나 변화된 항체이다.
"인간" 항체는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 또는 인간 항체 레퍼토리(repertory) 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 상기 정의는 명확하게 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다.
용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 본원에서 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 항체 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 통상적으로 대략 위치 231에서의 아미노산 잔기로부터 대략 위치 340에서의 아미노산 잔기까지 이른다. 한 양태에서, 탄수화물 쇄가 CH2 도메인에 결합된다. 본원에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다. "CH3 도메인"은 Fc 영역에서 CH2 도메인까지 C-말단 잔기들의 신장부(즉, IgG의 대략적 위치 341에서의 아미노산 잔기로부터 대략적 위치 447에서의 아미노산 잔기까지)를 포함한다. 본원에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인(예를 들면, 그의 한 쇄에 도입된 "돌출부"(놉) 및 그의 다른 쇄에 상응하는 도입된 "공동(cavity)"(홀)을 갖는 CH3 도메인; 특별히 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,821,333 호 참조)일 수 있다. 상기 변이체 CH3 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 2개의 비-동일 항체 중쇄의 이종이량체화를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 한 양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys 226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 이른다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 번호는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같은, EU 인덱스(EU index)로도 불리는 EU 번호 체계에 따른다.
"놉-인투-홀" 기술은, 예를 들면, US 5,731,168 호; US 7,695,936 호; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이량체 생성을 촉진하고 동종이량체 생성을 저해하기 위해 돌출부가 공동에 위치할 수 있도록, 제 1 폴리펩티드의 계면에 돌출부(놉) 및 제 2 폴리펩티드의 계면에 상응하는 공동(홀)을 도입하는 것을 포함한다. 돌출부는 제 1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들면, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써, 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상호보완적 공동이 제 2 폴리펩티드의 계면에 생성된다. 돌출부 및 공동은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을, 예를 들면, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 변이시킴으로써 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 놉 변형은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛중 하나에 아미노산 치환 T366W를 포함하고, 홀 변형은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛중 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 놉 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 추가로 아미노산 치환 S354C를 포함하고, 홀 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 추가로 아미노산 치환 Y349C를 포함한다. 상기 2개 시스테인 잔기의 도입은 Fc 영역의 2개 서브유닛들 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 야기하여 이량체를 더 안정화시킨다[Carter, J Immonol Methods 248, 7-15 (2001)]. 번호는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]의 EU 인덱스에 따른다.
"면역글로불린의 Fc 영역과 등가의 영역"은 면역글로불린의 Fc 영역의 천연 대립유전자 변이체 뿐 아니라, 치환, 부가 또는 결실을 야기하지만 작동인자 기능(예를 들면, 항체-의존성 세포성 세포독성)을 매개하는 면역글로불린의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 변이를 갖는 변이체를 포함하는 것이다. 예를 들면, 1개 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 실질적인 손실없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있다. 상기 변이체들은 활성에 최소의 영향을 미치기 위해 당해 분야에 공지된 일반적인 규칙에 따라 선택될 수 있다(예를 들면, 문헌[Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-1310 (1990)] 참조).
용어 "작동인자 기능"은 항체 이소타입에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 말한다. 항체 작동인자 기능의 예로는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 의한 후속 결합이 작동인자 기능을 수행하도록 수용체-함유 세포를 자극하는 신호전달 사건을 유도하는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체로는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)가 포함된다. 특정한 활성화 Fc 수용체는 인간 FcγRIIIa(유니프롯 등록번호 P08637(버전 141) 참조)이다.
용어 "TNF 리간드 계열 구성원" 또는 "TNF 계열 리간드"는 전염증성 사이토카인을 말한다. 일반적으로 사이토카인, 및 특히 TNF 리간드 계열의 구성원들은 면역계의 자극 및 조정에 중요한 역할을 한다. 현재, 19개의 사이토카인이 서열, 기능적 및 구조적 유사성을 기준으로 TNF(종양 괴사 인자) 리간드 상위계열의 구성원으로 확인되었다. 이들 리간드는 모두 C-말단 세포외 도메인(엑토도메인), N-말단 세포내 도메인 및 단일 막관통 도메인을 갖는 II형 막관통 단백질이다. TNF 상동성 도메인(THD)으로 알려진 C-말단 세포외 도메인은 상위계열 구성원들 사이에 20 내지 30% 아미노산 동일성을 가지며 수용체에 대한 결합을 담당한다. TNF 엑토도메인은 또한 TNF 리간드가 그의 특이적 수용체들에 의해 인식되는 삼량체성 복합체를 형성하는 것을 담당한다.
TNF 리간드 계열의 구성원들은 림프독소 α(Lymphotoxin α)(LTA 또는 TNFSF1으로도 알려짐), TNF(TNFSF2로도 알려짐), LTβ(TNFSF3으로도 알려짐), OX40L(TNFSF4로도 알려짐), CD40L(CD154 또는 TNFSF5로도 알려짐), FasL(CD95L, CD178 또는 TNFSF6으로도 알려짐), CD27L(CD70 또는 TNFSF7로도 알려짐), CD30L(CD153 또는 TNFSF8로도 알려짐), 4-1BBL(TNFSF9로도 알려짐), TRAIL(APO2L, CD253 또는 TNFSF10으로도 알려짐), RANKL(CD254 또는 TNFSF11로도 알려짐), TWEAK(TNFSF12로도 알려짐), APRIL(CD256 또는 TNFSF13으로도 알려짐), BAFF(CD257 또는 TNFSF13B로도 알려짐), LIGHT(CD258 또는 TNFSF14로도 알려짐), TL1A(VEGI 또는 TNFSF15로도 알려짐), GITRL(TNFSF18로도 알려짐), EDA-A1(엑토디스플라신 A1로도 알려짐) 및 EDA-A2(엑토디스플라신 A2로도 알려짐)로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 용어는, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들면, 인간), 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 TNF 계열 리간드를 말한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, TNF 리간드 계열 구성원은 OX40L, FasL, CD27L, TRAIL, 4-1BBL, CD40L 및 GITRL로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 실시양태에서, TNF 리간드 계열 구성원은 4-1BBL 및 OX40L로부터 선택된다.
TNF 리간드 계열 구성원의 추가의 정보, 특히 서열은 유니프롯(www.uniprot.org)과 같은 공적으로 접근할 수 있는 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 인간 TNF 리간드는 하기의 아미노산 서열을 갖는다: 인간 림프독소 α(유니프롯 등록번호 P01374, 서열번호 34), 인간 TNF(유니프롯 등록번호 P01375, 서열번호 35), 인간 림프독소 β(유니프롯 등록번호 Q06643, 서열번호 36), 인간 OX40L(유니프롯 등록번호 P23510, 서열번호 37), 인간 CD40L(유니프롯 등록번호 P29965, 서열번호 38), 인간 FasL(유니프롯 등록번호 P48023, 서열번호 39), 인간 CD27L(유니프롯 등록번호 P32970, 서열번호 40), 인간 CD30L(유니프롯 등록번호 P32971, 서열번호 41), 4-1BBL(유니프롯 등록번호 P41273, 서열번호 42), TRAIL(유니프롯 등록번호 P50591, 서열번호 43), RANKL(유니프롯 등록번호 O14788, 서열번호 44), TWEAK(유니프롯 등록번호 O43508, 서열번호 45), APRIL(유니프롯 등록번호 O75888, 서열번호 46), BAFF(유니프롯 등록번호 Q9Y275, 서열번호 47), LIGHT(유니프롯 등록번호 O43557, 서열번호 48), TL1A(유니프롯 등록번호 O95150, 서열번호 49), GITRL(유니프롯 등록번호 Q9UNG2, 서열번호 50) 및 엑토디스플라신 A(유니프롯 등록번호 Q92838, 서열번호 51).
"엑토도메인"은 세포외 공간(즉, 표적 세포 밖의 공간)으로 연장되는 막 단백질의 도메인이다. 엑토도메인은 통상적으로 표면과의 접촉을 개시하는 단백질의 부분들로서, 상기 접촉은 신호 전달을 유도한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 TNF 리간드 계열 구성원들의 엑토도메인은 세포외 공간(세포외 도메인)으로 연장되는 TNF 리간드 단백질의 부분을 말할 뿐 아니라, 삼량체화 및 상응하는 TNF 수용체에 대한 결합을 담당하는 그의 더 짧은 부분 또는 단편도 포함한다. 따라서, 용어 "TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인 또는 그의 단편"은 세포외 도메인을 형성하는 TNF 리간드 계열 구성원의 세포외 도메인, 또는 수용체에 결합할 수 있는 그의 부분(수용체 결합 도메인)을 말한다.
용어 "동시자극 TNF 리간드 계열 구성원" 또는 "동시자극 TNF 계열 리간드"는 T-세포의 증식 및 사이토카인 생성을 동시자극할 수 있는 TNF 리간드 계열 구성원의 아군(subgroup)을 말한다. 이들 TNF 계열 리간드는 그의 상응하는 TNF 수용체와의 상호작용시 TCR 신호를 동시자극할 수 있으며, 그의 수용체와의 상기 상호작용은 T-세포 활성화를 야기하는 신호전달 연쇄반응을 개시하는 TNFR-연관 인자(TRAF)의 동원을 유도한다. 동시자극 TNF 계열 리간드는 4-1BBL, OX40L, GITRL, CD70, CD30L 및 LIGHT로 이루어진 군에서 선택되고, 보다 특히 동시자극 TNF 리간드 계열 구성원은 4-1BBL 및 OX40L로부터 선택된다.
본원에서 상기 기술된 바와 같이, 4-1BBL는 II형 막관통 단백질이며 TNF 리간드 계열의 한 구성원이다. 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 완전 또는 전장 4-1BBL은 세포의 표면상에서 삼량체를 형성하는 것으로 기술되었다. 삼량체의 형성은 4-1BBL의 엑토도메인의 특정 모티프들에 의해 가능해진다. 상기 모티프들은 본원에서 "삼량체화 영역"으로 지칭된다. 인간 4-1BBL 서열의 아미노산 50-254(서열번호 52)는 4-1BBL의 세포외 도메인을 형성하지만, 그의 단편도 삼량체를 형성할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 용어 "4-1BBL의 엑토도메인 또는 그의 단편"은 서열번호 4(인간 4-1BBL의 아미노산 52-254), 서열번호 1(인간 4-1BBL의 아미노산 71-254), 서열번호 3(인간 4-1BBL의 아미노산 80-254) 및 서열번호 2(인간 4-1BBL의 아미노산 85-254)로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 96(인간 4-1BBL의 아미노산 71-248), 서열번호 375(인간 4-1BBL의 아미노산 52-248), 서열번호 374(인간 4-1BBL의 아미노산 80-248) 및 서열번호 373(인간 4-1BBL의 아미노산 85-248)으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 말하지만, 삼량체화될 수 있는 엑토도메인의 다른 단편들도 또한 본 발명에 포함된다.
본원에서 상기 기술된 바와 같이, OX40L은 또 다른 II형 막관통 단백질이며 TNF 리간드 계열의 또 다른 구성원이다. 완전 또는 전장 인간 OX40L은 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는다. 인간 OX40L 서열의 아미노산 51-183(서열번호 53)은 OX40L의 세포외 도메인을 형성하지만, 그의 단편들도 삼량체를 형성할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 용어 "OX40L의 엑토도메인 또는 그의 단편"은 서열번호 53(인간 OX40L의 아미노산 51-183) 또는 서열번호 54(인간 OX40L의 아미노산 52-183)로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 말하지만, 삼량체화될 수 있는 엑토도메인의 다른 단편들도 본 발명에 포함된다.
용어 "펩티드 링커"는 1개 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개 아미노산을 포함하는 펩티드를 말한다. 펩티드 링커는 당해 분야에 공지되어 있거나, 또는 본원에 기술되어 있다. 적합한 비-면역원성 링커 펩티드로는, 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커(여기서, "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 1 내지 4의 수, 특히 2이다), 즉, GGGGS(서열번호 128), GGGGSGGGGS(서열번호 13), SGGGGSGGGG(서열번호 55) 및 GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 56)로 이루어진 군에서 선택된 펩티드이지만, 또한 서열 GSPGSSSSGS(서열번호 57), GSGSGSGS(서열번호 58), GSGSGNGS(서열번호 59), GGSGSGSG(서열번호 60), GGSGSG(서열번호 61), GGSG(서열번호 62), GGSGNGSG(서열번호 63), GGNGSGSG(서열번호 64) 및 GGNGSG(서열번호 65)도 포함한다. 특히 주목되는 펩티드 링커는 (G4S)1 또는 GGGGS(서열번호 128), (G4S)2 또는 GGGGSGGGGS(서열번호 13) 및 GSPGSSSSGS(서열번호 57), 보다 특히 (G4S)2 또는 GGGGSGGGGS(서열번호 13) 및 GSPGSSSSGS(서열번호 57)이다.
용어 "아미노산"은 본 출원내에서 사용될 때 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산의 군을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "단일쇄 융합 단백질"은 항원 결합 잔기의 일부 또는 Fc 부분에 융합된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 또는 2개의 엑토도메인으로 이루어진 단일쇄 폴리펩티드를 말한다. 융합은 항원 결합 잔기의 N 또는 C-말단 아미노산을 펩티드 링커에 의해 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인의 C- 또는 N-말단 아미노산에 직접 결합시킴으로써 일어날 수 있다.
"융합된" 또는 "연결된"은 구성성분들(예를 들면, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 폴리펩티드 및 엑토도메인)이 펩티드 결합에 의해 직접적으로, 또는 1개 이상의 펩티드 링커에 의해 결합된 것을 의미한다.
기준 폴리펩티드(단백질) 서열과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN.SAWI 또는 메갈린(Megalign)(디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어와 같은 공적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 경우, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었으며, 소스 코드는 워싱턴 D.C., 20559의 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아 사우스 샌프란시스코의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공적으로 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 유닉스(UNIX) V4.0D를 포함하여, 유닉스 작업 시스템상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 상기 서열 B와 비교해 또는 상기 서열 B에 대비해, 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(양자택일적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 상기 서열 B와 비교해 또는 상기 서열 B에 대비해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 다음과 같이 산출된다:
100 x 분율 X/Y
상기에서, X는 A와 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임을 인지할 것이다. 특별히 달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술된 바와 같이 수득된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 아미노산 서열 변이체는, 상기 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기의 삽입 및/또는 상기 서열내에서의 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구조물을 수득할 수 있으나, 단, 최종 구조물은 목적하는 특성, 예를 들면, 항원-결합 특성을 가져야 한다. 치환적 돌연변이유발을 위한 해당 부위는 HVR 및 프레임워크(FR)를 포함한다. 보존적 치환을 "바람직한 치환"이란 제목하에 표 B에 나타내었으며, 아미노산 측쇄 클래스 (1) 내지 (6)과 관련하여 하기에서 더 기술된다. 아미노산 치환은 해당 분자 내에 도입될 수 있으며, 생성물들은 목적하는 활성, 예를 들면, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별될 수 있다.
[표 B]
아미노산은 공통적인 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Gln;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 클래스들중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 포함한다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 모 항원 결합 분자(예를 들면, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기들에 아미노산 치환이 존재하는 실질적인 변이체를 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 수득된 변이체(들)은 모 항원 결합 분자에 비해 특정 생물학적 성질(예를 들면, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 변화(예를 들면, 개선)를 가지고/가지거나, 모 항원 결합 분자의 실질적으로 유지된 특정 생물학적 성질을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 증진된 항체로서, 이것은, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 증진 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 변이체 항원 결합 분자를 파지상에 디스플레이시키고 특정 생물 활성(예를 들면, 결합 친화도)을 스크리닝한다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 상기 변이들이 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변이(예를 들면, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)가 HVR에 이루어질 수 있다. 돌연변이유발에 표적이 될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기술된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 상기 방법에서는, 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 표적 잔기들(예를 들면, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기들)의 잔기 또는 기를 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기들은 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 그들이 목적하는 성질을 보유하는지를 측정하기 위해 변이체들을 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은, 길이가 1개 잔기로부터 백개 이상 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 포함된다. 상기 분자의 다른 삽입 변이체는 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는, 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변이된다. 상기 분자의 글리코실화 변이체는, 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변이시킴으로써 편리하게 수득될 수 있다. TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 결합된 탄수화물이 변이될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로, 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 결합된, 분지된 바이안테너리(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들면, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐 아니라, 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정한 개선된 성질을 갖는 변이체를 생성하기 위해 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자중 상기 올리고사카라이드의 변형이 수행될 수 있다. 한 양태에서, Fc 영역에 결합된(직접 또는 간접적으로) 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 변이체가 제공된다. 상기 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다(예를 들면, US 특허 공개 US 2003/0157108 호(프레스타(Presta, L.)) 또는 US 2004/0093621 호(쿄와 하꼬 코교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)) 참조). 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는, 예를 들면, Fc 영역에 결합된 바이안테너리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 이등분 올리고사카라이드를 갖는 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다(예를 들면, WO 2003/011878 호(진-메이렛(Jean-Mairet) 등); 미국 특허 제 6,602,684 호(우마나(Umana) 등); 및 US 2005/0123546 호(우마나 등) 참조). Fc 영역에 결합된 올리고사카라이드에 1개 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 변이체도 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있으며, 예를 들면, WO 1997/30087 호(파텔(Patel) 등); WO 1998/58964 호(라주(Raju, S.)); 및 WO 1999/22764 호(라주)에 기술되어 있다.
특정 실시양태에서, 분자의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 시스테인 조작된 변이체, 예를 들면, "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환된 잔기는 분자의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기들을 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 위치되고, 항체를 다른 잔기, 예를 들면, 약물 잔기 또는 링커-약물 잔기에 접합시켜 면역접합체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기들 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카바트 번호); 중쇄의 A118(EU 번호); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 번호). 시스테인 조작된 항원 결합 분자는, 예를 들면, 미국 특허 제 7,521,541 호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
특정 양태에서, 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는, 당해 분야에 공지되어 있고 용이하게 이용가능한 추가의 비-단백성 잔기를 함유하도록 더 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 수용성 중합체의 비-제한 예로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알콜 및 그의 혼합물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수중 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 항체에 결합되는 중합체의 수는 달라질 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 결합되는 경우, 이들은 같거나 다른 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선될 항체의 특정한 성질 또는 기능, 이중특이성 항체 유도체가 정의된 조건하에서 치료에 사용될 것인지 여부 등을 포함하나 이로 한정되지는 않는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다. 또 다른 양태에서, 방사선에 노출됨으로써 선택적으로 가열될 수 있는 항체와 비-단백성 잔기의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비-단백성 잔기는 탄소 나노튜브이다(Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 정상 세포에 유해하지 않으나 항체-비-단백성 잔기에 근접한 세포가 사멸되는 온도까지 비-단백성 잔기를 가열시키는 파장을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 면역접합체가 수득될 수 있다. "면역접합체"는 세포독성 약제를 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단리된 핵산 분자 또는 구조물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA), 바이러스-유래 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 말한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들면, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 바와 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 1개 이상의 핵산 절편, 예를 들면, DNA 또는 RNA 단편을 말한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그 천연 환경으로부터 분리된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미하는 것이다. 예를 들면, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 있어서 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 또 다른 예는 이종 숙주 세포들내에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액중의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 정상적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 존재하거나 또는 그의 천연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체 뿐 아니라 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성에 의해 생성된 상기 분자를 또한 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자와 같은 조절 요소일 수 있거나 또는 상기 조절 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들면, 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드란, 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각각의 100개 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의미하는 것이다. 즉, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열중 뉴클레오티드의 5% 이하가 결실되거나 또는 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열중 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 일부의 뉴클레오티드가 기준 서열중에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 상기 변이는, 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서, 또는 기준 서열중 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접 기들중의 잔기들 사이에 개별적으로 배치된, 상기 말단 위치들 사이 어디에서나 일어날 수 있다. 실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 통상적으로, 폴리펩티드에 대해 상기 논의한 것(예를 들면, ALIGN-2)과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정된 핵산 요소를 사용하여 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 폴리뉴클레오티드를 말한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편내에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 다른 서열들 중에서, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중 특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 "발현 구조물"과 동의어이며, 표적 세포에서 작동가능하게 결합되는 특정 유전자를 도입하고 상기 유전자의 발현을 유도하기 위해 사용되는 DNA 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조물로서의 벡터 뿐 아니라, 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈내에 혼입된 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 대량의 안정한 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 일단 발현 벡터가 표적 세포 내부에 있으면, 상기 유전자에 의해 암호화되는 리보핵산 분자 또는 단백질은 세포 전사 및/또는 번역 절차에 의해 생성된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 그 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자를 생성하기 위해 사용될 수 있는 임의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양 세포, 예를 들면, 배양된 포유동물 세포, 예를 들어, 몇가지만 들자면, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 식물 세포 뿐 아니라, 유전자전이 동물, 유전자전이 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.
약제의 "효과량"은 약제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리적 변화를 야기하기 위해 필요한 양을 말한다.
약제, 예를 들면, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위한 투여량에서 필요한 시간 기간동안 효과적인 양을 말한다. 약제의 치료 효과량은, 예를 들면, 질환의 부작용을 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화시키거나 또는 방지한다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특히, 개체 또는 대상은 인간이다.
용어 "약학 조성물"은, 그중에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하는 그런 형태이면서, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 부형제"는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른, 약학 조성물내 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 부형제로는 완충제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 적응증, 사용법, 투여량, 투여법, 병용 치료, 금기 및/또는 사용에 관한 경고에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 말하기 위해 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 그의 문자적 변형, 예를 들면, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도에서의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과로는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 분자는 질환의 진전을 지연시키거나 질환의 진행을 지체시키기 위해 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "암"은, 예를 들면, 그의 난치성 형태를 포함하여, 림프종, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 림프구성 백혈병, 폐암, 비-소세포 폐(NSCL)암, 기관지폐포 세포 폐암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 복부암, 위암, 대장암(CRC), 췌장암, 유방암, 삼중-음성 유방암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨(Hodgkin)병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신세포암, 신우암, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추 신경계(CNS) 종양, 척추 종양, 뇌간교세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 수막종, 편평세포암, 뇌하수체 선종 및 유잉(Ewing) 육종, 흑색종, 다발성 골수종, B-세포암(림프종), 만성 림프구성 백혈병, 또는 상기 암들중 하나 이상의 조합과 같은 증식성 질환을 말한다.
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자
본 발명은 생산성, 안정성, 결합 친화도, 생물 활성, 표적화 효율 및 감소된 독성과 같은 특히 유리한 성질을 갖는 신규 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다).
특정 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기,
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다), 및
(c) 안정하게 결합할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인.
특정 양태에서, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편만 포함하고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원이 인간 T-세포 활성화를 동시자극하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 특정 양태에서, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고, TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인이 모든 경우에서 동일한 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 제 1 항의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
[이때, 상기 항원 결합 분자는,
(i) 제 1 폴리펩티드가 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고 제 2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 각각 함유하고, 이때 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나, 또는
(ii) 상기 제 1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하고, 이때 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나, 또는
(iii) 상기 제 1 폴리펩티드가 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 각각 함유하고, 이때 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1 및 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 VH 또는 VL에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다].
특정 양태에서, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 4-1BBL 및 OX40L로부터 선택되는, 인간 T-세포 활성화를 동시자극하는 TNF 리간드 계열 구성원을 포함한다. 보다 특히, TNF 리간드 계열 구성원은 4-1BBL이다.
또 다른 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 96, 서열번호 373, 서열번호 374 및 서열번호 375로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함한다. 한 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인 또는 그의 단편은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 96으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인 또는 그의 단편은 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 특정 양태에서, 상기 제 1 폴리펩티드는 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 184 또는 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원은 OX40L이다. 특정 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인이 서열번호 53 또는 서열번호 54의 아미노산 서열, 특히 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 371 또는 서열번호 372의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 53 또는 서열번호 54의 아미노산 서열을 각각 포함하는 것을 특징으로 한다].
한 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) CH1 또는 CL 도메인을 함유하는 제 1 폴리펩티드 및 CL 또는 CH1 도메인을 함유하는 제 2 폴리펩티드(이때, 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합된다) 각각을 포함하고, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다].
한 양태에서, (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) CH1 도메인을 함유하는 제 1 폴리펩티드 및 CL 도메인을 함유하는 제 2 폴리펩티드(이때, 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합된다)를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH1 도메인에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 도메인에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) CL 도메인을 함유하는 제 1 폴리펩티드 및 CH1 도메인을 함유하는 제 2 폴리펩티드(이때, 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합된다)를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CL 도메인에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH1 도메인에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개보다 많은 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 양태에서, (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하고, 이때 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다. 특히, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하며, 이때 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기는 2개의 상이한 표적 세포 항원들에 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 항체, 항체 단편 및 스캐폴드 항원 결합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
한 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 항체 단편, Fab 분자, 교차형 Fab 분자, 단일쇄 Fab 분자, Fv 분자, scFv 분자, 단일 도메인 항체, VH 및 스캐폴드 항원 결합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 한 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 VH 또는 스캐폴드 항원 결합 단백질이다. 한 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 스캐폴드 항원 결합 단백질이다.
특히, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 또는 2개의 잔기를 포함한다.
특정 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자 또는 교차형 Fab 분자인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 특히, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab이다.
또한, 표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 암배아 항원(CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군에서 선택되는, 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 CH1 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편이 그의 C-말단에서 제 3의 펩티드 링커에 의해 경쇄 상의 CL 도메인에 융합되는, 본 발명에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편이 그의 C-말단에서 제 3의 펩티드 링커에 의해 경쇄 상의 CH1 도메인에 융합되는, 본 발명에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 경쇄의 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편이 그의 C-말단에서 제 3의 펩티드 링커에 의해 중쇄 상의 CH1 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은, 펩티드 링커가 (G4S)2인, 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다. 한 양태에서, 제 1 펩티드 링커는 (G4S)2(서열번호 13)이고, 제 2 펩티드 링커는 GSPGSSSSGS(서열번호 57)이고, 제 3 펩티드 링커는 (G4S)2(서열번호 13)이다. 특히, 본 발명은 제 1 펩티드 링커가 (G4S)2(서열번호 13)이고, 제 2 펩티드 링커가 (G4S)2(서열번호 13)이고, 제 3 펩티드 링커가 (G4S)2(서열번호 13)인, 상기 정의된 바와 같은 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본원에서 상기 정의된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 안정하게 결합할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함한다.
특히, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자(이때, Fab 중쇄는 C-말단에서 Fc 도메인 내의 CH2 도메인의 N-말단에 융합된다), 및 (c) 안정하게 결합할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, Fc 도메인은 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특히, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 특정 양태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다.
Fc 수용체 결합 및/또는 작동인자 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어진다. 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체로서, 이의 각 서브유닛은 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 서로와 안정하게 결합할 수 있다.
Fc 도메인은, 표적 조직에서의 양호한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기 및 유리한 조직-혈액 분포비를 포함하여 유리한 약동학적 성질을 본 발명의 항원 결합 분자에 제공한다. 그러나, 동시에, Fc 도메인은, 바람직한 항원-함유 세포로가 아니라 Fc 수용체를 발현하는 세포로 본 발명의 이중특이성 항체의 바람직하지 않은 표적화를 유도할 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 작동인자 기능을 나타낸다. 한 양태에서, 상기 Fc는 실질적으로 Fc 수용체에 결합하지 않고/않거나 작동인자 기능을 유도하지 않는다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 한 양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 특정 양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 특히 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특히는 인간 FcγRIIIa이다. 한 양태에서, Fc 도메인은 작동인자 기능을 유도하지 않는다. 감소된 작동인자 기능은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이로 한정되지는 않는다: 감소된 보체 의존성 세포독성(CDC), 감소된 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 감소된 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원-제공 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수의 감소, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵구에 대한 감소된 결합, 다형핵 세포에 대한 감소된 결합, 세포자살을 유도하는 직접 신호전달의 감소, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T 세포 프라이밍(priming).
특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc-영역내에 도입됨으로써 Fc-영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들면, 치환)을 포함하는, 인간 Fc-영역 서열(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기,
(b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다), 및
(c) 안정하게 결합할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인(이때, 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다).
한 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 작동인자 기능을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 1개 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에 존재한다. 특히, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329(EU 번호)의 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 특히, Fc 도메인은 IgG 중쇄의 위치 234 및 235(EU 번호) 및/또는 329(EU 번호)에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특히, IgG 중쇄에 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA", EU 번호)를 갖는 Fc 도메인을 포함하는, 본 발명에 따른 삼량체성 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 아미노산 치환 L234A 및 L235A는 소위 LALA 돌연변이를 말한다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 배제시키며, 상기 돌연변이 Fc 도메인을 제조하는 방법 및 Fc 수용체 결합 또는 작동인자 기능과 같은 그의 성질을 측정하는 방법을 또한 기술하고 있는 국제 특허출원 공개 WO 2012/130831 A1 호에 기술되어 있다. "EU 번호"는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]의 EU 인덱스에 따른 번호체계를 말한다.
감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 감소된 작동인자 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329중의 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 도메인을 포함한다(미국 특허 제 6,737,056 호). 상기 Fc 돌연변이체로는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327중의 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체가 포함된다(미국 특허 제 7,332,581 호).
또 다른 양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. IgG4 항체는 IgG1 항체에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및 감소된 작동인자 기능을 나타낸다. 보다 특정한 양태에서, Fc 도메인은 위치 S228(카밧 번호)에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특정한 양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L235E 및 S228P 및 P329G(EU 번호)를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 상기 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 그의 Fcγ 수용체 결합 성질은 또한 WO 2012/130831 호에 기술되어 있다.
돌연변이 Fc 도메인은 당해 분야에 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 이용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는, 예를 들면, 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은, 예를 들면, ELISA에 의해, 또는 비아코어(BIAcore) 기기(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))와 같은 표준 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 측정될 수 있으며, Fc 수용체는 예를 들어 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 적절한 상기 결합 분석법은 본원에서 기술된다. 또는, Fc 수용체에 대한, Fc 도메인의 결합 친화도 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자의 결합 친화도는, FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포와 같이 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주를 사용하여 평가할 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체의 작동인자 기능은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석법은 본원에서 기술된다. 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 다른 예는 미국 특허 제 5,500,362 호; 문헌[Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; 미국 특허 제 5,821,337 호; 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기술되어 있다. 또는, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수 있다(예를 들면, 유동세포분석을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아 마운틴뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 위스콘신 매디슨) 참조). 상기 분석에 유용한 작동인자 세포로는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 해당 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 보체 성분, 특히 C1q에 대한 Fc 도메인의 결합은 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 작동인자 기능을 갖도록 조작된 일부 실시양태에서, 상기 감소된 작동인자 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석은, 본 발명의 이중특이성 항체가 C1q에 결합할 수 있으며 따라서 CDC 활성을 갖는지 여부를 측정하기 위해 수행될 수 있다(예를 들면, WO 2006/029879 호 및 WO 2005/100402 호에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); and Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)] 참조).
특정 양태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
한 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드(이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다), 및 (c) 안정하게 결합할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인(이때, Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다)을 포함한다. 따라서, 이들은, 전형적으로 2개의 비-동일 폴리펩티드 쇄("중쇄")에 포함되는 Fc 도메인의 2개 서브유닛들 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 잔기들을 포함한다. 상기 폴리펩티드들의 재조합 동시-발현 및 후속 이량체화는 2개의 폴리펩티드들의 여러 가능한 조합들을 유도한다. 따라서, 재조합체 생산에서 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선하기 위해, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 목적하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변형을 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 서브유닛들 사이에서 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다. 따라서, 상기 변형은 특히 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다.
특정 양태에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나에 놉 변형 및 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 다른 하나에 홀 변형을 포함하는 소위 "놉-인투-홀" 변형이다. 따라서, 특정한 양태에서, 본 발명은, 제 1 중쇄의 Fc 부분이 제 1 이량체화 모듈을 포함하고 제 2 중쇄의 Fc 부분이 제 2 이량체화 모듈을 포함하여 IgG 분자의 2개의 중쇄의 이종이량체화를 가능하게 하고, 제 1 이량체화 모듈이 놉 인투 홀 기술에 따른 놉을 포함하고 제 2 이량체화 모듈이 홀을 포함하는 IgG 분자를 포함하는, 본원에서 상기 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
놉-인투-홀 기술은, 예를 들면, US 5,731,168 호; US 7,695,936 호; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은, 이종이량체 생성을 촉진하고 동종이량체 생성을 저해하기 위해 돌출부가 공동에 위치할 수 있도록 제 1 폴리펩티드의 계면에 돌출부(놉) 및 제 2 폴리펩티드의 계면에 상응하는 공동(홀)을 도입하는 것을 포함한다. 돌출부는 제 1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들면, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써, 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 보상적인 공동이 제 2 폴리펩티드의 계면에 생성된다.
따라서, 특정 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 공동에 위치할 수 있는 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내에 돌출부가 생성되고, Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제 1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제 2 서브유닛의 CH3 도메인 내에 공동이 생성된다.
돌출부 및 공동은, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을, 예를 들면, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 변이시킴으로써 제조될 수 있다.
특정 양태에서, Fc 도메인의 제 1 서브유닛의 CH3 도메인에서, 위치 366에서의 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기로 치환되고(T366W), Fc 도메인의 제 2 서브유닛의 CH3 도메인에서, 위치 407에서의 티로신 잔기가 발린 잔기로 치환된다(Y407V). 보다 특히, Fc 도메인의 제 2 서브유닛에서, 추가로 위치 366에서의 트레오닌 잔기가 세린 잔기로 치환되고(T366S), 위치 368에서의 류신 잔기가 알라닌 잔기로 치환된다(L368A). 보다 특히, Fc 도메인의 제 1 서브유닛에서, 위치 354에서의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 치환되고(S354C), Fc 도메인의 제 2 서브유닛에서, 위치 349에서의 티로신 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다(Y349C). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 야기한다. 상기 다이설파이드 가교는 이량체를 더 안정화시킨다(Carter, J Immonol Methods 248, 7-15 (2001)).
대안적 양태에서, Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형은, 예를 들면, PCT 공개 WO 2009/089004 호에 기술된 바와 같이 정전기 스티어링 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은, 동종이량체 생성은 정전기적으로 불리하지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기로 치환시키는 것을 포함한다.
CH1/CL 도메인에서의 변형
정확한 쌍형성(pairing)을 더 개선하기 위해, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 상이한 하전된 아미노산 치환(소위 "하전된 잔기")을 함유할 수 있다. 상기 변형들은 교차되거나 비-교차된 CH1 및 CL 도메인 내에 도입된다. 특정 양태에서, 본 발명은, CL 도메인들중 하나에서 위치 123(EU 번호)에서의 아미노산이 아르기닌(R)으로 치환되고 위치 124(EU 번호)에서의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, CH1 도메인들중 하나에서 위치 147(EU 번호) 및 위치 213(EU 번호)에서의 아미노산들이 글루탐산(E)으로 치환된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은, TNF 리간드 계열 구성원에 인접한 CL 도메인에서 위치 123(EU 번호)에서의 아미노산이 아르기닌(R)으로 치환되고 위치 124(EU 번호)에서의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, TNF 리간드 계열 구성원에 인접한 CH1 도메인에서 위치 147(EU 번호) 및 위치 213(EU 번호)에서의 아미노산들이 글루탐산(E)으로 치환된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다.
특정한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자
또 다른 양태에서, 본 발명은, 다음을 각각 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다:
둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄,
그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 제 2 중쇄 또는 경쇄에 융합된 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드, 및
그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 제 2 경쇄 또는 중쇄에 융합된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인을 포함하는 제 2 펩티드.
또 다른 양태에서, 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 펩티드가 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 펩티드가 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 VH 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 펩티드가 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 VL 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은, TNF 리간드 계열 구성원에 인접한 CL 도메인에서 위치 123(EU 번호)에서의 아미노산이 아르기닌(R)으로 치환되고 위치 124(EU 번호)에서의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, TNF 리간드 계열 구성원에 인접한 CH1 도메인에서 위치 147(EU 번호) 및 위치 213(EU 번호)에서의 아미노산들이 글루탐산(E)으로 치환된, 제 21 항 내지 제 23 항의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 상기 변형은 예를 들면 쌍형성오류와 같은 바람직하지 않는 영향을 방지하는 유리한 성질을 갖는 소위 하전된 잔기들을 유도한다.
또한, 표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 암배아 항원(CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군에서 선택되는, 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
표적 세포 항원이 FAP인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자
특정 양태에서, 표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 7 또는 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 8 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 9 또는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 10 또는 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 11 또는 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 12 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, (i) 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 106의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 107의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
특정 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 양태에서, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 106의 아미노산 서열로 이루어진 VH 도메인 및 서열번호 107의 아미노산 서열로 이루어진 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄, 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 CH1 도메인에 융합되는 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 2 중쇄, 및 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 CL 도메인에 융합되는 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되며, 이때 상기 항원 결합 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 14, 서열번호 108, 서열번호 111 및 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 15, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 112 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
또 다른 특정 양태에서, 둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄, 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 CL 도메인에 융합되는 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 2 중쇄, 및 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 CH1 도메인에 융합되는 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되며, 이때 상기 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 115, 서열번호 117, 서열번호 119 및 서열번호 173으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120 및 서열번호 174로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
보다 특히, 다음을 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다:
(a) 둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄(이때, 상기 제 1 중쇄는 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 상기 제 1 경쇄는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다), 및
(b) 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 CL 도메인에 융합되는 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 2 중쇄, 및 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 CH1 도메인에 융합되는 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 경쇄(이때, 상기 제 2 중쇄는 서열번호 119 또는 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제 2 경쇄는 서열번호 120 또는 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함한다). 특히, 제 2 중쇄는 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하고, 제 2 경쇄는 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는 상기 제 1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하는 것을 특징으로 하고, 이때 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함한다.
특정한 양태에서, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함한다.
보다 특히, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(ii) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(iii) 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다:
a) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
c) 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호109:의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
d) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
e) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄를 포함하는 분자;
f) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
g) 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
h) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
i) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자; 및
j) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 다음으로 이루어진 군에서 선택된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다:
a) 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
b) 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄를 포함하는 분자;
d) 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
e) 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자; 및
f) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄를 포함하는 분자.
특히, 본 발명은, 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, TNF 리간드 계열 구성원이 OX40L이고, 표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 7 또는 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 8 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 9 또는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 10 또는 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 11 또는 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 12 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 355로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 356의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
표적 세포 항원이 CD19인 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자
특정 양태에서, 표적 세포 항원이 CD19인 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양태에서, CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 195 또는 서열번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 196 또는 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 197 또는 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 198 또는 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 199 또는 서열번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 200 또는 서열번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, (i) 서열번호 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 198의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 199의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, (i) 서열번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 201의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 202의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 357의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 358의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 양태에서, CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하거나, 또는 이때 CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
특정 양태에서, CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄, 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 CH1 도메인에 융합되는 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 2 중쇄, 및 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 CL 도메인에 융합되는 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되며, 이때 상기 항원 결합 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 14, 서열번호 108, 서열번호 111 및 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 15, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 112 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
또 다른 특정 양태에서, 둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄, 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 CL 도메인에 융합되는 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 2 중쇄, 및 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 CH1 도메인에 융합되는 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되며, 이때 상기 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 115, 서열번호 117, 서열번호 119 및 서열번호 173으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120 및 서열번호 174로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
또한, 본 발명은 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는 상기 제 1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하는 것을 특징으로 하고, 이때 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함한다.
특정한 양태에서, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함한다.
보다 특히, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(ii) 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(iii) 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 310의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(iv) 서열번호 313의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 314의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다:
a) 서열번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
b) 서열번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
c) 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄를 포함하는 분자;
d) 서열번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
e) 서열번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자; 및
f) 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄를 포함하는 분자.
특히, 본 발명은, 서열번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 다음으로 이루어진 군에서 선택된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다:
a) 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
b) 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
c) 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄를 포함하는 분자;
d) 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
e) 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자; 및
f) 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄를 포함하는 분자.
특히, 본 발명은, 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
표적 세포 항원이 CEA인 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자
특정 양태에서, 표적 세포 항원이 CEA인 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양태에서, CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 321의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 322의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 323의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 324의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 326의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
특정 양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, (i) 서열번호 321의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 322의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 323의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 324의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 326의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 327의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 328의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 양태에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 327의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 328의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 329의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 330의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 양태에서, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기는 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 (a) 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄, 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 CH1 도메인에 융합되는 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 2 중쇄, 및 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 CL 도메인에 융합되는 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되며, 이때 상기 항원 결합 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 14, 서열번호 108, 서열번호 111 및 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 15, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 112 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
또 다른 특정 양태에서, 둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄, 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 CL 도메인에 융합되는 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 2 중쇄, 및 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 CH1 도메인에 융합되는 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공되며, 이때 상기 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
(ii) 서열번호 115, 서열번호 117, 서열번호 119 및 서열번호 173으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
(iii) 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120 및 서열번호 174로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
또한, 본 발명은 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기 및 (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공하며, 이때, 상기 항원 결합 분자는 상기 제 1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하는 것을 특징으로 하고, 이때 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함한다.
특정한 양태에서, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함한다.
보다 특히, 상기 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 337의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 338의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
(ii) 서열번호 341의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 342의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 관한 것이다:
a) 서열번호 333의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
b) 서열번호 333의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
c) 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 337의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 338의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄를 포함하는 분자;
d) 서열번호 333의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자;
e) 서열번호 333의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 분자; 및
f) 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 서열번호 341의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 342의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄를 포함하는 분자.
특히, 본 발명은, 서열번호 333의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명의 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 전체 항원 결합 분자를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 발현되거나 또는 동시-발현되는 다중(예를 들면, 2개 이상) 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 동시-발현되는 폴리뉴클레오티드들에 의해 암호화된 폴리펩티드들은, 예를 들면, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합되어 기능성 항원 결합 분자를 생성할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린의 경쇄 부분은 면역글로불린의 중쇄 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 동시-발현되는 경우, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합하여 면역글로불린을 생성할 것이다.
일부 양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 전체 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 암호화한다. 특히, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에 포함된 폴리펩티드를 암호화한다.
