JP5463013B2 - 軟骨マーカー - Google Patents
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Description
すなわち,本発明の一目的は,軟骨組織に特異的に結合する軟骨マーカーを提供することである。
本発明の更なる一目的は,そのような軟骨マーカーであって,蛍光物質,X線吸収物質その他の信号発生手段を結合させた軟骨マーカーを提供することである。
本発明のなおも更なる一目的は,軟骨組織を周囲組織から区別して選択的に検出するための,軟骨マーカーを含んでなる組成物である,軟骨標識用剤を提供することである。
1.ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドを含んでなる軟骨マーカー。
2.該ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドが,アルギニン残基又はリジン残基を6〜20個を含んでなるものである,上記1の軟骨マーカー。
3.該ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドに結合した信号発生手段を更に含んでなるものである,上記1又は2の軟骨マーカー。
4.該信号発生手段が,該ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドのC末端又はN末端に結合しているものである,上記3の軟骨マーカー。
5.該信号発生手段が,該ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドのC末端又はN末端に直接又は他のアミノ酸を介して結合しているものである,上記4の軟骨マーカー。
6.該信号発生手段が蛍光物質又はX線吸物質である,上記3ないし5の何れかの軟骨マーカー。
7.該信号発生手段が,ローダミン系色素又はAtto系色素である,上記3ないし5の何れかの軟骨マーカー
8.上記3ないし7の何れかの軟骨マーカー及び水性媒質を含んでなる,軟骨標識用剤。
更に,本発明の軟骨マーカーは,軟骨に選択的に集積するため,軟骨を標的化してこれに薬剤を運搬する担体として使用することもできる。すなわち,本発明の軟骨マーカーに,軟骨の治療に用いる薬剤を結合させて,投与(例えば関節腔内)することによって,薬剤を効率よく軟骨に集積させることが可能となる。
1.ポリアルギニン及び蛍光軟骨マーカーの作成
J Biol Chem 276:5836-5840の記載に準じて,上述のようにして,アルギニン残基数4,8,12及び16個のポリアルギニンペプチド〔それぞれR4(配列番号1),R8(配列番号2),R12(配列番号3)及びR16(配列番号4)〕を合成し,続いて各ポリアルギニンペプチドのC末端にグリシンを介してシステインを結合させた(それぞれ,配列番号5,6,7及び8)。これらの各々ポリペプチドをリン酸緩衝液(pH7.2)1mLに溶解させ(濃度6.17nmol),これに5mg/200μL(0.55mmol/μL)に調製したテトラメチルローダミン−5−マレイミド(Invtrogen)のDMF溶液112.2μLを加えて室温にて12時間反応させることにより,各ポリペプチドのシステイン残基の側鎖のチオール基を介して両化合物を結合させた。反応混合物をHPLCにより精製して,各蛍光標識ペプチドを,収率約50%で得た。
正常なDBA1J系マウス(9週齢、雌)2匹を用意した。0.1mMおよび1mMの,R8−ローダミン100μLを各々の右アキレス腱下、足関節周囲に注射した。これに際し,ポリアルギニンはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で溶解した。1時間15分後、ジエチルエーテルにてマウスを屠殺した。還流固定せず、注射した右足関節と両側大腿骨遠位端を採取した。4本の大腿骨を各0.01mMのR4,R8,R12又はR16の各ローダミン結合ペプチドに浸漬し(1時間30分間)、PBSで2回洗浄した。これを4%CMC内に包埋し、液体窒素とヘキサンで凍結して、硬組織切片用のタングステンカーバイド製ブレードTC−65(Leica製)とCryofilm (Finetec製)を用いて、脱灰せずにクライオスタットで7μmの厚さに薄切した。切片を室温に10秒置いて解凍し,100%エタノールに約30秒間浸漬し,4%パラホルムアルデヒド(PFA)内にしばらく保存した後,水道水で洗浄した。切片に0.1%カルセインを滴下して5分置き,水道水で洗浄し,更に1mMヘキスト液(ヘキスト33258)2μL/PBS1mL(終濃度2μM)を滴下して5分置き,水道水で洗浄して,CMCに封入し,蛍光顕微鏡撮影を行った。蛍光フィルターとしては,GFP+及びCy3フィルターを用いた。結果を図1〜7に示す。
