CN102548466A - 非侵入性体内光学成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在受试者的血液中测定包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的存在，定量该荧光分析物的血液水平，和/或监测或测定该荧光分析物的血液清除的非侵入性方法，其包括下列步骤或由下列步骤组成：(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，(b)通过所述受试者的眼，接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，藉此在测定所述受试者的血液中所述荧光分析物的存在、定量所述荧光分析物的血液水平、和/或监测或测定所述荧光分析物的血液清除。本发明进一步涉及用于任一种前述方法的如前述权利要求中任一项限定的荧光分析物或荧光标记物。此外，本发明涉及如前述权利要求中任一项限定的荧光分析物或荧光标记物用于制备要在任一种前述方法中采用的诊断组合物的用途。此外，本发明涉及用于本文中限定的任何方法的装置。

Description

非侵入性体内光学成像方法
本发明涉及在受试者的血液中测定包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的存在、定量该荧光分析物的血液水平、和/或监测或测定该荧光分析物的血液清除的非侵入性方法，其包括下列步骤或由下列步骤组成：(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，(b)通过所述受试者的眼，接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，藉此测定所述受试者的血液中所述荧光分析物的存在，定量所述荧光分析物的血液水平，和/或监测或测定所述荧光分析物的血液清除。本发明进一步涉及用于任一种前述方法的如前述权利要求中任一项限定的荧光分析物或荧光标记物。此外，本发明涉及如前述权利要求中任一项限定的荧光分析物或荧光标记物用于制备要在任一种前述方法中采用的诊断组合物的用途。此外，本发明涉及用于本文中限定的任何方法的装置。
非侵入性成像可以追溯到威尔姆·伦琴(Wilhelm Roentgen)于1895年发现X-射线。在现代医学中成像技术及其应用的数量剧增。计算机断层摄影术(CT)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机化断层摄影术(SPECT)和磁共振成像(MRI)是一些经典的非侵入性成像技术。这些技术容许基于解剖学、形态学和生理学变化来诊断疾病，诸如癌症。
然而，大多数这些已建立的技术缺乏灵敏性，降低特异靶向性、而且不能展现出分子基础上的功能性变化，故而不是基础研究、临床前和转化应用中的合适工具。因此，仅可以在晚期、形态学可见的时间点时诊断出疾病。
出于此原因，研究人员已经聚焦于具有高灵敏性和高对比度的用于对基因表达、受体激活、信号传导途径、凋亡和多药物抗性成像的分子-功能成像技术(Weissleder和Mahmood，Radiology 2001；第219卷：316-333)。
与“经典的”诊断成像，例如磁共振(MR)、计算断层摄影术(CT)、和超声(US)成像相对的是，分子成像(诸如光学分子成像)是对作为疾病基础的分子异常进行分析，而不是对这些分子变化的终末效应成像。
光学分子成像诸如荧光和生物发光成像是医学诊断学中最新的尖端技术之一，并且已成为一种对分子水平变化成像的有力工具。此技术的目的是显现并定量疾病形成过程中的分子变化。
特别感兴趣的是这样的荧光染料，其在近红外(NIR，一种光谱窗口)发射，而血红蛋白和水程度吸收最小，从而容许光子在组织中穿透数厘米。
作为标记物使用的荧光染料应当吸收并发射近红外范围中的光。它们应当揭示高荧光量子产率、良好的水溶性和光灵敏性(Heiduschka等，Investigative Ophthalmology & Visual Science 2007；第48卷：2814-2823)。在过去数年中，花青染料(Cy-染料)被证明为在生物医学研究中有效且可靠的荧光染料。由于其在近红外区中的荧光，容许光子较深地穿过组织，并且它们以低的组织自身荧光为特征。它们是非常光稳定的，并且针对pH变化不敏感。除了花青染料外，alexa染料也是光学成像技术中使用的常见荧光染料。
在早期阶段诊断出疾病，对于患者的预后会是极大的优势，并且可以适时地启动适当的治疗。功能性成像技术性能包括研究功能性途径的能力，在细胞和分子水平评估血管生成和低氧。为了非侵入性显现生物学过程并为了能够进行定量，可注射成像剂是必需的。此探针包含可以高度灵敏地检出的标记物和展现出针对期望靶物的高亲和力的配体。为了提高灵敏度，加强标记物特异性信号的策略是必需的；最后但也很重要的一点是，需要高分辨率的成像方式来检测标记物特异性的信号(Hengerer和Mertelmeier，Electromedica 2001；第1卷：44-49)。其他可选的标记技术，诸如遗传报告物和外源细胞追踪剂，是以不同的标记策略为基础的，但是它们主要局限于小鼠模型和基础生物科学。
光学分子技术越来越多地用于了解癌症的复杂性、多样性和体内行为。可以使用对胞外受体特异性的经标记抗体来检测肿瘤。可以使用分子标志基因来监测基因疗法。此技术使得人们能够对合适目标结构进行体外和/或体内评估，并可以测定针对这些结构的治疗剂的效率，为更快速的药物开发提供了可能(Hengerer和Mertelmeier，Electromedica 2001；第1卷：44-49；
Figure BDA0000147641970000021
和Weissleder，Radiologie 2001；第41卷：116-120；Reiser等，Lehrbuch derRadiologie，Thieme Verlag，2004；Cutler，Surg Gunecol Obstet 1929：721-728)。目前，主要地，CT、MRT、PET和SPECT是临床试验中用于测试治疗效率的常用成像技术。
穿过组织并与组织组分相互作用的光子是光学成像技术的基础。卡特勒(Cutler)在1929年首次报告了光学成像，即光诊断(diagnostic with light)，但是正是伴随着高灵敏性CCD检测系统的开发和偶联荧光染料与生物化学标志物的机会，才促使光学成像成为研究人员关注的对象(Ntziachristos和Bremer，Radiology 2003；第1卷：195-208)。荧光照明和观察已经是医学和生物科学两门学科中最快得到适用的成像技术之一。许多天然存在的材料在暴露于具有特定波长的光时发射另一波长的光。这种现象称作发光。若发射光快速出现(在百万分之一秒左右)，则它定义为荧光，而若发射花费长于百万分之一秒，则发光称作磷光。这种现象早已为人所知，并且那些荧光分子已经证明在许多生物学系统中作为标记物极端有用。发荧光的材料几乎总是发射比激发光波长(λ吸收)长的波长的光(λ发射)。上述波长间的差异称作斯托克斯(Stoke)位移(λ斯托克斯)，它说明了激发与发射波长间的能量水平(ΔE)。一定范围的激发波长会激发荧光。此范围称为吸收光谱。发射光谱也涵盖一定范围的波长，提示了一种荧光材料不限于仅一种激发波长。许多生物学材料是天然荧光的，具体说有多种维生素、一些激素、和多种酶和结构蛋白。这些分子经常发射强到足以干扰特定的体内荧光标记研究的荧光。这样所谓的自身荧光造成不期望的背景，因此激发光和发射光两者都需要高度过滤。限制激发光波长可以降低自身荧光量。限制发射光的波长范围可以使那些干扰期望的特定荧光的观察和测量的自身荧光量最小化。随着发射在电磁波谱的近红外范围中的光的荧光染料的开发，有可能进行更深组织水平的体内诊断。灵敏度依赖于检查的标志物的量和定位(Bremer和Ntziachristos，AmericanJournal of Surgery 2001；第189卷：389-392)。可见光能够穿透深度不超过数毫米的组织，而近红外光子(650-900nm)在若干厘米的范围内更高效地穿过组织。此现象的原因是在所述波长范围中来自水、黑色素和血红蛋白的吸收系数低。由于此正面的组织特性，近红外波长范围又称作“诊断窗口”(Mahmood和Weissleder，Molecular cancer therapeutics 2003；第5卷：489-496)。在近红外光谱中，光子被吸收的水平最低，并且组织自身荧光得到降低，产生最佳的靶物-背景比率(Licha和Riefke，Photochemistry and Photobiology 2000；第3卷：392-398)。
监测人或动物身体的功能在许多情况下是必需的。传统上，自受试者采集血液样品，并用分光光度法(即一种光学成像技术)来测量组分。也可以直接应用分光光度计，通过使其与受试者接触，例如通过使用改良的接触镜等装置(即一种体内光学成像系统)，来测量受试者血液中的组分。
WO 90/12534、WO 02/071932和WO 2006/079824描述了一种装置，具体地，一种改良的接触镜系统，用来通过眼来实时监测人体或身体功能，如血液中的氧水平。这些文献中所描述的发明聚焦于在麻醉期间通过眼来测量特别是氧浓度，因为眼提供了一种更为直接的评估脑中的状况的方法。这是因为藉由眼动脉对眼的主要血供是颈内动脉的分支。因而，可以贴切地把眼称为脑的“窗口”。
其中所描述的装置是一种非侵入性分光分度系统，据称其-与现有技术(US 5,553,617和US 5,919,132)相反-通过在虹膜平面中心聚焦沿着眼轴引导光，由此克服现有技术的缺点。
这些分光光度技术的原理在于将光引导入眼中。此光通过眼，并被视网膜反射。用发光二极管或其它光感应器来测量反射光(来自视网膜)和反射光强度，然后计算此波长的透射率(transmittance)。因为眼是身体中唯一旨在传播光的部分，因此可以说它们起着分光光度计的比色皿的作用。
体内分子成像是一个发展很快的领域，对例如临床诊断成像产生着影响。光学分子成像是这样一种方法，其中将光学造影物质导入受试者或者在受试者体内激活光学造影物质，然后缘于光学造影物质的信号可使用光学检测器如照相机加以测量，以提供一张或多张图像。
有光学分子探针可供使用，这些探针可以包含荧光或发光染料，或吸收物质，可以用于靶向并标记特定的细胞类型或激活生物化学过程，如生物发光。与磁共振成像(MRI)、X-射线或正电子发射成像(PET)相比，光学分子成像得益于此类荧光、发光或吸收物质可以是小的生物相容性分子。
通常对小动物实施体内光学分子成像以研究各种药物或疾病的生理、病理或药理效应。也可以对人体实施分子成像，人们希望分子成像最终会为诊断成像带来实质性进展。小动物的体内成像的优点是显著的，因为它容许过程和应答在它们天然环境中得到实时显现，而且容许使用相同的小动物实施随时间的纵向研究，为评估疾病进展或对治疗的响应提供条件。此外，小动物的体内成像可减少研究所需的动物数目，并且在疾病表现在不同动物间有变化的场合，诸如原位癌，可以降低研究的不一致性。
光学分子成像(例如在小动物中)利用高度特异性的且生物相容的造影剂的能力来服务于药物开发和疾病研究。然而，体内光学成像由于不能清楚地解析并识别被靶定的内部器官，阻碍了其广泛应用。为了解决此问题而开发的光学断层摄影术及组合X-射线和微计算断层摄影术(微-CT)方法通常昂贵、复杂，或者不能实现真正的解剖影像融合(co-registration)。
相应地，Hillman和Moore，Nature Photonics(2007)，第1卷：526-530提供了使用动力学造影剂对例如小动物分子成像的全光学解剖影像融合，即一种动力学荧光分子成像技术。他们的技术使用注射例如惰性染料后获得的图像的时间系列。染料的体内分布动力学的差异容许对器官进行精确的描绘和识别。
此类影像融合的解剖图容许在不用考虑重定位(repositioning)或体重增加(weight gain)的条件下实施纵向鉴定，由此有望极大地改善用于原位疾病研究、诊断和治疗等方面的精确性和多用性。
总之，有高度先进光学分子成像技术可供使用，它们容许精确地描绘并识别器官。此外，有许多不同类型的荧光(包括近红外荧光和发光)染料可供使用，它们可以在光学分子成像中应用。
还有，已经公认，眼至少对于脑而言可以作为“窗口”
然而，尽管有先前的努力及高度先进的技术和染料，尚未开发出临床诊断应用诸如定性或定量测定受试者血液中的外来的和天然的生理物质的商业上可行的、非侵入性体内(实时)方法和用途。
因此，本发明背后的技术问题是提供用于在体内非侵入性地监测和/或定量血液中的荧光分析物的手段和方法。
本发明致力于解决此需要，由此，作为该技术问题的解决方案，提供了关于在体内且非侵入性地定性和/或定量测定受试者血液中的荧光分析物的手段和方法及用途的实施方案，藉此借助光学分子成像通过受试者的眼测定、定量或监测经荧光标记的分析物。
这些实施方案在本文中表征并描述，并在权利要求书中得到反映。
必须注意，如本文中所使用的，单数形式“一种”、“一个”、和“所述/该”包括复数指代，除非背景另有明确指示。如此，例如，提及“试剂”包括一种或多种此类不同试剂，而提及“方法”包括提及可以修饰或替换本文中所描述的方法的本领域普通技术人员已知的等同步骤和方法。
通过提述完整并入本公开内容中引用的所有出版物和专利。若通过提述并入的材料与本说明书矛盾或者不一致，本说明书应当优于任何此类材料。
除非另有指示，在一系列成分之前的术语“至少”应当理解为指系列中的每种成分。本领域技术人员只需通过常规试验就会认识或能够确认与本文中所描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。本发明意图涵盖此类等同方案。
在此说明书和所附的权利要求书全文中，除非上下文另有需要，词语“包含”及变型应当理解为暗示包括规定的整数或步骤或整数组或步骤组，而不排除任何其它整数或步骤或整数组或步骤组。
此说明书文本全文中引用了数个文件。在此通过提及而完整收录本文中引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等)(无论上文或下文)。本文中的任何文字都不应解释为承认本发明没有资格凭借在先发明而早于所述公开。
药动学描述了身体如何影响施用后的特定药物。由此可见，“药动学”包括所施用药物的吸收和分布机制、药物作用开始的速率和效果的持续时间、物质在身体中的化学变化(例如通过酶实现)和药物代谢物的影响和排泄途径的研究。因而，药动学提供了探究生物系统中的化合物代谢的合理手段。关于药动学公式和模型的综述，参见例如Poulin和Theil，J Pharm Sci.(2000)，第89卷：16-35；Slob等，Crit Rev Toxicol.(1997)，第27卷：261-272；Haddad等，Toxicol Lett.(1996)，第85卷：113-126；Hoang，Toxicol Lett.(1995)，第79卷：99-106；Knaak等，Toxicol Lett.(1995)，第79卷)：87-98；及Ball和Schwartz，Comput Biol Med.(1994)，第24卷：269-276。在实践中，药动学主要应用于药物物质，但理论上，它关注的对象包括各种各样的以摄入或其它方式从外部投递至生物体的化合物，诸如营养物、代谢物、激素、毒素等。
在本发明的公开内容之前，药动学(PK)的“常规”测量常规上通过静脉内或腹膜内注射药物来实施。在施用后的不同时间点，抽出血液，并通过不同分析方法(例如使用未标记的或经放射性标记的化合物的ELISA、SEC、HPLC、液相层析-串联质谱术)定量药物血清水平。为了接受统计学有意义的数据，通常对每个时间点使用约3至5只小鼠以得到血清峰水平(tmax)和药物血清半衰期(t1/2)。对于一次研究，需要约9至15只小鼠(例如，7个时间点，每个时间点3至5只小鼠，连续血液取样)。通过插值测定tmax和t1/2两者，所述插值可能影响这些数值的精确性(图1，2)。在PK研究终止后处死小鼠。
与其形成鲜明对比的是，我们提出了一种方法和相应的装置，其容许在期望的期间内，在一个受试者(例如，小鼠)中非侵入性地、连续实时地监测血液中的荧光分析物水平，和(如果这种情况出现的话)同时监测血液和器官中的荧光分析物水平(例如药物水平)。通过采集血液样品来定量荧光分析物(例如经荧光标记物的药物)对于获取PK数据而言几乎是不必要的，并且不需要处死动物。我们通过评估3种不同化合物来证明了此方法的效用：
1.吲哚花青绿(Indocyanine green)：荧光染料
2.帕米膦酸盐(Pamidronate)：经荧光标记的二膦酸盐
3.用Cy5标记的针对受体酪氨酸激酶的单克隆抗体
