CN1093768C - 诊断用标记物 - Google Patents

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Abstract

含有用(a)例如抗体等的检测系统，及(b)与该检测系统结合的下述式(R1及R2分别独立地表示氢原子或烷基等；R3表示烷基或磺酸烷基等；根据需要，X-表示阴离子种；Y表示碳数1～10的亚烷基、或含有由氧原子、氮原子及硫原子组成群选出的，1个以上原子的碳数1～10的亚烷基)表示的荧光性官能基的诊断用标记物。由于通过照射近红外线乃至远红外线，发出780nm以上波长的荧光，所以对于红外线内窥镜检查或外科手术时，确定病灶等是有用的。

Description

诊断用标记物
技术领域
本发明涉及诊断用标记物。进一步详细地说，本发明涉及使特异识别癌细胞的抗体等与用对组织障碍性小的经近红外线或远红外线照射激发后发出荧光的特定标记用化合物结合的，可适用于生物体的诊断用标记物。
背景技术
近年，由于电子内窥镜的普及，使内窥镜诊断变得容易，在癌症早期，可确切地发现胃癌和大肠癌等。进而，对于微小癌的诊断，电子内窥镜和使用通常的内窥镜时的诊断能力几乎相同，这就意味着还未确立活用电子内窥镜功能的新的诊断方法。对于用通常的内窥镜不能识别的微小病变，只要用在电子内窥镜下可检测的标记抗体，标记微小病变，就可用计算机处理，进行图像解析，可容易地进行检测，但这种方法还未实用化。
为了确立使用电子内窥镜的上述诊断方法，需要用免疫组织化学的染色法直接对生物体组织染色。固定化标本的染色法是已经确立的技术。可是，非固定化标本的染色法对于本专业人员还不是可利用的技术。例如，对于非固定化标本的免疫染色法虽然有报告(四国医学杂志，29，180，1987)但对于使用近红外线的本领域的切除新鲜标本和生物体组织本身的免疫染色法，还没有报告。
另一方面，对于上述的诊断方法，也需要在电子内窥镜下可检测的诊断用标记物(标记化的抗体等)。已知将用紫外线激发，发出紫外·可见光的荧光的标记用化合物与抗体结合的诊断用标记物，广泛用于检测存在于摘出生物体外的组织的癌细胞和癌组织。可是，使用由紫外线激发的荧光性诊断用标记物的方法，由于紫外线能损伤生物体组织和DNA，所以不适用于生物体。目前，还没有可直接适用于生物体的诊断用标记物。
已知吲哚花青绿(ICG)，在红外线内窥镜下，显示特异的吸收，发出荧光。已知用红外线内窥镜，使用吲哚花青绿的例子(Gastroenterological Endoscopy，34，pp.2287-2296，1992；及Gastrointestinal Endoscopy，40，pp.621-2；628，1994)，但任何一个例子都是在血管内投入ICG。另外，一般由于以吲哚花青绿为主的荧光性色素疏水性高，以单体给于肠道内时可快速吸收，所以试图通过在母环或侧链部分导入亲水性的磺酰基等，提高水溶性，提高测定效率，避免吸收后的毒性问题。可是，还未发现与吲哚花青绿发出相同荧光的水溶性标记用化合物。
本发明的目的在于提供对于通过免疫组织化学的染色法直接使生物体组织染色的有用的诊断用标记物。本发明另一目的在于提供通过对组织障碍性小的近红外线乃至远红外线照射，发生荧光，可直接用于生物体的诊断用标记物。即，本发明的课题在于提供不必担心由于紫外线激发所引起生物体组织和DNA损伤的、也适用于生物体的诊断用标记物。提供具有这样特征的，且水溶性优良的诊断用标记物也是本发明的目的之一。
另外，本发明的目的在于提供对于使用红外线内窥镜等的准体内的食道癌、胃癌、大肠癌等上皮性组织的恶性新生物及感染症等早期诊断和外科手术时病灶的确定或诊断上有用的，适用于生物体的诊断标记物。另外，本发明另一目的在于提供使用这种诊断用标记物，通过免疫组织化学的染色法，将生物体组织直接染色的方法。
发明的公开
本发明者们，通过潜心研究上述课题，合成各种吲哚花青绿的衍生物，成功地制造了通过近红外线乃至远红外线激发，发出荧光的吲哚花青绿衍生物。另外，本发明者们发现使用上述的吲哚花青绿衍生物作为标记用化合物，与抗癌抗原体等反应，可制造对生物体直接适用的诊断用标记物，以及这种诊断用标记物，对于通过免疫组织化学的染色法直接染色生物体组织是有用的。
进而，本发明者们对于提供水溶性优良的诊断用标记物进行潜心研究结果发现，在上述的吲哚花青绿衍生物中，对于可形成分子内抗衡离子(两性离子)的化合物，由于形成抗衡离子，分子的离子性降低，有损坏水溶性的场合，但是若碘化钠等与该衍生物作用，在分子内不形成抗衡离子，保持了整个分子的离子性，显著地增大了水溶性。本发明就是基于这些见解而完成的。
即，本发明提供了包括(a)检测系统，及(b)结合在该检测系统上的用下述式(I)表示的荧光性官能基的诊断用标记物，
Figure C9619285400071
(式中，R1及R2分别独立地表示氢原子、烷基、芳基、烷氧基或磺酸基；R3表示烷基、磺酸烷基或氨基取代烷基；X-，根据需要，表示阴离子种；Y表示碳数1～10的亚烷基、或含有从氧原子、氮原子及硫原子组成群选出的1个以上原子的碳数1～10的亚烷基)。
另外，按照本发明的另一个方案，提供包括(a)检测系统，及(b)结合在该检测系统上的用下式(II)表示的荧光性官能基的诊断用标记物，
Figure C9619285400072
(式中，R4及R5分别独立地表示氢原子、烷基、烷氧基、或磺酸盐基；R6表示亚烷基；M+表示碱金属离子；Q-表示卤离子、高氯酸根离子、或硫氰酸根离子；Y表示碳数1～10的亚烷基、或含有从氧原子、氮原子及硫原子组成群选出的1个以上原子的碳数1～10的亚烷基)。
