JPH11504524A - スタフィロコッカス・アウレウスのヒスチジル−tRNAシンセターゼ - Google Patents

スタフィロコッカス・アウレウスのヒスチジル−tRNAシンセターゼ

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JPH11504524A JP9525809A JP52580997A JPH11504524A JP H11504524 A JPH11504524 A JP H11504524A JP 9525809 A JP9525809 A JP 9525809A JP 52580997 A JP52580997 A JP 52580997A JP H11504524 A JPH11504524 A JP H11504524A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、tRNAシンセターゼポリペプチドおよびtRNAシンセターゼポリペプチドをコードするDNA(RNA)、ならびに組換え法による該ポリペプチドの製造方法を提供する。また本発明はtRNAシンセターゼポリペプチドを、感染とりわけ細菌感染に対する防御のために利用する方法をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 スタフィロコッカス・アウレウスのヒスチジル−tRNAシンセターゼ 発明の分野 本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびそ の製造および使用、ならびにそれらの変種、アゴニストおよびアンタゴニストお よびそれらの使用に関する。詳細には、これらのおよびその他の点に関して、本 発明は、本明細書で「tRNAシンセターゼ」と称するtRNAシンセターゼフ ァミリーの新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。 発明の背景 抗生物質の開発を目的として、スタフィロコッカス(Staphylococcus)の遺伝 子および遺伝子産物を用いることがとりわけ好ましい。スタフィロコッカス属は 医学的に重要な微生物の属である。これらは浸潤性および毒素原性の2つの型の 疾患を生み出すことが知られている。浸潤性感染は一般的に、皮膚表面および深 部の組織の両方に影響を及ぼす膿瘍を形成する特徴がある。エス・アウレウス( S.aureus)は癌患者の菌血症を二次的に引き起こす原因となる。骨髄炎、敗血症 性関節炎、敗血症性血栓静脈炎および急性細菌性心内膜炎もまた比較的一般的で ある。スタフィロコッカス属の毒素原特性から少なくとも3つの臨床病態が引き 起こされる。これらの疾患の発現は、組織浸潤および菌血症に対するものとして の外毒素の作用の結果である。これらの病態には:スタフィロコッカスの食物汚 染、熱傷様皮膚症候群およびトキシックショック症候群等がある。 tRNAシンセターゼは以下のスキームに従って、タンパク質合成に主要な役 割を果たす: 酵素+ATP+AA⇔酵素.AA-AMP+PPi 酵素.AA-AMP+tRNA⇔酵素+AMP+AA-tRNA (AAはアミノ酸である) この過程を阻害すると、荷電tRNAのレベル低下を導き、緊縮応答として知 られている応答のカスケードの引き金となり、結果的に生体の休眠状態を誘導す る。そのようなものとして、細菌性tRNAシンセターゼの選択的阻害剤は、抗 細菌剤としての可能性を有する。これに関する一つの例として、イソロイシルt RNAシンセターゼを選択的に阻害するムピロシンがある。tRNAシンセター ゼの単離により、潜在的抗菌性の目的物質の同定および分析のための、抗菌性化 合物のスクリーニングが容易になる。 イソロイシルtRNAシンセターゼはスタフィロコッカス・アウレウス(Stap hylococcus aureus)から単離され、すでに報告されている(Chalker,A.F.、War d,J.M.、Fosberry,A.P.およびHodgson,J.E.,Gene 141:103-108(1994))。 明らかに、化合物の抗生物質活性をスクリーニングするために用いることがで きる因子、ならびに感染、機能障害および疾患の発病における役割を決定するた めにも用いることができる因子が必要とされている。また、感染、機能障害また は疾患の予防、改善または抑制に役割を果たすことができるかかる因子ならびに アンタゴニストおよびアゴニストの同定および特徴づけも必要とされている。本 発明のポリペプチドは、ミコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae) からの既知tRNAシンセターゼタンパク質に相同的なアミノ酸配列を有する。 発明の概要 本発明の目的は、図2に示すアミノ酸配列と既知アミノ酸配列またはヒスチジ ルtRNAシンセターゼ蛋白のごとき他のタンパク質の配列との相同性により、 新規tRNAシンセターゼポリペプチドとして同定されたポリペプチドを提供す ることである。 本発明のさらなる目的は、tRNAシンセターゼポリペプチドをコードするポ リヌクレオチド、特に本明細書においてtRNAシンセターゼと称するポリペプ チドをコードするポリヌクレオチドを提供することである。 本発明のとりわけ好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、図1[配列番 号:1]に示す配列を含む新規ヒスチジルtRNAシンセターゼポリペプチド、 またはそれらの変種をコードする領域を含む。 本発明の別のとりわけ好ましい態様において、図2[配列番号:2]に示すアミ ノ酸配列を含む、スタフィロコッカス・アウレウス由来の新規ヒスチジルtRN Aシンセターゼタンパク質、またはそれらの変種がある。 本発明のこの態様によれば、NCIMB受託番号40771に含まれるスタフ ィロコッカス・アウレウスWCUH29株により発現されうる成熟ポリペプチド をコードする単離核酸分子が提供される。 本発明のこの態様によれば、tRNAシンセターゼ、とりわけスタフィロコッ カス・アウレウスtRNAシンセターゼをコードする、mRNA、cDNA、ゲ ノムDNA等の単離核酸分子が提供される。本発明のさらなる態様は、生物学的 、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なそれらの変種、およびこれら を含んでなる組成物を包含する。 本発明の別の態様によれば、治療的、予防的目的で、とりわけ遺伝学的免疫に おける本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明のこの態様におけ るとりわけ好ましい具体例は、tRNAシンセターゼの自然発生対立遺伝子変種 およびそれによりコードされるポリペプチドである。 本発明のこの態様によれば、本明細書でtRNAシンセターゼと称するスタフ ィロコッカス・アウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断学的、 予防的、臨床的または治療的に有用なそれらの変種、およびこれらを含んでなる 組成物が提供される。 本発明のとりわけ好ましい具体例は、tRNAシンセターゼ遺伝子の自然発生 対立遺伝子によりコードされるtRNAシンセターゼポリペプチドの変種である 。 本発明のこの態様における好ましい具体例において、前述のtRNAシンセタ ーゼポリペプチドの製造方法が提供される。 本発明の別の態様によれば、例えば抗体等の抗細菌物質として有用な、このよ うなポリペプチドの阻害物質が提供される。 本発明のこの態様における1の好ましい態様によれば、 (i)tRNAシンセターゼ発現の評価、(ii)疾患、例えば上気道感染(例え ば中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道感染(例えば蓄膿 症、肺膿瘍)、心臓感染(例えば感染性心内膜炎)消化器感染(例えば分泌性下 痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍)、CNS感染(例えば大脳膿瘍)、眼感染(例えば 眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔(preseptal)および眼窩蜂巣炎、涙 嚢炎)、腎および尿管感染(例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシッ クショック症候群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創 傷感染、細菌性筋炎)、骨および関節感染(例えば敗血症性関節炎、骨髄炎)の 処置、(iii)遺伝学的変種のアッセイ、(iv)ならびに細菌とりわけスタフィ ロコッカス・アウレウスに対する免疫学的応答を上昇させるための、tRNAシ ンセターゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの生体への投与のための製品、 組成物および方法が提供される。 本発明のこのおよび他の態様における1の好ましい具体例によれば、tRNA シンセターゼポリヌクレオチド配列に、とりわけ厳密な条件でハイブリダイゼー ションするポリヌクレオチドが提供される 本発明のこの態様における1の好ましい具体例において、tRNAシンセター ゼポリペプチドに対する抗体が提供される。 本発明の別の態様によれば、各々好ましい静細菌性または殺細菌性をも有する tRNAシンセターゼアゴニストおよびアンタゴニストを提供する。 本発明のさらなる態様において、tRNAシンセターゼポリヌクレオチドまた はtRNAシンセターゼポリペプチドを含有する、細胞または多細胞生物への投 与用の組成物が提供される。 開示した本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載 および本明細書のその他の部分を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろ う。 図面の簡単な説明 以下の図は本発明のある態様を表すものである。これらは説明のためのみに示 すものであり、特記しない限り本明細書に記載する本発明を限定するものではな い。 図1は、スタフィロコッカス・アウレウスのヒスチジルtRNAシンセターゼ [配列番号:1]のポリヌクレオチド配列を示す。 図2は、図1のポリヌクレオチド配列から推定したスタフィロコッカス・アウ レウスのヒスチジルtRNAシンセターゼ[配列番号:2]のアミノ酸配列を示す 。 用語集 以下の定義は、本明細書、とりわけ実施例において汎用される特定の用語の理 解を容易にするために示すものである。 「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列により形質転換もしくはトランス フェクションされた、または形質転換もしくはトランスフェクションされ得る細 胞である。 「同一性」とは、当該分野に周知であるように、二つもしくはそれ以上のポリ ペプチド配列また二つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であり 、配列を比較して決定する。当該分野において、「同一性」とは、場合によって はかかる配列の鎖の合致により決定できる、ポリペプチドまたはポリヌクレオチ ド配列の配列関連性の程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は共に既 知の方法により容易に算出できる(Computational Molecular Biology,Lesk,A. M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年; Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編、アカデミッ ク・プレス・ニューヨーク、1993年;Computer Analysis of Sequence Data,パ ートI,Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマン・プレス、ニュージャ ージー、1994年;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.、 アカデミック・プレス、1987年;およびSequence Analysis Primer,Gribskov,M .およびDevereux,J.編、Mストックトン・プレス、ニューヨーク、1991年)。二 つの配列の同一性および類似性を測定する方法は多くあるが、両用語共当業者に 周知である(Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.、アカ デミック・プレス、1987年;Sequence Analysis Primer, Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Mストックトン・プレス、ニューヨーク、19 91年;ならびにCarillo,H.およびLipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073( 1988))。配列間の同一性または類似性を測定するために通常用いられる方法は Carillo,H.およびLipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)等に開示 されているが、これらに限定するものではない。同一性を決定するための好まし い方法は、試験する配列間で最も良く合致するように設計される。同一性および 類似性を決定する方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに集成され ている。