KR20090034926A - 신약 확인용 스크리닝 방법 - Google Patents

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KR20090034926A
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루이스 리바스 드 포플라나
테레사 보리 산츠
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인스티튜시오 카탈라나 드 르세르카 아이 에스투디스 아반카츠(아이크레아)
펀다시오 프리바다 파크 사이언티픽 드 바르셀로나
펀다시오 프리바다 인스티튜트 드 르세르카 바이오메디카
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Abstract

약품 후보 확인용 스크리닝(screening) 방법으로서, 상기 방법은, a) 자연적으로 발생하는 병원성의 비식별 tRNA 합성효소를 코드화하는 유전 시퀀스를 포함하는 익스프레션 벡터를 획득하는 단계; b) 익스프레션 벡터와 고립 포유 동물 세포들을 변형하는 단계; c) 병원성 tRNA 합성효소의 익스프레션을 허용하는 조건들 하에서 영양 매체 중의 단계(b)로부터 얻어진 재조합형 세포들을 성장시켜, 병원성 tRNA 합성효소의 익스프레션을 세포 분할의 속도로 감소시키거나 죽은 세포들로 발생시키는 단계; d) 시험 물질을 제공하는 단계; 및 e) 세포 성장의 증가가 있으면, 상기 물질은 선택적으로 병원성 tRNA 합성효소의 활성을 금지하며 세포 올소로그(ortholog)에 영향을 미치지 않으면 상기 물질이 약품 후보가 되도록 발생된 세포 성장을 분석하는 단계를 구비하는 것을 특징으로 한다.
스크리닝, 유전자 시퀀스, 신약품, 합성효소, 벡터, 약품 후보

Description

신약 확인용 스크리닝 방법{A Screening Method for Identifying New Drugs}
본 발명은 신약들을 식별할 수 있는 새로운 스크리닝 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다른 것들 중에서 항균성이며 항진균성 제제들로서 유용할 수 있는 아미노아실(aminoacyl)-tRNA 합성효소(ARS) 인히비터 화합물의 선택용 스크리닝방법에 대한 것이다.
현대의 약품 발견 프로그램들에서 화학 자료들이 로봇 시스템과 함께 일정한 작용에 대해 많은 수의 화합물의 효과를 신속하게 평가하기 위하여 사용되었다. 이러한 방안은 두 가지 주요 결점들을 가진다. 우선, 용이하게 모니터될 수 있는 생화학적 시금석(assay)이 자주 지원 화합물들을 확인하기 위하여 개발될 필요가 있다. 이 과정은 선택된 약들의 가능한 부정적인 영향에 기인하여 고가이며 반응하지 않는다. 둘째로, 이러한 방안은 생물학적 이용효능(bioavailability) 및 독성(toxicity) 인자들을 무시한다. 대부분의 화합물들은 용해성, 생물학적 이용효능 또는 독성 문제들에 기인하여 더 늦게 포기된다.
아미노아실-tRNA 합성효소 (이하에서 ARSs로 호칭)는, 이들이 일반적으로 분포되는 본질적인 효소들이므로 약품 개발을 위한 이상적인 타겟들을 나타내며, 그 대로의 성질이 특정 인히비터(inhibitor)들을 선택하도록 한다.
또한, 이들은 수용성이며, 안정되고, 다량으로 나타내고 정화하기 용이하며, 하나 이상의 방법들에 의하여 평가하기에 간단하다.
X-레이 구조물들이 예컨대 모든 합성효소들에 유용하며 아미노아실레이션(aminoacylation) 작용의 기구에 대해 많은 것이 알려져 있으며(참조, 웨이건-듀라시빅 아이(Wwygand-Durasevic I.) 등의 “대장균에 발현된 이스트 세릴-tRNA 합성효소가 비보(vivo)의 박테리아 tpsm-특정의 tRNA 인식”, Eur. J. Biochem., 1993, vol. 214, pp. 869-877).
ARSs는 특정 아미노산들의 동종의 tRNAs로의 결찰을 촉진한다. 이 반응은 단일 활성 사이트 영역 내에서 발생하며 통상 두 단계들로 진행한다. 우선, 아미노산이 ATP로 활성화되어 아미노아실-아데닐염을 형성하여 파이로인산염을 방출한다. 다음에, 아미노산이 아미노아실-tRNA 및 AMP를 생성하기 위하여 tRNA의 3' 단부에 전달된다. 이 두 단계의 반응이 특정 뉴클레오티드 삼쇄환들(tRNA 안티코돈)을 특정 아미노산과 연결시킴으로써 유전 코드를 형성한다. 각각의 아미노산이 일반적으로 분포된 그 자체의 특정 ARS에 의하여 인식된다. 아미노아실-tRNA 합성효소들은 각각 두 등급들의 대략 10개 효소들로 균등하게 구분된다. 하나의 등급의 모든 효소들은 단일 영역의 ATP 결합 프로테인으로부터 진화되는 것으로 나타난다. 이 영역에의 삽입 및 변경은 tRNA 억셉터 스템을 결합하기 위한 프레임워크를 구축한다. 진화 과정에서 부가적인 영역들이 이 핵심 구조에 부가된다.
아미노아실-tRNA 합성효소에 의한 tRNAs의 인식은 대체로 억셉터 시스템과 tRNA의 안티코돈 루프의 분자 상호작용에 의존한다(리치 에이. “단백빌 합성의 RNA 구조 및 루트”, 콜드 스프링 하브(Harb.) 심프(Svmp). 퀀트(Quant). 바이올.(Biol.), 2001, vol. 66. pp. 1 -16 참조). 이러한 효소들의 활성 사이 영역들이 tRNA 분자의 억셉터 아암에 결합하며, 여기서 아미노산이 부착된다.
