ES2344028T3 - Metodo de cribaje para la identificacion de nuevos inhibidores de la aminoacil t-rna sintetasa. - Google Patents
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Abstract
Método de cribaje para identificar un candidato a fármaco en el que dicho método comprende los siguientes pasos: a) obtener una secuencia génica que codifica una aminoacil-tRNA sintetasa de origen natural; b) modificar por ingeniería genética el gen que codifica dicha aminoacil-tRNA sintetasa, dando como resultado una aminoacil-tRNA sintetasa con una actividad defectuosa, a condición de que la modificación por ingeniería genética no afecte a la funcionalidad del sitio catalítico de la enzima; c) clonar el gen resultante del paso (b) en un vector de expresión; d) transformar células de mamífero aisladas con el vector de expresión resultante del paso (c); e) cultivar las células recombinantes resultantes del paso (d) en un medio nutriente bajo condiciones que permitan la expresión de la aminoacil-tRNA sintetasa modificada por ingeniería genética, dando como resultado muerte celular o una disminución en la tasa de división celular; f) proporcionar al medio del paso (e) una sustancia a ensayar; y g) analizar el crecimiento celular resultante, en el que si hay un aumento del crecimiento celular, entonces la sustancia inhibe selectivamente la actividad de la aminoacil-tRNA sintetasa modificada por ingeniería genética y no afecta a su ortólogo celular, dando como resultado que dicha sustancia sea un candidato a fármaco.
Description
Método de cribaje para la identificación de
nuevos inhibidores de la aminoacil-tRNA
sintetasa.
La presente invención se refiere a un nuevo
método de cribaje que permite la identificación de nuevos fármacos.
En particular, la presente invención se refiere a un método de
cribaje para la selección de sustancias inhibidoras de
aminoacil-tRNA sintetasa que pueden ser útiles como
agentes antibacterianos y antifúngicos, entre otros.
En los programas modernos de descubrimiento de
fármacos, se usan bibliotecas químicas en combinación con sistemas
robóticos para evaluar rápidamente el efecto de grandes números de
compuestos en una reacción determinada. Este enfoque tiene dos
desventajas principales. Primero, a menudo es necesario desarrollar
un ensayo bioquímico que pueda ser fácilmente monitorizado para
poder identificar compuestos candidatos. Este proceso es costoso y
falto de sensibilidad debido a los posibles efectos negativos de los
fármacos seleccionados. En segundo lugar, este enfoque ignora los
parámetros de biodisponibilidad y toxicidad. De hecho, la mayoría de
los compuestos inicialmente seleccionados se descartan más tarde
debido a los problemas de solubilidad, biodisponibilidad, o
toxicidad.
Las aminoacil-tRNA sintetasas
(llamadas en lo sucesivo en este documento "ARS") representan
dianas idóneas para el desarrollo de fármacos porque son enzimas
esenciales de distribución universal, cuya naturaleza ancestral
permite la selección de inhibidores específicos. Además son
solubles, estables, fáciles de expresar y purificar en grandes
cantidades, y son sencillas de ensayar por uno o varios métodos. Se
dispone de estructuras de rayos X para todas las sintetasas, y se
conoce mucho acerca del mecanismo de reacción de aminoacilación
(consúltese Weygand-Durasevic 1. et al.,
"Yeast seryl-tRNA synthetase expressed in
Escherichia coli recognizes bacterial
serine-specific tRNAs in vivo", Eur. J.
Biochem., 1993, vol. 214, pp. 869-877).
El código genético se establece en las
reacciones de aminoacilación por las ARS, donde cada aminoácido se
une a su ARNt afín que lleva el triplete anticodón del código. La
tasa de incorporación errónea de aminoácidos en proteínas es muy
baja (se estima en un error cada 10^{5} codones) y esta alta
precisión se debe en gran medida a la precisión de las reacciones
de aminoacilación. La reacción de aminoacilación tiene lugar dentro
de un solo dominio de sitio activo y habitualmente sucede en dos
pasos. Primero, el aminoácido se activa con ATP para formar
aminoacil-adenilato con liberación de pirofosfato. A
continuación, el aminoácido se transfiere al extremo 3' del ARNt
para generar aminoacil-ARNt y AMP. Esta reacción en
dos pasos establece el código genético uniendo tripletes de
nucleótidos específicos (anticodones de ARNt) con aminoácidos
específicos.
El reconocimiento de los ARNt por las ARS
depende principalmente de interacciones moleculares con el brazo
aceptor y el bucle del anticodón del ARNt (consúltese Rich, A.
"RNA structure and the roots of protein synthesis", Cold
Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 2001, vol. 66, pp.
1-16). El dominio de sitio activo de las enzimas se
une al brazo aceptor de la molécula de ARNt, donde se une el
aminoácido. La base "discriminante" (la base no emparejada que
precede a la secuencia CCA universal), y los tres primeros pares de
bases del brazo aceptor albergan la mayoría de los elementos
identificativos reconocidos por los sitios activos de la ARS. Las
enzimas usan otros dominios para reconocer la región del anticodón
u otras estructuras del ARNt. Estos dominios adicionales no se
conservan universalmente y pueden variar de una enzima a otra y de
una especie a otra.
Además del reconocimiento de ARNt, las ARS deben
diferenciar entre aminoácidos en la mezcla celular. En este
sentido, hay 20 ARS, reconociendo cada una un aminoácido específico.
Generalmente, los aminoácidos con cadenas laterales que son más
voluminosas que las de los aminoácidos afines se excluyen
estéricamente de los sitios activos de las ARS, pero los
aminoácidos más pequeños pueden encajar en la cavidad del sitio
activo y ser activados y cargados erróneamente. Estos adenilatos
activados erróneamente o ARNt cargados erróneamente se eliminan
normalmente por la función de edición de las ARS. Si no se eliminan,
se introduce ambigüedad en el código genético.
