KR100689274B1 - 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 원암 유전자는 유방암, 백혈병, 자궁암, 및 악성림프종 등을 비롯한 암의 진단 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질{HUMAN PROTOONCOGENE AND PROTEIN ENCODED BY SAME}
도 1은 정상 유방 조직, 유방암 조직, 및 MCF-7 암세포에서 FC21(a);FC23(f);FC34(g);FC24(l);FC54(m);FC71(n);BBCC5-5(o);FC4(q)의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과; 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 MC113 DNA 단편(b);CA338d DNA 단편(c);H124 DNA 단편(d);H122 DNA 단편(e);H148 DNA 단편(r)의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이며, 정상 간 조직, 간암 조직, 및 HepG2 간암세포에서 HP103(h); HP11(j);HP23(k);HP15(p);HP47(t)의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과; 정상 말초혈액 백혈구 조직, 백혈병조직, 및 K562 백혈병 세포주에서 GV11 DNA 단편(i)의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이며 또 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L738(s);L690(u)의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 유방암 조직들에서 PIG12(a); PIG30(f); PIG31(g);PIG46(l); PIG47(m); PIG48(n); PIG50(o);PIG55(q) 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며; 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 PIG18(b);PIG23(c); PIG27(d);PIG28(e);GIG9(r) 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 인간 정상 간, 간암 및 간암세포주들에서 PIG38(h); PIG43(j);PIG44(k); PIG54(p);GIG18(t) 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며, 정상 말초혈액 백혈구 조직, 백혈병조직, 및 K562 백혈병 세포주에서 PIG40(i) 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 2s 및 2u는 정상 폐조직, 좌측 폐암 조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서 HLC9(s);MIG22(u) 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며; 각 도 2 하단은 각 도 2 상단과 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG12(a);PIG18(b);PIG23(c); PIG27(d);PIG28(e); PIG30(f);PIG31(g); PIG38(h);PIG40(i); PIG43(j);PIG44(k) ;PIG46(l); PIG47(m); PIG48(n); PIG50(o);PIG54(p); PIG55(q);GIG9(r); HLC-9(s);GIG18(t);MIG22(u) 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며; 각 도 3 하단은 도 3 상단과 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 4는 인간 암 세포주들에서 PIG12(a);PIG18(b);PIG23(c); PIG27(d);PIG28(e); PIG30(f);PIG31(g); PIG38(h);PIG40(i); PIG43(j);PIG44(k) ;PIG46(l); PIG47(m); PIG48(n); PIG50(o);PIG54(p); PIG55(q);GIG9(r); HLC-9(s);GIG18(t);MIG22(u) 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며; 각 도 4 하단은 각 도 4 상단과 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 5는 PIG12(a);PIG18(b);PIG23(c); PIG27(d);PIG28(e); PIG30(f);PIG31(g); PIG38(h);PIG40(i); PIG43(j);PIG44(k) ;PIG46(l); PIG47(m); PIG48(n); PIG50(o);PIG54(p); PIG55(q);GIG9(r); HLC-9(s);GIG18(t);MIG22(u) 원암 유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 IPTG 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아마이드 겔(PAGE)에서 전기영동한 결과이다.
본 발명은 암발생과 암전이 유발능을 나타내는 신규 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것이다.
인간을 포함한 고등동물들은 약 30,000 개의 유전자들을 갖고 있으나 이들중 약 15% 만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉, 발생, 분화, 항상성(homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화 및 아폽토시스(apoptosis; programmed cell death) 등이 결정된다(Liang, P. and A. B. Pardee, Science, 257: 967-971(1992)).
종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현들의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다.
예를 들면, 리앙과 파디(Liang and Pardee, 상기 문헌 참조)에 의해 제안된 mRNA 감별전개(differential display) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기(cell cycle)에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자(transcriptional regulatory gene) 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들의 상호 관련성의 규명에도 다양하게 활용되고 있다.
종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체부위의 소실(loss of chromosomal heterozygosity), 원암 유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다(Bishop, J. M., Cell, 64: 235-248(1991); 및 Hunter, T., Cell, 64: 249-270(1991)). 또한, 암의 10 내지 30%는 원암유전자가 증폭됨으로써 원암 유전자가 활성화되어 일어난다고 보고되어 있다.
원암유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 유방암의 발생기전을 원암 유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 세포 증식유도 유전자(proliferation-inducing gene; PIG)로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현이 증가된다는 것을 밝혀내었다. 상기 원암유전자는 유방암, 백혈병, 자궁암, 및 악성림프종등과 같은 다양한 암의 진단, 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 원암 유전자 및 그의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자에 의해 코드되는 단백질 및 그의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1;서열번호 5; 서열번호: 9;서열번호 13; 서열번호: 17;서열번호: 21;서열번호 25; 서열번호: 29;서열번호 33 서열번호: 37;서열번호: 41;서열번호 45; 서열번호: 49;서열번호 53;서열번호 57; 서열번호: 61;서열번호 65; 서열번호: 69;서열번호 73; 서열번호: 77; 또는 서열번호: 81의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공된다.
상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기의 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호: 2; 서열번호: 6; 서열번호: 10; 서열번호: 14; 서열번호: 18;서열번호: 22; 서열번호: 26; 서열번호: 30; 서열번호: 34; 서열번호: 38;서열번호: 42; 서열번호: 46; 서열번호: 50; 서열번호: 54;서열번호: 58; 서열번호: 62; 서열번호: 66; 서열번호: 70; 서열번호: 74; 서열번호: 78; 또는 서열번호: 82의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
1. PIG12
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 12(proliferation-inducing gene 12; PIG12, “이후 PIG12 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 1로 나타낸 바와 같은 1258 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 68 내지 1252 부위(1250-1252: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 2에 나타나 있으며 394개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG12 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 394개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2와 같은 서열을 가지며 크기는 약 46 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미 노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
2.PIG18
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 세포 성장 유도 유전자 18 (human proliferation-inducing gene 18; 이후 PIG18로 지칭함)은 서열번호: 5로 기재되는 1024 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 5의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 875 내지 1063 부위 (1061-1063: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 6에 나타나 있으며 62개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "PIG18A 단백질"로 지칭함).
서열번호: 5의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY771596 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_001992호인 Homo sapiens 응고 인자(coagulation factor) II (thrombin) receptor (F2R) 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG18 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 5의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 6과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 5와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 62개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 7 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
3. PIG23
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 세포 성장 유도 유전 자 23 (human proliferation-inducing gene 23; 이후 PIG23으로 지칭함)은 서열번호: 9로 기재되는 2150 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 9의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 25 내지 1953 부위 (1951-1953: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 10에 나타나 있으며 642개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "PIG23 단백질"로 지칭함).
서열번호: 9의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY826819 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_016166 호인 Homo sapiens 활성화된 STAT, 1의 단백질 저해제(PIAS1) 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG23 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 9의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리 뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 10과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 9와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 642개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 70 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
4. PIG27
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 세포 성장 유도 유전자 27 (human proliferation-inducing gene 27; 이후 PIG27로 지칭함)은 서열번호: 13으로 기재되는 446 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 13의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 20 내지 337 부위 (335-337: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 14에 나타나 있으 며 105개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "PIG27 단백질"로 지칭함).
서열번호: 13의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY453399 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 CR456487호인 Homo sapiens DNAL4 전장 오픈 리딩 프레임(ORF) cDNA clone 유전자 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 이들 유전자의 기능은 아직 확인되지 않고 있다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG27 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 13의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 14와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 13과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 105개의 아미노산으로 이루 어져 있고 서열번호: 14로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 12 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
5. PIG28
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 세포 성장 유도 유전자 28 (human proliferation-inducing gene 28; 이후 PIG28로 지칭함)은 서열번호: 17로 기재되는 1024 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 17의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 33 내지 998 부위 (996-998: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 18에 나타나 있으며 321개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "PIG28 단백질"로 지칭함).
서열번호: 17의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY453398 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_001153호인 Homo sapiens annexin A4 (ANXA4) 유전자와 제 BC000182호인 Homo sapiens annexin A4 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG28 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 17의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 18과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 17과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 321개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 18로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 36 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적 으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
6. PIG30
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 30(proliferation-inducing gene 30; PIG30, “이후 PIG30 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 21로 나타낸 바와 같은 2152 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 21의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 6 내지 2150 부위(2148-2150: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 22에 나타나 있으며 714개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG30 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 21의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서 열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 714개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 22와 같은 서열을 가지며 크기는 약 82 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
7. PIG31
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 31(proliferation-inducing gene 31; PIG31, “이후 PIG31 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 25로 나타낸 바와 같은 2246 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 25의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 37 내지 2232 부위(2230-2232: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 26에 나타나 있으며 731개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG31 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코 딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 25의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 731개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 26과 같은 서열을 가지며 크기는 약 83 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
8. PIG38
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 38(proliferation-inducing gene 38; PIG38, “이후 PIG38 원암유전자로 지칭함”) 는 서열번호: 29로 나타낸 바와 같은 1973 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 29의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 25 내지 1956 부위(1954-1956: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 30에 나타나 있으며 643개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG38 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 29의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 643개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 30과 같은 서열을 가지며 크기는 약 73 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
9. PIG40
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 세포 성장 유도 유전자 40 (human proliferation-inducing gene 40; 이후 PIG40으로 지칭함)은 서열번호: 33으로 기재되는 1586 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 33의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 36 내지 1541 부위 (1539-1541: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 34에 나타나 있으며 501개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "PIG40 단백질"로 지칭함).
