JPH11506019A

JPH11506019A - スタフィロコッカス・アウレウスのチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼ

Info

Publication number: JPH11506019A
Application number: JP9525806A
Authority: JP
Inventors: ホッジソン，ジョン・エドワード; ローラー，エリザベス
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 1999-06-02
Also published as: EP0785258A1; WO1997026351A1; EP1260587A3; JP2002142785A; GB9601067D0; EP1260587A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドおよびｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、ならびに組換え法による該ポリペプチドの製造方法を提供するものである。また、本発明は、感染、とりわけ細菌感染に対する防御のためのｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドの利用方法を提供するものでもある。

Description

【発明の詳細な説明】スタフィロコッカス・アウレウスのチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼ発明の分野本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびその製造および使用、ならびにそれらの変種、アゴニストおよびアンタゴニストおよびそれらの使用に関する。詳細には、これらのおよびその他の点に関して、本発明は本明細書で「ｔＲＮＡシンセターゼ」と称するｔＲＮＡシンセターゼファミリーの新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。発明の背景抗生物質の開発を目的として、スタフィロコッカス（Ｓtaphylococcis）の遺伝子および遺伝子産物を用いるのがとりわけ好ましい。スタフィロコッカス属は医学的に重要な微生物の属である。これらは浸潤性および毒素原性の２つの型の疾患を生み出すことが知られている。浸潤性感染は一般的に、皮膚表面および深部の組織の両方に影響を及ぼす膿瘍を形成する特徴がある。スタフィロコッカスアウレウス（Ｓ．aureus）は癌患者の菌血症を二次的に引き起こす原因となる。骨髄炎、敗血症性関節炎、敗血症性血栓静脈炎および急性細菌性心内膜炎もまた比較的一般的である。スタフィロコッカス属の毒素原特性から少なくとも３つの臨床病態が引き起こされる。これらの疾患の発現は、組織浸潤および菌血症に対するものとしての外毒素の作用の結果である。これらの病態には：スタフィロコカスの食物汚染、熱傷様皮膚症候群およびトキシックショック症候群等がある。ｔＲＮＡシンセターゼは以下のスキームに従って、タンパク質合成に主要な役割を果たす：酵素＋ＡＴＰ＋ＡＡ⇔酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ＰＰｉ酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡ⇔酵素＋ＡＭＰ＋ＡＡ-ｔＲＮＡ（ＡＡはアミノ酸である）この過程を阻害すると、荷電ｔＲＮＡのレベル低下を導き、緊縮応答として知られている応答のカスケードの引き金となり、結果的に生体の休眠状態を誘導する。細菌性ｔＲＮＡシンセターゼの選択的阻害剤は、それ自体、抗細菌剤としての可能性を有する。これに関する一つの例として、イソロイシルｔＲＮＡシンセターゼを選択的に阻害するムピロシンがある。ｔＲＮＡシンセターゼの単離により、潜在的抗菌性の目的物質の同定および分析のために、抗菌性化合物のスクリーニングを容易になる。イソロイシルｔＲＮＡシンセターゼはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓta phylococcus aureus）から単離され、すでに報告されている（Chalker，A. F.、 Ward，J．M.，Fosberry，A．P．およびHodgson，J．E.，Gene 141:103-108(1994 )）。明らかに、化合物の抗生物質活性をスクリーニングするために用いることができる因子、ならびに感染、機能障害および疾患の病因における役割を決定するためにも用いることができる因子が必要とされている。また、感染、機能障害または疾患の予防、改善または抑制に役割を果たすことができるかかる因子ならびにアンタゴニストおよびアゴニストの同定および特徴づけも必要とされている。本発明のポリペプチドは、既知ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質に相同的なアミノ酸配列を有する。発明の概要本発明の目的は、図２に示すアミノ酸配列とｔＲＮＡシンセターゼなどの他のタンパク質の既知の一つのもしくは複数のアミノ酸配列との相同性により、新規ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドとして同定されたポリペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に本明細書においてｔＲＮＡシンセターゼと称するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することである。本発明のこの態様のとりわけ好ましい具体例では、ポリヌクレオチドは、図１［配列番号１］に示す配列を含むトロシルｔＲＮＡシンセターゼポリペプチド、またはそれらの変種をコードする領域を包含する。本発明のこの態様の別のとりわけ好ましい具体例では、図２［配列番号２］に示すアミノ酸配列を含む、スタフィロコッカス・アウレウス由来の新規ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質、またはそれらの変種がある。本発明のこの態様によれば、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１に含まれるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株により発現されうる成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供される。本発明のこの態様によれば、ｔＲＮＡシンセターゼ、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスｔＲＮＡシンセターゼをコードする、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等の単離核酸分子が提供される。本発明のこの態様のさらなる具体例は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なそれらの変種、およびこれらを含有してなる組成物を包含する。本発明の別の態様によれば、治療的または予防的目的で、とりわけ遺伝学的免疫において本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明のこの態様のとりわけ好ましい具体例は、ｔＲＮＡシンセターゼの自然発生対立遺伝子変種およびそれによりコードされるポリペプチドである。本発明のこの態様によれば、本明細書でｔＲＮＡシンセターゼと称するスタフィロコッカス・アウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なそれらの変種、およびこれらを含んでなる組成物が提供される。本発明のこの態様のとりわけ好ましい具体例は、ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子の自然発生対立遺伝子によりコードされるｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドの変種である。本発明のこの態様の好ましい具体例では、前述のｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドの製造方法が提供される。本発明の別の態様によれば、例えば抗体等の抗細菌物質として有用な、このようなポリペプチドの阻害物質が提供される。本発明のこの態様のある好ましい具体例によれば、（i）ｔＲＮＡシンセターゼ発現の評価、（ii）疾患、例えば上気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、および骨および関節感染（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）などの処置、（iii）遺伝的変種のアッセイ、（iv）ならびに細菌とりわけスタフィロコッカス・アウレウスに対する免疫学的応答を上昇させるための、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの生体への投与のための製品、組成物および方法が提供される。本発明のこの態様および他の態様のある好ましい具体例によれば、ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチド配列に、とりわけ厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが提供される。本発明のこの態様のある好ましい具体例において、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明の別の態様によれば、各々好ましくは静細菌性または殺細菌性をも有するｔＲＮＡシンセターゼアゴニストおよびアンタゴニストが提供される。本発明のさらなる態様において、ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドまたはｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドを含有する、細胞または多細胞生物への投与用の組成物が提供される。開示した本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載および本明細書のその他の部分を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろう。図面の簡単な説明以下の図は本発明のある具体例を表すものである。これらは説明のためのみに示すものであり、特記しない限り本明細書に記載する本発明を限定するものではない。図１は、スタフィロコッカス・アウレウスのチロシルｔＲＮＡシンセターゼのポリヌクレオチド配列［配列番号１］を示す。図２は、図１のポリヌクレオチド配列から推定したスタフィロコッカス・アウレウスのチロシルｔＲＮＡシンセターゼのアミノ酸配列［配列番号２］を示す。用語集以下の定義は、本明細書において汎用される特定の用語の理解を容易にするために示すものである。「宿主細胞」は外来ポリヌクレオチド配列により形質転換もしくはトランスフェクトされたか、または形質転換もしくはトランスフェクトされ得る細胞である。「同一性」とは、当該分野に周知であるように、配列を比較して決定される、二つもしくはそれ以上のポリペプチド配列または二つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、「同一性」とは、場合によってはかかる配列の鎖の合致により決定できる、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の配列関連性の程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は既知の方法により容易に算出できる（Computational Molecular Biology，Lesk，A .M．編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D．W．編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993年；Computer Analysis of Sequence Data ，パートＩ，Griffin，A．M．およびGriffin，H．G．編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequence Analysis in Molecular Biology，von He inje，G.、アカデミック・プレス、1987年；およびSequence Analysis Primer， Gribskov，M．およびDevereux，J．編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、1991年）。二つの配列間の同一性および類似性を測定する方法は数多くあるが、両用語とも当業者に周知である（Sequence Analysis in Molecular Biology， von Heinje，G.