CN113030051B - 一种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法及其应用，涉及生物医学诊断分析方法技术领域，该均相双荧光分析方法包括基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号，金属离子有效改变QDs的荧光信号和NMM的荧光信号，并基于QDs的荧光信号和NMM的荧光信号定量单一目标物，目标物为β‑Gal或者E.Coli。本发明可用于β‑Gal和E.Coli的高灵敏、简单、均相和低成本双荧光分析中，即定量β‑Gal和E.Coli，为β‑Gal和E.Coli的分析检测提供更多选择。

Description

一种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学诊断分析方法技术领域，尤其是涉及一种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法及其应用。
背景技术
现有生物化学和医学诊断体系中，主要是依靠单个信号分子的信号强度实现对单一目标物的定量分析。如基于免疫识别反应的酶联免疫吸附分析(ELISA)使用紫外可见分光光度计监测紫外信号、电化学发光分析方法监测三吡啶钌等的电化学信号、荧光分析方法监测荧光染料的荧光信号(如FITC、FAM等)等。
再比如，β-Gal和E.Coli的检测方法上，其β-Gal分析检测方法已有多种报道，然而使用双荧光信号的分析方法极少，对于E.Coli的检测现有临床是利用培养和计数的方法实现细菌的定量，其耗时、灵敏度低、成本高。
目前的β-Gal和E.Coli的检测方法具有以下不足：1.多数为单个信号读取，其准确性易受介质等影响；2.一般无信号放大技术参与的分析方法，分析灵敏度低，信号放大引入时提高了分析灵敏度，同时大大增加成本；3.耗时，操作繁琐，非均相分析方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法，以解决现有技术中依靠单个信号分子实现β-Gal和E.Coli的检测，准确性易受介质等影响，导致分析灵敏度低的技术问题。
本发明的目的之二在于提供一种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法的应用。
为了实现上述目的之一，本发明提供了一种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法，所述方法包括基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号，所述金属离子有效改变QDs的荧光信号和NMM的荧光信号，并基于QDs的荧光信号和NMM的荧光信号定量单一目标物，所述目标物为β-Gal或者E.Coli。
所述NMM为N-甲基卟啉二丙酸。
根据一种优选实施方式，变价或者易于水解的所述金属离子可有效抑制NMM的荧光信号。
根据一种优选实施方式，相同元素的不同价态所述金属离子对NMM的荧光信号抑制作用具有显著差异。
根据一种优选实施方式，所述金属离子为Cu2+和Cu+，所述QDs和所述NMM选择性识别Cu2+和Cu+，所述Cu+对所述QDs荧光信号和所述NMM荧光信号的抑制作用大于所述Cu2+。
根据一种优选实施方式，所述金属离子为Fe3+和Fe2+，所述QDs和所述NMM选择性识别Fe3+和Fe2+，所述Fe3+对所述QDs荧光信号和所述NMM荧光信号的抑制作用大于所述Fe2+。
根据一种优选实施方式，所述NMM和所述QDs的激发波长为399nm，所述NMM和所述QDs的荧光信号监测范围均为400-700nm。
根据一种优选实施方式，所述QDs包括CdTe QDs或者CdSe QDs。
为了实现上述目的之二，本发明提供了一种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法的应用，所述应用包括将上述任一所述的基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法应用于β-Gal的分析或者E.Coli的分析，以定量所述β-Gal和所述E.Coli，所述E.Coli裂解释放所述β-Gal。
所述β-Gal为β-糖苷酶，所述E.Coli为大肠杆菌。
根据一种优选实施方式，所述β-Gal水解底物生成还原性物质，所述还原性物质还原所述金属离子，生成的所述金属离子可被所述NMM和所述QDs竞争识别，进而同时改变所述NMM和所述QDs的荧光信号。
