JP2015504413A - Ｐａｔ−ｌｍ１エピトープおよびそれを使用するための方法 - Google Patents

Ｐａｔ−ｌｍ１エピトープおよびそれを使用するための方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、概して、ＰＡＴ−ＬＭ１として知られる抗体のエピトープ、およびそのエピトープを用いる方法に関する。

Description

本開示は、ＰＡＴ−ＬＭ１として知られる抗体のエピトープおよびミモトープ、ならびに該エピトープおよびミモトープを使用するための方法に関する。
ＰＡＴ−ＬＭ１と表示される抗体（受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２６２３の下にＤＳＭＺに寄託され、本明細書で「ＬＭ１」とも称される）は、ＩｇＭであり、異なる種類の新生物、癌、腫瘍、またはそれらの転移癌に結合する。ＰＡＴ−ＬＭ１は、種々の種類の癌細胞の成長を阻害し、種々の種類の癌細胞のアポトーシスを刺激または誘導する。ＰＡＴ−ＬＭ１はまた、原発性新生物、腫瘍、もしくは癌から生じる１つ以上の部位での転移癌の形成または確立、あるいは１つ以上の他の部位で形成もしくは確立されている転移癌の成長もしくは増殖も低減する。
ＰＡＴ−ＬＭ１抗体、変異体、機能的断片、および標的抗原（核マトリックスタンパク質５５としても知られるＮＭＴ５５、ＮＯＮＯ（非ｐｏｕドメイン含有八量体結合タンパク質）、ｐ５４ｎｒｂ（５４ｋＤａ核ＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質）、または５５ｋＤａ核タンパク質）が以前に特定されている（国際公開第ＷＯ２００４／０８１０２７号および同第ＷＯ２０１０／００４４３８号を参照されたい）。しかしながら、特異的なＰＡＴ−ＬＭ１エピトープを特定する必要性が残っている。ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープの理解は、抗癌療法の開発を補助するであろう。本開示は、これらの必要性に対処する。
国際公開第ＷＯ２００４／０８１０２７号 国際公開第ＷＯ２０１０／００４４３８号
本発明者らは、ＰＡＴ−ＬＭ１抗体を使用して、増殖性障害を治療するまたは予防するための有用な薬剤である、ＮＭＴ５５上のエピトープおよびそのミモトープを特定した。
したがって、本開示は配列番号３、４、または５のうちのいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列を含む、約６〜５０アミノ酸の単離ペプチドを提供する。本開示は、配列番号３、４、または５のうちのいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離ペプチドを更に提供する。本開示は、１つ以上の保存的アミノ酸置換、例えば、１または２または３または４の保存的アミノ酸置換を有する、配列番号３、４、または５のうちのいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列を含む、単離ペプチドを更に提供する。本開示は配列番号３、４、または５のうちのいずれか１つにおいて示されるアミノ配列からなる単離ペプチドを更に提供する。
本開示は、本開示の少なくとも１つのペプチドをコードする、単離および／または外来性核酸も提供する。
本開示はまた、本開示のペプチドを含む組成物も提供する。ある実施形態において、組成物は、アジュバント等の、薬学的に許容される担体を更に含む。更なる実施形態において、組成物は、免疫応答を誘導または強化する。
本開示は、本開示のペプチドまたはそれをコードする核酸を含むワクチンも提供する。ある実施形態において、そのワクチンは、アジュバント等の、薬学的に許容される担体を更に含む。
本開示はまた、本開示のペプチドもしくはそれをコードする核酸、組成物、またはワクチンを、対象に投与することを含む、該対象において免疫応答を誘導する方法も提供する。
本開示のある実施形態において、対象は、増殖性障害、例えば、新生物、癌、腫瘍、もしくはそれらの転移癌を有するか、またはそれらを有する危険性がある。癌は、例えば、結腸直腸癌、卵巣癌、鱗状細胞肺癌、小細胞肺癌、小葉性乳癌および乳管癌、黒色腫、乳癌、肺腺癌等の肺癌、胃癌、膵臓腺癌等の膵臓癌、神経膠腫、肉腫、胃腸癌、脳の腫瘍、食道鱗状細胞癌等の食道癌、胃癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺腺癌等の前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、子宮腺癌、ホジキン病、リンパ腫、および白血病であり得る。
ある実施形態において、本開示のペプチドもしくはそれをコードする核酸、組成物、またはワクチンは、対象における新生物、癌、腫瘍、もしくはそれらの転移癌のサイズおよび／または成長を低減する。ある実施形態において、本開示のペプチドもしくはそれをコードする核酸、組成物、またはワクチンは、新生物もしくは腫瘍成長、または癌の初発を予防する。ある実施形態において、本開示のペプチドまたは組成物は、対象における新生物、腫瘍、または癌の転移を予防するか、またはそれらの転移の発症を遅延させる。
本開示はまた、対象における増殖性障害を治療するための方法も提供し、本方法は、対象に、本開示のペプチド、本開示の核酸、本開示の組成物、または本開示のワクチンを投与することを含む。
更なる実施形態において、対象における増殖性障害を治療するための方法は、その対象に抗新生物剤を投与することを更に含む。その抗新生物剤は、例えば、放射線または化学療法であり得る。
また、対象において免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、本開示のペプチド、本開示の核酸、本開示の組成物、または本開示のワクチンの使用も提供される。
また、対象において免疫応答を誘導するための、本開示のペプチド、本開示の核酸、本開示の組成物、または本開示のワクチンの使用も提供される。
また、対象における増殖性障害の治療のための医薬製造のための、本開示のペプチド、本開示の核酸、本開示の組成物、または本開示のワクチンの使用も提供される。
また、対象における増殖性障害の治療のための、本開示のペプチド、本開示の核酸、本開示の組成物、または本開示のワクチンの使用も提供される。
本開示はまた、化合物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を本開示のペプチドと接触させることを含む、その化合物をアッセイ、濃縮、単離、または精製するための方法も提供する。
ある実施形態において、本方法は、ある試料中の化合物のレベルをアッセイするためのものであり、その試料中のその化合物のレベルを検出することを含む。
ある実施形態において、その化合物は、抗体または抗原結合断片である。
一実施例において、抗体または抗原結合断片の検出は、その抗体またはその抗原結合断片の特異的結合を達成するような条件下で、その抗体またはその抗原結合断片を接触させて複合体を形成させることと、例えば、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＺＡによりその複合体の量を検出することとによって、決定することができる。
ある実施形態において、本方法は、生体試料を対象から単離するかまたは得ることと、その試料中のその化合物のレベルを検出することとを更に含む。その試料は、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、腹水等の生体液であり得る。本方法は、例えば、インビトロまたはエクスビボで行われてもよい。
別の実施形態において、本方法は、化合物を濃縮する、単離する、または精製するためのものであり、本開示のペプチドに結合する化合物、またはそれを発現する細胞もしくはそれを表示する粒子を選択することを含む。
一実施例において、その化合物は、抗体またはその抗原結合断片である。
一実施例において、その抗体または抗原結合断片は、キメラ、ヒト化、またはヒトの抗体または抗原結合断片である。
一実施例において、本方法は、その抗原結合断片を再フォーマットして、それによって抗体を生成することを更に含む。
一実施例において、本方法は、その化合物を製造することと、任意に、その化合物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）および薬学的に許容される担体を含む組成物を調製することとを更に含む。
ある実施形態において、本開示は、本発明の少なくとも１つのペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を試料と接触させることと、その試料中の化合物がそのペプチドに特異的に結合するかどうかを検出することとを含む、アッセイを提供する。
ある実施形態において、本開示は、本開示のペプチドを含む基質を提供し、その本開示のペプチドはその基質上に固定されている。
その基質は、シリコン、シリカ、石英、硝子、制御孔ガラス、炭素、アルミナ、チタニア、酸化タンタル、ゲルマニウム、窒化シリコン、ゼオライト、ガリウムヒ素、金、プラチナ、アルミニウム、銅、およびチタン、重合体、それらの組み合わせ等を含む、種々の材料から作製されてもよい。その基質は、本発明の基質が使用される任意のアッセイおよび試薬に実質的に影響しない材料から好ましく作製される。好ましい実施形態において、その基質は、ポリスチレン、ポリ（テトラ）フルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンジフルオリド、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ（エーテルエーテル）ケトン、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリビニルフェノール、ポリ乳酸、ポリメタクリルイミド（ＰＭＩ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、シクロ−オレフィン、ポリアルケンスルホン（ＰＡＳ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリアクリルアミド、ポリイミド、およびブロック共重合体等の重合体、ならびにそれらの組み合わせを含む。
本発明は、化合物（例えば、抗体）へのペプチドの結合を検出するための免疫アッセイにおいて使用される試薬のような、少なくとも１つの試薬と一緒にパッケージ化された、本開示の少なくとも１つのペプチドを含むキットを提供する。そのキットは、使用のための指示書も含み得る。
本開示は、本開示のペプチドに結合する化合物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）のスクリーニング方法を更に提供する。
例えば、本方法は、ライブラリ、例えば、ファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることを含む。
本開示は、本開示のペプチドを対象から得られた試料と接触させることと、その試料中の抗体がそのペプチドに特異的に結合するかどうかを決定することとを含む、対象において癌を検出する、診断する、または監視する方法を更に提供する。
その試料は、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、腹水等の生体液であり得る。
一実施例において、その癌は、ＮＭＴ５５を発現する。その癌は、例えば、結腸直腸癌、卵巣癌、鱗状細胞肺癌、小細胞肺癌、小葉性乳癌および乳管癌、黒色腫、乳癌、肺腺癌等の肺癌、胃癌、膵臓腺癌等の膵臓癌、神経膠腫、肉腫、胃腸癌、脳の腫瘍、食道鱗状細胞癌等の食道癌、胃癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺腺癌等の前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、子宮腺癌、ホジキン病、リンパ腫、および白血病であり得る。
ある実施形態において、本方法は、生体試料を対象から単離するかまたは得ることを更に含む。
一実施例において、その試料中の抗体の検出は、その抗体の特異的結合を達成するような条件下で、その抗体を接触させて複合体を形成させることと、例えば、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＺＡによりその複合体の量を検出することとによって、決定することができる。
本開示は、本開示のペプチドに結合する、抗体またはその抗原結合断片等の化合物を更に提供する。本開示は、本開示の方法におけるこの化合物の使用、例えば、対象における新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌の診断および治療を更に提供する。
実施例１に記載され、かつ図２に概説される、ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープをマッピングするために、ＮＭＴ５５の断片をクローニングするよう使用された計画を示す。太字で強調された部分は、ＮＭＴ５５上のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ配列（配列番号４）を含む配列である。 エピトープマッピングのための、ＰＡＴ−ＬＭ１抗原（ＮＭＴ５５）のアミノ酸配列に由来する重複断片を走査するために使用された計画を示す。Ａ）ＮＭＴ５５のアミノ酸２９０〜４７１を含む断片３に、ＰＡＴ−ＬＭ１が結合することが特定されたことを示す、ウェスタンブロット。Ｂ）ＮＭＴ５５サブクローニング計画。ＮＭＴ５５を、１０個の１５アミノ酸削減断片中にサブクローニングした。ＮＭＴ５５のアミノ酸１〜３１０を含むサブ断片が最後の陽性ＰＡＴ−ＬＭ１構築物として特定された。したがって、ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープはＮＭＴ５５のアミノ酸２９０〜３１０にマッピングされた。 ＮＭＴ５５上のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープの精巧なマッピングのために使用された計画を示す（ＡおよびＣ）。Ｂ）ウェスタンブロットは、ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープがＮＭＴ５５のアミノ酸２９２〜３０６に存在することを示す。 ＰＡＴ−ＬＭ１ ＩｇＭの、Ａ）アラニン置換エピトープ配列、およびＢ）セリン置換エピトープ配列への結合についてのＥＬＩＳＡの結果を示す。 ファージディスプレイ実験を通じて特定された「エピトープ１」のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ配列を精巧にマッピングするために使用された計画を示す（Ａ）。Ｂ、Ｃ、およびＤ）は、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．１、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．２、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．３、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．４、およびＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．５がＰＡＴ−ＬＭ１抗体への結合を示す唯一のポリペプチドであったことを示す、ウェスタンブロットである。ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．３．１、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．３．２、およびＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．６は、ＰＡＴ−ＬＭ１抗体への結合を示さなかった。 ファージディスプレイ実験を通じて特定された「エピトープ２」のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ配列を精巧にマッピングするために使用された計画を示す（Ａ）。ＢおよびＣ）は、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−２．１およびＬＭ−Ｅｐｉ−２．２がＰＡＴ−ＬＭ１抗体への結合を示す唯一のポリペプチドであったことを示す、ウェスタンブロットである。ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−２．３、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−２．４、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−２．５、およびＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−２．６は、ＰＡＴ−ＬＭ１抗体への結合を示さなかった。 ＰＡＴ−ＬＭ１抗体が「エピトープ１」および「エピトープ２」についての最小限のエピトープに結合することが確認された、ウェスタンブロットを示す。 Ａ）陰性対照番号１（Ｃｈｒｏｍ Ｐｕｒｅ ＣＰ抗体単独）、Ｂ）陰性対照番号２（緩衝液＋ＰＡＴ−ＬＭ１−エピトープ２（緑色）またはＳａｍ−３エピトープ（青色））、Ｃ）ＰＡＴ−ＬＭ１抗体単独、Ｄ）ＰＡＴ−ＬＭ１抗体＋ＰＡＴ−ＬＭ１−エピトープ２（緑色）またはＳａｍ−３エピトープ（青色）についての蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）の結果を示す。ＰＡＴ−ＬＭ１抗体の細胞への結合（Ｃ）は、ＰＡＴ−ＬＭ１抗体がＰＡＴ−ＬＭ１追加エピトープ２（配列番号８）と事前インキュベートされたとき、阻害される（Ｄ）。配列表についての解読法配列番号１−ヒトＮＭＴ５５のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９８６７．１、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１５２３３）。配列番号２−ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープを含むアミノ酸配列（ＮＭＴ５５のアミノ酸２９２〜３０６）。配列番号３−最小限ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープのアミノ酸配列。配列番号４−追加のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ１のアミノ酸配列（ミモトープ１）。配列番号５−追加のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ２のアミノ酸配列（ミモトープ２）。配列番号６−ヒトＮＭＴ５５をコードするＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９８６７．１、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１５２３３）。配列番号７〜２５−オリゴヌクレオチドプライマー。配列番号２６−ＰＡＴ−ＬＭ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列番号２７−ＰＡＴ−ＬＭ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列。配列番号２８−ＰＡＴ−ＬＭ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列。
概説
本明細書全体を通じて、特に別段の定めがない限り、または文脈上、別段の要求がない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群への言及は１つおよび複数（すなわち、１つ以上）のそれらのステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群を包含するように見なされるものとする。
当業者であれば、本開示が、具体的に記載されているもの以外の変形および改変の影響を受けやすいことを理解するであろう。本開示は、かかる変形および改変全てを含むことが理解されるべきである。本開示は、本明細書で言及され、またはそこで示される全てのステップ、特徴、組成物、および化合物を個々にまたは集合的に、ならびに該ステップもしくは特徴のありとあらゆる組み合わせ、またはそれらのうちの任意の２つ以上も含む。
本開示は、例示の目的のためのみに意図される、本明細書に示される特定の実施例により範囲を限定されるべきでない。機能的に均等な生成物、組成物、および方法は、明らかに本開示の範囲内である。
本明細書における本開示の任意の実施例は、特に別段の定めがない限り、本開示の任意の他の実施例に必要な変更を加えて適用するように見なされるものとする。
特定の特徴もしくは特徴の群、または方法もしくは方法ステップを開示する、本開示の任意の実施例は、その特定の特徴もしくは特徴の群、または方法もしくは方法ステップを放棄するための明示的な支持を提供するように見なされるものとする。
特に別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生化学における）、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有するように見なされるものとする。
特に別段の定めがない限り、本開示において利用される組換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的技術は、当業者に周知の標準の手順である。かかる技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ１ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ１−４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６）、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（編集者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての最新版を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、およびＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（編集者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全ての最新版を含む）等の情報源中の文献を通じて記載され、説明される。
本明細書におけるそれらの可変領域および部分、抗体およびその断片の説明および定義は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７および１９９１中の議論により更に明確にすることができる。
「および／または」、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」という用語は、「ＸおよびＹ」または、「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するように理解されるものとし、また両方の意味のためのまたはいずれかの意味のための明示的な支持を提供するように見なされるものとする。
本明細書全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語等の変形は所定の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群の包含を暗示するが、任意の他の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群の排除を暗示するようには理解されないであろう。
選択される定義
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンドメインを含む、任意の抗原結合タンパク質を含むように理解されるものとする。例示的な免疫グロブリンは、抗体である。「免疫グロブリン」という用語により包含される更なるタンパク質は、ドメイン抗体、ラクダ科の抗体、および軟骨魚類からの抗体（すなわち、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ））を含む。概して、ラクダ科の抗体およびＩｇＮＡＲはＶＨを含むが、ＶＬを欠き、しばしば、重鎖免疫グロブリンと称される。他の「免疫グロブリン」は、Ｔ細胞受容体を含む。
当業者であれば、「抗体」が、概して、複数のポリペプチド鎖、例えば、ＶＬを含むポリペプチドとＶＨを含むポリペプチドとからなる可変領域を含む、タンパク質であると考えられることに気付くであろう。抗体は、概して、定常ドメインを含み、それらの幾つかは、定常領域または定常断片もしくは結晶性断片（Ｆｃ）に配置され得る。ＶＨとＶＬとは相互作用して、１つまたは数個の親密に関連する抗原に特異的に結合する、ある抗原結合領域を含むＦvを形成する。概して、哺乳類からの軽鎖は、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかであり、哺乳類からの重鎖は、α、δ、ε、γ、またはμである。抗体は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスのものであり得る。ある実施形態において、その抗体はまた、ＩｇＭである。「抗体」という用語は、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、およびキメラ抗体も包含する。
「完全長抗体」という用語は、抗体の抗原結合断片とは対照的に、その実質的に無傷な形態の抗体を指す。特に、抗体全体は、Ｆｃ領域を含む重鎖および軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは野生型配列定常ドメイン（例えば、ヒト野生型配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。幾つかの事例において、無傷の抗体は、１つ以上のエフェクター機能を誘導可能であり得る。
抗体の「抗原結合断片」は、完全長抗体の１つ以上の可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、およびＦｖ断片、二重特異性抗体、直鎖抗体、抗体断片から形成された単鎖抗体分子および多特異的抗体が挙げられる。
本開示の文脈において、「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に結合する細胞またはタンパク質により媒介される生物学的活性を指し、それは細胞の殺滅をもたらす。抗体またはその抗原結合断片により誘導されるエフェクター機能の例としては、補体依存性細胞傷害性、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、およびＢ細胞活性化が挙げられる。
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」または、「ＡＤＣＣ」とは、細胞傷害性の形態を指し、ある細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（「ＦｃＲ」）上に結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後その標的細胞を細胞毒で殺滅することを可能にする。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイが行われてもよい。かかるアッセイのために有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）を含む。
