KR20080058105A - 인간 원암 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를포함하는 발현벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 원암 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자 또는 그의 단편 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편에 대한 것이다. 또한, 본 발명의 원암 유전자는 간암, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암, 피부암 등을 비롯한 여러가지 다양한 암의 진단과 예방, 안티센스 또는 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 유전자 치료, 그리고 형질전환 동물(transgenic animals)의 제조에 효과적으로 이용될 수 있다.

원암 유전자, 원암 단백질, 형질전환, 안티센스, RNA 간섭

Description

인간 원암 유전자, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이를 포함하는 발현벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 세포{HUMAN PROTOONCOGENE, PROTEIN ENCODED BY SAME, EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME, AND CELL TRANSFORMED BY SAID VECTOR}

도 1은 정상 간 조직, 간암 조직, 및 HepG2 간암세포에서 HP73의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이고,

도 2의 A는 인간 정상 간, 간암 및 간암세포주들에서 GIG47 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며,

도 2의 B는 도 2의 A와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며,

도 3의 a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 GIG47 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며,

도 3의 b는 도 3의 a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며,

도 4의 a는 인간 암 세포주들에서 GIG47 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며,

도 4의 b는 도 4의 a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며,

도 5는 GIG47 원암 유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 L-아라비노즈 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아마이드 겔(PAGE)에서 전기영동한 결과를 보여주는 것이다.

인간을 포함한 고등동물들은 약 30,000 개의 유전자들을 갖고 있으나 이들 중 약 15% 만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉, 발생, 분화, 항상성(homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화 및 아폽토시스(apoptosis; programmed cell death) 등이 결정된다[리앙, 피.(Liang, P.) 및 에이. 비. 파디(A. B. Pardee), Science, 257:967-971, 1992]. 종양의 발생과 같은 병리학적 현상은 유 전자 변이 과정에서 유발되어 종국적으로 유전자 발현의 변이를 유도하게 된다. 따라서 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다.

예를 들면, 리앙과 파디에 의해 상기 언급된 논문을 통해 제안된 mRNA 감별전개(Differential Display, DD) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며, 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들간의 상호 관련성의 규명에도 다각도로 활용되고 있다.

종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체부위의 소실(loss of chromosomal heterozygosity), 원암 유전자들의 활성화, 그리고 p53 유전자를 비롯한 기타 종양억제 유전자들의 불활성화 등의 여러 가지 유전적 변이들이 인간 종양 조직에 축적됨으로써 종양이 발생된다고 보고되었으며[비숍 제이. 엠.(Bishop, J. M.), Cell, 64:235-248, 1991; 헌터 티.(Hunter, T.), Cell, 64:249-270, 1991], 암의 10-30%는 원암 유전자가 증폭됨으로써 원암 유전자가 활성화되어 발생된다고 보고되어 있다.

특히, 원암유전자의 활성화라는 이슈는 많은 암의 병인학 연구에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로, 이를 밝히는 것이 요청되고 있다.

이에 본 발명자들은 간암의 발생기전을 원암 유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 세포 증식유도 유전자 47, GIG47로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현이 증가된다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다. GIG 47 원암유전자는 간암, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암, 피부암 등의 다양한 암의 진단, 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 신규한 원암 유전자 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자에 의해 코드되는 단백질 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 세포를 제공하여 상기 유전자 또는 그의 단편 및 상기 단백질 또는 그의 단편을 대량으로 생산하는 기술을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 또는 그의 단편에 대한 항체를 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자에 코딩된 단백질의 발현을 억제 또는 저해함으로써 암을 예방 및 치료하는 안티센스 폴리뉴클레오티드와 간섭 RNA(RNAi) 분자들과 같은 유전자치료에 이용될 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드 및 RNAi 분자를 이용한 유전자 치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 원암 단백질을 코딩하는 염기서열, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 원암 유전자를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 원암 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.

또 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하여 시료내 상기 원암 유전자 또는 그의 단편의 존재를 검사하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 원암 단백질 또는 그의 단편에 대해 특이성을 가지는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함하는 암 진단용 키트를 제공하여, 시료내 존재하는 상기 원암 단백질 또는 그의 단편의 존재를 검사하는 진단키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 원암 유전자로부터 전사되는 mRNA 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 가지고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 원암 유전자로부터의 단백질의 발현을 억제하는 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 상기 원암 유전자의 mRNA와 상동성 서열을 갖는 이중가닥의 간섭 RNA(RNAi) 분자를 제공한다.

