PT1390535E - Bibliotecas combinatórias de domínios monoméricos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "BIBLIOTECAS COMBINATÓRIAS DE DOMÍNIOS MONOMÉRICOS"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A análise de sequências de proteína e estruturas tridimensionais revelou que muitas proteínas são compostas por um determinado número de domínios monoméricos discretos. A maioria das proteínas de domínio monomérico discreto é extracelular ou constitui as partes extracelulares de proteínas membranares.

Uma importante característica de um domínio monomérico discreto é a sua capacidade para se enrolar independentemente ou com alguma assistência limitada. A assistência limitada pode incluir assistência de uma chaperonina(s) (e. g., uma proteína associada a receptor (RAP)). A presença de um ião(iões) metálico (s) também oferece assistência limitada. A capacidade para se enrolar independentemente previne o enrolamento incorrecto do domínio quando é inserido dentro de um novo ambiente proteico. Esta característica tem permitido que os domínios monoméricos discretos sejam evolucionariamente móveis. Como resultado, os domínios discretos propagaram-se durante a evolução e, agora, ocorrem em proteínas de outro modo não relacionadas. Alguns domínios, incluindo os domínios de fibronectina de tipo III e o domínio semelhante a imunoglobina, ocorrem em numerosas proteínas, enquanto outros domínios apenas se verificam num número limitado de proteínas. 1 numa

As proteínas que contêm estes domínios estão envolvidas variedade de processos, tais como transportadores celulares, movimento de colesterol, funções de transdução de sinal e sinalização que estão envolvidas no desenvolvimento e neurotransmissão. Ver Herz, Lipoprotein receptors: beacons to neurons?, (2001) Trends in Neurosciences 24(4):193-195; Goldstein e Brown, The Cholesterol Quartet, (2001) Science 292: 1310-1312. A função de um domínio monomérico discreto é, frequentemente, específica mas também contribui para a actividade global da proteína ou polipéptido. Por exemplo, o domínio do receptor de LDL de classe A (também referido como um módulo de classe A, uma repetição do tipo complemento ou um domínio A) está envolvido na ligação de ligando, enquanto o domínio do ácido gama-carboxiglutâmico (Gla), que se encontra nas proteínas de coagulação do sangue dependentes de vitamina K, está envolvido na ligação de elevada afinidade a membranas fosfolipídicas. Outros domínios monoméricos discretos incluem, e. g., o domínio semelhante ao factor de crescimento epidérmico (EGF) no activador do plasminogénio de tipo tecidular, que medeia a ligação a células hepáticas e, desse modo, regula a depuração desta enzima fibrinolítica da circulação e a cauda citoplasmática do receptor de LDL que está envolvido na endocitose mediada por receptor.

Proteínas individuais podem possuir um ou mais domínios monoméricos discretos. Estas proteínas são, frequentemente, denominadas proteínas mosaico. Por exemplo, os membros da família do receptor de LDL contêm quatro domínios estruturais principais: as repetições do domínio A ricas em cisteína, repetições semelhantes ao precursor do factor de crescimento epidérmico, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático. A família do receptor de LDL inclui membros que: 2 1) são receptores de superfície celular; 2) reconhecem ligandos extracelulares; e 3) internalizam os mesmos para degradação por lisossomas. Ver Hussain et al.f The Mammalian Low-Density Lipoprotein Receptor Family, (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:141-72. Por exemplo, alguns membros incluem receptores de lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL-R), receptor 2 de apolipoproteína E, proteína relacionada com LDLR (LRP) e megalina. Os membros da família têm as seguintes características: 1) expressão de superfície celular; 2) ligação de ligando extracelular consistindo em repetições de domínio A; 3) requisito de cálcio para ligação de ligando; 4) reconhecimento de proteína associada a receptor e apolipoproteína (apo) E; 5) domínio de homologia do precursor do factor de crescimento epidérmico (EGF) contendo repetições YWTD; 6) região abrangendo membrana única; e 7) endocitose mediada por receptor de diversos ligandos. Ver Hussain, supra. Contudo, os membros ligam-se a diversos ligandos estruturalmente dissemelhantes. É vantajoso desenvolver métodos para a geração e optimização das propriedades desejadas destes domínios monoméricos discretos. Contudo, os domínios monoméricos discretos, embora sendo, frequentemente, estruturalmente conservados, não são conservados ao nível nucleotídico ou de aminoácido, à excepção de determinados aminoácidos, e. g., os resíduos de cisteína no domínio A. Deste modo, os métodos de recombinação nucleotídica existentes são insatisfatórios na geração e optimização das propriedades desejadas destes domínios monoméricos discretos. A presente invenção debruça-se sobre estes e outros problemas. 3

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método para identificação de um multimero que se liga a uma molécula alvo, compreendendo o método, (a) proporcionar uma biblioteca de polipéptidos, compreendendo os polipéptidos diferentes dominios monoméricos, em que cada dominio monomérico tem 30-100 aminoácidos, compreende, pelo menos, duas ligações dissulfureto e é um dominio do receptor de LDL de classe A; (b) rastrear a biblioteca de polipéptidos para afinidade para uma molécula alvo; (c) identificar, pelo menos, um primeiro polipéptido compreendendo um primeiro dominio monomérico que se liga especificamente a uma molécula alvo; (d) ligar o primeiro domínio monomérico a uma pluralidade de domínios monoméricos diferentes, para formar uma biblioteca de diferentes multímeros, compreendendo os multímeros o primeiro domínio monomérico e um da pluralidade de domínios monoméricos diferentes; (e) rastrear a biblioteca de multímeros para a capacidade para se ligarem à molécula alvo; e (f) identificar um multimero que se liga especificamente à molécula alvo, em que o multimero compreende o primeiro domínio monomérico e um segundo domínio monomérico.

Em algumas formas de realização, pelo menos três domínios monoméricos ligam-se à mesma molécula alvo. São aqui, adicionalmente, descritos métodos compreendendo uma etapa adicional de mutação de, pelo menos, um domínio 4 monomérico proporcionando, desse modo, uma biblioteca compreendendo domínios monoméricos mutados. A etapa de mutação pode compreender a recombinação de uma pluralidade de fragmentos polinucleotidicos de, pelo menos, um polinucleótido codificando um domínio monomérico. A etapa de mutação pode compreender evolução dirigida. A etapa de mutação pode compreender mutagénese dirigida pontual. São aqui, adicionalmente, descritos métodos que compreendem: rastrear a biblioteca de domínios monoméricos para afinidade para uma segunda molécula alvo; identificar um domínio monomérico que se liga a uma segunda molécula alvo; ligar, pelo menos, um domínio monomérico com afinidade para a primeira molécula alvo com, pelo menos, um domínio monomérico com afinidade para a segunda molécula alvo formando, desse modo, uma biblioteca de multímeros; rastrear a biblioteca de multimeros para a capacidade para se ligarem à primeira e segunda moléculas alvo; e identificar um multímero que se liga à primeira e segunda moléculas alvo identificando, desse modo, um multímero que se liga especificamente a uma primeira e uma segunda molécula alvo.

Determinados métodos aqui descritos compreendem, adicionalmente: proporcionar uma segunda biblioteca de domínios monoméricos; rastrear a segunda biblioteca de domínios monoméricos para afinidade para, pelo menos, uma segunda molécula alvo; identificar um segundo domínio monomérico que se liga à segunda molécula alvo; ligar os domínios monoméricos identificados que se ligam à primeira molécula alvo ou à segunda molécula alvo formando, desse modo, uma biblioteca de multímeros; rastrear a biblioteca de multímeros para a capacidade para se ligarem à primeira e segunda moléculas alvo; 5 e identificar um multimero que se liga à primeira e segunda moléculas alvo. A molécula alvo pode ser seleccionada do grupo consistindo num antigénio virai, um antigénio bacteriano, um antigénio fúngico, uma enzima, uma proteína de superfície celular, um inibidor enzimático, uma molécula repórter e um receptor. 0 antigénio virai pode ser um polipéptido requerido para replicação virai. A primeira e, pelo menos, segunda moléculas alvo podem ser componentes diferentes do mesmo sistema de replicação virai. 0 multimero seleccionado pode ligar-se a, pelo menos, dois serotipos do mesmo vírus.

Em algumas formas de realização, a biblioteca de multímeros é expressa como uma apresentação fágica, apresentação ribossómica ou apresentação de superfície celular.

Em algumas formas de realização, os domínios monoméricos são ligados por um ligante polipeptídico. Como aqui se descreve, o ligante polipeptídico pode ser um ligante naturalmente associado com o domínio monomérico. Em algumas formas de realização, o ligante polipeptídico é uma variante de um ligante naturalmente associado com o domínio monomérico. A etapa de ligação pode compreender a ligação dos domínios monoméricos com uma variedade de ligantes de comprimentos e composição diferentes. A presente invenção também proporciona polipéptidos compreendendo os multímeros seleccionados como anteriormente descrito. 6 A presente invenção também proporciona polinucleótidos codificando os multímeros seleccionados como anteriormente descrito. A presente invenção também proporciona bibliotecas de multímeros formados com anteriormente descrito. A presente invenção também proporciona métodos para identificação de um multímero que se liga a, pelo menos, uma molécula alvo, compreendendo as etapas de: proporcionar uma biblioteca de multímeros, em que cada multímero compreende, pelo menos, dois domínios monoméricos e em que cada domínio monomérico compreende, pelo menos, duas ligações dissulfureto, tem 30-100 aminoácidos, é um domínio do receptor de LDL de classe A e os domínios monoméricos são separados por um ligante heterólogo; e rastrear a biblioteca de multímeros para multímeros ligando-se a molécula alvo. Em algumas formas de realização, os métodos compreendem, adicionalmente, a identificação de multímeros ligando-se a molécula alvo, tendo uma avidez para a molécula alvo que é superior à avidez de um único domínio monomérico para a molécula alvo. Em algumas formas de realização um ou mais dos multímeros compreende um domínio monomérico que se liga especificamente a uma segunda molécula alvo. A presente invenção também proporciona bibliotecas de multímeros. Em algumas formas de realização, cada multímero compreende, pelo menos, dois domínios monoméricos juntos por um ligante; cada domínio monomérico exibe uma especificidade de ligação para uma molécula alvo; e cada domínio monomérico é um domínio monomérico de ocorrência não natural. 7 A presente invenção também proporciona polipéptidos compreendendo, pelo menos, dois domínios monoméricos separados por uma sequência ligante heteróloga. Em algumas formas de realização, cada domínio monomérico liga-se especificamente a uma molécula alvo; e cada domínio monomérico é um domínio monomérico proteico de ocorrência não natural. São aqui adicionalmente descritos polipéptidos compreendendo um primeiro domínio monomérico que se liga a uma primeira molécula alvo e um segundo domínio monomérico que se liga a uma segunda molécula alvo. Os polipéptidos podem compreender dois domínios monoméricos, tendo cada domínio monomérico uma especificidade de ligação que é específica para um sítio diferente na mesma molécula alvo. Os polipéptidos podem adicionalmente compreender um domínio monomérico tendo uma especificidade de ligação para uma segunda molécula alvo.

Como aqui adicionalmente descrito, os domínios monoméricos de uma biblioteca, multímero ou polipéptido podem ser, pelo menos, 70% idênticos.

DEFINIÇÕES

Salvo indicação em contrário, as seguintes definições suplantam aquelas na técnica. O termo "domínio monomérico" ou "monómero" é aqui utilizado indiscriminadamente para se referir a uma região discreta encontrada numa proteína ou polipéptido. Na ausência de sequências de aminoácidos flanqueantes nativas, um domínio monomérico forma uma estrutura tridimensional nativa em solução.

Os domínios monoméricos da invenção irão ligar-se especificamente a uma molécula alvo. Por exemplo, um polipéptido que forma uma estrutura tridimensional que se liga a uma molécula alvo é um domínio monomérico. Como aqui utilizado, o termo "domínio monomérico" não abrange a região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo. 0 termo "variante de domínio monomérico" refere-se a um domínio resultando de manipulação humana de uma sequência de domínio monomérico. Exemplos de alterações manipuladas pelo homem incluem, e. g., mutagénese aleatória, mutagénese específica pontual, rearranjo, evolução dirigida, etc. 0 termo "variante de domínio monomérico" não engloba uma região determinante de complementaridade (CDR) mutagenizada de um anticorpo. 0 termo "multímero" é aqui utilizado para indicar um polipéptido compreendendo, pelo menos, dois domínios monoméricos e/ou domínios imunitários (e. g., pelo menos, dois domínios monoméricos, pelo menos, dois domínios imunitários ou, pelo menos, um domínio monomérico e, pelo menos, um domínio imunitário). Os domínios monoméricos e/ou domínios imunitários separados num multímero podem ser unidos entre si por um ligante. Um multímero também é conhecido como uma proteína mosaico combinatória ou uma proteína mosaico recombinante. 0 termo "ligando", também aqui referido como a "molécula alvo", abrange uma ampla variedade de substâncias e moléculas que vai desde moléculas simples até alvos complexos. As moléculas alvo podem ser proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono ou qualquer outra molécula capaz de reconhecimento por um domínio polipeptídico. Por exemplo, uma 9 molécula alvo pode incluir um composto químico (i. e., composto não biológico, tal como, e. g., uma molécula orgânica, uma molécula inorgânica ou uma molécula tendo átomos orgânicos e inorgânicos, mas excluindo polinucleótidos e proteínas), uma mistura de compostos químicos, uma matriz de compostos espacialmente localizados, uma macromolécula biológica, uma biblioteca de apresentação peptídica de bacteriófago, uma biblioteca de apresentação peptídica polissomal, um extracto preparado a partir de materiais biológicos, tais como bactérias, plantas, fungos ou células ou tecido animais (e. g., mamíferos), uma proteína, uma toxina, uma hormona peptídica, uma célula, um vírus ou semelhantes. Outras moléculas alvo incluem, e. g., uma célula intacta, um tecido intacto, uma mistura de proteínas relacionadas ou não relacionadas, uma mistura de vírus ou estirpes bacterianas ou semelhantes. As moléculas alvo também podem ser definidas por inclusão em ensaios de rastreio aqui descritos ou por melhoramento ou inibição de uma interacção de proteína específica (i. e., um agente que inibe selectivamente uma interacção de ligação entre dois polipéptidos predeterminados).

Como aqui utilizado, o termo "domínios imunitários" refere-se a domínios de ligação de proteína que contêm, pelo menos, uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo. Os domínios imunitários podem ser domínios imunológicos de ocorrência natural (i. e., isolados da natureza) ou podem ser domínios imunológicos de ocorrência não natural que foram alterados por manipulação humana (e. g., por meio de métodos de mutagénese, tais como, por exemplo, mutagénese aleatória, mutagénese específica pontual e semelhantes, assim como por métodos de evolução dirigida, tais como, por exemplo, PCR propenso a erros recursivo, recombinação recursiva e 10 semelhantes). Os diferentes tipos de dominios imunitários que são adequados para utilização na prática da presente invenção incluem um minicorpo, um anticorpo de domínio único, um fragmento variável de cadeia única (ScFv) e um fragmento Fab. 0 termo "minicorpo" refere-se aqui a um polipéptido que codifica apenas 2 regiões determinantes de complementaridade (CDR) de um domínio variável de cadeia pesada ou domínio variável de cadeia leve, de ocorrência natural ou não natural (e. g., mutagenizado) ou sua combinação. Um exemplo de um minicorpo é descrito por Pessi et al., A designed metal-binding protein with a novel fold, (1993) Nature 362:367-369. Um multímero de minicorpos é esquematicamente ilustrado na

Figura 11A. Os círculos representam minicorpos e as linhas a cheio representam as fracções ligantes unindo os domínios imunitários entre si.

Como aqui utilizado, o termo "anticorpo de domínio único" refere-se ao domínio variável de cadeia pesada ("VH") de um anticorpo, i. e., um domínio variável de cadeia pesada sem um domínio variável de cadeia leve. Anticorpos de domínio único exemplificativos, empregues na prática da presente invenção incluem, por exemplo, o domínio variável de cadeia pesada Camelídeo (cerca de 118 a 136 resíduos de aminoácidos), como descrito em Hamers-Casterman, C. et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains (1993) Nature 363:446-448 e Dumoulin, et al. , Single-domain antibody fragments with high conformational stability (2002) Protein Science 11:500-515. Um multímero de anticorpos de domínio único é representado na Figura 11B. As elipses representam os anticorpos de domínio único e as linhas a cheio representam as fracções ligantes unindo os anticorpos de domínio único entre si. 11

Os termos "fragmento variável de cadeia única" ou "ScFv" são aqui utilizados indiscriminadamente para referir domínios variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpo que são unidos por um ligante peptídico tendo, pelo menos, 12 resíduos de aminoácidos. Os fragmentos variáveis de cadeia única contemplados para utilização na prática da presente invenção incluem aqueles descritos em Bird, et ai., Single-chain antigen-binding proteins (1988) Science 242(4877):423-426 e

Huston et al., Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli (1988,) Proc Natl Acad Sei USA 85(16):5879-83. Um multímero de fragmentos variáveis de cadeia única é ilustrado na Figura 11C. As linhas a tracejado representam o ligante peptídico unindo os domínios variáveis de cadeia pesada e leve entre si. As linhas a cheio representam as fraeções ligantes unindo os domínios variáveis de cadeia pesada entre si.

Como aqui utilizado, o termo "fragmento Fab" refere-se a um domínio imunitário que tem duas cadeias de proteína, uma das quais é uma cadeia leve consistindo em dois domínios de cadeia leve (domínio variável VL e domínio constante CL) e uma cadeia pesada consistindo em dois domínios pesados (i. e., um domínio variável VH e um constante CH) · Os fragmentos Fab empregues na prática da presente invenção incluem aqueles que têm uma ligação dissulfureto intercadeia na extremidade C de cada componente pesado e leve, assim como aqueles que não têm uma tal ligação dissulfureto C-terminal. Cada fragmento tem cerca de 47 kD. Os fragmentos Fab são descritos por Pluckthun e Skerra, Expression of functional antibody Fv and Fab fragments in Escherichia col (1989) Methods Enzymol 178:497-515. Um multímero de fragmentos Fab é representado na Figura 11D. As elipses a branco 12 representam o componente de cadeia pesada do fragmento Fab, as elipses a cheio representam o componente de cadeia leve do Fab. 0 termo "ligante" é aqui utilizado para indicar uma fracção ou grupo de fracções que une ou junta dois ou mais domínios monoméricos separados discretos. 0 ligante permite que os domínios monoméricos separados discretos permaneçam separados quando unidos entre si num multímero. A fracção ligante é, tipicamente, uma fracção substancialmente linear. Ligantes adequados incluem polipéptidos, ácidos polinucleicos, ácidos nucleicos peptídicos e semelhantes. Os ligantes adequados também incluem fracções alquileno, opcionalmente substituídas, que têm um ou mais átomos de oxigénio incorporados na estrutura de carbono. Tipicamente, o peso molecular do ligante é inferior a cerca de 2000 daltons. Mais tipicamente, o peso molecular do ligante é inferior a cerca de 1500 daltons e, habitualmente, é inferior a cerca de 1000 daltons. O ligante pode ser pequeno o suficiente, para permitir que os domínios monoméricos separados discretos cooperem, e. g., onde cada um dos domínios monoméricos separados discretos num multímero se liga à mesma molécula alvo, por meio de sítios de ligação separados. Ligantes exemplificativos incluem um polinucleótido codificando um polipéptido ou um polipéptido de aminoácidos ou outras fracções de ocorrência não natural. O ligante pode ser uma porção de uma sequência nativa, um seu variante ou uma sequência sintética. Os ligantes podem compreender, e. g., aminoácidos de ocorrência natural, de ocorrência não natural ou uma combinação de ambos. O termo "separado" é aqui utilizado para indicar uma propriedade de uma fracção que é independente e permanece independente, mesmo quando complexada com outras fracções, incluindo por exemplo, outros domínios monoméricos. Um domínio 13 monomérico é um domínio separado numa proteína, em virtude de ter uma propriedade independente que pode ser reconhecida e separada da proteína. Por exemplo, a capacidade de ligação do ligando do domínio A na LDLR é uma propriedade independente. Outros exemplos de separado incluem os domínios monoméricos separados num multímero que permanecem domínios independentes separados, mesmo quando complexados ou unidos entre si no multímero por um ligante. Outro exemplo de uma propriedade separada são os sítios de ligação separados num multímero para um ligando.