‘식별자’의 염기(일반적인 CCA 시퀀스를 앞서는 쌍이 없는 염기), 및 억셉터 스템의 제1의 세 개의 염기쌍들은 ARS 활성 사이트들에 의하여 인식된 대부분의 동일성 소자들을 감춘다.
번역-지향의 상업적 항균제들 중에서 하나는 tRNA 합성효소를 타겟으로 한다. 슈도몬산(뮤피로신)은 그램-포지티브 전염성 병원균으로부터 이소루실-tRNA 합성효소(NeRS)의 인히비터이다. 슈도몬산은 병원균 대 포유동물 NeRS 에 대해 대략 8000배의 선택성(selectivity)을 가지나, 의약품의 시스템적인 생물학적 유효 성능의 결핍이 국부적인 용도들에 사용하는 것을 제한한다.
합성효소들에 향해진 다른 알려진 천연 제품의 인히비터들이 존재하지만(예컨대, 보레리딘, 푸라노마이신, 그래나타이신(granaticin), 등), 인히비터로서의 활성의 부족, 특이성의 부족, 또는 약한 생물학적 효능에 기인하여 상업적인 항균제로 개발된 것은 없다. 이와 같이, 대량의 화학적 자료들을 스크리닝하고 장래성 있는 신약 후보들을 확인하기 위하여 ARS 인히비터들을 선택하기 위한 더욱 효과적인 방법이 필요하다.
본 발명의 목적은 ARS 인히비터들의 선택을 위한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
가능한 선도 화합물의 소정 효과는 포유 동물 세포의 성장 구조 및/또는 자극이며, 세포 환경의 성장의 금지 또는 주어진 반응의 금지가 아님을 의미하는 적극적인 스크리닝방법을 제공하는 것이다. 이와 같이, 적극적인 선택에서 포유 동물 세포(및 특히 인간 세포들)의 성장이 타겟 ARS의 독성 작용을 금지할 수 있는 그러한 분자들에 의하여 구조될 수 있기를 제안한다. 이 효과는 신속하고 저가의 공정인 배양 밀도를 측정함으로써 모니터될 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 일 측면에 따라, 신약 후보 확인을 위한 스크리닝 방법이 제공되는 데, 상기 방법은, 약품 후보 확인용 스크리닝 방법으로서, 상기 방법은: a) 자연적으로 발생하는 병원성의 비식별 tRNA 합성효소를 코드화하는 유전 시퀀스를 포함하는 익스프레션 벡터를 획득하는 단계; b) 익스프레션 벡터와 고립 포유 동물 세포들을 변형하는 단계; c) 병원성 tRNA 합성효소의 익스프레션을 허용하는 조건들 하에서 영양 매체 중의 (b)로부터 얻어진 재조합형 세포들을 성장시켜, 병원성 tRNA 합성효소의 익스프레션을 세포 분할의 속도로 감소하거나 죽은 세포들로 발생시키는 단계; d) 시험 물질을 제공하는 단계; 및 e) 세포 성장의 증가가 있으면, 상기 물질은 선택적으로 병원성 tRNA 합성효소의 활성을 금지하며 세포 올소로그(ortholog)에 영향을 미치지 않으며 상기 물질이 약품 후보가 되도록 발생된 세포 성장을 분석하는 단계를 구비한다.
바람직하게, 상기 고립된 포유 동물 세포들은 고립된 인간 세포들이다.
본 발명의 스크리닝 방법은, 비특정 ARS가 세포들에 유독하면 그리고 이러한 독성이 활성 사이트의 조작 없이 달성될 수 있으며 이어서 인간 병원균의 ARS를 잘못 적재시키도록 설계하여 이 단백질을 표현할 수 있는 포유 동물의 세포들을 죽이고 성장 속도에 영향을 미칠 수 있을 것이다. 약품 후보 분자가 효소의 활성 사이트에 결합하는 화합물이면, 독성 ARS의 촉매 캐비티가 이 과정에서 조정되지 않으므로 관심있는 병균으로부터 원시형의 ARS를 균등하게 활성이 될 것이다.
바람직하게는 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 약품 후보들로 확인된 분자들은 비특정 ARS의 독성 효과를 복귀시킬 수 있는 능력으로서 선택된 작은 분자들임을 특징으로 하며, 동시에 인간 오소로그들을 금지하지 않고, 세포 물질대사의 다른 측면에 영향을 미치지 않으며 세포막을 가로지르고 병원균 합성효소를 금지할 수 있음을 특징으로 한다. 따라서, 상기 약품 후보들은 병원균을 살균하며 주 세포에 대해 독성이 없다.
달리 정의된 바가 없으면, 여기 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자들에게 공용되는 의미를 가진다. 여기 기재된 바와 유사하거나 균등한 방법들과 소재는 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본 명세서 및 청구범위에 걸쳐 "포함한다(comprise)"는 단어 및 그 변형들인 "포함하는(comprising)" 단어는 다른 기술적 특징들, 부가제들, 부품들, 또는 단계들을 배제하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 부가적인 목적들, 이점들 및 특징은 상세한 설명의 검토에서 당업자들에게 명백해질 것이며 또는 본 발명의 실시를 통해 배워질 것이다. 이하의 예들과 도면들은 단지 예로서 제공되며 본 발명을 한정하려는 것은 아니다.
도 1은 HeLa 세포들에서 H.파이로리(pylori) GFPGRS2의 익스프레션을 나타낸다. 여기에서 허위 또는 일시적으로 H.파이로리(pylori) GFPGRS2에 감염된 모든 세포 용해체들(lysates)은 축소 상태에서 SDS/PAGE 처리된다. GFPGRS2는 다클론성 항-GFP 항체를 이용한 이무노블라팅(immunoblotting)에 의하여 검출된다.