본 발명은 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드 및 RNAi 분자를 활성성분으로서 포함하는 암의 유전자적 치료 및 예방용 약학적조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 원암 유전자(protooncogene)는 인간 세포 증식유도 유전자 47(이하, “GIG47” 원암 유전자로 약칭함)로서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자로서, 바람직하게 상기 원암 유전자 및 이의 단편은 총 517 내지 703bp의 염기길이를 가질 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 703bp 길이의 염기서열을 갖는 유전자이다.

구체적으로, 서열번호 1의 전체 염기서열 중 17번째 내지 535번째 뉴클레오티드 부위(533-535: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 단백질 코딩 영역이며, 이로부터 코딩되는 아미노산 서열이 서열번호 2에 표시된 아미노산 서열이며, 총 172개의 아미노산으로 이루어져 있다(이하, “GIG47 원암 단백질”이라 약칭함).

본 발명의 원암 유전자는 코돈의 축퇴성(degeneracy)에 따른 워블링 코드(wobbling code) 및 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물내에 선호되는 코돈을 고려하여, 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위에서 다양한 염기서열의 변이가 이루어질 수 있으며, 상기 원암 단백질 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 서열은 또한 본 발명의 원암 유전자의 범위에 포함된다.

따라서, 본 발명의 원암 유전자는 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 이의 단편일 수 있다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가짐을 의미한다.

본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 172개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 19 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것이다.

본 발명의 원암 유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주세포 예를 들어, 대장균, 효모, 동물세포 및 식물세포 등에 도 입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주세포를 이용하여 본 발명의 원암 유전자 DNA를 대량으로 복제하거나 원암 단백질 또는 그 단편을 대량으로 생산할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 상기 원암 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 선택된 프로모터, 터미네이터 등의 발현 조절서열, 자가복제서열, 분비 시그날 등을 조합하여 제조할 수 있다.

노던 블롯(northern blot) 등의 분석법을 통해 확인한 바에 따르면, 정상 간조직에서는 본 발명의 유전자의 발현이 거의 확인되지 않은 반면 간암 조직과 간암 세포주들에서는 상기 유전자의 과발현이 확인되었다. 즉, 본 발명의 원암 유전자는 간암을 유발시키는 강력한 발암 유전자로 판단되며, 이에서 나아가, 간암조직 외에도, 본 발명의 원암 유전자는 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암, 피부암 등의 많은 다양한 암 종양들에서 높은 수준으로 발현된다. 따라서, 본 발명의 원암유전자는 여러 가지 암의 발생에 공통되는 발암유전자일 것으로 판단되는바, 여러 가지 다양한 암의 진단과, 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 원암 유전자는 상기한 암의 진단, 예방 및 치료를 위한 형질전환된 동물의 제조 및 안티센스 유전자 치료 또는 RNA 간섭 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

상기 원암 유전자를 이용하여 암을 진단하는 것이 가능한데, 예를 들면 상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 피험자의 체액으로부터 분리된 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 상기 프로브와 복합체 형성 여부를 검출함으로써 피험자가 본 발명의 원암 유전자를 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소, 효소 등으로 표지하여 용이하게 복합체 형성 유무를 확인할 수 있다. 본 발명에서는 상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 암 진단용 키트를 역시 제공한다.

본 발명의 원암 유전자를 포유동물 예들들어, 래트(rat) 등의 설치류 동물에 도입함으로써 형질전환 동물(transgenic animal)을 제조할 수 있으며, 상기 유전자의 형질도입은 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 이루어지는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 안티센스 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 원암 유전자 서열로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보성을 갖는 서열을 갖는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드이다. 이는 상기 mRNA의 단백질 결합부위에 결합하여 원암 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 파괴할 수 있는 서열로서, 이들 안티센스 폴리뉴클레오티드를 환자의 체내로 도입함으로써 상기 원암 유전자의 발현으로 인한 암을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드는 당해 기술분야에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 제작될 수 있다.

