JPH11503618A

JPH11503618A - スタフィロコッカス・アウレウスのロイシル−ｔＲＮＡシンセターゼ

Info

Publication number: JPH11503618A
Application number: JP9525804A
Authority: JP
Inventors: ホッジソン，ジョン・エドワード; ローラー，エリザベス
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 1999-03-30
Also published as: EP1300468A3; JPH11504820A; EP0785264A1; EP0785265A1; EP1288299A2; JPH11502724A; US5994111A; WO1997026349A1; EP1300468A2; EP1288299A3; EP0815237A1; US5750387A; EP0785271A1; JP2002142786A; WO1997026344A1; WO1997026342A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドおよびｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、ならびに組換え法による該ポリペプチドの製造方法を提供する。また本発明はｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドを、感染とりわけ細菌感染に対する防御のために利用する方法をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】スタフィロコッカス・アウレウスのロイシル−ｔＲＮＡシンセターゼ発明の分野本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびその製造および使用、ならびにそれらの変種、アゴニストおよびアンタゴニストおよびそれらの使用に関する。詳細には、これらのおよびその他の点に関して、本発明は、本明細書で「ｔＲＮＡシンセターゼ」と称するｔＲＮＡシンセターゼファミリーの新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。発明の背景抗生物質の開発を目的として、スタフィロコッカス（Staphylococcus）の遺伝子および遺伝子産物を用いることがとりわけ好ましい。スタフィロコッカス属は医学的に重要な微生物の属である。これらは浸潤性および毒素原性の２つの型の疾患を生み出すことが知られている。浸潤性感染は一般的に、皮膚表面および深部の組織の両方に影響を及ぼす膿瘍を形成する特徴がある。エス・アウレウス（ S.aureus）は癌患者の菌血症を二次的に引き起こす原因となる。骨髄炎、敗血症性関節炎、敗血症性血栓静脈炎および急性細菌性心内膜炎もまた比較的一般的である。スタフィロコッカス属の毒素原特性から少なくとも３つの臨床病態が引き起こされる。これらの疾患の発現は、組織浸潤および菌血症に対するものとしての外毒素の作用の結果である。これらの病態には：スタフィロコッカスの食物汚染、熱傷様皮膚症候群およびトキシックショック症候群等がある。ｔＲＮＡシンセターゼは以下のスキームに従って、タンパク質合成に主要な役割を果たす：酵素＋ＡＴＰ＋ＡＡ⇔酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ＰＰｉ酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡ⇔酵素＋ＡＭＰ＋ＡＡ-ｔＲＮＡ（ＡＡはアミノ酸である）この過程を阻害すると、荷電ｔＲＮＡのレベル低下を導き、緊縮応答として知られている応答のカスケードの引き金となり、結果的に生体の休眠状態を誘導する。そのようなものとして、細菌性ｔＲＮＡシンセターゼの選択的阻害剤は、抗細菌剤としての可能性を有する。これに関する一つの例として、イソロイシルｔＲＮＡシンセターゼを選択的に阻害するムピロシンがある。ｔＲＮＡシンセターゼの単離により、潜在的抗菌性の目的物質の同定および分析のための、抗菌性化合物のスクリーニングが容易になる。イソロイシルｔＲＮＡシンセターゼはスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）から単離され、すでに報告されている(Chalker,A.F.、Ward,J.M.、Fosberry,A.P.およびHodgson,J.E. ，Gene 141:103-108（1994）)。明らかに、化合物の抗生物質活性をスクリーニングするために用いることができる因子、ならびに感染、機能障害および疾患の発病における役割を決定するためにも用いることができる因子が必要とされている。また、感染、機能障害または疾患の予防、改善または抑制に役割を果たすことができるかかる因子ならびにアンタゴニストおよびアゴニストの同定および特徴づけも必要とされている。本発明のポリペプチドは、ミコバクテリウム・レプラエ（Mycobacterium leprae ）からの既知ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質に相同的なアミノ酸配列を有する。発明の概要本発明の目的は、図２に示すアミノ酸配列と既知アミノ酸配列またはバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）のロイシルｔＲＮＡシンセターゼのごとき他のタンパク質の配列との相同性により、新規ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドとして同定されたポリペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に本明細書においてｔＲＮＡシンセターゼと称するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することである。本発明のとりわけ好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、図１[配列番号：１]に示す配列を含む新規ロイシルｔＲＮＡシンセターゼポリペプチド、またはそれらの変種をコードする領域を含む。本発明の別のとりわけ好ましい態様において、図２[配列番号：２]に示すアミノ酸配列を含む、スタフィロコッカス・アウレウス由来の新規ロイシルｔＲＮＡシンセターゼタンパク質、またはそれらの変種がある。本発明のこの態様によれば、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１に含まれるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株により発現されうる成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供される。本発明のこの態様によれば、ｔＲＮＡシンセターゼ、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスｔＲＮＡシンセターゼをコードする、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等の単離核酸分子が提供される。本発明のさらなる態様は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なそれらの変種、およびこれらを含んでなる組成物を包含する。本発明の別の態様によれば、治療的、予防的目的で、とりわけ遺伝学的免疫における本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明のこの態様におけるとりわけ好ましい具体例は、ｔＲＮＡシンセターゼの自然発生対立遺伝子変種およびそれによりコードされるポリペプチドである。本発明のこの態様によれば、本明細書でｔＲＮＡシンセターゼと称するスタフィロコッカス・アウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なそれらの変種、およびこれらを含んでなる組成物が提供される。本発明のとりわけ好ましい具体例は、ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子の自然発生対立遺伝子によりコードされるｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドの変種である。本発明のこの態様における好ましい具体例において、前述のｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドの製造方法が提供される。本発明の別の態様によれば、例えば抗体等の抗細菌物質として有用な、このようなポリペプチドの阻害物質が提供される。本発明のこの態様における１の好ましい態様によれば、（i）ｔＲＮＡシンセターゼ発現の評価、（ii）疾患、例えば上気道感染（例えば中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば感染性心内膜炎）消化器感染（例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば大脳膿瘍）、眼感染（例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管感染（例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば膿痴疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、骨および関節感染（例えば敗血症性関節炎、骨髄炎）の処置、（iii）遺伝学的変種のアッセイ、（iv）ならびに細菌とりわけスタフィロコッカス・アウレウスに対する免疫学的応答を上昇させるための、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの生体への投与のための製品、組成物および方法が提供される。本発明のこのおよび他の態様における１の好ましい具体例によれば、ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチド配列に、とりわけ厳密な条件でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドが提供される本発明のこの態様における１の好ましい具体例において、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明の別の態様によれば、各々好ましい静細菌性または殺細菌性をも有するｔＲＮＡシンセターゼアゴニストおよびアンタゴニストを提供する。本発明のさらなる態様において、ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドまたはｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドを含有する、細胞または多細胞生物への投与用の組成物が提供される。開示した本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載および本明細書のその他の部分を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろう。図面の簡単な説明以下の図は本発明のある態様を表すものである。これらは説明のためのみに示すものであり、特記しない限り本明細書に記載する本発明を限定するものではない。図１は、スタフィロコッカス・アウレウスのロイシルｔＲＮＡシンセターゼ[ 配列番号：１]のポリヌクレオチド配列を示す。図２は、図１のポリヌクレオチド配列から推定したスタフィロコッカス・アウレウスのロイシルｔＲＮＡシンセターゼ[配列番号：２]のアミノ酸配列を示す。用語集以下の定義は、本明細書、とりわけ実施例において汎用される特定の用語の理解を容易にするために示すものである。「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列により形質転換もしくはトランスフェクションされた、または形質転換もしくはトランスフェクションされ得る細胞である。「同一性」とは、当該分野に周知であるように、二つもしくはそれ以上のポリペプチド配列また二つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であり、配列を比較して決定する。当該分野において、「同一性」とは、場合によってはかかる配列の鎖の合致により決定できる、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の配列関連性の程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は共に既知の方法により容易に算出できる（Computational Molecular Biology,Lesk,A.M .