도 2는 H.파이로리 GFPGRS2 익스프레션이 세포 죽음을 인도함을 도시한다. GFP (회색) 또는 H. 파이로리 GFPGRS2(흑색)는 HeLa 세포들에서 일시적으로 감염되었으며 16시간 후에 신선한 매체가 부가되었다. 세포 죽음은 신선한 매체를 부가한 후에 일, 이, 삼일 P1로 착색하여 검사되었다. 죽음된 감염 세포(“dtc"로 약칭) 비율 대 죽음된 비감염 세포들("dntc”로 약칭)의 비율이 y축에 표시된다. 삼중 샘플들이 각 조건들에 대해 산출되고 표준 편차가 나타내진다.
여기 사용되는 용어인 "비식별 ARN-t-합성효소"(약칭으로 "ND ARN-t 합성효소")는 생물학적 기능이 하나 이상의 tRNA를 같은 아미노산과 아미노아실레이트(aminoacylate)하는 것을 의미한다. 예컨대, 대부분의 박테리아는 그 등가 아미노산인 글루타민 대신 글루틴염(glutamate)과 tRNA를 아미노아실레이팅할 수 있는GluRS 효소를 포함한다. 이 반응은 이 효소를 감추는 세포들에 해롭지 않은 데 이유는 글루타민염으로 아미노아실레이트된 tRNA의 임시 형태는 신속히 개질되며 아미노산 그루타민염은 글루타민으로 변형된다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "비특정의(non-specific)", 또는 "비정규적인(non-canonical)"이라는 용어는 "비식별적인(non-discriminating)"이라는 용어보다 같은 의미를 가진다.
"자연발생균(naturally occuring pathogenic)"이라는 용어는 본 발명에 따른 비식별적인 tRNA 합성효소가 포유동물에 대해 병원균이며 유전적으로 가공되지 않은 유기체로부터 얻어지는 점을 이해해야 한다.
본 발명의 일 측면에 따른 일 실시예에서, (a) 단계에서 얻어진 익스프레션 벡터는 또한 자연발생균의 비식별 tRNA 합성효소의 tRNA 기지(substrate)를 코드화하는 유전자 시퀀스를 포함한다.
본 발명의 제1 측면의 다른 실시예에서 포유동물 세포들은 자연발생균의 비식별 tRNA 합성효소의 tRNA 기지(substrate)를 코드화하는 유전자 시퀀스를 포함하는 제2 익스프레션 벡터를 사용하는 벡터(b)에서 변형된다.
본 발명의 발명자들은 병원균인 비식별적인 tRNA 합성효소용 유전자 코드의 익스프레션과 tRNA 기지는 동시에 양 유전자를 표현하는 세포들에 독성을 유발하는 비식별 tRNA 합성효소의 효능을 증가시킬 수 있음을 발견하였다.
병원균인 비식별적인 tRNA 합성효소용 tRNA의 유전자 시퀀스 코드는 일반 데이터베이스(예컨대, 세 가지 상이한 이솔레이트로부터이 헬리코박터 파이롤리 완전 게놈 시퀀스는 유전 은행 기준들인 NC 000915.1, NC 008086.1, 및 NC 000921.1에서 발견될 수 있다)로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 자연 발생 병원균인 비식별적인 tRNA 합성효소는 Glu-tRNA 합성효소와 Asp-tRNA 합성효소로 이루어진 그룹에서 선택된다.
아미노아실-tRNA 합성효소 중에서, 글루타밀- 및 글루타닐-tRNA 합성효소들( 각각. GIuRS 및 GInRS)과 애스파르틸(aspartyl)- 및 애스파라기닐(asparaginyl)- tRNA(각각 AspRS 및 AsnRS)은 각각 연속으로 및 진화적으로 관련된다(브라운 제이.알. 등의 "글루타밀 및 글루타미닐-tRNA 합성효소의 전개에서 유전자 상속, 복제, 및 수평 교환", 제이. 모아이. Evol. 1998, vol. 49, p 485-495; 홍 K. W., 등의 " 글루타미닐-tRNA 합성효소에서의 아미노산 특이성의 전개 역추적", FEBS Lett, 1999, vol.434, p.149-154 참조).
진핵생물(eukarya) 및 일부 세균(bacteria)에서, GInRS 및 GIuRS(GIuRS-D)는 각각 아주 특이한 tRNA 아미노아실레이션 반응을 촉진시킨다. GiuRS-D는 tRNA를 GIu와 잘못 아실화시키지 않으며 GInRS는 tRNA를 GIn과 잘못 아실화시키지 않는다.
그와는 달리, 아키박테리아 및 대부분의 세균류는 작용기 GInRS를 해독하지 못하며, GIn-tRNA는 간접적으로 생합성된다(윌콕스, 엠. 앤 니렌버그, "단백질과의아미노산 합서을 연결하는 보조인자로서의 전이 RNA", 1968, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 61, p229-236 참조).
우선, tRNA는 Glu-tRNA를 형성하기 위하여 비식별 GIuRS (GIuRS-ND)에 의하여 잘못 아실레이트된다(식 1)[GIuRS-ND는 여전히 Glu-tRNA를 생성하기 위하여 동종 반응을 촉진시킨다].
다음에, 잘못 아실레이트된 Glu-tRNA 중간체는 글루타민-의존 Giu-tRNA 아미도트랜스퍼라제(Glu-Adt)에 의하여 트랜스아미더티브하게(transamidatively) 개질되었다.
GIu + tRNAGln + ATP + GIuRS-ND → Glu-tRNAGln + AMP + PPi
GIn + Glu-tRNAGln + ATP+ Glu-Adt → Gln-tRNAGln + GIu + ADP
AspRS 및 AsnRS에 대해서도 유사한 상황으로 식(3 및 4)이 적용된다.