본 발명의 안티센스 유전자 치료는 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드를 통상적인 방법으로 환자에게 투여하여 원암유전자의 발현을 예방하는 것이다. 예를 들면, 상기 안티센스 유전자 치료방법은 문헌 “제.에스. 김 등(J.S. Kim, et al.), J. Controlled Release, 53: 175-182, 1998”에 공지된 방법에 따라 안티센스 ODN을 폴리-L-리신 유도체와 정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이 혼합체를 환자에게 정맥 투여하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드를 활성성분으로 하며 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 필요시 기타 첨가제를 포함하는 항암제 조성물을 제공한다. 본 발명의 항암제 조성물은 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다. 투여되는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 양은 치료 대상 증상의 유형, 투여 경로, 환자의 연령 및 체중, 증상의 중증도 등의 다양한 관련 인자를 고려하여 결정할 수 있다.

또한, 본 발명은 유전자 치료에 효과적인 간섭 RNA(RNAi)를 제공한다. RNA 간섭(RNA interference)이라고 함은 이중가닥 RNA(dsRNA)가 세포내로 들어갔을 때, 그와 상동성의 염기 서열을 가진 mRNA 만을 선택적으로 전사 후 단계에서 분해하는 현상을 말한다. RNA 간섭은 이러한 현상이 곤충에서 일어나는 것이 확인되었다는 보고 이래, 초파리, 생쥐, 트리파노소마, 플라나리아 등의 몇몇 동물에서 보고되었고, 식물에서는 유전자 침묵(genetic silencing) 현상에 관여하는 것으로 보고되어 있다[샤프, 피. 에이. 등(Sharp, P. A. et.al.), Genes Dev., 13,139-41, 1999]. 최근에는 포유동물에서도 dsRNA가 21-22개의 작은 크기로 프로세싱 되는 경우라면 동물세포내에서 인터페론에 의한 단백질 키나아제 활성화에 따라 상기 dsRNA가 분해되는 것을 회피할 수 있게 되고, 따라서 성공적으로 RNA 간섭이 유도될 수 있음이 확인되었는바, 질병의 발병에 관련된 많은 유전자를 침묵(silencing)시키는 연구가 활발히 진행되고 있다[엘바쉬어, 에스. 엠. 등(Elbashir, S. M. et. al.), Nature, 411;494-8, 2001; 엘바쉬어, 에스. 엠. 등, Genes Dev ., 15;188-200, 2001; 로셀, 케이. 에프.(Rosel, K. F.) 및 조오지, 에스(Georg, S.), Nucleic acids Res., 31;4417-4424, 2003; 주디, 엘. 등(Judy, L., et al.), Trends Mol Med., 9; 397-403, 2003; 마이클, 비. 엠., 등(Michael, B.M., et al.), Methods, 30; 287-8, 2003]. 그러나, 이러한 RNA 간섭 현상은 포유동물세포에서는 심각한 세포독성(cytotoxic) 반응을 유발시키는 것으로 알려졌으며 이러한 부작용은 짧은(19 내지 22개 뉴클레오티드 길이) 간섭성 RNA (short interfering RNA, siRNA)를 사용할 경우 회피할 수 있으며 그 유전자 발현의 억제 작용이 매우 크며 특이적임이 알려졌다[엘바쉬어, 에스. 엠., 등, Nature, 411;494-8, 2001; 엘바쉬어, 에스. 엠., 등, Genes Dev ., 15; 188-200, 2001].

이에, 본 발명에 따른 간섭 RNA는 서열번호 1로 표시되는 원암 유전자 서열로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보성을 갖는 염기서열을 갖는 이중가닥의 RNA 분자로 제조될 수 있다. 구체적인 제조방법은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따른다.

또한, 본 발명의 간섭 RNA를 활성성분으로 하며 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 필요시 기타 첨가제를 포함하는 항암제 조성물을 제공한다. 본 발명의 항암제 조성물은 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다. 투여되는 간섭 RNA의 양은 치료 대상 증상의 유형, 투여 경로, 환자의 연령 및 체중, 증상의 중증도 등의 다양한 관련 인자를 고려하여 결정할 수 있다.

