KR100367978B1 - 인간 자궁경부암 1 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는단백질 - Google Patents
인간 자궁경부암 1 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는단백질 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 원암 유전자는 기존의 보고된 원암 유전자와는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규 유전자로서 자궁경부암, 폐암, 백혈병, 림프종, 신장암, 간암, 난소암, 자궁암을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 및 안티-센스(anti-sense) 유전자치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
Description
인간을 포함한 고등동물들은 약 100,000 개의 유전자들을 갖고 있으나 이들중 약 15% 만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉 발생, 분화, 항상성(homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화, 및 아폽토시스(apoptosis; programmed cell death)등이 결정된다(Liang, P. and A. B. Pardee,Science, 257: 967-971(1992)).
종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현들의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다.
예를 들면, 리앙과 파디(Liang and Pardee, 상기 문헌 참조)에 의해 제안된mRNA 감별전개(differential display) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기(cell cycle)에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자(transcriptional regulatory gene) 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들의 상호 관련성의 규명에도 다양하게 활용되고 있다.
종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체부위의 소실(loss of chromosomal heterozygosity), 원암 유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다(Bishop, J. M.,Cell, 64: 235-248(1991); 및 Hunter, T.,Cell, 64:249-270(1991)). 또한, 암의 10 내지 30%는 원암유전자가 증폭됨으로써 원암 유전자가 활성화되어 일어난다고 보고되어 있다.
원암유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 자궁경부암의 발생기전을 원암 유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 자궁경부암 1(HCCR-1)으로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현된다는 것을 밝혀내었다. 상기 원암유전자는 백혈병, 림프종, 신장암, 간암, 난소암 및 자궁경부암과 같은 다양한 암의 진단, 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규 원암 유전자 및 그의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자에 의해 코드되는 단백질 및 그의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편으로부터 유도되는 mRNA에 상보적인 염기서열을 지닌 안티센스 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 안티센스 유전자를 사용하여 암을 치료 또는 예방하는 것이다.
본 발명의 한 태양에 따라, 서열번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 신규한 원암유전자 또는 그의 단편이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편이 제공된다.
도 1은 정상 자궁경부 조직, 초기 자궁경부암조직, 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CUMC-6)들에서 HCCR-1 원암 유전자의 발현여부를 감별전개 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이며;
도 2는 TMPRED 프로그램을 이용하여 본 발명의 원암 유전자의 막통과 부위의 소수성을 예측한 그래프이고;
도 3은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암조직 및 자궁경부암 세포주(CaSki 및 CUMC-6)들에서 HCCR-1 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 4는 정상 폐 조직 및 폐암 세포주 (NCI-H358, NCI-H460, NCI-H441, NCI-H1299, NCI-H520, NCI-H2009 및 NCI-H157)들에서 HCCR-1 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 5A는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 HCCR-1 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 5B는 도 5A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 6A는 인간 암 세포주들에서 HCCR-1 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 6B는 도 6A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 7A는 인간 암 조직 및 각각의 정상 세포들에서 HCCR-1 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 7B는 도 7A와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 8은 인 시츄 하이브리드된 인간 자궁경부암 조직의 형태학적 특성을 나타내는 현미경사진이며;
도 9는 야생형 NIH/3T3 섬유모세포를 단층배양시킨 후 그 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 것이며;
도 10은 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포를 단층배양시킨 후 그 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 것이며;
도 11은 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포를 단층배양한 후 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 세포의 형태학적 특성을 관찰한 것이며;
도 12는 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포를 단층배양한 후 투과 전자현미경으로 세포 및 세포내 소기관의 형태학적 특성을 관찰한 것이며;
도 13은 누드마우스에서 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포의 종양형성능을 확인한 것이며;
도 14는 누드마우스에서 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포에 의해 형성된 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 후 형태학적 특성을 관찰한 것이며;
도 15는 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포를 누드마우스에서 성장시킨후 형성된 종괴를 적출하여 투과 전자현미경으로 세포 및 세포내 소기관의 형태학적 특성을 각각 관찰한 것이며;
도 16은 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포에 의해 누드마우스에서 형성된 종괴로부터 확립된 HCCR-1N 세포주를 단층배양시킨 후 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 것이며;
도 17은 HCCR1 원암 유전자를 대장균에 형질도입시킨후 IPTG 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 아가에서 전기영동한 결과이며;
도 18은 야생형 NIH/3T3 섬유모세포, pcDNA3 벡터만을 형질 도입시킨 NIH/3T3 섬유모세포(pcDNA3) 및 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포(HCCR-1 세포)의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 19는 신장, 폐, 난소 및 자궁경부에서 암조직 및 각각의 정상 조직의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 20은 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포(HCCR-1 세포)의 레티쿨린 섬유에 대한 면역조직화학적(immunohistochemical) 관찰결과를 나타낸것이며(X250);
도 21은 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포에서 상피 세포의 표지물질인 케라틴의 발현을 관찰한 것이며(X250);
도 22는 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포에서 상피 세포막 항원의 발현을 관찰한 것이며(X250);
도 23은 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포에서 간엽 세포의 표지물질인 비멘틴의 발현을 관찰한 것이며(X250);
도 24는 야생형 NIH/3T3 섬유모세포, pcDNA3 벡터만을 형질 도입시킨 NIH/3T3 섬유모세포(pcDNA3) 및 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포(HCCR-1 세포)에서의 PKC 활성을 비교한 것이며;
도 25는 293 세포, +RNase 세포, 야생형 NIH/3T3 섬유모세포, pcDNA3 벡터만을 형질 도입시킨 NIH/3T3 섬유모세포(pcDNA3) 및 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포(HCCR-1 세포)에서의 텔로머레이즈 활성을 비교한 것이며;
도 26A은 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드로 처리된 H358 폐암세포주에서의 HCCR-1 cDNA의 RT-PCR 증폭 결과를 나타낸 것이며;
도 26B는 도 26A에서와 동일한 샘플을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이며;
도 27은 센스, 안티센스 및 미스센스 올리고데옥시뉴클레오티드로 처리된 H358 폐암세포주의 성장 곡성을 나타낸 것이며;
도 28은 16-(F16), 18-(F18), 20-일 래트 태아(F20) 및 생후 1-(P1), 7-(P7)및 14-일 래트(P14) 및 성체 래트 신장 조직 추출물에서의 HCCR-1 단백질 발현을 나타낸 것이며;
도 29는 20일된 래트 태아 신장의 면역조직화학적 염색을 나타낸 것이며(x42);
도 30은 18일령 래트 태아 신장의 수질 수집관의 기저외측 혈장 막에서의 HCCR-1 면역염색을 나타내는 시차-간섭 대조 현미경 사진이다(x200).