我们首先通过使用吲哚花青绿(ICG，一种荧光染料)来评估此新方法的技术可行性。在i.v.注射入小鼠中时，ICG在约2至4分钟后自循环清除(1，2)，并在肝中积累(3)。雌性BALB/c裸鼠接受吸入麻醉，放置在成像室(图3)中，并i.v.注射一剂20μg/200μl。在i.v.注射ICG前10秒开始眼中的荧光信号强度测量，并在一段8分钟的时间里每秒以500ms的采集时间记录图像。用范围为671至705nm的波长的光激发ICG，并以820nm检测发射。将眼区中荧光信号强度的最高值标准化为100，并且图5，6中所描绘的数据表明在2分钟时达到tmax，而荧光强度的半衰期为6.6分钟。在第二个实验中，给具有s.c.生长肿瘤(Calu3)的BALB/c裸鼠i.v.注射ICG，并监测眼、肝、肾、脑和肿瘤区中的信号强度。在此实验中，tmax是1.2分钟。此后信号强度下降(t1/2＝5.4分钟)，并观察到肝中的积累在3.8分钟时达到平台(图7)。这些结果与发表的数据一致。在成功完成实施例1中所显示的可行性研究后，我们评估了一种经荧光标记的二膦酸盐(帕米膦酸盐)。二膦酸盐(例如帕米膦酸盐；MW 279)临床上可用于治疗骨病。帕米膦酸盐(在i.v.注射后)具有范围为20至30分钟的血清半衰期，并且在所检查的所有组织中骨(胫骨)含有最高的浓度。PongchaidechaM等Clearance and tissue uptake following 4-hour and 24-hour infusions ofpamidronate in rats.Drug Metab Dispos 1993；21(1)：100-104Daley-Yates等Acomparison of the pharmacokinetics of 14C-labelled ADP and 99mTc-labelledADP in the mouse.Calcif Tissue Int 1988；43：125-127。我们使用经荧光标记的帕米膦酸盐通过测量小鼠眼中的荧光强度和全身成像以监测所描述的动力学来计算tmax和t1/2血浆水平。在i.v.注射后，帕米膦酸盐具有范围为20至30分钟的血清半衰期，并且在所检查的所有组织中骨(胫骨)含有最高的浓度。i.v.注射OsteoSense(200μl PBS中的2nMol)，并且每5秒记录荧光信号强度(采集时间：3000ms；激发波长：615至665nm；发射波长：780nm)。血清t1/2是34分钟(图7，8)，并且此后4.4小时和48小时时明显表现出脊柱和后肢中的积累(图9)。这两个观察结果均与发表的数据对应。最后，比较了未标记的和经Cy5标记的靶向受体酪氨酸激酶的单克隆抗体的t1/2。常规测量揭示在5mg/k i.v.的剂量t1/2为7.7小时(图10)。使用光学成像，在2.5mg/kg i.v.的剂量t1/2是3.05小时(图11)。
这些结果表明tmax和t1/2可以通过仅测量经麻醉动物的眼中的荧光信号强度来容易地实施。相对于常规技术，此新方法改善PK研究的性能，因为对药物的定量和数据插值不是必要的。此外，小鼠数目显著减少，并且不需要处死小鼠。可以时间分辨地在线获得关于来自不同器官的药物积累和t1/2值的信息。总的来说，此规程容许在一只动物中进行多次测量(改善tmax和t1/2的精确性)。与常规方法相比，显著缩短了工作时间，防止了血液样品的混淆，而且非放射性材料的使用使得在没有放射化学要求的预防措施的情况下通过常规实验室方法进一步分析成为可能。除了tmax和t1/2外，还可以追踪器官分布。这样的同时测量方便了关于与血清中的t1/2相比在所讨论的器官中的积累的信息(例如血脑屏障渗透的指标)。可以用不同有机荧光染料容易地标记药物(低分子量物质、肽、蛋白质、抗体和siRNA)。然而，在用经标记的药物实施此类体内研究前，功能测定必须证明与未标记的药物相比不存在差异。关于铁调素调节蛋白(Hemojuvelin)，体外研究确认了未标记的和经Cy5标记的铁调素调节蛋白在其阻断BMP-2诱导的铁调素(Hepcidin)mRNA在HepG2细胞中的上调的能力上没有差异。还有，Biacore数据揭示与未标记的赫赛汀相比，经Cy5标记的赫赛汀具有相同的结合特征，并且结合表达Her2的肿瘤细胞。经标记的靶向受体酪氨酸激酶的抗体仍导致受体的内在化。因为不处死动物，可以多次给予相同的和/或其他的药物(用与第一种荧光染料具有不同发射光谱的荧光染料标记)以得到关于药物-药物相互作用的信息。此外，可以在正常小鼠和基因工程小鼠(例如FcRn敲除或hu FcRn转基因鼠)中评估i.v.、i.p.、口服、吸入、鼻和皮肤应用后的新设计的药物制剂和药物剂量的优化。成像方法的非凡进展使得对药物和药物投递系统在体内的表现的可视化成为可能。关于药物定位和浓度的详细且定量的信息可以作为时间函数获得，由此对生物学效应实现更深刻的了解。此信息对于优化药物的设计是至关重要的。
因此，由本发明提供的新的非侵入性成像方法的影响是显著的。第一，这些新方法可以用来实时地在体内评估荧光分析物诸如经荧光标记的药物的药动学。这一点预期会对药物开发、药物测试、以及为给定的受试者(例如人患者)选择合适的疗法和疗法变化及药物剂量的优化产生影响。例如，可以想见，可以建立患者依赖性疗法(patient dependent therapy)，即基于给定的一组药物或药物制剂的药动学，有可能为每名个体患者找到最好的可能的用药，即个人化用药(personalized medication)。实际上，可以实时地评估每一受试者的药动学概况(profile)，可以非侵入性地快速获得反馈，并且因此可以为每一受试者提供最优化的用药(根据例如受试者的特征诸如重量、性别、年龄、健康状态、疾病过程等)。
第二，本发明的新的分子成像/定量方法和装置为研究任何种类的药物在活体系统的完整微环境中的药动学提供了可能。所述新的成像装置、用途和方法在为了促进许多不同疾病的控制和根治而设计的极其多种新生物制品、免疫学制品、和分子疗法中将具有广泛的应用，所述疾病包括癌症、心血管疾病、神经变性疾病、炎性疾病、传染性疾病和其它疾病。此外，所描述的检测系统和方法对于组合环境(combined settings)中的无缝(seamless)疾病检测和治疗会具有广泛的应用。
第三，新方法和装置可以不仅在体内而且实时检测许多疾病的基础病原体的存在。
第四，新方法可以在药效学(有时缩写为“PD”，并且在与药动学一起提及时可以称为“PKPD”)中使用。药效学是研究药物对身体或对身体之内或之上的微生物或寄生物的生理学影响和药物作用机制及药物浓度与效果间的关系。
光学成像是一种非侵入性、非离子化模式，它正在作为不同应用的诊断工具崭露头角。此技术为分子成像研究提供了简单化的而高度灵敏的模式。可以通过使用经荧光标记的分析物来实现对于药物峰水平、血中半衰期以及器官积累的非侵入性可视化。可以连续实施测量，由此使得以秒级时间分辨率进行PK分析成为可能。通过在数小时的时段里多次测量(采集时间通常在1秒之下)，可以创建“动力学影片(kinetic movies)”，使得计算血液峰水平、血液中的半衰期时间、刚施用后的理论浓度和对不同器官的分布/积累成为可能。
因此，在第一方面，本发明提供了一种测定在受试者的血液中包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的存在的非侵入性方法，包括下列步骤或由下列步骤组成：
(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含至少所述受试者的瞳孔的一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，
(b)通过所述受试者的眼，接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，藉此测定所述受试者的血液中所述荧光分析物的存在。
“测定存在”意指定性检测受试者血液(或血液循环系统)中的荧光分析物，由此容许确定荧光分析物是否在那里(在血液和/或血液循环系统中)。
在又一方面，本发明提供了一种定量包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的血液水平的非侵入性方法，包括下列步骤：
(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含至少所述受试者的瞳孔的一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，
(b)藉由所述受试者的眼，接受具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，由此定量荧光分析物的血液水平。
为此目的，预想对受试者施用限定量的所讨论的分析物，并自所述受试者采集血液样品以定量血液中的所述分析物的量，随后将这些数据与通过本发明的方法获得(同时或连续获得)的荧光信号联系起来或将这些数据与所述荧光强度比较。应当理解，一旦发生所述关联，便不再必需自同一受试者采集血液样品，即一旦将数据联系起来，便有可能通过本发明的方法定量荧光分析物的血液水平。
或者和/或另外，还设想将通过本发明的方法获得的荧光信号与已经知道(例如现有技术发表)或之前或之后已经通过常规方法(包括血液样品)评估的血清水平数据比较。
如此，在一个优选的实施方案中，比较步骤(b)中接受的所述光与参考值，由此：
(i)定量所述荧光分析物的血液水平。
本发明还提供了监测或测定受试者中包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的血液清除的非侵入性方法，包括下列步骤：
(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，
(b)通过所述受试者的眼，接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，由此监测或测定所述荧光分析物的血液清除。
在一个优选的实施方案中，将步骤(b)中接受的所述光与参考值比较，由此
(ii)测定所述荧光分析物的血液清除。
术语“血液清除”包括生物学半衰期、tmax和/或t1/2的测定和/或监测。
术语“生物学半衰期”意指分析物丧失其一半的活性(例如生物学、药理学或生理学活性)所花费的时间。
术语“t max”在本文中使用时指达到最大血液浓度的时间(time to reachmaximum blood concentration)。最大血液浓度是受试者血液中存在的化合物量。
“T 1/2”是某种分析物在身体中的总量、或该物质在血液中的浓度降低一半所需要的时间。也可以使用t 1/2来测定分析物在该物质(例如药物)停用(discontinue)后自身体或血液有效消除会花费多长时间。知晓半衰期对于，例如，确定为获得期望的血液浓度的药物施用频率(每天摄取的次数)是有用的。
例如，本发明的方法容许通过在一段时间里监测荧光信号来测定t max和t1/2。这样，通过测定最大信号强度和最低信号强度，就可以测定t max和t 1/2。如此便不需要如通常为了测定t max和t 1/2那样在预定的时段里抽取血液样品。
然而，任选地，可以如通常那样通过抽取血液样品测定t max和/或t 1/2。然后，可以将t max和t 1/2值与如通过本发明的方法测定的t max和t 1/2值比较。因而，本发明的方法容许，例如，改进药物的剂量，即目的是达到每种药物的可确保对受试者功效最好且副作用最小的剂量的处方。
“监测或测定荧光分析物的血液清除”进一步包括监测或测定按时间的自受试者的血液或血液循环清除的荧光分析物量。对于展现出实质性血浆蛋白质结合的荧光分析物，清除一般定义为总浓度(游离的+蛋白质结合的)而非游离的浓度。
例如，分析物可能通过肾、肝、肠、肺、或免疫系统的细胞诸如专门的抗原呈递细胞的处理而被滤出或清除。除了通过本发明的方法获得的结果(其在下文进一步解释)外，还可以获得这些数据。
然而，在肾之外的部位，清除是通过膜转运蛋白而不是过滤来进行的，在这些部位中普遍的血浆蛋白结合可以通过保持整个毛细管床中游离物质的浓度相当恒定，抑制由通过毛细管的游离物质的浓度降低所致的清除降低，从而提高清除。
分析物也可以例如通过靶物介导的清除，诸如抗体对肿瘤或实体瘤的结合，而被滤出或清除。
如本文中所使用的，术语“肿瘤”指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理学状况。肿瘤的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤、和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(schwannoma)(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、和黑素瘤。
术语“实体瘤”在本文中使用时指选自下组的肿瘤：胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌(hepaticcarcinoma)、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤、及头颈癌，优选地乳腺癌。
存在着至少三种不同光源检测技术，它们在本发明的方法中可以根据本发明的方法的目的单独地或以任意组合采用。
最简单的是连续波(CW)成像。此技术使用恒定强度的激发光，并采用多个光源-检测器对(source-detector pair)来测量(1)由于激发荧光团分布所致的信号或(2)光衰减(由于组织吸收和散射所致)。该技术在技术上相对简单，并且通常提供最好的信噪比(SNR)特征。
一种更精巧的方法是使用单一或多频率的强度调制(IM)激发光。凭借此方法，可以测量多个光源-检测器对的相对于入射光的经调制的光衰减和相移。与产生强度衰减的CW测量相比，IM技术提供两种信息，即每个光源-检测器对的强度衰减和相移。振幅和相位通常是不相关的测量值，并且可以更有效地解析固有衬比(intrinsic contrast)的吸收和散射系数。在荧光模式中，该技术可以对两组信息即荧光团浓度和荧光半衰期成像。
第三种方法，即时间分辨(TR)技术，使用射入眼和/或组织中的激发光的短脉冲。该技术解析检测光子传播到多个光源-检测器对的介质中的时间的分布。时间分辨方法每个光源-检测器对含有最高的信息含量，其仅与以多频率同时实施的IM方法相当。考虑到时间分辨数据的傅里叶变换产生多至1GHz的多个频率(包括通过先前两种方法使用的连续波成分(f＝0MHz))的信息，这一点是容易解释的。因此，时间分辨的方法提供用以与CW系统直接比较的CW成分，而且还提供多个频率(经由傅里叶变换)的强度衰减和相移测量值，其可以对固有吸收和散射，以及荧光团浓度和荧光半衰期成像。
在荧光成像中，使用具有限定带宽(包括至少一个，即1、2、3、4、5、或甚至更多个预定波长)的经过滤光(filtered light)或激光作为激发光的来源。“预定的波长”意指激发光包含能够自相应的荧光团(由荧光实体和/或荧光分析物构成)激发荧光的、限定的光谱成分(包括单一波长、单一波长带、超过一种波长、或超过一个波长带)。若采用超过一种预定的波长，则优选的是这至少两种波长互相区分或可区分。如本文中所使用的，术语“激发光”用于描述由激发光源产生的光。激发光包括但不限于能够自荧光团激发荧光的光谱光成分(即波长)。能够激发荧光的激发光中的光谱成分可以包括单一波长、单一波长带、超过一种波长、或超过一个波长光谱带。激发光中能够激发荧光的的光谱成分可以包括约400至700纳米(nm)的可见光谱区中的一种或多种波长。然而，激发光中能够激发荧光的的光谱成分还可以包括其它光谱区中，例如约700至1000纳米的近红外(NIR)光谱区中，或约1至400纳米的紫外(UV)光谱区中的一种或多种波长。激发光可以进一步包括不激发荧光的光谱成分。激发光中能够激发荧光的光谱成分可以具有比它们所激发的荧光短的波长。然而，在其它设置中，激发光的一些其它光谱组分可以具有比它们激发的荧光长的波长。在一个优选的实施方案中，激发光包括范围为约671至705nm(ICG)的光谱带。
激发光可以是在强度上连续的(continuous in intensity)，连续波的(continued in wave)，脉冲的(pulsed)，或者可以是受调制的(例如按照频率或幅度)或其任何合适的组合。在一些实施方案中，激发光是相干光，例如激光。在其它实施方案中，激发光是非相干光，例如自LED产生的光子或自黑体辐射(例如白炽、卤素、或氙灯泡)产生的过滤光。在其它实施方案中，激发光是相干和非相干光的组合。
优选地，可用于实施本发明的成像系统包括三种主要组件：(1)激发光，(2)用于分离或区分激发光和发射光的手段(优选地可适合于激发光和/或检测系统的软件和/或硬件滤光器)，和(3)用于接收从至少一种荧光标记物和/或从荧光实体和/或从本发明的荧光分析物发射的光的检测系统(光学检测器)。设想光源(激发手段)可以任选地(i)包含预定的或可调的滤光器。光源可以是适当过滤的白光，即来自宽带光源的带通光。例如，来自150瓦卤素灯的光可以通过合适的带通滤光器。在一些实施方案中，光源是激光。参见例如Boas等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4887-4891；Ntziachristos等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：2767-2772；Alexander，1991，J.Clin.LaserMed.Surg.9：416-418。关于用于成像的近红外激光的信息可参见http://www.imds.com和各种其它公知的来源。可以使用高通或带通滤光器(例如700nm)来自分离光学发射(发射光)与激发光。可以在本发明中使用任何合适的光检测/图像记录组件(光学检测器)，例如电荷耦合装置(CCD)系统、光电二极管、光敏电阻器、互补金属氧化物半导体(CMOS)或光电倍增管。在下文更为详细地解释所述组件。光检测/图像记录的选择将取决于各种因素，包括所使用的光聚集/图像形成组件的类型。选择合适的组件、将它们装配成本发明的成像系统、及操作所述系统属于本领域的普通技术。
激发光从眼的角膜传播至视网膜，由此通过瞳孔。在激发光遇到荧光标记物时，光被吸收。在荧光标记物在被激发后弛豫至其基态时发生荧光。然后，荧光标记物发射与激发光具有可检出的差别(可区别)特性、即光谱特性(例如略长的波长等)的光。被吸收的能量的一部分被转化成热。这种能量损失引起从较短激发波长至较长发射波长的波长移动。此过程称为斯托克斯位移。然而，也可以使用其他的光学现象，如那些记载于Xu等(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.93：10763-10768的现象来产生荧光。
被引导到包含至少受试者瞳孔的一部分的划定区上的激发光可以沿着相应眼的光轴传播，或者不然；或者激发光的一部分沿着相应眼的光轴传播，而其它部分不然。还设想，例如，在产生多个激发光(它们优选的是可区分的)的多个光源的情况中，激发光的一部分沿着相应眼的光轴传播，而其它部分不然。眼的“光轴”是一种公知的术语，定义为穿过眼的中心且与其前表面和后表面垂直的想象的直线，或者定义为角膜的前面或顶点与眼球的最远后面部分之间的最长矢状距离(sagittal distance)(这两个定义都是本领域中公认的)。
