JP7197827B2 - 蛍光標識ポリリジン及びこれを用いる観察方法 - Google Patents
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このうち皮膚角層細胞の観察を目的とする場合には、例えば頬部や上腕内側部よりテープストリッピング法にて採取された角層細胞を、ゲンチアナバイオレット-ブリリアントグリーン染色、ローダミンB-メチレンブルー染色、ヘマトキシリン-エオジン染色などの染色方法で角層細胞を染色したのち、顕微鏡観察する方法が広く行われている。
しかしながら、これらの染色方法は操作手順が煩雑で、かつ染色に時間がかかるうえ測定者の技量に負うところが大きく、しばしば染色が不十分となり安定した顕微鏡観察が行えない問題があった。
このような問題に鑑み、本発明の課題は、操作が簡便で、かつ高価な分析機器を使用しなくても、高い精度で角層細胞を始めとする生体組織の観察方法を提供することである。
[1]蛍光色素化合物で標識した蛍光標識ポリリジン。
[2]蛍光色素化合物が、3,6-ジアミノ-9-[2,4-ビス(リチオオキシカルボニル)フェニル]-4-(リチオオキシスルホニル)-5-スルホナトキサンチリウム/3,6-ジアミノ-9-[2,5-ビス(リチオオキシカルボニル)フェニル]-4-(リチオオキシスルホニル)-5-スルホナトキサンチリウム又はその誘導体である、[1]に記載の蛍光標識ポリリジン。
[3]蛍光色素化合物が、9-[2-カルボキシ-4(オア5)-[[(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ]-カルボニル]フェニル]-3,6-ビス-(ジメチル
アミノ)-キサンチリウム インナーソルト又はその誘導体である、[1]に記載の蛍光
標識ポリリジン。
[4]蛍光色素化合物の導入率が蛍光標識ポリリジン全量の0.1~10重量%である、[1]~[3]のいずれかに記載の蛍光標識ポリリジン。
[5]ポリリジンが、ε-ポリリジン及び/又はその塩である、[1]~[4]のいずれかに記載の蛍光標識ポリリジン。
[6][1]~[5]のいずれかに記載の蛍光標識ポリリジンを含有する、観察用試薬。[7][1]~[5]のいずれかに記載の蛍光標識ポリリジンを対象に吸着させる工程を含む、対象の観察方法。
[8]対象が角層細胞、毛髪、微生物、及び繊維製品からなる群から選択される、[7]に記載の観察方法。
[9]吸着工程がpH6~8の条件下で行われる、[7]又は[8]に記載の観察方法。[10]対象がダメージ毛髪である、[8]又は[9]に記載の観察方法。
また、ポリリジンは、通常はリジンのホモポリマーであるが、本発明の効果を損なわない限りにおいて、他のアミノ酸をモノマーとして含んでもよい。
また、ポリリジンの大きさは、特に限定されないが、重量平均分子量が好ましくは3000以上、より好ましくは4000以上であり、好ましくは10000以下、より好ましくは8000以下、さらに好ましくは6000以下であり、3000~6000の範囲が特に好ましい。なお、ここで重量平均分子量は、GPC-LALLS法により測定された値である。
及び硫酸鉄・7水和物0.03重量%であり、pHが6.8に調整された培地にて培養し、得られた培養物からε-ポリリジンを分離・回収する。
他にも、化学的手法によりポリリジンを製造してもよい。
ポリリジン塩は常法により製造される。例えば含水メタノール溶液に前記ε-ポリリジンを溶解させ、これに前記酸を加え、溶液が中和点を過ぎたところで、冷アセトンを加えて沈澱した塩を乾燥させることによって得られる。
蛍光色素化合物の例としては、Alexa類、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)又はその誘導体、TAMRA、Cy3、Cy5、ローダミン6G(R6G)又はその誘導体(例えば、テトラメチルローダミン(TMR))、テキサスレッド、BODIPY類、ROX、Hex、JOE、BHQ類等が挙げられる。これらのうち、3,6-ジアミノ-9-[2,4-ビス(リチオオキシカルボニル)フェニル]-4-(リチオオキシスルホニル)-5-スルホナトキサンチリウム/3,6-ジアミノ-9-[2,5-ビス(リチオオキシカルボニル)フェニル]-4-(リチオオキシスルホニル)-5-スルホナトキサンチリウム(商品名Alexa Fluor488(Thermo Fisher Scientific社製))またはその誘導体、及び9-[2-カルボキシ-4(オア5)-[[(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ]-カルボニル]フェニル]-3,6-ビス-(ジメチルアミノ