本明細書で使用されるとき、「可変領域」とは、抗原に特異的に結合し、例えば、ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、本明細書で定義されるような抗体の軽鎖および／または重鎖の部分を指す。例えば、可変領域は、３つのＣＤＲと共に、３つまたは４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および任意にＦＲ４）を含む。ＶＨは、重鎖の可変領域を指す。ＶＬは、軽鎖の可変領域を指す。
本明細書で使用されるとき、「相補性決定領域」（ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と同義）という用語は、抗体可変領域のアミノ酸残基を指し、その抗体可変領域の存在が特異的抗原結合に主に寄与する。各可変領域は、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として特定される３つのＣＤＲ領域を有する。一実施例において、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられたアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１（本明細書で「Ｋａｂａｔ付番系」とも称される）に従って定義される。Ｋａｂａｔ付番系に従って、ＶＨＦＲおよびＣＤＲは、以下のように位置付けられる：残基１〜３０（ＦＲ１）、３１〜３５（ＣＤＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、５０〜６５（ＣＤＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、９５〜１０２（ＣＤＲ３）、および１０３〜１１３（ＦＲ４）。Ｋａｂａｔ付番系に従って、ＶＬＦＲおよびＣＤＲは、以下のように位置付けられる：残基１〜２３（ＦＲｌ）、２４〜３４（ＣＤＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、８９〜９７（ＣＤＲ３）、および９８〜１０７（ＦＲ４）。
「フレームワーク領域」（これ以降、ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書で使用されるとき、「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体の重鎖または軽鎖の一部を指す。重鎖において、定常領域は、概して、複数の定常ドメインおよびヒンジ領域を含み、例えば、ＩｇＧ定常領域は、以下の結合された構成要素、定常重鎖（ＣＨ）１、リンカー、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。重鎖において、定常領域は、Ｆｃを含む。軽鎖において、定常領域は、概して、１つの定常ドメイン（ＣＬ１）を含む。
「結晶性断片」または、「Ｆｃ」または、「Ｆｃ領域」または、「Ｆｃ部分」（本明細書で交換可能に使用され得る）という用語は、少なくとも１つの定常ドメインを含む抗体の領域を指し、それは概して（必ずではないが）、グリコシル化され、それは１つ以上のＦｃ受容体および／または補体カスケードの構成要素に結合することができる。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ、α、δ、ε、γ、またはμのいずれかから選択され得る。更に、（重鎖のＩｇＧサブクラス等の）種々のサブクラスの重鎖は、種々のエフェクター機能に関与し、したがって、所望の重鎖定常領域を選択することにより、所望のエフェクター機能を有するタンパク質を生成することができる。例示的な重鎖定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）、およびガンマ３（ＩｇＧ３）、またはそれらのハイブリッドである。
「定常ドメイン」とは、抗体におけるドメインであり、その配列は、抗体／同じ種類の抗体、例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭまたはＩｇＥで非常に類似している。抗体の定常領域は、概して、複数の定常ドメインを含み、例えば、γ、α、またはδ重鎖の定常領域は、２つの定常ドメインを含む。
「ＫａｂａｔのＥＵ付番系」という用語は、抗体重鎖の付番がＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａに教示される、ＥＵ指標に従うことを意味するように理解される。このＥＵ指標はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基付番に基づく。
本明細書における「ＰＡＴ−ＬＭ１抗体」へのまたは「ＬＭ１」への言及は、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２６２３下でＤＳＭＺに寄託され、かつ国際公開第ＷＯ２００４／０８１０２７号および／または同第ＷＯ２０１０／００４４３８号に示される抗体への言及である。ＬＭ１抗体は、配列番号２６および２８、または配列番号２７および２８にそれぞれ示される、重鎖および軽鎖可変領域配列を含む。
本明細書で使用されるとき、「特異的結合」という用語は、抗体またはその抗原結合断片が代替のペプチド、抗原、または細胞と反応するか、または会合するより頻繁に、より速く、より長い期間、および／またはより大きな親和性で、本開示のペプチド、そのペプチドを含む抗原（例えば、ＮＭＴ５５）、またはそのペプチドもしくは抗原を発現する細胞と反応するか、または会合する、抗体またはその抗原結合断片を意味するように見なされるものとする。例えば、本開示のペプチド、そのペプチドを含む抗原、または該ペプチドもしくは抗原を発現する細胞に特異的に結合する抗体は、そのペプチド、抗原、または細胞に、他のペプチド、抗原、または細胞に結合するより大きな親和性、結合活性で、より容易に、および／またはより長い期間、結合する。例えば、そのペプチド、抗原、または細胞に特異的に結合する抗体は、第２のぺプチド、抗原、または細胞に特異的に結合する場合もあれば、結合しない場合もある。このように、「特異的結合」とは、排他的結合または別の分子の結合が検出できないことを必ずしも必要とせず、このことは「選択的結合」という用語により意味される。概して、必然的ではないが、結合への言及は特異的結合を意味し、各用語は、他の用語についての明示的な支持を提供することが理解されるものとする。
本明細書で使用されるとき、「検出可能に結合しない」という用語は、本開示の抗体またはその抗原結合断片が候補ペプチドまたは抗原（例えば、ＮＭＴ５５）にバックグラウンドを１０％未満上回る、または８％もしくは６％もしくは５％上回るレベルで結合することを意味するように理解されるものとする。そのバックグラウンドは、抗体もしくは抗原結合断片の不在下で、および／または陰性対照ペプチドもしくはタンパク質の存在下で検出される結合シグナルのレベル、ならびに／または陰性対照ペプチドもしくは抗原の存在下で検出される結合のレベルであり得る。結合レベルは、そのペプチドもしくは抗原を発現する、またはそのペプチドもしくは抗原の発現を欠く細胞のウェスタンブロットおよび／またはＦＡＣＳ分析を用いて検出される。
「競合的に阻害する」という用語は、本開示の抗体またはその抗原結合断片が、列挙された抗体の、ＮＭＴ５５または本開示のペプチドへの結合を低減または予防することを意味するように理解されるものとする。抗体またはその抗原結合断片は、列挙された抗体の結合を完全に阻害する必要はなく、むしろ、それは単に統計的に有意な量で、例えば、少なくとも約１０％または２０％または３０％または４０％または５０％または６０％または７０％または８０％または９０％または９５％、結合を低減することを必要とすることが、上記から明らかであろう。結合の競合的阻害を決定する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、抗体は、試験抗体またはその抗原結合断片の存在下または不在下のいずれかで、ＮＭＴ５５または本開示のペプチドに暴露される。試験抗体または抗原結合断片の不在下と比較して、その試験抗体または抗原結合断片の存在下では、その抗体のうちのほとんどが結合しない場合、その試験抗体または抗原結合断片は、その抗体の結合を競合的に阻害すると考えられる。
本明細書で使用されるとき、「ＮＭＴ５５媒介状態」という用語は、哺乳類における過剰なＮＭＴ５５発現、および／または新生物細胞もしくは癌細胞等の、過剰な数のＮＭＴ５５発現細胞に関連するか、またはそれらにより引き起こされる病態を意味するように理解されるものとする。
本明細書で使用されるとき、「治療」という用語は、臨床病理の過程中に治療される個体または細胞の自然な過程を変えるように設計された臨床的介入を指す。治療の所望の効果は疾患の進行速度の減少、病状の改善または緩和、および緩解または改善された予後を含む。例えば、疾患に関連する１つ以上の症状が鎮静または除去された場合、個体は成功裏に「治療され」る。
本明細書で使用されるとき、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、個体における疾患の発生または再発についての予防を提供することを含む。個体は、疾患または疾患再発の素因があるか、またはそれらの危険性があり得るが、その疾患または再発を未だに診断されていない。
本明細書で使用されるとき、疾患もしくは病態、もしくはその再発、または再発を有する「危険性のある」対象は、検出可能な疾患または疾患の症状を有する場合も、有しない場合もあり、本開示に従う治療の前に検出可能な疾患または疾患の症状を呈したことがある場合も、呈したことがない場合もある。「危険性のある」とは、対象が、当該技術分野において既知の、その疾患または病態にかかることに関連する、測定可能なパラメータである、１つ以上の危険要因を有することを示す。
「有効量」とは、必要な投薬量での、および必要な期間の、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効な少なくとも１つの量を指す。有効量は、１つ以上の投与において提供することができる。本開示のある実施例において、「有効量」という用語は、増殖性障害、例えば、癌等の疾患または病態の治療を達成するのに必要な量が意図される。有効量は治療されるべき疾患または病態に従って、および治療される哺乳類に関連する体重、年齢、民族的背景、性別、健康、および／または身体的状態、ならびに他の要因にも従って、変動し得る。典型的に、有効量は、開業医により日常的な試験および実験を通じて決定され得る、比較的広い範囲（例えば、「投薬量」範囲）内に入るであろう。有効量は、単回用量で、または治療期間にわたり１回もしくは複数回反復される用量で投与することができる。
「治療上有効量」とは、特定の障害（例えば、癌）の測定可能な改善を達成するのに必要とされる、少なくとも最小限の濃度である。本明細書における治療上有効量は患者の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘導するワクチンまたは抗体もしくはその抗原結合断片の能力等の要因に従って、変動し得る。治療上有効量はまた、そのワクチンまたは抗体もしくはその抗原結合断片の任意の毒性作用または有害作用よりも、治療的に有益な効果が勝る、量でもある。
「予防上有効量」とは、必要な投薬量での、および必要な期間の、所望の予防的結果を達成するための有効量を指す。典型的に、必然的ではないが、予防的用量は疾患前にまたは疾患の初期段階で対象において使用されるので、予防上有効量は、治療上有効量より少ない量であり得る。
「免疫応答」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味を有し、体液性および細胞性免疫の両方を含む。免疫応答は、抗−抗原抗体の発達、抗原特異的Ｔ細胞の拡張、腫瘍浸透リンパ球（ＴＩＬ）の増加；抗腫瘍もしくは抗腫瘍抗原遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答の発達、病原体の除去、病原体および／もしくは腫瘍の成長ならびに／または広まりの抑制、腫瘍減少、転移の減少または除去、再発までの時間の延長、病原体または腫瘍を含まない生存期間の延長、ならびに生存期間の延長のうちの１つ以上として現れ得る。免疫応答は、Ｂ細胞活性化、Ｔ細胞活性化、ナチュラルキラー細胞活性化、抗原表示細胞（例えば、Ｂ細胞、ＤＣ、単球、および／またはマクロファージ）の活性化、サイトカイン生成、ケモカイン生成、特異的細胞表面マーカー発現、具体的には、共刺激性分子の発現のうちの１つ以上により媒介され得る。免疫応答は、体液性、細胞性、Ｔｈ１もしくはＴｈ２応答、またはそれらの組み合わせにより特徴付けることができる。
本開示に従って治療される「対象」は、非ヒト霊長類またはヒト等の、哺乳類であり得る。一実施例において、その哺乳類は、ヒトである。
「腫瘍」、「癌」、および「新生物」という用語は、交換可能に使用され、その成長、増殖、または生存が正常な同等の細胞の成長、増殖、または生存よりも大きい、細胞または細胞集団、例えば、細胞増殖性または分化性障害を指す。典型的に、その成長は、制御不能である。「悪性」という用語は、組織の近くの侵襲を指す。「転移」という用語は、腫瘍、癌、または新生物の、対象内の他の部位、位置、または領域への広がりまたは播種を指し、ここでその部位、位置、または領域は、原発性の腫瘍または癌から区別される。新生物、腫瘍、および癌は、良性、悪性、転移性、および非転移性の種類を含み、任意の段階（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶ）またはグレード（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３等）の新生物、腫瘍、もしくは癌、または進行中の、悪化中の、安定化された、もしくは緩解中の新生物、腫瘍、癌、もしくは転移癌を含む。
「同一性」という用語およびその文法的変形は、２つ以上の言及された実体が同じであることを意味する。したがって、２つのタンパク質またはポリペプチド配列が同一である場合、それらは、少なくとも言及された領域または部分内で、同じアミノ酸配列を有する。２つの核酸配列が同一である場合、それらは、少なくとも言及された領域または部分内で、同じポリヌクレオチド配列を有する。その同一性は、その配列の定義された範囲（領域またはドメイン）にわたることができる。「同一性の範囲」とは、同じである、２つ以上の言及された実体の部分を指す。したがって、２つのタンパク質、ポリペプチド、または核酸配列が１つ以上の配列領域にわたり同一である場合、それらはその領域内で同一性を共有する。例示的な同一性は、参照タンパク質もしくはポリペプチドまたはそれらの機能的断片に対して５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、タンパク質もしくはポリペプチドまたはそれらの機能的断片である。
配列同一性は、デフォルト設定で配列分析ソフトウェアを用いて測定することができる（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７０５）。かかるソフトウェアは、種々の置換、欠失、および他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることによって、類似の配列を合致させてもよい。
保存的置換は典型的に、以下の群、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換を含む。
多数の配列はまた、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（１．４）プログラム（Ｊｕｌｉｅ Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ａｎｄ Ｔｏｂｙ Ｇｉｂｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ Ｄｅｓｍｏｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより作成）を用いても、対ごとの整列モードを「ｓｌｏｗ」に、対ごとの整列パラメータを１０．０のオープンギャップペナルティおよび０．１の延長ギャップペナルティを含むよう設定し、かつ類似性マトリックスを「ｂｌｏｓｕｍ」に設定することにより、整列することができる。更に、多数の整列パラメータは１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１の延長ギャップペナルティ、ならびに類似性マトリックスを「ｂｌｏｓｕｍ」に、遅延分散を４０％に、およびギャップ距離を８に設定することを含み得る。
「相同の」または「相同性」という用語は、２つ以上の言及された実体が、ある領域または部分にわたり少なくとも部分的な同一性を共有することを意味する。
相同性または同一性の「範囲、領域、またはドメイン」とは、２つ以上の言及された実体のある部分が相同性を共有するか、または同じであることを意味する。したがって、２つの抗体配列が１つ以上の配列領域にわたり同一である場合、それらはこれらの領域において同一性を共有する。
「実質的な相同性」とは、ある分子が、その分子が相同性を共有する参照分子の構造もしくは機能（例えば、生物学的機能）のうちの１つ以上の少なくとも部分的な構造もしくは機能、または参照分子の関連領域もしくは部分／対応する領域もしくは部分を有するか、または有すると予想されるように、その分子が構造的にまたは機能的に保存されていることを意味する。実質的な相同性を有するタンパク質、ポリペプチド、または機能的断片は、参照タンパク質またはポリペプチドのような少なくとも部分的な活性または機能を有するか、または有すると予想される。
２つの配列間の同一性または相同性の程度は、当該技術分野で既知であるコンピュータプログラムおよび数学的アルゴリズムを用いて確認することができる。配列同一性または相同性の割合を計算する、かかるアルゴリズムは概して、比較領域または範囲にわたり配列ギャップおよび不整合を説明する。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）検査アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０を参照されたい、ＮＣＢＩを通じて公に入手可能）は、以下のような例示的な検査パラメータを有する：不整合−２、ギャップオープン５、ギャップ延長２。ポリぺプチド配列の比較のために、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは典型的に、ＰＡＭ１ＯＯ、ＰＡＭ２５０、ＢＬＯＳＵＭ６２、またはＢＬＯＳＵＭ５０等のスコア付けマトリックスとの組み合わせで使用される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）およびＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムも同一性の程度を定量するために使用される（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８、Ｐｅａｒｓｏｎ２０００、およびＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８１）。Ｄｅｌａｕｎａｙベースの位相的マッピングを用いてタンパク質構造の類似性を定量するためのプログラムも開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
ＮＭＴ５５
ＰＡＴ−ＬＭ１抗体は、その標的としてＮＭＴ５５を認識することが以前に発見された（国際公開第ＷＯ ２０１０／００４４３８号を参照されたい）。ＮＭＴ５５は、核マトリックスタンパク質５５、ＮＯＮＯ（非ｐｏｕドメイン含有八量体結合タンパク質）、ｐ５４ｎｒｂ（５４ｋＤａ核ＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質）、または５５ｋＤａ核タンパク質としても当該技術分野で既知である。
ＮＭＴ５５は、癌、腫瘍、および悪性細胞上で発現される核タンパク質である。ＰＡＴ−ＬＭ１は、ＮＭＴ５５のＮ末端領域に結合する。ＮＭＴ５５へのＰＡＴ−ＬＭ１結合は、それが結合した細胞のアポトーシスを誘導する。
ＮＭＴ５５は、幾つかの核プロセスに関連する、ＤＮＡおよびＲＮＡ結合タンパク質である。それは、二重鎖ＤＮＡ中の正常な八量体配列に結合する。それは、二重部位から独立した部位で、単鎖ＤＮＡおよびＲＮＡにも結合する。ＮＭＴ５５は、おそらくＳＦＰＱ（スプライシング因子、プロリンおよびグルタミンを多く含むタンパク質）とのヘテロ二量体として、前ｍＲＮＡスプライシングに関連する。ＮＭＴ５５は、おそらくＵ５ ｓｎＲＮＡステム１ｂの３′側に位置付けられるプリンを多く含む配列に結合することにより、Ｕ５ ｓｎＲＮＡと相互作用する。ＭＡＴＲ３と関連するＳＦＰＱ−ＮＭＴ５５ヘテロマーは、欠陥のあるＲＮＡの核内保持において役割を果たし得る。ＳＦＰＱ−ＮＭＴ５５ヘテロマーはトポイソメラーゼＩ／ＴＯＰ１の機能を調節することによりＤＮＡ巻戻しに関連し得る。ＳＦＰＱ−ＮＭＴ５５ヘテロマーは、二重鎖切断修復およびＶ（Ｄ）Ｊ組換えに必要とされるＤＮＡ非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に関与し得、対のＤＮＡ末端を安定化することができる。インビトロで、その複合体は、ＤＮＡ末端結合を強く刺激し、ＤＮＡ基質に直接的に結合し、Ｋｕ７０／Ｇ２２Ｐ１−Ｋｕ８０／ＸＲＣＣ５（Ｋｕ）二量体と協同して、機能的な前ライゲーション複合体を確立する。ＮＭＴ５５はまた、転写調節にも関与する。ＳＦＰＱ−ＮＭＴ５５−ＮＲ５Ａ１複合体は、ＣＹＰ１７プロモーターに結合し、基底のおよびｃＡＭＰ依存的な転写活性を調節する。ＮＭＴ５５は、内在性嚢内Ａ粒子（ＩＡＰ）の長い末端の反復内のエンハンサーエレメントに結合し、転写を活性化する。
４７１アミノ酸を含有する（５４．２ｋＤａ）、標準的なＮＭＴ５５配列は、配列番号１に提供される（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９８６７．１またはＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１５２３３）。ＮＭＴ５５は、種々のイソ型を有することが予想される（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｃ９ＪＹＳ８、Ｃ９ＪＲＡ５、Ｂ７Ｚ４Ｃ２、およびＢ４ＤＷＩ８）。しかしながら、これらのイソ型は、自動配列予想プログラムから予想されており、その予想を支持する機能的データは存在しないので、これらのイソ型の配列は、断続的に改定され、最新化される。本明細書で使用されるとき、ＮＭＴ５５という用語は、標準的なＮＭＴ５５配列を指すように使用される。
化合物
抗体
免疫化ベースの方法
抗体を生成する方法は、当該技術分野において既知であり、および／またはＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に示される。概して、かかる方法において、（ＮＭＴ５５のエピトープまたはミモトープを含む）本開示のペプチド、そのペプチドを含む抗原（例えば、ＮＭＴ５５）、またはそのペプチドもしくは抗原を発現する細胞、およびそれらを表示する細胞（すなわち、免疫原）は、任意の好適なまたは所望の担体、アジュバント、または賦形剤と共に任意に調合され、非ヒト動物、例えば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、またはブタに投与される。免疫原は鼻内で、筋内で、皮下で、静脈内で、皮内で、腹腔内で、または他の既知の経路により投与することができる。
ポリクローナル抗体の生成は、免疫化後の種々の点で免疫化動物の血液の試料を採取することにより監視されてもよい。所望の抗体力価を達成する必要が幾つかの事例において、１回以上の更なる免疫化を与えることができる。ブースティングおよびタイタリングのプロセスは、好適な力価が達成されるまで反復される。所望のレベルの免疫原性が得られたとき、免疫化動物を出血させ、血清を単離し、貯蔵し、および／またはその動物を使用して、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）を生成する。
モノクローナル抗体は、本開示により企図される抗体の１つの例示的な形態である。抗体について使用されるとき、「モノクローナル」という用語は、同じ抗原（単数または複数）に、例えば、その抗原内の同じエピトープに結合することができる、均一な抗体集団を指す。かかる抗体は、任意の真核性クローン、原核性クローン、またはファージクローンを含む、単一のクローンに基づき、それから得られ、またはそれに由来し得る。「モノクローナル」という用語は、抗体の源、またはそれが作製される様式について限定されるようには意図されない。Ｍａｂの生成のために、例えば、米国特許第４１９６２６５号またはＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）（上記）に例示される手順等の、幾つかの既知の技術のうちのいずれか１つを使用することができる。
例えば、好適な動物は、抗体生成細胞を刺激するのに十分な条件下で、免疫原（例えば、本開示のペプチド）で免疫化される。ウサギ、マウス、およびラット等のげっ歯類は、例示的な動物である。ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように、および例えば、ネズミ科免疫グロブリンタンパク質を発現しないように、遺伝子工学で組換えられたマウスも本開示の抗体を生成するために使用することができる（例えば、国際公開第ＷＯ２００２／０６６６３０号に示されるように）。
免疫化後、抗体を生成する能力を有する体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）がＭＡｂ作製プロトコルにおける使用のために選択される。これらの細胞は、脾臓、扁桃、もしくはリンパ節の生検から、または末梢血試料から得ることができる。免疫化動物からのＢ細胞はその後、概して免疫原で免疫化された動物と同じ種に由来する、骨髄腫等の不死の新生物性細胞の細胞と融合される。
ハイブリッドは、組織培養培地中でのヌクレオチドの新規合成をブロックする薬剤を含む、選択的培地中での培養により増幅される。例示的な剤は、アミノプテリン、メトトレキセート、およびアザセリンである。
増幅されたハイブリドーマは、例えば、フローサイトメトリーおよび／または免疫組織化学および／または免疫アッセイ（例えば、放射性免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫アッセイ等）によるような、抗体特異性および／または力価についての機能的選択にかけられる。
代替的に、ＡＢＬ−ＭＹＣ技術（ＮｅｏＣｌｏｎｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ ５３７１３，ＵＳＡ）がＭＡｂを分泌する細胞株を生成するために使用される（例えば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９６に示されるように）。
ハイブリドーマ細胞株
本開示のペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体等の、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株により生成され得る。「ハイブリドーマ」とは、本明細書で使用されるとき、活性化リンパ球等の正常細胞と、新生物性細胞、例えば、骨髄腫との融合により人為的に作製される任意の細胞である。少なくとも２つ細胞の融合から生じるハイブリッド細胞は免疫学的に能力のある親細胞により生成されるものと同一のモノクローナル抗体またはＴ細胞生成物を生成することができる。更に、これらの細胞は、新生物性の親細胞のように、不死である。
