ES2347190T3 - Procedimiento de cribado para la identificacion de nuevos farmacos. - Google Patents
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Abstract
Método de cribaje para la identificación de un candidato a fármaco que es un inhibidor de aminoacil-tRNA sintetasa patógena en el que dicho método comprende las siguientes etapas: a) obtener un vector d expresión que comprende una secuencia de un gen que codifica una tRNA sintetasa no discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza; b) transformar células aisladas de un mamífero con el vector de expresión; c) crecimiento de las células recombinantes resultantes de (b) en un medio con nutrientes en condiciones que permiten la expresión de la tRNA sintetasa patógena, lo que resulta en muerte celular; d) proporcionar una sustancia a ensayar; y e) analizar el crecimiento celular resultante, en donde si hay un aumento de crecimiento celular con respecto al crecimiento celular del mismo cultivo en ausencia de las sustancia a ensayar, entonces la sustancia inhibe selectivamente la actividad de la tRNA sintetasa patógena y no afecta a su ortólogo celular, lo que indica que dicha sustancia es un candidato a fármaco.
Description
Procedimiento de cribado para la identificación
de nuevos fármacos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención está relacionada con un
nuevo método de exploración que permite la identificación de nuevos
fármacos. Particularmente, la presente invención se refiere a un
método de exploración para la selección de compuestos inhibidores de
aminoacil-tRNA sintetasa (ARS) que pueden ser útiles
como agentes antibacterianos y antifúngicos, entre otros.
En programas modernos de descubrimiento de
fármacos las bibliotecas químicas se usan en combinación con
sistemas robóticos para evaluar rápidamente el efecto de grandes
cantidades de compuestos en una reacción dada. Este enfoque tiene
dos principales inconvenientes. Primero, con frecuencia es necesario
desarrollar un ensayo bioquímico que pueda controlarse fácilmente
con el fin de identificar nuevos compuestos candidatos. Este
procedimiento es costoso e insensible debido a potenciales efectos
negativos de los fármacos seleccionados. Segundo, este enfoque
ignora los parámetros de biodisponibilidad y toxicidad. La mayoría
de los compuestos inicialmente seleccionados se descartan
posteriormente debido a problemas de solubilidad, biodisponibilidad
o toxicidad.
Las aminoacil-tRNA sintetasas
(en lo sucesivo en la presente memoria llamadas "ARS")
representan dianas ideales para el desarrollo de fármacos debido a
que son enzimas esenciales de distribución universal, cuya
naturaleza ancestral permite la selección de inhibidores
específicos. Además, son solubles, estables, fáciles de expresar y
purificar en grandes cantidades y sencillas de ensayar mediante uno
o más métodos. Las estructuras de rayos X están disponibles para
ejemplos de todas las sintetasas y se sabe mucho acerca del
mecanismo de la reacción de aminoacilación (consúltese,
Weygand-Durasevic I. et al., "Yeast
seryl-tRNA synthetase expressed in Escherichia
coli recognizes bacterial serine-specific tRNAs
in vivo", Eur. J. Biochem., 1993, vol. 214, pp.
869-877).
Las ARS catalizan la ligación de aminoácidos
específicos a ARNt afines. Esta reacción tienen lugar dentro de un
dominio de sitio activo único y transcurre típicamente en dos
etapas. Primero, el aminoácido se activa con ATP para formar
aminoaciladenilato con liberación de pirofosfato. A continuación, el
aminoácido se transfiere al extremo 3' del ARNt para generar
aminoacil ARNt y AMP. Esta reacción en dos etapas establece el
código genético mediante la unión de tripletes de tripletes
nucleotídicos específicos (anticodones de ARNt) con aminoácidos
específicos. Cada aminoácido se reconoce por su propia ARS
específica, que está universalmente distribuida. Las aminoacil tRNA
sintetasas se dividen uniformemente en dos clases de aproximadamente
10 enzimas cada una. Todas las enzimas dentro de una clase parecen
haber evolucionado a partir de una proteína de unión a ATP de
dominio único. Las inserciones en y las variaciones de este dominio
establecieron un armazón para la unión al brazo aceptor de ARNt. A
lo largo de la evolución se añadieron dominios adicionales a esta
estructura central.
El reconocimiento de ARNt por aminoacil tRNA
sintetasas depende principalmente de la interacciones moleculares
con el sistema aceptor y el bucle del anticodón del ARNt (consúltese
Rich, A. "RNA structure and the roots of protein synthesis",
Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 2001, vol. 66, pp.
1-16). Los dominios de sitio activo de las enzimas
se unen al brazo aceptor de la molécula de ARNt, donde se une el
aminoácido. La base "discriminadora" (la base no emparejada
que precede a la secuencia universal CCA) y los primeros tres pares
de bases del brazo aceptor albergan la mayoría de los elementos de
identidad reconocidos por los sitios activos de ARS.