在本发明的语境中，设想将包含至少一种，即1种、2种、3种、4种、5种或更多种预定的且优选地区分的或可区分的波长的激发光引导到受试者的划定区上，所述划定区包含受试者瞳孔的至少一部分。这样，“包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区”涵盖至多(最多)受试者的整个身体或较之为小的身体的任何部分，只要所述较小的部分仍涵盖受试者瞳孔的至少一部分(例如头、或头和肩、或头和身体的上部)。所述划定区可以比受试者的眼小或者比受试者的眼大。优选的是，所述划定区包含受试者的整个瞳孔或者甚至全眼(即眼球)，全眼是更优选的。“全眼”具体包括眼的可见部分(自外部可见)。
“眼”、“眼球”或“全眼”可互换使用。“眼”包括受试者的一只眼或受试者的双眼。
成像系统的例子是MAESTRO系统，其在图3中例示。它是一种近红外荧光成像系统。MAESTRO系统是一种优选的成像系统，其可以与本发明的实施方案结合应用。
MAESTRO系统是一种平面荧光反射成像系统，其容许非侵入性体内荧光测量。在此多光谱分析中，在特定波长捕获一系列图像。捕获的波长范围应当覆盖存在于标本中的标记物的预期光谱发射范围。结果将是一系列称作“图像立方(image cube)”的图像，正是使用此一系列图像内的数据来限定自身荧光和特定标记物两者各自的光谱。许多具有生物学意义的标记物具有如此相似的发射光谱，使得使用昂贵的窄带滤光器来分离是困难或不可能的。用单一长通发射滤光器代替大量发射滤光器。除了皮肤、毛皮、皮脂腺的天然自身荧光外，还存在着来自共栖生物体(真菌、螨等)和摄取食物(叶绿素)的独特自身荧光。多光谱分析能够藉由发射荧光的线性信号混合物的数学解开(分解)分开所有来自应用于标本的特定标记物的这些信号，只要期望信号和自身荧光的发射光谱是已知的。
使用MAESTRO系统的测量如下运作：给照明模块装备激发白光的氙气灯(Cermax)。经由下游连接的激发滤光器(由实验者选择)，将光限定于(对于该实验)期望的波长范围，并经由光纤引导入成像模块中。在这里，将受限制的光划分入照亮经过麻醉的测试动物的四根光纤中。MAESTRO系统自动选择最佳的曝光时间(exposure time)，从而没有过度曝光(overexposure)的风险。激活的荧光探针的发射荧光光经过发射滤光器选择(参见表1)，并经由液晶(LC)引导到高灵敏度的冷却型CCD照相机。液晶使照相机能够进行特定波长的选择性照片记录。波长测量范围取决于选定的滤光器组(蓝色、绿色、黄色、红色、深红色、NIR)，以10nm的步长记录照片。将每个单一照片的光谱信息组合在一个称作“图像立方体”的“照片包”中。
表1：Maestro滤光器组。
Figure BDA0000147641970000161
用MAESTRO系统的分析如下进行：
每个记录由12比特黑白照片组成，这些照片可以以4096个不同灰度显示，因此能够区别发射强度的最小差异。与之相对的，人眼能够区别30-35个灰度。将发射强度的那些数值(灰度)针对波长范围绘图，结果，我们获得每个探针和组织自身荧光的发射光谱。软件将三种基本色(红色、绿色、蓝色)细分成用于成像立方体的波长范围，由此黑白照片变成有颜色的图像。在这些获取的多光谱信息外，系统能够区别注射的探针和任何来源的自身荧光。该程序使用光谱文库，其中每个纯探针的单一光谱和通过对没有任何注射的研究动物(例如Balbc/裸鼠或Scid米色小鼠)成像获取的光谱(小鼠自身荧光)。由于知晓纯成像和自身荧光的精确光谱，系统能够针对期望的光谱过滤整个图像，并为它们中每一个分配一种颜色。所得的图像(分解的合成图像)以不同的颜色显示当前的光谱。为了显现探针信号的强度分布，可以用伪彩色显示信号，低强度是例如蓝色，而高强度区是例如红色。除此之外，可以限定探针的信号强度的检测限，其容许降低循环探针和非特异性结合的信号。
用MAESTRO系统的比较和定量如下进行：
MAESTRO比较图像荧光团区的能力使比较治疗过程中的荧光信号强度变得容易。该程序提供了用于比较肿瘤区(被比较的图像)中的不同信号强度的工具。因为所有图像都是以最佳的曝光时间拍摄的，所以它们根据信号强度而有所不同。为了实现可靠的比较，将各照片相对于一个曝光时间标准化，结果得到信号强度差异的显示。通过手工绘制和调整测量区，可以用强度值来定量信号强度。一旦在肿瘤周围选定了一个测量区域，便可以将其克隆，并移动至要比较的下一图像。基于当前的设置(台高和框并(binning))以像素和mm2计算每个区域。结果，其给出关于创建的测量区域内平均信号、总信号、最大信号和平均信号/曝光时间(1/ms)的信息。
另一种可以与本发明结合应用的成像技术是FMT技术(荧光分子断层摄影术)，这是一种基于激光的三维成像技术，其提供了小动物模型中的非侵入性、全身、深组织成像，而且产生荧光源的3D重建和/或容许测量经荧光标记的分析物的荧光。FMT技术记载于例如US 6,615,063。
另一种可以与本发明结合应用的成像技术是记载于WO 2007/143141的光学成像方法。这种用于产生包括划定区的受试者的图像的成像技术包括：
使用光学检测器在受试者内获取靶光学造影剂物质(荧光染料或标记物，发光染料或吸收染料)的图像数据组的时间系列，其中每个图像数据组在选定的时间时获得，并且具有相同的多个像素，其中每个像素具有一个关联值，分析图像数据组以识别出多个独特的时间过程，测定图像数据组以识别出多个独特的时间过程，测定来自多个像素的对应于每个时间过程的相应像素组，并将每个像素组与识别出的结构联系起来，并产生受试者的图像，其中使用识别出的结构来描绘靶区。
在本发明方法的又一个实施方案中，上文所描述的方法的步骤(a)和/或(b)进一步包括测定眼的瞳孔位置的步骤。可以在本发明方法的步骤(a)和/或(b)之前、期间和/或之后测定瞳孔的位置。测定眼的瞳孔位置所需的手段和方法是技术人员公知的，例如记载于US 5,784,145或US 6,820,979的瞳孔计。
还涵盖的是，本发明的方法进一步包括：
(i)测定步骤(a)中所述瞳孔的所述部分的面积，和/或
(ii)测定步骤(b)中所述眼的瞳孔的面积。
应当理解，可能希望或者可能恰巧，在步骤(a)和(b)中采用相异，即不相同的划定区，这会导致如下的情况：被激发的区域较大，而用来接受发射光的区域较小(或反之)。因此，可以希望/必须测定视网膜、瞳孔和/或眼的所述部分的面积，以便能够测定/估计单位面积的激发光和/或发射光强度。可以这样做来调节信号。测定瞳孔面积所必需的手段和方法是技术人员公知的，例如通过改良标准的瞳孔计，诸如记载于US 5,784,145或US 6,820,979的瞳孔计来进行。
还设想，用可区别的和/或相同的激发光激发受试者双眼的划定区，其中对双眼同时或连续激发。如此，本发明的提供用于同时或连续地选择性检测、定量、监测(等等)至少两种不同的荧光分析物、荧光标记物或荧光实体的方法，其中通过受试者的一只眼测定一种信号，并通过受试者的另一只眼测定另一种信号。或者/另外，还设想通过受试者的同一只眼同时或连续测定/监测/定量(等等)彼此可区别的至少两种荧光分析物。为此目的，可以随后“解开”(unmix)至少两种荧光分析物的“不同”荧光特征，例如通过软件辅助评估来进行。解开超过一种不同荧光团的发射的手段和方法是技术人员公知的。
因为本发明涉及在受试者的血液中测定、定量(等等)荧光分析物的存在、药动学等的方法，应当理解必须这样引导激发光，使得它至少达到受试者的眼的视网膜的划定区。
通过受试者的眼接受自本发明的至少一种荧光标记物和/或自荧光实体和/或自荧光分析物发射的光。“通过眼”意指检测系统接受来自至少一种荧光标记物、实体或分析物的、穿过受试者眼的视网膜的血流/血液循环系统的发射光。因此，“通过眼”包括发射光是至少自视网膜(特别地，视网膜血液循环系统的划定区)、瞳孔和/或眼的划定区接受到的。因此，“划定区”至多(最多)涵盖受试者的全身，或任何较之为小的身体部分，只要所述部分仍涵盖受试者视网膜的至少一部分(包括其中的血液循环系统)，例如头、或头和肩、或头和身体的上部。设想所述划定区包含受试者的瞳孔、瞳孔和虹膜、或者甚至全眼(眼球)，全眼是优选的。或者，所述划定区比受试者的眼小或者比受试者的眼大。如本发明的背景中所使用的，“眼”包括受试者的一只眼或受试者的双眼。
可以通过调节光学检测器，即调节硬件，从而接受来自划定区的光，和/或通过评估划定区的“软件滤光器”来获得所述划定区。
还设想，在本发明的方法中，(a)将至少一种预定波长的所述激发光专门地(exclusively)引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上。在这方面，“专门地”意指所述激发光至多(最多)被引导到受试者的一只眼或双眼(或眼的较小部分)上，而不引导到受试者的任何其它部分上。
还设想，在本发明的方法中，自所述荧光分析物发射的具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的光专门通过所述受试者的眼被接受。在这方面，“专门地”明确排除接受(例如通过调节硬件进行)和/或评估(例如通过软件滤光器进行)来自受试者任何其它区域(除了眼外)的任何发射光以测定血液中的所述荧光分析物的存在、定量荧光分析物的血液水平或监测或测定所述荧光分析物的血液清除。由此，“眼”包括受试者的眼的包括瞳孔、瞳孔和虹膜的任何部分，或者全眼，全眼是优选的。“全眼”还包括受试者眼的可视部分(自外部可见的)。因此设想，不测定来自受试者的除了眼外的任何其它区域的发射光。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，(i)将所述激发光引导到受试者的划定区上，所述划定区比受试者的整个身体小(但是仍涵盖受试者瞳孔的至少一部分)并且比受试者的全眼大。在这方面，还优选的是，通过所述受试者的眼，优选地眼球，专门接收自荧光分析物发射的所述光。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，将所述激发光引导到受试者的划定区上，并专门地通过所述受试者的眼接受自荧光分析物发射的所述光。
应当理解，通过受试者的眼被接受的发射光沿着相应眼的光轴传播，或者不然，或者发射光的一部分沿着相应眼的光轴传播，而其它部分不然。眼的“光轴”在本文中别处定义。
本发明的方法进一步涵盖如下的实施方案，其中激发光的光轴与发射光的光轴完全相同，不相同，或仅部分相同。
如在所附实施例中可以看到的，现在有可能仅通过测定自所述受试者的一只眼和/或双眼接受的荧光信号(发射)来非侵入性地测定受试者的血液和/或血液循环中的感兴趣荧光分析物的存在、量、半衰期、动力学。换言之，虽然本领域已知，对受试者施用的荧光化合物可产生(但不仅仅产生)从所述受试者的眼接受到的信号，但仍不为人所知的是，该信号确切地反映(定性地、定量地、经时地)了所述受试者的血液(血液循环)中发生的情况。因此，通过受试者的眼接受的发射光实际上并不类似于荧光分析物在眼中的分布，而是反映所述分析物在血液或血液循环中的分布。通过受试者的眼获得的信号与所述分析物在血液中的实际情况(浓度、存在等)的关联在现有技术中既没有得到披露也没有得到提示。因此，现在有可能仅根据该知识可靠地检测并排除受试者血液中的荧光分析物的存在。例如，设想在某个时间点施用荧光分析物，并在后来的某个时间(例如在预定的时段后)检测其存在——倘若信号不可检出，现有就可以做出该分析物不再存在于相应受试者的血液中的结论。类似地，现在在体内条件下测定荧光分析物的生物学半衰期变得容易得多，因为有可能以非常短的时间间隔测定发射光的信号强度(并且由此测定所述分析物的理论量)，由此可以显著更精确地指示荧光分析物自相应受试者的血液降解和/或分泌和/或清除的过程。此测量是非侵入性的，因此对受试者(例如非人测试动物)几乎没有应激，由此可以使两次测量间的时间间隔最小化。还可能希望同时评估荧光分析物的分泌途径和/或所述分析物的器官分布。此外，本发明提供了一种筛选系统，优选地在非人测试动物中，其使用以不同第二实体(例如不同药物或相互作用配偶体，即两种或更多种彼此特异性相互作用的结合配偶体，诸如抗原-抗体、抗体-抗体、多聚体蛋白质复合物、蛋白质-蛋白质结合、凝集素-糖结合等)为特征、并用可区别的荧光标记物(例如在发射光谱上有所不同和/或适合于评估FRET效应)标记的至少两种荧光分析物，以评估这两种第二实体本身间的体内相互作用(由此评估两种实体是否在体内相互作用)，或者以筛选提高(激动剂)或降低(拮抗剂)所述相互作用的物质。
如此，提出的非侵入性方法通过显著减少动物数目，使动物应激最小化，改善数据集的质量，并改善就时间和成本而言的分析功效，可测定例如血清峰水平(tmax)、血清半衰期时间(t1/2)和/或c0。有利的是，本发明的方法可以与本领域中已知的体内成像方法(例如全身体内成像)组合以检测荧光分析物的(任选地，时间依赖性的)器官分布，而后者会进一步揭示感兴趣化合物的药理学概况。还设想，通过本发明的方法，现在有可能检测与血流一起传播或通过血流传播的物质的存在，例如，在体内以非侵入性方式，任选地实时或经时地测定病原体的存在。为此，设想施用包含对靶物(例如病原体)特异性的表位结合域的荧光分析物、标记物或实体，并通过相应受试者的眼接受发射光以测定血液中的所述靶物的存在。在此方面，激活的或可激活的荧光标记物/实体是优选的。或者还设想，施用包含对靶物(例如病原体)特异性的表位结合域的荧光剂，然后测定所述靶物针对某种测试化合物的存在(或施用)的存在(presence of said target against the presence or administration ofa test-compound)，其中所述测试化合物是已知会，或者预期会对该靶效应产生影响的测试化合物(例如药物)(例如抗生素，若靶物是病原性细菌细胞的话)；并通过相应受试者的眼接受发射光来测定所述影响。倘若测试化合物有效，则该靶物会例如从血流被清除，这一点由通过所述受试者的眼接受的荧光信号之缺无来指示。因此，可以使用本发明的方法来筛选治疗剂，优化治疗剂，测定治疗剂的药动学概况，筛选配制剂，确定合适的施用方式(i.v.，i.p等)，等等。
本发明的方法是非侵入性的。如本文中所使用的，“非侵入性”意指本发明的方法、用途和/或装置不产生皮肤破裂，特别是受试者眼的角膜或巩膜的破裂，但是容许并涉及使眼(包括其角膜或巩膜)与辐射接触，并且同样地，容许并涉及辐射对眼(包括其角膜或巩膜)的穿透。由此，辐射包括所有种类的光，例如激发光、发射光等，本文中对它们在本发明的背景下进行了描述。受试者眼的“角膜”是眼中覆盖虹膜、瞳孔、和前房的透明前面部分。“巩膜”是眼中含有胶原和弹性纤维的不透明的、纤维状的、保护性的外层，其形成球后部六分之五的结缔组织外层。它与角膜是连续的。
“瞳孔”是位于眼虹膜中心的圆形开口，其控制进入眼的光(例如激发光)的量。虹膜是一种可收缩结构，其主要由围绕瞳孔的平滑肌组成。光(诸如激发光)经由瞳孔进入眼，虹膜通过控制瞳孔大小来调节光量。在光学上，解剖学的瞳孔是眼的光圈(aperture)，而虹膜是孔阑。如自眼外部看到的瞳孔图像是入射瞳孔。在光学系统中，入射瞳孔是一种虚拟光圈(virtual aperture)，其限定系统入口处可接受光的面积。在本发明的语境中，“瞳孔”或“入射瞳孔”可以互换使用。
如本发明所提供的成像方法的非凡进展容许在体内条件下显现任何分析物在血流中的性能，例如药物和药物投递系统的性能。可以获得作为时间函数的关于药物和载体的位置和浓度的详细且定量的信息，由此可实现对生物学效应的更深刻了解。此信息对于设计优化的药物和/或药物投递系统是至关重要的。一般地，这里提出的技术可用来(a)优化给定的药物，例如通过药物的(化学)修饰；(b)评估/优化期望的第二实体或荧光分析物的新设计的制剂；(c)评估/优化第二实体或荧光分析物的剂量；(d)评估/优化期望的第二实体或荧光分析物的不同施用路径，例如系统或局部，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、皮肤、硬膜外、口服、心室内和鞘内注射、或肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器进行。通过使用以发射光谱差异的荧光标记物标记的不同第二实体(例如不同药物)，可以实施这两种第二实体(例如药物-药物)间的相互作用研究。另外，可以在疾病区域中和/或在经遗传工程的临床前模型(例如FcRn敲除体)中用此新方法产生药动学数据。
如此，如本文中所描述的非侵入性方法能够实时和/或在一段时间里测定、定量或监测血液中的荧光分析物的存在、量、动力学(例如血浆清除)。所述一段时间取决于实验/方法的意图，即，可能想要分析可历时数天或甚至数周时间的抗体血液浓度(以浓度-时间概况为例)，或者可能想要分析可在数分钟内或者甚至在数秒内出现的快速可降解分析物的半衰期。物质的生物学半衰期或消除半衰期是物质(药物、放射性核素等)丧失其一半的药理学、生理学、或放射学活性所花费的时间。通过本发明的方法，现有有可能在一段时间里、在体内、实时、在不需要采集血液样品的情况下(即，以非侵入性方式)监测并测定任何想要的荧光分析物的血液浓度(例如血浆清除)。在一段时间里包括但不限于1、2、3个、4、5或甚至更多个月、天、小时、分钟或秒的时间间隔。时间间隔可以包含例如对于喂养受试者、更新麻醉处理(倘若期望的话)、湿润眼球等必需的一次或多次中断。