본 발명의 신규 암원(癌原)유전자(protooncogene)인 인간 자궁경부암 1(Human Cervical Cancer 1, HCCR-1, 이후 "HCCR-1 암원유전자"로 지칭함)은 서열번호: 1로 나타낸 바와 같은 2118 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 9 내지 1088 부위에 해당하는 전사 해독 프레임(open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 2에 나타나 있으며 360개의 아미노산으로 이루어져 있다("HCCR-1 단백질"). 또한, 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 9 내지 83 부위는 서열번호: 2의 아미노산 번호 1 내지 25의 아미노산으로 이루어진 시그날 펩타이드(signaling peptide)를 코드하는 것으로 예측된다. 뉴클레오티드 번호 435 내지 494 부위는 단일 막통과 도메인(single transmembrane domain)을 코드하며, 이로부터 서열번호: 2의 아미노산 번호 143 내지 162의 아미노산 서열이 예측된다. 이로부터, 본 발명의 유전자는 막 수용체 (membrane receptor) 유전자일 것으로 판단된다.
단일 N-글리코실화 부위가 서열번호 1의 뉴클레오티드 번호 945 내지 953에 존재하는 것으로 보이고, 이로부터 HCCR-1 단백질의 C-말단 부근에 위치하는 서열번호: 2의 아미노산 번호 313 내지 315에 해당하는 아미노산 서열이 추정되므로, HCCR-1 단백질은 II형 막단백질인 것으로 보인다. 폴리아데닐화 시그널은 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 2008 내지 2012에 해당한다.
HCCR-1의 예측되는 세포외 도메인은 뉴클레오티드 번호 495 내지 1088에 해당하며, 5개의 시스테인 잔기를 포함하여 198개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 번호 163-360의 서열을 갖는 아미노산을 코드하는 것으로 예측된다. 예측되는 세포내 도메인은 117개의 아미노산(서열번호: 1의 염기 번호 84 내지 434 및 서열번호: 2의 아미노산 번호 26 내지 142에 해당)을 포함하며, 세린-42 및 세린-48에서 2개의 프로테인 키네이즈 C(PKC) 포스포릴레이션 부위 및 글리신-34 및 글리신-38에서 2개의 N-미리스트릴레이션 부위를 지니는 것으로 추정된다. 도 2에 나타낸 바와 같이 컴퓨터 프로그램(TMPRED program, software/TMPRED_form.html)으로 분석한 결과, HCCR-1은 매우 소수성이고, 특징적인 단일 막관통(membrane-spanning) 도메인 및 전분비(前分泌) 시그널 펩티드의 특성을 지니고 있음을 알 수 있다.
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호:1의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 360개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2와 같은 서열을 가지며 크기는 약 40 kd이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암 유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 본원에서는 HCCR-1 원암유전자 또는 그의 단편을 함유하는 벡터로 형질전환된 세포를 "HCCR-1 세포"로 지칭한다.
이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 예를 들면, 벡터를 사용하여 HCCR-1 원암유전자를 대장균 JM109에 형질감염(transfection)시키고, 이렇게 하여 얻어진 JM109/HCCR-1을, 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의규정에 따라, 1999년 10월 11일 자로 한국생명공학연구소 유전자 은행(Korea Collection for Type Cultures(KCTC), 한국생명공학연구소(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB), 대한민국 대전 305-333 유성구 어은동 #52)에 기탁번호 제KCTC 0667BP호로서 기탁하였다.
벡터의 제작시에는, 상기 원암 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.
본 발명의 유전자는 노던 블롯(Northern blot) 등의 분석방법에서 정상 자궁경부조직과 정상 폐 조직에서는 발현이 거의 확인되지 않은 반면 자궁경부암 조직, 자궁암 세포주들, 및 폐암 세포주들에서는 그 과발현이 확인되므로 자궁암과 폐암을 유발시키는 강력한 발암 유전자로 판단된다. 정상 섬유모세포(fibroblast)(NIH/3T3)에 이 유전자를 형질도입(transfection)시키면 정상 섬유모세포의 형태 즉 섬유모세포가 기원하는 간엽조직 (mesenchymal tissue)과는 전혀 다른 크기와 모양을 나타내는 형태의 세포 모양을 나타낸다. 새로운 형태의 세포들을 광학 현미경과 전자현미경으로 분석하면 종양세포의 형태학적 소견을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 원암 유전자를 형질도입시킨 정상 섬유모세포를 누드 마우스의 둔위 부위에 접종시 약 28일이 경과하면서부터 종괴의 형성소견이 보이면서 약 40일이 경과시 1 cm X 1 cm 크기의 종양이 형성된다. 형성된 종괴는 헤마톡실린-에오신 염색시에 암종 (carcinoma)이 확인되었으며, 전자현미경 및 면역조직화학 염색 (immunohistochemical staining)으로도 상피성 암종 (epithelial carcinoma)이 확인된다
자궁경부암과 폐암 조직들과 같은 상피성 조직외에도, 본 발명의 원암 유전자는 백혈병, 림프종, 신장암, 간암 및 난소암과 같은 많은 다른 암 종양에서 발현된다. 따라서, 본 발명의 원암유전자는 다양한 암의 발생에 공통된 발암유전자일 것으로 판단되며, 다양한 암의 진단, 형질전환된 동물의 제조 및 안티-센스(anti-sense) 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
상기 원암 유전자를 이용한 암의 진단 방법은, 예를 들어, 상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 이를 검출하므로써 대상자가 본 발명의 원암 유전자를 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 암 진단용 키트를 역시 제공한다.
형질전환 동물은 본 발명의 원암 유전자를 포유동물, 예를 들어, 래트 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 안티-센스 유전자를 제공한다. 본원에서, "안티센스 유전자(anti-sense gene)"는 서열번호: 1의 원암 유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA의 단백질 결합부위에 결합하여 원암유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)을 파괴할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 원암 유전자의 발현으로 인한 암을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 안티센스 유전자의 한 예는 서열번호: 3의 18량체의 HCCR-1 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)이다. 따라서, 본 발명의 범위에는 서열번호: 3 및 그의 단편과 실질적으로 동일한 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 또한 그 범위내에 본 발명의 안티센스 유전자의 치료 효과량을 환자에게 투여하여 암을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.
본 발명의 안티센스 유전자 치료에서, 본 발명의 안티센스 유전자는 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 원암유전자의 발현을 예방한다. 예를 들면, 문헌[J.S. Kim et al.,J. Controlled Release, 53, 175-182(1998)]의 방법에 따라 안티센스 ODN을 폴리-L-리신 유도체와 정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이 혼합체를 환자에게 정맥투여한다.
본 발명의 범위에는 또한, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 본 발명의 안티센스 유전자를 활성성분으로 포함하는 항암조성물을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물을 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.