El documento US 6 475 726 describe un método
para la identificación de uno o más compuestos que son candidatos
para la unión a un componente celular diana en un patógeno e inhibir
la infección de un mamífero mediante patógeno que comprende: a) la
construcción de un patógeno que comprende un gen regulable que
codifica una biomolécula que se une al componente celular diana; b)
la infección de uno o más animales de ensayo con el patógeno
construido y uno o más animales control con el patógeno construido o
con un patógeno de control; c) la regulación de la expresión del
gen regulable para producir la biomolécula en animales de ensayo; d)
el control de los animales de ensayo y los animales de control con
respecto a señales de infección, en el que la observación de
señales de infección más escasas o menos graves en los animales de
ensayo que en los animales control indica que la biomolécula es un
inhibidor biomolecular de la infección por el patógeno; y e) la
identificación de uno o más compuestos que compiten con el inhibidor
biomolecular de la infección por la unión al componente celular
diana en un ensayo de unión competitiva; mediante el cual, si un
compuesto compite con el inhibidor biomolecular de infección por la
unión al componente celular diana, entonces el compuesto es un
candidato para la unión al componente celular diana en el patógeno y
la inhibición de la infección de un mamífero por el patógeno.
El documento WO 02/04611 describe aminoacil tRNA
sintetasas humanas (ATRS) y polinucleótidos que identifican y
codifican dichas sintetasas.
Los documentos EP 785 258 y EP 1 300 468
describen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican tRNA
sintetasa, particularmente de tRNA sintetasa de Staphylococcus
aureus incluyendo ARNm, ADNc, ADN genómicos.
Entre los antibióticos comerciales dirigidos a
la traducción uno se dirige a tRNA sintetasa. El ácido seudomónico
(mupirocina) es un inhibidor de isoleucil-tRNA
sintetasa (IleRS) de patógenos infecciosos Gram positivos. El ácido
seudomónico tiene una selectividad aproximadamente 8000 veces para
IleRS de patógeno frente a de mamífero, pero la falta de
biodisponiblidad sistémica del fármaco limita su uso a aplicaciones
tópicas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Aunque existen otros inhibidores de producto
natural dirigidos contra sintetasas (por ejemplo, borrelidina,
furanomicina, granaticina, etc.), ninguno de estos se ha
desarrollado para antibióticos comerciales debido a la falta de
actividad inhibidora, baja especificidad o baja biodisponibilidad.
Así pues, se requiere un método más eficiente para la selección de
inhibidores de ARS para explorar grandes bibliotecas químicas e
identificar candidatos a fármaco prometedores.
El objetivo de la presente solicitud es
proporcionar un método de exploración para la selección de
inhibidores de ARS.
Se proporciona un método de exploración positivo
que implica que el efecto deseado de un compuesto candidato
potencial es el rescate y/o estimulación del crecimiento de células
de mamífero y no la inhibición de cualquier reacción dada o la
detención del crecimiento de un cultivo celular. Así pues, en la
selección positiva que se propone aquí, el crecimiento de células
de mamífero (y en particular de células humanas) se rescataría
mediante las moléculas capaces de inhibir la acción tóxica de una
ARS diana. Este efecto podría controlarse simplemente mediante la
medición de la densidad de cultivo, un procedimiento rápido y
barato.
Así pues, un aspecto de la presente invención es
la provisión de un método de exploración para identificar un
candidato a fármaco, comprendiendo dicho método las etapas de: a) la
obtención de un vector de expresión que comprende una secuencia
génica que codifica una tRNA sintetasa patógena de origen natural no
discriminante; b) la transformación de células mamíferas aisladas
con el vector de expresión; c) el crecimiento de las células
recombinantes que resultan de (b) en un medio nutritivo en
condiciones que permitan la expresión de la tRNA sintetasa
patógena, resultando la expresión de la tRNA sintetasa patógena en
muerte celular o disminución de la tasa de división celular; d)
proporcionar una sustancia a ensayar; y e) el análisis del
crecimiento celular resultante, en el que si hay un aumento de
crecimiento celular, entonces la sustancia inhibe selectivamente la
actividad de la tRNA sintetasa patógena y no afecta a su ortólogo
celular, resultando que dicha sustancia es un candidato a
fármaco.
Preferiblemente, las células mamíferas aisladas
son células humanas aisladas.
El método de exploración de la presente
invención se basa en la estrategia de si una ARS no específica es
tóxica para las células y esa toxicidad puede conseguirse sin la
manipulación del sitio activo, entonces debería ser posible obtener
por ingeniería genética la ARS de un patógeno humano para cargar
erróneamente ARNt humanas, de este modo matando o afectando a la
tasa de crecimiento de las células de mamífero que resultó que
expresaron esta proteína. Si la molécula candidato a fármaco
resulta ser un compuesto que se une al sitio activo de la enzima
entonces serían igualmente activas en la ARS de tipo silvestre del
patógeno de interés, porque la cavidad catalítica de la ARS tóxica
no se ha manipulado en este proceso.
Ventajosamente, las molécula identificadas como
candidatos a fármaco tras el método de exploración de la presente
invención se caracterizan como moléculas pequeñas seleccionadas
debido a su capacidad para revertir el efecto tóxico de las ARS no
específicas, pero también como capaces de, simultáneamente, cruzar
la membrana celular, inhibir la sintetasa patógena, no inhibir sus
ortólogos humanos y no afectar otros aspectos del metabolismo
celular. Por lo tanto, dichos candidatos a fármaco matan
específicamente el patógeno y no son tóxicas para la célula
hospedadora.
A no ser que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en la presente memoria
tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la
materia a la que pertenece esta invención. Los métodos y materiales
similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria
pueden usarse en la práctica de la presente invención. A lo largo
de la descripción y de las reivindicaciones la palabra
"comprender" y variaciones de la palabra, tales como
"comprendiendo" o "que comprende", no se pretende que
excluyan otras características técnicas, aditivos, componentes o
etapas. Se pondrán de manifiesto objetos, ventajas y características
adicionales de la invención para los expertos en la materia tras la
examinación de la descripción o pueden aprenderse mediante la
práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se
proporcionan como ilustración y no se pretende que sean limitantes
de la presente invención.
