KR100689282B1 - 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포 - Google Patents

인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포 Download PDF

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KR100689282B1 KR1020060069326A KR20060069326A KR100689282B1 KR 100689282 B1 KR100689282 B1 KR 100689282B1 KR 1020060069326 A KR1020060069326 A KR 1020060069326A KR 20060069326 A KR20060069326 A KR 20060069326A KR 100689282 B1 KR100689282 B1 KR 100689282B1
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Abstract

본 발명은 신규 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 원암 유전자는 신규 유전자로서 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 폐암, 및 피부암등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를 포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포{HUMAN PROTOONCOGENE AND PROTEIN ENCODED BY SAME, AND EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME}
도 1a는 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L699의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이며; 도 1b는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 CA325 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이고;도 1c는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 CA273 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이고;도 1d는 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L667의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것;도 1e는 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L668의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것;도 1f는 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L211의 발현여부를 확인 한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것; 도 1g는 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L722의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이며; 도 1h는 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L752의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이며; 도 1i는 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L1003의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이며; 도 1j는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 HP90-8115 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이다.
도 2A는 정상 폐조직, 좌측 폐암 조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서 PIG5 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 2B는 도 2A와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;도 3a는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 PIG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 3b는 도 3a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고, 도 4a는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 PIG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 4b는 도 4a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고, 도 5A는 정상 폐조직, 좌측 폐암 조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서 PIG11 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 5B는 도 5A와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며; 도 6A는 정상 폐조직, 좌측 폐암 조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서 PIG16 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 6B는 도 6A와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며; 도 7A는 정상 폐조직, 좌측 폐암 조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서 PIG17 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 7B는 도 7A와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며; 도 8A는 정상 폐조직, 좌측 폐암 조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서 PIG19 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 8B는 도 8A와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며; 도 9A는 정상 폐조직, 좌측 폐암 조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서 PIG20 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 9B는 도 9A와 동 일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 10A는 정상 폐조직, 좌측 폐암 조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서 PIG21 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 10B는 도 10A와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며; 도 11은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 자궁암세포주인 HeLa, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주인 SW480, 폐암 세포주인 A549 및 흑색종 피부암 세포주인 G361들에서 HCCRBP2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며, 도 12a는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 TRG2 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 12b는 도 12a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.
도 13A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG5 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 13B는 도 13A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 14a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 PIG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 14b는 도 14a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 15a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 PIG7 원암유전자의 발현 여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 15b는 도 15a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 16A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG11 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 16B는 도 16A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 17A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG16 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 17B는 도 17A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 18A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG17 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 18B는 도 18A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 19A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG19 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 19B는 도 19A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 20A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG20 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 20B는 도 20A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 21A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 PIG21 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 21B는 도 21A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 22는 정상 인간 12-열 다중 조직들, 즉 뇌, 심장, 골격근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간장, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구에서 HCCRBP2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며,
도 23a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG2 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 23b는 도 23a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.
도 24A는 인간 암 세포주들에서 PIG5 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 24B는 도 24A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 25a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 PIG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 25b는 도 25a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 26a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 PIG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 26b는 도 26a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 27A는 인간 암 세포주들에서 PIG11 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 27B는 도 27A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 28A는 인간 암 세포주들에서 PIG16 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 28B는 도 28A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 29A는 인간 암 세포주들에서 PIG17 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 29B는 도 29A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 30A는 인간 암 세포주들에서 PIG19 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 30B는 도 30A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 31A는 인간 암 세포주들에서 PIG20 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 31B는 도 31A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 32A는 인간 암 세포주들에서 PIG21 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;도 32B는 도 32A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 33 상단은 자궁암 조직들에서 HCCRBP2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 33 하단은 도 33 상단과 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 34 상단은 대장암 조직들에서 HCCRBP2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 34 하단은 도 34 상단과 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 35 상단은 백혈병 조직들에서 HCCRBP2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 35 하단은 도 35 상단과 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 36a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG2 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 36b는 도 36a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 37a는 본 발명의 PIG5 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 37b는 본 발명의 PIG6 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과; 도 37c는 본 발명의 PIG7 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 37d는 본 발명의 PIG11 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 37e는 본 발명의 PIG16 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 37f는 본 발명의 PIG17 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L- Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 37g는 본 발명의 PIG19 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 37h는 본 발명의 PIG20 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트- 폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 37i는 본 발명의 PIG21 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과; 도 37j는 HCCRBP2 원암 유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 IPTG 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 SDS-PAGE 겔에서 전기영동한 결과;도 37k는 본 발명의 TRG2 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과이다.
인간을 포함한 고등동물들은 약 30,000 개의 유전자들을 갖고 있으나 이들중 약 15% 만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현 되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉, 발생, 분화, 항상성(homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화 및 아폽토시스(apoptosis; programmed cell death) 등이 결정된다(Liang, P. and A. B. Pardee, Science , 257: 967-971(1992)).
종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현들의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다.
예를 들면, 리앙과 파디(Liang and Pardee, 상기 문헌 참조)에 의해 제안된 mRNA 감별전개(differential display) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기(cell cycle)에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자(transcriptional regulatory gene) 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들의 상호 관련성의 규명에도 다양하게 활용되고 있다.
종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체부위의 소실(loss of chromosomal heterozygosity), 원암 유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다(Bishop, J. M., Cell , 64: 235-248(1991); 및 Hunter, T., Cell , 64: 249-270(1991)). 또한, 암의 10 내지 30%는 원암유전자가 증폭됨으로써 원암 유전자가 활성화되어 일어난다고 보고되 어 있다. 원암유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 폐암 및 자궁경부암의 발생기전을 원암 유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 증식유도 유전자 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현이 증가된다는 것을 밝혀내었다. 상기 원암유전자들은 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등과 같은 다양한 암의 진단 등에 효과적으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규 원암 유전자들 및 그의 단편들을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 원암 유전자들 또는 그의 단편들을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자들에 의해 코드되는 단백질들 및 그의 단편들을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자들 또는 그의 단편들을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질들 또는 그의 단편들을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1의 염기 서열을 갖는 원암 유 전자 또는 그의 단편을 제공한다.
상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호: 5의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명에서는 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호: 9의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명에서는 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호: 13의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명에서는 서열번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호: 17의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명에서는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호: 21의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그 의 단편을 제공한다.
본 발명에서는 서열번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호: 25의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명에서는 서열번호: 26의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호: 29의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명에서는 서열번호: 30의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호: 33의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명에서는 서열번호: 34의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 37의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명에서는 서열번호: 38의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호: 39의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그 의 단편을 제공한다.
본 발명에서는 서열번호: 40의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
1. PIG 5
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 증식유도 유전자 5(Human proliferation-inducing gene 5, PIG5, 이후 “PIG5 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 1로 나타낸 바와 같은 1009 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 9 내지 746 부위(744-746: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 2에 나타나 있으며 245개의 아미노산으로 이루어져 있다(이후“PIG5 단백질”로 지칭함).
서열번호: 1의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY236486 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AK022515 호인 Homo sapiens cDNA FLJ12453 fis, clone NT2RM1000430, moderately similar to Homo sapiens erythroblast macrophage protein EMP mRNA 유전자 및 제 BC006470 호인 Homo sapiens macrophage erythroblast attacher 유전자와 일부 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. Homo sapiens cDNA FLJ12453 유전자는 유전자 서열은 밝혀져 있으나 아직 기능이 규명되 있지 않고 있다.
금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG5 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 원암 유전자와 상기 서열번호: 1의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 PIG5로부터 발현되는 단백질은 245개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2와 같은 서열을 가지며 크기는 약 27 kDa이다.