실제로 투여되는 안티센스 유전자의 양은 치료되는 증상, 투여 경로, 환자의 연령 및 체중, 증상의 중증도와 같은 다양한 관련되는 인자를 고려하여 결정한다.
본 발명의 원암 유전자로부터 유도되는 단백질은 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 원암 유전자로부터 발현된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당분야에 공지된 효소 면역측정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 원암 유전자를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 예를 들어, 상기 원암 유전자가 형질도입된 섬유모세포를 이용하여 누드 마우스 등에 형성시킨 종양조직으로부터 제조할 수 있다. 이러한 암 세포주는 항암제 등의 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 종양세포 배양 및 총 RNA의 분리
(단계 1) 종양세포 배양
mRNA의 감별 전개를 위하여, 부분적 자궁절제술을 받은 동일한 환자로부터 정상자궁경부 조직, 처리하지 않은 원발성 자궁경부 종양조직 및 전이 임파절 종양조직을 취하였다. 감별 전개법에 사용된 인간 자궁경부암 세포주는 CUMC-6(Kim, J. W.et al.,Gynecol. Oncol., 62: 230-240(1996))이었다.
상기 기술된 조직 및 CUMC-6 세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청(Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰(Waymouth's) MB 752/1 배양액(Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 도중의 세포들로서 트리판 블루(trypan blue) 염료로 염색할 때 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다(프레쉬니(Freshney), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York(1987) 참조).
(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법
상업적으로 판매되는 시스템(RNeasy 총 RNA 키트) 키아겐(Qiagen Inc., 독일)을 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트(Message clean kit)(GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터DNA 오염원을 제거하였다.
실시예 2: 감별 전개 역전사 중합효소 연쇄반응(differential display reverse transcription(DDRT)-PCR)
감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2㎍ 씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 H-T11G, H-T11C 또는 H-T11A의 세 가지 프라이머(RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 중 하나를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5mM [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 존재하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 13프라이머(RNAimage primer sets 1-4, H-AP 1-32)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장(final extension)을 위하여 72℃에서 5 분간 더 반응시켰다.
PCR-증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현(differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 시퀀싱 겔로부터 약 200 염기쌍(bp) 크기 이상의 밴드, CC214를 도려내었다. 15분간 가열하여 CC214 cDNA를 용출시킨후, [α-35S] dATP(1200 Ci/mmole) 및 20μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 동일한 프라이머 쌍 및 PCR 조건하에서 증폭시켰다.
실시예 3: 클로닝
상기에서 얻은 재증폭된 CC214 PCR 산물을 TA클로닝 시스템(Promega, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 pGEM-T 이지(EASY) 벡터에 삽입하였다.
(단계 1) 연결반응
실시예 2에서 얻은 재증폭된 CC214 PCR 산물 2㎕, pGEM-T 이지 벡터(50 ng) 1 ㎕, T4 DNA 연결효소 10X 완충액 1㎕ 및 T4 DNA 연결효소(3 weiss units/ul; T4 DNA ligase, Promega) 1 ㎕를 0.5㎖ 시험관에 넣은 후, 증류수를 가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 하였다. 연결 반응 혼합물은 14℃에서 밤새 배양하였다.
(단계 2) TA 클로닝 형질전환
TA 클로닝 형질전환은 다음 절차에 따라 수행되었다.
대장균 JM109(Promega, WI, USA)를 10 ml 의 LB 브로쓰(박토-트립톤 10 g, 박토-효모 추출물 5 g, NaCl 5 g) 중에서 600㎚에서의 광학밀도 값이 약 0.3 - 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양 혼합물을 얼음에 약 10분간 방치한 후, 4℃에서 10 분간 4000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 수집하였다. 수집한 세포 펠릿을 10 ml의 빙냉 0.1 M CaCl2에 30분 내지 1시간 가량 노출시켜 컴피턴트(competent) 세포를 제조하였다. 결과물을 4℃, 4000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 모아서 2 ml의 빙냉 0.1 M CaCl2에 현탁시켰다.
컴피턴트 세포 현탁액 200 ㎕를 새로운 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브에 옮기고, 여기에 단계 1에서 제조한 연결 반응 산물 2㎕를 가하였다. 혼합물을 42℃의 수욕(water bath)에서 90초간 배양시킨 후, 0℃에서 급냉시켰다. 여기에, SOC 배지(박토-트립톤 2.0 g, 박토-효모 추출물 0.5 g, 1 M NaCl 1 ml, 1 M KCl 0.25 ml, TDW 97 ml, 2M Mg2+1 ml, 2 M 글루코스 1 ml) 800 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 220 rpm의 회전진탕 배양기에서 45분간 배양시켰다.
37℃ 배양기에 미리 넣어둔, 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 X-gal(40㎎/㎖ 디메틸포름아미드에 저장) 25 ㎕를 유리봉으로 확산시킨 후, 여기에 25 ㎕의 형질전환된 세포를 넣어서 다시 유리봉으로 확산시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 형성된 백색 콜로니를 3-4개 선택하여 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 각각의 선택된 클론들을 심었다. 플라스미드를 제조하기 위하여 이들 중 삽입이 확인된 콜로니, 즉, 형질전환된 대장균 JM109/CC214을 선택하여 10 ml의 테리픽 브로쓰(terrific broth; TDW 900 ml, 박토-트립톤 12 g, 박토-효모 추출물 24 g, 글리세롤 4 ml, 0.17 M KH2PO4, 0.72 N K2HPO4100 ml)에서 배양하였다.
실시예 4: 재조합 플라스미드 DNA의 분리
위저드 플러스 미니프렙스 DNA 정제 키트(WizardTMPlus Minipreps DNA Purificatin Kit, Promega, USA)를 사용해서 제조사의 지시에 따라 형질전환된 대장균으로부터 CC214 플라스미드 DNA를 분리하였다.
분리된 플라스미드 DNA의 일부를ECoRI효소로 처리한 후, 2% 겔에서 전기영동을 실시하여 CC214 부분서열이 플라스미드에 삽입되었음을 확인하였다.
실시예 5: DNA 염기서열 분석
실시예 2에서 수득한 CC214 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 PCR 시킨 후, 클로닝되고 재증폭된 CC214 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트(Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법(dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 1883 내지 2088에 해당하며, 본원에서 "CC214"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP21 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 206 bp cDNA 단편, 즉, CC214를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응(DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 림프절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 206 bp cDNA 단편, CC214는 자궁경부암, 전이 림프절 조직 및 CUMC-6 암 세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현되지 않았다.
실시예 6: HCCR-1 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석
32P-표지된 CC214를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리(Miki, T.et al.,Gene, 83: 137-146 (1989))를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2118 bp가 삽입된 전체 HCCR-1 cDNA 클론을 얻고, 이를 1999년 11월 5일자로 AF195651호로 진뱅크(GeneBank)에 등록하였다.
