JP2011229531A - Her2に対する結合親和性を有するポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前記結合親和性を有するポリペプチドをコードする核酸、ならびに発現ベクターおよび核酸を発現するための宿主細胞。そのようなポリペプチドの薬剤としての使用、及びHER2を過剰発現する細胞へ該ポリペプチドに結合させた物質を誘導するためのターゲッティング剤としての使用。および、該ポリペプチドとHER2との結合を利用する方法および当該方法を実施するためのキット。
【選択図】なし
Description
ブドウ球菌のプロテインA(SPA)のドメインBに由来するプロテインZに関連した分子(Nilsson B et al (1987) Protein Engineering 1, 107-133)が、このような分子の無作為化されたライブラリーから、種々の相互作用標的を用いて選択されている(例えばWO95/19374;WO00/63243;Nord K et al (1995) Prot Eng 8: 601-608; Nord K et al (1997) Nature Biotechnology 15, 772-777参照)。種々の標的分子を用いて、例えばNord K et al (1997、上述)に記載されているようなプロテインZ誘導体を選択する。この参考文献に記載された実験は、特定の治療またはバイオテクノロジーへの応用に用いるための十分に高い親和性を有する分子を得るという明確な目的をもった研究というよりはむしろ、所定の標的に対するプロテインZ誘導体を選択するという一般的な技法の原理の概要を記したものである。
HER2癌原遺伝子は、HER2タンパク質または受容体として既知である185kD細胞表面受容体タンパク質の産生をコードする(Hynes NE et al (1994) Biochim Biophys Acta 1198: 165-184)。この遺伝子は、時として、neu、HER2/neuまたはc−erbB−2とも呼ばれる.neuは、エチルニトロソ尿素で処理され、この遺伝子の突然変異を示すラットで最初に発見されたものである(Shih C et al (1981) Nature 290: 261-264)。突然変異型のneuは、構成的な活性型受容体の産生を引き起こし、低コピー数で細胞を形質転換し得る強力な癌遺伝子を構成する(Hynes NE et al、上記を参照)。
治療用(例えば90Y、131I、211At)の放射性核種を容易に組入れるために、放射性同位体のためのキレート剤をポリペプチド配列にカップリングすることを目的として、上記で言及した付加的アミノ酸(特にヘキサヒスチジンタグ、システイン)が意図される。
スプレイ法を用いることにより、59残基からなる3ヘリックス束の結合ドメインは、結果的に33残基からなる2ヘリックス誘導体へと縮小された。これは、異なる領域からの無作為な突然変異の段階的な選択により達成され、それによって、安定性および結合親和性が繰り返し改善された。本発明の第一の態様によるポリペプチドに対すると同一の推論により、当業者は、「親」HER2ポリペプチドと同一の結合特性を有する「最小化」HER2結合ポリペプチドを得ることができよう。それゆえ、本発明の上記の態様によるポリペプチドの断片を構成するポリペプチドであって、該断片がHER2に対する結合親和性を保有するポリペプチドは、本発明のさらなる態様である。
胞分裂抑制)。この論証は、分子(抗体)が細胞表面上のHER2タンパク質に結合するといくつかの受容体の細胞内取り込みが生じ、細胞がさらに増殖するためのシグナルを制限する、という観察に基づいている(Baselga J et al (1998) Cancer Res 58: 2825-2831; Sliwkowski MX et al、上記を参照)。
HER2結合ポリペプチドの選択および試験
これらの実験では、多数の異なるSPAドメイン関連ポリペプチドのライブラリーから本発明のいくつかのHER2結合ポリペプチドを選択し、その後、特性を明らかにした。
Nord K et al (1995、上記参照)に記載されたのと本質的に同様に、コンビナトリアル・ファージディスプレイライブラリーを調製した。本試験に用いたこのライブラリーのプールは、第9位、10位、11位、13位、14位、17位、18位、24位、25位、27位、28位、32位および35位に無作為なアミノ酸残基を有するプロテインZ(Affibody(登録商標)分子)の8.7×108の変異体を含む。標的としてビオチニル化ヒトHER2細胞外ドメイン(HER2−ECD)を用いて、4回のパニングで、抗原結合Affibody(登録商標)分子を選択した(組換えヒト細胞外ドメイン、アミノ酸238〜2109、Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, USAにより提供)。4回の選択サイクルの結果、91個のクローンをファージELISA用に選択し、それらのHER2結合活性の分析を実施した。
4回の選択後に得られたクローンからのファージを96ウエルプレート中で生成させ、HER2結合Affibody(登録商標)分子を発現するファージをスクリーニングするために、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いた。シングルコロニーを、深穴96ウエルプレート中で2%グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを補充した250μlのTSB培地(30.0gのトリプシンダイズブロス(Merck)、水で最終
容積を1lとする。オートクレーブ処理)に接種し、37℃で一晩、振盪器上で増殖させた。5μlの一晩培養物を、新プレート中で、0.1%グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを補充した500μlのTSB+YE培地(30.0gのトリプシンダイズブロス(Merck)、5.0gの酵母抽出物、水で最終容積を1lとする。オートクレーブ処理)に添加した。37℃で3時間増殖後、0.5μlの5×1012pfu/ml(2.5×109pfu)のヘルパーファージM13K07(New England Biolabs, #NO315S)および100μlのTSB+YE培地を各ウエルに添加し、37℃で30分間、振盪せずにプレートをインキュベートした。IPTG、カナマイシンおよびアンピシリンを補充した300μlのTSB+YEを各ウエルに添加して、最終濃度を1mMのIPTG、25μg/mlのカナマイシンおよび100μg/mlのアンピシリンとして、プレートを30℃で一晩、振盪器上でインキュベートした。2,500gで15分間の遠心分離により細胞をペレット化し、Affibody(登録商標)分子を発現するファージを含有する上清をELISAに用いた。PBS(2.68mMのKCl、137mMのNaCl、1.47mMのKH2PO4、8.1mMのNa2HPO4、pH7.4)中の4μg/mlのHER2の100μlを、微量滴定プレート(Nunc #446612)に添加し、4℃で1ヶ月間インキュベートした。PBS中の2%粉末スキムミルク(ブロッキング緩衝液)で、室温で1時間、ウエルをブロッキング処理し、200μlのファージ含有上清および50μlの10%ブロッキング緩衝液を添加した。プレートを、室温で2時間インキュベートした。ポリクローナル抗体(ウサギ抗M13、Abcam #ab6188)を2%ブロッキング緩衝液中で1:1,000に希釈し、150μlを各ウエルに添加した。プレートを、室温で1時間インキュベートした。アルカリ性ホスファターゼと結合したヤギ抗ウサギIgG抗体(Sigma #A-3687)を2%ブロッキング緩衝液中で1:10,000に希釈し、その後150μlを各ウエルに添加し、室温で1時間インキュベートした。1Mのジエタノールアミン、5mMのMgCl2(pH9.8)と水の1:1混合物中にSigma−104基質(Sigma #104-105)を溶解することにより(1錠/5mlの1:1混合物)、展開溶液を調製した。その後、180μlの展開溶液を各ウエルに添加した。ウエルをPBS−T(PBS+0.1%Tween−20)で2回、PBSで1回洗浄した後、各々の新試薬を添加した。基質を添加してから25分後、ELISA分光光度計(Basic Sunrise, Tecan)を用い、A405で、プレートを読取った。