서열번호: 33의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY762100 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_001349호인 Homo sapiens 아스파틸-tRNA 신쎄테이즈(DARS) 유전자 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 백혈병을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG40 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 33의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 34와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 33과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 501개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 34로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 57 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
10. PIG43
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 43(proliferation-inducing gene 43; PIG43, “이후 PIG43 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 37로 나타낸 바와 같은 1245 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 37의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 57 내지 758 부위(756-758: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 38에 나타나 있으며 233개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG43 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 37의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 233개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 38과 같은 서열을 가지며 크기는 약 26 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백 질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
11. PIG44
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 44(proliferation-inducing gene 44; PIG44, “이후 PIG44 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 41로 나타낸 바와 같은 1721 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 41의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 55 내지 1512 부위(1510-1512: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 42에 나타나 있으며 485개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG44 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 41의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴 리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 485개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 42와 같은 서열을 가지며 크기는 약 55 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
12. PIG46
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 46(proliferation-inducing gene 46; PIG46, “이후 PIG46 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 45로 나타낸 바와 같은 1312 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 45의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 5 내지 1297 부위(1295-1297: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 46에 나타나 있으며 430개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG46 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 45의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 430개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 46과 같은 서열을 가지며 크기는 약 48 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
13. PIG47
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 47(proliferation-inducing gene 47; PIG47, “이후 PIG47 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 49로 나타낸 바와 같은 827 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 49의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 56 내지 826 부위(824-826: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 50에 나타나 있으며 256개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG47 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 49의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 256개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 50과 같은 서열을 가지며 크기는 약 29 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
14. PIG48
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 48(proliferation-inducing gene 48; PIG48, “이후 PIG48 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 53으로 나타낸 바와 같은 1707 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 53의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 57 내지 1694 부위(1692-1694: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 54에 나타나 있으며 545개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG48 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명 은 상기 서열번호: 53의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 545개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 54와 같은 서열을 가지며 크기는 약 60 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
15. PIG50
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 50(proliferation-inducing gene 50; PIG50, “이후 PIG50 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 57로 나타낸 바와 같은 643 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 57의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 2 내지 595 부위(593-595: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 58에 나타나 있으며 197 개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG50 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 57의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 197개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 58과 같은 서열을 가지며 크기는 약 22 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
16.PIG54
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 54(proliferation-inducing gene 54; PIG54, “이후 PIG54 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 61로 나타낸 바와 같은 1936 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 61의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 38 내지 1840 부위(1838-1840: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 62에 나타나 있으며 600개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG54 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 61의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 600개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 62와 같은 서열을 가지며 크기는 약 69 kDa이다. 그러나, 상 기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
17. PIG55
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 세포 증식유도 유전자 55(proliferation-inducing gene 55; PIG55, “이후 PIG55 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 65로 나타낸 바와 같은 526 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 65의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 15 내지 485 부위(483-485: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 66에 나타나 있으며 156개의 아미노산으로 이루어져 있다(“PIG55 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 65의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 156개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 66과 같은 서열을 가지며 크기는 약 18 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
18.GIG9
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 원암유전자 GIG9은 서열번호: 69로 기재되는 1008 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 69의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 1 내지 1008 부위 (1006-1008: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 70에 나타나 있 으며 335개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "GIG9 단백질"로 지칭함).
서열번호: 69의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY453396 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_016930호인 Homo sapiens syntaxin 18 (STX18) 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 GIG9 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 69의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 70과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 69와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 335개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 70으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 38 kDa이 다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
19.HLC-9
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 Human lung cancer-associated gene 9 (이후 “HLC9 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 73으로 나타낸 바와 같은 1382 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 73의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 27 내지 1370 부위(1368-1370: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 74에 나타나 있으며 447개의 아미노산으로 이루어져 있다(이후“HLC9 단백질”로 지칭함).
서열번호: 73의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY189686 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 5월 1일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_002717호인 Homo sapiens 단백질 포스페테이즈 2 (formerly 2A), 조절 소단위체 B (PR 52), 알파 이소폼 (PPP2R2A)유전자 등과 일부 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 HLC9 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 73의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 HLC9으로부터 발현되는 단백질은 447개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 74와 같은 서열을 가지며 크기는 약 51 kDa이다.
그러나, 상기 단백질들의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질들과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게 는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
20.GIG18
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 GIG18 유전자 (“이후 GIG18 원암유전자로 지칭함”)는 서열번호: 77로 나타낸 바와 같은 1301 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 77의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 3 내지 1244 부위(1242-1244: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 78에 나타나 있으며 413개의 아미노산으로 이루어져 있다(“GIG18 단백질”).
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 77의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 413개의 아미노산으로 이루 어져 있고 서열번호: 78과 같은 서열을 가지며 크기는 약 46 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
21.MIG22
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 이동 유도유전자 14 (human migration-inducing gene 22; MIG22, 이후 “MIG22 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 81로 기재되는 749 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 81의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 15 내지 734 부위 (732-734: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 82에 나타나 있으며 239개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "MIG22 단백질"로 지칭함).
서열번호: 81의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY771595 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 D45248호 유전자와 제 BC072025호인 유전자와 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 기 보고된 RAE1 유전자의 기 능과는 달리 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 MIG22 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 81의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 82와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 81과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 239개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 82로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 27 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으 로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 PIG 전장 cDNA를 발현 벡터 pBAD/Thio-Topo (Invitrogen, USA)에 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질전환시켜, 형질전환체를 얻을 수 있다.
벡터의 제작시에는, 상기 원암 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.
본 발명의 유전자는 노던 블롯(northern blot) 등의 분석방법에서 정상 유방조직에서는 발현이 거의 확인되지 않은 반면 유방암 조직과 유방암 세포주들에서는 그 과발현이 확인되므로 유방암을 유발시키는 강력한 발암 유전자로 판단된다. 유방암과 같은 상피성 조직외에도, 본 발명의 원암 유전자는 유방암, 백혈병, 자궁암, 및 악성림프종등과 같은 많은 다른 암 종양들에서 높게 발현된다. 따라서, 본 발명의 원암유전자는 다양한 암의 발생에 공통된 발암유전자일 것으로 판단되며, 다양한 암의 진단, 형질전환된 동물의 제조 및 안티-센스(anti-sense) 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
상기 원암 유전자를 이용한 암의 진단 방법은, 예를 들어, 상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 이를 검출하므로써 대상자가 본 발명의 원암 유전자를 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 암 진단용 키트를 역시 제공한다.
형질전환 동물은 본 발명의 원암 유전자를 포유동물, 예를 들어, 래트 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 원암 유전자로부터 유도되는 단백질은 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 원암 유전자로부터 발현된 서열번호: 2; 서열번호: 6; 서열번호: 10; 서열번호: 14; 서열번호: 18; 서열번호: 22; 서열번호: 26; 서열번호: 30; 서열번호: 34; 서열번호: 38; 서열번호: 42;서열번호: 46; 서열번호: 50; 서열번호: 54; 서열번호: 58; 서열번호: 62; 서열번호: 66; 서열번호: 70; 서열번호: 74; 서열번호: 78; 또는 서열번호: 82의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당분야에 공지된 효소 면역측정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 원암 유전자를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 예를 들어, 상기 원암 유전자가 형질도입된 섬유모세포를 이용하여 누드 마우스 등에 형성시킨 종양조직으로부터 제조할 수 있다. 이러한 암 세포주는 항암제 등의 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 종양세포 배양 및 총 RNA의 분리
1-1; PIG12 , PIG30 , PIG31 , PIG46 , PIG47 , PIG48 , PIG50 , PIG55
(단계 1) 종양세포 배양
mRNA의 감별 전개를 위하여, 유방적출술(mastectomy)을 받은 유방암 환자로부터 정상유방 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지않은 유방암 환자로부터 수술시에 원발성 유방 종양조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 유방암 세포주로 MCF-7 (American Type Culture Collection; ATCC Number HTB-22) 유방 암세포주를 사용하였다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 도중의 세포들로서 트리판 블루(trypan blue) 염료로 염색할 때 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다(프레쉬니(Freshney), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York(1987) 참조).
(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법
상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트(Qiagen Inc., 독일)을 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 유방 조직, 원발성 유방암조직, 및 MCF-7 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트(Message clean kit)(GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.
1-2;PIG18, PIG23 , PIG27 , PIG28,GIG9
(단계 1) 종양세포의 배양
mRNA의 감별 전개를 위하여, 자궁적출술 (hysterectomy)을 받은 자궁근종 환자로부터 정상자궁경부 (exocervical) 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지 않은 자궁암 환자로부터 수술시에 원발성 자궁경부 종양조직 및 전이 임파절 종양조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 자궁경부암 세포주로 CUMC-6 (Kim, J. W. et al., Gynecol. Oncol . 62: 230-240, 1996)을 사용하였다.
상기 수득된 조직 및 CUMC-6 세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청 (Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰 (Waymouth's) MB 752/1 배양액 (Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 과정의 세포들로서 트리판 블루 (trypan blue) 염색에 의해 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다 (Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York, 1987).
(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법
상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트 (Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트 (Message clean kit, GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.
1-3; PIG38 , PIG43 , PIG44,PIG54,GIG18
(단계 1) 종양세포 배양
mRNA의 감별 전개를 위하여, 간 조직생검 (liver biopsy)을 받은 환자로부터 정상간 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지않은 간암 환자로부터 조직생검시에 원발성 간 종양조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 간암 세포주로 HepG2 (American Type Culture Collection) 간암세포주를 사용하였다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 도중의 세포들로서 트리판 블루(trypan blue) 염료로 염색할 때 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다(프레쉬니(Freshney), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York(1987) 참조).