Entre los antibióticos comerciales dirigidos a
la traducción uno tiene como diana una ARS. El ácido pseudomónico
(mupirocina) es un inhibidor de isoleucil-tRNA
sintetasas (IleRS) de patógenos infecciosos
Gram-positivos. El ácido pseudomónico tiene una
selectividad de aproximadamente 8000 veces para IleRS de patógeno
frente a IleRS de mamífero, pero la falta de biodisponibilidad
sistémica del fármaco limita su uso a aplicaciones tópicas.
Aunque existen otros inhibidores de productos
naturales conocidos dirigidos contra sintetasas (por ejemplo,
borrelidina, furanomicina, granaticina, etc.), ninguno de éstos se
ha desarrollado a antibióticos comerciales debido a la falta de
actividad inhibidora, baja especificidad o baja biodisponibilidad.
Así pues, se requiere un método más eficiente para seleccionar
inhibidores de ARS para explorar grandes bibliotecas químicas e
identificar candidatos prometedores de fármacos.
El objetivo de la presente solicitud es
proporcionar un método de cribaje para la selección de inhibidores
de ARS.
Se proporciona un método de cribaje que supone
que el efecto deseado de una sustancia candidata potencial es el
rescate y/o la estimulación del crecimiento de células de mamíferos,
y no la inhibición de ninguna reacción determinada o la detención
del crecimiento del cultivo celular. Así pues, en la selección
positiva que se propone aquí, el crecimiento de células de
mamíferos se rescata por las sustancias capaces de inhibir la acción
tóxica de una ARS diana que se ha obtenido previamente por
ingeniería genética. Este efecto puede monitorizarse simplemente
midiendo la densidad del cultivo, un procedimiento rápido y
barato.
Así pues, un aspecto de la presente invención es
la provisión de un método de cribaje para identificar un candidato
a fármaco, comprendiendo dicho método los pasos de: a) obtener una
secuencia génica que codifica una aminoacil-tRNA
sintetasa de origen natural; b) obtener por ingeniería genética el
gen que codifica dicha aminoacil-tRNA sintetasa,
dando como resultado una aminoacil-tRNA sintetasa
con actividad defectuosa, a condición de que la obtención por
ingeniería genética no afecte a la funcionalidad del sitio
catalítico de la enzima; c) clonar el gen resultante del paso (b)
en un vector de expresión; d) transformar células de mamífero
aisladas con el vector de expresión resultante del paso (c); e)
dejar crecer las células recombinantes resultantes del paso (d) en
un medio nutriente bajo condiciones que permitan la expresión de la
aminoacil-tRNA sintetasa obtenida por ingeniería
genética, dando como resultado la expresión la muerte celular o una
disminución de la tasa de división celular; f) proporcionar una
sustancia para ensayar en el medio resultante del paso (e); y g)
analizar el crecimiento celular resultante, en el que si hay un
aumento del crecimiento celular, entonces la sustancia inhibe
selectivamente la actividad de la aminoacil-tRNA
sintetasa obtenida por inge-
niería genética y no afecta a su ortólogo celular, dando como resultado que dicha sustancia sea un candidato a fármaco.
niería genética y no afecta a su ortólogo celular, dando como resultado que dicha sustancia sea un candidato a fármaco.
De esta forma, usando técnicas de ingeniería
genética la enzima pierde la especificidad de unir únicamente al
aminoácido afín a su ARNt afín.
Así pues, cuando se produce el ARNt que porta
errores de aminoacilación, la proteína modificada se vuelve tóxica
para la célula hospedadora de mamífero, dando lugar esta toxicidad a
una reducción de la tasa de crecimiento de la división celular o a
muerte celular. Cuando se proporciona la sustancia para ensayar a
los medios de cultivo celular, puede interactuar con el sitio
catalítico de la ARS obtenida por ingeniería genética, inhibiendo
esta enzima (es decir, inhibiendo la producción de proteínas mutadas
que son tóxicas para la célula hospedadora). Por consiguiente, se
rescata el crecimiento celular puesto que no se producen más
proteínas tóxicas y se puede confirmar que la sustancia
administrada es un candidato a fármaco. Esto se debe al hecho de que
el sitio catalítico de la ARS obtenida por ingeniería genética no
se ha manipulado y, por tanto, la sustancia que se une al sitio
activo de la enzima obtenida por ingeniería genética también es
capaz de unirse a una de las ARS de tipo silvestre de origen
patógeno y, por lo tanto, se convierte en candidato a fármaco para
el tratamiento de una enfermedad causada por el patógeno.
La capacidad de la sustancia para distinguir
selectivamente entre la ARS con actividad defectuosa y la ARS
ortóloga de la célula de mamífero transfectada se puede estimar, por
ejemplo, midiendo la capacidad de la sustancia para inhibir la
incorporación de aminoácidos radiactivos a su ARNt afín, y
comparando esta actividad con la capacidad de la misma sustancia
para inhibir la actividad de las enzimas de mamífero
correspondientes en sus ARNt afines respectivos. Una sustancia es
específica cuando puede inhibir la enzima del patógeno, pero no la
enzima de mamífero correspondiente.
Por consiguiente, se ensaya la sustancia con
respecto a su capacidad para inhibir el crecimiento del organismo a
partir del cual se obtiene por ingeniería genética la ARS para así
obtener una ARS defectuosa. La sustancia que presenta inhibición
selectiva de la ARS defectuosa y la capacidad para retrasar o
detener el crecimiento del organismo que contiene de forma natural
la ARS original se considera un candidato potencial a fármaco útil
para inhibir el crecimiento de este organismo.
