KR20060089714A - 인간 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 원암유전자는 인간 암발생에 관여하며 동시에 암전이 (metastasis) 유발능을 나타내는 신규 유전자로서 폐암, 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 및 피부암 등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

인간 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질{HUMAN PROTOONCOGENE AND PROTEIN ENCODED THEREIN}

도 1a는 정상 폐 조직, 좌측 폐암조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L276811 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것;도 1b는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 CC231 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것; 도 1c는 정상 폐 조직, 좌측 폐암조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L789 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것;도 1d는 정상 폐 조직, 좌측 폐암조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L986 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것;도 1e는 정상 폐 조직, 좌측 폐암조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 L1284 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것;도 1f는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 CA367 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것; 도 1g는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 CA335 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것;도 1h는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 CG263 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것; 도 1i는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 CG233 DNA 단편의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이다.

도 2a는 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549와 NCI-H358 폐암 세포주들에서 본 발명의 MIG3원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 2b는 도 2a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고, 도 3a는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 MIG8 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 3b는 도 3a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고, 도 4a는 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549와 NCI-H358 폐암 세포주들에서 본 발명의 MIG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 4b는 도 4a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고, 도 5a는 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549와 NCI-H358 폐암 세포주들에서 본 발명의 MIG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 5b는 도 5a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고, 도 6a는 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549와 NCI-H358 폐암 세포주들에서 본 발명의 MIG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 6b는 도 6a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고, 도 7a는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 MIG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 7b는 도 7a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고, 도 8a는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 MIG19 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 8b는 도 8a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고, 도 9a는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 MIG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 9b는 도 9a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고, 도 10a는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 MIG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 10b는 도 10a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.

도 11a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 MIG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 11b는 도 11a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 12a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 MIG8 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 12b는 도 12a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 13a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 MIG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 13b는 도 13a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 14a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 MIG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 14b는 도 14a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 15a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 MIG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 15b는 도 15a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 16a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 MIG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 16b는 도 16a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 17a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 MIG19 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 17b는 도 17a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 18a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 MIG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 18b는 도 18a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 19a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 MIG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 19b는 도 19a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.

도 20a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 MIG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 20b는 도 20a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 21a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 MIG8 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 21b는 도 21a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 22a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 MIG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 22b는 도 22a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 23a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 MIG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 23b는 도 23a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 24a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 MIG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 24b는 도 24a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 25a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 MIG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 25b는 도 25a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 26a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 MIG19 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 26b는 도 26a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 27a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 MIG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 27b는 도 27a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 28a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 MIG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 28b는 도 28a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.

도 29a는 본 발명의 MIG3 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과; 도 29b는 MIG8 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 29c는 본 발명의 MIG10 원암유전자를 대장 균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 29d는 MIG18 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 29e는 본 발명의 MIG13 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 29f는 본 발명의 MIG14 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 29g는 본 발명의 MIG19 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과;도 29h는 본 발명의 MIG5 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과; 도 29i는 본 발명의 MIG7 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과이다.

본 발명은 기존의 보고된 원암유전자와는 전혀 상동성을 나타내지 않으며 암전이 유발능을 나타내는 신규 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것이다.

인간을 포함한 고등동물들은 약 30,000개의 유전자들을 갖고 있으나 이들 중 약 15%만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉, 발생, 분화, 항상성 (homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화 및 아폽토시스 (apoptosis; programmed cell death) 등이 결정된다 (Liang, P. and A. B. Pardee, Science 257: 967-971, 1992).

종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서, 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현들의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다. 예를 들면, 리앙과 파디 (Liang, P. and A. B. Pardee, Science 257: 967-971, 1992)에 의해 제안된 mRNA 감별전개 (differential display) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기 (cell cycle)에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자 (transcriptional regulatory gene) 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며, 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들의 상호 관련성의 규명에도 다양하게 활용되고 있다.

종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체 부위의 소실 (loss of chromosomal heterozygosity), 원암유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다 (Bishop, J. M., Cell 64: 235-248, 1991; Hunter, T., Cell 64: 249-270, 1991). 또한, 암의 10 내지 30%는 원암유전자가 증폭됨으로써 활성화되어 일어난다고 보고되어 있어, 원암유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 폐암 및 자궁경부암의 발생기전을 원암유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 이동 유도유전자 (human migration-inducing gene) 및 으로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현이 증가된다는 것을 밝혀내었다. 상기 원암유전자는 폐암, 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 및 피부암 등과 같은 다양한 암의 진단, 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 신규 원암유전자 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자에 의해 코드되는 단백질 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암과 암전이 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암과 암전이 진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1의 염기 서열을 갖는 원암유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

본 발명에서는 서열번호: 5의 염기 서열을 갖는 원암유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

본 발명에서는 서열번호: 9의 염기 서열을 갖는 원암유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

본 발명에서는 서열번호: 13의 염기 서열을 갖는 원암유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

본 발명에서는 서열번호: 17의 염기 서열을 갖는 원암유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

본 발명에서는 서열번호: 21의 염기 서열을 갖는 원암유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

본 발명에서는 서열번호: 25의 염기 서열을 갖는 원암유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 26의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

본 발명에서는 서열번호: 29의 염기 서열을 갖는 원암유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 30의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

본 발명에서는 서열번호: 33의 염기 서열을 갖는 원암유전자 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 34의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암과 암전이 진단용 키트를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암과 암전이 진단용 키트를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

1. MIG 3

본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 이동 유도유전자 3 (human migration-inducing gene 3; MIG3, 이후 “MIG3 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 1로 기재되는 2,295 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 89 내지 709 부위 (707-709: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 2에 나타나 있으며 206개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "MIG3 단백질"로 지칭함).

서열번호: 1의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY239293 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AK027166 호인 Homo sapiens cDNA: FLJ23513 fis, clone LNG03869 유전자와 염기서열이 유사함이 확인되었다. Homo sapiens cDNA: FLJ23513 fis 유전자는 human cDNA sequencing project 에 의하여 발굴된 유전자로 아직 기능이 밝혀져있지 않았으나 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 MIG3 원암유전자를 발굴하게 되었다.

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발 현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 2와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 1과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 206개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 23 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

2. MIG 8

본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 이동 유도유전자 8 (human migration-inducing gene 8, MIG8, 이후 “MIG8 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 5로 기재되는 3,737 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 5의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 113 내지 1627 부위 (1625-1627: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 6에 나타나 있으며 665개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "MIG8 단백질"로 지칭함).

서열번호: 5의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY311389 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_006595 NM_021112 호인 Homo sapiens apoptosis inhibitor 5 (API5) 유전자와는 단백질 서열은 일치하나 일부 유전자 염기서열이 다름이 확인되었다. API5 유전자는 성장인자 제거후 아폽토시스 (apoptosis)를 억제하는 유전자 기능을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다 (Tewari, M., et al., Cancer Res., 57, 4063-4069 (1997) ; Van den Berghe, L., et al., Mol . Endocrinol., 14, 1709-1724 (2000)). 그러나 기 보고된 API5의 기능과는 달리 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 MIG8 원암유전자를 발굴하게 되었다.