二つの配列間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピューター プログラム法は、GCGプログラムパッケージ(Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Atschul,S.F.ら 、J.Molec.Biol.215:403-410(1990)))を包含するが、これらに限定するもの ではない。BLAST XプログラムはNCBIおよびその他の供給源より公に入手可能で ある(BLAST Manual、Altschul,S.ら、NCBI NLMNIHベゼスダ、メリーランド州2 0894;Altschul,S.ら、J.Molec.Biol.215:403-410(1990))。 「単離」とは、「人間の手により」天然の状態から変化させられた、すなわち 、それが天然に存在する場合、元来の環境から変化または除去されたこと、ある いはその両方が行われたことを意味する。例えばポリヌクレオチドまたはポリペ プチドが、天然の状態で生存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、 同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に共存する物質から分離さ れている場合は、本明細書に用いる用語「単離」がなされている。 「ポリヌクレオチド」とは、修飾されていないRNAもしくはDNA、または 修飾されたRNAもしくはDNAであってよい、任意のポリリボヌクレオチドま たはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド」は、一本 鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖 および三本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに 一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖もしくはより普通には二 本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物でよいDNAおよ びRNAを含むハイブリッド分子を意味するが、これに限定するものではない。 さらに、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNAまたはR NAとDNAの両方を含む三本鎖領域を意味する。そのような領域における鎖は 同一の分子または異なる分子由来のものでよい。この領域は一つまたはそれ以上 の分子の全体を含み得るが、より典型的には幾つかの分子の一領域のみを含む。 三重らせん領域の分子の一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書 で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基 を含有する、上述のDNAまたはRNA等を含む。このように、安定性またはそ の他の理由で修飾した骨格を有するDNAまたはRNAは、本明細書の用語であ る「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない塩基、または トリチル化塩基等の修飾塩基を含むDNAまたはRNAは(二つの例だけをを示 す)、本明細書で用いる用語ポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有 用な目的を提供するDNAおよびRNAに非常に多くの修飾がなされていること は、明らかであろう。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、ポリ ヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、なら びにウイルスおよび、例えば単純型細胞および複雑型細胞等の細胞に特徴的なD NAおよびRNAの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしば オリゴヌクレオチドと称する短いポリヌクレオチドを包含する。 「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾したペプチド結合により互いに 結合している2個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパ ク質を意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペプチド、オリゴペプチド およびオリゴマーとも称する短鎖、および一般的にタンパク質と称する長鎖の両 方を意味する。ポリペプチドは20種の遺伝子によりコードされたアミノ酸とは 異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプチド」には、プロセッシングおよびそ の他の翻訳後修飾のような天然のプロセッシングにより修飾されたものが含まれ るが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾される。このような修飾は基 礎的な参考書およびさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載さ れており、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾が該ポリペプチドのい くつかの部位で、同一または異なる程度で存在し得るということが理解されよう 。 また、該ポリペプチドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプチド骨格、 アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端等のポリペプチドの任意の部 位で起こりうる。修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミ ド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオ チド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシ トールの共有結合、クロスリンキング、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル 化、共有結合クロスリンキング形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、 ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水 酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセ ッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化 、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、水酸化およびADPリボシル化 、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーRNAにより媒 介されるタンパク質へのアミノ酸の添加、ならびにユビキチネーションなどがあ る。例えばProteins-Structure and Molecular Properties、第2版、T.E.Creig hton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク(1993)およびPosttranslation al Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス 、ニューヨーク(1983)のWold,F.,Posttranslational Protein Modifications :Perspective and Prospects、1〜12頁;Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-64 6(1990)およびRattanら、Protein Synthesis:Posttranslational Modificati ons and Aging,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992)を参照されたい。ポリペ プチドは分岐または環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。環状、分岐お よび分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセッシングの結果であり 、同様に全く合成的な方法で合成できる。 本明細書で用いる「変種」なる用語は、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプ チドとは各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的な特 性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変種は、別の対照ポリヌクレオ チドとはヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポ リヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させるも のであってもよく、変化させないものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結 果的に、以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリペプチドにおけ るアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を招く。典型的なポリペプチドの 変種は、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、差異は 参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に非常に類似しており、多くの領 域で同一であるようなものに限られる。変種および対照ポリペプチドは、1また はそれ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで起こることにより、アミノ 酸配列が変化し得る。置換または挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードにより コードされたものであってもそうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリ ペプチドの変種は例えば対立遺伝子変種のような自然発生的なものでもよく、あ るいは自然に発生することが知られていない変種でよい。ポリヌクレオチドおよ びポリペプチドの自然に発生しない変種は、突然変異技術、直接的合成、および 当業者に既知のその他の組換え技術により製造できる。 発明の説明 本発明は以下により詳細に記載する、新規tRNAシンセターゼポリペプチド およびポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、アミノ酸配列の相同性とい う点でヒスチジルtRNAシンセターゼポリペプチドに関連している、スタフィ ロコッカス・アウレウスの新規tRNAシンセターゼ遺伝子のポリペプチドおよ びポリヌクレオチドに関する。本発明は特に図1および図2に各々示すヌクレオ チドおよびアミノ酸配列を有するtRNAシンセターゼ、ならびにNCIMB受 託番号40771のDNAのtRNAシンセターゼヌクレオチド配列およびそれ らにコードされるアミノ酸配列に関する。 とりわけ研究室的条件および宿主感染条件下での生存性に適用された場合に、 細菌における一時的な遺伝子発現を評価するのに有用な技法がある。それ自体生 存に必須であるかまたは感染の確立および/もしくは維持に必須である遺伝子を 同定するために、多くの方法を用いることができる。これらの方法の一つにより 配列の発現を同定することは、その機能についてのさらなる情報を提供し、スク リーニングの目的物質としてさらに開発するためのかかる配列の選別を助ける。 簡単に説明すると、これらの研究は例えば: 1)シグニチャータグ化突然変異法(Signature Tagged Mutagenesis:STM) この技法はHenselら、Science269:400-403(1995)に記載されており、参照に より本明細書に記載されているものとみなす。シグニチャータグ化突然変異誘発 は、該感染モデルにおける感染の確立/維持に必要な遺伝子を同定するものであ る。 この技法は、種々の方法(例えばトランスポゾン)により、標的生物をランダ ムに突然変異を誘発し、ユニークなDNA配列タグを突然変異部位に非常に近接 して挿入することに基づく。細菌性突然変異体の混合集団からのタグおよび感染 宿主から回収した細菌は、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーション分 析により検出される。毒性を減じた突然変異体は、感染宿主から回収した細菌の プールのタグの欠如により表される。 スタフィロコッカス・アウレウスにおいては、トランスポゾンシステムはよく 発達していないので、タグ化突然変異体を作るためのより有効な方法には、Morr isonら、J.Bacteriol.159:870(1984)(参照によりその内容を本明細書に記載 されているものともなす)に記載される挿入-複製突然変異法を用いる。 