JP6008837B2 - アラニルtRNA合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見 - Google Patents
アラニルtRNA合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見 Download PDFInfo
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Description
本願は、米国特許法第119条(e)の下、2010年4月28日に出願された米国特許仮出願第61/329,048号、2010年4月28日に出願された米国特許仮出願第61/328,867号および2010年4月28日に出願された米国特許仮出願第61/328,871号の利益を主張するものであり、上記各明細書の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、ここにおいて参照により本明細書に組み込まれる。配列表を掲載しているテキストファイル名は120161_426PC_SEQUENCE_LISTING.txtである。このテキストファイルは約281KBであり、2011年4月22日に作成され、EFS−Webを介して電子的に提出されている。
一実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
(項目1)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも100アミノ酸の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントを含み、前記タンパク質フラグメントの溶解度が少なくとも約5mg/mLである組成物であって、純度がタンパク質ベースで少なくとも約95%、エンドトキシンが約10EU/mgタンパク質未満であり、かつ実質的に無血清である、組成物。
(項目2)
前記AARSタンパク質フラグメントが、配列番号59、配列番号43、配列番号81および配列番号142からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記AARSタンパク質フラグメントが非カノニカルな生物活性を含む、項目1〜2のいずれかに記載の組成物。
(項目4)
前記非カノニカルな生物活性が、細胞外シグナル伝達の調節、細胞増殖の調節、細胞分化の調節、遺伝子転写の調節、サイトカイン産生または活性の調節、サイトカイン受容体活性の調節および炎症の調節から選択される、項目3に記載の組成物。
(項目5)
前記非カノニカルな生物活性が遺伝子転写の調節である、項目4に記載の組成物。
(項目6)
前記AARSタンパク質フラグメントが異種ポリペプチドと融合している、項目1〜5のいずれかに記載の組成物。
(項目7)
前記AARSタンパク質フラグメントの非カノニカルな活性を実質的に保持している、項目6に記載のAARS融合タンパク質。
(項目8)
前記AARSタンパク質フラグメントの非カノニカルな活性を抑制する、項目6に記載のAARS融合タンパク質。
(項目9)
前記異種ポリペプチドが、前記AARSタンパク質フラグメントのN末端に結合している、項目6に記載のAARS融合タンパク質。
(項目10)
前記異種ポリペプチドが、前記AARSタンパク質フラグメントのC末端に結合している、項目6に記載のAARS融合タンパク質。
(項目11)
前記異種ポリペプチドが、精製タグ、エピトープタグ、標的化配列、シグナルペプチド、膜転位配列およびPK調節物質からなる群より選択される、項目6に記載のAARS融合タンパク質。
(項目12)
AARSタンパク質フラグメントを少なくとも約10mg/mLの濃度で含む、項目1〜5のいずれかに記載の組成物。
(項目13)
前記AARSタンパク質フラグメントが少なくとも90%の単分散である、項目12に記載の組成物。
(項目14)
約3%未満の高分子量凝集タンパク質を含む、項目12または13に記載の組成物。
(項目15)
4℃で1週間、PBS中で少なくとも10mg/mLの濃度で保管された場合に3%未満の凝集を示す、項目12〜14のいずれかに記載の組成物。
(項目16)
約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11個のアミノ酸の置換、削除および/または付加により、表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のアミノ酸配列とは異なる少なくとも100アミノ酸の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントを含み、前記改変タンパク質フラグメントが未改変の前記タンパク質の非カノニカルな活性を実質的に保持し、溶解度が少なくとも約10mg/mLである組成物であって、純度がタンパク質ベースで少なくとも約95%、エンドトキシンが約10EU/mgタンパク質未満であり、かつ実質的に血清が混入していない、組成物。
(項目17)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントと特異的に結合する単離抗体を含む組成物であって、前記AARSタンパク質フラグメントに対する前記抗体の親和性が、対応する完全長AARSポリペプチドに対するその親和性よりも約10倍強く、前記抗体が、前記AARSタンパク質フラグメントの非カノニカルな活性に拮抗する、組成物。
(項目18)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントと特異的に結合する単離抗体を含む組成物であって、前記抗体が、前記AARSタンパク質フラグメントに対する少なくとも約10nMの親和性と、対応する完全長AARSポリペプチドに対する少なくとも約100nMの親和性とを有する、組成物。
(項目19)
前記抗体が、表1〜3(1つもしくは複数)もしくは表4〜6(1つもしくは複数)もしくは表7〜9(1つもしくは複数)のいずれかに記載のAARSポリペプチド固有のスプライスジャンクション内にあるエピトープまたはこのスプライス部位のアミノ酸配列C末端と結合する、項目17または18のいずれかに記載の組成物。
(項目20)
前記抗体が、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号130、配列番号132、配列番号134および配列番号136からなる群より選択される少なくとも5個の連続するアミノ酸を含むエピトープと結合する、項目17または18のいずれかに記載の組成物。
(項目21)
前記AARSポリペプチドの非カノニカルな活性に拮抗する、項目17または18のいずれかに記載の組成物。
(項目22)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも100アミノ酸の実質的に純粋なアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントと、前記AARSタンパク質フラグメントと結合する結合パートナーとを含む、バイオアッセイ系。
(項目23)
前記結合パートナーが、細胞表面受容体タンパク質、核酸、脂質膜、細胞調節タンパク質、酵素および転写因子からなる群より選択される、項目22に記載のバイオアッセイ系。
(項目24)
前記AARSタンパク質フラグメントが、配列番号59、配列番号43、配列番号81および配列番号142からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、項目22に記載の組成物。
(項目25)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも100アミノ酸の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントと、少なくとも1個の細胞が前記AARSタンパク質フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む操作された細胞集団とを含み、前記細胞が無血清培地で増殖することができる、細胞組成物。
(項目26)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも100アミノ酸の実質的に純粋なアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントと、前記タンパク質フラグメントと結合する細胞表面受容体またはその細胞外部分を含む細胞と、前記AARSタンパク質フラグメントと前記細胞外受容体との結合または相互作用を調節する約2000ダルトン未満の分子または第二のポリペプチドとを含む、検出系。
(項目27)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも100アミノ酸の実質的に純粋なアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントと、前記タンパク質フラグメントと特異的に結合する細胞表面受容体またはその細胞外部分を含む細胞とを含み、前記細胞が、前記細胞表面受容体またはその細胞外部分のレベルまたは活性の変化の検出を可能にする指示分子を含む、診断系。
(項目28)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)に記載されているアミノ酸配列を含む少なくとも100アミノ酸の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントと、少なくとも1個の細胞が前記AARSタンパク質フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む操作された細胞集団と、少なくとも約10リットルの無血清増殖培地と、無菌容器とを含む、細胞増殖装置。
(項目29)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数に)に記載のAARSスプライスバリアント固有のスプライスジャンクションを標的とする配列を含む、アンチセンスまたはRNA干渉(RNAi)剤。
(項目30)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも100アミノ酸の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントを含み、前記タンパク質フラグメントが、結合パートナー特異的と結合して生理作用を及ぼし、かつ少なくとも約5mg/mLの溶解度を有する治療用組成物であって、純度がタンパク質ベースで少なくとも約95%、エンドトキシンが約10EU/mgタンパク質未満である、治療用組成物。
(項目31)
前記AARSタンパク質フラグメントが、配列番号12、配列番号59、配列番号43、配列番号81および配列番号142からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、項目29に記載の治療用組成物。
(項目32)
前記結合パートナーが、細胞表面受容体、核酸、脂質膜、調節タンパク質、酵素および転写因子からなる群より選択される、項目29または30に記載の治療用組成物。
(項目33)
前記AARSタンパク質フラグメントが異種ポリペプチドと融合している、項目29または30に記載の治療用組成物。
(項目34)