かかる細胞株は典型的に、結腸癌または膵臓癌等の新生物を有する患者に由来する脾臓およびリンパ節リンパ球と、ヘテロ骨髄腫細胞株との融合により生成される。例示的なヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、ＨＡＢ−１（Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、ＣＢ−Ｆ７（Ｄｅｌｖｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、Ｋ６Ｈ６Ｂ５（Ｄｅｌｖｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、Ｈ７ＮＳ．９３４（Ｄｅｌｖｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、ＳＨＭ−Ｄ３３（Ｂｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、およびＢ６Ｂ１１（Ｂｏｒｉｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を含む。癌患者のリンパ球からヒトモノクローナル抗体を生成する能力は、癌患者における腫瘍に対する免疫応答により生成される抗体の単離を可能にする。
典型的に、リンパ節または脾臓の部分は、結腸癌または膵臓癌等の癌を有する患者から外科的に除去される。リンパ球は、機械的手段により細胞懸濁液として調製され、その後、細胞融合をもたらす条件下で例えば、１：２または１：３の割合で、ヘテロ骨髄腫細胞株と融合され得る。例えば、ヒトリンパ球とマウス骨髄腫ＮＳ−０との融合により生成される、ヘテロ骨髄腫細胞株ＨＡＢ−１は、この目的のために使用することができる。癌患者から単離されたリンパ球のある部分も培養中で維持することができる。これらの細胞は以下に示される始めの抗体スクリーニングのために有用なヒト自家細胞の源として働く。
癌患者に由来するリンパ球とヘテロ骨髄腫細胞株との融合後、抗体生成ハイブリドーマまたはトリオーマが生成される。一旦、構築されると、ハイブリドーマは概して、標準培養および大量培養（フラスコ、ミニＰｅｒｍ、発酵槽等）における成長および抗体生成において数ヶ月間安定である。抗体生成のレベルは典型的に、フラスコ中で０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬ、ミニＰｅｒｍ中で０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬに及ぶ。細胞融合は当該技術分野で既知のいずれの方法によっても達成することができ、例えば、４０％ポリエチレングリコールの使用を含む。ハイブリドーマは、ＨＡＴ（ヒポバンチン−アミノプテリン−チミジン）を含有する培地中で培養されることができ、４週間後、上清は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗体生成についてスクリーニングされ得る。陽性クローンはその後、上記で調製される自家細胞株を用いて、付着阻害および結合アッセイにおいて試験され得る。陽性クローンは、腫瘍および正常組織の免疫ペルオキシダーゼ染色を用いて試験することができる。したがって、クローンは自家および同種異系新生物性細胞とのそれらの反応性に基づいて選択され得る。抗体は、例えば、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８により示されるように、陽イオン交換クロマトグラフィー、その後のゲルろ過の使用により、大量培養から精製することができる。抗体の生成後、トリオーマにより生成された抗体の追加の機能および免疫組織化学試験が行われ得る。例えば、ハイブリドーマにより生成された抗体は、無処理の対照細胞と比較して、アポトーシスを誘導する、細胞増殖を阻害する、またはそれらの両方のその抗体の能力について試験することができる。
ライブラリベースの方法
本開示は、抗体または（例えば、その可変領域を含む）その抗原結合断片のライブラリのスクリーニングも包含する。
本開示により企図されるライブラリの例としては（免疫化を受けていない対象からの）、ナイーブライブラリ、（あるペプチドまたは抗原で免疫化された対象からの）免疫化ライブラリ、または合成ライブラリを含む。抗体またはその領域（例えば、可変領域）をコードする核酸は、従来技術によりクローニングされ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ，ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に開示されるように）、当該技術分野で既知の方法を用いてタンパク質をコードし、提示するために使用される。タンパク質ライブラリを生成するための他の技術は、例えば、米国特許第６３０００６４号（例えば、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧのＨｕＣＡＬライブラリ）、同第５８８５７９３号、同第６２０４０２３号、同第６２９１１５８号、または同第６２４８５１６号に示される。
本開示に従う抗原結合断片は、可溶性の分泌されたタンパク質であり得、または細胞、粒子（例えば、ファージもしくは他のウイルス、リボソーム、または胞子）の表面上の融合タンパク質として提示され得る。種々のディスプレイライブラリフォーマットは、当該技術分野で既知である。例えば、ライブラリはインビトロディスプレイライブラリ（例えば、リボソームディスプレイライブラリ、共有ディスプレイライブラリ、またはｍＲＮＡディスプレイライブラリ、例えば、米国特許第７２７０９６９号に示されるように）である。更に別の実施例において、ディスプレイライブラリは、例えば、米国特許第６３０００６４号、同第５８８５７９３号、同第６２０４０２３号、同第６２９１１５８号、または同第６２４８５１６号に示されるように、抗体の抗原結合断片を含むタンパク質がファージ上で発現される、ファージディスプレイライブラリである。他のファージディスプレイ方法は、当該技術分野において既知であり、本開示により企図される。同様に、細胞ディスプレイの方法、例えば、米国特許第５５１６６３７号に示される、例えば、細菌ディスプレイライブラリ、例えば、米国特許第６４２３５３８号に示される酵母ディスプレイライブラリ、または哺乳類ディスプレイライブラリが、本開示により企図される。
ディスプレイライブラリをスクリーニングする方法は、当該技術分野で既知である。一実施例において、本開示のディスプレイライブラリは、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）に示されるように、親和性精製を用いてスクリーニングされる。親和性精製の方法は、典型的に、ライブラリにより提示された抗原結合断片を含むタンパク質を、標的ペプチドまたは抗原（例えば、ＮＭＴ５５）と接触させることと、洗浄後、そのペプチドまたは抗原に結合したままのそれらのドメインを溶離することとを含む。
スクリーニングにより特定された任意の可変領域またはｓｃＦｖは、所望される場合、容易に完全な抗体に改変される。可変領域またはｓｃＦｖを完全な抗体に改変するか、または再フォーマットする例示的な方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０、またはＪｏｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００４、または国際公開第ＷＯ２０１２／０４０７９３号に示される。代替的に、または更に、標準のクローニング方法が、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ ０４７ １５０３３８，１９８７）、および／または（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１）に示されるように、使用される。
脱免疫化、キメラ、ヒト化、合成ヒト化、霊長類化、およびヒト抗体、または抗原結合断片
本開示の抗体または抗原結合断片は、ヒト化され得る。
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体からのＦＲ上に移植された、またはそれに挿入された、非ヒト種（例えば、マウスもしくはラットまたは非ヒト霊長類）からの抗体からのＣＤＲを含む、ヒト様可変領域を含むタンパク質を指すように理解されるものとする（この種類の抗体は、「ＣＤＲ移植抗体」とも称される）。ヒト化抗体はまた、ヒトタンパク質のうちの１つ以上の残基が１つ以上のアミノ酸置換により修飾される、および／またはヒト抗体のうちの１つ以上のＦＲ残基が対応する非ヒト残基により置換される、抗体も含む。ヒト化抗体はまた、ヒト抗体においてもは非ヒト抗体においても見られない残基も含んでもよい。抗体の任意の追加の領域（例えば、Ｆｃ領域）は概して、ヒトである。ヒト化は、当該技術分野で既知の方法、例えば、米国特許第５２２５５３９号、同第６０５４２９７号、同第７５６６７７１号、または同第５５８５０８９号を用いて行われてもよい。「ヒト化抗体」という用語は、例えば、米国特許第７７３２５７８号に示されるような、超ヒト化抗体も包含する。同様の意味が、「ヒト化抗原結合断片」という用語に当てはまるように見なされる。
本開示の抗体またはその抗原結合断片は、ヒト抗体またはその抗原結合断片であり得る。本明細書で使用されるとき、「ヒト抗体」という用語は、ヒトにおいて、例えば、ヒト生殖細胞株もしくは体細胞において見られる、または可変抗体領域、および任意に、定常抗体領域を用いて生成されたライブラリからの、可変抗体領域、および任意に、定常抗体領域を有する抗体を指す。「ヒト」抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基、例えば、ランダムまたはインビトロ部位特異的突然変異により導入された突然変異（具体的には、そのタンパク質の少数の残基における、例えば、そのタンパク質の残基のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つにおける、保存的置換または突然変異を含む突然変異）を含み得る。これらの「ヒト抗体」は、ヒトの免疫応答の結果として生成される必要は必ずしもなく、むしろ、それらは組換え手段（例えば、ファージディスプレイライブラリのスクリーニング）を用いて、ならびに／またはヒト抗体定常領域および／もしくは可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物（例えば、マウス）により、ならびに／または（例えば、米国特許第５５６５３３２号に示されるような）ガイド選択を用いて生成することができる。これらの用語はまた、かかる抗体の親和性成熟形態も包含する。本開示の目的のために、ヒト抗体は、ヒト抗体からのＦＲ、またはヒトＦＲのコンセンサス配列からの配列を含むＦＲを含み、かつＣＤＲのうちの１つ以上は、例えば、米国特許第６３０００６４号および／または同第６２４８５１６号に示されるように、ランダムまたは半ランダムである、タンパク質を含むとも考えられるであろう。同様の意味が、「ヒト抗原結合断片」という用語に当てはまるように見なされる。
本開示の抗体またはその抗原結合断片は、合成ヒト化抗体またはその抗原結合断片であり得る。「合成ヒト化抗体」という用語は、国際公開第ＷＯ２００７／０１９６２０号に示される方法により調製される抗体を指す。合成ヒト化抗体は、抗体の可変領域を含み、ここで、その可変領域は、新世界の霊長類抗体可変領域からのＦＲと、非新世界霊長類抗体可変領域からのＣＤＲとを含む。
本開示の抗体またはその抗原結合断片は、霊長類化されてもよい。「霊長類化抗体」とは、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）の免疫化後に作製された抗体からの可変領域（単数または複数）を含む。任意に、その非ヒト霊長類抗体の可変領域は、霊長類化抗体を生成するためにヒト定常領域に連結される。霊長類化抗体を生成する例示的な方法は、米国特許第６１１３８９８号に示される。
一実施例において、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、キメラ抗体または断片である。「キメラ抗体」または、「キメラ抗原結合断片」という用語は、可変ドメインのうちの１つ以上が特定の種（例えば、マウスまたはラット等の、ネズミ科）からであり、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し、一方、その抗体もしくは断片の残りの部分は（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類等の）別の種からであり、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する、抗体または断片を指す。一実施例において、キメラ抗体は、非ヒト抗体（例えば、ネズミ科抗体）からのＶＨおよび／またはＶＬを含み、その抗体の残りの領域は、ヒト抗体からである。かかるキメラ抗体およびその抗原結合断片の生成は当該技術分野において既知であり、（例えば、米国特許第６３３１４１５号、同第５８０７７１５号、同第４８１６５６７号、および同第４８１６３９７号に示されるような）標準の手段により達成することができる。
本開示は、例えば、国際公開第ＷＯ２０００／３４３１７号、および同第ＷＯ２００４／１０８１５８号に示されるような、脱免疫化抗体またはその抗原結合断片も企図する。脱免疫化抗体および断片は、１つ以上のエピトープ、例えば、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープが除去され（すなわち、変異され）、それによって対象がその抗体またはタンパク質に対して免疫応答を生じるであろう可能性を低減する。例えば、本開示の抗体は、１つ以上のＢまたはＴ細胞エピトープを特定するために分析され、そのエピトープ内の１つ以上のアミノ酸残基は変異され、それによって抗体の免疫原性を減少させる。
抗体断片
単一ドメイン抗体
ある実施例において、本開示の抗体の抗原結合断片は、（「ドメイン抗体」または、「ｄＡｂ」という用語と交換可能に使用される）単一ドメイン抗体であり、またはそれを含む。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てまたは一部を含む、単一ポリペプチド鎖である。
二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体
ある実施例において、本開示の抗原結合断片は、国際公開第ＷＯ９８／０４４００１号、および／または同第ＷＯ９４／００７９２１号に示されるもの等の、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、またはより高い等級のタンパク質複合体であり、またはそれらを含む。
例えば、二重特異性抗体は、２つの関連ポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、核ポリペプチド鎖は、構造ＶＬ−Ｘ−ＶＨまたはＶＨ−Ｘ−ＶＬを含み、ここで、Ｘは単一のポリペプチド鎖中のＶＨおよびＶＬが関連すること（またはＦｖを形成すること）を許容するのに不十分な残基を含むリンカーであり、または不在であり、かつここで、１つのポリペプチド鎖のＶＨは他のポリペプチド鎖のＶＬに結合し、抗原結合部位を形成する、すなわち、１つ以上の抗原に特異的に結合することができるＦｖ分子を形成する。ＶＬおよびＶＨは各ポリペプチド鎖において同じであり得る、あるいはＶＬおよびＶＨは各ポリペプチド鎖において異なり、二重特異的二重特異性抗体を形成し得る（すなわち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む）。
エフェクター活性を誘導することができる、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体等は、本開示のペプチドに結合することができる抗原結合断片と、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞上の細胞表面分子（例えば、ＣＤ３）に結合することができる抗原結合断片とを用いて作製されてもよい。
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片
当業者であれば、ｓｃＦｖが、単一のポリペプチド鎖中のＶＨおよびＶＬ領域と、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする（すなわち、その単一のポリペプチド鎖のＶＨおよびＶＬが互いに関連し、Ｆｖを形成するための）ＶＨとＶＬとの間のポリペプチドリンカーとを含むことに気づくであろう。例えば、そのリンカーは１２以上のアミノ酸残基を含み、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３はｃｓＦｖのためのより好ましいリンカーのうちの１つである。
本開示は、単一のシステイン残基がＶＨのＦＲおよびＶＬのＦＲに導入され、そのシステイン残基がジスルフィド結合により連結され、安定なＦｖを生成する、ジスルフィド安定化Ｆｖ（またはｄｉＦｖまたはｄｓＦｖ）も企図する。
代替的に、または更に、本開示は、二量体ｓｃＦｖ、すなわち、非共有または共有結合により、例えば、（例えば、ＦｏｓまたはＪｕｎに由来する）ロイシンジッパードメインにより連結された２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質を包含する。代替的に、２つのｓｃＦｖは、例えば、米国特許公報第２００６０２６３３６７号に示されるように、両方のｓｃＦｖが形成することと、ペプチドまたは抗原に結合することとを許容するのに十分な長さのペプチドリンカーにより連結される。
本開示は、エフェクター活性を誘導することができる二量体ｓｃＦｖも企図する。例えば、１つのｓｃＦｖは本開示のペプチドに結合し、別のｓｃＦｖは免疫細胞、例えば、Ｔ細胞上の細胞表面分子（例えば、ＣＤ３またはＣＤ１９）に結合する。一実施例において、その二量体タンパク質は、ｄＡｂおよびｓｃＦｖの組み合わせである。エフェクター機能を誘導することができる二重特異的抗体断片の例は、例えば、米国特許第７２３５６４１号に示される。
他の抗体および抗体断片
本開示はまた、以下のような他の抗体及び抗体断片も企図する。
（ｉ）米国特許第５，７３１，１６８号に示されるような、「鍵と鍵穴の」二重特異的タンパク質、
（ｉｉ）例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に示されるような、ヘテロ結合タンパク質、
（ｉｉｉ）例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に示されるような、化学的クロスリンカーを用いて生成されるヘテロ結合タンパク質、および
（ｉｖ）Ｆａｂ３（例えば、欧州特許第１９９３０３０２８９４号に示されるような）。
例示的な抗体または抗原結合断片
一実施例において、抗体またはその抗原結合断片は、国際公開第ＷＯ２００４／０８１０２７号または同第ＷＯ２０１０／００４４３８号に定義されるような、ＬＭ１抗体、変異体、または機能的断片ではない。
一実施例において、抗体またはその抗原結合断片は、以下のものではない。
（ｉ）配列番号２６または２７に示されるような可変重鎖配列を含む、抗体またはその抗原結合断片、
（ｉｉ）配列番号２６または２７に示されるような可変重鎖配列、および配列番号２８に示されるような可変軽鎖配列を含む、抗体またはその抗原結合断片、
（ｉｉｉ）配列番号２６または２７に示されるアミノ酸配列の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、または
（ｉｖ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）。
免疫グロブリンおよび免疫グロブリン断片
本開示の化合物の一実施例は、Ｔ細胞受容体等の免疫グロブリンの可変領域を含むタンパク質、または重鎖免疫グロブリン（例えば、ＩｇＮＡＲ、ラクダ科抗体）である。
重鎖免疫グロブリン
重鎖免疫グロブリンは、それらが重鎖を含むが、軽鎖を含まない点において、免疫グロブリン（例えば、抗体）の多くの他の形態と構造的に異なる。したがって、これらの免疫グロブリンは、「重鎖のみ抗体」とも称される。重鎖免疫グロブリンは、例えば、ラクダ科および軟骨魚類（ＩｇＮＡＲとも称される）において見られる。
天然の重鎖免疫グロブリン中に存在する可変領域は、概して、それらを従来の４鎖抗体中に存在する（「ＶＨドメイン」と称される）重鎖可変領域と、および従来の４鎖抗体中に存在する（「ＶＬドメイン」と称される）軽鎖可変領域と区別するために、ラクダ科Ｉｇ中の「ＶＨＨドメイン」およびＩｇＮＡＲ中のＶ−ＮＡＲと称される。
重鎖免疫グロブリンは、関連する抗原に対して高い親和性で、かつ高い特異性で結合するために軽鎖の存在を必要としない。このことは、単一ドメイン結合断片が、発現することが容易な、かつ概して安定で、可溶性である、重鎖免疫グロブリンに由来し得ることを意味する。
ラクダ科からの重鎖免疫グロブリン、およびその可変領域、ならびにそれらの生成および／または単離および／または使用の方法の概説説明は、以下の引用文献、国際公開第ＷＯ９４／０４６７８号、同第ＷＯ９７／４９８０５号、および同第ＷＯ ９７／４９８０５号に特に見られる。
軟骨魚類からの重鎖免疫グロブリン、およびその可変領域、ならびにそれらの生成および／または単離および／または使用の方法の概説説明は、国際公開第ＷＯ２００５／１１８６２９号に特に見られる。
Ｖ様タンパク質
本開示の化合物の一例は、Ｔ細胞受容体である。Ｔ細胞受容体は、結合して抗体のＦｖモジュールに同様の構造になる、２つのＶドメインを有する。Ｎｏｖｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１は、どのようにＴ細胞受容体の２つのＶドメイン（アルファおよびベータと称される）が融合され、単鎖ポリペプチドとして発現されるか、更に、抗体ｓｃＦｖに類似の疎水性を直接的に低減するためにどのようにして表面残基を変えるかを示す。単鎖Ｔ細胞受容体、または２つのＶ−アルファおよびＶ−ベータドメインを含む多量体Ｔ細胞受容体の生成を示す、他の出版物は、国際公開第ＷＯ１９９９／０４５１１０号または同第ＷＯ２０１１／１０７５９５号を含む。
抗原結合ドメインを含む他の非抗体タンパク質は、概して単量体である、Ｖ様ドメインを有するタンパク質を含む。かかるＶ様ドメインを含むタンパク質の例としては、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、およびＩＣＯＳが挙げられる。かかるＶ様ドメインを含むタンパク質の更なる開示は、国際公開第ＷＯ１９９９／０４５１１０号に含まれる。
アドネクチン
一実施例において、本開示の化合物は、アドネクチンである。アドネクチンは、ループ領域がペプチドまたは抗原結合を与えるよう変えられた、ヒトフィブロネクチンの第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインに基づく。例えば、１０Ｆｎ３ドメインのβサンドウィッチの１つの末端の３つのループは、アドネクチンがあるペプチドまたは抗原を特異的に認識することを可能にするよう作製され得る。更なる詳細については、米国特許公報第２００８０１３９７９１号または国際公開第ＷＯ２００５／０５６７６４号を参照されたい。
アンチカリン
１つの更なる実施例において、本開示の化合物は、アンチカリンである。アンチカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド、および脂質等の小疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである、リポカリンに由来する。リポカリンは、あるペプチドまたは抗原に結合するよう作製され得る、円錐構造の開放末端に複数のループを有する堅いβシート二次構造を有する。このように作製されたリポカリンは、アンチカリンとして知られる。アンチカリンの更なる説明については、米国特許第７２５０２９７Ｂ１号、または米国特許公報第２００７０２２４６３３号を参照されたい。
アフィボディ
１つの更なる実施例において、本開示の化合物は、アフィボディである。アフィボディは、あるペプチドまたは抗原に結合するよう作製され得る、黄色ブドウ球菌のタンパク質ＡのＺドメイン（抗原結合ドメイン）に由来する足場である。そのＺドメインは、約５８アミノ酸の３つのヘリックスの束からなる。ライブラリは、表面残基のランダム化により作製されている。更なる詳細については、欧州特許第ＥＰ１６４１８１８号を参照されたい。
アビマー
１つの更なる実施例において、本開示の化合物は、アビマーである。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来する多ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは定義されたジスルフィド結合構造を取る。多様性は、Ａドメインのファミリーにより示される天然変形のシャッフルにより作製される。更なる詳細については、国際公開第ＷＯ２００２０８８１７１号を参照されたい。
ＤＡＲＰｉｎ
１つの更なる実施例において、本開示の化合物は、設計アンキリン反復タンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＤＡＲＰｉｎ））である。ＤＡＲＰｉｎは、細胞骨格への完全な膜タンパク質の付着を媒介するタンパク質のファミリーである、アンキリンに由来する。単一のアンキリン反復は、２つのα−ヘリックスおよびβ−ターンからなる、３３残基モチーフである。それらは、各反復の第１のα−ヘリックスおよびβ−ターン中の残基をランダム化することにより、異なる標的ペプチドまたは抗原に結合するよう作製され得る。それらの結合境界面は、モジュールの数を増加させることにより増加することができる（親和性成熟の方法）。更なる詳細については、米国特許公報第２００４０１３２０２８号を参照されたい。
他の非抗体ポリペプチド
結合ドメインを含む他の非抗体タンパク質は、ヒトγ−クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクーニッツ型ドメイン、Ｒａｓ結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、サソリ毒素（カリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）に基づくものを含む。
小分子
別の実施例において、結合分子は小分子である。かかる小分子は、ライブラリから単離することができる。化学小分子ライブラリは、市販されているか、または代替的に、例えば、米国特許第５，４６３，５６４号中のもの等の、当該技術分野で既知の方法を用いて作製されてもよい。
小有機化合物を合成する技術は、その化合物により大幅に異なるであろう。しかしながら、かかる方法は、当業者に既知であろう。