、アカデミック・プレス、1987年；Sequence Analysis Primer， Gribskov，M．およびDevereux，J．編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、1991年；ならびにCarillo，H．およびLipman，D.，SIAM J．Applied Math.，4 8:1073(1988)）。配列間の同一性または類似性を測定するために通常用いられる方法はCarillo，H．およびLipman，D.，SIAM J．Applied Math.，48:1073(1 988)に開示されているが、これらに限定するものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間で最も良く合致するように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公に入手できるコンピュータープログラムで集成されている。二つの配列間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux，J．ら、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Atschul，S．F.ら、J．Molec．Biol．215:403-410(1990)））があるが、これらに限定するものではない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよびその他の供給源より公に入手可能である（BLAST Manual，Altschul， S.ら、NCBI NLM NIHメリーランド州２０８９４ベゼスダ；Altschul，S.ら、J．M ol．Biol．215:403-410(1990)）。「単離」とは、「人間の手により」自然の状態から変化させられた、すなわち、それが自然に存在する場合、元来の環境から変化もしくは除去されたこと、またはその両方が行われたことを意味する。例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、自然の状態で生存動物に存在している場合は「単離」されていないが、このポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然に共存する物質から分離されている場合は、本明細書に用いる用語である「単離」がなされている。「ポリヌクレオチド」とは、一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これに限定するものではない。さらに、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。そのような領域における鎖は同一の分子または異なる分子由来のものでよい。この領域は一つまたはそれ以上の分子の全体を含み得るが、より典型的には幾つかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、上述のＤＮＡまたはＲＮＡ等を含む。このように、安定性またはその他の理由で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書の用語である「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例だけを示す）は、本明細書で用いる用語であるポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに非常に多くの修飾がなされていることは明らかであろう。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば単純型細胞および複雑型細胞等を含む細胞の特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称する短いポリヌクレオチドを包含する。「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾したペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖、および一般的にタンパク質と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは２０種の遺伝子によりコードされたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプチド」には、プロセシングおよびその他の翻訳後修飾のような自然の工程により修飾されたものが含まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾される。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく開示されており、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾は該ポリペプチドのいくつかの部位で、同一または異なる程度で存在し得ることは理解されよう。また、該ポリペプチドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、クロスリンキング、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合クロスリンキング形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマーカルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸の添加、ならびにユビキチネーションなどがある。例えばPROTEINS -STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES、第２版、T．E．Creighton，W．H．Free man and Company、ニューヨーク（1993）およびPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MO DIFICATION OF PROTEINS、B．C．Johnson編、アカデミックプレス、ニューヨーク（1983）のWold，F.，Posttranslational Protein Modifications：Perspecti ve and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth．Enzymol．182:626-646（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：Posttranslational Modifications and A ging，Ann．N．Y．Acad．Sci．663:48-62（1992）を参照されたい。ポリペプチドは分岐または環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。環状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後の自然プロセスの結果であり、同様に全く合成的な方法で合成できる。本明細書で用いる「変種」なる用語は、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させるものであってもよく、変化させないものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、差異は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるように限定される。変種および対照ポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで起こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換または挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコードされたものであってもそうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝子変種のような自然発生的なものでよいか、または自然に発生することが知られていない変種でよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、突然変異技術、直接的合成、および当業者に既知のその他の組換え技術により製造できる。発明の説明本発明は以下により詳細に記載する、新規ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ｔｙｒＳ遺伝子によりコードされるバシラス・サチリス（Ｂacillus subtilis）のｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドにアミノ酸配列の相同性という点で関連している、スタフィロコッカス・アウレウスの新規ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は特に図１および図２に各々示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセターゼ、ならびにＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１のＤＮＡのｔＲＮＡシンセターゼヌクレオチド配列およびそれらにコードされるアミノ酸配列に関する。とりわけ研究室的条件および宿主感染条件下での生存性に適用した場合に、細菌における一時的な遺伝子発現を評価するのに有用な技法がある。それ自体が生存するのに必須であるかまたは感染の確立および／もしくは維持に必須である遺伝子を同定するために、多くの方法を用いることができる。これらの方法の一つにより配列の発現を同定することにより、その機能についてのさらなる情報が得られ、スクリーニングの目的物質としてさらなる開発のためのかかる配列の選別が助けられる。すなわち、これらの研究は例えば以下に挙げられるものである：１）シグニチャータグ化突然変異誘発（Ｓignature Ｔagged Ｍutagenesis：ＳＴＭ）この技法はHenselら、Science 269:400-403（1995）に開示されている（引用して本明細書の記載とする）。シグニチャータグ化突然変異誘発は、該感染モデルにおける感染の確立／維持に必要な遺伝子を同定するものである。この技法は、種々の方法（例えばトランスポゾン）により、標的生物のランダムな突然変異を誘発し、独特なＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異体の混合集団からのタグおよび感染した宿主から回収した細菌は、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーション分析により検出される。毒性を減じた突然変異体は、感染宿主から回収した細菌のプールにタグが存在しないことにより表される。スタフィロコッカス・アウレウスにおいては、トランスポゾンシステムはよく発達していないので、タグ化突然変異体を作るためのより有効な方法は、 Morrisonら、J．Bacteriol．159:870（1984）（引用して本明細書の記載とする）に開示されている挿入−複製突然変異誘発法を用いることである。２）インビボ発現技法（Ｉn Ｖivo Ｅxpression Ｔechnology：ＩＶＥＴ）この技術は、Camilliら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA．91:2634-2638（1994 ）およびMahanら、Infectious Agents and Diseases 2:263-268（1994）に開示されている（各々、引用して本明細書の記載とする）。ＩＶＥＴは、実験培養と比較した場合、感染中にアップレギュレートされた遺伝子を同定し、感染における重要な役割を果たす。この技法により同定される配列は感染の確立／維持に重要な役割を果たす。この技法では、標的生物のランダムな染色体フラグメントは、プラスミドベクターのプロモーター不含リポーター遺伝子の上流でクローン化される。プールを宿主に導入し、感染後の種々の時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現の存在を評価する。発現したリポーター遺伝子の上流に担持された染色体フラグメントは、感染中に正常にアップレギュレートされたプロモーターまたは遺伝子部分を担持すべきである。リポーター遺伝子の上流を配列決定すると、アップレギュレートされた遺伝子を同定できる。３）特徴的表示この技法はChuangら、J．Bacteriol．175:2026-2036（1993）に開示されている（引用して本明細書の記載とする）。この方法はランダムプライムＲＴ−ＰＣＲを用いて存在するｍＲＮＡを同定することにより、生体に発現する遺伝子を同定する。感染前および感染後のプロフィールを比較することにより、感染中にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた遺伝子を同定でき、ＲＴ−ＰＣＲ生成物を配列決定し、ライブラリー配列に適合させられる。