进而，按照本发明的另一方案，提供制造上述诊断用标记物有用的化合物，用下述式(III)和用下述式(V)表示的化合物。
Figure C9619285400081
(式中，R1及R2分别独立地表示氢原子、烷基、芳基、烷氧基或磺酸基；R3表示烷基、磺酸烷基或氨基取代烷基；X-，根据需要，表示阴离子种；Z表示由下述式组成群选出的基；
Figure C9619285400082
W及Y分别独立地表示碳数1～10的亚烷基、或含有  氧原子、氮原子及硫原子组成群选出的1以上原子的碳数1～10的亚烷基)。
Figure C9619285400083
(式中，R4及R5分别独立地表示氢原子、烷基、烷氧基、或磺酸盐基；R6表示亚烷基；M+表示碱金属离子；Q-表示卤离子、高氯酸根离子、或硫氰酸根离子；Z表示由下式组成群选出的基，W及Y分别独立地表示碳数1～10的亚烷基、或含有从氧原子、氮原子及硫原子组成群选出的1个以上原子的碳数1～10的亚烷基的化合物)。本发明也提供了包括使这些化合物和检测系统结合的工序的上述诊断用标记物的制造方法。
另外，提供了包括(a)检测系统；及(b)结合在该检测系统上的荧光官能基的诊断用标记物，当用波长600～800nm的激发光照射时，所述官能基发出780nm以上波长的荧光。此外，按照上述各诊断用标记物优选的方案，可提供荧光性官能基与检测系统直接结合的上述各诊断用标记物；荧光性官能基，通过接头或者蛋白，与检测系统结合的上述各诊断用标记物；检测系统从抗体、核酸及扩增系物质组成群中选出的上述各诊断用标记物；作为抗体，使用抗癌抗原体、抗细菌抗体或抗病毒抗体的上述各诊断用标记物；用于红外线内窥镜检查或外科手术时，确定病灶的上述各诊断用标记物；及通过免疫组织化学的染色法，直接用于染色生物体组织上述各诊断用标记物。另外，提供了含有上述各诊断用标记物作为有效成分的诊断药。
图的简单说明
图1是表示标记用化合物(化合物18)的红外线吸收光谱的图。(A)是通过添加碘化钠，形成盐的化合物18的红外线吸收光谱，(B)是作为原料使用的吲哚花青绿-N-己酸磺基琥珀酰亚胺酯(化合物17)的红外线吸收光谱。
图2是表示用标记用化合物6和抗EMA抗体结合，得到的本发明诊断用标记物(74μg/ml)的紫外·可见光吸收光谱。
图3是表示使标记用化合物18和人体IgG结合的本发明诊断用标记物的荧光光谱。图中，实线表示发光光谱、虚线表示激发光谱。
实施发明的最佳方案
上述用通式(I)及(II)表示的荧光性官能基，通过结合在母核的-Y-CO-基的羰基，与检测系统结合。上述通式(I)中，R1及R2分别独立地表示氢原子、烷基、烷氧基或磺酸基(-SO3H)。R1及R2分别可在苯基上的任意位置上取代。作为烷基，可使用碳数1～6左右的直链或支链的低级烷基，优选的是碳数1～4的直链或支链的低级烷基。例如，适宜的是甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等。
作为R1及R2表示的芳基，可使用取代的或未取代的苯基、萘基、吡啶基等。作为烷氧基，可使用碳数1～6左右，优选的是碳数1～4的直链或支链的低级烷氧基，更具体地，可使用甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。作为磺酸基，除了游离态的-SO3H基之外，可使用磺酸基的碱性加成盐(磺酸盐基)，例如钠盐、钾盐等。在这些之中，优选的，R1及R2分别独立地是氢原子、烷基、烷氧基或磺酸盐基。
R3表示烷基、磺酸烷基或氨基取代烷基。在这些基中，作为烷基，例如可使用上述的烷基。磺酸烷基的磺酸基或氨基取代烷基的氨基，也可分别取代在烷基上的任何位置上，例如可使用取代在烷基的末端上的。
磺酸基及氨基也可分别形成碱性加成盐及酸加成盐。例如，优选的是磺酸形成钠盐和钾盐的、氨基形成卤化铵等盐的、氨基季胺化的等。另外，作为氨基，可使用取代或未取代的氨基。作为磺酸烷基或氨基取代烷基的例子，例如可举出磺酸甲基(-CH2SO3H)、磺酸乙基、氨基甲基、氨基乙基、甲基氨基乙基、及它们的盐等。
在用式(I)表示的荧光性官能基中，根据需要，X-表示卤离子、醋酸根离子、高氯酸根离子、碳酸根离子等的阴离子种。用X-表示的这些阴离子，起到消除Y-CO-基取代的母核内氮原子上的正电荷，将整个用式(I)表示的荧光性官能基维持中性的作用。因此，例如，在用式(I)表示的荧光性官能基中的R1、R2及R3中的一个基是阴离子性的基时，由于其基的负电荷消除母核内的季氮原子上的正电荷，形成分子内两性离子，所以有时不需要X-。另一方面，R1或R2中的任何一个是磺酸基、R3是氨基取代烷基时，由于在这些基之间，电荷平衡，所以有时需要X-。
在用上述通式(II)表示的荧光性官能基中，R4及R5分别独立地表示氢原子、烷基、烷氧基或磺酸盐基。R4及R5可分别取代在苯基上的任意位置上。作为烷基及烷氧基，可使用上述的，作为磺酸盐基(-SO3 -M+：M+表示碱金属离子，可与Q-的抗衡离子的M+相同或不同)，例如可使用钠磺酸盐基或钾磺酸盐基等。
R6表示直链或支链的亚烷基，例如，可使用碳数1～6左右，优选的是碳数2～5的直链或支链的低级亚烷基，最优选的是亚丙基、正丁基、或亚戊基。在R6上取代的-SO3 -基，可取代在该亚烷基的任意位置上，但例如，优选的使用取代在亚烷基的末端上的。更具体地，作为R6-SO3 -，例如，优选的是用-(CH2)k-SO3 -(k表示2～4的整数)表示的基等。