上記の手法に従って単離されたクローンからのDNAのシーケンシングを、メーカーの推奨によりABIプリズム(登録商標)、ビッグダイ(商標)ターミネーターv2.0レディリアクションサイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems)を用いて実施した。プラスミドを調製し、オリゴヌクレオチドRIT−27(5’−GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG−3’)およびビオチン化NOKA−2(5’−ビオチン−CGGAACCAGAGCCACCACCGG−3’)を用いて、Affibody(登録商標)分子をコードするDNAをシーケンシングした。ABIプリズム(登録商標)3700遺伝子分析装置(Applied Biosystems)で、配列を分析した。予め選択された53のクローンから、いくつかのクローンが同一アミノ酸配列をコードすることが判明した。これらの縮重を考慮に入れて、ELISA結合検定で選択されたクローンにより発現されるAffibody(登録商標)分子の4つの配列を図1に示し(ZHER2 A-D)、かつ配列番号2〜5として配列表中で同定した。
図2で概略的に示されている構築物をコードする発現ベクターを用いて、大腸菌細胞中でZHER2ポリペプチドを発現させた。これにより、該ポリペプチドは、N末端ヘキサヒスチジルタグとの融合体として産生された。融合ポリペプチドHis6−ZHER2 AおよびHis6−ZHER2 Bを固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)カラムで精製し、SDS−PAGEで分析した。SDS−PAGE実験の結果を、図3に示す。
前節により産生されたHisタグ化ZHER2変異体とHER2との間の相互作用を、ビアコア(登録商標)2000システム(Biacore AB, Uppsala, Sweden)により表面プラズモン共鳴を利用して分析した。ヒトHER2、HIV−1gp120(Protein Sciences Corporation、#2003-MN)およびBB(連鎖球菌プロテインG由来のアルブミン結合タンパク質)(後者2つは対照として用いる)を、メーカーの推奨に従って、CM−5チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、異なるフローセル中に固定した。ヒトHER2、HIV−1gp120およびBBの固定化は、それぞれ1900、6290および1000共鳴単位(RU)を生じた。第四フローセル表面を活性化し、注入を行う間のブランクとして用いるために非活性化した。His6−ZHER2 AおよびHis6−ZHER2 Bタンパク質をHBS(5mMのHEPES、150mMのNaCl、3.4mMのEDTA、0.005%界面活性剤P−20(pH7.4))で希釈して最終濃度を10μMとし、30μl/分の一定流量で、二つ組として、順不同に注入した。精製タンパク質His6−ZHER2 A及びHis6−ZHER2 BのHER2と相互作用する能力を、それぞれ図4および5のセンサグラム(sensorgram)に例示したように確認した。
HER2を発現する細胞とのZHER2 Aの結合
細胞培養
約2×106HER2分子/細胞を発現することが知られているヒト乳癌細胞株SKBR−3を、ATCCから購入した(ATCC#HTB−30)。10%ウシ胎仔血清、2mMのL−グルタミンおよびPEST(100 IU/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン)(すべてBiochrom KG, Berlin, Germanyから)を補充したRPMI 1640培地中で細胞を培養した。細胞を、37℃で、5%CO2を含有す
る湿潤空気中で培養し、実験の3日前に3cmペトリ皿中に植え付けた。
Orlova et al in Nucl Med Biol 27: 827-835 (2000)に従って、標識前駆体N−スクシンイミジルp−(トリメチル−スタンニル)ベンゾエート(SPMB)を調製し、5μgのSPMBを5%酢酸溶液中の5MBqの125Iに添加した。反応を開始するために、水溶液中の40μgのクロラミン−T(Sigma, St. Louis, MO)を添加した。反応混合物を5分間撹拌し、水溶液中の80μgのナトリウム−メタ−ビスルフェート(Aldrich, Steinheim, Germany)を添加して、反応を停止した。0.07Mのホウ酸緩衝液(pH9.2)中の40μgのHis6−ZHER2 AまたはHis6−ZHER2 Bに、該放射性標識前駆体を添加した。連続的に撹拌しながら、室温で45分間、カップリング反応を実施した。PBSで平衡化したNAP(商標)−5サイズ排除カラム(Amersham Biosciences)を用いて、標識ZHER2変異体を低分子量生成物から分離した。次に放射性標識ZHER2変異体をビアコア(登録商標)技法を用いて分析して、標識処理がHER2−ECDに対する結合親和性に影響を及ぼさなかったことを確認した。両ZHER2変異体は親和性保持を示した(データは示されていない)。
約100,000個のSKBR−3細胞を有する各培養皿に、14ngの標識His6−ZHER2 AまたはHis6−ZHER2 Bを含む1mlの培地を添加した。この量は、理論的
なリガンド:受容体比である5:1に相当する。細胞に由来しない非特異的結合を測定するために、細胞を含有しない3つの培養皿を同一方法で処理した。この値を、全ての他の値から差し引いた。細胞結合の特異性を分析するために、3つの培養皿を、標識されたZHER2変異体だけでなく、500倍過剰量の標識されていないZHER2変異体でも処理した。37℃で3時間のインキュベーション後、放射性培地を除去し、培養皿を氷冷無血清培地で3回、迅速に洗浄した。0.5mlのトリプシン/EDTA溶液(PBS中0.25%/0.02%;Biochrom KG, Berlin, Germany)を用いて、37℃で15分間、細胞をトリプシン処理した。次に細胞を1mlの培地中に再懸濁し、0.5mlの細胞懸濁液を細胞計数のために用い、残り1mlを自動ガンマーカウンターでの放射能測定のために用いた。
離速度の結果(上記参照)として、検出限界より低かった(データは示されていない)。
HER2結合ポリペプチド二量体の発現および特徴付け
DNA構築およびタンパク質産生
HER2受容体に対する親和性を有する新規のAffibodyリガンド(His6−ZHER2 Aと名づけられている)の選抜を、上に記した。ZHER2 Aポリペプチドをコードする遺伝子断片をHis6−ZHER2 Aのための発現ベクター中にサブクローニングすること
により、二量体ZHER2変異体を構築した。DNAシーケンサーABIプリズム(登録商標)3700アナライザー(Applied Biosystems, Foster City, CA)によるDNAシーケンシングにより、ZHER2 A断片の導入を確認した。大腸菌RRIΔM15菌株(Ruther, Nucleic Acids Res 10: 5765-5772 (1982))を、クローニングを行う間、細菌宿主として用いた。その結果得られたベクターは、T7プロモーターの制御下で(Studier et al, Methods Enzymol 185: 60-89 (1990))、N末端ヘキサヒスチジン(His6)タグと融合した二量体ZHER2変異体(ZHER2 A)2をコードし、これにより固定化金属イオンアフィ
ニティークロマトグラフィー(IMAC)による精製が可能になる。
リアルタイム生体特異的相互作用分析(BIA)のために、ビアコア(登録商標)2000機器(Biacore AB)を用いた。10mMのNaAc(pH4.5)で希釈したHER2の組換え細胞外ドメイン(HER2−ECD)を、メーカーの使用説明書に従って、アミンカップリングによりCM5センサーチップ(研究等級)(BR−1000−14、Biacore AB)の一方のフローセル表面のカルボキシル化デキストラン層上に固定した(約2200RU)。他方のフローセル表面を活性化及び非活性化して、参照用の表面として供した。ZHER2試料に関しては、メーカーのプロトコル(Amersham Biosciences)に従って、NAP(商標)−10カラムを用いて、ゲル濾過により、緩衝液をHBS(5mMのHEPES、150mMのNaCl、3.4mMのEDTA、0.005%界面活性剤P20(pH7.4))へと変更し、その後試料を濾過した(0.45μm;Millipore, Billerica, MA)。結合分析を25℃で実施し、HBSをランニングバッファーとして用いた。全てのビアコア(登録商標)分析に関して;試料は順不同に2度繰り返して流し、各回の注入の後に、10mMのHClの注入により、フローセルを復元させた。