前記AARS融合タンパク質が、前記AARSタンパク質フラグメントの非カノニカルな活性を実質的に保持している、項目32に記載の治療用組成物。
(項目35)
前記AARS融合タンパク質が、前記AARSタンパク質フラグメントの非カノニカルな活性を抑制する、項目32に記載の治療用組成物。
(項目36)
前記異種ポリペプチドが、前記AARSタンパク質フラグメントのN末端に結合している、項目32に記載の治療用組成物。
(項目37)
前記異種ポリペプチドが、前記AARSタンパク質フラグメントのC末端に結合している、項目32に記載の治療用組成物。
(項目38)
前記異種ポリペプチドが、精製タグ、エピトープタグ、標的化配列、シグナルペプチド、膜転位配列およびPK調節物質からなる群より選択される、項目32に記載の治療用組成物。
(項目39)
AARSタンパク質フラグメントを少なくとも約10mg/mLの濃度で含む、項目29〜30のいずれかに記載の治療用組成物。
(項目40)
前記AARSタンパク質フラグメントが少なくとも90%の単分散である、項目29〜30のいずれかに記載の治療用組成物。
(項目41)
約3%未満の高分子量凝集タンパク質を含む、項目39に記載の治療用組成物。
(項目42)
4℃で1週間、PBS中で少なくとも10mg/mLの濃度で保管された場合に3%未満の凝集を示す、項目39に記載の治療用組成物。
(項目43)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または100%同一である少なくとも100アミノ酸の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントを含み、前記タンパク質フラグメントの溶解度が少なくとも約5mg/mLである組成物であって、純度がタンパク質ベースで少なくとも約95、エンドトキシンが約10EU/mgタンパク質未満である、組成物。
(項目44)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも100アミノ酸の実質的に純粋なアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントと、それと共有結合または非共有結合している少なくとも1つの部分とを含む、組成物。
(項目45)
前記AARSタンパク質フラグメントが、配列番号12、配列番号59、配列番号43、配列番号81および配列番号142からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、項目42に記載の組成物。
(項目46)
前記部分が検出可能な標識である、項目42または43に記載の組成物。
(項目47)
前記部分が水溶性ポリマーである、項目42または43に記載の組成物。
(項目48)
前記水溶性ポリマーがPEGである、項目42または43に記載の組成物。
(項目49)
前記部分が前記タンパク質フラグメントのN末端に結合している、項目42または43に記載の組成物。
(項目50)
前記部分が前記タンパク質フラグメントのC末端に結合している、項目42または43に記載の組成物。
(項目51)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも100アミノ酸の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントと結合した固体基質を含み、前記タンパク質フラグメントの溶解度が少なくとも約5mg/mLである組成物であって、純度がタンパク質ベースで少なくとも約95%である、組成物。
(項目52)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質フラグメントと特異的に結合する結合物質を含み、前記結合物質が、前記タンパク質フラグメントに対して少なくとも約1nMの親和性を有する、組成物。
(項目53)
前記結合物質が、表1〜3(1つもしくは複数)もしくは表4〜6(1つもしくは複数)もしくは表7〜9(1つもしくは複数)のいずれかに記載のAARSポリペプチド固有のスプライスジャンクション内にあるエピトープまたはこのスプライス部位のアミノ酸配列C末端と結合する、項目52に記載の組成物。
(項目54)
前記結合物質が、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号130、配列番号132、配列番号134および配列番号136からなる群より選択される少なくとも5個の連続するアミノ酸を含むエピトープと結合する、項目52に記載の組成物。
(項目55)
前記AARSポリペプチドの非カノニカルな活性に拮抗する、項目52に記載の組成物。
(項目56)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のAARSタンパク質フラグメントのアミノ酸配列を含む、単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチド。
(項目57)
前記AARSポリペプチドが、配列番号59、配列番号43、配列番号81および配列番号142からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目56に記載の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチド。
(項目58)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかの配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または100%同一であるアミノ酸配列を含む、単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチド。
(項目59)
前記AARSポリペプチドが、配列番号12、配列番号59、配列番号43、配列番号81および配列番号142からなる群より選択される、項目58に記載の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチド。
(項目60)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかの配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または100%同一であるアミノ酸配列から実質的になる、単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチド。
(項目61)
前記AARSポリペプチドが、配列番号12、配列番号59、配列番号43、配列番号81および配列番号142からなる群より選択される、項目60に記載の単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチド。
(項目62)
非カノニカルな生物活性を含む、項目61に記載のポリペプチド。
(項目63)
前記非カノニカルな生物活性が、細胞外シグナル伝達の調節、細胞増殖の調節、細胞分化の調節、遺伝子転写の調節、サイトカイン産生または活性の調節、サイトカイン受容体活性の調節および炎症の調節から選択される、項目62に記載のポリペプチド。
(項目64)
前記非カノニカルな生物活性が転写の調節である、項目63に記載のポリペプチド。
(項目65)
前記AARSタンパク質フラグメントが異種ポリペプチドと融合している、項目62に記載のポリペプチド。
(項目66)
前記AARSタンパク質フラグメントの非カノニカルな活性を実質的に保持している、項目65に記載のAARS融合タンパク質。
(項目67)
前記AARSタンパク質フラグメントの非カノニカルな活性を抑制する、項目65に記載のAARS融合タンパク質。
(項目68)
前記異種ポリペプチドが、前記AARSタンパク質フラグメントのN末端に結合している、項目65に記載のAARS融合タンパク質。
(項目69)
前記異種ポリペプチドが、前記AARSタンパク質フラグメントのC末端に結合している、項目65に記載のAARS融合タンパク質。
(項目70)
前記異種ポリペプチドが、精製タグ、エピトープタグ、標的化配列、シグナルペプチド、膜転位配列およびPK調節物質からなる群より選択される、項目65に記載のAARS融合タンパク質。
(項目71)
AARSタンパク質フラグメントを少なくとも約10mg/mLの濃度で含む、項目62に記載の組成物。
(項目72)
少なくとも90%の単分散であるAARSタンパク質フラグメントを含む、項目62に記載の組成物。
(項目73)
約3%未満の高分子量凝集タンパク質を含む、項目62に記載の組成物。
(項目74)
4℃で1週間、PBS中で少なくとも10mg/mLの濃度で保管された場合に3%未満の凝集を示す、項目62に記載の組成物。
(項目75)
項目60に記載の単離AARSポリペプチド、前記AARSポリペプチドの結合パートナーまたはその両方に対する結合特異性を示し、前記AARSポリペプチドに対する親和性が、対応する完全長AARSポリペプチドに対するその親和性よりも約10倍強い、抗体。
(項目76)
表1〜3(1つもしくは複数)もしくは表4〜6(1つもしくは複数)もしくは表7〜9(1つもしくは複数)のいずれかに記載のAARSポリペプチド固有のスプライスジャンクション内にあるエピトープまたはこのスプライス部位のアミノ酸配列C末端と結合する、項目75に記載の抗体。
(項目77)
配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号130、配列番号132、配列番号134および配列番号136からなる群より選択される少なくとも5個の連続するアミノ酸を含むエピトープと結合する、項目75または76のいずれかに記載の抗体。
(項目78)
単離AARSポリペプチドとの結合に関して、項目75〜77のいずれかに記載の抗体と競合する抗体。
(項目79)
項目62に記載の単離AARSポリペプチドまたは前記AARSポリペプチドの結合パートナーに対して結合特異性を示す結合物質。
(項目80)
ペプチド、可溶性受容体、アドネクチン、小分子およびアプタマーから選択される、項目79に記載の結合物質。
(項目81)
前記AARSポリペプチドの非カノニカルな活性に拮抗する、項目75〜80のいずれか1項に記載の抗体または結合物質。
(項目82)
前記AARSポリペプチドの非カノニカルな活性を刺激する、項目75〜80のいずれか1項に記載の抗体または結合物質。
(項目83)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のAARSタンパク質フラグメントをコードするヌクレオチド配列、少なくとも80%の配列同一性を有するそのバリアント、そのフラグメントまたは相補体を含む、単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリヌクレオチド。
(項目84)
前記ヌクレオチド配列が、配列番号13、配列番号60、配列番号44、配列番号82および配列番号143からなる群より選択される配列と少なくとも80%同一である、項目83に記載のポリヌクレオチド。
(項目85)
前記ヌクレオチド配列が細菌発現に対してコドン最適化されている、項目83に記載のポリヌクレオチド。
(項目86)
配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号168および配列番号172から選択される配列と少なくとも80%同一である、項目85に記載のポリヌクレオチド。