Ventajosamente, las sustancias identificadas
como candidatos a fármaco después del método de cribaje de la
presente invención se caracterizan por ser moléculas pequeñas
seleccionadas debido a su capacidad para revertir el efecto tóxico
de la ARS obtenida por ingeniería genética, pero también por ser
capaces de, simultáneamente, cruzar la membrana celular, inhibir la
sintetasa ajena, no inhibir su ortóloga humana, y no afectar a otros
aspectos del metabolismo celular. Por lo tanto, el método de
cribaje de la presente invención permite la identificación de un
candidato a fármaco que inhibe específicamente la ARS sintetasa
ajena y no es tóxico para la célula hospedadora, no siendo
necesarios ensayos adicionales de toxicidad.
A menos que se definan de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado que entienden normalmente los expertos
habituales en la técnica a la que pertenece la presente invención.
En la práctica de la presente invención pueden usarse métodos y
materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente
documento. En toda la descripción y las reivindicaciones no se
pretende que la palabra "comprender" y variantes de la palabra,
tales como "que comprende", excluyan otras características
técnicas, aditivos, componentes o pasos. Otros objetos, ventajas y
características adicionales de la invención serán evidentes para
los expertos en la materia al examinar la descripción o pueden
aprenderse con la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos
y dibujos se proporcionan a modo ilustrativo, y no se pretende que
sean limitantes de la presente invención.
La Fig. 1 muestra la detección por
inmunotransferencia de la isoleucil-tRNA sintetasa
(IleRS) de tipo silvestre de S. pneumoniae así como su
expresión, una vez obtenida por ingeniería genética, siendo una
isoleucil-tRNA sintetasa defectuosa en edición
(IleRSTA) en células HeLa. La línea de "Simulado" corresponde a
células que no albergan ninguno de los dos plásmidos usados.
La Fig. 2 muestra la toxicidad causada por
concentraciones crecientes de valina en células HeLa que expresan
la isoleucil-tRNA sintetasa de tipo silvestre
(\ding{115}) y la isoleucil-tRNA sintetasa
defectuosa en edición (\sqbullet). La muerte celular se midió
mediante tinción con yoduro de propidio. El eje y representa el
porcentaje de supervivencia celular (abreviado como "% S.C.")
y el eje x representa la concentración de valina (mM).
Como se usa en el presente documento, la
expresión "con una actividad defectuosa" en relación a la
aminoacil-tRNA sintetasa se refiere a la pérdida
parcial o total de la capacidad de la aminoacil-tRNA
sintetasa de unir el aminoácido específico a su ARNt afín, una vez
que se ha sometido a técnicas de ingeniería genética bien conocidas
para el experto en la materia, dando como resultado la
aminoacilación del ARNt con aminoácidos distintos a los aminoácidos
afines naturales de los ARNt. No hay restricciones respecto a la
técnica de ingeniería genética que se usa a condición de que el
sitio catalítico de la enzima (en el cual se lleva a cabo la unión
del aminoácido al ARNt) no esté mutado. Son ejemplos ilustrativos,
no limitantes: mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria seguida
de selección genética y técnicas de presentación en fagos, entre
otros.
La expresión simultánea de los genes que
codifican la tRNA sintetasa de origen natural obtenida por
ingeniería genética y su sustrato de ARNt puede aumentar la
capacidad de dicha tRNA sintetasa para inducir toxicidad en las
células que expresan ambos genes.
Así pues, en una realización del primer aspecto
de la invención, el vector de expresión obtenido en el paso (c)
también comprende una secuencia génica que codifica un sustrato de
ARNt de la tRNA sintetasa patógena no discriminante de origen
natural.
En otra realización del primer aspecto de la
invención, las células de mamífero se transforman en el paso (d)
usando un segundo vector de expresión que comprende una secuencia
génica que codifica un sustrato de ARNt de la tRNA sintetasa
patógena no discriminante de origen natural.
Las secuencias génicas que codifican un sustrato
de ARNt de la tRNA sintetasa patógena no discriminante de origen
natural están disponibles en bases de datos públicas (las secuencias
genómicas completas de Helicobacter pylori de tres aislados
distintos pueden encontrarse en las referencias de banco de genes
NC_000915.1, NC_008086.1, y NC_000921.1).
Las aminoacil-tRNA sintetasas de
origen natural, que son bien conocidas para el experto en la
materia, son las valil-, isoleucil-, cisteinil-, leucil-,
metionil-, tirosil-, triptofanil-, glutamil-, glutaminil-, arginil-,
alanil-, treonil-, seril-, prolil-, glicil-, histidil-, aspartil-,
lisil-, aparaginil-, y fenilalanil-tRNA sintetasas
y cualquiera de ellas puede modificarse por ingeniería genética para
volverse defectuosa en actividad (consúltese Giegé, R. et
al., "Universal rules and idiosyncratic features in tRNA
identity", Nucleic Acids Research, 1998, vol. 26, pp.
5017-5035).
En una realización de la presente invención, la
aminoacil-tRNA sintetasa que resulta del paso (b) es
defectuosa en el reconocimiento de su ARNt afín.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "aminoacil-tRNA sintetasa es defectuosa
en el reconocimiento del ARNt" o "ARS defectuosa en
reconocimiento" se refiere a una aminoacil-tRNA
sintetasa cuyos dominios de reconocimiento de ARNt se han
modificado de tal forma que la especificidad de reconocimiento se ha
reducido o alterado, sin afectar al dominio del sitio catalítico de
dicha aminoacil-tRNA sintetasa. Se ha logrado la
modificación de las especificidades de ARNt de varias ARS. Son
ejemplos ilustrativos no limitantes aquellas modificaciones basadas
principalmente en cambios en los dominios de unión a anticodón de
estas proteínas. Por ejemplo, el reconocimiento del anticodón por
IleRS y MetRS puede manipularse para forzar a la IleRS a reconocer
ARNt^{Met} y a la MetRS a hacer lo mismo con ARNt^{Ile}
(consúltese Muramatsu, T. et al., "Codon and
amino-acid specificities of a transfer RNA are both
converted by a single post-transcriptional
modification", Nature, 1988, vol. 336, pp.