の流量でのHER2−ECD表面上への5μMの各タンパク質の注入により検定した。図10から分かるように、His6−(ZHER2 A)2に関してより遅い解離速度(off-rate)が観察されたが、これは、HER−ECDとHis6−(ZHER2 A)2との結合が、His6−ZHER2 Aと比較してより強力であることを示す。
SKOV−3異種移植片を有するヌードマウスにおける、(ZHER2 A)2の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング
本実施例を構成する実験では、実施例3のHis6タグ化二量体(ZHER2 A)2ポリペプチドを125Iで放射性標識し、HER2の過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。標識されたポリペプチドの局在化を調べるため、ペプチドを注入されたマウスの画像処理と同様に、該ポリペプチドの生体内分布の検査も実施した。Taq DNAポリメラーゼに対する結合親和性を有する標識されたZドメイン誘導体を、HER2に対する特異性を有さない対照として用いた(ZTaq;Gunneriusson E et al(上記参照)に記載され、その中ではZTaq S1-1として言及されている)。
(ZHER2 A)2の間接的放射性ヨウ素標識
2.3μlの容量の125I(10MBqに相当する)(Na[125I]、Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)を、シリコン処理した微量遠心分離管に加えた。10μlの酢酸(水に0.1%)、5μlのN−スクシンイミジルp−トリメチル−スタンニル−ベンゾエート(の5%酢酸メタノール中で1mg/ml)(Koziorowski J et al, Appl Radiat Isot 49: 955-959 (1998)に従って調製)、ならびに10μlのクロラミン−T(4mg/ml水溶液)(CH3C6H4SO2N(Cl)Na・H2O、Sigma, St Louis, MO, USA)を添加した。多少混合しながら、5分間反応させた。次に、10μlのメタ亜硫酸水素ナトリウム(8mg/ml水溶液)(Na2S2O5、Sigma, St Louis, MO, USA)で、反応を終わらせた。40μlの容量の(ZHER2 A)2二量体(0.07Mのホウ酸緩衝液(pH9.2)(ホウ酸ナトリウム(Na2B4H7・10H2O)Sigma, St Louis, MO, USAおよび塩酸(HCl)Merck, Darmstadt, Germany)中、0.25mg/ml)を、反応試験管に添加した。別の40μlのホウ酸緩衝液を、pHを約9に上げるために、各試験管に添加した。連続振盪しながら45分間反応させた後、メーカーのプロトコルに従って、PBSで平衡化したNAP−5サイズ排除カラム(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)上で、反応成分を分離した。反応試験管、素通り画分、高MW画分、低MW画分およびカラムを、標識収率を算定するために、小型γ検出器(Mini-instruments Ltd, Essex, UK)を用いて60cm(125I)で測定した。後日使用するまで、20℃で、シリコン処理微量遠心分離管中に高分子量画分を貯蔵した。得られた収率は、25〜30%であった。
[125I]−NaIのストック溶液を、0.1%酢酸水溶液10μl、5μlのN−スクシンイミジルp−トリメチル−スタンニル−ベンゾエート溶液(5%酢酸メタノール中で1mg/ml)、および10μlのクロラミン−Tの水溶液(4mg/ml)と混合した。反応混合物を激しく撹拌し、振盪しながら室温で5分間、インキュベートした。10μlのメタ亜硫酸水素ナトリウムの水溶液(8mg/ml)で、反応を終了させた。PBS中のZTaq(2.4mg/ml)の溶液21μlを粗反応混合物に添加した。ホウ酸緩衝液(0.1M、pH9.15)の添加により、反応混合物のpHを約9に調整した。振盪しながら30分間、室温で反応混合物をインキュベートし、溶離液としてPBSを用いて、PBS中の5%アルブミン(ウシ、分画V、Sigma, St Louis, MO, USA)で予備平衡化したNAP−5カラムを用い、高分子量画分(標識ZTaq)および低分子量画分に分離した。得られた放射性物質の収率は、75%〜80%であった。具体的な放射能は、100kBq/μgであった。
M & Bからの雌非近交系nu/nu balbマウス(到着時に10〜12週齢)を、C181/1承認下で用いた。異種移植片を該マウスに移植する前の1週間、ルドベック研究所(Uppsala, Sweden)の動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。
A組からのマウス20匹を、各グループ4匹で5つのグループ(I〜V)に無作為に分けた。大型腫瘍を有するA組からの2匹は、画像処理試験に用いるために除外した。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム1に従った。
全注射が良好に耐容されたと判断した。
B組からのマウス24匹を、各グループ4匹で6つのグループに無作為に分けた。大型腫瘍を有するB組からの8匹は、画像処理試験に用いるために選択した。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム2に従った。
125Iの測定に関する標準プロトコルを用いた。バックグラウンドレベルを用いて補正した計数/分を、評価のために用いた。%ID/g(組織1gあたりの、注射された線量に対する百分率)として表される組織取込み値を、以下のように算出した。
%ID/g=[(組織の放射能/注射された放射能)/組織重量]×100
ここで、静脈注射に関しては、
注射された放射能=対照の注射器の平均放射能−使用した注射器の放射能−尾の放射能であり、皮下注射に関しては:
注射された放射能=対照の注射器の平均放射能−使用した注射器の放射能
である。
画像処理のために、全てのグループがA組からの大型腫瘍を有する1匹のマウスを含むということを考慮に入れつつ、各グループ5匹で2つのグループにマウスを分けた。B組からのマウスを無作為に抽出した。2グループのマウスに、PBS90μl中の125I(
2.9MBq/マウス)で間接標識した(ZHER2 A)2 2.3μgを、それぞれ画像処理の6時間または8時間前に注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全ての注射が良好に耐容されたと判断した。
エアを用いて、画像を評価した。
遮断実験
腫瘍中への(ZHER2 A)2の取込みが特異的で且つ受容体調節性であるか否かをはっきりさせるために、生体内分布実験Iにおける遮断実験を実施した。放射性ヨウ素標識二量体の主要静脈注射の前に、スキーム1のグループIIのマウスに、0.05mgの非標識(ZHER2 A)2を皮下注射した。グループIおよびグループIIにおける注射後1時間での放射能の取込みを比較した。マウスの2つのグループに関する腫瘍対血液比は、0.72(グループI平均)および0.25(グループII平均)であった(図11)。しかしながら、取込みの差は有意でなかった(p=0.16)。腫瘍を除く全ての器官において、放射能取込みは遮断ありおよび遮断なし、の動物の両方に関して同一であった。
生体内分布実験IIにおいて、グループIIIのマウスに、他のグループのマウスに注射した(ZHER2 A)2の量に相当する量のZTaqを注射した。(ZHER2 A)2に関すると同
一の間接的な方法を用いて、放射性ヨウ素でZTaqを標識しておいた。ZTaqは、HER2受容体に対して非特異的である。グループIおよびグループIIIにおける注射後4時間での放射能の取込みを比較した。この実験の結果(図12)は、非特異的ZTaq分子が特異的(ZHER2 A)2分子より低い腫瘍取り込みを有する、ということを示した。この実験における腫瘍対血液比は、1.43(グループI、特異的(ZHER2 A)2)および0.15(グループIII、非特異的ZTaq)であった。統計学的分析により、差が有意である(p=0.009)ことが示された。他の器官すべてにおいて、放射能取込みは、両Z分子に関して同一レベルであった。
標識された(ZHER2 A)2を静脈注射しておいた生体内分布実験IおよびIIにおけるマウスのグループからの結果を、腫瘍を保持するマウスの器官および組織中の放射性ヨウ素の生体内分布の分析と併せた。結果を図13〜図16に示す。