그러나, 상기 단백질들의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질들과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
2. PIG 6
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 증식 유도유전자 6 (human proliferation-inducing gene 6, PIG6, 이후 “PIG6 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 5로 기재되는 2,964 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 5의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 293 내지 2302 부위 (2300-2302: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 6에 나타나 있으며 669개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "PIG6 단백질"로 지칭함).
서열번호: 5의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY236487 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AF542172 호인 Homo sapiens HLC-6 mRNA 유전자와 제 NM_003971 호인 Homo sapiens sperm associated antigen 9 (SPAG9), transcript variant 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. HLC-6 유전자는 염색체상의 위치만 밝혀져있고 아직까지 기능은 규명되지 않고 있으며, SPAG9 유전자는 정소세포 (testicular haploid germ)에서 과발현되며 불임과 관련되어있다고 보고되고 있다 (Shankar, S., et al ., Biochem . Biophys . Res . Comm., 243, 561-565 (1998) ; Yasuoka, H., et al., J. Immunol., 171, 6883-6890 (2003)). 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG6 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 5의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 6과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 5와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 669개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 72 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
3. PIG 7
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 증식 유도유전자 7 (human proliferation-inducing gene 7, PIG7, 이후 “PIG7 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 9로 기재되는 4,301 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 9의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 3536 내지 3792 부위 (3790-3792: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 10에 나타나 있으며 78개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "PIG7 단백질"로 지칭함).
서열번호: 9의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY236488 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AC116447 호인 Homo sapiens chromosome 18, clone RP11-54G14 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. clone RP11-54G14 유전자는 염색체상의 위치만 밝혀져있고 아직까지 기능은 규명되지 않고 있다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG7 원암유전자 를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 9의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 10과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 9와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 78개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 9 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이 상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
4. PIG 11
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 증식유도 유전자 11(Human proliferation-inducing gene 11, PIG11, 이후 “PIG11 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 13으로 나타낸 바와 같은 1038bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 13의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 50 내지 931 부위(929-931: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 14에 나타나 있으며 293개의 아미노산으로 이루어져 있다(이후“PIG11 단백질”로 지칭함).
서열번호: 13의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY258284 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 BC014991 호인 Homo sapiens N-methylpurine-DNA glycosylase 유전자와 염기서열이 일치함이 확인되었다. N-methylpurine-DNA glycosylase 유전자는 DNA 손상인자 (DNA damaging agents)들로부터 저항을 나타내는 효소로 알려져있다 (O' Connor, T. R. and Laval, J., Biochem. Biophys . Res . Comm ., 176, 1170-1177 (1991) ; Wyatt, M. D., et al., Bioessays, 21, 668-676 (1999)). 그러나 기보고된 기능과는 달리 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG11 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 13의 원암 유전자와 상기 서열번호: 13의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 PIG11로부터 발현되는 단백질은 293개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 14와 같은 서열을 가지며 크기는 약 32 kDa이다.
그러나, 상기 단백질들의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질들과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
5. PIG 16
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 증식유도 유전자 16(Human proliferation-inducing gene 16, PIG16, 이후 “PIG16 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 17로 나타낸 바와 같은 1682 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 17의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 696 내지 1577 부위(1575-1577: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 18에 나타나 있으며 293개의 아미노산으로 이루어져 있다(이후“PIG16 단백질”로 지칭함).
서열번호: 17의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY305873 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 BC014991
호인 Homo sapiens N-methylpurine-DNA glycosylase 유전자와 일부 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. N-methylpurine-DNA glycosylase 유전자는 손상된 DNA를 회복시키는 기능을 가지고 있다고 보고되고 있다 (Chakravarti, D., et al., J. Biol . Chem., 266, 15710-15715 (1991) ; O'Brien, P. J. and Ellenberger, T., Biochemistry, 42, 12418-12429 (2003)). 그러나 기보고된 기능과는 달리 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG16 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발 현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 17의 원암 유전자와 상기 서열번호: 17의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 PIG16으로부터 발현되는 단백질은 293개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 18과 같은 서열을 가지며 크기는 약 32 kDa이다.
그러나, 상기 단백질들의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질들과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
6. PIG 17
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 증식유도 유전자 17(Human proliferation-inducing gene 17, PIG17, 이후 “PIG17 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 21로 나타낸 바와 같은 626 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 21의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 59 내지 610 부위 (608-610: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 22에 나타나 있으며 183개의 아미노산으로 이루어져 있다(이후“PIG17 단백질”로 지칭함).
서열번호: 21의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY336092 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_016454 호인 Homo sapiens hypothetical protein LOC51234 (LOC51234) 유전자, 제 CR858446 호인 Pongo pygmaeus mRNA; cDNA DKFZp468K0411 (from clone DKFZp468K0411) 유전자 및 제 AF151018 호인 Homo sapiens HSPC184 mRNA 유전자들과 유전자 염기서열이 일치함이 확인되었다. HSPC184 유전자는 CD34+ hematopoietic stem/progenitor cell 들에 존재한다고 밝혀져있으며 그 기능은 아직 보고되지 않고 있다 (Zhang, Q-H., et al., Genome Res., 10, 1546-1560 (2000)). 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG17 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코 딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 21의 원암 유전자와 상기 서열번호: 21의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 PIG17로부터 발현되는 단백질은 183개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 22와 같은 서열을 가지며 크기는 약 20 kDa이다.
그러나, 상기 단백질들의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질들과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
7. PIG 19
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 증식유도 유전자 19(Human proliferation-inducing gene 19, PIG19, 이후 “PIG19 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 25로 나타낸 바와 같은 1031 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 25의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 32 내지 1030 부위(1028-1030: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 26에 나타나 있으며 332개의 아미노산으로 이루어져 있다(이후“PIG19 단백질”로 지칭함).
서열번호: 25의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423727 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_005566 호인 Homo sapiens lactate dehydrogenase A (LDHA) 유전자와 유전자 염기서열이 일치함이 확인되었다. LDHA 유전자는 호기성 당분해 (anaerobic glycolysis) 과정 중 lactate를 pyruvate로 전환시키며 임신과 수유 중 유선에서 높게 발현된다고 보고되고 있다 (Tsujibo, H., et al ., Eur . J. Biochem ., 147, 9-15 (1985) ; Li, X., et al., Biochem. Biophys . Res . Commu. 320, 625-634 (2004)). 그러나 기존의 보고된 기능과는 달리 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG19 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에 서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 25의 원암 유전자와 상기 서열번호: 25의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 PIG19로부터 발현되는 단백질은 332개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 26과 같은 서열을 가지며 크기는 약 37 kDa이다.
그러나, 상기 단백질들의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질들과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
8. PIG 20
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 증식유도 유전자 20(Human proliferation-inducing gene 20, PIG20, 이후 “PIG20 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 29로 나타낸 바와 같은 526 bp 길이의 전체 염기서열을 가진 다.
서열번호: 29의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 1 내지 498 부위(496-498: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 30에 나타나 있으며 165개의 아미노산으로 이루어져 있다(이후“PIG20 단백질”로 지칭함).
서열번호: 29의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423728 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_002901 호인 Homo sapiens reticulocalbin 1, EF-hand calcium binding domain (RCN1) 유전자와 유전자 염기서열이 일치함이 확인되었다. reticulocalbin 1 유전자는 소포체 (endoplasmic reticulum) 에 존재하는 칼슘 결합 단백질 (calcium-binding protein)으로 보고되고 있다 (Ozawa, M. and Muramatsu, T. J. Biol. Chem., 268, 699-705 (1993) ; Ozawa, M. J. Biochem (Tokyo), 117, 1113-1119 (1995)). 그러나 기보고된 기능과 달리 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG20 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 29의 원암 유전자와 상기 서열번호: 29의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 PIG20으로부터 발현되는 단백질은 165개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 30과 같은 서열을 가지며 크기는 약 19 kDa이다.