2)インビボ発現法(In Vivo Expression Technology:IVET) この技術はCamilliら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA.91:2634-2638(1994)およ びMahanら、Infectious Agents and Diseases 2:263-268(1994)に記載されて おり、各々の内容を参照により本明細書に記載されているものとみなす。IVETは 、実験培養と比較した場合、感染中にアップレギュレーションする遺伝子を同定 し、感染における重要な役割を有する。この技法により同定される配列は感染の 確立/維持に重要な役割を有する。 この技法では、標的生物のランダムな染色体フラグメントは、プラスミドベク ターのプロモーター不含リポーター遺伝子の上流でクローン化される。プールを 宿主に導入し、感染後の種々の時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現の存 在を評価する。発現したリポーター遺伝子の上流に担持された染色体フラグメン トは、感染中に正常なアップレギュレーションをうけるプロモーターまたは遺伝 子部分を担持すべきである。リポーター遺伝子の上流を配列決定すると、アップ レギュレーションされた遺伝子を同定できる。 3)特徴ディスプレイ この技法はChuangら、J.Bacteriol.175:2026-2036(1993)に記載されており 、内容を参照により本明細書に記載されているものとみなす。この方法はランダ ムプライムRTPCRを用いてmRNAの存在を同定することにより、生体に発 現する遺伝子を同定する。感染前および感染後のプロフィールを比較することに より、感染中にアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされる遺 伝子を同定でき、RTPCR生成物が配列決定され、ライブラリー配列に適合さ せられる。 4)トランスポゾン突然変異誘発による条件致死変異体の発生 この技法はde Lorenzo,V.ら、Gene123:17-24(1993);Neuwald,A.F.ら、Gen e125:69-73(1993)およびTakiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553(1992) に記載されており(参照により本明細書に記載されているものとみなす)、発現が 細胞の生存性に必須である遺伝子を同定する。 この技法では、一方向または両方向でトランスポゾンから外側へ転写する、調 節可能なプロモーターを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトランスポ ゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモーター活性のインデューサー の存在下で挿入突然変異体を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子 のコーディング領域とプロモーターとを分離するインサートが回収されることが 確認される。このインサートは生存できないので、引き続いてインデューサー不 含のレプリカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポゾンに隣接する 領域の配列決定により挿入部位を同定し、分断された遺伝子を同定する。インデ ューサー不存在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を正確にモニターし、遺 伝子の可能な機能に関する情報を得る。このようなモニタリングには、フローサ イトメトリー(細胞分割、溶解、酸化還元能、DNA複製)DNA、RNA、タ ンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射性学的標識前駆体の取り込み、既知 の細胞性ストレスに反応するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等がある。 5)化学的突然変異法による条件致死突然変異の発生 この技法はBeckwith,J.、Methods in Enzymology204:3-18(1991)に記載され ており、参照により本明細書に記載されているものとみなす。この技法では標的 生物のランダム化学的突然変異を誘発し、生理学的温度(許容温度)とは異なる 温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異なる温度(例えばts同定の ためには42℃、cs同定のためには25℃)で成長させ、その時成長できなか った単離物(条件突然変異体)を同定する。上述のように、非許容温度での増殖 における変化を正確にモニターし、突然変異遺伝子の機能に関する情報を得る。 標的生物からのライブラリーにより条件致死突然変異を相補し、および相補遺伝 子を配列決定することにより、ライブラリー配列と適合させることができる。 これらの技法の各々は、特定の適用に応じて有利であったり、不利であったり する。当業者は意図する特定の使用目的に最も関連する研究法を選択する。例え ば、いくつかの遺伝子は感染に必須であると認識されているが、実際には感染の 開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は、確立された慢性の感染の治療 のために開発された抗細菌物質にとってはそれほど魅力的な標的ではない。 6)RT−PCR 細菌性メッセンジャーRNA、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスの 細菌性メッセンジャーRNAを、細菌感染した組織、例えば48時間ネズミ・肺 感染の組織から単離し、ランダムヘキサヌクレオチドでプライムしたRNAサン プルの逆転写により、続いて遺伝子特異的プライマー対でのPCRにより、各m RNA種の量を評価する。得られたPCR生成物の定量化により特定のRNA種 の存在および量を決定し、感染した組織に転写された細菌遺伝子に関する情報を 得る。遺伝子転写の分析は、感染の異なる時間で実施でき、細菌による発病にお ける遺伝子制御に関する詳細な知識を得ることができ、遺伝子産物が新規抗菌物 質をスクリーニングすべき目的物質に相当することが明快に理解できるようにな る。用いたPCRプライマーの遺伝子特異的特性のために、細菌性mRNA調製 物は遊離の哺乳動物RNAである必要はないことが理解されるべきである。これ により研究者は、感染組織から簡単で迅速にRNAを調製して、細菌中で非常 に短時間しか生育できない(半減期2分程度)細菌性mRNA種を得ることがで きる。最適には、製造者の指示に従ってTRIゾール(ギブコ−BRL)を非常 に短時間存在させ、機械的に破壊することにより、細菌性mRNAを感染ネズミ 肺組織から調製し、続いてTRIゾール試薬の製造者の指示に従ってプロセッシ ングし、DNAase処理して夾雑DNAを除去する。好ましくは、細菌性16 SリボソームRNA、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスの16Sリボ ソームRNAの最大量を得る条件を見出すことによりプロセッシングを最適化し 、該16SリボソームRNAは、適当に標識した配列特異的オリゴヌクレオチド プローブを用いてノーザンブロットをプロービングすることにより検出される。 典型的には、所望により8から25サイクルで終了するPCR反応における各P CRプライマー対には5'色素標識プライマーを用いる。PCR生成物は6%ポ リアクリルアミドゲルで分離し、GeneScanner(ABI製造)を用いて検出およ び定量する。 本発明の配列に適用する場合、これらの技法を用いると、感染中に発現する細 菌性タンパク質、抗細菌治療に利用できる阻害物質の同定が可能になる。 寄託物 スタフィロコッカス・アウレウスWCUH29株を含有する寄託物は、ナショ ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・ リミテッド(NCIMB)、23ストリート、マッカードライブ、アベルディー ンAB21RY、スコットランドに、1995年9月11日寄託し、NCIMB 受託番号40771が付与された。寄託したスタフィロコッカス・アウレウス株 は本明細書では「寄託株」または「寄託株のDNA」と称する。 寄託物質はtRNAシンセターゼDNAの全長を含有し、寄託に関して「NC IMB40771」と称する。 本明細書の配列に関する任意の記載に矛盾する事象は、寄託物質に含まれるポ リヌクレオチド配列、およびそれらにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列 に従う。 寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件 下でなされている。特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最終的に 株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、35U.S.C.1 12条のもとに要求されるような、寄託が実施可能要件であることを承認するも のではない。 寄託物を製造、使用または販売するためにはライセンスが必要であるが、その ようなライセンスはここでは賦与されていない。 ポリペプチド 本発明ポリペプチドは、図2[配列番号:2]のポリペプチド(詳細には成熟ポ リペプチド)、とりわけtRNAシンセターゼの生物学的活性を有するポリペプ チドおよびフラグメント、ならびに図2[配列番号:2]のポリペプチドまたは相 当する部分に少なくとも70%の同一性を有するポリペプチド、好ましくは図2 [配列番号:2]のポリペプチドに少なくとも80%の同一性を有するポリペプチ ド、およびさらに好ましくは図2[配列番号:2]のポリペプチドに少なくとも9 0%の類似性(さらに好ましくは少なくとも90%の同一性)を有するポリペプ チド、なおさらに好ましくは図2[配列番号:2]のポリペプチドに少なくとも9 5%の類似性(なおさらに好ましくは少なくとも95%の同一性)を有するポリ ペプチドを包含し、また通常少なくとも30個のアミノ酸、さらに好ましくは少 なくとも50個のアミノ酸を含むようなポリペプチド部分を有する、かかるポリ ペプチドの部分も包含する。 本発明ポリペプチドのフラグメントである変種は、ペプチド合成により対応す るポリペプチド全長を製造するのに用いることができる;従って、これらの変種 をポリペプチドの全長を製造するための中間体として用いることができる。本発 明ポリヌクレオチドのフラグメントである変種は本発明ポリヌクレオチド全長を 合成するために用いることができる。 フラグメントは、前述のポリペプチドのアミノ酸配列のすべてではなく一部に 対して全く同一であるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。tRNA シンセターゼポリペプチドでは、フラグメントは「フリースタンディング(free standing)」であるか、または一部もしくは領域を形成するより大きなポリペ プチド内に含まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続した領域として、単 一のより大きなポリペプチドに含まれる。 好ましいフラグメントは、例えば、図2[配列番号:2]のアミノ酸配列を有 する切断ポリペプチドまたはその変種を包含するが、アミノ末端を含む一連の欠 失、またはカルボキシル末端を含む残基の一連の連続の欠失、または一つはアミ ノ末端を含み、一つはカルボキシル末端を含む2個の連続した残基の欠失を除く 。宿主、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスにおける本発明ポリペプチド の切断形態もまた好ましい。また、構造的または機能的属性により特徴づけられ たフラグメント、例えばアルファーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成 領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、ターンおよびターン形成領域 、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファー両親媒性 領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、および高 抗原性指標領域を含むフラグメントも好ましい。 tRNAシンセターゼの活性を媒介する、生物学的に活性な領域もまた好まし く、類似の活性もしくは改善された活性を有する、または望ましくない活性を減 じたフラグメントが包含される。動物、とりわけヒトにおいて抗原性または免疫 原性フラグメントも包含される。 ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は、図2[配列番号:2]の推定アミノ酸配列を有するtRN Aシンセターゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、ならびにそれ らに、およびそれらの変種に密接に関連したポリヌクレオチドを提供する。 本明細書に提供する情報を用いて、例えば図1[配列番号:1]に示すポリヌク レオチド配列のような、tRNAシンセターゼポリペプチドをコードする本発明 ポリヌクレオチドを、例えば、出発物質としてスタフィロコッカス・アウレウス WCUH29細胞からの染色体DNAフラグメントをクローニングおよび配列決 定するために用いるような標準的なクローニングおよびスクリーニングを用いて 得ることができ、次いでクローン全長を得ることができる。