“血液”意指包含血浆和血液的细胞组分的全血。如本文中所使用的，“血浆”或“受试者的血浆”意指全血中的血细胞在正常情况下会悬浮于其中的血液液体组分。由此可见，在本发明方法的语境下，荧光分析物的存在、血液水平、和/或血液清除是在全血中测定的。其中，所述荧光分析物可以是自由漂浮的(未结合的)和/或可以是结合的。“结合的”包括荧光分析物是例如结合下列各项和/或被下列各项结合：全血的细胞组分、病原体、抗体和/或其功能性片段、蛋白质(例如血浆内的蛋白质，如人血清白蛋白、脂蛋白、糖蛋白、α、β、和γ球蛋白)、肽、酶、毒素、维生素、激素、细胞因子、治疗剂/化合物(药物)、核酸、受体、受体配体、细胞靶物诸如肿瘤细胞、经由血液传播的循环肿瘤细胞(CTC)或(微)转移、肿瘤抗原、肿瘤标志物，如β-HCG、CA 15-3、CA 19-9、CA72-4、CFA、MUC-1、MAGE、p53、ETA、CA-125、CEA、AFP、PSA、PSMA等、药物、或任何其它种类的如下物质，所述物质(a)存在于血液中，并且(b)通过任何合适的结合反应，例如抗原-抗体结合；受体-配体结合、基于核酸杂交的结合、凝集素-糖结合、蛋白质-蛋白质结合、蛋白质-核酸结合等结合本发明的荧光分析物和/或被本发明的荧光分析物结合。“血液的细胞组分”包括血细胞，包括红细胞(红血球)、白细胞(诸如白血球)和血小板。除了血液的细胞组分之外还可能存在的“细胞靶物”包括已知或怀疑存在于全血中的任何其它细胞类型，例如肿瘤细胞和/或转移。
本发明的荧光分析物包含至少两种不同实体，即荧光实体和第二实体。然而，还考虑荧光分析物还包含其它实体，例如保护基以增强血浆半衰期和/或其它非荧光标记物诸如化学发光或放射性标记物。
还设想，本发明的荧光分析物作为混合物使用，该混合物实质上包含(a)荧光分析物(其包含例如与荧光实体偶联的第二实体X)和(b)没有任何荧光实体/标记物的所述第二实体X。未标记的第二实体X与经标记的第二实体X(即包含X的荧光分析物)间的分配是可变的，包括1∶10，1∶5，1∶1，2∶1，5∶1，10∶1，100∶1，1000∶1等比率。优选的是，在与混合物中的所述第二实体X的总量相比时，上文所提及的混合物包含等于或小于10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0，5％，0，1％，0，01％，0，001％等的经荧光标记的第二实体X(荧光分析物)。此类混合物记载于WO 2008/119493。
“荧光实体”是或者包含至少一种荧光标记物，其容许通过如本文中所公开的方法/用途/装置来检测本发明的荧光分析物。应当理解，荧光分析物的荧光实体是直接和/或间接附接于第二实体的荧光标记物的集体(collectivity)。
荧光实体可以包含至少一种荧光标记物，或者它可以包含可以与至少一种荧光标记物偶联的间隔物。所述间隔物可以以与至少一种荧光标记物和(若可适用的话)淬灭剂共价连接的含有可降解键的微球，例如胶乳珠、肽、寡核苷酸、高分子骨架、或其它模块，例如合成模块为例。高分子骨架可以是任何生物相容性聚合物。例如，它可以是多肽、多糖、核酸、或合成的聚合物。作为骨架有用的多肽包括例如聚赖氨酸、白蛋白、和抗体、多聚(L-赖氨酸)是一种优选的多肽骨架。骨架也可以是合成的聚合物，诸如聚乙醇酸、聚乳酸、聚(乙醇酸-乳酸)共聚物、聚二氧杂环己酮(polydioxanone)、聚戊内酯(polyvalerolactone)、聚-ε-己内酯、聚(3-羟基丁酸酯、聚(3-羟基戊酸酯)、聚丙醇二酸、和聚(β-丙二酸)。高分子骨架的设计会取决于如下的考虑因素，诸如生物相容性(例如毒性和免疫原性)、血清半衰期、有用的官能团(例如，用于缀合间隔物，和保护基)、和成本。高分子骨架的有用类型包括多肽(聚氨基酸)、聚乙烯胺、多糖、胺化多糖、胺化寡糖、聚酰胺胺、聚丙烯酸和多元醇。在一些实施方案中，骨架包括自L-氨基酸、D-氨基酸、或其组合形成的多肽。例如，此类多肽可以是与天然存在的蛋白质诸如白蛋白、均聚物诸如聚赖氨酸、或共聚物诸如D-tyr-D-lys共聚物相同或相似的多肽。在赖氨酸残基存在于高分子骨架中时，赖氨酸残基侧链上的e-氨基基团可以充当与间隔物共价连接的便利反应基团。当高分子骨架是多肽时，优选地，探针的分子量是2kD至1000kD。更优选地，其分子量是4kd至500kd。
荧光实体(及荧光分析物)可以包括与间隔物，例如与高分子骨架共价连接的一个或多个保护链。合适的保护链包括聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚丙二醇、聚乙二醇和甲氧基聚丙二醇的共聚物、右旋糖苷、和聚乳酸-聚乙醇酸。
如本文中所使用的，“荧光标记物”表征包含荧光团的分子。荧光团(其有时又称作荧光染料)是分子中的一种官能团，其会吸收特定波长的能量，并且以不同波长再发射能量。在与所述特定的(预定的)波长相比时，所述不同波长以与特定的(预定的)波长可区别的波长再发射，例如以更长的波长或以更短的波长再发射，然而在后一种情况中强度降低。发射的能量的量和波长取决于荧光团和荧光团的化学环境两者。
以更短的波长再发射波长的原理在多光子荧光激发中得到了应用；参见Xu等(1996)，Proc.Nathl.Acad.Sci.93，10763-10768。可以在本发明的语境中使用多光子荧光激发。例如，以所使用的荧光团的吸收峰的波长两倍左右的波长照亮样品。例如，对于具有500nm左右的吸收峰的荧光素，可以使用1000nm激发。在此波长基本上不会发生荧光团激发。然而，若使用高峰功率脉冲激光(使得平均功率水平是适度的，并且不损害标本)，则会在聚焦点发生两光子事件。在此点，光子密度足够高，使得荧光团可以基本上同时吸收两个光子。这等同于具有等于吸收的两个光子的能量之和的能量的单一光子。这样，荧光团激发仅会在聚焦点(在需要时)发生，由此消除焦点外的荧光团的激发并实现光学断层(optical sectioning)。
也可以在本发明的语境中使用三光子激发。在此情况中，同时吸收三个光子，从效果上说使激发能量变为三倍。使用此技术，UV激发的荧光团可以用IR激发成像。因为激发水平依赖于激发功率的立方，所以与存在二次功率依赖(quadratic power dependence)的两光子激发相比，(对于相同的激发波长的)分辨率得到改善。有可能选择荧光团以便能够利用单一IT激发光源通过组合2光子激发和3光子激发对多重标记的样品成像。
也可以在本发明的语境中使用两光子激发显微术。这种技术是容许对深达1毫米的活组织成像的荧光成像技术。
两光子激发的构思基于如下的想法，即低能量的两个光子可以在一个量子事件中激发荧光团，导致一个荧光光子的发射，该发射的能量通常以比两个激发光子之任一都高。两个光子的接近同时吸收的可能性是极低的。因此，通常需要高通量的激发光子，通常为飞秒激光。
两光子吸收与激光扫描仪的使用组合[4]。在两光子激发显微术中，经由物镜聚焦红外激光束。通常使用的Ti-蓝宝石激光具有约100飞秒的脉冲宽度和约80MHz的重复速度，这容许两个光子吸收所需要的高光子密度和通量，并且在宽范围的波长间可调。
最常使用的荧光团具有400-500nm范围内的激光光谱，而用于激发荧光团的激光位于约700-1000nm(红外)范围内。若荧光团同时吸收两个红外光子，则它会吸收足够的能量以提升为激发状态。然后，荧光团会发射单一光子，其波长取决于所使用荧光团类型的波长(通常为可见光谱)。因为需要吸收两个光子来激发荧光团，所以来自荧光团的荧光发射的可能性随激发强度以二次方增加。因此，在激光束紧密聚焦时比更漫射时产生多得多的两光子荧光。
设想，本发明的荧光实体包含至少1个，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或甚至更多个荧光标记物。这些荧光标记物可以是相同或不同的，即，设想如本发明的背景中所使用的荧光实体包含仅一种荧光标记物或至少2、3、4、5或甚至更多种不同种荧光标记物的混合物。“仅一种”意指荧光标记物含有同一种荧光团，而不同种意指不同荧光标记物包含不同荧光团，并且因此显示不同吸收和/或发射特征。随后，例如可以通过软件辅助评估来“解开”这些“不同”特征。解开超过一种不同荧光团发射的手段和方法是技术人员公知的。
可以使用荧光标记物上的任何合适的反应基团和间隔物或第二实体上的相容性官能团来将荧光标记物与间隔物或荧光分析物的第二实体共价和/或非共价连接。
在本发明的语境中，所述荧光标记物优选地选自下组：量子点剂、荧光蛋白、荧光染料、pH-敏感性荧光染料、电压敏感性荧光染料和/或经荧光标记的微球。
“量子点剂”或“量子点”(又称为纳米晶体)是称为半导体的特殊的一类材料，其是由II-VI、III-V、或IV-VI材料的周期群组成的晶体。
“荧光蛋白”包括例如绿色荧光蛋白(GFP)、CFP、YFP、BFP(或是增强型的或为非增强型的)。其它荧光蛋白记载于Zhang，Nat Rev Mol Cell Biol.2002，12，页906-18或于Giepmans，Science.2006，312，页217-24。
“荧光染料”包括所有种类的荧光标记物，包括但不限于荧光素，包括所有其衍生物，例如FITC；罗丹明(Rhodamine)，包括所有其衍生物诸如四甲基罗丹明(TAMRA)及其异硫氰酸盐衍生物(TRITC)、磺基罗丹明(sulforhodamine)101(及其磺酰氯形式德克萨斯红(Texas Red))、罗丹明红(Rhodamine Red)、和罗丹明的其它衍生物，其包括更新的荧光团，诸如Alexa546、Alexa 555、Alexa 633、DyLight 549和DyLight 633)；Alexa Fluor(AlexaFluor荧光染料家族由Molecular Probes生产)；DyLight Fluor(其是由Dyomics生产的荧光染料家族)、ATTO染料(其代表由在Siegen的ATTO-TEC GmbH制造的一系列荧光标记物和染料，WO/2007/067978日本)；LaJolla蓝(Diatron，Miami，Fla.)；吲哚花青绿(ICG)及其类似物(Licha等，1996，SPIE 2927：192-198；Ito等，美国专利No.5,968,479)；吲哚三羰花青(ITC；WO 98/47538)、和螯合镧系元素化合物。荧光镧系元素金属包括铕和铽。
如上文所提及的，也可以用近红外(NIR)荧光标记物标记分析物。使用在近红外光谱中具有激发和发射波长的NIR荧光标记物，即640-1300nm，优选地640-1200nm，且更优选地640-900nm。使用电磁谱的这个部分使组织穿透最大化，并使生理上丰富的吸收剂诸如血红蛋白(＜650nm)和水(＞1200nm)的吸收最小化。体内使用的理想的近红外荧光染料展现出：
(1)窄的光谱特征，
(2)高灵敏度(量子产率)，
(3)生物相容性，
(4)解耦吸收和激发光谱，和
(5)光稳定性。
各种近红外(NIR)荧光标记物是商品化的，并且可以用于依照本发明制备荧光实体。例示性的NIRF标记物包括下列各项：Cy5.5、Cy5和Cy7(Amersham，Arlington Hts.，IL)；IRD41和IRD700(LI-COR，Lincoln，NE)；NIR-I，(Dejindo，Kumamoto，Japan)；LaJoIIa蓝色(Diatron，Miami，FL)；吲哚花青绿(ICG)及其类似物(Licha，K.，等，SPIE-The International Society for OpticalEngineering 1996；第2927卷：192-198；US 5,968,479)；吲哚三羰花青(ITC；WO98/47538)；和螯合的镧系元素化合物和SF64、5-29、5-36和5-41(来自WO2006/072580)。荧光镧系元素金属包括铕和铽。镧系元素的荧光特性记载于Lackowicz，J.R.，Principles of Fluorescence Spectroscopy，第2版，KluwerAcademic，New York，(1999)。
“荧光微球”详细地记载于WO/2007/067978，通过提及而将其收入本文。
在本发明的又一个实施方案中，荧光实体的至少一个荧光标记物是可激活的。还设想该荧光实体是可激活的。
如前文所提及的，已知由荧光染料发射的能量的量和波长取决于荧光团和荧光团的化学环境两者。由此可见，荧光染料可以以pH灵敏性或电压敏感性方式起反应，即它们可由于化学环境的此类变化而被激活。此外，可激活的荧光标记物详细地记载于US 2006/0147378A1，US 6592847，US 6,083,486，WO/2002/056670或US 2003/0044353A1，通过提及而将所有专利收入本文。
荧光标记物/实体的“激活”意指对标记/实体的任何如下所述的改变：其导致标记物/实体的可检测特性，例如光学特性的改变。这包括但不限于导致特性(例如光学特性)的可检测差异，例如荧光信号振幅变化(例如去淬灭(dequenching)和淬灭)、波长、荧光寿命、光谱特性、或极性的变化的对标记物/实体的任何修饰、改变、或结合(共价的或非共价的)。光学特性包括波长，例如在电磁谱的可见、紫外、近红外、和红外区中。激活可以是但不限于通过酶切割、酶转化、磷酸化或去磷酸化、由于结合所致的构象变化、酶介导的剪接、酶介导的荧光团转移、互补DNA或RNA的杂交、分析物结合诸如与分析物诸如Na+、K+、Ca2+、Cl-、或另一种分析物的结合、探针环境的疏水性变化、和对荧光团的化学修饰。光学特性的激活可以或可以不通过其它可检测特性，诸如(但不限于)磁弛豫和生物发光的变化来实现。
在本发明的又一个实施方案中，一旦所述第二实体的表位结合域已经结合其靶物，便激活荧光分析物的至少一种荧光标记物。还设想，一旦所述第二实体的表位结合域已经结合其靶物，便激活荧光实体。
“激活的”包括激活前文已经提及的可激活荧光标记物。例如，设想，本发明的荧光分析物包含至少一种可激活荧光标记物，其通过蛋白水解切割(例如，通过释放可切割清除剂的酶促切割-此类系统记载于例如US2006/0147378A1，US 6592847，US 6,083,486，WO/2002/056670或US2003/0044353A1)激活。“激活的”还包括“基于FRET的”效应。
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共振能量转移(缩写为FRET)(又称为荧光共振能量转移、共振能量转移(RET)或电子能转移(EET))是一种描述两个荧光团间的能量转移的机制。FRET提供了供体荧光团与接受荧光团间的接近性的指示。在用限定频率的入射辐射激发供体时，当接受体足够紧密地接近供体(通常，对于大多数供体荧光团在约50埃内)时，供体的一些能量(这些能量在普通条件下会作为荧光发射)被转移至接受体。转移至接受体的能量的至少一些以接受体的荧光频率作为辐射发射。各种来源中有关于FRET进一步说明，诸如“FRET Imaging”(Jares-Erijman，E.A和Jovin，T.M，Nature Biotechnology，21(11)，(2003)，第1387页-第1395页)，为了所有目的通过提及而将其收入本文。基于此类FRET效应的筛选系统是公知的，并且记载于例如WO 2006107864，将其完整纳入本文。
本发明的荧光分析物进一步包含第二实体。所述第二实体通常是“分析物”本身，即要通过本文中所公开的方法、用途和装置测定其存在、量、动力学、血液清除等的分析物。为此，将所述第二实体与荧光实体连接，然后，通过本发明的手段和方法来测定、定量、监测(等等)荧光分析物。应当理解，本发明的荧光分析物的第二实体是直接或间接附接于荧光实体的第二实体的集体。例如，设想，本发明的荧光分析物包含超过一种，即2、3、4、5、或甚至更多个第二实体。所述各第二实体可以是彼此相同和/或不同的。
还设想，一旦荧光实体已经结合第二实体，它便被激活(例如基于上文所描述的FRET效应)。所述激活可以在体外发生，并且或者，所述激活可以在体内发生，即设想如下的方法，其中要在所述受试者中激活所述荧光实体。“要被激活”可以以被动方式发生，其意味着以可激活荧光标记物为特征的荧光分析物被施用给受试者，其可检测特性在受试者中被改变(例如通过FRET效应或者通过蛋白水解效应实现)；或者它们可以以主动方式发生，例如通过施用可在体内激活荧光标记物/实体的蛋白酶。
应当理解，荧光标记物/实体的激活优选地先于本发明的步骤(b)，即先于接收自所述荧光分析物发射的光的步骤。或者，所述激活和所述接收同时发生。
还设想，在本发明方法的语境中，所述荧光分析物、荧光实体、荧光标记物、第二实体和/或所述靶物要被施用给所述受试者。
或者，设想本发明的方法无一包括对所述受试者施用所述荧光分析物、荧光实体、荧光标记物、第二实体和/或所述靶物的步骤。
应当理解，在本文所公开的方法的语境中，所述荧光分析物、所述荧光实体和/或所述靶物的所述施用先于本发明方法的步骤(b)，即先于接收自所述荧光分析物发射的光的步骤。
术语“第二实体”指要通过本发明的方法、用途和装置来测定、定量、监测(等等)其存在、药动学、血浆清除、生物学半衰期、峰水平等的分析物。因此，术语“第二实体”包括但不限于病原体、表位结合域(结合或不结合其靶物)、抗体和/或其功能性片段(结合或不结合靶物)、蛋白质(例如，血浆内的蛋白质，如人血清白蛋白、脂蛋白、糖蛋白、α、β、和γ球蛋白)、肽、酶、毒素、维生素、多糖、脂质、激素、细胞因子、治疗剂/化合物(药物)、核酸(例如siRNA)、受体(结合或不结合其配体)、受体配体(结合或不结合其受体)、细胞靶物诸如经由血液传播的(微)转移或肿瘤细胞、肿瘤抗原、肿瘤标志物，如β-HCG、CA 15-3、CA 19-9、CA 72-4、CFA、MUC-1、MAGE、p53、ETA、CA-125、CEA、AFP、PSA、PSMA等、或任何其它种类的、人们对其血液中的存在感兴趣的物质。上述术语已经在本文中别处限定。
优选的是，“第二实体”在医学语境中产生有益效果，即在离体和/或在体内展现出治疗和/或诊断活性/能力。由此可见，在本发明的一个实施方案中，所述第二实体包含诊断和/或治疗剂。