한 양태에서, 본 발명은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기를 암호화하는 서열, (b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열, 및 (c) 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기를 암호화하는 서열, (b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 4-1BBL의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열, 및 (c) 4-1BBL의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는, 4-1BB 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 96에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 2개의 4-1BBL 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 96에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1개의 4-1BBL 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기를 암호화하는 서열, (b) 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 OX40L의 2개의 엑토도메인 또는 그의 2개의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열, 및 (c) OX40L의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는, OX40L 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 서열번호 53 또는 서열번호 54에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 2개의 4-1BBL 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 53 또는 서열번호 54에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1개의 4-1BBL 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 특정 cDNA 서열과 적어도 약 90%, 95%, 98% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 특정 cDNA 서열 중 하나와 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
다른 양태에서, 핵산 분자는 서열번호 5, 6, 97, 98, 99, 183, 184 또는 185 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 14, 15, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115,116, 117, 118, 119, 120, 173 또는 174 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 핵산 분자는 서열번호 66, 67, 68, 69, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 137, 138, 141, 142, 143, 144, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 162, 163, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 203, 204, 207, 208, 211, 212, 215, 216, 273, 274, 277, 278, 281, 282, 285, 286, 289, 290, 293, 294, 297, 298, 301, 302, 305, 307, 308, 311, 312, 315, 316, 331, 332, 335, 336, 339, 340, 343, 344, 347, 348, 353 또는 354로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는, 예를 들면, 고체-상태 펩티드 합성(예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고상 합성) 또는 재조합 생성에 의해 수득될 수 있다. 재조합 생성의 경우, 예를 들어, 전술한 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입시킨다. 상기 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리되고 서열화될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 방법을 이용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 상기 방법들로는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다(예를 들면, 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); and Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기재되어 있는 기술 참조). 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있거나, 또는 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편(즉, 암호화 영역)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동가능하게 결합되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈들로 이루어지는 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 존재하는 경우, 암호화 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있으나, 임의의 인접(flanking) 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5' 및 3' 미번역 영역 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 암호화 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구조물에, 예를 들면, 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구조물들에, 예를 들면, 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나, 또는 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다, 예를 들면, 본 발명의 벡터는 번역후 또는 번역과 동시에 단백질분해성 절단에 의해 최종 단백질로 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 비융합된 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은, 제한하지 않고, 분화된(specialized) 요소 또는 모티프, 예를 들면, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동가능한 결합은, 유전자 산물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 조절하에 유전자 산물의 발현이 일어나게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들면, 폴리펩티드 암호화 영역 및 그와 결합된 프로모터)은, 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우, 및 2개의 DNA 단편들 사이의 결합의 성질이 유전자 산물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 또는 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 결합"된다. 따라서, 프로모터 영역은, 프로모터가 핵산의 전사를 수행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 작동가능하게 결합되는 것이다. 프로모터는, 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 조절 요소, 예를 들면, 인핸서, 작동유전자, 억제유전자 및 전사 종료 신호가 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 결합되어 세포-특이적 전사를 유도할 수 있다.
적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역들이 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역들이 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 이들로는, 제한하지 않고, 척추동물 세포에서 작용하는 전사 조절 영역, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(예를 들면, 인트론-A와 함께, 급속 초기발현(immediate early) 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들면, 초기발현 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들면, 라우스(Rous) 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 절편(이로 한정되지는 않는다)이 포함된다. 다른 전사 조절 영역으로는 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유도된 것들 뿐 아니라, 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 또 다른 적합한 전사 조절 영역으로는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서 뿐 아니라, 유도성 프로모터(예를 들면, 테트라사이클린 유도성 프로모터)가 포함된다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 이들로는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종료 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유도된 요소들(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES)이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 발현 카세트는 또한 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복서열(long terminal repeat, LTR), 또는 아데노-결합 바이러스(AAV)의 역 말단 반복서열(ITR)과 같은 다른 특징들도 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가의 암호화 영역과 결합될 수 있다. 예를 들면, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편의 분비를 목적하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA는 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 위치할 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 일단 조면 소포체를 가로질러 성장 단백질 쇄의 확산이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면, 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드는 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 상기 신호 펩티드는 번역된 폴리펩티드로부터 절단되어, 분비된 형태 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생성함을 인지할 것이다. 특정 실시양태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그와 작동가능하게 결합된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 또는, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 그의 기능성 유도체가 사용될 수도 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
후속의 정제를 촉진하거나(예를 들면, 히스티딘 태그) 또는 융합 단백질의 표지화를 돕기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA가 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내에 또는 그의 말단에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터 각각과 관련하여 본원에 기술된 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다. 한 양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자(의 일부)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들면, 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 융합 단백질 또는 그의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의 종류의 세포 시스템을 말한다. 항원 결합 분자를 복제하고 그의 발현을 촉진하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 세포는 특정 발현 벡터로 적절하게 형질감염되거나 또는 형질도입될 수 있으며, 대규모 발효조에 접종하여 임상 용도로 충분한 양의 항원 결합 분자를 수득하기 위해 대량의 벡터 함유 세포를 성장시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵 미생물, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이, 또는 다양한 진핵 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등이 포함된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 세균에서 생성될 수 있다. 발현 후에, 폴리펩티드는 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며, 더 정제될 수 있다. 원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴으로 폴리펩티드의 생성을 야기하는 진균류 및 효모 균주를 포함하여, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 폴리펩티드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)] 및 [Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)] 참조).
(글리코실화) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다. 식물 세포 배양물도 또한 숙주로 사용될 수 있다(예를 들면, (유전자전이 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES: 상표) 기술을 기재하고 있는) 미국 특허 제 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 호 참조). 척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액중에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들면, 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 dhfr_ CHO 세포[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)]를 포함하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주가 포함된다. 단백질 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조하시오. 숙주 세포로는 배양 세포, 예를 들어, 몇가지만 들자면, 포유동물 배양 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포 뿐 아니라, 유전자전이 동물, 유전자전이 식물 또는 배양 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포가 포함된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프구 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 상기 시스템들에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 둘 다 갖는 면역글로불린이도록 면역글로불린 쇄들 중 나머지 쇄를 또한 발현하도록 조작될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편의 발현에 적합한 조건하에서, 본원에서 제공된 바와 같은 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편을 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 그의 폴리펩티드 단편의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자에서, 구성성분들(표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 1개의 폴리펩티드, 및 상기 TNF 계열 리간드 계열 구성원의 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드)은 유전적으로 서로에 융합되지 않는다. 상기 폴리펩티드들은, 그 구성성분들(TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편, 및 CH 또는 CL과 같은 다른 구성성분들)이 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 서로에 융합되도록 설계된다. 링커의 조성 및 길이는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있으며, 효능에 대해 검사될 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자의 상이한 구성성분들 사이의 링커 서열의 예는 본원에 제공된 서열들에서 확인된다. 바람직한 경우, 융합 단백질의 개개 구성성분들을 분리하기 위한 절단 부위를 혼입시키기 위해 추가의 서열, 예를 들면, 엔도펩티다제 인식 서열도 또한 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항원 결합 분자의 일부를 형성하는, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기(예를 들면, Fab 단편)는 적어도, 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비-천연 항체 및 그의 단편의 일부를 형성할 수 있고, 상기 항체 및 그의 단편으로부터 유도될 수 있다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 비-천연 항체는 고상-펩티드 합성을 이용하여 구성될 수 있거나, 재조합적으로 생성될 수 있거나(예를 들면, 미국 특허 제 4,186,567 호에 기술된 바와 같이), 또는 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다(예를 들면, 맥카퍼티(McCafferty)의 미국 특허 제 5,969,108 호 참조).
임의의 동물 종의 면역글로불린이 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 비-제한적 면역글로불린은 뮤린, 영장류 또는 인간 기원을 가질 수 있다. 융합 단백질이 인간에 사용하기 위한 것인 경우, 면역글로불린의 불변 영역이 인간으로부터 유래된, 면역글로불린의 키메라 형태를 사용할 수 있다. 면역글로불린의 인간화 또는 완전 인간 형태는 또한 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들면, 윈터(Winter)의 미국 특허 제 5,565,332 호 참조). 인간화는, (a) 핵심 프레임워크 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 유지하는데 중요한 것들)를 갖거나 갖지 않는 인간(예를 들면, 수용체 항체) 프레임워크 및 불변 영역 상으로 비-인간(예를 들면, 공여체 항체) CDR의 그라프팅, (b) 비-인간 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 결정적인 잔기)의 인간 프레임워크 및 불변 영역 상으로의 그라프팅, 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하되, 표면 잔기의 치환에 의해 인간-유사 구획으로 이들을 "클로킹(cloaking)"하는 것을 포함하는(이로 한정되지는 않는다) 다양한 방법들에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들면, 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에 개관되어 있으며, 예를 들면, 다음 문헌들에 더 기술되어 있다: 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)]; [Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409 호; 문헌[Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)]; [Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)]; [Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)]; [Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)]; [Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)](SDR(a-CDR) 그라프팅을 기술하고 있음); 문헌[Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)]("표면처리(resurfacing)"를 기술하고 있음); 문헌[Dall' Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 기술하고 있음); 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005)] 및 [Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근방법을 기술하고 있음). 본 발명에 따른 특정한 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-374 (2001)] 및 [Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 기술되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단일클론 항체의 일부를 형성할 수 있으며, 상기 항체로부터 유도될 수 있다(예를 들면, 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 항원 자극에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 유전자전이 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌[Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다(예를 들면, 문헌[Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]; 및 [MaCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다.
특정 양태에서, 본 발명의 항원 결합 분자에 포함된, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기(예를 들면, Fab 단편)는, 예를 들면, PCT 공개 WO 2012/020006 호(친화도 증진에 관한 실시예 참조) 또는 미국 특허출원 공개 제 2004/0132066 호에 개시된 방법에 따라 증대된 결합 친화도를 갖도록 조작된다. 특이적 항원 결정기에 결합하는 본 발명의 항원 결합 분자의 능력은, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 당해 분야의 기술을 가진 자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명 기술[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)] 및 전통적인 결합 분석법[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)]을 통해 측정할 수 있다. 경쟁 분석법을 이용하여, 특정 항원에 대한 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항원 결합 분자를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 경쟁 항체는 기준 항원 결합 분자에 의해 결합되는 동일 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프의 지도작성을 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Human Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다. 예시적인 경쟁 분석법에서는, 항원에 결합하는 제 1 표지된 항원 결합 분자 및 항원에 대한 결합에 대해 제 1 항원 결합 분자와 경쟁하는 그의 능력에 대해 검사되는 제 2의 비표지 항원 결합 분자를 포함하는 용액중에서, 고정화된 항원을 배양한다. 상기 제 2 항원 결합 분자는 하이브리도마 상등액중에 존재할 수 있다. 대조군으로, 제 1 표지된 항원 결합 분자는 포함하지만 제 2의 비표지된 항원 결합 분자는 포함하지 않는 용액중에서 고정화 항원을 배양한다. 제 1 항체의 항원에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 배양한 후, 과잉 미결합 항체를 제거하고, 고정화 항원과 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화 항원과 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 검사 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 그것은 제 2 항원 결합 분자가 항원에 대한 결합에 대해 제 1 항원 결합 분자와 경쟁하는 것을 나타낸다(문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참조).
본원에 기술된 바와 같이 제조된 본 발명의 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하기 위해 사용되는 실제 조건은, 부분적으로, 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 요인들에 따라 달라질 것이며, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스를 사용할 수 있다. 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 기본적으로 실시예에 기술된 바와 같이 항원 결합 분자를 단리할 수 있다. TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 또는 그의 단편의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하여 다양한 공지된 임의의 분석 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면, 실시예에서 기술된 바와 같이 발현된 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 환원 및 비-환원 SDS-PAGE에 의해 입증되는 바와 같이 온전하고 적절히 구성된 것으로 나타났다.
분석법
본원에 제공된 항원 결합 분자는, 당해 분야에 공지된 다양한 분석법들에 의해 그의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 스크리닝되거나 또는 특성화될 수 있다.
1. 친화도 분석법
상응하는 TNF 수용체에 대한 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 친화도는, 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)와 같은 표준 기기장치, 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 나타낸 방법에 따라 측정될 수 있다. 표적 세포 항원에 대한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 친화도는 또한, 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)와 같은 표준 기기장치, 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예증적이고 예시적인 실시양태는 실시예 4에서 기술된다. 한 양태에 따라서, KD는 25℃에서 비아코어(등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된다.
2. 결합 분석법 및 기타 분석법
상응하는 수용체 발현 세포에 대한 본원에 제공된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 결합은 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여, 예를 들면, 유동세포분석(FACS)에 의해 평가될 수 있다. 한 양태에서, TNF 수용체를 발현하는 신선한 말초혈 단핵 세포(PBMC)가 결합 분석에 사용된다. 상기 세포들은 단리후에(나이브 PBMC) 또는 자극후에(활성화된 PBMC) 직접 사용된다. 또 다른 양태에서, 상응하는 TNF 수용체 발현 세포에 대한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 결합을 입증하기 위해 활성화된 마우스 비장세포(TNF 수용체 분자를 발현하는)를 사용하였다.
또 다른 양태에서, 표적 세포 항원, 예를 들면, FAP를 발현하는 암 세포주를 사용하여 표적 세포 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합을 입증하였다.
또 다른 양태에서, 경쟁 분석법을 이용하여 표적 또는 TNF 수용체 각각에 결합하기 위해 특이적 항체 또는 항원 결합 분자와 경쟁하는 항원 결합 분자를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 경쟁 항원 결합 분자는 특이적 항-표적 항체 또는 특이적 항-TNF 수용체 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 그에 항체가 결합하는 에피토프의 지도작성을 위한 상세한 예시적 방법은 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다.
3. 활성 분석법
한 양태에서, 특이적 표적 세포 항원에 및 생물 활성을 갖는 특이적 TNF 수용체에 결합하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 확인하기 위한 분석법이 제공된다. 생물 활성은, 예를 들면, 표적 세포 항원을 발현하는 세포 상에서 TNF 수용체를 통한 작용성 신호전달을 포함할 수 있다. 상기 분석법들에 의해 시험관내에서 상기 생물 활성을 갖는 것으로 확인된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자도 또한 제공된다.
특정 양태에서, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 상기 생물 활성에 대해 검사된다. 본 발명의 분자들의 생물 활성을 검출하기 위한 분석법들은 실시예 6에서 기술된 것들이다. 또한, 세포 용해(예를 들면, LDH 방출을 측정함으로써), 유도된 세포자살 동역학(예를 들면, 카스파제 3/7 활성을 측정함으로써) 또는 세포자살(예를 들면, TUNEL 분석법을 이용하여)을 검출하기 위한 분석법은 당해 분야에 공지되어 있다. 또한, 상기 복합체들의 생물 활성은, NK 세포, NKT-세포 또는 γδ T-세포와 같은 다양한 림프구 아집단의 생존, 증식 및 림포카인 분비에 대한 그의 영향을 평가하거나, 또는 수지상 세포, 단핵구/대식세포 또는 B-세포와 같은 항원 제공 세포의 표현형 및 기능을 조절하는 그의 능력을 평가함으로써 평가될 수 있다.
약학 조성물, 제형 및 투여 경로
또 다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들면, 하기 치료 방법들 중 임의의 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 및 1개 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 및 1개 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 하기에 기술되는 바와 같은 치료제를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제에 용해되거나 분산된 하나 이상의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 결합 분자를 치료 효과량 포함한다. "약학적 또는 약리학적으로 허용되는"이란 어구는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체(recipient)에게 일반적으로 무독성인, 즉, 예를 들면, 인간과 같은 동물에 적절하게 투여될 때, 해롭거나, 알레르기성이거나 다른 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 말한다. 하나 이상의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 결합 분자 및 선택적으로 추가의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제제는, 본원에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company (1990)]에 예시된 바와 같이, 본 개시내용에 비추어, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지되어 있을 것이다. 특히, 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 부형제"는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 바와 같이, 임의 및 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 방부제(예를 들면, 항균제, 항진균제), 등장화제, 염, 안정화제 및 그의 혼합물을 포함한다
비경구 조성물로는 주사, 예를 들면, 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 기관지내 또는 복강내 주사에 의해 투여하도록 설계된 것들이 포함된다. 주사의 경우, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충제, 예를 들어, 행크스(Hanks) 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 생리적 식염수 완충액 중에 제형화될 수 있다. 상기 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또는, 융합 단백질은 사용전에, 적당한 비히클, 예를 들면, 멸균 발열원-비함유수로 조성되기 위한 분말 형태일 수 있다. 멸균 주사액은, 본 발명의 융합 단백질을, 필요에 따라, 하기에 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매에 필요량으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균은, 예를 들면, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사액, 현탁액 또는 유화액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균-여과된 액체 매질로부터 활성 성분과 임의의 추가의 바람직한 성분들의 분말을 제공하는 진공-건조 또는 동결-건조 기술이다. 액체 매질은 필요한 경우 적절히 완충되어야 하며, 액체 희석제는 주사전에 충분한 식염수 또는 글루코스로 먼저 등장성이 되어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며, 세균 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들면, 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 함을 인지할 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 부형제로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예를 들면, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사용 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적당한 안정화제, 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고농축 용액의 제조를 가능케 하는 약제를 함유할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절하게 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예를 들면, 호마유 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어, 에틸 클리에이트 또는 트라이글리세리드 또는 리포좀이 포함된다.
활성 성분들은, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 거대유화액에 봉입될 수 있다. 상기 기술들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예로는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 특정 실시양태에서, 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 조성물중에 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 그의 혼합물을 사용하여 이루어질 수 있다.
본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 부형제로는 또한 간질성(intersitial) 약물 분산제, 예를 들면, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들면, rhuPH20(하일레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))이 포함된다. rhuPH20을 포함하여, 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법은 US 특허 공개 2005/0260186 호 및 2006/0104968 호에 기술되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 혼합된다.
예시적인 동결건조 항체 제형이 미국 특허 제 6,267,958 호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형으로는 미국 특허 제 6,171,586 호 및 WO 2006/044908 호에 기술된 것들이 포함되며, 상기 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
전술한 조성물 이외에, 융합 단백질은 또한 데포(depot) 제제로 제형화될 수 있다. 상기 지효성(long acting) 제형은 이식(예를 들면, 피하 또는 근육내에)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 융합 단백질은 적당한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용되는 오일중 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들면, 난용성 염으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 봉입 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물은, 단백질을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 유리 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물 중에 배합될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 유리 산 또는 염기의 생물 활성을 실질적으로 유지하는 염이다. 이들로는 산 부가염, 예를 들면, 단백성 조성의 유리 아미노기에 의해 생성된 염, 또는 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산에 의해 생성된 염이 포함된다. 유리 카복실기에 의해 생성된 염도 또한, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물과 같은 무기 염기로부터; 또는 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에 더 가용성인 경향이 있다.
본 발명의 조성물은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 대로 하나보다 많은 활성 성분, 바람직하게는 서로에 불리하게 영향을 미치지 않는 상호보완적인 활성을 갖는 활성 성분을 함유할 수 있다. 상기 활성 성분들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 적절히 함께 존재한다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들면, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 치료 방법에 사용될 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 올바른 의료 행위에 따른 방식으로 제형화되고 조제되고 투여된다. 이와 관련하여 고려될 요인들로는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지되어 있는 기타 요인들이 포함된다.
한 양태에서, 약제로 사용하기 위한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 또 다른 양태에서, 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 특히 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 한 양태에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은, 개체에게 치료 효과량의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 양태에서, 치료될 질환은 암이다. 암의 예로는 고형 종양, 방광암, 신세포 암종, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 대장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암종, 뼈암, 및 신장암, 흑색종, B-세포 림프종, B-세포 백혈병, 비-호지킨 림프종 및 급성 림프모구성 백혈병이 포함된다. 따라서, 암의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 치료를 필요로 하는 대상, 환자 또는 "개체"는 전형적으로 포유동물, 보다 특히는 인간이다.
또 다른 양태에서, 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한, 특히 바이러스 감염의 치료를 위한, 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다. 또 다른 양태에서, 예를 들면, 루푸스 질환과 같은 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
한 양태에서, 표적 세포 항원이 FAP인, 두경부 편평세포암종(HNSCC), 유방암, 대장암(CRC), 췌장암(PAC), 위암, 비-소세포 폐암종(NSCLC) 및 중피종을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료를 위한 약제를 제조하는데 있어서 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 한 양태에서, 상기 약제는 질환을 갖는 개체에게 치료 효과량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 치료될 질환은 증식성 질환, 특히 암이다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 암의 예로는 고형 종양, 방광암, 신세포 암종, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 대장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암종, 뼈암, 및 신장암, 흑색종, B-세포 림프종, B-세포 백혈병, 비-호지킨 림프종 및 급성 림프모구성 백혈병이 포함된다. 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 사용하여 치료될 수 있는 다른 세포 증식 질환으로는 복부, 뼈, 유방, 소화기관, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 및 비뇨생식계에 위치한 종양이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 전암성 병태 또는 병변 및 암 전이도 또한 포함된다. 특정 실시양태에서, 암은 신세포암, 피부암, 폐암, 대장암, 유방암, 뇌암, 두경부암으로 이루어진 군에서 선택된다. 숙련된 전문가라면 일부 경우에서 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 치유를 제공할 수는 없고 단지 부분적 이점만을 제공할 수 있음을 인지할 수 있다. 일부 양태에서, 다소의 이점을 갖는 생리학적 변화도 또한 치료적으로 유리한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 양태에서, 생리적 변화를 제공하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"으로 간주된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 감염성 질환의 치료, 특히 바이러스 감염의 치료 또는 자가면역 질환, 예를 들면, 루푸스 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기술된 바와 같은 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료 효과량의 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명의 융합 단백질을 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 특정 양태에서, 치료될 질환은 증식성 질환이다. 특정 양태에서, 질환은 암이다. 또 다른 양태에서, 질환은 감염성 질환 또는 자가면역 질환이다. 특정 양태에서, 상기 방법은 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 치료될 질환이 암인 경우 항암제를 투여하는 것을 또한 포함한다. 임의의 상기 실시양태들에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, 융합 단백질의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 융합 단백질이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 또는 병행 치료 개입, 환자의 병력 및 융합 단백질에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 투여를 책임지는 의사는 아무튼 조성물 중 활성 성분(들)의 농도 및 개개 대상에 적절한 용량(들)을 결정할 것이다. 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.1 내지 10 mg/kg)의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가, 예를 들면, 하나 이상의 별개 투여에 의해서든 또는 연속 주입에 의해서든, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 전형적인 한 일일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 융합 단백질의 한 예시적인 투여량은 약 0.005 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 다른 예로, 용량은 또한 투여당, 약 1 ㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중, 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중, 약 500 mg/kg 체중, 약 1000 mg/kg 체중 이상, 및 그 안에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 숫자로부터 유도될 수 있는 범위의 예로, 전술한 숫자들에 준하여, 약 5 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주, 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20개, 또는 예를 들면, 약 6개 용량의 융합 단백질을 투여받도록). 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서, 하나 이상의 저용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 요법도 유용할 수 있다. 상기 치료의 진전은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 일반적으로 의도한 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 사용된다. 질환 상태를 치료하거나 예방하기 위한 용도로, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자, 또는 그의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 적용된다. 치료 효과량의 결정은, 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어, 당해 분야에 숙련된 자의 능력에 속한다.
전신 투여의 경우, 치료 효과적인 용량은 초기에 세포 배양 분석과 같은 시험관내 분석으로부터 평가될 수 있다. 이어서, 세포 배양물에서 측정시 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위한 용량을 동물 모델에서 제형화할 수 있다. 상기 정보를 이용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
초기 투여량은 또한 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여, 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모델로부터 평가될 수 있다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 동물 데이터에 근거하여 인간에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
투여량 및 간격은 치료 효과를 유지하기에 충분한 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여에 통상적인 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일의 범위이다. 치료 효과적인 혈장 수준은 매일 다중 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장내 수준은, 예를 들면, HPLC로 측정될 수 있다.
국소 투여 또는 선택적 섭취의 경우, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수도 있다. 당해 분야에 숙련된 자는 과도한 실험없이 치료 효과적인 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기술된 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 치료 효과적 용량은 일반적으로 실질적인 독성을 야기하지 않고 치료 이점을 제공할 것이다. 융합 단백질의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 측정될 수 있다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구를 이용하여 LD50(한 개체군의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(한 개체군의 50%에서 치료 효과적인 용량)을 측정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수로서, 비 LD50/ED50으로 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자가 바람직하다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구에서 수득된 데이터를, 인간에 사용하기에 적합한 범위의 투여량을 제형화하는데 이용할 수 있다. 상기 투여량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 든다. 상기 투여량은 다양한 요인들, 예를 들면, 사용되는 투여 형태, 사용되는 투여 경로, 대상의 병태 등에 따라 상기 범위내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 병태에 비추어 개개 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 본원에 전체로 참고로 인용된 문헌[Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1] 참조).
본 발명의 융합 단백질로 치료된 환자의 주치의는 독성, 장기 기능부전 등으로 인해 투여를 어떻게 및 언제 종료하거나, 중단하거나 또는 조정할지를 알 것이다. 반대로, 주치의는 또한 임상 반응이 적절하지 않은 경우(방해하는 독성), 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 것을 알 것이다. 해당 질환의 관리에서 투여되는 용량의 크기는 치료될 병태의 중증도에 따라, 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 병태의 중증도는, 예를 들면, 부분적으로, 표준 진단 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 아마도 용량 빈도도 또한 개개 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
다른 약제 및 치료
본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 치료에서 하나 이상의 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 동시-투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 상기 치료를 필요로 하는 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있는 임의의 약제를 포함한다. 상기 추가의 치료제는 치료되는 특정 징후에 적합한 임의의 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상호보완적 활성을 갖는 성분들을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 또 다른 항암제이다.
상기 다른 약제들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 함께 적절히 존재한다. 상기 다른 약제들의 효과량은 사용되는 융합 단백질의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의한 기타 요인들에 따라 달라진다. TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자는 일반적으로 본원에 기술된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로로 사용되거나, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 측정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
상기 언급한 상기 병용 치료는 복합 투여(2개 이상의 치료제가 동일 조성물 또는 별개의 조성물에 포함되는 경우) 및 별도의 투여를 포함하며, 별도 투여의 경우, 본 발명의 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다.
제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 상기 용기 상에 또는 용기에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 포함하며, 멸균 진입구를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자이다.
표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성 약제 또는 아니면 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서의 상기 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 상기 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3)의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
[표 C]
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제공되어 있다. 항체 쇄들의 아미노산은 상기에서 정의된 바와 같은 카바트[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 따른 EU 번호 체계에 따라 번호를 붙이고 지칭된다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 실시양태들이 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
재조합 DNA 기술
표준 방법을 이용하여 문헌[Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약들은 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242]에 제공되어 있다.
DNA 서열분석
DNA 서열은 이중 가닥 서열분석에 의해 결정하였다.
유전자 합성
필요한 경우, 목적하는 유전자 절편을 적절한 주형을 사용하여 PCR에 의해 생성하거나 또는 자동 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 진아트 아게(Geneart AG)(독일 레겐스부르크)에 의해 합성하였다. 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없는 경우, 가장 근사한 동족체로부터의 서열을 기준으로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고, 적절한 조직에서 유래한 RNA로부터 RT-PCR에 의해 유전자를 분리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 인접한 유전자 절편을 표준 클로닝/서열화 벡터 내에 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 UV 분광법으로 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편들의 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 각각의 발현 벡터내에 서브클로닝시키기 위해 적당한 제한효소 부위를 갖는 유전자 절편들을 설계하였다. 모든 구조물들은 진핵 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 암호화하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 설계되었다.
세포 배양 기술
표준 세포 배양 기술을 문헌[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.]에 기술된 바와 같이 이용하였다.
단백질 정제
표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 간략하게, 항체들을 단백질 A 세파로스 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용하고 PBS로 세척하였다. 항체의 용출을 pH 2.8에서 달성한 후 샘플을 즉시 중화시켰다. 응집된 단백질을 PBS 중에서 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl pH 6.0 중에서 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스(Superdex) 200, 지이 헬쓰케어)에 의해 단량체성 항체들로부터 분리하였다. 단량체성 항체 분획들을 모으고, (필요한 경우) 예를 들면, 밀리포어 아미콘 울트라(MILLIPORE Amicon Ultra)(30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축시키고, 냉동시키고 -20℃ 또는 -80℃에서 저장하였다. 예를 들면, SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 질량 분석법에 의한 후속 단백질 분석 및 분석적 특성화를 위해 샘플들의 일부를 제공하였다.
SES-PAGE
뉴페이지(NuPAGE)(등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐 (Invitrogen))을 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 특히, 10% 또는 4 내지 12% 뉴페이지(등록상표) 노벡스(Novex)(등록상표) 비스-트리스(Bis-TRIS) 프리-캐스트 겔(pH 6.4) 및 뉴페이지(등록상표) MES(환원 겔, 뉴페이지(등록상표) 산화방지제 러닝 완충액(running buffer) 첨가제 사용) 또는 MOPS(비-환원 겔) 러닝 완충액을 사용하였다.
분석적 크기 배제 크로마토그래피
항체들의 응집 및 올리고머 상태를 측정하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 HPLC 크로마토그래피로 수행하였다. 간략하게, 단백질 A 정제된 항체를 에이질런트(Agilent) HPLC 1100 시스템상에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.5 중에서 토소(Tosoh) TSK겔 G3000SW 컬럼에 적용하거나, 또는 디오넥스 HPLC-시스템상에서 2 x PBS 중에서 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 용출된 단백질은 UV 흡광도 및 피크 면적 적분에 의해 정량화하였다. 바이오래드 겔 여과 표준물(BioRad Gel Filtration Standard) 151-1901이 표준물로 사용되었다.
질량 분석법
본 섹션은 그의 정확한 조립을 강조하여 VH/VL 교환(VH/VL 크로스Mab)을 갖는 다중특이성 항체의 특성화를 기술한다. 예상된 1차 구조는 탈글리코실화된 온전한 크로스Mab 및 탈글리코실화/플라스민 절단되거나 또는 양자택일적으로 탈글리코실화/제한 LysC 절단된 크로스Mab의 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)에 의해 분석하였다.
37℃에서 1 mg/ml의 단백질 농도에서 포스페이트 또는 트리스 완충액 중에서 N-글리코시다제 F를 사용하여 17 시간 이하동안 VH/VL 크로스Mab를 탈글리코실화시켰다. 플라스민 또는 제한 LysC(로슈(Roche)) 절단은 각각 실온에서 120 시간동안 및 37℃에서 40 분동안, 트리스 완충액 pH 8 중에서 100 ㎍ 탈글리코실화 VH/VL 크로스Mab를 사용하여 수행하였다. 질량 분석 전에, 샘플들을 세파덱스 G25 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에서 HPLC에 의해 탈염시켰다. 총 질량은 트라이버사 나노메이트(TriVersa NanoMate) 광원(애드비온(Advion))이 장착된 maXis 4G UHR-QTOF MS 시스템(브루커 달토닉(Bruker Daltonik)) 상에서 ESI-MS에 의해 측정하였다.
표면 플라즈몬 공명(SPR)(비아코어)을 이용한 각각의 항원에 대한 다중특이성 항체의 결합 및 결합 친화도의 측정
생성된 항체들의 각각의 항원들에 대한 결합은 비아코어 기기(지이 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 조사하였다. 간략하게, 친화도 측정을 위해 염소-항-인간 IgG, JIR 109-005-098 항체를, 각 항원에 대한 항체를 제공하기 위해 아민 커플링을 통해 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 결합은 25℃(또는 양자택일적으로 37℃)에서 HBS 완충액(HBS-P(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% 트윈 20, pH 7.4)) 중에서 측정하였다. 항원(R&D 시스템즈 또는 사내 정제됨)을 용액중에서 다양한 농도로 첨가하였다. 결합은 80 초부터 3 분까지의 항원 주입에 의해 측정하고; 해리는 칩 표면을 HBS 완충액으로 3 내지 10 분동안 세척하여 측정하고, KD 값을 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 사용하여 평가하였다. 시스템 고유 기준선 드리프트의 보정을 위해서 및 잡음 신호 감소를 위해 음성 대조군 데이터(예를 들면, 완충액 곡선)를 샘플 곡선으로부터 차감하였다. 센서그램의 분석 및 친화도 데이터의 산출을 위해 각각의 비아코어 평가 소프트웨어를 이용하였다.
실시예 1
1.1 표적화 인간 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조
인간 4-1BB 리간드의 엑토도메인의 일부(아미노산 71-254, 52-254 및 80-254)를 암호화하는 DNA 서열의 상이한 단편들을 유니프롯 데이터베이스의 P41273 서열(서열번호 42)에 따라 합성하였다.
TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 조립을 위한 구성성분들로서, (G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드의 2개의 엑토도메인을 포함하고 인간 IgG1-CH1 또는 CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를, 도 1A(인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH1 또는 CL)에 도시된 바와 같이, 또는 도 1C(인간 CH3, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드)에 도시된 바와 같이 클로닝하였다.
4-1BB 리간드의 1개 엑토도메인을 포함하고 인간 IgG1-CL 또는 CH1 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 1B (인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL 또는 CH1)에 도시된 바와 같이 또는 도 1D (인간 CH3, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드)에 도시된 바와 같이 클로닝하였다.
상기 폴리펩티드들은 선택적 펩티드 링커를 사용하여 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다, 예를 들면, 구조물 1의 경우, 인간 CH1 도메인에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를, 서열번호 13의 링커 (G4S)2 또는 서열번호 57의 (GSPGSSSSGS)를 사용하여 놉(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열들의 가변 영역, 즉, 28H1을, 홀[Carter, J. Immunol. Methods (2001), 248, 7-15]의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. FAP 결합자의 생성 및 제조는 본원에 참고로 인용된 WO 2012/020006 A2 호에 기술되어 있다.
표 1은 생성된 구조물들의 특성을 요약한 것이다. 구조물 1 내지 10은 그의 기하구조, FAP에 대한 결합가, 4-1BB 리간드 엑토도메인, CH1 및 CL 도메인의 교차(크로스Mab 기술), CH1 및 CL 도메인에서의 돌연변이, 및 4-1BB 리간드의 1개 엑토도메인을 포함하는 폴리펩티드(단량체성 4-1BBL 쇄)에서의 상이한 펩티드 링커에 있어 상이하다.
생성된 TNF 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자(FAP 분할 4-1BBL 삼량체)의 특성
구조물 FAP에
대한 결합가 		FAP
결합자 		4-1BBL
엑토도메인 		교차된
CH1-CL
도메인 		하전된
잔기 		경쇄에서
4-1BBL에 대한 링커
1.1 1가 28H1 71-254 없음 없음 (G4S)2
1.2 1가 28H1 71-254 있음
(리간드)		 있음
(리간드)		 (G4S)2
1.3 1가 28H1 71-254 있음
(FAP Fab)		 있음
(리간드)		 (G4S)2
1.4 1가 28H1 71-254 없음 있음
(리간드)		 (G4S)2
1.5 2가 28H1 71-254 없음 없음 (G4S)2
1.6 1가 28H1 71-254 없음 있음
(리간드)		 (G4S)2
1.7 2가 28H1 71-254 있음
(리간드)		 있음
(리간드)		 (G4S)2
1.8 2가 28H1 71-254 있음
(리간드에 융합된 FAP Fab)		 있음
(리간드)		 (G4S)2
1.9 1가 28H1 52-254 없음 있음
(리간드)		 (G4S)2
1.10 1가 28H1 80-254 없음 있음
(리간드)		 (G4S)2
쌍형성오류를 방지하기 위해, 구조물들의 대부분에서 CH1 및 CL 도메인들의 1개 쌍을 WO 2009/080253 A1 호에 기술된 바와 같이 서로 치환시켰다(도메인 교차).
정확한 쌍형성을 더 개선하기 위해, 상이한 하전된 아미노산 치환들을 구조물 2 내지 4 및 6 내지 10에서 하전된 잔기로서 교차 또는 비-교차된 CH1 및 CL 도메인들에 도입하였다. 인간 CL 도메인에는 돌연변이 E123R 및 Q124K가 도입된 반면, 돌연변이 K147E 및 K213E가 인간 CH1 도메인내에 클로닝되었다.
모든 구조물들에 있어서, 놉쇄의 CH3 도메인에 S354C/T366W 돌연변이 및 홀쇄의 CH3 도메인에 상응하는 Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이와 함께 놉 인투 홀 이종이량체화 기술을 사용하였다[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)].
국제 특허 출원 공개 WO 2012/130831 A1 호에 기술된 방법에 따라 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입시켜 Fc 감마 수용체들에 대한 결합을 배제시켰다.
예를 들면, 구조물 1에서, 제 2 CH3 도메인에 Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-FAP-Fc 홀쇄와, 제 1 CH3 도메인에 S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 리간드-Fc 놉쇄의 조합은 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 FAP 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 2, 그래프 1.1).
표 2는 1가 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 1.1)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
표 3은 CH1-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 1가 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 1.2)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
표 4는 1가 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구조물 1.3(항-FAP Fab에 CH1-CL 교차 및 4-1BBL 함유 쇄 상에 하전된 잔기를 갖는 FAP 분할 삼량체)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
표 5는 1가 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구조물 1.4(CH1-놉쇄에 융합된 항-FAP Fab, 단량체성 4-1BB 리간드 및 4-1BBL 함유 쇄 상에 하전된 잔기를 갖는 FAP 분할 삼량체)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
표 6은 2가 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구조물 1.5(각각, 각 중쇄의 C-말단에서 융합된 2개의 항-FAP Fab, 이량체 및 단량체성 4-1BB 리간드를 갖는 FAP 분할 삼량체)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
표 7은 1가 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구조물 1.6((G4S)-링커를 통해 CL*에 융합된 항-FAP Fab, 단량체성 4-1BB 리간드를 갖는 FAP 분할 삼량체)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
표 8은 2가 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구조물 7(Fc 홀쇄의 N-말단 상에 이중 항-FAP 및 4-1BB 리간드에 융합된 교차된 CH1 및 CL 상에 하전된 잔기를 갖는 FAP 분할 삼량체)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
표 9는 2가 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구조물 1.8(놉쇄 상에 하전된 잔기와 함께 항-FAP 교차Fab에 융합된 4-1BB 리간드를 갖는 FAP 분할 삼량체)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
표 10은 1가 FAP-표적화 4-1BB 리간드(52-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구조물 1.9(리간드 쇄 상에 4-1BBL 엑토도메인 아미노산 52-254 및 하전된 잔기를 갖는 FAP 분할 삼량체)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
표 11은 1가 FAP-표적화 4-1BB 리간드(80-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구조물 1.10(리간드 쇄 상에 4-1BBL 엑토도메인 아미노산 80-254 및 하전된 잔기를 갖는 FAP 분할 삼량체)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
1.2 FAP(28H1) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 구조물의 생성
표적화 TNF 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 암호화 서열들을, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3' 말단에 위치한 합성 폴리A 서열을 함유하는 플라스미드 벡터내에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 표적화 TNF 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자를 생성하였다. 구조물 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10에 대해 1:1:1:1 비(예를 들면, "벡터 이량체성 리간드-(CH1 또는 CL)-놉쇄":"벡터 단량체성 리간드 융합물-(CL 또는 CH1)":"벡터 항-FAP Fab-홀 중쇄":"벡터 항-FAP 경쇄")에서 상응하는 발현 벡터로 세포를 형질감염시켰다. 2가 구조물 5의 경우, 1:1:1 비("벡터 홀 중쇄":"벡터 놉 중쇄":"벡터 항-FAP 경쇄")를 사용하였다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 생성을 위해, 30억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간전에 접종하였다. 형질감염을 위해 세포를 210 x g에서 10 분동안 원심분리하고, 상등액을 20 mL의 예열된 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터(200 ㎍의 전체 DNA)를 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15 초동안 볼텍싱하고 실온에서 10 분간 배양하였다. 그후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3 시간동안 배양하였다. 배양 후에, 6 mM L-글루타민, 5 g/L 펩소이(PEPSOY) 및 1.2 mM 발프로산이 보충된 160 mL의 엑셀(Excell) 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간동안 배양하였다. 형질감염 1일후에 12% 피드(Feed) 7 및 글루코스(최종 농도 3 g/L)를 첨가하였다. 7 일동안 배양한 후에, 상등액을 400 x g에서 30 내지 40 분동안 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 표적화 TNF 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자를 정제하였다. 친화성 크로마토그래피의 경우, 상등액을 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산나트륨 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 맵셀렉트 슈어(MabSelect Sure) 컬럼(CV = 5 내지 15 mL, 지이 헬쓰케어의 수지) 상에 부하시켰다. 적어도 6개 컬럼 부피의 동일 완충액으로 세척하여 미결합 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은, 20 mM 시트르산나트륨, 100 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신 완충액(pH 3.0)으로 선형 구배(20 CV) 또는 단계 용출(8 CV)을 이용하여 용출시켰다. 선형 구배의 경우, 추가의 4개 컬럼 부피의 단계 용출을 적용하였다.
수거된 분획들의 pH를 1/10(v/v)의 0.5 M 인산나트륨 pH 8.0을 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축시킨 다음, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, 0.01%(v/v) 트윈20 용액으로 평형화된 하이로드(HiLoad) 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 표적화 TNF 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 분자의 순도 및 분자량은, 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에서 SDS-PAGE, 및 쿠마시 심플블루(Coomassie SimpleBlue: 상표) 세이프스테인(SafeStain)(인비트로겐 USA)을 사용한 염색 또는 캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용한 CE-SDS에 의해 분석하였다. 샘플의 응집물 함량은, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
표 12는 FAP-표적화 4-1BBL 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
FAP(28H1)-표적화 4-1BBL 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 생화학적 분석
구조물 수율
[mg/l] 		단량체
[%]
(SEC)
구조물 1.1 12.7 95
구조물 1.2 25.2 97
구조물 1.3 22 92
구조물 1.4 14.2 99
구조물 1.5 14 99
구조물 1.6 12 98
구조물 1.7 3.4 99
구조물 1.8 5.4 98
구조물 1.9 11.2 98
구조물 1.10 19.8 99
1.3 표적화 뮤린 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조
표적화 인간 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자와 유사하게, 뮤린 FAP-표적화 4-1BBL 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자를 제조하였다.
뮤린 4-1BB 리간드의 엑토도메인의 일부(아미노산 104-309)를 암호화하는 DNA 서열을 유니프롯 데이터베이스의 Q3U1Z9-1 서열(서열번호 70)에 따라 합성하였다. 구조물 M.1의 경우, 위치 137, 160 및 246에서의 시스테인을 표준 PCR 방법에 의해 세린으로 돌연변이시킨 반면, 구조물 M.2의 경우에는 위치 160에서의 시스테인을 세린으로 돌연변이시켰다(C160S).
뮤린 리간드는 인간 4-1BBL에 대해 기술한 바와 같이 및 도 3A 및 3B에 도시된 바와 같이 조립하였다. (G4S)2 링커에 의해 분리된 이량체성 4-1BBL을 뮤린 IgG1-CL 도메인에 융합시키고(도 3A), 단량체성 4-1BBL을 뮤린 IgG1-CH 도메인에 융합시켰다(도 3B). 뮤린 CL 도메인에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 뮤린 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임내에 서브클로닝하여 도 3C에 도시된 바와 같은 구조물들을 구축하였다.
뮤린 구조물들의 경우, 돌연변이 Lys392Asp 및 Lys409Asp(DD)를 뮤린 4-1BBL을 함유하는 중쇄에 도입하고, 돌연변이 Glu356Lys 및 Asp399Lys(KK)를 항-FAP Fab를 함유하는 중쇄에 도입하여 비대칭 분자를 수득하였다[Gunasekaran K. et al, J Biol. Chem., 2010, Jun 18;285(25):19637-46].
돌연변이 Asp265Ala 및 Pro329Gly(DAPG)를 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
표 13은 FAP-표적화 뮤린 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자 구조물 M.1의 cDNA 및 아미노산 서열 각각을 나타낸다.
표 14는 비표적화(DP47) 뮤린 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자 대조군 M.1의 cDNA 및 아미노산 서열 각각을 나타낸다.