一実施例において、インフォーマティクスは、コンビナトリアルライブラリを生成するために、既知の化合物から好適な化学構築ブロックを選択するために使用される。例えば、ＱＳＡＲ（定量的構造活性関係）モデリングアプローチは好適性を決定するために化合物構造の直線回帰または回帰ツリーを使用する。Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）のソフトウェアは、確率的ＱＳＡＲモデルを作製するために、活性および不活性化合物についてのハイスループットスクリーニング実験データを使用し、そのモデルは、その後リード化合物を選択するために使用される。２成分ＱＳＡＲ方法は、ある特定の化合物が必要とされる機能、部分電荷、モル屈折率（結合相互作用）、およびｌｏｇＰ（分子の親油性）を行うであろう、または行わないであろう可能性の「記述子」を形成する、化合物の３つの特徴的特性に基づく。各原子は、その分子中に表面範囲を有し、その表面範囲は、それに関連するこれらの３つの特性を有する。ある範囲内の部分電荷を有する化合物の全ての原子が決定され、表面範囲（ファンデルワールス表面範囲記述子）が合計される。２成分ＱＳＡＲモデルは、その後活性モデルまたはＡＤＭＥＴモデルを作製するために使用され、それらは、コンビナトリアルライブラリを構築するために使用される。したがって、最初のスクリーニングで特定されたリード化合物は、スクリーニングされる化合物のリストを拡張し、それによって高活性化合物を特定するために使用することができる。
核酸アプタマー
別の実施例において、結合分子は、核酸アプタマー（適応可能オリゴマー）である。アプタマーは、本開示のペプチドまたはそのペプチドを含む抗原（例えば、ＮＭＴ５５）等の、特定の標的に結合する能力を提供する、二次および／または三次構造を形成することができる、単鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログである。したがって、アプタマーは、抗体に類似のオリゴヌクレオチドである。概して、アプタマーは、約１５〜約４０ヌクレオチド、例えば、約２０〜約４０ヌクレオチド等の、約１５〜約１００ヌクレオチドを含み、この範囲内に入る長さのオリゴヌクレオチドは従来技術により調製することができる。
アプタマーは、アプタマーのライブラリから単離され、またはそれから特定され得る。アプタマーライブラリは、例えば、ランダムオリゴヌクレオチドをベクター（またはＲＮＡアプタマーの場合、発現ベクター）にクローニングすることにより生成され、ここで、そのランダム配列は、ＰＣＲプライマーの結合部位を提供する既知の配列に隣接する。所望の生物学的活性（例えば、本開示のペプチド、またはそのペプチドを含む抗原（例えば、ＮＭＴ５５）に特異的に結合する）を提供するアプタマーが選択される。活性が増大したアプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドのシテマティック展開（Ｓｙｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））を用いて選択される。アプタマーライブラリを生成する、および／またはスクリーニングするための好適な方法は、例えば、Ｅｌｌｏｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８−２２，１９９０、米国特許第５２７０１６３号、および／または同第５４７５０９６号に示される。
本開示のペプチドに特異的に結合する化合物の選択
（ＮＭＴ５５エピトープまたはミモトープを含む）本開示のペプチドに特異的に結合する化合物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を選択する好適な方法は、当業者に使用可能である。
例えば、スクリーニングは本開示のペプチドに結合することができる化合物を特定するために行われてもよい。
例えば、抗体断片を表示するファージディスプレイライブラリは本開示のペプチドに結合するタンパク質を特定するために、本開示のペプチドでスクリーニングされる。非ヒト哺乳類の免疫化についてのスクリーニングプロセスも上記に基づいて工夫することができ、本明細書に示される他の化合物を特定するためのスクリーニング方法もそうである。
１つの更なる実施例において、本開示のペプチドまたはそれを発現する細胞を抗体ＬＭ１と接触させる。ライブラリ（例えば、ファージディスプレイライブラリ）をその後、ＬＭ１もしくはそれを発現する細胞、またはそのＮ末端ドメインもしくはその可溶化形態、および選択される結合についてＬＭ１と競合し得る化合物（または化合物を発現するファージもしくは細胞）と接触させる。
１つのまた更なる実施例において、キメラタンパク質は、例えば、マウスＮＭＴ５５を含み、ここで、（ＮＭＴ５５エピトープまたはミモトープを含む）本開示のペプチドが、対応するマウス配列に置換されている。このキメラタンパク質は、その後（マウスタンパク質に対して免疫応答を誘導する可能性がより少ない）マウスを免疫化するために、および／またはライブラリをスクリーニングするために使用される。生じる化合物（例えば、抗体）はその後本開示のペプチドに結合するが、マウスＮＭＴ５５には結合しない化合物を特定するためにスクリーニングされる。
定常領域
本開示は、抗体の定常領域および／または抗体のＦｃ領域を含む化合物（例えば、抗体およびその抗原結合断片）を包含する。
本開示の免疫グロブリン、抗体、または抗原結合断片を生成するために有用な定常領域および／またはＦｃ領域の配列は、幾つかの種々の源から得ることができる。ある実施例において、その化合物の定常領域、Ｆｃ、またはそれらの部分はヒト抗体に由来する。定常領域、Ｆｃ、またはそれらの部分はＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む任意の抗体クラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意の抗体アイソタイプに由来し得る。一実施例において、定常領域またはＦｃはヒトアイソタイプＩｇＧ１もしくはヒトアイソタイプＩｇＧ２もしくはヒトアイソタイプＩｇＧ３、または上記のうちのいずれかのハイブリッドでもある。
一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、エフェクター機能を誘導することができる。例えば、定常領域またはＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３ Ｆｃ領域である。別の実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、ＩｇＧ１とＩｇＧ２定常領域もしくはＦｃ領域とのハイブリッド、またはＩｇＧ１とＩｇＧ３定常領域もしくはＦｃ領域とのハイブリッド、またはＩｇＧ２とＩｇＧ３定常領域もしくはＦｃ領域とのハイブリッドである。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２定常領域またはＦｃ領域の例示的なハイブリッドはＣｈａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１に示される。
Ｆｃ領域がエフェクター機能を誘導し得るかどうかを決定する方法は、当業者に明らかであり、および／または本明細書に示されるであろう。
エフェクター機能
好適には、本開示の化合物（例えば、抗ＮＭＴ５５抗体またはその抗原結合断片）は、ＮＭＴ５５発現細胞の少なくとも部分的な枯渇、実質的な枯渇、または除去を促進するか、または可能にするエフェクター機能を有するか、または示す。かかるエフェクター機能はＦｃ受容体に対する結合親和性の強化、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）、および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）であり得る。
本明細書における説明に基づいて当業者に明らかであろうように、本開示のある実施例は、エフェクター機能を誘導することができる化合物（抗体またはその抗原結合断片）を含む。
ＩｇＧクラスの抗体について、幾つかのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ）はＦｃ領域と、種々の免疫細胞上で発現されるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と称される受容体のファミリーと、および／または補体、例えば、Ｃ１ｑ（例えば、ＣＤＣ）との係合により支配される。
Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は免疫細胞を結合された抗原の部位に補充し、典型的にシグナルおよび続く免疫応答をもたらす。エフェクター機能を強化するために、例えば、「親」Ｆｃ領域と比較してＡＤＣＣ活性を変えるために、抗体Ｆｃ領域に対するＦｃγＲの結合親和性を最適化する方法は、当業者に知られる。これらの方法は、抗体のＦｃ領域と、関連するＦｃ受容体との相互作用を強化し、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを促進するその能力を増大させるための、抗体のＦｃ領域の改変を含み得る。ＡＤＣＣ活性における強化も、Ｆｃ領域中の保存されたＡｓｎ２９７でのＩｇＧ１抗体に共有結合されたオリゴ糖の改変にその後示されている。
幾つかの非限定的な実施例において、ＡＤＣＣ等のエフェクター機能を強化することは、通常グリコシル化野生型定常ドメインを有する化合物（例えば、抗体）の、グリコシル化の変化または除去（例えば、国際公開第ＷＯ００／６１７３９号を参照されたい）および／またはアミノ酸配列突然変異（例えば、国際公開第ＷＯ２００８０３６６８８号を参照されたい）を含む改変により達成され得ることが、当業者により理解されるものとする。
一実施例において、その化合物は、それがＡＤＣＣ等のエフェクター機能を誘導することができるような様式で、ＮＭＴ５５に結合する。
一実施例において、その化合物は、それがＡＤＣＣ等のエフェクター機能を誘導することを許容する、ＮＭＴ５５内のエピトープに結合する。
別の実施例において、その化合物は、哺乳類の細胞上のＮＭＴ５５に結合することができ、それによってＡＤＣＣ等のエフェクター機能を誘導する。
例えば、その化合物は、ＡＤＣＣ等のエフェクター機能を誘導するのに十分な時間、細胞表面上のＮＭＴ５５に結合したままである。例えば、その化合物は、ＡＤＣＣが誘導されることを許容しないほど速く取り込まれることはない。
代替的に、または更に、その化合物は、免疫エフェクター細胞がその化合物中の定常領域またはＦｃ領域に結合し、ＡＤＣＣ等のエフェクター機能を誘導することを許容するような様式で、細胞表面上のＮＭＴ５５に結合される。例えば、その化合物のＦｃ領域は、その化合物がＮＭＴ５５に結合されたとき、免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）と相互作用することができるような様式で暴露される。本開示の文脈中で、「免疫エフェクター細胞」という用語は、Ｆｃ受容体を発現し、かつＡＤＣＣまたはＡＤＣＰによりそれが結合する細胞を殺滅することができる、任意の細胞を意味するように理解されるものとする。
抗体または抗原結合断片のエフェクター機能に関する上記段落のそれぞれはＣＤＣの誘導に、必要な変更を加えて適用するように見なされるものとする。例えば、化合物は、補体成分Ｃ１ｑがその化合物中の定常領域またはＦｃ領域に結合し、ＣＤＣを誘導することを許容するような様式で細胞表面上のＮＭＴ５５に結合される。
更に、抗体または抗原結合断片のエフェクター機能に関する上記段落のそれぞれは、抗体のＦｃ領域または定常領域以外の化合物の効力による、細胞媒介エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ）の誘導に、必要な変更を加えて適用するように見なされるものとする。例えば、細胞媒介エフェクター機能は本明細書に示されるようにＮＭＴ５５に、および（例えば、ＮＫ細胞上のＣＤ１９および／またはＴ細胞上のＣＤ４への結合の効力により）免疫エフェクター細胞に結合する化合物を用いて誘導される。
一実施例において、その化合物は、エフェクター機能のレベルの強化を誘導することができる。
一実施例において、定常領域またはＦｃ領域により誘導されるエフェクター機能のレベルは、ＩｇＧ１抗体の野生型定常領域もしくはＦｃ領域、またはＩｇＧ３抗体の野生型定常領域もしくはＦｃ領域と比較して強化される。
別の実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、改変していない定常領域またはＦｃ領域と比較して、それが誘導することができるエフェクター機能のレベルを増大させるよう改変される。かかる改変はアミノ酸レベルおよび／もしくは二次構造レベルおよび／もしくは三次構造レベルでの改変、ならびに／またはその定常領域もしくはＦｃ領域のグリコシル化への改変であり得る。
当業者であれば、より大きなエフェクター機能は、例えば、より大きなレベルの効果、より維持された効果、またはより速い速度の効果として、幾つかの手段のいずれでも表され得ることを理解するであろう。
一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、エフェクター機能の強化を誘導するそれらの能力を増大させる、１つ以上のアミノ酸改変を含む。一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、１つ以上のＦｃγＲに、より大きな親和性で結合する。一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、野生型定常領域もしくはＦｃ領域の親和性より１倍超大きい、または野生型定常領域もしくはＦｃ領域の親和性より５倍超大きい、または野生型定常領域もしくはＦｃ領域の親和性より５倍〜３００倍大きい、ＦｃγＲについての親和性を有する。一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う番号２３０、２３３、２３４、２３５、２３９、２４０、２４３、２６４、２６６、２７２、２７４、２７５、２７６、２７８、３０２、３１８、３２４、３２５、３２６、３２８、３３０、３３２、および３３５からなる群から選択される位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う番号Ｐ２３０Ａ、Ｅ２３３Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４３Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ｉ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｌ、Ｙ２７８Ｔ、Ｖ３０２Ｉ、Ｅ３１８Ｒ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｎ３２５Ｔ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、およびＴ３３５Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う番号Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｌ３２８Ｍ、 Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２６６Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ａ３３０Ｉ、Ｎ３２５Ｔ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、 Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｉ、Ｐ２３０Ａ、Ｐ２３０Ａ／Ｅ２３３Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｌ、Ｙ２７８Ｔ、Ｖ３０２Ｉ、Ｅ３１８Ｒ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、Ｔ３３５Ｙ、Ｖ２４０Ｉ／Ｖ２６６Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｌ２３４Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｌ２３５Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２４０Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２６４Ｔ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｋ３２６Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｋ３２６Ｔからなる群から選択される、アミノ酸置換を含む。
別の実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩｂに結合するより効率的にＦｃγＲＩＩＩａに結合する。例えば、定常領域またはＦｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う番号２３４、２３５、２３９、２４０、２６４、２９６、３３０、およびＩ３３２からなる群から選択される位置での、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う番号Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｙ、Ｙ２９６Ｑ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、およびＩ３３２Ｅからなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。例えば、定常領域またはＦｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う番号Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｉ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ａ３３０Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
１つの更なる実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、野生型定常領域またはＦｃ領域により媒介されるＡＤＣＣより大きなレベルでＡＤＣＣを誘導する。例えば、定常領域またはＦｃ領域は、野生型定常領域またはＦｃ領域により誘導されるＡＤＣＣより５倍超大きい、または５倍〜１０００倍大きいレベルでＡＤＣＣ誘導する。一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う番号２３０、２３３、２３４、２３５、２３９、２４０、２４３、２６４、２６６、２７２、２７４、２７５、２７６、２７８、３０２、３１８、３２４、３２５、３２６、３２８、３３０、３３２、および３３５からなる群から選択される位置での、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う番号Ｐ２３０Ａ、Ｅ２３３Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４３Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ｉ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｌ、Ｙ２７８Ｔ、Ｖ３０２Ｉ、Ｅ３１８Ｒ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｎ３２５Ｔ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、およびＴ３３５Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う番号Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｌ３２８Ｍ、Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２６６Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ａ３３０Ｉ、Ｎ３２５Ｔ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｉ、Ｐ２３０Ａ、Ｐ２３０Ａ／Ｅ２３３Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｌ、Ｙ２７８Ｔ、Ｖ３０２Ｉ、Ｅ３１８Ｒ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、Ｔ３３５Ｙ、Ｖ２４０Ｉ／Ｖ２６６Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｌ２３４Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｌ２３５Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２４０Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｖ２６４Ｔ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｋ３２６Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ／Ｋ３２６Ｔからなる群から選択される、アミノ酸置換を含む。
一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、以下のアミノ酸置換、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う番号Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅを含む。この定常領域またはＦｃ領域は、野生型定常領域またはＦｃ領域と比較してＦｃγＲＩＩＩａについての親和性における約１４倍の増大、および野生型定常領域またはＦｃ領域と比較して約３．３増大されたＡＤＣＣを誘導する能力を有する。
一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、以下のアミノ酸置換、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う番号Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含む。この定常領域またはＦｃ領域は、野生型定常領域またはＦｃ領域と比較してＦｃγＲＩＩＩａについての親和性における約１３８倍の増大、および野生型定常領域またはＦｃ領域と比較して約３２３増大されたＡＤＣＣを誘導する能力を有する。
エフェクター機能を誘導するＦｃ領域の能力を増大させる、追加のアミノ酸置換は当該技術分野において既知であり、および／または、例えば、米国特許第６７３７０５６号、または同第７３１７０９１号に示される。
一実施例において、定常領域またはＦｃ領域のグリコシル化はエフェクター機能の強化を誘導するそれらの能力を増大させるよう変えられる。この点において、哺乳類細胞により生成された天然抗体は、典型的に、概して、定常領域またはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合により取り付けられた、有枝の、二分岐のオリゴ糖を含む。そのオリゴ糖は種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」中のＧｌｃＮＡｃに取り付けられたフコースを含み得る。ある実施例において、本開示に従う定常領域またはＦｃ領域は、Ｆｃ領域に（直接的にまたは間接的に）取り付けられたフコースを欠く炭水化物構造を含む、すなわち、そのＦｃ領域は、「非フコシル化」される。かかる変異体はＡＤＣＣを誘導する改善された能力を有することができる。非フコシル化Ｆｃ領域または定常領域を生成する方法は、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を発現することができない細胞株において免疫グロブリンまたは抗体を発現させること（例えば、Ｙｕｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４に示される）と、ＦＵＴ８に対する低分子干渉ＲＮＡを発現する細胞において免疫グロブリンまたは抗体を発現させること（例えば、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００４に示される）と、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）−マンノース４，６−脱水酵素（ＧＭＤ）を発現することができない細胞において抗体または抗原結合断片を発現させること（例えば、Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７に示される）とを含む。本開示は、例えば、β−（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）を発現するよう改変された細胞株を用いて生成される、フコシル化レベルが減少した化合物の使用も企図する（例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９に示される）。
一実施例において、本開示に従う抗体または抗原結合断片は、非フコシル化される。例えば、免疫グロブリンまたは抗体は、ＦＵＴ８を発現しない細胞（例えば、ＣＨＯ細胞等の、哺乳類細胞）において生成される。
他の方法は、Ｆｃ媒介エフェクター機能の強化を誘導することができる、Ｆｃ領域もしくは定常領域または抗原結合断片を先天的に生成する細胞株の使用を含む（例えば、ウイルスワクチンの生成のためのアヒル胚由来幹細胞、国際公開第ＷＯ２００８／１２９０５８号、鳥類ＥＢＸ（登録商標）細胞における組換えタンパク質生成、国際公開第ＷＯ２００８／１４２１２４号）。
本開示の方法において有用な化合物（例えば、抗体または抗原結合断片）は、例えば、定常領域またはＦｃ領域に取り付けられた二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている、二分オリゴ糖を有する化合物も含む。かかる化合物は、フコシル化の減少および／またはＡＤＣＣ機能の改善を有し得る。かかる化合物の例は、例えば、米国特許第６６０２６８４号、および米国特許公報第２００５０１２３５４６号に示される。
定常領域またはＦｃ領域に取り付けられたオリゴ糖における少なくとも１つのガラクトース残基を有する化合物（例えば、抗体または抗原結合断片）も企図される。かかる抗体または抗原結合断片は、ＣＤＣ機能の改善を有し得る。かかる免疫グロブリンは、例えば、国際公開第ＷＯ１９９７／３００８７号、および同第ＷＯ１９９９／２２７６４号に示される。
エフェクター機能を誘導する化合物の能力を決定する方法は、当該技術分野において既知であり、および／または本明細書でより詳細に示される。
追加の改変
本開示は、化合物（例えば、抗体または抗原結合断片）の定常領域またはＦｃ領域への追加の改変も企図する。
例えば、Ｆｃ領域の定常領域はその抗体または断片の半減期を増大させる、１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、定常領域またはＦｃ領域は、新生児Ｆｃ領域（ＦｃＲｎ）についての定常領域またはＦｃ領域の親和性を増大させる、１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、定常領域またはＦｃ領域は、エンドソームにおけるＦｃ／ＦｃＲｎ結合を促進する、より低いｐＨ、例えば、約ｐＨ６．０でのＦｃＲｎについての親和性の増大を有する。一実施例において、定常領域またはＦｃ領域は、約ｐＨ７．４でのＦｃＲｎについてのその親和性と比較して、細胞再生利用後の定常領域またはＦｃの血中への再放出を促進する約ｐＨ６でのＦｃＲｎについての親和性の増大を有する。これらのアミノ酸置換は、血液からのクリアランスを低減することにより、Ｆｃ含有または定常領域含有化合物の半減期を延長させるために有用である。
