KR100397020B1 - 진단용마커 - Google Patents

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KR100397020B1
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스스무 이토
마사유키 노자와
마사노부 시가
가즈미 시사모토
가즈히로 다케사코
히로시 다케우치
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다이이치 가가쿠 야쿠힝 가부시키가이샤
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Abstract

(a) 예를 들면, 항체 등의 검출계, 및 (b) 전기 검출계에 결합한 하기식으로 표시되는 형광성 관능기를 포함하는 진단용 마커 :
Figure pct00018
상기 식에서,
R1및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 알킬기 등 ;
R3는 알킬기 또는 술폰산알킬기 등 ;
X-는 필요에 따라서 음이온 종 ; 및,
Y는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 또는 산소원자, 질소 원자, 및 유황 원자로 구성된 그룹에서 선택되는 1 이상의 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타낸다.
근적외선 내지 원적외선의 조사에 의해 780 nm 이상의 파장 형광을 발하므로, 적외선 내시경 검사 또는 외과 수술시의 병소의 특정 등에 유용하다.

Description

진단용 마커
최근, 전자내시경의 보급으로 내시경 진단이 용이해져, 위암이나 대장암 등이 초기암의 상태에서 정확하게 발견될 수 있게 되었다. 더우기, 미소(微小)암의 진단에 관해서는, 전자내시경과 통상내시경을 이용할 경우의 진단 효과는 거의 같은 정도이다. 이는 전자내시경의 기능을 활용한 새로운 진단방법이 아직 확립되지 않았다는 것을 의미하고 있다. 통상 내시경으로 식별할 수 없을 정도의 미소병변이라 하더라도, 전자내시경 하에서 탐지할 수 있는 표지항체로 미소병변을 표지할 수 있다면, 컴퓨터 처리를 이용하여 화상화함으로써 용이하게 검출할 수 있을 가능성이 있지만, 이러한 방법은 아직 실용화되지 않고 있다.
전자내시경을 이용한 상기와 같은 진단방법을 확립하기 위해서는, 면역조직화학적 염색법으로 생체조직을 직접 염색하는 것이 필요하다. 고정화 표본의 염색법은 이미 확립된 기술이다. 그렇지만, 비고정화표본의 염색법은 아직 당 업자가이용 가능한 기술이 아니다. 예를 들면, 비고정화 표본의 면역염색법에 대해서는 보고가 있지만 (사국의학잡지(四國醫學雜誌), 29, 180, 1987), 근적외선을 이용한 해당영역에서의 절제신선표본(切除新鮮標本)이나 생체조직 그 자체의 면역염색법은 아직 보고되어 있지 않다.
한편, 상기 진단방법에는 전자내시경 하에서 탐지할 수 있는 진단용 마커(표지화된 항체 등)도 필요하다. 자외선에 의해 여기되어 자외·가시광의 형광을 발하는 표지용 화합물을 항체에 결합시킨 진단용 마커가 알려져 있고, 생체 외로 적출된 조직 중에 존재하는 암세포나 암조직의 검출에 범용되고 있다. 그러나, 자외선에 의해 여기하는 형광성 진단용 마커를 이용하는 방법은 자외선에 의해 생체조직이나 DNA의 손상이 일어나기 때문에 생체에 적용할 수는 없다. 생체에 직접 적용할 수 있는 진단용 마커는 아직 알려져 있지 않다.
인도시아닌글린(ICG)은 적외선 내시경 하에서 특이한 흡수를 나타내서 형광을 발하는 것으로 알려져 있다. 적외선내시경을 이용하여 인도시아닌글린을 사용한 예가 알려져 있지만(Gastroenterological Endoscopy, 34, pp. 2287-2296, 1992; 및 Gastrointestinal Endoscopy, 40, pp. 621-2 ; 628, 1994), 이들은 모두 혈관 내에 ICG를 투여한 것이다. 또한, 일반적으로, 인도시아닌글린을 비롯한 형광성 색소는 소수성이 높고, 단체로 장기관 내로 투여될 경우 빠르게 흡수되기 때문에, 모핵 또는 측쇄부분에 친수성인 술포닐기 등을 도입함으로써 수용성을 높이고, 측정효율의 향상과 흡수 후의 독성 문제를 해결하려는 시도가 이루어지고 있다. 그렇지만, 인도시아닌글린과 같은 정도의 형광을 발하는 수용성의 표지용 화합물은 아직 알려져있지 않다.
본 발명의 목적은 면역 조직화학적 염색법에 의하여 생체 조직을 직접 염색하는데 유용한 진단용 마커를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 조직의 장해성이 적은 근적외선 내지 원적외선의 조사에 의해 형광을 발하고, 생체에 직접 사용할 수 있는 진단용 마커를 제공하는 것이다. 즉, 자외선 여기에 의한 생체조직이나 DNA 손상에 대한 염려 없이 생체에도 적용가능한 진단용 마커를 제공하는 것이 본 발명의 과제이다. 이러한 특징을 가지면서, 수용성이 우수한 진단용 마커를 제공하는 것도 본 발명의 목적 중 하나이다.
또한, 본 발명은 적외선 내시경 등을 이용한 준체내적(準體內的)인 식도암, 위암, 또는 대장암 등 상피성 조직에 있어서의 악성 신생물이나 감염증 등의 조기진단이나 외과수술시 병소의 특정 또는 진단에 유용한, 생체에 적용가능한 진단용 마커를 제공하는 것을 목적으로 하고 있다. 또, 이러한 진단용 마커를 이용하여, 생체조직을 면역조직화학적 염색법으로 직접 염색하는 방법을 제공하는 것도 본 발명의 다른 목적이다.
발명의 개시
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 노력하여, 인도시아닌글린의 유도체를 다양하게 합성함으로써, 근적외선 내지 원적외선에 의해 여기되어 형광을 발하는 인도시아닌글린 유도체를 제조하는데 성공하였다. 또, 본 발명자들은 상기의 인도시아닌글린 유도체를 표지용 화합물로서 이용하여 항암 항원항체 등과 반응시킴으로써, 생체에 직접 적용 가능한 진단용 마커를 제조할 수 있다는 것,및, 그러한 진단용 마커가 면역 조직화학적 염색법에 의해 생체조직을 직접 염색하는데 유용하다는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 높은 수용성을 가지는 진단용 마커를 제공하기 위해 예의 연구를 수행한 결과, 상기의 인도시아닌글린 유도체 중, 분자내 양쪽성 이온(zwitter ion)을 형성할 수 있는 화합물은, 양쪽성 이온의 형성에 의해 분자의 이온성이 저하하여 수용성이 손상되는 경우가 있지만, 이 유도체에 요오드화나트륨 등을 작용시키면, 분자 내에서 양쪽성 이온이 형성되지 않고, 분자 전체의 이온성이 유지되어 수용성이 현저히 증대한다는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 사실을 기초로 하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명은 (a) 검출계 및 (b) 전기 검출계에 결합한 하기 식(I)로 표시되는 형광성 관능기를 포함한 진단용 마커를 제공하는 것이다 :
Figure pct00001
상기 식에서,
R1및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 알킬기, 아릴기, 알콕시기, 또는 술폰산기 ;
R3는 알킬기, 술폰산 알킬기 또는 아미노 치환 알킬기 ;
X-는 필요에 따라 음이온종 ; 및,
Y는 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 또는 산소원자, 질소원자 및 유황원자로 구성된 그룹에서 선택되는 1 이상의 원자를 포함한 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타낸다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 의하면, (a) 검출계 및 (b) 전기 검출계에 결합한 하기 식(Ⅱ) 로 표시되는 형광성 관능기를 포함한 진단용 마커가 제공된다 :
Figure pct00002
상기 식에서,
R4및 R5는 각각 독립적으로 수소원자, 알킬기, 알콕시기, 또는 술포네이트기 ;
R6는 알킬렌기 ;
M+는 알칼리금속이온 ;
Q-는 할로겐 이온, 과염소산 이온, 또는 티오시안산 이온 ; 및,
Y는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 또는 산소원자, 질소원자, 및 유황원자로 구성된 그룹에서 선택되는 1 이상의 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타낸다.