그러나, 상기 단백질들의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질들과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
9. PIG 21
본 발명의 원암(原癌)유전자(protooncogene)인 인간 증식유도 유전자 21(Human proliferation-inducing gene 21, PIG21, 이후 “PIG21 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 33으로 나타낸 바와 같은 965 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 33의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 146 내지 961 부위(959- 961: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 34에 나타나 있으며 271개의 아미노산으로 이루어져 있다(이후“PIG21 단백질”로 지칭함).
서열번호: 33의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY336089 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 CR625157 호인 full-length cDNA clone CS0DA008YE03 of Neuroblastoma of Homo sapiens (human) 유전자, 제 CR616147 호인 full-length cDNA clone CS0DI031YI19 of Placenta Cot 25-normalized of Homo sapiens (human) 유전자 및 제 BC035460 호인 Homo sapiens guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 2-like 1, mRNA (cDNA clone IMAGE:4705256) 유전자들과는 일부 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 이들 유전자들의 기능은 아직 보고되지 않고 있으나 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG21 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발 명은 상기 서열번호: 33의 원암 유전자와 상기 서열번호: 33의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 PIG21로부터 발현되는 단백질은 271개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 34와 같은 서열을 가지며 크기는 약 30 kDa이다.
그러나, 상기 단백질들의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질들과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
10. HCCR BP2
본 발명의 신규 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)는 HCCRBP2로 명명된 것으로서 서열번호: 37로 나타낸 바와 같은 626 bp 길이의 전체 염기서열을 가지며, 본 출원인에 의해 출원된 대한민국 특허출원 제 2000-16757 호에 기재된 인간 자궁경부암 1 (Human Cervical Cancer 1 protooncogene, HCCR-1, 이후 "HCCR-1 원암 유전자”로 지칭함)과 결합하는 성질을 가진다.
서열번호: 37의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터 베이스에 등록번호 제 AY323819 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_003288 호인 Homo sapiens tumor protein D52-like 2 (TPD52L2), transcript variant 5 유전자와 제 BC006804 호인 Homo sapiens tumor protein D52-like 2, transcript variant 5, mRNA (cDNA clone MGC:5064 IMAGE:3446037) 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 HCCRBP2 원암유전자를 발굴하게 되었다.
서열번호: 37의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 9 내지 356 부위에 해당하는 전사 해독 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 38에 나타나 있으며 115개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 “HCCRBP2 단백질”로 지칭함).
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 37의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴 리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 115개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 38과 같은 서열을 가지며 크기는 약 12 kd이다. HCCR-1 원암 유전자로부터 코드되는 단백질에 결합하는 성질을 갖는 상기 단백질을 본 발명에서는 “HCCRBP2 (HCCR-binding protein 2)” 로 지칭한다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
11. TRG 2
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 2 (human transformation-related gene 2; 이후 TRG2로 지칭함)은 서열번호: 39로 기재되는 2,302 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 39의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 747 내지 2066 부위 (2064-2066: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 40에 나타 나 있으며 439개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG2 단백질"로 지칭함).
서열번호: 39의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY170823 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 30일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AK025711 호인 Homo sapiens cDNA: FLJ22058 fis, clone HEP10089, highly similar to HUMRANBP2 RanBP2(Ran-binding protein 2) 유전자, 제 L41840 호인 Homo sapiens nucleoporin (NUP358) gene 유전자 및 제 D42063 호인 Human mRNA for RanBP2 (Ran-binding protein 2) 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. RanBP2(Ran-binding protein 2) 유전자들은 peptide repeats, Ran-GTP binding sites, zinc fingers, a cyclophilin A homologous domain, 및 leucine-rich region 들을 갖는 cytoplasmically exposed nucleoporin, Nup358 유전자로 알려져있다 ((Wu, J., et al., J. Biol . Chem., 270, 14209-13213 (1995) ; Yokoyama, N., et al., Nature, 376, 184-188)). 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG2 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어 질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 39의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 40과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 39와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 439개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 40으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 48 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 및 단백질들은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다.
벡터의 제작시에는, 상기 원암 유전자들 또는 단백질들을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.
본 발명의 유전자들은 노던 블롯(northern blot) 등의 분석방법에서 정상 폐조직에서는 발현이 거의 확인되지 않은 반면 폐암 조직, 전이 폐암조직 및 폐암 세포주들에서는 그 과발현이 확인되므로 폐암을 유발시키는 강력한 발암 유전자들로 판단된다. 또한 전이된 폐암조직 들에서 발현이 증가되는 것으로 보아 암 전이를 유발시키는 암전이 관련유전자들로 판명된다. 폐암과 같은 상피성 조직외에도, 본 발명의 원암 유전자들은 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암등과 같은 많은 다른 암 종양들에서 높게 발현된다. 따라서, 본 발명의 원암유전자들은 다양한 암의 발생에 공통된 발암유전자일 것으로 판단되며, 다양한 암의 진단, 형질전환된 동물의 제조 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
상기 원암 유전자들을 이용한 암의 진단 방법은, 예를 들어, 상기 원암 유전자들의 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 이를 검출하므로써 대상자가 본 발명의 원암 유전자들을 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브들을 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 원암 유전자들의 전부 또는 일 부를 포함하는 암 진단용 키트를 역시 제공한다.
형질전환 동물은 본 발명의 원암 유전자들을 포유동물, 예를 들어, 래트 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 원암 유전자들로부터 유도되는 단백질은 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 원암 유전자로부터 발현된 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당분야에 공지된 효소 면역측정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 원암 유전자들를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주들은 예를 들어, 상기 원암 유전자들이 형질도입된 섬유모세포를 이용하여 누드 마우스 등에 형성시킨 종양조직으로부터 제조할 수 있다. 이러한 암 세포주들은 항암제 등의 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 종양세포 배양 및 총 RNA 의 분리
1-1: PIG 5, PIG 11, PIG 16, PIG 17, PIG 19, PIG 20, PIG 21
(단계 1) 종양세포 배양
mRNA의 감별 전개를 위하여, 정상 폐조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지않은 폐암 환자로부터 수술시에 원발성 폐암조직 및 우측 폐에 전이된 암조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 폐암 세포주로 A549(American Type Culture Collection; ATCC Number CCL-185)를 사용하였다.
상기 수득된 조직 및 A549 폐암세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청(Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰(Waymouth's) MB 752/1 배양액(Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 도중의 세포들로서 트리판 블루(trypan blue) 염료로 염색할 때 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다(프레쉬니(Freshney), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York(1987) 참조).
(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법
상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트(Qiagen Inc., 독일)을 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 폐조직, 원발성 폐암조직, 전이된 폐암조직 및 A549 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트(Message clean kit)(GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.
1-2: PIG 6, PIG 7, TRG 2
(단계 1) 종양세포의 배양
mRNA의 감별 전개를 위하여, 자궁적출술 (hysterectomy)을 받은 자궁근종 환자로부터 정상자궁경부 (exocervical) 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지 않은 자궁암 환자로부터 수술시에 원발성 자궁경부 종양조직 및 전이 임파절 종양조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 자궁경부암 세포주로 CUMC-6 (Kim, J. W. et al ., Gynecol . Oncol . 62: 230-240, 1996)을 사용하였다.
상기 수득된 조직 및 CUMC-6 세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청 (Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰 (Waymouth's) MB 752/1 배양액 (Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 과정의 세포들로서 트리판 블루 (trypan blue) 염색에 의해 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다 (Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York, 1987).
(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법
상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트 (Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트 (Message clean kit, GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.
