ES2319426T3 - Polipeptidos que presentan afinidad de union por her-2. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido, que tiene afinidad de unión por HER-2 de manera que el valor K D de la interacción es como máximo de 1 x 10 -6 M y que está relacionado con un dominio de la proteína A del estafilococo (SPA), en el que la secuencia del polipéptido se corresponde con la secuencia de la proteína Z de la SPA, según se establece en la SEC ID NO:1, que consta de entre 3 a 20 mutaciones por sustitución, constando el polipéptido de por lo menos tres de las siguientes mutaciones por sustitución: (a) de fenilalanina a tirosina en la posición 13, (b) de tirosina a triptófano en la posición 14, (c) de glutamina a arginina en la posición 32 y (d) de lisina a tirosina en la posición 35.
Description
Polipéptidos que presentan afinidad de unión por
HER-2.
La presente invención se refiere a un nuevo
polipéptido, que se une al Receptor del Factor de Crecimiento
Epidérmico Humano 2 (en adelante referido como
HER-2). El polipéptido está relacionado con un
dominio de la proteína A del estafilococo (SPA) en que la secuencia
del polipéptido se corresponde con la secuencia del dominio de la
SPA teniendo por lo menos una mutación por sustitución. La presente
invención también se refiere al uso como medicamento de un
polipéptido de unión a HER-2, y más en concreto al
uso del mismo para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de formas de cáncer caracterizadas por la
sobre-expresión de HER-2.
Las moléculas relacionadas con la proteína Z,
derivadas del dominio B de la proteína A del estafilococo (SPA)
(Nilsson B et al. (1987) Protein Engineering 1,
107-133), han sido seleccionadas de una biblioteca
de tales moléculas aleatorias utilizando diferentes puntos de
interacción (ver, por ejemplo, WO95/19374; WO00/63243; Nord K et
al. (1995) Prot Eng 8:601-608; Nord K et
al. (1997) Nature Biotechnology 15, 772-777). Se
utilizaron diferentes moléculas diana para seleccionar tales
derivados de la proteína Z, por ejemplo, como las descritas en Nord
K et al. (1997, supra). Los experimentos descritos en
esta referencia resumen principios de la tecnología general para
seleccionar derivados de la proteína Z contra determinadas dianas,
en vez de ser un estudio con el objetivo expreso de obtener una
molécula con una afinidad suficientemente alta para su uso
específico en una aplicación biotecnológica o terapéutica. El
documento WO 02/08263 muestra a virus modificados que comprende de
un polipéptido basado en el dominio Z de la proteína A del
estafilococo y enseña que las posiciones 9, 10, 11, 13, 14, 17, 18,
24, 25, 27, 28, 32 y 35 del dominio Z se pueden variar.
El proto-oncogén
HER-2 codifica para la producción de una proteína
receptora de superficie celular de 185 kD conocida como proteína o
receptor HER-2 (Hynes NE et al. (1994)
Biochim Biophys Acta 1198:165-184). Este gen es
también a veces conocida como neu, HER-2/neu ó
c-erbB-2. El gen neu fue descubierto
por primera vez en ratas que habían sido tratadas con
etilnitrosourea, y que exhibían una mutación de este gen (Shih C
et al. (1981) Nature 290:261-264). El
resultado de la versión mutada del neu es la producción de una forma
constantemente activa del receptor, y
constituye un potente oncogén que puede transformar las células a bajo número de copias (Hynes NE et al., supra).
constituye un potente oncogén que puede transformar las células a bajo número de copias (Hynes NE et al., supra).
Las células normales expresan una cantidad
pequeña de la proteína HER-2 en sus membranas
plasmáticas en un patrón que es específico para cada tejido. Ningún
ligando conocido de HER-2 ha sido esclarecido; sin
embargo, se ha demostrado que HER-2 forma
heterodímeros con HER1 (el receptor del factor de crecimiento
epidérmico, EGFR), HER3 y HER4 en complejo con los ligandos para
estos receptores. Dicha formación de heterodímeros lleva a señales
del receptor HER-2 activado de transmisión para el
crecimiento de HER-2 desde el exterior de la célula
al núcleo, controlando así aspectos normales de crecimiento y
división de la célula (Sundaresan S et al. (1999) Curr Oncol
Rep 1:16-22).
En células tumorales, errores en el sistema de
reproducción del ADN pueden resultar en la existencia de múltiples
copias de un gen en un único cromosoma, un fenómeno conocido como
amplificación genética. La amplificación del gen
HER-2 lleva a una transcripción incrementada de este
gen. Esto eleva los niveles de ARNm de HER-2 e
incrementa la síntesis concomitante de la proteína
HER-2, que tiene como resultado una
sobre-expresión de la proteína
HER-2 en la superficie de estas células tumorales.
Esta sobre-expresión puede tener como resultado
unos niveles de proteína HER-2 que son de 10 a 100
veces mayores que los encontrados en las células normales
adyacentes. Esto, a su vez, tiene como resultado una división
celular incrementada y una tasa simultáneamente elevada del
crecimiento celular. La amplificación del gen HER 2 está implicada
en la transformación de células normales a un fenotipo canceroso
(Hynes NE et al., supra; Sundaresan S et al.,
supra).
Se cree que la sobre-expresión
de la proteína HER-2 tiene como resultado la
formación de homodímeros de HER-2, que a su vez
tiene resulta en un receptor constantemente activo (Sliwkowski MX
et al. (1999) Semin Oncol 26(4 Suppl
12):60-70). En estas condiciones, las señales que
promueven el crecimiento se podrían estar transmitiendo
constantemente al interior de las células en ausencia de ligandos.
Como consecuencia, se activan muchas vías intracelulares de
transducción de señales, teniendo como resultado un crecimiento no
regulado de las células y, en algunas ocasiones, una transformación
oncogénica (Hynes NE et al., supra). De esta manera, los
mecanismos de transducción de señales mediados por receptores de
factores de crecimiento son dianas importantes para la inhibición de
la reproducción celular y el crecimiento tumoral.
El cáncer de mama es el tumor más común entre
las mujeres en Estados Unidos, con un pronóstico de 192,200 nuevos
casos previstos para el 2001 (Greenlee R et al. (2001) CA
Cancer J Clin 51:15-36). En aproximadamente un 25%
de todas las pacientes de cáncer de mama, se da una
sobre-expresión del gen HER-2 debida
a una amplificación del mismo (Slamon DJ et al. (1989)
Science 244:707-712). Esta
sobre-expresión de la proteína HER-2
se asocia con varias variables con un pronóstico negativos,
incluyendo el estado negativo del receptor de estrógeno, fracción
alta de la fase S, el estado positivo de nódulos, el p53 mutada, y
el elevado grado nuclear (Sjogren S et al. (1998) J Clin
Oncol 16(2):462-469). Según Slamon et
al. (supra), la amplificación del gen
HER-2 se vio fuertemente asociada con una
supervivencia más breve sin una enfermedad y una supervivencia
general acortada en pacientes con nódulos linfáticos positivos.
Por estas razones, ha sido, y todavía es, un
objetivo importante continuar con las investigaciones sobre el papel
de HER-2 en la patogénesis y tratamiento del cáncer
de mama. La identificación de moléculas que interactúan con
HER-2 forma parte de este esfuerzo.
Estudios preclínicos in vitro han
examinado si la inhibición de la actividad de HER-2
podría afectar al crecimiento de las células tumorales. El
tratamiento de las células de cáncer de mama
SK-BR-3 que
sobre-expresan la proteína HER-2
con 4D5HER-2, uno de los varios anticuerpos
monoclonales anti-HER-2 murinos,
efectivamente inhibía la proliferación de las células tumorales,
comparado con el tratamiento con un anticuerpo monoclonal como
control. La administración de 4D5 a ratones padeciendo cánceres de
mama y ovarios humanos (como xenoinjertos) que
sobre-expresan HER-2, prolongaba su
tiempo de supervivencia libres de tumores. Estudios similares en
ratones demostraron una inhibición de crecimiento mediante
anticuerpos monoclonales antiHER-2 en xenoinjertos
de cáncer gástrico humano (Pietras RJ et al, (1994) Oncogene
9:1829-1838).
Entre los métodos de inhibir la proteína
HER-2 abundantemente presente en las superficies de
las células tumorales utilizando un anticuerpo, se ha puesto una
terapia comercialmente disponible desde hace pocos años. De esta
manera, el anticuerpo monoclonal 4D5, ó trastuzumab, está
comercializada por F Hoffman-La Roche y Genentech
con este propósito bajo el nombre comercial de Herceptin®.
A pesar de las obvias ventajas mostradas por la
terapia con anticuerpos contra cánceres caracterizados por una
sobre-expresión de la proteína
HER-2, se mantiene el hecho de que una variedad de
factores tienen el potencial de reducir la eficacia de los
anticuerpos (ver, por ejemplo, Reilly RM et al. (1995) Clin
Pharmacokinet 28:126-142). Éstos incluyen lo
siguiente: (1) penetración limitada del anticuerpo en un tumor
sólido de gran tamaño o en regiones vitales como el cerebro; (2)
reducida extravasación de los anticuerpos hacia los sitios de
interés debido a una permeabilidad vascular reducida; (3) una
reactividad cruzada y unión inespecífica del anticuerpo a tejidos
normales, reduciendo el efecto diana; (4) captación tumoral
heterogénea que tiene como resultado zonas no tratadas; (5)
incrementado metabolismo de los anticuerpos inyectados, que reduce
los efectos terapéuticos; y (6) rápida formación de HAMA
(anticuerpos humanos anti-ratón) y anticuerpos
humanos anti-humanos, que inactivan el anticuerpo
terapéutico.
Además, efectos tóxicos han sido el obstáculo
principal en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos para el
cáncer (Carter P (2001) Nat Rev Cancer 1:118-129;
Goldenberg DM (2002) J Nucl Med 43:693-713; Reichert
JM (2002) Curr Opin Mol Ther 4:110-118). La
reactividad cruzada con tejidos sanos puede causar considerables
efectos secundarios para anticuerpos no conjugados (desnudos), cuyos
efectos secundarios pueden ser potenciados al conjugar los
anticuerpos con toxinas o radioisótopos. Las complicaciones mediadas
por las reacciones inmunológicas incluyen disnea por efectos
tóxicos a nivel pulmonar, complicaciones ocasionales del sistema
nervioso central y periférico, y funciones renal y hepática
disminuidas.
Ocasionalmente, se dan complicaciones tóxicas
inesperadas, como los efectos cardiotóxicos asociados con
trastuzumab (Herceptin®), el anticuerpo especifico para
HER-2 (Schneider JW et al. (2002) Semin Oncol
29 (3 suppl 11):22-28). La
radio-inmunoterapia con anticuerpos conjugados con
isótopos también puede causar supresión de la médula ósea.
A pesar del reciente éxito clínico y comercial
de los anticuerpos anti-cancerígenos utilizados en
la actualidad, quedan todavía un número considerable de cuestiones
importantes referente al futuro de esta estrategia terapéutica.
Como consecuencia, el continuo disposición de agentes con una
afinidad comparable para HER-2 sigue siendo una
cuestión de considerable interés dentro del campo, así como la
disposición de usos de tales moléculas en el tratamiento de la
enfermedad.
Es un objetivo de la presente invención de
satisfacer este interés mediante la disposición de un polipéptido
que se caracteriza por una unión específica a
HER-2.
Un objetivo relacionado a la invención es un
polipéptido de unión a HER-2 que muestra una baja o
nula unión inespecífica.
Es otro objetivo de la invención proporcionar un
polipéptido de unión a HER-2 que pueda ser
fácilmente utilizado como fracción en un polipéptido de fusión.
Otro objetivo es la disposición de un
polipéptido de unión a HER-2, que resuelva uno o más
de los conocidos problemas experimentados con reactivos para
anticuerpos existentes.
Un objetivo adicional es la disposición de un
polipéptido de unión a HER-2, que es susceptible de
ser utilizado para aplicaciones terapéuticas.
Un objetivo relacionado es encontrar nuevas
formas para el tratamiento, inhibición y/o enfoque en el ámbito
clínico de las enfermedades cancerosas caracterizadas por una
sobre-expresión de la proteína
HER-2.
También es un objetivo proporcionar una molécula
que pueda ser utilizada como reactivo para la detección de
concentraciones bajas de HER-2.
Estos y otros objetivos son satisfechos por los
diferentes aspectos de la invención como se reivindica en las
reivindicaciones adjuntas. De esta manera, en un primer aspecto, la
invención proporciona un polipéptido, que tiene una afinidad de
unión para HER-2 de manera que el valor K_{D} de
la interacción es como máximo de 1 x 10^{-6} M y que está
relacionado con el dominio de la proteína A del estafilococo (SPA),
en el que la secuencia del polipéptido corresponde con la secuencia
Z de la proteína SPA, según se establece en la SEC ID NO:1,
constando entre 3 y 20 mutaciones por sustitución, y que el
polipéptido consta de por lo menos tres de las siguientes mutaciones
por sustitución:
(a) de fenilalanina a tirosina en la posición
13,
(b) de tirosina a triptófano en la posición
14,
(c) de glutamina a arginina en la posición 32
y
(d) de lisina a tirosina en la posición 35.
En otra realización, el polipéptido según la
invención se une específicamente al dominio extracelular, ECD, de la
proteína HER-2.
De acuerdo con lo presentado aquí, los presentes
inventores han descubierto que es posible obtener un polipéptido
con una unión de alta afinidad para HER-2 mediante
mutagénesis por sustitución de un dominio de la SPA, y que tal
polipéptido es capaz de interactuar con HER-2. Se
encuentran varias aplicaciones para el polipéptido de la invención
como una alternativa a los anticuerpos contra el
HER-2. A modo de ejemplos no limitativos, será útil
en el tratamiento de cánceres caracterizados por una
sobre-expresión de HER-2, en la
inhibición de la señalización celular mediante la unión a
HER-2 en la superficie celular, en el diagnóstico de
cáncer tanto in vivo como in vitro, en la dirección
de agentes hacia células que sobre-expresan
HER-2, en métodos histoquímicos para la detección
de HER-2, en métodos de separación y en otras
aplicaciones. El polipéptido según la invención puede resultar útil
en cualquier método que dependa de la afinidad de un reactivo para
HER-2. De esta manera, el polipéptido podría ser
utilizado como un reactivo de detección, como un reactivo de
capturación o como un reactivo de separación en dichos métodos, pero
también como un agente terapéutico por su propio derecho o como
medio de dirigir otros agentes terapéuticos hacia la proteína
HER-2. Los métodos que emplean el polipéptido según
la invención in vitro pueden ser llevados a cabo en
diferentes formatos, como en placas de microtitulación, en matrices
proteicas, sobre superficies de biosensores, sobre secciones de
tejido, etcétera. Pueden llevarse a cabo diferentes modificaciones
del, y/o adiciones al, polipéptido según la invención, para obtener
un polipéptido a medida para el uso específico que se desea, sin
irse del alcance de la presente invención. Tales modificaciones y
adiciones se describen más detalladamente a continuación, y pueden
constar de aminoácidos adicionales contenidos en la misma cadena
polipeptídica, o marcadores y/o agentes terapéuticos que son
químicamente conjugados o bien unidos al polipéptido según la
invención. Además, la invención también abarca segmento específicos
del polipéptido que conservan la capacidad de unión a
HER-2.
La "afinidad de unión por
HER-2" se refiere a la propiedad de un
polipéptido que puede ser sometido a ensayos, por ejemplo, mediante
el uso de la tecnología de resonancia de plasmón superficial, como
en un instrumento Biacore®. La afinidad de unión para
HER-2 puede ser sometida a ensayo en un experimento
en el que se inmoviliza HER-2 sobre un chip
sensorial del instrumento, y se pasa una muestra que contiene el
polipéptido por el chip para someterlo al ensayo. De manera
alternativa, el polipéptido a someter al ensayo se inmoviliza sobre
un chip sensorial del instrumento, y se pasa una muestra que
contiene HER-2 por el chip. Entonces, los
sensogramas obtenidos se pueden ser interpretados por una persona
experta p y por lo menos establecer una medida cualitativa de la
afinidad de unión del polipéptido para HER-2. Si se
busca una medida cuantitativa, por ejemplo con el propósito de
establecer un cierto valor de K_{D} para la interacción, es
nuevamente posible utilizar métodos de resonancia de plasmón
superficial. Los valores de unión pueden, por ejemplo, ser definidos
en un instrumento Biacore® 2000 (Biacore AB). Se inmoviliza
HER-2 sobre un chip sensorial del instrumento, se
preparan las muestras de polipéptido cuya afinidad va a ser
determinada con una dilución seriada y se inyectan en orden
aleatorio. Luego se pueden calcular a partir de los resultados los
valores de K_{D}, utilizando por ejemplo el modelo de Langmuir de
una 1:1 interacción del software BIAevaluation 3.2 proporcionado por
el fabricante del instrumento.
Como es indicado anteriormente, la secuencia del
polipéptido según la presente invención está relacionada con la
secuencia del dominio de la SPA en que han sido sustituidos de 1 a
20 residuos aminoácidos de dicho dominio de la SPA por otros
residuos aminoácidos. Sin embargo, las mutaciones por sustitución
introducidas no deberían afectar a la estructura básica del
polipéptido. Es decir, el plegamiento general del esqueleto
C_{\alpha} del polipéptido de la invención será esencialmente el
mismo que el del dominio de la SPA con el que está relacionado, por
ejemplo teniendo los mismos elementos de estructura secundaria en el
mismo orden, etc. De esta manera, los polipéptidos se clasifican
como aquellos que tienen el mismo plegamiento que el dominio de la
SPA si se comparten las propiedades estructurales básicas, dando
como resultando de esas propiedades, por ejemplo, en espectros de
CD similares. La persona experta es consciente de otros parámetros
que son relevantes. Este requisito de esencialmente conservar la
estructura básica del dominio de la SPA, tras la mutación del
mismo, establece restricciones sobre qué posiciones del dominio
pueden ser sometidas a sustitución. Cuando se empieza a partir de
la estructura conocida de la proteína Z, por ejemplo, es preferible
que sean sustituidos los residuos aminoácidos situados en la
superficie de la proteína Z, mientras que los residuos aminoácidos
enterrados en el núcleo del "haz de triple hélice" de la
proteína Z deberían mantenerse constantes para preservar las
propiedades estructurales de la molécula. El mismo razonamiento es
aplicable a otros dominios de la SPA, y segmentos específicos de los
mismos.
La invención también abarca polipéptidos en los
que el polipéptido de unión a HER-2 descrito
anteriormente está presente como un dominio de unión a
HER-2, al que han sido añadido residuos aminoácidos
adicionales en cualquier extremo terminal. Estos residuos
aminoácidos adicionales pueden jugar un papel en la unión de
HER-2 al polipéptido, pero igualmente pueden
servir para otros propósitos, relacionados por ejemplo con uno o más
de los siguientes: producción, purificación, estabilización,
acoplamiento o detección del polipéptido. Dichos residuos
aminoácidos adicionales pueden constar de uno o más residuos
aminoácidos añadidos para fines de acoplamientos químicos. Un
ejemplo de esto es la adición de un residuo de cisteína en la
primera posición o en la última posición en la cadena
polipeptídica, es decir, en el extremo N-terminal o
en el extremo C-terminal. Dichos residuos
aminoácidos adicionales pueden constar también de un "marcador"
para la purificación o detección del polipéptido, como un marcador
hexahistidil (His_{6}), o un marcador "myc" o un marcador
"flag" para interactuar con anticuerpos específicos para el
marcador. La persona experta es consciente de otras
alternativas.