根据一种优选实施方式，所述应用还包括结合不同生物反应、信号分子以及检测器实现不同分析目标物的分析。
本发明提供的一种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法及其应用，具有以下技术效果：
该种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法，是基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号，金属离子可有效改变QDs的荧光信号和NMM的荧光信号，在基于QDs的荧光信号和NMM的荧光信号定量单一目标物，本发明可用于β-Gal和E.Coli的高灵敏、简单、均相和低成本双荧光分析中，即定量β-Gal和E.Coli，为β-Gal和E.Coli的分析检测提供更多选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是基于选择性识别反应的β-Gal和大肠杆菌的均相双荧光信号分析原理图；
图2是在不同条件下，Cu2+、Cu+、Fe3+和Fe2+对NMM荧光信号的抑制现象；
图3是相同条件下，除Cu2+、Cu+、Fe3+和Fe2+外的金属离子NMM荧光信号的抑制现象；
图4是QDs材料表征和β-Gal分析可行性；
图5是β-Gal分析条件优化；
图6是β-Gal分析性能；
图7是E.Coli分析性能。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
原理如下：
图1.基于选择性识别反应的β-Gal和大肠杆菌的均相双荧光信号分析。(A)NMM和QDs选择性识别Cu2+和Cu+。(B)β-Gal和大肠杆菌的均相双荧光信号分析示意图。
如图1A所示，金属离子对NMM和QDs荧光信号的选择性识别现象，即大多数金属离子可有效抑制NMM的荧光信号，且相同元素的不同价态金属离子对NMM的荧光信号抑制具有显著差异。
本发明选择其中的Cu2+和Cu+作为桥梁，利用其可被NMM和QDs有效识别，构建一种双荧光信号分析方法。以β-Gal和E.Coli为目标物，利用β-Gal可以水解底物生成还原性的对氨基酚(PAP)，其后PAP还原Cu2+为Cu+，生成的Cu+可被NMM和QDs竞争识别，进而同时改变NMM和QDs的荧光信号。因此，通过检测体系内NMM和QDs荧光信号的改变可实现多目标β-Gal和E.Coli的定量，如图1B所示。
下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体验证。
1.不同条件下金属离子对NMM荧光信号的抑制
如图2所示，首先对比了Cu2+、Cu+、Fe3+和Fe2+对NMM荧光信号的抑制现象。
在将以上四种金属离子直接加入至NMM中时，在10μM以上浓度时，其均可抑制NMM荧光信号。
其中Cu+的抑制作用优于Cu2+，Fe3+优于Fe2+。此外，低至nM水平的Cu+对NMM的抑制作用也是很明显的，如图2A、2D、2G和2J所示。
鉴于已有多篇文献报道NMM可与G四链体DNA结构配位耦合，进而有效增强NMM的荧光信号。随后，对比了在K+存在与否时，金属离子对G四链体DNA-NMM复合物的荧光信号的影响。如图2所示，以上金属离子对G四链体DNA-NMM复合物的荧光信号依然有抑制作用，且其依然保持着Cu+的抑制作用优于Cu2+，Fe3+优于Fe2+的现象。
在探讨了以上Cu2+、Cu+、Fe3+和Fe2+对NMM荧光信号的抑制现象之后，对其它金属离子是否可抑制NMM信号进行了调查。如图3所示，大多数金属离子对NMM的荧光信号具有抑制作用，且具有变价或者易于水解的离子抑制作用突出，如Mn2+、MnO4-、Cr2O7 2-和Al3+等，而对于Na+、K+、Mg2+等金属离子未发现对NMM的抑制作用。
结论：在对以上现象进行了探讨之后，可发现在对NMM荧光信号抑制作用上，Cu2+和Cu+，Fe3+和Fe2+间具有显著的区别，其可作为潜在的生物分析和临床医学诊断技术的桥梁。同时结合我们前期发现的QDs可有效区分Cu2+和Cu+的显著，可为双荧光信号分析方法的建立奠定基础。
2.CdTe QDs的合成
CdTe QDs是根据一锅法合成的：
首先，将0.5mmol CdCl2和0.20g的柠檬酸三钠溶解在50毫升的水中，向以上溶液中加入52μL巯基丙酸(MPA)，使用NaOH溶液，将以上混合物溶液pH调节至10.5。
然后，将0.1mmol Na2TeO3和50mg KBH4加入以上溶液中，回流1小时，至溶液呈黄绿色，在紫外灯下呈现出强烈的绿色荧光。