(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법
상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트(Qiagen Inc., 독일)을 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 간 조직, 원발성 간암조직, 및 HepG2 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트(Message clean kit)(GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.
1-4; PIG40
(단계 1) 종양세포의 배양
mRNA의 감별 전개를 위하여, 정상인의 말초혈액 (peripheral blood leukocytes) 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지 않은 백혈병환자로부터 골수조직생검사 (bone marrow biopsy)에 원발성 백혈병 골수조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 만성 골수성 백혈병 세포주로 K-562 (Americal Type Cell Collection; ATCC Number CCL-243)를 사용하였다.
상기 수득된 조직 및 K-562 세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청 (Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰 (Waymouth's) MB 752/1 배양액 (Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 과정의 세포들로서 트리판 블루 (trypan blue) 염색에 의해 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다 (Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York, 1987).
(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법
상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트 (Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 단계 1에서 얻은 정상인의 말초혈액 (peripheral blood leukocytes), 원발성 백혈병 골수조직 및 인간 만성 골수성 백혈병 세포주로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트 (Message clean kit, GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.
1-5;HLC-9,MIG22
(단계 1) 종양세포 배양
mRNA의 감별 전개를 위하여, 정상 폐조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지않은 폐암 환자로부터 수술시에 원발성 폐암조직 및 우측 폐에 전이된 암조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 폐암 세포주로 A549(American Type Culture Collection; ATCC Number CCL-185)를 사용하였다.
상기 수득된 조직 및 A549 폐암세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청(Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰(Waymouth's) MB 752/1 배양액(Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 도중의 세포들로서 트리판 블루(trypan blue) 염료로 염색할 때 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다(프레쉬니(Freshney), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York(1987) 참조).
(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법
상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트(Qiagen Inc., 독일)을 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 폐조직, 원발성 폐암조직, 전이된 폐암조직 및 A549 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트(Message clean kit)(GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.
실시예 2: 감별 전개 역전사 중합효소 연쇄반응(differential display reverse transcription(DDRT)-PCR)
감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.
2-1; PIG12
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 3의 H-T11A 고정 프라이머 (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’)를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5mM [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5‘ 13프라이머(RNAimage primer sets 1-5, H-AP 1-40들중 H-AP21 프라이머(서열번호: 4) (5’-AAGCTTTCTCTGG-3’)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장(final extension)을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.
PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 262 염기쌍(bp) 크기의 밴드, FC21 cDNA (서열번호: 1의 913-1174 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 FC21 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-2; PIG18
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 7로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, 및 서열번호: 8로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP11 프라이머 (5'-AAGCTTCGGGTAA-3')를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 277 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, MC113 cDNA (서열번호: 5의 2023-2299 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 MC113 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-3; PIG23
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 11로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, 및 서열번호: 12로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP33 프라이머 (5'-AAGCTTGCTGCTC-3')를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 278 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, CA338d cDNA (서열번호: 9의 1822-2099 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 CA338d cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상 기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-4; PIG27
올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 15로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP12 프라이머 (5'-AAGCTTGAGTGCT-3')를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 177 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H124 cDNA (서열번호: 13의 243-419 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H124 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-5; PIG28
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 19로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)및 서열번호: 20으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP12 프라이머 (5'-AAGCTTGAGTGCT-3')를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 232 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H122 cDNA (서열번호: 17의 748-979 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H122 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-6; PIG30
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 23으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, 및 서열번호: 24로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP33 프라이머 (5'-AAGCTTGCTGCTC-3')를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 271 염기쌍(bp) 크기의 밴드, FC23 cDNA (서열번호: 21의 1823-2093 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 FC23 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-7; PIG31
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 27의 H-T11G 고정 프라이머 (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’) 및 서열번호: 28로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP34 프라이머 (5’-AAGCTTCAGCAGC-3’)를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 312 염기쌍(bp) 크기의 밴드, FC34 cDNA (서열번호: 25의 1884-2195 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 FC34 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-8; PIG38
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 31의 H-T11C 고정 프라이머 (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’) 및 서열번호: 32로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP10 프라이머(5’-AAGCTTCCACGTA-3’)를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 267 염기쌍(bp) 크기의 밴드, HP103 cDNA (서열번호: 29의 1633-1899 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 HP103 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-9; PIG40
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 35의 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)
및 서열번호: 36으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP11 프라이머 (5'-AAGCTTCGGGTAA-3')를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 215 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, GV11 cDNA (서열번호: 33의 1313-1527 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 GV11 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-10; PIG43
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 39의 H-T11G 고정 프라이머 (5’ -AAGCTTTTTTTTTTTG-3’) 및 서열번호: 40으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP11 프라이머(5’-AAGCTTCGGGTAA-3’)를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 321 염기쌍(bp) 크기의 밴드, HP11 cDNA (서열번호: 37의 879-1199 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 HP11 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-11; PIG44
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 43의 H-T11C 고정 프라이머 (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’)및 서열번호: 44로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP23 프라이머(5’-AAGCTTGGCTATG-3’)를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 311 염기쌍(bp) 크기의 밴드, HP23 cDNA (서열번호: 41의 1633-1899 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 HP23 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-12; PIG46
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 47의 H-T11A 고정 프라이머 (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’)및 서열번호: 48로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP24 프라이머(5’-AAGCTTCACTAGC-3’)를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 256 염기쌍(bp) 크기의 밴드, FC24 cDNA (서열번호: 45의 992-1247 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 FC24 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-13; PIG47
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 51의 H-T11C 고정 프라이머 (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’) 및 서열번호: 52로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP5 프라이머(5’-AAGCTTAGTAGGC-3’)를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 192 염기쌍(bp) 크기의 밴드, FC54 cDNA (서열번호: 49의 587-778 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 FC54 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-14; PIG48
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 55의 H-T11A 고정 프라이머 (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’) 및 서열번호: 56으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP7 프라이머(5’-AAGCTTAACGAGG-3’)를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 272 염기쌍(bp) 크기의 밴드, FC71 cDNA (서열번호: 53의 1348-1619 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 FC71 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-15; PIG50
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 59의 H-T11C 고정 프라이머 (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’) 및 서열번호: 60으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP5 프라이머(5’-AAGCTTAGTAGGC-3’)를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 182 염기쌍(bp) 크기의 밴드, BBCC5-5 cDNA (서열번호: 57의 418-599 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 BBCC5-5 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-16;PIG54
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 63의 H-T11A 고정 프라이머 (5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’) 및 서열번호: 64로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP15 프라이머(5’-AAGCTTACGCAAC-3’)를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 345 염기쌍(bp) 크기의 밴드, HP15 cDNA (서열번호: 61의 1533-1877 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 HP15 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기 와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-17; PIG55
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 67의 H-T11G 고정 프라이머 (5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’)및 서열번호: 68로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP4 프라이머(5’-AAGCTTCTCAACG-3’)를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 186 염기쌍(bp) 크기의 밴드, FC4 cDNA (서열번호: 65의 292-477 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 FC4 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-18;GIG9
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 71의 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 72로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP14 프라이머 (5'-AAGCTTGGAGCTT-3')를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 221 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H148 cDNA (서열번호: 69의 769-989 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H148 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-19;HLC-9
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 75의 H-T11G (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3') 및 서열번호: 76으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP7 프라이머(5'-AAGCTTAACGAGG-3')를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 322 염기쌍(bp) 크기의 밴드, L738 cDNA (서열번호: 73의 1007-1328 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L738 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-20;GIG18
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 79의 H-T11C 고정 프라이머 (5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’) 및 서열번호: 80으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP4 프라이머(5’-AAGCTTCTCAACG-3’)를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 321 염기쌍(bp) 크기의 밴드, HP47 cDNA (서열번호: 77의 879-1199 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 HP47 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-21;MIG22
고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 83의 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 84로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP6 프라이머 (5'-AAGCTTGCACCAT-3')를 사용한 것을 제외하곤 2-1과 동일한 과정을 거쳐서 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 327 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, L690 cDNA (서열번호: 81의 273-599 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L690 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
실시예 3: 클로닝
상기에서 얻은 재증폭된 FC21;MC113;CA338d;H124;H122;FC23; FC34;HP103;GV11;HP11;HP23;FC24;FC54;FC71;BBCC5-5;HP15;FC4;H148;L738;HP47;또는L690 PCR 산물을 TA클로닝 시스템(Promega, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 pGEM-T 이지(EASY) 벡터에 삽입하였다.
(단계 1) 연결반응
실시예 2에서 얻은 재증폭된 FC21 ;MC113;CA338d ;H124 ;H122 ;FC23; FC34;HP103 ;GV11 ;HP11 ;HP23 ;FC24 ;FC54 ;FC71 ;BBCC5-5 ;HP15;FC4;H148;L738 ;HP47;또는 L690 PCR 산물 2㎕, pGEM-T 이지 벡터(50 ng) 1 ㎕, T4 DNA 연결효소 10X 완충액 1㎕ 및 T4 DNA 연결효소(3 weiss units/ul; T4 DNA ligase, Promega) 1 ㎕를 0.5㎖ 시험관에 넣은 후, 증류수를 가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 하였다. 연결 반응 혼합물은 14℃에서 밤새 배양하였다.
(단계 2) TA 클로닝 형질전환
대장균 JM109(Promega, WI, USA)를 10 ㎖의 LB 브로쓰(박토-트립톤 10 g, 박토-효모 추출물 5 g, NaCl 5 g) 중에서 600㎚에서의 광학밀도 값이 약 0.3 - 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양 혼합물을 얼음에 약 10분간 방치한 후, 4℃에서 10 분간 4000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 수집하였다. 수집한 세포 펠릿을 10 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl2에 30분 내지 1시간 가량 노출시켜 컴피턴트(competent) 세포를 제조하였다. 결과물을 4℃, 4000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 모아서 2 ml의 빙냉 0.1 M CaCl2에 현탁시켰다.
