KR100675967B1 - 인간 원암유전자 ｔｒｇ 및 이에 의해 코드되는 단백질 - Google Patents

인간 원암유전자 ｔｒｇ 및 이에 의해 코드되는 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 원암유전자는 인간 암발생에 관여하며 자궁암, 백혈병, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등을 비롯한 암의 진단 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

인간 원암유전자 ＴＲＧ 및 이에 의해 코드되는 단백질{HUMAN PROTOONCOGENE TRG AND PROTEIN ENCODED THEREIN}
도 1은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 H20-121 DNA 단편(a); H93-811 DNA 단편(b); H117-321 DNA 단편(c);H38-211 DNA 단편(d);H38-621 DNA 단편(e);H96 DNA 단편(f);H94 DNA 단편 (g);H42 DNA 단편(h); H109 DNA 단편(i);H119 DNA 단편(j);H201 DNA 단편 (k);H151 DNA 단편(l);H132 DNA 단편(m);H141 DNA 단편 (n);H181 DNA 단편 (o);H134 DNA 단편 (p)의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이고,
도 2는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 TRG3(a 상단); TRG4(b 상단); TRG5(c 상단); TRG6(d 상단); TRG7(e 상단); TRG9(f 상단); TRG10(g 상단); TRG11(h 상단); TRG12(i 상단) TRG13(j 상단); TRG14(k 상단); TRG15(l 상단) ; TRG16(m 상단); TRG17(n 상단); TRG18(o 상단); TRG20(p 상단)원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 각 도2의 하단은 각 도 2상단과 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 3a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG3 원암유전자의 발현 여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 3b는 도 3a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 4a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 4b는 도 4a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 5a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 5b는 도 5a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 6a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 6b는 도 6a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 7a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 7b는 도 7a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 8a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 8b는 도 8a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 9a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 9b는 도 9a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 10a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG11 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 10b는 도 10a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 11a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG12 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 11b는 도 11a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 12a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 12b는 도 12a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 13a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 13b는 도 13a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 14a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG15 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 14b는 도 14a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 15a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG16 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 15b는 도 15a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 16a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG17 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 16b는 도 16a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 17a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 17b는 도 17a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 18a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG20 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 18b는 도 18a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.
도 19a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 19b는 도 19a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 20a는 인간 암 세포주들에서 TRG4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 20b는 도 20a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 21a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 21b는 도 21a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 22a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 22b는 도 22a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 23a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG7 원암유전자의 발현여부를 확 인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 23b는 도 23a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 24a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 24b는 도 24a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 25a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 25b는 도 25a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 26a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG11 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 26b는 도 26a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 27a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG12 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 27b는 도 27a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 28a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 28b는 도 28a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 29a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 29b는 도 29a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 30a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG15 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 30b는 도 30a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 31a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG16 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 31b는 도 31a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 32a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG17 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 32b는 도 32a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 33a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 33b는 도 33a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 34a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG20 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 34b는 도 34a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명의 TRG3 (a); TRG4(b); TRG5(c); TRG6(d); TRG7(e); TRG9(f); TRG10(g); TRG11(h); TRG12(i) TRG13(j); TRG14(k); TRG15(l); TRG16(m); TRG17(n); TRG18(o); TRG20(p) 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과이다.
본 발명은 암발생과 암전이 유발능을 나타내는 신규 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것이다.
인간을 포함한 고등동물들은 약 30,000개의 유전자들을 갖고 있으나 이들 중 약 15%만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉, 발생, 분화, 항상성 (homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화 및 아폽토시스 (apoptosis; programmed cell death) 등이 결정된다 (Liang, P. and A. B. Pardee, Science 257: 967-971, 1992).
종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서, 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현들의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다. 예를 들면, 리앙과 파디 (Liang, P. and A. B. Pardee, Science 257: 967-971, 1992)에 의해 제안된 mRNA 감별전개 (differential display) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기 (cell cycle)에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자 (transcriptional regulatory gene) 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며, 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들의 상호 관련성의 규명에도 다양하게 활용되고 있다.
종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체 부위의 소실 (loss of chromosomal heterozygosity), 원암유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다 (Bishop, J. M., Cell 64: 235-248, 1991; Hunter, T., Cell 64: 249-270, 1991). 또한, 암의 10 내지 30%는 원암유전자가 증폭됨으로써 활성화되어 일어난다고 보고되어 있어, 원암유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 자궁경부암의 발생기전을 원암유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 형질전환 관련 유전자 (human transformation-related gene; TRG)로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현이 증가 된다는 것을 밝혀내었다. 상기 원암유전자는 자궁암, 백혈병, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등과 같은 다양한 암의 진단, 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 신규 원암유전자 및 그의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자에 의해 코드되는 단백질 및 그의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1; 서열번호 5; 서열번호: 9; 서열번호: 13; 서열번호: 17; 서열번호: 21; 서열번호: 25; 서열번호: 29; 서열번호: 33; 서열번호: 37; 서열번호: 41; 서열번호: 45; 서열번호: 49; 서열번호: 53; 서열번호: 57; 또는 서열번호: 61의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호: 2; 서열번호: 6; 서열번호: 10; 서열번호: 14; 서열번호: 18; 서열번호: 22; 서열번호: 26; 서열번호: 30; 서열번호: 34; 서열번호: 38; 서열번호: 42; 서열번호: 46; 서열번호: 50; 서열번호: 54; 서열번호: 58; 또는 서열번호: 62의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 원암유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자를 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 안티-센스 유전자를 활성성분으로 포함하는 항암 및 항전이 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
1. TRG 3
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 3 (human transformation-related gene 3; 이후 TRG3로 지칭함)은 서열번호: 1로 기재되는 1,703 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 113 내지 1522 부위 (1520-1522: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 2에 나타나 있으며 469개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG3 단백질"로 지칭함).
서열번호: 1의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY189688 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 4월 8일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 BC011681호인 Homo sapiens CGI-51 protein 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서 는 발현이 매우 낮은 TRG3 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 2와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 1과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 469개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 52 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이 상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
2. TRG 4
본　발명의　원암　(原癌)　유전자　(protooncogene)인　인간　형질전환　관련　유전자　4　(human　transformation-related　gene　4;　이후　TRG4로　지칭함)은　서열번호:　5로　기재되는　2,576　bp　길이의　전체　염기서열을　가진다.
서열번호: 5의　염기서열에서,　뉴클레오티드　번호　87　내지　482　부위 (480- 482: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체　단백질코딩　영역으로서　이로부터　유도되는　아미노산　서열은　서열번호: 6에 나타나 있으며 131개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후　"TRG4　단백질"로　지칭함).
서열번호:　5의　염기서열은　미국　국립보건원의　진뱅크(NIH　GenBank)　데이터베이스에 등록번호 제　AY189690　호로　등록되었으며(공개예정일:　2005년　4월　8일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_022463호인 Homo sapiens nucleoredoxin (NXN)　유전자와　유전자　염기서열이　유사함이　확인되었으나　단백질서열은　완전히　다른　유전자이다.　그러나　금번　연구　결과　자궁암을　포함한　여러 인간 종양들에서는　발현이　높고　반면에　여러　정상조직들에서는　발현이 매우 낮은 TRG4 원암유전자를　발굴하게　되었다.