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코 딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 5의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 6과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 5와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 504개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 57 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

3. MIG 10

본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 이동 유도유전자 10 (human migration-inducing gene 10, MIG10, 이후 “MIG10 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 9로 기재되는 1,321 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 9의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 23 내지 1276 부위 (1274-1276: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 10에 나타나 있으며 417개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "MIG10 단백질"로 지칭함).

서열번호: 9의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY423725 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 BC023234 호인 Homo sapiens phosphoglycerate kinase 1 유전자 및 제 NM_000291 호인 Homo sapiens phosphoglycerate kinase 1 (PGK1) 유전자와 염기서열이 일치함이 확인되었다. PGK1 유전자는 당대사 (glycolysis)에서 중요한 효소이며 인간의 X chromosome 상에 위치한다고 보고되고 있다 (Fujii, H., et al., J. Biol . Chem., 255, 6421-6423 (1980) ; Michelson, A. M., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 80, 472-476 (1983)). 그러나 기 보고된 PKG1의 기능과는 달리 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 MIG10 원암유전자를 발굴하게 되었다.

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내 에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 9의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 10과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 9와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 417개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 45 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

4. MIG 13

본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 이동 유도유전자 13 (human migration-inducing gene 13; MIG13, 이후 “MIG13 원암유전자”로 지칭함) 은 서열번호: 13으로 기재되는 1,019 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 13의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 11 내지 844 부위 (842-844: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 14에 나타나 있으며 277개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "MIG13 단백질"로 지칭함).

서열번호: 13의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY336090 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 CR613087 호인 full-length cDNA clone CS0DL001YE02 of B cells (Ramos cell line) Cot 25-normalized of Homo sapiens (human) 유전자와는 염기서열이 일부 유사함이 확인되었다. clone CS0DL001YE02 유전자는 아직 기능이 규명되지 않고 있으나 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 MIG13 원암유전자를 발굴하게 되었다.

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 13의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴 리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 14와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 13과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 277개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 14로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 31 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

5. MIG 14

본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 이동 유도유전자 14 (human migration-inducing gene 14; MIG14, 이후 “MIG14 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 17로 기재되는 1,142 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 17의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 67 내지 1125 부위 (1123-1125: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 18에 나타나 있 으며 206개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "MIG14 단백질"로 지칭함).

서열번호: 17의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY336091 호로 등록되었으며(공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_003610 호인 Homo sapiens RAE1 RNA export 1 homolog (S. pombe) (RAE1) 유전자 및 제 CR626728 호인 full-length cDNA clone CS0DI002YP18 of Placenta Cot 25-normalized of Homo sapiens (human) 유전자와 염기서열이 유사함이 확인되었다. 인간 RAE1 유전자는 Poly(A)+ RNA의 nuclear export에 관여하는 것으로 알려진 Schizosaccharomyces pombe rae1 gene 의 기능적 homologue 로 알려져 있다 (Bharathi, A., et al., Gene, 198, 251-258 (1997) ; Pritchard, C. E., et al., J. Cell Biol., 145, 237-254 (1999)). 그러나 기 보고된 RAE1 유전자의 기능과는 달리 금번 연구 결과 폐암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 MIG14 원암유전자를 발굴하게 되었다.

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 17의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴 리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 18과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 17과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 352개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 18로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 39 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

6. MIG 18

본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 이동 유도유전자 18 (human migration-inducing gene 18, MIG18, 이후 “MIG18 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 21로 기재되는 3,633 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 21의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 215 내지 2212 부위 (2210-2212: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 22에 나타 나 있으며 665개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "MIG18 단백질"로 지칭함).

염기서열 분석결과, 본 발명의 MIG18 원암유전자의 염기서열은 c-Cbl 유전자 (Langdon, W. Y., et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 86: 1168-1172, 1989)와 결합하면서 상피세포 성장인자(EGF receptor)관련 신호전달 역할을 담당하는 유전자인 Homo sapiens SH3-domain kinase binding protein 1 (SH3KBP1) (GenBank Accession No. NM_031892)(Take, H., et al., Biochem . Biophy . Res . Comm . 268: 321-328, 2000) 과 단백질 서열은 일치하나 일부 유전자 염기서열이 다름이 확인되었다. 그러나 기 보고된 SH3KBP1의 기능과는 달리 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 MIG18 원암유전자를 발굴하게 되었다.

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 21의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 22와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 21과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 665개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 22로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 73 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

7. MIG 19

본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 이동 유도유전자 19 (human migration-inducing gene 19, MIG19, 이후 “MIG19 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 25로 기재되는 4,639 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 25의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 65 내지 2965 부위 (2963-2965: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 26에 나타나 있으며 966개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "MIG19 단백질"로 지칭함).

서열번호: 25의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY450308 호로 등록되었으며 (공개예정일: 2004년 12월 31 일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_031862 호인 Homo sapiens membrane component, chromosome 17, surface marker 2 (ovarian carcinoma antigen CA125) (M17S2), transcript variant 3 유전자와는 단백질 서열은 일치하나 일부 유전자 염기서열이 다름이 확인되었다. 이 유전자가 coding 하는 단백질은 난소암에서 난소암 항원으로 발견되었으며 이 단백질은 B-box/coiled coil motif를 가지고 있는데 이들은 transformation potential 은 있으나 아직까지 기능은 모르고 있다 (Campbell, I. G., et al., Human Mol . Genet., 3, 589-594 (1994) ; Miki, Y., et al., Science, 266, 66-71 (1994) ; Brown, M. A., et al., Oncogene, 12, 2507-2513 (1996)). 그러나 기 보고된 ovarian carcinoma antigen CA125 (M17S2)의 기능과는 달리 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 MIG19 원암유전자를 발굴하게 되었다.

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 25의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴 클레오티드란 서열번호: 26과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 25와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 966개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 26으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 107 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

8. MIG 5

본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 이동 유도유전자 5 (human migration-inducing gene 5, MIG5, 이후 “MIG5 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 29로 기재되는 833 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 29의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 159 내지 737 부위 (735-737: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 30에 나타나 있으며 192개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "MIG5 단백질"로 지칭함).

서열번호: 29의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY279384 호로 등록되었으며 (공개예정일: 2004년 12월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_006908 호인 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Rac1) (RAC1), transcript variant Rac1 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. RAC1 유전자는 세포성장 조절, 세포골격 재구성 (cytoskeletal reorganization) 및 protein kinase들의 활성을 유도하는 것으로 알려져있다 (Didsbury, J., et al., J. Biol . Chem., 264, 16378-16382 (1989). 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 없는 MIG5 원암유전자를 발굴하게 되었다.