본 발명의 원암 유전자로부터 유도되는 단백질은 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 원암 유전자로부터 발현된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다. 효소 면역측정법(ELISA), 방사선면역측정법(RIA), 샌드위치 측정법(Sandwich Assay), 폴리아크릴 겔 상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 당분야에 공지된 방법을 통해, 상기 항체들을 이용하여 피험자의 체액 시료 중 상기 단백질이 발현되었는지를 검사함으로써 암을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 원암 유전자를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 예를 들어, 상기 원암 유전자가 형질도입된 섬유모세포를 이용하여 누드 마우스에 형성시킨 종양조직으로부터 제조할 수 있다. 이러한 암 세포주는 항암제 등의 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명할 것이나, 본 발명이 이에 한정되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 종양세포 배양 및 총 RNA의 분리

(단계 1) 종양세포 배양

mRNA의 감별 전개를 위하여, 간 조직 생검을 받은 환자로부터 정상 간 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지 않은 간암 환자로부터 조직 생검 시에 원발성 간 종양조직을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 간암 세포주로 HepG2(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, American Type Culture Collection) 간암 세포주를 사용하였다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 중의 세포들로서 트리판 블루 염료로 염색할 때 95% 이상의 생존률을 보이는 세포들이다[프레쉬니(Freshney), “동물세포의 배양(Culture of Animal Cells)”, A Manual of Basic Technique, 2판, A. R. Liss, New York, 1987 참조].

(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법

상업적으로 판매되는 시스템인 알엔이지(RNeasy) 총 RNA 키트(Qiagen 사, 독일)를 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 간 조직, 원발성 간암조직, 및 HepG2 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트(Message clean kit)(GenHunter 사, 미국)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.

실시예 2: 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응( DDRT - PCR )

감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.

먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호 3의 H-T11C 고정 프라이머(RNAimage 키트, Genhunter 사, 미국)를 사용하여 역전사를 수행하였다.

이어서, 0.5mM[α-35S]dATP(1200 Ci/mmole) 존재 하에, 상기한 고정 프라이머와 무작위 5말단 13프라이머(RNAimage 프라이머 세트 1-5, H-AP 1-40 중 H-AP23 프라이머)(서열번호 4)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.

PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differential expression) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.

건조된 겔로부터 282 염기쌍(bp) 크기의 밴드 HP73 cDNA(서열번호 1의 346 내지 627 부위)를 도려내었다. 15분간 가열하여 HP73 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.

실시예 3: 클로닝

상기에서 얻은 재증폭된 HP73 PCR 산물을 TA클로닝 시스템(Promega, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 pGEM-T 이지(EASY) 벡터에 삽입하였다.

(단계 1) 연결반응

실시예 2에서 얻은 재증폭된 HP73 PCR 산물 2㎕, pGEM-T 이지 벡터(50 ng) 1 ㎕, T4 DNA 연결효소 10X 완충액 1㎕ 및 T4 DNA 연결효소(3 weiss units/ul; T4 DNA ligase, Promega) 1 ㎕를 0.5㎖ 시험관에 넣은 후, 증류수를 가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 하였다. 연결 반응 혼합물은 14℃에서 밤새 배양하였다.

(단계 2) TA 클로닝 형질전환

대장균 JM109(Promega, WI, USA)를 10 ㎖의 LB 브로쓰(박토-트립톤 10 g, 박 토-효모 추출물 5 g, NaCl 5 g) 중에서 600㎚에서의 광학밀도 값이 약 0.3 - 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양 혼합물을 얼음에 약 10분간 방치한 후, 4℃에서 10 분간 4000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 수집하였다. 수집한 세포 펠릿을 10 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl2에 30분 내지 1시간 가량 노출시켜 컴피턴트(competent) 세포를 제조하였다. 결과물을 4℃, 4000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 모아서 2 ml의 빙냉 0.1 M CaCl2에 현탁시켰다.

컴피턴트 세포 현탁액 200 ㎕를 새로운 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브에 옮기고, 여기에 단계 1에서 제조한 연결 반응 산물 2㎕를 가하였다. 혼합물을 42℃의 수욕(water bath)에서 90초간 배양시킨 후, 0℃에서 급냉시켰다. 여기에, SOC 배지(박토-트립톤 2.0 g, 박토-효모 추출물 0.5 g, 1 M NaCl 1 ml, 1 M KCl 0.25 ml, TDW 97 ml, 2M Mg2+ 1 ml, 2 M 글루코스 1 ml) 800 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 220 rpm의 회전진탕 배양기에서 45분간 배양시켰다.