編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年；B iocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993年；Computer Analysis of Sequence Data，パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.、アカデミック・プレス、1987年；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M. およびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、1991年）。二つの配列の同一性および類似性を測定する方法は多くあるが、両用語共当業者に周知である（Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987年；Sequence Analysis Primer， Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、19 91年；ならびにCarillo,H.およびLipman,D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073（ 1988））。配列間の同一性または類似性を測定するために通常用いられる方法は Carillo,H.およびLipman,D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073（1988）等に開示されているが、これらに限定するものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間で最も良く合致するように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに集成されている。二つの配列間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387（1984）、BLASTP、BLASTN、およびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215:403-410（1990）））を包含するが、これらに限定するものではない。BLAST XプログラムはNCBIおよびその他の供給源より公に入手可能である（BLAST Manual、Altschul,S.ら、NCBI NLMNIHベゼスダ、メリーランド州２０８９４；Altschul,S.ら、J.Molec.Biol.215:403-410（1990））。「単離」とは、「人間の手により」天然の状態から変化させられた、すなわち、それが天然に存在する場合、元来の環境から変化または除去されたこと、あるいはその両方が行われたことを意味する。例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で生存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に共存する物質から分離されている場合は、本明細書に用いる用語「単離」がなされている。「ポリヌクレオチド」とは、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより普通には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を意味するが、これに限定するものではない。さらに、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。そのような領域における鎖は同一の分子または異なる分子由来のものでよい。この領域は一つまたはそれ以上の分子の全体を含み得るが、より典型的には幾つかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、上述のＤＮＡまたはＲＮＡ等を含む。このように、安定性またはその他の理由で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書の用語である「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは（二つの例だけをを示す）、本明細書で用いる用語ポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに非常に多くの修飾がなされていることは、明らかであろう。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば単純型細胞および複雑型細胞等の細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称する短いポリヌクレオチドを包含する。「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾したペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖、および一般的にタンパク質と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは２０種の遺伝子によりコードされたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプチド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾のような天然のプロセッシングにより修飾されたものが含まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾される。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾が該ポリペプチドのいくつかの部位で、同一または異なる程度で存在し得るということが理解されよう。また、該ポリペプチドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、クロスリンキング、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合クロスリンキング形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸の添加、ならびにユビキチネーションなどがある。例えばProteins-Structure and Molecular Properties、第２版、T.E.Creig hton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1993）およびPosttranslation al Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslational Protein Modifications ：Perspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-64 6（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：Posttranslational Modificati ons and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62（1992）を参照されたい。ポリペプチドは分岐または環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。環状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセッシングの結果であり、同様に全く合成的な方法で合成できる。本明細書で用いる「変種」なる用語は、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させるものであってもよく、変化させないものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、差異は参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるようなものに限られる。変種および対照ポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで起こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換または挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコードされたものであってもそうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝子変種のような自然発生的なものでもよく、あるいは自然に発生することが知られていない変種でよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの自然に発生しない変種は、突然変異技術、直接的合成、および当業者に既知のその他の組換え技術により製造できる。発明の説明本発明は以下により詳細に記載する、新規ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、アミノ酸配列の相同性という点でバチルス・ズブチリスのロイシルｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドに関連している、スタフィロコッカス・アウレウスの新規ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は特に図１および図２に各々示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセターゼ、ならびにＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１のＤＮＡのｔＲＮＡシンセターゼヌクレオチド配列およびそれらにコードされるアミノ酸配列に関する。とりわけ研究室的条件および宿主感染条件下での生存性に適用された場合に、細菌における一時的な遺伝子発現を評価するのに有用な技法がある。それ自体生存に必須であるかまたは感染の確立および／もしくは維持に必須である遺伝子を同定するために、多くの方法を用いることができる。これらの方法の一つにより配列の発現を同定することは、その機能についてのさらなる情報を提供し、スクリーニングの目的物質としてさらに開発するためのかかる配列の選別を助ける。簡単に説明すると、これらの研究は例えば：１）シグニチャータグ化突然変異法（Signature Tagged Mutagenesis：STM）この技法はHenselら、Science269:400-403（1995）に記載されており、参照により本明細書に記載されているものとみなす。シグニチャータグ化突然変異誘発は、該感染モデルにおける感染の確立／維持に必要な遺伝子を同定するものである。この技法は、種々の方法（例えばトランスポゾン）により、標的生物をランダムに突然変異を誘発し、ユニークなＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異体の混合集団からのタグおよび感染宿主から回収した細菌は、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーション分析により検出される。毒性を減じた突然変異体は、感染宿主から回収した細菌のプールのタグの欠如により表される。スタフィロコッカス・アウレウスにおいては、トランスポゾンシステムはよく発達していないので、タグ化突然変異体を作るためのより有効な方法には、Morr isonら、J.Bacteriol.159:870（1984）（参照によりその内容を本明細書に記載されているものともなす）に記載される挿入-複製突然変異法を用いる。２）インビボ発現法（In Vivo Expression Technology：IVET）この技術はCamilliら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA．91:2634-2638（1994）およびMahanら、Infectious Agents and Diseases 2:263-268（1994）に記載されており、各々の内容を参照により本明細書に記載されているものとみなす。IVETは、実験培養と比較した場合、感染中にアップレギュレーションする遺伝子を同定し、感染における重要な役割を有する。この技法により同定される配列は感染の確立/維持に重要な役割を有する。この技法では、標的生物のランダムな染色体フラグメントは、プラスミドベクターのプロモーター不含リポーター遺伝子の上流でクローン化される。プールを宿主に導入し、感染後の種々の時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現の存在を評価する。発現したリポーター遺伝子の上流に担持された染色体フラグメントは、感染中に正常なアップレギュレーションをうけるプロモーターまたは遺伝子部分を担持すべきである。リポーター遺伝子の上流を配列決定すると、アップレギュレーションされた遺伝子を同定できる。３）特徴ディスプレイこの技法はChuangら、J.Bacteriol.175:2026-2036（1993）に記載されており、内容を参照により本明細書に記載されているものとみなす。