컴피턴트 세포 현탁액 200 ㎕를 새로운 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브에 옮기고, 여기에 단계 1에서 제조한 연결 반응 산물 2㎕를 가하였다. 혼합물을 42℃의 수욕(water bath)에서 90초간 배양시킨 후, 0℃에서 급냉시켰다. 여기에, SOC 배지(박토-트립톤 2.0 g, 박토-효모 추출물 0.5 g, 1 M NaCl 1 ml, 1 M KCl 0.25 ml, TDW 97 ml, 2M Mg2+ 1 ml, 2 M 글루코스 1 ml) 800 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 220 rpm의 회전진탕 배양기에서 45분간 배양시켰다.
37℃ 배양기에 미리 넣어둔, 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 X-gal(40㎎/㎖ 디메틸포름아미드에 저장) 25 ㎕를 유리봉으로 확산시킨 후, 여기에 25 ㎕의 형질전환된 세포를 넣어서 다시 유리봉으로 확산시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 형성된 백색 콜로니를 3-4개 선택하여 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 각각의 선택된 클론들을 심었다. 플라스미드를 제조하기 위하여 이들 중 삽입이 확인된 콜로니, 즉, 형질전환된 대장균 JM109/FC21 ; JM109/MC113;JM109/CA338d ; JM109/H124 ; JM109/H122; JM109/FC23; JM109/FC34; JM109/HP103 ; JM109/GV11 ; JM109/HP11 ; JM109/HP23;JM109/FC24;JM109/FC54; JM109/FC71 ; JM109/BBCC5-5 ; JM109/HP15;JM109/FC4;JM109/H148;JM109/L738;JM109/HP47;또는 JM109/L690을 선택하여 10 ml의 테리픽 브로쓰(terrific broth; TDW 900 ml, 박토-트립톤 12 g, 박토-효모 추출물 24 g, 글리세롤 4 ml, 0.17 M KH2PO4, 0.72 N K2HPO4 100 ml)에서 배양하였다.
실시예 4: 재조합 플라스미드 DNA의 분리
위저드 플러스 미니프렙스 DNA 정제 키트(WizardTM Plus Minipreps DNA Purificatin Kit, Promega, USA)를 사용해서 제조사의 지시에 따라 형질전환된 대장균으로부터 FC21 플라스미드 DNA를 분리하였다.
분리된 플라스미드 DNA의 일부를 ECoRI 효소로 처리한 후, 2% 겔에서 전기영동을 실시하여 FC21; MC113;CA338d; H124 ;H122 ;FC23; FC34;HP103 ;GV11 ;HP11 ;HP23 ;FC24 ;FC54 ;FC71 ;BBCC5-5 ;HP15;FC4;H148;L738;HP47;또는 L690 부분서열이 플라스미드에 삽입되었음을 확인하였다.
실시예 5: DNA 염기서열 분석
실시예 2에서 수득한 FC21; MC113;CA338d; H124 ;H122 ;FC23; FC34;HP103 ;GV11 ;HP11;HP23 ;FC24 ;FC54 ;FC71 ;BBCC5-5 ;HP15;FC4;H148;L738;HP47;또는 L690 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR시킨 후, 클로닝되고 재증폭된 FC21; MC113;CA338d; H124 ;H122 ;FC23 ; FC34;HP103 ;GV11 ;HP11;HP23 ;FC24 ;FC54 ;FC71 ;BBCC5-5 ;HP15;FC4;H148;L738;HP47;또는 L690 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 913 내지 1174에 해당하며, 본원에서 “FC21”으로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP21 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 262 bp cDNA 단편, 즉, FC21을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 정상 유방 조직, 유방암 조직 및 MCF-7 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1a에서 알 수 있는 바와 같이, 262 bp cDNA 단편인 FC21은 유방 암, 및 MCF-7 암 세포에서는 강하게 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 아주 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 5의 뉴클레오티드 번호 2023 내지 2299에 해당하며, 본 발명에서는 "MC113"으로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP11 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 277 bp cDNA 단편, 즉, MC113을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1b에서 알 수 있는 바와 같이, 277 bp cDNA 단편인 MC113은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 번호 1822 내지 2099에 해당하며, 본 발명에서는 "CA338d"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP33 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 278 bp cDNA 단편, 즉, CA338d 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1c에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1c에서 알 수 있는 바와 같이, 278 bp cDNA 단편인 CA338d는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 13의 뉴클레오티드 번호 243 내지 419에 해당하며, 본 발명에서는 "H124"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP12 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 177 bp cDNA 단편, 즉, H124 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1d에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1d에서 알 수 있는 바와 같이, 177 bp cDNA 단편인 H124는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 17의 뉴클레오티드 번호 748 내지 979에 해당하며, 본 발명에서는 "H122"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP12 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 232 bp cDNA 단편, 즉, H122 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1e에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1e에서 알 수 있는 바와 같이, 232 bp cDNA 단편인 H122는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 21의 뉴클레오티드 번호 1823 내지 2093에 해당하며, 본원에서 “FC23”으로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP23 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 271 bp cDNA 단편, 즉, FC23을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1f에 나타낸 바와 같이, 정상 유방 조직, 유방암 조직 및 MCF-7 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1f에서 알 수 있는 바와 같이, 271 bp cDNA 단편인 FC23은 유방 암, 및 MCF-7 암 세포에서는 강하게 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 아주 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 25의 뉴클레오티드 번호 1884 내지 2195에 해당하며, 본원에서 “FC34”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP34 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 312 bp cDNA 단편, 즉, FC34를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1g에 나타낸 바와 같이, 정상 유방 조직, 유방암 조직 및 MCF-7 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1g에서 알 수 있는 바와 같이, 312 bp cDNA 단편인 FC34는 유방 암, 및 MCF-7 암 세포에서는 강하게 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 아주 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 29의 뉴클레오티드 번호 1633 내지 1899에 해당하며, 본원에서 “HP103”으로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP10 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 267 bp cDNA 단편, 즉, HP103을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1h에 나타낸 바와 같이, 정상 간 조직, 간암 조직 및 HepG2 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1h에서 알 수 있는 바와 같이, 267 bp cDNA 단편인 HP103은 간암, 및 HepG2 암 세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 되지 않거나 없었다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 33의 뉴클레오티드 번호 1313 내지 1527에 해당하며, 본 발명에서는 "GV1"으로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP11 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 215 bp cDNA 단편, 즉, GV11을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1i에 나타낸 바와 같이, 정상 말초혈액 조직, 백혈병 조직 및 K-562 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1i에서 알 수 있는 바와 같이, 215 bp cDNA 단편인 GV11은 백혈병 조직 및 K-562 세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 37의 뉴클레오티드 번호 879 내지 1199에 해당하며, 본원에서 “HP11”으로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP11 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 321 bp cDNA 단편, 즉, HP11을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1j에 나타낸 바와 같이, 정상 간 조직, 간암 조직 및 HepG2 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1j에서 알 수 있는 바와 같이, 321 bp cDNA 단편인 HP11은 간암, 및 HepG2 암 세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 되지 않거나 없었다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 41의 뉴클레오티드 번호 1369 내지 1679에 해당하며, 본원에서 “HP23”으로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP23 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 311 bp cDNA 단편, 즉, HP23을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1k에 나타낸 바와 같이, 정상 간 조직, 간암 조직 및 HepG2 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1k에서 알 수 있는 바와 같이, 311 bp cDNA 단편인 HP23은 간암, 및 HepG2 암 세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 되지 않거나 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 45의 뉴클레오티드 번호 992 내지 1247에 해당하며, 본원에서 “FC24”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP24 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 256 bp cDNA 단편, 즉, FC24를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1(l)에 나타낸 바와 같이, 정상 유방 조직, 유방암 조직 및 MCF-7 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1(l)에서 알 수 있는 바와 같이, 256 bp cDNA 단편인 FC24는 유방 암, 및 MCF-7 암 세포에서는 강하게 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 아주 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 49의 뉴클레오티드 번호 587 내지 778에 해당하며, 본원에서 “FC54”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP5 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 192 bp cDNA 단편, 즉, FC54를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1m에 나타낸 바와 같이, 정상 유방 조직, 유방암 조직 및 MCF-7 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1m에서 알 수 있는 바와 같이, 192 bp cDNA 단편인 FC54는 유방 암, 및 MCF-7 암 세포에서는 강하게 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 아주 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 53의 뉴클레오티드 번호 1348 내지 1619에 해당하며, 본원에서 “FC71”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP7 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 272 bp cDNA 단편, 즉, FC71을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1n에 나타낸 바와 같이, 정상 유방 조직, 유방암 조직 및 MCF-7 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1n에서 알 수 있는 바와 같이, 272 bp cDNA 단편인 FC71은 유방암, 및 MCF-7 암 세포에서는 강하게 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 아주 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 57의 뉴클레오티드 번호 418 내지 599에 해당하며, 본원에서 “BBCC5-5”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP5 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 182 bp cDNA 단편, 즉, BBCC5-5를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1(o)에 나타낸 바와 같이, 정상 유방 조직, 유방암 조직 및 MCF-7 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1(o)에서 알 수 있는 바와 같이, 182 bp cDNA 단편인 BBCC5-5는 유방 암, 및 MCF-7 암 세포에서는 강하게 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 아주 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 61의 뉴클레오티드 번호 1533 내지 1877에 해당하며, 본원에서 “HP15”으로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP15 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 345 bp cDNA 단편, 즉, HP15를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1p에 나타낸 바와 같이, 정상 간 조직, 간암 조직 및 HepG2 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1p에서 알 수 있는 바와 같이, 345 bp cDNA 단편인 HP15는 간암, 및 HepG2 암 세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 되지 않거나 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 65의 뉴클레오티드 번호 292 내지 477에 해당하며, 본원에서 “FC4”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP4 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 186 bp cDNA 단편, 즉, FC4를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1q에 나타낸 바와 같이, 정상 유방 조직, 유방암 조직 및 MCF-7 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1q에서 알 수 있는 바와 같이, 186 bp cDNA 단편인 FC4는 유방 암, 및 MCF-7 암 세포에서는 강하게 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 아주 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 69의 뉴클레오티드 번호 769 내지 989에 해당하며, 본 발명에서는 "H148"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP14 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 221 bp cDNA 단편, 즉, H148을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1r에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1r에서 알 수 있는 바와 같이, 221 bp cDNA 단편인 H148은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 73의 뉴클레오티드 번호 1007 내지 1328에 해당하며, 본원에서 “L738”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP7 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 322 bp cDNA 단편, 즉, L738을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1s에 나타낸 바와 같이, 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1s에서 알 수 있는 바와 같이, 322 bp cDNA 단편인 L738은 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암 세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현되지 않거나 매우 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 77의 뉴클레오티드 번호 879 내지 1199에 해당하며, 본원에서 “HP47”으로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP4 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 321 bp cDNA 단편, 즉, HP47을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1t에 나타낸 바와 같이, 정상 간 조직, 간암 조직 및 HepG2 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확 인되었다. 도 1t에서 알 수 있는 바와 같이, 321 bp cDNA 단편인 HP47은 간암, 및 HepG2 암 세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 약하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 81의 뉴클레오티드 번호 273 내지 599에 해당하며, 본 발명에서는 "L690"으로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP6 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 327 bp cDNA 단편, 즉, L690을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1u에 나타낸 바와 같이, 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1u에서 알 수 있는 바와 같이, 327 bp cDNA 단편인 L690은 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현이 약하거나 발현되지 않았다. 암조직에서도 특히 전이암 조직에서 가장 발현이 높았다.
