KR100915609B1 - 인간 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 원암유전자는 인간 암발생에 관여하며 자궁암, 백혈병, 악성림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조, 항암유전자 치료에 효과적으로 이용될 수 있으며 동시에 암전이 (metastasis)를 유발하는 기능을 가지고 있다.

Description

인간 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질{HUMAN PROTOONCOGENE AND PROTEIN ENCODED THEREIN}

본 발명은 암발생과 암전이 유발능을 나타내는 신규 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것이다.

인간을 포함한 고등동물들은 약 30,000개의 유전자들을 갖고 있으나 이들 중 약 15%만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉, 발생, 분화, 항상성 (homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화 및 아폽토시스 (apoptosis; programmed cell death) 등이 결정된다 (Liang, P. and A. B. Pardee, Science 257: 967-971, 1992).

종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서, 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현들의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다. 예를 들면, 리앙과 파디 (Liang, P. and A. B. Pardee, Science 257: 967-971, 1992)에 의해 제안된 mRNA 감별전개 (differential display) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기 (cell cycle)에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자 (transcriptional regulatory gene) 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며, 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들의 상호 관련성의 규명에도 다양하게 활용되고 있다.

종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체 부위의 소실 (loss of chromosomal heterozygosity), 원암유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다 (Bishop, J. M., Cell 64: 235-248, 1991; Hunter, T., Cell 64: 249-270, 1991). 또한, 암의 10 내지 30%는 원암유전자가 증폭됨으로써 활성화되어 일어난다고 보고되어 있어, 원암유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 자궁경부암의 발생기전을 원암유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 세포 성장 유도 유전자 25 (human proliferation-inducing gene 25; 이하 'PIG25'로 지칭함) 및 인간 세포 성장 유도 유전자 60 (human proliferation-inducing gene 60; 이하 'PIG60'으로 지칭함)으로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현이 증가된다는 것을 밝혀내었다.

또한, 본 발명자들은 간암의 발생기전을 원암 유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 세포 증식유도 유전자 61 (proliferation-inducing gene 61; 이하 'PIG61'로 지칭함)로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현이 증가된다는 것을 밝혀내었다. 이들 원암유전자는 자궁암, 백혈병, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등과 같은 다양한 암의 진단, 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 신규 원암유전자 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자에 의해 코드되는 단백질 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편으로부터 유도되는 mRNA에 상보적인 염기서열을 지닌 안티센스 또는 siRNA 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 안티센스 또는 siRNA 유전자를 포함하는 항암 및 항전이 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1, 3 및 5로 구성된 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 원암유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 2, 4 또는 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 원암유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자 또는 siRNA 유전자를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 안티-센스 또는 siRNA 유전자를 활성성분으로 포함하는 항암 및 항전이 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 세포 성장 유도 유전자 25 (human proliferation-inducing gene 25; PIG25)은 서열번호: 1로 기재되는 1740 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 631 내지 828 부위 (826-828: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 2에 나타나 있으며 65개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "PIG25 단백질"로 지칭함).

서열번호: 1의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 EU219624 호로 2007년 10월 14일에 등록되었으며(공개예정일: 2008년 11월 1일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NW927719.1 호인 Homo sapiens chromosome 2 genomic contig, alternate assembly (based on Celera assembly) 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 이유전자는 유전자의 서열만 알려져있고 아직까지 그 기능이 보고된바가 없다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG25 원암유전자를 발굴하게 되었다.

또한, 본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 세포 성장 유도 유전자 60 (human proliferation-inducing gene 60; PIG60)은 서열번호: 3으로 기재되는 1889 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 3의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 24 내지 1088 부위 (1086-1088: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 4에 나타나 있으며 354개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "PIG60 단백질"로 지칭함).

서열번호: 3의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY947344 호로 등록되었으며(공개예정일: 2007년 10월 30일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_014341 호인 Homo sapiens mitochondrial carrier homolog 1 (C. elegans) (MTCH1), nuclear gene encoding mitochondrial protein 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 이유전자는 분비성 및 막투과성 인간단백질로 알려져있으며 (Clark, H. F. et al., Genome Res., 12, 2265-70 (2003)), 또한 세포사멸유도 미토콘드리아 단백질로도 알려져있다 (Xu, X. et al., J. Biol . Chem., 277, 48913-22 (2002)). 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 PIG60 원암유전자를 발굴하게 되었다.

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 1, 3 및 5의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 2 또는 4 또는 6과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 1 또는 3 또는 5와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자 PIG25로부터 발현되는 단백질은 65개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 7 kDa이다. 본 발명의 원암유전자 PIG60으로부터 발현되는 단백질은 354개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 38 kDa이다. 또한, 본 발명의 원암 유전자 PIG61로부터 발현되는 단백질은 1210개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2와 같은 서열을 가지며 크기는 약 134 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다.

벡터의 제작시에는, 상기 원암유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 노던 블롯 (northern blot) 등의 분석방법에서 정상 자궁경부 조직에서는 발현이 거의 확인되지 않은 반면 자궁경부암 조직, 전이 자궁암조직과 자궁암 세포주들에서는 그 과발현이 확인되므로 자궁암을 유발시키는 강력한 발암 유전자로 판단된다. 자궁경부암과 같은 상피성 조직외에도, 본 발명의 원암유전자는 백혈병, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등과 같은 많은 다른 암 종양들에서 높게 발현된다. 따라서, 본 발명의 원암유전자는 다양한 암의 발생에 공통된 발암유전자일 것으로 판단되며, 다양한 암과 암전이의 진단, 형질전환된 동물의 제조, 안티-센스 (anti-sense) 또는 siRNA 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

상기 원암유전자를 이용한 암의 진단 방법은, 예를 들어, 상기 원암유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 혼성화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 이를 검출하므로써 대상자가 본 발명의 원암유전자를 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 원암유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 암 진단용 키트를 역시 제공한다.