画像処理のために選択された各々5匹から成る2グループの各々から、ガンマ画像を撮影した(それぞれ注射後6時間および8時間)。両時点での全てのマウスにおいて、鮮明な構造を有する腎臓を同定することができた。いくつかのさらなる構造(おそらくは肝臓)が、注射後6時間のマウスの画像に、腎臓に重なって、全身血液プールからのバックグラウンド増大に加えて、認められる。いくつかの動物はそれらの膀胱中に多少の尿を有したが、これも直接観察される。注射後8時間のマウスに関する画像では、頚部領域のさらなる構造が同定され得るが、これはおそらく甲状腺である。
SKOV−3(卵巣癌細胞株)腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素(125I)で間接的に標識された二量体ポリペプチド(ZHER2 A)2の生体内分布は、正常マウスにおける該二量体ポリペプチドの正常な生体内分布と良好な一致を示した。125I−ベンゾエート−(ZHER2 A)2として注射される放射性ヨウ素の腫瘍への取込みが達成された。腫瘍への取込みは、高濃度の非標識(ZHER2 A)2分子の予備注射を用いた遮断実験により、且つ非特異的な、標識されたZ変異体ZTaqの注射により示されるように、受容体介在性かつ特異的であった。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度が注射後4時間の血中の放射能濃度より高く、且つ腎臓および甲状腺を除いて、注射後6時間における大多数の正常器官および組織中より高い、ということが示された。SKOV−3異種移植腫瘍を保有するマウスのガンマ画像を、注射後6および8時間で得た。良好な分解能が達成された。両時点で、大きい侵潤腫瘍を明瞭に同定できた。
SKOV−3異種移植片を保有するヌードマウスにおけるHis6−ZHER2 A単量体の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング
本実施例を構成する実験では、実施例1および2の単量体ZHER2 Aポリペプチドを125Iで放射性標識し、HER2の過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。該ポリペプチドの生体内分布の検査を、その局在化を調べるために実施した。
ZHER2 Aの間接的放射性ヨウ素標識
125Iで標識するために、40μlの単量体His6−ZHER2 Aを、実施例4における二量体ポリペプチド構築物と同様の処理に付した。
M & Bからの雌の非近交系nu/nu balbマウス(到着時、10〜12週齢)を、C66/4承認下で用いた。異種移植片をマウス中に移植する前の1週間、ルドベック研究所(Uppsala, Sweden)の動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の3週間前に、5×107個のSKOV−3ヒト卵巣癌細胞(ATCC#HTB−77)を16匹のマウスの右後足に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全てのマウスにおいて定着しており、全てのマウスの体重は22〜27gであった。
実施例4に記載されたように125I測定を実施し、%ID/gを算出した。
マウス16匹を、各グループ4匹で4つのグループ(I〜IV)に無作為に分けた。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム3に従った。PBS50μl中の125I(100kBq/マウス)で間接標識したZHER2 A0.5μgをマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
標識されたZHER2 Aを皮下注射しておいたマウスのグループからの結果を、マウスの器官および組織中の放射性ヨウ素の分布を確証するために分析した。結果を図18〜図20に示す。図18および図19を参照すると、腫瘍中の125Iの濃度は、4時間および24時間で大多数の正常器官中での濃度より高く、このことはZHER2 AポリペプチドがHER2を保有する腫瘍細胞を標的にすることができる、ということを示す。正常な器官および組織中の放射能濃度は、腎臓(全時点)および甲状腺(全時点)を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した。実験は、血液および正常器官からの放射性ヨウ素の迅速なクリアランスを示した。正常器官からのクリアランスは、放射性ヨウ素の蓄積が見出された甲状腺を除いて、大抵の場合は血中クリアランスに次ぐものであった。高濃度の放射性ヨウ素はマウスの腎臓においても見出された。図20は、血中および腫瘍中の放射性ヨウ素濃度の長時間にわたる経過を示す。注射後4時間から始めると、腫瘍の放射能は、血液の放射能より6倍高かった。放射能濃度の腫瘍対血液比(図21)は、注射後少なくとも8時間の間(この時点での該比の値は10対1であった)、時間に伴って増大した。
SKOV−3(卵巣癌細胞株)腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素(125I)で間接的に標識された単量体ポリペプチドZHER2 Aの生体内分布は、正常マウスにおける該ポリペプチドの正常な生体内分布と良好な一致を示した。125I−ベンゾエート−ZHER2 Aとして注射される放射性ヨウ素の腫瘍取込みが達成された。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度が注射後4時間の血中の放射能濃度より高く、二量体の形態(ZHER2 A)2と比較した場合、腎臓および甲状腺を除いて、注射後4時間においてすでに大多数の正常器官および組織中より高い、ということが示された。
SKOV−3異種移植片を保有するヌードマウスにおけるABD(ZHER2 A)2の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング
本実施例を構成する実験では、ABD(ZHER2 A)2と名づけられたポリペプチドを生成するために、実施例3の二量体(ZHER2 A)2ポリペプチドを、そのN末端で、連鎖球菌プロテインG由来の「アルブミン結合ドメイン」(ABD)と遺伝子操作によって融合した(図22)。ABDは、ヒトおよびマウス血清アルブミンに高い親和性で結合する(M Johansson et al, J Biol Chem 277: 8114-8120 (2002))。アルブミンは、緩徐な血漿クリアランスを有する血中に豊富なタンパク質である。アルブミンとの高親和性の結合は、アルブミンタンパク質それ自体と同様に、該結合剤に緩徐な動態を付与する。動物における腫瘍ターゲッティングリガンドの循環時間が延長されると、理論上、腫瘍に送達される用量は増加する。これを試験するために、ABD(ZHER2 A)2ポリペプチドを125Iで放射性標識し、HER2過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。ポリペプチドの生体内分布の検査を、その局在化を調べるために実行した。
DNA構築およびタンパク質産生
His6−ZHER2 Aと名づけた、HER2受容体に対する親和性を有する新規のAffibodyリガンドの選択は、実施例1および2に記されている。ZHER2 Aポリペプチドをコードする遺伝子断片をHis6−ZHER2 A用の発現ベクター中にサブクローニングすることにより構築される二量体ZHER2変異体は、実施例3に記載された。ABDポリペプチドをコードする遺伝子断片をHis6−ZHER2 A用の発現ベクター中にサブクローニングし、ヘキサヒスチジンタグをABDポリペプチドで置換することにより、この二量体ZHER2 A変異体のABD融合タンパク質を構築した。さらに、エクステンションPCRを利用して、C末端システイン残基を融合タンパク質に付加した。DNAシーケンサーABIプリズム(登録商標)3700アナライザー(Applied Biosystems, Foster City, CA)でのDNAシーケンシングにより、導入されたABD断片を確認した。大腸菌RRIΔM15菌株(Ruther, Nucleic Acids Res 10: 5765-5772 (1982))を、クローニングの間、細菌宿主として用いた。得られたベクターは、T7プロモーターの制御下で(Studier et al, Meth Enzymol 185: 60-89 (1990))、ABDと融合した二量体ZHER2変異体(ABD(ZHER2 A)2)をコードしており、これはC末端がシステイン残基と融合されていることにより部位特異的な化学的修飾が可能である(図22)。二量体ZHER2変異体を、大腸菌BL21(DE3)菌株中でABDとの融合体として発現させて、メーカーのプロトコル(Amersham Biosciences)に従って調製されたアルブミンセファロースアフィニティーカラム上でのアフィニティークロマトグラフィー精製により、回収した。適切な吸光係数を用いて、280nmでの吸光度測定値からタンパク質濃度を算定した。Novexシステム(Novex, CA, USA)を用いて、トリス−グリシン16%均質ゲル上でのSDS−PAGEにより、精製タンパク質をさらに分析した。クマシーブリリアントブルー染色により、タンパク質帯域を可視化した。SDS−PAGE分析により、該タンパク質は、予測された分子量の明確な帯域として観察された。
