ES2708565T3 - Conjugados de Fc-histidil-ARNt sintetasa - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido de fusión histidil-ARNt sintetasa (HRS)-Fc, que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 98 % idéntica a la SEQ ID NO:337, donde el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene una actividad antiinflamatoria, y tiene farmacocinética alterada con respecto a un polipéptido de HRS no modificado que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:6, donde dicha farmacocinética alterada es mayor semivida en suero, mayor biodisponibilidad y/o disminución del aclaramiento.

Description

DESCRIPCION
Conjugados de Fc-histidil-ARNt sintetasa
ANTECEDENTES
Campo tecnico
La presente descripcion se refiere, en general, a conjugados, tales como polipeptidos de fusion, de uno o mas polipeptidos de histidil-ARNt sintetasa (HRS) y regiones Fc de inmunoglobulina, composiciones que los comprenden y procedimientos de uso de dichos polipeptidos y composiciones para tratar o diagnosticar diversas afecciones. Descripcion de la tecnica relacionada
Las fisiocrinas son dominios de protefnas de origen natural generalmente pequenos que se encuentran en la familia de genes de aminoacil-ARNt sintetasas (AARS) de organismos superiores, que no son necesarios para el papel bien establecido de las aminoacil-ARNt sintetasas en la sfntesis de protefnas. Hasta que se descubrio el paradigma fisiocrino, las aminoacil-ARNt sintetasas, una familia de aproximadamente 20 enzimas, eran conocidas solo por su expresion ubicua en todas las celulas vivas, y su papel esencial en el proceso de sfntesis de protefnas. Sin embargo, hallazgos cientfficos mas recientes sugieren ahora que las aminoacil-ARNt sintetasas poseen funciones adicionales mas alla de la sfntesis de protefnas y, de hecho, han evolucionado en organismos multicelulares para desempenar importantes papeles homeostaticos en la fisiologfa y las enfermedades de los tejidos.
Los indicios de la existencia de la funcion no canonica de las AARS incluye comparaciones de secuencias bien definidas que establecen que, durante la evolucion de organismos unicelulares simples a formas de vida mas complejas, las AARS han evolucionado para ser mas estructuralmente complejas a traves de la adicion de dominios adjuntos, sin perder la capacidad de facilitar la sfntesis de protefnas.
De forma coherente con esta hipotesis, se ha descubierto un conjunto rico y diverso de funciones expandidas para las AARS en eucariotas superiores, y en particular para ARNt sintetasas humanas. Estos datos, que se basan tanto en el analisis directo de los dominios individuales como en el descubrimiento de mutaciones en los genes de las ARNt sintetasas que estan vinculadas causalmente a la enfermedad, pero que no afectan la actividad de aminoacilacion o de sfntesis de protefnas, sugieren que estos dominios recien adjuntados o fisiocrinas son fundamentales para las funciones no canonicas recien adquiridas de las AARS.
Adicionalmente, existe un creciente reconocimiento de que las ARNt sintetasas especfficas, tales como la histidil-ARNt sintetasa (HRS), pueden ser liberadas o secretadas por las celulas vivas y pueden proporcionar importantes senales de accion local con propiedades inmunomoduladoras, quimiotacticas y angiogenicas. La confirmacion directa del papel de las AARS como moleculas de senalizacion extracelular se ha obtenido a traves de estudios que muestran la secrecion y la liberacion extracelular de ARNt sintetasas especfficas, asf como la demostracion directa de que la adicion de fragmentos de las ARNt sintetasas que comprenden los dominios recien adjuntados (fisiocrinas), pero no otros fragmentos que carecen de estos dominios, estan activos en una gama de vfas de senalizacion extracelular. Estas fisiocrinas, tales como la HRS, representan una oportunidad nueva y sin explotar previamente para desarrollar nuevas protefnas terapeuticas de primera clase para tratar enfermedades humanas. Para explotar de la mejor manera estas y otras actividades en entornos terapeuticos o de diagnostico, existe una necesidad en la tecnica de polipeptidos de HRS que tengan propiedades farmacocineticas mejoradas. Estas formas terapeuticas mejoradas de los polipeptidos de h Rs permiten el desarrollo de regfmenes terapeuticos mas eficaces para el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos, y requieren una administracion significativamente menos frecuente que las protefnas no modificadas.
El documento WO 2010/107825 se refiere a variantes de splicing de histidil-ARNt sintetasa que pueden conjugarse con un enlazador u otra secuencia, tal como una region Fc de inmunoglobulina.
El documento WO 2011/072265 se refiere a histidil-ARNt sintetasas para tratar la inflamacion y que pueden fusionarse con una region Fc para mejorar las caracterfsticas deseadas, tales como el aumento de la semivida en circulacion y la mejora del direccionamiento in vivo.
El documento WO2013/123432 se refiere a polipeptidos de histidil-ARNt sintetasa que pueden fusionarse con dominios Fc de anticuerpos y usarse para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.
El documento US 2014/066321 se refiere a polipeptidos variantes de histidil-ARNt sintetasa que pueden fusionarse a regiones Fc y que pueden ser utiles para la terapia y el descubrimiento de farmacos.
El documento Carter y col. Experimental cell research, academic press 2011, 1261-1269 divulga la tecnica de fusion de protefnas y peptidos a un dominio Fc de una inmunoglobulina con el fin de mejorar sus propiedades farmacocineticas y biologicas.
El documento Huang y col. Current opinion in biotechnology 2009, 692-699 se refiere a la terapeutica de fusion de receptor-Fc y divulga los diferentes enfoques para disenar protefnas de fusion Fc.
El documento Haussermann y col. Pneumologie 2010, 496-503 divulga la relacion de histidil-ARNt con ciertas enfermedades tales como una forma especffica de miositis con enfermedad pulmonar intersticial.
El documento Levine y col. Current opinion in rheumatology 2003, 708-713 se refiere a respuestas inmunitarias antiaminoacil ARNt sintetasa y divulga los enlaces entre las moleculas de ARS, la inflamacion y la apoptosis.
El documento US 2011/086058 se refiere a composiciones inmunogenas para prevenir la infeccion con virus de la gripe y divulga las composiciones inmunogenas tales como hemaglutinina de un virus de la gripe y un inmunopotenciador tal como un fragmento Fc de IgG humana.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 ilustra la composicion estructural de una inmunoglobulina ejemplar, y proporciona una vision general de las clases y subclases de anticuerpos.
La figura 2 muestra un alineamiento de las regiones Fc de IgA1 (SEQ ID NO:156), IgA2 (SEQ ID NO:157), IgM (SEQ ID NO:158), IgG1 (SEQ ID NO:159), IgG2 (SEQ ID NO:160), IgG3 (SEQ ID NO:161), IgG4 (SEQ ID NO:162) e IgE (SEQ ID NO:163) humanas. La estructura secundaria de Fca se muestra por encima de las secuencias. Los signos de intercalacion (A) y los asteriscos (*) muestran residuos que contribuyen respectivamente al 0-4 % y al 5­ 12 % de la superficie de union.
La figura 3 muestra los resultados del analisis SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras de HRS de longitud completa y HRS(1-506). Los resultados muestran que HRS(1-506) reduce drasticamente la formacion de la formacion de enlaces entre cadenas mediada por disulfuro en comparacion con la protefna de longitud completa. Las muestras (10 p g) se cargaron en un gel Bis-Tris al 4-12 %, utilizando un tampon de desplazamiento MOPS-SDS.
La figura 4 muestra las propiedades antiinflamatorias de un polipeptido derivado de HRS ejemplar en un modelo de colitis en raton inducida por TNBS. Los estudios se realizaron en ratones BDF-1 macho, con 12 ratones/grupo. Se anadieron TNBS y budesonida a 5 mg/kg al agua. La HRS(1-60) (Resokine, (HisRSN4)) se administro diariamente mediante inyeccion IV, comenzando 3 dfas antes del tratamiento con TNBS, a una concentracion de 1 o 5 mg/kg. Esta figura muestra el porcentaje (%) de supervivencia de ratones tratados y no tratados durante aproximadamente 80 horas.
La figura 5A muestra el regimen de dosificacion usado para evaluar la utilidad terapeutica de HRS (1-506) en el modelo de miopatfa de estatina. Los grupos de dosificacion de tratamiento incluyeron vehfculo (n = 11), 0,3 mg/kg HRS(1-506) (n = 8), 1,0 mg/kg HRS(1-506) (n = 8), 3,0 mg/kg HRS(1-506) (n = 8); La figura 5B muestra los resultados de las mediciones de troponina C despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg. La figura muestra el efecto positivo de HRS (1-506) en la reduccion de la induccion de troponina C inducida por estatinas.
La figura 6A muestra los resultados de las mediciones de CK despues de 12 dfas de tratamiento con estatinas /-HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg; La figura 6B muestra los mismos datos despues de 15 dfas de tratamiento. La figura muestra el efecto positivo de HRS(1-506) en la reduccion de los niveles de CK inducidos por estatinas.
La figura 7 muestra los niveles de HARS circulante despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas en comparacion con el control con vehfculo. La figura muestra que las estatinas inducen la liberacion de HARS extracelular.
La figura 8 muestra imagenes representativas de H&E de secciones de isquiotibiales a 10 aumentos despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 9 muestra los resultados del perfil de expresion genica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina. Los datos muestran cambios en la expresion de 137 genes seleccionados para rastrear los marcadores musculares y la funcion de las celulas inmunitarias, la inflamacion, el estado metabolico, la recuperacion de tejidos, el crecimiento y la atrofia musculares. Los valores de expresion genica se normalizaron respecto a genes de referencia y se representaron como cambio de veces frente al grupo tratado con vehfculo.
La figura 10A muestra los resultados del perfil de expresion genica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina. Los datos muestran cambios en la expresion de 137 genes (como en la figura 7) para comparar los cambios relativos en la expresion genica de animales tratados con estatina en comparacion con animales tratados con vehfculo. La figura 10B muestra los cambios relativos en la expresion genica de los animales tratados con estatina que tambien se trataron con HRS(1-506) en comparacion con los animales tratados con estatina sola.
La figura 11 muestra los resultados del perfil de expresion genica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 10 genes relacionados con diabetes/sfndrome metabolico despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /-HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 12 muestra los resultados del perfil de expresion genica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 26 genes marcadores de celulas inmunitarias despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1.0 y 3,0 mg/kg.
Las figuras 13A-D muestran los resultados del perfil de expresion genica de los genes CD11a, CD11b, CD8a y CD8b en isquiotibiales de ratas tratadas con estatina despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
Las figuras 14A-C muestran los resultados del perfil de expresion genica de los genes CD18, CCR5 y CD45R en isquiotibiales de ratas tratadas con estatina despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1.0 y 3,0 mg/kg.
La figura 15 muestra los resultados del perfil de expresion genica de 17 genes marcadores inflamatorios en isquiotibiales de ratas tratadas con estatina despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1.0 y 3,0 mg/kg.
Las figuras 16A-D muestran los resultados del perfil de expresion genica de las citocinas inflamatorias IL-6, MCP1, IL-10 e interferon-gamma (IFN-y) en isquiotibiales de ratas tratadas con estatina despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 17 muestra los resultados del perfil de expresion genica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 14 genes relacionados con la adhesion, el desarrollo y la fibrosis despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /-HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 18 muestra los resultados del perfil de expresion genica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 14 genes relacionados con atrofia/atrofia progresiva musculares despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /-HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 19A muestra los resultados del perfil de expresion genica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 14 genes relacionados con atrofia/atrofia progresiva musculares despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg. La figura 19B muestra cambios especfficos en MMP-3, y la figura 19C muestra cambios especfficos en la expresion del gen MMP-9 en las mismas condiciones.
La figura 20 muestra los resultados del perfil de expresion genica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 29 genes relacionados con la miogenesis despues de 15 dfas de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 21 muestra los resultados del analisis SDS-PAGE de protefnas de fusion Fc purificadas. Carril 1: vease escalera de protefnas Blue Plus2 (Life Technologies). Carriles 2 y 6: Fc-HRS (2-60) n.° de lote 472. Carriles 3 y 7: HRS (1-60)-Fc n.° de lote 473. Carriles 4 y 8: Fc-HRS (2-60) n.° de lote 480. Carriles 5 y 9: HRS (1-60)-Fc n.° de lote 482. Los carriles 2-5 se desplazaron en condiciones no reducidas, y los carriles 6-9 en condiciones reducidas.
La figura 22. Muestra un analisis analftico por HPLC de exclusion por tamano de la fusion Fc-HRS (2-60) representativa purificada despues de cromatograffa con protefna A, de intercambio cationico y con hidroxiapatita (superposicion de inyecciones duplicadas). La pureza es el 99,2 % del pico principal y el 0,8 % de especies de alto peso molecular (HMW).
La figura 23A muestra el tiempo frente a la concentracion de HRS(1-60) despues de inyeccion intravenosa o subcutanea a ratones. La figura 23B muestra el tiempo frente a la concentracion de Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc despues de inyeccion intravenosa a ratones. La figura 23C muestra el tiempo frente a la concentracion de Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc despues de inyeccion subcutanea a ratones.
La figura 24A muestra las puntuaciones del fndice de actividad de la enfermedad (DAI) en el sacrificio en ratones tratados con diferentes protefnas de fusion HRS-Fc. Las barras representan la media de DAI (± SEM) para cada grupo de tratamiento. El DAI incorpora informacion sobre el sangrado y la diarrea junto con una puntuacion para la perdida de peso. La figura 24B muestra la relacion peso:longitud del colon en el sacrificio en ratones tratados con compuestos. Las barras representan la relacion media (± SEM) para cada grupo de tratamiento.
La figura 25 muestra una vision general de los cambios transcripcionales en el estudio con TNBS. Se muestran cambios transcripcionales relativos en animales tratados con TNBS (grupo 2), animales tratados con TNBS y budesonida (grupo 3), TNBS y artfculo de prueba A (HRS(1-60); grupo 4) y Tn BS y artfculo de prueba B (Fc-HRS(2-60); grupos 5 y 6) despues de la normalizacion respecto a animales sin tratamiento previo (grupo 1). Cada punto en el diagrama de dispersion representa un gen medido. 7 genes en el grupo 2 fueron regulados positivamente mas de 10 veces (IL6, IL1b, MCP-1, MMP3, MMP9, CD11b e IL10).
Las figuras 26A-26H muestran los genes relacionados con respuestas inmunitaria e inflamatoria regulados positivamente por TNBS. Se muestran cambios transcripcionales relativos de genes individuales en animales tratados con TNBS (grupo 2), animales tratados con TNBS y budesonida (grupo 3), TNBS y artfculo de prueba A (HRS(1-60); grupo 4) y TNBS y artfculo de prueba B (Fc-HRS(2-60); grupos 5 y 6) despues de la normalizacion respecto a animales sin tratamiento previo (grupo 1). Cada punto en el diagrama de dispersion representa la abundancia del gen de interes en cada animal dentro del grupo. La significacion se calculo usando la prueba de la t de Student, donde * = valor p < 0,05 y ** = valor p < 0,01.
Las figuras 27A-27D muestran los porcentajes relativos de diferentes poblaciones de linfocitos T en los bazos de ratones sin tratamiento previo o ratones tratados por via intracolonica con TNBS para inducir colitis experimental, tratados con TNBS ± 0,5 mg/kg de Fc-HRS (2-60). Se muestra el porcentaje de linfocitos vivos tenidos para (27A) CD3, (27B) CD8, (27C) CD4 y (27D) CD25 y FoxP3. Los linfocitos Treg se acotaron adicionalmente en linfocitos CD4+.
BREVE RESUMEN
Las realizaciones de la presente descripcion se refieren, en general, a conjugados polipeptfdicos de histidil-ARNt sintetasa (HRS) que tienen una o mas regiones Fc de inmunoglobulina unidas covalentemente a los mismos, composiciones farmaceuticas que comprenden dichas moleculas, procedimientos de fabricacion y procedimientos para su uso terapeutico. Entre otras ventajas, los conjugados HRS-Fc de la presente descripcion pueden poseer propiedades farmacocineticas mejoradas y/o actividades biologicas terapeuticamente relevantes mejoradas, con respecto a los polipeptidos de HRS no modificados correspondientes.
Ciertas realizaciones de la presente descripcion incluyen, por lo tanto, polipeptidos de fusion HRS, que comprenden un polipeptido de HRS que comprende una secuencia de aminoacidos al menos el 80 % identica a una cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o una secuencia de cualquiera de las tablas D1, D3-D6 o D8, y al menos una region Fc fusionada con el extremo C, el extremo N o ambos, del polipeptido de HRS. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoacidos al menos el 90 % identico a cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o una secuencia de cualquiera de las tablas D1, D3-D6 o D8. En realizaciones particulares de la presente descripcion, el polipeptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o una secuencia de cualquiera de las tablas D1, D3-D6 o D8.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, el polipeptido de HRS comprende los residuos de aminoacidos 2-40, 2-45, 2-50, 2-55, 2-60, 2-66 o 1-506 de la SeQ iD NO:1, o una secuencia de aminoacidos al menos el 90 % identica a los residuos 2-40, 2-45, 2-50, 2-55, 2-60, 2-66 o 1-506 de la SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 40-80 aminoacidos y comprende los residuos 2-45 de la SEQ ID NO:1. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, el polipeptido de HRS consiste o consiste esencialmente en los residuos de aminoacidos 2-40, 2-45, 2­ 50, 2-55, 2-60, 2-66 o 1-506 de la SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, al menos un residuo de cistefna endogeno del polipeptido de HRS se ha sustituido con otro aminoacido o se ha eliminado. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el al menos un residuo de cistefna endogeno se selecciona de entre Cys174, Cys191, Cys224, Cys235, Cys507 y Cys509. En realizaciones particulares de la presente descripcion, el al menos un residuo de cistefna endogeno se selecciona de entre Cys224, Cys235, Cys507 y Cys509. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, los residuos de cistefna endogenos son Cys507 y Cys509. En algunas realizaciones de la presente descripcion, todos los residuos de cistefna expuestos en la superficie endogenos se han sustituido con otro aminoacido o se han eliminado.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS se repite en tandem. En realizaciones particulares de la presente descripcion, el polipeptido de h Rs comprende un dominio WHEP. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, el polipeptido de HRS carece de un dominio de aminoacilacion funcional. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS consiste esencialmente en un dominio WHEP. En aspectos especfficos de la presente descripcion, el dominio WHEP de un polipeptido de HRS o variante o fragmento del mismo tiene la secuencia de consenso en la tabla D5.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc y el polipeptido de HRS estan separados por un enlazador peptfdico. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el enlazador peptfdico tiene aproximadamente 1-200 aminoacidos, 1-150 aminoacidos, 1-100 aminoacidos, 1-90 aminoacidos, 1-80 aminoacidos, 1-70 aminoacidos, 1 -60 aminoacidos, 1-50 aminoacidos, 1-40 aminoacidos, 1-30 aminoacidos, 1-20 aminoacidos, 1­ 10 aminoacidos o 1-5 aminoacidos de longitud. En realizaciones particulares de la presente descripcion, el enlazador peptfdico tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoacidos de longitud. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el enlazador peptfdico consiste en residuos de Gly y/o Ser. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el enlazador peptfdico es un enlazador fisiologicamente estable. En otras realizaciones de la presente descripcion, el enlazador peptfdico es un enlazador liberable, opcionalmente un enlazador escindible enzimaticamente. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, el enlazador peptfdico comprende una secuencia de una cualquiera de las s Eq ID NO:200-260, u otro enlazador peptfdico descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc se fusiona con el extremo C del polipeptido de HRS. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc se fusiona con el extremo N del polipeptido de HRS.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc comprende uno o mas de un dominio bisagra, CH2, CH3 y/o CH4 de una IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y/o IgM de mamffero. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc comprende los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc comprende los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG2. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc comprende los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG3. En realizaciones particulares de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS no comprende las regiones CH1, Cl, Vl y Vh de una inmunoglobulina.
En realizaciones especfficas de la presente descripcion, la region Fc comprende una cualquiera de las SEQ ID NOS:128-163 o 339-342, o una variante, o un fragmento, o una combinacion de los mismos. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el dominio bisagra es un dominio bisagra de IgG1 modificado que comprende la SEQ ID NO:341.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, la region Fc comprende una secuencia de aminoacidos al menos el 90 % identica a m s d k t h t c p p c p a p e llg g p s v f lf p p k p k d t lm is r t p e v t c v v v d v s h e d p e v k f n w y v d g v e v h n a k t k p r e e q y n s t y r v v s v lt v lh q d w ln g k e y k c k v s n k a lp a p ie k t is k a k g q p r e p q v y t lp p s r e e m t k n q v s lt c lv k g f y p s d ia v e w e s n g q p e n n y k t t p p v l d s d g s f f ly s k lt v d k s r w q q g n v f s c s v m h e a lh n h y t q k s ls ls p g k (SEQ ID NO:339) o s d k t h t c p p c p a p e llg g p s v f lf p p k p k d t lm is r t p e v t c v v v d v s h e d p e v k f n w y v d g v e v h n a k t k p r e e q y n s t y r v v s v lt v lh q d w ln g k e y k c k v s n k a lp a p ie k t is k a k g q p r e p q v y t lp p s r e e m t k n q v s lt c lv k g f y p s d ia v e w e s n g q p e n n y k t t p p v l d s d g s f f ly s k lt v d k s r w q q g n v f s c s v m h e a lh n h y t q k s ls ls p g k (SEQ ID NO:340).
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS-Fc comprende una secuencia de aminoacidos al menos el 90 % identica a Fc-HRS(2-60) (SEQ ID NO:337), o HRS(1-60)-Fc (SEQ ID NO:338), o Fc-HRS(2-40) (SEQ ID NO:381), o HRS(1-40)-Fc (SEQ ID NO:386), o Fc-HRS(2-45) (SEQ ID NO:382), o HRS(1-45)-Fc (SEQ ID NO:387), o Fc-HRS(2-50) (SEQ ID NO:383), o HRS(1-50)-Fc (SEQ ID NO:388), o Fc-HRS(2-55) (SEQ ID NO:384), o HRS(1-55)-Fc (SEQ ID NO:389), o Fc-HRS(2-66) (SEQ ID NO:385), o HRS(1-66)-Fc (SEQ ID NO:390), o Fc-HRS(2-60) HRS(2-60) (SEQ ID NO:396).
En ciertos aspectos, el polipeptido de fusion HRS tiene farmacocinetica alterada con respecto a un polipeptido de HRS correspondiente. Los ejemplos de dicha farmacocinetica alterada incluyen una mayor semivida en suero, mayor biodisponibilidad, mayor exposicion y/o disminucion del aclaramiento. En ciertos aspectos, la exposicion aumenta en al menos 100 veces. En algunos aspectos, el polipeptido de fusion HRS tiene una semivida de al menos 30 horas en ratones. En ciertos aspectos, la biodisponibilidad es una biodisponibilidad subcutanea que aumenta en al menos aproximadamente un 30 %. En algunos aspectos, el polipeptido de fusion HRS tiene una actividad efectora inmunitaria alterada en relacion con un polipeptido de HRS correspondiente. Los ejemplos de dichas actividades efectoras inmunitarias incluyen una o mas de activacion del complemento, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC) o fagocitosis mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCP).
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc comprende una region Fc variante, con respecto a una region Fc de tipo silvestre. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc variante comprende una secuencia que es al menos el 90 % identica a cualquiera de las SEQ ID NO:128-163 o 341, o una combinacion de dichas secuencias. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc variante comprende un hfbrido de una o mas regiones Fc de diferentes especies, diferentes clases de Ig o diferentes subclases de Ig. En realizaciones particulares de la presente descripcion, la region Fc variante comprende un hfbrido de uno o mas dominios bisagra, CH2, CH3 y/o CH4 de regiones Fc de diferentes especies, diferentes clases de Ig y/o diferentes subclases de Ig.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc variante es una glucoforma modificada, con respecto a una region Fc de tipo silvestre correspondiente. En realizaciones particulares de la presente descripcion, la region Fc variante tiene una farmacocinetica alterada con respecto a una region Fc de tipo silvestre correspondiente. Los ejemplos de dicha farmacocinetica alterada incluyen semivida en suero, biodisponibilidad y/o aclaramiento. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc variante tiene una actividad efectora alterada con respecto a una region Fc de tipo silvestre correspondiente. Los ejemplos de dichas actividades efectoras incluyen una o mas de activacion del complemento, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC), o fagocitosis mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCP).
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc variante tiene una union alterada a uno o mas receptores de Fcy, con respecto a una region Fc de tipo silvestre correspondiente. Los receptores de Fcy ejemplares se describen en el presente documento y se conocen en la tecnica.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc variante tiene union alterada a uno o mas receptores FcRn, con respecto a una region Fc de tipo silvestre correspondiente. Los receptores FcRn ejemplares se describen en el presente documento y se conocen en la tecnica.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc variante tiene solubilidad alterada (por ejemplo, aumentada), con respecto a una region Fc de tipo silvestre correspondiente, y el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene solubilidad alterada, con respecto a un polipeptido de HRS no modificado correspondiente.
En realizaciones especfficas de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS-Fc esta sustancialmente en forma dimerica en una solucion fisiologica, o en otras condiciones fisiologicas, tales como condiciones in vivo. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene sustancialmente la misma estructura secundaria que un polipeptido de HRS no modificado o modificado de forma diferente correspondiente, de acuerdo con se determina mediante un analisis de dicrofsmo circular UV.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene un perfil de AUC farmacocinetico en plasma o suero al menos 5 veces mayor que un polipeptido de HRS no modificado correspondiente cuando se administra a un mamffero.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene sustancialmente la misma actividad que un polipeptido de HRS no modificado o modificado de forma diferente correspondiente, en un ensayo de actividad antiinflamatoria.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene mas de 2 veces la actividad de un polipeptido de h Rs no modificado o modificado de forma diferente correspondiente, en un ensayo de actividad antiinflamatoria.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene una estabilidad que es al menos un 30 % mayor que un polipeptido de HRS no modificado o modificado de forma diferente correspondiente, cuando se comparan en condiciones similares a temperatura ambiente, durante 7 dfas en PBS a pH 7,4.
Los ejemplos especfficos de polipeptidos de fusion HRS-Fc pueden comprender al menos una de las SEQ ID NO:107-110 o 337-338 o 349-350 o 381-390 o 396, o una secuencia de aminoacidos al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % identica a la SEQ ID NO:107-110 o 337-338 o 349-350 o 381-390 o 396. Las SEQ ID NO:107 y 338 son las secuencias de aminoacidos de polipeptidos de fusion Fc C-terminales ejemplares respecto a los residuos 1-60 de la SEQ ID NO:1 (HRS(1-60)_Fc); las SEQ ID NOS:108 y 337 son las secuencias de aminoacidos de los polipeptidos de fusion Fc N-terminales ejemplares respecto a los residuos 1-60 de la SEQ ID NO:1 (Fc_HRS(1-60)); la SEQ ID NO:109 es la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de fusion Fc C-terminal ejemplar respecto a los residuos 1-506 de la SEQ ID NO:1 (HRS(1-506)_Fc); y la s Eq ID NO:110 es la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de fusion Fc N-terminal ejemplar respecto a los residuos 1-506 de la SEQ ID NO:1 (Fc_HRS(1-506)).
En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene una actividad antiinflamatoria, por ejemplo, en un ensayo basado en celulas o tras la administracion a un sujeto.
Tambien se incluyen composiciones, por ejemplo, composiciones farmaceuticas o terapeuticas, que comprenden un polipeptido de fusion HRS-Fc descrito en el presente documento y un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable o de calidad farmaceutica. En algunas composiciones, el polipeptido es al menos aproximadamente un 95 % puro y menos de aproximadamente un 5 % agregado. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la composicion se formula para administracion por via oral, subcutanea, intranasal, pulmonar o parental. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la composicion comprende un vehfculo de administracion seleccionado del grupo que consiste en liposomas, micelas, emulsiones y celulas.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, la composicion es para uso en a) tratar una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria, b) reducir la inflamacion muscular o pulmonar asociada opcionalmente con una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, c) inducir tolerancia a un autoantfgeno de histidil-ARNt sintetasa (HRS), d) eliminar un conjunto o subconjunto de linfocitos T implicados en una respuesta autoinmunitaria a un autoantfgeno de HRS, e) reducir la inflamacion tisular en un sujeto, opcionalmente de tejido, muscular, pulmonar y/o cutaneo, f) tratar una distrofia muscular, g) tratar rabdomiolisis, atrofia muscular progresiva, caquexia, inflamacion muscular o lesion muscular, y/o h) tratar una enfermedad asociada con un autoanticuerpo.
Tambien se incluyen regfmenes de dosificacion que mantienen una concentracion promedio en situacion de equilibrio de un polipeptido de fusion histidil-ARNt sintetasa (HRS)-Fc en el plasma de un sujeto de entre aproximadamente 300 pM y aproximadamente 1000 nM cuando se usa un intervalo de dosificacion de 3 dfas o mas, que comprende administrar al sujeto una composicion terapeutica o un polipeptido de fusion HRS-Fc descritos en el presente documento.
Algunas realizaciones de la presente descripcion incluyen procedimientos para mantener niveles de polipeptido de fusion histidil-ARNt sintetasa (HRS)-Fc por encima del nivel terapeutico efectivo mfnimo en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composicion terapeutica o un polipeptido de fusion HRS-Fc descritos en el presente documento.
Tambien se incluyen procedimientos para tratar una enfermedad o afeccion inflamatoria o autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composicion terapeutica o un polipeptido de fusion HRS-Fc descritos en el presente documento.
Algunas realizaciones de la presente descripcion incluyen procedimientos para reducir la inflamacion muscular o pulmonar asociada con una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composicion terapeutica o un polipeptido de fusion HRS-Fc descritos en el presente documento.
Ciertas realizaciones de la presente descripcion incluyen procedimientos para inducir tolerancia a un autoantfgeno de histidil-ARNt sintetasa (HRS) en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composicion terapeutica o un polipeptido de fusion HRS-Fc descritos en el presente documento.
Algunas realizaciones de la presente descripcion incluyen procedimientos para eliminar un conjunto o subconjunto de linfocitos T implicados en una respuesta autoinmunitaria a un autoantfgeno de histidil-ARNt sintetasa (HRS) en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composicion terapeutica o un polipeptido de fusion HRS-Fc descritos en el presente documento.
Tambien se incluyen procedimientos de reduccion de la inflamacion tisular en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composicion terapeutica o un polipeptido de fusion HRS-Fc descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el tejido se selecciona de entre musculo, intestino, cerebro, pulmon y piel.
Algunas realizaciones de la presente descripcion incluyen procedimientos de tratamiento de una distrofia muscular en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composicion terapeutica o un polipeptido de fusion HRS-Fc descritos en el presente documento. En realizaciones particulares de la presente descripcion, la distrofia muscular se selecciona de entre distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular de la cintura y los miembros, distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia miotonica, distrofia muscular oculofarfngea, distrofia muscular distal y distrofia muscular congenita.
Ciertas realizaciones de la presente descripcion incluyen procedimientos de tratamiento de rabdomiolisis, atrofia muscular progresiva, caquexia, inflamacion muscular o lesion muscular en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composicion terapeutica o un polipeptido de fusion HRS-Fc descritos en el presente documento.
Algunas realizaciones de la presente descripcion incluyen procedimientos de tratamiento de una enfermedad asociada con un autoanticuerpo, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composicion o un polipeptido AARS/HRS descritos en el presente documento. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en miopatfas inflamatorias, incluyendo miopatfas inflamatorias, polimiositis, dermatomiositis y trastornos relacionados, superposicion de polimiositis-esclerodermia, miositis por cuerpos de inclusion (MCI), sfndrome anti-sintetasa, enfermedad pulmonar intersticial, artritis y fenomeno de Reynaud. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la composicion se administra al sujeto antes de la aparicion de los sfntomas de la enfermedad. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el autoanticuerpo es especffico para histidil-ARNt sintetasa. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS comprende al menos un epftopo de la histidil-ARNt sintetasa reconocido por el autoanticuerpo especffico de la enfermedad. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el epftopo es un epftopo inmunodominante reconocido por anticuerpos en sueros del sujeto. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS bloquea la union del autoanticuerpo a la histidil-ARNt sintetasa nativa. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS causa la eliminacion clonal de linfocitos T autorreactivos. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS causa la inactivacion funcional de los linfocitos T implicados en la respuesta autoinmunitaria. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la administracion del polipeptido de HRS da como resultado una inflamacion reducida de los musculos o los pulmones. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS induce tolerancia a un autoantfgeno.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la composicion se formula para administracion por via oral, intranasal, pulmonar, intramuscular o parental.
Tambien se incluyen polinucleotidos aislados, que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica un conjugado o polipeptido de fusion HRS-Fc descrito en el presente documento, incluyendo vectores que comprenden dichos polinucleotidos y celulas huesped que comprenden dichos polinucleotidos y/o vectores.
Algunas realizaciones de la presente descripcion incluyen procedimientos para fabricar un polipeptido de fusion HRS-Fc descrito en el presente documento, que comprenden a) cultivar una celula huesped (por ejemplo, una celula huesped de E. coli K-12) para expresar un polipeptido de fusion HRS-Fc, donde la celula huesped comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido de fusion HRS-Fc descrito en el presente documento, que esta unido operativamente a un elemento regulador; y b) aislar el polipeptido de fusion HRS-Fc a partir de la celula huesped. En realizaciones espedficas de la presente descripcion, la cepa de E. coli K-12 se selecciona de entre W3110 y UT5600.
DESCRIPCION DETALLADA
La invencion se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realizacion que no este dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invencion. La puesta en practica de la presente descripcion empleara, a menos que se indique espedficamente lo contrario, procedimientos convencionales de biologfa molecular y tecnicas de ADN recombinante dentro del alcance de la tecnica, muchos de los cuales se describen a continuacion con fines ilustrativos. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a Edicion, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 5a Ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3a Edicion 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3a Edicion 2005). Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, 1997; Veronese, F., and J.M. Harris, Eds., Peptide and protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews, 54(4) 453-609 (2002); Zalipsky, S., y col., «Use of functionalized Poly(Ethylene Glycols) for modification of polypeptides» en Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comunmente por los expertos en la materia a los que pertenece la presente descripcion. Aunque puede usarse cualquier procedimiento y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la puesta en practica o a prueba de la presente descripcion, se describen procedimientos y materiales preferidos. Para los fines de la presente descripcion, los siguientes terminos se definen a continuacion. Los artmulos «un» y «una» se usan en el presente documento para referirse a uno o mas de uno (es decir, al menos a uno) del objeto gramatical del artmulo. A modo de ejemplo, «un elemento» significa un elemento o mas de un elemento.
Por «aproximadamente» se entiende una cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud que vana hasta el 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % respecto a una cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud de referencia.
Como se usa en el presente documento, el termino «aminoacido» pretende significar tanto aminoacidos de origen natural como de origen no natural, asf como analogos y mimeticos de aminoacidos. Los aminoacidos de origen natural incluyen los 20 (L)-aminoacidos utilizados durante la biosmtesis de protemas, asf como otros tales como 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, homocistema, citrulina y ornitina, por ejemplo. Los aminoacidos de origen no natural incluyen, por ejemplo, (D)-aminoacidos, norleucina, norvalina, p-fluorofenilalanina, etionina y similares, que son conocidos por los expertos en la materia. Los analogos de aminoacidos incluyen formas modificadas de aminoacidos de origen natural y de origen no natural. Dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, la sustitucion o reemplazo de grupos y restos qmmicos en el aminoacido o por derivatizacion del aminoacido. Los mimeticos de aminoacidos incluyen, por ejemplo, estructuras organicas que exhiben propiedades funcionalmente similares tales como caractensticas de carga y separacion de carga del aminoacido de referencia. Por ejemplo, una estructura organica que imita a la arginina (Arg o R) tendna un resto con carga positiva ubicado en un espacio molecular similar y que tiene el mismo grado de movilidad que el grupo e-amino de la cadena lateral del aminoacido Arg natural. Los mimeticos tambien incluyen estructuras restringidas para mantener la separacion y las interacciones de carga optimas del aminoacido o de los grupos funcionales del aminoacido. Los expertos en la materia saben o pueden determinar que estructuras constituyen analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos funcionalmente equivalentes.
Como se usa en el presente documento, un sujeto «en riesgo» de desarrollar una enfermedad o reaccion adversa puede o no tener una enfermedad detectable, o smtomas de la enfermedad, y puede o no haber mostrado una enfermedad detectable o smtomas de la enfermedad antes de los procedimientos de tratamiento descritos en el presente documento. «En riesgo» denota que un sujeto tiene uno o mas factores de riesgo, que son parametros medibles que se correlacionan con el desarrollo de una enfermedad, como se describe en el presente documento y se conoce en la tecnica. Un sujeto que tenga uno o mas de estos factores de riesgo tiene una mayor probabilidad de desarrollar una enfermedad, o una reaccion adversa, que un sujeto sin uno o mas de estos factores de riesgo.
Una «enfermedad autoinmunitaria» como se usa en el presente documento es una enfermedad o trastorno que surge de y esta dirigida contra los propios tejidos de un individuo. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios incluyen, aunque sin limitarse a, respuestas inflamatorias tales como enfermedades inflamatorias de la piel que incluyen psoriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atopica); esclerodermia y esclerosis sistemicas; respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria intestinal (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa); sfndrome de dificultad respiratoria (incluyendo sfndrome de dificultad respiratoria del adulto; SDRA); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveitis colitis; glomerulonefritis; afecciones alergicas tales como eccema y asma y otras afecciones que implican la infiltracion de linfocitos T y respuestas inflamatorias cronicas; aterosclerosis; deficiencia de adhesion de leucocitos; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistemico (LES); diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus tipo I o diabetes mellitus dependiente de insulina); esclerosis multiple; sfndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmunitaria; encefalomielitis alergica; sfndrome de Sjorgen; diabetes de inicio juvenil; y respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T que se encuentran tfpicamente en la tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, miopatfas inflamatorias, enfermedad pulmonar intersticial, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison); enfermedades que implican diapedesis leucocitaria; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC); sfndrome de lesion multiorganca; anemia hemolftica (que incluye, aunque sin limitarse a, crioglobinemia o anemia positiva de Coombs); miastenia grave; enfermedades mediadas por el complejo antfgeno-anticuerpo; enfermedad de la membrana basal anti­ glomerular; sfndrome anti-fosfolfpido; neuritis alergica; enfermedad de Graves; sfndrome miastenico de Lambert-Eaton; penfigoide bulloso; penfigo; poliendocrinopatfas autoinmunitarias; enfermedad de Reiter; sfndrome de la persona rfgida; enfermedad de Behcet; arteritis de celulas gigantes; nefritis por complejos inmunitarios; nefropatfa por IgA; polineuropatfas por IgM; purpura trombocitopenica inmunitaria (PTI) o trombocitopenia autoinmunitaria, etc.
En toda esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entendera que las palabras «comprenden», «comprende» y «que comprende» implican la inclusion de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos enunciados, pero no la exclusion de ninguna otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Por «que consiste en» se entiende que incluye, y se limita a, lo que sigue a la frase «que consiste en». Por lo tanto, la frase «que consiste en» indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, y que no puede haber otros elementos presentes. Por «que consiste esencialmente en» se entiende que incluye todos los elementos enumerados despues de la frase, y esta limitado a otros elementos que no interfieran en o contribuyan a la actividad o accion especificada en la presente descripcion para los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase «que consiste esencialmente en» indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no materialmente a la actividad o accion de los elementos enumerados.
El termino «eliminacion clonal» se refiere a la eliminacion (por ejemplo, perdida o muerte) de linfocitos T autorreactivos. La eliminacion clonal se puede conseguir de manera central en el timo, en la periferia, o en ambos.
El termino «conjugado» pretende referirse a la entidad formada como resultado de la union covalente de una molecula, por ejemplo, una molecula biologicamente activa (por ejemplo, polipeptido de HRS), a una region Fc de inmunoglobulina. Un ejemplo de un polipeptido conjugado es una «protefna de fusion» o «polipeptido de fusion», es decir, un polipeptido que se crea a traves de la union de dos o mas secuencias codificantes, que originalmente codificaron polipeptidos independientes; la traduccion de las secuencias codificantes unidas da como resultado un unico polipeptido de fusion, tfpicamente con propiedades funcionales derivadas de cada uno de los polipeptidos independientes.
La mencion «libre de endotoxinas» o «sustancialmente libre de endotoxinas» se refiere, en general, a composiciones, disolventes y/o recipientes que contienen, como maximo, cantidades traza (por ejemplo, cantidades que no tienen efectos fisiologicos clfnicamente adversos para un sujeto) de endotoxina, y preferentemente cantidades indetectables de endotoxina. Las endotoxinas son toxinas asociadas con ciertas bacterias, tfpicamente bacterias gram negativas, aunque las endotoxinas pueden encontrarse en bacterias gram positivas, tales como Listeria monocytogenes. Las endotoxinas mas prevalentes son lipopolisacaridos (LPS) o lipooligosacaridos (LOS) que se encuentran en la membrana externa de diversas bacterias gram negativas, y que representan una caracterfstica patogena central en la capacidad de estas bacterias para causar la enfermedad. Pequenas cantidades de endotoxina en los seres humanos pueden producir fiebre, una disminucion de la presion arterial y la activacion de la inflamacion y la coagulacion, entre otros efectos fisiologicos adversos.
Por lo tanto, en la produccion farmaceutica, a menudo es deseable eliminar la mayorfa o todos los rastros de endotoxina de medicamentos y/o recipientes de medicamentos, ya que incluso pequenas cantidades pueden causar efectos adversos en los seres humanos. Se puede usar un horno de despirogenacion para este fin, ya que tfpicamente se requieren temperaturas superiores a 300 °C para descomponer la mayorfa de las endotoxinas. Por ejemplo, basandose en el material de envasado primario, tal como jeringas o viales, la combinacion de una temperatura vftrea de 250 °C y un tiempo de mantenimiento de 30 minutos a menudo es suficiente para conseguir una reduccion de 3 log en los niveles de endotoxinas. Se contemplan otros procedimientos para eliminar endotoxinas, que incluyen, por ejemplo, procedimientos de cromatograffa y filtracion, como se describen en el presente documento y se conocen en la tecnica. Tambien se incluyen procedimientos para producir conjugados HRS-Fc y aislarlos de celulas eucariotas, tales como celulas de mamffero, para reducir, si no eliminar, el riesgo de que esten presentes endotoxinas en una composicion de la presente descripcion. Se prefieren los procedimientos de producir conjugados HRS-Fc y aislarlos a partir de celulas libres de suero.
Las endotoxinas pueden detectarse usando tecnicas de rutina conocidas en la tecnica. Por ejemplo, el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus, que usa sangre del cangrejo herradura, es un ensayo muy sensible para detectar la presencia de endotoxinas. En esta prueba, niveles muy bajos de LPS pueden causar una coagulacion detectable del lisado del limulus debido a una potente cascada enzimatica que amplifica esta reaccion. Las endotoxinas tambien se pueden cuantificar mediante un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA). Para estar sustancialmente libre de endotoxinas, los niveles de endotoxinas pueden ser inferiores a aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 UE/ml. Tfpicamente, 1 ng de lipopolisacarido (LPS) corresponde a aproximadamente 1-10 UE.
Como se usan en el presente documento, los terminos «funcion» y «funcional» y similares se refieren a una funcion biologica, enzimatica o terapeutica.
«Homologia» se refiere al porcentaje de aminoacidos que son identicos o constituyen sustituciones conservativas. La homologfa se puede determinar usando programas de comparacion de secuencias tales como GAP (Deveraux y col., Nucleic Acids Research. 12, 387-395, 1984). De esta manera, las secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente a las citadas en el presente documento podrfan compararse mediante la insercion de huecos en el alineamiento, determinandose dichos huecos, por ejemplo, mediante el algoritmo de comparacion usado por GAP.
Un enlazador «fisiologicamente estable» se refiere a un enlazador que es sustancialmente estable en agua o en condiciones fisiologicas (por ejemplo, condiciones de cultivo in vivo, in vitro, por ejemplo, en presencia de una o mas proteasas), es decir, no experimenta una reaccion de degradacion (por ejemplo, una reaccion degradable enzimaticamente) en condiciones fisiologicas en cualquier grado apreciable durante un perfodo de tiempo prolongado. En general, un enlazador fisiologicamente estable es uno que muestra una tasa de degradacion de menos de aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 4 % o aproximadamente el 5 % por dfa en condiciones fisiologicas.
Por «aislado» se entiende material que esta sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompanan en su estado nativo. Por ejemplo, un «peptido aislado» o un «polipeptido aislado» y similares, como se usan en el presente documento, incluye el aislamiento y/o la purificacion in vitro de una molecula peptfdica o polipeptfdica a partir de su entorno celular natural, y a partir de la asociacion con otros componentes de la celula; es decir, no esta significativamente asociado con sustancias in vivo.
La expresion «concentracion efectiva semimaxima» o «CE50» se refiere a la concentracion de un conjugado HRS-Fc descrito en el presente documento donde induce una respuesta a mitad de camino entre el valor inicial y el maximo despues de cierto tiempo de exposicion especificado; la CE50 de una curva de respuesta a la dosis graduada, por lo tanto, representa la concentracion de un compuesto a la que se observa el 50 % de su efecto maximo. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la CE50 de un agente proporcionado en el presente documento se indica en relacion con una actividad «no canonica», como se ha indicado anteriormente. La CE50 tambien representa la concentracion plasmatica requerida para obtener el 50 % de un efecto maximo in vivo. De manera similar, la «CE90» se refiere a la concentracion de un agente o composicion a la cual se observa el 90 % de su efecto maximo. La «CE90» se puede calcular a partir de la «CE50» y la pendiente de Hill, o se puede determinar a partir de los datos directamente, usando el conocimiento de rutina en la tecnica. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el valor de CE50 de un conjugado HRS-Fc es inferior a aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19,20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nM. Preferentemente, la composicion bioterapeutica tendra un valor de CE50 de aproximadamente 1 nM o menos.
La «semivida» de un conjugado HRS-Fc puede referirse al tiempo que tarda el conjugado en perder la mitad de su actividad farmacologica, fisiologica u otra, con respecto dicha actividad en el momento de la administracion al suero o tejido de un organismo, o con respecto a cualquier otro punto temporal definido. «Semivida» tambien puede referirse al tiempo que tarda la cantidad o la concentracion de un conjugado HRS-Fc en reducirse a la mitad de la cantidad de partida administrada al suero o tejido de un organismo, con respecto a dicha cantidad o concentracion en el momento de la administracion al suero o tejido de un organismo, o con respecto a cualquier otro punto temporal definido. La semivida puede medirse en suero y/o en uno o mas tejidos seleccionados.
El termino «enlace», «enlazador», «resto enlazador» o «L» se usa en el presente documento para referirse a un enlazador que se puede usar para separar un polipeptido de HRS de otro polipeptido de HRS y/o de una o mas regiones Fc. El enlazador puede ser fisiologicamente estable o puede incluir un enlazador liberable tal como un enlazador enzimaticamente degradable (por ejemplo, enlazadores escindibles proteolfticamente). En ciertos aspectos de la presente descripcion, el enlazador puede ser un enlazador peptfdico, por ejemplo, como parte de una protefna de fusion HRS-Fc. En algunos aspectos de la presente descripcion, el enlazador puede ser un enlazador no peptfdico.
Los terminos «modular» y «alterar» incluyen «aumentar», «mejorar» o «estimular», asf como «disminuir» o «reducir», tfpicamente en una cantidad o grado estadfsticamente significativo o fisiologicamente significativo con respecto a un control. Una cantidad «aumentada», «estimulada» o «mejorada» es tfpicamente una cantidad «estadfsticamente significativa», y puede incluir un aumento de 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o mas veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los numeros enteros y puntos decimales intermedios y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la cantidad producida sin composicion (por ejemplo, en ausencia de cualquiera de los conjugados HRS-Fc de la presente descripcion) o una composicion de control, muestra o sujeto de prueba. Una cantidad «disminuida» o «reducida» es tfpicamente una cantidad «estadfsticamente significativa», y puede incluir un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de disminucion en la cantidad producida sin composicion (la ausencia de un agente o compuesto) o una composicion de control, incluyendo todos los numeros enteros intermedios. Como un ejemplo no limitante, un control en la comparacion de actividades canonicas y no canonicas podrfa incluir el conjugado HRS-Fc de interes en comparacion con un polipeptido de HRS no modificado o modificado de forma diferente correspondiente (secuencialmente). Otros ejemplos de comparaciones y cantidades «estadfsticamente significativas» se describen en el presente documento.
Actividad «no canonica» como se usa en el presente documento, se refiere en general a i) una nueva actividad no de aminoacilacion que posee el polipeptido de HRS de la presente descripcion que no posee en ningun grado significativo la protefna parental de longitud completa nativa intacta, o ii) una actividad que posefa la protefna parental de longitud completa nativa intacta, donde el polipeptido de HRS exhibe una actividad especffica significativamente mayor (por ejemplo, al menos un 20 % mayor) con respecto a la actividad no canonica en comparacion con la protefna parental de longitud completa nativa intacta, o exhibe la actividad en un nuevo contexto; por ejemplo, aislando la actividad de otras actividades que posee la protefna parental de longitud completa nativa intacta. En el caso de los polipeptidos de HRS, los ejemplos no limitantes de actividades no canonicas incluyen la senalizacion extracelular incluyendo la modulacion de la proliferacion celular, modulacion de la migracion celular, modulacion de la diferenciacion celular (por ejemplo, hematopoyesis, neurogenesis, miogenesis, osteogenesis y adipogenesis), modulacion de la transcripcion genica, modulacion de la apoptosis u otras formas de muerte celular, modulacion de la senalizacion celular, modulacion de la captacion o secrecion celular, modulacion de la angiogenesis, modulacion de la union celular, modulacion del metabolismo celular, modulacion de la produccion o actividad de citocinas, modulacion de la actividad del receptor de citocinas, modulacion de la inflamacion, inmunogenicidad y similares.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la «pureza» de cualquier agente dado (por ejemplo, conjugado HRS-Fc, tal como una protefna de fusion) en una composicion puede definirse especfficamente. Por ejemplo, ciertas composiciones pueden comprender un agente que es al menos un 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % puro, incluyendo todos los decimales intermedios, de acuerdo con lo medido, por ejemplo y en absoluto limitante, mediante cromatograffa de lfquidos de alta presion (HPLC), una forma bien conocida de cromatograffa en columna usada frecuentemente en bioqufmica y qufmica analftica para separar, identificar y cuantificar compuestos.
Sin desear quedar ligado a teorfa particular alguna, un «enlazador enzimaticamente degradable» significa un enlazador, por ejemplo, una secuencia de aminoacidos que esta sujeta a degradacion por una o mas enzimas, por ejemplo, peptidasas o proteasas.
Los terminos «polipeptido» y «protefna» se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polfmero de residuos de aminoacidos y a variantes y analogos sinteticos del mismo. Por lo tanto, estos terminos se aplican a polfmeros de aminoacidos donde uno o mas residuos de aminoacidos son aminoacidos de origen no natural sinteticos, tales como un analogo qufmico de un aminoacido de origen natural correspondiente, asf como a polfmeros de aminoacidos de origen natural.
Un «enlazador liberable» incluye, aunque sin limitarse a, un enlazador fisiologicamente escindible y un enlazador enzimaticamente degradable. Por lo tanto, un «enlazador liberable» es un enlazador que puede experimentar hidrolisis espontanea, o escision por algun otro mecanismo (por ejemplo, catalizada por una enzima, catalizada por un acido, catalizada por una base, y asf sucesivamente) en condiciones fisiologicas. Por ejemplo, un «enlazador liberable» puede implicar una reaccion de eliminacion que tiene una abstraccion de base de un proton, (por ejemplo, un atomo de hidrogeno ionizable, Ha ), como fuerza impulsora. Para los fines del presente documento, un «enlazador liberable» es sinonimo de un «enlazador degradable». En realizaciones particulares de la presente descripcion, un enlazador liberable tiene una semivida a pH 7,4, 25 °C, por ejemplo, un pH fisiologico, temperatura del cuerpo humano (por ejemplo, in vivo), de aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 hora, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas o aproximadamente 96 horas o mas.
Por «estadfsticamente significativo», se entiende que es poco probable que el resultado se haya producido por casualidad. La significacion estadfstica puede determinarse mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Las medidas de significacion comunmente usadas incluyen el valor p, que es la frecuencia o probabilidad con la que se producirfa el acontecimiento observado, si la hipotesis nula fuera cierta. Si el valor de p obtenido es menor que el nivel de significacion, entonces se rechaza la hipotesis nula. En casos simples, el nivel de significacion se define a un valor p de 0,05 o menos.
El termino «solubilidad» se refiere a la propiedad de un polipeptido conjugado HRS-Fc proporcionado en el presente documento para disolverse en un disolvente lfquido y formar una solucion homogenea. La solubilidad se expresa tfpicamente como una concentracion, ya sea por masa de soluto por unidad de volumen de disolvente (g de soluto por kg de disolvente, g por dl (100 ml), mg/ml, etc.), molaridad, molalidad, fraccion molar u otras descripciones similares de concentracion. La cantidad maxima en equilibrio de soluto que puede disolverse por cantidad de disolvente es la solubilidad de ese soluto en ese disolvente en las condiciones especificadas, incluyendo temperatura, presion, pH y la naturaleza del disolvente. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la solubilidad se mide a pH fisiologico u otro pH, por ejemplo, a pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0 o pH 7,4. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la solubilidad se mide en agua o un tampon fisiologico tal como PBS o NaCl (con o sin NaP). En realizaciones especfficas de la presente descripcion, la solubilidad se mide a un pH relativamente mas bajo (por ejemplo, pH 6,0) y una sal relativamente mas alta (por ejemplo, NaCl 500 mM y NaP 10 mM). En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la solubilidad se mide en un fluido (disolvente) biologico tal como sangre o suero. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la temperatura puede ser aproximadamente temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25 °C) o aproximadamente temperatura corporal (37 °C). En ciertas realizaciones de la presente descripcion, un polipeptido conjugado HRS-Fc tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 mg/ml a temperatura ambiente o a 37 °C.
Un «sujeto», como se usa en el presente documento, incluye cualquier animal que exhibe un sfntoma, o que este en riesgo de exhibir un sfntoma, que pueda tratarse o diagnosticarse con un polipeptido conjugado HRS-Fc de la presente descripcion. Los sujetos (pacientes) adecuados incluyen animales de laboratorio (tales como raton, rata, conejo o cobaya), animales de granja y animales domesticos o mascotas (tales como un gato o un perro). Se incluyen primates no humanos y, preferentemente, pacientes humanos.
«Sustancialmente» o «esencialmente» significa casi total o completamente, por ejemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de alguna cantidad dada.
«Tratamiento» o «tratar», como se usa en el presente documento, incluye cualquier efecto deseable sobre los sfntomas o la patologfa de una enfermedad o afeccion, y puede incluir incluso cambios o mejoras mfnimos en uno o mas marcadores medibles de la enfermedad o afeccion que esta siendo tratada. «Tratamiento» o «tratar» no necesariamente indica la erradicacion o curacion completa de la enfermedad o afeccion, o sfntomas asociados de la misma. El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier sujeto que lo necesite. Marcadores ejemplares de mejorfa clfnica seran evidentes para los expertos en la materia.