Asp + tRNAAsn + ATP + AspRS-ND → Asp-tRNAAsn + AMP + PPi
Asn + Asp-tRNAAsn + ATP+ Asp-Adt →Asn-tRNAAsn + Asp + ADP
이와 같이, 유전 코드의 충실성은 동종의 GInRS 또는 AsnRS가 없어도 정확하게 유지된다.
그러나, 이 개질 단계를 촉진할 수 없는 세포에 NDGIuRS를 도입한 것은 세포에 해로운 데, 이유는, 글루타민염으로 아미노아실레이트된 tRNA의 축적으로 발생하여 마침내, 이러한 유기체에 의하여 합성된 단백질에서 대량의 돌연변이를 유발하기 때문이다. 이러한 효과는 tRNA의 글루타민염을 글루타민으로 변형시킬 능력이 부족한 유기체인 대장균의 NDGIuRS를 나타내는 것에 의하여 입증되었다.
본 발명에서 "익스프레션 벡터(expression vector)"는 DNA의 소정 부분(예컨대, 이종 핵산)이 삽입된 캐리어 분자를 의미한다. 벡터는 외래 DNA를 주 세포에 통합하도록 작용한다. 특히, "익스프레션 벡터"는 적절한 숙주에서 DNA의 발현을 발생할 수 있는 적절한 조절 시퀀스에 작용가능하게 연결되는 DNNA 시퀀스를 포함하는 DNA 벡터이다. 이러한 조절 시퀀스는 전사(transcription)를 수행하는 프로모터와, 이러한 전사를 조절하기 위한 임의적인 오퍼레이터 시퀀스와, 적절한 imRNA hbosome의 바인딩 사이트를 해독하기 위한 시퀀스, 및 전사 밀 번역을 종료를 조절하기 위한 시퀀스들을 구비한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 단순히 게놈 삽입체일 수 있다. 적절한 숙주로 변형되면, 벡터는 복제되어 숙주 게놈과 무관하게 작용하며, 또는 소정의 경우, 상기 유전자를 구조적으로 표현하는 안정한 세포 라인들을 생성하며, 또는 세포들을 유전자 익스프레션 유도자로 처리 후에 게놈 자체에 통합된다. "플라스미드" 및 "벡터"라는 용어는 여기서 대체적으로 때로 사용되는 데, 이는 플라스미드는 현재 가장 공통적으로 사용되는 벡터이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동일한 작용을 수행하고 이 기술 분야에서 알려진 이러한 다른 형태의 벡터를 포함하도록 의도된다.
익스프레션 벡터는 통상 익스프레션 카세트 해독 항생 저항 단백질들, 다중 클로닝사이트들, 복제 시퀀스들, 등을 포함하는 다른 기능상 중요한 핵산 시퀀스들을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 익스프레션 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 서틀 벡터, 야크, 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직하겐ㄴ 익스프레션 벡터는 아데노바이러스이다.
본 발명의 다른 실시예에서, 벡터는 또한 유전자 익스프레션용 테트라아실린-의존 조정 시스템을 구비한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 벡터는 선택 마커를 포함하며, 바람직하게는 이 선택 마커는 하이지로마이신(hygromicine)이다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 병원균(pathogen)은 예컨대 스트렙토커스 폐렴의 유전자 코드의 번역용 비특이성 ARS를 이용하는 유기체로 구성되는 그룹에서 선택된다.
여기 사용된 바와 같은 "변형(transformation)" 또는 "감염(transfection)"이라는 용어는 외부 핵산(예컨대, DNA)을 원핵세포(prokaryotic) 또는 진핵세포(eukaryotic) 숙주 세포들(분리된 인간 세포를 포함)에 도입하는 다양한 기술-인식 기술의 하나를 의미한다. 형질 도입된 재조합 세포들을 발생하기 위하여 또는 세포들의 핵산 DNA에 통합된 유전자를 포함하는 안정한 세포 라인을 생성하기 위하여 숙주 세포들에 핵산을 포함하는 익스프레션 벡터를 도입하는 적절한 수단은 이 기술분야에서 잘 알려져 있다. 숙주 세포들을 변형하거나감염시키기 위한 적절한 방법들은 제이. 샘브룩(Sambrook) 및 디.더블유.러셀(Russell) 편집의 실험실 매뉴얼 3판(3rd. edition)의 분자 클로닝(Molecular Cloning), 및다른 실험실 매뉴얼들에서 발견될 수 있다[(콜드 스피링 하버 래버러터리 프레스(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 콜드 스프링 하버(Cold Spring harbor), NY, 2000)].
박테리아 계통의 성장 및 보존 방법들은 분자 클로닝(실험 매뉴얼;제이. 샘브룩(Sambrook) 및 디.더블유.러셀(Russell) 편집의 실험실 매뉴얼 3판(3rd. edition)[(콜드 스피링 하버 래버러터리 프레스(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 콜드 스프링 하버(Cold Spring harbor), NY, 2000)]에 개시된다.
인간 세포의 유전자들의 익스프레션을 조절하고 근본적인 익스프레션의 존재를 억제하는 것은 이 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려진 바와 같이 흥미로울 수 있다(라이(Rai) 등의 "이질 단백질들의 생산을 위한 익스프레션 시스템" 현재 과학(Current Science), 2001, vol. 80, 001121-11 참조). 발명자들은 시험자들의 계통을 전환하기 위하여 인간 세포들의 단백질 익스프레션 분야에서 두 개의 최근 연구들을 이용하였다. 첫째, 테트라아실린-조정 Tet-ON 및 프로게스테론 길항 RU 486-조정 유전자 익스프레션 시스템에 기초하여 아데노바이럿,-기초 유전자 익스ㅍ레션 벡터를 사용하였다. 이 벡터는 여러 세포 형태들에서 작용할 수 있으며 단백질 익스프레션의 조정은 엄격하게 조절된 것으로 나타났다(에드홈(Edholm), 디. 등의 " 독성 단백질의 익스프레션으로 설계된 아데노바이러스 벡터", 제이. 바이롤러지, 2001, vol. 75, pp. 9579-9584 참조).