Los "residuos aminoácidos adicionales"
analizados anteriormente pueden también constituir uno o más
dominios del polipéptido con cualquier función deseada, como la
misma función de unión que el primer dominio de unión a
HER-2, u otra función de unión, o una función
enzimática, o una función fluorescente, o mezclas de las mismas.
De esta manera, la invención abarca multímeros
de polipéptidos con afinidad para HER-2. Esto puede
ser interesante, por ejemplo cuando se usa el polipéptido según la
invención para el tratamiento de un cáncer o en un método de
purificación de HER-2, para obtener una unión a
HER-2 incluso más fuerte que la que es posible con
un solo polipéptido como descrito en esta invención. En este caso,
la disposición de un multímero, como un dímero, trímero o
tetrámero, del polipéptido puede proporcionar los efectos de avidez
necesarios. El multímero puede consistir en un número adecuado de
polipéptidos según la invención. Estos dominios del polipéptido
según la invención, que forman los monómeros en tal multímero,
pueden tener todos la misma secuencia de aminoácidos, pero es
igualmente posible que tengan diferentes secuencias de aminoácidos.
Las "unidades" del polipéptido ligadas al multímero según la
invención pueden estar conectadas por una unión covalente utilizando
métodos de química orgánica conocidos, o expresadas como uno o más
polipéptidos de fusión en un sistema para la expresión recombinante
de polipéptidos, o unidas de cualquier otra manera, bien
directamente o mediante un agente ligante, por ejemplo un agente
ligante aminoácido.
Adicionalmente, también son contemplados
polipéptidos de fusión "heterogénicos", en los que el
polipéptido de unión a HER-2 constituye un primer
dominio, o un primer segmento especifico, y los segundos y otras
segmentos específicos tienen otras funciones además de la de unirse
a HER-2, y entran dentro del ámbito de la presente
invención. El segundo y otro segmento(s) especifico(s)
del polipéptido de fusión pueden constar de un dominio de unión
con afinidad para otra molécula diana diferente a
HER-2. Dicho dominio de unión puede sin problema
también estar relacionado con un dominio de la SPA que tenga
mutaciones mediante la sustitución en las mismo posiciones de
entre la 1 y aproximadamente la 20. El resultado es entonces un
polipéptido de fusión que tiene por lo menos un dominio de unión a
HER-2 y por lo menos un dominio con afinidad para
dicha otra molécula diana, en el que ambos dominios están
relacionados con un dominio de la SPA. Esto hace posible crear
reactivos multiespecíficos que pueden utilizarse en varias
aplicaciones biotecnológicas, como cuando son utilizados como
agentes terapéuticos o como reactivos de captura, detección o
separación. La preparación de tales multímeros
multi-específicos de polipéptidos relacionados con
el dominio de la SPA, en los que por lo menos un dominio del
polipéptido tiene afinidad para HER-2, puede
llevarse a cabo como se ha descrito anteriormente para el multímero
de varias "unidades" de unión a HER-2. En
otras alternativas, el segundo u otro(s) segmento(s)
especifico(s) pueden constar de una proteína no relacionada,
natural o recombinante (o un segmento especifico de la misma que
conserva la capacidad de unión de la proteína natural o
recombinante) que tiene afinidad de unión por una diana. Un ejemplo
de tal proteína de unión, que tiene afinidad para la albúmina humana
y que puede ser utilizada como asociado para la fusión con el
dominio de la SPA de unión a HER-2 derivado de la
invención, es el dominio de unión a la albúmina de la proteína G
del estreptococo (SPG) (Nygren P-\ring{A} et
al. (1988) Mol Recogn 1:69-74). Por lo tanto un
polipéptido de fusión entre el polipéptido relacionado con el
dominio de la SPA de unión a HER-2 y el dominio de
unión a la albúmina de SPG entra dentro del alcance de la presente
invención. Cuando el polipéptido según la invención es administrado
a un sujeto humano como agente terapéutico o como agente diana, la
fusión del mismo con un segmento especifico que se une a la
albúmina, podría resultar beneficiosa, en que es probable que la
vida media in vivo de tal proteína de fusión resulte extensa
en comparación con la vida media del segmento especifico de unión
a HER-2 relacionada con el dominio de la SPA a solas
(este principio ha sido descrito en, por ejemplo, WO91/01743).
También se ha contemplado otras posibilidades
para la creación de polipéptidos de fusión. Como, por ejemplo, el
polipéptido relacionado con el dominio de la SPA de unión a
HER-2 según el primer aspecto de la invención se
podría acoplar covalentemente a un segundo u otro(s)
segmento(s) especifico(s) que, además de o, en vez
de, la función de unirse a una diana muestran otras funciones. Un
ejemplo es una fusión entre uno o más polipéptidos de unión a
HER-2 y un polipéptido enzimáticamente activo que
sirve como correspondiente o como fracción efectora. Ejemplos de
enzimas correspondientes, que pueden ser acopladas al polipéptido de
unión a HER-2 para formar una proteína de fusión,
son conocidos por la persona experta e incluyen enzimas tales como
la \beta-galactosidasa, la fosfatasa alcalina, la
peroxidasa de rábano, la carboxipeptidasa. Otras opciones para el
segundo y otro(s) segmento(s) especifico(s) de
un polipéptido de fusión según la invención incluyen polipéptidos
fluorescentes, tales como la proteína verde fluorescente, la
proteína roja fluorescente, luciferasa y variantes de las
mismas.
Otras opciones para el segundo y otro(s)
segmento(s) especifico(s) de un polipéptido de fusión
según la invención incluyen un segmento especifico o segmentos
específicos para aplicaciones terapéuticas. Para las aplicaciones
terapéuticas, otras moléculas también podrían unirse covalentemente
o no covalentemente y por otros medios al polipéptido de la
invención, Ejemplos no limitativos incluyen enzimas para
aplicaciones "ADEPT" (terapia profármaca de enzimas dirigidas
a anticuerpos) utilizando el polipéptido según la invención para
dirigir la enzima efectora (por ejemplo la carboxipeptidasa);
proteínas para el reclutamiento de células efectoras y otros
componentes del sistema inmune; citoquinas, tales como la
IL-2, IL-12, TNF_{\alpha},
IP-10; factores procoagulantes, como los factor del
tejido, los factores de von Willebrand; toxinas, tales como la
ricina A, las exotoxinas de Pseudomonas, la calicheamicina,
los maitansinoides; pequeñas moléculas tóxicas, como las análogas a
auristatina, la dexorubicina. También, se contemplaron los
aminoácidos adicionales anteriormente indicados (en particular el
marcador de hexahistidina, cisteína), proporcionado el objetivo de
acoplar queladores para radioisótopos a la secuencia del
polipéptido, para incorporar fácilmente nucleótidos emisores
para el diagnostico (por ejemplo ^{68}Ga, ^{76}Br, ^{111}In, ^{99}Tc, ^{124}I, ^{125}I) o para la terapia (por ejemplo ^{90}Y, ^{131}I, ^{211}At).
para el diagnostico (por ejemplo ^{68}Ga, ^{76}Br, ^{111}In, ^{99}Tc, ^{124}I, ^{125}I) o para la terapia (por ejemplo ^{90}Y, ^{131}I, ^{211}At).
La invención abarca polipéptidos en los que el
polipéptido de unión a HER-2 descrito anteriormente
ha sido provisto con un grupo marcador, como por lo menos un
fluoróforo, biotina o un isótopo radiactivo, por ejemplo para fines
de detección del polipéptido.
Con respecto a la descripción anterior de
proteínas de fusión que incorporan el polipéptido de unión a
HER-2 según la invención, se debe de advertir que
la denominación de primeros, segundos y otros segmentos específicos
se lleva a cabo por razones de claridad para distinguir entre el
segmento especifico o segmentos específicos de unión a
HER-2 por un lado, y los segmentos específicos que
muestran otras funciones por otro lado. Estas denominaciones no
tienen intención de referirse al orden real de los diferentes
dominios en la cadena polipeptídica de la proteína de fusión. De
esta manera, por ejemplo, dicho primer segmento especifico puede
aparecer sin restricción en el extremo N-terminal,
en la mitad, o en el extremo C-terminal de la
proteína de fusión.
Un ejemplo de un dominio de la SPA para su uso
como un punto de partida para la creación de un polipéptido según
la invención es la proteína Z, derivada del dominio B de la proteína
A del estafilococo. Como está especificado en el apartado de
Antecedentes, esta proteína ha sido previamente utilizada como
estructura de soporte o "scaffold" para la creación de
moléculas, denominadas moléculas Affibody®, capaces de unirse a una
variedad de dianas. La secuencia de 58 aminoácidos de la proteína Z
sin modificar, denominada Z_{wt}, se presenta en la SEC ID NO:1 y
se ilustra en la Figura 1.
En una forma de realización del polipéptido
según la invención, éste se relaciona con un dominio de la SPA en
que la secuencia del polipéptido se corresponde con la secuencia del
dominio de la SPA teniendo entre 4 a 20 mutaciones por sustitución.
Otras formas de realización pueden tener de 1 a 13 mutaciones por
sustitución, o de 4 a 13 mutaciones por sustitución.
En una forma de realización más específica del
polipéptido según la invención, su secuencia se corresponde con la
secuencia establecida en la SEC ID NO:1 teniendo entre 1 a 20
mutaciones por sustitución, así como entre 4 a 20, entre 1 a 13 o
entre 4 a 13 mutaciones por sustitución.
El polipéptido según la invención puede en
algunas formas de realización corresponderse con la secuencia
establecida en la SEC ID NO:1, cuya secuencia abarca de mutaciones
por sustitución en una o más de las posiciones 13, 14, 28, 32 y 35.
Adicionalmente, la secuencia del polipéptido según la invención
puede constar de mutaciones por sustitución en una o más de las
posiciones 9, 10, 11, 17, 18, 24, 25 y 27.
La secuencia de un polipéptido según otra forma
de realización de la invención se corresponde con la SEC ID NO:1,
abarcando de por lo menos una mutación por sustitución en la
posición 13 de fenilalanina a tirosina.
La secuencia de un polipéptido según otra forma
de realización de la invención se corresponde con la SEC ID NO:1,
abarcando de por lo menos una mutación por sustitución en la
posición 14 de tirosina a triptófano.
La secuencia de un polipéptido según otra forma
de realización de la invención se corresponde con la SEC ID NO:1,
abarcando de por lo menos una mutación por sustitución en la
posición 28 de asparagina a un residuo aminoácido seleccionado de
entre la arginina y la histidina, más preferentemente a
arginina.
La secuencia de un polipéptido según otra forma
de realización de la invención se corresponde con la SEC ID NO:1,
abarcando de por lo menos una mutación por sustitución en la
posición 32 de glutamina a arginina.
La secuencia de un polipéptido según otra forma
de realización de la invención se corresponde con la SEC ID NO:1,
abarcando de por lo menos una mutación por sustitución en la
posición 35 de lisina a tirosina.
La secuencia de un polipéptido según otra forma
de realización de la invención se corresponde con la SEC ID NO:1,
abarcando de por lo menos una mutación por sustitución en la
posición 10 de glutamina a arginina.
La secuencia de un polipéptido según otra forma
de realización de la invención se corresponde con la SEC ID NO:1,
abarcando de por lo menos una mutación por sustitución en la
posición 11 de asparagina a treonina.
La secuencia de un polipéptido según otra forma
de realización de la invención se corresponde con la SEC ID NO:1,
abarcando de por lo menos una mutación por sustitución en la
posición 17 de leucina a valina.
La secuencia de un polipéptido según otra forma
de realización de la invención se corresponde con la SEC ID NO:1,
abarcando de por lo menos una mutación por sustitución en la
posición 27 de arginina a un residuo aminoácido seleccionado de
entre la lisina y la serina.
Un polipéptido preferente según la invención se
corresponde con la SEC ID NO:1, abarcando de por lo menos las
siguientes mutaciones: F13Y, Y14W, N28R, Q32R y K35Y.
Ejemplos de secuencias específicas de diferentes
formas de realización del polipéptido según la invención, cada una
abarcando de una o más de las mutaciones específicas descritas
anteriormente, se presentan en la SEC ID NO:2-4 y
6-79 (la SEC ID NO:5 se lista únicamente para fines
ilustrativos) y se ilustran en la Figura 1. Las características de
unión a HER-2 de estos polipéptidos se describen en
los ejemplos que siguen a esta descripción general de la
invención.
Como alternativa a la utilización del dominio de
la SPA sin modificar, el dominio de la SPA puede también estar
sujeto a una mutagénesis para incrementar la estabilidad del mismo
en condiciones alcalinas. Dicha estabilización implica la
sustitución dirigida al sitio en la secuencia no modificada en que
se encuentre cualquier residuo de asparagina por residuos
aminoácidos que son menos sensibles a las condiciones alcalinas.
Cuando se utiliza el polipéptido según la invención como un ligando
de afinidad en una cromatografía de afinidad, esta propiedad de
tener una reducida sensibilidad a los álcalis proporciona
beneficios; las columnas de cromatografía de afinidad son
frecuentemente sometidas a tratamientos duros con álcali para su
limpieza in situ (CIP) entre los ciclos de separaciones, y
la capacidad de soportar dicho tratamiento prolonga la vida útil de
la matriz usada en la cromatografía por afinidad. Como ejemplo,
utilizando la proteína Z como punto de partida, el polipéptido
según la invención puede tener, además de las mutaciones por
sustitución que le confieren unión a HER-2,
modificaciones en que por lo menos un residuo de asparagina
seleccionado de entre N3, N6, N11, N21, N23, N28, N43 y N52 ha sido
sustituido con un residuo aminoácido que es menos sensible al
tratamiento alcalino. Ejemplos no limitativos de tales polipéptidos
son los que tienen los siguientes conjuntos de mutaciones (con
respecto a la secuencia de Z_{wt}): N3A; N6D; N3A, N6D y N23T;
N3A, N6D, N23T y N28A; N23T; N23T y N43E; N28A; N6A; N11S; N11S y
N23T; N6A y N23T. De esta manera, estos dominios de la SPA, al igual
que otros dominios de la SPA que han sido sometidos a mutación de
asparagina por razones de estabilidad, pueden ser todos sometidos a
posteriores mutaciones por sustitución de residuos aminoácidos para
obtener el polipéptido de unión a HER-2 de la
invención. De manera alternativa, un polipéptido de unión a
HER-2 de la invención que consta de residuos de
asparagina puede ser sometido a mutaciones adicionales para
sustituir dichos residuos. Evidentemente, esta última alternativa es
sólo posible si se conserva la capacidad de unión a
HER-2 de dicha molécula.
La invención también incluye polipéptidos que
han sido derivados de cualquiera de los polipéptidos descritos
anteriormente, a través de la generación de un fragmento de los
polipéptidos anteriores, que conserva la afinidad para
HER-2. El fragmento de polipéptido es tal que se
mantiene estable, y conserva la especificidad para unirse a
HER-2. La posibilidad de crear fragmentos de un
dominio del tipo salvaje de la SPA con especificidad de unirse a la
conservada inmunoglobulina G es mostrada por Braisted AC y Wells JA
et al. en Proc Natl Acad Sci USA
93:5688-5692 (1996). Usando un diseño basado en la
estructura y métodos de expresión mediante fagos, el dominio de la
unión de un haz de triple hélice de 59 residuos fue reducido a un
derivado resultante de doble hélice de 33 residuos. Esto se
consiguió mediante una selección a pasos de mutaciones aleatorias
en diferentes regiones, lo que causó una estabilidad y una afinidad
de unión que mejoraron iterativamente. Siguiendo el mismo
razonamiento con los polipéptidos según el primer aspecto de la
invención, la persona experta sería capaz de obtener un polipéptido
"minimizado" de unión a HER-2 con las mismas
propiedades de unión que las del polipéptido HER-2
"parental". Por lo tanto, un polipéptido que constituye un
segmento especifico de un polipéptido según el aspecto anterior de
la invención, un fragmento que conserva la afinidad de unión para
HER-2, es un aspecto adicional de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una molécula de ácido nucleico que abarca una secuencia que
codifica un polipéptido según la invención.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a un vector de expresión que abarca la molécula de ácido
nucleico del aspecto anterior, y otros elementos ácido nucleicos que
posibilitan la producción del polipéptido según la invención
mediante la expresión de la molécula de ácido nucleico.
Otro aspecto más de la presente invención se
refiere a una célula huésped que incluye el vector de expresión del
aspecto anterior.
Los tres últimos aspectos de la invención son
herramientas para la producción de un polipéptido según la
invención, y la persona experta será capaz de obtenerlos y ponerlos
en uso práctico sin excesivo esfuerzo, con la información acerca
del polipéptido a expresar dada en este documento y dado el actual
nivel de dominio de la técnica de expresión de proteínas
recombinantes. Como ejemplo, un plásmido puede ser utilizado para la
expresión de la proteína Z no modificada (ver por ejemplo Nilsson B
et al. (1987), supra) como el material de partida.
Las deseadas mutaciones por sustitución pueden introducirse en este
plásmido, utilizando técnicas conocidas, para obtener un vector de
expresión según la invención.
Sin embargo, el polipéptido según la invención
puede también ser producido por otros medios conocidos, incluyendo
síntesis química o expresión en diferentes huéspedes procariotas o
eucariotas, incluyendo plantas y animales transgénicos. Al utilizar
síntesis químicas de polipéptidos, cualquiera de los residuos
naturales de ácidos nucleicos que esté presente en el polipéptido
como descrito anteriormente pueden ser sustituidos por cualquier
residuo aminoácido que no se exprese naturalmente o un derivado del
mismo, siempre y cuando la capacidad de unión a
HER-2 del polipéptido no quede sustancialmente
comprometida. La capacidad de unión debería por lo menos ser
conservada, pero la sustitución con un residuo aminoácido que no se
exprese naturalmente o un derivado del mismo podría realmente
servir también para mejorar la capacidad de unión a
HER-2 del polipéptido. También, la incorporación de
un aminoácido que no se exprese naturalmente puede ser llevada a
cabo para proporcionar un espacio para el acoplamiento alternativo
de moléculas (por ejemplo marcadores, efectores, queladores, etc.)
al polipéptido de unión a HER-2. Los aminoácidos no
clásicos, o análogos sintéticos de aminoácidos, incluyen, pero no
se limitan a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido
\alpha-amino isobutírico, ácido
4-amino butírico, ácido 2-amino
butírico, ácido 6-amino hexanoico, ácido
2-amino isobutírico, ácido 3-amino
propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina,
sarcosina, citrulina, ácido cisteico,
t-butilglicina, t-butilalanina,
fenilglicina, ciclohexilalanina, \beta-alanina,
ácidos fluoro aminos, aminoácidos de diseño como aminoácidos
\beta-metil, aminoácidos
C\alpha-metil, aminoácidos
N\alpha-metil, y aminoácidos análogos en general.
Además, los residuos aminoácidos pueden presentarse en su forma D o
L.