La Figura 1 representa la expresión de H.
pylori GFPGRS2 en células HeLa. Lisados celulares completos de
simulación o transfectados transitoriamente con H. pylori
GFPGRS2 se sometieron a SDS/PAGE en condiciones reductoras. Se
detectó GFPGRS2 mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo
policlonal anti-GFP.
La Figura 2 muestra que la expresión de H.
pylori GFPGRS2 conduce a un aumento en la muerte celular. GFP
(en gris) o H. pylori GFPGRS2 (en negro) se transfectaron
transitoriamente a células HeLa y 16 horas después se añadió medio
fresco. La muerte celular se examinó mediante PI tiñendo uno, dos o
tres días después de haber añadido el medio fresco. La relación del
porcentaje de células transfectadas muertas (abreviadas como
"ctm") frente al porcentaje de células no transfectadas muertas
(abreviadas como "cntm") se presenten en el eje y. Las muestras
triplicadas se contaron para cada condición y la desviación estándar
se muestra.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"tRNA sintetasa no discriminante" (abreviado como "tRNA
sintetasa ND") se refiere a una aminoacil tRNA sintetasa cuya
función biológica es la aminoacilación de más de un tipo de ARNt
con el mismo aminoácido. Por ejemplo, la mayoría de las bacterias
contienen una enzima GluRS que es capaz de aminoacilar ARNt^{Gln}
con glutamato en lugar de con glutamina, su aminoácido afín. Esta
reacción no es tóxica para las células que albergan esta enzima
debido a que la forma transitoria de ARNt^{Gln} aminoacilado con
glutamato se modifica rápidamente y el aminoácido glutamato se
transforma en glutamina. Como se usa en la presente invención, las
expresiones "no específico" o "no canónico" tienen el
mismo significado que la expresión "no discriminante".
La expresión "patógeno de origen natural"
debe entenderse como que la tRNA sintetasa no discriminante de
acuerdo con la presente invención se obtiene de organismos que son
patógenos para mamíferos y que no se han obtenido por ingeniería
genética.
En una realización del primer aspecto de la
invención el vector de expresión obtenido en el paso (a) también
comprende una secuencia génica que codifica un sustrato de ARNt de
la tRNA sintetasa no discriminante del patógeno de origen
natural.
En otra realización del primer aspecto de la
invención las células mamíferas se transforman en el paso (b) usando
un segundo vector de expresión que comprende una secuencia génica
que codifica para un sustrato de ARNt de la tRNA sintetasa no
discriminante del patógeno de origen natural.
Los inventores de la presente invención han
descubierto que la expresión simultánea de los genes que codifican
la tRNA sintetasa no discriminante patógena y su sustrato de ARNt
puede aumentar la capacidad de dicha tRNA sintetasa no
discriminante para inducir toxicidad en las células que expresan
ambos genes.
Las secuencias génicas que codifican un sustrato
de ARNt de tRNA sintetasas no discriminantes patógenas de origen
natural están disponibles de las bases de datos públicas (por
ejemplo, las secuencias genómicas completas de Helicobacter
pylori de tres aislados diferentes pueden encontrarse en las
referencias de Genebank NC_000915.1, NC_008086.1 y NC_000921.1).
En una realización de la presente invención, la
tRNA sintetasa no discriminante de patógeno de origen natural se
selecciona del grupo que consiste en Glu-tRNA
sintetasa y Asp-tRNA sintetasa.
Entre las aminoacil-tRNA
sintetasas, la glutamil y glutaminil-tRNA sintetasas
(GluRS y GlnRS, respectivamente) y la aspartil y asparaginil tRNA
sintetasa (AspRS y AsnRS respectivamente) están relacionadas
respectivamente en secuencia y evolutivamente (consúltese, Brown,
J. R. et al., "Gene descent, duplication, and horizontal
transfer in the evolution of glutamyl- and
glutaminyl-tRNA synthetases", J. Mol. Evol. 1998,
vol. 49, p. 485-495; Hong, K. W., et al.,
"Retracing the evolution of amino acid specificity in
glutaminyl-tRNA synthetase", FEBS Lett. 1999,.
vol. 434, p.149-154).
En eucariotas y algunas bacterias, GlnRS y GluRS
(GluRS-D) catalizan cada una una reacción de
aminoacilación de ARNt altamente específica. GluRS-D
no acila erróneamente ARNt^{Gln} con Glu y GlnRS no acila
erróneamente ARNt^{Glu} con Gln.
Por el contrario, las arqueobacterias y la
mayoría de las bacterias no codifican una GlnRS funcional y
Gln-ARNt^{Gln} se biosintetiza indirectamente
(consúltese, Wilcox, M. & Nirenberg, "Transfer RNA as a
cofactor coupling amino acid synthesis with that of protein",
1968, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 61, p.
229-236.).
Primero, ARNt^{Gln} se acila erróneamente
mediante una GluRS no discriminante (GluRS-ND), para
formar Glu-ARNt^{Gln} (Ecuación 1).