この方法はランダムプライムＲＴＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同定することにより、生体に発現する遺伝子を同定する。感染前および感染後のプロフィールを比較することにより、感染中にアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされる遺伝子を同定でき、ＲＴＰＣＲ生成物が配列決定され、ライブラリー配列に適合させられる。４）トランスポゾン突然変異誘発による条件致死変異体の発生この技法はde Lorenzo，V.ら、Gene123:17-24（1993）；Neuwald,A.F.ら、Gen e125:69-73（1993）およびTakiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553(1992)に記載されており（参照により本明細書に記載されているものとみなす）、発現が細胞の生存性に必須である遺伝子を同定する。この技法では、一方向または両方向でトランスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモーターを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトランスポゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモーター活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子のコーディング領域とプロモーターとを分離するインサートが回収されることが確認される。このインサートは生存できないので、引き続いてインデューサー不含のレプリカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポゾンに隣接する領域の配列決定により挿入部位を同定し、分断された遺伝子を同定する。インデューサー不存在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を正確にモニターし、遺伝子の可能な機能に関する情報を得る。このようなモニタリングには、フローサイトメトリー（細胞分割、溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製）ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射性学的標識前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに反応するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等がある。５）化学的突然変異法による条件致死突然変異の発生この技法はBeckwith,J.、Methods in Enzymology204:3-18（1991）に記載されており、参照により本明細書に記載されているものとみなす。この技法では標的生物のランダム化学的突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温度）とは異なる温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異なる温度（例えばｔｓ同定のためには４２℃、ｃｓ同定のためには２５℃）で成長させ、その時成長できなかった単離物（条件突然変異体）を同定する。上述のように、非許容温度での増殖における変化を正確にモニターし、突然変異遺伝子の機能に関する情報を得る。標的生物からのライブラリーにより条件致死突然変異を相補し、および相補遺伝子を配列決定することにより、ライブラリー配列と適合させることができる。これらの技法の各々は、特定の適用に応じて有利であったり、不利であったりする。当業者は意図する特定の使用目的に最も関連する研究法を選択する。例えば、いくつかの遺伝子は感染に必須であると認識されているが、実際には感染の開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は、確立された慢性の感染の治療のために開発された抗細菌物質にとってはそれほど魅力的な標的ではない。６）ＲＴ−ＰＣＲ細菌性メッセンジャーＲＮＡ、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスの細菌性メッセンジャーＲＮＡを、細菌感染した組織、例えば４８時間ネズミ・肺感染の組織から単離し、ランダムヘキサヌクレオチドでプライムしたＲＮＡサンプルの逆転写により、続いて遺伝子特異的プライマー対でのＰＣＲにより、各ｍＲＮＡ種の量を評価する。得られたＰＣＲ生成物の定量化により特定のＲＮＡ種の存在および量を決定し、感染した組織に転写された細菌遺伝子に関する情報を得る。遺伝子転写の分析は、感染の異なる時間で実施でき、細菌による発病における遺伝子制御に関する詳細な知識を得ることができ、遺伝子産物が新規抗菌物質をスクリーニングすべき目的物質に相当することが明快に理解できるようになる。用いたＰＣＲプライマーの遺伝子特異的特性のために、細菌性ｍＲＮＡ調製物は遊離の哺乳動物ＲＮＡである必要はないことが理解されるべきである。これにより研究者は、感染組織から簡単で迅速にＲＮＡを調製して、細菌中で非常に短時間しか生育できない（半減期２分程度）細菌性ｍＲＮＡ種を得ることができる。最適には、製造者の指示に従ってＴＲＩゾール（ギブコ−ＢＲＬ）を非常に短時間存在させ、機械的に破壊することにより、細菌性ｍＲＮＡを感染ネズミ肺組織から調製し、続いてＴＲＩゾール試薬の製造者の指示に従ってプロセッシングし、ＤＮＡａｓｅ処理して夾雑ＤＮＡを除去する。好ましくは、細菌性１６ＳリボソームＲＮＡ、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスの１６ＳリボソームＲＮＡの最大量を得る条件を見出すことによりプロセッシングを最適化し、該１６ＳリボソームＲＮＡは、適当に標識した配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてノーザンブロットをプロービングすることにより検出される。典型的には、所望により８から２５サイクルで終了するＰＣＲ反応における各ＰＣＲプライマー対には５'色素標識プライマーを用いる。ＰＣＲ生成物は６％ポリアクリルアミドゲルで分離し、GeneScanner（ＡＢＩ製造）を用いて検出および定量する。本発明の配列に適用する場合、これらの技法を用いると、感染中に発現する細菌性タンパク質、抗細菌治療に利用できる阻害物質の同定が可能になる。寄託物スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株を含有する寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭＢ）、２３ストリート、マッカードライブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランドに、１９９５年９月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１が付与された。寄託したスタフィロコッカス・アウレウス株は本明細書では「寄託株」または「寄託株のＤＮＡ」と称する。寄託物質はｔＲＮＡシンセターゼＤＮＡの全長を含有し、寄託に関して「ＮＣＩＭＢ４０７７１」と称する。本明細書の配列に関する任意の記載に矛盾する事象は、寄託物質に含まれるポリヌクレオチド配列、およびそれらにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に従う。寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件下でなされている。特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ．１１２条のもとに要求されるような、寄託が実施可能要件であることを承認するものではない。寄託物を製造、使用または販売するためにはライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはここでは賦与されていない。ポリペプチド本発明ポリペプチドは、図２[配列番号：２]のポリペプチド（詳細には成熟ポリペプチド）、とりわけｔＲＮＡシンセターゼの生物学的活性を有するポリペプチドおよびフラグメント、ならびに図２[配列番号：２]のポリペプチドまたは相当する部分に少なくとも７２％の同一性を有するポリペプチド、好ましくは図２ [配列番号：２]のポリペプチドに少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、およびさらに好ましくは図２[配列番号：２]のポリペプチドに少なくとも９０％の類似性（さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチド、なおさらに好ましくは図２[配列番号：２]のポリペプチドに少なくとも９５％の類似性（なおさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを包含し、また通常少なくとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むようなポリペプチド部分を有する、かかるポリペプチドの部分も包含する。本発明ポリペプチドのフラグメントである変種は、ペプチド合成により対応するポリペプチド全長を製造するのに用いることができる；従って、これらの変種をポリペプチドの全長を製造するための中間体として用いることができる。本発明ポリヌクレオチドのフラグメントである変種は本発明ポリヌクレオチド全長を合成するために用いることができる。フラグメントは、前述のポリペプチドのアミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドでは、フラグメントは「フリースタンディング（free standing）」であるか、または一部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続した領域として、単一のより大きなポリペプチドに含まれる。好ましいフラグメントは、例えば、図２［配列番号：２］のアミノ酸配列を有する切断ポリペプチドまたはその変種を包含するが、アミノ末端を含む一連の欠失、またはカルボキシル末端を含む残基の一連の連続の欠失、または一つはアミノ末端を含み、一つはカルボキシル末端を含む２個の連続した残基の欠失を除く。宿主、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスにおける本発明ポリペプチドの切断形態もまた好ましい。また、構造的または機能的属性により特徴づけられたフラグメント、例えばアルファーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含むフラグメントも好ましい。ｔＲＮＡシンセターゼの活性を媒介する、生物学的に活性な領域もまた好ましく、類似の活性もしくは改善された活性を有する、または望ましくない活性を減じたフラグメントが包含される。動物、とりわけヒトにおいて抗原性または免疫原性フラグメントも包含される。ポリヌクレオチド本発明の別の態様は、図２[配列番号：２]の推定アミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、ならびにそれらに、およびそれらの変種に密接に関連したポリヌクレオチドを提供する。本明細書に提供する情報を用いて、例えば図１[配列番号：１]に示すポリヌクレオチド配列のような、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードする本発明ポリヌクレオチドを、例えば、出発物質としてスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９細胞からの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決定するために用いるような標準的なクローニングおよびスクリーニングを用いて得ることができ、次いでクローン全長を得ることができる。例えば、図１[配列番号：１]に示す配列のごとき本発明ポリヌクレオチド配列を得るためには、典型的には、イー・コリ（E.coli）またはいくつかの異なる適当な宿主におけるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９細胞由来の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、部分的配列由来の、好ましくは１７量体またはそれ以上の長さの放射性標識オリゴヌクレオチドにてプローブする。プローブのＤＮＡに同一であるＤＮＡを担持するクローンは厳密な条件を用いて区別できる。元の配列から設計した配列決定プライマーを用いてこのように同定した個々のクローンを配列決定することにより、両方向で配列が伸長できるようになり、全遺伝子配列を決定することができる。