例示的なアミノ酸置換は、ＫａｂａｔのＥＵ付番系に従う、Ｔ２５０Ｑ、および／またはＭ４２８Ｌを含む。追加のまたは代替のアミノ酸置換は、例えば、米国特許公報第２００７０１３５６２０号に示される。
タンパク質生成
組換え発現
一実施例において、本明細書に示される化合物は、ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合断片）である。一実施例において、その化合物は、組換えである。
組換えペプチドまたはポリペプチドの場合、それらをコードする核酸は発現ベクターにクローニングすることができ、その後、その発現ベクターを、トランスフェクトされなければ免疫グロブリンまたは抗体タンパク質を生成しない、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、またはサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、もしくは骨髄腫細胞等の、哺乳類細胞等の、ホスト細胞にトランスフェクトする。
そのペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅することができる。ＰＣＲ技術は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に示される。例えば、ハイブリドーマにより発現されるモノクローナル抗体の配列を得ることができ、その抗体の機能的断片を増幅することができる。例えば、全ＲＮＡは腫瘍特異的モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマから単離することができる。その後、逆転写酵素を用いてそのＲＮＡからｃＤＮＡを作製することができ、重鎖および軽鎖の可変領域の機能的断片を含有するｃＤＮＡはＰＣＲを用いて増幅することができる。ＰＣＲ生成物は、その後、精製され、発現ベクターにクローニングされ得る。多くの標準的なベクターが使用可能であり、適切なベクターの選択は、例えば、そのベクターに挿入されるＤＮＡのサイズ、およびそのベクターでトランスフェクトされるホスト細胞によるであろう。
これらの目的を達成するための分子クローニング技術は当該技術分野において既知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（編集者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての最新版を含む）、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）に示される。広く種々のクローニングおよびインビトロ増幅方法は、組換え核酸の構築に好適である。組換え抗体を生成する方法も当該技術分野で既知である。米国特許第４８１６５６７号または同第５５３０１０１号を参照されたい。
単離後、その核酸を更なるクローニングのために（ＤＮＡの増幅）または細胞以外の系におけるもしくは細胞における発現のために、発現構築物または発現ベクター中のプロモーターに機能的に連結して挿入する。したがって、本開示の別の実施例は、本開示の単離された核酸と、１つ以上の追加のヌクレオチド配列とを含む、発現構築物を提供する。核酸分子は種々の標準のベクターおよびホスト細胞において発現することができる。ホスト細胞において活性な、どんなプロモーターも核酸分子を発現するために使用することができる。
好適には、その発現構築物は、当該技術分野において理解されるように、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母、または細菌性人工染色体の形態であり、またはそれらの遺伝的構成要素を含む。発現構築物は、細菌もしくは他のホスト細胞における単離された核酸の維持増殖のために、組換えＤＮＡ技術による操作のために、および／または本開示の核酸または化合物の発現のために、好適であり得る。
本明細書で使用されるとき、「プロモーター」という用語は、その最も広い文脈において取られるべきであり、正確な転写開始のために必要とされる、ＴＡＴＡボックスまたは開始エレメントを含む、ゲノム遺伝子の転写調節配列を含み、その転写調節配列は、例えば、発達刺激および／もしくは外部刺激に応答して、または組織特異的様式で、核酸の発現を変える追加の調節エレメント（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー、およびサイレンサー）を伴う、または伴わない。本文脈において、「プロモーター」という用語は、それが機能的に連結される、核酸の発現を与える、活性化する、または強化する、組換え、合成、もしくは融合核酸、または誘導体を示すためにも使用される。例示的なプロモーターは、その核酸の発現を更に強化する、ならびに／または空間的な発現および／もしくは一時的な発現を変えるための、１つ以上の特異的調節エレメントの追加のコピーを含有し得る。
本明細書で使用されるとき、「〜に機能的に連結される」という用語は、核酸の発現がプロモーターにより制御されるように、その核酸に関連してそのプロモーターを配置することを意味する。
細胞における発現のための多くのベクターが入手可能である。ベクター構成要素は概して、非限定的に、以下のもの、シグナル配列、（例えば、本明細書に提供される情報に由来する）化合物をコードする配列、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列のうちの１つ以上を含む。例示的なシグナル配列は、原核生物分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、αファクターリーダー、または酸性ホスファターゼリーダー）、または哺乳類分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）を含む。
哺乳類細胞において活性な例示的なプロモーターはサイトメガロウイルス媒介初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａおよびＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモーター、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要遅延プロモーター、β−アクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーター、または免疫グロブリンもしくは抗体プロモーターもしくはそれらの活性断片を含むハイブリッド調節エレメントを含む。有用な哺乳類ホスト細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚腎臓系（懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞）、ハムスター仔腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。哺乳類細胞における抗体またはその結合断片の発現のために、免疫グロブリン遺伝子プロモーターの使用が所望される。
例えば、ピキア・パストリス、出芽酵母、および分裂酵母を含む群から選択される酵母細胞等の、酵母細胞における発現のために好適な典型的なプロモーターは、非限定的に、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、またはＴＥＦ１プロモーターを含む。
単離された核酸、またはそれを含む発現構築物を発現のために細胞に導入する手段は当業者に知られる。ある細胞のために使用される技術は既知の成功した技術による。
ベクターをホスト細胞に導入する方法は、当該技術分野において標準的であり、エレクトロポーレーション、合成脂質重合体、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）の使用、塩化カルシウムの使用、およびＤＥＡＥデキストランの使用を含む。かかる方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．， ２００１にも示される。
化合物（例えば、抗体または抗原結合断片）を生成するために使用されるホスト細胞は、使用される細胞の種類により、種々の培地中で培養され得る。Ｈａｍ′ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭｌ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ′ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）等の、市販の入手可能な培地は哺乳類細胞を培養するために好適である。本明細書で議論される他の細胞種を培養するための培地は当該技術分野で既知である。
タンパク質の単離
ペプチドまたはポリペプチド（例えば、抗体または抗原結合断片）を精製する方法は、当該技術分野において既知であり、および／または本明細書に示される。
ペプチドまたはポリペプチドが培地中に分泌される場合、かかる発現系からの上清は、はじめに、市販の入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｕｎｉｔを用いて濃縮することができる。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために上記ステップのいずれにも含めることができ、抗生物質は、外来性汚染物質の成長を予防するために含めることができる。
細胞から調製されたペプチドまたはポリペプチドは、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーまたはタンパク質Ｇクロマトグラフィー）、または上記の任意の組み合わせを用いて精製することができる。これらの方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、国際公開第ＷＯ９９／５７１３４号、またはＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に示される。
ペプチド合成
ペプチドは当業者に知られる化学的方法を用いて合成される。例えば、合成ペプチドは固相、液相、もしくはペプチド濃縮、またはそれらの任意の組み合わせの既知の技術を用いて調製され、天然および／または非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４，１９６３の元の固相手順の脱保護、中和、カップリング、および洗浄プロトコルでの、標準のＢｏｃ（Ｎα−アミノ保護Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂、またはＣａｒｐｉｎｏ ａｎｄ Ｈａｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３７：３４０３−３４０９，１９７２により示される、塩基性不安定性Ｎα−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であり得る。ＦｍｏｃおよびＢｏｃ両方のＮα−アミノ保護アミノ酸は、例えば、Ｆｌｕｋａ、Ｂａｃｈｅｍ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｂａｃｈｅｍ、またはＰｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｓ等の、種々の商業的源から得ることができる。
概して、化学合成方法は、伸長中のペプチド鎖への１つ以上のアミノ酸の連続的追加を含む。通常、はじめのアミノ酸のアミノまたはカルボキシル基のいずれかは好適な保護基により保護される。保護された、または誘導されたアミノ酸はその後、アミド結合の形成を許容する条件下で、不活性固体支持に取り付けられ、または好適に保護された相補（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中に次のアミノ酸を添加することにより溶液中で利用され得る。その保護基をその後、新規に添加されたアミノ酸残基から除去し、次のアミノ酸（好適に保護された）をその後添加し、このように続ける。所望のアミノ酸を適切な配列に連結させた後、任意の残りの保護基（および、固相合成技術を使用した場合、任意の固体支持）を連続してまたは同時に除去し、最終的なポリペプチドにする。この一般的な手順の単純な改変により、例えば、保護されたトリペプチドと適切に保護されたジペプチドとを（キラル中心をラセミ化しない条件下で）カップリングさせ、脱保護後にペンタペプチドを形成させることにより、１つ超のアミノ酸を一度に伸長中の鎖に添加することが可能である。例えば、固相ペプチド合成技術については、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ １９８４）、およびＧ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，編集者Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．２，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０），ｐｐ．３−２５４、ならびに古典的な溶液合成については、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８４）、およびＥ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１を参照されたい。これらの方法は、本開示のペプチドの合成のために好適である。
本明細書に示されるペプチドは同時多ペプチド合成の方法によるような、他の方法によっても化学的に調製することができる。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５，１９８５、または米国特許第４，６３１， ２１１号を参照されたい。
核酸合成
本開示の核酸ベースの化合物を生成する／合成する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、オリゴヌクレオチド合成はＧａｉｔ（編集者）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）に示される。例えば、プローブまたはプライマーは生物学的合成により（例えば、制限エンドヌクレアーゼでの核酸消化により）、または化学合成により得ることができる。短い配列（最大約１００ヌクレオチド）については、化学合成が望ましい。
より長い配列については、例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１０１：２０−７８，１９８３により示される一重鎖ＤＮＡのためのＭ１３の使用等の、分子生物学において使用される標準の複製方法が有用である。
オリゴヌクレオチド合成についての他の方法は、例えば、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル方法（Ｎａｒａｎｇ，編集者，”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ” Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７））、および支持上合成（Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８１）、およびホスホルアミデート技術（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、ならびにＮａｒａｎｇ（１９８７）およびそれらの中に含有される引用文献に示される他のものを含む。
化合物活性のアッセイ
本開示の化合物は、例えば、以下に示されるように、生物学的活性について容易にスクリーニングされる。
結合アッセイ
かかるアッセイの１つの形態は、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）に示されるような、抗原結合アッセイである。かかる方法は、概して、化合物（例えば、抗体または抗原結合断片）を標識化することと、それを固定された本開示のペプチドまたは抗原（例えばＮＭＴ５５）と接触させることとを含む。非特異的に結合したタンパク質を除去するための洗浄後、標識の量および、その結果、結合した化合物が検出される。もちろん、その化合物を固定し、かつペプチドまたは抗原を標識化することができる。例えば、本明細書に示されるような、パニング型アッセイも使用することができる。
競合的結合の決定
本明細書に示される抗体の結合を競合的に阻害する化合物を決定するためのアッセイは当業者に明らかであろう。例えば、抗体を検出可能な標識、例えば、蛍光標識または放射活性標識に結合する。その標識化抗体およびその化合物をその後混合し、本開示のペプチド、そのペプチドを含む抗原（例えば、ＮＭＴ５５）、またはそのペプチドもしくは抗原を発現する細胞と接触させる。結合した標識化抗体のレベルをその後決定し、その標識化抗体をその化合物の不在下で本開示のペプチド、そのペプチドを含む抗原（例えば、ＮＭＴ５５）、またはそのペプチドもしくは抗原を発現する細胞と接触させたときに決定されたレベルと比較する。標識化抗体のレベルがその化合物の不在下と比較してその化合物の存在下で減少する場合、その化合物は、そのペプチドまたは抗原に対するその標識化抗体の結合を競合的に阻害すると考えられる。
別の実施例において、その化合物は、本開示のペプチド、そのペプチドを含む抗原（例えば、ＮＭＴ５５）、またはそのペプチドもしくは抗原を発現する細胞と、その標識化抗体とを接触させる前に、そのペプチド、抗原、または細胞に結合することを許可される。その化合物の不在下と比較した、その化合物の存在下での結合した標識化抗体の量における減少は、その化合物が、そのペプチドまたは抗原に対するその標識化抗体の結合を競合的に阻害することを示す。相互アッセイは標識化試験抗体または抗原結合断片を用いても行われてもよい。
エフェクター機能の決定
ＡＤＣＣ活性を評価する方法は、当該技術分野で既知である。
一実施例において、ＡＤＣＣ活性のレベルは５１Ｃｒ放出アッセイ、ユーロピウム放出アッセイ、または３５Ｓ放出アッセイを用いて評価される。これらのアッセイのそれぞれにおいて、ＮＭＴ５５を発現する細胞を、列挙される化合物のうちの１つ以上と共に、その化合物がその細胞により取り込まれるのに十分な時間及び条件下で培養する。３５Ｓ放出アッセイの場合、ＮＭＴ５５を発現する細胞を３５Ｓ−標識化メチオニンおよび／またはシステインと共に、標識化されたアミノ酸が新規に合成されたタンパク質に取り込まれるのに十分な時間、培養し得る。細胞をその後、本開示の化合物の存在下または不在下、および免疫エフェクター細胞の存在下で培養する。細胞培養培地中の５１Ｃｒ、ユーロピウム、および／または３５Ｓの量をその後検出し、その化合物の不在下と比較した、その化合物の存在下での増大は、その抗体または抗原結合断片がエフェクター機能を有することを示す。化合物により誘導されるＡＤＣＣのレベルを評価するためのアッセイを開示する例示的な出版物は、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．，１９８６、およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７を含む。
化合物により誘導されるＡＤＣＣのレベルを評価するための他のアッセイはフローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（登録商標）非放射活性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．ＣＡ，ＵＳＡ）またはＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射活性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＷＩ，ＵＳＡ）を含む。
代替的に、または更に、化合物のエフェクター機能は、例えば、米国特許第７３１７０９１号に示されるように、１つ以上のＦｃγＲについてのその親和性を決定することにより評価される。
Ｃ１ｑ結合アッセイも、化合物がＣ１ｑに結合することができ、ＣＤＣを誘導し得ることを確認するために行われてもよい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが行われてもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照されたい）。
親和性決定
任意に、本開示のペプチド、そのペプチドを含む抗原（例えば、ＮＭＴ５５）についての、化合物の解離定数（Ｋｄ）または会合定数（Ｋａ）または平衡定数（ＫＤ）が決定される。化合物（例えば、抗体または抗原結合断片）についてのこれらの定数は、一実施例において、放射性標識化または蛍光標識化ペプチドまたは抗原結合アッセイにより測定される。このアッセイは、非標識化ペプチドまたは抗原の１連の滴定の存在下で、その化合物と、最小限の濃度の標識化ペプチドまたは抗原（例えば、ＮＭＴ５５またはその可溶性形態）とを平衡化する。結合していないペプチドまたは抗原を除去するための洗浄後、標識の量が決定される。
親和性測定は抗体反応についての標準の方法、例えば、免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１１：：５４，２０００、Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ Ａｎａｌｙｓｔ．１２３：１５９９，１９９８）、等温滴定カロリメトリ（ＩＴＣ）、または当該技術分野で既知である他の動力学的相互作用アッセイにより決定することができる。
一実施例において、定数は、固定されたペプチドまたは抗原（例えば、ＮＭＴ５５またはその可溶性形態）で、表面プラズモン共鳴アッセイを用いること、例えば、ビアコア表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いることにより測定される。例示的なＳＰＲ方法は、米国特許第７２２９６１９号に示される。
療法効率の評価
本開示の化合物の、本明細書に示される疾患または病態を治療する能力を評価するための、種々のインビトロアッセイが使用可能である。
例えば、化合物は、アポトーシスを誘導することによる、細胞、例えば、乳癌細胞等の癌細胞を殺滅する、その能力について評価される。
本明細書で使用されるとき、「アポトーシスを誘導する」とは、当該技術分野において十分に定義される、細胞における特徴の出現を指す（例えば、Ｗｙｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，１９７２を参照されたい）。これらの特徴は膜小疱形成、ＤＮＡ濃縮等の、形態的特徴、ならびにＦ−アクチン含有量、ミトコンドリア質量、および膜ポテンシャルの変化を含む。アポトーシスの誘導は当該技術分野において標準の幾つかの方法、例えば、細胞死ＥＬＩＳＡ、ＴＵＮＥＬ染色、ＤＮＡ染色、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ならびにアクリジンオレンジ、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、およびアネキシンＶ染色（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ）等の、種々の生体色素での染色を用いてアッセイされ得る。本明細書で使用されるとき、「アポトーシスを誘導する」とは、対照細胞集団と比較したときの、アポトーシスを受ける細胞の数の増大を指す。例えば、アポトーシスの増大は１０％、２０％、４０％、５０％、または７５％であり得る。所望の実施形態において、アポトーシスの誘導は対照細胞集団において見られるアポトーシスの２倍、３倍、１０倍、または１００倍でさえあるアポトーシスの増大をもたらす。
別の実施例において、化合物は、細胞、例えば、乳癌細胞等の癌細胞の増殖を低減する、その能力について評価される。
細胞増殖の阻害は当該技術分野において標準の幾つかの方法、例えば、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ、ＢｒｄＵ組み込み、および３Ｈチミジン取り込みを用いてアッセイすることができる。かかるアッセイは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ｌｉｌｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ′ｌｏｓａｉｈ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｉ））Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，２００１に示される。
細胞増殖の阻害は、例えば、２０％、４０％、５０％、または７５％であり得る。好ましい実施形態において、細胞増殖の阻害は８０％、９０％、９５％で、または細胞増殖の完全な阻害でさえある。
エピトープ／ミモトープ
ある実施形態において、本開示は、配列番号３、４、または５のうちのいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列を含む、約６〜５０アミノ酸の単離ペプチドを提供する。
別の実施形態において、本開示は、配列番号３、４、または５のうちのいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列からなる単離ペプチドを提供する。
配列番号３はＮＭＴ５５中に見られる、最小限のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ配列を示す。配列番号４および５はファージディスプレイ実験により発見された追加のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ配列（ミモトープ）を示す。
「単離された」または、「精製された」とは、それに天然に付随する他の構成要素から分離されていることを意味する。典型的に、ある要素は、その要素が、それが天然に関連しているタンパク質、抗体、および天然有機分子を少なくとも５０重量％含まないとき、または核酸分子については、生物のゲノム内でその核酸分子の配列に天然に隣接する核酸配列を含まないとき、実質的に純粋である。望ましくは、要素は少なくとも７５重量％、より望ましくは、少なくとも９０重量％、または９５重量％、および最も望ましくは、少なくとも９９重量％純粋である。実質的に純粋な要素は化学合成、天然源からのその要素の分離、または天然ではその要素を生成しない組換えホスト細胞におけるその要素の生成により得ることができる。タンパク質、小胞、および細胞小器官は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）により示されるもの等の、標準の技術を用いて当業者により精製され得る。要素はポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、光学密度、ＨＰＬＣ分析、またはウェスタンブロット分析（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）を用いて測定されるように、望ましくは出発物質と比較して少なくとも２、５、または１０倍純粋である。望ましい精製方法は、免疫沈澱、免疫親和性クロマトグラフィーおよびニッケル親和性カラム等のカラムクロマトグラフィー、磁気ビーズ免疫親和性精製、およびプレート結合抗体でのパニングを含む。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。しかしながら、「ペプチド」という用語は、５０、またはそれ以下の、より好ましくは２５、またはそれ以下のアミノ酸を含む、比較的短い分子を指すために典型的に使用される。本明細書で定義される各ペプチドの完全長は、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸等の、６〜５０アミノ酸であり得る。