그러나,　코돈의　축퇴성　(degeneracy)으로　인해서　또는　상기　원암유전자를 발현시키고자 하는　생물에서　선호되는　코돈을　고려하여　본　발명의　원암유전자는　코딩영역으로부터　발현되는　발암단백질의　아미노산　서열을　변화 시키지　않는　범위 내에서 코딩영역에　다양한　변형이　이루어질　수　있고　코딩영역을　제외한　부분에서도　유전자의 발현에 영향을　미치지　않는　범위　내에서　다양한　변형　또는　수식이　이루어질 수 있으며, 그러한　변형　유전자　역시　본　발명의　범위에　포함된다.　　따라서,　본　발명은　상기　서열번호:　5의　원암유전자와　실질적으로　동일한　염기　서열을　갖는 폴리뉴클레오티드　및　상기　유전자의　단편을　역시　포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란　서열번호:　6과　동일한　단백질　번역　생성물을　암호화하는 DNA로서 서열번호:　5와　80%　이상,　바람직하게는　90%　이상,　가장　바람직하게는　95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본　발명의　원암유전자로부터　발현되는　단백질은　131개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호:　6으로　기재되는　아미노산　서열을　가지며　크기는　약　14　kDa이다.　　그러나,　상기　단백질의　아미노산　서열에서도　역시　단백질의　기능에　영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라　단백질의　일부만이　사용될　수도　있다. 그러한 변형된　아미노산 서열 역시 본　발명의　범위에　포함된다.　따라서,　본　발명은　상기　발암　단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는　폴리펩티드　및　그의　단편을　역시　포함하며,　실질적으로　동일한　폴리펩티드란　80%　이상,　바람직하게는　90%　이상,　가장 바람직하게는 95%　이상의　서열　상동성을　갖는　것들을　의미한다.
3. TRG 5
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 5 (human transformation-related gene 5; 이후 TRG5로 지칭함)은 서열번호: 9로 기재되는 1,334 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 9의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 88 내지 1092 부위 (1090-1092: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 10에 나타나 있으며 334개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG5 단백질"로 지칭함).
서열번호: 9의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY189689 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 4월 8일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_002300 호인 Homo sapiens lactate dehydrogenase B (LDHB) 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG5 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발 명은 상기 서열번호: 9의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 10과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 9와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 334개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 37 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
4. TRG 6
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 6 (human transformation-related gene 6; 이후 TRG6로 지칭함)은 서열번호: 13으로 기재되는 3,309 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다. 서열번호: 13의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 233 내지 481 부위 (479-481: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유 도되는 아미노산 서열은 서열번호: 14에 나타나 있으며 82개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG6 단백질"로 지칭함).
서열번호: 13의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY191222 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 4월 8일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AL354928호인 염색체 9 상의 RP11-175D17 클론 등과 유전자와 유전자 염기서열이 일부 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG6 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 13의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 14와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 13과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 82개의 아미노산으로 이루어 져 있고 서열번호: 14로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 9 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
5. TRG 7
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 7 (human transformation-related gene 7; 이후 TRG7으로 지칭함)은 서열번호: 17로 기재되는 1,334 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 17의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 42 내지 1422 부위 (1420-1422: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 18에 나타나 있으며 175개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG7 단백질"로 지칭함).
서열번호: 17의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY191223 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 4월 8일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AK074557호인 Homo sapiens cDNA FLJ90076 fis, 클론 HEMBA1004444 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG7 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 17의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 18과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 17과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 175개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 18로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 20 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질 적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
6. TRG 9
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 9 (human transformation-related gene 9; 이후 TRG9으로 지칭함)은 서열번호: 21로 기재되는 1,582 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 21의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 17 내지 1576 부위 (1574-1576: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 22에 나타나 있으며 519개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG9 단백질"로 지칭함).
서열번호: 21의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY272044 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_003100호인 Homo sapiens sorting nexin 2 (SNX2) 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG9 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유 전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 21의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 22와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 21과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 519개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 22로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 58 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
7. TRG 10
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 10 (human transformation-related gene 10; 이후 TRG10으로 지칭함)은 서열번호: 25로 기재되는 3,979 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 25의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 1100 내지 1270 부위 (1268-1270: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 26에 나타나 있으며 56개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG10 단백질"로 지칭함).
서열번호: 25의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277593 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_033346호인 Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type II (serine/threonine kinase) (BMPR2), 전사 변이체 2 유전자 등과 유전자 서열이 유사한 것이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 낮은 TRG10 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 25의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 26과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서 열번호: 25와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 56개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 26으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 6 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
8. TRG 11
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 11 (human transformation-related gene 11; 이후 TRG11로 지칭함)은 서열번호: 29로 기재되는 235 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 29의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 26 내지 214 부위 (227-229: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 30에 나타나 있으며 62개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG11 단백질"로 지칭함).
서열번호: 29의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터 베이에 등록번호 제 AY277594 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 BC022205호인 Homo sapiens IMAGE:5258564유전자 클론 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG11 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 29의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 30과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 29와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 62개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 30으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 7 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
9. TRG 12
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 12 (human transformation-related gene 12; 이후 TRG12로 지칭함)은 서열번호: 33으로 기재되는 510 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 33의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 80 내지 475 부위 (473-475: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 34에 나타나 있으며 131개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG12 단백질"로 지칭함).
서열번호: 33의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277595 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AY358674호인 Homo sapiens DNA59497 MY047 (UNQ577) 유전자 클론 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG12 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 33의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 34와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 33과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 131개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 34로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 14 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
10. TRG 13
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 13 (human transformation-related gene 13; 이후 TRG13으로 지칭함)은 서열번호: 37로 기재되는 1,301 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 37의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 18 내지 1193 부위 (1191-1193: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 38에 나타나 있으며 391개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG13 단백질"로 지칭함).
서열번호: 37의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277596 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 BC002940호인 Homo sapiens MGC11349 유전자와 제 BC012729호인 Homo sapiens MGC11349 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 이들 유전자는 아직 기능이 밝혀져 있지 않고 있다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG13 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 37의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 38과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 37과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 391개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 38로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 40 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
11. TRG 14
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 14 (human transformation-related gene 14; 이후 TRG14로 지칭함)은 서열번호: 41로 기재되는 1,206 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 41의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 18 내지 1202 부위 (1200- 1202: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 42에 나타나 있으며 394개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG14 단백질"로 지칭함).
서열번호: 41의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277597 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_006096호인 Homo sapiens N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1)유전자 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG14 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 41의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 42와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 41과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서 열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 394개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 42로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 43 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
12. TRG 15
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 15 (human transformation-related gene 15; 이후 TRG15로 지칭함)은 서열번호: 45로 기재되는 1,104 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 45의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 1 내지 1104 부위 (1102-1104: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 46에 나타나 있으며 367개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG15 단백질"로 지칭함).
서열번호: 45의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277598 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염 기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_017952 호 인 Homo sapiens FLJ20758 protein 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. FLJ20758 protein 유전자는 아직 기능이 밝혀져있지 않고 있다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG15 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 45의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 46과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 45와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 367개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 46으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 42 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
13. TRG 16
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 16 (human transformation-related gene 16; 이후 TRG16으로 지칭함)은 서열번호: 49로 기재되는 1,064 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 49의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 92 내지 1064 부위 (1062-1064: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 50에 나타나 있으며 324개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG16 단백질"로 지칭함).