179-181).
El reconocimiento de ARNt por ARS depende
principalmente de las interacciones moleculares con el brazo aceptor
y el bucle del anticodón del ARNt. La base "discriminante" (la
base no emparejada que precede a la secuencia CCA universal), y los
tres primeros pares de bases del brazo aceptor albergan la mayoría
de los elementos identificativos reconocidos por los sitios activos
de la ARS. Las enzimas usan otros dominios para reconocer la región
anticodón u otras estructuras del ARNt. Estos dominios adicionales
no se conservan universalmente, y pueden variar de una enzima a
otra y de una especie a otra. Cuando se obtiene por ingeniería
genética la ARS, dando como resultado una ARS defectuosa en
reconocimiento, y se introduce en una célula de mamífero, puede
observarse una toxicidad dentro de la célula. De esta forma, cuando
la ARS se obtiene por ingeniería genética hay una pérdida total o
parcial de la especificidad en el reconocimiento del ARNt afín, no
siendo posible unir el aminoácido específico a su ARNt afín, dando
como resultado la producción de ARNt aminoacilados con aminoácidos
incorrectos. La consecuencia principal es que puede haber una
mutagénesis masiva en las proteínas sintetizadas por la célula,
generando un efecto tóxico que da lugar a muerte celular o a una
reducción en el crecimiento de la división celular.
En otra realización de la presente invención, la
aminoacil-tRNA sintetasa de origen natural del paso
(a) tiene actividad de edición y la aminoacil-tRNA
sintetasa resultante del paso (b) es defectuosa en edición.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "aminoacil-tRNA sintetasa de edición"
o "aminoacil-tRNA sintetasa de origen natural con
actividad de edición" se refiere a las
aminoacil-tRNA sintetasas que contienen, junto con
el sitio de reconocimiento que cataliza la formación de
aminoacil-adenilato y la aminoacilación de ARNt
(que es común a todas las aminoacil-tRNA
sintetasas), un sitio de edición o corrección de errores que
hidroliza adenilatos activados erróneamente o ARNt cargados
erróneamente. La actividad de edición está en un dominio adicional
unido a los dominios centrales de la enzima (consúltese Lin L. et
al., "Aminoacylation error correction", Nature, 1996, vol.
384, pp. 33-34). Las actividades combinadas de estos
dos sitios conducen a una precisión rigurosa en la aminoacilación
de ARNt, evitando que los aminoácidos similares al aminoácido diana
se unan al ARNt. Las aminoacil-tRNA sintetasas con
actividad de edición son la isoleucil-, valil-, leucil-, metionil-,
alanil-, treonil-, prolil- y fenilalanil sintetasas y los expertos
en la materia las conocen bien.
Por ejemplo, la isoleucil-tRNA
sintetasa puede unirse a valina en lugar de su sustrato natural
isoleucina, porque estos dos aminoácidos difieren sólo en un único
grupo metilo. Para prevenir la formación de
valina-ARNt^{Ile}, la enzima reconoce este
producto erróneo o el intermedio de reacción erróneo a través de su
actividad de edición y los hidroliza, liberando la valina del ARNt.
Así pues, la isoleucil-tRNA sintetasa (abreviada
"IleRS") puede comenzar la reacción de aminoacilación
activando la valina (el sustrato erróneo) con ATP para formar un
valil-adenilato como paso intermedio para
aminoacilar el ARNt^{Ile}. La reacción puede continuar y la enzima
puede acilar erróneamente el ARNt^{Ile} para formar
Val-ARNt^{Ile} (Ecuación 1). Después, la valina
activada erróneamente en forma de valina-adenilato,
o la valina-ARNt^{Ile} erróneamente cargada, sería
hidrolizada por el sitio de edición de la enzima, evitando así su
posterior uso para producir una proteína que es tóxica para la
célula (Ecuación 2):
Como se usa en el presente documento, el término
"defectuoso en edición" se refiere a una
aminoacil-tRNA sintetasa cuyo sitio de edición se
ha modificado de tal modo que la actividad de edición se ha reducido
o eliminado sin afectar al sitio de reconocimiento. Para reducir o
eliminar la actividad de edición de las
aminoacil-tRNA sintetasas, se pueden usar técnicas
de ingeniería genética comunes, por ejemplo mutagénesis dirigida
(consúltese Doring, V et al., "Enlarging the amino acid
set of Escherichia coli by infiltration of the valine coding
pathway", Science, 2001, vol. 292, pp.
453-454).
La introducción de una ARS defectuosa en edición
en una célula de mamífero da como resultado la formación de ARNt
cargados erróneamente que no pueden hidrolizarse por la enzima ya
que es defectuosa en su actividad de edición. La principal
consecuencia es que puede haber una mutagénesis masiva en las
proteínas sintetizadas por la célula, generando un efecto tóxico
que da lugar a muerte celular o a reducción del crecimiento de la
división celular.
Este efecto tóxico puede aumentarse
incrementando la concentración de los aminoácidos que la ARS
defectuosa en edición usa erróneamente en los medios usados para
cultivar las células de mamífero que expresan las
aminoacil-tRNA sintetasas defectuosas en
edición.
La muerte celular causada por
aminoacil-tRNA sintetasas con actividad defectuosa
puede monitorizarse por diversos métodos comerciales o estándar
(captación de rojo neutro, WST1, niveles de LDH, niveles de ATP, y
otros), usando espectrofotómetros o cualquier otro dispositivo
diseñado con el propósito de monitorizar la muerte celular.