“病原体”意指对其宿主引起疾病或病的媒介物。因此，病原体包括所有种类的细菌，如例如埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、弧菌属(Vibrio)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、疏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clo stridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、密螺旋体属(Treponema)、立克次氏体(Rickettsia)、衣原体(Chlamydia)、支原体(Mycoplasma)、考克斯氏体属(Coxiella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、利斯特氏菌属(Listeria)、嗜血菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、博德特氏菌属(Bordetella)、布鲁氏菌属(Brucella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)等的种；病毒，如例如属小RNA病毒科(Picomaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、布尼病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、逆转录病毒科(Rteroviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、HAV、HBV、HCV、HIV、HTLV、流感病毒、疱疹病毒、痘病毒的病毒，包括所有已知的亚型和变异，HBV、HCV和HIV是优选的；真菌，如例如曲霉(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、芽生菌属(Blastomyces)、Paracoccoides、毛霉菌(Mucor)、弯孢属(Curvularia)、镰孢菌属(Fusarium)等的种，包括真菌孢子，原生动物或原生动物寄生物，如例如溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)或属于顶复合器门(Apicomplexa)的物种(特别地，血液传播亚目，包括Adeleorina、血孢子虫亚目(Haemosporida)和艾美耳亚目(Eimeriorina)，疟原虫(Plasmodia)属的物种是优选的)、和/或内寄生物。引起血液传播疾病的病原体是优选的。“血液传播疾病”是可以通过血液污染传播的疾病。
术语“抗体”指结合靶物的单克隆或多克隆抗体(参见Harlow和Lane，“Antibodies，A Laboratory Manual”，CSH Press，Cold Spring Harbor，USA，1988)，或保留或基本上保留其结合特异性的所述抗体的衍生物。此类抗体的优选的衍生物是嵌合抗体，其包含例如小鼠或大鼠可变区和人恒定区。如本文中所使用的，术语“功能性片段”指保留或基本上保留抗体的结合特异性的如本文中所规定的抗体片段，如分离的轻链和重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab’、F(ab’)2。术语“抗体”还包括双功能性(双特异性)抗体和抗体构建体，如单链Fv(scFv)或抗体融合蛋白。术语“scFv片段”(单链Fv片段)是本领域中充分了解的，由于此类片段尺寸较小，并且由于其可能能够重组产生，因而此类片段是优选的。所述抗体或抗体结合部分是人抗体或人源化抗体。依照本发明，术语“人源化抗体”意指这样的抗体，其来自非人类的来源，其可变域中的至少一个互补决定区(CDR)，诸如CDR3(优选地，所有6个CDR)，已经被替换为具有期望特异性的、源于人的抗体的CDR。任选地，抗体的非人恒定区已经被替换为人抗体的恒定区。用于生成人源化抗体的方法记载于例如EP-A1 0 239 400和WO90/07861。术语“抗体或其功能性片段”还包括重链抗体及其可变域，其在WO 94/04678，WO 96/34103和WO 97/49805，WO04/062551，WO 04/041863，WO 04/041865，WO 04/041862和WO 04/041867中提及；及域抗体或“dAb”，其基于或衍生自传统的4链抗体分子的重链可变域(VH)或轻链可变域(VL)(参见例如Ward等1989Nature 341，544-546)。
本发明的荧光分析物和/或第二实体可以包含至少1个，即1、2、3、4、5或甚至更多个“表位结合域”。除了上文提及的抗体或其功能性片段外，术语“表位结合域”还包括其它如下所述的结合实体，选自实体结合(特异性结合)靶物，诸如例如病原体、蛋白质、肽、酶、毒素、维生素、多糖、脂质、激素、细胞因子、治疗剂/化合物(药物)、核酸(例如siRNA)、受体、受体配体、细胞靶物诸如经由血液传播的(微)转移或肿瘤细胞、肿瘤抗原、肿瘤标志物等。
如本文中所使用的，术语“靶物”或“靶分子”指表位结合域所结合的任何感兴趣的生物分子。例示性的靶物包括但不限于分泌性肽生长因子、药剂、细胞信号传导分子、血液蛋白质、细胞表面受体分子的一部分、核受体的一部分、类固醇分子、病毒蛋白、碳水化合物、酶、酶的活性位点、酶的结合位点、酶的一部分、小分子药物、细胞、细菌细胞、蛋白质、蛋白质表位、蛋白质-蛋白质相互作用中涉及的蛋白质表面、细胞表面表位、诊断蛋白质、诊断标志物、植物蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用中涉及的肽、和食物，包括食物成分。靶物可以与生物学状态，诸如植物或动物中的疾病或病症及病原体的存在有关。在靶物与某种生物学状态“有关”时，靶物的存在或缺无、或特定量的靶物的存在可以鉴定生物学状态。
如本文中所使用的，与靶物与表位结合域间的相互作用有关的术语“结合”(binding)指示与一般的蛋白质缔合(association)(即非特异性结合)相比，表位结合域以统计学显著的程度与靶物缔合(例如相互作用或复合)。如此，术语“表位结合域”也理解为指与靶物具有统计学显著的缔合或结合的域。
术语“表位结合域”包括例如不依赖于不同V区或域(特异性)而结合抗原或表位的域，这可以是域抗体(dAb)，例如人、羊驼(camelid)或鲨鱼免疫球蛋白单一可变域，或者可以是这样的域，其是选自下组的支架的衍生物：CTLA-4(Evibody)；脂笼蛋白；蛋白A衍生的分子诸如蛋白A的Z域(Affibody，SpA)、A域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白诸如GroEI和GroES；运铁蛋白(trans-body)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C型凝集素域(四连蛋白(Tetranectin))；人γ-晶体蛋白和人泛素(affilins)；PDZ域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型域；和纤连蛋白(adnectin)；并且其已接受蛋白质工程化改造以获得对天然配体之外的配体的结合。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是一种主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。它的胞外域具有可变域样Ig折叠。可以用异源序列替换与抗体的CDR对应的环，以赋予不同的结合特性。经过工程化改造而具有不同结合特异性的CTLA-4抗体又称为Evibody。关于更多详情，参见Journal of Immunological Methods 248(1-2)，31-45(2001)。
脂笼蛋白是一个胞外蛋白质家族，这些蛋白质转运小的疏水性分子诸如类固醇、后胆色素、类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在圆锥结构的开口端有许多环，这些环可以接受工程化改造而结合不同的靶抗原。Anticalin的大小是160-180个氨基酸，衍生自脂笼蛋白。关于更多详情，参见Biochim Biophys Acta 1482：337-350(2000)，US7250297B1和US20070224633。
Affibody是一种可以工程化改造为结合抗原的自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A衍生的支架。域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化来生成文库。关于更多详情，参见ProteinEng.Des.SeI.17，455-462(2004)和EP1641818A1。
Avimer是自A域支架家族衍生的多域蛋白质。约35个氨基酸的天然域采用限定的二硫键键合的结构。通过由A域家族展现的天然变异的改组来产生多样性。关于更多详情，参见Nature Biotechnology 23(12)，1556-1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6)，909-917(2007年6月)。
运铁蛋白是一种单体血清转运糖蛋白。可以通过在许可的表面环中插入肽序列来将运铁蛋白工程化改造以结合不同靶抗原。工程化改造的运铁蛋白支架的例子包括Transbody。关于更多详情，参见J.Biol.Chem 274，24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)是自锚蛋白衍生的；锚蛋白是一种介导整合膜蛋白附着于细胞骨架的蛋白质家族。单一锚蛋白重复是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33个残基的基序。可以通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基来将它们工程化改造成结合不同靶抗原。其结合界面可以通过增加模块数目(一种亲和成熟方法)来增加。关于更多详情，参见J.MoI.Biol.332，489-503(2003)，PNAS 100(4)，1700-1705(2003)和J.MoI.Biol.369，1015-1028(2007)及US20040132028A1。
纤连蛋白是一种可以工程化改造成结合抗原的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10个域的天然氨基酸序列的主链组成。可以工程化改造β-夹心(sandwich)一端的3个环以使Adnectin能够特异性识别感兴趣的治疗性靶物。关于更多详情，参见Protein Eng.Des.SeI.18，435-444(2005)，US20080139791，WO2005056764和US6818418B 1。
肽适体是一类组合识别分子(combinatorial recognition molecules)，其由恒定的支架蛋白组成，支架蛋白通常为含有活性位点处插入的约束性可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。关于更多详情，参见Expert Opin.Biol.Ther.5，783-797(2005)。
微体(microbodies)自长度为25-50个氨基酸、含有3-4个半胱氨酸桥的天然存在的微生物蛋白质衍生，微生物蛋白质的例子包括KalataBI和食鱼螺毒素(conotoxin)及knottin。所述微生物蛋白质具有这样的环，该环可以工程化改造以包括多至25个氨基酸，而不影响微生物蛋白质的总体折叠。关于工程化改造的knottin域的详情，参见WO2008098796。
其它表位结合域包括已经作为支架使用以工程化改造不同靶抗原结合特性的蛋白质，包括人γ-晶体蛋白和人泛素(affilin)、人蛋白酶抑制剂的kunitz型域、Ras结合蛋白AF-6的PDZ域、蝎毒素(卡律蝎毒素(charybdotoxin))、C型凝集素域(四连蛋白)，其综述见Handbook of Therapeutic Antibodies(2007，Stefan Dubel编)之第7章《Non-Antibody Scaffolds》和Protein Science 15：14-27(2006)。本发明的表位结合域可以衍生任一这些备选的蛋白质域。其它“表位结合域”的例子是受体(特异性结合其配体)、凝集素(特异性结合多糖)、锌指和亮氨酸拉链(结合核酸)、酶(特异性结合其底物)、病毒和细菌(例如特异性结合其靶细胞)、核酸(彼此特异性杂交)等。
充当治疗剂(药物)的治疗性“表位结合域”、和治疗性抗体或其功能性片段是优选的。特别优选的是阿仑单抗(alemtuzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、加利昔单抗(galiximab)、吉姆单抗(gemtuzumab)、易普利姆玛(ipilimumab)、labetuzumab、帕尼单抗(panitumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥单抗(trastuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、rhMab ICR62、rhMab B-Ly1和帕妥珠单抗(pertuzumab)。
“治疗剂”指如下的作用剂，其中治疗性化合物的主要目的是改善特定疾病的症状或不利的医学状况。如本文中所使用的，术语“疾病”指源自遗传或发育错误、传染、毒物、营养缺乏或不平衡、毒素、或不利的环境因素；疾病；不适；或小病的效应的、身体器官、部分、结构、或系统任何紊乱的或不正确运行。如本文中所使用的，术语“症状”指任何源自并伴随特定疾病或病症，由此充当指征的现象。“治疗剂”或“治疗性化合物”包括但不限于抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗增殖剂、免疫抑制剂、免疫激活剂、止痛剂、抗新生物剂，或组胺受体拮抗剂。术语“疾病”进一步包括对活动物或其某一部分的正常状态的任何损伤，其中断或改变生命功能的发挥(通常表现为区别体征和症状)。例如，疾病可以包括但不限于癌症疾病、心血管疾病、神经变性性疾病、免疫学疾病、自身免疫性疾病、遗传病、感染性疾病、骨疾病、和环境疾病。
术语“抗细菌剂”涉及对细菌具有生长抑制或生长约束活性的任何化合物，包括例如β-内酰胺抗生素或喹诺酮抗生素。该术语进一步包括选自下组的药剂：萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素、阿莫西林(amoxicillin)、氨苄西林、头孢菌素(cephalo sporine)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、利福平(rifampin)、米诺环素(minocycline)、环丙沙星(ciprofloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、红霉素(erythromycin)、四环素(tetracycline)、庆大霉素(gentamicin)、大环内酯(macrolide)、喹诺酮(quinolone)、β-内酯、P-内酰胺酶抑制剂、水杨酰胺、和万古霉素、磺胺，磺胺甲
Figure BDA0000147641970000341
唑、磺胺醋酰(sulfacetamide)、磺胺异
Figure BDA0000147641970000342
唑(sulfisoxazole)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、青霉素类诸如青霉素G和V、甲氧西林(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、萘夫西林(naficillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxacillin)、羧苄西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)和哌拉西林(piperacillin)、头孢菌素诸如头孢噻吩(cephalothin)、头孢唑林(cefaxolin)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢呋辛(cefuroxine)、氯碳头孢(loracarbef)、头孢尼西(cefonicid)、头孢替坦(cefotetan)、头孢雷特(ceforanide)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、proxetil、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢他啶(ceftazidime)、和头孢吡肟(cefepime)、氨基葡糖苷(aminoglycoside)诸如庆大霉素(gentamycin)、妥布霉素(tobramycin)、阿米卡星(amikacin)、奈替米星(netilmicin)、新霉素(neomycin)、卡那霉素(kanamycin)、链霉素(streptomycin)等、四环素诸如金霉素(chlortetracycline)、土霉素(oxytetracycline)、地美环素(demeclocycline)、美他环素(methacycline)、多西环素(doxycycline)和米诺环素(minocycline)、和大环内酯(macrolides)诸如红霉素、克拉霉素、和阿奇霉素(azithromycin)或其类似物。