M+表示碱金属离子。作为碱金属离子，优选的可使用钠离子或钾离子。Q-表示卤离子、高氯酸离子、或硫氰酸离子，优选的是使用氯离子、溴离子或碘离子等。这些之中，特别优选的是碘离子。不拘泥任何特定的理论，但上述荧光性官能基具有Y-CO-基取代的氮原子上的正电荷(用上述式中N+表示)和来自R3-SO3 -的负电荷，但若用M+Q-表示的碱金属盐共存时，则在氮原子上的正电荷(用上述式中N+表示)和Q-之间，以及R3-SO3 -和M+之间，分别形成离子键。其结果，阻止分子内形成抗衡离子，维持整个分子的离子性，显著增大水溶性。
在上述通式(I)及(II)中，Y表示碳数1～10的直链或支链的烷基，优选的是碳数3～5的直链或支链的亚烷基，最优选的是亚丙基、亚丁基或亚戊基。另外，Y表示含有从氧原子、氮原子及硫原子组成群选出的，1个以上的原子的碳数1～10的直链或支链的烷基。作为用-Y-CO-表示的基，例如可利用-CH2-CO-；-(CH2)2-CO-；-(CH2)3-CO-；-(CH2)4-CO-；-(CH2)5-CO-；-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-；-(CH2)2-CO-NH-(CH2)5-CO-；-(CH2)3-CO-NH-(CH2)5-CO-；-(CH2)4-CO-NH-(CH2)5-CO-；-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-NH-(CH2)2-CO-；-(CH2)4-CO-(N，N′-哌嗪基(piperadinyl))-(CH2)2-CO、(N，N′-哌嗪基表示在哌嗪的1的位置上取代-(CH2)4-CO-、在4的位置上取代-(CH2)2-Z基，以下相同)；另外，-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-(N，N′-哌嗪基)-(CH2)2-CO-等。
另外，-Y-CO-基的羰基，也可含有碳数1～10的直链或支链的亚烷基，从氧原子、氮原子及硫原子组成群选出的1个原子的碳数1～10的直链或支链的亚烷基；或通过-NH-NH-基等与检测系统结合。
在本发明的诊断用标记物中，在制造具有用式(I)表示的荧光性官能基的诊断用标记物时，优选的，作为标记用化合物，使用上述式(III)的化合物。另外，在制造具有用式(II)表示的荧光性官能基的本发明诊断用标记物时，优选的是使用下述式(V)的标记用化合物。
在上述通式(III)及(V)的化合物中，作为用Y-CO-Z表示的基，例如可使用-CH2-CO-Z；-(CH2)2-CO-Z；-(CH2)3-CO-Z；-(CH2)4-CO-Z；-(CH2)5-CO-Z；-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-Z；-(CH2)2-CO-NH-(CH2)5-CO-Z；-(CH2)3-CO-NH-(CH2)5-CO-Z；-(CH2)4-CO-NH-(CH2)5-CO-Z；-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-NH-(CH2)2-CO-Z；-(CH2)4-CO-(N，N′-哌嗪基)-(CH2)2-Z；。另外，-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-(N，N′-哌嗪基)-(CH2)2-Z等。
在用Z表示的基中，作为W，可适当使用相当于上述Y-CO-Z例中的Y的基。另外，N-磺基丁二酰亚氨氧基的磺酸基的抗衡离子的M+和式(V)的标记用化合物中的Q-的抗衡离子的M+，可相同，也可不同，但优选的，两者都是钠离子。上述的标记用化合物中的式(V)表示的化合物，例如可通过制造在用式(V)表示的化合物中，不存在用M+X-表示的碱金属盐的抗衡离子型的化合物后，将该化合物，以高浓度溶解在二甲基亚砜或二甲基甲酰胺等的溶剂中，在该溶液中，添加碱金属盐，而容易地制造。
另外，在实施例中，具体地说明适宜使用制造本发明诊断用标记物的本发明化合物的制造例，但对于本专业人员，通过参照该实施例，可理解到适当改变初始原料、药剂、反应条件等，容易地制造本发明的化合物。
在作为Z，使用N-丁二酰亚氨氧基及N-磺基丁二酰亚氨氧基时，由于这些基，与Z结合的羰基同时形成反应性的活性酯，所以含在检测系统的氨基(H2N-R)，与该活性酯中的Z置换，形成-Y-CO-NH-R。另外，作为Z，使用2-(N-马来酰亚氨)-烷基时，含在检测系统的硫醇基(HS-R)进行反应，形成-Y-CO-烷基-S-R。进而，Z是-NH-NH2时，含在检测系统的还原糖末端的醛基(OHC-R)进行反应，形成-Y-CO-NH-NH-CO-R。
因此，通过使标记用化合物与检测系统反应，相当于连接在用式(III)或(V)表示的标记用化合物的母环及结合在母环的连接部分的-Y-CO-部，作为荧光性的官能基，保存在本发明的诊断用标记物中。进而，对于用上述方法制造具有这种化学结构的本发明诊断用标记物，没有限制，当然用任何方法制造的，也包括在本发明范围内。
另外，在用上述式(I)及(II)表示的荧光性官能基，用式(III)及(V)表示的化合物，以及实施例中流程图所述的化合物中，是将氮原子上的正电荷(用上述式中N+表示)，固定在母环中的一个氮原子上的，但通过共轭双键，可将正电荷移到另一个氮原子上，这是本专业人员容易理解的。因此，这样的共轭，互变异构体，当然是完全包括在本
发明范围内的。