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 HCCR-1 클론을NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드(phagemid) 벡터 형태로 분리하였다(상기 문헌 참조).
상기 HCCR-1 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 HCCR-1 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 JM109를 형질전환시켰다.
상기 수득한 JM109/HCCR-1을, 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 1999년 10월 11일 자로 한국생명공학연구소 유전자 은행(Korea Collection for Type Cultures(KCTC), 한국생명공학연구소(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB), 대한민국 대전 305-333 유성구 어은동 #52)에 기탁번호 제KCTC 0667BP호로서 기탁하였다.
2118 bp로 이루어진 HCCR-1의 전체 서열은 서열번호: 1에 나타내었다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 전사 해독 프레임(open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 9 내지 1088에 해당하며, 서열번호: 2의 360개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다. 또한, 서열번호:1의 뉴클레오티드 번호 9 내지 83 부위는 시그날 펩타이드(signaling peptide)를 코드하며, 이로부터는 서열번호:2의 아미노산 번호 1 내지 25의 아미노산이 예측된다. 뉴클레오티드 번호 435 내지 494 부위는 단일 막통과 도메인(single transmembrane domain)을 코드하며, 이로부터는 서열번호:2의 아미노산 번호 143 내지 162의 아미노산이 예측된다. 이로부터, 본 발명의 원암유전자는 막 결합 유전자일 것으로 판단된다.
단일 N-글리코실화 부위가 서열번호 1의 뉴클레오티드 번호 945 내지 953에 존재하는 것으로 보이고, 이로부터 HCCR-1 단백질의 C-말단 부근에 위치하는 서열번호: 2의 아미노산 번호 313 내지 315에 해당하는 아미노산 서열이 추정되므로, HCCR-1 단백질은 II형 막단백질인 것으로 보인다. 폴리아데닐화 시그널은 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 2008 내지 2012에 해당한다.
HCCR-1의 예측되는 세포외 도메인은 뉴클레오티드 번호 495 내지 1088에 해당하며, 5개의 시스테인 잔기를 포함하여 198개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 번호 163-360의 서열을 갖는 아미노산을 코드하는 것으로 예측된다. 예측되는 세포내 도메인은 117개의 아미노산(서열번호: 1의 염기 번호 84 내지 434 및 서열번호: 2의 아미노산 번호 26 내지 142에 해당)을 포함하며, 세린-42 및 세린-48에서 2개의 포텐셜 프로테인 키네이즈 C(PKC) 포스포릴레이션 부위 및 글리신-34 및 글리신-38에서 2개의 N-미리스트릴레이션 부위를 지니는 것으로 추정된다. 도 2에 나타낸 바와 같이 컴퓨터 프로그램(TMPRED program, software/TMPRED_form.html)으로 분석한 결과, HCCR-1은 매우 소수성이고, 특징적인 단일 막관통 도메인 및 전분비 시그널 펩티드의 특성을 지니고 있음을 알 수 있다.
실시예 7 : 다양한 세포에서의 HCCR-1 유전자의 노던 블롯 분석
실시예 1에서와 같이, 다양한 조직 및 세포주로부터 총 RNA를 추출하였다.
HCCR-1 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ug씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막(Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 II(Rediprime II) 무작위 프라임 표지 시스템(Amersham, 영국)을 사용하여 제조한32P-표지된 무작위프라임된 HCCR-1 전체 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복실시하였으며, 그 결과는 농도계(densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴(actin)으로 표준화시켰다.
도 3은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암조직 및 자궁경부암 세포주(CaSki 및 CUMC-6)들에서 HCCR-1 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 자궁경부암 조직 및 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상조직에서는 발현 정도가 매우 낮거나 관찰되지 않았다. 도 3에서, 정상(Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암(Cancer)열은 자궁 경부암 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 자궁암 세포주를 각각 나타낸다.
도 4는 정상 폐 조직 및 폐암 세포주 (ATCC NCI-H358, NCI-H460, NCI-H441, NCI-H1299, NCI-H520, NCI-H2009 및 NCI-H157)들에서 HCCR-1 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 폐암 세포주인 H358, H460, H441, H1299, H520, H2009 및 H157 세포주들에서는 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 폐조직에서는 발현이 관찰되지 않았다.
도 5A는 정상 인간 12-열 다중 조직(Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 백혈구 조직에서 HCCR-1 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 5A에서 알 수 있는 바와 같이, HCCR-1 mRNA(약 2.1 kb)은 여러 정상조직들에서는 약하게 발현되거나 또는 거의 발현을 확인할 수 없었으나, 정상 신장 조직에서는 그 발현이 높았다.
도 6A은 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361(Clontech)에서 HCCR-1 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 6A에서 알 수 있는 바와 같이, HCCR-1은 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 버키트(Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 임파아구 백혈병 세포주인 MOLT-4 및 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60 및 HeLa 세포와 같은 인간 백혈병 및 림프종 세포주에서 높은 수준으로 발현된다.
특히, K-562, MOLT-4 및 HL-60은 정상 백혈구에 비하여 각각 약 190, 90 및 70배 정도 더 높은 전사 수준을 나타낸다.
또한, 인간 신장, 간, 폐, 난소 및 자궁 암 조직 및 이들 각각의 정상 조직에 대한 노던 블롯 분석을 실시하였다. 도 7A에 나타낸 바와 같이, HCCR-1은 인간 암 세포에서 높은 수준으로 전사되는 반면, 정상 조직에서는 HCCR-1 유전자의 발현은 거의 관찰되지 않았다. 도 7B는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
실시예 8: 인 시츄 하이브리드화된 인간 자궁경부암 조직의 현미경 관찰
인 시츄 하이브리드화(in situhybridization)를 위하여, 안(Ahn) 등의방법(Am. J. Physiol.,265, F792-F801(1993))에 따라, 인간 자궁경부암 조직을 과요오드산염-라이신-파라포름알데히드에 고정시키고, 왁스에서 포매한 후, 절단하였다(5㎛). 전체 HCCR-1 cDNA 단편을 사용하여 디곡시게닌-표지된 RNA 프로브를 합성하였다. RNA 인 시츄 하이브리드화는 DIG RNA 표지 키트(Boehringer Mannheim)를 사용하여 제조한 안티센스 RNA 프로브를 사용하여 수행하였다. 센스 RNA 프로브를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 8은 인 시츄 하이브리드된 인간 자궁경부암 조직의 대표적인 특징을 나타내는 현미경사진이다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 인 시츄 하이브리드된 자궁경부암 조직은 높은 수준의 HCCR-1 유전자를 포함하는 것으로 확인되었다. 주위의 정상 섬유상 조직에서는 염색이 관찰되지 않았다.