서열번호: 49의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277601 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AF318376 호인 Homo sapiens pp9320 mRNA 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. pp9320 유전자는 아직 기능이 밝혀져있지 않고 있다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG16 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 49의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 50과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 49와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 324개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 50으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 36 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
14. TRG 17
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 17 (human transformation-related gene 17; 이후 TRG17로 지칭함)은 서열번호: 53으로 기재되는 432 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 53의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 1 내지 408 부위 (406-408: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 54에 나타나 있으며 135개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG17 단백질"로 지칭함). 서열번호: 53의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277599 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_032286호인 Homo sapiens MGC5309 (MGC5309)유전자와 제 BC003353호인 Homo sapiens MGC5309유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG17 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 53의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 54와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 53과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 135개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 54로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 16 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
15. TRG 18
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 18 (human transformation-related gene 18; 이후 TRG18로 지칭함)은 서열번호: 57로 기재되는 1,141 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 57의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 20 내지 1141 부위 (1139- 1141: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 58에 나타나 있으며 373개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG18 단백질"로 지칭함). 서열번호: 57의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277600 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AJ131389호인 Homo sapiens PEX3 단백질에 대한 mRNA 유전자 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG18 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 57의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 58과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 57과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 373개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 58로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 42 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
16. TRG 20
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 20 (human transformation-related gene 20; 이후 TRG20으로 지칭함)은 서열번호: 61로 기재되는 449 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 61의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 42 내지 449 부위 (447-449: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 62에 나타나 있으며 135개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG20 단백질"로 지칭함). 서열번호: 61의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY453397 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_032286호인 Homo sapiens 가상 단백질 MGC5309 (MGC5309)유전자와 제 BC003353호인 Homo sapiens 가상 단백질 MGC5309유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG20 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 61의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 62와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 61과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 135개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 62로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 16 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본　발명의　원암유전자　및　단백질은　사람의　암　조직으로부터　분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성　방법에　따라　합성할　수도　있다.　또한,　이렇게 제조된 유전자를 당　분야에　공지된　미생물　발현용　벡터에　삽입하여　발현벡터를 제조한 후 이를 적절한　숙주　세포,　예를　들어,　대장균　또는　효모　세포　등에　도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대향으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다.
벡터의　제작시에는,　상기　원암유전자　또는　단백질을　생산하고자　하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터,　터미네이터　등과　같은　발현조절서열, 자가복제서열 및 분비　시그날　등을　적절히　선택하고　조합할　수　있다.
본　발명의　유전자는　노던　블롯　(northern　blot)　등의　분석방법에서 정상 자궁경부　조직에서는　발현이　약한　반면　자궁경부암　조직과　자궁암　세포주들에서는 그 과발현이 확인되므로　자궁암을　유발시키는　강력한　발암　유전자로　판단된다. 자궁경부암과　같은　상피성　조직외에도,　본　발명의　원암유전자는　백혈병과　대장암　등과 같은 많은 다른　암　종양들에서　높게　발현된다.　따라서,　본　발명의　원암유전자는 다양한 암의　발생에　공통된　발암유전자일　것으로　판단되며,　다양한　암의　진단, 형질전환된 동물의 제조,　안티-센스 　(anti-sense)　유전자　치료　등에　효과적으로 이용될 수 있다.
상기　원암유전자를　이용한　암의　진단　방법은,　예를　들어,　상기 원암유전자의 전부 또는　일부를　프로브로　사용하여　대상자의　체액으로부터　분리한　핵산과 혼성화한 후 당　분야에　공지된　다양한　방법으로　이를　검출하므로써　대상자가 본 발명의 원암유전자를 가지고 있는지를　판단하는　과정을　포함한다.　　상기　프로브를 방사선 동위원소 또는　효소　등으로　표지하면　용이하게　유전자의　존재를　확인할　수 있다. 따라서, 본　발명에서는　상기　원암유전자의　전부　또는　일부를　포함하는　암 진단용 키트를 역시　제공한다.
형질전환　동물은　본　발명의　원암유전자를 포유동물, 예를 들어, 래트 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할　수　있으며,　이　유전자를　적어도 8세포기 이전의 수정란　단계에서　도입하는　것이　바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와　같은　항암성　물질의　탐색　등에　유용하게　사용될　수　있다.
본　발명은　또한　유전자　치료에　효과적인　안티-센스　유전자를　제공한다. 본원에서, "안티센스　유전자　(anti-sense　gene)"는　상기 원암유전자　또는　그의 일부로부터　전사되는　mRNA의　일부　또는　전부와　상보적인　서열을　가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA의　단백질　결합부위에　결합하여　원암유전자의　오픈　리딩 프레임 (open　reading　frame;　ORF)을　파괴할　수　있는　서열을　갖는　DNA　서열을　환자의 체내로 도입함으로써 상기 원암유전자의　발현으로　인한　암을　예방　또는　치료할　수　있다.　본　발명은　또한　그　범위　 내에　본　발명의　안티센스　유전자의 치료 효과량을 환자에게 투여하여　암　또는　암　전이를　치료　또는　예방하는　방법을　포함한다.
본　발명의　안티센스　유전자　치료에서,　본　발명의　안티센스　유전자는 통상적인 방법으로 환자에게　투여되어　원암유전자의　발현을　예방한다.　예를　들면, 문헌 (J.　S.　Kim　et　al.,　J.　 Controlled 　 Release　53:　175-182,　1998)의　방법에　따라 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드　(ODN)를　폴리-L-리신　유도체와　정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이　혼합체를　환자에게　정맥투여한다.
본　발명의　범위에는　또한,　약학적으로　허용가능한　담체,　부형제　또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께　본　발명의　안티센스　유전자를　활성성분으로　포함하는 항암조성물을 포함한다. 본　발명의　약학　조성물을　주사제로　제제화하는　것이　바람직하다.
실제로　투여되는　안티센스　유전자의　양은　치료되는　증상,　투여　경로, 환자의 연령 및　체중,　증상의　중증도와　같은　다양한　관련되는　인자를　고려하여　결정한다.
본　발명의　원암유전자로부터　유도되는　단백질은　진단　도구로서　항체를 생산하는데　유용하게　사용될　수　있다.　　본　발명의　항체는,　본　발명의 원암유전자로부터 발현된　상기 아미노산　서열을　갖는　단백질　또는　그의　단편을　이용하여　당 분야에 공지된　통상의　방법에　따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을　이용하여 당분야에 공지 된 효소 면역측정법 (enzyme　linked　immunosorbent　assay;　ELISA), 방사선면역측정법 (radioimmunoassay; RIA),　샌드위치　측정법　(sandwich　assay), 폴리아크릴아미드 겔상의 웨스턴 블롯 또는　면역　블롯　등의　방법에　의해　대상자의　체액　시료 중에 상기 단백질이 발현되었는지를　확인함으로써　암을　진단할　수　있다.
또한,　본　발명의　원암유전자를　이용하여　지속적으로　증식할　수　있는　암　세포주를　확립할　수　있으며,　이러한　세포주는　예를　들어,　상기 원암유전자가 형질도입된 섬유모세포를　이용하여　누드　마우스　등에　형성시킨　종양조직으로부터　제조할　수　있다.　　이러한　암　세포주는　항암제　등의　탐색에　유용하게　이용될　수　있다.
이하,　본　발명을　실시예에　의해　상세히　설명한다.
단,　하기　실시예는　본　발명을　예시하는　것일　뿐,　본　발명의　내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>　종양세포의　배양　및　총　RNA의　분리
(단계　1)　종양세포의　배양
mRNA의　감별　전개를　위하여,　자궁적출술　(hysterectomy)을　받은　자궁근종 환자로부터 정상자궁경부　(exocervical)　조직,　그리고　이전에　항암요법과　방사선치료를　받지　않은　자궁암　환자로부터　수술시에　원발성　자궁경부　종양조직　및　전이 임파절 종양조식을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 자궁경 부암 세포주로 CUMC-6　(Kim,　J.　W.　et 　 al .,　Gynecol .　 Oncol .　62:　230-240,　1996)을　사용하였다.
상기　수득된　조직　및　CUMC-6　세포주로부터　얻은　세포를　2　mM　글루타민, 100 IU/㎖　페니실린,　100　㎍/㎖　스트렙토마이신　및　10%　우태아　혈청　(Gibco,　USA)이 함유된 웨이마우쓰　(Waymouth's)　MB　752/1　배양액　(Gibco)에서　증식시켰다. 실험에 사용한　배양　세포들은　지수적　증식　과정의　세포들로서 트리판 블루 (trypan blue) 염색에 의해 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다 (Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York, 1987).
(단계　2)　RNA의　분리　및　mRNA의　감별　전개법
상업적으로　판매되는　시스템인 RNeasy 총 RNA 키트 (Qiagen Inc., 독일)를 사용하여　단계　1에서　얻은　정상　자궁경부　조직,　원발성　자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 세포로부터 총 RNA를　추출하였다.　메시지 클린 키트 (Message clean kit, GenHunter Corp., Brookline,　MA)를　사용하여　RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.