Polipeptidos derivados de histidil-ARNt sintetasa
Realizaciones de la presente descripcion se refieren a conjugados de polipeptidos de histidil-ARNt sintetasa («polipeptidos de HRS o de HisRS»)-Fc, incluidos conjugados HRS-Fc que comprenden secuencias de HRS de tipo silvestre, secuencias de origen natural, secuencias de origen no natural y/o variantes y fragmentos de las mismas. Los ejemplos especfficos de polipeptidos derivados de HRS incluyen aquellos con contenido de cistefna alterado. Las histidil-ARNt sintetasas pertenecen a la familia de la ARNt sintetasa de clase II, que tiene tres motivos de secuencia altamente conservados. Las ARNt sintetasas de clase I y II son ampliamente reconocidas como responsables de la union especffica de un aminoacido a su ARNt analogo en una reaccion de dos etapas: el aminoacido (AA) es activado primero por ATP para formar AA-AMP y a continuacion es transferido al extremo aceptor del ARNt. Las histidil-ARNt sintetasas de longitud completa existen tfpicamente como un homodfmero citosolico o una forma mitocondrial sometida a splicing de forma alternativa.
Mas recientemente, se ha establecido que algunos fragmentos biologicos, o isoformas sometidas a splicing de forma alternativa de histidil-ARNt sintetasas eucariotas (fisiocrinas, o polipeptidos de HRS), o en algunos contextos la sintetasa intacta, modulan ciertas vfas de senalizacion celular, o tienen propiedades antiinflamatorias. Estas actividades, que son distintas del papel clasico de las ARNt sintetasas en la sfntesis de protefnas, se denominan colectivamente en el presente documento «actividades no canonicas». Estas fisiocrinas pueden producirse naturalmente mediante splicing alternativo o proteolisis, y pueden actuar de forma autonoma celular (es decir, dentro de la celula huesped) o de manera autonoma no celular (es decir, fuera de la celula huesped) para regular diversos mecanismos homeostaticos. Por ejemplo, como se proporciona en la presente descripcion, los polipeptidos de HRS tales como el fragmento N-terminal de histidil-ARNt sintetasa (por ejemplo, HRS 1-48, HRS 1-60) son capaces, entre otras cosas, de ejercer una senal antiinflamatoria bloqueando la migracion, activacion o diferenciacion de celulas inflamatorias (por ejemplo, monocitos, macrofagos, linfocitos T, linfocitos B) asociadas con los sitios de inflamacion activa in vivo. Ademas, ciertas mutaciones o eliminaciones (por ejemplo, HRS 1-506, HRS 1-60) relativas a la secuencia del polipeptido de HRS de longitud completa confieren un aumento de las actividades y/o una mejora de las propiedades farmacologicas. Las secuencias de ciertos polipeptidos de HRS ejemplares se proporcionan en la tabla D1.
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Se han secuenciado una serie de polimorfismos de un solo nucleotido (SNP) de histidil-ARNt sintetasa y variantes de origen natural del gen humano, y se sabe en la tecnica que son al menos parcialmente funcionalmente intercambiables. Varias de dichas variantes de histidil-ARNt sintetasa (es decir, SNP de histidil ARNt sintetasa representativos) se muestran en la tabla D2.
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Adicionalmente, existen homologos y ortologos del gen humano en otras especies, como se enumeran en la tabla D3 y, por lo tanto, seria un asunto de rutina seleccionar un aminoacido de origen natural o una variante de nucleotido presente en un SNP, u otro homologo de origen natural en lugar de cualquiera de las secuencias polipeptidicas de HRS humana enumeradas en las tablas D1, D4-D6 o D8.
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Por consiguiente, en cualquiera de los procedimientos, composiciones terapeuticas y kits de la presente descripcion, las expresiones «polipeptido de HRS» «protefna de HRS» o «fragmento de protefna de HRS» incluyen todas las formas de origen natural y sinteticas de la histidil-ARNt sintetasa que posee una actividad no canonica, tal como una actividad antiinflamatoria y/o conserva al menos un epftopo que reacciona especfficamente de forma cruzada con un autoanticuerpo o un linfocito T autorreactivo de un sujeto con una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil-ARNt sintetasa. Dichos polipeptidos de HRS incluyen la protefna humana de longitud completa, asf como los peptidos de HRS derivados de la protefna de longitud completa enumerados en las tablas D1, D3-D6 o D8. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la expresion polipeptido de HRS se refiere a una secuencia polipeptfdica derivada de histidil-ARNt sintetasa humana (SEQ ID NO:1 en la tabla D1) de aproximadamente 45 o 50 a aproximadamente 250 aminoacidos de longitud. Se apreciara que, en cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento, el acido N-terminal del polipeptido de HRS (por ejemplo, el Met N-terminal) se puede eliminar de cualquiera de las secuencias enumeradas en las tablas D1, D3-D6 o D8 cuando se crea la protefna de fusion o el conjugado.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS esta entre aproximadamente 20-509, 20­ 508, 20-507, 50-506, 20-505, 50-504, 20-503, 20-502, 20-501, 20-500, 20-400, 20-300, 20-250, 20-200 o 20-100 aminoacidos de longitud. Por ejemplo, en realizaciones especfficas de la presente descripcion, el polipeptido esta entre aproximadamente 20-25, 20-35, 20-40, 20-45, 20-55, 20-60, 20-65, 20-70, 20-75, 20-80, 20-85, 20-90, 20-95 o 20-100 aminoacidos de longitud, o aproximadamente 30-35, 30-40, 30-45, 30-55, 30-60, 30- 65, 30-70, 30-75, 30-80, 30-85, 30-90, 30-95 o 30-100 aminoacidos de longitud, o aproximadamente 40-45, 40-55, 40-60, 40 -65, 40-70, 40­ 75, 40-80, 40-85, 40-90, 40-95 o 40-100 aminoacidos de longitud, o aproximadamente 45-50, 45-55, 50-55, 50-60, 50-65, 50-70, 50-75, 50-80, 50-85, 50-90, 50-95 o 50-100 aminoacidos de longitud, o aproximadamente 60-65, 60­ 70, 60-75, 60-80, 60-85, 60-90, 60-95 o 60-100 aminoacidos de longitud, o aproximadamente 70-75, 70-80, 70-85, 70-90, 70- 95 o 70-100 aminoacidos de longitud, o aproximadamente 80-85, 80-90, 80-95 u 80-100 aminoacidos de longitud. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS tiene aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38., 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508 o 509 aminoacidos de longitud.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS no compite significativamente por la union del autoanticuerpo asociado a la enfermedad (por ejemplo, anticuerpo Jo-1) a la histidil-ARNt sintetasa de tipo silvestre en un ELISA competitivo hasta una concentracion de aproximadamente 1 a 5 x 10'7 M, o superior. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS tiene una afinidad mas baja por el autoanticuerpo asociado a la enfermedad que la histidil-ARNt sintetasa de tipo silvestre (SEQ ID NO:1) de acuerdo con se mide en un ELISA competitivo. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS tiene una afinidad aparente por el autoanticuerpo asociado a la enfermedad (por ejemplo, el anticuerpo Jo-1) que es al menos aproximadamente 10 veces menos, o al menos aproximadamente 20 veces menos, o al menos aproximadamente 50 veces menos, o al menos aproximadamente 100 veces menos que la afinidad del autoanticuerpo asociado a la enfermedad por el ser humano de tipo silvestre (SEQ ID NO:1).
Por lo tanto, todos dichos homologos, ortologos e isoformas de origen natural o sinteticas de histidil-ARNt sintetasa (por ejemplo, cualquiera de las protefnas enumeradas en las tablas D1, D3-D6 o D8) se incluyen en cualquiera de los procedimientos, conjugados HRS-Fc, kits y composiciones de la presente descripcion, siempre que conserven al menos un epftopo que reacciona especfficamente de forma cruzada con un autoanticuerpo o linfocito T autorreactivo de un sujeto con una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil ARNt sintetasa, o posea una actividad no canonica. Los polipeptidos de HRS pueden estar en su forma nativa, es decir, como diferentes variantes tal como aparecen en la naturaleza en diferentes especies que pueden verse como variantes funcionalmente equivalentes de histidil-ARNt sintetasa humana, o pueden ser sus derivados naturales funcionalmente equivalentes, que pueden diferir en su secuencia de aminoacidos, por ejemplo, por truncamiento (por ejemplo, desde el extremo N o C o ambos) u otras eliminaciones, adiciones, inserciones, sustituciones o modificaciones postraduccionales de aminoacidos. Los derivados qufmicos de origen natural, incluyendo modificaciones postraduccionales y productos de degradacion de cualquier polipeptido de HRS, tambien se incluyen especfficamente en cualquiera de los procedimientos y composiciones de la presente descripcion, que incluyen, por ejemplo, piroglutamilo, isoaspartilo, variantes proteolfticas, fosforiladas, glucosiladas, oxidadas, isomerizadas y desaminadas de un polipeptido de HRS o conjugado HRS-Fc. Los polipeptidos de HRS y los conjugados HRS-Fc tambien pueden estar compuestos por aminoacidos de origen natural y/o aminoacidos de origen no natural, como se describe en el presente documento.
Como se ha senalado anteriormente, las realizaciones de la presente descripcion incluyen todos los homologos, ortologos e isoformas de origen natural de histidil-ARNt sintetasa (por ejemplo, cualquiera de las protefnas enumeradas en o derivables de, o sus correspondientes acidos nucleicos enumerados en, las tablas o la lista de secuencias) y «variantes» de estos polipeptidos de HRS de referencia. La mencion «variante» polipeptfdica se refiere a polipeptidos que se distinguen de un polipeptido de HRS de referencia por la adicion, eliminacion y/o sustitucion de al menos un residuo de aminoacido, y que tfpicamente conservan (por ejemplo, imitan) o modulan (por ejemplo, antagonizan) una o mas actividades no canonicas de un polipeptido de HRS de referencia. Las variantes tambien incluyen polipeptidos que se han modificado mediante la adicion, eliminacion y/o sustitucion de al menos un residuo de aminoacido para tener una estabilidad mejorada u otras propiedades farmaceuticas.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, una variante polipeptfdica se distingue de un polipeptido de referencia por una o mas sustituciones, que pueden ser conservativas o no conservativas, como se describe en el presente documento y se conoce en la tecnica. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la variante polipeptfdica comprende sustituciones conservativas y, a este respecto, se entiende bien en la tecnica que algunos aminoacidos pueden cambiarse a otros con propiedades ampliamente similares sin cambiar la naturaleza de la actividad del polipeptido. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la variante comprende uno o mas residuos conservados, incluyendo uno o mas de Leu7, Gln14, Gly15, Val18, Arg19, Leu21, Lys22, Lys25, Ala26, Val35, Leu38, Leu39, Leu41 y Lys 42 (basandose en la numeracion de la SEQ ID NO:1).
Los ejemplos especfficos de variantes de polipeptidos de HRS utiles en cualquiera de los procedimientos y composiciones de la presente descripcion incluyen polipeptidos de HRS de longitud completa, o truncamientos o variantes de splicing de los mismos (por ejemplo, cualquiera de las protefnas enumeradas o derivables de las tablas o la lista de secuencias) que i) conservan la actividad no canonica detectable y/o conservan al menos un epftopo que reacciona especfficamente de forma cruzada con un autoanticuerpo o linfocito T autorreactivo de un sujeto con una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil-ARNt sintetasa, y ii) tienen una o mas inserciones, sustituciones, eliminaciones y/o truncamientos de aminoacidos adicionales. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, un polipeptido variante incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos aproximadamente el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %. 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o mas de identidad o similitud de secuencia con una secuencia correspondiente de un polipeptido de HRS de referencia, como se describe en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las protefnas enumeradas en o derivables de las tablas o la lista de secuencias) y conserva sustancialmente la actividad no canonica de ese polipeptido de referencia. Tambien se incluyen secuencias que difieren de las secuencias de HRS de referencia por la adicion, eliminacion o sustitucion de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16., 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o mas aminoacidos, pero que conservan las propiedades del polipeptido de HRS de referencia. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, las adiciones o eliminaciones de aminoacidos se producen en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal del polipeptido de HRS de referencia. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, las adiciones de aminoacidos incluyen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o mas residuos de tipo silvestre (es decir, del polipeptido de HRS de longitud completa correspondiente) que estan proximos al extremo C-terminal y/o al extremo N-terminal del polipeptido de HRS de referencia.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, los polipeptidos de HRS comprenden un fragmento polipeptfdico de la histidil ARNt sintetasa de longitud completa de aproximadamente 45 a 250 o aproximadamente 50 a 250 aminoacidos, que comprende, consiste o consiste esencialmente en los aminoacidos de la secuencia de polipeptido de HRS expuesta en una o mas de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en los residuos 1 -141, 1-408, 1-113 o 1-60 de la SEQ ID NO:1. En algunos aspectos de la presente descripcion, el polipeptido de HRS es una variante de splicing que comprende, consiste o consiste esencialmente en los residuos 1-60+175-509, 1­ 60+211-509 o 1-60+101-509 de la SEQ ID NO:1. En aspectos particulares de la presente descripcion, el polipeptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en los residuos 1-48 o 1-506 de la SEQ iD NO:1.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, un polipeptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en el fragmento activo mfnimo de un polipeptido de HRS de longitud completa capaz de modular una actividad antiinflamatoria in vivo o que tiene actividades de bloqueo de anticuerpos o linfocitos T autorreactivos. En un aspecto de la presente descripcion, dicho fragmento activo mfnimo comprende, consiste o consiste esencialmente en el dominio WHEP (es decir, aproximadamente los aminoacidos 1-43 de la SEQ ID NO:1). En algunos aspectos de la presente descripcion, el fragmento activo mfnimo comprende, consiste o consiste esencialmente en el dominio de aminoacilacion (es decir, aproximadamente los aminoacidos 54-398 de la SEQ ID NO:1). En algunos aspectos de la presente descripcion, el fragmento activo mfnimo comprende, consiste o consiste esencialmente en el dominio de union anticodon (es decir, aproximadamente los aminoacidos 406-501 de la SEQ ID NO:1). Otros fragmentos activos ejemplares se muestran en la tabla D4 a continuacion.
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Para algunos polipeptidos de HRS, aproximadamente o al menos aproximadamente 20-40, 20-45, 20-50, 20-55, o 20-60, 20-65, o 20-67 aminoacidos contiguos o no contiguos del polipeptido de HRS son de los aminoacidos 1-67 de la SEQ ID NO:1. En realizaciones particulares de la presente descripcion, aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 o 67 aminoacidos contiguos o no contiguos del polipeptido de HRS son de los aminoacidos 1-67 de la SEQ ID NO:1. El polipeptido de HRS puede comprender uno o mas de un dominio WHEP, un dominio de aminoacilacion, un dominio de union anticodon, o cualquier combinacion de los mismos. En realizaciones particulares de la presente descripcion, el polipeptido de HRS carece de un dominio de aminoacilacion funcional. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido consiste esencialmente en el dominio WHEP de HRS humana. Sin desear estar ligado a ninguna teorfa, la orientacion o conformacion unica del dominio WHEP en ciertos polipeptidos de HRS puede contribuir a las actividades mejoradas no canonicas y/o de bloqueo de anticuerpos observadas en estas protefnas.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de dominio WHEP de HRS humana. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la secuencia del dominio WHEP de HRS humana esta definida por ciertos residuos conservados. Por ejemplo, en algunos aspectos de la presente descripcion, el polipeptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de consenso del dominio WHEP de HRS humana en la tabla D5 a continuacion.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o todos los 29 aminoacidos de un enlazador flexible que conecta el dominio mfnimo a una protefna heterologa (por ejemplo, dominio Fc), o variante de splicing.
Las menciones «identidad de secuencia» o, por ejemplo, que comprende una «secuencia 50 % identica a», como se usan en el presente documento, se refieren al grado en que las secuencias son identicas nucleotido por nucleotido o aminoacido por aminoacido en una ventana de comparacion. Por lo tanto, un «porcentaje de identidad de secuencia» se puede calcular comparando dos secuencias alineadas de manera optima en la ventana de comparacion, determinando el numero de posiciones en las cuales la base de acido nucleico identica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoacido identico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) se produce en ambas secuencias para dar el numero de posiciones coincidentes, dividiendo el numero de posiciones coincidentes por el numero total de posiciones en la ventana de comparacion (es decir, el tamano de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
Las expresiones usadas para describir las relaciones de secuencia entre dos o mas polipeptidos incluyen «secuencia de referencia», «ventana de comparacion», «identidad de secuencia», «porcentaje de identidad de secuencia» e «identidad sustancial». Una «secuencia de referencia» tiene al menos 12 pero con frecuencia de 15 a 18 y a menudo al menos 25 unidades monomericas, incluyendo nucleotidos y residuos de aminoacidos, de longitud. Debido a que dos polipeptidos pueden comprender, cada uno, (1) una secuencia (es decir, solo una parte de la secuencia polipeptfdica completa) que es similar entre los dos polipeptidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polipeptidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o mas) polipeptidos se realizan tfpicamente comparando secuencias de los dos polipeptidos en una «ventana de comparacion» para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una «ventana de comparacion» se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, mas habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 donde se compara una secuencia con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas despues de que la dos secuencias estan alineadas de manera optima. La ventana de comparacion puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de aproximadamente el 20 % o menos en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni eliminaciones) para el alineamiento optimo de las dos secuencias. El alineamiento optimo de secuencias para alinear una ventana de comparacion puede realizarse mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en la version 7.0 del paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EE. UU.) o por inspeccion y el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el porcentaje mas alto de homologfa en la ventana de comparacion) generado por cualquiera de los diversos procedimientos seleccionados. Tambien se puede hacer referencia a la familia de programas BLAST como se divulga, por ejemplo, por Altschul y col., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389. Una discusion detallada del analisis de secuencias se puede encontrar en la Unidad 19.3 del documento Ausubel y col., «Current Protocols in Molecular Biology», John Wiley & Sons Inc., 1994-1998, Capftulo 15.
Los calculos de similitud de secuencia o identidad de secuencia entre secuencias (los terminos se usan de manera intercambiable en el presente documento) se pueden realizar de la siguiente manera. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos, o de dos secuencias de acido nucleico, las secuencias pueden alinearse para fines de comparacion optima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoacidos o secuencia de acido nucleico para un alineamiento optimo y las secuencias no homologas se pueden ignorar con fines de comparacion). En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines de comparacion es al menos el 30 %, preferentemente al menos el 40 %, mas preferentemente al menos el 50 %, 60 %, e incluso mas preferentemente al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. A continuacion se comparan los residuos de aminoacidos o los nucleotidos en las posiciones de aminoacidos o las posiciones de nucleotidos correspondientes. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo residuo de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion.
El porcentaje de identidad entre las dos secuencias esta en funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para un alineamiento optimo de las dos secuencias.
La comparacion de las secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden conseguir usando un algoritmo matematico. En una realizacion preferida de la presente descripcion, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, (1970,
J. Mol. Biol. 48: 444-453) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,
2, 3, 4, 5 o 6. En otra realizacion preferida de la presente descripcion, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 o 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto de parametros particularmente preferido (y el que debe usarse a menos que se especifique lo contrario) es una matriz de puntuacion Blossum 62 con una penalizacion de hueco de 12, una penalizacion por extension de hueco de 4 y una penalizacion de hueco por desplazamiento del marco de 5. El porcentaje de identidad entre dos secuencias aminoacidos o nucleotidos tambien se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (1989, Cabios, 4: 11-17) que se incorporo al programa ALIGN (version 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalizacion de longitud de hueco de 12 y una penalizacion de hueco de 4.
Las secuencias de acidos nucleicos y protefnas descritas en el presente documento pueden usarse como una «secuencia de consulta» para realizar una busqueda en bases de datos publicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas busquedas se pueden realizar usando los programas NBLAST y XBLAST (version 2.0) de Altschul, y col., (1990, J. Mol. Biol, 215: 403-10). Las busquedas de nucleotidos en BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleotidos homologas a las moleculas de acido nucleico de la presente descripcion. Las busquedas de protefnas en BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas de protefnas de la presente descripcion. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparacion, puede usarse Gapped BLAST como se describe en Altschul y col. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, los polipeptidos variantes difieren de las secuencias de referencia de HRS correspondientes en al menos un 1 % pero menos del 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de los residuos. Si esta comparacion requiere alineamiento, las secuencias deben alinearse para una maxima similitud. Las secuencias
«en bucle» de las eliminaciones o inserciones, o faltas de correspondencia, se consideran diferencias. Las diferencias son, adecuadamente, diferencias o cambios en un residuo no esencial o una sustitucion conservativa. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el peso molecular de un polipeptido de HRS variante difiere del peso del polipeptido de HRS de referencia en aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %. 9 %, 10 %,
11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 % o mas.
Tambien se incluyen «fragmentos» biologicamente activos de los polipeptidos de HRS de referencia, es decir, fragmentos biologicamente activos de los fragmentos de protefna de HRS. Los fragmentos representativos biologicamente activos generalmente participan en una interaccion, por ejemplo, una interaccion intramolecular o intermolecular. Una interaccion intermolecular puede ser una interaccion de union especffica o una interaccion enzimatica. Una interaccion intermolecular puede ser entre un polipeptido de HRS y un socio de union celular, tal como un receptor celular u otra molecula huesped que participa en la actividad no canonica del polipeptido de HRS.
Un fragmento biologicamente activo de un polipeptido de HRS de referencia puede ser un fragmento polipeptfdico que tiene, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50,
55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 38, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 380, 400, 450, 500, 505, o mas aminoacidos contiguos o no contiguos, incluyendo todos los numeros enteros (p ejemplo, 101, 102, 103) e intervalos (por ejemplo, 50-100, 50-150, 50-200) intermedios, de las secuencias de aminoacidos expuestas en cualquiera de los polipeptidos de HRS de referencia descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, un fragmento biologicamente activo comprende una secuencia, dominio o motivo relacionado con la actividad no canonica. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region C-terminal o N-terminal de cualquier polipeptido de HRS de referencia puede truncarse en aproximadamente
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120,
130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o mas aminoacidos, o en aproximadamente 10-50, 20-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500 o mas aminoacidos, incluyendo todos los numeros enteros e intervalos intermedios (por ejemplo, 101, 102, 103, 104, 105), siempre que el polipeptido de HRS truncado conserve la actividad no canonica del polipeptido de referencia. Ciertos polipeptidos de HRS truncados ejemplares y una secuencia de consenso del dominio WHEP de HRS humana se muestran en la tabla D5 a continuacion.
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Se apreciara que, en cualquiera de los conjugados HRS-Fc de la presente descripcion, el acido N-terminal del polipeptido de HRS (por ejemplo, el Met N-terminal) puede eliminarse adicionalmente de cualquiera de los polipeptidos de HRS truncados ejemplares u otras secuencias de HRS descritas en el presente documento.
Tfpicamente, el fragmento biologicamente activo tiene no menos de aproximadamente el 1 %, 10 %, 25 % o 50 % de una actividad del polipeptido de HRS de referencia biologicamente activo (es decir, actividad no canonica) del cual se deriva. Los procedimientos ejemplares para medir dichas actividades no canonicas se describen en los ejemplos. En algunas realizaciones de la presente descripcion, las protefnas de HRS, variantes y fragmentos biologicamente activos de las mismas, se unen a uno o mas socios de union celular con una afinidad de al menos aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,60,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 100 o 150 nM. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la afinidad de union de un fragmento de protefna de HRS por un socio de union celular seleccionado, particularmente un socio de union que participa en una actividad no canonica, puede ser mas fuerte que la del polipeptido de HRS de longitud completa correspondiente o una variante del polipeptido de HRS sometida a splicing de forma alternativa, en al menos aproximadamente 1,5x, 2x, 2,5x, 3x, 3,5x, 4x, 4,5x, 5x, 6x, 7x,8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1000x o mas (incluyendo todos los numeros enteros intermedios).
Como se ha senalado anteriormente, un polipeptido de HRS puede alterarse de diversas maneras, incluyendo las sustituciones, eliminaciones, truncamientos e inserciones de aminoacidos. Los procedimientos para dichas manipulaciones son generalmente conocidos en la tecnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de HRS de referencia se pueden preparar mediante mutaciones en el ADN. Los procedimientos para la mutagenia y las alteraciones de la secuencia de nucleotidos son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 82: 488-492), Kunkel y col., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), Patente de Estados Unidos N.° 4.873.192, Watson, J. D. y col, («Molecular Biology of the Gene», Cuarta Edicion, Benjamin/Cummings, Menlo Park, California, 1987) y las referencias citadas en el mismo. En el modelo de Dayhoff y col., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC) se puede encontrar orientacion sobre las sustituciones apropiadas de aminoacidos que no afectan a la actividad biologica de la protefna de interes.
Los polipeptidos de HRS truncados y/o variantes biologicamente activos pueden contener sustituciones de aminoacidos conservativas en diversas ubicaciones a lo largo de su secuencia, en comparacion con un residuo de aminoacido de HRS de referencia, y dichas sustituciones adicionales pueden mejorar aun mas la actividad o estabilidad de los polipeptidos de h Rs con un contenido de cistefna alterado. Una «sustitucion de aminoacidos conservativa» es aquella donde el residuo de aminoacido se reemplaza por un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la tecnica, que en general se pueden subdividir de la siguiente manera:
Acidos: el residuo tiene una carga negativa debido a la perdida de iones H a pH fisiologico y el residuo es atrafdo por una solucion acuosa para buscar las posiciones superficiales en la conformacion de un peptido donde esta contenido cuando el peptido esta en medio acuoso a pH fisiologico. Los aminoacidos que tienen una cadena lateral acida incluyen acido glutamico y acido aspartico.
Basicos: el residuo tiene una carga positiva debido a la asociacion con el ion H a pH fisiologico o dentro de una o dos unidades de pH del mismo (por ejemplo, histidina) y el residuo es atrafdo por una solucion acuosa para buscar las posiciones superficiales en la conformacion de un peptido donde esta contenido cuando el peptido esta en medio acuoso a pH fisiologico. Los aminoacidos que tienen una cadena lateral basica incluyen arginina, lisina e histidina. Cargados: los residuos estan cargados a pH fisiologico y, por lo tanto, incluyen aminoacidos que tienen cadenas laterales acidas o basicas (es decir, acido glutamico, acido aspartico, arginina, lisina e histidina).
Hidrofobos: los residuos no estan cargados a pH fisiologico y el residuo es repelido por una solucion acuosa para buscar las posiciones internas en la conformacion de un peptido donde esta contenido cuando el peptido esta en un medio acuoso. Los aminoacidos que tienen una cadena lateral hidrofoba incluyen tirosina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina y triptofano.
Neutros/polares: los residuos no estan cargados a pH fisiologico, pero el residuo no es repelido lo suficiente por las soluciones acuosas de modo que buscara posiciones internas en la conformacion de un peptido donde esta contenido cuando el peptido esta en un medio acuoso. Los aminoacidos que tienen una cadena lateral neutra/polar incluyen asparagina, glutamina, cistefna, histidina, serina y treonina.
Esta descripcion tambien caracteriza a ciertos aminoacidos como «pequenos», ya que sus cadenas laterales no son lo suficientemente grandes, incluso si faltan grupos polares, para conferir hidrofobicidad. Con la excepcion de la prolina, los aminoacidos «pequenos» son aquellos con cuatro carbonos o menos cuando al menos un grupo polar esta en la cadena lateral y tres carbonos o menos cuando no lo esta. Los aminoacidos que tienen una cadena lateral pequena incluyen glicina, serina, alanina y treonina. El aminoacido secundario codificado por el gen, prolina, es un caso especial debido a sus efectos conocidos sobre la conformacion secundaria de las cadenas peptfdicas. La estructura de la prolina difiere de todos los otros aminoacidos naturales en que su cadena lateral esta unida al nitrogeno del grupo a-amino, asf como al carbono a. Se conocen varias matrices de similitud de aminoacidos en la tecnica (vease, por ejemplo, matriz PAM120 y matriz PAM250 como es divulgado, por ejemplo, por Dayhoff y col., 1978, A model of evolutionary change in proteins). Matrices para determinar relaciones de distancia En M. O. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, pags. 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC; y por Gonnet y col., (Science, 256: 14430-1445, 1992), sin embargo, incluyen la prolina en el mismo grupo que la glicina, la serina, la alanina y la treonina. Por consiguiente, para los fines de la presente descripcion, la prolina se clasifica como un aminoacido «pequeno».
El grado de atraccion o repulsion requerido para la clasificacion como polar o no polar es arbitrario y, por lo tanto, los aminoacidos especfficamente contemplados por la presente descripcion se han clasificado como uno u otro. La mayorfa de los aminoacidos que no se mencionan especfficamente pueden clasificarse basandose en el comportamiento conocido.
Los residuos de aminoacidos pueden ser subclasificados como clasificaciones autoexplicativas, cfclicas o no cfclicas, y aromaticas o no aromaticas, con respecto a los grupos sustituyentes de cadena lateral de los residuos, y como pequenos o grandes. El residuo se considera pequeno si contiene un total de cuatro atomos de carbono o menos, incluido el carbono del carboxilo, siempre que este presente un sustituyente polar adicional; tres o menos si no. Los residuos pequenos siempre son, por supuesto, no aromaticos. Dependiendo de sus propiedades estructurales, los residuos de aminoacidos pueden estar en dos o mas clases. Para los aminoacidos de protefnas naturales, la subclasificacion de acuerdo con este esquema se presenta en la tabla A.
Tabla A: subclasificacion de aminoacidos.
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La sustitucion de aminoacidos conservativa tambien incluye agrupaciones basadas en cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales alifaticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifatico es serina y treonina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales aromaticas es fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cistefna y metionina. Por ejemplo, es razonable esperar que el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoacido con un aminoacido relacionado estructuralmente no tenga un efecto considerable sobre las propiedades del polipeptido variante resultante. Si un cambio de aminoacido da como resultado un polipeptido de HRS truncado y/o variante funcional, se puede determinar facilmente mediante el ensayo de su actividad no canonica, como se describe en el presente documento. Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla B bajo el encabezado de sustituciones ejemplares. Las sustituciones de aminoacidos que estan dentro del alcance de la presente descripcion, se realizan, en general, seleccionando sustituciones que no difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto peptfdico en el area de la sustitucion, (b) la carga o hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana, (c) la mayor parte de la cadena lateral, o (d) la funcion biologica. Despues de que se introducen las sustituciones, las variantes se examinan para determinar la actividad biologica.
Tabla B: sustitu i n m l r min i .
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Como alternativa, los aminoacidos similares para realizar sustituciones conservativas pueden agruparse en tres categorfas basandose en la identidad de las cadenas laterales. El primer grupo incluye acido glutamico, acido aspartico, arginina, lisina, histidina, que tienen todos cadenas laterales cargadas; el segundo grupo incluye glicina, serina, treonina, cistefna, tirosina, glutamina, asparagina; y el tercer grupo incluye leucina, isoleucina, valina, alanina, prolina, fenilalanina, triptofano, metionina, como se describe en Zubay, G., Biochemistry, tercera edicion, Wm.C. Brown Publishers (1993).
La estructura de RMN del dominio WHEP de HRS humana se ha determinado (vease Nameki y col., Acceso 1X59_A). Ademas, tambien se han determinado las estructuras cristalinas de HRS humana de longitud completa y un mutante de eliminacion del dominio catalftico interno de HRS (HRSACD) (vease Xu y col., Structure. 20: 1470-7, 2012; y la solicitud de Estados Unidos N.° 61/674.639). Junto con la secuencia de aminoacidos primaria de HRS, estas descripciones ffsicas detalladas de la protefna proporcionan informacion precisa sobre los papeles desempenados por aminoacidos especfficos dentro de la protefna. Los expertos en la materia pueden usar esta informacion para identificar dominios conservados estructuralmente, regiones de enlace, estructuras secundarias tales como helices alfa, aminoacidos superficiales o expuestos por disolvente, regiones internas o no expuestas, sitios catalfticos y superficies de interaccion con ligandos, entre otras caracterfsticas estructurales. Dichos expertos pueden usar esa y otra informacion para disenar facilmente variantes de HRS que conservan o mejoran la actividad no canonica de interes, por ejemplo, conservando o alterando las caracterfsticas de los residuos de aminoacidos dentro o adyacentes a estas y otras caracterfsticas estructurales, tal como por ejemplo conservando o alterando la polaridad, el fndice de hidropatfa, la carga, el tamano y/o el posicionamiento (es decir, hacia adentro, hacia afuera) de la o las cadenas laterales de aminoacidos seleccionadas con respecto a los residuos de tipo silvestre (vease, por ejemplo, Zaiwara y col., Mol Biotechnol. 51:67-102, 2012; Perona y Hadd, Biochemistry. 51:8705-29, 2012; Morin y col., Trends Biotechol. 29:159-66, 2011; Collins y col., Annu. Rev. Biophys. 40:81-98, 2011; y solicitud de Estados Unidos N.° 61/674.639).
Por lo tanto, un residuo de aminoacido no esencial predicho en un polipeptido de HRS truncado y/o variante se reemplaza tfpicamente con otro residuo de aminoacido de la misma familia de cadenas laterales. Como alternativa, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de HRS, tal como mediante mutagenia de saturacion, y los mutantes resultantes pueden seleccionarse para una actividad del polipeptido parental para identificar mutantes que conservan esa actividad. Despues de la mutagenia de las secuencias codificantes, el peptido codificado se puede expresar de forma recombinante y se puede determinar la actividad del peptido. Un residuo de aminoacido «no esencial» es un residuo que se puede alterar de la secuencia de referencia de un polipeptido de realizacion sin suprimir o alterar sustancialmente una o mas de sus actividades no canonicas. Adecuadamente, la alteracion no suprime sustancialmente una de estas actividades, por ejemplo, la actividad es al menos un 20 %, 40 %, 60 %, 70 % o 80 % 100 %, 500 %, 1000 % o mas de la secuencia de HRS de referencia. Un residuo de aminoacido «esencial» es un residuo que, cuando se modifica a partir de la secuencia de referencia de un polipeptido de HRS, da como resultado la supresion de una actividad de la molecula parental de manera que menos del 20 % de la actividad de referencia esta presente. Por ejemplo, dichos residuos de aminoacidos esenciales incluyen aquellos que se conservan en los polipeptidos de HRS a traves de diferentes especies, incluyendo aquellas secuencias que se conservan en el o los sitios de union activos o en el o los motivos de los polipeptidos de HRS de diversas fuentes.
Los ensayos para determinar la actividad antiinflamatoria, incluyendo las mediciones de rutina de la liberacion de citocinas a partir de celulas in vitro, y los estudios en animales estan bien establecidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Wittmann y col., J Vis Exp. (65):e4203. doi: 10.3791 / 4203, 2012; Feldman y col., Mol Cell. 47: 585-95, 2012; Clutterbuck y col., J. Proteomics. 74: 704-15, 2011, Giddings y Maitra, J Biomol Screen. 15: 1204-10, 2010; Wijnhoven y col., Glycoconj J. 25: 177-85, 2008; y Frow y col., Med Res Rev. 24: 276-98, 2004) y se pueden usar facilmente para perfilar y optimizar la actividad antiinflamatoria. Un sistema experimental in vivo ejemplar tambien se describe en los ejemplos adjuntos.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, los polipeptidos de HRS pueden tener una o mas sustituciones de cistefna, donde uno o mas residuos de origen natural (no cistefna) estan sustituidos con cistefna (por ejemplo, para alterar la estabilidad, para facilitar la conjugacion basada en tiol de un fragmento Fc, para facilitar la union a base de tiol de PEG u otras moleculas). En algunas realizaciones de la presente descripcion, las sustituciones de cistefna estan cerca del extremo N y/o el extremo C del polipeptido de HRS (por ejemplo, SEQ ID NOS:1-106, 170­ 181 o 185-191), u otras regiones expuestas en la superficie de un polipeptido de h Rs . Las realizaciones particulares de la presente descripcion incluyen cuando uno o mas residuos dentro de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoacidos en relacion con el extremo N y/o el extremo C de cualquiera de las SEQ ID NOS:1-106, 170-181 o 185-191 estan sustituidos con un residuo de cistefna. En algunas realizaciones de la presente descripcion, pueden anadirse residuos de cistefna al polipeptido de HRS a traves de la creacion de protefnas de fusion N o C-terminales. Dichas protefnas de fusion pueden ser de cualquier longitud, pero tfpicamente seran de aproximadamente 1-5, o aproximadamente de 5 a 10, de aproximadamente 10 a 20, o de aproximadamente 20 a 30 aminoacidos de longitud. En algunas realizaciones de la presente descripcion, se prefiere la fusion al extremo C.
Realizaciones especfficas ejemplares de la presente descripcion de dichas protefnas modificadas con cistefna se muestran en la tabla D6, basandose en el polipeptido de HRS, HRS(1-60). Este enfoque es directamente aplicable a los polipeptidos de HRS de la tabla D5, y a otros polipeptidos de HRS descritos en el presente documento.
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En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido HRS puede incluir mutantes donde los residuos de cistefna endogenos o de origen natural se han mutado a aminoacidos alternativos, o se han eliminado. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la insercion o sustitucion de uno o mas residuos de cistefna en el polipeptido de HRS se puede combinar con la eliminacion de otros residuos de cistefna reactivos expuestos en la superficie. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS puede comprender una o mas sustituciones y/o eliminaciones en Cys83, Cys174, Cys191, Cys196, Cys224, Cys235, Cys379, Cys455, Cys507 y/o Cys509 (como se define mediante la SEQ ID NO:1), por ejemplo, para eliminar los residuos de cistefna de origen natural.
Las realizaciones especfficas de la presente descripcion incluyen cualquiera de las SEQ ID NOS:1-106, 170-181 o 185-191, o variantes o fragmentos de las mismas, que tienen en la mutacion o eliminacion de uno cualquiera o mas de Cys83, Cys174, Cys191, Cys196, Cys224, Cys235, Cys379, Cys455, o la eliminacion de Cys507 y Cys509, por ejemplo, mediante la eliminacion de los 3 aminoacidos C-terminales (A507-509). Las mutaciones ejemplares en estas posiciones incluyen, por ejemplo, la mutacion de cistefna a serina, alanina, leucina, valina o glicina. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, los residuos de aminoacidos para sustituciones de cistefna especfficas pueden seleccionarse de sustituciones naturales que se encuentran en los ortologos de HRS de otras especies y organismos. Las sustituciones ejemplares de este tipo se presentan en la Tabla D7.
Tabla D7
variation de secuencia de origen natural en posiciones ocupadas por residuos de cisteina en HRS humana
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En algunas realizaciones de la presente description, las cistefnas de origen natural seleccionadas para la mutagenia se seleccionan basandose en su exposition en la superficie. Por consiguiente, en un aspecto de la presente description, los residuos de cisteina seleccionados para la sustitucion se seleccionan de entre Cys224, Cys235, Cys507 y Cys509. En algunas realizaciones de la presente description, los ultimos tres residuos (C-terminales) de la s Eq ID NO:1 se eliminan para eliminar los residuos 507 a 509. En algunas realizaciones de la presente description, las cistefnas se seleccionan para su mutation o elimination para eliminar un par de cistefnas intramoleculares, por ejemplo Cys174 y Cys191.
Los ejemplos adicionales especfficos de mutaciones/sustituciones de cisteina deseadas (indicadas en subrayado en negrita) para reducir los residuos de cisteina expuestos en la superficie incluydonde se enumeran a continuation en la tabla D8.
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En algunas realizaciones de la presente descripcion, dichos mutantes sustituidos con cistefna se modifican para disenar, insertar o introducir de otro modo un nuevo residuo de cistefna expuesta en la superficie en una posicion expuesta en la superficie definida, donde el residuo introducido no interfiere sustancialmente en la actividad no canonica del polipeptido de HRS. Los ejemplos especfficos incluyen, por ejemplo, la insercion (o reinsercion) de residuos de cistefna adicionales en el extremo N o C de cualquiera de los polipeptidos de HRS con cistefna reducida descritos anteriormente. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la insercion de dichas cistefnas expuestas en la superficie N o C-terminales implica la reinsercion del ultimo 1, los ultimos 2 o los ultimos 3 aminoacidos C-terminales naturales de la HRS humana de longitud completa a una variante de cistefna reducida de un polipeptido de HRS, por ejemplo, la reinsercion total o parcial de la secuencia CIC (Cys Ile Cys). Los ejemplos de mutantes reducidos de cistefna incluyen, por ejemplo, cualquier combinacion de mutaciones (o la eliminacion de) en los residuos Cys174, Cys191, Cys224 y Cys235, y o la eliminacion o sustitucion de Cys507 y Cys509 (basandose en la numeracion de HRS humana de longitud completa (SEQ ID NO:1) en cualquiera de los polipeptidos de HRS de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o las tablas D1, D3-D6 o D8.
Para algunos tipos de conjugacion o union especfficas de sitio a moleculas heterologas tales como las regiones Fc o PEG u otras moleculas heterologas, los polipeptidos de HRS pueden tener una o mas sustituciones de glutamina, donde uno o mas residuos de origen natural (no glutamina) estan sustituidos con glutamina, por ejemplo, para facilitar la union catalizada por transglutaminasa de la o las moleculas al grupo amida de la glutamina. En algunas realizaciones de la presente descripcion, las sustituciones de glutamina se introducen cerca del extremo N y/o el extremo C del polipeptido de HRS (por ejemplo, SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o los polipeptidos de h Rs de las tablas D1, D3-D6 o D8). Las realizaciones particulares de la presente descripcion incluyen cuando uno o mas residuos dentro de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoacidos en relacion con el extremo N y/o el extremo C de cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185­ 191 estan sustituidos con un residuo de glutamina. Estos y los polipeptidos de HRS relacionados tambien pueden incluir sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) para eliminar cualquier residuo de glutamina natural, si se desea, y regular de este modo el grado de conjugacion o union especffica del sitio.
Para ciertos tipos de conjugacion o union especffica de sitio a moleculas heterologas tales como regiones Fc o PEG u otras moleculas heterologas, los polipeptidos de HRS pueden tener una o mas sustituciones de lisina, donde uno o mas residuos de origen natural (no lisina) estan sustituidos con lisina, por ejemplo, para facilitar la acilacion o la union basada en la alquilacion de la o las moleculas al grupo amino de la lisina. Estos procedimientos tambien suelen dar como resultado la union de una o mas moleculas al residuo N-terminal. En algunas realizaciones de la presente descripcion, las sustituciones de lisina estan cerca del extremo N y/o del extremo C del polipeptido de HRS (por ejemplo, SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o los polipeptidos de HrS de las tablas D1, D3-D6 o D8). Las realizaciones particulares de la presente descripcion incluyen cuando uno o mas residuos dentro de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoacidos hasta el extremo N y/o el extremo C de cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 (o los polipeptidos de HRS de las tablas D1, D3-D6 o D8) estan sustituidos con un residuo de lisina. Estos y los polipeptidos de HRS relacionados tambien pueden incluir sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) para eliminar cualquier residuo de lisina de origen natural, si se desea, y regular de este modo el grado de conjugacion o union especffica de sitio.
La conjugacion especffica de sitio a polipeptidos de HRS tambien se puede realizar sustituyendo uno o mas aminoacidos superficiales accesibles al disolvente de un polipeptido de HRS. Por ejemplo, los aminoacidos accesibles al disolvente adecuados pueden determinarse en funcion de la accesibilidad al disolvente predicha usando el servidor SPIDDER (http://sppider.cchmc.org/) usando la estructura cristalina publicada de un polipeptido de HRS ejemplar (vease Xu y col. Structure, 20: 1470-7, 2012 y solicitud de Estados Unidos N.° 61/674.639). Basandose en este analisis, varios aminoacidos en la superficie se pueden usar potencialmente como sitios de mutacion para introducir grupos funcionales adecuados para la conjugacion o union. La puntuacion de accesibilidad superficial de los aminoacidos basada en la estructura cristalina se puede calcular, donde las puntuaciones mas altas representan una mejor accesibilidad. En realizaciones particulares de la presente descripcion, se prefieren puntuaciones mas altas (por ejemplo, >40). Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripcion, una posicion de aminoacido que tiene una puntuacion de accesibilidad en la superficie mayor que 40 puede usarse para introducir una cistefna, lisina, glutamina u otro aminoacido no natural.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, un aminoacido de superficie accesible al disolvente se selecciona del grupo que consiste en: alanina, glicina y serina, y se puede sustituir con aminoacidos de origen natural que incluyen, aunque sin limitarse a, cistefna, glutamina o lisina, o un aminoacido de origen no natural que esta optimizado para la conjugacion o union especffica de sitio.
En diversas realizaciones, la presente descripcion contempla la conjugacion o union especffica de sitio en cualquier posicion de aminoacido en un polipeptido de HRS en virtud de la sustitucion de un aminoacido de origen no natural que comprende un grupo funcional que formara un enlace covalente con el grupo funcional unido a moleculas heterologas tales como una region Fc o PEG u otra molecula heterologa. Los aminoacidos de origen no natural se pueden insertar o sustituir en, por ejemplo, uno o mas de los residuos dentro de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoacidos en relacion con el extremo N y/o el extremo C de cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170- 181, o 185-191 (o los polipeptidos de HRS de las tablas D1, D3-D6 o D8); en el extremo N y/o en el extremo C de cualquiera de las SEQ ID No :1-106, 170-181 o 185-191 (o los polipeptidos de HRS de las tablas D1, D3-D6 o D8); o un residuo de aminoacido superficial accesible al disolvente como se describe en el presente documento.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, los aminoacidos de origen no natural incluyen, sin limitacion, cualquier aminoacido, aminoacido modificado o analogo de aminoacido distinto de la selenocistefna y los siguientes veinte alfa-aminoacidos codificados geneticamente: alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, glutamina, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina. La estructura generica de un alfa-aminoacido se ilustra mediante la siguiente formula:
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Un aminoacido no natural es tfpicamente cualquier estructura que tenga la formula anterior donde el grupo R es cualquier sustituyente distinto de uno usado en los veinte aminoacidos naturales. Vease, por ejemplo, textos de bioqufmica tales como Biochemistry de L. Stryer, 3a ed. 1988, Freeman and Company, Nueva York, para las estructuras de los veinte aminoacidos naturales. Tengase en cuenta que los aminoacidos no naturales divulgados en el presente documento pueden ser compuestos de origen natural distintos de los veinte alfa-aminoacidos anteriores. Debido a que los aminoacidos no naturales divulgados en el presente documento difieren tfpicamente de los aminoacidos naturales en la cadena lateral solamente, los aminoacidos no naturales forman enlaces amida con otros aminoacidos, por ejemplo, naturales o no naturales, de la misma manera en que se forman en protefnas de origen natural. Sin embargo, los aminoacidos no naturales tienen grupos de cadena lateral que los distinguen de los aminoacidos naturales. Por ejemplo, R en la formula anterior comprende opcionalmente un haluro de alquilo, arilo, arilo, haluro de vinilo, haluro de alquilo, acetilo, cetona, aziridina, nitrilo, nitro, haluro, acil-, ceto-, azido-, hidroxil-, hidracina-, ciano-, halo-, hidrazida, alquenilo, alquinilo, eter, tio eter, epoxido, sulfona, acido boronico, ester de boronato, borano, acido fenilboronico, tiol, seleno-, sulfonil-, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocfclico-, piridilo, naftilo, benzofenona, un anillo restringido tal como un grupo ciclooctilo, tio ester, enona, imina, aldehfdo, ester, tioacido, hidroxilamina, amino, acido carboxflico, acido alfa-ceto carboxflico, acidos alfa o beta-insaturados y amidas, glioxil amida, u organosilano, o similares, o cualquier combinacion de los mismos.
Los ejemplos especfficos de aminoacidos no naturales incluyen, aunque sin limitarse a, p-acetil-L-fenilalanina, O-metil-L-tirosina, una L-3-(2-naftil)alanina, una 3-metil-fenilalanina, y O-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcp-serina, p-O-GlcNAc-L-serina, una tri-O-acetil-GalNAc-a-treonina, una a-GalNAc-L-treonina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p­ bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina, las enumeradas a continuacion, o en otra parte en el presente documento, y similares.
Por consiguiente, se puede seleccionar un aminoacido de origen no natural que comprende un grupo funcional que forma un enlace covalente con cualquier grupo funcional preferido de una molecula deseada (por ejemplo, region Fc, PEG). Los aminoacidos no naturales, una vez seleccionados, pueden adquirirse de proveedores o sintetizarse qufmicamente. Se puede incorporar cualquier numero de aminoacidos no naturales en la molecula diana y puede variar de acuerdo con el numero de moleculas deseadas a unir. Las moleculas pueden estar unidas a todos o solo a algunos de los aminoacidos no naturales. Ademas, se pueden incorporar los mismos o diferentes aminoacidos no naturales en un polipeptido de HRS, dependiendo del resultado deseado. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas aminoacidos no naturales se incorporan a un polipeptido de HRS, cualquiera o todos los cuales pueden estar conjugados a una molecula que comprende un grupo funcional deseado.
En ciertos aspectos de la presente descripcion, el uso de aminoacidos no naturales puede utilizarse para modificar (por ejemplo, aumentar) una actividad no canonica seleccionada de un polipeptido de HRS, o para alterar la semivida in vivo o in vitro de la protefna. Los aminoacidos no naturales tambien se pueden usar para facilitar modificaciones qufmicas (selectivas) (por ejemplo, pegilacion) de una protefna de HRS, como se describe en otra parte en el presente documento. Por ejemplo, ciertos aminoacidos no naturales permiten la union selectiva de polfmeros tales como una region Fc o p Eg a una protefna dada, y, por lo tanto, mejoran sus propiedades farmacocineticas.
Los ejemplos especfficos de analogos y mimeticos de aminoacidos se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en Roberts y Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross y Meinhofer, vol. 5, p. 341, Academic Press, Inc., Nueva York, N.Y. (1983). Otros ejemplos incluyen aminoacidos peralquilados, particularmente aminoacidos permetilados. Vease, por ejemplo, Combinatorial Chemistry, Eds. Wilson y zarnik, cap. 11, p. 235, John Wiley & Sons Inc., Nueva York, N.Y. (1997). Otros ejemplos mas incluyen aminoacidos cuya parte (y, por lo tanto, el esqueleto de amida del peptido resultante) se ha reemplazado, por ejemplo, por un anillo de azucar, esteroide, benzodiazepina o ciclo carbo. Vease, por ejemplo, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, Ed. Manfred E. Wolff, cap. 15, pags. 619-620, John Wiley & Sons Inc., Nueva York, N.Y. (1995). Los procedimientos para sintetizar peptidos, polipeptidos, peptidomimeticos y protefnas son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.420.109; M. Bodanzsky, Principles of Peptide Synthesis (1a ed. Y 2a ed. rev.), Springer-Verlag, Nueva York, NY (1984 y 1993), vease el capftulo 7; Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (2a ed.), Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois (1984)). Por consiguiente, los polipeptidos de HRS de la presente descripcion pueden estar compuestos por aminoacidos de origen natural y de origen no natural, asf como por analogos y mimeticos de aminoacidos.
Polin ucleotidos
Ciertas realizaciones de la presente descripcion se refieren a polinucleotidos que codifican un polipeptido de HRS o una protefna de fusion HRS-Fc. Tambien se incluyen los polinucleotidos que codifican una o mas de las regiones Fc descritas en el presente documento, solas o en combinacion con una secuencia codificante de HRS. Entre otros usos, estas realizaciones de la presente descripcion pueden utilizarse para producir de forma recombinante una HRS, region Fc, o polipeptido HRS-Fc o variante del mismo deseado, o para expresar el polipeptido de HRS, la region Fc o HRS-Fc en una celula o sujeto seleccionados. Los expertos en la materia apreciaran que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, hay muchas secuencias de nucleotidos que codifican una protefna de fusion HRS-Fc del polipeptido de HRS como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleotidos pueden tener una homologfa minima con la secuencia de nucleotidos de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleotidos que varfan debido a las diferencias en el uso de codones se contemplan especfficamente en la presente descripcion, por ejemplo, polinucleotidos que estan optimizados para la seleccion de codones humanos, de levadura o bacterianos.
Como reconocera el experto en la materia, los polinucleotidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moleculas de ADN (genomico, ADNc o sintetico) o ARN. Secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleotido de la presente descripcion, y un polinucleotido puede, pero es necesario, estar unido a otras moleculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleotidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endogena que codifica un polipeptido de fusion HRS-Fc o una parte del mismo) o pueden comprender una variante, o un equivalente funcional biologico de dicha secuencia. Las variantes de polinucleotidos pueden contener una o mas sustituciones, adiciones, eliminaciones y/o inserciones, como se describe adicionalmente a continuacion, preferentemente de modo que la actividad del polipeptido codificado no disminuya sustancialmente con respecto al polipeptido no modificado.
En realizaciones adicionales, la presente descripcion proporciona polinucleotidos aislados que comprenden diversas longitudes de tramos contiguos de secuencia identicos o complementarios a un polipeptido de h Rs o protefna de fusion HRS-Fc, donde los polinucleotidos aislados codifican un polipeptido de HRS truncado como se describe en el presente documento.
Por lo tanto, multiples polinucleotidos pueden codificar los polipeptidos de HRS, las regiones Fc y las protefnas de fusion de la presente descripcion. Ademas, la secuencia de polinucleotidos se puede manipular por diversas razones. Los ejemplos incluyen, aunque no se limitan a, la incorporacion de codones preferidos para mejorar la expresion del polinucleotido en diversos organismos (vease en general Nakamura y col, Nuc. Acid. Res. 28: 292, 2000). Ademas, se pueden incorporar mutaciones silenciosas para introducir, o eliminar sitios de restriccion, disminuir la densidad de los motivos de dinucleotidos CpG (vease, por ejemplo, Kameda y col., Biochys. Biophys. Res. Commun. 349: 1269-1277, 2006) o reducir la capacidad de las secuencias monocatenarias para formar estructuras de tallo-bucle: (vease, por ejemplo, Zuker M., Nucl. Acid Res. 31: 3406-3415, 2003). Ademas, la expresion en mamfferos puede optimizarse aun mas al incluir una secuencia de consenso de Kozak (es decir, (a/g)cc(a/g)ccATGg) (SEQ ID NO:199) en el codon de inicio. Las secuencias de consenso de Kozak utiles para este fin son conocidas en la tecnica (Mantyh y col., PNAS 92: 2662-2666, 1995; Mantyh y col., Prot. Exp. & Purif. 6: 124, 1995). Las versiones ejemplares de tipo silvestre y con optimizacion de codones de diversos polipeptidos de HRS se proporcionan en la tabla D9 a continuacion.
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Secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleotido de la presente descripcion, y un polinucleotido puede, pero no es necesario, estar unido a otras moleculas y/o materiales de soporte. Por lo tanto, los polinucleotidos de la presente descripcion, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de ADN o ARN, tales como promotores, senales de poliadenilacion, sitios de enzimas de restriccion adicionales, sitios de clonacion multiple, otros segmentos codificantes y similares, de modo que su longitud total puede variar considerablemente.
Por lo tanto, se contempla que se pueda emplear un fragmento de polinucleotido de casi cualquier longitud; con la longitud total preferentemente limitada por la facilidad de preparacion y uso en el protocolo de ADN recombinante deseado. Se incluyen polinucleotidos de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32., 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 270, 280, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2800, 2900, 3000 o mas (incluyendo todos los numeros enteros intermedios) bases de longitud, incluyendo cualquier parte o fragmento (por ejemplo, mayor de aproximadamente 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidos de longitud) de un polinucleotido de HRS de referencia (por ejemplo, numero de bases X-Y, donde X es aproximadamente 1-3000 o mas e Y es aproximadamente 10-3000 o mas), o su complemento.