La presente invención también tiene que ver con
diferentes aspectos del uso del polipéptido de unión a
HER-2 descrito anteriormente, así como varios
métodos para el tratamiento, diagnóstico y detección en los que el
polipéptido resulta ser útil debido a sus características de unión.
Cuando se hace referencia al "polipéptido de unión a
HER-2" en la siguiente descripción de estos usos
y métodos, este término pretende abarcar solo al polipéptido de
unión a HER-2, pero también a todas las moléculas
basadas en este polipéptido descrito anteriormente que por ejemplo
constituyen segmentos específicos del mismo y/o incorporan el
polipéptido de unión a HER-2 como un segmento
especifico en una proteína de fusión y/o están conjugadas con un
marcador o agente terapéutico y/o están provistas de residuos
aminoácidos adicionales para ser utilizados como marcador o para
otros propósitos. Como explicado anteriormente, dichas proteínas de
fusión, derivados, segmentos específicos, etcétera, forman parte de
la presente invención.
Es así que, por una parte, la invención
proporciona el uso como medicamento del polipéptido de unión a
HER-2 como es descrito en la presente memoria.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un uso del polipéptido de unión a HER-2
como es descrito en la presente memoria en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de por lo menos una forma de cáncer
caracterizada por la sobre-expresión de
HER-2. Una forma particular de cáncer caracterizada
por la sobre-expresión de HER-2 es
el cáncer de mama. Como es descrito en el apartado de Antecedentes,
aproximadamente el 25% de todas las pacientes con cáncer de mama
muestran una sobre-expresión de
HER-2 (Slamon DJ et al., supra).
Sin desear estar restringido por esta teoría, se
piensa que el polipéptido descrito en la presente memoria es útil
como agente terapéutico basándose en por lo menos uno de los
siguientes mecanismos: (i) Potenciar la quimioterapia (citotóxico),
en que la administración del polipéptido funcionará en sinergia con
existentes y venideras cromoterapias y terapias hormonales. Se ha
demostrado que el bloqueo de la proteína HER-2 en
las superficies celulares evita la reparación del ADN que sigue al
impacto que tienen los fármacos que dañan el ADN (Pietras RJ et
al. (1994) Oncogene 9:1829-1838). (ii)
Inhibición de la proliferación de células tumorales (citostático).
Este argumento se basa en la observación de que la regulación
descendente de la proteína HER-2 ocurre cuando una
molécula (anticuerpo) se une a la proteína HER-2 en
la superficie celular, provocando que algunos receptores sean
endocitosados, limitando la señal para un crecimiento adicional de
células (Baselga J et al. (1998) Cancer Res
58:2825-2831; Sliwkowski MX et al.,
supra).
Un aspecto relacionado con la presente invención
es la disposición de un método para el tratamiento de por lo menos
una forma de cáncer caracterizada por la
sobre-expresión de HER-2, método que
incluye la administración a un sujeto necesitado de dicho
tratamiento de una cantidad terapéuticamente efectiva de un
compuesto, que consta de un polipéptido de unión a
HER-2 como se describe en la presente memoria como
sustancia activa.
Las propiedades de unión a HER-2
del polipéptido según descrito en la invención, junto con la
adecuada creación de proteínas de fusión y/o moléculas de unión
marcadas por el polipéptido, significa que el polipéptido también
puede ser útil para dirigir otras sustancias activas hacia la
localidad de un tumor que incluye células que
sobre-expresan HER-2. De esta
manera, otro aspecto de la presente invención es la disposición de
un uso del polipéptido de unión a HER-2 como
descrito en la presente memoria, conjugado con una sustancia con
actividad anti-cancerígena para el envío de dicha
sustancia a células que sobre-expresan
HER-2. La sustancia conjugada también puede ser una
que funciona provocando una respuesta del sistema inmune endógeno
del sujeto. Las células Natural Killer (NK), u otros efectores del
sistema inmune, pueden ser atraídas hacia el complejo de
HER-2 y polipéptido de unión a
HER-2 en la superficie de las células mediante la
disposición de un segmento especifico de fusión que sirve para
reclutar dichos efectores. Las células NK u otros efectores,
habiendo detectado que la célula es anormal, se unen a la proteína
de unión a HER-2. Finalmente, la célula cancerosa es
consumida por las células NK (Sliwkowski MX et al., supra;
Pegram MD et al. (1997) Proc Am Assoc Cancer Res 38:602,
Abstract 4044).
Dicha sustancia activa puede ser una proteína
acoplada al polipéptido de unión a HER-2 mediante
fusión o mediante una unión química, como la escogida entre enzimas
efectoras para aplicaciones "ADEPT" (terapia con profármacos
de enzimas dirigidas a anticuerpos); proteínas para el reclutamiento
de células efectoras y otros componentes del sistema inmune;
citoquinas, tales como la IL-2,
IL-12, TNF\alpha, IP-10; factores
procoagulantes, tales como el factor de tejido, el factor von
Willebrand; toxinas, tales como la ricina A, la endotoxina del
Pseudomonas, la calicheamicina, los maitansinoides. De
manera alternativa, la sustancia activa puede ser un fármaco
citotóxico, como las análogas a la auristatina o la dexorubicina, o
un isótopo radiactivo (por ejemplo ^{90}Y, ^{131}I,
^{211}At), tal isótopo puede estar directamente asociado al
polipéptido de unión a HER-2, o asociado mediante un
agente quelante, tales como los queladores DOTA o DTPA bien
conocidos.
En un aspecto relacionado, la invención también
proporciona un método para dirigir una sustancia que tiene una
actividad anti-cancerosa hacia células que
sobre-expresan HER-2 in vivo,
abarcando la administración a un paciente de un conjugado de dicha
sustancia activa y un polipéptido de unión a HER-2
como descrito en la presente memoria. El conjugado es adecuado como
es descrito en el párrafo anterior.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
del polipéptido de unión a HER-2 como descrito en la
presente memoria para la detección de HER-2 en una
muestra. Por ejemplo, dicha detección puede llevarse a cabo con el
objetivo de diagnosticar estados de la enfermedad caracterizados por
una sobre-expresión de HER-2. La
detección de la presencia de HER-2 en una muestra
puede realizarse in vitro o in vivo. Una opción
preferente para el diagnóstico in vivo es la utilización de
una tomografía por emisión de positrones, PET. La muestra en
cuestión puede ser, por ejemplo, una muestra de un fluido biológico
o una muestra de tejido. Un método habitual, en uso hoy en día con
anticuerpos dirigidos contra HER-2, puede ser
adaptado para su uso con el polipéptido de unión a
HER-2 de la presente invención, es la detección
histoquímica de la presencia de HER-2 utilizada
para la identificación de la sobre-expresión de
proteína HER-2 en muestras de tejido fresco,
congelado, o fijado en formalina y embebido en parafina. con el fin
de detectar el HER-2, el polipéptido según la
invención puede ser utilizado nuevamente como parte de la proteína
de fusión, en la que el otro dominio es una enzima corresponsal o
enzima fluorescente. De manera alternativa, puede ser marcado
opcionalmente mediante un quelador con uno o más agentes
fluorescentes y/o isótopo(s) radiactivo(s).
Isótopos radiactivos adecuados incluyen ^{68}Ga, ^{76}Br, ^{111}In, ^{99}Tc, ^{124}I y ^{125}I.
Isótopos radiactivos adecuados incluyen ^{68}Ga, ^{76}Br, ^{111}In, ^{99}Tc, ^{124}I y ^{125}I.
Otro aspecto más de la presente invención está
constituido por el uso de un polipéptido de unión a
HER-2 como descrito en la presente memoria en un
método de detección de HER-2 en una muestra de flujo
biológico. Este método abarca los pasos de (i) proporcionar una
muestra para ser examinado de flujo biológico de un paciente, (ii)
aplicar un polipéptido de unión a HER-2 como
descrito en la presente memoria a la muestra en condiciones tales
que se posibilite la unión del polipéptido a cualquier
HER-2 presente en la muestra, (iii) retirar el
polipéptido no unido, y (iv) detectar el polipéptido unido. La
cantidad detectada de polipéptido unido se relaciona con la
cantidad de HER-2 presente en la muestra. En el paso
(ii), la aplicación de un polipéptido de unión a
HER-2 a la muestra puede ser realizada en cualquier
formato adecuado, e incluye por ejemplo la situación en la que el
polipéptido de unión a HER-2 está inmovilizado sobre
un soporte sólido que se pone en contacto con la muestra, como en
configuraciones en las que el polipéptido de unión a
HER-2 se presenta en solución.
Otro aspecto, relacionado, de la presente
invención es un método para la detección de HER-2 en
una muestra, que abarca los pasos de (i) proporcionar una muestra
de tejido sospechosa de contener HER-2, por ejemplo
una sección criostática de tejido o una sección de tejido embutida
en parafina, (ii) aplicar un polipéptido de unión a
HER-2 según la invención a dicha muestra en
condiciones que lleven el polipéptido a unirse a cualquier
HER-2 presente en la muestra, (iii) retirar el
polipéptido no unido, y (iv) detectar el polipéptido unido. La
cantidad de polipéptido unido detectado se relaciona con la cantidad
de HER-2 presente en la muestra.
También se proporciona en la presente invención
un kit para el diagnóstico de la sobre-expresión de
HER-2 en una muestra de tejido, que abarca el
polipéptido de unión a HER-2 según la invención
fusionado con una enzima corresponsal (como la fosfatasa alcalina o
la peroxidasa de rábano), reactivos para la detección de actividad
enzimática, y porta objetivos con tejidos de control positivo y
negativo.
También se proporciona en la presente invención
un kit para el diagnóstico de la sobre-expresión de
HER-2 en una muestra de tejido, que abarca el
polipéptido de unión a HER-2 según la invención
fusionado con un marcador para la detección mediante un anticuerpo
(como un marcador flag o marcador myc), un anticuerpo primario
específico para el marcador, un anticuerpo secundario específico
para el anticuerpo primario y conjugado con una enzima
corresponsal, reactivos para la detección de la actividad
enzimática, y porta objetivos de tejidos de control positivo y
negativo.
Un área dentro de las aplicaciones del
diagnóstico es la detección in vivo de las células cancerosas
o agregados de las mismas. La invención proporciona un kit para la
realización de dicho diagnóstico, abarcando el polipéptido de unión
a HER-2 según la invención marcado con un quelador,
un isótopo radiactivo para el diagnóstico (ejemplos no limitativos
son ^{68}Ga, ^{76}Br, ^{111}In, ^{99}Tc, ^{124}I y
^{125}I), y reactivos para el análisis de la eficiencia de
incorporación.
Como descrito anteriormente, la invención
incluye el uso del polipéptido de unión a HER-2
según la invención para dirigir sustancias activas hacia células
que sobre-expresan HER-2, tales como
ciertos tipos de células cancerosas. La invención también
proporciona un kit para este propósito, que abarca el polipéptido de
unión a HER-2 según la invención marcado con un
quelador, un isótopo radiactivo terapéutico (ejemplos no limitativos
son ^{90}Y, ^{131}I, ^{211}At), y reactivos para el análisis
de la eficiencia de incorporación.
La Figura 1 muestra una alineación de las
secuencias del listado de secuencias. Las posiciones de los
aminoácidos que han sido sometidos a modificación según la invención
en los polipéptidos Z_{HER-2} (representados por
la SEC ID NO:2-79) están indicadas en negrita.
La Figura 2 es una ilustración esquemática de la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión producido en el
Ejemplo 1. Z_{HER-2} representa un dominio de
unión a HER-2 con una secuencia seleccionada de SEC
ID NO:2-3 y el His_{6} representa un marcador
hexahistidil.
La Figura 3 muestra el resultado de la
electroforesis en gel de proteínas de fusión purificadas. Línea 1:
His_{6-}Z_{HER-2 A} (8,7 kDa); Línea 2:
His_{6-}Z_{HER-2 B} (8,7 kDa); M: marcador de
peso molecular (LMW-SDS Marker Kit, Amersham
Biosciences #17-0446-01).
La Figura 4 muestra sensogramas de Biacore
obtenidos tras la inyección de 10 \muM de la proteína de fusión
His_{6-}Z_{HER-2 A} sobre las superficies de un
chip sensorial que tienen inmovilizadas sobre ellas A:
HER-2, B: HIV-1 gp 120, y C: BB.
La Figura 5 muestra sensogramas de Biacore
obtenidos tras la inyección de 10 \muM de la proteína de fusión
His_{6-}Z_{HER-2 B} sobre las superficies de un
chip sensorial que tienen inmovilizadas sobre ellas A:
HER-2, B: HIV-1 gp 120, y C: BB.
La Figura 6 muestra sensogramas de Biacore
obtenidos tras la inyección de A: 1 \muM; B: 2 \muM; C: 5
\muM; D: 10 \muM, E: 20 \muM; F: 40 \muM de la proteína de
fusión His_{6-}Z_{HER-2 A} sobre la superficie
de un chip sensorial que tiene HER-2 inmovilizada
sobre ella.
La Figura 7 muestra sensogramas de Biacore
obtenidos tras la inyección de A: 1 \muM; B: 2 \muM; C: 5
\muM; D: 10 \muM, E: 20 \muM; F: 40 \muM de la proteína de
fusión His_{6-}Z_{HER-2 B} sobre la superficie
de un chip sensorial que tiene HER-2 inmovilizada
sobre ella.
La Figura 8A muestra sensogramas de Biacore
obtenidos tras la inyección de His_{6-}Z_{HER-2
A} en un sistema de células de flujo con
HER-2-ECD a las siguientes
concentraciones seleccionadas; 312,5 nM (rombos rellenos), 156,3 nM
(círculos rellenos), 78,2 nM (triángulos rellenos), 39,1 nM
(cuadrados vacíos), 19.6 nM (rombos vacíos), y 9,8 nM (círculos
vacíos).
La Figura 8B muestra sensogramas de Biacore
obtenidos tras la inyección de His_{6-}Z_{HER-2
B} en un sistema de células de flujo con
HER-2-ECD a las siguientes
concentraciones seleccionadas; 625 nM (cuadrados rellenos), 312,5 nM
(rombos rellenos), 156,3 nM (círculos rellenos), 78,2 nM (triángulos
rellenos), 39,1 nM (cuadrados vacíos) y 19,6 nM (rombos vacíos).
La Figura 9 muestra la especificidad de unión de
His_{6-}Z_{HER-2 A} a células
SKBR-3. Se dejó His_{6-}Z_{HER-2
A} marcada con ^{125}I unirse a células SKBR-3,
con una relación entre ligado:receptor Her-2
teóricamente estimada a un 5:1. Los valores son las medias de tres
medidas. Las barras de error representan desviaciones estándar.
La Figura 10 muestra sensogramas de Biacore
obtenidos tras la inyección de His_{6-}Z_{HER-2
A} purificada (cuadrados vacíos) e
His_{6-}(Z_{HER-2 A})_{2}
(cuadrados rellenos) sobre la superficie de un sistema de células de
flujo en un chip sensorial que contiene
HER-2-ECD acoplados mediante grupos
amino. Los valores "y" de las curvas han sido normalizados a
entre 0 y 100 Unidades de Resonancia. El gel insertado para
SDS-PAGE (gel homogéneo de un 16% sw
Tris-Glicina, condiciones reductoras) muestra la
His_{6-}Z_{HER-2 A} expresada y purificada
mediante IMAC (línea 1) y la
His_{6-}(Z_{HER-2 A})_{2} (línea
2). La línea M indica las proteínas marcadoras con masas moleculares
en kilodaltons.
La Figura 11 muestra una comparación de la
biodistribución de radio-actividad en ratones
desnudos con un tumor, 1 hora después de la inyección de
^{125}I-benzoato-(Z_{HER-2
A})_{2}. Bloqueado: datos para ratones
pre-inyectados con (Z_{HER-2
A})_{2}
sin marcar. No bloqueado: datos para ratones sin esta pre-inyección.
sin marcar. No bloqueado: datos para ratones sin esta pre-inyección.
La Figura 12 muestra una comparación de la
biodistribución de radio-actividad en ratones
desnudos con un tumor, 4 horas después de la inyección de
^{125}I-benzoato-(Z_{HER-2
A})_{2} (Z4dimer) o
^{125}I-benzoato-Z_{Taq}
(Ztaq4:5).
La Figura 13 muestra la biodistribución de yodo
radioactivo en ratones desnudos con un tumor, tras varios instantes
en el tiempo después de la inyección de
^{125}I-benzoato-(Z_{HER-2
A})_{2}. Se ha combinado datos de dos experimentos de
biodistribución. Los datos dados de 4 horas después de la inyección
son las medias de ambos experimentos.
La Figura 14 muestra la biodistribución de yodo
radioactivo en ratones desnudos con un tumor, 8 horas después de la
inyección de
^{125}I-benzoato-(Z_{HER-2
A})_{2}.
La Figura 15 muestra una comparación de la
concentración de radio-actividad en la sangre y
tumores. Los datos son combinados a partir de dos experimentos de
biodistribución. A: datos experimentales. B: curvas ajustadas usando
regresión no lineal con un modelo de decaimiento exponencial de dos
fases.
La Figura 16 muestra la relación de
concentración de radio-actividad entre un tumor y la
sangre. Los datos son combinados a partir de dos experimentos de
biodistribución.
La Figura 17 es una imagen de cuerpo completo
hecho con una cámara-\gamma de ratones desnudos
con un tumor (SKOV-3) 6 horas (ratón de la
izquierda) y 8 horas (ratón de la derecha) después de la inyección
intra-venosa del conjugado
^{125}I-benzoato-(Z_{HER-2
A})_{2} en la cola.
La Figura 18 muestra la biodistribución de la
radio-actividad en ratones desnudos con un tumor, 4
horas después de la inyección de
^{125}I-benzoato-Z_{HBR-2
A}.
La Figura 19 muestra la biodistribución de la
radio-actividad en ratones desnudos con un tumor, 24
horas después de la inyección de
^{125}I-benzoato-Z_{HER-2
A}.
La Figura 20 muestra la cinética del yodo
radioactivo en un tumor y la sangre de ratones desnudos con el tumor
tras varios instantes en el tiempo después de la inyección de
^{125}I-benzoato-Z_{HER-2
A}.
La Figura 21 muestra la relación de
radio-actividad entre el tumor y la sangre después
de la inyección de
^{125}I-benzoato-Z_{HER-2
A}.
La Figura 22 es una ilustración esquemática de
la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión producido en
el Ejemplo 6. Z_{HBR-2 A} representa el dominio de
unión a HER-2 con la secuencia que se muestra en SEC
ID NO:2 y ABD representa un dominio de unión a albúmina de la
proteína G del estreptococo.
La Figura 23 muestra la biodistribución de la
radio-actividad en ratones desnudos con un tumor, 12
horas (gris) y 24 horas (blanco) después de la inyección de
^{125}I-benzoato-ABD
(Z_{HER-2 A})_{2}.
La Figura 24 muestra la cinética del yodo
radioactivo en ratones desnudos con un tumor tras varios instantes
en el tiempo después de la inyección de (A): ^{125}I- _{ABD}
(Z_{HER-2 A})_{2}, (B):
^{125}I-(Z_{HER-2 A})_{2}, y (c):
^{125}I-Z_{HER 2 A}.
La Figura 25 muestra una comparación de la dosis
de
^{125}I-benzoato-Z_{HER-2
A}, ^{125}I-benzoato-(Z_{HER-2
A})_{2}, y ^{99m}TC-(Z_{HER-2
A})_{2}.