En la presente invención "un vector de
expresión" se refiere a una molécula de soporte en la que se
inserta un segmento deseado de ADN (por ejemplo ácido nucleico
heterólogo). El vector sirve para incorporar ADN ajeno en células
hospedadoras. Más específicamente, un "vector de expresión" es
un vector de ADN que contiene una secuencia de ADN que está unida
operativamente a una secuencia de control adecuada capaz de realizar
la expresión del ADN en un hospedador apropiado. Tales secuencias
de control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una
secuencia operador opcional para controlar dicha transcripción, una
secuencia que codifica sitios de unión al ribosoma del ARNm, y
secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la
traducción.
El vector puede ser un plásmido, una partícula
de fago, o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez que
se ha introducido para transformar un hospedador adecuado, el vector
puede replicarse y funcionar independientemente del genoma
hospedador, o puede, en algunos casos, integrarse en el genoma
generando por sí mismo líneas celulares estables que expresan dicho
gen de manera constitutiva o después del tratamiento de las células
con un inductor de la expresión del gen. Los términos
"plásmido" y "vector" se usan a veces de manera
intercambiable en el presente documento, porque el plásmido es la
forma de vector usada de manera más habitual actualmente. Sin
embargo, se pretende que la invención incluya otras formas de vector
que cumplen una función equivalente y que se conocen o se conocerán
en la técnica.
Los vectores de expresión habitualmente
contienen además otras secuencias de ácidos nucleicos funcionalmente
importantes, tales como casetes de expresión que codifican
proteínas de resistencia a antibióticos, sitios de clonación
múltiple, secuencias de replicación, y similares.
En una realización de la presente invención, el
vector de expresión se selecciona del grupo que consiste en un
plásmido viral o no viral, cósmido, fagémido, vector lanzadera, yak,
y similares. Preferiblemente el vector de expresión es un
adenovirus.
En otra realización de la presente invención, el
vector comprende además un sistema de regulación dependiente de
tetraciclina para la expresión del gen.
En otra realización más de la invención, el
vector comprende un marcador de selección. Preferiblemente el
marcador de selección es higromicina.
En otra realización más, la
aminoacil-tRNA sintetasa de origen natural procede
de bacterias, hongos, protozoos y metazoos.
Como se usan en el presente documento, los
términos "transformación" y "transfección" se refieren a
cualquiera de la diversidad de técnicas reconocidas en este campo
para introducir ácido nucleico ajeno (por ejemplo ADN) en una
célula hospedadora procariota o eucariota (incluyendo células
humanas aisladas). Se conocen bien en la técnica medios apropiados
para introducir (transducir) vectores de expresión que contienen
ácidos nucleicos en células hospedadoras para producir células
recombinantes transducidas, o para generar líneas celulares
estables que contienen el gen integrado en el ADN nuclear de las
células. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o
transfectar células hospedadoras en Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 3ª edición, editado por J. Sambrook y D.W. Russell (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2000), y
otros manuales de laboratorio.
Se describen métodos para el crecimiento y la
preservación de cepas bacterianas en Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 3ª edición, editado por J. Sambrook y D.W. Russell (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 2000). Controlar la expresión de
genes en células humanas y reprimir la existencia de expresión basal
puede ser un desafío como saben bien los expertos en la materia
(consúltese Rai et al., "Expression systems for production
of heterologous proteins", Current Science, 2001, vol. 80, pp.
1121-11). Los inventores han sacado partido de dos
recientes novedades en el campo de la expresión de proteínas de
células humanas para construir nuestras cepas de ensayo. En primer
lugar, se ha usado un vector de expresión de genes basado en
adenovirus basado en los sistemas de expresión de genes
Tet-ON regulados por tetraciclina y sistemas de
expresión de genes regulados por el antagonista de progesterona RU
486. Este vector puede funcionar en múltiples tipos celulares y se
ha comprobado que la regulación de expresión proteínica está
firmemente controlada (consúltese Edholm, D. et al.,
"Adenovirus vector designed for expression of toxic proteins",
J. Virology, 2001, vol. 75, pp. 9579-9584).
Alternativamente, la construcción de cepas de
ensayo puede basarse en el sistema de recombinación Cre/IoxP para
la activación de transcritos génicos. Cre es una proteína
recombinasa de 38 kDa del bacteriófago P1 que media recombinación
específica de sitio intramolecular (de escisión o inversión) e
intermolecular (integrativa) entre sitios IoxP. La capacidad de
escisión de ADN de Cre puede usarse para activar un gen ajeno
cortando una secuencia intermedia de parada entre el promotor y la
región codificante del gen. Así pues, los genes que codifican las
sintetasas tóxicas podrían introducirse en células humanas en un
vector cuyo sitio de inicio de transcripción está bloqueado por una
señal de parada. La recombinación, es decir, la escisión de la señal
de parada, sólo ocurre cuando la expresión de Cre se activa
(consúltese Sauer, B. et al., "Cre/Iox: one more step in
the taming of the genome", Endocrine, 2002, Vol. 19, pp.
221-228).
Una vez que las cepas de ensayo se desarrollan,
los inventores han diseñado un ensayo de monitorización de
crecimiento sencillo en placas de 96 pocillos usando un lector de
placas automático. Ya han logrado implementar un procedimiento
similar para el análisis del efecto enzimático tóxico en E.
coli. Una vez que este ensayo está operativo se comienza la
exploración de bibliotecas de moléculas pequeñas para buscar nuevos
inhibidores potenciales de sintetasas diana.
Las expresiones "sustancia de ensayo" y
"sustancia" se usan de forma intercambiable y se refieren a un
compuesto, una mezcla de compuestos (es decir, al menos dos
compuestos), o una muestra de producto natural que contiene uno o
más compuestos.