便利には、かかる配列決定はプラスミドクローンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用いて実施する。適切な技法については、Maniatis,T .、Fitsch,F.F.およびSambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている（Screening By Hybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Template s 13.70参照）。本発明の実例として、図１[配列番号：１]に示すポリヌクレオチドは、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９に由来するＤＮＡライブラリーで発見された。このように得られたＤＮＡ配列を図１[配列番号：１]に示す。これは当該分野で周知のアミノ酸残基分子量を用いて算出できる推定分子量を有する、図２[配列番号：２]に示すものとほぼ同数のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードする読み枠を含有する。本発明ｔＲＮＡシンセターゼは、寄託株のｔＲＮＡシンセターゼをコードするＤＮＡの配列決定の結果により示されるように、ｔＲＮＡシンセターゼファミリーの他のタンパク質に構造的に関連している。該タンパク質は、既知タンパク質の中で、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）のロイシルｔＲＮＡシンセターゼに対して最大の相同性を示す。図２[配列番号：２]のロイシルｔＲＮＡシンセターゼは、バチルス・ズブチリスのロイシルｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドのアミノ酸配列に対して、全長で約７１％の同一性、および全長にわたり約８２％の類似性を有する。本発明配列はまた、図１[配列番号：１]のコーディング配列に全長にわたり同一であってもよい。本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはそれらのフラグメントのコーディング配列自体、ならびに他のコーディング配列（例えばリーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プレプロタンパク質配列をコードする）を伴った読み枠中の該成熟ポリペプチドまたはフラグメントのコーディング配列をも提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、停止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、および付加アミノ酸をコードする付加コーディング配列のごとき非コーディング５'および３'配列等の非コーディング配列をも包含しうるが、これらに限定するのではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコーディングされていてもよい。本発明のある好ましい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（キアゲン・インコーポレーティッド）に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド（Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡタグ（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である。また本発明ポリヌクレオチドは、構造遺伝子および遺伝子発現を調節するその天然において関連した配列を含んでなるポリヌクレオチドを包含するが、これらに限定するものではない。前述によれば、本明細書で用いる「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本発明ポリペプチド、とりわけ図２[配列番号：２]に示すアミノ酸配列を有する細菌性の、さらに詳細にはスタフィロコッカス・アウレウスのｔＲＮＡシンセターゼをコーディングする配列を含有するポリヌクレオチドを包含する。この用語はまた、付加領域と一緒になった、ポリペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領域（例えば組み込まれたファージもしくは挿入配列または修正により分断される）、さらにはコーディングおよび／または非コーディング配列をも含み得るポリヌクレオチドをも包含する。本発明はさらに、図２[配列番号：２]の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコードする、本明細書ですでに述べたポリヌクレオチドの変種に関する。本発明の特に好ましい態様は、図２[配列番号：２]に示すｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドのアミノ酸配列にいくつか、少しの、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を任意の組み合わせで施したアミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセターゼ変種をコードするポリヌクレオチドである。中でもとりわけ好ましいものは、ｔＲＮＡシンセターゼの特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失である。本発明のさらに好ましい態様は、図２[配列番号：２]に示すアミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長で少なくとも７２％同一であるポリヌクレオチドである。また別に、最も好ましいポリヌクレオチドは、寄託株スタフィロコッカス・アウレウスのＤＮＡのｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドおよびそれらに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長にわたり少なくとも８０％同一である領域を含むポリヌクレオチドである。この点に関して、全長にわたり少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好ましい。さらに少なくとも９５％の同一性を有するものの中でも少なくとも９７％であるのがより好ましく、中でも少なくとも９８％および少なくとも９９％であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好ましい。この点に関するとりわけ好ましい態様は、さらに、図１[配列番号：１]のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。さらに本発明は、本明細書ですでに述べた配列にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。この点に関して、本発明は、厳密な条件にて本明細書ですでに述べたポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに特に関連している。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密なハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例としては、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ7.6）、５ｘデンハーツ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性され剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０．１ｘＳＳＣ中フィルターを洗浄するものである。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）、とりわけその第２章に実例が示されており、その全開示を参照により本明細書に記載されているものとみなす。本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーション条件で配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列の完全遺伝子を含有する適当なライブラリーを、配列番号：１に示す該ポリヌクレオチド配列の配列を有するプローブでスクリーニングし、該ＤＮＡ配列を単離することにより得られるポリヌクレオチド配列を必須としてなるポリヌクレオチドをも提供する。このようなポリヌクレオチドを得るために有用なフラグメントは、例えば本明細書に別に記載するプローブおよびプライマーを包含する。本発明ポリヌクレオチドのアッセイに関してここでさらに論じるが、例えば上述の本発明ポリヌクレオチドをＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ｔＲＮＡシンセターゼをコードするｃＤＮＡ全長およびゲノムクローンを単離し、ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子に高度な配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離することができる。このようなプローブは通常少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこのようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、少なくとも５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプローブは少なくとも３０塩基を有し、５０塩基以下である。例えばｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子のコーディング領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、スクリーニングすることにより単離できる。次いで、本発明遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーのスクリーニングに用い、プローブがハイブリダイゼーションするライブラリーのメンバーを決定する。本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、疾患、とりわけヒトの疾患の処置法および診断法の発見のために研究試薬および材料として使用でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本明細書でさらに論じる。配列番号：１および２の配列に由来するオリゴヌクレオチドである本発明ポリヌクレオチドは本明細書に記載する方法に使用できるものであるが、ＰＣＲに用いるのが好ましく、本明細書で同定したポリヌクレオチドが全てまたは一部が感染した組織に転写されるかどうかを決定する。このような配列が、病原体が達成した感染の段階および感染の型の診断にも有用であることが理解される。ポリヌクレオチドは、付加アミノ酸もしくはカルボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペプチドに内在するアミノ酸を加えた成熟タンパク質であるポリペプチドをコードできる（例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。このような配列は、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシングに役割を担い、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質の半減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイもしくは製造のためのタンパク質の操作を容易にすることができる。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞の酵素によりプロセッシングされ、成熟タンパク質から取り除かれる。１またはそれ以上のプロ配列と融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去されると、このような不活性前駆体が通常活性化される。プロ配列のいくつかまたは全てを活性化の前に除去できる。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称される。要するに、本発明ポリヌクレオチドは成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク質（プレタンパク質と称することができる）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列および１またはそれ以上のプロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタンパク質をコードでき、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態を生じるプロセッシング段階で除去される。