실시예 9: 발현 벡터 및 형질전환된 세포의 제조
(단계 1) HCCR1을 함유하는 벡터의 제조
HCCR-1의 코딩 부위를 함유하는 발현 벡터를 다음과 같이 제조하였다.
먼저, 실시예 6에서 수득한 전체 HCCR-1 cDNA를 원핵 발현벡터인 pCEV-LAC의SalI 제한부위에 삽입하였다(문헌[Miki, T.et al.,Gene, 83: 137-146 (1989)] 참조). 이어서, 상기 pCEV-LAC/HCCR-1 벡터로부터SalI 단편을 분리하였다.
이어서, pCDNA3 발현 벡터(Invitrogen)을XhoI로 처리하여SalI과 상용성인 말단을 제조하였다. 전체 HCCR-1 코딩 서열을 지닌SalI 단편을XhoI로 처리된pcDNA3에 삽입하였다. 생성된 pcDNA3/HCCR-1 발현 벡터를 리포펙타민(Gibco BRL)을 사용하여 NIH/3T3 정상 섬유모세포(ATCC CRL 1658)내로 형질도입시키고 G418(Gibco)을 포함하는 배지에서 선택하였다. HCCR-1로 형질도입된 NIH/3T3 세포를 "HCCR-1 세포"로 지칭한다. pcDNA3 만을 포함하는 NIH/3T3 세포를 대조군으로 제조한 후, 이를 "pcDNA3 세포"로 지칭하였다.
(단계 2) HCCR-1 원암유전자를 형질도입시킨 NIH/3T3 섬유모세포
도 9에 나타낸 바와 같이, 분화된 섬유모세포인 야생형 정상 NIH/3T3 세포는 길고 가느다란 핵과 빈약한 세포질을 지닌 방추형 세포이다. 단계 1에서 얻은 HCCR-1을 발현하는 NIH/3T3 세포(HCCR-1 세포)에서 HCCR-1이 발현되는 경우, 세포의 형태는 도 10에 나타낸 바와 같이 난형의 핵 및 다량의 세포질을 지닌 다각형 모양으로 변화되었다.
HCCR-1 형질도입된 NIH/3T3을 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin, H E) 염색을 한 후 관찰한 결과, 핵의 다형성, 뚜렷한 핵소체, 및 과립상 염색질 소견 및 종양 거대세포들을 보여주었고, 비정형 유사분열이 관찰되었다(도 11 참조).
투과 전자현미경(TEM) 관찰을 위하여, 세포 및 조직을 인산염 완충용액(pH 7.4) 중의 2.5% 글루타르알데하이드로 고정시켰다. 이어서, 2% 오스뮴 테트라옥사이드(osmium tetroxide)로 2시간 동안 후고정시킨 후 20% 에탄올로 탈수시켜 Epon 812(Sigma)에 포매(embedding)시켰다. 중합반응(polymerization) 후 초미세절편(ultrathin section)을 만들어 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 시트르산 납(lead citrate)으로 이중염색한 후 투과 전자현미경(1200 EX, JEOL,Japan)으로 관찰하였다.
투과 전자현미경 사진에는 배양된 종양 세포가 미세융모 및 잘 발달된 소기관을 갖는 것이 나타나 있다(도 12 및 삽입그림 참조). 도 12에 나타낸 바와 같이, HCCR-1 세포는 세포 표면에는 불규칙한 크기의 미세융모가 보이면서, 뚜렷한 핵소체(nucleoli)를 지니는 소엽 핵, 잘 발달된 세포질내 소망(rough surfaced endoplasmic reticulum: rER) 및 골지체를 가지고 있다(원 내). 도 12에서 스케일 바의 길이는 3㎛에 해당하며, 원으로 나타낸 부분을 보다 고배율로 관찰한 결과는 삽입그림(스케일 바 길이 1㎛)으로 나타내었다.
실시예 10: 동물에서 HCCR-1 원암유전자의 종양 형성능 및 전이 유무 조사
생후 5 주된 9 마리의 누드마우스(athymic nu/nu on BALB/c background; 대덕 화학연구소)를 대상으로 5 x 106개의 원암 유전자 HCCR-1를 형질감염시킨 NIH/3T3 세포를 둔위 부위의 피하에 주입하였다. 피하 종양의 크기가 1.5 내지 2.5㎝가 되었을 때 누드 마우스를 희생시켰다.
도 13에 나타낸 바와 같이, HCCR-1 세포를 주입한 9마리의 마우스 모두가 21일 후 뚜렷한 종양을 나타내었다.
HCCR-1 세포가 이식된 누드 마우스는 상피성 암종의 특성을 나타낸다. 도 14는 누드마우스에서 HCCR-1 원암 유전자가 형질도입된 NIH/3T3 섬유모세포에 의해형성된 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 후 형태학적 특성을 관찰한 것으로, 섬유상 간질 조직에 의해 분리된 전형적인 상피성 세포소를 나타낸다.
실시예 11: HCCR-1 원암 유전자에 의해 유도된 종양조직의 전자현미경적 소견과 이로부터 새로운 암 세포주의 확립
실시예 10의 누드마우스에서 형성된 종양조직을 적출하여 그 일부를 전자현미경 표본을 만들어 관찰한 결과 잘 발달한 소기관 및 종양 세포가 데스모좀(결합반, desmosome)에 의해 연결되어 있었다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 종양조직은 세포간 결합조직으로 단단하게 결합된 세포로 이루어져 있다(원 내). 도 15에서 스케일 바의 길이는 3㎛에 해당하며, 원으로 나타낸 부분을 보다 고배율로 관찰한 결과는 삽입그림(스케일 바 길이 0.5㎛)으로 나타내었다.
상기 종양 조직으로부터 얻은 세포는 20%의 우태아 혈청을 사용하여 통상적인 방법으로 배양하였다. 배양된 세포는 "HCCR-1N" 세포로 명명되었으며, 도 16에 나타낸 바와 같이 시험관내에서는 HCCR-1 세포와 유사한 세포학적 특성을 나타내었다.
실시예 12: HCCR-1 원암유전자를 대장균에 형질감염시킨후 발현되는 단백질의 크기 결정
서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 123 내지 473에 해당하고, 서열번호: 2의 아미노산 번호 39 내지 155를 코드하는 것으로 예측되는 HCCR-1 원암유전자의 일부를 pET-32b(+) 벡터(Novagen)의 다중 클로닝 부위에 삽입한 후, pET-32b(+)/HCCR-1 벡터를 대장균 BL21(ATCC 47092)에 형질감염시켰다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간동안 배양하였다. 여기에 1 mM의 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노즈(Isopropyl beta-D-thiogalacto-pyranoside(IPTG), Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다.