术语“抗真菌剂”涉及对真菌物种具有生长抑制或生长约束活性的任何化合物，诸如两性霉素(amphotericin)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、咪康唑(miconazole)、制霉菌素(nystatin)、克霉唑(clotrimazole)、氟康唑(fluconazole)、环吡酮(ciclopirox)、益康唑(econazole)、萘替芬(naftifine)、特比萘芬(terbinafine)、和灰黄霉素(griseofulvin)。
术语“抗病毒剂”涉及任何对病毒物种具有生长抑制或生长约束活性的化合物，诸如阿昔洛韦(aciclovir)、泛昔洛韦(famciclovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、膦甲酸(foscarnet)、碘苷(idoxuridine)、索立夫定(sorivudine)、曲氟尿苷(trifluridine)(三氟吡啶(trifluoropyridine))、伐昔洛韦(valacyclovir)、西多福韦(cidofovir)、去羟肌苷(didanosine)、司他夫定(stavudine)、扎西他滨(zalcitabine)、齐多夫定(zidovudine)、利巴韦林(ribavirin)、和金刚乙胺(rimantatine)。
术语“抗增殖剂”涉及任何限制或约束细胞增殖的化合物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、羟基脲(hydroxyurea)、6-硫鸟嘌呤(thioguanine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、盐酸二氯甲基二乙胺(mechloroethamine hydrochloride)、卡莫司汀(carmustine)、环孢霉素(cyclosporine)、泰素(taxol)、他克莫司(tacrolimus)、长春碱(vinblastine)、氨苯砜(dapsone)、奈多罗米(nedocromil)、色甘酸钠(cromolyn)(色甘酸(cromoglycic acid))、和柳氮磺吡啶(sulfasalazine)。
术语“免疫抑制剂”涉及任何导致免疫系统活性的抑制或阻止的化合物，诸如糖皮质素(glucocorticoid)、细胞抑制药(cytostatics)、对抑免蛋白或TNF结合蛋白起作用的药物。该术语还包括环磷酰胺(cyclophosphamide)、蒽环类抗生素(anthracycline)、丝裂霉素(mitomycin)C、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(mithramycin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、环孢菌素(cyclosporin)、抗IL-2受体抗体、抗OKT3抗体和抗CD3抗体、和TNF-α结合单克隆抗体诸如英夫利昔单抗(infliximab)
Figure BDA0000147641970000361
依那西普(etanercept)
Figure BDA0000147641970000362
或阿达木单抗(adalimumab)
Figure BDA0000147641970000363
术语“止痛剂”涉及用于减轻疼痛的任何化合物，诸如利多卡因(lidocaine)、布比卡因(bupivacaine)、奴佛卡因(novocaine)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、苯佐卡因(benzocaine)、可卡因(cocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、依替卡因(etidocaine)、丙美卡因(proparacaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、和丙胺卡因(prilocaine)。
术语“抗新生物剂”涉及抑制并抗击肿瘤形成的任何化合物，诸如喷司他丁(pentostatin)、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、甲氨蝶呤、博来霉素(bleomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、羟基脲、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、丝裂霉素(mitomycin)、顺铂(cisplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、帕利他塞(paclitaxel)、多西他赛(docetaxe)、秋水仙碱(colchicine)、和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
术语“组胺受体拮抗剂”涉及用来抑制组胺释放或作用的任何化合物，诸如2-甲基组胺、2-吡啶乙胺(pyridylethylamine)、2-噻唑乙胺(thiazolylethylamine)、(R)-a-甲基组胺、英普咪定(impromidine)、dimaprit、4(5)-甲基组胺、苯海拉明(diphenhydramine)、美吡拉敏(pyrilamine)、异丙嗪(promethazine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、氯环力嗪(chlorcyclizine)、特非那定(terfenadine)等。
在本发明的语境中，术语“毒素”指任何能够在与身体组织接触或吸收后，通过与生物学大分子诸如酶或细胞受体相互作用，引起疾病或细胞死亡的分子。该术语包括但不限于肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、热稳定的和热不稳定的大肠杆菌外毒素、霍乱毒素、志贺氏毒素、细胞致死性膨胀毒素、气管细胞毒素、白喉毒素、梭菌毒素、海豚毒素、蟾毒素、莫鲁蝎毒素(maurotoxin)、蝎毒素(agitoxin)、卡律蝎毒素、玛格毒素(margatoxin)、slotoxin、地毯海葵毒素(scyllatoxin)、calciseptine、taicatoxin、和calcicludine。
术语“激素”涉及任何作为信使经由血液将信号从一个细胞(或细胞组)携带至另一个细胞的化合物，诸如前列腺素(prostaglandine)、血清紧张素(serotonine)、组胺、缓激肽、激肽释放酶、和胃肠道激素、释放激素、垂体激素、胰岛素、加压素(ADH)、胰高血糖素(glucagon)、脑啡肽、降钙素(calcitonin)、和皮质类固醇(corticosteroid)。
术语“维生素”涉及任何生物体作为营养物以微小量需求的化合物，诸如维生素A、B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、D、E、或K。
术语“受体分子”涉及在细胞膜上或在胞质或细胞核内结合配体，并且通常转导信号的蛋白质，诸如代谢型受体、G蛋白偶联受体、蕈毒碱性乙酰胆碱受体、腺苷受体、肾上腺素受体、GABA受体、血管紧张肽受体、大麻素受体、缩胆囊素受体、多巴胺受体、胰高血糖素受体、代谢型谷氨酸受体、组胺受体、嗅觉受体(olfactory receptor)、阿片样物质受体、趋化因子受体、钙传感受体(calcium-sensing receptor)、促生长素抑制素受体、血清紧张素受体、胰泌素受体或Fc受体。
术语“细胞因子”涉及这样的可溶性蛋白质和肽，它们充当体液调节物，在正常的或病理学条件下调控各个细胞和组织的功能活性，而且还直接介导细胞间的相互作用，并且调节胞外环境中发生的过程。该术语涵盖由Th1 T辅助细胞生成的1型细胞因子、由Th2 T辅助细胞生成的2型细胞因子、白介素、趋化因子或干扰素，例如IL-1ra(拮抗剂)、CNTF、LIF、OSM、Epo、G-CSF、GH、PRL、IP10、I309、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12(p35+p40)、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17A-F、IL18、IL19、IL20、IL21、IL22、IL23(p19+p40)、IL24、IL25、IL26、IL27(p28-EBI3)、IL28A、IL28B、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35(p35-EBI3)、LT-α、LT-β、light、TWEAK、APRIL、BAFF、TL1A、GITRL、OX40L、CD40L、FASL、CD27L、CD30L、4-1BBL、TRAIL、RANK、GM-CSF、M-CSF、SCF、IL1-α、IL1-β、aFGF、bFGF、int-2、KGF、EGF、TGF-α、TGF-β、TNF-α、TNF-α、β细胞素(betacellulin)，SCDGF，双调蛋白(amphiregulin)或HB-EGF，如本领域技术人员已知的，并且可以源自例如Tato，C.M.和Cua，D.J.(Cell 132：900；Cell 132：500，Cell 132：324，(2008))或Cytokines & Cells Online Pathfinder Encyclopaedia(http://www.copewith-cytokines.de)。“促炎性细胞因子”也在考虑之列。术语“促炎性细胞因子”意指有利于炎症的免疫调节性细胞因子。通常，促炎性细胞因子包括IL-1-α、IL-1-β、IL-6、和TNF-α。这些促炎性细胞因子主要负责早期应答。其它促炎性介导物包括LIF，IFN-γ，IFN-α，OSM，CNTF，TGF-β，GM-CSF，TWEAK，IL-11，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20，IL-8，IL-16，IL-22，IL-23，IL-31和IL-32(Tato，C.M.和Cua，D.J.Cell 132：900；Cell 132：500，Cell 132，324(2008))。这些促炎性细胞因子可以充当内源热原(IL-1，IL-6，TNF-α)，上调巨噬细胞和间充质细胞(包括成纤维细胞、上皮和内皮细胞)两者的次级介导物和促炎性细胞因子的合成，刺激急性期蛋白质合成，或者吸引炎性细胞。优选地，术语“促炎性细胞因子”指TNF-α，IL-15，IFN-γ，IFN-α，IL-1-β，IL-8，IL-16和IL-22。
术语“核酸”指本领域技术人员已知的任何核酸，例如多核苷酸，如DNA、RNA、单链DNA、cDNA、PNA或其衍生物。优选地，该术语指DNA和RNA形成的寡核苷酸和多核苷酸及其类似物，其具有为了与互补靶杂交而设计的选定序列，诸如单链或双链靶物的反义序列，或为了表达由核酸编码的核酸转录物或蛋白质而设计的选定序列。类似物包括带电荷的和优选地不带电荷的骨架类似物，诸如膦酸酯、膦酸甲酯、氨基磷酸酯，优选地N-3’或N-5’，硫代磷酸酯、不带电荷的基于吗啉代的聚合物、和蛋白质核酸(PNA)。此类分子可以在多种多样的治疗方案中使用，包括例如酶替代疗法、基因疗法、和反义疗法。此外，该术语指siRNA、或反义RNA/DNA。含有所有四种天然核碱基的PNA服从Watson-Crick碱基配对规则与互补寡核苷酸杂交，并且就碱基对识别而言是真正的DNA模拟物(Egholm等Nature 365：566-568(1993))。PNA的骨架是通过肽键而不是磷酸酯形成的，使其完全适合于反义应用。
术语“蛋白质”包括任何感兴趣的多肽，包括治疗活性蛋白质、酶、标志物蛋白质等。
在本发明的方法和用途及装置的另一个实施方案中，荧光实体是荧光分析物。这意味着荧光实体是分析物本身，即荧光分析物包含至少一个荧光实体，而无第二实体。
在本发明的一个实施方案中，用所述荧光实体直接标记所述第二实体。术语“直接标记”包括荧光实体和第二实体彼此共价连接。所述共价连接可以在荧光标记物和第二实体间和/或在荧光标记物偶联的间隔物和第二实体间建立。只要第二实体被超过一种荧光标记物直接标记，还设想这些荧光标记物中的一些(或一个)与第二实体共价连接，而其它的则与共价偶联于所述第二实体的间隔物偶联。间隔物已经在本文中别处定义。
用于偶联包括NIR荧光标记物在内的荧光标记物的方法是本领域中公知的。这些标记物与抗体的缀合技术在过去数年期间已经显著成熟，Aslam，M.和Dent，A.，Bioconjugation(1998)216-363，London，及Tijssen，P.，“Practice andtheory of enzyme immunoassays”(1990)，Elsevier，Amsterdam中《Macromolecule conjugation》一章给出了优秀的综述。
合适的偶联化学从上文引用的文献(Aslam，见上文)得知。取决于存在哪种偶联模块，荧光标记物可以在水性或有机介质中与抗体直接起反应。偶联模块是一种用于化学偶联荧光染料标记物与抗体的反应基团或活化基团。可以将荧光染料标记物直接附着于抗体或经由间隔物与抗体连接，以形成包含抗体和NIR荧光标记物的NIR荧光标记物缀合物。可以选择或设计所使用的间隔物，使其具有内在的、长度合适的体内持久性(半衰期)。
在本发明的方法的另一个实施方案中，用所述荧光实体间接标记所述第二实体。术语“间接标记”意指荧光实体和第二实体彼此非共价地连接。“非共价地”包括(a)荧光实体插入第二实体中(诸如插入核酸中的溴化乙锭)；和(b)基于以非共价方式彼此特异性相互作用的两个结合配偶体的任何种类的合适的结合反应，诸如例如抗原-抗原结合；受体-配体结合、基于核酸杂交的结合、凝集素-糖结合、蛋白质-蛋白质结合、蛋白质-核酸结合、生物素-链霉亲合素、DIG-抗DIG抗体等。在此语境下，将荧光实体与一个结合配偶体缀合，而第二实体与所述结合配偶体的特异性对应物偶联，或者第二实体就是所述结合配偶体的所述特异性对应物。例如，可以生成抗体或抗体片段，并使用常规的抗体技术将其与本发明的荧光实体或第二实体偶联(参见例如Folli等，1994，“Antibody-Indocyanin Conjugates for Immunophotodetection ofHuman Squamous Cell Carcinoma in Nude Mice，”Cancer Res.54：2643-2649；Neri等，1997，“Targeting By Affinity-Matured Recombinant Antibody Fragmentsof an Angiogenesis Associated Fibronectin Isoform，”Nature Biotechnology15：1271-1275)。然后，所述抗体或其功能性片段可以结合可已经存在或人工导入荧光分析物的“第二部分”中的特定表位，即只要荧光实体与抗体或其片段偶联，则被抗体或片段特异性结合的表位必须存在或者必须被导入第二实体中。或者反之亦然。类似地，可以生成受体结合性多肽和受体性结合多糖，并使用已知技术来将其与本发明的荧光或第二实体缀合。
间接标记可以在体外或在体内实施。
还设想，同时直接和间接标记所述第二实体。例如，将一种荧光标记物共价附着，而将另一种荧光标记物与抗DIG抗体偶联，所述抗DIG抗体识别第二实体上的DIG标记物。
在本发明的方法的又一个实施方案中，所述荧光实体包含对所述第二实体特异性的至少一个表位结合域。“至少一个”包括1、2、3、4、5或甚至更多个表位结合域，所述表位结合域可以是一个种类(具有相同特异性)或不同种类(具有不同特异性)。特别地，第二实体可以包含至少两种不同表位结合域，其中至少一种对荧光实体是特异性的，而至少一种对靶物是特异性的。在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述第二实体与DIG偶联，而所述荧光实体与抗DIG抗体偶联，或者反之亦然。
有时，存在于本发明的荧光分析物中的荧光实体可能会改变第二实体的期望特性(例如其药动学概况、生物学半衰期等)。因而，可以想要将通过“常规的方法”，例如通过采集血液样品用未标记的第二实体获得的数据，与通过本发明的方法获得的数据进行比较，以便能够调节/校准通过本发明的方法获得的结果。因此，还设想调适/校准或优化本发明的方法和/或装置。此外，设想调适/校准荧光分析物的某些特征(例如其药动学特征，诸如血浆中的稳定性、血浆清除、靶物亲和力、血液中的峰水平(tmax)、血浆半衰期等)。为此，例如可以选择不同荧光标记物、每个荧光分析物的不同量的标记物和/或不同荧光实体(例如以不同间隔物和/或每个分子间隔物的不同量的荧光团为特征)以将荧光分析物的体内特征(例如，其药动学特征)调整为未标记第二实体的特征。由此可见，本发明的方法可以另外包括如下的步骤，即比较通过本发明的方法获得的数据与用未标记的分析物(例如，第二实体)获得的数据以(a)调节荧光分析物的药动学特征；和/或(b)将用经荧光标记的分析物获得的数据与用未标记的分析物(例如第二实体)获得的数据联系起来；和/或(c)优化荧光标记物(定性和定量地，即可以期望选择不同荧光团，和/或选择每个第二实体分子的荧光团分子的不同浓度和/或每个荧光实体间隔物分子的荧光团分子的不同浓度)。“未标记的分析物(例如，第二实体)”意指所述分析物不是荧光标记的，即它可以根本不是标记的，或者它可以用其它非荧光标记物诸如放射性标记物等标记。
在本发明的语境中，“受试者”包括任何包含血液循环系统和至少一只眼的动物。“眼”在此语境中至少包含瞳孔和视网膜，其中所述视网膜有供血。优选地，所述受试者是脊椎动物，更优选是哺乳动物。更优选的是，所述哺乳动物受试者是非人动物、人、猴诸如猕猴、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、马、骆驼、犬、猫、猪、牛、山羊或禽。甚至更优选的是，受试者是小鼠、大鼠、兔和/或人。