ベクター、宿主細胞、発現本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操作する宿主細胞および組換え技法による本発明ポリペプチドの製造にも関する。本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてかかるタンパク質を製造できる。組換え体を製造するために、宿主細胞は、遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davisら、Basic Methods in Molecu lar Biology（1986）；Sambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual 、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）のような多くの標準的な研究室マニュアルに記載される方法により行うことができ、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質により媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入および感染等がある。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例えばスタフィロコッカス属（streptococ ci）、スタフィロコッカス属（staphylococci）、イー・コリ（E.coli）、ストレプトミセスおよびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞例えばドロソフィラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細胞；動物細胞例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞を包含する。本発明ポリペプチドを製造するために非常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、インサート由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来のベクター、ならびにそれらを組み合わせた物に由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は、発現を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよい。通常宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または発現するのに適した、および／またはポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベクターを、この点に関する発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入でき、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual（上述）に記載されている。翻訳タンパク質を、小胞体内腔、ペリプラスミックスペースまたは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルはポリペプチドに対して内在性であってもよく、あるいは異種性のシグナルでもよい。本発明のポリペプチドは周知の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方法は、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いるのが最も好ましい。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性した場合、再び活性な立体配座にするために、タンパク質再生のための周知の技法を用いることができる。診断アッセイ本発明はまた診断試薬として使用するための本発明ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるｔＲＮＡシンセターゼの検出は、疾患の診断のための診断方法を提供する。真核生物（本明細書において「個体」とも称する）とりわけ哺乳動物、特にヒトがｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子を含む生物に感染すると、種々の方法によりＤＮＡレベルで検出できる。診断用核酸は、感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より得ることができる。ゲノムＤＮＡは直接的に検出するのに使用できるか、または分析の前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同じ方法に使用することができる。増幅を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすることができる。対照配列の遺伝子型と比較した増幅生成物の大きさの変化により、欠失および挿入を検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることにより同定できる。完全に対合した配列はＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差により、誤対合二重らせんから区別できる。ＤＮＡ配列の差はまた、変性剤を伴うまたは伴わないゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、または直接的なＤＮＡの配列決定により検出できる。例えばMeyersら、Science，230:1242（1 985）参照。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的切断法によっても明らかにすることができる。例えばCottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:4397-4401（1985）参照。本発明遺伝子の突然変異または多型性を担持する細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベルで、例えばセロタイピングすることにより検出できる。例えば、ＲＴＰＣＲは突然変異を検出するために用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目的で、ＰＣＲまたはＲＴＰＣＲに用いることができる。例を挙げると、ｔＲＮＡシンセターゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて突然変異を同定および分析することができる。これらのプライマーを用いて、個体に由来するサンプルから単離したｔＲＮＡシンセターゼＤＮＡを増幅することができる。本発明はまた５'および／または３'末端から１、２、３または４ヌクレオチド除去したプライマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染した個体から単離した遺伝子を増幅することができ、次いで、該遺伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供することができる。このように、ＤＮＡ配列における突然変異を検出し、これを用いて感染の診断および感染性物質のセロタイピングまたは分類をすることができる。本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感染、さらに好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスによる感染、および最も好ましくは上気道感染（例えば中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば大脳膿瘍）、眼感染(例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染（例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば膿痴疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、骨および関節感染（例えば敗血症性関節炎、骨髄炎）のごとき疾患の診断方法を提供し、図１[配列番号：１]の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上昇を、個体由来のサンプルから決定することを特徴とする。ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドの発現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で周知の方法の任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いて測定できる。さらに、正常対照組織サンプルと比較してｔＲＮＡシンセターゼタンパク質の過剰発現を検出するための本発明による診断アッセイは、例えば感染の存在を検出するために用いることができる。宿主由来のサンプル中のｔＲＮＡシンセターゼタンパク質のレベルを決定するために用いることができるアッセイ技法は、当業者に周知である。このようなアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。抗体本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそれらを発現する細胞は、このようなポリペプチドに免疫特異的な抗体を産生する免疫原として用いることができる。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの生成物を包含するＦａｂフラグメント等がある。本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが付いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくはヒトはでない動物に、通常の実験法を用いて投与することにより得ることができる。連続的細胞系培養により産生される抗体を提供する当業者周知の技術を用いて、モノクローナル抗体を調製することができる。実例としては、Kohler，G.およびMilstein,C.，N ature，256:495-497（1975）；Kozborら、Immunology Today，4:72（1983）；Co leら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記載されるような種々の技法がある。一本鎖抗体の製造のための記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）は、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。また、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例えばその他の哺乳動物は、ヒト化抗体等の抗体を発現するのに用いることができる。別法としてファージディスプレイ（phage display）技法を用いて、抗Ｆｂｐを有することについてスクリーニングしたヒトのリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ遺伝子のレパートリー由来の、または無処理のライブラリー由来のポリペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選別することができる（McCafferty,J.ら、Nature 348:552-554(1990);Marks,J.ら、Biotechnology 10:779-783（1992））。これらの抗体の親和性はチェインシャフリング（chain shuffling）により改善することもできる（Clackson,T.ら、Nature 352:624-628（1991））。二つの抗原結合ドメインが存在する場合、各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトープに対して指向される。上述の抗体はポリペプチドを発現するクローンを単離または同定するために用いることができ、親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。