４）トランスポゾン突然変異誘発による条件致死変異体の発生この技法はde Lorenzo，V.ら、Gene 123:17-24（1993）；Neuwald，A．F.ら、 Gene 125:69-73（1993）およびTakiff，H．E.ら、J．Bacteriol．174:1544-1553 （1992）に開示されており（引用して本明細書の記載とする）、発現が細胞の生存性に必須である遺伝子を同定する。この技法では、一方向または両方向でトランスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモーターを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトランスポゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモーター活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子のコーディング領域からプロモーターを分離するインサートが確実に回収される。このインサートは生存できないので、続いてインデューサー不含のレプリカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポゾンに隣接する領域の配列決定により挿入部位を同定し、分断された遺伝子を同定する。インデューサー不存在下での成長中の細胞の過程／形態の変化を正確にモニターすることにより、遺伝子の可能な機能に関する情報が得られる。このようなモニターリングとしては、フローサイトメトリー（細胞分割、溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射化学的標識化前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに反応するリポーター酵素遺伝子融合のモニター等がある。５）化学的突然変異誘発による条件致死突然変異の発生この技法はBeckwith，J.、Methods in Enzymology 204:3-18（1991）に記載されている（引用して本明細書の記載とする）。この技法では標的生物のランダム化学的突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温度）とは異なる温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異なる温度（例えばｔｓ同定のためには４２℃ 、ｃｓ同定のためには２５℃）で成長させ、その時成長できなかった単離物（条件突然変異体）を同定する。上述のように、非許容温度での増殖における変化を正確にモニターすることにより、突然変異遺伝子の機能に関する情報が得られる。標的生物からのライブラリーによる条件致死突然変異の相補性、および相補遺伝子を配列決定することにより、ライブラリー配列と適合させることができる。これらの技法の各々は、特定の適用に応じて有利であったり、不利であったりする。当業者は意図する特定の使用目的に最も関連する研究法を選択する。例えば、いくつかの遺伝子は感染に必須であると認識されているが、実際には感染の開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は、確立された慢性感染の治療のために開発された抗細菌物質にはそれほど魅力的な標的ではない。６）ＲＴ−ＰＣＲ細菌性メッセンジャーＲＮＡ、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスの細菌性メッセンジャーＲＮＡを、細菌感染した組織、例えば４８時間ネズミ肺感染の組織から単離し、ランダムヘキサヌクレオチドでプライムしたＲＮＡサンプルの逆転写、続いて遺伝子特異的プライマー対でのＰＣＲにより、各ｍＲＮＡ種の量を評価する。得られたＰＣＲ生成物の定量化による特定のｍＲＮＡ種の存在および量の決定により、感染した組織において転写された細菌遺伝子に関する情報が得られる。遺伝子転写の分析は、感染の異なる時間で実施でき、細菌性病因における遺伝子制御に関する詳細な知識を得ることができ、遺伝子産物が新規抗菌物質をスクリーニングする目的物質に相当することが明快に理解できるようになる。用いたＰＣＲプライマーの遺伝子特異的特性のために、細菌性ｍＲＮＡ調製物は遊離の哺乳動物ＲＮＡである必要はないことが理解されるべきである。これにより研究者は、感染組織から簡単で迅速にＲＮＡを調製でき、細菌中で非常に短時間しか生育できない（半減期２分程度）細菌性ｍＲＮＡ種を得ることができる。最適には、細菌性ｍＲＮＡは、感染ネズミ肺組織から、ＴＲＩゾール試薬の製造者に従って、非常に短時間ＴＲＩゾール（ギブコ−ＢＲＬ）の存在下で機械的に崩壊させ、続いてプロセシングし、次いでＤＮＡａｓｅ処理して夾雑ＤＮＡを除去することにより調製する。好ましくは、該プロセスは、適切に標識化した配列特異的オリゴヌクレオチドプローブでノーザンブロットをプローブすることにより検出される場合に細菌性１６ＳリボソームＲＮＡ、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスの１６ＳリボソームＲＮＡの最大量を得る条件を見出すことにより最適化される。典型的には、至適には８から２５サイクルで終了するＰＣＲ反応における各ＰＣＲプライマー対には５'色素標識プライマーを用いる。ＰＣＲ生成物は６％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＧeneＳcanner（ＡＢＩ製造）を用いて検出および定量する。本発明の配列に適用する場合、これらの技法を用いると、感染中に発現する細菌性タンパク質、抗細菌治療における利用能を有する該細菌性タンパク質の阻害物質の同定が可能になる。寄託物スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株を含有する寄託物は、スコットランド、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、セント・マッカードライブ２３番のナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭＢ）に１９９５年９月１１日に寄託され、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１が付与された。寄託したスタフィロコッカス・アウレウス株は本明細書では「寄託株」または「寄託株のＤＮＡ」と称する。寄託物は、寄託により「ＮＣＩＭＢ４０７７１」と称された、ｔＲＮＡシンセターゼＤＮＡの全長を含有する株である。寄託物に含まれるポリヌクレオチド配列、およびそれらにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の配列に関するいずれの記載にも矛盾する事象においてコントロールしている。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下でなされている。該株は、特許が発行されると何らの制限または条件もなく最終的に分譲されるであろう。寄託は当業者の便宜のためにのみ規定されており、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要求されるような実施可能要件であることを承認するものではない。寄託物を製造、使用または販売するためにはライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはここでは賦与されない。ポリペプチド本発明のポリペプチドとしては、図２［配列番号２］のポリペプチド（詳細には成熟ポリペプチド）ならびにポリペプチド類およびフラグメント、とりわけｔＲＮＡシンセターゼの生物学的活性を有するもの、および図２［配列番号２］のポリペプチドまたは相当する部分に少なくとも７０％の同一性を有するもの、好ましくは図２［配列番号２］のポリペプチドに少なくとも８０％の同一性を有するもの、およびさらに好ましくは図２［配列番号２］のポリペプチドに少なくとも９０％の類似性（さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するもの、なおさらに好ましくは図２［配列番号２］のポリペプチドに少なくとも９５％の類似性（なおさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するものが挙げられ、また、一般に少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むポリペプチドのかかる部分を有するこのようなポリペプチドの部分が挙げられる。本発明のポリペプチドのフラグメントである変種は、ペプチド合成により対応するポリペプチド全長を産生するのに用いることができる；従って、これらの変種をポリペプチド全長を製造するための中間体として用いることができる。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントである変種を用いて、本発明のポリヌクレオチド全長を合成することができる。フラグメントは、前述のポリペプチドのアミノ酸配列の全てではなく一部と全く同一であるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドに関しては、フラグメントは「フリースタンディング（free-s tanding）」であるか、またはそれらが一部もしくは領域を形成する大きなポリペプチド内に含まれてもよく、最も好ましくは単一の連続した領域として、単一の大きなポリペプチド内に含まれる。好ましいフラグメントとしては、例えば、アミノ末端を含む連続する一連の残基の欠失もしくはカルボキシル末端を含む連続する一連の残基の欠失またはアミノ末端を含むものおよびカルボキシル末端を含むものからなる二つの連続する一連の残基の欠失以外の、図２［配列番号２］のアミノ酸配列またはそれらの変種の一部を有する切断ポリペプチドが挙げられる。宿主細胞、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスにおける本発明のポリペプチドの切断形態もまた好ましい。また、構造的または機能的属性により特徴づけられたフラグメント、例えばアルファーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベーターシートおよびベーターシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含むフラグメントなどがある。ｔＲＮＡシンセターゼの活性を媒介するこれらのフラグメントである生物学的に活性なフラグメントもまた好ましく、類似の活性もしくは改善された活性があるかまたは望ましくない活性を減じたフラグメント等がある。動物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原的であるこれらのフラグメントもまた含まれる。ポリヌクレオチド本発明の別の態様は、図２［配列番号２］の推定アミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドおよびそれらに密接に関連したポリヌクレオチドおよびそれらの変種を提供する。本明細書に提供する情報を用いて、例えば図１［配列番号１］に示すポリヌクレオチド配列のような、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを、例えば出発物質としてスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９細胞由来の染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングし配列決定するために用いるような標準的なクローニングおよびスクリーニングを用いて得ることができ、次いで全長クローンを得ることができができる。例えば、図１［配列番号１］に示す配列のような本発明のポリヌクレオチド配列を得るために、典型的には、イー・コリ（Ｅ．coli）または何か別の適切な宿主におけるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９細胞の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、部分的配列に由来の、好ましくは１７量体またはそれ以上の長さの放射性標識オリゴヌクレオチドにてプローブする。次いで、プローブのＤＮＡと同一のＤＮＡを有するクローンは、厳密な条件を用いて区別できる。オリジナルの配列から設計した配列決定プライマーでこのように同定した個々のクローンを配列決定することにより、次に両方向に配列を伸長させて、全遺伝子配列を決定することができる。このような配列決定は、プラスミドクローンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用いて行うのが好都合である。適切な技法については、Maniatis， T.、Fitsch，F．F.およびSambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manua l、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に開示されている（Screenin g By Hybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Tem plates 13.70を参照）。本発明の説明のために、図１［配列番号１］に示すポリヌクレオチドは、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９に由来するＤＮＡライブラリーで発見された。このようにして得られたＤＮＡ配列を図１［配列番号１］に示す。これは当該分野で周知のアミノ酸残基分子量を用いて算出できる推定分子量を有する、図２［配列番号２］に示すものとほぼ同数のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードする読み取り枠を含有する。本発明の新規ｔＲＮＡシンセターゼは、寄託株のｔＲＮＡシンセターゼをコードするＤＮＡの配列決定の結果により示されるように、ｔＲＮＡシンセターゼファミリーの他のタンパク質に構造的に関連している。該タンパク質は、既知のタンパク質の中でｔｙｒＳ遺伝子によりコードされているバシラス・サチリスｔＲＮＡシンセターゼタンパク質に対する最大の相同性を示す。図２［配列番号２］のチロシルｔＲＮＡシンセターゼは、ｔｙｒＳ遺伝子によりコードされているバシラス・サチリスのｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドのアミノ酸配列と、全長で約６１％の同一性、および全長にわたり約７９％の類似性を有する。本発明の配列はまた、図１［配列番号１］のコーディング配列と全長にわたり同一であってもよい。本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはそれらのフラグメントのコーディング配列、ならびに単独で他のコーディング配列を有する読み取り枠の成熟ポリペプチドまたはフラグメントについてのコーディング配列、例えばリーダーまたは分泌配列、プレー、プロー、プレプロ−タンパク質配列をコードするコーディング配列をも提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、停止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、および付加アミノ酸をコードする付加コーディング配列などの非コーディング５'および３'配列などの非コーディング配列をも含有しうるが、これらに限定するのではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列をコードすることができる。本発明のこの態様のある好ましい具体例において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（キアゲン・インコーポレーテッド）に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド（Gentzら、Proc．Natl．Acad ．Sci.，USA，86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡタグ（Wilsonら、C ell，37:767(1984)）である。本発明のポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子発現を調節するその天然において関連した配列をも含むが、これらに限定するものではない。前述によれば、本明細書で用いる「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本発明のポリペプチド、とりわけ図２［配列番号２］に示すアミノ酸配列を有する細菌性の、さらに詳細にはスタフィロコッカス・アウレウスｔＲＮＡシンセターゼをコードする配列を含有するポリヌクレオチド包含する。この用語はまた、付加領域と一緒になった、ポリペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領域（例えば、組み込まれたファージもしくは挿入配列または修正により分断される）、さらにはコーディングおよび／または非コーディング配列をも含有し得るポリヌクレオチドをも包含する。本発明はさらに、図２［配列番号２］の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコードする、本明細書で上述したポリヌクレオチドの変種に関する。さらに、特に好ましい具体例は、図２［配列番号２］に示すｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドのアミノ酸配列にいくつか、少しの、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加を任意の組み合わせて施したアミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセターゼ変種をコードするポリヌクレオチドである。中でもとりわけ好ましいものは、ｔＲＮＡシンセターゼの特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失である。本発明のさらに好ましい具体例は、図２［配列番号２］に示すアミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長にわたり少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチドである。また別に、最も好ましいポリヌクレオチドは、寄託株のスタフィロコッカス・アウレウスＤＮＡのｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれらに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長にわたり少なくとも８０％同一である領域を含むポリヌクレオチドである。これに関して、寄託株のスタフィロコッカス・アウレウスＤＮＡのｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれらに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長にわたり少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、これらのとりわけ好ましいポリヌクレオチドの中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好ましい。さらにまた、少なくとも９５％の同一性を有するものの中でも少なくとも９７％であるものがより好ましく、これらの中でも少なくとも９８％および少なくとも９９％であるものがとりわけ非常に好ましく、さらに少なくとも９９％であるものがより好ましい。これに関するとりわけ好ましい具体例は、さらに、図１［配列番号１］のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同一の生物学的機能または活性を実質的に保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明は、さらに本明細書で上述した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は、特に、厳密な条件下で本明細書で上述したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いる場合、「厳密な条件」および「厳密なハイブリダイゼーション条件」なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列間の同一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％である場合のみに起こることを意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例としては、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮaＣl、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（pＨ７.６）、５ｘデンハーツ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μg ／mlの、変性され剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃で一晩インキュベートし、続いて約６５℃で０．１ｘＳＳＣ中フィルターを洗浄するものが挙げられる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sambrook ら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）、とりわけその第１１章に例示されている（引用して本明細書の記載とする）。本発明はまた、本質的に、厳密なハイブリダイゼーション条件下で配列番号１に示すポリヌクレオチド配列について完全遺伝子を含有する適当なライブラリーを、配列番号１に示すポリヌクレオチド配列の配列またはその断片を有するプローブでスクリーニングし、該ＤＮＡ配列を単離することにより得られるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを提供するものでもある。このようなポリヌクレオチドを得るために有用なフラグメントとしては、例えば本明細書に別に記載するプローブおよびプライマーなどが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドアッセイに関してここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌクレオチドをＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡについてのハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ｔＲＮＡシンセターゼをコードするｃＤＮＡ全長およびゲノムクローンを単離し、ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子に高度な配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離することができる。このようなプローブは、通常、少なくとも１５塩基を含む。好ましくは、このようなプローブは、少なくとも３０塩基を有し、少なくとも５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプローブは、少なくとも３０塩基を有し、５０塩基以下である。例えば、ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子のコーディング領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、スクリーニングすることにより単離できる。次いで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、プローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバーを決定する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、疾患、とりわけヒトの疾患の処置法および診断法の発見のために研究試薬および材料として使用でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本明細書でさらに論じる。オリゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１および２の配列に由来する配列番号３および４を含み、本明細書に記載する方法に使用できるが、ＰＣＲに用いるのが好ましく、本明細書で同定したポリヌクレオチドの全てまたは一部が感染した組織に転写されるか否かを決定する。このような配列が、病原体が達成した感染の段階および感染の型の診断にも有用であることが理解される。ポリヌクレオチドは、付加アミノ酸もしくはカルボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペプチドに内在するアミノ酸を加えた成熟タンパク質であるポリペプチドをコードできる（例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。このような配列は、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセシングにおいて役割を果たし、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質の半減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイもしくは製造のためのタンパク質の操作を容易にすることができる。