KR100503566B1 - 인간 원암유전자 ｈｌｃ-4 및 이에 의해 코드되는 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 원암유전자는 기존의 보고된 원암유전자와는 전혀 상동성을 나타내지 않으며 암전이 (metastasis) 유발능을 나타내는 신규 유전자로서 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 폐암, 및 피부암 등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 및 안티-센스 (anti-sense) 유전자요법을 비롯한 항암유전자 치료 및 항암전이 요법 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

인간 원암유전자 ＨＬＣ-4 및 이에 의해 코드되는 단백질{HUMAN PROTOONCOGENE HLC-4 AND PROTEIN ENCODED THEREIN}

본 발명은 기존의 보고된 원암유전자와는 전혀 상동성을 나타내지 않으며 암전이 유발능을 나타내는 신규 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것이다.

인간을 포함한 고등동물들은 약 100,000개의 유전자들을 갖고 있으나 이들 중 약 15%만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉, 발생, 분화, 항상성 (homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화 및 아폽토시스 (apoptosis; programmed cell death) 등이 결정된다 (Liang, P. and A. B. Pardee, Science 257: 967-971, 1992).

종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서, 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현들의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다. 예를 들면, 리앙과 파디 (Liang, P. and A. B. Pardee, Science 257: 967-971, 1992)에 의해 제안된 mRNA 감별전개 (differential display) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기 (cell cycle)에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자 (transcriptional regulatory gene) 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며, 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들의 상호 관련성의 규명에도 다양하게 활용되고 있다.

종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체 부위의 소실 (loss of chromosomal heterozygosity), 원암유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다 (Bishop, J. M., Cell 64: 235-248, 1991; Hunter, T., Cell 64: 249-270, 1991). 또한, 암의 10 내지 30%는 원암유전자가 증폭됨으로써 활성화되어 일어난다고 보고되어 있어, 원암유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 폐암의 발생기전을 원암유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 폐암관련 유전자 4 (HLC-4)로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현이 증가된다는 것을 밝혀내었다. 상기 원암유전자는 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등과 같은 다양한 암의 진단, 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 신규 원암유전자 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자에 의해 코드되는 단백질 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편으로부터 유도되는 mRNA에 상보적인 염기서열을 지닌 안티센스 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 안티센스 유전자를 포함하는 항암 및 항전이 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편으로부터 유도되는 mRNA와 동등한 염기서열을 지닌 짧은 단편의 특징을 갖는 이중가닥 RNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중가닥 RNA를 포함하는 RNAi 유전자 치료용 항암 및 항전이 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1의 염기 서열을 갖는 원암유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 원암유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 안티-센스 유전자를 활성 성분으로 포함하는 항암 및 항전이 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 원암유전자 또는 그의 단편으로부터 유도되는 mRNA와 동등한 염기서열을 지닌 짧은 단편의 특징을 갖는 이중가닥 RNA를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 이중가닥 RNA를 포함하는 RNAi 유전자 치료용 항암 및 항전이 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 폐암관련 유전자 4 (Human Lung Cancer Oncogene 4, HLC-4, 이후 "HLC-4 원암유전자"로 지칭함)은 서열번호: 1로 기재되는 2,361 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 1,075 내지 1,677 부위 (1,675-1,677: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 2에 나타나 있으며 200개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "HLC-4 단백질"로 지칭함).

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 2와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA 서열로서 서열번호: 1과 80 % 이상, 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 200개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 21 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80 % 이상, 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 발현벡터 pCEV-LAC (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989)에 본 발명의 유전자를 삽입한 후 대장균 DH5α에 형질감염 (transfection)시키고, 이렇게 하여 얻어진 대장균 DH5α/HLC-4/pCEV-LAC를 2003년 5월 30일자로 한국생명공학연구원 유전자은행 (Korea Collection for Type Cultures; KCTC)에 기탁번호 제 KCTC 10480BP 호로서 기탁하였다.