)-キサンチリウム インナーソルト(商品名NHS-Rhodamine(Therrmo Fisher Scientific社製))又はその誘導体が、入手のし易さ、取り扱いの簡便さから、好ましい。これら
の蛍光色素化合物は常法によりポリリジンに反応させることにより、共有結合、イオン結合、配位結合、又は水素結合等でポリリジンを蛍光標識する。これらの蛍光色素化合物はポリリジンの有するアミノ基を介して錯体を形成し、蛍光標識ポリリジンを得ることができる(図1及び図2)。
そのため、本発明の蛍光標識ポリリジンは、ポリリジンが吸着し得る対象の観察用試薬として好適に用いることができる。かかる対象としては、特に限定されないが、角層細胞を始めとする生体細胞や毛髪等の生体組織、微生物、天然繊維や化学繊維及び合成繊維等の繊維素材、天然樹脂や合成樹脂等の工業素材などを好適に挙げられる。
吸着工程を行う条件は、特に限定されないが、pH6~8が好ましい。また、温度は4~40℃が好ましい。また、蛍光標識ポリリジンは0.001~0.01重量%の濃度の水溶液で適用することが好ましい。かかる適用時間は、前記濃度にもよるが、5~60分
間で十分に吸着が行われる。
観察対象は、特に限定されないが、角層細胞を始めとする生体細胞や毛髪等の生体組織、微生物、天然繊維や化学繊維及び合成繊維等の繊維素材、天然樹脂や合成樹脂等の工業素材などを好適に挙げられる。
ε-L-ポリリジン(以降「PLL」と記す、Mn:4090、Mw:4700、10質量%水溶液、JNC株式会社製)を0.1M NaHCO3(pH9.0)溶液で希釈
して10mg/mLとした。これに、Alexa Fluor 488 5-TFP ester (Thermo Fisher Scientific)100μg/100μLを加えて室温にて1時間反応させた。反応液を遠心限外ろ過(Amicon Ultra 3K)に供し、未反応の蛍光色素を除去し、蛍光標識されたポリリ
ジンAlexa Fluor 488-PLL(AF-PLL)を得た。得られたAF-PLLは精製水で所
定の濃度に希釈して、以降の吸着実験に供した。
角質チェッカー(日本アッシュ)を用いたテープストリッピングにより、健常人上腕内側より最外層角層の角層細胞を非侵襲的に採取した。これにAF-PLL水溶液(50μg/mL)を添加し、室温にて所定の時間インキュベートした。反応後、水洗した後に、角層に吸着したAF-PLLを蛍光顕微鏡EVOS-FL(Thermo Fisher Scientific)により観察した。
反応時間ごとの染色結果を図3に示す。AF-PLLにより角層細胞が均一に染色された。また、反応時間に依存して蛍光強度が大きくなり吸着量が増加し、約60分でほぼ飽和した。
AF-PLL水溶液の濃度を変えて(0~100μg/mL)、実施例2と同様に角層細胞を染色し(室温、2時間)、観察した。
結果を図4に示す。AF-PLLの濃度に依存して、蛍光強度の増大が認められた。
AF-PLLと非標識PLLとを所定の割合で含有する水溶液(AF-PLL濃度:50μg/mL)を角層細胞に添加し、実施例2と同様に角層細胞を染色(室温、2時間)した後、観察した。
結果を図5に示す。AF-PLLの角層細胞への吸着は、非標識PLLにより競合的に阻害された。この結果から、蛍光検出により観察されるのがPLLの角層細胞への吸着挙動であることが確認された。
AF-PLLとL-リジンとを所定の割合で含有する水溶液(AF-PLL濃度:50μg/mL)を角層細胞に添加し、実施例2と同様に角層細胞を染色(室温、2時間)した後、観察した。
結果を図6に示す。100倍濃度のL-リジンモノマー共存下でもAF-PLLの吸着
はほとんど阻害されなかった。
種々の緩衝剤を用いてAF-PLL水溶液(50μg/mL)のpHを2.5~9.0に調整し、実施例2と同様に角層細胞を染色(室温、2時間)した後、観察した。