最后，通过沉淀(使用正丙醇)和离心(11000rpm，30分钟)纯化CdTe QDs溶液。以上合成的MPA-CdTe QDs在使用前保存在4℃。
3.β-Gal和E.Coli分析步骤
3.1 NMM为信号分子时
向离心管中依次加入100μLTris-HCl缓冲液(pH＝7.4,10mM，50mM NaCl，5mMMgCl2)，50μLPAPG(14mM)和50μL不同浓度β-Gal(或者不同浓度细菌的裂解液)，于37℃下孵育0.5h完成水解反应。
随后冷却至室温，向离心管加入20μL CuCl2(120μM)，室温继续孵育20min使铜离子被还原。
然后，加入1.8μL NMM(50μM)溶液，室温下反应2min。
最后，将以上溶液转移至比色皿中，使用荧光仪测试并记录数据(激发波长：399nm，发射波长范围：480-650nm)。
3.2 QDs为信号分子时
向离心管中依次加入100μL Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4，10mM，50mM NaCl，5mMMgCl2)，50μL PAPG(14mM)和50μL不同浓度β-Gal(或者不同浓度细菌的裂解液)，于37℃下孵育0.5h完成水解反应。
随后，冷却至室温，向离心管加入20μL CuCl2溶液(120μM)，室温下继续孵育20min使Cu2+被还原。向以上离心管中加入8.2μL QDs(原液稀释十倍)，室温下反应2min。
最后，将以上溶液转移至比色皿中，使用荧光仪测试并记录数据(激发波长：365nm，发射波长范围：450-600nm)。
3.3 NMM和QDs双荧光信号时
其与以上单个信号分子时相似，只是QDs和NMM提前混合后，同时加入至反应溶液中，最后在399nm波长激发下，同时监测450-650nm范围内的荧光信号。
4.QDs材料表征和β-Gal分析可行性
在成功合成QDs后(如图4A和4D所示为QDs的TEM和紫外可见吸收峰形图)，首先对发明人前期研究的QDs选择性识别Cu2+和Cu+的现象进行了验证，如图4A-C，TEM图像表明Cu+对QDs的团聚现象强于Cu2+，即其发生了阳离子交换反应，生成了CuTe。
随后，通过荧光实验对NMM和QDs选择性识别Cu2+和Cu+的现象进行了验证。如图4E-H，直接对比Cu2+和Cu+，和通过抗坏血酸还原Cu2+生成Cu+时，其均具有选择性识别的特性。
其后对该β-Gal的双荧光信号分析策略的可行性进行了调查。
如图4J和4K，分别以QDs和NMM为信号分子时，其对β-Gal的定量分析均是可行的，且可以实现1U/L浓度级别的检测。
在探讨双荧光信号分析之前，先对激发波长进行了选择，如图4I所示，在365和399nm激发下，QDs和NMM均发射出了其特征峰形，然而考虑到399nm激发时，NMM和QDs的信号强度均高，故在后期实验中选择399nm为激发波长。将两个信号分子混合，改变β-Gal浓度时，随时浓度增加，两个信号分子的信号强度均在逐渐降低，即该双信号荧光体系可成功用于β-Gal定量分析，如图4L所示。
5.β-Gal分析条件优化
为了取得更优的分析性能，对实验中涉及到的条件进行了考察。
如图5所示，在对比空白溶液和目标β-Gal酶引起的荧光信号后，可发现14mM底物PAPG浓度(图5A-B)；30分钟的酶水解底物时间(图5C-D)；120μM Cu2+浓度(图5E-F)和2分钟的还原时间(图5G-H)；1.8μL NMM(图5I)和8.2μL QDs(图5J)，以及2分钟的配位和阳离子交换反应时间(图5K和L)为最优实验条件。
6.β-Gal分析性能
随后对β-Gal分析性能进行了考察，为了更好的表现出单信号和双信号的优势，首先对单信号模式下分析灵敏度进行了调查。
如图6A所示，随着酶活性增加，QDs的荧光信号在逐渐降低。如图6B，在0.1-100U/L范围内，酶活性的对数与荧光信号强度呈现良好的线性关系，其检测限为0.05U/L(基于三倍信噪比)。
相比于QDs为信号分子时，NMM的荧光强度与酶活性的对数也呈现出良好的线性关系，且在0.1-104U/L范围内线性良好，检测限为0.03U/L，如图6C和6D所示。
在以上结果的引导下，对双荧光信号分析性能进行考察，发现QDs和NMM作为双信号时对酶的定量是完全可行的。
此外，检测灵敏度具有很高的提高，其可实现1mU/L浓度级别的酶分析，两个信号分子均在1-1000mU/L范围内呈现良好线性，其检测限分别为0.3和0.4mU/L，如图6E和6F所示。
在分析体系内，高浓度(10ng/mL)潜在蛋白等对β-Gal分析未引起明显的干扰，其引起的荧光信号改变与空白溶液相近，如图6G和6H所示，其中β-Gal为0.1U/L。