표 15는 FAP-표적화 뮤린 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자 구조물 M.2의 cDNA 및 아미노산 서열 각각을 나타낸다.
표 16은 DP47-비표적화 뮤린 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자 구조물 대조군 M.2의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
FAP-표적화 뮤린 대조군 M.2의 서열
서열번호 설명 서열
158 이량체 mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CL Fc DD 쇄 표 15 참조
159 단량체 mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CH1 표 15 참조
154 DP47 Fc KK 쇄 표 14 참조
155 DP47 경쇄 표 14 참조
160 이량체 mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CL Fc DD 쇄 표 15 참조
161 단량체 mu 4-1BBL (104-309, C160S) - CH1 표 15 참조
156 DP47 Fc KK 쇄 표 14 참조
157 DP47 경쇄 표 14 참조
인간 4-1BBL 구조물에 대해 본원에서 상기 기술된 바와 같이 뮤린 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자를 생성하고 정제하였다.표 17은 FAP-표적화 및 비표적화 뮤린 4-1BB 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
FAP-표적화 및 비표적화 뮤린 4-1BB 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 생성에 대한 요약
구조물 수율
[mg/l] 		단량체
[%]
(SEC)
구조물 M.1 2.6 95
대조군 M.2 2.3 96
구조물 M.2 8.5 98
대조군 M.2 8.1 97
1.4 비표적화 인간 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(대조군 분자)의 제조 및 정제항-FAP 결합자(VH-VL)를, 항원에 결합하지 않는, DP47로 지칭된 생식계열 대조군으로 대체한 것만 다른 채로, FAP-표적화 구조물 1 및 2에 대해 전술한 바와 같이 대조군 분자들을 제조하였다. 대조군은 비표적화 1가 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih)(대조군 A, 도 5A)이며, 대조군 B의 경우, 구조물은 또한 하전된 잔기와 함께 CH-Cl 교차를 함유한다(도 5B). FAP 결합자의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열들의 가변 영역은 생식계열 대조군(DP47)의 가변 영역으로 대체되었으며 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자를 FAP-표적화 구조물에 대해 전술한 바와 같이 생성하였다. 세포를 1:1:1:1 비("벡터 이량체성 리간드-CH1 또는 CL*-놉쇄":"벡터 단량체성 리간드 융합물-CL 또는 CH1*":"벡터 DP47 Fab-홀쇄":"벡터 DP47 경쇄")에서 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
표 18은 DP47-비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 대조군 A의 cDNA 및 아미노산 서열을 각각 나타낸다.
표 19는 4-1BB 리간드 함유 아암(arm)에 CH1-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 DP47-비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(대조군 B)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
DP47 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(DP47 분할 4-1BBL 삼량체) 대조군 B의 서열
서열번호 설명 서열
96 이량체 hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc 놉쇄 표 3 참조
97 단량체 hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 표 3 참조
79 DP47 Fc 홀쇄 표 18 참조
80 DP47 경쇄 표 18 참조
98 이량체 hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc 놉쇄 표 3 참조
99 단량체 hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 표 3 참조
81 DP47 Fc 홀쇄 표 18 참조
82 DP47 경쇄 표 18 참조
표 20은 DP47 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 수율 및 최종 단량체 농도를 요약한 것이다.
DP47 비표적화 4-1BBL 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(대조군 분자)의 생성 특성
구조물 단량체
[%]
(SEC) 		수율
[mg/l] 		LC/MS
(비환원)
대조군 A 97 3.7 이론치*: 179069.7 Da
실험치: 179116.2 Da
*말단 리신 비함유
대조군 B 99 15.4
실시예 22.1 FAP(4B9) 표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조
인간 4-1BB 리간드의 엑토도메인의 일부(아미노산 71-254 및 71-248)를 암호화하는 DNA 서열의 상이한 단편들을 유니프롯 데이터베이스의 P41273 서열(서열번호 42)에 따라 합성하였다.
2.1.1 하전된 잔기와 함께 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 FAP(4B9) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 1A에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL.
4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 1B에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH1.
인간 CL 도메인에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 링커 (G4S)2 또는 양자택일적으로 (GSPGSSSSGS)를 사용하여 놉(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임 내에 서브클로닝하였다.
정확한 쌍형성을 개선하기 위해, 교차된 CH-CL에 하기의 돌연변이들을 도입하였다. 인간 CL에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드에 돌연변이 E123R 및 Q124K가 도입되었다. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에는, 돌연변이 K147E 및 K213E가 인간 CH1 도메인내에 클로닝되었다.
섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 클론 4B9에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
FAP 결합자의 생성 및 제조는 본원에 참고로 인용된 WO 2012/020006 A2 호에 기술되어 있다.
국제 특허 출원 공개 WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
모든 구조물들에 있어서, 놉쇄에 S354C/T366W 돌연변이 및 홀쇄에 상응하는 Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이와 함께 놉 인투 홀 이종이량체화 기술을 사용하였다.
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-FAP-Fc 홀쇄 및 항-FAP 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 FAP 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 4, 구조물 2.1).
표 21은 CH1-CL 교차 및 하전된 잔기를 함유하는 1가 FAP(4B9)-인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 2.1)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
2.1.2 하전된 잔기 없이 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 FAP(4B9) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 2.2)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 1A에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL.
4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 1B 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH1.
인간 CL 도메인에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 링커 (G4S)2 또는 양자택일적으로 (GSPGSSSSGS)를 사용하여 놉(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임 내에 서브클로닝하였다.
섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 클론 4B9에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다(WO 2012/130831 호).
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-FAP-Fc 홀쇄 및 항-FAP 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 FAP 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 4, 구조물 2.2).
표 22는 하전된 잔기 없이 CH1-CL 교차를 함유하는 1가 FAP(4B9)-인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 2.2)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
2.1.3 각 중쇄의 C-말단에서 융합된 이량체성 및 단량체성 4-1BB 리간드를 갖는 2가 FAP(4B9) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 2.3)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 1C에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 홀쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 홀, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 1D에 기술된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 놉쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 놉, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드.
이량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 (G4S)2 연결자를 사용하여 홀(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인의 C-말단에서 프레임내에 서브클로닝하였다. 단량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 (G4S)2 연결자를 사용하여 놉(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인의 C-말단에서 프레임내에 서브클로닝하였다.
섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 클론 4B9에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄, 놉, 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 항-FAP huIgG1 홀 이량체성 리간드 쇄, S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항-FAP huIgG1 놉 단량체성 리간드 쇄, 및 항-FAP 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 2개의 FAP 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 4, 구조물 2.3).
표 23은 2가 FAP(4B9)-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구조물 2.3(각각, 각 중쇄의 C-말단에서 융합된 2개의 항-FAP Fab, 이량체성 및 단량체성 4-1BB 리간드를 갖는 FAP 분할 삼량체)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
2.1.4 하전된 잔기와 함께 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 FAP(4B9) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 2.4)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 1A에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-248)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 1B에 기술된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH.
인간 CL 도메인에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 링커 (G4S)2 또는 양자택일적으로 (GSPGSSSSGS)를 사용하여 놉(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. 정확한 쌍형성을 개선하기 위해, 교차된 CH-CL에 하기의 돌연변이들을 도입하였다. 인간 CL에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드에 E123R 및 Q124K. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에, K147E 및 K213E.
섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 클론 4B9에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-FAP-Fc 홀쇄, 및 항-FAP 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 FAP 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 4, 구조물 2.4).
표 24는 하전된 잔기와 함께 CH1-CL 교차를 함유하는 1가 FAP(4B9)-인간 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 2.4)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
2.1.5 하전된 잔기 없이 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 FAP(4B9) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 2.5)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 1A에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-248)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 1B에 기술된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH.
인간 CL 도메인에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 링커 (G4S)2 또는 양자택일적으로 (GSPGSSSSGS)를 사용하여 놉(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 클론 4B9에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-FAP-Fc 홀쇄, 및 항-FAP 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 FAP 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 4, 구조물 2.5).
표 25는 하전된 잔기 없이 CH1-CL 교차를 함유하는 1가 FAP(4B9)-인간 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 2.5)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
2.1.6 각 중쇄의 C-말단에서 융합된 이량체성 및 단량체성 4-1BB 리간드를 갖는 2가 FAP(4B9) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 2.6)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 1C에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 홀쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 홀, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드. 4-1BB 리간드(71-248)의 1개 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 1D에 기술된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 놉쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 놉, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드.
이량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 (G4S)2 연결자를 사용하여 홀(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인의 C-말단에서 프레임내에 서브클로닝하였다. 단량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 (G4S)2 연결자를 사용하여 놉(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인의 C-말단에서 프레임내에 서브클로닝하였다.
섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 클론 4B9에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄, 놉, 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 항-FAP huIgG1 홀 이량체성 리간드 쇄, S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항-FAP huIgG1 놉 단량체성 리간드 쇄, 및 항-FAP 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 2개의 FAP 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 4, 구조물 2.6).
표 26은 2가 FAP(4B9)-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 구조물 2.6(각각, 각 중쇄의 C-말단에서 융합된 2개의 항-FAP Fab, 이량체성 및 단량체성 4-1BB 리간드를 갖는 FAP 분할 삼량체)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
2.2 비표적화 인간 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조(대조군 분자)
대조군 A 및 B에 대해 상기 실시예 1.4에서 기술된 바와 같이 추가의 대조군 분자들을 제조하였다. 항-FAP 결합자(VH-VL)을 항원에 결합하지 않는, DP47로 지칭된 생식계열 대조군으로 대체한 것만 다른 채로, 2가 변이체 대조군 C를 변이체 구조물 2.3 및 2.6과 유사하게 제조하고, 1가 변이체 대조군 E를 구조물 2.5(4-1BB 리간드(71-248) 삼량체 함유)와 유사하게 제조하였다.
표 27은 2가 DP47-비표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 분자 대조군 C의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 표 28은 1가 DP47-비표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 분자 대조군 E의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
1가 비표적화 인간 4-1BB 리간드(71-248) 함유 Fc(kih) 융합 분자 대조군 E의 서열
서열번호 설명 서열
171 이량체 hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc 놉쇄 표 25 참조
172 단량체 hu 4-1BBL (71-248) - CH1 표 25 참조
79 DP47 Fc 홀쇄 표 18 참조
80 DP47 경쇄 표 18 참조
173 이량체 hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc 놉쇄 표 25 참조
174 단량체성 hu 4-1BBL (71-248) - CH1 표 25 참조
81 DP47 Fc 홀쇄 표 18 참조
82 DP47 경쇄 표 18 참조
2.3 대조군 F로서 비표적화 인간 IgG1의 제조분석에서 사용된 추가의 대조군 분자는, 국제 특허 출원 공개 WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시키기 위해 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 함유하는 비표적화 DP47, 생식계열 대조군 인간 IgG1이었다.
표 29는 비표적화 DP47 huIgG1 PGLALA(대조군 F)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
2.4 1가 및 2가 FAP(4B9) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 구조물 및 대조군 분자의 생성
표적화 및 비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물 암호화 서열을, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3' 말단에 위치한 합성 폴리A 서열을 함유하는 플라스미드 벡터내에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물을 생성하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 구조물 2.1, 2.2, 2.4 및 2.5 및 상응하는 대조군 분자의 경우, 1:1:1:1 비(예를 들면, "벡터 이량체성 리간드-CL-놉쇄":"벡터 단량체성 리간드 융합물-CH1":"벡터 항-FAP Fab-홀쇄":"벡터 항-FAP 경쇄")를 이용하였다. 구조물 2.3 및 2.6 및 그의 대조군 분자의 경우에는, 1:1:1 비("벡터 huIgG1 Fc 홀 이량체성 리간드 쇄":"벡터 huIgG1 Fc 놉 단량체성 리간드 쇄":"벡터 항-FAP 경쇄")를 취하였다. 분석에서 대조군으로 사용된 인간 IgG는 이중특이성 구조물들의 경우에서와 같이 생성하였다(형질감염의 경우에만 경쇄용 벡터 및 중쇄용 벡터를 사용하였다).
500 mL 진탕 플라스크에서의 생성을 위해, 30억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간전에 접종하였다. 형질감염을 위해 세포를 210 x g에서 10 분동안 원심분리하고, 상등액을 20 mL의 예열된 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터(200 ㎍의 전체 DNA)를 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15 초동안 볼텍싱하고 실온에서 10 분간 배양하였다. 그후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3 시간동안 배양하였다. 배양 후에, 6 mM L-글루타민, 5 g/L 펩소이 및 1.2 mM 발프로산이 보충된 160 mL의 엑셀 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간동안 배양하였다. 형질감염 1일후에 12% 피드 7 및 글루코스(최종 농도 3 g/L)를 첨가하였다. 7 일동안 배양한 후에, 상등액을 적어도 400 x g에서 30 내지 40 분동안 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 표적화 및 비표적화 TNF 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 및 인간 IgG1을 정제하였다. 친화성 크로마토그래피의 경우, 상등액을 인산나트륨(20 mM), 시트르산나트륨(20 mM) 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 맵셀렉트 슈어 컬럼(CV = 5-15 mL, 지이 헬쓰케어의 수지) 상에 부하시켰다. 적어도 6개 컬럼 부피의 동일 완충액으로 세척하여 미결합 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은, 20 mM 시트르산나트륨, 100 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신 완충액(pH 3.0)으로 선형 구배(20 CV) 또는 단계 용출(8 CV)을 이용하여 용출시켰다. 선형 구배의 경우, 추가의 4개 컬럼 부피의 단계 용출을 적용하였다.
수거된 분획들의 pH를 1/10(v/v)의 0.5 M 인산나트륨 pH 8.0을 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축시킨 다음, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, 0.01%(v/v) 트윈20 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 표적화 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물의 순도 및 분자량은, 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에서 SDS-PAGE, 및 쿠마시 심플블루(상표) 세이프스테인(인비트로겐 USA)을 사용한 염색, 또는 캘리퍼 랩칩 GXII(퍼킨 엘머)를 사용한 CE-SDS에 의해 분석하였다. 샘플의 응집물 함량은, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02 %(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
표 30은 FAP(4B9) 표적화 및 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 및 대조군 분자의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
FAP(4B9) 표적화 및 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 및 대조군 분자의 생화학적 분석
구조물 단량체
[%] (SEC)		 수율
[mg/l]
구조물 2.1 95 15.8
구조물 2.3 97 11.5
구조물 2.4 97 14.1
구조물 2.5 100 16.5
대조군 C (2가) 98 12.6
대조군 E (1가) 93 4.1
대조군 F (생식계열 DP47 인간 IgG1 PGLALA) 100 50
실시예 34-1BB의 제조, 정제 및 특성화
인간, 마우스 또는 사이노몰구스 4-1BB의 엑토도메인을 암호화하는 DNA 서열들(표 31)을, 놉(Merchant et al., 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. AcTEV 프로테아제 절단 부위를 항원 엑토도메인과 인간 IgG1의 Fc 사이에 도입하였다. 유도된 비오티닐화에 대한 Avi 태그를 항원 Fc-놉의 C-말단에 도입하였다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항원-Fc 놉쇄와 Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 Fc 홀쇄의 조합은 4-1BB 엑토도메인 함유 쇄의 단일 카피를 포함하므로, 단량체 형태의 Fc-결합된 항원을 생성한다(도 5C). 표 32는 항원 Fc-융합 구조물의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
항원 엑토도메인(ECD)의 아미노산 번호 및 그의 기원
서열번호 구조물 기원 ECD
83 인간 4-1BB ECD Q07011에 따라 합성 aa 24-186
84 사이노몰구스 4-1BB ECD 사이노몰구스 혈액으로부터 단리 aa 24-186
85 뮤린 4-1BB ECD P20334에 따라 합성 aa 24-187
모든 4-1BB-Fc 융합 분자 암호화 서열들을, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3' 말단에 위치한 합성 폴리A 신호 서열을 함유하는 플라스미드 벡터내에 클로닝하였다. 또한, 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
비오티닐화 단량체성 항원/Fc 융합 분자의 제조를 위해, 지수적으로 성장하는 현탁 HEK293-EBNA 세포를, 융합 단백질의 2개 성분(놉 및 홀 쇄) 뿐 아니라 비오티닐화 반응에 필수적인 효소인 BirA를 암호화하는 3개의 벡터로 동시-형질감염시켰다. 상응하는 벡터들은 2:1:0.05 비("항원 ECD-AcTEV-Fc 놉":"Fc 홀":"BirA")로 사용하였다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 생성을 위해, 40억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간전에 접종하였다. 형질감염을 위해 세포를 210 x g에서 5 분동안 원심분리하고, 상등액을 예열된 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 200 ㎍의 벡터 DNA를 함유하는 20 mL의 CD CHO 배지에 재현탁하였다. 540 ㎕의 폴리에틸렌이민(PEI)을 첨가한 후, 용액을 15 초동안 볼텍싱하고 실온에서 10 분간 배양하였다. 그후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3 시간동안 배양하였다. 배양 후에, 160 mL의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간동안 배양하였다. 생성 배지에 5 μM 키푸넨신을 보충하였다. 형질감염 1일후에, 보충제와 함께 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1을 배양물에 첨가하였다. 7 일동안 배양한 후에, 세포 상등액을 210 g에서 15 분동안 스핀다운시켜 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을, 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 친화성 크로마토그래피의 경우, 상등액을 40 mL의 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산나트륨(pH 7.5)으로 평형화된 하이트랩(HiTrap) 단백질A HP 컬럼(CV = 5 mL, 지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다. 적어도 10개 컬럼 부피의 20 mM 인산나트륨, 20 mM 시트르산나트륨, 0.5 M 염화나트륨 함유 완충액(pH 7.5)으로 세척하여 미결합 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은, 20개 컬럼 부피의 20 mM 시트르산나트륨, 0.01%(v/v) 트윈-20, pH 3.0 상에서 생성된 염화나트륨의 선형 pH-구배(0으로부터 500 mM까지)를 사용하여 용출시켰다. 이어서, 컬럼을 10개 컬럼 부피의 20 mM 시트르산나트륨, 500 mM 염화나트륨, 0.01%(v/v) 트윈-20, pH 3.0으로 세척하였다.
수거된 분획들의 pH를 1/40(v/v)의 2 M 트리스, pH 8.0을 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축하고 여과한 다음, pH 7.4의 2 mM MOPS, 150 mM 염화나트륨, 0.02%(w/v) 나트륨 아지드 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
인간 수용체에 대한 친화도 측정을 위해, 인간 4-1BB의 엑토도메인을 또한 avi(GLNDIFEAQKIEWHE) 및 헥사히스티딘 태그를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
단백질 생성은 Fc-융합 단백질에 대해 전술한 바와 같이 수행하였다. 분비된 단백질은 킬레이트화 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 1차 크로마토그래피 단계는 20 mM 인산나트륨, 500 nM 염화나트륨, pH 7.4에서 평형화된 NiNTA 슈퍼플로우 카트리지(Superflow Cartridge)(5 mL, 키아겐(Qiagen)) 상에서 수행하였다. 용출은, 5%로부터 45%까지의 용출 완충액(20 mM 인산나트륨, 500 nM 염화나트륨, 500 mM 이미다졸, pH 7.4)의 12개 컬럼 부피에 걸친 구배를 적용함으로써 수행하였다. 단백질을 농축하고 여과한 다음, pH 7.4의 2 mM MOPS, 150 mM 염화나트륨, 0.02%(w/v) 나트륨 아지드 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 75 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다(표 33).
실시예 4
표면 플라즈몬 공명에 의한 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 생화학적 특성화
재조합 4-1BB에 대한 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 결합은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 평가하였다. 모든 SPR 실험은 25℃에서 러닝 완충액으로 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 비아코어 T100 상에서 수행하였다.
FAP-표적화 또는 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체 함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자와 재조합 4-1BB(인간, 사이노몰구스 및 뮤린) 사이의 상호작용의 결합활성을 하기에 기술하는 바와 같이 측정하였다. 데이터는, 표적화 4-1BB 리간드 삼량체 함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 뿐 아니라, 비표적화 DP47 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자가 둘 다 필적하는 결합활성하에 인간 및 사이노몰구스 4-1BB에 결합하지만 마우스 동족체에는 거의 결합하지 않음을 나타내었다.
재조합 비오티닐화 인간, 사이노몰구스 및 뮤린 4-1BB Fc(kih) 융합 분자를, 표준 커플링 설명서(비아코어, 프라이부르크/독일)를 이용하여 SA 칩 상에 직접 커플링시켰다. 고정화 수준은 약 30 RU이었다. FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 또는 DP47 비표적화 대조군을, 0.39 내지 200 nM 범위의 농도에서 30 ㎕/분의 흐름하에 120 초동안 유동 세포들에 통과시켰다. 해리는 180 초동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이는 기준 빈(empty) 유동 세포상에서 수득된 반응을 차감함으로써 보정하였다.
친화도 측정을 위해, 표준 아민 커플링 키트(지이 헬쓰케어)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에서 약 7200 공명 단위(RU)의 항-인간 Fc 특이적 항체의 직접적 커플링을 수행하였다. 50 nM에서 FAP-표적화 또는 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자가 30 ㎕/분의 유량하에 유동 세포 2 상에서 60 초동안 포획되었다. 인간 4-1BB-avi-His의 연속 희석물(1.95 내지 1000 nM)을 2개 유동 세포 둘 다의 위로 180 초동안 30 ㎕/분으로 통과시켜 결합상을 기록하였다. 해리상은 180 초동안 모니터링하였으며 샘플 용액으로부터 HBS-EP로 교체시킴으로써 유발되었다. 60 초 10 mM 글리신-HCl pH 2.1의 이중 주입을 이용하여 매 주기후에 칩 표면을 재생시켰다. 벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포 1에서 수득된 반응을 차감함으로써 보정하였다. 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자와 hu4-1BB avi His 사이의 상호작용을 위해, 바이에발(Biaeval) 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 이용하여 1:1 랭뮤어 결합 곡선에 적합화시킴으로써 속도 상수로부터 친화 상수를 유도하였다.
1:1 랭뮤어 결합에 대한 적합화 및 친화 상수
리간드 분석물 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
FAP 분할 4-1BBL 삼량체
(구조물 1.1) 		hu4-1BB 4.8E+04 2.6E-02 5.5E-07
DP47 분할 4-1BBL 삼량체
(대조군 A) 		hu4-1BB 6.2E+04 3.3E-02 5.2E-07
실시예 5표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 기능 특성화
5.1 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 나이브 인간 PMBC 대 활성화 인간 PMBC 상에서의 결합
취리히 헌혈 센터에서 백혈구연층을 수득하였다. 신선한 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리하기 위해, 백혈구연층을 동일 부피의 DPBS(깁코 바이 라이프 테크놀로지스(Gibco by Life Technologies), 카탈로그 번호 14190 326)로 희석하였다. 50 mL 폴리프로필렌 원심분리관(TPP, 카탈로그 번호 91050)에 15 mL 히스토파크(Histopaque) 1077(시그마 라이프 사이언스(SIGMA Life Science), 카탈로그 번호 10771, 폴리슈크로스 및 나트륨 디아트리조에이트, 1.077 g/mL의 밀도로 조정)을 보충하고, 희석된 백혈구연층 용액을 히스토파크 1077 위에 적층시켰다. 상기 관들을 400 x g에서 30 분동안 원심분리하였다. 이어서, PBMC를 계면으로부터 수거하고, DPBS로 3회 세척하고, 10% 태아 소 혈청(FBS, 깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 16000-044, Lot 941273, 감마선-조사되고, 마이코플라스마가 없고 56℃에서 35 분동안 열 불활성화됨), 1%(v/v) 글루타맥스(GlutaMAX)-I(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 35050 038), 1 mM 나트륨 피루베이트(시그마, 카탈로그 번호 S8636), 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산(시그마, 카탈로그 번호 M7145) 및 50 μM β-머캅토에탄올(시그마, M3148)이 보충된 RPMI 1640 배지(깁코 바이 라이프 테코놀로지스, 카탈로그 번호 42401-042)로 이루어진 T 세포 배지에 재현탁하였다.
PBMC는 단리한 후에 직접 사용하거나, 또는 37℃ 및 5% CO2에서, 6-웰 조직 배양 플레이트에서 200　U/mL 프로류킨(노바티스 파마 슈바이츠 AG(Novartis Pharma Schweiz AG), CHCLB-P-476-700-10340) 및 2 ㎍/mL PHA-L(시그마 카탈로그 번호 L2769)이 보충된 T 세포 배지에서 4 일동안 배양한 다음 T 세포 배지 중에 10 ㎍/mL 항-인간 CD3(클론 OKT3, 바이오레전드(BioLegend), 카탈로그 번호 317315) 및 2 ㎍/mL 항-인간 CD28(클론 CD28.2, 바이오레전드, 카탈로그 번호 302928)로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트에서 1 일동안 배양함으로써 T 및 NK 세포의 세포 표면에서 4-1BB 발현을 유도하도록 자극하였다.
인간 PBMC에 대한 4-1BBL 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 결합을 측정하기 위해, 0.1 x 106 나이브 또는 활성화 PBMC를 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원(Greiner bio-one), 셀스타(cellstar), 카탈로그 번호 650185)의 각 웰에 가하였다. 플레이트를 400 x g로 및 4℃에서 4 분동안 원심분리하였다. 상등액을 폐기하였다. 그 후에, 4℃에서 어두운 상태에서, UV 여기를 위한 1:1000 희석된 생/사멸 정착성 블루 사멸 세포 염색 키트(LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit)(라이프 테크롤로지스(Life Technologies), 몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes), L-23105) 또는 정착성 생존도 지시염료(Fixable Viability Dye) eF660(이바이오사이언스(eBioscience) 65-0864-18) 또는 생/사멸 정착성 그린 사멸 세포 염색 키트(LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit)(라이프 테크놀로지스, 몰레큘라 프로브즈, L-23101)를 함유하는 100 ㎕/웰 DPBS에서 30 분동안 세포를 염색하였다. DAPI를 생/사멸세포 염색제로 사용한 경우, 상기 염색 단계는 생략하였다. 세포를 200 ㎕의 차가운 FACS 완충액(2%(v/v) FBS, 5 mM EDTA pH8(암레스코(Amresco), 카탈로그 번호 E177) 및 7.5 mM 나트륨 아지드(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) S2002)로 보충된 DPBS) 으로 1회 세척하였다.
다음으로, 상이한 적정된 농도의 4-1BBL 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자를 함유하는 4℃의 차가운 FACS 완충액 50 ㎕/웰을 첨가하고, 세포를 4℃에서 120 분동안 배양하고, 200 ㎕/웰의 4℃ FACS 완충액으로 4회 세척하고 재현탁하였다. 0.67　㎍/mL 항-인간 CD3-PerCP-Cy5.5(클론 UCHT1, 마우스 IgG1κ, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300430) 또는 0.16 ㎕ 항-인간 CD3-PE/Cy7(클론 SP34-2, 마우스 IgG1κ, BD 파밍겐(BD Pharmingen), 카탈로그 번호 557749, Lot 33324597), 0.67 ㎍/mL 항-인간 CD45-AF488(클론 HI30, 마우스 IgG1κ, 바이오레전드, 카탈로그 번호 304017) 또는 0.12　㎍/mL 항-인간 CD56-FITC(클론 NCAM16.2, 마우스 IgG2bκ, BD 파밍겐, 카탈로그 번호 345811) 또는 1 ㎕ 항-인간 CD56-APC(클론 B159, 마우스 IgG1κ, BD 파밍겐, 카탈로그 번호 555518, Lot 3098894), 0.25 ㎍/mL 항-인간 CD4-BV421(클론 RPA-T4, 마우스 IgG1κ, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300532) 또는 0.23 ㎍/mL 항-인간 CD4-BV421(클론 OKT4, 마우스 IgG2bκ, 바이오레전드, 카탈로그 번호 317434), 0.25　㎕ 항-인간 CD8a-APC(클론 RPA-T8, 마우스 IgG1κ, BD 파밍겐, 카탈로그 번호 555369) 또는 0.67　 ㎕ 항-인간 CD8a-APC/Cy7(클론 RPA-T8, 마우스 IgG1κ, 바이오레전드, 카탈로그 번호 301016) 또는 0.83 ng/mL 항-인간 CD8a-BV711(클론 RPA-T8, 마우스 IgG1κ, BD 파밍겐, 카탈로그 번호 301044) 및 5 ㎍/mL PE-접합된 어피니퓨어(AffiniPure) 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 카탈로그 번호 109 116 098 또는 109 116 170)을 함유하는 4℃ 차가운 FACS 완충액 50 ㎕/웰로 세포를 더 염색하였다. 세포를 FACS-완충액으로 2회 세척하였다. 세포가 정착성 생존도 지시염료로 염색된 경우, 이들 세포는 1% 포름알데하이드(시그마, HT501320-9.5L)를 함유하는 50 ㎕/웰 DPBS로 고정시켰다. 세포를 FACS 완충액에 재현탁하고, 다음날 또는 같은 날 5-레이저 LSR-포르테사(Fortessa)(BD 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어) 또는 3-레이저 밀테나이 퀀트 분석기(Miltenyi Quant Analyzer) 10(밀테나이 바이오텍(Mitenyi Biotec)) 및 플로우 조(Flow Jo)(플로우조(FlowJo) X 10.0.7)를 사용하여 획득하였다. 사멸 세포를 검출하기 위해 DAPI 염색을 이용한 경우, 이들 세포는 0.2 ㎍/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍(Santa Cruz Biotec), 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 80 ㎕/웰 FACS 완충액에 재현탁하고, 같은 날 5-레이저 LSR-포르테사(BD 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, FAP-표적화 또는 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자는 둘 다 휴지 인간 CD4+ T 세포에 결합하지 않았으며, 휴지 CD8+ T 세포 및 NK 세포에 대해 검출가능한 결합을 나타내지 않았다. 대조적으로, 두 구조물 모두 활성화된 NK, CD8+ 또는 CD4+ T 세포에는 강하게 결합하였지만, CD4+ T 세포는 NK 세포에 비해 약 10배 더 낮은 특이적 형광 강도 및 CD8+ T 세포에 비해 20배 감소된 특이적 형광 강도를 나타내었다.
도 7a 및 7b는 각각 4-1BB-발현 활성화 인간 CD3+ CD8+ T 세포 및 4-1BB-발현 활성화 인간 CD3+ CD4+ T 세포 상에서의 실시예 1에서 제조된 바와 같은 구조물 1.1 내지 1.10의 결합을 나타낸 것이다. 표 35는 구조물 1.1 내지 1.10에 대해 측정된 바와 같은 EC50 값을 나타낸다.
활성화 인간 CD3+ CD8+ T 세포 및 CD3+ CD4+ T 세포 상에서의 결합
구조물 EC50 [nM]
4-1BB+CD8+ 		EC50 [nM]
4-1BB+CD4+
대조군 B 0.11 16.21
1.1 0.43 4.99
1.2 0.18 20.79
1.3 0.07 2.82
1.4 0.19 0.34
1.5 0.17 2.67
1.6 0.19 0.95
1.7 0.26 16.47
1.8 0.14 2.77
1.9 0.18 12.92
1.10 0.12 0.3
도 8a 및 8b는 신선한 인간 혈액으로부터의 CD4+ 및 CD8+ 및 활성화 4-1BB-발현 CD4+ T 세포 및 CD8 + T 세포 각각에 대한, 실시예 2에서 제조된 바와 같은 구조물 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 및 2.6의 결합을 나타낸다. 게이트(gate)는 살아있는 CD45+ CD3+ CD4+ 또는 CD45+ CD3+ CD8+ T 세포 상에 설정하였으며, PE-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편의 MFI를 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 변이체의 적정된 농도에 대해 블롯화하였다. 표 36은 구조물 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 및 2.6에 대해 측정된 바와 같은 EC50 값을 나타낸다.
활성화 4-1BB-발현 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 상에서의 결합
구조물 EC50 [nM]
4-1BB+CD8+ 		EC50 [nM]
4-1BB+CD4+
대조군 B 0.36 0.42
대조군 C 0.39 0.41
대조군 E 0.57 0.76
2.1 0.21 0.24
2.3 0.44 0.3
2.4 0.3 0.38
2.5 0.35 0.68
2.6 0.33 0.24
5.2 활성화된 마우스 비장세포에 대한 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 결합마우스 비장을 3 mL PBS 중에 수거하고, 적당한 MACS 튜브(밀테나이 바이오텍 카탈로그 번호 130-096-334) 및 적당한 MACS 옥토 해리장치(Octo Dissociator)(밀테나이 바이오텍)를 사용하여 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 그 후에, 비장세포를 30 ㎛ 예비-분리 필터(Pre-Separation Filters)(밀테나이 바이오텍 카탈로그 번호 130-041-407)를 통해 여과시키고, 350 x g 및 4℃에서 7 분동안 원심분리하였다. 상등액을 흡인시키고, 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I, 1 mM 나트륨-피루베이트, 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산, 50 μM β-머캅토에탄올 및 10% 페니실린-스트렙토마이신(시그마, 카탈로그 번호 P4333)으로 보충된 RPMI 1640 배지에 세포를 재현탁하였다. 106 세포/mL를, 10 ㎍/mL 항-마우스 CD3ε 아르메니아 햄스터 IgG(클론 145-2C11, 바이오레전드, 카탈로그 번호 100331) 및 2 ㎍/mL 항-마우스 CD28 시리아 햄스터 IgG(클론 37.51, 바이오레전드, 카탈로그 번호 102102)로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트에서 2 일동안 배양하였다.
활성화된 마우스 비장세포를 수거하고, DPBS에 세척하고, 계수하고, 0.1 x 106 세포를 96 U-바닥 비-조직 배양물 처리된 웰 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 상등액을 꺼내고, 4℃에서 1:5000 희석된 정착성 생존도 지시염료 eF660(바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0864-18)을 함유하는 100 ㎕/웰 DPBS에서 30 분동안 세포를 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 상이한 농도의 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(FAP 분할 4-1BBL 삼량체), 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(DP47 분할 4-1BBL 삼량체) 또는 항-마우스 CD137 인간 IgG1 P329G LALA mAb(클론 Lob.12.3, 바이오엑셀(BioXcell) 카탈로그 번호 BE0169)를 함유하는 50 ㎕ FACS 완충액에서 염색하였다. 세포를 4℃에서 120 분동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액으로 4회 세척하고, 4℃에서 10 ㎍/mL의 정제된 항-마우스 CD16/CD32 래트 IgG-Fc-블록(BD 파밍겐, 카탈로그 번호 553142 클론 2.4G2), 5 ㎍/mL의 항-마우스 CD8b 래트 IgG2bκ-FITC(바이오레전드, 카탈로그 번호 126606, 클론 YTS156.7.7), 0.67 ㎍/mL의 항-마우스 CD3 래트 IgG2bκ-APC-Cy7(바이오레전드, 카탈로그 번호 100222, 클론 17A2), 0.67 ㎍/mL의 항-마우스 CD4 래트 IgG2bκ-PE-Cy7(바이오레전드, 카탈로그 번호 100422, 클론 GK1.5), 2 ㎍/mL의 항-마우스 NK1.1 마우스(C3H x BALB/c) IgG2aκ-PerCp-Cy5.5(바이오레전드, 카탈로그 번호 108728, 클론 PK136) 및 소, 마우스 및 토끼 혈청 단백질에 대해 Fcγ 단편 특이적, 최소 교차-반응성인 10 ㎍/mL의 PE-접합된 어피니퓨어 다중클론 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-116-170)를 함유하는 50 ㎕/웰 FACS 완충액중에서 30 분동안 염색하였다. 세포를 200 ㎕/웰의 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 1% 포름알데하이드를 함유하는 50 ㎕/웰 DPBS로 고정시켰다. 세포를 FACS-완충액에 재현탁하고, 다음날 5-레이저 LSR-포르테사(BD 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, FAP-표적화 hu4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(FAP 분할 hu4-1BBL 삼량체) 및 비표적화 hu4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(DP47 분할 hu4-1BBL 삼량체)는 마우스 4-1BB에 결합하지 않는다. 그러므로, 면역 반응능 마우스에서 활성은 검사할 수 없다. 생체내 작용 방식 연구를 위해, 면역 반응능 마우스에서의 인간화 마우스 모델 또는 도 3에 나타낸 바와 같은 마우스 4-1BBL 삼량체를 함유하는 대용물을 사용해야 한다.
5.3 FAP-발현 종양 세포에 대한 결합
FAP 발현 세포 상에서의 결합 분석을 위해, 인간 흑색종 세포주 MV-3(문헌[Ruiter et al., Int. J. Cancer 1991, 48(1), 85-91] 참조), WM-266-4(ATTC CRL-1676) 또는 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포주를 사용하였다. 상기 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포주를 생성하기 위해, NIH/3T3 세포를 인간 FAP(NIH/3T3-huFAP 클론 39)로 형질감염시켰다. 마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3 세포(ATCC CRL-1658)를 CMV 프로모터하에 인간 FAP를 암호화하는 pETR4921 발현 플라스미드로 형질감염시켜 상기 세포를 생성하였다. 세포를 1.5 ㎍/mL의 퓨로마이신(인비보겐(InvivoGen), 카탈로그 번호 ant-pr-5)의 존재하에서 유지시켰다. 0.1 x 106개의 FAP 발현 종양 세포를 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각 웰에 가하였다. 세포를 200 ㎕의 DPBS로 1회 세척하고 펠릿을 재현탁하였다. 1:5000으로 희석된 정착성 생존도 지시염료 이플루오르(eFluor) 450(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0863-18) 또는 정착성 생존도 지시염료 이플루오르 660(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0864-18)을 함유하는 4℃ 차가운 DPBS 완충액 100 ㎕/웰을 첨가하고 플레이트를 4℃에서 30 분동안 배양하였다. 세포를 200 ㎕의 4℃ 차가운 DPBS 완충액으로 1회 세척하고, 상이한 농도의 적정된 4-1BBL 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자를 함유하는 4℃의 차가운 FACS 완충액(2%(v/v) FBS, 5　mM EDTA pH 8(암레스코, 카탈로그 번호 E177) 및 7.5 mM 나트륨 아지드(시그마-알드리치 S2002)로 보충된 DPBS) 50 ㎕/웰에 재현탁시킨 후, 4℃에서 1 시간동안 배양하였다. 200 ㎕/웰로 4회 세척한 후, 4℃에서 30 ㎍/mL FITC-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-096-098) 또는 5 ㎍/mL PE-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-116-098 또는 109-116-170)을 함유하는 4℃ 차가운 FACS 완충액 50 ㎕/웰로 30 분동안 세포를 염색하였다. 세포를 200 ㎕의 4℃ FACS 완충액으로 2회 세척한 다음 1% 포름알데하이드를 함유하는 DPBS 50 ㎕/웰에 재현탁하였다. 같은 날 또는 다음 날 세포를 100 ㎕ FACS-완충액에 재현탁하고, 5-레이저 LSR-포르테사(BD 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어) 또는 3-레이저 밀테나이 퀀트 분석기 10(밀테나이 바이오텍) 및 플로우 조(플로우조 X 10.0.7)를 사용하여 획득하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(FAP 분할 4-1BBL 삼량체) 구조물 1.1은 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)-발현 흑색종 (10A) MV-3 세포 또는 (10B) WM-266-4 세포에 효과적으로 결합하였지만, 비표적화 DP47-Fab-함유 구조물(DP47 분할 4-1BBL 삼량체) 대조군 A는 그렇지 않았다.
도 11a는 실시예 1에서 제조된 바와 같은 구조물 1.1 내지 1.10의 인간-FAP 발현 인간 흑색종 MV-3 세포에 대한 결합을 나타내고, 도 11b에는 마우스 배아 섬유아세포로 형질감염된 인간 FAP 발현 NIH/3T3-huFAP 클론 39에 대한 구조물 1.1, 1.2, 1.3 및 1.5의 결합을 나타내었다. 표 37은 구조물 1.1 내지 1.10에 대해 측정된 바와 같은 EC50 값을 나타낸다.
인간 FAP-발현 종양 세포에 대한 결합
구조물 EC50 [nM]
FAP+ MV-3 		EC50 [nM]
NIH/3T3-hu FAP
1.1 4.14 12.2
1.2 5.36 9.35
1.3 - 14.97
1.4 5.13 -
1.5 0.53 10.06
1.6 8.16 -
1.7 4.09 -
1.8 2.79 -
1.9 4.22 -
1.10 4.31 -
도 12는 인간-FAP 발현 인간 흑색종 MV-3 세포(도 12a) 및 WM-266-4 세포(도 12b)에 대한 상이한 FAP(4B9)-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체성 인간 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물들의 결합을 나타낸다. 구조물 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 및 2.6은 실시예 2에서 기술된 바와 같이 제조하였고 대조군들은 본원에서 상기 기술된 바와 같이 제조하였다. 게이트는 살아있는 종양 세포 상에 설정하였고, PE-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편의 MFI를 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 구조물들의 적정 농도에 대해 블롯화하였다. 표 38은 측정된 바와 같은 EC50 값을 나타낸다.
인간 FAP-발현 종양 세포에 대한 결합
구조물 EC50 [nM]
FAP+ MV-3 		EC50 [nM]
FAP+ WM-266-4
2.1 1.66 0.99
2.3 0.53 0.42
2.4 0.83 0.59
2.5 1.66 1.2
5.4 뮤린 표적화 4-1BB 리간드 삼량체 함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 기능 특성화5.4.1 활성화된 마우스 비장세포에 대한 결합
마우스 비장을 3 mL PBS중에 수거하고, 적당한 MACS 튜브(밀테나이 바이오텍 카탈로그 번호 130-096-334) 및 적당한 MACS 옥토 해리장치(밀테나이 바이오텍)를 사용하여 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 그 후에, 비장세포를 30 ㎛ 예비-분리 필터(밀테나이 바이오텍 카탈로그 번호 130-041-407)를 통해 여과시키고, 350 x g 및 4℃에서 7 분동안 원심분리하였다. 상등액을 흡인시키고, 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I, 1 mM 나트륨-피루베이트, 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산, 50 μM β-머캅토에탄올로 보충된 RPMI 1640 배지에 세포를 재현탁하였다.
신선한 마우스 비장세포 상에서의 결합을 위해, 세포를 직접 사용하였다. T 세포 상에서의 마우스 4-1BB 발현을 유도하기 위해, 마우스 비장세포를 다음과 같이 활성화시켰다: 106 세포/mL를, 10 ㎍/mL 항-마우스 CD3ε 아르메니아 햄스터 IgG(클론 145-2C11, 바이오레전드, 카탈로그 번호 100331) 및 2 ㎍/mL 항-마우스 CD28 시리아 햄스터 IgG(클론 37.51, 바이오레전드, 카탈로그 번호 102102)로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트에서 2 일동안 배양하였다.