Como aqui utilizado, "evolução dirigida" refere- se a um processo pelo qual variantes polinucleotídicos sao gerados, expressos e rastreados para uma actividade (e. g-, um polipéptido com actividade de ligação) num processo recursivo. São seleccionados um ou mais candidatos no rastreio e o processo é, depois, repetido utilizando polinucleótidos que codificam os candidatos seleccionados, para gerar novos variantes. A evolução dirigida envolve, pelo menos, duas séries de geração de variação e pode incluir 3, 4, 5, 10, 20 ou mais séries de geração de variação e selecção. A variação pode ser gerada por qualquer método conhecido dos especialistas na técnica, incluindo, e. g., por PCR propenso a erros, rearranjo génico, mutagénese química e semelhantes. O termo ''rearranjo" é aqui utilizado para indicar recombinação entre sequências não idênticas. Em algumas formas de realização, o rearranjo pode incluir entrecruzamento por meio de recombinação homóloga ou por meio de recombinação não homóloga, tal como por meio de sistemas cre/lox e/ou flp/frt. O rearranjo pode ser efectuado através do emprego de uma variedade de formatos diferentes, incluindo por exemplo, formatos de 14 rearranjo in vitro e in vivo, formatos de rearranjo in silico, formatos de rearranjo que utilizam moldes de cadeia dupla ou de cadeia simples, formatos de rearranjo baseados em iniciadores, formatos de rearranjo baseados em fragmentação de ácido nucleico e formatos de rearranjo mediados em oligonucleótidos, todos eles são baseados em eventos de recombinação entre sequências não idênticas e são aqui descritos em maior detalhe ou referenciados abaixo, assim como outros formatos baseados em recombinação semelhantes. 0 termo "aleatório", como aqui utilizado, refere-se a uma sequência polinucleotidica ou uma sequência de aminoácidos composta por dois ou mais aminoácidos e construída por um processo estocástico ou aleatório. A sequência polinucleotidica ou sequência de aminoácidos aleatória pode incluir motivos de estrutura ou armação que podem compreender sequências invariantes. 0 termo "pseudoaleatório", como aqui utilizado, refere-se a um conjunto de sequências, polinucleotídicas ou polipeptídicas, que têm variabilidade limitada, de modo que o grau de variabilidade de resíduo em algumas posições seja limitado, mas qualquer posição pseudoaleatória seja permitida, pelo menos, algum grau de variação de resíduo.

Os termos "polipéptido" "péptido" e "proteína" são aqui utilizados indiscriminadamente para referir uma sequência de aminoácidos de dois ou mais aminoácidos. "Substituição conservativa de aminoácidos" refere-se à permutabilidade de resíduos tendo cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais 15 alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas-hidroxilo é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteina e metionina. Grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina. A expressão "sequência de ácido nucleico" refere-se a um polímero de cadeia simples ou dupla de bases desoxirribonucleotídicas ou ribonucleotídicas, lidas da extremidade 5' paa a 3'. Inclui ADN cromossómico, plasmídeos auto-replicáveis e ADN ou ARN que desempenha um papel principalmente estrutural. 0 termo "codificando" refere-se a uma sequência polinucleotídica codificando um ou mais aminoácidos. 0 termo não requer um codão de iniciação ou terminação. Uma sequência de aminoácidos pode ser codificada em qualquer uma de seis fases de leitura diferentes proporcionadas por uma sequência polinucleotídica. 0 termo "promotor" refere-se a regiões ou sequência localizadas a montante e/ou jusante da iniciação de transcrição que estão envolvidas no reconhecimento e ligação de ARN polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. 16

Um "vector" refere-se a um polinucleótido que, quando independente do cromossoma hospedeiro, é capaz de replicação num organismo hospedeiro. Exemplos de vectores incluem plasmídeos. Os vectores tipicamente têm uma origem de replicação. Os vectores podem compreender, e. g., terminadores de transcrição e tradução, sequências de iniciação de transcrição e tradução e promotores úteis para regulação da expressão do particular ácido nucleico. 0 termo "recombinante", quando utilizado com referência, e. g., a uma célula ou ácido nucleico, proteína ou vector, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vector, foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heterólogo ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativo, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Deste modo, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não se verificam dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outro modo expressos anormalmente, subexpressos ou não expressos de modo algum. A expressão "liga-se especificamente (ou selectivamente)" a um polipéptido, quando fazendo referência a um monómero ou multimero, refere-se a uma reacção de ligação que pode ser determinativa da presença do polipéptido numa população heterogénea de proteínas e outros biológicos. Deste modo, sob condições ou ensaios padrão utilizados em ensaios de ligação de anticorpos, o monómero ou multimero especificado liga-se a uma particular molécula alvo acima do fundo (e. g., 2X, 5X, 10X ou mais acima do fundo) e não se liga, numa quantidade significativa, a outras moléculas presentes na amostra. 17

Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptidicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais. "Substancialmente idêntico" refere-se a duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptidicas tendo uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleótidos que são iguais (i. e., 60% de identidade, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade ao longo de uma região especificada ou, quando não especificada, ao longo de toda a sequência) , quando comparada e alinhada para máxima correspondência ao longo de uma janela de comparação ou região designada, como medida utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por alinhamento manual e inspecção visual. Opcionalmente, a identidade ou identidade substancial existe ao longo de uma região que tem, pelo menos, cerca de 50 nucleótidos em comprimento ou, de um modo mais preferido, ao longo de uma região que tem 100 a 500 ou 1000 ou mais nucleótidos ou aminoácidos em comprimento. O termo "ligante heterólogo", quando utilizado em referência a um multímero, indica que o multímero compreende um ligante e um monómero que não se encontram na mesma relação entre si na natureza (e. g., formam uma proteína de fusão).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra esquematicamente o tipo, número e ordem de domínios monoméricos verificados em membros da família do receptor de LDL. Estes domínios monoméricos incluem domínios de Hélice β, domínios semelhantes a EGF e domínios do receptor de 18 LDL de classe A. Os membros mostrados incluem o receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR), Receptor 2 de ApoE (ApoER2), receptor de lipoproteína de densidade muito baixa (VLDLR), proteína 2 relacionada com LDLR (LRP2) e proteína relacionada com LDLR (LRP1). A Figura 2 ilustra esquematicamente o alinhamento de sequência parcial de aminoácidos de uma variedade dos domínios do receptor de LDL de classe A que incluem duas sequências LRP1 humanas, duas sequências LRP2 humanas, duas sequências LDLR humanas, duas sequências LDVR humanas, uma sequência LRP3 humana, uma sequência MAT humana, uma sequência C06 humana e uma sequência SORL humana, para demonstrar as cisteínas conservadas. A Figura 3, painel A, ilustra esquematicamente um exemplo de um domínio A. 0 painel A ilustra esquematicamente aminoácidos conservados num domínio A de cerca de 40 aminoácidos de comprimento. Os resíduos de cisteína conservados são indicados por C e os aminoácidos carregados negativamente são indicados por um círculo com um sinal menos . Os círculos com um "H" indicam resíduos hidrófobos. O painel B ilustra esquematicamente dois domínios A enrolados, juntos por meio de um ligante. O painel B também indica dois sítios de ligação de cálcio, os círculos a escuro com Ca+2 e três ligações dissulfureto dentro de cada domínio A enrolado, para um total de 6 ligações dissulfureto. A Figura 4 indica alguns dos ligandos reconhecidos pela família do receptor de LDL, que inclui inibidores, proteases, complexos de protease, complexos de transporte de vitamina, proteínas envolvidas no metabolismo da lipoproteína, ligandos não humanos, antibióticos, vírus e outros. 19 A Figura 5 ilustra esquematicamente um esquema geral para identificação de domínios monoméricos que se ligam a um ligando, isolando os domínios monoméricos seleccionados, criando multímeros dos domínios monoméricos seleccionados através da união dos domínios monoméricos seleccionados em diversas combinações e rastreio dos multímeros, para identificar multímeros compreendendo mais de um monómero que se liga a um ligando. A Figura 6 é uma representação esquemática de outra estratégia de selecção (selecção guiada). Um domínio monomérico com propriedades de ligação apropriadas é identificado a partir de uma biblioteca de domínios monoméricos. 0 domínio monomérico identificado é, depois, ligado a domínios monoméricos de outra biblioteca de domínios monoméricos, para formar uma biblioteca de multímeros. A biblioteca de multímeros é rastreada para identificar um par de domínios monoméricos que se ligam simultaneamente ao alvo. Este processo pode, depois, ser repetido até que as propriedades de ligação óptimas sejam obtidas no multímero. A Figura 7 mostra o processo de multimerização de domínios monoméricos. Os acertos de monómeros ligando-se ao alvo são amplificados a partir de um vector. Esta mistura de domínios monoméricos e/ou domínios imunitários ligando-se ao alvo é, depois, clivada e misturada com uma combinação óptima de ligante e oligonucleótidos de terminação. Os multímeros que são gerados são, depois, clonados dentro de um vector adequado para a segunda etapa de selecção para identificação de multímeros ligando-se ao alvo. 20 A Figura 8 representa aminoácidos comuns em cada posição do domínio A. As percentagens por cima das posições de aminoácidos referem-se à percentagem de domínios A de ocorrência natural, com o espaçamento intercisteína exibido. Potenciais resíduos de aminoácidos em negrito, representados por baixo de cada posição de aminoácido, representam resíduos comuns nessa posição. Os seis aminoácidos finais, representados como círculos de cor mais clara, representam sequências ligantes. As duas colunas de resíduos de aminoácidos em itálico nas posições 2 e 3 do ligante, representam resíduos de aminoácidos que não ocorrem nessa posição. Qualquer outro aminoácido (e. g., A, D, E, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T e V) pode ser incluído nestas posições. A Figura 9 exibe a frequência de ocorrência de resíduos de aminoácidos nos domínios A de ocorrência natural para domínios A com o seguinte espaçamento entre cisteínas: CX6CX4CX6CX5CX8C. A Figura 10 representa um alinhamento de domínios A. No topo e no fundo da figura, letras pequenas (a-q) indicam resíduos conservados. Os aminoácidos predominantes nestas posições e a percentagem de tempo que foram observados em domínios A nativos são ilustrados no fundo da figura. A Figura 11 representa possíveis conformações multiméricas compreendidas de domínios imunitários. A Figura 11A ilustra um multímero de minicorpos. A Figura 11B ilustra um multímero de anticorpos de domínio único. A Figura 11C ilustra um multímero de domínio imunitário de scfvs. A Figura 11D ilustra um multímero de fragmentos Fab. 21 A Figura 12 representa a ligaçao de domínios por meio de ligantes parciais. A Figura 13 ilustra formações de anel de multímero exemplificativas. A Figura 14 ilustra diversas conformações de multímero de cadeias pesadas e leves de Fvs.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção proporciona uma abordagem melhorada para selecção e optimização de propriedades de domínios monoméricos do receptor de LDL de classe A discretos, para criar multímeros. Em particular, esta divulgação descreve métodos, composições e kits para identificação de domínios monoméricos do receptor de LDL de classe A discretos que se ligam a um ligando desejado ou mistura de ligandos, e criação de multímeros (também conhecidos como proteínas mosaico combinatórias ou proteínas mosaico recombinantes) que compreendem dois ou mais domínios monoméricos e/ou domínios imunitários que são unidos por meio de um ligante. Os multímeros podem ser rastreados para identificar aqueles que têm um fenótipo melhorado, tal como avidez ou afinidade melhorada ou especificidade alterada para o ligando ou a mistura de ligandos, comparada ao domínio monomérico discreto. 22 1. Domínios Monoméricos Discretos

Os domínios monoméricos podem ser cadeias polipeptídicas com cerca de 30 a cerca de 100 aminoácidos. De modo semelhante, um domínio monomérico da presente invenção compreende 30 a cerca de 100 aminoácidos. Os domínios monoméricos e domínios imunitários podem manter uma conformação estável em solução. A conformação estável contém ligações dissulfureto (e. g., pelo menos, duas ou três ou mais ligações dissulfureto) . As ligações dissulfureto podem ser, opcionalmente, formadas entre dois resíduos de cisteína.

As publicações descrevendo domínios monoméricos e proteínas mosaico e referências aí citadas incluem as seguintes: Hegyi, H e Bork, P., On the classification and evolution of protein modules, (1997) J. Protein Chem., 16 (5):545-551; Baron et al., Protein modules (1991) Trends Biochem. Sei., 16(1) :13 — 7; Ponting et al., Evolution of domain families, (2000), Adv. Protein Chem., 54:185-244; Doolittle, The multiplicity of domains in proteins, (1995) Annu. Rev. Biochem 64:287-314; Doolitte e Bork, Evolutionarily mobile modules in proteins (1993) Scientific American, 269 (4):50—6; e Bork, Shuffled domains in extracellular proteins (1991), FEBS letters 286(1-2):47-54. Os domínios monoméricos da presente invenção também incluem aqueles domínios verificados na base de dados Pfam e na base de dados SMART. Ver Schultz, et al., SMART: a web~based tool for the study of genetically mobile domains, (2000) Nucleic Acid Res. 28 (1) : 231-34.

Os domínios monoméricos adequados para utilização na prática da presente invenção são o domínio do receptor de LDL de classe A. A Figura 1 representa em diagrama de modo esquemático 23 diversos géneros de domínios monoméricos encontrados em moléculas na família do receptor de LDL.

Outras características de domínios monoméricos incluem a capacidade para ligar ligandos (e. g., como no domínio do receptor de LDL de classe A, a capacidade para ligar um ião (e. g. , ligação de Ca2+ pelo domínio A do receptor de LDL).

As características de um domínio monomérico incluem a capacidade para se enrolar independentemente e a capacidade para formar uma estrutura estável. Deste modo, a estrutura do domínio monomérico é, frequentemente, conservada, embora a sequência polinucleotídica codificando o monómero não necessite de ser conservada. Por exemplo, a estrutura do domínio A é conservada entre os membros da família do domínio A, enquanto a sequência de ácido nucleico do domínio A não é. Deste modo, por exemplo, um domínio monomérico é classificado como um domínio A pelos seus resíduos de cisteína e sua afinidade para cálcio, não necessariamente pela sua sequência de ácido nucleico. Ver a Figura 2 .

Especificamente, os domínios A (por vezes denominados "repetições do tipo complemento") contêm cerca de 30-50 aminoácidos. Em algumas formas de realização, os domínios compreendem cerca de 35-45 aminoácidos e, em alguns casos, cerca de 40 aminoácidos. Dentro dos 30-50 aminoácidos, há cerca de 6 resíduos de cisteína. Das seis cisteínas, as ligações dissulfureto verificam-se tipicamente entre as seguintes cisteínas: Cl e C3, C2 e C5, C4 e C6. O domínio A constitui uma fracção de ligação de ligando. Os resíduos de cisteína do domínio são ligados por dissulfureto, para formar uma fracção compacta, estável, funcionalmente independente. Ver a Figura 3.

Os aglomerados destas repetições constituem um domínio de ligação de ligando e a aglomeração diferencial pode conferir especificidade em relação à ligação de ligando.

Sequências de domínio A exemplificativas e sequências consenso são representadas nas Figuras 2, 3 e 8. A Figura 9 exibe a localização e ocorrência de resíduos em domínios A, com o seguinte espaçamento entre cisteínas. Adicionalmente, a Figura 10 representa um determinado número de domínios A e proporciona uma listagem de aminoácidos conservados. Uma sequência consenso típica, útil para identificar domínios A é a seguinte: C- [VILMA] -X(5)-C- [DNH] -X(3)- [DENQHT] -C-X(3,4)- [STADE] - [DEH] - [DE] -X(i,5)-C, onde os resíduos entre parêntesis indicam possíveis resíduos numa posição. "X(#>" indica o número de resíduos. Estes resíduos podem ser qualquer resíduo de aminoácido. Os parentéticos contendo dois números referem-se à gama de aminoácidos que podem ocupar essa posição (e. g., "[DE]- X(i,5)-C" significa que os aminoácidos DE são seguidos de 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos, seguidos de C). Esta sequência consenso representa apenas a porção do domínio A começando na terceira cisteína. Um segundo consenso é como se segue: C-X(3-i5)-C-X(4-i5>-C-X(6_7)-C- [N,D]-X(3)-[D,E,N,Q,H,S,T] —C—X(4,6)—D—E—X(2-8)-C. 0 segundo consenso prevê resíduos de aminoácidos abarcando todos os seis resíduos de cisteína. Em algumas formas de realização, os variantes de domínio A compreendem sequências substancialmente idênticas a qualquer das sequências anteriormente descritas.

Até à data estão identificados, pelo menos, 190 domínios A humanos, com base em sequências de ADNc. Ver, e. g., a

Figura 10. Proteínas exemplificativas contendo domínios A incluem, e. g. , componentes do complemento (e. g., C6, C7, C8, C9 e Factor I), proteases de serina (e. g., enteropeptidase, 25 matriptase e corina), proteínas transmembranares (e. g., ST7, LRP3, LRP5 e LRP6) e receptores endocíticos (e. g. , receptor relacionado com Sortilina, receptor de LDL, VLDLR, LRP1, LRP2 e ApoER2). Os domínios A e variantes de domínios A podem ser facilmente empregues na prática da presente invenção como domínios monoméricos e seus variantes. Descrição adicional de domínios A pode consultar-se nas seguintes publicações e referências aí citadas: Howell e Hertz, The LDL receptor gene family: signaling functions during development, (2001) Current Opinion in Neurobiology 11:74-81; Herz (2001), supra; Krieger,

The "best" of cholesterols, the "worst" of cholesterols: A tale of two receptors, (1998) PNAS 95: 4077-4080; Goldstein e Brown,

The Cholesterol Quartet, (2001) Science, 292: 1310-1312; e

Moestrup e Verroust, Megalin-and Cubilin-Mediated Endocytosis of Protein-Bound Vitamins, Lípide, and Hormones in Polarized

Epithelia, (2001) Ann. Rev. Nutr. 21:407-28.