<실시예 2> 감별 전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (differential display reverse　transcription-PCR)
감별전개　역전사는　상기　리앙과　파디에　의해　기술된　역전사-중합효소　연쇄반응　(RT-PCR)을　약간　변형하여　수행하였다.
2-1: TRG 3
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5 mM [α-35S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 4로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP20 프라이머 (5'-AAGCTTGTTGTGC-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.
PCR로　증폭된　단편을　6%　폴리아크릴아미드　시퀀싱　겔에　용해시킨　후, 방사능 사진을 이용하여 서로　다른　발현　(differentially　expressed)　정도를　보이는　밴드의　위치를　확인하였다.
건조된 겔로부터 258 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H20-121 cDNA (서열번호: 1의 1342-1599 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H20-121 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-2: TRG 4
서열번호: 7로 H-T11G　고정　프라이머　(5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 8로 H-AP9　프라이머　(5'-AAGCTTCATTCCG-3')를　사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된　겔로부터　393　염기쌍　(bp)　크기의　밴드,　H93-811　cDNA　(서열번호:　5의　2086-2478　bp)를　도려내었다.　　15분간　가열하여　H93-811　cDNA를　용출시킨　후,　[α-35S]　표지된　dATP　(1200　Ci/mmole)　및　20　μM　dNTP를　사용하지　않는　것을　제외하고는　상기와　동일한　프라이머　및　동일한　조건　하에서　PCR을　수행하여　재증폭시켰다.
2-3: TRG 5
서열번호: 11로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 12로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP11 프라이머 (5'-AAGCTTCGGGTAA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 292 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H117-321 cDNA (서열번호: 9의 933-1224 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H117-321 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-4: TRG 6
서열번호: 15로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘- AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP38 프라이머 (5'-AAGCTTCCAGTGC-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 311 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H38-211 cDNA (서열번호: 13의 2823-3133 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H38-211 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-5: TRG 7
서열번호: 19로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11G 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 20으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP38 프라이머 (5'-AAGCTTCCAGTGC-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 292 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H38-621 cDNA (서열번호: 17의 1404-1695 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H38-621 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-6: TRG 9
서열번호: 23으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 24로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP9 프라이머 (5'-AAGCTTCATTCCG-3')를 사용한 것 을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 275 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H96 cDNA (서열번호: 21의 1225-1499 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H96 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-7; TRG10
서열번호: 27로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 28로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP9 프라이머 (5'-AAGCTTCATTCCG-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 352 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H94 cDNA (서열번호: 25의 3528-3879 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H94 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-8; TRG11
서열번호: 31로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 32로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP4 프라이머 (5'-AAGCTTCTCAACG-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 147 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H42 cDNA (서열번호: 29의 83-229 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H42 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-9: TRG 12
서열번호: 35로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11G 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 36으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP10 프라이머 (5'-AAGCTTCCACGTA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 212 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H109 cDNA (서열번호: 33의 284-495 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H109 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-10: TRG 13
서열번호: 39로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 40으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP11 프라이머 (5'-AAGCTTCGGGTAA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 232 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H119 cDNA (서열번호: 37의 1004-1235 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H119 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기 와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-11: TRG 14
서열번호: 43으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11G 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 44로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP20 프라이머 (5'-AAGCTTGTTGTGC-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 195 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H201 cDNA (서열번호: 41의 902-1096 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H201 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-12: TRG 15
서열번호: 47로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 48로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP15 프라이머 (5'-AAGCTTACGCAAC-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 252 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H151 cDNA (서열번호: 45의 848-1099 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H151 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-13: TRG 16
서열번호: 51로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 52로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP13 프라이머 (5'-AAGCTTCGGCATA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 227 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H132 cDNA (서열번호: 49의 813-1039 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H132 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-14: TRG 17
서열번호: 55로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11G 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 56으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP14 프라이머 (5'-AAGCTTGGAGCTT-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 185 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H141 cDNA (서열번호: 53의 235-419 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H141 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-15: TRG 18
서열번호: 59로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 60 으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP18 프라이머 (5'-AAGCTTAGAGGCA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 227 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H181 cDNA (서열번호: 57의 902-1128 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H181 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-16: TRG 20
서열번호: 63으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 64로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP13 프라이머 (5'-AAGCTTCGGCATA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을　수행하였다.
건조된 겔로부터 186 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H134 cDNA (서열번호: 61의 232-417 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H134 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
<실시예 3>　클로닝
상기에서　얻은　재증폭된　 H20-121; H93-811;　 H117-321;H38-211;H38-621;H96 ; H94; H42;H109;H119;H201;H151;H132;H141;H181; 또는 H134 PCR　산물을　TA　클로닝　시스템　(Promega,　USA)을　사용하여　제조사의　방법에　따라　pGEM-T　EASY 　벡터에 삽입하였다.
(단계　1)　연결반응
실시예　2에서　얻은　재증폭된 H20-121; H93-811; H117-321; H38-211 ;H38-621 ;H96; H94;H42;H109 ;H119 ;H201 ;H151 ;H132 ;H141 ;H181 또는 H134 PCR 산물 2㎕,　pGEM-T　EASY　벡터　(50　ng)　1　㎕,　T4　DNA　연결효소　10X　완충액　1　㎕　및 T4 DNA 연결효소　(3　weiss　units/㎕;　T4　DNA　ligase,　Promega)　1　㎕를　0.5　㎖ 시험관에 넣은 후, 증류수를　가하여　최종　부피가　10　㎕가　되도록　하였다.　연결 반응 혼합물은 14℃에서　밤새　배양하였다.
(단계　2)　TA　클로닝　형질전환
대장균　JM109　(Promega,　WI,　USA)를　10　㎖의　LB 브로쓰 (박토-트립톤 10 g, 박토-효모 추출물 5　g,　NaCl　5　g)　중에서　600　㎚에서의　광학밀도　값이　약　0.3　내지　0.6이　될　때까지　배양하였다.　배양　혼합물을　얼음에 약 10분간 방치한 후, 4℃에서 10분간　방치한　후,　4℃에서 10분간　4000　rpm으로　원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 수집하였다. 수집한　세포　펠릿을　10　㎖의　빙냉　0.1　M　CaCl2에　30분　내지　1시간　가량　노출시켜　컴피턴트　(competent)　세포를　제조하였다.　　결과물을　4℃, 4000 rpm에서 10분　동안　다시　원심분리하여　상청액을　버리고　세포를　모아서　2　㎖의　빙냉　0.1　M　CaCl2에　현탁시켰다.
컴피턴트　세포　현탁액　200　㎕를　새로운　마이크로퓨즈　(microfuge) 튜브에 옮기고, 여기에 단계　1에서　제조한　연결　반응　산물　2　㎕를　가하였다.　혼합물을 42℃의 수욕 (water bath)에서　90초간　배양시킨　후,　0℃에서 급냉시켰다. 여기에, SOC 배지　(박토-트립톤　2.0　g,　박토-효모　추출물　0.5　g,　1　M　NaCl　1　㎖,　1　M KCI 0.25㎖,　TDW　97　㎖,　2　M　Mg2 +　1　㎖,　2　M　글루코스　1　㎖) 800㎕를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서　220　rpm의　회전진탕　배양기에서　45분간　배양시켰다.