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞の酵素により処理され、成熟タンパク質から取り除かれる。１またはそれ以上のプロ配列と融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去されると、このような不活性前駆体が通常活性化される。プロ配列のいくつかまたは全てを活性化の前に除去できる。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称される。要するに、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク質（プレタンパク質と称することができる）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列および１またはそれ以上のプロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタンパク質をコードでき、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態を生じるプロセシング段階で除去される。ベクター、宿主細胞、発現本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作する宿主細胞および組換え技法による本発明のポリペプチドの製造にも関する。無細胞翻訳系を用い、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を製造することもできる。組換え体を製造するために、宿主細胞は、遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davisら、BASIC METHODS IN MOLECU LAR BIOLOGY，(1986);Sambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニュアルに記載される方法により行うことができ、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入および感染などがある。適当な宿主の代表的な例としては、細菌細胞、例えばストレプトコッカス細胞、スタフィロコッカス細胞、イー・コリ（Ｅ．coli）細胞、ストレプトミセス細胞およびバシラス・サチリス細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス（Ａspergillus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Ｄrosophila Ｓ２）細胞およびスポドプテラＳｆ９（Ｓpodoptera Ｓｆ９）細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Ｂows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞などが挙げられる。非常に多くの発現系を用いて、本発明のポリペプチドを製造することができる。このようなベクターとしては、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、インサートエレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、ならびにそれらを組み合わせた物に由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミドなどが挙げられる。発現系の構築物は、発現を制御および引き起こす調節領域を含有できる。通常、宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または発現するのに、および／またはポリペプチドを発現するのに適したいずれの系またはベクターをも、この点に関する発現に使用できる。種々の周知かつ慣用的な技術のいずれか（例えばSambro okら、MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL（上述）に記載されている技術）により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入できる。翻訳タンパク質を、小胞体内腔、ペリプラスミックスペースまたは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルはポリペプチドに対して内在性であってもよく、あるいは異種性のシグナルでもよい。本発明のポリペプチドは、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。精製のために高速液体クロマトグラフィーを用いるのが最も好ましい。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性した場合、タンパク質再生のための周知の技法を用いて、再び活性な立体配座にすることができる。診断アッセイ本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるｔＲＮＡシンセターゼの検出は、疾患の診断のための診断法を提供する。真核生物（本明細書において「個体」とも称する）、とりわけ哺乳動物、特にヒトがｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子を含む生物に感染すると、種々の方法によりＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は、感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より得ることができる。ゲノムＤＮＡを用いて、直接的に検出することができるか、または分析の前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることができる。増幅法を用いると、真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすることができる。対照配列の遺伝子型に比較した増幅産物の大きさの変化により、欠失および挿入を検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識化ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることにより同定できる。完全に対合した配列はＲＮａｓｅ消化により、または融解温度の差により、ミスマッチ二重らせんと区別できる。ＤＮＡ配列の差は、また、変性剤を伴うまたは伴わないゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度の変化により、または直接的なＤＮＡの配列決定により検出できる。例えばMeyersら、Science，230: 1242（19 85）を参照。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮａｓｅおよびＳ１保護または化学的切断法によっても明らかにすることができる。例えばCottonら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，85: 4397-4401（ 1985）を参照。本発明遺伝子の突然変異または多型性を担持する細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベルで、例えばセロタイピングすることにより検出できる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、突然変異を検出することができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばＧeneＳcan等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目的で、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いることができる。例を挙げると、ｔＲＮＡシンセターゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、突然変異を同定および分析することができる。これらのプライマーは、個体に由来するサンプルから単離したｔＲＮＡシンセターゼＤＮＡを増幅するために用いてもよい。本発明はまた、５'および／または３'末端から取り出した１、２、３または４ヌクレオチドを有するこれらのプライマーを提供するものでもある。該プライマーを用いて、感染した個体から単離した遺伝子を増幅することができ、次いで、該遺伝子を、ＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供することができる。このように、ＤＮＡ配列における突然変異を検出し、これを用いて、感染を診断し、感染性物質のセロタイピングまたは分類することができる。本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感染、さらに好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスによる感染、最も好ましくは上気道感染(例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道感染(例えば、蓄膿症、肺膿瘍) 、心臓感染（例えば、感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿瘍）、眼感染(例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、ならびに骨および関節感染（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）などの疾患の診断方法であって、図１［配列番号１］の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上昇を個体由来のサンプルから決定することを含む診断方法を提供するものである。ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドの発現の増加または減少は、ポリヌクレオチドの定量について当該技術分野で周知の方法のいずれか１つ、例えば、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いて測定することができる。さらに、正常対照組織サンプルと比較したｔＲＮＡシンセターゼタンパク質の過剰発現を検出するための本発明の診断アッセイを用いて、例えば、感染の存在を検出することができる。宿主由来のサンプル中のｔＲＮＡシンセターゼタンパク質のレベルを決定するために用いることができるアッセイ技法は、当業者に周知である。このようなアッセイ法としては、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイなどが挙げられる。抗体本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそれらを発現する細胞を免疫原として用いて、このようなポリペプチドに対して免疫特異的な抗体を産生することができる。本明細書で用いる場合、「抗体」としては、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの生成物などのＦａｂフラグメントなどが挙げられる。本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが付いたフラグメント、アナログまたは細胞を、動物、好ましくはヒトはでない動物に、慣用のプロトコールを用いて投与することにより得ることができる。連続的細胞系培養により産生される抗体を提供する、当該技術分野で周知の技術を用いて、モノクローナル抗体を調製することができる。実例としては、Kohler， G.およびMilstein，C.，Nature，256: 495-497(1975)；Kozborら、Immunology T oday，4: 72(1983)；Coleら、MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Ala n R．Liss，Inc.、77-96頁（1985）に記載されるような種々の技法がある。一本鎖抗体の産生についての技術（米国特許第４,９４６,７７８号）を適用して、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生することができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば、他の哺乳動物を用いて、ヒト化抗体を発現することができる。別法としては、ファージディスプレイ技法を用いて、抗Ｆｂｐプロセシングについてスクリーニングしたヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ遺伝子のレパートリー由来の、または無処理ライブラリー由来のポリペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選別することができる（McCafferty，J.