대체적으로, 시험자 계통의 벡터는 유전자 전사 활성화용 Cre/loxP 재조합 시스템에 기초할 수 있다. Cre는 loxP 사이트들 사이의 분자내 및 분자간(통합적인) 재조합에 특이한 사이트를 매개하는 박테리아파지 P1로부터 선택된 38 kDa 재조합 단백질이다. Cre의 DNA 절제 성능은 프로모터와 유전자의 코드 영역 사이의 감섭 정지 시퀀스를 잘라냄으로써 외부 유전자를 발현시키도록 사용될 수 있다. 이와 같이, 독성 합성효소용 유전자 암호화는 정지 신호에 의하여 전사 개시 사이트가 차단된 벡터의 인간 세포들에 도입될 수 있다. 재조합, 즉, 정지 신호의 절제는 Cre 익스프레션이 활성화된 경우에만 발생한다(사우어(Sauer), 비. 등의, "Cre/lox; 게놈의 배양의 추가 단계", 엔도크라인, 2002, vol. 19, pp.221-228 참 조).
일단 시험자의 계통이 개발되면 발명자들은 자동 플레이트 판독기를 사용하여 96-웰(well) 플레이트들의 단순한 성장-모니터링 시험을 설계하였다. 이들은 이미 대장균(E. coli)에서의 독성 효소 효과의 분석을 위한 유사 공정을 수행하였다. 이 시험이 일단 수행되면, 타겟 합성효소들의 새로운 가능한 인히비터들을 찾기 위한 작은 분자 라이브러리들의 스크리닝이 개시되었다.
"시험 물질(test substance)" 및 "물질(substance)"이라는 용어는 화합물(compound), 화합물들의 혼합물(즉, 적어도 두 화합물들), 또는 하나 이상의 화합물들을 포함하는 자연 산물을 의미한다. 이와 같이, 시험 물질의 세포 성장의 분석은 하나 이상의 성장 인히비터의 억지 활동을 포함하므로 타겟 유전자 산물의 선택 및 비선택 인히비터들의 조합은 독성 비식별 ARS를 포함하는 진핵생물 세포들의 성장에 관련된 관찰가능한 내용을 가진다.
모든 조직들과 개인들의 작은 분자들의 효과를 시험하지 않고, 인간 세포의 배양에서 이들을 시험하는 것은 가능한 최고의 식별력을 스크린들에 제공할 것인 데, 세포 성장에 기초한 선택은 다 요인들에 기초한 화합물 또는 화합물들의 조합을 확인한다. 초기 선택들은 합성효소의 활동을 차단할 수 있으며
세포막을 가로지를 수 있는 인히비터들을 확인하며, 제2 스크린은 인간 세포의 물질대사에 영햐을 미치지 않았던 분자들에 대한 조사를 정련한다.
비식별 아미노아실-tRNA 합성효소를 나타내는 인간 세포들은 이들 효소들의 인히비터들의 발견을 위하여 사용된다. 비식별 아미노아실-tRNA 합성효소용 유전자 코드를 포함하는 세포들은 동일한 유전자의 익스프레션이 유발되면 이들 단백질을 합성하며, 이는 비식별 아미노아실-tRNA 합성효소에 의하여 촉진된 생화학 반응에 의하여 사명 세포를 유발한다.
비식별 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 유발된 세포 죽음은 분광 측정기들 또는 세포 죽음을 감시할 목적으로 설계된 다른 장치들을 사용하여 상용 또는 표준 방법들(중립 적색 흡수, WST1, LDH 수준들, ATP 수준들, 등)에 의하여 감시될 수 있다.
비식별 아미노아실-tRNA 합성효소에 의하여 유발된 독성 효과를 제거하기 위한 능력을 시험하기 위한 화합물들이 비식별 아미노아실-tRNA 합성효소용 유전자 코드의 익스프레션의 유발 전, 중간, 또는 후에 세포들에 부가된다. 유전자의 유발 후에, 각 세포 배지 중의 세포들의 죽음은 시험 중의 화합물들 각각의 존재 혹은 부재 중에 감시된다.
화합물의 부재 중에 동일한 배지의 세포 죽음의 비율에 대한 소정 배지의 세포 죽음의 비율의 감소는 세포 죽음을 유발하는 비식별 아미노아실-tRNA 합성효소의 가능한 인히비터들의 존재에 기인하는 것으로 판단된다.
이와 같이, 본 발명의 일 실시예에서, 자연발생 병원균인 비식별 아미노아실-tRNA 합성효소는 박테리아로부터 유래하며 이 물질은 재조합 인간 세포로 표현된 세균 오리진의 비식별 tRNA 합성효소의 기능을 선택적으로 억제하는 것에 의하여 작용하는 항균제 여부를 판단하기 위하여 시험된다.