As descrições de alguns domínios monoméricos adicionais podem consultar-se nas seguintes publicações e nas referências ai citadas: Yamazaki et al., Elements of Neural Adhesion Molecules and a Yeast Vacuolar Protein Sorting Receptor are

Present in a Novel Mammalian Low Density Lipoprotein Receptor Family Member, (1996) Journal of Biological Chemistry 271(40) 24761-24768; Nakayama et al., Identification of

High-Molecular-Weight Proteins with Multiple EGF-like Motifs by Motif-Trap Screening, (1998) Genomics 51:27-34; Liu et al., Genomic Organization of New Candidate Tumor Suppressor Gene, LRPlB, (2000) Genomics 69:271-274; Liu et al., The Putative

Tumor Suppressor LRPlB, a Novel Member of the Low Density Lipoprotein (LDL) Receptor Family, Exhibits Both Overlapping and Distinct Properties with the LDL Receptor-related Protein, (2001) Journal of Biological Chemistry 276(31):28889-28896; 26

Ishii et al., cDNA of a New Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein and Mapping of its Gene (LRP3) to Chromosome Bands 19ql2-ql3.2, (1998) Genomics 51:132-135; Orlando et al., Identification of the second cluster of ligand binding repeats in megalin as a site for receptor-ligand interactions, (1997) PNAS USA 94:2368-2373; Jeon e Shipley, Vesicle-reconstituted Low Density Lipoprotein Receptor, (2000) Journal of Biological Chemistry 275(39):30458-30464; Simmons et al., Human Low Density Lipoprotein Receptor Fragment, (1997) Journal of Biological Chemistry 272(41):25531-25536; Fass et al., Molecular Basis of familial hypercholesterolaemia from structure of LDL receptor module, (1997) Nature 388:691-93; Daly et al. , Three-dimensional structure of a cysteine-rich repeat from the low-density lipoprotein receptor, (1995) PNAS USA 92:6334-6338; North e Blacklow, Structural Independence of Ligand-Binding Modules Five and Six of the LDL Receptor, (1999) Biochemistry 38:3926-3935; North e Blacklow, Solution Structure of the Sixth LDL-A module of the LDL Receptor, (2000) Biochemistry 39:25640-2571; North e Blacklow, Evidence that Familial Hypercholesterolemia Mutations of the LDL Receptor Cause Limited Local Misfolding in an LDL-A Module Pair, (2000) Biochemistry 39:13127-13135; Beglova et al., Backbone Dynamics of a Module Pair from the Ligand-Binding Domain of the LDL Receptor, (2001) Biochemistry 40:2808-2815; Bieri et al., Folding, Calcium binding, and Structural Characterization of a Concatemer of the First and Second Ligand-Binding Modules of the Low-Density Lipoprotein Receptor, (1998) Biochemistry 3 7:10994-11002; Jeon et al., Implications for familial hypercholesterolemia from the structure of the LDL receptor YWTD-EGF domain pair, (2001) Nature Structural Biology 8 (6):499-504,- Kurniawan et al., NMR structure of a concatemer of the first and second ligand-binding modules of the human low- 27 density lipoprotein receptor, (2000) Protein Science 9:1282-1293; Esser et al., Mutational Analysis of the Ligand Binding Domain of the Low Density poprotein Receptor, (1988) Journal of Biological Chemistry 263 (26):13282-13290; Russell et al., Different Comhinations of Cysteine-rich Repeats Mediate Binding of Low Density Lipoprotein Receptor to Two Different Proteins, (1989) Journal of Biological Chemistry 264(36):21682-21688; Davis et al., Acid-dependent ligand dissociation and recycling of LDL receptor mediated by growth factor homology region, (1987) Nature 326:760-765; Rong et al., Conversion of a human low-density lipoprotein receptor ligand-binding repeat to a virus receptor: Identification of residues important for ligand specificity, (1998) PNAS USA 95:8467-8472; Agnello et al., Hepatitis C virus and other Flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor; (1999) PNAS 96(22):12766-12771; Esser e Russell, Transport-deficient Mutations in the Low Density lipoprotein receptor, (1988) Journal of Biological Chemistry 263 (26):13276-13281; Davis et al., The Low Density Lipoprotein Receptor, (1987) Journal of Biological Chemistry 262 (9):4075-4082; e Peacock et al., Human Low Density Lipoprotein Receptor Expressed in Xenopus Oocytes, (1988) Journal of Biological Chemistry 263(16):7838-7845.

Outras publicações que descrevem as proteínas VLDLR, ApoER2 e LRP1 e seus domínios monoméricos incluem as seguintes, assim como as referências aí citadas: Savonen et al., The Carboxyl-terminal Domain of Receptor-associated Protein Facilitates Proper Folding and Trafficking of the Very Low Density Lipoprotein Receptor by Interaction with the Three Amino-terminal Ligand-binding Repeats of the Receptor, (1999) Journal of Biological Chemistry 274(36):25877-25882; Hewat et al., The cellular receptor to human rhinovirus 2 binds around 28 the 5-fold axis and not in the canyon: a structural view, (2000) EMBO Journal 19 (23) :6317-6325; Okun et al. , VLDL Receptor Fragments of Different Lengths Bind to Human Rhinovirus HRV2 with Different Stoichiometry, (2001) Journal of Biological Chemistry 276 (2) :1057-1062; Rettenberger et al. , Ligand Binding Properties of the Very Low Density Lipoprotein Receptor, (1999) Journal of Biological Chemistry 274 (13) :8973-8980 ; Mikhailenko et al., Functional Domains of the very low density lipoprotein receptor: molecular analysis of ligand binding and acid-dependent ligand dissociation mechanisms, (1999) Journal of Cell Science 112:3269-3281; Brandes et al., Alternative Splicing in the Ligand Binding Domain of Mouse ApoE Receptor-2 Produces Receptor Variants Binding Reelin but not alpa2-rnacroglobulin, (2001) Journal of Biological Chemistry 276 (25) : 22160-22169; Kim et al., Exon/Intron Organization, Chromosome Localization, Alternative Splicing, and Transcription Units of the Human Apolipoprotein E Receptor 2 Gene, (1997) Journal of Biological Chemistry 272(13):8498-8504; Obermoeller-McCormick et al., Dissection of receptor folding and ligand-binding property with functional minireceptors of LDL receptor-related protein, (2001) Journal of Cell Science 114(5):899-908; Horn et al., Molecular Analysis of Ligand Binding of the Second Cluster of Complement-type Repeats of the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1997) Journal of Biological Chemistry 272(21):13608-13613; Neels et al., The Second and Fourth Cluster of Class A Cysteine-rich Repeats of the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein Share Ligand binding Properties, (1999) Journal of Biological Chemistry 274(44):31305-31311; Obermoeller et al., Differential Functions of the Triplicated Repeats Suggest Two Independent Roles for the Receptor-Associated Protein as a Molecular Chaperone, (1997) Journal of Biological Chemistry 272 (16) : 10761-10768; Andersen et al., Identification 29 of the Minimal Functional Unit in the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein for Binding the Receptor-associated Protein (RAP), (2000) Journal of Biological Chemistry 275 (28) : 21017-21024; Andersen et al., Specific Binding of alpha-Macroglobulin to Complement-Type Repeat CR4 of the Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein, (2000) Biochemistry 39:10627-10633; Vash et al., Three Complement-Type Repeats of the Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein Define a Common Binding Site for RAP, PAI-1, and Lactoferrin, (1998) Blood 92 (9):327 7-32 85; Dolmer et al., NMR Solution Structure of Complement-like Repeat CR3 from the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (2000) Journal of Biological Chemistry 275(5):3264-3269; Huang et al., NMR Solution Structure of Complement-like Repeat CR8 from the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1999) Journal of Biological Chemistry 274 (20) : 14130-14136; e Liu et al., Uptake of HIV—1 Tat protein mediated by low-density lipoprotein receptor-related protein disrupts the neuronal metabolic balance of the receptor ligands, (2000) Nature Medicine 6(12):1380-1387.

Outras referências em relação a domínios monoméricos também incluem as seguintes publicações e referências aí citadas: FitzGerald et al., Pseudomonas Exotoxin-mediated Selection Yields Cells with Altered Expression of Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein, (1995) Journal of Cell Biology, 129: 1533-41; Willnow e Herz, Genetic deficiency in low density lipoprotein receptor-related protein confers cellular resistance to Pseudomonas exotoxin A, (1994) Journal of Cell Science, 107:719-726; Trommsdorf et ai., Interaction of Cytosolic Adaptor Proteins with Neuronal Apolipoprotein E Receptors and the Amyloid Precursor Protein, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(5): 33556-33560; Stockinger et al.., The Low 30

Density Lipoprotein Receptor Gene Family, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(48): 32213-32221; Obermoeller et al.,

Ca+2 and Receptor-associated Protein are independently required for proper folding and disulfide bond formation of the low density lipoprotein receptor-related protein, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273 (35) : 22374-22381; Sato et al., 39-kDa receptor-associated protein (RAP) facilitates secretion and ligand binding of extracellular region of very-low-density-lipoprotein receptor: implications for a distinct pathway from low-density-lipoprotein receptor, (1999) Biochem. J., 341:377- 383; Avromoglu et al., Functional Expression of the Chicken Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein in a mutant Chinese Hamster Ovary Cell Line Restores Toxicity of Pseudomonas Exotoxin A and Degradation of alpha2 Macroglobulin, (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(11) 6057-6065; Kingsley e

Krieger, Receptor-mediated endocytosis of low density lipoprotein: Somatic cell mutants define multiple genes required for expression of surface-receptor activity, (1984) PNAS USA, 81:5454-5458; Li et al., Differential Functions of Members of the Low Density Lipoprotein Receptor Family Suggests by their distinct endocystosis rates, (2001) Journal of Biological

Chemistry 276 (21) :18000-18006; e Springer, An Extracellular beta-Propeller Module Predicted in Lipoprotein and Scavenger Receptors, Tyrosine Kinases, Epidermal Growth Factor Precursor, and Extracellular Matrix Components, (1998) J. Mol. Biol. 283:837-862.

Os polinucleótidos (também referidos como ácidos nucleicos) codificando os domínios monoméricos são tipicamente empregues para preparar domínios monoméricos por meio de expressão. Os ácidos nucleicos que codificam domínios monoméricos podem ser derivados de uma variedade de fontes diferentes. As bibliotecas 31 de domínios monoméricos podem ser preparadas através da expressão de uma pluralidade de ácidos nucleicos diferentes codificando domínios monoméricos de ocorrência natural, domínios monoméricos alterados (i. e., variantes de domínios monoméricos) ou suas combinações. A invenção proporciona métodos de identificação de domínios monoméricos que se ligam a um ligando ou mistura de ligandos seleccionados ou desejados. Em algumas formas de realização, os domínios monoméricos e/ou domínios imunitários são identificados ou seleccionados para uma desejada propriedade (e. g. , afinidade de ligação) e, depois, os domínios monoméricos e/ou domínios imunitários são formados em multímeros. Ver, e. g., a Figura 5. Para aquelas formas de realização, pode ser utilizado qualquer método resultando na selecção de domínios com uma desejada propriedade (e. g., uma propriedade de ligação específica). Por exemplo, os métodos podem compreender proporcionar uma pluralidade de ácidos nucleicos diferentes, cada ácido nucleico codificando um domínio monomérico; traduzir a pluralidade de ácidos nucleicos diferentes proporcionando, desse modo, uma pluralidade de domínios monoméricos diferentes; rastrear a pluralidade de domínios monoméricos diferentes para ligação do ligando desejado ou uma mistura de ligandos; e, identificar membros da pluralidade de domínios monoméricos diferentes que se ligam ao ligando desejado ou mistura de ligandos.

Como anteriormente mencionado, os domínios monoméricos podem ser de ocorrência natural ou alterados (variantes não naturais). 0 termo "de ocorrência natural" é aqui utilizado para indicar que um objecto pode ser encontrar na natureza. Por exemplo, domínios monoméricos naturais podem incluir domínios monoméricos humanos ou, opcionalmente, domínios derivados de 32 diferentes espécies ou fontes, e. g., mamíferos, primatas, roedores, peixes, aves, répteis, plantas, etc. Os domínios monoméricos de ocorrência natural podem ser obtidos por um determinado número de métodos, e. g., por amplificação por PCR de ADN genómico ou ADNc.

Os domínios monoméricos da presente invenção podem ser domínios de ocorrência natural ou variantes de ocorrência não natural. As bibliotecas de domínios monoméricos empregues na prática da presente invenção podem conter domínios monoméricos de ocorrência natural, variantes de domínios monoméricos de ocorrência não natural ou uma sua combinação.

Os variantes de domínios monoméricos podem incluir domínios ancestrais, domínios quiméricos, domínios aleatorizados, domínios mutados e semelhantes. Por exemplo, os domínios ancestrais podem ser baseados em análise filogenética. Os domínios quiméricos são domínios nos quais uma ou mais regiões são substituídas por regiões correspondentes de outros domínios da mesma família. Os domínios aleatorizados são domínios nos quais uma ou mais regiões são aleatorizadas. A aleatorização pode ser baseada em aleatorização completa ou, opcionalmente, aleatorização parcial baseada em distribuição natural.

Os domínios monoméricos não naturais ou domínios monoméricos alterados podem ser produzidos por um determinado número de métodos. Qualquer método de mutagénese, tal como mutagénese dirigida pontual e mutagénese aleatória (e. g., mutagénese química) pode ser utilizado para produzir variantes. Em algumas formas de realização, PCR propenso a erros é empregue para criar variantes. Métodos adicionais incluem o alinhamento de uma pluralidade de domínios monoméricos de ocorrência 33 natural, através do alinhamento de aminoácidos conservados na pluralidade de domínios monoméricos de ocorrência natural; e a concepção de domínio monomérico de ocorrência não natural através da manutenção dos aminoácidos conservados e a inserção, deleção ou alteração de aminoácidos em torno dos aminoácidos conservados, para gerar o domínio monomérico de ocorrência não natural. Numa forma de realização, os aminoácidos conservados compreendem cisteínas. Noutra forma de realização, a etapa de inserção utiliza aminoácidos aleatórios ou, opcionalmente, a etapa de inserção utiliza porções dos domínios monoméricos de ocorrência natural. Os aminoácidos podem ser inseridos sinteticamente ou podem ser codificados por um ácido nucleico.

Os ácidos nucleicos codificando fragmentos de domínios monoméricos e/ou domínios imunitários de ocorrência natural também podem ser misturados e/ou recombinados (e. g., através da utilização de fragmentos quimicamente ou enzimaticamente produzidos), para gerar domínios monoméricos e/ou domínios imunitários de comprimento completo, modificados. Os fragmentos e o domínio monomérico também podem ser recombinados através da manipulação de ácidos nucleicos codificando domínios ou seus fragmentos. Por exemplo, a ligação de uma construção de ácido nucleico codificando fragmentos do domínio monomérico pode ser utilizada para gerar um domínio monomérico alterado.

Os domínios monoméricos alterados também podem ser gerados pelo proporcionar de uma colecção de oligonucleótidos sintéticos (e. g., oligonucleótidos de sobreposição) codificando uma sequência conservada, aleatória, pseudo-aleatória ou definida de sequências peptídicas que são, depois, inseridas através de ligação dentro de um sítio predeterminado num polinucleótido codificando um domínio monomérico. De modo semelhante, a 34 diversidade de sequência de um ou mais domínios monoméricos pode ser expandida através de mutação do(s) domínio(s) monomérico(s) com mutagénese dirigida pontual, mutação aleatória, mutação pseudo-aleatória, mutação kernal definida, mutação baseada em codão e semelhantes. As moléculas de ácidos nucleicos resultantes podem ser propagadas num hospedeiro para clonagem e amplificação. Os ácidos nucleicos podem ser rearranjados. É aqui adicionalmente descrito um método para recombinação de uma pluralidade de ácidos nucleicos codificando domínios monoméricos e rastreio da biblioteca resultante para domínios monoméricos que se ligam ao ligando desejado ou mistura de ligandos ou semelhantes. Os ácidos nucleicos de domínios monoméricos seleccionados também podem ser rectrocruzados através de rearranjo com sequências polinucleotídicas codificando sequências neutras (i. e., tendo efeito funcional insubstancial sobre a ligação), tal como, por exemplo, através de rectrocruzamento com uma sequência de tipo selvagem ou de ocorrência natural substancialmente idêntica a uma sequência seleccionada, para produzir domínios monoméricos funcionais de tipo nativo. Em geral, durante o rectrocruzamento, é aplicada selecção subsequente, para reter a propriedade, e. g., ligação ao ligando.

Como aqui se descreve, a biblioteca monomérica pode ser preparada por rearranjo. Nesse caso, os domínios monoméricos são isolados e rearranjados para recombinar, de modo combinatório, as sequências de ácido nucleico que codificam os domínios monoméricos (a recombinação pode ocorrer entre ou dentro de domínios monoméricos ou ambos). A primeira etapa envolve a identificação de um domínio monomérico tendo a desejada propriedade, e. g., afinidade para um determinado ligando. 35

Embora mantendo os aminoácidos conservados durante a recombinação, as sequências de ácido nucleico codificando os domínios monoméricos podem ser recombinadas, ou recombinadas e unidas em multímeros. A selecção de domínios monoméricos e/ou domínios imunitários de uma biblioteca de domínios pode ser realizada por uma variedade de processos. Por exemplo, um método de identificação de domínios monoméricos e/ou domínios imunitários que têm uma desejada propriedade envolve a tradução de uma pluralidade de ácidos nucleicos, onde cada ácido nucleico codifica um domínio monomérico e/ou domínio imunitário, rastreio dos polipéptidos codificados pela pluralidade de ácidos nucleicos e identificação daqueles domínios monoméricos e/ou domínios imunitários que, e. g., se ligam a um ligando desejado ou mistura de ligandos produzindo, desse modo, um domínio monomérico e/ou domínio imunitário seleccionado. Os domínios monoméricos e/ou domínios imunitários expressos por cada dos ácidos nucleicos, podem ser testados para a sua capacidade para se ligarem aos ligandos por métodos conhecidos na técnica (i. e., enriquecimento, cromatografia de afinidade, análise FACS).

Como anteriormente mencionado, a selecção de domínios monoméricos e/ou domínios imunitários pode ser baseada na ligação a um ligando, tal como um proteína alvo ou outra molécula alvo (e. g., lípido, hidrato de carbono, ácido nucleico e semelhantes). Outras moléculas podem ser opcionalmente incluídas nos métodos juntamente com o alvo, e. g., iões, tal como Ca+2. 0 ligando pode ser um ligando conhecido, e. g., um ligando conhecido por se ligar a um da pluralidade de domínios monoméricos ou, e. g., o ligando desejado pode ser um ligando de 36 domínio monomérico desconhecido. Ver, e. g., a Figura 4, que ilustra alguns dos ligandos que se ligam ao domínio A. Outras selecções de domínios monoméricos e/ou domínios imunitários podem ser baseadas em, e. g. , inibição ou melhoramento de uma função especifica de uma proteína alvo ou uma actividade. A actividade de proteína alvo pode incluir, e. g., endocitose ou internalização, indução de sistema de segundo mensageiro, regulação positiva ou regulação negativa de um gene, ligação a uma matriz extracelular, libertação de uma molécula(s) ou uma alteração na conformação. Neste caso, o ligando não necessita de ser conhecido. A selecção também pode incluir a utilização de ensaios de alta capacidade.

Quando um domínio monomérico e/ou domínio imunitário é seleccionado com base na sua capacidade para se ligar a um ligando, a base de selecção pode incluir selecção baseada numa velocidade de dissociação baixa que é, habitualmente, preditiva de elevada afinidade. A valência do ligando também pode ser variada, para controlar a afinidade de ligação média de domínios monoméricos e/ou domínios imunitários seleccionados. 0 ligando pode ser ligado a uma superfície ou substrato a densidades variáveis, tal como por inclusão de um composto competidor, através de diluição ou através de outro método conhecido daqueles na técnica. A densidade elevada (valência) de ligando predeterminado pode ser utilizada para enriquecer para domínios monoméricos que tenham afinidade relativamente baixa, enquanto uma densidade baixa (valência) pode enriquecer, de um modo preferido, para domínios monoméricos de afinidade superior. 37

Uma variedade de vectores de apresentaçao repórteres ou sistemas pode ser utilizada para expressar ácidos nucleicos codificando os domínios monoméricos , domínios imunitários e/ou multímeros da presente invenção e para testar para uma actividade desejada. Por exemplo, um sistema de apresentação fágica é um sistema no qual os dominios monoméricos são expressos como proteínas de fusão na superfície fágica (Pharmacia, Milwaukee Wis.)· A apresentação fágica pode envolver a apresentação de uma sequência polipeptídica codificando domínios monoméricos e/ou domínios imunitários na superfície de um bacteriófago filamentoso, tipicamente como uma fusão com uma proteína de revestimento de bacteriófago.