1-3: 효모 이- 하이브리드 분석법에 의한 HCCR BP2 클로닝
인간 원암 유전자인 HCCR-1 유전자 (Genebank Accession No.: AF195651)의 단백질 산물과 결합하는 단백질을 찾기 위하여, 매치메이커 LexA 이-하이브리드 시스템 (MATCHMAKER LexA Two-Hybrid System; Clontech. Laboratories사)을 사용하고 기존의 보고된 방법 (Golemis, E. A., et al ., Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, Inc. Chapters 20.0 and 20.1, 1996)을 이용하여 실험을 수행하였다.
다음 실험에 이용된 균주와 벡터들은 상용화된 클론테크 (Clontech사)의 카탈로그 # K1609-1 키트에 포함된 것들이다.
효모 균주인 EGY48에 p8op-lacZ 벡터를 형질전환 (transformation)시킨 후 우라실 (Uracil)이 없는 합성 드롭아웃 (dropout) 배지인 SD/-우라실/글루코스 플레이트에 도말하여 자라는 균주 (colony)들을 선별하였다. 이로부터 선별된 균주들을 SD/-우라실/글루코스 배지 (media)에서 배양한 후, HCCR-1 유전자를 pLexA 벡터의 BamHI과 SalI 부위에 삽입하여 제조한 벡터를 베이트 (bait)로서 이 효모 균주들에 형질전환시켰다. pLexA 벡터에 클로닝된 HCCR-1 유전자가 제대로 발현되는가를 확인하기 위하여, LexA 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅 (western blotting)을 실시한 결과 원하는 크기인 64～65 kDa에서 밴드를 얻을 수 있었다. 확인된 콜로 니를 SD/-우라실, -히스티딘/글루코스 배지에서 배양한 후 인간 태아 뇌 (fetal brain) 유래 AD 융합 라이브러리인 pBD42AD 벡터로 다시 형질전환시켰다. 베이트와 라이브러리가 결합하는 것을 확인하기 위하여 콜로니 리프팅 분석법 (colony lifting assay; Breeden, L. & Nasmyth, K., Cold Spring Harbor Symposium Quant . Bio. 50:643-650, 1985)을 수행하였다. 베이트와 라이브러리가 결합하면 X-gal이 들어있는 플레이트에서 파란색 콜로니가 형성된다. 효모를 배양한 후 글래스 비드 (glass bead)를 이용하여 DNA를 추출하고 대장균 (E. coli) KC8에 일렉트로포레이션법 (electroporation)으로 형질전환 시킨 후 M9 최소 배지에 도말하여 형질전환체를 선별하였다. 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 이것을 대장균 DH5α에 다시 형질전환시킨 후 DNA를 추출하여 HindⅢ를 처리하여 원하는 크기인 약 0.6 kb를 갖는 클론을 구하였다.
실시예 2: 감별 전개 역전사 중합효소 연쇄반응( differential display reverse transcription(DDRT)-PCR)
감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.
2-1: PIG 5
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11G (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3')고정 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5mM [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5‘ 11프라이머(RNAimage primer sets 1-5, H-AP 1 내지 40들 중 H-AP9 프라이머(서열번호 : 4)(5'-AAGCTTCATTCCG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장(final extension)을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.
PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 192 염기쌍(bp) 크기의 밴드, L699 cDNA (서열번호: 1의 778-969 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L699 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-2: PIG 6
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 7로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5 mM [α-35S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 8로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP32 프라이머 (5'-AAGCTTCCTGCAA-3') 를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.
PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 392 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, CA325 cDNA (서열번호: 5의 2485-2876 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 CA325 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-3: PIG 7
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 11로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5 mM [α-35S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 12로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP27 프라이머 (5'-AAGCTTCTGCTGG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.
PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 368 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, CA273 cDNA (서열번호: 9의 3762-4129 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 CA273 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-4: PIG 11
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 15으로 기재되는 염기서열을 갖는
H-T11G (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3')고정 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5mM [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5‘ 11프라이머(RNAimage primer sets 1-5, H-AP 1 내지 40들 중 H-AP11 프라이머(서열번호 : 16)(5'-AAGCTTCGGGTAA-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장(final extension)을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.
PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 203 염기쌍(bp) 크기의 밴드, L667 cDNA (서열번호: 13의 796-998 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L667 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-5: PIG 16
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 19로 기재되는 염기서열을 갖는
H-T11C (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')고정 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5mM [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5‘ 11프라이머(RNAimage primer sets 1-5, H-AP 1 내지 40들 중 H-AP16 프라이머(서열번호 : 20)(5'-AAGCTTTAGAGCG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장(final extension)을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.
PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 322 염기쌍(bp) 크기의 밴드, L668 cDNA (서열번호: 17의 1277-1598 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L668 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-6: PIG 17
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 23으로 기재되는 염기서열을 갖는
H-T11C (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')고정 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5mM [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5‘ 11프라이머(RNAimage primer sets 1-5, H-AP 1 내지 40들 중 H-AP18 프라이머(서열번호 : 24)(5'-AAGCTTAGAGGCA-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장(final extension)을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.
PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 211 염기쌍(bp) 크기의 밴드, L211 cDNA (서열번호: 21의 389-599 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L211 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표 지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-7: PIG 19
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 27로 기재되는 염기서열을 갖는
H-T11G (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3')고정 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5mM [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5‘ 11프라이머(RNAimage primer sets 1-5, H-AP 1 내지 40들 중 H-AP16 프라이머(서열번호 : 28)(5'-AAGCTTTAGAGCG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장(final extension)을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.
PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 233 염기쌍(bp) 크기의 밴드, L722 cDNA (서열번호: 25의 777-1009 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L722 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-8: PIG 20
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 31로 기재되는 염기서열을 갖는
H-T11G (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3')고정 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5mM [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5‘ 11프라이머(RNAimage primer sets 1-5, H-AP 1 내지 40들 중 H-AP17 프라이머(서열번호 : 32)(5'-AAGCTTACCAGGT-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장(final extension)을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.
PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 211 염기쌍(bp) 크기의 밴드, L752 cDNA (서열번호: 29의 304-514 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L752 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-9: PIG 21
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프 라이머로서 서열번호: 35로 기재되는 염기서열을 갖는
H-T11C (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')고정 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5mM [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5‘ 11프라이머(RNAimage primer sets 1-5, H-AP 1 내지 40들 중 H-AP15 프라이머(서열번호 : 36)(5'-AAGCTTACGCAAC-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장(final extension)을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.
PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 272 염기쌍(bp) 크기의 밴드, L1003 cDNA (서열번호: 33의 665-936 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L1003 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-10: TRG 2
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 41로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전 사를 수행하였다.
이어서, 0.5 mM [α-35S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 42로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP32 프라이머 (5'-AAGCTTCCTGCAA-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.
PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 373 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, HP90-811 cDNA (서열번호: 39의 1797-2169 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 HP90-811 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
실시예 3: 클로닝
PIG 5, PIG 6, PIG7 , PIG 11, PIG 16, PIG 17, PIG 19, PIG 20, PIG 21, TRG 2
상기에서 얻은 재증폭된 L699 PCR 산물;CA325 PCR 산물; CA273 PCR 산물; L667 PCR 산물; L668 PCR 산물; L211 PCR 산물; L722 PCR 산물; L752 PCR 산물; L1003 PCR 산물; 또는 HP90-811 PCR 산물을 TA클로닝 시스템(Promega, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 pGEM-T 이지(EASY) 벡터에 삽입하였다.