(項目87)
項目83に記載のポリヌクレオチドと少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または100%同一であるヌクレオチド配列またはその相補体を含む、項目83に記載のポリヌクレオチド。
(項目88)
項目83に記載のポリヌクレオチドと少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または100%同一であるヌクレオチド配列またはその相補体から実質的になる、項目83に記載のポリヌクレオチド。
(項目89)
項目83に記載のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリヌクレオチド。
(項目90)
プライマー、プローブおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される、項目89に記載のポリヌクレオチド。
(項目91)
前記AARSポリヌクレオチドの固有のスプライスジャンクションと特異的にハイブリダイズする、項目90に記載のポリヌクレオチド。
(項目92)
試料中のAARSタンパク質フラグメントの存在またはレベルを決定する方法であって、前記試料を、表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のAARSタンパク質フラグメントと特異的に結合する1つ以上の結合物質と接触させることと、前記結合物質の有無を検出することと、これにより前記AARSタンパク質フラグメントの存在またはレベルを決定することとを含む、方法。
(項目93)
試料中のAARSタンパク質フラグメントの存在またはレベルを決定する方法であって、表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のタンパク質フラグメントを特異的に同定することができる検出器で前記試料を解析することと、これにより前記AARSタンパク質フラグメントの存在またはレベルを決定することとを含む、方法。
(項目94)
前記検出器が、質量分析器(MS)、フローサイトメータ、タンパク質イメージング装置、酵素結合免疫吸着測定(ELISA)またはタンパク質マイクロアレイである、項目93に記載の方法。
(項目95)
試料中のAARSスプライスバリアントのポリヌクレオチド配列の存在またはレベルを決定する方法であって、前記試料を、項目83に記載のAARSポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする1つ以上のオリゴヌクレオチドと接触させることと、前記試料中の前記オリゴヌクレオチドの有無を検出することと、これにより前記AARSスプライスバリアントのポリヌクレオチド配列の存在またはレベルを決定することとを含む、方法。
(項目96)
試料中のAARSスプライスバリアントのポリヌクレオチド配列の存在またはレベルを決定する方法であって、前記試料を、項目83に記載のAARSポリヌクレオチドを特異的に増幅する少なくとも2つのオリゴヌクレオチドと接触させることと、増幅反応を行うことと、増幅産物の有無を検出することと、これにより前記AARSスプライスバリアントのポリヌクレオチド配列の存在または有無を決定することとを含む、方法。
(項目97)
前記オリゴヌクレオチド(1つまたは複数)が、AARSスプライスバリアントに固有のスプライスジャンクションと特異的にハイブリダイズするか、またはこれを特異的に増幅する、項目95または96に記載の方法。
(項目98)
前記AARSタンパク質フラグメントまたはスプライスバリアントの存在またはレベルを、対照試料または所与の値と比較することをさらに含む、項目95〜97のいずれか1項に記載の方法。
(項目99)
前記試料の状態を特徴付けて、それを前記対照と区別することをさらに含む、項目98に記載の方法。
(項目100)
前記試料および対照が細胞または組織を含む項目98に記載の方法であって、異なる種間の細胞もしくは組織、異なる組織もしくは器官の細胞、異なる細胞発生段階の細胞、異なる細胞分化段階の細胞、異なる生理状態の細胞、または健常細胞と疾患細胞を区別することを含む、方法。
(項目101)
表1〜3(1つもしくは複数)もしくは表4〜6(1つもしくは複数)もしくは表7〜9(1つもしくは複数)のいずれかに記載のアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチドまたはその1つ以上の細胞結合パートナーと特異的に結合する化合物を同定する方法であって、a)前記AARSポリペプチドまたはその細胞結合パートナーまたはその両方を適当な条件下で少なくとも1つの試験化合物と結合させることと、b)前記AARSポリペプチドまたはその細胞結合パートナーまたはその両方と前記試験化合物との結合を検出することにより、前記AARSポリペプチドまたはその細胞結合パートナーまたはその両方と特異的に結合する化合物を同定することとを含む、方法。
(項目102)
前記試験化合物が、ポリペプチドもしくはペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ペプチド模倣物または小分子である、項目101に記載の方法。
(項目103)
前記試験化合物が、前記AARSポリペプチドまたはその細胞結合パートナーの非カノニカルな生物活性を完全にまたは部分的に刺激する、項目101に記載の方法。
(項目104)
前記試験化合物が、前記AARSポリペプチドまたはその細胞結合パートナーの非カノニカルな生物活性に完全にまたは部分的に拮抗する、項目101に記載の方法。
(項目105)
項目101〜104のいずれか1項に記載の方法により同定される化合物。
(項目106)
項目56〜74のいずれか1項に記載のAARSポリペプチド、項目75〜82のいずれか1項に記載の抗体もしくは結合物質、項目83〜91のいずれか1項に記載のAARSポリヌクレオチドまたは項目105に記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
(項目107)
対象における免疫応答で刺激を引き起こさない、項目106に記載の医薬組成物。
(項目108)
対象における免疫応答を刺激する少なくとも1つのアジュバントを含む、項目106に記載の医薬組成物。
(項目109)
細胞の細胞活性またはタンパク質を調節する方法であって、前記細胞またはタンパク質を、項目56〜74のいずれか1項に記載のAARSポリペプチド、項目75〜82のいずれか1項に記載の抗体または結合物質、項目83〜91のいずれか1項に記載のAARSポリヌクレオチド、項目105に記載の化合物または項目108に記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。
(項目110)
前記細胞活性が、細胞増殖、細胞分化、細胞シグナル伝達、遺伝子転写、血管新生、細胞結合、代謝、サイトカイン産生または活性、サイトカイン受容体活性および炎症から選択される、項目109に記載の方法。
(項目111)
前記細胞の型が、脂肪前駆細胞、骨髄、好中球、血液細胞、肝細胞、アストロサイト、間葉系幹細胞および骨格筋細胞からなる群より選択される、項目110に記載の方法。
(項目112)
前記細胞が対象中に存在する、項目111に記載の方法。
(項目113)
前記対象の治療を含み、前記対象が、腫瘍性疾患に関連した状態、免疫系の疾患もしくは状態、炎症性疾患、感染症、代謝性疾患、神経細胞/神経疾患、筋/心血管疾患、造血異常に関連した疾患、血管新生異常に関連した疾患または異常な細胞生存に関連した疾患を有する、項目112に記載の方法。
(項目114)
医薬化合物を製造する工程であって、
a)表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも100アミノ酸のAARSタンパク質フラグメントの存在下で、1つ以上の候補化合物のin vitroスクリーニングを行って、前記AARSタンパク質フラグメントと特異的に結合する化合物を同定することと、
b)段階a)で同定された化合物に関して細胞ベースのアッセイを行って、前記AARSタンパク質フラグメントの1つ以上の非カノニカルな活性を調節する化合物を同定することと、
c)任意に、段階b)で同定された化合物の構造活性相関(SAR)を評価してその構造を前記非カノニカルな活性の調節と関連付け、任意に、前記化合物を誘導して前記非カノニカルな活性を調節するその能力を改変することと、
d)ヒトでの使用に十分な量の段階b)で同定された化合物または段階c)で誘導体化された化合物を生産することにより、医薬化合物を製造することと
を含む、方法。
(項目115)
医薬化合物を製造する工程であって、
a)表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかのAARSタンパク質フラグメントと特異的に結合する細胞表面受容体またはその細胞外部分の存在下で、1つ以上の候補化合物のin vitroスクリーニングを行って、前記細胞表面受容体またはその細胞外部分と特異的に結合する化合物を同定することと、
b)段階a)で同定された化合物に関して細胞ベースのアッセイを行って、前記AARSタンパク質フラグメントの1つ以上の非カノニカルな活性を調節する化合物を同定することと、
c)任意に、段階b)で同定された化合物の構造活性相関(SAR)を評価してその構造を前記非カノニカルな活性の調節と関連付け、任意に、前記化合物を誘導して前記非カノニカルな活性を調節するその能力を改変することと、
d)ヒトでの使用に十分な量の段階b)で同定された化合物または段階c)で誘導体化された化合物を生産することにより、医薬化合物を製造することと
を含む、方法。
(項目116)
少なくとも1個の細胞が、異種性完全長アラニルアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、操作された細胞集団を含み、前記細胞が無血清培地中で増殖することができる、細胞組成物。
(項目117)
前記完全長アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質が、AARSタンパク質フラグメントの精製を容易にする異種性の精製タグまたはエピトープタグを含む、項目116に記載の細胞組成物。
(項目118)
前記完全長アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質が、切断時の前記AARSタンパク質フラグメントの生成を可能にする異種性タンパク質分解部位を含む、項目116または117に記載の細胞組成物。
(項目119)
細胞内で項目56〜74に記載のAARSポリペプチドをin situで作製する方法であって、i)異種性完全長アラニルアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質を細胞内で発現させることを含み、前記細胞が、前記異種性完全長アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質を切断して前記AARSポリペプチドを生成することができるプロテアーゼを含む、方法。
(項目120)
項目56〜74に記載のAARSポリペプチドを作製する方法であって、単離完全長システイニルアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質を、前記完全長アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質を切断してAARSポリペプチドを生成することができるプロテアーゼと接触させることを含む、方法。