Em geral, nestes métodos, cada partícula ou célula de fago serve como um membro de biblioteca individual apresentando uma única espécie de polipéptido apresentado, adicionalmente às sequências naturais de fago ou proteína celular. A pluralidade de ácidos nucleicos é clonada no ADN de fago, num sítio que resulta na transcrição de uma proteína de fusão, uma porção da qual é codificada pela pluralidade dos ácidos nucleicos. 0 fago contendo uma molécula de ácido nucleico é submetido a replicação e transcrição na célula. A sequência condutora da proteína de fusão dirige o transporte da proteína de fusão para a extremidade da partícula fágica. Deste modo, a proteína de fusão que é parcialmente codificada pelo ácido nucleico é apresentada na partícula fágica para detecção e selecção pelos métodos anteriormente e abaixo descritos. Por exemplo, a biblioteca fágica pode ser incubada com um ligando predeterminado (desejado), de modo que as partículas fágicas que apresentam uma sequência de proteína de fusão que se ligam ao ligando podem ser particionadas, de modo diferencial, daquelas que não apresentam sequências polipeptídicas que se ligam ao ligando 38 predeterminado. Por exemplo, a separação pode ser proporcionada pela imobilização do ligando predeterminado. As partículas fágicas (i. e., membros de biblioteca) que estão ligadas ao ligando imobilizado são, depois, recuperadas e replicadas para amplificar a subpopulação fágica seleccionada para uma série subsequente de enriquecimento de afinidade e replicação fágica. Após várias séries de enriquecimento de afinidade e replicação fágica, os membros da biblioteca fágica que são, deste modo, seleccionados são isolados e a sequência nucleotídica codificando a sequência polipeptídica apresentada é determinada identificando, desse modo, a(s) sequência(s) de polipéptidos que se ligam ao ligando predeterminado. Tais métodos são, adicionalmente, descritos nas Publicações de Patentes PCT N° 91/17271, 91/18980, 91/19818 e 93/08278.

Exemplos de outros sistemas de apresentação incluem apresentações ribossómicas, uma apresentação de ligação de nucleótido (ver, e. g., as Patente U.S. N° 6281344; 6194550, 6207446, 6214553 e 6258558), apresentações de superfície celular e semelhantes. As apresentações de superfície celular incluem uma variedade de células, e. g., células de E. coli, levedura e/ou de mamífero. Quando uma célula é utilizada como uma apresentação, os ácidos nucleicos, e. g., obtidos por amplificação por PCR seguida de digestão, são introduzidos na célula e traduzidos. Opcionalmente, os polipéptidos codificando os domínios monoméricos ou os multímeros da presente invenção podem ser introduzidos, e. g., por injecção, dentro da célula. A invenção também inclui composições que são produzidas por métodos da presente invenção. Por exemplo, a presente invenção inclui domínios monoméricos seleccionados ou identificados a 39 partir de uma biblioteca e/ou bibliotecas compreendendo domínios monoméricos produzidos pelos métodos da presente invenção. A presente invenção também proporciona bibliotecas de domínios monoméricos. As bibliotecas podem incluir, e. g., cerca de 100, 250, 500 domínios monoméricos ou a biblioteca pode incluir, e. g., cerca de 100, 250, 500 ou mais polipéptidos que codificam domínios monoméricos. As bibliotecas podem incluir domínios monoméricos contendo a mesma estrutura de cisteína, e. g., domínios A.

Como aqui se descreve, as bibliotecas podem ser rastreadas para uma propriedade desejada, tal como ligação de um ligando desejado ou mistura de ligandos. Por exemplo, os membros da biblioteca de domínios monoméricos podem ser apresentados e pré-rastreados para ligação a um ligando conhecido ou desconhecido, ou uma mistura de ligandos. As sequências de domínios monoméricos podem ser, depois, mutagenizadas (e. g., recombinadas, quimicamente alteradas, etc.) ou, de outro modo, alteradas e os novos domínios monoméricos podem ser rastreados de novo para ligação ao ligando ou à mistura de ligandos com uma afinidade melhorada. Os domínios monoméricos seleccionados podem ser combinados ou unidos, para formarem multímeros que podem ser, depois, rastreados para uma afinidade ou avidez ou especificidade alterada melhoradas para o ligando ou a mistura de ligandos. A especificidade alterada pode significar que a especificidade é alargada, e. g., ligação de múltiplos vírus relacionados ou, opcionalmente, a especificidade alterada pode significar que a especificidade é estreitada, e. g., ligação dentro de uma região específica de um ligando. Os especialistas na técnica irão reconhecer que há um determinado número de método disponíveis para calcular a avidez. Ver, e. g., Mammen et 40 al.f Angew Chem Int. Ed. 37:2754-2794 (1998); Muller et al.r Anal. Biochem. 261:149-158 (1998).

Os especialistas na técnica irão reconhecer que as etapas de geração de variação e rastreio para uma desejada propriedade podem ser repetidas (i. e., realizadas de modo recursivo), para optimizar resultados. Por exemplo, numa biblioteca de apresentação fágica ou outro formato igual, um primeiro rastreio de uma biblioteca pode ser realizado a estringência relativamente inferior seleccionando, desse modo, tantas partículas associadas a uma molécula alvo quanto possível. As partículas seleccionadas podem ser, depois, isoladas e os polinucleótidos codificando o monómero ou multímero podem ser isolados das partículas. Variações adicionais podem ser, depois, geradas a partir destas sequências e subsequentemente rastreadas a afinidade superior. A Figura 7 ilustra um ciclo genérico de selecção e geração de variação. São incluídas composições polipeptídicas na presente invenção. Por exemplo, a presente invenção proporciona uma pluralidade de ácidos nucleicos diferentes, em que cada ácido nucleico codifica, pelo menos, dois domínios monoméricos do receptor de LDL de classe A. 2. Multímeros (também denominados Proteínas Mosaico Recombinantes ou Proteínas Mosaico Combinatórias)

Os métodos para geração de multímeros são uma característica da presente invenção. Os multímeros compreendem, pelo menos, dois domínios monoméricos do receptor de LDL de classe A. Por exemplo, os multímeros da invenção podem 41 compreender de ; 2 a cerca de 10 domínios monoméricos e/ou domínios imunitários, de ; 2 e cerca de 8 domínios monoméricos e/ou domínios imunitários, de cerca de 3 e cerca de 10 domínios monoméricos e/ou domínios imunitários, cerca de 7 domínios monoméricos e/ou domínios imunitários, cerca de 6 domínios monoméricos e/ou domínios imunitários, cerca de 5 domínios monoméricos e/ou domínios imunitários ou cerca de 4 domínios monoméricos e/ou domínios imunitários. Em algumas formas de realização, o multímero compreende, pelo menos, 3 domínios monoméricos e/ou domínios imunitários. Tipicamente, os domínios monoméricos foram pré-seleccionados para ligação à molécula alvo de interesse.

Em algumas formas de realização, cada domínio monomérico liga-se especificamente a uma molécula alvo. Em algumas destas formas de realização, cada monómero liga-se a uma posição diferente (análoga a um epitopo) numa molécula alvo. Múltiplos domínios monoméricos e/ou domínios imunitários que se ligam à mesma molécula alvo resultam num efeito de avidez, resultando numa avidez melhorada do multímero para a molécula alvo, em comparação com cada monómero individual. Em algumas formas de realização, o multímero tem uma avidez de, pelo menos, cerca de 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 ou 100 vezes a avidez de um domínio monomérico isolado.

Noutra forma de realização, o multímero compreende domínios monoméricos com especificidades para diferentes moléculas alvo. Por exemplo, os multímeros de tais domínios monoméricos diversos podem ligar-se especificamente a diferentes componentes de um sistema de replicação virai ou diferentes serotipos de um vírus. Em algumas formas de realização, pelo menos, um domínio monomérico liga-se a uma toxina e, pelo menos, um domínio 42 monomérico liga-se a uma molécula de superfície celular actuando, desse modo, como um mecanismo para visar a toxina. Em algumas formas de realização, pelo menos, dois domínios monoméricos e/ou domínios imunitários do multímero ligam-se a diferentes moléculas alvo numa célula ou tecido alvo. De modo semelhante, as moléculas terapêuticas podem ser direccionadas para a célula ou tecido através da ligação de um agente terapêutico a um monómero do multímero que também contém outros domínios monoméricos e/ou domínios imunitários tendo especificidade de ligação de célula ou tecido.

Os multímeros podem compreender uma variedade de combinações de domínios monoméricos. Por exemplo, num único multímero, os domínios monoméricos seleccionados podem ser os mesmos ou idênticos, opcionalmente, diferentes ou não idênticos. Além disso, os domínios monoméricos seleccionados podem compreender diversos domínios monoméricos diferentes da mesma família de domínios monoméricos ou diversos domínios monoméricos de famílias de domínios diferentes ou, opcionalmente, uma combinação de ambos.

Os multímeros que são gerados na prática da presente invenção podem ser quaisquer dos seguintes: (1) Um homo-multímero (um multímero do mesmo domínio, i. e., Al-Al-Al-Al); (2) Um hetero-multímero de domínios diferentes da mesma classe de domínio, e. g., A1-A2-A3-A4. Por exemplo, hetero-multímero inclui multímeros onde Al, A2, A3 e A4 são variantes diferentes de ocorrência não natural de particulares domínios do receptor de LDL de classe A ou onde alguns dos Al, A2, A3, e A4 são variantes de 43 ocorrência natural de um domínio do receptor de LDL de classe A (ver, e. g., a Figura 10).

As bibliotecas de multímeros empregues na prática da presente invenção podem conter homo-multímeros, hetero-multímeros de diferentes domínios monoméricos (naturais ou não naturais) de domínios do receptor de LDL de classe A.

Os domínios não necessitam de ser seleccionados antes de os domínios serem ligados para formarem multímeros. Por outro lado, os domínios podem ser seleccionados para a capacidade para se ligarem a uma molécula alvo, antes de serem ligados em multímeros. Deste modo, por exemplo, um multímero pode compreender dois domínios que se ligam a uma molécula alvo e um terceiro domínio que se liga a uma segunda molécula alvo.

Os domínios monoméricos seleccionados são unidos por um ligante para formarem um multímero. Por exemplo, um ligante é posicionado entre cada domínio monomérico discreto separado num multímero. A união dos domínios monoméricos seleccionados por meio de um ligante pode ser realizada utilizando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, o agrupamento combinatório de polinucleótidos codificando domínios monoméricos seleccionados pode ser alcançado por ligação de ADN ou, opcionalmente, por reacções de sobreposição de auto-iniciador, baseadas em PCR. O ligante pode ser conjugado a um monómero antes de o monómero ser identificado para a sua capacidade para se ligar a um multímero alvo ou após o monómero ter sido seleccionado para a capacidade para se ligar a um multímero alvo. 44 0 ligante pode ser de ocorrência natural, sintético ou uma combinação de ambos. Por exemplo, o ligante sintético pode ser um ligante aleatorizado, e. g., tanto em sequência como tamanho. Num aspecto, o ligante aleatorizado pode compreender uma sequência totalmente aleatorizada ou, opcionalmente, o ligante aleatorizado pode ser baseado em sequências ligantes naturais. 0 ligante pode compreender, e. g., uma fracção não polipeptídica, um polinucleótido, um polipéptido ou semelhantes.

Um ligante pode ser rígido ou, alternativamente, flexível ou uma combinação de ambos. A flexibilidade de ligante pode ser uma função da composição tanto do ligante como dos domínios monoméricos com que o ligante interage. 0 ligante une dois domínios monoméricos seleccionados e mantém os domínios monoméricos como domínios monoméricos discretos separados. 0 ligante pode permitir que os domínios monoméricos discretos separados cooperem mas mantenham propriedades separadas, tal como múltiplos sítios de ligação separados para o mesmo ligando num multímero ou, e. g. , múltiplos sítios de ligação separados para diferentes ligandos num multímero. A escolha de um ligante adequado para um caso específico, onde dois ou mais domínios monoméricos (i. e., cadeias polipeptídicas) devem ser juntos pode depender de uma variedade de parâmetros incluindo, e. g., a natureza dos domínios monoméricos, a estrutura e natureza do alvo ao qual o multímero polipeptídico se deve ligar e/ou a estabilidade do ligante peptídico para proteólise e oxidação. A presente invenção proporciona métodos para optimização da escolha de ligante, assim que os desejados domínios monoméricos tenham sido identificados. Em geral, as bibliotecas de 45 multímeros tendo uma composição que é fixa, em relação a composição de domínio monomérico, mas variável na composição e comprimento de ligante, podem ser facilmente preparadas e rastreadas como anteriormente descrito.

Tipicamente, o polipéptido ligante pode incluir predominantemente resíduos de aminoácidos seleccionados do grupo consistindo em Gly, Ser, Ala e Thr. Por exemplo, o ligante peptídico pode conter, pelo menos, 75% (calculado com base no número total de resíduos presentes no ligante peptídico ) , tal como, pelo menos, 80%, e . g., pelo menos, 85% ou, pelo menos, 90% de resíduos de aminoácidos seleccionados do grupo consistindo em Gly , Ser, Ala e Thr. 0 ligante peptídico também pode consistir apenas em resíduos Gly, Ser, Ala e/ou Thr. 0 polipéptido ligante deve ter um comprimento que seja adequado para ligar dois domínios monoméricos de tal modo que assumam a conformação correcta um em relação ao outro, de modo que retenham a actividade desejada, por exemplo como antagonistas de um determinado receptor.

Um comprimento adequado para o efeito é um comprimento de, pelo menos, um e, tipicamente, menos de cerca de 50 resíduos de aminoácidos, tais como 2-25 resíduos de aminoácidos, 5-20 resíduos de aminoácidos, 5-15 resíduos de aminoácidos, 8-12 resíduos de aminoácidos ou 11 resíduos. De modo semelhante, o polipéptido codificando um ligante pode variar em tamanho, e. g., de cerca de 2 a cerca de 15 aminoácidos, de cerca de 3 a cerca de 15, de cerca de 4 a cerca de 12, cerca de 10, cerca de 8 ou cerca de 6 aminoácidos. Em métodos e composições envolvendo ácidos nucleicos, tais como ADN, ARN ou combinações de ambos, o polinucleótido contendo a sequência ligante pode ser, e. g., entre cerca de 6 nucleótidos e cerca de 45 nucleótidos, entre 46 cerca de 9 nucleótidos e cerca de 45 nucleótidos, entre cerca de 12 nucleótidos e cerca de 36 nucleótidos, cerca de 30 nucleótidos, cerca de 24 nucleótidos ou cerca de 18 nucleótidos. Do mesmo modo, os resíduos de aminoácidos seleccionados para inclusão no polipéptido ligante devem exibir propriedades que não interfiram significativamente com a actividade ou função do multimero polipeptidico. Deste modo, o ligante peptidico não deve, no todo, exibir uma carga que seria inconsistente com a actividade ou função do multimero polipeptidico ou interferir com o enrolamento interno, ou formar ligações ou outras interacções com resíduos de aminoácidos em um ou mais dos domínios monoméricos que impediriam seriamente a ligação do multimero polipeptidico ao alvo em questão.

Como aqui se descreve, o ligante peptidico é seleccionado de uma biblioteca onde os resíduos de aminoácidos no ligante peptidico são aleatorizados para um conjunto específico de domínios monoméricos num particular multimero polipeptidico. Um ligante flexível poderia ser utilizado para procurar combinações adequadas de domínios monoméricos que são, depois, optimizados utilizando esta biblioteca aleatória de ligantes variáveis com comprimento e geometria óptimos. Os ligantes óptimos podem conter o número mínimo de resíduos de aminoácidos do tipo correcto que participam na ligação ao alvo e restringem o movimento dos domínios monoméricos uns em relação aos outros no multimero polipeptidico, quando não ligados ao alvo. A utilização de ligantes peptídicos de ocorrência natural, assim como artificial, para juntar polipéptidos em novos polipéptidos de fusão ligados é bem conhecida na literatura (Hallewell et al. (1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268; Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8, 725-731; Robinson & Sauer (1996),

Biochemistry 35, 109-116; Khandekar et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 32190-32197; Fares et al. (1998), Endocrinology 139, 2459-2464; Smallshaw et al. (1999), Proteln Eng. 12, 623-630; documento US 5856456).

Um exemplo onde a utilização dos ligantes peptídicos está disseminada é para a produção de anticorpos de cadeia única, onde as regiões variáveis de uma cadeia leve (VL) e uma cadeia pesada (VH) são unidas através de um ligante artificial e existe um grande número de publicações dentro deste particular campo. Um ligante peptídico largamente utilizado é um 15 mer, consistindo em três repetições de uma sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ( (Gly4Ser)3) . Foram utilizados outros ligantes e tecnologia de apresentação fágica, assim como foi utilizada a tecnologia de fago infeccioso selectivo para diversificar e seleccionar sequências ligantes apropriadas (Tang et ai. (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686; Hennecke et ai. (1998), Protein Eng. 11, 405-410). Os ligantes peptidicos foram utilizados para juntar cadeias individuais em proteínas hetero-e homodiméricas, tais como o receptor de células T, o repressor Cro de lambda, o repressor Arc do fago P22, IL-12, TSH, FSH, IL-5 e interferão-γ. Os ligantes peptídicos também foram utilizados para criar polipéptidos de fusão. Foram utilizados diversos ligantes e, no caso do repressor Arc, a apresentação fágica foi utilizada para optimizar o comprimento e composição de ligante para estabilidade aumentada da proteína de cadeia única (Robinson e Sauer (1998), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 5929-5934).

Outro tipo de ligante é uma inteína, i. e., um segmento peptídico que é expresso com o polipéptido de cadeia única, mas removido pós-traducionalmente por excisão proteica. A utilização 48 de inteínas é revista por F.S. Gimble em Chemistry and Biology, 1998, Vol 5, N° 10, p. 251-256.

Ainda outra forma de se obter um ligante adequado é através da optimização de um ligante simples, e. g., (Gly4Ser)n, através de mutagénese aleatória.

Como anteriormente mencionado é, em geral, preferido que o ligante peptidico possua, pelo menos, alguma flexibilidade. Consequentemente, em algumas formas de realização, o ligante peptidico contém 1-25 resíduos de glicina, 5-20 resíduos de glicina, 5-15 resíduos de glicina ou 8-12 resíduos de glicina. O ligante peptidico irá, tipicamente, conter, pelo menos, 50% de resíduos de glicina, tal como, pelo menos, 75% de resíduos de glicina. O ligante peptidico pode compreender apenas resíduos de glicina. O ligante peptidico pode, além dos resíduos de glicina, compreender outros resíduos, em particular resíduos seleccionados do grupo consistindo em Ser, Ala e Thr, em particular Ser. Deste modo, um exemplo de um ligante peptidico específico inclui um ligante peptidico tendo a sequência de aminoácidos Glyx-Xaa-Glyy-Xaa-Glyz, em que cada Xaa é independentemente seleccionado do grupo consistindo em Ala, Vai, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin, Lys, Arg, His, Asp e Glu e em que x, y e z são cada um números inteiros na gama de 1-5. Em algumas formas de realização, cada Xaa é independentemente seleccionado do grupo consistindo em Ser, Ala e Thr, em particular Ser. De um modo mais particular, o ligante peptidico tem a sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly, em que cada Xaa é independentemente seleccionado do grupo consistindo em Ala, Vai, 49

Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin, Lys, Arg, His, Asp e Glu. Como aqui se descreve, cada Xaa pode ser independentemente seleccionado do grupo consistindo em Ser, Ala e Thr, em particular Ser.