Las realizaciones de la presente descripcion tambien incluyen «variantes» de las secuencias de polinucleotidos de HRS de referencia. Las «variantes» de polinucleotidos pueden contener una o mas sustituciones, adiciones, eliminaciones y/o inserciones en relacion con un polinucleotido de referencia. Generalmente, las variantes de una secuencia de polinucleotidos de HRS de referencia pueden tener al menos aproximadamente el 30 %, 40 % 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, generalmente al menos aproximadamente el 75 %, 80 %, 85 %, deseablemente aproximadamente del 90 % al 95 % o mas, y mas adecuadamente aproximadamente el 98 % o mas de identidad de secuencia con esa secuencia de nucleotidos particular (tal como por ejemplo, las SEQ ID NO:111-127, 182-184, 192-198; vease tambien los ejemplos) de acuerdo con lo determinado por los programas de alineamiento de secuencias descritos en otra parte en el presente documento usando parametros por defecto. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, las variantes pueden diferir de una secuencia de referencia en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41,43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 (incluyendo todos los numeros enteros intermedios) o mas bases. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, tal como cuando la variante de polinucleotido codifica un polipeptido de HRS que tiene una actividad no canonica, la actividad deseada del polipeptido de HRS codificado no disminuye sustancialmente con respecto al polipeptido no modificado. El efecto sobre la actividad del polipeptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones de la presente descripcion, las variantes pueden alterar el estado de agregacion de los polipeptidos de HRS, por ejemplo para proporcionar polipeptidos de HRS que existen en diferentes realizaciones de la presente descripcion principalmente como un monomero, dfmero o multfmero.
Ciertas realizaciones de la presente descripcion incluyen polinucleotidos que hibridan con una secuencia de polinucleotidos de HRS de referencia (tal como por ejemplo, SEQ ID NO:111-127, 182-184, 192-198; veanse tambien los ejemplos) o sus complementos, bajo condiciones de rigurosidad descritas a continuacion. Como se usa en el presente documento, el termino «hibrida en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media, alta rigurosidad o rigurosidad muy alta» describe las condiciones para la hibridacion y el lavado. Se puede encontrar orientacion para realizar reacciones de hibridacion en Ausubel y col., (1998, citado anteriormente), Secciones 6.3.1-6.3.6. Procedimientos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y se pueden usar cualquiera de ellos.
Las referencias en el presente documento a condiciones de baja rigurosidad incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente el 1 % v/v hasta al menos aproximadamente el 15 % v/v de formamida y desde al menos aproximadamente 1 M hasta al menos aproximadamente 2 M de sal para hibridacion a 42 °C, y al menos aproximadamente 1 M a al menos aproximadamente 2 M de sal para lavado a 42 °C. Las condiciones de baja rigurosidad tambien pueden incluir albumina de suero bovino (BSA) al 1 %, EDTA 1 mM, NaHPO40,5 M (pH 7,2), SDS al 7 % para hibridacion a 65 °C y (i) 2 * SSC, SDS al 0,1 %; o (ii) BSA al 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPO440 mM (pH 7,2), SDS al 5 % para lavado a temperatura ambiente. Una realizacion de la presente descripcion de condiciones de baja rigurosidad incluye la hibridacion en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguida de dos lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados se puede aumentar a 55 °C para condiciones de baja rigurosidad).
Las condiciones de rigurosidad media incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente el 16 % v/v hasta al menos aproximadamente el 30 % v/v de formamida y desde al menos aproximadamente 0,5 M hasta al menos aproximadamente 0,9 M de sal para hibridacion a 42 °C, y al menos aproximadamente 0,1 M a al menos aproximadamente 0,2 M de sal para lavado a 55 °C. Las condiciones de rigurosidad media tambien pueden incluir albumina de suero bovino (BSA) al 1 %, EDTA 1 mM, NaHPO40,5 M (pH 7,2), SDS al 7 % para hibridacion a 65 °C y (i) 2 * SSC, SDS al 0,1 %; o (ii) BSA al 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPO440 mM (pH 7,2), SDS al 5 % para lavado a 60­ 65 °C. Una realizacion de la presente descripcion de las condiciones de rigurosidad media incluye la hibridacion en 6 x SSC a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o mas lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 60 °C. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente el 31 % v/v hasta al menos aproximadamente el 50 % v/v de formamida y desde aproximadamente 0,01 M hasta aproximadamente 0,15 M de sal para la hibridacion a 42 °C y aproximadamente 0,01 M hasta aproximadamente 0,02 M de sal para el lavado a 55 °C.
Las condiciones de alta rigurosidad tambien pueden incluir BSA al 1 %, EDTA 1 mM, NaHPO40,5 M (pH 7,2), SDS al 7 % para hibridacion a 65 °C y (i) 0,2 x SSC, SDS al 0,1 %; o (ii) BSA al 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPO440 mM (pH 7,2), SDS al 1 % para lavado a una temperatura superior a 65 °C. Una realizacion de la presente descripcion de condiciones de alta rigurosidad incluye la hibridacion en 6 x SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o mas lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C. Una realizacion de la presente descripcion de condiciones de muy alta rigurosidad incluyen la hibridacion en fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7 % a 65 °C, seguido de uno o mas lavados en 0,2 x SSC, SDS al 1 % a 65 °C.
Otras condiciones de rigurosidad son bien conocidas en la tecnica y un experto en la materia reconocera que pueden manipularse diversos factores para optimizar la especificidad de la hibridacion. La optimizacion de la rigurosidad de los lavados finales puede servir para garantizar un alto grado de hibridacion. Para ejemplos detallados, vease Ausubel y col., mencionado anteriormente en las paginas 2.10.1 a 2.10.16 y Sambrook y col. (1989, mencionado anteriormente) en las secciones 1.101 a 1.104. Mientras que los lavados rigurosos se realizan tfpicamente a temperaturas de aproximadamente 42 °C a 68 °C, un experto en la materia apreciara que otras temperaturas pueden ser adecuadas para condiciones rigurosas. La tasa maxima de hibridacion se produce tfpicamente entre aproximadamente 20 °C y 25 °C por debajo de la Tm para la formacion de un hfbrido de ADN-ADN. Es bien conocido en la tecnica que la Tm es la temperatura de fusion, o la temperatura a la que se disocian dos secuencias de polinucleotidos complementarias. Los procedimientos para estimar la Tm son bien conocidos en la tecnica (vease Ausubel y col., mencionado anteriormente, en la pagina 2.10.8).
En general, la Tm de un duplex de ADN perfectamente emparejado se puede predecir como una aproximacion mediante la formula: Tm = 81,5 16,6 (log10 M) 0,41 (% de G+C) - 0,63 (% de formamida) - (600/longitud) donde: M es la concentracion de Na+, preferentemente en el intervalo de 0,01 molar a 0,4 molar; % de G+C es la suma de las bases de guanosina y citosina como porcentaje del numero total de bases, dentro del intervalo entre el 30 % y el 75 % de G+C; % de formamida es el porcentaje de concentracion de formamida por volumen; longitud es el numero de pares de bases en el duplex de ADN. La Tm de un ADN duplex disminuye en aproximadamente 1 °C con cada aumento del 1 % en el numero de pares de bases con falta de coincidencia aleatoria. El lavado se realiza generalmente a Tm - 15 °C para una rigurosidad alta, o Tm - 30 °C para una rigurosidad moderada.
En un ejemplo de un procedimiento de hibridacion, una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nylon) que contiene ADN inmovilizado se hibrida durante una noche a 42 °C en un tampon de hibridacion (formamida desionizada al 50 %, 5 x SSC, 5 x solucion de Denhardt (ficoll al 0,1 %, polivinilpirrolidona al 0,1 % y albumina de suero bovino al 0,1 %), SDS al 0,1 % y 200 mg/ml de ADN de esperma de salmon desnaturalizado que contiene una sonda etiquetada. La membrana se somete a continuacion a dos lavados secuenciales a rigurosidad media (es decir, 2 x SSC, SDS al 0,1 % durante 15 min a 45 °C, seguido de 2 x SSC, SDS al 0,1 % durante 15 min a 50 °C), seguido de dos lavados secuenciales a mayor rigurosidad (es decir, 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % durante 12 min a 55 °C, seguido de 0,2 x SSC y solucion de SDS al 0,1 % durante 12 min a 65-68 °C.
Production de polipeptidos de HRS y conjugados HRS-Fc
Los polipeptidos conjugados HRS-Fc pueden prepararse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante el uso de sfntesis de peptidos en fase solida estandar (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)), o mediante tecnologfa recombinante usando un huesped modificado geneticamente. La sfntesis de protefnas se puede realizar usando tecnicas manuales o por automatizacion. La sfntesis automatizada se puede conseguir, por ejemplo, usando el sintetizador de peptidos 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer). Como alternativa, varios fragmentos pueden sintetizarse qufmicamente por separado y combinarse usando procedimientos qufmicos para producir la molecula deseada.
Los conjugados HRS-Fc tambien pueden producirse expresando una secuencia de ADN o ARN que codifica el polipeptido de HRS o los conjugados HRS-Fc en cuestion en una celula huesped adecuada mediante tecnicas bien conocidas. La secuencia de polinucleotidos que codifica el conjugado HRS-Fc o el polipeptido de HRS puede prepararse sinteticamente mediante procedimientos estandar establecidos, por ejemplo, el procedimiento de la fosforamidita descrito por Beaucage y col., Tetrahedron Letters 22: 1859-1869, 1981; o el procedimiento descrito por Matthes y col., EMBO Journal 3: 801-805, 1984. De acuerdo con el procedimiento de la fosforamidita, los oligonucleotidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador automatico de ADN, se purifican, se duplexan y se ligan para formar la construccion sintetica de ADN. Como alternativa, la construccion de ADN o ARN puede construirse usando tecnicas estandar de biologfa molecular recombinante que incluyen la clonacion mediada por enzimas de restriccion y la amplificacion de genes basada en PCR. En algunas realizaciones de la presente descripcion para la expresion directa mediada por ARNm, el polinucleotido puede encapsularse en una nanopartfcula o liposoma para permitir un suministro y captacion eficientes en la celula, y opcionalmente incluir una estructura de casquete o cola modificada para mejorar la estabilidad y la traduccion.
Las secuencias de polinucleotidos tambien pueden ser de genomica mixta, ADNc, ARN y una de origen sintetico. Por ejemplo, una secuencia genomica o de ADNc que codifica un peptido lfder puede unirse a una secuencia genomica o de ADNc que codifica el polipeptido de HRS o el conjugado HRS-Fc, despues de lo cual la secuencia de ADN o ARN puede modificarse en un sitio insertando oligonucleotidos sinteticos que codifican la secuencia de aminoacidos deseada para recombinacion homologa de acuerdo con procedimientos bien conocidos o, preferentemente, generando la secuencia deseada mediante PCR usando oligonucleotidos adecuados. En algunas realizaciones de la presente descripcion, se puede incluir una secuencia senal antes de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un peptido senal N-terminal a la secuencia codificante que se comunica con la celula huesped para dirigir el polipeptido a la superficie celular o secretar el polipeptido al medio. Tfpicamente, la celula huesped corta el peptido senal antes de que la protefna salga de la celula. Los peptidos senal se pueden encontrar en diversas protefnas en procariotas y eucariotas.
Se conocen diversos sistemas de vector de expresion/huesped y pueden utilizarse para contener y expresar secuencias de polinucleotidos. Estos incluyen, aunque sin limitarse a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresion de ADN de bacteriofagos recombinantes, plasmidos o cosmidos; levaduras transformadas con vectores de expresion de levaduras; sistemas de celulas de insecto infectados con vectores de expresion de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas celulares vegetales transformados con vectores de expresion de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresion bacterianos (por ejemplo, plasmidos Ti o pBR322); o sistemas de celulas animales, incluyendo celulas de mamfferos y mas especfficamente sistemas de celulas humanas transformadas con vectores de expresion virales, plasmfdicos, episomales o integradores.
Los «elementos de control» o las «secuencias reguladoras» presentes en un vector de expresion son regiones no traducidas del vector--potenciadores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3'--que interaction con las protefnas celulares del huesped para llevar a cabo la transcripcion y la traduccion. Dichos elementos pueden variar en su potencia y especificidad. Dependiendo del sistema de vectores y del huesped utilizado, pueden usarse cualquier numero de elementos de transcripcion y traduccion adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles como el promotor lacZ hfbrido del fagemido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, California) o el plasmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) y similares. En sistemas celulares de mamfferos, generalmente se prefieren los promotores de genes de mamfferos o de virus de mamfferos. Si es necesario generar una lfnea celular que contenga multiples copias de la secuencia que codifica un polipeptido, los vectores basados en SV40 o EBV pueden usarse ventajosamente con un marcador seleccionable apropiado.
Ciertas realizaciones de la presente descripcion pueden emplear sistemas de expresion basados en E. coli (vease, por ejemplo, Structural Genomics Consortium y col., Nature Methods. 5: 135-146, 2008). Estas y realizaciones relacionadas de la presente descripcion pueden basarse parcial o totalmente en la clonacion independiente de ligamiento (LIC) para producir un vector de expresion adecuado. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, la expresion de protefnas puede controlarse mediante una ARN polimerasa T7 (por ejemplo, una serie de vectores pET), o vectores pET modificados con promotores alternativos, que incluyen, por ejemplo, el promotor TAC. Estas y otras realizaciones relacionadas de la presente descripcion pueden utilizar la cepa huesped de expresion BL21 (DE3), un lisogeno ZDE3 de BL21 que soporta la expresion mediada por T7 y es deficiente en proteasas lon y ompT para mejorar la estabilidad de la protefna diana. Tambien se incluyen las cepas huesped de expresion que portan los plasmidos que codifican los ARNt usados raramente en E. coli, tales como las cepas ROSETTA™ (d E3) y Rosetta 2 (DE3). En algunas realizaciones de la presente descripcion, se pueden utilizar otras cepas de E. coli, incluyendo otras cepas de E. coli K-12 tales como W3110 (F-lambda-IN (rrnD-rrnE) 1 rph-1) y UT5600 (F, araC14, leuB6 (Am), secA206(aziR), lacY1, proC14, tsx67, A(ompTfepC)266, entA403, glnX44(AS), X-, trpE38, rfbC1, rpsL109(strR), xylA5, mtl-1, thiE1), lo que puede dar como resultado niveles reducidos de modificaciones postraduccionales durante la fermentacion. La lisis celular y el manejo de la muestra tambien se pueden mejorar usando los reactivos comercializados con las marcas registradas nucleasa BENZONASE® y reactivo de extraccion de protefnas BUGBUSTER®. Para el cultivo celular, los medios autoinductores pueden mejorar la eficiencia de muchos sistemas de expresion, incluyendo los sistemas de expresion de alto rendimiento. Los medios de este tipo (por ejemplo, el sistema de autoinduccion OVERNIGHT EXPRESS™) provocan gradualmente la expresion de protefnas a traves del cambio metabolico sin la adicion de agentes inductores artificiales tales como IPTG.
Las realizaciones particulares de la presente descripcion emplean etiquetas de hexahistidina (tales como las comercializadas con la marca registrada HIS^TAG®), seguidas de la purificacion mediante cromatograffa por afinidad metalica inmovilizada (IMAC), o tecnicas relacionadas. Sin embargo, en ciertos aspectos de la presente descripcion, las protefnas de grado clfnico se pueden aislar de cuerpos de inclusion de E. coli, con o sin el uso de marcas de afinidad (vease, por ejemplo, Shimp y col., Protein Expr Purif. 50: 58-67, 2006). Como un ejemplo adicional, ciertas realizaciones de la presente descripcion pueden emplear un sistema de produccion de alto rendimiento de E. coli inducido por choque de frfo, porque la sobreexpresion de protefnas en Escherichia coli a baja temperature mejora su solubilidad y estabilidad (vease, por ejemplo, Qing y col., Nature Biotechnology. 22: 877-882, 2004).
Tambien se incluyen sistemas de fermentacion bacteriana de alta densidad. Por ejemplo, el cultivo de alta densidad celular de Ralstonia eutropha permite la produccion de protefnas a densidades celulares de mas de 150 g/l, y la expresion de protefnas recombinantes a tftulos que superan 10 g/l. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, se pueden usar una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para revisiones, vease Ausubel y col. (mencionado anteriormente) y Grant y col., Methods Enzymol. 153: 516-544, 1987. Tambien se incluyen los sistemas de expresion de Pichia pandoris (vease, por ejemplo, Li y col., Nature Biotechnology. 24, 210-215, 2006; y Hamilton y col., Science, 301: 1244, 2003). Ciertas realizaciones de la presente descripcion incluyen sistemas de levadura que estan disenados para glucosilar selectivamente protefnas, incluyendo levaduras que tienen vfas de N-glucosilacion humanizadas, entre otras (vease, por ejemplo, Hamilton y col., Science. 313: 1441-1443, 2006; Wildt y col., Nature Reviews Microbiol. 3: 119-28, 2005; y Gerngross y col., Nature-Biotechnology. 22: 1409-1414, 2004; patentes de Estados Unidos N.° 7.629.163; 7.326.681; y 7.029.872). Simplemente a modo de ejemplo, los cultivos de levadura recombinante se pueden cultivar en matrices Fernbach o en fermentadores de 15 l, 50 l, 100 l y 200 l, entre otros.
En casos en que se usan vectores de expresion de plantas, la expresion de secuencias que codifican polipeptidos puede ser impulsada por cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo, promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de CaMv se pueden usar solos o en combinacion con la secuencia lfder omega de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6: 307-311,1987). Como alternativa, se pueden usar promotores de plantas tales como la subunidad pequena de RUBISCO o promotores por choque termico (Coruzzi y col., EMBO J. 3: 1671-1680, 1984; Broglie y col., Science. 224: 838-843, 1984; y Winter y col., Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105, 1991). Estas construcciones pueden introducirse en celulas vegetales mediante transformacion directa de ADN o transfeccion mediada por patogenos. Dichas tecnicas se describen en una serie de revisiones generalmente disponibles (vease, por ejemplo, Hobbs en McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, pags. 191-196, 1992).
Tambien se puede usar un sistema de insectos para expresar un polipeptido de interes. Por ejemplo, en un sistema de este tipo, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes extranos en celulas de Spodoptera frugiperda o en celulas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipeptido pueden clonarse en una region no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de la polihedrina. La insercion exitosa de la secuencia que codifica el polipeptido hara que el gen de la polihedrina sea inactivo y produzca un virus recombinante que carezca de protefna de la cubierta. Los virus recombinantes se pueden usar para infectar, por ejemplo, celulas de S. frugiperda o celulas de Trichoplusia donde se puede expresar el polipeptido de interes (Engelhard y col., PNAS EE. UU. 91: 3224-3227, 1994). Tambien se incluyen los sistemas de expresion de baculovirus, incluidos los que utilizan celulas SF9, SF21 y T. ni (vease, por ejemplo, Murphy y Piwnica-Worms, Curr Protoc Protein Sci. Capftulo 5: Unidad 5.4, 2001). Los sistemas de insectos pueden proporcionar modificaciones postraduccionales que son similares a los sistemas de mamfferos.
En celulas huesped de mamffero, una serie de sistemas de expresion son bien conocidos en la tecnica y estan disponibles en el mercado. Los sistemas de vectores de mamfferos ejemplares incluyen, por ejemplo, pCEP4, pREP4 y pREP7 de Invitrogen, el sistema PerC6 de Crucell y sistemas basados en lentivirus tales como pLP1 de Invitrogen y otros. Por ejemplo, en casos donde se usa un adenovirus como vector de expresion, las secuencias que codifican un polipeptido de interes pueden ligarse en un complejo de transcripcion/traduccion de adenovirus que consiste en el promotor tardfo y la secuencia lfder tripartita. La insercion en una region no esencial E1 o E3 del genoma viral se puede usar para obtener un virus viable que sea capaz de expresar el polipeptido en celulas huesped infectadas (Logan & Shenk, PNAS EE. UU. 81: 3655-3659, 1984). Ademas, los potenciadores de la transcripcion, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), se pueden usar para aumentar la expresion en celulas huesped de mamfferos.
Los ejemplos de lfneas celulares huesped de mamffero utiles incluyen la lfnea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la linea de rinon embrionario humano (celulas 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspension, Graham y col., J. Gen Virol. 36: 59, 1977); celulas de rinon de crfa de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); celulas de rinon de mono (CV1 ATCC CCL 70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); celulas de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); celulas renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de hfgado de rata de Buffalo (BRL 3a , ATCC CRL 1442); celulas pulmonares humanas (W138, ATCC Cc L 75); celulas hepaticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (MMT 060562, At Cc CCL51); celulas TR1 (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68, 1982); celulas MRC 5; celulas FS4; y una linea de hepatoma humano (Hep G2). Otras lineas celulares huesped de mamifero utiles incluyen celulas de ovario de hamster chino (CHO), incluyendo celulas DHFR-CHO (Urlaub y col., PNAS EE. UU. 77: 4216, 1980); y lineas celulares de mieloma tales como NSO y Sp2/0. Para una revision de ciertas lineas celulares huesped de mamifero adecuadas para la produccion de anticuerpos, vease, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K.C Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pags. 255-268. Ciertos sistemas de expresion de celulas de mamifero preferidos incluyen sistemas de expresion basados en celulas CHO y HEK293. Los sistemas de expresion de mamfferos pueden utilizar lineas celulares adjuntas, por ejemplo, en matraces T, frascos de cultivo rotatorios o fabricas celulares, o cultivos en suspension, por ejemplo, en matraces de agitacion de 1 l y 5 l, biorreactores con tanque de agitacion de 5 l, 14 l, 40 l, 100 l y 200 l. o biorreactores WAVE de 20/50 l y 100/200 l, entre otros conocidos en la tecnica.
Tambien se incluyen procedimientos de expresion de protefnas libres de celulas. Estas y otras realizaciones relacionadas de la presente descripcion utilizan tfpicamente ARN polimerasa purificada, ribosomas, ARNt y ribonucleotidos. Dichos reactivos pueden producirse, por ejemplo, por extraccion a partir de celulas o a partir de un sistema de expresion basado en celulas.
Ademas, se puede seleccionar una cepa de celulas huesped por su capacidad para modular la expresion de las secuencias insertadas o para procesar la protefna expresada de la manera deseada. Dichas modificaciones del polipeptido incluyen, aunque sin limitarse a, modificaciones postraduccionales tales como acetilacion, carboxilacion, glucosilacion, fosforilacion, lipidacion y acilacion, o la insercion de aminoacidos de origen no natural (vease, en general, las patentes de Estados Unidos N.° 7.939.496 7.816.320; 7.947.473; 7.883.866; 7.838.265; 7.829.310; 7.820.766; 7.820.766; 7.7737.226, 7.736.872; 7.638.299; 7.632.924; y 7.230.068). En algunas realizaciones de la presente descripcion, dichos aminoacidos de origen no natural pueden insertarse en la posicion Cys130. El procesamiento postraduccional que escinde una forma «prepro» de la protefna tambien se puede usar para facilitar la insercion, el plegamiento y/o la funcion correctos. Se pueden seleccionar diferentes celulas huesped tales como levadura, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138, ademas de las celulas bacterianas, que tienen o incluso carecen de maquinaria celular especffica y mecanismos caracterfsticos para dichas actividades postraduccionales, para garantizar la modificacion y el procesamiento correctos de la protefna extrana.
Los polipeptidos de HRS o conjugados HRS-Fc producidos por una celula recombinante pueden purificarse y caracterizarse de acuerdo con diversas tecnicas conocidas en la tecnica. Los sistemas ejemplares para realizar la purificacion de protefnas y analizar la pureza de protefnas incluyen cromatograffa de lfquidos de protefna rapida (FPLC) (por ejemplo, sistemas AKTA de AKTA y Bio-Rad), cromatograffa de lfquidos de alta presion (HPLC) (por ejemplo, HPLC de Beckman y Waters). Qufmicas ejemplares para la purificacion incluyen cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, Q, S), cromatograffa de exclusion por tamano, gradientes de sal, purificacion por afinidad (por ejemplo, Ni, Co, FLAG, maltosa, glutation, protefna A/G), filtracion en gel, fase inversa, cromatograffa de intercambio ionico HYPERD® de ceramica y columnas de interaccion hidrofoba (HIC), entre otras conocidas en la tecnica. Varios procedimientos ejemplares tambien se describen en las secciones de ejemplos.
Conjugados HRS-Fc
Como se senalo anteriormente, las realizaciones de la presente descripcion se refieren a conjugados HRS-Fc, que comprenden al menos una region Fc que esta unida covalentemente a uno o mas polipeptidos de HRS. Los ejemplos de conjugados HRS-Fc incluyen protefnas de fusion y diversas formas de protefnas reticuladas qufmicamente. Se puede emplear una amplia variedad de secuencias de la region Fc en los conjugados HRS-Fc de la presente descripcion, incluyendo secuencias de tipo silvestre de cualquier numero de especies, asf como variantes, fragmentos, hfbridos y formas qufmicamente modificadas de las mismas. Los polipeptidos de HRS-Fc tambien pueden comprender (opcionalmente) uno o mas enlazadores, que tfpicamente separan la o las regiones Fc del o de los polipeptidos de HRS, incluyendo enlazadores peptfdicos y enlazadores qufmicos, como se describe en el presente documento y se conoce en la tecnica. Se apreciara que, en cualquiera de estos conjugados HRS-Fc, el aminoacido N o C terminal nativo de los polipeptidos de HRS, o el aminoacido N o C nativo en el dominio Fc, puede ser eliminado y/o reemplazado con uno o mas aminoacidos no nativos, por ejemplo, para facilitar la expresion y/o la clonacion o para servir como una secuencia enlazadora entre las dos protefnas.
Los polipeptidos de conjugados HRS-Fc pueden proporcionar diversas ventajas con respecto a los polipeptidos de HRS no conjugados o no modificados, por ejemplo, los polipeptidos de HRS correspondientes de la misma secuencia o secuencia similar que no tienen una o mas regiones Fc unidas a ellos. Simplemente a modo de ilustracion, la union covalente de una o mas regiones Fc puede alterar (por ejemplo, aumentar, disminuir) la solubilidad, la semivida (por ejemplo, en suero, en un tejido seleccionado, en un tubo de ensayo en condiciones de almacenamiento, por ejemplo, a temperatura ambiente o en refrigeracion), las propiedades de dimerizacion o multimerizacion, la actividad o actividades biologicas del polipeptido de HRS, por ejemplo, proporcionando funciones efectoras asociadas a la region Fc (por ejemplo, activacion de la cascada clasica del complemento, interaccion con celulas efectoras inmunitarias mediante el receptor de Fc (FcR), compartimentacion de inmunoglobulinas), captacion celular, transporte intracelular, distribucion tisular y/o biodisponibilidad, con respecto a un polipeptido de HRS no modificado que tiene la misma secuencia o similar. En ciertos aspectos de la presente descripcion, las regiones Fc pueden conferir funciones efectoras relacionadas con citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o fagocitocis mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCP), que se cree que desempenan un papel en el aclaramiento de celulas diana especfficas, tales como celulas tumorales y celulas infectadas.
Ciertas realizaciones de la presente descripcion emplean protefnas de fusion HRS-Fc. Las «protefnas de fusion» se definen en otra parte en el presente documento y son bien conocidas en la tecnica, como lo son procedimientos para elaborar protefnas de fusion (vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.116.964; 5.428.130; 5.455.165; 5.514.582; 6.406.697; 6.291.212; y 6.300.099 para descripcion general y procedimientos relacionados con las protefnas de fusion Fc). En una protefna de fusion HRS-Fc, la region Fc puede fusionarse con el extremo N del polipeptido de HRS, el extremo C, o ambos. En algunas realizaciones de la presente descripcion, una o mas regiones Fc pueden fusionarse internamente con respecto a las secuencias de HRS, por ejemplo, colocando una region Fc entre una primera secuencia de HRS (por ejemplo, dominio) y una segunda secuencia de HRS (por ejemplo, dominio), donde la primera secuencia de HRS se fusiona con el extremo N de la region Fc y la segunda secuencia de HRS se fusiona con el extremo C de la region Fc. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, la primera y la segunda secuencias de HRS son identicas. En otras realizaciones de la presente descripcion, la primera y la segunda secuencias de HRS son diferentes (por ejemplo, incluyen diferentes dominios funcionales del polipeptido de HRS). Ciertas protefnas de fusion HRS-Fc tambien pueden incluir secuencias de protefnas heterologas adicionales, es decir, secuencias no de region Fc y no de polipeptido de HRS.
El termino «HRS-Fc» puede indicar, pero no necesariamente indica, la union N-terminal o C-terminal de la region Fc al polipeptido de HRS. Por ejemplo, en ciertos casos, el termino «Fc-HRS» indica la fusion de la region Fc con el extremo N del polipeptido de h Rs , y el termino «HRS-Fc» indica la fusion de la region Fc con el extremo C del polipeptido de HRS. Sin embargo, cualquiera de los dos terminos puede usarse mas generalmente para referirse a cualquier protefna de fusion o conjugado de una region Fc y un polipeptido de HRS.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, las protefnas de fusion HRS-Fc pueden comprender copias repetidas en tandem del polipeptido de HRS acoplado a un unico dominio Fc, opcionalmente separados por peptidos enlazadores. Las protefnas de fusion HRS-Fc repetidas en tandem ejemplares se proporcionan en la tabla D10. La preparacion y las secuencias para conjugados HRS-Fc especfficos repetidos en tandem se ilustran en los ejemplos.
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Ciertas realizaciones de la presente descripcion se refieren a conjugados HRS-Fc, donde, por ejemplo, una o mas regiones Fc estan conjugadas qufmicamente o reticuladas con el o los polipeptidos de HRS. En estos y en aspectos relacionados de la presente descripcion, la region Fc puede conjugarse al polipeptido HRS en la region N-terminal (por ejemplo, dentro de los primeros 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 aminoacidos mas o menos), la region interna (entre las regiones N-terminal y C-terminal), y/o la region C-terminal (por ejemplo, dentro de los ultimos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 aminoacidos mas o menos). Los polipeptidos se pueden conjugar o reticular con otros polipeptidos de acuerdo con diversas tecnicas de rutina en la tecnica. Por ejemplo, ciertas tecnicas emplean el reticulador de carbodiimida reactivo con carboxilo EDC (o EDAC), que se une covalentemente a traves de los grupos carboxilo D, E y C-terminales. Otras tecnicas emplean EDC activado, que se une covalentemente a traves de los grupos amino K y N-terminal). Todavfa otras tecnicas emplean el ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) o Sulfo-MBS, que se unen covalentemente mediante el grupo tiol de un residuo de cistefna (vease tambien la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0092940 para regiones de Ig disenadas con cistefna que pueden usarse para la conjugacion de tiol). Dichas protefnas reticuladas tambien pueden comprender enlazadores, incluyendo enlazadores escindibles o liberables de otro modo (por ejemplo, enlazadores escindibles enzimaticamente, enlazadores hidrolizables), y enlazadores no escindibles (es decir, enlazadores fisiologicamente estables). Ciertas realizaciones de la presente descripcion pueden emplear polfmeros no peptfdicos (por ejemplo, polfmeros de PEG; conjugado HRS-N-PEG-N-Fc) como un reticulador entre la o las regiones Fc y el o los polipeptidos de HRS, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de Estados Unidos N.° 2006/0269553. Vease tambien la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0269369 para descripciones ejemplares de los sitios de conjugacion de la region Fc.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, descritas con mayor detalle a continuacion, pueden emplearse regiones Fc variantes o modificadas de otra manera, incluyendo aquellas que tienen propiedades o actividades biologicas alteradas con respecto a la o las regiones Fc de tipo silvestre. Los ejemplos de regiones Fc modificadas incluyen aquellas que tienen secuencias mutadas, por ejemplo, por sustitucion, insercion, eliminacion o truncamiento de uno o mas aminoacidos con respecto a una secuencia de tipo silvestre, polipeptidos Fc hfbridos compuestos por dominios de diferentes clases/subclases de inmunoglobulina, polipeptidos Fc que tienen patrones de glucosilacion/sialilacion alterados y polipeptidos Fc que se modifican o derivan, por ejemplo, por biotinilacion (vease, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2010/0209424), fosforilacion, sulfatacion, etc., o cualquier combinacion de las anteriores. Dichas modificaciones pueden emplearse para alterar (por ejemplo, aumentar, disminuir) las propiedades de union de la region Fc a uno o mas FcR particulares (por ejemplo, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc, FcyRIIIa, FcyRIIb, FcRn), sus propiedades farmacocineticas (por ejemplo, estabilidad o semivida, biodisponibilidad, distribucion tisular, volumen de distribucion, concentracion, constante de velocidad de eliminacion, velocidad de eliminacion, area bajo la curva (AUC), aclaramiento, Cmax, tmax, Cmin, fluctuacion), su inmunogenicidad, su fijacion o activacion del complemento, y/o las actividades relacionadas con CDC/ADCC/ADCP de la region Fc, entre otras propiedades descritas en el presente documento, con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente.
La «region Fc» de un conjugado HRS-Fc que proporcionada en el presente documento se deriva habitualmente de la cadena pesada de una molecula de inmunoglobulina (Ig). Una molecula de Ig tfpica esta compuesta por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las cadenas pesadas se pueden dividir en al menos tres regiones funcionales: la region Fd, la region Fc (region cristalizable del fragmento) y la region bisagra (vease la figura 1), encontrandose esta ultima solo en inmunoglobulinas IgG, IgA e IgD. La region Fd comprende los dominios variable (Vh) y constante (CH1) de las cadenas pesadas y, junto con los dominios variable (Vl) y constante (Cl) de las cadenas ligeras, forma el fragmento de union al antfgeno o la region Fab.
La region Fc de las inmunoglobulinas IgG, IgA e IgD comprende los dominios constantes de cadena pesada 2 y 3, designados respectivamente como regiones CH2 y CH3; y la region Fc de las inmunoglobulinas IgE e IgM comprende los dominios constantes de cadena pesada 2, 3 y 4, designados respectivamente como regiones CH2, CH3 y CH4. La region Fc es la principal responsable de las funciones efectoras de la inmunoglobulina, que incluyen, por ejemplo, fijacion del complemento y union a los receptores Fc analogos de celulas efectoras.
La region bisagra (descubierta en IgG, IgA e IgD) actua como un espaciador flexible que permite que la parte Fab se mueva libremente en el espacio con respecto a la region Fc. En contraste con las regiones constantes, las regiones bisagra son estructuralmente diversas, variando tanto en secuencia como en longitud entre las clases y subclases de inmunoglobulina. La region bisagra tambien puede contener uno o mas sitios de glucosilacion, que incluyen varios tipos de sitios estructuralmente distintos para la union de carbohidratos. Por ejemplo, la IgA1 contiene cinco sitios de glucosilacion dentro de un segmento de 17 aminoacidos de la region bisagra, lo que confiere una resistencia significativa del polipeptido de la region bisagra a las proteasas intestinales. Los residuos en la region proximal de la bisagra del dominio CH2 tambien pueden influir en la especificidad de la interaccion entre una inmunoglobulina y su o sus receptores de Fc respectivos (vease, por ejemplo, Shin y col., Intern. Rev. Immunol. 10: 177-186, 1993).
La expresion «region Fc» o «fragmento Fc» o «Fc», como se usa en el presente documento, se refiere a una protefna que contiene una o mas de una region CH2, una region CH3 y/o una region CH4 de una o mas inmunoglobulinas seleccionadas, incluyendo fragmentos y variantes y combinaciones de los mismos. Una «region
Fc» tambien puede incluir una o mas regiones bisagra de la region constante de cadena pesada de una inmunoglobulina. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc no contiene una o mas de las regiones CH1, Cl, Vl y/o Vh de una inmunoglobulina.
La region Fc puede derivarse de la region CH2, la region CH3, la region CH4 y/o la o las regiones bisagra de una cualquiera o mas de las clases de inmunoglobulina, incluyendo aunque sin limitarse a IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, incluyendo las subclases y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc se deriva de una inmunoglobulina IgA, incluyendo las subclases IgA1 y/o IgA2. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc se deriva de una inmunoglobulina IgD. En realizaciones particulares de la presente descripcion, la region Fc se deriva de una inmunoglobulina IgE. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc se deriva de una inmunoglobulina IgG, incluyendo las subclases IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 y/o
IgG4. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc se deriva de una inmunoglobulina IgM. La figura 2 muestra un alineamiento de regiones Fc de IgA1 (SEQ ID NO:156), IgA2 (SEQ ID NO:157), IgM
(SEQ ID NO:158), IgG1 (SEQ ID NO:159), IgG2 (SEQ ID NO:160), IgG3 (SEQ ID NO:161), IgG4(SEQ ID NO:162) e
IgE (SEQ ID NO:163) humanas.
Ciertas regiones Fc demuestran una union especffica para uno o mas receptores de Fc (FcR). Los ejemplos de clases de receptores de Fc incluyen receptores de Fcy (FcyR), receptores de Fca (FcaR), receptores de Fce (FceR) y el receptor de Fc neonatal (FcRn). Por ejemplo, ciertas regiones Fc tienen una mayor union a (o afinidad por) uno o mas FcyR, con respecto a FcaR, FceR y/o FcRn. En algunas realizaciones de la presente descripcion, las regiones
Fc tienen union aumentada a FcaR, con respecto a uno o mas FcyR, FceR y/o FcRn. En otras realizaciones de la presente descripcion, las regiones Fc tienen union aumentada a FceR (por ejemplo, FcaRI), con respecto a uno o mas FcyR, FcaR y/o FcRn. En realizaciones particulares de la presente descripcion, las regiones Fc tienen union aumentada a FcRn, con respecto a uno o mas FcyR, FcaR y/o FceR. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la union (o afinidad) de una region Fc a uno o mas FcR seleccionados aumenta con respecto a su union a (o afinidad por) uno o mas FcR diferentes, tfpicamente en aproximadamente 1,5x, 2x, 2,5x, 3x, 3,5x, 4x, 4,5x, 5x,
6x, 7x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x,
900x, 1000x o mas (incluyendo todos los numeros enteros intermedios).
Los ejemplos de FcyR incluyen FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc, FcyRIIIa y FcyRIIIb. FcyRI (CD64) se expresa en macrofagos y celulas dendrfticas y desempena un papel en la fagocitosis, el estallido respiratorio, la estimulacion de citocinas y el transporte endocftico de celulas dendrfticas. La expresion de FcyRI esta regulada por incremento tanto por GM-CSF como por el interferon y (y-IFN) y por la interleucina-4 (IL-4). FcyRIIa se expresa en leucocitos polimorfonucleares (PMN), macrofagos, celulas dendrfticas y mastocitos. FcyRIIa desempena un papel en la fagocitosis, el estallido respiratorio y la estimulacion de citocinas. La expresion de FcyRIIa esta regulada positivamente por GM-CSF y y-IFN, y es reducida por IL-4. FcyIIb se expresa en linfocitos B, PMN, macrofagos y mastocitos. FcyIIb inhibe las respuestas mediadas por el mecanismo de activacion basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) y, por lo tanto, es un receptor inhibidor. La expresion de FcyRIIc esta regulada positivamente por la inmunoglobulina intravenosa (IVIG) e IL-4 y es reducida por y-IFN. FcyRIIc se expresa en linfocitos NK. FcyRIIIa se expresa en linfocitos citolfticos naturales (NK), macrofagos, mastocitos y plaquetas. Este receptor participa en la fagocitosis, el estallido respiratorio, la estimulacion de citocinas, la agregacion y la desgranulacion de las plaquetas, y la ADCC mediada por NK. La expresion de FcyRIII esta regulada positivamente por C5a, TGF-p y y-IFN y esta regulada negativamente por IL-4. FcyRIIIb es un receptor enlazado a GPI expresado en PMN.
Ciertas regiones Fc tienen union aumentada a FcyRI, con respecto a FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc, FcyRIIIa y/o FcyRIIIb.
Algunas realizaciones de la presente descripcion tienen union aumentada a FcyRIIa, con respecto a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIc, FcyRIIIa y/o FcyRIIIb. Las regiones Fc particulares tienen union aumentada a FcyRIIb, con respecto a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIc, FcyRIIIa y/o FcyRIIIb. Ciertas regiones Fc tienen union aumentada a FcyRIIc, con respecto a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa y/o FcyRIIIb. Algunas regiones Fc tienen union aumentada a FcyRIIIa, con respecto a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc y/o FcyRIIIb. Las regiones Fc especfficas tienen union aumentada a FcyRIIIb, con respecto a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc y/o FcyRIIIa.
Los FcaR incluyen FcaRI (CD89). El FcaRI se encuentra en la superficie de neutrofilos, eosinofilos, monocitos, ciertos macrofagos (por ejemplo, celulas de Kupffer) y ciertas celulas dendrfticas. El FcaRI esta compuesto por dos dominios extracelulares similares a Ig, es miembro tanto de la superfamilia de inmunoglobulinas como de la familia
del receptor de reconocimiento inmunitario de multiples cadenas (MIRR), y constituye una senal al asociarse con dos cadenas de senalizacion de FcRy.
Los FcgR incluyen FcgRI y FcgRII. El receptor de alta afinidad FcgRI es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, se expresa en celulas de Langerhans epidermicas, eosinofilos, mastocitos y basofilos, y desempena un papel fundamental en el control de las respuestas alergicas. El FcgRI tambien se expresa en las celulas presentadoras de antfgenos y regula la produccion de citocinas proinflamatorias. El receptor de baja afinidad FcgRII (CD23) es una lectina de tipo C que puede funcionar como un receptor unido a la membrana o soluble. El FcgRII regula el crecimiento y la diferenciacion de los linfocitos B, y bloquea la union a IgE de eosinofilos, monocitos y basofilos. Ciertas regiones Fc tienen union aumentada a FcgRI, con respecto a FcgRII. Otras regiones Fc tienen union aumentada a FcgRII, con respecto a FcgRI.
La tabla F1 a continuacion resume las caracterfsticas de ciertos FcR.
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Las regiones Fc pueden derivarse de las moleculas de inmunoglobulina de cualquier animal, incluyendo vertebrados tales como mamfferos, tales como vacas, cabras, cerdos, perros, ratones, conejos, hamsteres, ratas, cobayas, primates no humanos y seres humanos. Las secuencias de aminoacidos de las regiones CH2, CH3, CH4 y bisagra de las inmunoglobulinas IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM humanas ejemplares de tipo silvestre se muestran a continuacion (SEQ ID NO:128-154).
La SEQ ID NO:128 es la secuencia de aminoacidos de una region bisagra de IgA1 humana (VPSTPPTPSPSTPPTPSPS).
La SEQ ID NO:129 es la secuencia de aminoacidos de una region CH2 de IgA1 humana (CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWN HGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKS).
La SEQ ID NO:130 es la secuencia de aminoacidos de una region CH3 de IgA1 humana (GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILR VAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVM AEVDGTCY).
La SEQ ID NO:131 es la secuencia de aminoacidos de una region bisagra de IgA2 humana (VPPPPP).
La SEQ ID NO:132 es la secuencia de aminoacidos de una region CH2 de IgA2 humana (CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWN HGETFTCTAAHPELKTPLTANITKS).
La SEQ ID NO:133 es la secuencia de aminoacidos de una region CH3 de IgA2 humana (GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILR VAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVM AEVDGTCY).
La SEQ ID NO:134 es la secuencia de aminoacidos de una region bisagra de IgD humana (ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP).
La SEQ ID NO:135 es la secuencia de aminoacidos de una region CH2 de IgD humana (ECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFWGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLT LPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREP).
La SEQ ID NO:136 es la secuencia de aminoacidos de una region CH3 de IgD humana (AAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPRSTTFWAWSVLRVP APPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK).
La SEQ ID NO:137 es la secuencia de aminoacidos de una region CH2 de IgE humana (VCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLS QKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCA).
La SEQ ID NO:138 es la secuencia de aminoacidos de una region CH3 de IgE humana (DSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGT RDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS).
La SEQ ID NO:139 es la secuencia de aminoacidos de una region CH4 de IgE humana (GPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTR AEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK).
La SEQ ID NO:140 es la secuencia de aminoacidos de una region bisagra de IgG1 humana (EPKSCDKTHTCPPCP).
La SEQ ID NO:341 es la secuencia de aminoacidos de una secuencia derivada de una region bisagra de IgG1 humana modificada (SDKTHTCPPCP).
La SEQ ID NO:141 es la secuencia de aminoacidos de una region CH2 de IgG1 humana (APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK).
La SEQ ID NO:142 es la secuencia de aminoacidos de una region CH3 de IgG1 humana (GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK).
La SEQ ID NO:342 es la secuencia de aminoacidos de una secuencia de cadena pesada de IgG1 humana (MSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK) . Se apreciara que el residuo de Met en esta secuencia de la cadena pesada de IgG1 humana se puede eliminar, por ejemplo, tras la fusion N-terminal a un polipeptido de HRS (vease la SEQ ID NO:340).
La SEQ ID NO:143 es la secuencia de aminoacidos de una region bisagra de IgG2 humana (ERKCCVECPPCP). La SEQ ID NO:144 es la secuencia de aminoacidos de una region CH2 de IgG2 humana (APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTV VHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK).
La SEQ ID NO:145 es la secuencia de aminoacidos de una region CH3 de IgG2 humana (GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK).
La SEQ ID NO:146 es la secuencia de aminoacidos de una region bisagra de IgG3 humana (ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP).
La SEQ ID NO:147 es la secuencia de aminoacidos de una region CH2 de IgG3 humana (APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTK).
La SEQ ID NO:148 es la secuencia de aminoacidos de una region CH3 de IgG3 humana (GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK).
La SEQ ID NO:149 es la secuencia de aminoacidos de una region bisagra de IgG4 humana (ESKYGPPCPSCP). La SEQ ID NO:150 es la secuencia de aminoacidos de una region CH2 de IgG4 humana (APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK).
La SEQ ID NO:151 es la secuencia de aminoacidos de una region CH3 de IgG4 humana (GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK).
La SEQ ID NO:152 es la secuencia de aminoacidos de una region CH2 de IgM humana (VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTST LTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP).
La SEQ ID NO:153 es la secuencia de aminoacidos de una region CH3 de IgM humana (DQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWN SGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPK).
La SEQ ID NO:154 es la secuencia de aminoacidos de una region CH4 de IgM humana (GVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILT VSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVM SDTAGTCY).
Un conjugado HRS-Fc de la presente descripcion puede, por lo tanto, comprender, consistir en, o consistir esencialmente en una o mas de las secuencias de aminoacidos de la region Fc humana de las SEQ ID NO:128-163 o 339-342, incluyendo variantes, fragmentos, homologos, ortologos, paralogos, y combinaciones de las mismas. Ciertas realizaciones ilustrativas de la presente descripcion comprenden una region Fc que varfa en tamano desde aproximadamente 20-50, 20-100, 20-150, 20-200, 20-250, 20-300, 20-400, 50-100, 50-150, 50-200, 50-250, 50-300, 50-400, 100-150, 100-200, 100-250, 100-300, 100-350, 100-400, 200-250, 200-300, 200-350, o 200-400 aminoacidos de longitud, y opcionalmente comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una o mas de las SEQ ID NO:128-154 o 341-342. Ciertas realizaciones de la presente descripcion comprenden una region Fc de hasta aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400 o mas aminoacidos, que opcionalmente comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una o mas de las SEQ ID NO:128-154 o 339-342.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgA1 humana expuestas en las SEQ ID NO:128-130 o 156, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID No :128 y 129 y 130, las SEQ ID NO:128 y 129; las SEQ ID NO:128 y 130; las SEQ ID NO:129 y 130), y variantes y fragmentos de las mismas. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA1 humana expuesta en la SEQ ID NO:128. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA1 humana expuesta en la SEQ ID NO:129. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA1 humana expuesta en la SEQ ID NO:130.
Algunas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgA2 humana expuestas en las SEQ ID NO:131-133 o 157, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID No :131 y 132 y 133, las SEQ ID NO:131 y 132; las SEQ ID NO:131 y 133; las SEQ ID NO:132 y 133), y variantes y fragmentos de las mismas. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA2 humana expuesta en la SEQ ID NO:131. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA2 humana expuesta en la SEQ ID NO:132. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA2 humana expuesta en la SEQ ID NO:133.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgD humanas expuestas en las SEQ ID NO:134-136, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID NO:134 y 135 y 136, las SEQ ID NO:134 y 135; las SeQ ID NO:134 y 136; las SEQ ID NO:135 y 136), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgD humana expuesta en la SEQ ID NO:134. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgD humana expuesta en la SEQ ID NO:135. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgD humana expuesta en la SEQ ID NO:136.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencia de IgE humana expuestas en las SEQ ID NO:137-139 o 163, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID NO:137 y 138 y 139, las SEQ ID NO:137 y 138; la SEQ ID NO:137 y 139; las SEQ ID NO:138 y 139), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgE humana expuesta en la SEQ ID NO:137. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgE humana expuesta en la SEQ ID NO:138. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgE humana expuesta en la SEQ ID NO:139.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgG1 humana expuestas en las SEQ ID NO:140-142 o 159 o 339-342, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID NO:140 y 141 y 142, las SEQ ID NO:140 y 141; las SEQ ID NO:140 y 142; las SeQ ID NO:141 y 142), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID nO:140. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:141. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:142. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:339. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:340. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:341. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:342.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgG2 humana expuestas en las SEQ ID NO:143-145 o 160, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID No :143 y 144 y 145, las SEQ ID NO:143 y 144; las SEQ ID NO:143 y 145; las SEQ ID NO:144 y 145), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG2 humana expuesta en la SEQ ID NO:143. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG2 humana expuesta en la SEQ ID NO:144. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG2 humana expuesta en la SEQ ID NO:145.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgG3 humana expuestas en las SEQ ID NO:146-148 o 161, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID No :146 y 147 y 148, las SEQ ID NO:146 y 147; las SEQ ID NO:146 y 148; las SEQ ID NO:147 y 148), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG3 humana expuesta en la SEQ ID NO:146. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG3 humana expuesta en la SEQ ID NO:147. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG3 humana expuesta en la SEQ ID NO:148.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgG4 humana expuestas en las SEQ ID NO:149-151 o 162, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID No :149 y 150 y 151, las SEQ ID NO:149 y 150; las SEQ ID NO:149 y 151; las SEQ ID NO:150 y 151), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG4 humana expuesta en la SEQ ID NO:149. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG4 humana expuesta en la SEQ ID NO:150. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG4 humana expuesta en la SEQ ID NO:151.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgM humana expuestas en las SEQ ID NO:152-154 o 158, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID NO:152 y 153 y 154, las SEQ ID NO:152 y 153; las SEQ ID NO:152 y 154; las SEQ ID NO:153 y 154), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgM humana expuesta en la SEQ ID NO:152. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgM humana expuesta en la SEQ ID NO:153. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgM humana expuesta en la SEQ ID NO:154.
Como se senalo anteriormente, ciertas realizaciones de la presente descripcion emplean variantes, fragmentos, hfbridos y/o formas modificadas de otra manera una region Fc descrita en el presente documento y conocida en la tecnica (por ejemplo, las secuencias de Ig humana de las SEQ ID NO:128-163).
Se incluyen variantes que tienen una o mas sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o truncamientos de aminoacidos con respecto a una secuencia de referencia, tal como una o mas de las secuencias de referencia expuestas en las SEQ ID NO:128-163. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, una region Fc variante incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos aproximadamente el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %., 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o mas de identidad o similitud u homologfa de secuencia con una o mas de las SEQ ID NO:128-163. Tambien se incluyen las regiones Fc que difieren de una o mas de las SEQ ID NO:128-163 por la adicion, eliminacion, insercion o sustitucion de 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o mas aminoacidos. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, las adiciones o eliminaciones de aminoacidos se producen en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal de la secuencia Fc de referencia.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, una region Fc variante comprende una secuencia de aminoacidos que puede alinearse de manera optima con una cualquiera o mas de las SEQ ID NO:128-163 para generar una puntuacion (bit score) de BLAST o una puntuaciones de similitud de secuencia de al menos aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240,
250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 o mas, incluyendo todos los numeros enteros e intervalos intermedios, donde el alineamiento de BLAST uso la matriz BLOSUM62, una penalizacion de existencia de hueco de 11 y una penalizacion de extension de hueco de 1.
Tambien se incluyen regiones Fc hfbridas, por ejemplo, regiones Fc que comprenden una combinacion de dominios
Fc (por ejemplo, bisagra, CH2, CH3, CH4) de inmunoglobulinas de diferentes especies, diferentes clases de Ig y/o diferentes subclases de Ig. Los ejemplos generales incluyen regiones Fc hfbridas que comprenden, consisten o consisten esencialmente en la siguiente combinacion de dominios CH2/CH3: IgA1/IgA1, IgA1/IgA2, IgA1/IgD, IgA1/IgE, IgA1/IgG1, IgA1/IgG2, IgA1/IgG3, IgA1/IgG4, IgA1/IgM, IgA2/IgA1, IgA2/IgA2, IgA2/IgD, IgA2/IgE, IgA2/IgG1, IgA2/IgG2, IgA2/IgG3, IgA2/IgG4, IgA2/IgM, IgD/IgA1, IgD/IgA2, IgD/IgD, IgD/IgE, IgD/IgG1, IgD/IgG2, IgD/IgG3, IgD/IgG4, IgD/IgM, IgE/IgA1, IgE/IgA2, IgE/IgD, IgE/IgE, IgE/IgG1, IgE/IgG2, IgE/IgG3, IgE/IgG4, IgE/IgM, IgG1/IgA1, IgG1/IgA2, IgG1/IgD, IgG1/IgE, IgG1/IgG1, IgG1/IgG2, IgG1/IgG3, IgG1/IgG4, IgG1/IgM, IgG2/IgA1, IgG2/IgA2, IgG2/IgD, IgG2/IgE, IgG2/IgG1, IgG2/IgG2, IgG2/IgG3, IgG2/IgG4, IgG2/IgM, IgG3/IgA1, IgG3/IgA2, IgG3/IgD, IgG3/IgE, IgG3/IgG1, IgG3/IgG2, IgG3/IgG3, IgG3/IgG4, IgG3/IgM, IgG4/IgA1, IgG4/IgA2, IgG4/IgD, IgG4/IgE, IgG4/IgG1, IgG4/IgG2, IgG4/IgG3, IgG4/IgG4, IgG4/IgM, IgM/IgA1, IgM/IgA2, IgM/IgD, IgM/IgE, IgM/IgG1, IgM/IgG2, IgM/IgG3, IgM/IgG4, IgM/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), e incluyen opcionalmente una bisagra de una o mas de IgA1, IgA2, IgD, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, y/o un dominio CH4 de IgE y/o IgM. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, los dominios bisagra, CH2, CH3 y CH4 son de Ig humana.
Los ejemplos adicionales incluyen regiones Fc hfbridas que comprenden, consisten o consisten esencialmente en la siguiente combinacion de dominios CH2/CH4: IgA1/IgE, IgA2/IgE, IgD/IgE, IgE/IgE, IgG1/IgE, IgG2/IgE, IgG3/IgE, IgG4/IgE, IgM/IgE, IgA1 /IgM, IgA2/IgM, IgD/IgM, IgE/IgM, IgG1 /IgM, IgG2/IgM, IgG3/IgM, IgG4/IgM, IgM/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), y opcionalmente incluyen una bisagra de una o mas de IgA1, IgA2, IgD,
IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y/o un dominio CH3 de una o mas de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, los dominios bisagra, CH2, CH3 y CH4 son de Ig humana.
Ciertos ejemplos incluyen regiones Fc hfbridas que comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la siguiente combinacion de dominios CH3/CH4: IgA1/IgE, IgA2/IgE, IgD/IgE, IgE/IgE, IgG1 /IgE, IgG2/IgE, IgG3/IgE, IgG4/IgE, IgM/IgE, IgA1 /IgM, IgA2/IgM, IgD/IgM, IgE/IgM, IgG1 /IgM, IgG2/IgM, IgG3/IgM, IgG4/IgM, IgM/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), y opcionalmente incluyen una bisagra de una o mas de IgA1, IgA2, IgD,
IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, y/o un dominio CH2 de una o mas de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, los dominios bisagra, CH2, CH3 y CH4 son de Ig humana.