또한, 본 발명의 또 다른 태양에 의하면, 상기 진단용 마커의 제조에 유용한 화합물로서, 하기의 식(Ⅲ)으로 표시되는 화합물 및 하기 식(Ⅴ)로 표시되는 화합물이 제공된다 :
Figure pct00003
상기 식에서,
R1및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 알킬기, 아릴기, 알콕시기 또는 술폰산기 ;
R3는 알킬기, 술폰산 알킬기 또는 아미노 치환 알킬기 ;
X-는 필요에 따라 음이온종 ;
Z는 하기의 식
Figure pct00004
으로 구성된 그룹에서 선택되는 기 ; 및,
W 및 Y는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 또는 산소원자, 질소원자 및 유황원자로 구성된 그룹에서 선택되는 1 이상의 원자를 포함한 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타낸다.
Figure pct00005
상기 식에서,
R4및 R5는 각각 독립적으로 수소원자, 알킬기, 알콕시기 또는 술포네이트기 ;
R6는 알킬렌기 ;
M+는 알칼리 금속이온 ;
Q-는 할로겐이온, 과염소산 이온, 또는 티오시안산 이온 ;
Z는 하기의 식
Figure pct00006
으로 구성된 그룹에서 선택되는 기 ; 및,
W 및 Y는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 또는 산소원자, 질소원자 및 유황원자로 구성된 그룹에서 선택되는 1 이상의 원자를 포함한 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타낸다.
이들 화합물과 검출계를 결합시킨 공정을 포함한 상기 진단용 마커의 제조방법도 본 발명에서 제공된다.
아울러, (a) 검출계, 및 (b) 전기 검출계에 결합한, 600∼800nm의 파장 여기광을 조사함으로써 780nm 이상의 파장 형광을 발하는 형광성 관능기를 포함하는 진단용 마커가 제공된다. 이외에도, 상기의 각 진단용 마커의 바람직한 태양에 따라, 형광성 관능기가 검출계에 직접 결합한 상기의 각 진단용 마커 ; 형광성 관능기가검출계에 링커 또는 단백을 매개로 결합한 상기의 각 진단용 마커 ; 검출계가 항체, 핵산 및 증폭계 물질로 구성된 그룹에서 선택되는 상기의 각 진단용 마커 ; 항체로서 항 암항원 항체를 이용한 상기의 각 진단용 마커 ; 적외선 내시경 검사 또는 외과수술시 병소의 특정에 사용하는 상기 각 진단용 마커 ; 및, 면역조직화학적 염색법에 의해 생체 조직을 직접 염색하기 위해 이용한 상기의 각 진단용 마커가 제공된다. 또, 상기의 각 진단용 마커를 유효성분으로서 포함하는 진단약이 제공된다.
본 발명은 진단용 마커에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 조직의 장해성이 적은 근적외선 또는 원적외선의 조사에 의해 여기(勵起)되어 형광을 발하는 특정의 표지용 화합물에 암세포 등을 특이적으로 인식하는 항체 등을 결합시킨, 생체에 적용 가능한 진단용 마커에 관한 것이다.
제 1도는 표지용 화합물(화합물18)의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타내는 그림이다. (A)는 요오드화나트륨 첨가로 염을 형성한 화합물18의 적외선 흡수 스펙트럼이고, (B)는 원료로서 사용한 인도시아닌글린-N-헥산산술포숙신산 이미드에스테르 (화합물17)의 적외선 흡수 스펙트럼이다.
제 2도는 표지용 화합물인 화합물 6과 항 EMA 항체를 결합함으로써 얻은 본 발명의 진단용 마커 (74㎍/ml)의 자외·가시흡수 스펙트럼을 나타내는 그림이다.
제 3도는 표지용 화합물인 화합물 18을 사람 IgG에 결합시킨 본 발명의 진단용 마커의 형광 스펙트럼을 나타내는 그림이다. 그림 중에서, 실선은 발광 스펙트럼, 점선은 여기 스펙트럼을 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최적의 형태
상기 일반식(I) 및 (Ⅱ)로 표시되는 형광성 관능기는, 모핵에 결합한-Y-CO-기의 카르보닐기를 매개로 하여 검출계와 결합하고 있다. 상기 일반식(I) 중에서,R1및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 알킬기, 알콕시기, 또는 술폰산기(-SO3H)를 나타낸다. R1및 R2는 각각 페닐기상의 임의의 위치에서 치환할 수 있다. 알킬기로서는, 탄소수 1 내지 6 정도의 직쇄 또는 분지상 저급 알킬기, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지상 저급 알킬기를 이용할 수 있다. 예를 들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기 등이 가장 바람직하다.
R1및 R2가 나타내는 아릴기로서는 치환 또는 무치환의 페닐기, 나프틸기, 피리딜기 등을 이용할 수 있다. 알콕시기로서는, 탄소수 1 내지 6정도, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지상 저급 알콕시기를 이용할 수 있고, 가장 바람직하게는, 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, n-부톡시기, sec-부톡시기, tert-부톡시기 등을 이용할 수 있다. 술폰산기로서는, 유리형태인 -SO3H기 외에, 술폰산기의 염기부가염(술포네이트기), 예를 들면, 나트륨염, 칼륨염 등을 이용할 수 있다. 이들 중, R1및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 알킬기, 알콕시기, 또는 술포네이트기인 것인 바람직하다.
R3는 알킬기, 술폰산 알킬기 또는 아미노 치환 알킬기를 나타낸다. 이들 기에 있어서, 알킬기로서는, 예를 들어 상기 화합물을 사용할 수 있다. 술폰산 알킬기의 술폰산기 또는 아미노 치환 알킬기의 아미노기는, 각각 알킬기상의 어느 위치에서 치환하여도 되는데, 예를 들면, 알킬기의 말단에 치환한 것을 사용할 수 있다.
술폰산기 및 아미노기는 각각 염기부가염 및 산부가염을 형성해도 된다. 예를 들면, 술폰산이 나트륨염이나 칼륨염을 형성한 것이나, 아미노 기가 암모늄할라이드 등의 염을 형성한 것, 아미노기가 4급화된 것 등도 바람직하다. 또한, 아미노기로서 치환 또는 무치환의 아미노기를 이용할 수 있다. 술폰산 알킬기 또는 아미노 치환 알킬기의 예로서는, 술폰산 메틸기(-CH2SO3H), 술폰산 에틸기, 아미노메틸기, 아미노에틸기, 메틸아미노에틸기 및 이들의 염 등이 있다.
식(I)로 표시되는 형광성 관능기에서, X-는 필요에 따라 할로겐이온, 초산이온, 과염소산이온, 탄소이온 등의 음이온종을 나타낸다. X-로 나타내어지는 이들 음이온종은 Y-CO-기가 치환하는 모핵 내의 질소원자 상의 양전하를 부인하고, 식(I)로 표시되는 형광성 관능기를 전체로서 중성으로 유지하기 위해 작용한다. 따라서, 예를 들어, 식(I)로 표시되는 형광성 관능기 중 R1, R2및 R3중 하나의 기가 음이온성기인 경우에는, 그 기의 음전하가 모핵 내의 4급 질소원자상의 양전하를 부인하여 분자 내 쯔비터·이온이 형성되기 때문에, X-가 불필요한 경우가 있다. 한 편, 예를 들어, R1또는 R2중의 어느 하나가 술폰산기이고, R3가 아미노 치환 알킬기인 경우에는, 이들 기 사이에서 전하가 균형적이 되기 때문에, X-가 필요해지는 경우가있다.
상기 일반식(Ⅱ)로 표시되는 형광성 관능기에서, R4및 R5는각각 독립적으로 수소원자, 알킬기, 알콕시기 또는 술포네이트기를 나타낸다.
R4및 R5는 각각 페닐기 상의 임의의 위치에서 치환할 수 있다. 알킬기 및 알콕시기로서는 상기의 것을 이용할 수 있고, 술포네이트기(-SO3 -M+: M+는 알칼리 금속이온을 나타내며, Q-의 양쪽성 이온인 M+와는 동일하거나 상이해도 된다) 로서는, 예를 들어 나트륨술포네이트기 또는 칼륨술포네이트기 등을 이용할 수 있다.