従って、とりわけｔＲＮＡシンセターゼに対する抗体を、感染、とりわけ細菌感染、特に上気道感染（例えば中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば大脳膿瘍）、眼感染(例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔（prese ptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染（例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば膿痴疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、骨および関節感染（例えば敗血症性関節炎、骨髄炎）のごとき疾患の処置に用いることができる。ポリペプチド変種は抗原的、エピトープ的または免疫学的に等価な変種を包含し、本発明の特定の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導体」なる用語は、本発明によりタンパク質またはポリペプチドに対して生起された場合、病原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊椎動物において抗体を生起させるのに適した処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用するペプチドまたはその等価物を包含する。ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に等価な誘導体、またはそれらの融合タンパク質は、マウスまたは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質はポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合することにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結合することができる。あるいはまた、タンパク質もしくはポリペプチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチドは、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有しているので、キャリヤを使用しなくてすむ。抗体またはそれらの変種を、個体における免疫原性を減じるために修飾するのが好ましい。例えば、個体がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒト化」されており；ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域がヒトモノクローナル抗体に移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-525（1986）またはTe mpestら、Biotechnology 9:266-273（1991）に記載されている。本発明ポリヌクレオチドを遺伝学的免疫において使用する場合、好ましくは、例えばプラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:363（1992）；Mantho rpeら、Hum.Gene Ther.4:419（1963））、特異的タンパク質キャリヤを伴ったＤＮＡ複合体の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshef、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（1989））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（1992）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12 :791（1993））およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたインビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））のごとき適切な送達方法を用いる。本発明のポリペプチドはまた、例えば細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産物の混合物中の、小型分子基質とリガンドとの結合を評価するために用いることもできる。これらの基質およびリガンドは天然の基質およびリガンドでよく、または構造上もしくは機能上の擬似物質でもよい。例えばColiga nら、Current Protocols in Immunology 1(2):第5章（1991）参照。アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子本発明はまたｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法をも提供する。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドおよびかかるポリペプチドの標識基質またはリガンド含んでなる合成反応混合物、膜、細胞表面膜もしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそれらのいずれかの調製物を、ｔＲＮＡシンセターゼアゴニストまたはアンタゴニストとなりうる候補分子の存在下または不在下でインキュベーションする。候補分子がｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドにアゴナイズまたは拮抗する能力は、標識リガンドの結合の低下またはかかる基質からの生成物の生成低下に反映される。結合しても影響を及ぼさない分子、すなわちｔＲＮＡシンセターゼの効果を誘起しない分子は、最も良好なアンタゴニストとなるであろう。結合性が良好で、基質からの生成物の生成速度を高める分子はアゴニストである。基質からの生成物の生成速度またはレベルはリポーターシステムを用いることにより増強できる。この点に関して有用なリポーターシステムは、生成物に転換される比色標識基質、ｔＲＮＡシンセターゼ活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当該分野で周知の結合アッセイを包含するが、これらに限定するものではない。ｔＲＮＡシンセターゼアンタゴニストのアッセイの他の例は競争アッセイであり、競争阻害アッセイに適した条件下で、ｔＲＮＡシンセターゼおよび潜在的なアンタゴニストをｔＲＮＡシンセターゼ結合分子、組換えｔＲＮＡシンセターゼ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド擬似物質と混合する。ｔＲＮＡシンセターゼを例えば放射活性または比色化合物により標識し、結合分子に結合した、または生成物に変換したｔＲＮＡシンセターゼ分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。さらなる態様において、本発明はロイシルｔＲＮＡシンセターゼの相互作用を妨害する薬物、例えばアンタゴニストおよびアゴニストを同定するための薬物のスクリーニング方法を提供する。酵素により媒介される放射性標識アミノ酸のｔＲＮＡへの組み込みを、ｔＲＮＡおよびＡＴＰの存在下、アミノ酸−ｔＲＮＡを放射性標識アミノ酸からのトリクロロ酢酸沈殿放射活性として測定するアミノアシル化法により測定できる（Hughes J.、Mellows G.およびSoughton S.、FEBS L etters 122:322-324（1980））。このようにロイシルｔＲＮＡシンセターゼ阻害物質を対照と比較して、トリクロロ酢酸沈殿放射性活性の減少により検出できる。あるいはまた、ＰＰｉからの放射性標識ＡＴＰの形成を測定する、部分ＰＰｉ／ＡＴＰ交換反応を触媒するｔＲＮＡシンセターゼを、ロイシルｔＲＮＡシンセターゼ阻害物質を検出するために使用できる（Calender R. & Berg P.、Biochem istry 5:1681-1690（1966））。潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合し、それによりその活性を阻害し、消滅させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を包含する。潜在的アンタゴニストはまた、結合分子の同一部位に結合する、正確に関連したタンパク質または抗体のような小型有機分子、ペプチド、ポリペプチド、例えばｔＲＮＡシンセターゼ誘起活性を誘起しない結合分子であってもよく、そのことによりｔＲＮＡシンセターゼを結合から排除して、ｔＲＮＡシンセターゼの作用を妨げる。潜在的なアンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に結合し、およびそれを占領し、それにより細胞性結合分子への結合を防御して、正常な生物学的活性を防御する小型分子等がある。小型分子の例は、小型有機分子、ペプチド、ペプチド様分子を包含するが、これらに限定するものではない。その他の潜在的なアンタゴニストはアンチセンス分子を包含する（これらの分子についての記載に関してはOkano,J.，Neurochem.56:560（1991）；Oligodeoxy-nucleotides as Anti sense Inhibitors of Gene Expression，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州（1988）参照）。好ましい潜在的アンタゴニストは、ｔＲＮＡシンセターゼ関連化合物およびｔＲＮＡシンセターゼの変種を包含する。特定の態様において、本発明は、感染の続発症に関与する、病因および哺乳動物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供する。とりわけ本発明の分子を、i）細菌とりわけグラム陽性細菌の内在デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質、または創傷の細胞外マトリックスタンパク質への付着の防御；ii）例えば哺乳動物チロシンキナーゼのリン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介するｔＲＮＡシンセターゼタンパク質の阻害(Rosenshineら、Infect.Immun.60:2211(1992))； iii）哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質との間の細菌付着の阻害；iv）内在デバイスの埋め込みまたはその他の外科的手技以外により開始した感染における病因の通常の進行の防御に使用することができる。本明細書で提供する各々のＤＮＡ配列は抗細菌化合物の発見および開発に用いることができる。発現すると、コーディングされたタンパク質は、抗菌薬物のスクリーニングのための目的物質として用いることができる。さらに、コーディングされたタンパク質もしくはShine-Delgarnoまたはその他の個々のｍＲＮＡの翻訳容易化配列のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列を、目的のコーディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構築するために用いることができる。アンタゴニストおよびアゴニストは、疾患、例えば、上気道感染（例えば中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば大脳膿瘍）、眼感染(例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎) 、腎および尿管感染（例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば膿痴疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、骨および関節感染（例えば敗血症性関節炎、骨髄炎）の阻止に用いることができる。ワクチン本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方法に関し、その方法には個体にｔＲＮＡシンセターゼ、またはそれらのフラグメントもしくは変種を個体に接種し、該個体が感染とりわけ細菌感染、特にスタフィロコッカス・アウレウス感染から防御する抗体を十分に産生させることを含む。本発明のまた別の態様は、個体に免疫学的応答を誘起する方法に関し、その方法には遺伝子治療によりｔＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラグメントもしくは変種をコードする遺伝子を送達し、ｔＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラグメントもしくは変種をインビボで発現し、該個体を疾患から保護する抗体を産生する免疫学的応答を誘起することを含む。本発明のさらなる態様は免疫学的組成物に関し、該組成物は、免疫学的応答を体内に誘起できる、あるいは誘起している宿主に導入した場合、宿主中でｔＲＮＡシンセターゼまたはそれによりコードされるタンパク質に対する免疫学的応答を誘起するものであり、該組成物は組換えｔＲＮＡシンセターゼ、またはそれによりコードされたタンパク質を含んでなり、また該ｔＲＮＡシンセターゼの抗原をコードし発現するＤＮＡ、またはそれによりコードされるタンパク質を含んでなる。ｔＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラグメントは、それ自身は抗体を産生しないが、第１のタンパク質を安定化し、免疫原性があり防御特性を有する融合タンパク質を形成することのできる補タンパク質（co-protein）と融合できる。このように融合した組換えタンパク質には、さらに抗原補タンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化し、それらの生成および精製を容易にする比較的大型の補タンパク質等が含まれるのがより好ましい。さらに、補タンパク質は免疫系において一般的な刺激を提供するという意味で、アジュバントとして作用しうる。補タンパク質は第１のタンパク質のアミノまたはカルボキシル末端のいずれに結合していてもよい。本発明は、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび免疫刺激ＤＮＡ配列を含んでなる組成物、とりわけワクチン組成物ならびに方法を提供し、免疫刺激ＤＮＡ配列はSato Y.ら、Science 273:352(1969)に記載されている。また、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウスに感染した動物モデルにおける、このような遺伝的免疫化実験で用いるＤＮＡ構築物の、細菌細胞表面タンパク質の非可変領域をコードすることが示されている記載されたポリヌクレオチドまたはとりわけそれらのフラグメントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的または治療的免疫反応を生じることができるタンパク質エピトープを同定するのに有用である。このアプローチは、哺乳動物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフィロコッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の開発のために、感染に抵抗し一掃するのに成功した動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル抗体を引き続き調製することを可能にすると考えられる。ポリペプチドは、例えば細菌の損傷組織への付着を阻害することにより、細菌の侵入に対して防御的な特異的抗体を産生するための宿主のワクチン化のための抗原として使用することができる。組織損傷の例は、例えば機械的、化学的もしくは熱損傷により、または内在デバイスの埋め込みにより、引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、または粘膜例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷を包含する。本発明にはまた免疫原性組換えタンパク質を適切な担体と共に含むワクチン処方を包含する。タンパク質は胃で分解されるので、非経口的例えば皮下、筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好ましい。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝液、静細菌剤および個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質を含有していてもよい水性または非水性滅菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方は単位投与または多回投与用容器、例えば密封したアンプルおよびバイアルに入れてよく、凍結乾燥状態で保存し、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする。ワクチン処方は処方の免疫原性を高めるアジュバント系をも含めることができ、例えば水中油系または当該分野で周知のその他の系がある。投与量はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により容易に決定できる。本発明は特定のｔＲＮＡシンセターゼに関して記載したが、これは天然に存在するタンパク質および、実質的に組換えタンパク質の免疫原特性に影響しない付加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフラグメントを包含することが理解されよう。組成物、キットおよび投与本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含んでなる組成物にも関する。本発明のポリペプチドは未滅菌もしくは滅菌担体と、または細胞、組織もしくは生物に用いられる担体、例えば対象への投与に適した医薬的担体と組み合わせて用いることができる。このような組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポリペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形剤を含む。このような担体にはセイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定するものではない。処方は投与法に適したものにすべきである。本発明はさらに、本発明の前述の組成物成分を１またはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器を含む診断用および医薬用パックおよびキットにも関する。本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独でまたは治療用化合物等のその他の化合物と組み合わせて用いることができる。医薬組成物は任意の有効な、利便的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の経路で投与できる。治療において、または予防として、活性物質を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の、滅菌水性分散物として個体に投与できる。また別に、組成物は局所適用用、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、洗口剤、染み込ませた包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾル等の形態に処方でき、適当な慣用的な添加物、例えば保存料、薬物の浸透を補助する溶媒を含有してもよく、軟膏およびクリームは軟化剤を含有してもよい。このような局所用処方はまた、適合した慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタノールまたはオレイルアルコールを含有してもよい。このような担体は処方の約１重量％から約９８重量％でよく；より通常的には処方の約８０重量％までとする。哺乳動物とりわけヒトに投与するために、有効成分の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。医者はいずれの場合にも、個体に最も適した実際の投与量を決定し、年齢、体重および特に個体の応答に応じて変化させる。上述の投与量は、平均的なケースの模範例である。もちろん、高量および低量の範囲が適合する個々の例もあり、これらは本発明の範囲内である。内在デバイスには外科的インプラント、プロテーゼデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体に導入し、長時間その位置に存在するデバイスである。このようなデバイスは、例えば人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析 (continuous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ)カテーテルを包含する。本発明組成物を注射により投与し、内在デバイスの挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的な効果を得ることができる。手術後、デバイスが体内に在る時間中、処置を続けてよい。さらに、任意の外科的手技のために手術中用カバーを広げて、細菌性創傷感染、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスの創傷感染を防御するために用いることができる。多くの整形外科医は、プロテーゼ関節を有するヒトは、菌血症を生じ得る歯科的処置の前に、抗生物質予防法を考慮されるべきであると考える。遅延性の重篤な感染は、時々プロテーゼ関節を失うに至る深刻な合併症であり、有意性のある羅病率および死亡率を伴う。従って、この場合、予防的な抗生物質の代わりに、活性物質の用途を拡張することが可能である。上述の治療に加え、本発明の組成物は一般的に創傷の治療薬として使用でき、創傷組織に曝露したマトリックスタンパク質に細菌が付着するのを防ぎ、歯科治療において抗生物質の予防法に代わって、またはそれと組み合わせて、予防的に使用できる。あるいはまた、本発明の組成物は、挿入直前に内在デバイスを浸すために使用できる。有効成分は創傷または内在デバイスを浸すために１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。便利には、ワクチン組成物を注射可能な形態にする。慣用的なアジュバントは免疫反応を高めるために用いることができる。ワクチン化に適した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適切な個体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察されない。上述の抗体もまたｔＲＮＡシンセターゼタンパク質を含有する細菌の存在を検出するための診断試薬として使用できる。実施例以下の実施例は、詳細に記載したこと以外は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を限定するものではない。実施例１：ライブラリーの製造配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドはイー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウレウスの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入手した。重複するスタフィロコッカス・アウレウスのＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローンからの配列決定データを、配列番号：１に示す連続したＤＮＡ配列を構築するために使用した場合もある。ライブラリーは通常の方法、例えば以下の方法１および２により製造できる。全細胞ＤＮＡは、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９より、標準法に準じて単離し、二つの方法のどちらかによりサイズ分画する。方法１標準法によりサイズ分画、するために、全細胞ＤＮＡをニードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大きさのフラグメントを、エキソヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、次いでパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。方法２全細胞ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈ１２３５Ｉ）にクローニングするための一連のフラグメントを適切に生じる１の制限酵素または制限酵素を組み合わせたもので部分加水分解し、このようなフラグメントを標準法によりサイズ分画する。ＥｃｏＲＩリンカーはＤＮＡおよびフラグメントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、およびパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染させる。ライブラリーを標準法により増幅する。実施例２：ロイシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＬＲＳ）活性の測定酵素はｔＲＮＡ^Leuのアミノアシル化を触媒し、これは２段階メカニズムで進行する。最初の段階では、ＡＴＰおよびＬ−ロイシンの特異的結合および反応の結果、安定な酵素：ロイシルアデニル化複合体を形成する。続いて、酵素結合ｔＲＮＡＬｅｕの３'末端アデノシンはアミノアシルアデニレートと反応し、ｔＲＮＡがエステル化され、ＡＭＰが放出される。これらの反応を以下にまとめる；ａ）Ｌ-Ｌｅｕ＋ＡＴＰ.Ｍｇ＋ＬＲＳ⇒ＬＲＳ：ＧＬＹ-ＡＭＰ＋ＰＰｉ.Ｍｇｂ）ＬＲＳ：Ｌｅｕ-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡ^Leu⇒ＬＲＳ＋Ｌｅｕ−ｔＲＮＡ^Leu ＋ＡＭＰこの反応をアッセイして、酵素の特徴づけ、または多くの方法でのその活性の特異的阻害物質を同定をすることができる：Ｌｅｕ-ｔＲＮＡ^Leuの形成の測定は放射性標識ロイシンを用いて特異的に決定でき、および沈殿/ろ過技法（例えば冷トリクロロ酢酸¹,²中）を用いてＬｅｕ- ｔＲＮＡから遊離のロイシンを分離できる。