형질전환 동물은 본 발명의 원암유전자를 포유동물, 예를 들어, 래트 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 안티-센스 유전자를 제공한다. 본원에서, "안티센스 유전자 (anti-sense gene)"는 서열번호: 1, 3 및 5로 구성되는 군으로부터 선택되는 원암유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA의 단백질 결합부위에 결합하여 원암유전자의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame; ORF)을 파괴할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 원암유전자의 발현으로 인한 암을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명은 또한 그 범위 내에 본 발명의 안티센스 유전자의 치료 효과량을 환자에게 투여하여 암 또는 암 전이를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.

본 발명의 안티센스 유전자 치료에서, 본 발명의 안티센스 유전자는 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 원암유전자의 발현을 예방한다. 예를 들면, 문헌 (J. S. Kim et al., J. Controlled Release 53: 175-182, 1998)의 방법에 따라 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)를 폴리-L-리신 유도체와 정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이 혼합체를 환자에게 정맥투여한다.

본 발명의 범위에는 또한, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 본 발명의 안티센스 유전자를 활성성분으로 포함하는 항암조성물을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물을 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.

실제로 투여되는 안티센스 유전자의 양은 치료되는 증상, 투여 경로, 환자의 연령 및 체중, 증상의 중증도와 같은 다양한 관련되는 인자를 고려하여 결정한다.

본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 RNAi 유전자를 제공한다. RNA interference 는 double stranded RNA 가 세포내로 들어갔을 때, 그와 상동 되는 염기 서열을 가진 mRNA 만을 post-transcriptional level에서 분해하는 현상을 말한다. RNA interference는 곤충에서 일어나는 현상을 보고한 이래로 초파리, 생쥐, trypanosome, planaria 등의 몇몇 동물에서 보고 되었고, 식물에서는 genetic silencing 에 관여한다고 보고 되고 있다 (Sharp, P. A. et . al., Genes Dev., 13,139-41 (1999)). 최근에는 포유 동물 에서도 double stranded RNA가 21개 내지는 22개의 작은 크기로 processing 되었을 경우에는 세포내에서 interferon에 의한 protein kinase 활성화를 통해 분해 되는 것을 피함으로서RNA interference가 일어날 수 있음을 알게 하였고, 이에 질병의 발병에 관련된 많은 gene을 silencing 시키는 연구가 활발히 진행되고 있다. (Elbashir, S. M. et . al ., Nature, 411, 494-8 (2001); Elbashir, S. M. et . al ., Genes Dev ., 15, 188-200 (2001) Rosel, K. F. & Georg, S. Nucleic acids Res., 31, 4417-4424 (2003); Judy, L., et al., Trends Mol Med., 9, 397-403 (2003); Michael, B.M., et al., Methods, 30, 287-8 (2003)). 그러나 이러한RNA interference (RNAi) 현상은 포유동물세포에서는 심각한 세포독성 (cytotoxic) 반응을 유발시키는 것으로 알려졌으며 이러한 부작용은short (19-22nt) interfering RNA (siRNA)를 사용할 경우 피할 수 있으며 그 유전자 발현의 억제 작용이 매우 크며 특이적임이 알려져 있다 (Elbashir, S. M. et . al ., Nature, 411, 494-8 (2001); Elbashir, S. M. et. al ., Genes Dev ., 15, 188-200 (2001)).

본 발명의 원암유전자로부터 유도되는 단백질은 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 원암유전자로부터 발현된 서열번호: 2, 4 및 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당분야에 공지된 효소 면역측정법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 원암유전자를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 예를 들어, 상기 원암유전자가 형질도입된 섬유모세포를 이용하여 누드 마우스 등에 형성시킨 종양조직으로부터 제조할 수 있다. 이러한 암 세포주는 항암제 등의 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 원암유전자는 인간 암발생에 관여하며 동시에 암전이 (metastasis) 유발능을 나타내는 유전자로서 자궁암, 백혈병, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조, 항암 유전자 치료등에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 CC224bcd DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이고,

도 2a는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 PIG25 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 2b는 도 2a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 3a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 PIG25원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 3b는 도 3a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 4a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 PIG25 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 4b는 도 4a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명의 PIG25 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과이다.

도 6은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 CC212b DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이고,

도 7a는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 PIG60 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 7b는 도 7a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 8a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 PIG60 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 8b는 도 8a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 9a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 PIG60 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 9b는 도 9a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 10은 본 발명의 PIG60 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과이다.

도 11은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 CC212b DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이고,

도 12a는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 PIG60 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 12b는 도 12a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 13a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 PIG60 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 13b는 도 13a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 14a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 PIG60 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 14b는 도 14a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 15는 본 발명의 PIG60 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 종양세포의 배양 및 총 RNA의 분리

1. PIG25 및 PIG60

(단계 1) 종양세포의 배양

mRNA의 감별 전개를 위하여, 자궁적출술 (hysterectomy)을 받은 자궁근종 환자로부터 정상자궁경부 (exocervical) 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지 않은 자궁암 환자로부터 수술시에 원발성 자궁경부 종양조직 및 전이 임파절 종양조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 자궁경부암 세포주로 CUMC-6 (Kim, J. W. et al., Gynecol. Oncol. 62: 230-240, 1996)을 사용하였다.

상기 수득된 조직 및 CUMC-6 세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청 (Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰 (Waymouth's) MB 752/1 배양액 (Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 과정의 세포들로서 트리판 블루 (trypan blue) 염색에 의해 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다 (Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York, 1987).

(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법

상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트 (Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트 (Message clean kit, GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.

2. PIG61

(단계 1) 종양세포 배양

mRNA의 감별 전개를 위하여, 간 조직생검 (liver biopsy)을 받은 환자로부터 정상간 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지않은 간암 환자로부터 조직생검시에 원발성 간 종양조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 간암 세포주로 HepG2 (American Type Culture Collection) 간암세포주를 사용하였다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 도중의 세포들로서 트리판 블루(trypan blue) 염료로 염색할 때 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다(프레쉬니(Freshney), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York(1987) 참조).

(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법

상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트(Qiagen Inc., 독일)을 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 간 조직, 원발성 간암조직, 및 HepG2 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트(Message clean kit)(GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.

<실시예 2> 감별 전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (differential display reverse transcription-PCR)

감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.

1. PIG25 및 PIG60

먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 7로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5 mM [α-35S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 8로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP33 프라이머 (5'-AAGCTTGCTGCTC-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.

PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 243 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, CC224bcd cDNA (서열번호: 1의 787-1029 bp) 및 411 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, CC212b cDNA (서열번호: 3의 778-1188 bp)를 각각 도려내었다. 15분간 가열하여 CC224bcd cDNA 및 CC212b cDNA를 각각 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

2. PIG61

실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 : 7의 H-T11C 고정 프라이머 (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5mM [α-³⁵S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5‘ 13프라이머(RNAimage primer sets 1-5, H-AP 1-40들중 H-AP23 프라이머(서열번호: 9) (5'-AAGCTTGGCTATG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장(final extension)을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.

PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 332 염기쌍(bp) 크기의 밴드, HP80 cDNA (서열번호: 5의 3364-3695 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 HP80 cDNA를 용출시킨후, [α-³⁵S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

<실시예 3> 클로닝

상기에서 얻은 재증폭된 CC224bcd, CC212b 및 HP80 PCR 산물을 각각 TA 클로닝 시스템 (Promega, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 pGEM-T EASY 벡터에 삽입하였다.

(단계 1) 연결반응

실시예 2에서 얻은 재증폭된 CC224bcd PCR 산물 중 어느 하나 2 ㎕, pGEM-T EASY 벡터 (50 ng) 1 ㎕, T4 DNA 연결효소 10X 완충액 1 ㎕ 및 T4 DNA 연결효소 (3 weiss units/㎕; T4 DNA ligase, Promega) 1 ㎕를 0.5 ㎖ 시험관에 넣은 후, 증류수를 가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 하였다. 연결 반응 혼합물은 14℃에서 밤새 배양하였다.

실시예 2에서 얻은 재증폭된 CC212b 및 HP80 PCR 산물에 대하여도 각각 동일하게 수행하였다.

(단계 2) TA 클로닝 형질전환

대장균 JM109 (Promega, WI, USA)를 10 ㎖의 LB 브로쓰 (박토-트립톤 10 g, 박토-효모 추출물 5 g, NaCl 5 g) 중에서 600 ㎚에서의 광학밀도 값이 약 0.3 내지 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양 혼합물을 얼음에 약 10분간 방치한 후, 4℃에서 10분간 4000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 수집하였다. 수집한 세포 펠릿을 10 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl2에 30분 내지 1시간 가량 노출시켜 컴피턴트 (competent) 세포를 제조하였다. 결과물을 4℃, 4000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 모아서 2 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl2에 현탁시켰다.

컴피턴트 세포 현탁액 200 ㎕를 새로운 마이크로퓨즈 (microfuge) 튜브에 옮기고, 여기에 단계 1에서 제조한 연결 반응 산물 2 ㎕를 가하였다. 혼합물을 42℃의 수욕 (water bath)에서 90초간 배양시킨 후, 0℃에서 급냉시켰다. 여기에, SOC 배지 (박토-트립톤 2.0 g, 박토-효모 추출물 0.5 g, 1 M NaCl 1 ㎖, 1 M KCl 0.25 ㎖, TDW 97 ㎖, 2 M Mg2+ 1 ㎖, 2 M 글루코스 1 ㎖) 800 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 220 rpm의 회전진탕 배양기에서 45분간 배양시켰다.

37℃ 배양기에 미리 넣어둔, 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 X-gal (40 ㎎/㎖ 디메틸포름아미드에 저장) 25 ㎕를 유리봉으로 확산시킨 후, 여기에 25 ㎕의 형질전환된 세포를 넣어서 다시 유리봉으로 확산시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 형성된 백색 콜로니를 3-4개 선택하여 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 각각의 선택된 클론들을 심었다. 플라스미드를 제조하기 위하여 이들 중 삽입이 확인된 콜로니, 즉, 형질전환된 대장균 JM109/CC224bcd를 선택하여 10 ㎖의 테리픽 브로쓰 (terrific broth; TDW 900 ㎖, 박토-트립톤 12 g, 박토-효모 추출물 24 g, 글리세롤 4 ㎖, 0.17 M KH2PO4, 0.72 N K2HPO4 100 ㎖)에서 배양하였다.

<실시예 4> 재조합 플라스미드 DNA의 분리

위저드 플러스 미니프렙스 DNA 정제 키트 (WizardTM Plus Minipreps DNA Purificatin Kit, Promega, USA)를 사용해서 제조사의 지시에 따라 형질전환된 대장균으로부터 CC224bcd 플라스미드 DNA, CC212b 플라스미드 DNA 및 HP80 플라스미드 DNA를 각각 따로 분리하였다.

분리된 플라스미드 DNA의 일부를 ECoRI 효소로 처리한 후, 2% 겔에서 전기영동을 실시하여 CC224bcd 부분서열이 플라스미드에 삽입되었음을 확인하였다. CC212b 및 HP80의 부분서열이 플라스미드에 삽입되었음을 동일한 방법으로 확인하였다.

<실시예 5> DNA 염기서열 분석

1. PIG25

실시예 2에서 수득한 CC224bcd PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 CC224bcd PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 787 내지 1029에 해당하며, 본 발명에서는 "CC224bcd"로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP33 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 243 bp cDNA 단편, 즉, CC224bcd 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 243 bp cDNA 단편인 CC224bcd는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.

2. PIG60

실시예 2에서 수득한 CC212b PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 CC212b PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 3의 뉴클레오티드 번호 778 내지 1188에 해당하며, 본 발명에서는 "CC212b"로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP33 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 411 bp cDNA 단편, 즉, CC212b 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 441 bp cDNA 단편인 CC212b는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.

3. PIG61

실시예 2에서 수득한 HP80 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR시킨 후, 클로닝되고 재증폭된 HP80 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 5의 뉴클레오티드 번호 3364 내지 3695에 해당하며, 본원에서 "HP80"으로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP23 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 332 bp cDNA 단편, 즉, HP80을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 정상 간 조직, 간암 조직 및 HepG2 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 332 bp cDNA 단편인 HP80은 간암, 및 HepG2 암 세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.