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 29의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 30과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 29와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서 열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 192개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 30으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 21 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

9. MIG 7

본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 이동 유도유전자 7 (human migration-inducing gene 7, MIG7, 이후 “MIG7 원암유전자”로 지칭함)은 서열번호: 33으로 기재되는 2,364 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.

서열번호: 33의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 1435 내지 1685 부위 (1683-1685: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 34에 나타나 있으며 76개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "MIG7 단백질"로 지칭함).

서열번호: 33의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY305872 호로 등록되었으며 (공개예정일: 2004년 12월 31 일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NG_001332 호인 Homo sapiens T cell receptor alpha delta locus (TCRA/TCRD) on chromosome 14 유전자, 제 AE000658 AE000521 U85195 호인 Homo sapiens T-cell receptor alpha delta locus from bases 1 to 250529 (section 1 of 5) of the Complete Nucleotide Sequence 유전자 및 제 AF283991 호인 Homo sapiens (N6-adenosine)-methyltransferase gene 유전자와 일부 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. TCRA/TCRD 유전자는 antigen presenting cells (APC)들의 표면에 있는 histocompatibility complex (MHC) molecules 들에 이종항원들이 small peptide 형태로 나타날 때 이를 인식하는 기능을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다 ((Sim, G. K., et al ., Nature, 312, 771-775 (1984) ; Krangel, M. S., et al ., Imunol . Rev., 165, 131-147 (1998)). 그러나 달리 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 MIG7 원암유전자를 발굴하게 되었다.

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 33의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리 뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 34와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 33과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 76개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 34로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 9 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다.

벡터의 제작시에는, 상기 원암유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 노던 블롯 (northern blot) 등의 분석방법에서 정상 폐 조직에서는 발현이 거의 확인되지 않은 반면 폐암 조직과 폐암 세포주들에서는 그 과발현이 확인되므로 폐암을 유발시키는 강력한 발암 유전자로 판단된다. 또한, 암전이 임파절 조직들에서 발현이 증가되는 것으로 보아 암 전이를 유발시키는 암전이 관련 유전자로 판단된다. 폐암과 같은 상피성 조직외에도, 본 발명의 원암유전자는 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 및 피부암 등과 같은 많은 다른 암 종양들에서 높게 발현된다. 따라서, 본 발명의 원암유전자는 다양한 암의 발생에 공통된 발암유전자일 것으로 판단되며, 다양한 암의 진단, 형질전환된 동물의 제조 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

상기 원암유전자를 이용한 암의 진단 방법은, 예를 들어, 상기 원암유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 혼성화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 이를 검출하므로써 대상자가 본 발명의 원암유전자를 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 원암유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 암 진단용 키트를 역시 제공한다.

형질전환 동물은 본 발명의 원암유전자를 포유동물, 예를 들어, 래트 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 원암유전자로부터 유도되는 단백질은 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 원암유전자로부터 발현된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당분야에 공지된 효소 면역측정법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 암과 암전이를 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 원암유전자를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 예를 들어, 상기 원암유전자가 형질도입된 섬유모세포를 이용하여 누드 마우스 등에 형성시킨 종양조직으로부터 제조할 수 있다. 이러한 암 세포주는 항암제 등의 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 종양세포의 배양 및 총 RNA 의 분리

1-1: MIG 3, MIG 10, MIG 13, MIG 14

(단계 1) 종양세포의 배양

mRNA의 감별 전개를 위하여, 정상 폐조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지 않은 폐암 환자로부터 수술시에 원발성 폐암조직 및 우측 폐에 전이된 암조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 폐암 세포주로 A549 (American Type Culture Collection; ATCC Number CCL-185)를 사용하였다.

상기 수득된 조직 및 A549 폐암 세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청 (Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰 (Waymouth's) MB 752/1 배양액 (Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 과정의 세포들로서 트리판 블루 (trypan blue) 염색에 의해 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다 (Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York, 1987).

(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법

상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트 (Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 폐조직, 원발성 폐암조직, 전이된 폐암조직 및 A549 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트 (Message clean kit, GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.

1-2: MIG 8, MIG 18, MIG 19, MIG 5, MIG 9

(단계 1) 종양세포의 배양

mRNA의 감별 전개를 위하여, 자궁적출술 (hysterectomy)을 받은 자궁근종 환자로부터 정상자궁경부 (exocervical) 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지 않은 자궁암 환자로부터 수술시에 원발성 자궁경부 종양조직 및 전이 임파절 종양조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 자궁경부암 세포주로 CUMC-6 (Kim, J. W. et al ., Gynecol . Oncol . 62: 230-240, 1996)을 사용하였다.

상기 수득된 조직 및 CUMC-6 세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청 (Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰 (Waymouth's) MB 752/1 배양액 (Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 과정의 세포들로서 트리판 블루 (trypan blue) 염색에 의해 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다 (Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York, 1987).

(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법

상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트 (Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트 (Message clean kit, GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.

실시예 2: 감별 전개 역전사 중합효소 연쇄반응 ( differential display reverse transcription-PCR)

2-1: MIG 3

감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.

먼저, 실시예 1-1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5 mM [α-³⁵S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 4로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP22 프라이머 (5'-AAGCTTTTGATCC-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.

PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 305 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, L276-811 cDNA (서열번호: 1의 1862-2166 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L276-811 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

2-2: MIG 8

감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.

먼저, 실시예 1-2의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 7으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5 mM [α-³⁵S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 8로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP23 프라이머 (5'-AAGCTTGGCTATG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.

PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 342 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, CC231 cDNA (서열번호: 5의 3142-3483 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 CC231 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

2-3: MIG 10

먼저, 실시예 1-1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 11로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5 mM [α-³⁵S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 12로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP23 프라이머 (5'-AAGCTTGGCTATG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.

PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 284 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, L789 cDNA (서열번호: 9의 1022-1305 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L789 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

2-4: MIG 13

먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 15로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5 mM [α-³⁵S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP21 프라이머 (5'-AAGCTTTCTCTGG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.

PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 295 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, L986 cDNA (서열번호: 13의 685-979 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L986 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

2-5: MIG 14

먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 19로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5 mM [α-³⁵S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 20으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP21 프라이머 (5'-AAGCTTTCTCTGG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.

PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 276 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, L1284 cDNA (서열번호: 17의 823-1098 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 L1284 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상 기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

2-6: MIG 18

먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 23으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5 mM [α-³⁵S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 24로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP36 프라이머 (5'-AAGCTTCGACGCT-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.

PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 221 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, CA367 cDNA (서열번호: 21의 2920-3140 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 CA367 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

2-7: MIG 19

먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 27로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5 mM [α-³⁵S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 28로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP33 프라이머 (5'-AAGCTTGCTGCTC-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.

PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 381 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, CA335 cDNA (서열번호: 25의 4123-4503 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 CA335 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

2-8: MIG 5

감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.

먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 31로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11G 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5 mM [α-³⁵S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 32로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP26 프라이머 (5'-AAGCTTGCCATGG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.

PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 263 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, CG263 cDNA (서열번호: 29의 476-738 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 CG263 cDNA를 용출시킨 후, [α-³⁵S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

2-9: MIG 7

감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.

먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 35으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11G 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5 mM [α-35S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 36으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP23 프라이머 (5'-AAGCTTGGCTATG-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.

PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 327 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, CG233 cDNA (서열번호: 33의 1903-2229 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 CG233 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

실시예 3: 클로닝

상기에서 얻은 재증폭된 L276-811 PCR 산물; CC231 PCR 산물; L789 PCR 산물;L986 PCR 산물; L1284 PCR 산물;CA367 PCR 산물;CA335 PCR 산물; CG263 PCR 산물; 또는 CG233 PCR 산물을 TA 클로닝 시스템 (Promega, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 pGEM-T EASY 벡터에 삽입하였다.

(단계 1) 연결반응

실시예 2에서 얻은 재증폭된 L276-811 PCR 산물; CC231 PCR 산물; L789 PCR 산물;L986 PCR 산물;L1284 PCR 산물;CA367 PCR 산물;CA335 PCR 산물; CG263 PCR 산물 또는 CG233 PCR 산물 2 ㎕, pGEM-T EASY 벡터 (50 ng) 1 ㎕, T4 DNA 연결효소 10X 완충액 1 ㎕ 및 T4 DNA 연결효소 (3 weiss units/㎕; T4 DNA ligase, Promega) 1 ㎕를 0.5 ㎖ 시험관에 넣은 후, 증류수를 가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 하였다. 연결 반응 혼합물은 14℃에서 밤새 배양하였다.

(단계 2) TA 클로닝 형질전환

대장균 JM109 (Promega, WI, USA)를 10 ㎖의 LB 브로쓰 (박토-트립톤 10 g, 박토-효모 추출물 5 g, NaCl 5 g) 중에서 600 ㎚에서의 광학밀도 값이 약 0.3 내지 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양 혼합물을 얼음에 약 10분간 방치한 후, 4℃에서 10분간 4000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 수집하였다. 수집한 세포 펠릿을 10 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl₂에 30분 내지 1시간 가량 노출시켜 컴피턴트 (competent) 세포를 제조하였다. 결과물을 4℃, 4000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 모아서 2 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl₂에 현탁시켰다.

컴피턴트 세포 현탁액 200 ㎕를 새로운 마이크로퓨즈 (microfuge) 튜브에 옮기고, 여기에 단계 1에서 제조한 연결 반응 산물 2 ㎕를 가하였다. 혼합물을 42℃의 수욕 (water bath)에서 90초간 배양시킨 후, 0℃에서 급냉시켰다. 여기에, SOC 배지 (박토-트립톤 2.0 g, 박토-효모 추출물 0.5 g, 1 M NaCl 1 ㎖, 1 M KCl 0.25 ㎖, TDW 97 ㎖, 2 M Mg^{2 +} 1 ㎖, 2 M 글루코스 1 ㎖) 800 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 220 rpm의 회전진탕 배양기에서 45분간 배양시켰다.

37℃ 배양기에 미리 넣어둔, 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 X-gal (40 ㎎/㎖ 디메틸포름아미드에 저장) 25 ㎕를 유리봉으로 확산시킨 후, 여기에 25 ㎕의 형질전환된 세포를 넣어서 다시 유리봉으로 확산시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 형성된 백색 콜로니를 3-4개 선택하여 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 각각의 선택된 클론들을 심었다. 플라스미드를 제조하기 위하여 이들 중 삽입이 확인된 콜로니, 즉, 형질전환된 대장균 JM109/L276-811;JM109/CC231;JM109/L789;JM109/L986;JM109/L1284;JM109/CA367;JM109/CA335; JM109/CG263 또는 JM109/CG233를 선택하여 10 ㎖의 테리픽 브로쓰 (terrific broth; TDW 900 ㎖, 박토-트립톤 12 g, 박토-효모 추출물 24 g, 글리세롤 4 ㎖, 0.17 M KH₂PO₄, 0.72 N K₂HPO₄ 100 ㎖)에서 배양하였다.

실시예 4: 재조합 플라스미드 DNA 의 분리

위저드 플러스 미니프렙스 DNA 정제 키트 (WizardTM Plus Minipreps DNA Purificatin Kit, Promega, USA)를 사용해서 제조사의 지시에 따라 형질전환된 대장균으로부터 L276-811 플라스미드 DNA; CC231 플라스미드 DNA;L789 플라스미드 DNA;L986 플라스미드 DNA; L1284 플라스미드 DNA;CA367 플라스미드 DNA;CA335 플라스미드 DNA;CG263 플라스미드 DNA 또는 CG233 플라스미드 DNA를 분리하였다.

분리된 플라스미드 DNA의 일부를 ECoRI 효소로 처리한 후, 2% 겔에서 전기영동을 실시하여 L276-811; CC231 ; L789; L986; L1284; CA367; CA335; CG263 또는 CG233 부분서열이 플라스미드에 삽입되었음을 확인하였다.

실시예 5: DNA 염기서열 분석

5-1: MIG 3

실시예 2에서 수득한 L276-811 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 L276-811 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 1862 내지 2166에 해당하며, 본 발명에서는 "L276-811"로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP22 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 305 bp cDNA 단편, 즉, L276-811을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 1a에 나타낸 바와 같이, 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1a에서 알 수 있는 바와 같이, 305 bp cDNA 단편인 L276-811은 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현되지 않았다. 암조직에서도 특히 전이암 조직에서 가장 발현이 높았다.

5-2: MIG 8

실시예 2에서 수득한 CC231 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 CC231 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 5의 뉴클레오티드 번호 3142 내지 3483에 해당하며, 본 발명에서는 "CC231"로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP23 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 342 bp cDNA 단편, 즉, CC231을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 1b에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1b에서 알 수 있는 바와 같이, 342 bp cDNA 단편인 CC231은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현되지 않았다.

5-3: MIG 10

실시예 2에서 수득한 L789 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 L789 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 번호 1022 내지 1305에 해당하며, 본 발명에서는 "L789"로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP23 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 284 bp cDNA 단편, 즉, L789을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 1c에 나타낸 바와 같이, 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1c에서 알 수 있는 바와 같이, 255 bp cDNA 단편인 L276은 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현되지 않았다. 암조직에서도 특히 전이암 조직에서 가장 발현이 높았다.