ら、Nature 348 ， 552-554(1990)；Marks，J.ら、Biotechnology 10，779-783(1992)）。これらの抗体の親和性はまた、チェインシャフリング（chain shuffling）により改善することもできる（Clackson，T.ら、Nature 352，624-628(1991)）。二つの抗原結合ドメインが存在する場合、各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトープに対して指向される。上述の抗体を用いて、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定することができ、親和性クロマトグラフィーにより該ポリペプチドを精製することができる。したがって、とりわけｔＲＮＡシンセターゼに対する抗体を用いて、感染、とりわけ細菌感染、特に上気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、骨および関節感染（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）などの疾患を処置することができる。ポリペプチド変種としては、抗原的、エピトープ的または免疫学的に等価な変種などが挙げられ、これは、本発明の特定の態様を形成する。本明細書で用いる場合、「抗原的に等価な誘導体」なる用語は、本発明によるタンパク質またはポリペプチドに対して生起された場合に病原体と哺乳動物宿主との間での即時的な物理的相互作用を妨害するある種の抗体により特異的に認識されるポリペプチドまたはその等価物を包含する。本明細書で用いる場合、「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊椎動物における抗体を生起させるのに適した処方において用いた場合に抗体が病原体と哺乳動物宿主との間での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用するペプチドまたはその等価物を包含する。ポリペプチド、例えば抗原的もしくは免疫学的に等価な誘導体、またはそれらの融合タンパク質を抗原として用いて、マウスまたは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫化することができる。融合タンパク質は、ポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例えばコンジュゲーションにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬＨ）と結合することができる。別法としては、タンパク質もしくはポリペプチド、またはそれらの抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチドは、免疫原性を改良するのに充分な抗原性を有しているので、キャリヤを用いなくてすむ。好ましくは、抗体またはそれらの変種を修飾して、個体においてあまり免疫原性ではないようにする。例えば、個体がヒトである場合、抗体は、最も好ましくは「ヒト化」される；この場合、例えば、Jones，P.ら、Nature 321，522-525(1 986)またはTempestら、Biotechnology 9，266-273（1991）に開示されているように、ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域は、ヒトモノクローナル抗体に移植されてきた。本発明のポリヌクレオチドを遺伝学的免疫化において使用するには、例えばプラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum Mol Genet 1:363(1992)；Ma nthorpeら、Hum．Gene Ther．4，419(1963)）、特異的タンパク質キャリヤとのＤＮＡ複合体の送達（Wuら、J．Biol．Chem．264，16985(1989)）、リン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshef、PNAS 83，9551(1986)）、種々の形態のリポソーム中へのＤＮＡ封入(Kanedaら、Science 243，375(1989))、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152(1992)；Eisenbraunら、DNA Cell Biol．12:79 1，(1993)）およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたインビボ感染（S eegerら、PNAS 81，5849(1984)）などの適切なデリバリー方法を用いるのが好ましい。また、本発明のポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産物の混合物中の、小さな分子基質およびリガンドの結合を評価することもできる。これらの基質およびリガンドは、天然の基質およびリガンドでよく、または構造的もしくは機能的擬似物質でもよい。例えば、Co liganら、Current Protocols in Immunology 1(2): 第５章（1991）を参照。アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子本発明はまた、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を増強する化合物（アゴニスト）または阻害する化合物（アンタゴニスト）を同定するための、化合物のスクリーニング方法を提供するものでもある。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドおよびかかるポリペプチドの標識基質またはリガンドを含んでなる、合成反応混合物、細胞コンパートメント、例えば膜、細胞表面膜もしくは細胞壁、またはそれらのいずれかの調製物を、ｔＲＮＡシンセターゼアゴニストまたはアンタゴニストとなりうる候補分子の存在下または不在下で、インキュベートする。候補分子がｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをアゴナイズまたは拮抗する能力は、標識化リガンドの結合の低下またはかかる基質からの生成物の生産低下に反映される。結合しても影響を及ぼさない分子、すなわちｔＲＮＡシンセターゼの効果を誘起しない分子は、おそらく良好なアンタゴニストとであろう。結合性が良好であって、基質からの生成物の生成速度を高める分子はアゴニストである。基質からの生成物の生成速度またはレベルは、リポーターシステムを用いることにより増強できる。これに関して有用なリポーターシステムとしては、生成物に転換される比色標識化基質、ｔＲＮＡシンセターゼ活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当該技術分野で周知の結合アッセイなどが挙げられるが、これらに限定するものではない。さらなる態様において、本発明は、チロシルｔＲＮＡシンセターゼの相互作用を妨害する薬物を同定するための薬物スクリーニング法を提供するものである。酵素により媒介される放射性標識化アミノ酸のｔＲＮＡへの組み込みは、ｔＲＮＡおよびＡＴＰの存在下、アミノ酸−ｔＲＮＡを放射性標識アミノ酸からのトリクロロ酢酸沈殿放射活性として測定するアミノアシル化法により測定され得る（ Hughes J.、Mellows G．および Soughton S.、FEBS Letters 122:322-324(1980) ）。かくして、チロシルｔＲＮＡシンセターゼ阻害物質は、対照と比較して、トリクロロ酢酸沈殿放射性活性の減少により検出することができる。また別に、ＰＰｉからの放射性標識化ＡＴＰの形成を測定する、部分ＰＰｉ／ＡＴＰ交換反応を触媒するｔＲＮＡシンセターゼを用いて、チロシルｔＲＮＡシンセターゼ阻害物質を検出することができる（Calender R．& Berg P.、Biochemistry 5，168 1-1690(1966)）。ｔＲＮＡシンセターゼアンタゴニストのアッセイの他の例は、競争阻害アッセイに適した条件下で、ｔＲＮＡシンセターゼおよび潜在的なアンタゴニストをｔＲＮＡシンセターゼ結合分子、組換えｔＲＮＡシンセターゼ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド擬似物質と組み合わせる競争アッセイである。ｔＲＮＡシンセターゼを、例えば放射活性または比色化合物などにより標識化して、結合分子に結合した、または生成物に変換したｔＲＮＡシンセターゼ分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価することができる。潜在的なアンタゴニストとしては、本発明のポリペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消滅させる小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体などが挙げられる。潜在的アンタゴニストはまた、結合分子の同一部位に結合する、密接に関連したタンパク質または抗体のような小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチド、例えばｔＲＮＡシンセターゼ誘起活性を誘起しない結合分子であってよく、それによりｔＲＮＡシンセターゼを結合から排除して、ｔＲＮＡシンセターゼの作用を妨げる。潜在的なアンタゴニストとしては、ポリペプチドの結合部位に結合し、かつ該結合部位を占領し、それにより細胞性結合分子への結合を防御して、正常な生物学的活性を防御する小さな分子が挙げられる。小さな分子の例としては、小さな有機分子、ペプチド、ペプチド様分子などが挙げられるが、これらに限定するものではない。他の潜在的なアンタゴニストとしては、アンチセンス分子などが挙げられる（これらの分子についての記載に関しては、Okano，J.，Neurochem．56 ：560(1991)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRE SSION，ＣＲＣプレス、ボッカ・ラートン、フロリダ州（1988）を参照）。好ましい潜在的アンタゴニストとしては、ｔＲＮＡシンセターゼに関連する化合物およびｔＲＮＡシンセターゼの変種が挙げられる。特定の態様において、本発明は、感染の続発症に関与する、病原体と哺乳動物宿主との間の最初の物理的相互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供するものである。とりわけ本発明の分子は、ｉ）細菌、とりわけグラム陽性細菌の、内在デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質または創傷の細胞外マトリックスタンパク質への付着の防御；ii）例えば哺乳動物チロシンキナーゼのリン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介するｔＲＮＡシンセターゼタンパク質の阻害（Rosenshineら、In fect．Immun．60:2211(1992)）；iii）哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質との間の細菌付着の阻害；iv）内在デバイスの埋め込みまたは他の外科的手技以外により開始された感染における病因の通常の進行の防御に使用することができる。本明細書で提供する各々のＤＮＡ配列は、抗細菌化合物の発見および開発に用いることができる。発現してコードされたタンパク質は、抗菌薬物のスクリーニングのための目的物質として用いることができる。さらに、コードされたタンパク質もしくはＳhine-Ｄelgarnoまたは他の個々のｍＲＮＡの翻訳促進配列のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列を用いて、目的のコーディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構築することができる。アンタゴニストおよびアゴニストを用いて、例えば、疾患、例えば、上気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、骨および関節感染（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）などを阻害することができる。ワクチン本発明の別の態様は、個体、とりわけ哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方法であって、該個体を感染、とりわけ細菌感染、特にスタフィロコッカス・アウレウス感染から保護する抗体を産生するのに充分なｔＲＮＡシンセターゼ、またはそれらのフラグメントもしくは変種を個体に接種することを含んでなる方法に関する。