벡터의 제작시에는, 상기 원암유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 노던 블롯 (northern blot) 등의 분석방법에서 정상 폐조직에서는 발현이 거의 확인되지 않은 반면 폐암조직, 전이 폐암조직 및 폐암 세포주들에서는 그 과발현이 확인되므로 폐암을 유발시키는 강력한 발암 유전자로 판단된다. 또한, 전이된 폐암조직 들에서 발현이 증가되는 것으로 보아 암전이를 유발시키는 암전이 관련 유전자로 판명된다. 폐암과 같은 상피성 조직 외에도, 본 발명의 원암유전자는 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등과 같은 많은 다른 암 종양들에서 높게 발현된다. 따라서, 본 발명의 원암유전자는 다양한 암의 발생에 공통된 발암유전자일 것으로 판단되며, 다양한 암의 진단, 형질전환된 동물의 제조 및 안티-센스 (anti-sense) 유전자 치료, RNAi (RNA interference) 유전자 치료를 포함한 다양한 유전자 치료 요법 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

상기 원암유전자를 이용한 암의 진단 방법은, 예를 들어, 상기 원암유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 혼성화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 이를 검출하므로써 대상자가 본 발명의 원암유전자를 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 원암유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 암 진단용 키트를 역시 제공한다.

형질전환 동물은 본 발명의 원암유전자를 포유동물, 예를 들어, 래트 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 안티-센스 유전자를 제공한다. 본원에서, "안티센스 유전자 (anti-sense gene)"는 서열번호: 1의 원암유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA의 단백질 결합부위에 결합하여 원암유전자의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame; ORF)을 파괴할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 원암유전자의 발현으로 인한 암을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명은 또한 RNAi (RNA interference) 유전자 치료에 유용한 이중가닥 RNA를 제공한다.

RNAi는 이중가닥 RNA (double-stranded RNA; dsRNA)가 세포내로 도입되어 21 내지 23 bp의 짧은 RNA들로 전환된 후, 이를 인지하는 세포내 효소복합체에 의해 상동성을 지닌 mRNA가 분해되면서 유전자의 발현이 억제되는 현상으로, 생체내 유전자를 조절하는 일반적인 기전으로서 생체내에서 발달과정과 바이러스에 대항하는 과정 및 조직 특이적인 유전자 적중에 이용되고 있다 (Fire, A. S., et al., Nature 391: 806-811, 1998; Montgomery and Fire, Trends Genetics 14: 255-258, 1998).

본 발명의 이중 가닥 RNA는 본 발명의 원암유전자로부터 전사되는 mRNA 서열과 상동성을 갖는 염기서열을 가지며, 상기 mRNA 서열과 동일한 길이를 갖거나 21 내지 23 bp의 길이를 갖는 그의 단편일 수 있다.

본 발명은 또한 그 범위 내에 본 발명의 안티센스 유전자 또는 이중 가닥 RNA의 치료 효과량을 환자에게 투여하여 암 또는 암 전이를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.

본 발명의 유전자 치료에서, 본 발명의 안티센스 유전자는 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 원암유전자의 발현을 예방한다. 예를 들면, 문헌 (J. S. Kim et al., J. Controlled Release 53: 175-182, 1998)의 방법에 따라 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)를 폴리-L-리신 유도체와 정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이 혼합체를 환자에게 정맥투여할 수 있다.

또한 이중가닥 RNA의 경우, 예를 들면, 문헌 (E. Song et al., Nature Medicine 9: 347-351, 2003)의 방법에 따라 50 ug의 이중가닥 RNA를 1 ml의 인산 완충용액에 혼합시킨 후 혼합체를 유체역학적 형질감염 (hydrodynamic transfection) 방식(G. Zhang et al., Hum. Gene Ther. 10: 1735-1737, 1999)으로 정맥에 8시간 간격으로 3회 투여할 수 있다.

본 발명의 범위에는 또한, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 본 발명의 안티센스 유전자 또는 이중 가닥 RNA를 활성 성분으로 포함하는 항암 및 항전이 조성물을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.

실제로 투여되는 안티센스 유전자 또는 이중 가닥 RNA의 양은 치료되는 증상, 투여 경로, 환자의 연령 및 체중, 증상의 중증도와 같은 다양한 관련되는 인자를 고려하여 결정한다.

본 발명의 원암유전자로부터 유도되는 단백질은 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 원암유전자로부터 발현된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당분야에 공지된 효소 면역측정법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 원암유전자를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 예를 들어, 상기 원암유전자가 형질도입된 섬유모세포를 이용하여 누드 마우스 등에 형성시킨 종양조직으로부터 제조할 수 있다. 이러한 암 세포주는 항암제 등의 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 종양세포의 배양 및 총 RNA의 분리

(단계 1) 종양세포의 배양

mRNA의 감별 전개를 위하여, 정상 폐조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지 않은 폐암 환자로부터 수술시에 원발성 폐암조직 및 우측 폐에 전이된 암조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 폐암 세포주로 A549 (American Type Culture Collection; ATCC Number CCL-185)를 사용하였다.