Ejemplos particulares incluyen regiones Fc hfbridas que comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la siguiente combinacion de dominios bisagra/CH2: IgA1 /IgA1, IgA1/IgA2, IgA1 /IgD, IgA1 /IgE, IgA1/IgG1, IgA1/IgG2, IgA1/IgG3, IgA1/IgG4, IgA1 /IgM, IgA2/IgA1, IgA2/IgA2, IgA2/IgD, IgA2/IgE, IgA2/IgG1, IgA2/IgG2, IgA2/IgG3, IgA2/IgG4, IgA2/IgM, IgD/IgA1, IgD/IgA2, IgD/IgD, IgD/IgE, IgD/IgG1, IgD/IgG2, IgD/IgG3, IgD/IgG4, IgD/IgM, IgG1/IgA1, IgG1/IgA2, IgG1/IgD, IgG1 /IgE, IgG1/IgG1, IgG1/IgG2, IgG1/IgG3, IgG1/IgG4, IgG1 /IgM, IgG2/IgA1, IgG2/IgA2, IgG2/IgD, IgG2/IgE, IgG2/IgG1, IgG2/IgG2, IgG2/IgG3, IgG2/IgG4, IgG2/IgM, IgG3/IgA1, IgG3/IgA2, IgG3/IgD, IgG3/IgE, IgG3/IgG1, IgG3/IgG2, IgG3/IgG3, IgG3/IgG4, IgG3/IgM, IgG4/IgA1, IgG4/IgA2, IgG4/IgD, IgG4/IgE, IgG4/IgG1, IgG4/IgG2, IgG4/IgG3, IgG4/IgG4, IgG4/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), y opcionalmente incluyen un dominio CH3 de una o mas de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM, y/o un dominio CH4 de IgE y/o IgM. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, los dominios bisagra, CH2, CH3 y CH4 son de Ig humana.
Ciertos ejemplos incluyen regiones Fc hfbridas que comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la siguiente combinacion de dominios bisagra/Chb: IgA1/IgA1, IgA1/IgA2, IgA1/IgD, IgA1/IgE, IgA1/IgG1, IgA1/IgG2, IgA1/IgG3, IgA1/IgG4, IgA1/IgM, IgA2/IgA1, IgA2/IgA2, IgA2/IgD, IgA2/IgE, IgA2/IgG1, IgA2/IgG2, IgA2/IgG3, IgA2/IgG4, IgA2/IgM, IgD/IgA1, IgD/IgA2, IgD/IgD, IgD/IgE, IgD/IgG1, IgD/IgG2, IgD/IgG3, IgD/IgG4, IgD/IgM, IgG1/IgA1, IgG1/IgA2, IgG1/IgD, IgG1/IgE, IgG1/IgG1, IgG1/IgG2, IgG1/IgG3, IgG1/IgG4, IgG1/IgM, IgG2/IgA1, IgG2/IgA2, IgG2/IgD, IgG2/IgE, IgG2/IgG1, IgG2/IgG2, IgG2/IgG3, IgG2/IgG4, IgG2/IgM, IgG3/IgA1, IgG3/IgA2, IgG3/IgD, IgG3/IgE, IgG3/IgG1, IgG3/IgG2, IgG3/IgG3, IgG3/IgG4, IgG3/IgM, IgG4/IgA1, IgG4/IgA2, IgG4/IgD, IgG4/IgE, IgG4/IgG1, IgG4/IgG2, IgG4/IgG3, IgG4/IgG4, IgG4/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), y opcionalmente incluyen un dominio CH2 domain de una o mas de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM, y/o un dominio CH4 de IgE y/o IgM. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, los dominios bisagra, CH2, CH3 y CH4 son de Ig humana.
Algunos ejemplos incluyen regiones Fc hfbridas que comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la siguiente combinacion de dominios bisagra/CH4: IgA1 /IgE, IgA1/IgM, IgA2/IgE, IgA2/IgM, IgD/IgE, IgD/IgM, IgG1 /IgE, IgG1/IgM, IgG2/IgE, IgG2/IgM, IgG3/IgE, IgG3/IgM, IgG4/IgE, IgG4/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), y opcionalmente incluyen un dominio CH2 de una o mas de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM, y/o un dominio CH3 de una o mas de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM.
Se pueden encontrar ejemplos especfficos de regiones Fc hfbridas, por ejemplo, en el documento WO 2008/147143, que se derivan de combinaciones de subclases de IgG o combinaciones de IgD e IgG humanas.
Tambien se incluyen las regiones Fc derivadas o modificadas de otra manera. En ciertos aspectos de la presente descripcion, la region Fc puede modificarse por fosforilacion, sulfatacion, acrilacion, glucosilacion, metilacion, farnesilacion, acetilacion, amidacion y similares, por ejemplo, con respecto a una region Fc de tipo silvestre o de origen natural. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la region Fc puede comprender patrones de glucosilacion de tipo silvestre o nativos, o como alternativa, puede comprender glucosilacion aumentada con respecto a una forma nativa, glucosilacion disminuida con respecto a una forma nativa, o puede estar completamente desglucosilada. Como ejemplo de una glucoforma de Fc modificada, la glucosilacion disminuida de una region Fc reduce la union a la region C1q del primer componente C1 del complemento, una disminucion en la actividad relacionada con ADCC y/o una disminucion en la actividad relacionada con CDC. Ciertas realizaciones de la presente descripcion emplean, por tanto, una region Fc desglucosilada o aglucosilada. Vease, por ejemplo, el documento WO 2005/047337 para la produccion de regiones Fc aglucosiladas ejemplares. Otro ejemplo de una glucoforma de la region Fc puede generarse sustituyendo la posicion Q295 con un residuo de cistefna (vease, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2010/0080794), de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat y col. Ciertas realizaciones de la presente descripcion pueden incluir regiones Fc donde aproximadamente el 80­ 100 % de la glucoprotefna en la region Fc comprende una estructura de carbohidrato central madura que carece de fructosa (vease, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2010/0255013). Algunas realizaciones de la presente descripcion pueden incluir regiones Fc que estan optimizadas por sustitucion o eliminacion para reducir el nivel de fucosilacion, por ejemplo, para aumentar la afinidad por FcyRI, FcyRIa o FcyRIIIa, y/o para mejorar la fagocitosis por celulas que expresan FcyRIIa (veanse las solicitudes de Estados Unidos N.° 2010/0249382 y 2007/0148170).
Como otro ejemplo de una glucoforma de Fc modificada, una region Fc puede comprender N-glucanos de tipo oligomanosa y, opcionalmente, tener una o mas de las siguientes: mayor actividad de ADCC, mayor afinidad de union por FcyRIIIA (y algunos otros FcR), similar o mayor especificidad de union para la diana del polipeptido de HRS, similar o mayor afinidad de union por la diana del polipeptido de HRS, y/o similar o menor afinidad de union por el receptor de manosa, con respecto a la region Fc correspondiente o el conjugado HRS-Fc que contiene complejos tipo N-glucanos (vease, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0092521 y la patente de Estados Unidos N.° 7.700.321). Como otro ejemplo, la afinidad mejorada de las regiones Fc por FcyR se ha conseguido usando glucoformas creadas por ingenierfa genetica generadas por la expresion de anticuerpos en lfneas celulares variantes o modificadas por ingenierfa genetica (vease, por ejemplo, Umana y col., Nat Biotechnol. 17: 176-180, 1999; Davies y col., Biotechnol Bioeng. 74: 288-294, 2001; Shields y col., J. Biol Chem. 277: 26733-26740, 2002; Shinkawa y col., 2003, J Biol Chem. 278: 3466-3473, 2003 y la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0111281). Ciertas glucoformas de la region Fc comprenden una proporcion aumentada de cadenas de azucares complejas de tipo N-glucosido, que no tienen la posicion 1 de fucosa unida a la posicion 6 de N-acetilglucosamina en el eXtremo reductor de la cadena de azucar (vease, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2010/0092997). Las realizaciones particulares de la presente descripcion pueden incluir la region Fc de IgG que esta glucosilada con al menos un resto galactosa conectado a un resto de acido sialico terminal respectivo mediante un enlace a-2,6, opcionalmente cuando la region Fc tiene una mayor actividad antiinflamatoria con respecto a una region Fc de tipo silvestre correspondiente (vease la solicitud de Estados Unidos N.° 2008/0206246). Ciertos de estos enfoques de glucosilacion alterada y otros relacionados han generado mejoras sustanciales de la capacidad de las regiones Fc para unirse selectivamente a FcR tales como FcyRIII, para mediar la ADCC y para alterar otras propiedades de las regiones Fc, como se describe en el presente documento.
Ciertas regiones Fc variantes, fragmentos, hfbridas o modificadas de otra manera pueden tener union alterada a uno o mas FcR, con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente (por ejemplo, la misma especie, la misma clase de Ig, la misma subclase de Ig). Por ejemplo, dichas regiones Fc pueden tener una union aumentada a uno o mas de los receptores de Fcy, receptores de Fca, receptores de Fce y/o el receptor de Fc neonatal, con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones de la presente descripcion, regiones Fc variantes, fragmentos, hfbridas o modificadas pueden tener una union disminuida a uno o mas de los receptores de Fcy, receptores de Fca, receptores de Fce y/o el receptor de Fc neonatal, con respecto a una secuencia de Fc de tipo silvestre correspondiente. Los FcR especfficos se describen en otra parte en el presente documento.
Los ejemplos especfficos de variantes de Fc que tienen union a FcR alterada (por ejemplo, aumentada, disminuida) se pueden encontrar, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 5.624.821 y 7.425.619; las solicitudes de Estados Unidos N.° 2009/0017023, 2009/0010921 y 2010/0203046; y los documentos WO 2000/42072 y WO 2004/016750. Ciertos ejemplos incluyen regiones Fc humanas que tienen una o mas sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334, por ejemplo, S298A, E333A y/o K334A (basandose en la numeracion del fndice UE de Kabat y col.), que se ha demostrado que aumenta la union al receptor activador FcyRIIIa y reduce la union al receptor inhibidor FcyRIIb. Estas mutaciones se pueden combinar para obtener variantes de mutacion dobles y triples que tienen mejoras adicionales en la union a FcR. Ciertas realizaciones de la presente descripcion incluyen un mutante triple S298A/E333A/K334A, que tiene union aumentada a FcyRIIIa, union disminuida a FcyRIIb y ADCC aumentada (vease, por ejemplo, Shields y col., J Biol Chem. 276: 6591-6604, 2001, y Presta y col., Biochem Soc Trans. 30: 487-490, 2002). Vease tambien las glucoformas de Fc disenadas por manipulacion genetica que tienen una mayor union a los FcR, como se describe en Umana y col., mencionado anteriormente; y la patente de Estados Unidos N.° 7.662.925. Algunas realizaciones de la presente descripcion incluyen regiones Fc que comprenden una o mas sustituciones seleccionadas de 434S, 252Y/428L, 252Y/434S y 428L/434S (vease las solicitudes de Estados Unidos N.° 2009/0163699 y 20060173170), basadas en el fndice UE de Kabat y col.
Ciertas regiones Fc variantes, fragmentos, hfbridas o modificadas pueden tener funciones efectoras alteradas, con respecto a una secuencia de Fc de tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, dichas regiones Fc pueden tener una mayor fijacion o activacion del complemento, mayor afinidad de union a Clq, mayor actividad relacionada con CDC, mayor actividad relacionada con ADCC y/o mayor actividad relacionada con ADCP, con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones de la presente descripcion, dichas regiones Fc pueden tener una fijacion o activacion del complemento disminuida, una afinidad de union a Clq disminuida, una actividad relacionada con CDC disminuida, una actividad relacionada con ADCC disminuida y/o una actividad relacionada con ADCP disminuida, con respecto a una secuencia de Fc de tipo silvestre correspondiente. Como meramente un ejemplo ilustrativo, una region Fc puede comprender una eliminacion o sustitucion en un sitio de union al complemento, tal como un sitio de union a C1q, y/o una eliminacion o sustitucion en un sitio de ADCC. Ejemplos de dichas eliminaciones/sustituciones se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 7.030.226. Muchas funciones efectoras de Fc, tales como ADCC, pueden ensayarse de acuerdo con tecnicas de rutina en la tecnica (vease, por ejemplo, Zuckerman y col., CRC Crit Rev Microbiol. 7: 1-26, 1978). Las celulas efectoras utiles para dichos ensayos incluyen, aunque sin limitarse a, linfocitos citolfticos naturales (NK), macrofagos y otras celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC). Como alternativa, o adicionalmente, ciertas funciones efectoras de Fc pueden evaluarse in vivo, por ejemplo, empleando un modelo animal descrito en Clynes y col. PNAS. 95: 652-656, 1998.
Ciertas regiones Fc variantes, hfbridas o modificadas pueden tener estabilidad o semivida relativas a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, dichas regiones Fc pueden tener una semivida aumentada con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones de la presente descripcion, las regiones Fc hfbridas variantes o modificadas pueden tener una semivida reducida con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. La semivida se puede medir in vitro (por ejemplo, en condiciones fisiologicas) o in vivo, de acuerdo con tecnicas de rutina en la tecnica, tales como radioetiquetado, ELISA u otros procedimientos. Las mediciones in vivo de estabilidad o semivida se pueden medir en uno o mas fluidos corporales, incluyendo sangre, suero, plasma, orina o lfquido cefalorraqufdeo, o un tejido dado, tal como hfgado, rinones, musculos, tejidos del sistema nervioso central, hueso, etc. Como ejemplo, las modificaciones a una region Fc que alteran su capacidad para unirse al FcRn pueden alterar su semivida in vivo. Los ensayos para medir las propiedades farmacocineticas in vivo (por ejemplo, la semivida de eliminacion media in vivo) y los ejemplos no limitantes de modificaciones de Fc que alteran su union al FcRn se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 7.217.797 y 7.732.570; y las solicitudes de Estados Unidos N.° US 2010/0143254 y 2010/0143254.
Ejemplos no limitantes adicionales de modificaciones para alterar la estabilidad o la semivida incluyen sustituciones/eliminaciones en uno o mas de los residuos de aminoacidos seleccionados de entre 251-256, 285-290 y 308-314 en el dominio CH2, y 385-389 y 428-436 en el dominio CH3, de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat y col. Vease la solicitud de Estados Unidos N.° 2003/0190311. Los ejemplos especfficos incluyen la sustitucion con leucina en la posicion 251, la sustitucion con tirosina, triptofano o fenilalanina en la posicion 252, la sustitucion con treonina o serina en la posicion 254, la sustitucion con arginina en la posicion 255, la sustitucion con glutamina, arginina, serina, treonina o glutamato en la posicion 256, sustitucion con treonina en la posicion 308, la sustitucion con prolina en la posicion 309, la sustitucion con serina en la posicion 311, la sustitucion con aspartato en la posicion 312, la sustitucion con leucina en la posicion 314, la sustitucion con arginina, aspartato o serina en la posicion 385, la sustitucion con treonina o prolina en la posicion 386, la sustitucion con arginina o prolina en la posicion 387, la sustitucion con prolina, asparagina o serina en la posicion 389, la sustitucion con metionina o treonina en la posicion 428, la sustitucion con tirosina o fenilalanina en la posicion 434, la sustitucion con histidina, arginina, lisina o serina en la posicion 433 y/o la sustitucion con histidina, tirosina, arginina o treonina en la posicion 436, incluyendo cualquier combinacion de las mismas. Dichas modificaciones aumentan opcionalmente la afinidad de la region Fc por el FcRn y, por lo tanto, aumentan la semivida, con respecto a una region Fc de tipo silvestre correspondiente.
Ciertas regiones Fc variantes, hfbridas o modificadas, pueden tener una solubilidad alterada con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, dichas regiones Fc pueden tener mayor solubilidad con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones de la presente descripcion, las regiones Fc variantes, hfbridas o modificadas pueden tener una solubilidad disminuida con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. La solubilidad se puede medir, por ejemplo, in vitro (por ejemplo, en condiciones fisiologicas) de acuerdo con tecnicas de rutina en la tecnica. Las mediciones de solubilidad ejemplares se describen en otra parte en el presente documento.
Los ejemplos adicionales de variantes incluyen regiones Fc de IgG que tienen sustituciones conservativas o no conservativas (como se describe en otra parte en el presente documento) en una o mas de las posiciones 250, 314 o 428 de la cadena pesada, o en cualquier combinacion de las mismas, tal como en las posiciones 250 y 428, o en las posiciones 250 y 314, o en las posiciones 314 y 428, o en las posiciones 250, 314 y 428 (vease, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2011/0183412). En realizaciones especfficas de la presente descripcion, el residuo en la posicion 250 esta sustituido con acido glutamico o glutamina, y/o el residuo en la posicion 428 esta sustituido con leucina o fenilalanina. Como otro ejemplo ilustrativo de una variante de Fc de IgG, uno cualquiera o mas de los residuos de aminoacidos en las posiciones 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 y/o 327 a 331 se pueden usar como una diana adecuada para la modificacion (por ejemplo, sustitucion conservativa o no conservativa, eliminacion). En realizaciones particulares de la presente descripcion, el dominio CH2 variante de Fc de IgG contiene sustituciones de aminoacidos en las posiciones 228, 234, 235 y/o 331 (por ejemplo, IgG4 humana con mutaciones Ser228Pro y Leu235Ala) para atenuar las funciones efectoras de la region Fc (vease la patente de Estados Unidos N.° 7.030.226). En este contexto, la numeracion de los residuos en la cadena pesada es la del fndice UE (vease Kabat y col., «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5a edicion, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Algunas de estas y realizaciones relacionadas de la presente descripcion tienen alterada (por ejemplo, aumentada, disminuida) la union a FcRn y/o la semivida en suero, opcionalmente sin funciones efectoras reducidas tales como actividades relacionadas con ADCC o CDC.
Los ejemplos adicionales incluyen regiones Fc variantes que comprenden una o mas sustituciones de aminoacidos en las posiciones 279, 341, 343 o 373 de una region Fc de tipo silvestre, o cualquier combinacion de las mismas (vease, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0224188). Los residuos de aminoacidos de tipo silvestre en estas posiciones para la IgG humana son valina (279), glicina (341), prolina (343) y tirosina (373). La o las sustituciones pueden ser conservativas o no conservativas, o pueden incluir aminoacidos o mimeticos de origen no natural, como se describe en el presente documento. Solas o en combinacion con estas sustituciones, ciertas realizaciones de la presente descripcion tambien pueden emplear una region Fc variante que comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas sustituciones de aminoacidos seleccionadas de entre las siguientes: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 256I, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279F, 279G, 279H, 279I, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283M, 283P, 283R, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 332S, 332V, 332W, 339D, 339E, 339F, 339G, 339H, 339I, 339K, 339L, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343I, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373G, 373H, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380D, 380N, 380S, 380T, 382D, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 426D, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H, 4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431K, 431P, 432R, 432S, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 439Q, 440D, 440E, 440F, 440G, 440H, 440I, 440K, 440L, 440M, 440Q, 440T, 440V o 442K. Como anteriormente, la numeracion de los residuos en la cadena pesada es la del fndice UE (vease Kabat y col., mencionado anteriormente). Dichas regiones Fc variantes confieren tfpicamente una funcion efectora alterada o una semivida en suero alterada al polipeptido de HRS al que esta unida operativamente la region Fc variante. Preferentemente, la funcion efectora alterada es un aumento en ADCC, una disminucion en ADCC, un aumento en CDC, una disminucion en CDC, un aumento en la afinidad de union a Clq, una disminucion en la afinidad de union a Clq, un aumento en la afinidad de union a FcR (preferentemente FcRn) o una disminucion en la afinidad de union a FcR (preferentemente FcRn) en comparacion con una region Fc correspondiente que carece de dicha o dichas sustituciones de aminoacidos.
Los ejemplos adicionales incluyen regiones Fc variantes que comprenden una sustitucion de aminoacido en una o mas de las posiciones 221, 222, 224, 227, 228, 230, 231, 223, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 283, 285, 286, 288, 290, 291, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335336 y/o 428 (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 7.662.925). En realizaciones especfficas de la presente descripcion, la region Fc variante comprende al menos una sustitucion de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en: P230A, E233D, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239T, V240I, V240M, F243L, V264I, V264T, V264Y, V266I, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V302I, E318R, S324D, S324I, S324V, N325T, K326I, K326T, L328M, L328I, L328Q, L328D, L328V, L328T, A330Y, A330L, A330I, I332D, I332E, I332N, I332Q, T335D, T335R y T335Y. En otras realizaciones especfficas de la presente descripcion, la region Fc variante comprende al menos una sustitucion de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en: V264I, F243L/V264I, L328M, I332E, L328M/I332E, V264I/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, A330Y, I332D, L328I/I332E, L328Q/I332E, V264T, V240I, V266I, S239D, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/I332D, S239N/I332E, S239Q/I332D, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239T, V240M, V264Y, A330I, N325T, L328D/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328I/I332E, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E, S239D/V264I/A330L/I332E, S239D/I332E/A330I, P230A, P230A/E233D/I332E, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V302I, E318R, S324D, S324I, S324V, K326I, K326T, T335D, T335R, T335Y, V240I/V266I, S239D/A330Y/I332E/L234I, S239D/A330Y/I332E/L235D, S239D/A330Y/I332E/V240I, S239D/A330Y/I332E/V264T, S239D/A330Y/I332E/K326E y S239D/A330Y/I332E/K326T, En realizaciones mas especfficas de la presente descripcion, la region Fc variante comprende una serie de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: N297D/I332E, F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/I332E, S239D/D265Y/N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, V264E/N297D/I332E, Y296N/N297D/I332E, N297D/A330Y/I332E, S239D/D265V/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E y N297D/S298A/A330Y/I332E. En realizaciones especfficas de la presente descripcion, la region Fc variante comprende una sustitucion de aminoacidos en la posicion 332 (usando la numeracion del fndice UE, Kabat y col., mencionado anteriormente). Los ejemplos de sustituciones incluyen 332A, 332D, 332E, 332F, 332G, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W y 332Y. La numeracion de los residuos en la region Fc es la del fndice UE de Kabat y col. Entre otras propiedades descritas en el presente documento, dichas regiones Fc variantes pueden tener afinidad aumentada por un FcyR, estabilidad aumentada y/o solubilidad aumentada, con respecto a una region Fc de tipo silvestre correspondiente.
Otros ejemplos incluyen regiones Fc variantes que comprenden una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: 224N/Y, 225A, 228L, 230S, 239P, 240A, 241L, 243S/L/G/H/I, 244L, 246E, 247L/A, 252T, 254T/P, 258K, 261Y, 265V, 266A, 267G/N, 268N, 269K/G, 273A, 276D, 278H, 279M, 280N, 283G, 285R, 288R, 289A, 290E, 291L, 292Q, 297D, 299A, 300H, 301C, 304G, 305A, 306I/F, 311R, 312N, 315D/K/S, 320R, 322E, 323A, 324T, 325S, 326E/R, 332T, 333D/G, 335I, 338R, 339T, 340Q, 341E, 342R, 344Q, 347R, 351S, 352A, 354A, 355W, 356G, 358T, 361D/Y, 362L, 364C, 365Q/P, 370R, 372L, 377V, 378T, 383N, 389S, 390D, 391C, 393A, 394A, 399G, 404S, 408G, 409R, 4111, 412A, 414M, 421S, 422I, 426F/P, 428T, 430K, 431S, 432P, 433P, 438L, 439E/R, 440G, 441F, 442T, 445R, 446A, 447E, opcionalmente, cuando la variante tiene reconocimiento alterado de un ligando de Fc y/o una funcion efectora alterada en comparacion con un polipeptido Fc parental, y donde la numeracion de los residuos es la del fndice UE como en Kabat y col. Los ejemplos especfficos de estas y realizaciones relacionadas de la presente descripcion incluyen regiones Fc variantes que comprenden o consisten en los siguientes conjuntos de sustituciones: (1) N276D, R292Q, V305A, I377V, T394A, V412A y K439E; (2) P244L, K246E, D399G y K409R; (3) S304G, K320R, S324T, K326E y M358T; (4) F243S, P247L, D265V, V266A, S383N y T411I; (5) H224N, F243L, T393A y H433P; (6) V240A, S267G, G341E y E356G; (7) M252T, P291L, P352A, R355W, N390D, S408G, S426F y A431S; (8) P228L, T289A, L365Q, N389S y 5440G; (9) F241L, V273A, K340Q y L441F; (10) F241L, T299A, I332T y M428T; (11) E269K, Y300H, Q342R, V422I y G446A; (12) T225A, R301c, S304G, D312N, N315D, L351S y N421S; (13) S254T, L306I, K326R y Q362L; (14) H224Y, P230S, V323A, E333D, K338R y S364C; (15) T335I, K414M y P445R; (16) T335I y K414M; (17) P247A, E258K, D280N, K288R, N297D, T299A, K322E, Q342R, S354A y L365P; (18) H268N, V279M, A339T, N361D y S426P; (19) C261Y, K290E, L306F, Q311R, E333G y Q438L; (20) E283G, N315K, E333G, R344Q, L365P y S442T; (21) Q347R, N361Y y K439R; (22) S239P, S254P, S267N, H285R, N315S, F372L, A378T, N390D, Y391C, F404S, E430K, L432P y K447E; y (23) E269G, Y278H, N325S y K370R, donde la numeracion de los residuos es la del fndice UE como en Kabat y col., (vease, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2010/0184959).
Otro ejemplo especffico de una variante de Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO:155, donde Xaa en la posicion 1 es Ala o esta ausente; Xaa en la posicion 16 es Pro o Glu; Xaa en la posicion 17 es Phe, Val o Ala; Xaa en la posicion 18 es Leu, Glu o Ala; Xaa en la posicion 80 es Asn o Ala; y/o Xaa en la posicion 230 es Lys o esta ausente (vease, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0253966). Ciertas de estas regiones Fc, y los conjugados HRS-Fc relacionados, tienen semivida aumentada, actividad efectora reducida y/o son significativamente menos inmunogenas que las secuencias Fc de tipo silvestre.
Las regiones Fc variantes tambien pueden tener una o mas regiones bisagra mutadas, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de Estados Unidos N.° 2003/0118592. Por ejemplo, una o mas cistefnas en una region bisagra se pueden eliminar o sustituir con un aminoacido diferente. La region bisagra mutada puede no comprender residuos de cistefna, o puede comprender 1, 2 o 3 residuos de cistefna menos que una region bisagra de tipo silvestre correspondiente. En algunas realizaciones de la presente descripcion, una region Fc que tiene una region bisagra mutada de este tipo exhibe una capacidad reducida para dimerizar, con respecto a una region bisagra de Ig de tipo silvestre.
Como se ha senalado anteriormente, los conjugados HRS-Fc, tales como las protefnas de fusion HRS-Fc, tfpicamente tienen propiedades farmacocineticas alteradas (por ejemplo, mejoradas, aumentadas, disminuidas) con respecto a los polipeptidos de HRS correspondientes. Los ejemplos de propiedades farmacocineticas incluyen estabilidad o semivida, biodisponibilidad (la fraccion de un farmaco que se absorbe), distribucion tisular, volumen de distribucion (volumen aparente donde un farmaco se distribuye inmediatamente despues de haber sido inyectado por via intravenosa y se equilibra entre plasma y los tejidos circundantes), concentracion (concentracion inicial o en equilibrio del farmaco en plasma), constante de la tasa de eliminacion (tasa a la que se eliminan los farmacos del cuerpo), tasa de eliminacion (tasa de infusion requerida para equilibrar la eliminacion), area bajo la curva (AUC o exposicion; integral de la curva de concentracion-tiempo, despues de una dosis unica o en situacion de equilibrio), aclaramiento (volumen de plasma aclarado del farmaco por unidad de tiempo), Cmax (concentracion plasmatica maxima de un farmaco despues de la administracion oral), tmax (tiempo hasta alcanzar la C max), Cmin (la concentracion mas baja que alcanza un farmaco antes de que se administre la siguiente dosis) y la fluctuacion (fluctuacion entre maximos dentro un intervalo de dosificacion en situacion de equilibrio). En algunos aspectos de la presente descripcion, estas propiedades mejoradas se consiguen sin alterar significativamente la estructura secundaria y/o reducir la actividad biologica no canonica del polipeptido de HRS. De hecho, algunos conjugados HRS-Fc tienen un aumento de la actividad biologica no canonica.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de la presente descripcion, el conjugado HRS-Fc o el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene un perfil de AUC farmacocinetico en plasma o suero al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 veces mayor que un polipeptido de HRS no modificado o modificado de manera diferente correspondiente, cuando se administra a un mamffero en condiciones iguales o comparables. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el conjugado HRS-Fc o el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene una estabilidad (por ejemplo, medida mediante semivida) que es al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 % mayor que un polipeptido de HRS no modificado o modificado de manera diferente correspondiente, cuando se compara en condiciones similares a temperatura ambiente, por ejemplo, en PBS a pH 7,4 durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 dfas, o 1, 2, 3, 4 semanas mas o menos.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, un conjugado HRS-Fc o un polipeptido de fusion HRS-Fc tiene una semivida biologica a pH 7,4, 25 °C, por ejemplo, un pH fisiologico, temperatura corporal humana (por ejemplo, in vivo, en suero, en un tejido dado, en una especie dada tal como rata, raton, mono o ser humano), de aproximadamente o al menos aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 50 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 70 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 80 horas, aproximadamente 84 horas, aproximadamente 90 horas, aproximadamente 96 horas, aproximadamente 120 horas, o aproximadamente 144 horas o mas o cualquier semivida intermedia.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el conjugado HRS-Fc o el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene una mayor biodisponibilidad despues de la administracion subcutanea (SC) en comparacion con un polipeptido de HRS no modificado correspondiente. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el conjugado HRS-Fc o el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 100 %, o mas biodisponibilidad en comparacion con el polipeptido de HRS no modificado correspondiente.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene sustancialmente la misma estructura secundaria que un polipeptido de HRS no modificado o modificado de manera diferente correspondiente, de acuerdo con se determina mediante un analisis de dicroismo circular UV. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene sustancialmente la misma actividad que un polipeptido de HRS no modificado o modificado de manera diferente correspondiente, en un ensayo de actividad antiinflamatoria. En otras realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene mas de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces la actividad de un polipeptido de HRS no modificado o modificado de manera diferente correspondiente, en un ensayo de actividad antiinflamatoria.
Enlazadores peptidicos
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, se puede emplear una secuencia de enlazador peptfdico para separar el o los polipeptidos de HRS y la o las regiones Fc en una distancia suficiente para asegurar que cada polipeptido se pliegue a sus estructuras secundarias y terciarias deseadas. Dicha secuencia de enlazador peptfdico puede incorporarse a la protema de fusion usando tecnicas estandar bien conocidas en la tecnica.
Ciertas secuencias de enlazador peptfdico se pueden seleccionar basandose en los siguientes factores ejemplares: (1) su capacidad para adoptar una conformacion extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podna interactuar con los epttopos funcionales en el primer y segundo polipeptidos; (3) su estabilidad fisiologica; y (4) la falta de residuos hidrofobos o cargados que puedan reaccionar con los epftopos funcionales del polipeptido, u otras caractensticas. Vease, por ejemplo, George y Heringa, J Protein Eng. 15: 871­ 879, 2002.
La secuencia de enlazador generalmente puede tener una longitud de 1 a aproximadamente 200 aminoacidos. Los enlazadores particulares pueden tener una longitud global de aminoacidos de aproximadamente 1-200 aminoacidos, 1-150 aminoacidos, 1-100 aminoacidos, 1-90 aminoacidos, 1-80 aminoacidos, 1-70 aminoacidos, 1-60 aminoacidos, 1-50 aminoacidos, 1-40 aminoacidos, 1-30 aminoacidos, 1-20 aminoacidos, 1-10 aminoacidos, 1-5 aminoacidos, 1-4 aminoacidos, 1-3 aminoacidos, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mas aminoacidos.
Un enlazador peptfdico puede emplear uno cualquiera o mas aminoacidos de origen natural, aminoacidos de origen no natural, analogos de aminoacidos y/o mimeticos de aminoacidos como se describe en otra parte en el presente documento y se conoce en la tecnica. Ciertas secuencias de aminoacidos que pueden emplearse de manera util como enlazadores incluyen las divulgadas en Maratea y col., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy y col., PNAS EE. UU.
83: 8258-8262, 1986; patente de Estados Unidos N.° 4.935.233 y patente de Estados Unidos N.° 4.751.180. Las secuencias de enlazador peptfdico particulares contienen residuos Gly, Ser y/o Asn. Si se desea, tambien se pueden emplear otros aminoacidos casi neutros, tales como Thr y Ala, en la secuencia de enlazador peptfdico.
Ciertos enlazadores ejemplares incluyen enlazadores que contienen Gly, Ser y/o Asn, de la siguiente manera: enlazadores [G]x, [S]x, [N]x, [GS]x, [GGS]x, [GSS]x, [GSGS]x (SEQ ID NO:200), [GGSG]x (SEQ ID NO:201), [GGGS]x (SEQ ID NO:202), [GGGGS]x (SEQ ID NO:203), [GN]x, [GGN]x, [GNN]x, [GNGN]x (SEQ ID NO:204), [GGNG]x (SEQ ID NO:205), [GGGN]x (SEQ ID NO:206), [GGGGN]x (SEQ ID NO:207), donde x es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 o mas. Otras combinaciones de estos y aminoacidos relacionados seran evidentes para los expertos en la materia.
Los ejemplos adicionales de peptidos enlazadores incluyen, aunque sin limitarse a las siguientes secuencias de aminoacidos: Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ ID NO:208); Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ ID NO:209); Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ ID NO:210); Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-(SEQ ID NO:211); y Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg-(SEQ ID NO:212).
Otros ejemplos no limitantes de peptidos enlazadores incluyen DGGGS (SEQ ID NO:213); TGEKP (SEQ ID NO:214) (vease, por ejemplo, Liu y col., PNAS. 94: 5525-5530, 1997); GGRR (SEQ ID NO:215) (Pomerantz y col. 1995); (GGGGS)n (SEQ ID NO:203) (Kim y col., PNAS. 93: 1156-1160, 1996); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO:216) (Chaudhary y col., PNAS. 87: 1066-1070, 1990); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO:217) (Bird y col., Science.
242: 423-426, 1988), GGRRGGGS (SEQ ID NO:218); LRQRDGERP (SEQ ID NO:219); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO:220); LRQKd(GGGS)2 ERP (SEQ ID NO:221). En realizaciones especfficas de la presente descripcion, la secuencia de enlazador comprende una secuencia de enlazador Gly3, que incluye tres residuos de glicina. En realizaciones particulares de la presente descripcion, los enlazadores flexibles pueden disenarse racionalmente usando un programa informatico capaz de modelizar tanto los sitios de union a ADN como los propios peptidos (Desjarlais y Berg, PNAS. 90: 2256-2260, 1993; y PNAS. 91: 11099-11103, 1994) o mediante procedimientos de presentacion en fagos.
Los enlazadores peptfdicos pueden ser fisiologicamente estables o pueden incluir un enlazador liberable tal como un enlazador fisiologicamente degradable o enzimaticamente escindible (por ejemplo, un enlazador escindible proteolfticamente). En ciertas realizaciones de la presente descripcion, uno o mas enlazadores liberables pueden dar como resultado una semivida mas corta y un aclaramiento mas rapido del conjugado. Estas y otras realizaciones relacionadas de la presente descripcion se pueden usar, por ejemplo, para mejorar la solubilidad y la vida util en la circulacion sangufnea de los polipeptidos de HRS en el torrente sangufneo, mientras que tambien se suministra un polipeptido de HRS al torrente sangufneo que, posteriormente a la degradacion del enlazador, esta sustancialmente libre de la o las regiones Fc. Estos aspectos de la presente descripcion son especialmente utiles en aquellos casos donde los polipeptidos de HRS, cuando se conjugan permanentemente a una region Fc, demuestran una actividad reducida. Usando los enlazadores que se proporcionan en el presente documento, dichos polipeptidos de HRS pueden mantener su actividad terapeutica cuando estan en forma conjugada. Como otro ejemplo, se puede administrar un polipeptido conjugado HRS-Fc grande y relativamente inerte, que a continuacion se degrada in vivo (mediante el enlazador degradable) para generar un polipeptido de HRS bioactivo que posee una parte de la region Fc o que carece por completo de la region Fc. De esta y otras maneras, las propiedades del polipeptido conjugado HRS-Fc se pueden adaptar de manera mas eficaz para equilibrar la bioactividad y la semivida en circulacion del polipeptido de HRS a lo largo del tiempo.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, el peptido enlazador comprende un sitio de escision del peptido autocatalftico o de autoescision. En una realizacion particular de la presente descripcion, los peptidos de autoescision incluyen aquellas secuencias polipeptfdicas obtenidas de peptidos de potyvirus y cardiovirus 2A, FMDV (virus de la fiebre aftosa), virus A de rinitis equina, virus de Thosea asigna y tescovirus porcino. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el sitio del polipeptido de autoescision comprende un sitio, secuencia o dominio 2A o similar a 2A (Donnelly y col., J. Gen. Virol. 82: 1027-1041, 2001). Los sitios 2A ejemplares incluyen las siguientes secuencias: LLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:222); TLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:223); LLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:224); NFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:225); QLLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:226); APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:227); VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQT (SEQ ID NO:228); LNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:229); LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:230); y EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:231). En una realizacion de la presente descripcion, el sitio de escision del peptido autocatalftico comprende una secuencia senal de traduccion 2A, tal como, por ejemplo, la region 2A de la poliprotefna del virus de la fiebre aftosa (FMDV), que es una secuencia de 18 aminoacidos. Los ejemplos adicionales de secuencias similares a 2A que pueden usarse incluyen poliprotefnas de virus de insectos, la protefna NS34 de los rotavirus de tipo C y secuencias repetidas en Trypanosoma spp., Como se describe, por ejemplo, en Donnelly y col., Journal of General Virology. 82: 1027-1041, 2o0l.
Los sitios de escision de proteasas y los peptidos de autoescision adecuados son conocidos por los expertos (vease, por ejemplo, Ryan y col., J. Gener. Virol. 78: 699-722, 1997; y Scymczak y col., Nature Biotech. 5: 589-594, 2004). Los sitios ejemplares de escision de proteasas incluyen, aunque sin limitarse a, los sitios de escision de proteasas NIa de potyvirus (por ejemplo, proteasas del virus del jaspeado del tabaco), las proteasas HC de potyvirus, las proteasas P1 (P35) de potyvirus, las proteasas NIa de biovirus, las proteasas codificadas por ARN-2 de biovirus, proteasas L de aftovirus, proteasas 2A de enterovirus, proteasas 2A de rinovirus, proteasas 3C de picornavirus, proteasas 24K de comovirus, proteasas 24K de nepovirus, proteasa similar a 3C de RTSV (virus esferico del tungro del arroz), proteasa similar a 3c de PYVF (virus del moteado amarillo de la chirivfa), heparina, trombina, factor Xa y enterocinasa. Debido a su alta rigurosidad de escision, los sitios de escision de la proteasa de TEV (virus de jaspeado del tabaco) se incluyen en algunas realizaciones de la presente descripcion, por ejemplo, EXXYXQ (G/S) (SEQ ID NO:232), por ejemplo, ENLYFQG (SEQ ID NO:233) y ENLYFQS (SEQ ID NO:234), donde X representa cualquier aminoacido (la escision por TEV se produce entre Q y G o Q y S).
Otros ejemplos de enlazadores degradables enzimaticamente adecuados para uso en realizaciones particulares de la presente descripcion incluyen, aunque sin limitarse a: una secuencia de aminoacidos escindida por una serina proteasa tal como trombina, quimotripsina, tripsina, elastasa, calicrefna o substilisina. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoacidos escindibles por trombina incluyen, aunque sin limitarse a: -Gly-Arg-Gly-Asp-(SEQ ID NO:235), -Gly-Gly-Arg-, -Gly- Arg-Gly-Asp-Asn-Pro-(SEQ ID NO:236), -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-(SEQ ID NO:237), -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-(SEQ ID NO:238), -Gly-Pro-Arg-, -Val-Pro-Arg-, y -Phe- Val -Arg-. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoacidos escindibles por elastasa incluyen, aunque sin limitarse a: -Ala-Ala-Ala-, -Ala-Ala-Pro-Val-(SEQ ID NO:239), - Ala-Ala-Pro-Leu-(SEQ ID NO:240), -Ala-Ala-Pro-Phe-(SEQ ID NO:241), -Ala-Ala-Pro-Ala-(SEQ ID NO:242) y -Ala-Tyr-Leu-Val-(SEQ ID NO:243).
Los enlazadores enzimaticamente degradables tambien incluyen secuencias de aminoacidos que pueden ser escindidas por una metaloproteinasa de la matriz tal como colagenasa, estromelisina y gelatinasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoacidos escindibles por metaloproteinasas de la matriz incluyen, aunque sin limitarse a: -Gly-Pro-Y-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:244), -Gly-Pro-, Leu-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:245), -Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:246), y -Ala-Pro-Gly-Leu-Z-(SEQ ID NO:247), donde Y y Z son aminoacidos. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoacidos escindibles por colagenasa incluyen, aunque sin limitarse a: -Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-Z-(SEQ ID NO:248), -Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-Gly-Z-(SEQ ID NO:249), -Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Trp-(SEQ ID NO:250), -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-(SEQ ID NO:251), -Pro-Leu-Gly-Leu-Tyr-Ala-(SEQ ID NO:252), -Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID NO:253) y -Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID NO:254), donde Z es un aminoacido. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de aminoacidos escindible por estromelisina es -Pro-Tyr-Ala-Tyr-Tyr-Met-Arg-(SEQ ID NO:255); y un ejemplo de una secuencia de aminoacidos escindible por gelatinasa es -Pro-Leu-Gly-Met-Tyr-Ser-Arg-(SEQ ID NO:256).
Los enlazadores enzimaticamente degradables para uso en realizaciones particulares de la presente descripcion tambien incluyen secuencias de aminoacidos que pueden ser escindidas por una enzima convertidora de angiotensina, tales como, por ejemplo, -Asp-Lys-Pro-, -Gly-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO:257) y -Gly-Ser-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO:258).
Los enlazadores enzimaticamente degradables para uso en realizaciones particulares de la presente descripcion tambien incluyen secuencias de aminoacidos que pueden ser degradadas por catepsina B, tales como, por ejemplo, Val-Cit, Ala-Leu-Ala-Leu-(SEQ ID NO:259), Gly-Phe-Leu-Gly-(SEQ ID NO:260) y Phe-Lys.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, un conector liberable tiene una semivida a pH 7,4, 25 °C, por ejemplo, un pH fisiologico, temperatura del cuerpo humano (por ejemplo, in vivo, en suero, en un tejido dado), de aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas o aproximadamente 96 horas o mas o cualquier semivida intermedia. Un experto en la materia apreciarfa que la semivida de un polipeptido conjugado HRS-Fc puede adaptarse a medida de manera precisa usando un enlazador liberable particular.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, sin embargo, uno o mas de los enlazadores peptfdicos son opcionales. Por ejemplo, las secuencias de enlazador pueden no ser necesarias cuando el primer y el segundo polipeptidos tienen regiones de aminoacidos N-terminales y/o C-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia esterica.
Procedimientos para uso
Las realizaciones de la presente descripcion se refieren al descubrimiento de que los polipeptidos conjugados de region Fc-histidil-ARNt sintetasa (HRS-Fc), y los fragmentos y variantes de los mismos, ofrecen procedimientos mejorados para modular las respuestas inflamatorias de diversas maneras utiles, tanto in vitro como in vivo Las composiciones de la presente descripcion pueden ser utiles, por lo tanto, como inmunomoduladores para el tratamiento de una amplia gama de indicaciones proinflamatorias, inflamatorias y/o autoinmunitarias, incluyendo las respuestas inflamatorias, la inflamacion cronica, la inflamacion aguda y las enfermedades inmunitarias, modulando las celulas que median, ya sea directa o indirectamente, dichas enfermedades afecciones y trastornos inflamatorios y/o autoinmunitarios. La utilidad de las composiciones de la presente descripcion como inmunomoduladores se puede monitorizar usando cualquiera de una serie de tecnicas conocidas y disponibles en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, ensayos de migracion (por ejemplo, usando leucocitos o linfocitos), ensayos de produccion de citocinas o ensayos de viabilidad celular o diferenciacion celular (por ejemplo, usando linfocitos B, linfocitos T, monocitos o linfocitos NK).
La «inflamacion» se refiere en general a la respuesta biologica de los tejidos a estfmulos perjudiciales, tales como patogenos, celulas danadas (por ejemplo, heridas) e irritantes. La expresion «respuesta inflamatoria» se refiere a los mecanismos especfficos mediante los cuales se consigue y regula la inflamacion, incluyendo, simplemente a modo de ilustracion, activacion o migracion de las celulas inmunitarias, migracion, autoinmunidad y enfermedad autoinmunitaria, produccion de citocinas, vasodilatacion, incluyendo liberacion de quinina, fibrinolisis y coagulacion, entre otros descritos en el presente documento y conocidos en la tecnica. Idealmente, la inflamacion es un intento de proteccion por parte del cuerpo tanto para eliminar los estfmulos perjudiciales como para iniciar el proceso de curacion del tejido o tejidos afectados. En ausencia de inflamacion, las heridas e infecciones nunca se curarfan, creando una situacion donde la destruccion progresiva del tejido amenazarfa la supervivencia. Por otro lado, la inflamacion excesiva o cronica puede asociarse con diversas enfermedades, tales como la fiebre del heno, la aterosclerosis y la artritis reumatoide, entre otras descritas en el presente documento y conocidas en la tecnica.
Los signos clfnicos de la inflamacion cronica dependen de la duracion de la enfermedad, las lesiones inflamatorias, la causa y la zona anatomica afectada (ver, por ejemplo, Kumar y col., Robbins Basic Pathology-8ft Ed., 2009 Elsevier, Londres; Miller, LM, Pathology Lecture Notes, Atlantic Veterinary College, Charlottetown, PEl, Canada). La inflamacion cronica se asocia con diversas afecciones o enfermedades patologicas, incluyendo, por ejemplo, alergias, enfermedad de Alzheimer, anemia, estenosis de la valvula aortica, artritis tal como artritis reumatoide y osteoartritis, cancer, insuficiencia cardfaca congestiva, fibromialgia, fibrosis, ataque cardfaco insuficiencia renal, lupus, pancreatitis, accidente cerebrovascular, complicaciones quirurgicas, enfermedad pulmonar inflamatoria, enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (CU), aterosclerosis, trastornos neurologicos, diabetes, trastornos metabolicos, obesidad y psoriasis, entre otras descritas en el presente documento y conocidas en la tecnica. Muchas otras enfermedades cronicas tambien pueden incluir un componente inflamatorio y, por lo tanto, pueden tratarse con los conjugados HRS-Fc de la presente descripcion, incluyendo, por ejemplo, distrofias musculares y rabdomiolisis. Por lo tanto, los conjugados HRS-Fc pueden usarse para tratar o gestionar inflamacion cronica, modular cualquiera de una o mas de las respuestas inflamatorias cronicas individuales, o tratar una o mas enfermedades o afecciones asociadas con la inflamacion cronica.
Ciertas respuestas inflamatorias especfficas incluyen la produccion y actividad de citocinas y rutas relacionadas. Por ejemplo, ciertas realizaciones ejemplares de la presente descripcion se refieren a la modulacion de la senalizacion celular a traves del factor nuclear-kB (NF-kB), tal como aumentando las actividades aguas abajo de este factor de transcripcion. En ciertos aspectos, los aumentos en la actividad de NF-kB pueden causar a aumentos en la senalizacion o actividad de citocinas, tales como citocinas proinflamatorias (por ejemplo, TNF-alfa o beta) y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-10).
Criterios para evaluar los signos y sfntomas de afecciones inflamatorias y otras, incluso para fines de diagnostico diferencial y tambien para monitorizar tratamientos, tales como determinar si se ha administrado una dosis terapeuticamente efectiva en el ciclo de tratamiento, por ejemplo, determinando la mejorfa de acuerdo con criterios clfnicos aceptado, seran evidentes para los expertos en la materia y se ejemplifican con las ensenanzas de, por ejemplo, Berkow y col., eds., The Merck Manual, 16a edicion, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Goodman y col., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a edicion, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (2001); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3 a edicion, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD. (1987); Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, (1985); Osolci al., eds., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edicion, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990); Katzung, Basic and Clinical Pharmacology, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992).
Tambien se incluyen procedimientos para modular una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta inmunitaria innata o adaptativa mediante el uso de cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, la expresion «respuesta inmunitaria» incluye una reaccion medible u observable a un antfgeno, una composicion de vacuna o una molecula inmunomoduladora mediada por una o mas celulas del sistema inmunitario. Una respuesta inmunitaria generalmente comienza con un antfgeno o una molecula inmunomoduladora que se une a una celula del sistema inmunitario. Una reaccion a un antfgeno o molecula inmunomoduladora puede estar mediada por muchos tipos de celulas, incluyendo una celula que inicialmente se une a un antfgeno o molecula inmunomoduladora y celulas que participan en la mediacion de una respuesta inmunitaria innata, humoral, mediada por celulas.
Tambien se incluyen procedimientos de tratamiento de enfermedades inmunitarias. Las enfermedades, trastornos o afecciones ilustrativas del sistema inmunitario que pueden tratarse de acuerdo con la presente descripcion incluyen, aunque sin limitarse a, inmunodeficiencias primarias, trombocitopenia mediada por el sistema inmunitario, sfndrome de Kawasaki, trasplante de medula osea (por ejemplo, trasplante reciente de medula osea en adultos o ninos), leucemia linfocftica cronica de linfocitos B, infeccion por VIH (por ejemplo, infeccion por VIH en adultos o pediatrica), polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica, purpura postransfusional y similares.
Adicionalmente, otras enfermedades, trastornos y afecciones que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen el sfndrome de Guillain-Barre, anemia (por ejemplo, anemia asociada con parvovirus B19, pacientes con mieloma multiple estable que tienen un alto riesgo de infeccion (por ejemplo, infeccion recurrente), anemia hemolftica autoinmunitaria (por ejemplo, anemia hemolftica autoinmunitaria de tipo calido), trombocitopenia (por ejemplo, trombocitopenia neonatal) y neutropenia mediada por el sistema inmunitario), trasplante (por ejemplo, receptores negativos para citomegalovirus (CMV) de organos positivos para CMV), hipogammaglobulinemia (por ejemplo, neonatos hipogammaglobulinemicos con factor de riesgo de infeccion o morbilidad), epilepsia (por ejemplo, epilepsia intratable), sfndromes vasculfticos sistemicos, miastenia grave (por ejemplo, descompensacion en miastenia grave) dermatomiositis y polimiositis.
Otras enfermedades, trastornos y afecciones autoinmunitarias que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen, aunque sin limitarse a, anemia hemolftica autoinmunitaria, trombocitopenia neonatal autoinmunitaria, purpura trombocitopenia idiopatica, autoinmunocitopenia, anemia hemolftica, sfndrome antifosfolfpido, dermatitis, encefalomielitis alergica, miocarditis, policondritis recidivante, cardiopatfa reumatica, glomerulonefritis (por ejemplo, nefropatfa por IgA), esclerosis multiple, neuritis, uveitis oftalmia, poliendocnopatfas, purpura (por ejemplo, purpura de Henloch-Scoenlein) inflamacion pulmonar autoinmunitaria, sfndrome de Guillain-Barre, diabetes mellitus dependiente de insulina y enfermedad ocular inflamatoria autoinmunitaria.
Enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias adicionales que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen, aunque sin limitarse a, tiroiditis autoinmunitaria; hipotiroidismo, incluyendo tiroiditis de Hashimoto y tiroiditis caracterizadas, por ejemplo, por citotoxicidad tiroidea mediada por celulas y humoral; LES (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por complejos inmunitarios circulantes y generados localmente); sfndrome de Goodpasture (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra la membrana basal); penfigo (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos acantolfticos epidermicos); autoinmunidades del receptor como, por ejemplo, enfermedad de Graves (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides; miastenia grave, que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos para el receptor de acetilcolina); resistencia a la insulina (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos para el receptor de insulina); anemia hemolftica autoinmunitaria (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por la fagocitosis de globulos rojos sensibilizados por anticuerpos); y purpura trombocitopenica autoinmunitaria (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por la fagocitosis de plaquetas sensibilizadas por anticuerpos).
Otras enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen, aunque sin limitarse a, artritis reumatoide (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por complejos inmunitarios en las articulaciones); esclerodermia con anticuerpos anticolageno (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos nucleolares y otros anticuerpos nucleares); enfermedad mixta del tejido conectivo, (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos para antfgenos nucleares extrafbles, por ejemplo, ribonucleoprotefna); polimiositis/dermatomiositis (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos antihistamfnicos sin histona); anemia perniciosa (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos anticelulas parietales, antimicrosomas y antifactor intrfnseco); enfermedad de Addison idiopatica (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por citotoxicidad suprarrenal humoral y mediada por celulas); esterilidad (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos antiespermatozoides); glomerulonefritis (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra la membrana basal glomerular o complejos inmunitarios); por glomerulonefritis primaria, por nefropatfa por IgA; penfigoide bulloso (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por IgG y complemento en la membrana basal); sfndrome de Sjogren (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por multiples anticuerpos tisulares y/o el anticuerpo antinuclear no histona especffico (SS-B)); diabetes mellitus (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra celulas de los islotes mediados por celulas y humorales); y resistencia farmacologica adrenergica, incluyendo resistencia farmacologica adrenergica con asma o fibrosis qufstica (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra receptores betaadrenergicos).
Otras enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias adicionales que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen, aunque sin limitarse a, hepatitis cronica activa (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra musculo liso); cirrosis biliar primaria (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos antimitocondriales); otra insuficiencia de la glandula endocrina (que se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos tisulares especfficos en algunos casos); vitiligo (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos antimelanocitos); vasculitis (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por inmunoglobulina y complemento en las paredes de los vasos y/o bajo complemento de suero); afecciones posinfarto de miocardio (que a menudo se caracterizan, por ejemplo, por anticuerpos antimiocardio); sfndrome de cardiotomia (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos antimiocardio); urticaria (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE); dermatitis atopica (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE); asma (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE); miopatias inflamatorias; y otros trastornos inflamatorios, granulomatosos, degenerativos y atroficos.
Enfermedades y trastornos adicionales que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen aquellos que resultan de o estan asociados con un desequilibrio de Th17 u otros subtipos de celulas Th. Los ejemplos incluyen psoriasis, artritis psoriasica, dermatitis atopica (eccema), esclerosis concentrica de Balo, esclerosis difusa de Schilder, EM de Marburg, EII, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis colagenosa, colitis linfocitica, colitis isquemica, colitis por derivacion, enfermedad de Behpet, colitis indeterminada, asma, miocarditis autoinmunitaria, endometriosis, trastorno de Still de inicio en adultos (TSIA), purpura de Schonlein-Henoch (PHS), Vogt-Koyanagi-Harada (VKH), enfermedad periodontal, insuficiencia de trasplante de organos, enfermedad de injerto contra huesped y enfermedad de Devic (neuromielitis optica).
En algunos aspectos de la presente descripcion, la presente descripcion incluye un procedimiento de reduccion de la inflamacion muscular o pulmonar asociada con una enfermedad autoinmunitaria que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composicion que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento. Las enfermedades y trastornos inflamatorios musculares ejemplares incluyen distrofias musculares, inflamacion muscular inducida por el ejercicio, inflamacion asociada con lesion o cirugfa muscular, rabdomiolisis y enfermedades y trastornos relacionados como se describen en el presente documento.
Tambien se incluyen procedimientos de tratamiento de una enfermedad asociada con un autoanticuerpo que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composicion terapeutica que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento, donde el polipeptido de HRS comprende al menos un epitopo especificamente reconocido por el autoanticuerpo.
Ciertas realizaciones de la presente descripcion incluyen procedimientos de induccion de tolerancia a un antigeno de histidil-ARNt sintetasa (HisRS), comprendiendo dicho procedimiento administrar a un sujeto una composicion que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento, donde el polipeptido de HRS comprende al menos un epitopo especificamente reconocido por el autoanticuerpo, y donde la administracion de la composicion causa tolerancia al autoantfgeno.