본 발명의 다른 실시예에서, 자연 발생 병원균인 비식별 tRNA 합성효소는 균 류(fungus)로부터 유래되며 이 물질은 재조합 인간 세포로 표현된 세균 오리진의 비식별 tRNA 합성효소의 작용을 선택적으로 억제함으로써 작용하는 항균제 여부를 판단하도록 시험된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 자연 발생 병원균인 비식별 tRNA 합성효소는 원생동물(protozoan)로부터 유래되며 이 물질은 재조합 인간 세포로 표현된 원생동물 오리진의 비식별 tRNA 합성효소의 작용을 선택적으로 억제함으로써 작용하는 구충제(anti-parasite agent) 여부를 판단하도록 시험된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 자연 발생 병원균인 비식별 tRNA 합성효소는 후생동물(metazoan)로부터 유래되며 이 물질은 재조합 인간 세포로 표현된 후생동물 오리진의 비식별 tRNA 합성효소의 작용을 선택적으로 억제함으로써 작용하는 억제제(inhibitory agent) 여부를 판단하도록 시험된다.
예(example): HeLa 세포들의 He/Zcokacterpy 또는 글루타밀(glutamyl)-tRNA 합성효소 익스프레션
서두(Introduction)
병원균 박테리아인 헬리코박터 파이롤리는 두 가지 기초적인 글루타밀-tRNA 합성효소(GIuRSI 및 GluRS2)를 이용한다. GIuRSI는 정규의 식별 GIuRS이며 GIuRS2는 잘못 아실레이트된 Glu-tRNAGln의 제조에 대해서만 기본적이므로 비정규적이다.
H.파이롤리 비정규 GRS2의 익스프레션이 포유동물 시스템에 해로운 효과를 가지며 세포 죽음에 이르는 여부를 조사하기 위하여, H. 파이롤리 GFPGRS2가 HeLa 세포들로 표현되고, 인간세포 라인 및 그 추정상의 독성 효과가 조사되었다.
익스프레션 벡터의 획득( Acqusition of expression vector)
플라스미드 벡터들GRS2#1(SEQ 식별번호1):
δ'-GTCACCACCATGCTTCGTTTT GCGCCTTCGCCTACAG 및 GRS2#2(SEQ 식별번호2):
5'-GACTCAATGGTGATGGTGATGA TGTGCTTTGAGCCTTAAAACTT
가 헬리코박터 파이롤리(ATCC 700392D)로부터의 게놈 DNA로부터 GRS2를 확장하고 코작 콘센서스(kozak consensus) 리보솜 바인딩 사이드 시퀀스 및 히스-태그 에피토프(epitope)를 C-터미날에 부가하도록 시험이 진행되었다. 녹색 형광성 단백질(이하에서 "GFP")이 GRS2의 NH2 말단(terminus)에 융착되어 유세포분석기(flow cytometry) 및 표준 중첩 PCR 기술을 이용한 이뮤노블라팅 (immunoblotting)에 의한 검출을 용이하게 하였다.
GFP는 GFP-GRS2#1(SEQ 식별번호:3):
5-ATCTCCACCATGGTGAGCAAGGG CGAGGAG 및 GFP-GRS2#2 (SEQ 식별번호:4):
5'-CTGTAGGCGAAGGCGCAAAACGAAGCTTGTACAGCTCGTCCATGC CGA
를 이용하여 확장되며, GFP-GRS2#3 (SEQ 식별번호: 5):
5'-TCGGCATGGACGAGC TGTACAAGCTTCGTTTTGCGCCTTCGCCTACAG) 및 GFP-GRS2#3 (SEQ 식별번호: 6):
5'-GATATT CAATGGTGATGGTGATGATGTGCTTTGAGCCTTAAAACTT
를 이용하여 GRS2에 접합된다. 이어서 두 개의 부분들은 같이 프라이머들인 GFP-GRS2#1 및 GFP-GRS2#4와 혼합되고, 제2의 중첩 PCR이 실행되었다. 확장된 산물이 PCR2.1-TOPO/TA(인비트론)으로 클론되었다. GFPGRS2/ PCR2.1-TOPO/TA는 Notl로 소화되어 유사하게 절단된 포유동물 익스프레션 벡터인 pCMV(BD 바이오사이언스 클론테크)에 삽입되었다.
GFPGRS2/ PCR2.1 -TOPO/TA 는 Xbal 및 Spel과 소화되어 Xbal 절단 포유동물 테트라아시클린-유발 익스프레션 벡터 pTRE2(BD바이오사이언스 클론테크)에 삽입된다. pTRE2는 Tet-On Hela 세포 라인에서 GRS2를 나타내기 위하여 사용되었다.
pTRE2는 테트라이시클린-반응 PhCMV-i 프로모터(상업적으로 획득된)를 포함한다. 이 프로모터는 42-Tet 오퍼레터 시퀀스(tetO)의 7개이 복제물로 이루어진 Tet 반응 요소(Responsive Element)(TRE)를 포함한다. TRE는 완전한 CMV 프로모터의 일부인 인핸서를 결하고 있는 최소 CMV 프로모터의 바로 위이다.
이중의 안정적인 HeLa Tet-on 발현세포주(transfectant)를 위하여, 항 하이지로마이신(hygromycine)은 Pvull 및 pcDNA3.1/하이지로마이신 벡터(인비트론(Invitrogen))로부터 얻어진 Xmnl (무딘 단부들을 생성하는)에 침지(digest)되어 무딘 단부들을 가지는 Zral-침지(digested)-GFPGRS2/pTRE2로 클론된다.
모든 벡터들의 충실성과 진실성은 표준 시퀀싱 기술에 의하여 뉴클레오티드 시퀀스의 결정에 의하여 확인되었다.
세포 획득(Obtaining cells)
Tet-On Hela 세포들의 획득은 리버서 테트라아시클린-조절 트랜스액티베이터(transactivator)(rtTA)를 나타내는 인간 경부(cervical)의 암(carcinoma)-유발 세포들이며 BD 바이오사이언스 클론테크로부터 획득되었다.