125Iで標識するために、40μlのABD(ZHER2 A)2を、実施例4における二量体ポリペプチド構築物と同一の処理に付した。
M & Bからの雌非近交系nu/nu balbマウス(到着時、10〜12週齢)を、C66/4承認下で用いた。異種移植片を該マウスに移植する前の1週間、ルドベック研究所(Uppsala, Sweden)の動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の3週間前に、5×107個のSKOV−3ヒト卵巣癌細胞(ATCC#HTB−77)を16匹のマウスの右後足に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全マウスにおいて定着しており、全マウスの体重は22〜27gであった。
実施例4に記載されたように、125I測定を実施し、%ID/gを算定した。
マウス16匹を、各グループ4匹の4つのグループ(I〜IV)に無作為に分けた。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム4に従った。50μlのPBS中の125I(
100kBq/マウス)で間接標識した0.5μgのABD(ZHER2 A)2をマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
結果を図23〜図24に示す。図23を参照すると、腫瘍中の125Iの濃度は、12時間(腫瘍 2.4%ID/g)および24時間(腫瘍 2.2%ID/g)では、ほとんどの正常器官中の濃度より高く、このことは、ABD(ZHER2 A)2ポリペプチドがHER2を保有する腫瘍細胞を標的にし得る、ということを示す。正常な器官および組織中の放射能濃度は、腎臓(全時点、24時間で3.5%ID/g)、甲状腺(全時点、24時間で5.2%ID/g)および血液(全時点、24時間で3.9%ID/g)を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した。肺での値は、腫瘍での値とほとんど等価であるが、これは、肺中の血液含量が高いためかもしれない。実験は、血液からの放射性ヨウ素の非常に遅いクリアランスを示した。これは、ABD(ZHER2 A)2のABD部分が、緩徐な動態を有する血中に豊富なタンパク質である血清アルブミンと高親和性で結合するため、予測できることである。正常器官からのクリアランスは、放射性ヨウ素の蓄積が見出された甲状腺を除いて、血中クリアランスより迅速であった。高濃度の放射性ヨウ素はマウスの腎臓においても見出された。図24は、実施例4および5におけるZHER2 Aの単量体および二量体構築物に関して作成された結果と比較した場合の、腫瘍中のABD(ZHER2 A)2に関連した放射性ヨウ素濃度の長時間にわたる経過を示す。注射後24時間で、ABD(ZHER2 A)2を用いた際の腫瘍の放射活性は、単量体または二量体の場合より13倍高かったが、これは、標的部分の体内での残留時間の延長が実際に腫瘍上での線量を増大するために利用され得る、ということを示す。このデータにより(ZHER2 A)2部分をアルブミン結合ドメインに機能的に結合できる、ということも裏付けられる。
SKOV−3(卵巣癌細胞株)腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素(125I)で間接的に標識された融合ポリペプチドABD(ZHER2 A)2の生体内分布は、予測されたアルブミン結合ポリペプチドの特性と良好な一致を示した。125I−ABD(ZHER2 A)2として注射された放射性ヨウ素の腫瘍への取込みが達成され、腫瘍での線量はZHER2 Aポリペプチドの二量体または単量体バージョンでのものより高かった。得られたデータの分析により、肺、腎臓、甲状腺および血液中の放射能は依然として高かったものの、腫瘍中の放射能濃度は注射後12時間でのほとんどの他の器官中の放射能濃度よりは高いことが示された。
テクネチウム標識二量体99mTc−(ZHER2 A)2の生体内分布
本実施例を構成する実験では、実施例3による二量体His6−(ZHER2 A)2ポリペプチドを、診断用画像処理核種99m−テクネチウムで標識し、正常マウス及びHER2過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウス中に注射した。99mテクネチウム(99mTc)は、in vivo診断のための理想に近い特性を有する放射性核種である。さらにこれは安価で且つ容易に入手可能であり、このことが99mテクネチウムを、病院における医学的画像処理のための望ましい候補にしている。該ポリペプチドの生体内分布の試験を実行して、その局在化を調べた。
His6−(ZHER2 A)2のテクネチウム標識
His6−(ZHER2 A)2タンパク質上のヘキサヒスチジンタグへ99mTc核種を送達する市販のIsoLink(商標)キット(Mallinckrodt, Netherlands)を用いて、メーカーの使用説明書に従って、His6−(ZHER2 A)2ポリペプチドを標識した。IsoLink(商標)キット試薬はテクネチウム陽イオン[99mTc(CO)3(H2O)3]+を生じ、これは次に、ヘキサヒスチジンタグにより安定的に配位結合されて、His6−(ZHER2 A)2ポリペプチドのHis6タグを特異的に標識するための手段を提供する。
M & Bからの雌非近交系nu/nu balbマウス(到着時、10〜12週齢)を、C66/4承認下で用いた。異種移植片をマウス中に移植する前の1週間、標準的な食餌、寝床および環境を用い、ルドベック研究所(Uppsala, Sweden)の動物施設でマウスを
順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の3週間前に、5×107個のSKOV−3ヒト卵巣癌細胞(ATCC#HTB−77)を4匹のマウスの右後足
に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全マウスにおいて定着しており、全マウスの体重は22〜27gであった。
実施例4において125Iに関して記載したと同様に、99mTcの測定を実施し、%ID/gを算出した。
4匹のマウスを有する1つのグループを実験に用いた。注射および屠殺の時間は、スキーム5に従った。50μlのPBS中の99mTc(100kBq/マウス)で標識した0
.5μgのHis6−(ZHER2 A)2をマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
結合体99mTc−His6−(ZHER2 A)2は、in vitroで高い安定性を有した(PBS、血漿、システインおよび過剰量の遊離ヒスチジンで攻撃)。99mTc−His6−(ZHER2 A)2のin vivoでの生体内分布実験からの結果を、図25〜図27に示す。図25を参照すると、総腫瘍線量は、125I標識された単量体構築物である125I−ベンゾエート−ZHER2 A(注射後8時間で1.1%ID/g)または二量体構築物である125I−ベンゾエート−(ZHER2 A)2(注射後8時間で1.06%ID/g)と比較した場合、99mTc−His6−(ZHER2 A)2(注射後8時間で、3.3%ID/g)を用いた場合は3倍高かった。99mTcは、125Iより良好な残留性物質であるということが既知であり、これは、99mTcでは送達された用量が残存する一方、ヨウ素では用量は代謝され、腫瘍細胞から放出されることを意味する。図26を参照すると、腫瘍中の99mTcの濃度は、注射後8時間においてはほとんどの正常器官より高かった(腫瘍 3.3%ID/g)が、これは、99mTc−His6−(ZHER2 A)2ポリペプチドがHER2を保有する腫瘍細胞を標的にし得る、ということを示す。正常器官および組織中の放射能濃度は、腎臓(8時間で27%ID/g、腫瘍線量の36倍)および肝臓(8時間で11.4%ID/g、腫瘍線量の3倍)を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した(図27)。99mTc−His6−(ZHER2 A)2は腎臓を介して除去されるため、腎臓での高い値が予測された。腎臓中の高レベルのトレーサーは毒性の問題を示さないが、これは、注射された総線量は診断目的であって非常に低いからである。甲状腺中の放射能の量は、予測どおり、125Iを用いた場合(実施例4)ほど高いことは全くなかった(8時間で1%ID/g)。正常器官からのクリアランスは、1時間をピークとする99mテクネチウムの蓄積が観察された腎臓を除き、主として血中クリアランスに次ぐものであった。レベルはその後低下し、1時間の間(注射後2時間まで)に急速排除期、その後、緩徐排除期が続き、24時間後においても腎臓中には依然としてかなりの線量(70%ID/g)が認められた。