Em alguns casos, pode ser desejável ou necessário proporcionar alguma rigidez dentro do ligante peptídico. Isto pode ser realizado pela inclusão de resíduos de prolina na sequência de aminoácidos do ligante peptídico. Deste modo, o ligante peptídico pode compreender, pelo menos, um resíduo de prolina na sequência de aminoácidos do ligante peptídico. Por exemplo, o ligante peptídico tem uma sequência de aminoácidos em que, pelo menos 25%, tal como, pelo menos 50%, e. g., pelo menos, 75% dos resíduos de aminoácido são resíduos de prolina. Como aqui se descreve, o ligante peptídico compreende apenas resíduos de prolina.

Também são aqui descritos ligantes peptídicos modificados, de tal modo que é introduzido um resíduo de aminoácido compreendendo um grupo de conjugação para uma fracção não polipeptídica. Exemplos de tais resíduos de aminoácidos podem ser um resíduo de cisteína (ao qual a fracção não polipeptídica é, depois, subsequentemente conjugada) ou a sequência de aminoácidos pode incluir um sítio de N-glicosilação in vivo (conjugando, desse modo, uma fracção de açúcar (in vivo) ao ligante peptídico) . O ligante peptídico pode compreender, pelo menos, um resíduo de cisteína, tal como um resíduo de cisteína. Deste modo, em algumas formas de realização da invenção, o ligante peptídico compreende resíduos de aminoácidos seleccionados do 50 grupo consistindo em Gly, Ser, Ala, Thr e Cys. Um tal ligante peptidico pode compreender apenas um resíduo de cisteína. 0 ligante peptidico aqui descrito pode compreender resíduos de glicina e resíduo de cisteína, tais como apenas resíduos de glicina e resíduos de cisteína. Tipicamente, apenas um resíduo de cisteína será incluído por ligante peptidico. Deste modo, um exemplo de um ligante peptidico específico, compreendendo um resíduo de cisteína, inclui um ligante peptidico tendo a sequência de aminoácidos Glyn-Cys-Glym, em que nem são cada, números inteiros de 1-12, e. g., de 3-9, de 4-8 ou de 4-7. De um modo mais particular, o ligante peptidico pode ter a sequência de aminoácidos GGGGG-C-GGGGG.

Esta abordagem (i. e., a introdução de um resíduo de aminoácido compreendendo um grupo de conjugação para uma fracção não polipeptídica) também pode ser utilizada para os ligantes mais rígidos contendo prolina. Consequentemente, o ligante peptidico pode compreender resíduos de prolina e cisteína, tal como apenas resíduos de prolina e cisteína. Um exemplo de um ligante peptidico contendo prolina específico compreendendo um resíduo de cisteína, inclui um ligante peptidico tendo a sequência de aminoácidos Pron-Cys-Prom, em que nem são cada números inteiros de 1-12, de um modo preferido, de 3-9, tal como de 4-8 ou de 4-7. De um modo mais particular, o ligante peptidico pode ter a sequência de aminoácidos PPPPP-C-PPPPP. 0 objectivo da introdução de um resíduo de aminoácido, tal como um resíduo de cisteína, compreendendo um grupo de conjugação para uma fracção não polipeptídica, é para conjugar subsequentemente uma fracção não polipeptídica ao referido resíduo. Por exemplo, as fracções não polipeptídicas podem 51 melhorar a semi-vida sérica do multímero polipeptídico. Deste modo, o resíduo de cisteína pode ser covalentemente conjugado a uma fracção não polipeptídica. Exemplos preferidos de fracções não polipeptídicas incluem moléculas poliméricas, tal como PEG ou mPEG, em particular mPEG, assim como agentes terapêuticos não polipeptídicos. 0 especialista irá reconhecer que podem ser utilizados resíduos de aminoácidos que não cisteína para conjugar um não polipéptido ao ligante peptídico. Um exemplo particular desse outro resíduo inclui a ligação da fracção não polipeptídica a um resíduo de lisina.

Outra possibilidade de introdução de um grupo de conjugação específico de sítio para uma fracção não polipeptídica no ligante peptídico é introduzir um sítio de N-glicosilação in vivo, tal como um sitio de N-glicosilação in vivo, no ligante peptídico. Por exemplo, um sítio de N-glicosilação in vivo pode ser introduzido num ligante peptídico compreendendo resíduos de aminoácidos seleccionados do grupo consistindo em Gly, Ser, Ala e Thr. Será compreendido que, com o fim de garantir que uma fracção de açúcar esteja de facto conjugada ao referido sítio de N-glicosilação in vivo, a sequência nucleotídica codificando o multímero polipeptídico tem que ser inserida num hospedeiro de expressão de glicosilação, eucariótico.

Um exemplo específico de um ligante peptídico compreendendo um sítio de N-glicosilação in vivo é um ligante peptídico tendo a sequência de aminoácidos Glyn-Asn-Xaa-Ser/Thr-Glym, de um modo preferido, Glyn-Asn-Xaa-Thr-Glym, em que Xaa é qualquer resíduo de aminoácido excepto prolina e, em que nem são cada números inteiros na gama de 1-8, de um modo preferido, na gama de 2-5. 52

Frequentemente, as sequências de aminoácidos de todos os ligantes peptídicos presentes no multímero polipeptídico serão idênticas. Não obstante, em determinados ligantes, as sequências de aminoácidos de todos os ligantes peptídicos presentes no multímero polipeptídico podem ser diferentes. Pensa-se que o último seja particularmente relevante no caso de o multímero polipeptídico ser um tri-mer ou tetra-mer polipeptídico e, particularmente, em casos onde um resíduo de aminoácido compreendendo um grupo de conjugação para uma fracção não polipeptídica é incluído no ligante peptídico.

Muito frequentemente, será desejável ou necessário conjugar apenas algumas, tipicamente apenas uma, fracção/fracções não polipeptídicas (tal como mPEG, uma fracção de açúcar ou um agente terapêutico não polipeptídico) ao multímero polipeptídico, para se alcançar o desejado efeito, tal como semi-vida sérica prolongada. Evidentemente, no caso de um tri-mer polipeptídico, que conterá dois ligantes peptídicos, apenas um ligante peptídico é tipicamente requerido para ser modificado, e. g., pela introdução de um resíduo de cisteína, ao passo que a modificação do outro ligante peptídico não irá, tipicamente, ser necessária. Neste caso todos (ambos) os ligantes peptídicos do multímero polipeptídico (tri-mer) são diferentes.

Consequentemente, como aqui se descreve, as sequências de aminoácidos de todos os ligantes peptídicos presentes no multímero polipeptídico sao idênticas à excepção de um, dois ou três ligantes peptídicos, tal como à excepção de um ou dois ligantes peptídicos, em particular à excepção de um ligante peptídico, que tem/têm uma sequência de aminoácidos compreendendo um resíduo de aminoácido compreendendo um grupo de 53 conjugação para uma fracção não polipeptídica. Exemplos preferidos de tais resíduos de aminoácidos incluem resíduos de cisteína de sítios de N-glicosilação in vivo.

Um ligante pode ser uma sequência ligante nativa ou sintética. Um ligante nativo exemplificativo inclui, e. g., a sequência entre a última cisteína de um primeiro domínio A do receptor de LDL e a primeira cisteína de um segundo domínio A do receptor de LDL pode ser utilizada como uma sequência ligante. A análise de diversas ligações de domínios A revela que os ligantes nativos variam de, pelo menos, 3 aminoácidos a menos de 20 aminoácidos, e. g. , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 aminoácidos de comprimento. Contudo, os especialistas na técnica irão reconhecer que podem ser utilizadas sequências mais compridas ou mais curtas. Uma sequência ligante de domínio A exemplificativa é representada na Figura 8. O ligante é um 6-mer da seguinte sequência A1A2A3A4A5A6, em que Ai é seleccionado dos aminoácidos A, P, T, Q, E e K; A2 e A3 são qualquer aminoácido, excepto C, F, Y, W ou M; A4 é seleccionado dos aminoácidos S, G e R; A5 é seleccionado dos aminoácidos Η, P, e R; e A6 é o aminoácido T.

Os métodos para gerar multímeros a partir de domínios monoméricos podem incluir a união dos domínios seleccionados com, pelo menos, um ligante para gerar, pelo menos, um multímero, e. g., o multímero pode compreender, pelo menos, dois dos domínios monoméricos e o ligante. 0(s) multímero(s) é (são), depois, rastreado(s) para uma avidez ou afinidade melhorada ou especificidade alterada para o ligando desejado ou mistura de ligandos, em comparação com os domínios monoméricos seleccionados. 54

Em outros métodos aqui descritos, os domínios multiméricos seleccionados são unidos com, pelo menos, um ligante para gerar, pelo menos, dois multímeros, em que os dois multímeros compreendem dois ou mais dos domínios monoméricos seleccionados e o ligante. Os dois ou mais multímeros são rastreados para uma avidez ou afinidade melhorada ou especificidade alterada para o ligando desejado ou mistura de ligandos, em comparação com os domínios monoméricos seleccionados. As composições de dois ou mais multímeros produzidos pelo método anterior também são aqui descritas.

Tipicamente, os multímeros da presente invenção são um único polipéptido discreto. Os multímeros de fracções parciais de ligante-domínio-ligante parcial são uma associação de múltiplos polipéptidos, cada correspondendo a uma fracção parcial de ligante-domínio-ligante parcial.

Em alguns polipéptidos aqui descritos, o multímero seleccionado compreende mais de dois domínios. Tais multímeros podem ser gerados num modo em etapas, e. g., onde a adição de cada novo domínio é testada individualmente e o efeito dos domínios é testado num modo sequencial. Ver, e. g., a Figura 6. Em outros polipéptidos aqui descritos, os domínios são ligados para formarem multímeros compreendendo mais de dois domínios e seleccionados para ligação, sem conhecimento anterior de que modo os multímeros mais pequenos ou, alternativamente, de que modo cada domínio se liga.

Os métodos aqui descritos também incluem métodos de multímeros de evolução. Os métodos podem compreender, e. g., qualquer ou a totalidade das seguintes etapas: proporcionar uma pluralidade de ácidos nucleicos diferentes, onde cada ácido 55 nucleico codifica um domínio monomérico; traduzir a pluralidade de ácidos nucleicos diferentes, o que proporciona uma pluralidade de domínios monoméricos diferentes; rastrear a pluralidade de domínios monoméricos diferentes para ligação do ligando desejado ou mistura de ligandos; identificar membros da pluralidade de domínios monoméricos diferentes que se ligam ao ligando desejado ou mistura de ligandos, o que proporciona domínios monoméricos seleccionados; unir os domínios monoméricos seleccionados com, pelo menos, um ligante para gerar, pelo menos, um multímero, em que o, pelo menos um, multímero compreende, pelo menos, dois dos domínios monoméricos e o, pelo menos um, ligante; e rastrear o, pelo menos um, multímero para uma afinidade ou avidez melhorada ou especificidade alterada para o ligando desejado ou mistura de ligandos, em comparação com os domínios monoméricos seleccionados.

Variação adicional pode ser introduzida através da inserção de ligantes de composição e comprimento diferentes entre domínios. Isto permite a selecção de ligantes óptimos entre domínios. Em alguns métodos aqui descritos o comprimento e composição óptimos de ligantes irão permitir a ligação óptima de domínios. Em alguns métodos aqui descritos, os domínios com uma particular afinidade(s) de ligação são ligados por meio de diferentes ligantes e os ligantes óptimos são seleccionados num ensaio de ligação. Por exemplo, os domínios são seleccionados para desejadas propriedades de ligação e os mesmos formados numa biblioteca compreendendo uma variedade de ligantes. A biblioteca pode ser, depois, rastreada para identificar ligantes óptimos. Alternativamente, as bibliotecas de multímeros podem ser formadas onde o efeito do domínio ou ligante sobre a ligação da molécula alvo não é conhecido. 56

Os métodos aqui descritos também incluem a geração de um ou mais multímeros seleccionados proporcionando de uma pluralidade de domínios monoméricos. A pluralidade de domínios monoméricos é rastreada para ligação de um ligando desejado ou mistura de ligandos. Os membros da pluralidade de domínios que se ligam ao ligando desejado ou mistura de ligandos são identificados proporcionando, desse modo, domínios com uma desejada afinidade. Os domínios identificados são unidos com, pelo menos, um ligante para gerar os multímeros, em que cada multímero compreende, pelo menos, dois dos domínios seleccionados e o, pelo menos um, ligante; e os multímeros são rastreados para uma afinidade ou avidez melhorada ou especificidade alterada para o ligando desejado ou mistura de ligandos, em comparação com os domínios seleccionados identificando, desse modo, os um ou mais multímeros seleccionados. A selecção de multímeros pode ser alcançada utilizando uma variedade de técnicas, incluindo aquelas anteriormente mencionadas para identificação de domínios monoméricos. Outros métodos de selecção incluem, e. g., uma selecção baseada num afinidade ou avidez melhorada ou especificidade alterada para o ligando, em comparação com domínios monoméricos seleccionados. Por exemplo, uma selecção pode ser baseada na ligação selectiva a tipos celulares específicos ou a um conjunto de células ou tipos de proteínas relacionadas (e. g., diferentes serotipos virais). A optimização da propriedade seleccionada para, e. g., avidez de um ligando pode ser, então, alcançada através da recombinação dos domínios, assim como a manipulação da sequência de aminoácidos dos domínios monoméricos individuais ou o domínio ligante ou a sequência nucleotídica codificando tais domínios, como mencionado na presente invenção. 57

Um método para identificação de multímeros pode ser alcançado através da apresentação dos multímeros. Como com os domínios monoméricos, os multímeros são opcionalmente expressos ou apresentados numa variedade de sistemas de apresentação, e. g. , apresentação fágica, apresentação ribossómica, apresentação nucleotídica (ver, e. g., as Patentes U.S. Nos 6281344; 6194550, 6207446, 6214553 e 6258558) e/ou apresentação de superfície celular, como anteriormente descrito. As apresentações de superfície celular podem incluir mas não estão limitadas a células de E. coli, levedura ou de mamífero. Adicionalmente, as bibliotecas de apresentação de multímeros com múltiplos sítios de ligação podem ser enriquecidas para avidez ou afinidade ou especificidade alterada para um ligando ou para múltiplos ligandos.

Outras variações incluem a utilização de múltiplos compostos de ligação, para que domínios monoméricos, multímeros ou bibliotecas destas moléculas possam ser simultaneamente rastreados para uma multiplicidade de ligandos ou compostos que tenham diferente especificidade de ligação. Múltiplos ligandos ou compostos predeterminados podem ser concomitantemente rastreados numa única biblioteca ou rastreio sequencial contra um determinado número de domínios monoméricos ou multímeros. Numa variação, múltiplos ligandos ou compostos, cada um codificado numa esférula separada (ou subconjunto de esférulas), podem ser misturados e incubados com domínios monoméricos, multímeros ou bibliotecas destas moléculas sob condições de ligação adequadas. A colecção de esférulas, compreendendo múltiplos ligandos ou compostos pode ser, depois, utilizada para isolar, por selecção de afinidade, domínios monoméricos seleccionados, multímeros seleccionados ou membros de biblioteca. Em geral, subsequentes séries de rastreio de 58 afinidade podem incluir a mesma mistura de esférulas, seus subconjuntos ou esférulas contendo apenas um ou dois ligandos ou compostos individuais. Esta abordagem proporciona rastreio eficiente e é compatível com automatização laboratorial, processamento por lotes e métodos de rastreio de alta capacidade.

Como aqui se descreve, os multímeros podem ser simultaneamente rastreados para a capacidade de se ligarem a múltiplos ligandos, em que cada ligando compreende um marcador diferente. Por exemplo, cada ligando pode ser marcado com uma marcador fluorescente diferente, contactado simultaneamente com um multímero ou biblioteca de multímeros. Os multímeros com a desejada afinidade são, depois, identificados (e. g., por triagem FACS) com base na presença dos marcadores ligadas às marcas desejadas.

Os multímeros seleccionados dos métodos anteriores podem ser adicionalmente manipulados, e. g., através de recombinação ou rearranjo dos multímeros seleccionados (a recombinação pode ocorrer entre ou dentro de multímeros ou ambos), mutação dos multímeros seleccionados e semelhantes. Isto resulta em multímeros alterados que, depois, podem ser rastreados e seleccionados para membros que tenham uma propriedade melhorada, comparativamente com os multímeros seleccionados produzindo, desse modo, multímeros alterados seleccionados.

Os ligantes, multímeros ou multímeros seleccionados produzidos pelos métodos indicados anteriormente e a seguir são aqui descritos. São proporcionadas bibliotecas compreendendo multímeros, e. g., uma biblioteca compreendendo cerca de 100, 250, 500 ou mais membros produzidos pelos métodos da presente 59 invenção ou seleccionados pelos métodos da presente invenção. Como aqui se descreve, também estão incluídas uma ou mais células compreendendo membros das bibliotecas. As bibliotecas dos polipéptidos recombinantes também estão aqui descritas, e. g. , uma biblioteca compreendendo cerca de 100, 250, 500 ou mais polipéptidos recombinantes diferentes.

As composições aqui descritas podem ser ligadas a uma matriz de um material de afinidade, e. g. , os polipéptidos recombinantes. Exemplos de material de afinidade incluem, e. g. , esférulas, uma coluna, um suporte sólido e/ou semelhantes.

Ligantes adequados, como aqui se descrevem, incluem um heterodímero obrigatório de fracções ligantes parciais. O termo "heterodímero obrigatório" refere-se aqui a um dímero de duas fracções ligantes parciais que diferem entre si em composição e que se associam umas com as outras num modo específico, não covalente para unir dois domínios um com o outro. A associação específica é tal que os dois ligantes parciais se associam substancialmente entre si, em comparação com a associação com outros ligantes parciais. Deste modo, em contraste com multímeros da presente invenção que são expressos como um único polipéptido, os multímeros de domínios que são ligados entre si por meio de heterodímeros são agrupados a partir de unidades discretas de ligante parcial-monómero-ligante parcial. O agrupamento dos heterodímeros pode ser alcançado através de, por exemplo, mistura. Deste modo, se os ligantes parciais forem segmentos polipeptídicos, cada unidade parcial de ligante— monómero-ligante parcial pode ser expressa como um péptido discreto, antes do agrupamento multimérico. Uma ligação dissulfureto pode ser adicionada para covalentemente aprisionar os péptidos entre si, após o correcto emparelhamento não 60 covalente. Um multímero contendo esses heterodímeros obrigatórios é representado na Figura 12. As fracções ligantes parciais que são apropriadas para formar heterodímeros obrigatórios incluem, por exemplo, polinucleótidos, polipéptidos e semelhantes. Por exemplo, quando o ligante parcial é um polipéptido, os domínios de ligação são produzidos individualmente, juntamente com o seu péptido de ligação único (i. e., um ligante parcial) e, mais tarde, combinado para formar multímeros. A ordem espacial dos domínios de ligação no multímero é, deste modo, encarregada pela especificidade de ligação de heterodímero de cada ligante parcial. Os ligantes parciais podem conter sequências de aminoácidos terminais que se ligam especificamente a uma sequência de aminoácidos heteróloga definida. Um exemplo de uma dessas sequências de aminoácidos é o activador de cabeça neuropeptídico Hidra, como descrito em Bodenmuller et al., The neuropeptide head activator loses its biological activity by dimerization, (1986) EMBO J 5 (8):1825-1829. Ver, e. g. , a Patente U.S. N° 5491074 e documento WO 94/28173. Estes ligantes parciais permitem que o multímero seja produzido primeiro como unidades ligantes parciais monoméricas ou unidades parciais de ligante-monómero-ligante parcial que são, depois, misturadas entre si e deixadas agrupar-se na ordem ideal, com base nas especificidades de ligação de cada ligante parcial.