신선한 마우스 비장세포 또는 활성화된 마우스 비장세포를 수거하고, DPBS(깁코 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 14190-136)에 세척하고, 계수하고, 0.1 x 106 세포를 96 U-바닥 비-조직 배양물 처리된 웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각 웰로 옮겼다. 상등액을 꺼내고, 4℃에서 1:1000 희석된 생/사멸 정착성 수성 사멸 세포 염색 키트(LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit)(라이프 테크놀로지스, L34957)를 함유하는 4℃ 차가운 DPBS 100 ㎕/웰에서 30 분동안 세포를 염색하였다. 세포를 차가운 DPBS로 세척하고, 상이한 농도의 마우스 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 또는 마우스 IgG1κ 이소타입 대조군(바이오레전드, 카탈로그 번호 400153, 클론 MOPC-21)을 함유하는 차가운 FACS 완충액(2%(v/v) FBS, 5　mM EDTA pH 8(암레스코, 카탈로그 번호 E177) 및 7.5 mM 나트륨 아지드(시그마-알드리치 S2002)로 보충된 DPBS) 50 ㎕/웰에서 염색하였다. 세포를 4℃에서 120 분동안 배양하고, 차가운 DPBS로 4회 세척하고, 4℃에서 30 ㎍/mL FITC-접합된 항-마우스 IgG Fc-감마-특이적 염소 F(ab')2(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 115-096-071)를 함유하는 차가운 FACS 완충액 50 ㎕/웰에서 30 분동안 염색하였다. 그 후에 세포를 차가운 DPBS로 2회 세척하고, 4℃에서 10 ㎍/mL의 정제된 항-마우스 CD16/CD32 래트 IgG-Fc-블록(BD 파밍겐, 카탈로그 번호 553142 클론 2.4G2), 0.67 ㎍/mL 항-마우스 CD8a-APC-Cy7(바이오레전드, 카탈로그 번호 100714, 클론 53-6.7), 0.67 ㎍/mL 항-마우스 CD3ε-PerCP-Cy5.5(바이오레전드, 카탈로그 번호 100328, 클론 145-2C11), 0.67 ㎍/mL 항-마우스 CD4 래트 IgG2bκ-PE-Cy7(바이오레전드, 카탈로그 번호 100422, 클론 GK1.5)로 보충된 50 ㎕/웰 FACS 완충액으로 30 분동안 염색하였다. 세포를 200 ㎕/웰의 차가운 DPBS로 2회 세척하고, 1% 포름알데하이드를 함유하는 50 ㎕/웰 DPBS로 고정시키고, FACS-완충액에 재현탁하였다. 3-레이저 맥스퀀트(MACSQuant) 분석기 10(밀테나이 바이오텍) 및 플로우 조 v10.0.7(플로우조 LLC)를 사용하여 세포를 획득하였다. 게이트는 CD3+ CD8+ 또는 CD3+ CD4+ T 세포 상에 설정하였고, FITC-접합된 항-마우스 IgG Fc-감마-특이적 염소 F(ab')2의 평균 형광 강도(MFI)를 분석하고 블랭크 대조군(마우스 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 무첨가)의 MFI를 차감하여 표준화시켰다. MFI는 마우스 4-1BB 세포-결합된 분자에 대한 결합을 나타내기 위해 사용된 마우스 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자의 농도에 대해 블롯화하였다.
도 13에서 볼 수 있듯이, 뮤린 4-1BBL 구조물 M.1 및 M.2 뿐 아니라 상응하는 대조군 분자 대조군 M.1 및 대조군 M.2는 마우스 4-1BB에 매우 유사한 친화도하에 결합한다. 표 39는 구조물 M.1 및 M.2 및 대조군 분자에 대해 측정된 바와 같은 EC50 값을 나타낸다.
활성화된 4-1BB-발현 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 상에서의 결합
구조물 EC50 [nM]
4-1BB+CD8+ 		EC50 [nM]
4-1BB+CD4+
대조군 M.1 0.95 0.74
M.1 0.87 0.52
대조군 M.2 0.78 0.6
M.2 0.54 0.42
5.4.2 FAP-발현 종양 세포 상에서의 결합FAP 발현 세포상에서의 결합 분석을 위해, 인간 흑색종 세포주 MV-3(문헌[Ruiter et al., Int. J. Cancer 1991, 48(1), 85-91] 참조) 및 WM-266-4(ATTC CRL-1676)를 사용하였다(항-FAP 특이적 클론 28H1은 마우스/인간-교차반응성이다). 0.1 x 106개의 FAP 발현 종양 세포를 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각 웰에 가하였다. 세포를 200 ㎕의 차가운 DPBS로 1회 세척하고, 펠릿을 1:1000 희석된 생/사멸 정착성 수성 사멸 세포 염색 키트(라이프 테크놀로지스, L34957)를 함유하는 4℃ 차가운 DPBS 완충액 100 ㎕/웰에 재현탁하고, 4℃에서 30 분동안 배양하였다. 세포를 200 ㎕의 차가운 DPBS 완충액으로 1회 세척하고, 일련의 농도로 뮤린 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자를 함유하는 차가운 FACS 완충액(2%(v/v) FBS, 5　mM EDTA pH 8(암레스코, 카탈로그 번호 E177) 및 7.5 mM 나트륨 아지드(시그마-알드리치 S2002)로 보충된 DPBS) 50 ㎕/웰에 재현탁시킨 후, 4℃에서 1 시간동안 배양하였다. 200 ㎕ DPBS/웰로 4회 세척한 후에, 4℃에서 30 ㎍/mL FITC-접합된 항-마우스 IgG Fc-감마-특이적 염소 F(ab')2(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 115-096-071)를 함유하는 4℃ 차가운 FACS 완충액 50 ㎕/웰로 30 분동안 세포를 염색하였다. 세포를 200 ㎕/웰의 차가운 DPBS 완충액으로 2회 세척하고, 1% 포름알데하이드를 함유하는 50 ㎕/웰 DPBS로 고정시키고, FACS-완충액에 재현탁하였다. 3-레이저 맥스퀀트 분석기 10(밀테나이 바이오텍) 및 플로우 조 v10.0.7(플로우조 LLC)을 사용하여 세포를 획득하였다. 게이트는 살아있는 세포 상에 상에 설정하였고, FITC-접합된 항-마우스 IgG Fc-감마-특이적 염소 F(ab')2의 평균 형광 강도(MFI)를 분석하고, 블랭크 대조군(마우스 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자 무첨가)의 MFI를 차감하여 표준화시켰다. MFI는 뮤린 4-1BB 세포-결합된 분자에 대한 결합을 나타내기 위해 사용된 뮤린 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자의 농도에 대해 블롯화하였다. 예상된 바와 같이, 뮤린 4-1BBL 구조물 M.1 및 M.2는 매우 유사한 친화도하에 FAP에 결합하는 반면, 대조군 분자는 결합하지 않는다.
도 14는 인간-FAP 발현 인간 흑색종 MV-3 세포(도 14A) 및 WM-266-4 세포(도 14B)에 대한 FAP-표적화 또는 비표적화 분할 삼량체 뮤린 4-1BB 리간드 Fc(kih) 구조물 M.1 및 M.2의 결합을 나타낸다. 표 40은 측정된 바와 같은 EC50 값을 나타낸다.
인간 FAP-발현 종양 세포에 대한 결합
구조물 EC50 [nM]
FAP+ MV-3 		EC50 [nM]
FAP+ WM-266-4
M.1 7.26 5.14
M.2 6.9 5.63
실시예 6표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 생물 활성
6.1. 인간 4-1BB를 발현하는 HeLa 세포에서 NF-κB 활성화
인간 4-1BB 및 NF-κB-루시퍼라제를 발현하는 HeLa 세포의 생성
자궁암 세포주 HeLa(ATCC CCL-2)를, CMV-프로모터 및 퓨로마이신 내성 유전자의 조절하에 인간 4-1BB의 서열(유니프롯 등록번호 Q07011)을 함유하는 발현 벡터 pETR10829를 기반으로 하는 플라스미드로 형질도입시켰다. 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I 및 3 ㎍/mL 퓨로마이신이 보충된 DMEM 배지에서 세포를 배양하였다.
4-1BB-형질도입된 HeLa 세포를 유동세포분석에 의해 4-1BB 발현에 대해 검사하였다: 0.1 ㎍ PerCP/Cy5.5 접합된 항-인간 4-1BB 마우스 IgG1λ 클론 4B4-1(바이오레전드 카탈로그 번호309814) 또는 그의 이소타입 대조군(PerCP/Cy5.5 접합된 마우스 IgG1λ 이소타입 대조군 항체 클론 MOPC-21, 바이오레전드 카탈로그 번호400150)을 함유하는 100 ㎕ FACS 완충액에 0.2 x 106개의 살아있는 세포를 재현탁하고, 4℃에서 30 분동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 0.06 ㎍ DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 300 ㎕ FACS 완충액에 재현탁하고, 5-레이저 LSR-포르테사(BD 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다. 한계 희석을 수행하여 기술된 바와 같이 단일 클론을 생성하였다: 인간-4-1BB-형질도입된 HeLa 세포를 10, 5 및 2.5 세포/mL의 밀도로 배지에 재현탁하고, 200 ㎕의 세포 현탁액을 환저 조직-배양물 처리된 96-웰 플레이트(6개 플레이트/세포 농도, TPP 카탈로그 번호 92697)로 옮겼다. 단일 클론을 수거하고, 증식시키고 전술한 바와 같이 4-1BB 발현에 대해 검사하였다. 4-1BB의 최고 발현을 나타낸 클론(클론 5)을, NF-κB-루시퍼라제 발현-벡터 5495p Tranlucent HygB를 사용한 후속 형질감염을 위해 선택하였다. 상기 벡터는 하이그로마이신 B에 대한 내성 및 NF-κB-반응 요소(HyB 내성이 도입된 주쇄 벡터 파노믹스(Panomics), 카탈로그 번호 LR0051)의 조절하에 루시퍼라제를 발현하는 능력 둘 다를 갖는 형질감염 세포를 제공한다. 인간-4-1BB HeLa 클론 5 세포를 70% 밀집도까지 배양하였다. 50 ㎍(40 ㎕)의 선형화된(제한 효소 AseI 및 SalI) 5495p Tranlucent HygB 발현 벡터를 멸균 0.4 cm 진 펄서(Gene Pulser)/마이크로펄서(MicroPulser) 큐벳(바이오래드(Biorad), 카탈로그 번호 165-2081)에 가하였다. 400 ㎕의 무보충제 DMEM 배지 중의 2.5 x 106개 인간-4-1BB HeLa 클론 5 세포를 첨가하고 플라스미드 용액과 조심스럽게 혼합하였다. 다음 설정: 지수 펄스, 전기용량 500 μF, 전압 160V, 무한 저항하에서 진 펄서 엑셀(Gene Pulser Xcell) 전체 시스템(바이오래드, 카탈로그 번호　165-2660)을 이용하여 세포의 형질감염을 수행하였다. 펄스 직후에, 형질감염된 세포를, 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I으로 보충된 37℃ 따뜻한 DMEM 배지 15 mL를 함유한 75 cm2 조직 배양 플라스크(TPP, 카탈로그 번호 90075)로 옮겼다. 다음 날, 3 ㎍/mL 퓨로마이신 및 200 ㎍/mL 하이그로마이신 B(로슈, 카탈로그 번호 10843555001)를 함유하는 배양 배지를 첨가하였다. 생존 세포들을 증식시키고, 전술한 바와 같이 한계 희석을 수행하여 단일 클론들을 생성하였다.
클론들을 전술한 바와 같이 4-1BB 발현에 대해 검사하고 다음과 같이 NF-κB-루시퍼라제 활성에 대해 검사하였다: 클론들을 선택 배지에 수거하고, 세포 계수기 바이-셀(Cell Counter Vi-cell) xr 2.03(베크만 쿨터(Beckman Coulter), 카탈로그 번호 731050)을 사용하여 계수하였다. 세포를 0.33 x 106 세포/mL의 세포 밀도로 맞추고, 상기 세포 현탁액 150 ㎕를 뚜껑이 있는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오-원, 카탈로그 번호 655083)의 각 웰로 옮기고, - 대조군으로서 - 표준 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(TPP 카탈로그 번호 92096)로 옮겨서 다음날 생존 및 세포 밀도를 검사하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 상이한 농도의 재조합 인간 종양 괴사 인자 알파(rhTNF-a, 페프로테크(PeproTech), 카탈로그 번호 300-01A)를 함유하는 배지 50 ㎕를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 0 ng/웰의 rhTNF-a의 최종 농도를 제공하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 6 시간동안 배양한 다음 200 ㎕/웰 DPBS로 3회 세척하였다. 리포터 용해 완충액(Reporter Lysis Buffer)(프로메가, 카탈로그 번호 E3971)을 각 웰에 첨가하고(40 ㎕), 플레이트를 -20℃에서 밤새 저장하였다. 다음 날, 냉동된 세포 플레이트 및 검출 완충액(루시퍼라제 1000 분석 시스템, 프로메가, 카탈로그 번호 E4550)을 실온에서 해동하였다. 100 ㎕의 검출 완충액을 각 웰에 첨가하고, 스펙트라맥스(SpectraMax) M5/M5e 마이크로플레이트 리더 및 소프트맥스 프로 소프트웨어(SoftMax Pro Software)(몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices))를 사용하여 가능한 한 신속하게 플레이트를 측정하였다. 대조군(rhTNF-α 무첨가)보다 높은, 500 분/웰 동안 측정된 방출광 단위(URL)를 루시퍼라제 활성으로 취하였다. 최고의 루시퍼라제 활성 및 상당한 수준의 4-1BB 발현을 나타내는 NF-κB-luc-4-1BB-HeLa 클론 26을 추가의 사용을 위해 선택하였다.
FAP-발현 종양 세포와 공-배양된 인간 4-1BB를 발현하는 HeLa 세포에서 NF-κB 활성화
NF-κB-루시퍼라제 인간-4-1BB HeLa 세포를 수거하고, 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I로 보충된 DMEM 배지에 0.2 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 100 ㎕(2 x 104 세포)의 상기 세포 현탁액을 뚜껑이 있는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오-원, 카탈로그 번호 655083)의 각 웰로 옮기고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 적정된 농도의 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(FAP 분할 4-1BBL 삼량체) 또는 DP47-비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(DP47 분할 4-1BBL 삼량체)를 함유하는 배지 50 ㎕를 첨가하였다. FAP-발현 종양 세포(MV3, WM-266-4 또는 NIH/3T3-huFAP 클론 39)를, 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I로 보충된 DMEM 배지에 2 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다.
FAP-발현 종양 세포(50 ㎕, 최종비 1:5)의 현탁액 또는 배지만을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 6 시간동안 배양하였다. 세포를 200 ㎕/웰 DPBS로 2회 세척하였다. 40 ㎕의 새로 제조한 리포터 용해 완충액(프로메가, 카탈로그 번호 E3971)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 -20℃에서 밤새 저장하였다. 다음 날, 냉동된 세포 플레이트 및 검출 완충액(루시퍼라제 1000 분석 시스템, 프로메가, 카탈로그 번호 E4550)을 실온으로 해동하였다. 100 ㎕의 검출 완충액을 각 웰에 첨가하고, URL(0.5 초/웰동안 방출광 단위)로 광방출을 계수하는 스펙트라맥스 M5/M5e 마이크로플레이트 리더 및 소프트맥스 프로 소프트웨어(몰레큘라 디바이시즈), 또는 초당계수(CPS)로서 광방출을 계수하는 빅터3(Victor3) 1420 다중표지 계수기 플레이트 리더(퍼킨 엘머) 및 퍼킨 엘머 2030 매니저 소프트웨어를 사용하여 가능한 한 신속하게 루시퍼라제 활성을 측정하고, 검사한 구조물들의 농도에 대해 블롯화하였다.
FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(FAP 분할 4-1BBL 삼량체)는 FAP-발현 종양 세포의 존재하에 리포터 세포주에서 NFκB 신호전달 경로의 활성화를 유발하였다. 대조적으로, 동일한 분자의 비표적화 변이체는 검사된 어떤 농도에서도 상기 효과를 유발하지 못하였다(도 16). FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 존재하에서조차 FAP-음성 종양 세포와 함께 NF-κB 수용체 세포주를 배양했을 때 NF-κB 활성화를 검출할 수 없었기 때문에, 표적화 4-1BBL의 상기 활성은 종양 세포의 세포 표면에서 FAP의 발현에 분명하게 의존하였다. 구조물 1.1 내지 1.10에 대해 측정된 바와 같은 활성은 도 17에 나타내었고, 구조물 2.1, 2.4 및 2.5에 대해 측정된 바와 같은 데이터는 도 18에 나타내었다.
6.2 사이노몰구스 원숭이 4-1BB를 발현하는 HEK T293 세포에서 NFκB 활성화
사이노몰구스 원숭이 4-1BB 및 NFκB-루시퍼라제를 발현하는 HEK T293 세포의 생성
바이러스-유사 입자(VLP)의 생성을 위해, 인간 배아 신장(HEK)세포 T293/17(ATCC CRL-11268)을, 플러스(PLUS: 상표) 시약(라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 15338100) 시약과 함께 리포펙타민(Lipofectamine)(등록상표) LTX 시약을 사용하여, 제조사의 프로토콜에 따라 NFκB-루시퍼라제-IRIS-GFP 리포터 유전자 카세트(NFκB-luc-GFP)를 암호화하는 벡터 pETR14372로 형질감염시켰다. 6 시간 후에, 10% FBS로 보충된 DMEM 배지 교체를 수행하고 VLP를 4 일후에 수거하였다. 신선한 HEK 293T 세포를 70 내지 80%의 밀집도에서, 생성된 pETR14372-VLP 및 4 ㎍/mL 폴리브렌을 사용하여 형질도입시켰다. 세포를 24 시간동안 배양하고 배지 교환을 수행하였다. 형질도입된 HEK T293/17 세포를 수거하고, 1개 세포/웰의 한계 희석을 수행하여 안정한 단일 클론을 스크리닝하였다. 단일 클론을 배지중에서 25 ng/mL의 TNF-α(페프로테크 인코포레이티드, 카탈로그 번호 300-01A)로 자극하고, 인큐사이트 줌 형광 현미경검사 시스템(Incucyte Zoom Fluorescence Microscope System)(에센 바이오사이언스(Essen Bioscience))을 사용하여 시간 경과에 따른 양성 GFP 신호에 대해 스크리닝하였다. GFP 신호 기록 후에, 세포를 나노 글로 루시퍼라제 키트(Nano Glo Luciferase Kit)(프로메가, N1120)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 루시퍼라제 활성에 대해 검사하였다. 루시퍼라제 활성은 빅터3 1420 다중표지 계수기 플레이트 리더(퍼킨 엘머) 및 퍼킨 엘머 2030 매니저 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 광방출은 0.5 초/웰 동안 초당계수(CPS)로 계수하였다. 클론 61은 TNF-α 활성화 후에 GFP 및 루시퍼라제의 최고 발현을 나타내었으며, 수용체 세포주 생성을 위해 더 사용되었다.
전술한 바와 같이, 사이노몰구스 원숭이 4-1BB 및 퓨로마이신 내성을 암호화하는 벡터 pETR14879를 사용하여 VLP를 생성하였으며, HEK 293T NFκB-fluc-GFP 클론 61 세포주를 70 내지 80%의 밀집도에서, 생성된 pETR14372-VLP 및 4 ㎍/mL 폴리브렌을 사용하여 형질도입시켰다. 세포를 24 시간동안 배양하고 배지 교환을 수행하였다. 형질도입 4일후에, 1% FBS를 함유하는 DPBS 중에서 PE-접합된 항-인간 사이노몰구스-교차반응성 4-1BB 항체(마우스 IgG1κ, 클론 MOPC-21, 바이오레전드 카탈로그 번호 309804)로 세포를 염색하고, FACS(아리아(ARIA), BD)로 분류하고, 1 ㎍/mL 퓨로마이신(인비보겐, 카탈로그 번호 ant-pr)을 함유하는 10% FBS 배지로 보충된 DMEM에 5개 세포/웰로 접종하였다. 성장하는 클론을 TNF-α 자극후 GFP 및 루시퍼라제 활성에 대해서 기술된 바와 같이 검사하고 유동세포분석에 의해 높은 사이노몰구스 원숭이 4-1BB 발현에 대해 검사하였다. 이중 양성 클론들을 선택하고 1가 FAP-표적화 구조물 2.1 또는 대조군 B 및 FAP-발현 MV-3 또는 WM-266-4 세포의 존재하에서 루시퍼라제 활성에 대해 검사하였다. HEK T293/17-NF-kB-luc-GFP-cy4-1BB 발현 클론 61-13을 선택하여 모든 추가의 실험들에 사용하였다.
FAP-발현 종양 세포와 공-배양된 사이노몰구스 원숭이 4-1BB를 발현하는 HEK T293/17 수용체 세포의 NFκB 활성화
HEK T293/17-NFkB-luc-GFP-cy4-1BB 발현 클론 61-13 세포를 수거하고, 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I로 보충된 DMEM 배지에 0.2 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 100 ㎕(2 x 104 세포)의 상기 세포 현탁액을 뚜껑이 있는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오-원, 카탈로그 번호 655083)의 각 웰로 옮기고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 상이한 적정된 농도의 FAP-표적화 또는 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자를 함유하는 배지 50 ㎕를 첨가하였다. FAP-발현 종양 세포(MV3 및 WM-266-4)를 배지에 2 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. FAP-발현 종양 세포(50 ㎕)의 현탁액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 6 시간동안 배양하였다. 분석 원리는 도 19에 나타내었다. 배양후에 세포를 200 ㎕/웰 DPBS로 3회 세척하였다. 40 ㎕의 새로 제조한 리포터 용해 완충액(프로메가, 카탈로그 번호 E3971)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 -20℃에서 밤새 저장하였다. 다음 날, 냉동된 세포 플레이트 및 검출 완충액(루시퍼라제 1000 분석 시스템, 프로메가, 카탈로그 번호 E4550)을 실온으로 해동하였다. 100 ㎕의 검출 완충액을 각 웰에 첨가하고, 스펙트라맥스 M5/M5e(몰레큘라 디바이시즈) 마이크로플레이트 리더(500 분 적분 시간, 모든 파장을 수집하는 필터 없음)를 사용하여 가능한 한 신속하게 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 광방출을 0.5 초/웰 동안 방출광 단위(URL)로 계수하고, 검사한 FAP-표적화 또는 비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 농도에 대해 블롯화하였다. 실시예 2의 구조물들에 대한 결과를 도 20에 나타내었다.
6.3 항원-특이적 CD8+ T 세포-기반 분석
항원-특이적 CD8 T 세포의 단리 및 배양
HLA-A2+ CMV-감염된 지원자로부터 신선한 혈액을 수득하였다. PBMC를 전술한 바와 같이 단리하였다. 음성 선택 인간 CD8 T 세포 단리 키트를 제조사의 권고(밀테나이 바이오텍, 카탈로그 번호 130-094-156)에 따라 사용하여 PBMC로부터 CD8 T 세포를 정제하였다. 천만개의 단리된 CD8 T 세포를, CMV-유래 NLVPMVATV 펩티드(프로임뮨(ProImmune), 카탈로그 번호 F008-2B)를 함유하는 50 ㎕의 PE-표지된 HLA-A2-오량체와 함께 1%(v/v) FBS로 보충된 1 mL 멸균 DPBS에 재현탁하고, 실온에서 10 분동안 배양하였다. 세포를 1%(v/v) FBS로 보충된 3 mL 멸균 DPBS로 2회 세척하였다. 세포를, 1 ㎍/mL 항-인간 CD8-FITC(클론 LT8, 압캠(Abcam), 카탈로그 번호 Ab28010)을 함유하는 1%(v/v) FBS로 보충된 1 mL 세포 DPBS에 재현탁하고, 4℃에서 30 분동안 배양하였다. 세포를 2회 세척하고, 1%(v/v) FBS로 보충된 DPBS에 5 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁하고, 30 ㎛ 예비-분리 나일론-네트 세포 여과기(밀테나이 바이오텍, 카탈로그 번호 130-041-407)를 통해 여과시켰다. 아리아(ARIA) 세포 분류기(BD 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 하기 설정하에 사용하여 FACS 분류에 의해 NLV-펩티드-특이적 CD8+ T 세포를 단리하였다: 100 ㎛ 노즐 및 순도 분류 마스크. 분류된 세포를, 10%(v/v)　FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I 및 400　U/mL 프로류킨이 보충된 5 mL RPMI 1640 배지를 함유하는 15 mL 폴리프로필렌 원심분리관(TPP, 카탈로그 번호 91015)에 수집하였다. 분류된 세포를 실온에서 350 x g에서 7 분동안 원심분리하고, 동일 배지에 0.53 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 100 ㎕/웰의 상기 세포 현탁액을 미리 제조된 피더 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
PHA-L-활성화되고 방사선조사된 동종이계 피더 세포를 전술한 바와 같이 (Levitsky et al., 1998) PBMC로부터 제조하고, 웰 당 2 x 105 피더 세포로 96 웰 배양 플레이트에 분배하였다.
배양 하루후에, 100 ㎕ 배지/웰을 분류된 CD8+ T-세포를 함유하는 웰로부터 제거하고 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I이 보충된 새 RPMI 1640 배지 및 400 U/mL 프로류킨으로 교체하였으며, 이것을 정기적으로(2 내지 4일마다) 배양시에 반복하였다. 세포가 증식하기 시작하자마자, 이들을 24-웰 평저 조직 배양 플레이트(TPP, 92024)로 옮겼다. 세포들을 증식/분할시키고, 정기적으로 새로운 피더 세포 제제로 재활성화시켰다.
항원-특이적 CD8+ 세포의 활성화 분석
MV3 세포를 수거하고 DPBS로 세척하고, 2 x 107 세포를 PKH-26 레드 형광 세포 링커 키트(PKH-26 Red Fluorescence Cell linker Kit)(시그마, 카탈로그 번호 PKH26GL)의 250 ㎕ C 희석제에 재현탁하였다. 1 ㎕ PKH26-레드-염색 용액을 250 ㎕의 C 희석제로 희석하고 MV3 세포의 현탁액에 첨가하고, 이어서 실온에서 어두운 상태에서 5 분동안 배양하였다. 그 후에 0.5 mL FBS를 첨가하고, 세포를 1 분동안 배양하고 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I, 1 mM 나트륨-피루베이트, 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산 및 50 μM β-머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640 배지로 이루어진 T 세포 배지로 1회 세척하였다. 1 x 106 MV3 세포/mL를 T 세포 배지에 재현탁하고 3개의 튜브내에 분리하였다. 합성 NLVPMVATV 펩티드(씽크펩티드(thinkpeptides)로부터 수득)를 1 x 10-9 M 또는 1 x 10-8 M의 최종 농도로 가하고, 세포를 90 분동안 배양하였다. MV3 세포를 T 세포 배지로 1회 세척하고, 0.5 x 106 세포/mL의 밀도로 재현탁하고, 96-웰 환저 세포-현탁 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)에 분배(100 ㎕/웰)하고, 37℃ 및 5　% CO2에서 밤새 배양하였다. 분석 원리는 도 21에 나타내었다.
다음 날, 상이한 적정된 농도의 표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자를 함유하는 50 ㎕/웰의 T 세포 배지를 첨가하였다. NLV-특이적 CD8 T 세포를 수거하고, CFDA-SE (5(6)-카복시플루오레세인다이아세테이트-N-숙신이미딜에스터, 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 21888-25MG-F)를 40 nM의 최종 농도로 첨가하고, 세포를 37℃에서 15 분동안 회전시키면서 배양하였다. FBS를 첨가하여 표지화를 중단하고, 세포를 세척하고, T 세포 배지에 0.125 x 106 세포/mL의 최종 농도로 재현탁하였다. 50 ㎕의 상기 CFSE-표지된 CD8 T 세포 현탁액을 각 웰에 첨가하였다(최종 E:T 비 = 1:8). 세포 플레이트를 24 시간동안 배양하고, 50 ㎕/웰을 제거하고, 2.64 ㎕/mL 골지(Golgi) 스탑(모네신(Monesin)을 함유하는 단백질 운반 억제제, BD 바이오사이언스, 카탈로그 번호 554724)을 함유하는 50 ㎕의 T 세포 배지를 각 웰에 첨가하였다(최종 농도 0.66 ㎕/mL). 세포를 4 시간동안 배양한 다음 플레이트를 200 ㎕/웰 DPBS로 세척하고, 4℃에서 1:5000 희석된 정착성 생존도 지시염료-eF450(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0864)을 함유하는 100 ㎕/웰의 4℃ DPBS로 30 분동안 염색하였다. 세포 플레이트를 200 ㎕/웰 DPBS로 세척한 후 하기의 형광 염료-접합된 항체들로 염색하였다: 항-인간 CD137-PerCP/Cy5.5(클론 4B4-1, 마우스 IgG1κ, 바이오레전드, 카탈로그 번호 309814), 항-인간 CD8-BV605(클론 RPA-T8, 마우스 IgG1κ, 바이오레전드, 카탈로그 번호 301012) 또는 0.67 ㎍/mL 항-인간 CD8a-APC/Cy7(클론 RPA-T8, 마우스 IgG1κ, 바이오레전드, 카탈로그 번호 301016) 및 항-인간 CD25 PE/Cy7(클론 BC96, 마우스 IgG1κ, 바이오레전드, 카탈로그 번호 302612). 4℃에서 30 분간 배양한 후, 세포를 200 ㎕/웰 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 50 ㎕/웰의 새로 제조한 폭스P3 픽스/펌(FoxP3 Fix/Perm) 완충액(이바이오사이언스 카탈로그 번호 00-5123 및 00-5223)에 재현탁하고, 4℃에서 30 분동안 배양하였다. 플레이트를 200 ㎕/웰의 펌-완충액(Perm-Buffer)(2%(v/v) FBS, 1%(w/v) 사포닌(시그마 라이프 사이언스, S7900) 및 1%(w/v) 나트륨 아지드(시그마-알드리치, S2002)가 보충된 DPBS)으로 2회 세척하고, 0.25 ㎍/mL 항-인간 IFNγ-APC(클론 B27, 마우스 IgG1κ, 바이오레전드, 카탈로그 번호 506510) 또는 0.33 ㎍/mL 항-인간 IFNγ-BV510(클론 4S.B3, 마우스 IgG1κ, 바이오레전드, 카탈로그 번호502543)을 함유하는 50 ㎕/웰 펌-완충액(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 00-8333-56)으로 염색하였다. 플레이트를 4℃에서 1 시간동안 배양하고, 200 ㎕/웰 펌-완충액으로 2회 세척하였다. 고정시키기 위해, 1% 포름알데하이드를 함유하는 50 ㎕/웰 DPBS를 첨가하였다. 같은 날 또는 다음 날, 세포를 100 ㎕/웰 FACS 완충액에 재현탁하고, 5-레이저 포르테사 유동세포분석기((BD 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어) 또는 3-레이저 밀테나이 퀀트 분석기 10(밀테나이 바이오텍) 및 플로우 조(플루우조 X 10.0.7)를 사용하여 획득하였다.
구조물 1.1 내지 1.10에 대해 도 22 및 도 23에, 및 구조물 2.1, 2.3 및 2.4에 대해 도 24 및 도 25에 나타낸 바와 같이, 항원-특이적 CD8+ T 세포는 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(FAP 분할 4-1BBL 삼량체)의 존재하에서 증가된 수준의 표면 4-1BB 발현을 나타내었지만, 비자극된 대조군들은 그렇지 않았다. 비자극된 대조군 분자의 첨가가 4-1BB 발현 수준에 영향을 미치지 않았기 때문에, 4-1BBL의 상기 효과는 용량 의존성이었으며 FAP-표적화를 필요로 하였다. 또한, 더 높은 펩티드 농도(1 x 10-8M)에서 활성화된 T-세포는 FAP-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(FAP 분할 4-1BBL 삼량체)의 존재하에서 INFγ의 지속적인 분비를 나타내었다. 총괄하여, 이들 데이터는 항원-표적화된 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자가 표적화 의존 방식으로 항원 특이적 T-세포의 표면 표현형 및 반응성을 조절하는 것을 입증한다.
6.4 세포-표적화 및 비표적화 마우스 4-1BBL Fc 융합 항원 결합 분자의 비교
표적화 및 비표적화 마우스 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(FAP 분할 마우스 4-1BBL 삼량체 및 DP47 분할 마우스 4-1BBL 삼량체)를 실시예 1.3에서 기술된 바와 같이 제조하였다.
세포-표적화 및 비표적화 마우스 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자들의 생물활성을 비교하기 위해, 증식 지시염료 이플라워670(Proliferation Dye eFlour670)-표지되거나(이바이오사이언스, 카탈로그 번호65-0840-90) 또는 셀트레이스 바이올렛 세포 증식 지시염료(CellTrace Violet Cell Proliferation dye)-표지된(셀 트레이서(Cell tracer), 카탈로그 번호 C34557) 신선한 마우스 비장세포를, 0.5 ㎍/mL 항-마우스 CD3 시리아 햄스터 IgG(클론 145-2C11, BD, 카탈로그 번호 553057) 및 다양한 농도에서 첨가된 지시된 약물 후보 분자의 존재하에, 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) 글루타맥스-I, 1 mM 나트륨-피루베이트, 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산 및 50 μM β-머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640 배지(깁코, 카탈로그 번호 42401-042) 중에서 부착성 50 Gy 조사된 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포(생성에 대해 5.3 참조)와 96 웰 조직 배양 U-바닥 플레이트(TTP, 카탈로그 번호 92097)에서 3 내지 4 일동안 공배양하였다(도 26). 3 또는 4 일후에, 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 4℃에서 항-마우스 CD8 래트 IgG2a-BV711(바이오레전드, 카탈로그 번호 100747, 클론 53-6.7,) 및 항-마우스 CD4 래트 IgG2a-BV421(바이오레전드, 카탈로그 번호 100544, 클론 RM4-5) 및 0.67 ㎍/mL 항-마우스 CD137(4-1BB) 시리아 햄스터 IgG-PE(바이오레전드, 카탈로그 번호 106106, 클론 17B5) 및 항-마우스 CD25-PErCP-Cy5.5 래트 IgG2b(바이오레전드, 카탈로그 번호 1019112)를 함유하는 25 ㎕ FACS 완충액/웰에서 30 분동안 염색하였다. 세포를 세척하고, 실온에서, 제조된 픽스/펌 완충액(폭스P3/전사 인자 염색 완충액 세트, 이바이오사이언스, Cat.-Ni. 00-5523-00)에서 1 시간동안 배양하였다. 세포를 새로 제조한 펌 완충액으로 2회 세척하고, 실온에서, 세포독성 계통 전사 인자 에오메스(Eomes), 즉, 항-마우스 에오메스 래트IgG2a-알렉사플루오르(AlexaFluor)488(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 534875, 클론 Dan11mag)에 대해서, 및 - CD137이 염색되지 않은 경우 - 세포독성 작동인자 분자 그랜자임 B, 즉, 항-마우스 래트IgG2a 그랜자임 B-PE(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 128822, 클론 16G6)에 대해 형광-표지된 항체를 함유하는 25 ㎕/웰 펌-완충액으로 1 시간동안 동시-염색하였다. 이어서, 세포를 2회 세척하고, FACS 완충액에 재현탁하고, 레이저 포르테사 유동세포분석기(BD 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어) 또는 3-레이저 맥스퀀트 분석기 10(밀테나이 바이오텍) 및 플로우 조 v10.0.7(플루우조 LLC)를 사용하여 획득하였다. 게이트를 살아있는 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포 상에 설정하였고, 증식 세포의 빈도 뿐 아니라 CD25, 에오메스 및 그랜자임 B 또는 CD137의 발현 수준도 측정하였다. 기능 활성을 나타내기 위해 상기 증식세포 빈도 및 활성화 마커들의 빈도 및 MFI를 사용된 마우스 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 분자의 농도에 대해 블롯화하였다. 도 27에서 볼 수 있듯이, 증식 CD8+ T 세포의 증가를 구조물 M.1 및 M.2의 경우에서 관찰할 수 있었다.
6.5 항-뮤린 4-1BB 항체 Lob 12.3(muIgG1 Wt) 또는 구조물 M.2로 처리된 마우스에서의 간 변화
MC38-muFAP(뮤린 대장암 모델) s.c를 갖는 C57BL/6 마우스를 FAP에 표적화된 작용성 항-뮤린 4-1BB 항체로 1주일에 1회씩 3 주동안 처리하였다[Efficacy Study 020-GA1401: "Experiment to show efficacy of 4-1BB targeted therapy in combination with a-PD-L1 in MC38-muFAP s.c. model in C57B6 mice."]. 사용된 항체들은 Lob 12.3 muIgG1 Wt("야생형" Fc, 클론 Lob 12.3 사용, 바이오엑셀 카탈로그 번호 BE0169) 또는 DAPG 돌연변이(불활성 Fc)를 갖는 구조물 M.2이었다. 상기 2개의 항체들을 연속되는 3주동안 매주 1회 투여하였다. 4마리 동물/군을 마지막 처리 7일후에 희생시키고 간을 현미경검사로 검사하였다.
F4/80 양성 대식세포의 축적, 및 맥관중심성(vasocentric) 분포를 종종 보여주는 소량의 염증 세포들(주로 림프구)의 혼합 집단과 함께 간세포 변성의 병소에 존재하는 간 변화는 Lob 12.3 muIgG1 Wt를 투여받은 동물에서만 관찰되었다. 가끔 간세포의 단일 세포 괴사, 및 문맥 공간에서 혈관주위 단핵 세포 침윤이 주목되었다. 구조물 M.2를 투여받은 동물들의 간에서 치료 관련 결과는 관찰되지 않았다(표 41).
조직병리학적 결과의 발생률(n=4/군)
처리 비히클 Lob 12.3
muIgG1 Wt		 구조물 M.2
대식세포 및 염증 세포와 함께 간세포 변성 병소 - 4 -
혈관주위 염증 세포 침윤 - 4 -
단일 세포 괴사 - 4 -
간에서 FcγR에 의한 가교결합에 기인한 간염이 우렐무맙(Urelumab) BMS-663513(Ascierto P.A. et al. 2010)으로 치료된 환자 및 마우스 대용물을 사용한 마우스에서 관찰되었다. 불활성 Fc를 갖는 항체로 치료된 동물들에서 간 결과물의 부재는 상기 가설을 뒷받침한다.6.6 인간 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 약동학적 파라미터의 측정
본 발명의 인간 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자가 약학적 용도에 적합한지를 검사하기 위해, 마우스에서 제거율, 분포 용적 또는 제거 반감기(t1/2)와 같은 약동학적 파라미터(PK 데이터)를 측정하였다. 따라서, 하기의 실험을 수행하였다:
실험 A: 건강한 NOG 마우스에서 구조물 1.2 및 대조군 B의 단일 용량 PK
실험 시작때 8 내지 10주의 평균 연령의 NOG 암컷 마우스(타코닉(Taconic), SOPF 시설에서 구입)를 승인된 지침(GV-Solas; Felasa; TierschG)에 따라서 12시간 밝음/12시간 어두움의 일일 주기하에 무특이 병원체 조건하에서 유지시켰다. 실험 연구 프로토콜은 지방 자치에 의해 검토되고 승인되었다(P 2011128). 동물들이 도착한 후 새로운 환경에 익숙해지도록 및 관찰을 위해 1 주일동안 유지시켰다. 정기적으로 연속적인 건강 모니터링을 수행하였다.
구조물 1.2 및 대조군 B의 노출을 평가하기 위해 단일 용량 약동학 연구(SDPK)를 수행하였다. 2.5 mg/kg의 i.v. 볼루스 투여를 NOG 마우스에게 투여하고 약동학 평가를 위해 선택된 시점들에서 혈액 샘플을 채취하였다. 마우스 혈청 샘플은 ELISA로 분석하였다. 비오티닐화 인간 4-1BB, 검사 샘플, 디곡시게닌(Digoxygenin) 표지된 항-huCH1 항체 및 항-디곡시게닌 검출 항체(POD)를 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 미세적정 플레이트에 단계적으로 첨가하고, 매 단계후에 실온에서 1 시간동안 배양하였다. 플레이트를 각 단계후에 3회 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 최종적으로, ABTS 기질 용액을 첨가하여 착색된 반응 생성물을 생성시킴으로써 퍼옥시다제-결합된 복합체를 가시화시켰다. 405 nm(490 nm에서의 기준 파장하에)에서 광도계로 측정된 반응 생성물 강도는 혈청 샘플중 분석물 농도에 비례한다. 구조물들에 대한 표준 곡선의 보정 범위는 0.156 내지 10 ng/ml이었으며, 이때 3 ng/ml가 정량하한(LLOQ)이다. 도 28a는 본 실험에서 관찰된 바와 같은 시간경과에 따른 농도의 감소를 나타낸다.
실험 B: 줄기 세포로 인간화된 종양 함유 NOG 마우스에서 구조물 2.1, 2.3, 대조군 B 및 C의 단일 용량 PK
구조물 2.1, 2.3, 대조군 B 및 대조군 C의 노출을 평가하기 위해 단일 용량 약동학 연구(SDPK)를 수행하였다. 인간 줄기 세포가 전이된 NSG 암컷 마우스는 잭슨 래버러토리즈(Jackson Laboratories)에서 전달받았다. 마우스들은 승인된 지침(GV-Solas; Felasa; TierschG)에 따라서 12시간 밝음/12시간 어두움의 일일 주기하에 무특이 병원체 조건하에서 유지시켰다. 실험 연구 프로토콜은 지방 자치에 의해 검토되고 승인되었다(ZH193-2014). 동물들이 도착한 후 새로운 환경에 익숙해지도록 및 관찰을 위해 1 주일동안 유지시켰다. 정기적으로 연속적인 건강 모니터링을 수행하였다.
인간 MKN45 세포(인간 위암세포)를 원래 ATCC에서 입수하고, 증식후 글리카르트(Glycart) 국제 세포 은행에 기탁하였다. 세포를 10% FCS를 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 세포는 5% CO2에서 수-포화 대기하에 37℃에서 배양하였다. 시험관내 계대수 9를 97%의 생존도에서 피하 주사에 사용하였다. 인간 섬유아세포 NIH-3T3을 로슈 너틀리(Roche Nutley)에서 인간 FAP를 발현하도록 조작하였다. 클론 39를 시험관내 계대수 12에서 및 98%의 생존도에서 사용하였다. 50 ㎕의 마트리젤(Matrigel)과 혼합된 50 ㎕의 세포 현탁액(1 x 106 MKN45 세포 + 1 x 106 3T3-huFAP)을 마취시킨 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 190 mm3의 평균 크기에 이르렀을 때 10 mg/kg의 i.v. 볼루스 투여를 인간화 마우스에게 투여하였다. 약동학 평가를 위해 선택된 시점들에서 혈액 샘플을 채취하였다. 마우스 혈청 샘플은 ELISA로 분석하였다. 비오티닐화 인간 4-1BB, 검사 샘플, 디곡시게닌 표지된 항-huCH1 항체 및 항-디곡시게닌 검출 항체(POD)를 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 미세적정 플레이트에 단계적으로 첨가하고, 매 단계후에 실온에서 1 시간동안 배양하였다. 플레이트를 각 단계후에 3회 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 최종적으로, ABTS 기질 용액을 첨가하여 착색된 반응 생성물을 생성시킴으로써 퍼옥시다제-결합된 복합체를 가시화시켰다. 405 nm(490 nm에서의 기준 파장하에)에서 광도계로 측정된 반응 생성물 강도는 혈청 샘플중 분석물 농도에 비례한다. 구조물들에 대한 표준 곡선의 보정 범위는 0.156 내지 10 ng/ml이었으며, 이때 3 ng/ml가 정량하한(LLOQ)이다. 도 28b는 본 실험에서 관찰된 바와 같은 시간경과에 따른 구조물들의 농도의 감소를 나타낸다.