R6는 직쇄 또는 분지쇄의 알킬렌기를 나타내는데, 예를 들면, 탄소수 1∼6 정도, 바람직하게는 탄소수 2∼5의 직쇄 또는 분지쇄의 저급 알킬렌기, 가장 바람직하게는, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기 또는 펜타메틸렌기를 이용할 수 있다. R6에 치환하는 -SO3 -기는 전기 알킬렌기의 임의의 위치에서 치환할 수 있지만, 예를 들어 알킬렌기의 말단에 치환한 것을 이용하는 것이 가장 바람직하다. 좀 더 구체적으로, R6-SO3 -로서는 예를 들어 -(CH2)k-SO3 -(k는 2∼4의 정수를 나타낸다)로 표시되는 기 등이 가장 바람직하다.
M+는 알칼리금속이온을 나타낸다. 알칼리 금속이온으로서 나트륨이온 또는칼륨이온을 이용하는 것이 바람직하다. Q-는 할로겐이온, 과염소산이온 또는 티오시안산이온을 나타내고, 바람직하게는 염소이온, 브롬이온, 또는 요소이온 등을 이용할 수 있다. 이들 중, 요소 이온이 가장 바람직하다. 어떠한 특정 이론에 구애되는 것은 아니지만, 상기 형광성 관능기는 Y-CO-기가 치환하는 질소원자상의 양전하(상기 식에서 N+로 표시)와 R3-SO3 -에서 유래하는 음전하를 가지고 있지만, M+Q-로 나타내어지는 알칼리금속염이 공존하면, 질소원자상의 양전하(상기 식에서는 N+로 표시)와 Q-와의 사이에서, 그리고 R3-SO3 -와 M+와의 사이에서 각각 이온 결합이 형성된다. 이 결과, 분자 내에서의 양쪽성 이온 형성이 저해되고, 분자 전체의 이온성이 유지되어 수용성이 현저하게 증대한다.
상기 일반식(I) 및 (Ⅱ)에서, Y는 탄소수 1 내지 10의 직쇄 또는 분지상 알킬기, 바람직하게는 탄소수 3∼5의 직쇄 혹은 분지쇄의 알킬렌기, 가장 바람직하게는, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 또는 펜타메틸렌기를 나타낸다. 또는, Y는 산소원자, 질소원자 및 유황원자로 구성된 그룹에서 선택되는 1 이상의 원자를 포함한 탄소수 1 내지 10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기를 나타낸다. -Y-CO-로 표시되는 기로서는, 예를 들면, -CH2-CO- ; -(CH2)2-CO- ; -(CH2)3-CO- ; -(CH2)4-CO- ; -(CH2)5-CO- ; -CH2-CO-NH-(CH2)5-CO- ; -(CH2)2-CO-NH-(CH2)5-CO- ; -(CH2)3-CO-NH-(CH2)5-CO- ; -(CH2)4-CO-NH-(CH2)5-CO- ; -CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-NH-(CH2)2CO- ; -(CH2)4-CO-(N, N'-피페라디닐)-(CH2)2-CO(N, N'-피페라디닐은 피페라딘의 1번위치에-(CH2)4-CO기가 치환되어 있고, 4번위치에 -(CH2)2-Z 기가 치환되 있는 것을 나타낸다. 이하, 동일하다) ; 또는 -CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-(N, N'-피페라디닐)-(CH2)2-CO-등을 이용할 수 있다.
또한, -Y-CO-기의 카르보닐기는, 탄소수 1∼10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기 ; 산소원자, 질소원자 및 유황원자로 구성된 그룹에서 선택되는 1 이상의 원자를 포함하는 탄소수 1∼10의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬렌기 ; 또는, -NH-NH-기 등을 매개로 검출계와 결합하여도 된다.
본 발명의 진단용 마커 중, 식(I)로 표시되는 형광성 관능기를 가진 진단용 마커의 제조에는 상기 식(Ⅲ)의 화합물을 표지용 화합물로서 이용하는 것이 가장 바람직하다. 또, 식(Ⅱ)으로 표시되는 형광성 관능기를 가지는 본 발명의 진단용 마커의 제조에는 하기 식(Ⅴ)의 표지용 화합물을 이용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 일반식(Ⅲ) 및 (Ⅴ)의 화합물에서, Y-CO-Z로 표시되는 기로서, 예를 들어, -CH2-CO-Z ; -(CH2)2-CO-Z ; -(CH2)3-CO-Z ; -(CH2)4-CO-Z ; -(CH2)5-CO-Z ; -CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-Z ; -(CH2)2-CO-NH-(CH2)5-CO-Z ; -(CH2)3-CO-NH-(CH2)5-CO-Z ; -(CH2)4-CO-NH-(CH2)5-CO-Z ; -CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-NH-(CH2)2-CO-Z ; (-CH2)4-CO-(N, N'-피페라디닐)-(CH2)2-Z ; 또는 -CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-(N, N'-피페라디닐)-(CH2)2-Z 등을 이용할 수 있다.
Z로 표시되는 기에 있어서, W로서는 상기 Y-CO-Z의 예시 중의 Y에 상당하는 기를 가장 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, N-6술포석시이미딜옥시기의 술폰산기의 양쪽성 이온 M+와 식(Ⅴ)의 표지용 화합물 중의 Q-의 양쪽성 이온 M+는 동일하든지 상이하든지 상관없지만, 양자가 나트륨 이온인 것이 바람직하다. 상기의 표지용 화합물 중 식(Ⅴ)로 표시되는 화합물은, 예를 들면, 식(Ⅴ)로 표시하는 화합물에서 M+X-로 표시되는 알칼리 금속염이 존재하지 않는 양쪽성 이온 화합물을 제조한 후, 이 화합물을 디메틸술폭시드 또는 디메틸포름아미드 등의 용매에 고농도로 용해하여, 그 용액에 알칼리 금속염을 첨가함으로써 용이하게 제조할 수 있다.
또한, 본 발명 진단용 마커의 제조에 최적으로 사용할 수 있는 본 발명의 화합물 제조예를 실시예에서 구체적으로 설명하겠지만, 당 업자에게는, 이 실시예를 참조함으로서, 출발원료, 시약, 반응조건 등을 적절하게 수식·개변하여 본 발명의 화합물을 용이하게 제조할 수 있다는 것으로 이해될 것이다.
Z로서 N-석시이미딜옥시기 및 N-술포석시이미딜옥시기를 이용할 경우, 이들 기는 Z가 결합하는 카르보닐기와 함께 반응성의 활성 에스테르를 형성하기 때문에, 검출계에 포함되는 아미노기(H2N-R)는, 전기 활성 에스테르 중의 Z와 치환하여 -Y-CO-NH-R을 형성한다. 또한, Z로서 2-(N-말레이미드)-알킬기를 이용할 경우, 검출계에 포함되는 티올기(HS-R)가 반응하여, -Y-CO-알킬-S-R이 형성된다. 아울러, Z가 -NH-NH2인 경우에는 검출계에 포함되는 환원당 말단의 알데히드기(OHC-R)가 반응하여- Y-CO-NH-NH-CO-R이 형성된다.
따라서, 표지용 화합물과 검출계를 반응시킴으로써, 식(Ⅲ) 또는 (Ⅴ)로 표시되는 표지용 화합물의 모핵 및 모핵에 결합하여 링커 부분에 해당하는 -Y-CO-부분은, 형광성의 관능기로서 본 발명의 진단용 마커 중에 보존된다. 더우기, 이러한 화학구조를 가지는 본 발명의 진단용 마커는 상기의 방법으로 제조되는 것에 한정되지 않고, 어떠한 방법으로 제조될지라도 본 발명의 범위에 포함된다는 것은 자명하다.
또한, 상기의 식(I) 및 (Ⅱ)로 표시되는 형광성 관능기, 식(Ⅲ) 및 (Ⅴ)로 표시되는 화합물, 그리고 실시예 중의 공정에 기재된 화합물에서는, 편의상 질소원자상의 양전하(상기 식에서 N+로 표시한다)를 모핵 내의 하나의 질소원자상에 고정하여 기재하였지만, 공액이중결합을 매개하여 양전하가 또 다른 하나의 질소원자로 이동할 수 있는 것은 당 업자에게 용이하게 이해된다. 따라서, 이러한 공액에 기초한 호변이성체(互變異性體)는 모두 본 발명의 범위에 포함되는 것은 물론이다.