作为应与上述荧光性官能基结合的检测系统，可使用识别对于癌特异性高的抗体等各种抗原的抗体、作为探针可使用的核酸、或可用于生物素-卵白素等用于扩增系的扩增系物质等。作为抗体，例如可使用与癌细胞和癌组织，优选的是特异地结合在初期癌细胞和初期癌组织的抗癌抗原抗体。例如除了对于CEA、AFP、CA19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、span-1、CA72-4、CA125、HCG、p53、STN(シアリルTn抗原)、C-erb B-2蛋白特异反应的胃的抗肿瘤抗体之外，可利用对于食道癌、大肠癌、直肠癌、皮肤癌、子宫癌等肿瘤抗原特异反应的抗肿瘤抗体等。另外，也可使用抗病原体蛋白抗体。作为核酸，可使用可作为对于特定的基因乃至病原体基因探针使用的核酸。
作为检测系统，使用上述抗体和核酸时，由于本发明诊断用标记物所含的上述检测系统，与癌抗原和癌基因等特异地结合，所以用本发明的诊断用标记物可将癌细胞和癌组织等病灶免疫地染色。然后，使用红外线激光等，照射近红外线乃至远红外线，可确认发出荧光的病灶。
本发明诊断用标记物的另一个形式，是将荧光性官能基导入到作为检测系统的卵白素或生物素等扩增系物质中。例如，通过将以往通用的生物素标记化抗癌抗原抗体等用于生物体，可使抗癌抗原抗体和生物素标记化抗体结合，进行标记。进行这样标记后，通过将作为检测系统，含有卵白素的本发明诊断用标记物，与生物素标记化抗体结合，可用本发明的诊断标记物，使由卵白素标记化抗体的标记扩增，通过红外线激光等，可检测出初期癌。作为扩增系物质，只要可扩增上述标记的，可使用任何一种。
进而，作为本发明诊断用标记物的检测系统，也可使用将上述扩增系物质，与上述抗体或核酸结合的产物。例如，作为本发明诊断用标记物的检测系统。可使用将卵白素与抗癌抗原抗体结合的抗体。或者，作为本发明的诊断用标记物的检测系统，也可使用二次抗体。上述说明的检测系统，就是例子，可用于本发明诊断用标记物的检测系统，不限于上面所述的。只要是对于用于检查、诊断目的的标的细胞或标的组织具有实质特异地结合性质的，任意的检测系统都可使用。
本发明诊断用标记物，与上述荧光性官能基和检测系统不限于直接或通过接头而结合，例如也可通过将荧光性官能基和检测系统导入到白蛋白等蛋白中，通过白蛋白等蛋白，将荧光性官能基与检测系统结合。在白蛋白等蛋白中，可将上述荧光性官能基导入1个或2个以上，优选的可导入约10个以上，由于容易导入抗体等检测系统，所以使用这种蛋白的诊断用标记物是本发明优良的方案。
进而，本发明另一方案的诊断用标记物，是由通过照射600～800nm波长的激发光，发出780nm以上，优选的是发出780～840nm以上波长荧光的荧光性官能基结合的检测系统组成。作为这种荧光性官能基，除了来自上述式(I)及式(II)的之外，只要通过照射600～800nm波长的激发光，发出780nm以上波长的荧光的，都可使用。根据诊断用标记物使用目的和使用的激发光种类，可由本专业人员适当选择为导入这种荧光性官能基的化合物。
为将这样的荧光性官能基与检测系统结合，例如可使用花青苷类、酞青类、二硫醇镍络合类、萘醌·蒽醌类、靛酚系、偶氮类等的近红外线吸收性化合物。将这些的化合物，直接或通过接头与检测系统结合时，由于化合物的吸收波长往往移动到长波长侧，所以用于导入荧光性官能基的化合物的激发光波长下降到600nm也无妨。另外，为将荧光性官能基导入到检测系统，使用的上述化合物，最好在上述通式(III)或(V)中，具有用Z表示的基。在这样的基不存在时，本专业人员，可通过可利用的接头，使荧光性官能基与检测系统结合。
由本发明提供的诊断药，其特征是含有上述诊断用标记物作为有效成分。本发明的诊断药可通过近红外线乃至远红外线进行激发，由于在诊断时，不引起生物体组织和DNA的损伤，所以是有用的。另外，本发明的诊断药具有水溶性极其优良的特点。在本发明的诊断药中，特别优选的是含有在照射780nm的激发光时，发出比820nm左右更长波长的荧光的诊断用标记物的诊断药。另外，本发明的诊断药，也可含有1种或1种以上的诊断用标记物。
本发明的诊断药在于将上述诊断用标记物，作成溶解在各种缓冲液等的水溶性介质，优选的是溶解在生理食盐水和磷酸缓冲液等的缓冲液中的溶液剂的形态，或在诊断、检查用时，添加生理食盐水和磷酸缓冲液等的缓冲液，作成可溶解的微粒子状粉末和冷冻干燥粉末形态的固形剂等形式提供，但诊断药的形态不受上述的限制，本专业人员可根据目的等，进行适当选择。
为制造本发明的诊断药，可使用作为药理学、制药学上容许的添加剂，例如赋形剂、崩解剂、乃至崩解辅助剂、粘合剂、润滑剂、被覆剂、色素、稀释剂、基剂、溶解剂乃至溶解辅助剂、等渗透压剂、pH调节剂、稳定剂、喷射剂及粘合剂等。例如也可添加葡萄糖、乳糖、D-甘露醇、淀粉或结晶纤维素等赋形剂；羧甲基纤维素、淀粉、或羧甲基纤维素钙等的崩解剂或崩解辅助剂；凡士林、液体石蜡、聚乙二醇、明胶、高岭土、甘油、蒸馏水或硬脂性等基剂；葡萄糖、氯化钠、D-甘露醇、甘油等等渗透压剂；无机酸、有机酸、无机碱或有机碱等的pH调节剂；维生素A、维生素E、可给予辅酶Q等稳定化的药剂等的制剂用添加物。
对于含有本发明诊断用标记物的诊断药的使用方法，例如若对于使用红外线内窥镜的检查方法加以说明，将怀疑存在病灶的组织，在内窥镜下，喷雾或涂敷上述诊断药(浓度为0.1～1,000mg/ml左右的)，染色病变部，进行适当洗涤，从组织中除去多余诊断药后，通过照射近红外线乃至远红外线，更具体地，例如照射600～800nm，优选的是780nm左右波长的激发光，可检测发出荧光的病灶部。本发明诊断用标记物，具有可直接适用于生物体的特点，但本发明诊断用标记物的使用状态不限于适用生物体，当然对于石腊固定化标本等的固定化标本也适用。