(項目121)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)のいずれかに記載のAARSタンパク質フラグメントのタンパク質分解生成を可能にする異種性タンパク質分解部位を含む、操作された完全長アラニルアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)タンパク質。
(項目122)
単離完全長アラニルアミノアシルtRNA合成酵素を含み、純度がタンパク質ベースで少なくとも約95%、エンドトキシンが約10EU/mgタンパク質未満であり、かつ実質的に無血清である、組成物。
(項目123)
前記完全長アラニルアミノアシルtRNA合成酵素が、少なくとも10mg/mLの濃度で存在し、かつ少なくとも90%の単分散である、項目122に記載の組成物。
(項目124)
表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)または表E2に記載のAARSタンパク質フラグメントまたは前記ARRSタンパク質フラグメントをコードする核酸の投与による、tRNA合成酵素の発現、活性または時空間的位置の調節不全により仲介される疾患または障害の治療法。
(項目125)
前記疾患が、癌、神経障害、糖尿病および炎症性障害から選択される、項目124に記載の方法。
I.概要 [0050]
II.定義 [0055]
III.精製AARSタンパク質フラグメントおよびバリアント [0098]
IV.AARSポリヌクレオチド [0174]
V.抗体 [0219]
VI.抗体代替物およびその他の結合物質 [0234]
VII.バイオアッセイならびに解析アッセイ [0249]
VIII.発現系および精製系 [0256]
IX.診断法および診断用組成物 [0294]
X.アンチセンス剤およびRNAi剤 [0348]
A.アンチセンス剤 [0351]
B.RNA干渉剤 [0379]
XI.創薬 [0405]
XII.使用法 [0437]
XIII.医薬製剤、投与およびキット [0452]
XIV.実施例 [0487]
本発明は、少なくとも部分的には、新規AARSポリペプチドの発見、ならびに天然の野生型タンパク質を天然の完全長アラニルtRNA合成酵素遺伝子と比べて著しく異なる特性を示す新たな形態へ形質転換することを意味するその調製法および使用法に関する。このようなAARSポリペプチドは、様々な組織で発現されるアラニルtRNA合成酵素の広範な配列解析および質量スペクトル解析を行い、次いで、潜在的な各AARSポリペプチドを体系的に作製および試験し、新規な生物活性を示す安定な可溶性タンパク質ドメインを表すタンパク質配列を同定することにより同定された。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術・科学用語は、本発明の属する分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは同等の任意の方法および材料を本発明の実施また試験に用いることができるが、好適な方法および材料を記載する。本発明の目的のために、次の用語を以下で定義する。
驚くべきことに、アミノアシル化活性しか知られていないその完全長親配列とは異なり、AARSフラグメントがバイオセラピューティック、発見および診断への適用に重要な生物活性を有するということがわかった。したがって、本発明の実施形態は、アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)の生物学的に活性なバリアントおよびフラグメントに加え、その完全長タンパク質、成熟タンパク質アイソフォームおよびタンパク質フラグメントを含む。特定の実施形態では、タンパク質およびフラグメントは、種々の機序の中でも特に内因性のタンパク質分解、in vitroでのタンパク質分解、スプライス変異またはコンピュータ予測により生じ得る。本明細書に記載のAARSタンパク質フラグメントおよびそのバリアントは、少なくとも1つの「非カノニカルな」生物活性を有し得る。また本発明のAARSタンパク質フラグメント(1つまたは複数)は、本明細書では「AARSポリペプチド」または「AARS参照ポリペプチド」とも呼ばれる。特定の実施形態では、本明細書に記載のAARSポリペプチドは、アラニルtRNA合成酵素の各種フラグメントのアミノ酸配列(1つまたは複数)を表す下の表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)に記載されているAARSポリペプチド「参照配列(1つまたは複数)」の全部または一部を含むか、またはそれらから実質的になる。マウスとヒトのAARSタンパク質配列は関連性が高く、通常、配列全体、特定のドメインまたは特定のタンパク質フラグメント内において数個以下のアミノ酸しか異ならない。
本発明の実施形態は、アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)の1つ以上の新規に同定されたタンパク質フラグメントをコードするポリヌクレオチド、ならびにその相補体、バリアントおよびフラグメントを含む。特定の実施形態では、AARSポリヌクレオチドは、アラニルtRNA合成酵素のスプライスバリアント、タンパク質分解フラグメントまたはその他のタイプのフラグメントを表す、表1〜3(1つまたは複数)または表4〜6(1つまたは複数)または表7〜9(1つまたは複数)に記載されているAARSポリペプチド参照配列(1つまたは複数)のすべてまたは一部をコードする。特定の実施形態は、これらのスプライスバリアントの1つ以上のスプライスジャンクションの配列を含むポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにその相補体、バリアントおよびフラグメントを含む。特定の実施形態では、通常は、新規なまたは例外的な方法でエクソンを結合させる選択されたAARSスプライスバリアントの特異な性質により、AARSポリヌクレオチド参照配列は、固有のまたは例外的なスプライスジャンクションを含む。特定の実施形態は、対応する完全長AARSポリペプチドを含まない。
別の態様では、本発明は、AARSポリペプチドまたはその天然の細胞結合パートナー(すなわち、細胞受容体、脂質、炭水化物、タンパク質または核酸結合パートナー)またはその複合体に対して結合特異性を示す抗体、およびその使用法をさらに提供する。抗体という用語は、抗体の様々な変化物、例えば、本明細書に記載されているおよび当該技術分野で公知のFAB、ヒト抗体、改変ヒト抗体、一本鎖、非ヒト抗体および抗原に対する免疫系リガンドの基礎となる免疫グロブリンフォールドの他の誘導体を包含する。抗体を、本明細書で提供される治療、診断、創薬またはタンパク質発現/精製のための方法および組成物のいずれにおいても使用することができる。
別の態様では、本発明は、本明細書に開示されるAARSポリペプチドもしくはその細胞結合パートナーまたはその一部分、バリアントもしくは誘導体に対して結合特異性を示す抗体代替物またはその他の結合物質、例えば可溶性受容体、アドネクチン、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、アプタマーなど、ならびにその組成物および使用法をさらに提供する。結合物質を、本明細書に記載の治療、診断、創薬またはタンパク質発現/精製および分析のための方法および組成物のいずれかで使用することができる。アドネクチン、可溶性受容体、アビマーおよびトリネクチンのような生物製剤ベースの結合物質が特に有用である。
また、治療および診断試薬としてのAARSタンパク質フラグメントおよび関連薬剤に関連したバイオアッセイも含まれる。例としては、特に純度、生物活性、親和性、溶解度、pH、エンドトキシンレベルを測定するバイオアッセイおよび解析アッセイが挙げられ、これらは本明細書に多数記載されている。また、用量反応曲線を確立し、かつ/または様々なバッチの薬剤を比較するための1つ以上の基礎を提供するアッセイも含まれる。バッチ比較は、化学的特徴付け、生物学的特徴付けおよび臨床的特徴付けのいずれか1つ以上に基づくものであり得る。タンパク質剤に関しては、選択された薬剤の効力、安定性、薬物動態および免疫原性を評価する方法も含まれる。各種用途の中でも特に、これらおよびその他の方法を、本明細書に記載のAARSタンパク質フラグメント、抗体、結合物質、ポリヌクレオチド(アンチセンス剤およびベクターなど)およびその他のものを含めた、生物学的または化学的薬剤のロット放出試験のために使用することができる。
本発明の実施形態は、本発明のAARSタンパク質フラグメントまたはその他のポリペプチド系薬剤の発現および精製のための方法および関連組成物を含む。このような組換えAARSポリペプチドは、例えば、Sambrookら(1989,上記)、特に第16節および17節;Ausubelら(1994,上記)、特に第10章および16章;ならびにColiganら,Current Protocols in Protein Science(John Wiley & Sons,Inc.1995−1997)、特に第1章、5章および6章に記載されているような標準的なプロトコルを用いて調製することが好都合であろう。1つの一般的な例として、AARSポリペプチドを次に挙げる段階の1つ以上を含む手順で調製し得る:(a)AARSポリペプチドをコードし調節エレメントと作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含む構築物を調製する段階;(b)構築物を宿主細胞に導入する段階;(c)宿主細胞にAARSポリペプチドを発現させる段階;および(d)宿主細胞からAARSポリペプチドを単離する段階。
本明細書に記載のAARSタンパク質フラグメント、AARSポリヌクレオチドならびに抗体およびその他の結合物質のようなAARS剤を、診断検査および診断用組成物に使用することができる。特に生化学的、組織学的および細胞ベースの方法および組成物が含まれる。
また本発明の実施形態は、AARSポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびRNAi剤、ならびに選択されたAARS転写産物および/またはタンパク質フラグメントの発現を減少させるためのその使用法も含む。特定の実施形態は、本発明のAARSタンパク質フラグメントであるスプライスバリアントを生じる1つ以上のスプライスジャンクション(多くの場合は固有である)の標的化に関連する。また、特定のスプライス型を標的として、選択されたタンパク質フラグメントのスプライシングを促進または抑制する、アンチセンスまたはRNAi阻害の方法も含まれる。特定の好適な実施形態では、AARSタンパク質フラグメントを生じるスプライスジャンクションは特定の組織で過剰発現され、そのスプライスバリアントに固有のものである。これらのおよび関連する実施形態では、このようなスプライスバリアントは、標的細胞型における細胞質AARS活性の唯一の源ではない。例えば、標的となる特定のスプライスバリアントは、所与の細胞または組織中のAARS RNAスプライスバリアントの全コピー数の約10%〜50%、好ましくは、所与の細胞または組織中のAARS RNAスプライスバリアントの約1〜10%であり得る。所与の細胞または組織中のAARS RNAスプライスバリアントの全コピー数の約1%未満のスプライスバリアントバリアントも標的になり得る。