상기의 형광성 관능기와 결합해야하는 검출계로서는 암에 특이성이 높은 항체 등 각종 항원을 인식하는 항체, 프로브로서 사용 가능한 핵산, 또는 비오틴-아비딘 등의 증폭계에 이용되는 증폭계 물질 등을 이용할 수 있다. 항체로서는 예를 들어, 암세포나 암 조직, 바람직하게는 초기 암세포나 초기 암조직에 특이적으로 결합하는 항 암항원 항체를 이용할 수 있다. 예를 들면, CEA, AFP, CA19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, CA125, HCG, p53, STN(시알릴Tn항원), c-erbB-2단백에 특이적으로 반응하는 위 항종양항체 외에, 식도암, 대장암, 직장암, 피부암, 자궁암 등의 종양항원에 특이적으로 반응하는 항종양항체 등이 이용 가능하다. 또한, 항 병원체단백 항체를 이용할 수 도 있다. 핵산으로서는 특정의 유전자 내지 병원체 유전자에 대한 프로브로서 사용 가능한 핵산을 이용할 수 있다.
상기의 항체나 핵산을 검출계로서 이용하는 경우, 본 발명의 진단용 마커에 포함된 상기 검출계는 항암원이나 암 유전자 등에 특이적으로 결합하기 때문에, 암세포나 암조직 등의 병소가 본 발명의 진단용 마커에 의해 면역적으로 염색된다. 그 후, 적외선 레이저 등을 이용하여 근적외선 내지 원적외선을 조사함으로써 형광을 발하는 병소를 확인할 수 있다.
본 발명의 진단용 마커의 다른 태양은 형광성 관능기가 검출계인 아비딘 또는 비오틴 등의 증폭계 물질에 도입되는 것이다. 예를 들어, 종래 범용하는 비오틴 표지화 항 암항원 항체 등을 생체에 적용함으로써, 항 암항원 항체와 비오틴 표지화 항체를 결합시켜 표지를 행할 수 있다. 이러한 표지를 행한 후, 아비딘을 검출계로서 포함하는 본 발명의 진단용 마커를 비오틴 표지화 항체에 결합시킴으로써, 비오틴 표지화 항체에 의한 표지를 본 발명의 진단용 마커로 증폭할 수 있고, 적외선 레이저 등으로 초기암을 검출할 수 있다. 증폭계 물질로서 상기와 같은 표지의 증폭을 가능케하는 것이면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다.
아울러, 상기의 항체 또는 핵산에 상기의 증폭계 물질을 결합시킨 것을 본 발명의 진단용 마커의 검출계로서 이용해도 된다. 예를 들어, 항암 항원항체에 아비딘을 결합시킨 항체를 본 발명의 진단용 마커의 검출계로서 이용할 수 있다. 또는, 본 발명의 진단용 마커의 검출계로서, 2차 항체를 이용하는 것도 가능하다. 앞에서 설명한 검출계는 예시를 위한 것이며, 본 발명의 진단용 마커에 이용하는 것이 가능한 검출계는 상기의 것에만 한정되지 않는다. 검사·진단을 목적으로 하는 표준세포나 표적조직에 실질적으로 특이하게 결합하는 성질을 가진 것이라면, 어떠한 것을 검출계로서 이용해도 무방하다.
본 발명의 진단용 마커는 상기와 같은 형광성 관능기와 검출계가 직접 또는 링커를 매개로 하여 결합한 것에 한정하지 않고, 예를 들어 알부민 등의 단백에 형광성 관능기와 검출계를 도입함으로써, 알부민 등의 단백을 매개로 형광성 관능기와 검출계를 결합시킬 수 있다. 알부민 등의 단백에는 상기의 형광성 관능기를 1 또는 2 이상, 바람직하게는 10개 이상 도입할 수 있고, 항체 등의 검출계 도입도 용이하기 때문에, 이러한 단백을 이용한 진단용 마커는 본 발명의 바람직한 태양이다.
또한, 본 발명의 다른 진단용 마커는 600∼800nm 파장의 여기광을 조사함으로써 780nm 이상, 바람직하게는 780∼840nm 이상 파장의 형광을 발하는 형광성 관능기가 결합한 검출계로 이루어진 것이다. 이러한 형광성 관능기로서는 상기의 식(I) 및 식(Ⅱ) 유래인 것 외에, 600∼800nm 파장의 여기광을 조사함으로써 780nm 이상 파장의 형광을 발하는 것이면, 어떠한 것을 이용해도 된다. 이러한 형광성 관능기를 도입하기 위한 화합물은 진단용 마커의 사용 목적이나 사용하는 여기광의 종류 등에 따라, 당 업자가 적절하게 선택할 수 있다.
이러한 형광성 관능기를 검출계에 결합시키기 위해서는, 예를 들어, 시아닌계, 프탈로시아닌계, 디티올니켈착체(錯體)계, 나프토퀴논·안스라퀴논계, 인도페놀계, 아조계 등의 근적외선 흡수성의 화합물을 이용할 수 있다. 이들 화합물을 직접 또는 링커를 매개로 검출계에 결합시키는 경우, 화합물의 흡수파장이 장파장측으로 이동하는 경우가 있기 때문에, 형광성 관능기의 도입에 이용하는 화합물의 여기광 파장은 600nm를 하회해도 지장이 없다. 또한, 형광성 관능기를 검출계에 도입하기 위해 사용하는 상기 화합물이 상기 일반식(Ⅲ) 또는 (Ⅴ)에서 Z로 표시되는 기를 가지고 있는 것이 바람직하다. 이러한 기가 존재하는 않는 경우에는 당 업자가 이용할 수 있는 링커를 매개로 형광성 관능기와 검출계를 결합시킬 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 진단약은 상기의 진단용 마커를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명의 진단약은 근적외선 내지 원적외선에 의해 여기될 수 있고, 진단에 있어서 생체조직이나 DNA의 손상을 야기하지 않기 때문에 유용하다. 또한, 본 발명의 진단약은 매우 수용성이 뛰어나다는 특징을 가지고 있다. 본 발명의 진단약에 있어서, 780nm의 여기광을 조사하는 경우에 820nm 정도보다 장파장의 형광을 발하는 진단용 마커를 포함하는 진단약이 특히 바람직하다. 또한, 본 발명의 진단약은 1종 또는 그 이상의 진단용 마커를 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 진단약은 예를 들어, 상기의 진단용 마커를 여러 완충액 등의 수성매체, 바람직하게는, 생리식염수나 인산완충액 등의 완충액에 용해한 용액제의 형태, 또는 진단·검사에 있어서 필요한 때에 생리식염수나 인산완충액 등의 완충액을 첨가하여 용해할 수 있는 미립자 모양의 분말이나 동결건조분말 형태의 고형제 등으로서 제공되지만, 진단약의 형태는 상기의 것에 한정되지 않고, 당 업자가 사용 목적 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 진단약을 제조하는데는 약리학적, 제제학적으로 허용할 수 있는 첨가물로서, 예를 들어, 부형제, 붕해제 내지 붕해보조제, 결합제, 활탁제, 코팅제, 색소, 희석제, 기제, 용해제 내지 용해보조제, 등장화제, pH조절제, 안정화제, 분사제 및 접착제 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, 포도당, 유당, D-만니톨, 전분, 또는 결정 셀룰로스 등의 부형제 ; 카르복시메틸셀룰로스, 전분, 또는 카르복시메틸셀룰로스칼슘 등의 붕해제 또는 붕해보조제 ; 와세린, 유동 파라핀, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 카올린, 글리세린, 정제수, 또는 하드패트 등의 기제 ; 포도당, 염화나트륨, D-만니톨, 글리세린 등의 등장화제 ; 무기산, 유기산, 무기염기 또는 유기염기 등의 pH조절제 ; 비타민A, 비타민E, 코엔자임Q등 안정화에 기여할 수 있는 약제 등의 제제용 첨가물을 첨가할 수 있다.