(단계 1) 연결반응
실시예 2에서 얻은 재증폭된 L699 PCR 산물; CA325 PCR 산물; CA273 PCR 산물; L667 PCR 산물; L668 PCR 산물; L211 PCR 산물; L722 PCR 산물; L752 PCR 산물; L1003 PCR 산물 또는 HP90-811 PCR 산물 2㎕, pGEM-T 이지 벡터(50 ng) 1 ㎕, T4 DNA 연결효소 10X 완충액 1㎕ 및 T4 DNA 연결효소(3 weiss units/ul; T4 DNA ligase, Promega) 1 ㎕를 0.5㎖ 시험관에 넣은 후, 증류수를 가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 하였다. 연결 반응 혼합물은 14℃에서 밤새 배양하였다.
(단계 2) TA 클로닝 형질전환
대장균 JM109(Promega, WI, USA)를 10 ㎖의 LB 브로쓰(박토-트립톤 10 g, 박토-효모 추출물 5 g, NaCl 5 g) 중에서 600㎚에서의 광학밀도 값이 약 0.3 - 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양 혼합물을 얼음에 약 10분간 방치한 후, 4℃에서 10 분간 4000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 수집하였다. 수집한 세포 펠릿을 10 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl2에 30분 내지 1시간 가량 노출시켜 컴피턴트(competent) 세포를 제조하였다. 결과물을 4℃, 4000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 모아서 2 ml의 빙냉 0.1 M CaCl2에 현탁시켰다.
컴피턴트 세포 현탁액 200 ㎕를 새로운 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브에 옮기고, 여기에 단계 1에서 제조한 연결 반응 산물 2㎕를 가하였다. 혼합물을 42℃ 의 수욕(water bath)에서 90초간 배양시킨 후, 0℃에서 급냉시켰다. 여기에, SOC 배지(박토-트립톤 2.0 g, 박토-효모 추출물 0.5 g, 1 M NaCl 1 ml, 1 M KCl 0.25 ml, TDW 97 ml, 2M Mg2+ 1 ml, 2 M 글루코스 1 ml) 800 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 220 rpm의 회전진탕 배양기에서 45분간 배양시켰다.
37℃ 배양기에 미리 넣어둔, 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 X-gal(40㎎/㎖ 디메틸포름아미드에 저장) 25 ㎕를 유리봉으로 확산시킨 후, 여기에 25 ㎕의 형질전환된 세포를 넣어서 다시 유리봉으로 확산시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 형성된 백색 콜로니를 3-4개 선택하여 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 각각의 선택된 클론들을 심었다. 플라스미드를 제조하기 위하여 이들 중 삽입이 확인된 콜로니, 즉, 형질전환된 대장균 JM109/L699; JM109/CA325 ; JM109/CA273; JM109/L667
;JM109/L668;JM109/L211; JM109/L699; JM109/L752; JM109/L1003; 또는 JM109/HP90-811를 선택하여 10 ml의 테리픽 브로쓰(terrific broth; TDW 900 ml, 박토-트립톤 12 g, 박토-효모 추출물 24 g, 글리세롤 4 ml, 0.17 M KH2PO4, 0.72 N K2HPO4 100 ml)에서 배양하였다.
실시예 4: 재조합 플라스미드 DNA의 분리
PIG 5, PIG 6, PIG7 , PIG 11, PIG 16, PIG 17, PIG 19, PIG 20, PIG 21, TRG 2
위저드 플러스 미니프렙스 DNA 정제 키트(WizardTM Plus Minipreps DNA Purificatin Kit, Promega, USA)를 사용해서 제조사의 지시에 따라 형질전환된 대 장균으로부터 L699 플라스미드 DNA; CA325 플라스미드 DNA; CA273 플라스미드 DNA; L667 플라스미드 DNA; L668 플라스미드 DNA; L211 플라스미드 DNA; L722 플라스미드 DNA; L752 플라스미드 DNA; L1003 플라스미드 DNA 또는 HP90-8115 플라스미드 DNA를 분리하였다.
분리된 플라스미드 DNA의 일부를 ECoRI 효소로 처리한 후, 2% 겔에서 전기영동을 실시하여 L699; CA325; CA273; L667; L668; L211; L722; L752; L1003 ; 또는 HP90-8115 부분서열이 플라스미드에 삽입되었음을 확인하였다.
실시예 5: DNA 염기서열 분석
5-1: PIG 5
실시예 2에서 수득한 L699 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR시킨 후, 클로닝되고 재증폭된 L699 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 778 내지 969에 해당하며, 본원에서 “L699”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP9 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 192 bp cDNA 단편, 즉, L699를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1a에서 알 수 있는 바와 같이, 192 bp cDNA 단편인 L699는 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암 세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현되지 않았다.
5-2: PIG 6
실시예 2에서 수득한 CA325 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 CA325 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 5의 뉴클레오티드 번호 2485 내지 2876에 해당하며, 본 발명에서는 "CA325"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP32 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 392 bp cDNA 단편, 즉, CA325 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1b에서 알 수 있는 바와 같이, 392 bp cDNA 단편인 CA325 는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-3: PIG 7
실시예 2에서 수득한 CA273 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 CA273 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 번호 3762 내지 4129에 해당하며, 본 발명에서는 "CA273"으로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP27 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 368 bp cDNA 단편, 즉, CA273을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1c에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1c에서 알 수 있는 바와 같이, 368 bp cDNA 단편인 CA273은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-4: PIG 11
실시예 2에서 수득한 L667 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR시킨 후, 클로닝되고 재증폭된 L667 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 13의 뉴클레오티드 번호 796 내지 998에 해당하며, 본원에서 “L667”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP11 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 203 bp cDNA 단편, 즉, L667을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1d에 나타낸 바와 같이, 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1d에서 알 수 있는 바와 같이, 203 bp cDNA 단편인 L667은 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암 세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현되지 않았다.
5-5: PIG 16
실시예 2에서 수득한 L668 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR시킨 후, 클로닝되고 재증폭된 L668 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 17의 뉴클레오티드 번호 1277 내지 1598에 해당하며, 본원에서 “L668”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP16 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 322 bp cDNA 단편, 즉, L668을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1e에 나타낸 바와 같이, 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1e에서 알 수 있는 바와 같이, 322 bp cDNA 단편인 L668은 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암 세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현되지 않았다.
5-6: PIG 17
실시예 2에서 수득한 L211 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR시킨 후, 클로닝되고 재증폭된 L211 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 21의 뉴클레오티드 번호 389 내지 599에 해당하며, 본원에서 “L211”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP18 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 211 bp cDNA 단편, 즉, L211을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1f에 나타낸 바와 같이, 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1f에서 알 수 있는 바와 같이, 211 bp cDNA 단편인 L211은 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암 세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현되지 않았다.
5-7: PIG 19
실시예 2에서 수득한 L722 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR시킨 후, 클 로닝되고 재증폭된 L722 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 25의 뉴클레오티드 번호 777 내지 1009에 해당하며, 본원에서 “L722”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP16 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 233 bp cDNA 단편, 즉, L722를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1g에 나타낸 바와 같이, 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1g에서 알 수 있는 바와 같이, 233 bp cDNA 단편인 L722는 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암 세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현되지 않았다.
5-8: PIG 20
실시예 2에서 수득한 L752 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR시킨 후, 클로닝되고 재증폭된 L752 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 29의 뉴클레오티드 번호 304 내지 514에 해당하며, 본원에서 “L752”로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP17 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 211 bp cDNA 단편, 즉, L752를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1h에 나타낸 바와 같이, 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1h에서 알 수 있는 바와 같이, 211 bp cDNA 단편인 L752는 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암 세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 아주 약하게 발현되었다.
5-9: PIG 21
실시예 2에서 수득한 L1003 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR시킨 후, 클로닝되고 재증폭된 L1003 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 33의 뉴클레오티드 번호 665 내지 936에 해당하며, 본원에서 “L1003”으로 지칭하였다.