실시예 6: 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석
6-1; PIG12
32P-표지된 FC21을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1258 bp가 삽입된 전체 PIG12 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 2월 16일자로 AY550973 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31 일).
AY550973 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_006299호인 Homo sapiens 진크 핑거 단백질 193 (ZNF193)유전자 등과 서열이 유사하다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY550973 유전자는 특히 유방암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 유방암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG12 원암유전자를 발굴하게 되었다.
1258 bp로 이루어진 PIG12의 전체 서열은 서열번호: 1에 나타내었다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 68 내지 1252에 해당하며, 서열번호: 2의 394개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-2;PIG18
32P-표지된 MC113을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2403 bp가 삽입된 전체 PIG18 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 10월 5일자로 등재번호 제AY771596호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG18 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 PIG18 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG18 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
2403 bp로 이루어진 PIG18의 전체 염기서열은 서열번호: 5에 나타내었다.
서열번호: 5의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 875 내지 1063에 해당하며, 서열번호: 6의 62개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-3; PIG23
32P-표지된 CA338d를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2150 bp가 삽입된 전체 PIG23 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 10월 23일자로 등재번호 제AY826819호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG23 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 PIG23 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG23 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
2150 bp로 이루어진 PIG23의 전체 염기서열은 서열번호: 9에 나타내었다.
서열번호: 9의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 25 내지 1953에 해당하며, 서열번호: 10의 642개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-4; PIG27
32P-표지된 H124를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 446 bp가 삽입된 전체 PIG27 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 10월 30일자로 등재번호 제AY453399호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG27 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 PIG27 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG27 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
446 bp로 이루어진 PIG27의 전체 염기서열은 서열번호: 13에 나타내었다.
서열번호: 13의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 20 내지 337에 해당하며, 서열번호: 14의 105개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-5; PIG28
32P-표지된 H122를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1024 bp가 삽입된 전체 PIG28 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 10월 30일자로 등재번호 제AY453398호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG28 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 PIG28 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG28 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1024 bp로 이루어진 PIG28의 전체 염기서열은 서열번호: 17에 나타내었다.
서열번호: 17의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 33 내지 998에 해당하며, 서열번호: 18의 321개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-6; PIG30
32P-표지된 FC23을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2152 bp가 삽입된 전체 PIG30 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 2월 16일자로 AY550975 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31일).
AY550975 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_005186 호인 Homo sapiens calpain 1, (mu/I) 큰 소단위체(CAPN1)유전자와 서열이 유사하다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY550975 유전자는 특히 유방암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 유방암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG30 원암유전자를 발굴하게 되었다.
2152 bp로 이루어진 PIG30의 전체 서열은 서열번호: 21에 나타내었다.
서열번호: 21의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 6 내지 2150에 해당하며, 서열번호: 22의 714개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-7; PIG31
32P-표지된 FC34를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬 유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2246 bp가 삽입된 전체 PIG31 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 6월 3일자로 AY644768 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31일). AY644768 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 AF085199호인 Homo sapiens golgin-84 mRNA 유전자 등과 유전자 서열이 유사하다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY644768 유전자는 특히 유방암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 유방암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG31 원암유전자를 발굴하게 되었다.
2246 bp로 이루어진 PIG31의 전체 서열은 서열번호: 25에 나타내었다.
서열번호: 25의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 37 내지 2232에 해당하며, 서열번호: 26의 731개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-8; PIG38
32P-표지된 HP103을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1973 bp가 삽입된 전체 PIG38 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 12월 24일자로 AY513282 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31 일). AY513282 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 ACCESSION BC024178 호인 Homo sapiens 가설 단백질 FLJ10094 유전자 등과 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 이들 유전자들의 기능은 아직 밝혀져 있지 않다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY513282 유전자는 특히 간암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 간조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 간암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG38 원암유전자를 발굴하게 되었다.
1973 bp로 이루어진 PIG38의 전체 서열은 서열번호: 29에 나타내었다.
서열번호: 29의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 25 내지 1956에 해당하며, 서열번호: 30의 643개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-9; PIG40
32P-표지된 GV11을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1586 bp가 삽입된 전체 PIG40 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 9월 23일자로 등재번호 제AY762100호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG40 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 PIG40 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG40 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1586 bp로 이루어진 PIG40의 전체 염기서열은 서열번호: 33에 나타내었다.
서열번호: 33의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 36 내지 1541에 해당하며, 서열번호: 34의 501개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-10; PIG43
32P-표지된 HP11을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1245 bp가 삽입된 전체 PIG43 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 12월 25일자로 AY513283 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31일). AY513283 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_002065호인 Homo sapiens glutamate-ammonia ligase (glutamine synthase) (GLUL) 유전자 등과 서열이 유사하나 단백질이 다른 유전자이다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY513283 유전자는 특히 간암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 간조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 간암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매 우 증가된 PIG43 원암유전자를 발굴하게 되었다.
1245 bp로 이루어진 PIG43의 전체 서열은 서열번호: 37에 나타내었다.
서열번호: 37의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 57 내지 758에 해당하며, 서열번호: 38의 233개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-11; PIG44
32P-표지된 HP23을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1721 bp가 삽입된 전체 PIG44 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 12월 25일자로 AY513284 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31일). AY513282 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 AB037773 호인 Homo sapiens KIAA1352 단백질에 대한 mRNA 유전자 등과 유사하나 단백질이 다르다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY513284 유전자는 특히 간암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 간조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 간암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG44 원암유전자를 발굴하게 되었다.
1721 bp로 이루어진 PIG44의 전체 서열은 서열번호: 41에 나타내었다.
서열번호: 41의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 55 내지 1512에 해당하며, 서열번호: 42의 485개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-12; PIG46
32P-표지된 FC24를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1312 bp가 삽입된 전체 PIG46 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 9월 23일자로 AY762101 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31일). AY762101 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_000224호인 Homo sapiens keratin 18 (KRT18), 전사 변이체 1 유전자 등과 유전자 서열이 유사하다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY762101 유전자는 특히 유방암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하거나 없고 반면에 유방암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG46 원암유전자를 발굴하게 되었다.
1312 bp로 이루어진 PIG46의 전체 서열은 서열번호: 45에 나타내었다.
서열번호: 45의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 5 내지 1297에 해당하며, 서열번호: 46의 430개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-13; PIG47
32P-표지된 FC54를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬 유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 827 bp가 삽입된 전체 PIG47 cDNA 클론을 얻고, 이를 2005년 1월 1일자로 AY871272 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2006년 10월 1일). AY871272 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_001688 호인 Homo sapiens ATP 신테이즈, H+ 트랜스포팅, 미토콘드리아 F0 복함체 소단위체 b, 이소폼1 (ATP5F1) 과 유전자 서열이 유사하다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY871272 유전자는 특히 유방암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 유방암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG47 원암유전자를 발굴하게 되었다. 827 bp로 이루어진 PIG47의 전체 서열은 서열번호: 49에 나타내었다.
서열번호: 49의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 56 내지 826에 해당하며, 서열번호: 50의 256개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-14; PIG48
32P-표지된 FC71을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1707 bp가 삽입된 전체 PIG48 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 1월 12일자로 AY524046 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31일). AY524046 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_005998 호인 Homo sapiens TCP1 함유 샤페로닌, 소단위체 3 (gamma) (CCT3)유전자 등과 유전자 서열이 유사하다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY524046 유전자는 특히 유방암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 유방암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG48 원암유전자를 발굴하게 되었다.