상기 수득된 조직 및 A549 폐암 세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청 (Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰 (Waymouth's) MB 752/1 배양액 (Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 과정의 세포들로서 트리판 블루 (trypan blue) 염색에 의해 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다 (Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York, 1987).

(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법

상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트 (Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 폐조직, 원발성 폐암조직, 전이된 폐암조직 및 A549 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트 (Message clean kit, GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.

<실시예 2> 감별 전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (differential display reverse transcription-PCR)

감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.

먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 H-T11A 고정 프라이머 (RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5 mM [α-³⁵S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-4) H-AP 1 내지 32 중 H-AP32 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.

PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 252 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, L278 cDNA (서열번호: 1의 1801-2052 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L278 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

<실시예 3> 클로닝

상기에서 얻은 재증폭된 L278 PCR 산물을 TA 클로닝 시스템 (Promega, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 pGEM-T EASY 벡터에 삽입하였다.

(단계 1) 연결반응

실시예 2에서 얻은 재증폭된 L278 PCR 산물 2 ㎕, pGEM-T EASY 벡터 (50 ng) 1 ㎕, T4 DNA 연결효소 10X 완충액 1 ㎕ 및 T4 DNA 연결효소 (3 weiss units/㎕; T4 DNA ligase, Promega) 1 ㎕를 0.5 ㎖ 시험관에 넣은 후, 증류수를 가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 하였다. 연결 반응 혼합물은 14℃에서 밤새 배양하였다.

(단계 2) TA 클로닝 형질전환

대장균 JM109 (Promega, WI, USA)를 10 ㎖의 LB 브로쓰 (박토-트립톤 10 g, 박토-효모 추출물 5 g, NaCl 5 g) 중에서 600 ㎚에서의 광학밀도 값이 약 0.3 내지 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양 혼합물을 얼음에 약 10분간 방치한 후, 4℃에서 10분간 4000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 수집하였다. 수집한 세포 펠릿을 10 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl₂에 30분 내지 1시간 가량 노출시켜 컴피턴트 (competent) 세포를 제조하였다. 결과물을 4℃, 4000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 모아서 2 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl₂에 현탁시켰다.

컴피턴트 세포 현탁액 200 ㎕를 새로운 마이크로퓨즈 (microfuge) 튜브에 옮기고, 여기에 단계 1에서 제조한 연결 반응 산물 2 ㎕를 가하였다. 혼합물을 42℃의 수욕 (water bath)에서 90초간 배양시킨 후, 0℃에서 급냉시켰다. 여기에, SOC 배지 (박토-트립톤 2.0 g, 박토-효모 추출물 0.5 g, 1 M NaCl 1 ㎖, 1 M KCl 0.25 ㎖, TDW 97 ㎖, 2 M Mg²⁺ 1 ㎖, 2 M 글루코스 1 ㎖) 800 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 220 rpm의 회전진탕 배양기에서 45분간 배양시켰다.

37℃ 배양기에 미리 넣어둔, 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 X-gal (40 ㎎/㎖ 디메틸포름아미드에 저장) 25 ㎕를 유리봉으로 확산시킨 후, 여기에 25 ㎕의 형질전환된 세포를 넣어서 다시 유리봉으로 확산시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 형성된 백색 콜로니를 3-4개 선택하여 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 각각의 선택된 클론들을 심었다. 플라스미드를 제조하기 위하여 이들 중 삽입이 확인된 콜로니, 즉, 형질전환된 대장균 JM109/L278을 선택하여 10 ㎖의 테리픽 브로쓰 (terrific broth; TDW 900 ㎖, 박토-트립톤 12 g, 박토-효모 추출물 24 g, 글리세롤 4 ㎖, 0.17 M KH₂PO₄, 0.72 N K₂HPO₄ 100 ㎖)에서 배양하였다.

<실시예 4> 재조합 플라스미드 DNA의 분리

위저드 플러스 미니프렙스 DNA 정제 키트 (Wizard^TM Plus Minipreps DNA Purificatin Kit, Promega, USA)를 사용해서 제조사의 지시에 따라 형질전환된 대장균으로부터 L278 플라스미드 DNA를 분리하였다.