HeLa 세포들 및 HeLa Tet-On은 가습 인큐베이터에서 5%CO2/95% 공기 하에서 100 Uml페니실린, 100 ㎍/mL 스토렙토마이신 및 10% 열-비활성 배아(fetal) 상태의 의 둔감한(bovine) 혈장액(serum)(Gibcofhqnxj 얻어진)으로 보충된 DMEM 매체에서 성장된다. HeLa Tet-On 세포들은 100㎍/mL G418 존재하에서 유지된다. 세포들은 성장의 지수 위상이 유지된다. 고유 세포들은 세척 전에 37℃에서 5분간 트립신-EDTA 용액으로 배양하여 분리되었다.
세포 이입(Transfection of cells)
일시적인 감염으로 각 DNA의 20㎍이 252mM CaCI2를 포함하는 500μl 물에 첨가되었다. 이어서, 2x헵스(Hepes)-완충-염수 버퍼(buffer)(280mM NaCl, 10m MKCl, 1.5mM Na2HPO4, 50mM HEPES, 12 mM 텍스트로즈, pH 7.1) 500μl가 DNA 혼합물에 한 방울씩 첨가되고, 이러한 세포에의 감염 혼합물의 첨가 16 시간 후에 DNA를 포함하는 매체는 제거되고 새로운 매체가 첨가되었다. 24 시간 후에, 감염된 세포들은 실험을 위하여 사용되었다.
이중으로 안정된 발현세포주(transfectant)를 위하여, Tet-On HeLa 세포들에 DNA 20㎍이 이입되고, 이입 48 시간 후에 세포들은 24홈판(well-plate)에서 분절되었으며 선택용 하이지로마이신 500㎍/mL이 첨가되었다. 대략 15일 후에, 세포들의 개별 클론들이 선택되고 확장을 위하여 96-홈판들에 적재되었다. 클론들은 유동 분석기에 의하여 익스프레션 GFP를 검사하여 선택되었다.
Im 밀 노블라팅(no-blotting) 클론들의 선택
Laemmli 청색 샘플 버퍼에서 추출된 모든 단백질은 10%겔 위에 SDS-PAGE에 의하여 장입되고 분리되었다. 겔들은 적어도 1시간 PVDF 막들로 이전되고 10%(w/v) 우유를 포함하는 TBS-T (0.5 M 트리스, 1.5 M NaCl), 0.1% (v/v) 트윈(Tween)-20, pH 7.4으로 차단되었다. 이어서, 블랏(blot)들은 (10% BSA/TBS-T 억제 용액에서 1:5000에서 정화된 항녹색 형광 단백질 토끼 다중 클로날 항체(Immunukontact)로 배양되었다. 블랏들은 기본 항체로 배양에 이어서 즉각 2회 세척되고 이어서 15분 간격으로 2회 세척되었다. 마침내 블랏들은 이전과 같이 세척되고 향상된 화학형광(ECL;enhanced chemiluminescence) 검사 시스템인 아마샴(Amersham)을 사용한 발전에 앞서 1 시간 동안 TBS-T에서 1:10000에서 제2 항체(아마샴(Amersham)에 의하여 공급된 전체 항체와 연결된 항-토끼 IgG, 호스디시(horsedish) 페록시다제(peroxidase)로 배양되었다.
유세포 분석기(Flow cytometry) 연구
10㎍/ml 요드화 프로피디움(PI)이 HeLa 세포들에 이입된 임시 GFP 융착 단백질의 세포 생존 능력(viability)을 결정하기 위하여 사용되었다. Pl-이입 세포들이 쿨터(Coulter) 에픽스(Epics) 티 (Beckman Coulter)를 이용하여 즉시 분석되고 시스템Ⅱ 소프트웨어를 이용하여 분석되었다.
이들 기술을 이용하여 얻어진 결과들로부터 HeLa 세포들(인간의 경부 암으로 부터 얻어진)이 일시적으로 빈 플라스미드(허위) 또는 GFP-GRS2/pCMV 코드의 플라스미드로 일시적으로 이식되었다고 결론되었다. GFP 융합 단백질의 익스프레션은 도 1 도시와 같은 항GFP 다중 클로날 항체를 사용하여 이무노블라팅(Immnoblotting)에 의하여 검출되었다. 대략 78 kDa가 GFP-GRS2 HeLa 세포들의 전체 세포 파쇄액(whole cell lysate)에서 검출되지 않았다.
세포 죽음의 결정( Determination of cell death )
H. 파이롤리 비식별 GRS2가 포유동물 시스템에서 독성 효과를 가지며 세포 죽음을 초래하는 여부를 평가하고 H. 파이롤리 GFPGRS2가 HeLa 세포들에 발현되는 여부를 평가하기 위하여 인간세포 라인 및 그 추정상의 독성 효과가 평가되었다.
도 2 도시와 같이, HeLa 세포들에서 H. 파이롤리 GFPGRS2 은 익스프레션은 Pl스테닝(staining)으로 측정된 세포 죽음의 증가를 가져온다. H. 파이롤리 GFPGRS2 익스프레션은 HeLa 세포에서의 GFP 익스프레션과 비교하여 세포 생존에 유해한 효과를 가지며 이 효과는 이식 후에도 3일간 계속된다. 이러한 결과들은 포유동물 시스템에서 H. 파이롤리 GFPGRS2의 익스프레션은 세포 죽음의 증가를 초래함을 보인다. 이러한 세포 죽음의 인식의 증가는 HeLa 세포들을 표현하는 H.파이롤리 GFPGRS2의 증가된 정도의 잘못 접혀진 단백질들을 발생시키는 글루타민 대신에 글루타민산의 혼합의 증가에 기인할 것이며, 이는 세포 죽음의 증가를 유발한다. HeLa 세포들에서의 H. 파이롤리 GFPGRS2 구성 익스프레션은 세포 죽음의 증가를 유발하며, 발명자들은 HeLa Tet-On 세포들, 테트라아시클린-유발가능한 시스템에서 H. 파이롤리 GFPGRS2를 안정되게 표현하였다.