5-4: MIG 13

실시예 2에서 수득한 L986 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 L986 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 13의 뉴클레오티드 번호 685 내지 979에 해당하며, 본 발명에서는 "L986"로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP21 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 295 bp cDNA 단편, 즉, L986을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 1d에 나타낸 바와 같이, 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1d에서 알 수 있는 바와 같이, 295 bp cDNA 단편인 L986은 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현되지 않았다. 암조직에서도 특히 전이암 조직에서 가장 발현이 높았다.

5-5: MIG 14

실시예 2에서 수득한 L1284 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 L1284 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 17의 뉴클레오티드 번호 823 내지 1098에 해당하며, 본 발명에서는 "L1284"로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP21 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 276 bp cDNA 단편, 즉, L1284를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 1e에 나타낸 바와 같이, 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측에서 우측으로 전이된 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1e에서 알 수 있는 바와 같이, 276 bp cDNA 단편인 L1284는 폐암, 전이 폐암조직 및 A549 폐암세포에서는 발현되었으나, 정상 폐조직에서는 발현되지 않았다. 암조직에서도 특히 전이암 조직에서 가장 발현이 높았다.

5-6: MIG 18

실시예 2에서 수득한 CA367 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 CA367 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 21의 뉴클레오티드 번호 2920 내지 3140에 해당하며, 본 발명에서는 "CA367"으로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP36 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 221 bp cDNA 단편, 즉, CA367을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 1f에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC- 6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1f에서 알 수 있는 바와 같이, 221 bp cDNA 단편인 CA367은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현되지 않았다.

5-7: MIG 19

실시예 2에서 수득한 CA335 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 CA335 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 25의 뉴클레오티드 번호 4123 내지 4503에 해당하며, 본 발명에서는 "CA335"로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP33 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 381 bp cDNA 단편, 즉, CA335를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 1g에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1g에서 알 수 있는 바와 같이, 381 bp cDNA 단편인 CA335는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현되지 않았다.

5-8: MIG 5

실시예 2에서 수득한 CG263 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 CG263 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 29의 뉴클레오티드 번호 476 내지 738에 해당하며, 본 발명에서는 "CG263"으로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP26 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 263 bp cDNA 단편, 즉, CG263을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 1h에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1h에서 알 수 있는 바와 같이, 263 bp cDNA 단편인 CG263은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현되지 않았다.

5-9: MIG7

실시예 2에서 수득한 CG233 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 CG233 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 33의 뉴클레오티드 번호 1903 내지 2229 에 해당하며, 본 발명에서는 "CG233"로 지칭하였다.

5' 무작위 프라이머 H-AP23 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 327 bp cDNA 단편, 즉, CG233을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.

도 1i에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1i에서 알 수 있는 바와 같이, 327 bp cDNA 단편인 CG233은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 약하였다.

실시예 6: 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석

6-1: MIG 3

³²P-표지된 L276-811을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2295 bp가 삽입된 전체 MIG3 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 2월 19일자로 등재번호 제AY239293호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 MIG3 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 MIG3 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 MIG3 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.

서열번호: 1의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 89 내지 709에 해당하며, 서열번호: 2의 206개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

6-2: MIG 8

³²P-표지된 CC231을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 3737 bp가 삽입된 전체 MIG8 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 6월 1일자로 등재번호 제AY311389호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 MIG8 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 MIG8 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 MIG8 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.

3737 bp로 이루어진 MIG18의 전체 염기서열은 서열번호: 5에 나타내었다.

서열번호: 5의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 113 내지 1627에 해당하며, 서열번호: 6의 504개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

6-3: MIG 10

³²P-표지된 L789을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1321 bp가 삽입된 전체 MIG10 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 9월 26일자로 등재번호 제AY423725호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 MIG10 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 MIG10 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 MIG10 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.

서열번호: 9의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 23 내지 1276에 해당하며, 서열번 호: 10의 417개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

6-4: MIG 13

³²P-표지된 L986을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1019 bp가 삽입된 전체 MIG13 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 7월 4일자로 등재번호 제AY336090호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 MIG13 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 MIG13 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 MIG13 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.

서열번호: 13의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 11 내지 844에 해당하며, 서열번호: 14의 277개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

6-5: MIG 14

³²P-표지된 L1284를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1142 bp가 삽입된 전체 MIG14 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 7월 4일자로 등재번호 제AY336091호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 MIG14 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 MIG14 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 MIG14 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.

서열번호: 17의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 67 내지 1125에 해당하며, 서열번호: 18의 352개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

6-6: MIG 18

³²P-표지된 CA367을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 3633 bp가 삽입된 전체 MIG18 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 9월 30일자로 등재번호 제AY423734호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 MIG18 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 MIG18 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 MIG18 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.

3633 bp로 이루어진 MIG18의 전체 염기서열은 서열번호: 21에 나타내었다.

서열번호: 21의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 215 내지 2212에 해당하며, 서열번호: 22의 665개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

6-7: MIG 19

³²P-표지된 CA335를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 4639 bp가 삽입된 전체 MIG19 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 10월 26일자로 등재번호 제AY450308호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 MIG19 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 MIG19 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 MIG19 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.

4639 bp로 이루어진 MIG19의 전체 염기서열은 서열번호: 25에 나타내었다.

서열번호: 25의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 65 내지 2965에 해당하며, 서열번호: 26의 966개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

6-8: MIG 5

³²P-표지된 CG263을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 833 bp가 삽입된 전체 MIG5 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 19일자로 등재번호 제AY279384호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 MIG5 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 MIG5 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 MIG5 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.

833 bp로 이루어진 MIG5의 전체 염기서열은 서열번호: 29에 나타내었다.

서열번호: 29의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 159 내지 737에 해당하며, 서열번호: 30의 192개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

6-9: MIG 7

32P-표지된 CG233을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2364 bp가 삽입된 전체 MIG7 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 5월 24일자로 등재번호 제AY305872호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2004년 12월 31일).

파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 MIG7 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).

상기 MIG7 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 MIG7 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰 다.

2364 bp로 이루어진 MIG7의 전체 염기서열은 서열번호: 33에 나타내었다.

서열번호: 33의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 1435 내지 1665에 해당하며, 서열번호: 34의 76개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

실시예 7: 다양한 세포에서의 유전자의 노던 블롯 분석

7-1: MIG 3, MIG 10, MIG 13, MIG 14

실시예 1에서와 같이, 정상 폐조직, 좌측 폐암조직, 좌측 폐에서 우측폐로 전이된 전이 폐암조직, A549와 NCI-H358 (American Type Culture Collection; ATCC Number CRL-5807) 폐암 세포주들부터 총 RNA를 추출하였다.

MIG3; MIG 10; MIG 13 또는 MIG 14 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막 (Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 Ⅱ (Rediprime Ⅱ) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 ³²P-표지된 무작위 프라임된 MIG 전체 cDNA 프로브로 블롯을 혼성화시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.