本発明の別の態様は、個体における免疫学的応答を誘起する方法であって、遺伝子治療により、ｔＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラグメントもしくは変種をコードする遺伝子を送達し、ｔＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラグメントもしくは変種をインビボで発現し、該個体を疾患から保護する抗体を産生する免疫学的応答を誘起することを含んでなる方法に関する。本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を宿主内に誘起できるかまたは誘起した宿主に導入した場合、該宿主におけるｔＲＮＡシンセターゼまたはそれによりコードされたタンパク質に対する免疫学的応答を誘起する免疫学的組成物であって、該組成物が、組換えｔＲＮＡシンセターゼまたはそれによりコードされたタンパク質を含んでなり、該ｔＲＮＡシンセターゼの抗原をコードし発現するＤＮＡまたはそれからコードされるタンパク質を含んでなる。ｔＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラグメントは、それ自身は抗体を産生しないが、第１のタンパク質を安定化し、免疫原性および保護特性を有する融合タンパク質を産生する能力を有する補タンパク質（co-protein）と融合できる。かくして、融合した組換えタンパク質は、さらに、抗原補タンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化し、それらの産生および精製を容易にする比較的大きな補タンパク質などを含んでなるのがより好ましい。さらにまた、補タンパク質は、免疫系の一般化された刺激を提供するという意味で、アジュバントとして作用することができる。補タンパク質は、第１のタンパク質のアミノまたはカルボキシル末端のいずれに結合していてもよい。本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび免疫刺激ＤＮＡ配列を含むことからなる、例えばSato Y.ら、Science 273:352（1969）に記載されているもののような、組成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供するものである。また、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウスに感染した動物モデルにおけるこのような遺伝的免疫化実験で用いられるＤＮＡ構築物における細菌細胞表面タンパク質の非可変領域をコードすることが示されている上記ポリヌクレオチドまたはとりわけそのフラグメントを用いる方法を提供するものであり、これらはとりわけ予防的または治療的免疫応答を生じることができるタンパク質エピトープを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフィロコッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の開発のために、感染に抵抗するかまたは一掃するのに成功した動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル抗体を引き続き調製することを可能にすると思われる。該ポリペプチドは、宿主のワクチン化のための抗原として使用して、例えば細菌の損傷組織への付着を阻害することなどにより、細菌の侵入に対して保護する特異的抗体を産生することができる。組織損傷の例としては、例えば機械的損傷、化学的損傷もしくは熱損傷によるかまたは内在デバイスの埋め込みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、または粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷などが挙げられる。本発明は、また、免疫原性組換えタンパク質を適切な担体と共に含んでなるワクチン処方を包含する。該タンパク質は、胃で分解されるので、非経口的、例えば皮下、筋肉内、静脈内または皮内投与するのが好ましい。非経口投与に適した処方としては、抗酸化剤、緩衝液、静細菌剤、および処方を個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質を含有していてもよい、水性または非水性無菌注射液；および懸濁化剤または増粘剤を含有していてもよい水性または非水性無菌懸濁液などが挙げられる。処方は、単位投与または多回投与用容器、例えば密封したアンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に無菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存する。ワクチン処方は、例えば水中油系および当該技術分野で周知の他の系など、処方の免疫原性を増強するアジュバント系をも含有できる。投与量は、ワクチンの特異的活性に依存するであろうし、慣用の実験法により容易に決定することができる。本発明は、ある種のｔＲＮＡシンセターゼに関して記載したが、これは、天然タンパク質および、実質的に組換えタンパク質の免疫原性に影響しない付加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフラグメントを包含することが理解されよう。組成物、キットおよび投与本発明は、また、上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含んでなる組成物にも関する。本発明のポリペプチドは、細胞、組織もしくは生物用の非無菌もしくは無菌担体、例えば対象への投与に適した医薬的担体と組み合わせて用いることができる。このような組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポリペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせななどが挙げられるが、これらに限定するものではない。処方は、投与の形態に適したものにすべきである。本発明は、さらに、本発明の前記組成物の成分を１またはそれ以上充填した１またはそれ以上の容器を含んでなる診断用および医薬用パックおよびキットにも関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独で、または治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いることができる。医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、経口、肛門、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内の経路による投与を含む、いずれかの有効なかつ好都合な方法で投与されてよい。治療において、または予防として、活性物質を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の、無菌水性分散物として、個体に投与できる。また別に、該組成物は、局所適用用に、例えば軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、眼軟膏剤、点眼液、点耳液、洗口剤、染み込ませた包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾールなどの形態に処方でき、適当な慣用的な添加物、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏およびクリームには軟化剤を含有してよい。このような局所用処方はまた、適合した慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤、およびローションについてはエタノールまたはオレイルアルコールを含有してよい。このような担体は、処方の約１重量％から約９８重量％を構成してよ；より通常的には、処方の約８０重量％までを構成する。哺乳動物、とりわけヒトに投与するために、活性物質の１日あたりの投与量は、０.０１mg／kg〜１０mg／kgであり、典型的には約１mg／kgである。医者は如何なる場合にも、個体に最も適した実際の投与量を決定し、とりわけ個体の年齢、体重および反応性に応じて変化させる。上記投与量は、平均的なケースの模範例である。もちろん、高い投与量の範囲または低い投与量の範囲が適合する個々の例もあり、これらは本発明の範囲内である。内在デバイスとしては、外科的インプラント、プロテーゼデバイスおよびカテーテル、すなわち個体の体に導入し、長時間その位置に存在するデバイスが挙げられる。このようなデバイスとしては、例えば人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャント、尿カテーテル、持続的外来腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテーテルが挙げられる。本発明の組成物を注射により投与して、内在デバイスの挿入の直前に、関連する細菌に対する全身的な効果を得ることができる。手術後、デバイスが体内に在る時間中、処置を続けてよい。さらに、任意の外科的手技の手術中のカバーを広げて、細菌性創傷感染、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスの創傷感染を防御するために用いることもできる。多くの整形外科医は、プロテーゼ関節を有するヒトが菌血症を生み出し得る歯科的処置の前に、抗生物質予防法を考慮されるべきであると考える。遅延性の重篤な感染は、時々プロテーゼ関節を失うに至る重篤な合併症であり、有意性のある羅病率および死亡率を伴う。従って、この場合、予防的な抗生物質の代わりとして活性物質の使用を拡張することが可能である。上記治療に加え、本発明の組成物は、一般的に創傷治療薬として使用して、創傷組織に曝露したマトリックスタンパク質に細菌が付着するのを防ぎ、抗生物質予防法に代わって、またはそれと組み合わせて、歯科治療において予防的に使用できる。また別に、本発明の組成物を用いて、挿入直前に内在デバイスを浸すことができる。活性物質は、創傷または内在デバイスを浸すために１μg／ml〜１０mg／m lの濃度であるのが好ましい。ワクチン組成物は、便宜的には、注射可能な形態である。慣用のアジュバントを用いて、免疫応答を増強することができる。ワクチン化に適した単位投与量は、抗原０.５〜５μg／kgであり、かかる投与量は、１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。示した投与量範囲では、本発明の化合物について、適切な個体への投与を妨げるような不利な毒性効果は観察されない。上記抗体は、また、ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質を含有する細菌の存在を検出するための診断試薬として使用できる。実施例以下の実施例は、詳細に記載したこと以外は、当業者に周知かつ慣用的である標準的な技法を用いて行われる。該実施例は、説明のためにのみ示すもので、本発明を限定するものではない。実施例１スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９由来のチロシルｔＲＮＡシンセターゼをコードしているＤＮＡの単離配列番号２に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、イー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入手した。ライブラリーは、慣用的な方法、例えば以下の方法１および２により製造できる。方法１および２標準的な方法により、スタフィロコッカス・アウレウス株ＷＣＵＨ２９（ＮＣＩＭＢ４０７７１）から全細胞ＤＮＡを単離し、二つの方法のどちらかによりサイズ分画する。方法１標準的な方法によりサイズ分画化するために、全細胞ＤＮＡをニードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大きさのフラグメントをエキソヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼによる処理により平滑末端化し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントをＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結させ、標準的な方法により該ライブラリーをパッケージングし、次いでパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染させる。該ライブラリーを標準的方法により増幅する。方法２全細胞性ＤＮＡを４つの制限酵素（例えば、Ｒｓａｌ、ＰａｌＩ、Ａｌｕｌ）Ｂｓｈ１２３５Ｉ）を組み合わせたもので部分的加水分解し、標準的方法によりサイズ分画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメントに連結させ、次いでＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結させ、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、パッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染させる。