본 발명의 진단용 마커를 포함하는 진단약의 사용 방법에 있어서, 예를 들면, 적외선 내시경을 이용한 검사 방법에 대해서 설명하면, 병소의 존재가 의심되어지는 조직에 대해서 내시경적으로 상기 진단약 (농도 0.1∼1,000 mg/㎖ 정도의 것)을 분무 또는 도포하여 병변부를 염색하고, 적당히 세척을 하여 여분의 진단약을 조직에서 제거한 다음, 근적외선 내지 원적외선, 보다 구체적으로는, 예를 들면 600∼800 nm, 바람직하게는 780 nm 정도 파장의 레이저 여기광을 조사함으로써, 형광을 발하는 병소부를 검출할 수 있다. 본 발명의 진단용 마커는 생체에 직접 적용할 수 있다는 점이 특징이지만, 본 발명의 진단용 마커의 사용 태양은 생체에만 적용되는 것이 아니라, 파라핀 고정화 표본 등의 고정화 표본에 대해서도 적용 가능하다.
형광의 검출에는 예를 들면, 적외선 내시경 또는 적외선 현미경 등의 수단을 이용할 수 있고, 예를 들면, 투과 특성을 갖춘 필터, 구체적으로는, 여기광 차단 특성을 갖는 필터와 형광 검출용 필터를 1장 또는 2장 이상을 조합하여 이용할 수가 있다. 본 발명의 진단용 마커를 생체에 적용하여 내시경 검사를 실시할 때에는 그 배율이 10∼1,000 정도의 것을 이용할 수가 있으며, 예를 들면, 현미경 레벨의 배율을 갖는 적외선 내시경 등을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 내시경에는 본 발명의 진단약의 분무 또는 도포수단과 세척수단이 장착되어 있는 것이 바람직하다.
생체 외로 적출한 조직이나 표본 등에 본 발명의 진단용 마커를 적용하는 경우에는 형광의 검출에 적외선 현미경을 이용할 수 있다. 또, 통상광하에서 프레파라트를 관찰하여 염색 부위를 확인한 후에, 암실 내에서 적외선 광원 하에 적외선 필름으로 촬영하거나, 비디오필름에 수록하여 컴퓨터에 의한 화상 해석을 하는 것도 가능하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하며, 본 발명의 범위는 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
예 1 : 표지용 화합물의 제조
이하의 공정에 따라서, 식(Ⅲ) 의 화합물을 본 발명의 진단용 마커 제조에이용하는 표지용 화합물로서 제조하였다. 또한, 이하의 제조예에 있어서 화합물 번호는 공정 중의 화합물 번호에 대응하고 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
화합물1 (5g, 23.9 mmol, 제일화학약품 주식회사에서 입수) /아세토니트릴 100㎖ 에 요오드화에탄 (2.84㎖, 35.5 mmol)을 가해 5시간 환류하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔사에 에테르 200 ㎖를 가해서 결정화시킨 다음, 얻은 결정을 여과하여 에테르로 세척하고, 감압하에 건조시켜 화합물 2의 담적갈색 분말을 얻었다. 수량 6.83 g (수율 78.2%).
화합물1 (5g, 23.9 mmol) /DMF 100㎖에 6-브로모카프론산 에틸에스테르 (6.32㎖, 35.5 mmol)를 가해서 80℃에서 16시간 가열하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔사에 에테르 200 ㎖를 가해서 결정화시킨 다음, 얻은 결정을 여과하여 에테르로 세척하고, 감압하에 건조시켰다. 1M 수산화나트륨 수용액 / 메탄올 = 1/1 혼합용액 30㎖를 가하여 실온에서 2시간 교반하였다. 메탄올을 감압유거(留去)하고, 수용액을 4M 염산 수용액으로 중화한 후, 클로로포름으로 3회 세척하였다. 수용액을 감압 농축하여, 화합물 3의 적색 고체를 얻었다. 수량 5.75 g (수율 74.4%).
화합물 2 (5 g, 13.7mmol) 와 글루타콘알데히드디아닐염산염 (3.90 g, 13.7 mmol)을 무수초산 50 ㎖에 현탁하고, 100℃에서 1.5시간 가열하였다. 적색 용액을 물 300 ㎖ 에 부어, 생긴 흑적색고체를 여과해서 얻었다. 물로 세척한 후, 감압하에서 건조시켜 화합물 4의 흑적색 분말을 얻었다. 수량 6.02 g (수율 101%).
화합물 4 (220 mg, 0.505 mmol) 와 화합물 3 (164 mg, 0.507mmol)을 피리딘 3㎖ 에 용해하여, 50℃에서 1시간 교반하였다. 반응 흔합물을 감압 농축하고, 얻은 잔사를 실리카겔 칼럼 (용매 : 1∼20% 메탄올/클로로포름)으로 정제하여 화합물 5의 흑녹색고체를 얻었다. 수량 49 mg (수율 15.5%).
화합물 5 (40 mg, 64μmol) / DMF 1 ㎖에 N-히드록시무수숙신산(8.8 mg, 76 μmol)과 N,N'-디시클로헥실카보디이미드 (DCC, 26.4 mg, 0.128 mmol)을 가해서 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후, 반응액에 에테르 10 ㎖를 가해, 생긴 잔사를 다시 에테르로 3회 세척하였다. 이 고체를 클로로포름 400 ㎕ 에 용해하여, 0.1 M 염산수용액 200 ㎕를 가하여 교반한 다음, 클로로포름상을 분리하고, 3회 물로 세척하였다. 클로로포름 용액을 감압 농축하여 화합물 6 [식(Ⅲ)의 표지용 화합물] 의 흑녹색 고체를 얻었다. 수량 38 mg (수율 78.5%), MS (FAB) m/e=720(M+) ; 형광 스펙트럼 : λex=769 nm, λ em=820 nm (10% DMSO/물)
화합물 5 (20 mg, 32 μmol) /DMF 1 ㎖에 N-히드록시무수숙신산술폰산나트륨 (8.3 mg, 38 μmol)과 N,N'-디시클로헥실카보디이미드 (13.2 mg, 64μmol)를 가하여 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후에 여과하였다. 여액에 에테르 10 ㎖를 가해, 생긴 잔사를 다시 에테르로 3회 세척하였다. 이 고체를 DMF 400μl에 용해하여, 0.1M 염산 수용액 200μl를 가해서 교반한 다음, 클로로포름상을 분리하고 물로 3회 세척하였다. 클로로포름 용액을 감압 농축해서 화합물 7 [식(III)의 표지용 화합물] 의 흑녹색고체를 얻었다. 수량 17 mg (수율 66.4%). MS (FAB) m/e=822(M+Na) ; 형광 스펙트럼 : λex=769 nm, λem=820 nm (10% DMSO/물)
화합물 5 (20 mg, 32 μmol) /DMF 0.5 ㎖에 N-(2-(N'-말레이미드)에틸) 피페라딘이염산염 (PEM, 4.4 mg, 38 μmol)과 트리에틸아민 (TEA, 20μl, 0.146 mmol), 및 DCC (10.2 mg, 49 μmol)를 가해서 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후, 반응액에 에테르 10 ㎖를 가해, 생긴 잔사를 다시 에테르로 3회 세척하였다. 이 고체를 클로로포름 400μl 에 용해하여, 0.1M 염산 수용액 200μl를 가해서 교반한 다음, 클로로포름상을 분리하고 물로 3회 세척하였다. 클로로포름 용액을 감압 농축해서 화합물 8 [식(Ⅲ)의 표지용 화합물]의 흑녹색고체를 얻었다. 수량 20 mg (수율 70.5%). MS (FAB) m/e=814(M+) ; 형광 스펙트럼 : λex=773 nm, λem=821 nm (10% DMSO/물)
예 2 :표지용 화합물의 제조
화합물 6 (20 mg, 26.4 μmol) /DMF 0.5 ㎖에 히드라진일염산염 (9.0 mg, 0.131 mmol)을 가하고 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 반응액을 여과하고, 여액을 감압농축한 후, 잔사를 클로로포름 0.5 ㎖ 에 용해하여, 클로로포름 용액을 물로 3회 세척하였다. 클로로포름상을 감압 농축하여 화합물 9의 흑녹색고체를 얻었다. 수량 16 mg (수율 90.0%). MS (FAS) m/e=637(M+) ; 형광 스펙트럼 : λex=771 nm, λem=820 nm (10% DMSO/물)
화합물 10 (5.0 g, 15.1 mmol) 과 글루타콘알데히드디아닐염산염 (4.40 g, 15.1 mmol)을 무수초산 20 ㎖와 초산 300 ㎖ 의 혼합용액에 현탁하고, 환류온도에서 5 시간 가열하였다. 적색 용액을 감압농축하고, 얻은 잔사에 초산 에틸과 물의 혼합용액 200 ㎖를 가해 현탁시키고, 흑적색고체를 여과하여 얻었다. 물로 세척한 후, 감압하에 건조하여 화합물 11의 흑적색분말을 얻었다. 수량 5.33 g (수율 65.2%).