非人受试者可以代表特定疾病或病症的模型。还设想，本发明的受试者包含异种移植物，优选地肿瘤。
还设想，本发明的受试者是要接受荧光分析物、荧光实体、荧光标记物、第二实体和/或靶物施用的受试者。或者，本发明的受试者是已经接受本发明的荧光分析物、荧光实体、荧光标记物、第二实体、和/或靶物的受试者(这意味着受试者是已经接受前述实体预投递的受试者)。“预投递”在此方面包括已经在本发明的方法(及所有相关实施方案)前，即在要实施本发明的方法前对受试者投递实体。此外，设想，本发明的受试者是包含本发明的荧光分析物、荧光实体、荧光标记物、第二实体和/或靶物的受试者。
本发明的方法可以进一步包括步骤(c)，该步骤(c)测定来自受试者的其它区域的具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
“来自受试者的其它区域”意指受试者中除了眼或眼的各部分外可能是任何种类的测量感兴趣的进一步限定的或离散的部分或区域。例如，设想，要检测和/或评估荧光分析物的器官分布和/或积累和/或分泌(测定分泌途径)和/或代谢(例如药物代谢物的产生)，这样做会例如帮助确定所述分析物的分泌途径。因此，“其它区域”包含例如受试者的器官的一部分、器官、血管网络或神经细胞系统。还设想将通过本发明的方法获得的数据与上文提及的别的数据联系起来以评估药物的功效(例如：药物是否达到其靶物？)、评估是否有必要再施用药物(例如：药物是否仍存在于靶物？)等等。
在此方面，“器官”包括一种或多种选自下组的器官：消化系统(包括唾液腺、食管、胃、肝、胆囊、胰、肠、直肠和肛门)；内分泌系统(包括内分泌腺诸如下丘脑、垂体或脑垂体、松果体或松果腺、甲状腺、甲状旁腺和肾上腺，即肾上腺)；外皮系统(包括皮肤、毛发和甲)；淋巴系统(包括淋巴系统、淋巴结、扁桃体、腺样、胸腺和脾)；肌肉系统；神经系统(包括脑、脊髓、外周神经和神经)；生殖系统(包括卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺和阴茎)；呼吸系统(包括咽、喉、气管、支气管、肺和横隔膜)；骨骼系统(包括骨、软骨、韧带和腱)；和泌尿系统(包括牵涉流体平衡、电解质平衡和尿液排泄的肾、输尿管、膀胱和尿道)。
心脏、肝、肾、脾、膀胱、肺和脑是优选的；膀胱和/或肝是甚至更优选的。
本发明还涉及本发明的方法，其中在(b)中，用光学检测器接受具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的所述光。
术语“光学检测器”包括能够将光能或其它电磁能转化成可测量的电信号的任何适合的光检测或图像记录系统。光学检测器有时称作光检测器或光传感器。光学检测器可以以电荷耦合装置(CCD)、光电二极管、光电导管、互补金属氧化物半导体(CMOS)、光电倍增管、光敏电阻、光电晶体管、反偏LED，或者以低温检测器为例。CCD和CMOS是优选的。
设想，光学检测器是或者包含成像装置，成像装置任选地可以包含透镜系统和/或照相机。另外还设想，成像装置包括提高检测发射光的灵敏性的特征，诸如图像增强器、大型芯片上显微透镜(on-chip microlenses)(其降低芯片的低效区域)，并改善总体量子效率。或者，可以使用薄型背照射致冷型CCD或具有图像加强器的CCD。生物学组织的靶区域中的荧光团的浓度和量子效率是影响灵敏度的其他因素。一种改善灵敏度的方式是通过开发具有更好的量子效率的荧光团及通过使用淬灭性较低(less-quenching)的荧光团。此外，因为使用具有相隔较开的激发和发射光谱的荧光团，所以任选的带通滤光器的通带可以加宽，以在不提高串扰的同时收集更大百分比的相应荧光光子。所有这些措施是技术人员公知的，并且在例如WO 2005/062987中例示。
成像装置可以进一步包含适用于自光学检测器捕获多个图像的图像捕获处理器。所述多个图像内的每个图像具有各自的曝光时间。图像捕获处理器可以包含适用于动态调节与多个图像内的每个图像有关的相应曝光时间的曝光处理器。成像系统可以进一步包含显示和储存手段，例如与图像捕获处理器偶联的、适用于接收及储存多个图像、并适用于接收及储存相应曝光时间的存储器。
成像装置可以进一步包含图像处理软件以便生成计算图像。例如，实时或近实时图像流显示为叠加、伪彩色图像、差减图像(subtraction image)、或分割图像。可以使用其它数学功能来加工图像，包括噪音过滤技术、比率成像、阈值检测和/或先验概率分析以便于检测生物学信息。
任选地，可以在本发明的语境中使用的光学检测器可以(i)包含预定的或可调的滤光器(硬件滤光器)，其优选地在所述检测器上游，和/或(ii)可以分开(软件滤光器)本发明方法的步骤(a)中(即在将激发光引导到如本文中所描述的划定区的步骤中)使用的激发光的预定波长。
光学滤光器选择性透射具有某些特性(往往是特定范围的波长)的光，而阻断其余的光。所述特性在预定的滤光器中是固定的，而在可调滤光器中是可变的。可以例如通过入射束的入射角的变化来调整光学成像系统中传播和/或反射的波长带。此入射角的选择可实现传播的光谱带和反射的光谱带的微调。
优选地，所述预定的或可调的滤光器“在所述检测器上游”，即它设置在光学检测器和受试者之间的某处。
还设想，与硬件滤光器联合或者替代硬件滤光器使用“软件滤光器”。软件滤光器容许分开激发光的预定波长，由此有可能扣除激发光的波长。
优选的是，所述滤光器(硬件)特异性排除本发明方法的步骤(a)中所使用的激发光的预定波长。
此外，本发明涉及如下的方法，其中步骤(b)以如下的步骤为特征，即接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，专门测定通过所述受试者的眼发射的光量，由此：
(i)测定所述荧光分析物的存在；
(ii)定量所述荧光分析物的血液水平；或
(iii)监测或测定所述荧光分析物的血液清除。
在又一个实施方案中，本发明涉及如本文中所公开的方法，其中激发手段的光轴和光学检测器的光轴彼此平行和/或相互成一定的角度排布；所述激发手段用于将至少一种预定波长的激发光引导到包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区上以激发荧光分析物，所述光学检测器用于接收具有与所述预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。所述排布可以是固定的或可调节的。还设想，激发手段和/或光学检测器可移动。由此，“激发手段”包括提供激发光的光源(和任选的滤光器)。
本发明的方法进一步涵盖如下的实施方案，其中激发光的光轴与发射光的光轴完全相同，不相同，或仅部分相同。如此，还设想，激发光的光轴与发射光的光轴成一定角度。
本发明还涵盖如下的方法，其中激发手段和光学检测器是空间上分开的或统一的(单元)，所述激发手段用于将至少一种预定波长的激发光引导到包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区上以激发荧光分析物，所述光学检测器用于接收具有与所述预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
以下非限制性的技术领域列表例示了本发明的广泛适用性。本发明的方法和/或装置可以用于：
(a)测定受试者血液中的分析物的存在；
(b)测定受试者血液中的分析物的生物学半衰期(t1/2)；
(c)定量受试者血液中的分析物的血液水平；
(d)监测或测定受试者血液中的分析物的血液清除；
(e)测定受试者血液中的分析物的血清峰水平(tmax)；
(f)测定受试者血液中的分析物的理论浓度；
(g)评估受试者血液中的饱和动力学，由此例如测定结合例如肿瘤的抗体量；
(h)测定受试者血液中的药物或诊断组合物的溶解动力学；
(i)评估受试者血液中的分析物的消除动力学和/或途径；
(j)评估受试者血液中的分析物的药动学；
(k)测定受试者血液中的分析物的生物利用度。生物利用度是达到受试者系统循环的分析物的施用剂量的百分比或分数。可以改变生物利用度的因素的例子包括所施用药物(例如，盐、酯)的固有溶解和吸收特征、剂量形式(例如片剂、胶囊)、施用路径、活性成分在胃肠道中的稳定性、和达到系统循环前药物代谢的程度等。
在本文中别处例示了本发明的方法/装置的其它应用。术语“分析物”在此语境中等同本文中所描述的荧光分析物、第二实体、靶物等。
本发明还设想本发明方法中使用的如本文中所限定的荧光分析物或荧光标记物。
此外，本发明涉及如本文中所限定的荧光分析物或荧光标记物用于制备优选地要在本发明方法中采用的药物和/或诊断组合物的用途。
“药物或诊断组合物”可以包含本发明的荧光分析物、第二实体、荧光标记物、靶物等和任选地药物或诊断可接受的载体和/或稀释剂。
合适的载体和/或稀释剂的例子是本领域中公知的，包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂，诸如油/水乳剂、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。可以通过公知的常规方法来配制包含此类载体的组合物。
在一个优选的实施方案中，所述装置包含：
(a)激发手段，其用于将至少一种预定波长的激发光引导到包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区上以激发荧光分析物；和
(b)光学检测器，其用于专门接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
在一个备选的实施方案中，所述装置包含：
(a)激发手段，其用于将至少一种预定波长的激发光专门引导到包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区上以激发荧光分析物；和
(b)光学检测器，其用于接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
本发明还涉及如下的装置，其包含：
(a)激发手段，其用于将至少一种预定波长的激发光专门引导到包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区上以激发荧光分析物；和
(b)光学检测器，其用于专门接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
本发明进一步涉及如下的装置，其包含：
(a)激发手段，其用于将至少一种预定波长的激发光引导到包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区上以激发荧光分析物；和
(b)光学检测器，其用于接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光；和
(c)专门测定通过所述受试者的眼发射的光的量的手段。
在本发明的装置的一个优选的实施方案中，所述光学检测器包含连接在所述检测器上游的预定的或可调的滤光器。优选地，所述滤光器排除激发光的至少一种预定波长。
在本发明的装置的又一个优选的实施方案中，所述光学检测器分开(a)中使用的激发光的预定波长。
还设想，所述激发手段的光轴和所述光学检测器的光轴彼此平行和/或相互成一定的角度排布，所述光学检测器用于接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
在本发明装置的又一个实施方案中，所述激发手段和所述光学检测器是空间上分开的或统一的(即，它们形成一个单元)。还设想所述激发手段和/或所述光学检测器是可移动的。
任选地，本发明的装置可以包含用于测定下列各项的手段：
(i)眼的瞳孔的位置；和/或
(ii)步骤(a)中的所述瞳孔的一部分的面积和/或步骤(b)中的所述眼的瞳孔的面积。
设想，本发明的装置是或包含眼镜。
优选的是，本发明的装置本身与受试者眼的角膜没有直接接触。特别优选的是，本发明的装置不以接触镜形成。
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本公开内容结合附图(通过提及而将其收入本文)可以得到最好的理解。此外，从以下实施例看会更好地理解本发明及其许多优点，所述实施例作为例示给出，而并不意图为限制性的。
附图简述
图显示了：
图1例示通过插值测定tmax和t1/2可以影响这些数值的精确性的理论性例子。
图2例示通过插值测定tmax和t1/2可以影响这些数值的精确性的理论性例子。
图3光学成像设备
本发明的光学成像设备的代表性例子。将麻醉小鼠在成像室(1)中放置，注射经标记的药物，并用某个波长的光(2)照明。光自所检查的物体(3)中的荧光团向后发射，通过发射滤光器(4)，之后被CCD照相机(5)检测。根据选定的波长，所得的图像在PC上以灰度(6)或假彩色图像显示，并且可以进一步加工(7)。
图4监测小鼠眼中的ICG的荧光强度。
将接受吸入麻醉的雌性BALB/c裸鼠放入成像室中，并i.v.注射ICG(20μg/200μl)。在注射ICG前10秒时开始测量荧光信号强度。在一段8分钟的时间里以500ms的采集时间内每秒记录感兴趣区域中的图像。用范围为671至705nm的波长的光激发ICG，并以820nm检测发射。然后，计算来自这些区域的荧光强度，并作为时间的函数绘图。
图5无数据插值的tmax和t1/2的易化计算
图6监测不同小鼠器官中的ICG的荧光强度
测量Calu3异种移植物中的荧光信号强度，如前文所描述的。
使用受试者的解剖照片对眼、肝、肾、脑和皮下生长的肿瘤鉴定ROI。然后，计算来自这些区域的荧光强度，并作为时间的函数绘图。
图7监测整只小鼠中的帕米膦酸盐的荧光强度
将经荧光标记的二膦酸盐(OsteoSense；VisenMedical，Woburn，USA)i.v.注射(200μl PBS中的2nMol)，并在4.4小时的时段里记录荧光信号强度(获取时间：3000ms；激发波长：615至665nm；发射波长：780nm)。计算眼中的荧光强度，并作为时间的函数绘图。
图8没有数据插值的tmax和t1/2的易化计算
图9靶器官中的帕米膦酸盐积累的确认
给小鼠i.v.注射2mmol OsteoSense750，并在此后48小时测量NIRF。
图10抗受体酪氨酸激酶抗体的常规PK测量
图11监测小鼠眼中的经标记的抗RTK抗体的荧光强度。
将经Cy5标记的针对受体酪氨酸激酶的单抗i.v.注射(2.5mg/kg)，并在3小时的时段里记录荧光信号强度(采取时间：500ms；激发波长：615至665nm；发射波长：720nm)。计算眼中的荧光强度，并作为时间的函数绘图。
实施例
以下实施例例示了本发明。这些实施例不应解释为限制本发明的范围。出于例示的目的而包括实施例，并且本发明仅受限于权利要求书。
我们提出一种如下的方法，其容许连续监测血浆/血清中的药物水平，并在至少4小时的时段里在一只小鼠中同时测量器官分布。我们通过评估3种不同化合物来证明此方法的效用：
1.吲哚花青绿：荧光染料
2.帕米膦酸盐：经荧光标记的二膦酸盐
3.用Cy5标记的针对受体酪氨酸激酶的单克隆抗体
实施例1：用吲哚花青绿(ICG)的可行性研究
我们首先评估了通过使用吲哚花青绿(ICG)，即一种荧光染料来评估此新方法的技术可行性。在i.v.注射入小鼠中时，ICG在约2至4分钟中自循环清除(1，2)，并在肝中积累(3)。
材料和方法
雌性BALB/c裸鼠接受吸入麻醉，在成像室(图3)中放置，并i.v.注射一剂20μg/200μl。在i.v.注射ICG前10秒开始眼中的荧光信号强度测量，并在一段8分钟的时间里以500ms的获取时间每秒记录图像。用范围为671至705nm的波长的光激发ICG，并以820nm检测发射。
结果
将眼区中荧光信号强度的最高数值标准化为100，图4，5中所描绘的数据表明在2分钟时达到tmax，而荧光强度的半衰期为6.6分钟。在第二个实验中，给具有s.c.生长肿瘤(Calu3)的BALB/c裸鼠i.v.注射ICG，并监测眼、肝、肾、脑和肿瘤区中的信号强度。在此实验中，tmax是1.2分钟。此后信号强度下降(t1/2＝5.4分钟)，并观察到肝中的积累在3.8分钟时达到平台(图6)。这些结果与发表的数据一致。
实施例2：用帕米膦酸盐(一种经荧光标记的二膦酸盐)的可行性研究
在成功完成实施例1中所显示的可行性研究后，我们评估经荧光标记的二膦酸盐(帕米膦酸盐)。二膦酸盐(例如帕米膦酸盐；MW 279)临床上可用于治疗骨病症。帕米膦酸盐(在i.v.注射后)具有范围为20至30分钟的血清半衰期，在所检查的所有组织中骨(胫骨)含有的浓度最高。Pongchaidecha M等Clearance and tissue uptake following 4-hour and 24-hour infusions ofpamidronate in rats.Drug Metab Dispos 1993；21(1)：100-104Daley-Yates等Acomparison of the pharmacokinetics of 14C-labelled ADP and 99mTc-labelledADP in the mouse.Calcif Tissue Int 1988；43：125-127。我们使用经荧光标记的帕米膦酸盐来计算tmax和t1/2血浆水平，这通过测量小鼠眼中的荧光强度和全身成像以监测所描述的动力学来进行。在i.v.注射后，帕米膦酸盐具有范围为20至30分钟的血清半衰期，并且在所检查的所有组织中骨(胫骨)含有的浓度最高(4，5)。i.v.注射OsteoSense(200μl PBS中的2nMol)，并且记录荧光信号强度(获取时间：3000ms；激发波长：615至665nm；发射波长：780nm)。血清t1/2是34分钟(图7，8)，并且此后4.4小时和48小时时明显表明脊柱和后肢中的积累(图9)。这两个观察结果与发表的数据相关联。
实施例3：用未标记的和经Cy5标记的靶向受体酪氨酸激酶的单克隆抗体的可行性研究