例えば、図1[配列 番号:1]に示す配列のごとき本発明ポリヌクレオチド配列を得るためには、典 型的には、イー・コリ(E.coli)またはいくつかの異なる適当な宿主におけるス タフィロコッカス・アウレウスWCUH29細胞由来の染色体DNAのクローン のライブラリーを、部分的配列由来の、好ましくは17量体またはそれ以上の長 さの放射性標識オリゴヌクレオチドにてプローブする。プローブのDNAに同一 であるDNAを担持するクローンは厳密な条件を用いて区別できる。元の配列か ら設計した配列決定プライマーを用いてこのように同定した個々のクローンを配 列決定することにより、両方向で配列が伸長できるようになり、全遺伝子配列を 決定することができる。便利には、かかる配列決定はプラスミドクローンから調 製した変性二本鎖DNAを用いて実施する。適切な技法については、Maniatis,T .、Fitsch,F.F.およびSambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、 第2版;コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1989)に記載されている(Screening By Hybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Template s 13.70参照)。本発明の実例として、図1[配列番号:1]に示すポリヌクレオ チドは、スタフィロコッカス・アウレウスWCUH29に由来するDNAライブ ラリーで発見された。 このように得られたDNA配列を図1[配列番号:1]に示す。これは当該分野 で周知のアミノ酸残基分子量を用いて算出できる推定分子量を有する、図2[配 列番号:2]に示すものとほぼ同数のアミノ酸残基を有するタンパク質をコード する読み枠を含有する。本発明tRNAシンセターゼは、寄託株のtRNAシン セターゼをコードするDNAの配列決定の結果により示されるように、tRNA シンセターゼファミリーの他のタンパク質に構造的に関連している。該タンパク 質は、既知タンパク質の中で、ヒスチジルtRNAシンセターゼタンパク質に対 して最大の相同性を示す。図2[配列番号:2]のヒスチジルtRNAシンセター ゼは、ストレプトコッカス・エクイシミルス(Streptococcus equisimilus)由 来のヒスチジルtRNAシンセターゼのポリペプチドのアミノ酸配列に対して、 全長で約46%の同一性、および全長にわたり約68%の類似性を有する。 本発明配列はまた、図1[配列番号:1]のコーディング配列に全長にわたり同 一であってもよい。 本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはそれらのフラグメントのコーディング 配列自体、ならびに他のコーディング配列(例えばリーダーまたは分泌配列、プ レ、プロ、プレプロタンパク質配列をコードする)を伴った読み枠中の該成熟ポ リペプチドまたはフラグメントのコーディング配列をも提供する。ポリヌクレオ チドは、例えば、転写された非翻訳配列、停止シグナル、リボソーム結合部位、 mRNA安定化配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、および付加アミノ 酸をコードする付加コーディング配列のごとき非コーディング5'および3'配列 等の非コーディング配列をも包含しうるが、これらに限定するのではない。例え ば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコーディングされてい てもよい。本発明のある好ましい態様において、マーカー配列は、pQEベクタ ー(キアゲン・インコーポレーティッド)に提供されるようなヘキサ−ヒスチジ ンペプチド(Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:821-824(1989)に記載さ れる)またはHAタグ(Wilsonら、Cell,37:767(1984))である。また本発明 ポリヌクレオチドは、構造遺伝子および遺伝子発現を調節するその天然において 関連した配列を含んでなるポリヌクレオチドを包含するが、これらに限定するも のではない。 前述によれば、本明細書で用いる「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ド」なる用語は、本発明ポリペプチド、とりわけ図2[配列番号:2]に示すアミ ノ酸配列を有する細菌性の、さらに詳細にはスタフィロコッカス・アウレウスの tRNAシンセターゼをコーディングする配列を含有するポリヌクレオチドを包 含する。この用語はまた、付加領域と一緒になった、ポリペプチドをコードする 単一の連続領域または不連続領域(例えば組み込まれたファージもしくは挿入配 列または修正により分断される)、さらにはコーディングおよび/または非コー ディング配列をも含み得るポリヌクレオチドをも包含する。 本発明はさらに、図2[配列番号:2]の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ ドの変種をコードする、本明細書ですでに述べたポリヌクレオチドの変種に関す る。 本発明の特に好ましい態様は、図2[配列番号:2]に示すtRNAシンセター ゼポリペプチドのアミノ酸配列にいくつか、少しの、5〜10、1〜5、1〜3 、2、1または0個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を任意の組み合わせ で施したアミノ酸配列を有するtRNAシンセターゼ変種をコードするポリヌク レオチドである。中でもとりわけ好ましいものは、tRNAシンセターゼの特性 および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失である。 本発明のさらに好ましい態様は、図2[配列番号:2]に示すアミノ酸配列を有 するtRNAシンセターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および このようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長で少なく とも70%同一であるポリヌクレオチドである。また別に、最も好ましいポリヌ クレオチドは、寄託株スタフィロコッカス・アウレウスのDNAのtRNAシン セターゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドおよびそれらに相補的 なポリヌクレオチドに対し、全長にわたり少なくとも80%同一である領域を含 むポリヌクレオチドである。この点に関して、全長にわたり少なくとも90%同 一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも95%の同一 性を有するものが特に好ましい。さらに少なくとも95%の同一性を有するもの の中でも少なくとも97%であるのがより好ましく、中でも少なくとも98%お よび少なくとも99%であるのが特に好ましく、さらに少なくとも99%である のがより好ましい。 この点に関するとりわけ好ましい態様は、さらに、図1[配列番号:1]のDN Aによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活 性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。 さらに本発明は、本明細書ですでに述べた配列にハイブリダイゼーションする ポリヌクレオチドに関する。この点に関して、本発明は、厳密な条件にて本明細 書ですでに述べたポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオ チドに特に関連している。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密なハイ ブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同一性が少なくとも95%、好 ましくは少なくとも97%である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意 味する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例としては、50%ホルムアミド 、5xSSC(150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)、50 mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハーツ溶液、10%硫酸デキスト ラン、および20μg/mlの変性され剪断されたサケ精子DNAを含有する溶 液中、42℃で一晩インキュベーションし、続いて約65℃で0.1xSSC中 フィルターを洗浄するものである。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周 知であり、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第2版;コ ールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1989)、とりわけその第2章に 実例が示されており、その全開示を参照により本明細書に記載されているものと みなす。 本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーション条件で配列番号:1に示すポリ ヌクレオチド配列の完全遺伝子を含有する適当なライブラリーを、配列番号:1 に示す該ポリヌクレオチド配列の配列を有するプローブでスクリーニングし、該 DNA配列を単離することにより得られるポリヌクレオチド配列を必須としてな るポリヌクレオチドをも提供する。このようなポリヌクレオチドを得るために有 用なフラグメントは、例えば本明細書に別に記載するプローブおよびプライマー を包含する。 本発明ポリヌクレオチドのアッセイに関してここでさらに論じるが、例えば上 述の本発明ポリヌクレオチドをRNA、cDNAおよびゲノムDNA用のハイブ リダイゼーションプローブとして用いて、tRNAシンセターゼをコードするc DNA全長およびゲノムクローンを単離し、tRNAシンセターゼ遺伝子に高度 な配列類似性を有するその他の遺伝子のcDNAおよびゲノムクローンを単離す ることができる。このようなプローブは通常少なくとも15塩基を含む。好まし くはこのようなプローブは少なくとも30塩基を有し、少なくとも50塩基を有 していてもよい。とりわけ好ましいプローブは少なくとも30塩基を有し、 50塩基以下である。 例えばtRNAシンセターゼ遺伝子のコーディング領域は、既知DNA配列を 用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、スクリーニングすることにより単 離できる。次いで、本発明遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌ クレオチドを、cDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリーのスクリ ーニングに用い、プローブがハイブリダイゼーションするライブラリーのメンバ ーを決定する。 本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、疾患、とりわけヒトの疾患の 処置法および診断法の発見のために研究試薬および材料として使用でき、とりわ けポリヌクレオチドアッセイに関連して本明細書でさらに論じる。 配列番号:1および2の配列に由来するオリゴヌクレオチドである本発明ポリ ヌクレオチドは本明細書に記載する方法に使用できるが、PCRに用いるのが好 ましく、本明細書で同定したポリヌクレオチドが全てまたは一部が感染した組織 に転写されるかどうかを決定する。このような配列が、病原体が達成した感染の 段階および感染の型の診断にも有用であることが理解される。 ポリヌクレオチドは、付加アミノ酸もしくはカルボキシル末端アミノ酸または 成熟ポリペプチドに内在するアミノ酸を加えた成熟タンパク質であるポリペプチ ドをコードできる(例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合) 。このような配列は、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシングに役 割を担い、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質の半減期を延長もしくは短縮 し、またはとりわけアッセイもしくは製造のためのタンパク質の操作を容易にす ることができる。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞の酵素により プロセッシングされ、成熟タンパク質から取り除かれる。 1またはそれ以上のプロ配列と融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆 タンパク質は、ポリペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去され ると、このような不活性前駆体が通常活性化される。プロ配列のいくつかまたは 全てを活性化の前に除去できる。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称 される。 