Tambien se incluyen procedimientos para eliminar un conjunto o subconjunto de linfocitos T implicados en una respuesta autoinmunitaria a un autoantfgeno de histidil ARNt sintetasa (HisRS), comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto una composicion que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento. El polipeptido de HRS comprende al menos un epitopo especificamente reconocido por el autoanticuerpo, o el linfocito T autorreactivo, y donde la administracion de la composicion causa la eliminacion clonal de linfocitos T autorreactivos.
En otra realizacion de la presente descripcion, la presente descripcion incluye un procedimiento para inducir anergia en linfocitos T implicados en una respuesta autoinmunitaria a un autoantfgeno de histidil ARNt sintetasa (HRS), comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto una composicion que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento, donde el polipeptido HRS comprende al menos un epftopo especfficamente reconocido por el autoanticuerpo o linfocito T, y donde la administracion de la composicion causa la inactivacion funcional de los linfocitos T implicados en la respuesta autoinmunitaria.
En otra realizacion de la presente descripcion, la presente descripcion incluye una terapia de sustitucion para tratar una enfermedad asociada con una insuficiencia de histidil ARNt sintetasa que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composicion terapeutica que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento, donde el polipeptido de HRS compensa funcionalmente la insuficiencia de histidil ARNt sintetasa.
En un aspecto de la presente descripcion de esta terapia de sustitucion, la insuficiencia de histidil ARNt sintetasa es causada por la presencia de anticuerpos anti-Jo-1. En un aspecto de la presente descripcion de esta terapia de sustitucion, la insuficiencia de histidil ARNt sintetasa esta causada por mutaciones en una histidil ARNt sintetasa endogena que modula la actividad, expresion o distribucion celular de la histidil ARNt sintetasa endogena. En un aspecto de la presente descripcion, la insuficiencia de histidil ARNt sintetasa esta asociada con el sfndrome de Perrault o el sfndrome de Usher.
En cualquiera de estos procedimientos, el termino «tolerancia» se refiere a la reduccion o ausencia sostenida de una respuesta inmunitaria a un antfgeno especffico en un mamffero, particularmente un ser humano. La tolerancia es distinta de la inmunosupresion generalizada, donde todas, o toda una clase especffica de las respuestas inmunitarias mediadas por celulas inmunitarias, tales como linfocitos B, de respuestas inmunitarias se reducen o eliminan. El desarrollo de la tolerancia puede monitorizarse rutinariamente mediante la ausencia, o una disminucion, de la concentracion de anticuerpos contra polipeptidos de HRS en el suero del sujeto huesped despues de la administracion, en dosis unicas o sucesivas del conjugado HRS-Fc de tratamiento. El desarrollo de tolerancia tfpicamente sera suficiente para disminuir los sfntomas de la enfermedad autoinmunitaria en el paciente, por ejemplo, un paciente puede haber mejorado suficientemente para mantener las actividades normales en ausencia, o en presencia de cantidades reducidas, de inmunosupresores generales, por ejemplo, corticoides.
En cualquiera de estos procedimientos, la tolerancia de las composiciones tfpicamente sera sostenida, lo que significa que tendra una duracion de aproximadamente un mes, aproximadamente dos meses, aproximadamente tres meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses o aproximadamente 6 meses o mas. La tolerancia puede dar lugar a una anergia selectiva de los linfocitos B, o una anergia de los linfocitos T o ambas.
En cualquiera de estos procedimientos, tratamientos y composiciones terapeuticas, la expresion «una enfermedad asociada con autoanticuerpos especfficos para histidil ARNt sintetasa» se refiere a cualquier enfermedad o trastorno en el cual los anticuerpos para histidil ARNt sintetasa se detectan o son detectables, independientemente de si otros autoanticuerpos tambien se detectan, o se cree que desempenan un papel en la progresion o la causa de la enfermedad. Los procedimientos para detectar anticuerpos en muestras de pacientes pueden llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento estandar incluyendo, por ejemplo, mediante RIA, ELISA, mediante inmunoprecipitacion, mediante tincion de tejidos o celulas (incluyendo celulas transfectadas), micromatrices de antfgeno, analisis de espec. de masas, ensayos de neutralizacion especfficos o uno de una serie de otros procedimientos conocidos en la tecnica para identificar la especificidad por un antfgeno deseado. En algunos aspectos de la presente descripcion, la especificidad del anticuerpo puede caracterizarse adicionalmente determinando la capacidad de los anticuerpos para unirse selectivamente a diferentes variantes de splicing y formas truncadas o proteolfticas de histidil ARNt sintetasa. Un autoanticuerpo humano relativamente bien conocido para la histidil ARNt sintetasa incluye, por ejemplo, anticuerpos para Jo-1.
En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos y composiciones divulgados, el polipeptido de HRS o el conjugado HRS-Fc comprende un epftopo de histidil ARNt sintetasa que reacciona especfficamente de forma cruzada con un autoanticuerpo asociado a enfermedad para histidil ARNt sintetasa. En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos y composiciones divulgados, el polipeptido de HRS o el conjugado HRS-Fc comprende un epftopo de histidil ARNt sintetasa que reacciona especfficamente de forma cruzada con un linfocito T asociado a enfermedad autorreactivo para histidil ARNt sintetasa. En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos y composiciones divulgados, el polipeptido de HRS o el conjugado HRS-Fc comprenden un epftopo que reacciona especfficamente de forma cruzada con un autoanticuerpo asociado a enfermedad para otra ARNt sintetasa, o con un autoanticuerpo no para ARNt sintetasa.
En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos descritos, el polipeptido de HRS o el conjugado HRS-Fc comprenden un epftopo inmunodominante que es reconocido especfficamente por la mayorfa de los anticuerpos de los sueros de un paciente con una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil-ARNt sintetasa. En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos descritos, el polipeptido de HRS o el conjugado HRS-Fc comprende un epftopo inmunodominante que es reconocido especfficamente por la mayorfa de los linfocitos T autorreactivos de los sueros de un paciente con una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil-ARNt sintetasa.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, el epftopo esta comprendido dentro del dominio WHEP del polipeptido de HRS (aproximadamente los aminoacidos 1-43 de la SEQ ID NO:1); el dominio de aminoacilacion (aproximadamente los aminoacidos 54-398 de la SEQ ID NO:1); o el dominio de union anticodon (aproximadamente los aminoacidos 406-501 de la SEQ ID NO: 1) o cualquier combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS no comprende un epftopo que reacciona especfficamente de manera cruzada con un autoanticuerpo asociado a enfermedad para histidil-ARNt sintetasa. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS no compite significativamente por la union de un autoanticuerpos asociado a enfermedad para histidil-ARNt sintetasa en un ELISA competitivo hasta una concentracion de aproximadamente 1 x 10'7 M. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS no compite significativamente por la union de un autoanticuerpo asociado a enfermedad para histidil-ARNt sintetasa en un ELISA competitivo hasta una concentracion de aproximadamente 5 x 10'7 M. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS no compite significativamente por la union de un autoanticuerpo asociado a enfermedad para histidil-ARNt sintetasa en un ELISA competitivo hasta una concentracion de aproximadamente 1 x 10-6 M.
Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS tiene una afinidad mas baja por un autoanticuerpo asociado a enfermedad que la histidil-ARNt sintetasa de tipo silvestre (SEQ ID NO:1) de acuerdo con se mide en un ELISA competitivo. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido de HRS tiene una afinidad aparente por el autoanticuerpo asociado a enfermedad que es al menos aproximadamente 10 veces menos, o al menos aproximadamente 20 veces menos, o al menos aproximadamente 50 veces menos, o al menos aproximadamente 100 veces menos que la afinidad del autoanticuerpo asociado a enfermedad para ser humano de tipo silvestre (SEQ ID NO:1). En un aspecto de la presente descripcion, el autoanticuerpo para histidil-ARNt sintetasa se dirige al antfgeno Jo-1.
Los ejemplos de enfermedades asociadas con autoanticuerpos especfficos para histidil-ARNt sintetasa (asf como enfermedades asociadas con una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa) incluyen, sin limitacion, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias y miopatfas inflamatorias, incluyendo miopatfas inflamatorias idiopaticas, polimiositis, miopatfas inducidas por estatinas, dermatomiositis, enfermedad pulmonar intersticial (y otras afecciones fibroticas pulmonares) y trastornos relacionados, tales como superposicion de polimiositis-esclerodermia y miositis por cuerpos de inclusion (MCI) y afecciones tales como las que se encuentran en los sfndromes antisintetasa, incluyendo por ejemplo enfermedad pulmonar intersticial, artritis, dismotilidad esofagica, enfermedad cardiovascular y otras manifestaciones vasculares tales como fenomeno de Reynaud; otros ejemplos de enfermedades asociadas con una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa incluyen trastornos geneticos que dan como resultado una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa activa, incluyendo el sfndrome de Usher y el sfndrome de Perrault.
La polimiositis afecta los musculos esqueleticos (implicados en la realizacion de movimientos) en ambos lados del cuerpo. Rara vez se ve en personas menores de 18 anos; la mayorfa de los casos son en personas de 31 a 60 anos de edad. Ademas de los sfntomas mencionados anteriormente, la debilidad muscular progresiva causa dificultad para tragar, hablar, levantarse de una posicion sentada, subir escaleras, levantar objetos o juntar las manos por encima de la cabeza. Las personas con polimiositis tambien pueden experimentar artritis, dificultad para respirar y arritmias cardfacas. La polimiositis a menudo se asocia con anticuerpos para sintetasas, incluyendo HisRS, dando como resultado la invasion de celulas inmunitarias en las celulas musculares danadas. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activacion y la invasion de las celulas inmunitarias y para tratar la polimiositis.
La dermatomiositis se caracteriza por una erupcion cutanea que precede o acompana a la debilidad muscular progresiva. La erupcion es de aspecto irregular, con decoloraciones purpuras o rojas, y se desarrolla caracterfsticamente en los parpados y en los musculos utilizados para extender o enderezar las articulaciones, incluyendo nudillos, codos, rodillas y dedos del pie. Tambien pueden aparecer erupciones rojas en la cara, el cuello, los hombros, la parte superior del torax, la espalda y otras ubicaciones, y puede haber hinchazon en las zonas afectadas. La erupcion a veces se produce sin implicacion muscular evidente. Los adultos con dermatomiositis pueden experimentar perdida de peso o decimas de fiebre, tener los pulmones inflamados y ser sensibles a la luz. La dermatomiositis en adultos, a diferencia de la polimiositis, puede acompanar a tumores de mama, pulmon, genitales femeninos o intestino. Los ninos y adultos con dermatomiositis pueden desarrollar depositos de calcio, que aparecen como protuberancias duras debajo de la piel o en el musculo (llamada calcinosis). La calcinosis se produce con mayor frecuencia de 1 a 3 anos despues del inicio de la enfermedad, pero puede producirse muchos anos despues. Estos depositos se ven con mas frecuencia en la dermatomiositis infantil que en la dermatomiositis que comienza en adultos. La dermatomiositis puede estar asociada con enfermedades del colageno vascular o autoinmunitarias.
En algunos casos de polimiositis y dermatomiositis, los musculos distales (lejos del tronco del cuerpo, como los de los antebrazos y alrededor de los tobillos y las munecas) pueden verse afectados a medida que avanza la enfermedad. La polimiositis y la dermatomiositis pueden asociarse con enfermedades del colageno vascular o autoinmunitarias que dan como resultado la invasion de celulas inmunitarias hacia las celulas musculares danadas. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activacion e invasion de las celulas inmunitarias y para tratar la dermatomiositis.
La miositis por cuerpos de inclusion (MCI) se caracteriza por debilidad y atrofia musculares progresivas. El inicio de la debilidad muscular es generalmente gradual (durante meses o anos) y afecta tanto a los musculos proximales como a los distales. La debilidad muscular puede afectar solo un lado del cuerpo. En ocasiones, se ven pequenos orificios llamados vacuolas en las celulas de las fibras musculares afectadas. Las cafdas y los tropiezos suelen ser los primeros sfntomas perceptibles de MCI. Para algunas personas, el trastorno comienza con debilidad en las munecas y los dedos que causa dificultad para pellizcar, abotonar y agarrar objetos. Puede haber debilidad en los musculos de la muneca y los dedos y atrofia (adelgazamiento o perdida de masa muscular) de los musculos del antebrazo y los musculos del cuadriceps en las piernas. La dificultad para tragar se produce en aproximadamente la mitad de los casos de MCI. Los sfntomas de la enfermedad generalmente comienzan despues de los 50 anos, aunque la enfermedad puede ocurrir antes. A diferencia de la polimiositis y la dermatomiositis, la MCI se presenta con mas frecuencia en hombres que en mujeres. Al igual que con otras distrofias musculares, la MCI tambien da como resultado una invasion progresiva de celulas inmunitarias en las celulas musculares danadas. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activacion e invasion de las celulas inmunitarias y para tratar la MCI.
La miositis juvenil tiene algunas similitudes con la dermatomiositis y polimiositis en adultos. Tfpicamente afecta a ninos de 2 a 15 anos, con sfntomas que incluyen debilidad e inflamacion de los musculos proximales, edema (una acumulacion anormal de lfquidos en los tejidos corporales que causa inflamacion), dolor muscular, fatiga, erupciones en la piel, dolor abdominal, fiebre y contracturas (acortamiento cronico de los musculos o tendones alrededor de las articulaciones, causado por la inflamacion en los tendones musculares, que evita que las articulaciones se muevan libremente). Los ninos con miositis juvenil tambien pueden tener dificultad para tragar y respirar, y el corazon puede verse afectado. Aproximadamente del 20 al 30 por ciento de los ninos con dermatomiositis juvenil desarrollan calcinosis. Los ninos afectados pueden no mostrar niveles mas altos de lo normal de la enzima creatina cinasa en su sangre, pero tienen niveles mas altos de lo normal de otras enzimas musculares. La miositis juvenil tambien produce una invasion progresiva de celulas inmunitarias en las celulas musculares danadas. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activacion e invasion de las celulas inmunitarias y para tratar la miositis juvenil.
Las miopatfas inducidas por estatinas estan asociadas con el uso a largo plazo de estatinas que actuan a traves de la inhibicion de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMGCR). Generalmente bien tolerados, estos medicamentos se han descrito como inductores de miotoxicidad. Mas recientemente, ha habido informes de pacientes donde las miopatfas con estatinas persisten incluso despues del cese del farmaco, formulandose la hipotesis de que tienen una causa autoinmunitaria. Los beneficios de las estatinas son indiscutibles en la reduccion del riesgo de cardiopatfa coronaria y la progresion de la aterosclerosis coronaria. No obstante, las complicaciones asociadas pueden ser potencialmente mortales. En la actualidad, se estima que mas de 38 millones de personas en los EE. u U., toman estatinas y se espera que hasta el 7 % (> 2,6 millones) de estas desarrollen sfntomas musculares, y hasta el 0,5 % (> 190.000) de estas personas potencialmente desarrollen miopatfas potencialmente mortales.
Todas las estatinas pueden causar problemas musculares y el riesgo aumenta junto con los aumentos en su lipofilicidad, la potencia para reducir el colesterol y la dosis. La cerivastatina en particular ha estado implicada como causante de un mayor riesgo y se ha retirado del mercado estadounidense. De las estatinas restantes, la atorvastatina y la simvastatina tienen tasas de miotoxicidad mas altas. Otros agentes hipolipemiantes no estatinas, tales como la niacina y los fibratos, tambien conllevan riesgos de problemas musculares, especialmente cuando se combinan con estatinas. Aunque no es posible predecir que pacientes tendran problemas musculares inducidos por estatinas, los problemas musculares previos pueden ser un factor de riesgo y deben considerarse al iniciar el tratamiento con estatinas. Antecedentes familiares de miopatfa son relevantes si un paciente puede ser portador de una miopatfa genetica, ya que podrfa ser desenmascarado por el estres anadido del tratamiento con estatinas. Otros factores de riesgo pueden incluir la edad de mas de 80 anos, bajo peso corporal, sexo femenino, hipotiroidismo, ciertos defectos geneticos y descendencia asiatica, asf como el uso concomitante de ciertos medicamentos, incluidos los bloqueadores de los canales de calcio, antibioticos macrolidos, omeprazol, amiodarona, antifungicos azolicos, antagonistas del receptor de histamina H2, nefazodona, ciclosporina, inhibidores de la proteasa del VIH, warfarina y zumo de pomelo.
El sfntoma muscular mas comun causado por las estatinas es el dolor muscular o mialgia y se presenta en aproximadamente el 7 % de los usuarios de estatinas. La mialgia puede ser de leve a grave y, a menudo, empeora con la actividad muscular. Si el sfntoma es tolerable y la indicacion para el tratamiento con estatinas es fuerte, por ejemplo, en un paciente con hipercolesterolemia y un infarto de miocardio reciente, el tratamiento con estatinas continuado puede ser apropiado.
Los niveles iniciales de creatina cinasa (CK) no se recomiendan uniformemente antes del inicio del tratamiento con estatinas por parte de las organizaciones que gufan el tratamiento con estatinas, pero los niveles de CK pueden proporcionar informacion muy util si posteriormente se desarrollan sfntomas musculares. Tambien puede producirse debilidad muscular, y con frecuencia produce fatiga y se combina con dolor y CK elevada. Como la mayorfa de las miopatfas, la debilidad es mas pronunciada proximalmente. Episodios raros de rabdomiolisis tambien se han producido con el tratamiento con estatinas; estos son mucho menos frecuentes pero pueden ser posiblemente mortales. Los cambios que se pueden observar en la histologfa muscular que son mas tfpicos de una miopatfa por estatinas son fibras negativas de citocromo oxidasa, aumento del contenido de lfpidos y fibras rojas irregulares. La miopatfa necrotizante autoinmunitaria es una forma rara de miopatfa por estatinas. En estos pacientes, la interrupcion del medicamento con estatinas no se traduce en recuperacion, incluso despues de varios meses sin tomar el medicamento. Los pacientes tienen una debilidad predominantemente proximal, a menudo sin dolor.
El diagnostico se basa en los antecedentes medicos del individuo, los resultados de una exploracion ffsica y pruebas de fuerza muscular y muestras de sangre que muestran niveles elevados de diversas enzimas musculares y autoanticuerpos. Las herramientas de diagnostico incluyen la electromiograffa para registrar la actividad electrica que controla los musculos durante la contraccion y en reposo, ecograffa para detectar inflamacion muscular e imagenes de resonancia magnetica para revelar musculo anomalo y evaluar la enfermedad muscular. Una biopsia muscular puede examinarse mediante microscopfa para detectar signos de inflamacion cronica, muerte de la fibra muscular, deformidades vasculares o cambios especfficos del diagnostico de MCI. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activacion y la invasion de celulas inmunitarias en el musculo danado, y para tratar las miopatfas inducidas por estatinas y la rabdomiolisis.
La enfermedad pulmonar intersticial (EPI) es una categorfa amplia de enfermedades pulmonares que incluye mas de 130 trastornos caracterizados por cicatrizacion (es decir, «fibrosis») y/o inflamacion de los pulmones. La EPI representa el 15 por ciento de los casos vistos por los neumologos. La enfermedad pulmonar intersticial (EPI) puede desarrollarse a partir de diversas fuentes, que van desde otras enfermedades hasta factores ambientales. Algunas de las causas conocidas de la EPI incluyen: enfermedad del tejido conectivo o autoinmunitaria, incluyendo, por ejemplo, esclerodermia/esclerosis sistemica progresiva, lupus (lupus eritematoso sistemico), artritis reumatoide y polimiositis/dermatomiositis; y exposiciones ocupacionales y ambientales, incluyendo, por ejemplo, exposicion al polvo y ciertos gases, venenos, quimioterapia y radioterapia.
En EPI, el tejido en los pulmones se inflama y/o cicatriza. El intersticio del pulmon incluye el area dentro y alrededor de los pequenos vasos sangufneos y los alveolos (sacos de aire) donde tiene lugar el intercambio de oxfgeno y dioxido de carbono. La inflamacion y la cicatrizacion del intersticio alteran este tejido y causan una disminucion en la capacidad de los pulmones para extraer oxfgeno del aire. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activacion y la invasion de celulas inmunitarias en el pulmon danado, y para tratar la EPI.
La progresion de la EPI varfa de una enfermedad a otra y de una persona a otra. Debido a que la enfermedad pulmonar intersticial interrumpe la transferencia de oxfgeno y dioxido de carbono en los pulmones, sus sfntomas generalmente se manifiestan como problemas respiratorios. Los dos sfntomas mas comunes de la EPI son dificultad para respirar al hacer ejercicio y una tos no productiva.
El sfndrome de Usher es la afeccion mas comun que afecta tanto a la audicion como a la vision. Los principales sfntomas del sfndrome de Usher son la perdida de audicion y la retinitis pigmentaria (RP). La RP causa ceguera nocturna y perdida de la vision periferica (vision lateral) a traves de la degeneracion progresiva de la retina. A medida que RP avanza, el campo de vision se reduce hasta que solo queda la vision central. Muchas personas con sfndrome de Usher tambien tienen problemas graves de equilibrio. Aproximadamente del 3 al 6 por ciento de todos los ninos sordos y otro 3 al 6 por ciento de los ninos con problemas de audicion tienen el sfndrome de Usher. En pafses desarrollados como los Estados Unidos, aproximadamente cuatro bebes de cada 100.000 nacimientos tienen el sfndrome de Usher. El sfndrome de Usher se hereda como un rasgo autosomico recesivo. Varios loci geneticos se han asociado con el sfndrome de Usher, incluyendo la histidil t-ARN sintetasa (Puffenberger y col., (2012) PLoS ONE 7(1) e28936 doi: 10.1371 / journal. pone.0028936).
Hay tres tipos clfnicos de sfndrome de Usher: tipo 1, tipo 2 y tipo 3. En los Estados Unidos, los tipos 1 y 2 son los tipos mas comunes. Juntos, representan aproximadamente del 90 al 95 por ciento de todos los casos de ninos que tienen sfndrome de Usher.
Los ninos con sfndrome de Usher de tipo 1 son profundamente sordos al nacer y tienen problemas graves de equilibrio. Debido a los problemas de equilibrio asociados con el sfndrome de Usher de tipo 1, los ninos con este trastorno tardan en sentarse sin apoyo y, por lo general, no caminan de forma independiente antes de los 18 meses. Habitualmente, estos ninos comienzan a desarrollar problemas de vision en la primera infancia, casi siempre cuando cumplen los 10 anos. Los problemas de vision generalmente comienzan con dificultades para ver de noche, pero tienden a progresar rapidamente hasta que la persona esta completamente ciega.
Los ninos con sfndrome de Usher de tipo 2 nacen con perdida auditiva de moderada a grave y un equilibrio normal. Aunque la gravedad de la perdida auditiva varfa, la mayorfa de estos ninos pueden beneficiarse de los audffonos y pueden comunicarse oralmente. Los problemas de vision en el sfndrome de Usher de tipo 2 tienden a progresar mas lentamente que los del tipo 1, y la aparicion de RP a menudo no se manifiesta hasta la adolescencia.
Los ninos con sfndrome de Usher de tipo 3 tienen una audicion normal al nacer. Aunque la mayorfa de los ninos con el trastorno tienen un equilibrio de normal a casi normal, algunos pueden desarrollar problemas de equilibrio mas adelante. La audicion y la vista empeoran con el tiempo, pero la velocidad a la que se deterioran puede variar de persona a persona, incluso dentro de la misma familia. Una persona con sfndrome de Usher de tipo 3 puede desarrollar perdida de audicion en la adolescencia y, habitualmente, necesitara audffonos en la edad adulta media o tardfa. La ceguera nocturna generalmente comienza en algun momento durante la pubertad. Los puntos ciegos aparecen desde la adolescencia tardfa hasta la edad adulta temprana y, a mediados de la edad adulta, la persona suele ser legalmente ciega.
El sfndrome de Perrault (SP) se caracteriza por la asociacion de disgenesia ovarica en mujeres con discapacidad auditiva neurosensorial y, en algunos sujetos, anomalfas neurologicas, incluyendo ataxia cerebelosa progresiva y deficit intelectual. La prevalencia exacta para el sfndrome de Perrault es desconocida, y probablemente se diagnostique de manera insuficiente, particularmente en hombres donde el hipogonadismo no es una caracterfstica y el sfndrome no se detecta. La edad media en el momento del diagnostico es 22 anos despues de la presentacion con pubertad tardfa en mujeres con sordera neurosensorial. Se observaron defectos auditivos en todos los casos menos uno (edad media en el momento del diagnostico 8 anos). La perdida auditiva es siempre neurosensorial y bilateral, pero la gravedad es variable (leve a profunda), incluso en pacientes afectados de la misma familia. Se ha notificado disgenesia ovarica en todos los casos femeninos, pero no se detectan defectos gonadales en los hombres. La amenorrea es generalmente primaria, pero tambien se ha notificado amenorrea secundaria. El crecimiento tardfo (altura por debajo del tercer percentil) se notifico en la mitad de los casos documentados. Se desconoce la frecuencia exacta de las anomalfas neurologicas, pero se han notificado nueve mujeres y dos hombres (16 a 37 anos de edad) que carecen de anomalfas neurologicas. Los signos neurologicos son progresivos y generalmente aparecen mas tarde en la vida, sin embargo, se ha observado retraso en la marcha o cafdas frecuentes y tempranas en pacientes jovenes con SP. Los signos neurologicos comunes son ataxia, dispraxia, movimientos extraoculares limitados y polineuropatfa. Tambien se han notificado algunos casos de escoliosis. La transmision de SP es autosomica recesiva y recientemente se han identificado mutaciones en la histidil ARNt sintetasa mitocondrial como causantes de disgenesia ovarica y perdida de audicion neurosensorial asociadas con el sfndrome de Perrault. (Pierce y col., PNAS EE. UU. 108 (16) 6543-6548, 2011).
La distrofia muscular se refiere a un grupo de trastornos hereditarios donde la fuerza y la masa muscular disminuyen gradualmente. Todas las distrofias musculares estan marcadas por una debilidad muscular que es impulsada por un defecto genetico primario en uno o mas genes especfficos del musculo. Adicionalmente, las distrofias musculares, tfpicamente tienen un componente inflamatorio variable que impulsa la inflamacion muscular y, en ultima instancia, potencia la degeneracion de los tejidos musculares. Por consiguiente, los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activacion y la invasion de celulas inmunitarias en el musculo danado, y para tratar las distrofias musculares. Generalmente se reconocen al menos nueve tipos de distrofias musculares. En algunos aspectos de la presente descripcion, la distrofia muscular se selecciona entre la distrofia muscular de Duchenne, la distrofia muscular de Becker, la distrofia muscular de Emery-Dreifuss, la distrofia muscular de la cintura y los miembros, la distrofia muscular facioescapulohumeral, la distrofia miotonica, la distrofia muscular oculofarfngea, la distrofia muscular distal y la distrofia muscular congenita.
Distrofia muscular de Duchenne (DMD): la DMD afecta a los ninos pequenos y causa una debilidad muscular progresiva, que habitualmente comienza en las piernas. Esta es la forma mas grave de distrofia muscular. La DMD se produce en aproximadamente 1 de cada 3.500 nacimientos masculinos y afecta a aproximadamente 8.000 ninos y hombres jovenes en los Estados Unidos. Una forma mas leve se produce en muy pocas mujeres portadoras. La DMD es causada por mutaciones en el gen que codifica la distrofina, una protefna del subsarcolema que funciona dentro del complejo de glucoprotefnas asociado a la distrofina (DGC) que previene la produccion de protefna funcional. La cantidad de distrofina se correlaciona con la gravedad de la enfermedad (es decir, cuanto menos distrofina este presente, mas grave sera el fenotipo). El complejo DGC conecta el citoesqueleto intracelular a la matriz extracelular. La DGC se concentra en las lfneas Z del sarcomero y confiere la transmision de fuerza a traves de la fibra muscular. La interrupcion de este enlace da como resultado la inestabilidad de la membrana, lo que, en ultima instancia, conduce a rupturas sarcolemicas. El flujo de calcio extracelular altera procesos moleculares como la contraccion muscular y activa la actividad proteolftica. Las fibras musculares afectadas se vuelven necroticas o apoptoticas, y liberan quimioatrayentes mitogenos, que inician procesos inflamatorios. Los ciclos de degeneracion y regeneracion conducen eventualmente a la perdida muscular irreversible y al reemplazo por tejido fibrotico y adiposo.
Un nino con distrofia muscular de Duchenne por lo general comienza a mostrar sfntomas como un nino en edad preescolar. Las piernas resultan afectadas primero, lo que dificulta el caminar y causa problemas de equilibrio. La mayorfa de los pacientes caminan de tres a seis meses despues de lo esperado y tienen dificultades para correr. Las contracturas (endurecimiento muscular permanente) generalmente comienzan a la edad de cinco o seis anos, mas severamente en los musculos de la pantorrilla. Las cafdas frecuentes y los huesos rotos son comunes a partir de esta edad. Subir escaleras y levantarse sin ayuda puede llegar a ser imposible a los nueve o diez anos, y la mayorfa de los ninos usan una silla de ruedas para moverse a los 12 anos. El debilitamiento de los musculos del tronco alrededor de esta edad a menudo causa escoliosis (una curvatura de la columna vertebral de un lado a otro) y cifosis (una curvatura de adelante hacia atras).
Una de las debilidades mas graves de la DMD es la debilidad del diafragma, la lamina de musculos en la parte superior del abdomen que realiza el trabajo principal de respirar y toser. La debilidad del diafragma causa una reduccion de la energfa y la resistencia ffsica, y un aumento de infecciones pulmonares debido a la incapacidad de toser de manera efectiva. Los hombres jovenes con DMD pueden vivir hasta los veinte anos, siempre que cuenten con asistencia de ventilacion mecanica y una buena higiene respiratoria.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, un sujeto que tiene DMD se caracteriza por uno o mas de los siguientes: un signo de Gower positivo, que refleja el deterioro de los musculos de las extremidades inferiores; niveles altos de creatina cinasa (CPK-MM) en la sangre; errores geneticos en el gen Xp21; o niveles reducidos de ausencia de distrofina, por ejemplo, medidos por biopsia muscular.
Los conjugados HRS-Fc se pueden usar en el tratamiento de la DMD, ya sea solos o en combinacion con otras terapias, tales como oligonucleotidos antisentido (por ejemplo, terapias de omision de exon tales como Eteplirsen), corticoides, beta2-agonistas, terapia ffsica, asistencia respiratoria, terapias con celulas madre y terapias de sustitucion genetica. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la administracion de conjugados HRS-Fc conduce a mejoras estadfsticamente significativas en la prueba de marcha de 6 minutos.
Distrofia muscular de Becker (DMB): la DMB afecta a los ninos mayores y a los hombres jovenes, siguiendo un curso mas suave que la DMD. La DMB se produce en aproximadamente 1 de cada 30.000 nacimientos masculinos. La distrofia muscular de Becker es una variante menos grave de la distrofia muscular de Duchenne y es causada por la produccion de una forma truncada, pero parcialmente funcional, de distrofina.
Los sfntomas de la DMB suelen aparecer en la infancia tardfa hasta la edad adulta temprana. Aunque la progresion de los sfntomas puede ser paralela a la de la DMD, los sfntomas generalmente son mas leves y el curso es mas variable. La escoliosis puede producirse, pero generalmente es mas leve y progresa mas lentamente. La enfermedad del musculo cardfaco (cardiomiopatfa) se produce con mas frecuencia en la DMB. Los problemas pueden incluir latidos cardfacos irregulares (arritmias) e insuficiencia cardfaca congestiva. Los sfntomas pueden incluir fatiga, dificultad para respirar, dolor en el pecho y mareos. La debilidad respiratoria tambien se produce, y puede causar necesidad de ventilacion mecanica. Los conjugados HRS-Fc pueden usarse en el tratamiento de la DMB, ya sea solos o en combinacion con otras terapias.
Distrofia muscular de Emery-Dreifuss (DMED): la DMED afecta a los ninos pequenos, causando contracturas y debilidad en las pantorrillas, debilidad en los hombros y la parte superior de los brazos y problemas en la forma en que los impulsos electricos viajan a traves del corazon para hacerlo latir (defectos de la conduccion cardfaca). Hay tres subtipos de distrofia muscular de Emery-Dreifuss, que se distinguen por su patron de herencia: ligada al cromosoma X, autosomica dominante y autosomica recesiva. La forma ligada al cromosoma X es la mas comun. Cada tipo varfa en prevalencia y sfntomas. La enfermedad es causada por mutaciones en el gen LMNA, o mas comunmente, el gen EMD. Ambos genes codifican componentes proteicos de la envoltura nuclear.
La DMED generalmente comienza en la primera infancia, a menudo con contracturas que preceden a la debilidad muscular. La debilidad afecta originalmente al hombro y la parte superior del brazo, junto con los musculos de la pantorrilla, lo que causa una postura del pie cafdo. La mayorfa de los hombres con DMED sobreviven a la mediana edad, aunque un defecto en el ritmo cardfaco (bloqueo cardiaco) puede ser mortal si no se trata con un marcapasos. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar en el tratamiento de la DMED, ya sea solos o en combinacion con otras terapias.
Distrofia muscular de la cintura y los miembros (DMCM): la DMCM comienza en la infancia tardfa hasta la edad adulta temprana y afecta a hombres y mujeres, causando debilidad en los musculos alrededor de las caderas y los hombros. Es la mas variable de las distrofias musculares, y ahora se reconocen varias formas diferentes de la enfermedad. Muchas personas con sospecha de DMCM probablemente hayan sido mal diagnosticadas en el pasado y, por lo tanto, la prevalencia de la enfermedad es dificil de estimar. El numero de personas afectadas en los Estados Unidos puede ser de unos pocos miles.
Aunque hay al menos media docena de genes que causan los diversos tipos de DMCM, habitualmente se reconocen dos formas clfnicas principales de DMCM. Una forma infantil grave es similar en apariencia a la DMD, pero se hereda como un rasgo autosomico recesivo.
La distrofia muscular de la cintura y los miembros de tipo 2B (DMCM2B) es causada por la perdida de mutaciones de la funcion en el gen de la disferlina. La disferlina se expresa principalmente en el musculo esqueletico y cardfaco, pero tambien en monocitos, macrofagos y otros tejidos donde se localiza en vesfculas citoplasmaticas y la membrana celular. La disferlina parece estar implicada en la fusion y el trafico de membranas, asf como en los procesos de reparacion. La DMCM2B es una enfermedad muscular de inicio tardfo (adolescentes/adultos jovenes) que se caracteriza por una progresiva debilidad muscular simetrica y una patologfa inmunitaria/inflamatoria notablemente agresiva. Las biopsias musculares tfpicamente muestran una marcada infiltracion de celulas inflamatorias, que consisten principalmente en macrofagos/marcadores de activacion de macrofagos (HLA-DR, HLA-ABC, CD86), linfocitos T citotoxicos CD8+ y linfocitos T CD4+, junto con la degeneracion/regeneracion de las fibras musculares. Por consiguiente, los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activacion y la invasion de celulas inmunitarias en el musculo danado, y para tratar la distrofia muscular de la cintura y los miembros.
Los sfntomas de DMCM de inicio en adultos generalmente aparecen en los adolescentes o en los veinte anos de una persona, y estan marcados por una debilidad progresiva y la atrofia progresiva de los musculos mas cercanos al tronco. Pueden producirse contracturas, y la capacidad de caminar generalmente se pierde unos 20 anos despues del inicio. Algunas personas con DMCM desarrollan una debilidad respiratoria que requiere el uso de un respirador. La esperanza de vida se puede acortar un poco. (Las formas autosomicas dominantes habitualmente se producen mas tarde en la vida y progresan de manera relativamente lenta).
Distrofia muscular facioescapulohumeral (FEH): la FEH, tambien conocida como enfermedad de Landouzy-Dejerine, comienza en la infancia tardfa hasta la edad adulta temprana y afecta tanto a hombres como a mujeres, causando debilidad en los musculos de la cara, los hombros y la parte superior de los brazos. Las caderas y las piernas tambien pueden verse afectadas. La FEH se produce en aproximadamente 1 de cada 20.000 personas y afecta a aproximadamente 13.000 personas en los Estados Unidos.
La FEH varfa en su gravedad y edad de inicio, incluso entre miembros de la misma familia. Los sfntomas generalmente comienzan en la adolescencia o en los primeros anos de la veintena, aunque es posible un inicio en bebes o ninos. Los sfntomas tienden a ser mas graves en aquellos con un inicio mas temprano. La enfermedad lleva el nombre de las regiones del cuerpo mas afectadas por la enfermedad: los musculos de la cara (facio-), los hombros (escapulo-) y la parte superior de los brazos (humeral). Las caderas y las piernas tambien pueden verse afectadas. Los ninos con FEH a menudo desarrollan sordera parcial o completa.
Se necesitan dos defectos para EFEH, el primero es la eliminacion de las repeticiones de D4Z4 y el segundo es una «ganancia de funcion toxica» del gen DUX4. El primer sfntoma observado es a menudo dificultad para levantar objetos por encima de los hombros. La debilidad puede ser mayor en un lado que en el otro. La debilidad del hombro tambien hace que los omoplatos sobresalgan hacia atras, lo que se denomina aleteo escapular. La EFEH esta asociada con la invasion inflamatoria en grupos musculares especfficos y, por consiguiente, los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activacion y la invasion de celulas inmunitarias de los musculos danados y para tratar la EFEH.
Distrofia miotonica: la distrofia miotonica, tambien conocida como enfermedad de Steinert, afecta tanto a hombres como a mujeres, causando una debilidad generalizada que se observa por primera vez en la cara, los pies y las manos. Se acompana de la incapacidad de relajar los musculos afectados (miotonfa). Los sfntomas pueden comenzar desde el nacimiento hasta la edad adulta. La distrofia muscular miotonica de tipo 1 (DM1) es la forma mas comun de distrofia muscular y afecta a mas de 30.000 personas en los Estados Unidos. Es el resultado de la expansion de una repeticion corta (CTG) en la secuencia de ADN del gen DMG/KG (protefna cinasa de la distrofia miotonica). La distrofia muscular miotonica de tipo 2 (DM2) es mucho mas rara y es el resultado de la expansion de la repeticion CCTG en el gen ZNF9 (protefna de dedo de zinc 9).
Los sfntomas de la distrofia miotonica incluyen debilidad facial y mandfbula floja, parpados cafdos (ptosis) y atrofia muscular progresiva en los antebrazos y las pantorrillas. Una persona con esta distrofia tiene dificultad para relajar su agarre, especialmente si el objeto esta frfo. La distrofia miotonica afecta al musculo cardfaco, causando arritmias y bloqueo cardfaco, y a los musculos del sistema digestivo, lo que causa trastornos de motilidad y estrenimiento. Otros sistemas corporales tambien se ven afectados: la distrofia miotonica puede causar cataratas, degeneracion de la retina, bajo coeficiente intelectual, calvicie frontal, trastornos de la piel, atrofia testicular, apnea del sueno y resistencia a la insulina. Un aumento en la necesidad o el deseo de dormir es comun, al igual que una motivacion disminuida. La discapacidad grave afecta a la mayorfa de las personas con este tipo de distrofia dentro de los 20 anos del inicio, aunque la mayorfa no requiere una silla de ruedas incluso en una edad avanzada. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para tratar la distrofia miotonica, por ejemplo, reduciendo la inflamacion asociada con el tejido muscular, incluyendo el musculo esqueletico (por ejemplo, los musculos del cuadriceps) y/o el tejido cardiaco, entre otros tejidos.
Distrofia muscular oculofarfngea (DMOF): la DMOF afecta a adultos de ambos sexos y causa debilidad en los musculos de los ojos y la garganta. Es mas comun entre las familias francocanadienses en Quebec y en las familias hispanoamericanas en el suroeste de los Estados Unidos.
La DMOF generalmente comienza en los anos treinta o cuarenta de una persona, con debilidad en los musculos que controlan los ojos y la garganta. Los sfntomas incluyen parpados cafdos, dificultad para tragar (disfagia), y la debilidad progresa hacia otros musculos de la cara, el cuello y, ocasionalmente, las extremidades superiores. La dificultad para tragar puede causar aspiracion o la introduccion de alimentos o saliva en las vfas respiratorias. La neumonfa puede seguir. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para tratar la DMOF, por ejemplo, reduciendo la inflamacion asociada con el tejido muscular.
Distrofia muscular distal (DD): la DD comienza en la mediana edad o mas tarde, causando debilidad en los musculos de los pies y las manos. Es mas comun en Suecia y rara en otras partes del mundo. La DD suele comenzar en los anos veinte o treinta, con debilidad en las manos, antebrazos y parte inferior de las piernas. Dificultad con movimientos finos tales como escribir a maquina o abrochar botones pueden ser los primeros sfntomas. Los sfntomas progresan lentamente, y la enfermedad generalmente no afecta a la esperanza de vida. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para tratar la DD, reduciendo la inflamacion asociada con la inflamacion del tejido muscular.
Distrofia muscular congenita (DMC): la DMC esta presente desde el nacimiento, produce una debilidad generalizada y, habitualmente, progresa lentamente. Un subtipo, llamado DMC de Fukuyama, tambien implica retraso mental. Ambos son raros; DMC de Fukuyama es mas comun en Japon.
La DMC esta marcada por una grave debilidad muscular desde el nacimiento, con bebes que muestran «flacidez» y muy poco movimiento voluntario. No obstante, un nino con DMC puede aprender a caminar, con o sin algun dispositivo de asistencia, y vivir hasta la edad adulta temprana o mas alla. En contraste, los ninos con DMC de Fukuyama rara vez pueden caminar y tienen un retraso mental grave. La mayorfa de los ninos con este tipo de DMC mueren en la infancia. Al igual que con las otras distrofias musculares, los conjugados HRS-Fc se pueden usar para tratar la DMC, por ejemplo, reduciendo la inflamacion asociada con la inflamacion del tejido muscular.
Caquexia: la caquexia (o sfndrome de atrofia progresiva) se caracteriza tfpicamente por perdida de peso, atrofia muscular, fatiga, debilidad y perdida significativa de apetito en alguien que no esta intentando activamente perder peso. La definicion formal de caquexia es la perdida de masa corporal que no puede revertirse nutricionalmente. Incluso si el paciente afectado consume mas calorfas, la masa corporal magra se pierde, lo que indica la existencia de una patologfa primaria.
La caquexia es experimentada por pacientes con cancer, SIDA, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, esclerosis multiple, insuficiencia cardfaca congestiva, tuberculosis, polineuropatfa amiloide familiar, envenenamiento por mercurio (acrodinia) y deficiencia hormonal, entre otras enfermedades.
La caquexia tambien puede ser un signo de diversos trastornos subyacentes, tales como cancer, acidosis metabolica (es decir, disminucion de la sfntesis de protefnas y aumento del catabolismo de protefnas), ciertas enfermedades infecciosas (por ejemplo, tuberculosis, SIDA), pancreatitis cronica, trastornos autoinmunitarios o adiccion a las anfetaminas. La caquexia debilita ffsicamente a los pacientes hasta un estado de inmovilidad derivado de la perdida de apetito, astenia y anemia, y la respuesta al tratamiento estandar suele ser deficiente.
Aproximadamente el 50 % de todos los pacientes con cancer padecen caquexia. Aquellos con canceres gastrointestinales y pancreaticos superiores tienen la mayor frecuencia de desarrollo de un sfntoma caquexico. Ademas de aumentar la morbilidad y la mortalidad, agravando los efectos secundarios de la quimioterapia y reduciendo la calidad de vida, la caquexia se considera la causa inmediata de muerte de una gran proporcion de pacientes con cancer, que va del 22 % al 40 % de los pacientes. Los sfntomas de la caquexia cancerosa incluyen la perdida progresiva de peso y el agotamiento de las reservas de tejido adiposo y musculo esqueletico de huesped. Los enfoques de tratamiento tradicionales incluyen el uso de estimulantes del apetito, antagonistas de 5-HT3, suplementos de nutrientes e inhibidores de la COX-2.
Aunque la patogenia de la caquexia se entiende de forma deficiente, se espera que esten implicadas multiples vfas biologicas, incluyendo citocinas proinflamatorias tales como TNF-a, hormonas neuroendocrinas, IGF-1 y factores especfficos de tumores tales como el factor inductor de proteolisis.
Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para tratar la caquexia y cualquiera de sus trastornos o complicaciones relacionadas, subyacentes o secundarias. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar solos o en combinacion con otras terapias, tales como la suplementacion dietetica con una combinacion con alto contenido de protefnas, leucina y aceite de pescado, antioxidantes, progestagenos (acetato de megestrol, acetato de medroxiprogesterona) y anticiclooxigenasa 2, estimulantes del apetito, y antagonistas de 5-HT3, entre otros.
Rabdomiolisis: la rabdomiolisis es la descomposicion de las fibras musculares en el tejido muscular esqueletico. Los productos de descomposicion se liberan al torrente sangufneo, y algunos de estos productos, tales como la mioglobina, son perjudiciales para los rinones y pueden provocar insuficiencia renal.
Los sfntomas incluyen dolor muscular, vomitos, confusion, coma o frecuencia y ritmo cardfacos anormales, y su gravedad generalmente depende de la extension del dano muscular y de si se desarrolla insuficiencia renal. El dano a los rinones puede causar disminucion o ausencia de produccion de orina, generalmente entre 12 y 24 horas despues del dano muscular inicial. La inflamacion del musculo danado puede causar el sfndrome compartimental o la compresion de los tejidos circundantes, tales como los nervios y los vasos sangufneos, en el mismo compartimento fascial, y causar la perdida de sangre y danos en (por ejemplo, perdida de funcion) las partes del cuerpo afectadas. Los sfntomas de esta complicacion incluyen dolor o sensacion reducida en la extremidad afectada. Otras complicaciones incluyen la coagulacion intravascular diseminada (CID), una perturbacion grave en la coagulacion de la sangre que puede causar una hemorragia incontrolable.
El dano muscular inicial puede ser causado, por ejemplo, por factores ffsicos (por ejemplo, lesion por aplastamiento, ejercicio vigoroso), suministro sangufneo alterado (por ejemplo, trombosis arterial, embolia), metabolismo alterado (por ejemplo, estado hiperosmolar hiperglucemico, hiper- e hiponatremia, hipopotasemia, hipocalcemia, hipofosfatemia, cetoacidosis, hipotiroidismo), temperatura corporal alterada (hipertermia, hipotermia), medicamentos y toxinas (por ejemplo, estatinas, medicamentos antipsicoticos, agentes bloqueadores neuromusculares, diureticos, metales pesados, cicuta, venenos de insecto o de serpientes), abuso de drogas (por ejemplo, alcohol, anfetamina, cocafna, herofna, ketamina, LDS, MDMA), infecciones (por ejemplo, virus de Coxsackie, virus de la gripe A, virus de la gripe B, virus de Epstein-Barr, infeccion primaria por VIH, Plasmodium falciparum, virus del herpes, Legionella neumophila, salmonela) y dano muscular autoinmunitario (por ejemplo, polimiositis, dermatomiositis). Ademas, ciertas afecciones hereditarias aumentan el riesgo de rabdomiolisis, incluyendo defectos de glucolisis y glucogenolisis (por ejemplo, enfermedad de McArdle, deficiencia de fosfofructocinasa, enfermedades por almacenamiento de glucogeno VIII, IX, X y XI), defectos del metabolismo de lfpidos (por ejemplo, deficiencia de carnitina palmitoiltransferasa I y II, deficiencia de subtipos de acil CoA deshidrogenasa (por ejemplo, deficiencia de LCAD, SCAD, MCAD, VLCAD, 3-hidroxiacil-coenzima A deshidrogenasa), deficiencia de tiolasa), miopatfas mitocondriales (por ejemplo, deficiencia de succinato dehidrogenasa, citocromo c oxidasa y coenzima Q10) y otros, tales como deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, deficiencia de mioadenilato desaminasa y distrofias musculares.
La rabdomiolisis habitualmente se diagnostica con analisis de sangre y analisis de orina, y puede indicarse por niveles anormalmente elevados o en aumento de creatinina y urea, disminucion de la produccion de orina o decoloracion marron-rojiza de la orina. Los tratamientos primarios incluyen fluidos intravenosos, dialisis y hemofiltracion.
Los conjugados HRS-Fc se pueden usar, por lo tanto, para tratar la rabdomiolisis y cualquiera de sus trastornos o complicaciones relacionadas, secundarias o subyacentes. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar solos o en combinacion con otras terapias, incluyendo aquellas destinadas a tratar el shock y preservar la funcion renal. Las terapias ejemplares incluyen la administracion de fluidos intravenosos, habitualmente solucion salina isotonica (0,9 % en peso por volumen de solucion de cloruro de sodio) y terapias de sustitucion renal (TSR) tales como hemodialisis, hemofiltracion continua y dialisis peritoneal.
Mas generalmente, los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento pueden reducir una respuesta inflamatoria, tal como reduciendo la activacion, diferenciacion, migracion o infiltracion de celulas inmunitarias en tejidos seleccionados, aumentando la produccion de citocinas antiinflamatorias, o reduciendo la produccion o actividad de citocinas proinflamatorias, entre otros mecanismos. Ademas, ciertos de los presentes procedimientos, bloqueando la union, la accion o la produccion de anticuerpos anti-histidil-ARNt sintetasa o linfocitos T autorreactivos, tienen utilidad para tratar una amplia gama de enfermedades y trastornos autoinmunitarios e inflamatorios asociados con anticuerpos anti-histidil-ARNt sintetasa, otros autoanticuerpos, asf como otras causas de insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa.
Formulaciones farmaceuticas, administracion y kits
Las realizaciones de la presente descripcion incluyen composiciones que comprenden polipeptidos conjugados HRS-Fc formulados en soluciones farmaceuticamente aceptables o fisiologicamente aceptables para administracion a una celula, sujeto o animal, ya sea solos o en combinacion con una o mas modalidades de terapia. Tambien se entendera que, si se desea, las composiciones de la presente descripcion pueden administrarse en combinacion con otros agentes tambien, por ejemplo, otras protefnas o polipeptidos o diversos agentes farmaceuticamente activos. Practicamente no hay lfmite a otros componentes que tambien pueden incluirse en las composiciones, siempre que los agentes adicionales no afecten adversamente a los efectos moduladores u otros que se desean conseguir. Para la produccion farmaceutica, las composiciones terapeuticas de conjugado HRS-Fc estaran tfpicamente sustancialmente libres de endotoxinas. Las endotoxinas son toxinas asociadas con ciertas bacterias, tfpicamente bacterias gram negativas, aunque las endotoxinas pueden encontrarse en bacterias gram positivas, tales como Listeria monocytogenes. Las endotoxinas mas prevalentes son los lipopolisacaridos (LPS) o los lipooligosacaridos (LOS) que se encuentran en la membrana externa de diversas bacterias gram negativas, y que representan una caracterfstica patogena crucial en la capacidad de estas bacterias para causar enfermedad. Pequenas cantidades de endotoxinas en los seres humanos pueden producir fiebre, una disminucion de la presion arterial y la activacion de la inflamacion y la coagulacion, entre otros efectos fisiologicos adversos.
Las endotoxinas pueden detectarse usando tecnicas de rutina conocidas en la tecnica. Por ejemplo, el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus, que usa sangre del cangrejo herradura, es un ensayo muy sensible para detectar la presencia de endotoxinas. En esta prueba, niveles muy bajos de LPS pueden causar una coagulacion detectable del lisado del limulus debido a una potente cascada enzimatica que amplifica esta reaccion. Las endotoxinas tambien se pueden cuantificar mediante un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Para estar sustancialmente libre de endotoxinas, los niveles de endotoxinas pueden ser inferiores a aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 UE/mg de protefna. Tfpicamente, 1 ng de lipopolisacarido (LPS) corresponde a aproximadamente 1-10 UE. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, como se indica en el presente documento, las composiciones de conjugado HRS-Fc tienen un contenido de endotoxina de menos de aproximadamente 10 UE/mg de conjugado HRS-Fc, o menos de aproximadamente 5 UE/mg de conjugado HRS-Fc, menos de aproximadamente 3 UE/mg de conjugado HRS-Fc, o menos de aproximadamente 1 UE/mg de conjugado HRS-Fc o menos de aproximadamente 0,1 UE/mg de conjugado HRS-Fc, o menos de aproximadamente 0,01 UE/mg de conjugado HRS-Fc. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, como se ha indicado anteriormente, las composiciones farmaceuticas de conjugado HRS-Fc estan en un 95 % libres de endotoxinas, preferentemente en un 99 % libres de endotoxinas, y mas preferentemente en aproximadamente un 99,99 % libres de endotoxinas basandose en p/p de protefna.
Las composiciones farmaceuticas que comprenden una dosis terapeutica de un polipeptido conjugado HRS-Fc incluyen todos los homologos, ortologos e isoformas naturales de histidil-ARNt sintetasa.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, las composiciones farmaceuticas pueden comprender un tampon de histidina, que puede estar presente en cualquiera de las composiciones farmaceuticas dentro del intervalo de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el tampon de histidina puede estar presente a una concentracion de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 90 mM o aproximadamente 100 mM, incluyendo todos los numeros enteros e intervalos entre dichas concentraciones.
En un aspecto de la presente descripcion, dichas composiciones pueden comprender polipeptidos conjugados HRS-Fc que son sustancialmente monodispersos, lo que significa que las composiciones de conjugado HRS-Fc existen principalmente (es decir, al menos aproximadamente el 90 %, o mas) en una forma de peso molecular aparente cuando se evalua, por ejemplo, mediante cromatograffa de exclusion por tamano, dispersion dinamica de la luz o ultracentrifugacion analftica.
En otro aspecto de la presente descripcion, dichas composiciones tienen una pureza (basandose en protefnas) de al menos aproximadamente el 90 %, o en algunos aspectos de la presente descripcion al menos aproximadamente el 95 % de pureza, o en algunas realizaciones de la presente descripcion, al menos el 98 % de pureza. La pureza puede determinarse mediante cualquier procedimiento analftico de rutina como se conoce en la tecnica.
En otro aspecto de la presente descripcion, dichas composiciones tienen un contenido de agregados de alto peso molecular de menos de aproximadamente el 10 %, en comparacion con la cantidad total de protefna presente, o en algunas realizaciones de la presente descripcion, dichas composiciones tienen un contenido de agregados de alto peso molecular de menos de aproximadamente el 5 %, o en algunos aspectos de la presente descripcion, dichas composiciones tienen un contenido de agregados de alto peso molecular de menos de aproximadamente el 3 %, o en algunas realizaciones de la presente descripcion un contenido de agregados de alto peso molecular de menos de aproximadamente el 1 %. El contenido de agregados de alto peso molecular se puede determinar mediante una variedad de tecnicas analfticas que incluyen, por ejemplo, cromatograffa de exclusion por tamano, dispersion dinamica de la luz o ultracentrifugacion analftica.