結果を図7に示す。酸性領域(pH2.5~5.0)では蛍光が検出されず、AF-PLLの吸着は阻害されていた。一方、中性領域(pH6.0~8.0)ではAF-PLL
の吸着は阻害されなかった。アルカリ性領域(pH9.0)では吸着は阻害される傾向であったが、用いる緩衝液により吸着挙動が異なっていた。
NaClを0~1.0mol/Lで含有するAF-PLL水溶液(50μg/mL)を調製し、実施例2と同様に角層細胞を染色(室温、2時間)した後、観察した。
結果を図8に示す。0.1mol/L以上ではNaCl濃度に依存して蛍光強度の減弱が認められ、1mol/Lではほぼ完全に吸着が阻害された。
実施例6及び7の結果から、ポリリジンと角層細胞との間の相互作用の少なくとも一部は、ポリリジンのアミノ基とのイオン結合を介したものであると推測できる。
種々のカチオン性界面活性剤を含有するAF-PLL水溶液(50μg/mL)を調製し、実施例2と同様に角層細胞を染色(室温、2時間)した後、観察した。
結果を表1並びに図9及び10に示す。いずれのカチオン性界面活性剤においても、炭素鎖長が長くなるほど、蛍光強度の減弱が認められ、ポリリジンと角層細胞との相互作用が阻害されることが認められた。
市販のテスト用毛束(ビューラックス)、および健常人より採取した毛髪を角質チェッカー(日本アッシュ)に瞬間接着剤で固定したのち、精製水またはAF-PLL水溶液(100μg/mL)を添加し、室温にて2時間インキュベートした。反応後、水洗した後に、毛髪に吸着したAF-PLLを蛍光顕微鏡EVOS-FL(Thermo Fisher Scientific)により観察した。
染色結果を図11に示す。AF-PLLにより毛髪が均一に染色された。なお、毛髪には自家蛍光を示すものもあり、精製水においてもわずかに蛍光が観察された。
AF-PLL水溶液の濃度を変えて(0~100μg/mL)、実施例9と同様に毛髪を染色し(室温、2時間)、観察した。
結果を図12に示す。AF-PLLの濃度に依存して、蛍光強度の増大が認められた。
AF-PLLと非標識PLLとを所定の割合で含有する水溶液(AF-PLL濃度:100μg/mL)を毛髪に添加し、実施例9と同様に毛髪を染色(室温、2時間)した後、観察した。
結果を図13に示す。AF-PLLの毛髪への吸着は、非標識PLLにより競合的に阻害された。この結果から、蛍光検出により観察されるのがPLLの毛髪への吸着挙動であることが確認された。
ダメージ毛髪は、市販のテスト用毛束をブリーチ処理して作製した。ブリーチ剤処理は、使用直前に1剤(アルカリ剤)と2剤(酸化剤)を混合して、テスト用毛束に塗布した。30分程放置し、水洗した後、実施例9と同様に毛髪を染色(室温、2時間)した後、観察した。
結果を図14に示す。ダメージ毛髪ではAF-PLLにより蛍光輝度の顕著な上昇が認められた。また、ダメージ毛髪では自家蛍光の増加も観察された。
サブロー平板培地にて25℃/3日培養したSaccharomyces cerevisiae(NBRC10217)
を、滅菌綿棒を用いて、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)6mLに懸濁し、~107 CFU/mLの微生物懸濁液を得た。得られた微生物懸濁液を滅菌ピペットで適当量採取して、1.5mL容マイクロチューブ(Eppendorf製)に分注した後、10 mg/mL A
F-PLLを50 μL加え(最終濃度が500μg/mL)、トータル1mLの反応液を調製した。比較対照のため、AF-PLL水溶液に代えて同量の精製水を添加した試験区を調製した。これらを室温にて2時間インキュベートした後、遠心分離機(Eppendorf製
)にて遠心分離(5000rpm、10分)して上清を除去した。沈殿の菌体に1mLのPBSを加えて懸濁し、再度遠心分離し上清液を除去した。これを更に2回繰り返して洗浄した後、微生物に吸着したAF-PLLを蛍光顕微鏡EVOS-FL(Thermo Fisher Scientific)により観察した。
染色結果を図15に示す。AF-PLLを作用させることにより、微生物の形に沿うように蛍光が検出され、AF-PLLにより微生物が染色されることが観察された。
実施例13と同様の方法で~107CFU/mLに調製した微生物懸濁液を950μL
取り、10 mg/mLのAF-PLLを10 μL(最終濃度100μg/mL)と250