실험 C: 건강한 NOG 마우스에서 구조물 2.1 및 2.3의 단일 용량 PK
실험 시작때 8 내지 10주의 평균 연령의 NOG 암컷 마우스(타코닉, SOPF 시설에서 구입)를 승인된 지침(GV-Solas; Felasa; TierschG)에 따라서 12시간 밝음/12시간 어두움의 일일 주기하에 무특이 병원체 조건하에서 유지시켰다. 실험 연구 프로토콜은 지방 자치에 의해 검토되고 승인되었다(P 2011128). 동물들이 도착한 후 새로운 환경에 익숙해지도록 및 관찰을 위해 1 주일동안 유지시켰다. 정기적으로 연속적인 건강 모니터링을 수행하였다.
구조물 2.1 및 2.3의 노출을 평가하기 위해 단일 용량 약동학 연구(SDPK)를 수행하였다. 2.5 mg/kg의 i.v. 볼루스 투여를 NOG 마우스에게 투여하고 약동학 평가를 위해 선택된 시점들에서 혈액 샘플을 채취하였다. 마우스 혈청 샘플은 ELISA로 분석하였다. 비오티닐화 인간 4-1BB, 검사 샘플, 디곡시게닌 표지된 항-huCH1 항체 및 항-디곡시게닌 검출 항체(POD)를 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 미세적정 플레이트에 단계적으로 첨가하고, 매 단계후에 실온에서 1 시간동안 배양하였다. 플레이트를 각 단계후에 3회 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 최종적으로, ABTS 기질 용액을 첨가하여 착색된 반응 생성물을 생성시킴으로써 퍼옥시다제-결합된 복합체를 가시화시켰다. 405 nm(490 nm에서의 기준 파장하에)에서 광도계로 측정된 반응 생성물 강도는 혈청 샘플중 분석물 농도에 비례한다. 구조물들에 대한 표준 곡선의 보정 범위는 0.156 내지 10 ng/ml이었으며, 이때 3 ng/ml가 정량하한(LLOQ)이다. 도 28c는 관찰된 시간 경과에 따른 농도의 감소를 나타낸다.
검사한 구조물 2.1 및 2.3은 체내에서 충분히 안정하며 약제 개발에 적합한 범위의 PK 파라미터를 갖는다. 결과들로부터 구조물 2.1이 약간 더 안정한 것으로 결론지을 수 있다.
6.7 인간 종양에서 FAP 출현율
FAP-표적화 구조물들의 가능한 임상 사용에 대한 이해를 얻기 위해 인간 종양에서 FAP의 출현율을 WO 2014/161845 호에 기술된 바와 같이 평가하였다.
비타텍스(Vitatex)(MABS1001)로부터의 래트 항-인간 세프라제 항체(IgG2a, 클론 D8)를 사용하여, 벤타나 벤치마크 XT(Ventana Benchmark XT) 상의 다양한 종양 지표들로부터의 2.5 ㎛ FFPET 절편들을 면역염색하였다. 절편들을 표준 CC1 처리에 적용한 후 37℃에서 다코(Dako) 항체 희석제(S3022) 중에서 5 ㎍/mL의 농도로 60 초동안 배양하고, 울트라뷰(Ultraview) DAB 검출 시스템(벤타나 #760-4456)을 사용하여 양성 염색을 검출하였다. 압캠으로부터의 매칭된 이소타입 항체(ab18450)를 음성 대조군으로 사용하였다. 두경부 편평세포암종(HNSCC), 유방암, 대장암(CRC), 췌장암(PAC), 위암, 비-소세포 폐암(NSCLC) 및 중피종을 포함하여 상이한 징후들의 인간 종양에 FAP+ 기질 침윤이 존재하여, FAP-표적화 구조물들에 대한 잠재적으로 주목되는 임상 징후들을 나타내었다.
인간 종양에서 FAP 출현율
종양 유형 중간 내지 고등급의 FAP+ 침윤이
있는 사례 %		 조사된 샘플 수
HNSCC 90 10
유방암 77 105
3중 음성 BC 80 7
CRC 77 90
PAC 74 19
위암 68 28
NSCLC 66 90
중피종 60 10
실시예 77.1 CD19(8B8-018) 표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조
7.1.1 파지 디스플레이 캠페인을 위한 CD19 항원 Fc 융합물의 제조, 정제 및 특성화
단량체 상태의 인간 및 사이노몰구스 CD19 엑토도메인(인간 CD19에 대해 서열번호 31 참조)을 발현하고 정제하기 위해, 각각의 DNA 단편을 놉 돌연변이(인간: 서열번호 186; 사이노몰구스: 서열번호 188)를 함유하는 인간 IgG1 Fc 유전자 절편에 융합시키고, "Fc-홀"(서열번호 86) 대응물(Merchant et al., 1998)로 형질감염시켰다. IgA 절단 부위(PTPPTP)를 항원 엑토도메인과 Fc 놉쇄 사이에 도입하였다. 유도된 비오티닐화에 대한 Avi 태그를 항원-Fc 놉쇄의 C-말단에 도입하고, 돌연변이 H435R 및 Y436F를 정제 목적으로 Fc 홀에 도입하였다[Jendeberg L. et al, J. Immunological methods, 1997]. S354C/T366W 돌연변이(인간: 서열번호 187; 사이노몰구스: 서열번호 189)를 함유하는 항원-Fc 놉쇄와, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이(서열번호 90)를 함유하는 Fc 홀쇄와의 조합은 CD19 엑토도메인의 단일 카피를 포함하는 이종이량체성 Fc 융합 단편의 생성을 가능하게 한다(도 5C의 4-1BB 구조물과 유사). 표 43은 항원 Fc-융합 구조물의 cDNA 및 아미노산 서열을 나열한 것이다.
단량체성 항원/Fc 융합 분자의 생성을 위해, 지수적으로 성장하는 현탁 CHO 세포를, 표준 방법을 이용하여 융합 단백질의 2개 구성성분(놉 및 홀 쇄)을 암호화하는 2개의 플라스미드로 동시-형질감염시켰다.
분비된 단백질을 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 친화성 크로마토그래피의 경우, 상등액을 인산나트륨(20 mM), 시트르산나트륨(20 mM), 0.5 M 염화나트륨 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 맵셀렉트 슈어 컬럼(부피(CV) = 5-15 mL, 지이 헬쓰케어의 수지) 상에 부하시켰다. 적어도 6개 컬럼 부피의 동일 완충액으로 세척하여 미결합 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은, 선형 구배: 단계 1, 0%부터 60%까지 용출 완충액(20 mM 시트르산나트륨, 500 mM 염화나트륨 완충액(pH 2.5)) 10 CV; 단계 2, 60%부터 100%까지 용출 완충액 2 CV를 이용하여 용출시켰다. 선형 구배의 경우, 100% 용출 완충액을 사용하여 추가의 2개 컬럼 부피의 단계 용출을 적용하였다.
수거된 분획들의 pH를 1/40(v/v)의 2 M 트리스 pH 8.0을 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축하고 여과한 다음, pH 7.4의 2 mM MOPS, 150 mM 염화나트륨, 0.02%(v/v) 나트륨 아지드 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
표 44는 단량체성 인간 및 사이노몰구스 CD19 항원 Fc(kih) 융합 단백질의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
단량체성 인간 및 사이노몰구스 CD19 항원 Fc(kih) 융합 단백질의 생화학적 분석
구조물 단량체 [%]
(SEC)		 수율
[mg/l]
단량체 인간 CD19 Fc(kih) 융합 단백질 91 0.2
단량체 사이노몰구스 CD19 Fc(kih) 융합 단백질 95 3.56
정제된 항원의 일부를 BirA 비오틴-단백질 리가제 표준 반응 키트(아비디티(Avidity), 카탈로그 번호 BirA500)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 시험관내에서 비오티닐화시켰다. 인간 CD19-함유 융합물의 경우 비오티닐화 정도는 94%이었고, 각각의 사이노몰구스 CD19 구조물의 경우에는 100%이었다. 이어서, 비오티닐화된 단백질을 탈아미드화 다발점 N27d 및 N28이 없는 친화도-증진된 8B8-유래 클론의 선택, 스크리닝 및 특성화에 사용하였다.7.1.2 항-CD19 클론 8B8-018의 제작
7.1.2.1 마우스 항-인간 CD19 항체(하이브리도마)의 면역화 및 제작
Balb/c 마우스를 CD19-형질감염된 HEK293 세포(세포 당 평균 수용체 밀도 35,000)로 6회 면역화시키고 추가접종하였다. 인간 CD19-형질감염된 NIH-3T3 세포 상에서의 CD19-세포-ELISA로 혈청 샘플을 검사하여 면역 반응을 모니터링하였다. 항-인간 CD19 항체의 충분한 역가를 갖는 마우스로부터의 비장 세포를 마우스 골수종 세포주 P3X63 Ag8.653과 융합시켜 불멸화에 사용하였다. 3개의 융합을 수행하고, 인간 CD19-형질감염된 NIH-3T3 세포 상에서의 세포-ELISA, 및 항-인간 CD19 특이적 항체에 대한 다우디(Daudi)(CD19+) 및 CD19- 세포를 이용한 FACS 결합 분석에 의해 하이브리도마 상등액을 스크리닝하였다(WO 2011/147834 호의 실시예 1 참조).
7.1.2.2 항-CD19 항체의 하이브리도마 스크리닝 및 세포 생물학적 기능 평가
인간 CD19에 대한 항체를 스크리닝하기 위한 세포-ELISA
하이브리도마의 스크리닝을 위해서 및 인간-CD19에 대한 항체를 분비하는 상기 하이브리도마들을 확인하기 위해 세포 ELISA를 적용하였다. 인간-CD19로 형질감염된 NIH3T3 세포를 양성 세포로 사용하였고; 비-형질감염된 NIH3T3 세포를 음성 대조군 세포로 사용하였다. 양성 하이브리도마의 평가를 위해, 형질감염 및 비-형질감염 NIH3T3 세포 사이의 OD 비를 정량화하였다.
- 배양 배지: DMEM 고 글루코스(4.5 mg/mL), 10% FCS, Na-피루베이트, NEAA, 글루타민
- 항체 양성 대조군: 항 CD19 단일클론 항체(IgG1) 파밍겐 카탈로그 번호 555409 c = 1 mg/mL
- 검출 항체: 염소 항-마우스 IgG(H+L) HRP 접합체 바이오-래드 카탈로그 번호 170-06516
- 희석물 1: 1x ELISA 차단 시약 중 2000
- 다른 시약: 피브로넥틴 로슈 카탈로그 번호 838039 c = 1 mg/mL
- 글루타르알데하이드: 25% 저장용액//그레이드 아가 사이언티픽(Grade Agar Scientific) #R102 최종 농도: PBS 중 0.05%
- ELISA 차단 시약: 10x 저장용액//로슈 카탈로그 번호 1112589
- TMB 기질: 로슈 카탈로그 번호 11432559
- 정지 용액: 1 M H2SO4
- 바이오래드 카탈로그 번호 170-6516 희석물 1: 1x ELISA 차단 시약 중 2000
제 1 일:
- 피브로넥틴 코팅: PBS 중 5 ㎍/cm2; 96 웰 플레이트 = 32 cm2; 6 ml 중 160 ㎍/플레이트
- PBS, 50 ㎕/웰
- RT에서 45 분 배양, 코팅 용액 흡인
- 96 웰 플레이트에서 50 ㎕ 배양 배지중 1.25 x 104 세포/웰 접종
- 37℃에서 40 시간 배양
- 플레이트의 위 절반에 첨가: CD19를 발현하는 NIH3T3 세포
- 플레이트의 아래 절반에 첨가: 비-형질감염된 NIH3T3 세포
제 3 일:
- 50 ㎕ 배양 배지 중 양성 대조군 항체 또는 샘플(상등액 또는 마우스 혈청)의 첨가
- 4℃에서 2 시간 배양
- 배지 제거, 100 ㎕ 글루타르알데하이드(PBS 중 0.05%)로 세포 고정
- 200 ㎕ PBS로 2회 세척
- 검출 항체 1:2000, 50 ㎕/웰 첨가
- RT에서 2 시간 배양
- 200 ㎕ PBS로 3회 세척
- 50 ㎕ TMB 첨가, RT에서 30 분 배양
- 25 ㎕ 1 M H2SO4 첨가하여 중단; 450 nm/620 nm에서의 여기 판독
- 결과 산출: NIH3T3 CD19 OD : 비-형질감염된 NIH3T3 OD 비
선택된 항체는 비형질감염된 NIH3T3 세포에 비해 CD19 형질감염된 NIH3T3 세포에 특이적 결합을 나타내었다(WO 2011/147834 호의 실시예 2 참조).
7.1.2.3 항-CD19 항체의 인간화
인체가 외래물질로 인식할 서열 신장부로부터 야기되는 잠재적인 면역원성 문제를 배제시키기 위해 뮤린 항체의 CD19 결합 특이성을 인간 수용체 프레임워크 상으로 전이시켰다. 이것은 뮤린(공여체) 항체의 전체 상보성 결정 영역(CDR)을 인간(수용체) 항체 프레임워크 상에 융합시킴으로써 수행되었으며, CDR-그라프팅 또는 항체 인간화로 불린다.
뮤린 아미노산 서열을 인간 생식-계열 항체 V 유전자들의 집합체에 맞추어 정렬시키고, 서열 동일성 및 상동성에 따라 분류하였다. 1개의 특정한 수용체 서열을 선택하기 전에, 공여체 항체의 소위 표준 루프 구조가 결정되어야 한다[Morea, V., et al., Methods, Vol 20, Issue 3 (2000) 267-279]. 상기 표준 루프 구조는 소위 표준 위치에 존재하는 잔기들의 유형에 의해 결정된다. 상기 위치들은 (부분적으로) CDR 영역들의 밖에 존재하고, 모(공여체) 항체의 CDR 입체형태를 유지하기 위해 최종 구조물에서 기능적으로 동등하게 유지되어야 한다. 인간 생식-계열 서열 VBASE_VH1_1이 중쇄를 위한 수용체로 선택되었고 서열 VBASE_VK2_5가 경쇄를 위해 선택되었다.
7.1.2.4 탈아미드화 다발점의 제거
야생형 인간화 항-인간 CD19 항체는 HVR-L1에 3개의 탈아미드화 다발점: N S N G N T(서열번호 190)를 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, HVR-H2에는 추가의 탈아미드화 다발점: KF N G(서열번호 191)가 존재하는 것으로 밝혀졌다. HVR-H2에서 탈아미드화 다발점을 처리하기 위해, 위치 64(카바트에 따른 번호)에 N(Asn)의 Q(Gln)로의 점 돌연변이를 도입하였다. 따라서, 본원에 보고된 바와 같은 항체는 아미노산 서열 TEKFQGRVTM(서열번호 192)을 포함하는 HVR-H2를 갖는다.
경쇄중 탈아미드화 다발점을 처리하고 개선된 탈아미드화 안정성을 갖는 인간화 항-인간 CD19 항체를 수득하기 위해, 카바트 위치 27d, 27e, 28 및 29에 개별적 돌연변이 및 위치 27e 및 28(카바트에 따른 번호)에 이중 돌연변이를 도입하였다. 통틀어서 야생형 인간화 항체(var.0)의 9개 변이체(var.1 내지 var.9)가 생성되었다(표 45 참조).
카바트에 따른 위치 27e에서 S(세린)으로부터 P(프롤린)으로의 단일 돌연변이에 의해 HVR-L1에서의 모든 탈아미드화 다발점이 처리될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이것은 탈아미드화 프론 N(아스파라긴) 잔기가 아니라 인접 잔기의 돌연변이이다.
따라서, 본원에 보고된 바와 같은 항체는 아미노산 서열 LENPNGNT(서열번호 193)를 포함하는 HVR-L1을 갖는다. 한 실시양태에서, 인간화 항-인간 CD19 항체는 아미노산 서열 LENPSGNT(서열번호 194)를 갖는 HVR-L1을 포함한다.
따라서, 상기 항체들은 하기 표 46에 나타낸 바와 같이 사이노몰구스 CD19에 대한 교차반응성을 유지한다.
EC50 [㎍/ml] var.0 var.5 var.9
huCD19 ECD 0.087 0.084 0.089
cyCD19 ECD 0.313 0.255 0.435
야생형 인간화 항-인간 CD19 항체(var.0)는 정제후 약 7.5% 탈아미드화를 나타내었다. pH 7.4에서 2 주동안 저장후 탈아미드화 항체의 양은 약 18.5%로 증가되었다. S27eP 돌연변이를 갖는 변이체 항체(var.5)는 정제후 약 2% 탈아미드화 및 2% 숙신이미드 생성을 나타내었다. pH 7.4에서 2 주동안 저장시 약 7.5% 탈아미드화 항체만이 존재하였다. var.5는 클론 8B8-018로 명명하였고 CD19-표적화 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 제조를 위해 선택되었다.7.1.3 하전된 잔기들과 함께 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 3.1)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 29A에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 29B에 기술된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH.
인간 CL 도메인에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 놉(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임 내에 서브클로닝하였다. 정확한 쌍형성을 개선하기 위해, 교차된 CH-CL에 하기의 돌연변이들을 도입하였다. 인간 CL에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드에 E123R 및 Q124K. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에, K147E 및 K213E.
CD19, 클론 8B8-018에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-CD19-Fc 홀쇄 및 항-CD19 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 CD19 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 30, 구조물 3.1).
표 47은 교차된 CH-CL 및 하전된 잔기를 갖는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
7.1.4 하전된 잔기 없이 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 3.2)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를, CL 도메인에 아미노산 돌연변이가 없는 것을 제외하고 도 29A에 도시된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합된 폴리펩티드를, CH1 도메인에 아미노산 돌연변이가 없는 것을 제외하고 도 29B에 도시된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH1.
CD19, 클론 8B8-018에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-CD19-Fc 홀쇄 및 항-CD19 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 CD19-결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 30, 구조물 3.2).
표 48은 하전된 잔기들 없이 교차된 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
하전된 잔기 없이 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물(구조물 3.2)의 cDNA 및 아미노산 서열
서열번호 설명 서열
165 뉴클레오티드 서열 이량체 리간드(71-254)- CL Fc 놉쇄 표 22 참조
166 뉴클레오티드 서열 단량체 hu 4-1BBL (71-254) - CH1 표 22 참조
203 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-018) Fc 홀쇄 표 47 참조
204 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-018) 경쇄 표 47 참조
117 이량체 리간드(71-254) - CL Fc 놉쇄 표 22 참조
118 단량체 리간드(71-254) -CH1 표 22 참조
205 항-CD19(8B8-018) Fc 홀쇄 표 47 참조
206 항-CD19(8B8-018) 경쇄 표 47 참조
7.1.5 2가 CD19(8B8-018) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합분자의 제조(구조물 3.3)(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 29C에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 홀쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 홀, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 29D에 기술된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 놉쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 놉, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드.
CD19, 클론 8B8-018에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄, 놉, 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다. Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 항-CD19 huIgG1 홀 이량체성 리간드 쇄, S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항-CD19 huIgG1 놉 단량체성 리간드 쇄, 및 항-CD19 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 2개의 CD19 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 30, 구조물 3.3).
표 49는 2가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 3.3)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
7.1.6 하전된 잔기들과 함께 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 3.4)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 29A에 도시된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-248)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 29B에 기술된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH.
인간 CL 도메인에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 놉(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임 내에 서브클로닝하였다. 정확한 쌍형성을 개선하기 위해, 교차된 CH-CL에 하기의 돌연변이들을 도입하였다. 인간 CL에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드에 E123R 및 Q124K. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에, K147E 및 K213E.
CD19, 클론 8B8-018에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-CD19-Fc 홀쇄 및 항-CD19 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 CD19 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 30, 구조물 3.4).
표 50은 교차된 CH-CL 및 하전된 잔기를 갖는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 3.4)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
하전된 잔기들과 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물(구조물 3.4)의 cDNA 및 아미노산 서열. * 하전된 잔기들
서열번호 설명 서열
169 뉴클레오티드 서열 이량체 리간드(71-248) - CL* Fc 놉쇄 표 24 참조
170 뉴클레오티드 서열 단량체 hu 4-1BBL (71-248) - CH1* 표 24 참조
203 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-018) Fc 홀쇄 표 47 참조
204 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-018) 경쇄 표 47 참조
119 이량체 리간드(71-248) - CL* Fc 놉쇄 표 24 참조
120 단량체 리간드(71-248)-CH1* 표 24 참조
205 항-CD19(8B8-018) Fc 홀쇄 표 47 참조
206 항-CD19(8B8-018) 경쇄 표 47 참조
7.1.7 하전된 잔기 없이 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 3.5)(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를, CL 도메인에 아미노산 돌연변이가 없는 것을 제외하고 29A에 도시된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-248)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합된 폴리펩티드를, CH1 도메인에 아미노산 돌연변이가 없는 것을 제외하고 도 29B에 도시된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH1.
CD19, 클론 8B8-018에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-CD19-Fc 홀쇄 및 항-CD19 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 CD19-결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 30, 구조물 3.5).
표 51은 하전된 잔기들 없이 교차된 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 3.5)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
하전된 잔기 없이 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물(구조물 3.5)의 cDNA 및 아미노산 서열
서열번호 설명 서열
171 뉴클레오티드 서열 이량체 리간드(71-248) - CL Fc 놉쇄 표 25 참조
172 뉴클레오티드 서열 단량체 리간드(71-248) - CH1 표 25 참조
203 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-018) Fc 홀쇄 표 47 참조
204 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-018) 경쇄 표 47 참조
173 이량체 리간드(71-248) - CL Fc 놉쇄 표 25 참조
174 단량체 리간드(71-248)-CH1 표 25 참조
205 항-CD19(8B8-018) Fc 홀쇄 표 47 참조
206 항-CD19(8B8-018) 경쇄 표 47 참조
7.1.8 2가 CD19(8B8-018) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합분자의 제조(구조물 3.6)(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 29C에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 홀쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 홀, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 29D에 기술된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 놉쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 놉, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드.
CD19, 클론 8B8-018에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄, 놉, 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다. Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 항-CD19 huIgG1 홀 이량체성 리간드 쇄, S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항-CD19 huIgG1 놉 단량체성 리간드 쇄, 및 항-CD19 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 2개의 CD19 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 30, 구조물 3.6).
표 52는 2가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 3.6)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
7.2 CD19 (8B8-유래 친화도 증진된) 표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자 및 상응하는 대조군 분자들의 제조
7.2.1 다발점이 없는 8B8-유래 친화도 증진된 항-CD19 결합자의 생성
7.2.1.1 친화도 증진된 CD19-특이적 항체의 선별
인간화 클론 8B8의 경쇄의 CDR1에 위치한, 위치 27d 및 28에서의 아스파라긴 잔기의 탈아미드화는 생물 활성에 상당한 감소를 야기한다. 그러므로, a) 위치 27d 및 28의 아스파라긴 잔기 둘 다가 제거되고 b) 개선된 친화도를 갖는 8B8 변이체를 선별하기 위해 중쇄 및 경쇄의 추가의 CDR이 무작위선정된 2개의 파지 디스플레이 라이브러리를 제작하였다.
7.2.1.2 LCDR1 다발점이 없는 8B8 친화도 증진 라이브러리의 제작
LCDR1에 위치한 탈아미드화 부위 N27d 및 N28이 없는 친화도-증진된 8B8-유래 항체의 생성을 표준 프로토콜(Silacci et al, 2005)을 이용하여 파지 디스플레이에 의해 수행하였다. 첫번째 단계로, 인간화 모 클론 8B8(서열번호 215 및 서열번호 216)의 VL 및 VH DNA 서열을 본 발명의 파지미드내에 클로닝하고, 이것을 무작위선정에 주형으로 사용하였다. 다음 단계로, 파지 디스플레이에 의해 유리한 클론의 선별을 위해 2개의 라이브러리를 제작하였다. 상기-언급한 다발점 위치를 제거하기 위해, 위치 27d 및 28에서 아미노산 S T Q E 만을 허용하는 LCDR1 무작위선정 프라이머(서열번호 217)를 두 라이브러리 모두에 사용하였다. 친화도증진 라이브러리 1은 경쇄 및 중쇄 둘 다의 CDR1 및 2에서 무작위선정된 반면, 친화도증진 라이브러리 2는 경쇄의 CDR1 및 3 및 중쇄의 CDR3에서 무작위선정되었다. 각각의 CDR 영역들에서 무작위선정된 위치는 도 31A에 나타내었다. 경쇄 및 중쇄 둘 다의 CDR1 및 2에서 무작위선정된 친화도증진 라이브러리 1의 제작을 위해, 3개의 단편을 "중복 연장 스플라이싱(splicing by overlapping extension)"(SOE) PCR에 의해 조립하고, 파지 벡터내에 클로닝하였다(도 31B). 하기의 프라이머 조합들을 이용하여 라이브러리 단편들을 제작하였다: 단편 1(LMB3 (서열번호 222) 및 CD19 L1 역방향 랜덤프라이머(서열번호 217), 단편 2(CD19 L2 정방향 랜덤프라이머(서열번호 218) 및 CD19 H1 역방향 랜덤프라이머(서열번호 219), 및 단편 3(CD19 H2 정방향 랜덤프라이머(서열번호 220) 및 CD19 H3 역방향 고정프라이머(서열번호 221)(표 53). 충분한 양의 전장 무작위선정된 단편의 조립후에, 이것을 동등하게 처리된 수용체 파지미드 벡터와 함께 NcoI/NheI로 절단하였다. 3배 몰 과량의 라이브러리 삽입물을 10 ㎍의 파지미드 벡터와 접합시켰다. 정제된 접합물을 20개 형질전환에 사용하여 2 x 10 exp9개의 형질전환체를 생성하였다. 8B8 친화도 증진 라이브러리를 나타내는 파지미드 입자를 취하고 선별에 사용되도록 PEG/NaCl 정제에 의해 정제하였다.
경쇄의 CDR1 및 3 및 중쇄의 CDR3에서 무작위선정된 두번째 라이브러리의 제작을 유사하게 수행하였다. 하기의 프라이머 조합들을 이용하여 라이브러리 단편들을 제작하였다: 단편 1(LMB3 (서열번호 222) 및 CD19 L1 역방향 랜덤프라이머(서열번호 217), 단편 2(CD19 L1 정방향 고정프라이머(서열번호 223) 및 CD19 L3 역방향 랜덤프라이머(서열번호 224), 및 단편 3(CD19 L3 정방향 고정프라이머(서열번호 225) 및 CD19 H3 역방향 랜덤프라이머(서열번호 226)(표 54). 충분한 양의 전장 무작위선정된 단편의 조립후에, 이것을 동등하게 처리된 수용체 파지미드 벡터와 함께 NcoI/KpnI로 절단하였다. 3배 몰 과량의 라이브러리 삽입물을 20 ㎍의 파지미드 벡터와 접합시켰다. 정제된 접합물을 40개 형질전환에 사용하여 2 x 10 exp9개의 형질전환체를 생성하였다. 8B8 친화도 증진 라이브러리를 나타내는 파지미드 입자를 취하고 선별에 사용되도록 PEG/NaCl 정제에 의해 정제하였다.
7.2.1.3 LCDR1 다발점 N27d 및 N28이 없는 친화도 증진된 8B8-유래 클론의 선별
LCDR1 다발점 N27d 및 N28이 없는 친화도-증진된 클론의 선별을 위해, 파지 디스플레이에 의한 두가지 선별 접근방법을 수행하였다:
첫번째 접근방법에서는, 두 파지 디스플레이 라이브러리를 둘 다 사용하여 인간 CD19-Fc 융합 단백질 상에서 선별을 수행하였다. 패닝(panning) 과정은 하기 패턴에 따라서 용액중에서 수행하였다:
1. 1 mL의 총부피에서 약 1012개 파지미드 입자의 30 nM 비오티닐화 CD19-Fc 단백질에 대한 결합,
2. 10 분동안 5.4 x 107개 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드의 첨가에 의해 비오티닐화 CD19-Fc 단백질 및 특이적으로 결합된 파지 입자의 포획,
3. 5x 1 mL PBS/트윈20 및 5x 1 mL PBS를 사용한 비드의 세척,
4. 10 분동안 1 mL의 100 mM TEA 첨가에 의한 파지 입자의 용출 및 500 ㎕ 1 M 트리스/HCl, pH 7.4의 첨가에 의한 중화,
5. 지수적으로 성장하는 에스케리키아 콜라이 TG1 세균의 재-감염, 및
6. 헬퍼파지 VCSM13에 의한 감염 및 후속 선별 과정에 사용될 파지미드 입자의 후속 PEG/NaCl 침전. 선별은 감소하는 항원 농도(30 x 10-9 M, 10 x 10-9 M, 및 3 x 10-9 M)를 이용하여 3회 과정에 걸쳐 수행하였다. 2회 및 3회 과정에서, 항원:파지 복합체의 포획은 스트렙타비딘 비드 대신에 뉴트라비딘 플레이트를 사용하여 수행하였다. 뉴트라비딘 플레이트는 5x PBS/트윈20 및 5x PBS로 세척하였다. 3회 과정에서, 파지를 플레이트로부터 용출시키기 전에 "오프-속도(off-rate)" 선별을 위해 뉴트라비딘 플레이트를 2 L PBS 중에서 밤새 배양하였다. 또한, 교차-반응성 결합자를 증식시키기 위해 2회 과정에서 사이노몰구스 CD19-Fc 단백질을 사용하였다.
두번째 선별 접근방법에서는, 세포 표면상에서 인간 또는 사이노몰구스 CD19 ECD를 일시적으로 발현하는 세포 상에서 파지 패닝을 수행하였다. HEK 세포의 일시적 형질감염을 위해, 하기의 단백질 절편들에 대한 DNA 서열(5'로부터 3'로)을 갖는 발현 플라스미드를 생성하였다: Flag 태그, SNAP 태그, 인간 또는 사이노몰구스 기원을 갖는 CD19 ECD, 및 혈소판-유래 성장 인자 수용체(PDGFR)의 막관통 영역(서열번호 227 및 228). 세포 표면 상에서 각각의 단백질(서열번호 229 및 230)의 발현은 검출을 위해 항-Flag 항체를 사용하여 유동세포분석에 의해 확인하였다. 두 라이브러리 모두 첫번째 선별 과정에서 인간 또는 사이노몰구스 CD19 ECD-함유 단백질 융합물을 발현하는 세포에 노출되었다. 후속 패닝 과정동안, CD19 ECD의 종들이 그에 따라 교차되었다. 무관한 막 단백질로 일시적으로 형질감염된 세포를 전처리(pre-clearing)에 사용하였다.
패닝 과정은 하기 패턴에 따라서 수행하였다.
1. 전술한 표준 절차에 따라서 CD19 ECD 또는 무관한 막관통 단백질을 발현하는 구조물로 HEK 세포의 형질감염,
2. 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 총 48 시간동안 세포의 배양, 3. 원심분리(250xg에서 3 분)에 의한 세포의 단리, 및 PBS/5% BSA 중에 1 x 10E7 CD19 ECD-양성 세포 및 1 x 10E7 음성 세포 각각의 재현탁,
3. 약하게 회전하는 튜브 회전기를 사용하여 4℃에서 60 분동안 1 x 107 CD19-음성 세포와 함께 파지 라이브러리를 배양함으로써 비특이적 파지의 전처리,
4. 250xg에서 3 분동안 세포의 원심분리, 및 새 튜브로 상등액의 옮김 및 1 x 10E7 CD19-양성 세포의 첨가 및 튜브 회전기 상에서 약하게 회전시킴으로써 4℃에서 60 분동안 배양,
5. 250xg에서 1 분동안 원심분리에 의한 세포의 세척, 상등액의 흡인, 및 1 mL PBS 중에 재현탁(8 회),
6. 1 mL 100 mM TEA를 사용한 파지 용출, RT에서 5 분동안 배양, 및 500 ㎕ 1 M 트리스-HCl, pH 7.6을 사용한 용출액의 중화,
7. 지수적으로 성장하는 에스케리키아 콜라이 TG1 세균의 재-감염, 및
8. 헬퍼파지 VCSM13에 의한 감염 및 후속 선별 과정에 사용될 파지미드 입자의 후속 PEG/NaCl 침전. 선별은 3회 과정에 걸쳐 수행하였다.
두 선별 접근방법 모두에서, 특이적 결합자는 ELISA에 의해 다음과 같이 확인하였다: 웰 당 100 ㎕의 30 nM 비오티닐화 CD19-Fc 단백질을 뉴트라비딘 플레이트 상에 코팅하였다. Fab-함유 세균 상등액을 첨가하고, 결합 Fab를 항-Flag/HRP 2차 항체를 사용하여 그의 Flag-태그에 의해 검출하였다.
재조합 인간 CD19 상에서 ELISA-양성인 클론들을, 인간 CD19 ECD-함유 발현 플라스미드(서열번호 227)로 일시적으로 형질감염된 세포들을 사용하여 세포-기반 ELISA에서 추가로 검사하였다. 상기 분석은 다음과 같이 수행하였다: 형질감염 48 시간후에, HEK 세포를 수거하고 250xg에서 5 분동안 원심분리하였다. 이어서, 세포를 빙냉 PBS BSA 2% 중에 4 x 106 세포/mL로 재현탁하고, 얼음위에서 20 분동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 100 ㎕ 중 4 x 105 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 분배하고 250xg 및 4℃에서 3 분동안 원심분리하였다. 상등액을 흡인하고 가용성 Fab 단편을 함유하는 50 ㎕ 세균 상등액을 50 ㎕ 빙냉 PBS/BSA 2%로 희석하고, 플레이트에 첨가하고, 세포들과 혼합하고, 4℃에서 1 시간동안 배양하였다. 그 후에, 세포를 빙냉 PBS로 3회 세척한 다음, 항-Fab-HRP 항체의 1:2000 희석물을 함유하는 웰 당 100 ㎕ PBS BSA 2%를 첨가하였다. 1 시간의 배양 시간 후에, 세포를 빙냉 PBS로 3회 다시 세척하였다. 발생을 위해, 100 ㎕ "1-단계 울트라 TMB-ELISA" 기질을 웰 당 첨가하였다. 10 분의 배양 시간 후에, 상등액을 웰 당 40 ㎕ H2SO4 1 M을 함유하는 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배경위로 유의적 신호를 나타내는 클론을 프로테온(ProteOn) XPR36을 사용하여 SPR-분석에 의해 동적 스크리닝 실험에 적용하였다.
7.2.1.4 SPR에 의한 친화도-증진된 8B8-유래 변이체의 확인
ELISA-양성 클론들을 더 특성화하기 위해, 오프-속도를 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하고 모 인간화 클론 8B8과 비교하였다.
본 실험을 위해, 7000 RU의 다중클론 항-인간 Fab 항체를 아민 커플링(Na아세테이트, pH4.5, 25 ㎕/분, 240 초)에 의해 CLM 칩의 6개 채널 모두 위에 고정화시켰다(수직 배향). 각각의 항체-함유 세균 상등액을 여과시키고, PBS로 2배 희석한 다음, 25 ㎕/분에서 360 초동안 주입하여 수직 배향으로 100 내지 400 반응 단위(RU)의 고정화 수준을 달성하였다. 단량체성 CD19-Fc의 주입: 원-샷(one-shot) 동역학 측정을 위해, 주입 방향을 수평 배향으로 바꾸고, 정제된 단량체성 CD19-Fc의 3배 연속 희석물(150 내지 6 nM의 달라지는 농도 범위)을 50 ㎕/분에서 별개의 채널 1 내지 4를 따라서, 180 초의 결합 시간 및 300 초의 해리 시간하에 동시에 주입하였다. 인간 IgG Fc 단편(150 nM)을 단량체성 CD19-Fc에 대한 특이적 결합에 대한 음성 대조군으로서 채널 5에서 주입하였다. 완충액(PBST)을 6번째 채널을 따라 주입하여 참조를 위한 "인-라인" 블랭크를 제공하였다. 90 ㎕/분에서 30 초동안 10 mM 글리신 pH 1.5 및 50 mM NaOH의 2개 펄스에 의해 재생을 수행하였다(수평 배향). 센서그램들을 동시에 적합화시킴으로써 프로테온 매니저 v3.1 소프트웨어에서 단순한 1-대-1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 해리 속도 상수((koff)를 산출하였다. 가장 느린 해리 속도 상수를 갖는 Fab를 발현하는 클론들을 확인하였다(표 55). 중요하게, 클론 5A07 및 5B08의 해리 속도 상수는 부적절한 적합화로 인해 측정할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 두 클론 모두 수득된 결과가 매우 느린 해리를 시사하였기 때문에 선택하였다. 상응하는 파지미드들의 가변 도메인들을 서열분석하였다. 중요하게, LCDR1에서 2개 아스파라긴 잔기(위치 27d 및 28) 모두 세린 또는 트레오닌으로 치환되어, 2개 탈아미드화 부위 모두 제거되었음을 나타내었다. 정렬은 도 32에 나타내었다. 가장 우수한 클론들의 CDR을 표 56(경쇄의 가변 영역들) 및 표 57(중쇄의 가변 영역들)에 나열하였다: 클론 5H09: (서열번호 231-236); 클론 7H07: (서열번호 237-242); 클론 2B03: (서열번호 243-248); 클론 2B11: (서열번호 249-254); 클론 5A07: (서열번호 255-260); 클론 5B08: (서열번호 261-266); 클론 5D08: (서열번호 267-272).
세균 상등액을 사용한 스크리닝 분석에서 수득된 선별된 클론들의 해리 상수
클론 해리 상수 kd (1/s)
모 8B8 3.01E-4
5H09 2.58E-4
7H07 5.75E-5
2B03 3.24E-5
2B11 4.37E-6
5A07 n.d.
5B08 n.d.
5D08 1.95E-4
선별된 8B8 경쇄들의 CDR 서열
클론 서열번호 CDR-L1 서열번호 CDR-L2 서열번호 CDR-L3
5H09 231 KSSQSLESSTGNTYLN 232 RVSKRFS 233 LQLIDYPVT
7H07 237 KSSQSLETSTGNTYLN 238 RVSKRFS 239 LQATHIPYT
2B03 243 KSSQSLETSTGNTYLN 244 RVSKRFS 245 LQLTHVPYT
2B11 249 KSSQSLETSTGTTYLN 250 RVSKRFS 251 LQLLEDPYT
5A07 255 KSSQSLETSTGNTYLN 256 RVSKRFS 257 LQPGHYPGT
5B08 261 KSSQSLETSTGNTYLN 262 RVSKRFS 263 LQLDSYPNT
5D08 267 KSSQSLETSTGNTYLN 268 RVSKRFS 269 LQLTHEPYT
선별된 8B8 중쇄들의 CDR 서열
클론 서열번호 CDR-H1 서열번호 CDR-H2 서열번호 CDR-H3
5H09 234 DYIMH 235 YINPYNDGSKYTEKFQG 236 GTYYYGSALFDY
7H07 240 DYIMH 241 YINPYNDGSKYTEKFQG 242 GTYYYGSELFDY
2B03 246 DYITH 247 YINPYNDGSKYTEKFQG 248 GTYYYGPDLFDY
2B11 252 DYIMH 253 YINPYNDGSKYTEKFQG 254 GTYYYGPQLFDY
5A07 258 DYIMH 259 YINPYNDGSKYTEKFQG 260 GTYYYGSALFDY
5B08 264 DYIMH 265 YINPYNDGSKYTEKFQG 266 GTYYYGPQLFDY
5D08 270 DYIMH 271 YINPYNDGSKYTEKFQG 272 GTYYYGSELFDY
7.2.2 친화도-증진된 8B8-유래 항체의 특성화7.2.2.1 발현 벡터내에 가변 항체 도메인의 클로닝
선별된 항-CD19 결합자들의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역들을 인간 IgG1의 불변 중쇄 또는 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. 국제 특허 출원 공개 WO 2012/130831 A1 호에 기술된 방법에 따라서 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시키기 위해, 중쇄에 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 도입하였다.
항-CD19 IgG의 cDNA 및 아미노산 서열을 표 58 및 표 59에 각각 나타내었다. 모든 항체-암호화 서열을, 키메라 MPSV 프로모터를 사용한 삽입물의 전사를 유도하고 CDS의 3' 말단에 위치한 합성 폴리A 신호 서열을 함유하는 발현 벡터 내에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
7.2.2.2 SPR에 의한 선별 항체들의 친화도 측정
SPR에 의한 친화도의 정확한 측정을 위해, HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜, 선별된 항-CD19 항체를 생성하였다. 상기 세포를 표준 절차에 따라서 1:1 비("벡터 중쇄":"벡터 경쇄")로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 7일후에, 상등액중의 항체 역가를 측정하고 모든 역가를 10 ㎍/mL로 평형화시켰다.
모 항체 8B8 뿐 아니라 그 유도체의 친화도(KD)는 25℃에서 프로테온 XPR36 기기(바이오래드)를 사용하여 SPR로 측정하였다. 7000 RU의 다중클론 항-인간 Fab 항체를 아민 커플링(Na아세테이트 pH4.5, 25 ㎕/분, 240 초)에 의해 GLM 칩의 6개 채널 모두 위에 고정화시켰다(수직 배향). 각각의 항체-함유 HEK 상등액을 여과시키고, PBST(10 mM 포스페이트, 150 mM 염화나트륨 pH 7.4, 0.005% 트윈20)로 10 ㎍/mL의 농도로 희석한 다음, 25 ㎕/분에서 360 초동안 주입하여 수직 배향으로 500 내지 800 반응단위(RU)의 고정화 수준을 달성하였다. 단량체성 CD19-Fc의 주입: 원-샷 동역학 측정을 위해, 주입 방향을 수평 배향으로 바꾸고, 정제된 단량체성 CD19-Fc의 3배 연속 희석물(150 내지 6 nM의 달라지는 농도 범위)을 50 ㎕/분에서 별개의 채널 1 내지 4를 따라서, 180 초의 결합 시간 및 300 초의 해리 시간하에 동시에 주입하였다. 인간 IgG Fc 단편(150 nM)을 단량체성 CD19-Fc에 대한 특이적 결합에 대한 음성 대조군으로서 채널 5에서 주입하였다. 완충액(PBST)을 6번째 채널을 따라 주입하여 참조를 위한 "인-라인" 블랭크를 제공하였다. 각각의 센서그램들의 개요를 도 33에 나타내었다. 90 ㎕/분에서 30 초동안 10 mM 글리신 pH 1.5 및 50 mM NaOH의 2개 펄스에 의해 재생을 수행하였다(수직 배향). 결합 및 해리 센서그램들을 동시에 적합화시킴으로써 프로테온 매니저 v3.1 소프트웨어에서 단순한 1-대-1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 결합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수((koff)를 산출하였다. 평형 해리 상수(KD)는 비 kon/koff로서 산출하였다. 동적 및 열역학 데이터의 요약은 표 60에 나타내었다. 모든 친화도-증진된 클론들의 해리 상수는 그의 모 클론 8B8에 비해 개선되었다.