「アンチセンスオリゴマー」または「アンチセンス化合物」またはアンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、それぞれが塩基対形成部分を有する環状サブユニットの配列を指す。これらのサブユニットを結合するサブユニット間結合により、塩基対形成部分はWatson−Crick塩基対形成により核酸(通常はRNA)内の標的配列とハイブリダイズして、標的配列内で核酸:オリゴマーのヘテロ二本鎖を形成し、通常そのRNAの翻訳を阻害することができる。また、スプライスバリアントまたはタンパク質分解フラグメントおよび/またはその対応するポリペプチドのような選択されたAARS転写産物の発現を調節するためのその使用法も含まれる。
特定の実施形態は、アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)参照ポリヌクレオチドの1つ以上のmRNA転写産物(そのフラグメントおよびスプライスバリアントを含む)を標的とするRNA干渉(RNAi)剤に関する。また、例えばAARSスプライスバリアントまたは内因性タンパク質分解フラグメントのような選択されたAARS転写産物を調節するためのその使用法も含まれる。
特定の実施形態は、通常は参照AARSポリペプチド、例えばAARSタンパク質フラグメントの1つ以上の非カノニカルな活性を調節する薬剤を同定するための、創薬におけるAARSポリペプチド、抗体またはポリヌクレオチドの使用に関する。
本発明の実施形態は、治療法を含む。したがって、AARSポリペプチド、AARSポリヌクレオチド、AARSポリヌクレオチドベースのベクター、AARS発現宿主細胞、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi剤ならびに結合物質、例えばペプチド、抗体および抗原結合フラグメントなど、ペプチド模倣物ならびにその他の小分子を含めた本明細書に記載のAARS剤を用いて、参照AARSの非カノニカルな活性に関連した各種の非限定的な疾患または状態を治療することができる。このような非カノニカルな活性の例としては、細胞外シグナル伝達の調節、細胞増殖の調節、細胞遊走の調節、細胞分化の調節(例えば、造血、ニューロン新生、筋形成、骨形成および脂肪生成)、アポトーシスまたはその他の形態の細胞死の調節、血管新生の調節、細胞結合の調節、細胞代謝の調節、サイトカイン産生または活性の調節、サイトカイン受容体活性の調節、細胞内取込みまたは分泌の調節、免疫調節、炎症の調節、グルコース制御のような代謝過程の調節などが挙げられる。
本発明の実施形態は、単独でまたは1つ以上の他の様式の治療法と組み合わせて細胞または動物に投与するために、薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液中で製剤化された、本明細書に記載のAARSポリヌクレオチド、AARSポリペプチド、AARSポリペプチドを発現する宿主細胞、結合物質、調節物質またはその他の化合物を含む。また、必要に応じて、本発明の組成物を他の薬剤、例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは様々な薬学的に活性な薬剤と併用して投与し得ることも理解されるであろう。組成物中に同様に含まれ得る他の成分は、達成が望まれる調節その他の作用に追加の薬剤が悪影響を及ぼさない限り、実質的に限定されない。
一般的方法
下の実施例において別途明記されない限り、下の実施例に記載されているAARSポリペプチドの作製および特徴付けを行うために、以下の遺伝子最適化、小規模および大規模なタンパク質発現、タンパク質精製、転写プロファイリングおよびスクリーニングの一般的な方法を用いた。
エピトープタグ化した型のAARSポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、以下に挙げる方法を用いてコドン最適化し、細菌発現ベクター中にクローニングした。
(5’−TGGCCGCATATGGACTCTACTCTAACAGC−3’)(配列番号182)
(5’−TAGCGGCCGCGTTCTTTACATCCCCGAGG−3’)(配列番号183)
必要なタンパク質の量に応じて、6×Hisタグ化AARSポリペプチドを中程度のスループットの形式で細菌内で、および/またはより大規模のフラスコ培養で発現させる。以下に記載のように、また特定の実験に関して明記されているように、アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いてAARSポリペプチドを精製する。
細菌培養:各AARSポリペプチドを(遺伝子合成およびクローニング方法(3)で説明したように)コードするDNAを含む100ngの発現ベクターは、BL21(DE3)−RIPL(Agilent Technology、カタログ番号#230280)コンピテント大腸菌細菌へ、42℃、30秒間で変換される。500μLのLB培地を細胞へ添加し、37℃のシェイカー内、250rpmで1時間培養し、150μLの変換反応物をアンピシリンLB寒天プレート上にプレーティングし、37℃で一晩培養する。
転写プロファイリング
背景および治療的関連:従来の標的同定技術に加え、AARSポリペプチドの作用機序の解明に役立つ重要なアプローチとしてゲノムツールが近年見られるようになり、創薬の初期において治療的関連の直接的な洞察を得ることができる。潜在的な治療的有用性の理解を容易にするために、初代ヒト細胞型をAARSポリペプチドとともに培養し、AARSポリペプチドとのインキュベーション後の2つの異なる時点で、転写プリファイリングを評価する。
背景および治療的関連:様々な細胞型の細胞増殖およびアポトーシスの速度を調節する能力は、数多くの治療用化合物の基本的特性を表し、広範な疾患および障害の治療および予防に直接関連する。
増殖を評価するための標準的な細胞計数を、dsRNAと結合すると青い蛍光を発する細胞透過性の核対比染色剤であるヘキスト33432を用いて行う。ヘキスト33432は溶液として入手可能であり(Invitrogen、カタログ番号H−3570)、培地またはPBS中1ug/mLの最終濃度で使用する。細胞型に応じて、標準的な増殖時間である48時間またはそれより長い時間、下の実施例に記載されているように、細胞をARSポリペプチドの存在下、96ウェルプレートで増殖させる。
細胞のATPレベルは細胞の健康状態と関連し、各種市販のキットで容易に決定することができる。溶解液とATP検出試薬の均一混合物であるATP−lite(Perkin−Elmer、カタログ番号6016947、Boston、MA02481)を使用前に予め混合し、培養細胞に対して1:1の体積比で使用する。プレートを5分間インキュベートして溶解を促進し、発光プレートリーダーを用いてプレートを測定する。細胞型に応じて、標準的な増殖時間である48時間またはそれより長い時間、下の実施例に記載されているように、細胞をAARSポリペプチドの存在下、96ウェルプレートで増殖させる。
背景および治療的関連:LDLは血中コレステロールの主な担体であり、血漿中コレステロールの60%超を占めている。ヒトでは、循環からの血漿LDLの約70%の除去に肝LDL受容体が関与している。内部に取り込まれたLDLは、リソソーム内で分解されて遊離コレステロールとアミノ酸になる。肝臓は、ヒトでのLDL異化作用およびLDL受容体活性にとって最も重要な器官である。内部に取り込まれず循環中に残ったLDLは、血管内皮細胞により血管壁内に運ばれて、アテローム性動脈硬化プラークの形成の原因となり得る。また循環するLDLは、マクロファージによっても取り込まれ、これがプラーク形成の一因となることもある。肝組織内へのLDL取込みの増加はヒトに健康に有益であると考えられており、また、この過程を正に調節し得る安全かつ有効な治療剤の発見は、心血管疾患および代謝性疾患の新たな治療法をもたらすかもしれない。AARSポリペプチドの固有の特性がアセチル化LDLの取込みを調節することができるか否かを調べるために、アセチル化LDL取込みを測定するための標準的なアッセイをHepG2C3a細胞で用いる。
好中球酸化バースト
背景および治療的関連:多形核好中球および単球による食作用は、細菌および真菌を含めた微生物による感染に対する宿主防御の重要な武器を構成している。食作用の過程は、次のようないくつかの主な段階に分けることができる:走化性(炎症部位への食細胞の移動)、食細胞の細胞表面への粒子の付着、取込み(食作用)ならびに酸素依存性(酸化バースト)および酸素非依存性の機序による細胞内殺作用。慢性肉芽腫性疾患(CGD)のような先天的欠陥では、バースト活性の低下または欠如が見られる。CGDは遺伝性疾患の異質性のグループであり、通常、生後2年の間に発症する。この疾患は、細菌および真菌微生物により繰り返し引き起こされる致命的な感染症が特徴である。これらの感染症は通常、肺炎、リンパ節炎、またはリンパ節、肺および肝臓に影響する膿瘍からなる。NADPHオキシダーゼは、過酸化水素およびヒドロキシルラジカルへ速やかに変換されるスーパーオキシド陰イオンの生成に関与する酵素系である。NADPHオキシダーゼ酵素系の成分ペプチドの異常は、CGDに特徴的な機能不全を引き起こす。CGD患者の好中球では、刺激後の重要な酸化バーストが生じない。様々な形態のCGDが記載されている(古典的X関連CGDおよび常染色体劣性遺伝パターン)。移植、HIV感染後期および高齢者では顆粒球の酸化バーストが低下して、これらの者は二次感染および炎症性疾患の増悪を引き起こしやすくなる。様々な免疫調節剤(例えば、サイトカイン(GM−CSF、G−CSF、TNF)または薬物)も酸化バーストに影響を及ぼすと思われる。治療的方法で酸化バーストを上方制御または下方制御する能力を有するタンパク質は、各種の様々な病的状態に対して有効である可能性がある。
背景および治療的関連:好中球エラスターゼは、肺および心血管系の様々なヒトの疾患状態において特定の役割を有すると考えられているセリンプロテアーゼである。エラスターゼは諸刃の剣であると考えられており、活性範囲は組織特異的であると考えられている。その鍵となる生理的役割は生得的な宿主防御におけるものであるが、好中球エラスターゼは組織リモデリングにも関与している可能性があり、現在、局所的な炎症シグナルに重要であることが認められている分泌促進剤作用を有する。好中球エラスターゼ活性は、数十年間、肺気腫の発達に関与するとされてきたが、比較的最近になってようやく、過剰な細胞外マトリックスの沈着が生じる状況での病原性機能はこのセリンプロテアーゼが原因であるとされた。その作用が繊維症の肺修復に影響し得るその考え得る道筋の解明が、遺伝子操作された動物モデルの使用により始まっている。新たに得られた証拠により、線維形成メディエーターの生成およびコラーゲン合成に対してより直接的な作用を有する細胞経路の関与が、肺のマトリックス蓄積促進における好中球エラスターゼの作用を支持するらしいことが示唆されている。また、ヒト好中球エラスターゼはアテローム性動脈硬化プラーク内にも存在し、そこでは、動脈瘤形成とプラーク破裂の合併症に関連したマトリックス分解および血管壁の脆弱化の一因となっている。これらの作用には他の細胞外プロテアーゼも加わるが、この破壊的なプロテアーゼは、好中球脱顆粒に関連した活性と結び付く広範な基質およびこの酵素の効力ゆえに、動脈硬化性疾患における治療標的として選ばれる。