IPTG 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다(SDS-PAGE). 도 17은 pET-32b(+)/HCCR-1 벡터로 형질감염된 대장균 BL21 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, IPTG 유도 후에 약 35kDa의 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 35kDa 융합단백질은 pET-32b(+) 벡터의 유전자로부터 발현된 약 20kDa 크기의 Trix·Tag 티오레독신 단백질을 함유하고 있다.
실시예 13: 항체 생산
실시예 12의 pET-32b(+)/HCCR-1 벡터로 형질감염된 대장균 BL21 균주로부터 분리된 35kDa의 융합단백질을 His-Hind 키트(Novagen)으로 정제하였다. 정제된 펩티드를 면역블롯팅한 결과 35kDa의 단백질이 다량 함유되어 있음을 확인하였다.
이어서, 2 마리의 6주령 스프라그-돌리 래트(체중 약 150g)에 상기에서 얻은펩티드 1㎎을 1주일에 1회씩 3회 복강내 투여하였다. 이와 같이 면역화된 래트로부터 혈액 시료를 취하여 원심분리시켜 폴리클로날 혈청을 얻었다. 상기 폴리클로날 항체의 항 HCCR-1 활성은 효소면역측정법(ELISA)으로 확인하였다(1:10,000)
실시예 14: 항체 특이성 확인을 위한 면역 블로팅
웨스턴 블롯 분석을 위하여, 램리(Laemmli)의 문헌[Nature 227:680-685 (1970)]에 기술된 방법에 따라 도 18 및 19에서 확인된 세포를 수확하고 용해시켰다. 세포 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리시키고, 니트로셀룰로즈 막에 전기적으로 이동시켰다. 상기 막을 실시예 13에서 제조한 래트 폴리클로날 항HCCR-1 혈청과 함께 16 시간 동안 반응시켰다. 상기 막을 세척한 후, 1:1,000 비율로 희석된 퍼옥시다제-결합된 염소 항-래트 면역글로불린(Jackson ImmunoResearch)을 2차 항체로 포함하는 블로킹 용액과 반응시켰다. ECL-웨스턴 블롯 검출 키트(Western blot detection kit, Amersham)을 사용하여 단백질을 확인하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, HCCR-1 단백질은 HCCR-1 세포에서 과발현되었으며, 야생형 및 pcDNA3만으로 형질감염된 세포(pcDNA)에서는 희미한 밴드만이 검출되었다. 이는 폴리클로날 항체중의 항-HCCR-1 항체의 특이성을 나타내는 것이다.
또한, 폴리클로날 항체 중의 HCCR-1 항체는 다양한 조직으로부터의 인간 단백질 추출물 중에서 약 40kDa의 단백질을 인식하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 신장, 폐, 난소 및 자궁경부암을 비롯한 인간 암 조직은 이들 각각의 정상 조직과비교하였을 때, 증가된 HCCR-1 단백질의 발현을 나타내었다.
실시예 15: 면역조직화학분석법(Immunohistochemistry)
실시예 9의 누드 마우스상에 형성된 종양 종괴를 각각 항-비멘틴, 항-케라틴, 항-EMA(상피막 항원) 항체(DAKO) 및 HCCR-1에 대한 폴리클로날 항체와 함께 배양하였다. 이어서, 배양된 종괴를 5㎛ 단편으로 절단하여 면역조직화학분석을 수행하였다.
1차 항체의 결합은 비오틴-결합 2차 항체, 애비딘, 비오틴-결합 서양고추냉이 퍼옥시다제 및 아미노에틸 카바졸 기질 키트(Aminoethyl Carbaxzole Substrate Kit, AEC)로 염색하여 관찰하였다. 면역조직화학분석으로부터 NIH/3T3으로 형질감염된 HCCR-1이 세포의 성질을 간엽세포에서 상피세포로 변화시켰음을 알 수 있다. 도 20에 나타낸 바와 같이 세포구(cell nest)는 레티쿨린 섬유로 둘러싸였다.
세포에서는 케라틴(도 21) 및 상피막 항원(도 22)과 같은 상피성 표지물질과 간엽 표지물질인 비멘틴(도 23)이 함께 발현된다.
실시예 16: 단백질 키네이즈 C 및 텔로머레이즈 활성 분석
야생형 NIH/3T3 세포(ATCC CRL 1658), 실시예 9의 단계 1에서 제조한 pcDNA3 함유 NIH/3T3 세포 및 HCCR-1 형질감염된 NIH/3T3 세포를 사용하여 단백질 키네이즈 C(PKC) 활성을 분석하여 HCCR-1이 세포내에서 PKC의 활성을 조절함을 확인하였다.
PKC 활성은 SigmaTECTTM단백질 키네이즈 C 분석 시스템(Promega)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정되었다. PKC 활성은 인지질의 부재 및 존재 시에 분당 기질에 도입되는 PKC의 양의 차이로 정의된다. 각각의 값은 3회의 독립적인 실험 후 평균±표준편차로 나타낸 것이다.
도 24의 결과는 HCCR-1 형질감염된 NIH/3T3 세포의 PKC 활성이 야생형 보다 약 10배 정도 더 높음을 나타낸다.
HCCR-1의 종양형성을 설명하기 위하여, 텔로머레이즈 PCR-ELISA 키트를 사용하여 제조사의 지시에 따라, 야생형 NIH/3T3 세포, 실시예 9의 단계 1에서 제조한 pcDNA3 함유 NIH/3T3 세포 및 HCCR-1 형질감염된 NIH/3T3 세포에서의 텔로머레이즈 활성을 측정하였다. 상기 키트에 포함되어 있는 인간 텔로머레이즈에 양성인 불멸화된 인간 신장 세포(293 세포)를 양성 대조군으로 사용하였다.
RNase로 미리 처리된 293 세포(+RNase)를 음성 대조군으로 사용하였다. 분석시험은 1 x 103의 세포에 당량인 추출량으로 수행되었다.
도 25에 4개의 독립적인 실험에서 얻은 광학 밀도(OD) 값을 나타내었다(평균 ±표준편차). 이전의 연구(Holt, S. E., Wright, W. E. and Shay J. W.Mol. Cell Biol. 16, 2932-2939 (1996)))와 일치하게, 야생형 NIH/3T3는 검출가능한 정도의 텔로머레이즈 활성을 보인 반면, HCCR-1 유전자가 형질감염된 경우에는 텔로머레이즈의 활성이 야생형에 비해 약 7배 정도 증가하였다. 293 세포에서는 높은 텔로머레이즈 활성이 관찰되었으나, RNase로 처리된 경우에는 활성이 나타나지 않았다.