[GluRS-ND aún cataliza su reacción afín, para
generar Glu-ARNt^{Glu}]. A continuación, el
intermedio de Glu-ARNt^{Gln} acilado erróneamente
se modifica transamidativamente mediante la
Glu-tRNA^{Gln} amidotransferasa dependiente de
glutamina (Glu-Adt) (Ecuación 2):
- Glu + ARNt^{Gln} + ATP + GluRS-ND \rightarrow Glu-ARNt^{Gln} + AMP + PPi
- (Ec. 1)
- Glu + Glu-ARNt^{Gln} + ATP + Glu-Adt \rightarrow Gln-ARNt^{Gln} + Glu + ADP
- (Ec. 2)
\vskip1.000000\baselineskip
Existe una situación análoga para la AspRS y
AsnRS:
- Asp + ARNt^{Asn} + ATP + AspRS-ND \rightarrow Asp-ARNt^{Asn} + AMP + PPi
- (Ec. 3)
- Asn + Asp-ARNt^{Asn} + ATP + Asp-Adt \rightarrow Asn-ARNt^{Asn} + Asp + ADP
- (Ec. 4)
\vskip1.000000\baselineskip
De esta manera, la fidelidad del código genético
se mantiene de forma precisa, a pesar de la ausencia de una GlnRS o
AsnRS afines.
Sin embargo, la introducción de una GluRSND a
una célula que no es capaz de catalizar esta etapa de modificación
es tóxica para la célula, porque da como resultado la acumulación de
ARNt^{Gln} aminoacilado con glutamato, causando eventualmente una
mutagénesis masiva en las proteínas que está sintetizando el
organismo. Este efecto se ha demostrado mediante la expresión de
una GluRSND en Escherichia coli, un organismo que no tiene la
capacidad de transformar el glutamato de ARNt^{Gln} en
glutamina.
En la presente invención "un vector de
expresión" se refiere a una molécula vehículo en la que se
inserta un segmento de ADN deseado (por ejemplo ácido nucleico
heterólogo). El vector sirve para incorporar ADN ajeno en células
hospedadoras. Más particularmente, un "vector de expresión" es
un vector de ADN que contiene una secuencia de ADN que está unida
operativamente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar
la expresión del ADN en un hospedador adecuado. Dichas secuencias
de control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una
secuencia operadora opcional para controlar dicha transcripción, una
secuencia que codifica los sitios de unión a ribosoma de ARNm
adecuados y secuencias que controlan la terminación de transcripción
y traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de
fago o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez
transformado en un hospedador adecuado, el vector puede replicarse y
funcionar independientemente del genoma hospedador, o pueden en
algunas ocasiones, integrarse en el genoma mismo, generando líneas
celulares estables que expresan dicho gen constitutivamente o
después del tratamiento de las células con un inductor de expresión
del gen. Los términos "plásmido" y "vector" se utilizan a
veces de forma intercambiable en la presente memoria, debido a que
el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector en la
actualidad. Sin embargo, se pretende que la invención incluya tales
otras formas de vector que sirven una función equivalente y se
conocen o llegarán a conocerse en
la técnica.
la técnica.
Los vectores de expresión típicamente contienen
además otras secuencias de ácido nucleico funcionalmente
importantes, tales como casetes de expresión que codifican proteínas
de resistencia a antibióticos, múltiples sitios de clonación,
secuencias de aplicación y similares.
En una realización de la presente invención, el
vector de expresión se selecciona del grupo que consiste en un
plásmido viral o no viral, cósmido, fagémido, vector lanzadera, yac
y similares. Preferiblemente el vector de expresión es un
adenovirus.
En otra realización de la presente invención, el
vector comprende además un sistema de regulación dependiente de
tetraciclina para la expresión del gen.
En otra realización más de la invención el
vector comprende un marcador de selección. Preferiblemente el
marcador de selección es higromicina.
En otra realización más, el patógeno se
selecciona del grupo que consiste en organismos que utilizan ARS no
específicas para la traducción de su código genético como, por
ejemplo, Streptococcus pneumoniae.
Como se usa en la presente memoria, los términos
"transformación" y "transfección" se refieren a cualquiera
de la diversidad de técnicas reconocidas en la materia para
introducir ácido nucleico ajeno (por ejemplo ADN) en una célula
hospedadora procariota o eucariota (incluyendo células humanas
aisladas). Los medios adecuados para la introducción (transducción)
de vectores de expresión que contienen ácido nucleico en células
hospedadoras para producir células recombinantes transducidas o
para generar líneas celulares estables que contienen el gen
integrado en el ADN nuclear de las células se conocen bien en la
técnica. Los métodos adecuados para transformar o transfectar
células hospedadoras pueden encontrarse en Molecular Cloning: A
Laboratory Manual,3ª edición, editado por J. Sambrook y D. W.
Russell (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 2000), y otros manuales de
laboratorio.
laboratorio.
Los métodos para el crecimiento y preservación
de cepas bacterianas se describen en Molecular Cloning: A Laboratory
Manual,3ª edición, editado por J. Sambrook y D. W. Russell (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 2000).
El control de la expresión de genes en células
humanas y la represión de la existencia de expresión basal pueden
ser problemáticos como conoce bien el experto en la materia
(consúltese, Rai et al., "Expression systems for
production of heterologous proteins", Current Science, 2001, vol.