화합물 11 (167 mg, 0.308 mmol) 과 화합물 3 (100 mg, 0.309 mmol)을 피리딘 3 ㎖에 용해하여, 50℃에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여, 얻은 잔사를 물 10 ㎖ 에 용해하고 용액의 pH를 3에 맞춘 후, 세파덱스 LH 20 칼럼 (용매:물) 으로 정제하여, 화합물 12의 흑녹색고체를 얻었다. 수량 51 mg (수율 23.1%).
화합물 12 (30 mg, 41.8 μmol) /50 v/v% THE 수용액 1 ㎖ 에 N-히드록시무수숙신산술폰산나트륨 (16.8 mg, 77.4 μmol) 과 N,N'-디시클로헥실카보디이미드 ( 25.8 mg, 0.125 mmol)을 가해서 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후에 여과하여, 여액을 20℃ 이하에서 감압하에 농축하였다. 잔사에 초산 에틸 10 ㎖를 가해, 생긴 결정을 다시 에테르로 3회 세척하였다. 이 결정을 물 200 μl 에 용해하여, 세파덱스 LH20 칼럼 (용매:물) 으로 정제하고, 화합물 13 [식(Ⅲ)의 표지용 화합물] 의 흑녹색고체를 얻었다. 수량 34 mg(수율 88.8%). MS (FAB) m/e=892(M-) ; 형광 스펙트럼 : λex=771 nm, λem=822 nm(물)
예 3 :표지용 화합물의 제조
이하의 공정에 따라서, 본 발명의 진단용 마커의 제조에 이용하는 식 (Ⅴ) 의 표지용 화합물을 제조하였다. 또한, 이하의 제조예에 있어서 화합물 번호는 공정 중의 화합물 번호에 대응하고 있다.
Figure pct00009
화합물 14 (5.0 g, 14.5 mmol) 와 글루타콘알데히드디아닐염산염 (4.23 g,14.5 mmol)을 무수초산 20 ㎖와 초산 300 ㎖ 의 혼합용액에 현탁하여, 환류온도에서 5 시간 가열하였다. 적색 용액을 감압농축하고, 얻은 잔사에 초산 에틸과 물의 혼합용액 200 ㎖를 가해 현탁시키고, 흑적색고체를 여과하여 얻었다. 물로 세척한 후, 감압하에 건조시켜 화합물 15의 흑적색분말을 얻었다. 수량 5.20 g (수율 66.1%).
화합물 15 (300 mg, 0.553 mmol) 과 화합물 3 (179 mg, 0.553 mmol)을 피리딘 5 ㎖에 용해하여, 50℃에서 1시간 교반하였다. 반응혼합물을 감압 농축하고, 얻은 잔사를 물 10 ㎖ 에 용해하여 용액의 pH를 3에 맞춘 후, 세파덱스 LH 20 칼럼 (용매:물) 으로 정제하여, 화합물 16의 흑녹색고체를 얻었다. 수량 105 mg (수율 25.9%).
화합물 16 (106 mg, 0.145 mmol) /50 v/v% THF 수용액 3 ㎖ 에 N-히드록시무수숙신산술폰산나트륨 (65.2 mg, 0.287 mmol) 과 N,N'-디시클로헥실카보디이미드 (129 mg, 0.596 mmol)을 가해서 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후에 여과하여, 여액을 20℃ 이하에서 감압 농축하였다. 잔사에 초산에틸 10 ㎖를 가해, 생긴 결정을 다시 에테르로 3회 세척하여, 화합물 17의 흑녹색고체를 얻었다. 수량 110 mg (수율 80.7%). MS (FAB) m/e=906(M-) ; 형광 스펙트럼 : λex=768 nm, λem=807 nm(물)
상기의 화합물 17 (100 mg, 0.11 mmol)을 메탄올 2 ㎖ 에 용해하고, 요오드화 나트륨 1 g (6.7 mmol)의 메탄올 용액 5 ㎖를 가하였다. 메탄올 용액을 1/2 로 감압농축하고 4℃에서 하룻밤 냉각시킨 후, 석출 결정을 여과하여 얻었다. 얻은 녹색 결정을 감압데시케이터에서 건조시켜 화합물 18 [식(Ⅴ)의 표지용 화합물]을 얻었다 (85 mg, 수율 72%). 요오드화 나트륨의 염형성 전 (양쪽성 이온형) 및 염형성 후에서의 수용성 데이타 및 적외선 흡수 스펙트럼 데이타 (IR)를 측정하였다. 또한, 요소 함량을 세니거법으로 구하였다.
요오드화 나트륨을 염으로 한 화합물 18과 원료로서 이용한 양쪽성 이온형의 인도시아닌글린 N-헥산산술포숙신산이미드에스테르 (화합물 17)에서는, 적외흡수 스펙트럼이 변화하고 있고, 양쪽성 이온형 화합물 17에서 관찰된 2360 및 1740 cm-1의 흡수가 화합물 18 에서는 소실되어 있었다(제 1도 참조:(a) 는 화합물 18, (b)는 화합물 17, 즉 염형성 전의 것을 나타낸다). 이들 결과로부터, 분자내 양쪽성 이온을 형성하고 있는 경우와 요오드화 나트륨의 복염을 형성한 경우는, 결정 구조가 다름이 분명하다.
예 4 :표지용 화합물의 제조
예 3의 방법에 준하여 인도시아닌글린-N-부탄산술포숙신산이미드에스테르 (화합물19)를 제조하였다. 이 화합물 19 (150 mg, 0.17 mmol)를 메탄올 3㎖에 용해하여, 요오드화 나트륨 1.5 g (10 mmol)의 메탄올 8 ㎖ 용액을 가하였다. 메탄올을 1/2 로 감압농축하여 4℃에서 하룻밤 냉각시킨 후, 석출 결정을 여과하여 얻었다. 얻은 녹색 결정을 감압데시케이터에서 건조시켜, 화합물 20 [식(Ⅴ)의 표지용 화합물]을 얻었다 (117 mg, 수율 66%). 요오드화 나트륨의 염형성 전 (양쪽성 이온형) 및 염형성 후에서의 수용성 데이타 및 적외선 흡수 스펙트럼 데이타 (IR)를 측정하였다. 또한, 요소 함량을 세니거법으로 구하였다.
예 5 :표지용 화합물의 제조
예 3의 방법에 준하여 인도시아닌글린-N-헥산산술포숙신산이미드에스테르 (화합물21)를 제조하였다. 이 화합물 21 (100 mg, 0.11 mmol)를 메탄올 2㎖에 용해하여, 과염소산 나트륨 0.3 g (2.5 mmol)의 메탄올 20 ㎖ 용액을 가하였다. 메탄올을 1/4로 감압농축하여 4℃에서 하룻밤 냉각시킨 후, 석출 결정을 여과하여 얻었다. 얻은 녹색 결정을 감압데시케이터에서 건조시켜, 화합물 22 [식(Ⅴ)의 표식용 화합물] 23 mg을 얻었다 (수율 21%). 과염소산나트륨의 염형성 전후에서의 수용성 데이타 및 IR을 측정하였다.