La Figura 26 muestra la biodistribución de la
radio-actividad en ratones desnudos con un tumor, 8
horas después de la inyección de
^{99m}TC-(Z_{HER-2 A})_{2}.
La Figura 27 muestra una comparación de la
radio-actividad en órganos seleccionados tomados de
ratones desnudos con un tumor, 8 horas después de la inyección de
^{99m}TC-(Z_{HER-2 A})_{2}.
La Figura 28 es un diagrama que muestra el
crecimiento de las células SKBR-3 después de su
exposición a ^{211}At-(Z_{HER-2 A})_{2}
durante 24 horas. Los círculos negros rellenos de la curva A
representan células no expuestas; los cuadrados vacíos de la curva B
representan células expuestas a un nivel moderado; y los cuadrados
grises rellenos de la curva D representan células expuestas a un
alto nivel de ^{211}At-(Z_{HER-2
A})_{2}. Los triángulos grises rellenos de la curva C
representan células expuestas a alto nivel de
^{211}At-(Z_{HER-2})_{2} combinado con
una cantidad 500 veces mayor de His_{6}-(Z_{HER-2
A})_{2} sin marcar. Los valores son las medias de tres
experimentos, las barras de error representan la desviación
estándar.
Las Figuras 29A y 29B muestran los resultados de
un ABAS ELISA para determinar la actividad de unión de clones
escogidos de las cuartas y quintas rondas de selección de
maduración por afinidad.
La Figura 30 es una ilustración esquemática de
la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión producido en
los Ejemplos 9 y 10. Z_{HER-2} representa un
polipéptido de unión a HER-2 según el primer aspecto
de la invención, e His_{6} representa un marcador
hexahistidil.
La Figura 31 es un conjunto trazado de varios
sensogramas obtenidos a partir de 10 polipéptidos de unión a
HER-2 madurados por afinidad según la invención,
después de ser inyectados sobre una superficie cubierta con
HER-2 a una concentración aproximada de 50 nM. A:
Z_{HER-2:205}; B: Z_{HER-2:149};
C: Z_{HER-2:202}; D: Z_{HER-2
A}; E: Z_{HER-2:222}; F:
Z_{HER-2:225}; G: Z_{HER-2:209};
H: Z_{HER-2:229}; I:
Z_{HER-2:207}; J: Z_{HER-2:107};
K: Z_{HER-2:101}. Observen que
Z_{HER-2 A}, aislada de la selección de la
biblioteca de primera generación, fue añadida al estudio.
La Figura 32 muestra los resultados del análisis
de unión de variantes de Z_{HER-2}, que posee una
actividad específica de unión a HER-2. Los diversos
sensogramas trazados conjuntamente de las inyecciones de (A)
Z_{HER-2:3053} (B)
Z_{HER-2:0434} (C)
Z_{HER-2:0024*} sobre las superficies de chips
sensoresiales, contienen HER-2 o
HIV-1 gp 120 como esta indicado.
A continuación se procederá con la ilustración
de la invención mediante la serie de experimentos llevados a cabo de
acuerdo con lo descrito en la presente memoria.
En estos experimentos, varios polipéptidos de
unión a HER-2 según la invención fueron
seleccionados, y posteriormente tipificados a partir de una
biblioteca de una multitud de polipéptidos relacionados con
diferentes dominios de la SPA.
Se preparó una biblioteca combinatoria de
péptidos expresados en fagos como esencialmente se describe en Nord
K et al. (1995, supra). El fondo común de esta
biblioteca fue utilizada en el presente estudio abarcando 8,7 x
10^{8} variantes de la proteína Z (moléculas Affibody®), con
residuos aminoácidos aleatorios en las posiciones 9, 10, 11, 13,
14, 17, 18, 24, 25, 27, 28, 32 y 35. Las moléculas Affibody® de
unión a antígenos fueron seleccionadas en cuatro ciclos de
analización severa utilizando el dominio extracelular de
HER-2 humana biotinizado
(HER-2-ECD) como diana (dominio
extracelular recombinante de HER-2 humana,
aminoácidos 238-2109, proporcionado por el Fox
Chase Cancer Center, Philadelphia, E.E.U.U.). A partir de los
resultados de los cuatro ciclos de selección, fueron recogidos 91
clones para ELISA por fago para llevar a cabo un análisis de su
actividad de unión a HER-2.
Los fagos de los clones obtenidos después de las
cuatro rondas de selección fueron producidos en placas de 96
pocillos, y se utilizó una Técnica de Ensayo con sustancias
Inmunoabsorbentes unidas a Enzimas (ELISA) para el cribado de fagos
que expresaron moléculas Affibody® de unión a HER-2.
Colonias individuales fueron utilizadas para inocular 250 \mul de
medio TSB (30,0 Tryptic Soy Broth (Merck), con agua hasta un volumen
final de 1l, esterilizado en un autoclave) con un suplemento de 2%
glucosa y 100 \mul de ampicilina en una placa de 96 pocillos
hondos y cultivados en un agitador durante toda la noche a una
temperatura de 37ºC. Se añadieron 5 \mul de este cultivo a 500
\mul de medio TSB+YE (30,0 Tryptic Soy Broth (Merck), 5,0 extracto
de levadura, y agua hasta un volumen final de 1l, esterilizado en
un autoclave) con un suplemento de 0,1% glucosa y 100 \mug/ml de
ampicilina en una placa nueva. Después de ser cultivados a 37ºC
durante 3 horas, se añadieron a cada pocillo 0,5 \mul de 5 x
10^{12} pfu/ml (2,5 x 10^{9} pfu) de fago ayudante M13K07 (New
England Biolabs, #NO325S) y 100 \mul de medio TSB+YE, y se
incubaron las placas sin agitación a 37ºC durante 30 minutos. Se
añadieron a cada pocillo 300 \mul de TSB+YE suplementado con IPTG,
kanamicina y ampicilina hasta una concentración final de 1 mM de
IPTG, 25 \mug/ml de kanamicina y 100 \mug/ml de ampicilina, y
se incubaron las placas en un agitador durante toda la noche a 30ºC.
Se obtuvo un precipitado de las células mediante centrifugación a
2500 g durante 15 minutos y los sobrenadantes, conteniendo fagos que
expresan moléculas Affibody®, fueron utilizados en un ELISA. Se
añadieron 100 \mul de 4 \mug/ml de HER-2 en PBS
(2,68 mM KCl, 137 mM NaCl, 1,47 mM KH_{2}PO_{4}, 8,1 mM
Na_{2}HPO_{4}, a pH=7,4) a una placa con pocillos pequeños
(Nunc #446612) y esta fue incubada durante 1 mes a 4ºC. Después de
tapar los pocillos con 2% de leche desnatada en polvo en PBS
(tampón de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente, se añadió
200 \mul de sobrenadante conteniendo fagos y 50 \mul del 10%
tampón de bloqueo. Las placas fueron incubadas durante 2 horas a
temperatura ambiente. Se diluyó un anticuerpo policlonal
(anti-M13 de conejo, Abcam #ab6188) en una
proporción de 1:1000 con el tampón de bloqueo al 2%, y se añadió
150 \mul a cada pocillo. Se incubó la placa a temperatura
ambiental durante 1 hora. Se diluyó un anticuerpo de cabra IgG
anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma
#A-3687) en una proporción de 1:1000 con el tampón
de bloqueo al 2%, después de lo cual se añadió 150 \mul a cada
pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiental. Se
preparó una solución de desarrollo disolviendo el sustrato
Sigma-104 (Sigma #104-105) en una
mezcla con una proporción de 1:1 con M dietanolamina, 5 mM de
MgCl_{2}, a pH=9,8 y agua (1 comprimido/5 ml de mezcla 1:1).
Después, se añadió a cada pocillo 180 \mul de la solución de
desarrollo. Se lavaron los pocillos dos veces con
PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20) y una
vez con PBS antes de añadir cada reactivo nuevo. 25 minutos después
de añadir el sustrato, se leyeron las placas a A_{405} en un
espectrofotómetro para ELISA (Basic Sunrise, Tecan).
Los fagos que codifican ligandos para
HER-2 fueron identificados mediante el criterio del
umbral de un valor A_{405} del ELISA de por encima de 0,5. 48
clones dieron una señal por encima de este valor, y fueron
seleccionados para el análisis de la secuencia de ADN, junto con 5
clones seleccionados aleatoriamente que no dieron ningún
resultado.
La secuenciación del ADN de los clones aislados
según el procedimiento anterior se llevó a cabo en el equipo ABI
PRISM®, BigDye^{TM} Terminator v2.0 Ready Reaction Cycle
Sequencing Kit (Applied Biosystems) según las recomendaciones del
fabricante. Se prepararon los plásmidos y se secuenció el ADN
codificador de las moléculas Affibody® utilizando los
oligonucleótidos RIT-27
(5'-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3') Y el
NOKA-2 biotinizado
(5'-CGGAACCAGAGCCACCACCGG-3'). Las
secuencias fueron analizadas en un analizador ABI PRISM®3700 Genetic
Analyser (Applied Biosystems). De los 53 clones previamente
seleccionados, se descubrió que varios clones codificaban la misma
secuencia de aminoácidos. Teniendo en cuenta estas degeneraciones,
se muestran cuatro secuencias de moléculas Affibody® expresadas por
clones seleccionados durante el ensayo de unión de ELISA en la
Figura 1 (Z_{HER-2 A-D}), y se
identifican en la secuencia listada como SEC ID
NO:2-5.
Los polipéptidos Z_{HER-2}
fueron expresados en células E. coli, utilizando vectores de
expresión que codifican construcciones que son ilustrados
esquemáticamente en la Figura 2. Los polipéptidos fueron producidos
por estos como uniones a un marcador hexahistidil
N-terminal. Los polipéptidos unidos a
His_{6}-Z_{HER-2 A} e
His_{6}-Z_{HER-2 A} fueron
purificados sobre columnas de Cromatografía de Afinidad por ión
Metálico Inmovilizado (IMAC) y analizados en
SDS-PAGE. Los resultados del experimento
SDS-PAGE son mostrados en la Figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Las interacciones entre las variantes de
Z_{HER-2} marcado con His producidas según la
sección anterior y HER-2 fueron analizadas
utilizando la resonancia de plasmón superficial en un sistema
Biacore®2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). La
HER-2 humana, HIV-1 gp 120 (Protein
Sciencies Corporation, #2003-MN), y BB (proteína de
unión a la albúmina derivada de la proteína G del estreptococo), las
dos últimas empleadas como controles, fueron inmovilizadas en
diferentes células de flujo mediante el acoplamiento de aminas a la
capa de dextran carboxilado encima de superficies de chips
CM-5, según las recomendaciones del fabricante. La
inmovilización de la HER-2 humana,
HIV-1 gp 120, y BB dió como resultado 1900, 6290, y
1000 unidades de resonancia (RU), respectivamente. Una cuarta
superficie de una célula de flujo fue activada y desactivada para su
uso como blanco durante las inyecciones. Las proteínas
His_{6}-Z_{HER-2 A} e
His_{6}-Z_{HER-2 B} fueron
diluidas en HBS (5 mM HEPES, 150 Mm NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005%
P-20 surfactante, a pH=7,4) hasta una concentración
final de 10 \muM, e inyectadas aleatoriamente como duplicados a
una velocidad de flujo de 30 \mul/minuto. La capacidad de las
proteínas purificadas
HIS_{6}-Z_{HER-2 A} e
His_{6}-Z_{HER-2 B} de
interactuar con HER-2 se confirmó, como se ilustra
mediante los sensogramas de las Figuras 4 y 5, respectivamente.
Además, se llevó a cabo estudios cinéticos para
His_{6}-Z_{HER-2 A} e
His_{6}-Z_{HER-2 B}. Se utilizó
el chip CM-5 con 1900 RU de HER-2
humana inmovilizada en el mismo. Se prepararon una serie de seis
diferentes concentraciones (1 \muM-40 \muM) de
polipéptido de unión a HER-2 en HBS para cada
His_{6}-Z_{HER-2 A} e
His_{6}-Z_{HER-2 B}, y se
inyectaron aleatoriamente como duplicados a una velocidad de flujo
de 30 \mul/minuto. El tiempo total de la inyección fue de 50
segundos (asociación) seguido de un lavado durante 6 minutos
(disociación). Las superficies fueron regeneradas con 20 mM de HCl
durante 10 segundos. Las respuestas medidas en las células de
referencia (superficie activada/desactivada) fueron substraídas de
la respuesta medida en las células con la HER-2
inmovilizada. Las curvas denominando la unión (sensogramas) fueron
analizadas utilizando el modelo de Langmuir de interacción
proporcionado al 1:1 del programa BIAevaluation 3.0.2 (Biacore AB).
Como queda claro en las curvas de interacción presentadas en las
Figuras 6 (His_{6}-Z_{HER-2 A})
y 7 (His_{6}-Z_{HER-2 B}), ambos
His_{6}-Z_{HER-2 A} e
His_{6}-Z_{HER-2 B} claramente
se unen a HER-2, como es evidente en las curvas de
asociación y disociación con una K_{D} indicada de
10-100 nM para
His_{6}-Z_{HER-2 A} y de
200-400 nM para
His_{6}-Z_{HER-2 B}. Además, la
unión es selectiva, ya que ninguno de los polipéptidos de unión a
HER-2 estudiados se unen a los antígenos de control
BB y gp 120 (Figuras 4 y 5).
En un segundo experimento cinético, las
variantes His_{6}-Z_{HER-2 A} y
His_{6}-Z_{HER-2 B} fueron
nuevamente inyectadas sobre la superficie de HER-2 a
diferentes concentraciones (de 0 a 5 \muM, con 0,0098 \muM como
la menor concentración para
His_{6}-Z_{HER-2 A} y 0,0196
\muM para His_{6}-Z_{HER-2 B},
diluidas en HBS) con una velocidad de flujo de 30 \mul/minuto.
Previo al análisis cinético, las concentraciones de proteínas
habían sido determinadas por análisis de aminoácidos. La constante
de equilibrio de disociación (K_{D}), la constante de velocidad
de asociación (k_{a}), y la constante de velocidad de disociación
(k_{b}) fueron calculadas utilizando el programa BIAevaluation
3.2 (Biacore), suponiendo que la unión era de uno a uno. Para los
dos primeros análisis Biacore, se corrieron las muestras a 25ºC por
duplicado y en orden aleatorio, y las células de flujos fueron
regenerados mediante la inyección de 10 mM de HCl después de cada
inyección. Tras la evaluación de las curvas de asociación (Figura
8A-8B), se determinó que la constante de equilibrio
de disociación (K_{D}) era de aproximadamente 50 nM para
His_{6}-Z_{HER-2 A} y de
aproximadamente 140 nM para
His_{6}-Z_{HER-2 B}. La razón
para la diferencia de la K_{D} probablemente se debe a la
destacada diferencia en la velocidad de disociación, como puede
verse comparando el diagrama A de la Figura 4 con el diagrama A de
la Figura 5. Para
His_{6}-Z_{HER-2 A}, se calculó
que la constante de velocidad de asociación (k_{a}) era de
aproximadamente 1,8 x 10^{5} M^{-1}s^{-1} y la constante de
velocidad de disociación (k_{d}) de aproximadamente 9,9 x
10^{-3} s^{-1}, mientras que para
His_{6}-Z_{HER-2 B}, k_{a} y
k_{d} eran difíciles de estimar debido a la rápida cinética de
asociación y disociación. De esta manera, la variante
His_{6}-Z_{HER-2 A} de affibody
que mostraba una unión más fuerte a su diana, fue seleccionada para
una caracterización adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular de cáncer de mama humano
SKBR-3, que como se sabe expresa aproximadamente 2 x
10^{6} moléculas de HER-2 por célula, fue
adquirida de ATCC (ATCC #HTB-30). Las células fueron
cultivadas en medio RPMI 1640 con un suplemento de un suero fetal
bovino al 10%, 2 mM de L-glutamina, y PEST (100
IU/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina), todo de
Biochrom KG (Berlín, Alemania). Las células fueron cultivadas a
37ºC en aire humidificado que contenía 5% CO_{2}, y sembradas en
placas de petri de 3 cm tres días antes del experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el precursor para marcar,
N-succinilmidyl
p-(trimetilestaño)benzoato (SPMB), según Orlova et
al. En Nucl Med Biol 27:827-835 (2000), y se
añadió 5 \mug de SPMB a 5 MBq de ^{125}I en una solución de 5%
ácido acético. Para iniciar la reacción, se añadió 40 \mug de
cloramina-T (Sigma, St. Louis, MO) en una solución
acuosa. Se mezcló la mezcla de reacción durante 5 minutos, y se
añadió 80 \mug de sodio metabisulfato (Aldrich, Steinheim;
Alemania) en una solución acuosa para aplacar la reacción. Se añadió
el precursor marcado con un radioactivo a 40 \mug de
His_{6}-Z_{HER-2 A} o
His_{6}-Z_{HER-2 B} en 0,07 M de
tampón borato, a pH=9,2. Se llevó a cabo una reacción de
acoplamiento a temperatura ambiental durante 45 minutos en constante
agitación. Se separaron las variantes de
Z_{HER-2} marcadas de los productos de bajo peso
molecular utilizando una columna de exclusión por tamaño
NAP^{TM}-5 (Amersham Biosciences) equilibrada con
PBS. A continuación se analizaron las variantes de
Z_{HER-2} marcadas utilizando la tecnología
Biacore para verificar que el procedimiento de marcado no había
afectado la afinidad de unión hacia
HER-2-ECD. Ambas variantes de
Z_{HER-2} mostraron conservar la afinidad (datos
no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
A cada placa de aproximadamente 100000 células
SKBR-3, se añadió 14 ng de
His_{6}-Z_{HER-2 A} o
His_{6}-Z_{HER-2 B} en 1 ml de
medio complementado. Esta cantidad corresponde a una relación
teórica de 5:1 ligando:receptor. Se trataron tres placas sin
células de la misma manera, para determinar la unión inespecífica
que no deriva de las células. Este valor fue restado de todos los
demás. Para analizar la especificidad de unión de las células, tres
placas se trataron no solo con las variantes de
Z_{HER-2} marcadas, sino también con una cantidad
500 veces mayor de variantes de Z_{HER-2} no
marcadas. Después de tres horas de incubación a 37ºC, se retiró el
medio reactivo y se lavaron rápidamente las placas tres veces con un
medio helado libre de suero. Se incubaron las células con 0,5 ml de
solución Tripsina/EDTA (0,25%/0,02% en PBS; Biochrom KG, Berlín,
Alemania) durante 15 minutos a 37ºC. Luego las células fueron
suspendidas en 1 ml de medio complementario, y se utilizó 0,5 ml de
suspensión celular para el contar la cantidad de células y el
restante 1 ml fue utilizado para medir de la
radio-actividad en un contador \gamma
automático.
Como es presentado en la Figura 9,
His_{6}-Z_{HER-2 A} mostró una
unión específica a las células SKBR-3(barra
denominada "no bloqueada"), que como se sabe expresan 2 x
10^{6} receptores de HER-2 por célula. La unión
de His_{6}-Z_{HER-2 A} marcada
con un radioactivo podría ser totalmente bloqueada por la adición de
un exceso de His_{6}-Z_{HER-2
A} no marcada (barra denominada "bloqueada"). Sin embargo, la
unión de His_{6}-Z_{HER-2 B} a
células SKBR-3 estaba por debajo del límite de
detección (datos no mostrados), probablemente como resultado de la
mayor velocidad de disociación para esta variante de
Z_{HER-2} (un factor de conductividad mayor).