<실시예 6> 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석

1. PIG25

32P-표지된 CC224bcd를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1740 bp가 삽입된 전체 PIG25 cDNA 클론을 얻고, 이를 2007년 10월 14일자로 등재번호 제EU219624호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2008년 11월 1일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG25 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 PIG25 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG25 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.

1740 bp로 이루어진 PIG25의 전체 염기서열은 서열번호: 1에 나타내었다.

서열번호: 1의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 631 내지 828에 해당하며, 서열번호: 2의 65개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

2. PIG60

32P-표지된 CC212b를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1889 bp가 삽입된 전체 PIG60 cDNA 클론을 얻고, 이를 2005년 2월 28일자로 등재번호 제AY947344호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2007년 10월 31일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 PIG60 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 PIG60 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 PIG60 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.

1889 bp로 이루어진 PIG60의 전체 염기서열은 서열번호: 3에 나타내었다.

서열번호: 3의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 24 내지 1088에 해당하며, 서열번호: 4의 354개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

3. PIG61

³²P-표지된 HP80을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T. et al ., Gene , 83: 137-146(1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 3735 bp가 삽입된 전체 PIG61 cDNA 클론을 얻고, 이를 2005년 6월 8일자로 DQ088980 호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2007년 10월 30일). DQ088980 유전자는 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_005228 호인 Homo sapiens epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian) (EGFR), transcript variant 1 유전자 및 제 NM_201284 호인 Homo sapiens epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian) (EGFR), transcript variant 4 유전자들과는 서열이 유사한 유전자이나 단백질은 일부 유전자이다. 이들 유전자들의 기능은 암과 관련하여 일부 밝혀져 있지 않다 (Huang, P.H. et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA , 104, 12867-72 (2007); Suehisa, H. et al., J. Clin . Oncol., 25, 3952-7 (2007)). 그러나 기 보고된 바와 같은 기능과는 달리 DQ088980 유전자는 특히 간암을 포함한 인간의 각종 암화과정에 깊숙히 관련되어 있는 것으로 금번 연구결과 밝혀졌다. 연구 결과 간조직을 포함한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하고 반면에 간암을 포함한 여러 암조직들에서는 발현이 매우 증가된 PIG61 원암유전자를 발굴하게 되었다.

3735 bp로 이루어진 PIG61의 전체 서열은 서열번호: 5에 나타내었다.

서열번호: 5의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 47 내지 3679에 해당하며, 서열번호: 6의 1210개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

<실시예 7> 다양한 세포에서의 원암 유전자의 노던 블롯 분석

1. PIG25 유전자

실시예 1에서와 같이, 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁암 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주 CaSki (ATCC CRL 1550), CUMC-6으로부터 총 RNA를 추출하였다.

PIG25 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막 (Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II (Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 PIG25 전체 cDNA 프로브로 블롯을 혼성화시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.

도 2a는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 PIG25 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG25 원암유전자는 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이조직 및 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.4 kb의 우점(dominant) PIG25 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 3a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG25 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG25 mRNA (약 1.4 kb의 우점(dominant) PIG25 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현이 전혀 없었다.

도 4a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG25 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG25 mRNA (약 1.4 kb의 우점(dominant) PIG25 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 증가된 수준으로 발현되었다. 또한, 3.5 kb와 2.2 kb 크기의 PIG25 mRNA 전사물도 동시에 발현이 되는 것으로 관찰되었다.

2. PIG60

실시예 1에서와 같이, 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁암 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주 CaSki (ATCC CRL 1550), CUMC-6으로부터 총 RNA를 추출하였다.

PIG60 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막 (Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II (Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 PIG60 전체 cDNA 프로브로 블롯을 혼성화시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.

도 7a는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 PIG60 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 7a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG60 원암유전자는 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이조직 및 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.5 kb의 우점(dominant) PIG60 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 7에서 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 7b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 8a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG60 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 8b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 8a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG60 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) PIG60 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현이 되거나 발현이 없었다.

도 9a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG60 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 9b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 9a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG60 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) PIG60 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji 들에서 매우 증가된 수준으로 발현이 되었으며, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 증가된 수준으로 발현되었다.

3. PIG61

실시예 1에서와 같이, 정상 간조직, 간암 조직, 및 간암 세포주 HepG2로부터 총 RNA를 추출하였다.

PIG61 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막(Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 ³²P-표지된 무작위 프라임된 HP80 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계(densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴(actin)으로 표준화시켰다.

도 12a는 정상 간조직, 간암조직 및 간암 세포주(HepG2)들에서 PIG61 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 12a에서 알 수 있는 바와 같이, 간암 조직 및 간암 세포주인 HepG2 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현이 되지 않거나 약하였다. 도 12b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 13a는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 PIG61 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 13b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 13a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG61 mRNA(약 9.8 kb)은 정상 간조직에서와 같이 여러 다른 정상조직들에서도 발현이 되지 않았고 단지 정상 태반에서만 낮은 수준으로 발현되었다. 또한 정상 태반에서는 약 5.5 kb의 PIG61 mRNA도 아주 약하게 발현되었다. 도 14a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 PIG61 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 14b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 14a에서 알 수 있는 바와 같이, PIG61는 HeLa 자궁암 세포주, 대장암세포주 SW480, 및 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강하였다. 동시에 약 5.5 kb의 PIG61 mRNA도 발현되었다.

<실시예 8> PIG25 원암유전자를 대장균에 형질감염시킨 후 발현되는 단백질의 크기 결정

1. PIG25

서열번호: 1의 PIG25 원암유전자 전체를 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/PIG25 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다.

엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 5는 pBAD/thio-Topo/PIG25 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 22 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 22 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG25 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 7 kDa의 PIG25 단백질을 함유하고 있는 것이다.

2. PIG60

서열번호: 3의 PIG60 원암유전자 전체를 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/PIG60 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다.

엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 10은 pBAD/thio-Topo/PIG60 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 53 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 53 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG60 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 38 kDa의 PIG60 단백질을 함유하고 있는 것이다.

3. PIG61

서열번호: 5의 PIG61 원암유전자 전체를 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/PIG61 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다.　 pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다.　 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다.　 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. 엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 15는 pBAD/thio-Topo/PIG61 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 149 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 149 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/PIG61 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 134 kDa의 PIG61 단백질을 함유하고 있는 것이다.