背景および治療的関連:マクロファージは自然免疫系において主要な役割を果たし、免疫応答を強力に調節および制御するToll様受容体(TLR)のファミリーを含めた、幅広いレパートリーの様々なクラスのパターン認識受容体(PRR)を発現する。
RAW−BLUE(商標)細胞(Invivogen、カタログコード:raw−sp)の商標名で販売されているマウスマクロファージは、TLR5以外のすべてのTLRを発現し、NF−κBおよびAP−1転写因子により誘導される分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)遺伝子を含む。TLR刺激時に、RAW−BLUE(商標)細胞がNF−κBおよび/またはAP−1を活性化してSEAPが分泌され、これはSEAP検出培地を使用すれば測定可能である。
ヒトHEK293細胞は遺伝子が改変されており、HEK−Blue(商標)TLR細胞(Invivogen)の商標名で販売されている。この細胞型のTLR2およびTLR4バージョンはすべてのTLR2またはTLR4を選択的に発現し、5つのNF−κBおよびAP−1転写因子結合部位と融合したIFN−ベータミニマルプロモーターの制御下にある分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子を含む。特定のTLR2またはTLR4アゴニスト(それぞれ)を使用すると、Hek−Blue(商標)TLR2およびHek−Blue(商標)TLR4細胞がNF−κBおよび/またはAP−1を活性化してSEAPが分泌され、これはSEAP検出試薬を用いれば検出可能である。Hek−Blue(商標)TLR2細胞をLPS共受容体タンパク質CD14でコトランスフェクトして、TLR2応答性を増強しシグナルの質を向上させる。親細胞は、内因性レベルのTLR1、3、5、6およびNOD1を発現する。
背景および治療的関連:サイトカインは、細胞間コミュニケーションに広く利用され、免疫調節および制御を含めた正常な身体ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしている、多様な小分子の細胞シグナル伝達タンパク質分子の集まりである。従って、サイトカインの放出または生物活性を調節するAARSポリペプチドは、広範な疾患および障害における、例えば炎症性の疾患および障害、自己免疫性疾患、組織移植/臓器拒絶、癌の予防または治療、造血および感染の調節を含めた治療的有用性を有する。
方法:試験細胞を、1mL増殖培地中約106細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートに播く。細胞をAARSポリペプチド(下の実施例で示される濃度)または等体積のPBSで処置し、5%CO2、37℃で一晩インキュベートする。細胞処置の後、試料をスイングバケット遠心機で5分間、2,000×g、4℃で遠心分離する。細胞ペレットを崩さないように培地を慎重に取り出し、新しいチューブに移す。試料を直ちにアッセイするか、または次の解析のために液体窒素中で急速凍結する。市販のキット(R&D Systems,Inc、MN、USA)を用いて、または開発業務受託機関(MD Biosciences(St.Paul、MN)を通じて、サイトカイン放出(MIF、IL−8、IL−10、セルピンE1、GM−CSF、GRO、IL−1アルファ、IL−1ベータ、IL−1ra、IL−6、MCP−1、MIP−1、RANTESおよびTNF−アルファのサイトカインを含む)を判定する。
方法:ヒト全血を正常なヒトドナーから採取し、標準的な採血管にヘパリンとともに収集する。適切な細胞の健康状態を確保するために、血液を収集した同じ日にこれを使用する。血液を穏やかにかき混ぜ、100μLの体積で96ウェルポリカーボネートV底プレートに播く。マルチチャンネルピペットセットを50μLで2回使用して、AARSポリペプチドを血液に加えてゆっくりかき混ぜる。すべての実験でフィルターチップを使用し、フルPPEを装着する。すべての実験を、ヒト血液での実験に適した専用のバイオセーフティフード内で行う。血液を5%CO2、37℃で一晩インキュベートする。細胞処置の後、スイングバケット遠心機で試料を2,000×gで5分間、遠心分離する。上清をサイトカインELISA用に収集する。ELISAを既に記載の通りに行う。
方法:末梢血単核球を分離するために、新たに分離したヒト全血を50mLのコニカルチューブ中、室温で、Sigma社のHISTOPAQUE(登録商標)−1077により1:1の比で、室温で穏やかに層状にする。層状の試料を、スイングバケット臨床用遠心機で30分間、ブレーキなしで400×gで遠心分離する。次いで、血漿と密度勾配の境界にある白血球の層をピペットで取り出す。この末梢血単核球を、希釈および250×gで10分間の遠心分離によりRPMI−1640(Invitrogen、番号22400−105)で2回洗浄する。洗浄したPBMCをRPMI−1640+10%FBS中に再懸濁させ、1×106細胞/mLで播いた。
背景および治療的関連:いくつかの疾患ではIL−6およびIL−8が過剰に産生されるため、これらが炎症性疾患の発病において基本的な役割を果たし得ることが、数多くの研究により示されている。IL−6は内皮細胞産生を活性化し、IL−8および単球化学誘引物質タンパク質の放出、接着分子の発現および炎症部位への白血球動員を引き起こす。これらのサイトカインは、全身性若年性関節炎、全身性エリテマトーデス、クローン病および関節リウマチの発病に関与する細胞を含めた、炎症性疾患に関連した細胞型で発現される。サイトカイン産生の中で最も重要な全身作用の1つは、急性期応答の誘発である。急性期タンパク質は主として肝臓により産生され、補体活性化、炎症誘発性サイトカインの誘導および好中球走化性の刺激を介して免疫応答を促進するタンパク質がこれに含まれる。あるいは、急性期応答は役に立つ場合もあり、プロテイナーゼアンタゴニスト、オプソニンおよびプロコアグラントのような急性期タンパク質は、炎症を消散させることにより組織破壊を制限するのに役立つ。特に、IL−6は滑膜細胞増殖および破骨細胞活性化を刺激して、滑膜パンヌスの形成および修復をもたらし得る。IL−6はIL−1とともに作用してマトリックスメタロプロテイナーゼの産生を増加させ、これが関節および軟骨破壊の一因となり得る。しかし、IL−6を抗原誘導性関節炎のマウス関節内に注射すると、このサイトカインが組織メタロプロテアーゼ阻害物質の発現を誘導してプロテオグリカン合成を刺激するという知見により示唆されるように、IL−6は関節における保護作用も有し得る。ヒト線維芽細胞様滑膜細胞−関節リウマチ(HFLS−RA)は、関節リウマチ(RA)の患者から採取した滑膜組織から分離される。これを二代目で凍結保存し、培養して少なくとも5集団倍加数まで増殖させることができる。HFLSは、軟骨分解の一因となるサイトカインおよびメタロプロテイナーゼの産生による関節破壊でのその役割で長い間知られている。
背景および治療的関連:ヒトアストロサイト(HA)はヒト大脳皮質から得られる。これを二代目で凍結保存し、培養して10集団倍加数まで増殖させることができる。HAは中枢神経系に最も豊富に存在する細胞であり、ニューロンへの機械的支持および栄養分の提供ならびにニューロンの不要物の除去のような数多くの機能を担っている。最適なニューロン機能に重要な補助的役割を果たすことに加え、HAは、血液脳関門を形成している血管内皮細胞の生化学的補助も行っている。最近の研究では、アストロサイトが、幹細胞をニューロン分化に運命付け単一シナプスの機能を制御することによりニューロン新生を調節すること可能であり、脳内の情報の伝達および保存に積極的に関わっているということが示されている。神経系の機能におけるアストロサイトの重要性がますます認識されつつある。HAは、アストロサイト機能の多様性を探るための有用なin vitroモデルとして働き得る。アストロサイトは、IL6およびTNFアルファに応答して増殖することが示されている。さらに、この細胞は自身のIL6およびTNFアルファを生成することができる。したがって、HAの増殖およびサイトカイン産生を調節するAARSポリペプチドは、神経炎症、神経変性、脳の腫瘍形成ならびに脳の虚血および修復を含めた各種神経疾患における治療的有用性を有する。
背景および治療的関連:肺血管系は生理学的/病理学的に非常に重要である。肺血管系は、循環する基質および有形成分と相互作用して全身動脈血の組成を調節し、標的器官の機能に影響を及ぼし、血栓症、止血および免疫反応ならびに腫瘍転移の一因となる、代謝的に活性で機能的に応答する細胞からなる組織であることが現在認められている。ヒト肺微小血管内皮細胞(HLMVEC)は、急性肺傷害時に白血球が肺に向かって移動するための重要なキューを与える化学誘引物質サイトカインおよび細胞接着分子の高い発現を示す。この主要な細胞型は、肺微小血管系の病理学および生物学の様々な側面をin vitroで研究するための有用なツールとなり得る。炎症性刺激に応答した微小血管系の構造および機能の変化は、臓器損傷において鍵となる因子であると考えられており、また適切な条件下では、修復のための刺激をもたらし得る。これらの血管変化の重要な原因は、白血球浸潤が関与する炎症性反応の誘導である。内皮細胞への顆粒球接着に焦点を当てた各種の研究により、白血球の動員および遊出には、よく組織化された接着カスケードが伴うことが明らかになっている。接着カスケードは、顆粒球が内皮細胞に付着し、低速度で液流の方向に転がり始めることで始まる。顆粒球は転がる間に活性化され、次いで内皮細胞にしっかりと接着し、内皮細胞を横断して血管外スペースへ移動する。これらの接着事象は、顆粒球表面のCAMと内皮細胞上に存在する同族糖タンパク質との間で生じる分子相互作用により一部仲介される。内皮細胞接着分子であるE−セレクチンは、顆粒球リガンドであるSLex型グリカンと相互作用して、接着カスケードのうちの付着とローリングの段階を仲介し得るということが、各種の研究により明らかになっている。カスケードの下流段階には、内皮細胞で発現する細胞間接着分子と顆粒球で発現するCD18インテグリンとの相互作用が含まれる。
背景および治療的関連:細胞接着分子(CAM)は細胞表面に存在するタンパク質であり、細胞接着と呼ばれる過程で他の細胞または細胞外マトリックス(ECM)との結合に関与する。これらのタンパク質は通常、膜貫通型受容体であり、3つのドメインすなわち、細胞骨格と相互作用する細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および同じ種類の他のCAMと相互作用する(ホモフィリック結合)または他のCAMもしくは細胞外マトリックスと相互作用する(ヘテロフィリック結合)細胞外ドメインからなる。CAMの大部分は、Ig(免疫グロブリン)スーパーファミリー(IgSF CAM)、インテグリン、カドヘリンおよびセレクチンの4つのタンパク質ファミリーに属する。免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)細胞接着分子はカルシウム依存性膜貫通型糖タンパク質であり、神経細胞接着分子(NCAM)、細胞間細胞接着分子(ICAM)、血管細胞接着分子(VCAM)、血小板内皮細胞接着分子(PECAM−1)、内皮細胞選択性接着分子(ESAM)、接合部接着分子(JAM)、ネクチンおよびその他の細胞接着分子がこれに含まれる。
初代ヒト脂肪前駆細胞における脂肪細胞の分化および増殖