該ライブラリーを標準法により増幅する。実施例２：チロシニルｔＲＮＡシンセターゼ（ＹＲＳ）活性の測定酵素は、ｔＲＮＡ^Tyrのアミノアシル化を触媒し、これは２段階メカニズムで進行する。最初の段階では、ＡＴＰおよびＬ−チロシンの特異的結合および反応の結果、安定な酵素：チロシニルアデニル化複合体を形成する。次いで、酵素結合ｔＲＮＡＴｙｒの３'末端アデノシンは、アミノアシルアデニレートと反応し、ｔＲＮＡがエステル化され、およびＡＭＰが放出される。これらの反応を以下にまとめる；ａ）Ｌ-Ｔyr＋ＡＴＰ.Ｍg＋ＹＲＳ⇒ＹＲＳ：Ｔyr-ＡＭＰ＋ＰＰi.Ｍg ｂ）ＹＲＳ：Ｔyr-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡ^Tyr⇒ＹＲＳ＋Ｔyr-ｔＲＮＡ^Tyr＋ＡＭＰ酵素を特徴付けするため、または以下のような多くの方法でのその活性の特異的阻害物質を同定するために、この反応をアッセイすることができる：１．Ｔyr−ｔＲＮＡ^Tyrの形成の測定は、放射性標識化チロシンを用いて特異的に決定することができ、沈殿／濾過技法（例えば、冷トリクロロ酢酸¹,²中）を用いてＴｙｒ-ｔＲＮＡから遊離のチロシンを分離できる。２．全アシル化反応もまた、ｔＲＮＡアシル化に対して化学量論的比率で産生されるＰＰｉまたはＡＭＰのどちらかの産生を分析することにより測定できる。これは、例えば比色測定³；または過剰の無機ピロホスファターゼを添加した後のＰｉの酵素結合測定⁴を用いるか、または直接的にＡＭＰもしくはＰＰｉ産生を測定する酵素結合アッセイ⁵を用いるなどの多くの方法により達成できる。３．部分反応（ａ）は、反応のこの部分の各段階が自由に可逆的であるので、ＡＴＰとＰＰｉとの間の放射性標識アイソトープ交換により評価することができる。これは、典型的には，全アシル化反応（ａ＋ｂ）よりも約２０倍高いｋ_cat を有し、ＡＴＰからＰＰｉを分離するクロマトグラフィーの原理を用いて（すなわち活性炭¹,²を用いて）容易に測定される。ＹＲＳへのリガンド結合基質のターンオーバーを触媒する酵素に依存しない実験において、リガンドのＹＲＳとの相互作用を決定することも可能である。この型の実験は、多くの方法で実施できる：１．酵素固有の蛍光に対するリガンド結合の影響（例えばトリプトファン）。天然リガンドまたは阻害物質を結合させることにより、酵素の蛍光を変化させる酵素の立体配座の変化が生じる。これを用いて、ストップトフロー蛍光装置を用いて、結合を表す顕微鏡的速度定数を定義することができる。また別に、定常状態蛍光滴定法は、これらが酵素阻害実験で評価されるのと同一の方法で全体的な解離定数を得ることができる。２．リガンドのスペクトル効果。リガンド自体が蛍光性であるか、または酵素トリプトファン蛍光と重複する発色団を有する場合、結合は、リガンド蛍光特性（例えば、強度、寿命または分極）の変化、または酵素トリプトファンとの蛍光共鳴エネルギー転移により検出できる。該リガンドは、阻害物質であるか、または天然リガンドの変種である（すなわち、蛍光ＡＴＰ誘導体または発蛍光団で標識化したｔＲＮＡＴｙｒ）。３．酵素：リガンド複合体の熱分析。熱量測定法（例えば、等温熱量測定、示差スキャンニング熱量測定）を用いると、温度変化、または報告によりリガンド結合を特徴付けすることができるＹＲＳの安定性のシフトの検出が可能になる。文献１．Calender & Berg、Biochemistry 5，1681-1690（1966）２．Toth M．J．& Schimmel P、J．Biol．Chem．265，1000-1004（1990）３．Hoenig、J．Biochem．Biophys．Meth．19，249-252（1989）４．Webb，T．M.、Anal．Biochem．218，449-454（1994）５．Sigma Chemicals Catalogue（1986）実施例３：ＹＲＳ活性についてのアミノアシル化アッセイイー・コリにて過剰発現した精製スタフィロコッカス・アウレウスＹＲＳを用いるか、またはＹＲＳを過剰発現するイー・コリからの粗製細胞溶解物を用いて、アッセイを実施する。後者は、通常、全タンパク質の約１０％をＹＲＳとして含有する。酵素は、液体窒素中急速冷凍した後、５０mＭトリス−ＨＣl緩衝液（ pＨ７.８）、１０mＭＭgＣl₂および１０mＭＢ−メルカプトエタノール中−７０℃で保存する。酵素サンプルの活性を決定する実験では、これらの貯蔵物を５０mＭトリス（pＨ７.８）、１０mＭＭgＣl₂、１mＭジチオスレイトールで広範に（１００倍〜１００００倍）希釈し、アッセイ前に氷上で貯蔵する。該アッセイ方法は、以下のとおりである；上記のとおり調製し、希釈した酵素５０mlを、０.２５μＣi Ｌ−[Ｕ−¹⁴Ｃ]−チロシン（アメルシャム・インターナショナル(Ａmersham Ｉnternational)）、４mg／mlイー・コリＭＲＥ６００混合ｔＲＮＡ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannheim）より）、５m ＭＡＴＰ、１５mＭＭgＳＯ₄、３mＭＤＴＴ、７５mＭＫＣlおよび５０mＭトリス−ＨＣl（pＨ７.８）を含有してなる反応混合物（１００ml）と混合する。特記しない限り、全ての試薬は、シグマ・ケミカル・カンパニー・リミテッド（Ｓigma Ｃhemical Ｃompany Ｌtd.）より入手した。濃度は、最終反応混合物での濃度である。酵素を添加して反応を開始した後、アッセイサンプルを３７℃でインキュベートし、所望の時間、２検体ずつ（５０μl）取り出し、７％トリクロロ酢酸（１００μl）でクエンチし、氷上で３０分放置する。沈殿物を、パッカード・フィルターメート・１９６・セル・ハーベスター［パッカード・インストラメント・リミテッド(Ｐackard Ｉnstrumets Ｌtd.)］を用いて、ガラス繊維フィルター上で回収し、７％トリクロロ酢酸、次いでエタノールで順次洗浄する。フィルターを７０℃で１時間乾燥させ、放射活性のレベルをシンチレーションカウンティング（パッカード・トップカウント）により測定する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 45/00 ＡＤＺＣ１２Ｎ 9/00 48/00 ＡＢＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 9/00 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 ＴＧ０１Ｎ 33/15 33/569 Ｅ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/569 Ａ６１Ｋ 37/48 ＡＥＤ // Ｃ１２Ｐ 21/08 37/66 Ｄ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ローラー，エリザベスアメリカ合衆国19426−0989 ペンシルベニア州カレッジビル、ピー・オー・ボックス5089、サウス・カレッジビル・ロード 1250番スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号２のアミノ酸１から４２０を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。４．配列番号１に示すヌクレオチド１から１２６０を含む請求項２記載のポリヌクレオチド。５．配列番号１に示すヌクレオチド１から１２６３を含む請求項２記載のポリヌクレオチド。６．配列番号２のアミノ酸１から４２０を含むポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。７．（ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１に含まれるｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子により発現される同一の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の塩基を含むポリヌクレオチドからなる群から選択されるものを含んでなる単離ポリヌクレオチド。８．請求項２記載のＤＮＡを含んでなるベクター。９．請求項８記載のベクターを含んでなる宿主細胞。１０．該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを請求項９記載の宿主細胞から発現させることを特徴とするポリペプチドの製造方法。１１．細胞が請求項８記載のベクターに含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現するように、該ベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクトすることを特徴とする、ポリペプチドを発現する細胞の製造方法。１２．ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまたはフラグメントを製造するのに充分な条件下で、請求項９記載の宿主を培養することを特徴とする、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまたはフラグメントの製造方法。１３．配列番号２のアミノ酸１から４２０に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド。１４．配列番号２に示すアミノ酸を含んでなるポリペプチド。１５．請求項１３記載のポリペプチドに対する抗体。１６．請求項１３記載のポリペプチドの活性を阻害するアンタゴニスト。１７．治療上有効量の請求項１３記載のポリペプチドを個体に投与することを特徴とする、ｔＲＮＡシンセターゼを必要とする個体の処置方法。１８．該ポリペプチドをコードするＤＮＡを個体に提供し、該ポリペプチドをインビボで発現させることにより、治療上有効量の該ポリペプチドが投与される請求項１６記載の方法。１９．治療上有効量の請求項１６記載のアンタゴニストを個体に投与することを特徴とする、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドを阻害することを必要とする個体の処置方法。２０．請求項１３記載のポリペプチドをコードする核酸配列を決定することを特徴とする、該ポリペプチドの発現に関与する疾患の診断方法。２１．宿主由来のサンプル中の請求項１３記載のポリペプチドの存在を分析することを特徴とする診断方法。２２．請求項１３記載のポリペプチドに結合し、該ポリペプチドの活性を阻害する化合物の同定方法であって；結合部位との結合を可能にする条件下、ポリペプチドの結合部位を表面に発現する細胞を、スクリーニングしようとする化合物と接触させること（ここで、該結合部位は、化合物の該結合部位への結合に反応して検出可能なシグナルを提供する能力を有する第２の成分に関連するものである）；次いで、該化合物と該結合部位との相互作用により生じるシグナルの存在または不在を検出することにより、該化合物が該結合部位に結合して該結合部位を活性化するかまたは阻害するかを決定すること；を特徴とする方法。２３．哺乳動物を疾患から防御する抗体を産生させるに充分なｔＲＮＡシンセターゼまたはそのフラグメントもしくは変種を哺乳動物に接種することを特徴とする、哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方法。２４．免疫学的応答を誘起させて哺乳動物を疾患から防御する抗体を産生するために、インビボでｔＲＮＡシンセターゼ、またはそのフラグメントもしくは変種を発現させるために、遺伝子治療によりｔＲＮＡシンセターゼフラグメントまたはその変種をコードする遺伝子を送達することを特徴とする、哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方法。２５．ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるタンパク質をコードし、発現するＤＮＡを含んでなる免疫学的組成物であって、哺乳動物に導入されると、哺乳動物において所定のｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドまたはそれらによりコードされるタンパク質に対する免疫学的応答を誘起する免疫学的組成物。２６．厳密なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１に示すポリヌクレオチド配列の完全遺伝子を含有する適当なライブラリーを、配列番号１に示す該ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントの配列を有するプローブでスクリーニングし、次いで、ＤＮＡ配列を単離することにより得られるＤＮＡ配列を必須としてなるポリヌクレオチド。２７．チロシルｔＲＮＡシンセターゼの相互作用を妨害する薬物を同定するための、薬物のスクリーニング方法であって、全アミノアシル化反応または部分ＰＰｉ／ＡＴＰ交換反応による酵素活性の測定を特徴とするスクリーニング方法。