실시예 17: 세포주기 실험
미드 로그기(mid-log phase)에서 DMEM 배지에서 배양된 야생형 및 HCCR-1-형질감염된 NIH/3T3 세포를 0.5% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 36 시간 동안 배양하여 성장을 중지시켰다. DNA 함량을 분석하려는 세포를 트립신 처리한 후, 수확하여 70% 에탄올에서 고정시켰다. 이어서, 헤들리(Hedley)의 방법(Flow Cytometry,DNA Analysis from Paraffin-embedded Blocks; Darzynkiewicz, Z. Crissman, H. A. eds., Academic Press, San Diego, 1990)에 따라 고정된 세포를 프로피디윰 요오다이드로 염색하였다.
먼저, 프로피디움 요오다이드 염색 용액(Sigma) 50㎍/㎖ 및 RNase A (Boerhinger Mannheim) 100 단위/㎖를 2 x 106세포에 가하였다. 1 시간 동안 배양한 후, FACS Caliber(Becton Dickinson)를 이용하여 488㎚에서의 형광분석을 통해 세포 DNA 함량을 분석하였다. Modfit 5.2 소프트웨어로 분석한 결과, 시료당 최소 1x104의 세포가 있음이 확인되었다.
세포주기 프로파일을 조사하여 HCCR-1-형질감염된 NIH/3T3 세포의 성장 특성이 변화되었는지 검사하였다. 야생형 및 HCCR-1-형질감염된 NIH/3T3 세포(HCCR-1세포)(미드-로그기)의 G0/G1, S 및 G2/M기에서의 상대적 세포 함량을 측정하여 표 1에 나타내었다.
| 야생형 | HCCR-1 세포 | |||||
| G0/G1 | S | G2/M | G0/G1 | S | G2/M | |
| 세포함량(%) | 55.7 | 20.6 | 24 | 46.6 | 31.5 | 22.4 |
표 1에 나타낸 바와 같이, S-기에 있는 야생형 및 HCCR-1-형질감염된 NIH/3T3 세포의 함량은 각각 20.6% 및 31.5%이다. 이러한 결과는 HCCR-1 형질감염된 NIH/3T3 세포의 다수가 G0/G1기에서 S-기로 변화되었음을 보여주는 것이다.
혈청-종속 세포 주기 변화를 조사하기 위하여, 세포를 0.5% 우태아 혈청에서 36 시간 동안 배양하였다. 배양후, 20% 우태아 혈청으로 세포를 옮기고, 지정된 시간에 수확하였다. 특정시간에서, 야생형 및 HCCR-1-형질감염된 NIH/3T3 세포(HCCR-1 세포)의 G0/G1, S 및 G2/M기에서의 상대적 세포 함량을 측정하여 표 2에 나타내었다.
| 시간(h) | 세포 함량(%) | |||||
| 야생형 | HCCR-1 세포 | |||||
| G0/G1 | S | G2/M | G0/G1 | S | G2/M | |
| 0 | 77 | 8.0 | 14.9 | 70 | 21.8 | 8.7 |
| 12 | 72.2 | 14.0 | 14.2 | 66.9 | 24.0 | 9.6 |
| 24 | 49.6 | 13.4 | 37.2 | 56.7 | 24.7 | 19.2 |
| 48 | 58.3 | 18.3 | 23.7 | 52.7 | 30.4 | 17.5 |
표 2에 나타낸 바와 같이, 0시간에서는 적은 양(8%)의 야생형 세포가 S-기에잔류한 반면, HCCR-1 세포는 상당한 양(21.8%)으로 S기에 잔류하였다. 이는 HCCR-1의 과발현에 의해 혈청 부족으로 유도된 G0/G1어레스트(arrest)를 상대적으로 저지한다는 것을 나타낸다. 혈청 부족으로 유도된 성장 어레스트 상태를 해소시키면, 측정된 시간 간격(12, 24, 및 48 시간)에서 야생형 세포에 비하여 HCCR-1 세포의 S-기 세포수가 10% 이상 일관되게 증가한다. 따라서, HCCR-1의 과발현은 G0/G1-기를 단축시키고, S-기 세포수를 늘려서 세포 성장을 교란시킬 수 있다.
실시예 18: 안티 센스 올리고데옥시뉴클레오티드의 제조
HCCR-1 mRNA의 번역 시작 부위를 목표로 하는 안티-센스 및 센스 포스포티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드(ODNs)를 인간 HCCR-1 cDNA 서열(GenBank 등록번호 제AF195651호)을 기초로 하여 자동화 DNA 합성기(Expedite Nucleic Acid System, Framingham, MA)를 이용하여 시아노에틸포스포르아미다이트 법으로 제조하였다.
18량(18-mer) HCCR-1 안티-센스 ODN 서열은 5'-CCTGGACATTTTGTCACC-3' (서열번호: 3; 서열번호:1의 뉴클레오티트 번호 66 내지 83에 해당함)이고, 대조군으로서 상응하는 센스 서열 5'-GGTGACAAAATGTCCAGG-3'(서열번호: 4) 및 미스센스 서열 5'-CGCGGATATTTCCTCACC-3'(서열번호: 5)을 사용하였다.
실시예 19: HCCR-1 안티 센스 ODN을 사용한 암 유전자 치료
(단계 1) 유전자 발현의 저해
지수적으로 성장하는 2x105H-358 폐 암종 세포(ATCC CRL-5807)를 트립신-EDTA로 분리시키고, 24-웰 플레이트에 넣었다. 올리고데옥시뉴클레오티드를 처리하는데에는 리포펙타민(Gibco BRL)이 사용되었다. 리포펙타민(5㎕/㎖ 배지)을 실온에서 30분 동안 세포 현탁액 중에서 적절한 양의 ODN과 함께 배양하여 최종 농도가 100 nM ODN이 되도록 하였다. 이어서, 혼합물 1000㎕를 상기 24-웰 플레이트의 세포상에 직접 첨가하고, 1, 2, 3, 5 및 7일 동안 각각 배양하였다. 트립판 블루 염색 배제 분석법으로 조절한 결과 형질감염 시약에는 세포독성이 관찰되지 않았다.
HCCR-1 안티-센스의 저해 효과를 관찰하기 위하여, 실시예 18에서 수득한 센스, 미스센스 및 안티센스 ODN를 각각 100 nM 사용하여 배양된 폐 암종 세포를 처리하였다. 안티센스 ODN 처리된 폐 암종 세포에서의 HCCR-1 발현은 역전사 중합효소 연쇄법(RT-PCR)으로 검사하였다. HCCR-1 cDNA의 코딩 부위에 따라 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 중합시에 사용하였다: 정방향 5'-GGGAGATGGAGCATTTGAGA-3' (서열번호: 6, 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 376 내지 395에 해당) 및 역방향 5'-GCTTCCGGAAAGCATGATAG-3'(서열번호: 7, 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 554 내지 573에 상보적인 서열).