\vskip1.000000\baselineskip
La elección de un ligando de affibody novedoso,
denominado His_{6}-Z_{HER-2 A} y
con afinidad para el receptor de HER-2, ha sido
descrito anteriormente. Se construyó una variante
Z_{HER-2} dimérica mediante
sub-clonación del segmento especifico del gen que
codifica el polipéptido Z_{HER-2 A} en el vector
de expresión para
His_{6}-Z_{HER-2 A}. El segmento
especifico Z_{HMR2A} introducido se verificó mediante la
secuenciación del ADN en un secuenciador de ADN ABI Prism®3700
Analyzer (Applied Biosystems, Fostre City, CA). Se utilizó la cepa
RR1\DeltaM15 de Escherichia Coli (Rüther, Nucleic Acids Res
10:5765-5772 (1982)) como huésped bacteriano
durante el procedimiento de clonación. El vector resultante
codifica, bajo el control del promotor T7 (Sturdier et al.,
Methods Enzymol 185:60-89 (1990)), una variante de
Z_{HER-2} dimérica (Z_{HER-2
A})_{2}, unida con un marcador hexahistidil
N-terminal (His_{6}), que permite la purificación
mediante Cromatografía de Afinidad por ión Metálico inmovilizado
(IMAC).
La variante dimérica de
Z_{HER-2} fue expresada como una proteína de
fusión marcada con His_{6} en la cepa E. coli BL21 (DE3),
y recuperada mediante purificación IMAC en una columna "Talon
Metal Affinity Resin" (8901-2, Biosciences, CA)
en condiciones de desnaturalización, como es descrita para los
polipéptidos monoméricos en el Ejemplo 1. La renaturalización de la
proteína de unión His_{6}-(Z_{HBR2 A})_{2} purificada
fue llevada a cabo por filtración en gel utilizando columnas
PD-10, equilibradas con PBS (10 mM de fosfato, 154
mM de NaCl, a pH=7,1) según el protocolo del fabricante (Amersham
Biosciences). La concentración de proteína fue calculada a partir
de las medidas de absorción a 280 nm, utilizando el coeficiente de
extinción apropiado (30440 M^{-1}cm^{-1}), y también verificada
mediante análisis de aminoácidos (Aminosyraanalyscentralen,
Uppsala, Suecia). La proteína purificada fue adicionalmente
analizada mediante SDS-PAGE en un gel de
Tris-Glicina homogéneo al 16%, utilizando un
sistema Novex (Novex, CA, E.E.U.U.). Las bandas de proteína fueron
visualizadas con un tinte de Azul Brillante Coomassie. Tras el
análisis con SDS-PAGE, la proteína fue visualizada
como una banda específica del peso molecular esperado (15,6 kD)
(Figura 10, Línea 2 de inserción). Las estimaciones a partir de las
medidas de absorción a 280 nm demostraron un nivel de expresión de
aproximadamente 200 mg/l de cultivo celular.
Se utilizó un instrumento Biacore®2000 (Biacore
AB) para el análisis de la interacción bioespecífica en tiempo real
(BIA). Un dominio extracelular recombinante de HER-2
(HER-2-ECD), diluido en 10 mM de
NaAc, a pH=4,5, fue inmovilizado (aproximadamente 2200 RU) en la
capa de dextran carboxilado de la superficie de una célula de flujo
de un chip sensor CM5 (de un nivel de investigación)
(BR-1000-14, Biacore AB) mediante la
unión a aminas según las instrucciones del fabricante. Otra
superficie de la célula de flujo fue activada y desactivada, para
servir como superficie de referencia. Para la muestra de
Z_{HER-2}, el tampón fue cambiado a HBS (5 mM
HEPES, 150 mM de NaCl, 3,4 mM de EDTA, 0,005% de P20 surfactante, a
pH=7,4) mediante una filtración sobre gel utilizando una columna
NAP^{TM}-10, según el protocolo del fabricante
(Amersham Biosciences), y a continuación se filtró la muestra
f(0,4 \mum; Milipore, Billerica, MA). Los análisis de la
unión fueron llevados a cabo a 25ºC, y se utilizó HBS como el
tampón para las ejecuciones. Para todos los análisis Biacore; las
muestras fueron ensayadas por duplicado en orden aleatorio, y
después de cada inyección las células de flujo fueron regeneradas al
inyectar 10 mM de HCl.
En un primer experimento, se ensayó la
diferencia de la unión a HER-2-ECD
entre las proteínas Z_{HER-2} monomérica y
dimérica (His_{6}-Z_{HER-2 A}
del Ejemplo 1 e His_{6}-(ZHER-2 A)_{2})
mediante la inyección de 5 \muM de cada proteína sobre la
superficie de HER-2-ECD, con una
velocidad de flujo de 5 \mul/min. Como puede observar en la
Figura 10, se encontró una velocidad de disociación más lenta para
His_{6}-(ZHER-2 A)_{2}, indicando una
unión más fuerte entre HER-ECD e
His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2}, comparada
con His_{6}-Z_{HBR2A}.
En un segundo experimento,
His_{6}-(ZHER-2 A)_{2} fue sometida a un
análisis cinético, en el que la proteína fue inyectada sobre la
superficie de HER-2-ECD a diferentes
concentraciones (de 0 a 5 \muM, con una concentración de 0,0049
\muM como mínimo, diluida en HBS) con una velocidad de flujo de 30
\mul/min. Previo al análisis cinético, se determinó la
concentración de proteína mediante el análisis de aminoácidos. La
constante de equilibrio de disociación (K_{D}), la constante de
velocidad de asociación (k_{a}), y la constante de velocidad de
disociación (k_{d}) fueron calculadas utilizando el programa
BIAevaluation 3.2 (Biacore AB), suponiendo una proporción de unión
de 1:1. Tras la evaluación de las curvas de unión, se determinó que
la constante de equilibrio de disociación (K_{D}) era de
aproximadamente 3 nM, se calculó que la constante de velocidad de
asociación (k_{a}) era de aproximadamente 2,5 x 10^{5} M^{-1}
s^{-1} y la constante de velocidad de disociación (k_{d}) de
aproximadamente 7,6 x 10^{-4} M^{-1} s^{-1}. Pueden compararse
estos valores con las constantes cinéticas obtenidas para el
His_{6}-Z_{HER-2 A} monomérico
del Ejemplo 1, confirmando la asociación más fuerte del
His_{3}-(Z_{HER-2 A})_{2} dimérico.
Dicha afinidad elevada aparentemente mejorada, debida a los efectos
de avidez para los construcciones diméricos, ha sido demostrado
anteriormente para otras moléculas Affibody® (Gunneriusson E et
al., Protein Eng 12:873-878) (1999)).
\vskip1.000000\baselineskip
En los experimento que constituyen este ejemplo,
el polipéptido (Z_{HER-2 A})_{2} dimérico
marcado con His_{6} según el Ejemplo 3 fue marcado el radioactivo
^{121}I e inyectado en ratones desnudos que padecían de un tumor
injerto caracterizado por la sobre-expresión de
HER-2. Se llevaron a cabo estudios de la
biodistribución del polipéptido, al mismo tiempo que se tomó
imágenes de los ratones inyectados para estudiar la localización
del polipéptido marcado. Se utilizó un derivado del dominio Z
marcado con afinidad de unión para la polimerasa Taq ADN como
control sin especificidad para HER-2 (Z_{Taq};
descrita en Gunneriusson E et al., supra y denominada Z_{Taq
S1-1}).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió un volumen de 2,3 \mul de ^{125}I
(correspondiente a 10 MBq) (Na[^{1,25}I], Amersham
Biosciences, Uppsala, Suecia) a un tubo con recubrimiento de
silicona para la microcentrífuga. Se añadió 10 \mul de ácido
acético (al 0,1% en agua), 5 \mul de
N-succinilmidyl
p-(trimetilestaño)benzoato (1 mg/ml en ácido acético
en metanol al 5%) (preparado según Koziorowski J et al., Appl
Radiat Isot 49:955-959 (1998)) y 10 \mul de
Cloramina-T (4 mg/ml en agua)
(CH_{3}C_{6}H_{4}SO_{2}N(Cl)Na\cdot3H_{2}O,
Sigma, St Louis, MO, E.E.U.U.). Se dejó que la reacción tuviese
lugar durante cinco minutos mezclando de vez en cuando. Luego se
paró la reacción añadiendo 10 \mul de sodio metabisulfato (8 mg/ml
en agua) (Na_{2}S_{2}O_{5}, Sigma, St Louis, MO, E.E.U.U.).
Se añadió un volumen de 40 \mul de dímero
(Z_{HER-2 A})_{2} (0,25 mg/ml en 0,07 M
de tampón borato, a pH=9,2 (borato de sodio,
Na_{2}B_{4}H_{7}.10H_{2}O, Sigma, St Louis, MO, USA y ácido
hidroclórico, HCl, Merck, Darmstadt, Alemania)) al tubo de ensayo.
Se añadieron a cada tubo otros 40 \mul de tampón borato para
elevar el pH hasta aproximadamente 9. Después de un tiempo de
reacción de 45 minutos mezclando continuamente, se separaron los
componentes de la reacción sobre columnas de exclusión por tamaño
NAP-5 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia)
equilibradas con PBS según el protocolo del fabricante. El tubo de
ensayo, la fracción vacía, la fracción MW alta, la fracción MW baja
y la columna fueron todos medidos a 60 cm (^{125}I) con un
detector portátil \gamma (Mini-instruments Lt.,
Essex, UK) para calcular el rendimiento del etiquetado. La fracción
con un alto peso molecular fue almacenada en un tubo con
recubrimiento de silicona para la microcentrífuga a -20ºC hasta su
uso al día siguiente. El rendimiento obtenido fue del
25-30%.
Se mezcló una solución estándar de
[^{125}I]-NaI con 10 \mul de solución acuosa de
0,1% ácido acético, 5 \mul de solución
N-succinilmidyl
p-trimetilestaño-benzoato (1 mg/ml en ácido
acético en metanol al 5%), y 10 \mul de solución acuosa de
Cloramina-T (4 mg/ml). La mezcla reactiva fue
agitada vigorosamente en un vórtex, e incubada durante 5 minutos a
temperatura ambiental con agitación. La reacción fue enfriada con
10 \mul de solución acuosa de metabisulfito de sodio (8 mg/ml). Se
añadió 21 \mul de solución de Z_{Taq} en PBS (2,4 mg/ml) a la
mezcla reactiva cruda. El pH de la mezcla reactiva fue ajustado a
aproximadamente 9 mediante la adición de tampón borato (0,1 M, a
pH=9,15). Se incubó la mezcla reactiva a temperatura ambiental
durante 30 minutos en agitación, y se separó en una fracción de alto
peso molecular (Z_{Taq} marcada) y en una fracción de bajo peso
molecular utilizando una columna NAP-5
pre-equilibrada con 5% albúmina (bovina, fracción
V, Sigma, St. Louis, MO, E.E.U.U.) en PBS, utilizando PBS como
disolvente. El rendimiento
del químico radioactivo obtenido fue de entre un 75% y un 80%. La radio-actividad específica fue de 100 kBq/\mug.
del químico radioactivo obtenido fue de entre un 75% y un 80%. La radio-actividad específica fue de 100 kBq/\mug.
Se utilizaron ratones hembras mestizas BALB/c
nu/nu de M&B (de 10 a 12 semanas de edad cuando llegaron) bajo
el permiso C181/1. Los ratones fueron aclimatados en las
instalaciones para animales del laboratorio Rudbeck, Uppsala,
Suecia, utilizando una dieta, un alojamiento y un ambiente estándar
durante una semana anterior a la implantación de los xenoinjertos.
Los ratones tenían acceso libre a la comida y al agua potable.
Dos meses antes del primer experimento, 33
ratones fueron inyectadas subcutáneamente en la pata trasera derecha
con 5 x 10^{6} células de cáncer de ovario humano
SKOV-3 (ATCC #HTB-77) de. Este grupo
se denomina "Conjunto A".
Tres semanas antes del segundo experimento, 32
ratones fueron inyectados subcutáneamente en ambas patas traseras
con 10^{7} células SKOV-3 de. Este grupo de
denomina "Conjunto B".
Para los estudios por imágenes, se tomaron del
Conjunto A los dos ratones con los tumores más grandes (ver a
continuación) y todos los demás del Conjunto B.
En el momento de hacer los experimentos, los
tumores se habían establecido en todos los ratones, pero eran
bastante pequeños y diferían en tamaño y estatus (encapsulado e
invasivo, estadio de vascularización). En el momento de uso, todos
los ratones pesaban entre 22 y 27 gramos.
Se dividieron aleatoriamente los 20 ratones del
Conjunto A en 5 grupos (I-V) con 4 ratones en cada
grupo. Se excluyeron 2 ratones del Conjunto A que tenían los tumores
más grandes para su uso en los estudios por imágenes. Los grupos,
inyecciones y tiempos de sacrificio se hicieron de acuerdo con el
Esquema 1.
Se inyectó en la cola de los ratones por vía
intra-venosa 0,5 \mug de
(Z_{HER-2 A})_{2}, marcada indirectamente
con ^{125}I (100 kBq por ratón), en 50 \mul de PBS. Los ratones
del grupo II ("grupo bloqueado") fueron
pre-inyectados subcutánemente con 200 \mul de PBS
con 0,05 mg de (Z_{HER-2 A})_{2} sin
marcar, 45 minutos antes de la inyección de
(Z_{HER-2 A})_{2} marcado. Todas las
inyecciones fueron bien toleradas, a juzgar por la ausencia de
cualquier problema visible.
Esquema
1
5 minutos antes del sacrificio, se inyectó a los
ratones por vía intra-peritoneal una dosis letal de
la solución Ketalar/Rompun (20 \mul/g de peso corporal, Kelatar
10 mg/ml (Pfizer, New York, E.E.U.U.), Rompun 1 mg/ml (Bayer,
Leverdusen, Alemania)). Se sacó la sangre al momento del sacrifico
mediante la punción con una jeringa de 1 ml lavada con heparina
diluida (5000 IE/ml, Leo Pharma, Copenhagen, Dinamarca). La sangre,
las muestras de orina, el músculo, el hueso, el intestino delgado y
grueso, el corazón, la vejiga, el pulmón, el hígado, el bazo, el
páncreas, el riñón, el estómago, las glándulas salivares y el
tiroides, el cerebro, los tumores y las colas fueron diseccionadas
y recogidas en botellas de plástico de 20 ml pesadas anteriormente.
En el caso de tumores múltiples en algunos de los ratones del
Conjunto B, cada tumor fue recogido en una botella separada. Las
muestras de órganos y tejidos fueron pesadas, y su
radio-actividad fue medida con un contador \gamma
(contador \gamma automatizado con un detector Nal(T1) de 3
pulgadas, 1480 Wallac WIZARD, Wallak OY, Turku, Finlandia).
\vskip1.000000\baselineskip
Se dividieron aleatoriamente los 24 ratones del
Conjunto B en 6 grupos diferentes con 4 ratones en cada grupo. Se
seleccionaron 8 ratones del Conjunto B que tenían tumores más
grandes para su uso en los estudios por imágenes. Los grupos,
inyecciones y tiempos de sacrifico se hicieron de acuerdo con el
Esquema 2.
Se inyectó en la cola de los ratones de los
grupos I y IV-VI por vía intra venosa 0,5 \mug de
(Z_{HER-2 A})_{2}, marcado indirectamente
con ^{125}I (100 kBq por ratón), en 50 \mul de PBS. Se inyectó a
los ratones del grupo II la misma cantidad de
(Z_{HER-2 A})_{2} yodado
radio-activamente, pero por vía subcutáneo en la
cola. A los ratones del grupo III ("grupo control negativo") se
inyecto por vía intra-venosa en la cola 1,07 \mug
de Z_{Taq} marcado indirectamente con ^{125}I (100 kBq por
ratón) en 50 \mul de PBS. Todas las inyecciones fueron bien
toleradas, a juzgar por la ausencia de cualquier problema
visible.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
2
Se llevó a cabo el sacrificio y la toma de
muestras como se ha descrito anteriormente para el Experimento de
Biodistribución I. En este segundo experimento, también se recogió
el cuerpo y se midió su contenido en
radio-actividad. Se pesaron las muestras de órganos
y tejidos, y se midió su radio-actividad con un
contador \gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó un protocolo estándar para la
medición de ^{125}I. Se utilizaron los recuentos por minuto
corregidos con el nivel de señal de fondo para la evaluación. Se
calculó el valor de absorción del tejido, expresado como %ID/g,
porcentaje de dosis inyectado por gramo de tejido, como
Donde para inyecciones intra venosas:
Radioactividad
Inyectada = Radioactividad media en jeringas de
control
- \quad
- – Radioactividad en jeringa usada
- \quad
- – Radioactividad en cola
y para inyecciones
sub-cutáneas:
Radioactividad
Inyectada = Radioactividad media en jeringas de
control
- \quad
- – Radioactividad en jeringa usada
\vskip1.000000\baselineskip
Para la toma de imágenes, los ratones fueron
divididos en dos grupos con 5 ratones en cada uno, teniendo en
cuenta que cada grupo constaría de un ratón con un tumor grande del
Conjunto A. Los ratones del Conjunto B fueron aleatorizado.
Se inyectó a los dos grupos de ratones 2,3 \mug de
(Z_{HER-2 A})_{2} marcado indirectamente
con ^{125}I (2,9 MBq por ratón) en 90 \mul de PBS, 6 horas o 8
horas antes de la toma de imágenes, respectivamente. Todas las
inyecciones fueron bien toleradas, a juzgar por la ausencia de
cualquier problema visible.
Se llevó a cabo la toma de imágenes del cuerpo
completo de los ratones a las 6 horas y 8 horas
post-inyección (p.i.) del
radio-conjugado. Se forzó a los ratones a orinar, se
les anestesió con una inyección intra-peritoneal de
Ketalar/Rompun letal y se les mató por dislocación cervical. Se
colocó a los ratones (5 en cada grupo) en una cámara \gamma e.CAM
(Siemens, Alemania), y se obtuvieron imágenes de 10 minutos en cada
punto del tiempo. Se seleccionaron dos ratones con los tumores más
grandes (1 de cada grupo) para una imagen especial en la misma
cámara, con una exposición de 20 minutos. Las imágenes fueron
obtenidas en una matriz de 256 x 256 bit con baja energía,
colimador de alta resolución en una ventana de energía de 35 keV con
un tamaño de ventana del 99%. Las imágenes fueron evaluadas con la
ayuda del programa de Nuclear Diagnostics (Kent, Reino Unido).