要するに、本発明ポリヌクレオチドは成熟タンパク質、リーダー配列を加えた 成熟タンパク質(プレタンパク質と称することができる)、プレタンパク質のリ ーダー配列ではない1またはそれ以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆 体、またはリーダー配列および1またはそれ以上のプロ配列を有するプロタンパ ク質の前駆体であるプレプロタンパク質をコードでき、プロ配列は通常ポリペプ チドの活性および成熟形態を生じるプロセッシング段階で除去される。 ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明ポリヌクレオチドを含むベクタ ー、本発明ベクターで遺伝子操作する宿主細胞および組換え技法による本発明ポ リペプチドの製造にも関する。本発明のDNA構築物に由来するRNAを用い、 無細胞翻訳系を用いてかかるタンパク質を製造できる。 組換え体を製造するために、宿主細胞は、遺伝子操作して、発現系もしくはそ れらの一部、または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌ クレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davisら、Basic Methods in Molecu lar Biology(1986);Sambrookら、Molecular Cloning;A Laboratory Manual 、第2版;コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド ・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1989)のような多くの標準的な研究室 マニュアルに記載される方法により行うことができ、例えばリン酸カルシウムト ランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、トラ ンスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質により媒介される トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレ ープ負荷、バリスティック導入および感染等がある。 適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例えばスタフィロコッカス属(streptococ ci)、スタフィロコッカス属(staphylococci)、イー・コリ(E.coli)、スト レプトミセスおよびバチルス・ズブチリス(Bacillus subtiis)細胞;真菌細胞 例えば酵母細胞およびアスペルギルス属(Aspergillus)細胞;昆虫細胞例えば ドロソフィラS2(Drosophila S2)およびスポドプテラSf9 (Spodoptera Sf9)細胞;動物細胞例えばCHO、COS、HeLa、C127 、3T3、BHK、293およびボウズ(Bows)黒色腫細胞;ならびに植物細胞 を包含する。 本発明ポリペプチドを製造するために非常に多くの発現系を使用できる。この ようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例え ば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エ ピソーム由来、インサート由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウ イルス、パポバウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、アデノウイル ス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来 のベクター、ならびにそれらを組み合わせた物に由来するベクター、例えばプラ スミドおよびバクテリオファージ遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコ スミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は、発現を制御および引き 起こす調節領域を含有していてもよい。通常宿主中にポリヌクレオチドを保持、 伸長または発現するのに適した、および/またはポリペプチドを発現するのに適 した任意の系またはベクターを、この点に関する発現に使用できる。周知のおよ び通常的な種々の任意の技術により、適当なDNA配列を発現系に挿入でき、例 えばSambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual(上述)に記載され ている。 翻訳タンパク質を、小胞体内腔、ペリプラスミックスペースまたは細胞外環境 へ分泌するために、適当な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと ができる。これらのシグナルはポリペプチドに対して内在性であってもよく、あ るいは異種性のシグナルでもよい。 本発明のポリペプチドは周知の方法により、組換え細胞培養物から回収および 精製でき、その方法は、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出 、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマト グラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、 ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー を包含する。高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)を精製に用いるのが 最 も好ましい。ポリペプチドが単離および/または精製中に変性した場合、再び活 性な立体配座にするために、タンパク質再生のための周知の技法を用いることが できる。 診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明tRNAシンセターゼポリ ヌクレオチドの使用にも関する。真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおける tRNAシンセターゼの検出は、疾患の診断のための診断方法を提供する。真核 生物(本明細書において「個体」とも称する)とりわけ哺乳動物、特にヒトがt RNAシンセターゼ遺伝子を含む生物に感染すると、種々の方法によりDNAレ ベルで検出できる。 診断用核酸は、感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨 および皮膚より得ることができる。ゲノムDNAは直接的に検出するのに使用で きるか、または分析の前にPCRもしくはその他の増幅法を用いることにより酵 素的に増幅できる。RNAまたはcDNAも同じ方法に使用することができる。 増幅を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物株を 、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすることができる。対照配列 の遺伝子型と比較した増幅生成物の大きさの変化により、欠失および挿入を検出 できる。点突然変異は、増幅DNAを標識tRNAシンセターゼポリヌクレオチ ド配列にハイブリダイゼーションすることにより同定できる。完全に対合した配 列はRNアーゼ消化により、または融解温度の差により、誤対合二重らせんから 区別できる。DNA配列の差はまた、変性剤を伴うまたは伴わないゲル中のDN Aフラグメントの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、または直接的 なDNAの配列決定により検出できる。例えばMeyersら、Science,230:1242(1 985)参照。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ例 えばRNアーゼおよびS1保護または化学的切断法によっても明らかにすること ができる。例えばCottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(1985)参 照。 本発明遺伝子の突然変異または多型性を担持する細胞はまた、種々の技術によ り、DNAレベルで、例えばセロタイピングすることにより検出できる。例えば 、RTPCRは突然変異を検出するために用いることができる。RT−PCRは 自動検出系、例えばGeneScan等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。R NAまたはcDNAもまた同じ目的で、PCRまたはRTPCRに用いることが できる。例を挙げると、tRNAシンセターゼをコードする核酸に相補的なPC Rプライマーを用いて突然変異を同定および分析することができる。これらのプ ライマーを用いて、個体に由来するサンプルから単離したtRNAシンセターゼ DNAを増幅することができる。本発明はまた5'および/または3'末端から1 、2、3または4ヌクレオチド除去したプライマーをも提供する。該プライマー を用いて、感染した個体から単離した遺伝子を増幅することができ、次いで、該 遺伝子をDNA配列を調べるための種々の技法に供することができる。このよう に、DNA配列における突然変異を検出し、これを用いて感染の診断および感染 性物質のセロタイピングまたは分類をすることができる。 本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感染、さらに好ましくはスタフィロコッ カス・アウレウスによる感染、および最も好ましくは上気道感染(例えば中耳炎 、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道感染(例えば蓄膿症、肺膿 瘍)、心臓感染(例えば感染性心内膜炎)、消化器感染(例えば分泌性下痢、脾 臓膿瘍、腹膜後膿瘍)、CNS感染(例えば大脳膿瘍)、眼感染(例えば眼瞼炎 、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔(preseptal)および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎) 、腎および尿管感染(例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショ ック症候群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染 、細菌性筋炎)、骨および関節感染(例えば敗血症性関節炎、骨髄炎)のごとき 疾患の診断方法を提供し、図1[配列番号:1]の配列を有するポリヌクレオチド の発現レベルの上昇を、個体由来のサンプルから決定することを特徴とする。 tRNAシンセターゼポリヌクレオチドの発現の増加または低下は、ポリヌクレ オチドの定量法として当該分野で周知の方法の任意の方法、例えば増幅、PCR 、RTPCR、RNアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブ リ ダイゼーション法を用いて測定できる。 さらに、正常対照組織サンプルと比較してtRNAシンセターゼタンパク質の 過剰発現を検出するための本発明による診断アッセイは、例えば感染の存在を検 出するために用いることができる。宿主由来のサンプル中のtRNAシンセター ゼタンパク質のレベルを決定するために用いることができるアッセイ技法は、当 業者に周知である。このようなアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競争結合 アッセイ、ウェスタンブロット分析およびELISAアッセイを包含する。 抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそれらを発現する細胞は 、このようなポリペプチドに免疫特異的な抗体を産生する免疫原として用いるこ とができる。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリクロー ナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒト化抗体、ならびにFab免疫 グロブリン発現ライブラリーの生成物を包含するFabフラグメント等がある。 本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ が付いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくはヒトはでない動物に 、通常の実験法を用いて投与することにより得ることができる。連続的細胞系培 養により産生される抗体を提供する当業者周知の技術を用いて、モノクローナル 抗体を調製することができる。実例としては、Kohler,G.およびMilstein,C.,N ature,256:495-497(1975);Kozborら、Immunology Today,4:72(1983);Co leら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.、77-96頁 (1985)に記載されるような種々の技法がある。 一本鎖抗体の製造のための記載された技術(米国特許第4946778号)は 、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。また、 トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例えばその他の哺乳動物は、ヒ ト化抗体等の抗体を発現するのに用いることができる。 