<110> KIM, Hyun-Kee <120> HUMAN PROTOONCOGENE AND PROTEIN ENCODED THEREIN <130> 08P-517M <140> 10-2007-0107895 <141> 2007-10-25 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1740 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (631)..(825) <400> 1 ttctccccat cagtataatt atttattcta tcctataata taccccaaat agtttcagat 60 tgtgacacga gttctagtat tgaattgtta ttaatactat ttcagttagt tttctatgcc 120 cttcatgatg ataatctgtc agccattcat ttccttaagt aattactgaa ttcaggatag 180 caaatgcctt ccatcttcgg tccataatta agagtaattc agatgttgta cagccttgtc 240 tttagagatc tagatctaat tccctggcct acagagaagg ccaaagattt ctcccttttg 300 cttctgcaag ctcctggtag tttccttcat tgaaaataat tctgcacaca ctgcaccctg 360 gcaaggagac tcatagccct tcaagattcc cccacatggc cagacacagt ggctcatgcc 420 tgtaatccca gcactctggg aggccaaggc gggcagatca cttgaggtca ggagttcaag 480 accagcctgg ccaacatggc aaaaccccgt ctctacaaaa atacaaaaat tatccgagca 540 tggtggcatg cacttgtagt cccagctact caggaggctg aagcacgaga attgcttgag 600 cccaggaggc agaggctgca gtgagccaag atg cca ccg cac tcc agc ctg ggc 654 Met Pro Pro His Ser Ser Leu Gly 1 5 aac aga gta aga ctc tgc ctc gaa aaa aaa aaa aag gaa aaa aaa atc 702 Asn Arg Val Arg Leu Cys Leu Glu Lys Lys Lys Lys Glu Lys Lys Ile 10 15 20 ccc caa atc atc tct tgc aga gat ttc aca aac cag gca tat ttt gct 750 Pro Gln Ile Ile Ser Cys Arg Asp Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Phe Ala 25 30 35 40 gac aac ttc cca gga att atg gta gaa gga ata aca gcg caa att cac 798 Asp Asn Phe Pro Gly Ile Met Val Glu Gly Ile Thr Ala Gln Ile His 45 50 55 agc tct cac aaa aac agt cag caa cac tgatc tcaaaagagc ccccagccac 850 Ser Ser His Lys Asn Ser Gln Gln His 60 65 acctcattgt ggcatttctt tattggtctt tcagctcatc tcagtatcat gctctccttc 910 ccgctgtttt tttcctcctc ttccttccct ctcctttctc catttaggat caaaatgcac 970 cattcttctc ctctgtcaag cagggcaacc tcctcctctg aagctttgtt caaggcattc 1030 ttagaacaaa gacagccttc ttcctaagaa aaattacagt gaataaaatt tcctctgcct 1090 tattacacat acaagggttg ggatcttttt aaagtgaggt catttataaa ctacaaagaa 1150 gtacctgcaa aattccctca agaggagttt ctccattgat tcagctaatg tccctcagaa 1210 ccaggtcacc agatggctca agctgcctag gatctttcta cttctggacc ccccagcttc 1270 cagagccacc tcctcaagtc ctcacgacct ctactgttct ctcttcatca cagacaaatg 1330 agctcatcca aatttcctcc agctaagcag caaccacccc gtgctccctc ccaggacacc 1390 agccaagggc cctgggagga aaacagtatt tatgagccat ggtctgtgga ctgactccag 1450 cattgagggg gagcctggcc ctcccagtgc cccacagctc atcgggaggg actcagaggc 1510 ctctaatttc ccattgcatt gatggagatg accttgctaa ataacctgcc tagacgagag 1570 ccaatgagga gtatggccgc tatcttgctt gcccagaggt cccattcatg gcccttccag 1630 agtttgtgga gcctagaaga tcttctgttg gcagaagctt tcaaaaaggc cagcaggtag 1690 tcctggaaac aatccccaac tggggtacag tggggaggag aagtgcagat 1740 <210> 2 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Pro His Ser Ser Leu Gly Asn Arg Val Arg Leu Cys Leu Glu 1 5 10 15 Lys Lys Lys Lys Glu Lys Lys Ile Pro Gln Ile Ile Ser Cys Arg Asp 20 25 30 Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Phe Ala Asp Asn Phe Pro Gly Ile Met Val 35 40 45 Glu Gly Ile Thr Ala Gln Ile His Ser Ser His Lys Asn Ser Gln Gln 50 55 60 His 65 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Thr Leu Gly Thr Asn Val Leu 90 95 100 ggg agg aag gtc ctc tat ctg ccg agc ttc ttc acc tac gcc aag tac 383 Gly Arg Lys Val Leu Tyr Leu Pro Ser Phe Phe Thr Tyr Ala Lys Tyr 105 110 115 120 atc gtg caa gtg gat ggt aag ata ggg ctg ttc cga ggc ctg agt ccc 431 Ile Val Gln Val Asp Gly Lys Ile Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ser Pro 125 130 135 cgg ctg atg tcc aac gcc ctc tct act gtg act cgg ggt agc atg aag 479 Arg Leu Met Ser Asn Ala Leu Ser Thr Val Thr Arg Gly Ser Met Lys 140 145 150 aag gtt ttc cct cca gat gag att gag cag gtt tcc aac aag gat gat 527 Lys Val Phe Pro Pro Asp Glu Ile Glu Gln Val Ser Asn Lys Asp Asp 155 160 165 atg aag act tcc ctg aag aaa gtt gtg aag gag acc tcc tac gag atg 575 Met Lys Thr Ser Leu Lys Lys Val Val Lys Glu Thr Ser Tyr Glu Met 170 175 180 atg atg cag tgt gtg tcc cgc atg ttg gcc cac ccc ctg cat gtc atc 623 Met Met Gln Cys Val Ser Arg Met Leu Ala His Pro Leu His Val Ile 185 190 195 200 tca atg cgc tgc atg gtc cag ttt gtg gga cgg gag gcc aag tac agt 671 Ser Met Arg Cys Met Val Gln Phe Val Gly Arg Glu Ala Lys Tyr Ser 205 210 215 ggt gtg ctg agc tcc att ggg aag att ttc aaa gag gaa ggg ctg ctg 719 Gly Val Leu Ser Ser Ile Gly Lys Ile Phe Lys Glu Glu Gly Leu Leu 220 225 230 gga ttc ttc gtt gga tta atc cct cac ctc ctg ggc gat gtg gtt ttc 767 Gly Phe Phe Val Gly Leu Ile Pro His Leu Leu Gly Asp Val Val Phe 235 240 245 ttg tgg ggc tgt aac ctg ctg gcc cac ttc atc aat gcc tac ctg gtg 815 Leu Trp Gly Cys Asn Leu Leu Ala His Phe Ile Asn Ala Tyr Leu Val 250 255 260 gat gac agc ttc agc cag gcc ctg gcc atc cgg agc tat acc aag ttc 863 Asp Asp Ser Phe Ser Gln Ala Leu Ala Ile Arg Ser Tyr Thr Lys Phe 265 270 275 280 gtg atg ggg att gca gtg agc atg ctg acc tac ccc ttc ctg cta gtt 911 Val Met Gly Ile Ala Val Ser Met Leu Thr Tyr Pro Phe Leu Leu Val 285 290 295 ggc gac ctc atg gct gtg aac aac tgc ggg ctg caa gct ggg ctc ccc 959 Gly Asp Leu Met Ala Val Asn Asn Cys Gly Leu Gln Ala Gly Leu Pro 300 305 310 cct tac tcc cca gtg ttc aaa tcc tgg att cac tgc tgg aag tac ctg 1007 Pro Tyr Ser Pro Val Phe Lys Ser Trp Ile His Cys Trp Lys Tyr Leu 315 320 325 agt gtg cag ggc cag ctc ttc cga ggc tcc agc ctg ctt ttc cgc cgg 1055 Ser Val Gln Gly Gln Leu Phe Arg Gly Ser Ser Leu Leu Phe Arg Arg 330 335 340 gtg tca tca gga tca tgc ttt gcc ctg gag taacc tgaatcatct 1100 Val Ser Ser Gly Ser Cys Phe Ala Leu Glu 345 350 aaaaaacacg gtctcaacct ggccaccgtg ggtgaggcct gaccaccttg ggacacctgc 1160 aagacgactc caacccaaca acaaccagat gtgctccagc ccagccgggc ttcagttcca 1220 tatttgccat gtgtctgtcc agatgtgggg ttgagcgggg gtggggctgc acccagtgga 1280 ttgggtcacc cggcagacct agggaaggtg aggcgaggtg gggagttggc agaatcccca 1340 tacctcgcag atttgctgag tctgtcttgt gcagagggcc agagaatggc ttatgggggc 1400 ccaggttgga tggggaaagg ctaatggggt cagaccccac cccgtctacc cctccagtca 1460 gcccagcgcc catcctgcag ctcagctggg agcatcattc tcctgctttg tacatagggt 1520 gtggtcccct ggcacgtggc caccatcatg tctaggccta tgctaggagg caaatggcca 1580 ggctctgcct gtgtttttct caacactact tttctgatat gagggcagca cctgcctctg 1640 aatgggaaat catgcaacta ctcagaatgt gtcctcctca tctaatgctc atctgtttaa 1700 tggtgatgcc tcgcgtacag gatctggtta cctgtgcagt tgtgaatacc cagaggttgg 1760 gcagatcagt gtctctagtc ctacccagtt ttaaagttca tggtaagatt tgacctcatc 1820 tcccgcaaat aaatgtattg gtgatttgga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1880 aaaaaaaaa 1889 <210> 4 <211> 354 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Arg