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento de bloqueo descrito en el
Experimento de Biodistribución I se llevó a cabo para establecer si
la absorción de (Z_{HER-2 A})_{2} en los
tumores era específico y regulado por el receptor. Antes de la
inyección intra venosa principal del dímero radioyodado, se
inyectaron sub cutaneamente 0,05 mg de (Z_{HER-2
A})_{2} en los ratones del grupo II del Esquema 1. Se
compararon la absorción de radio-actividad 1 hora
después de la inyección en el grupo I con el grupo II. Las
relaciones entre el tumor y la sangre para los dos grupos de
ratones fue de 0,72 (grupo I, media) y de 0,25 (grupo II, media)
(Figura 11). Sin embargo, la diferencia en la absorción no es
significativa (p=0,16). En todos los órganos, excepto en el tumor,
la absorción de radio-actividad fue la misma tanto
para animales bloqueados como animales no bloqueados.
Esta relación bastante baja entre tumor y sangre
en el caso de los ratones no bloqueados puede explicarse por el
instante en el tiempo temprano (1 hora
post-inyección) escogido para este experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
En el experimento de Biodistribución II, se
inyectó a los ratones del grupo II con una cantidad de Z_{Taq}
correspondiente a la cantidad de (Z_{HER-2
A})_{2} inyectada en los ratones de los otros grupos.
Z_{Taq} había sido marcada con yodo radioactiva utilizando el
mismo método indirecto que para (Z_{HER-2
A})_{2}. Z_{Taq} es no-específica con
respecto a los receptores de HER-2. Se compararon la
absorción de radio-actividad a las 4 horas
post-inyección en el grupo I y en el grupo III. Los
resultados de este experimento (Figura 12) muestran que la molécula
Z_{Taq} no-específica tenía una menor absorción al
tumor que la molécula (Z_{HER-2 A})_{2}
específica. Las relaciones entre el tumor y la sangre en este
experimento fuero de 1,43 (grupo I, (Z_{HER-2
A})_{2} específica) y 0,15 (grupo III, Z_{Taq}
inespecífica). El análisis estadístico mostró que la diferencia era
significativa (p=0,009). En todos los demás órganos, la absorción de
radio-actividad fue del mismo nivel para ambas
moléculas Z.
En este experimento se observó una relación
mayor entre tumor y sangre para (Z_{HER-2
A})_{2}, en comparación con el experimento de bloqueo.
Esto se debió probablemente al instante en el tiempo más tardío (4
horas post-inyección).
Los resultados de los grupos de ratones en los
Experimentos de Biodistribución I y II que habían sido inyectados
intra-venosa con (Z_{HER-2
A})_{2} marcada fueron combinados en un análisis de la
biodistribución del yodo radioactivo en los órganos y tejidos de
los ratones con tumor. Los resultados se muestran en las Figuras 13
a 16.
Referente a las Figuras 13 y 14, la
concentración de ^{125}I en los tumores fue mayor que en la
mayoría de los órganos normales, indicando que el polipéptido
(Z_{HER-2 A})_{2} es capaz de señalizar
células tumorales con HER-2. Se descubrió que la
concentración de radio-actividad en órganos y
tejidos normales era menor que en los tumores, con la excepción del
riñón (en cualquier instante en el tiempo), tiroides (cualquier
instante en el tiempo), e hígado (instantes tempranos en el tiempo).
Los experimentos mostraron una rápida eliminación del yodo
radioactivo en la sangre y de los órganos normales. La eliminación
en los órganos normales siguió principalmente a la eliminación en
la sangre, con la excepción de la tiroides, donde se encontró
acumulación de yodo radioactivo. La elevada absorción de yodina
libre en la tiroides, incluso en métodos de marcado indirecto, es
bien conocida y puede, hasta cierto punto, ser evitada mediante
yodina "fría", o no radiactiva (Larsen RH et al., Nucl
Med Biol 25:351-357 (1998)). Las altas
concentraciones de yodo radioactivo fueron también encontradas en
los riñones de los ratones, lo que también se esperaba ya que los
riñones son la principal vía de excreción de tales pequeñas
moléculas y catabolitos.
Las Figuras 15A y 15B muestran la progresión en
el tiempo de la concentración de yodo radioactivo en sangre y en el
tumor. Comenzando a las 4 horas post-inyección, la
radio-actividad en el tumor era mayor que la
radio-actividad en la sangre. Utilizando los datos
del experimento como se presentan en la Figura 15A, se calcularon
las vidas medias de yodo radioactivo en la sangre y en los tumores
utilizando GraphPad Prism©, v 3.0, de GraphPad Software (San Diego,
E.E.U.U.). Se utilizó como modelo la regresión no lineal de
decaimiento exponencial de dos fases, y las gráficas resultantes se
presentan en la Figura 15B. T_{1/2}\alpha para los tumores fue
más corto (0,36 horas) que para la sangre (0,76 horas), pero
T_{1/2}\beta fue más largo (87,5 horas para tumores
versus 4,3 horas para la sangre), lo que está de acuerdo con
los resultados obtenidos. Para comparar, el T_{1/2}\alpha del
dímero marcado en la sangre, calculado con el mismo modelo
utilizando datos de distribución de ratones sin tumor normales, fue
de 0,3 horas (datos no mostrados).
La relación de concentración de
radio-actividad entre el tumor y la sangre (Figura
16) se incrementó con el tiempo durante al menos 12 horas
post-inyección. Esta relación es un buen factor de
estimación para el contraste de imagen, porque el fondo principal
en la toma de imágenes por radio-actividad viene de
la radio-actividad en la sangre. Teniendo en cuenta
la relación entre el tumor y la sangre y las concentraciones de
radio-actividad en los tumores, se concluyó que 6
horas y 8 horas opst-inyección podrían ser los
instantes en el tiempo óptimos para las imágenes. Para una imagen
con un buen contraste, la proporción de la concentración de
radio-actividad entre tumor y no tumor no debería
ser menor de 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Las imágenes Gamma fueron tomadas de cada uno de
los dos grupos de 5 ratones, cada uno de ellos seleccionado por
visualización de imágenes (a las 6 horas y a las 8 horas
post-inyección, respectivamente). En todos los
ratones en ambos instantes en el tiempo, pudieron ser identificados
los riñones con estructuras bien definidas. Una estructura
adicional (probablemente hígado) es visible sobre los riñones en la
imagen de ratones 6 horas post-inyección, así como
un fondo elevado de un pool de sangre generalizado. Algunos animales
tenían algo de orina en sus vejigas, lo que también es directamente
visible. En la imagen con ratones a las 8 horas
post-inyección, se puede identificar una estructura
adicional en el área del cuello, que con toda probabilidad es la
tiroides.
De los 5 animales en cada sesión de imágenes, se
denotó un tumor (del lote de inyección de SKOV-3)
invasivo. Ninguna otra localización para el tumor fue evidente. Los
dos animales en cuestión fueron escogidos para una sesión adicional
de imágenes, y el resultado se muestra en la Figura 17.
\vskip1.000000\baselineskip
La biodistribución del polipéptido dímero
(Z_{HER-2 A})_{2}, indirectamente marcado
con yodo radioactivo (^{125}I) mediante un grupo benzoato, en
ratones con tumores SKOV-3 (línea celular de cáncer
de ovario) se mostró de acuerdo con la biodistribución normal del
conjugado en ratones normales. Se consiguió que el tumor absorbiese
el yodo radioactivo inyectado como
^{125}I-benzoato-(Z_{HER-2
A})_{2}. La absorción del tumor fue mediada por un
receptor y específica, como se muestra con los experimentos de
bloqueo utilizando una pre-inyección de una alta
concentración de una molécula (Z_{HER-2
A})_{2} no marcada, y mediante la inyección de una
Z_{Taq}, variante Z marcada, no específica. El análisis de los
datos obtenidos mostró que la concentración de la
radio-actividad en el tumor fue mayor que la
concentración de la radio-actividad en sangre
después de 4 horas post-inyección, y mayor que en la
mayoría de los órganos y tejidos normales después de 6 horas
post-inyección, excepto para los riñones y la
tiroides. Las imágenes Gamma de ratones con tumores xenoinjertados
con SKOV-3 fueron obtenidas a las 6 horas y a las 8
horas post-inyección. Se obtuvo una buena
resolución. En ambos instantes en el tiempo, pudieron identificarse
claramente tumores invasivos grandes.
En los experimentos que constituyen este
ejemplo, el polipéptido Z_{HER-2 A} monomérico
según los Ejemplos 1 y 2 fue marcado con ^{125}I radioactivo e
inyectado en ratones que padecían de un tumor injertado
caracterizado por la sobre-expresión de
HER-2. Estudios de biodistribución del polipéptido
fueron llevados a cabo para estudiar su localización.
\vskip1.000000\baselineskip
Para marcar con ^{125}I, 40 \mul de
His-Z_{HER-2 A} fueron sometidos
al mismo tratamiento que el constructo polipéptido dimérico en el
Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron ratones hembra BALB/c nu/nu de
M&B (de 10 a 12 semanas cuando llegaron) bajo el permiso C66/4.
Los ratones fueron aclimatados en las instalaciones para animales
del laboratorio Rudbeck, Uppsala, Suecia, utilizando una dieta, un
alojamiento y un ambiente estándar durante la semana anterior a que
se les implantaran los xenoinjertos. Los ratones tenían acceso
libre a comida y agua potable. Tres semanas antes del experimento,
5 x 10^{7} células de cáncer de ovario humano
SKOV-3 (ATCC #HTB-77) fueron
inyectadas subcutáneamente en la pata trasera derecha de 16
ratones. En el momento de los experimentos, se habían establecido
tumores en todos los ratones y todos los ratones pesaban de 22 a 27
gramos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la medición de ^{125}I y se
calculó el %ID/g como se ha descrito en el Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se dividieron al azar 16 ratones en 4 grupos
(I-IV) con 4 ratones en cada grupo. Los grupos,
inyecciones y tiempos de sacrificio se determinaron de acuerdo con
el Esquema 3. Se inyectó a los ratones en la col
intra-venosamente a 0,5 \mug de
Z_{HER-2 A}, marcado indirectamente con ^{125}I
(100 kBq por ratón) en 50 \mul de PBS. Todas las inyecciones
fueron bien toleradas, a juzgar por la ausencia de cualquier
problema visible.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
3
Los ratones fueron sacrificados y se tomaron las
muestras como se ha descrito en el primer estudio de biodistribución
del Ejemplo 4. Se pesaron las muestras de los órganos y tejidos, y
se midió su radio-actividad con un contador \gamma
(contador \gamma automatizado con un detector Nal (T1) de 3
pulgadas, 1480 Wallac WIZARD, Wallak OY, Turku, Finlandia).
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron los resultados de los grupos de
ratones que habían sido inyectados sub-cutaneamente
con Z_{HER-2 A} marcado para establecer la
distribución del yodo radioactivo en los órganos y tejidos de los
ratones. Los resultados se muestran en las Figuras 18 a 20. En
relación a las Figuras 18 y 19, la concentración de ^{125}I en
los tumores fue mayor que en la mayoría de los órganos normales a
las 4 horas y a las 24 horas, indicando que el polipéptido
Z_{HER-2 A} es capaz de señalizar células
tumorales con HER-2. La concentración de
radio-actividad en los órganos y tejidos normales
resultó ser menor que en los tumores, con la excepción del riñón
(en cualquier instante en el tiempo) y tiroides (en cualquier
instante en el tiempo). Los experimentos mostraron una rápida
eliminación del yodo radioactivo en la sangre y en los órganos
normales. La eliminación de los órganos normales siguió
principalmente a la eliminación en la sangre, con la excepción de la
tiroides, donde se encontró acumulación de yodo radioactivo.
También se encontraron altas concentraciones de yodo radioactivo en
los riñones de los ratones. La Figura 20 muestra la progresión a lo
largo del tiempo de la concentración de yodo radioactico en la
sangre y en el tumor. Comenzando a las 4 horas
post-inyección, la radio-actividad
en el tumor era seis veces mayor que la
radio-actividad en la sangre. La relación entre
tumor y sangre de la concentración de
radio-actividad (Figura 21) se incrementó a lo largo
del tiempo durante por lo menos 8 horas
post-inyección, momento en el que fue de 10 a 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La biodistribución del polipéptido monómero
Z_{HERA 2}, marcado indirectamente con yodo radioactivo
(^{125}I) mediante un grupo benzoato, en ratones con tumores
SKOV-3 (línea celular de cáncer de ovario) se mostró
de acuerdo con la distribución normal del conjugado en ratones
normales. Se consiguió la absorción del tumor del yodo radioactivo
inyectado como
^{125}I-benzoato-Z_{HER-2
A}. El análisis de los datos obtenidos mostró que la concentración
de radio-actividad en el tumor era mayor que la
concentración de radio-actividad en sangre después
de 4 horas post-inyección, y en contraste con la
forma dimérica de (Z_{HER-2 A})_{2},
también mayor que en la mayoría de los órganos y tejidos normales
después de 4 horas post-inyecicón, excepto para los
riñones y la tiroides.
\vskip1.000000\baselineskip
En los experimentos que constituyen este
ejemplo, un polipéptido (Z_{HER-2 A}) dimérico
según el Ejemplo 3 fue genéticamente fusionado en su extremo
N-terminal con un "Dominio de Unión a la
Albúmina" (ABD) de la proteína G del estreptococo, para formar
un polipéptido denominado ABD(Z_{HER-2
A})_{2} (Figura 22). ABD se une a la seroalbúmina humana
y del ratón con una alta afinidad (M Johansson et al., J Biol
Chem 277:8114-8120 (2002)). La albúmina es una
proteína abundante en la sangre con una eliminación lenta del
plasma. La unión a la albúmina con una alta afinidad debería
conferir al ligando una cinética lenta similar a la de la proteína
albúmina misma. Alargando el tiempo de circulación de un ligando que
marca el tumor en un animal, debería, en teoría, potenciar la dosis
enviada al tumor. Para probar esto, se marcó el polipéptido
ABD(Z_{HER-2 A})_{2} con
^{125}I radioactivo y esto se inyectó en ratones con injerto de
tumor caracterizado por la sobre-expresión de
HER-2. Los estudios de biodistribución del
polipéptido fueron llevados a cabo para estudiar su
localización.
\vskip1.000000\baselineskip
La selección de un ligando affibody novedoso,
denominado His_{6}-Z_{HER-2 A} y
con afinidad por el receptor HER-2, se ha descrito
anteriormente en los Ejemplos 1 y 2. Una variante
Z_{HER-2 A} dimérica, construida mediante
subclonación del segmento especifico genético que codifica el
polipéptido Z_{HER-2 A} en el vector de expresión
para HIS_{6}-Z_{HER-2 A}, fue
descrita en el Ejemplo 3. Se construyó una proteína de fusión ABD
de esta variante Z_{HER-2 A} dimérica mediante
subclonación del segmento especifico genético que codifica el
polipéptido ABD en el vector de expresión para
HIS_{6}-Z_{HER-2 A},
sustituyendo el marcador hexahistidina con el polipéptido ABD. Se
verificó el segmento especifico ABD introducido mediante
secuenciación del ADN en un secuenciador de ADN ABI Prism®3700
Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). La cepa
RR1\DeltaM15 de Escherichia Coli (Rüther, Nucleic Acids
Res 10:5765-5772 (1982)) fue utilizada como huésped
bacteriano durante el procedimiento de clonación. El vector
resultante codifica, bajo control del promotor T7 (Sturdier et
al., Meth Enzymol 185:60-89 (1990)), una
variante Z_{HER-2} dimérica fusionada con ABD,
ABD(Z_{HER-2 A})_{2}, fusionada
con un residuo de cisteína C-terminal, que permite
situar modificaciones químicas específicas (Figura 22). La variante
Z_{HER-2} dimérica fue expresada como una fusión
con ABD en la cepa BL21 de E. Coli (DE3), y fue recuperado
mediante purificación por cromatografía de afinidad sobre una
columna de afinidad de Sefarosa albúmina preparada según el
protocolo del fabricante (Amersham Biosciences). Se calculó la
concentración de proteína a partir de las mediciones de absorbancia
a 280 nm, utilizando el apropiado coeficiente de extinción. La
proteína purificada fue posteriormente analizada mediante
SDS-PAGE en un gel homogéneo de
Tris-Glicina al 16%, utilizando un sistema Novex
(Novex, CA, E.E.U.U.). Las bandas de proteína fueron visualizadas
con tinción Azul Brillante Coomassie. Tras el análisis
SDS-PAGE, se observó la proteína como una banda
específica del peso molecular esperado.
\vskip1.000000\baselineskip
Para marcar con ^{125}I, 40 \mul de
ABD-(Z_{HER-2 A)2} fueron sometidos al
mismo tratamiento que el constructo polipéptido dimérico en el
Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron ratones hembra BALB/c nu/nu de
M&B (de 10 a 12 semanas de edad cuando llegaron) bajo el permiso
C66/4. Los ratones fueron aclimatados en las instalaciones para
animales del laboratorio Rudbeck, Uppsala, Suecia, utilizando una
dieta, un alojamiento y un ambiente estándar durante la semana
anterior a que se les implantaran los xenoinjertos. Los ratones
tenían acceso libre a comida y agua potable. Tres semanas antes del
experimento, 16 ratones fueron inyectadas subcutáneamente con 5 x
10^{7} células de cáncer de ovario humano SKOV-3
(ATCC #HTB-77) en la pata trasera derecha. En el
momento de los experimentos, se habían establecido tumores en todos
los ratones y todos los ratones pesaban de 22 a 27 gramos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la medición de ^{125}I y se
calculó el %ID/g como se ha descrito en el Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se dividieron al azar 16 ratones en 4 grupos
(I-IV) con 4 ratones en cada grupo. Los grupos,
inyecciones y tiempos de sacrificio fueron de acuerdo al Esquema 4.
Se inyectó intra venosamente a los ratones en la cola 0,5 \mug de
ABD(Z_{HER-2 A})_{2}, marcado
indirectamente con ^{125}I (100 kBq por ratón) en 50 \mul de
PBS. Todas las inyecciones fueron bien toleradas, a juzgar por la
ausencia de cualquier problema visible.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
4
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones fueron sacrificados y se tomaron las
muestras como se ha descrito en el primero estudio de
biodistribución del Ejemplo 4. Se pesaron las muestras de órganos y
tejidos, y se midió su radio-actividad con un
contador \gamma (contador \gamma automatizado con un detector
Nal(T1) de 3 pulgadas, 1480 Wallac WIZARD, Wallak OY, Turku,
Finlandia).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en las Figuras 23 y
24. En relación a la Figura 23, la concentración de ^{125}I en
los tumores fue mayor que en la mayoría de los órganos normales a
las 12 horas (tumor 2,4%ID/g) y 24 horas (tumor 2,2%ID/g),
indicando que el polipéptido ABD(Z_{HER-2
A})_{2} es capaz de señalizar células tumorales con
HER-2. La concentración de
radio-actividad en órganos y tejidos normales
resultó ser menor que en los tumores, con la excepción del riñón
(en cualquier instante en el tiempo, a las 24 horas 3,5%ID/g),
tiroides (en cualquier instante en el tiempo, a las 24 horas
5,2%ID/g) y la sangre (en cualquier instante en el tiempo, a las 24
horas 3,9%ID/g). Los valores en los pulmones son más o menos
equivalentes a los valores del tumor, lo que puede ser debido al
alto contenido de sangre en los pulmones. Los experimentos mostraron
una eliminación muy lenta del yodo radioactivo en la sangre. Esto
era de esperar, ya que la fracción de
ABD(Z_{HER-2 A})_{2} se une con
alta afinidad a la seroalbúmina, una proteína abundante en la sangre
y con una cinética baja. La eliminación en los órganos normales fue
más rápida que la eliminación en la sangre, con la excepción de la
tiroides, donde se encontró acumulación de yodo radioactivo. También
se encontraron altas concentraciones de yodo radioactivo en los
riñones de los ratones. La Figura 24 muestra la progresión en el
tiempo de la concentración de yodo radioactivo asociada con
ABD(Z_{HER-2 A})_{2} en el tumor,
en comparación con los resultados generados para los constructos
monomérico y dimérico de Z_{HER-2 A} en los
Ejemplos 4 y 5. A las 24 horas post-inyección, la
radio-actividad del tumor utilizando
ABD(Z_{HER-2 A})_{2} era trece
veces mayor que para el monómero o el dímero, indicando que
alargando el tiempo de residencia de la fracción de señalización en
el cuerpo podía efectivamente ser utilizado para incrementar la
dosis en el tumor. Los datos también sostienen que la fracción
(Z_{HER-2 A})_{2} puede ser acoplada
funcionalmente al dominio de unión a la albúmina.