Quando o ligante parcial compreende um motivo de ligação de ADN, cada domínio monomérico tem um ligante parcial a montante e a jusante (i. e., Lp-domínio-Lp, onde "Lp" é uma representação de um ligante parcial) que contém uma proteína de ligação de ADN com especificidade de ligação de ADN exclusivamente única. Estes domínios podem ser produzidos individualmente e, depois, agrupados num multímero específico pela mistura dos domínios com 61 fragmentos de ADN contendo as sequências nucleotídicas convenientes (i. e., os sítios de reconhecimento específicos para as proteínas de ligação de ADN doS liganteS parciais dos dois desejados domínios), para unir os domínios na ordem desejada. Adicionalmente, os mesmos domínios podem ser agrupados em muitos multímeros diferentes pela adição de sequências de ADN contendo diversas combinações de sítios de reconhecimento de proteínas de ligação de ADN. A aleatorização adicional das combinações de sítios de reconhecimento de proteínas de ligação de ADN nos fragmentos de ADN pode permitir o agrupamento de bibliotecas de multímeros. 0 ADN pode ser sintetizado com análogos de estrutura para prevenir a degradação in vivo.

Uma vantagem significativa da presente invenção é que os ligandos conhecidos ou ligandos desconhecidos, podem ser utilizados para seleccionar os domínios monoméricos e/ou multímeros. Não é requerida informação anterior em relação à estrutura de ligando para isolar os domínios monoméricos de interesse ou os multímeros de interesse. Os domínios monoméricos identificados podem ter actividade biológica, o que significa incluir, pelo menos, afinidade de ligação específica para um ligando seleccionado ou desejado e, em alguns casos, irá adicionalmente incluir a capacidade de bloquear a ligação de outros compostos, estimular ou inibir vias metabólicas, actuar como um sinal ou mensageiro, estimular ou inibir a actividade celular e semelhantes.

Pode ser utilizado um único ligando ou, opcionalmente, pode ser utilizada uma variedade de ligandos para seleccionar os domínios monoméricos e/ou multímeros. Um domínio monomérico da presente invenção pode ligar-se a um único ligando ou uma variedade de ligandos. Um multímero da presente invenção pode 62 ter múltiplos sítios de ligação discretos para um único ligando ou, opcionalmente, pode ter múltiplos sítios de ligação para uma variedade de ligandos.

As potenciais aplicações de multímeros da presente invenção são diversas. Por exemplo, a invenção pode ser utilizada na aplicação para a criação de antagonistas, onde os domínios monoméricos ou multímeros seleccionados bloqueiam a interacção entre duas proteínas. Opcionalmente, a invenção pode gerar agonistas. Por exemplo, multímeros ligando-se a duas proteínas diferentes, e. g., enzima e substrato, podem melhorar a função de proteína, incluindo, por exemplo, actividade enzimática e/ou conversão de substrato.

Outras aplicações incluem direccionamento celular. Por exemplo, multímeros consistindo em domínios monoméricos e/ou domínios imunitários que reconhecem proteínas específicas de superfície celular podem ligar-se selectivamente a determinados tipos de células. As aplicações envolvendo domínios monoméricos e/ou domínios imunitários como agentes antivíricos também estão incluídas. Por exemplo, multímeros ligando-se a diferentes epitopos na partícula virai podem ser úteis como agentes antivíricos, em virtude da polivalência. Outras aplicações podem incluir, mas não estão limitadas a purificação de proteína, detecção de proteína, biossensores, experiências de captura de afinidade de ligando e semelhantes. Além disso, os domínios ou multímeros podem ser sintetizados em bruto por meios convencionais para qualquer utilização adequada, e. g., como um agente terapêutico ou de diagnóstico.

Como aqui se descreve, o multímero compreende domínios monoméricos com especificidades para diferentes proteínas. As 63 diferentes proteínas podem ser relacionadas ou não relacionadas. Exemplos de proteínas relacionadas, incluindo membros de uma família de proteínas ou diferentes serotipos de um vírus. Alternativamente, os domínios monoméricos e/ou domínios imunitários de um multímero podem visar diferentes moléculas numa via fisiológica (e. g., diferentes proteínas de coagulação do sangue). Como aqui adicionalmente descrito, os domínios monoméricos e/ou domínios imunitários ligam-se a proteínas em vias não relacionadas (e. g., dois domínios ligam-se a factores do sangue, dois outros domínios ligam-se a proteínas relacionadas com inflamação e um quinto liga-se a albumina sérica). 3. Método de Tratamento Terapêutico e Profiláctico -Incluído Apenas para Referência A presente patente também descreve métodos de tratar terapeuticamente ou profilacticamente uma doença ou distúrbio, pela administração in vivo ou ex vivo de um ou mais ácidos nucleicos ou polipéptidos da invenção anteriormente descritos (ou composições compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável e um ou mais desses ácidos nucleicos ou polipéptidos) a um indivíduo, incluindo, e. g., um mamífero, incluindo um humano, primata, murganho, porco, vaca, cabra, coelho, rato, cobaio, hámster, cavalo, ovelha; ou um vertebrado não mamífero, tal como uma ave (e. g., uma galinha ou pato), peixe ou invertebrado.

Em métodos ex vivo, uma ou mais células ou uma população de células de interesse do indivíduo (e. g., células tumorais, amostra de tecido tumoral, células de órgãos, células 64 sanguíneas, células da pele, pulmão, coração, músculo, cérebro, mucosas, fígado, intestino, baço, estômago, sistema linfático, cérvix, vagina, próstata, boca, língua, etc.) são obtidas ou removidas do indivíduo e colocadas em contacto com uma quantidade de um domínio monomérico e/ou multímero seleccionado da invenção que é eficaz no tratamento profiláctico ou terapêutico da doença, distúrbio ou outro estado. As células colocadas em contacto são, depois, devolvidas ao indivíduo para o local de onde foram obtidas ou para outro local (e. g., incluindo aqueles anteriormente definidos) de interesse no indivíduo a ser tratado. Se desejado, as células colocadas em contacto podem ser enxertadas num local de tecido, órgão ou sistema (incluindo todos os anteriormente descritos) de interesse no indivíduo, utilizando técnicas de enxerto padrão e bem conhecidas ou, e. g., distribuídas para o sangue ou sistema linfático utilizando técnicas de distribuição ou transfusão padrão. São aqui descritos métodos in vivo nos quais uma ou mais células ou uma população de células de interesse do indivíduo são colocadas em contacto, directamente ou indirectamente, com uma quantidade de um domínio monomérico e/ou multímero seleccionado da invenção, eficaz no tratamento profiláctico ou terapêutico da doença, distúrbio ou outro estado. Em formatos de contacto/administração directos, o domínio monomérico e/ou multímero seleccionado é, tipicamente, administrado ou transferido directamente para as células a ser tratadas ou para o local de tecido de interesse (e. g., células tumorais, amostra de tecido tumoral, células de órgãos, células sanguíneas, células da pele, pulmão, coração, músculo, cérebro, mucosas, fígado, intestino, baço, estômago, sistema linfático, cérvix, vagina, próstata; boca, língua, etc.) através de qualquer de uma 65 variedade de formatos, incluindo administração tópica, injecção (e. g. , através da utilização de uma agulha ou seringa) ou vacina ou distribuição por canhão de genes, impelindo para dentro de um local de tecido, órgão ou pele. 0 domínio monomérico e/ou multímero seleccionado pode ser distribuído, por exemplo, intramuscularmente, intradermicamente, subdermicamente, subcutaneamente, oralmente, intraperitonealmente, intratecalmente, intravenosamente ou colocado dentro de uma cavidade do corpo (incluindo, e. g., durante cirurgia) ou por inalação ou administração vaginal ou rectal.

Em formatos de contacto/administração indirectos in vivo, o domínio monomérico e/ou multímero seleccionado é, tipicamente, administrado ou transferido indirectamente para as células a serem tratadas ou para o local de tecido de interesse, incluindo aqueles anteriormente descritos (tal como, e. g., células da pele, sistemas de órgãos, sistema linfático ou sistema de células sanguíneas, etc.), através da colocação em contacto ou administração do polipéptido da invenção directamente a uma ou mais células ou população de células, a partir das quais o tratamento pode ser facilitado. Por exemplo, as células tumorais dentro do corpo do indivíduo podem ser tratadas através da colocação em contacto das células do sistema sanguíneo ou linfático, pele ou um órgão com uma quantidade suficiente do domínio monomérico e/ou multímero seleccionado, para que ocorra a distribuição do domínio monomérico e/ou multímero seleccionado para o local de interesse (e. g., tecido, órgão ou células de interesse ou sistema sanguíneo ou linfático dentro do corpo) e resulte um tratamento eficaz profiláctico ou terapêutico. Tal contacto, administração ou transferência é, tipicamente, realizada através da utilização de uma ou mais das vias ou modos de administração anteriormente descritos. 66 São aqui adicionalmente descritos métodos ex vivo, nos quais uma ou mais células de interesse ou uma população de células de interesse do indivíduo (e. g., células tumorais, amostra de tecido tumoral, células de órgãos, células sanguíneas, células da pele, pulmão, coração, músculo, cérebro, mucosas, fígado, intestino, baço, estômago, sistema linfático, cérvix, vagina, próstata, boca, língua, etc.) são obtidas ou removidas do indivíduo e transformadas através da colocação em contacto das referidas uma ou mais células ou população de células com uma construção polinucleotídica compreendendo uma sequência de ácido nucleico da invenção que codifica um polipéptido biologicamente activo de interesse (e. g., um domínio monomérico e/ou multímero seleccionado) que é eficaz no tratamento profiláctico ou terapêutico da doença, distúrbio ou outro estado. A uma ou mais células ou população de células são colocadas em contacto com uma quantidade suficiente da construção polinucleotídica e um promotor controlando a expressão da referida sequência de ácido nucleico, para que ocorra a absorção da construção polinucleotídica (e promotor) dentro da(s) célula(s) e resulte expressão suficiente da sequência de ácido nucleico alvo, para produzir uma quantidade do polipéptido biologicamente activo, codificando um domínio monomérico e/ou multímero seleccionado, eficaz a tratar profilacticamente ou terapeuticamente a doença, distúrbio ou estado. A construção polinucleotídica pode incluir uma sequência promotora (e. g., sequência promotora de CMV) que controle a expressão da sequência de ácido nucleico da invenção e/ou, se desejado, uma ou mais sequências nucleotídicas adicionais codificando, pelo menos, um ou mais de outro polipéptido da invenção, uma citocina, adjuvante ou molécula co-estimulatória ou outro polipéptido de interesse. 67

Após transfecção, as células transformadas são devolvidas, distribuídas ou transferidas para o indivíduo para o local de tecido ou sistema de onde foram obtidas ou para outro local (e. g., células tumorais, amostra de tecido tumoral, células de órgãos, células sanguíneas, células da pele, pulmão, coração, músculo, cérebro, mucosas, fígado, intestino, baço, estômago, sistema linfático, cérvix, vagina, próstata, boca, língua, etc.) a ser tratado no indivíduo. Se desejado, as células podem ser enxertadas num tecido, pele, órgão ou sistema corporal de interesse no indivíduo, utilizando técnicas de enxerto padrão e bem conhecidas ou distribuídas para o sistema sanguíneo ou linfático utilizando técnicas de distribuição ou transfusão padrão. Tal distribuição, administração ou transferência de células transformadas é, tipicamente, realizada pela utilização de uma ou mais das vias ou modos de administração anteriormente descritos. A expressão do ácido nucleico alvo ocorre naturalmente ou pode ser induzida (como descrito em maior detalhe abaixo) e uma quantidade do polipéptido codificado é suficiente e eficazmente expressa para tratar a doença ou estado no local ou sistema de tecido. São também aqui descritos métodos in vivo nos quais uma ou mais células de interesse ou uma população de células do indivíduo (e. g., incluindo aquelas células e sistemas de celulares e indivíduos anteriormente descritos) são transformadas no corpo do indivíduo através da colocação em contacto da(s) célula(s) ou população de células com (ou administrar ou transferir para a(s) célula(s) ou população de células utilizando uma ou mais das vias ou modos de administração anteriormente descritos) uma construção polinucleotídica compreendendo uma sequência de ácido nucleico da invenção que codifica um polipéptido biologicamente activo de 68 interesse (e. g., um domínio monomérico e/ou multímero seleccionado) que é eficaz no tratamento profiláctico ou terapêutico da doença, distúrbio ou outro estado. A construção polinucleotídica pode ser directamente administrada ou transferida para a(s) célula(s) sofrendo da doença ou distúrbio (e. g., por contacto directo utilizando uma ou mais das vias ou modos de administração anteriormente descritos). Alternativamente, a construção polinucleotídica pode ser indirectamente administrada ou transferida para a(s) célula(s) sofrendo da doença ou distúrbio, em primeiro lugar através da colocação em contacto directamente de célula(s) não doente(s) ou outras células doentes, utilizando uma ou mais das vias ou modos de administração anteriormente descritos, com uma quantidade suficiente da construção polinucleotídica compreendendo a sequência de ácido nucleico codificando o polipéptido biologicamente activo, e um promotor controlando a expressão da sequência de ácido nucleico, para que ocorra a absorção da construção polinucleotídica (e promotor) dentro da(s) célula(s) e suficiente resulte expressão da sequência de ácido nucleico da invenção, para produzir uma quantidade do polipéptido biologicamente activo eficaz para tratar profiláctica ou terapeuticamente a doença ou distúrbio, e pelo que a construção polinucleotídica ou o polipéptido expresso resultante seja transferido natural ou automaticamente do local, sistema, tecido ou órgão de distribuição inicial do corpo do indivíduo para o local, tecido, órgão ou sistema doente do corpo do indivíduo (e. g. , por meio do sistema sanguíneo ou linfático) . A expressão do ácido nucleico alvo ocorre naturalmente ou pode ser induzida (como descrito em maior detalhe abaixo), para que uma quantidade de polipéptido expresso seja suficiente e eficaz para tratar a doença ou estado no local 69 ou sistema de tecido. A construção polinucleotídica pode incluir uma sequência promotora (e. g. , sequência promotora de CMV) que controle a expressão da sequência de ácido nucleico e/ou, se desejado, uma ou mais sequências nucleotídicas adicionais codificando, pelo menos, um ou mais de outro polipéptido da invenção, uma citocina, adjuvante ou molécula co-estimulatória ou outro polipéptido de interesse.

Em cada um dos métodos de tratamento in vivo e ex vivo, como anteriormente descritos, uma composição compreendendo um excipiente e o polipéptido ou ácido nucleico da invenção pode ser administrada ou distribuída. Também aqui descrita, uma composição compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável e um polipéptido ou ácido nucleico pode ser administrada ou distribuída ao indivíduo, como anteriormente descrito, numa quantidade eficaz para tratar a doença ou distúrbio.

Como adicionalmente aqui descrito, em cada método de tratamento in vivo e ex vivo anteriormente descrito, a quantidade de polinucleótido administrada à(s) célula(s) ou indivíduo pode ser uma quantidade para que ocorra absorção do referido polinucleótido dentro de uma ou mais células do indivíduo e resulte suficiente expressão da referida sequência de ácido nucleico, para produzir uma quantidade de um polipéptido biologicamente activo eficaz para melhorar uma resposta imunitária no indivíduo, incluindo uma resposta imunitária induzida por um imunogénio (e. g., antigénio) . Para cada um desses métodos, a quantidade de polipéptido administrada à(s) célula(s) ou indivíduo pode ser uma quantidade suficiente para melhorar uma resposta imunitária no indivíduo, incluindo aquela induzida por um imunogénio (e. g., antigénio). 70 São aqui adicionalmente descritos métodos de tratamento in vivo ou in vivo nos quais uma construção polinucleot idica (ou composição compreendendo uma construção polinucleotidica) é utilizada para distribuir um polipéptido fisiologicamente activo a um indivíduo. A expressão da construção polinucleotidica pode ser induzida através da utilização de um sistema de expressão génica indutível ligado e desligado. Exemplos de tais sistemas de expressão génicos ligados e desligados incluem o Sistema de Expressão Génica Tet-On™ e Sistema de Expressão Génica Tet-Off™ (ver, e. g., Catálogo Clontech 2000, p. 110-111, para uma descrição detalhada de cada um desses sistemas), respectivamente. Outros sistemas de expressão génicos, ligados e desligados, controláveis ou indutíveis são conhecidos pelo especialista na técnica. Com tal sistema, a expressão do nucleico alvo da construção polinucleotidica pode ser regulada num modo preciso, reversível e quantitativo. A expressão génica do ácido nucleico alvo pode ser induzida, por exemplo, após as células transfectadas estáveis contendo a construção polinucleotidica compreendendo o ácido nucleico alvo serem distribuídas ou transferidas, ou realizarem contacto com local de tecido, órgão ou sistema de interesse. Tais sistemas são de particular benefício em métodos e formatos de tratamento, nos quais seja vantajoso atrasar ou controlar de modo preciso a expressão do ácido nucleico alvo (e. g., para dar tempo para conclusão de cirurgia e/ou cura após cirurgia; para dar tempo para que a construção polinucleotidica compreendendo o ácido nucleico alvo alcance o local, células, sistema ou tecido a ser tratado; para dar tempo para que as células contendo enxerto transformadas com a construção fiquem incorporadas no tecido ou órgão sobre o qual foi excisado ou conjugado, etc.). 71 4. Manipulação Adicional de Ácidos Nucleicos e Polipéptidos de Domínios Monoméricos e/ou Multímeros - Aqui Descrita Apenas para Referência

Como anteriormente mencionado, o polipéptido da presente invenção pode ser alterado. As descrições de uma variedade de processos de geração de diversidade, para geração de sequências de ácidos nucleicos modificadas ou alteradas codificando estes polipéptidos, são descritas anteriormente e abaixo nas seguintes publicações e nas referências ai citadas: Soong, N. et al., Molecular breeding of viruses, (2000) Nat Genet 25 (4):436-43 9,-Stemmer, et al., Molecular breeding of viruses for targeting and other clinicai properties, (1999) Tumor Targeting 4:1-4; Ness et al. , DNA Shuffling of subgenomic sequences of subtilisin, (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang et al., Evolution of a cytokine using DNA family shuffling, (1999) Nature

Biotechnology 17:793-797; Minshull e Stemmer, Protein evolution by molecular breeding, (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians et al., Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling, (1999) Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri et al., DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution, (1998) Nature 391:288-291; Crameri et al., Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling, (1997) Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang et al., Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-4509; Patten et al., Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines, (1997) Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al., Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling, (1996) Nature Medicine 2:100-103; 72

Crameri et al., Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling, (1996) Nature Biotechnology 14:315-319; Gates et al., Affinity selective isolatlon of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor 'headpiece dimer', (1996) Journal of Molecular Blology 255:373-386; Steminer, Sexual PCR and Assembly PCR, (1996) In: The Encyclopedia of Molecular Blology. Editores VCH, Nova Iorque, p. 447-457; Crameri e Stemmer, Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutatlons of mutant and wildtype cassettes, (1995) BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al., Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxy-ribonucleotides, (1995) Gene, 164:49-53; Stemmer, The Evolution of Molecular Computation, (1995) Science 270: 1510; Stemmer. Searching Sequence Space, (1995) Bio/Technology 13:549-553; Stemmer, Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, (1994) Nature 370:389-391; e Stemmer, DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751.