항-CD19 huIgG1 및 인간 CD19 사이의 상호작용에 대한 동적 및 열역학적 데이터 요약
클론 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
모 8B8 5.66E+4 1.34E-4 2.36E-9
5H09 7.91E+4 1.50E-5 1.89E-10
7H07 7.45E+4 5.57E-5 7.47E-10
2B03 6.02E+4 5.00E-5 8.31E-10
2B11 6.34E+4 3.14E-5 4.95E-10
5A07 6.98E+4 3.07E-5 4.40E-10
5B08 6.81E+4 5.26E-5 7.72E-10
5D08 8.88E+4 8.44E-5 9.51E-10
7.2.2.3 항-CD19 IgG1 P329G LALA의 제조 및 정제HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜, 선별된 항-CD19 항체를 생성하였다. 상기 세포를 1:1 비("벡터 중쇄":"벡터 경쇄")로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
500 mL 진탕 플라스크에서의 생성을 위해, 40억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간전에 접종하였다. 형질감염 전에, 세포를 210 x g에서 10 분동안 원심분리하고, 상등액을 예열된 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터(200 ㎍의 전체 DNA)를 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15 초동안 볼텍싱하고 실온에서 10 분간 배양하였다. 그후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3 시간동안 배양하였다. 배양 후에, 160 mL의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간동안 배양하였다. 형질감염 1 일후에 보충물들과 함께 1 mM 발프로산 및 7% 피드를 첨가하였다. 7 일동안 배양한 후에, 상등액을 210 x g에서 15 분동안 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
항원 Fc 융합물의 정제에 대해 전술한 바와 같이 단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 항체 분자의 정제를 수행하였다. 단백질을 농축하고 여과시킨 후, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 OD를 측정함으로써 정제된 항체들의 단백질 농도를 측정하였다. 항체들의 순도 및 분자량은, 환원제(인비트로겐, USA)의 존재 및 부재하에서 랩칩GXII(캘리퍼)를 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다. 항체 샘플의 응집물 함량은, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다(표 61).
항-CD19 P329G LALA IgG1 클론의 생화학적 분석
클론 수율
[mg/l]		 단량체
[%]		 CE-SDS
(비환원)
모 8B8 25.3 100 99.1
2B11 35.4 100 98.4
7H07 89.8 100 99.4
2B03 182 100 100
5A07 90.2 100 99.4
5D08 90.2 100 99.3
5B08 24.1 99.6 100
5H09 29.9 100 98.1
이중특이성 구조물의 제조를 위해, 클론 2B11이 3개의 탈아미드화 다발점이 결어되어 있어서 상기 클론을 선택하였다.인간 4-1BB 리간드의 엑토도메인(아미노산 71-254 및 71-248)의 일부분을 암호화하는 DNA 서열을 유니프롯 데이터베이스의 P41273 서열에 따라 합성하였다.
7.2.3 하전된 잔기들과 함께 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CD19(8B8-2B11) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 4.1)
CD19, 클론 8B8-2B11에 대해 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 사용하는 것을 제외하고 구조물 3.1(도 30)에 대해 기술된 바와 같이 구조물 4.1을 제조하였다.
표 62는 교차된 CH-CL 및 하전된 잔기들을 갖는 1가 CD19(8B8-2B11) 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 4.1)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
7.2.4 하전된 잔기없이 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CD19(8B8-2B11) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 4.2)
CD19, 클론 8B8-2B11에 대해 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 사용하는 것을 제외하고 구조물 3.2(도 30)에 대해 기술된 바와 같이 구조물 4.2를 제조하였다.
표 63은 하전된 잔기없이 교차된 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-2B11) 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 4.2)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
하전된 잔기없이 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-2B11) 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물(구조물 4.2)의 cDNA 및 아미노산 서열
서열번호 설명 서열
165 뉴클레오티드 서열 이량체 리간드(71-254)- CL Fc 놉쇄 표 22 참조
166 뉴클레오티드 서열 단량체 hu 4-1BBL (71-254) - CH1 표 22 참조
305 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-2B11) Fc 홀쇄 표 62 참조
277 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-2B11) 경쇄 표 59 참조
117 이량체 리간드(71-254) - CL Fc 놉쇄 표 22 참조
118 단량체 리간드(71-254) -CH1 표 22 참조
306 항-CD19(8B8-2B11) Fc 홀쇄 표 62 참조
279 항-CD19(8B8-018) 경쇄 표 59 참조
7.2.5 2가 CD19(8B8-2B11) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합분자의 제조(구조물 4.3)CD19, 클론 8B8-2B11에 대해 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 사용하는 것을 제외하고 구조물 3.3(도 30)에 대해 기술된 바와 같이 구조물 4.3을 제조하였다.
표 64는 2가 CD19(8B8-2B11) 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 4.3)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
7.2.6 하전된 잔기들과 함께 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CD19(8B8-2B11) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 4.4)
CD19, 클론 8B8-2B11에 대해 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 사용하는 것을 제외하고 구조물 3.4(도 30)에 대해 기술된 바와 같이 구조물 4.4를 제조하였다.
표 65는 교차된 CH-CL 및 하전된 잔기들을 갖는 1가 CD19(8B8-2B11) 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 4.4)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
하전된 잔기들과 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-2B11) 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물(구조물 4.4)의 cDNA 및 아미노산 서열. * 하전된 잔기
서열번호 설명 서열
169 뉴클레오티드 서열 이량체 리간드(71-248) - CL* Fc 놉쇄 표 24 참조
170 뉴클레오티드 서열 단량체 hu 4-1BBL (71-248) - CH1* 표 24 참조
305 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-2B11) Fc 홀쇄 표 62 참조
277 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-2B11) 경쇄 표 59 참조
119 이량체 리간드(71-248) - CL* Fc 놉쇄 표 24 참조
120 단량체 리간드(71-248)-CH1* 표 24 참조
306 항-CD19(8B8-2B11) Fc 홀쇄 표 62 참조
279 항-CD19(8B8-2B11) 경쇄 표 59 참조
7.2.7 하전된 잔기없이 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CD19(8B8-2B11) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 4.5)CD19, 클론 8B8-2B11에 대해 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 사용하는 것을 제외하고 구조물 3.5(도 30)에 대해 기술된 바와 같이 구조물 4.5를 제조하였다.
표 66은 하전된 잔기 없이 교차된 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-2B11) 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 4.5)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
하전된 잔기없이 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-2B11) 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물(구조물 4.5)의 cDNA 및 아미노산 서열
서열번호 설명 서열
171 뉴클레오티드 서열 이량체 리간드(71-248) - CL Fc 놉쇄 표 25 참조
172 뉴클레오티드 서열 단량체 리간드(71-248) - CH1 표 25 참조
305 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-2B11) Fc 홀쇄 표 62 참조
277 뉴클레오티드 서열 항-CD19(8B8-2B11) 경쇄 표 59 참조
173 이량체 리간드(71-248) - CL Fc 놉쇄 표 25 참조
174 단량체 리간드(71-248)-CH1 표 25 참조
306 항-CD19(8B8-2B11) Fc 홀쇄 표 62 참조
279 항-CD19(8B8-2B11) 경쇄 표 59 참조
7.2.8 2가 CD19(8B8-2B11) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합분자의 제조(구조물 4.6)CD19, 클론 8B8-2B11에 대해 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 사용하는 것을 제외하고 구조물 3.6(도 30)에 대해 기술된 바와 같이 구조물 4.6을 제조하였다.
표 67은 2가 CD19(8B8-2B11) 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 3.6)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
7.3 대조군 분자로서 비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합물 및 인간 IgG의 제조
7.3.1 비표적화 인간 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조(대조군 분자)
상기 대조군 분자들은, 항-CD19 결합자(VH-VL)가 항원에 결합하지 않는, DP47로 지칭된 생식계열 대조군으로 대체된 것만 다른 채로, CD19 표적화 구조물 3.1(대조군 B로 지칭), 3.3(대조군 C로 지칭), 3.4(대조군 D로 지칭) 및 3.5(대조군 E로 지칭)에 대해 전술한 바와 같이 제조하였다(도 30 참조).
표 68은 하전된 잔기와 함께 교차된 CH-CL을 함유하는 1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물, 대조군 B의 cDNA 및 아미노산 서열들을 각각 나타낸다.
표 69는 2가 DP47-비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물, 대조군 C의 cDNA 및 아미노산 서열들을 각각 나타낸다.
표 70은 하전된 잔기와 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물, 대조군 D의 cDNA 및 아미노산 서열들을 각각 나타낸다.
표 71은 CH-CL 교차도메인에 하전된 잔기를 갖지 않는 1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물, 대조군 E의 cDNA 및 아미노산 서열들을 각각 나타낸다.
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 1가 DP47 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물(대조군 B)의 cDNA 및 아미노산 서열. * 하전된 잔기
서열번호 설명 서열
96 뉴클레오티드 서열 이량체 hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc 놉쇄 표 3 참조
97 뉴클레오티드 서열 단량체 hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 표 3 참조
79 뉴클레오티드 서열 DP47 Fc 홀쇄 표 18 참조
80 뉴클레오티드 서열 DP47 경쇄 표 18 참조
98 이량체 hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc 놉쇄 표 3 참조
99 단량체 hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 표 3 참조
81 DP47 Fc 홀쇄 표 18 참조
82 DP47 경쇄 표 18 참조
2가 DP47 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물(대조군 C)의 cDNA 및 아미노산 서열
서열번호 설명 서열
177 이량체 hu 4-1BBL (71-254)에 융합된 뉴클레오티드 서열 DP47 Fc 홀쇄 표 27 참조
178 단량체 hu 4-1BBL (71-254)에 융합된 뉴클레오티드 서열 DP47 Fc 놉쇄 표 27 참조
80 뉴클레오티드 서열 DP47 경쇄 표 18 참조
179 이량체 hu 4-1BBL (71-254)에 융합된 DP47 Fc 홀쇄 표 27 참조
180 단량체 hu 4-1BBL (71-254)에 융합된 DP47 Fc 놉쇄 표 27 참조
82 DP47 경쇄 표 18 참조
CH-CL 교차 및 하전된 잔기를 갖는 1가 DP47 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물(대조군 D)의 cDNA 및 아미노산 서열. * 하전된 잔기
서열번호 설명 서열
169 뉴클레오티드 서열 이량체 hu 4-1BBL (71-248) - CL* Fc 놉쇄 표 24 참조
170 뉴클레오티드 서열 단량체 hu 4-1BBL (71-248) - CH1* 표 24 참조
79 뉴클레오티드 서열 DP47 Fc 홀쇄 표 18 참조
80 뉴클레오티드 서열 DP47 경쇄 표 18 참조
119 이량체 hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc 놉쇄 표 24 참조
120 단량체 hu 4-1BBL (71-254) - CH1* 표 24 참조
81 DP47 Fc 홀쇄 표 18 참조
82 DP47 경쇄 표 18 참조
CH-CL 교차를 가지고 하전된 잔기를 갖지 않는 1가 DP47 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물(대조군 E)의 cDNA 및 아미노산 서열
서열번호 설명 서열
171 뉴클레오티드 서열 이량체 hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc 놉쇄 표 25 참조
172 뉴클레오티드 서열 단량체 hu 4-1BBL (71-248) - CH1 표 25 참조
79 뉴클레오티드 서열 DP47 Fc 홀쇄 표 18 참조
80 뉴클레오티드 서열 DP47 경쇄 표 18 참조
173 이량체 hu 4-1BBL (71-254) - CL Fc 놉쇄 표 25 참조
174 단량체 hu 4-1BBL (71-254) - CH1 표 25 참조
81 DP47 Fc 홀쇄 표 18 참조
82 DP47 경쇄 표 18 참조
7.3.2 대조군 분자로서 항체2개의 대조군 인간 IgG1 함유 PGLALA를 제조하였다.
표 72는 항-CD19 huIgG1 PGLALA(클론 8B8-018), 즉, 대조군 G의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
표 73은 생식계열 대조군 DP47 huIgG1 PGLALA(대조군 F)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
생식계열 대조군 DP47 huIgG1 PGLALA(대조군 F)의 cDNA 및 아미노산 서열
서열번호 설명 서열
181 뉴클레오티드 서열 DP47 중쇄(hu IgG1 PGLALA) 표 29 참조
80 DP47 경쇄 표 18 참조
182 DP47 중쇄 (hu IgG1 PGLALA) 표 29 참조
82 DP47 경쇄 표 18 참조
7.4 CD19-표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자 및 그의 대조군 분자의 생성표적화 및 비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 암호화 서열을, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3' 말단에 위치한 합성 폴리A 서열을 함유하는 플라스미드 벡터내에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자를 생성하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 변이체 1, 2, 4, 5 및 그의 대조군 B, D 및 E의 경우, 1:1:1:1 비("벡터 이량체성 리간드-CL-놉쇄":"벡터 단량체성 리간드 융합물-CH1":"벡터 항-CD19 Fab-홀쇄":"벡터 항-CD19 경쇄")를 이용하였다. 변이체 3, 6 및 그의 대조군 C의 경우에는, 1:1:1 비("벡터 huIgG1 Fc 홀 이량체성 리간드 쇄":"벡터 huIgG1 Fc 놉 단량체성 리간드 쇄":"벡터 항-CD19 경쇄")를 취하였다. 분석에서 대조군으로 사용된 인간 IgG는 이중특이성 구조물들의 경우에서와 같이 생성하였다(형질감염의 경우에만 경쇄용 벡터 및 중쇄용 벡터를 1:1 비로 사용하였다).
500 mL 진탕 플라스크에서의 생성을 위해, 30억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간전에 접종하였다. 형질감염을 위해 세포를 210 x g에서 10 분동안 원심분리하고, 상등액을 20 mL의 예열된 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터(200 ㎍의 전체 DNA)를 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15 초동안 볼텍싱하고 실온에서 10 분간 배양하였다. 그후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3 시간동안 배양하였다. 배양 후에, 6 mM L-글루타민, 5 g/L 펩소이 및 1.2 mM 발프로산이 보충된 160 mL의 엑셀 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간동안 배양하였다. 형질감염 1일후에 12% 피드(아미노산 및 글루코스)를 첨가하였다. 7 일동안 배양한 후에, 상등액을 적어도 400 x g에서 30 내지 40 분동안 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 뿐 아니라 IgG를 정제하였다. 친화성 크로마토그래피의 경우, 상등액을 인산나트륨(20 mM), 시트르산나트륨(20 mM) 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 맵셀렉트 슈어 컬럼(CV = 5-15 mL, 지이 헬쓰케어의 수지) 상에 부하시켰다. 적어도 6개 컬럼 부피의 동일 완충액으로 세척하여 미결합 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은, 20 mM 시트르산나트륨, 100 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신 완충액(pH 3.0)으로 선형 구배(20 CV) 또는 단계 용출(8 CV)을 이용하여 용출시켰다. 선형 구배의 경우, 추가의 4개 컬럼 부피의 단계 용출을 적용하였다.
수거된 분획들의 pH를 1/10(v/v)의 0.5 M 인산나트륨(pH 8.0)을 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축시킨 다음, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, 0.01%(v/v) 트윈20 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 표적화 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물의 순도 및 분자량은, 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에서 SDS-PAGE, 및 쿠마시 심플블루(상표) 세이프스테인(인비트로겐 USA)을 사용한 염색에 의해 분석하였다. 샘플의 응집물 함량은, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
표 74는 CD19 표적화 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 항원 분자의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
CD19 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 생화학적 분석
구조물 단량체
[%]
(SEC)		 수율
[mg/l]
하전된 잔기와 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19 (8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc 융합물
(구조물 3.1)		 98 8.6
2가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc 융합물
(구조물 3.3)		 100 11.3
하전된 잔기와 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19 (8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc 융합물
(구조물 3.4)		 99 11.5
하전된 잔기없이 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc 융합물
(구조물 3.5)		 97 13.3
2가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc 융합물
(구조물 3.6)		 96 19.9
하전된 잔기와 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19 (8B8-2B11) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc 융합물
(구조물 4.4)		 99.2 21.2
표 75는 1가(대조군 B, D 및 E) 및 2가(대조군 C) 둘 다의 DP47 비표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
DP47 비표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물의 생화학적 분석
구조물 단량체
[%]
(SEC)		 수율
[mg/l]
1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물
(대조군 B)		 99 15.4
2가 DP47 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물
(대조군 C)		 98 12.6
1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물
(대조군 D)		 99.5 25.9
1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물
(대조군 E)		 93.3 4.1
표 76은 항-CD19(8B8-018) 및 생식계열 DP47 인간 IgG1 PGLALA(대조군 F)의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
대조군 인간 IgG1 PGLALA의 생화학적 분석
구조물 단량체[%] (SEC) 수율 [mg/l]
항-CD19(8B8-018) huIgG1 PGLALA 100 36.6
생식계열 DP47 인간 IgG1 PGLALA 100 50
실시예 8CD19 표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 기능 특성화
8.1. 표면 플라즈몬 공명(친화도)
재조합 4-1BB Fc(kih) 및 CD19에 대한 CD19 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자(구조물 3.4 및 3.6)의 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험들은 25℃에서 러닝 완충액으로 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 비아코어 T200 상에서 수행하였다.
인간 및 사이노몰구스 4-1BB와의 상호작용
항-인간 Fab 항체(비아코어, 프라이부르크/독일)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 직접 커플링시켰다. 고정화 수준은 약 8000 RU이었다. CD19 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc 융합물을 2 및 5 nM에서 60 초동안 포획하였다(대조군 D도 또한 주입하였다). 재조합 인간 또는 사이노몰구스 4-1BB avi His를, 2.7 내지 2000 nM 범위의 농도에서(3배 희석) 30 ㎕/분의 흐름하에 120 초동안 유동 세포들에 통과시켰다. 해리는 180 초동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포상에서 수득된 반응을 차감함으로써 보정하였다. 여기서, 항원들은 고정화된 항-인간 Fab-항체를 갖는 표면 위로 흘려보냈는데, 이때 상기 표면 위에는 항체가 아니라 HBS-EP가 주입되었었다.
인간 CD19와의 상호작용
항-인간 Fab 항체(비아코어, 프라이부르크/독일)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 직접 커플링시켰다. 고정화 수준은 약 8000 RU이었다. CD19 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc 융합물 또는 대조군 항체(항-CD19(8B8-018) huIgG1 PGLALA)를 20 nM에서 60 초동안 포획하였다. 재조합 인간 CD19-Fc(kih)를, 7.8 내지 500 nM 범위의 농도에서(2배 희석) 30 ㎕/분의 흐름하에 120 초동안 유동 세포들에 통과시켰다. 해리는 120/1800 초동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이는 기준 유동 세포상에서 수득된 반응을 차감함으로써 보정하였다. 여기서, 항원들은 고정화된 항-인간 Fab 항체를 갖는 표면 위로 흘려보냈는데, 이때 상기 표면 위에는 항체가 아니라 HBS-EP가 주입되었었다.
수치 적분에 의해 속도 방정식을 1:1 랭뮤어 결합에 적합화시키기 위해, 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 동적 상수들을 유도하였다.
이중특이성 구조물 3.4, 3.6 및 대조군 D는 4-1BB에 유사하게 결합한다. 표 77은 2개 실험들(2 nM 또는 5 nM에서 구조물 포획 용액 사용)로부터의 표준 편차(괄호안)와 함께 평균을 나타낸다. 이중특이성 구조물 3.4 및 3.6은 IgG와 유사한 친화도하에 인간 CD19에 결합한다. 상호작용에 대한 친화도 상수들은 1:1 랭뮤어 결합에 적합화시켜 측정하였다. hu4-1BB 및 cy4-1BB를 사용한 측정에서, 평균 및 표준 편차(괄호안)를 나타내었다(2 또는 5 nM 포획 용액을 사용한 2개 실험).
재조합 인간(hu) 4-1BB, 사이노몰구스(cy) 4-1BB 및 인간(hu) CD19에 대한 CD19 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc 융합물의 결합
항원 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
하전된 잔기와 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물
(구조물 3.4)		 hu 4-1BB 7.2E+04
(5.9E+03) 		2.5E-02
(1.0E-05) 		3.4E-07
(2.8E-08)
cy 4-1BB 1.2E+05 (8.6E+03) 1.3E-02
(1.8E-04) 		1.1E-07
(9.9E-09)
hu CD19 2.77E+04 2.67E-04 9.64E-09
2가 CD19(8B8-018) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물
(구조물 3.6)		 hu 4-1BB 6.9E+04
(1.7E+03) 		2.4E-02
(1.5E-04) 		3.5E-07
(1.1E-08)
cy 4-1BB 1.1E+05 (7.7E+03) 1.4E-02
(3.1E-04) 		1.3E-07
(1.3E-08)
hu CD19 2.55E+04 2.69E-04 1.06E-08
하전된 잔기와 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 DP47 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물
(대조군 D)		 hu 4-1BB 7.3E+04
(3.9E+03) 		2.6E-02
(6.3E-04) 		3.5E-07
(1.0E-08)
cy 4-1BB 1.2E+05 (1.9E+03) 1.4E-02
(1.0E-04) 		1.2E-07
(2.9E-09)
항-CD19(8B8-018) huIgG1 PGLALA hu CD19 2.12E+04 2.61E-04 1.23E-08
8.2 표면 플라즈몬 공명(동시 결합)인간 4-1BB Fc(kih)와 인간 CD19에 동시에 결합하는 능력을 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험들은 25℃에서 러닝 완충액으로 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 비아코어 T200 상에서 수행하였다. 비오티닐화 인간 4-1BB Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 250 공명 단위(RU)까지의 고정화 수준을 사용하였다.
CD19 표적화 삼량체 분할 4-1BBL 구조물들(구조물 3.1, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 4.4)을 200 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 흐름하에 90 초동안 유동 세포들에 통과시키고 해리는 0(제로)초로 설정하였다. 인간 CD19를 제 2의 분석물로서 500 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 흐름하에 90 초동안 유동 세포들을 통해 주입하였다(도 34A). 해리는 120 초동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이는, 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 차감함으로써 보정하였다.
도 35의 그래프에서 볼 수 있듯이, 모든 이중특이성 구조물들은 인간 4-1BB 및 인간 CD19에 동시에 결합할 수 있다.
실시예 9
CD-19 표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 기능 특성화
9.1 CD19-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 활성화 인간 PMBC 상에서의 결합
4-1BBL 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 인간 PBMC에 대한 결합을 측정하기 위해, 상이한 적정된 농도의 CD19-표적화 4-1BBL 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자를 실시예 5.2에서 기술된 바와 같은 분석에 사용하였다.
도 36a 및 36b는 각각 활성화된 4-1BB-발현 CD4+ T 세포 및 CD8 + T 세포 상에서 실시예 7에서 제조된 바와 같은 구조물 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 및 3.6의 결합을 나타낸다. 게이트는 살아있는 CD45+ CD3+ CD4+ 또는 CD45+ CD3+ CD8+ T 세포 상에 설정하였고, PE-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편의 MFI를 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 변이체의 적정 농도에 대해 블롯화하였다. 표 78은 구조물 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 및 3.6 및 대조군 분자들에 대해 측정된 바와 같은 EC50 값을 나타낸다.
활성화 4-1BB-발현 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 상에서의 결합
구조물 EC50 [nM]
4-1BB+CD8+ 		EC50 [nM]
4-1BB+CD4+
대조군 B 0.05 0.26
대조군 C 0.02 0.30
대조군 D 0.04 0.28
대조군 E 0.13 1.22
3.1 0.03 0.28
3.3 0.01 0.29
3.4 0.15 2.04
3.5 0.04 1.03
3.6 0.05 0.21
9.2 CD19-발현 종양 세포에 대한 결합CD19-발현 종양 세포 상에서의 결합 분석을 위해, 하기의 인간 CD19-발현 림프종 세포주를 사용하였다: 미만성 거대 비-호지킨 B 세포 림프종(B-NHL) 세포주 SU-DHL-8(DSMZ ACC573), 급성 B 세포 전구체 림프성 백혈병 세포주 Nalm6(DSMZ ACC-128), 미만성 거대 세포 림프모구 림프종 세포주 톨레도(ATCC CRL-2631) 및 미만성 거대 B 세포 림프종 세포주 OCI-Ly18(DSMZ ACC-699). 분석은 실시예 5.3에서 FAP-발현 MV-3 및 WM-266-4 종양 세포주에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다.
게이트는 살아있는 종양 세포 상에 설정하였고, PE-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편의 MFI를 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 구조물들의 적정 농도에 대해 블롯화하였다.
도 37a는 실시예 7.1에서 제조된 바와 같은 구조물 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 및 3.6의 미만성 거대 비-호지킨 B 세포 림프종(B-NHL) 세포주 SU-DHL-8에 대한 결합을 나타내고, 도 37b에는 급성 B 세포 전구체 림프성 백혈병 세포주 Nalm6에 대한 구조물 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 및 3.6의 결합을 나타내었다. 도 37c는 미만성 거대 세포 림프모구 림프종 세포주 톨레도에 대한 구조물 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 및 3.6의 결합을 나타내고, 도 37d는 미만성 거대 B 세포 림프종 세포주 OCI-Ly18에 대한 구조물 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 및 3.6의 결합을 나타낸다. 표 79는 구조물 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 및 3.6 및 대조군 분자들에 대해 측정된 바와 같은 EC50 값을 나타낸다.
CD19-발현 종양 세포에 대한 결합
구조물 EC50 [nM]
SU-DHL-8		 EC50 [nM]
Nalm6 		EC50 [nM]
톨레도		 EC50 [nM]
OCI-Ly18
3.1 0.64 0.43 0.29 0.29
3.3 0.15 0.14 0.10 0.09
3.4 0.31 0.39 0.29 0.26
3.5 0.54 0.43 0.27 0.31
3.6 0.14 0.12 0.09 0.10
대조군 G 0.09 0.10 0.06 0.07
실시예 10CD19-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 생물 활성
10.1. 인간 4-1BB를 발현하는 HeLa 세포에서 NF-κB 활성화
인간 4-1BB 및 NF-κB 루시퍼라제를 발현하는 HeLa 세포를 실시예 6.1에서 기술된 바와 같이 생성하였다.
CD19-발현 종양 세포와 공-배양된 인간 4-1BB를 발현하는 HeLa 세포에서 NF-κB 활성화
NF-κB-루시퍼라제 인간-4-1BB HeLa 세포를 수거하고, 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I로 보충된 DMEM 배지에 0.2 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 100 ㎕(2 x 104 세포)의 상기 세포 현탁액을 뚜껑이 있는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오-원, 카탈로그 번호 655083)의 각 웰로 옮기고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 적정된 농도의 CD19-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(CD19 분할 4-1BBL 삼량체) 또는 DP47-비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(DP47 분할 4-1BBL 삼량체)를 함유하는 배지 50 ㎕를 첨가하였다. CD19-발현 B 세포 림프종 세포주(미만성 거대 비-호지킨 B 세포 림프종(B-NHL) 세포주 SU-DHL-8(DSMZ ACC573) 및 인간 비-호지킨 B 세포 림프종 세포주 파이퍼(ATCC CRL-2632))를, 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I로 보충된 DMEM 배지에 2 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다.
CD19-발현 B 세포 림프종 세포(50 ㎕, 최종비 1:5)의 현탁액 또는 배지만을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 6 시간동안 배양하였다. 세포를 200 ㎕/웰 DPBS로 2회 세척하였다. 40 ㎕의 새로 제조한 리포터 용해 완충액(프로메가, 카탈로그 번호 E3971)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 -20℃에서 밤새 저장하였다. 다음 날, 냉동된 세포 플레이트 및 검출 완충액(루시퍼라제 1000 분석 시스템, 프로메가, 카탈로그 번호 E4550)을 실온에서 해동하였다. 100 ㎕의 검출 완충액을 각 웰에 첨가하고, URL(0.5 초/웰동안 방출광 단위)로 광방출을 계수하는 스펙트라맥스 M5/M5e 마이크로플레이트 리더 및 소프트맥스 프로 소프트웨어(몰레큘라 디바이시즈), 또는 초당계수(CPS)로서 광방출을 계수하는 빅터3 1420 다중표지 계수기 플레이트 리더(퍼킨 엘머) 및 퍼킨 엘머 2030 매니저 소프트웨어를 사용하여 가능한 한 신속하게 루시퍼라제 활성을 측정하고, 검사한 구조물들의 농도에 대해 블롯화하였다.
CD19-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자 구조물 3.1 및 3.3은 CD19-발현 B 세포 림프종 세포의 존재하에 리포터 세포주에서 NF-κB 신호전달 경로의 활성화를 유발하였다. 대조적으로, 비표적화 대조군 분자는 검사된 어떤 농도에서도 상기 효과를 유발하지 못하였다(도 38).
실시예 11
11.1 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조
11.1.1 항-CEA 클론 T84.66의 인간화
인간 생식계열 프레임워크 수용체 서열 위에 CDR을 그라프팅시켜 뮤린 항체 T84.66[Wagener et al., J Immunol 130, 2308 (1983), Neumaier et al., J Immunol 135, 3604 (1985)]의 신규 인간화 변이체를 개발하였다.
비-인간 기원의 항체의 인간화는 필수적으로 비-인간 항체(공여체)로부터의 CDR 잔기를 인간(수용체) 항체의 프레임워크 상에 이식하는 것으로 이루어진다. 통상적으로 수용체 프레임워크는, 공여체의 서열을 잠재적인 수용체 서열들의 집합체에 맞추어 정렬시키고, 공여체에 대해 타당한 상동성을 갖거나 또는 구조 및 활성에 중요한 일부 위치들에서 유사한 아미노산을 나타내는 서열을 선택함으로써 선정된다. 본 경우에서는, 마우스 T84.66 단백질(중쇄에 대해 NCBI 수탁 번호 CAA36980(서열번호 317), 및 경쇄에 대해 CAA36979(서열번호 318)) 서열을 인간 생식계열 서열의 집합체에 맞추어 정렬시키고 높은 서열 동일성을 나타낸 인간 서열을 고름으로써 항체 수용체 프레임워크에 대한 검색을 수행하였다. 이때, IMGT 데이터베이스로부터의 서열 IGHV1-69*08을 중쇄 프레임워크 수용체 서열(IMGT 수탁 번호 Z14309, 서열번호 319)로 선택하고, IGKV3-11*01 서열(IMGT 수탁 번호 X01668, 서열번호 320)을 경쇄에 대한 프레임워크 수용체로 선택하였다. 이들 2개의 수용체 프레임워크 상에, 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 그라프팅하였다. 프레임워크 4(FR4) 영역은 생식계열 V 유전자의 가변 영역의 일부가 아니므로, 상기 위치에 대한 정렬은 개별적으로 수행하였다. 중쇄의 경우 JH4 서열이 선택되었고, 경쇄의 경우 JK2 서열이 선택되었다.
11.1.2 T84.66 IgG의 상이한 인간화 변이체들의 세포에 대한 결합
T84.66 IgG의 상이한 인간화 변이체들의 결합은 CEA-발현 인간 위선암 세포들(MKN45, DSMZ ACC 409) 상에서 검사하였다.
세포를 수거하고, 계수하고, 생존도에 대해 검사하고, FACS 완충액(100 ㎕ PBS 0.1% BSA) 중에 2 x 106 세포/mL로 재현탁하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액(0.2 x 106 세포 함유)을 4℃에서 증가하는 농도의 CEA IgG(4 ng/mL 내지 60 ㎍/mL)와 함께 환저 96-웰 플레이트에서 30 분동안 배양하고, 차가운 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, 4℃에서 PE-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 2차 항체(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-116-170)와 함께 30 분동안 더 재배양하고, 차가운 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, FACS CantoII(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 FACS에 의해 즉시 분석하였다. 결합 곡선 및 EC50 값을 수득하고 그래프패드프리즘5(GraphPadPrism5)를 사용하여 산출하였다.
도 39는 T84.66 IgG의 선별된 인간화 변이체들의, MKN45 세포 상에서 발현된 인간 CEA에 대한 상이한 결합 패턴을 나타낸다. 산출된 EC50 결합 값(표 80)에 근거하여, 인간화 변이체 1을 추가의 평가를 위해 선택하였다.
T84.66 IgG의 상이한 인간화 변이체들의 세포에 대한 결합(그래프 패드 프리즘에 의해 산출된, 도 39에 나타낸 결합 곡선에 근거한 EC50 값)
EC50 (㎍/mL)
모 키메라 T84.66 0.99
인간화 변이체 1 1.5
인간화 변이체 2 8.6
인간화 변이체 3 1.4
인간화 변이체 4 3.1
인간화 변이체 5 -
인간화 변이체 6 -
인간화 변이체 1은 하기 T84.66-LCHA에서 지칭된다. 그 CDR의 아미노산 서열 및 VH 및 VL의 아미노산 서열뿐 아니라 모 키메라 T84.66 클론의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열도 표 81에 나타내었다.
11.2 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조
인간 4-1BB 리간드의 엑토도메인의 일부(아미노산 71-254 및 71-248)를 암호화하는 DNA 서열의 상이한 단편들을 유니프롯 데이터베이스의 P41237 서열(서열번호 42)에 따라 합성하였다.
11.2.1 하전된 잔기들과 함께 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 5.1)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 29A에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 29B에 기술된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH.
정확한 쌍형성을 개선하기 위해, 교차된 CH-CL에 하기의 돌연변이들을 도입하였다. 인간 CL에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드에 E123R 및 Q124K. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에, K147E 및 K213E.
CEA, 클론 T84.66-LCHA에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-CEA-Fc 홀쇄 및 항-CEA 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 CEA 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 40, 구조물 5.1).
표 82는 교차된 CH-CL 및 하전된 잔기를 갖는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 5.1)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
11.2.2 하전된 잔기없이 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 5.2)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를, CL 도메인에 아미노산 돌연변이가 없는 것을 제외하고 도 29A에 도시된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합된 폴리펩티드를, CH1 도메인에 아미노산 돌연변이가 없는 것을 제외하고 도 29B에 도시된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH1.
CEA, 클론 T84.66-LCHA에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다.
WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-CEA-Fc 홀쇄 및 항-CEA 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 CEA 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 40, 구조물 5.2).
표 83은 하전된 잔기 없이 교차된 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 5.2)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
하전된 잔기없이 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물(구조물 5.2)의 cDNA 및 아미노산 서열
서열번호 설명 서열
165 뉴클레오티드 서열 이량체 리간드(71-254)- CL Fc 놉쇄 표 22 참조
166 뉴클레오티드 서열 단량체 hu 4-1BBL (71-254) - CH1 표 22 참조
331 뉴클레오티드 서열 항- CEA (T84.66-LCHA) Fc 홀쇄 표 82 참조
332 뉴클레오티드 서열 항- CEA (T84.66-LCHA) 경쇄 표 82 참조
117 이량체 리간드(71-254) - CL Fc 놉쇄 표 22 참조
118 단량체 리간드(71-254) - CH1 표 22 참조
333 항- CEA (T84.66-LCHA) Fc 홀쇄 표 82 참조
334 항- CEA (T84.66-LCHA) 경쇄 표 82 참조
11.2.3 2가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 5.3)(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 29C에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 홀쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 홀, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 29D에 기술된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 놉쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 놉, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드.
CEA, 클론 T84.66-LCHA에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄, 놉 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다. Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 항-CEA huIgG1 홀 이량체성 리간드 쇄, S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항-CEA huIgG1 놉 단량체성 리간드 쇄 및 항-CEA 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 2개의 CEA 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 40, 구조물 5.3).
표 84는 2가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 5.3)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
11.2.4 하전된 잔기들과 함께 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 5.4)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 29A에 도시된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-248)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 29B에 기술된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH.
인간 CL 도메인에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드를 암호화하는 폴리펩티드를 놉(Merchant, Zhu et al. 1998) 상에서 인간 IgG1 중쇄 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 프레임 내에 서브클로닝하였다. 정확한 쌍형성을 개선하기 위해, 교차된 CH-CL에 하기의 돌연변이들을 도입하였다. 인간 CL에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드에 E123R 및 Q124K. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에, K147E 및 K213E.
CEA, 클론 T84.66-LCHA에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-CD19-Fc 홀쇄 및 항-CD19 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 CEA 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 40, 구조물 5.4).
표 85는 교차된 CH-CL 및 하전된 잔기를 갖는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 5.4)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
하전된 잔기들과 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물(구조물 5.4)의 cDNA 및 아미노산 서열. * 하전된 잔기들
서열번호 설명 서열
169 뉴클레오티드 서열 이량체 리간드(71-248) - CL* Fc 놉쇄 표 24 참조
170 뉴클레오티드 서열 단량체 hu 4-1BBL (71-248) - CH1* 표 24 참조
331 뉴클레오티드 서열 항- CEA(T84.66-LCHA) Fc 홀쇄 표 82 참조
332 뉴클레오티드 서열 항- CEA(T84.66-LCHA) 경쇄 표 82 참조
119 이량체 리간드(71-248) - CL* Fc 놉쇄 표 24 참조
120 단량체 리간드(71-248)-CH1* 표 24 참조
333 항- CEA(T84.66-LCHA) Fc 홀쇄 표 62 참조
334 항- CEA(T84.66-LCHA) 경쇄 표 59 참조
11.2.5 하전된 잔기없이 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 5.5)(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를, CL 도메인에 아미노산 돌연변이가 없는 것을 제외하고 도 29A에 도시된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-248)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합된 폴리펩티드를, CH1 도메인에 아미노산 돌연변이가 없는 것을 제외하고 도 29B에 기술된 바와 유사하게 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH1.
CEA, 클론 T84.66-LCHA에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다. S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-CEA-Fc 홀쇄 및 항-CEA 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 CD19-결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 40, 구조물 5.5).
표 86은 하전된 잔기 없이 교차된 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 5.5)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
하전된 잔기없이 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물(구조물 5.5)의 cDNA 및 아미노산 서열
서열번호 설명 서열
171 뉴클레오티드 서열 이량체 리간드(71-248)- CL Fc 놉쇄 표 25 참조
172 뉴클레오티드 서열 단량체 리간드(71-248) - CH1 표 25 참조
331 뉴클레오티드 서열 항- CEA (T84.66-LCHA) Fc 홀쇄 표 82 참조
332 뉴클레오티드 서열 항- CEA (T84.66-LCHA) 경쇄 표 82 참조
173 이량체 리간드(71-248) - CL Fc 놉쇄 표 25 참조
174 단량체 리간드(71-248) - CH1 표 25 참조
333 항-CEA (T84.66-LCHA) Fc 홀쇄 표 82 참조
334 항-CEA (T84.66-LCHA) 경쇄 표 82 참조
11.2.6 2가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 4-1BB 리간드(71-248) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 5.6)(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-248)의 2개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 29C에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 홀쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 홀, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 29D에 기술된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 놉쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 놉, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드.
CEA, 클론 T84.66-LCHA에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄, 놉 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다. Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 항-CEA huIgG1 홀 이량체성 리간드 쇄, S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항-CEA huIgG1 놉 단량체성 리간드 쇄 및 항-CEA 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 2개의 CEA 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 40, 구조물 5.6).
표 87은 2가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 5.6)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
11.2.7 하전된 잔기들과 함께 교차된 CH1-CL 도메인을 갖는 1가 CEA(T84.66) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 5.7)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 29A에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 29B에 기술된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH.
정확한 쌍형성을 개선하기 위해, 교차된 CH-CL에 하기의 돌연변이들을 도입하였다. 인간 CL에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드에 E123R 및 Q124K. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에, K147E 및 K213E.
CEA, 클론 T84.66에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-CD19-Fc 홀쇄 및 항-CD19 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 CEA 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다. 구조물 5.7은 도 40에 나타낸 바와 같은 구조물 5.1에 상응한다.
표 88은 교차된 CH-CL 및 하전된 잔기를 갖는 1가 CEA(T84.66) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 5.7)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
11.2.8 2가 CEA(T84.66) 표적화 4-1BB 리간드(71-254) 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 제조(구조물 5.8)
(G4S)2 링커에 의해 분리된 4-1BB 리간드(71-254)의 2개의 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 29C에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 홀쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 홀, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드. 4-1BB 리간드(71-254)의 1개 엑토도메인을 함유하는 폴리펩티드를 도 29D에 기술된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 놉쇄의 C-말단에 융합시켰다: 인간 IgG1 Fc 놉, (G4S)2 연결자, 인간 4-1BB 리간드.
CEA, 클론 T84.66에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄, 놉 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다. Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 항-CEA huIgG1 홀 이량체성 리간드 쇄, S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 항-CEA huIgG1 놉 단량체성 리간드 쇄 및 항-CEA 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 4-1BB 리간드 및 2개의 CEA 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다. 구조물 5.8은 도 40에 나타낸 바와 같은 구조물 5.3에 상응한다.
표 89는 2가 CEA(T84.66) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 5.8)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
11.3 대조군 분자로서 비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 분자 및 인간 IgG의 제조
11.3.1 비표적화 인간 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조(대조군 분자)
상기 대조군 분자들은, 항-CD19 결합자(VH-VL)가 항원에 결합하지 않는, DP47로 지칭된 생식계열 대조군으로 대체된 것만이 다른 채로, CEA 표적화 구조물 3.1(대조군 B로 지칭), 3.3(대조군 C로 지칭), 3.4(대조군 D로 지칭) 및 3.5(대조군 E로 지칭)에 대해 전술한 바와 같이 제조하였다(도 40 참조). 대조군 B, 하전된 잔기와 함께 교차된 CH-CL을 함유하는 1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물의 cDNA 및 아미노산 서열은 상기 표 68에 나타내었다(실시예 7.3.1 참조). 표 69는 2가 DP47-비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물, 대조군 C의 cDNA 및 아미노산 서열들을 각각 나타낸다. 표 70은 하전된 잔기와 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물, 대조군 D의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 표 71은 CH-CL 교차에 하전된 잔기를 갖지 않는 1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc(kih) 융합물, 대조군 E의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
11.3.2 대조군 분자로서 항체
대조군 F로 지칭된, 상기 분석들에서 사용된 추가의 대조군은 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시키기 위해 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 함유하는 비표적화 DP47, 생식계열 대조군, 인간 IgG1이었다. 대조군 F의 cDNA 및 아미노산 서열은 상기 표 73에서 찾을 수 있다.