1707 bp로 이루어진 PIG48의 전체 서열은 서열번호: 53에 나타내었다.
서열번호: 53의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 57 내지 1694에 해당하며, 서열번호: 54의 545개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-15; PIG50
32P-표지된 BBCC5-5를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 643 bp가 삽입된 전체 PIG50 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 2월 5일자로 AY542309 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31일). AY542309 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 AK000504호인 Homo sapiens cDNA FLJ20497 fis 유전자와 유사하다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY542309 유전자는 특히 유방암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 유방암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG50 원암유전자를 발굴하게 되었다.
643 bp로 이루어진 PIG50의 전체 서열은 서열번호: 57에 나타내었다.
서열번호: 57의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 2 내지 595에 해당하며, 서열번호: 58의 197개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-16;PIG54
32P-표지된 HP15를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1936 bp가 삽입된 전체 PIG44 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 2월 16일자로 AY550968 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31일). AY550968 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 BC041361호인 Homo sapiens SCC-112 단백질 유전자 등과 서열이 유사한 유전자이다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY550968 유전자는 특히 간암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 간조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 간암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG54 원암유전자를 발굴하게 되었다.
1936 bp로 이루어진 PIG54의 전체 서열은 서열번호: 61에 나타내었다.
서열번호: 61의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 38 내지 1840에 해당하며, 서열번호: 62의 600개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-17; PIG55
32P-표지된 FC4를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 526 bp가 삽입된 전체 PIG55 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 6월 2일자로 AY644767 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31일). AY644767 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_007362 호인 Homo sapiens 핵 캡 결합 단백질 소단위체 2, 20kDa (NCBP2)유전자 등과 유사하다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY644767 유전자는 특히 유방암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 유방조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 유방암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG55 원암유전자를 발굴하게 되었다.
526 bp로 이루어진 PIG55의 전체 서열은 서열번호: 65에 나타내었다.
서열번호: 65의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 15 내지 485에 해당하며, 서열번호: 66의 156개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-18;GIG9
32P-표지된 H148을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1008 bp가 삽입된 전체 GIG9 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 10월 29일자로 등재번호 제AY453396호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 GIG9 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 GIG9 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 GIG9 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1008 bp로 이루어진 GIG9의 전체 염기서열은 서열번호: 69에 나타내었다.
서열번호: 69의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 1 내지 1008에 해당하며, 서열번호: 70의 335개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-19;HLC-9
32P-표지된 L738을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝 한 결과 L738 cDNA 염기서열을 가지고 있는 전장 유전자들을 구하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 두종류의 전장 유전자들을 구하였으며 하나는 pCEV-LAC 벡터 중에 1382 bp가 삽입된 전체 HLC9 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 11월 30일자로 AY189686 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개일: 2004년 5월 1일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 HLC9 클론을 Not I 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드(phagemid) 벡터 형태로 분리하였다(상기 문헌 참조).
상기 HLC9 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 HLC9 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1382 bp로 이루어진 HLC9의 전체 서열은 서열번호: 73에 나타내었다.
서열번호: 73의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 27 내지 1370에 해당하며, 서열번호: 74의 447개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-20;GIG18
32P-표지된 HP47을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1301 bp가 삽입된 전체 GIG18 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 12월 24일자로 AY513279 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2005년 12월 31 일). AY513279 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_002079 호인 Homo sapiens 글루타믹-옥살로아세틱 트랜스아미네이즈 1, 수용성(아스파테이트 아미노트랜스퍼레이즈1) (GOT1), mRNA 유전자와 서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 AY513279 유전자는 특히 간암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 간조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 간암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 GIG18 원암유전자를 발굴하게 되었다. 1301 bp로 이루어진 GIG18의 전체 서열은 서열번호: 77에 나타내었다.
서열번호: 77의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 3 내지 1244에 해당하며, 서열번호: 78의 413개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-21;MIG22
32P-표지된 L690을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 749 bp가 삽입된 전체 MIG22 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 10월 5일자로 등재번호 제AY771595호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 MIG22 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 MIG22 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 MIG22 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
서열번호: 81의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 15 내지 734에 해당하며, 서열번호: 82의 239개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
실시예 7 : 다양한 세포에서의 원암 유전자의 노던 블롯 분석
7-1; PIG12 , PIG30 , PIG31 , PIG46 , PIG47 , PIG48 , PIG50 , PIG55
실시예 1-1에서와 같이, 정상 유방조직, 유방암 조직, 및 유방암 세포주 MCF-7으로부터 총 RNA를 추출하였다.
PIG 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막(Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 FC21 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계(densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴(actin)으로 표준화시켰다.
도 2a는 정상 유방 조직, 유방암조직 및 유방암 세포주(MCF-7)들에서 PIG12 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직 및 유방암 세포주인 MCF-7 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2a에서, 정상(Normal)열은 정상 유방 조직을, 암(Cancer)열은 유방암 조직을, 그리고 MCF-7열은 유방암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2a 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3a는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG12 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3a 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG12 mRNA(약 2.0 kb)은 여러 정상조직들에서 발현이 되지 않고 있다.
도 4a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG12 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4a 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG12는 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji 들에서는 강하게 발현되었으나 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 대장암세포주 SW480, 피부암세포주 G361 및 폐암세포주 A549 들에서는 발현이 없었다.
도 2f는 정상 유방 조직, 유방암조직 및 유방암 세포주(MCF-7)들에서 PIG30 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2f에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직 및 유방암 세포주인 MCF-7 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2f에서, 정상(Normal)열은 정상 유방 조직을, 암(Cancer)열은 유방암 조직을, 그리고 MCF-7열은 유방암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2f 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3f는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG30 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3f 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3f에서 알 수 있는 바와 같이, PIG30 mRNA(약 3.5 kb)은 여러 정상조직들에서 발현이 아주 약하였다.
도 4f는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG30 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4f 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4f에서 알 수 있는 바와 같이, PIG30은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강 하였다.
도 2g는 정상 유방 조직, 유방암조직 및 유방암 세포주(MCF-7)들에서 PIG31 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2g에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직 및 유방암 세포주인 MCF-7 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2g에서, 정상(Normal)열은 정상 유방 조직을, 암(Cancer)열은 유방암 조직을, 그리고 MCF-7열은 유방암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2g 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3g는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG31 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3g 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3g에서 알 수 있는 바와 같이, PIG31 mRNA(약 2.5 kb)은 여러 정상조직들에서 발현이 약하였다.
도 4g는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG31 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4g 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4g에서 알 수 있는 바와 같이, PIG31은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강하였다.
도 2(l)은 정상 유방 조직, 유방암조직 및 유방암 세포주(MCF-7)들에서 PIG46 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2(l)에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직 및 유방암 세포주인 MCF-7 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2(l)에서, 정상(Normal)열은 정상 유방 조직을, 암(Cancer)열은 유방암 조직을, 그리고 MCF-7열은 유방암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2(l) 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3(l)은 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG46 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3(l) 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3(l)에서 알 수 있는 바와 같이, PIG46 mRNA(약 1.4 kb)은 여러 정상조직들에서 발현이 아주 약하거나 없었다.
도 4(l)은 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG46 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4(l) 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4(l)에서 알 수 있는 바와 같이, PIG46 mRNA(약 1.4 kb)은 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 대장암세포주 SW480, 및 폐암세포주 A549 들에서는 발현이 강하였으나 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 없었다.
도 2m은 정상 유방 조직, 유방암조직 및 유방암 세포주(MCF-7)들에서 PIG47 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2m에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직 및 유방암 세포주인 MCF-7 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2m에서, 정상(Normal)열은 정상 유방 조직을, 암(Cancer)열은 유방암 조직을, 그리고 MCF-7열은 유방암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2m 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3m은 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG47 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3m 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3m에서 알 수 있는 바와 같이, PIG47 mRNA(약 1.3 kb)은 정상 심장과 근육조직에서는 발현이 되고 있으나 다른 여러 정상조직들에서 발현이 아주 약하였다.
도 4m은 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG47 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4m 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4m에서 알 수 있는 바와 같이, PIG47은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 및 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji 에서는 발현이 강하였으나 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 없었다.
도 2n은 정상 유방 조직, 유방암조직 및 유방암 세포주(MCF-7)들에서 PIG48 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2n에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직 및 유방암 세포주인 MCF-7 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2n에서, 정상(Normal)열은 정상 유방 조직을, 암(Cancer)열은 유방암 조직을, 그리고 MCF-7열은 유방암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2n 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3n은 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG48 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3n 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3n에서 알 수 있는 바와 같이, PIG48 mRNA(약 2.0 kb)은 여러 정상조직들에서 발현이 아주 약하거나 없었다.
도 4n은 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG48 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4n 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4n에서 알 수 있는 바와 같이, PIG48은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강하였다.
도 2(o)는 정상 유방 조직, 유방암조직 및 유방암 세포주(MCF-7)들에서 PIG50 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2(o)에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직 및 유방암 세포주인 MCF-7 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 관찰되지 않았다. 도 2에서, 정상(Normal)열은 정상 유방 조직을, 암(Cancer)열은 유방암 조직을, 그리고 MCF-7열은 유방암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2(o) 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3(o)는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG50 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3(o) 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3(o)에서 알 수 있는 바와 같이, PIG50 mRNA(약 1.0 kb)은 여러 정상조직들에서 발현이 아주 약하거나 없었다. 동시에 약 5.0 kb의 PIG50 mRNA 전사물도 아주 약하게 발현이 되고 있다.