분리된 플라스미드 DNA의 일부를 EcoRI 효소로 처리한 후, 2% 겔에서 전기영동을 실시하여 L278 부분서열이 플라스미드에 삽입되었음을 확인하였다.

<실시예 5> DNA 염기서열 분석

실시예 2에서 수득한 L278 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 L278 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 1801 내지 2052에 해당하며, 본 발명에서는 "L278"로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP32 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 252 bp cDNA 단편, 즉, L278을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 252 bp cDNA 단편인 L278은 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현되지 않았다.

<실시예 6> HLC-4 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석

³²P-표지된 L278을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2,361 bp가 삽입된 전체 HLC-4 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 6월 3일자로 등재번호 제AY117689호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2003년 7월 1일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 HLC-4 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 HLC-4 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 HLC-4 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.

상기 수득한 DH5α/HLC-4/pCEV-LAC를, 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 2003년 5월 30일자로 한국생명공학연구원 유전자은행 (Korea Collection for Type Cultures; KCTC)에 기탁번호 제 KCTC 10480BP 호로서 기탁하였다. 2,361 bp로 이루어진 HLC-4의 전체 서열은 서열번호: 1에 나타내었다.

서열번호: 1의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 1,075 내지 1,677에 해당하며, 서열번호: 2의 200개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

<실시예 7> 다양한 세포에서의 HLC-4 유전자의 노던 블롯 분석

실시예 1에서와 같이, 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549와 NCI-H358 (American Type Culture Collection; ATCC Number CRL-5807) 폐암 세포주들부터 총 RNA를 추출하였다.

HLC-4 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막 (Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 Ⅱ (Rediprime Ⅱ) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 ³²P-표지된 무작위 프라임된 HLC-4 전체 cDNA 프로브로 블롯을 혼성화시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.

도 2a는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)들에서 HLC-4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, HLC-4 원암유전자는 폐암조직, 폐암 전이조직 및 A549와 NCI-H358 폐암 세포주들에서는 현저하게 유전자 발현이 증가되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2에서, 정상 (Normal)열은 정상 폐조직을, 암 (Cancer)열은 폐암조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직, 그리고 A549열 및 NCI-H358열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 3a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 HLC-4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3a에서 알 수 있는 바와 같이, HLC-4 mRNA (약 2.4 kb)는 간, 신장 및 태반조직들에서만 발현되고 있으며 그 외 심장과 근육 조직에서는 약하게 발현되었다.

도 4a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 HLC-4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, HLC-4는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암 세포주 A549 및 피부암 세포주 G361들에서 매우 높은 수준으로 발현되었다.

<실시예 8> HLC-4 원암유전자를 대장균에 형질감염시킨 후 발현되는 단백질의 크기 결정

서열번호: 1의 HLC-4 원암유전자 전체를 pET-32b(+) 벡터 (Novagen, Germany)의 다중 클로닝 부위 내 BamHI/SalI 제한효소 부위에 삽입한 후, 생성된 pET-32b(+)/HLC-4 벡터를 대장균 BL21 (ATCC 47092)에 형질감염시켰다. pET-32b(+) 벡터의 다중클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 Trx·Tag, His·Tag 및 S·Tag이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 1 mM의 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노즈 (Isopropyl beta-D-thiogalacto-pyranoside; IPTG, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다.

IPTG 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 소디움 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE). 도 5는 pET-32b(+)/HLC-4 벡터로 형질감염된 대장균 BL21 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, IPTG 유도 후에 약 42 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 42 kDa 융합단백질은 pET-32b(+)/HLC-4 벡터에 삽입되어 있는 약 21 kDa 크기의 Trx·Tag, His·Tag 및 S·Tag 단백질과 약 21 kDa의 HLC-4 단백질을 함유하고 있는 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 원암유전자는 기존의 보고된 발암유전자와는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규 유전자로서 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 폐암, 피부암 등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 및 안티-센스 (anti-sense) 유전자 요법을 비롯한 항암유전자 치료 및 항암전이 요법 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 정상 폐 조직, 좌측 폐암조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L278 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이고,

도 2a는 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549와 NCI-H358 폐암 세포주들에서 본 발명의 HLC-4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 2b는 도 2a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 3a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 HLC-4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 3b는 도 3a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 4a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 HLC-4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 4b는 도 4a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명의 HLC-4 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 IPTG 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과이다.