ペプチドは天然アミノ酸または非天然アミノ酸のうちの１つ以上を含み得る。天然アミノ酸はアラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、ヒドロキシプロリン（Ｏおよび／またはＨｙｐ）、イソジチロシン（ＩＤＴ）、およびジイソジチロシン（ジ−ＩＤＴ）を含む。ヒドロキシプロリン、イソジチロシン、およびジイソジチロシンは翻訳後に形成される。
非従来型および／または非天然アミノ酸は、例えば、α−アミノ酪酸、α−アミノ−α−メチル酪酸塩、α−メチルアミノイソ酪酸塩、α−メチル−γ−アミノ酪酸塩、α−メチルシクロヘキシルアラニン、α−メチルシクロペンチルアラニン、α−メチル−α−ナフチルアラニン、α−メチルペニシラミン、α−ナフチルアラニン、γ−アミノ酪酸、アミノシクロプロパン−カルボン酸塩、アミノイソ酪酸、アミノノルボルニル−カルボン酸塩、シクロヘキシルアラニン、シクロペンチルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−システイン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−リジン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−バリン、Ｄ−α−メチルアラニン、Ｄ−α−メチルアルギニン、Ｄ−α−メチルアスパラギン、Ｄ−α−メチルアスパラギン酸、Ｄ−α−メチルシステイン、Ｄ−α−メチルグルタミン、Ｄ−α−メチルヒスチジン、Ｄ−α−メチルイソロイシン、Ｄ−α−メチルロイシン、Ｄ−α−メチルリジン、Ｄ−α−メチルメチオニン、Ｄ−α−メチルオルニチン、Ｄ−α−メチルフェニルアラニン、Ｄ−α−メチルプロリン、Ｄ−α−メチルセリン、Ｄ−α−メチルトレオニン、Ｄ−α−メチルトリプトファン、Ｄ−α−メチルチロシン、Ｄ−α−メチルバリン、Ｄ−Ｎ−メチルアラニン、Ｄ−Ｎ−メチルアルギニン、Ｄ−Ｎ−メチルアスパラギン、Ｄ−Ｎ−メチルアスパラギン酸、Ｄ−Ｎ−メチルシステイン、Ｄ−Ｎ−メチルグルタミン、Ｄ−Ｎ−メチルグルタミン酸、Ｄ−Ｎ−メチルヒスチジン、Ｄ−Ｎ−メチルイソロイシン、Ｄ−Ｎ−メチルロイシン、Ｄ−Ｎ−メチルリジン、Ｄ−Ｎ−メチルメチオニン、Ｄ−Ｎ−メチルオルニチン、Ｄ−Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｄ−Ｎ−メチルプロリン、Ｄ−Ｎ−メチルセリン、Ｄ−Ｎ−メチルトレオニン、Ｄ−Ｎ−メチルトリプトファン、Ｄ−Ｎ−メチルチロシン、Ｄ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−ｔ−ブチルグリシン、Ｌ−エチルグリシン、Ｌ−ホモフェニルアラニン、Ｌ−メチルエチルグリシン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、Ｌ−α−メチルアラニン、Ｌ−α−メチルアルギニン、Ｌ−α−メチルアスパラギン、Ｌ−α−メチルアスパラギン酸、Ｌ−α−メチル−ｔ−ブチグリシン、Ｌ−α−メチルシステイン、Ｌ−α−メチルグルタミン酸、Ｌ−α−メチルグルタミン、Ｌ−α−メチルヒスチジン、Ｌ−α−メチルホモフェニルアラニン、Ｌ−α−メチルイソロイシン、Ｌ−α−メチルロイシン、Ｌ−α−メチルリジン、Ｌ−α−メチルメチオニン、Ｌ−α−メチルノルロイシン、Ｌ−α−メチルノルバリン、Ｌ−α−メチルオルニチン、Ｌ−α−メチルフェニルアラニン、Ｌ−α−メチルプロリン、Ｌ−α−メチルセリン、Ｌ−α−メチルトレオニン、Ｌ−α−メチルトリプトファン、Ｌ−α−メチルチロシン、Ｌ−α−メチルバリン、Ｌ−Ｎ−メチルアラニン、Ｌ−Ｎ−メチルアルギニン、Ｌ−Ｎ−メチルアスパラギン、Ｌ−Ｎ−メチルアスパラギン酸、Ｌ−Ｎ−メチルシステイン、Ｌ−Ｎ−メチルグルタミン、Ｌ−Ｎ−メチルグルタミン酸、Ｌ−Ｎ−メチルヒスチジン、Ｌ−Ｎ−メチルイソロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルリジン、Ｌ−Ｎ−メチルメチオニン、Ｌ−Ｎ−メチルノルロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルノルバリン、Ｌ−Ｎ−メチルオルニチン、Ｌ−Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｌ−Ｎ−メチルプロリン、Ｌ−Ｎ−メチルセリン、Ｌ−Ｎ−メチルトレオニン、Ｌ−Ｎ−メチルトリプトファン、Ｌ−Ｎ−メチルチロシン、Ｌ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−Ｎ−メチルエチルグリシン、Ｌ−Ｎ−メチル−ｔ−ブチルグリシン、Ｌ−Ｎ−メチルホモフェニルアラニン、Ｌ−Ｏ−メチルセリン、Ｌ−Ｏ−メチルホモセリン、Ｎ−（４−アミノブチル）グリシン、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン、Ｎ−（３−アミノプロピル）グリシン、Ｎ−（２，２−ジフェニルエチル）グリシン、Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）グリシン、Ｎ−（３−グアニジノプロピル）グリシン、Ｎ−（１−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（３−インドリリエチル）グリシン、Ｎ−（２−カルバミルエチル）グリシン、Ｎ−（２−カルボキシエチル）グリシン、Ｎ−（１−メチルプロピル）グリシン、Ｎ−（２−メチルプロピル）グリシン、Ｎ−（１−メチルエチル）グリシン、Ｎ−（２−メチルチオエチル）グリシン、Ｎ−アミノ−α−メチル酪酸塩、Ｎ−ベンジルグリシン、Ｎ−（カルバミルメチル）グリシン、Ｎ−（カルボキシメチル）グリシン、Ｎ−シクロブチルグリシン、Ｎ−シクロヘプチルグリシン、Ｎ−シクロヘキシルグリシン、Ｎ−シクロデシルグリシン、Ｎ−シクロドデシルグリシン、Ｎ−シクロオクチルグリシン、Ｎ−シクロプロピルグリシン、Ｎ−シクロウンデシルグリシン、Ｎ−（ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシン、Ｎ−（イミダゾリルエチル）グリシン、Ｎ−メチル−γ−アミノ酪酸塩、Ｎ−メチルアミノイソ酪酸塩、Ｎ−メチルシクロヘキシルアラニン、Ｎ−メチルシクロペンチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチル−α−ナフチルアラニン、Ｎ−メチルペニシラミン、Ｎ−（チオメチル）グリシン、ペニシラミン、Ｎ−（Ｎ−（３，３−ジフェニルプロピル）カルバミルメチル）グリシン、Ｎ−（Ｎ−（２，２−ジフェニルエチル）カルバミルメチル）グリシン、および１−カルボキシ−１−（２，２−ジフェニルエチルアミノ）シクロプロパンを含む。
ある実施形態において、本開示は、１つ以上のアミノ酸置換を有する、配列番号３、４、または５のうちのいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列を含む、約６〜５０アミノ酸の単離ペプチドを提供する。
別の実施形態において、本開示は、１つ以上のアミノ酸置換を有する、配列番号３、４、または５のうちのいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列からなる、単離ペプチドを提供する。
置換は、置換されたアミノ酸が参照配列中の対応するアミノ酸と同様の構造または化学的特性を有する、保存的アミノ酸置換であり得る。代替的に、置換は、所望の活性が維持される、すなわち、そのペプチドがＰＡＴ−ＬＭ１にまだ結合する限り、非保存的アミノ酸置換であり得る。
例示のために、保存的アミノ酸置換は１つの脂肪族または疎水性アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンと、別のアミノ酸との置換；１つのヒドロキシル含有アミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンと、別のアミノ酸との置換；１つの酸性残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸と、別のアミノ酸との置換；１つのアミド含有残基、例えば、アスパラギンおよびグルタミンと、別のアミノ酸との置換；１つの芳香族残基、例えば、フェニルアラニンおよびチロシンと、別のアミノ酸との置換、１つの塩基性残基、例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジンと、別のアミノ酸との置換；ならびに１つの小アミノ酸、例えば、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、およびグリシンと、別のアミノ酸との置換に関する。
かかる保存的置換は表１に示される。かかる置換が機能的活性の変化をもたらさない場合、表１中の例示的な置換で示される、より実質的な変化を導入することができ、生じる変異体を機能的活性について分析する。
表１ アミノ酸置換
モノクローナル抗体、または幾つかの事例において、ポリクローナル血清をマッピングするエピトープは概して、抗体調製物が最も高い親和性を有する、抗原または標的分子の正確な領域を推測するプロセスを意味するように理解される。標的の決定子またはエピトープは概して、結合の結合活性および選択性の点で、最も強固な免疫応答が作製される抗原の部分を意味するように理解される。ポリペプチドまたは抗原の他の小断片は、免疫原として使用することができる（Ｎｉｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９８３、および米国特許第５，０３０，５６５号）。幾つかの事例において、関連しない配列または構造を有するペプチドが、抗体の結合パートナーとして働くことができ、または元の抗原と結合について競合することができる点で、エピトープまたは、「ミモトープ」としてふるまい得る。これらのペプチドの配列分析はそのエピトープの構造および物理化学的特徴の特定に繋がり得る。しばしば、エピトープペプチドは元の抗原性タンパク質またはポリペプチドとほとんどまたは全く配列相同性を有しない（Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。この発見は、幾つかの事例において、抗体は、直線配列の折畳みおよびより合わせに際して三次元空間でのみ形成される、またはヘテロ多量体におけるような別のポリペプチドとの関連のための、「コンフォメーションエピトープ」を認識した、という概念への支持を与えた。コンフォメーションエピトープは、「ミモトープ」とも称される。
エピトープマッピングのプロセスは抗原性分子についての情報を提供し、それは、抗原の生物学的活性、または抗体の存在下で変えられた特性についての情報と繋げられたとき、抗原またはエピトープにより示される標的の生物学的機能、および逆に、そのエピトープと、その天然の同起源リガンドとの通常の相互作用を予防する、拮抗性抗体の可能性としての効果の範囲を推測する、または理解する手段を提供する。
エピトープマッピングが提供する上記に挙げられた価値から、治療用抗体のための任意の同起源リガンドの発見は、代替の方向付けられた抗原として機能し得る新規ミモトープを提供するのみでなく、その治療用抗体の量および機能を測定するための重要なツールを更に提供することが理解され得る。
本開示のペプチドは当該技術分野で既知の方法により作製されてもよい。それらは当該技術分野で既知の方法および装置を用いて手動でまたは合成的に合成することができる（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌを参照されたい）。エピトープまたはミモトープは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換もしくは免疫親和性クロマトグラフィー、ろ過もしくはサイズ排除、または電気泳動等の、当該技術分野で既知であるタンパク質精製技術を用いて精製することができる（例えば、Ｏｌｓｎｅｓ ａｎｄ Ｐｉｈｌ（１９７３）、およびＳｃｏｐｅｓ（１９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹを参照されたい）。
代替的に、ペプチドは当該技術分野で既知である組換えＤＮＡ技術により作製されてもよい。したがって、本開示のペプチドをコードするポリヌクレオチドは本明細書で企図される。
本開示のペプチドは多くの適用を有する。それらは診断ツールとして使用することができる。例えば、ペプチドは、本開示のペプチドを対象から得られた試料と接触させることと、その試料中の抗体がそのペプチドに特異的に結合するかどうかを決定することとを含む、対象における癌を検出する、診断する、または監視する方法において使用することができる。
本開示のペプチドは代替的に、ワクチンとして使用することができる。例えば、ペプチドは対象に投与されたときに免疫応答を誘導するのに好適な組成物中に調合され得る。
本開示のペプチドは代替的に、研究ツールとして使用することができる。例えば、ペプチドは、抗体と本開示のペプチドとを接触させることにより、その抗体をアッセイする、濃縮する、単離する、または精製するために使用することができる。ある実施形態において、本開示のペプチドは標的抗原に対する更なる抗体またはその抗原結合断片を作製するために使用される。例えば、ペプチドは、ＮＭＴ５５等の標的抗原に対する更なる抗体またはその抗原結合断片を特定するためのファージディスプレイ実験において使用することができる。かかる方法は、抗体またはその抗原結合断片がＰＡＴ−ＬＭ１抗体と比較して、所望の特性の強化、例えば、結合親和性、安定性、または結合活性の増大を有し得ることを特定するために使用することができる。
本開示のペプチドは、当該技術分野で既知の方法により、好適な対象、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳類をエピトープまたはミモトープで免疫化することにより、抗体を調製するためにも使用することができる。かかる抗体は、上記に示されるように、当該技術分野で既知の方法により生成することができる。また、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ、およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．、Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２ｄ ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、ならびにＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５を参照されたい。抗体は、その後、本開示の方法において使用することができる。
ペプチドをコードする核酸
ある実施形態において、本開示の組成物またはワクチンは、ペプチドをコードする核酸を含む。多数の核酸がワクチン中に組み込まれ、多価抗原ワクチンを生成し得る。ある実施形態において、ワクチンは、ＤＮＡワクチンである。
ＤＮＡワクチン接種は典型的に、対象の細胞による抗原の発現のための、抗原をコードするＤＮＡの、例えば、対象の筋肉または皮膚への直接的なインビボ導入に関する。一旦、ＤＮＡにコードされた抗原がプロセスされ、トランスフェクトされた細胞により表示されたら、細胞性および／または体液性免疫応答が引き起こされ得る。ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，９３９，４００号、同第６，１１０，８９８号、国際公開第ＷＯ９５／２０６６０号、および同第ＷＯ９３／１９１８３号に示される。
現在まで、哺乳類系のほとんどのＤＮＡワクチンは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するウイルスプロモーターに頼ってきた。これらは幾つかの哺乳類種において筋肉および皮膚接種両方での優れた効率を有した。ＤＮＡ免疫化により誘導される免疫応答に影響することが知られる要因はＤＮＡデリバリーの方法であり、例えば、非経口経路は低速の遺伝子移送をもたらし、遺伝子発現のかなりの変異性を生成し得る。遺伝子ガンを用いたプラスミドの高速接種は、おそらくＤＮＡトランスフェクションのより大きな効率、およびＤＣによるより有効な抗原提示のために、マウスの免疫応答を強化した。本発明の核酸ベースのワクチンを含有するベクターは、当該技術分野で既知である他の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、またはＤＮＡベクタートランスポーターによっても、所望のホストに導入され得る。
組成物またはワクチンの調合
ある実施形態において、本開示は、本開示のペプチドまたはそれをコードする核酸を含む、組成物またはワクチンを提供する。
別の実施形態において、本開示は、本開示のペプチドもしくはそれをコードする核酸、または組成物もしくはワクチンを対象に投与することを含む、免疫応答を誘導する方法を提供する。
ペプチドまたはそれをコードする核酸は、免疫応答を誘導することができる濃度をもたらす、任意の好適な手段により投与することができる。ペプチドまたはそれをコードする核酸は任意の好適な担体中に任意の適切な量で含有されることができ、概して組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。その組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋内、または腹腔内）投与経路に好適である、投与形態で提供することができる。その組成物またはワクチンは、従来の医薬の実施に従って調合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００、およびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
組成物またはワクチンは、投与形態、調合物で、または好適なデリバリー装置もしくはインプラントにより、注入、点滴、もしくは移植（皮下、静脈内、筋内、腹腔内等）により非経口で投与することができる。
ペプチドをコードする核酸はレトロウイルス、アデノウイルス、もしくは他の好適なベクター、または種々の他のタンパク質ベースのもしくは脂質ベースの遺伝子デリバリー複合体への組み込みにより、および（エレクトロポーレーションまたは、「遺伝子ガン」デリバリー等の）「裸の」ポリヌクレオチドのデリバリーを促進する技術の使用を通じて、細胞に直接的にデリバリーされ得る。代替的に、核酸はデリバリーのために、タンパク質を発現することができるホスト細胞に導入され得る。これらのトランスフェクトされたまたは形質転換された細胞はその後、治療上有効量で抗原を発現するのに有効量で（単独でまたは障壁装置中に）埋め込まれ、注入され、または別段のように導入され得る。
１つの代替の実施形態において、抗原表示細胞、例えば、マクロファージおよび／またはＤＣを、抗原のロードに影響するよう、インビトロまたはエクスビボである組成物と接触させ、その後対象に投与することができる。ある実施形態において、抗原表示細胞は対象または自家ドナーに由来し、エクスビボで抗原をロードされる。例えば、対象または自家ドナーから血液を採取し、密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）について濃縮し、その後プラスティック表面に粘着させ、単核細胞を濃縮することができる。粘着性細胞はその後、例えば、未成熟ＤＣへの分化を誘導するためにサイトカイン混合物と共に培養することができ、生じる未成熟ＤＣをワクチン抗原およびマンナンと接触させ、または代替的にその抗原をコードする核酸でトランスフェクトすることができる。生じる成熟／活性化樹状突起細胞調製物（すなわち、アップレギュレートされた共刺激性分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６を有する）の一定分量（例えば、凍結乾燥保存一定分量）はその後、例えば、プロトコルで定義された計画での皮内注入（単数または複数）により、対象に投与することができる。
本開示の組成物またはワクチンは、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含むことができる。「薬学的に許容される担体」という用語は、対象、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトに投与されたとき、アレルギー性、毒性、またはそれ以外の悪い反応を生成しない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体は固体または液体であり得る。薬学的に許容される担体の有用な例は、非限定的に、本発明の活性剤の活性に影響しない、希釈剤、賦形剤、アジュバント、溶媒、界面活性剤、懸濁剤、緩衝剤、潤滑剤、媒体、乳化剤、吸着剤、分散媒体、コーティング、安定化剤、保護性コロイド、粘着剤、増粘剤、チキソトロピー剤、浸透剤、封鎖剤、等張剤、および吸収遅延剤を含む。
担体は従来使用されているもののいずれでもあることができ、溶解性、および活性剤との反応性がないこと等の化学物理的考慮によって、および投与経路によってのみ、限定される。本発明のために好適な担体は従来使用されているもの、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、乳糖、リンガー溶液、緩衝液、ヒアルロナン、グリコール、デンプン、セルロース、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含む。リポソームも担体として使用することができる。
本開示の組成物の免疫原性または有効性を更に強化し得る化合物（本明細書で「アジュバント」とも称される）はその組成物中に含まれることも、またはそれと共に共投与されることもできる。例えば、組成物は、１つ以上の油（例えば、フロイント完全および不完全）、サポニン、修飾サポニン、リポソーム、鉱物塩（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、および炭素）、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、およびある天然物質（例えば、結核菌からの脂質Ａ、ロウＤ、ならびにコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、百日咳菌、およびブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属の構成員中に見られる物質）、ウシ血清アルブミン、ジフテリア類毒素、破傷風類毒素、エデスチン、キーホールカサガイヘモシアニン、緑膿菌毒素Ａ、コレラゲノイド、コレラ毒素、百日咳毒素、ウイルスタンパク質、ならびにインターフェロン、インターロイキン、または腫瘍壊死因子等の真核生物タンパク質を含むことができる。かかるタンパク質は、当業者に知られる方法に従って、天然または組換え源から得ることができる。他の既知の免疫原性巨大分子は、多糖、ｔＲＮＡ；ポリビニルアミン、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、４′，４−ジアミノジフェニル−メタン−３，３′−ジカルボン酸および４−ニトロ−２−アミノ安息香酸の（比較的高い分子量の）混合ポリ濃縮物等の代謝不可能な合成重合体；または糖脂質、脂質、もしくは炭水化物を含む。
本開示のある実施形態において、本開示のペプチドもしくはそれをコードする核酸、または組成物もしくはワクチンは、増殖性障害、例えば、新生物、癌、腫瘍、またはそれらの転移癌を有するまたはそれを有する危険性のある対象に投与される。新生物性または癌性の細胞が血液と直接的に接触している場合（例えば、白血病）、または腫瘍が血流によってのみアクセス可能である場合、静脈内（ＩＶ）経路が使用され得る。腫瘍が胸腔または腹腔等の限られた空間内で成長する場合、本開示のペプチドもしくはそれをコードする核酸、または組成物もしくはワクチンは、血流中よりむしろ、その腔内に直接的に投与され得る。かかる組成物の調合および調製は医薬調合の分野における当業者に周知である。好適な調合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（上記）に見ることができる。
免疫応答を誘導する方法
ある実施形態において、本開示は、本開示のペプチドもしくはそれをコードする核酸、または組成物、代替的にワクチンを対象に投与することを含む、免疫応答を誘導する方法を提供する。
本開示のペプチドは、配列番号３、４、または５のうちのいずれか１つにおいて示されるエピトープまたはミモトープが得られた抗原に対して作製された抗体に、選択的に結合可能であり得る。ある実施形態において、本開示のペプチドは、対象において癌により発現された抗原、例えば、ＮＭＴ５５に対する免疫応答として作製された、対象からの抗体に特異的に結合することができる。
ある実施形態において、対象は、哺乳類である。一実施例において、対象は、ヒトである。
ある実施形態において、免疫応答は増殖性疾患に対して対象を保護する。
本明細書で使用されるとき、「増殖性疾患」とは、細胞の異常な増殖をもたらす、任意の障害を指す。ある実施形態において、増殖性疾患は新生物、癌、腫瘍、またはそれらの転移癌である。増殖性疾患の特定の例は、胃腺癌、結腸直腸腺癌、鱗状細胞肺癌、肺腺癌、食道の鱗状細胞癌、膵臓の腺癌、膀胱の尿路上皮癌、腎臓の腎臓細胞癌、前立腺の腺癌、乳管癌、小葉性乳癌、卵巣腺癌、および子宮腺癌等の、種々の種類の新生物である。しかしながら、増殖性疾患は形質転換ウイルスに感染した細胞の結果でもあり得る。
本開示の方法を受けやすい例示的な癌は、非限定的に、結腸直腸癌、卵巣癌、鱗状細胞肺癌、小細胞肺癌、小葉性乳癌および乳管癌、黒色腫、乳癌、肺腺癌等の肺癌、胃癌、膵臓腺癌等の膵臓癌、神経膠腫、肉腫、胃腸癌、脳の腫瘍、食道鱗状細胞癌等の食道癌、胃癌、骨肉腫、線維肉腫、膀胱癌、前立腺腺癌等の前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、精巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、子宮腺癌、ホジキン病、リンパ腫、および白血病を含む。
ある実施形態において、本方法は、抗細胞増殖または免疫強化治療または療法を対象に投与することを更に含む。
本明細書に示される組成物および方法は、所望の効果を提供する任意の他の治療または療法と組み合わせることができる。具体的には、抗細胞増殖活性または機能を有すると特徴付けられた治療および療法が適用可能である。例示的な治療および療法は抗細胞増殖剤もしくは薬、または免疫強化剤もしくは薬を含む。
ここで使用されるとき、「免疫を強化する」という用語は、治療、療法、剤、または薬物について使用されるとき、その治療、療法、剤、または薬物が体液性または細胞媒介性の免疫応答の増大、刺激、誘導、または促進を提供することを意味する。かかる療法は概して免疫応答を強化するか、または特定の標的、例えば、新生物、癌、腫瘍、またはそれらの転移癌等の、細胞増殖性または細胞高増殖性障害に対する免疫応答を強化することができる。