SKOV−3(卵巣癌細胞株)腫瘍を保有するマウスにおける、99mTc標識ポリペプチド99mTc−His6−(ZHER2 A)2の生体内分布は、医療用画像処理目的にとって相対的に良好な分布特性を示した。99mTc−His6−(ZHER2 A)2として注射されたテクネチウムの腫瘍への取込みが達成され、腫瘍での線量は、ZHER2 Aポリペプチドの125I標識二量体または単量体バージョンに対するものより高かった。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度は、実質的に腫瘍より高い取込みが肝臓および腎臓で認められるものの、注射後8時間ではほとんどの他の器官および血液中の放射能濃度よりは高いことが示された。
211Atを用いたin vitro標識および特徴付け
本実施例を構成する実験においては、実施例3による二量体His6−(ZHER2 A)2ポリペプチドを、125Iを用いた標識に関して上記したと同様の化学的手法を用いて、治療用放射性核種である211アスタチン(211At)で標識した。放射性核種の腫瘍へのターゲッティングの一目的は、放射線療法である。これは、標的細胞を根絶することができる高エネルギー粒子、例えばα粒子および高エネルギーβ粒子を放射する核種を要する。α放出放射性ハロゲン211At(T1/2=7.2時間)は、ごく少数の細胞の直径程度の飛程(range)を有しており、これは、細胞の根絶が高精度で起こり得ることを意味する。211At標識ポリペプチドのin vitroでの殺細胞能力の試験を実行した。
2日前に、HER2過剰発現により特徴付けられる100,000個のSKBR−3細胞を、3cm培養皿に植え付けた。60μgのHis6−(ZHER2 A)2ポリペプチドを、
コペンハーゲン大学病院のScanditronixMC32サイクロトロン中で生成した211Atで標識して、Jorgen Carlsson(ウプサラ大学(Uppsala, Sweden))の研究室で精製した。約1:1および5:1モル比の211At−(ZHER2 A)2分子/細胞受容体を、3つの培養皿の各々に添加した。さらに3つの別の培養皿には、5:1濃度の211At−(ZHER2 A)2に加えて、結合部位を遮断することにより非特異的な放射の影響を概算することを目的として、500倍過剰量の非標識His6−(ZHER2 A)2を供給した。細胞を、37℃で24時間、211At−(ZHER2 A)2とともにインキュベートした。24時間のインキュベーション後、全細胞を洗浄し、新しい新鮮な培地を補給した。次に、約2ヶ月間、週に1回、それらの増殖をモニタリングした。
HER−2を過剰発現するヒト乳癌細胞株SKBR−3からの細胞を、2つの異なる用量の211At−(ZHER2 A)2に24時間曝露した。第一の用量では、添加した211At−(ZHER2 A)2分子は、細胞上のHER2標的受容体の数と等しかった。第二の用量では、211At−標識分子を5倍過剰量で添加した。24時間のインキュベーション後、週に1回、2ヶ月にわたって細胞をモニタリング、計数し、生存画分を確定した。図28で観察されるように、応答は、投与された用量に関連した。等モル量の211At−(ZHER2 A)2を投与された細胞は、放射能がターゲッティング剤を伴わずに添加される対照と比較して、いかなる特異的な増殖の遅延も示さなかった。非特異的な放射線傷害により短期間の増殖遅延が認められたが、しかし細胞は増殖を停止しなかった。これに対比して、211At−(ZHER2 A)2を5倍過剰量で添加した場合、細胞増殖の抑制は目覚ましいものであった。実験終了時、高用量投与グループは未だ正常な状態に回復していなかったが、一方、低用量および対照グループは106倍に増殖していた。生存細胞が実験前とほぼ同一の増殖率を照射後にも維持していると考えると、5:1グループ中の全細胞が根絶されたことになる。取込み曲線は、遮断処理された5:1グループも、おそらくは遮断が不十分であったために、細胞に対してかなりの量の照射を受けていた、ということを明示した。細胞あたりの崩壊数(DPC)を、統合した取込み曲線から概算した。増殖曲線から、指数増殖曲線の勾配として倍加時間を算出し、かつ、遅延した増殖の曝露時間への外挿により、生存画分を算定した。第1表に結果を示す。
211At−(ZHER2 A)2は、in vitroでHER2過剰発現SKBR−3細胞との特異的な結合を示した。誘導された細胞死は、蓄積された線量と良好に相関した。100未満の崩壊数/細胞は、単一の細胞を殺傷して完全に細胞を根絶するのに十分であることを示した。
付加的なHER2結合ポリペプチドの同定および特徴付け
実施例1に記載した選択から得られるHER2結合Z変異体の親和性を増大させるために、第二のライブラリーの構築(Gunneriusson et al, Protein Eng 12: 873-878(1999); Nord et al, Eur J Biochem 268: 4269-77 (2001))と、その後のHER2に対する再選択とを包含する親和性の成熟戦略を適用した。第一世代のポリペプチド変異体ZHER2 A、B、CおよびDのアラインメントは、第13位、14位、28位、32位および35位での同一性とは別に、ZHER2 AおよびZHER2 B間に、第10位におけるRおよびKへの、そして第11位におけるQおよびTへの集中(convergence)が認められる、ということを示した。したがって第二世代のライブラリーは、5つの固定された位置、すなわち第13位、14位、28位、32位および35位、ならびに2つの部分的に固定された位置、すなわち第10位(縮重コドンとしてcgc/aaa)および第11位(縮重コドンとしてcaa/acc)を含有する一方、残りの第9位、17位、18位、24位、25位および27位は、NNG/T縮重コドンを用いて再び無作為化された。形質転換後、3×108クローンのライブラリーを得た。標的としてヒトHER2(HER2−ECD)のビオチニル化細胞外ドメイン(組換えヒトHER2細胞外ドメイン、アミノ酸238〜2109、Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, USAによる提供)を用い、その濃度を低下させながら、抗原結合分子に対して5回の選択を施した。
4回および5回の選択から無作為に選択されるクローンを、96ウエルプレート(Nunc)中で生成させた。ABAS ELISAと呼ばれるELISAスクリーニング手法を用いて、高親和性HER2結合Z変異体を同定した。単一コロニーを、深穴96ウエルプレート中で1mMのIPTGおよび100μg/mlのアンピシリンを補充した1mlのTSB−YE培地(30.0gのトリプシンダイズブロス(Merck)および5.0gの酵母抽出物(Merck)、水で最終容積を1lとする)に接種し、37℃で一晩、振盪器上で増殖させた。3,000gで10分間の遠心分離により細胞をペレット化した。ペレットを300μlのPBS−T中に再懸濁し、−80℃で少なくとも30分間凍結させた。プレートをぬるま湯中で解凍し、3,500gで20分間遠心分離した。100μlの上清を微量滴定ウエル(#9018 Costar(登録商標))に入れて、これを4℃で一晩、15mMのNa2CO3および35mMのNaHCO3(pH9.6)中の6μg/mlのヒト血清アルブミン(HSA)と共にインキュベートし、室温で1時間、PBS−T中の2%粉末スキムミルクでブロッキングしておいた。プレートを4回洗浄した後、1μg/mlのビオチニル化HER2/ウエル100μlを添加し、1.5時間インキュベートした。ウエルを4回洗浄した後、ストレプトアビジン−HRP(1:5,000)(#P0397 Dako)を添加し、1時間インキュベートした。ウエルを4回洗浄し、最終洗浄後、100μlの展開溶液(ImmunoPure)TMB(#34021 Pierce)を各ウエルに添加した。20〜30分後、100μlの停止溶液(2MのH2SO4)を、各ウエルに添加した。450nmでの吸光度をELISA読取器(Tecan)で測定した。ABAS ELISAからの結果を図29に示す。図29Aおよび図29BのグラフのX軸は、該96ウエルプレートのウエルの番号に対応する。したがって図29Aは第一の96ウエルプレートに関するELISA結果を示し、一方、図29Bは第二のプレートに関する結果を示す。