\vskip1.000000\baselineskip
La biodistribución del polipéptido de fusión
ABD(Z_{HER-2 A})_{2}, marcado
indirectamente con yodo radioactivo (^{125}I) mediante un grupo
benzoato, en ratones con tumores SKOV-3 (línea
celular de cáncer de ovario) se mostró de acuerdo con las
propiedades esperadas de un polipéptido de unión a la albúmina. Se
consiguió la absorción del tumor del yodo radioactivo inyectad como
^{125}I-ABD(Z_{HER-2
A})_{ 2}, y la dosis en el tumor fue mayor que para la
versión monomérica o dimérica del polipéptido
Z_{HER-2 A.} El análisis de los datos obtenidos
mostró que la concentración de radio-actividad en el
tumor era mayor que la concentración de
radio-actividad en la mayoría de los demás órganos
después de 12 horas post-inyección, aunque el nivel
de radio-actividad en los pulmones, los riñones, el
tiroides y la sangre se mantuvo alto.
\vskip1.000000\baselineskip
En los experimento que constituyen este ejemplo,
el polipéptido His_{6}-(Z_{HER-2
A})_{2} dimérico según el Ejemplo 3 fue marcado con el
núclido 99m-tecnecio de diagnóstico por imágenes e
inyectado en ratones normales y en ratones que padecían de un tumor
injertado caracterizado por la sobre-expresión de
HER-2. El ^{99m}Tecnecio (^{99m}TC) es un
radionucleótido con propiedades cercanas al ideal para diagnosis
in vivo. Además, es barato y fácilmente disponible, siendo
un buen candidato para la obtención de imágenes médicas en la
clínica práctica. Los estudios de biodistribución del polipéptido
fueron llevados a cabo para estudiar su localización.
\vskip1.000000\baselineskip
Se marcó el polipéptido
His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2} según las
instrucciones del fabricante utilizando el kit IsoLink^{TM}
(Mallinckrodt, Países Bajos) comercialmente disponible, que dirige
el núclido ^{99m}TC al marcador hexahistidina en la proteína
His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2}. Los
reactivos del kit IsoLink^{TM} generan un catión tecnecio,
[^{99}mTC(CO)_{3}(H_{2}O)_{3}]^{+},
que entonces puede ser coordinado establemente por el marcador
hexahistidina, proporcionando medios para marcar específicamente el
marcador His_{6} del polipéptido
His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2}.
Brevemente, se incubaron 0,5-0,6
ml de solución madre de ^{99m}TC del generador en el Hospital
Universitario de Uppsala eluído con el contenido del agente
marcador Carbonil del IsoLink^{TM} (DRN4335, Mallinckrodt)
durante 20 minutos a 100ºC en baño de agua. Se mezclaron 40 \mul
del catión tecnecio así obtenido,
[^{99}mTC(CO)_{3}(H_{2}O)_{3}]^{+},
con 40 \mul de His_{6}-(Z_{HER-2
A})_{2} en PBS (1,2 mg/ml) y se incubaron durante 1 hora a
50ºC. Se purificó el producto por separación sobre una columna de
exclusión por tamaño NAP-5 con un corte de 5 kD
(Pharmacia, Uppsala). La pureza del producto fue del 97%, según la
cromatografía en capa fina instantánea.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron ratones hembra BALB/c nu/nu de
M&B (de 10 a 12 semanas de edad cuando llegaron) bajo el permiso
C66/4. Los ratones fueron aclimatados en las instalaciones para
animales del laboratorio Rudbeck, Uppsala, Suecia, utilizando una
dieta, un alojamiento y un ambiente estándar durante la semana
anterior a que se les implantaran los xenoinjertos. Los ratones
tenían acceso libre a comida y agua potable. Tres semanas antes del
experimento, 4 ratones fueron inyectadas subcutáneamente con 5 x
10^{7} células de cáncer de ovario humano SKOV-3
(ATCC #HTB-77) en la pata trasera derecha. En el
momento de los experimentos, se habían establecido tumores en todos
los ratones y todos los ratones pesaban de 22 a 27 gramos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la medición de ^{99}mTC y se
calculó el %ID/g como se ha descrito para ^{125}I en el Ejemplo
4.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el experimento se utilizó un grupo de
ratones con 4 animales. Los grupos, inyecciones y tiempos de
sacrificio se hicieron de acuerdo al Esquema 5. Se inyectó a 0,5
\mug de His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2},
marcado con ^{99m}TC (100 kBq por ratón) en 50 \mul de PBS intra
venosamente en la cola de los ratones. Todas las inyecciones fueron
bien toleradas, a juzgar por la ausencia de cualquier problema
visible.
\newpage
Esquema
5
Los ratones fueron sacrificados y se tomaron las
muestras como se ha descrito en el primer estudio de biodistribución
del Ejemplo 4. Se pesaron las muestras de los órganos y tejidos, y
se midió su radio-actividad con un contador \gamma
(contador \gamma automatizado con un detector Nal(T1) de 3
pulgadas, 1480 Wallac WIZARD, Wallak OY, Turku, Finlandia).
\vskip1.000000\baselineskip
El conjugado ^{99m}TC-
His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2} tenía una
alta estabilidad in vitro (confrontación con PBS, plasma,
cisteína y exceso de histidina libre). Los resultados de los
experimentos de la biodistribución in vivo de
^{99m}TC-His_{6}-(Z_{HER-2
A})_{2}
se muestran desde la Figura 25 a la 27. En relación a la Figura 25, la dosis total en el tumor fue tres veces mayor utilizando ^{99m}TC-His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2} (3,3%ID/g a las 8 horas p.i.) en comparación con la concentración del constructo monomérico marcado conI, ^{125}I-benzoato-Z_{HER-2 A} (1,1%ID/g a las 8 horas post-inyección), o el constructo dimérico, ^{125}I-benzoato-(Z_{HER-2 A})_{2} (1,06%ID/g a las 8 horas p.i.). Es conocido que el ^{99m}TC es un mejor agente de permanencia que el ^{125}I, lo que implica que la dosis enviada se mantiene, mientras que las dosis de yodina se metabolizan y se liberan de las células tumorales. En relación a la Figura 26, la concentración de ^{99m}TC en los tumores era mayor que en la mayoría de los órganos normales a las 8 horas post-inyección (tumor 3,3%ID/g), indicando que el polipéptido ^{99m}TC-His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2} es capaz de señalizar células tumorales con HER-2. La concentración de radio-actividad en los órganos y tejidos normales resultó ser menor que en los tumores, con la excepción del riñón (a las 8 horas 27%ID/g, 36 x la dosis del tumor) y el hígado (a las 8 horas 11,4%ID/g, 3 x la dosis del tumor) (Figura 27). Los altos valores en el riñón eran esperados, ya que el ^{99m}TC-His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2} se elimina a través de los riñones. El alto nivel de marcador en los riñones no presenta problemas de toxicidad, ya que la dosis total inyectada será muy baja para propósitos de diagnóstico. La cantidad de radio-actividad en la tiroides no fue en absoluto tan alta como cuando se utilizó ^{125}I (Ejemplo 4), como se esperaba (a las 8 horas 1%ID/g). La eliminación en los órganos normales siguió principalmente a la eliminación en la sangre, con la excepción de los riñones, donde se observó la acumulación de ^{99m}Tecnecio con un pico después de una hora. Los niveles decrecieron después, con una fase de eliminación rápida durante una hora (hasta 2 horas post-inyecicón) seguida de una fase de eliminación lenta, con una dosis sustancial (70%ID/g) todavía en el riñón después de 24 horas.
se muestran desde la Figura 25 a la 27. En relación a la Figura 25, la dosis total en el tumor fue tres veces mayor utilizando ^{99m}TC-His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2} (3,3%ID/g a las 8 horas p.i.) en comparación con la concentración del constructo monomérico marcado conI, ^{125}I-benzoato-Z_{HER-2 A} (1,1%ID/g a las 8 horas post-inyección), o el constructo dimérico, ^{125}I-benzoato-(Z_{HER-2 A})_{2} (1,06%ID/g a las 8 horas p.i.). Es conocido que el ^{99m}TC es un mejor agente de permanencia que el ^{125}I, lo que implica que la dosis enviada se mantiene, mientras que las dosis de yodina se metabolizan y se liberan de las células tumorales. En relación a la Figura 26, la concentración de ^{99m}TC en los tumores era mayor que en la mayoría de los órganos normales a las 8 horas post-inyección (tumor 3,3%ID/g), indicando que el polipéptido ^{99m}TC-His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2} es capaz de señalizar células tumorales con HER-2. La concentración de radio-actividad en los órganos y tejidos normales resultó ser menor que en los tumores, con la excepción del riñón (a las 8 horas 27%ID/g, 36 x la dosis del tumor) y el hígado (a las 8 horas 11,4%ID/g, 3 x la dosis del tumor) (Figura 27). Los altos valores en el riñón eran esperados, ya que el ^{99m}TC-His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2} se elimina a través de los riñones. El alto nivel de marcador en los riñones no presenta problemas de toxicidad, ya que la dosis total inyectada será muy baja para propósitos de diagnóstico. La cantidad de radio-actividad en la tiroides no fue en absoluto tan alta como cuando se utilizó ^{125}I (Ejemplo 4), como se esperaba (a las 8 horas 1%ID/g). La eliminación en los órganos normales siguió principalmente a la eliminación en la sangre, con la excepción de los riñones, donde se observó la acumulación de ^{99m}Tecnecio con un pico después de una hora. Los niveles decrecieron después, con una fase de eliminación rápida durante una hora (hasta 2 horas post-inyecicón) seguida de una fase de eliminación lenta, con una dosis sustancial (70%ID/g) todavía en el riñón después de 24 horas.
La relación entre el tumor y la sangre para el
conjugado de tecnecio a las 8 horas post-inyecicón
fue de 4, con una dosis total en el tumor de 3,3%ID/g. Esto indicaba
que el ^{99m}Tecnecio podría ser utilizado para aplicaciones de
diagnóstico in vivo. Para comparar, en el mismo instante en
el tiempo, las dosis de
^{125}I-benzoato-(Z_{HER-2
A})_{2} y
^{125}I-benzoato-Z_{HER-2
A} en el tumor fueron de aproximadamente un 1%, pero la relación
entre el tumor y la sangre fue de aproximadamente 11.
\vskip1.000000\baselineskip
La biodistribución del polipéptido marcado con
^{99m}TC,
^{99m}TC-His_{6}-(Z_{HER-2
A})_{2}, en ratones con tumores SKOV-3
(línea celular de cáncer de ovario) mostraron propiedades de
distribución relativamente buenas para propósitos de toma de
imágenes médicas. Se consiguió la absorción en del tumor y la dosis
en el tumor fue mas alta que para las versiones monomérica o
dimérica del polipéptido Z_{HER-2 A} marcadas con
^{125}I. El análisis de los datos obtenidos mostró que la
concentración de radio-actividad en el tumor era
más alta que la concentración de radio-actividad en
la mayoría del resto de los órganos y el sangre después de las 8
horas post-inyección, aunque el hígado y el riñón
tenían una absorción sustancialmente mayor que el tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
En los experimentos que constituyen este
ejemplo, el polipéptido dimérico
His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2} según el
Ejemplo 3 fue marcado con el radio núclido terapéutico
^{211}Astatina (^{211}At), utilizando la misma química descrita
anteriormente para el marcado con ^{125}I. Un objetivo para el
enfoque al tumor con radionúclidos es la terapia de radiación. Esto
requiere núclidos que emitan partículas de alta energía, como
partículas \alpha y partículas \beta de alta energía, que puedan
erradicar la célula señalizada. El radiohalógeno ^{211}At, emisor
de partículas \alpha (T_{1/2}=7,2 horas), tiene una variedad de
sólo unos pocos diámetros celulares, lo que significa que la
erradicación celular puede darse con gran precisión. Se llevaron a
cabo estudios de la capacidad aniquiladora de células in
vitro del polipéptido marcado con ^{211}At.
Dos días por adelantado, 100.000 células
SKBR-3, caracterizadas por la
sobre-expresión de HER-2, fueron
sembradas en placas de 3 cm. Se marcaron 60 \mug de polipéptido
His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2} con
^{211}At producida en el ciclotrón Scanditronix MC32 del Hospital
Universitario de Copenhague y se purificaron en el laboratorio de
Jörgen Carlsson, Universidad de Uppsala, Suecia. Se añadieron a cada
una de las tres placas una relación molar aproximada de 1:1 y 5:1
moléculas de ^{211}At-(Z_{HER-2 A})_{2}
por receptor celular. Se suministró a tres placas adicionales una
concentración 5:1 de ^{211}At-(Z_{HER-2
A})_{2} pero también 500 veces mayor
His_{6}-(Z_{HER-2 A})_{2} sin marcar
para bloquear los sitios de unión y así estimar los efectos de la
irradiación inespecífica. Las células fueron incubadas con
^{211}At-(Z_{HER-2 A})_{2} durante 24
horas a 37ºC. Después de 24 horas de incubación, se lavaron todas
las células y se les suministró un nuevo medio fresco. Después se
monitorizó su crecimiento una vez por semana durante aproximadamente
dos meses.
Paralelamente, se suministró a un conjunto de
placas preparadas de la misma manera que las utilizadas en el
ensayo de aniquilación celular descrito anteriormente, las mismas
soluciones de ^{211}At-(Z_{HER-2
A})_{2}. Estas células se cosecharon en diferentes
instantes en el tiempo, se contó el número de células y se midió el
contenido radiactivo, para establecer curvas de absorción para todos
los grupos de placas. Estas curvas se utilizaron para calcular la
cantidad de desintegraciones por célula durante el período de 24
horas utilizado en el experimento de aniquilación celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Células de la línea celular
SKBR-3 de cáncer de mama humano, que
sobre-expresan HER-2, fueron
expuestas a dos dosis diferentes de
^{211}At-(Z_{HER-2 A})_{2} durante 24
horas. En la primera dosis, las moléculas de
^{211}At-(Z_{HER-2 A})_{2} añadidas
igualaron el número de receptores diana de HER-2 en
las células. En la segunda dosis, se añadieron moléculas marcadas
con ^{211}At en una cantidad 5 veces mayor. Después de 24 horas
de incubación, las células fueron monitorizadas y contadas una vez a
la semana durante dos meses, y se determinó la fracción de
supervivientas. Como se ve en la Figura 28, la respuesta se
relaciona con la dosis suministrada. Las células que habían
recibido una cantidad equimolar de
^{211}At-(Z_{HER-2 A})_{2} no
mostraban ningún retraso específico en su crecimiento en comparación
con el control donde la radio-actividad había sido
añadida sin un agente señalizador. Hubo un pequeño retraso en el
crecimiento debido a daños por radiación inespecífica, pero las
células no dejaron de crecer. Al contraste, cuando se añadió una
cantidad cinco veces mayor de ^{211}At-(Z_{HER-2
A})_{2}, la inhibición del crecimiento celular fue
impresionante. Al final del experimento, el grupo que había
recibido la dosis alta no se había recuperado todavía, mientras que
el grupo con una dosis baja y el grupo control se habían
multiplicado por 10^{6}. Asumiendo que las células supervivientes
conservan aproximadamente la misma tasa de crecimiento después de la
irradiación que antes, todas las células en el grupo 5:1 fueron
erradicaron. La curva de absorción también reveló que el grupo
bloqueado 5:1 había recibido una irradiación sustancial asociada a
las células, probablemente debido a un bloqueo insuficiente. Se
estimó el número de desintegraciones por célula (DPC) a partir de
las curvas de absorción integradas. A partir de la curva de
crecimiento, se calcularon los tiempos de duplicación como la
pendiente de la curva de crecimiento exponencial, y la fracción
superviviente fue calculada por extrapolación del crecimiento
retrasado remontándose al tiempo de exposición. Los resultados se
muestran en la
Tabla 1.
Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
^{211}At-(Z_{HER-2
A})_{2} mostró unión específica a células
SKBR-3 que sobre-expresan
HER-2 in vitro. La muerte celular inducida
correlacionó bien con la dosis acumulada. Menos de 100
desintegraciones por célula resultaron ser suficientes para causar
la muerte de células individuales y para conseguir la total
erradicación celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Para incrementar la afinidad de las variantes de
Z de unión a HER-2 obtenidas a partir de la
selección descrita en el Ejemplo 1, se aplicó una estrategia de
maduración de la afinidad que implica la construcción de una
segunda biblioteca (Gunneriusson et al., Protein Eng
12:873-878 (1999); Nord et al.,Eur J Biochem
268:4269-77 (2001)), seguida de una reselección
contra HER-2. Una alineación de la primera
generación de las variantes Z_{HER-2 A,B,C y D}
del polipéptido mostró que, aparte de las identidades en las
posiciones, 13, 14, 28, 32 y 35, entre Z_{HER-2
A} y Z_{HER-2 B}, hay una convergencia de R y K
en la posición 10 y de Q y T en la posición 11. De esta manera, la
biblioteca de segunda generación contenía cinco posiciones fijas
13, 14, 28, 32 y 35 y dos posiciones parcialmente fijas, la posición
10 (cgc/aaa como codones degenerados) y la posición 11 (caa/acc
como codones degenerados), mientras que las restantes posiciones 9,
17, 18, 24, 25 y 27 fueron nuevamente aleatoriomente escogidas
utilizando codones degenerados NNG/T. Después de la transformación,
se obtuvo una biblioteca de 3 x 10^{8} clones. Se sometieron las
moléculas de unión al antígeno a cinco rondas de selección,
utilizando concentraciones decrecientes de un dominio extracelular
biotinizado de HER-2 humana
(HER-2-ECD) como diana (dominio
extracelular biotinizado de HER-2 humana
recombinante, aminoácidos 238-2109, proporcionado
por el Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, E.E.U.U.).