免疫強化剤の特定の非限定的な例は、抗体、細胞成長因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン、およびケモカインを含む。免疫強化剤および治療の追加の例は、細胞増殖性障害に対する抗体を発現するか、あるいはそうでなければ、細胞増殖性障害に対する免疫応答を開始するような、リンパ球、血漿細胞、マクロファージ、樹状突起細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞等の、免疫細胞を含む。免疫原性を強化するか、または刺激するサイトカインは、免疫強化剤の非限定的な例でもある、ＩＬ−２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βを含む。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ−８、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ−ＴＧ／ＮＡＰ−２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１、およびリンホタクチンを含むケモカインは、免疫強化剤の更なる非限定的な例である。
治療および療法は本開示の任意の他の方法、例えば、抗細胞増殖性または抗細胞高増殖性障害（例えば、新生物、癌、腫瘍、またはそれらの転移癌）の前に、実質的に同時に行われてもよい。本開示は、それゆえ、本開示のペプチドのいずれかが、本明細書に示されるまたは当該技術分野で既知である抗細胞増殖プロトコル、剤、または薬物等の、任意の療法計画、治療プロトコル、または組成物との組み合わせで使用される、組み合わせ方法を提供する。
本明細書で使用されるとき、「抗細胞増殖」、「抗新生物」、「抗腫瘍」、または、「抗癌」治療、療法、活性、または効果は、異常なまたは所望されない細胞増殖（細胞高増殖）、細胞高増殖性障害、新生物、癌、腫瘍、またはそれらの転移癌に関連する、またはそれらにより引き起こされる病理、悪い症状、または合併症を治療することにおいて有用な、任意の療法、治療計画、剤、薬物、プロトコル、またはプロセスを意味する。特定の療法、治療計画、剤、薬物、プロトコル、またはプロセスは、細胞増殖、細胞成長、細胞高増殖、新生物、腫瘍、または癌（悪性）の成長、増殖、生存、または転移を阻害し、低下させ、遅め、減少させ、遅延させ、または予防し得る。かかる治療、療法、計画、プロトコル、剤、および薬物は、細胞周期進行または細胞増殖もしくは成長を破壊する、低減する、阻害する、または遅延させる；細胞アポトーシス、溶解、または死を増大させる、刺激する、または強化する；核酸もしくはタンパク質合成または代謝を阻害する；細胞分割を低減する、低下させる、阻害する、または遅延させる；あるいは細胞生存、または細胞生存因子、成長因子、もしくはシグナル経路（細胞外または細胞内）の生成もしくは利用を低下させる、低減する、または阻害することにより操作することができる。
抗細胞増殖治療および療法の例は、化学療法、免疫療法、放射線療法（イオン化または化学的）、局所的または局部的熱療法（加温療法）、および外科的切除を含む。抗細胞増殖剤および薬の特定の非限定的なクラスはアルキル化剤、代謝拮抗薬、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン（ステロイド）、ヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログを含む。微生物毒素の特定の非限定的な例は、細菌コレラ毒素、百日咳毒素、炭疽菌毒素、ジフテリア毒素、および植物毒素リシンを含む。薬物の特定の例は、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジン、シトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカトプリン、ＡＺＴ、５−アザシチジン（５−ＡＺＣ）および５−アザシチジン関連化合物、ペントスタチン、ゲムシタビン、シタラビン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、ミトマイシンＣ、カルムスチン、カリケアマイシン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、テニポシド、エトポシド、ヒドロキシ尿素、ニトロソ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、レバミソール、イフォスファミド、ミトタン、ミトキサントロン、プロカルバジン、デカルバジン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノマイシン、およびジブロモマンニトールを含む。ホルモンの特定の非限定的な例は、プレドニゾン、プレドニゾロン、ジエチルスチルベステロール、フルオキシメステロン、フルタミド、ロイプロリド、トレミフェン、トリアムシノロン、ゾラデックス、およびゴナトロフィン放出ホルモンアンタゴニストを含む。
放射線療法は対象への内部または外部デリバリーを含む。例えば、アルファ、ベータ、ガンマ、およびＸ線は、対象が放射性同位体を取り入れる、またはそうでなければそれと物理的に接触することなく、外部から対象に加えることができる。Ｘ線量の特定の例は、長い期間（１週間当たり３〜５回）についての５０〜２０００レントゲンの１日量から、２０００〜６０００レントゲンの単回量に及ぶ。線量は広く変化し、暴露期間、同位体の半減期、放射される放射線の種類、治療される細胞の種類および場所、ならびに疾患の進行段階による。放射性核種の特定の非限定的な例は、例えば、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、７２Ｓｅ、８８Ｙ、９０Ｓｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１０５Ｒｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４９Ｔｂ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９４Ｏｓ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ５、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、２２７Ａｃ、および２２８Ｔｈを含む。
腫瘍細胞に結合する抗体は、抗細胞増殖治療または療法の特定の例である。抗腫瘍抗体は、例えば、白血病細胞ＣＤ３３抗原に結合するＭ１９５抗体（米国特許第６，５９９，５０５号）、卵巣癌ＣＡ６腫瘍関連抗原に結合するモノクローナル抗体ＤＳ６（米国特許第６，５９６，５０３号）、上皮細胞表面Ｈ抗原に結合するヒトＩＢＤ１２モノクローナル抗体（米国特許第４，８１４，２７５号）、ならびに結腸癌、乳癌、卵巣癌、および肺癌により発現されるＬｅｘ炭水化物エピトープに結合するＢＲ９６抗体を含む。使用され得る追加の抗腫瘍抗体は、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（抗−Ｈｅｒ−２ｎｅｕ抗体）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）、Ｂｅｘｘａｒ、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｏｎｃｏｌｙｍ、１７−１Ａ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、３Ｆ８（抗神経芽細胞腫抗体）、ＭＤＸ−ＣＴＬＡ４、ＩＭＣ−Ｃ２２５（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、およびＭｙｌｏｔａｒｇを含む。
ここで使用されるとき、「免疫を強化する」という用語は、治療、療法、剤、または薬物について使用されるとき、その治療、療法、剤、または薬物が体液性または細胞媒介性の免疫応答の増大、刺激、誘導、または促進を提供することを意味する。かかる療法は概して免疫応答を強化するか、または特定の標的、例えば、新生物、癌、腫瘍、またはそれらの転移癌等の、細胞増殖性または細胞高増殖性障害に対する免疫応答を強化し得る。
免疫強化剤の特定の非限定的な例は、抗体、細胞成長因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン、インターフェロン、およびケモカインを含む。免疫強化剤および治療の追加の例は、細胞増殖性障害に対する抗体を発現する、またはそうでなければ細胞増殖性障害に対する免疫応答を開始するような、リンパ球、血漿細胞、マクロファージ、樹状突起細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞等の免疫細胞を含む。免疫原性を強化する、または刺激するサイトカインは、免疫強化剤の非限定的な例でもある、ＩＬ−２、ＩＬ− ｌα、ＩＬ− ｌβ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βを含む。ＭＥＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−Ｉ、ＭＣＰ−Ｉ、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ−Ｉ、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１Ｏ、ＩＬ−８、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ−ＴＧ／ＮＡＰ−２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１、およびリンホタクチンを含むケモカインは、免疫強化剤の更なる非限定的な例である。
腫瘍関連抗原に対する抗体またはその抗体を分泌するＢ細胞をアッセイする、濃縮する、単離する、または精製する方法
ある実施形態において、本開示は、抗体またはその抗原結合断片と、本開示のペプチドとを接触させることを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片をアッセイする、濃縮する、単離する、または精製する方法を提供する。
「アッセイする」および「測定する」という用語ならびにそれらの文法的変形は本明細書で交換可能に使用され、定性的もしくは定量的決定、または定性的および定量的決定の両方を指す。その用語が結合について使用されるとき、本明細書に示され、および当該技術分野で既知である種々の方法を含む、結合の相対量、親和性、または特異性を評価する任意の手段が企図される。例えば、抗体結合はＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット、または免疫沈澱アッセイによりアッセイするか、または測定することができる。
「接触させる」という用語は、ポリペプチド（例えば、抗体）、材料、試料、または治療を含む組成物について使用されるとき、組成物（例えば、抗体等のポリペプチド）と他の参照される実体との直接的または間接的相互作用を意味する。直接的相互作用の特定の例は、結合である。間接的相互作用の特定の例は、組成物が中間体分子に対して働き、その中間体分子が今度は参照される実体に対して働く場合である。したがって、例えば、細胞（例えば、細胞高増殖性障害を含む）と抗体とを接触させることは、その抗体がその細胞に結合することを許容すること、またはその抗体が中間体（例えば、抗原）に対して働くことを許容し、その中間体が今度はその細胞に対して働くことを含む。
ある実施形態において、本開示のペプチドは標的抗原に対する更なる抗体を作製するために使用される。例えば、本開示のペプチドは、ＮＭＴ５５等の標的抗原に対する更なる抗体またはその抗原結合断片を特定するために、ファージディスプレイ実験において使用され得る。かかる方法は、所望の特性の強化、例えば、結合親和性、安定性、または結合活性の増大を有し得る、抗体またはその抗原結合断片を特定するために使用することができる。抗体および機能的断片のスクリーニングおよび選択の追加の非限定的な特定の方法は、ファージディスプレイ、リボソームおよびｍＲＮＡディスプレイによるタンパク質−ｍＲＮＡ連結、酵母、細菌、哺乳類細胞、もしくはレトロウイルス上でのディスプレイ、インビトロ区画化によるマイクロビーズ、タンパク質−ＤＮＡディスプレイ、酵母２−ハイブリッドによる成長選択、タンパク質断片補完を含む（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，２００５）。
新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌を検出する、診断する、または監視する方法
本開示は、哺乳類、好ましくはヒト患者等の対象における、新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌を検出する、診断する、または監視する方法を提供する。典型的に、任意の新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌はＮＭＴ５５を発現する。
ある実施形態において、本開示は、本開示のペプチドを対象に投与すること、または代替的に、本開示のペプチドを対象から得られた試料と接触させ、その対象または試料中の抗体がそのペプチドに特異的に結合するかどうかを決定することを含む、対象における新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌を検出する、診断する、または監視する方法を提供する。
別の実施形態において、本開示は、対象に本開示の化合物を投与すること、または本開示の化合物と、対象から得られた試料とを接触させ、その化合物がその対象または試料中の細胞に特異的に結合するかどうかを決定することを含む、対象における新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌を検出する、診断する、または監視する方法を提供する。
本開示のペプチドに特異的に結合する化合物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）をインビボ、エクスビボ、またはインビトロで生物学的組織または試料と接触させ、その生物学的組織または試料が新生物性または癌性であるかどうか、すなわち、その化合物により特異的に結合される抗原を発現する細胞を含むかどうかを決定することができる。代替的に、本開示のペプチドをインビボ、エクスビボ、またはインビトロで生物学的組織または試料と接触させ、その生物学的組織または試料がそのペプチドに特異的に結合する抗体を含有するかどうかを決定し、それによって対象が新生物、癌、腫瘍、またはそれらの転移癌を患うことを示すことができる。
所望される場合、そのペプチドまたは化合物は、そのペプチドまたは化合物の精製、および癌の検出、診断、またはモニタリングの必要のある対象における癌の検出、診断、またはモニタリングを促進するために、検出可能な剤と連結され得る。好適な検出可能な剤の選択はそのペプチドまたは化合物の意図された使用によるであろう、そして当業者に明らかであろう。請求された開示に従う検出可能な剤は、例えば、上記に概説されるように、タンパク質精製タグ、細胞毒素、酵素、常磁性標識、酵素基質、共因子、酵素阻害剤、色素、放射性核種、化学発光標識、蛍光マーカー、成長阻害剤、およびビオチンを含む。
タンパク質精製タグはそのペプチドの単離を促進するために、そのペプチドまたは化合物と結合され得る。使用され得るタグの例は、Ｈｉｓ−タグ、ＨＡ−タグ、ＦＬＡＧ（登録商標）−タグ、およびｃ−Ｍｙｃタグを含む。そのタグが精製後に除去され得るように、酵素的または化学的切断部位がそのペプチドまたは化合物と、そのタグ基との間に作製され得る。好適な毒素はジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、リシン、およびコレラ毒素を含む。好適な酵素標識の例は、リンゴ酸塩ヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロールリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを含む。好適な放射性同位体標識の例は、Ｈ、Ｉ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、およびＣを含む。望ましくは、放射性同位体は１０〜５，０００ｋｅｖの範囲、より望ましくは１００〜５００ｋｅｖで放射するであろう。常磁性同位体もそのペプチドまたは化合物と連結され、癌の診断および治療のためにインビボで使用され得る。
かかる連結されたペプチドまたは化合物の使用はインビボ核磁気共鳴画像法のためのものであり得る。かかる方法は、以前に示されている（例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｓｈｒｅｖｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｗｏｌｆ，１９８４、Ｗｅｓｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４、およびＲｕｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照されたい）。代替的に、放射性標識化合物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、標識化化合物が結合した任意の組織の外科的除去に関連する、放射免疫ガイド外科手術（ＲＩＧＳ）においても使用され得る。したがって、標識化化合物は、新生物性組織または癌性組織を非新生物性組織または非癌性組織と区別することにより、外科医に新生物性組織または癌性組織をガイドする。
腫瘍画像化法に有用な放射性標識は好ましくは短命の放射性同位体である。スカンジウム−４７（３．４日間）、ガリウム−６７（２．８日間）、ガリウム−６８（６８分間）、テクニチウム−９９ｍ（６時間）、インジウム−Ｉ１１（３．２日間）、およびラジウム−２２３（１１．４日間）等の、１時間〜１１．４日間に及ぶ半減期を有する種々の放射活性金属が抗体への結合のために入手可能であり、そのうち、ガリウム−６７、テクニチウム−９９ｍ、およびインジウム−１１１はガンマカメラ画像法に好ましく、ガリウム−６８は陽電子放出断層撮影に好ましく、スカンジウム−４７およびラジウム−２２３（および他のアルファ放出放射性核種）は腫瘍療法に好ましい。
好適な蛍光マーカーの例は、フルオレセイン、イソチオシアレート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスカミンを含む。化学発光マーカーの例は、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識を含む。当業者であれば本開示に従って使用され得る、他の好適な標識を知っているであろう。これらの検出可能な剤の、本開示のペプチドまたは化合物への結合は当該技術分野において通常知られる標準の技術を用いて達成することができる。典型的な抗体結合技術はＫｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９７６、およびＳｃｈｕｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９７７により示され、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法を含む。抗体は、例えば、米国特許第４，４４４，７４４号に示される、当該技術分野で既知である幾つかの技術のいずれかにより放射性標識され得る。
本開示の全ての態様において、同じまたは異なる新生物、癌、腫瘍、または新生物細胞種、癌細胞種、腫瘍細胞種に関連する、異なる抗原、または同じもしくは異なる抗原の異なるペプチドに特異的な、異なるまたは同じ標識化化合物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）の混合物が使用され得ることが理解される。かかる組み合わせは、幾つかの事例において、検出、位置の特定、および／または療法を強化することができ、１超の新生物または新生物の種類についての広いスクリーニングの範囲も増大することができる。
本開示の化合物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、それらが新生物、癌、もしくは腫瘍、または新生物性細胞もしくは癌性細胞に特異的であるが、正常細胞もしくは組織に特異的ではないので、特に有用である。したがって、ある実施形態において、本開示の化合物は、腫瘍内の新生物性細胞または癌性細胞に結合するが、正常な周りの組織には結合せず、したがって、哺乳類において腫瘍の検出、治療、またはそれらの両方を許容することができる。例えば、本開示の抗体またはその抗原結合断片により結合される細胞が患者内に残っていないことを確認することにより、またはその患者から除去された腫瘍がその抗体または抗原結合断片により結合されない細胞により完全に囲まれていることを確認することにより、生検が腫瘍全てを除去したかどうかを決定するために、本開示の抗体またはその抗原結合断片を使用することができる。
検出の感受性を改善するために、多数の新生物性または癌性マーカーがある試料または個体内でアッセイされうることが理解される。したがって、異なる抗原に特異的な、抗体またはその抗原結合断片等の化合物は、単一のアッセイ内で、または複数のアッセイにおいて組み合わせられ得る。マーカーの選択は最適感受性をもたらす組み合わせを決定するための日常的な実験に基づき得る。
新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌のインビトロ検出
概して、哺乳類における新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌の診断はその哺乳類（例えば、ヒト患者）から生体試料を得ることと、かかる試料と本開示のペプチドまたは化合物とを接触させることと、１）健康な対象に由来する非新生物性または非癌性試料に対応する対照試料と比較した、その試料中の抗体の、そのペプチドへの、２）癌と診断されている対象からのまたは健康な対象からの健康な組織に由来する非新生物性または非癌性細胞に対応する対照試料と比較した、その化合物の、新生物性または癌性細胞への、反応性または結合のレベルをその試料中で検出することとに関する。したがって、本開示の方法は、他の方法では検出不可能な、初期段階の新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌の検出のために特に有用である。
患者において新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌を診断することに加えて、本開示の方法は、対象における新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌の進行を監視するためにも使用することができる。本明細書に示されるペプチドはそれゆえ、新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌の進行についてのマーカーとして使用することができる。この目的のために、新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌の診断のために使用される、以下に示されるアッセイが時間にわたり行われ、反応性ペプチドまたは化合物のレベルの変化が評価され得る。
例えば、アッセイは２４〜７２時間毎に６ヶ月〜１年の期間行われ、その後必要に応じて行われ得る。概して、新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌は、検出された結合した化合物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）のレベルが時間にわたり増大する患者においては進行性であり、対照的に、新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌は、結合した化合物のレベルが一定のままであるか、または時間に伴って低下するとき、進行性でない。
代替的に、上記に示されるように、本開示の化合物は、腫瘍が対象から完全に除去されたかどうかを決定するために、外科的介入による腫瘍切除後の対象内の新生物性細胞または癌性細胞の存在を決定するためにも使用することができる。
望ましくは、そのペプチドまたは化合物は、ペプチドまたは化合物の反応性の検出または測定を促進する、検出可能な剤と連結される。生体試料は、新生物性細胞もしくは癌性細胞またはＮＭＴ５５に対する抗体を含有し得る、任意の生物学的材料であり、例えば、血液、唾液、組織、血清、粘液、痰、尿、または涙を含む。生体試料は、固定組織、新鮮な組織、または凍結組織であり得る、組織切片でもあり得る。新生物は、その試料が得られた対象において、対照試料に対して、その生体試料でそのペプチドまたは化合物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）の反応性のレベルの増大があるかどうかを検出され、または診断される。かかる増大は対照レベルに対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または５０％以上である。結合または反応性のレベルは当該技術分野で既知である任意の方法により決定することができ、以下に更に詳細に示される。
インビトロ診断アッセイ
本開示のペプチドまたは化合物を用いた新生物、癌、腫瘍、またはそれらの転移癌の診断は、試料中で抗体またはペプチドマーカーを検出するための、結合剤の使用についての当業者に知られる任意の方法により行われてもよい（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９９を参照されたい）。
例えば、ペプチドまたは化合物は、組織試料中の腫瘍細胞の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、またはインサイツ検出のために使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイは典型的に、生体試料中の腫瘍細胞に結合するための、固体支持上に固定された、抗体等の化合物の使用に関する。結合した腫瘍細胞はその後、レポーター基を含有し、抗体／腫瘍細胞複合体に特異的に結合する検出試薬を用いて検出することができる。かかる検出試薬は、例えば、抗免疫グロブリン、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ、またはレクチン等の、抗体に特異的に結合する任意の結合剤を含む。代替的に、化合物が抗体であり、その抗体が特異性を有する抗原がレポーター基で標識化され、その抗体と生体試料とのインキュベーション後に固定された抗体に結合することを許容される、競合アッセイが利用され得る。試料の構成要素が標識化抗原の、その抗体への結合を阻害する程度は、その試料とその固定された抗体との反応性の指標である。別の実施例において、ＥＬＩＳＡアッセイは、生体試料中の抗体（例えば、抗ＮＭＴ５５抗体）に結合するために固体支持上に固定された、本開示のペプチドの使用に関する。結合した抗体は、その後、レポーター基を含有し、抗体／ペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を用いて検出され得る。かかる検出試薬は、例えば、抗Ｆｃ−受容体抗体等の、抗体に特異的に結合する任意の結合剤を含む。