別法としてファージディスプレイ(phage display)技法を用いて、抗Fbp を有することについてスクリーニングしたヒトのリンパ球のPCR増幅したv遺 伝子のレパートリー由来の、または無処理のライブラリー由来のポリペプチドに 対する結合活性を有する抗体遺伝子を選別することができる(McCafferty,J.ら 、Nature 348:552-554(1990);Marks,J.ら、Biotechnology 10:779-783(1992) )。これらの抗体の親和性はチェインシャフリング(chain shuffling)により 改善することもできる(Clackson,T.ら、Nature 352:624-628(1991))。 二つの抗原結合ドメインが存在する場合、各ドメインは「二特異性」抗体と称 する異なるエピトープに対して指向される。 上述の抗体はポリペプチドを発現するクローンを単離または同定するために用 いることができ、親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。 従って、とりわけtRNAシンセターゼに対する抗体を、感染、とりわけ細菌 感染、特に上気道感染(例えば中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎) 、下気道感染(例えば蓄膿症、肺膿瘍)、心臓感染(例えば感染性心内膜炎)、 消化器感染(例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍)、CNS感染(例えば 大脳膿瘍)、眼感染(例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔(presep tal)および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染(例えば副睾丸炎、腎内 および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、毛 嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎)、骨および関節感染(例えば 敗血症性関節炎、骨髄炎)のごとき疾患の処置に用いることができる。 ポリペプチド変種は抗原的、エピトープ的または免疫学的に等価な変種を包含 し、本発明の特定の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導体」な る用語は、本発明によりタンパク質またはポリペプチドに対して生起された場合 、病原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗 体により特異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含する。本明細 書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊椎動物において抗体を生 起させるのに適した処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間での即 時的な物理的相互作用を妨害するように作用するペプチドまたはその等価物を包 含する。 ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に等価な誘導体、またはそれらの融合 タンパク質は、マウスまたは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫す るための抗原として使用できる。融合タンパク質はポリペプチドに安定性を付与 できる。抗原は、例えば抱合することにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例 えばウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホール・リムペット・ヘモシアニ ン(keyhole limpet haemocyanin:KLH)に結合することができる。あるいは また、タンパク質もしくはポリペプチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学 的に等価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチドは、免疫原性を改 良するための十分な抗原性を有しているので、キャリヤを使用しなくてすむ。抗 体またはそれらの変種を、個体における免疫原性を減じるために修飾するのが好 ましい。例えば、個体がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒト化」され ており;ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域がヒトモノクローナル抗体 に移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-525(1986)またはTemp estら、Biotechnology 9:266-273(1991)に記載されている。 本発明ポリヌク レオチドを遺伝学的免疫において使用する場合、好ましくは、例えばプラスミド DNAの筋肉への直接注射(Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:363(1992);Manthorp eら、Hum.Gene Ther.4:419(1963))、特異的タンパク質キャリヤを伴ったDN A複合体の送達(Wuら、J.Biol.Chem.264:16985(1989))、リン酸カルシウム とのDNA共沈(Benvenisty & Reshef、PNAS 83:9551(1986))、種々の形態 のリポソーム中へのDNA封入(Kanedaら、Science 243:375(1989))、微粒 子爆撃(Tangら、Nature 356:152(1992);Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:7 91(1993))およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたインビボ感染( Seegerら、PNAS 81:5849(1984))のごとき適切な送達方法を用いる。 本発明のポリペプチドはまた、例えば細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリ ー、および天然産物の混合物中の、小型分子基質とリガンドとの結合を評価する ために用いることもできる。これらの基質およびリガンドは天然の基質およびリ ガンドでよく、または構造上もしくは機能上の擬似物質でもよい。例えばColiga nら、Current Protocols in Immunology 1(2):第5章(1991)参照。 アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子 本発明はまたtRNAシンセターゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作 用を増強(アゴニスト)または阻害(アンタゴニスト)する化合物を同定するた めの化合物のスクリーニング方法をも提供する。 例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、tR NAシンセターゼポリペプチドおよびかかるポリペプチドの標識基質またはリガ ンド含んでなる合成反応混合物、膜、細胞表面膜もしくは細胞壁のごとき細胞コ ンパートメント、またはそれらのいずれかの調製物を、tRNAシンセターゼア ゴニストまたはアンタゴニストとなりうる候補分子の存在下または不在下でイン キュベーションする。候補分子がtRNAシンセターゼポリペプチドにアゴナイ ズまたは拮抗する能力は、標識リガンドの結合の低下またはかかる基質からの生 成物の生成低下に反映される。結合しても影響を及ぼさない分子、すなわちtR NAシンセターゼの効果を誘起しない分子は、最も良好なアンタゴニストとなる であろう。結合性が良好で、基質からの生成物の生成速度を高める分子はアゴニ ストである。基質からの生成物の生成速度またはレベルはリポーターシステムを 用いることにより増強できる。この点に関して有用なリポーターシステムは、生 成物に転換される比色標識基質、tRNAシンセターゼ活性の変化に応答するリ ポーター遺伝子、および当該分野で周知の結合アッセイを包含するが、これらに 限定するものではない。 tRNAシンセターゼアンタゴニストのアッセイの他の例は競争アッセイであ り、競争阻害アッセイに適した条件下で、tRNAシンセターゼおよび潜在的な アンタゴニストをtRNAシンセターゼ結合分子、組換えtRNAシンセターゼ 結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド擬似物質と 混合する。tRNAシンセターゼを例えば放射活性または比色化合物により標識 し、結合分子に結合した、または生成物に変換したtRNAシンセターゼ分子の 数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。 さらなる態様において、本発明はヒスチジルtRNAシンセターゼの相互作用 を妨害する薬物、例えばアンタゴニストおよびアゴニストを同定するための薬物 のスクリーニング方法を提供する。酵素により媒介される放射性標識アミノ酸の tRNAへの組み込みを、tRNAおよびATPの存在下、アミノ酸−tRNA を放射性標識アミノ酸からのトリクロロ酢酸沈殿放射活性として測定するアミノ アシル化法により測定できる(Hughes J.、Mellows G.およびSoughton S.、FEBS Letters 122:322-324(1980))。このようにヒスチジルtRNAシンセターゼ 阻害物質を対照と比較して、トリクロロ酢酸沈殿放射性活性の減少により検出で きる。あるいはまた、PPiからの放射性標識ATPの形成を測定する、部分P Pi/ATP交換反応を触媒するtRNAシンセターゼを、ヒスチジルtRNA シンセターゼ阻害物質を検出するために使用できる(Calender R.& Berg P.、B iochemistry 5:1681-1690(1966))。 潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合し、それによりその 活性を阻害し、消滅させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を 包含する。潜在的アンタゴニストはまた、結合分子の同一部位に結合する、正確 に関連したタンパク質または抗体のような小型有機分子、ペプチド、ポリペプチ ド、例えばtRNAシンセターゼ誘起活性を誘起しない結合分子であってもよく 、そのことによりtRNAシンセターゼを結合から排除して、tRNAシンセタ ーゼの作用を妨げる。 潜在的なアンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に結合し、およびそれ を占領し、それにより細胞性結合分子への結合を防御して、正常な生物学的活性 を防御する小型分子等がある。小型分子の例は、小型有機分子、ペプチド、ペプ チド様分子を包含するが、これらに限定するものではない。その他の潜在的なア ンタゴニストはアンチセンス分子を包含する(これらの分子についての記載に関 してはOkano,J.,Neurochem.56:560(1991);Oligodeoxy-nucleotides as Anti sense Inhibitors of Gene Expression,CRCプレス、ボッカラートン、フロ リダ州(1988)参照)。好ましい潜在的アンタゴニストは、tRNAシンセター ゼ関連化合物およびtRNAシンセターゼの変種を包含する。 特定の態様にお いて、本発明は、感染の続発症に関与する、病因および哺乳動物宿主間の最初の 物理的相互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドま たは阻害物質の使用を提供する。とりわけ本発明の分子を、i)細菌とりわけグ ラム陽性細菌の内在デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質、また は創傷の細胞外マトリックスタンパク質への付着の防御;ii)例えば哺乳動物チ ロシンキナーゼのリン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介するtRNA シンセターゼタンパク質の阻害(Rosenshineら、Infect.Immun.60:2211(1992)); iii)哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性tR NAシンセターゼタンパク質との間の細菌付着の阻害;iv)内在デバイスの埋め 込みまたはその他の外科的手技以外により開始した感染における病因の通常の進 行の防御に使用することができる。 本明細書で提供する各々のDNA配列は抗細菌化合物の発見および開発に用い ることができる。発現すると、コーディングされたタンパク質は、抗菌薬物のス クリーニングのための目的物質として用いることができる。さらに、コーディン グされたタンパク質もしくはShine-Delgarnoまたはその他の個々のmRNAの翻 訳容易化配列のアミノ末端領域をコードするDNA配列を、目的のコーディング 配列の発現を調節するアンチセンス配列を構築するために用いることができる。 