<110> KIM, Jin-Woo <120> HUMAN PROTOONCOGENE HLC-4 AND PROTEIN ENCODED THEREIN <130> FPD/200306-0002 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2361 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1075)..(1674) <400> 1 gcggaattgt cgacggccat taccaatcgc gaaaccggtt tcgcgattgg taaccaatcg 60 cgaaaccgcg cttccggcag accagtgaga gcaccaacca gcgggtgctg tggtggtcca 120 ttctgcagac cctcatcctc gtggccatcg gtgtctggca gatgcggcac ctcaagagct 180 tctttgaagc caagaagctt gtgtagctgt cccaggcgtc acaacccatc ctcccaggct 240 gggggagaaa ggacctcctg gaactgactt cttctgtcag gaggactggt ttccagccat 300 acctgttctg gaagggagag gggctggagg cacccacagg cacaagctga aggcagcagc 360 ttggctaata ctgagcaggt agtggggcaa attcctgccc tctctctctg gcctctgggc 420 cgtttggtag taatcaccca ggggctggta aagcccctcc tcttggcacc tcagaatcac 480 agtgttactg atcagggatg tgaggctgct gttgggggtg gggggagggg aatgggcagg 540 caagccagtc ttctgtcttc ctttgctaac ttagggtttt gagcaggttg gggtatggtg 600 cctgtcatac ccacctgcca ccctgggaac ctcactgttc tctctttcag cctagacctg 660 ctgatccagg gtgtgtgtga gttgagggtg ggtggagggg tttgcagtgt gggaatgtgg 720 ccctgcagtt gacctgagct gcttcacatg gttgtccatt ctggggctta aagaactggg 780 accagaccaa gtagaggcct tggtgctggt tggggtgggg cctgcagagt cttagttact 840 gatttcattt tcaataaatg taggtttgtt acatgagttt cccaataaaa aaaaaaatga 900 cttctaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aataaaaaaa aaaaaggccg cctcggcgcg 960 tgggtggggg atggcgtgtg ggtctccatt cgcttggatt ctacgctccg tctctatcat 1020 gcacacactt atcaacatct acaggatgtg gacattgagc cttatgtaag caaa 1074 atg tta ggt act gga aaa ctg ggc ttc tct ttt gtg aga att aca gct 1122 Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Gly Phe Ser Phe Val Arg Ile Thr Ala 1 5 10 15 ctt atg gtg tct tgt aat cgt ttg tgg gtg ggg aca gga aat ggt gtc 1170 Leu Met Val Ser Cys Asn Arg Leu Trp Val Gly Thr Gly Asn Gly Val 20 25 30 att atc tcc atc cca ttg aca gaa acc gta atc ctc cac cag gga cgt 1218 Ile Ile Ser Ile Pro Leu Thr Glu Thr Val Ile Leu His Gln Gly Arg 35 40 45 tta ctg ggg ctg agg gca aat aaa acc tca ggt gta cca gga aat cgt 1266 Leu Leu Gly Leu Arg Ala Asn Lys Thr Ser Gly Val Pro Gly Asn Arg 50 55 60 cct gga agt gta atc cgt gta tat ggt gat gaa aac agt gat aaa gtg 1314 Pro Gly Ser Val Ile Arg Val Tyr Gly Asp Glu Asn Ser Asp Lys Val 65 70 75 80 act cca ggg aca ttt ata ccc tat tgt tca atg gca cat gca cag ctt 1362 Thr Pro Gly Thr Phe Ile Pro Tyr Cys Ser Met Ala His Ala Gln Leu 85 90 95 tgc ttc cat ggg cac cgg gat gct gtg aaa ttc ttt gtg gca gtc cca 1410 Cys Phe His Gly His Arg Asp Ala Val Lys Phe Phe Val Ala Val Pro 100 105 110 ggt caa gtc atc agc cca caa agt agc agt agt ggc acg gat ctg acg 1458 Gly Gln Val Ile Ser Pro Gln Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asp Leu Thr 115 120 125 ggt gac aaa gca ggg cca tct gca cag gag cct ggt agt cag acg ccc 1506 Gly Asp Lys Ala Gly Pro Ser Ala Gln Glu Pro Gly Ser Gln Thr Pro 130 135 140 ttg aag tct atg ctt gtc atc agt gga gga gag