80, pp. 1121-11). Los inventores se han aprovechado
de dos progresos recientes en el campo de la expresión proteínica de
células humanas para vectorizar nuestras cepas de ensayo. Primero,
se ha usado un vector de expresión génica basado en adenovirus
basado en los sistemas de expresión génica regulados por
Tet-ON- regulado por tretraciclina y regulados por
el antagonista de progesterona RU 486. Este vector puede actuar en
una variedad de tipos celulares y se demostró que la regulación de
la expresión de proteínas estaba estrechamente controlada
(consúltese, Edholm, D. et al., "Adenovirus vector designed
for expression of toxic proteins", J. Virology, 2001, vol. 75,
pp. 9579-9584).
Como alternativa, el vector de sepas de ensayo
podría basarse en el sistema de recombinación Cre/IoxP para la
activación de transcritos génicos. Cre es una proteína recombinasa
de 38kDA del bacteriófago P1 que media la recombinación de sitio
específico intramolecular (de escisión o inversión) e intermolecular
(integradora) entre sitios IoxP. La capacidad de escisión de ADN de
la Cre puede usarse para activar un gen ajeno mediante el corte de
una secuencia de parada intermedia entre el promotor y la región
codificante del gen. Así pues, los genes que codifican las
sintetasas tóxicas podrían introducirse en células humanas en un
vector cuyo sitio de iniciación de transcripción está bloqueado por
una señal de parada. La recombinación, es decir la escisión de la
señal de parada sucede solamente cuando la expresión de Cre se
activa (consúltese, Sauer, B et al., "Cre/Iox: one more
step in the taming of the genome", Endocrine, 2002, Vol. 19, pp.
21-228).
Una vez que las cepas de ensayo se desarrollan
los inventores han diseñado un ensayo sencillo de control de
crecimiento en placas de 96 pocillos usando un lector de placas
automático. Ya han logrado implementar un procedimiento similar
para el análisis del efecto enzimático tóxico en E. coli. Una
vez que este ensayo esté operativo se comienza la exploración de
bibliotecas de moléculas pequeñas para buscar nuevos inhibidores
potenciales de sintetasas
diana.
diana.
La expresión "sustancia de ensayo" y el
término "sustancia" se usan de forma intercambiable y se
refieren a un compuesto, una mezcla de compuestos (es decir, al
menos dos compuestos), o una muestra de producto natural que
contiene uno o más compuestos. Así pues, el análisis del crecimiento
celular de una sustancia de ensayo puede abarcar la actividad
inhibidora de más de un inhibidor de crecimiento, de modo que las
combinaciones de inhibidores selectivos y no selectivos del
producto génico diana tienen un observable en relación con el
crecimiento de células eucariotas que contienen la ARS tóxica no
discriminante.
En lugar de ensayar el efecto de las moléculas
pequeñas en tejidos o individuos completos, su ensayo en cultivos
celulares humanos proporcionaría a la exploración la mayor potencia
discriminatoria posible, debido a que la selección basada en
crecimiento celular identifica compuestos o combinaciones de
compuestos multifactorialmente. Las selecciones iniciales
identifican inhibidores capaces de bloquear la actividad de la
sintetasa y de atravesar las membranas celulares, mientras que la
segunda exploración refina más la búsqueda de moléculas que no
afectan al metabolismo de células humanas.
Las células humanas que expresan las
aminoacil-tRNA sintetasas no discriminantes se usan
para el descubrimiento de inhibidores de estas enzimas. Las células
que contienen los genes que codifican las
aminoacil-tRNA sintetasas no discriminantes
sintetizan estas proteínas cuando se induce la expresión de los
mismos genes y esto causa muerte celular debido a la reacción
bioquímica catalizada por las aminoacil-tRNA
sintetasas no discriminantes.
La muerte celular causada por las
aminoacil-tRNA sintetasas no discriminantes pueden
controlarse mediante una diversidad de procedimientos comerciales o
convencionales (captación del rojo neutro, WST1, niveles de LDH,
niveles de ATP y otros), usando espectrofotómetros o cualquier otro
dispositivo diseñado con el propósito de controlar la muerte
celular.
Los compuestos a ensayar con respecto a su
capacidad para eliminar el efecto tóxico causado por las
aminoacil-tRNA sintetasas no discriminantes se
añaden a las células antes, durante o después de la inducción de la
expresión de los genes que codifican las
aminoacil-tRNA sintetasas no discriminantes. Después
de la inducción de los genes, la muerte de las células en cada
cultivo celular se controla en presencia o ausencia de cada uno de
los compuestos que se están ensayando.
Los compuestos que causan una reducción en la
tasa de muerte celular del cultivo con respecto a la tasa de muerte
celular del mismo cultivo en ausencia del compuesto se consideran
potenciales inhibidores de las aminoacil-tRNA
sintetasas no discriminantes que causan muerte celular.
Así pues, en una realización de la presente
invención la tRNA sintetasa no discriminante patógena de origen
natural viene de una bacteria y la sustancia se ensaya para
determinar si es un agente antibacteriano que actúa mediante la
inhibición selectiva de la función de la tRNA sintetasa no
discriminante de origen bacteriano expresada en la célula humana
recombinante.
En otra realización de la presente invención la
tRNA sintetasa no discriminante patógena de origen natural viene de
un hongo y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente
antifúngico que actúa mediante la inhibición selectiva de la función
de la tRNA sintetasa no discriminante de origen bacteriano expresada
en la célula humana recombinante.