上記1と同様の手順で,正常なマウス(ICR系、16週)の足関節に長さの異なるポリアルギニン(ローダミン結合)ペプチド(0.01mM R4−,R8−,R12−及びR16−ローダミン,各50μL)を注射して1時間後にサンプル採取し,更にカルセイン及びヘキストで蛍光染色した。この蛍光顕微鏡写真を図8〜11に示す。図8は,ローダミン結合ポリアルギニンペプチド(軟骨染色),カルセイン(骨染色),ヘキスト(細胞核染色)の全てによる染色像を示し,図9はポリアルギニン(ローダミン結合)ペプチドによる染色象のみを,図10はカルセインによる染色像のみを,そして図11は,ヘキストによる染色像のみを,元のカラー画像からそれぞれ色別に抽出したものである。これらの図からも,アルギニン(ローダミン結合)ペプチドは,軟骨のみを染色するのが確認される。特に,図9は,R8〜R12−ローダミンが軟骨に強く結合していることを示している。
上記と同様の手順で,正常マウスと関節炎モデルマウスそれぞれの足関節に0.05mMのR8−ローダミン,50μLを注射し1時間後にサンプル採取して上記と同様の手順で切片とした。図12は,その結果を示す図面代用写真である。図において,左側は正常マウス,右側は関節炎モデルマウスの足関節の蛍光像を示し,それぞれ,上段は,アルギニン(ローダミン結合)ペプチド染色,中段は,アルギニン(ローダミン結合)ペプチド(軟骨染色),カルセイン(骨染色),ヘキスト(細胞核染色)の全てによる染色像を示し,下段は,カルセイン(骨染色)による染色像を,それぞれ示す。図に見られるように,関節炎モデルマウスでは,関節軟骨の染まり方が不均一であり、関節軟骨の損傷が明瞭に観察できる。
蛍光色素として,近赤外領域に蛍光波長を有するAtto 655(ATTO-TEC GmbH)を用いた。上述したのと同様にして,ポリアルギニンペプチドR8のC末端にスペーサーとしてのグリシン残基を介してシステイン残基を結合させ,これにマレイミドを取り付けたAtto 655(SIGMA-ALDRICH)を結合させて蛍光軟骨マーカー(R8−Atto 655)を作成した。これをPBSで0.1mMに調整し,その50μLを,BALB/cマウス(7週齢、雌)に,ジエチルエーテル麻酔下,左足関節周囲に注射した。実験小動物用in vivo蛍光イメージングシステムであるeXplore Optix(GE HEALTHCARE)により,R8−Atto 655の注射前,注射後1,2,4,6時間の時点でのマウスの左足関節を外部から経時的に撮影した。図13は,その結果を示す図面代用写真である。図において,マウス左足関節からのAtto 655蛍光の相対的強度が画像化されている。蛍光マーカー注射1時間後の左足関節部位の画像において,黒色領域は中等度の蛍光強度,その中の2個の分離した白色領域(軟骨に対応)はより強い蛍光強度,外側の白い領域はより弱い蛍光強度に対応する。同写真より,軟骨部位が最も強い蛍光を発していることが分かる。蛍光強度は,蛍光マーカー注射後1時間をピークに以後減衰した(但し下記のように,注射から6時間経過後も,組織切片の蛍光顕微鏡撮影に十分な蛍光強度は残る)。
正常マウスへの蛍光軟骨マーカーの投与及びin vivoでの経時的検出
蛍光色素として,近赤外領域に蛍光波長を有するAtto 655(ATTO-TEC GmbH)を用いた。リジン残基数8個のポリリジンペプチドK8(配列番号9)を合成し,そのC末端にスペーサーとしてのグリシン残基を介してシステイン残基を結合させ,これにマレイミドを取り付けたAtto 655(SIGMA-ALDRICH)を結合させて,蛍光軟骨マーカー(K8−Atto 655)を作成した。これをPBSで0.1mMに調整し,その50μLを,BALB/cマウス(7週齢、雌)に,ジエチルエーテル麻酔下,右膝関節周囲に注射した。eXplore Optix(GE HEALTHCARE)により,K8−Atto 655の注射前,注射後1,2,4,6時間の時点でのマウスの右膝関節を外部から経時的に撮影した。図15は,その結果を示す図面代用写真である。図において,マウス右膝関節からのAtto 655蛍光の相対的強度が画像化されている。図に見られるように,注射部位の蛍光は,注射後4時間の間にわたって殆ど減衰することなく観察された。
Claims (4)
- ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドを含んでなる関節軟骨マーカーと水性媒質とを含んでなる関節腔内投与用関節軟骨標識用剤であって,該ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドが,アルギニン残基又はリジン残基6〜20個からなるものであり,該関節軟骨マーカーが,該ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドに結合した信号発生手段を更に含んでなるものである,関節腔内投与用関節軟骨標識用剤。
- 該信号発生手段が,該ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドのC末端又はN末端に結合しているものである,請求項1の関節腔内投与用関節軟骨標識用剤。
- 該信号発生手段が,該ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドのC末端又はN末端に直接又は他のアミノ酸を介して結合しているものである,請求項2の関節腔内投与用関節軟骨標識用剤。
- 該信号発生手段が蛍光物質又はX線吸物質である,請求項1ないし3の何れかの関節腔内投与用関節軟骨標識用剤。
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