Figure pct00010
Figure pct00011
예 6 :표지용 화합물의 제조
화합물 13을 예 2의 방법에 따라서, 요오드화 나트륨의 메탄올 용액으로 처리하여 화합물 23을 얻었다. 원료로서 사용한 화합물 13의 적외선 흡수 스펙트럼과 표지용 화합물 23의 적외선 흡수 스펙트럼을 비교한 결과, 화합물 13에서 관측된 2360 및 1740 cm-1의 흡수가 화합물 23에서는 관측되지 않았다.
예 7 :진단용마커의 제조
(a) 항체의 정제
항 EMA (Epitherial Membrane Antigen) 항체를 포함하는 배양상청액 (다코社製, M613)에서 MabTrap GII(Pharmacia社製)을 이용해서 항 EMA 모노클로날 항체를 하기와 같이 정제하였다. 4㎖의 배양상청에 결합 완충액 4㎖를 가해, 미리 결합완충액으로 평형화한 MabTrap GII 칼럼에 주입하였다. 결합완충액 5㎖로 세척한 후, 용출완충액 3㎖를 가해서 용출 완충액 0.5㎖ 씩 분취하였다. 분광광도계를 이용하여 280 nm의 흡광도가 0.05 이상인 분획을 정제 IgG 분획으로서 모아, PD-10 칼럼 (Pharmacia社製)을 사용하여 0.1 M 인산완충액 (pH 7.5) 으로 완충액을 교환한 다음, SDS-PAGE (제일화학약품주식회사製)에 의해 정제도를 확인하였다. 배양 상청 4㎖ 로부터 정제 항 EMA 모노클로날 항체 725 ㎍을 얻었다.
(b) 항체와 표지용 화합물의 결합
상기의 정제 항체 500 ㎍을 함유하는 100 mM 인산완충액 0.5 ㎖에 ICG-OSu (상기 화합물 6) 의 DMF 용액 0.125 ㎖ (0.8 mg/㎖)를 가해, 30℃에서 30분간 정치하였다. 이 반응 혼합액을 미리 같은 반응완충액으로 평형화시킨 PD-10 칼럼에 주입하고, 미반응의 ICG-OSu를 분리하였다.
이어, PD-10 칼럼을 이용하여 단백분획의 완충액을 0.1 M 인산완충액-0.05% 아지화나트륨 (pH 7.4) 으로 교환하여, 표지용 화합물(화합물6) 에 항 EMA 항체가 결합된 본 발명의 진단용 마커 74 단백 ㎍/㎖를 얻었다. 그 후, 0.1%의 BSA를 첨가하고 보존하였다. 자외·가시흡수스펙트럼을 제 2도에 나타내었다.
상기 스펙트럼의 측정 조건은 하기와 같다. 측정 기구 : 日立 U-3200 분광광도계 ; 측정 용매 : 100 mM 인산완충액 (pH7.4), 0.05% 아지화나트륨 ; 스캔속도 : 300.0 nm/min. 그 후, 0.1%의 BSA를 첨가하고 보존하였다. BCA 프로틴· 앗세이 시약 (pierce社製) 에 의해 얻은 항체 농도와 표지용 화합물의 DMSO 내에서의 분자흡광계수로부터 구한 표지용 화합물에 대한 항체의 결합수는 약 12 mol 표지용 화합물/mol 항체이었다.
예 8 :진단용 마커의 제조
화합물 18 (1mg)을 물 0.94 ㎖ 에 용해하여 1 mM 용액으로 하였다. 인간 IgG 1 mg을 pH 8.5 의 50 mM 탄산나트륨 완충액 1 ㎖ 에 용해하고, 이 용액에 화합물 18을 포함하는 상기의 용액 0.2 ㎖를 가해서 30℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액을세파덱스 G-25 칼럼에 주입하여, 본 발명의 진단용 마커를 분리하였다. 분리용 완충액으로서는 50 mM 인산 완충액(pH 7.4)을 사용하였다. 미반응 화합물 18은 세파덱스 겔의 상단에 남아, 진단용 마커와의 분리는 양호하였다. 얻은 진단용 마커를 동결건조하고 -20℃에서 냉동 보존하였다. 진단용 마커 1 mg을 취해 100 ㎖의 50 mM 인산 완충액 (pH 7.4) 에 용해하여 형광 스펙트럼을 측정한 결과를 제 3도를 나타내었다.
예 9 :진단용 마커의 제조
예 7에서 얻은 정제 항체 500 ㎍을 함유하는 100 mM 인산완충액 0.5 ㎖ 화합물 18의 DMF 용액 0.125 ㎖ (0.8 mg/㎖)를 가해, 30℃에서 30분간 정치하였다. 이 반응 혼합액을 미리 같은 반응완충액으로 평형화시킨 PD-10 칼럼에 주입하고, 미반응 화합물 18을 분리하였다. 이어, PD-10 칼럼을 이용하여 단백분획의 완충액을 0.1 M 인산완충액-0.05% 아지화나트륨 (pH 7.4) 으로 교환하여, 화합물 18이 항 EMA 항체에 결합한 본 발명의 진단용 마커 74 단백 μg/㎖를 얻었다. 그 후, 0.1% 의 BSA를 첨가하여 보존했다.
예 10 :표지용 화합물과 단백의 결합
BSA (화광순약공업製) 10 mg (0.151 μmol)을 HEPES 완충액 3.0 ㎖ 에 용해하여 BSA 용액으로 하였다. 표지용 화합물 (화합물6) 2.0 mg(2.64 μmol)을 DMSO 150 ㎕ 에 용해하여 상기의 BSA 용액에 혼합하고, 냉장고 내에 하룻밤 방치하였다. 그 후, 상기와 동일한 방법으로, PD-10 칼럼을 이용한 겔여과를 수행하고, BSA 에 표지용 화합물 유래의 형광성 관능기가 도입된 표지단백을 얻었다. 또한, 반응 완료 후의 겔여과시에는 표지용 화합물 유래의 녹색 용액이 칼럼에 잔존하지 않은 것으로부터, 표지용 화합물이 모두 BSA 와 반응하고 있고, BSA 1분자당 형광성관능기가 약 17.5 분자 도입된 것으로 추측된다.
예 11 :진단용 마커의 제조
(a) BSA (10mg)을 포함하는 100mM 인산완충액 (pH 7.5) 5 ㎖ 에 화합물 6의 DMF용액 0.5 ㎖ (4.6 mg/㎖)를 가해서 30℃에서 30분간 정치하였다. 이 반응 혼합액을 미리 동일반응 완충액으로 평형화시킨 세파덱스 G25 칼럼에 주입하고, 미반응 화합물 6에서 표지용 화합물과 단백과의 결합체 (표지화 BSA)를 분리하였다. 세파덱스 G25 칼럼을 이용하여 결합체를 포함하는 분획의 완충액을 20 mM 인산완충액-0.15M NaCl (pH 7.0)로 교환하여, 형광성 관능기를 도입한 BSA 약 8 mg을 얻었다.
(b) 항 CEA 항체 1.0 mg/㎖ (0.1 M 구연산/0.15 NaCl, pH 4.0)에 펩신 농도 0.004 mg/㎖ 이 되도록 펩신을 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응액을 20 mM 인산완충액, 0.15 M NaCl, 1mM EDTA 로 미리 평형화시킨 TSKgelG3000SW에 첨가하여, F(ab')2를 미소화 IgG 및 소화 단편으로부터 분리하였다 (약 500 ㎍). 상기의 F(ab')2분획에 2-아미노에탄티올염산염을 최종 농도 10mM 이 되도록 첨가해서 37℃에서 90분간 반응시켰다. 반응액을 세파덱스 G25 칼럼에 주입하고 2-아미노에탄티올을 제거하여, Fab'를 포함하는 용액을 얻었다.