En otra realización de la presente invención la
tRNA sintetasa no discriminante patógena de origen natural viene de
un protozoo y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente
antiparasitario que actúa mediante la inhibición selectiva de la
función de la tRNA sintetasa no discriminante de origen protozoario
expresada en la célula humana recombinante.
En otra realización más de la presente invención
la tRNA sintetasa no discriminante de patógeno de origen natural
viene de un metazoo y la sustancia se ensaya para determinar si es
un agente inhibidor que actúa mediante la inhibición selectiva de la
función de la tRNA sintetasa no discriminante de origen metazoario
expresada en la célula humana recombinante.
\newpage
Ejemplo
La bacteria patógena Helicobacter pylori
utiliza dos glutamil-tRNA sintetasas esenciales
(GluRS1 y GluRS2). GluRS1 es una GluRS discriminante canónica y
GluRS2 es no canónica puesto que sólo es esencial para la producción
de Glu-ARNt^{Gln} acilado erróneamente.
Para investigar si la expresión de GRS2 de H.
pylori no canónica tiene un efecto tóxico en un sistema de
mamífero y conduce a muerte celular, se expresó GFPGRS2 de H.
pylori en células HeLa, una línea celular humana y se examinó su
efecto tóxico putativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores plasmídicos GRS2 Nº 1 (SEC ID Nº:
1) 5'-GTCACCACCATGCTTCGTTTTGCGCCTTCGCCTA
CAG y GRS2 Nº 2 (SEC ID Nº: 2) 5'-GACTCAATGGTGATGGTGATGATGTGCTTTGAGCCTTAAAACTT se usaron para amplificar GRS2 del ADN genómico de Helicobacter pylori (ATCC 700392D) y para añadir una secuencia lateral consenso de unión a ribosoma kozak y un epítopo marcado con His en su extremo C terminal. La proteína verde fluorescente (en lo sucesivo en la presente memoria denominada "GFP") se fusionó con el extremo NH_{2} de GRS2 para facilitar su detección mediante citometría de flujo e inmunotransferencia, usando técnicas de PCR de solapamiento convencionales.
CAG y GRS2 Nº 2 (SEC ID Nº: 2) 5'-GACTCAATGGTGATGGTGATGATGTGCTTTGAGCCTTAAAACTT se usaron para amplificar GRS2 del ADN genómico de Helicobacter pylori (ATCC 700392D) y para añadir una secuencia lateral consenso de unión a ribosoma kozak y un epítopo marcado con His en su extremo C terminal. La proteína verde fluorescente (en lo sucesivo en la presente memoria denominada "GFP") se fusionó con el extremo NH_{2} de GRS2 para facilitar su detección mediante citometría de flujo e inmunotransferencia, usando técnicas de PCR de solapamiento convencionales.
Se amplificó la GFP usando
GFP-GRS2 Nº 1 (SEC ID Nº: 3)
5-ATCTCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
y GFP-GRS2 Nº 2
(SEC ID Nº:
4)
y se unió a GRS2 usando
GFP-GRS2 Nº 3 (SEC ID Nº:
5)
y GFP-GRS2 Nº 4
(SEC ID Nº: 6)
5'-GATATTCAATGGTGATGGTGATGATGTGCTTTGAGCCTTAAAACTT.
\vskip1.000000\baselineskip
Los dos segmentos se mezclaron posteriormente
con los cebadores GFP-GRS2 Nº 1 y
GFP-GRS2 Nº 4 y se realizó una PCR de solapamiento
secundario. El producto amplificado se clonó en
PCR2.1-TOPO/TA (Invitrogen).
GFPGRS2/PCR2.1-TOPO/TA se digirió con NotI y se
insertó en un vector de expresión mamífero cortado de manera
similar, pCMV (BD Biosciences Clontech).
GFPGRS2/PCR2.1-TOPO/TA se
digirió con XbaI y SpeI y se insertó en un vector de expresión pTRE2
inducido por tetraciclina de mamífero cortado con XbaI (BD
Biosciences Clontech). Se usó pTRE2 para expresar GRS2 en una línea
celular HeLa Tet-On.
pTRE2 es un plásmido de respuesta que contiene
un promotor P_{hCMV-1} sensible a tetraciclina
(obtenido comercialmente). Este promotor contiene el Elemento de
Respuesta Tet (TRE), que consiste en siete copias de la secuencia
operadora tet de 42 pares de bases (tetO). El TRE está justo
aguas arriba del promotor mínimo CMV que carece del potenciador que
es parte del promotor CMV completo.
Para transfectantes Tet-On de
HeLa doblemente estables, se digirieron resistencia a higromicina
con PvuII y XmnI (que generan extremos romos) del vector
pcDNA3.1/higromicina (Invitrogen) y se subclonó en GFPGRS2/pTRE2 con
extremos romos digerido por ZraI.
La integridad y autenticidad de todos los
vectores se confirmó mediante la determinación de su secuencia
nucleotídica con técnicas de secuenciación convencionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células HeLa Tet-On son
células derivadas de carcinoma cervical humano que expresan el
transactivador controlado por tetraciclina reverso (rtTA) y se
obtuvieron de BD Biosciences Clontech.
Las células HeLa y las Tet-On
HeLa se cultivaron en medio DMEM suplementado con 100 U/ml de
penicilina, estreptomicina 100 \mug/ml y suero bovino fetal
inactivado por calor al 10% (de Gibco) en CO_{2} al 5%/aire al 95%
en un incubador humidificado. Las células Tet-On
HeLa se mantuvieron en presencia de G418 100 \mug/ml.