mg/mLの非標識PLLを40 μL(最終濃度10 mg/mL)それぞれ加え(標識
ポリリジン:非標識ポリリジン=1:100)、実施例13と同様に微生物を染色(室温、2時間)した後、観察した。
結果を図16に示す。AF-PLLの微生物への吸着は、非標識PLLにより競合的に阻害された。この結果から、蛍光検出により観察されるのがPLLの微生物への吸着挙動であることが確認された。
蛍光色素化合物をNHS-Rhodamineとした以外は実施例1と同様の処理を行い、蛍光標識
されたポリリジンRhodamine-PLL(Rho-PLL)を得た。得られたRho-PLLは
精製水で所定の濃度に希釈して、以降の吸着実験に供した。
蛍光標識されたポリリジンをRho-PLL水溶液(濃度0~200μg/mL)とした以外は、実施例2と同様に角層細胞を染色(室温、2時間)した。反応後、水洗した後に、角層に吸着したRho-PLLを、蛍光顕微鏡EVOS-FL(RFPフィルター装着)により観察した。
結果を図17に示す。前述したAF-PLL同様に、Rho-PLLの濃度に依存して蛍光強度の増大が認められた。
Rho-PLLと非標識PLLとを所定の割合で含有する水溶液(Rho-PLL濃度:20μg/mL、および200μg/mL)を角層細胞に添加し、実施例2と同様に角層細胞を染色(室温、2時間)した後、蛍光顕微鏡EVOS-FL(RFPフィルター装着)により観察した。
結果を図18に示す。前述したAF-PLL同様に、Rho-PLLの角層細胞への吸着は、非標識PLLにより競合的に阻害された。この結果から、蛍光検出により観察されるのがPLLの角層細胞への吸着挙動であることが確認された。
蛍光標識されたポリリジンをRho-PLL水溶液(Rho-PLL濃度;100μg/mL)とした以外は、実施例12と同様に毛髪を染色(室温、2時間)した後、蛍光顕微鏡EVOS-FL(RFPフィルター装着)により観察した。
結果を図19に示す。ダメージ毛髪では、前述したAF-PLL同様に、Rho-PLLにより蛍光輝度の顕著な上昇が認められた。しかしながら、Rho-PLLではAF-PLLとは異なり、毛髪自身の自家蛍光はほとんど観察されず安定した観察が可能であった。
Claims (8)
- 蛍光色素化合物で標識した蛍光標識ポリリジンを含有する、観察用試薬であって
角層細胞、毛髪、微生物、及び繊維製品からなる群から選択されるいずれかを観察するためのものである試薬。 - 蛍光色素化合物が、3,6-ジアミノ-9-[2,4-ビス(リチオオキシカルボニル)フェニル]-4-(リチオオキシスルホニル)-5-スルホナトキサンチリウム/3,6-ジアミノ-9-[2,5-ビス(リチオオキシカルボニル)フェニル]-4-(リチオオキシスルホニル)-5-スルホナトキサンチリウム又はその誘導体である、
請求項1に記載の試薬。 - 蛍光色素化合物が、9-[2-カルボキシ-4(オア5)-[[(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ]-カルボニル]フェニル]-3,6-ビス-(ジメチルアミ
ノ)-キサンチリウム インナーソルト又はその誘導体である、請求項1に記載の試薬。 - 蛍光色素化合物の導入率が蛍光標識ポリリジン全量の0.1~10重量%である、請求項1~3のいずれか一項に記載の試薬。
- ポリリジンが、ε-ポリリジン及び/又はその塩である、請求項1~4のいずれか一項に記載の試薬。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の試薬に含有される蛍光標識ポリリジンを対象に吸着させる工程を含む、対象の観察方法であって、
対象が角層細胞、毛髪、微生物、及び繊維製品からなる群から選択される、観察方法。 - 吸着工程がpH6~8の条件下で行われる、請求項6に記載の観察方法。
- 対象がダメージ毛髪である、請求項6又は7に記載の観察方法。
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佐々木千鶴 ほか,アゾ色素修飾ε-ポリリジンの会合挙動,日本化学会講演予稿集,2005年03月11日,Vol.85, No.2,p.1448 |
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