도 2a는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)들에서 MIG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나 타낸 것이다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG3 원암유전자는 폐암조직, 폐암 전이조직 및 A549와 NCI-H358 폐암 세포주들에서는 현저하게 유전자 발현이 증가되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 2a에서, 정상 (Normal)열은 정상 폐조직을, 암 (Cancer)열은 폐암조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직, 그리고 A549열 및 NCI-H358열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 2b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 11a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 MIG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 11b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 11a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG3 mRNA (약 4.0 kb)는 정상조직들에서는 매우 약하게 발현되고 있다.

도 20a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 MIG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 20b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 20a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG3은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암 세포주 A549 및 피부암 세포주 G361들에서 매우 높은 수준 으로 발현되었다.

도 4a는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)들에서 MIG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG10 원암유전자는 폐암조직, 폐암 전이조직 및 A549와 NCI-H358 폐암 세포주들에서는 현저하게 유전자 발현이 증가되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 4에서, 정상 (Normal)열은 정상 폐조직을, 암 (Cancer)열은 폐암조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직, 그리고 A549열 및 NCI-H358열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 4b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 13a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 MIG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 13b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 13a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG10 mRNA (약 2.0 kb)는 정상조직들에서는 단지 약하게 발현되고 있다.

도 22a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 MIG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 22b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 22a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG10은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암 세포주 A549 및 피부암 세포주 G361들에서 매우 높은 수준으로 발현되었다. 또한, 2.0 kb 외에도 이보다 큰 크기인 약 2.4 kb의 mRNA도 발현되는 것이 확인되었다.

도 5a는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)들에서 MIG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG13 원암유전자는 폐암조직, 폐암 전이조직 및 A549와 NCI-H358 폐암 세포주들에서는 현저하게 유전자 발현이 증가되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 5a에서, 정상 (Normal)열은 정상 폐조직을, 암 (Cancer)열은 폐암조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직, 그리고 A549열 및 NCI-H358열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 5b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 14a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 MIG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 14b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 14a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG13 mRNA (약 1.7 kb 의 우점전사물과 약 1.4 kb의 전사물)는 정상조직들에서는 매우 약하게 발현되거나 발현이 없었다.

도 23a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 MIG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 23b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 23a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG14 mRNA (약 1.7 kb 의 우점전사물과 약 1.4 kb의 전사물)는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암 세포주 A549 및 피부암 세포주 G361들에서 매우 높은 수준으로 발현되었다.

도 6a는 정상 폐조직, 폐암조직, 폐암 전이조직 및 폐암 세포주 (A549 및 NCI-H358)들에서 MIG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG14 원암유전자는 폐암조직, 폐암 전이조직 및 A549와 NCI-H358 폐암 세포주들에서는 현저하게 유전자 발현이 증가되었으나, 정상 폐조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 6에서, 정상 (Normal)열은 정상 폐조직을, 암 (Cancer)열은 폐암조직을, 전이 (metastasis)열은 폐암 전이조직, 그리고 A549열 및 NCI-H358열은 폐암 세포주를 각각 나타낸다. 도 6b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 15a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 MIG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 15b는 동 일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 15a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG14 mRNA (약 1.3 kb 의 우점전사물과 약 2 kb의 전사물)는 정상조직들에서는 매우 약하게 발현되거나 발현이 없었다.

도 24a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 MIG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 24b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 24a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG14 mRNA (약 1.3 kb 의 우점전사물과 약 2 kb의 전사물)는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암 세포주 A549 및 피부암 세포주 G361들에서 매우 높은 수준으로 발현되었다.

7-2: MIG 8, MIG 18, MIG 19, MIG 5, MIG 7

실시예 1에서와 같이, 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁암 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주 CaSki (ATCC CRL 1550), CUMC-6으로부터 총 RNA를 추출하였다.

MIG8; MIG 18; MIG 19; MIG 5 또는 MIG 7 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막 (Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II (Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham, 영 국)을 사용하여 제조한 ³²P-표지된 무작위 프라임된 MIG 전체 cDNA 프로브로 블롯을 혼성화시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.

도 3a는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 MIG8 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG8 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 4.0 kb의 우점(dominant) MIG8 mRNA 전사물과 약 1.3 kb의 MIG8 mRNA 전사물들이 과발현되었다, 특히 자궁경부암 전이 임파절 조직에서의 발현정도가 가장 높았으며 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮았다. 도 3a에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 3b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 12a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 MIG8 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 12b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 12a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG8 mRNA ((약 4 kb의 우점(dominant) MIG8 mRNA 전사 물과 약 1.3 kb의 MIG8 mRNA 전사물))는 정상 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 약하게 발현되고 있다.

도 21a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 MIG8 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 21b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 21a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG8 mRNA ((약 4 kb의 우점(dominant) MIG8 mRNA 전사물과 약 1.3 kb의 MIG8 mRNA 전사물))는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암 세포주 A549 및 피부암 세포주 G361들에서도 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 그러나 피부암 세포주 G361에서는 약 1.3 kb의 MIG8 mRNA 전사물이 발현되지 않았다.

도 7a는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 MIG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 7a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG18 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며, 특히 자궁경부암 전이 임파절 조직에서의 발현정도가 가장 높았으며 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮았다. 도 7에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 7b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 16a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 MIG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 16b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 16a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG18 mRNA (약 4 kb)는 정상 심장, 근육조직 및 간조직들에서는 약하게 발현되고 있다.

도 25a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 MIG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 25b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 25a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG18은 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562에서는 매우 높게 발현이 증가되어있으며 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암 세포주 A549 및 피부암 세포주 G361들에서도 증가된 수준으로 발현되었다.

도 8a는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 MIG19 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 8a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG19 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 4.7 kb의 우점(dominant) MIG19 mRNA 전사물이 과발현되었다, 특히 자궁경부암 전이 임파절 조직에서의 발현정도가 가장 높았으며 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮았다. 도 8에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 8b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 17a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 MIG19 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 17b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 17a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG19 mRNA (약 4.7 kb의 우점 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현이 약하거나 발현이 없었다.

도 26a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 MIG19 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 26b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 26a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG19 mRNA (약 4.7 kb의 우점 mRNA 전사물)는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포 주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암 세포주 A549 및 피부암 세포주 G361들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.

도 9a는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 MIG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 9a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG 5 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 5.5 kb의 우점(dominant) MIG5 mRNA 전사물이 과발현되었다, 특히 자궁경부암 전이 임파절 조직에서의 발현정도가 가장 높았으며 정상조직에서는 발현이 없었다. 도 9에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 9b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 18a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 MIG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 18b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 18a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG5 mRNA (약 5.5 kb의 우점 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현이 없었다.

도 27a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 MIG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 27b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 27a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG5 mRNA (약 5.5 kb의 우점 mRNA 전사물)는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암 세포주 A549 및 피부암 세포주 G361들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.