Las células se mantuvieron en la fase
exponencial de crecimiento. Las células adherentes se desprendieron
mediante la incubación con una solución de
tripsina-EDTA durante 5 minutos a 37ºC antes del
lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
Para las transfecciones transitorias, se
añadieron 20 \mug de cada ADN a 500 \mul de agua que contenía
CaCl_{2} 252 mM. Después se añadieron 500 \mul de tampón de
solución salina tamponada con Hepes 2x (NaCl 280 mM, KCl 10 mM,
Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM, HEPES 50 mM, dextrosa 12 mM, pH 7,1) a la
mezcla de ADN gota a gota. 16 horas después de la adición de esta
mezcla de transfección a las células, el medio que contenía ADN se
eliminó y se añadió nuevo medio. Después de 24 horas se usaron las
células transfectadas para la experimentación.
Para los transfectantes doblemente estables, las
células HeLa Tet-On se transfectaron con 20 \mug
de ADN. 48 horas después de la transfección, se separaron las
células en placas de 24 pocillos y se añadió 500 \mug/ml de
higromicina para la selección. Aproximadamente, 15 días después, se
seleccionaron clones individuales de las células y se pusieron en
placas de 96 pocillos para su expansión. Los clones se seleccionaron
mediante la comprobación de su GFP de expresión mediante citometría
de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cargaron extractos de proteínas completas en
tampón de muestra azul de Laemmli y se separaron mediante
SDS-PAGE en geles al 10%. Los geles se transfirieron
a membranas PVDF y se bloquearon con TBS-T (Tris 0,5
M, NaCl 1,5 M), Tween-20 al 0,1% (v/v), pH 7,4) que
contenía leche al 10% (p/v) durante al menos 1 hora. Las
transferencias posteriores se incubaron con anticuerpo policlonal de
conejo antiproteína verde fluorescente (Immunokontact) a 1:5000 en
solución de bloqueo BSA/TBS-T al 10%. Las
transferencias se lavaron dos veces inmediatamente después de la
incubación con anticuerpo primario y después otras dos veces a
intervalos de 15 minutos. Finalmente las transferencias se
incubaron con anticuerpo secundario (anticuerpo completo unido a
peroxidasa de rábano rusticano anti-IgG de conejo,
suministrado por Amersham) a 1:10000 en TBS-T
durante 1 hora antes de lavar como antes y su desarrollo usando un
sistema de detección de quimioluminiscencia potenciada (ECL)
(Amersham).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó yoduro de propidio (PI) a 10 \mug/ml
para la determinación de viabilidad celular en células HeLa
transfectadas transitoriamente con proteínas de fusión GFP. Las
células marcadas con PI se analizaron inmediatamente usando un
Coulter Epics XL (Beckman Coulter) y se analizaron usando software
System II.
A partir de los resultados obtenidos usando
estas técnicas se concluyó que las células HeLa (de carcinoma
cervical humano) se transfectaron de forma transitoria con plásmido
vacío (simulación) o plásmido que codificaba
GFP-GRS2/pCMV.
La expresión de proteínas de fusión de GFP se
detectó mediante inmunotransferencia usando anticuerpo policlonal
anti-GFP, como se muestra en la Figura 1. Se detectó
una banda de aproximadamente 78 kDa en lisados celulares completos
de células HeLa GFP-GRS2.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de evaluar si la GSR2 no
discriminante de H. pylori de expresión tiene un efecto
tóxico en un sistema mamífero y conduce a muerte celular, se
expresó GFPGRS2 de H. pylori en células HeLa, una línea
celular humana y se examinó su efecto tóxico putativo.
Como se muestra en la Figura 2, la expresión de
GFPGRS2 de H. pylori en células HeLa condujo a un aumento de
la muerte celular, medida mediante tinción con PI.
\newpage
La expresión de GFPGRS2 H. pylori tuvo un
efecto deletéreo en la supervivencia celular comparada con la
expresión de GFP en células HeLa y este efecto continuó hasta 3 días
después de la transfección.
Estos resultados demuestran que la expresión de
GFPGRS2 de H. pylori en un sistema mamífero lleva a un
aumento en la muerte celular.
Este incremento en la sensibilidad de la muerte
celular puede deberse a un aumento de la incorporación de ácido
glutámico en lugar de glutamina que podría causar un aumento en el
nivel de proteínas plegadas erróneamente en células HeLa que
expresan GFPGRS2 de H. pylori llevando a un aumento en la
muerte celular.
Puesto que la expresión constitutiva de GFPGRS2
de H. pylori en células HeLa conduce a un aumento en la
muerte celular, los inventores han expresado de forma estable
GFPGRS2 de H. pylori en células Tet-On HeLa,
un sistema sensible a tetraciclina.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de determinar si una sustancia es un
fármaco candidato, esta debe permitir o mejorar el crecimiento de
células humanas en presencia de NDGlu tRNA sintetasa (es decir, este
compuesto debe tener una actividad inhibidora frente a dicha ARS no
discriminante).
Se lleva a cabo una reacción bioquímica en la
que la NDGlu tRNA sintetasa cataliza la incorporación del aminoácido
correspondiente al ARNt afín. Esta incorporación se controla usando
un aminoácido marcado radiactivamente y se mide la adición del
marcador radiactivo a la molécula de ARNt. Se cataliza una reacción
similar mediante las enzimas humanas homólogas a la ARS cuya
inhibición se busca.