En lugar de ensayar el efecto de sustancias
pequeñas en tejidos o individuos completos, su ensayo en cultivos
celulares humanos puede proporcionar a las exploraciones la mayor
potencia discriminatoria posible, porque la selección basada en
crecimiento celular identifica compuestos o combinaciones de
compuestos multifactorialmente. Las selecciones iniciales
identifican inhibidores capaces de bloquear la actividad de la
sintetasa y de atravesar membranas celulares, mientras que la
segunda exploración refina más la búsqueda de sustancias que no
afectaron al metabolismo de células humanas.
Las sustancias que se van a ensayar con respecto
a su capacidad para eliminar el efecto tóxico causado por las
aminoacil-tRNA sintetasas defectuosas en edición se
añaden a las células antes, durante o después de la inducción de la
expresión de los genes que codifican las
aminoacil-tRNA sintetasas defectuosas en edición.
Después de inducir la expresión de los genes, la muerte celular se
monitoriza en cada cultivo en presencia o ausencia de la sustancia
que va a ser ensayada.
Las sustancias que causan una reducción en la
tasa de muerte celular del cultivo con respecto a la tasa de muerte
celular del mismo cultivo en ausencia de la sustancia se consideran
inhibidores potenciales de las aminoacil-tRNA
sintetasas defectuosas en edición que causan muerte celular.
Así pues, en una realización de la presente
invención, la aminoacil-tRNA sintetasa se obtiene de
una bacteria, y la sustancia se ensaya para determinar si es una
agente antibacteriano.
En otra realización de la presente invención, la
aminoacil-tRNA sintetasa se obtiene de un hongo, y
la sustancia se ensaya para determinar si es un agente
antifúngico.
En otra realización de la presente invención, la
aminoacil-tRNA sintetasa se obtiene de un protozoo y
la sustancia se ensaya para determinar si es un agente
antiparasitario.
En otra realización de la presente invención, la
aminoacil-tRNA sintetasa se obtiene de un metazoo y
la sustancia se ensaya para determinar si es un agente
antimetazoo.
Como comprenderán los expertos en la materia, el
tipo de células de mamífero usadas en la presente invención puede
variar ampliamente. Básicamente, puede usarse cualquier célula de
mamífero, siendo las células de ratón, rata, primate y humano
especialmente preferidas. Más preferiblemente, las células de
mamífero aisladas son humanas.
La bacteria patógena Streptococcus
pneumoniae utiliza una isoleucil-tRNA sintetasa
(IleRS) esencial. La IleRS es una aminoacil-tRNA
sintetasa de edición, y su reacción de edición es esencial para
prevenir la producción de valina-ARNt^{Ile}
acilada erróneamente por esta enzima (consúltese Edred, E. W. y
Schimmel, P. R., "Interstice mutations that block
site-to-site translocation of a
misactivated amino acid bound to a class I tRNA synthetase", J.
Biol. Chem., 1972, vol. 247, pp. 2961-2964).
Para investigar si la expresión de IleRS de
S. pneumoniae, que contiene mutaciones que inactivan la
actividad de edición de esta enzima, tiene un efecto tóxico en un
sistema mamífero y lleva a muerte celular, la
isoleucil-tRNA sintetasa de S. pneumoniae
cuya actividad de edición se destruyó (y que se abreviará en lo
sucesivo como "IleRSTA"), se fusionó con la proteína verde
fluorescente. La construcción resultante se expresó en células
HeLa, una línea celular humana, y su supuesto efecto tóxico se
examinó con concentraciones crecientes de valina en los medios de
cultivo.
El gen completo que codifica la
isoleucil-tRNA sintetasa de tipo silvestre de S.
pneumoniae se puede adquirir en la base de datos de secuencias
de ADN de NCBI con el número de entrada AE008519. Este gen se
amplificó a partir de ADN genómico purificado de Streptococcus
pneumoniae (proporcionado por la Dra. Petra Zwijnenburg, del
Centro Científico Médico de la Universidad de los Países Bajos,
Ámsterdam) por el método de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) usando dos cebadores de ADN:
-
3
El producto de esta amplificación se clonó a
continuación directamente en el plásmido
PCR2.1-TOPO/TA (Invitrogen) para su posterior
manipulación.
El gen que codifica la proteína verde
fluorescente (proporcionada por el Dr. Antonio Zorzano, Instituto de
Investigaciones Biomédicas de Barcelona, Barcelona) se amplificó
por PCR usando los siguientes cebadores:
Una vez que el gen GFP se amplificó, se fusionó
con el gen de la isoleucil-tRNA sintetasa incubando
ambos productos de PCR con los engarcees oligonucleotídicos:
El producto resultante se mezcló posteriormente
junto con cebadores GFP-IRS Nº 1 (SEC ID Nº: 3) y
GFP-IRS Nº 4 (SEC ID Nº: 6), y se realizó una PCR
solapada secundaria. El producto amplificado final se clonó en
PCR2.1-TOPO/TA (Invitrogen).
El vector final se digirió con NotI y el
producto resultante se insertó en vectores de expresión de mamífero
cortados de forma similar, pCMV (BD Biosciences Clontech).
Se ha indicado previamente que las sustituciones
de alanina en un péptido rico en treonina en el dominio de edición
de IleRS generaron variantes de IleRS que tienen su actividad de
edición disminuida (consúltese Pezo, V. et al.,
"Artificially ambiguous genetic code confers growth yield
advantage", P.N.A.S., 2004, Vol. 101, pp.
8593-8597). La mutagénesis dirigida de IleRS para
alterar su dominio de edición sustituyendo los restos T231, T232 y
T233 (como se encuentra en la base de datos de secuencias de
proteínas de NCBI con el número de entrada Q9ZHB3) por alaninas.