Os métodos mutacionais de geração de diversidade incluem, por exemplo, mutagénese dirigida pontual (Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, (1997) Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, (1996) Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith, In vitro mutagenesis, (1985) Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, (1985) Science 229:1193-1201; Cárter, Site-directed mutagenesis, (1986) Biochem. J. 237:1-7; e Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, (1987) in Nucleic Acids & Molecular Blology (Eckstein, F. e Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, 73

Berlin)); mutagénese utilizando moldes contendo uracilo (Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, (1987) Methods in Enzymol. 154, 367-382; e

Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, (1988) Science 242:240-245); mutagénese dirigida oligonucleotidica ((1983) Methods in Enzymol. 100: 468-500; (1987) Methods in Enzymol. 154: 329-350; Zoller & Smith,

Oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into Ml 3 vectors, (1983) Methods in Enzymol. 100:468-500; e Zoller & Smith,

Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, (1987) Methods in Enzymol. 154:329-350); mutagénese de ADN modificado por fosforotioato (Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787; Nakamaye & Eckstein,

Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, (1986) Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698;

Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, (1988) Nucl. Acids Res. 16 : 791-802; e Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. 74

Acids Res. 16: 803-814); mutagénese utilizando ADN dúplex com lacunas (Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, (1984) Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, (1987) Methods in Enzymol. 154:350-36 7; Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 7207; e Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999). Métodos adequados adicionais incluem reparação de erro-de-emparelhamento pontual (Kramer et al., Point Mismatch Repair, (1984) Cell 38:879-887), mutagénese utilizando estirpes hospedeiras deficientes de reparação (Cárter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; e Cárter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml 3 vectors, (1987) Methods in Enzymol. 154: 382-403), mutagénese de deleção (Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, (1986) Nucl. Acids Res. 14: 5115), selecção de restrição e purificação de restrição (Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition State of subtilisin, (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), mutagénese por síntese génica total (Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, (1984) Science 223: 1299-1301;

Sakamar e Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), (1988) Nucl. Acids Res. 75 14: 6361-6372; Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, (1985) Gene 34:315-323; e Grundstrõm et al. , Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), reparação de fracturas de cadeia dupla (Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:7177-7181; e Arnold, Protein engineering for unusual environments, (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455). Detalhes adicionais sobre muitos dos métodos anteriores podem consultar-se em Methods in Enzymology, Volume 154, que também descreve controlos úteis para resolução de problemas com diversos métodos de mutagénese.

Detalhes adicionais em relação a diversos métodos de geração de diversidade podem consultar-se nas seguintes patentes U.S., publicações e pedidos PCT e publicações EPO: Pat. U.S. N° 5605793 para Stemmer (25 de Fevereiro de 1997), "Métodos para Recombinação In vitro"; Pat. U.S. N° 5811238 para Stemmer et al. (22 de Setembro de 1998) "Métodos para Geração de Polinucleótidos tendo Características Desejadas por Selecção Iterativa e Recombinação"; Pat. U.S. N° 5830721 para Stemmer et al. (3 de Novembro de 1998), "Mutagénese de ADN por

Fragmentação Aleatória e Reagrupamento"; Pat . U.S. N° 5834252 para Stemmer, et al. (10 de Novembro de 1998) "Reacção de Polimerase de Extremidade Complementar"; Pat . U.S. N° 5837458 para Minshull, et al. (17 de Novembro de 1998), "Métodos e

Composições para Manipulação Celular e Metabólica"; documento WO 95/22625, Stemmer e Crameri, "Mutagénese de ADN por Fragmentação Aleatória e Reagrupamento"; documento WO 96/33207 por Stemmer e Lipschutz "Reacção de Polimerização em Cadeia de 76

Extremidade Complementar"; documento WO 97/20078 por Stemmer e Crameri "Métodos para Geração de Polinucleótidos tendo Características Desejadas por Selecção Iterativa e "Métodos para e Selecção de "Métodos para documento WO de Seguências e Seguências

Recombinação"; documento WO 97/35966 por Minshull e Stemmer, "Métodos e Composições para Manipulação Celular e Metabólica"; documento WO 99/41402 por Punnonen et al. "Alvejamento de Vectores Vacinais Genéticos"; documento WO 99/41383 por Punnonen et al. "Imunização de Biblioteca Antigénica"; documento WO 99/41369 por Punnonen et al. "Manipulação de Vector Vacinai Genético"; documento WO 99/41368 por Punnonen et al. "Optimização de Propriedades Imunomoduladoras de Vacinas Genéticas"; documento EP 752008 por Stemmer e Crameri, "Mutagénese de ADN por Fragmentação Aleatória e Reagrupamento"; documento EP 0932670 por Stemmer "Absorção de ADN Celular de Evolução por Recombinação de Seguência Recursiva"; documento WO 99/23107 por Stemmer et al., "Modificação de Tropismo de Vírus e Especificidade de Hospedeiro por Rearranjo de genoma Virai"; documento WO 99/21979 por Apt et al., "Vectores de Papilomavírus Humano"; documento WO 98/31837 por del Cardayre et al. "Evolução de Células Intactas e Organismos por Recombinação de Seguência Recursiva"; documento WO 98/27230 por Patten e Stemmer, "Métodos e Composições para Manipulação Polipeptídica"; documento WO 98/27230 por Stemmer et al.,

Optimização de Terapia Génica por Rearranjo Seguência Recursiva", documento WO 00/00632,

Geração de Bibliotecas Altamente Diversas, 00/09679, "Métodos para Obtenção de Bancos Polinucleotídicas Recombinadas In Vitro Resultantes", documento WO 98/42832 por Arnold et al., "Recombinação de Seguências Polinucleotídicas Utilizando

Iniciadores Aleatórios ou Definidos", documento WO 99/29902 por Arnold et al., "Método para Criação de Seguências 77

Polinucleotídicas e Polipeptídicas", documento WO 98/41653 por Vind, "Um Método In vitro para Construção de uma Biblioteca de ADN, documento WO 98/41622 por Borchert et ai., "Método para Construção de uma Biblioteca Utilizando Rearranjo de ADN" e documento WO 98/42727 por Pati e Zarling, "Alterações de

Sequência Utilizando Recombinação Homóloga"; documento WO 00/18906 por Patten et ai., "Rearranjo de Genes de Codões Alterados"; documento WO 00/04190 por del Cardayre et ai. "Evolução de Células Intactas e Organismos por Recombinação Recursiva"; documento WO 00/42561 por Crameri et ai., "Recombinação de Ácido Nucleico Mediada por Oligonucleótido"; documento WO 00/42559 por Selifonov e Stemmer "Métodos de

Povoação de Estruturas de Dados para Utilização em Simulações Evolutivas"; documento WO 00/42560 por Selifonov et ai., "Métodos para Preparação de Cadeias de Caracteres, Polinucleótidos & Polipéptidos Tendo Caracteristicas Desejadas"; documento WO 01/23401 por Welch et ai., "Utilização de Síntese Oligonucleotídica de Variação de Codão para Rearranjo Sintético"; e documento PCT/US01/06775 "Recombinação de Ácido Nucleico de Cadeia Simples Mediada por Molde e Isolamento de Fragmento de Ácido Nucleico" por Affholter.

Outro aspecto aqui descrito inclui a clonagem e expressão de domínios monoméricos, domínios monoméricos seleccionados, multímeros e/ou multímeros seleccionados codificando ácidos nucleicos. Deste modo, os domínios multiméricos podem ser sintetizados como uma única proteína utilizando sistemas de expressão bem conhecidos na técnica. Adicionalmente aos muitos textos notados anteriormente, testos gerais que descrevem técnicas de biológicas moleculares aqui úteis, incluindo a utilização de vectores, promotores e muitos outros tópicos relevantes para expressar ácidos nucleicos, tais como domínios 78 monoméricos, domínios monoméricos seleccionados, multímeros e/ou multímeros seleccionados, incluem Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Technlques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2a Ed.) , Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989 ("Sambrook") e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementado até 1999) ("Ausubel")). Exemplos de técnicas suficientes para orientar especialistas através de métodos de amplificação in vitro, úteis na identificação, isolamento e clonagem de domínios monoméricos e multímeros codificando ácidos nucleicos, incluindo a reacção de polimerização em cadeia (PCR), a reacção em cadeia da ligase (LCR) , amplificação de Q ΞΙ-replicase e outras técnicas mediadas por ARN polimerase (e. g., NASBA), encontram-se em Berger, Sambrook, e Ausubel, assim como Mullis et al., (1987) Patente U.S. N° 4683202; PCR Protocols A Guide to Methods and

Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1 de Outubro de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3, 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35, 1826; Landegren et al., (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291-294; Wu e

Wallace, (1989) Gene 4, 560; Barringer et al. (1990) Gene 89, 117, e Sooknanan e Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Métodos melhorados de clonagem de ácidos nucleicos amplificados in vitro são descritos em Wallace et al., Pat. U.S. N° 5426039. Métodos melhorados de amplificação de ácidos nucleicos de grandes dimensões são sumariados em Cheng et al. (1994) Nature 79 369: 684-685 e as suas referências, em que são gerados produtos de amplificação de PCR até 40 kb. Um especialista irá entender que essencialmente qualquer ARN pode ser convertido num ADN de cadeia dupla adequado para digestão de restrição, expansão em PCR e sequenciação utilizando transcritase reversa e uma polimerase. Ver, Ausubel, Sambrook e Berger, todos supra.

Os vectores aqui descritos podem ser introduzidos em células hospedeiras e dominios monoméricos, domínios monoméricos seleccionados, multímeros e/ou multímeros seleccionados da invenção podem ser produzidos por técnicas recombinantes. As células hospedeiras são geneticamente manipuladas (i. e., transduzidas, transformadas ou transfectadas) com os vectores aqui descritos que podem ser, por exemplo, um vector de clonagem ou um vector de expressão. O vector pode ser, por exemplo, na forma de um plasmídeo, uma partícula virai, um fago, etc. As células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais, modificados conforme apropriado para activação de promotores, selecção de transformantes ou amplificação do domínio monomérico, domínio monomérico seleccionado, multímero e/ou gene(s) multimérico(s) seleccionado(s) de interesse. As condições de cultura, tal como temperatura, pH e semelhantes, são aquelas anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e será evidente para os especialistas na técnica e nas referências aqui citadas, incluindo, e. g., Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, terceira edição, Wiley-Liss, Nova Iorque Iorque e as referências aí citadas.

Como aqui se descreve, os polipéptidos da invenção também podem ser produzidos em células não animais, tal como vegetais, levedura, fungos, bactérias e semelhantes. De facto, como 80 notado, a apresentação fágica é uma técnica especialmente relevante para a produção de tais polipéptidos. Adicionalmente a Sambrook, Berger e Ausubel, detalhes com respeito a cultura celular pode consultar-se em Payne et al. (1992) Plant Cell e

Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nova Iorque, NI; Gamborg e Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nova Iorque) e Atlas e Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL. É também aqui descrita a alteração de domínios monoméricos e/ou multímeros para melhorar propriedades farmacológicas, para reduzir imunogenicidade ou para facilitar o transporte do multímero e/ou domínio monomérico para dentro de uma célula ou tecido (e. g., através da barreira hematoencefálica ou através da pele). Estes tipos de alterações incluem uma variedade de modificações (e. g., a adição de grupos de açúcar ou glicosilação), a adição de PEG, a adição de domínios de proteína que se ligam a uma determinada proteína (e. g., HAS ou outra proteína sérica), a adição de fragmentos ou sequências de proteína que sinalizam o movimento ou transporte para dentro, fora e através de uma célula. Também podem ser adicionados componentes adicionais a um multímero e/ou domínio monomérico, para manipular as propriedades do multímero e/ou domínio monomérico. Também podem ser adicionados uma variedade de componentes incluindo, e. g., um domínio que se liga a um receptor conhecido (e. g., um domínio proteico de região Fc que se liga a um receptor Fc), toxina(s) ou parte de uma toxina, um prodomínio que pode ser opcionalmente clivado para activar o multímero ou domínio monomérico, uma molécula repórter (e. g., proteína verde fluorescente, um componente que se liga a uma 81 molécula repórter (tal como um radionuclíeo para radioterapia, biotina ou avidina) ou uma combinação de modificações. 5. Kits - Aqui descritos Apenas para Referência São aqui descritos kits compreendendo os componentes necessários nos métodos (tipicamente numa forma não misturada) e componentes de kit (materiais de acondicionamento, instruções para utilização dos componentes e/ou os métodos, um ou mais recipientes (tubos de reacção, colunas, etc.)) para conter os componentes. Os kits podem conter uma biblioteca de multímeros ou um único tipo de multímero. Os kits também podem incluir reagentes adequados para promoção da ligação da molécula alvo, tais como tampões ou reagentes que facilitam a detecção, incluindo moléculas marcadas de um modo detectável. Nos kits da invenção também podem ser incluídos padrões para calibração da ligação de ligando a um domínio monomérico ou semelhantes. São também aqui descritos ensaios de ligação e kits comercialmente valiosos para praticar os ensaios. Em alguns dos ensaios são empregues um ou mais ligandos para detectar a ligação de um domínio monomérico e/ou multímero. Tais ensaios são baseados em qualquer método conhecido na técnica, e. g., citometria de fluxo, microscopia fluorescente, ressonância de plasmónio e semelhantes, para detectar a ligação de ligando(s) ao domínio monomérico e/ou multímero.

Também são proporcionados kits baseados no ensaio. Os kits tipicamente incluem um recipiente e um ou mais ligandos. Os kits compreendem, opcionalmente, indicações para a realização dos ensaios, reagentes de detecção adicionais, tampões ou instruções 82 para a utilização de qualquer destes componentes ou semelhantes. Alternativamente, os kits podem incluir células, vectores, (e. g. , vectores de expressão, vectores de secreção compreendendo um polipéptido da invenção), para a expressão de um domínio monomérico e/ou um multímero da invenção. 6. Sistemas Integrados - Descritos Apenas para Referência

Também são aqui descritos computadores, meios informáticos sistemas integrados compreendendo cadeias de caracteres, correspondente a domínios monoméricos, domínios monoméricos seleccionados, multímeros e/ou multímeros seleccionados e ácidos nucleicos codificando tais polipéptidos. Estas sequências podem ser manipuladas por métodos de rearranjo in silico ou por alinhamento de sequência padrão ou software de processamento de texto.

Por exemplo, diferentes tipos de semelhança e considerações de estringência e comprimento de cadeia de caracteres diversos podem ser detectados e reconhecidos nos presentes sistemas integrados. Por exemplo, foram concebidos muitos métodos de determinação de homologia para análise comparativa de sequências de biopolímeros, correcção ortográfica em processamento de texto e para recuperação de dados a partir de diversas bases de dados. Com uma compreensão de interacções de complemento de emparelhamento de hélice dupla entre as 4 principais nucleobases em polinucleótidos naturais, também podem ser utilizados modelos que simulem o emparelhamento de cadeias polinucleotídicas homólogas complementares como uma fundação de alinhamento de sequência ou outras operações tipicamente realizadas nas cadeias de caracteres correspondendo às presentes sequências (e. g., 83 manipulações de processamento de texto, construção de figuras compreendendo cadeias de caracteres de sequência ou subsequência, tabelas de resultados, etc.). Um exemplo de um pacote de software com GO para cálculo de semelhança de sequência é o BLAST, o qual pode ser adaptado à presente invenção através da inserção de cadeias de caracteres correspondendo às presentes sequências. 0 BLAST é descrito em Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. O software para realização de análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (disponível na Internet em ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de sequências de pontuação elevada (HSP), através da identificação de palavras curtas, de comprimento W, na sequência de pesquisa que, ou corresponde ou satisfaz alguma pontuação limiar, de valor positivo T, quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento numa sequência de base de dados. T é referido como o limiar de pontuação de palavra de vizinhança (Altschul et al., supra). Estes acertos de palavras de vizinhança iniciais actuam como sementes para o início de pesquisas para encontrar HSP mais longos contendo-os. Os acertos de palavras são, depois, estendidos em ambas as direcções ao longo de cada sequência, tanto quanto a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas utilizando, para sequências nucleotídicas, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre >0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, é utilizada uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavra em cada direcção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento 84 cumulativa cai pela quantidade X do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, em virtude da acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou o fim de qualquer das sequências seja alcançado. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. 0 programa BLASTN (para sequências nucleotídicas) utiliza como predefinições um tamanho de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, uma exclusão de 100, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como predefinições um tamanho de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff &

Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915).

Um exemplo adicional de um algoritmo de alinhamento de sequências é o PILEUP. O PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas utilizando alinhamentos progressivos aos pares. Também pode representar graficamente uma árvore mostrando relações de agrupamento utilizadas para criar o alinhamento. O PILEUP utiliza uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. O método

utilizado é semelhante ao método descrito por Higgins & Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153. O programa pode alinhar, e. g., até 300 sequências de um comprimento máximo de 5000 letras. O processo de alinhamento múltiplo começa com o alinhamento aos pares das duas sequências mais semelhantes, produzindo um agrupamento de duas sequências alinhadas. Este agrupamento pode ser, depois, alinhado com a próxima sequência mais relacionada ou agrupamento de sequências alinhadas. Dois agrupamentos de sequências podem ser alinhados por uma extensão simples do alinhamento aos pares de duas sequências individuais. O 85 alinhamento final é alcançado por uma série de alinhamentos progressivos, aos pares. 0 programa também pode ser utilizado para representar graficamente uma representação de dendrograma ou árvore de relações de agrupamento. 0 programa é corrido designando sequências específicas e suas coordenadas de aminoácido ou nucleótido para regiões de comparação de sequência. Por exemplo, com o fim de determinar aminoácidos conservados numa família de domínios monoméricos ou para comparar as sequências de domínios monoméricos numa família, a sequência da invenção ou ácidos nucleicos codificantes, é alinhada para proporcionar informação de estrutura-função.

Num aspecto aqui descrito, o sistema informático é utilizado para realizar recombinação ou rearranjo de sequência “in silico" de cadeias de caracteres correspondendo aos domínios monoméricos. Uma variedade desses método é exposta em "Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics" por Selifonov e Stemmer, apresentado a 5 de Fevereiro de 1999 (USSN 60/118854) e "Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics" por Selifonov e Stemmer, apresentado a 12 de Outubro de 1999 (USSN 09/416,375). Em resumo, são utilizados operadores genéticos em algoritmos genéticos para alterar sequências dadas, e. g., através de mimetização de eventos genéticos, tais como mutação, recombinação, morte e semelhantes. A análise multidimensional para optimizar sequências também pode ser realizada no sistema informático, e. g., como descrito no "pedido 375".

Um sistema digital também pode instruir um sintetizador oligonucleotídico para sintetizar oligonucleótidos, e. g., utilizado para reconstrução ou recombinação génica, ou para 86 encomendar oligonucleótidos de fontes comerciais (e. g., através da impressão de formulários de encomenda apropriados ou através de ligação a um formulário de encomenda a partir da Internet). 0 sistema digital também pode incluir elementos de saída para controlar a síntese de ácidos nucleicos (e. g., baseados numa sequência ou num alinhamento de um domínio monomérico recombinante, e. g., rearranjado, como aqui), i. e., um sistema integrado da invenção inclui, opcionalmente, um sintetizador oligonucleotídico ou um controlador de síntese oligonucleotídico. 0 sistema pode incluir outras operações que ocorram a jusante de um alinhamento ou outra operação realizada utilizando uma cadeia de caracteres correspondendo a uma sequência presente, e. g., como notado anteriormente fazendo referência a ensaios.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar mas não para limitar a invenção reivindicada.

Exemplo 1

Este exemplo descreve a selecção de domínios monoméricos e a criação de multímeros.