荧光检测时，例如可使用红外线内窥镜或红外线显微镜等手段，例如可使用1个或2个以上组合的，具有透过特性的过滤器，具体地，是具有遮断激发光特性的过滤器和荧光检测用过滤器。在将本发明诊断用标记物用于生物体进行内窥镜检查时，作为内窥镜，可使用倍率是10～1,000左右的，例如优选的是使用具有显微镜水平倍率的红外线内窥镜等。另外，对于内窥镜，优选的是设置有本发明诊断药的喷雾或涂敷手段和洗涤手段的。
在将本发明诊断用标记物用于摘出到生物体外的组织和标本等时，荧光检测时，可使用红外线显微镜。另外，在通常光下，观察标本，确认染色部位后，在暗室内，红外线光源下，用红外线胶片进行摄影，或收录在录像片上，用计算机进行图像解析。
实施例
以下，用实施例进一步具体地说明本发明，但本发明的范围不受以下实施例限制。
例1：标记用化合物的制造
按照以下的流程图，用于制造本发明诊断用标记物的标记用化合物，制造式(III)的化合物。另外，以下制造例的化合物号，对应于流程图中的化合物号。
Figure C9619285400171
Figure C9619285400181
在化合物1(5g，23.9mmol，由第一化学药品株式会社得到的)/乙腈100ml中，加入碘乙烷(2.84ml，35.5mmol)，回流5小时。在减压下，浓缩反应液，在残渣中，加入乙醚200ml，结晶化后，过滤得到的结晶，用乙醚洗涤后，在减压下进行干燥，得到淡红褐色粉末的化合物2。收量6.83g(收率78.2％)。
在化合物1(5g，23.9mmol)/DMF 100ml中，加入6-溴己酸乙酯(6.32ml，35.5mmol)，在80℃下，加热16小时。在减压下，浓缩反应液，在残渣中，加入乙醚200ml，结晶化后，过滤得到的结晶，用乙醚洗涤，在减压下进行干燥。加入1M氢氧化钠水溶液/甲醇＝1/1混合溶液30ml，在室温下，搅拌2小时。减压蒸出甲醇，用4M盐酸水溶液中和水溶液后，用氯仿洗涤3次。在减压下浓缩水溶液，得到红色固体的化合物3。收量5.75g(收率744％)。
将化合物2(5g，13.7mmol)和戊烯二醛二缩苯胺盐酸盐(3.90g，13.7mmol)，悬浮在无水醋酸50ml中，在100℃下，加热1.5小时。将红色溶液注入到300ml水中，过滤生成的黑红色固体。用水洗涤后，在减压下，进行干燥，得到黑红色粉末的化合物4。收量是6.02g(收率101％)。
将化合物4(220mg，0.505mmol)和化合物3(164mg，0.507mmol)，溶解在吡啶3ml中，在50℃下，搅拌1小时。减压浓缩反应混合物，用硅胶柱(溶剂：1～20％甲醇/氯仿)精制得到的残渣，得到黑绿色固体的化合物5。收量是49mg(收率15.5％)。
在化合物5(40mg，64μmol)/DMF 1ml中，加入N-羟基琥珀酸酐(8.8mg，76μmol)和N，N′-二环己基甲酰亚胺(DCC，26.4mg，0.128mmol)，在4℃下，反应1晚后，在反应液中，加入乙醚10ml，进而，用乙醛洗涤生成的残渣3次。将该固体，溶解在氯仿400μl中，加入0.1M盐酸水溶液200μl，搅拌后，分离氯仿相，水洗3次。在减压下，浓缩氯仿溶液，得到黑绿色固体的化合物6〔式(III)的标记用化合物〕。收量38mg(收率78.5％)。MS(FAB)m/e＝720(M+)；荧光光谱：λex＝769nm，λem＝820nm(10％DMSO/水)。
在化合物5(20mg，32μmol)/DMF 1ml中，加入N-羟基琥珀酸酐磺酸钠(8.3mg，38μmol)和N，N′-二环己基甲酰亚胺(13.2mg，64μmol)，在4℃下，使其反应1夜后，过滤。在滤液中，加入乙醚10ml，进而，用乙醚洗涤生成的残渣3次。将该固体溶解在DMF 400μl中，加入0.1M盐酸水溶液200μl，搅拌后，分离氯仿相，水洗3次。在减压下，浓缩氯仿溶液，得到黑绿色固体的化合物7〔式(III)的标记用化合物〕。收量是17mg(收率为66.4％)。MS(FAB)m/e＝822(M+Na)；荧光光谱：λex＝769nm，λem＝820nm(10％DMSO/水)。
在化合物5(20mg，32μmol)/DMF 0.5ml中，加入N-(2-(N′-马来酰亚胺)乙基)哌嗪二盐酸盐(PEM，4.4mg，38μmol)和三乙胺(TEA，20μl，0.146mmol)、及DCC(10.2mg，49μmol)，在4℃下，反应1晚后，在反应液中，加入乙醚10ml，进而，用乙醚洗涤生成的残渣3次。将该固体，溶解在氯仿400μl中，加入0.1M盐酸水溶液200μl，搅拌后，分离氯仿相，水洗3次。在减压下，浓缩氯仿，得到黑绿色固体的化合物8〔式(III)的标记用化合物〕。收量是20mg(收率是70.5％)。MS(FAB)m/e＝814(M+)；荧光光谱：λex＝773nm，λem＝821nm(1 0％DMSO/水)。
例2：标记用化合物的制造
在化合物6(2mg，26.4μmol)/DMF 0.5ml中，加入肼-盐酸盐(9.0mg，0.131mmol)，在室温下，反应1晚。过滤反应液，减压浓缩滤液后，将残渣溶解在氯仿0.5ml中，水洗氯仿溶液3次。在减压下，浓缩氯仿相，得到黑绿色固体的化合物9。收量是16mg(收率是90.0％)。MS(FAB)m/e＝637(M+)；荧光光谱：λex＝771nm，λem＝820nm(10％DMSO/水)。
将化合物10(5.0g，15.1mmol)和戊烯二醛二缩苯胺盐酸盐(4.40g，15.1mmol)，悬浮在醋酸酐20ml和醋酸300ml的混合溶液中，在回流温度下，加热5小时。减压浓缩红色溶液，在得到的残渣中，加入醋酸乙酯和水的混合溶液200ml，使其悬浮，过滤得到黑红色固体。用水洗涤后，在减压下进行干燥，得到黑红色粉末的化合物11。收量是5.33g(收率是65.2％)。