37℃　배양기에　미리　넣어둔,　앰피실린이　첨가된　LB　플레이트에　X-gal　(40　㎎/㎖　디메틸포름아미드에　저장)　25　㎕를　유리봉으로　확산시킨　후,　여기에　25　㎕의　형질전환된　세포를　넣어서　다시 유리봉으로 확산시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 형성된 백색 콜로니를 3-4개　선택하여 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 각각의 선택된　클론들을　심었다.　　플라스미드를　제조하기　위하여　이들　중 삽입이 확인된 콜로니, 즉,　형질전환된　대장균　JM109/H20-121;JM109/H93-811;JM109/H117-321;JM109/H38-211 ; JM109/H38-621 ; JM109/H96 ; JM109/H94; JM109/H42; JM109/H109 ; JM109/H119 ; JM109/H201 ; JM109/H151 ; JM109/H132 ; JM109/H141 ; JM109/H181; 또는 JM109/H134을 선택하여 10㎖의 테리픽 브로쓰 (terrific broth; TDW　900　㎖,　박토-트립톤　12　g,　박토-효모　추출물　24　g,　글리세롤　4　㎖, 0.17 M KH2PO4,　0.72　N　K2HPO4 　100　㎖)에서　배양하였다.
<실시예 4>　재조합　플라스미드　DNA의　분리
위저드　플러스　미니프렙스　DNA　정제　키트 (WizardTM Plus Minipreps DNA Purificatin Kit, Promega, USA)를 사용해서　제조사의　지시에　따라　형질전환된　대장균으로부터　 H20-121;H93-811 ;　H117-321; H38-211 ;H38-621 ;H96 ; H94 ;H42 ;H109 ;H119 ;H201 ;H151 ;H132 ;H141 ;H181 ; 또는 H134 플라스미드　DNA를　분리하였다.
분리된　플라스미드　DNA의　일부를　ECoRI　효소로　처리한　후,　2% 겔에서 전기영동을 실시하여　H20-121;H93-811;　H117-321;H38-211 ;H38-621 ;H96 ; H94 ;H42;H109 ;H119 ;H201 ;H151 ;H132 ;H141 ;H181 ;또는 H134 부분서열이　플라스미드에　삽입되었음을　확인하였다.
<실시예 5>　DNA　염기서열　분석
5-1; TRG 3
실시예　2에서　수득한　H20-121　PCR　산물을　통상적인　방법에　따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H20-121　PCR　단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing　kit;　United　States　Biochemical, Cleveland, OH,　USA)를　이용하여　디데옥시　쇄　종결법　(dideoxy　chain　termination)에　따라　서열　분석을　실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 1342 내지 1599에 해당하며, 본 발명에서는 "H20-121"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP20 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 258 bp cDNA 단편, 즉, H20-121를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1a에서 알 수 있는 바와 같이, 258 bp cDNA 단편인 H20-121은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-2; TRG 4
실시예 2에서 수득한 H93-811 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H93-811 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기　DNA의　염기　서열은　서열번호:　5의　뉴클레오티드　번호　2086　내지　2478에　해당하며,　본　발명에서는　"H93-811"로　지칭하였다.
5'　무작위　프라이머　H-AP9　및　3'　H-T11G　고정　프라이머를　사용하여　상기에서　수득한　393　bp　cDNA　단편,　즉,　H93-811　를　감별전개　역전사　중합효소　연쇄반응　(DDRT-PCR)시키고,　전기　영동으로　확인하였다.
도　1b에　나타낸　바와　같이,　정상　자궁경부　조직,　전이　임파절　조직　및　CUMC-6　세포에서　DD에　의한　유전자　발현이　상이한　것으로　확인되었다.　　도　1b에서　알　수　있는　바와　같이,　393　bp　cDNA　단편인　H93-811은　자궁경부암,　전이　임파절　조직　및　CUMC-6　암세포에서는　발현되었으나,　정상　조직에서는　발현이　매우　약하였다.
5-3; TRG 5
실시예 2에서 수득한 H117-321 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H117-321 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 번호 933 내지 1224에 해당하며, 본 발명에서는 "H117-321"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP11 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 292 bp cDNA 단편, 즉, H117-321 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1c에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1c에서 알 수 있는 바와 같이, 292 bp cDNA 단편인 H117-321은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-4; TRG 6
실시예 2에서 수득한 H38-211 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H38-211 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 13의 뉴클레오티드 번호 2823 내지 3133에 해당하며, 본 발명에서는 "H38-211"로 지칭하였다. 5' 무작위 프라이머 H-AP38 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 311 bp cDNA 단편, 즉, H38-211 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1d에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1d에서 알 수 있는 바와 같이, 311 bp cDNA 단편인 H38-211은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-5; TRG 7
실시예 2에서 수득한 H38-621 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H38-621 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination) 에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 17의 뉴클레오티드 번호 1404 내지 1695에 해당하며, 본 발명에서는 "H38-621"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP38 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 292 bp cDNA 단편, 즉, H38-621 을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1e에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1e에서 알 수 있는 바와 같이, 292 bp cDNA 단편인 H38-621은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-6; TRG 9
실시예 2에서 수득한 H96 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H96 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 21의 뉴클레오티드 번호 1225 내지 1499에 해당하며, 본 발명에서는 "H96"으로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP9 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 275 bp cDNA 단편, 즉, H96을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시 키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1f에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1f에서 알 수 있는 바와 같이, 275 bp cDNA 단편인 H96은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-7; TRG10
실시예 2에서 수득한 H94 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H94 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 25의 뉴클레오티드 번호 3528 내지 3879에 해당하며, 본 발명에서는 "H94"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP9 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 352 bp cDNA 단편, 즉, H94 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1g에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1g에서 알 수 있는 바와 같이, 352 bp cDNA 단편인 H94는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 약하였다.
5-8; TRG11
실시예 2에서 수득한 H42 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H42 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 29의 뉴클레오티드 번호 83 내지 229에 해당하며, 본 발명에서는 "H42"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP4 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 147 bp cDNA 단편, 즉, H42를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1h에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1h에서 알 수 있는 바와 같이, 147 bp cDNA 단편인 H42는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 약하였다.