Os materiais de partida para identificação de domínios monoméricos e criação de multímeros a partir dos domínios monoméricos seleccionados e processos podem ser derivados de qualquer de uma variedade de sequências humanas e/ou não humanas. Por exemplo, para produzir um domínio monomérico 87 seleccionado com ligação específica para um ligando desejado ou mistura de ligandos, um ou mais gene(s) de domínios monoméricos é (são) seleccionados de uma família de domínios monoméricos que se ligam a um determinado ligando. As sequências de ácidos nucleicos codificando o um ou mais genes de domínios monoméricos podem ser obtidas por amplificação por PCR de ADN genómico ou ADNc ou, opcionalmente, podem ser produzidos sinteticamente utilizando oligonucleótidos de sobreposição.

Mais geralmente, estas sequências são, depois, clonadas num formato de apresentação de superfície celular (i. e., apresentação de superfície celular bacteriana, de levedura ou de mamífero (COS); apresentação fágica) para expressão e rastreio. As sequências recombinantes são transfectadas (transduzidas ou transformadas) para dentro da célula hospedeira apropriada, onde são expressas e apresentadas à superfície celular. Por exemplo, as células podem ser coradas com um ligando marcado desejado (e. g. , marcado fluorescentemente). As células coradas são tríadas por citometria de fluxo e os domínios monoméricos seleccionados codificando genes são recuperados (e. g., por isolamento plasmídico, PCR ou expansão e clonagem) a partir das células positivas. 0 processo de coloração e triagem pode ser repetido múltiplas vezes (e. g., utilizando concentrações progressivamente decrescentes do ligando desejado até que um nível desejado de enriquecimento seja obtido). Alternativamente, pode ser empregue qualquer método de rastreio ou detecção conhecido na técnica que possa ser utilizado para identificar células que se ligam ao ligando desejado ou mistura de ligandos. 0 domínio monomérico seleccionado, codificando genes recuperados a partir do ligando desejado ou mistura de ligandos ligando-se a células pode ser, opcionalmente, recombinado de acordo com qualquer dos métodos aqui descritos ou nas referências citadas. As sequências recombinantes produzidas nesta série de diversificação são, depois, rastreadas pelo mesmo método ou um método diferente, para identificar genes recombinantes com afinidade melhorada para o ligando desejado ou ligando alvo. 0 processo de diversificação e selecção é opcionalmente repetido até que uma desejada afinidade seja obtida.

Os ácidos nucleicos de domínios monoméricos seleccionados, seleccionados pelos métodos podem ser unidos entre si por meio de uma sequência ligante, para criar multímeros, e. g., pelo agrupamento combinatório de sequências de ácidos nucleicos codificando domínios monoméricos seleccionados por ligação de ADN ou, opcionalmente, reacções de sobreposição baseadas em PCR, de auto-iniciação. As sequências de ácidos nucleicos codificando os multímeros são, depois, clonadas num formato de apresentação de superfície celular (i. e., apresentação de superfície celular bacteriana, de levedura ou de mamífero (COS); apresentação fágica) para expressão e rastreio. As sequências recombinantes são transfectadas (transduzidas ou transformadas) para dentro da célula hospedeira apropriada, onde são expressas e apresentadas à superfície celular. Por exemplo, as células podem ser coradas com um ligando desejado, ou mistura de ligandos, marcado, e. g., marcado fluorescentemente. As células coradas são tríadas por citometria de fluxo e os multímeros seleccionados codificando genes são recuperados (e. g., por PCR ou expansão e clonagem) a partir das células positivas. As células positivas incluem multímeros com uma avidez ou afinidade melhorada ou especificidade alterada para o ligando desejado ou mistura de ligandos, em comparação com o(s) domínio(s) monomérico(s) seleccionado(s). 0 processo de coloração e triagem pode ser 89 repetido múltiplas vezes (e. g., utilizando concentrações progressivamente decrescentes do ligando desejado, ou mistura de ligandos, até que um nível desejado de enriquecimento seja obtido). Alternativamente, pode ser empregue qualquer método de rastreio ou detecção conhecido na técnica que possa ser utilizado para identificar células que se ligam ao ligando desejado ou mistura de ligandos. 0 multímero seleccionado, codificando genes recuperados a partir do ligando desejado ou mistura de ligandos ligando-se a células pode ser, opcionalmente, recombinado de acordo com qualquer dos métodos aqui descritos ou nas referências citadas. As sequências recombinantes produzidas nesta série de diversificação são, depois, rastreadas pelo mesmo método ou um método diferente, para identificar genes recombinantes com avidez ou afinidade melhorada ou especificidade alterada para o ligando desejado ou ligando alvo. 0 processo de diversificação e selecção é opcionalmente repetido até que uma desejada avidez ou afinidade ou especificidade alterada seja obtida.

Exemplo 2

Este exemplo descreve o desenvolvimento de uma biblioteca de multímeros constituídos por domínios C2. É criada uma biblioteca de sequências de ADN codificando domínios C2 monoméricos através de PCR de agrupamento, como descrito em Stemmer et al.. Gene 164, 49-53 (1995) Os oligonucleótidos utilizados nesta reacção de PCR sao: 90 5'-acactgcaatcgcgccttacggctCCCGGGCGGATCCtcccataagttca 5' -agctaccaaagtgacaimknnknnkiinknnkiinkimknnknnkimknnknnkccatacgtcgaattgttca t 5' -agctaccaaagtgacaaaaggtgcttttggtgatatgttggatactccagatccatacgtcgaattgttca t 5' -taggaagagaacacgtcattttnnknnknnkattaaccctgtttggaacgagacctttgagt 5' -taggaagagaacacgtcattttaataatgatattaaccctgtttggaacgagacctttgagt 5' -ttggaaatcaccctaatgnnknnknnknnknnknnknnknnkactctaggtacagcaa 5' -ttggaaatcaccctaatggatgcaaattatgttatggacgaaactctaggtacagcaa 5' -aagaaggaagtcccatttattttcaatcaagttactgaaatggtcttagagatgtccctt 5'-tgtcactttggtagctcttaacacaactacagtgaacttatgggaGGA 5' -acgtgttctcttcctagaatctggagttgtactgatgaacaattcgacgta 5'-attagggtgatttccaaaacattttcttgattaggatctaatataaactcaaaggtctcgtt 5' -atgggacttccttcttttctcccactttcattgaagatacagtãaacgttgctgtacctagagt 5' -gaccgatagcttgccgattgcagtgtGGCCACAGAGGCCTCGAGaacttcaagggacatctctaaga

Os fragmentos de PCR são digeridos com BamHI e Xhol. Os produtos de digestão são separados em gel de agarose a 1,5% e os fragmentos de domínio C2 são purificados a partir do gel. Os fragmentos de ADN são ligados dentro dos sítios de restrição correspondentes do vector de apresentação de superfície pYDl (Invitrogen) A mistura de ligação é utilizada para transformação da estirpe de levedura EBY100. Os transformantes são seleccionados através do cultivo das células em meios selectivo contendo glucose (-Trp), a 30 °C.

A apresentação de superfície da biblioteca do domínio C2 é induzida através do cultivo das células em meio selectivo contendo galactose, a 20 °C. As células são enxaguadas com PBS e, depois, incubadas com proteína alvo fluorescentemente marcada e de novo enxaguadas em PBS.

As células são, depois, tríadas por FACS e as células positivas são recultivadas em meio selectivo contendo glucose. A cultura celular pode ser utilizada para uma segunda série de 91 triagem ou podem ser utilizadas para isolamento de ADN plasmidico. 0 ADN plasmidico purificado é utilizado como um molde para amplificar por PCR sequências de ADN codificando domínio C2.

Os oligonucleótidos utilizados nesta reacção de PCR são: 5' -acactacaatcacaccttacqactCAGataCTGataqttcccataaattcactata 5' -gaccgataqcttqccqattqcaqtCAGcacCTGaaccaccaccaccaqaaccaccaccaccaacttcaa gggacatctcta (a sequência ligante está sublinhada).

Os fragmentos de PCR são, depois, digeridos com AlwNI, os produtos de digestão são separados em gel de agarose a 1,5% e os fragmentos de domínio C2 são purificados a partir do gel. Subsequentemente, os fragmentos de PCR são multimerizados por ligação de ADN na presença de fragmentos de terminação. Os fragmentos de terminação são listados abaixo:

Terminaçãol: 5' -gaattcaacgctactaccattagtagaattgatgccaccttttcagctcgcgccccaaat gaaaaaatggtcaaactaaatctactcgttcgcagaattgggaatcaactgttacatggaatgaaacttccagac accgtactttatgaatatttatgacgattccgaggcgcgcccggactacccgtatgatgttccggattatgcccc gggatcctcaggtgctg-3' (digerida com EcoRI e AlwNI).

Terminaçao2: 5' -caggtgctgcactcgaggccactgcggccgcatattaacgtagatttttcctccc aacgtcctgactggtataatgagccagttcttaaaatcgcataaccagtacatggtgattaaagttgaaattaaa ccgtctcaagagctttgttacgttgatttgggtaatgaagctt-3' (digerida com AlwNI e HindIII). 92 A mistura de ligação é, depois, digerida com EcoRI e HindiII.

Os multimeros são separados em gel de agarose a 1% e os fragmentos de ADN correspondendo a terminaçãol-C2-C2-terminação2 são purificados a partir do gel. Os fragmentos terminaçãol-C2-C2-terminação2 são amplificados por PCR utilizando os iniciadores 5' aattcaacgctactaccat-3' e 5'-agcttcattacccaaatcaac-3' e subsequentemente digeridos com BamHI e Xhol. Opcionalmente, os polinucleótidos codificando os multimeros podem ser submetidos a uma série adicional de rastreio de afinidade (e. g. , análise FACS, como anteriormente descrito).

Subsequentemente, os ligantes de elevada afinidade são isolados e sequenciados. 0 ADN codificando os ligantes de elevada afinidade é clonado em vector de expressão e replicado num hospedeiro adequado. As proteínas expressas são purificadas e caracterizadas.

Exemplo 3

Este exemplo descreve o desenvolvimento de uma biblioteca de trimeros compreendidos por domínios A do receptor de LDL. É criada uma biblioteca de sequências de ADN codificando domínios A monoméricos através de PCR de agrupamento, como descrito em Stemmer et al.r Gene 164, 49-53 (1995) . Os oligonucleótidos utilizados nesta reacção de PCR são: 93

5' -CACTATGCATGGACTCAGTGTGTCCGATAAGGGCACACGGTGCCTACCCGTATGATGTTCCGGATTATGCC CCGGGCAGTA

5' -CGCCGTCGCATMSCMAGYKCNSAGRAATACAWYGGCCGYTWYYGCACBKAAATTSGYYAGVCNSACAGGTA CTGCCCGGGGCAT

5' -CGCCGTCGCATMSCMATKCCNSAGRAATACAWYGGCCGYTWYYGCACBKAAATTSGYYAGVCNSACAGGTA CTGCCCGGGGCAT

5' -ATGCGACGGCGWWRATGATTGTSVAGATGGTAGCGATGAAVWGRRTTGTVMAVNMVNMVGCCVTACGGGCT CGGCCTCT

5 1 -ATGCGACGGCGWWCCGGATTGTSVAGATGGTAGCGATGAAVWGRRTTGTVMAVNMVNMVGCCVTACGGGCT CGGCCTCT

5' -ATGCGACGGCGWWRATGATTGTSVAGATAACAGCGATGAAVWGRRTTGTVMAVNMVNMVGCCVTACGGGCT CGGCCTCT

5' -ATGCGACGGCGWWCCGGATTGTSVAGATAACAGCGATGAAVWGRRTTGTVMAVNMVNMVGCCVTACGGGCT CGGCCTCT

5' - TCCTGGTAGTACTTATCTACTACTATTTGTCTGTGTCTGCTCTGGGTTCCTAACGGTTCGGCCACAGAGGC CGAGCCCGTA onde R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/T, B=C/G/T, D=A/G/T, H=A/C/T, V=A/C/G e N=A/C/G/T.

Os fragmentos de PCR são digeridos com Xmal e Sfil. Os produtos de digestão são separados em gel de agarose a 3% e os fragmentos de domínio A são purificados a partir do gel. Os fragmentos de ADN são, depois, ligados dentro dos sítios de restrição correspondentes do vector de apresentação fágica fuse5-HA, um derivado de fuse5. A mistura de ligação é submetida a electroforese dentro de células E. coli electrocompetentes (estirpe F, e. g., ToplO ou MC1061). As células E. coli transformadas são cultivadas, de um dia para o outro, em meio 2xYT contendo tetraciclina a 20 pg/mL.

Os viriões são purificados a partir desta cultura por precipitação com PEG. A proteína alvo é imobilizada em superfície sólida (e. g., placa de Petri ou placa de microtitulação) directamente através de incubação em NaHC03 a 0,1 M ou indirectamente por meio de uma ligação de biotina-estreptavidina. Os viriões purificados são adicionados a um 94 número típico de ~l-3 x 1011 TU. A placa de Petri ou placa de microtitulação é incubada a 4 °C, lavada várias vezes com tampão de lavagem (TBS/Tween) e os fagos ligados são eluídos através da adição de tampão glicina.HCl. 0 eluato é neutralizado através da adição de Tris-HCl a 1 M (pH 9,1)

Os fagos são amplificados e subsequentemente utilizados como entrada para uma segunda série de selecção de afinidade. É extraído ADNss do eluato final utilizando o kit QIAprep Ml3. 0 ADNss é utilizado como um molde para amplificar por PCR sequências de ADN codificando domínios A.

Os oligonucleótidos utilizados nesta reacção de PCR são: 5'-aagcctcagcgaccgaa 5'-agcccaataggaacccat

Os fragmentos de PCR são digeridos com AlwNI e BglI. Os produtos de digestão são separados em gel de agarose a 3% e os fragmentos de domínio A são purificados a partir do gel. Os fragmentos de PCR são multimerizados por ligação de ADN na presença dos seguintes fragmentos de terminação:

Terminaçaol: 5' -gaattcaacgctactaccattagtagaattgatgccaccttttcagctcgcgccccaaatgaaaaaatggt caaactaaatctactcgttcgcagaattgggaatcaactgttacatggaatgaaacttccagacaccgtacttta tgaatatttatgacgattccgaggegcgcccggactacccgtatgatgttccggattatgccccgggcggatcca gtacctg-3' (digerida com EcoRI e AlwNI) 95

Terminaçao2: 5' -gccctacgggcctcgaggcacctggtgcggccgcatattaacgtagatttttcctcccaacgtcctgactg gtataatgagccagttcttaaaatcgcataaccagtacatggtgattaaagttgaaattaaaccgtctcaagagc tttgttacgttgatttgggtaatgaagott-3' (digerida com Bgll e HindIII) A mistura de ligação é digerida com EcoRI e HindIII.

Os multimeros são separados em gel de agarose a 1% e os fragmentos de ADN correspondendo a terminaçãol-A-A-A-terminação2 são purificados a partir do gel. Os fragmentos terminaçãol-A-A-A-terminação2 são subsequentemente amplificados por PCR utilizando os iniciadores 5'-agcttcattacccaaatcaac-3' e 5' aattcaacgctactaccat-3' e subsequentemente digeridos com Xmal e Sfil. Os polinucleótidos seleccionados são, depois, clonados num sistema de expressão fágico e testados para afinidade para a proteina alvo.

Ligantes de elevada afinidade são subsequentemente isolados e sequenciados. 0 ADN codificando os ligantes de elevada afinidade é clonado em vector de expressão e subsequentemente expresso num hospedeiro adequado. A proteína expressa é, depois, purificada e caracterizada.

Lisboa, 27 de Setembro de 2010 96

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para identificação de um multimero que se liga a uma molécula alvo, compreendendo o método, (a) proporcionar uma biblioteca de polipéptidos, compreendendo os polipéptidos diferentes domínios monoméricos, em que cada domínio monomérico tem 30-100 aminoácidos, compreende, pelo menos, duas ligações dissulfureto e é um domínio do receptor de LDL de classe A; (b) rastrear a biblioteca de polipéptidos para afinidade para uma molécula alvo; (c) identificar, pelo menos, um primeiro polipéptido compreendendo um primeiro domínio monomérico que se liga especificamente a uma molécula alvo; (d) ligar o primeiro domínio monomérico a uma pluralidade de domínios monoméricos diferentes, para formar uma biblioteca de multímeros diferentes, compreendendo os multímeros o primeiro domínio monomérico e um da pluralidade de domínios monoméricos diferentes; (e) rastrear a biblioteca de multímeros para a capacidade para se ligarem à molécula alvo; e (f) identificar um multimero que se liga especificamente à molécula alvo, em que o multimero compreende o primeiro domínio monomérico e um segundo domínio monomérico.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que o multimero seleccionado compreende, pelo menos, três domínios monoméricos. 1 3. Método de qualquer reivindicação anterior, em que a biblioteca de multímeros é expressa como uma apresentação fágica, apresentação ribossómica ou apresentação de superfície celular.
3. 4. Método de qualquer reivindicação anterior, em que os domínios monoméricos são ligados por um ligante polipeptídico heterólogo.
4. 5. Método para identificação de um multímero que se liga a, pelo menos, uma molécula alvo, compreendendo o método: (a) proporcionar uma biblioteca de multímeros, em que cada multímero compreende, pelo menos, dois domínios monoméricos, em que cada domínio monomérico tem 30-100 aminoácidos e compreende, pelo menos, duas ligações dissulfureto, separadas por um ligante heterólogo, em que os domínios monoméricos são domínios do receptor de LDL de classe A; e (b) rastrear a biblioteca de multímeros para multímeros ligando-se à molécula alvo.
5. 6. Método da reivindicação 5, compreendendo, adicionalmente, a identificação de multímeros ligando-se à molécula alvo, tendo uma avidez para a molécula alvo que é superior à avidez de um único domínio monomérico para a molécula alvo.
6. 7. Método da reivindicação 5 ou reivindicação 6, em que um ou mais dos multímeros compreende um domínio monomérico que se liga especificamente a uma segunda molécula alvo. 2 Biblioteca de multimeros, em que (a) cada multimero compreende, pelo menos, dois domínios monoméricos, juntos por um ligante heterólogo, em que cada domínio monomérico tem 30-100 aminoácidos e compreende, pelo menos, duas ligações dissulfureto; e (b) os domínios monoméricos são domínios do receptor de LDL de classe A.
7. 9 . Biblioteca da reivindicação 8, em que cada domínio monomérico dos multimeros é um domínio monomérico de ocorrência não natural. O \—1 Biblioteca da reivindicação 8, em que os domínios monoméricos são ligados por um ligante polipeptídico.
8. 11. Método ou biblioteca de qualquer reivindicação anterior, em que a biblioteca contém, pelo menos, 100 membros.
9. 12. Polipéptido compreendendo, pelo menos, dois domínios monoméricos, separados por um ligante heterólogo, em que cada domínio monomérico tem 30-100 aminoácidos e compreende, pelo menos, duas ligações dissulfureto, em que cada domínio monomérico se liga especificamente a uma molécula alvo e em que os domínios monoméricos são domínios do receptor de LDL de classe A.
10. 13. Polipéptido da reivindicação 12, em que cada domínio monomérico é um domínio monomérico proteico de ocorrência não natural. 3
11. 14. Polipéptido da reivindicação 12, em que o polipéptido compreende um primeiro domínio monomérico que se liga a uma primeira molécula alvo e um segundo domínio monomérico que se liga a uma segunda molécula alvo.
12. 15. Polipéptido da reivindicação 12, em que o polipéptido compreende dois domínios monoméricos, cada domínio monomérico tendo uma especificidade de ligação para um sítio diferente numa primeira molécula alvo.
13. 16. Polipéptido da reivindicação 12, em que o polipéptido compreende, pelo menos, três domínios monoméricos.
14. 17. Polipéptido da reivindicação 12, em que os domínios monoméricos são ligados por um ligante polipeptídico. Lisboa, 27 de Setembro de 2010 4