방해 효과를 나타내는 안티-센스 유전자의 양은 HCCR-1 mRNA 발현량과 연관되어있다. mRNA의 완전성(integrity)을 확인하기 위한 내부 표지물질로는 497bp β-액틴이 사용되었다(도 26B). 음성 대조군(N)에서는 RNA 주형 대신에 뉴클리에이즈를 함유하지 않는 물이 사용되었다. 1000-bp 래더(ladder) DNA 크기 표지물질(M)도 사용되었다. 도 26A에 나타낸 바와 같이, 198 bp HCCR-1 RT-PCR 산물의 발현 농도는 안티-센스 ODN 처리에 의해 시간에 따라 감소하였다. HCCR-1 유전자 발현은 100 nM의 안티-센스 HCCR-1 ODN을 7일간 처리한 세포에서 완전히 저해되었다. 반면에, 100 nM의 센스 또는 미스센스 HCCR-1 ODN을 처리하거나, 미처리 세포의 경우에는 예상대로 198 bp HCCR-1 RT-PCR 산물이 검출되었다.
이러한 결과는 100 nM의 안티-센스 HCCR-1 ODN이 폐암종에서 HCCR-1 유전자 발현을 완전히 차단한다는 것을 나타내는 것이다.
(단계 2) 세포 성장 저해
100 nM의 센스, 안티-센스 또는 미스센스 HCCR-1 ODN으로 처리한 H-358 폐암 세포의 성장 양상을 성장곡선으로 평가하였다.
3회의 독립적인 실험에서, H-358 폐암세포는 트립신 처리된 후, 100 nM의 센스, 안티-센스 또는 미스센스 HCCR-1 ODN의 존재하에 플레이트에 넣었다. 100 nM of HCCR-1 ODN를 함유하는 성장 배지(RPMI-1640)는 이틀에 한번 교체하였다. 3개의 접시중의 세포를 분리하여 트립판 블루 염색 배제법으로 이틀에 한번씩 생존 세포수를 측정하였다.
도 27에 나타낸 바와 같이, 처리 1일째까지는 센스(□), 안티-센스(○) 또는 미스센스(△) HCCR-1 ODN 처리된 암세포에서 큰 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, HCCR-1 ODN 처리 3일 후에는 안티-센스 HCCR-1 ODN이 시간에 따라 폐암 세포의 성장을 감소시켰다.
안티-센스 HCCR-1 ODN에 노출시키고 7일 후에는 H-358 폐암세포에 대한 성장 저해 효과는 거의 100%인 반면, 센스 또는 미스센스 HCCR-1 ODN에 노출시킨 경우에는 처리되지 않은 야생형 H-358 세포(대조군 세포, ◇)와 유사하였다.
실시예 20: 태아 신장 발생 조절자로서의 HCCR-1 유전자의 효과
섬유모세포 유도된 HCCR-1 세포가 상피성이 되는 과정이 신장의 유기 발생 동안에 세포가 간엽세포에서 상피세포로 전환된 것과 유사하므로, HCCR-1이 발생되는 신장에서 발현되는지 조사하였다(문헌[Giordano, S.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 649-653 (1993): Tsarfaty, I.,et al.,Science 263, 98-101 (1994) 참조).
16-(F16), 18-(F18), 20-일 래트 태아(F20) 및 생후 1-(P1), 7-(P7) 및 14-일 래트(P14) 및 성체(adult) 래트 신장 조직 추출물을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 실시예 14에서와 같이 래트 폴리클로날 항-HCCR-1 혈청 및 ECL-웨스턴 블롯 검출 키트를 사용하여 HCCR-1 양성 밴드에서의 HCCR-1 단백질을 검출하였다.
도 28에서는, 약 40,000 (Mr ~40K)의 상대 분자량을 갖는 HCCR-1 단백질이18-일 래트 태아에서 과발현되는 것이 나타나있다. 도 28에서,F및P는 각각 태아 및 생후를 나타낸다.
20-일령 래트 태아의 신장을 실시예 15에서와 같이 면역조직화학적 염색을 하였다. 도 29의 염색된 래트 신장 단편(배율 x42)에서 알 수 있는 바와 같이, HCCR-1 항체는 자궁뢰로부터 유도된 수집관만을 염색시킨다(왼쪽: 척수)(문헌[Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom, 1987); Coles, H. S., et al.,Development 118, 777-784 (1993)] 참조). 피질에서 발생되는 네프론은 염색되지 않았다(오른쪽: 네프론 생성 영역).
또한, 18-일령 래트 태아 신장을 실시예 15에서와 같이 면역조직화학적 염색을 하여 시차-간섭 대조 현미경으로 관찰하였다. 도 30에서 나타낸 바와 같이, 수질 수집관의 기저외측 혈장 막은 HCCR-1 항체에 대하여 특히 반응성이 있다(배율 x220).
신장 발생은 뚜렷한 요관 신호이며 간엽세포를 상피성으로 전환시키는 확산-제한된 기저외측(basolateral) 분자에 의해 자극되므로(문헌[Barasch, J., et al.,Am. J. Physiol. 271, F50-F61 (1996)] 참조), HCCR-1 산물은 신장 발생 과정에서 상피세포로의 전환을 자극하고 신생 형질전환시에 간엽세포와 상피세포 사이의 상호작용을 매개하는 간엽세포-유도된 조절인자로 생각된다(문헌[Barasch, J.et al., Cell 99, 377-386 (1999) : Barasch, J.et al., J. Clin. Invest. 103, 1299-1307 (1999) 참조).
본 발명의 원암 유전자는 기존의 보고된 발암유전자와는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규 유전자로서 자궁경부암, 폐암, 백혈병 등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 및 안티-센스(anti-sense) 유전자치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
Claims (12)
- 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 자궁경부암 1 원암 유전자.
- 서열번호: 1의 염기 번호 9 내지 1088에 해당하는 염기서열을 갖는, 제 1 항의 인간 자궁경부암 1 원암 유전자의 단백질 코딩 영역 유전자.
- 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 유전자를 포함하는 벡터.
- 제 4 항의 벡터에 의해 형질전환된 미생물.
- 제 5 항에 있어서,대장균 JM109/HCCR-1(기탁번호: KCTC 0667BP)인 미생물.
- 제 5 항 또는 제 6 항의 미생물을 이용하여 제 3 항의 단백질을 제조하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 유전자를 포함하는 암 진단용 키트.
- 제 3 항의 단백질을 포함하는 암 진단용 키트.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 유전자로부터 전사되는 mRNA의 서열과 상보적인 염기서열을 갖고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자.
- 제 10 항에 있어서,서열번호: 3의 염기서열을 갖는 안티-센스 유전자.
- 제 10 항 또는 제 11 항의 안티-센스 유전자를 활성성분으로서 포함하는 항암 조성물.
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