37℃ 배양기에 미리 넣어둔, 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 X-gal(40㎎/㎖ 디메틸포름아미드에 저장) 25 ㎕를 유리봉으로 확산시킨 후, 여기에 25 ㎕의 형질전환된 세포를 넣어서 다시 유리봉으로 확산시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 형성된 백색 콜로니를 3-4개 선택하여 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 각각의 선택된 클론들을 심었다. 플라스미드를 제조하기 위하여 이들 중 삽입이 확 인된 콜로니, 즉, 형질전환된 대장균 JM109/HP73을 선택하여 10 ml의 테리픽 브로쓰(terrific broth; TDW 900 ml, 박토-트립톤 12 g, 박토-효모 추출물 24 g, 글리세롤 4 ml, 0.17 M KH2PO4, 0.72 N K2HPO4 100 ml)에서 배양하였다.

실시예 4: 재조합 플라스미드 DNA의 분리

위저드 플러스 미니프렙스 DNA 정제 키트(WizardTM Plus Minipreps DNA Purificatin Kit, Promega, USA)를 사용해서 제조사의 지시에 따라 형질전환된 대장균으로부터 HP73 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA의 일부를 ECoRI 효소로 처리한 후, 2% 겔에서 전기영동을 실시하여 HP73 부분서열이 플라스미드에 삽입되었음을 확인하였다.

실시예 5: DNA 염기서열 분석

실시예 2에서 수득한 HP73 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR시킨 후, 클로닝되고 재증폭된 HP73 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical 사, 미국)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열분석을 실시하였다.

상기 DNA의 염기 서열은 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 뉴클레오티드 번호 346 내지 627에 해당하며, 본원에서 “HP73”으로 명명하였다.

5말단 무작위 프라이머 H-AP23 및 3말단 H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 282 bp cDNA 단편, 즉, HP73을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고 전기영동으로 확인하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 정상 간 조직, 간암 조직 및 HepG2 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 282 bp cDNA 단편인 HP73은 간암, 및 HepG2 암 세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 되지 않거나 약하였다.

실시예 6: GIG47 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석

³²P-표지된 HP73을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리[미키 티. 등(Miki, T. et al.), Gene, 83: 137-146, 1989]를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 703 bp가 삽입된 전체 GIG47 cDNA 클론을 얻고, 이를 2004년 9월 24일자로 AY762102호로 미국 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다(공개예정일: 2006년 12월 22일). AY762102 유전자는 진뱅크에 등록된 여타의 유전자들, 제ACCESSION NM_013349호인 호모사피엔스 뉴런유도 신경 영양성 인자(Homo sapiens neuron derived neurotrophic factor, NENF), mRNA 유전자, 제ACCESSION AF173937호인 호모사피엔스 기능불명 분비단백질(Homo sapiens secreted protein of unknown function, SPUF), mRNA, 컴피트(compete) cds 유전자, 제ACCESSION AK223135호인 호모사피엔스 SCIRPIO-관련 단백질 변이체 mRNA(Homo sapiens mRNA for SCIRP10-related protein variant)(클론: KAT11637) 유전자들과 서열의 유사성이 있다. 그러나, 이들 유전자들의 기능 또는 암 등의 질병과의 관련성에 대해 아직 밝혀지거나 보고된 바 없다. 이에, 본 발명자들은 본 발명에 따른 원암 유전자 즉, AY762102 유전자는 간암을 비롯한 인간의 각종 암의 발생과정에 깊이 관련되어 있는 것으로 확인하였다.

본 발명자들은 간 조직을 비롯한 여러 인간 정상 조직들에서는 발현이 약하거나 없는 반면에 간암을 비롯한 여러 암조직들에서는 GIG47 원암유전자의 발현이 매우 증가되어 있음을 확인하였다.

703 bp로 이루어진 GIG47의 전체 서열은 서열번호 1에 나타낸 바와 같다. 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임은 뉴클레오티드 번호 17 내지 535에 해당하며, 이는 서열번호 2로 표시되는 172개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코딩하는 것이다.

실시예 7 : 다양한 세포에서의 GIG47 유전자의 노던 블롯 분석

실시예 1에서와 같이, 정상 간조직, 간암 조직, 및 간암 세포주 HepG2로부터 총 RNA를 추출하였다.

GIG47 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막(Boehringer-Mannheim 사, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II 무작위 프라임 표지시스템(Amersham 사, 영국)을 사용하여 제조한 ³²P-표지된 무작위 프라임된 HP73 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계(densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴(actin)으로 표준화시켰다.