最后，比较未标记的和经Cy5标记的靶向受体酪氨酸激酶的单克隆抗体的t1/2。常规测量揭示在一剂5mg/k i.v.时t1/2为7.7小时(图10)。使用光学成像，在一剂2.5mg/kg i.v.时，t1/2是3.05小时(图11)。
讨论
这些结果表明tmax和t1/2可以通过简单测量麻醉动物的眼中的荧光信号强度来容易地实施。相对于常规技术，此新方法改善PK研究的性能，因为药物的定量和数据插值不是必要的。此外，小鼠数目显著减少，并且不需要处死小鼠。可以时间分辨地、在线地获得关于来自不同器官的药物积累和t1/2值的信息。
综合考虑，此规程容许一只动物中的多次测量(改善tmax和t1/2的精确性)。与常规方法相比，显著缩短了运行时间，防止血液样品的混淆，并且非放射性材料的使用容许在没有放射化学所需的预防措施的情况下通过常规实验室方法进一步分析。除了tmax和t1/2外，还可以追踪器官分布。这样的同时测量方便了关于与血清中的t1/2相比在所讨论的器官中的积累的信息(例如血脑屏障渗透的指标)。可以用不同有机荧光染料容易地标记药物(低分子量物质、肽、蛋白质、抗体和siRNA)。然而，在用经标记的药物实施此类体内研究前，功能测定必须证明与未标记的药物相比不存在差异。
关于铁调素调节蛋白(Hemojuvelin)，体外研究确认了未标记的和经Cy5标记的铁调素调节蛋白在其阻断BMP-2诱导的铁调素(Hepcidin)mRNA在HepG2细胞中的上调的能力上没有差异。还有，Biacore数据揭示与未标记的赫赛汀相比，经Cy5标记的赫赛汀具有相同的结合特征，并且结合表达Her2的肿瘤细胞。经标记的靶向受体酪氨酸激酶的抗体仍导致受体的内在化。
因为不处死动物，可以多次给予相同的和/或其他的药物(用与第一种荧光染料具有不同发射光谱的荧光染料标记)以得到关于药物-药物相互作用的信息。此外，可以在正常小鼠和基因工程小鼠(例如FcRn敲除或hu FcRn转基因鼠)中评估i.v.、i.p.、口服、吸入、鼻和皮肤应用后的新设计的药物制剂和药物剂量的优化。
成像方法的非凡进展使得对药物和药物投递系统在体内的表现的可视化成为可能。关于药物定位和浓度的详细且定量的信息可以作为时间函数获得，由此对生物学效应实现更深刻的了解。此信息对于优化药物的设计是至关重要的。
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本发明的其它项是：
1.一种在受试者中监测或测定包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的血液清除的非侵入性方法，包括下列步骤：
(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，
(b)通过所述受试者的眼，接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，由此监测或测定所述荧光分析物的血液清除。
2.一种在受试者中定量包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的血液水平的非侵入性方法，包括下列步骤：
(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，
(b)通过所述受试者的眼，接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，由此定量荧光分析物的血液水平。
3.一种在受试者的血液中测定包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的存在的非侵入性方法，包括下列步骤或由下列步骤组成：
(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，
(b)通过所述受试者的眼，接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，藉此测定所述受试者的血液中所述荧光分析物的存在。
4.项1或2中任一项的方法，其中将步骤(b)中接受的所述光与参照值比较，由此：
(i)定量所述荧光分析物的血液水平；或
(ii)测定所述荧光分析物的血液清除。
5.项1至4中任一项的方法，其中所述第二实体包含诊断和/或治疗剂。
6.前述项中任一项的方法，其中所述第二实体包含至少一个对靶物特异性的表位结合域。
7.项6的方法，其中一旦所述第二实体的表位结合域已经结合其靶物，则激活所述荧光实体中包含的荧光标记物。
8.项6的方法，其中所述靶物是或包括抗体或其功能性片段、蛋白质、肽、酶、核酸例如siRNA、多糖、脂质、受体、受体配体、病原体、病毒、细菌、细胞、细胞靶物、肿瘤抗原和/或药物。
9.前述项中任一项的方法，其中所述第二实体用所述荧光实体直接标记。
10.前述项中任一项的方法，其中所述第二实体用所述荧光实体间接标记。
11.项10的方法，其中所述荧光实体包含对所述第二实体特异性的表位结合域。
12.前述项中任一项的方法，其中所述荧光实体可激活。
13.项10至12中任一项的方法，其中所述荧光实体一旦已经结合所述第二实体便被激活。
14.项13的方法，其中所述荧光实体要在所述受试者中被激活。
15.项14的方法，其中所述激活在步骤(b)之前。
16.项1至4中任一项的方法，其中所述荧光分析物是所述荧光实体。
17.前述项中任一项的方法，其中所述荧光分析物要对所述受试者施用。
18.项11的方法，其中所述荧光实体要对所述受试者施用。
19.项8的方法，其中所述靶物要对所述受试者施用。
20.项17至19中任一项的方法，其中所述荧光分析物、所述荧光实体和/或所述靶物的所述施用先于步骤(b)。
21.前述项中任一项的方法，其中步骤(b)以如下的步骤为特征，即接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，专门测定通过所述受试者眼发射的光的量，由此：
(i)测定所述荧光分析物的存在；
(ii)定量所述荧光分析物的血液水平；或
(iii)监测或测定所述荧光分析物的血液清除。
22.前述项中任一项的方法，其中通过所述受试者的眼专门接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的所述光。
23.前述项中任一项的方法，其中在(a)中，将至少一种预定波长的所述激发光专门引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上。
24.前述项中任一项的方法，其进一步包括步骤(c)，该步骤(c)自所述受试者的其它区域测定具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
25.项24的方法，其中所述其它区域至少包含器官、淋巴结、血管网络或神经细胞系统的一部分。
26.项25的方法，其中所述器官选自下组：心脏、肝、肾、脾、膀胱、肺和脑，膀胱和/或肝是优选的。
27.前述项中任一项的方法，其中所述受试者是动物，优选地是人。
28.前述项中任一项的方法，其中在(b)中，用光学检测器接受具有与(a)的所述预定波长可区别的波长的所述光。
29.项28的方法，其中所述光学检测器：
(i)包含所述检测器上游的预定的或可调的滤光器，和/或
(ii)分开(a)中使用的所述激发光的预定波长。
30.项29的方法，其中所述滤光器滤去用于(a)的所述激发光的预定波长。
31.前述项中任一项的方法，其中用于将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上以激发所述荧光分析物的激发手段的光轴，与用于接收具有与所述预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光的光学检测器的光轴相互成一定的角度排布。
32.前述项中任一项的方法，其中用于将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上以激发所述荧光分析物的激发手段，与用于接收具有与所述预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光的光学检测器在空间上是分开的。
33.前述项中任一项的方法，其中所述光学检测器是或包含光电二极管、光电导管、电荷耦合装置(CCD)、或互补金属氧化物半导体(CMOS)。
34.前述项中任一项的方法，其用于在受试者的血液中测定下列各项的存在、定量下列各项的血液水平、监测或测定下列各项的血液清除：药物、抗体或其功能性片段、蛋白质、肽、酶、核酸例如siRNA、多糖、脂质、受体、受体配体、病原体、病毒、细菌、细胞、细胞靶物、和/或肿瘤抗原，用于测定药物或诊断组合物的溶解动力学，和/或用于评估物质的消除途径。
35.前述项中任一项的方法，其中步骤(a)和/或(b)进一步包括测定眼的瞳孔的位置。
36.前述项中任一项的方法，进一步包括：
(i)测定步骤(a)中所述瞳孔的所述部分的面积，和/或
(ii)测定步骤(b)中所述眼的瞳孔的面积。
37.如前述项中任一项中限定的荧光标记物，其选自下组：量子点剂、荧光染料、pH-敏感性荧光染料、电压敏感性荧光染料、和经荧光标记的微球。
38.如前述项中任一项中限定的荧光分析物或荧光标记物，供任一前述方法中使用。
39.如前述项中任一项中限定的荧光分析物或荧光标记物用于制备要在前述方法中任一种中使用的诊断组合物的用途。
40.供前述项中限定的任何方法中使用的装置。
41.在上文所限定的方法中任一种中使用的装置，其包含：
(a)激发手段，其用于将至少一种预定波长的激发光引导到包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区上以激发荧光分析物；和
(b)光学检测器，其用于专门接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
42.在上文所限定的方法中任一种中使用的装置，其包含：
(a)激发手段，其用于将至少一种预定波长的激发光专门引导到包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区上以激发荧光分析物；和
(b)光学检测器，其用于接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
43.在上文所限定的方法中任一种中使用的装置，其包含：
(a)激发手段，其用于将至少一种预定波长的激发光专门引导到包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区上以激发荧光分析物；和
(b)光学检测器，其用于专门接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
44.供上文所限定的任一方法中使用的装置，其包含：
(a)激发手段，其用于将至少一种预定波长的激发光引导到包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区上以激发荧光分析物；和
(b)光学检测器，其用于接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光；和
(c)专门测定通过所述受试者的眼发射的光的量的手段。
45.项41至44中任一项的装置，其中所述光学检测器包含连接在所述检测器上游的预定的或可调的滤光器。
46.项41至45中任一项的装置，其中所述光学检测器分开(a)中使用的激发光的预定波长。
47.项45的装置，其中所述滤光器排除(a)中使用的激发光的至少一种预定波长。
48.项41至47中任一项的装置，所述激发手段的光轴与用于接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光的所述光学检测器的光轴相互成一定的角度排布。
49.前述项中任一项的装置，其中所述激发手段和所述光学检测器是空间上分开的。
50.项49的装置，其中所述激发手段和/或所述光学检测器是可移动的。
51.前述项中任一项的装置，其进一步包含测定下列各项的手段：
(i)眼的瞳孔位置；和/或
(ii)步骤(a)中的所述瞳孔的一部分的面积和/或步骤(b)中的所述眼的瞳孔的面积。
52.前述项中任一项的装置，本发明的装置是或包含眼镜。

Claims (16)

1.一种在受试者中监测或测定包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的血液清除的非侵入性方法，包括下列步骤：
(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，
(b)通过所述受试者的眼接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，由此监测或测定所述荧光分析物的血液清除。
2.一种在受试者中定量包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的血液水平的非侵入性方法，包括下列步骤：
(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，
(b)通过所述受试者的眼接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，由此定量荧光分析物的血液水平。
3.一种在受试者的血液中测定包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的存在的非侵入性方法，包括下列步骤或由下列步骤组成：
(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，
(b)通过所述受试者的眼接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，由此测定所述受试者的血液中所述荧光分析物的存在。
4.权利要求1或2中任一项的方法，其中将步骤(b)中接收的所述光与参照值比较，由此：
(i)定量所述荧光分析物的血液水平；或
(ii)测定所述荧光分析物的血液清除。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述第二实体包含诊断和/或治疗剂。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二实体包含至少一个对靶物特异性的表位结合域。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)以如下的步骤为特征：接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，专门测定通过所述受试者的眼发射的光的量，由此：
(i)测定所述荧光分析物的存在；
(ii)定量所述荧光分析物的血液水平；或
(iii)监测或测定所述荧光分析物的血液清除。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中通过所述受试者的眼专门接收所述具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中在(a)中，将所述至少一种预定波长的激发光专门引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上。
10.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括步骤(c)，该步骤(c)测定来自所述受试者的其它区域的具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中，所述被引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上以激发所述荧光分析物的至少一种预定波长的激发光的光轴，与所述具有与所述预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光的光轴相互成一定的角度排布。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中，用于将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上以激发所述荧光分析物的激发手段，与用于接收具有与所述预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光的光学检测器是在空间上分开的。
13.前述权利要求中任一项的方法，其用于在受试者的血液中测定药物、抗体或其功能性片段、蛋白质、肽、酶、核酸例如siRNA、多糖、脂质、受体、受体配体、病原体、病毒、细菌、细胞、细胞靶物、和/或肿瘤抗原的存在；定量药物、抗体或其功能性片段、蛋白质、肽、酶、核酸例如siRNA、多糖、脂质、受体、受体配体、病原体、病毒、细菌、细胞、细胞靶物、和/或肿瘤抗原的血液水平；监测或测定药物、抗体或其功能性片段、蛋白质、肽、酶、核酸例如siRNA、多糖、脂质、受体、受体配体、病原体、病毒、细菌、细胞、细胞靶物、和/或肿瘤抗原的血液清除，用于测定药物或诊断组合物的溶解动力学，和/或用于评估物质的消除途径。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中在(b)中，用光学检测器接收所述具有与(a)的所述预定波长可区别的波长的光。
15.权利要求14的方法，其中所述光学检测器：
(i)包含所述检测器上游的预定的或可调的滤光器，和/或
(ii)分开(a)中使用的所述激发光的预定波长。
16.权利要求15的方法，其中所述滤光器排除(a)中使用的所述激发光的预定波长。
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