Gly Gly Ala Ala Ala 1 5 10 15 Gly Val Glu Ala Arg Ala Arg Asp Pro Pro Pro Ala His Arg Ala His 20 25 30 Pro Arg His Pro Arg Pro Ala Ala Gln Pro Ser Ala Arg Arg Met Asp 35 40 45 Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Ser Gly Asp Asn Ala Pro Thr Thr Glu 50 55 60 Ala Leu Phe Val Ala Leu Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Ser His Pro 65 70 75 80 Leu Leu Tyr Val Lys Leu Leu Ile Gln Val Gly His Glu Pro Met Pro 85 90 95 Pro Thr Leu Gly Thr Asn Val Leu Gly Arg Lys Val Leu Tyr Leu Pro 100 105 110 Ser Phe Phe Thr Tyr Ala Lys Tyr Ile Val Gln Val Asp Gly Lys Ile 115 120 125 Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ser Pro Arg Leu Met Ser Asn Ala Leu Ser 130 135 140 Thr Val Thr Arg Gly Ser Met Lys Lys Val Phe Pro Pro Asp Glu Ile 145 150 155 160 Glu Gln Val Ser Asn Lys Asp Asp Met Lys Thr Ser Leu Lys Lys Val 165 170 175 Val Lys Glu Thr Ser Tyr Glu Met Met Met Gln Cys Val Ser Arg Met 180 185 190 Leu Ala His Pro Leu His Val Ile Ser Met Arg Cys Met Val Gln Phe 195 200 205 Val Gly Arg Glu Ala Lys Tyr Ser Gly Val Leu Ser Ser Ile Gly Lys 210 215 220 Ile Phe Lys Glu Glu Gly Leu Leu Gly Phe Phe Val Gly Leu Ile Pro 225 230 235 240 His Leu Leu Gly Asp Val Val Phe Leu Trp Gly Cys Asn Leu Leu Ala 245 250 255 His Phe Ile Asn Ala Tyr Leu Val Asp Asp Ser Phe Ser Gln Ala Leu 260 265 270 Ala Ile Arg Ser Tyr Thr Lys Phe Val Met Gly Ile Ala Val Ser Met 275 280 285 Leu Thr Tyr Pro Phe Leu Leu Val Gly Asp Leu Met Ala Val Asn Asn 290 295 300 Cys Gly Leu Gln Ala Gly Leu Pro Pro Tyr Ser Pro Val Phe Lys Ser 305 310 315 320 Trp Ile His Cys Trp Lys Tyr Leu Ser Val Gln Gly Gln Leu Phe Arg 325 330 335 Gly Ser Ser Leu Leu Phe Arg Arg Val Ser Ser Gly Ser Cys Phe Ala 340 345 350 Leu Glu <210> 5 <211> 3735 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (47)..(3676) <400> 5 ccagtattga tcgggagagc cggagcgagc tcttcgggga gcagcg atg cga ccc 55 Met Arg Pro 1 tcc ggg acg gcc ggg gca gcg ctc ctg gcg ctg ctg gct gcg ctc tgc 103 Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ala Leu Cys 5 10 15 ccg gcg agt cgg gct ctg gag gaa aag aaa gtt tgc caa ggc acg agt 151 Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser 20 25 30 35 aac aag ctc acg cag ttg ggc act ttt gaa gat cat ttt ctc agc ctc 199 Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu 40 45 50 cag agg atg ttc aat aac tgt gag gtg gtc ctt ggg aat ttg gaa att 247 Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile 55 60 65 acc tat gtg cag agg aat tat gat ctt tcc ttc tta aag acc atc cag 295 Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln 70 75 80 gag gtg gct ggt tat gtc ctc att gcc ctc aac aca gtg gag cga att 343 Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 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Asn Cys Gln Lys Leu Thr 200 205 210 aaa atc atc tgt gcc cag cag tgc tcc ggg cgc tgc cgt ggc aag tcc 727 Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser 215 220 225 ccc agt gac tgc tgc cac aac cag tgt gct gca ggc tgc aca ggc ccc 775 Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro 230 235 240 cgg gag agc gac tgc ctg gtc tgc cgc aaa ttc cga gac gaa gcc acg 823 Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr 245 250 255 tgc aag gac acc tgc ccc cca ctc atg ctc tac aac ccc acc acg tac 871 Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr 260 265 270 275 cag atg gat gtg aac ccc gag ggc aaa tac agc ttt ggt gcc acc tgc 919 Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys 280 285 290 gtg aag aag tgt ccc cgt aat tat gtg gtg aca gat cac ggc tcg tgc 967 Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys 295 300 305 gtc cga gcc tgt ggg gcc gac agc tat gag atg gag gaa gac ggc gtc 1015 Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val 310 315 320 cgc aag tgt aag aag tgc gaa ggg cct tgc cgc aaa gtg tgt aac gga 1063 Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly 325 330 335 ata ggt att ggt gaa ttt aaa gac tca ctc tcc ata aat gct acg aat 1111 Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn 340 345 350 355 att aaa cac ttc aaa aac tgc acc tcc atc agt ggc gat ctc cac atc 1159 Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile 360 365 370 ctg ccg gtg gca ttt agg ggt gac tcc ttc aca cat act cct cct ctg 1207 Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu 375 380 385 gat cca cag gaa ctg gat att ctg aaa acc gta aag gaa atc aca ggg 1255 Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly 390 395 400 ttt ttg ctg att cag gct tgg cct gaa aac agg acg gac ctc cat gcc 1303 Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala 405 410 415 ttt gag aac cta gaa atc ata cgc ggc agg acc aag caa cat ggt cag 1351 Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln 420 425 430 435 ttt tct ctt gca gtc gtc agc ctg aac ata aca tcc ttg gga tta cgc 1399 Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg 440 445 450 tcc ctc aag gag ata agt gat gga gat gtg ata att tca gga aac aaa 1447 Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys 455 460 465 aat ttg tgc tat gca aat aca ata aac tgg aaa aaa ctg ttt ggg acc 1495 Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr 470 475 480 tcc ggt cag aaa acc aaa att ata agc aac aga ggt gaa aac agc tgc 1543 Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys 485 490 495 aag gcc aca ggc cag gtc tgc cat gcc ttg tgc tcc ccc gag ggc tgc 1591 Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys 500 505 510 515 tgg ggc ccg gag ccc agg gac tgc gtc tct tgc cgg aat gtc agc cga 1639 Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg 520 525 530 ggc agg gaa tgc gtg gac aag tgc aac ctt ctg gag ggt gag cca agg 1687 Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg 535 540 545 gag ttt gtg gag aac tct gag tgc ata cag tgc cac cca gag tgc ctg 1735 Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu 550 555 560 cct cag gcc atg aac atc acc tgc aca gga cgg gga cca gac aac tgt 1783 Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys 565 570 575 atc cag tgt gcc cac tac att gac ggc ccc cac tgc gtc aag acc tgc 1831 Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys 580 585 590 595 ccg gca gga gtc atg gga gaa aac aac acc ctg gtc tgg aag tac gca 1879 Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala 600 605 610 gac gcc ggc cat gtg tgc cac ctg tgc cat cca aac tgc acc tac gga 1927 Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly 615 620 625 tgc act ggg cca ggt ctt gaa ggc tgt cca acg aat ggg cct aag atc 1975 Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile 630 635 640 ccg tcc atc gcc act ggg atg gtg ggg gcc ctc ctc ttg ctg ctg gtg 2023 Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val 645 650 655 gtg gcc ctg ggg atc ggc ctc ttc atg cga agg cgc cac atc gtt cgg 2071 Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His Ile Val Arg 660 665 670 675 aag cgc acg ctg cgg agg ctg ctg cag gag agg gag ctt gtg gag cct 2119 Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Val Glu Pro 680 685 690 ctt aca ccc agt gga gaa gct ccc aac caa gct ctc ttg agg atc ttg 2167 Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu Arg Ile Leu 695 700 705 aag gaa act gaa ttc aaa aag atc aaa gtg ctg ggc tcc ggt gcg ttc 2215 Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe 710 715 720 ggc acg gtg tat aag gga ctc tgg atc cca gaa ggt gag aaa gtt aaa 2263 Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys 725 730 735 att ccc gtc gct atc aag gaa tta aga gaa gca aca tct ccg aaa gcc 2311 Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala 740 745 750 755 aac aag gaa atc ctc gat gaa gcc tac gtg atg gcc agc gtg gac aac 2359 Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn 760 765 770 ccc cac gtg tgc cgc ctg ctg ggc atc tgc ctc acc tcc acc gtg cag 2407 Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln 775 780 785 ctc atc acg cag ctc atg ccc ttc ggc tgc ctc ctg gac tat gtc cgg 2455 Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg 790 795 800 gaa cac aaa gac aat att ggc tcc cag tac ctg ctc aac tgg tgt gtg 2503 Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val 805 810 815 cag atc gca aag ggc atg aac tac ttg gag gac cgt cgc ttg gtg cac 2551 Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His 820 825 830 835 cgc gac ctg gca gcc agg aac gta ctg gtg aaa aca ccg cag cat gtc 2599 Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val 840 845 850 aag atc aca gat ttt ggg ctg gcc aaa ctg ctg ggt gcg gaa gag aaa 2647 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys 855 860 865 gaa tac cat gca gaa gga ggc aaa gtg cct atc aag tgg atg gca ttg 2695 Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu 870 875 880 gaa tca att tta cac aga atc tat acc cac cag agt gat gtc tgg agc 2743 Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser 885 890 895 tac ggg gtg acc gtt tgg gag ttg atg acc ttt gga tcc aag cca tat 2791 Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr 900 905 910 915 gac gga atc cct gcc agc gag atc tcc tcc atc ctg gag aaa gga gaa 2839 Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu 920 925 930 cgc ctc cct cag cca ccc ata tgt acc atc gat gtc tac atg atc atg 2887 Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met 935 940 945 gtc aag tgc tgg atg ata gac gca gat agt cgc cca aag ttc cgt gag 2935 Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu 950 955 960 ttg atc atc gaa ttc tcc aaa atg gcc cga gac ccc cag cgc tac ctt 2983 Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu 965 970 975 gtc att cag ggg gat gaa aga atg cat ttg cca agt cct aca gat tcc 3031 Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser 980 985 990 995 aac ttc tac cgt gcc ctg atg gat gaa gaa gac atg gac gac gtg gtg 3079 Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val 1000 1005 1010 gat gcc gac gag tac ctc atc cca cag cag ggc ttc ttc agc agc ccc 3127 Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro 1015 1020 1025 tcc acg tca cgg act ccc ctc ctg agc tct ctg agt gca acc agc aac 3175 Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn 1030 1035 1040 aat tcc acc gtg gct tgc att gat aga aat ggg ctg caa agc tgt ccc 3223 Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro 1045 1050 1055 atc aag gaa gac agc ttc ttg cag cga tac agc tca gac ccc aca ggc 3271 Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly 1060 1065 1070 1075 gcc ttg act gag gac agc ata gac gac acc ttc ctc cca gtg cct gaa 3319 Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu 1080 1085 1090 tac ata aac cag tcc gtt ccc aaa agg ccc gct ggc cct gtg cag aat 3367 Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Pro Val Gln Asn 1095 1100 1105 cct gtc tat cac aat cag cct ctg aac ccc gcg ccc agc aga gac cca 3415 Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro 1110 1115 1120 cac tac cag gac ccc cac agc act gca gtg ggc aac ccc gag tat ctc 3463 His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu 1125 1130 1135 aac act gtc cag ccc acc tgt gtc aac agc aca ttc gac agc cct gcc 3511 Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala 1140 1145 1150 1155 cac tgg gcc cag aaa ggc agc cac caa att agc ctg gac aac cct gac 3559 His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp 1160 1165 1170 tac cag cag gac ttc ttt ccc aag gaa gcc aag cca aat ggc atc ttt 3607 Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe 1175 1180 1185 aag ggc tcc aca gct gaa aat gca gaa tac cta agg gtc gcg cca caa 3655 Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln 1190 1195 1200 agc agt gaa ttt att gga gca tgac cacggaggat agtatgagcc ctaaaaatcc 3710 Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210 agactctttc gatacccagg accaa 3735 <210> 6 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895 Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser 900 905 910 Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr 930 935 940 Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975 Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro 980 985 990 Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe 1010 1015 1020 Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala 1025 1030 1035 1040 Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln 1045 1050 1055 Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp 1060 1065 1070 Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro 1075 1080 1085 Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Pro 1090 1095 1100 Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser 1105 1110 1115 1120 Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro 1125 1130 1135 Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp 1140 1145 1150 Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp 1155 1160 1165 Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn 1170 1175 1180 Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val 1185 1190 1195 1200 Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anchored oligo-dT primer H-T11C <400> 7 aagctttttt tttttc 16 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer H-AP33 <400> 8 aagcttgctg ctc 13