5-9; TRG 12
실시예 2에서 수득한 H109 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H109 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination) 에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 33의 뉴클레오티드 번호 284 내지 495에 해당하며, 본 발명에서는 "H109"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP10 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 212 bp cDNA 단편, 즉, H109 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1i에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1i에서 알 수 있는 바와 같이, 212 bp cDNA 단편인 H109는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-10; TRG 13
실시예 2에서 수득한 H119 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H119 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 37의 뉴클레오티드 번호 1004 내지 1235에 해당하며, 본 발명에서는 "H119"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP11 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 232 bp cDNA 단편, 즉, H119 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR) 시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1j에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1j에서 알 수 있는 바와 같이, 232 bp cDNA 단편인 H119는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-11; TRG 14
실시예 2에서 수득한 H201 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H201 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 41의 뉴클레오티드 번호 902 내지 1096에 해당하며, 본 발명에서는 "H201"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP20 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 195 bp cDNA 단편, 즉, H201 을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1k에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1k에서 알 수 있는 바와 같이, 195 bp cDNA 단편인 H201은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-12; TRG 15
실시예 2에서 수득한 H151 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H151 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 45의 뉴클레오티드 번호 848 내지 1099에 해당하며, 본 발명에서는 "H151"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP15 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 252 bp cDNA 단편, 즉, H151 을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1(l)에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1(l)에서 알 수 있는 바와 같이, 252 bp cDNA 단편인 H151은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-13; TRG 16
실시예 2에서 수득한 H132 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H132 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination) 에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 49의 뉴클레오티드 번호 813 내지 1039에 해당하며, 본 발명에서는 "H132"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP13 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 227 bp cDNA 단편, 즉, H132 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1m에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1m에서 알 수 있는 바와 같이, 227 bp cDNA 단편인 H132는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-14; TRG 17
실시예 2에서 수득한 H141 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H141 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 53의 뉴클레오티드 번호 235 내지 419에 해당하며, 본 발명에서는 "H141"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP14 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 185 bp cDNA 단편, 즉, H141 을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR) 시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1n에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1n에서 알 수 있는 바와 같이, 185 bp cDNA 단편인 H141은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-15; TRG 18
실시예 2에서 수득한 H181 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H181 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 57의 뉴클레오티드 번호 902 내지 1128에 해당하며, 본 발명에서는 "H181"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP18 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 227 bp cDNA 단편, 즉, H181 을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1(o)에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1(o)에서 알 수 있는 바와 같이, 227 bp cDNA 단편인 H181은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-16; TRG 20
실시예 2에서 수득한 H134 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H134 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 61의 뉴클레오티드 번호 232 내지 417에 해당하며, 본 발명에서는 "H134"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP13 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 186 bp cDNA 단편, 즉, H134 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1p에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1p에서 알 수 있는 바와 같이, 186 bp cDNA 단편인 H134는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
<실시예 6>　TRG　원암유전자의　전체　cDNA　서열　분석
6-1; TRG 3
32P-표지된 H20-121을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하 였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1703 bp가 삽입된 전체 TRG3 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 12월 2일자로 등재번호 제AY189688호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 4월 8일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG3 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989). 상기 TRG3 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG3 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1703 bp로 이루어진 TRG3의 전체 염기서열은 서열번호: 1에 나타내었다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 113 내지 1522에 해당하며, 서열번호: 2의 469개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-2; TRG 4
32P-표지된　H93-811을　프로브로　사용하여　박테리오파지　λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포　cDNA　라이브러리　(Miki,　T.　et 　 al .,　Gene　83:　137-146,　1989)를 스크리닝하였다. 상기　인간　폐　태아　섬유모세포　cDNA　라이브러리로부터　pCEV-LAC 벡터 중에 2576　bp가　삽입된　전체　TRG4　cDNA　클론을　얻고,　이를　2002년　12월　2일자로 등재번호　제AY189690호로　미국　진뱅크　(GeneBank) 에　등록하였다　(공개예정일:　2005년 4월 8일). 파지로부터　λpCEV　벡터에　삽입된　TRG4　클론을　NotI　절단에　의해　앰피실린　내성　pCEV-LAC　파지미드　(phagemid)　벡터　형태로　분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83:　137-146,　1989).　상기　TRG4　유전자를　함유하는　pCEV-LAC　벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG4 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를　형질전환시켰다. 2576　bp로　이루어진　TRG4의　전체　염기서열은　서열번호: 5에 나타내었다. 서열번호:　5의　염기서열에서,　본　발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임　(open　reading　frame)은　뉴클레오티드　번호　87　내지　482에 해당하며, 서열번호:　6의　131개의　아미노산으로　이루어진　단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-3; TRG 5
32P-표지된 H117-321을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1334 bp가 삽입된 전체 TRG5 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 12월 2일자로 등재번호 제AY189689호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 4월 8일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG5 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989). 상기 TRG5 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이 즈로 연결시켜 TRG5 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 1336 bp로 이루어진 TRG5의 전체 염기서열은 서열번호: 9에 나타내었다.
서열번호: 9의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 88 내지 1092에 해당하며, 서열번호: 10의 334개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-4; TRG 6
32P-표지된 H38-211을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 3309 bp가 삽입된 전체 TRG6 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 12월 5일자로 등재번호 제AY191222호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 4월 8일).파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG6 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG6 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG6 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
3309 bp로 이루어진 TRG6의 전체 염기서열은 서열번호: 13에 나타내었다.
서열번호: 13의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 233 내지 481에 해당하며, 서열번호: 14의 82개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-5; TRG 7
32P-표지된 H38-621을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1778 bp가 삽입된 전체 TRG7 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 12월 5일자로 등재번호 제AY191223호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 4월 8일).파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG7 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG7 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG7 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 1778 bp로 이루어진 TRG7의 전체 염기서열은 서열번호: 17에 나타내었다.
서열번호: 17의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 42 내지 1422에 해당하며, 서열번호: 18의 175개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-6; TRG 9
32P-표지된 H96을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1582 bp가 삽입된 전체 TRG9 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 9일자로 등재번호 제AY272044호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG9 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989). 상기 TRG9 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG9 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1582 bp로 이루어진 TRG9의 전체 염기서열은 서열번호: 21에 나타내었다.
서열번호: 21의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 17 내지 1576에 해당하며, 서열번호: 22의 519개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-7; TRG10
32P-표지된 H94를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 3979 bp가 삽입된 전체 TRG10 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 12일자로 등재번호 제AY277593호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG10 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG10 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG10 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
3979 bp로 이루어진 TRG10의 전체 염기서열은 서열번호: 25에 나타내었다.
서열번호: 25의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 1100 내지 1270에 해당하며, 서열번호: 26의 56개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-8; TRG11
32P-표지된 H42를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 235 bp가 삽입된 전체 TRG11 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277594호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG11 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG11 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG11 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
235 bp로 이루어진 TRG11의 전체 염기서열은 서열번호: 29에 나타내었다.
서열번호: 29의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 26 내지 214에 해당하며, 서열번호: 30의 62개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-9; TRG 12
32P-표지된 H109을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 510 bp가 삽입된 전체 TRG12 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277595호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG12 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG12 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG12 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
510 bp로 이루어진 TRG12의 전체 염기서열은 서열번호: 33에 나타내었다.
서열번호: 33의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 80 내지 475에 해당하며, 서열번호: 34의 131개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-10; TRG 13
32P-표지된 H119를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1301 bp가 삽입된 전체 TRG13 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277596호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG13 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG13 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG13 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1301 bp로 이루어진 TRG13의 전체 염기서열은 서열번호: 37에 나타내었다.
서열번호: 37의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 18 내지 1193에 해당하며, 서열번호: 38의 391개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-11; TRG 14
32P-표지된 H201을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1206 bp가 삽입된 전체 TRG14 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277597호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG14 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG14 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG14 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1206 bp로 이루어진 TRG14의 전체 염기서열은 서열번호: 41에 나타내었다.
서열번호: 41의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 18 내지 1202에 해당하며, 서열번호: 42의 394개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-12; TRG 15
32P-표지된 H151을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1104 bp가 삽입된 전체 TRG15 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277598호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG15 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG15 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG15 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1104 bp로 이루어진 TRG15의 전체 염기서열은 서열번호: 45에 나타내었다.
서열번호: 45의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 1 내지 1104에 해당하며, 서열번호: 46의 367개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-13; TRG 16
32P-표지된 H132를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1064 bp가 삽입된 전체 TRG16 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 14일자로 등재번호 제AY277601호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG16 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG16 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG16 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1064 bp로 이루어진 TRG16의 전체 염기서열은 서열번호: 49에 나타내었다.
서열번호: 49의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 92 내지 1064에 해당하며, 서열번호: 50의 324개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-14; TRG 17
32P-표지된 H141을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 432 bp가 삽입된 전체 TRG17 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277599호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일). 파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG17 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG17 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG17 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
432 bp로 이루어진 TRG17의 전체 염기서열은 서열번호: 53에 나타내었다.
서열번호: 53의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 1 내지 408에 해당하며, 서열번호: 54의 135개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-15; TRG 18
32P-표지된 H181을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1141 bp가 삽입된 전체 TRG18 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277600호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG18 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG18 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG18 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1141 bp로 이루어진 TRG18의 전체 염기서열은 서열번호: 57에 나타내었다.
서열번호: 57의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 20 내지 1141에 해당하며, 서열번호: 58의 373개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-16; TRG 20
32P-표지된 H134를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 449 bp가 삽입된 전체 TRG20 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 10월 29일자로 등재번 호 제AY453397호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG20 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG20 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG20 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
449 bp로 이루어진 TRG20의 전체 염기서열은 서열번호: 61에 나타내었다.