도 10a는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 MIG19 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 10a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG7 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 10 kb의 우점(dominant) MIG7 mRNA 전사물이 과발현되었다, 특히 자궁경부암 전이 임파절 조직에서의 발현정도가 가장 높았으며 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮았다. 도 10에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 10b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 19a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 MIG19 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 19b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 19a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG7 mRNA (약 10 kb의 우점 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현이 약하거나 발현이 없었다.

도 28a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 MIG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 28b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 28a에서 알 수 있는 바와 같이, MIG7 mRNA (약 10 kb의 우점 mRNA 전사물)는 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 및 폐암 세포주 A549 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.

실시예 8: 원암유전자를 대장균에 형질감염시킨 후 발현되는 단백질의 크기 결정

서열번호: 1의 MIG3; 서열번호: 5의 MIG8; 서열번호: 9의 MIG10; 서열번호: 13의 MIG13; 서열번호: 17의 MIG14; 서열번호: 21의 MIG18; 서열번호 25의 MIG 19; 서열번호 29의 MIG 5; 또는 서열번호 33의 MIG 7 원암유전자 전체를 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/MIG 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin 이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다.

엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE).

도 29a는 pBAD/thio-Topo/MIG3벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 38 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 38 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG3 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 23 kDa의 MIG3 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 29b는 pBAD/thio-Topo/MIG8 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 72 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 72 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG8 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 57 kDa의 MIG8 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 29c는 pBAD/thio-Topo/MIG10벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 60 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 60 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG10 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 45 kDa의 MIG10 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 29d는 pBAD/thio-Topo/MIG13벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 46 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 46 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG13 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 31 kDa의 MIG13 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 29e는 pBAD/thio-Topo/MIG14벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 54 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 54 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG14 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 39 kDa의 MIG14 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 29f는 pBAD/thio-Topo/MIG18 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 88 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 88 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG18 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 73 kDa의 MIG18 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 29g는 pBAD/thio-Topo/MIG19 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 122 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 122 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG19 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 107 kDa의 MIG19 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 29h는 pBAD/thio-Topo/MIG5 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 36 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 36 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG5 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 21 kDa의 MIG5 단백질을 함유하고 있는 것이다.

도 29i는 pBAD/thio-Topo/MIG7 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 24 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 24 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/MIG7 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 9 kDa의 MIG7 단백질을 함유하고 있는 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 원암유전자는 인간 암발생에 관여하며 동시에 암전이 (metastasis) 유발능을 나타내는 신규 유전자로서 폐암, 백혈병, 자궁암, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