Se recogieron 80 y 260 clones de colonias
obtenidos a partir de las rondas cuarta y quinta, respectivamente,
para llevar a cabo un análisis de su actividad de unión a
HER-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjeron los clones escogidos
aleatoriamente a partir de las rondas cuarta y quinta de la
selección en placas de 96 pocillos (Nunc.). Se utilizó un
procedimiento de detección ELISA, denominado ABAS ELISA, para
identificar variantes de Z de unión de alta afinidad a
HER-2. Se inocularon colonias individuales en 1 ml
de medio TBS-YE (30,0 g de Tryptic Soy Broth (Merck)
y 5,0 g de extracto de levadura (Merck), y agua hasta un volumen
final de 1 l) suplementado con 1 mM de IPTG y 100 \mug/ml de
ampicilina en placas de 96 pocillos hondos tipo y se hicieron
crecer en agitación durante toda la noche a 37ºC. Se obtuvo el
pellet de las células por centrifugación a 3000 g durante 10
minutos. Los pellet se resuspendieron en 300 \mul de
PBS-T y se congelaron al menos durante 30 minutos a
-80ºC. Se descongelaron las placas en agua tibia y se centrifugaron
a 3500 g durante 20 minutos. Se cargaron 100 \mul del
sobrenadante en pocillos de microtitulación (#9018 Costar®) que
habían sido incubados con 6 \mug/ml de seroalbúmina humana (HSA)
en 15 mM de Na_{2}CO_{3} y 35 mM de NaHCO_{3} (a pH=9,6)
durante toda la noche a 4ºC y bloqueados con 2% leche desnatada en
polvo en PBS-T durante 1 hora a temperatura
ambiental. Se lavaron las placas cuatro veces, antes de añadir a
cada pocillo 100 \mul de HER-2 biotinizada 1
\mug/ml y se incubaron durante 1,5 horas. Después de lavar los
pocillos cuatro veces, se añadieron 100 \mul de
Streptavidin-HPR (1:5000) (#P0397 Dako) a cada
pocillo y se incubaron durante 1 hora. Se lavaron los pocillos
cuatro veces y después del lavado final, se añadieron 100 \mul de
solución de desarrollo (ImmunoPure) TMB (#34021 Pierce) a cada
pocillo. Después de 20-30 minutos, se añadieron 100
\mul de solución de deteción (2 M H_{2}SO_{4}) a cada pocillo.
Se midió la absorbancia a 450 nm en un lector ELISA (Tecan). Los
resultados del ABAS ELISA se presentan en la Figura 29. Los ejes X
de los diagramas de las Figuras 29A y 29B corresponden a la
numeración del pocillos de la placa de 96 pocillos en
cuestión-de esta manera, la Figura 29A muestra los
resultados del ELISA para una primera placa de 96 pocillos, mientras
que la Figura 29B muestra los resultados para una segunda placa.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuenciación del ADN que codifica las
variantes de Z_{HER-2} analizadas en el ABAS ELISA
fue llevada a cabo con un Kit ABI PRISM® dGTP, BigDye^{TM}
Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing (Applied
Biosystems) según las recomendaciones del fabricante, utilizando el
oligonucleótido biotinizado AFFI-72
(5'-biotin-CGGAACCAGAGCCACCAC-CGG).
Se analizaron las secuencias en un analizador ABI PRISM®3100
Genetic Analyser (Applied Biosystems). El análisis de la secuencia
dio como resultado 130 secuencias únicas. Las secuencias originadas
a partir de las variantes de Z_{HER-2} que
mostraron unión en el experimento ABAS ELISA, como se fue evidente
por un valor de absorbancia al menos dos veces mayor que el valor
del control negativo, se presentan en la Figura 1 y se identifican
en el listado de secuencias como SEC ID NO:6-76. La
nomenclatura de estas variantes de Z que se unen a
HER-2 es lo siguente. Las variantes aisladas a
partir de la primera placa del experimento ELISA (Figura 29A) se
denominan Z_{HER-2:1NN}, donde NN corresponde al
número del pocillo en la primera placa en la que fue analizada esa
variante concreta del polipéptido. Las variantes aisladas a partir
de la segunda placa del experimento ELISA (Figura 29B) se denominan
Z_{HER-2:2NN}, donde NN corresponde al número del
pocillo en la segunda placa en la que fue analizada esa variante
concreta del polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos de unión a
HER-2 seleccionados se expresaron en células E.
coli utilizando un vector de expresión que codifica constructos
que han sido esquemáticamente ilustrados en la Figura 30. Los
polipéptidos fueron producidos como combinaciones con un marcador
hexahistidil N-terminal. Los polipéptidos marcados
con His_{6} Z_{HER-2:101},
Z_{HER-2:107}, Z_{HER-2:149},
Z_{HER-2:202}, Z_{HER-2:205},
Z_{HER-2:207}, Z_{HER-2:209},
Z_{HER-2:222,} Z_{HER-2:225} y
Z_{HER-2:229}, así como Z_{HER-2
A} fueron purificados utilizando un equipo BioRobot 3000 (Qiagen)
y el procedimiento NI-NTA Superflow 96 BioRobot en
condiciones de desnaturalización. Se dializaron las proteínas
marcadas con His_{6} purificadas en PBS (2,68 mM de KCl, 137 mM
de NaCl, 1,47 mM de KH_{2}PO_{4}, 8,1 mM de Na_{2}HPO_{4}, a
pH=7,4). La concentración de proteína en las muestras fue calculada
a partir del valor de absorción medido a 280 nm y a partir del
coeficiente de extinción teórico de la respectiva proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Las interacciones entre las variantes de
Z_{HER-2} marcadas con His_{6} producidas según
la sección anterior y la HER-2 fueron analizadas
utilizando la resonancia del plasmón superficial en un sistema
Biacore®2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). La
HER-2 humana y la IgG (Inmunoglobulina G) fueron
inmovilizadas en diferentes células de flujo mediante acoplamiento
sobre aminas sobre la capa de dextran carboxilado en superficies de
chips CM-5, según las recomendaciones del
fabricante. La inmovilización de HER-2 humana e IgG
dio como resultado 4600 y 5100 unidades de resonancia (RU),
respectivamente. Una tercera superficie de una célula de flujo fue
activada y desactivada para su uso como blanco durante las
inyecciones. Los polipéptidos de fusión
Z_{HER-2:101}, Z_{HER-2:107},
Z_{HER-2:149}, Z_{HER-2:202},
Z_{HER-2:205}, Z_{HER-2:207},
Z_{HER-2:209}, Z_{HER-2:222,}
Z_{HER-2:225} y Z_{HER-2:229}
fueron diluidos en 1 x HBS-EP (5 mM de HEPES, 150 mM
de NaCl, 3,4 mM de EDTA, P-20 surfactante al
0,005%, a pH=7,4) hasta una concentración final de 50 nM, e
inyectados a una velocidad de flujo constante de 10 \mul/minuto.
El tiempo total de inyección fue de 2 minutos (asociación) seguido
de un lavado durante 3 minutos (disociación). Las superficies fueron
regeneradas con dos inyecciones de 25 mM de HCl (30 segundos/
inyección). Las respuestas medidas en las células de referencia
(superficie activada/desactivada) fueron substraídas de la
respuesta medida en las células con HER-2
inmovilizada. Se confirmó la capacidad de las proteínas purificadas
para interactuar con HER-2, como se muestra en los
sensogramas de la Figura 31.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un análisis completo de
secuencia de los clones obtenidos después de la tercera y cuarta
rondas de la selección descrita en el Ejemplo 1. Se secuenció el
ADN utilizando el equipo ABI PRISM®, BigDye^{TM} Terminator v2.0
Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) según las
recomendaciones del fabricante y un analizador ABI PRISM®3100
Genetic Analyser (Applied Biosystems) según las recomendaciones del
fabricante. Se utilizó como cebador el oligonucleótido biotinizado
AFFI-72
(5'-biotin-CGGAACCAGAGCCACCACCGG).
El análisis de la secuencia reveló 11 nuevas secuencias de
polipéptido, es decir, clones que no habían sido encontrados en el
estudio descrito en el Ejemplo 1.
Se decidió expresar estas variantes de Z en
células de E. coli, utilizando un vector de expresión que
codifica constructos que son esquemáticamente ilustrados en la
Figura 30. Los polipéptidos fueron producidos de esta manera como
fusiones con un marcador hexahistidil N-terminal. Se
purificaron los polipéptidos mediante Cromatografía de Afinidad por
ión Metálico Inmovilizado (IMAC) utilizando un BioRobot 3000
(Qiagen) y el procedimiento NI-NTA Superflow 96
BioRobot bajo condiciones de desnaturalización. Las proteínas
eluídas fueron analizadas utilizando SDS-PAGE. Los
tampones de proteínas marcadas con His_{6} purificadas fueron
cambiados por 5 mM de NH_{4}Ac utilizando columnas
PD-10 (Amersham Biosciences) según las
recomendaciones del fabricante. Después, las proteínas fueron
liofilizadas y disueltas en HBS-EP (5 mM de HEPES,
150 mM de NaCl, 3,4 mM de EDTA, P-20 surfactante al
0,005%, a pH=7,4). Las concentraciones de proteína de las muestras
fueron calculadas a partir de los valores de absorción medidos a
280 nm y a partir del coeficiente de extinción teórico de la
respectiva proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de unión entre las variantes de
Z_{HER-2} marcadas con His_{6} y la
HER-2 fue analizada utilizando un equipo
Biacore®2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Se inmovilizaron
HER-2 humana y HIV-1 gp 120 (Protein
Sciencies Corporation, #2003-MN) en diferentes
células de flujo mediante acoplamiento sobre aminas sobre la capa
de dextran carboxilado en superficies de chips CM-5,
según las recomendaciones del fabricante. La inmovilización de
HER-2 humana y HIV-1 gp 120 dio como
resultado 2631 y 3138 unidades de resonancia (RU), respectivamente.
Una tercera superficie de una célula de flujo fue activada y
desactivada para su uso como blanco durante las inyecciones. Se
diluyeron las variantes de Z_{HER-2} en 1 x
HBS-EP (5 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 3,4 mM de
EDTA, P-20 surfactante al 0,005%, a pH=7,4) hasta
una concentración final de 1 \muM, y se inyectaron a una
velocidad de flujo constante de 10 \mul/minuto. El tiempo total de
inyección fue de 1 minuto (asociación) seguido de un lavado durante
3 minutos (disociación). Las superficies se regeneraron con una
inyección de 10 mM de HCl durante 30 segundos. Las respuestas
medidas en células de referencia (superficie activada/desactivada)
fueron substraídas de la respuesta medida en las células con
HER-2 inmovilizada. Tres de las proteínas
purificadas, Z_{HER-2:3053},
Z_{HER-2:0434} y
Z_{HER-2:0024*}, se unieron específicamente a
HER-2 como se ilustra mediante los sensogramas de
la Figura 32. Las secuencias de estas variantes de
Z_{HER-2} se presentan en la Figura 1, y se
identifican en el listado de secuencias como SEC ID
NO:77-79.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es solamente para conveniencia del lector. La misma no
forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha
tenido mucho cuidado durante la recopilación de las referencias, no
deben excluirse errores u omisiones y a este respecto la OEP se
exime de toda responsabilidad.
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Claims (49)
1. Polipéptido, que tiene afinidad de unión por
HER-2 de manera que el valor K_{D} de la
interacción es como máximo de 1 x 10^{-6} M y que está relacionado
con un dominio de la proteína A del estafilococo (SPA), en el que la
secuencia del polipéptido se corresponde con la secuencia de la
proteína Z de la SPA, según se establece en la SEC ID NO:1, que
consta de entre 3 a 20 mutaciones por sustitución, constando el
polipéptido de por lo menos tres de las siguientes mutaciones por
sustitución:
(a) de fenilalanina a tirosina en la posición
13,
(b) de tirosina a triptófano en la posición
14,
(c) de glutamina a arginina en la posición 32
y
(d) de lisina a tirosina en la posición 35.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, que
tiene una afinidad de unión por HER-2 de manera que
el valor K_{D} de la interacción es como máximo de 1 x 10^{-7}
M.
3. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, que consta de entre 4 a 20 mutaciones por
sustitución.
4. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que consta de todas las mutaciones por
sustitución (a)-(d).
5. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que consta de una mutación por sustitución
en la posición 28.
6. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que además consta de mutaciones por
sustitución en una o más de las posiciones 9, 10, 11, 17, 18, 24, 25
y 27.
7. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que consta de una mutación por sustitución
en la posición 28 de asparagina a un residuo aminoácido seleccionado
entre arginina e histidina.
8. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que consta de una mutación por sustitución
en la posición 28 de asparagina a arginina.
9. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que consta de una mutación por sustitución
en la posición 10 de glutamina a arginina.
10. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, que consta de una mutación por sustitución
en la posición 11 de asparagina a treonina.
11. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, que consta de una mutación por sustitución
en la posición 17 de leucina a valina.
12. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que consta de una mutación por sustitución
en la posición 27 de arginina a un residuo aminoácido seleccionado
entre lisina y serina.
13. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, cuya secuencia de aminoácidos corresponde
con la de la SEC ID NO:1, y que consta por lo menos de las
siguientes mutaciones: F13Y, Y14W, N28R, Q32R y K35Y.
14. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, cuya secuencia de aminoácidos es como se
presenta en cualquiera de las secuencias SEC ID
NO:2-4 y 6-79.
15. Polipéptido según la reivindicación 14, cuya
secuencia de aminoácidos es como se presenta en cualquiera de las
secuencias SEC ID NO:2-3.
16. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos uno de los
residuos de asparagina presentes en el dominio de la proteína A del
estafilococo (SPA) con la que dicho polipéptido está relacionado ha
sido reemplazado con otro residuo aminoácido.
17. Polipéptido según la reivindicación 16, en
el que la secuencia de dicho domino de la proteína A del
estafilococo (SPA) corresponde con la secuencia de la proteína Z de
la SPA según se establece en la SEC ID NO:1, y el polipéptido
abarcando las mutaciones por sustitución en por lo menos una de las
posiciones escogidas de entre N3, N6, N11, N21, N23, N28, N43 y
N52.
\newpage
18. Polipéptido según la reivindicación 17, que
consta de por lo menos una de las siguientes mutaciones: N3A, N6A,
N6D, N11S, N23T, N28A y N43E.
19. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que consta de residuos aminoácidos
adicionales en cualquier extremo terminal.
20. Polipéptido según la reivindicación 19, en
el que el residuo aminoácido adicional abarca un residuo de
cisteína en el extremo N-terminal o en el extremo
C-terminal del polipéptido.
21. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 20, en el que los residuos aminoácidos
adicionales abarcan un marcador, preferentemente escogido de entre
un marcador de hexahistidina, un marcador myc y un marcador
flag.
22. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 20, en el que los residuos aminoácidos
adicionales abarcan por lo menos un dominio funcional del
polipéptido, de manera que el polipéptido es un polipéptido de
fusión de un primer segmento específico, que consiste en el
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 18, y
por lo menos un segundo y opcionalmente otro segmento específico o
segmentos específicos.
23. Polipéptido según la reivindicación 22, en
el que el segundo segmento específico consiste en uno o más
polipéptido(s) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
18, haciendo el polipéptido un multímero de los polipéptidos de
unión a HER-2 según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, cuyas secuencias pueden ser las mismas o
diferentes.
24. Polipéptido según la reivindicación 22, en
el que el segundo segmento específico abarca por lo menos un
dominio del polipéptido capaz de unirse a una molécula diana aparte
de HER-2.
25. Polipéptido según la reivindicación 24, en
el que el segundo segmento específico abarca por lo menos un
dominio del polipéptido capaz de unirse a la
suero-albúmina humana.
26. Polipéptido según la reivindicación 25, en
el que por lo menos un dominio del polipéptido capaz de unirse a la
seroalbúmina humana es el dominio de unión a la albúmina de la
proteína G del estreptococo.
27. Polipéptido según la reivindicación 24, en
el que el segundo segmento específico abarca un polipéptido que
está relacionado con un dominio de la proteína A del estafilococo
(SPA) en que la secuencia del polipéptido corresponde con la
secuencia del dominio de la SPA teniendo entre 1 a 20 mutaciones por
sustitución.
28. Polipéptido según la reivindicación 27, en
el que la secuencia del polipéptido del segundo segmento específico
corresponde con la secuencia de la proteína Z de la SPA, según se
establece en la SEC ID NO:1, teniendo entre 1 a 20 mutaciones por
sustitución.
29. Polipéptido según la reivindicación 22, en
el que el segundo segmento específico es capaz de actividad
enzimática.
30. Polipéptido según la reivindicación 22, en
el que el segundo segmento específico es capaz de actividad
fluorescente.
31. Polipéptido según la reivindicación 22, en
el que el segundo segmento específico es una proteína de
recubrimiento de fagos o un segmento especifico del la misma.
32. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que consta de un grupo marcador.
33. Polipéptido según la reivindicación 32, en
el que el grupo marcador se elige entre los marcadores
fluorescentes, biotina y marcadores radioactivos.
34. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, acoplado a una sustancia con una
actividad contra las células que sobre-expresan
HER-2.
35. Polipéptido según la reivindicación 34, en
el que dicha sustancia con actividad contra las células que
sobre-expresan HER-2 se elige entre
agentes citotóxicos, agentes radiactivos, encimas para aplicaciones
ADEPT, citoquinas y factores pro-coagulantes.
36. Molécula de ácido nucleico que consta de una
secuencia que codifica un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 31.
37. Vector de expresión que consta de la
molécula de ácido nucleico según la reivindicación 36.
38. Célula huésped que consta del vector de
expresión según la reivindicación 37.
39. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 35 para su uso como medicamento.
40. Uso de un polipéptido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 35 en la preparación de un medicamento para
el tratamiento de por lo menos una forma de cáncer
caracterizada por la sobre-expresión de
HER-2.
41. Uso según la reivindicación 40, en el que
dicho polipéptido está conjugado con una sustancia con actividad
anti-cancerígena.
42. Uso de un polipéptido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 35 para la detección in vitro de
HER-2 en una muestra.
43. Método de detección in vitro de
HER-2 en una muestra, en el que se utiliza un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35.
44. Método según la reivindicación 43, que
abarca los pasos: (i) disposición de una muestra para ser sometida a
ensayo, (ii) aplicación de un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 35 a la muestra en condiciones tales que se
facilite la unión del polipéptido a cualquier HER-2
presente en la muestra, (iii) eliminación del polipéptido no unido,
y (iv) detección del polipéptido unido.
45. Método según la reivindicación 44, en el que
la muestra es una muestra de fluido biológico, preferentemente una
muestra de plasma sanguíneo humano.
46. Método según la reivindicación 44, en el que
la muestra es una muestra de tejido, preferentemente una muestra de
tejido humano, más preferentemente una muestra de biopsia de un ser
humano que padece cáncer.
47. Kit de diagnóstico de
sobre-expresión de HER-2 en una
muestra de tejido, kit que abarca un polipéptido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 35 fusionado con una enzima corresponsal,
reactivos para la detección de la actividad de dicha enzima
corresponsal, y porta objetos con tejido de control positivo y
negativo.
48. Kit de diagnóstico in vivo de
sobre-expresión de HER-2, kit que
abarca un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
35 marcado con un quelador, un isótopo radiactivo para el
diagnóstico, y reactivos para el análisis de la eficiencia de
incorporación.
49. Kit para llevar a cabo un método de dirigir
una sustancia que tiene actividad anti-cancerosa a
células que sobre-expresan HER-2
in vivo, método que abarca la administración de un conjugado
de dicha sustancia y un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 35 a un sujeto, kit que abarca un polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 marcado con un
quelador, un isótopo radiactivo terapéutico, y reactivos para el
análisis de la eficiencia de incorporación.
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