도 2의 A는 정상 간조직, 간암조직 및 간암 세포주(HepG2)들에서 GIG47 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 2의 A에서 알 수 있는 바와 같이, 간암 조직 및 간암 세포주인 HepG2 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현이 되지 않거나 약하였다. 도 2의 B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.

도 3의 a는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 GIG47 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3의 b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3의 a에서 알 수 있는 바와 같이, GIG47 mRNA(약 1.2 kb)은 정상 간조직에서와 같이 여러 다른 정상조직들에서도 발현이 되지 않거나 매우 약하였고 단지 정상 심장에서만 발현이 약하게 발현하였다.

도 4의 a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji. SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 GIG47 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4의 a에서 알 수 있는 바와 같이, GIG47은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암세포주 SW480, 폐암세포주 A549, 및 피부암세포주 G361 들에서는 발현이 강하였다. 동시에 약 5.0 kb의 GIG47 mRNA도 매우 약하게 발현이 되고 있다.

실시예 8: GIG47 원암유전자를 대장균에 형질감염시킨 후 발현되는 단백질의 크기결정

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 GIG47 원암유전자 전체를 pBAD/thio-Topo 벡터(Invitrogen사, 미국)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/GIG47 벡터를 대장균 Top10(Invitrogen사, 미국)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-티오레독신(HT-Thioredoxin)이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 L-아라비노즈(Sigma사)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다. L-아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다(SDS-PAGE). 도 5는 pBAD/thio-Topo/GIG47 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, L-아라비노즈 유도 후에 약 34 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 34 kDa 융합단백질은pBAD/thio-Topo/GIG47 벡터에 삽입되어 있는 약 15kDa 크기의 HT-티오레독신 단백질과 약 19 kDa의 GIG47 단백질을 함유하고 있는 것이다.

본 발명의 원암 유전자는 간암, 백혈병, 자궁암, 악성림프종, 대장암, 폐암, 피부암 등을 비롯한 여러가지 암의 진단, 형질전환 동물의 제조, 및 안티센스 유전자 치료법, RNA 간섭 유전자 치료법 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