Las composiciones farmaceuticas pueden incluir sales farmaceuticamente aceptables de un polipeptido conjugado HRS-Fc. Para una revision de las sales adecuadas, vease Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use de Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, 2002). Las sales basicas adecuadas se forman a partir de bases que forman sales no toxicas. Los ejemplos representativos incluyen las sales de aluminio, arginina, benzatina, calcio, colina, dietilamina, diolamina, glicina, lisina, magnesio, meglumina, olamina, potasio, sodio, trometamina y zinc. Tambien se pueden formar hemisales de acidos y bases, por ejemplo, sales de hemisulfato y hemicalcio. Las composiciones a usar en la presente descripcion adecuadas para administracion parenteral pueden comprender soluciones acuosas y/o suspensiones esteriles de los ingredientes farmaceuticamente activos, que preferentemente se hacen isotonicos con la sangre del receptor, generalmente usando cloruro de sodio, glicerina, glucosa, manitol, sorbitol y similares. Los acidos organicos adecuados para formar sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables incluyen, a modo de ejemplo y no de limitacion, acido acetico, acido trifluoroacetico, acido propionico, acido hexanoico, acido ciclopentanopropionico, acido glicolico, acido oxalico, acido piruvico, acido lactico, acido malonico, acido succfnico, acido malico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido cftrico, acido palmftico, acido benzoico, acido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acidos alquilsulfonicos (por ejemplo, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido 1,2-etano-disulfonico, acido 2-hidroxietanosulfonico), acidos arilsulfonicos (por ejemplo, acido bencenosulfonico, acido 4-clorobencenosulfonico, acido 2-naftalenosulfonico, acido 4-toluenosulfonico, acido alcanforsulfonico), acido 4-metilbiciclo(2.2.2)-octo-2-eno-1-carboxflico, acido glucoheptonico, acido 3-fenilpropionico, acido trimetilacetico, acido butilacetico terciario, acido laurilsulfurico, acido gluconico, acido glutamico, acido hidroxinaftoico, acido salicflico, acido estearico, acido muconico, y similares.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, el portador puede incluir agua. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el portador puede ser una solucion acuosa de solucion salina, por ejemplo, agua que contiene concentraciones fisiologicas de sodio, potasio, calcio, magnesio y cloruro a un pH fisiologico. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el portador puede ser agua y la formulacion puede incluir ademas NaCl. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion puede ser isotonica. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion puede ser hipotonica. En otras realizaciones de la presente descripcion, la formulacion puede ser hipertonica. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion puede ser isoosmotica. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion esta sustancialmente libre de polfmeros (por ejemplo, polfmeros formadores de gel, agentes de aumento de viscosidad polimericos). En algunas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion esta sustancialmente libre de agentes que aumentan la viscosidad (por ejemplo, carboximetilcelulosa, polfmeros polianionicos). En algunas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion esta sustancialmente libre de polfmeros formadores de gel. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la viscosidad de la formulacion es aproximadamente la misma que la viscosidad de una solucion salina que contiene la misma concentracion de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo).
En las composiciones farmaceuticas de la presente descripcion, la formulacion de excipientes farmaceuticamente aceptables y soluciones portadoras es bien conocida por los expertos en la materia, como es el desarrollo de regfmenes de dosificacion y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en diversos regfmenes de tratamiento, que incluyen, por ejemplo, administracion y formulacion oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polipeptido conjugado HRS-Fc tiene una solubilidad que es deseable para el modo particular de administracion, tal como administracion intravenosa. Los ejemplos de solubilidad deseable incluyen al menos aproximadamente 1 mg/ml, al menos aproximadamente 10 mg/ml, al menos aproximadamente 25 mg/ml y al menos aproximadamente 50 mg/ml.
En ciertas aplicaciones, las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento pueden administrarse mediante administracion oral a un sujeto. Por tanto, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un portador comestible, o pueden incluirse en una capsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente al alimento de la dieta.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para el suministro de conjugados de HRS-Fc y los procedimientos para su preparacion seran facilmente evidentes para los expertos en la materia. Dichas composiciones y procedimientos para su preparacion se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a edicion (Mack Publishing Company, 1995).
La administracion de una dosis terapeutica de un conjugado HRS-Fc puede realizarse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en las tecnicas medicas, incluyendo, por ejemplo, administracion oral, intranasal, parenteral que incluye intravftrea, subconjuctival, subcapsular, retrobulbar, supracoroidal intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular, intrasinovial, intraocular, topica y subcutanea. Los dispositivos adecuados para la administracion parenteral incluyen inyectores de aguja (incluyendo microagujas), inyectores sin aguja y tecnicas de infusion.
Las formulaciones parenterales son tfpicamente soluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, carbohidratos y agentes tamponantes (preferentemente a un pH de 3 a 9), pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse mas adecuadamente como una solucion no acuosa esteril o como una forma seca a usar junto con un vehfculo adecuado, tal como agua esteril sin pirogenos. La preparacion de formulaciones parenterales en condiciones esteriles, por ejemplo, mediante liofilizacion, puede conseguirse facilmente usando tecnicas farmaceuticas estandar bien conocidas por los expertos en la materia.
Las formulaciones para administracion parenteral pueden formularse para ser de liberacion inmediata y/o sostenida. Las composiciones de liberacion sostenida incluyen la liberacion retardada, modificada, pulsada, controlada, dirigida y programada. Por lo tanto, un conjugado HRS-Fc se puede formular como una suspension o como un solido, semisolido o lfquido tixotropico para la administracion como un deposito implantado que proporciona una liberacion sostenida de conjugados HRS-Fc. Los ejemplos de dichas formulaciones incluyen, sin limitacion, endoprotesis vasculares recubiertas de farmaco y semisolidos y suspensiones que comprenden vesfculas laminares o micropartfculas cargadas de farmaco de acido poli-(DL-lactico-co-glucolico) (PGLA), poli(DL-lactida-co-glucolido) (PLG) o poli(lactida) (PLA), hidrogeles (Hoffman AS: Ann. NY Acad. Sci. 944: 62-73 (2001)), sistemas de nanopartfculas de poli-aminoacidos, tales como el sistema Medusa desarrollado por Flamel Technologies Inc., sistemas de gel no acuoso, tal como Atrigel, desarrollado por Atrix, Inc., y SABER (acarato de sacarosa, isobutirato de liberacion prolongada), desarrollado por Durect Corporation, y sistemas basados en lfpidos, tales como DepoFoam, desarrollado por SkyePharma.
Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacologicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones tambien pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles lfquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles (patente de Estados Unidos N.° 5.466.468). En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida en la medida en que exista una facil capacidad de inyeccion con jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe conservarse contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol lfquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de la dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de los microorganismos puede facilitarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion debe ser adecuadamente tamponada si es necesario y el diluyente lfquido primero debe hacerse isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. A este respecto, un medio acuoso esteril que puede emplearse sera conocido por los expertos en la materia a la luz de la presente descripcion. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de solucion isotonica de NaCl y anadirse a 1000 ml de lfquido hipodermoclftico o inyectarse en el lugar propuesto para la infusion (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a edicion, pags. 1035-1038 y 1570-1580). Una cierta variacion en la dosificacion ocurrira necesariamente dependiendo de la condicion del sujeto que esta siendo tratado. La persona responsable de la administracion, en cualquier caso, determinara la dosis adecuada para el sujeto individual. Ademas, para la administracion humana, las preparaciones deben cumplir con los estandares de esterilidad, pirogenicidad y seguridad y pureza generales que exigen los estandares de la Oficina de Productos Biologicos de la FDA.
Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con los otros ingredientes enumerados anteriormente, conforme sea necesario, seguido de esterilizacion por filtracion. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehfculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los procedimientos preferidos de preparacion son tecnicas de secado al vacfo y liofilizacion que producen un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion del mismo filtrada previamente esteril.
Las composiciones divulgadas en el presente documento pueden formularse en forma neutra o salina. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protefna) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhfdrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden derivarse de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferricos, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procafna y similares. Tras la formulacion, las soluciones se administraran de una manera compatible con la formulacion de dosificacion y en una cantidad que sea terapeuticamente efectiva. Las formulaciones se administran facilmente en diversas formas de dosificacion tales como soluciones inyectables, capsulas de liberacion de farmaco y similares.
Como se usa en el presente documento, «portador» incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, vehfculos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y de retardo de la absorcion, tampones, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticas activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en la composicion terapeutica. Principio activos suplementarios tambien pueden incorporarse en las composiciones. La frase «farmaceuticamente aceptable» se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion alergica o adversa similar cuando se administran a un ser humano. La preparacion de una composicion acuosa que contiene una protefna como principio activo se entiende bien en la tecnica. Tfpicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones lfquidas o suspensiones; tambien se pueden preparar formas solidas adecuadas para solucion o suspension en lfquido antes de la inyeccion. La preparacion tambien puede emulsionarse.
Los polipeptidos conjugados de HRS-Fc para uso en la presente descripcion tambien pueden administrarse por via topica, (intra)dermica o transdermica a la piel, mucosa o superficie del ojo, ya sea solos o en combinacion con uno o mas antihistamfnicos, uno o mas antibioticos, uno o mas agentes antifungicos, uno o mas bloqueadores beta, uno o mas agentes antiinflamatorios, uno o mas agentes antineoplasicos, uno o mas agentes inmunosupresores, uno o mas agentes antivirales, uno o mas agentes antioxidantes u otros agentes activos. Las formulaciones para administracion topica y ocular pueden formularse para ser de liberacion inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberacion modificada incluyen la liberacion retardada, sostenida, pulsada, controlada, dirigida y programada. Las formulaciones tfpicas para este fin incluyen geles, hidrogeles, lociones, soluciones, colirios, cremas, pomadas, polvos de espolvorear, apositos, espumas, pelfculas, parches cutaneos, obleas, implantes, esponjas, fibras, vendas y microemulsiones. Tambien se pueden usar liposomas. Los portadores tfpicos incluyen alcohol, agua, aceite mineral, vaselina lfquida, vaselina blanca, glicerina, polietilenglicol y propilenglicol. Pueden incorporarse potenciadores de la penetracion, vease, por ejemplo, Finnin y Morgan: J. Pharm. Sci. 88 (10): 955-958, (1999). Otros medios de administracion topica incluyen el suministro por electroporacion, iontoforesis, fonoforesis, sonoforesis e inyeccion con microagujas o sin agujas (por ejemplo, los sistemas comercializados con las marcas comerciales POWDERJECT™, BIOJECT™).
Los ejemplos de antihistamfnicos incluyen, aunque sin limitarse a, loradatina, hidroxizina, difenhidramina, clorfeniramina, bromfeniramina, ciproheptadina, terfenadina, clemastina, triprolidina, carbinoxamina, difenilpiralina, fenindamina, azatadina, tripelenamina, dexclorfeniramina, dexbromfeniramina, metdilazina y trimprazina, doxilamina, feniramina, pirilamina, clorciclizina, tonzilamina, y derivados de las mismas.
Los ejemplos de antibioticos incluyen, aunque sin limitarse a, aminoglucosidos (por ejemplo, amikacina, apramicina, arbekacina, bambermicinas, butirosina, dibekacina, dihidroestreptomicina, fortimicina(s), gentamicina, isepamicina, kanamicina, micronomicina, neomicina, undecilenato de neomicina, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina, espectinomicina, estreptomicina, tobramicina, trospectomicina), anfenicoles (por ejemplo, azidanfenicol, cloranfenicol, florfenicol, tianfenicol), ansamicinas (por ejemplo, rifamida, rifampicina, rifamicina sv, rifapentina, rifaximina), lactamas (por ejemplo, carbacefemos (por ejemplo, loracarbef), carbapenemos (por ejemplo, biapenem, imipenem, meropenem, panipenem), cefalosporinas (por ejemplo, cefaclor, cefadroxil, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefazolina, cefcapeno pivoxil, cefclidina, cefdinir, cefditoren, cefepima, cefetamet, cefixima, cefmenoxima, cefodizima, cefonicid, cefoperazona, ceforanida, cefotaxima, cefotiam, cefozopran, cefpimizol, cefpiramida, cefpiroma, cefpodoxima proxetil, cefprozil, cefroxadina, cefsulodina, ceftazidima, cefteram, ceftezol, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefuroxima, cefuzonam, cefacetrilo sodico, cefalexina, cefaloglicina, cefaloridina, cefalosporina, cefalotina, cefapirina sodica, cefradina, pivcefalexina), cefamicinas (por ejemplo, cefbuperazona, cefmetazol, cefminox, cefotetan, cefoxitina), monobactamas (por ejemplo, aztreonam, carumonam, tigemonam), oxacefemas, flomoxef, moxalactama), penicilinas (por ejemplo, amdinocilina, amdinocilina pivoxil, amoxicilina, ampicilina, apalcilina, aspoxicilina, azidocilina, azlocilina, bacampicilina, acido bencilpenicilfnico, bencilpenicilina sodica, carbenicilina, carindacilina, clometocilina, cloxacilina, ciclacilina, dicloxacilina, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, hetacilina, lenampicilina, metampicilina, meticilina sodica, mezlocilina, nafcilina sodica, oxacilina, penamecilina, yodhidrato de penetamato, penicilina g benetamina, penicilina g benzatina, penicilina g benzhidrilamina, penicilina g calcica, penicilina g hidrabamina, penicilina g potasica, penicilina g procafa, penicilina n, penicilina o, penicilina v, penicilina v benzatina, penicilina v hidrabamina, penimepiciclina, feneticilina potasica, piperacilina, pivampicilina, propicilina, quinacilina, sulbenicilina, sultamicilina, talampicilina, temocilina, ticarcilina), otros (por ejemplo, ritipenem), lincosamidas (por ejemplo, clindamicina, lincomicina), macrolidos (por ejemplo, azitromicina, carbomicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, acistrato de eritromicina, estolato de eritromicina, glucoheptonato de eritromicina, lactobionato de eritromicina, propionato de eritromicina, estearato de eritromicina, josamicina, leucomicinas, midecamicinas, miokamicina, oleandomicina, primicina, rokitamicina, rosaramicina, roxitromicina, espiramicina, troleandomicina), polipeptidos (por ejemplo, anfomicina, bacitracina, capreomicina, colistina, enduracidina, enviomicina, fusafungina, gramicidina s, gramicidina(s), mikamicina, polimixina, pristinamicina, ristocetina, teicoplanina, tiostreptona, tuberactinomicina, tirocidina, tirotricina, vancomicina, viomicina, virginiamicina, bacitracina de zinc), tetraciclinas (por ejemplo, apiciclina, clortetraciclina, clomociclina, demeclociclina, doxiciclina, guameciclina, limeciclina, meclociclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, penimepiciclina, pipaciclina, rolitetraciclina, sanciclina, tetraciclina) y otros (por ejemplo, cicloserina, mupirocina, tuberina). 2.4-diaminopirimidinas (por ejemplo, brodimoprima, tetroxoprima, trimetoprima), nitrofuranos (por ejemplo, furaltadona, cloruro de furazolio, nifuradeno, nifuratel, nifurfolina, nifurpirinol, nifurprazina, nifurtoinol, nitrofurantofna), quinolonas y analogos (por ejemplo, cinoxacina, ciprofloxacina, clinafloxacina, difloxacina, enoxacina, fleroxacina, flumequina, grepafloxacina, lomefloxacina, miloxacina, nadifloxacina, acido nalidfxico, norfloxacina, ofloxacina, acido oxolfnico, pazufloxacina, pefloxacina, acido pipemfdico, acido piromfdico, rosoxacina, rufloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, tosufloxacina, trovafloxacina), sulfonamidas (por ejemplo, acetil sulfametoxipirazina, bencilsulfamida, cloramina-b, cloramina-t, dicloramina t, n2-formilsulfisomidina, mafenida, 4'-(metilsulfamoil)sulfanilanilida, noprilsulfamida, ftalilsulfacetamida, ftalilsulfatiazol, salazosulfadimidina, succinilsulfatiazol, sulfabenzamida, sulfacetamida, sulfaclorpiridazina, sulfacrisoidina, sulfacitina, sulfadiazina, sulfadicramida, sulfadimetoxina, sulfadoxina, sulfaetidol, sulfaguanidina, sulfaguanol, sulfaleno, acido sulfaloxico, sulfamerazina, sulfametro, sulfametazina, sulfametizol, sulfametomidina, sulfametoxazol, sulfametoxipiridazina, sulfametrol, sulfamidocrisoidina, sulfamoxol, sulfanilamida, acido 4-sulfanilamidosalicflico, n4-sulfanililsulfanilamida, sulfanililurea, n-sulfanilil-3,4-xilamida, sulfanitan, sulfaperina, sulfafenazol, sulfaproxilina, sulfapirazina, sulfapiridina, sulfasomizol, sulfasimazina, sulfatiazol, sulfatourea, sulfatolamida, sulfisomidina, sulfisoxazol) sulfonas (por ejemplo, acedapsona, acediasulfona, acetosulfona sodica, dapsona, diatiosulfona, glucosulfona sodica, solasulfona, sucisulfona, acido sulfanflico, psulfanililbencilamina, sulfoxona sodica, tiazolsulfona) y otros (por ejemplo, clofoctol, hexedina, metenamina, anhidrometilencitrato de metenamina, hipurato de metenamina, mandelato de metenamina, sulfosalicilato de metenamina, nitroxolina, taurolidina, xibornol).
Los ejemplos de agentes antifungicos incluyen, aunque sin limitarse a, polienos (por ejemplo, anfotericina b, candicidina, dermostatina, filipina, fungicromina, hachimicina, hamicina, lucensomicina, mepartricina, natamicina, nistatina, pecilocina, perimicina), otros, (por ejemplo, azaserina, griseofulvina, oligomicinas, undecilenato de neomicina, pirrolnitrina, siccanina, tubercidina, viridina), alilaminas (por ejemplo, butenafina, naftifina, terbinafina), imidazoles (por ejemplo, bifonazol, butoconazol, clordantofna, clormidazol, cloconazol, clotrimazol, econazol, enilconazol, fenticonazol, flutrimazol, isoconazol, ketoconazol, lanoconazol, miconazol, omoconazol, nitrato de oxiconazol, sertaconazol, sulconazol, tioconazol), tiocarbamatos (por ejemplo, tolciclato, tolindato, tolnaftato), triazoles (por ejemplo, fluconazol, itraconazol, saperconazol, terconazol) otros (por ejemplo, acrisorcina, amorolfina, bifenamina, bromosaliclorcloranilida, buclosamida, propionato de calcio, clorfenesina, ciclopirox, cloxiquina, coparafinato, diclorhidrato de diamtazol, exalamida, flucitosina, haletazol, hexetidina, loflucarban, nifuratel, yoduro de potasio, acido propionico, piritiona, salicilanilida, propionato de sodio, sulbentina, tenonitrozol, triacetina, ujotion, acido undecilenico, propionato de zinc).
Los ejemplos de bloqueadores beta incluyen, aunque sin limitarse a, acebutolol, atenolol, labetalol, metoprolol, propranolol, timolol y derivados de los mismos.
Los ejemplos de agentes antineoplasicos incluyen, aunque sin limitarse a, antibioticos y analogos (por ejemplo, aclacinomicinas, actinomicina f1 , antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carubicina, carzinofilina, cromicicinas, dactinomicina, daunorubicina, 6-diazo-5 norleucina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, menogarilo, mitomicinas, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, pirarubicina, plicamicina, porfiromicina, puromicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, zinostatina, zorubicina), antimetabolitos (por ejemplo, analogos de acido folico (por ejemplo, denopterina, edatrexato, metotrexato, piritrexima, pteropterina, Tomudex®, trimetrexato), analogos de purina, (por ejemplo, cladribina, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina), analogos de pirimidina (por ejemplo, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, doxifluridina, emitefur, enocitabina, floxuridina, fluorouracilo, gemcitabina, tagafur).
Los ejemplos de agentes antiinflamatorios incluyen, aunque sin limitarse a, agentes antiinflamatorios esteroideos y agentes antiinflamatorios no esteroideos. Los agentes antiinflamatorios esteroideos ejemplares incluyen acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flunisolida, fluocinolona acetonida, fluocinonida, fluocortin butilo, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenolida, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 25-dietilamino-acetato de prednisolona, fosfato sodico de prednisolona, prednisona, prednival, prednilideno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, triamcinolona acetonida, triamcinolona benetonida y triamcinolona hexacetonida.
Los agentes antiinflamatorios no esteroideos ejemplares incluyen derivados del acido aminoarilcarboxflico (por ejemplo, acido enfenamico, etofenamato, acido flufenamico, isonixina, acido meclofenamico, acido mefenamico, acido niflumico, talniflumato, terofenamato, acido tolfenamico), derivados del acido arilacetico (por ejemplo, aceclofecaco, acemetacina, alclofenaco, amfenaco, amtolmetin guacil, bromfenaco, bufexamaco, cinmetacina, clopiraco, diclofenaco de sodio, etodolaco, felbinaco, acido fenclozico, fentiazaco, glucametacina, ibufenaco, indometacina, isofezolaco, isoxepaco, lonazolaco, acido metiazfnico, mofezolaco, oxametacina, pirazolaco, proglumetacina, sulindaco, tiaramida, tolmetina, tropesina, zomepiraco), derivados del acido arilbutfrico (por ejemplo, bumadizona, butibufeno, fenbufeno, xenbucina), acidos arilcarboxflicos (por ejemplo, clidanaco, ketorolaco, tinoridina), derivados del acido arilpropionico (por ejemplo, alminoprofeno, benoxaprofeno, bermoprofeno, acido bucloxico, carprofeno, fenoprofeno, flunoxaprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ibuproxam, indoprofeno, ketoprofeno, loxoprofeno, naproxeno, oxaprozina, piketoprofeno, pirprofeno, pranoprofeno, acido protizfnico, suprofeno, acido tiaprofenico, ximoprofeno, zaltoprofeno), pirazoles (por ejemplo, difenamizol, epirizol), pirazolonas (por ejemplo, apazona, benzpiperilona, feprazona, mofebutazona, morazona, oxifenbutazona, fenilbutazona, pipebuzona, propifenazona, ramifenazona, suxibuzona, tiazolinobutazona), derivados del acido salicflico (por ejemplo, acetaminosalol, aspirina, benorilato, bromosaligenina, acetilsalicilato de calcio, diflunisal, etersalato, fendosal, acido gentfsico, salicilato de glicol, salicilato de imidazol, acetilsalicilato de lisina, mesalamina, salicilato de morfolina, 1-naftil salicilato, olsalazina, parsalmida, acetilsalicilato de fenilo, salicilato de fenilo, salacetamida, salicilamida acido oacetico, acido salicilsulfurico, salsalato, sulfasalazina), tiazincarboxamidas (por ejemplo, ampiroxicam, droxicam, isoxicam, lornoxicam, piroxicam, tenoxicam), acido g-acetamidocaproico, s-adenosilmetionina, acido 3-amino-4-hidroxibutfrico, amixetrina, bendazac, bencidamina, bucoloma, difenpiramida, ditazol, emorfazona, fepradinol, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, oxaceprol, paranilina, perisoxal, proquazona, superoxido dismutasa, tenidap y zileuton.
Los ejemplos de agentes antivirales incluyen interferon gamma, zidovudina, clorhidrato de amantadina, ribavirina, aciclovir, valciclovir, didesoxicitidina, acido fosfonoformico, ganciclovir y derivados de los mismos.
Los ejemplos de agentes antioxidantes incluyen ascorbato, alfa-tocoferol, manitol, glutation reducido, diversos carotenoides, cistefna, acido urico, taurina, tirosina, superoxido dismutasa, lutefna, zeaxantina, criotpxantina, astazantina, licopeno, N-acetil-cistefna, carnosina, gamma-glutamilcistefna, quercitina, lactoferrina, acido dihidrolipoico, citrato, extracto de Ginkgo Biloba, catequinas del te, extracto de arandano, vitaminas E o esteres de vitamina E, palmitato de retinilo y derivados de los mismos. Otros agentes terapeuticos incluyen escualamina, inhibidores de la anhidrasa carbonica, agonistas del receptor adrenergico alfa-2, antiparasitarios, antifungicos y derivados de los mismos.
La dosis exacta de cada componente administrado diferira, por supuesto, dependiendo de los componentes especfficos prescritos, del sujeto que esta siendo tratado, de la gravedad de la enfermedad, por ejemplo, la gravedad de la reaccion inflamatoria, de la forma de administracion y del criterio del medico prescriptor. Por lo tanto, debido a la variabilidad de paciente a paciente, las dosis dadas anteriormente son una gufa y el medico puede ajustar las dosis de los compuestos para conseguir el tratamiento que el medico considere apropiado.
Como entendera el experto en la materia, para formulaciones de conjugados HRS-Fc donde el portador incluye un polfmero formador de gel, en ciertas formulaciones, la inclusion de una o mas sales, en particular solucion salina, esta contraindicada, ya que la inclusion de sal puede causar la solucion a gel antes de la administracion topica, como con ciertos polfmeros formadores de gel in situ (por ejemplo, gel de goma gellan), o la inclusion de sales puede inhibir las propiedades gelificantes del polfmero formador de gel. El experto en la materia podra seleccionar combinaciones apropiadas basandose en las propiedades deseadas de la formulacion y las caracterfsticas de los polfmeros formadores de gel conocidos en la tecnica.
Los expertos en la materia entenderan las soluciones salinas acuosas adecuadas y estas pueden incluir, por ejemplo, soluciones a un pH de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente pH 8,0. En variaciones adicionales de soluciones acuosas (donde el agua esta incluida en el portador), el pH de la formulacion esta entre cualquiera de aproximadamente 6 y aproximadamente 8,0; entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7,5; entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7,0; entre aproximadamente 6,2 y aproximadamente 8; entre aproximadamente 6,2 y aproximadamente 7,5; entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8; entre aproximadamente 6,2 y aproximadamente 7,2; entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0; entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7,5; entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 8,0; entre aproximadamente 6,1 y aproximadamente 7,7; entre aproximadamente 6,2 y aproximadamente 7,6; entre aproximadamente 7,3 y aproximadamente 7,4; aproximadamente 6,0; aproximadamente 7,1; aproximadamente 6,2; aproximadamente 7,3; aproximadamente 6,4; aproximadamente 6,5; aproximadamente 6,6; aproximadamente 6,7; aproximadamente 6,8; aproximadamente 6,9; aproximadamente 7,0; aproximadamente 7,1; aproximadamente 7,2; aproximadamente 7,3; aproximadamente 7,4; aproximadamente 7,5; aproximadamente 7,6; o aproximadamente 8,0. En algunas variaciones, la formulacion de conjugado HRS-Fc tiene un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0. En algunas variaciones, la formulacion tiene un pH de aproximadamente 7,4. En variaciones particulares, la formulacion tiene un pH de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 7,5.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la concentracion de la sal (por ejemplo, NaCl) sera, por ejemplo, de aproximadamente el 0 % a aproximadamente el 0,9 % (p/v). Por ejemplo, la concentracion de sal puede ser de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,02 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 9 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,9 % de aproximadamente el 0,07 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,09 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,9 % de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,3 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,4 % a aproximadamente el 0,9 % de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,6 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,7 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,8 % a aproximadamente el 0,9 %, aproximadamente el 0,9 %, aproximadamente el 0 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,09 %, aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,2 %, aproximadamente el 0,3 %, aproximadamente el 0,4 %, aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 0,6 %, aproximadamente el 0,7 % o aproximadamente el 0,8 %. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la solucion salina acuosa sera isotonica (por ejemplo, una concentracion de NaCl de aproximadamente un 0,9 % de NaCl (p/v)). En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la solucion acuosa contendra una concentracion de NaCl de aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 0,7 %, aproximadamente el 0,8 %, aproximadamente el 0,85, o aproximadamente el 0,75 %. Como se apreciara el experto en la materia, dependiendo de las concentraciones de otros componentes, por ejemplo, cuando los conjugados HRS-Fc estan presentes como sales de, la concentracion de NaCl u otra sal necesaria para conseguir una formulacion adecuada para la administracion puede variar.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, cuando la formulacion esta sustancialmente libre de agentes que aumentan la viscosidad, la formulacion puede estar sustancialmente libre de agentes que aumentan la viscosidad tales como, aunque sin limitarse a, polfmeros polianionicos, derivados de celulosa solubles en agua (por ejemplo, hipromelosa (tambien conocida como HPMC, hidroxipropilmetilcelulosa e hidroxipropilcelulosa), hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, etc.), alcohol polivinflico, polivinilpirrolidona, sulfato de condroitina, acido hialuronico, almidones solubles, etc. En algunas variaciones, la formulacion no incorpora un hidrogel u otro agente de retencion (por ejemplo, tal como los divulgados en la publicacion de patente de Estados Unidos N° 2005/0255144), por ejemplo, donde el hidrogel puede incluir hidrogeles que incorporan homopolfmeros; copolfmeros (por ejemplo, tetrapolfmeros de hidroximetilmetacrilato, etilenglicol, dimetilmetacrilato y acido metacrflico), copolfmeros de trimetilencarbonato y acido poliglicolico, poliglactina 910, gluconato, poli-p-dioxanona, acido poliglicolico, fieltro de acido poliglicolico, poli-4-hidroxibutirato, una combinacion de poli(L-lactida) y poli(L-lactida-coglucolido), metacrilato de glicol, poli-DL-lactida o Primacryl); compuestos de celulosa regenerada oxidada, polipropileno y polidioxanona o un compuesto de polipropileno y poligelcaprona; etc. En algunas variaciones, las formulaciones no incluyen uno o mas de alcohol polivinflico, hidroxipropilmetilcelulosa, emulsion en aceite de ricino de polietilenglicol 400, carboximetilcelulosa sodica, propilenglicol, hidroxipropil guar, carboximetilcelulosa sodica, baselina blanca, aceite mineral, dextrano 70, glicerina, hipromelosa, aceite de linaza, aceites de pescado, acidos grasos omega 3 y omega 6, lutefna o aceite de onagra. En algunas variaciones, las formulaciones no incluyen uno o mas de los portadores descritos en la patente de Estados Unidos N.° 4.888.354, por ejemplo, tal como uno o mas de acido oleico, etanol, isopropanol, monooleato de glicerol, diooleato de glicerol, laurato de metilo, propilenglicol, propanol o dimetilsulfoxido. En algunas variaciones, las formulaciones estan sustancialmente libres de diooleato de glicerol e isopropanol.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, el polfmero formador de gel puede ser, por ejemplo, un polisacarido. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polisacarido es goma gellan. La goma gellan se refiere a un heteropolisacarido elaborado por la bacteria Pseudomonas elodea, aunque el nombre «goma gellan» se usa mas comunmente en este campo. La goma gellan, en particular la formulacion GELRITE® se describe en detalle en la patente de Estados Unidos N.° 4.861.760), en particular en su uso en la formulacion de timolol. GELRITE®, una forma clarificada de goma gellan de baja graduacion de acetilo, esta disponible en el mercado de Merck & Co (Rahway, N.J.) y la goma gellan puede obtenerse comercialmente de, entre otros, CPKelco (Atlanta, Ga.). La preparacion de polisacaridos tales como la goma gellan se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N. ° 4.326.053 y 4.326.052.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el polfmero formador de gel esta presente a una concentracion de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 2 % (p/v). En algunas realizaciones de la presente descripcion, el polfmero formador de gel esta presente a una concentracion de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 1,75 %; de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el O, 03 % a aproximadamente el 1,25 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,8 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,7 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,6 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,5 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 1,75 %; de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 1.25 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,8 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,7 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,6 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,5 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1,75 %; de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1.5 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1,25 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,8 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,7 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,6 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,5 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 1,75 %; de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 1.25 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,8 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,7 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,6 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,5 %, o de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 1.5 %. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la concentracion de polfmero formador de gel es aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,2 %, aproximadamente el 0,4 %, aproximadamente el 0,6 %, aproximadamente el 0,8 %, aproximadamente el 1 %.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, el polfmero formador de gel es goma gellan a una concentracion de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 2 % (p/v), de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 2 % (p/v), de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1 % (p/v), de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 1 % (p/v) o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,6 % (p/v). En algunas realizaciones de la presente descripcion, la concentracion de goma gellan es aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,2 %, aproximadamente el 0,4 %, aproximadamente el 0,6 %, aproximadamente el 0,8 %, aproximadamente el 1 %.
En algunas realizaciones de la presente descripcion de las formulaciones, la formulacion puede incluir componentes adicionales tales como uno o mas conservantes, uno o mas tensioactivos, o uno o mas agentes farmaceuticos. En realizaciones particulares de la presente descripcion, la formulacion puede incluir componentes adicionales tales como uno o mas conservantes, uno o mas tensioactivos, uno o mas agentes de tonicidad, uno o mas agentes tamponantes, uno o mas agentes quelantes, uno o mas agentes que aumentan la viscosidad, una o mas sales, o uno o mas agentes farmaceuticos. En ciertas de estas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion puede incluir (ademas de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo) y un portador): uno o mas conservantes, uno o mas agentes tamponantes (por ejemplo, uno, dos, tres, etc.), uno o mas agentes quelantes, y una o mas sales. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion puede incluir (ademas de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo) y un portador): uno o mas conservantes, uno o mas agentes de tonicidad, uno o mas agentes tamponantes, uno o mas agentes quelantes, y uno o mas agentes que aumentan la viscosidad.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, la viscosidad de la formulacion es aproximadamente la misma que la viscosidad de una solucion salina que contiene la misma concentracion de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo). En algunas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion esta sustancialmente libre de polfmeros formadores de gel. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, cuando el portador es agua, la formulacion puede incluir adicionalmente uno o mas agentes quelantes (por ejemplo, EDTA disodico (EDTA), uno o mas conservantes (por ejemplo, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorhexidina, clorobutanol, metilparabeno, alcohol feniletflico, propilparabeno, timerosal, nitrato fenilmercurico, borato fenilmercurico, acetato fenilmercurico o combinaciones de dos o mas de los anteriores), sal (por ejemplo, NaCl) y uno o mas agentes tamponantes (por ejemplo, uno o mas tampones de fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio dibasico, fosfato de sodio monobasico, combinaciones de los mismos, etc.), tampones de citrato, tampones de maleato, tampones de borato y combinacion de dos o mas de los anteriores).
En realizaciones particulares de la presente descripcion, el agente quelante es EDTA disodico, el conservante es cloruro de benzalconio, la sal es NaCl y los agentes tamponantes son fosfato de sodio dibasico y fosfato de sodio monobasico. En ciertas de estas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion esta sustancialmente libre de polfmero. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion esta sustancialmente libre de uno o mas agentes que aumentan sustancialmente la viscosidad (por ejemplo, carboximetilcelulosa, polfmeros polianionicos, etc.). En algunas realizaciones de la presente descripcion, la viscosidad de la formulacion es aproximadamente la misma que la viscosidad de una solucion salina que contiene la misma concentracion de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo). En algunas de estas realizaciones de la presente descripcion, la concentracion de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo) es de aproximadamente el 0,02 % a aproximadamente el 3 %, de aproximadamente el 0,02 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,02 % a aproximadamente el 1 % (p/v). En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la concentracion de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo) es aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,02 %, aproximadamente el 0,03 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,07 %, aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,3 %, aproximadamente el 0,4 %, aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 0,6 %, aproximadamente el 0,8 % o aproximadamente el 1 % (p/v).
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, donde el vehfculo incluye agua, tambien se puede incluir un agente que aumenta la viscosidad en la formulacion. El experto en la materia estara familiarizado con los agentes que aumentan la viscosidad que son adecuados (por ejemplo, derivados de celulosa solubles en agua (por ejemplo, hipromelosa (tambien conocida como HPMC, hidroxipropilmetilcelulosa e hidroxipropilcelulosa), hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, etc.), alcohol polivinflico, polivinilpirrolidona, sulfato de condroitina, acido hialuronico y almidones solubles. Se pretende que, cuando se usan agentes que aumentan la viscosidad, no se incluyan en concentraciones suficientemente altas, de modo que la formulacion formara un gel antes o despues de la administracion (por ejemplo, donde la concentracion del agente que aumenta la viscosidad no es suficiente para inducir la formacion de gel).
Aunque las concentraciones exactas de los agentes que aumentan la viscosidad dependeran de la seleccion y concentracion de otros componentes en la formulacion, asf como del agente o agentes de que aumentan la viscosidad seleccionados, en general, los agentes que aumentan la viscosidad pueden estar presentes en una concentracion tal que la viscosidad de la solucion resultante es menor de aproximadamente 1000 centipoises. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la viscosidad de la formulacion es menor de aproximadamente 900, menor de aproximadamente 800, menor de aproximadamente 700, menor de aproximadamente 600, menor de aproximadamente 500, menor de aproximadamente 400, menor de aproximadamente 300, menor de aproximadamente 200, menor de aproximadamente 150, menor de aproximadamente 100, menor de aproximadamente 50 centipoises. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la viscosidad de la formulacion es aproximadamente 200, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50 centipoises. En realizaciones particulares de la presente descripcion, la viscosidad es menor de aproximadamente 200 centipoises. En otras, menor de aproximadamente 120 centipoises o menor de aproximadamente 100 centipoises. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la viscosidad es de aproximadamente 100 centipoises. En otras aproximadamente 50 centipoises. En aun otras realizaciones de la presente descripcion, la viscosidad es de aproximadamente 200 centipoises. Los procedimientos para medir la viscosidad son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, como se describe en la Farmacopea de los Estados Unidos 29 (Capftulo 911) Viscosidad, pagina 2785. Como es bien sabido por los expertos en la materia, las formulaciones comunmente consideradas «geles» tendran una viscosidad significativamente mayor de 1000 centipoises, por ejemplo, mayor de aproximadamente 2000 centipoises, mayor de aproximadamente 5000 centipoises.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, incluyendo (aunque sin limitarse a) que el uso de sales esta contraindicado como se ha descrito anteriormente, la formulacion puede incluir ademas uno o mas agentes de tonicidad. Como se usa en el presente documento, la expresion «agente de tonicidad» y sus analogos se refieren a agentes que ajustan la tonicidad de la formulacion, pero no son sales (por ejemplo, no NaCl), que, como apreciara el experto en la materia a la vista de las ensenanzas proporcionadas en el presente documento, estan contraindicados para algunas formulaciones debido a la presencia de ciertos polfmeros formadores de gel o agentes que aumentan la viscosidad. Estos agentes pueden usarse para preparar formulaciones que son isotonicas o casi isotonicas (por ejemplo, algo hiper- o hipoisotonicas, por ejemplo, dentro de aproximadamente ± 20 %, aproximadamente ± 15 %, aproximadamente ± 10 %, aproximadamente ± 5 % de ser isotonicos). El o los agentes de tonicidad tambien se pueden usar en formulaciones donde el uso de sales no esta contraindicado.
Los agentes de tonicidad que se pueden usar para ajustar la tonicidad de la formulacion de las formulaciones descritas en el presente documento y que son conocidos por los expertos en la materia y pueden seleccionarse basandose en las ensenanzas proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, los agentes de tonicidad incluyen polioles (por ejemplo, alcoholes de azucar (por ejemplo, manitol, etc.), alcoholes de trihidroxi (por ejemplo, glicerina, etc.), propilenglicol o polietilenglicol, etc.), o combinaciones de dos o mas polioles. Del mismo modo, la concentracion del o de los agentes de tonicidad dependera de la identidad y las concentraciones de los otros componentes en la formulacion y puede ser determinada facilmente por el experto en la materia en vista de las ensenanzas proporcionadas en el presente documento.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el agente de tonicidad es glicerina o manitol. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el agente de tonicidad es glicerina. En otras realizaciones de la presente descripcion, es manitol. En todavfa otras se puede usar una combinacion de manitol y glicerina. Las concentraciones ejemplares de agentes de tonicidad incluyen, por ejemplo, de aproximadamente el 0,001 a aproximadamente el 3 %. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la concentracion del agente de tonicidad (por ejemplo, manitol o glicerina) es, por ejemplo, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 2,7 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 2,5 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 3 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 2,7 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 2,5 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 3 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 2,7 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 2,5 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,01 % de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 3 %; de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 2,5 %; de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 2 %; de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 1,8 %; de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 1,5 %; o aproximadamente el 0,001 %, aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,08 %, aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,2 %, aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 0,8 %, aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 1,5 %, aproximadamente el 1,8 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 2,2 %, aproximadamente el 2,5 %, aproximadamente el 2,8 % o aproximadamente el 3 % (p/v). En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el agente de tonicidad es manitol. En algunas de estas realizaciones de la presente descripcion, el portador incluye un agente formador de gel (por ejemplo, goma gellan).
En algunas realizaciones de la presente descripcion, el agente de tonicidad es manitol. En ciertas de estas realizaciones de la presente descripcion, el portador incluye un agente que aumenta la viscosidad (por ejemplo, derivados de celulosa solubles en agua (por ejemplo, hipromelosa), alcohol polivinflico, polivinilpirrolidona, sulfato de condroitina, acido hialuronico o almidones solubles).
En algunas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion puede incluir adicionalmente un conservante (por ejemplo, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorhexidina, clorobutanol, metilparabeno, alcohol feniletflico, propilparabeno, timerosal, nitrato fenilmercurico, borato fenilmercurico, o acetato fenilmercurico, peroxidos), o una combinacion de dos o mas de los conservantes anteriores. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el conservante es cloruro de benzalconio.
Como apreciara el experto en la materia, los conservantes pueden estar presentes en concentraciones de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,7 % (p/v). En realizaciones particulares de la presente descripcion, el o los conservantes pueden estar presentes en una concentracion de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,5 % (p/v); de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,05 % (p/v), de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,02 % (p/v), de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,015 % (p/v), de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,005 % (p/v), de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,02 %, de aproximadamente el 0,002 % a aproximadamente el 0,01 %, de aproximadamente el 0,015 % a aproximadamente el 0,05 %, menos de aproximadamente <0,5 %, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,01 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,15 %, de aproximadamente el 0,002 % a aproximadamente el 0,004 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,002 %. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la concentracion del conservante puede ser, por ejemplo, aproximadamente el 0,001 %, aproximadamente el 0,005 %, aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,02 %, aproximadamente el 0,03 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,2 %, aproximadamente el 0,5 %, o aproximadamente el 0,7 % (p/v). Las concentraciones tfpicas (p/v) para diversos conservantes de uso comun se enumeran en la tabla C a continuacion.
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En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion puede incluir adicionalmente un tensioactivo, o combinaciones de dos o mas tensioactivos. En realizaciones particulares de la presente descripcion, la formulacion esta sustancialmente libre de tensioactivo. Tal como se usa en el presente documento, el termino «sustancialmente libre» pretende referirse a niveles de un componente particular que no son detectables usando procedimientos y protocolos de deteccion de rutina conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, HPLC (incluyendo HPLC quiral, HPLC quiral/MS, LC/MS/MS, etc.), cromatograffa en capa fina, espectrometrfa de masas, mediciones polarimetricas, cromatograffa de gases-espectrometrfa de masas, u otros.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, la formulacion puede incluir ademas un agente quelante (por ejemplo, EDTA disodico (EDTA) (por ejemplo, EDTA disodico (dihidrato), etc.) citratos, etc.). En algunas realizaciones de la presente descripcion, puede estar presente una combinacion de agentes quelantes. Como apreciaran los expertos en la materia, los agentes quelantes se pueden usar para impedir la degradacion de los componentes de la formulacion y, por lo tanto, aumentar la vida util de las formulaciones. Como apreciara el experto en la materia, el uso de EDTA en combinacion con una formulacion de goma gellan puede estar contraindicado, ya que el EDTA puede causar la formacion de gel antes de la administracion de la formulacion de goma gellan.
Las concentraciones tfpicas para los agentes quelantes son de aproximadamente el 0,005 % al 0,1 % (p/v). Por ejemplo, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,09 %, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,08 %, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 07 %, de aproximadamente el 0,005 %, a aproximadamente el 0,06 %, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,05 %, de aproximadamente el 0,005 a aproximadamente el 0,04 %, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,03 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,1 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,09 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,08 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,07 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,06 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,05 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,04 %, etc. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la concentracion de uno o mas agentes quelantes es aproximadamente el 0,005 %, aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,02 %, aproximadamente el 0,03 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,06 %, aproximadamente el 0,07 %, aproximadamente el 0,08 %, aproximadamente el 0,09 % o aproximadamente el 0,1 %.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, el agente quelante es EDTA disodico. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el agente quelante es EDTA disodico (dihidrato). En algunas de estas realizaciones de la presente descripcion, el EDTA disodico dihidrato esta presente a una concentracion de aproximadamente el 0,01 % (p/v).
En algunas realizaciones de la presente descripcion, la formulacion puede incluir adicionalmente uno o mas agentes tamponantes (por ejemplo, uno o mas tampones de fosfato (por ejemplo, tampones de fosfato de sodio (por ejemplo, fosfato de sodio dibasico, fosfato de sodio monobasico, etc.), tampones de citrato, tampones de maleato, tampones de borato, etc.) Como apreciara el experto en la materia, el uno o mas agentes tamponantes, deben seleccionarse en combinacion con los otros componentes de una formulacion dada para conseguir un pH adecuado para su uso (por ejemplo, pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 8).
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, el agente tamponante es un tampon fosfato o una combinacion de dos o mas tampones fosfato. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, los agentes tamponantes son fosfato sodico dibasico y fosfato sodico monobasico.
Las concentraciones tfpicas para el agente o agentes tamponantes, por ejemplo, el agente o agentes tamponantes de fosfato pueden ser de aproximadamente 0,005 molar a 0,1 molar. En algunas realizaciones de la presente descripcion, el agente o agentes tamponantes pueden estar a una concentracion de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,08, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,04, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,1, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,08, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,06, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,05, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,04 molar, etc. En realizaciones particulares de la presente descripcion, hay dos agentes tamponantes. Los agentes tamponantes ejemplares incluyen una combinacion de fosfato de sodio dibasico (por ejemplo, fosfato de sodio dibasico, 7 H2O) y fosfato de sodio monobasico (por ejemplo, fosfato de sodio monobasico anhidro). En algunas realizaciones de la presente descripcion, la concentracion del o de los agentes tamponantes es aproximadamente 0,005 molar, aproximadamente 0,01 molar, aproximadamente 0,02 molar, aproximadamente 0,03 molar, aproximadamente 0,04 molar, aproximadamente 0,05 molar, aproximadamente 0,06 molar, aproximadamente 0,07 molar, o aproximadamente 0,1 molar.
Un aspecto adicional de la presente descripcion incluye el uso de las formulaciones como se describe en el presente documento en la fabricacion de un medicamento. Particularmente, la fabricacion de un medicamento para uso en el tratamiento y/o la prevencion de afecciones como se describe en el presente documento. Ademas, las formulaciones, que se describen de manera diversa en el presente documento, tambien estan destinadas para uso en la fabricacion de un medicamento para uso en el tratamiento y/o la prevencion de las afecciones y, de acuerdo con los procedimientos, descritos en el presente documento, a menos que se indique lo contrario.
Los procedimientos de formulacion son bien conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19a Edicion (1995). Las composiciones y agentes proporcionados en el presente documento pueden administrarse de acuerdo con los procedimientos de la presente descripcion en cualquier regimen de dosificacion terapeuticamente efectivo. La cantidad y la frecuencia de dosificacion se seleccionan para crear un nivel efectivo del agente sin efectos perjudiciales. La cantidad efectiva de un compuesto de la presente descripcion dependera de la via de administracion, el tipo de animal de sangre caliente que este siendo tratado y las caracterfsticas ffsicas del animal especffico de sangre caliente en consideracion. Estos factores y su relacion con la determinacion de esta cantidad son bien conocidos por los expertos en medicina. Esta cantidad y el procedimiento de administracion pueden adaptarse para conseguir una eficacia optima, pero dependeran de factores tales como el peso, la dieta, la medicacion concurrente y otros factores que reconoceran los expertos en medicina.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, las composiciones farmaceuticas pueden administrarse mediante pulverizaciones intranasales, inhalacion y/u otros vehfculos de administracion en aerosol. Los procedimientos para administrar genes, polinucleotidos y composiciones peptfdicas directamente a los pulmones a traves de pulverizaciones nasales en aerosol se han descrito, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 5.756.353 y la patente de Estados Unidos N.° 5.804.212. Del mismo modo, la administracion de farmacos que utilizan resinas de micropartfculas intranasales (Takenaga y col., 1998) y compuestos de lisofosfatidilglicerol (patente de Estados Unidos N.° 5.725.871) tambien son bien conocidos en las tecnicas farmaceuticas. Del mismo modo, la administracion de un farmaco transmucoso en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno se describe en la patente de Estados Unidos N.° 5.780.045.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la administracion puede producirse mediante el uso de liposomas, nanocapsulas, micropartfculas, microesferas, partfculas lipfdicas, vesfculas y similares, para la introduccion de las composiciones de la presente descripcion en celulas huesped adecuadas. En particular, las composiciones de la presente descripcion pueden formularse para la administracion encapsulada en una partfcula lipfdica, un liposoma, una vesfcula, una nanoesfera, una nanopartfcula o similares. La formulacion y el uso de dichos vehfculos de administracion pueden llevarse a cabo usando tecnicas conocidas y convencionales.
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, los agentes proporcionados en el presente documento pueden unirse a un sustrato solido farmaceuticamente aceptable, que incluye sustratos biocompatibles y biodegradables tales como polfmeros y matrices. Los ejemplos de dichos sustratos solidos incluyen, sin limitacion, poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinflico)), polilactidas (patente de Estados Unidos N.° 3.773.919), copolfmeros de acido L-glutamico y y-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolfmeros de acido lactico-glicolico degradables tales como poli(acido lactico-co-glicolico) (PLGA) y LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolfmero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolida), acido poli-D-(-)-3-hidroxibutfrico, colageno, metal, hidroxiapatita, Bioglass, aluminato, materiales bioceramicos y protefnas purificadas.
En una realizacion particular de la presente descripcion, el sustrato solido comprende Atrigel™ (QLT, Inc., Vancouver, B.C.). El sistema de administracion de farmacos Atrigel® consiste en polfmeros biodegradables disueltos en portadores biocompatibles. Los productos farmaceuticos pueden mezclarse en este sistema de administracion de lfquidos en el momento de la fabricacion o, dependiendo del producto, el medico puede anadirlos mas tarde en el momento de su uso. Cuando el producto lfquido se inyecta en el espacio subcutaneo a traves de una aguja de pequeno calibre o se coloca en sitios de tejido accesibles a traves de una canula, el agua en los fluidos tisulares hace que el polfmero precipite y atrape el farmaco en un implante solido. El farmaco encapsulado dentro del implante se libera a continuacion de forma controlada a medida que la matriz polimerica se biodegrada con el tiempo.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, la cantidad de una composicion de conjugado HRS-Fc administrada variara generalmente de una dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/kg, y tfpicamente de aproximadamente 0,1 a 10 o 20 mg/kg cuando se administra por via oral, por via subcutanea o por via intravenosa. En realizaciones particulares de la presente descripcion, una dosis es aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 7,5 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, una composicion se administra en una dosis unica de 0,1 a 10 mg/kg o de 0,5 a 5 mg/kg. En algunas realizaciones de la presente descripcion, una composicion se administra en una dosis de 0,1 a 50 mg/kg, 0,5 a 20 mg/kg, o 5 a 20 mg/kg.
Para seres humanos, la dosis diaria usada puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a 5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a 10 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a 20 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a 30 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg a 50 mg/kg, y aproximadamente 50 mg/kg a 100 mg/kg/24 horas.
Para conjugados HRS-Fc con semividas mas largas, la dosificacion humana usada puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg/kg/semana a 0,5 mg/kg/semana, aproximadamente 1 mg/kg/semana a 5 mg/kg/semana, aproximadamente 5 mg/kg/semana a 10 mg/kg/semana, aproximadamente 10 mg/kg/semana a 20 mg/kg/semana, aproximadamente 20 mg/kg/semana a 30 mg/kg/semana, aproximadamente 30 mg/kg/semana a 50 mg/kg/semana, o aproximadamente 50 mg/kg/semana a 100 mg/kg/semana.
Los conjugados HRS-Fc con semividas aun mas largas se pueden dosificar en seres humanos de aproximadamente 0,1 mg/kg/mes a 0,5 mg/kg/mes, aproximadamente 1 mg/kg/mes a 5 mg/kg/mes, aproximadamente 5 mg/kg/mes a 10 mg/kg/mes, aproximadamente 10 mg/kg/mes a 20 mg/kg/mes, aproximadamente 20 mg/kg/mes a 30 mg/kg/mes, aproximadamente 30 mg/kg/mes a 50 mg/kg/mes, o aproximadamente 50 mg/kg/mes a 100 mg/kg/mes.
En diversas realizaciones de la presente descripcion, la dosificacion es de aproximadamente 50-2500 mg por dfa, 100-2500 mg/dfa, 300-1800 mg/dfa, o 500-1800 mg/dfa, o 500-2500 mg por semana, 1000 -2500 mg/semana, 300­ 1800 mg/semana, o 500-1800 mg/semana, o 500-2500 mg por mes, 1000-2500 mg/mes, 300-1800 mg/mes, o 500­ 1800 mg/mes. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la dosis esta entre aproximadamente 100 y 600 mg/dfa, 100 y 600 mg/semana, o 100 y 600 mg/mes. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la dosis esta entre aproximadamente 300 y 1200 mg/dfa, 300 y 1200 mg/semana, o 300 y 1200 mg/mes. En realizaciones particulares de la presente descripcion, la composicion o el agente se administra en una dosificacion de 100 mg/semana, 2,4 mg/semana 300 mg/semana, 600 mg/semana, 1000 mg/semana, 1200 mg/semana o 1800 mg/semana, en una o mas dosis por semana o por mes (es decir, cuando las dosis combinadas consiguen la dosis semanal o mensual deseada). En algunas realizaciones de la presente descripcion, una dosis es 100 mg dos veces al dfa, 150 mg dos veces al dfa, 240 mg dos veces al dfa, 300 mg dos veces al dfa, 500 mg dos veces al dfa o 600 mg dos veces al dfa. En diversas realizaciones de la presente descripcion, la composicion o el agente se administra en dosis unicas o repetidas. La dosificacion inicial y las dosificaciones posteriores pueden ser iguales o diferentes.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, la dosis diaria total puede ser aproximadamente 0,001 mg, aproximadamente 0,005 mg, aproximadamente 0,01 mg, aproximadamente 0,05 mg, aproximadamente 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg o aproximadamente 100 mg/24 horas.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, la dosis semanal total puede ser de aproximadamente 0,001 mg, aproximadamente 0,005 mg, aproximadamente 0,01 mg, aproximadamente 0,05 mg, aproximadamente 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg o aproximadamente 100 mg/ semana.
En algunas realizaciones de la presente descripcion, la dosis mensual total puede ser de aproximadamente 0,001 mg, aproximadamente 0,005 mg, aproximadamente 0,01 mg, aproximadamente 0,05 mg, aproximadamente 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg o aproximadamente 100 mg/mes.
Para administraciones repetidas durante varios dfas o mas, dependiendo de la afeccion, el tratamiento se mantiene hasta que se produzca una supresion deseada de los sfntomas de la enfermedad. El progreso de estas y otras terapias (por ejemplo, terapias ex vivo) puede monitorizarse facilmente mediante procedimientos y ensayos convencionales y basandose en criterios conocidos por el medico u otras personas expertas en la materia.
Se apreciara ademas que, para dispositivos y composiciones de administracion sostenida, la dosis total de HRS contenida en dicho sistema de administracion sera correspondientemente mayor dependiendo del perfil de liberacion del sistema de liberacion sostenida. Por lo tanto, una composicion o dispositivo de liberacion sostenida que esta concebido para administrar conjugados HRS-Fc durante un perfodo de 5 dfas tfpicamente comprendera al menos aproximadamente de 5 a 10 veces la dosis diaria de conjugado HRS-Fc; una composicion o dispositivo de liberacion sostenida que esta concebido para administrar un conjugado HRS-Fc durante un perfodo de 365 dfas tfpicamente comprendera al menos aproximadamente de 400 a 800 veces la dosis diaria del conjugado HRS-Fc (dependiendo de la estabilidad y la biodisponibilidad del conjugado HRS-Fc cuando se administra usando el sistema de liberacion sostenida).