Los codones correspondientes a los aminoácidos mutados son: (A691,
C692, A693), (A694, C695, G696) y (A697, C698, T699). La mutagénesis
dirigida se realizó usando el kit de mutagénesis dirigida
QuickChange (Stratagene) usando los siguientes cebadores
oligonucleotídicos mutantes,
-
7
Esta reacción de mutagénesis produjo un gen que
codifica la IleRS mutada (IleRSTA).
La integridad y autenticidad tanto de las
construcciones de ADN que incluyen la IleRS como de la que incluye
la IleRSTA se confirmaron por secuencia de nucleótidos.
Se cultivaron células HeLa (referencia ATCC
CCL-2) en un medio DMEM complementado con 100 U/ml
de penicilina, estreptomicina 100 \mug/ml y suero bovino fetal
inactivado por calor al 10% (de Gibco) bajo un 5% de CO_{2}/95%
de aire en una incubadora humidificada. Las células se mantuvieron
en la fase exponencial del crecimiento. Las células adherentes se
desunieron incubando con solución de tripsina-EDTA
durante 5 minutos a 37ºC antes de lavar.
Para transfecciones transitorias, se añadieron
20 \mug de cada construcción de ADN a 500 \mul de agua que
contenían CaCl_{2} 252 mM. Después se añadieron 500 \mul de
tampón salino neutralizado con Hepes 2x (NaCl 280 mM, KCl 10 mM,
Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM, HEPES 50 mM, dextrosa 12 mM, pH 7,1) a la
mezcla de ADN gota a gota. 16 horas después de añadir esta mezcla
de transfección a las células, el medio que contenía ADN se retiró
y se añadió medio nuevo. Después de 24 horas, las células
transfectadas se usaron para experimentación.
Para transfecciones estables, 48 horas después
de la transfección, las células se dividieron en placas de 24
pocillos y se añadieron 500 \mug/ml de G418 para selección.
Aproximadamente 15 días más tarde, se seleccionaron clones
individuales de células y se pusieron en placas de 96 pocillos para
expansión. Los clones se seleccionaron comprobando la expresión de
GFP mediante citometría de flujo.
Se incubaron extractos de proteínas completas de
las células transfectadas con tampón de muestra azul Laemmli y se
cargaron y separaron mediante SDS-PAGE en geles al
8%. Los geles se transfirieron a membranas de PVDF (Amersham) y se
bloquearon con TBS-T (Tris 0,5 M, NaCl 1,5 M),
Tween-20 0,1% (v/v), pH 7,4) que contenía al menos
un 10% (p/v) de leche durante al menos 1 hora. Posteriormente se
incubaron las transferencias con anticuerpo policlonal de conejo
anti-proteína verde fluorescente (Immunokontact) a
1:5000 en solución de bloqueo BSA/TBS-T al 10%. Las
transferencias se lavaron dos veces inmediatamente después de la
incubación con anticuerpos primarios y otras dos veces a intervalos
de 15 minutos. Finalmente se incubaron las transferencias con
anticuerpos secundarios (anti-IgG de conejo,
anticuerpo completo unido a peroxidasa de rábano rusticano que
suministró Amersham) a 1:10000 en TBS-T durante 1
hora antes de lavar como antes y se revelaron usando un sistema de
detección de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham).
Se usó yoduro de propidio a 10 \mug/ml para la
determinación de la viabilidad celular en células HeLa transfectadas
de forma transitoria con proteínas de fusión a GFP. Las células
teñidas se analizaron inmediatamente usando un Coulter Epics XL
(Beckman Coulter) y se analizaron usando software System II.
Se transfectaron células HeLa (de carcinoma
cervical humano) transitoriamente con plásmido vacío (simulado) o
plásmido que codifica GFP-IleRS de S.
pneumoniae con dominio de edición de tipo silvestre
(pTBGFP-IleRS) y mutado
(pTBGFP-IleRSTA). La expresión de la proteína de
fusión a GFP se detectó mediante inmunotransferencia usando
anticuerpo policlonal anti-GFP, como se muestra en
la Fig. 1. Se detectó una banda de aproximadamente 148 kDa en las
células HeLa que expresan GFP-IleRS de S.
pneumoniae con dominio de edición de tipo silvestre (TS) y
mutado (TA)
Estos resultados demuestran que la IleRS de
S. pneumoniae con dominio de edición de tipo silvestre y
mutado puede expresarse en una línea celular humana.
Para evaluar si la expresión de GFPIleRS de
S. pneumoniae con dominio de edición mutado tiene un efecto
tóxico en un sistema mamífero en presencia de concentraciones
crecientes de valina en los medios, se expresaron GFP, dominio de
edición de S. pneumoniae de tipo silvestre (IleRS) y mutado
(IleRSTA) en células HeLa.
La IleRSTA de S. pneumoniae con dominio
de edición mutado parece contribuir a una mayor sensibilidad en
presencia de mayores concentraciones de valina en los medios,
comparada con las células HeLa que expresan IleRS de S.
pneumoniae de tipo silvestre o GFP, como se ilustra en la Fig.
2.
Este aumento en la susceptibilidad a la muerte
celular puede deberse a un aumento de la incorporación errónea de
valina que, a su vez, causa un mayor nivel de proteínas plegadas
erróneamente o desplegadas en las células que expresan GFPIleRS
mutante, lo que conduce a un aumento de la muerte celular.
Para determinar si una sustancia es un fármaco
candidato, ésta debe permitir o mejorar el crecimiento de las
células humanas en presencia de IleRSTA (es decir, esta sustancia
debe tener una actividad inhibidora contra dicha ARS defectuosa en
edición).