<110> KIM, hyun kee <120> HUMAN PROTOONCOGENE, PROTEIN ENCODED BY SAME, EXPRESSION VECTOR CONTAINING SAME, AND CELL TRANSFORMED BY SAID VECTOR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 703 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (17)..(532) <220> <221> terminator <222> (533)..(535) <400> 1 gcgctgcgcg ctcacc atg gtg ggc ccc gcg ccg cgg cgg cgg ctg cgg 49 Met Val Gly Pro Ala Pro Arg Arg Arg Leu Arg 1 5 10 ccg ctg gca gcg ctg gcc ctg gtc ctg gcg ctg gcc ccg ggg ctg ccc 97 Pro Leu Ala Ala Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Ala Pro Gly Leu Pro 15 20 25 aca gcc cgg gcc ggg cag aca ccg cgc cct gcc gag cgg ggg ccc cca 145 Thr Ala Arg Ala Gly Gln Thr Pro Arg Pro Ala Glu Arg Gly Pro Pro 30 35 40 gtg cgg ctt ttc acc gag gag gag ctg gcc cgc tat ggc ggg gag gag 193 Val Arg Leu Phe Thr Glu Glu Glu Leu Ala Arg Tyr Gly Gly Glu Glu 45 50 55 gaa gat cag ccc atc tac ttg gca gtg aag gga gtg gtg ttt gat gtc 241 Glu Asp Gln Pro Ile Tyr Leu Ala Val Lys Gly Val Val Phe Asp Val 60 65 70 75 acc tcc gga aag gag ttt tat gga cga gga gcc ccc tac aat gcc ttg 289 Thr Ser Gly Lys Glu Phe Tyr Gly Arg Gly Ala Pro Tyr Asn Ala Leu 80 85 90 acg ggg aag gac tcc act aga ggg gta gcc aag atg tcc ttg gat cct 337 Thr Gly Lys Asp Ser Thr Arg Gly Val Ala Lys Met Ser Leu Asp Pro 95 100 105 gca gac ctc acc cat gac act acg ggt ctc acg gcc aag gaa ctg gag 385 Ala Asp Leu Thr His Asp Thr Thr Gly Leu Thr Ala Lys Glu Leu Glu 110 115 120 gcc ctg gat gag gtc ttc acc aaa gtg tac aaa gcc aaa tac ccc atc 433 Ala Leu Asp Glu Val Phe Thr Lys Val Tyr Lys Ala Lys Tyr Pro Ile 125 130 135 gtc ggc tac act gcc cgg aga att ctc aat gag gat ggc agc cct aac 481 Val Gly Tyr Thr Ala Arg Arg Ile Leu Asn Glu Asp Gly Ser Pro Asn 140 145 150 155 ctg gac ttc aag cct gaa gac cag ccc cat ttt gac atc aag gat gag 529 Leu Asp Phe Lys Pro Glu Asp Gln Pro His Phe Asp Ile Lys Asp Glu 160 165 170 ttc tgatgttc cccctgcagg agcaggttct tgggagcgtg aggcaggaag 580 Phe acactaggtg ctgaatctcc tgcaaaactg gctgcctgga ggccctgagc cacccagatc 640 tgaataaaac agatgcttac cctggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 700 aaa 703 <210> 2 <211> 172 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Gly Pro Ala Pro Arg Arg Arg Leu Arg Pro Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Leu Val Leu Ala Leu Ala Pro Gly Leu Pro Thr Ala Arg Ala Gly 20 25 30 Gln Thr Pro Arg Pro Ala Glu Arg Gly Pro Pro Val Arg Leu Phe Thr 35 40 45 Glu Glu Glu Leu Ala Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Glu Asp Gln Pro Ile 50 55 60 Tyr Leu Ala Val Lys Gly Val Val Phe Asp Val Thr Ser Gly Lys Glu 65 70 75 80 Phe Tyr Gly Arg Gly Ala Pro Tyr Asn Ala Leu Thr Gly Lys Asp Ser 85 90 95 Thr Arg Gly Val Ala Lys Met Ser Leu Asp Pro Ala Asp Leu Thr His 100 105 110 Asp Thr Thr Gly Leu Thr Ala Lys Glu Leu Glu Ala Leu Asp Glu Val 115 120 125 Phe Thr Lys Val Tyr Lys Ala Lys Tyr Pro Ile Val Gly Tyr Thr Ala 130 135 140 Arg Arg Ile Leu Asn Glu Asp Gly Ser Pro Asn Leu Asp Phe Lys Pro 145 150 155 160 Glu Asp Gln Pro His Phe Asp Ile Lys Asp Glu Phe 165 170 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-TIIC anchored oligo-dT primer <400> 3 aagctttttt tttttc 16 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-AP23, 5' random primer <400> 4 aagcttggct atg 13

Claims (18)

1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 염기서열을 필수로 포함하는 유전자.
2. 제 1 항에 있어서, 전체 염기서열의 총 길이가 517bp 내지 703bp 길이인 유전자.
3. 제 2 항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자.
4. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
5. 제1항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 염기서열을 갖는 유전자.
6. 제4항에 따른 단백질과 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 유전자를 포함하는 벡터.
8. 제7항의 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포.
9. 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(E.Coli), 효모세포, 동물세포 또는 식물세포인 형질전환된 숙주세포.
10. 제8항에 따른 형질전환된 숙주세포를 배양하여 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 단편을 발현시키고 발현된 단백질 또는 이의 단편을 분리하는 것으로 이루어진 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 단편의 제조방법.
11. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는, 시료내 상기 유전자의 존재를 검사하기 위한 진단 키트.
12. 제11항에 있어서, 상기 진단키트는 검출 표지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
13. 제4항에 따른 단백질, 제4항에 따른 단백질의 단편, 제6항에 따른 폴리펩티드, 또는 제6항에 따른 폴리펩티드의 단편에 특이적인 항체를 포함하는, 시료내 서열번호 2로 표시되는 단백질의 존재를 검사하기 위한 진단 키트.
14. 제13항에 있어서, 상기 항체는 검출 표지와 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
15. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 유전자에 의해 코딩되는 GIG 47 원암 단백질의 발현을 저해하는 안티센스 폴리뉴클레오티드.
16. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 유전자에 의해 코딩되는 GIG 47 원암 단백질의 발현을 저해하는 간섭 RNA(RNAi) 분자.
17. 제13항에 따른 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1항에 따른 유전자의 발현을 억제하는 조성물.
18. 제14항에 따른 간섭 RNA 분자를 포함하는 제1항에 따른 유전자의 발현을 억제하는 조성물.

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