5‘ 무작위 프라이머 H-AP15 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 272 bp cDNA 단편, 즉, L1003을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1i에 나타낸 바와 같이, 정상 폐 조직, 좌측 폐암 조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1i에서 알 수 있는 바와 같이, 272 bp cDNA 단편인 L1003은 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암 세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 아주 약하게 발현되었다.
5-10: TRG 2
실시예 2에서 수득한 HP90-811 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 HP90-811 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 39의 뉴클레오티드 번호 1797 내지 2169에 해당하며, 본 발명에서는 "HP90-811"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP32 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 373 bp cDNA 단편, 즉, HP90-811 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1j에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1j에서 알 수 있는 바와 같이, 373 bp cDNA 단편인 HP90-811은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
실시예 6: 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석
6-1: PIG 5
32P-표지된 L699를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝한 결과 L699 cDNA 염기서열을 가지고 있는 전장 유전자들을 구하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 두종류의 전장 유전자들을 구하였으며 하나는 pCEV-LAC 벡터 중에 1009 bp가 삽입된 전체 PIG5 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 2월 13일자로 AY236486 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개일: 2004년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG5 클론을 Not I 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드(phagemid) 벡터 형태로 분리하였다(상기 문헌 참조).
상기 PIG5 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG5 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1009 bp로 이루어진 PIG5의 전체 서열은 서열번호: 1에 나타내었다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 9 내지 746에 해당하며, 서열번호: 2의 245개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-2: PIG 6
32P-표지된 CA325 를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리 닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2964 bp가 삽입된 전체 PIG6 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 2월 13일자로 등재번호 제AY236487호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG6 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 PIG6 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG6 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
22964 bp로 이루어진 PIG6의 전체 염기서열은 서열번호: 5에 나타내었다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 293 내지 2302에 해당하며, 서열번호: 6의 669개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-3: PIG 7
32P-표지된 CA273을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 4301 bp가 삽입된 전체 PIG7 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 2월 13일자로 등재번호 제AY236488호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG7 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 PIG7 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG7 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
4301 bp로 이루어진 PIG7의 전체 염기서열은 서열번호: 9에 나타내었다.
서열번호: 9의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 3556 내지 3792에 해당하며, 서열번호: 10의 78개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-4: PIG 11
32P-표지된 L667을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝한 결과 L667 cDNA 염기서열을 가지고 있는 전장 유전자들을 구하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 두종류의 전장 유전자들을 구하였으며 하나는 pCEV-LAC 벡터 중에 1038 bp가 삽입된 전체 PIG11 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 2월 24일자로 AY258284 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개일: 2004년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG11 클론을 Not I 절단에 의해 앰피실 린 내성 pCEV-LAC 파지미드(phagemid) 벡터 형태로 분리하였다(상기 문헌 참조).
상기 PIG11 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG11 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1038 bp로 이루어진 PIG11의 전체 서열은 서열번호: 13에 나타내었다.
서열번호: 13의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 50 내지 931에 해당하며, 서열번호: 14의 293개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-5: PIG 16
32P-표지된 L668을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝한 결과 L668 cDNA 염기서열을 가지고 있는 전장 유전자들을 구하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 두종류의 전장 유전자들을 구하였으며 하나는 pCEV-LAC 벡터 중에 1682 bp가 삽입된 전체 PIG16 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 5월 24일자로 AY305873 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개일: 2004년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG16 클론을 Not I 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드(phagemid) 벡터 형태로 분리하였다(상기 문헌 참조).
상기 PIG16 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG16 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰 다.
1682 bp로 이루어진 PIG16의 전체 서열은 서열번호: 17에 나타내었다.
서열번호: 17의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 696 내지 1577에 해당하며, 서열번호: 18의 293개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-6: PIG 17
32P-표지된 L211을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝한 결과 L211 cDNA 염기서열을 가지고 있는 전장 유전자들을 구하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 두종류의 전장 유전자들을 구하였으며 하나는 pCEV-LAC 벡터 중에 626 bp가 삽입된 전체 PIG17 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 7월 4일자로 AY336092 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개일: 2004년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG5 클론을 Not I 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드(phagemid) 벡터 형태로 분리하였다(상기 문헌 참조).
상기 PIG17 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG17 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
626 bp로 이루어진 PIG17의 전체 서열은 서열번호: 21에 나타내었다.
서열번호: 21의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레 임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 59 내지 610에 해당하며, 서열번호: 22의 183개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-7: PIG 19
32P-표지된 L722를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝한 결과 L722 cDNA 염기서열을 가지고 있는 전장 유전자들을 구하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 두종류의 전장 유전자들을 구하였으며 하나는 pCEV-LAC 벡터 중에 1031 bp가 삽입된 전체 PIG19 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 9월 26일자로 AY423727 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개일: 2004년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG19 클론을 Not I 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드(phagemid) 벡터 형태로 분리하였다(상기 문헌 참조).
상기 PIG19 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG19 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1031 bp로 이루어진 PIG19의 전체 서열은 서열번호: 25에 나타내었다.
서열번호: 25의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 32 내지 1030에 해당하며, 서열번호: 26의 332개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-8: PIG 20
32P-표지된 L752를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝한 결과 L752 cDNA 염기서열을 가지고 있는 전장 유전자들을 구하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 두종류의 전장 유전자들을 구하였으며 하나는 pCEV-LAC 벡터 중에 526 bp가 삽입된 전체 PIG20 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 9월 27일자로 AY423728 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개일: 2004년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG21 클론을 Not I 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드(phagemid) 벡터 형태로 분리하였다(상기 문헌 참조).
상기 PIG20 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG20 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
526 bp로 이루어진 PIG20의 전체 서열은 서열번호: 29에 나타내었다.
서열번호: 29의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 1 내지 498에 해당하며, 서열번호: 30의 165개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-9: PIG 21
32P-표지된 L1003을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝한 결과 L1003 cDNA 염기서열을 가지고 있는 전장 유전자들을 구하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 두종류의 전장 유전자들을 구하였으며 하나는 pCEV-LAC 벡터 중에 965 bp가 삽입된 전체 PIG21 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 7월 4일자로 AY336089 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개일: 2004년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG21 클론을 Not I 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드(phagemid) 벡터 형태로 분리하였다(상기 문헌 참조).
상기 PIG21 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG21 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
965 bp로 이루어진 PIG21의 전체 서열은 서열번호: 33에 나타내었다.
서열번호: 33의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 146 내지 961에 해당하며, 서열번호: 34의 271개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-10: HCCR BP 2
실시예 1에서 수득한 클론을 통상적인 방법에 따라 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical사)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다. 그 결과, 서열번호: 37에 나타낸 626 bp로 이루어진 원암 유전자를 확인하여 이를 “HCCRBP2”로 지칭하였으며 이 유전자가 삽입된 전체 HCCRBP2 cDNA 클론을 2003년 6월 14일자로 등록번호 제 AY323819 호로 진뱅크 (GenBank)에 등록하였다.
서열번호: 37의 염기서열에서, 본 발명의 원암 유전자 HCCRBP2의 전체 전사 해독 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 9내지 356에 해당하며, 서열번호: 38의 115개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
상기 HCCRBP2 유전자를 pGEM-T-easy 벡터 (Promega사)의 클로닝 부위에 T4 DNA 라이게이즈로 연결시켜 HCCRBP2 발현 플라스미드 DNA를 제조하고, 제조된 플라스미드로 대장균 DH5α(Stratagene사)를 형질전환시켰다.
6-11: TRG 2
32P-표지된 HP90-811을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2302 bp가 삽입된 전체 TRG2 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 10월 30일자로 등재번호 제AY170823호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG2 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG2 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG2 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
2302 bp로 이루어진 TRG2의 전체 염기서열은 서열번호: 39에 나타내었다.