도 4(o)는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG50 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4(o) 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4(o)에서 알 수 있는 바와 같이, PIG50은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강하였다. 동시에 약 5.0 kb의 PIG50 mRNA 전사물도 강하게 발현이 되고 있다.
도 2q는 정상 유방 조직, 유방암조직 및 유방암 세포주(MCF-7)들에서 PIG55 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2q에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직 및 유방암 세포주인 MCF-7 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2q에서, 정상(Normal)열은 정상 유방 조직을, 암(Cancer)열은 유방암 조직을, 그리고 MCF-7열은 유방암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2q 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3q는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG55 원암 유 전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3q 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3q에서 알 수 있는 바와 같이, PIG55 mRNA(약 3.0 kb)은 여러 정상조직들에서 발현이 아주 약하거나 없었다.
도 4q는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG55 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4q 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4q에서 알 수 있는 바와 같이, PIG55는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강하였다.
7-2;PIG18, PIG23 , PIG27 , PIG28,GIG9
실시예 1-2에서와 같이, 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁암 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주 CaSki (ATCC CRL 1550), CUMC-6으로부터 총 RNA를 추출하였다.
PIG 또는 GIG 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막 (Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II (Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 PIG23 전체 cDNA 프로브로 블롯을 혼성화시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.
도 2b는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 PIG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2b에서 알 수 있는 바와 같이, PIG18 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 5.0 kb의 우점(dominant) PIG18 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2b에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2b 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3b는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3b 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3b에서 알 수 있는 바와 같이, PIG18 mRNA (약 5.0 kb의 우점(dominant) PIG18 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현이 되거나 발현이 없었다. 또한 동시에 약 3.0 kb의 PIG18 mRNA 전사물도 정상 심장에서 아주 약하게 발현이 되었다.
도 4b는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4b 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4b에서 알 수 있는 바와 같이, PIG18 mRNA (약 5.0 kb의 우점(dominant) PIG18 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 동시에 약 3.0 kb의 PIG18 mRNA 전사물도 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4 들에서 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2c는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 PIG23 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2c에서 알 수 있는 바와 같이, PIG23 원암유전자는 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이조직 및 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 4.5 kb의 우점(dominant) PIG23 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2c에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세 포주를 나타낸다. 도 2c 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3c는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG23 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3c 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3c에서 알 수 있는 바와 같이, PIG23 mRNA (약 4.5 kb의 우점(dominant) PIG23 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현이 되거나 발현이 없었다.
도 4c는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG23 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4c 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4c에서 알 수 있는 바와 같이, PIG23 mRNA (약 4.5 kb의 우점(dominant) PIG23 mRNA 전사물)는 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 동시에 약 7.0 kb 및 2.0 kb의 PIG23 mRNA 전사물들도 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2d는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 PIG27 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2d에서 알 수 있는 바와 같이, PIG27 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.5 kb의 우점(dominant) PIG27 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2d에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2d 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3d는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG27 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3d 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3d에서 알 수 있는 바와 같이, PIG27 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) PIG27 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현이 되고 있었다.
도 4d는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG27 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4d 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4d에서 알 수 있는 바와 같이, PIG27 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) PIG27 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2e는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 PIG28 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2e에서 알 수 있는 바와 같이, PIG28 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.5 kb의 우점(dominant) PIG28 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2e에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2e 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3e는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG28 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3e 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3e에서 알 수 있는 바와 같이, PIG28 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) PIG28 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현이 되거나 발현이 없었다. 또한 동시에 약 2.2 kb의 PIG28 mRNA 전사물도 정상 뇌, 심장과 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서 아주 약하게 발현이 되거나 발현이 없었다.
도 4e는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG28 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4e 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG28 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) PIG28 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 동시에 약 2.2 kb의 PIG28 mRNA 전사물도 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2r은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 GIG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2r에서 알 수 있는 바와 같이, GIG9 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.5 kb의 우점(dominant) GIG9 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2r에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2r 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3r은 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 GIG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3r 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3r에서 알 수 있는 바와 같이, GIG9 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) GIG9 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현이 되고 있었다.
도 4r은 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 GIG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4r 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4r에서 알 수 있는 바와 같이, GIG9 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) GIG9 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
7-3; PIG38 , PIG43 , PIG44,PIG54,GIG18
실시예 1-3에서와 같이, 정상 간조직, 간암 조직, 및 간암 세포주 HepG2로부터 총 RNA를 추출하였다.
PIG 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막(Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 HP103 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계(densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴(actin)으로 표준화시켰다.
도 2h는 정상 간조직, 간암조직 및 간암 세포주(HepG2)들에서 PIG38 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2h에서 알 수 있는 바와 같이, 간암 조직 및 간암 세포주인 HepG2 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현이 되지 않거나 약하였다. 도 2h 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3h는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG38 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3h 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3h에서 알 수 있는 바와 같이, PIG38 mRNA(약 1.5 kb)는 정상 간조직에서와 같이 여러 다른 정상조직들에서도 발현이 되지 않거나 발현이 약하였다. 도 4h는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG38 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4h 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4h에서 알 수 있는 바와 같이, PIG38 mRNA(약 1.5 kb)는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강하였다. 또한 암세포주들에서는 PIG38 mRNA의 또다른 전사물인 2.5 kb, 3kb, 및 4.5 kb 전사물들도 발현이 확인되었다.
도 2j는 정상 간조직, 간암조직 및 간암 세포주(HepG2)들에서 PIG43 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2j에서 알 수 있는 바와 같이, 간암 조직 및 간암 세포주인 HepG2 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현이 되지 않거나 약하였다. 도 2j 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3j는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG43 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3j 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3j에서 알 수 있는 바와 같이, PIG43 mRNA(약 3.0 kb)은 정상 간조직에서와 같이 여러 다른 정상조직들에서도 발현이 되지 않거나 발현이 약하였다. 도 4j는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG43 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4j 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4j에서 알 수 있는 바와 같이, PIG43은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 대장암세포주 SW480, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강하였으나 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 및 폐암세포주 A549 들에서는 발현이 없었다.
도 2k는 정상 간조직, 간암조직 및 간암 세포주(HepG2)들에서 PIG44 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2k에서 알 수 있는 바와 같이, 간암 조직 및 간암 세포주인 HepG2 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현이 되지 않거나 약하였다. 도 2k 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3k는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG44 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3k 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3k에서 알 수 있는 바와 같이, PIG44 mRNA(약 4.5 kb)은 정상 간조직에서와 같이 여러 다른 정상조직들에서도 발현이 되지 않았고 단지 정상 심장과 근육에서만 발현이 약하였다. 또한 정상 심장과 근육에서는 약 5.0 kb의 PIG44 mRNA도 아주 약하게 발현이 되고 있다. 도 4k는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG38 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4k 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4k에서 알 수 있는 바와 같이, PIG44는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강하였다. 동시에 약 5.0 kb의 PIG44 mRNA도 발현이 되고 있다.
도 2p는 정상 간조직, 간암조직 및 간암 세포주(HepG2)들에서 PIG54 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2p에서 알 수 있는 바와 같이, 간암 조직 및 간암 세포주인 HepG2 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현이 되지 않거나 약하였다. 도 2p 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3p는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG54 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3p 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3p에서 알 수 있는 바와 같이, PIG54 mRNA(약 7.0 kb)는 정상 간조직에서와 같이 여러 다른 정상조직들에서 발현이 되지 않거나 발현이 약하였다. 또한 정상 조직들에서는 약 9.0 kb의 PIG54 mRNA도 아주 약하게 발현이 되고 있다. 도 4p는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG38 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4p 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4p에서 알 수 있는 바와 같이, PIG54는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강하였다. 동시에 약 9.0 kb 와 3.0 kb의 PIG54 mRNA도 발현이 강하게 되고 있다.
도 2t는 정상 간조직, 간암조직 및 간암 세포주(HepG2)들에서 GIG18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2t에서 알 수 있는 바와 같이, 간암 조직 및 간암 세포주인 HepG2 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현이 약하였다. 도 2t 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3t는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 GIG18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3t 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3t에서 알 수 있는 바와 같이, GIG18 mRNA(약 2.2 kb)는 정상 간조직에서와 같이 여러 다른 정상조직들에서도 발현이 되지 않거나 발현이 약하였다. 또한 정상조직들에서는 GIG18 mRNA의 또다른 전사물인 2.0 kb 전사물도 발현이 약하게 확인되었다. 도 4t는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 GIG18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4t 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4t에서 알 수 있는 바와 같이, GIG18 mRNA(약 2.2 kb)는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강하였다. 또한 암세포주들에서는 GIG18 mRNA의 또다른 전사물인 2.0 kb 전사물도 발현이 강하게 확인되었다.
7-4; PIG40
실시예 1-4에서와 같이, 정상 말초혈액 조직, 백혈병 조직 및 K-562 세포로 부터 총 RNA를 추출하였다.
PIG40 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막 (Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II (Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 PIG40 전체 cDNA 프로브로 블롯을 혼성화시켰다. 노던 블롯 분석 을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.
도 2i는 정상 말초혈액 조직, 백혈병 조직 및 K-562 세포들에서 PIG40 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2i에서 알 수 있는 바와 같이, PIG40 원암유전자는 백혈병 조직 및 K-562 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 2.5 kb의 우점(dominant) PIG40 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2에서, 정상 (Normal)열은 정상 말초혈액 조직을, 암 (Cancer)열은 백혈병 조직을, 그리고 K562열은 각각 백혈병 세포주를 나타낸다. 도 2i 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3i는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG40 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3i 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3i에서 알 수 있는 바와 같이, PIG40 mRNA (약 2.5 kb의 우점(dominant) PIG40 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현이 되거나 발현이 없었다.