患者における新生物の診断は２抗体サンドウィッチアッセイによっても決定することができる。このアッセイは、はじめに固体支持、通常マイクロ力価プレートのウェル上に固定された抗体と試料とを接触させ、その試料中のポリペプチド（例えば、ＮＭＴ５５またはそれを発現する細胞）が固定された抗体に結合することを許容することにより行われ得る。結合していない試料をその後、固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去し、レポーター基を含有する検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合することができる二次抗体）を添加する。固体支持に結合したままの検出試薬の量をその後、特定のレポーター基に適切な方法を用いて決定する。例えば、結腸直腸腺癌等の新生物の存在または不在を決定するために、固体支持に結合したままのレポーター基から検出されたシグナルは概して、事前に決定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較される。新生物の検出のためのカットオフ値は、その抗体が新生物を有しない患者からの試料とインキュベートされたときに得られた、平均シグナルである。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質による。放射活性基のために、シンチレーション測定またはオートラジオグラフィー法を使用することができる。分光学的方法は、色素、発光基、および蛍光基を検出するために使用することができる。ビオチンは種々のレポーター基（通常、放射活性もしくは蛍光基、または酵素）に連結された、アビジンを用いて検出することができる。酵素レポーター基は概して、基質の添加（概して、定義された期間の間）、その後反応生成物の分光学的または他の分析により検出することができる。
本開示の化合物（例えば、抗体またはその抗原結合断片）は、例えば、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡による、腫瘍細胞のインサイツ検出または定量的決定のために組織学的にも使用され得る。インサイツ検出または決定は、患者から組織標本を除去し、標識化抗体がその標本中の任意の腫瘍細胞に結合することを許容することにより達成することができる。かかる手順を用いることは、試料中の新生物性細胞の検出を許容するのみでなく、それらの空間的分布の決定も許容する。別の実施例として、生体試料は、スライド上の新生物性細胞を含有する生物学的材料の塗抹標本であり得、その生物学的材料中の新生物性細胞の検出は顕微鏡でその塗抹標本を調べることにより達成される。
新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌のインビボ検出
代替的に、本開示のペプチドは新生物を検出し、可能性として、位置を特定するためにインビボで使用することができる。かかる方法は、哺乳類、望ましくはヒト対象に、検出可能な剤で標識化した、本開示のペプチドまたは化合物を非経口で注入することに関し得る。例えば、ペプチドまたは化合物は、薬理学的に不活性な放射性同位体で放射性標識化され、患者に投与され得る。その放射性同位体の活性はフォトスキャニング装置を用いてその哺乳類内で検出することができ、対照と比較した活性の増大は新生物、癌、もしくは腫瘍、またはそれらの転移癌の検出、および可能性として、位置の特定を反映する。
特に別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が関連する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に示される方法および材料と同様のまたは均等の方法および材料が本開示の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料は本明細書に示される。
本開示は、以下の非限定的な実施例において更に説明される。
実施例１
ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープのマッピング
ＰＡＴ−ＬＭ１抗体は、その標的としてＮＭＴ５５を認識することが以前に発見された（国際公開第ＷＯ２０１０／００４４３８号を参照されたい）。この実施例は、ＰＡＴ−ＬＭ１抗原（ヒトＮＭＴ５５）のアミノ酸配列に由来する重複断片の走査をどのようにエピトープマッピングのために使用したかを説明する。これらの実験において、ＮＭＴ５５のＣ末端は切り取られ、エピトープが位置する領域を見つけるために、ＰＡＴ−ＬＭ１への結合がウェスタンブロットにより決定された。
１．１材料および方法
ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープマッピングのためのＮＭＴ５５サブ断片のクローニングおよび発現
図１に概説されるように、ＰＣＲプライマーをＮＭＴ５５のＣ末端の種々の区分について作製し、ＮＭＴ５５のＮ末端を包含する前向きプライマーと共に増幅させた。その後、Ｃ−末端領域の短い、種々のｎｍｔ−５５イソ型をクローニングした。
エピトープマッピングのために、ＮＭＴ５５サブ断片を増幅するために使用されたプライマーは以下のとおりであった：Ｎｏｎｏ−Ｋｏｚａｋ−前向き：ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＧＴＡＡＴＡＡＡＡＣＴＴＴＴＡＡＣ（配列番号７）、Ｎｏｎｏ−２９０ＡＡ−逆向き：ＴＴＡＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＣＧＧＴＣＣＡＣＴＴＧ（配列番号８）、Ｎｏｎｏ−３１０ＡＡ−逆向き：ＴＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧＣＧ （配列番号９）、Ｎｏｎｏ−３３０ＡＡ−逆向き：ＴＴＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＧ（配列番号１０）、Ｎｏｎｏ−３５０ＡＡ−逆向き：ＴＴＡＧＣＧＣＣＴＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧ（配列番号１１）、Ｎｏｎｏ−３７０ＡＡ−逆向き：ＴＴＡＧＡＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＣＧ（配列番号１２）、Ｎｏｎｏ−３９０ＡＡ−逆向き：ＴＴＡＴＣＣＣＡＴＡＧＣＣＡＴＣＴＧＡＣＣＣＡＴ（配列番号１３）、Ｎｏｎｏ−４１０ＡＡ−逆向き：ＴＴＡＧＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧＡＧＣ（配列番号１４）、Ｎｏｎｏ−４３０ＡＡ−逆向き：ＴＴＡＴＧＧＴＧＧＧＧＴＣＡＡＴＣＣＣＡＡＡＧＴ（配列番号１５）、Ｎｏｎｏ−４５０ＡＡ−逆向き：ＴＴＡＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＧＣＣＣＣＡＡＴ（配列番号１６）、Ｎｏｎｏ−２９２ＡＡ−逆向き：ＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＣＧＧＴＣ（配列番号１７）、Ｎｏｎｏ−２９４ＡＡ−逆向き：ＴＣＡＣＴＣＡＣＧＡＧＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴ（配列番号１８）、Ｎｏｎｏ−２９６ＡＡ−逆向き：ＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＣＧＡＧＣＣＴＣＣＴＴ（配列番号１９）、Ｎｏｎｏ−２９８ＡＡ−逆向き：ＴＣＡＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＣＧＡＧＣ（配列番号２０）、Ｎｏｎｏ−３００ＡＡ−逆向き：ＴＣＡＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣ （配列番号２１）、Ｎｏｎｏ−３０２ＡＡ−逆向き：ＴＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧ （配列番号２２）、Ｎｏｎｏ−３０４ＡＡ−逆向き：ＴＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＴ（配列番号２３）、Ｎｏｎｏ−３０６ＡＡ−逆向き：ＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴ（配列番号２４）、Ｎｏｎｏ−３０８ＡＡ−逆向き：ＴＣＡＣＴＧＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣ（配列番号２５）。
これらのプライマーを用いて、ＮＭＴ５５完全長配列を鋳型として、ＮＭＴ５５の所望の断片を増幅するためにＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプロトコルは約９８℃で約５秒間、約５８℃で約５秒間、および約７２℃で約１０〜２０秒間を約３５サイクルであった。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターｐＥＸＰ５−ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、その配列を確認した。重複ＮＭＴ５５タンパク質の発現をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ発現マニュアル（ｐＥＸＰ５−ＣＴ／Ｔｏｐｏ ＴＡ発現キット）に基づいてＢＬ２１（大腸菌）において行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
約３５μｌの溶解した細胞への、約１５μｌのローディング緩衝液の添加後に、試料を約１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用した。約１４μｌの試料をレーン毎にロードし、４０ｍＡで約４５分間電気泳動した。
ウェスタンブロット
ゲルをＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に、濡れたブロッティングチャンバー（ＢｉｏＲａｄ）中で、３５０ｍＡで約１時間ブロットした。ブロットをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の約５％粉乳中で約１時間ブロックした。一次抗体、抗−Ｈｉｓ（１：１０００）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の約５％粉乳中で約１時間適用した。ＰＡＴ−ＬＭ１（約４０μｇ／ｍｌ）を約２時間適用した。ブロットをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回、約５分間洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体を約１時間適用した。ブロットを約３回約１５分間洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ溶液で現像した。
１．２結果
はじめのＰＡＴ−ＬＭ１エピトープマッピング
はじめのエピトープマッピング実験の結果が図２に示される。ＮＭＴ５５のアミノ酸２９０〜４７１を含む断片は、ＰＡＴ−ＬＭ１陽性である（すなわち、ＰＡＴ−ＬＭ１結合を示した）ことが特定された。ＮＭＴ５５の、１０個の１５アミノ酸削減断片へのサブクローニングを上記に概説されるように行った。ＮＭＴ５５のアミノ酸１〜３１０からなるサブ断片が最後のＰＡＴ−ＬＭ１陽性構築物であることが特定された（図２ＡおよびＢを参照されたい）。したがって、ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープはＮＭＴ５５の２９０〜３１０アミノ酸にマッピングされることが結論付けられた。
ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープの精巧なマッピング
ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープＣ末端の精巧なマッピングのために、ＮＭＴ５５のアミノ酸２９０〜３１０を含むＮＭＴ５５断片を、２アミノ酸ずつに分けた１０個のサブ断片に分け、ＰＡＴ−ＬＭ１への結合をウェスタンブロットにより決定した。これらの精巧なマッピング実験の結果は図３に示される。ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープはＮＭＴ５５のアミノ酸２９２〜３０６に存在すると決定された（すなわち、ＡＲＥＫＬＥＭＥＭＥＡＡＲＨＥ（配列番号２）、図３ＡおよびＢを参照されたい）。
アラニンスキャニング実験をその後、ＮＭＴ５５上で最小限ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープをマッピングするために行った。系統的なアラニン置換を有する１連のペプチドを合成した。等量のペプチドでＮｕｎｃプレートをコーティングし、ＰＡＴ−ＬＭ１ ＩｇＭの結合をＥＬＩＳＡにより試験した。結果は図４Ａに示される。
アラニンを有する別の組のペプチドをセリンで置換し、ＥＬＩＳＡにより、アラニン置換ペプチドの幾つかと共に、上記に概説されるように、ＰＡＴ−ＬＭ１ ＩｇＭ結合について試験した。結果は図４Ｂに示される。
アラニンおよびセリンスキャニング実験から、最小限ＰＡＴ−ＬＭ１エピトープはＥＡＡＲＸＥ（配列番号３）であることが結論付けられ、ここでＸは任意のアミノ酸であり得る。
実施例２
追加のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ（ミモトープ）についてのスクリーニング
この実施例は、追加のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ、または、「ミモトープ」についてのスクリーニングのためにファージディスプレイライブラリを利用する実験を説明する。
２．１材料および方法
ドデカペプチドファージディスプレイライブラリスクリーニング
Ｐｈ．Ｄ．−１２（登録商標）ファージディスプレイペプチドライブラリキットをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から得た。これはＭ１３ファージのマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合されたコンビナトリアルペプチド１２マーである。表示されたペプチド１２マーはｐＩＩＩのＮ末端で発現される。ライブラリは約１．９×１０９エレクトロポーレーション配列からなり、１０μｌの供給されたファージ中に約２０コピーの各配列を生成するよう１回増幅される。
３回のバイオパニングを製造業者の指示書に従って、幾つかの改変を伴って行った。ライブラリの事前クリアリングのために、約１μｇの無関係なヒトＩｇＭ（ＳＡＭ６）を９６ウェルポリスチレン皿（Ｃｏｓｔａｒ）に結合させ、約５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する約０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．６）でブロックし、約１０％ライブラリと共に室温（ＲＴ）で約２時間インキュベートした。この事前吸収上清（約９０μｌ ＴＢＳ／１０μｌ ＰＨ．Ｄ．−１２）をバイオパニングの第１回目に使用した。約１μｇのＰＡＴ−ＬＭ１（ＩｇＭ）を９６ウェルポリスチレン皿に結合させ、約５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する約０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．６）でブロックした。その後、その皿を約１００μｌの事前吸収上清と共に室温で約２時間インキュベートし、約０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する約５０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）（ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で約６回洗浄した。結合したファージをその後、約１００μｌの溶離緩衝液（約０．１Ｎ ＨＣｌ（ｐＨはグリセリンで２．２に調節されている）および約１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で、その９６ウェルから１５分間溶離させた。約１５μｌの約１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）での中和後、溶離したファージを大腸菌ＥＲ２５３７（ｒｅｃＡ＋株細胞）の一晩培養物の約１：１００希釈液、約２０ｍｌの感染により、製造業者により推奨されるように増幅させた。そのファージを激しく振騰しながら約３７℃で約４．５時間インキュベートし、約１／６体積のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ＮａＣｌ（２０（体積／体積）％ポリエチレングリコール８０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）で２回の冷却沈殿により精製した。
第２および第３回目の選択においては、前の回からの約１０％の増幅ファージを、約１００μｇ／ｍｌの最終濃度でコーティングされたｈＩｇＭ（ＰＡＴ−ＬＭ１）と共に室温で約２時間事前インキュベートした。手順はその後、第１回目と同一であった。第３回目のバイオパニング溶離物からの単一のファージクローンを単離し、ＥＬＩＳＡ分析およびＤＮＡシークエンシングのために増幅させた。
ファージ結合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートウェルの列を約０．１ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．６）中の約１００μｇ／ｍｌの最終濃度で、約１００μｌのＰＡＴ−ＬＭ１（ＩｇＭ）もしくはＳＡＭ６（ＩｇＭ）のいずれかでコーティングするか、またはコーティングしなかった。そのプレートを約４℃で一晩インキュベートし、その後、約５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する約０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．６）でブロックした。室温で約２時間のインキュベーション後、そのプレートをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで約６回洗浄した。バイオパニング第１〜第３回目からの増幅された溶離物の８倍連続希釈物を、約１００μｌのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎの最終体積中で、マイクロ力価プレートの各ウェルに添加し、ある列の第１のウェル中の約１０−５の溶離物−希釈液で始め、第８のウェル中の約１０−１２で終わった。プレートを攪拌しながら室温で約２時間インキュベートし、その後上記に示されるようにＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで約６回洗浄した。結合したファージを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗Ｍ１３モノクローナル抗体（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を約１：４０００希釈で用いたサンドウィッチアッセイにおいて検出した。そのプレートを３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびＨ２Ｏ２を含有する市販の着色キット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて現像した。約５分間のインキュベーション後、反応を約５０μｌの３Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、そのプレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで約４５０ｎｍで読み取った。
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）
細胞（Ａ５４９、ＭＫＮ−４５、またはＨＴ−２９癌細胞）を約７０〜８０％コンフルエントまで成長させ、細胞分離溶液で取り外した。細胞懸濁液を完全培地中で約２×１０５／ｍｌに調節した。細胞を氷上に約３０分間置いた。
１つのＦＡＣＳ管当たり約１ｍｌの細胞懸濁液を分配した。懸濁液を約４℃で、約５００ｇで、約５分間スピンダウンした。上清を捨て、細胞を約５００μｌのＦＡＣＳ Ｆｌｏｗ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，３４２００３）中に溶解した。再び、懸濁液を約４℃で、約５００ｇで約５分間スピンダウンし、上清を捨てた。
約２００μｌ ＦＡＣＳ Ｆｌｏｗ中の約５０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＭをその細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。抗体の飽和のために、約５μｇ／ｍｌのＰＡＴ−ＬＭ１「追加エピトープ２」（配列番号８）または約５μｇ／ｍｌのＳａｍ−３エピトープをその抗体溶液に添加し、約１５分間事前インキュベートした。Ｓａｍ−３抗体は、ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ３０６０により示されるとおりであった。同様のことをアイソタイプ対照（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ（ＣＰ）ＩｇＭ００９−０００−０１２、ｄｉａｎｏｖａ、４．４ｍｇ／ｍｌ、陰性対照：番号１）で、および一次抗体を伴わない緩衝液（陰性対照：番号２）で行った。
懸濁液を約４℃で、約５００ｇで約５分間スピンダウンし、細胞を約５００μｌのＦＡＣＳ Ｆｌｏｗで洗浄した。細胞を約２００μｌのＦＡＣＳ Ｆｌｏｗ中に二次抗体（抗ヒトＩｇＭ−ＦＩＴＣ、Ｆ（ａｂ）２、ＤＡＫＯ Ｆ０３１７）の約１：５０希釈物と共に再懸濁し、約４℃で、暗室で約３０分間インキュベートした。細胞を氷冷ＦＡＣＳ Ｆｌｏｗで２回洗浄し、約２５０μｌのＦＡＣＳ Ｆｌｏｗ中に再懸濁した。蛍光をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（バンドパスフィルターＦＩＴＣ：５３０ ｎｍ）で測定した。
２．２結果
上記のファージディスプレイ実験を通じて、２つのエピトープを特定した（「エピトープ１」および「エピトープ２」）。これらのエピトープをその後、それぞれ図５Ａおよび６Ａに概説されるように、ＮまたはＣ末端のいずれかから１つのアミノ酸を系統的に削除することにより更なる精巧なマッピングにかけた。
図５Ａ、Ｃ、およびＤに見ることができるように、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．１、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．２、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．３、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．４、およびＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．５のみがＰＡＴ−ＬＭ１抗体への結合を示すポリペプチドであった。ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．３．１、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．３．２、およびＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−１．６はＰＡＴ−ＬＭ１抗体への結合を示すことができなかった。したがって、「エピトープ１」についての最小限エピトープはＤＰＷＹＭＦＲ（配列番号４、「追加のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ１」）であることが結論付けられた。
図６ＡおよびＣに見ることができるように、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−２．１、およびＬＭ−Ｅｐｉ−２．２のみがＰＡＴ−ＬＭ１抗体への結合を示すポリペプチドであった。ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−２．３、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−２．４、ＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−２．５、およびＰＡＴ−ＬＭ１−Ｅｐｉ−２．６はＰＡＴ−ＬＭ１抗体への結合を示すことができなかった。したがって、「エピトープ２」についての最小限エピトープはＤＰＷＲＥＹＲＱＰＹ（配列番号５、「追加のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ２」）であることが結論付けられた。
ウェスタンブロットを上記に示されるように行い、ＰＡＴ−ＬＭ１抗体が「エピトープ１」および「エピトープ２」についての最小限エピトープに結合することを確認した（図７を参照されたい）。
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）実験からの結果は図８に示される。結果は、細胞へのＰＡＴ−ＬＭ１結合（図５Ｃを参照されたい）はファージディスプレイライブラリから単離された「追加のＰＡＴ−ＬＭ１エピトープ２」（配列番号５）での抗体の事前インキュベーションにより阻害されること（図８Ｄを参照されたい）を示す。
多くの変形および／または改変が、広く示されている本開示の範囲から離れることなく、特定の実施形態に示される本開示についてなされ得ることが、当業者により理解されるものとする。本実施形態は、それゆえ、全ての点について例示であり、限定とは考えられるべきでない。
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Claims (11)

  1. 配列番号３、４、または５のいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列を含む、約６〜５０アミノ酸の単離ペプチド。
  2. 配列番号３、４、または５のいずれか１つにおいて示されるアミノ酸配列からなる、単離ペプチド。
  3. 請求項１または２に記載のペプチドと、アジュバントとを含む、組成物。
  4. 請求項１または２に記載のペプチドと、アジュバントとを含む、ワクチン。
  5. 対象に、請求項１もしくは２に記載のペプチド、または請求項３もしくは４に記載の組成物を投与することを含む、前記対象において免疫応答を誘導する方法。
  6. 癌対象に、請求項１もしくは２に記載のペプチド、または請求項３もしくは４に記載の組成物を投与することを含む、前記対象において免疫応答を誘導する方法。
  7. 抗体またはその抗原結合断片と、請求項１または２に記載のペプチドとを接触させることを含む、少なくとも１つの前記抗体またはその抗原結合断片をアッセイする、濃縮する、単離する、または精製する方法。
  8. 請求項１または２に記載のペプチドと、対象から得られた試料とを接触させることと、前記試料中の抗体が前記ペプチドに特異的に結合するかどうかを決定することとを含む、前記対象において癌を検出する、診断する、または監視する方法。
  9. 前記癌がＮＭＴ５５を発現する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記試料が前記癌の治療前、治療中、または治療後に得られる、請求項８または９に記載の方法。
  11. 請求項１または２に記載のペプチドに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
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