ggc tac atc gac ttc 1554 Leu Lys Ser Met Leu Val Ile Ser Gly Gly Glu Gly Tyr Ile Asp Phe 145 150 155 160 cga atg ggt gat gaa ggt gga gaa tca gaa ctt ctt gga gag gat ctt 1602 Arg Met Gly Asp Glu Gly Gly Glu Ser Glu Leu Leu Gly Glu Asp Leu 165 170 175 cca ctt gaa cct tct gtc acc aaa gca gaa agg agt cac ttg ata gtg 1650 Pro Leu Glu Pro Ser Val Thr Lys Ala Glu Arg Ser His Leu Ile Val 180 185 190 tgg caa gtg atg tat ggc aat gag tgagcc catgggaaac aggtggagat 1700 Trp Gln Val Met Tyr Gly Asn Glu 195 200 ggggaagccg tctcttctgc atggtttatt ttccctctat ccttttattt aatgctcttt 1760 tgtgagataa gtttcaccac ataatgtgtg agcatttttt cctgttaact ttatattaca 1820 aaatccgttc taccataaca atacagagga actagctgtg ttactgcacc agtgttatag 1880 gtaacttcag tatattatga acaaatcaaa gaatgtttac ttcctgcaaa ctggtgaatt 1940 atagaaagca atccagatgt ggtttactct gccacagtct aatgtcattc acttcatttg 2000 atggggtcac ttgttagctg tcactaataa tggaattaat gggaaacact tgataaatga 2060 aactgtaccg ttaaatacaa tagctgagtt ttccccagtg tattgtaaaa ttgacacaca 2120 ctaatacaag atggattatc aggatgtatc taaatgtccc gagagggtta aaagctaact 2180 gtaaattact ttaactttca ctttcaaatc tgacaaatct tgtttatatg gtatataaaa 2240 ctttgttttc atcagatttg ggggggtttt atattaaaga aattaagact acactattta 2300 aataaacgtt tcctgtttct gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2360 a 2361 <210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Gly Phe Ser Phe Val Arg Ile Thr Ala 1 5 10 15 Leu Met Val Ser Cys Asn Arg Leu Trp Val Gly Thr Gly Asn Gly Val 20 25 30 Ile Ile Ser Ile Pro Leu Thr Glu Thr Val Ile Leu His Gln Gly Arg 35 40 45 Leu Leu Gly Leu Arg Ala Asn Lys Thr Ser Gly Val Pro Gly Asn Arg 50 55 60 Pro Gly Ser Val Ile Arg Val Tyr Gly Asp Glu Asn Ser Asp Lys Val 65 70 75 80 Thr Pro Gly Thr Phe Ile Pro Tyr Cys Ser Met Ala His Ala Gln Leu 85 90 95 Cys Phe His Gly His Arg Asp Ala Val Lys Phe Phe Val Ala Val Pro 100 105 110 Gly Gln Val Ile Ser Pro Gln Ser Ser Ser Ser Gly Thr Asp Leu Thr 115 120 125 Gly Asp Lys Ala Gly Pro Ser Ala Gln Glu Pro Gly Ser Gln Thr Pro 130 135 140 Leu Lys Ser Met Leu Val Ile Ser Gly Gly Glu Gly Tyr Ile Asp Phe 145 150 155 160 Arg Met Gly Asp Glu Gly Gly Glu Ser Glu Leu Leu Gly Glu Asp Leu 165 170 175 Pro Leu Glu Pro Ser Val Thr Lys Ala Glu Arg Ser His Leu Ile Val 180 185 190 Trp Gln Val Met Tyr Gly Asn Glu 195 200

Claims (13)

1. 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 원암단백질.
2. 서열번호: 2의 단백질을 암호화하는 인간 원암유전자.
3. 제 2항에 있어서,

   서열번호: 1의 염기 번호 1,075 내지 1,677에 해당하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
4. 제 2항에 있어서,

   서열번호: 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 벡터.
6. 제 5항의 벡터에 의해 형질전환된 미생물.
7. 제 6항에 있어서,

   대장균 DH5α/HLC-4/pCEV-LAC (기탁번호: KCTC 10480BP)인 미생물.
8. 제 6항 또는 제 7항의 미생물을 이용하여 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제조하는 방법.
9. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 암 진단용 키트.
10. 제 1항의 단백질을 포함하는 암 진단용 키트.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제