アンタゴニストおよびアゴニストは、疾患、例えば、上気道感染(例えば中耳 炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道感染(例えば蓄膿症、肺 膿瘍)、心臓感染(例えば感染性心内膜炎)、消化器感染(例えば分泌性下痢、 脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍)、CNS感染(例えば大脳膿瘍)、眼感染(例えば眼瞼 炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔(preseptal)および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎) 、腎および尿管感染(例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショ ック症候群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染 、細菌性筋炎)、骨および関節感染(例えば敗血症性関節炎、骨髄炎)の阻止に 用いることができる。 ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免疫学的応答を誘起する 方法に関し、その方法には個体にtRNAシンセターゼ、またはそれらのフラグ メントもしくは変種を個体に接種し、該個体が感染とりわけ細菌感染、特にスタ フィロコッカス・アウレウス感染から防御する抗体を十分に産生させることを含 む。本発明のまた別の態様は、個体に免疫学的応答を誘起する方法に関し、その 方法には遺伝子治療によりtRNAシンセターゼまたはそれらのフラグメントも しくは変種をコードする遺伝子を送達し、tRNAシンセターゼまたはそれらの フラグメントもしくは変種をインビボで発現し、該個体を疾患から保護する抗体 を産生する免疫学的応答を誘起することを含む。 本発明のさらなる態様は免疫学的組成物に関し、該組成物は、免疫学的応答を 体内に誘起できる、あるいは誘起している宿主に導入した場合、宿主中でtRN Aシンセターゼまたはそれによりコードされるタンパク質に対する免疫学的応答 を誘起するものであり、該組成物は組換えtRNAシンセターゼ、またはそれに よりコードされたタンパク質を含んでなり、また該tRNAシンセターゼの抗原 をコードし発現するDNA、またはそれによりコードされるタンパク質を含んで なる。 tRNAシンセターゼまたはそれらのフラグメントは、それ自身は抗体を産生 しないが、第1のタンパク質を安定化し、免疫原性があり防御特性を有する融合 タンパク質を形成することのできる補タンパク質(co-protein)と融合できる。 このように融合した組換えタンパク質には、さらに抗原補タンパク質、例えばグ ルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)またはベーターガラクトシダー ゼ、タンパク質を可溶化し、それらの生成および精製を容易にする比較的大型の 補タンパク質等が含まれるのがより好ましい。さらに、補タンパク質は免疫系に おいて一般的な刺激を提供するという意味で、アジュバントとして作用しうる。 補タンパク質は第1のタンパク質のアミノまたはカルボキシル末端のいずれに結 合していてもよい。 本発明は、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび免疫刺激DNA 配列を含んでなる組成物、とりわけワクチン組成物ならびに方法を提供し、免疫 刺激DNA配列はSato Y.ら、Science 273:352(1969)に記載されている。 また、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウスに感染した動物モデルにお ける、このような遺伝的免疫化実験で用いるDNA構築物の、細菌細胞表面タン パク質の非可変領域をコードすることが示されている記載されたポリヌクレオチ ドまたはとりわけそれらのフラグメントを用いる方法を提供し、これらはとりわ け予防的または治療的免疫反応を生じることができるタンパク質エピトープを同 定するのに有用である。このアプローチは、哺乳動物、とりわけヒトにおける細 菌感染とりわけスタフィロコッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置 の開発のために、感染に抵抗し一掃するのに成功した動物の必須器官から特に価 値あるモノクローナル抗体を引き続き調製することを可能にすると考えられる。 ポリペプチドは、例えば細菌の損傷組織への付着を阻害することにより、細菌 の侵入に対して防御的な特異的抗体を産生するための宿主のワクチン化のための 抗原として使用することができる。組織損傷の例は、例えば機械的、化学的もし くは熱損傷により、または内在デバイスの埋め込みにより、引き起こされた皮膚 または結合組織の創傷、または粘膜例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷を包含 する。 本発明にはまた免疫原性組換えタンパク質を適切な担体と共に含むワクチン処 方を包含する。タンパク質は胃で分解されるので、非経口的例えば皮下、筋肉内 、静脈内または皮膚内等に投与するのが好ましい。非経口投与に適した処方は、 抗酸化剤、緩衝液、静細菌剤および個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶 質を含有していてもよい水性または非水性滅菌注射液;および懸濁化剤または増 粘剤を含有していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方は単位 投与または多回投与用容器、例えば密封したアンプルおよびバイアルに入れてよ く、凍結乾燥状態で保存し、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする。 ワクチン処方は処方の免疫原性を高めるアジュバント系をも含めることができ、 例えば水中油系または当該分野で周知のその他の系がある。投与量はワクチンの 特異的活性に依存し、通常の実験法により容易に決定できる。 本発明は特定のtRNAシンセターゼに関して記載したが、これは天然に存在 するタンパク質および、実質的に組換えタンパク質の免疫原特性に影響しない付 加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフラグメントを包含することが 理解されよう。 組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニス トもしくはアンタゴニストを含んでなる組成物にも関する。本発明のポリペプチ ドは未滅菌もしくは滅菌担体と、または細胞、組織もしくは生物に用いられる担 体、例えば対象への投与に適した医薬的担体と組み合わせて用いることができる 。このような組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポリペプ チド、および医薬的に許容できる担体または賦形剤を含む。このような担体には セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノー ルおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定するものではない。処方 は投与法に適したものにすべきである。本発明はさらに、本発明の前述の組成物 成分を1またはそれ以上を充填した1またはそれ以上の容器を含む診断用および 医薬用パックおよびキットにも関する。 本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独でまたは治療用化合物等 のその他の化合物と組み合わせて用いることができる。 医薬組成物は任意の有効な、利便的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経 膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の経路で投与できる 。 治療において、または予防として、活性物質を注射用組成物として、例えば、 好ましくは等張の、滅菌水性分散物として個体に投与できる。 また別に、組成物は局所適用用、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏 、点眼液、点耳液、洗口剤、染み込ませた包帯および縫合用の糸、ならびにエア ロゾル等の形態に処方でき、適当な慣用的な添加物、例えば保存料、薬物の浸透 を補助する溶媒を含有してもよく、軟膏およびクリームは軟化剤を含有してもよ い。このような局所用処方はまた、適合した慣用的な担体、例えばクリームまた は軟膏基剤、およびローションにはエタノールまたはオレイルアルコールを含有 してもよい。このような担体は処方の約1重量%から約98重量%でよく;より 通常的には処方の約80重量%までとする。 哺乳動物とりわけヒトに投与するために、有効成分の1日あたりの投与量は、 0.01mg/kgから10mg/kgであり、典型的には約1mg/kgであ る。医者はいずれの場合にも、個体に最も適した実際の投与量を決定し、年齢、 体重および特に個体の応答に応じて変化させる。上述の投与量は、平均的なケー スの模範例である。もちろん、高量および低量の範囲が適合する個々の例もあり 、これらは本発明の範囲内である。 内在デバイスには外科的インプラント、プロテーゼデバイスおよびカテーテル 等があり、即ち個体の体に導入し、長時間その位置に存在するデバイスである。 このようなデバイスは、例えば人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管移植片 、血管カテーテル、脳脊髄液シャント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析 (continuous ambulatory peritoneal dialysis:CAPD)カテーテルを包含 する。 本発明組成物を注射により投与し、内在デバイスの挿入の直前に、関連する細 菌に対する全身的な効果を得ることができる。手術後、デバイスが体内に在る時 間中、処置を続けてよい。さらに、任意の外科的手技のために手術中用カバーを 広げて、細菌性創傷感染、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスの創傷感染 を防御するために用いることができる。 多くの整形外科医は、プロテーゼ関節を有するヒトは、菌血症を生じ得る歯科 的処置の前に、抗生物質予防法を考慮されるべきであると考える。遅延性の重篤 な感染は、時々プロテーゼ関節を失うに至る深刻な合併症であり、有意性のある 羅病率および死亡率を伴う。従って、この場合、予防的な抗生物質の代わりに、 活性物質の用途を拡張することが可能である。 上述の治療に加え、本発明の組成物は一般的に創傷の治療薬として使用でき、 創傷組織に曝露したマトリックスタンパク質に細菌が付着するのを防ぎ、歯科治 療において抗生物質の予防法に代わって、またはそれと組み合わせて、予防的に 使用できる。 あるいはまた、本発明の組成物は、挿入直前に内在デバイスを浸すために使用 できる。有効成分は創傷または内在デバイスを浸すために1μg/mlから10 mg/mlの濃度であるのが好ましい。 便利には、ワクチン組成物を注射可能な形態にする。慣用的なアジュバントは 免疫反応を高めるために用いることができる。ワクチン化に適した単位投与量は 、抗原0.5〜5μg/kgであり、このような投与量は1〜3週間隔で1〜3 回投与するのが好ましい。提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適切な 個体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察されない。 上述の抗体もまたtRNAシンセターゼタンパク質を含有する細菌の存在を検 出するための診断試薬として使用できる。 実施例 以下の実施例は、詳細に記載したこと以外は、当業者に周知で通常的な標準的 な技法を用いて実施する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を限定 するものではない。 実施例1:ライブラリーの製造 配列番号:1に示すDNA配列を有するポリヌクレオチドはイー・コリにおけ るスタフィロコッカス・アウレウスの染色体DNAのクローンのライブラリーよ り入手した。重複するスタフィロコッカス・アウレウスのDNAを含有する2個 またはそれ以上のクローンからの配列決定データを、配列番号:1に示す連続し たDNA配列を構築するために使用した場合もある。ライブラリーは通常の方法 、例えば以下の方法1および2により製造できる。 全細胞DNAは、スタフィロコッカス・アウレウスWCUH29より、標準法 に準じて単離し、二つの方法のどちらかによりサイズ分画する。 方法1 標準法によりサイズ分画するために、全細胞DNAをニードルに通して機械的 に剪断する。11kbpまでの大きさのフラグメントを、エキソヌクレアーゼお よびDNAポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化し、EcoRIリン カーを加える。フラグメントを、EcoRIで切断したベクターラムダZapI Iに連結し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、次いでパッケージ ングしたライブラリーでイー・コリを感染させる。ライブラリーは標準法により 増幅する。 方法2 全細胞DNAは、ライブラリーベクター(例えば、RsaI、PalI、Al uI、Bshl235I)にクローニングするための一連のフラグメントを適切 に生じる1の制限酵素または制限酵素を組み合わせたもので部分加水分解し、こ のようなフラグメントを標準法によりサイズ分画する。