将化合物11(167mg，0.308mmol)和化合物3(100mg，0.309mmol)，溶解在吡啶3ml中，在50℃下，搅拌1小时。在减压下，浓缩反应混合物，将得到的残渣，溶解在10ml水中，使溶液的pH达到3后，用交联葡聚糖LH20柱(溶剂：水)精制，得到黑绿色固体的化合物12。收量是51mg(收率是23.1％)。
在1ml化合物12(30mg，41.8μmol)/50 v/v％THF水溶液中，加入N-羟基琥珀酸酐磺酸钠(16.8mg，77.4μmol)和N，N′-二环己基甲酰亚胺(25.8mg，0.125mmol)，在4℃下，使其反应1晚后，过滤，在20℃以下，减压下浓缩滤液。在残渣中，加入醋酸乙酯10ml，进而，用乙醚洗涤生成的结晶3次。将该结晶溶解在水200μl中，用交联葡聚糖LH20柱(溶剂：水)精制，得到黑绿色固体的化合物13〔式(III)的标记用化合物〕。收量是34mg(收率是88.8％)。MS(FAB)m/e＝892(M-)；荧光光谱：λex＝771nm，λem＝822nm(水)。
例3：标记用化合物的制造
按照以下流程图，制造用于制造本发明诊断用标记物的式(V)的标记用化合物。另外，以下的制造例的化合物号，对应于流程图中的化合物号。
Figure C9619285400211
将化合物14(5.0g，14.5mmol)和戊烯二醛二缩苯胺盐酸盐(4.23g，14.5mmol)，悬浮在醋酸酐20ml和醋酸300ml的混合溶液中，在回流温度下，加热5小时。减压浓缩红色溶液，在得到的残渣中，加入醋酸乙酯和水的混合溶液200ml，使其悬浮，过滤得到黑红色固体。用水洗涤后，减压下干燥，得到黑红色粉末的化合物15。收量是5.20g(收率是66.1％)。
将化合物15(300mg，0.553mmol)和化合物3(179mg，0.553mmol)，溶解在5ml的吡啶中，在50℃下，搅拌1小时。在减压下，浓缩反应混合物，将得到的残渣，溶解在10ml水中，使溶液的pH达到3后，用交联葡聚糖LH20柱(溶剂：甲醇)进行精制，得到黑绿色固体的化合物16。收量是105mg(收率是25.9％)。
在化合物16(106mg，0.145mmol)/50 v/v％THF水溶液3ml中，加入N-羟基琥珀酸酐磺酸钠(65.2mg，0.287mmol)和N，N′-二环己基甲酰亚胺(129mg，0.596mmol)，在4℃下，使其反应1夜后，进行过滤，在20℃以下，减压浓缩滤液。在残渣中，加入醋酸乙酯10ml，进而，用乙醚，洗涤生成的结晶3次，得到黑绿色固体的化合物17。收量是110mg(收率80.7％)。MS(FAB)m/e＝906(M-)；荧光光谱：λex＝768nm，λem＝807nm(水)。
将上述化合物17(100mg，0.11mmol)，溶解在2ml的甲醇中，加入碘化钠1g(6.7mmol)的甲醇5ml溶液。将甲醇减压浓缩到1/2，在4℃下，使其冷却1夜后，滤得析出结晶。用减压干燥器干燥得到的绿色结晶，得到化合物18〔式(V)的标记用化合物〕(85mg，收率72％)。测定碘化钠的盐形成前(抗衡离子型)及盐形成后的水溶性数据及红外线吸收光谱数据(IR)。另外，用Schniger法求出碘含量。
对于引入碘化钠成盐的化合物18和作为原料用的抗衡离子型的吲哚花青绿N-己酸磺基琥珀酸亚胺酯(化合物17)，进行红外吸收光谱变化，在抗衡离子型化合物17中，观察的2360及1740cm-1的吸收，对于化合物18则消失了(参照图1：(a)表示化合物18、(b)表示化合物17，即表示盐形成前的)。从这些结果表明，对于形成分子内抗衡离子时和形成碘化钠的复盐时，结晶结构是变化的。
例4：标记用化合物的制造
按照例3的方法，制造吲哚花青绿N-丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(化合物19)。将该化合物19(150mg，0.17mmol)溶解在甲醇3ml中，加入碘化钠1.5g(10mmol)的甲醇8ml溶液。将甲醇减压浓缩到1/2，在4℃下冷却1夜后，滤取析出结晶。用减压干燥器干燥得到的绿色结晶，得到化合物20〔式(V)的标记用化合物〕(117mg，收率66％)。测定碘化钠的盐形成前后的水溶性数据及红外线吸收光谱数据(IR)。另外，用Schniger法求得碘含量。
例5：标记用化合物的制造
按照例3的方法，制造吲哚花青绿-N-己酸磺基琥珀酰亚胺酯(化合物21)。将该化合物21(100mg，0.11mmol)溶解在甲醇2ml中，加入高氯酸钠0.3g(2.5mmol)的甲醇20ml溶液。将甲醇减压浓缩到1/4，在4℃下，冷却1夜后，滤得析出结晶。用减压干燥器干燥得到的绿色结晶，得到化合物22〔式(V)的标记用化合物〕23mg(收率21％)。测定高氯酸钠形成盐前后的水溶性数据及IR。
                       表1
标记用化合物         抗衡离子型           形成复盐型
例3                  化合物17             化合物18
   水溶性：          1mg/10ml以上         1mg/0.8ml
   IR(cm-1)：       2360，1740           左边吸收消失
   碘含量：          -                    12.3％