(c) 표지화 BSA (2mg, 20 mM 인산완충액-0.15 M NaCl, pH 7.0 ; PBS) 에 50 ㎍ 의 sulfo-SMCS 용액 (sulfo-EMCS, (주) 동인화학연구소, 1 mg/㎖, PBS)을 교반하면서 적하하여, 실온에서 20분간 반응시켰다. 이 반응 액을 미리 PBS로 평형화시킨 세파덱스 G25 칼럼에 주입하고, sulfo-SMCS로 활성화된 표지화 BSA를 분리하였다. 이 용액을 상기(b) 의 Fab' 용액에 첨가하고, 교반하에 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 종료후, 반응 혼합액을 TSKgel G3000SW를 이용한 겔여과에 의해 분리·정제하여, 형광성 관능기와 Fab' 가 도입된 BSA를 얻었다.
예 12 :진단용 마커를 이용한 면역조직화학적 염색
본 발명의 진단용 마커로서 상기 예 6의 진단용 마커를 이용하여, 항 EMA 항체의 염색성이 확인된 식도 점막의 파라핀 절편 (면적 약 10×10mm, 두께 2.5 ㎛) 혹은 식도암의 적출 생절편에 진단용 마커를 작용시켜, ABC 법 (아비딘·비오틴·콘프렉스법) 으로 발색시키고, 현미경 및 통상 내시경으로 관찰하여 염색의 정도를 확인하였다. 또한, 상기와 같이 발색시킨 프레파라트를 적외선 내시경으로 관찰하여 염색 부위를 동정하고, 통상 내시경에 의한 관찰로 동정된 염색부위와 비교하였다. 그리고, 진단용 마커의 농도를 배수희석하고, 통상 내시경 및 적외선 내시경으로 관찰하여, 양자의 식별 능력을 검토하였다.
진단용 마커의 5배 희석액과 10배 희석액을 염색에 사용하였는데, 현미경하에서의 발색은 양호하고, 대조구로서 이용한 항 EMA 항체 (50배 희석) 와 비교하여 같은 정도의 염색성이 확인될 수 있었다. 통상 내시경에 의한 프레파라트의 관찰에서는 10배 희석한 진단용 마커도 대조구와 거의 동일하게 식도 점막에 일치하여, DAB (diaminobenzidine) 의 침착이 확인되었다.
본 발명의 진단용 마커를 이용함으로써, 예를 들면, 적외선 내시경 등을 이용하여 준체내적으로 식도암, 위암, 또는 대장암 등 상피성 조직의 악성 신생물의 조기 진단이나 외과 수술시 병소의 특정·진단을 간편하고도 정확하게 수행할 수 있다. 본 발명의 진단용 마커에 의한 검사나 진단은 자외선 여기에 의한 생체 조직이나 DNA 의 손상에 대해 염려가 없어, 생체 자체의 직접 검사나 진단을 행할 수 있으므로, 생체 면역 조직 염색법으로서 유용하다.
또한, 본 발명의 진단용 마커에 포함되는 표지용 화합물은 수용성이 매우 높다는 특징을 갖고 있으므로, 본 발명의 진단용 마커는 위장관에서 흡수되지 않고, 매우 안전하게 검사나 진단을 행할 수가 있다.

Claims (24)

  1. (a) 검출계, 및 (b) 전기 검출계에 결합한 하기의 식으로 표시되는 형광성 관능기를 포함하는 진단용 마커:
    Figure pct00012
    상기 식에서,
    R1및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자, 알킬기, 아릴기, 알콕시기 또는 술폰산기;
    R3는 알킬기, 술폰산알킬기 또는 아미노 치환 알킬기;
    X-는 필요에 따라서 음이온 종; 및,
    Y는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 또는 산소원자, 질소 원자 및 유황 원자로 구성된 그룹에서 선택되는 1 이상의 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타낸다.
  2. (a) 검출계, 및 (b) 전기 검출계에 결합한 하기 식으로 표시되는 형광성 관능기를 포함하는 진단용 마커:
    Figure pct00013
    상기 식에서,
    R4및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자, 알킬기, 알콕시기 또는 술포네이트기;
    R6는 알킬렌기;
    M+는 알카리금속 이온;
    Q-는 할로겐 이은, 과염소산이온 또는 티오시안산 이온; 및,
    Y는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 또는 산소원자, 질소 원자 및 유황 원자로 구성된 그룹에서 선택되는 1 이상의 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타낸다.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    형광성 관능기는 검출계에 직접 결합되는 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    형광성 관능기는 검출계에 링커(linker) 또는 단백을 매개로하여 결합되는 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    겸출계는 항체, 핵산 및 증폭계 물질로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  6. 제 5항에 있어서,
    항체는 항 암항원 항체, 항 세균 항체 또는 항 바이러스 항체인 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  7. 제 1항, 제 2항 또는 제 6항에 있어서,
    근적외선 내지 원적외선의 조사에 의해 780nm 이상의 파장 형광을 발하는 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  8. 제 1항, 제 2항 또는 제 6항에 있어서,
    적외선 내시경 검사 또는 외과수술 시의 병소의 특정에 사용하는 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  9. 제 1항, 제 2항 또는 제 6항에 있어서,
    면역 조직화학적 면역법에 의해 생체의 조직을 직접 염색하기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  10. 제 1항, 제 2항 또는 제 6항에 기재된 진단용 마커를 유효성분으로 포함하는 진단약.
  11. 하기의 식으로 표시되는 화합물:
    Figure pct00014
    상기 식에서,
    R1및 R2는 각각 독립적으로 수소원자, 알킬기, 아릴기, 알콕시기 또는 술폰산기;
    R3는 알킬기, 술폰산알킬기 또는 아미노 치환 알킬기;
    X-는 필요에 따라서 음이온 종;
    Z는 하기의 식
    Figure pct00015
    으로 구성된 그룹에서 선택되는 기; 및,
    W 및 Y는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 또는 산소 원자, 질소원자 및 유황 원자로 구성된 그룹에서 선택되는 1 이상의 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타낸다.
  12. 제 11항에 있어서,
    형광 표지제로 이용되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 제 11항의 화합물을 검출계와 반응시키는 공정을 포함하는 제 1항의 진단용 마커의 제조방법.
  14. 하기의 식으로 표시되는 화합물:
    Figure pct00016
    상기 식에서,
    R4및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자, 알킬기, 알콕시기 또는 술포네이트기;
    R6는 알킬렌기;
    M+는 알카리금속 이온;
    Q-는 할로겐 이온, 과염소산이온, 또는 티오시안산 이온;
    Z는 하기의 식
    Figure pct00017
    으로 구성된 그룹에서 선택되는 기; 및
    W 및 Y는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 또는 산소 원자, 질소 원자 및 유황 원자로 구성된 그룹에서 선택되는 1 이상의 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기를 나타낸다.
  15. 제 14항에 있어서,
    형광 표지제로 이용되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제 14항의 화합물을 검출계와 반응시키는 공정을 포함하는 제 2항의 진단용 마커의 제조방법.
  17. (a) 검출계, 및 (b) 전기 검출계에 결합하고 있고, 600nm ~ 800nm 파장의 여기광을 조사함으로써 780nm 이상의 파장 형광을 발하며, 시아닌계, 프탈로시아닌계, 디티올니케착제(錯體)계, 나프토퀴논·안스라퀴논계, 인도페놀계, 및 아조계로 구성된 그룹에서 선택되는 근적외선 흡수성 화합물에서 유래하는 형광성 관능기를 포함하는 진단용 마커.
  18. 제 17항에 있어서,
    형광성 관능기는 검출계에 직접 결합되는 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서,
    형광성 관능기는 검출계에 링커(linker) 또는 단백을 매개로 하여 결합되는 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  20. 제 17항 또는 제 18항에 있어서,
    검출계는 항체, 핵산 및 증폭계물질로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  21. 제 20항에 있어서,
    항체는 항 암항원 항체인 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  22. 제 17항, 제 18항 또는 제 21항에 있어서,
    적외선 내시경 검사 또는 외과수술 시의 병소의 특정에 사용하는 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  23. 제 17항, 제 18항 또는 제 21항에 있어서,
    면역 조직화학적 면역법에 의해 생체의 조직을 직접 염색하기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 진단용 마커.
  24. 제 17항, 제 18항 또는 제 21항에 기재된 진단용 마커를 유효성분으로 포함하는 진단약.
KR1019970705159A 1995-01-30 1996-01-30 진단용마커 KR100397020B1 (ko)

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