全アシル化反応もまたｔＲＮＡアシル化に対して化学量論的比率で生成されるＰＰｉまたはＡＭＰのどちらかの生成を分析することにより測定できる。これは、例えば比色³；または過剰の無機ピロホスファターゼを添加した後Ｐｉの酵素結合⁴測定を用いる；または直接的にＡＭＰもしくはＰＰｉ生成⁵を測定する酵素結合アッセイを用いる等の多くの方法により達成できる。部分反応（ａ）は、反応のこの部分の各段階は自由に可逆的であるので、ＡＴＰおよびＰＰｉ間の放射性標識アイソトープ交換により評価できる。これは典型的には，全アシル化反応（ａ＋ｂ）よりも約２０倍高いｋ_cat有し、ＡＴＰからＰＰｉを分離するクロマトグラフィーの原理を用いて（すなわち活性炭¹,²を用いて）容易に測定される。ＬＲＳへのリガンド結合基質のターンオーバーを触媒する酵素に依存しない実験において、リガンドのＬＲＳとの相互作用を決定することも可能である。この型の実験は、多くの方法で実施できる：酵素固有の蛍光へのリガンド結合の影響（例えばトリプトファン）。天然のリガンドまたは阻害物質の結合は、酵素の立体配座を変化させ、それは酵素の蛍光を変化させる。このことを利用して、ストップトフロー蛍光装置（stopped-flow fluorescence equipment）を用いて、結合を表す顕微鏡的速度定数を決定することができる。別法として、定常状態蛍光滴定法（steady-state fluorescence titration methods）は、酵素阻害実験で評価されるのと同一の方法で正味の解離定数を得ることができる。リガンドのスペクトル効果。リガンド自身が蛍光性であるかまたは酵素トリプトファン蛍光と重複する発色団を有する場合、結合はリガンド蛍光特性（例えば強度、寿命または分極）における変化、または酵素トリプトファンとの蛍光共鳴エネルギー転移により検出できる。リガンドは阻害物質であるか、または天然リガンドの変種である（すなわち蛍光ＡＴＰ誘導体または発蛍光団で標識したｔＲＮＡＬｅｕ）。酵素：リガンド複合体の熱分析。熱量測定法（例えば等温熱量測定、示差スキャンニング熱量測定）を用いると、温度変化またはそれによりリガンド結合を特徴づけることのできるＬＲＳの安定性のシフトの検出が可能になる。文献１．Calender & Berg、Biochemistry5:1681-1690（1966）２．Toth,M.J．& Schimmel,P.、J.Biol.Chem.265:1000-1004（1990）３．Hoenig、J.Biochem.Biophys.Meth.19:249-252（1989）４．Webb,T.M.、Anal.Biochem.218:449-454（1994）５．Sigma Chemicals Catalogue（1986）実施例３：ＬＲＳ活性についてのアミノアシル化アッセイイー・コリにて過剰発現した精製スタフィロコッカス・アウレウスのＬＲＳを用いるか、またはＬＲＳを過剰発現したイー・コリからの粗細胞溶解物を用いて、アッセイを実施する。後者は通常全タンパク質の約１０％をＬＲＳとして含有する。酵素は、液体窒素中急速冷凍した後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７.８）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂および１０ｍＭ β−メルカプトエタノール中−７０℃で保存する。酵素サンプルの活性を決定する実験では、これらの貯蔵物を５０ｍＭトリスｐＨ７.８、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭジチオスレイトールで広範に（１００倍から１００００倍）希釈し、アッセイ前に氷上で貯蔵する。アッセイ方法は以下のとおりである；上述のとおり調製し、希釈した酵素５０ｍｌを、０．２５μＣｉＬ−[Ｕ−¹⁴Ｃ]−ロイシン（アメルシャム・インターナショナル）、４ｍｇ／ｍｌイー・コリＭＲＥ６００混合ｔＲＮＡ（ベーリンガー・マンハイムより）、５ｍＭＡＴＰ、１５ｍＭＭｇＳＯ₄、３ｍＭＤＴＴ、７５ｍＭＫＣｌおよび５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.８を含有する反応混合物（１００ｍｌ）と混合する。他に記載しない場合、全ての試薬はシグマ・ケミカル・カンパニー・リミテッドより入手した。濃度は最終反応混合物での濃度である。酵素を添加して反応を開始した後、アッセイサンプルを３７℃でインキュベーションし、所望時間、２検体ずつ（５０μｌ）取り出し、７％トリクロロ酢酸（１００μｌ）で不活性化し、氷上で３０分放置する。パッカードフィルターメート１９６セルハーベスト[パッカード・インストラメント・リミテッド]を用いてグラスファイバーフィルター上で沈殿物を回収し、７％トリクロロ酢酸、エタノールで順次洗浄する。フィルターを７０℃で１時間乾燥し、放射活性のレベルをシンチレーションカウンティング（パッカード・トップカウント）により測定する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 45/00 ＡＤＺＣ０７Ｋ 16/40 48/00 ＡＢＡＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 16/40 9/10 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/10 1/25 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 1/25 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/15 33/569 Ｅ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/569 Ａ６１Ｋ 37/48 ＡＥＤ // Ｃ１２Ｐ 21/08 37/64 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:445） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ローラー，エリザベスアメリカ合衆国19426−0989 ペンシルベニア州カレッジビル、ピー・オー・ボックス5089、サウス・カレッジビル・ロード 1250番スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号：２のアミノ酸１から８０４を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７２％の同一性を有するポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオチド；からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。４．配列番号：１に示すヌクレオチド１から２４１５を含む請求項２記載のポリヌクレオチド。５．配列番号：１に示すヌクレオチド１から２４１２を含む請求項２記載のポリヌクレオチド。６．配列番号：２のアミノ酸１から８０４を含むポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。７．（ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１に含まれるｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子により発現される同一の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７２％の同一性を有するポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の塩基を含むポリヌクレオチド；からなる群から選択されるものを含む、単離ポリヌクレオチド。８．請求項２記載のＤＮＡを含むベクター。９．請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。１０．該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを請求項９記載の宿主細胞から発現させることを特徴とするポリペプチドの製造方法。１１．細胞が、請求項８記載のベクターに含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現するように、該ベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクションすることを特徴とする、ポリペプチドを発現する細胞の製造方法。１２．ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまたはフラグメントの製造方法であって、該ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまたはフラグメントを生成するのに十分な条件下で請求項９記載の宿主を培養することを特徴とする方法。１３．配列番号：２のアミノ酸１から８０４に対して少なくとも７２％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。１４．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。１５．請求項１３記載のポリペプチドに対する抗体。１６．請求項１３記載のポリペプチドの活性を阻害するアンタゴニスト。１７．治療上有効量の請求項１３記載のポリペプチドの個体への投与を特徴とする、ｔＲＮＡシンセターゼの必要性を有する個体の処置方法。１８．該ポリペプチドをコードするＤＮＡを個体に提供し、該ポリペプチドをインビボで発現させることにより、該治療上有効量のポリペプチドを投与する、請求項１６記載の方法。１９．治療上有効量の請求項１６記載のアンタゴニストを個体に投与することを特徴とする、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドを阻害する必要性を有する個体の処置方法。２０．請求項１３記載のポリペプチドをコードする核酸配列を決定することを特徴とする、該ポリペプチドの発現に関与する疾患の診断方法。２１．宿主由来のサンプル中の請求項１３記載のポリペプチドの存在を分析することを特徴とする診断方法。２２．請求項１３記載のポリペプチドに結合し、活性を阻害する化合物の同定方法であって；結合部位との結合を可能にする条件下で、ポリペプチドの結合部位を表面に発現する細胞を、スクリーニングされる化合物と接触させること（ここに該結合部位は、化合物の該結合部位への結合に反応して検出可能なシグナルを提供する能力のある第２の成分に結合するものである）；次いで、該化合物と該結合部位との相互作用から生じるシグナルの存在または不存在を検出することにより、該化合物が該結合部位に結合して活性化するかまたは阻害するかを決定すること；を特徴とする方法。２３．哺乳動物を疾患から防御する抗体を産生させるに十分なｔＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラグメントもしくは変種を哺乳動物に接種することを特徴とする、哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方法。２４．遺伝子治療により、ｔＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラグメントもしくは変種をコードする遺伝子を送達し、インビボでｔＲＮＡシンセターゼ、またはそれらのフラグメントもしくは変種を発現させ、次いで、該動物を疾患から防御する抗体を産生する免疫学的応答を誘起することを特徴とする、哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方法。２５．ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるタンパク質をコードし、発現するＤＮＡを含んでなる免疫学的組成物であって、哺乳動物に導入した場合、哺乳動物においてｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるタンパク質を生じる免疫学的応答を誘起する免疫学的組成物。２６．厳密なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列の完全遺伝子を含む適当なライブラリーを、配列番号：１に示す該ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントの配列を有するプローブでスクリーニングし、次いで、単離することにより得られるＤＮＡ配列を必須としてなるポリヌクレオチド。２７．新規ｔＲＮＡシンセターゼの相互作用を妨害する薬物を同定するための薬物のスクリーニング方法であって、全アミノアシル化反応または部分ＰＰｉ／ＡＴＰ交換反応による酵素活性の測定を特徴とするスクリーニング方法。