例4                  化合物19             化合物20
   水溶性：          1mg/10ml以上         1mg/0.9ml
   IR(cm-1)：       2370，1790           左边吸收消失
   碘含量：          -                    13.5％
例5                  化合物21             化合物22
   水溶性：          1mg/10ml以上         1mg/5ml
   IR(cm-1)：       2370，1790           左边吸收消失化合物18化合物20
Figure C9619285400243
化合物22
例6：标记用化合物的制造
按照例2的方法，用碘化钠的甲醇溶液处理化合物13，得到化合物23。将作为原料所用的化合物13的红外线吸收光谱和标记用化合物23的红外线吸收光谱进行比较，在化合物13中观测的2360及1740cm-1的吸收，在化合物23中，未观察到。
例7：诊断用标记物的制造
(a)抗体的精制
人含有抗EMA(Epitherial Membrane Antigen)抗体的培养上清液(ダコ社制，M613)，使用MabTrap GII(弗尔马西亚社制)，如下所述，精制抗EMA单克隆抗体。在4ml的培养上清液中，加入结合缓冲液4ml，加入到预先用结合缓冲液平衡的MabTrap GII柱上。用结合缓冲液5ml洗涤后，加入洗脱缓冲液3ml，以每0.5ml分取洗脱缓冲液。用分光光度计，收集280nm的吸光度是0.05以上的级分，作为精制IgG级分，使用PD-10柱(弗尔马西亚社制)，在0.1M磷酸缓冲液(pH7.5)中，进行缓冲液交换，通过SDS-PAGE(第一化学药品株式会社制)，确认精制度。从培养上清液4ml，得到精制抗EMA单克隆抗体725μg。
(b)抗体和标记用化合物的结合
在含有上述精制抗体500μg的100mM磷酸缓冲液0.5ml中，加入ICG-osu(上述化合物6)的DMF溶液0.125ml(0.8mg/ml)，在30℃下，静置30分钟。将该反应混合液，加入到用预先相同的反应缓冲液平衡了的PD-10柱中，分离未反应的ICG-osu。进而，使用PD-10柱，将蛋白级分的缓冲液，与0.1M磷酸缓冲液-0.05％叠氮化钠(pH7.4)交换，得到抗EMA抗体结合在标记用化合物(化合物6)的本发明诊断用74蛋白μg/ml。然后，在保存期间，添加0.1％的BSA。紫外·可见吸收光谱，如图2所示。
上述的光谱测定条件如下。测定仪器：日立U-3200分光光度计；测定溶剂：100mM磷酸缓冲液(pH7.4)，0.05％叠氮化钠；扫描速度：300.0nm/min。然后，在保存时，添加0.1％的BSA。对于通过BCA蛋白鉴定试剂(ピ了ス社制)得到的抗体浓度和从标记用化合物的DMSO中的分子吸光系数求得的标记用化合物的抗体的结合数，约是12mol标记用化合物/mol抗体。
例8：诊断用标记物的制造
将化合物18(1mg)，溶解在0.94ml水中，作成1mM溶液。将人体IgG 1mg，溶解在pH8.5的50mM碳酸钠缓冲液1ml中，在该溶液中，加入含有化合物18的上述溶液0.2ml，在30℃下，使其反应1小时。将反应液加入到交联葡聚糖G-25柱中，分离本发明的诊断用标记物。作为分离用的缓冲液，使用50mM磷酸缓冲液(pH7.4)。未反应的化合物18，留在交联葡聚糖凝胶的上端，与诊断用标记物的分离是良好的。将得到的诊断用标记物，进行冷冻干燥，在-20℃下，冷冻保存。取诊断用标记物1mg，溶解在100ml的50mM磷酸缓冲液(pH7.4)中，测定荧光光谱的结果，如图3所示。
例9：诊断用标记物的制造
在含有由例7得到的精制抗体500μg的100mM磷酸缓冲液0.5ml中，加入化合物18的DMF溶液0.125ml(0.8mg/ml)，在30℃下，静置30分钟。将该反应混合物，加入到用预先相同的反应缓冲液平衡了的PD-10柱中，分离未反应的化合物18。进而，使用PD-10柱，将蛋白级分的缓冲液，与0.1M磷酸缓冲液-0.05％叠氮化钠(pH7.4)进行交换，得到化合物18结合在抗EMA抗体的本发明诊断用标记物74蛋白μg/ml。然后，在保存时，添加0.1％的BSA。
例10：标记用化合物和蛋白的结合
将BSA(和光纯药工业制)10mg(0.151μmol)溶解在HEPES缓冲液3.0ml中，作成BSA溶液。将标记用化合物(化合物6)2.0mg(2.64μmol)溶解在DMSO 150μl中，与上述BSA溶液混合，在冰箱中放置1夜。然后，与上述方法相同，使用PD-10柱，进行凝胶过滤，得到在BSA中导入来自标记用化合物的荧光性官能基的标记蛋白。另外，在反应终了后的凝胶过滤时，由于来自标记用化合物的绿色溶液不残存在柱中，所以可认为标记化合物全部与BSA反应，每1分子的BSA，约导入17.5分子的荧光性官能基。
例11：诊断用标记物的制造
(a)在含有BSA(10mg)的100mM磷酸缓冲液(pH7.5)5ml中，加入化合物6的DMF溶液0.5ml(4.6mg/ml)，在30℃下静置30分钟。将该反应混合液，加入到预先用相同反应缓冲液平衡的交联葡聚糖柱中，从未反应的化合物6。分离标记用化合物和蛋白的结合体(标记化BSA)。使用交联葡聚糖G25柱，将含有结合体的级分的缓冲液，与20mM磷酸缓冲液-0.15M NaCl(pH7.0)交换，得到导入荧光性官能基的BSA约8mg。