서열번호: 61의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 42 내지 449에 해당하며, 서열번호: 62의 135개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
<실시예 7>　다양한　세포에서의　TRG　유전자의　노던　블롯　분석
실시예　1에서와　같이,　정상　자궁경부　조직,　자궁경부암　조직,　자궁암　전이　임파절조직　및　자궁경부암　세포주　CaSki　(ATCC　CRL　1550),　CUMC-6으로부터　총 RNA를 추출하였다.
TRG　유전자들의 발현　정도를　결정하기　위하여,　각각의　조직　및 세포주로부터 추출한 변성된 총　RNA　20　㎍씩을　1%　포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론　막　(Boehringer-Mannheim,　독일)으로　옮겼다.　　레디프라임　Ⅱ (Rediprime Ⅱ) 무작위　프라임　표지　시스템　(Amersham,　영국)을　사용하여 　제조한　32P-표지된　무작위　프라임된　TRG　전체　cDNA　프로브로　블롯을　혼성화시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그　결과는　농도계　(densitometry)를　사용하여　정량화하였고,　β-액틴　(actin)으로　표준화시켰다.
도 2a 상단은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG3 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.7 kb의 우점(dominant) TRG3 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2a에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2a 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG3 mRNA (약 1.7 kb의 우점(dominant) TRG3 mRNA 전사물)는 심장과 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 약하게 발현되고 있다.
도 19a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 19b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 19a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG3 mRNA (약 1.7 kb의 우점(dominant) TRG3 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도　2b 상단은　정상　자궁경부　조직,　자궁경부암　조직,　자궁경부암　전이 임파절 조직 및　자궁경부암　세포주　(CaSki　및　CUMC-6)들에서　TRG4　원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2b에서 알 수 있는 바와 같이, TRG4　원암유전자는　자궁경부암　조직과　자궁경부암　세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 별현이 증가되었으며 즉 약 3.0 kb의 우점(dominant) TRG4 mRNA 전사물이 과발현되었다.　도　2b에서,　정상　(Normal)열은　정상　자궁　경부　조직을,　암　(Cancer)열은　자궁경부암　조직을,　전이　(metastasis)열은　자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각　자궁암　세포주를　나타낸다.　도 2b 하단은　동일한　시료를　β-액틴　프로브로　혼성화시켜　mRNA의　존재를　확인한　것이다.
도　4a는　정상　인간　12-열　다중　조직　(Clontech),　뇌,　심장,　횡문근,　대 장,　흉선,　비장,　신장,　간,　소장,　태반,　폐　및　말초　혈액　백혈구　조직에서 TRG4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4b는　동일한　시료를　β-액틴　프로브로　혼성화시켜　mRNA의　존재를　확인한　것이다.　도　4a에서 알 수 있는 바와 같이,　TRG4 mRNA (약3.0　kb의　우점(dominant)　TRG4　mRNA　전사물)는　정상근육　조직에서는　발현이　되고　있으나　정상　뇌,　심장,　대장,　흉선,　비장,　신장, 간, 소장, 태반,　폐　및　말초　혈액　백혈구　조직들에서는　아주　약하게　발현되고　있다.
도　20a는　인간　암　세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯　분석　결과를　나타낸　것이다.　　도　20b는　동일한　시료를　β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.　도　20a에서　알　수　있는　바와　같이, TRG4 mRNA (약 3.0 kb의 우점(dominant)　TRG4　mRNA　전사물)는　HeLa　자궁암　세포주,　만성　골수 백혈병 세포주 K-562,　및　대장암　세포주　SW480　들에서　매우　증가된　수준으로　발현되었다.
도 2c는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2c에서 알 수 있는 바와 같이, TRG5 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.4 kb의 우점(dominant) TRG5 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2c에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2c 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 5a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 5a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG5 mRNA (약 1.4 kb의 우점(dominant) TRG5 mRNA 전사물)는 뇌, 심장, 정상근육 및 신장조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 대장, 흉선, 비장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 약하게 발현되고 있다.
도 21a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 21b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 21a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG5 mRNA (약 1.4 kb의 우점(dominant) TRG5 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2d 상단은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG6 원암유전자의 발현여부를 확 인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2d에서 알 수 있는 바와 같이, TRG6 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 7.0 kb의 우점(dominant) TRG6 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2d에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2d 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 6a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 6a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG6 mRNA (약 7.0 kb의 우점(dominant) TRG6 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장, 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현이 되지 않고 있다.
도 22a는 인간 암 세포주, HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 (Clontech)에서 TRG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 22b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 22a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG6 mRNA (약 7.0 kb의 우점(dominant) TRG6 mRNA 전사물)는 HeLa 자궁암 세포주, 및 피부암세포주 G361 들에서 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2e 상단은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2e에서 알 수 있는 바와 같이, TRG7 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 2.0 kb의 우점(dominant) TRG7 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2e에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2e 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 7a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 7b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 7a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG7 mRNA (약 2.0 kb의 우점(dominant) TRG7 mRNA 전사물)는 심장, 정상근육, 신장 및 태반조직에서는 발현이 되고 있으며 동시에 약 2.4 kb의 TRG7 mRNA 전사물도 약하게 발현되고 있다, 그러나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 간, 소장, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현이 되지 않고 있다.
도 23a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 23b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 23a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG7 mRNA (약 2.0 kb의 우점(dominant) TRG7 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 동시에 약 2.4 kb의 TRG7 mRNA 전사물도 인간 암세포주들에서 과발현되었다.
도 2f 상단은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2f에서 알 수 있는 바와 같이, TRG9 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG9 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2f에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2 f 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 8a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 8b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 8a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG9 mRNA (약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG3 mRNA 전사물)는 심장, 정상근육, 신장 및 태반 조직에서는 약하게 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 간, 소장, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현이 거의 되지 않고 있다.
도 24a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 24b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 24a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG3 mRNA (약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG9 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 동시에 약 2.0 kb의 TRG9 mRNA 전사물도 발현이 확인되었다.
도 2g는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2g에서 알 수 있는 바와 같이, TRG3 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 6.0 kb의 우점(dominant) TRG10 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2g에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2g 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 9a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 9b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 9a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG10 mRNA (약 6.0 kb의 우점(dominant) TRG10 mRNA 전사물)는 심장, 간, 말초백혈구, 및 정상비장 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 근육, 대장, 흉선, 신장, 소장, 태반, 및 폐 조직들에서는 발현이 확인되지 않고 있다.
도 25a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 25b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 25a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG10 mRNA (약 6.0 kb의 우점(dominant) TRG10 mRNA 전사물)는 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었으며 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서도 증가된 수준으로 발현되었다. 동시에 약 3.0 kb의 TRG10 mRNA 전사물도 암세포주들에서 획인되 었다.
도 2h는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG11 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2h에서 알 수 있는 바와 같이, TRG11 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 전이조직, 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.5 kb의 우점(dominant) TRG11 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2h에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2h 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 10a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG11 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 10b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 10a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG11 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) TRG11 mRNA 전사물)는 심장과 정상 간 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 근육, 대장, 흉선, 비장, 신장, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 거의 발현되지 않고 있다.
도 26a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG11 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 26b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 26a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG11 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) TRG11 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 암세포주들에서는 약 1.3 kb의 TRG11 mRNA 전사물도 약하게 발현되고 있다.
도 2i는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG12 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2i에서 알 수 있는 바와 같이, TRG12 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 5.0 kb의 우점(dominant) TRG12 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2i에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2i 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 11a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG12 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 11b는 동일한 시 료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 11a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG12 mRNA (약 5.0 kb의 우점(dominant) TRG12 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장, 정상근육, 콩팥, 간, 태반 및 말초혈액 백혈구 조직에서는 약하게 발현이 되고 있으나 정상 대장, 흉선, 비장, 소장, 및, 폐 조직들에서는 발현이 거의 없었다.