7.E.Coli分析性能
在以上β-Gal优越分析性能的鼓励下，以及结合E.Coli裂解可释放出大量的β-Gal的特性，将该策略用于大肠杆菌的双荧光分析。
与β-Gal分析相似，首先对单信号分子时分析性能进行了考察。如图7A和7B，7C和7D所示，在0-106CFU/mL范围内，随E.Coli浓度增加，溶液中QDs和NMM均在降低，且细菌浓度的对数与荧光信号呈现出良好的线性关系。QDs为信号分子时，其可实现10-104CFU/mL范围内细菌的分析，其检测限为3CFU/mL；NMM为信号分子时，检测线性范围与QDs一样，且检测限为4CFU/mL。
随后，考察了双信号时大肠杆菌的分析性能，如图7E所示，QDs和NMM的信号均随着细菌浓度增加在逐渐下降，且均与细菌浓度对数呈现良好线性。同样值得注意的是，双信号时细菌的分析灵敏度也得到了极大的改善，且可实现0.1-1000CFU/mL范围内大肠杆菌的定量分析，其检测限分别为0.03和0.05CFU/mL，相比于单信号时，灵敏度提高了100倍，如图7F所示。
综上，该策略可成功用于β-Gal和E.Coli的高灵敏、简单和均相和低成本双荧光分析中。该策略中报道的金属离子调控NMM信号的现象不仅仅可用于本发明，其结合不同生物反应、信号分子以及检测器可实现不同分析目标物的分析，以及更加广阔的应用场景。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法，其特征在于，所述方法包括基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号，所述金属离子有效改变QDs的荧光信号和NMM的荧光信号，并基于QDs的荧光信号和NMM的荧光信号定量单一目标物，所述目标物为β-Gal或者E.Coli；
所述金属离子为相同元素不同价态的金属离子，所述相同元素不同价态的金属离子对NMM的荧光信号抑制作用具有显著差异；
所述相同元素的不同价态的金属离子可有效抑制NMM的荧光信号；
所述相同元素的不同价态的金属离子为Cu2+和Cu+或者Fe3+和Fe2+。
2.根据权利要求1所述的基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法，其特征在于，所述金属离子为Cu2+和Cu+，所述QDs和所述NMM选择性识别Cu2+和Cu+，所述Cu+对所述QDs荧光信号和所述NMM荧光信号的抑制作用大于所述Cu2+。
3.根据权利要求1所述的基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法，其特征在于，所述金属离子为Fe3+和Fe2+，所述QDs和所述NMM选择性识别Fe3+和Fe2+，所述Fe3+对所述QDs荧光信号和所述NMM荧光信号的抑制作用大于所述Fe2+。
4.根据权利要求1所述的基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法，其特征在于，所述NMM和所述QDs的激发波长为399nm，所述NMM和所述QDs的荧光信号监测范围均为400-700nm。
5.根据权利要求1所述的基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法，其特征在于，所述QDs包括CdTe QDs或者CdSe QDs。
6.一种基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法的应用，其特征在于，所述应用包括将权利要求1-5任一所述的基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法应用于β-Gal的分析或者E.Coli的分析，以定量所述β-Gal和所述E.Coli，所述E.Coli裂解释放所述β-Gal。
7.根据权利要求6所述的基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法的应用，其特征在于，所述β-Gal水解底物生成还原性物质，所述还原性物质还原所述金属离子，生成的所述金属离子可被所述NMM和所述QDs竞争识别，进而同时改变所述NMM和所述QDs的荧光信号。
8.根据权利要求6所述的基于金属离子选择性调控QDs和NMM荧光信号的均相双荧光分析方法的应用，其特征在于，所述应用还包括结合不同生物反应、信号分子以及检测器实现不同分析目标物的分析。
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