背景および治療的関連:肥満症およびリポジストロフィーはともに、糖尿病および心血管疾患を含めた病態に関連することが多い。脂肪組織は多種多様な因子を分泌する内分泌器官であり、分泌の調節異常は脂肪生成だけでなく、全身のグルコース/インスリンホメオスタシスにも影響を与えるということが現在認められている。肥満症を招く過剰な脂肪組織は、周知の深刻な健康上の脅威となっている。脂肪組織の発達は、遺伝的背景、ホルモンバランス、食事および身体活動により影響され得る。トリアシルグリセロールの蓄積が高まって脂肪細胞の大きさが増加すると、脂肪組織量が増加し得る。さらに、前駆細胞の脂肪細胞への分化により生じる脂肪細胞の数が成体でも増加することがあり、これは重症のヒト肥満症および高炭水化物食または高脂肪食を摂取したげっ歯類において観察されている。脂肪細胞は特に、間葉細胞が拘束および分化の過程である脂肪生成を経て生じると考えられている。前脂肪細胞細胞系は、合成糖質コルチコイド、デキサメタゾン(DEX)、イソブチルメチルキサンチン(IBMX)およびインスリンからなる脂肪生成剤による処置で脂肪細胞分化を経ることができ、これらの研究では有用であった。転写因子のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)およびCCAATエンハンサー結合タンパク質(C/EBP)ファミリーでは、脂肪細胞分化において重要な役割を果たすという十分な確証が得られている。脂肪細胞分化の初期に、C/EBPβおよびC/EBPδがそれぞれDEXおよびIBMXより誘導され、次いでこの2つがPPARγおよびC/EBPαを誘導して、脂肪細胞機能に必要な様々な脂肪細胞マーカーを活性化する。他の転写因子も脂肪生成を正または負に調節することが報告されており、また様々な増殖因子およびホルモンが、脂肪生成転写因子の発現を調節することにより脂肪細胞分化に影響を及ぼし得る。実際、脂肪組織は、トリアシルグリセロールを貯蔵し、必要時に脂肪酸を放出することにより、哺乳動物の主なエネルギー貯蔵部位となっていることに加え、免疫応答、血管機能およびエネルギー恒常性を含めた多様な生理過程に関与する広範な分子を分泌する。TNF−αおよびIL−6のようなサイトカインが脂肪細胞から分泌される。これらの因子の一部も、オートクリン/パラクリン作用により脂肪組織の増殖および発達に影響を及ぼし得る。
背景および治療的関連:骨格筋の発生は、多能性中胚葉細胞から筋芽細胞を生じるという決定、筋芽細胞の細胞周期からの離脱および筋細胞への分化、そして最後に骨格筋線維の増殖および成熟を含む、多段階の過程である。骨格筋分化には、筋特異的な調節遺伝子および構造遺伝子の誘導とともに、筋芽細胞の整列、伸長および多核性筋管への融合が含まれる。分子レベルにおいて、筋原性への拘束および筋特異的遺伝子発現には、MyoD、ミオゲニン、myf−5およびMRF4を含めた骨格筋特異的ヘリックス−ループ−ヘリックス(bHLH)MyoDファミリーのタンパク質、ならびに筋細胞エンハンサー結合因子2(MEF2)が含まれる。MyoDファミリータンパク質のDNA結合活性はIdにより弱められるが、このIdは、増殖中の細胞ではE2a遺伝子産物と複合体を形成し、細胞が分化するように誘導されると下方制御される。筋管への分化の決定は、複数の因子により負の影響を受ける。筋芽細胞をウシ胎仔血清、塩基性線維芽細胞増殖因子2またはトランスフォーミング増殖因子β1で処置すると、筋芽細胞の分化が抑制されることが知られている。また筋形成は、癌遺伝子、例えばc−myc、c−jun、c−fos、H−rasおよびE1aなどによっても負の調節を受ける。血清枯渇時に筋芽細胞において誘発され、MyoDファミリー遺伝子発現の誘導および筋肉分化を引き起こすシグナル伝達に関する情報はほとんどない。筋原性分化は、筋芽細胞の細胞膜上に存在するインテグリンの活性化に依存すると思われ、このことは、インテグリンが上流分子種である「裏返し」の生化学的経路の働きを示唆している。インスリン様成長因子(IGF)−Iおよび−IIとその受容体との相互作用も骨格筋分化の正の調節因子である。
背景および治療的関連:間葉系幹細胞(MSC)は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、ベータ−膵島細胞および可能性として神経細胞を含めた各種細胞型に分化することができる多能性幹細胞である。多数の経路の転写因子、補助因子およびシグナル伝達中間体の複雑なネットワークの協調を含めた多くの様々な事象が、他の系列へのMSCの拘束に寄与する。MSCは、広範な急性および変性性の疾患を治療する可能性のある細胞集団であるため、強い治療学的関心がもたれている。
背景および治療的関連:正常なヒト成人の肺血管の肺動脈平滑筋細胞(PASMC)のほとんどが静止状態かつ非遊走性であり、主として肺での収縮機能の遂行に関与している。しかし、PASMCは分化を終えたわけではなく、自らの表現型を調節する能力を有し、局所的な環境的キューの変化に応答してその静止状態から脱する。この分化状態は、組織の要求の変化に応答した発生、組織損傷および血管再構築において生じ得る。肺高血圧症(PH)は、血管緊張およびPASMC収縮性の増加ならびに血管再構築の結果としての末梢肺血管抵抗の増加を含めた各種の基礎状態に関連する。血管再構築には、小肺動脈(PA)壁でのPASMC増殖、マトリックス物質合成ならびに細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用の変化が含まれ、これにより血管壁の平滑筋要素の厚さの増大および通常は筋肉化されていない遠位部PAの異常な筋肉化が生じる。この過程は、管腔径縮小および末梢抵抗増加の一因となる。疾患の一次的原因におけるPASMCの正確な役割は議論の余地のあるところだが、生じる変化が疾患の臨床的帰結において鍵となる役割を果たす。細胞分化研究の重要な段階は、細胞の分化した機能(1つまたは複数)に寄与する細胞特異的または細胞選択的な遺伝子セットの同定である。血管SMCの分化または成熟の相対的状態の有用なマーカーとして働く各種の平滑筋細胞(SMC)遺伝子、例えばSMアルファ−アクチン、SM MHC、h1−カルポニン、SM22−アルファ、デスミン、メタビンキュリン、スムーテリンなどが同定されている。最も広く使用されているマーカーはSMアルファ−アクチンであるが、それは部分的には、このタンパク質に対して非常に親和性および選択性の高い多数の抗体が購入できるという理由による。PASMCの変化がその本来の特性によるものなのか、またはPASMC増殖を支配する分子事象の調節不全によるものなのかは依然として不明である。しかし、調節キューを決定し、潜在的な調節不全を管理することにより、肺高血圧症、血管疾患を含めた各種の血管および肺疾患の管理に対する重要な治療的洞察が得られる。
背景および治療的関連:AARSポリペプチドと特定の細胞型との結合は、対象とする細胞型が、対象とするAARSポリペプチドに対して特異的な受容体を発現することを示す。細胞結合は、対象とする細胞型に応じて、その細胞または同様の型の細胞の活性または挙動の調節におけるin vivoでのAARSポリペプチドの潜在的な役割を示唆する。このような調節的な役割の具体例としては、例えば、B細胞およびT細胞(免疫調節/走化性/自己免疫/炎症);HepG2細胞(代謝制御、コレステロールの取込みまたは代謝);THP−1、jurkat、Raji細胞(免疫調節/走化性/自己免疫/炎症)、血小板(血小板生成)、3T3L1脂肪細胞(脂質生成/代謝)ならびにC2C12マウス筋芽細胞(筋形成、骨形成)の結合および調節が挙げられる。
方法:血液を健常なドナーからEDTAチューブに採取する。2mLの全血を5mLのFalcon FACSチューブに入れる。2mLの染色緩衝液(PBS+2%FBS)を加え、3〜5秒間ボルテックスし、300×gで5分間、遠心分離する。上清を吸引し、洗浄を繰り返し、ペレットを2mLの染色緩衝液中で再懸濁させる。
背景および治療的関連:造血(「hematopoiesis」;あるいは「haemopoiesis」または「hemopoiesis」)とは、血液細胞成分の形成のことである。細胞性血液成分はすべて、骨の髄質(骨髄)に存在しすべての異なる成熟血液細胞タイプを生じる固有の能力を有する造血幹細胞(HSC)から生じる。HSCは自己再生する、すなわち、HSCが増殖するとき、少なくともその一部の娘細胞がHSCのままで存在するため、幹細胞のプールが枯渇することはない。しかし、それ以外のHSC娘細胞(骨髄前駆細胞およびリンパ球前駆細胞)は、1つ以上の特定のタイプの血液細胞が生じる別の分化経路のいずれかにそれぞれ従うことができるが、それ自体は自己再生することができない。したがって、AARSポリペプチドへの曝露に応答した血液成分の変化は、AARSポリペプチドが造血を調節し、造血幹細胞の発生を制御することが可能であることを示す。
タンパク質トポグラフィーおよび泳動解析プラットフォームを用いたAARSS由来のタンパク質分解フラグメントおよび選択的スプライシング産物の同定
細胞系、馴化培地および組織のAARSフラグメントを同定するために、試料を以下の方法で調製する。
ディープシーケンシングを用いたスプライスバリアントの同定
アミノアシルtRNA合成酵素転写産物に関して濃縮されたcDNAライブラリーのハイスループットシーケンシングを用いて、アミノアシルtRNA合成酵素のスプライスバリアントを同定する。ヒト成人および胎児脳のような組織の全RNA抽出物からcDNA鋳型を調製し、すべての注釈付きヒトアミノアシルtRNA合成酵素およびその関連タンパク質のすべての注釈付きエクソンに特異的なプライマー配列を用いて、アミノアシルtRNA合成酵素転写産物に関して濃縮する。
バイオインフォマティクスを用いたAARSポリペプチドの同定
バイオインフォマティクスを用いてAARSタンパク質フラグメント(リセクチン(resectin)またはアペンダクリン(appendacrine) ペプチド)を同定する。FASTA(ウェブサイトhttp://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgiで入手可能)またはNCBIのBLASTPプログラム(ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthomで入手可能)のようなプログラムを用いて、完全長ヒトアミノアシルtRNA合成酵素のアミノ酸配列を、細菌(Escherichia coli)由来のそのオルソログの完全長アミノ酸配列とともに整列させる。ヒトタンパク質由来のリセクチン(resectin)配列を、アライメント中の細菌配列にギャップが存在する領域または2種間の相同性が低い領域をカバーする配列として同定する。表3、6および9のペプチドおよび対応するDNA配列には、この方法で同定された例が含まれている。
質量分析法によるAARSポリペプチドの差次的発現の同定
実施例1に記載されているPROTOMAP技術を用いて、様々な組織/細胞型におけるシステイニルtRNA合成酵素の差次的発現を比較する(配列および比較に関しては、表1、4および7を参照されたい)。すなわち、アミノアシルtRNA合成酵素リセクチン(resectin)の発現を、マウス肝臓組織とマウス膵臓組織との間で比較する。アミノアシルtRNA合成酵素リセクチン(resectin)の発現を、RAW264.7の細胞質ゾルと血清飢餓の48時間後にRAW264.7細胞から回収した馴化培地との間で比較する。
ディープシーケンシングによるAARSポリペプチドの差次的発現の同定