Después, la sustancia candidata a fármaco se
añade a la mezcla de reacción. La capacidad de la sustancia para
discriminar selectivamente entre la ARS no discriminante y su
homólogo humano se estima mediante la medición de la capacidad de
la molécula para inhibir la incorporación del aminoácido radiactivo
a su ARNt^{Glu} afín y la comparación de esta actividad con la
capacidad del mismo compuesto para inhibir la actividad de enzimas
humanas similares en sus ARNt afines respectivos. Una molécula es
específica cuando puede inhibir la enzima del patógeno, pero no las
enzimas similares humanas.
Por consiguiente, la molécula se ensaya con
respecto a su capacidad para inhibir el crecimiento del organismo
que contiene originalmente la ARS no discriminante. La molécula que
presenta inhibición selectiva de la ARS no discriminante y la
capacidad para retrasar o detener el crecimiento del organismo que
contiene de manera natural la ARS no discriminante se considera un
candidato potencial a fármaco útil para inhibir el crecimiento de
este organismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido
gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden
excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a
este respecto.
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- \bullet EP 1300468 A [0008]
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> INSTITUCIÓ CATALANA DE RECERCA I
ESTUDIS AVANÇATS FUNDACIÓ PRIVADA PARC CIENTIFIC DE BARCELONA
FUNDACIÓ PRIVADA INSTITUT DE RECERCA BIOMÉDICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de cribaje para la
identificación de nuevos fármacos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P669EP00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP06116233
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
28-06-2006
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia para unir la proteína
verde fluorescente amplificada a la Glutamil t-RNA
sintetasa no canónica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia para unir la proteína
verde fluorescente amplificada a la Glutamil t-RNA
sintetasa no canónica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
Claims (14)
1. Método de cribaje para la identificación de
un candidato a fármaco que es un inhibidor de
aminoacil-tRNA sintetasa patógena en el que dicho
método comprende las siguientes etapas:
a) obtener un vector d expresión que comprende
una secuencia de un gen que codifica una tRNA sintetasa no
discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza;
b) transformar células aisladas de un mamífero
con el vector de expresión;
c) crecimiento de las células recombinantes
resultantes de (b) en un medio con nutrientes en condiciones que
permiten la expresión de la tRNA sintetasa patógena, lo que resulta
en muerte celular;
d) proporcionar una sustancia a ensayar; y
e) analizar el crecimiento celular resultante,
en donde si hay un aumento de crecimiento celular con respecto al
crecimiento celular del mismo cultivo en ausencia de las sustancia a
ensayar, entonces la sustancia inhibe selectivamente la actividad de
la tRNA sintetasa patógena y no afecta a su ortólogo celular, lo que
indica que dicha sustancia es un candidato a fármaco.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
donde el vector de expresión obtenido en la etapa (a) también
comprende una secuencia de un gen que codifica un sustrato de tRNA
de la tRNA sintetasa no discriminante patógena que se encuentra en
la naturaleza.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
donde las células de mamífero se transforman en la etapa (b) usando
un segundo vector de expresión que comprende una secuencia de un gen
que codifica un sustrato de tRNA de la tRNA sintetasa no
discriminante patógena de que se encuentra en la naturaleza.
4. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la t-RNA
sintetasa no discriminante patógena que se encuentra en la
naturaleza se selecciona del grupo consistente en
Glu-tRNA sintetasa y Asp-tRNA
sintetasa.
5. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde el vector de expresión se
selecciona del grupo consistente en un plásmido viral o no viral,
cósmido, fagémido, vector lanzadera y yac.
6. Método de acuerdo con la reivindicación 5 en
donde el vector de expresión es un vector de adenovirus.
7. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 5-6, en donde el vector comprende
un sistema de regulación dependiente de tetraciclina para la
expresión del gen.
8. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 5-7, en donde el vector comprende
un marcador de selección.
9. Método de acuerdo con la reivindicación 8, en
donde el marcador de selección es higromicina.
10. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el cual la tRNA sintetasa no
discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza procede de
una bacteria y la sustancia se ensaya para determinar si es un
agente antibacteriano que actúa inhibiendo selectivamente la función
de la tRNA sintetasa no discriminante de origen bacteriano expresada
en la célula de mamífero recombinante.
11. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en donde la tRNA sintetasa no
discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza procede de
un hongo y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente
antifúngico que actúa inhibiendo selectivamente la función de la
tRNA sintetasa no discriminante de origen fúngico expresada en la
célula de mamífero recombinante.
12. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en donde la tRNA sintetasa no
discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza procede de
un protozoo y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente
antiparasitario que actúa inhibiendo selectivamente la función de la
tRNA sintetasa no discriminante de origen protozoario expresada en
la célula de mamífero recombinante.
13. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en donde la tRNA sintetasa no
discriminante patógena que se encuentra en la naturaleza procede de
un metazoo y la sustancia se ensaya para determinar si es un agente
inhibidor que actúa inhibiendo selectivamente la función de la tRNA
sintetasa no discriminante de origen metazoario expresada en la
célula de mamífero recombinante.
14. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la célula de mamífero
recombinante es una célula humana recombinante.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| EP06116233 | 2006-06-28 | ||
| EP06116233 | 2006-06-28 |
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|---|---|
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Family
ID=37075051
Family Applications (1)
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