Se lleva a cabo una reacción bioquímica en la
que la GFP-IleRS cataliza la incorporación de
isoleucina al ARNt afín. Esta incorporación se monitoriza usando un
aminoácido marcado radiactivamente, y midiendo la adición del
marcador radiactivo a la molécula de ARNt.
Después, la sustancia candidata a fármaco se
añade a la mezcla de reacción. La capacidad de la sustancia para
discriminar selectivamente entre la ARS defectuosa en edición y su
homóloga humana se estima midiendo la capacidad de la sustancia de
inhibir la incorporación del aminoácido radiactivo a su ARNt^{Ile}
afín, y comparando esta actividad con la capacidad de la misma
sustancia para inhibir la actividad de enzimas humanas similares en
sus respectivos ARNt afines. Una sustancia es específica cuando
puede inhibir la enzima del patógeno, pero no las enzimas similares
humanas.
Por consiguiente, la sustancia se ensaya con
respecto a su capacidad para inhibir el crecimiento del organismo
que contiene originalmente la ARS usada para construir la ARS
defectuosa en edición. La sustancia que presenta inhibición
selectiva de la ARS defectuosa en edición y la capacidad para
retrasar o detener el crecimiento del organismo que contiene de
forma natural la ARS original se considera un candidato potencial a
fármaco útil para inhibir el crecimiento de este organismo.
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletWeygand-Durasevic 1. et al. Yeast
seryl-tRNA synthetase expressed in Escherichia
coli recognizes bacterial serine-specific tRNAs
in vivo, Eur. J. Biochem., 1993, vol. 214,
869-877 [0003]
\bulletRich, A. RNA structure and the
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<110> INSTITUCIÓ CATALANA DE RECERCA I
ESTUDIS AVANÇATS FUNDACIÓ PRIVADA PARC CIENTÍFIC DE BARCELONA
FUNDACIÓ PRIVADA INSTITUT DE RECERCA BIOMÈDICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un método de cribaje para
identificar nuevos inhibidores de aminoacil-tRNA
sintetasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P670EP00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR
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<400> 3
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<220>
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<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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\hskip1cm11
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 49
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<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Engarce oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\hskip1cm12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 47
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Engarce oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\hskip1cm13
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico para
llevar a cabo mutagénesis dirigida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\hskip1cm14
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico para
llevar a cabo mutagénesis dirigida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm15
Claims (15)
1. Método de cribaje para identificar un
candidato a fármaco en el que dicho método comprende los siguientes
pasos:
- a)
- obtener una secuencia génica que codifica una aminoacil-tRNA sintetasa de origen natural;
- b)
- modificar por ingeniería genética el gen que codifica dicha aminoacil-tRNA sintetasa, dando como resultado una aminoacil-tRNA sintetasa con una actividad defectuosa, a condición de que la modificación por ingeniería genética no afecte a la funcionalidad del sitio catalítico de la enzima;
- c)
- clonar el gen resultante del paso (b) en un vector de expresión;
- d)
- transformar células de mamífero aisladas con el vector de expresión resultante del paso (c);
- e)
- cultivar las células recombinantes resultantes del paso (d) en un medio nutriente bajo condiciones que permitan la expresión de la aminoacil-tRNA sintetasa modificada por ingeniería genética, dando como resultado muerte celular o una disminución en la tasa de división celular;
- f)
- proporcionar al medio del paso (e) una sustancia a ensayar; y
- g)
- analizar el crecimiento celular resultante, en el que si hay un aumento del crecimiento celular, entonces la sustancia inhibe selectivamente la actividad de la aminoacil-tRNA sintetasa modificada por ingeniería genética y no afecta a su ortólogo celular, dando como resultado que dicha sustancia sea un candidato a fármaco.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de cribaje de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el vector de expresión usado en el paso
(c) también comprende una secuencia génica que codifica un sustrato
de ARNt de la aminoacil-tRNA sintetasa de origen
natural.
3. El método de cribaje de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que las células de mamífero se transforman
en el paso (d) usando un segundo vector de expresión que comprende
una secuencia génica que codifica un sustrato de ARNt de la tRNA
sintetasa de origen natural.
4. El método de cribaje de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la aminoacil-tRNA
sintetasa que resulta del paso (b) es defectuosa en el
reconocimiento del ARNt.
5. El método de cribaje de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la
aminoacil-tRNA sintetasa de origen natural del paso
(a) tiene actividad de edición y la aminoacil-tRNA
sintetasa que resulta del paso (b) es defectuosa en edición.
6. El método de cribaje de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la
aminoacil tRNA sintetasa se modifica por ingeniería genética por
mutagénesis dirigida.
7. El método de cribaje de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el
vector de expresión se selecciona del grupo que consiste en un
plásmido viral o no viral, cósmido, fagémido, vector lanzadera y
yak.
8. El método de cribaje de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el vector de expresión es un vector
adenovirus.
9. El método de cribaje de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en el que el
vector comprende un sistema de regulación dependiente de
tetraciclina para la expresión del gen.
10. El método de cribaje de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que el
vector comprende un marcador de selección.
11. El método de cribaje de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que el marcador de selección es
higromicina.
12. El método de cribaje de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la
aminoacil-tRNA sintetasa proviene de una bacteria y
la sustancia se ensaya para determinar si es un agente
antibacteriano.
13. El método de cribaje de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que
la tRNA sintetasa proviene de un hongo y la sustancia se ensaya
para determinar si es un agente antifúngico.
14. El método de cribaje de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que
la tRNA sintetasa proviene de un protozoo y la sustancia se ensaya
para determinar si es un agente antiparasitario.
15. El método de cribaje de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que
la tRNA sintetasa proviene de un metazoo y la sustancia se ensaya
para determinar si es un agente antimetazoo.
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