スプライス事象の差次的発現を試験するために、様々な組織から調製したcDNAに対してディープシーケンシングを行う。ディープシーケンシングサンプルのシーケンシングのヒット数は、サンプル内のシーケンスの相対量を反映している。表2B、5Bおよび8B中で「Hs Adult」および「Hs Fetal」とラベルされたカラムは、何度、シーケンスが、ヒト成人脳からおよびヒト胎児脳からそれぞれ濃縮されたcDNAのランダムシークエンスで識別されたかを示す。
抗体スクリーニング
特定のアミノアシルtRNA合成酵素フラグメントとの選択的結合(例えば、親完全長酵素と比べて親和性が10倍以上高い)を示す抗体の発見を容易にするために、ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを、アフィニティー濃縮技術(パニング)を用いてAbD Serotec社(MorphoSys(商標)社、Martinsried/Planegg、Germanyの一部門)でスクリーニングする。アミノアシルtRNA合成酵素フラグメントによる複数ラウンドのスクリーニング後に濃縮された抗体を、次いで、フラグメントおよび親完全長酵素に対する反応性に関してELISAにより特徴付ける。アミノアシルtRNA合成酵素フラグメントとの選択的結合(例えば、10倍以上高い親和性)を示すクローンをさらに特徴付ける。
体系的なPCRを用いたスプライスバリアントの同定
組織または細胞(例えば、ヒト脳、IMR−32およびHEK293T)の全RNA抽出物からPCR反応用のcDNA鋳型を逆転写する。遺伝子の5’非翻訳領域または5’側半分のエクソンとアニールするように設計された順方向プライマー(FP1)と、遺伝子の3’側半分のエクソンまたは3’UTRとアニールするように設計された逆方向プライマー(RP1)とをペアにしたアミノアシルtRNA合成酵素特異的プライマーを用いて、PCR反応を行う。増幅されたDNA産物をアガロースゲル電気泳動により解析して、カノニカルな転写産物から増幅されたフラグメントと大きさの異なるPCR産物を同定する。これらの異なるPCR産物を切り取ってゲルから単離し、標準的なDNA配列解析用のベクター内に連結する。カノニカルな転写産物とは異なる配列として選択的スプライシングバリアントを同定する。この体系的なPCR法により同定されたスプライスバリアントを、ヒト成人脳およびヒト胎児脳の両方においてゼロシーケンシングを備えた変異体が読み取るものとして、表2、5および8に示す。
選択されたAARSポリヌクレオチドのコドン最適化
さらなる生化学的、生物物理学的および機能的特徴付けのために、典型的なAARSポリペプチド(表E2にまとめてある)を以下の1つ以上の基準に基づいて選択する:i)AARSポリペプチドタンパク質分解フラグメントの同定、ii)AARSポリペプチドスプライスバリアントの同定、iii)バイオインフォマティック解析によるAARSポリペプチドの同定、iv)特定のAARSポリペプチドの差次的発現の証拠、v)AARSタンパク質のドメイン構造、vi)AARSポリペプチドの大きさ、およびvii)同様の重複した配列の最小化。
小規模な細菌発現および精製
表E2に記載のAARSポリペプチドを、一般的な材料および方法の節に記載されている通りに大腸菌(E.coli)内で発現させる。可溶性および封入体局在性のAARSポリペプチドの相対的発現を下の表E3にまとめる。
大規模なAARSポリペプチド産生
さらなる機能的および生物物理学的特徴付けを可能にするために、典型的なAARSポリペプチドを大量に調製する。表E4に記載のAARSポリペプチドを、一般的な材料および方法の節に記載されている通りに大腸菌(E.coli)内で発現させる。発現された各可溶性タンパク質の収量および生物物理学的特性を下の表E4にまとめる。
典型的なAARSポリペプチドの転写プロファイリング
AARSポリペプチドが遺伝子発現を調節する能力を試験するために、選択されたAARSポリペプチドを間葉系幹細胞またはヒト骨格筋細胞とともに、表E5に示される時間でインキュベートした。
典型的なAARSポリペプチドの機能プロファイリング
AARSポリペプチドが表現型の過程の範囲を調節する能力を試験するために、選択されたAARSポリペプチドを、一般的方法の節ならびに表E5およびE6に記載されている細胞型および条件を用いてインキュベートした。
従って、アラニルtRNA合成酵素のアミノ酸747〜968を含むAARSポリペプチドが、新規で高度に活性なAARSポリペプチドドメインのおおよその境界を画定する、つまり、i)高度に機能的に活性であり、ii)大腸菌内で、容易に作られ、且つ、生成することができ、iii)有利なタンパク質の安定性と凝集性を示すことが結論付けられる。
アラニルtRNA合成酵素の少なくとも約210のアミノ酸を含むものから、アラニルtRNA合成酵素の少なくとも約221のアミノ酸を含むものまでの任意のAARSポリペプチドが、記載の特定のAARSポリペプチドと機能的に同等であるということを当業者は理解するであろう。
(実施例13)
動物実験
Claims (23)
- 治療用組成物であって、
前記治療用組成物は、配列番号81のアミノ酸配列、または配列番号81のアミノ酸配列の200個以上の連続するアミノ酸であるそのフラグメントと少なくとも95%、98%または100%同一である単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチドを含み、
前記ポリペプチドまたは前記そのフラグメントは、細胞外シグナル伝達活性を有し、かつ少なくとも5mg/mLの溶解度を有し、
前記組成物の純度がタンパク質ベースで少なくとも95%であり、エンドトキシンが10EU/mgタンパク質未満である、
治療用組成物。 - 治療用組成物であって、
前記治療用組成物は、配列番号142のアミノ酸配列、または配列番号142のアミノ酸配列の200個以上の連続するアミノ酸であるそのフラグメントと少なくとも95%、98%または100%同一である単離アミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチドを含み、
前記ポリペプチドまたは前記そのフラグメントは、細胞外シグナル伝達活性を有し、かつ少なくとも5mg/mLの溶解度を有し、
前記組成物の純度がタンパク質ベースで少なくとも95%であり、エンドトキシンが10EU/mgタンパク質未満である、
治療用組成物。 - 前記AARSポリペプチドは、配列番号81のアミノ酸配列からなるか、または、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11個のアミノ酸の置換、削除および/または付加により、配列番号81のアミノ酸配列とは異なる、請求項1に記載の治療用組成物。
- 前記AARSポリペプチドは、配列番号142のアミノ酸配列からなるか、または、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11個のアミノ酸の置換、削除および/または付加により、配列番号142のアミノ酸配列とは異なる、請求項2に記載の治療用組成物。
- 前記AARSポリペプチドは異種ポリペプチドと融合している、請求項1または3に記載の治療用組成物。
- 前記AARSポリペプチドは異種ポリペプチドと融合している、請求項2または4に記載の治療用組成物。
- 前記異種ポリペプチドが、精製タグ、エピトープタグ、標的化配列、シグナルペプチド、膜転位配列およびPK調節物質からなる群より選択される、請求項5に記載の治療用組成物。
- 前記異種ポリペプチドが、精製タグ、エピトープタグ、標的化配列、シグナルペプチド、膜転位配列およびPK調節物質からなる群より選択される、請求項6に記載の治療用組成物。
- 少なくとも1つの部分が、前記ポリペプチドと共有結合または非共有結合しているか、または、固体基質が、前記ポリペプチドと結合している、請求項1、3、5および7のいずれか一項に記載の治療用組成物。
- 少なくとも1つの部分が、前記ポリペプチドと共有結合または非共有結合しているか、または、固体基質が、前記ポリペプチドと結合している、請求項2、4、6および8のいずれか一項に記載の治療用組成物。
- 細胞組成物であって、
前記細胞組成物は、請求項1〜8のいずれか一項において規定されるアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチド、および、操作された細胞集団であって、少なくとも1個の細胞が前記AARSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記細胞は無血清培地で増殖することができる、操作された細胞集団、
を含む、細胞組成物。 - 細胞増殖装置であって、
前記細胞増殖装置は、請求項1〜8のいずれか一項において規定されるアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチド、操作された細胞集団であって、少なくとも1個の細胞が前記AARSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む操作された細胞集団、少なくとも10リットルの無血清細胞培地、および、無菌容器、
を含む、細胞増殖装置。 - 請求項1〜10のいずれか一項において規定されるアミノアシルtRNA合成酵素(AARS)ポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
前記方法は、
a)適当な条件下で、前記AARSポリペプチドと少なくとも1つの試験化合物とを混合すること、および
b)前記AARSポリペプチドと前記試験化合物との結合を検出して、それにより前記AARSポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定すること、
を含む、方法。 - 神経疾患を治療するための医薬の製造における、請求項1、3、5、7および9のいずれか一項に記載の治療用組成物の使用。
- 前記神経疾患は、神経炎症、神経変性または脳の虚血である、請求項14に記載の使用。
- 慢性肉芽腫性疾患(CGD)または顆粒球の酸化バーストが損なわれる状態を治療するための医薬の製造における、請求項2、4、6、8および10のいずれか一項に記載の治療用組成物の使用。
- 炎症性疾患を治療するための医薬の製造における、請求項1、3、5、7および9のいずれか一項に記載の治療用組成物の使用。
- 前記炎症性疾患が、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、自己免疫および肺高血圧症から選択される、請求項17に記載の使用。
- 神経疾患を治療するための医薬であって、請求項1、3、5、7および9のいずれか一項に記載の治療用組成物を含む、医薬。
- 前記神経疾患は、神経炎症、神経変性または脳の虚血である、請求項19に記載の医薬。
- 慢性肉芽腫性疾患(CGD)または顆粒球の酸化バーストが損なわれる状態を治療するための医薬であって、請求項2、4、6、8および10のいずれか一項に記載の治療用組成物を含む、医薬。
- 炎症性疾患を治療するための医薬であって、請求項1、3、5、7および9のいずれか一項に記載の治療用組成物を含む、医薬。
- 前記炎症性疾患が、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、自己免疫および肺高血圧症から選択される、請求項22に記載の医薬。
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