<110> KIM, HYUN KEE <120> HUMAN PROTOONCOGENE AND PROTEIN ENCODED THEREIN <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2295 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aaagtctgcc tctctagcta caacatttct tcaagaaaag aaagcagaag cccagaatca 60 taatcgtgtc cctgatgtaa aggcattaat ggagagtccc gagggacagt tatctctgga 120 gcccaaatct gatagtcact tccaagcatc acacactggg tgccagagcc ctttatgttc 180 agcccagcgt cacactcctc agagcccctt caccaatcat gctgcagctg ctggcaggaa 240 gactcttcgc agctgcatgg ggctggagtg gtttccagag ctctatcctg gttaccttgg 300 actaggggtg ttgccaggga agcctcagtg ttggaatgca atgacccaga agccacaact 360 tatcagtccc cagggggaaa gactctcgca agtttctttg ttggaacgaa gctcaactca 420 tataaggagt ttggaacccc ctaccggact tacaacctcc aacttctctc taatgaggct 480 cttgggagct gtacaaaaag gctggatcag gtgcaacacc accataagga agagtggatt 540 cggtggcatc acgatgctct tcacaggata cttcgtcctg tgttgtagct ggagtttcag 600 acgtctgaaa aaattgtgcc gacccctgcc ctggaagagc acagtacctc catgcattgg 660 tgtggcgaag acgactgggg attgccgctc taaaacatgt ttggattagg aagcacgttt 720 aagtaggaga agccttcgtg acttctctct agtgccttcg tgccctgtgt tgcccactga 780 attgccctgt aacacctaag tgtagtggta gcattaaggg atagcttttc agccctcaag 840 gttatcagga gcatttgtat cactgctata aataaagtag tatcacttgt cataatcagg 900 gtgctgaaac ataatgaaaa ggtttaactt agtcacagta aatattttat atccctgaaa 960 ataagttatt taatgagaat agaactattt aatgatccat gagtcctaaa aggatatctg 1020 ccttgtattg ccaagtttaa ggcaaaggtg agatcctgta ttaataagaa gacagctttt 1080 ttgtttgaca ttggtaagta ccaagaattc taactcacat atagtaggaa acaacaaaaa 1140 gtctccactg acttctttga attagatact gagaatccac aatacagtag tgtggataac 1200 tttcaagaag ccattggaaa catctccaca ttctgggatg acttgtaaat gtctacagag 1260 taatggaagg aaaggcttcc ttgtctgctc attgctgcca cctgggttgg gaaaataatt 1320 gaagatgttt tctcaagtcc ttcaagaatc tcttcttaat gttcagaata gtttaagagc 1380 gttgttgagg taaagtgata gctgattatt ttctgagatt tagatctaaa caaactcagc 1440 atgacgagga agcacacttc acagctccag ggtgcaatac tgatgtaaag ttgcctcgtg 1500 aggatacatt tttcgctcat gtatgcaaaa ttcctatcag ttcatttgca cagccagttc 1560 caatcatgta tgtgatcacc agattaaaag cttcatccag aaagacaaga ctcctcagaa 1620 cgaatagtag acaagtaaga ctgctaccca cagaagccag tacgcttcag gtgtgaggcg 1680 gggtaactac tcatctcttc acagagccaa ggaaagaaaa agaacgtctc taacatgatt 1740 taccatttta aacagcctta taagttttgt ctcttaaaat catgctgcag aaggaggggg 1800 taaaagtcgt gttctgccct gtctgtggca ttggagtgcc ccgctaggta agaagcaatg 1860 cttagatctt gcttccaggc agcagcttga attcccgaat cttcctgcaa ggtgcataca 1920 aatgcagcgt gagaatccat acacgtaatc catattcacc ttcccatcca tcccgcagaa 1980 gaggcatggt gacacccagg ctactgtcca tgcttgagag gacgtatttg aaggttctgt 2040 tactacaagt tgggaatatt cacggacatg cctgaatacc ccggctgtaa ctcacacgtg 2100 gtctgtgtaa gtggattaac ctcggggcgg ccttgtttaa tcctgaataa tatctgaaag 2160 actgagttta cttgggaatg tgtagttttt ctaatgcaca ttaaaattta ttttagctgt 2220 taaaaataaa atcattttat tatcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaa 2295 <210> 2 <211> 206 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Ser Pro Glu Gly Gln Leu Ser Leu Glu Pro Lys Ser Asp Ser 1 5 10 15 His Phe Gln Ala Ser His Thr Gly Cys Gln Ser Pro Leu Cys Ser Ala 20 25 30 Gln Arg His Thr Pro Gln Ser Pro Phe Thr Asn His Ala Ala Ala Ala 35 40 45 Gly Arg Lys Thr Leu Arg Ser Cys Met Gly Leu Glu Trp Phe Pro Glu 50 55 60 Leu Tyr Pro Gly Tyr Leu Gly Leu Gly Val Leu Pro Gly Lys Pro Gln 65 70 75 80 Cys Trp Asn Ala Met Thr Gln Lys Pro Gln Leu Ile Ser Pro Gln Gly 85 90 95 Glu Arg Leu Ser Gln Val Ser Leu Leu Glu Arg Ser Ser Thr His Ile 100 105 110 Arg Ser Leu Glu Pro Pro Thr Gly Leu Thr Thr Ser Asn Phe Ser Leu 115 120 125 Met Arg Leu Leu Gly Ala Val Gln Lys Gly Trp Ile Arg Cys Asn Thr 130 135 140 Thr Ile Arg Lys Ser Gly Phe Gly Gly Ile Thr Met Leu Phe Thr Gly 145 150 155 160 Tyr Phe Val Leu Cys Cys Ser Trp Ser Phe Arg Arg Leu Lys Lys Leu 165 170 175 Cys Arg Pro Leu Pro Trp Lys Ser Thr Val Pro Pro Cys Ile Gly Val 180 185 190 Ala Lys Thr Thr Gly Asp Cys Arg Ser Lys Thr Cys Leu Asp 195 200 205 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-T11A Primer <400> 3 aagctttttt tttttc 16 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-AP22 primer <400> 4 aagcttttga tcc 13 <210> 5 <211> 3737 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cggcagctgg aggtgtaata gtgcgggtag tgggtttgga gaagttccga ggcggcggtg 60 gcgccggtca ggacaaggat agcggaaccg ggccctgggc ttgtcgctca ccatgccgac 120 agtagaggag ctttaccgca attatggcat cctggccgat gccacggagc aagtgggcca 180 gcataaagat gcctatcaag tgatattgga tggtgtgaaa ggtggtacta aggaaaagcg 240 attagcagct caatttattc cgaaattctt taagcatttt ccagaattgg ctgattctgc 300 tatcaatgca cagttagacc tctgtgagga tgaagatgta tctattcgac gtcaagcaat 360 taaagaactg cctcaatttg ccactggaga aaatcttcct cgagtggcag atatactaac 420 gcaacttttg cagacagatg actctgcaga atttaaccta gtgaacaatg ccctattaag 480 tatatttaaa atggatgcaa aagggacttt aggtgggttg ttcagccaaa tacttcaagg 540 agaggacatt gttagagaac gagcaattaa attcctttct acaaaactta agactttacc 600 agatgaagtc ttaacaaagg aagtggaaga gcttatacta actgaatcca aaaaggtcct 660 agaagatgtg actggtgaag aatttgttct atttatgaag atactgtctg ggttaaaaag 720 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cttgactaca caacataaat cactttttaa attccaggaa cgggtagtct 2460 gacacggtga ttatcctttt gaggctgaat ccgttattaa cttgttattt aggtttttac 2520 tcccagtagc aagggattct aagttagttg cacttacatg attattgtta tttaaaacta 2580 agaataaagg ctgcattttc aaagataaat tggaattgct gttggtgaaa taacaaccaa 2640 aatactgaat ctgatgtaca tacaggtttc tacaggaaga gatggtataa tttacaattt 2700 ggagatttaa taaccagggc tacccagaaa aagtgacttg ataacatggt accaataagt 2760 aagggatgct ctctcggttt gcttttgcca ctttcaagat tttaacttct caggttatta 2820 atcaaaatta ttgtataagt tagccaatag aatttttagg ttaaaacaac agatgggggg 2880 tttgtggagt gtttaatgtc atgggcattt ttagtagcat agaccctttg ttctgcattt 2940 gaatgtttcg tatatttttg tttcacagtt aatcttccct ccccaagttt gctattcaaa 3000 tcaactgcct gaatgacatt tctagtagtc tgatgtattt ttctgaggaa tagtttgtga 3060 ttccaatgca ggtgtcttca ttaccattac ctctacactg cagaagaagc aaaactcctt 3120 tattagaatt actgcacatg tgtatgggga aaatagttct gaaaggctag aatgatacaa 3180 gtgagcaaaa gttggtcagc ttggctatgg agtggtggca ataatctcta aacattccaa 3240 aagaccatga 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aaggggtgaa agatgtaatt 1860 attgacagat taaatagata acttcgtaac caccaggggg cagattcaat acatcacaga 1920 atggctgagg aagatccttg ggttgtgaag agagtagaaa ccctagggag cagtgctttt 1980 gggtcctaga acctgttgag tttctaatga atatttgtag aatctcataa aacagtttaa 2040 atacaagctt aagtggctta tgaatcctgt gaagctcatt tatggactag tgtaaaacaa 2100 tgtgaagctc tactaagttc tgtccttaat cataaataat agccccttga ggactagcct 2160 gttctctggt caccttacca gttgggttgc acattgtgtg gtcgtccaaa taactcaatc 2220 ttgcgagtgc caggagatag tctttcaatc atgccataga tttcatctgg tttatgactg 2280 gtggaacgaa cctaggaaat aaaaactagc tgctttttaa gttaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2364 <210> 34 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Ile Pro Ser Gly Tyr Leu Cys Leu Asn Arg Ala Thr Thr Ser Gly 1 5 10 15 Ser Ser Arg Trp Ile Pro Ser Ser Trp Phe Pro Arg Val Ile Leu Lys 20 25 30 Gln Cys Lys Arg Arg Gly Lys Pro Glu Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu 35 40 45 Ile Leu Leu Lys Asn Ala Tyr Gln Met Lys Thr Ala Tyr His His Ile 50 55 60 Lys Tyr Ala Asn Ser Lys Lys Ser Leu Thr Leu Glu 65 70 75 <210> 35 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-T11G primer <400> 35 aagctttttt tttttg 16 <210> 36 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-AP23 primer <400> 36 aagcttggct atg 13

Claims (6)

1. 서열번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 인간 원암단백질.
2. 제 1항의 원암단백질을 암호화하는 서열번호: 17의 뉴클레오티드 번호 67 내지 1125에 해당하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
3. 제 2항에 있어서, 상기 원암 유전자는 서열번호: 17의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
4. 제 2항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 벡터.
5. 제 1항의 원암단백질을 포함하는 암과 암 전이 진단용 키트.
6. 제 2항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 암과 암전이 진단용 키트.

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