(b)在抗CEA抗体1.0mg/ml(0.1M柠檬酸/0.15M NaCl，pH4.0)中，加入胃蛋白酶，以使胃蛋白酶浓度达到0.004mg/ml，37℃反应2小时。将反应液，添加到预先用20mM磷酸缓冲液、0.15M NaCl、1mM EDTA平衡了的TSKgel G 3000SW中，从未消化的IgG及消化片断，分离F(ab′)2(约500μg)。在上述的F(ab′)2级分中，添加2-氨基乙硫醇盐酸盐，以使其最终浓度达到10mM，在37℃下，反应90分钟。将反应液加到交联葡聚糖G25柱中，除去2-氨基乙硫醇，得到含有Fab′的溶液。
(c)在标记化BSA(2mg，20mM磷酸缓冲液-0.15M NaCl，pH7.0；PBS)中，一边搅拌，一边滴入50μl的sulfo-SMCS溶液(sulfo-EMCS，(株)同仁化学研究所，1mg/ml，PBS)，在室温下，反应20分钟。将该反应液，加在预先用PBS平衡化的交联葡聚糖G25柱中，分离用sulfo-SMCS活化了的标记化BSA。将该溶液添加到上述(b)的Fab′溶液中，在搅拌下，在室温下，反应2小时。反应终了后，通过使用TSKgel G3000SW的凝胶过滤，分离，精制反应混合液，得到导入荧光性官能基和Fab′的BSA。
例12：使用诊断用标记物的免疫组织化学的染色
使用上述例6的诊断用标记物作为本发明的诊断用标记物，使诊断用标记物与确认了抗EMA抗体的染色性的食道粘膜的石蜡切片(面积约10×10mm，厚度为2.5μm)或食道癌的摘出生切片作用，用ABC法(卵蛋白·生物素·复合物法)使其发色，在显微镜下及通常内窥镜下，进行观察，确认染色的程度。另外，如上所述，将发色了的标本，在红外线内窥镜下观察，鉴定染色部位，与通过通常内窥镜观察鉴定的染色部位进行比较。进而，稀释成诊断用标记物倍数浓度，用通常内窥镜及红外线内窥镜观察，研究两者的识别能力。
将诊断用标记物的5倍稀释液和10倍稀释液用于染色，但在显微镜下发色良好，即使与作为对照用的抗EMA抗体(稀释50倍)比较，也可确定相同程度的染色性。对于用通常内窥镜观察标本，可确认稀释10倍的诊断用标记物，与对照大致相同地，在食道粘膜上沉淀DAB(二氨基联苯胺)。
产业上的可利用性
通过使用本发明诊断用标记物，例如使用红外线内窥镜等，可简便且正确地进行食道癌、胃癌或大肠癌等上皮性组织的恶性新生物的早期诊断和确定，诊断外科手术时的病灶。通过本发明诊断用标记物进行的检查和诊断，由于可不必担心由紫外线激发引起的生物体组织和DNA的损伤，而直接对生物体检查和诊断，所以作为生物体免疫组织染色法是有用的。
另外，由于含在本发明诊断用标记物的标记用化合物，具有极高的水溶性，所以本发明的诊断用标记物，不被胃肠道吸收，可极安全地进行检查和诊断，所以是有用的。

Claims (12)

1.包括(a)检测系统，及(b)与该检测系统结合的下式表示的荧光性官能基的诊断用标记物，并且用近红外线或远红外线激发光照射时荧光官能基团能够发出780nm以上波长的荧光，所述检测系统选自抗体、核酸和生物素-卵白素系统
Figure C9619285400021
式中，R1及R2分别独立地表示氢原子、烷基、芳基、烷氧基或磺酸基；R3表示烷基、磺酸烷基或氨基取代烷基；X-表示阴离子种；Y表示碳数1～10的亚烷基、或含有从氧原子、氮原子及硫原子组成群选出的1个以上原子的碳数1～10的亚烷基。
2.包括(a)检测系统，及(b)与该检测系统结合的下式表示的荧光性官能基的诊断用标记物，并且用近红外线或远红外线激发光照射时荧光官能基团能够发出780nm以上波长的荧光，
式中，R4及R5分别独立地表示氢原子、烷基、烷氧基或磺酸盐基；R6表示亚烷基；M+表示碱金属离子；Q-表示卤离子、高氯酸根离子、或硫氰酸根离子；Y表示碳数1～10的亚烷基、或含有从氧原子、氮原子及硫原子组成群选出的1个以上原子的碳数1～10的亚烷基。
3.权利要求1或2所述的诊断用标记物，其中，荧光性官能基是直接与检测系统结合的。
4.权利要求1或2所述的诊断用标记物，其中，荧光性官能基是通过接头或蛋白与检测系统结合的。
5.权利要求1所述的诊断用标记物，其中，作为抗体，使用抗癌抗原抗体，抗细菌抗体或抗病毒抗体。
6.诊断药，含有权利要求1～5中任何一项所述的诊断用标记物作为有效成分。
7.用下式表示的化合物，
Figure C9619285400031
式中，R1及R2分别独立地表示氢原子、烷基、芳基、烷氧基或磺酸基；R3表示烷基、磺酸烷基或氨基取代烷基；X-表示阴离子种；Z表示由下式组成群选出的基；
Figure C9619285400032
以及Y分别独立地表示碳数1～10的亚烷基、或含有由氧原子、氮原子及硫原子组成群选出的1个以上原子的碳数1～10的亚烷基。
8.权利要求7所述的化合物作为荧光标记剂的用途。
9.权利要求1所述的诊断用标记物的制造方法，其是包括使权利要求7所述的化合物与检测系统反应的工序。
10.用下式表示的化合物，
式中，R4及R5分别独立地表示氢原子、烷基、烷氧基或磺酸盐基；R6表示亚烷基；M+表示碱金属离子；Q-表示卤离子、高氯酸根离子、或硫氰酸根离子；Z表示用下式组成群选出的基；
Figure C9619285400042
W及Y分别独立地表示碳数1～10的亚烷基、或含有由氧原子、氮原子及硫原子组成群选出的1个以上原子的碳数1～10的亚烷基。
11.权利要求10所述的化合物作为荧光标记剂的用途。
12.权利要求2所述的诊断用标记物的制造方法，其包括使权利要求10所述的化合物，与检测系统反应的工序。
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