서열번호: 39의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 747 내지 2066에 해당하며, 서열번호: 40의 439개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
실시예 7 : 다양한 세포에서의 유전자의 노던 블롯 분석
7-1: PIG 5, PIG 11, PIG 16, PIG 17, PIG 19, PIG 20, PIG 21
실시예 1에서와 같이, 정상 폐조직, 좌측 폐암 조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549, NCI-H2009 (American Type Culture Collection; ATCC Number CRL-5911), NCI-H441 (American Type Culture Collection; ATCC Number HTB-174) 폐암세포주들부터 총 RNA를 추출하였다.
PIG5; PIG 11; PIG 16; PIG 17; PIG 19; PIG 20; 또는 PIG 21 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막(Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 L699; L667; L668; L211; L722; L752; 또는 L1003 부분 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계(densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴(actin)으로 표준화시켰다.
도 2A는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549, NCI- H2009, 및 NCI-H441)들에서 PIG5 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2A에서 알 수 있는 바와 같이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주인 A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2에서, 정상(Normal)열은 정상 폐조직을, 암(Cancer)열은 폐암 조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직 그리고 A549열, NCI-H2009열 및 NCI-H441열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 13A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG5 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 13B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 13A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG5 mRNA(약 3.0 kb)은 근육과 심장조직들에서만 약하게 발현되고 있으며 다른 정상조직들에서는 발현이 매우 약하거나 없었다.
도 24A는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG5 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 24B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 24A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG5는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361들에서 높은 수준으로 발현되었다.
도 5A는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549, NCI-H2009, 및 NCI-H441)들에서 PIG11 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 5A에서 알 수 있는 바와 같이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주인 A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 5에서, 정상(Normal)열은 정상 폐조직을, 암(Cancer)열은 폐암 조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직 그리고 A549열, NCI-H2009열 및 NCI-H441열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 5B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 16A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG11 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 16B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 16A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG11 mRNA(약 1.3 kb)는 근육과 심장조직들에서만 약하게 발현되고 있으며 다른 정상조직들에서는 발현이 매우 약하거나 없었다.
도 27A는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG11 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 27B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 27A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG11은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361들에서 높은 수준으로 발현되었다.
도 6A는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549, NCI-H2009, 및 NCI-H441)들에서 PIG16 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 6A에서 알 수 있는 바와 같이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주인 A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 6에서, 정상(Normal)열은 정상 폐조직을, 암(Cancer)열은 폐암 조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직 그리고 A549열, NCI-H2009열 및 NCI-H441열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 6B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 17A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG16 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 17B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 17A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG16 mRNA(약 1.3 kb)은 근육과 심장조직들에서만 약하게 발현되고 있으며 다른 정상조직들에서는 발현이 매우 약하거나 없었다.
도 28A는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG16 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 28B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 28A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG16은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361들에서 높은 수준으로 발현되었다.
도 7A는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549, NCI-H2009, 및 NCI-H441)들에서 PIG17 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 7A에서 알 수 있는 바와 같이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주인 A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 7에서, 정상(Normal)열은 정상 폐조직을, 암(Cancer)열은 폐암 조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직 그리고 A549열, NCI-H2009열 및 NCI-H441열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 7B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 18A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG17 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 18B는 동 일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 18A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG17 mRNA(약 1.3 kb)은 근육과 심장조직들에서만 약하게 발현되고 있으며 다른 정상조직들에서는 발현이 매우 약하거나 없었다.
도 29A는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG17 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 29B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 29A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG17은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361들에서 높은 수준으로 발현되었다.
도 8A는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549, NCI-H2009, 및 NCI-H441)들에서 PIG19 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 8A에서 알 수 있는 바와 같이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주인 A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 8에서, 정상(Normal)열은 정상 폐조직을, 암(Cancer)열은 폐암 조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직 그리고 A549열, NCI-H2009열 및 NCI-H441열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 8B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 19A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG19 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 19B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 19A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG19 mRNA(약 1.5 kb)은 근육과 심장조직들에서만 약하게 발현되고 있으며 다른 정상조직들에서는 발현이 매우 약하거나 없었다.
도 30A는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG19 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 30B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 30A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG19는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361들에서 높은 수준으로 발현되었다.
도 9A는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549, NCI-H2009, 및 NCI-H441)들에서 PIG20 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 9A에서 알 수 있는 바와 같이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주인 A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮았다. 도 9에서, 정상(Normal)열은 정상 폐조직을, 암(Cancer)열은 폐암 조직을, 전이 (metastasis)열 은 폐암 전이조직 그리고 A549열, NCI-H2009열 및 NCI-H441열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 9B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 20A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG20 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 20B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 20A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG20 mRNA(약 2.5 kb)은 근육, 심장, 및 태반 조직들에서만 약하게 발현되고 있으며 다른 정상조직들에서는 발현이 매우 약하거나 없었다.
도 31A는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG20 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 31B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 31A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG20은 HeLa 자궁암 세포주, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361들에서 높은 수준으로 발현되었으나, 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji 들에서는 발현이 아주 낮거나 없었다.
도 10A는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549, NCI-H2009, 및 NCI-H441)들에서 PIG21 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 10A에서 알 수 있는 바와 같이, 폐암 조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주인 A549, NCI-H2009, NCI-H441 폐암세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮았다. 도 10에서, 정상(Normal)열은 정상 폐조직을, 암(Cancer)열은 폐암 조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직 그리고 A549열, NCI-H2009열 및 NCI-H441열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 10B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 21A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG21 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 21B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 21A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG21 mRNA(약 1.3 kb)은 근육과 심장조직들에서만 약하게 발현되고 있으며 다른 정상조직들에서는 발현이 매우 약하거나 없었다.
도 32A는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG21 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 32B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 31A에서 알 수 있는 바와 같이, PIG21은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361들에서 높은 수준으로 발현되었다.
7-2: PIG 6, PIG 7, TRG 2
실시예 1에서와 같이, 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁암 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주 CaSki (ATCC CRL 1550), CUMC-6으로부터 총 RNA를 추출하였다.
PIG6; PIG 7 또는 TRG 2유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막 (Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II (Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 PIG 전체 cDNA 프로브로 블롯을 혼성화시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.
도 3a는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 PIG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG6 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 4.4 kb의 우점(dominant) PIG6 mRNA 전사물이 과발현되었다, 특히 자궁경부암 전이 임파절 조직에서의 발현정도가 가장 높았으며 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮았다. 도 3에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열 은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 3b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 14a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 14b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 14a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG6 mRNA ((약 4.4 kb의 우점(dominant) PIG6 mRNA 전사물과 약 8 kb의 PIG6 mRNA 전사물))는 정상 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 약하게 발현되고 있다.
도 25a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 25b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 25a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG6 mRNA ((약 4.4 kb의 우점(dominant) PIG6 mRNA 전사물과 약 8 kb의 PIG6 mRNA 전사물)는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 및 대장암 세포주 SW480들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 4a는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조 직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 PIG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG7 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 7.5 kb의 우점(dominant) PIG7 mRNA 전사물이 과발현되었다, 특히 자궁경부암 전이 임파절 조직에서의 발현정도가 가장 높았으며 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮았다. 도 4에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 4b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 15a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 15b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 15a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG7 mRNA (약 7.5 kb의 우점(dominant) PIG7 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 약하게 발현되고 있다.
도 26a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 26b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA 의 존재를 확인한 것이다. 도 26a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG7 mRNA (약 7.5 kb의 우점(dominant) PIG7 mRNA 전사물)는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암 세포주 A549 및 피부암 세포주 G361들에서도 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 12a는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG2 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 12a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG2 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 10 kb의 우점(dominant) TRG2 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 12에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 23a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG2 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 23b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 23a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG2 mRNA (약 10 kb의 우점(dominant) TRG2 mRNA 전사물)는 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 심장, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 매우 약하게 발현되고 있다.