ABAS−ELISAで分析したZHER2変異体をコードするDNAのシーケンシングを、ビオチニル化オリゴヌクレオチドAFFI−72(5’−ビオチン−CGGAACCAGAGCCACCACCGG)を用いて、製造者の推奨に従って、ABIプリズム(登録商標)、dGTP、ビッグダイ(商標)ターミネーターv3.0レディリアクションサイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems)を用いて実施した。ABIプリズム(登録商標)3100遺伝子分析器(Applied Biosystems)で、配列を分析した。配列分析は、130の独特の配列を生じた。ネガティブ対照の値より少なくとも2倍高い吸光度値により立証されるような、ABAS ELISA実験で結合を示したZHER2変異体かに由来する配列は図1に示されており、配列番号6〜76として配列表で同定される。これらのHER2結合Z変異体の命名法は、以下の通りである。ELISA実験の第一のプレートから単離された変異体(図29A)は、ZHER2:1NNと呼ばれ、この場合、NNはその特定のポリペプチド変異体が分析された第一のプレート中のウエルの番号に対応する。ELISA実験の第二のプレートから単離された変異体(図29B)は、ZHER2:2NNと呼ばれ、この場合、NNはその特定のポリペプチド変異体が分析された第二のプレート中のウエルの番号に対応する。
図30で模式的に示されている構築物をコードする発現ベクターを用いて、大腸菌細胞中で、選定したHER2結合ポリペプチドを発現させた。N末端ヘキサヒスチジルタグとの融合体として、該ポリペプチドを生成させた。His6−タグ化ポリペプチドZHER2:101、ZHER2:107、ZHER2:149、ZHER2:202、ZHER2:205、ZHER2:207、ZHER2:209、ZHER2:222、ZHER2:225およびZHER2:229、ならびにZHER2 Aを、変性条件下で、BioRobot3000(Qiagen)およびNI−NTA Superflow96BioRobot手法を用いて精製した。精製されたHis6−タグ化タンパク質を、PBS(2.68mMのKCl、137mMのNaCl、1.47mMのKH2PO4、8.1mMのNa2HPO4、pH7.4)中で透析した。試料のタンパク質濃度を、280nmでの測定吸光度値およびそれぞれのタンパク質の理論的吸光係数から算出した。
前節により産生されたHisタグ化ZHER2変異体とHER2との間の相互作用を、ビアコア(登録商標)2000システム(Biacore AB, Uppsala, Sweden)での表面プラズモン共鳴を用いて分析した。ヒトHER2およびIgG(免疫グロブリンG)を、製造者の推奨に従って、CM−5チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、別個のフローセル中に固定した。ヒトHER2およびIgGの固定化は、それぞれ4,600および5,100共鳴単位(RU)を生じた。第三のフローセル表面を活性化し、及び注入の間のブランクとして用いるために不活性化した。融合ポリペプチドZHER2:101、ZHER2:107、ZHER2:149、ZHER2:202、ZHER2:205、ZHER2:207、ZHER2:209、ZHER2:222、ZHER2:225およびZHER2:229を、1×HBS−EP(5mMのHEPES、150mMのNaCl、3.4mMのEDTA、0.005%界面活性剤P−20、pH7.4)により希釈して、最終濃度を50nMとし、10μl/分の一定流量で注入した。総注入時間は2分(会合)で、その後3分間洗浄した(解離)。表面を、25mMのHClの2回の注入により再生した(30秒/注入)。参照細胞中で測定された応答(活性化/不活性化表面)を、固定化されたHER2を有する細胞中で測定された応答から差し引いた。HER2と相互作用する精製タンパク質の能力を、図31のセンサグラムにより例示されるように、確認した。
付加的なHER2結合ポリペプチドの同定および特徴付け
実施例1に記載した選択の3回目および4回目に得られるクローンの包括的な配列分析を実施した。製造者の推奨に従って、ABIプリズム(登録商標)、dGTP、ビッグダイ(商標)ターミネーターv3.0レディリアクションサイクルシーケンシングキット(
Applied Biosystems)を、そしてABIプリズム(登録商標)3100遺伝子分析器(Applied Biosystems)を用いて、DNAをシーケンシングした。ビオチニル化オリゴヌクレオチドAFFI−72(5’−ビオチン−CGGAACCAGAGCCACCACCGG)を、プライマーとして用いた。配列分析は、11の新規のポリペプチド配列、即ち実施例1に記載した試験において見出されなかったクローンを明示した。
His6タグ化ZHER2変異体とHER2との間の結合活性を、ビアコア(登録商標)2000(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を用いて分析した。ヒトHER2およびHIV−1gp120(Protein Sciences Corporation、#2003−MN)を、製造者の推奨に従って、CM−5チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、別個のフローセル中に固定した。ヒトHER2およびHIV−1gp120の固定化は、それぞれ2631および3138共鳴単位(RU)を生じた。第三のフローセル表面を活性化し、及び注入を行う間のブランクとして用いるために不活性化した。ZHER2変異体を、1×HBS−EP(5mMのHEPES、150mMのNaCl、3.4mMのEDTA、0.005%界面活性剤P−20、pH7.4)中に希釈して、最終濃度を1μMとし、10μl/分の一定流量で注入した。総注入時間は1分(会合)で、その後3分間洗浄した(解離)。表面を、10mMのHClの30秒間の注入により再生した。参照細胞中で測定された応答(活性化/不活性化表面)を、固定化HER2を有する細胞中で測定された応答から差し引いた。3つの精製タンパク質ZHER2:3035、ZHER2:0434およびZHER2:0024*は、図32のセンサグラムにより例示されるように、HER2と特異的に結合した。これらのZHER2変異体の配列は図1に示されており、配列番号77〜79として配列表で同定される。
Claims (57)
- HER2に対する結合親和性を有し、かつブドウ球菌のプロテインA(SPA)のドメインに関連するポリペプチドであって、該ポリペプチドの配列は1〜約20の置換変異を有する前記SPAドメインの配列に相当する、ポリペプチド。
- HER2に対する結合親和性を有し、相互作用のKD値が最大で1×10-6Mであることを特徴とする、請求項1記載のポリペプチド。
- HER2に対する結合親和性を有し、相互作用のKD値が最大で1×10-7Mであることを特徴とする、請求項2記載のポリペプチド。
- 配列番号1に示されるSPAプロテインZの配列において1〜約20の置換変異を含む配列に相当する配列であることを特徴とする、請求項1〜3いずれか一項記載のポリペプチド。
- 4〜約20の置換変異を含む、請求項4記載のポリペプチド。
- 第13位、第14位、第28位、第32位および第35位のうちの1以上の位置における置換変異を含む、請求項4又は5記載のポリペプチド。
- 第9位、第10位、第11位、第17位、第18位、第24位、第25位および第27位のうちの1以上の位置における置換変異をさらに含む、請求項6記載のポリペプチド。
- 第13位におけるフェニルアラニンからチロシンへの置換変異を含む、請求項4〜7いずれか一項記載のポリペプチド。
- 第14位におけるチロシンからトリプトファンへの置換変異を含む、請求項4〜8いずれか一項記載のポリペプチド。
- 第28位における、アスパラギンから、アルギニンおよびヒスチジンから選択されるアミノ酸残基への置換変異を含む、請求項4〜9いずれか一項記載のポリペプチド。