11.4 CEA-표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자 및 그의 대조군 분자의 생성
표적화 및 비표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 암호화 서열을, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3' 말단에 위치한 합성 폴리A 서열을 함유하는 플라스미드 벡터내에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물을 생성하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 변이체 1, 2, 4, 5 및 그의 대조군 B, D 및 E의 경우, 1:1:1:1 비("벡터 이량체성 리간드-CL-놉쇄":"벡터 단량체성 리간드 융합물-CH1":"벡터 항-CEA Fab-홀쇄":"벡터 항-CEA 경쇄")를 이용하였다. 변이체 3, 6 및 그의 대조군 C의 경우에는, 1:1:1 비("벡터 huIgG1 Fc 홀 이량체성 리간드 쇄":"벡터 huIgG1 Fc 놉 단량체성 리간드 쇄":"벡터 항-CEA 경쇄")를 이용하였다. 분석에서 대조군으로 사용된 인간 IgG는 이중특이성 구조물들의 경우에서와 같이 생성하였다(형질감염의 경우에만 경쇄용 벡터 및 중쇄용 벡터를 1:1 비로 사용하였다).
500 mL 진탕 플라스크에서의 생성을 위해, 30억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간전에 접종하였다. 형질감염을 위해 세포를 210 x g에서 10 분동안 원심분리하고, 상등액을 20 mL의 예열된 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터(200 ㎍의 전체 DNA)를 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15 초동안 볼텍싱하고 실온에서 10 분간 배양하였다. 그후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3 시간동안 배양하였다. 배양 후에, 6 mM L-글루타민, 5 g/L 펩소이 및 1.2 mM 발프로산이 보충된 160 mL의 엑셀 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간동안 배양하였다. 형질감염 1일후에 12% 피드(아미노산 및 글루코스)를 첨가하였다. 7 일동안 배양한 후에, 상등액을 적어도 400 x g에서 30 내지 40 분동안 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물 뿐 아니라 IgG를 정제하였다. 친화성 크로마토그래피의 경우, 상등액을 인산나트륨(20 mM), 시트르산나트륨(20 mM) 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 맵셀렉트 슈어 컬럼(CV = 5-15 mL, 지이 헬쓰케어의 수지) 상에 부하시켰다. 적어도 6개 컬럼 부피의 동일 완충액으로 세척하여 미결합 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은, 20 mM 시트르산나트륨, 100 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신 완충액(pH 3.0)으로 선형 구배(20 CV) 또는 단계 용출(8 CV)을 이용하여 용출시켰다. 선형 구배의 경우, 추가의 4개 컬럼 부피의 단계 용출을 적용하였다.
수거된 분획들의 pH를 1/10(v/v)의 0.5 M 인산나트륨 (pH 8.0)을 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축시킨 다음, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, 0.01%(v/v) 트윈20 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 표적화 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 순도 및 분자량은, 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에서 SDS-PAGE, 및 쿠마시 심플블루(상표) 세이프스테인(인비트로겐 USA)을 사용한 염색 또는 캘리퍼 랩칩 GXII(퍼킨 엘머)를 사용한 CE-SDS에 의해 분석하였다. 샘플의 응집물 함량은, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
표 90은 CEA 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
CEA 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물의 생화학적 분석
구조물 단량체
[%]
(SEC)		 수율
[mg/l]
하전된 잔기와 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CEA (T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc 융합물 (구조물 5.4) 98 1.4
2가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-248) Fc 융합물 (구조물 5.6) 98 0.4
하전된 잔기와 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 CEA (T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc 융합물 (구조물 5.7) 97 15
2가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드(71-254) Fc 융합물 (구조물 5.8) 96 2
표 91은 1가(대조군 B, D 및 E) 및 2가(대조군 C) 둘 다의 DP47 비표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합 분자, 및 생식계열 DP47 인간 IgG1 PGLALA(대조군 F)의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
DP47 비표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물의 생화학적 분석
구조물 단량체
[%]
(SEC)		 수율
[mg/l]
1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물 (대조군 B) 99 15.4
2가 DP47 비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물 (대조군 C) 98 12.6
1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물 (대조군 D) 99.5 25.9
1가 DP47-비표적화 분할 삼량체 인간 4-1BB 리간드(71-254) Fc(kih) 융합물 (대조군 E) 93.3 4.1
생식계열 DP47 인간 IgG1 PGLALA 100 50
실시예 12CEA 표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 기능 특성화
12.1 표면 플라즈몬 공명(동시 결합)
CEA 표적화 삼량체 분할 4-1BBL 구조물에 대한 항원으로서 hu NA3B3A2의 생성
SPR에 의해 CEA에 대한 결합을 평가하기 위해 사용된 항원은, NABA에 대해 기술된 것[Durbin H. et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 May 10;91(10):4313-7]과 유사하게 인간 CEACAM5(CEA)로부터의 A3 및 B3 도메인, 및 인간 CEACAM1 (BGP1)로부터의 N 및 A2 도메인으로 이루어진 하이브리드 분자였다. 상기 항원은 여기서 NA3B3A2로 지칭되고, 도식적 설명은 도 41A에서 찾을 수 있다.
표 92는 hu NA3B3A2-avi-His의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다.
단백질 생성은 Fc-융합 단백질(실시예 7.1.1)에 대해 전술한 바와 같이 수행하였다. 분비된 단백질은 킬레이트화 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 1차 크로마토그래피 단계는 20 mM 인산나트륨, 500 nM 염화나트륨, pH 7.4에서 평형화된 NiNTA 슈퍼플로우 카트리지(5 mL, 키아겐) 상에서 수행하였다. 용출은, 5%로부터 45%까지의 용출 완충액(20 mM 인산나트륨, 500 nM 염화나트륨, 500 mM 이미다졸, pH 7.4)의 12개 컬럼 부피에 걸친 구배를 적용함으로써 수행하였다.
단백질을 농축하고 여과한 다음, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl 0.01% 트윈-20 pH 6.0으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 75 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다. 표 93은 인간 NA3B3A2-avi-His의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
인간 NA3B3A2-avi-His의 생화학적 분석
구조물 단량체 [%]
(SEC)		 수율
[mg/l]
인간 NA3B3A2-avi-His 88 14.1
인간 4-1BB Fc(kih)와 인간 NA3B3A2에 동시에 결합하는 능력을 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험들은 25℃에서 러닝 완충액으로 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 프라이브루크/독일)를 사용하여 비아코어 T200 상에서 수행하였다. 비오티닐화 인간 4-1BB Fc(kih)를 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 유동 세포에 직접 커플링시켰다. 250 공명 단위(RU)까지의 고정화 수준을 사용하였다.CEA 표적화 삼량체 분할 4-1BBL 구조물들(구조물 5.4, 5.6, 5.7 및 5.8)을 200 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 흐름하에 90 초동안 유동 세포들에 통과시키고, 해리를 0(제로)초로 설정하였다. 인간 NA3B3A2를 제 2의 분석물로서 500 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 흐름하에 90 초동안 유동 세포를 통해 주입하였다(도 41B). 해리는 120 초동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이는, 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포에서 수득된 반응을 차감함으로써 보정하였다.
도 42의 그래프에서 볼 수 있듯이, 모든 이중특이성 구조물들은 인간 4-1BB 및 인간 NA3B3A2에 동시에 결합할 수 있다.
12.2. CEA 표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자의 활성화 인간 PMBC 상에서의 결합
4-1BBL 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 인간 PBMC에 대한 결합을 측정하기 위해, 상이한 적정된 농도의 CEA-표적화 4-1BBL 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자를 실시예 5.2에서 기술된 바와 같은 분석에 사용하였다.
도 43은 활성화된 4-1BB-발현 CD4+ T 세포 및 CD8 + T 세포 각각 상에서의 실시예 11에서 제조된 바와 같은 구조물 5.4, 5.6, 5.7 및 5.8의 결합을 나타낸다. 게이트는 살아있는 CD45+ CD3+ CD4+ 또는 CD45+ CD3+ CD8+ T 세포 상에 설정하였고, PE-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편의 MFI를 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 변이체의 적정 농도에 대해 블롯화하였다. 표 94는 구조물 5.4, 5.6, 5.7 및 5.8 및 대조군 분자들에 대해 측정된 바와 같은 EC50 값을 나타낸다.
활성화 4-1BB-발현 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 상에서의 결합
구조물 EC50 [nM]
4-1BB+CD8+ 		EC50 [nM]
4-1BB+CD4+
대조군 B 0.05 0.26
대조군 C 0.02 0.30
대조군 D 0.04 0.28
대조군 E 0.13 1.22
5.4 0.13 0.35
5.6 0.06 0.34
5.7 0.0004 0.36
5.8 0.17 0.38
12.2 CEA-발현 종양 세포에 대한 결합CEA-발현 종양 세포 상에서의 결합 분석을 위해, 하기의 인간 CEA-발현 림프종 세포주를 사용하였다: CEA-발현 종양 세포주 인간 위암 세포주 MKN-45(ATCC TCP-1008) 및 인간 대장 선암 세포주 LS180(ATCC CL-187). 분석은 실시예 5.3에서 FAP-발현 MV-3 및 WM-266-4 종양 세포주에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다.
게이트는 살아있는 종양 세포 상에 설정하였고, PE-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG IgG Fcγ-단편-특이적 염소 F(ab')2 단편의 MFI를 표적화 분할 삼량체 4-1BB 리간드 Fc 융합 구조물들의 적정 농도에 대해 블롯화하였다.
도 44는 실시예 11.2.7에서 제조된 바와 같은 구조물 5.7의 CEA-발현 인간 위암 세포주 MKN-45(왼쪽) 및 인간 대장 선암 세포주 LS180(오른쪽)에 대한 결합을 나타낸다. 표 95는 인간-CEA 발현 인간 위암 세포주 MKN-45에 대해 측정된 바와 같은 EC50 값을 나타낸다.
CEA-발현 종양 세포에 대한 결합
구조물 EC50 [nM]
MKN45-8		 EC50 [nM]
LS180
5.7 11.6 14.4
실시예 13CEA-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 생물 활성
13.1. 인간 4-1BB를 발현하는 HeLa 세포에서 NF-κB 활성화
인간 4-1BB 및 NF-κB 루시퍼라제를 발현하는 HeLa 세포를 실시예 6.1에서 기술된 바와 같이 생성하였다.
CEA-발현 종양 세포와 공-배양된 인간 4-1BB를 발현하는 HeLa 세포에서 NF-κB 활성화
NF-κB-루시퍼라제 인간-4-1BB HeLa 세포를 수거하고, 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I로 보충된 DMEM 배지에 0.2 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 100 ㎕(2 x 104 세포)의 상기 세포 현탁액을 뚜껑이 있는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오-원, 카탈로그 번호 655083)의 각 웰로 옮기고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 적정된 농도의 CEA-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(CEA 분할 4-1BBL 삼량체) 또는 DP47-비표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자(DP47 분할 4-1BBL 삼량체)를 함유하는 배지 50 ㎕를 첨가하였다. CEA-발현 종양 세포주 인간 위암 세포주 MKN-45(ATCC TCP-1008)를, 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 글루타맥스-I로 보충된 DMEM 배지에 2 x 106 세포/mL의 농도로 재현탁하였다.
CEA-발현 B 세포 림프종 세포(50 ㎕, 최종비 1:5)의 현탁액 또는 배지만을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 6 시간동안 배양하였다. 세포를 200 ㎕/웰 DPBS로 2회 세척하였다. 40 ㎕의 새로 제조한 리포터 용해 완충액(프로메가, 카탈로그 번호 E3971)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 -20℃에서 밤새 저장하였다. 다음 날, 냉동된 세포 플레이트 및 검출 완충액(루시퍼라제 1000 분석 시스템, 프로메가, 카탈로그 번호 E4550)을 실온에서 해동하였다. 100 ㎕의 검출 완충액을 각 웰에 첨가하고, URL(0.5 초/웰동안 방출광 단위)로 광방출을 계수하는 스펙트라맥스 M5/M5e 마이크로플레이트 리더 및 소프트맥스 프로 소프트웨어(몰레큘라 디바이시즈), 또는 초당계수(CPS)로서 광방출을 계수하는 빅터3 1420 다중표지 계수기 플레이트 리더(퍼킨 엘머) 및 퍼킨 엘머 2030 매니저 소프트웨어를 사용하여 가능한 한 신속하게 루시퍼라제 활성을 측정하고, 검사한 구조물들의 농도에 대해 블롯화하였다.
CEA-표적화 4-1BB 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자 구조물 5.7 및 5.8은 인간 위암 세포주 MKN-45의 존재하에 리포터 세포주에서 NF-κB 신호전달 경로의 활성화를 유발하였다. 대조적으로, 비표적화 대조군 분자는 검사된 어떤 농도에서도 상기 효과를 유발하지 못하였다(도 45). 표 96은 상응하는 EC50 값을 나타낸다.
CEA-발현 종양 세포에 대한 결합
구조물 EC50 [nM]
MKN-45
종양 세포 없음		 EC50 [nM]
MKN45
5.4 3.1 0.34
5.6 2.05 0.21
5.7 0.85 0.05
5.8 1.52 0.45
실시예 1414.1 FAP 표적화 OX40 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 제조
인간 OX40 리간드의 엑토도메인의 일부(아미노산 51-183)를 암호화하는 DNA 서열을 유니프롯 데이터베이스의 P23510에 따라 합성하였다. 글리코실화로 인한 인간 Ox40 리간드의 이질성을 감소시키기 위해 위치 90 및 114에서 아스파라긴 잔기를 부위-지향 돌연변이유발(문헌[Compaan D.M., Hymowitz S.G., Structure (2006) 14(8), 1321-30]에 따라)에 의해 아스파르트산으로 돌연변이시켰다.
(G4S)2 링커에 의해 분리된 OX40 리간드의 2개의 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 46A에 도시된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 OX40 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 OX40 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CL.
OX40 리간드의 1개 엑토도메인을 함유하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드를 도 46B에 기술된 바와 같이 클로닝하였다: 인간 OX40 리간드, (G4S)2 연결자, 인간 CH.
정확한 쌍형성을 개선하기 위해, 교차된 CH-CL에 하기의 돌연변이들을 도입하였다. 인간 CL에 융합된 이량체성 4-1BB 리간드에 E123R 및 Q124K. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에, K147E 및 K213E.
FAP 결합자의 생성 및 제조는 본원에 참고로 인용된 WO 2012/020006 A2 호에 기술되어 있다.
FAP, 클론 28H11에 특이적인 결합자를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄를 갖는 프레임내에 서브클로닝하였다. WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 놉 및 홀 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시켰다.
S354C/T366W 돌연변이를 함유하는 이량체성 리간드-Fc 놉쇄, 단량체성 CH1 융합물, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 함유하는 표적화 항-FAP-Fc 홀쇄 및 항-FAP 경쇄의 조합은, 조립된 삼량체 OX40 리간드 및 FAP 결합 Fab를 포함하는 이종이량체의 생성을 가능하게 한다(도 46C, 구조물 6.1).
표 97은 교차된 CH-CL 및 하전된 잔기를 갖는 1가 CEA(T84.66-LCHA) 표적화 분할 삼량체 OX40 리간드(51-183) Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(구조물 6.1)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
14.2 대조군 F로서 비표적화 인간 IgG1의 제조
대조군 F(도 46D)로 지칭된, 상기 분석들에서 사용된 대조군 분자는, 국제 특허출원 공개 WO 2012/130831 호에 기술된 방법에 따라서 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 배제시키기 위해 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이들을 함유하는 비표적화 DP47, 생식계열 대조군, 인간 IgG1이었다. 그의 제조는 실시예 2.3에서 기술되어 있고, 표 29는 비표적화 DP47 huIgG1 PGLALA(대조군 F)의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
14.3 FAP-표적화 분할 삼량체 OX40 리간드 Fc 융합 항원 결합 분자 및 그의 대조군 분자의 생성
표적화 및 비표적화 분할 삼량체 OX40 리간드 Fc(kih) 융합물 암호화 서열을, MPSV 프로모터로부터 삽입물의 발현을 유도하고 CDS의 3' 말단에 위치한 합성 폴리A 서열을 함유하는 플라스미드 벡터내에 클로닝하였다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 EBV OriP 서열을 함유한다.
HEK293-EBNA 세포를 폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 동시-형질감염시켜 분할 삼량체성 OX40 리간드 Fc(kih) 융합물을 생성하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 변이체 1, 2, 4, 5 및 그의 대조군 B, D 및 E의 경우, 1:1:1:1 비("벡터 이량체성 리간드-CL-놉쇄":"벡터 단량체성 리간드 융합물-CH1":"벡터 항-FAP Fab-홀쇄":"벡터 항-FAP 경쇄")를 이용하였다. 변이체 3, 6 및 그의 대조군 C의 경우에는, 1:1:1 비("벡터 huIgG1 Fc 홀 이량체성 리간드 쇄":"벡터 huIgG1 Fc 놉 단량체성 리간드 쇄":"벡터 항-FAP 경쇄")를 이용하였다. 분석에서 대조군으로 사용된 인간 IgG는 이중특이성 구조물들의 경우에서와 같이 생성하였다(형질감염의 경우에만 경쇄용 벡터 및 중쇄용 벡터를 1:1 비로 사용하였다).
500 mL 진탕 플라스크에서의 생성을 위해, 30억개 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24 시간전에 접종하였다. 형질감염을 위해 세포를 210 x g에서 10 분동안 원심분리하고, 상등액을 20 mL의 예열된 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터(200 ㎍의 전체 DNA)를 20 mL CD CHO 배지에 혼합하였다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15 초동안 볼텍싱하고 실온에서 10 분간 배양하였다. 그후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 mL 진탕 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2 대기하에 배양기에서 3 시간동안 배양하였다. 배양 후에, 6 mM L-글루타민, 5 g/L 펩소이 및 1.2 mM 발프로산이 보충된 160 mL의 엑셀 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간동안 배양하였다. 형질감염 1일후에 12% 피드(아미노산 및 글루코스)를 첨가하였다. 7 일동안 배양한 후에, 상등액을 적어도 400 x g에서 30 내지 40 분동안 원심분리하여 수거하였다. 용액을 멸균 여과(0.22 ㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드로 0.01%(w/v)의 최종 농도로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
단백질 A를 사용한 친화성 크로마토그래피에 이어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 분할 삼량체 OX40 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자뿐 아니라 IgG를 정제하였다. 친화성 크로마토그래피의 경우, 상등액을 인산나트륨(20 mM), 시트르산나트륨(20 mM) 완충액(pH 7.5)으로 평형화된 맵셀렉트 슈어 컬럼(CV = 5-15 mL, 지이 헬쓰케어의 수지) 상에 부하시켰다. 적어도 6개 컬럼 부피의 동일 완충액으로 세척하여 미결합 단백질을 제거하였다. 결합된 단백질은, 20 mM 시트르산나트륨, 100 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신 완충액(pH 3.0)으로 선형 구배(20 CV) 또는 단계 용출(8 CV)을 이용하여 용출시켰다. 선형 구배의 경우, 추가의 4개 컬럼 부피의 단계 용출을 적용하였다.
수거된 분획들의 pH를 1/10(v/v)의 0.5 M 인산나트륨 (pH 8.0)을 첨가하여 조정하였다. 단백질을 농축시킨 다음, pH 6.0의 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, 0.01%(v/v) 트윈20 용액으로 평형화된 하이로드 슈퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 부하시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 산출된 몰흡광계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 표적화 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물의 순도 및 분자량은, 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에서 SDS-PAGE, 및 쿠마시 심플블루(상표) 세이프스테인(인비트로겐 USA)을 사용한 염색 또는 캘리퍼 랩칩 GXII(퍼킨 엘머)를 사용한 CE-SDS에 의해 분석하였다. 샘플의 응집물 함량은, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충액에 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석적 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
표 98은 FAP 표적화 분할 삼량체 Ox40 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자 및 생식계열 DP47 인간 IgG1 PGLALA(대조군 F)의 수율 및 최종 단량체 함량을 요약한 것이다.
CEA 표적화 분할 삼량체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) 융합물의 생화학적 분석
구조물 단량체
[%]
(SEC)		 수율
[mg/l]
하전된 잔기와 함께 CH-CL 교차를 함유하는 1가 FAP(28H1) 표적화 분할 삼량체 Ox40 리간드 Fc 융합물
(구조물 6.1)		 93.8 19.7
생식계열 DP47 인간 IgG1 PGLALA 100 50
실시예 15표적화 OX40 리간드 삼량체-함유 Fc 융합 항원 결합 분자의 기능 특성화
15.1 인간 FAP-발현 종양 세포에 대한 결합
WM-266-4(ATTC CRL-1676)를 사용하여 세포 표면 FAP에 대한 결합을 검사하였다. 0.5 x 105개의 WM-266-4 세포를 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각 웰에 가하였다. 4℃에서 어두운 상태에서 적정된 항-Ox40 항체 구조물을 함유하는 4℃ 차가운 FACS 완충액(DPBS(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 14190 326) w/BSA(0.1% v/w, 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 A9418)) 50 ㎕/웰에서 120 분동안 세포를 염색하였다. 과량의 FACS 완충액으로 3회 세척한 후에, 4℃에서 어두운 상태에서 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109 096 098)을 함유하는 4℃ 차가운 FACS 완충액 25 ㎕/웰에서 45 분동안 세포를 염색하였다.
플레이트를 최종적으로 0.2 ㎍/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 90 ㎕/웰 FACS-완충액에 재현탁하고, 같은 날 5-레이저 LSR-포르테사(BD 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 47a에 나타낸 바와 같이, 1가 FAP(28H1) 표적화 분할 삼량체 Ox40 리간드 Fc(kih) 융합 항원 결합 분자(FAP-OX40L)은 인간 FAP-발현 표적 세포에 효과적으로 결합되었지만, 음성 대조군 F는 그렇지 않았다. FAP 양성 WM-266-4에 대한 결합의 EC50 값은 [6.9 nM]이었다.
15.2 OX40 및 FAP 음성 종양 세포에 대한 결합
OX40 음성 FAP 음성 종양 세포에 대한 결합의 결여를, 핵에 제한된 누크라이트 레드 형광 단백질을 발현하는 A549 누크라이트(상표) 레드 세포(에센바이오사이언스(Essenbioscience), 카탈로그 번호 4491)를 사용하여 검사하였다. 모 A549(ATCC CCL-185)를, 표준 에센(Essen) 프로토콜에 따라서 8 ㎍/mL 폴리브렌의 존재하에 3(TU/세포)의 MOI에서 에센 셀플레이어 누크라이트 레드 렌티바이러스(Essen CellPlayer NucLight Red Lentivirus)(에센바이오사이언스, 카탈로그 번호 4476; EF1α, 퓨로마이신)으로 형질도입시켰다.
FACS 완충액 중의 5 x 104개의 비표지된 WM266-4 세포와 비표지된 A549 누크라이트(상표) 레드 세포의 혼합물을 환저 현탁 세포 96-웰의 각 웰에 가하고, 섹션 15.1에서 기술된 바와 같이 결합 분석을 수행하였다.
도 47b에 나타낸 바와 같이, FAP-OX40L은 OX40 음성 FAP 음성 인간 종양 세포에 결합하지 않았다.
15.3 인간 OX40 발현 세포: 나이브 및 활성화 인간 말초혈 단핵 백혈구(PBMC)에 대한 결합
취리히 헌혈 센터에서 백혈구연층을 수득하였다. 신선한 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 단리하기 위해, 백혈구연층을 동일 부피의 DPBS(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 14190 326)로 희석하였다. 50 mL 폴리프로필렌 원심분리관(TPP, 카탈로그 번호 91050)에 15 mL 히스토파크 1077(시그마 라이프 사이언스, 카탈로그 번호 10771, 폴리슈크로스 및 나트륨 디아트리조에이트, 1.077 g/mL의 밀도로 조정)을 넣고, 백혈구연층 용액을 히스토파크 1077 위에 적층시켰다. 상기 관들을 400 x g, 실온에서 및 낮은 가속하에 중단하지 않고 30 분동안 원심분리하였다. 그 후에, PBMC를 계면으로부터 수거하고, DPBS로 3회 세척하고, 10% 태아 소 혈청(FBS, 깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 16000-044, Lot 941273, 감마선-조사되고, 마이코플라스마가 없고 56℃에서 35 분동안 열 불활성화됨), 1%(v/v) 글루타맥스-I(깁코 바이 라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 35050 038), 1 mM 나트륨-피루베이트(시그마, 카탈로그 번호 S8636), 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산(시그마, 카탈로그 번호 M7145) 및 50 μM β-머캅토에탄올(시그마, M3148)로 보충된 RPMI 1640 배지(깁코 바이 라이프 테코놀로지스, 카탈로그 번호 42401-042)로 이루어진 T 세포 배지에 재현탁하였다.
PBMC는 단리한 후에 직접 사용하거나(휴지 인간 PBMC 상에서의 결합), 또는 T 세포의 세포 표면 상에서 강한 인간 Ox40 발현을 수용하도록 이들을 자극시켰다(활성화 인간 PBMC 상에서의 결합). 따라서, 나이브 PBMC를, 37℃ 및 5% CO2에서, 6-웰 조직 배양 플레이트에서 200　U/mL 프로류킨(노바티스) 및 2 ㎍/mL PHA-L(시그마-알드리치, L2769-10)로 보충된 T 세포 배지에서 4 일동안 배양한 다음, 200　U/mL 프로류킨이 보충된 T 세포 배지에서 예비-코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트[4 ㎍/mL] 항-인간 CD3(클론 OKT3, 이바이오사이언스, 카탈로그 번호 16-0037-85) 및 [2 ㎍/mL] 항-인간 CD28(클론 CD28.2, 이바이오사이언스, 카탈로그 번호 16-0289-85)]에서 밤새 배양하였다.
Ox40의 검출을 위해 나이브 인간 PBMC와 활성화 인간 PBMC를 혼합하였다. 활성화 인간 PBMC로부터 나이브 세포의 구별을 가능하게 하기 위해, 나이브 세포를 표지화한 후, 이플르오르670 세포 증식 지시염료(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 65-0840-85)를 사용하여 결합 분석을 수행하였다.
표지화를 위해, 세포를 수거하고, 예열된(37℃) DPBS로 세척하고, DPBS 중에 1 x 107 세포/mL의 세포 밀도로 조정하였다. 이플루오르670 세포 증식 지시염료(이바이오사이언스, 카탈로그 번호65-0840-85)를 나이브 인간 PBMC의 현탁액에 DPBS 중 2.5 mM의 최종 농도 및 0.5 x 107 세포/mL의 최종 세포 밀도로 첨가하였다. 이어서, 세포를 실온에서 어두운 상태에서 10 분동안 배양하였다. 표지화 반응을 중단시키기 위해, 4 mL 열 불활성 FBS를 첨가하고, 세포를 T 세포 배지로 3회 세척하였다. 이어서, 1 x 105 휴지 이플루오르670 표지된 인간 PBMC와 0.5 x 105 비표지화된 활성화 인간 PBMC의 2:1 혼합물을 환저 현탁 세포 96-웰 플레이트(그레이너 바이오-원, 셀스타, 카탈로그 번호 650185)의 각 웰에 첨가하였다.
4℃에서 어두운 상태에서, 적정된 항-Ox40 항체 구조물을 함유하는 4℃ 차가운 FACS 완충액 50 ㎕/웰에서 120 분동안 세포를 염색하였다. 과량의 FACS 완충액으로 3회 세척한 후에, 4℃에서 어두운 상태에서, 형광 표지된 항-인간 CD4(클론 RPA-T4, 마우스 IgG1 k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300532), 항-인간 CD8(클론 RPa-T8, 마우스 IgG1k, 바이오레전드, 카탈로그 번호 3010441) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 어피니퓨어 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 카탈로그 번호 109-096-098)의 혼합물을 함유하는 4℃ 차가운 FACS 완충액 25 ㎕/웰에서 45 분동안 세포를 염색하였다.
플레이트를 최종적으로 0.2 ㎍/mL DAPI(산타 크루즈 바이오텍, 카탈로그 번호 Sc-3598)를 함유하는 90 ㎕/웰 FACS-완충액에 재현탁하고, 같은 날 5-레이저 LSR-포르테사(BD 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 48A 및 48B에 나타낸 바와 같이, FAP-OX40L은, OX40에 대해 음성인 휴지 인간 CD4+ T-세포 또는 CD8+ T-세포에 결합하지 않았다. 대조적으로, FAP-OX40L은, OX40을 발현하는 활성화 CD8+ 또는 CD4+ T-세포에 결합하였다. CD4+ T-세포에 대한 결합이 CD8+ T 세포에 대한 결합보다 훨씬 더 강하였다. 활성화 인간 CD8+ T 세포는 활성화 CD4+ T 세포 상에서 검출된 OX40 수준의 일부만을 발현한다. OX40에 대한 발현 수준은 자극의 동역학 및 강도에 따라 달라지고, 여기서 조건들은 CD4+ T 세포 상에서의 OX40 발현에 최적화되었지만, CD8+ T 세포에 대해서는 그렇지 않았다. 따라서, CD8 T 세포상에서는 단지 약간의 OX40 발현만이 유도되었다. OX40 양성 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 대한 결합의 EC50 값은 [0.15 nM]이었다.
15.4 인간 OX40 및 리포터 유전자 NFκB-루시퍼라제를 발현하는 HeLa 세포에서 NFκB 활성화
Ox40의 리간드에 대한 작용성 결합은 핵 인자 카파 B(NFκB)의 활성화에 의해 하류 신호전달을 유도한다[A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972]. 재조합 리포터 세포주 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1을 그 표면에서 인간 Ox40을 발현하도록 제조하였다. 또한, 상기 세포주는 NFκB-민감성 인핸서 절편의 조절하에 루시퍼라제 유전자를 함유하는 리포터 플라스미드를 함유한다. Ox40 유발은, 핵에서 전위되는 NFκB의 용량-의존성 활성화를 유도하고, 이때 상기 Ox40은 리포터 플라스미드의 NFκB 민감성 인핸서상에서 결합하여 루시퍼라제 단백질의 발현을 증가시킨다. 루시퍼라제는 루시페린-산화를 촉진시켜 빛을 방출하는 옥시루시페린을 생성한다. 이것은 발광광도계에 의해 정량화될 수 있다. 따라서, HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 리포터 세포에서 NFκB 활성화를 유도하는 다양한 항-Ox40 분자의 능력을 생물활성에 대한 척도로서 분석하였다.
부착성 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 세포를 37℃에서 세포 해리 완충액(인비트로겐, 카탈로그 번호 13151-014)을 사용하여 10 분동안 수거하였다. 세포를 DPBS로 1회 세척하고, MEM(인비트로겐, 카탈로그 번호 22561-021), 10%(v/v) 열-불활성화된 FBS, 1 mM 나트륨-피루베이트 및 1%(v/v) 비필수 아미노산으로 이루어진 분석 배지중에 1.33 x 105의 세포 밀도로 조정하였다. 세포를 뚜껑이 있는 멸균 백색 96-웰 평저 조직 배양 플레이트(그레이너 바이오-원, 카탈로그 번호 655083)에 웰 당 0.2 x 105 세포의 밀도로 접종하고, 37℃ 및 5% CO2 에서 배양기(헤라(Hera) 세포 150)에서 밤새 유지하였다.
다음 날, 적정된 FAP-Ox40L 또는 음성 대조군 F를 함유하는 분석 배지를 첨가하여 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1을 5 시간동안 자극하였다. 항-Ox40 항체 상에서의 초가교결합의 효과를 검사하기 위해, 2차 항체 항-인간 IgG Fcγ-단편-특이적 염소 IgG F(ab')2 단편(잭슨 이뮤노리서치, 109-006-098)을 함유하는 25 ㎕/웰의 배지를 1:2 비로(1차 항체보다 2배 더 많은 2차 항체) 첨가하였다. 배양 후에, 상등액을 흡인하고, 플레이트를 DPBS로 2회 세척하였다. 광방출의 정량화는 루시퍼라제 100 분석 시스템 및 리포터 용해 완충액(둘 다 프로메가, 카탈로그 번호 E4550 및 카탈로그 번호 E3971)을 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행하였다. 간략하게, 30 ㎕/웰의 1x 용해 완충액을 첨가하여 -20℃에서 10 분동안 세포를 용해시켰다. 세포를 37℃에서 20 분동안 해동한 후 90 ㎕/웰의 제공된 루시퍼라제 분석 시약을 첨가하였다. 광방출은, 모든 파장을 수집하는 어떤 필터도 없이, 500 분의 적분 시간을 이용하여 스펙트라맥스 M5/M5e 마이크로플레이트 리더(몰레큘라 디바이시즈, USA)로 즉시 정량화하였다. 방출된 상대적 광 단위(URL)는 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 세포의 기본 발광에 의해 보정하였으며, 프리즘4(그래프패드 소프트웨어, USA)를 사용하여 대수적 1차 항체 농도에 대해 블롯화하였다. 곡선들은 고유의 S자형 용량 반응을 이용하여 적합화시켰다.
도 49에 나타낸 바와 같이, 리포터 세포주에 FAP-Ox40L(왼쪽)의 첨가에 의해 제한된 용량 의존성 NFκB 활성화가 이미 유도되었다. 항-인간 IgG 특이적 2차 항체에 의한 FAP-Ox40L의 초가교결합은 NFκB-매개된 루시퍼라제-활성화를 농도-의존성 방식으로 증가시켰다(오른쪽).
따라서, 본 발명자들은 FAP+ 종양 세포주에 의한 구조물들의 초가교결합을 갖는 FAP-Ox40L의 NFκB 활성화 능력을 검사하였다.
검사된 종양 세포주는 NIH/3T3-huFAP 클론 39였다. NIH/3T3-huFAP 클론 39는, 마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3 세포주(ATCC CRL-1658)를 발현 벡터 pETR4921로 형질감염시켜 huFAP를 1.5　㎍/mL 퓨로마이신 선택하에 발현시킴으로써 제조하였다. FAP의 표면 발현은 퀴피키트(Quifikit)(다코(Dako) 카탈로그 번호 K0078)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 정량화하였다. 세포 표면 FAP 발현을 검출하기 위해 사용된 1차 항체는 인간/마우스 교차반응성 클론 F11-24(마우스 IgG1, 칼바이오켐(Calbiochem), 카탈로그 번호 OP188)이었다. NIH/3T3-huFAP 클론 39 상에서의 표면 발현은 세포 당 약 90000 huFAP이었다.
본원에서 상기 기술된 바와 같이, 부착성 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 세포를 0.2 x 105 세포/웰의 세포 밀도에서 밤새 배양하고, 적정된 FAP-Ox40L을 함유하는 분석 배지로 5 시간동안 자극하였다. 세포 표면 FAP 결합에 의한 초가교결합의 효과를 검사하기 위해, FAP+ 종양 세포 NIH/3T3-huFAP 클론 39를 함유하는 배지 25 ㎕/웰을 3 대 1 비(웰 당 리포터 세포보다 3배만큼 많은 FAP+ 종양 세포)로 공-배양하였다. 루시퍼라제 100 분석 시스템 및 리포터 용해 완충액(둘 다 프로메가, 카탈로그 번호 E4550 및 카탈로그 번호 E3971)을 사용하여 광방출을 측정함으로써 활성화 NFκB를 정량화하였다.
도 50A에 나타낸 바와 같이, FPA-발현 종양 세포의 존재는 FAP-Ox40L이 첨가되었을 때 NFκB-매개된 루시퍼라제-활성화의 유도를 강하게 증가시켰다. 각각의 블롯화된 용량-반응 곡선의 곡선하면적을 각 구조물의 작용 능력에 대한 마커로서 정량화하였다. 도 50A에 나타낸 바와 같이, 세포 표면에 제공된 FAP의 존재는 Fc 특이적 2차 항체의 첨가보다 FAP-Ox40L의 더 높은 가교결합 및 따라서 더 우수한 효과를 보장하였다.
15.5 최적이하로 TCR 유발된 휴지 인간 PBMC의 OX40 매개된 동시자극 및 세포 표면 FAP에 의한 초가교결합
실시예 15.4에는 FAP+ 종양 세포의 첨가가 OX40 수용체의 강한 올리고머화를 제공함으로써 인간 Ox40 양성 리포터 세포주에서 FAP 표적화 OX40L에 의해 유도된 NFκB 활성을 강하게 증가시킬 수 있음을 나타내었다. 유사하게, 본 발명자들은 FAP-OX40L 구조물들을 NIH/3T3-huFAP 클론　39 세포의 존재하에서 휴지 인간 PBMC 세포의 최적이하 TCR 자극을 해제시키는 그의 능력에 대해 검사하였다.
인간 PBMC 제제는 (1) 휴지 Ox40 음성 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 (2) 그의 세포 표면 상에 다양한 Fc-γ 수용체 분자를 갖는 항원 제공 세포, 예를 들면, B 세포 및 단핵구를 함유한다. 인간 IgG1 이소타입의 항-인간 CD3 항체는 그의 Fc 부분과 함께, 존재하는 Fc-γ 수용체 분자에 결합하고 휴지 Ox40 음성 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 지연된 TCR 활성화를 매개할 수 있다. 이어서, 상기 세포들은 수시간 내에 Ox40을 발현하기 시작한다. Ox40에 대한 기능성 작용성 화합물들은 활성화된 CD8+ 및 CD4+ T 세포 상에 존재하는 Ox40 수용체를 통해 신호를 전달하고 TCR-매개된 자극을 촉진할 수 있다.
휴지 CFSE-표지된 인간 PBMC를 방사선조사된 FAP+ NIH/3T3-huFAP 클론　39 세포 및 적정된 FAP-Ox40L의 존재하에서 최적이하 농도의 항-CD3 항체로 5 일동안 자극하였다. T-세포 생존 및 증식에 대한 효과는 총 세포 수의 모니터링 및 유동세포분석에 의해 살아있는 세포내 CFSE 희석의 모니터링을 통해 분석하였다.
마우스 배아 섬유아세포 NIH/3T3-huFAP 클론　39 세포(실시예 15.4 참조)를 37℃에서 세포 해리 완충액(인비트로겐, 카탈로그 번호 13151-014)을 사용하여 10 분동안 수거하였다. 세포를 DPBS로 1회 세척하였다. NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포를, 37℃ 및 5% CO2에서 배양기(헤라 세포 150)에서 멸균 96-웰 환저 부착 조직 배양 플레이트(TPP, 카탈로그 번호 92097)에서 T 세포 배지중 0.2 x 105 세포/웰의 밀도로 밤새 배양하였다. 다음 날, 종양 세포주에 의한 인간 PBMC의 말기 과성장을 방지하기 위해 4500 RAD의 선량을 사용하여 엑스레이 방사선조사기에서 조사하였다.
인간 PBMC를 실시예 15.3에 기술된 바와 같이 피콜 밀도 원심분리에 의해 단리하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 10 분동안 [50 nM]의 최종 농도에서 CFDA-SE(시그마-알드리치, 카탈로그 번호 2188)를 사용하여 1 x 106 세포/mL의 세포 밀도에서 CFSE로 표지화하였다. 그 후에, 세포를 FBS(10% v/v)를 함유하는 과량의 DPBS로 2회 세척하였다. 표지된 세포를 37℃에서 30 분동안 T-세포 배지중에서 휴지시켰다. 그 후에, 비-전환된 CFDA-SE를 DPBS를 사용한 추가의 2회 세척 단계에 의해 제거하였다. CFSE 표지된 휴지 인간 PBMC를 0.5 x 105 세포/웰의 밀도에서 각 웰에 첨가하였다. [20 nM]의 최종 농도의 항-인간 CD3 항체(클론 V9, 인간 IgG1, 문헌[Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992)] 및 미국 특허 제 6,054,297 호에 기술됨) 및 FAP-OX40L을 지시된 농도로 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 배양기(헤라 세포 150)에서 세포를 5일동안 활성화시켰다. 이이서, 세포를 4℃에서 형광 염료-접합된 항체 항-인간 CD4(클론 RPA-T4, 바이오레전드, 카탈로그 번호 300532) 및 CD8(클론 RPa-T8, 바이오레전드, 카탈로그 번호 3010441)으로 20 분동안 표면-염색시켰다. FACS 완충액을 사용한 세척 단계 후에, 세포를 85 ㎕/웰의 FACS 완충액에 재현탁하고 5-레이저 포르테사 유동세포분석기(BD 바이오사이언스 위드 디바 소프트웨어)를 사용하여 획득하였다.
도 51에 나타낸 바와 같이, 존재하는 NIH/3T3-huFAP 클론 39 세포에 의한 FAP-OX40L 구조물들의 초가교결합은 TCR 자극된 인간 CD4 및 CD8 T 세포에서 증식(위쪽 "이벤트" 그래프 참조) 및 생존(아래쪽 "증식" 그래프 참조)을 촉진하였다. 인간 CD8+ T 세포 상에서의 OX40의 보다 낮은 발현과 함께, FAP-OX40L의 작용물질 효과는 CD4+ T 세포상에서보다 CD8+ T 세포상에서 덜 강하였다.
인용문헌:
Ascierto, P. A., E. Simeone, M. Sznol, Y. X. Fu, and I. Melero (2010), Clinical experiences with anti-CD137 and anti-PD1 therapeutic antibodies. Semin Oncol 37:508-516.
Aggarwal B.B. (2003), Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nat. Rev. Immunol. 3(9),745-56.
Banner D. et al (1993), Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation. Cell 73, 431-445.
Bodmer J., Schneider P. and Tschopp, J. (2002), The molecular architecture of the TNF superfamily. Trends in Biochemical Sciences 27(1), 19-26.
Broll, K., Richter, G., Pauly, S., Hofstaedter, F., and Schwarz, H. (2001). CD137 expression in tumor vessel walls. High correlation with malignant tumors. Am J Clin Pathol 115, 543-549.
Buechele, C., Baessler, T., Schmiedel, B.J., Schumacher, C.E., Grosse-Hovest, L., Rittig, K., and Salih, H.R. (2012). 4-1BB ligand modulates direct and Rituximab-induced NK-cell reactivity in chronic lymphocytic leukemia. Eur J Immunol 42, 737-748.
Choi, B.K., Kim, Y.H., Kwon, P.M., Lee, S.C., Kang, S.W., Kim, M.S., Lee, M.J., and Kwon, B.S. (2009). 4-1BB functions as a survival factor in dendritic cells. J Immunol 182, 4107-4115.
Cuadros, C., Dominguez, A.L., Lollini, P.L., Croft, M., Mittler, R.S., Borgstrom, P., and Lustgarten, J. (2005). Vaccination with dendritic cells pulsed with apoptotic tumors in combination with anti-OX40 and anti-4-1BB monoclonal antibodies induces T cell-mediated protective immunity in Her-2/neu transgenic mice. Int J Cancer 116, 934-943.
Curran, M.A., Kim, M., Montalvo, W., Al-Shamkhani, A., and Allison, J.P. (2011). Combination CTLA-4 blockade and 4-1BB activation enhances tumor rejection by increasing T-cell infiltration, proliferation, and cytokine production. PLoS One 6, e19499.
Diehl, L., van Mierlo, G.J., den Boer, A.T., van der Voort, E., Fransen, M., van Bostelen, L., Krimpenfort, P., Melief, C.J., Mittler, R., Toes, R.E., and Offringa, R. (2002). In vivo triggering through 4-1BB enables Th-independent priming of CTL in the presence of an intact CD28 costimulatory pathway. J Immunol 168, 3755-3762.