EcoRIリンカーはD NAおよびフラグメントに連結し、次いでEcoRIで切断したベクターラムダ ZapIIに連結し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、およびパ ッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染させる。ライブラリーを標準 法により増幅する。 実施例2:ヒスチジルtRNAシンセターゼ(HRS)活性の測定 酵素はtRNAHisのアミノアシル化を触媒し、これは2段階メカニズムで進 行する。最初の段階では、ATPおよびL−ヒスチジンの特異的結合および反応 の結果、安定な酵素:ヒスチジルアデニル化複合体を形成する。続いて、酵素結 合tRNAHisの3'末端アデノシンはアミノアシルアデニレートと反応し、 tRNAがエステル化され、AMPが放出される。これらの反応を以下にまとめ る; a) L-His+ATP.Mg+HRS⇒HRS:GLY-AMP+PPi.Mg b) HRS:His-AMP+tRNAHis⇒HRS+His-tRNAHis +AMP この反応をアッセイして、酵素の特徴づけ、または多くの方法でのその活性の 特異的阻害物質を同定をすることができる: 1.His-tRNAHisの形成の測定は放射性標識ヒスチジンを用いて特異的に 決定でき、および沈殿/ろ過技法(例えば冷トリクロロ酢酸1,2中)を用いてHi s-tRNAから遊離のヒスチジンを分離できる。 2.全アシル化反応もまたtRNAアシル化に対して化学量論的比率で生成され るPPiまたはAMPのどちらかの生成を分析することにより測定できる。これ は、例えば比色3;または過剰の無機ピロホスファターゼを添加した後Piの酵 素結合4測定を用いる;または直接的にAMPもしくはPPi生成5を測定する酵 素結合アッセイを用いる等の多くの方法により達成できる。 3.部分反応(a)は、反応のこの部分の各段階は自由に可逆的であるので、A TPおよびPPi間の放射性標識アイソトープ交換により評価できる。これは典 型的には,全アシル化反応(a+b)よりも約20倍高いkcat有し、ATPか らPPiを分離するクロマトグラフィーの原理を用いて(すなわち活性炭1,2を 用いて)容易に測定される。 HRSへのリガンド結合 基質のターンオーバーを触媒する酵素に依存しない実験において、リガンドの HRSとの相互作用を決定することも可能である。この型の実験は、多くの方法 で実施できる: 1.酵素固有の蛍光へのリガンド結合の影響(例えばトリプトファン)。天然の リガンドまたは阻害物質の結合は、酵素の立体配座を変化させ、それは酵素の蛍 光を変化させる。このことを利用して、ストップトフロー蛍光装置(stopped-fl ow fluorescence equipment)を用いて、結合を表す顕微鏡的速度定数を決定す ることができる。別法として、定常状態蛍光滴定法(steady-state fluorescenc e titration methods)は、酵素阻害実験で評価されるのと同一の方法で正味の 解離定数を得ることができる。 2.リガンドのスペクトル効果。リガンド自身が蛍光性であるかまたは酵素トリ プトファン蛍光と重複する発色団を有する場合、結合はリガンド蛍光特性(例え ば強度、寿命または分極)における変化、または酵素トリプトファンとの蛍光共 鳴エネルギー転移により検出できる。リガンドは阻害物質であるか、または天然 リガンドの変種である(すなわち蛍光ATP誘導体または発蛍光団で標識したt RNAHis)。 3.酵素:リガンド複合体の熱分析。熱量測定法(例えば等温熱量測定、示差ス キャンニング熱量測定)を用いると、温度変化またはそれによりリガンド結合を 特徴づけることのできるHRSの安定性のシフトの検出が可能になる。 文献 1.Calender & Berg、Biochemistry5:1681-1690(1966) 2.Toth,M.J.& Schimmel,P.、J.Biol.Chem.265:1000-1004(1990) 3.Hoenig、J.Biochem.Biophys.Meth.19:249-252(1989) 4.Webb,T.M.、Anal.Biochem.218:449-454(1994) 5.Sigma Chemicals Catalogue(1986) 実施例3:HRS活性についてのアミノアシル化アッセイ イー・コリにて過剰発現した精製スタフィロコッカス・アウレウスのHRSを 用いるか、またはHRSを過剰発現したイー・コリからの粗細胞溶解物を用いて 、アッセイを実施する。後者は通常全タンパク質の約10%をHRSとして含有 する。酵素は、液体窒素中急速冷凍した後、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH 7.8)、10mM MgCl2および10mM β−メルカプトエタノール中−7 0℃で保存する。酵素サンプルの活性を決定する実験では、これらの貯蔵物を5 0mMトリスpH7.8、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトールで広 範に(100倍から10000倍)希釈し、アッセイ前に氷上で貯蔵する。 アッセイ方法は以下のとおりである;上述のとおり調製し、希釈した酵素50 mlを、0.25μCi L−[U−14C]−ヒスチジン(アメルシャム・インター ナショナル)、4mg/mlイー・コリMRE600混合tRNA(ベーリンガ ー・マンハイムより)、5mM ATP、15mM MgSO4、3mM DTT、 75mM KClおよび50mM トリス−塩酸 pH7.8を含有する反応混合物 (100ml)と混合する。他に記載しない場合、全ての試薬はシグマ・ケミカ ル・カンパニー・リミテッドより入手した。濃度は最終反応混合物での濃度であ る。酵素を添加して反応を開始した後、アッセイサンプルを37℃でインキュベ ーションし、所望時間、2検体ずつ(50μl)取り出し、7%トリクロロ酢酸 (100μl)で不活性化し、氷上で30分放置する。パッカードフィルターメ ート196セルハーベスト[パッカード・インストラメント・リミテッド]を用い てグラスファイバーフィルター上で沈殿物を回収し、7%トリクロロ酢酸、エタ ノールで順次洗浄する。フィルターを70℃で1時間乾燥し、放射活性のレベル をシンチレーションカウンティング(パッカード・トップカウント)により測定 する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI A61K 45/00 ADZ C07K 16/40 48/00 ABA C12N 9/00 C07K 16/40 C12Q 1/02 C12N 9/00 1/25 C12Q 1/02 1/68 A 1/25 G01N 33/53 P 1/68 A61K 37/48 AED G01N 33/53 37/64 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),JP,US (72)発明者 ローラー,エリザベス アメリカ合衆国19426−0989 ペンシルベ ニア州カレッジビル、ピー・オー・ボック ス5089、サウス・カレッジビル・ロード 1250番 スミスクライン・ビーチャム・フ ァーマシューティカルズ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.(a) 配列番号:2のアミノ酸1から420を含むポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチドに対して少なくとも70%の同一性を有するポリヌクレ オチド; (b) (a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド;および (c) (a)または(b)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続し た塩基を含むポリヌクレオチド; からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。 2.ポリヌクレオチドがDNAである請求項1記載のポリヌクレオチド。 3.ポリヌクレオチドがRNAである請求項1記載のポリヌクレオチド。 4.配列番号:1に示すヌクレオチド1から1263を含む請求項2記載のポ リヌクレオチド。 5.配列番号:1に示すヌクレオチド1から1260を含む請求項2記載のポ リヌクレオチド。 6.配列番号:2のアミノ酸1から420を含むポリペプチドをコードする請 求項2記載のポリヌクレオチド。 7.(a) NCIMB受託番号40771に含まれるtRNAシンセターゼ 遺伝子により発現される同一の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド に対して少なくとも70%の同一性を有するポリヌクレオチド; (b) (a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド;および (c) (a)または(b)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の塩基を 含むポリヌクレオチド; からなる群から選択されるものを含む、単離ポリヌクレオチド。 8.請求項2記載のDNAを含むベクター。 9.請求項8記載のベクターを含む宿主細胞。 10.該DNAにコードされるポリペプチドを請求項9記載の宿主細胞から発 現させることを特徴とするポリペプチドの製造方法。 11.細胞が、請求項8記載のベクターに含まれるcDNAによりコードされ るポリペプチドを発現するように、該ベクターで細胞を形質転換またはトランス フェクションすることを特徴とする、ポリペプチドを発現する細胞の製造方法。 12.tRNAシンセターゼポリペプチドまたはフラグメントの製造方法であ って、該tRNAシンセターゼポリペプチドまたはフラグメントを生成するのに 十分な条件下で請求項9記載の宿主を培養することを特徴とする方法。 13.配列番号:2のアミノ酸1から420に対して少なくとも70%同一で あるアミノ酸配列を含むポリペプチド。 14.配列番号:2に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。 15.請求項13記載のポリペプチドに対する抗体。 16.請求項13記載のポリペプチドの活性を阻害するアンタゴニスト。 17.治療上有効量の請求項13記載のポリペプチドの個体への投与を特徴と する、tRNAシンセターゼの必要性を有する個体の処置方法。 18.該ポリペプチドをコードするDNAを個体に提供し、該ポリペプチドを インビボで発現させることにより、該治療上有効量のポリペプチドを投与する、 請求項16記載の方法。 19.治療上有効量の請求項16記載のアンタゴニストを個体に投与すること を特徴とする、tRNAシンセターゼポリペプチドを阻害する必要性を有する個 体の処置方法。 20.請求項13記載のポリペプチドをコードする核酸配列を決定することを 特徴とする、該ポリペプチドの発現に関与する疾患の診断方法。 21.宿主由来のサンプル中の請求項13記載のポリペプチドの存在を分析す ることを特徴とする診断方法。 22.請求項13記載のポリペプチドに結合し、活性を阻害する化合物の同定 方法であって; 結合部位との結合を可能にする条件下で、ポリペプチドの結合部位を表面に発 現する細胞を、スクリーニングされる化合物と接触させること(ここに該結合部 位は、化合物の該結合部位への結合に反応して検出可能なシグナルを提供する能 力のある第2の成分に結合するものである);次いで、 該化合物と該結合部位との相互作用から生じるシグナルの存在または不存在を 検出することにより、該化合物が該結合部位に結合して活性化するかまたは阻害 するかを決定すること; を特徴とする方法。 23.哺乳動物を疾患から防御する抗体を産生させるに十分なtRNAシンセ ターゼまたはそれらのフラグメントもしくは変種を哺乳動物に接種することを特 徴とする、哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方法。 24.遺伝子治療により、tRNAシンセターゼまたはそれらのフラグメント もしくは変種をコードする遺伝子を送達し、インビボでtRNAシンセターゼ、 またはそれらのフラグメントもしくは変種を発現させ、次いで、該動物を疾患か ら防御する抗体を産生する免疫学的応答を誘起することを特徴とする、哺乳動物 における免疫学的応答を誘起する方法。 25.tRNAシンセターゼポリヌクレオチドまたはそれによりコードされる タンパク質をコードし、発現するDNAを含んでなる免疫学的組成物であって、 哺乳動物に導入した場合、哺乳動物においてtRNAシンセターゼポリヌクレオ チドまたはそれによりコードされるタンパク質を生じる免疫学的応答を誘起する 免疫学的組成物。 26.厳密なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号:1に示すポリヌク レオチド配列の完全遺伝子を含む適当なライブラリーを、配列番号:1に示す該 ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントの配列を有するプローブでスクリ ーニングし、次いで、単離することにより得られるDNA配列を必須としてなる ポリヌクレオチド。 27.新規tRNAシンセターゼの相互作用を妨害する薬物を同定するための 薬物のスクリーニング方法であって、全アミノアシル化反応または部分PPi/ ATP交換反応による酵素活性の測定を特徴とするスクリーニング方法。
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