도 4i는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG40 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4i 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4i에서 알 수 있는 바와 같이, PIG40 mRNA (약 2.5 kb의 우점(dominant) PIG40 mRNA 전사물)는 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 동시에 약 2.0 kb의 PIG40 mRNA 전사물들도 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 증가된 수준으로 발현되었다.
7-5;HLC-9,MIG22
실시예 1에서와 같이, 정상 폐조직, 좌측 폐암 조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549, NCI-H2009 (American Type Culture Collection; ATCC Number CRL-5911), NCI-H441 (American Type Culture Collection; ATCC Number HTB-174) 폐암세포주들부터 총 RNA를 추출하였다.
HLC9 또는 MIG22 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막(Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 L738;또는 L690 부분 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계(densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴(actin)으로 표준화시켰다.
도 2s는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549, NCI-H2009, 및 NCI-H441)들에서 HLC9 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2s에서 알 수 있는 바와 같이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주인 A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2s에서, 정상(Normal)열은 정상 폐조직을, 암(Cancer)열은 폐암 조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직 그리고 A549열, NCI-H2009열 및 NCI-H441열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2s 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3s는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 HLC9 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3s 하단은는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3s에서 알 수 있는 바와 같이, HLC9 mRNA(약 2.5 kb)은 근육, 심장조직 및 태반조직들에서만 발현되고 있으며 다른 정상조직들에서는 발현이 매우 약하거나 없었다. 동시에 LC9 mRNA의 또다른 전사물인 약 4.4 kb도 정상조직들에서는 발현이 매우 약하거나 없었다.
도 4s는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 HLC9 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4s 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시 켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4s에서 알 수 있는 바와 같이, HLC9은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361들에서 높은 수준으로 발현되었다. 또한 LC9 mRNA의 또다른 전사물인 약 4.4 kb도 암세포주들에서 발현이 강하였다.
도 2u는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)들에서 MIG22 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2u에서 알 수 있는 바와 같이, MIG22 원암유전자는 폐암조직, 폐암 전이조직 및 A549와 NCI-H358 폐암 세포주들에서는 현저하게 유전자 발현이 증가되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2u에서, 정상 (Normal)열은 정상 폐조직을, 암 (Cancer)열은 폐암조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직, 그리고 A549열 및 NCI-H358열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2u 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3u는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 MIG22 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3u 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3u에서 알 수 있는 바와 같이, MIG22 mRNA (약 1.0 kb 의 전사물)는 정상조직들에서 는 매우 약하게 발현되거나 발현이 없었다.
도 4u는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 MIG22 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4u 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4u에서 알 수 있는 바와 같이, MIG22 mRNA (약 1.0 kb 의 우점전사물과 약 5.0 및 8.0 kb의 전사물)는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암 세포주 A549 및 피부암 세포주 G361들에서 매우 높은 수준으로 발현되었다.
실시예 8: 원암유전자를 대장균에 형질감염시킨 후 발현되는 단백질의 크기결정
서열번호: 1의 PIG12 원암유전자; 서열번호: 5의 PIG18 원암유전자;서열번호: 9의 PIG23 원암유전자; 서열번호: 13의 PIG27 원암유전자; 서열번호: 17의 PIG28 원암유전자; 서열번호: 21의 PIG30 원암유전자; 서열번호: 25의 PIG31 원암유전자 ; 서열번호: 29의 PIG38 원암유전자; 서열번호: 33의 PIG40 원암유전자; 서열번호: 37의 PIG43 원암유전자; 서열번호: 41의 PIG44 원암유전자; 서열번호: 45의 PIG46 원암유전자 ; 서열번호: 49의 PIG47 원암유전자; 서열번호: 53의 PIG48 원암유전자; 서열번호: 57의 PIG50 원암유전자; 서열번호: 61의 PIG54 원암유전자;서열번호: 65의 PIG55 원암유전자; 서열번호: 69의 GIG9 원암유전자 ; 서열번호: 73의 HLC-9 원암유전자; 서열번호: 77의 GIG18 원암유전자; 또는 서열번호: 81의 MIG22 원암유전자;전체를 pBAD/Thio-TOPO 벡터(Invitrogen)의 다중 클로닝 부위에 삽입한 후, 대장균에 형질감염시켰다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간동안 배양하였다. 여기에 1 mM의 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노즈 (Isopropyl beta-D-thiogalacto-pyranoside(IPTG), Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. IPTG 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다(SDS-PAGE). 이 배양액으로부터 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))의 방법에 따라 단백질 시료를 얻어 SDS-PAGE를 실시하였다.
도 5a는 PIG12 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 6에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG12 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 5a에서 보듯이, 발현된 PIG12 단백질의 크기는 약 46 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.
도 5b는 pBAD/thio-Topo/PIG18 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 22 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 15 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG18 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 7 kDa의 PIG18 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5c는 pBAD/thio-Topo/PIG28 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 85 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 85 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG23 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 70 kDa의 PIG23 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5d는 pBAD/thio-Topo/PIG27 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 27 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 27 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG27 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 12 kDa의 PIG27 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5e는 pBAD/thio-Topo/PIG28 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 51 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 51 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG28 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 36 kDa의 PIG28 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5f는 PIG30 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도5f는 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG30 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 5f에서 보듯이, 발현된 PIG30 단백 질의 크기는 약 82 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.
도 5g는 PIG31 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 5g에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG31 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도 5g에서 보듯이, 발현된 PIG31 단백질의 크기는 약 83 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.
도 5h는 pBAD/thio-Topo/PIG38 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 88 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 88 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG38 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 73 kDa의 PIG38 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5i는 pBAD/thio-Topo/PIG40 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 72 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 72 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG40 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 57 kDa의 PIG40 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5j는 pBAD/thio-Topo/PIG43 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 41 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 41 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG43 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 26 kDa의 PIG43 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5k는 pBAD/thio-Topo/PIG44 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 70 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 70 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG44 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 55 kDa의 PIG44 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5(l)은 PIG46 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도 5(l)에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG46 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도5에서 보듯이, 발현된 PIG46 단백질의 크기는 약 48 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.
도 5m은 PIG47 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도5m에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG47 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도5에서 보듯이, 발현된 PIG47 단백질의 크기는 약 29 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.
도 5n은 PIG48 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도5n에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG48 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도5에서 보듯이, 발현된 PIG48 단백질의 크기는 약 60 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.
도 5(o)는 PIG50 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도5에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG50 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도5에서 보듯이, 발현된 PIG50 단백질의 크기는 약 22 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.
도 5p는 pBAD/thio-Topo/PIG54 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 84 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 84 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG54 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 69 kDa의 PIG54 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5q는 PIG55 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 사진이다. 도5q에서 제1열은 IPTG에 의한 유도 전의 단백질 시료이고, 제2열은 IPTG에 의해 PIG55 유전자의 발현을 유도한 후의 단백질 시료이다. 도5q에서 보듯이, 발현된 PIG55 단백질의 크기는 약 18 kDa으로서 이는 염기서열로부터 유추된 것과 일치한다.
도 5r은 pBAD/thio-Topo/GIG9 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 53 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 53 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/GIG9 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 38 kDa의 GIG9 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5s는 pBAD/thio-Topo/HLC9벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 66 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 66 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/HLC9 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 51 kDa의 HLC9 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5t는 pBAD/thio-Topo/GIG18 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 61 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 61 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/GIG18 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 46 kDa의 GIG18 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5u는 pBAD/thio-Topo/MIG22벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 42 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 42 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG22 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 27 kDa의 MIG22 단백질을 함유하고 있는 것이다.
본 발명의 원암 유전자는 유방암, 백혈병, 자궁암, 폐암 및 악성림프종등을 비롯한 암의 진단 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 서열 번호: 2; 서열 번호: 10; 서열 번호: 14; 서열 번호: 18; 서열 번호: 22; 서열 번호: 26; 서열 번호: 34; 서열 번호: 46;서열 번호: 50; 서열 번호: 54; 서열 번호: 58; 서열 번호: 62; 서열번호: 66; 서열번호: 70; 서열번호: 74; 서열번호: 78; 및 서열번호: 82로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 원암 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
  2. 제1항의 단백질을 각각 코팅하는 서열번호: 1의 염기 번호 68 내지 1252에 해당하는 염기서열; 서열번호: 9의 염기 번호 25 내지 1953에 해당하는 염기서열; 서열번호: 13의 염기 번호 20 내지 337에 해당하는 염기서열; 서열번호: 17의 염기 번호 33 내지 998에 해당하는 염기서열; 서열번호: 21의 염기 번호 6 내지 2150에 해당하는 염기서열; 서열번호: 25의 염기 번호 37 내지 2232에 해당하는 염기서열; 서열번호: 33의 염기 번호 36 내지 1541에 해당하는 염기서열; 서열번호: 45의 염기 번호 5 내지 1297에 해당하는 염기서열; 서열번호: 49의 염기 번호 56 내지 826에 해당하는 염기서열; 서열번호: 53의 염기 번호 57 내지 1694에 해당하는 염기서열; 서열번호: 57의 염기 번호 2 내지 595에 해당하는 염기서열; 서열번호: 61의 염기 번호 38 내지 1840에 해당하는 염기서열; 서열번호: 65의 염기 번호 15 내지 485에 해당하는 염기서열; 서열번호: 69의 염기 번호 1 내지 1008에 해당하는 염기서열; 서열번호: 73의 염기 번호 27 내지 1370에 해당하는 염기서열; 서열번호: 77의 염기 번호 3 내지 1244에 해당하는 염기서열; 및 서열번호: 81의 염기 번호 15 내지 734에 해당하는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 원암 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
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