Dubrot, J., Milheiro, F., Alfaro, C., Palazon, A., Martinez-Forero, I., Perez-Gracia, J.L., Morales-Kastresana, A., Romero-Trevejo, J.L., Ochoa, M.C., Hervas-Stubbs, S., et al. (2010). Treatment with anti-CD137 mAbs causes intense accumulations of liver T cells without selective antitumor immunotherapeutic effects in this organ. Cancer Immunol Immunother 59, 1223-1233.
Futagawa, T., Akiba, H., Kodama, T., Takeda, K., Hosoda, Y., Yagita, H., and Okumura, K. (2002). Expression and function of 4-1BB and 4-1BB ligand on murine dendritic cells. Int Immunol 14, 275-286.
Guo, Z., Cheng, D., Xia, Z., Luan, M., Wu, L., Wang, G., and Zhang, S. (2013). Combined TIM-3 blockade and CD137 activation affords the long-term protection in a murine model of ovarian cancer. J Transl Med 11, 215.
Heinisch, I.V., Daigle, I., Knopfli, B., and Simon, H.U. (2000). CD137 activation abrogates granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-mediated anti-apoptosis in neutrophils. Eur J Immunol 30, 3441-3446.
Hornig, N., Kermer, V., Frey, K., Diebolder, P., Kontermann, R.E., Mueller, D. (2012), Combination of a bispecific antibody and costimulatory antibody-ligand fusion proteins for targeted cancer immunotherapy. J. Immunother. 35, 418-429.
Ju, S.A., Cheon, S.H., Park, S.M., Tam, N.Q., Kim, Y.M., An, W.G., and Kim, B.S. (2008). Eradication of established renal cell carcinoma by a combination of 5-fluorouracil and anti-4-1BB monoclonal antibody in mice. Int J Cancer 122, 2784-2790.
Kienzle, G., and von Kempis, J. (2000). CD137 (ILA/4-1BB), expressed by primary human monocytes, induces monocyte activation and apoptosis of B lymphocytes. Int Immunol 12, 73-82.
Kim, D.H., Chang, W.S., Lee, Y.S., Lee, K.A., Kim, Y.K., Kwon, B.S., and Kang, C.Y. (2008). 4-1BB engagement costimulates NKT cell activation and exacerbates NKT cell ligand-induced airway hyperresponsiveness and inflammation. J Immunol 180, 2062-2068.
Kim, Y.H., Choi, B.K., Oh, H.S., Kang, W.J., Mittler, R.S., and Kwon, B.S. (2009). Mechanisms involved in synergistic anticancer effects of anti-4-1BB and cyclophosphamide therapy. Mol Cancer Ther 8, 469-478.
Kwon, B.S., and Weissman, S.M. (1989). cDNA sequences of two inducible T-cell genes. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 1963-1967.
Lee, H., Park, H.J., Sohn, H.J., Kim, J.M., and Kim, S.J. (2011). Combinatorial therapy for liver metastatic colon cancer: dendritic cell vaccine and low-dose agonistic anti-4-1BB antibody co-stimulatory signal. J Surg Res 169, e43-50.
Levitsky, V., de Campos-Lima, P.O., Frisan, T., and Masucci, M.G. (1998). The clonal composition of a peptide-specific oligoclonal CTL repertoire selected in response to persistent EBV infection is stable over time. J Immunol 161, 594-601.
Li, F., and Ravetch, J.V. (2011). Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies. Science 333, 1030-1034.
Lin, W., Voskens, C.J., Zhang, X., Schindler, D.G., Wood, A., Burch, E., Wei, Y., Chen, L., Tian, G., Tamada, K., et al. (2008). Fc-dependent expression of CD137 on human NK cells: insights into "agonistic" effects of anti-CD137 monoclonal antibodies. Blood 112, 699-707.
Melero, I., Johnston, J.V., Shufford, W.W., Mittler, R.S., and Chen, L. (1998). NK1.1 cells express 4-1BB (CDw137) costimulatory molecule and are required for tumor immunity elicited by anti-4-1BB monoclonal antibodies. Cell Immunol 190, 167-172.
Melero, I., Shuford, W.W., Newby, S.A., Aruffo, A., Ledbetter, J.A., Hellstrom, K.E., Mittler, R.S., and Chen, L. (1997). Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 3, 682-685.
Merchant, A.M., Zhu, Z., Yuan, J.Q., Goddard, A., Adams, C.W., Presta, L.G., and Carter, P. (1998). An efficient route to human bispecific IgG. Nat Biotechnol 16, 677-681.
Morales-Kastresana, A., Sanmamed, M.F., Rodriguez, I., Palazon, A., Martinez-Forero, I., Labiano, S., Hervas-Stubbs, S., Sangro, B., Ochoa, C., Rouzaut, A., et al. (2013). Combined immunostimulatory monoclonal antibodies extend survival in an aggressive transgenic hepatocellular carcinoma mouse model. Clin Cancer Res 19, 6151-6162.
Mueller, D., Frey, K., Kontermann, R.E. (2008), A novel antibody-4-1BBl fusion protein for targeted costimulation in cancer immunotherapy, J. Immunother. 31, 714-722.
Murillo, O., Dubrot, J., Palazon, A., Arina, A., Azpilikueta, A., Alfaro, C., Solano, S., Ochoa, M.C., Berasain, C., Gabari, I., et al. (2009). In vivo depletion of DC impairs the anti-tumor effect of agonistic anti-CD137 mAb. Eur J Immunol 39, 2424-2436.
Narazaki, H., Zhu, Y., Luo, L., Zhu, G., and Chen, L. (2010). CD137 agonist antibody prevents cancer recurrence: contribution of CD137 on both hematopoietic and nonhematopoietic cells. Blood 115, 1941-1948.
Nishimoto, H., Lee, S.W., Hong, H., Potter, K.G., Maeda-Yamamoto, M., Kinoshita, T., Kawakami, Y., Mittler, R.S., Kwon, B.S., Ware, C.F., et al. (2005). Costimulation of mast cells by 4-1BB, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, with the high-affinity IgE receptor. Blood 106, 4241-4248.
Olofsson, P.S., Soderstrom, L.A., Wagsater, D., Sheikine, Y., Ocaya, P., Lang, F., Rabu, C., Chen, L., Rudling, M., Aukrust, P., et al. (2008). CD137 is expressed in human atherosclerosis and promotes development of plaque inflammation in hypercholesterolemic mice. Circulation 117, 1292-1301.
Palazon, A., Teijeira, A., Martinez-Forero, I., Hervas-Stubbs, S., Roncal, C., Penuelas, I., Dubrot, J., Morales-Kastresana, A., Perez-Gracia, J.L., Ochoa, M.C., et al. (2011). Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res 71, 801-811.
Schwarz, H., Valbracht, J., Tuckwell, J., von Kempis, J., and Lotz, M. (1995). ILA, the human 4-1BB homologue, is inducible in lymphoid and other cell lineages. Blood 85, 1043-1052.
Shao, Z., and Schwarz, H. (2011). CD137 ligand, a member of the tumor necrosis factor family, regulates immune responses via reverse signal transduction. J Leukoc Biol 89, 21-29.
Shi, W., and Siemann, D.W. (2006). Augmented antitumor effects of radiation therapy by 4-1BB antibody (BMS-469492) treatment. Anticancer Res 26, 3445-3453.
Simeone, E., and Ascierto, P.A. (2012). Immunomodulating antibodies in the treatment of metastatic melanoma: the experience with anti-CTLA-4, anti-CD137, and anti-PD1. J Immunotoxicol 9, 241-247.
Snell, L.M., Lin, G.H., McPherson, A.J., Moraes, T.J., and Watts, T.H. (2011). T-cell intrinsic effects of GITR and 4-1BB during viral infection and cancer immunotherapy. Immunol Rev 244, 197-217.
Stagg, J., Loi, S., Divisekera, U., Ngiow, S.F., Duret, H., Yagita, H., Teng, M.W., and Smyth, M.J. (2011). Anti-ErbB-2 mAb therapy requires type I and II interferons and synergizes with anti-PD-1 or anti-CD137 mAb therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 7142-7147.
Teng, M.W., Sharkey, J., McLaughlin, N.M., Exley, M.A., and Smyth, M.J. (2009). CD1d-based combination therapy eradicates established tumors in mice. J Immunol 183, 1911-1920.
von Kempis, J., Schwarz, H., and Lotz, M. (1997). Differentiation-dependent and stimulus-specific expression of ILA, the human 4-1BB-homologue, in cells of mesenchymal origin. Osteoarthritis Cartilage 5, 394-406.
Wei, H., Zhao, L., Li, W., Fan, K., Qian, W., Hou, S., Wang, H., Dai, M., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E., and Guo, Y. (2013). Combinatorial PD-1 blockade and CD137 activation has therapeutic efficacy in murine cancer models and synergizes with cisplatin. PLoS One 8, e84927.
Wilcox, R.A., Chapoval, A.I., Gorski, K.S., Otsuji, M., Shin, T., Flies, D.B., Tamada, K., Mittler, R.S., Tsuchiya, H., Pardoll, D.M., and Chen, L. (2002). Cutting edge: Expression of functional CD137 receptor by dendritic cells. J Immunol 168, 4262-4267.
Wilcox, R.A., Tamada, K., Flies, D.B., Zhu, G., Chapoval, A.I., Blazar, B.R., Kast, W.M., and Chen, L. (2004). Ligation of CD137 receptor prevents and reverses established anergy of CD8+ cytolytic T lymphocytes in vivo. Blood 103, 177-184.
Zhang, N., Sadun, R.E., Arias, R.S., Flanagan, M.L., Sachsman, S.M., Nien, Y, Khawli, L.A., Hu, P., Epstein, A.L. (2007). Targeted and untargeted CD137L fusion proteins for the immunotherapy of experimental solid tumors. Clin. Cancer Res. 13, 2758-2767.
Zhang, X., Voskens, C.J., Sallin, M., Maniar, A., Montes, C.L., Zhang, Y., Lin, W., Li, G., Burch, E., Tan, M., et al. (2010). CD137 promotes proliferation and survival of human B cells. J Immunol 184, 787-795.
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Antigen Binding Molecules comprising a TNF family ligand trimer <130> P32429-WO <140> PCT/EP2015/076528 <141> 2015-11-13 <150> EP14193260.8 <151> 2014-11-14 <150> EP15183736.6 <151> 2015-09-03 <150> EP15188142.2 <151> 2015-10-02 <160> 375 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp 1 5 10 15 Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu 20 25 30 Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val 35 40 45 Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val 50 55 60 Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg 65 70 75 80 Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His 85 90 95 Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr 100 105 110 Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly 115 120 125 Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu 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ctatgaccat gattac 26 <210> 223 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 L1 forward constant <400> 223 tggtatctcc agaaaccggg tcagagcccg cag 33 <210> 224 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 34-36: 52% Y, 4% others, 37-39: 52% P, 4% others, 40-42: 42% V, 10% L, 4% others, 43-45: 52% H, 4% others, 46-48: 42% T, 10% I, 4% others, 49-51: 45% L, 11% G, 4% others <220> <221> misc_feature <222> (34)..(36) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (40)..(42) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (43)..(45) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (46)..(48) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(51) <223> n is a, c, g or t <400> 224 tttaatttcc agtttagttc cttgaccgaa ggtnnnnnnn nnnnnnnnnn nctgcagaca 60 atagtagacg ccaacgtctt cagc 84 <210> 225 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 L3 forward constant 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(83)..(85) <223> n is a, c, g or t <400> 226 ttggtgctag cagagcttac ggtcaccgtg gtaccttggc cccagtaatc aaannnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gcgtgcacaa tagtaaacag cggtgtc 107 <210> 227 <211> 1615 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAP tag human CD19 ECD- PDGFR DNA <400> 227 ggccgccgct agcggcatcg actacaagga cgacgatgac aaggccggca tcgatgccat 60 catggacaaa gactgcgaaa tgaagcgcac caccctggat agccctctgg gcaagctgga 120 actgtctggg tgcgaacagg gcctgcacga gatcaagctg ctgggcaaag gaacatctgc 180 cgccgacgcc gtggaagtgc ctgccccagc cgccgtgctg ggcggaccag agccactgat 240 gcaggccacc gcctggctca acgcctactt tcaccagcct gaggccatcg aggagttccc 300 tgtgccagcc ctgcaccacc cagtgttcca gcaggagagc tttacccgcc aggtgctgtg 360 gaaactgctg aaagtggtga agttcggaga ggtcatcagc taccagcagc tggccgccct 420 ggccggcaat cccgccgcca ccgccgccgt gaaaaccgcc ctgagcggaa atcccgtgcc 480 cattctgatc ccctgccacc gggtggtgtc tagctctggc gccgtggggg gctacgaggg 540 cgggctcgcc gtgaaagagt ggctgctggc ccacgagggc cacagactgg gcaagcctgg 600 gctgggtgat atccccgagg aacccctggt cgtgaaggtg gaagagggcg acaatgccgt 660 gctgcagtgc ctgaagggca cctccgatgg ccctacccag cagctgacct ggtccagaga 720 gagccccctg aagcccttcc tgaagctgtc tctgggcctg cctggcctgg gcatccatat 780 gaggcctctg gccatctggc tgttcatctt caacgtgtcc cagcagatgg gcggcttcta 840 cctgtgtcag cctggccccc catctgagaa ggcttggcag cctggctgga ccgtgaacgt 900 ggaaggatcc ggcgagctgt tccggtggaa cgtgtccgat ctgggcggcc tgggatgcgg 960 cctgaagaac agatctagcg agggccccag cagccccagc ggcaaactga tgagccccaa 1020 gctgtacgtg tgggccaagg acagacccga gatctgggag ggcgagcctc cttgcctgcc 1080 ccctagagac agcctgaacc agagcctgag ccaggacctg acaatggccc ctggcagcac 1140 actgtggctg agctgtggcg tgccacccga ctctgtgtct agaggccctc tgagctggac 1200 ccacgtgcac cctaagggcc ctaagagcct gctgagcctg gaactgaagg acgacaggcc 1260 cgccagagat atgtgggtca tggaaaccgg cctgctgctg cctagagcca cagcccagga 1320 tgccggcaag tactactgcc acagaggcaa cctgaccatg agcttccacc tggaaatcac 1380 cgccagaccc gtgctgtggc actggctgct gagaacaggc ggctggaagg tcgacgaaca 1440 aaaactcatc tcagaagagg atctgaatgc tgtgggccag gacacgcagg aggtcatcgt 1500 ggtgccacac tccttgccct ttaaggtggt ggtgatctca gccatcctgg ccctggtggt 1560 gctcaccatc atctccctta tcatcctcat catgctttgg cagaagaagc cacgt 1615 <210> 228 <211> 1620 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAP tag cynomolgus CD19 ECD- PDGFR DNA <400> 228 ccggccgccg ctagcggcat cgactacaag gacgacgatg acaaggccgg catcgatgcc 60 atcatggaca aagactgcga aatgaagcgc accaccctgg atagccctct gggcaagctg 120 gaactgtctg ggtgcgaaca gggcctgcac gagatcaagc tgctgggcaa aggaacatct 180 gccgccgacg ccgtggaagt gcctgcccca gccgccgtgc tgggcggacc agagccactg 240 atgcaggcca ccgcctggct caacgcctac tttcaccagc ctgaggccat cgaggagttc 300 cctgtgccag ccctgcacca cccagtgttc cagcaggaga gctttacccg ccaggtgctg 360 tggaaactgc tgaaagtggt gaagttcgga gaggtcatca gctaccagca gctggccgcc 420 ctggccggca atcccgccgc caccgccgcc gtgaaaaccg ccctgagcgg aaatcccgtg 480 cccattctga tcccctgcca ccgggtggtg tctagctctg gcgccgtggg gggctacgag 540 ggcgggctcg ccgtgaaaga gtggctgctg gcccacgagg gccacagact gggcaagcct 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gtctccaggg gaaagagcca 420 ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta gcagctactt agcctggtac caacagaaac 480 ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatg atgcatccaa cagggccact ggcatcccag 540 ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc agcctagagc 600 ctgaagattt tgcagtttat tactgtcagc agcgtagcaa ctggcctccc acagtgattc 660 cacatgaaac aaaaacccca acaagaccat cagtgtttac tagattatta taccagctgc 720 ttcctttaca gacagctagt ggggtggcca ctcagtgtta gcatctcagc tctatttggc 780 cattttggag ttcaagt 797 <210> 321 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (T84.66-LCHA) CDR-H1 <400> 321 Asp Thr Tyr Met His 1 5 <210> 322 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA(T84.66-LCHA) CDR-H2 <400> 322 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 323 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA(T84.66-LCHA) CDR-H3 <400> 323 Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr 1 5 10 <210> 324 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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catggcctat tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtcc 360 tctgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420 ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480 tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540 tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 332 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA(T84.66-LCHA) light chain DNA <400> 332 gagatcgtgc tgacccagag ccctgccacc ctgtcactgt ctccaggcga gagagccacc 60 ctgagctgta gagccggcga gagcgtggac atcttcggcg tgggatttct gcactggtat 120 cagcagaagc ccggccaggc ccccagactg ctgatctaca gagccagcaa ccgggccaca 180 ggcatccccg ccagattttc tggctctggc agcggcaccg acttcaccct gacaatcagc 240 agcctggaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agaccaacga ggacccctac 300 acctttggcc agggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac 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ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380 agagagggcc ctgagctgag ccctgatgat cctgccggac tgctggacct gcggcaggga 1440 atgtttgccc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500 agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560 aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620 agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680 agatctgctg ctggcgccgc tgctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 1740 gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800 aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860 ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagcagg cctgggaggc 1920 ggcggatctg gcggcggagg atctagagaa ggacccgagc tgtcccccga cgatcccgct 1980 gggctgctgg atctgagaca gggcatgttc gctcagctgg tggctcagaa tgtgctgctg 2040 attgacggac ctctgagctg gtactccgac ccagggctgg caggggtgtc cctgactggg 2100 ggactgtcct acaaagaaga tacaaaagaa ctggtggtgg ctaaagctgg ggtgtactat 2160 gtgttttttc agctggaact gaggcgggtg gtggctgggg agggctcagg atctgtgtcc 2220 ctggctctgc atctgcagcc actgcgctct gcagcagggg ctgcagcact ggccctgact 2280 gtggacctgc ccccagcttc ttccgaggcc agaaacagcg ccttcgggtt ccaaggacgc 2340 ctgctgcatc tgagcgccgg acagcgcctg ggagtgcatc tgcatactga agccagagcc 2400 cggcatgctt ggcagctgac tcagggggca actgtgctgg gactgtttcg cgtgacacct 2460 gagatcccag ccgggctc 2478 <210> 340 <211> 1914 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (T84.66-LCHA) Fc knob monomeric (71-248) 4-1BBL chain DNA <400> 340 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcagcag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt gcgccaggcc 120 cctggacagg gactggaatg gatgggcaga atcgaccccg ccaacggcaa cagcaaatac 180 gtgcccaagt tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcacctc caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc ccccttcggc 300 tactacgtgt ccgactacgc catggcctat tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtcc 360 tctgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgtctggtca agggcttcta ccccagcgat 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tactccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgagcct gagccccggc ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380 agagagggcc ctgagctgag ccctgatgat cctgccggac tgctggacct gcggcaggga 1440 atgtttgccc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500 agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560 aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620 agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680 agatctgctg ctggcgccgc tgctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 1740 gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800 aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860 ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttcctgccgg gctc 1914 <210> 341 <211> 826 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA (T84.66-LCHA) Fc hole dimeric 4-1BBL (71-248) chain <400> 341 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 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Asp Lys Val 225 230 235 240 Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val 245 250 255 Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys 260 265 270 Val Leu <210> 373 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu 4-1BBL (85-248) <400> 373 Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val 1 5 10 15 Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala 20 25 30 Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu 35 40 45 Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu 50 55 60 Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala 65 70 75 80 Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala 85 90 95 Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala 100 105 110 Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu 115 120 125 Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu 130 135 140 Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile 145 150 155 160 Pro Ala Gly Leu <210> 374 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu 4-1BBL (80-248) <400> 374 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 1 5 10 15 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 20 25 30 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 35 40 45 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 50 55 60 Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 85 90 95 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 100 105 110 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 115 120 125 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 130 135 140 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 145 150 155 160 Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu 165 <210> 375 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu 4-1BBL (52-248) <400> 375 Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser 1 5 10 15 Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly 20 25 30 Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn 35 40 45 Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu 50 55 60 Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu 85 90 95 Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu 100 105 110 Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu 115 120 125 Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser 130 135 140 Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg 145 150 155 160 Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln 165 170 175 Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu 180 185 190 Ile Pro Ala Gly Leu 195

Claims (58)

  1. (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자로서,
    이때, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (c) 안정하게 결합할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 도메인을 추가로 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
    를 포함하고,
    이때, (i) 제 1 폴리펩티드가 CH1 또는 CL 도메인을 함유하고 제 2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 각각 함유하고, 이때 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나,
    (ii) 상기 제 1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하고, 이때 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하거나, 또는
    (iii) 상기 제 1 폴리펩티드가 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 각각 함유하고, 이때 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1 및 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 제 1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로에 및 VH 또는 VL에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 리간드 계열 구성원이 인간 T-세포 활성화를 동시자극하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 리간드 계열 구성원이 4-1BBL 및 OX40L로부터 선택되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 리간드 계열 구성원이 4-1BBL인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 96, 서열번호 373, 서열번호 374 및 서열번호 375로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인이 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
    를 포함하고,
    이때, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
    (b) CH1 또는 CL 도메인을 함유하는 제 1 폴리펩티드 및 CL 또는 CH1 도메인을 함유하는 제 2 폴리펩티드 각각을 포함하되 상기 제 2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 다이설파이드 결합에 의해 상기 제 1 폴리펩티드에 결합하고,
    이때, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 단지 1개의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 항체 단편, Fab 분자, 교차 Fab 분자, 단일쇄 Fab 분자, Fv 분자, scFv 분자, 단일 도메인 항체, VH 및 스캐폴드 항원 결합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분자가 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개의 잔기를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 암배아 항원(CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군에서 선택되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 7 또는 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 8 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 9 또는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 10 또는 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 11 또는 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 12 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하거나, 또는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  18. 제 2 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  19. 제 2 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 위치 234 및 235(EU 번호) 및/또는 329(EU 번호)에서 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 Fc 도메인인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄,
    그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 제 2 중쇄 또는 경쇄에 융합된 제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드, 및
    그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 제 2 경쇄 또는 중쇄에 융합된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인을 포함하는 제 2 펩티드
    를 각각 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 펩티드가 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  22. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 펩티드가 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  23. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 펩티드 링커에 의해 서로에 연결된 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하는 제 1 펩티드가 그의 C-말단에서 제 2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 일부인 VH 도메인에 융합되고, 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 제 2 펩티드가 그의 C-말단에서 제 3 펩티드 링커에 의해 경쇄의 일부인 VL 도메인에 융합되는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 리간드 계열 구성원에 인접한 CL 도메인에서 위치 123(EU 번호)에서의 아미노산이 아르기닌(R)으로 치환되고 위치 124(EU 번호)에서의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, TNF 리간드 계열 구성원에 인접한 CH1 도메인에서 위치 147(EU 번호) 및 위치 213(EU 번호)에서의 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환된, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄,
    (b) 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
    서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  26. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 둘 다 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자를 포함하는 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄,
    (b) 서열번호 5, 서열번호 97, 서열번호 98 및 서열번호 99로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
    서열번호 1, 서열번호 96, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  27. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
    서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
    (ii) 서열번호 14, 서열번호 108, 서열번호 111 및 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
    (iii) 서열번호 15, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 112 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  28. 제 1 항 내지 제 20 항 및 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
    서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
    (ii) 서열번호 115, 서열번호 117, 서열번호 119 및 서열번호 173으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
    (iii) 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120 및 서열번호 174로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  29. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
    를 포함하고,
    이때, 상기 제 1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 함유하고 상기 제 2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 각각 함유하고, 상기 제 1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로에 및 CH3 도메인의 C-말단에 연결되는 TNF 리간드 계열 구성원의 2개의 엑토도메인 또는 그의 단편들을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된 상기 TNF 리간드 계열 구성원의 1개 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  30. 제 29 항에 있어서,
    표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 잔기를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  31. 제 29 항에 있어서,
    (i) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄,
    (ii) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
    (iii) 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  32. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 18 항 내지 제 26 항, 제 29 항 및 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원이 CD19인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  33. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 18 항 내지 제 26 항, 제 29 항, 제 30 항 및 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 195 또는 서열번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 196 또는 서열번호 253의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 197 또는 서열번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 198 또는 서열번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 199 또는 서열번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 200 또는 서열번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  34. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 18 항 내지 제 26 항, 제 29 항, 제 30 항, 제 32 항 및 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하거나, 또는 FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  35. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 18 항 내지 제 26 항 및 제 32 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
    서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
    (ii) 서열번호 14, 서열번호 108, 서열번호 111 및 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
    (iii) 서열번호 15, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 112 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  36. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 18 항 내지 제 26 항 및 제 32 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
    서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
    (ii) 서열번호 115, 서열번호 117, 서열번호 119 및 서열번호 173으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
    (iii) 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120 및 서열번호 174로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  37. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 29 항, 제 30 항 및 제 32 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄,
    (ii) 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄,
    (iii) 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 310의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
    (iv) 서열번호 313의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 314의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  38. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 18 항 내지 제 26 항, 제 29 항 및 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원이 CEA인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  39. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 18 항 내지 제 26 항, 제 29 항, 제 30 항 및 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 321의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 322의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 323의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 324의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 326의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  40. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 18 항 내지 제 26 항, 제 29 항, 제 30 항, 제 38 항 및 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  41. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 18 항 내지 제 26 항 및 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
    (ii) 서열번호 14, 서열번호 108, 서열번호 111 및 서열번호 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
    (iii) 서열번호 15, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 112 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  42. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 18 항 내지 제 26 항 및 제 38 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
    (ii) 서열번호 115, 서열번호 117, 서열번호 119 및 서열번호 173으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
    (iii) 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120 및 서열번호 174로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  43. 제 1 항 내지 제 14 항, 제 29 항, 제 30 항 및 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 337의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 338의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는
    (ii) 서열번호 341의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 서열번호 342의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  44. 제 1 항 내지 제 5 항, 제 10 항 내지 제 24 항, 제 29 항, 제 30 항, 제 32 항 내지 제 34 항 및 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 리간드 계열 구성원이 OX40L인, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  45. 제 1 항 내지 제 5 항, 제 10 항 내지 제 24 항, 제 29 항, 제 30 항, 제 32 항 내지 제 34 항, 제 38 항 내지 제 40 항 및 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF 리간드 계열 구성원의 엑토도메인이 서열번호 53 또는 서열번호 54의 아미노산 서열, 특히 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  46. 제 1 항 내지 제 5 항, 제 10 항 내지 제 24 항, 제 29 항, 제 30 항, 제 32 항 내지 제 34 항, 제 38 항 내지 제 40 항, 제 44 항 및 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 잔기, 및
    (b) 다이설파이드 결합에 의해 서로에 결합되는 제 1 및 제 2 폴리펩티드
    를 포함하고,
    이때, 상기 제 1 폴리펩티드가 서열번호 371 또는 서열번호 372의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제 2 폴리펩티드가 서열번호 53 또는 서열번호 54의 아미노산 서열을 각각 포함하는 것을 특징으로 하는,
    TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  47. 제 1 항 내지 제 5 항, 제 10 항 내지 제 24 항, 제 29 항, 제 30 항 및 제 44 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이고, FAP에 특이적으로 결합할 수 있는 잔기가 (i) 서열번호 7 또는 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 8 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열번호 9 또는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 (iv) 서열번호 10 또는 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (v) 서열번호 11 또는 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (vi) 서열번호 12 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  48. 제 1 항 내지 제 5 항, 제 10 항 내지 제 24 항, 제 29 항, 제 30 항 및 제 44 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄, 또는
    서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 제 1 경쇄,
    (ii) 서열번호 355로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및
    (iii) 서열번호 356의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄
    를 포함하는 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자.
  49. 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  50. 제 49 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
  51. 제 49 항의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 제 50 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  52. (i) 제 51 항의 숙주 세포를 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 및
    (ii) 상기 항원 결합 분자를 회수하는 단계
    를 포함하는, 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 제조 방법.
  53. 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  54. 제 1 항 내지 제 48 항 및 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로 사용하기 위한, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자, 또는 약학 조성물.
  55. 제 1 항 내지 제 48 항 및 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료에 사용하기 위한, TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자, 또는 약학 조성물.
  56. 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자의 용도.
  57. 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 따른 TNF 계열 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물을 치료 효과량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서,
    상기 질환이 암인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010062960A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Cedars-Sinai Medical Center METHODS OF DETERMINING RESPONSIVENESS TO ANTI-TNFα THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
MA38308B1 (fr) 2013-02-26 2022-09-30 Hoffmann La Roche Molécules de liaison à l'antigène bispécifiques activant des lymphocytes t
WO2014160883A1 (en) 2013-03-27 2014-10-02 Cedars-Sinai Medical Center Treating fibrosis and inflammation by inhibiting tl1a
US10316083B2 (en) 2013-07-19 2019-06-11 Cedars-Sinai Medical Center Signature of TL1A (TNFSF15) signaling pathway
PL3489256T3 (pl) 2014-11-14 2021-08-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Cząsteczki wiążące antygen zawierające trimer liganda z rodziny TNF
MA41460A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Oncomed Pharm Inc Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations
EP3973980A1 (en) 2015-03-31 2022-03-30 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
AR106188A1 (es) * 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CA2992853A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
MX2018003827A (es) * 2015-10-02 2018-06-22 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano con alta afinidad.
JP6937746B2 (ja) * 2015-10-02 2021-09-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ｃｄ１９×ｃｄ３ｔ細胞活性化抗原結合分子
PE20180950A1 (es) 2015-10-02 2018-06-11 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos especificos para un receptor de tnf coestimulador
CA2990755A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffman-La Roche Ag Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules
CA3004830A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Opi Vi- Ip Holdco Llc Composition and methods for anti-tnfr2 antibodies
WO2017118675A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
EP3430172A4 (en) 2016-03-17 2019-08-21 Cedars-Sinai Medical Center METHOD FOR DIAGNOSIS OF INFLAMMATORY ENDURANCE THROUGH RNASET2
WO2017194442A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
EP3243836A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
EP3243832A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
CN109952370B (zh) 2016-10-19 2023-09-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于产生免疫缀合物的方法
WO2018081074A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Cedars-Sinai Medical Center Neutralizing anti-tl1a monoclonal antibodies
TWI829628B (zh) * 2016-12-19 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與靶向4-1bb (cd137)促效劑併用之組合療法
KR102692708B1 (ko) * 2016-12-20 2024-08-07 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체 및 4-1bb(cd137) 작용물질의 병용 요법
CA3047070A1 (en) 2017-01-03 2018-07-12 F.Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
WO2018127916A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Kahr Medical Ltd. A pd1-cd70 fusion protein and methods of use thereof
US11130796B2 (en) 2017-01-05 2021-09-28 Kahr Medical Ltd. SIRPalpha-41BBL fusion protein and methods of use thereof
KR102597943B1 (ko) 2017-01-05 2023-11-06 카 메디컬 리미티드 Pd1-41bbl 융합 단백질 및 이의 이용 방법
WO2018151820A1 (en) * 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
CN110382542B (zh) 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
EP3601345A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
RU2761377C2 (ru) 2017-04-03 2021-12-07 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Иммуноконъюгаты антитела к pd-1 с мутантом il-2 или с il-15
JP6997212B2 (ja) 2017-04-05 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ１及びｌａｇ３に特異的に結合する二重特異性抗体
US11643473B2 (en) 2017-04-24 2023-05-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibody immune cell inhibitor fusion proteins
CN111246884A (zh) * 2017-11-01 2020-06-05 豪夫迈·罗氏有限公司 新颖的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
EP3502140A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
WO2019137552A1 (en) * 2018-01-15 2019-07-18 I-Mab MODIFIED Cκ AND CH1 DOMAINS
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
CN111683961A (zh) * 2018-03-13 2020-09-18 豪夫迈·罗氏有限公司 4-1bb激动剂与抗cd20抗体的治疗剂组合
SG11202007961QA (en) * 2018-04-13 2020-09-29 Hoffmann La Roche Her2-targeting antigen binding molecules comprising 4-1bbl
CA3098374A1 (en) 2018-04-25 2019-10-31 Prometheus Biosciences, Inc. Optimized anti-tl1a antibodies
EP3818082A1 (en) 2018-07-04 2021-05-12 F. Hoffmann-La Roche AG Novel bispecific agonistic 4-1bb antigen binding molecules
WO2020012485A1 (en) * 2018-07-11 2020-01-16 Kahr Medical Ltd. Pd1-4-1bbl variant fusion protein and methods of use thereof
MX2021000263A (es) * 2018-07-11 2021-05-12 Kahr Medical Ltd Proteina de fusion variante sirpalfa-4-1bbl y procedimientos de uso de la misma.
CN112955468B (zh) 2018-10-01 2024-08-09 豪夫迈·罗氏有限公司 包含抗fap克隆212的双特异性抗原结合分子
TWI839395B (zh) * 2018-10-09 2024-04-21 瑞士商Ｎｕｍａｂ治療公司 靶向cd137的抗體及其使用方法
JP2022514343A (ja) 2018-12-21 2022-02-10 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 腫瘍標的化アゴニストｃｄ２８抗原結合分子
TW202112804A (zh) 2019-06-04 2021-04-01 瑞士商分子夥伴股份有限公司 多特異性蛋白質
US20220259284A1 (en) * 2019-06-12 2022-08-18 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2 compositions and methods for tunable regulation
TW202115124A (zh) 2019-06-26 2021-04-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合至cea之新穎抗原結合分子
CN114026224B (zh) 2019-06-26 2024-03-15 豪夫迈·罗氏有限公司 具有sirt-1基因敲除的哺乳动物细胞系
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
IL292419A (en) 2019-10-24 2022-06-01 Prometheus Biosciences Inc Human antibodies to TNF-like ligand 1a (tl1a) and uses thereof
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
CN113512116B (zh) * 2020-04-10 2022-09-20 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
CN113234139A (zh) * 2020-04-17 2021-08-10 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 Tnfsf9基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
EP4149964A2 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Apogenix AG Multi-specific immune modulators
CA3153085A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cd19
IL298921A (en) 2020-07-10 2023-02-01 Hoffmann La Roche Antibodies that bind to cancer cells and direct radionuclides to said cells
CA3189520A1 (en) * 2020-07-24 2022-01-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the expression of an antibody-multimer-fusion
JP2024504931A (ja) 2021-01-12 2024-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がん細胞に結合し、放射性核種を前記細胞に標的化するスプリット抗体
AU2022207624A1 (en) 2021-01-13 2023-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy
AU2022231874A1 (en) 2021-03-09 2023-07-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugates and fap/4-1bb binding molecules
WO2022243261A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic cd40 antigen binding molecules targeting cea
EP4148067A1 (en) * 2021-09-08 2023-03-15 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the expression of an antibody-multimer-fusion
WO2023073225A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using a hla-a2/wt1 x cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
WO2023088889A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Apogenix Ag CD137 ligands
WO2023088876A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Apogenix Ag Multi-specific immune modulators
EP4448560A1 (en) 2021-12-14 2024-10-23 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer using a hla-a2/mage-a4 x cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
CN114426585B (zh) * 2022-02-15 2023-10-03 广东香雪干细胞再生医学科技有限公司 融合蛋白及其表达细胞株与应用
CN116462769A (zh) * 2022-04-02 2023-07-21 广东东阳光药业有限公司 一种嵌合受体及其应用
CN114805564B (zh) * 2022-06-10 2023-06-06 郑州大学 特异性识别SARS-CoV-2 S蛋白NTD区域的单克隆抗体及应用
WO2024056862A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for tumor-targeting of nk cells and use thereof
WO2024094741A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with anti-cd19/anti-cd28 bispecific antibody
WO2024184287A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of an anti-egfrviii/anti-cd3 antibody and an tumor-targeted 4-1bb agonist
WO2024188966A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using an anti-hla-g/anti-cd3 bispecific antibody and a 4‑1bb (cd137) agonist

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2808353C2 (de) 1977-04-18 1984-01-19 Hitachi Metals, Ltd., Tokyo Ohrring
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
JP2001521909A (ja) 1997-10-31 2001-11-13 ジェネンテク・インコーポレイテッド 糖タンパク質グリコフォームを含む方法及び組成物
EP1034298B1 (en) 1997-12-05 2011-11-02 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
NZ517906A (en) 1999-10-04 2003-01-31 Medicago Inc Cloning of genomic sequences encoding nitrite reductase (NiR) for use in regulated expression of foreign genes in host plants
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
JP2003531588A (ja) * 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
CA2421447C (en) 2000-09-08 2012-05-08 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
EP2180044A1 (en) 2001-08-03 2010-04-28 GlycArt Biotechnology AG Antibody glycosylation variants having increased anti-body-dependent cellular cytotoxicity
DE60232265D1 (de) 2001-10-25 2009-06-18 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
US20070010658A1 (en) 2002-10-29 2007-01-11 Holtet Thor L Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
CA2515100A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-19 Micromet Ag Trimeric polypeptide construct to induce an enduring t cell response
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
ES2319426T3 (es) 2003-07-04 2009-05-07 Affibody Ab Polipeptidos que presentan afinidad de union por her-2.
AU2003275958A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
ES2341009T3 (es) 2003-11-05 2010-06-14 Roche Glycart Ag Anticuerpos cd20 con afinidad de union a receptores fc y funcion efectora.
CN1946417A (zh) 2003-12-05 2007-04-11 阿德内克休斯治疗公司 2型血管内皮生长因子受体的抑制剂
ZA200608130B (en) 2004-03-31 2008-12-31 Genentech Inc Humanized anti-TGF-beta antibodies
EP1737891B1 (en) 2004-04-13 2013-03-06 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
ES2669510T3 (es) 2004-09-23 2018-05-28 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2013263717B2 (en) 2005-05-06 2016-05-19 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use
AU2011265482B2 (en) * 2005-05-06 2013-08-29 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use
EP1736482A1 (en) 2005-06-20 2006-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) Recombinant trimeric 4-1BBL
DE102005036542A1 (de) 2005-08-03 2007-02-08 Universität Stuttgart CTL-Prodrug
DK2059536T3 (da) 2006-08-14 2014-04-14 Xencor Inc Optimerede antistoffer, der er rettet mod cd19
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
EP2009022A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Apogenix GmbH Trimeric death ligands with enhanced activity (tenascin)
GB0718843D0 (en) 2007-09-26 2007-11-07 Cancer Rec Tech Ltd Materials and methods relating to modifying the binding of antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
CA2709847C (en) 2008-01-07 2018-07-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
CA2910512C (en) * 2008-07-21 2020-10-27 Apogenix Gmbh Tnfsf single chain molecules
WO2010037395A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cancer vaccines and immune monitoring
MX2012002014A (es) 2009-08-17 2012-06-13 Roche Glycart Ag Inmunoconjugados dirigidos.
AU2010303142B2 (en) 2009-09-29 2013-05-09 Roche Glycart Ag Bispecific death receptor agonistic antibodies
EP3798237A1 (en) 2010-03-05 2021-03-31 The Johns Hopkins University Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
US8552024B2 (en) 2010-08-13 2013-10-08 Hoffman-La Roche Inc. Azacyclic compounds
MA34519B1 (fr) 2010-08-13 2013-09-02 Roche Glycart Ag Anticorps anti-fap et procédés d'utilisation
TWI666027B (zh) 2011-02-10 2019-07-21 羅齊克雷雅公司 突變介白素-２多肽
SG193554A1 (en) 2011-03-29 2013-11-29 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
AU2012237456B2 (en) 2011-04-01 2017-06-29 Universitat Stuttgart Recombinant TNF ligand family member polypeptides with antibody binding domain and uses thereof
NZ729633A (en) 2012-04-30 2019-03-29 Biocon Ltd Targeted/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same
BR112015002085A2 (pt) 2012-08-08 2017-12-19 Roche Glycart Ag proteína, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produzir a proteína, composição farmacêutica, uso da proteína, método de tratamento e invenção
US20140242077A1 (en) * 2013-01-23 2014-08-28 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
MA38308B1 (fr) * 2013-02-26 2022-09-30 Hoffmann La Roche Molécules de liaison à l'antigène bispécifiques activant des lymphocytes t
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
MX2015014538A (es) 2013-05-07 2016-02-05 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigenos trimericas.
WO2015117930A1 (en) 2014-02-06 2015-08-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukine 10 immunoconjugates
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
MA40069A (fr) 2014-05-29 2021-04-14 Macrogenics Inc Molécules de liaison trispécifiques et leurs procédés d'utilisation
BR112016027845A2 (pt) 2014-05-29 2017-10-31 Medimmune Llc proteínas de fusão de ox40l e usos das mesmas
PL3489256T3 (pl) 2014-11-14 2021-08-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Cząsteczki wiążące antygen zawierające trimer liganda z rodziny TNF
EP3973980A1 (en) 2015-03-31 2022-03-30 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
JP7239320B2 (ja) 2015-10-02 2023-03-14 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 多重特異性抗体
PE20180950A1 (es) 2015-10-02 2018-06-11 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos especificos para un receptor de tnf coestimulador
JP6937746B2 (ja) 2015-10-02 2021-09-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ｃｄ１９×ｃｄ３ｔ細胞活性化抗原結合分子
MX2018003827A (es) 2015-10-02 2018-06-22 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano con alta afinidad.
JP7074665B2 (ja) 2015-10-07 2022-05-24 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激ｔｎｆ受容体に対する四価の二重特異性抗体発明の分野
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
EP3243836A1 (en) 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
EP3482170B1 (en) 2016-07-08 2020-02-12 Roche Diagnostics GmbH Apparatus for processing a laboratory sample, laboratory automation system and method for pipetting a laboratory sample
TWI829628B (zh) 2016-12-19 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與靶向4-1bb (cd137)促效劑併用之組合療法
KR102692708B1 (ko) 2016-12-20 2024-08-07 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체 및 4-1bb(cd137) 작용물질의 병용 요법
CA3047070A1 (en) 2017-01-03 2018-07-12 F.Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
PE20210844A1 (es) 2017-11-01 2021-05-10 Hoffmann La Roche Contorsbodies 2 + biespecificos
CN111246884A (zh) 2017-11-01 2020-06-05 豪夫迈·罗氏有限公司 新颖的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
CN111683961A (zh) 2018-03-13 2020-09-18 豪夫迈·罗氏有限公司 4-1bb激动剂与抗cd20抗体的治疗剂组合
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CN113677403B (zh) 2019-04-12 2024-12-27 豪夫迈·罗氏有限公司 包含脂质运载蛋白突变蛋白的双特异性抗原结合分子

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