도 36a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG2 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 36b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 36a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG2 mRNA (약 10 kb의 우점(dominant) TRG2 mRNA 전사물)는 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 증가된 수준으로 발현되었다.
7-3: HCCR BP 2
정상조직과 암세포에서 HCCRBP2 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 12종류의 장기에서 각각 정상 RNA를 추출하여 나이론 막위에 블롯팅시켜 놓은 상용화된 정상 인간 12-열 다중 조직들 (Clontech사) (도 22)과 8종류의 암세포들로부터 RNA들을 추출하여 막위에 블롯팅시켜 놓은 상용화된 인간 암세포 8-열 다중 조직들 (Clontech사) (도 11)를 구입하여 발현의 차이를 비교하였다. 두 종류의 막들은 레디프라임 Ⅱ (Rediprime Ⅱ) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham사)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 HCCRBP2 전체 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.
도 22는 정상 인간 12-열 다중 조직들 (Clontech사), 즉, 뇌, 심장, 골격근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초혈액 백혈구 조직에서 HCCRBP2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 22는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 22 에서 알 수 있는 바와 같이, HCCRBP2 mRNA 전사물 (transcript)인 dir 2.4 kb 전사물은 여러 정상조직들에서 발현이 약하거나 확인되지 않았다.
도 11은 인간 암 세포주들 (Clontech사), 즉, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 세포주에서 HCCRBP2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, HCCRBP2의 2.4 kb 전사물은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 자궁암 세포주인 HeLa 세포, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주인 SW480, 폐암 세포주인 A549 및 피부암인 흑색종 세포주 G361 세포주들에서 높은 수준으로 발현되었다.
자궁암, 대장암 및 백혈병들에서 HCCRBP2 유전자의 발현을 확인하기 위하여 RNeasy 총 RNA 키트 (Qiagen사)를 사용하여 건강한 정상인의 자궁, 대장 및 백혈구조직, 및 자궁암, 대장암 및 백혈병 환자들로부터 얻은 자궁암, 대장암 및 백혈병 조직들에서 총 RNA를 추출하였다. 각각의 암조직들로부터 추출한 총 RNA 20 ㎍씩을 1 % 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막 (Boehringer-Mannheim사)으로 옮겼다. 레디프라임 Ⅱ (Rediprime Ⅱ) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham사)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 HCCRBP2 전체 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.
도 33a는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 HCCRBP2 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 33a에서 알 수 있는 바와 같이, HCCRBP2 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 2.4 kb의 우점(dominant) HCCRBP2 mRNA 전사물이 과발현되었다, 특히 자궁경부암 전이 임파절 조직에서의 발현정도가 가장 높았으며 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮았다. 도 33에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 33b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 34a는 정상 대장 조직 및 대장암 조직들에서 HCCRBP2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 34b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 34a에서 알 수 있는 바와 같이, 대장암 조직들에서는 2.4 kb HCCRBP2 mRNA 전사물의 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 대장조직들에서는 발현 정도가 낮았다. 도 34a 및 34b에서, 정상열 (N)은 정상 대장 조직을, 암열 (C)은 대장암 조직을 각각 나타낸 다.
도 35a는 정상 백혈구 조직 및 백혈병 조직들에서 HCCRBP2 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 35b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 35a에서 알 수 있는 바와 같이, 백혈병 조직들에서는 2.4 kb HCCRBP2 mRNA 전사물의 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 백혈구조직들에서는 발현 정도가 낮았다. 도 35a 및 35b에서, 정상열 (N)은 정상 백혈구 조직을, 암열 (C)은 백혈병 조직을 각각 나타낸다.
실시예 8: 원암유전자를 대장균에 형질감염시킨 후 발현되는 단백질의 크기결정
8-1: PIG 5, PIG 6, PIG 7, PIG 11, PIG 16, PIG 17, PIG 19, PIG 20, PIG 21,TRG 2
서열번호: 1의 PIG5 원암유전자; 서열번호: 5의 PIG6 원암유전자;서열번호: 9의 PIG7 원암유전자; 서열번호: 13의 PIG 11 ; 서열번호: 17의 PIG 16 ; 서열번호: 21의 PIG 17; 서열번호 25의 PIG 19; 서열번호 29의 PIG 20; 서열번호 33의 PIG 21 ; 또는 서열번호 39의 TRG 2 원암유전자전체를 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/PIG 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100 로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다.
엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE).
도 37a는 pBAD/thio-Topo/PIG5벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 42 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 42 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG5 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 27 kDa의 PIG5 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 37b는 pBAD/thio-Topo/PIG6 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 87 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 87 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG6 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 72 kDa의 PIG6 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 37c는 pBAD/thio-Topo/PIG7 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 24 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 24 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG7 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 9 kDa의 PIG7 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 37d는 pBAD/thio-Topo/PIG11벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백 질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 47 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 47 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG11 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 32 kDa의 PIG11 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 37e는 pBAD/thio-Topo/PIG16 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 47 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 47 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG16 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 32 kDa의 PIG16 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 37f는 pBAD/thio-Topo/PIG17 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 35 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 35 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG17 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 20 kDa의 PIG17 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 37g는 pBAD/thio-Topo/PIG19벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 52 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 52 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG19 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 37 kDa의 PIG19 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 37h는 pBAD/thio-Topo/PIG20 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단 백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 34 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 34 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG20 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 19 kDa의 PIG20 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 37i는 pBAD/thio-Topo/PIG21 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 45 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 45 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG21 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 30 kDa의 PIG21 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 37k는 pBAD/thio-Topo/TRG2 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 63 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 63 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG2 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 48 kDa의 TRG2 단백질을 함유하고 있는 것이다.
8-2: HCCR BP 2
서열번호: 37의 뉴클레오티드 번호 9 내지 356에 해당하고, 서열번호: 38의 아미노산 번호 1 내지 115를 코드하는 것으로 예측되는 HCCRBP2 원암 유전자의 코딩영역 전체를 GST 유전자가 융합된 pGEX 4T-3 벡터 (Amersham Pharmacia Biotech사)의 다중 클로닝 부위 내 BamHI과 N otI 제한효소 부위에 삽입하여 pGEX 4T-3/HCCRBP2 벡터를 제조한 후, 이를 대장균 BL21 (ATCC 47092)에 형질감염시켰다. 형질감염된 대장균을 LB 배양액에서 37℃로 16시간동안 진탕 배양한 후, 배양액을 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 1 mM의 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노즈 (Isopropyl beta-D-thiogalacto-pyranoside, IPTG, Sigma사)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다.
IPTG 유도 전후에 배양액 시료를 취하여 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% SDS-PAGE 겔에서 전기영동하였다. 도 37j는 pGEX 4T-3/HCCRBP2 벡터로 형질감염된 대장균 BL21 균주의 단백질 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, IPTG 유도 후에 약 38 kDa의 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 38 kDa 융합단백질은 pGEX 4T-3 벡터의 유전자로부터 발현된 약 26 kDa 크기의 GST 단백질을 함유하고 있다.
본 발명의 원암 유전자는 신규 유전자로서 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 폐암, 피부암 등을 비롯한 암의 진단, 및 형질전환 동물의 제조 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 서열번호: 38의 아미노산 서열을 갖는 인간 원암단백질.
  2. 제 1항의 원암 단백질을 코딩하는 서열번호: 37의 염기 번호 9 내지 356에 해당하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호: 37의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
  4. 제 2항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 벡터.
  5. 제 1항의 원암단백질을 포함하는 암과 암전이 진단용 키트.
  6. 제 2항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 암과 암전이 진단용 키트.
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