도 27a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG12 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 27b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 27a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG12 mRNA (약 5.0 kb의 우점(dominant) TRG12 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2j는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2j에서 알 수 있는 바와 같이, TRG13 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 4.0 kb의 우점(dominant) TRG13 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2j에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2j 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 12a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 12b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 12a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG13 mRNA (약 4.0 kb의 우점(dominant) TRG13 mRNA 전사물)는 심장과 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 약하게 발현되고 있다. 동시에 약 5.0 kb의 TRG13 mRNA 전사물도 동시에 약하게 발현되었다.
도 28a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 28b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 28a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG13 mRNA (약 4.0 kb의 우점(dominant) TRG13 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 동시에 약 5.0 kb의 TRG13 mRNA 전사물도 동시에 강하게 발현되었다.
도 2k는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2k에서 알 수 있는 바와 같이, TRG14 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG14 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2k에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2k 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 13a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 13b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 13a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG14 mRNA (약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG14 mRNA 전사물)는 심장과 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 약하게 발현되고 있다.
도 29a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 29b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 29a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG14 mRNA (약 3.5 kb 의 우점(dominant) TRG14 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2(l)은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG15 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2(l)에서 알 수 있는 바와 같이, TRG15 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG15 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2(l)에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2(l) 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 14a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG15 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 14b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 14a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG15 mRNA (약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG15 mRNA 전사물)는 심장과 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현되고 있다. 또한 동시에 약 3.0 kb 와 4.0 kb의 TRG15 mRNA 전사물들도 아주 약하게 발현되고 있다.
도 30a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG15 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 30b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 30a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG15 mRNA (약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG15 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 동시에 약 3.0 kb 와 4.0 kb의 TRG15 mRNA 전사물들도 강하게 발현되고 있다.
도 2m은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG16 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2m에서 알 수 있는 바와 같이, TRG16 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 4.5 kb의 우점(dominant) TRG16 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2m에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2m 하 단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 15a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG16 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 15b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 15a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG16 mRNA (약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG15 mRNA 전사물)는 정상 뇌와 심장 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 근육, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현되고 있다. 또한 동시에 약 5.0 kb의 TRG16 mRNA 전사물들도 아주 약하게 발현되고 있다.
도 31a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG16 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 31b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 31a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG16 mRNA (약 4.5 kb의 우점(dominant) TRG16 mRNA 전사물)는 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 동시에 약 5.0 kb의 TRG16 mRNA 전사물들도 강하게 발현되고 있다.
도 2n은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG17 원암유전자의 발현여부를 확인 한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2n에서 알 수 있는 바와 같이, TRG17 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG17 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2n에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2n 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 16a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG17 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 16b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 16a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG17 mRNA (약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG17 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현되고 있다.
도 32a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG17 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 32b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 32a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG17 mRNA (약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG17 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2(o)는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2(o)에서 알 수 있는 바와 같이, TRG18 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG18 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2(o)에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2(o) 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 17a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 17b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 17a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG18 mRNA (약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG18 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 콩팥, 간 및 태반 조직에서는 약하게 발현이 되고 있으나 정상 대장, 흉선, 비장, 소장, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현 이 되지 않고 있다. 또한 동시에 약 1.5 kb의 TRG18 mRNA 전사물들도 아주 약하게 발현되고 있다.
도 33a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 33b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 33a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG18 mRNA (약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG18 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 동시에 약 1.5 kb의 TRG18 mRNA 전사물들도 강하게 발현되고 있다.
도 2p는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG20 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2p에서 알 수 있는 바와 같이, TRG20 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG20 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2p에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2p 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 18a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG20 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 18b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 18a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG20 mRNA (약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG20 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현이 되고 있으나 발현이 되지 않고 있다.
도 34a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG20 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 34b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 34a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG20 mRNA (약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG20 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
<실시예 8>　TRG　원암유전자를　대장균에　형질감염시킨　후　발현되는　단백질의　크기　결정
서열번호:　1; 서열번호:　5; 서열번호:　9; 서열번호:　13; 서열번호:　17; 서열번호:　21; 서열번호:　25; 서열번호:　29; 서열번호:　33; 서열번호:　37; 서열번호:　41; 서열번호:　45; 서열번호:　49; 서열번호:　53; 서열번호:　57; 또는 서열번호:　61;의　TRG　원암유전자　전체를　pBAD/thio-Topo　벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝　부위　내에　삽입한　후,　생성된 pBAD/thio-Topo/TRG 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo　벡터의 다중-클로닝 부위의　앞부위에는　발현　단백질들인　HT-Thioredoxin이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로　희석시켜　다시　3시간 동안 배양하였다.　여기에　0.5　mM의　엘　아라비노즈　(L-Arabinose,　Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다.
엘　아라비노즈　유도　전후의　배양액　중의　대장균　세포를　초음파　분쇄한　후,　12%　나트륨　도데실설페이트-폴리아크릴아미드　겔에서　전기영동하였다　(SDS-PAGE).
도 5a는 pBAD/thio-Topo/TRG3 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 67 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 67 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG3 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 52 kDa의 TRG3 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도　5b는　pBAD/thio-Topo/TRG4　벡터로　형질감염된　대장균　Top10　균주의　단백질의　발현　양상을　SDS-PAGE로　확인한　결과로서,　엘　아라비노즈　유도　후에　약 29 kDa의 융합 단백질　밴드가　뚜렷하게　관찰되었다. 이 29 kDa 융합단백 질은 pBAD/thio-Topo/TRG4　벡터에　삽입되어　있는　약　15　kDa　크기의　HT-thioredoxin 단백질과 약 14 kDa의 TRG4　단백질을　함유하고　있는　것이다.
도 5c는 pBAD/thio-Topo/TRG5 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 52 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 52 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG5 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 37 kDa의 TRG5 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5d는 pBAD/thio-Topo/TRG6 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 24 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 24 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG6 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 9 kDa의 TRG6 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5e는 pBAD/thio-Topo/TRG7 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 35 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 35 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG7 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 20 kDa의 TRG7 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5f는 pBAD/thio-Topo/TRG9 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 73 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 73 kDa 융합단백질은 pBAD/thio- Topo/TRG9 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 58 kDa의 TRG9 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5g는 pBAD/thio-Topo/TRG10 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 21 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 21 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG10 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 6 kDa의 TRG10 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5h는 pBAD/thio-Topo/TRG11 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 22 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 22 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG11 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 7 kDa의 TRG11 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5i는 pBAD/thio-Topo/TRG12 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 29 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 29 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG12 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 14 kDa의 TRG12 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5j는 pBAD/thio-Topo/TRG13 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 55 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 55 kDa 융합단백질은 pBAD/thio- Topo/TRG13 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 40 kDa의 TRG13 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5k는 pBAD/thio-Topo/TRG14 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 58 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 58 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG14 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 43 kDa의 TRG14 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5(l)은 pBAD/thio-Topo/TRG15 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 57 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 57 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG15 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 42 kDa의 TRG15 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5m은 pBAD/thio-Topo/TRG16 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 51 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 51 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG16 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 36 kDa의 TRG16 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5n은 pBAD/thio-Topo/TRG17 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 31 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 31 kDa 융합단백질은 pBAD/thio- Topo/TRG17 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 16 kDa의 TRG17 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5(o)는 pBAD/thio-Topo/TRG18 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 57 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 57 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG18 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 42 kDa의 TRG18 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5p는 pBAD/thio-Topo/TRG20 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 31 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 31 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG20 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 16 kDa의 TRG20 단백질을 함유하고 있는 것이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 원암유전자는 인간 암발생에 관여하며 동시에 암전이 (metastasis) 유발능을 나타내는 유전자로서 자궁암, 백혈병, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등을 비롯한 암의 진단 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 인간 원암단백질.
  2. 제 1항의 원암단백질을 암호화하는 인간 원암유전자.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호: 5의 염기 번호 87 내지 482에 해당하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
  5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 벡터.
  6. 제 1항의 원암단백질을 포함하는 암 진단용 키트.
  7. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 암 진단용 키트.
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