Claims (17)

1. 서열번호: 2, 서열번호: 4 및 서열번호: 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 인간 원암단백질.
2. 제 1 항의 원암단백질을 암호화하는 인간 원암유전자.
3. 제 2 항에 있어서, 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
4. 제 3 항에 있어서, 서열번호: 1의 염기 번호 631 내지 828에 해당되는 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 원암단백질을 코딩하는 것인 인간 원암유전자.
5. 제 2 항에 있어서, 서열번호: 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
6. 제 5 항에 있어서, 서열번호: 3의 염기 번호 24 내지 1088에 해당되는 염기서열은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 인간 원암단백질을 코딩하는 것인 인간 원암유전자.
7. 제 2 항에 있어서, 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
8. 제 7 항에 있어서, 서열번호: 5의 염기 번호 47 내지 3679에 해당되는 염기서열은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 인간 원암단백질을 코딩하는 것인 인간 원암유전자.
9. 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 벡터.
10. 제 9 항의 벡터에 의해 형질전환된 미생물.
11. 제 10 항의 미생물을 이용하여 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제조하는 방법.
12. 제 1항의 원암단백질을 포함하는 암 진단용 키트.
13. 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 암 진단용 키트.
14. 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 원암유전자로부터 전사되는 mRNA 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 원암유전자의 발현을 억제하는 안티-센스 올리고뉴클레오티드.
15. 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 원암유전자로부터 전사되는 mRNA 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 원암유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 암호화하는 유전자.
16. 제 14항의 안티-센스 올리고뉴클레오티드를 활성성분으로 포함하는 항암 및 항전이 조성물.
17. 제 15항의 siRNA를 암호화하는 유전자를 활성성분으로 포함하는 항암 및 항전이 조성물.