En ciertas realizaciones de la presente descripcion, una composicion o agente se administra por via intravenosa, por ejemplo, por infusion durante un perfodo de tiempo de aproximadamente, por ejemplo, 10 minutos a 90 minutos. En otras realizaciones relacionadas de la presente descripcion, una composicion o agente se administra mediante infusion continua, por ejemplo, a una dosis de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mg/kg/h durante un perfodo de tiempo. Aunque el perfodo de tiempo puede variar, en ciertas realizaciones de la presente descripcion, el perfodo de tiempo puede estar entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 24 horas o entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente tres dfas.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, una cantidad efectiva o una cantidad terapeuticamente efectiva es una cantidad suficiente para mantener una concentracion del conjugado HRS-Fc en el plasma sangufneo de un sujeto por encima de aproximadamente 300 pM, por encima de aproximadamente 1 nM, por encima de aproximadamente 10 nM, por encima de aproximadamente 100 nM, o por encima de aproximadamente 1000 nM. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, una dosificacion IV o SC es una cantidad suficiente para alcanzar una concentracion en plasma sangufneo (Cmax) de entre aproximadamente 1.000 nM y aproximadamente 5.000 nM o entre aproximadamente 200 nM y aproximadamente 1.000 nM, o aproximadamente 20 nM y aproximadamente 200 nM.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, un conjugado HRS-Fc se administra en una cantidad y frecuencia suficientes para conseguir en el mamffero una concentracion en plasma sangufneo que tenga una concentracion minima media de entre aproximadamente 300 pM y aproximadamente 1 nM y/o una concentracion en situacion de equilibrio de entre aproximadamente 300 pM y aproximadamente 1 nM. En algunas realizaciones de la presente descripcion, la Cmin del conjugado HRS-Fc en el plasma sangufneo del mamffero se mantiene por encima de aproximadamente 1 nM y/o una concentracion en situacion de equilibrio de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 10 nM. En ciertas realizaciones de la presente descripcion, la Cmin del conjugado HRS-Fc en el plasma sangufneo del mamffero se mantiene por encima de aproximadamente 10 nM y/o una concentracion en situacion de equilibrio de entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 100 nM. En ciertas realizaciones de la presente description, la Cmin del conjugado HRS-Fc en el plasma sanguineo del mamifero se mantiene por encima de aproximadamente 100 nM y/o una concentration en situation de equilibrio de entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1000 nM.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, una cantidad efectiva del conjugado HRS-Fc, o la concentracion en plasma sangufneo del conjugado HRS-Fc, se alcanza o mantiene, con una administration unica, por ejemplo, durante al menos 15 minutos, al menos 30 minutos, al menos 45 minutos, al menos 60 minutos, al menos 90 minutos, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 3 dias, al menos 4 dias, al menos 5 dfas, al menos 6 dfas, al menos una semana, al menos 2 semanas, al menos un mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, o al menos 6 meses.
En realizaciones particulares de la presente descripcion, la dosificacion eficaz alcanza los niveles en plasma sangufneo o la concentracion minima media de una composition o agente descrito en el presente documento. Estos pueden determinarse facilmente usando procedimientos de rutina.
Las realizaciones de la presente descripcion, en otros aspectos de la presente descripcion, proporcionan kits que comprenden uno o mas recipientes llenos con uno o mas de los conjugados HRS-Fc, polipeptidos, polinucleotidos, anticuerpos, complejos de multiples unidades, composiciones de los mismos, etc., de la presente descripcion, como se describe en el presente documento. Los kits pueden incluir instrucciones escritas sobre como usar dichas composiciones (por ejemplo, para modular la senalizacion celular, la angiogenesis, el cancer, las afecciones inflamatorias, el diagnostico, etc.).
Los kits en el presente documento tambien pueden incluir uno o mas agentes terapeuticos adicionales u otros componentes adecuados o deseados para la indication que esta siendo tratada, o para la aplicacion de diagnostico deseada. Un agente terapeutico adicional puede estar contenido en un segundo recipiente, si se desea. Los ejemplos de agentes terapeuticos adicionales incluyen, aunque sin limitarse a, agentes antineoplasicos, agentes antiinflamatorios, agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes angiogenicos, etc.
Los kits en el presente documento tambien pueden incluir una o mas jeringas u otros componentes necesarios o deseados para facilitar un modo de administracion previsto (por ejemplo, endoprotesis vasculares, depositos implantables, etc.).
Ciertas realizaciones de la presente descripcion se ilustraran a continuation mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos que no estan dentro del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invencion.
EJEMPLOS EJEMPLO 1
PRODUCCION DE SU RESOKINE ETIQUETADA CON HIS (HRS QUE COMPRENDE LOS AMINOACIDOS 1-60) Optimizacion de codones y sfntesis genica. El ADN que codifica Resokine (HRS (1-60)) se sometio a optimization de codones para la expresion de E. coli usando el algoritmo desarrollado por DNA2.0 (Menlo Park, CA). La secuencia de ADN con optimizacion de codones es la siguiente:
AT GGC AGAAC GT GCGGC ATT GGA AGAATT GGTT AAACT GC AAGGT G AAC GT GTT C GT GG TCT GAAGC AGCAGAAGGCTAGCGCGGAGCT GATCGAAGAAGAGGT GGCCAAACT GCT G AAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCC GAAAC ACC ACC AT CACCAT C AC (SEQ ID NO:261)
La secuencia de proteina traducida es la siguiente:
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKH HHHHH (SEQ ID NO:262)
Adicionalmente, se prepararon versiones modificadas por ingenieria de esta construction con residuos de cisteina insertados cerca del extremo N (que comprende residuos adicionales de Met y Cys en el extremo N), el extremo C (que comprende una cisteina C-terminal adicional en la position 61) y en el dominio enlazador que une las 2 secciones alfa helicoidales de la molecula (que comprende la mutation Ala 26^Cys). Las secuencias de ADN con optimization de codones y las secuencias de aminoacidos correspondientes para estas construcciones se enumeran a continuation.
H-N4:1 -H (codon-HRS(1 -60)-M1 MC-6xHis):
ATGTGTGCAGAAAGAGCCGCCCTGGAAGAGTTAGTTAAGTTGCAAGGTGAACGTGTCCG T GGT CT GAAGC AGC AGAAGGCTAGCGCGGAGCT GATCGAAGAAGAGGT GGCCAAACT G CTGAAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAAC CCCGAAACACCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO:263)
La secuencia de proteina traducida es la siguiente:
MCAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPK HHHHHH (SEQ ID NO:264)
H-N4:2-H (codon-HRS(1 -60)-A26C-6xHis):
AT GGC AGAAC GT GCGGC ATT GGA AGAATT GGTT AAACT GC AAGGT G AAC GT GTT C GT GG TCT GAAGC AGCAGAAGT GC AGCGCGGAGCT GATCGAAGAAGAGGT GGCCAAACT GCT G AAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCC GAAAC ACC ACC AT CACCAT C AC (SEQ ID NO:265)
La secuencia de proteina traducida es la siguiente:
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKCSAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKH HHHHH (SEQ ID NO:266)
H-N4:3-H (codon-HRS(1 -60)-C61 -6xHis):
ATGGCAGAACGTGCGGCATTGGAAGAATTGGTTAAACTGCAAGGTGAACGTGTTCGTGG TCT GAAGC AGCAGAAGGCTAGCGCGGAGCT GATCGAAGAAGAGGT GGCCAAACT GCT G AAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCC GAAATGCCACCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO:267)
La secuencia de proteina traducida es la siguiente:
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKC HHHHHH (SEQ ID NO:268)
Los genes correspondientes se sintetizaron (ADN 2.0) con una etiqueta 6xHis C-terminal y se subclonaron en el vector de expresion pJexpress411 donde se uso el promotor T7 para impulsar la transcription y se uso resistencia a kanamicina para la selection de antibioticos.
Cepa de expresion. Las celulas competentes BL21(DE3) (Novagen, n.° de cat. 69450) se transformaron con la construction de expresion con optimization de codones relevante, tal como se describe. En resumen, el plasmido (1 pl) se anadio a 50 pl de las celulas competentes. La reaction se mezclo y se incubo en hielo durante 30 minutos. La reaction se sometio a un choque de calor a 42 °C durante 30 segundos, seguido de un choque de frio sobre hielo durante 2 minutos. A continuation se anadio el medio SOC (500 pl) y el tubo se incubo a 37 °C, 250 rpm durante 1 hora. Finalmente, se extendio una parte alicuota del cultivo (50 pl) sobre la placa de kanamicina (Teknova S9641) y se incubo a 37 °C durante una noche. Se selecciono una sola colonia y se uso para el aumento de escala de la expresion.
Medio. El medio M9YE se preparo mezclando 200 ml de sal minima M9 esteril 5X (BD248510), 778 ml de 30 g/l de extracto de levadura en agua purificada esteril (BD212750), 20 ml de glucosa esterilizada al 20 % (Sigma G7021) y 2 ml de MgSO4 1,0 M esteril (Sigma M7506). La solution de alimentation contiene 5 % de extracto de levadura, 50 % de glucosa, oligoelementos y 2 g/l de sulfato de magnesio. Se anadio sulfato de kanamicina (Invitrogen 15160) a una concentration final de 100 pg/ml tanto en M9YE como en la solution de alimentation.
Fermentacion por lotes alimentados. Se uso un fermentador de 4 l (Sartorius Biostat B plus) con el software MFCS/DA para la fermentacion por lotes alimentados. La agitation se ajusto a 1000 rpm. El valor del pH se controlo automaticamente a 7,0 mediante la adicion de un 30 % de hidroxido de amonio (Sigma 221228) y un 30 % de acido fosforico (Sigma P5811). El aire se proporciono a un caudal de 4 l/min con un compresor de aire de diafragma sin aceite (Cole-Parmer). El aire se hizo pasar a traves de un filtro Midisart 2000 de 0,2 pm (Sartorius 17805). El oxfgeno puro (West Air) se suministro automaticamente para controlar el nivel de oxfgeno disuelto al 70 %. La temperatura se controlo a 30 °C con un circulador Neslab RTE7 (Thermo Scientific). La formacion de espuma se controlo mediante la adicion del antiespumante 204 (Sigma A8311). El volumen inicial de medio M9YE en el fermentador fue 3 l. El fermentador se inoculo con 150 ml del cultivo de siembra que se hizo crecer durante una noche a 30 °C y 250 rpm. Cuando la glucosa se agoto en el recipiente, la solucion de alimentation concentrada se introdujo en el recipiente mediante una bomba peristaltica ajustada a 0,9 ml/min. Cuando la densidad optica de las celulas a 600 nm alcanzo aproximadamente 30, se indujo el cultivo con IPTG 0,5 mM (Fisher Scientific BP1755). El cultivo se realizo durante una noche (aproximadamente 18 horas en fase de lote alimentado) y se recogio mediante centrifugation a 6.000 x g durante 1 hora. El sedimento celular se almaceno a -20 °C hasta la purification. La expresion de Resokine se confirmo en SDS-PAGE.
Purificacion de protefnas. Resokine y las variantes de Cys de la misma se purificaron a partir de pasta celular de E. coli a traves de lisis celular y clarification; cromatograffa por afinidad metalica inmovilizada y cromatograffa de intercambio cationico. Las celulas congeladas que pesaban 10 g y que contenfan Resokine o variantes de Cys se descongelaron y se resuspendieron en tampon NiNTA 1X (Tris 50 mM, NaCl 0,3 M, imidazol 25 mM, pH 8) en una proportion de pasta de 4:1 ml/g junto con beta-mercaptoetanol 5 mM (Sigma n.° de cat. M7154-25ML) y 1 comprimido de coctel inhibidor de proteasa (Roche n.° de cat. 05056489001). Despues de que todas las celulas se resuspendieron, las celulas se lisaron en hielo en un Microfluidizador M-110Y, 2 pases a 15000 psi en hielo para liberar Resokine soluble o variantes de Cys. Se anadio tampon NiNTA despues del segundo pase para limpiar el lisado restante a traves del Microfluidizador (100-120 ml de volumen final despues de la lisis). El lisado se centrifugo a 15000 x g a 4°C durante 30 min. El sobrenadante se filtro a 0,45/0,2 um con un Acropak 200 (Pall n.° de cat.
12094). El sobrenadante filtrado es lisado clarificado.
Purificacion por cromatograffa por afinidad metalica inmovilizada (IMAC). El lisado clarificado de 10 g de pasta celular se cargo en una columna de flujo por gravedad que contenfa 3 ml de resina NiNTA (Qiagen n.° 30210) y se equilibro previamente en tampon NiNTA. La resina se lavo con 50 volumenes de columna (VC) de Triton X-114 al 0,1 % en 1X tampon NiNTA para eliminar la endotoxina, a continuation con 30 VC de 1X tampon NiNTA, seguido de elucion con 5 VC de tampon de elucion NiNTA (Tris 50 mM, NaCl 0,3 M, Imidazol 0,3 M pH 8 @ 4 °C.
Purificacion por cromatograffa de intercambio cationico (CEX). La carga de CEX se preparo diluyendo el eluyente NiNTA 1/20x en el tampon CEX A (fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0, DTT 2 mM), a continuacion se cargo en una columna de alto rendimiento SP Sepharose equilibrada en CEX A. La protefna se eluyo con un gradiente lineal del 0-100 % B sobre 20 VC, donde A = fosfato de sodio 10 mM pH 7,0, DTT 2 mM y B = fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 1 M, DTT 2 mM, pH 7,0, monitorizando la absorbancia a 214 nm. Las fracciones se agruparon correspondientes al pico principal en el gradiente de elucion por absorbancia a 214 nm. El agrupamiento de CEX se intercambio con tampon en PBS 1X pH 7,4 (Gibco n.° 10010) usando dispositivos ultracentrffugos Amicon Ultra-153 kD MWCO.
EJEMPLO 2
PRODUCCION DE HISTIDIL-ARNT SINTETASA DE LONGITUD COMPLETA (HRS) ETIQUETADA CON HIS
Optimizacion de codones y sfntesis genica. El gen HisRS de longitud completa se sometio a optimization de codones para la expresion de E. coli y se subclono en el vector pET21a, donde se uso el promotor T7 para impulsar la transcription. Ademas, se unieron un enlazador de 5 aminoacidos y una etiqueta 6xHis al extremo C.
La secuencia de ADN es la siguiente:
ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGTACGTGG T CTTAAAC AACAAAAAGCCT CT GCGGAATT GATT GAAGAAGAAGTT GCC AAATTACT GA AACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAATTTGTGTTGAAlAACGCCC AAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGCCGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTT ATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGCTGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTG AAAGAG ACT CT GAT GGGC AAAT AT GGT G AAGATT CT A AACT GATTT AT GATTT GAAAGA CCAAGGAGGTGAACTGCTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTT AGCCATGAATAAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGA CAACCCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGTGTGATTTTGATATTGC CGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGTGTTTGAAAATTATGTGTGAAATTCT GAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGCCGTATTCTGGATGG TATGTTTGCTATTTGCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTACAATCTGCTCAAGCGTGGAC AAATT GGATAAAGT GT CTT GGGAAGAAGTAAAAAAT GAAAT GGT GGGAGAAAAAGGCC TGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTGGTGACTATGTTCAACAACATGGCGGTGTGTCCT TAGTCGAACAGTTATTACAGGATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGA CTGGGAGATCTGAAATTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATT AGCTTTGATCTGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCT GTT CT CTT GC AAACCCC AGCCC AGGCGGGCGAAGAGCCTTT GGGAGTCGGCAGT GT GGC AGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTGACCCTAAAGGCCGTAAAGTACC AT GT GT GGGGCTTT CTAT CGGT GT CGAACGTAT CTTTT CTATT GTT GAAC AACGT CTT GAA GCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAacCCAAGTCTTAGTTGCaAGTGCCCAAAAA AAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCAGAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGC CGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAAATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAG CTGGGATCCCACTCGTAGCTATTATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAAC TGCGTTCAGTAACAAGCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAA ATTAAACGCCGCACCGGTCAACCGTTATGTATTTGCGCGGCCGCACTCGAGCACCACCAC CACCACCACTGA (SEQ ID NO:269)
La secuencia de la proteina traducida es la siguiente:
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKG TRDYSPRQMAYREKYFDYIIRCFKRHGAEYIDTPYFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGE LLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDP MIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEE VKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEY LTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMF DPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWD AGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVE EIKRRTGQPLCICAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:270)
Cepa de expresion. Las celulas competentes BL21(DE3) (Novagen, n.° de cat. 69450) se transformaron con la construction de expresion con optimization de codones. En resumen, el plasmido (1 pl) se anadio a 50 pl de las celulas competentes. La reaction se mezclo y se incubo en hielo durante 30 minutos. La reaction se sometio a un choque de calor a 42 °C durante 30 segundos, seguido de un choque de frfo sobre hielo durante 2 minutos. A continuacion se anadio el medio SOC (500 pl) y el tubo se incubo a 37 °C, 250 rpm durante 1 hora. Finalmente, se extendio una parte alfcuota del cultivo (50 pl) sobre la placa de ampicilina (Teknova S9641) y se incubo a 37 °C durante una noche. Se selecciono una sola colonia y se uso para el aumento de escala de la expresion.
Medio. El medio M9YE se preparo mezclando 200 ml de sal minima M9 esteril 5X (BD248510), 778 ml de 30 g/l de extracto de levadura en agua purificada esteril (BD212750), 20 ml de glucosa esterilizada al 20 % (Sigma G7021) y 2 ml de MgSO4 1,0 M esteril (Sigma M7506). La solucion de alimentacion contiene 5 % de extracto de levadura, 50 % de glucosa, oligoelementos y 2 g/l de sulfato de magnesio. Se anadio ampicilina a una concentracion final de 100 pg/ml tanto en M9YE como en la solucion de alimentacion.
Fermentacion por lotes alimentados. Se uso un fermentador de 4 l (Sartorius Biostat B plus) con el software MFCS/DA para la fermentacion por lotes alimentados. La agitacion se ajusto a 1000 rpm. El valor del pH se controlo automaticamente a 7,0 mediante la adicion de un 30 % de hidroxido de amonio (Sigma 221228) y un 30 % de acido fosforico (Sigma P5811). El aire se proporciono a un caudal de 4 l/min con un compresor de aire de diafragma sin aceite (Cole-Parmer). El aire se hizo pasar a traves de un filtro Midisart 2000 de 0,2 pm (Sartorius 17805). El oxigeno puro (West Air) se suministro automaticamente para controlar el nivel de oxigeno disuelto al 70 %. La temperatura se controlo a 30 °C con un circulador Neslab RTE7 (Thermo Scientific). La formacion de espuma se controlo mediante la adicion del antiespumante 204 (Sigma A8311). El volumen inicial de medio M9Ye en el fermentador fue 3 l. El fermentador se inoculo con 150 ml del cultivo de siembra que se hizo crecer durante una noche a 30 °C y 250 rpm. Cuando la glucosa se agoto en el recipiente, la solucion de alimentacion concentrada se introdujo en el recipiente mediante una bomba peristaltica ajustada a 0,9 ml/min. Cuando la densidad optica de las celulas a 600 nm alcanzo aproximadamente 30, se indujo el cultivo con IPTG 0,5 mM (Fisher Scientific BP1755). El cultivo se realizo durante una noche (aproximadamente 18 horas en fase de lote alimentado) y se recogio mediante centrifugacion a 6.000 x g durante 1 hora. El sedimento celular se almaceno a -20 °C hasta la purificacion. La expresion de HisRS se confirmo en SDS-PAGE.
Purificacion de HisRS. La pasta celular congelada (40 g) se resuspendio en 160 ml (es decir, 4 ml/g de pasta celular) de tampon de lisis (Tris 20 mM, NaCl 400 mM, imidazol 20 mM, p-ME 14 mM, pH 8,0 a 4 °C). Se anadieron a la suspension comprimidos completos de inhibidor de proteasa libre de EDTA (Roche) en una proporcion de 1 comprimido/50 ml. La suspension se hizo pasar a traves de un microfluidizador (Microfluidics) dos veces a 15.000 psi con enfriamiento con hielo. El lisado se centrifugo a 35.000 x g durante 45 minutos a 4 °C. El sobrenadante se filtro a traves de filtros de capsula Acropak 200 de 0,22 pm (Pall).
El lisado clarificado se unio a la resina Ni-NTA (Qiagen), se equilibro previamente con tampon de union Ni-NTA (Tris 20 mM, NaCl 400 mM, imidazol 20 mM, p-ME 5 mM, pH 8,0 a 4 °C). La columna se lavo con 500 volumenes de columna de tampon de union Ni-NTA Triton X-114 al 0,1 %, seguido de 50 volumenes de columna del tampon de union Ni-NTA. La proteina unida, HisRS, se eluyo con 5 volumenes de columna de tampon de elucion Ni-NTA (Tris 20 mM, NaCl 400 mM, Imidazol 500 mM, p-ME 5 mM, pH 8,0 a 4 °C).
El eluato de Ni-NTA se purifico adicionalmente mediante una columna de intercambio anionico. Especificamente, el eluato de Ni-NTA se dializo contra el tampon de union Q (Tris 20 mM, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, pH 7,4) y se cargo en una columna de Q-Sepharose de 5 ml, previamente equilibrada con el tampon de union Q. El producto deseado se eluyo de la columna con un gradiente lineal de NaCl 0-1 M en el tampon de union Q en 10 volumenes de columna. La HisRS purificada se concentro y el tampon se intercambio en PBS (producto Invitrogen n.° 10010) DTT 1 mM y se filtro a traves de un filtro esteril de 0,22 pm.
EJEMPLO 3
TITULACION DE SITIOS ACTIVOS DE LOS RESIDUOS DE CISTEINA EN HARS DE LONGITUD COMPLETA
Para determinar la ubicacion e identidad de los residuos de cisteina expuestos en la superficie en HARS de longitud completa, se incubo proteina recombinante purificada con yodoacetamida en condiciones nativas y desnaturalizadas para alquilar cualquier residuo de cisteina expuesta en la superficie. Las muestras se analizaron a continuacion limitando la proteolisis seguida por un analisis por LC-masa para determinar la ubicacion y la identidad de los residuos de cisteina modificados.
Para realizar los estudios de alquilacion, HARS etiquetada con polihistidina de longitud completa (6,65 mg/ml en PBS, glicerol al 10 %, DTT 2 mM, pH 7,4, (ejemplo 2) se redujo completamente por primera vez mediante incubacion con DTT 10 mM durante 45 minutos a temperature ambiente. Las incubaciones con yodoacetamida se llevaron a cabo con una concentracion de yodoacetamida a 30 mM («Baja») o a 100 mM («Alta») durante 30 minutos en la oscuridad, y se llevaron a cabo en muestras nativas y desnaturalizadas de HARS para confirmar que la reaccion fue exitosa. Se preparo HARS desnaturalizada mediante pre-incubacion de la protefna con guanidina 4 M durante 45 minutos a 50 °C. Despues de la incubacion con yodoacetamida, las muestras se dializaron en PBS pH 7,4 a 4 °C usando una membrana de dialisis de valor de corte de peso molecular de 10 KDa, y con al menos 3 intercambios de tampon, y seguidamente se uso para el analisis por espectroscopia de masas como se describe a continuacion.
En resumen, las muestras se prepararon diluyendo las protefnas en acido formico al 0,1 % hasta una concentracion final de 1 m/ml y se inyectaron y analizaron muestras de 5 pg de las protefnas mediante HPLC de fase inversa, seguido de un analisis del espectro de masas usando un espectrometro de masas Agilent TOF. Las muestras se separaron primero en una columna de HPLC C3 (Agilent ZORBAX 300SB-C3, 5 pm, columna de 2,1x150 mm) usando un gradiente lineal de (fase movil B al 2-60 %) durante 18 minutos (fase movil A: acido formico al 0,1 %; fase movil B: acido formico al 0,1 % en acetonitrilo). El analisis por espectrometrfa de masas de las muestras se realizo en modo de perfil. Los datos fueron adquiridos y analizados por MassHunter (Agilent). El peso molecular medido fue calculado por MassHunter Bioconfirm (Agilent).
Los resultados (datos no mostrados) demostraron que, en condiciones nativas, solo se modifican facilmente 3 o 4 residuos de cistefna, mientras que, en comparacion, cuando la protefna se desnaturaliza por primera vez para romper su conformacion nativa, las 10 cistefnas se desnaturalizaron facilmente.
Para identificar la identidad de los residuos de cistefna modificados, las muestras antes y despues de la incubacion con yodoacetamida se sometieron a desnaturalizacion en Guanidina HCl 4 M a 37 °C durante 30 minutos, seguida de escision proteolftica con LysC usando una proporcion de 10:1 (p/p) a temperatura ambiente durante 20 h. Las digestiones de protefnas se analizaron por LC/MS/MS usando HPLC Dionex y el espectrometro de masas Thermo LTQ XL. Las muestras se separaron primero en una columna de HPLC C18 (Agilent ZORBAX 300SB-C18, 5 pm, 2,1x150 mm) usando un gradiente de fase movil B (fase movil A: acido formico al 0,1 %; fase movil B: acido formico al 0,1 % en acetonitrilo). El gradiente comienza con 1-3 % de B en 10 minutos y a continuacion 40 % de B en 76 minutos. Las digestiones de protefnas separadas se analizaron mediante MS completa en modo de perfil o mediante una exploracion de MS completa, se analizaron mediante exploracion de MS/MS en tandem en los tres iones superiores identificados. Los datos fueron adquiridos y analizados por Xcalibur (Thermo). La secuenciacion de peptidos se baso en los espectros de MS/MS de cada peptido, donde los picos de iones b e y coinciden con sus iones teoricos. La identificacion de los peptidos y el mapeo de los sitios de modificacion se basan en el peso molecular y se confirman mediante secuenciacion de peptidos usando espectros de MS/MS, y se enumeran en la tabla E1.
Figure imgf000116_0001
Los resultados revelaron (datos no mostrados) que Cys235, Cys507 y Cys509 se modifican facilmente mediante el tratamiento con yodoacetamida y, por lo tanto, probablemente sean residuos expuestos en la superficie que son facilmente susceptibles de modification quimica.
EJEMPLO 4
CREACION DE POLIPEPTIDOS DE HRS MODIFICADOS CON CONTENIDO DE CISTEINA ALTERADO
Para determinar si alguno de los 10 residuos de cisteina de origen natural en el HRS de longitud completa podria mutarse a residuos de aminoacidos de origen natural alternativos, o eliminarse, se disenaron cebadores para mutar selectivamente cada residuo de cisteina. Para conseguir esto, se pueden usar cebadores basados en lo siguiente (vease la tabla E2).
Figure imgf000116_0002
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Para confirmar los datos de titulacion del sitio activo, se analizo la estructura cristalina de HRS de longitud completa usando el programa Getarea1.1 para evaluar la ubicacion relativa de los 10 residuos de cistema. Los resultados (datos no mostrados) sugieren que ademas de C235, C507 y C509, las cistemas en las posiciones C174, C191 y C224 de la SEQ ID NO:1, estan expuestas al menos parcialmente en la superficie y probablemente podnan modificarse mediante reactivos estandar. Adicionalmente, el analisis de la estructura cristalina de HRS sugiere que C174 y C191 son capaces de formar un enlace disulfuro interno, mientras que C507 y C509 son capaces de formar enlaces disulfuro entre cadenas dentro del dfmero de HRS, ambos contribuyendo potencialmente a la microheterogeneidad que podna eliminarse de manera beneficiosa.
Para evaluar directamente la importancia de los dos residuos de cistema C-terminales para contribuir a la formacion de enlaces disulfuro entre cadenas, se compararon las versiones etiquetadas con His de la longitud completa y las versiones C-terminales eliminadas de HRS (HRS(1-506)) mediante analisis de SDS-PAGE antes y despues de la reduccion. Los resultados, que se muestran en la figura 3, demuestran que la HRS de longitud completa es una mezcla ~50:50 de dfmeros no covalentes y unidos a SS, mientras que HRS(1-506) reduce drasticamente el dfmero unido a SS. La comparacion de las dos protemas por ELISA competitivo, como se describe a continuacion, revelo que ambas protemas teman valores de CI50 comparables con respecto a la union del anticuerpo Jo-1 (datos no mostrados). La formacion de enlaces disulfuro entre cadenas drasticamente reducida asociada con HRS(1-506) sugiere que esta variante es un punto de partida adecuado para el desarrollo de formas mejoradas de productos de nueva generacion.
Para determinar si cualquiera de los cuatro residuos de cistema parcialmente expuestos en la HRS de longitud completa podna mutarse a los residuos de aminoacidos de origen natural alternativos, se disenaron cebadores para mutar selectivamente los residuos C174, C191, C224 y C235. Para conseguir esto, se usaron los siguientes cebadores que se enumeran en la tabla E3:
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Se introdujeron mutaciones por mutagenia usando el kit de mutagenia dirigida QuikChange Lightning (Agilent, n.° cat. 210518) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despues de la mutagenia, las muestras se trataron con enzima Dpn I a 37 °C y se transformaron en celulas competentes de oro XL10 usando procedimientos rutinarios. Se cultivan multiples colonias en caldo Terrific durante una noche a 37 °C y los plasmidos resultantes se purifican con el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen n.° cat. 27106). Los plasmidos se secuencian para confirmar la identidad de la sustitucion de aminoacidos de cada clon. Los clones representativos se transformaron en celulas competentes NovaBlue (Novagen n.° cat. 70181) y se cultivaron en 250 ml de medio M9YE a 37 °C durante una noche. Se realizo una preparacion maxima con el kit HiSpeed Plasmid Maxi (Qiagen n.° cat. 12663) para crear una reserva de plasmidos de mutantes para su posterior analisis. La concentracion y la pureza se determinaron midiendo A260, A280 y A230. Los plasmidos purificados se almacenaron a -20 °C antes de la transfeccion en celulas de E. coli o de mamffero de acuerdo con protocolos estandar.
Para evaluar el impacto de la mutacion de cada residuo, se transformaron clones representativos en celulas de E. coli o de mamffero, y el rendimiento de produccion, el contenido de endotoxinas, la estabilidad y la actividad relativa se midieron en un ensayo ELISA para determinar la union de anticuerpos Jo-1 como se describe mas adelante.
Produccion de protefnas. Se transformaron celulas competentes BL21 (DE3) (Novagen, n.° cat. 69450) o W3110 (ATTC) con la construccion de expresion con optimizaciones de codones que codifican las construcciones de cistefna reducidas tal como se ha descrito anteriormente. El sistema de expresion, los medios de fermentacion, las condiciones de fermentacion y las etapas de purificacion usados para producir protefnas recombinantes fueron esencialmente los mismos que los descritos en el ejemplo 4 mostrado a continuacion, despues de ajustar a la escala de produccion y la cantidad de pasta celular usada. La tabla E4 a continuacion muestra los rendimientos de purificacion y los niveles de endotoxinas para las protefnas preparadas.
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Los resultados muestran que todas las variantes de Cys reducidas estaban relativamente bien expresadas, y se purificaron con exito con bajos niveles de endotoxinas. En particular las variantes de cistefna reducidas basadas en la mutacion de Cys191 y Cys235 mostraron niveles de expresion favorables; aunque todos los clones mostraron niveles de expresion razonables y bajos niveles de endotoxinas.
Para evaluar el impacto de las mutaciones de cistefna en la heterogeneidad de carga de las protefnas purificadas, las muestras de cada clon se analizaron por enfoque isoelectrico. Las muestras (10 pg) se cargaron en un gel de enfoque isoelectrico (pH 3-10) usando un gel IEF de Life Technologies Novex de pH 3-10 de 1,0 mm (n.° cat. P/N EC6645BOX), marcador IEF Novex 3-10 (n.° cat. P/N 391201), kit de tampon IEF Novex pH 3-10 (n.° cat. P/N LC5317), se hicieron pasar con tampon de catodo 1X (camara superior) y tampon de anodo 1X (camara inferior) a 100 V durante 1 hora, 200 V durante 1 hora y 500 V durante 30 minutos. Los geles se fijaron con TCA al 12 % con acido sulfosalicflico al 3,5 % durante 30 minutos y se tineron con Expedeon InstantBlue (n.° cat. P/N ISB1L). Los datos (resultados no mostrados) demuestran que la mutacion de la cistefna en la posicion 174 redujo significativamente la heterogeneidad de punto isoelectrico, consecuente con la posibilidad de que este residuo de cistefna experimente una formacion de enlace de disulfuro intramolecular con cistefna 191.
Para evaluar el impacto de las modificaciones de cistefna en la estabilidad termica, la propension a la agregacion, la estructura y la actividad de ARNt sintetasa de las protefnas resultantes, se evaluaron las protefnas por fluorimetrfa diferencial de barrido, HPLC de exclusion por tamano (SE-HPLC), ELISA competitivo y titulacion de sitios activos. Los resultados se muestran en la tabla E5 mas adelante.
Se realizo fluorimetrfa diferencial de barrido en muestras de protefnas monitorizando la fluorescencia en funcion de la intensidad de fluorescencia de un colorante lipofilo durante desnaturalizacion termica. Los estudios se llevaron a cabo en muestras despues de ser diluidos a 0,5 mg/ml en un volumen final de 100 pl de PBS pH 7,0 (NaCl 150 mM, fosfato 20 mM) y mezclados con una solucion de colorante de desplazamiento termico, que se preparo diluyendo la solucion madre (Applied Biosystems/Life Technologies, P/N 4461146) 20 veces en agua destilada ultrapura (Gibco, P/N 10977). Se anadieron cinco pl del colorante diluido a 100 pl de muestra. La mezcla se sembro en una placa de reaccion optica transparente de 384 pocillos (Applied Biosystems/Life Technologies P/N 4309849) a 20 pl cada pocillo y replicados de 4 pocillos por muestra. La placa se leyo mediante ViiA 7 Real Time PCR Instrument (Applied Biosystems/Life Technologies, P/N 4453552). El protocolo de desnaturalizacion termica comenzo con un cambio de velocidad de 1,6 °C/s, hasta que se alcanzo una temperatura de 25 °C, punto en el cual el instrumento se mantuvo a esta temperatura durante 2 minutos, antes de aumentar adicionalmente la temperatura a 99 °C, a una velocidad de 0,5 °C/s punto en el cual se mantuvo esta temperatura durante 2 minutos mas.
El analisis por HPLC de exclusion por tamano se completo en las muestras de protefna purificada usando TSkgel Super SW3000, DI 4,6 mm x 30 cm, tamano de partfcula 4 pm, columna 250 A (Tosoh, 18675) usando una fase movil de fosfato de Na 200 mM, NaCl 150 mM pH 7,0, a un caudal de 0,3 ml/min, con un sistema HPLC Agilent 1260 equipado con un desgasificador de vacfo, bomba binaria/cuaternaria, muestreador automatico con termostato, compartimento de columna con termostato, detector de matriz de diodos (DAD) y software de cromatograffa Chemstation). Se inyectaron muestras no diluidas (40 pg) de cada protefna despues de una breve centrifugacion. Se uso una muestra de adecuacion del sistema (albumina de suero bovino, BSA, Thermo Scientific, P/N: 23209) y un control interno (HRS de tipo silvestre) para encuadrar las muestras y garantizar la validez de la prueba.
Se realizaron ensayos ELISA competitivos en placas de 96 pocillos (Immulon 4HBX) que se habfan revestido con una solucion de 50 pl de HARS con etiqueta His de longitud completa, ajustada a una concentracion de 2 pg/ml con PBS. Se sellaron las placas y se incubo durante toda la noche a 4 °C. Antes de usar, se lavaron las placas cinco veces con PBST y posteriormente se bloquearon con 100 pl de BSA al 1 % en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Mientras las placas ELISA estaban bloqueadas, se incubaron las moleculas de competencia de cistefna reducida (en un intervalo de concentracion de 1 x 10-6 M a 1 x 10-13 M) con anticuerpos a-Jo-1 (GenWay GWB-FB7A3D o Immunovision HJO-0100) a dilucion 1:10.000 en BSA al 1 % en PBS en una placa de incubacion separada (Costar 3357 de 96 pocillos) durante una hora a 4 °C. Despues de finalizar el bloqueo, se lavaron las placas de ELISA tres veces con PBST y se anadieron 50 pl de solucion que contenfa anticuerpo y competidor a la placa de ELISA y se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Despues de la incubacion de union inicial, se lavaron las placas cinco veces con PBST. A continuacion se anadieron, 50 pl de anticuerpo de deteccion (IgG F(ab')2:HRP antihumana de cabra AbD Serotec 0500-0099) a una dilucion 1:5.000 y se incubo durante una hora a temperatura ambiente. Despues de la incubacion de union secundaria, se lavaron las placas con cinco veces con PBST y se anadieron 50 pl de sustrato TMB (Thermo Scientific Pierce TMB Substrate PI-34021). Las reacciones prosiguieron durante 8 minutos hasta el momento en que se anadieron 50 pl de solucion de detencion de acido sulfurico 2 M. Se realizo cuantificacion colorimetrica con un lector de placas SpectraMax a 450 nM.
Para determinar el numero de sitios activos catalfticos en cada variante de cistefna HARS506 se empleo el ensayo de titulacion de sitios activos (tal como se describe en Fersht y col., (1975) Biochemistry). En resumen, los ensayos se realizaron a temperatura ambiente con HARS 5 pM, MgCl2 10 mM, ATP 50 pM, L-histidina 20 mM, 2 ug/ml de pirofosfatasa inorganica, [y-32P]ATP 1,65 pM en tampon estandar (HEPES 100 mM pH 7,5, KCl 20 mM). Las reacciones se iniciaron con enzima en placas PCR de perfil bajo y se inactivaron los puntos temporales en placas de filtro MultiScreen PVDF de 96 pocillos Millipore que contenfan suspension de HClO4/carbon (suspension 1:4 de HClO4 al 7 %:carbon al 10 %) a 30 s, 1 min, 2 min, 4 min, 6 min y 10 min. Despues de mezcla y pipeteo, se agitaron las muestras en una placa de recogida con centelleo Supermix, y se contaron con un lector de placas Microbetae.
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Los resultados de estos estudios confirman que todos los mutantes de cistefna estan activos, con perdida escasa o nula de actividad, estabilidad o conformacion tal como se mide por titulacion de sitios activos, union ELISA y determinaciones de Tf para desnaturalizacion termica. La titulacion de sitios activos de la actividad de ARNt sintetasa revela que todos los mutantes de cistefna reducida estan activos, y son, de este modo, adecuados para su uso en cualquiera de las composiciones, procedimientos y kits de la presente descripcion. En general, las sustituciones Cys191 mostraron menor termoestabilidad global, mientras que los mutantes Cys174 mostraron una heterogeneidad significativamente menor determinada por enfoque isoelectrico.
EJEMPLO5
CREACION DE POLIPEPTIDOS DE HRS MODIFICADOS (SIN ETIQUETAS) CON TRUNCAMIENTO C-TERMINAL (HisRSN8) o (HRS(1-506)
Para eliminar los ultimos tres aminoacidos y el enlazador entre HisRS de tipo silvestre y la etiqueta His, se disenaron cebadores para uso con el kit de mutagenia dirigida QuikChange Lightning (Agilent, n.° de cat. 210519). Para conseguir esto, se usan los siguientes cebadores como se enumeran en la tabla E6.
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La eliminacion se realizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de mutagenia dirigida QuikChange Lightning. Despues de la mutagenia, la muestra se trato con la enzima Dpn I a 37 °C y se transformo en celulas competentes de oro XL10 usando procedimientos de rutina. Se hicieron crecer multiples colonias en caldo de Luriabertani durante una noche a 37 °C y los plasmidos resultantes se purificaron con el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen n.° de cat. 27106). Los plasmidos se secuenciaron para confirmar la identidad de la sustitucion de aminoacidos de cada clon. Para eliminar la etiqueta His, se disenaron cebadores para usarlos con el kit de mutagenia dirigida QuikChange Lightning (Agilent, n.° de cat. 210519). Para conseguir esto, se usaron los siguientes cebadores como se enumeran en la tabla E7.
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La eliminacion se realizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de mutagenia dirigida QuikChange Lightning, como se ha descrito anteriormente.
Produccion de protefnas. Las celulas competentes BL21(DE3) (Novagen, n.° de cat. 69450) o las celulas W3110 (ATTC) se transformaron con la construccion de expresion con optimizacion de codones que codifica HisRSN8 (HRS(1-506)) como se describe en el ejemplo 2. El sistema de expresion, los medios de fermentacion y las condiciones de fermentacion usadas para producir protefnas recombinantes fueron esencialmente las mismas que las descritas en el ejemplo 2.
Purificacion de HisRSN8 sin etiqueta (HisRS(1-506)). La pasta celular congelada (400 g) se resuspendio en 4 volumenes (1600 ml) de tampon de lisis (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, MgCl2 5 mM, L-cistefna 2 mM, pH 7,4). Se anadieron a la suspension comprimidos completos de inhibidor de proteasa LIBRE de EDTA (Roche, N° de cat. 05 056489001) en una proporcion de 1 comprimido/50 ml. La suspension se hizo pasar a traves de un microfluidizador (Microfluidics) dos veces a 18.000 psi con enfriamiento con hielo. El lisado se centrifugo a 15.000 x g durante 45 minutos a 4 °C. El sobrenadante se filtro a traves de 2-3 capsulas AcroPak 1500 (0,8/0,2 pm, Pall, PN12675).
El lisado clarificado se cargo en una columna Q HP de 382 ml (5 x 19,5 cm) previamente equilibrada con tampon Q A (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4). El producto se eluyo con un gradiente lineal del 0-30 % de Tampon Q B (Tris 50 mM, NaCl 1 M, pH 7,4) en 10 volumenes de columna (VC). Las fracciones se recogieron a 1/2 VC/fraccion y se analizaron mediante SDS-PAGE. La agrupacion se baso en el analisis de gel.
Se anadio una solucion de sulfato de amonio 3,5 M al agrupamiento de Q HP anterior hasta una concentracion final de 1,2 M. La mezcla se filtro a traves de un AcroPak 200 (0,2 um) y se cargo en una columna Phenyl HP de 481 ml (5 x 24,5 cm) previamente equilibrada con Tris 20 mM, sulfato de amonio 1,2 M, pH 7,0. El producto se eluyo con un gradiente lineal de sulfato de amonio 1,2 - 0 M en Tris 20 mM/pH 7,0 a en 10 Vc . Se agruparon las fracciones (^ VC/fraccion) que contenfan el producto basandose en el analisis SDS-PAGE.
El agrupamiento de Phenyl de arriba se concentro a 0,5 l mediante un sistema TFF, que consiste en un soporte de casetes Pellicon Mini (Millipore N° de cat. XX42PMINI), una bomba Masterflex I/P y 2 casetes de 0,1 m2 (30 kD MWCO, Novasep N° de cat. PP030M01L). La solucion concentrada se intercambio a continuacion con tampon con 6 diavolumenes (3 l) de Tampon CHT A (fosfato sodico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0). El material retenido se filtro a traves de un filtro Millex GP-50 de 0,2 pm (Millipore numero de pieza SLGP 05010) antes de continuar con la siguiente etapa.
La solucion anterior se cargo en una columna de 380 ml de hidroxiapatita ceramica (CHT) (5x19,4 cm) previamente equilibrada con Tampon CHT A. La columna se lavo con tampon A y se siguio con un tampon B al 6 % (fosfato de sodio 500 mM, 150 , NaCl mM, pH 7,0). El producto se eluyo con un gradiente lineal del 6-56 % de tampon B en 10 VC. Se agruparon las fracciones ( ^ VC/fraccion) que contenfan el producto basandose en el analisis SDS-PAGE. Usando el mismo sistema de TFF, el agrupamiento de CHT se concentro a ~0,2 l, el tampon se intercambio con 6 diavolumenes del tampon de formulacion actual (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) y se concentro a una concentracion diana de ~10 mg/ml. La solucion del producto se filtro a traves de un filtro Millex GP-50 de 0,2 pm (Millipore numero de pieza SLGP 05010) y se almaceno en un congelador a -80 °C.
EJEMPLO 6
EVALUACION DE RESOKINE (HRS(1-60)) COMO UN AGENTE INFLAMATORIO
Para evaluar la potencial propiedad antiinflamatoria de los polipeptidos derivados de HRS, se probo una variante de splicing natural N-terminal que comprendfa los aminoacidos 1-60 de HRS («Resokine») en un modelo de colitis inducida por TNBS. Los estudios se realizaron en ratones BDF-1 machos, con 12 ratones/grupo; se anadio budesonida a 5 mg/kg por via oral.
En este estudio, se administro Resokine diariamente mediante inyeccion IV, comenzando 3 dfas antes del tratamiento con TNBS, a una concentracion de 1 o 5 mg/kg. Los datos que se muestran en la figura 4 demuestran que el tratamiento con Resokine a cualquiera de las concentraciones dio como resultado un aumento significativo de la supervivencia. Por consiguiente, Resokine parece tener potentes efectos antiinflamatorios, compatibles con la hipotesis de que los polipeptidos de HRS estan implicados en el control local de los procesos inflamatorios.
EJEMPLO 7
EVALUACION DE POLIPEPTIDOS DE HRS PARA EL TRATAMIENTO DE MIOSITIS Y RABDOMIOLISIS INDUCIDAS POR ESTATINAS
Las estatinas son inhibidores de la HMG CoA reductasa que inhiben la sfntesis de mevalonato, la etapa limitante de la velocidad en la sfntesis de colesterol. El tratamiento con estatinas ha demostrado ser beneficioso para reducir los niveles de colesterol en los pacientes. Sin embargo, los efectos secundarios y las complicaciones de la terapia con estatinas incluyen debilidad muscular, miositis y rabdomiolisis. La miopatfa muscular es una complicacion con varias estatinas en el mercado y los pacientes a menudo interrumpen su tratamiento con estatinas si presentan alguno de estos sfntomas. Al igual que muchas otras miopatfas, distrofias musculares y trastornos inflamatorios del musculo, la progresion de la enfermedad en la miopatfa inducida por estatinas parece ocurrir como resultado de una lesion qufmica, genetica o ffsica inicial, que se inflama cada vez mas como resultado de la invasion de celulas inmunitarias en las celulas musculares danado.
Por consiguiente, la miopatfa inducida por estatinas representa un sistema modelo ampliamente aplicable para estudiar la miositis inducida por farmacos, que es directamente aplicable a otras miopatfas y distrofias musculares, todas las cuales comparten un componente inflamatorio comun que media la progresion de la enfermedad promoviendo la invasion de celulas inmunitarias del tejido muscular danado.
El proposito de este estudio fue evaluar la eficacia de HRS(1-506) para revertir los efectos de la miositis muscular inducida por estatinas, como lo indican los niveles de enzimas circulantes alterados, y los cambios en la expresion genica de la funcion muscular y los marcadores inflamatorios en respuesta al tratamiento con HRS(1-506).
Para conseguir esto, las ratas recibieron una dosis diaria de 1 mg/kg de cerivastatina y a continuacion se cambiaron a una dosis cada dos dfas (qod) con cerivastatina. El objetivo de este regimen de dosificacion era mantener un estado de enfermedad sostenido en los animales, pero no tener una enfermedad tan grave como para que la supervivencia de la rata se viera afectada en gran medida. La eficacia de un intervalo de dosis de HRS(1-506) se evaluo a continuacion en ratas despues de que la dosificacion de estatinas ya habfa iniciado cambios medibles en los marcadores de miositis circulantes.
Protocolo y procedimientos. En este estudio, se trataron ratas Sprague-Dawley hembra de 10 semanas de edad con 1 mg/kg de cerivastatina ((Sigma, N° de cat. SML0005) en metilcelulosa al 0,5 %, a partir del dfa 1 mediante sonda oral. Despues de 7 dfas de administracion diaria, las ratas se cambiaron a una estrategia de dosificacion cada dos dfas (qod) en los dfas 9, 11 y 13. La administracion de HRS(1-506) y de vehfculo se iniciaron el dfa 6 mediante inyeccion intravenosa y a las ratas se les administraron dosis diariamente hasta el dfa 14 (se muestra esquematicamente en la figura 5A). Todas las ratas se sometieron a disminucion programada el dfa 15, 24 horas despues de la dosis final del artfculo de prueba y 48 horas despues de la ultima administracion de estatinas. Se administro HRS(1-506) a 3 dosis (0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg) en NaPO420 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,0 diariamente.
Para abordar el objetivo principal de este estudio, se realizaron las siguientes mediciones y criterios de valoracion del estudio: supervivencia de ratas, peso, niveles de CK en suero circulante los dfas 12 y 15, tincion con H&E en muestras de isquiotibiales el dfa 15, ELISA de troponina I, hemograma completo en sangre del dfa 15, qPCR en muestras de isquiotibiales y niveles de HARS endogenos en suero.
Procedimientos de qPCR. Se extirparon los isquiotibiales de raton de los animales y se almacenaron a -80 °C hasta el analisis. El tejido se preparo en grupos de 10 isquiotibiales usando el kit RNeasy Fibrous Tisue Midi de Qiagen (n.° de catalogo 75742). Una vez que el ARN se eluyo de la columna Qiagen, se hizo pasar por un Bioanalyzer 2100 de Agilent para poner a prueba la integridad del ARN y un NanoDrop para determinar la concentracion y pureza del ARN. A continuacion se almaceno el ARN a -80 °C.
La transcripcion inversa (RT) de ARN a ADNc se realizo en un formato de placa de PCR de 96 pocillos en la maquina de PCR Mastercycler de Eppendorf con el siguiente programa: 37 °C durante 60 minutos, 95 °C durante 5 minutos. Los pocillos de borde de la placa de 96 pocillos no se usaron y se llenaron con 50 mcl de agua para evitar la evaporacion de los pocillos internos. Se usaron 20 mcl de ARN y 30 mcl de la mezcla maestra de transcripcion inversa (TaqMan PreAmp Cells to CT Kit de Ambion n.° de catalogo 4387299) por muestra de RT. Una vez que se completo la RT, la siguiente etapa fue amplificar previamente los genes de interes en la muestra de ADNc. Se combinaron cebadores de genes de interes (cebadores DELTAgene disenados por Fluidigm) hasta una concentracion final de 200 nM. Usando estos cebadores, los genes de interes se amplificaron previamente en cada muestra. La preamplificacion se realizo en reacciones de 10 mcl (2,5 mcl de ADNc, 7,5 mcl de mezcla maestra PreAMp) en formato de 384 pocillos usando una maquina de PCR ViiA7 de Applied Biosystems con el siguiente programa: 95 °C durante 10 minutos, 14 ciclos de 95 °C Durante 15 segundos y 60 °C durante 4 minutos. Despues de la etapa de preamplificacion, se anadio exonucleasa (New England BioLabs n.° de catalogo M0293L) para eliminar los cebadores no incorporados de cada muestra. Esta reaccion de exonucleasa tambien se completo en la maquina de PCR ViiA7 con el siguiente programa: 37 °C durante 30 minutos, 80 °C durante 15 minutos. Despues de la exonucleasa, la muestra de RT se diluyo adicionalmente a 1:5 (7 mcl de muestra de exonucleasa 18 mcl de tampon de EDTA bajo).
El chip usado para ejecutar qPCR en el sistema Biomark de Fluidigm fue un 96.96 Dynamic Array IFC para la expresion genica. El chip se cebo primero con el controlador IFC HX de acuerdo con las recomendaciones del fabricante antes de cargar la muestra y los ensayos. Para preparar los ensayos que se cargaran en un chip, se prepararon 4,4 mcl de la mezcla maestra del ensayo (reactivo de carga del ensayo 2X de Fluidigm n.° de catalogo 8500736 y bajo EDTA TE) a 3,6 mcl los cebadores directos e inversos de 20 mcM para cada gen de interes se prepararon en una placa de 96 pocillos. Para preparar muestras, se anadieron 4,5 mcl de mezcla maestra de muestra (Mezcla maestra de expresion de genes TaqMan 2X de Ambion, Reactivo de carga de ADN 20X de Fluidigm, numero de catalogo 100-0388, y 20X EvaGreen de Biotium n.° de catalogo 31000) a 3 mcl de muestra diluida preamplificada/exonucleasa en una placa de 96 pocillos. Una vez que se habfa cebado el chip, se cargaron en el chip 5 mcl de una muestra o ensayo preparado anteriormente. El chip fue devuelto a continuacion al controlador de IFC para que las muestras se carguen en el chip. Una vez que el chip termino de cargarse, la qPCR podia ejecutarse en el Biomark usando un programa preestablecido para 96.96 Dynamic Array para la expresion genica con una curva de fusion para determinar la especificidad del cebador. La expresion genica relativa se determino mediante el procedimiento Ct delta delta.
Cuantificacion de HARS extracelular. Se desarrollo internamente un ELISA basado en 96 pocillos usando 2 anticuerpos monoclonales anti-HARS de raton M03 (Sigma n.° SAB1403905 y Abnova n.° H00003035-M03) y M01 (Abgent n.° AT2317a) en un formato de sandwich para detectar HARS en suero de rata. Los ensayos se realizaron en placas Costar de 96 pocillos (placa Costar de 96 pocillos n.° 3369) usando una curva estandar de siete puntos que se genero en un intervalo de 75 a 0,1 ng/ml usando una solucion madre de HRS(1-506); (7,5 mg/ml en NaPO4 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,0, usando 1x PBST (Tween-20 al 0,05 %) como diluyente). El clon monoclonal de raton M01, clon 1C8 (Abgent n.° AT2317a) se biotinilo internamente y se uso como el anticuerpo de deteccion, y el anticuerpo monoclonal de raton M03 (Sigma n.° SAB1403905, n.° de lote 11238, 0,5 mg/ml y Abnova n.° H00003035-M03, n.° de lote 11238, 0,5 mg/ml) se uso como un anticuerpo de captura. Se uso caseina (Thermo Scientific n.° 37528) como agente de bloqueo, y se uso 1x PBST (Tween-20 al 0,05 %) como tampon de lavado. La union del anticuerpo se cuantifico usando estreptavidina-HRP (Invitrogen n.° de cat 434323, n.° de lote 816755A) usando sustrato TMB (Thermo n.° 34021) y con acido sulfurico 2 M como solucion de detencion.
Los ensayos ELISA se realizaron revistiendo las placas durante una noche con de 0,6 a 2 pg/ml de anticuerpo M03 en 1X PBS, que a continuacion se bloquearon mediante incubacion con caseina durante una hora, y se lavaron 3x con PBST. Las placas se incubaron a continuacion con estandares y muestras durante 1 hora, se lavaron 3 x PBST y a continuacion se incubaron con 500 ng/ml de M01 biotinilado diluido en PBST, 1 hora, se lavaron 3 x PBST, se incubaron con 200 ng/ml de estreptavidina-HRP durante 1 hora, se lavaron 3x con PBST y a continuacion se anadio el sustrato TMB durante 4 minutos. Las reacciones se detuvieron con la solucion de detencion y se leyo la absorbancia a 450 nm.
Los resultados se cuantificaron basandose en la curva estandar basandose en los valores de absorbancia bruta promedio sin sustraccion de fondo. Se uso Prism para el ajuste de curvas estandar. Modelo: ajuste de Log(agonista) frente respuesta [regresion logfstica de 4 parametros] El porcentaje de recuperacion se calculo para cada punto de concentracion individual (no promediado) mediante:
(medido - real) x 1QQ %
(real)
Otras lecturas. Las ratas se pesaron diariamente. Las muestras de suero se tomaron los dfas 1, 8, 12 (a traves de la vena caudal) y el dfa 15 (terminal) para usarse para el analisis de enzimas circulantes (Idexx) y mediciones de la troponina-I del musculo esqueletico, se midieron con un kit comercial de ELISA. El analisis de orina se realizo los dfas 3, 5, 8, 10, 12 y 15 antes de la dosificacion en ese dfa. El analisis de hemograma completo se realizo en sangre aislada el dfa 15 antes de sacrificar las ratas. El dfa 15, las ratas se sacrificaron y se coloco una parte del musculo isquiotibial y el pulmon (no inflado) en NBF al 10 % para la inclusion en parafina y la tincion con H&E de las secciones (Premier Laboratory). Otra parte del musculo isquiotibial y el pulmon se coloco a -80 °C para usar en la extraccion y perfilado de ARN. El hfgado, el rinon y el corazon tambien se aislaron el dfa 15 y se colocaron en zincformalina para inclusion en parafina (TSRI Histology) para el almacenamiento de tejido a largo plazo.
Resultados. Hubo un 100 % de supervivencia en este estudio, y todas las ratas sobrevivieron a la disminucion programada programado el dfa 15. Las ratas con dosis de estatina tenfan pesos promedio mas bajos que las ratas de control que no recibieron estatina. El dfa 15, el grupo de estatinas vehfculo tenia el peso promedio mas bajo de rata de todos los grupos, mientras que el grupo de estatinas 3 mg/kg de HRS(1-506) tenia el promedio de peso mas alto de todos los animales tratados con estatinas (datos no mostrados). El analisis de hemograma completo mostro patrones similares globales de cambios entre diferentes grupos de tratamiento de animales (datos no mostrados).