- 第28位におけるアスパラギンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項4〜10いずれか一項記載のポリペプチド。
- 第32位におけるグルタミンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項4〜11いずれか一項記載のポリペプチド。
- 第35位におけるリジンからチロシンへの置換変異を含む、請求項4〜12いずれか一項記載のポリペプチド。
- 第10位におけるグルタミンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項4〜13いずれか一項記載のポリペプチド。
- 第11位におけるアスパラギンからスレオニンへの置換変異を含む、請求項4〜14いずれか一項記載のポリペプチド。
- 第17位におけるロイシンからバリンへの置換変異を含む、請求項4〜15いずれか一項記載のポリペプチド。
- 第27位における、アルギニンから、リジンおよびセリンから選択されるアミノ酸残基への置換変異を含む、請求項4〜12いずれか一項記載のポリペプチド。
- 配列番号1の配列において突然変異F13Y、Y14W、N28R、Q32RおよびK35Yを少なくとも含む配列に相当するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項4〜17いずれか一項記載のポリペプチド。
- アミノ酸配列が、配列番号2〜79のいずれか1つに示される、請求項4〜18いずれか一項記載のポリペプチド。
- アミノ酸配列が、配列番号2又は3に示される、請求項19記載のポリペプチド。
- 関連するブドウ球菌プロテインA(SPA)のドメイン中に存在するアスパラギン残基のうちの少なくとも1つが、別のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記ブドウ球菌プロテインA(SPA)のドメインの配列が配列番号1に示されるSPAプロテインZの配列に相当し、かつ該ポリペプチドはN3、N6、N11、N21、N23、N28、N43およびN52から選択される少なくとも1つの位置での置換変異を含む、請求項21記載のポリペプチド。
- N3A、N6A、N6D、N11S、N23T、N28AおよびN43E、の突然変異のうち少なくとも1つを含む、請求項22記載のポリペプチド。
- 前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドの断片を構成し、該断片はHER2に対する結合親和性を保持していることを特徴とする、ポリペプチド。
- いずれかの末端に付加的なアミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記付加的なアミノ酸残基は、N−またはC末端におけるシステイン残基を含む、請求項25記載のポリペプチド。
- 前記付加的なアミノ酸残基は、好ましくはヘキサヒスチジニルタグ、mycタグおよびFlagタグから選択される、タグを含む、請求項25又は26記載のポリペプチド。
- 前記付加的なアミノ酸残基が少なくとも1つの機能的なポリペプチドドメインを含み、請求項1〜24のいずれか一項記載のポリペプチドから成る第一の部分と、少なくとも1つの第二の部分及び任意のさらなる単一又は複数の部分との融合ポリペプチドである、請求項25又は26記載のポリペプチド。
- 前記第二の部分が請求項1〜24いずれか一項記載の1又は複数のポリペプチドから構成され、請求項1〜24いずれか一項記載の配列が同一でも異なっていてもよい、HER2結合ポリペプチドの多量体である、請求項28記載のポリペプチド。
- 前記第二の部分はHER2以外の標的分子と結合し得る少なくとも1つのポリペプチドドメインを含む、請求項28記載のポリペプチド。
- 前記第二の部分はヒト血清アルブミンと結合し得る少なくとも1つのポリペプチドドメインを含む、請求項30記載のポリペプチド。
- 前記ヒト血清アルブミンと結合し得る少なくとも1つのポリペプチドドメインは連鎖球菌のプロテインGのアルブミン結合ドメインである、請求項31記載のポリペプチド。
- 前記第二の部分がブドウ球菌のプロテインA(SPA)のドメインに関連するポリペプチドを含み、該ポリペプチドの配列は1〜約20の置換変異を有する前記SPAドメインの配列に相当する、請求項30記載のポリペプチド。
- 前記第二の部分のポリペプチドの配列が、配列番号1に示されるSPAプロテインZの配列において1〜約20の置換変異を有する配列に相当する、請求項33記載のポリペプチド。
- 前記第二の部分が酵素作用を有する、請求項28記載のポリペプチド。
- 前記第二の部分が蛍光作用を有する、請求項28記載のポリペプチド。
- 前記第二の部分が、ファージのコートタンパク質またはその断片である、請求項28記載のポリペプチド。
- 標識基を含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記標識基が蛍光標識、ビオチンおよび放射性標識から選択される、請求項38記載のポリペプチド。
- HER2を過剰発現する細胞に対して活性を有する物質と結合された、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
- HER2を過剰発現する細胞に対する活性を有する前記物質が、細胞傷害性物質、放射性物質、ADEPT法に使用される酵素、サイトカインおよび凝血原因子から選択される、請求項40記載のポリペプチド。
- 請求項1〜37いずれか一項記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子。
- 請求項42記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項43記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜41いずれか一項記載のポリペプチドの薬剤としての使用。
- HER2の過剰発現を特徴とする少なくとも一形態の癌の治療のための薬剤の調製における、請求項1〜41のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- HER2の過剰発現を特徴とする少なくとも一形態の癌の治療方法であって、請求項1〜41いずれか一項記載のポリペプチドを活性物質として含む治療的有効量の組成物を、そのような治療を必要とする患者に投与することを包含する方法。
- 抗癌活性を有する物質と結合された請求項1〜41いずれか一項記載のポリペプチドの、HER2を過剰発現する細胞に前記物質を送達するための使用。
- in vivoで、HER2を過剰発現する細胞へ抗癌活性を有する物質を送達する方法であって、前記物質と請求項1〜41いずれか一項記載のポリペプチドとの複合体を患者に投与することを包含する方法。
- 試料中のHER2の検出のための請求項1〜41いずれか一項記載のポリペプチドの使用。
- 請求項1〜41いずれか一項記載のポリペプチドを用いることを特徴とする、試料中のHER2の検出方法。
- (i)試験される試料を準備する工程、(ii)前記試料に対して請求項1〜41いずれか一項記載のポリペプチドを、該試料中に存在する任意のHER2との結合が可能な条件下で添加する工程、(iii)結合していないポリペプチドを除去する工程、および(iv)結合したポリペプチドを検出する工程を包含する、請求項51記載の方法。
- 前記試料は生体液試料、好ましくはヒト血漿試料である、請求項52記載の方法。
- 前記試料は組織試料、好ましくはヒト組織試料、さらに好ましくは癌に罹患しているヒトからの生検試料である、請求項52記載の方法。
- レポーター酵素を融合した請求項1〜41いずれか一項記載のポリペプチド、前記レポーター酵素の活性の検出のための試薬、ならびに陽性および陰性対照組織スライドを包含する、組織試料におけるHER2過剰発現の診断のためのキット。
- キレート剤で標識された請求項1〜41いずれか一項記載のポリペプチド、診断用放射性同位体、ならびに取り込み効率の分析のための試薬を包含する、HER2過剰発現をin vivoで診断するためのキット。
- キレート剤で標識された請求項1〜41いずれか一項記載のポリペプチド、治療用放射性同位体、ならびに取り込み効率の分析のための試薬を包含する、請求項49記載の方法を実施するためのキット。
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