후보 약품의 결정( Determination of a candiate drug )
물질이 gnq약품인 여부를 결정하기 위하여, NDGIu tRNA 합성효소(즉, 이 화합물은 상기 비식별 ARS에 대한 억제 활성을 가지므로)의 존재 항에서 인간 세포들의 성장을 허용하거나 향상시켜야 한다.
NDGIu tRNA 합성효소가 동종의 tRNA로의 대응하는 아미노산의 혼합을 촉진하는 생화학 반응을 수행하였다. 이 혼합은 방사능 표시된 아미노산을 사용하고, 방사능 표시를 tRNA 분자에 부가하는 것을 측정함으로써 감시된다. 유사한 반응이 억제가 모색되는 ARS에 이질적인 인간 효소에 의하여 촉진된다.
이어서, 약품의 후보 물질은 반응 혼합물에 부가된다. 비식별 ARS와 그 인간의 상동 기관(homologue) 사이의 선택적으로 식별할 수 있는 물질의 성능은 방사성 아미노산을 동종 tRNAGIu에 홉합시키는 것을 억제하는 능력을 측정하고, 이러한 활성과 각각의 동종 tRNA들에 대한 유사한 인간 효소들의 활성을 억제하기 위한 동일한 화합물의 성능과 비교함으로써 평가된다. 병원균으로부터 효소를 억제할 수 있으면 분자는 특유한 것이며, 유사한 인간 효소가 아니다.
따라서, 분자는 본래 비식별 ARS를 포함하는 유기체의 성장을 억제하는 성능이 시험된다. 비식별 ARS의 선택적인 억제와 자연적으로 비식별 ARS를 포함하는 유기체의 성장을 지연 또는 정지시크는 능력을 보이는 분자는 이러한 유기체의 성장 을 억제하기 위하여 사용될 수 있는 강력한 후보 약품으로 고려된다.
서열목록제출서에 첨부하여 제출

Claims (14)

  1. 약품 후보 확인용 스크리닝 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 자연적으로 발생하는 병원성의 비식별 tRNA 합성효소를 코드화하는 유전 시퀀스를 포함하는 익스프레션 벡터를 획득하는 단계;
    b) 익스프레션 벡터와 고립 포유 동물 세포들을 변형하는 단계;
    c) 병원성 tRNA 합성효소의 익스프레션을 허용하는 조건들 하에서 영양 매체 중의 (b)로부터 얻어진 재조합형 세포들을 성장시켜, 병원성 tRNA 합성효소의 익스프레션을 세포 분할의 속도로 감소하거나 죽은 세포들로 발생시키는 단계;
    d) 시험 물질을 제공하는 단계; 및
    e) 세포 성장의 증가가 있으면, 상기 물질은 선택적으로 병원성 tRNA 합성효소의 활성을 금지하며 세포 올소로그(ortholog)에 영향을 미치지 않으며 상기 물질이 약품 후보가 되도록 발생된 세포 성장을 분석하는 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    단계(a)에서 획득된 익스프레션 벡터는 또한 자연 발생 병원균인 비식별-tRNA 합성효소의 tRNA 기지를 위한 암호화용 유전자 시퀀스를 포함하는 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포들은 단계(b)에서 자연 발생 병원균인 비식별-tRNA 합성효소의 tRNA 기지를 위한 암호화용 유전자 시퀀스를 포함하는 제2 익스프레션 벡터를 이용하여 변형되는 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  4. 상기 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    자연 발생 병원균인 비식별-tRNA 합성효소는 Glu-tRNA 합성효소와 ASp-tRNA합성효소로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  5. 상기 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 익스프레션 벡터는 바이러스 또는 비바이러스 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 셔틀 벡터, 및 야크로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 익스프레션 벡터는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 벡터는 유전자 익스프레션용 테트라사이클린-의존성 조정 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 선택 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 선택 마커는 하이지로마이신(hygromicine)인 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  10. 상기 항들의 어느 한 항에 있어서,
    자연발생 병원균 비식별-tRNA 합성효소는 박테리아로부터 유래하며 이 물질은 재조합 포유동물 세포로 표현된 세균 오리진의 비식별-tRNA 합성효소의 기능을 선택적으로 억제함으로써 작용하는 항균제인 여부를 판단하기 위하여 시험되는 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항의 어느 한 항에 있어서,
    자연발생 병원균 비식별-tRNA 합성효소는 균류로부터 유래하며 이 물질은 재조합 포유동물 세포로 표현된 균류 오리진의 비식별-tRNA 합성효소의 기능을 선택 적으로 억제함으로써 작용하는 항균제인 여부를 판단하기 위하여 시험되는 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 9 항에 있어서,
    자연발생 병원균 비식별-tRNA 합성효소는 원생동물로부터 유래하며 이 물질은 재조합 포유동물 세포로 표현된 원생동물 오리진의 비식별-tRNA 합성효소의 기능을 선택적으로 억제함으로써 작용하는 구충제인 여부를 판단하기 위하여 시험되는 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 9 항의 어느 한 항에 있어서,
    자연발생 병원균 비식별-tRNA 합성효소는 후생동물로부터 유래하며 이 물질은 재조합 포유동물 세포로 표현된 후생동물 오리진의 비식별-tRNA 합성효소의 기능을 선택적으로 억제함으로써 작용하는 억제제인 여부를 판단하기 위하여 시험되는 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
  14. 상기 항들의 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 포유동물 세포는 재조합 인간 세포인 것을 특징으로 하는 약품후보 확인용 스크리닝 방법.
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