Se observo un pequeno aumento de la CK serica en ratas tratadas con estatina en comparacion con los controles no tratados los dfas 12 y 15. El dfa 12, las ratas a las que se les administro dosis de 1 mg/kg y 3 mg/kg de HRS(1-506) tuvieron promedios de CK mas pequenos y ajustados en comparacion con los animales tratados con estatina vehfculo (figuras 6A-B), consecuente con un impacto positivo del tratamiento con HRS(1-506) sobre la miositis inducida por estatinas, tambien consecuente con un efecto positivo de HRS(1-506) sobre la funcion muscular, los niveles de troponina C muscular tambien se redujeron en animales tratados con HRS(1-506) (figura 5B). Ademas, los niveles sericos endogenos de HRS se elevaron en las ratas tratadas con estatina en comparacion con las ratas que no recibieron estatina (figura 7), lo que sugiere que la liberacion de HRS puede jugar un papel como regulador endogeno de la inflamacion muscular. La tincion de H&E en los isquiotibiales demostro una reduccion en las puntuaciones de degeneracion/necrosis e inflamacion muscular en ratas tratadas con estatinas a las que se les administro 1 mg/kg y 3 mg/kg de HRS(1-506) en comparacion con ratas a las que se administro vehfculo y 0,3 mg/kg de HRS(1-506) (figura 8).
Para investigar mas a fondo la base mecanica de los efectos de HRS sobre la miopatfa inducida por estatinas, se examinaron los cambios en la expresion genica en los isquiotibiales de los animales tratados despues de la finalizacion del estudio. El perfil de ARN se realizo en los musculos isquiotibiales aislados de las ratas el dfa 15 como se ha descrito anteriormente. Los resultados de estos estudios demostraron que los 13 genes que se elevaron mas de 5 veces en respuesta al tratamiento con estatinas se redujeron con el tratamiento con HRS(1-506) (vease la tabla E8 y las figuras 9-10)
Figure imgf000124_0001
Perfil transcripcional de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina: revelo que 10 genes relacionados con la diabetes/el sfndrome metabolico (figura 11) y varios genes de mantenimiento (datos no mostrados) no se vieron afectados significativamente por el tratamiento con HRS. Por el contrario, el perfil transcripcional de los isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 26 genes marcadores de celulas inmunitarias revelo cambios significativos en un mayor numero de genes (vease las figuras 12-14), incluyendo la inhibicion dependiente de la dosis de ITGAL (CD11a), CD11b, CD8a, CD8b, CD18, CCR5, PTPPC y la expresion (CD45R). Ademas, HRS(1-506) fue eficaz para reducir la expresion de varios genes marcadores inflamatorios, incluidos IL6, MCP1, IL10 e IFN gamma (vease las figuras 15-16). Tambien se observaron cambios transcripcionales en 14 genes relacionados con la adhesion, el desarrollo y la fibrosis (vease las figuras 17-18), el gen de la contractilidad muscular Neb (datos no mostrados) y en genes asociados con atrofia muscular progresiva, atrofia y miogenesis (vease las figuras 19-20).
Conclusiones. Se observo una disminucion de la CK, la troponina I en suero y la degeneracion/necrosis de las celulas musculares y la inflamacion muscular en animales que recibieron dosis mas altas de HRS(1-506), ya sea a 1,0 mg/kg o 3,0 mg/kg en contraste con los animales que recibieron, bien vehfculo o bien dosis bajas de 0,3 mg/kg de HRS(1-506). Los datos de perfiles de ARN respaldaron estos resultados al demostrar la expresion reducida de CD8a, IL-6, MCP-1 y MMP-9 en los isquiotibiales de ratas tratadas con estatina que recibieron dosis mas altas de HRS(1-506). La regulacion positiva de estos genes es mas probable debido al aumento del infiltrado de celulas inmunitarias en el tejido muscular danado. Basandose en la identidad de los genes expresados, es probable que las celulas inmunitarias infiltrantes esten formadas por uno o mas de los siguientes tipos de celulas, linfocitos T, celulas dendrfticas, linfocitos NK y macrofagos/monocitos. Todos estos tipos de celulas se han asociado con la inflamacion muscular, y la capacidad de los polipeptidos de HRS, incluyendo HRS(1-506) para mediar una inhibicion drastica de esta afluencia de celulas inmunitarias, sugiere que los polipeptidos de HRS tales como HRS(1-506) representan inmunorreguladores potentes, que son capaces de actuar como inmunomoduladores potentes en una amplia gama de enfermedades y trastornos inflamatorios y autoinmunitarios.
EJEMPLO 8
PREPARACION DE POLIPEPTIDOS HRS-FC
Se prepararon, purificaron y analizaron las protefnas de fusion N-terminal y C-terminal Fc-histidil-ARNt sintetasa (HRS-Fc) de la siguiente manera.
Construccion de plasmidos. El dominio Fc de la IgG1 humana se amplifico mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) antes de insertarse en el extremo C o en el extremo N del polipeptido de HRS, HRS(1-60), mediante reacciones de PCR secuenciales usando los cebadores a continuacion y los fragmentos de ADN amplificados resultantes insertados en el extremo C o en el extremo N de HRS(1-60) ubicado en el vector de expresion pET28 (Novagen 69864). Se apreciara que la creacion de la protefna de fusion Fc N-terminal da como resultado la eliminacion/sustitucion de la metionina N-terminal en HRS(1-60) con el aminoacido C-terminal del dominio Fc, y viceversa, donde sea apropiado.
Se usaron los siguientes cebadores para crear la protefna de fusion Fc HRS(1-60) fusionada en el extremo N (Fc-HRS(2-60)) (tabla E9):
Figure imgf000125_0001
Se usaron los siguientes cebadores para crear la protefna de fusion HRS (1-60) Fc fusionada en el extremo C (HRS(1-60)-Fc) (tabla E10).
Figure imgf000125_0002
Figure imgf000126_0002
Las reacciones de PCR se realizaron usando los parametros de ciclos termicos recomendados, y los fragmentos amplificados por PCR se verificaron mediante electroforesis en gel. Las secuencias se confirmaron realizando alineamientos con las secuencias teoricas usando los algoritmos de alineamiento por pares EMBOSS. Las secuencias de ADN y protefnas clonadas de Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc se muestran a continuation.
Secuencia de ADN de Fc-HRS(2-60) (fusion de Fc N-terminal):
Figure imgf000126_0001
Figure imgf000127_0001
(SEQ ID NO:338)
Se prepararon construcciones de ADN adicionales de Fc-histidil ARNt sintetasa (HRS-Fc) N-terminal y C-terminal de la siguiente manera.
Construccion de plasmidos. HRS(2-60) con una Fc N-terminal o HRS (1-60) con una Fc C-terminal (ejemplo 8) se subclonaron en un vector pET24b modificado (EMD, Gibbstown, NJ) que contenfa un promotor TAC en lugar de T7 («pET24b_TAC»). Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc se amplificaron mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores a continuacion que contienen un sitio Ndel 5' y un sitio Xhol 3', y el ADN amplificado resultante se subclono en pET24b_TAC usando los sitios de restriction de Ndel y Xhol.
Se usaron l i i n r r m lifi r F-HR 2- f in F N- rminl l E11: ^
Figure imgf000127_0002
Figure imgf000128_0002
Se usaron los sig in r r m lifi r HR 1- -F f in F - rminl l E12).
Figure imgf000128_0003
Las reacciones de PCR se realizaron usando los parametros de ciclos termicos recomendados y los fragmentos amplificados por PCR se verificaron mediante electroforesis en gel. Las secuencias se confirmaron realizando alineamientos con las secuencias teoricas usando DNASTAR Lasergene SeqMan Pro. Las secuencias de ADN y protefnas clonadas de Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc se muestran a continuation.
Secuencia de ADN de Fc-HRS(2-60) (fusion de Fc N-terminal):
Figure imgf000128_0001
Figure imgf000129_0001
Se prepararon construcciones de ADN adicionales de Fc-histidil ARNt sintetasa (HRS-Fc) N-terminal y C-terminal como se indica a continuacion.
Construccion de plasmidos. HRS (2-40), (2-45), (2-50), (2-55), (2-66) con una Fc N-terminal o HRS (1-40), (1-45), (1-50), (1-55), (1-66) con una Fc C-terminal se generaron usando Quikchange Mutagenesis (Agilent, Santa Clara, CA). Las construcciones pET24b_TAC generadas anteriormente que contenfan Fc-HRS (2-60) y HRS (1-60)-Fc en combination con los cebadores enumerados a continuacion, se usaron en la reaction de Quikchange para generar las construcciones de HRS-Fc.
Se usaron los siguientes cebadores para amplificar los polipeptidos Fc-HRS (2-40), (2-45), (2-50), (2-55), (2-66) (fusion de Fc N-terminal) (tabla E13):
Figure imgf000129_0002
Figure imgf000130_0001
Se usaron los siguientes cebadores para amplificar HRS (1-40), (1-45), (1-50), (1-55), (1-66)-Fc (fusion de Fc C-terminal): (tabla E14).
Figure imgf000130_0002
Las reacciones de PCR se realizaron usando los parametros de ciclos termicos recomendados por el fabricante. Las secuencias se confirmaron realizando alineamientos con las secuencias teoricas usando DNASTAR Lasergene SeqMan Pro. Las secuencias de ADN y protefnas clonadas de las construcciones de HRS-Fc se muestran a continuation.
Secuencia de ADN de Fc-HRS (2-40) (fusion de Fc N-terminal):
Figure imgf000131_0001
Figure imgf000132_0001
5
Figure imgf000133_0001
Figure imgf000134_0001
5
Figure imgf000135_0001
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Figure imgf000137_0001
La construction de ADN de fusion en tandem Fc-histidil ARNt sintetasa (HRS-Fc) N-terminal se preparo de la siguiente manera.
Construccion de plasmidos. HRS (2-60)_HRS (2-60) con una Fc N-terminal se genero usando la construccion pET24b_TAC_Fc-HRS (2-60). El gen HRS(2-60) se amplifico por PCR con los cebadores enumerados a continuation, que contienen un sitio de Xhol 5' y 3'. Las reacciones de PCR se realizaron usando los parametros de ciclado termico recomendados. La construccion pET24b_TAC_Fc-HRS (2-60) se digirio con Xhol, se desfosforilo y se purifico en gel. El fragmento generado por PCR tambien se digirio con Xhol y se purifico en gel. El HRS purificado en gel (2-60) se subclono en el sitio Xhol de pET24b_TAC_Fc-HRS (2-60). Para generar la construccion final, se uso la mutagenia QuikChange para eliminar el codon de parada y el sitio Xhol entre los fragmentos de HRS (2-60) en tandem usando los cebadores que se enumeran a continuacion. Las secuencias se confirmaron realizando alineamientos con las secuencias teoricas usando DNASTAR Lasergene SeqMan Pro.
Se usaron los siguientes cebadores para amplificar Fc-HRS (2-60) (tabla E15):
Figure imgf000137_0002
Figure imgf000138_0002
Secuencia de ADN de Fc-HRS(2-60) HRS(2-60) (fusion de Fc N-terminal):
Figure imgf000138_0001
KQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPK (SEQ ID NO:396)
Preparacion y purification de protefnas de fusion HRS(1-60)-Fc y Fc-HRS(2-60). C e p a d e E. coli . Las celulas competentes de E. coli BL21-CodonPlus® (DE3) RIPL (Agilent 230280) transformadas con las construcciones de expresion pET descritas anteriormente se usaron para la production inicial de protefnas de fusion de Fc.
M e d i o s . El medio M9YE se preparo mezclando sal minima 5X M9 esteril (BD 248510), solution de extracto de levadura en agua purificada esteril (BD 212750), glucosa al 20 % esterilizada (Sigma G7021) y MgSO41,0 M esteril (Sigma M7506). Para la solucion de alimentation, la solucion de extracto de levadura (5 %), solucion de glucosa (50 %) y 10 ml de solucion de oligoelemento concentrado (que contenfa Fe3+, Mn2+, acido borico, Mo6+, Co2+, Cu2+, Zn2+ y EDTA), asi como 10 ml de solucion de sulfato de magnesio, se autoclavaron por separado. Los componentes se mezclaron justo antes de la fase de lote alimentado. Se anadio sulfato de kanamicina a una concentration final de 100 pg/ml en el medio de cultivo.
Fermentacion por lotes alimentados. Se uso un fermentador Multifors (HT-Infors) de 0,5 l con el software Iris para el proceso de fermentacion por lotes alimentados. La agitacion se ajusto a 1000 rpm. El valor del pH se controlo automaticamente a 7,0 mediante la adicion de un 30 % de hidroxido de amonio (Sigma 221228) y un 30 % de acido fosforico (Sigma P5811). Se proporciono aire a un caudal de 0,5 l/min con un compresor de aire de diafragma sin aceite (Cole-Parmer) y se hizo pasar a traves de un filtro de 0,2 pm. El nivel de oxfgeno disuelto se controlo al 70 % proporcionando oxfgeno puro (West Air). La temperatura se controlo a 30 °C con un circulador Neslab RTE7 (Thermo Scientific). La formacion de espuma se controlo mediante la adicion del antiespumante 204 (Sigma A8311).
El volumen inicial de medio M9YE en el fermentador fue 0,3 l. El fermentador se inoculo con 15 ml del cultivo de siembra que se hizo crecer durante una noche a 30 °C y 250 rpm. Cuando la fuente de carbono se agoto en el recipiente, la solucion de alimentacion concentrada se introdujo en el recipiente mediante una bomba peristaltica a 0,12 ml/min. Cuando la densidad optica de las celulas a 600 nm alcanzo la fase exponencial, el cultivo se indujo con IPTG 0,5 mM (Fisher Scientific BP1755). El cultivo se hizo crecer durante una noche (aproximadamente 17 horas de induccion) y la DO600 final alcanzo aproximadamente 120. Las celulas se recogieron mediante centrifugacion a 8.000 g durante 30 min. El sobrenadante se decanto y el sedimento se almaceno a -20 °C hasta la purificacion.
Se prepararon protefnas de fusion HRS-Fc adicionales usando un vector pET24b modificado (EMD, Gibbstown, NJ) que contenfa un promotor TAC en lugar de T7 («pET24b_TAC») y se transformaron en celulas competentes UT5600. Se prepararon celulas competentes UT5600 a partir de material bacteriano obtenido del Coli Genetic Stock Center (CGSC, Yale). UT5600 es una cepa derivada de K12 de E. coli y se designa como genotipo: F, araC14, leuB6 (Am), secA206 (aziR), lacY1, proC14, tsx-67, A(ompT-fepC) 266, entA403, glnX44 (AS), X, trpE38, rfbCI, rpsL109 (strR), xylA5, mtl-1, thiEI.
Los vectores de expresion que comprenden estas construcciones se transformaron en celulas UT5600 usando procedimientos estandar y se prepararon reservas de glicerol.
Medio de fermentacion. El medio UT5600_M9_YE se preparo mezclando, para los medios por lotes: 16 gramos/l de extracto de Levadura (Difco 212750), 8 g/l de glicerol (Sigma G2025), 11,28 g/l de Sales M9 (Difco 248510) y 100 pl/l de Antifoam 204 ( Sigma AG6426) con agua desionizada y esterilizando mediante autoclave. Las adiciones posteriores al autoclave fueron de 0,64 ml/l de solucion de metales traza, 2,3 ml/l de sulfato de magnesio 100x y 45.83 g/l de leucina. Los medios de alimentacion se prepararon mezclando 250 g/l de extracto de levadura, 225 g/l de glicerol y 100 pl/l de antiespumante 204 en agua desionizada y se esterilizaron mediante autoclave. Las adiciones posteriores a la esterilizacion fueron 10 ml/l de solucion de metales traza, 2,3 ml/l de sulfato de magnesio 100x, 45.83 ml/l de L-leucina.
Fermentacion por lotes alimentados. Se utilizo un fermentador de 0,5 l (Infors) con el software MFCS/DA para la fermentacion por lotes alimentados. La agitacion se ajusto en cascada a 500-1200 rpm. El valor del pH se controlo a 7,0 ± 0,1 automaticamente mediante la adicion de un 30 % de hidroxido de amonio (Sigma 221228) y un 30 % de acido fosforico (Sigma P5811). El aire se proporciono a un caudal de 0,5 l/min con un compresor de aire de diafragma sin aceite (Cole-Parmer). El aire se hizo pasar a traves de un filtro Midisart 2000 de 0,2 pm (Sartorius 17805). El oxfgeno puro (West Air) se suministro automaticamente para controlar el nivel de oxfgeno disuelto al 30 %. La temperatura se controlo a 30 °C con un circulador Neslab RTE7 (Thermo Scientific). La formacion de espuma se controlo mediante la adicion del antiespumante 204 (Sigma A8311) de acuerdo con fuera necesario. El volumen inicial de medio UT5600_M9_YE en el fermentador fue de 0,24 l. El fermentador se inoculo con “ 10 Unidades de DO (aproximadamente 1-2 ml de siembra a una DO de 5-10) del cultivo de siembra que se hizo crecer durante 6 horas a 37 °C y 250 rpm. Cuando el lote de glicerol se agoto en el recipiente (aproximadamente 4 horas), la solucion de alimentacion concentrada se introdujo en el recipiente mediante una bomba peristaltica ajustada en un programa de alimentacion exponencial. Cuando la densidad optica de las celulas a 600 nm alcanzo aproximadamente 150, se indujo el cultivo con IPTG 0,5 mM (Fisher Scientific BP1755). El cultivo se incubo 4 horas despues de la induccion y se recogio mediante centrifugacion a 10.000 x g durante 30 minutos. El rendimiento aproximado del sedimento celular final fue de 150-200 gramos por litro de peso celular humedo (WCW). El sedimento celular se almaceno a -80 °C hasta la purificacion. La expresion de la protefna diana se confirmo a traves de SDS-PAGE y transferencia de Western para IgG antihumana de cabra, anticuerpo conjugado con HRP (Thermo p/n 31413).
Purificacion de protefnas de fusion de FC. Los sedimentos celulares congelados se resuspendieron en 4 volumenes (es decir, 4 ml/g de sedimento celular) de tampon de lisis (Tris 50 mM, NaCl 500 mM, p-ME 14 mM, pH 7,5). Se anadieron a la suspension comprimidos completos de inhibidor de proteasa LIBRE de EDTA (Roche) en una proporcion de 1 comprimido/50 ml. La suspension se hizo pasar a traves de un microfluidizador (Microfluidics) dos veces a 14.000 psi con enfriamiento con hielo. El lisado se centrifugo a > 10.000 x g durante 45 minutos a 4 °C. El sobrenadante se filtro a traves de filtros de capsula de Sartobran de 0,45 0,22 pm (Sartorius).
El lisado clarificado se unio a la resina MabSelect (GE Healthcare), se equilibro previamente con tampon de union (Tris 50 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5) en una proporcion de 1 ml de resina por 10 g de pasta celular. La columna se lavo con 500 volumenes de columna de tampon de union 0,1 % de Triton X-114 seguido de 100 volumenes de columna del tampon de union. Con la protefna unida, las protefnas de fusion se eluyeron con 3,75 volumenes de columna de tampon de elucion (glicina 0,1 M, arginina 0,5 M, pH 3,0) a un tubo de recogida que contenfa 1,25 volumenes de columna de tampon de neutralizacion (Tris 1 M, pH 8,0).
Opcionalmente, para la eliminacion adicional de especies de alto peso molecular, el material se concentro en dispositivos de concentracion ultracentrffuga Amicon de 30 kDa (Millipore) y se cargo en una columna de cromatograffa de exclusion por tamano HiLoad Superdex 200 pg 16/600 (GE Healthcare). El material se eluyo en 1,1 volumenes de columna de 1X PBS pH 7,4 (Gibco n.° 10010), y se agruparon las fracciones correspondientes al pico principal basandose en el proceso de absorbancia del cromatograma a 280 nm.
Si no se realizo una cromatograffa de exclusion por tamano, las protefnas de fusion Fc purificadas se intercambiaron en un tampon que contenfa PBS, a pH 7,4. La protefna dializada se hizo pasar a traves de un filtro de membrana Q (Sartobind-Q de Sartorius o Mustang-Q de Pall) o una columna de Q-Sepharose (GE Healthcare) para la eliminacion adicional de endotoxinas, y se filtro a traves de un filtro esteril de 0,22 pm.
Proceso de purificacion escalable para protefnas de fusion FC. El proceso de purificacion con MabSelect seguido de cromatograffa de exclusion por tamano se uso para purificar multiples protefnas de fusion Fc usando un proceso robusto, efectivo con un desarrollo de purificacion mfnimo. Sin embargo, el uso de lavado con detergente durante la una etapa de cromatograffa de Protefna A (MabSelect) y de exclusion por tamano limita la capacidad de aumentar la purificacion. Tambien se desarrollo un proceso de purificacion para el aumento de escala para las protefnas de fusion de Fc utilizando floculacion de lisado, cromatograffa de protefna A, intercambio de cationes (CEX) y cromatograffa de hidroxiapatita ceramica (CHT).
La resuspension y la lisis se realizaron como se ha descrito anteriormente, con la omision de las tablas de inhibidores de proteasa y p-ME del tampon de lisis. Despues de la lisis, el lisado se floculo con la adicion de polietilenimina, pm 1300 (Sigma Aldrich) a 0,04 % (v/v) y se incubo durante 30 minutos a 4 °C. La centrifugacion y la clarificacion se realizaron como se ha descrito anteriormente. La cromatograffa de Protefna A se realizo en un lisado clarificado usando resina MabSelect en una columna de cromatograffa rellena a una proporcion de carga de 1 ml de resina por 4 g de pasta celular, con una etapa de lavado de 5 volumenes de columna en Tris 50 mM, NaCl 500 mM pH 7,5, seguida de elucion en 3 volumenes de columna de glicina 0,1 M pH 3,0 y neutralizacion en 0,3 volumenes de columna de Tris 1 M pH 8,0. Despues de la Protefna A, se preparo la carga de CEX mediante dilucion 5x del eluyente post-Protefna A en el tampon de equilibrio de CEX (fosfato de sodio 20 mM, pH 6,0), se cargo en una columna de alto rendimiento SP Sepharose, se lavo con 5 volumenes de columna de tampon de equilibrio, y se eluyo en un gradiente de cloruro de sodio lineal de 0 a 300 mM de NaCl en 10 volumenes de columna. Las fracciones de CEX se agruparon basandose en el analisis SDS-PAGE de las fracciones de pico de elucion. La hidroxiapatita ceramica se realizo en el grupo CEX cargando en una columna CHT Tipo I de 40 kDa pm (Bio-Rad) equilibrada en tampon de equilibrio de CHT (5 mM de fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, 1 pM de cloruro de calcio pH 6,5), se lavo con 5 columnas de tampon de equilibrio y se eluyo en un gradiente de cloruro de sodio lineal de 150 mM a cloruro de sodio 1,5 M en 10 volumenes de columna y un NaCl 1,5 M se mantuvo hasta 20 volumenes de columna para completar la elucion. Despues de CHT, la protefna se intercambio con tampon en PBS 1X pH 7,4 usando dispositivos de concentracion centrffuga Amicon de 30 kDa (Millipore).
La concentracion de protefna de fusion se determino mediante el ensayo de protefnas de Bradford (Thermo Scientific) o mediante absorbancia UV a 280 nm. La concentracion de protefna de fusion se determino mediante el ensayo de protefna de Bradford (Thermo Scientific). El nivel de endotoxinas estaba por debajo de 4 UE/mg de acuerdo con lo determinado por el ensayo EndoSafe PTS LAL (Charles River).
Analisis de protefnas de fusion HRS-Fc. Las protefnas de fusion HRS-Fc purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE como se muestra en la figura 21. Las muestras de 10 pg de carga proteica se procesaron en geles Bis-Tris NuPAGE 4-12 %, 150 V durante 60 minutos en tampon MOPS-SDS y se tineron con Instant Blue. Las muestras reducidas tenfan DTT 25 mM, y se calentaron a 95 °C durante 10 minutos en tampon LDS 1X antes de la carga. Las protefnas de fusion HRS-Fc purificadas tambien se analizaron mediante un procedimiento de cromatograffa de exclusion por tamano (SEC). Las muestras se cargaron en una columna aTSK-Gel Super SW3000 (TOSOH, 4,6 mm de diametro x 30 cm, 4 pm) en un sistema de HPLC Agilent 1260. Se llevo a cabo una prueba isocratica de 30 minutos a 0,3 ml/min con una fase movil que contema NaCl 0,1 M, fosfato de Na 0,2 M y 5 % de 2-propanol a pH 7. La deteccion por UV se realizo a 280 nm. El cromatograma se muestra en la figura 22.
Aproximadamente el 83 % de la protema esta en la forma de dfmero deseado, despues de la protema A y antes de la purificacion por cromatograffa de exclusion de tamano, con la cantidad restante presente como especie de alto peso molecular. Despues de la cromatograffa de exclusion por tamano, la proporcion de dfmero aumenta del 95 al 99 %. Usando el proceso de purificacion de Protema A, intercambio cationico e hidroxiapatita, la proporcion de dfmero es mayor al 99 %. La mayor parte de la protema dfmera contiene el enlace disulfuro intercatenario en la region bisagra Fc, mientras que tambien existe un dfmero no covalente.
El analisis de los datos de espectros de masas intactos obtenidos usando LC/ESI-MS demuestra que el tamano molecular de las protemas de fusion FC en condiciones no reductoras es consecuente con la masa molecular esperada de aproximadamente 64.520 daltons (datos no mostrados). Los espectros de CD de las protemas de fusion Fc en las regiones UV lejana y cercana revelan que la estructura de las protemas de fusion es consecuente con las estructuras de dominio esperadas. Adicionalmente, los datos de calorimetffa diferencial de barrido decovolucionados obtenidos de las protemas de fusion HRS-Fc demuestran que las protemas de fusion Fc estan plegadas con dos transiciones termicas principales caracteffsticas de los dominios CH1 y CH2 del componente Fc (datos no mostrados), compatibles con las estructuras predichas.
Para evaluar las caracteffsticas farmacocineticas de las construcciones de protemas de fusion HRS-Fc en comparacion con las protemas HRS no modificadas, se administraron protemas a ratones C57BL/6 normales a traves de una unica embolada intravenosa o subcutanea en una dosis de 8 mg/kg. Se tomaron muestras de sangre en serie con los tiempos de muestreo distribuidos en nueve animales por forma de producto. Para cada punto temporal, se extrajeron los sueros de tres ratones independientes. Las concentraciones del arffculo de prueba se midieron mediante ELISA y los parametros farmacocineticos se obtuvieron usando un analisis no compartimental en el software Phoenix.
Los resultados, que se muestran en las figuras 23A, 23B y 23C demuestran que la creacion de las protemas de fusion Fc dio como resultado una semivida, exposicion y biodisponibilidad SC significativamente mejoradas
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El analisis farmacocinetico mostrado en la tabla E16 demuestra que las construcciones de fusion HRS-Fc exhiben una exposicion, aclaramiento y semivida sistemicas significativamente mejoradas en comparacion con las protemas no modificadas. La creacion de las protemas de fusion Fc tambien mejoro la biodisponibilidad subcutanea de las protemas en comparacion con las protemas no modificadas. En particular, Fc-HRS(1-60) aumento la exposicion en comparacion con la protema no modificada de 200 a 300 veces, dependiendo de la via de administracion, ademas, la biodisponibilidad SC y la semivida aumentaron significativamente.
EJEMPLO 9
PRUEBAS DE PROTEfNAS DE FUSION FC EN COLITIS INDUCIDA POR TNBS
El intestino grueso esta recubierto por una mucosa epitelial que esta invaginada en estructuras similares a un matraz, las criptas. A diferencia del intestino delgado, no hay vellosidades en esta region, con la parte superior de las criptas abriendose en una region de mesa plana. Las celulas de la cripta son generadas por celulas madre ubicadas en la base de la cripta, cuyas celulas hijas se dividen rapidamente y se diferencian en colonocitos predominantes y celulas caliciformes que producen mucina (tambien se produce un numero menor de celulas endocrinas y celulas M). El tamano de la cripta y el numero de celulas caliciformes por cripta aumentan a lo largo del intestino grueso desde el ciego hasta el recto, presumiblemente para ayudar al paso de las heces y proporcionar suficiente proteccion de las celulas madre y de la mucosa a medida que el agua es absorbida por las heces.
Normalmente, la tasa de produccion de celulas en la cripta intestinal se ajusta de manera precisa a la tasa de perdida de celulas - opera un mecanismo homeostatico muy sensible. La ruptura de la barrera mucosa permite la entrada de bacterias en el cuerpo, con implicaciones de enfermedades resultantes. A la inversa, la hiperplasia puede generar polipos y finalmente tumores. La ruptura de la barrera intestinal puede ser causada por la exposicion a agentes citotoxicos no especfficos del tipo celular (a menudo especfficos de la proliferacion) - tfpicamente terapias contra el cancer. Sin embargo, la perturbacion del recambio de celulas epiteliales tambien es una caracterfstica comun de las enfermedades inflamatorias.
Los modelos actuales de roedores de la enfermedad intestinal inflamatoria (EII) incluyen, por ejemplo, modelos generados al desencadenar una enfermedad autoinmunitaria mediante la manipulacion de la poblacion de linfocitos T, que irritan el revestimiento mucoso del intestino por la acumulacion de material particulado en el intestino grueso (como con DSS, sulfato sodico de dextrano), o ruptura qufmica del epitelio (como con el sulfonato de trinitrobenceno, TNBS).
En cualquiera de estos modelos, la gravedad de la enfermedad puede evaluarse mediante una variedad de evaluaciones subjetivas de los grados patologicos observados, asf como medidas mas objetivas y cuantitativas del dano, para proporcionar informacion mas significativa sobre la biologfa subyacente. Es posible ampliar el analisis usando medidas de longitud/area asistidas por ordenador para mapear los cambios en la mucosa/submucosa y obtener mas medidas cuantitativas del dano, y por lo tanto, la eficacia terapeutica. Aunque cada uno de estos modelos presenta diferentes ventajas y desventajas, el modelo de colitis por TNBS es un modelo establecido de diversos aspectos de la enfermedad intestinal inflamatoria en seres humanos, que se ha usado con exito para validar y optimizar la eficacia de los productos terapeuticos humanos.
Modelo en raton de TNBS. En este modelo de colitis, la irritacion del colon se induce por la administracion intracolonica de TNBS en etanol. Esto provoca una colitis aguda que tiene un perfil de citocinas tipo TH1, que se caracteriza por la expresion de genes que codifican TNF-a, IFN-y e IL-12 entre otros (Fichtner-Feigl y col, J. Clin. Invest. 2005. 115: 3057-3071). La colitis puede ser grave y localizada en el area del colon donde se introduce el TNBS. La respuesta inflamatoria da como resultado hinchazon localizada, infiltracion de celulas inflamatorias y perdida epitelial.
En este estudio, la eficacia del polipeptido de HRS no modificado, (HRS(1-60), se comparo con las protefnas de fusion Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc para evaluar su eficacia en mejorar la colitis aguda inducida por TNBS en ratones. Se evaluaron tres regfmenes de dosificacion diferentes, que emplean la administracion iv o sc del elemento de prueba. Se utilizo budesonida (p.o.) como elemento de referencia para el estudio.
Animales y enjaulado: en el estudio se usaron un total de 100 ratones macho BDF-1 (libres de H.pylori, libres de norovirus murino) (Harlan Laboratories, Reino Unido). Los animales tenfan 8-10 semanas de edad en el suministro y se usaron a las 10-12 semanas de edad. Todos los ratones se mantuvieron en jaulas ventiladas individualmente (IVC) en una unidad de barrera SPF (libre de patogenos especfficos). Los animales fueron identificados por jaulas numeradas y punciones auriculares.
Dieta y bienestar animal: los animales fueron alimentados con dieta expandida de rata y raton de B & K. El agua se suministro en bolsas de agua HYDROPAC™ (agua RO filtrada; productos de Hydropac/lab, Delaware, EE. UU.). Tanto el alimento como el agua estaban disponibles ad libitum. Habfa una temperatura ambiente constante de 21 ± 2 °C y una humedad relativa media de 55 ± 10 %. El ciclo dfa-noche fue constante, con fases de luz y oscuridad de 12 horas cada una (turnos de 07:00 h/19:00 h). La salud animal fue monitorizada diariamente y las jaulas fueron limpiadas a intervalos regulares. Todos los procedimientos fueron certificados de acuerdo con la Ley de Reino Unido (Procedimientos Cientfficos) de Animales de 1986.
Grupos, dosis, administracion y formulaciones: un total de 100 ratones se asignaron al azar a diez grupos de e s t u d i o ( t a b l a E 17 ) . T o d o s l o s r a t o n e s e n u n a j a u l a r e c i b i e r o n e l m i s m o t r a t a m i e n t o y f u e r o n p e r f o r a d o s e n l a o r e j a p a r a i d e n t i f i c a r l o s . L a s m e d i c i o n e s d i a r i a s d e p e s o c o r p o r a l s e u t i l i z a r o n p a r a c a l c u l a r e l v o l u m e n d e l a r t f c u l o d e p r u e b a o e l v e h f c u l o a d m i n i s t r a d o a l o s g r u p o s a p l i c a b l e s .
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5
P r e p a r a c i o n y a d m i n i s t r a c i o n d e T N B S y a r t f c u l o s d e p r u e b a . TNBS: T N B S ( S i g m a ; n . ° d e l o t e S L B D 6 8 1 1 V ) s e p r e p a r o c o m o u n a s o l u c i o n d e 15 m g / m l e n s o l u c i o n s a l i n a / 50 % d e e t a n o l . S e i n s t i l o u n a d o s i s u n i c a d e 20 0 pl ( 3 m g d e T N B S ) e n e l c o l o n , u s a n d o u n c a t e t e r d e p l a s t i c o , c o l o c a d o a 4 c m p r o x i m a l a l b o r d e a n a l , a l a s 11 : 00 h o r a s d e l d f a d e e s t u d i o 0. L o s a n i m a l e s s e m a n t u v i e r o n e n p o s i c i o n i n v e r t i d a d u r a n t e 1 m i n u t o d e s p u e s d e la 0 i n t r o d u c c i o n d e T N B S e n e l c o l o n , p a r a m i n i m i z a r l a s f u g a s d e l c o m p u e s t o .
HRS (1-60): e l a r t f c u l o d e p r u e b a s e r e c i b i o c o m o c u a t r o v i a l e s d e s o l u c i o n m a d r e c o n g e l a d a ( 0 , 0 3 3 m l d e v o l u m e n e n c a d a u n o ) a 17 , 1 m g / m l , q u e s e a l m a c e n a r o n a - 80 ° C h a s t a s u u s o . E n c a d a d f a d e la a d m i n i s t r a c i o n d e l a r t f c u l o d e p r u e b a , s e t o m o u n a u n i c a a l f c u o t a y s e d e s c o n g e l o e n h i e l o h u m e d o . D e s p u e s d e d e s c o n g e l a r , l o s c o n t e n i d o s 5 d e l v i a l s e m e z c l a r o n p i p e t e a n d o a r r i b a y a b a j o d i e z v e c e s . P o s t e r i o r m e n t e , e l a r t f c u l o d e p r u e b a s e d i l u y o c o n v e h f c u l o f r fo ( e s t e r i l , x 1 P B S , p H 7 , 4 ) p a r a d a r u n a s o l u c i o n a 0 , 2 m g / m l ; la s o l u c i o n s e m e z c l o p i p e t e a n d o a r r i b a y a b a j o d i e z v e c e s . E s t a s o l u c i o n s e a d m i n i s t r o d i a r i a m e n t e ( d e s d e e l d f a 0 d e l e s t u d i o h a s t a e l d f a 3 d e l e s t u d i o ) m e d i a n t e i n y e c c i o n i n t r a v e n o s a , a 5 m l / k g , p a r a d a r u n a d o s i s d e 1 m g / k g .
0 Fc-HRS (2-60): e l a r t f c u l o d e p r u e b a s e r e c i b i o c o m o c u a t r o v i a l e s d e s o l u c i o n m a d r e c o n g e l a d a ( u n v i a l d e 2 , 5 1 m l y t r e s v i a l e s d e 2 , 01 m l ) a 4 , 7 m g / m l , q u e s e a l m a c e n a r o n a - 80 ° C h a s t a s u u s o . E n c a d a d f a d e la a d m i n i s t r a c i o n d e l a r t f c u l o d e p r u e b a , s e t o m o u n a u n i c a a l f c u o t a y s e d e s c o n g e l o e n h i e l o h u m e d o . D e s p u e s d e d e s c o n g e l a r , l o s c o n t e n i d o s d e l v i a l s e m e z c l a r o n p i p e t e a n d o a r r i b a y a b a j o d i e z v e c e s . P o s t e r i o r m e n t e , e l a r t f c u l o d e p r u e b a s e d i l u y o c o n v e h f c u l o f r fo ( e s t e r i l , x 1 P B S , p H 7 , 4 ) p a r a d a r s o l u c i o n e s a 3 m g / m l y 1 m g / m l ; l a s s o l u c i o n e s s e 5 m e z c l a r o n p i p e t e a n d o a r r i b a y a b a j o d i e z v e c e s . S e a d m i n i s t r o F c - H R S ( 2 - 60 ) d e a c u e r d o c o n 3 r e g f m e n e s d i f e r e n t e s : i) l a s o l u c i o n d e 1 m g / m l s e a d m i n i s t r o d i a r i a m e n t e ( d e s d e e l d f a 0 d e l e s t u d i o h a s t a e l d f a 3 d e l e s t u d i o ) m e d i a n t e i n y e c c i o n i n t r a v e n o s a , a 5 m l / k g , p a r a d a r u n d o s i s d e 5 m g / k g ; ii) la s o l u c i o n d e 1 m g / m l s e a d m i n i s t r o d i a r i a m e n t e , s o l o u n a v e z e n e l d f a 0 d e l e s t u d i o , m e d i a n t e i n y e c c i o n i n t r a v e n o s a , a 5 m l / k g , p a r a d a r u n a d o s i s d e 5 m g / k g ; iii) la s o l u c i o n d e 3 m g / m l s e a d m i n i s t r o d i a r i a m e n t e ( d e s d e e l d f a 0 d e l e s t u d i o h a s t a e l d f a 3 d e l e s t u d i o ) 0 m e d i a n t e i n y e c c i o n s u b c u t a n e a , a 5 m l / k g , p a r a d a r u n a d o s i s d e 15 m g / k g .
HRS (1-60)-Fc: e l a r t f c u l o d e p r u e b a s e r e c i b i o c o m o c u a t r o v i a l e s d e s o l u c i o n m a d r e c o n g e l a d a ( u n v i a l d e 2 , 3 7 m l y t r e s v i a l e s d e 1 , 89 m l ) a 4 , 99 m g / m l , q u e s e a l m a c e n a r o n a - 80 ° C h a s t a s u u s o . E n c a d a d f a d e la a d m i n i s t r a c i o n d e l a r t f c u l o d e p r u e b a , s e t o m o u n a u n i c a a l f c u o t a y s e d e s c o n g e l o e n h i e l o h u m e d o . D e s p u e s d e d e s c o n g e l a r , l o s 5 c o n t e n i d o s d e l v i a l s e m e z c l a r o n p i p e t e a n d o a r r i b a y a b a j o d i e z v e c e s . P o s t e r i o r m e n t e , e l a r t f c u l o d e p r u e b a s e d i l u y o c o n v e h f c u l o f r fo ( e s t e r i l , x 1 P B S , p H 7 , 4 ) p a r a d a r s o l u c i o n e s a 3 m g / m l y 1 m g / m l ; l a s s o l u c i o n e s s e m e z c l a r o n p i p e t e a n d o a r r i b a y a b a j o d i e z v e c e s . S e a d m i n i s t r o H R S ( 1 - 60 ) - F c d e a c u e r d o c o n 3 r e g f m e n e s d i f e r e n t e s : i) l a s o l u c i o n d e 1 m g / m l s e a d m i n i s t r o d i a r i a m e n t e ( d e s d e e l d f a 0 d e l e s t u d i o h a s t a e l d f a 3 d e l e s t u d i o ) m e d i a n t e i n y e c c i o n i n t r a v e n o s a , a 5 m l / k g , p a r a d a r u n a d o s i s d e 5 m g / k g ; ii) la s o l u c i o n d e 1 m g / m l s e a d m i n i s t r o 0 d i a r i a m e n t e , s o l o u n a v e z e n e l d f a 0 d e l e s t u d i o , m e d i a n t e i n y e c c i o n i n t r a v e n o s a , a 5 m l / k g , p a r a d a r u n a d o s i s d e 5 m g / k g ; iii) la s o l u c i o n d e 3 m g / m l s e a d m i n i s t r o d i a r i a m e n t e ( d e s d e e l d f a 0 d e l e s t u d i o h a s t a e l d f a 3 d e l e s t u d i o ) m e d i a n t e i n y e c c i o n s u b c u t a n e a , a 5 m l / k g , p a r a d a r u n a d o s i s d e 15 m g / k g .
Budesonida: la budesonida se obtuvo de Tocris (Tocris 1101, n.° de lote 1A/128902) y se almaceno en la oscuridad a temperatura ambiente hasta su uso. En cada dfa de administracion, se formulo budesonida como una solucion de 1 mg/ml en aceite de cacahuete (Sigma). La budesonida se administro diariamente (desde el dfa 0 del estudio hasta el dfa 3 del estudio) mediante sonda oral, a 5 ml/kg, para dar una dosis de 5 mg/kg.
Examenes cifnicos y analgesia. Cualquier animal que demostraba una perdida de peso superior al 15 % se consideraba enfermo y el tratamiento pudo haberse suspendido. Cualquier animal fue sacrificado si la perdida de peso era superior al 20 %. El bienestar animal fue monitorizado diariamente. Una vez al dfa, desde el dfa -1 hasta el final del estudio, todos los ratones fueron pesados y evaluados para determinar la consistencia de las heces y la presencia de sangre manifiesta en las heces o alrededor del ano de acuerdo con los criterios de la tabla E18.
Figure imgf000144_0001
Uso de la analgesia: no se uso analgesia en este estudio, siguiendo las indicaciones el Patrocinador, ya que podna haber interferido con la accion del artfculo de prueba.
Recoleccion y preparacion de tejido para examen histologico: en el momento del sacrificio, los ratones se anestesiaron con 4 % de isofluorano, con 2 l/min de O2 y 2 l/min de N2O. Cuando estaban completamente anestesiados, la sangre se retiro mediante puncion cardfaca directa y la muerte se confirmo mediante dislocacion cervical.
Preparacion de muestras de sangre completa y plasma. La sangre se recogio mediante puncion cardfaca de todos los ratones en tubos de microcentnfuga de 1,5 ml. Las muestras de sangre se colocaron inmediatamente en hielo y se dejaron coagular durante 60 minutos. Las muestras se centrifugaron a 3000 g durante 7 minutos, a 4 °C. Inmediatamente despues de la centrifugacion, el suero se transfirio con una pipeta esteril a viales previamente etiquetados y se congelo inmediatamente en hielo seco.
Preparacion de muestras intestinales. Se extirpo el intestino grueso y se enjuago con PBS y se registraron su longitud y peso humedo, antes de cortar en las regiones proximal, media y distal y la fijacion en la solucion de Carnoy. Ademas, una pequena muestra de colon se congelo instantaneamente en nitrogeno lfquido. El tejido fijado se deshidrato a traves de una serie de alcoholes y xileno y se incluyo en parafina, usando un procesador de tejidos Leica TP1020 y una estacion de trabajo EG1140H. Las secciones (5 pm de espesor) se cortaron usando un microtomo Leica RM2125RTF y se secaron al aire en portaobjetos de microscopio, durante una noche a 37 °C. Posteriormente, las diapositivas se desceraron en xileno y se rehidrataron a traves de alcoholes graduados a PBS. Todas las secciones se tineron con hematoxilina y eosina (H&E) y se montaron.
Analisis histologico: las secciones histologicas se evaluaron a ciegas. Las secciones se observaron al microscopio y se les asigno una puntuacion de gravedad subjetiva que oscila entre 0 y 5, de acuerdo con los criterios descritos en la tabla E19. Se evaluaron hasta doce secciones transversales desde el intestino grueso medio y distal.
Figure imgf000145_0001
Analisis estadfstico: donde se menciono, las comparaciones estadfsticas de los datos del grupo se realizaron usando ANOVA, en combinacion con pruebas post hoc, utilizando Graph Pad Prism.
Analisis de qPCR: se extirpo el colon de raton de los animales y se almaceno a -80 °C hasta el analisis. El ARN se preparo a partir de dos colones usando el RNeasy Mini Kit de Qiagen (numero de catalogo 74106). Una vez que el ARN se eluyo de la columna Qiagen, se hizo pasar por un Bioanalyzer 2100 de Agilent para poner a prueba la integridad del ARN y un NanoDrop para determinar la concentracion y pureza del ARN. A continuacion se almaceno el ARN a -80 °C.
La transcripcion inversa (RT) de ARN a ADNc se realizo en un formato de placa de PCR de 96 pocillos en la maquina de PCR Mastercycler de Eppendorf con el siguiente programa: 37 °C durante 60 minutos, 95 °C durante 5 minutos. Los pocillos de borde de la placa de 96 pocillos no se usaron y se llenaron con 50 mcl de agua para evitar la evaporacion de los pocillos internos. Se usaron 100 ng de ARN en 25 mcl de la mezcla maestra de transcripcion inversa (life Technologies n.° 4387406) por muestra de RT. Una vez que se completo la RT, la siguiente etapa fue amplificar previamente los genes de interes en la muestra de ADNc. Se combinaron cebadores de genes de interes (cebadores DELTAgene disenados por Fluidigm) hasta una concentracion final de 200 nM. Usando estos cebadores, los genes de interes se amplificaron previamente en cada muestra. La preamplificacion se realizo en reacciones de 10 mcl (2,5 mcl de ADNc, 7,5 mcl de mezcla maestra Pre-AMp) en formato de 384 pocillos usando una maquina de PCR ViiA7 de Applied Biosystems con el siguiente programa: 95 °C durante 10 minutos, 14 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 4 minutos. Despues de la etapa de preamplificacion, se anadio exonucleasa (New England BioLabs n.° de catalogo M0293L) para eliminar los cebadores no incorporados de cada muestra. Esta reaccion de exonucleasa tambien se completo en la maquina de PCR ViiA7 con el siguiente programa: 37 °C durante 30 minutos, 80 °C durante 15 minutos. Despues de la exonucleasa, la muestra de RT se diluyo adicionalmente a 1:5 (7 mcl de muestra de exonucleasa 18 mcl de tampon de EDTA bajo).
El chip usado para ejecutar qPCR en el sistema Biomark de Fluidigm fue un 96.96 Dynamic Array IFC para la expresion genica. El chip se cebo primero con el controlador IFC HX de acuerdo con las recomendaciones del fabricante antes de cargar la muestra y los ensayos. Para preparar los ensayos que se cargaran en un chip, se prepararon 4,4 mcl de la mezcla maestra del ensayo (reactivo de carga del ensayo 2X de Fluidigm n.° de catalogo 8500736 y bajo EDTA TE) a 3,6 mcl los cebadores directos e inversos de 20 mcM para cada gen de interes se prepararon en una placa de 96 pocillos. Para preparar muestras, se anadieron 4,5 mcl de mezcla maestra de muestra (mezcla maestra de expresion de genes TaqMan 2X de Ambion, Reactivo de carga de ADN 20X de Fluidigm, numero de catalogo 100-0388, y 20X EvaGreen de Biotium n.° de catalogo 31000) a 3 mcl de muestra diluida preamplificada/exonucleasa en una placa de 96 pocillos. Una vez que se habfa cebado el chip, se cargaron en el chip 5 mcl de una muestra o ensayo preparado anteriormente. El chip fue devuelto a continuacion al controlador de IFC para que las muestras se carguen en el chip. Una vez que el chip termino de cargarse, la qPCR podia ejecutarse en el Biomark usando un programa preestablecido para 96.96 Dynamic Array para la expresion genica con una curva de fusion para determinar la especificidad del cebador. La expresion genica relativa se determino mediante el procedimiento Ct delta delta usando multiples genes de mantenimiento.
Resultados:
Parametros en vida: todos los grupos de receptores de TNBS demostraron una disminucion aguda del peso corporal medio, de entre el 8-10 % del peso corporal inicial durante las primeras 24 horas despues de la administracion del agente colftico; posteriormente, hubo una disminucion mas lenta en el peso corporal medio, con todos los grupos mostrando una disminucion significativa en el peso corporal medio entre 80-90 % del peso inicial al final del estudio (p<0,0158). El peso corporal de los ratones tratados solo con vehiculo mostro un cambio minimo durante el periodo del estudio, con un peso corporal medio final del 99,6 ± 1,7 % del peso corporal inicial, el dia 4 del excluyo el raton 78 debido a la falta de induccion de la enfermedad). La supervivencia en otros grupos vario del 80 % (grupo de TNBS/Fc-HRS(2-60)-todos los dfas-i.v.) al 33,3 % (grupo de Tn Bs/Fc-HRS(2-60)-s.c.); la supervivencia en el grupo de TNBS/budesonida fue del 60 %. Los ratones se sacrificaron cuando presentaron mal estado (se retiraron/no consiguieron demostrar un comportamiento normal); a pesar de los controles de seis horas, dos ratones (40 y 50) fueron encontrados muertos a las 19:00 horas del dfa 3 del estudio (datos no mostrados).
Resultados de qPCR. Para investigar mas a fondo la base mecanica de los efectos de HRS(1-60) y Fc-HRS(2-60) sobre la colitis inducida por TNBS, se examinaron los cambios en la expresion genica en los colones de animales despues de la finalizacion del estudio. El perfil de ARN se realizo en dos colones aislados de los ratones en el dfa como se ha descrito anteriormente. Los resultados de estos estudios demostraron que siete genes se elevaron en mas de 10 veces en respuesta al tratamiento con TNBS y se redujeron significativamente mediante el tratamiento con Fc-HRS(2-60) (vease la tabla E20 y la figura 25).
Figure imgf000147_0001
El perfil transcripcional de colones de raton tratados con TNBS revelo muchos genes, incluidos varios genes de mantenimiento (datos no mostrados) que no se vieron afectados significativamente por el tratamiento con Fc-HRS(2-60). Por el contrario, el perfil transcripcional de los colones de raton tratados con TNBS revelo una reduccion significativa de los genes relacionados con el sistema inmunitario e inflamatorio regulados por TNBS por Fc-HRS(2-60). Este resultado se vio fortalecido por el descubrimiento de que HRS(1-60) tambien reduce significativamente los niveles de MCP1, MMP3, CD11b e IL10 inducidos por TNBS (vease las figuras 26A-26H).
Conclusion: la administracion intracolonica de TNBS a ratones BDF-1 dio como resultado el desarrollo de colitis caracterizada por una perdida de peso aguda, con un aumento moderado en la incidencia de diarrea y sangrado de la mucosa. La exploracion post mortem demostro un cambio significativo en la relacion de peso:longitud del intestino grueso y lesiones ulcerativas en el intestino grueso, con estenosis y acumulacion de heces en el intestino. El tratamiento con budesonida se asocio con mejoras en los parametros de la enfermedad tanto en vida como post mortem, y aunque tiene la puntuacion media mas baja en histopatologfa de todos los grupos de receptores de TNBS, la reduccion de este parametro de la enfermedad no alcanzo significacion. El tratamiento con Fc-HRS(2-60)-todos los dfas-i.v. tuvo un efecto similar a la budesonida en la reduccion de la puntuacion de histopatologfa y se asocio con una supervivencia superior. El grupo de TNBS/HRS(1-60)-Fc-todos los dfas-i.v. mostro el nivel mas alto de supervivencia y mejora significativa en la relacion de peso:longitud del intestino grueso, aunque fue menos eficaz que budesonida o Fc-HRS(2-60) para reducir la puntuacion de histopatologfa. Con respecto a la puntuacion de histopatologfa, los tres de estos artfculos de prueba parecieron tener su mayor efecto en el tercio distal del intestino grueso. Se observaron mejoras en los parametros de la enfermedad para el grupo de TNBS/Fc-HRS(2-60)-s.c. y el grupo de TNBS/HRS(1-60)-Fc-una vez-i.v. (por ejemplo, peso corporal y relacion peso:longitud del intestino grueso). Adicionalmente, el perfil transcripcional de los colones de raton tratados con TNBS revelo una reduccion significativa de los genes relacionados con el sistema inmunitario e inflamatorio regulados por TNBS por Fc-HRS (2-60). Este resultado se vio fortalecido por el descubrimiento de que HRS(1-60) tambien reduce significativamente los niveles de MCP1, MMP3, CD11b e IL10 inducidos por TNBS, demostrando que las protemas de fusion HRS-Fc eran activas en la expresion de genes inmunomoduladores en este sistema.
En general, los datos sugieren que Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc tienen un potencial significativo en el tratamiento de la inflamacion intestinal y otras afecciones inflamatorias.
EJEMPLO 10
IMPACTO DE LAS PROTEINAS DE FUSION HRS-FC SOBRE LAS POBLACIONES DE LINFOCITOS T Para evaluar el impacto potencial de los conjugados HRS-Fc sobre las poblaciones de linfocitos T in vivo, se puso a prueba Fc-HRS(2-60) en un modelo de colitis inducida por TNBS, similar al descrito anteriormente. Los estudios se

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un polipeptido de fusion histidil-ARNt sintetasa (HRS)-Fc, que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 98 % identica a la SEQ ID NO:337, donde el polipeptido de fusion HRS-Fc tiene una actividad antiinflamatoria, y tiene farmacocinetica alterada con respecto a un polipeptido de HRS no modificado que tiene una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO:6, donde dicha farmacocinetica alterada es mayor semivida en suero, mayor biodisponibilidad y/o disminucion del aclaramiento.
2. El polipeptido de fusion HRS-Fc de la reivindicacion 1, donde la region Fc y el polipeptido de HRS estan separados por un enlazador peptfdico.
3. El polipeptido de fusion HRS-Fc de la reivindicacion 2, donde el enlazador peptfdico tiene 1-10 aminoacidos, o 1-5 aminoacidos de longitud.
4. El polipeptido de fusion HRS-Fc de la reivindicacion 1, donde el polipeptido de fusion HRS tiene una semivida de al menos 30 horas en ratones.
5. El polipeptido de fusion HRS-Fc de la reivindicacion 1, donde la biodisponibilidad es una biodisponibilidad subcutanea que esta aumentada en al menos un 30 %.
6. Una composicion terapeutica, que comprende el polipeptido de fusion HRS-Fc de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable, donde el polipeptido de fusion HRS-Fc es al menos un 95 % puro y menos del 5 % agregado, y donde la composicion esta sustancialmente libre de endotoxinas.
7. El polipeptido de fusion HRS-Fc de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composicion terapeutica de acuerdo con la reivindicacion 6, para uso como un medicamento.
8. El polipeptido de fusion HRS-Fc de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composicion terapeutica de la reivindicacion 6, para uso en la reduccion de la inflamacion tisular en un sujeto que lo necesite.
9. Un polinucleotido aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de fusion HRS-Fc de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
10. Un procedimiento para fabricar un polipeptido de fusion histidil-ARNt sintetasa (HRS)-Fc de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende a) cultivar una celula huesped de E. coli K-12 para expresar un polipeptido de fusion HRS-Fc, donde la celula huesped comprende un polinucleotido de la reivindicacion 9 que esta unido de forma operativa a un elemento regulador; y b) aislar el polipeptido de fusion HRS-Fc a partir de la celula huesped.
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